CZ59598A3 - Složený biomateriál pro zabránění chirurgických adhezí tkáně, jeho použití a způsob - Google Patents

Description

SLOŽENÝ BIOMATERIÁL PRO ZABRÁNĚNÍ CHIRURGICKÝCH ADHEZÍ TKÁNĚ, JEHO

POUŽITÍ A ZPŮSOB

Oblast techniky > Tato technika sc zabývá novými biomateriály, v podstatě tvořenými esterifikovanými deriváty ' . .....i ^L r · r -W· iT “ · ^p *i w kyseliny hyaluronové nebo zesítěnými deriváty kyseliny hyaluronové pro užití v chirurgickém odvětví, zvláště pro použití v prevenci pooperačních adhezí tkání.

Dosavadní stav techniky

Tvorba pooperačních adhezí je běžnou komplikací v brisní nebo pánevní chirurgii, což může vést ke značné nemocnosti. Rozvoj adhezí může být ovlivněn mnoha faktory: mechanickým traumatem, chemikáliemi, vyschnutím serózní blány v kombinaci s krví, ischemií, infekcí a cizím materiálem - o tom všem je Známo, že to přispívá ke zvýšené tvorbě adhezí. Dalšími příčinami jsou nitrobřišní záněty a vrozené abnormality. Patofyziologický mechanismus zůstává ještě nejasný, ale byla naznačena společná centrální dráha, v níž hraje důležitou roli fibrinolýza.

Chirurgické poranění tkáně je příčinou uvolnění výpotku, obsahujícího tekutinu a krev. Tento výpotek tvoří fibrinoyý most, jenž přetrvává několik dní, během nichž dochází k buněčnému růstu.

Není-li výpotek v tomto období absorbován nebo lyžován, stává se z něj vrostlá vazivová buňka a následné ukládání kolagenu vede ke vzniku trvalé jizvy, spojující dva přilehlé povrchy, a této jizvě se říká srůst (ádheze). Je možno učinit závěr, že tvorba adhezí bude pravděpodobně výsledkem zánědivé odezvy.

V tomto posledně jmenovaném případě se výzkum zaměřil na hledáni bioabsorbovatelných materiálů s krátkým obdobím přetrvávání in vivo, které by fungovaly jako bariéry proti tvorbě adhezí, dokud nezačne hojení; zamezilo by se tak problémům zaviněným ncabsorbovatelnými materiály (infekce, zvápenatění implantátů, tvorba jizev a t. d.).

Jedním zvlást slibným polymerem je kyselina hyaluronová (HA = hýaluronic acid), složka mimobuněčné hmoty, nacházející se všude v lidském těle. Ukázalo se, Že roztoky kyseliny hyaluronové redukovaly pooperační tvorbu adhezí po operacích břišních (Urman, B. et al.: Effect ♦ · to of Hyaluronic Acid on Postoperative Intraperitoneal Adhcsions Formation in the Rat Model: Fertil. Steril. 1991, 56: 563; Shushan, A. et al.: Hyaluronic Acid for Preventing Experimental Postoperative - Intraperitoneal Adhesions: J, Reprod. Med. 1994: 39: 398) a ortopedických (Hagberg L., Gerdin, B.: Sodium Hyaluronate as an Adjunctive in Adhesion Prevcntion Aficr Flexor Tcndon Suigeiy in Rabbits; J. Hand. Surg. 1992; 17 A: 935).

Fidia Advanced Bíopolymers vyvinuli chemické deriváty kyseliny hyaluronové, t. j. vnitřní estery (řada ACP) a estery s neaktivními alkoholy (řada HYAFF ) (Rastrelli, A., et al·: Hyaluronic Acid ^Estci^a New Class of Sémisynthctic Bíopolymers: Chemical and Physico - chemical Properties,

Clinical Implant Materials, Advanced in Biomaterials, G. Heinrike, V. Sollz and AJC Lee (Eds), Elsevier, Amsterdam 1990; 9:199 - 205), které vykazují fzyikálne chemické vlastnosti, odlišné od Mastní kyseliny hyaluronové (t. j. delší dobu přetrvávání a možnost opracování k výrobě pomůcek), ale mají toleranční a biokompatibilní vlastnosti, typické pro původní biologický polymer. Kromě toho jsou tyto deriváty charakterizovány z hlediska chemického a toxikologického.

Cílem této techniky byl vývoj řady gelu ACP, který se zkoušel za účelem zhodnocení účinků tohoto gelu v prevenci adhezi.

Vznik adherencí nebo fibrózních hmot, které se tvoří mezi sousedícími tkáněmi, postiženými poraněním nebo pooperačňí ischémií, je stále ještě jednou z nejzávažnějších komplikací mnoha chirurgických postupů. K tomu, aby bylo možno se této komplikaci vyhnouζ bylo navrženo velké množství metod, ale problém zůstal v podstatě nevyřešen.

Jednou z navrhovaných metod bylo použití suspenzí dextranu (di Zerega G. S„ Contemporary Adhesion Prevention, Fertility and Sterility, Vol. 61, No. 2, February *94), injekčně vpravených do peritoneální dutiny po chirurgickém výkonu. Klinické výsledky použití takovýchto roztoků dextranu byly většinou sporné. Navíc bylo použití roztoků dextranu provázeno častými komplikacemi - otoky, bolestmi v břiše, dusností.

Bylo též navrhováno, aby se mezi poraněné orgány umístily bariery ve formě definovaných struktur (sítoviny, membrány) (di Zerega, G. S., Contemporary Adhesion Prevention, Fertility and Sterility, Vol. 61, No. 2, Februarý ‘94), nebo viskózní gely (Genzyme US Patent No. 4,937,20 US Patent 5,017,229).

Ukázalo se však, že obecně jsou tyto bariéry neúčinné, protože vyvolávaly ischemie či zánětlivé reakce v důsledku přítomnosti cizích těles. Jediné materiály, schválené v současnosti pro klinické používání, jsou bariéry založené na okysličené regenerované celulóze (Interceéd ®) a bariéry založené na lehčeném pólytetrafluorin ethylenu (e- PTFE) (Goretex - US Patent 4,478,665 a US Patent 4,482,516) nebo polyethylenu či polypropylenu.

Navíc k faktu, že klinická zkoumání účinnosti takovýchto bariér dávají vysoce rozporné výsledky, je nutno si též povšimnout, Žc oba zmíněné materiály jsou doprovázeny značnými kontraindikacemi. Užití bariérových membrán ze- PTFE nebo polyethylenu či polypropylenu znamená implantaci syntetického materiálu, který je lidskému tělu cizí a není biodegradabilní a který může vyžadovat druhou chirurgickou operaci, a to k odstranění či repozici bariérové * rňěmbřány kvůli reakcím zánčtlivého typu. - - -.·»««-

V preldinických a klinických modelech se ukázalo, žc síťoviny, založené na okysličené regenerované celulóze jsou účinné v prevenci tvorby adhezí, ale pouze tehdy, předchází -li jejich aplikaci důkladné zastavení krvácení.

V prevenci adhezí bylo proto navrženo použití viskózních roztoků kyseliny hyaluronové (HA) o vysoké molekulové hmotnosti jakožto pomocného prostředku prevence adhezí (Grainger, D. A., et al.: The Use of Hyaluronic Acid Polymers to Reduce Postoperative Adhesions; J. of. Gynecol. Surg., Vol. 7, No. 2, 1991; Hurrnan, B. et al.: Effect of Hyaluronic Acid on Postoperative Intraperitoneal Adhesion Foímation in the Rat Model , Fertility and Sterility,Vol. 56, No. 3, Scptember 1991; Shushan, A., et al.· Hyaluronic Acid for Prevcnting Experimental Postoperative Intraperitoneal Adhesions, J. of Reproductive Med., Vol. 39, No. 5, May 1994; Mitchell, J. D., et al.: Rediíction in Experimental Pericardial Adhesions Using a Hyaluronic Acid Bioabsorbable Membrane, Eur. J. Cardio-thorac. Surg., 8, 149 - 152,1994).

Avšak kyselina hyaluronová jako taková je charakterizována velmi iychlým absorpčním časem, který je iňkompatibilm s časem přetrvávání, nutným pro prevenci adhezí. Nadto, přírodní kyselina . hyaluronóva nemůže být zpracovávána a jako taková transformována do formy biomateriálu. Aby sc prodlouží její čas odbourávání a umožnilo sc její zpracováni do různých fyzických fórem pro použití v různých odvětvích chirurgie, byly vyvinuty estery kyseliny hyaluronové a zesítěné deriváty kyseliny hyaluronové. Příprava esterů kyseliny hyaluronové, kde všechny karboxylové skupiny nebo část karboxylových skupin jsou esterifikovány, příprava zesítěných derivátů kyseliny hyaluronové, kde Část karboxyskupin projde zesítěním a jejich využití v odvětvích farmacie, kosmetiky a chirurgie a v odvětvích biodcgradabilních plastických hmot, jsou popsány v amerických patentech č. 4,851,521 a 4,956,353, EP 0 216 453 a EP 0 341 745.

· · ♦”· 0 ♦ · 0 ·

A *··«*·· · · · 0 « ·

0 0 « · 0 0 · ♦ ·

00 ·· 0 ♦· 0·

Podstata vynalezu:

Současný vynález poskytuje biomateriátypro využití ve způsobu prevence poopcračních adhezí tkáně. Biomatcriály jsou tvořeny benzylester}' kyseliny hyaluronové a/nebo vnitřně zesítěnými deriváty kyseliny hyaluronové a mohou se nacházet ve formě gelů, membrán, tkanin nebo sítovin a netkaných látek.

Současný vynález tudíž popisuje přípravu zdravotnických a chirurgických předmětů založených na benzylesteru kyseliny hyaluronové nebo na zesítěných derivátech kyseliny hyaluronové, užívaných jednotlivě nebo ve směsi jednoho s druhým, charakterizovaných vysokou biokompatibilitou a převoditclných do fyzických forem, což je činí vhodnými pro různá použití v chirurgii včetně chirurgie laparoskopické. Materiály jsou, také kompletně biodegradabilní a nepotřebují odstraňování z místa aplikace, není proto nutná druhá chirurgická operace. Jsou-ii připraveny ve formě gelu, zesítěné deriváty představují materiály se značně větší viskožitou než nemodifikovaný polymer á s variabilními dobami odbourávání. Nadto, jak materiály založené na benzylesterech, ták materiály založené na zesítěných derivátech současného vynáleuu mohou být ve formě membrán, tkanin nebo síťovin a netkaných látek (připravených podle postupů, které jsou samy o sobě popsány v US 4-,851,521, US 4,956,353, WO 93/11803 , WO 94/17837 a EP 0 341 745) a jsou charakterizovány následujícími technickými specifikacemi:

- tloušťka membrán Se pohybuje mezi 10 mikrometry a 1,5 mm, obzvláště 20 až 50 um;

- tloušťka tkanin nebo síťovin se pohybuje mezi 200 pm a 1,5 mm

- netkané látky jsou v podstatě charakterizovány plošnou hmotností, která se pohybuje mezi 20 g/m² a 500 g/m² a tloušťkou mezi 0,2 mm a 5 mm, obzvláště < než 1 mm.

Tyto materiály mohou být použity jednotlivě nebo spolu nebo ve spojení s jinými materiály tvořenými syntetickými polymery (např. gely založené na zesítěné kyselině hyaluronové + polypropylenu, nebo membrány v podstatě tvořené esterifikovanými deriváty HA + polypropylenem nebo membrány tvořené esterifikovanými deriváty HA, potažené gelem z autozesítěné HA).

Současný vynález se také týká použití složených materiálů ve formě gelů (pro zesítěné deriváty), membrán, tkanin a netkaných látek, sestávajících v podstatě z ben2ylésterů nebo zesítěných derivátů kyseliny hyaluronové ve spojení s ncbiodegradabilriími materiály ve formě síťovin nebo membrán nebo netkaných látek jako je e-PTFE, polyethylen, polypropylen, polyester (Dacron).

« v ··· · · · · · · · · « « « 0 000 ···

Současný vynález se tudíž týká nové třídy zdravotnických a chirurgických předmětů pro použití v odvětví chirurgie k prevenci tvorby pooperačních adhezí.

Stručný popis nákresů

Diagramy 1 -10 jsou grafy výsledků studií adhezí na zvířecích krysích modelech.

Materiály

-*>·

Jak je zmíněno výše, současný vynález je charakterizován materiály tvořenými deriváty kyseliny hyaluronové, zvláště benzylesterovými deriváty a vnitřně zesítčnými deriváty.

