NO311605B1 - Biomaterialer til forhindring av post-kirurgiske adheranser som omfatter hyaluronsyrederivater - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår nye biomaterialer essensielt bestående av esterifiserte derivater av hyaluronsyre eller av tverrbundne derivater av hyaluronsyre for anvendelse i den kirurgiske sektor, og anvendelse til å fremstille et farmasøytisk preparat til forhindring av postkirurgiske adheranser.

Postoperativ adheransedannelse er en vanlig komplikasjon ved abdominal kirurgi eller bekkenkirurgi som kan føre til en betydelig morbiditet. Mange faktorer kan påvirke utviklingen av adheranser: mekanisk trauma, kjemiske midler, tørking av serosa i forbindelse med blod, ischemi, infeksjon og fremmede materialer er alle kjent for å øke adheransedannelse. Andre årsaker er intraabdominale inflammatoriske sykdommer og medfødte abnormaliteter. Den patofysiologiske mekanisme er fremdeles uklar men en sentral felles vei hvor peritoneal fibrinolyse spiller en viktig rolle er blitt foreslått.

Ved kirurgiske traumer i vevet forårsakes frigjøring av et blodinnblandet eksudat som danner en fibrinøs bro som opprettholdes flere dager hvor cellevekst skjer.

Hvis eksudatet ikke absorberes eller lyseres i denne periode gir det inngrodde fibroblaster og påfølgende kollagen deponeringer som fører til dannelse av et permanent arr som forbinder de to tilstøtende overflater, kalt en adheranse. I konklusjon synes adheransedannelse å være et resultat av en inflammatorisk respons.

I det siste tilfellet er forskningen hovedsakelig fokusert på leting av bio-absorberbare materialer med en kort in vivo opprettholdelsestid, som virker som en barriere for adheransedannelse inntil groprosessen har skjedd; for å forhindre problemer forårsaket av ikke-absorberbare materialer (infeksjon, kalcifisering av implantatene, arrdannelse etc).

En spesielt lovende polymer er hyaluronsyre (HA), en komponent av ekstracellulær matriks funnet overalt i det menneskelige legemet. Hyaluronsyreoppløsninger er blitt vist å redusere postoperativ adheranse-dannelse etter abdominal operasjon (Urman, B. et al., Effect of Hvaluronic Acid on Postoperative Intraperitoneal Adhesjons Formation in the Rat Model. Fertil. Steril. 1991; 56:563; Shushan A. et al., Hyaluronic Acid for Preventing Experimental Postoperative-intraperitoneal Adhesions, J. Reprod. Med. 1994; 39:398) og ortopedisk operasjon (Hagberg, L, Gerdin, B., Sodium Hyaluronate as an adjunctive in adhesion prevention after

flexor tendon surgery in rabbits, J. Hand. Surg. 1992; 17A:935).

Fidia Advanced Biopolymers har utviklet kjemiske derivater av hyaluron-syre, det vil si indre estere (ACP serier) og estere med ikke-aktive alkoholer (HYAFF serier) Rastrelli, A. et al., Hyaluronic Acid Esters, A New Class of Semisynthetic Biopolymers: Chemical and Physico-chemical Properties, Clinical Implant Materials, Advanced in Biomaterials, G. Heinrike, V. Sollz and AJC Lee (Eds), Elsevier, Amsterdam 1990; 9:199-205, som viser fysiko-kjemiske egenskaper forskjellig fra den til HA (det vil si høyere oppholdstid og evne til å bli bearbeidet til å fremstille anordninger, men har tolererbar-hets- og biokompatibilitets egenskaper som er typiske for den originale biologiske polymer). Videre er disse derivatene karakterisert fra et kjemisk og et toksikologisk synspunkt.

Målet med foreliggende oppfinnelse har vært å utvikle porsjoner av ACP gel i et forsøk på å evaluere virkningen på adheranseforhindring.

Igangsettelse av adheranser eller fribrøse masser som dannes mellom tilstøtende

vev påvirket av traumer eller ischemi etter kirurgi er fremdeles en av de mest alvorlige komplikasjoner i tallrike kirurgiske fremgangsmåter. Et stort antall fremgangsmåter er blitt foreslått for å unngå denne komplikasjon, men problemet har forblitt hovedsakelig uløst.

En foreslått fremgangsmåte har vært anvendelse av suspensjoner av dekstran (diZerega G.S., «Contemporary adhesion prevention» Fertility and Sterility, Vol. 61. No. 2, February '94) injisert i peritonealhulen etter kirurgi. De kliniske resultater av anvendelse av slike dekstranoppløsninger har i stor grad vært uoverstemmende. Videre har anvendelse av dekstranoppløsninger blitt etterfulgt av hyppige komplikasjoner, inkludert ødem, abdominal smerte og dyspnea.

Anvendelser av barrierer i form av definerte strukturer (for eksempel netting, membraner) (diZerega G.S., «Contemporary adhesion prevention» Fertility and Sterility, Vol. 61. No. 2, February '94) eller viskøse geler (Genzyme U.S. Patent

no. 4,937,279 - US Patent 5,017,229) plassert mellom de skadede organer er også blitt foreslått. Disse barrierer har imidlertid generelt vist seg å ikke være effektive fordi de provoserer de ischemiske eller inflammatoriske reaksjoner på grunn av nærvær av fremmedlegemer. De eneste materialer som for tiden er godkjent for klinisk bruk er barrierer basert på oksidert degenerert cellulose (Interceed®) og barrierer basert på ekspandert polytetrafluorin etylen (e-PTFE) (Goretex® - US

Patent 4,478,665 og US Patent 4,482,516) eller polyetylen eller polypropylen.

I tillegg til det faktum at kliniske undersøkelser av virkningsgraden av slike barrierer har produsert i stor grad uoverstemmende resultater, og det må også bemerkes at begge de ovenfor nevnte materialer er assosiert med store motsetninger. Anvendelse av barrierematerialer av e-PTFE eller polyetylen eller polypropylen omfatter implantering av et syntetisk materiale som er fremmed for menneskekroppen og ikke biodegraderbar, og som kan kreve en andre kirurgisk operasjon for å fjerne eller omplassere barrieremembranen på grunn av uønskede reaksjoner av inflammatorisk type.

I prekliniske og kliniske modeller, har netting basert på oksidert degenerert

cellulose vist seg å være effektiv til å hindre dannelsen av adheranser, men bare når deres anvendelse kommer etter grundig hemostase.

Anvendelse av viskøse oppløsninger av høy molekylvekt hyaluronsyre (HA) har derfor blitt foreslått til en hjelp for å forhindre adheranse (Grainger D.A. et al.,

«The use of hyaluronic acid polymers to reduce postoperative adhesions», J. of Gynecol. Surg., Vol. 7, No. 2, 1991; Hurman B. et al., «Effect of Hyaluronic Acid

on Postoperative Intraperitoneal Adhesions Formation in the Rat Model», Fertility and Sterility, Vol. 56, No. 3 September 1991; Shushan A. et al., Hyaluronic Acid for Preventing Experimental Postoperative-intraperitoneal Adhesions:, J. of Reproductive Med., Vol. 39, No. 5, May 1994; Mitchell J.D. et al., «Reduction in experimental pericardial adhesions using a hyaluronic acid bioabsorbable membrane», Eur. J. Cardio-thorac. Surg., 8, 149-152, 1994). Hyaluronsyre som sådan er imidlertid kjennetegnet av meget hurtig absorbsjon som ikke er kompatibel med oppholdstiden som er nødvendig for å forhindre adheranse. Videre kan ikke naturlig hyaluronsyre bearbeides og som sådan kan den ikke overføres til biomaterialeform. For å forlenge dens degraderingstider og tillate den å bli bearbeidet til forskjellige fysiske former for anvendelse i forskjellige kirurgiske sektorer, har estere av hyaluronsyre og tverrbundne derivater av hyaluronsyre blitt utviklet. Fremstilling av estere av hyaluronsyre hvori alle eller deler av karboksylgruppene er esterifisert, fremstilling av tverrbundede derivater av hyaluronsyre hvori del av karboksylgruppene gjennomgår tverrbinding og deres anvendelse i den farmasøytiske, kosmetiske og kirurgiske sektor og i den til biodegraderbare plastmaterialer er beskrevet i US patenter nr. 4, 851,521 og 4,965,353,

EP 0 216 453 og EP 0 341 745.

Det er derfor en hensikt å fremstille biomaterialer for anvendelse til å forhindre postkirurgiske adheranser uten ovenstående ulemper. Denne hensikt er oppnådd med foreliggende oppfinnelse kjennetegnet ved det som fremgår av de vedlagte krav.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer biomaterialer for anvendelse til å forhindre postkirurgiske adheranser. Biomaterialene består av benzylestere av hyaluronsyre og/eller indre tverrbundne derivater av hyaluronsyre og kan være i form av gitter, membraner, vevde materialer eller netting og ikke-vevde materialer.

Figurer 1 til 10 er kurver som viser resultatene av adheransestudier i rottemodeller.

Den foreliggende oppfinnelse beskriver derfor fremstilling av helsemessige og kirurgiske artikler basert på benzylester av hyaluronsyre eller tverrbundne derivater av hyaluronsyre, brukt alene eller i blanding med hverandre, kjennetegnet av høy biokompatibilitet og overføringsevne til fysiske former som gjør dem egnet for forskjellige anvendelser i kirurgi, inkludert laparoskopisk kirurgi. Materialene er også fullstendig biodegraderbare og behøver ikke å fjernes fra anvendelsesstedet, og gjør det således mulig å unngå en andre kirurgisk operasjon. Når det fremstilles i form av geler, presenterer de tverrbundne derivater materialer med signifikant større viskositet enn den umodifiserte polymer og med variable nedbrytningstider. Videre kan både de benzylesterbaserte materialer og de tverrbundne derivatbaserte materialer i henhold til foreliggende oppfinnelse være i form av geler, membraner, vevde materialer eller netting, og ikke-vevde materialer (fremstilt i henhold til fremgangsmåter som i seg selv er beskrevet i US 4,851,521; US 4,956,353; WO 93/11804; WO 93/11803; WO 94/17837 og EP 0 341 745) og kjenne-tegnet ved følgende tekniske spesifikasjoner: membranene varierer i tykkelse mellom lOum og 1,5 mm, særlig

20-50um;

materialene eller nettingene varierer i tykkelse mellom 200|im og

1,5mm;

de ikke-vevde materialer er essensielt karakterisert av en basisvekt

som varierer mellom 20g/m<2> og 500 g/m<2> og av en tykkelse mellom 0,2mm og 5mm, særlig <lmm.

Disse materialer kan anvendes alene eller i assosiasjon med hverandre eller med andre materialer bestående av syntetiske polymerer (for eksempel geler basert på tverrbundet hyaluronsyre + polypropylen, eller membraner essensielt sammensatt av esterifiserte derivater av HA + polypropylen eller membraner som omfatter esterifiserte derivater av HA belagt med en gel av auto-tverrbundet HA).

Den foreliggende oppfinnelse angår virkelig også anvendelse av kompositt-materialer i form av geler (for de tverrbundne derivater), membraner, vevde eller ikke-vevde materialer eller ark, essensielt bestående av benzylestere eller tverrbundne derivater av hyaluronsyre i assosiasjon med ikke-bio-degraderbare materialer i form av netting eller membraner eller ikke-vevde materialer så som e-PTFE, polyetylen, polypropylen, polyester (Dacron®). Foreliggende oppfinnelse angår derfor en ny klasse av helsepleie og kirurgiske artikler som skal anvendes på det kirurgiske området til å forhindre dannelsen av postkirurgiske adheranser.

