DK145001B - Fremgangsmaade til fremstilling af derivater af vinca-alkaloider - Google Patents

Description

(19) DANMARK CiV

m) (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT (id 145001 B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 5^10/77 (51) Int.CI.3 C 07 D 619/04 (22) Indleveringsdag 5 · dec. 1 977 (24) Løbedag 5· dec. 1977 (41) Aim. tilgængelig 7. Jun. 1978 (44) Fremlagt 26. jul. 1982 (86) International ansøgning nr. - (86) International indleveringsdag (85) Videreføreisesdag - (62) Stamansøgning nr. -

(30) Prioritet 6. dec. 1976, 7^7575, US

(71) Ansøger ELI LILLY AND COMPANY, Indianapolis, US.

(72) Opfinder Jean Corinne Miller, US: Gerald Edward GutowBki, US.

(74) Fuldmægtig Ingeniørfirmaet Hofman-Bang & Bout ard.

(54) Fremgangsmåde til fremstilling af derivater af vinca-alkaloider.

Den foreliggende opfindelse angår en særlig fremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte derivater af vinca-alkaloider med den i krav l’s indledning anførte formel III, og fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav l’s kendetegnende del anførte. De omhandlede forbindelser er terapeutisk anvendelige q som anti-tumor midler, og desuden anvendelige som syntesemellem- r- produkter.

D

D

D Adskillige naturligt forekommende alkaloider udvundne af Vinca rosea er konstateret virksomme i behandlingen af eksperimentelt fremkaldte maligne tilstande hos dyr. Blandt disse er leurosin ^ (U.S.A. patentskrift nr. 3 370 057), vincaleukoblastin (vinblastin), 2 145001 som herefter vil blive betegnet med forkortelsen VLB (U.S.A. patentskrift nr. 3 097 137), leuroformin (Belgisk patentskrift nr. 811 110), leurosidin (vinrosidin) og leurocristin (vineristin) (begge i U.S.A. patentskrift nr. 3 205 220); deoxy-VLB "A" og "B", Tetrahedron Letters, 783 (1958); 4-desacetoxyvinblastin (U.S.A. patentskrift nr. 3,954 773); 4-desacetoxy-3'-hydroxyvinblastin (U.S.A. patentskrift nr. 3 944 554); leurocolombin (U.S.A. patentskrift nr. 3 890 325) og vincadiolin (U.S.A. patentskrift nr. 3 887 565)· To af disse alkaloider, VLB og vineristin, bliver nu markedsført som medikament til behandling af maligne tilstande, specielt leukæmier og beslægtede sygdomme hos mennesker. Vineristin er det mest aktive og nyttige af de to medikamenter ved behandling af leukæmi, men er samtidig det mindst udbredte af de nævnte anti-neoplasma Vinca roseaalkaloider.

Disse alkaloider indgives normalt intravenøst.

Kemisk modifikation af Vinca-alkaloideme er kun lykkedes i begrænset omfang. For det første er de pågældende molekylstrukturer yderst komplicerede, og kemiske reaktioner, som berører en specifik, funktionel gruppe i molekylet uden at omdanne andre grupper, er vanskelige at udforme. For det andet har man udvundet eller produceret alkaloider uden ønskelig kemoterapeutisk effekt ud fra Vinca rosea-fraktioner eller -alkaloider, og fastlæggelsen af disses strukturformler har ført til den slutning, at disse forbindelser er nært beslægtede med de aktive alkaloider. Anti-neoplasma effekt synes at være begrænset til helt specielle strukturformler, og mulighederne for at opnå mere effektive medikamenter ved at modificere disse strukturer synes at være beskedne. Blandt de mere heldige modifikationer af fysiologisk aktive alkaloider har været fremstillingen af dihydro-VLB (U.S.A. patent skrift nr. 3 352 868) og udskiftningen af acetylgruppen ved C-4 (carbonatom nr. 4 i vincaalkaloid-ringsy-stemet, se den nummererede strukturformel i indledningen til krav 1) med en højere alkanoylgruppe eller med ikke-beslægtede acylgrupper-.

(Se U.S.A. patentskrift nr. 3 392 173). Adskillige af disse derivater er i stand til at forlænge levetiden for mus indpodet med P 1534 leukæmi. Et af derivaterne, i hvilket en chloracetylgruppe erstatter acetylgruppen ved C-4 atomet i VLB, var ligeledes anvendeligt som mellemprodukt ved fremstillingen af strukturelt modificerede VLB-forbindelser, i hvilke en Ν,Ν-dialkylglycylgruppe erstatter acetyl 3 145001 gruppen ved C-4 atomet i VLB (se U.S.A. patentskrift nr. 3 387 001). C-3 carboxamid-derivater af VLB, vineristin, vincadiolin m.fl, er ligeledes blevet fremstillet og har vist sig at være effektive antitumor-medikamenter (Belgisk patentskrift nr. 813 168). Disse forbindelser er særdeles interessante, fordi f.eks. 3-carboXamiderne af VLB er mere effektive over for Ridgeways osteogeniske sarcom og Gardners lymphosarkom end VLB, hvoraf de er derivater. Visse af amidderivaterne nærmer sig faktisk vineristin i effektivitet overfor disse tumorer. Et af disse amider, 4-desacetyl-VLB-C-3 carboxamid (også kaldet vindesin) er for tiden under klinisk afprøvning på mennesker og er blevet fundet aktivt over for visse leukæmier. Anvendt på mennesker synes vindesin at være mindre neurotoxisk end vineristin.

Det har nu overraskende vist sig, at de ved omsætning af vincaalka-loidderivater med formlen II i krav 1 med isocyanater med formlen RNCO dannede 3-carbamater er relativt ustabile ved normale reaktionstemperaturer, såsom 30-110°C, og omlejrer til spirooxazolidin-dioneme med formel III. Stabiliteten af 3-carbamatgruppen afhænger i høj grad af arten af R-substituenten ved carbamatnitrogenatomet.

