KR960008270B1

KR960008270B1 - 살아있는 세포내에 생물학적 물질을 도입시키는 개선된 방법 및 장치

Info

Publication number: KR960008270B1
Application number: KR1019920703020A
Authority: KR
Inventors: 로날드 에프. 브루너; 마이클 제이 데빗; 스티븐 에이. 죤스톤; 죤 씨. 샌포드
Original assignee: 미리암 디. 메코너헤이; 이.아이.듀우판 드 네모아 앤드 캄파니; 에이치. 월터 해우슬러; 코낼 리써치 파운데이션 인크.; 찰스 이. 푸트만; 듀크 유니버시티
Priority date: 1990-05-29
Filing date: 1992-11-28
Publication date: 1996-06-21
Also published as: AU7878891A; EP0535005A1; DE69103631D1; EP0535005B1; HU9203554D0; DK0535005T3; HUT67533A; HU216738B; ES2059140T3; WO1991018991A1; JPH05508316A; CA2083816A1; ATE110415T1; JP2517813B2; CA2083816C; DE69103631T2; US5204253A; AR243603A1

Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]

살아있는 세포내에 생물학적 물질을 도입시키는 개선된 방법 및 장치

[도면의 간단한 설명]

본 발명은 첨부된 도면을 참고로 더욱 잘 이해하게 된다.

제1도는 본 발명에 따라 제작된 생물학적 물질을 함유하는 입자를 세포 및(또는) 조직의 표적에 도입시키는 장치를 포함한 시스템의 선도.

제2도는 제1도의 장치의 세부 단면 분해도.

제3도는 손으로 쥐는 장치로서 특히 유용한, 제1도의장치의 다른 구조도.

제4도는 제1도의 입자 가속기의 목부의 다른 구조도.

제5a도 및 제5b도는 기체 비말동반법으로 작동시키기 위해 제작된 입자 가속기의 일실시태양의 초기 및 조작된 상태를 도시한 입자 가속기의 목부의 단면도.

제6a도 및 제6b도는 고정 막으로서 작동하도록 제작된 경우의 입자 가속기의 목부와 단면도.

제7a도 및 제7b도는 초기 및 조작된 상태를 나타내는 포획 막으로서 작동하도록 제작된 경우의 본 발명의 입자 가속기의 목부의 단면도.

제8a도, 8b도 및 8c도를 막 파괴법으로 작동시키기 위해 제작된 경우의 입자 가속기의 초기, 중간 및 작동된 상태를 도시한 입자 가속기의 목부의 단면도.

제9a도, 9b도 및 9c도를 비행 디스크로서 작동하도록 제작된 본 발명의 입자 가속기 및 그의 목부의 초기, 중간 및 작동된 상태를 나타내는 단면도.

제10도는 제1도의 입자 가속기의 노즐 부분의 3가지 다른 배열을 도시한 것이다.

제11도는 제1도의 입자 가속기의 노즐 부분의 다른 실시태양의 단면도.

제12도는 특히 큰 표적에 사용하기 적합한 본 발명의 다른 실시태양에 따라 제작된 입자 가속기의 단면도.

제13도는 절선 13-13을 따라 잘단된 제12도의 가속기에 사용된 배플의 단면도.

제14도, 14a도 및 14b도는 본 발명의 다른 실시태양의 추가 단면도.

[발명의 상세한 설명]

[발명의 분야]

본 발명은 살아있는 세포 및(또는) 조직내의 생물학적 물질을 도입시키는 개선된 방법 및 장치에 관한 것이다.

[발명의 배경]

충격에 의해 이형 DNA 또는 RNA와 같은 생물학적 물질로 살아있는 세포를 형질 전환시키는 것은 1984년 11월 13일자로 샌포드(Sanford) 등에 의해 출원된 발명의 명칭 살아있는 세포 및 조직으로 물질을 이동시키는 방법 및 그 장치(Method For Transporting Substances into Living Cell and Tissues and Apparatus Therefor)의 미합중국 특허 출원 제670,771호에 기제되어 있다. 역시 샌포드 등에 의해 1988년 2월 29일자로 출원된 발명의 명칭 세포 및 조직을 사멸시키지 않으면서 세포 및 조직에 물질을 전달하는 생물학적 장치의 미합중국 특허 출원 제161,807호에는 세포 및 조직내로 물질을 전달하는 개선된 장치가 기재되어 있다. 이들 방법은 적당한 크기의 입자가 세포벽 및/또는 세포막을 통과하여 세포질, 핵 또는 소기관 내로 유입되기에 충분한 고속으로 가속시키는 것을 포함하고 있다. 입자가 생물학적 물질은 함유하고, 그 속도가 세포를 파괴하지 않고 세포벽을 통과하기에 충분할 경우, 생물학적 물질은 세포내로 도입된다.

이 방법에서 세포막 내에 형성된 구멍들은 현미주사법을 사용하여 얻는 것보다 클 필요가 없으며 제2의 단편을 위해 개구만 남겨놓으면 된다. RNA 및 DNA와 같은 생물학적 물질들은 상기 샌포드 등에 의해 기재된 바와 같이 텅스텐구, 라텍스(latex) 구슬 또는 아철산염 결정과 같은 삽입 입자의 표면 상에 DNA를 침착시키는 것과 같은 여러 가지 메카니즘에 의해 세포내로 옮겨질 수 있다. 액체담체중의 DNA는 웰로서 사용될 수 있거나 고형 DNA는 그 자체로 입자를 구성할 수 있다. 특히 이 방법은 다수의 세포에 동시에 충격을 줄 수 있고 개별 세포의 처리가 필요하지 않기 때문에 특히 적합하다.

또한, 이 방법은 샌포드 등의 문헌 [: 27-39(1987)]에도 기재되어 있으며 샌포드의 문헌 [: 229-302(1988)]에는 그의 최근의 견해가 요약되어 있다. 클레인(Klein) 등의 문헌[: 70-73(1987)]에는 DNA의 양과 세포 내로의 탄도학적 전달이 기재되어 있다. 클레인 등의 문헌[: 4305-4309(1988) 및: 559-563(1988)]에는 옥수수 세포내로의 탄도학적 전달이 기재되어 있다. 존스톤(Johnston) 등의 문헌 [ : 1538-1541(1988)] 및 보인톤(Boynton) 등의 문헌[ : 1534-1538(1988)] 및 아르멜레오(Armeleo)의 문헌[: 97-103(1990)]에는 미생물 및 소기관의 형질 전환이 최초로 기재되었다. 소기관의 형질 전환은 폭스(Fox) 등의문헌[: 7282-7292(1988)], 블로워스(Blowers) 등의 문헌[: 123-132(1989)] 및 다니엘(Daniell) 등의 문헌[(in press) (1989)]에 의해 추가로 설명하였다.

보다 큰 식물 형질 전환 방법의 사용은 샌포드의 문헌[(in press)(1989)]에 의해 검토되었고 추가로 다수의 논문에서 입증되었다. 추가로, 상기 충격법은 사용한 도등 동물 세포의 형질 전화이 젤리닌(Zelenin)등의 문헌[(submitted)(1990)]에서 시험관 내에서 입증되었고 가장 최근에는 존스톤 등(in preparation) 및 젤라닌 등(inpreparation)에 의해 생체내에서 입증되었다.

샌포드 등에 의해 기재된 장치는 화약 폭발에 의해 생성된 고온 기체가 고온 기체 충격파를 형성하여 다수의 소형 미세 투사물을 함유하는 미세포사체를 가속시키는 화약 추진 장치의 형태의 미합중국 델라웨어주 월밍틴시 소재의 이. 아이. 듀우판 드 네모아 앤드 캄파니상의 제품이 시판중에 있다. 미세포사체가 그 내부에 구멍이 있는 정지판을 가격할 경우 미세포사체는 그의 진행을 계속하여 표적세포를 가격한다. 모리카와(Morikawa) 등의 문헌[: 320-322(1989)]는 샌포드 등의 방법을 기초로 압축 질소를 사용하여 미세포사체를 추진시키는 장치를 고안하였다. 아그라세투스(Agracetus)는 1987년 12월 2일자로 출원된 유럽 특허출원 제8731062.4호(공고 제0270356호)에 미세포사체 가속기를 기재하였다. 미세포사체가 얇은 디스크일 경우, 이 미세포사체는 매우 고압 방전을 사용하여 물방울을 증발시켜 화약 폭발로 생성된 고온 기체와 유사한, 포사체를 추진하는 고온 기체를 생성함으로써 가속된다.

로리 메츠(Laurie Mets) 박사는 센포드 등의 특허 출원에서 기재된 동일 원리 즉, 입자의 기류 비밀동반을 기초로 입자 가속기를 만들었다. 마지막으로 오드(Oard) 등(1990)은 압축 공기를 사용하여 원통형 미세포사체를 가속시켜 옥수수, 쌀 및 밀에서 일시적 유전자 발현을 성취하였다. 문헌[ : 334-339]는 DNA 코팅 미세포사체를 추진시키기 위한 공기총의 용도를 지재하고 있다. 폴리카르보네이트 진공 챔버에는 공기총구 및 표적 물질이 봉입되어 있다.

상기 여러 장치들은 생물학적 물질을 세포 및 조직내로 이동시키기 위해 미세포사체를 가속시키는 가장 양호한 방법의 문제에 대한 다양한 접근을 나태내고 있지만 이들 장치들은 모두 1가지 이상의 결점들을 안고 있다. 먼저 상기 연구된 대다수 장치들은 사용법에 따라 유연하지 못하다. 각각 상이한 가능출력, 세팅(setting), 배치 등을 요하는, 탄도학적 방법에 따른 폭넓은 용도가 존재한다. 현존하는 장치들은 단일 사용법 또는 단일 용도를 위해서는 적합하나 복수의 필요에는 적합하지 못한 경향이 있다. 두 번째로, 일반적으로 시판 중인 장치들은 표적마다, 매일 매일 바람직한 결과를 반복적으로 제공하지 못한다. 현존하는 가속기들은 성능에 있어서 높은 가변도를 갖고 있다. 또한 입자 분사 패턴이 불량하고 표적 부위에 따라 균일하지 못하다. 현존하는 장치들은 종종 입자 응집체를 효과적으로 파괴시키지 못하여 입자가 분사되는 면적만큼 큰 제어가 어렵다.

현존하는 대부분의 장치 부피는 크고 일반적으로 고정되어 있으며 일반적으로 일부 수의약 또는 의약적 사용에 필요한 바와같이 손으로 쥘 수 없다. 이와 관련하여 시판 중의 대부분의 장치는 진공 챔버 내에 표적을 배치시켜야 하며 표적이 진공 챔버보다 큰 경우에는 사용하기 적합치 않다. 무슨 표적을 사용하든지 가속기 장치는 다소의 세포를 손상(또는 사망)시키는 경향이 있으며, 이는 세포분열 또는 세포 분화를 해친다. 이는 특히 표적까지의 거리가 짧은 것이 필요할 경우 의약용에서와 같이 해당된다. 따라서, 보다 양호한 속도 조절, 보다 적은 기체 분사, 보다 적은 음향 충격, 보다 적은 속도의 파편, 보다 적은 열, 및 보다 적은 방사 에너지를 갖는 것이 바람직하다.

화약 또는 고압 방전을 사용하는 장치는 고온을 생성하는 경향이 있다. 또한, 고온 방전은 자외선 및 다른 형태의 이온화 방사선을 생성할 수 있는 블라인딩 플래쉬(blinding flash)를 생성한다. 이는 형질 전환되는 세포 또는 전달되는 DNA에 유해할 수 있다.