Materialer

Som bemerket ovenfor er den foreliggende oppfinnelse karakterisert av materialer som omfatter derivater av hyaluronsyre, spesielt benzylester-derivater og indre tverrbundne derivater.

Betegnelsen "hyaluronsyre" (også referert til som "HA") blir brukt i litteraturen for

å beskrive et surt polysakkarid med forskjellige molekyl-vekter utgjort av rester av D-glukoronsyre og N-acetyl-D-glukosamin, som naturlig forekommer i cellulære overflater, i den basale ekstracellulære stoffene til innervevet hos vertebrater, i synovialvæsken i ledd, i glass-legemet i øyet, i vevet i den menneskelige nevlestreng og i hanekammer.

Hyaluronsyre spiller en viktig rolle i den biologiske organisme, først som en mekanisk understøttelse av cellene i mange vev, så som hud, sener, muskler og brusk og er derfor hovedbestanddelen av den ekstracellulære matriks. Men hyaluronsyre utfører også andre funksjoner i de biologiske prosesser, så som hydrering av vevene, smøring, cellulær migrering, cellefunksjon og differensiering (se for eksempel A. Balazs et al., Cosmetics & Toiletries, No. 5/84, side 8-17). Hyaluronsyre kan ekstraheres fra de ovennevnte naturlige vev, så som

hanekammer eller også fra visse bakterier. I dag kan hyaluronsyre også fremstilles ved mikrobiologiske fremgangsmåter. Molekylvekten til gel hyaluronsyre oppnådd ved ekstrahering er i området fra 8-13 millioner. Molekylkjeden til polysakkarid kan imidlertid degraderes ganske lett under innflytelse av forskjellige fysiske og kjemiske faktorer, så som mekaniske påvirkninger eller under påvirkning av stråling, hydrolyse, oksidering eller enzymatiske midler. Av denne grunn oppnås ofte i ordinære rensingsprosedyrer av originale ekstrakter degraderte fraksjoner med en lavere molekylvekt. (Se Balazs et al., sitert ovenfor). Hyaluronsyre, dens molekylære fraksjoner og de respektive salter er blitt brukt som medikamenter og deres anvendelse er også foreslått i kosmetikk (se for eksempel ovennevnte artikkel av Balazs et al., og fransk patent nr. 2478468).

Skjønt betegnelsen "hyaluronsyre" er vanligvis brukt på en ukorrekt måte, betyr

det, som det kan ses ovenfor, en hel serie av polysakkarider med variasjoner i restene av D-glukuronsyre og N-acetyl-D-glukosamin med forskjellige molekylvekter eller til og med degraderte fraksjoner av de samme, og skjønt flertallsformen "hyaluronsyrer" kan synes mer passende vil vi i diskusjonen heri fortsette å bruke entallsformen og referere til hyaluronsyre i dets forskjellige former, inkludert dens molekylære fraksjoner, og forkortelsen "HA" vil også ofte bli brukt for å beskrive denne kollektive betegnelse.

1. Benzvlester derivater:

Det første foretrukne materialet i henhold til oppfinnelsen er basert på

benzylesteren av hyaluronsyre, særlig 80 til 100% estere hvori 80 til 100% av HA karboksylgrupper er esterifiserte. De benzylestere hvori 80 til 99% av HA karboksylgrupper er esterifisert med en benzylgruppe blir referert til som "delvise estere", fordi bare en del av karboksylgruppen er esterifisert og de gjenværende

karboksylgrupper er enten fri eller saltet med et alkalisk eller jordalkalisk metall,

så som natrium, kalsium eller kalium.

Mest foretrukket for biomaterialene i forhold til oppfinnelsen er såkalte "totale" benzylester hvori alle HA karboksylgrupper er esterifiserte. I disse totale estere kan alle HA karboksylgruppene være esterifiserte med en benzylgruppe (også referert til som HYAFF 11) eller en del (75 til 99%) kan være esterifiserte med en benzylgruppe og alle de gjenværende karboksyl-grupper er esterifisert med lipipkjede "alkylrest" fra en C,0.20 alifatisk alkohol for å fremstille det som kan refereres til som "blandede" estere. Av disse alifatiske alkoholer, palmitin alkohol (C,6 heksadecyl) og stearin alkohol (C18 oktadecyl) er de mest foretrukne. Disse blandede estere kan også være i form av delvise estere, det vil si derivater hvori en del (75 til 99%) av karboksylgruppene er esterifiserte med en benzylgruppe og noen men ikke alle av de gjenværende karboksylgrupper er esterifiserte med C10.20 alifatisk alkohol. Av disse mest foretrukne er de som er minst 75% benzylesterifiserte og minst 5% esterifisert med C10.20 alifatisk alkohol.

Benzylesterne av hyaluronsyre i henhold til oppfinnelsen kan fremstilles ved fremgangsmåte kjent per se for esterifisering av karboksylgrupper, for eksempel ved behandling av fri hyaluronsyre med alkoholen (benzyl og/eller Ci0.20 alkohol) i nærvær av katalyserende stoffer, så som sterke uorganiske syrer eller ionebyttere av den syretypen, eller med et eterifiserende middel som er i stand til å innføre den ønskede alkoholresten i nærvær av inorganiske eller organiske baser.

Benzyl hyaluronsyreesterne kan imidlertid med fordel fremstilles i henhold til en spesiell fremgangsmåte beskrevet i EP 0 216 453. Denne fremgangsmåte består i å behandle kvaternært ammoniumsalt av hyaluronsyre med et eterifiserende middel, fortrinnsvis i et aprotisk organisk oppløsningsmiddel.

For fremstilling av benzylestere er det mulig å bruke hyaluronsyrer av en hver opprinnelse, så som for eksempel syrene ekstrahert fra ovenfor nevnte naturlige utgangsmaterialer, for eksempel fra hanekammer. Fremstillingen av slike syrer er beskrevet i litteraturen; fortrinnsvis blir renset hyaluronsyre brukt. I henhold til oppfinnelsen blir det spesielt brukt hyaluronsyrer som omfatter molekulære fraksjoner av hele syrer oppnådd direkte ved ekstraksjon av det organiske materialet med molekylvekter som varierer innenfor et stort område, for eksempel fra cirka 90% til 80% (M = 11,7 - 10,4 millioner) til 0,2% (M = 30 000) av molekylvekten av den hele syren som har en molekylvekt på 13 millioner, fortrinnsvis mellom 5% og 0,2%. Slike fraksjoner kan oppnås med forskjellige fremgangsmåter beskrevet i litteraturen, så som ved hydrolysering, oksidering, enzymatiske eller fysiske fremgangsmåter, så som mekaniske fremgangsmåter eller strålingsfrem-gangsmåter. Opprinnelige ekstrakter blir derfor dannet under disse tomme rensingsfremgangsmåter (for eksempel se artikkelen av Balazs et al., sitert ovenfor i "Cosmetics & Toiletries"). Adskillelse og rensing av de oppnådde molekylære fraksjoner blir gjennomført ved kjente teknikker, for eksempel ved molekylær filtrasjon.

En fraksjon renset HY egnet for anvendelse i henhold til oppfinnelsen er for eksempel den kjent som "ikke-inflammatorisk-NIF-NaHA natrium hyaluronat beskrevet av Balazs i boken "Healon" - A guide to its use in Ophtalmic Surgery,

D. Miller & R. Stegmann, red. John Wiley & Sons, N.Y., 81983; p 5.

Særlig viktig som utgangsmateriale for benzylesteren er to rensede fraksjoner oppnåelig fra hyaluronsyre, for eksempel de ekstrahert fra hanekammer, kjent som "Hyalastine" og "Hyalectin". Fraksjonen Hyalastine har en gjennomsnittlig molekylvekt på cirka 50 000 til 100 000 mens fraksjonen Hyalectin har en gjennomsnittlig molekylvekt på mellom 500 000 og

730 000. En kombinert fraksjon av disse to fraksjoner er også blitt isolert og karakterisert som å ha en gjennomsnittlig molekylvekt på cirka 250 000 til cirka 350 000. Denne kombinerte fraksjon kan oppnås med et utbytte på 80% av total hyaluronsyre tilgjengelig i det spesielle utgangsmaterialet, mens fraksjonen Hyalectin kan oppnås med et utbytte på 30% og fraksjonen Hyalistin med et

utbytte på 50% fra utgangs HA. Fremstillingen av disse fraksjoner er beskrevet i EP 0 138 572.

De følgende avsnitt beskriver fremstillingen av benzylestere av HA.

Eksempel 1 - Fremstilling av benzvlestere av Hvaluronsvren ( HA )

12,4 g av HA tetrabutylammoniumsalt med en molekylvekt på 170 000 som tilsvarer 20 mEkv av en monomer enhet blir solubilisert i 620 ml dimetylsulfoksid ved 25°C, 4,5 g (25 mEkv) av benzylbromid og 0,2g av tetrabutylammoniumiodid blir tilsatt, og oppløsningen blir holdt i 12 timer ved 30°C.

Den resulterende blanding blir langsomt helt i 3500 ml etylacetat under konstant risting. Et bunnfall blir dannet som blir filtrert av og vasket 4 ganger med 500ml etylacetat og endelig vakuumtørket i 24 timer ved 30°C.

9g av benzylesterproduktet i tittelen blir oppnådd. Kvantitativ bestemmelse av estergruppene blir utført i henhold til fremgangsmåten beskrevet på sidene 169 til 172 i Siggia S. og Hann J.G. "Quantitative organic analysis via functional groups" 4th edition, John Wiley and Sons.

Eksempel 2 - Fremstilling av benzvlestere av h<y>aluronsyre ( HA)

3g av kaliumsaltet av HA med en molekylvekt på 162 000 blir oppslemmet i 200ml dimetylsulfoksid; 120mg tetrabutylammoniumiodid og 2,4 g benzylbromid blir tilsatt.

Oppslemmingen blir holdt under bevegelse i 48 timer ved 30°C. Den resulterende blanding blir langsomt helt i 100 000 ml etylacetat under konstant bevegelse. Et bunnfall blir dannet som filtreres og vaskes 4 ganger med 150 ml etylacetat og avsluttende vakuumtørket i 24 timer ved 30°C.

3,lg av benzylesterproduktet i tittelen blir oppnådd. Kvantitativ bestemmelse av estergruppen blir utført i henhold til fremgangsmåten beskrevet på sidene 1698-172

i Siggia S. og Hanna J.G. "Quantitative organic analysis via functional groups" 4th Edition, John Wiley and Sons.

Eksempel 3 - Fremstilling av et Hvaluronsyrederivat med 75% av sine karboksylfunksjoner esterifisert med benzvlalkohol og de gjenværende 25% esterifisert med Octadecvl alkohol TStearvl alkohol.

ch,-( chx< -CH, - om

6,2lg tetrabutylammoniumsalt av hyaluronsyre med en molekylvekt på 180 000 Dalton (10 mEkv) blir oppløst i 248 ml dimetylsulfoksid (DMSO) ved romtemperatur.

Denne oppløsning blir supplementert med 0,89ml benzylbromid (7,4 mEkv) og oppløsningen blir hensatt ved 30°C i 12 timer. Oppløsningen ble deretter avkjølt til romtemperatur og supplementert til 0,83g oktadekylbromid (2,5 mEkv). Oppløsningen blir oppvarmet til 30°C i 24 timer. En 2,4% oppløsning (vekt/vekt)

av NaCl i vann blir deretter tilsatt og den resulterende blanding blir helt i 750ml aceton, under omrøring. Et bunnfall blir dannet som filtreres, vaskes 3 ganger i 1 OOrnl aceton/vann 5:1,3 ganger med 1 OOrnl aceton og deretter tørket under høyt vakuum i 24 timer ved 30°C. 5,lg av det ønskede produkt blir således oppnådd. Kvantitative bestemmelser av benzyl-alkohol- og heksadekylalkoholinnhold blir utført ved gasskromatografi etter alkalisk hydrolyse. Det totale innholdet av estergrupper blir kvanitifisert i henhold til forsåpningsmetoden beskrevet på sidene 169-172 i "Quantitative organic analysis via functional group" 4th Edition (John Wiley and Sons Publication).

