NO176103B - Analogifremgangsmåte for fremstilling av mitomycinfosfatderivat - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en analogifremgangsmåte for fremstilling av mitomycin N<7->alkylfosfatderivater.

Mitomyciner og porfiromycin er en gruppe nært beslektet antitumor-antibiotika. Mitomycin C (la) selges for tiden i USA under navnet "Mutamycin" til terapi ved disseminert adenokarsinoma i mage eller pankreas i utprøvde kombinasjoner med andre godkjente kjemoterapeutiske midler. Strukturen av mitomycin C og A (lb), porfiromycin (lc) og N<la->metyl-mitomycin A (ld) er vist nedenfor med nummerering av molekyl-ene i ringdelen.

I det foreliggende henviser N<7-> til det nitrogenatom som er knyttet til 7-posisjonen, og N^<a-> henviser til aziridinnitrogenatomet. Den delen som er omsluttet av den stiplede linjen blir innenfor fagområdet kalt mitosan.

Et stort antall mitomycinanaloger er blitt fremstilt i den hensikt å tilveiebringe en forbindelse med gunstigere terapeutiske egenskaper, såsom høyere antitumoraktivitet og/eller forbindelser som er mindre myelosuppressive enn mitomycin C. Blant litteraturreferanser og patentskrifter som omhandler mitomycinderivater, betraktes de følgende som relevante i forbindelse med den foreliggende oppfinnelse.

Iyengar et al. beskriver forbindelser Ila - lic i J. Med. Chem., 1981, 24:975-981 og J. Med. Chem., 1983, 26:16-20. I US-patentskrift nr. 4 642 352 beskrives mitomycinderivater med formel III

der

R 1 er valgt blant H, C^.^-alkyl og R7, og

R<7> bl.a. er (R<b>0)2P(X)- og (R<a>)2P(X)-, hvor Ra f.eks. er H, alkyl, cykloalkyl eller aryl, og R<b> f.eks. er alkyl, aryl eller aralkyl.

Forbindelsene som fremstilles ifølge foreliggende oppfinnelse er fosfatderivater av forbindelser med formel II, og de utviser god antitumoraktivitet og lavere toksisitet i forhold til den opprinnelige hydroksyforbindelsen. Konseptet med fosfater som potensielle pro-legemidler er kort beskrevet i tidsskriftartikkelen med tittelen "Rational for Design of Biologically Reversible Drug Derivativest Prodrugs" (Sinkula og Yalkowsky, J. Pharm. Sei., 1975, 64:181-210 ved 189-191). Eksempler på fosfater av kjente antitumormidler omfatter camptothecin (Japan Kokai 21-95, 394 og 21-95, 393, Derwent Abst. nr. 87-281016 hhv. 87-281015) og daunorubicin (US-patentskrift nr. 4 185 111).

Ifølge den foreliggende oppfinnelse tilveiebringes det en analogifremgangsmåte for fremstilling av forbindelser med formel IV

der

X og Y uavhengig er oksygen eller svovel,

alk er en uforgrenet eller forgrenet karbonkjede med 2-8 karbonatomer, og

R<1> er H eller metyl,

eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

Farmasøytisk akseptable salter omfatter, men er ikke be-grenset til, alkalimetallsalter, jordalkalimetallsalter samt organiske nitrogenholdige basesalter.

Ifølge en foretrukket utførelsesform tilveiebringes forbindelser med formel IV, hvor Y er oksygen. Ifølge en annen foretrukket utførelsesform tilveiebringes forbindelser med formel IV, hvor alk er (CH2)2 eller (CH2)3. Ifølge en ytterligere foretrukket utførelsesform tilveiebringes forbindelser med formel IV, hvor RI er H. Fig. 1 viser virkningen av forbindelse V og Ila på veksten av H2981-tumorer i nakne mus. Pilene angir dagene da legemidler administreres. Fig. 2 viser toksisitet for av mitomycin C, forbindelse Ila og V samt forbindelse V etter forutgående behandling med alkalisk fosfatase.