[발명의 요지]

생물학적 물질을 함유한 입자를 세포의 표면에 도입시키기 위한 선행 기술의 가속 방법의 다수의 결점은 본 발명의 방법을 사용하여 극복된다. 본 발명의 방법은 세포의 사망없이 입자가 세포 표면을 관통하여 세포의 내부로 혼입되도록 충분히 가속시키는 단계, 및 순각적인 냉각 기체 충격파의 힘을 가하여 입자의 가속화를 수행하는 단계로 이루어져 있으며, 입자의 가속화를 수행하는 단계는 표적측을 갖는 평면 캐리어 시트를 이용하고 입자를 평면 캐리어 시트의 표적측 상에 배치시키고, 시트에 냉각 기체 충격파를 가함으으로써 캐리어 시트를 떠난 세포 입자를 가속시켜 세포에 이루게 하는 것을 포함하며, 시트는 움직이지 못하게 그의 모서리를 고정시킨 탄성막이고, 냉각 기체 충격파는 팽창은 시키되 막을 파괴시키지 않음으로써 충격파로부터 표적을 보호한다. 평면이 메시일 경우 입자는 임의로 충격파내에 비말동반된다. 시트가 고체이고 그의 모서리가 단단히 고정되어 있을 경우 냉각 기체 충격파는 막을 팽창시키되 파과하지 않음으로써 충격파로부터 표적을 임의 로 보호하면서 입자를 발진시킨다.

별법으로, 막이 고정되어 있고 파괴시키는 경우, 입자는 표적 세포의 보다 넓은 영역에 분산된다. 또는, 생물학적 물질은 기체 충격파의 통로에 있는 스크린상에 분산될 수 있다. 제지 스크린이 표적 세포와 고체 비고정 막(비행 디스크) 사이에 배치될 경우 이 디스크의 비행은 짧은 거리를 비행한 후 제지되어 입자는 발진되고 스크린을 통과하여 표적에 이르에 된다.

상기 다양한 방법을 사용할 경우 필요에 따라 사용할 수 있는 다수의 별법을 얻는다. 예를 들면, 비행 디스크의 사용으로 표적의 보호 및 매우 빠른 입자 속도를 얻는다. 입자가 단순하게 충격파에 비말동반될 경우 세포 및 조직에 대한 손상이 더욱 심해질 수 있으나 속도는 최고일 수 있다. 한편, 그의 팽창이 스크린에 의해 제한되는 팽창 막을 사용할 경우 막 손상이 발생된다. 파괴성 막은 보다 양호한 입자 분산을 성취시키나 세포 손상을 다소 증가시키는 경향이 있다.

본 발명의 방법을 수행하기 위한 장치는 진공 상태를 생성하기 위한 제1배기구, 주축, 주축상에 놓여있는 제2배기구의 반대쪽에 있고 축을 둘러싸고 있는 목부를 한정하는 제1배기구를 갖는, 진공을 유지시킬 수 있는 하우징, 제2배기구내에 배치되고 내부에 보관된 기체를 격렬히 방출시켜 목부 방향으로 기체 충격파를 제공하는 고압 챔버, 및 충격파의 힘에 의해 표적을 향해 가속화시키기 위해 입자를 목부내에 배치시키는 수단 등을 포함하고 있다. 큰 표적이 사용될 경우 표적에 목부를 커플링시키기 위해 목부에 고정된 임의의 계면이 제공될수 있거나, 여기서 진공 및(또는) 충격에 대한 표적의 노출은 제한된다. 본 발명은 입자를 목부내에 위치시키고 발진시키는 것에 유연성을 제공하며 각각의 배열은 여러 이점과 단점을 갖는다.

간략하게, 본 발명의 장치는 (a) 고압 기체 전달 시스템 ; (b) 고압 시스템으로부터 순간적인 기체 충격을 생성하는 메카니즘; (c) 기체 충격이 방출되고, 수용되는 배출되는 봉입물; 및 (d) 몇몇 다양한 메카니즘에 의한 기체 충격의 힘을 이용하여 기체 충격을 미세포사체 가속력으로 변형시키는, 상호 교환성 삽입을 위한 목부의 5개 분을 갖는 것을 알 수 있다. 마지막으로, 상호 교환성 계면 메카니즘을 작은 동물 또는 식물로부터 큰 동물 또는 식물, 페트리 접시에 담긴 세포까지를 범위로 하는 상이한 유형의 생물학적 표적에 사용할 수 있다.

[바람직한 실시태양의 상세한 설명]

제1도 및 2도를 참고할 때, 본 발명의 장치는 5개 부분, 즉, (a) 고압 기체 전달 시스템(10) ; (b) 고압 시스템으로부터의 순간 기체 충격파를 생성하기 위한 충격 메카니즘(12) ; (c) 기체 충격파의 방출, 수용 및 배출되는 봉입물 또는 하우징(14) ; (d) 다양한 메카니즘에 의해 기체 충격파를 미세포사체의 가속력으로 변형시키는, 상호 교환성 삽입을 위한 장치의 목부(16) 및 (e) 상이한 유형의 생물학벅 표적을 조준하기 위한 임의의 상호 교환성 노즐 또는 계면 메카니즘(18)으로 이루어진 것을 알 수 있다.

고압 기체 전달 시스템은 고압하의 기체 공급원(20)을 포함하고 있다. 전형적으로, 기체는 경량 및 고속 팽창 특성때문에 혤륨이 좋다. 전형적으로, 다른 바람직한 불활성 기체는 필요에 따라 질소가 사용될 수 있다, 또한, 공기, 수소 등을 사용할 수도 있다. 기체 공급원(20)은 적당한 조절기(22) 및 압력 표시기(24)를 갖추고 있으며 적당한 관(26)을 통해 순간 기체 충격파를 생성하기 위한 챔버(12)에 연결된다. 유출밸브(28) 및 차단 밸브(30)이 사용된다. 밸브(30)은 이하 기재되는 바와 같이 기체 공급원(20)을 노즐 또는 계면(18)에 연결시킨다.

제2도에 그의 세부가 더욱 명확히 도시되어 있는 충격 생성 시스템(12)는 기체의 유동 속도를 제한하여 파괴 활성화 메카니즘을 안정화시키고 적당한 압력에 도달하기 전에 미리 소성되는 것을 방지시키는 수축기(32)를 통해 관(26)으로부터 기체를 수령한다. 이는 기체 충격 생성 시스템으로서 제공된다. 챔버(12), 하우징(14), 목 삽입부(18), 계면(18)의 모든 부품들은 달리 기재하지 않는한 놋쇠 또는 스테인레스강과 같은 고압 또는 고진공을 잘 견딜 수 있는 임의의 적당한 재료로 제조할 수 있다. 또한, 수축기(32)는 다른 폐쇄 메카니즘이 고장날 경우 소정 후 시스템을 통과하는 기체의 흐름을 제한하기 위해 제공될 것이다. 수축기로 인해 충격 생성 시스템(12)의 아랫 부분에 함유된 고압 챔버(24)의 가압은 몇초간 수행된다.

재생된 균열 개구일 수 있는 밸브는 수축기 대신에 수축점을 통과하는 흐름 속도를 조정할 수 있다. 충격 생성 시스템(12)내 가압 기체 챔버(24)의 크기는 강력한 기체 충격파를 생성하기에는 충분히 크고 다만, 배출에 필요하고 생물학적 표적상에 기체 충격을 제공하는 기체의 양을 제한하기에 충분히 작아야 한다. 본래 상기 챔버 영역은 참고 번호(34)로 표시되어 있다. 챔버(34)의 부피는 필요에 따라 크기를 조정할 수 있는 나사형 슬리브 삽입부(36)에 의해 조정될 수 있다.

기체 충격파 생성 메카니즘(12)는 비교적 저압 영역 내로 자유롭게 팽창시킬 필요가 있는 예리하게 형성된 가압면을 제공하도록 설계되어 있다. 적당한 기체 충격파를 생성하기에 적당한 방출 메카니즘은 매우 빠르게 개방되어야 한다. 이는 순간 막 파괴 또는 매우 빠른 특별 밸브의 사용에 의해 성취될 수 있다. 매우 빠른 고압 밸브의 유효성의 결여로 인해 제1도 및 제2도에 도시된 파괴성 막(38)을 포함하는 실시태양이 바람직하다. 이 막은 충격 생성 시스템(12)를 포함하고 있는 원통에 나사를 통해 맞물려 있는 엔드캡(endcap : (40))(제2도)에 의해 고정되어 있다. 엔트캡(40)은 이하 적(42)의 방향으로 하향 방출되도록 그의 중앙 부분이 개방되어 있다. 막은폴리이미드 필름 또는폴리에스테르 필름과 같은 임의의 적당한 파괴성 재료가 좋다. 이런 유형 재료의 특성에 대해서는 이하 설명된다. 50.8㎛(2밀) 두께의막 5개를 사용하는 것이 성공적이었다(예를 들면 50.8㎛(2밀) 두께의막 4-5개 층은 81.7atm(1200psi)의 혤륨을 수용한다). 캡(40)은 마찰 압축 밀봉(도시되지 않음)을 갖는다. 상기 배열 하에서 가압 막은 바깥쪽으로 현저히 변형되나 자연적으로 파괴되지는 않는다. 별법으로, 자연적 파괴를 얻기 위해 약한 막 또는 고압을 사용할 수도 있다.

막(38)의 갑작스런 파괴(돌발적이어야 한다)를 얻기 위해서, 유효 파괴 메카니즘은 충격 시스템(12)의 중앙 구멍을 실제로 통과하는 봉(46)의 형태로 사용될 수 있다. 봉(46)은 바깥쪽으로의 기체 충격파의 자유 팽창을 방해하지 않도록 압력챔버(34)내에서 막을 파과시키는 예리한 부분을 갖고 있다.

충격 시스템의 고압관은 양 말단에 더욱 큰 구멍이 있는 중앙 부분의 구멍 또는 수축부를 갖도록 형성될 수 있다. 봉(46)은 수축 부분을 통해서 연장되며, 단 수축 부분은 기체가 막대 곁을 통과하여 저압 챔버 영역(34)안으로 들어갈 수 있도록 공동이거나 홈(도시되지 않음)이 새겨져 있어야 한다. 점화 후 봉이 포착되어 수축 영역까지 비행하지 않도록 봉(46)이 상단부(기체 공급원과 가장 가까운 부분)는 폭이 좀더 넓다. 이 폭이 좀더 넓은 부분의 봉은 자기 반응성 금속으로 제조되며 전기 공급 메카니즘(50)에 의해 작동된 솔레노이드(48)의 사용에 의해 하방으로 움직일 수 있다. 충격 시스템(12)를 형성하는 고압 튜브는 전술한 바와 같이 놋쇠와 같은 자기 비반응성 물질로 제조된다. 봉(46)의 상부의 넓은 단부와 수축된 부분 사이에 있는 스프링(54)는 각각의 점화 사이클 종료시 그의 윗지점으로의 봉이 복귀를 허용 또는 촉진시킨다.

봉(46)이 솔레노이드(48)에 의해 하방으로 작동될 때, 봉이 아래쪽의 예리한 다른 한쪽 단부는 압력 챔버(34) 내로 하향 연장되고 막을 관통함으로써 기체 충격파를 생성한다. 봉의 넓은 부분의 밑에는 밀봉 고리(56)이 있어서 점화 후 봉의 넓은 부분이 수축부를 밀봉시켜 임의의 일련의 기체가 저압 챔버(34)(막의 파괴로 압력이 방출됨) 내로 누출되는 것을 방지하도록 한다. 이어서, 오버라잉 기체 압력이 방출되는 경우, 소형 스프린(52)는 봉(46)을 원래 위치로 복귀시키고 그럼으로써 저압 챔버(34)은 새로운 막으로 다시 폐쇄되고 재가압될 수 있다.