Eksempel 4 - Fremstilling av et hvaluronsyrederivat med 75% av sine karboksylfunksjoner esterifisert med benzvlalkohol og de gjenværende 25% esterifisert med heksadekvlalkohol ( Cetvl Palmitvl alkohol.

ch,-( ch?v - ch7 - om

6,2lg tetrabutylammoniumsalt av hyaluronsyre med en molekylvekt på

180 000 Dalton (10 mEkv) blir oppløst i 248ml dimetylsulfoksid (DMSO) ved romtemperatur.

Denne oppløsning blir supplementert med 0,89ml benzylbromid (7,5 mEkv) og oppløsningen blir satt til henstand ved 30°C i 12 timer. Oppløsningen blir deretter avkjølt i romtemperatur og supplementert med 0,76g heksadekylbromid (2,5

mEkv). Oppløsningen blir oppvarmet til 30°C i 24 timer. En 2,5% oppløsning (vekt/vekt) av NaCl i vann blir deretter tilsatt og den resulterende blanding blir helt i 750ml aceton under omrøring. Et bunnfall blir dannet som filtreres og vaskes 3 ganger i lOOml aceton/vann, 5:1,3 ganger med lOOml aceton og deretter tørket under høyt vakuum i 24 timer ved 30°C. 5g av det ønskede produkt blir således oppnådd. Kvantitativ bestemmelse av benzylalkohol- og

heksadekylalkoholinnholdet blir utført ved gasskromatografi etter alkalisk hydrolyse. Det totale innholdet av estergrupper blir kvantifisert i henhold til forsåpningsmetoden beskrevet på sidene 169-172 i "Quantitative organic analysis via functional group" 4th Edition (John Wiley and Sons Publication).

2. De indre tverrbundne hvaluronsvrederivater: De tverrbundne hyaluronsyrederivater brukt i materialene i henhold til foreliggende oppfinnelse beskrevet i EP 0 341 745. Disse tverrbundne derivater er inter- og/eller intramolekulære estere av hyaluronsyre hvori en del av karboksygruppene er esterifiserte med hydroksylgrupper med de samme molekyl- og/eller molekyler av hyaluronsyre, for således å danne lakton eller intermolekulær esterbindinger. Disse "indre" estere hvor det ikke er noe intervensjon av OH-grupper fra andre alkoholer, kan også defineres som-"auto-tverrbundet hyaluronsyre" siden dannelse av en mono- eller polymolekulær tverrbinding er konsekvensen av den ovenfor nevnte indre estirifikasjon. Adjektivet "tverrbundet" refererer seg til de kryssvise forbindelser mellom karboksylene og hydroksylene i hyaluronsyre-molekylene.

De auto-tverrbundne produkter er spesielt delvis indre estere hvori prosent-andelen av "tverrbindinger" varierer fortrinnsvis mellom 0,5 til 20%, spesielt 4,5% av antall av karboksygrupper i hyaluronsyren. I utfellingsprosessen blir karboksygruppene i HA molekylet aktivert av tilsetting av stoffer som er i stand til å indusere slik aktivering. De ustabile mellomproduktene oppnådd fra aktiverings aksjonen adskilles spontant, enten etter tilsetting av katalysatorer og/eller etterfulgt av en økning i temperaturen, idet de danner de ovenfor nevnte indre esterbindingene med hydroksyler av samme eller andre

hyaluronsyremolekyler. I henhold til graden av ønsket indre esterifisering blir enten alle eller en porsjondel av karboksyfunksjonen aktivert (porsjonsdelen blir

opptatt ved å bruke et overskudd av aktiverende stoffer eller ved egnede doseringsmetoder).

Karboksygruppene som skal konverteres til indre estergrupper kan aktiveres ved å starte fra hyaluronsyre som inneholder fri karboksygruppe, eller fortrinnsvis fra HA som inneholder saltifiserte karboksygrupper, for eksempel metallsalter, fortrinnsvis alkali eller jordalkalimetaller, mest fortrinnsvis med kvaternære ammoniumsalter, så som de beskrevet herunder. Salter med organisk basis så som aminer kan imidlertid også anvendes som utgangsstoffer.

Fremgangsmåter for aktivering av fri eller saltifiserte karboksygrupper er i seg selv kjente, særlig i feltet peptidsyntese og de med kunnskap på området kan lett bestemme hvilken metode som er den mest egnede, særlig om det skal brukes utgangsstoffer i sine frie eller saltifiserte former eller ikke.

Aktiveringsfremgangsmåter i seg selv er kjent for peptidsyntese-fremgangsmåter

og de i fremstillingsprosessene i den foreliggende oppfinnelse er beskrevet, for eksempel i Bodanszky, M., "In search of new methods in peptide synthesis", Int. J. Peptide Protein Res. 25, 1985, 449-474; og Gross, E. et al. "The Peptides, Analysis Synthesis, Biology", Academic Press, Inc., 1979, Vol. 1, kapittel 2.1 henhold til slike fremgangsmåter blir en karboksylkomponent aktivert, det vil si en karboksylkomponent blir konvertert til den reaktive form. Slik aktivering omfatter typisk en reaksjon mellom en syre og et aktiverende middel i henhold til skjema:

hvori X er en elektrontiltrekkende del. De fleste aktiverte derivater av karboksylsyrer er derfor blandede anhydrider, inkludert på bredest mulig måte også syreazider og syreklorider som kan betraktes som blandede anhydrider av "hydrazoic"syre og HC1 som aktiverende midler. I tillegg kan aktivering av en karboksylkomponent utføres ved dannelse av "aktiverte estere" som mellomprodukter. Disse "aktiverte estere" kan være av forskjellig typer men spesielt nyttige "aktiverte estere" er de fremstilt ved anvendelse av dicyklo- - heksylkarbodiimid, p-nitrofenylestere, triklorfenyl-estere, pentaklorfenylestere, og O-acylderivater av hydroksylaminer spesielt estere av N-hydroksysuccinimid.

Alle disse forskjellige typer av aktiveringsfremgangsmåter er nyttige i fremstilling av den tverrbundne HA i henhold til oppfinnelsen, idet alle disse fremgangsmåtene kan karakteriseres som først og fremst å omfatte reaksjon av en karboksylgruppe med et aktiveringsmiddel som essensielt resulterer i dannelsen av substituentgruppe som er lett reaktiv med en hydroksylgruppe slik at det lett dannes den indre esterbinding som er karakteristisk for produktene i henhold til oppfinnelsen. Antall karboksyfunksjoner som skal konverteres til indre estere i forhold til antall aktiverte karboksyfunksjoner avhenger av kvaliteten på det anvendte aktiverende middel.

Den foretrukne fremgangsmåte for fremstilling av tverrbundet HA er derfor karakterisert ved å behandle HA som har frie eller saltifiserte karboksy-grupper,

med et middel som aktiverer karboksyfunksjonen, eventuelt ved nærvær av et hjelpemiddel som fremmer dannelse av mellomproduktaktiverte derivater og/eller en tertiær organisk eller uorganisk base, å eksponere blandingen til oppvarming eller bestråling (spesielt med UV-lys), og hvis ønsket, å saltifisere frie karboksygrupper eller ved å frigjøre saltifiserte karboksygrupper. Av stoffene som er i stand til å aktivere karboksygruppene kan det anvendes de konvensjonelle som er beskrevet i litteraturen, for eksempel de som vanligvis brukes i peptidsyntese, unntagen imidlertid de som ville ha den virkning at de forandrer eller ødelegger den molekulære strukturen til utgangs-HA, så som de brukt ved dannelse av karboksylhalogenider. Foretrukne stoffer som fører til dannelse av aktiverte estere er karbodiimider, dicykloheksylkarbodiimid, benzylisopropylkarbodiimd, benzyl-etyl-karbodiimid; etoksyacetylen; Woodwards reagens (N-etyl-5-fenylisoxazolium-3-sulfonat) eller halogenderivater fra alifatiske, cykloalifatiske eller aromatiske hydrokarboner, eller fra heterocykliske forbindelser med halogen gjort mobil ved nærvær av flere aktiverende grupper, så som kloracetonitryl og spesielt saltene av 2-klor-N-alkylpyridin, så som klorid av 2-klor-N-metyl-pyridin eller andre alkylderivater med indre alkylgrupper, så som de med opptil 6 karbonatomer. I steden for kloridderivater kan andre halogenderivater selvfølgelig anvendes, så som bromidderivater.

Denne aktiveringsreaksjonen kan utføres i organiske oppløsningsmidler, spesielt aprotiske oppløsningsmidler så som dialkylsulfoksider, dialkyl-karboksylamider,

så som spesielt lavere alkyl dialkylsulfoksider, særlig dimetylsulfoksid, polymetylensulfoksider, så som tetrametylensulfoksid, dialkyler eller polymetylensulfoner, så som tetrametylensulfon, sulfolan og lavere alkyldialkylamider av lavere alifatiske syrer i hvilke alkylgruppene har et maksimum på 6 karbonatomer, så som dimetyl eller dietylformamid eller dimetyl eller dietylacetamid. Andre oppløsningsmidler kan imidlertid også anvendes, og disse behøver ikke alltid å være aprotiske, så som alkoholer, etere, ketoner, estere,

så som lavere alifatiske dialkyloksyhydro-karbider, så som dimetoksyetan og spesielt alifatisk eller heterocykliske alkoholer og ketoner med et lavt kokepunkt,

så som lavere N-alkyl- pyrrolidoner, så som N-metylpyrrolidon eller N-etyl-pyrrolidon, heksafluor-isopropanol og trifluoretanol. Hvis halogenderivater blir brukt som karboksylaktiverende stoffer, spesielt i form av salter, så som de ovenfor nevnte 2-klor-N-metylpyridinklorid, er det bedre å bruke et metallsalt eller et salt

av den organiske base av utgangssakkaridet, spesielt en av de kvaternære aammoniumsalter beskrevet heretter, så som tetrabutylammoniumsalt. Disse salter har den spesielle fordel at de er meget oppløselige i de ovenfor nevnte organiske oppløsningmidler i hvilke tverrbindingsreaksjonen blir best utført, og garanterer således et utmerket utbytte. Det er tilrådelig å tilsette blandingen et stoff som er i stand til å trekke fra syren, så som organiske baser, karbonater, bikarbonater eller alkaliske acetater eller jordalkaliske acetater, eller organiske baser og spesielt tertiære baser så som pyridin og dets homologer, så som collidin, eller alifatiske aminbaser, så som trietylamin eller N-metyl-piperasin.

Anvendelsen av kvaternære ammoniumsalter representerer en spesielt fordelaktig fremgangsmåte. Slike ammoniumsalter er velkjente og blir fremstilt på samme måte som andre kjente salter. De avledes fra alkyler som har fortrinnsvis mellom 1 og 5 karbonatomer. Det er foretrukket å bruke tetrabetylammoniumsalter. En variasjon i fremgangsmåten i hvilke kvaternært ammoniumsalt blir brukt, består i å omsette et alkalisk salt, for eksempel natrium eller kaliumsalt, i nærvær av en katalyserende mengde av et kvaternært ammoniumsalt, så som

tetrabutylammoniumiodid.

Stoffene som katalyserer aktivering av karboksygrupper som skal tilsettes til de aktiverende midler rapporteres i litteraturen og også disse er fortrinnsvis baser slik som de nevnt tidligere. Således for eksempel når karboksygruppene blir aktivert med isotiazolinsalter er det foretrukket å tilsette noe trietylamin til reaksjonsblandingen.