Når eksempelvis R er β-chlorethyl, kan man isolere 3-carbamat-mellemproduktet, dannet ved reaktion mellem et overskud af isocyanat og det dimere alkaloid med formel II i krav 1*s kendetegnende del, ved chromatografering, hvorefter mellemproduktet kan omarrangeres til en spirooxazolidin-dion ved opvarmning. 3-Carbamater dannet med methylisocyanat omarrangeres til spirooxazolidin-dionen ved standard-reaktionen, men i de fleste tilfælde kan man isolere 3-carbamaterne kort tid efter, at isocyanatet er blevet tilsat. Længere tids opvarmning er unødvendig. Det isolerede 3-carbamat-mellemprodukt omlejres til en spirooxazolidin-dion ved opvarmning til 30-110°C i adskillige timer. De dannede vincaalkaloid-derivater med formlen III har antitumor-aktivitet, overraskende også veh peroral indgivelse.

Forbindelserne med den i krav l’s indledning anførte formel III kan 7 2 generisk beskrives som derivater af VLB, når R er acetoxy, R er 3 4 methyl, R^ er hydroxyl, og R er ethyl; som derivater af vineristin, 7 2 3 4 når R er acetoxy, R er formyl, R er hydroxyl og R er ethyl; som derivater af desmethyl-VLB (også kendt under navnet desformyl- vineristin), når R^ er acetoxy, R2 er hydrogen, og R3 og R^ er henholdsvis hydroxyl og ethyl, som derivater af leurosidin, når 4 145001 R7 er acetoxy, R2 er methyl, R3 er ethyl, og R4 er hydroxyl, som 7 2 ^

derivater af Deoxy-VLB "A", når R' er acetoxy, R er methyl, R

er H og R4 er ethyl, og som derivater af Deoxy-VLB "B", når R7 ? 3 4

og R er de samme som i Deoxy-VLB "A", men hvor R er ethyl og R

er hydrogen. De her omhandlede forbindelser er blevet betegnet som 3-spiro-5"-oxazolidin-dion-derivater af de specifikke alkaloider, der

er nævnt ovenfor. For eksempel vil en oxazolidin-dion afledt af VLB

blive betegnet som 3-descarbomethoxy-3-deshydroxy-VLB-3-spiro-5H- oxazolidin-2”,4"-dion. I henhold til denne betegnelse dannes der en spiro-forbindelse, i hvilken spiro-carbonatomet er carbonatom nr. 3 i vincaalkaloidringsystsnet og carbonatom nr. 5" i oxazolidindion-ring-systemet. Ved den systematiske nomenklatur for de omhandlede forbindelser har man anvendt udtrykket " 3-de scarbomethoxy- 3-de shydroxy" for at angive, at carbomethoxygruppen og hydroxygruppen i position 3 er blevet erstattet af (eller inkorporeret i) oxazolidinringen. For at simplificere betegnelserne for de omhandlede forbindelser vil imidlertid udtrykket "3-descarbomethoxy-3-deshydroxy" blive udeladt, eftersom tilstedeværelsen af oxazolidinringen i hver enkelt forbindelse skal forstås således, at ringen har erstattet hydroxy- og carbo-methoxygrupperne ved carbonatom nr. 3 i vincaalkaloidet. Det forstås således, at enhver betegnelse for en oxazolidin-dion i det efterfølgende implicit vil rumme betegnelsen ,,3-descarbomethoxy-3-deshydroxy,,.

Ikke-toxiske syrer anvendelige til fremstilling af farmaceutisk acceptable syreadditionssalte af de omhandlede forbindelser omfatter salte afledt af uorganiske syrer, såsom saltsyre, salpetersyre, phosphor syre, svovlsyre, hydrogenbromidsyre, hydrogeniodidsyre, salpetersyrling eller phosphorsyrling, såvel som salte af ikke-toxiske organiske syrer omfattende alifatiske mono- og dicarboxylsyrer, phe-nyl-substituerede alkanoater, hydroxyålkanoater og alkandioater, aromatiske syrer, alifatiske og aromatiske sulfonsyrer etc. Sådanne farmaceutisk acceptable salte omfatter således sulfat, pyrosulfat, bisulfat, sulfit, bisulfit, nitrat, phosphat, monohydrogenphosphat, dihydrogenphosphat, metaphosphat, pyrophosphat, chlorid, bromid, iodid, acetat, propionat, decanoat, caprylat, acrylat, formiat, iso-butyrat, caprat, heptanoat, propiolat, oxalat, malonat, succinat, suberat, sebacat, fumarat, maleat, butyn-l,4-dioat, hexyn-l,6-dioat, benzoat, chlorbenzoat, methylbenzoat, dinitrobenzoat, hydroxybenzoat, methoxybenzoat, phthalat, terephthalat, benzensulfonat, toluensulfo-nat, chlorbenzensulfonat, xylensulfonat, phenylacetat, phenylpropio- 5 U5001 nat, phenylbutyrat, citrat, lactat, 2-hydroxy-butyrat, glycolat, malat, tartrat, methansulfonat, propansulfonat, naphthalen-l-sul-fonat, naphthalen-2-sulfonat og lignende salte.

En anden type mellemprodukt isoleres hyppigt fra reaktionen mellem et isocyanat og et dimert indol-dihydroindol-alkaloid repræsenteret ved formel IIi specielt når der anvendes overskud af isocyanat, og opløsningsmidlet er benzen. Dette mellemprodukt er et vandopløseligt bundfald og omfatter en kompleksforbindelse af vinca-alkaloidet og - formentlig - mere end eet molekyle isocyanat per molekyle alkaloid. Hvis f.eks. et overskud af β-chlorethylisocyanat omsættes med VLB, danner det resulterende vandopløselige kompléks et bundfald, der isoleres ved filtrering.