Termín „kyselina hyaluronová“ (dále zde též uváděna jako „HA“) je v literatuře používán k označení kyselého polysacharidu o různých molekulových hmotnostech tvořených zbytky kyseliny D-gJukuronové a N-acetyl-D-glukosaminu, který se přirozeně vyskytuje (myšlen /ten/polysacharid, nikoliv ten glukosamin - pozn. překl.) v povrchu buněk, v základních mimobunččných substancích pojivových tkání obratlovců, v očním sklivci, vc tkáni lidské pupeční šňůry a v kohoutích hřebenech. Kyselina hyaluronová hraje důležitou úlohu v biologickém organismu, především jako mechanická opora buněk mnoha tkání jako kůže, šlach, svalů a chrupavek a je tudíž hlavní složkou mimobuněčné hmoty. Ale kyselina hyaluronová plní také další funkce v biologických procesech, jakými jsou např. hydralacé tkání, zajištění hladkého pohybu, buněčná migrace, funkce buňky a diferenciace (Viz například, A, Balasz ct al., Cosmetics & Toiletrics, No. 5/84, str.8-17). Kyselina hyaluronová může být extrahována z výše zmíněných přírodních tkání, jako např. jsou kohoutí hřebeny, nebo také z určitých bakterií. Dnes může být kyselina hyaluronová připravována též mikrobiologickými metodami. Molekulová hmotnost čisté kyseliny hyaluronové získané extrakcí se pohybuje v oblasti 8 až 13 milionů. Avšak molekulární řetězec polysacharidu může být celkem snadno odbouráván vlivem různých fyzikálních a chemických faktorů, jako jsou vlivy mechanické, či pod vlivem radiace, hydrolýzy, oxidačních činidel či enzymu. Proto se často pn obyčejných purifikačních procedurách originálních extraktů získávají odbourané frakce o nižší molekulové váze. (Viz Balazs et al;, výše zmíněný text). Kyselina hyaluronová, její molekulární frakce a příslušné soli jsou užívány jako léčiva a jejich používání se navrtitijeítakť vZkošmetibc (lizinapf zmíněný článek od Balazse & spol. a francouzský patent č. 247 84188). ’ * ’ *·

Třebaže je termín „kyselina hyaluronová“ běžné užíván v nevhodném smyslu, protože znamená, jak je vidět z výše uvedených textů, celou řadu polysacharidů se střídáním zbytků kyseliny Dglukuronové a N-acetyl-D glukosaminu s měnícími sc molekulovými hmotnostmi, ČÍ dokonce odbourané frakco téhož, a třebaže se může plurál „kyeoEny hyaluronové“ zdát příhodnější, diskuse bude pokračovat s použitím formy singuláru ve vztahu kc kyselině hyaluronové v jejích různých formách včetně jejích molekulárních frakcí, a zkratka „HA“ bude také Často používána k popisu tohoto kolektivního termínu.

Benzylesterové deriváty

První vybraný materiál vynálezu je založen na benzylesteru kyseliny hyaluronové, zvláště na 80 až 100% esterech, kde 80 až 100% karboxylových skupin je esterifikováno. Ty benzylestery, kde je ésterifikováno 80 až 99 % karboxylových skupin HA benzylovou skupinou, jsou uváděny jako „částečné estejy“, protože jen část karboxylových skupin je esteriíikována a zbylé karboxylové skupiny jsou buď volné či tvoří sůl se zásadou nebo s kovem alkalických zemin, jako je sodík, vápník nebo draslík. Nejlepšími pro biqmateriály této techniky jsou tzv. „úplné“ benzylestery, kde jsou esterifikovány všechny kařboxyskupíny HA. U těchto úplných esterů mohou být Všechny karboxyskupiny HA esterifikovány benzylovou skupinou (uváděné též jako HY AFF 11), nebo část (75-99 %) může být esteriíikována benzylovou skupinou a všechny zbývající karboxylové skupiny jsou esterifikovány lipidovým řetězcem / alkylovým zbytkem z alifatického alkoholu C₁₀ -₂o^a tí™ se dostane to, co může být uváděno jako „smíšené“ estery. Z těchto alifatických alkoholů je nejlepší palmitický alkohol (Ci₆ -hexadecyl) a stearylalkohol (C_w octadccyl). Tyto smíšené deriváty se mohou vyskytovat rovněž ve foímč částečných esterů, to jest, derivátů, kde část (75-99 %) karboxylových skupin je ěsterifikována benzýlovou skupinou a některé, ale ne všechny ze zbývajících karboxylových skupin jsou esterifikovány alifatickým alkoholem C_!0 -C20. Z nich jsou nejlepší ty, které jsou esterifikovány benzylem (nejméně 75%) a nejméně z 5% jsou esterifikovány alifatickým alkoholem Ci₀ -C20·

Benzylestery kyseliny hyaluronové podle teto techniky mohou být připravovány metodami, známými samy o sobe ž esterifikací karboxylových kyselin, například úpravou volné kyseliny • · * hyaluronové alkoholem (benzyl a/nebo Cw-Cm alkohol) v přítomnosti katalyzátorů, jako jsou silné anorganické kyseliny nebo iontoměniče kyselinového typu, nebo etherifikující reagens, schopné zavést požadovaný alkoholický zbytek v přítomnosti anoiganických nebo organických zásad. Benzylestciy kyseliny hyaluronové však mohou být výhodně připraveny podle zvláštní metody popsané v EP 0 2160453. Tato metoda sestává z úpravy kvarterni amonné soli kyseliny hyaluronové etherifikujícím Činidlem, nejlépe v aprotickém organickém rozpouštědle.

Pro přípravu benzylesterů je možno použít kyseliny hyaluronové jakéhokoliv původu, jako například kyseliny, extrahované z výše zmíněných přírodních výchozích materiálů, například z kohoutích hřebenů. Příprava takovýchto kyselin je popsána v literatuře: přednostně jsou používány purifikované hyaluronové kyseliny. Podle této techniky jsou obzvláště používány kyseliny obsahující molekulární frakce celých kyselin, získané přímo extrakcí organických materiálů s molekulovými hmotnostmi, pohybujícími se v širokém rozpětí, například od asi 90 % až 80 % (M = 11,7 -10,4 miliónů) do 0,2 % (M = 30.000) molekulové hmotnosti celé kyseliny o molekulové váze 13 milionů, nejlépe mezi 5 % a 0,2 %. Takové frakce mohou být získány různými postupy, popsanými v literatuře, například hydrolyzováním, oxidováním, enyzmatickými či fyzikálními procedurami, jako jsou například procedury mechanické nebo radiační. Prvotní extrakty jsou tudíž často tvořeny během těchto stejných purifikačních procedur (viz například článek od Balazse a spol., citovaný výše v „Cosmetics & Toilctries“). Separace a purifikacc získaných molekulárních frakcí jsou prováděny známými technikami, například molekulární filtrací. Jednou frakcí purifikované HA vhodné pro použití podle této techniky je například ta, která je známa jako „nczáněllivý -ŇIF-NaHA hyaluronát sodný“ popsaný Balazsem v příručce „Healon - směrnice k jeho použití“ v Ophtalmic Suigery, D. Miíler a R. Stcgmann, eds. Jóhn Wiley and Sons, N. Y., 81983: str. 5.

Jakožto výchozí materiály pro benzylester jsou obzvlášť důležité dvě purifikované frakce, které lze získat z kyseliny hyaluronové, například té, extrahované z kohoutích hřebenů, známé jako „Hyalastin“ a Jfyalcctin“. Frakce Hyalastin má průměrnou molekulovou hmotnost asi mezi 500.000 a 730.000. Kombinovaná frakce těchto dvou frakcí byla izolována také a byla charakterizována jakožto frakce o průměrné molekulové hmotnosti asi od 250.000 do asi 350.000. Tato kombinovaná frakce muže být získána s výtěžkem 80% úplné kyseliny hyaluronové, dostupné v tomto speciálním výchozím materiálu, zatímco frakce Hyalectin může být získána s výtěžkem 30% a frakce Hyalastin s výtěžkem 50% počáteční HA. Příprava těchto frakcí je popsána v EP 0

138 572.

φ · · « · φφφφ · · φ ·· φφ ·* φ ·· φφ

Následující příklady popisuji přípravu bcnzylestera HA.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Příprava benzylesteru kyseliny hyaluroňové (HA).

12,4 g tctrabutylamoniové ^soli HA. o molekulové hmotnosti 170.0()0 odpovídající 20 mEq, monomerické jednotky se rozpustí v 620 ml dimethylsulfoxidu při 25 stupních, přidá se 4.5 g (25 mEq) benžylbromidu a 0,2 tetrabutylamonium jodidu a roztok se uchová 12 hodin při 30 °C. Výsledná směs se opatrně vlije do 3.500 ml etylacetátu, za stálého promíchávání. Utvoří se piccipitát, který se zfiltruje a čtyřikrát promyje 500 ml etylacetátu a nakonec se suší ve vakuu dvacet Čtyři hodiny při 30 C. Získá se 9 g jmenovaného benzylesterového produktu. Kvantitativní určení esterových skupin se provádí podle metody popsané na sir. 169 - 172 práce S. Siggia a J.G. Hanna „Quantitative Organic Analysis via Functional Groups“ - 4. vydání, John Wiley and Sons.

Příklad 2: Příprava benzylesteru kyseliny hyaluronovc (HA) g draselné soli HA o molekulové hmotnosti 162.000 se suspenduje ve 200 ml dimetylsulfoxidu; přidá sc 120 mg tetrabutylamonium jodidu a 2,4 g benžylbromidu.

Suspenze se neustale promíchává 48 h při 30 °C. Výsledná směs se pomalu vlije do 1000 ml etylacetátu za stálého promíchávání. Utvoří se precipitát, který se zfiltruje a Čtyřikrát se promyje 150 ml etylacetátu a nakonec se suší ve vakuu dvacet čtyři hodiny při 30 °C. Získá se 3,1 g jmenovaného berizylesteru. Kvantitativní určení esterových skupin se provádí podle metody popsané na str. 169 -172 práce S. Siggia a J. G. Hanna „Quantitative Organic Analysis via Functional Groups“, 4. vydání, John Wiley and Sons.

Příklad 3: Příprava derivátu kyseliny hyaluroňové, kde 75 % jejích reaktivních skupin je esterifikováno benzylalkohólem a zbylých 25 % je esterifikováno oktadecylovým alkoholem (stcaryl alkohol, CH₃ - (CH_Z ),₆ - CH₂ - OH) « * ♦ 4 · 4 » · 4 · * W ** »· · « * 44 · ·

6,21 g tetrabůtylamonhé soli kyseliny hyaluronové o molekulové hmotností 180 000 daltonů (10 mEq) se rozpustí v 248 ml dimctylsulfoxidu (DMSO) při pokojové teplotě. K roztoku se přidá 0,89 ml benžylbromidu (7,5 mEq) a roztok se nechá stát 12 hodin při 30 °C. Pak se roztok zchladí na pokojovou teplotu a přidá se k němu 0,83 g oktadecyl bromidu (2,5 mEq). Roztok se zahřívá na 30 °Č po 24 hodin. Pak se přidá 2,5% roztok (váhový) NaCl ve vodě a výsledná směs se vlije do 750 ml acetonu a přitom sc míchá. Utvoří se prccipitát, který sc zíiltrujc a promyje třikrát jedním stem ml směsi aceton/voda 5:1, třikrát 100 ml acetonu a pak se suší ve vysokém vakuu 24 hodin při 30 °C. Takto sc získá 5,1 gramů požadovaného produktu. Kvantitativní stanovení obsahu bcnzylalkoholu a hexadecylálkoholu se provádí plynovou chromatografií, která následuje po alkalické hydrolýzc. Celkový obsah esterových skupin se určuje kvantitativně podle saponifikační metody popsané na str. 169 - 172 práce „Quantitativc Organic Analysis via Functional Groups“ - 4. vydání, John Wilcy and Sons Publication.

Příklad 4: Příprava derivátu kyseliny hyaluronové, kde je 75 % jejích karboxýlových reaktivních skupin esterifikováno benzylalkoholem a zbývajících 25 % je eslerifikováno héxadecylalkoholem (Cetyl Palmityl alkohol, CH₃- (CH₂)₁₄ - CH₂- OH)

6.21 g telrabutylamonné soli kyseliny hyaluronové o molekulové hmotnosti 180 000 daltonů (10 mEq) se rozpustí v 248 ml dimetylsulfoxidu (DMSO) při pokojové teplotě.

K. tomuto roztoku se přidá 0,89 ml benžylbromidu (7, 5 mEq) a roztok sc nechá stát 12 hodin při 30 °C. Pak se roztok zchladí na pokojovou teplotu a přidá se k němu 0,76 g hcxadccylbromidu (2,5 mEq). Roztok se zahřívá na 30 °C po 24 hodin. Pak se přidá 2,5% (váhový) roztok NaCl ve vodě a výsledná směs se vlije do 750 ml acetonu a přitom se míchá. Utvoří se prccipitát, který se zfiltruje a třikrát se promývá 100 ml směsi aceton/voda 5:1, třikrát 100 ml acetonu a pak se suší ve vysokém vakuu 24 hodin pn 30 °C. Takto se získá pět gramů požadovaného produktu. Kvantitativní stanovení obsahu benzylalkoholu a hčxadccylalkoholu sc provádí plynovou chromatografií, která následuje po alkalické hydrolýzc. Celkový obsah esterových skupin jc kvantifikován podle saponifikační metody popsané na str. 169 -172 práce „Quantitative Organic Analysis via Functional Groups“, 4. vydání, John Wiley and Sons Publication).