Reaksjonen til dannelse av aktiverte mellomprodukter, så som og spesielt estere,

blir utført ved den temperatur anbefalt i litteraturen og denne temperaturen kan imidlertid varieres hvis omstendighetene krever det på en måte som lett kan bestemmes av en med kunnskap på området. Dannelsen av indre esterbindinger kan foretas innenfor et rimelig stort temperaturområde, for eksempel mellom 0°C og 150°C, fortrinnsvis romtemperatur eller noe over, for eksempel mellom 20°C og 75°C. Å heve temperaturen favoriserer dannelsen av indre esterbindinger, som også eksponering til stråling av egnet bølgelengde gjør, så som ultrafiolette stråler.

Hyaluronsyresubstråtet kan være av en hver opprinnelse og kan være av forskjellig typer som diskutert ovenfor. De foretrukne HA utgangsmaterialer er de med en gjennomsnittlig molekylvekt på 150 000 til 730 000, spesielt 150 000 til 450 000 Dalton.

I tillegg kan mengden av indre tverrbinding variere, men foretrukne materialer i henhold til oppfinnelsen utnytter HA tverrbinding til en grad på 4,5 til 5,0% av karboksylgruppene.

I følgende eksempler beskrives fremstilling av nyttige tverrbundne HA-produkter

for fremstilling av materialer i henhold til oppfinnelsen.

Eksempel 5 - Fremstilling av 1% tverrbundet hyaluronsyre ( HA)

Produktbeskrivelse:

1% karboksygrupper brukt i indre esterifisering.

99% karboksygrupper saltifisert med natrium.

6,2lg HA tetrabutylammoniumsalt med en molekylvekt på 170 000

tilsvarer 10 mEkv av en monomer enhet blir oppløst i 248ml DMSO

ved 25°C, 0,01g (0,1 mEkv) av trietylamin blir tilsatt.

Eksempel 6 - Fremstillin<g> av 5% tverrbundet h<y>alurons<y>re ( HA)

Produktbeskrivelse:

5% karboksygrupper brukt i indre esterifisering.

95% karboksygruppene saltifisert med natrium.

6,21g HA tetrabutylammoniumsalt med en molekylvekt på 85 000

tilsvarer 10 mEkv av en monomer enhet blir oppløst i 248ml DMSO

ved 25°C, 0,05lg (0,5 mEkv) av trietylamin blir tilsatt og den resulterende oppløsning blir beveget i 30minutter.

Oppløsning på 0,128g (0,5 mEkv) av 2-klor-l -metyl pyridiniumiodid i 60ml

DMSO blir langsomt tilsatt dråpevis over et tidsintervall på 1 time og blandingen blir holdt i 15 timer ved 30°C.

En oppløsning blir dannet av lOOml vann og 2,5g natriumklorid blir deretter tilsatt og den resulterende blanding blir deretter helt langsomt i 750ml aceton, under opprettholdelse av kontinuerlig bevegelse. Et bunnfall blir dannet som deretter filtreres og vaskes 3 ganger i lOOml aceton/vann, 5:1, og 3 ganger med lOOml aceton og til slutt vakuumtørket i 24 timer ved 30°C.

3,95g av forbindelsen i tittelen blir oppnådd. Kvantitativ bestemmelse av estergruppene blir utført i henhold til forsåpningsmetoden beskrevet på sidene 169-172 i "Quantitative organic analysis via functional groups", 4th Edition, John

Wiley and Sons Publication.

Eksempel 7 - Fremstilling av 10% tverrbundet h<y>alurons<y>re ( HA)

Produktbeskrivelse:

10% karboksygrupper brukt i indre esterifisering.

90% karboksygruppene saltifisert med natrium.

6,2lg HA tetrabutylammoniumsalt med en molekylvekt på 620 000, som

tilsvarer 10 mEkv av en monomer enhet blir oppløst i 248ml DMSO

ved 25°C. 0,101g (1,0 mEkv) av trietylamin blir tilsatt og den resulterende oppløsning blir beveget i 30minutter.

En oppløsning på 0,255g (1,0 mEkv) av 2-klor-l-metyl-pyridiniumiodid i 60ml DMSO blir langsomt tilsatt dråpevis over et tidsintervall på 1 time og blandingen blir holdt i 15 timer ved 30°C.

En oppløsning dannet av lOOml vann og 2,5g natriumklorid blir deretter tilsatt og den resulterende blanding blir deretter helt langsomt i 750ml aceton, under opprettholdelse av kontinuerlig bevegelse. Et bunnfall blir dannet som deretter blir filtrert og vasket 3 ganger i lOOml aceton/vann, 5:1, og 3 ganger med lOOml aceton og til slutt vakuumtørket i 24 timer ved 30°C.

3,93g av forbindelsen i tittelen blir oppnådd. Kvantitativ bestemmelse av estergruppene blir utført i henhold til forsåpningsmetoden beskrevet på sidene 169-172 i "Quantitative organic analysis via functional groups", 4th Edition, John Wiley and Sons Publication.

Eksempel 8 - Fremstilling av 10% tverrbundet h<y>alurons<y>re ( HA)

Produktbeskrivelse:

10% karboksygrupper brukt i indre esterifisering.

90% karboksygruppene saltifisert med natrium.

6,2lg HA tetrabutylammoniumsalt med en molekylvekt på 170 000, som tilsvarer 10 mEkv av en monomer enhet, blir oppløst i 248ml DMSO

ved 25°C, 0,118g (1 mEkv) av pyridinklorid blir tilsatt og den resulterende oppløsning blir beveget i 30minutter.

En oppløsning på 0,16g (mEkv) av N-benzyl-N-etyl karbodiimid i 20ml DMSO blir langsomt tilsatt dråpevis over et tidsintervall på 1 time og blandingen blir holdt ved 30°C i 45 timer.

En oppløsning laget av lOOml vann og 2,5g av natriumklorid blir tilsatt og den resulterende blanding blir langsomt helt i 750ml aceton, under opprett-holdelse av kontinuerlig bevegelse. Et bunnfall blir dannet som deretter filtreres og vaskes 3 ganger med lOOml aceton/H20, 5:1, og 3 ganger med lOOml aceton og til slutt vakuumtørket i 24 timer ved en temperatur på 30°C.

3,9g av forbindelsen i tittelen blir oppnådd. Kvantitativ bestemmelse av de totale estergrupper blir utført i henhold til forsåpningsmetoden beskrevet på sidene 169-172 i "Quantitative organic analysis via functional groups", 4th Edition, John Wiley and Sons Publication.

3. Fremstilling av biomaterialer

I følgende eksempler beskrives fremstilling av kirurgiske/helsemessige produkter i henhold til oppfinnelsen som omfatter den totale benzylester av HA eller en auto-tverrbundet HA derivat eller kombinasjoner derav. Som bemerket ovenfor er fremgangsmåte for fremstilling av membraner, vevde materialer, vevde nettinger og ikke-vevde materialer beskrevet i

US 4 851 521; US 4 965 353, WO 93/11804; WO 93/11803; WO 94/17837 og EP 0_ _ 341 745.

Eksempel 9 - Fremstilling av et produkt basert på HYAFF 11 + pol<y>prop<y>len netting

En oppløsning av HYAFF 11 (100% benzylester av hyaluronsyre) i DMSO blir fremstilt (110mg/ml). Med en gang oppløsningen er fullstendig blir oppløsningen filtrert gjennom 20(im filterklede og avgasset ved å la det stå i vakuum i 2 timer. 5ml av oppløsningen blir helt ut og spredd på en glass-plate, etter hvilke polypropylen nettingen (6x11 cm) blir plassert på toppen og ytterligere 1 Oml av oppløsningen blir helt over den. Dette blir spredd likt over nettingen og alt overskudd eliminert.

Glassplaten blir nedsenket i et bad som inneholder etanol/H20 (90:10) i 5 timer for

å tillate preparatet å koagulere og at platen blir avfestet; preparatet blir deretter nedsenket i et bad med absolutt etanol 16 timer. Det blir deretter tørket på en plate i vakuum i 30 minutter ved 63°C.

Eksempel 10 - Fremstilling av et produkt basert på vevd materiale av HYAFF 11 dekket med en film av HYAFF 11

En oppløsning av HYAFF 11 i DMSO blir fremstilt (110um/ml). Når oppløsningen

er fullstendig blir oppløsningen filtrert gjennom et 20um filterklede og avgasset ved å la det stå i vakuum i 2 timer. 5ml av oppløsningen blir helt ut og spredd på

en glassplate, etter hvilken HYAFF 11 gass (10 x 20cm) blir plassert på toppen idet man tar seg umaken med at det kleber uten skrukker eller luftbobler, og ytterligere lOml av oppløsningen blir helt over den. Dette blir spredd likt ut over gassen og alt overskudd eliminert.

Glassplaten blir deretter senket ned i et bad som inneholder etanol i 30 minutter for

å tillate preparatet å koagulere og at platen blir avfestet. Preparatet blir deretter etterlatt i etanol i 16 timer og tørket på en plate i vakuum ved 63°C i 30 minutter.

Eksempel 11 - Membran av HYAFF 11 med forsterking av HYAFF 7

En kompositt membran som omfatter hyaluronsyrebenzylester HYAFF 11, det vil

si hyaluronsyreesterifisert 100% med benzylalkohol, med en netting-forsterkning som omfatter hyaluronsyreetylester HYAFF 7, det vil si hyaluronsyreesterifisert 100% med etanol, basisvekt 14mg/cm, 0,25mm tykk, minimumsbrekkstyrke ved brudd og forlengelse i tørr tilstand, henholdsvis 400kg/cm<2> og7%, minimum strekkstyrke og forlengelse i våt tilstand, henholdsvis 50kg/cm<2> og 55%, rivestyrke i tørr tilstand, 90kg/cm<2>, rivestyrke i våt tilstand, 50kg/cm<2>, ble fremstilt i henhold til følgende fremgangsmåte.

HYAFF 7 netting ble oppnådd ved å starte med en oppløsning av HYAFF 7 dimetylsulfoksid i en konsentrasjon på 125mg/ml. Oppløsningen blir matet ved en utvekslingsmålepumpe inn i en spinnevorte for våt ekstrusjon sammensatt av 100 hull som hver måler 65 mikron i diameter.

Den ekstruderte flertallstråden blir plassert i et koaguleringsbad som inneholder absolutt etanol og blir deretter beveget over transportvalser inn i 3 påfølgende rensebad, som også inneholder absolutt etanol. Forholdet mellom hastigheten av den tredje valse (III) og hastigheten på den første valse (I) blir kalt trekkforhold og har en verdi på 1,05, mens hastighetene til de enkle valsene er 23rpm (valse I), 24 rpm (valse II og III), 25rpm (valse IV). Når flertallstråden har passert gjennom rensebadene blir den tørket med varmluft ved en temperatur på 45°C og viklet på

en viklingsramme (8). Tråden er 237 denier. Flertallstråden blir deretter vridd 135 ganger per meter og vevd på en vevstol i et glatt knyttet stoff med et mål (gauge)

på 14. Fra vevstolen blir stoffet matet gjennom en kalander som tynner det ned.

Figur 2 viser nettingen som resulterer fra nevnte prosess.

Den polymere matriks blir påført ved 2 luftbørster som sprayer en oppløsning av HYAFF 11 i dimetylsulfoksid med en konsentrasjon på 40mg/ml. Nettingen som således blir sprayet passeres inn i et koaguleringsbad som inneholder absolutt etanol, inn i et rensekammer som inneholder rent destillert vann og inn i et spesielt tørkekammer med en temperatur på 50°C (17).