이 메카니즘으로 생성된 기체 충격파는 샌포드 등이 열 및 충격의 순간 방출을 생성하는 화약통으로 얻은 기체 충격파와는 다르기 때문에 중요하다. 본 발명의 기체 충격 시스템의 경우에 있어서, 기체 충격파는 생물학적 물질로 처리할 경우 표적 영역에서 생물학적 물질에 바람직하지 못한 자외광 또는 열을 방지할 수 있다는 잇점을 갖는, 실온에서 압축 기페로부터 생성된 기체 충격파(이하, 냉각기체 충격파라 기재함)이다. 기체 충격파는 그 자체로 잔류 기체를 통해 전파되는 거의 계단 함수에 달하는 압력의 급격한 증가를 유발한다. 일반적으로, 압력의 급격한 증가가 발생하는 투과 영역의 폭은 분자의 평균 자유 행로, 즉, 분자가 다른 분자와 콜리이드되기 전에 움직이는 행로 거리이다. 압력의 갑작스런 급격한 증가(특허청구의 범위에서는 순간적인이라 기재함)는 본 발명에 필요하고 바람직한 짧은 거리에서 입자에 금속 가속을 제공하는 데 효과적이다. 충격파는 냉각된 것이다. 냉각된이라는 의미는 기체가 조직의 생물학적 물질에 손상을 유발하지 않을만큼 충분히 차다는 의미이다.

가장 양호한 파열은 막 파괴가 장력 한계에서 일어나기 때문에 자연적인 막 파괴로부터 얻는다. 이와 같은 막은 주어진 압력에서 자연적으로 파괴되도록 균일하게 제조될 수 있다. 이 경우, 막(38)을 파괴시키고 표적(42)의 방향으로 전파되는 기체 충격파를 생성하는 임계 온도에 도달할 때까지 압력 챔버(34)은 항상 점차적 가압이 필요하다. 막들은 측을 이루는 것이 좋다. 각각 50.8㎛(2밀)의층은 19-20atm(275-300psi)의 압력에서 파괴되며 여러 층을 부가시킨다. 금속박을 사용할 수도 있다.

생성된 기체 충격파는 극히 크며 잠재적으로는 작업자의 청각에 유해하다. 또한, 기체 충격파는 일부 빈공간내로 자유롭게 팽창되지 않는한 힘이 다소 약해지는 경향이 있다. 또한, 기체 충격파로 가속되는 경중량의 입자들은 기체 충전된 영역을 통과하도록 요구될 경우 곧 속도가 떨어진다. 이런 이유 때문에, 기체 충격 방출 영역 내에 부분적 또는 완전 진공을 사용하기 위해 하우징(14)기 제공되어 있다. 하우징은 원통형이고 2개 부분, 즉 상부(60) 및 하부(62)로 형성되어 있다. 이 두 부분(60) 및 (62)는 스냅 클립(64) 및 두 부분 사이의 밀봉을 제공하는 적당한 O형-고리(66)에 연결되어 있다. 층은 원통형 하우징(14)의 주축(11)을 따라서 나란하게 맞물려 있으며, 시스템의 위치가 하우징(14) 내에 수직으로 맞추어질 수 있도록 하우징의 상단부에 나란하게 맞물려 있다. 더욱 구체적으로, 봉(46)의 축에 의해 한정된 챔버 축(11)은 목부(16) 및 계면(18)을 통해 표적(42)를 지나서 표적(42)에 이르는 하우징 축(11)과 일치되며, 이들은 모든 충격파가 표적을 향해 진행하도록 챔버축 상에 놓이거나 챔버축을 들러쌓고 있다.

목부(16)은 점점 작아져서 감소된 직경의 목부(16)을 형성하는 하우징(14)의 하반부(62)의 아랫 부분을 형성한다. 이 영역에서 기체 충격파의 에너지는 표적 가속을 위해 미세포사체에 전해진다. 이 에너지의 전달은 본 발명에 의한 각종 메카니즘에 의해 발생될 수 있으며 이 영역에서 사용법에 따라 다르게 상호 교환성 삽입부를 위치시킨다. 이 삽입부는 나사로 조여지거나 다른 방법으로 개별적으로 적소에 고정되거나 이하 설명되는 예비 조립 단위체로서 목부내에 낙하될 수 있다. 사용되는 전형적인 삽입부는 목부(16)내에 나란하게 걸려있는 2개의 고리형 삽입부(82)에 의해 고정된 일부 유형의 입자 캐리어(80)을 포함한다. 입자 캐리어(80)은 스크린, 막 또는 이들의 조합이 좋으며, 이는 제5도 내지 제9도와 관련하여 이하 기제된다. 이하 기재되는 바와 같이, 노즐/계면(18)(제1도) 또는 (18')(제2도)은 목부 영역의 단부에 나란하게 맞물려 있는 것이 좋다. 계면(18')의 전단부는 제10도 및 제11도에 도시된 바와 같이 다양한 부속장치를 수용하기 위해 안쪽으로 플랜지가 붙여져 있고 나사가 나있다.

제4도를 참조하면 목부 단면(16')내에서 미끄러지기 적합하고 안쪽으로 연장된 플랜지(102)에 의해 지지된 제거할 수 있는 삽입부(100)을 포함하는 다른 목부 단면이 도시되어 있다. 삽입부(100)의 내부는 한쌍의 고리(82')을 수용하도록 나사가 나있다. 조작의 편리를 위해 삽입부의 상단부에 소형 핸들(84)을 장착하는 것이 좋다. 삽입부(100) 주위의 공기 침입을 방지하기 위해 밀봉을 보조하기 위해 O형-고리(104)를 삽입부(100)의 저면에 장착한다. 삽입부(100)의 외부 및 목부(16)의 내부는 삽입부의 활주성을 돕기 위해 나사가 없다. 이 제거기능 삽입부(100)은 제5도 내지 제9도에 도시된 목부의 임의의 별도의 입자 가속 장치의 조작을 돕기 위해 사용될 수 있다.

제6a도 및 제6b도에 도시된 입자 가속 실시태양은 목부(16)의 고정형 막의 배치이며 이 막은 강력하나 탄성이 있는 물질, 예를 들면폴리이미드 필름 또는폴리에스테르 필름을 함유한다. 예외적으로 폴리이미드 필름은 강력하고 내열성이다. 폴리에스테르 필름은 유사한 특성을 갖고 폭넓은 온도 범위에서 그의 인장 강도를 유지한다. 이와 같은 필름들은 기체 충격파의 충격을 견디기에 충분한 강도를 갖는다. 탄성이라는 용어는 요구되는 최대 사용 한계에서 파괴없이 충격파를 견딜 수 있는 물질을 설명하는데 사용된다. 막(110)은 홈과 모서리(도시되지 않음)를 연결시켜 막의 적소 로킹을 돕는 링(82)와 같은 메카니즘에 의해 그의 말단부가 적소에 고정된다. 로킹은 링을 목부 영역(16)내에 위치시키고 막을 링들 사이에 두고 서로 단단히 조여서 성취될 수 있다.

미세포사체는 막(110)의 외표면(도면에서 표적에 가장 가까운 저면)에 부착되어 있다. 따라서, 기체 충격파가 막(110)에 충돌할 경우, 막은 팽창되나 파괴되지는 않음으로써 미세포사체(112)를 고속으로 표적(42)쪽으로 발진시킨다(제1도 참조). 이 실시태양은 추진 기체가 표적에 충격을 가하여 손상시키는 것을 방지시킬 필요가 있을 경우 특히 적합하다. 막은 표적 위에 양호한 밀봉을 형성하며 충격파 제공원으로부터 분리시킨다. 막 및 미세포사체의 연속 추진에 대한 기체 충격파의 효과는 제6b도에서 입자(112)를 표적에 비행시키는 것으로서 도시되어 있다.

제7a도 및 7b도를 참고로 하면 제6a도 및 제6b도에서 고정 막으로 양호한 바와 같이 포착 막으로 공지된 다른 삽입부의 실싱태양이 도시되어 있다. 이 경우 제6도와 관련하여 설명한 것과 매우 유사하며 스테인레스 스틸 또는 유사한 화학적 불활성, 비반응성, 비독성 물질(120)로 제조된 얇은 스페이서 고리(122) 및 견고한 스크린(120)이 고리(82) 사이의 고정된 막(110)을 따라 포착되어 있다. 점화 즉, 기체 충격파의 생성 후, 고정된 막(110)은 거의 가장 충만한 정도로 팽창되며, 이 지점(스페이서 고리(122)에 의해 조절됨)에서 견고한 스크린(120)에 충돌한다. 이 갑자스런 정지는 제7도의 고장 막의 실시태양에서 발생되는 것보다 막 표면으로부터 포사체의 더욱 큰 속도 및 포사체(112)의 더욱 양호한 방출, 포사체의 더욱 큰 속도 및 포사체(112)의 더욱 양호한 분산 및 응짐 파괴가 생성된다. 이 메카니즘은 막이 파과된다 할지라도 효과적이며 막 및 임의의 막 파편을 포착하고 대부분의 기체 충격이 표적에서 떨어져서 굴절되게 함으로써 안전하고 비교적 온화한 충격법을 제공한다. 소형 디스크 또는 막이 막(110)의 후면에 부착될 수 있으며 그럼으로써 막의 중앙을 강화시키고 그의 파괴 기회를 감소시키거나 또는 파가 발생될 경우 소형 막 주위에서 발생되게 하여 표적상에 취입될 가능성이 있는 방향의 기체를 줄인다.

파괴 막실시태양으로 공지된 제8a도, 8b도 및 8c도에 도시된 실시태양은 기체 충격 후 파괴되도록 더욱 얇은 폴리이미드 또는 폴리에스테르 필름이거나 또는 이들 보다 약한 재료(예를 들면, 알루미늄박)으로 제조된 막(110)을 사용한다. 파괴 순간, 막의 표면을 가로지르는 엄청난 측방 전단력이 존재하며, 이는 표면으로부터 입자를 방출시키고 매우 높은 효율로 입자들의 응집을 파괴시키고 입자를 비교적 넓은 면적에 입자를 분산시킨다. 이어서, 입자에 여전히 높은 속도를 제공하는 영역을 통한 기체 충격파의 흐름애 의해 입자의 초기 발진이 증가된다. 그러나, 많은 기체 충격파는 여전히 반사되어빈 봉입물 내로 되돌아가며(파괴 전), 그럼으로써 최악의 기체 충격으로부터 표적을 보호한다. 비교적 심한 충격에 잘 견딜 경우, 보다 높은 속도를 필요로 할 경우 및 우수한 응집 파괴 및 넓은 면적에 걸친 미세포사체의 분산이 필요할 경우, 상기 배열이 바람직하다. 파괴된 막이 비행 파편을 생성할 경우, 포착 스크린은 막(110) 및 표적 사이에 배치될 수 있다.

제9a도, 제9a도 및 제9c도에 도시되어 있고 비행 디스크로 공지된 본 발명의 별도의 실시태양이 도시되어 있다. 이 경우에 입자(112)와 함께 제7도의 실시태양에서 사용된 파괴되지 않는 유형의 보통 막(110)이 2개의 고리(82) 사이에 배치되며 고리 위치의 조정으로 필요한 높이로 조정된다. 본 발명에 따라서 50.8㎛(2밀) 폴리이미드 디스크와 같은 비교적 견고한 막 또는 디스크(130)은 중첩 고리가 고정되지 않은 아래쪽의 고리(82) 상에 배치된다. 이는 홈이 있는 립(lip)에 의해, 또는 소량의 적당한 접착제로 적소에 고정시킨다(즉, 얇은 진공 그리스 막은 적소에 고정시키에 충분하다). 필요에 따라 다른 중점제를 사용할 수도 있다. 중앙 고리(132)는 축(11)(제2도)을 따라 스크린(134)를 배치시키며 둘 모두 목부(16) 내에 나사로 조여진 링(133)에 의해 지지되고 있다. 점화 후 디스크(110)은 아래쪽 측면애 위치된 입자(112)와 함께 그의 플랫폼을 들어올이고 고리지지체(132)에 의해 목부 영역의 바닥에 적소 고정된 견고한 스크린(134)에 충돌할 때가지 장해물이 없는 목주 아래로 비행한다. 충돌 후 입자들은 제7도의 포착 막의 경우에서와 같이 발진된다.