2. Vnitřně zesítěné deriváty kyseliny hyaluronové

Zesítěné deriváty kyseliny hyaluronové, užité v materiálech předkládaného vynálezu, jsou popsány v EP 0 341 745. Tyto zesítěné deriváty jsou vnitřní a/nebo intramolekulánrí estery kyseliny hyaluronové, kde část karboxyskupin je esteriíikována hydroxylovými skupinami téže molekuly a/nebo různými molekulami kyseliny hyaluronové, kdy se tvoří laktonové nebo intermolekulární esterové vazby. Tyto „vnitřní“ estery, kde -nedochází k žádnému zásahu OH skupin jiných alkoholů, mohou být také definovány jako „autozesítěná kyselina hyaluronová“, jelikož tvorba mono - nebo potymolckulámího síťování je důsledek výše zmíněné vnitřní esterifikace. Adjektivum „zesítěné“ se vztahuje ke křížovým spojům mezi karboxyly a hydroxylý molekul kyseliny hyaluronové.

Autozesítené produkty jsou zvláště částečné vnitřní estery, kde procento „síťování“ se pohybuje zejména mezi 0,5 až 20 %, obzvláště 4,5/5,0 % počtu karboxyskupin v kyselině hyaluronové. V procesu přípravy jsou karboxyskupiny HA molekuly aktivovány přidáním substancí, schopných takovouto aktivaci navodit. Nestabilní meziprodukty získané z aktivační reakce se spontánně oddělí, bud’ po přidání katalyzátoru a/nebo poté, kdy je zvýšena teplota, a tvoří výše zmíněné vnitřní esterové vazby s hydroxyly téže molekuly nebo jiných molekul kyseliny hyaluronové. Podle stupně požadované vnitřní esterifikace jsou aktivovány buď všechny nebo alikvotní část karboxyreaktivních skupin (alikvotní část se získá použitím nadbytku aktivačních substancí nebo vhodnými metodami dávkování).

Karboxyskupiny, které mají být přetvořeny na vnitřní esterové skupiny, mohou být aktivovány počínaje kyselinou hyaluronovou, obsahující volné karboxyskupiny, nebo, ještě lépe, kyselinou hyaluronovou, obsahující karboxyskupiny tvořící soli, například soli kovů, nejlépe alkalických kovů nebo kovů alkalických zemin, a především s kvaiiemími amonnými solemi, jako jsou ty, popsané dále. Jako výchozí substance však mohou být použity také soli s organickou bází, jako jsou aminy. Metody pro aktivaci karboxyskupin volných i tvořících solí jsou samy o sobě známy, obzvláště na poli syntézy peptidu, a ti, kdož jsou v této problematice zběhlí, mohou snadno určit, která z metod

Aktivační metody známé samy o sobě pro postupy peptidové syntézy a užitečné v přípravných postupech tohoto vynálezu jsou popsány například v práci M. Bodanszkého ,,In search of new methods in peptide synthešis“, Int. J. Peptide Protein Res. 25, 1985, 449-474·, a E. Grosse et al., „The Pcptides, Analysis, Synlhcsis, Biology“, Academie Přess, lne., 1979, Vůl. 1, Chapter 2.

Podle takovýchto procedur je aktivována karboxylová složka, lo jes^jhaiíboxylevá .sTo^» *j^ ·· «· «· · ·· · převedena do reaktivní formy. Takováto aktivace typicky zahrnuje reakci mezi kyselinou a aktivační látkou podle schématu:

O )!

R - COOH->R - C - X kde X je polovina, která odebírá elektron. Většina aktivovaných derivátů karboxylových kyselin jsou tudíž smíšené anhydridy včetně, v širším smyslu, také kyselých azidů a kyselých chloridů, které mohou být považovány za smíšené anhydridy azoimidu a HC1 za aktivační látku. Navíc, aktivace karboxylové složky může být doprovázena tvorbou meziproduktů - „aktivovaných esterů“ Tylo „aktivované estery“ mohou být různých typů, ale obzvlášť užitečné „aktivované estery“ jsou . ty,, které jsou připraveny, použitím dicyklohexylkařbodiimidu, p- nitrofenyl· esterů, trichlorfenyl esterů, pentachlorfenyl esterů a O-aGyl derivátů hydroxylaminů, zvláště esterů N hydroxysuccinimidu.

Všechny tyto různé typy aktivačních procedur jsou užitečné v přípravě zesílené HA vynálezu, jelikož všechny tyto procedury mohou být charakterizovány jako postupy, které důležitou měrou zahrnuji reakci karboxylové skupiny s aktivačním Činidlem, což v podstatě vede k tvorbě substituční skupiny, snadno schopné reakce s hydroxylovou skupinou, tak, aby se snadno utvořila vnitřní esterová vazba, charakteristická pro produkty vynálezu: počet karboxyreaktivních skúpin, které mají být převedeny na vnitřní estery, v poměru k počtu aktivovaných karboxyfunkcí; a tento počet závisí na kvalitě použitého aktivačního činidla.

Nejlepší postup pro přípravu zešítčné HA je proto charakterizován reakcí HA, mající volné nebo salifikované karboxýskupíny, s činidlem, které aktivuje karboxyreaktivni skupiny, možno též v přítomnosti pomocného činidla, povzbuzujícího tvorbu meziproduktových aktivovaných derivátů a/nebo terciární organické nebo anorganické zásady, vystavením směsi teplu nebo ozařování (zejména UV světlu) a, je-li to požadováno, tvorbou solí volných karboxyskupin nebo uvolněním karboxyskupin, které tvoří sůl. Z látek, schopných aktivovat karboxyskupinu, mohou být použity látky konvenční, popsané v literatuře, například ty, které se užívají při syntéze peptidů, avšak s výjimkou těch, které by mely pozměňovací či destrukční účinek ňa molekulární strukturu výchozí HA, jako jsou látky, používané při tvorbě karboxylových halogenů.

Nejlepší látky, jejichž účinkem se tvoří aktivované estery, jsou látky jako např. karbodiímidy, dicyklohexylkarbodiímid, benzylisopropylkarbodiimid, benzyl ethyl karbodiimid; ctoxyacctylen;

II

• »---·	- - ~	---			♦
♦ · ·	t ·	•	• ·	• 9
« · ·	• · ·	0	» ·· 0	•	•
• · · 9	• ·	•	•	•	•
♦ · ·♦	·«	•		• ·

Woodwardovo reagens (N-etyl-5-fenylisoxazol-3-sulfonát) nebo halogenové deriváty alifatických, cykloalifatických nebo aromatických uhlovodíků, nebo heterocykličké složky s halogenem, uvedeným v pohyb přítomností jedné nebo více aktivačních skupin, jako je chloroacetonitiyl a obzvláště soli 2-chIoro-N-alkypyridinu jako je chlorid 2-chloro-N-metylpyridinu nebo další alkylové deriváty s nižšími alkylovými skupinami, jako ty, které mají až 6 atomů uhlíku. Namísto chloridových derivátů mohou ovšem být použity jiné halogenové deriváty, například deriváty bromidu.

—Tato aktivační reakce může být provedena v organických rozpouštědlech, obzvláště apirotických, jakými jsou dialkylsutfoxidy, dialkylkarboxylamidy, zejména dialkylsuífoxidy nižšího alkylu, zvláště dimetylsuJfoxid, polymetylenové sulfoxidy, jako je tetramctylenšulfoxid, dialkyly nebo polymétylensulfony, jako je tetrametyleňsulfon, sulfolan a dialkylamidy nižšího alkylu nižších alifatických kyselin, kde alkylové skupiny mají jako maximum šest atomů uhlíku, jako je dimetyl nebo dietylformamid nebo dimetyl nebo dietyl acetamid. Mohou se vsak použít také jiná rozpouštědla, a ta nemusí být vždy aprotická - jako jsou: alkoholy, ethery, ketony, estery - jako jsou nižší alifatické dialkyloxyhydrokarbidy, jako je dimelhoxyetan- a obzvlášť alifatické nebo heícrocyklické alkoholy a ketony s nízkým bodem Varu, jako jsou nižší N-alkykpyrolidony, jako N-mctylpyrolidon nebo N-etyipyrolidoň, hexafluorisopropanol a trifluoroetanol. Pokud jsou jako karboxyl-aktivačni látky užity halogenové deriváty, zejména ve formě solí, jako je výše zmíněný 2chloro-N-melylpyridinchlorid, je lepší použít sůl kovu nebo sůl oiganické báze výchozího polysacháridu, obzvlášť jednu z kvartemích amonných solí, popsaných později, jako je tetrabutyl amonná sůl. Tyto soli mají tu obzvláštní výhodu, že jsou velmi rozpustné ve výše zmíněných organických rozpouštědlech, v nichž má zesíťovací reakce nejlepší účinek a tudíž zaručuje výborný výtěžek. Je dobré přidat do směsi látku, schopnou redukovat kyselinu, jako jsou organické zásady, uhličitany, bikarbonáty, nebo zásadité acetáty či acetáty alkalických zemin, či organické zásady a zejména terciární zásady jako pyridin a jeho homology, jako kolidin, nebo alifatické aminové Zásady, jakó trietylamin nebo N-metylpiperázih.

Použití kvartemích amonných solí představuje obzvlášť výhodný postup. Takové amonné soli jsou dobře známé a připravují se stejným způsobem jako jiné známé soli. Odvozují se z alkylů, které mají nejlépe mezi 1 a 6 atomy uhlíku. Ňejlepší je použít tetrabutylamoňné soli. Jedna varianta postupu, při němž se používají kvartemí amonné soli, spočívá v reakci alkalické soli, například sodné nebo draselné, v přítomnosti katalyzujícího množství kvartemí amonné soli, jakou je tetrabutylamonium jodid.

• · · · ♦ · · ·· * ·; · · ♦ · · «· φ

Φ 9 «φ« · > ·ι «φφ Φ« • ·· · · · « φ Φ« »· «· Φ · Φ « · ·

Látky, které kaialyzují aktivaci karboxyskupin a mají být přidány k aktivačním činidlům, jsou uvedeny v literatuře a jsou to také již dříve zmíněné zásady. Například tedy, jsou-Ii karboxylové skupiny aktivovány solemi isothiazolinu, je nejlepší přidat do reakční směsi trochu triethylaminu.

Reakce, při níž sc tvoří aktivované meziprodukty, jako a zvláště estery, probíhá při teplotě, doporučené v literatuře, avšak tato teplota může být měněna tak, jak to okolnosti vyžadují, a ten, kdo je zběhlý v tomto postupu, ji může snadno určit. Tvorba vazeb vnitřních esterů může nastat v poměrně Širokém teplotním rozpětí, například mezi 0 °C a 150 °C, nejlépe při pokojové teplotě nebo o něco výše, například mezi 20 °C a 75 °C.

+ - v . .>r—u* *. · w ’ * + - ·-· *- r.

Vzestup teploty podporuje tvorbu vazeb vnitřních esterů, právě tak jako vystavení radiaci o vhodné vlnové délce (ultrafialové paprsky).

Substrát kyseliny hyaluronové může být jakéhokoliv původu a může být různých typů, o nichž bylo psáno dříve. Nejlepší výchozí materiály HA jsou ty, jejichž průměrná molekulová hmotnost jé 150.000 áž 730.000, zvláště 150.000 áž 450.000 daltohů. Mimoto se rozsah vnitřního zesítěrií může lišit, ale materiály, které jsou pro tento vynález nejlepší, využívají zesítěnou HA do stupně 4,5 až 5 % karbůxylových skupin.

Následující příklady popisují přípravu užitečných zesítěných produktů HA pro výrobu materiálů tohoto vynálezu.

Příklad 5: Příprava 1% zesílené kyseliny hyaluronové (HA).

Popis produktu:

% karboxyskupin užitých při vnitřní estcrifikaci.

% karboxyskupin salifikovaných sodíkem.

6,21 g tetrabutylamoiiné soli HA o molekulové hmotnosti 170.000, odpovídající 10 mEq monomerické jednotky se rozpustí v 248 ml ĎMSO při 25 °C. Přidá se 0,01g (0<1 mEq) trietylaminu.

Příklad 6: Příprava 5% zesílené kyseliny hyaluronové.

Φ Φ Φ Φ Φ · · · Μ • Φ Φ φ · Φ Φ Φ Φ« Φ φ « • ΦΦΦ ΦΦΦ Φ Φ φ

Φ· ·Φ Φ· Φ ΦΦ φφ

Popis produktu:

% karboxyskupin užitých ve vnitřní esterifikaci.

% karboxyskupin salifikovaných sodíkem.