En vandig opløsning af det frafiltrerede kompleks danner 3"-( -chlor-ethyl)spirooxazolidin-dionen efter henstand ved stuetemperatur i 16 timer. Andre isocyanater opfører sig på lignende måde sammen med VLB og andre dimere vinca-alkaloider, men kun visse af de dannede komplekser (tilsyneladende betinget af arten af R-gruppen i isocya-natet, RNCO) lader sig isolere ved almindelige reaktionstemperaturer.

Ved gennemførelsen af det oven for beskrevne reaktionsforløb uden at isolere carbamatmellemproduktet opløses vinca-alkaloidet (II) på den frie baseform i et inert organisk opløsningsmiddel såsom benzen, og det ønskede isocyanat (RNCO) sættes til opløsningen, sædvanligvis i overskud. Reaktionsblandingen koges under tilbagesvaling, indtil oxazolidin-diondannelsen i det store og hele er fuldstændig, og nedkøles derpå. Fjernelse af opløsningsmidlet og overskuddet af isocyanat ved inddampning fører til oxazolidin-dionen som er inddamp-ningsrest, som så kan renses yderligere, f.eks. ved chromatografering. Andre inerte opløsningsmidler, som kan anvendes i den oven for beskrevne reaktion, er methylenchlorid, chloroform, toluen og lignende.

Dersom man anvender et 4-desacetyl-alkaloid, såsom 4-desacetyl-VLB eller 4-desacetyl-vincristin, som udgangsmateriale, bliver resultatet af isocyanatreaktionen et 3-spiro-5,,-oxazolidin-2,, ,4,r-dion-4-carbamat (O-CO-NHR). Disse 4-carbamat-oxazolidin-dion-derivater er 6 145001 såvel virksomme anti-tumor midler som mellemprodukter ved frem- 7 stillingen af forbindelser, i hvilke R er OH eller, i sidste instans, acetoxy.

Forbindelser med strukturformel III, i hvilke R er OH, kan også fremstilles ved syrehydrolyse af forbindelser med formel III, i 7 hvilke R er acetoxy, f.eks. med saltsyre.

Farmakologisk acceptable syreadditionssalte af de omhandlede derivater af yinca-alkaloider fremstilles ved at blande en opløsning af alkaloidet på fri baseform med 1 mol af den ønskede ikke-toxiske syre i et inert opløsningsmiddel. Hvis saltet er opløseligt, genvindes det ved afdampning af opløsningsmidlet under vakuum. Hvis saltet er uopløseligt i reaktionsmediet, vil det bundfældes og kan isoleres ved filtrering. Visse af de uorganiske salte fremstilles på en noget afvigende måde. For eksempel fremstilles sulfatsaltet ved at opløse den frie baseform i den mindst mulige mængde polært opløsningsmiddel; såsom ethanol, og derpå justere denne opløsnings pH til ca. 4,0 ved dråbe for dråbe at tilsætte 2 % vandig svovlsyre i ethanol. Sulfatsaltet udvindes ved afdampning af opløsningsmidlerne til tørhed. Hydrochloridsaltet kan fremstilles på lignende måde ved at sætte en alkoholisk opløsning af HC1 til en alkoholisk opløsning af den frie base. De som ovenfor beskrevet fremstillede syreadditionssalte kan renses ved velkendte metoder såsom chromatografi eller omkrystallisation.

Som tidligere omtalt er de omhandlede forbindelser også anvendelige som mellemprodukter ved syntesen af andre vinca-alkaloider med antitumor-effekt. Behandling af oxazolidin-dionen (III) med base fører til et C-3 carboxamid-derivat, der sædvanligvis mangler acetylgruppen i C-4 stillingen. Omsætning af VLB-3"-methyl-3-spiro-5"-oxazolidin-2",4"-dion med vandig base fører f.eks. til 4-desacetyl-VLB-C-3-N-methylcarboxamid. C-3-carboxamid-derivateme af vinca-alkaloideme, såsom VLB, vineristin, leurosidin og deoxy-VLB "a" og "B", er aktive anti-tumor-midler hos dyr som anført i dansk patentansøgning nr. 3985/77.

Nogle af udgangsmaterialerne med formel II i den kendetegnende del af krav 1 kan isoleres fra bladene fra planten Vinca rosea. Dette gælder for VLB, vineristin, leurosidin og deoxy-VLB "A" og "B".

C

Når R i formel II er OH, kan de fremstilles ved syrehydrolyse af 7 145001

C

den tilsvarende forbindelse, i hvilken R er 0-C(=0)-CH^. 4-Des- acetyl-forbindelsen kan om ønsket igen acetyleres i C-4 stillingen ved den fremgangsmåde, der er beskrevet af Hargrove, Lloydia, 27, 340 (1964), eller ved at acetylere under lempelige forhold og ved anvendelse af 1 mol eddikesyreanhydrid. Udgangsmaterialer med for-2 mel II, hvori R er H eller formyl, med undtagelse af stofferne vin-cristin og N-desformyl-leurocristin, der udvindes af Vinca rosea blade, fremstilles på følgende måde: Deoxy-VLB "A" eller "B" etc, kan oxideres i 1-methylgruppen med chromoxid i iseddike ved -°0°C, hvilket fører til en blanding af forbindelser, i hvilke R er H eller formyl, i overensstemmelse med fremgangsmåden nævnt i U.S.A.

patentskrift nr. 3 899 493- De forbindelser, i hvilke R2 er H, kan o derpå formyleres, eller de forbindelser, i hvilke R er fonsyl, kan derpå deformyleres.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen illustreres nærmere ved følgende specifikke eksempler.

