ES2259846T3 - Promotores minimo y uso de los mismos. - Google Patents

Abstract

El uso de un constructo de ácido nucleico que comprende una secuencia codificadora que codifica un antígeno y una secuencia promotora que no está acoplada con su secuencia intensificadora natural y que está conectada operablemente a la secuencia codificadora, para la fabricación de un medicamento para su uso en la inmunización con ácido nucleico de un sujeto mamífero, donde dicho antígeno es un antígeno de un patógeno viral, bacteriano, parasítico o fúngico, o es un antígeno específico de tumores o un antígeno asociado con una enfermedad autoinmunitaria.

Description

Promotores mínimo y uso de los mismos.

Campo técnico

La invención se refiere a los campos generales de la biología molecular y la inmunología, y generalmente se refiere a reactivos útiles en las técnicas de inmunización con ácidos nucleicos. Más específicamente, la invención se refiere a formas truncadas de elementos promotores de la transcripción, a las moléculas de ácido nucleico que contienen tales elementos promotores, y al uso de reactivos que contienen tales moléculas de ácido nucleico para la inmunización con ácidos nucleicos.

Antecedentes

Las técnicas para la inyección de ADN y ARNm en tejido de mamíferos con fines de inmunización frente a un producto de expresión han sido descritas en la técnica. Ver, v.g., la Memoria de la Patente Europea EP 0 500 799 y la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.589.466. Se ha demostrado que las técnicas, denominadas aquí "inmunización con ácidos nucleicos", logran respuestas inmunitarias tanto humorales como mediadas por células. Por ejemplo, se ha demostrado que los sueros de ratones inmunizados con un constructo de ADN que codifica la glicoproteína de la envuelta, gp160, reaccionan con gp160 recombinante en inmunoanálisis, y se ha demostrado que los linfocitos de los ratones inyectados proliferan en respuesta a la gp120 recombinante. Wang y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4156-4160. De un modo similar, ratones inmunizados con un gen de la hormona del crecimiento humana (hGH) mostraban una respuesta inmunitaria basada en anticuerpos. Tang y col. (1992) Nature 356:152-154. Se ha demostrado que la inyección intramuscular de ADN que codifica la nucleoproteína de la influenza conducida por un promotor de mamífero logra una respuesta de los CTL CD8+ que puede proteger a los ratones de la sensibilización mortal con el virus. Ulmer y col. (1993) Science 259:1745-1749. Los estudios inmunohistoquímicos del sitio de la inyección revelaron que el ADN era absorbido por los mieloblastos, y la producción citoplásmica de la proteína viral podía ser demostrada durante al menos 6 meses.

Un objetivo principal de los artesanos practicantes en los campos de la terapia génica y la inmunización con ácidos nucleicos ha sido identificar y diseñar sistemas de expresión que proporcionen un nivel de producción tan alto como sea posible para un gen o una secuencia de interés que haya sido liberado en una célula huésped. Se ha visto que un requisito previo necesario es un elevado nivel de producción para cualquier sistema de expresión utilizado en la terapia génica (para proporcionar niveles suficientes de producto génico terapéutico) o inmunización con ácido nucleico (para proporcionar una respuesta inmunitaria suficiente frente a un producto antigénico codificado). Se sabe que numerosos factores afectan al nivel de producción alcanzable a partir de semejantes células huésped transfectadas, incluyendo la eficacia de transfección (v.g., el número de copias en la célula) y la eficacia con la cual el gen o la secuencia de interés es transcrito y el ARNm traducido.

Por consiguiente, se han descrito numerosos sistemas de expresión en la técnica, cada uno de los cuales consta típicamente de un vector que contiene un gen o una secuencia de nucleótidos de interés conectada operablemente a secuencias para el control de la expresión que controlan la expresión del gen o de la secuencia de nucleótidos. Entre estas secuencias de control se incluyen secuencias promotoras de la transcripción y secuencias de inicio y terminación de la transcripción. Las secuencias promotoras de la transcripción están localizadas generalmente inmediatamente aguas arriba de los sitios de inicio para los transcritos de ARN, e incluyen una caja "TATA" y una caja "CAAT", respectivamente localizadas a aproximadamente 30 y 80 nucleótidos aguas arriba (v.g., aproximadamente en la posición 30 u 80) con respecto al sitio de inicio. Corden y col. (1980) Science 209:1406-1414; Chambon, P. (1981) Ann. Rev. Biochem. 50:349-383. Entre los promotores comúnmente utilizados para los sistemas de expresión de células de mamíferos se incluyen el promotor temprano de SV40, un promotor CMV tal como el promotor temprano inmediato de CMV (Chapman y col. (1991) Nucl. Acids Res. 19:3979-3986), el promotor LTR del virus del tumor mamario de ratón, el promotor tardío principal de adenovirus (Ad MLP), y el promotor del virus herpes simplex, entre otros. Los promotores no virales, tales como un promotor derivado del gen de la metalotioneína murina, también son utilizados comúnmente para semejantes sistemas de expresión. Estos sistemas promotores se seleccionan normalmente para proporcionar el nivel de expresión más elevado posible para una secuencia dada.