6,21 g tetrabutylamonné soli HA o molekulové hmotnosti 85.000, odpovídající 10 mEq monomcrické jednotky, se rozpustí v 248 ml DMSO při 25 °C, přidá sc 0,051 g (0,5 mEq) triéthylaminu a výsledný roztok se 30 minut promíchává. Přidá se roztok 0,128 g (0,5 mEq) 2chloro-l-metylpyridinjodidu v 60 ml DMSO; přidává se po kapkách v průběhu časového intervalu jedné hodiny a směs se uchovává 15 hodin při 30 °C. Poté se přidá roztok, tvořený 100 ml vody a * 2,5, g, chloridu sodného, a .výsledná směs se pak. pomalu vlije do 750 ml. acetonu, . za stálého „. míchání. Utvoří se precipitát, který se pák zfiltruje a promyje třikrát 100 ml směsi accton/voda 5:1 a třikrát 100 ml acetonu a nakonec se suší ve vakuu 24 h při 30 °C. Získá se 3,95 gramů jmenované sloučeniny. Kvantitativní stanovení esterových skupin sc provádí podle saponifikační metody, popsané na str. 169 -172 práce „Quantitative Otganic Analysiš Via Functional Groups“, 4. vydání, John Wiley and Sons Publication.

Příklad 7: Příprava 10 % zesítěhé kyseliny hyaluronovc (HA).

Popis produktu :

% karboxyskupin užitých ve vnitřní esterifikaci.

% karboxyskupin salifikovaných sodíkem.

6,21 g tetrabutylamoniové soli HA o molekulové hmotnosti 620.000, odpovídající 10 mEq monomerické jednotky sc rozpustí v 248 ml DMSO při 25 °C. Přidá se 0,101 g (1,0 mEq) trietyláminu á výsledný roztok se 30 minut promíchává. Pak sé pomalu, po kapkách, přidá roztok 0,255 g (1,0 mEq) 2-chloro-l-metyl pyridin jodidu bčhem časového intervalu 1 hodiny a směs se udržuje 15 hodin při 30 °C. Pak se přidá roztok, tvořený 100 ml vody a 2,5 g chloridu sodného a výsledná směs sc za stálého míchání pomalu vlije do 750 ml acetonu. Utvoří se precipitát, který sc zfiltruje a promyje třikrát 100 ml směsi, aceton/voda 5:1 a třikrát 100 ml acetonu a nakonec se suší ve vakuu 24 h při 30 °C. Získá se 3,93 gramů jmenované sloučeniny. Kvantitativní stanovení esterových skupin se provádí podle saponifikační metody popsané na str. 169 -172 práce ♦ · · « · Φ « i «I φ φ φ φ · φφ φφφ φ φ φ · · φ φ φ φφφ ·· φ · φ. φ φ φ φ φ φ· „Quantitativc Oiganič Analysis via Functional Groups“, 4. vydání,* *John *Wiléy ancf Sons

Publication.

Pnldad 8: Příprava 10% zesítěné kyseliny hyaluronové (HA).

Popis produktu:

% kaiboxyskupin užitých vc vnitřní csterifikaci.

% karbóxýskupin tvořících sůl se sodíkem.

6,21. g^tetrabulylamoniové soli o .molekulové hmotnosti 170.000,_odpovídající 10 mEq. moňomerické jednotky, se rozpustí v 248 ml DMSO při 25 °C. Přidá se 0,118 g (1 mEq) pyridinchloridu a výsledný roztok se promíchává 30 minut. Přidá se roztok 0,16 g N-benzyl-Nethyl karbodiiniidu ve 20 ml DMSO. Přidává se pomalu po kapkách v časovém intervalu jedné hodiny a směs se udržuje 45 hodin při teplotě 30 °C. Přidá se roztok ze 100 ml vody a 2,5 g chloridu sodného a výsledná směs se pomalu vlije do 750 ml acetonu, přičemž se stále promíchává. Utvoří se prccipitát, který se pák žfiltruje a propláchne třikrát l()0 ml směsi aceton/voda 5:1 a třikrát 100 ml acetonu a nakonec se suší ve vakuu 24 hodin pri teplotě 30 °C. Získá se 3,9 gramů jmenované sloučeniny. Kvantitativní stanovení esterových skupin se provádí podle saponifikační metody popsané na str. 169 - 172 práce „Quantitative Organic Analysis via Functional Groups“, 4. vydání, John Wiley and Sohs Publication.

3. Příprava biomateriálů

Následující příklady popisují přípravu chirurgických / zdravotnických výrobků podle vynálezu, obsahující úplný benzylester HA nebo autozesítěný derivát HA, nebo kombinaci obou. Jak bylo uvedeno výše, postupy pro přípravu membrán, tkanin, tkaných síťovin a netkaných látek jsou popsány vUS. 4,956,353, WO 93/11804, WO 93/11803, WO 94/17837 a EP 0 341745.

Příklad 9: Příprava výrobku založeného na IJYAFF 11 + polypropylénové síťce

Připraví se roztok HYAFF 11 v DMSO (110 mg/ml). Poté, cojsejsložfcy, ďefijiitjvně.rtvgju^tí;* ···«··· ♦ · · roztok se přefiltruje přes 20 mikrometrovou filtrační plachetku a je z6avén plynu tím, že se*umíšfi na dvě hodiny do vakua. 5 ml tohoto roztoku se vylije a rozprostře na skleněnou destičku. Pak se tam umístí polypropylénová síťka (nejlépe 6x11 cm) a přes ni se přelije dalších 10 ml roztoku. Rozprostře sc po celé síťce a jakýkoli přebytek sc odstraní. Skleněná destička se ponoří do lázně obsahující ethanol/vodu (90:10) na 5 hodin, aby se přípravek mohl srazit a destička aby se mohla odstranit. Přípravek se pak ponoří do lázně absolutního etanolu na 16 hodin. Pák se suší na destičce ve vakuu 30 minut při 63 °C.

Příklad 10: Příprava výrobku založeného na tkanině z HYAFF 11, pokryté filmem z HYAFF 11

Připraví sc roztok HYAFF 11 v DMSO (110 mikrogramů/ml). Když je rozpuštění úplné, roztok se přefiltruje přes 20 mikrometrovou filtrační plachetku a zbaví se plynů umístěním do vakua na 2 hodiny. 5 ml roztoku se vylije a rozprostře na skleněnou destičku a pak se na povrch umístí gáza z HYAFF 11 (10x20cm) tak, aby přilnula bez jakýchkoli záhybů nebo vzduchových bublin, a přes ni se přelije dalších 10 ml roztoku. Rovnoměrně se rozprostře po gáze a jakýkoli přebytek se odstraní. Skleněná destička se ponoří do lázně obsahující ethanol na 30 minut, aby sc přípravek mohl srazit a destička aby se mohla odstranit. Přípravek sc pak nechá 16 hodin v ethanolu a suší se na destičce ve vakuu 30 minut při 63 °C.

Příklad 11: Membrána z HYAFF lis výztuží z HYAFF 7

Podle následujícího postupu byla vyvinuta složená membrána obsahující benzylester kyseliny hyáluronové HYAFF 11, t j, kyselina hyaluronová esterifikovaná stoprocentně benzylalkoholem, se síťovou výztuží, obsahující etylester kyseliny hyáluronové HYAFF 7, což jč kysclma hyaluronová, stoprocentně estcrifikovaná ethaňolem. Výrobek má plošnou váhu 14 mg/cm², jeho tloušťka je 0,25 mm, minimální mez pevnosti v tahu za sucha 400 kg/cm² a poměrné prodloužení pří přetržení 7%; za mokra jsou tytéž parámetiy 50 kg /cm² a 55%. Pevnost v roztržení za sucha je 90 kg /cm², za mokraje 50 kg/cm².

• · · · ♦ * • · · ·· • ·· · 4 4 ♦ · • ·· 44 • · • «

Síťovina HYAFF 7 byla sestrojena takto: Roztok HYAFF 7 dimetylsulfoxidu o koncentraci 125 mg/ml byl přiváděn posuvovým zubovým čerpadlem do trysky pro zvi ákň ování za mokra, která má 100 otvorů, každý o průměru 65 mikronů. Extrudované vrstevnaté vlákno se přivede do srážecí lázně, obsahující absolutní ethanol a pak se přes transportní válce přivede do tří po sobě jdoucích proplachovacích lázní, které rovněž obsahují absolutní ethanol. Poměr mezi rychlostí třetího válce (III) a rychlostí prvního válce (I) se jmenuje průtahový poměr. Má hodnotu 1,05, pokud rychlost jednotlivých válců je následující: Válec I 23 otáček za minutu, válce II a ΙΠ 24 ot./min. a válec IV 25'ot./min; Po^kprůchodu’vrstevnatého vlákna proplachovacími lázněmi se vlákno suší teplým'’ vzduchem při teplotě 45 °C a navine na navíjecí rám (8). Vlákno má index 237 denier. Pak se vlákno ohne 135x na metr a utká na stavu do hladké pleteniny textilního čísla 14. Ze stavu se látka protáhne kalandrem, který ji ztenčí. Diagram 2 ukazuje síťovinu, vzniklou tímto postupem.

Dvěma stříkacími pistolemi se aplikuje polymerická hmota - sprej roztoku HYAFF 11 v dimetylsulfoxidu o koncentraci .40 mg/ml. Takto postříkaná síťovina se přemístí do srážecí lázně obsahující absolutní ethanol, do promývací komory obsahující chemicky čistou destilovanou vodu a do speciální sušicí komory, mající teplotu 50 °C (17).

Příklad 12: Netkaná látka sestávající z HYAFF 11

Následujícím postupem byla připravena netkaná látka obsahující benzylester kyseliny hyaluronové HYAFF 11, vážící 40 gr/mq a o tloušťce 0,5 mm:

Připraví se roztok HYAFF 11 v dimetylsulfoxidu o koncentraci 135 mg/ml (připraví se v cisterně) a přivede se posuvovým zubovým čerpadlem do trysky pro zvlákňování za mokra, která má 3000 otvorů, každý o průměru 65 mikronů. Extrudovaná vlákenná hmota se préniístí do srážecí lázně, obsahující absolutní ethanol. Poté se transportními válci přivede dó dvou po sobě jdoucích proplachovacích lázní, obsahujících absolutní ethanol. Průtahový poměr prvního válce je nastaven na nulu, zatímco průtahový poměr mezi ostatními válci jc nastaven na 1,05. Po průchodu proplachovacími lázněmi sc vlákenná hmota suší proudem horkého vzduchu (45 až 50 °G) a válcovou řezačkou se nařeže na 40 mm vlákna. Takto získaná hmota vláken se vyklopí do násypného žlabu vedoucího do mykacího / snovačíhó lapovacího stroje, z něhož vyjde jako pavučina 1 mm silná a o váze 40 mg/mq. Pavučina se pak postříká sprejem roztoku HYAFF 11 v

• V · * · «· ·· • ·· · · · · · · «· • ♦ ····· ·«*·«» • · · ♦ «·· ·· ·· ♦· ·· « «* ·· dimctylsulfoxidu 80 mg/ml, umístí se do ethanolové srážecí lázně a posléze do sušicí komory. Konečná tloušťka materiálu je 0,5 mm.

Příklad 13: Netkaná látka složená zHYAFF 11 a HYAFF 7

Následujícím postupem byla připravena netkaná látka vážící 200 gr/mq a 1,5 mm silná, složená ze směsi ethylestéru kyseliny hyaluronové, HYAFF 7, a benzylesteru kyseliny hyaluronové, HYAFF * 117 ve stejném množství.

mm dlouhá vlákna HYAFF 7 a HYAFF 11, získaná zvlákňovacím postupem dle Příkladu 10, se důkladně smísila ve spirálovém mixeru. Směs vláken se přivedla do mykacího stroje, odkud vyšla jako pavučina o síle 1,8 mm a váze 200 gr/mq. Pavučina pak prošla jehlovacím strojem, který z ní vyrobil 1,5 mm silnou netkanou látku, vážící 200 gr/mq, v níž byly zmíněné dva materiály perfektně promíchány.

Příklad 14: Netkaná látka z částečného a úplného benzylesteru

Následujícím postupem byla získána netkaná látka o váze 40 gr/mq a 0,5 mm silná, obsahující směs benzylesteru kyseliny hyaluronové, HYAFF 11, a částečného (75%) benzylesteru kyseliny hyaluronové, HYAFF llp75, v totožném procentním poměru.

Příprava HYAFF llp75: 10 g tetrabutylamonné soli kyseliny hyaluronové, mv = 620,76, odpovídající 16,1 nmolu, se rozpustí ve směsi N-methyl-pyrolidonu i voda 90/10, 2,5% na váhu, aby se získalo 400 ml roztoku. Roztok se zchladí na 10 °C, pak se probublává puriíikovaným dusíkem po dobu 30 minut, a pak je esterifikován 1,49 mililitry (odpovídá 12,54 nmolu) benzyl bromidu. Roztok se pomalu jemně protřepává 60 hodin při 15 - 20 °C.

Následné purifikace se dosáhne precipitací v ethyl ácetátu, poté, co býl přidán nasycený roztok chloridu sodného, a následným promývánún směsí ethyl acetát/ absolutní ethanol 80/20. Tuhá složka se oddělí filtrací a vystaví sc působení bezvodého acetonu. Takto se získá 6,8 g produktu, což se rovná asi 95% výtěžku.