EKSEMPEL 1

Fremstilling af VLB-5w-methvl»3-SOiro-5w-oxazolidin-21,,4w-dion

Der blev fremstillet en opløsning indeholdende 2,84 g VLB i fri baseform i 40 ml vandfri benzen. 15 ml methylisocyanat blev tilsat, og den samlede blanding blev opvarmet til tilbage svalingstemperatur i ca. 6 timer. Reaktionsblandingen blev kølet ned, og de flygtige komponenter fjernet ved fordampning. Inddampningsresten, som bestod af VLB-3n-methyl-3-spiro-5n-oxazolidin-2n,4w-dion dannet ved ovennævnte reaktion, blev renset ved chromatografering på 200 g silicagel (procedure I). Chromatogrammet blev fremkaldt med 1 liter 4 % methanol i benzen efterfulgt af 2,5 liter 6 % methanol i benzen, som eluerede VLB-3"-methyl-3-spiro-5"-oxazolldin-2",4"-dion. Udbyttevægt 0,9764 g; molekylionvægt = 835; NMR: <T ved 0,17, 0,88, 2,0, 2,60, 2,74, 2,78, 2,81, 3,08, (nyNCH3), 3,58, 3,60, 3,79, 4,52, 5,18, 5,41, 5,88, 6,09, 6,64; massespektrum: iontoppe ved 849 (transmethylering), 835 , 817, 804, 776, 650, 543, 494, 355, 167, 154, 149, 135.

Ved en analog fremgangsmåde blev 270 mg VLB på fri baseform omsat med n-butyli so cyanat til VLB- 3 " -n-bu ty 1- 3- spir o-5 " - oxaz olidin- 2 M, 4 ” -dion (41 mg oprenset stof). Massespektrum: iontoppe ved 891, 877, 859, 8 145001 837, 836, 819, 818, 792, 747, 650, 543, 536, (512), 381, 380, 355, 341, 325, 295, (188), 154, 149, 135 og 136, 122, 121, 107. NMR i deuterochloroform: ved 0,66, 0,92, 1,3-1,7, 1,99, 2,07, 2,81, 3,61, 3,79, 5,17, 5,43, 5,87, 6,09, 6,61.

98,9 mg VLB på fri baseform blev omsat med allylisocyanat til VLB-3"-allyl-3-spiro-5"-oxazolidin-2",4"-dion (31,3 mg oprenset stof). Massespektrum: iontoppe ved 875, 861, 843 og 844, 830 og 831, 802 og 803, (784), 650, 543, 520, 380 og 381, 355, 295, 273, 242, 154, 149, 143, 136, 135, 122, 121, 107.

IR spektrum i chloroform: toppe ved 3440, 1810, 1740, 1610 οπΤ^.

NMR: ved 0,66, 0,88, 1,98, 2,41, 2,80, 3,57, 3,60, 3,79, 4,14, 5,1- 5,3, 5,43, 5,7-5,95, 6,08, 6,63.

EKSEMPEL 2

Fremstilling af vincrlstin-5l,-methyl-5-s^^iΓo-5>t-oxazolidin-2t,^"-dion.

Vineristin på fri baseform udvundet ud fra 158,3 mg vineristinsul-fat ved almindelig metodik blev opløst i ca. 15 ml vandfri benzen.

Ca. 2,5 ml methylisocyanat blev sat til vineristinopløsningen, og blandingen blev opvarmet til tilbagesvalingstemperatur i ca. 6 timer og derpå holdt ved stuetemperatur natten over efterfulgt af yderligere 4 timers tilbagesvaling. De flygtige bestanddele blev fjernet og efterlod en inddampningsrest på 159,6 mg, som var opløselig i methanol, men ikke opløselig i methylenchlorid. Præparativ TLC under anvendelse af et opløsningsmiddelsystem ethylacetat-ethanol i forholdet 3:1 resulterede i 4 bånd ud af hvilke det tredie (regnet efter stigende polaritet) var vincristin-3,,-methyl-3-spiro-5"-oxa-zolidin-2",4"-dion (26,3 mg oprenset stof) med følgende fysiske kendetal: Massespektrum: iontoppe ved 863, 849, 831, 806, 790, 751, 708, 647, 650, 635, 480, 393, 369, 355, 283, 270, 268, 183, 171, 168, 154, 141, 136, 122, 121. IR spektrum i chloroform: toppe ved 3440, 1805, 1730, (og 1745), 1660 cm-1. NMR i deuterochloroform: <? ved 0,59, 0,88, 1,35, 1,68, 2,74, 2,78, 3,00, 3,65, 3,87, 4,41, 4,68, 5,20, 5,90, 6,81, 6,91, 8,12, 8,78.

9 145001 EKSEMPEL 3

Fremstilling af l-desmethyl-4-desacetyl-4- (N-methylcarbamoyloxy)-VLB-3tl-methyl-3-spiro-5l,-oxazolidin-2n.4w-dion__

Analogt med fremgangsmåden i eksempel 1 blev 21,7 mg 1-desmethyl-4-desacetyl-VLB omsat med 3 ml methylisocyanat i ca. 12 ml vandfrit methylendichlorid ved tilbagesvalingstemperatur, l-desmethyl-4-des-acetyl-4- (N-methylcarbamoyloxy )-VLB-3 "-methyl-3-spiro-5"-oxazolidin-2",4"-dion dannet ved ovennævnte reaktion blev isoleret analogt med fremgangsmåden i eksempel 1 og oprenset ved præparativ TLC lander anvendelse af et methanol-opløsningsmiddelsystem (5,5 mg renset udbytte). Denne forbindelse havde følgende kendetal: NMR (i deutero-chloroform): # ved 2,75 , 2,79 , 3,08 , 3,59 , 3,76 , 3,84, 4,76 , 5,35, 5,19, 5,86, 6,26, 6,68. IR spektrum i chloroform udviste en ny top ved 1818 cm-1, og forøget absorption ved 1740 cm-1 samt ved 1130 cm"·1· sammenholdt med udgangsproduktet. Massespektrum: iontoppe ved 836, 834, 779, 777, 368, 256, 241, 213, 155 og 149.