Eksempel 12 - Ikke- vevd stoff som består av HYAFF 11

Et ikke-vevd stoff som består av hyaluronsyrebenzylester HYAFF 11, som veier 40g/mq, 0,5 mm tykk ble fremstilt ved følgende fremgangsmåte.

En oppløsning av HYAFF 11 i dimetylsulfoksid med en konsentrasjon på 135mg/ml blir fremstilt i en tank og matet ved en utvekslingsmålepumpe inn i en spinnevorte for våt ekstrusjon sammensatt av 3000 hull, som hver måler 65 mikron.

Den ekstruderte masse av tråder passerer inn i et koaguleringsbad som inneholder absolutt etanol. Det blir deretter beveget over på transportvalser i 2 påfølgende rensebad, som også inneholder absolutt etanol. Vektforholdet til den første valse blir satt på 0 mens trekkforholdet mellom de andre valsene blir satt på 1,05. Når den har passert gjennom rensebadene blir bunten av tråder blåst tørr med varmluft på 45°-50°C og skåret med en valsekutter i 40mm fibre.

Massen av fibre som således oppnås tippes inn i en renne som fører til en kardende/krysskjøtende maskin fra hvilken det kommer ut som en vev, lmm tykk og som veier 40mg/mq. Veven blir deretter sprayet med en oppløsning av HYAFF lii dimetylsulfoksid ved 80mg/ml, plassert i et etanol koaguleringsbad, i et rensekammer og til slutt i et tørkekammer.

Den endelige tykkelse på materialet er 0,5mm.

Eksempel 13 - Ikke- vevd stoff som omfatter HYAFF 11 og HYAFF 7

Et ikke-vevd stoff som veier 200g/mq og 1,5 mm tykk omfatter en blanding av etylester av hyaluronsyre, HYAFF 7, og av hyaluronsyrebenzylester, HYAFF 11, i like mengder ble oppnådd ved prosedyre.

Fibre av HYAFF 7 og HYAFF 11 som måler 3mm i lengde, oppnådd ved spinneprosessen beskrevet i eksempel 10 ble grundig blandet i en spiralblander. Blandingen av fibre ble matet inn i en kardemaskin fra hvilke den kom ut som en 1,8 mm tykk vev som veier 200 g/mq.

Veven ble puttet gjennom en nålestemplemaskin, som transformerte den til et 1,5 mm tykt ikke-vevd stoff som veier 200g/mq, med to materialer perfekt blandet sammen.

Eksempel 14 - Ikke- vevd stoff av delvis oe total benz<y>lester

Et ikke-vevd stoff som veier 40g/mq og 1,5 mm tykk som omfatter en blanding av hyaluronsyrebenzylester, HYAFF 11, og en delvis (75%) benzylester av hyaluronsyre, HYAFF 1 lp75, i like prosentandeler ble fremstilt ved følgende fremgangsmåte.

HYAFF 1 lp75 blir fremstilt som følger. 10g av hyaluronsyretetrabutyl-ammoniumsalt, molekylvekt 620,76, tilsvarende 16,1 nmol, blir oppløst i en blanding av N-metyl pyrrolidon/H20, 90/10, 2,5% i vekt, for å oppnå 400ml av oppløsningen. Oppløsningen blir avkjølt i 10°C, deretter blir renset N2 boblet gjennom i 30 minutter. Dette blir deretter esterifisert med l,49ml (tilsvarende 12,54 mmol) av benzylbromid. Oppløsningen blir forsiktig ristet i 60 timer ved 15°-20°C.

Påfølgende rensing blir utført ved utfelling i etylacetat etterfulgt av tilsetting av en mettet oppløsning av natriumklorid og påfølgende vaskinger med en blanding av etylacetat/absolutt etanol, 80/20. Den faste fase blir separert ved filtrering og behandlet med vannfri aceton. 6,8g av produktet blir således oppnådd, tilsvarende et utbytte på virka 95%.

Fibre av HYAFF 11 og HYAFF 1 lp75, 40mm lange, oppnådd ved prosessen beskrevet i eksempel 1, ble grundig blandet i en spiralblander.

De blandede fibre ble matet inn i en kardemaskin fra hvilken de kom ut som en

lmm tykk vev som veier 40mg/mq. Veven ble deretter sprayet med en oppløsning av HYAFF 11 i dimetylsulfoksid på 80mg/ml, plassert i et etanol koaguleringsbad, deretter i et rensekammer som inneholder vann eller en blanding av vann og etanol i et forhold fra 10 til 95% etanol, og endelig i et tørkekammer.

Materialet har en endelig tykkelse på 0,5mm og fibrene av HYAFF 11 og HYAFF 1 lp75 er perfekt blandet og klebet sammen.

Eksempel 15 - Flerla<g>et ikke- vevd materiale basert på HYAFF 11

Et flerlaget ikke-vevd materiale sammensatt av et lag av hyaluronsyre-benzylester, HYAFF 11, og et lag av ikke-vevd viskose (Jettex 2005 fra ORS A), basisvekt 80g/mq, tykkelse 2mm, og vannabsorbsjonsprosentandel 560 vektprosent, ble oppnådd ved følgende fremgangsmåte.

Lagene som kommer i kontakt med huden omfatter fibre av HYAFF 11 frem-stilt ved våtspinneteknikken i form av 30g/mq ark. Fibrene ble laget til ark.

Dette lag blir sammenføyd ved søm til et annet lag av ikke-vevd viskose-materiale med en basisvekt på 30g/mq.

Det endelige ikke-vevde produkt omfatter således 2 perfekt sammenklebede lag med en total basisvekt på 80g/mq, en tykkelse på 2mm og en vann-absorbsjonsprosentandel på 560 vektprosent.

Eksempel 16 - Flerla<g>et ikke- vevd materiale basert på HYAFF 11

Et flerlaget ikke-vevd materiale som omfatter et blandet lag av hyaluronsyre-benzylester, HYAFF 11, og kalsiumalginat i et 1:1 forhold og en forsterkende ikke-vevd materiale av polypropylen (spinnebundet ikke-vevd base, 50g/mq, fra NEUBERGER) med en basisvekt på 70g/mq, en tykkelse l,5mm, og vannabsorbsjonsprosentandel på 450 vektprosent, ble oppnådd ved følgende fremgangsmåte.

Fibre av HYAFF 11 og kalsiumalginat, 40 mm i lengde, oppnådd ved

konvensjonell våtspinningsteknikk, ble blandet og fremstilt i 20g/mq ark, og sammenføyd ved søm til et spinnbundet ikke-vevd materiale med en basisvekt på 50g/mq.

Det resulterende materiale omfatter 2 lag av ikke-vevd materiale med en total basisvekt på 70g/mq, en tykkelse på 1,5mm og en vannabsorbsjonsprosent-andel på 450 vektprosent.

Eksempel 17 - Flerlaget ikke- vevd materiale basert på HYAFF 11

Et flerlaget ikke-vevd materiale som omfatter et lag av hyaluronsyrebenzyl-ester, HYAFF 11, og et lag av polyuretanskum så som LYOBEND (fra DELCON) med

en basisvekt på 100g/mq, en tykkelse 6mm, og en vann-absorbsjonsprosentandel på 860 vektprosent, ble oppnådd ved følgende fremgangsmåte.

Laget som kommer i kontakt med huden omfatter fibre av HYAFF 11 fremstilt ved våtspinningsteknikken og produsert i et 45g/mq ark som blir sammenføyd ved sying ved et andre lag av polyuretanskum.

Det resulterende ikke-vevde produktet omfatter 2 perfekte sammenføyde lag med 100g/mq, en tykkelse på 6mm og en vannabsorbsjonsprosentandel på 860 vektprosent.

Eksempel 18 - Fremstilling av en membran laget av et derivat av hvaluron- svre

med 80% av karboksvfunksionene esterifisert med benzvlalkohol (CJH<- CH? - OH), 10% av karboksvfunksionene involvert i dannelse av indre esterbindinger og de gjenværende 10% saltifisert med natrium

6,2lg av tetrabutylammoniumsalt av hyalouonsyre med en molekylvekt på

180 000 Dalton (10 mEkv) blir oppløst i 248ml dimetylsulfoksid (DMSO) ved omgivelsestemperatur.

Til denne oppløsning blir det tilsatt 0,95lml benzylbromid (8,0 mEkv) og oppløsningen blir latt stå i 10 timer ved 30°C. 0,101g av trietylamin (1,0 mEkv)

blir tilsatt og oppløsningen blir omrørt i 30 minutter. En oppløsning av 0,255g (1,0 mEkv) av 2-klor-l-metyl-pyridiniod i 60ml i DMSO blir tilsatt og blandingen blir latt stå i 15 timer ved 30°C.

En 2,5% oppløsning (vekt/volum) av NaCl i vann blir tilsatt og den resulterende blanding blir helt i 750ml aceton under omrøring. Et bunnfall blir dannet som blir filtrert og vasket 3 ganger i lOOml aceton/vann, 5:1, 3 ganger med lOOml aceton og endelig vakuumtørket i 24 timer ved 30°C. 4,5g av det ønskede produkt blir således oppnådd. Kvantitative bestemmelser av benzylalkoholinnholdet blir utført ved gasskromatografi etter alkalisk hydrolyse.

Det totale estergruppe-innholdet blir målt ved forsåpningsmetoden beskrevet på sidene 169-172 i "Quantitative organic analysis via functional groups" 4th Edition (John Wiley and Sons Publication).

Esterderivatet fremstilt på denne måten blir oppløst til en konsentrasjon på 150mg/ml i DMSO ved en temperatur på 30°C. Det oppløste derivatet blir filtrert, gjennom et 20 micron netting og plassert i en ekstrusjonsreaktor sammenbundet med en filmekstruderingsanordning med en tykkelse på <lmm. Produktet blir ekstrudert i et koagulasjonsbad som inneholder et oppløsningsmiddel som tillater DMSO og ekstraheres fira produktet (for eksempel etanol), og materialet fra filmekstruderingsanordningen blir viklet på en serie av valser utstyrt med luftvifter for å tørke membranen.

Prekliniske undersøkelser

De følgende undersøkelser rapporterer resultater som viser nyttigheten av produktene i henhold til oppfinnelsen til å forhindre postkirurgiske adheranser og vise de forbedrede resultater for disse produkter sammenlignet med tidligere eksisterende produkter.

Undersøkelse 1

Denne undersøkelse viser den høye insidens av kirurgiske adheransedannelse observert i en modell med lesjoner indusert i rottelever, etablert som den positive kontrollen for å sammenligne den preventive virkning av helse-messig og kirurgiske artikler avledet fra HA i adheransedannelse.

I disse eksperimenter ble det brukt Sprague Dawley rotter som veier mellom 275 og 300g. 21 dyr ble utsatt for lesjoner.

Hvert dyr gjennomgikk laparotomi ved abdominalt innsnitt etter bedøvelse med en fortynnelse av Ketamin, 100mg/kg og Xylazine 1 lmg/kg, fremstilt under sterile betingelser og injisert intramuskulært.

Leveren ble lokalisert og eksponert; en skrape ble fremstilt på den nedre lapp ved å påfølge et lett trykk med en steril tampong inntil blødning. Etter hemostase med den sårede overflate ble laparotomien lukket med en silkesutur, størrelse 3.0. Dyrene ble ofret etter 7 til 21 dager.

Adheranse ble vurdert i henhold til hvor lett tilstøtende overflater (øvre og nedre) av lappen kunne separeres ved kirurgiske pinsetter, på basis av følgende skala: 0 ingen tilklebing - de to overflater kan adskilles; 1 lett - moderat adheranse, overflaten kan adskilles ved å trekke dem fra hverandre med pinsetter;

2 betydelig sammenklebning mellom de to overflater, et hvert

forsøk på å adskille dem gjør at vevet går i stykker.