기체 충격파가 표적에 충돌할 가능성이 존재하지만 기체가 비행중인 디스크의 앞쪽으로 누출될 수 있기 때문에 가능 속도는 제7도의 포착 막보다 크다. 목부 영역의 내측 직경에 거의 맞고 비교적 짧은 비행 거리의 비행 디스크를 사용함으로써 기체가 옆으로 새는 것을 작게 할 수 있다. 충돌 후, 비행이 있은 후, 디스크(130)을 놓아줌으로써 이 디스크에 비행 디스크 보다 현저히 작은 개구 스크린 부분(134)에 자리하여 이를 밀봉하며 표적 영역으로 투과되는 기체 충격파의 에너지를 최소로 유지시킨다. 따라서, 표적 부위에 대한 감소된 기체 충격으로 비교적 고속이 생성될 수 있다.

제5a도 및 5b도에 표시된 바와 같은 기체 비말동반으로 공지된 다른 실시태양에 있어서 적당한 메시 및 유형의 스크린(134)이 사용되며 이러한 목적에 적당한 스크린은 150㎛의 개구를 갖는 Swiss Polyester Mono-filament 스크리닝이다. 이러한 스크린으로는 뉴욕주 엘름스포트 소재의 테크토, 인크.(Tekto, Inc.)사 제품, 부품번호 7-150/43이 시판중이다. 스크린(134)는 목부 영역(16) 내 고리(82) 사이에 포착된다. 미세포사체는 기체 충격파의 통로에 직접 위치시킴으로써 기체 충격파에 의해 직접 가속된다. 미세포사체를 함유하는 액체의 소적이 스크린 또는 메시(134)의 중앙에 놓여질 수 있다. 점화 후 기체 충격파는 이 소적을 발진 및 분쇄시키며 그안의 미세포사체를 비말동반시킨다. 이어서, 입자(112) 및 기체 중해파는 함께 표적(42)에 직접 충돌한다. 표적이 기체 충격파의 전체 충격에 견딜 수 있을 경우 이 배열은 효과적이다.

[상이한 생물학적 표적을 위한 상호 교환성 계면]

이 장치를 흠없는 동물, 사람 또는 기타 큰 동물에 사용할 경우, 계면(18)은 정확한 위치 조정(제10도), 표면 표면까지의 비행 거리의 조절, 표적 부위의 기체 또는 진공의 조절, 진공 또는 충격에 대해 연한 조직의 지지 및 이 영역내로 투과될 수 있는 임의의 기체 충격파의 소산(消散) 가능성을 얻는데 필요하다. 소형 유기체, 티슈 또는 세포가 충격을 받을 경우 페트리 접시 또는 기타 세포 용기를 적당한 거리에서 진공을 유지할 수 있는 챔버에 배치시키는 편리한 메카니즘이 필요하다. 다음 계면의 실시태양을 사용할 수 있다.

제10도에 도시된 실시태양은 3겹이며 이들은 모두 목부(16)에 맞추는데 적합하다. 모두 관 형태의 노즐(144)을 가지고 있으며 이 노즐은 계면(18)(제2도) 또는 (18')(제4도에)에 나란하게 맞물리게 하는데 적합한다. 노즐의 변형(도면의 우측 아래)에는 통기관이 마련되어 있다. 두 변형(좌측 또는 우측 아래)은 노즐의 하단부 테이퍼형 홈(147)에 맞물린 스냅-인(snap-in) 스크린(148)9(스크린(120)(제7도)에 유사함)을 갖고 있다. 계면(18)은 진공 펌프(72)에 대한 연결(140)이 장작될 수 있고 별법으로, 시스템 내에서 기체의 유형을 변화시키기 위한 압축된 기체에 대한 연결(142)아 장착될 수 있다. O형-고리(145)는 목부(18)의 저면에 밀봉을 제공하기 위해 노즐(144)의 상면에 고랑(149)내에 제공되어 있다. 연장된 노즐 배열은 이 계면을 수술 구멍내에 배치시킬 필요가 있을 경우 외과용으로 특히 적합하다. 또한, 넓은 표면(예, 표피)상의 충격을 가할 부위의 정확한 표시에 유리하다. 노즐의 팁은 표적 부위에 직접 가압될 수 있다. 스크린 또는 메시(148)은 충격에 대해서 조직을 지지하고 노즐 내부에 진공이 가해질 경우 조직이 윗쪽으로 노즐 내로 흡입되는 것을 방지하기 위해 상기한 바와 같이 노즐의 단부에 배치될 수 있다. 용도의 성질에 따라 다르게 상이하게 배열된 노즐 중 어느 하나가 적소에 나사로 조여질 수 있다.

제11도에 도시된 바와 같은 다른 실시태양에 있어서,폴리카르보네이트 또는 유사한 내파쇄성 물질로 제조된 투명 챔버(18)은 나사식 조립을 통해 건(gun) 의 목부(18)의 단부에 부착될 수 있다. 진공을 유지시킬 수 있는 이 장치는 측벽(154) 및 밑판(156) 사이에 밀봉을 유지시키기 위해 고장(153)에 끼워 맞춘 O형-고리(152)를 갖는다. 2개의 부분, 즉 나란하게 맞물려 있을 수 있고 O형-고리(160)에 의해 계면(18)에 밀봉될 수 있는 상반부(156) 및 마찰 조립될 수 있고 적소에 물려질 수 있고 O형-고리 밀봉(152)에 의해 밀봉될 수 있는 밑판(158)으로 구성된다. 이 방법으로, 챔버는 패트리판(158) 또는 임의의 소형 시료의 삽입을 위해 용이하게 개방될 수 있다. 이 시료 챔버는 벤치 상부 실험실법에 사용할 수 있다.

제12도에서 볼 수 있는 바와 같이 큰 동물 또는 큰 표면으로 작업하기 특히 적합한 계면의 별도의 실시태양이 제공되어 있다. 이 실시태양은 입자의 발진 지점에서 표적 충돌 지점까지의 거리를 최소화시키면서 표적(42)로부터의 최대 통기 및 기체 분산의 굴절을 허용한다. 이 실시태양에 있어서, 배열은 제1도 및 제2도에 도시한 것과 실질적으로 동일하며, 하우징(14)의 하반부가 테이퍼형이 아닌 일정 직경의 나사형 노즐 삽입부(160)를 갖는다는 것이 유일하게 다른 점이다. 그러나, 필요할 경우 챔버(14')과 함께 사용할 수도 있다. 역 하우징 형태의 대기 챔버(164) 및 커버(170)은 하우징(14')의 바깥 부분상에 조립되며, 하우징(14')의 말단 주위는 대기 챔버(164)의 안쪽으로 플랜지를 붙힌 2개의 부품 사이에 포착된 그로밋(grommet)(162)에 의해 밀봉된다. 대기 챔버(164)의 저부 또는 커버 부분은 돌출 및 비교적 견고한 부분으로서 제11도의 경우에서와 같이 대기 챔버와 한가지로, 폴리카르보네이트 또는 유사한 내파쇄성 물질로 형성될 수 있다. 돌출 부재(170)은 하우징(14')의 축(11)을 따라 놓여있는 중앙 부분에 구멍(172)를 형성하며 스냅-인 스크링(174)가 표적 조작이 대기 챔버내로 흡입되는 것을 방지하도록 배열된다. 돌출 부재(170)은 적당한 나사(도시되지 않음)에 의해 대기 챔버에 고정될 수 있다. 밀봉을 제공하도록 고랑(177)에 배치된 O형-고리(176)은 진공을 유키시킨다.

배플판(178)(제13도)은 돌출 부재상에 배치되며 충분한 개구 및 대부분의 기체 충격파가 표적(42)를 빗겨나서 굴절되게 하기 위한 화살표(182)로 표시된 영역을 갖는다. 제13도는 제12도의 절선 13-13을 따라서 도시된 단면도이다. 그로밋(162)는 대기 챔버(164)가 하우징의 축을 따라 미끄러지게 함으로써 기체 충격파로부터의 표적의 거리를 조정할 수 있다. 배플(178)은 아래쪽의 오리피스 영역을 빗겨나서 측방으로 기체의 흐름 및 통기를 촉진하여 뒤쪽의 접근 입자 쪽으로서 기체의 굴절 또는 점성 장애물로 인한 입자의 탈가속화가 생성될 수 있는 구멍 영역내에 후진 기체가 갇히는 것을 방지시킨다. 배플판은 기체 및 기체 충격파의 흐름을 아래쪽 표적 영역을 빗겨나도록 전환시킨다.

[작동]

작동시 표적(42)이 세포인지 또는 조직인지를 선택하고 준비한다. 가능한 세포 플레이팅(plating), 모발의 제거, 조직의 외과적 노출 등을 제와하고 특별한 준비는 필요없다. 이를 위한 특정 방법은 본 발명의 일부를 형성하지 않는다. 표적 및 목표를 기초로 최적 포사체 형태, 양 및 크기를 선택 및 준비하고 적소에 충전시키며 바람직한 목부 어셈블리 배열을 선택하고 적당히 배치한다. 최종적으로, (22)에 바람직한 기체압력을 저장한다. 표적 및 목적에 가장 잘 맞는 계면 어셈불리(18)을 선정하고 고압 막을 적소에 밀봉하고 하우징을 폐쇄 및 밀봉시킨다. 이어서, 고압 챔버(12)를 가압시키고, 계면 어셈블리에 적절한 위치에 배치된 표적 및 기체 환경 또는 비행 대역내 봉입물의 진공 정도를 정한다. 솔레노이드는 단위체가 기체 충격을 생성하도록 활성화시킨다. 이어서, 진공을 풀고 고압 부품에 대한 압력을 제거하고 필요에 따라 이 고정을 계속한다.

DNA 코팅 입자 또는 용액 중의 DNA와 같은 생물학적 입자의 특별한 제조 방법음 물 또는 기체 비말동반에 사용되는 에탄올 중에 용해시킨 슬러리로서 충전하는 것이 가장 좋으며, 반면에 다른 배열들에 있어서는 DNA코팅된 입자를 충전하고 막의 표면의 말단 변부상에 전착시키고, 에탄올 중에 현탁시키고 충격전에 건조시키는 것이 가장 좋다. DNA코팅된 입자의 특별한 제조 방법은 본 발명의 일부를 형성하지 않는다. 본 명세서에서 사용된 입자라는 용어는 생물학적 물질 그 자체 또는 입자상에 코팅된 생물학적 물질 모두를 포함한다. 오늘날 사용되는 임의의 공지된 선행기술을 사용할 수 있다. 예를 들면, 아그라세투스(Agracetus)의 특허 출원, 또는 샌포드 등 또는 클레인 등에 의해 기제된 것들이 사용될 수도 있다.