EKSEMPEL 4

Fremstilling af VLB-3lt-(6-chlorethy3-3-spiro-5w-oxazolidin-2w,4w-dion

Analogt med fremgangsmåden i eksempel 1 blev 1,620 g VLB omsat med 15 ml β-chlorethylisocyanat i 100 ml vandfri benzen. Reaktionsblandingen blev holdt voider omrøring ved stuetemperatur i 16 timer efterfulgt af 2 timers opvarmning ved tilbage svalingstemperatur. Et bundfald bestående af et vandopløseligt kompleks af VLB og β-chlorethyl-isocyanat blev udskilt og isoleret ved filtrering af den nedkølede opløsning. Bundfaldet (1,692 g) blev opløst i ca. 30 ml vand, og den vandige opløsning holdt ved stuetemperatur under omrøring i ca. 16 timer. Opløsningen blev derpå gjort basisk med fortyndet natriumhydroxid, og VLB-3”-(β-chlorethyl )-3-spiro-5n-oxazolidin-2” ,4B-rdion, som var dannet ved ovennævnte reaktion, og som er uopløselig i basisk medium, blev udskilt og ekstraheret med methylenchlorid. Me-thylenchloridfaseme blev forenet og opløsningsmidlet fjernet derfra ved afdampning. Inddampningsresten, der indeholdt VLB-3B-(p-chlorethyl)-3-spiro-5"-o:sazolidin-2*,4w-dion, blev oprenset ved chromatografi på 150 g silica (aktivitet I) (1,127 g renset udbytte). Chromatogrammet blev fremkaldt med 6 % methanol i benzen. Forbindel- 10 145001 sen havde følgende fysiske kendetal: massespektrum: iontoppe ved 883, 847, 816, 789, 650, 592, 591, 543, 506, 485, 451, 355, 295, 154, 136, 135» 122, 121, 107. IR spektrum (i chloroform) viste toppe ved 3650, 3570, 3440, 1805, 1745, 1610 cm NMR i dexrterochloroform: ved 0,67, 0,88, 2,01, 2,81, 2,85, 3,61, 3,79, 3,87, 5,19, 5,44, 5,89, 6,11 og 6,65.

EKSEMPEL 5

Alternativ fremstilling af VLB-3"-(β-chlorethyl)-3-spiro-5"-oxazo-lidin-2" .4"-dion_;________ Først fremstilledes en opløsning indeholdende 481,2 mg VLB på fri haseform i 14 ml vandfri benzen. Til denne sattes 1,0 ml p>-chlorethylisocyanat. Man fik øjeblikkelig et bundfald. Reaktionsblandingen blev derpå opvarmet til tilbagasvalingstemperatur i ca.

16 timer. Benzenen blev fjernet ved afdampning under vakuum, og inddampningsresten blev behandlet ved præparativ TLC på silica under anvendelse af et 3:1 ethylacetat/methanol-opløsningsmiddelsy-stem. To bevægelige striber, som ikke lod sig adskille, blev isoleret sammen (totaludbytte 379,4 mg) og chromatograferet endnu en gang. Den anden chroraatografering under anvendelse af det samme 3:1 ethylacetyl/methanol-opløsningsmiddelsystem, men med kun 47 mg af tokomponentblandingen pr. præparativ plade, førte til isolation af VLB-3"-(β-chlorethyl)-3-spiro-5"-oxazolidin-2",4"-dion (147 mg).

EKSEMPEL 6

Fremstilling af 4-desacetyl-VLB-3"-methyl-3-spiro-5,,-oxazolidin-2" ,4"-dion _________ 99,7 mg VLB-3”-methyl-3^spiro-5"-oxazolidin-2",4"-dion fremstillet ifølge eksempel 1 blev kogt under tilbagesvaling i 0,5 N vandig saltsyre i ca.

1 1/2.time. Den vandige opløsning blev gjort basisk, hvorpå 4-desacetyl-VLB-3"-methyl-3-spiro-5"-oxazolidon-2,,,4,,-dion, der er uopløselig i base, blev udskilt og ekstraheret med methylenchlorid. Methylenchlo-ridfaseme blev forenet og opløsningsmidlet afdampet under vakuum. Inddampningsresten blev behandlet ved præparativ TLC på silicagel under anvendelse af en 3:1 ethylacetyl/methanol-opløsningsmiddelblan-ding til fremkaldelse af chromatogrammet. Hovedområdet bestod af 11 145001 4-de sacetyl-VLB-3M-methyl-3-sp ir o- 5 " -oxazolidon-2",4"-dion (32,3 mg oprenset udbytte). Denne forbindelse blev brugt som enkeltpletstof 1 3 andre chromatografisystemer. Den udviste følgende fysiske kendetal: massespektrum: iontoppe ved 807, 793, 763, 749, 734, 690, 493, 452, 408, 355, 295, 268, 167, 171, 154, 149, 143, 155, 122, 121, 107. IR-spektrum i chloroform: maxima ved 3580, 3440, 1815, 1735, 1615 cm-1. NMR i deuterochloroform:å ved 0,80, 0,88, 2,70, 2,81, 2,90, 3,04, 3,59, 3,76, 3,92, 4,20, 5,60, 5,88.