·' · ·

* · «

Vlákna HYAFF 11 a HYAFF 1 lp75, 40 mm dlouhá, získaná postupem, uvedeným v přikladu 1, se důkladně promísila ve spirálovém mixeru. Smíšená vlákna se přivedla do mykacího stroje, odkud vyšla jako 1 mm silná pavučina o váze 40 mg/mq. Na pavučinu se pak nastříkal sprej roztoku HYAFF 11 v dimetylsulfoxidu (80 mg/ml), pavučina se umístila do ethanolové srážecí lázně, pak do promývací komory obsahující vodu nebo směs vody a ethanolu v poměru od 10 do 95% ethanolu, a nakonec do sušicí komory. Materiál měl konečnou tloušťku 0,5 mm, a vlákna HYAFF 11a HYAFF 1 lp75 byla perfektně promíscna a naadherována k sobč.

Příklad 15 : Vrstevnatá netkaná látka založená na HYAFF 11 — »<nW II »F- —r — -**·· * U *·· .*· · ··' ¹ ·* * 1' “ **

Podle následujícího postupu byla připravena vrstevnatá netkaná látka, složená z vrstvy benzylesteru kyseliny hyaluronové, HYAFF 11, a z vrstvy netkané viskozy (Jettex 2005 z ORSA), o plošné váze 80 g/mq, tloušťce 2 mm, a procentuální absorpci vody 560% podle váhy.

Vrstva, která přijde do kontaktu s kůží, sestává z vláken HYAFF 11 vyrobených zvlákňováním za mokra a tvořících roušky 30 g/mq. Vlákna jsou upravena do tvaru roušek. Tato vrstva se přistěhuje ke druhé vnstvě netkané viskozy o plošné váze 30 g/mq. Konečný netkaný výrobek tudíž sestává ze dvou perfektně spojených vrstev o celkové plošné váze 80 g/ mq, tloušťce 2 mm, a procentuální absorpci vody 560% podle váhy.

Příklad 16: Vrstevnatá netkaná látka založená na HYAFF 11

Podle následujícího postupu byla získána vrstevnatá netkaná látka, obsahující smíšenou vrstvu benzylesteru kyseliny hyaluronové, HYAFF 11, a kalcium algjnátu v poměru 1:1, a vyztužující netkanou látku z polypropylenu (netkaný základ, 50 g/mq z NEUBERGEŘ) o plošné váze 70 g/mq, tloušťce l,5mm, a procentuální absorpci vody 450% podle váhy:

Vlákna HYAFF 11a kalcium algjnátu, 40 mm dlouhá, získaná konvenční technikou spřádání za mokra, byla promíscna, Utvořila še z nich rouška 20 g/mq, a ta se přistěhovala k netkané látce o plošné váze 50 g/mq. Výsledný materiál sestává ze dvou vrstev netkané látky s celkovou plošnou váhou 70 g/mq, o tloušťce 1,5 mm, a procentuální absorpci vody 450% podle váhy.

• 0 · • · » t

Příklad 17: Vrstevnatá netkaná látka založená na HYAFF 11

Podle následujícího postupu byla získána vrstevnatá netkaná látka sestávající z vrstvy bcnzylestcru kyseliny hyaluronové HYAFF 11a vrstvy polyuretanové pěny jako LYOBEND (z DELCON) o plošné váze 100 g/mq, tloušťce 6 mm, a procentuální absorpci vody 860% podle váhy :

Vrstva, přicházející do kontaktu s kůží sestává z vláken HYAFF 11 vyrobených technikou spřádání za mokra a vytvarovaných do formy roušky 45 g/mq, která je přistěhována ke druhé vrstvě z polyuretanové pěny. Výsledný netkaný výrobek sestává ze dvou perfektně spojených vrstev o celkové plošné váze 100 g/mq, tloušťce 6 mm, a procentuální absorpci vody 860% podle váhy.

Příklad 18: Příprava membrány vyrobené z derivátu kyseliny hyaluronové, majícího 80 % karboxyfunkcí cstcrifikovaných benzylalkoholem (CJHU-CHrOH), 10 % karboxyfunkcí zahrnutých do vnitřních esterových vazeb a zbývajících 10 % tvořících sůl se sodíkem.

6. 21 gr tetrabutylamoniové soli kyseliny hyaluronové o molekulové hmotnosti 180 000 daltonů (10 mEq) se rozpustí ve 248 ml dimethylsulfoxidu (DMSO) při teplotě okolí. K tomuto roztoku se přidá 0,951 ml benzyí bromidu (8,0 mEq) a roztok sc nechá stát 12 hodin pri 30 °C. Přidá sc 0,101 gr triethylaminu (1,0 mEq) a roztok se po 30 minut míchá. Přidá se 0,255 gr (1 mEq) 2cMoro-l-metyl-pyridin jodidu v 60 ml DN4SO a směs se nechá stát 15 hodin při 30 °C. Přidá se 2,5% roztok (váha na objem) chloridu sodného ve vodě a výsledná směs se vlije do 750 ml acetonů a přitom se míchá. Utvoří se precipilát, který se zfiltruje a proplachuje třikrát ve 100 ml směsi acctori/voda 5:1, třikrát 100 ml acetonu a nakonec sušen vc vakuu 24 hodin při 30 °C. Takto je získáno 4,5 g požadovaného produktu. Kvantitativní určení obsahů bén2ylalkoholu sc provádí plynovou chromatografií, následující po alkalické hydrolýze. Celkový obsah esterových skupin se měří saponifikačni metodou popsanou na str. 169 - 172 práce „Quantitative Analysis Via Functional Groups“, čtvrté vydání, John Wiley and Sons Publication.

Takto připravený esterový derivát je rozpuštěn na koncentraci 150 mg/ml v DMSO při teplotě 30 °C. Rozpuštěný derivát je filtrován přes 20 mikronovou síťku a vložen do extnísního reaktoru, napojeného na filmový průtlačníkO tloušťce méně než 1 mm. Produkt je extrudován v koagulační lázni, obsahující roztok, který umožní, aby byl DMSO z výrobku extrahován (např. ethánol), a materiál z filmového průtlačníku je navinut na sérii válců, opatřených JventJ^pí· aljy ge*njcnjhCvw* • · · · · · « « « usušila. ...........

PREKUNICKÉ STUDIE

Následující studie podávají přehled výsledků, které ukazují užitečnost vynalezených výrobků v prevenci pooperačních adhezí tkání a ukazují zlepšené výsledky zásluhou těchto výrobků ve srovnání s výrobky dřívějšími.

Studie 1

Tato studie demonstruje vysoký výskyt tvorby chirurgických adhezí pozorovaný na navozeném modelu poškozeni jater u krys, představujících pozitivní kontrolu při srovnáváni preventivního účinku zdravotnických a chirurgických pomůcek, odvozených z HA, proti tvorbě adherencí. Pro tyto experimenty byly vybrány krysy plemene Spraguc Dawley, o váze 275 až 300 g. Poškození jater bylo provedeno 21 živočichům.

Každému zvířeti byla provedena laparotomie abdominální incizí po anestézi roztokem Ketaminu, lOOmg/kg a Xylazinu, 11 mg/kg, připravených sterilním způsobem a podaných nitrosvalovč.

Játra byla upevněna a odkryta; dolní lalok byl poraněn jemným flakem sterilním tamponem, dokud se neobjevila krev. Po zastavení krvácení poraněného povrchu byla laparotomie uzavřena stehem z hedvábí velikosti 3. Zvířata byla utracena po 7-21 dnech.

Adhěze byla hodnocena podle toho, jak snadno šly přilehlé povrchy (horní a spodní) od sebe oddělit chirurgickými pinzetami, na základě následující stupnice :

žádná adheze - povrchy jdou od sebe lehká až střední adheze - povrchy lze od sebe odtáhnout pinzetou výrazná adheze mezi dvěma povrchy, j akýkoli pokus je od sebe oddělit končí roztržením tkáně • φ φ ···*· • 9 · · 9 999

9 9 · · 9 99* 99 • 9 9 9 9 99

V této studii byly jako klinický významné hodnoceny ty adheze, které mely u tohoto zvířecího modelu stupeň 2. V této pozitivní kontrolní skupině (tvorba adhezí) mělo 17 zvířat z 2'1 (80,9 %) adheze, dosahující stupně 2.

Studie 2

Tato studie ilustruje významnou redukci v tvorbě adhezí, pokud se použije gel vyrobený ze zesítčné kyseliny hyaluroňové (ACP), nebo gáza, založená na benzylesteru HA HYAFF 11, _ _x—au. «M«- i“ · — i ww.r·»»·· W ·, '··** -samotná, nebo v kombinaci s hemostatickým Suigicelem a Heparinem 50IU/ml. Gel ACP byl rozprostřen po ošetřovaném povrchu. Chirurgický protokol popsaný v Příkladu 1 byl užit jako zvířecí model navození tvorby adhezí. Významná redukce v tvorbě adhezí mezi dvěma přilehlými povrchy levého jatemího laloku je zobrazen v Tab. 1.

MATERIÁL	POČET ZVÍŘAT	POČET VÝRAZNÝCH ADHEZÍ (STUPEŇ 2)
Tkanina HYAFF 11	6	50%
Tkanina HYAFF 11 + SURGICEL	6	16%
Tkanina HYAFF 11 + Surgicel + heparin	6	16 %
Tkanina HYAFF 11 + heparin	6	33%
Membrána HYAFF 1.1 (20 mm silná)	11	36 %
HYAFF 11 netkaná látka + Surgicel	6	33%
ACP	24	20%

Je zřejmé, že užití těchto pomalu biodependábilních biomateriálů jako neprostupné bariéry pro

záhětlivé buňky mezi dvěma přilehlými povrchy redukuje tvorbu adhezí, jak je zřejmé ze srovnání s 80,9 % adhezí, pozorovaných v kontrolní skupině popsané v Příkladu 1.

Studie 3

Tento přiklad ukazuje vysoký výskyt tvorby póoperačňích adhezí pozorovaný na modelu

tohoto modelu s preventivním účinkem zdravotnických pomůcek sestávajících z derivátů HA tohoto vynalezu (HYAFF 11 + polypropylenová síťka) proti tvorbě adhezí.

Lézc byla navozena celkem ú 24 zvířat (12 kontrola, 12 lest). Každému zvířeti byla provedena laparotomie abdominální incizí poté, co byla podána anestéze roztokem Ketaminu 100 mgZkg a Xylazinu 11 mg/kg připravených za sterilních podmínek a podaných nitrosvalově.

Tkáň nalevo od incize byla zvednuta dvěma chirurgickými pinzetami, aby se zpřístupnila břišní stěna. Část peritoncálního povrchu 1,5 cm x 1,5 cm byla odstraněna chirurgickými nůžkami, dokud se neobjevil cxsudat Svalový snopek odstraněn nebyl. V kontrolní skupině bylo nutno přisít přes operovaný povrch polypropylenovou síťku (měřící dvojnásobek povrchu leze). Byl použit bioabsorbovatelný steh Vycil velikost 6. Tím se zajistil tažný odpor břišní stěny. Před aplikací materiálu byla na operovaném povrchu zajištěna důkladná hemostáza (= zastavení krvácení.) Zvířata byla utracena za 14 dní - střední doba citovaná v přikladli 1 - a adherence byla zhodnocena podle následující stupnice:

žádná adheze lehké adheze bez vaskiilarižace, jdou snadno odstranit střední adheze bez vaskularizace, jdou od sebe odtáhnout ručně pevná adheze, neprůhledná, vaskularizovaná, lze ji oddělit obtížně - je nutno užít skalpel velmi , pevná adheze, silná, neprůhledná, vaskularizovaná, lze ji pouze odstřihnout chirurgickými nůžkami, s následnou destrukcí tkáně.

φ · · • φφ φ • φ

Adheze se stupněm více než 2 byly považovány za závažné.

V pozitivní kontrolní skupině (tvorba adhezí) mělo 12 zvířat z 12 (=100 %) adheze se stupněm více než 2, zatímco při použití výrobků vynálezu byla zřetelná redukce ve výskytu adhezí mezi břišní stěnou a vnitřními orgány, jak ukazuje Tab. 2.

MATERIÁL	POČET ZVÍŘAT _ ;	POČET VÝRAZNÝCH ADHEZÍ (STUPEŇ 2) . —
HYAFF 11+ polypropylénová síťka	12	25 %
Kontrola - polypropylénová síťka	12	100%

Je zřejmé, že použití materiálu HYAFF 11 vynálezu jako bariéry (nepropustné pro zánětlivé buňky) mezi poraněný vnitřní povrch (břišní stěna) a přilehlé orgány redukuje tvorbu adhezí ve srovnání sc 100% adhezí v konlroiní skupině, ošetřené jen polypropylénovou síťkou.