I denne dyremodell ble adheranser som skåret 2 betraktet som klinisk signifikant.

I denne positive kontrollgruppen (adheransedannelse) presenterte 17 dyr av 21 (80,9%) dannelse av adheranse med et skår på 2.

Undersøkelse 2

Denne undersøkelse illustrerer den signifikante reduksjon i dannelse av adheranser når en gel laget av tverrbundet hyaluronsyre (ACP) blir brukt eller en gas basert på HYAFF 11 (benzylester av HA) blir brukt alene eller i kombinasjon med hemastatisk Surgicel™ og Heparin 50 IU/ml. ACP gelen ble spredd over overflaten som skulle behandles.

Den kirurgiske protokoll beskrevet i eksempel 1 ble brukt som en dyremodell for å indusere adheransedannelse.

Den signifikante reduksjon i adheransedannelse mellom de to tilstøtende overflater av venstre leverlapp er illustrert i tabell 1.

Det er klart at anvendelse av disse langsomt bioavhengige biomaterialer som en impermiabel barriere for inflammatoriske celler mellom to tilstøtende overflater reduserer dannelse av adheranser, sammenlignet med 80,9% av adheransene observert i kontrollgruppen beskrevet i eksempel 1.

Undersøkelse 3

Dette eksempel viser den høye insidensen av kirurgisk adheransedannelse observert i en modell hvor kirurgisk lesjon er indusert i abdominal veggen hos rotte for å etableres som en positiv kontroll og for å sammenligne den med den preventive virkning av helsemessig artikler omfatter av HA derivater i henhold til oppfinnelsen (HYAFF 11 + en polypropylen netting) i adheransedannelse.

Totalt 24 dyr (12 kontroller, 12 testdyr) gjennomgikk lesjonen.

Hvert dyr gjennomgikk laparotomi ved abdominal innsnitt etter anestesi med en fortynning av Ketamin 100mg/kg og Xylazine 11 mg/kg fremstilt under sterile betingelser og injisert intramuskulært.

Lappen til venstre for innsnittet ble hevet med 2 kirurgiske pinsetter for å eksponere abdominalveggen. Et areale på l,5cm x l,5cm av peritoneal-overflaten ble fjernet med kirurgiske sakser inntil et eksudat kom til syne, uten å fjerne muskelbunten. I kontrollgruppen var det nødvendig å sy en polypropylennetting (som måler det dobbelte av lesjonsarealet) med en bioabsorberbar Vycil sutur (størrelse 6,0) over den sårede overflate for å garantere den tensile motstand i abdominalveggen. Før anvendelse av materiale måtte den skadede overflate gjennomgå grundig hemostase.

Etter ofring ved 14 dager hvor mellomtiden var i området sitert i eksempel 1, ble adheranse vurdert i henhold til følgende skala: 0 fravær av adheranse; 1 lett adheranse uten vaskularisering, kan lett seprareres; 2 moderat adheranse uten vaskularisering, kan trekkes fra hverandre manuelt;

3 fast adheranse, opak og vaskularisert, vanskelig å separere,

krever anvendelse av skalpell; 4 meget fast adheranse, tykk, opak og vaskularisert, kan bare skjæres fra hverandre ved kirurgiske sakser, med påfølgende destruksjon av vev.

Adheranse med en skår på > 2 ble vurdert signifikant.

I den positive kontrollgruppe (adheransedannelse) presenterte 12 dyr av 12 (100%) adheransedannelse med en skår på mer enn 2; mens det var en signifikant reduksjon i insidensen av adheransedannelse mellom abdominal-veggen og indre organer når produktet i henhold til oppfinnelsen ble brukt, som vist i tabell 2. Det er klart at anvendelse av det nevnte HYAFF 11 materialet i henhold til oppfinnelsen som en barriere (impermiabel til inflammatoriske celler ) mellom en skadet, insideoverflate (abdominalvegg) og de tilstøtende organer, reduserer dannelse av adheranser sammenlignet med 100% av adheransene i kontrollgruppen behandlet bare med en polypropylen netting.

Undersøkelse 4

Denne undersøkelsen illustrerer evenen til auto-tverrbundet hyaluronsyre (ACP) i form av en gel og brukt som et belegg for å redusere kirurgisk adheransedannelse, i en lesjonsmodell indusert i blindtarmen hos rotter.

Denne type av lesjon induserer dannelsen av adheranser når behandlet med saltoppløsningsvask og hemostase alene etter kirurgi, som rapportert heretter.

Som i eksempel 1, ble det brukt Sprague Dawley rotter som veide 275 til 300g. Hvert dyr gjennomgikk laparotomi ved abdominal innsnitt etter anestesi med en fortynning av Ketamin, 100mg/kg og Xylazine 11 mg/kg, fremstilt under sterile betingelser og injisert intramuskulært. Blindtarmen ble lokalisert og eksponert. En termisk lesjon ble indusert på overflaten av tarmen med et fast legeme som benytter en kobberskive med en diameter på 1 cm koblet til en loddeanordning elektronisk satt på en temperatur på 69,5°C. Denne ble etterlatt i kontakt med armoverfiaten i 15 sekunder. En velldefinert

lesjon med eksudat ble fremstilt. Etter vasking av det skadede området med saltoppløsning og utførelse av hemostase med Surgicel™, ble laparotomien lukket med en silkesutur (størrelse 3,0).

Etter ofring ved 14 dager og mellomtid i området sitert i eksempel 1, ble adheranse vurdert i henhold til følgende skala: 0 fravær av adheranse; 1 lett adheranse uten vaskularisering, kan lett separeres; 2 moderat adheranse uten vaskularisering, kan trekkes fra hverandre manuelt;

3 fast adheranse, opak og vaskularisert, vanskelig å separere,

og krever anvendelse av en skalpell; 4 meget fast adheranse, tykk, opak og vaskularisert, kan bare skjæres fra hverandre ved kirurgiske sakser, med påfølgende destruksjon av vev.

I denne dyremodell ble adheranser med en skår på > 2 betraktet signifikant.

Det er en klar reduksjon i dannelse av adheranser når ACP gel blir brukt som barriere, sammenlignet med kontrollene behandlet med saltoppløsningsvask og hemostase alene (tabell 3).

Det er klart at anvendelse av nevnte materiale som en barriere reduserer dannelsen av adhesjoner, sammenlignet med kontrollbehandling av salt-oppløsningsvask og hemostase alene.

Undersøkelse 5 - Virkning av hvaluronsvrederivater ( HYAFF 7 og

HYAFF 1 lp7S til å forhindre postkirur<g>iske adheranser i den hepatiske lesjonsmodell hos rotte

Dyremodell:

Han, Harlan SD rotte som veier 250g.

Lesionstvpe:

Abdominalområdet ble grundig renset med en jod-oppløsning, deretter ble laparotomi på cirka 3 cm utført for å eksponere leveren. Den nedre høyre lapp av leveren ble ødelagt ved skraping og en lesjon fremstilt ved en steril trespatel inntil blod ble trukket.

Testmaterialer:

Eksperiment 1: HYAFF llp75, 75% delvis benzylester av hyaluronsyre i form av gas og et ikke-vevd materiale.

Eksperiment 2: HYAFF 7, total etylester av hyalyronsyre i form av en gas og et ikke-vevd materiale.

Anvendelse av materiale: etter grundig hemostase med en konvensjonell hemostatisk middel, ble test- og kontrollmateriale plassert mellom den nedre (lesjonsområdet) og den øvre leverlapp (tilstøtende overflate) uten anvendelse av sutur slik at det dannes en barrierevirkning og forhindring av adheransedannelse.

Vurdering og observasjoner:

Observasjoner ble gjort mellom 7 og 21 dager etter kirurgi. Adheransene som var dannet ble vurdert på basis av følgende visuelle skår:

0 = fravær av adheranse

1 = lett adheranse

2 = klar nærvær av adheranser

Ved siden av vurdering av adheranseskåren ble graden av inflammasjon vurdert

ved mikroskopisk observasjon (vevsreaksjon ved påføring av materiale), farging av histologiske prøver med hematoksilin/eosin og Mallorys trippelfarge.

Resultater

Eksperiment 1:1 eksperiment 1 ble materialene basert på HYAFF 1 lp75, delvis benzylester av hyaluronsyre, testet alene, i kombinasjon med Surgicel hemostase og i kombinasjon med hemostase pluss heparinmetning

(1000 Uml). Disse fremgangsmåtene er vanlig praksis i kirurgi.

Figur 1 er en kurve som viser yteevnen til biomaterialene brukt alene. Ingen effekt på adheranseforhindring ble observert i tilfelle av biomaterialer basert på HYAFF 1 lp75 og Interceed, selv om om trenden faktisk synes bedre, dog ikke signifikant forskjellig. I det siste tilfelle var leverlappene fullstendig tilklebet og en signifikant inflammatorisk reaksjon kunne sees. Det samme ble observert på histologisk observasjon av biopsier, hvor et klart nærvær av inflammatoriske celler, neutrofiler og makrofager, og modne kollagene fibre kunne sees.

I figur 2 og 3 ble materialene brukt i kombinasjon med Surgicel og Surgicel + heparin. Trenden observert i figur 1 ble konfirmert ved materialer observert på HYAFF 1 lp75, mens Interceed mettet med heparin syntes å gi bedre virkninger. Denne situasjon ble konfirmert ved de histologiske observasjoner. I konklusjon kan ikke materialene basert på HYAFF 1 lp75 brukes til å forhindre postkirurgiske adheranser, siden den inflammatoriske virkning sannsynligvis skyldes frigjøring av oligomerer av lav-molekylvekt hyaloronsyre, i lys av den ekstremt korte degraderingstiden til produktene.

Eksperiment 2:1 eksperiment 2 ble biomaterialene basert på HYAFF 7, etylester av hyaluronsyre, testet i kombinasjon med Surgicel og Surgicel + heparin. I noen av tilfellene ble en virkning på forhindring av postkirurgiske adheranser observert. Interceed brukt med Surgicel + heparin syntes å ha mere positiv effekt (figur 4).

Mikroskopisk observasjon konfirmerte disse data og klarga en klar mengde av inflammatoriske celler og kollagene fibre i tilfelle av behandling med HYAFF 7.1 dette tilfelle som i det siste, kan ikke biomaterialer basert på HYAFF 7 anvendes til å forhindre postkirurgiske adheranser, idet det er sannsynlig at det er en progressiv frigjøring av etanol i organismen.

Undersøkelse 6 - Virkningsgrad HYAFF 11- baserte biomaterialer til å forhindre postkirurgiske adheranser i to forskjellige modeller av lesjoner injisert i dyr: 1) intrahepatisk skraping i rotte: 2) lesjon av abdominalveg<g> i rotte Dyremodell 1

Når abdominalområdet var blitt desinfisert med jod og etanol ble et medialt snitt laget for å eksponere leveren.

I denne dyremodell ble de indre overflater av nedre hepatiske lapp skrapet inntil eksudat begynte å komme frem. Skrapingen mottok forsiktig hemostase med Tabotamp (Ethicon) og materialet ble etterlatt på den ødelagte overflate uten hjelp

av sutur på grunn av produktets store mucoklebende evne.

To HYAFF 11-baserte produkter ble testet, begge kommersielle versjoner av en 20p.m tykk, kontinuerlig membran, kalt Transporcess og Hyalobarrier 20. Makroskopisk vurdering ble gjort 14 dager etter kirurgi ved å bruke skårsystemet beskrevet ovenfor for å definere adheransene. En ytterligere vurdering ble foretatt av prosentandelen av dyr med adheranseskår = 2 (signifikant adheranse).