Forbindelsene som fremstilles ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilles fra mitomycin A (Ib) eller N<la->metyl-mitomycin A (Id) ved omsetning med et aminoalkylfosfat med formelen (HO)2P(X)-Y-alk-NH2, hvor alk har den ovenfor angitte betydning. Reaksjonen utføres vanligvis i et egnet oppløs-ningsmiddel, som metanol eller en blanding av oppløsnings-midler, som vann og metanol ved omgivelsestemperatur. En tertiær aminbase, såsom trietylamin, kan anvendes i reak-sjonsblandlngen. Produktet kan omdannes til et salt ved behandling med en base, idet f.eks. behandling med natriumbikarbonat tilveiebringer dinatriumsaltet av mitomycin N<7->alkylfosfater med formel IV. 2-aminoetyl-dihydrogenfosfat er et kommersielt tilgjengelig produkt og fremgangsmåter til fremstilling av andre aminoalkylfosfater eller aminoalkyltio-fosfater er beskrevet i f.eks. Heiv. Chim. Act., 1956:39:-1455, Heiv. Chim. Acta, 1958, 44:1168, Acta Chim. Scand., 1959, 13:1479 samt US-patentskrift nr. 3 501 557.

Forbindelsene som fremstilles ifølge foreliggende oppfinnelse kan alternativt fremstilles ved behandling av mitomycin A eller det N<la->metylerte derivat derav, med en aminoalkanol eller aminoalkyltiol til tilveiebringelse av N<7->hydroksy-alkyl- eller N<7->tioalkyl-mitomycin-C-mellomprodukter, som deretter fosforyleres under anvendelse av kjente, konven-sjonelle teknikker innenfor fagområdet. Denne reaksjonsvei er imidlertid ikke egnet til fremstilling av fosfatderivater av N<7->merkaptoetyl-mitomycin C, fordi den ikke er en stabil forbindelse (Senter et al., 1988, J. Antibiotics, 41:199-201). Når mitomycin A anvendes som utgangsmateriale, er det ønskelig å beskytte nitrogenatomet i aziridinringen før fosforyleringsreaksjonen. Beskyttelse kan oppnås ved kjente metoder, såsom acylering, dannelse av urea- eller uretan-derivater eller lignende. Fremgangsmåter til blokkering og avblokkering av en amin er beskrevet i litteraturen, såsom "Protective Groups in Organic Chemistry", J.F.W. McOmie, Ed., Plenum Press, 1973. Fosforylering eller tiofosforylering utføres typisk ved behandling av et N<7->hydroksyalkyl- eller N<7->tioalkyl-mitomycinderivat med fosforyl- eller tiofosforyl-klorid etterfulgt av hydrolyse og, om nødvendig ved beskyttelse av aziridinnitrogenatomet, og hvis hydrolysen er utført i nærvær av en base, oppnås et salt. N<7->hydroksyalkyl- eller N<7->tioalkylmitomycinderivatene kan alternativt omsettes med en forbindelse med formelen (G-0)gP(X)-L, hvor G er en fosfatbeskyttende gruppe, og L er en avspaltende gruppe, f.eks. Cl, idet fjerning av den fosfatbeskyttende gruppen og den nitrogenbeskyttende gruppen, hvis den er tilstede, tilveiebringer forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse.

Antitumoraktivitet av forbindelsen i eksempel I (V) ble vurdert i Balb C nu/nu hunn-mus (4-6 uker gamle, levert fra Life Sciences, St. Petersburg, Fl) implantert subkutant med et xenotransplantat av human lungetumor H2981 i høyre bakside. Forbindelse IIA fungerte som positiv kontroll. Legemiddelbehandling startet på dag 15 (dag 0 er dagen for tumorimplantering), da tumorene hadde et volum på ca. 100 mm<3>. 0,2 ml av forsøksforbindelsene (1 mg/ml Ila og 3 mg/ml V i fosfatbufferinnstilt saltvann) injiseres intraperitonealt på dag 15, 21, 31 og 37. Resultatene er angitt grafisk i fig.

1 og indikerer at den tiden som var nødvendig for å oppnå et gjennomsnittlig tumorvolum på 750 mm<3>, var 45 dager for mus behandlet med Ila, 63 dager for mus behandlet med V, og 27 dager for den ubehandlede kontrollgruppe. Den fosforylerte forbindelse viste således kraftigere antitumorvirkning enn den tilsvarende alkohol.