Studie 4

Tato studie ilustruje možnosti autozesítěné kyseliny hyaluronové (ACP) ve formě gelu a použité jako povlak k redukci tvorby adhezí, v modelu lézí, navozených na slepém střevě krys. Tento typ lézí vykazuje tvorbu adhezí, pokud je ošetřen oplachováním fyziologickým roztokem a zastavením krvácení po operaci, a nijak jinak.

Jako v Příkladu 1, byly použity krysy plemene Spfague Dawley o váze 275 - 300 gramů. Každému zvířeti se provedla laparotomie abdominální incizí po aneštézi roztokem Ketaminu, 100 mg/kg, a Xylazinu, 11 mg/kg, připravených za sterilních podmínek a podaných injekčnč nitrosvalovč. Slepé střevo bylo lokalizováno a exponováno. Na povrchu střeva sc navodila léze pevným předmětem • * · · Φ έ· · · · · » · (měděný disk o průměru lem, napojený na napájecí zařízení, elektrortitky n&tavěné na teplotu

69,5 °C. Kontakt disku s povrchem střeva byl 15 vteřin. Vznikla patrná lézc s exsudátem. po opláchnutí poraněné oblasti fyziologickým roztokem a zastavení krvácení Surgjcelem byla laparotomic uzavřena stehem z hedvábí velikosti 3.0. Po utracení zvířat za 14 dní, střední Čas uvedený v Příkladu 1, byly zhodnoceny adherence podle následující stupnice:

žádná adheze lehká adheze bez vaskularizacc, lze ji snadno oddělit středě silná adheze bez vaskularizace, lze ji odtáhnout ručně pevná adheze, neprůhledná a vaskularizovaná, lze ji obtížně oddělit, je nutno použít skalpel * * Λ #. q. ||I|R * .Fh -m . I φ Η Φ- velmi pevná adheze, silná, neprůhledná a vaskularizovaná, lze ji pouze odstřihnout chirurgickými nůžkami, s následnou destrukcí tkáně.

V tomto zvířecím modelu adheze se stupněm vyšším než .2 byly brány jako závažné. Je zřejmá redukce tvorby adhezí, byl-li užit gel ACP jako bariéra, ve srovnání s kontrolou ošetřenou pouze samotným oplachováním fyziologickým roztokem a zastavením krvácení (Tabulka 3).

TABULKA 3
MATERIÁL	POČET ZVÍŘAT	POČET VÝRAZNÝCH ADHEZÍ (STUPEŇ 2)
Kontrola (fyziolog. roztok + zastavení krvácení)	17	70%
ACP	11 ,	40 %

Je zřejmé, že použití jmenovaného materiálu jako bariéry redukuje tvorbu adhezí, ve srovnání s kontrolním ošetřováním samotným oplachováním fysiologickým roztokem á zastavením krvácení.

pooperační tvorby adhczí v modelu jatemích lézí krys

Zvířecí model: Krysí samci Harlan SD, váha 250 gr.

Typ lézc: Břišní oblast byla důkladně očištěna roztokem jódu, pak byla provedena asi 3 cm iapařotomie pro expozici jater. Pravý spodní lalok jater byl poškrábán a navozena tak leze sterilní dřevěnou špachtlí, dokud se neobjevila krev.

Testované materiály:

- · —— —Pokus 1: HYAFF 1 lp75, částečný benzylester kyseliny hyaluronové ve formě gázy a netkané ^Λ látky.

Pokus 2: HYAFF 7, úplný ethylester kyseliny hyaluronové ve formě gázy a netkané látky.

Aplikace materiálu: po zastavení krvácení konvenčním hemoštatikem, byly testované a kontrolní materiály umístěny mezi spodní (Oblast Jéze) a horní jatemí lalok (přilehlý povrch) bez použití Švu, aby nastal bariérový efekt a zabránilo se tvorbě adhczí.

Zhodnocení a pozorování:

Prováděla se pozorování mezi sedmým a dvacátým prvním dnem po operaci. Adheze, které se utvořily, byly hodnoceny na základě následujících vizuálních označení:

- Žádné adheze = Lehké adheze = Výrazná přítomnost adhezí

Kromě zhodnocení co do stupně šíty adhezí, byl zhodnocen také stupeň zánětu, a to miřoskopicky (tkáňová reakce na aplikaci materiálu). Histologické vzorky sě barvily hematoxylin - eosinem a MaUoryho trichromovým barvením.

Výsledky:

·♦· · • « « · • í · * fc fc · • fc « · * fc fc • fc ·· ·· ♦

Experiment 1:

V Experimentu 1, materiály založené na HÝAFF llp75, částečném benzylesteru kyseliny hyaluronové, byly testovány samostatně, v kombinaci s hcmostatikem Surgiccl, a v kombinaci s hcmostatikem plus saturací heparinem (1.000 Uml). Tyto postupy jsou v chirurgické praxi běžné.

Diagram 1 je graf, zobrazující účinek biomateriálů, jsou-li užity samostatně. Žádný efekt v prevenci adhezí nebyl pozorován v případech biomateriálů založených na HÝAFF llp75 a Iritcrcecdu, a i když ve druhém případe se trend zdál lepší, i když ne významně rozdílný, jatemí laloky byly kompletně srostlé a bylo možno pozorovat výraznou zánětlivou reakci. Totéž bylo vidět při histologickém vyšetření bíopsií, kde bylo možno pozorovat přítomnost velkého počtu zánětlivých buněk, neutrofilů, makrofágů, a vyzrálých vláken kolagenu.

Na diagramech 2 a 3 byly materiály užity v kombinaci se Suigicelem a sc Surgjcclem + heparinem. Trendy pozorované v diagramu 1 byly potvrzeny u materiálů založených na HÝAFF llp75, zatímco Interceed nasycený heparinem vykazoval, zdá se, lepší výsledky. Táto situace byla potvrzena histologicky.

Závěr : Materiály, založené na HÝAFF llp75 nemohou být použity v prevenci poopcračních adhezí, jelikož mají zánětlivý účinek; ten je zaviněn pravděpodobně uvolněním oligomerů kyseliny hyaluronové o nízké molekulové váze, z hlediska mimořádně krátkého degradačního času produktů.

Experiment 2:

V Experimentu 2 byly testovány biomateriály, založené na HÝAFF 7, ethylesteru kyseliny hyaluronové, v kombinaci se Suígjcelem a Surgicclem + heparinem. V žádném případě nebyl pozorován účinek co do prevence pooperáčních srůstů. Zdá se, že Interceed používaný se Surgicclem a heparinem dává pozitivnější výsledek (Diagram 4).

Mikroskopická vyšetření tyto údaje potvrdila a zjistilo se při nich velké množství zánětlivých buněk a kolagenových vláken v případě používání HÝAFF 7. V tomto případě, tak, jako v minulém, biomateriály, založené na HYAFF 7 nemohou být použity v prevenci tvorby pooperačních srůstů, jelikož je pravděpodobné, že do organismu uniká ethanol.

Studie 6 - Účinnost biomateriálů založených na HYAFF 11 v prevenci pooperační tvorby srůstů ve dvou odlišných modelech lézí, navozených u zvířat: 1) Nitrójatemí abraze u krys - 2) Léze břišní stěny u krys.

Zvířecí model 1 flW* '♦ >ιιιι»»ιΜιι·ιι !< a. mi—1,._ r,p *rr

Břišní oblast byla desinfikována jódem a alkoholem a pak se provedl řez k odkrytí jater. V tomto zvířecím modelu byl vnitřní povrch spodního jatemího laloku poškrábán, dokud se neobjevil exsudát. V poškozené oblasti bylo pečlivě zastaveno krvácení Tabotampem (Ethicon) a materiál byl zanechán ná poškozeném povrchu bez připevnění, protože výrobek má vysoce mukóadhesiviú vlastnosti. Byly testovány dva výrobky, založené na HYAFF 11, oba jsou komerční verze 20 mikrometru silné membrány, nazvané Transprocess a Hyalobarrier 20. Za 14 dní po operaci se provedlo makroskopické zhodnocení výše popsaným systémem stupňů, aby se určily adheze. Další zhodnocení sc provedlo co do procenta zvířat, u nichž byl zjištěn stupeň 2 (významná adheze).

Výsledky

Diagram 5 je graf, představující stupně adhezí, navozených v pokusu. Hyalobarrier 20 redukuje četnost tvorby adhezi ve srovnání s neléčenými kontrolami a dvěma ošetřováními kyselinou hyaluronovou o vysoké a nízké molekulové váze. Podobný trend byl zaznamenán; třebaže bez jakýchkoli statisticky významných rozdílů, v případě dalšího materiálu na bázi HYAFF 11, zvaného Transprocess. Diagram 6 ukazuje procenta případů adhezí se stupněm 2 v každé pokusné skupině (chirurgicky významná adhéže). Tendence zjištěná předchozím diagramem (1), byla potvrzena i v tomto případe, s redukcí tvorby adhezí stupně 2 (procento výskytu menší než 50% při ošetřování Ilyalobarricrem 20 a Transprocessem).

Zvířecí model 2

Po dcsinfekci břišní oblasti jódem a ethanolcm, byla provedena mediánní láparotomic, aby se zpřístupnila břišní stěna a peritoneum. Skalpelem se provedla incize 2 x 2 cm a pak se odstranilo peritoneum a svalová vrstva. Při tomto typů operace je nutno sešít poškozenou oblast materiálem, který podporuje růst tkáně a přitom zaručuje adekvátní tažnou sílu, aby sc zabránilo zhroucení břišní stěny. Obecně se užívají nedegradabilní materiály s polymerickou hmotou, jako jsou síťky z polypropylenu, polyesteru nebo lehčeného polytetrafluoroethylenu. Avšak užití takovýchto materiálů samotných není dostačující k tomu, aby se zabránilo vytvoření srůstů se střevními kličkami, což vede ke střevní obstrukci a k chronickým bolestem.

^Makroskopické zhodnocení se provedlo 14 dní po operaci, s použitím stupňů adhezí od 0 do 4. Dále sc provedlo zhodnocení procenta zvířat se stupněm více než 2 (významné adheze).

Výsledky

Tento pokus demonstruje, že potazem syntetické síťky Proleň (polypropylenová síťka, mající široké použití v břišní chirurgii) HYAFFem 11a rouška zHYAFFu 11 na síťce Proleň, připevněná stehem, může redukovat tvorbu póoperačních adhezí. Diagram 7 ukazuje, že kombinovaný produkt nazvaný Hyalobarrier Plus (HYAFF 11 rozprostřený a sražený na Prolenu) a spojení Hyalóbanicru vc formě filmu na prolenu výrazně redukuje adheze ve srovnání s prolcnem samotným. Diagram 8 tento trend potvrzuje, s nižším procentem významných adhezí (více než 2) po ošetření líYAFFem 11 oproti ošetření samotnou prolenovou síťkou.

Studie 7 - Účinky biomateriálu z gelu ACP na prevenci pooperační tvorby adhezí za období 14 dnů na zvířecí modely jatemího poškození krys a střevního poškození krys.

Účelem léto studie bylo zhodnocení účinků biomateriálu, založených na gelu ACP, při redukci nebo zábraně tvorby póoperačních adhezí. Ukázky testovaných materiálů byly zhodnoceny ve srovnání s kyselinou hyaluronovou o vysoké molekulové váze a ve srovnání s komerčně dostupnými biomateriály, okysličenou regenerovanou cellulosou (TC 7 Intcrcced) používanou při zábraně tvorby adhezí v břišní, pánevní a gynekologické chirurgii.

Γ 7 ’ W-» WW «·

Φ · « * φ Φ φ · Φ·Φ > · Φ Φ Φ Φ φ Φ * ···

Byl použit model poškození krysích jater lézí a poškození krysího střeva* spáleninou,* jelikož to jsou charakteristické modely experimentálního navození adhezí. Účinky testovaných a kontrolních materiálů v prevenci pooperačních adhezí byly zhodnoceny pozorováním místa lézí pouhým okem s použitím stupňů adhezí. Byl použit model poškození krysích jater (Experiment 1) a poškození krysích střev (Experiment 2), jelikož to jsou standardizované a rcprodukovatclné modely experimentálního navožení adhezí. Po poranění byly užity biomateriály, založené na ACP, jako bariéra mezi přilehlými povrchy jatemích laloků a vnitřních orgánů.

V obou experimentech byla zhodnocena účinnost gelů ACP co do jejich schopnosti zabránit tvorbě adhezí nebojí redukovaζ ve srovnání s TC 7 Intcrceed, absorbovatclnou bariérou proti tvorbě adhezí z okysličéné regenerované cellulosy, široce používanou v klinické praxi, ve srovnám s kopofymcrickým roztokem „Thermogel“, roztokem kyseliny hyaluronové o vysoké molekulové . -eu· :^· W· . «. .· , . -W. i. .1 . - - J<- Uf*. . 4- Jfk *·., v · váze a skupinou něošetřených živočichů (formální operace).