Numerosos elementos moduladores de la transcripción que se encuentran a más de 110 nucleótidos aguas arriba (-110) de diversos genes también han sido utilizados comúnmente en la técnica. Estas secuencias aguas arriba son consideradas esenciales para la expresión de genes tempranos en virus con ADN de simios, murinos y humanos, y son referidos comúnmente como "intensificadores". Los intensificadores se definen en términos generales como un agente que actúa en cis que, cuando están conectados operablemente a una secuencia promotora/génica, incrementan espectacularmente la transcripción de esa secuencia génica. Los intensificadores pueden funcionar a partir de posiciones que están mucho más lejos de una secuencia de interés que otros elementos de control de la expresión (v.g., promotores), y pueden operar cuando están situados en cualquier orientación con respecto a la secuencia de interés. Banerji y col. (1981) Cell 27:299-308, de Filleirs y col. (1981) Nucleic Acids Research 9:6251-6264. Han sido identificados intensificadores de numerosas fuentes virales, incluyendo virus del polioma, virus BK, citomegalovirus (CMV), adenovirus, virus de simios 40 (SV40), virus del Sarcoma de Moloney, virus del papiloma bovino, y virus del Sarcoma de Rous (de Villeirs y col. supra, Rosenthal y col. (1983) Science 222:749-755, Hearing y col. (1983). Cell 33:695-703, Weeks y col. (1983) Mol. Cell. Biol. 3:1222-1234, Lenvinson y col. (1982) Nature 295:568-572, y Luciw y col. (1983) Cell 33:705-716). Estos elementos intensificadores a menudo son acoplados con otras secuencias promotoras homólogas y heterólogas para proporcionar pares intensificadores/promotores para su uso en los sistemas de expresión. No obstante, probablemente el par intensificador/promotor más frecuentemente utilizado que se emplea en terapia génica e inmunización con ácido nucleico es el par intensificador temprano inmediato/promotor de hCMV. Ver v.g., las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.168.062 y 5.385.839 de Stinski, y la Memoria de la Patente EP 0 323 997 B1. El elemento intensificador de hCMV también ha sido utilizado sin el elemento promotor de hCMV, por ejemplo para modular una secuencia promotora heteróloga. Ver, v.g., la Memoria de la Patente EP 0 173 177 B1. El par intensificador temprano inmediato/promotor de hCMV proporciona una expresión fuerte de una variedad de secuencias de interés diferentes, y se piensa que este elevado nivel de expresión establece el "patrón dorado" para cualquier sistema de expresión dado.

WO 98/20041 tiene que ver con un elemento regulador presente en promotor de la proteína C endotelial que dirige la expresión de los genes de las células endoteliales. Mohammadi y col., Gene Therapy 5, 76-84, informan de la regulación transgénica por un constructo que comprende un elemento de respuesta controlado por un promotor sin intensificador de CMV/tetraciclina. Hofman y col., PNAS USA 93, 5185-5190, 1996, describen el uso de un promotor mínimo de CMV en un constructo de vector retroviral, junto con un elemento de control de tetraciclina. En WO 98/37185 se describe un vector de expresión sensible a la tetraciclina que utiliza un promotor mínimo. Bohm y col., J. Immunol. Methods 193, 29-40, 1996, describen constructos vectores de ADN que ceban las respuestas de los linfocitos T citotóxicos específicos del antígeno de superficie de la hepatitis B y de anticuerpos en ratones tras una inyección intramuscular.

Compendio de la invención

Un objeto principal de la invención es proporcionar un sistema promotor que proporcione un mejor carácter de expresión en células de mamífero, concretamente in vivo. Se ha descubierto ahora sorprendentemente que el uso de una secuencia promotora que normalmente está emparejada con su secuencia intensificadora homóloga en un sistema de expresión proporcionará una respuesta inmunitaria enormemente intensificada frente a un antígeno codificado cuando el promotor sea utilizado en una forma menos intensificadora, truncada en un sistema de expresión. La secuencia promotora "sin intensificador" es referida aquí como "promotor mínimo". Se puede lograr una respuesta inmunológica mejorada para una composición de vacuna con ácido nucleico que incorpore el sistema promotor.

Por consiguiente, la presente invención proporciona el uso de un constructo de ácido nucleico que comprende una secuencia codificadora que codifica un antígeno y una secuencia promotora que no está acoplada con su secuencia intensificadora nativa y que está conectada operablemente a la secuencia codificadora, para la fabricación de un medicamento para su uso en la inmunización con ácido nucleico de un sujeto mamífero, donde dicho antígeno es un antígeno de un patógeno viral, bacteriano, parasítico o fúngico, o es un antígeno específico de tumores o un antígeno asociado con una enfermedad autoinmunitaria. La invención también proporciona:

- partículas recubiertas adecuadas para el uso en la inmunización con ácido nucleico mediada por partículas, cuyas partículas comprenden partículas portadoras recubiertas con un constructo de ácido nucleico que comprende una secuencia codificadora que codifica un antígeno y una secuencia promotora que no está acoplada a su secuencia intensificadora nativa y que está conectada operablemente a la secuencia codificadora, donde dicho antígeno es un antígeno de un patógeno viral, bacteriano, parasítico o fúngico, o es un antígeno específico de tumores o un antígeno asociado con una enfermedad autoinmunitaria y

- un dispositivo para la aceleración de partículas adecuado para la inmunización con ácido nucleico mediada por partículas, estando cargado dicho dispositivo con las partículas recubiertas de la invención.

El constructo de ácido nucleico puede estar presente en un constructo vector, por ejemplo un vector plasmídico. De este modo se proporciona un reactivo de inmunización con ácido nucleico capaz de lograr una respuesta inmunitaria contra un antígeno de interés, comprendiendo el reactivo un constructo de ácido nucleico que incluye una secuencia de ácido nucleico de interés bajo el control transcripcional de una secuencia promotora mínima. Los sistemas de expresión pueden ser construidos para su uso en la inmunización con ácido nucleico para proporcionar una respuesta inmunitaria enormemente intensificada frente a un antígeno de interés.

Estos y otros objetos, aspectos, realizaciones y ventajas de la presente invención se les ocurrirán fácilmente a los expertos normales en la técnica a la vista de la presente descripción.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 representa una comparación entre los constructos promotores mínimos de la presente invención y sus correspondientes constructos promotores intensificados. El funcionamiento in vivo de los constructos promotores fue evaluado midiendo la producción de anticuerpo contra el antígeno de interés en animales que recibían la inmunización con ácido nucleico con los constructos.

La Figura 2 representa una comparación entre el constructo promotor de citomegalovirus humano (hCMV) mínimo producido según la presente invención, y su correspondiente constructo promotor de hCMV totalmente intensifi-
cado.

Las Figuras 3 y 4 también representan los resultados de la comparación obtenidos a partir de estudios de vacunación in vivo utilizando los constructos promotores mínimos de la presente invención y sus correspondientes constructos promotores intensificados. De nuevo aquí, el funcionamiento in vivo de los constructos promotores fue evaluado midiendo la producción de anticuerpo contra el antígeno de interés en animales que reciben la inmunización con ácido nucleico con los constructos.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

Antes de describir la presente invención con detalle, se debe entender que esta invención no está limitada a moléculas particularmente ejemplificadas o parámetros de los procedimientos que, por supuesto, pueden variar. Asimismo se debe entender que la terminología utilizada aquí tiene el propósito de describir realizaciones concretas de la invención solamente, y no se pretende que sean limitantes. Además, en la práctica de la presente invención se emplearán, a menos que se indique de otro modo, métodos de virología, microbiología y biología molecular, mecanismos de recombinación de ADN e inmunología convencionales, todos los cuales están dentro del conocimiento práctico de la técnica. Semejantes mecanismos se explican completamente en la literatura. Ver, v.g., Sambrook, y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª Edición, 1989); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I y II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); y Fundamental Virology, 2ª Edición, vol. I y II (B.N. Fields y D.M. Knipe, eds.)