본 발명의 다른 실시태양은 제3도에 도시되어 있다. 이 도면에는 제1도 및 제2도와 관련하여 기제된 건의 다수의 필수 부품이 도시되어 있고 제1도의 및 제2도의 부품에 대응하는 부품에는 더블 프라임 참고 부호를 부여하고 있다. 제3도의 실시태양 사이의 주요한 차이는 크기가 작아졌고 외과적 이용에 있어서 그의 파지를 손쉽게 하기 위해 권총 손잡이(206)을 갖는 다는 것이다. 손으로 잡을 수 있는 권총 손잡이(206)은 몇몇 밸브(28)(30)(200) 솔레노이드 작동 프라임(48)에 따라서 조절하는 스위치(204)에 제공되어 있다.

노즐 부분(18), 즉 목부(16)은 제1도 및 제2도의 목부(16)과 유사하며 여러 가지 디스크, 스크린 및 기타 제5도 내지 9도에서 도시한 바와 같은 것들을 수용할 수 있도록 내부에 나사가 나있다. 도시된 장치에는 동물 조직에 직접 사용할 수 있도록 하기위한 추가 삽입부가 제공되어 있지 않다. 도시하지는 않았지만 제10도의 항목(148)로 도시된 유형의 제지 스크린이 사용될 수 있다. 또한, 이 장치는 진공 조절용 밸브(200)를 함유하고 있으며 단위체에 힘을 공급하기 위한 라인(202)는 기체 공급원(20) 및 진공 펌프(72)로부터 고압을 수용하기 위한 아답타이다. 어쨌든 작동은 제1도 및 제2도와 관련하여 기재된 것과 동일하며 추가로 설명할 필요가 없다.

본 발명의 냉각 기체 충격파 생성기는 델라웨어주 월밍톤시 소재의 이. 아이. 듀우판 드 네모아 내드 캄파니사에 의해 현재 시판되고 있는 PDS-1000 내에 사용된 고온 기체 충격파 생성기에 개장될 수 있다. PDS-1000은 제14동의 단면으로 하우징(210)으로 도시된 2개의 원통형 챔버 장치이다. 장치의 상부 및 하부는 진공원(140)에 접속되어 있다. 표적은 앞문이 열린 후 미끄로져서 챔버로 들어갈 수 있도록 플랫폼(220) 상에 배치되어 있다. 장치의 상부에는 고온 기체 충격파를 생성하기 위해 사용된 약통을 직접 통과시키는 중앙 개구가 있다. 이 단위체의 약통 장치를 제거하고 기체 충격파 생성기(12)로 대체시킨다(제2도). 충격파 생성기 상의 나사(56)은 PDS1000의 통상의 장벽 어샘블리가 적소에 고정된 브라켓(bracket) 의해 적소에 고착된 평판 디스크형 판(214) 및 (216)에 맞물리도록 나사가 나 있다. 이 어셈블리는 고압 기체 공급원과 연결되기 때문에 조작할 수 있는 방법이 제한된다. 따라서, 판은 파라미터 주위의 복수 노치(notch, 도시하지 않음)를 가질 수 있으며 결과 이 노치들은 가장 편리한 다수의 회전 지점에서 적소에 고차될 수 있다. 판(214') 및 (216)의 제2의 세트는 나사(218)에 의해 아래쪽 판(214) 및 (216)에 고정된다. 그러나, 판(214') 및 (216')은 같은 방식으로 거꾸로 배치되어 있다. 기체 충격파 생성기는 막(38)(제2도)을 대체시키는 것이 바람직할 경우 제거 및 역전될 수 있다. 이는 고압 막(38)의 변화를 크게 촉진시킬 수 있다. 고압 기체 충격파 생성기의 모든 다른 일면은 본질적으로 제1도 및 제2도와 관련하여 앞서 기술한 것과 동일하 종류이다. 챔버(201)은 앞문이 열이면 본 질적으로 제1도 및 제2도와 관련하여 앞서 기술한 것과 동일한 종류이다. 챔버(210)은 앞문이 열리면 챔버(210)으로 미끄러져 들어갈 수 있는 윗판(220)을 갖는다. PDS-1000 내지 정지 판 어셈블리를 정상으로 붙들고 있는 판(210)은 전형적으로 기소(82) 및 (80)(제2도)을 포함한 목부 어셈블리(16)에 의해 본 발명에 따라 대체된다.

더욱 바람직하기로는, 목부 어셈블리(16)은 제4도에 도시된 제거가능한 삽입부(100)를 함유한다. 따라서, 목부는 간단하게 앞에서 정지 판 어셈블리가 있는 플렛폼 내에 적하될 수 있으며 이 플랫폼은 폭발 챔버(210)의 상부 및 하부 사이에 밀봉되어 격막으로서의 그의 기능을 계속한다. 챔버의 하부는 앞에서와 같이 표적 챔버로서 제공되며 표적은 트레이(212)로 도시되어 있다. 그후, 이 장치의 조작은 전술한 것과 실질적으로 동일하다.

상기 방법 및 장치는 식물, 미생물 및 동물 범위내에 여러 가지 상이한 살아 있는 세포 및 조직을 형질 전환(또는 약물의 전달)시키는데 사용될 수 있다. 상기 배열은 와과적 용도 및 큰 유기체용 손으로 잡을 수 있는 프로브 또는 시험관내 배양 및 기타 실험실용 비이동성(만곡부가 붙박힘) 장치로서 사용하기에 적당하다. 냉각 충격파 공급원은 살아있는 유기체를 함유한 입자를 가속시키는 함유유도하는데 사용된다. 충격파 공급원은 진공을 유지시킬 수 있는 하우징 내에 봉입된다. 진공은 기체 충격으로 발생되는 심한 소음으로부터 작업자의 귀를 보호하는 동시에 장치의 사용을 용이하게 하고 생성된 기체 충격파에 최대 팽창 속도를 촉진한다. 최종적으로 표적은 그 자체로 가능한 치명적인 충격으로부터 보호한다.

장치는 극단적인 가열없이 막파괴를 통해 또는 유사한 수단으로 격렬하고 본질적으로 순간적인 기체 충격을 생성할 수 있으며 주어진 부피의 고압 챔버를 통기 및 압력 조절로 충격파의 강도 및 속도가 임의의 입자의 성질의 탄도학적 목적에 적당한 스피드로 미세포사체를 가속시키기에 적절하게 된다. 이와 같은 장치는 동시에 기체 충격으로 사용자를 보호하고 표적 세포 또는 조직에 대한 기체 충격의 영향을 줄이고 보다 양호한 비행 특성을 위해 개선된 내부 기체 환경을 사용하는 하우징을 포함한다. 또한 이와같은 하우징은 흠없는 큰 유기체의 탄도학적 처리를 위해 표피, 피부 또는 외과적으로 노출된 조직에 노즐 또는 대기 챔버 직접 가압시키는 비교적 소형의 손으로 잡을 수 있는 권총 또는 막대배열을 허용한다.

장치의 목부는 고정된 막으로부터 포착 막, 파괴 막, 비행 디스크 및 기체 비말동반에 걸친 상이한 가속법으로 장치를 작동하도록 여러가지 상호 교환 할 수 있는 어셈블리를 제공한다.

표적의 계면 대역은 가속된 입자가 표적까지 그의 궤도를 따라 비행하는 큰 동물에서 작은 동물에 이르기까지 시험관내 이용에 있어서 상이한 용도에 도움을 주는 상호 교환성 계면을 제공한다. 이 계면 대역은 입자가 기체 또는 진공 통과하는 것에 있어서, 표적 까지의 비행 거리 표적과 충동하기 전 기체 충격의 소산 및 표적의 물리적 안정화에 유연성을 제공한다.

간략하게, 이 장치 및 방법은 비교적 안전 고도의 응용성 및 반복적인 결과를 제공하는 유연성 형질전환 장치를 제공한다. 이 장치는 이동성이고 적당한 삽입부를 사용할 경우 보다 적은 표적 손상을 얻는다. 또한, 응집된 입자의 분쇄에 따라 보다 양호한 입자 분배 및 분산을 제공한다.

[실시예 ]

[실시예 1]

본 발명에 따라 제작된 생물학적 물질을 함유하는 입자를 세포 및/또는 조작의 표적에 도입시키는, 냉각 기체 충격파를 사용하는 원형 장치(제1도 및 제2도)를 효모 세포를 형질 전환시키는데 사용하였다. PDS-1000을 사용하여 생성된 다수의 형질 전환된 콜로니 및 이 형질전환된 콜로니의 분산 패턴을 비교하였다. 현재 이 장치는 델라웨어주 월밍톤 소재의 이. 아이. 듀우판 드 네모아 앤드 캄파니사 제품 PDS-1000으로서 시판되고 있다. 화약 추진 장치는 생물학적 물질로 코팅된 미세포사체를 추진시켜 운반시킨다. 미사포사체는 중앙 구멍에 끼워진 정지판에 부딪치고, 정지 판은 미세포사체를 표적에 부딪히기 전에 미세포사체를 정지시키고, 미세포사체는 구멍을 통과하여 표적에 충격을 가한다.

효모 추출물 5g, 펩톤 10g 및 아데닌 0.025g을 증류수 900ml에 첨가하여 배양 배지(액체 YEP 배지)를 제조하였고, 별도의 글루코스 20g, 증류수 100ml에 첨가하고, 두 용액을 각각 고압솥으로 처리하고 이어서 두 용액을 혼합하였다. 원배양물로부터 효모 세포의 콜로니를 취하고 액체 YEP 배지 50ml를 함유하는 250ml플라스크에 넣었다. 효모 세포 및 액체 YEP배지를 함유하는 250ml 플라스크를 150RPM의 속도로 회전하는 진탕기 상에 올려놓고 37℃에 72시간 동안 정지 상으로 배양시켰다. 이어서 세포를 원심분리시켜 펠릿으로 만들고 상징액을 버리고 세포를 물 10ml중에 재현탁시켰다. 600nm에서 현탁액 광학도 밀도를 측정하여 세포의 농도를 결정하였다(1단위체 당 약 2¹⁰개 세포/ml). 아미노산이 없는 효모 질소 기재3.35g, 우라실 0.235g을 떨어뜨린 아미노산 예비 배합물(아데닌 0.4g, 트립토판0.4g, 히스트딘 0.4g, 아르기닌 0.4g, 메티오닌 0.4g, 티로신 0.6g, 로이신 1.2g, 리신 0.6g, 페닐알라닌 1.0g 및 트레오닌 4.0g의 D 및 L형을 연마 및 혼합하여 제조됨, 혼합물은 실온에서, 단단히 밀봉한 암색병에 보관하였다). 아가 7.5g 및 각각의 최종 농도 0.75M의 소르비톨 및 만니톨을 첨가하여 배양 배지(우라실 적하 배지)를 제조하고, 별도로 글루코스 10g을 증류수 50ml에 첨가하고 두 용액을 고압솥으로 처리한 다음 고압솥으로 처리된 두 용액을 혼합시켰다. 상기 우라실 적하된 배지를 함유하는 페트리 접시 상에 10⁸개 세포를 살포하였다.

펜실배니아주 투완다 소쟈의 GTE, Hawes St. 로부터 입수한 M-10 텅스텐 입자에 에스. 에이. 죤스톤( S. A. Johston), 알. 부토우(R. Butow), 케이. 샤크(K. Shark) 및 제이. 씨. 샌포드(J. C. Sanford)등에 의헤 문헌(Mitochondrial Transformationin yeasT by Bombardment with Microprojectiles,: 1538-1541(1988)에서 기재된 방법을 사용하여 플라스미스 DNA YEP 352를 코팅시켰다. 형질 변형시킨 DNA 5㎕(10mM 트리스 염산염 및 1mM 에틸렌디아민테트라 아세트산 중의 형질변환시킨 DNA 1㎍/ml)를 M-10 텅스텐 입자(60mg/1㎕(물)의 현탁액 25㎕와 혼합시켰고, 여기에 2.5M염화 칼슘 25㎕ 및 0.1M스페르미딘 5㎕를 첨가시켰다. 이 혼합물을 실온에서 10분 동안 가라앉혔다. 이어서, 혼합물을 원심분리시키고 상징액을 10㎕만 남기고 나머지는 모두 버렸다. 충격을 준비하기 위해 펠릿으로 만든 미세포사체를 잔류 용액 10㎕ 중에 현탁시켰다. 충격을 위해 현탁액 3㎕를 미세포사체의 팁 상에 올려놓았다.