EKSEMPEL 7

Fremstilling af 4-desacetyl-VLB-3"-methyl-3-spiro-5M-oxazolidin- 2 ” ,4”-dlon-4- (N-methyl) carbamat._

Der blev fremstillet en opløsning indeholdende 304 mg 4-desacetyl-VLB i 10 ml vandfrit benzen, 5 ml methylisocyanat blev tilsat, og blandingen opvarmet under tilbagesvaling i 6 timer. Opløsningsmidlet blev fjernet ved afdampning under vakuum, hvorved opstod en ind-dampningsrest på 444,4 mg. TLC viste, at der var 2 forbindelser tilstede i inddampningsresten, og disse blev separeret ved præparativ , TLC under anvendelse af et 3:1 ethylacetat/methanol-opløsningsmiddel-system. Denne fremgangsmåde førte til renset 4-desacetyl-VLB-3n-methyl-3-spiro-5,,-oxazolidin-2,,,4"-dion-4-(N-methyl)carbamat med følgende fysiske kendetal: massespektrum: iontoppe ved: 850, 807, 793, 775, 762, 734, 452, 355, 154, og 135. UV-spektrum i ethanol: toppe ved 215 og 268 med skuldre ved 290 og 298 ^um. IR-spektrum (i chloroform): maxima ved 3700, 3460, 1816, 1743, 1600 cm”1. NMR-i deuterochlorofrom: ved 0,67, 0,88, 2,78, 2,81, 3,07, 3,60, 3,70, 5,0, 5,25, 5,30, 5,84, 6,08 og 6,03. Denne forbindelse udviste selv ved koncentrationer så lave som 10”^ mg/ml metafasehæmmende effekt i en standard mitosehæmningstest.

EKSEMPEL 8

Fremstilling af 4-desacetyl-VLB-3,,-p-chlorethyl-3-spiro-5"-oxazoli-din-2H.4w-dion__ 25 ml tør methanol mættet med hydrogenchlorid ved 0° C blev sat til 12 145001 96,9 mg VLB-3"-p-chlorethyl-3-spiro-5"-oxazolidin-2",4"-dion fremstillet ifølge eksempel 1. Blandingen, fik lov til at varme op til stuetemperatur og blev holdt under omrøring i 18 timer. Opløsningsmidlet blev afdampet under vakuum. Vand blev sat til inddampningsresten sammen med is. Opløsningen blev gjort basisk med ammoniumhydrox-id og ekstraheret 4 gange med methylenchlorid. Methylenchlorid-faseme blev forenet og opløsningsmidlet bortdampet under vakuum. Inddampningsresten (88,6 mg) blev behandlet ved præparativ TLC på silicagel under anvendelse af en 3:1 ethylacetat/methanol-opløsnings-middelblanding til fremkaldelse af chromatogrammet. Det bånd der placerede sig med rf = 0,4, blev elueret med et udbytte på 14,3 mg. Fysiske kendetal: Massespektrum: toppe ved: 841 (oprindelig ion), 816, 782, 651, 453, 355, 295, 175, 167, 154, 149, 135, 125- EKSEMPEL 9

Alternativ fremstilling af 4-desacetyl-VLB-3"-P-chlorethyl-3-spiro-5"-oxazolidin-2",4"-dion.

25 ml β-chlorethylisocyanat blev sat til 9,86 g VLB på fri baseform i 200 ml tør benzen. Reaktionsblandingen blev holdt under omrøring ved stuetemperatur natten over og derpå kogt med tilbage svaling i 2,5 timer. Bundfaldet blev frafiltreret. Filtratet på 3,15 g blev opløst i 300 ml 0,1 N vandig saltsyre og kogt under tilbage svaling natten over. Reaktionsblandingen blev kølet ned,, gjort basisk med ammoniumhydroxid og ekstraheret med methylenchlorid. Ekstrakterne blev forenet, og opløsningsmidlet bortdampet under vakuum efterladende en inddampningsrest på 2,80 g. Denne, som indeholdt 4-desacetyl-VLB-3"^-chlorethyl-3-spiro-5,,-oxazolidin-2",4"-dion, blev oprenset ved chromatografering på silicagel. Chromatogrammet blev fremkaldt med benzen indeholdende en stigende methanolgradient. Udbytte 192,0 mg. Fysiske kendetal: Massespektrum: iontoppe var identiske med de i eksempel 8 nævnte. NMR i deuterochloroform: S ved 0,81, 0,88, 2,25, 2,71, 2,99, 3,60, 3,76, 3,79, 3,93, 5,61, 5,88, 6,00 og 6,63.

13 Η5001

Fremstilling af salte

Saltene af oxazolidindioneme (formel II) samt af 3-carbamaterne (formel III) fremstilles på følgende måde:

Den frie base opløses i den mindst mulige mængde ethanol. pH sænkes til 4,0-0,2 ved dråbe vi s tilføring af 2 % svovlsyre i ethanol. pH bestemmes ved at udtage en delmængde svarende til 2 dråber, fortynde til 1 ml med vand og derpå bestemme pH med et pH-meter. Den sure ethanoliske opløsning inddampes til tørhed. Inddampningsresten indeholdende sulfatsaltet kan om ønsket omkrystalliseres fra methanol eller ethanol.

De omhandlede forbindelser er blevet påvist som værende effektive over for i mus transplanterede tmorer in vivo, samt i stand til at fremkalde metafasestandsning i ovarieceller (kinesisk hamster) dyrket i vævskultur. Ved påvisningen af de omhandlede forbindelsers effektivitet over for i mus transplanterede tumorer blev anvendt en procedure, hvorved forbindelsen blev indgivet - oftest intraperi-tonalt - i et fastlagt dosisniveau i 7 til 10 dage efter indpodningen med tumoren.