Se debe observar que, según se utiliza en esta memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el" o "la" incluyen los referentes en plural a menos que el contenido dicte claramente otra cosa.

A. Definiciones

A menos que se defina de otra forma, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado comprendido comúnmente por un experto normal en la técnica a la cual pertenece la invención. Si bien se pueden utilizar numerosos métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos aquí en la práctica de la presente invención, aquí se describen los materiales y métodos preferidos.

Al describir la presente invención, se emplearán los siguientes términos, y se pretende que sean definidos como se indica más abajo.

El término "inmunización con ácido nucleico" se utiliza aquí para hacer referencia a la introducción de una molécula de ácido nucleico que codifica uno o más antígenos seleccionados en una célula huésped para la expresión in vivo del antígeno o los antígenos. La molécula de ácido nucleico puede ser introducida directamente en el sujeto receptor, por ejemplo mediante una inyección; una liberación de partículas transdérmica; inhalación; tópicamente, o mediante modos de administración intranasal o mucosal.

Un "antígeno" hace referencia a cualquier agente, generalmente una macromolécula, que puede lograr una respuesta inmunológica en un individuo. El término puede ser utilizado para hacer referencia a una macromolécula individual o a una población homogénea o heterogénea de macromoléculas antigénicas. Según se utiliza aquí, "antígeno" se utiliza generalmente para hacer referencia a una molécula de proteína o una porción de la misma que comprende uno o más epítopos. Para los fines de la presente invención, los antígenos pueden ser obtenidos o derivados de cualquier patógeno viral, bacteriano, parasítico o fúngico conocido. El término también está destinado a cualquiera de los antígenos específicos de tumores y antígenos asociados con enfermedades autoinmunitarias. Además, para los fines de la presente invención, un "antígeno" incluye una proteína que tiene modificaciones, tales como deleciones, adiciones y sustituciones (generalmente de naturaleza conservativa) en la secuencia natural, con tal que la proteína conserve suficiente inmunogenicidad. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, por ejemplo por medio de mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, por ejemplo por medio de mutaciones de huéspedes que producen los antígenos.

En diversos aspectos de la invención, el antígeno contiene uno o más epítopos de las células T. Un "epítopo de las células T" hace referencia generalmente a aquellos rasgos de una estructura peptídica que son capaces de inducir una respuesta de las células T. Con respecto a esto, se acepta en la técnica que los epítopos de las células T comprenden determinantes peptídicos lineales que asumen conformaciones ampliadas dentro de la hendidura de unión al péptido de las moléculas del MHC, (Unanue y col. (1987) Science 236:551-557). Según se utiliza aquí, un epítopo de las células T es generalmente un péptido que tiene al menos 3-5 restos aminoácido, y preferiblemente al menos 5-10 o más restos aminoácido. La capacidad de un antígeno concreto para estimular una respuesta inmunológica mediada por células puede ser determinada por numerosos análisis bien conocidos, tales como los análisis de linfoproliferación (activación de linfocitos), los análisis de las células citotóxicas CTL, o analizando los linfocitos T específicos para el antígeno en un sujeto sensibilizado. Ver, v.g., Erickson y col. (1993) J. Immunol. 151:4189-4199; y Doe y col. (1994) Eur. J. Immunol. 24:2369-2376.

En otros aspectos de la invención, el antígeno contiene uno o más epítopos de las células B. Un "epítopo de las células B" hace referencia generalmente al sitio de un antígeno al cual se une una molécula de anticuerpo específica. La identificación de epítopos que son capaces de lograr una respuesta de anticuerpos es fácilmente completada logrando mecanismos bien conocidos en la técnica. Ver, v.g., Geysen y col. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002 (método general de sensibilización rápida de péptidos para determinar la localización de epítopos inmunogénicos en un antígeno dado); Patente de los Estados Unidos Núm. 4.708.871 (procedimientos para identificar y sintetizar químicamente epítopos de antígenos); y Geysen y col. (1986) Molecular Immunology 23:709-715 (mecanismo para identificar péptidos con elevada afinidad para un anticuerpo dado).

Una "respuesta inmunitaria" contra a un antígeno de interés es el desarrollo en un individuo de una respuesta inmunitaria humoral y/o celular a ese antígeno. Para los fines de la presente invención, una "respuesta inmunitaria humoral" hace referencia a una respuesta inmune mediada por moléculas de anticuerpo, mientras una "respuesta inmunitaria celular" es aquella mediada por los linfocitos T y/o otros glóbulos blancos.

Una "secuencia codificadora", o una secuencia que "codifica" un polipéptido, es una molécula de ácido nucleico que es transcrita (en el caso del ADN) y traducida (en el caso del ARNm) a un polipéptido in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificadora son determinados por un codón de iniciación en el extremo 5' (amino) y un codón de terminación de la traducción en el extremo 3' (carboxi). Para los fines de la invención, una secuencia codificadora puede incluir, pero no está limitada a, ADNc de ARNm viral, procariótico o eucariótico, secuencias de ADN genómico de ADN viral o procariótico, e incluso secuencias de ADN sintéticas. Una secuencia de terminación de la transcripción puede estar localizada 3' con respecto a la secuencia codificadora.

Una molécula de "ácido nucleico" puede incluir, pero no está limitada a, secuencias procarióticas, ARNm eucariótico, ADNc de ARNm eucariótico, secuencias de ADN genómico de ADN eucariótico (v.g., mamífero), e incluso secuencias de ADN sintéticas. El término también abarca secuencias que incluyen cualquiera de los análogos de bases conocidos de ADN y ARN.