Počáteční údaje:

Experiment 1 - Poškození krysích jater

Testované materiály:

.2

KÓD PRODUKTU	SMK 0002	SMK 0002
BĚŽNÉ JMÉNO	ACP gel	AČP gel
KOMERČNÍ JMÉNO	Hyalogcl	Hyalogel Barricr
DODAVATEL	Barricr FAB	FAB
ČÍSLO Š ARŽE	101/96	104/96
DATUM EXPIRACE	20-02-96	20-02-96
SKLADOVÁNÍ	pod30°C	pod 30 °C
PŘEDBĚŽNÁ OPATŘENÍ	žádná	žádná

5* · · φ * · · ««« • Φφφ ΦΦΦ Φφφ φφ · φ · φ φφ «·

Gely ACP byly suspendovány ve vodě na koncentraci 60 mg/ml. Testované materiály byly dodávány vysteriližované autóklávováním v 5 ml injekčních stfíkačkáčh a zacházelo se s nimi sterilně. Gely ACP byly aplikovány jako povlak na poškozený povrch jatemích laloků po zastavení krvácení Tabotampem. Každé zvíře dostalo během operace jednorázovou dávku gelu, dostačující na úplné potažení poraněného povrchu (asi 2 ml).

^J Kontrolní materiály:'

2 3

OBCHODNÍ JMÉNO	TC7 Interceed	HYAL	Theimogel
VÝROBCE/ DODAVATEL	Johnson& Johnson Patient Care, NEW Brunswick, NJ	FAB	BASF Pharma
POPIS	Bariéra z okysličené regenerované celulózy	Kyselina hyaluronová m. v. 800.000	Kyselina pluronová
ČÍSLO ŠARŽE	2710TCM	0108 st	1/95
DATUM EXSPIRACE	11-97	05-97	—
SKLADOVÁNÍ	pod30°C	pod30°C	pod8°C
PŘEDBĚŽNÁ OPATŘENÍ	v r i / zadna	V f J * zadna

Interceed byl nařezán za sterilních podmínek, byl použil samotný i nasycený Hcparincm (500

U/ml) a potom aplikován tak, aby oddělil oba přilehlé povrchy jatemích laloků ve velikosti, která překračovala hranice poraněné oblasti o několik mm. HYAL, kyselina hyaluronová o vysoké molekulové váze (rozpuštěná ve vodě na koncentraci 10 mg/ml) a Thcrmogel byly dodány ve sterilní stříkačce.

Interceěd byl aplikován přímou aplikací bez chirurgických stehů. HYAL, Kyselina hyaluronová a Theimogel byly aplikovány po zastavení krvácení na poraněný povrch injekční stříkačkou ve formě povlaku. Každé zvíře dostalo během operace jednorázovou dávku, postačující k tomu, aby poraněná oblast byla kompletně potažena nebo pokryta.

EXPERIMENTÁLNÍ NÁVRH

K tomuto pokusu byty vybrány krysy plemene Sprague Dawley o váze 275-300g. Díky zkušenostem z předchozích pokusů byla jako doba, adekvátní pro zhodnocení tvorby adhezí na těchto zvířecích modelech, vzata doba 14' dnů. Při udaném počtu zvířat, požadovaných pro tuto studii, byla zvířata připravována několik dní po sobě.

Bylo použito celkem 78 zvířat, podle následujícího schématu :

SKUPINA	OŠETŘENÍ	POČET ZVÍŘAT
Formální operace	Neóšetřéno	12
Kontroly	Samotná TC 7 hrterceed	12
Kontroly	TC7 Interceed + Heparin	6
Kontroly	HYAL	12
Kontroly	Thcrmogel·	12
Ošetřeno	rouška ACP 5% (Šarže 101/96)	12
Ošetřeno	rouška ACP 5% (šarže 104/96)	12

• ·

Příprava zvířat:

Zvířata byla uspána nitrosvalovým podáním injekce Ketaminu (Gcllini Phannaceutical) / Xylaánu (Bayér), oholena a pak dcsinfikována roztokem jódu a ethanolem. Následovala levostranná laparotomie, levý jatemí lalok byl nadzvednut a vnitřní povrch levého a středního jatemího laloku byl poraněn jemným třením dřevěným aplikátorem, dokud se neukázalo krvácení nebo serosní exsudát.

Použití materiálů;

· Wi** ·· · « ir r -· ΙφΡ ττ;> . Ifr. . ·. ·- τ X ••ni.

Po zastavení krvácení Surgicclem nebo Tabotampem byty mezi povrchy obou laloků umístěny testované materiály, tak, aby pokryly celou poškozenou oblast a mezi laloky utvořily bariéru. K sešití bylo použito dvou vrstev hedvábných stehů (3.0). Po operaci bylo 4 dny podáváno antibiotikum (Procacillina podkožně 30. 0001. U. na krysu) a analgetikum (Temgesic nitrosvalově, 0,05 mg/kg).

Stupeň adhezí:

dní po operaci byla zvířata utracena CO₂. Stupeň adhezí byl hodnocen pozorováním pouhým okem. Bylo použito následující značení stupně adhezí:

- žádná aďheze.

= slabá až strcdnč silná adhezc. Oba laloky se daly chirurgicky oddělit mechanickým tahem kleštičkami.

= Výrazná adheze, oba laloky byly na sebe zcela přilehlé, jakýkoli pokus ό jejich oddělení mel za následek poškozeni tkáně.

Vstřebatelnost materiálů byla zhodnocena vizuálním stanovením přítomnosti materiálů, navíc místo ošetření bylo fotografováno.

Po provedení tohoto pozorování byla celá játra chirurgicky odstraněna a naložena do 10% pufrovaného formalínu na 48 hodin.

— . .to·*··»· ···

Po fixaci byl pitevním nožem oddělen oď jater 2mm příčný řez/žahMující ř^oškozenotf oblást.

Takto získané vzorky byly podrobeny hístologické analýze.

Tkáňová analýza:

Histologická analýza:

Vzorky byly fixovány v neutrálním pilířovaném formalínu 10%, pak dehydratovány a zality do parafínu standardními postupy. 8 míkronový řež byl obarven Massonovým trichrómem (na průkaz , i, tkáňové zánětlivé reakce), a v případě potřeby toluidinovou modří (na průkaz přítomnosti, zbytků_x, materiálů).

EXPERIMENT 2 - POPÁLENINY KRYSÍCH STŘEV

Testované materiály:

2

KÓD PRODUKTU	SMK 0002	SMK 0002
BĚŽNÉ JMÉNO	ACP 5% vysoká m. v.	AČP 5%
KOMERČNÍ NÁZEV	Hyálogel Barrier	Hyálogel Barrier
DODAVATEL	FAB	FAB
ČÍSLO ŠARŽE	3/94	ACP 5% (šarže 101/94)
DATUM EXPIRAČE .	07/95	07/95
SKLADOVÁNÍ	pod30°C	pod 30 °C
PŘEDBĚŽNÁ OP ATŘENÍ	žádná	žádná

KVIT nv-r V VYDUIÝV mm, v, wutv VTIT nwomranwYKUj T.W wn NKivwzrawn iik on.

* >· ··**·· *«O ·

5% ACP šarže 101/94 byl suspendován na konc. 50 mg/ml. Vt^kefé testované* materiály *byíy dodány vysterilizované autoklávováním v 5 ml stříkačkách a bylo s nimi sterilně zacházeno. Gely ACP byly aplikovány jako povlak na popálený povrch poté, co bylo zastaveno krvácení Tabotámpcm. Každé zvíře dostalo v době operace jednorázovou dávku, asi 2 ml, postačující k úplnému potažení poraněného povrchu.

Kontrolní materiály:

2 3

OBCHODNÍ NÁZEV	TC 7 Interceed	HYAL	Thennogel
VÝROBCE/ DODAVATEL -W - -r- Ιφ	Johnson & Johnson PaticntCare, NEW Brunšvvick, NJ	FAB K * - · ·- · IW* fa + ·.	BAŠFPharma -*»-·, *** -t- > J
POPIS	Bariéra z okysličené regenerované celulózy	Kyselina hyaluron. mol. v. 1,200.000	Kyselina pluronová
ČÍSLO ŠARŽE	2710TCM	0108 st	1/94
DATUM EXSPIRACE	11-97	05-97	—
SKLADOVÁNÍ	pod 30 °C	pod 30 °C	pod 8 °C
PŘEDBĚŽNÁ OPATŘENÍ	za dna	žádná

Interceed byl nařezán za sterilních podmínek, byl užit samostatně i nasycený Heparinem (500 U/ml), a pak aplikován tak, aby od sebe oddělil přilehlé povrchy obou jaťcmích laloků vc velikosti, přesahující poraněnou oblast 0 několik mm. HYAL, kyselina hyaluronová o vysoké molekulové • · «V • ··· · « • ♦ « ·♦ ·* • * * 9 99 ♦ · «:···· • · · t t ·4 • · M · · váze (rozpuštěná ve vodě na konc. 10 mg/ml) á Thermogel byly dodány ve sterilních injekčních stříkačkách. Interceed byl aplikován přímo, bez chirurgického šití. Kyselina hyaluronová a Theimogel byly aplikovány na poraněný povrch ve formě povlaku po zastavení krvácení injekční stříkačkou. Každé zvíře dostalo jednorázovou dávku, dostačující na to, aby poraněný povrch byl zcela potažen nebo pokryt.

EXPERIMENTÁLNÍ NÁVRH

Pro tento pokus byly použity krysy plemene Sprague Dawley (275-300 g). Ze zkušenosti z předchozích pokusů se jako doba, adekvátní pro zhodnocení tvorby adhezí u tohoto zvířecího modelu určila doba 14 dnů. Vzhledem k počtu zvířat, nutných pro tuto studii, se zvířata připravovala postupně. Celkem bylo vzato 59 zvířat podle následujícího schématu:

Experiment 2

SKUPINA	OŠETŘENÍ	POČET ZVÍŘAT
Formální operace	neošetřcni	10
Kontrola	TC Ί Interceed	6
Kontrola	Kaselina hyaluronová mol. v. 1,200.000	12
Kontrola	Thennogel	’ 13
Ošetřeni	ACP 5% (šarže 101794)	12
Ošetřeni	AGP 5% o vysoké mol. v., Šarže 3/94	6

• · · fr fr	fr	fr. fr	fr·
• · · · * ·	•	fr ···	•	fr
• ·' · « · fr	♦	fr	·'	fr
·« ·· ··	•	frfr	♦ fr

Příprava zvířat:

Zvířata byla uspána nitrosvalovým podáním Ketaminu (Gelliní Phannacculical) / Xylazinu (Bayer), oholena a pak desinfikována roztokem jódu a ethanolem. Provedl se středový břišní řez přes kůži a svalovou tkáň, aby se zpřístupnilo střevo. Spálenina se navodila na povrchu slepého střeva elektronicky zahřívaným měděným diskem (průměr 1 cm) za standardního tlaku 15 vteřin při 158 °F (69,3 °C).

Použití materiálů:

Po zastavení krvácení Surgicelem nebo Tabolampem, byty testované a kontrolní materiály umístěny na povrch střeva bez šití, aby se pokryla celá popálená oblast a utvořila se bariéra mezi pobrišnicí a vnitřními orgány. Pobnšniční svalová vrstva byla uzavřena nepřerušovanými hedvábnými stehy 3-0, kožní vrstva byla uzavřena kožními svorkami a přerušovaným stehem 3-0. Na závěr operace se podalo antibiotikum (Procacillina podkožně 30.000 LU. na krysu) a analgetikum (Temgesic nitrosvalově 0,05 mg/kg). Oboje bylo podáváno 4 dny.

Pozorování a vyhodnocení:

Stupeň adhezí:

dní po operaci byla zvířata utracená CO₂. Stupeň adhezí byl zhodnocen pozorováním pouhým okem. Bylo použito následující stupnice adhea:

- žádná adheze = lehká adheze, avaskulámí, snadno oddělitelná = středně silná adheze, avaskulámí, souvislá lze ji oddělit ručně

- neprůhledná, vaskularizovaná, Obtížně oddělitelná za použití skalpelu

- silná, neprůhledná, vaskularizovaná, oddělitelná pouze chirurgickými nůžkami za poškození tkáně.

Vstřebatelnost materiálů byla zhodnocena vizuálně na přítomnost materiálů, navíc, místo ošetření bylo fotografováno.

i «	«	•	*	» ·	*«
• » ·	• 4	V	4	• ···	• *
* ·♦ 4	4	•	•	•	• ·
99 ··	• 4	4	• ·	44

Výsledky

Experiment 1

Jedno zvíře uhynulo během podávání anestetika, umístění biomatcriáiů bylo snadno proveditelné. Dbalo se na to, aby materiály byly přichyceny na tkáň spodního jatemího laloku. U zvířat, ošetřených ACP, nebyly pozorovány žádné známky onemocnění nebo utrpení po operaci;

Dvě Zvířata, ošetřená kyselinou hyalnronovon, uhynula dva dny po operaci. Nekroptické vyšetřeni ukázalo vnitřní krvácení.