Den relative toksisitet av Ila og V bestemmes i Balb C nu/nu mus. Ved intraperitoneal administrering av legemidlene i to like store doser med 4 dagers mellomrom, ble det oppnådd LD5g-verdier på hhv 45 og 90 mg/kg kroppsvekt for forbindelsene Ila og V. Det har også vist seg, at en betydelig større mengde legemiddel kan administreres under anvendelse av mindre doser over et lengre tidsrom. Samlede mengder på opp til 40 mg/kg Ila og 100 mg/kg V kan tolereres, hvis de administreres i 4 like store doser i løpet av 25 dager. Disse undersøkelser antyder at signifikant mer pro-legemiddel ble tolerert på grunn av den reduserende toksisitet.

Toksisitet til forbindelsene V, Ila og mitomycin C ble bestemt ved å anvende human lungetumor-cellelinje H2981. En suspensjon av H2981-celler i Iscove's medium (IMDM) inne-holdende 10 % føtalt kalveserum ble anbrakt på mikrotiter-plater med 96 brønner (10 000 celler/brønn). Etter 1 time ble mediet fjernet, en fosfatbufferinnstilt saltvannsoppløsning (PBS), pH 7,2 med legemiddelet ble tilsatt og inkuberingen ved 37°C fortsatte i 1 time. Deretter ble cellene vasket to ganger og inkubasjonen fortsatte i ytterligere 17 timer etterfulgt av 6 timers radioisotopbehandling med <3>H-Thy (1,0 pCi/brønn). Platene ble nedfrosset ved -70°C for å frigjøre cellene, og cellene ble høstet på glassfiberskiver. Filtrene ble talt på en "Beckman 3701" scintillasjonsteller. In-hibering av <3>H-Thy-inkorporering ble anvendt som indikator for toksiske virkninger. Resultatene er vist i fig. 2. Både mitomycin C og Ila var sterkt toksiske og hadde ICsg-verdier nær 1 jjM. En liten grad av toksisk aktivitet kunne observeres for fosfat V, men for behandling av V med alkalisk fosfatase •resulterte i toksisitet som kunne sammenlignes med toksi-siteten av Ila og mitomycin C.

Det følgende eksempel belyser foreliggende oppfinnelse nærmere.

Eksempel 1

9a- metoksy- 7- rrfosf on o ok sy ) etyl1 aminolmitosan- dinatriumsalt 1X1

En oppløsning av 2-aminoetyldihydrogenfosfat (56 mg, 0,4 mmol) i vann (0,35 ml) og trietylamin (0,3 ml, 2 mmol) ble tilsatt mitomycin A (140 mg, 0,4 mmol) i metanol (6 ml). Reaksjonen ble gjennomført ved romtemperatur natten over, 1,4 ml mettet, vandig natriumbikarbonat ble tilsatt og opp-løsningen ble delt mellom vann og metylenklorid. Den vandige fase ble konsentrert til tørrhet, og flere porsjoner metanol ble tilsatt og inndampet. Resten ble tatt opp i metanol, filtrert og overført til en 2 x 10 cm C-18 (reversfase) silikagelkplonne. Produktet ble eluert med vann, og alt flyktig materiale ble inndampet. Metanol ble tilsatt og inndampet som ovenfor, og resten ble tørket i 24 timer under høyvakuum i en eksikkator med fosforpentoksid. Tittel-forbindelsen ble oppnådd som et fint, blått pulver (190 mg, 97 %).

360 MHz <1>H-NMR (D20) §: 1,94 (s, 3H, CH3), 2,9-3,1 (m, 4H), 3,20 (s, 3H, 0CH3), 3,28 (s, 1H), 3,36 (s, 1H), 3,5-3,65 (m, 4H), 4,1-4,25 (m, 2H), 4,50-4,57 (dd, 1H, 10-H).

Massespektrum M<+> 503.0912 (beregnet for C17H2.1N409PNa2 503.0920 ) .

Claims (1)

1. Analogifremgangsmåte til fremstilling av et terapeutisk virksomt mitomycin N<7->alkylfosfatderivat med den generelle formel (IV) der X og Y hver er oksygen eller svovel, alk er en uforgrenet eller forgrenet karbonkjede med 2-8 karbonatomer, ogR<1> er H eller metyl, eller er et farmasøytisk akseptabelt salt derav,karakterisert ved at man omsetter mitomycin A eller N<la->metylderivatet derav, eventuelt i nærvær av en tertiær aminbase med et aminoalkylfosfat med formel der X, Y og alk har den ovenfor angitte betydning.