"Conectado operablemente" hace referencia a una disposición de elementos en la cual los componentes descritos se configuran de manera que realizan su función habitual. De este modo, un promotor dado conectado operablemente a una secuencia codificadora es capaz de efectuar la expresión de la secuencia codificadora cuando las enzimas apropiadas estén presentes. El promotor no necesita ser contiguo a la secuencia codificadora, con tal que funcione dirigiendo la expresión de la misma. En ese caso, por ejemplo, pueden estar presentes secuencias transcritas aún no traducidas intermedias entre la secuencia promotora y la secuencia codificadora y la secuencia promotora todavía puede ser considerada "conectada operablemente" a la secuencia codificadora.

"Recombinante" según se utiliza aquí para describir una molécula de ácido nucleico representa un polinucleótido de origen genómico, ADNc, semisintético, o sintético que, en virtud de su origen o manipulación: (1) no está asociado con todo o una porción del polinucleótido con el cual está asociado en la naturaleza; y/o (2) está conectado con un polinucleótido distinto de aquél con el cual está conectado en la naturaleza.

Dos secuencias de ácido nucleico son "sustancialmente homólogas" cuando al menos aproximadamente el 70%, preferiblemente al menos aproximadamente el 80-90%, y muy preferiblemente al menos aproximadamente el 95% de los nucleótidos se emparejan a lo largo de una longitud de la molécula definida. Según se utiliza aquí, sustancialmente homóloga también hace referencia a secuencias que muestran identidad con el ácido nucleico especificado. Las secuencias de ácido nucleico que son sustancialmente homólogas pueden ser identificadas en un experimento de hibridación de Southern, por ejemplo, en condiciones restrictivas, definidas para ese sistema concreto. La definición de las condiciones de hibridación apropiadas está dentro del conocimiento práctico de la técnica. Ver, v.g., Sambrook y col., supra; DNA Cloning, Vols. I y II, supra: Nucleic Acid Hybridization, supra. Tales secuencias también pueden ser confirmadas y caracterizadas adicionalmente mediante secuenciación directa de los productos de PCR.

Los términos "individuo" y "sujeto" se utilizan indistintamente aquí para hacer referencia a cualquier miembro del subtipo cordata, incluyendo, sin limitación, humanos y otros primates, incluyendo primates no humanos tales como chimpancés y otras especies de simios y monos; animales de granja tales como ganado vacuno, ovejas, cerdos, cabras y caballos; mamíferos domésticos tales como perros y gatos; animales de laboratorio incluyendo roedores tales como ratones, ratas y cobayas; aves, incluyendo aves domésticas, salvajes y de caza tales como pollos, pavos y otras aves gallináceas, patos, gansos, y similares. Los términos no indican una edad particular. De este modo, se pretende abarcar individuos tanto adultos como recién nacidos. Los métodos descritos aquí están destinados al uso en cualquiera de las especies de vertebrados anteriores, puesto que los sistemas inmunitarios de todos estos vertebrados funcionan de un modo similar.

B. Métodos Generales

Se utiliza un promotor mínimo en la presente invención. La secuencia promotora mínima deriva generalmente de un virus con ADN. Típicamente, el promotor es un promotor que está asociado con un gen viral temprano y normalmente modulado por un elemento intensificador aguas arriba o aguas abajo. En la presente invención, no obstante, la secuencia promotora es utilizada en su forma sin intensificador (es decir, no está acoplada con su secuencia intensificadora nativa cuando es utilizada en el contexto de la presente invención, sin embargo, puede ser utilizada en un constructo que contenga otras secuencias intensificadoras heterólogas). De este modo, los promotores mínimos de la presente invención constarán típicamente de una secuencia de nucleótidos de aproximadamente 130 pares de bases o menos, cuya secuencia corresponderá a la secuencia que abarca las posiciones -1 a -130 con respecto al inicio de la síntesis de ARN del gen temprano viral natural.

En las realizaciones preferidas, el promotor mínimo es obtenido o derivado de un miembro de la familia de virus de los Herpesvirus. En las realizaciones concretas, el promotor mínimo consta esencialmente de una secuencia promotora sin intensificador de un virus CMV de simios, murino o humano (por ejemplo, el promotor temprano inmediato de sCMV, o hCMV), una secuencia promotora sin intensificador de un virus RSV, una secuencia promotora sin intensificador de un virus de la pseudorrabia (PRV) tal como la región promotora temprana de PRV, o una variante funcional de la misma. La secuencia promotora mínima puede constar esencialmente por lo tanto de una secuencia promotora temprana inmediata de citomegalovirus humano (hCMV), una secuencia promotora temprana del virus de la pseudorrabia (PRV) o una variante funcional de las mismas.

Una secuencia variante funcional puede variar de una secuencia promotora natural en una o más sustituciones, deleciones o inserciones de bases. Puede haber de 1 a 30, por ejemplo de 5 a 20, sustituciones de bases y/o de 1 a 30, por ejemplo de 5 a 20, deleciones de bases y/o de 1 a 30, por ejemplo de 5 a 20, inserciones de bases. Se pueden utilizar los fragmentos funcionales de una secuencia promotora natural.

Las variantes de las secuencias pueden ser construidas fácilmente mediante metodologías rutinarias tales como la mutagénesis dirigida al sitio. La capacidad de una secuencia de una variante para actuar como promotor y de este modo conservar la función puede ser determinada mediante experimentación. Una secuencia de una variante puede ser acoplada a un gen informador en un sistema de expresión adecuado y determinada la presencia o ausencia de expresión. La presente invención es particularmente aplicable a humanos, de manera que la capacidad de una secuencia de una variante para conducir la expresión in vitro en una línea celular humana puede ser examinada.

La secuencia promotora mínima es acoplada con una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés, específicamente una secuencia codificadora para un antígeno de un patógeno viral, bacteriano, parasítico o fúngico, o un antígeno específico de un tumor o un antígeno asociado con una enfermedad autoinmunitaria. De este modo, el promotor mínimo estará conectado operablemente a una secuencia codificadora que codifique un antígeno de interés. El antígeno de interés estará asociado preferiblemente con un patógeno, tal como un patógeno viral, bacteriano o parasítico, o el antígeno puede ser un antígeno especifico de un tumor. El antígeno puede ser una proteína completa. Alternativamente, el antígeno puede constar sólo esencialmente de un epítopo de las células B o un epítopo de las células T de un antígeno.