Vyhodnocení tvorby adhezí: Bylo provedeno po 14 dnech - týkalo sé adhezí, utvořených mezi dvěma přilehlými povrchy jatemího laloku po poškození tkáně. V době pozorování byly rozpadlé všechny materiály, použité při ošetření: stupeň adhezí u zvířat, ošetřených 5% ACP (šarže 104/96) bylo výrazně nižší něž všechny kontrolní materiály a neošetřené kontroly. U 5% ACP šarže 101/96 byla redukce tvorby adhezí vyšší, než u TC 7 Interceedu nasyceného heparinem, ale nebyly zaznamenány žádné statistické rozdíly; nicméně oba typy ošetření vykazovaly výrazné rozdíly (p = méně než 0,05) ve srovnání s kontrolami a neléčenými.

Histomorfoíogická pozorování: 14 dní po operaci bylo mikroskopií zjištěno, že materiály pro ošetření, vyrobené z ACP, jsou vysoce biokompatibilní, a byla pozorovatelná pouze velmi slabá zánětlivá reakce. Ze zánětlivých buněk bylo přítomno pouze několik neutrofilů a obrovských buněk. Nebylá zaznamenána žádná migrace těchto buněk nebo jejich průnik do míst mezi oběma laloky. TC 7 Interceeď vykazoval v mnoha případech tkáňovou reakci, pokud, byly jatemí laloky částečně srostlé; rámcové pozorování odhalilo přítomnost organizovaných kolagenových vláken. Zdá še, že zánětlivá reakce ustupuje, pokud je pomůcka pro ošetření nasycena héparinovým roztokem. Na většině nálezů bylo^; znát, že biomatcriály sc zcela odbouraly. Skupina bčz ošetření vykazovala střední áž silnou zánětlivóu reakci.

Experiment 2

Celkem 2 zvířata uhynula během podávání anestetika. Umt^pti^blomal^nálp býlo*’árBadňo proveditelné, a po umístění se materiály nehýbaly. U zvířat, ošetřených ACP, nebyly pozorovány známky nemoci nebo utrpení po operaci.

Čtyři zvířata, ošetřená kyselinou hyaluronovou o mol. v. 1,200.000, a tři zvířata s Thermogelem uhynula mezi dvěma a pěti dny po operaci. Nekroptické vyšetření ukázalo u všech těchto zvířat vnitřní krvácení.

Zhodnocení tvorby adhezí:

V-tomto pokusu, 14 dní po operaci, (Diagram 10), 5% gely ACP 101/94 a 3/94 vykázaly redukci pooperační tvorby adhezí ve srovnání s kyselinou hyaluronovou mol v. 1,200.000 a s ncléČenými ‘ kontrolami. Účinek gelů ACP by)'srovnatelný s“účinkem bariéry z Intcrcccdu, nasycené heparinem. Byly zjištěny statistické rozdíly mezi těmito skupinami a skupinami bez ošetření (p = méně než 0,05). Všechny pomůcky pro ošetření a kontrolu byly zcela absorbovány.

Histomorfologická pozorování:

Při rámcovém pozorování za 14 dní tkáně, ošetřené ACP vykazovaly jen slabou tkáňovou zánětlivou reakci, síla granulované tkáně byla jen velmi malá a nebyly zaznamenány žádné nepříznivé reakce na střevě v případě srůstu s přilehlým pcritoncálním povrchem. Začaly se organizovat kolagenové fibrily a proces hojení byl dokončen. V případě kyseliny hyaluroňové byla pozorována záněllivá reakce s přítomností značného počtu kolágenovýh vláken, což je známkou adheze; bylo vidět silnou granulovanou tkáň. Totéž bylo vidět u neošetřených kontrol.

Diskuse

Tvorba adhezí patří mezi hlavní příčiny pooperační nemocnosti v břišní a pánevní chirurgii, Často vedoucí k ucpání tenkého střeva a k jiným závazným patologickým komplikacím. Jsou - li postiženy pánevní orgány, srůsty jsou schopny narušit fyziologické funkce, což má za následek neplodnost. Mechanismus pooperační tvorby adhezí a jejich znovuvytvářem není ještě dobře probádán. Experimentální svědectví naznačují, že tvorba adhezí mezi dvěma chiiurgičky poraněnými povrchy je přirozenou opozicí během procesu hojení, protože je mnohem účinnější spojovacích srůstů mezi dvěma přilehlými povrchy.

V tomto screeningu bylo zjištěno, že použití běžného prostředku k zastavení krvácení, Surgicelu, po operaci, a úspěšné umístění biodcgradabilní bariéry z derivátu kyseliny hyaluronové zabraňuje tvorbě adhezí. Navíc mohou materiály být použity ve spojení s fibiinolytiky. Redukce tvorby adhezí ve srovnání s oxidizovanou regenerovanou cellulosou TC 7 dopadla příznivě.

Biomateriály založené na HYAFF 11 prokázaly dobrou biokompatibilitu a malou tvorbu zánětů. Stupeň rozpadu testovaných biomateriálů z FAB byl odlišný, což je v důsledku rozdílné fyzické formy ošetření: biomateriály HYAFF 11 přetrvávaly několik týdnů. Rozsah kontrolovaných stupňů rozpadu, jichž může být dosaženo při použití těchto derivátů kyseliny hyaluronové, může být užitečně využit pro prevenci adhezí po operacích na odlišných anatomických místech aplikace, _d např. xgynekologii nebo v břišně - pánevní chirurgii. Výsledky naznačují, že deriváty kyseliny hyaluronové (gáza a membrány z HYAFF 11) mají svou úlohu v prevenci tvorby adhezí po operacích.

Tak, jak byl tento vynález popsán, bude zjevné, že totéž může být mnoha různými způsoby obměněno. Takovéto variace nebudou brány jako něco,, co se odchyluje od ducha a cíle vynálezu, a myslí se na to, že všechny takovéto modifikace, jak by byty zřejmé odborníkovi, znalému stavu techniky, budou zahrnuty do rámce následujících patentových nároků.

Claims (28)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Složený biomateriál pro prevenci pooperačních adhezí tkání obsahující nejméně jeden derivát kyseliny hyaluronové vybraný ze skupiny, sestávající z:

   a) benzylesteru kyseliny hyaluronové kde 75 až 100 % karboxylových skupin kyseliny hyaluronové je esterifikováno benzylovým radikálem a až 25 % karboxylových skupin je esterifikováno alkylovým radikálem alifatického alkoholu Cio-a», pod podmínkou, že je esterifikováno nejméně 80 % karboxylových skupin a

   b) autozesítěného derivátu kyseliny hyaluronové kde 0,5 až 20 % karboxylových skupin kyseliny hyaluronové je zesítěno hydroxylovými skupinami téže nebo jiné molekuly kyseliny hyaluronové.
2. 2. Složený biomateriál podle nároku 1, kde řečený derivát je úplný benzylester v němž jsou všechny karboxylové skupiny kyseliny hyaluronové esterifikovány benzylovou skupinou.
3. 3. Složený biomateriál podle nároku 1, kde řečený derivát je benzylester kde 80 % karboxylových skupin je esterifikováno benzylovou skupinou.
4. 4. Složený materiál podle nároku 1, kde řečený derivát je benzylester kde 75 % karboxylových skupin je esterifikováno benzylovou skupinou a zbylých 25 % karboxylových skupin je ésterifikováno alifatickým zbytkem alifatického alkoholu C] Q.20-
5. 5. Složený materiál podle nároku 4, kde řečený alkohol je stearyl alkohol nebo palmytický alkohol.
6. 6. Složený materiál podle nároku 1, kde řečený autozesítěný derivát má zešíleno 4,5 áž 5,0 % karboxylových skupin molekuly kyseliny hyaluronové.
7. 7. Složený materiál podle jakéhokoliv z nároků 1 až 6, který dále obsahuje nebiodegradabilní syntetický polymer.

   • · *
8. 8. Složený materiál podle nároku 7, kde řečený syntetický polymer patří do skupiny sestávající z polypropylenu, polyethylenu, polyesteru a polytetrafluoro ethylenu a z této skupiny je vybrán.
9. 9. Složený materiál podle jakéhokoliv z nároků 1 až 8 ve formě membrány, síťky, tkaniny a netkané látky.
10. 10. Složený biomateriál podle nároku 1 nebo 6 ve formě gelu.

    RH-Z A„WR II . . r* ι Λ·. . -ΤΓΤ.
11. 11. Použití biomateriálu pro prevenci pooperačních adhezí tkání, kde řečený biomateriál obsahuje nejméně jeden derivát kyseliny hyaluronové, vybraný ze skupiny, sestávající z:

    a) benzylesteru kyseliny hyaluronové kde 75 až 100 % karboxylových skupin kyseliny hyaluronové je esterifikováno benzylovým radikálem a až 25 % karboxylových skupin je esterifikováno alkylovým radikálem alifatického alkoholu Cu^o, pod podmínkou, Že nejméně 80 % karboxylových skupin je esterifikováno a

    b) autozesítěného derivátu kyseliny hyaluronové kde 0,5 až 20 % karboxylových skupin ►

    kyseliny hyaluronové je zesíteno hydroxylovými skupinami téže nebo jiné molekuly kyseliny hyaluronové.
12. 12. Použití podle nároku 11, kde řečený derivát je úplný benzylester v němž jsou všechny karboxylová skupiny kyseliny hyaluronové esterifikovány benzylovou skupinou.
13. 13. Použití podle nároku 11, kde řečený derivát je běnzýlester kde 80 % karboxylových skupin je esterifikováno benzylovou skupinou.
14. 14. Použití podle nároku 11, kde řečený derivát je benzylester kde 75 % karboxylových skupin je esterifikováno benzylovou skupinou a zbývajících 25 % karboxylových Skupin je esterifikováno alifatickým zbytkem alifatického alkoholu C1O-2D- * φ φ · · • φ φ φφ • φ Φ·φ φ · • φφφ • ·· Φ ·
15. 15. Použití podle nároku 14, kde řečený alkohol je stearylalkohol nebo palmýtický alkohol.
16. 16. Použití podle nároku 11, kde řečený autozesítČný derivát má zesítěno 4,5 až 5,0 % karboxylových skupin molekuly kyseliny hyaluronové.
17. 17. Použití pódle jakéhokoliv z nároků 11 až 16, který dále obsahuje nebiodegradabilní syntetický polymer.

    ' « ,_r μ. Jt* _Λ A, ” V ··»!?. jaw
18. 18. Použití podle nároku 17, kde řečený syntetický polymer patří do skupiny sestávající z polypropylenu, polyetylénu, polyesteru a polytetrafluoroethylenu a z této skupiny je vybrán.
19. 19. Použití podle jakéhokoliv z nároků 11 až 18, kde řečený biomateriál je vc formě membrány, síťky, tkaniny nebo netkané látky.

    I
20. 20. Způsob prevence poopcračních srůstů tkání vyznačující sc tím, žc se na tkáň zahrnutou do operace aplikuje biomateriál obsahující nejméně jeden derivát kyseliny hyaluronové ze skupiny sestávající z:

    a) benzylesteru kyseliny hyaluronové kde 75 až 100 % karboxylových skupin kyseliny hyaluronové je esterifikováno benzylovým radikálem, a až 25 % karboxylových skupin je esterifikováno alkylovým radikálem alifatického alkoholu pod podmínkou, že nejméně 80 % karboxylových skupin je esterifikováno a

    b) autozěsítěného derivátu kyseliny hyaluronové, kde 0,5 až 20 % karboxylových skupin kyseliny hyaluronové je zesítěno hydroxylóvými skupinami ťéže nebo jiné molekuly kyseliny hyaluronové.
21. 21. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, žc řečený derivát je úplný benzyl ester kde jsou všechny karboxylové skupiny kyseliny hyaluronové esteriíikovány benzylovou skupinou.

    ··»··**··· ··· ··· ··.· • · · » » · . * _Βφφ _B a *··* *· * * »* * «··
22. 22. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že řečený derivát je benzyl ester kde 80 % karboxylových skupin je esterifikováno berrzylovou skupinou.
23. 23. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že řečený derivát je benzyl ester kde 75 % karboxylových skupin je esterifikováno benzylovou skupinou a zbývajících 25 % karboxylových skupin je eesterifikováno alifatickým zbytkem alifatického alkoholu C10.20.
24. 24. Způsob podle nároku 23, vyznačující sé tím, žc řečený alkohol je stearylalkohoí nebo palmytický alkohol.

    1 ,K* .u J - .L , ,ψ. ; . .. ,,, .
25. 25. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, žc řečený autozesítěný derivát má zesíleno 4,5 až

    5 % karboxylových skupin molekuty kyseliny hyáluronové.
26. 26. Způsob podle nároků 20 až 25, vyznačující se tím, že dále obsahuje nebiodegradabilní syntetický polymer.
27. 27. Způsob podle nároku 26, vyznačující sc tím, že řečený syntetický polymer patří do skupiny, sestávající z polypropylenu, polyethylenu, polyesteru a polytetrafiuoroethylcnu a z této skupiny je vybrán.
28. 28. Způsob podle nároků 20 až 27, vyznačující se tím, že řečený biomateriál je ve formě membrány, Síťky, tkaniny a netkané laiky.