동일 방법으로 본 발명의 장치에 사용하기 위한 미세포사체를 준비하고, 이어서 추가로 입자를 70%에탄올 용액 중에 재현탁시켜 처리하고 세척한 미세포사체를 원심분리시켜 펠릿으로 만들었다. 세포 내 도입(충격)을 준비할 때, 펠릿으로 만든 코팅된 미세포사체를 100%에탄올 용액 10㎕중에서 재현탁시켜 현탁액 3㎕를 막 위에 올려놓고 전개시켜 직경 약 5nm의 평평한 층을 생성시켰다. 에턴올을 실온에서 증발시켜 건조 분말이 남았다.

세포를 코팅된 미세포사체를 충격을 가하고 같은 날 이들을 우라실 적하된 배지를 함유하는 페트리 접시상에 전개시켰다. 세포에 PDS-1000를 사용하여 충격을 가하였다. 상부 셀프(shelf) 및 저부 셀프 위치 모두에 표적 표적으로 사용 하였다. 또한, 본 발명의 포착 막, 파괴 막 및 기체 비말동반의 실시태양, 작동부분에서 기재한 방법 및 제5,7도 및 제8도에서 도시한 방법을 세포에 충격을 가하였다. 탱크 소스에서 고 진공 조절기를 사용하여 바람직한 기체(혤륨) 압력을 선정하고 표적 주위의 진공을 상기 표준 밸브를 사용하여 조절하였다. 표적은 본 발명의 바람직한 실시태양의 상세한 설명 부분에서 하였고 제10도에 도시한 바와 같이 진공 펌프에 연결된챔버내에 넣었다.

표 1은 본 발명의 장치 및 화약 추진 장치를 사용하여 형질전환된 콜로니의 수를 비교하고 있다. 결과는 양쪽 모두 34atm 및 68atm(500 및 1000psi)에서, 파괴 막실시태양의 사용은 화약 추진 장치보다 역 2 내지 3배 많은 콜로니를 생성하는 것으로 나타났다. 또한, 본 발명의 장치는 페트리 접시의 표면 위에 더욱 넓고 휠씬 다수의 콜로니 분산을 생성하였다. 화약 추진 장장치는 전형적으로 형질 전환된 콜로니가 나타나지 않는 직경 약 1cm의 사망 구역이 존재하고 아가는 종종 파열에 의해 부풀에 오른 콜로니 분산을 생성하였다.

[실시예 2]

실시예1에 기재된 것과 같은 원형 장치를 사용하여 바실러스 메가테리움() 박테리아를 형질전환시켰다. 생성된 형질전환된 콜로니의 수 및 형질전환된 콜로니의 분산 패턴을 PDS-1000을 사용하여 얻은 것과 비교하였다.

루리아-베르타니(LB : Luria-Bertani)브로쓰 배지 50ml(트립톤 10g, 효모 추출물 5g 및 NaCl 5g을 NaOH로 pH를 7.5로 조정한 증류수 900ml에 첨가하고, 전체 부피가 1000ml가 되도록 추가로 증류수를 첨가하고 고압솥으로 처리함)에 오하이오주 콜롬부스 소재 주립 대학의 Bacillus Gednetic Stock Center로부터 구입한 바실러스 메가케리움 균주 7A17세포의 루프를 접종시켰다. 접종된 배양액을 2500RPM 의 회전 진탕기에서 24시간 동안 인큐베이트시켰다. 배양액을 원심분리시키고 40ml의 상징액을 버리고 세포 펠릿을 잔류 상징액 중에 재현탁시켰다. 60nm에서 현탁액의 광밀도를 측정하여 세포의 농도를 결정하였다. 트립톤 10g, 효모 추출물 5g, NaCl 5g 및 아가 15g을 NaOH로 pH를 7.5로 조정한 증류수 900ml에 첨가하고, 추가로 전체 부피가 1000ml가 될 때까지 증류수를 첨가하고, D-소르비톨 182.2g 및 D- 만니톨 136.6g을 첨가하고, 고압솥으로 처리하고 최종농도가 50㎍/ml가 될 때까지 메티오닐 무균 용액을 첨가하고 D,L-메티오닌(12.5mg/ml)의 무균 용액 4ml을 첨가하여 고상 배양 배지(고상 LB 배질 + 메티오닌 및 오스모티쿰)를 제조하였다. 10⁸개의 세포를 고상 LB 배지+메티오닌 및 오스모티쿰을 함유하는 페트리접지 상에 분산시켰다. 세포를 충격 전에 아가 상에서 건조시켰다. 이 배지를 바실러스 메카테리움의 형질전환 효과를 기초로 오소모티쿰 농도(소르비톨 및 만니톨)와 관련하여 관련하여 최적화시켰다. 오스모니쿰의 농도의 증가는 충격 직우 세포의 생존에 도움을 줄 수 있다.

펜실베니아주 투완다 소재 GET, Hawes St. 부터 구입한 M-5 텅스텐 입자를 샌포드 등에 의해 기재된 방법 및 실시예 1에서 기재한 방법을 사용하여 오하이오주 콜룸부스 소재의 Becillus Genetic Stock Center로 부터 구입한 플라스미드 DNA DNA pUB110으로 코팅시켰다. 플라스미드 pUB110은 4.5kb의 크기이었고 항생물질 가나마이신(Km) 및 네오마이신(Nm)에 내성을 가졌다. 플라스미그 pUB110을 티, 마니아티스(T. Maniatis), 이. 에프. 퍼취(E. F. Firstch) 및 제이. 삼브록(J. Sambrook)의 문헌(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1982)에 기재된 방법을 사용하여 바실러스 서브틸리스() 균주 1EG의 24시간 배양액으로부터 단리시켰다. 이어서, 플라스미드 pUB110을 세슘 클로라이드-테티듐 브로마이드 구배를 사용하여 정제시켰다.

또한, 본 발명의 장치와 함께 사용하기위한 미세포사체를 샌포드 등의 방법을 사용하여 제조하였다.

세포를 샌포드 등의 방법에 의해 PDS-1000으로 충격을 가하였다. 상기 작동 부분에 기재되고 제5도, 제7도 및 8도에 도시된 방법을 사용하여 본 발명의 포착 막, 파괴 막, 비행 디스크 및 기체 비말동반의 실시태양을 시험하였다.

상기 배지(고상 LB 배지+메티오닌 및 오스미티쿰)상에 정지 세포를 분산시키고 샌포드 등의 화약 추진 장치 또는 본 발명의 장치로 충격을 가하고, 이어서 중첩 배지 15ml(D,L-메티오닌 4ml 및 카나마이신 설페이트 2ml(25mg/ml용액)를 최종 농도가 각각 50㎍/ml가 되도록 고압솥 처리된 LB브로쓰 배지 1ml에 첨가하여 제조됨). 중첩 배지를 경화시킨 후 페트리 접시를 37℃로 유지시키고 72시간 후 형질전환 수를 산정하였다. 형질전환된 바실러스 메가테리움 세포는 항생물질 마나마이신 및 네오마이신 내성이 있었다. 따라서, 형질전환은 카나마이신 존재하에서 배양될 수 있는 능력으로 분별하였다.

10개의 형질전환계를 단리시키고 고상 LB배지 상에서 메티오닌 및 카나마이신(10㎍/ml)로 스트리킹시켰다. 카나마이신 농도는 현질전환체를 단리시킨 충격배지 및 중첩 배지를 함유하는 페트리 접시의 카나마이신의 농도와 거의 동일하였다. 플라스미드 DNA를 10개의 형질전환체로부터 단리시켰다. 정제된 플라스미드 DNA를 제한 효소 BamH1내에서 절단시키고, 이어서, 아가로스 겔 전기용동에 의해 가시화시켰다. pUB 110을 BamH1로 한 부위를 절단시켰다. 각각의 형질전환체로 침지된 플라스미드 DNA를 Hind III로 침지시킨 람브다어셈블리파아지 및 Hind II 및 ECoR1로 침지시킨 람바다-파아지인 공지된 표식자와 비교하고 또한, BamH1으로 침지기킨 바실러스 서브틸리스 1E6으로 부터 단리시킨 pUB110 플라스미드와 비교하였다. 형질전환체로 부터 침지된 플라스미드 DNA는 크기(4.5KB)에서 BamH1로 침지시킨 플라스미드 pUB110과 동일하였다. 따라서, 현질전환의 여부를 형질전환체로서 선별된 세포들에서 확인하였다.

바실러스 메카테리움에 화약 추진 PDS-1000장치 및 본 발명의 장치로 충격을 가한 결과를 표 2에 나타냈다. 표3 및 표4는 본 발명의 여러 실시태양을 사용한 충격 시험 결과를 나타내고 있다.

PDS-1000

16개의 페트리 접시에서 콜로니 없었음

대조 작업 :

1) 세포를 상기 각각의 실시태양을 사용하여 순수 입자로 충격을 가하기 전 DNA와 혼합시켰다(충격을 가한 18개의 페트리 접시, 형질전환된 콜로니가 발견되지 않음).

2) 세포를 일련의 충격없이 DNA코팅된 입자와 혼합하였다(18개의 페트리 접시, 형질전환된 콜로니가 발견되지 않음).

대조 작업 :

비처리된 세포, DNA를 혼합하고 순수 입자로 충격을 가한 세포, 순수 입자로 충격을 가하고 이어서 입자와 DNA를 혼합한 세포, DNA를 혼합하고 이어서 혤륨 충격(입자 없음)을 가한 세포, 및 혤륨 충격을 가하고 이어서 DNA를 혼합시킨 세포, 20개의 페트리 접시를 시험하였고 혈질전환된 콜로니는 발견되지 않았다.

표 2는 본 발명의 다양한 실시 태양을 사용한 경우는 여러개의 형질전환체가 관찰되었고, 반면에 PDS-1000으로는 형질전환체가 관찰되지 않았음을 나타내고 있다. 표 2,3 및 4는 본 발명의 장치가 종종 비교적 고율(콜로니수/페트리 접시)로 형질전환체를 성공적으로 생성하는데 있으며, PDS-1000으로는 불가능 함을 나타냈다. 또한, 형질전환을 최적 조건하에서 최대 수천 이상이 가능하다. 이와 같은 고 형질전환율을 얻기 위한 바람직한 조건으로는 15시간된 바실러스 배양액의 사용 10⁸개 세포/페트리 접시의 세포 밀도, 900psi에서 비행 디스크 실시태양의 사용, 및 세포의 삼투압 지지체로서 1.0M소르비톨 및 0.75M 만니톨을 함유하는 세포 배양 배지가 포함된다. 이들 조건하에서 본 발명은 샌포드 등의 화약 추진 장치보다 약 1000배의 펨 디스크 당 형질전환 수의 증가를 제공하였다.

[실시예 3]

본 발명에 따라서 제작된 생물학적 물질을 함유하는 입자를 세포 및(또는) 조작의 표적으로 도입시키는 원형 장치를 사용하여 NT1 니코티아나 타바쿰() 담배 세포를 형질전환시켰다. 생성된 형징전환된 세포의 수 및 형질전환된 세포의 분산 형태를 PDS-1000을 사용하여 얻은 것과 비교하였다.