Entre los antígenos específicos de tumores se incluyen, pero no están limitados a, cualquiera de los diversos MAGE (antígenos E asociados al melanoma), incluyendo MAGE 1, MAGE 2, MAGE 3 (péptido HLA-A1), MAGE 4, etc; cualquiera de las diversas tirosinasas (péptido HLA-2); ras mutante; p53 mutante; y el antígeno p97 del melanoma. Entre otros antígenos específicos de tumores se incluyen el péptido Ras y el péptido p53 asociado con los cánceres avanzados, los antígenos HPV 16/18 y E6/E7 asociados con los cánceres cervicales, el antígeno MUC1-KLH asociado con el carcinoma de mama, CEA (antígenos carcinoembriónicos) asociados con el cáncer colorrectal, los antígenos gp100 o MART1 asociados con el melanoma, y el antígeno PSA asociado con el cáncer de próstata. La secuencia del gen p53 es conocida (ver, v.g., Harris y col. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:4650-4656) y está depositada en GenBank con el Núm. de Acceso M14694.

Entre los antígenos virales adecuados se incluyen, pero no están limitados a, secuencias de polinucleótidos que codifican antígenos de la familia de virus de la hepatitis, incluyendo el virus de la hepatitis A (HAV), el virus de la hepatitis B (HBV), el virus de la hepatitis C (HCV), el virus de la hepatitis delta (HDV), el virus de la hepatitis E (HEV) y el virus de la hepatitis G (HGV). A modo de ejemplo, se conoce la secuencia genómica viral del HBV, como los métodos para obtener secuencias codificadoras de antígenos a partir de ella. Ver, v.g., Ganem y col., (1987) Annu. Rev. Biochem, 56:651-693; Hollinger , F.B. (1990) Hepatitis B virus, vol. II, pág. 2171-2235, en Fields y col. (eds.), Virology, 2ª ed., Raven Press, Nueva York, NY; y Valenzuela y col. (1980) The nucleotide Sequence of the Hepatitis B viral Genome and the Identification of the Major Viral Genes, págs. 57-70, en Fields y col. (eds.). Animal Virus Genetics, Academic Press, Nueva York, NY). El genoma de HBV codifica numerosas proteínas virales, incluyendo los polipéptidos de los antígenos de superficie grande, mediano y pequeño, el polipéptido del gen X, y el polipéptido del núcleo. Ver, v.g., Yokosuka y col. (1986) N. Engl. J. Med. 315:1187-1192; Imazeki y col. (1987) Hepatology 7:753-757; Kaneko y col., (1988) J. Virol. 62:3979-3984; y Ou y col. (1990) J. Virol. 64:4578-4581. De una manera similar, la secuencia genómica viral del HCV es conocida, como los son los métodos para obtener la secuencia. Ver, v.g., las Publicaciones Internacionales Núms. WO 89/04669; WO 90/11089; y WO 90/14436. El genoma de HCV codifica varias proteínas virales, incluyendo E1 y E2. Ver, v.g., Houghton y col. (1991) Hepatology 14:381-388. Las secuencias que codifican estas proteínas de HBV y HCV, así como los fragmentos antigénicos de las mismas, encontrarán uso en los presentes métodos. De un modo similar, las secuencias codificadoras para el antígeno \delta de HDV son conocidas (ver, v.g., la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.378.814).

De la misma manera, se pueden utilizar secuencias que codifican una amplia variedad de antígenos proteicos de la familia de herpesvirus en la presente invención, incluyendo antígenos derivados del virus herpes simplex (HSV) de los tipos 1 y 2, tales como las glicoproteínas de HSV-1 y HSV-2 gB, gD y gH; los antígenos del virus varicela zoster (VZV), el virus de Epstein-Barr (EBV) y el citomegalovirus (CMV) incluyendo gB y gH; y los antígenos de otros herpesvirus humanos tales como HHV6 y HHV7. (Ver, v.g., Chee y col. (1990) Cytomegaloviruses (J.K. McDougall, ed., Springer-Verlag, págs. 125-169; McGeoch y col. (1988) J. Gen. Virol. 69:1531-1574; Patente de los Estados Unidos Núms. 5.171.568; Baer y col. (1984) Nature 310:207-211; y Davidson y col. (1986) J. Gen. Virol. 67:1759-1816).

Los antígenos de HIV, tales como las secuencias de gp120 de una multitud de productos aislados de HIV-1 y HIV-2, incluyendo miembros de los diversos subtipos genéticos de HIV, son conocidos y han sido referidos (ver, v.g., Myers y col., Los Alamos Database, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, Nuevo Méjico (1992); y Modrow y col. (1987) J. Virol. 61:570-578) y los antígenos derivados de cualquiera de estos productos aislados encontrarán uso en los presentes métodos. Además, la invención es igualmente aplicable a otros radicales inmunogénicos derivados de cualquiera de los diversos productos aislados de HIV, incluyendo cualquiera de las diversas proteínas de la envuelta tales como gp160 y gp41, los antígenos gag tales como p24gag y p55gag, así como las proteínas derivadas de las regiones pol, env, tat, vif, rev, nef, vpr, vpu y LTR de HIV.

Las secuencias codificadoras de antígenos derivadas u obtenidas de otros virus también encontrarán uso en los métodos reivindicados, por ejemplo sin limitación, las secuencias de los miembros de las familias Picornaviridae (v.g., poliovirus, etc.); Caliciviridae; Togaviridae (v.g., virus de la rubéola, el virus del dengue, etc.); Flaviviridae; Coronaviridae; Reoviridae; Birnaviridae; Rhabdoviridae (v.g., virus de la rabia, etc.); Filoviridae; Paramyxoviridae (v.g., virus de la parotiditis, virus del sarampión, virus respiratorio sincitial, etc.); Bunyaviridae; Arenaviridae; Retroviridae (v.g., HTLV-1; HTLV-II, HIV-I (también conocido como HTLV-III, LAV, ARV, hTLR, etc.)), incluyendo pero no limitados a los antígenos de los productos aislados HIV_{IIIb}, HIV_{SF2}, HIV_{LAJ}, HIV_{MN}); HIV-1_{CM235}, HIV-1_{US4}; HIV-2, entre otros. Ver, v.g., Virology, 2ª Edición (W.K. Joklik ed. 1988); Fundamental Virology, 2ª Edición (B.N. Fields y D.M. Knipe, eds. 1991), para una descripción de estos y otros virus.