Nedenstående tabel (Tabel 1) viser resultaterne opnået ved flere experimenter, hvori mus, som var bærere af transplanterede tumorer, mad held blev behandlet med en af de omhandlede forbindelser.

I tabellen viser kolonne 1 forbindelsens navn, kolonne 2 viser hvilken tumor, der blev transplanteret, kolonne 3 viser dosisniveauet eller dosisniveauområdet samt det antal dage, hvori dosis blev vedligeholdt, kolonne 4 viser indgivelsesvejen, og kolonne 5 den procentvise hæmning af tumorvæksten eller den procentvise forlængelse af overlevelsestiden, f.eks. ved B16 og P388. (ROS er forkortelse for Ridgeways osteogeniske sarcom; GLS for Gardner lymphosarcom; P 1534(J) og P 388 er leukæmier; CA 755 en adenocarcinom; og B 16 er en melanom).

14 145001 Μ μ m ^

Ht ^ φ ω d Φ Φ ’ϋ ΰ φ ti ti ?, £ d d β η φ φ > ® -ρ > > ω Η μ φ φ η d φ η η ^ £ & μ d d £ > φη φ φ > ο

rid) > > g W

ø ø μ μ ό ·η Η τ3 Τ) u ifn

&0 d Η Η ·ρ WJ

d Φ -Ρ +> “ g •Η !> &0 60 ω Φ

d ° g g g H

gH HH H N

id cd 1 ^ <f [Λ m ro MØ''-''·—' w ---

>H 'SR'Sg.'SR'iS. ^ ^£.¾¾.¾¾.¾¾.¾^ ^ cR.'iR ^ ^cRcR

-P Φ

d n OOCVI O O O O O O 00 O H

ød «3000 co η o o o o σ\ o <J-q in oj in o vo o o æ inHHH OiHHHHin H 1NH m^ROtH ΗΦγΙ

0 H I I I I I I i I I I I I II

ll o- vo vo cnm oo o om N-mcrnn Hin a, o m cn in ·4·-ί m <f men <tmmni vom

Ή H

I CQ •ri 0 &øm _ B Φ Φ OPiftPi fL, ddftOOO Cd 0j p PjPjP^pPjPj

H > > CL| Η Η Η H H Hfli HHfcH fcHH

H

iij σι h oo „ Λ

pn 0 O OO I I HH O O

<3 &I m H HH IN en H H m

^ -d M M M Μ Μ M *HM MM

m o en o o mo i „ „ •hm η N- m vo h o vo oo oo H m voenvo -ovvo co vo o rn w ·* m *» ·« ** *. **H ·* Λ * o W MM Η O MHOMMM ni OM OiMO Mocvi q w mri ii i i imiii \ mvocvio m mmm-i-is h m<t· mi>-m<r rno-o y I h v. *S n I I I Λ ·* I ·*·»!·»·**·* SI moHH o <t-oommm o om o o mo mon H) b d o m<f m <f· o o h mm m m h a co ni vo t>-m coco co co coin vo m ni

3 H HH <CH JO J Η H<i Η Η H

η o h ffl ofd otd o o oo m (¾ h

I I* H

= 'Τ' m >>,d i Sf i i i od oos

do Η S H HH

•HH !>> I Ό >>Ό

ρ,-d os Η Η H

mi· a mn -P H

I = 0 I O 0 o

m<f a -? R 3 £ 3 P

l-d d J 0 Oød H= O ø F> M HM o

>,ηι H o i o Λ o 'H

0 ,d I 0 HHl O I Φ

m -p d ω -P N >i= d isdra-P

ΗΦΗ0 H fi-pmo Q3.m o ø H

0 Søil 0 -P Φ I H I Hil 0

•dlH Μ 0ΟΟ·ΟΙΟΤ) M

d = HH -P a Cd d I = d I H -p h m o d ø i ta hs mn = d ø ,Ω i N<H H Sø Prd· I Pt-d"'Η Ή

d pq 0 H '-"d m - pq m « H

o H x oø d i i i - J i s <ø S

fa > o pi< cq <t-<rmcvi >mcvi pi) co 15 145001 d Φ

Xj •Η -Ρ

Dl φ

Dl d Η ω φ Η r* Η Φ Φ Η d faO Φ β > •Η Ο 1 'Η i β Φ 01 01 Ή Η _ „ ί> φ ^5.

-ρ W

Αΰ ^ ^ ^ d

Φ S

ο Η ο LT\ Η I

ο d cm η νο is d Ο <Μ Ρη'Η '-ν I D1 Ρ Η Φ

CtJ &0 01 ο ΰΗτ „ -ρ ^ Φ 0) ft ft (¾ ft d Η>ί> ΗΗ Η Η Ο ΰ. -ρ' φ

w S| SS

i § Κ Η m 01 <ί X IS IS IS' Ο «Η

Eh - cd

01 W Η X X H

Ή S I f> 01 ·\ 1Λ Lf\ Ο 1Λ Φ

O fit - - ~ ·· H

Q >y| CM CM H OP

P

Φ

faO

d ®

0 M

1 CO CO CO CQ β 3 iJ kJ PI o

£i S S S O <H

H

=' p i -d· I "g H ·> > fj is= i -d- ή

il CM = I ·> I

-PI ΙΛ K>= 1=. Φ

φβ Id I CM QQ-IA d bO

g-H Ο Ο Η I ^ I Ο β i -d d -H >> d i p -h xi = rl ΉΌ drl ϊ ΙηΌ ft I -P Xl KVH I o i o oi = φ ·Η i ft= U3 pqN ι-d' ΘΗ pQtQ-d· (-3(0 10^10)-31^^ 5 ixj I = = N |> fO|= I O H CM ΙΌ (0 I I CM Φ ΦΗΐί^ΙίΜΗ^Ι'β to s= h d d o >»h d φ H +un H-H -H I -P >yH |> Φ φ i cd xi P = φ i! xi Φ