NT1니코티아나 타바쿰 세포를 회전 진탕기 상에서 액체 배양 배지 중의 현탁액으로서 배양시켰다(다니엘(Daniel)등의 PANS, 87 : 88-92, 1990). NT1 세포 계통을 워싱톤 대학에서 지. 안(G. An)으로부터 구입하였다(다니엘 등의 PASAS, 87 : 88-92-1990). NT1 세포는 식물로의 재생 능력은 잃었으나 그의 균일성 및 급속 배양 때문에 유용한 모델 시스템이다. 이 세포들은 일반적으로 각각 3 내지 4개 세포의 군락으로 발견되었다. 충격 준비시 흡인 여과기를 사용하여 여과지 디스크 상에 세포 현탁액 1 내지 5ml를 수집시켰다.

펜실파니아주 투완다 소재의 GTE, Hawes St. 로 부터 구입한 M-10텅스텐 입자에 형질전환 DNA로서 플라스미드 DNA pIB505를 티. 엠. 클레인, 엠. 이 프롬(M. E. Frmn), 에이. 와이정거(A. Wessinger), 디. 톰스(D. Tomes), 에스. 쉐아프(S. Schaaf), 엠 슬리텐(M. Sleeten) 및 제이. 씨. 샌포드의 문헌( : 4305-4309. 1988), 티. 엠. 클레인. 이. 프롬. 티. 그라드지엘(T. Gradziel) 및 제이. 씨. 샌포드의 문헌(: 559-563, 1988), 티. 엠. 클레인. 이. 씨. 하퍼(E. C. Harper), 제트, 스바브(Z. Svab), 제이. 시. 샌포드, 엠. 이. 프롬. 피. 말리가(P. Maliga)의 문헌(: 8502-8503, 1988), 및 샌포드 등에 의해 기재된 방법을 사용하여 코팅시켰다.

본 발명의 장치에 함께 사용하기 위한 미세포사체를 실시예 1과 동일한 방법을 사용하여 제조하였다.

β-글루쿠로니다제 유전자(GUS)를 리포터 유전자를 사용하고, 식물 세포 내형질전환율을 분석하였다. 대장균으로 부터 GUS 유전자를 클로닝시켰다(알. 에이. 제퍼슨(R.A. Jefferson) 등의 EMBO, 6 : 3901-3907. 1987). GUS유전자는 단백질 β-글루쿠로니다제를 코오드하였고, 이는 식물 내에 정상적으로 존재하지 않았다. GUS로 형질전환시킨 식물 세포는 기질 x-gluc의 존재하에 푸른색으로 변화된다. GUS분석을 사용하여 충격을 가한 NT1 식물 배양액 내 순간 유전자 발현을 검출하였다. 충격 후 2일 만에 세포를 착색하였다. 착색 방법은 맥카베(McCabe) 등의 문헌(: 923(1988)에 기재된 방법을 사용하여 x-gluc용액 1ml를 세포에 첨가하는 것으로 이루어져 있다. 용액은 DMSO, 10mM EDTA, 100mM 인산나트륨, 0.5mM 칼륨 페로시아나이드 및 01.% 트리톤 X-100중에 용해시킨 0.5mg/ml x-gluc 로 이루어져 있었다. 이 세포를 37℃에서 24시간 동안 인큐베이트시키고 이어서 푸른 점의 수를 기록하였다.

샌포 등의 문헌, 티. 엠. 클레인. 엠. 이. 프롬. 에이. 와이싱거, 디. 톰스(D. Tomes), 애스. 쉐이프, 엠. 슬라틴 및 제이. 씨. 샌포드의 문헌( : 4305-4309. 988) 및 티. 엠. 클레인, 이. 씨. 하퍼(E.C. Harper),제트. 스바브, 제이. 씨. 샌포드, 엠. 이. 프롬, 피. 말미가의 문헌( : 8502-8503, 1988)에 의해 기재된 PDS-100로 충격을 가하였다. 본 발명의 비행 디스크 및 기체 비말동반 실시태양을 상기 작동부분에 기재되고 제5도 , 7도 및 8도에 도시된 방법을 사용하여 시험하였다.

표 5는 PDS-1000 및 본 발명의 장치를 사용하여 NT1세포의 형질전환의 비교를 도시하였다.

표 5는 본 발명의 장치가 PDS-1000에 의해 제공된 기체 충격파 장치와 비교하여 보다 우수한 형질 전환율을 제공함을 나타내었다.

NT1 담배 세포의 형질 전환에서 기재된 동일 방법 및 플라스미드를 사용하여 복숭아의 배 유합조직을 형질전환시켰다. 복숭아 유압조직용 배양 배지(DKW 배지)는 4.4μM BAP, pH 5.8의 2%의 슈크로스, 및 아가(0.6-0.7%)또는 걸라이트(Girlite)(0.25%)로 이루어졌다. 복숭아의 유합조직에 USDA의 랄프 스코르자(Ralph Scorza) 박사에 의해 제공되었다. 독립 영향성이고 성장 조절제 의존성이며 계속해서 차세포를 생성할 수 있는 미숙 배로 부터 유도된 5년 배양물로 부터 복숭아 유합 조직을 취하였다. 이 경우 복숭의 유합 조직을 PDS-1000으로 3회 연속적으로 충격을 가하였다. 복숭아 유합 조직을 본 발명의 장치를 단 한번 사용하여 충격을 가하였다. 이 결과를 표 6에 도시하였다.

표 6은 본 발명의 장치가 단일 충격에서, PDS-1000로 3회 연속적 충격을 가하여 얻을 수 있는 것 보다 더욱 큰 유전자 전달율을 성취할 수 있음을 나타내었다. 또한, 분산의 균일성 및 덮는 면적의 양은 PDS-1000을 사용하여 얻는 것보다 질적으로 더 우수한 것으로 관찰되었다.

[실시예 4]

제1도에 도시된 바와 같은 원형 장치를 사용하였다. 생성된 형질전환된 세포의 수 및 형질전환된 세포의 분산 형태를 PDS-1000을 사용하여 얻은 것과 비교하였다.

펜실바니아주 투완다 소재의 GTE, Hawes St.로 부터 구입한 M-10텅스텐 입자를 샌포드 등의 방법을 사용하여 노스 케롤라이나주 더함 소재의 듀크 대학의 알. 에스 윌리암스(R. S. Williams)로 부터 구입한 플라스미드 DNA pHBluc로 코팅 시켰다. 플라스미드 pHBluc를 사용하여 시험관 내 및 귀, 피부 및 간의 관상 근 세포를 형질전환시켰으며 플라스미드 pHBluc는 puc19 기재 벡터내 사람β-악틴 프로모터에 융접된 나방 루시페라체 유전자를 함유하였다[올레웨드, 제이. 알(Olewet, J. r.)등의7 : 725-727(1987), 레아비트, 제이(Leaviti, J.)등의 Mot. Cell Biol. 4 : 1961-69(1984)].

본 발명의 장치에 사용하기 위한 미사포사체는 매사추세추스 단버스 마티 소재의 알프 죤슨(Alfa Johnson)으로부터 구입하였다.

미부화 병아리로 부터 관상 근세포를 준비하였다. 계란으로 부터 미부화 병아리를 제거하고 가슴 금육을 절개하여 제거시키고 시판 중인 용인, 염수 G의 소적 내에 위치시켰다. 근육을 잘개 썰고 이어서 염수 G 9ml, 10×트립신 용액 1ml(완충된 염수 중의 2.5% 용액)로 희석시켰다. 이 혼합물을 5분 동안 흔들고 이어서 혼합물을 피펫 내로 끌어당겨 진동시켰다. 이어서, 혼합물을 추가로 15분 동안 흔들고 여과하여 세포를 수집하였다. 이 세포를 CKI 배양 배지 20ml(L-글루타민 0.584g/l, 글루코스 1g/l, 중탄산나트륨 3.7g/l, 15% 말 혈청, 5% 미부화 병아리 추출물로 이루어진 통상적으로 제조된 Dulbecco's Modified. Eagles Medium) 20ml중에 재현탁시키고 계수하였다(미부화 병아리 추출물은 계란으로부터 병아리 100g 을 제거하고 목을 자르고 염화나트륨 121.12g/l, 염화칼륨 15.5g/l, 염화마그네슘 12.72g/l, 염화칼슘 7.8g/l, 이염기성 인산 나트륨 2g/l 및 일염기성 인산 나트륨 5.19g/l로 이루어진 배지 100ml중에 균질화시키고, 균질액을 할루로니다제(hyluronidase) 1000단위 첨가 후 1시간 동안 냉각실에서 교반시킴으로써 제조된다. 이 혼합물을 원심분리시켜 파편을 제거하고 상징액의 지질을 걷어내고 여과하여 살균하였다) 이어서, 세포를 1×10⁶개 세포수/1ml의 밀도로 50nm 페트리 접시 상에 분산시켰다. 관상 근세포를 충격 전에 5일 동안 방치하였다.

세포에 표준 방법을 사용하여 PDS-1000로 충격을 가하였다. 이 방법은 충격 직전 관상 근세포를 중첩한 액체 배지를 제거하는 것만 변형되었다. 본 발명의 포착 막 실시태양을 상기 조작부분에서 기재되어 제5도에서 도시된 방법을 사용하여 시험하였다. 충격를 가한 후 즉시 배지를 대체시켰다. 세포를 37℃에서 24시간 동안 인큐베이트시킨 다음 루시퍼라제 활성을 분석하였다.

루시퍼라제 활성을 분석하기 위해, 세포를 1ml 추출용 완충액(100mM 인산 칼륨 완충액, pH 7.8, 3mM 염화마그네슘 및 1mM DTT로 이루어짐)중의 플레이트에 비비고 원심분리시켜 펠릿으로 만들었다. 상징액을 제거하고 추출 완충액 10μl 및 용액 완충액50μl(pH 7.8의 0.25M 트리스 완충액 8.9ml, 대두 트립신 억제제 1.0ml(농도 10mg/ml)/아프로니틴 0.1ml로 이루어짐)을 첨가시키고 6초 동안 고주파 처리하여 세포를 용해시켰다. 세포 파편을 원심분리하여 펠릿으로 만들고 상징액의 루시퍼라제 활성을 분석하였다.

루시퍼라제 활성 분석은 루시퍼라제의 기질인 루시퍼린 존재하에 이 효소를 촉매로 하는 반응에 생성된 빛(광자)의 산출을 측정하는 것이다. 생성된 빛의 영(광자수)은 조직으로부터 추출된 루시퍼라제의 양에 비례하며, 이는 각각 형질전환된 세포의 수 및 각각 형질전환된 세포에 의해 생성된 루시퍼라제의 양에 의해 결정된다. 루시퍼라제 활성이 크면 클수록 형질전환은 더욱 더 효과적이다. 쇼트(shot) 면적 당 광자수는 시판중인 정제된 루시퍼라제를 사용하여 표준 곡선을 전재시킴으로써 쇼트 면적 당 루시퍼라제의 피코그람수로 전환될 수 있다. 표7은 본 발명의 장치와 PDS-1000의 형질 전환 효과의 비교 결과를 나타낸다.

피크 루시퍼라제 발형 : 충격 하루 후 PDS-1000 및 봉의 비교

충격 부위로 부터 발현된 총 루시퍼라제(pg)

표 7은 본 발명의 장치가 단상근세포에 있어서 화약 추진 장치 보다 평균 약 11배 더 높은 루시퍼라제 활성 및 그로인한 형질전환을 생성하였음을 나타내고 있다.