Las secuencias que codifican antígenos bacterianos y parásitos adecuados son obtenidos o derivados de agentes causales conocidos responsables de enfermedades tales como la Difteria, Pertussis, Tétanos, Tuberculosis, Neumonía bacteriana o fúngica, Cólera, Tifus, Peste, Shigelosis o Salmonelosis, Enfermedad del Legionario, Enfermedad de Lyme, Lepra, Malaria, Uncinaria, Oncocerquiasis, Esquistosomiasis, Tripanosomiasis, Leismaniasis, Giardia, Amebiasis, Filariasis, Borrelia, y Triquinosis. Antígenos adicionales pueden ser obtenidos o derivados de virus no convencionales o agentes similares a virus tales como los causantes de la enfermedad de kuru, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD), el escrapi, la encefalopatía transmisible de los visones, y la enfermedad de la emaciación crónica, o a partir de partículas infecciosas proteináceas tales como los priones que están asociados con la enfermedad de las vacas locas.

Tanto la secuencia para el promotor mínimo como la secuencia codificadora de interés pueden ser obtenidas y/o preparadas utilizando métodos conocidos. Por ejemplo, se pueden obtener preparaciones de antígenos sustancialmente puras utilizando herramientas biológicas moleculares normalizadas. Esto es, se pueden obtener secuencias de polinucleótidos que codifican los antígenos descritos antes utilizando métodos recombinantes, tales como rastreo de bancos de ADNc y genómicos de células que expresan el gen, o derivando el gen a partir de un vector conocido por incluir el mismo. Además, el gen o la secuencia promotora deseados pueden ser aislados directamente a partir de las células y tejidos que los contienen, utilizando mecanismos normalizados, tales como extracción con fenol y PCR del ADNc o del ADN genómico. Ver, v.g., Sambrook y col., supra, para una descripción de los mecanismos utilizados para obtener y aislar ADN. Las secuencias de polinucleótidos pueden ser producidas también sintéticamente, en vez de clonadas.

Otro método conveniente más para el aislamiento de moléculas de ácido nucleico específicas es mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Mullis y col. (1987) Methods Enzymol. 155:335-350. En este mecanismo se utiliza la ADN polimerasa, normalmente una ADN polimerasa termoestable, para replicar una región de ADN deseada. La región de ADN que va a ser replicada es identificada por los oligonucléotidos de la secuencia especificada complementaria a los extremos opuestos y las hebras opuestas del ADN deseado para cebar la reacción de replicación. El producto de la primera ronda de replicación es a su vez un molde para la posterior replicación, así sucesivos ciclos repetidos de replicación dan como resultado la amplificación geométrica del fragmento de ADN delimitado por el par de cebadores utilizado.

Una vez que se han obtenido las secuencias para el promotor mínimo y la secuencia codificadora han sido obtenidos, son conectados operablemente entre sí para proporcionar una molécula de ácido nucleico utilizando mecanismos de clonación o de la biología molecular normalizados. Ver, v.g., Edge (1981) Nature 292:756; Nambair y col (1984) Science 213:1299; y Jay y col. 91984) J. Biol. Chem. 259:6311. La molécula de ácido nucleico es insertada después en un vector adecuado tal como un plásmido de expresión o un constructo de un vector viral.

El constructo de ácido nucleico que comprende el promotor mínimo y una secuencia codificadora seleccionada también comprende generalmente otras secuencias de control. Estas otras secuencias de control comprenden típicamente un terminador y/o una secuencia de iniciación de la traducción (v.g. GCCACCATGG o GCCCCCATGG) y/o un codón de parada de la traducción (v.g. TAA, TAG o TGA) y/o una señal de poliadenilación y/o una sitio de pausa del ARN. No obstante, el intensificador natural para la secuencia promotora no está presente. Generalmente, no está presente ningún intensificador en absoluto.

Una vez completos, los constructos son utilizados para la inmunización con ácido nucleico utilizando protocolos de liberación génica normalizados. Los métodos para la liberación génica son conocidos en la técnica. Ver, v.g., las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.399.346, 5.580.859, 5.589.466. Los genes pueden de este modo ser liberados directamente en un sujeto.

Se pueden utilizar preparaciones liposomales para liberar las moléculas de ácido nucleico de la invención. Entre las preparaciones liposomales útiles se incluyen preparaciones catiónicas (cargadas positivamente), aniónicas (cargadas negativamente) y neutras, siendo particularmente preferidos los liposomas catiónicos. Se ha demostrado que los liposomas catiónicos median la liberación intracelular del ADN plasmídico (Felgner y col. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7416) y el ARNm (Malone y col. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6077-6081).

Alternativamente, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden ser encapsuladas, adsorbidas, o asociadas con portadores particulados. Entre tales portadores particulados se incluyen aquellos derivados de polímeros de poli(metacrilato de metilo), así como micropartículas PLG derivadas de poli(lactidas) y poli(lactida-co-glicólidos). Ver, v.g., Jeffery y col. (1993) Pharm. Res. 10:362-368. También se pueden utilizar otros sistemas particulados y polímeros, por ejemplo, polímeros tales como polilisina, poliarginina, poliornitina, espermina, espermidina, así como productos conjugados de estas moléculas.

La formulación de una composición que comprende las moléculas de ácido nucleico anteriores se puede llevar a cabo utilizando las químicas y las metodologías de la formulación farmacéutica normalizada todas las cuales son fácilmente asequibles para un artesano razonablemente experto. Por ejemplo, las composiciones que contienen una o más moléculas de ácido nucleico pueden ser combinadas con uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables. Las sustancias coadyuvantes, tales como los agentes humectantes o emulsionantes, las sustancias tamponadoras del pH y similares, pueden estar presentes en el excipiente o vehículo. Estos excipientes, vehículos y sustancias coadyuvantes son generalmente agentes farmacéuticos que no inducen una respuesta inmune en el individuo que recibe la composición, y que pueden ser administrados sin una toxicidad indebida. Entre los excipientes farmacéuticamente aceptables se incluyen, pero no están limitados a, líquidos tales como agua, solución salina, polietilenglicol, ácido hialurónico, glicerol y etanol. Las sales farmacéuticamente aceptables también pueden estar incluidas aquí, por ejemplo, sales de ácidos minerales tales como hidrocloruros, hidrobromuros, fosfatos, sulfatos, y similares; y sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos, y similares. Asimismo se pueden incluir ciertos facilitadores de la absorción y/o la expresión del ácido nucleico en las composiciones, por ejemplo, facilitadores tales como bupivacaína, cardiotoxina y sacarosa. Se encuentra disponible un estudio completo de los excipientes, vehículos y sustancias coadyuvantes farmacéuticamente aceptables en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Publishing Co., N.J. 1991), incorporada aquí como referencia.