Resultater

Figur 5 er en kurvepresentasjon av adheranseskår oppnådd i eksperimentet. Hyalobarrier 20 reduserte insidensen av adheransedannelse sammenlignet med ikke-behandlede kontroller og til de to behandlinger med høy- og lav-molekylærvekt hyalyronsyre. En lignende tendens ble registrert, dog uten noe statistisk signifikante forskjeller, i tilfelle av det andre HYAFF 11- baserte materialet, Transprocess. Figur 6 viser prosentandeler av tilfellet med adheranseskår = 2 i hver behandlingsgruppe (kirurgisk signifikant adheranse.). Tendensen sett i den tidligere kurve (figur 1) ble konfirmert i dette tilfelle også,

med en reduksjon av adheranseskår = 2 (prosentandel av mindre enn 50% for Hyalobarrier 20 og Transprocess behandlinger).

Dyremodell 2

Når abdominalområdet var blitt desinfisert med jod og etanol, ble en midtlinje laparotomi på cirka 5 cm i lengde gjort for å eksponere abdominal-veggen og peritoneum.

Et innsnitt på 2cm x 2cm ble gjort med en skalpell og deretter ble peritoneum og muskellaget fjernet. Denne type operasjon er det nødvendig å sy til det skadede området et materiale som favoriserer vevsvekst men som garanterer tilstrekkelig tensiv styrke, for å unngå sammenfall av peritonealveggen. Generelt ikke-degraderbare materialer med en polymer matriks ble brukt, så som nettinger av polypropylen, polyester eller ekspandert polytetrafluor-etylen. Anvendelse av slike materialer alene, er imidlertid ikke tilstrekkelig for å unngå dannelse adheranser til de tarmløkkene, med påfølgende tarmobstruksjon og kronisk smerte.

Makroskopiske vurderinger ble foretatt 14 dager etter kirurgi ved å anvende adheranseskårer som går fra 0 til 4. En ytterligere vurdering ble gjort av prosentandelen av dyr med en adheranseskår på mere enn 2% (signifikant adheranse).

Resultater:

Dette eksperimentet viser at et belegg av HYAFF 11 på en syntetisk Prolen netting (polypropylennetting, utstrakt brukt i abdominalkirurgi) og et ark med et HYAFF 11 på en Prolene-netting festet ved sying kan redusere dannelsen av postkirurgiske adheranser. Figur 7 viser at det kombinerte produkt kalt Hyalobarrier Plus (HYAFF 11 utbredd og koagulert på prolen) og Hyalobarrier filmsyingen på prolen reduserte signifikant adheranse sammenlignet med prolennettingen alene. Figur 8

konfirmerer denne tendens, med en lavere prosentandel av adheranser >2 (signifikante adheranser) etter behandling med HYAFF 11 enn observert etter behandling med prolennetting alene.

Undersøkelse 7 - Virkninger av ACP gel biomaterialer og forhindring av <p>ostkirurgiske adheransedannelse ved 14 dager i en rottelever skademodell. og en rottetarmskademodell

Hensikten med denne undersøkelse var å evaluere virkningsgraden av ACP gel-baserte biomaterialer, for å redusere eller forhindre postoperative adheransedannelser. Yteevnen til testmaterialene ble vurdert i sammenligning med hyaluronsyre høy-molekylvekt og de kommersielt tilgjengelige biomaterialer, Oxidized Regenerated Cellulose (TC 7 Interceed<*>) brukt i abdominal/bekken og i kirurgi for å hindre adheransedannelse.

En rotteleverskademodell og en rottetarmbrennmodell ble brukt siden de er karakteristiske modeller for eksperimentell adheranseinduksjon. Virkningen av test og kontrollmaterialet på forhindring av postkirurgiske adheranse ble evaluert ved makroskopisk observasjon av lesjonssetet ved å anvende en adheranseskår.

En rotteleverskademodell (eksperiment 1) og en rottetarmskademodell (eksperiment 2) ble brukt siden de er standardiserte og reproduserbare modeller for eksperimentell adheranseinduksjon. ACP baserte biomaterialer ble brukt etter skade som barriere mellom tilstøtende overflater på leverlappen og indre organer.

I begge eksperimenter ble virkningsgraden av ACP-geler evaluert for sin evne til å forhindre eller redusere adheransedannelse i sammenligning med TC7 Interceed, en absorberbar Oxidized Cellulose adheransebarriere bredt utnyttet i klinisk praksis, en kopolymer oppløsning "Thermogel", en oppløsning av høy molekylvekt hyaluronsyre og en gruppe av ubehandlede dyr (blindopererte).

Start dato:

Eksperiment 1 - Rotteleveravskraping

ACP-gelene ble suspendert i vann i en konsentrasjon på 60mg/ml. Testmaterialene ble tilført sterile ved autoklav og i 5ml sprøyte og manipulert ved sterile betingelser. ACP gelene ble anvendt slik at de ble brukt som et belegg på de avskrapede leverlappoverfiatene etter hemostase med Tabotamp®. Hvert dyr mottok en mengde tilstrekkelig til fullstendig å dekke det skadede området (cirka 2ml) ved enkel administrering på kirurgitidspunktet.

Interceed ble kappet under sterile behandlingsbetingelser, det ble brukt alene og mettet i Heparin (500 U/ml), deretter applisert slik at det holdt separert de 2 tilstøtende overflatene av leverlappene til en størrelse som strekker seg ut over grensene til det skadede område med flere millimeter. HY AL, hyaluron-syre høy-molekylvekt (oppløst i vann) i en konsentrasjon på 10mg/ml) og Thermogel ble kjøpt i sterile sprøyter.

Interceed ble applisert ved direkte påføring uten kirurgisk sutur. HY AL, hyaluronsyre og Thermogel ble påført den skadede overflate (belagt) med en sprøyte etter hemostase. Hvert dyr mottok en mengde tilstrekkelig til full-stendig å dekke eller innhylle det skadede området ved enkel administrasjon på kirurgiti dspunktet.

Eksperimentelt oppsett

Sprague Dawley rotter (275 - 300g) ble brukt i dette eksperiment. Fra erfaring oppnådd i tidligere eksperimenter ble en periode på 14 dager betraktet som dekkende tidspunkt for å evaluere adheransedannelser i disse dyremodeller. Gitt nummer av dyr som var nødvendig for denne under-søkelsen ble dyrene preparert på påfølgende dager.

Et totalt antall på 78 dyr i henhold til følgende skjema:

Preparering av dyrene:

Dyrene ble anestesert ved i.m. Ketamine (Gellini Pharmaceutical)/Xylazoine (Bayer) injeksjon, barbert og deretter desinfisert med jodoppløsning og etanol. Etter laparotomi på venstre side ble venstre leverlapp bøyd oppover og de indre overflater av venstre og midtre leverlapper ble skrapet ved forsiktig skraping med en trespatel inntil tegn på blødning eller serøst eksudat ble oppnådd.

Administrering av materialene:

Etter hemostase oppnådd med Surgicel® eller Tabotamp™, ble test og kontrollmateriale ble plassert mellom overflatene til de to lappene slik at de dekker hele det skrapede området og danner en barriere mellom lappene.

Det kirurgiske setet ble lukket i to lag med 3,0 silkesutur.

Ved slutten av kirurgien ble et antibiotikum (Procacilline sub-kutant 30.000 I.U./rotte) og et smertestillende middel (Temgesic I.M. 0,05mg/kg) administrert i 4 dager.

Adheransegrad:

14 dager etter kirurgi ble dyrene drept ved C02.

Adheransegraden ble evaluert ved makroskopisk observasjon. De følgende adheranseskår ble brukt: 0 ingen adheranse; 1 lav til moderat adheranse. De to leverlapper ble kirurgisk adskilt ved mekanisk trekk av pinsetter. 2 markert adheranse, de to leverlapper var fullstendig klistret sammen, en hver prøve på å adskille dem påførte skade på vevet.

Resorberbarheten av materialene ble evaluert ved visuell vurdering av nærvær av materialene, og i tillegg ble behandlingsstedet fotografert.

Etter at makroskopisk observasjon var foretatt ble hele leveren kirurgisk fjernet og plassert i 10% bufret formalin i 48 timer. Etter fiksering ble det fjernet en 2,0mm tverrsnitt inkludert det avskrapede området fra leveren ved å bruke et disseksjonsblad. En slik oppnådd prøve ble utsatt for histologisk analyse.

Analyse av vevet:

Histologisk analyse

Prøvene ble fiksert i en nøytral bufret formalin 10% og deretter dehydrert og innstøpt i paraffin ved standard teknikk; 8um snitt ble farget med Asson's Trichnome (for vevsimflammatorisk reaksjon) og Toluidine Blue hvis nødvendig (for nærvær av materialrester).

Eksperiment 2 - Rottetarmbrenning

ACP 5% geler høy mol.vekt porsjon 3/94 ble suspendert i vann med konsentrasjon på 20mg/ml, ACP 5% porsjon 101/94 ble suspendert med konsentrasjon på 50mg/ml. Alle testmaterialer ble levert sterile ved autoklav og i 5ml sprøyter og manipulert under sterile betingelser. ACP geler ble overført slik at de dekket de brente tarmoverflater etter hemostase med Tabotamp®. Hvert dyr mottok en mengde tilstrekkelig til å fullstendig dekke det skadede området (cirka 2ml) i en enkel doseadministrering på kirurgitidspunktet.

Interceed ble skåret under sterile behandlingsbetingelser, det ble brukt alene og mettet i heparin (500U/ml), og deretter påført slik at det holder de to tilstøtende overflater av leverlappene adskilt med en størrelse overskrider grensene for de skadede områdene med flere millimeter. HAL, hyaluronsyre, høy molekylvekt (oppløst i vann med en konsentrasjon på 10mg/ml) og Thermogel ble kjøpt i sterile sprøyter.

Interceed ble påført ved direkte påføring uten kirurgisk sutur. Hyaluronsyre og Thermogel ble påført den skadede overflaten (belegging) med en sprøyte med hemostase. Hvert dyr mottok en mengde tilstrekkelig til fullstendig å belegge eller å dekke det skadede området ved en enkelt dose admininstrer-ing på tidspunktet for kirurgi.

Eksperimentell konstruksjon

Sprague Dawley rotter (275 - 300g) ble brukt for dette eksperiment. Fra erfaring oppnådd i tidligere eksperimenter ble en periode på 14 dager betraktet som tilstrekkelig tidspunkt for å evaluere adheransedannelse i denne dyremodell.

Gitt antall dyr som er nødvendig for denne undersøkelse ble dyrene preparert på påfølgende dager.

Et totalt antall på 78 dyr ble brukt i henhold til følgende skjema:

Eksperiment 2:

Preparering av dyrene:

Dyrene ble anestesert ved i.m. Ketamine (Gellini Pharmaceutical)/ Xylazoine (Bayer) injeksjon, barbert og deretter desinfisert med jodoppløs-ning og etanol. Midtlinjeabdomitalsnitt ble laget gjennom huden og muskel-vevet slik at tarmen ble eksponert. Brannsår ble produsert ved påføring på cecum- overflaten en elektronisk kontrollert oppvarmet kobberskive (1 cm diameter) ved å bruke standardtrykk i 15 sek ved 69,3°C (158°F).

Administrering av materialer:

Etter hemostase oppnådd med Surgicel® eller Tabotamp™, ble test- og kontrollmateriale plassert på tarmoverflaten uten sutur slik at hele det brente området ble dekket og det skapes en barriere mellom peritoneum og indre organer.

Det muskulopeirtoneale lag ble lukket med kontinuerlige 3-0 silkesuturer, hudlaget med hudstifter og avbrutt silke (3-0) sutur.