X) O O I iH 01lf\ Ο P *H H

d COP = Η *H I cOQlrH β •H 01 ι-l K> O do OldO Φ P Φ ft d IN odd Φ O N >

d X) oi O ffl cd d -Η O OH ¢) O

Ο I I ·Η η X ·Η dd*rj I P R

ft-d-f^Op-OSoixl-d-ooHI

16 1-45001

Som det fremgår af ovennævnte tabel er de omhandlede oxazolidin-dioner effektive når de indgives peroralt. Denne aktivitet ved peroral indgivelse er helt uventet, eftersom de markedsførte midler VLB og vineristin ikke udviser den samme grad af aktivitet ved peroral indgivelse over for de samme tumorer i forsøgsdyr. For eksempel medfører VLB-3"-methyl-3-spiro-5”-oxazolidin-2",4"-dion og dennes 3"-(β-chlorethyl)-analoge 100 % hæmning, når den indgives peroralt mod GLS, ROS og CA 755 ved doseringsniveauer på 6-7 og 3-6 mg/kg, hvor-, imod VLB og vineristin højst er marginalt effektive, om overhovedet, ved doseringsniveauer på henholdsvis 2 og 2-4,5 mg/kg, og de er normalt toxiske ved højere niveauer. Ved parenteral indgift (intraperi-tonealt) påvises imidlertid sammenlignelig tumorhæmning eller levetidsforlængelse ved 0,5-0,75 mg/kg doseringsniveau for oxazolidin-dionerne og ved 0,4-0,45 mg/kg for VLB og 0,2-0,25 mg/kg for vinerist in.

Ved anvendelsen af de omhandlede hidtil ukendte oxazolidin-dioner som antitumormiddel på pattedyr, kan man indgive dem enten parente-ralt eller peroralt. Ved peroral dosering blandes en passende mængde af et farmaceutisk acceptabelt salt af en base, overensstemmende med formel III, dannet med en ikke-toxisk syre/ med-stivelse eller en anden excipiens, og blandingen fyldes på teleskopiske gelatinekapsler, hver indeholdende mellem 7>5 og 50 mg aktive bestanddele. Tilsvarende kan et farmaceutisk acceptabelt salt blandes med stivelse, et bindemiddel og et smøremiddel, og blandingen kan slås til tabletter, der hver indeholder mellem 7,5 og 50 mg salt. Tabletter kan forsynes med delekærv, dersom mindre doser eller opdelte doser skal anvendes.

Ved parenteral brug foretrækkes intravenøs indgift, omend man ved mindre pattedyr såsom mus anvender intraperitonal indgift. Ved patenteral indgift anvendes isotoniske opløsninger, der rummer 1-10 mg/ml af et salt dannet af en oxazolidin-dion med formel III. Forbindelserne gives i et omfang svarende til fra 0,01 til 1 mg/kg, fortrinsvis fra 0,1 til 1 mg/kg, dyrelegemsvægt een eller to gange om ugen eller hveranden uge afhængig af såvel effektiviteten som toxiciteten af forbindelsen. En alternativ metode til fastlæggelse af den terapeutiske dosering baseres på legemsoverfladen og består i dosering af mellem 0,1 og 10 mg/mdyrelegemsoverflade hver 7. eller hver 14. dag.

Claims (4)

17 145001 P_a_t_e_n_t_k_r_a_v_i:

1. Fremgangsmåde til fremstilling af vincaalkaloid-derivater med den almene formel , R3 5' oiT I 3’ . tt Formel III 11‘ ° 1 19f*vJ2*x* H “frrT ▼ ^15' N 17» - - C-O-CH- 9 14· i 11 ior--“-N ff7 Η I o XUT CH3"° Γ-η2"—o " tf 'An -xn C4-N·5-R n 0 hvor R betyder H, C-^-C^ alkyl, C-^-C^ alkenyl, CHgCHX-CH^, eller. 0^·“ CH5X, hvori X er Br eller Cl, R2 betegner H, CH, eller CHO; en af ^ 7 Zi ·? 7 grupperne R og R betegner H eller OH og den anden 0^5 °S R betegner OH, 0-C-NH-R eller 0-C-CH,, eller syreadditionssalte heraf, II ti 3

0 O kendetegnet ved, at man i nærvær af et inert organisk op løsningsmiddel omsætter et vincaalkaloid-derivat med den almene formel 18 145001 R3 21» 8'i" ^ 4*y—">—R^ vi____τι ΐΓ'~ H 1^'liel, FOmel 11 U·15 ^V-c-O-CH, H : 4 g 8 i^^llil2il9 \ 6 n if3“ι®] ---- i2 i C-OCH, II 3 0 hvori R^, og har den oven for anførte betydning, og R8 er OH eller O-C-CH*, med et isocyanat med formlen RNCO, hvor R har den oven II -> 0 for anførte betydning, og om ønsket hydrolyserer en dannet forbindelse med den almene formel III, hvori R^ betegner -0-C-CH til dannel- II j 0 se af det tilsvarende 4-desacetyl-derivat og/eller overfører den dannede forbindelse i et salt deraf.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at reaktionsblandingen opvarmes til en temperatur mellem 30 og 110° C.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2 til fremstilling af VLB-3M-methyl-3-spiro-5"-oxazolidin-2,L,4M-dion, kendetegnet ved, at man opvarmer en blanding af VLB på fri baseform og methylisocyanat.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2 til fremstilling af VLB-3"-n-butyl-3-spiro-5"-oxazolidin-2,,,4,,-dion, kendetegnet ved, at man opvarmer en blanding af VLB på fri baseform og n-butylisocyanat.