Cuando se utilizan en inmunizaciones con ácido nucleico, las composiciones formuladas incluirán una cantidad del antígeno de interés que sea suficiente para montar una respuesta inmunológica, como se ha definido antes. La cantidad efectiva apropiada puede ser fácilmente determinada por un experto en la técnica. Semejante cantidad estará en un intervalo relativamente amplio que puede ser determinado por medio de pruebas rutinarias. Las composiciones pueden contener de aproximadamente el 0,1% a aproximadamente el 99,9% del antígeno y pueden ser administradas directamente al sujeto. Los métodos para la liberación in vivo pueden abarcar la inyección utilizando una jeringa convencional. Los constructos pueden ser inyectados subcutáneamente, epidérmicamente, intradérmicamente, intramucosalmente tal como nasalmente, rectalmente y vaginalmente, intraperitonealmente, intravenosamente, oralmente o intramuscularmente. Entre otros modos de administración se incluyen las aplicaciones transdérmicas.

No obstante, se prefiere que las moléculas de ácido nucleico sean liberadas utilizando un dispositivo de aceleración de partículas que dispare las micropartículas recubiertas con ácido nucleico al tejido diana, o libere transdérmicamente las composiciones de ácido nucleico particuladas. Con respecto a esto, se ha demostrado que la inmunización con ácido nucleico mediada por partículas (a veces referida como "pistola génica") logra respuestas inmunitarias tanto humorales como de los linfocitos T citotóxicos tras la liberación epidérmica de cantidades de ADN en nanogramos. Pertmer y col. (1995) Vaccine 13:1427-1430. Las técnicas de liberación mediadas por partículas han sido comparadas con otros tipos de inoculación de ácido nucleico, y se ha encontrado que es marcadamente superior. Fynan y col. (1995) Int. J. Immunopharmacology 17:79-83, Fynan y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11478-11482, y Raz y col. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9519-9523. Tales estudios han investigado la liberación mediada por partículas de las vacunas basadas en ácido nucleico tanto en la superficie de la piel como en el tejido muscular.

Los métodos mediados por partículas para liberar preparaciones de ácido nucleico son conocidos en la técnica. De este modo, una vez preparadas y adecuadamente purificadas, las moléculas de ácido nucleico descritas antes pueden recubrir partículas portadoras utilizando una variedad de mecanismos conocidos en la técnica. Las partículas portadoras son seleccionadas entre materiales que tienen una densidad adecuada en el intervalo de tamaños de las partículas utilizadas típicamente para la liberación intracelular desde un dispositivo de pistola génica. El tamaño de la partícula portadora óptima dependerá, por supuesto, del diámetro de las células diana.

Para los fines de la invención, se pueden utilizar partículas portadoras de tungsteno, oro, platino e iridio. Se prefieren las partículas de tungsteno y oro. Las partículas de tungsteno son fácilmente asequibles en tamaños de partícula de 0,5 a 2,0 \mum de diámetro. Las partículas de oro o el oro microcristalino (v.g., polvo de oro A1570, asequible de Engelhard Corp., East Newark, NJ) también encontrarán uso en la presente invención. Las partículas de oro proporcionan uniformidad en el tamaño (asequibles de Alpha Chemicals en tamaños de partícula de 1-3 \mum, o asequibles de Degussa, South Plainfield, NJ en un intervalo de tamaños de partícula que incluye 0,95 \mum). El oro microcristalino proporciona una distribución del tamaño de partícula diversa, típicamente en el intervalo de 0,5-5 \mum. No obstante, el área
de superficie irregular del oro microcristalino proporciona un recubrimiento altamente eficaz con ácidos nucleicos.

Se conocen numerosos métodos y han sido descritos para recubrir o precipitar ADN o ARN sobre partículas de oro o tungsteno. La mayoría de tales métodos combinan generalmente una cantidad predeterminada de oro o tungsteno con ADN plasmídico, CaCl_{2} y espermidina. La solución resultante es sometida a vórtice continuamente durante el procedimiento de recubrimiento para asegurara la uniformidad de la mezcla de reacción. Tras la precipitación del ácido nucleico, las partículas recubiertas se pueden transferir a membranas adecuadas y se puede permitir que se sequen antes de su uso, recubrir sobre las superficies de un módulo o una casete de muestra, o cargar en una casete de muestra para su uso en aparatos de pistola génica concretos.

Se conocen en la técnica varios dispositivos de aceleración de partículas adecuados para la liberación mediada por partículas, y todos son adecuados para su uso en la práctica de la invención. En los diseños de los dispositivos corrientes se emplea una descarga explosiva, eléctrica o gaseosa para propulsar las partículas de portador recubiertas hacia las células diana. Las propias partículas de portador recubiertas pueden ser ancladas de manera liberable a una lámina de portador movible, o ancladas de manera retirable a una superficie a lo largo de la cual pasa una corriente gaseosa, levantando las partículas de la superficie y acelerándolas hacia la diana. Un ejemplo de dispositivo de descarga gaseosa se describe en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.204.253. Un dispositivo de tipo explosivo se describe en la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.945.050. Un ejemplo de un aparato de aceleración de partículas de tipo descarga de helio es el aparato PowderJect XR® (PowderJect Vaccines, Inc., Madison), WI, cuyo aparato se describe en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.120.657. Un aparato de descarga eléctrica adecuado para su uso aquí se describe en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.149.655. La descripción de todas estas patentes se incorpora aquí como referencia.

Las composiciones de ácido nucleico particuladas pueden ser administradas alternativamente transdérmicamente utilizando un dispositivo de jeringa sin aguja. Por ejemplo, se puede obtener una composición particulada que comprende los constructos de ácido nucleico para la presente invención utilizando métodos farmacéuticos generales tales como evaporación simple, secado a vacío, secado de rocío o liofilización. Si se desea, las partículas pueden ser densificadas adicionalmente utilizando mecanismos descritos en la Publicación Internacional del mismo propietario Núm. WO 97/48485, incorporada aquí como referencia. Estas composiciones particuladas pueden ser liberadas después de un sistema de jeringa sin aguja como los descritos en las Publicaciones Internacionales del mismo propietario Núm. WO 94/24263, WO 96/04947, WO 96/12513, y WO 96/20022, todas las cuales se incorporan aquí como referencia.