다른 시험에서, 살아있는 조직의 원위치 형질전환을 위해 DNA로 미세입자를 코팅시키고 충격을 준비한 다음 PDS-1000을 사용하여 충격을 가하였다, 텅스텐 대신에 금 미세입자를 사용하였다. 사용된 금 입자는 직경 1 내지 3μl 또는 2 내지 5μl의 구이었다(알파(Alpha)사 제품, 제품 번호 제00766호로 시판 중임). 추가로 장치의 배열을 변형시켜 진공 챔버 대신에 노즐(제10도)을 미세입자가 작은 조직편을 향하도록 장치의 끝에 위치시켰다. 피부 및 귀의 조직에 있어서는 노즐을 진공 펌프에 연결시켜 미세 입자가 감압 분위기를 통해 이동되도록 하였다. 간 조직은 감압 분위기에 의해 손상되었으며, 따라서 감압 분위기를 사용하지 않았다.

본 발명의 장치에 사용하기 위한 미세입자는 매사추세츠주 댄버스 소재의 알파 죤슨 마티사로 부터 구입하였으며 또한 샌포드 등의 방법을 사용하여 제조하였다.

피부 및 귀의 충격을 준비하기 위해 동물을 마취시키고 탈모제로 충격을 가할 부위로 부터 모발을 제거하였다. 직경 약 6nm의 부위에 충격을 가하고, 이어서 동물을 마취로부터 회복시켰다. 24시간 내에 동물을 희생시키고 충격 부위를 전달하였다. 조직을 추출용 완충액 140μl, 용해용 완충액 50μl 및 2% NP-40 세제(시판 중임) 10μl의 혼합물에 담가서 부드럽게하였다. 이어서, 세포 파편을 원심분리시켜 펠릿으로 만들고 상징액으로 루시퍼라제 활성을 분석하였다.

간 조직을 형질전환시키기 위해 생쥐를 마취시키고 복부를 절개하고 간엽을 한 군데 드러냈다. 10mm의 부위에 충격을 가하였다(진공을 생성하지 않는 것을 제외한 피부 및 귀에서 같은 방법으로). 24시간 내에 동물을 희생시키고 충격 부위를 제거하고 추출용 완충액 200μl에 담가서 부드럽게하고 이어서 세포 파편을 원심분리시켜 펠릿으로 만들고 상징액으로 루시퍼라제 활성을 분석하였다.

표 8은 본 발명의 장치로 충격을 가한 간으로 부터 얻은 결과를 나타낸 것이다. 샌포드 등의 화약 추진 장치를 사용하여 간을 형질전환시키는 것을 불가능하였다.

Claims

표적측을 갖는 평면 캐리어 시트를 제공하는 단계, 세포의 표적을 제공하는 단계, 생물학적 물질을 함유하는 입자를 캐리어 시트의 표적측 상에 배치시키는 단계, 및 상기 시트에 순간적인 냉각 기체 충격파의 힘을 노출시켜 캐리어 시트를 떠난 입자를 가속화시켜 세포의 사망없이 입자를 세포의 표면을 관통하여 세포의 내부로 혼입시키는 단계로 이루어진, 생물학적 물질을 함유하는 입자를 세포의 표적에 도입시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 시트가 충격파로 팽창되나 파괴되지 않는 탄성 막이고, 상기 방법이 제지 스크린을 세포의 표적과 막 사이에 배치시키는 추가 단계를 포함하며, 상기 제지 스크린이 막이 상기 냉각 기체 충격파에 반응하여 충분히 팽창하기 전에 스크린에 대해 제지되어 입자가 스크린을 통과하여 표적에 이르도록 배치되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 시트가 탄성 막이고, 상기 냉기 기체 충격파가 막을 팽창 및 파괴시킴으로써 입자를 발진 응집파괴시키고 표적 세포의 넓은 영역에 분산시키는 추가 단계를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 시트가 비탄성이고, 상기 냉각 기체 충격파가 막을 팽창 및 파괴시킴으로써 입자를 발진, 웅집 파괴시키고 표적 세포와의 넓은 영역에 분산시키는 추가 단계를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 시트가 스크린인 방법.
제5항에 있어서, 충격파가 스크린을 통과한 후 충격파의 힘의 일부가 표적 세포를 빗겨나서 굴절되도록 충격파를 배플시키는 추가 단계를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 시트가 탄성 막이고, 평면 디스크가 디스크의 표적측 상에 배치된 입자와 함께 막의 표적측 상에 배치되고, 상기 충격파가 막을 팽창 및 파괴시킴으로써 디스크를 표적 세포를 향해 이동시키는 추가 단계를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 사기 시트가 탄성 막이고, 디스크의 표적측 상에 배치된 입자와 함께 막의 표적측 상에 배치된 평면 디스크를 갖고, 상기 냉각 기체 충격파가 상기 막을 팽창시키되 파괴시키지는 않도록 함으로써 디스크를 표적 세포를 향해 이동시키고, 세포를 가격하기 전에 디스크를 정지시키기 위해 장벽을 제공하는 추가 단계를 포함하는 방법.
가압 기체의 소스 및 기체의 소스와 관련하여 파괴성 막 밀봉을 제공하는, 표적측을 갖는 평면 캐리어 시트를 제공하는 단계, 세포의 표적을 제공하는 단계, 생물학적 물질을 함유하는 입자를 평면 캐리어 시트의 표적측 상에 배치시키는 단계, 순간적인 기체 충격파를 위해 밀봉을 파괴시켜 격렬하게 기체를 방출시키는 단계, 상기 시트에 순간적인 기체 충격파의 힘을 노출시켜 캐리어 시트를 떠난 입자를 가속시키고 세포의 사망없이 입자를 세포의 표면을 관통하여 세포의 내부로 혼입시키는 단계로 이루어진, 생물학적 물질을 함유하는 입자를 세포의 표적에 도입시키는 방법.
제9항에 있어서, 시트와 세포의 표적 사이에 장벽을 배치시키는 것을 추가로 포함하고, 입자를 표적 세포를 향해 이동시키는 장벽에 의해 제한될 때까지 표적 세포의 방향으로 시트가 지속되어 자유롭게 이동하도록 시트가 느슨하게 배치하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 시트가 이동하지 못하게 그의 모서리를 고정시킨 탄성 막이고, 막을 팽창시키되 파괴시키는 않음으로써 충격파로 부터 표적을 보호시키는 순간적인 기체 충격파를 생성하기 위해 밀봉을 기계적으로 파괴시켜 소스로 부터 기체를 급속 방출시키는 추가 단계를 포함하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 기체 충격파에 대한 반응으로 막이 충분히 팽창되기 전에 스크린에 대해 제지되도록 세포의 표적과 막 사이에 제지 스크린을 배치시키는 단계, 및 입자가 스크린을 통과하여 표적에 이르도록 하는 단계의 추가 단계를 포함하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 시트가 이동하지 못하게, 그의 모서리를 고정시킨 탄성 막이고, 상기 냉각 시체 충격파가 막을 팽창 및 파괴시킴으로써 입자를 발진, 응집 파괴시키고 표적 세포의 넓은 영역에 입자를 분산시키는 추가 단계를 포함하는 방법.
진공을 생성하기 위한 제1배기구(70), 주축, 이 축 위에 놓여 있는 제2배기구, 및 입자를 가속시키는 목부를 한정하며 하우징의 표적측 상에 위치한 제3배기구(16)을 갖는 진공을 유지시킬 수 있는 폐쇄 하우징(14), 제2배기구 내에 배치되고, 목부를 향해 배치되어 있고 파괴되어 충격파를 제공하는 파괴성 막(38)에 의해 밀봉된 부분을 가지며, 내부에 보관된 기체를 방출시켜 목부를 향해 기체 충격파를 제공하도록 제작된 고압 챔버(12), 및 고압 챔버에 의해 제공되는 충격파의 힘에 의해 제3배지구를 통해서 표적을 향해 가속시키기 위해 입자를 목부 내에 배치시키는 수단(8)으로 이루어진, 생물학적 물질을 함유하는 입자를 세포 및(또는) 조직의 표적에 도입시키는 장치.
제14항에 있어서, 상기 기체 충격파를 얻기 위해 기계적으로 파괴성 막(38)을 파괴시키는 수단(46)을 포함하는 장치.
제14항에 있어서, 배치 수단(80)이, 목부 내에 배치된 표적측을 갖는 캐리어 시트(110)을 포함하고, 입자가 캐리어 시트(110)의 표적측 상에 배치될 수 있게 함으로써 충격파의 힘에 의해 입자가 추진되어 표적에 이를 수 있도록 제작된 장치.
제14항에 있어서, 목부와 표적을 커플링시키기 위해 목부에 고정된 계면(18)을 포함하는 장치.
제16항에 있어서, 캐리어 시트(110)이 탄성이고, 캐리어 시트에 말단부를 붙들어 캐리어 시트를 목부 내에 고정시키는, 축을 따라서 여러 지점에 배치될 수 있는 고정 수단(82)를 추가로 포함하는 장치.
제18항에 있어서, 배치 수단(80)이 추가로 그의 모서리가 캐리어 시트와 표적 사이에 고정되어 있어 캐리어 시트의 이동은 제지하되 캐리어 시트가 충격파에 반응하여 부분적으로 팽창하는 것은 허용되는 스크린(120)을 포함하는 장치.
제16항에 있어서, 캐리어 시트(110)이 충격파에 반응하여 파괴될 수 있고, 캐리어 시트의 말단부를 붙들어 캐리어 시트를 목부 내에 고정시키는, 축을 따라서 여러 지점에 배치될 수 있는 고정 수단(82)를 포함하는 장치.
제20항에 있어서, 캐리어 시트가, 입자가 표적 세포에 인접하여 배치되어 있고, 자유롭게 비행할 수 있도록 목부에 느슨하게 고정된 평면 디스크(130), 및 탄성 캐리어 시트와 표적 사이에 배치되고 디스크는 정지시키되 입자는 표적까지 계속해가 이동시키도록 제작된 고정 장벽(132)를 포함하는 장치.
진공을 생성하기 위한 제1배기구(70), 주축, 및 이 축 위에 놓여 있는 제2배기구, 및 입자를 가속시키는 목부를 한정하며 하우징의 표적측 상에 위치한 제3배기구(16)을 갖는 진공을 유지시킬 수있는 폐쇄 하우징(14), 제2배기구 내에 배치되고 기체를 방출시켜 목부를 향해 기체 충격파를 제공하는 수단(12), 냉각 기체 충격파의 힘에 의해 표적을 향해 가속화시기 위해 목부 내에 입자를 배치시키는 수단(80), 및 목부를 표적에 커플링시키기 위해 목부에 고정된 계면(18)으로 이루어지고, 배치 수단이 목부 내에 배치된 표적측을 갖는 일회용 캐리어 시트(110)을 포함하고, 입자가 캐리어 시트의 표적측 상에 배치될 수 있게 하여 냉각 충격파의 힘에 의해 표적으로 추진될수 있도록 제작된, 생물학적 물질을 함유하는 입자를 세포 및(또는) 조직의 표적에 도입시키는 장치.
제22항에 있어서, 캐리어 시트(110)이 탄성이고, 캐리어 시트의 말단부를 붙들여 캐리어 시트를 목부 내에 고정시키며 축을 따라서 여러 지점에 위치될 수 있는 고정 수단을 포함하는 장치.
제22항에 있어서, 캐리어 시트(110)에 충격파에 반응하여 파괴될 수 있고, 캐리어 시트의 말단부를 붙들어 목부 내에 캐리어 시트를 고정시키며 축을 따라서 여러 지점에 위치될 수 있는 고정 수단(82)를 포함하는 장치.
제22항에 있어서, 추가로 계면이, 목부에 결합되어 있고 표적의 제한된 영역으로 입자를 통과시키도록 제작된 노즐(170), 및, 표적이 계면 내로 끌려들어가는 것을 방지하기 위해 계면의 노즐 내에 배치된 스크린(174)를 포함하는 장치.