Ved slutten av kirurgien ble det administrert et antibiotokum (Procacillina sub-kutant 30.000 I.U./rotte) og et smertestillende middel (Temgesic I.M. 0,05mg/kg) i 4 dager.

Observasjoner og bestemmelser:

Adheransegrad:

14 dager etter kirurgi ble dyrene drept ved hjelp av C02.

Adheransegraden ble evaluert ved makroskopisk observasjon. Følgende adheranseskår ble brukt: 0 = ingen adheranse; 1 = lav avaskulær lett dissekterbar; 2 = moderat avaskulær, kontinuerlig, manuelt dissektert; 3 = opak, vaskulær, vanskelig å snitte, krever skalpelladskillelse;

4 = tett, opak, vaskulær, disekteres bare med kirurgiske sakser

og vevsødeleggelser.

Resorberbarheten av materialene ble evaluert ved visuell vurdering av nærvær av materialene, og i tillegg ble behandlingsstedet fotografert.

Resultater

Eksperiment 1

Ett dyr døde under administrering av anestesi, plassering av biomaterialene ble lett utført. Materialene ble bemerket å klebe seg til vevet på den nedre leverlapp. Intet klinisk signal på sykdom eller lidelse ble notert etter kirurgi i dyrene som ble behandlet med ACP.

To dyr behandlet med hyaluronsyre døde 2 dager etter kirurgi. Mikroskopiske undersøkelser viste indre blødning.

Evaluering av adheransedannelse: Adheransene dannet mellom de to tilstøtende overflater av leverlappen etter vevsskade ble evaluert etter 14 dager. Alle behandlinger ble gradert ned på observasjonstidspunktet; Adheranseskåren (figur 9) i dyrene behandlet med ACP 5% (porsjon 104/96) biomateriale var signifikante lavere enn alle kontrollmaterialene og ubehandlede kontroller. Ved ACP 5%

(porsjon 101/96) behandling var reduksjon av adheranse bedre enn TC7 Interceed mettet med heparin, men ingen statistiske forskjeller ble notert; ikke desto mindre viste begge behandlinger signifikante forskjeller (p<0,05) hvis de ble sammenlignet med kontroller og ubehandlede.

Histomorfolo<g>isk observasjon: Ved mikroskopisk undersøkelse 14 dager etter kirurgi ble ACP behandlingene funnet å være i stor grad biokompatible og en meget lav inflammatorisk reaksjon ble observert, spesielt var få inflamma-toriske celler, så som neutrofiler og gigantceller til stede, ingen migrering eller forsterking av disse celler på innsiden av gapet mellom de to lapper ble notert, TC7 i Interceed<*> viste vevsreaksjon med den følge at i mange tilfeller var leveroverflatene delvis klebet; observasjonen understreket nærvær av organiserte kollagene fibiller, den inflammatoriske reaksjonen syntes å forminkes hvis behandlingen er mettet med heparin oppløsning. I hoved-parten av objektglassene syntes biomaterialene fullstendig biodegradert. De ubehandlede kontrollene ga moderat til høy inflammatorisk reaksjon.

Eksperiment 2

Et totalt antall på 2 dyr døde under administrering av anestesi, plasseringen av biomaterialene ble lett utført og de beveget seg ikke etter plassering. Ingen kliniske signaler på sykdom eller lidelse ble notert etter kirurgi i ACP behandlingsgruppe av dyr. 4 dyr behandlet med hyaluronsyre med molekylvekt 1,2 • IO<6> og 3 dyr med Thermogel døde mellom 2 og 5 dager etter kirurgi. Nekroskopisk under-søkelse viste indre blødning i alle dyr.

Evaluering av adheransedannelse: 14 dager etter kirurgien (figur 10) i dette eksperimentet viste ACP 5% geler 101/94 og 3/94 en reduksjon av postkirurgisk adheransedannelse sammenlignet med hyaluronsyre, med molekylvekt 1,2 • 10<6> og ubehandlede kontroller, yteevnen til ACP-geler var sammenlignbar til den for en Interceed barriere, heparin-mettet, statistisk forskjell ble funnet mellom disse behandlinger og ubehandlede kontrollgrupper (P<0,05); alle behandlinger og kontroller ble fullstendig absorbert.

Histomorfolo<g>isk observasjon: Ved observasjon etter 14 dager viste ACP-behandlinger en lav vevsinflammatorisk reaksjon, tykkelsen på granulerings-vev var meget lav og ingen uheldig reaksjon på tarmen som tilklebing til den tilstøtende peritoneale overflaten ble notert. De kollagene fibriller var begynt å organiseres og groprosessen var fullstendig. En inflammatorisk reaksjon ble observert i hyaluronsyrebehandlinger med betydelig nærvær av kollagene fibrer som induserer adheranse; et tykt granuleringsvev ble sett. Den samme histomorfologiske bilde ble observert i de ubehandlede kontroller.

Diskusjon

Adheransedannelse er blant den viktigste årsak til postoperativ dødelighet etter abdominal/bekkenkirurgi, fører til ofte til tynntarmobstruksjon og andre viktige patologien Vedrørende bekkeninnvollene har disse adheranser mulighet til å forstyrre fysiologisk funksjon og resultere i fertilitet. Mekanismen for postkirurgisk adheransedannelse og redannelse forblir dårlig forstått. De eksperimentelle resultater antyder at adheranser dannes mellom to kirurgiske traumatiserte overflater i naturlig apposisjon under tilhelings-prosessen fordi det er mer effektivt å kombinere to steder av vevsreparasjon i et enkelt tilhelings-sted, som resulterer i sammenvoksende adheranse mellom to tilstøtende overflater.

I denne screening ble det funnet at anvendelse av et konvensjonelt kirurgisk hemostatisk middel (Surgicel ®) etter kirurgi og den påfølgende plassering av en biodegraderbar hyaluronsyrederivatbarriere, forhindrer dannelsen av adheranser. I tillegg kan materialene brukes i forbindelse med fibrinolytiske midler. Adheransereduksjonen sammenlignes gunstig med den til oksidert degenerert cellulose TC7 Interceed<*>.

HYAFF® 11 biomateriale viste god biokompatibilitet og meget lav inflammasjon.

Graden av degradering av F AB biomaterialer undersøkt var forskjellig og avhenger fra den forskjellige fysisk form av behandlingen; HYAFF 11® biomaterialer varte i flere uker. Området av kontrollert degraderingshastighet som kan oppnås med disse hyaluronsyrederivatene kan passende utforskes til å forhindre postkirurgiske adheranser på forskjellige anatomiske steder og påføringer, for eksempel kynogologisk og/eller abdominobekkenområder.

Resultatene foreslår at hyaluronsyrederivater (HYAFF® 11 gas og membraner) har en rolle til å forhindre adheransedannelse etter kirurgi.

Vedrørende oppfinnelsen som er heri beskrevet vil det være klart at den samme kan variere på mange måter. Slike variasjoner skal ikke betraktes som et avvik fra oppfinnelsens ide og omfang og alle slike modifikasjoner som vil være klare for en med kunnskaper på området er ment å være inkludert innenfor området til påfølgende krav.

Claims (19)

1. Kompositt biomateriale til å forhindre kirurgiske adheranser av vev, karakterisert ved at det omfatter minst ett hvaluronsyrederivat valgt fra gruppen som består av: (a) en benzylester av hyaluronsyre hvori 75 til 100% av karboksylgruppene av hyaluronsyren er esterifisert med et benzylradikal og opptil 25% av karboksylgruppene er esterifisert med alkylradikalet til en Ci0.20 alifatisk alkohol, med det forbehold at minst 80% av karboksylgruppene er esterifisert; og (b) et auto-tverrbundet derivat av hyaluronsyre hvori 0,5 til 20% av karboksylgruppene av hyaluronsyren er tverrbundet til hydroksyl-gruppen av det samme eller foreskjellige hyaluronsyremolekyl.

2. Kompositt biomateriale i henhold til krav 1, karakterisert ved at nevnte derivat er den totale benzylester, i hvilken alle karboksylgrupper av hyaluronsyre er esterifisert med en benzylgruppe.

3. Kompositt biomateriale som angitt i krav 1, karakterisert ved at nevnte derivat er en benzylester hvori 80% av karboksylgruppene er esterifisert med en benzylgruppe.

4. Komposittmateriale som angitt i krav 1, karakterisert ved at nevnte derivat er en benzylester hvori 75% av karboksylgruppene er esterifisert med en benzylgruppe og de gjenværende 25% av karboksylgrupper er esterifisert med den alifatiske rest av en Ci„.20 alifatisk alkohol.

5. Komposittmateriale som angitt i krav 4, karakterisert ved at nevnte alkohol er stearyl eller palmitin alkohol.

6. Komposittmateriale som angitt i krav 1, karakterisert ved at nevnte auto-tverrbundet derivat har 4,5 til 5% av karboksylgruppene av hyaluronsyremolekylet tverrbundet.

7. Komposittmateriale som angitt i et av kravene 1 til 6, karakterisert ved at det ytterligere omfatter en ikke-biodegraderbar syntetisk polymer.

8. Komposittmateriale som angitt i krav 7, karakterisert ved at nevnte syntetiske polymer er et medlem av gruppen som består av polypropylen, polyetylen, polyester og polytetrafluoretylen.

9. Komposittmateriale som angitt i et av kravene 1 til 8, karakterisert ved at det er i form av en membran, et nett eller et vevd eller ikke-vevd stoff.

10. Kompositt biomateriale som angitt i krav 1 til 6, karakterisert ved at det er i form av en gel.

11. Anvendelse av et komposittbiomateriale som angitt i krav 1-10 til fremstilling av et farmasøytisk preparat til å forhindre kirurgiske adheranser av vev, hvori nevnte biomateriale omfatter minst ett hyaluronsyrederivat valgt fra gruppen som består av: (a) en benzylester av hyaluronsyre hvori 75 til 100% av karboksylgruppene av hyaluronsyre er esterifisert med et benzylradikal og opptil 25% av karboksylgruppene er esterifisert med alkylradikal til en C,0.2o alifatisk alkohol, med det forbehold at minst 80% av karboksylgruppene er esterifiserte; og (b) et auto-tverrbundet derivat av hyaluronsyre hvori 0,5 til 20% av karboksylgruppen i hyaluronsyren er tverrbundet til hydroksyl-gruppen i det samme eller foreskjellige hyaluronsyremolekyl.

12. Anvendelse av som angitt i krav 11 hvori nevnte derivat er den totale benzylester, i hvilken alle karboksylgruppene til hyaluronsyre er esterifisert med en benzylgruppe.

13. Anvendelse som angitt krav 11 hvori nevnte derivat er en benzylester hvori 80% av karboksylgruppene er esterifisert med en benzylgruppe.

14. Anvendelse som angitt i krav 11 hvori nevnte derivat er en benzylester hvori 75% av karboksylgruppene er esterifisert med en benzylgruppe og de gjenværende 25% karboksylgrupper er esterifisert med den alifatiske rest av en C10.20 alifatisk alkohol.

15. Anvendelse som angitt i krav 14 hvori nevnte alkohol er stearyl eller palmitin alkohol.

16. Anvendelse som angitt i krav 11 hvori nevnte auto-tverrbundne derivat har 4,5 til 5% av karboksylgruppene i hyaluronsyremolekyl et tverrbundet.

17. Anvendelse som angitt i et av kravene 11 til 16, som videre omfatter en ikke-biodegraderbar syntetisk polymer.

18. Anvendelse som angitt i krav 17 hvori nevnte syntetiske polymer er et medlem av gruppen som består av polypropylen, polyetylen, polyester og poly tetrafluorety 1 en.

19. Anvendelse som angitt i et av kravene 11 til 18, hvori nevnte biomateriale er i form av en membran, en netting eller en vevd eller ikke-vevd stoff.