Las composiciones particuladas o las partículas recubiertas son administradas al individuo de una manera compatible con la formulación de dosificación, y en una cantidad que será eficaz para los fines de la invención. La cantidad de la composición que se va a liberar depende del individuo que se vaya a someter a ensayo. La cantidad exacta necesaria variará dependiendo de la edad y del estado general del individuo que se vaya a tratar, y una cantidad eficaz apropiada puede ser fácilmente determinada por un experto normal en la técnica tras la lectura de la presente memoria.

C. Experimental

Más abajo se encuentran ejemplos de las realizaciones específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen solamente con fines ilustrativos, y no se pretende que limiten el alcance de la presente invención.

Se han realizado esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los números utilizados (v.g., cantidades, temperaturas, etc.), pero se deben permitir, por supuesto, algunos errores y desviaciones experimentales.

Ejemplo 1

Se construyeron numerosos sistemas de expresión para comparar la expresión antigénica de vectores que contenían una secuencia codificadora de antígeno bajo el control transcripcional de un promotor intensificado y el correspondiente promotor mínimo (utilizando métodos de ensayo para la expresión in vivo). La inmunogenicidad de los mismos constructos del vector fue evaluada después (capacidad para lograr una respuesta inmune contra el antígeno) utilizando métodos de ensayo para la inmunización con ácido nucleico in vivo.

Concretamente, los vectores que contienen el promotor CMV de simios ("sCMV") con y sin ("mP-sCMV") su intensificador, los vectores que contienen el promotor temprano inmediato de CMV humano con ("CMV") y sin ("mp" o "mP-CMV") su intensificador, y los vectores que contienen el promotor PRV con ("PRV") y sin ("mP-PRV") su intensificador, fueron evaluados en cuanto a la producción de antígeno (expresión in vitro) y a la producción de anticuerpo (inmunogenicidad in vivo). Los resultados se representan en la Figura 1 adjunta. En todos los casos, la eliminación de las secuencias intensificadoras reducía los niveles de expresión de los constructos con los promotores mínimos (en relación con los promotores intensificados) (no mostrados). No obstante, como se puede observar en la figura, los constructos con el promotor mínimo proporcionaban una producción de anticuerpo espectacularmente incrementada (en relación con los promotores intensificados) en el componente in vivo del estudio.

Ejemplo 2

Con el fin de evaluar adicionalmente el efecto de utilizar un sistema promotor sin intensificador en un protocolo de inmunización de ácido nucleico, se llevaron a cabo numerosos experimentos para comparar la inmunogenicidad de constructos de antígeno que contenían los sistemas promotores completos (intensificados) y los sistemas promotores mínimos (sin intensificador) de la presente invención.

Más concretamente, se construyeron una serie de constructos del antígeno de superficie de la Hepatitis B (HBsAg) como sigue. Para generar la región codificadora de HbsAg, se cortó el constructo pAM6 (obtenido de la American Type Culture Collection "ATCC") con NcoI y se trató con nucleasa de judía mung para separar el codón de iniciación del antígeno X. El ADN resultante fue cortado después con BamHI y tratado con ADN polimerasa de T4 para volver romos los extremos del ADN y crear una casete de expresión de HBsAg. La casete de expresión de HbsAg está presente en el fragmento de 1,2 kB. El constructo plasmídico pJV7077 (Schmaljohn y col. (1977) J. Virol. 71:9563-9569) que contiene el promotor temprano inmediato de CMV humano completo (cepa Towne) (con intensificador) fue cortado con Hind3 y Bgl2, y después tratado con ADN polimerasa de T4 y fosfatasa alcalina de ternera para crear ADN de extremos romos adyacente.

El plásmido huésped pJV7232 (un derivado del constructo PJV7077 descrito antes) contiene una región de inserción del promotor flanqueada por un sitio SalI y BamHI. Los nuevos promotores fueron sometidos a PCR fuera de las soluciones de partida virales, células infectadas, plásmidos, etc., utilizando cebadores homólogos a la región del promotor de interés. Estos cebadores fueron diseñados con sitios de restricción SalI y BamHI en los extremos terminales de manera que el fragmento de la PCR pueda ser cortado con estas enzimas para facilitar la rápida inserción en el constructo PJV7232 cortado de un modo similar. Este método fue utilizado después para construir las casetes de expresión de HBsAg dirigidas por sistemas promotores de CMV de simios (CMV) y del virus de la pseudorrabia (PRV) completos (intensificados). Todas las reacciones de PCR fueron llevadas a cabo en condiciones normalizadas para amplificar los elementos promotores a partir de las secuencias diana según las instrucciones del fabricante, concretamente:

1x tampón para núcleo de la PCR w/MgCl_{2} 15 mM;

cada uno de los cebadores efectores y antisentido 0,4 \muM;

200 \muM de cada dNTP;

polimerasa Taq 2,5 \mug;

0,1-1,0 \mug muestra diana (ATCC# VR706 para sCMV y ATCC# VR135 para PRV);

agua hasta 100 \mul; y

cubrir con aceite mineral.

El termociclador fue programado para que funcionara con la siguiente rutina:

4 minutos a 95ºC;

30 ciclos de (1 minutos a 95º + 1 minuto 15 segundos a 55ºC + 1 minuto a 72ºC);

10 minutos a 72ºC; y

mantener a 4ºC.

Una vez que se hubo completado el ciclo térmico, se separó la polimerasa Taq mediante extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol de los productos de la PCR. Este ADN amplificado, así como el constructo PJV7232 fueron cortados después con las enzimas de restricción SalI y BamHI.

Después de haber sido cortado con las enzimas de restricción apropiadas (y haber hecho romos los extremos si fuera necesario), los ADN se hicieron correr sobre un gel de agarosa para separar, purificar y aislar las bandas de ADN de interés. Estas bandas aisladas fueron mezcladas después entre sí en una reacción con ligasa e incubadas durante la noche a 16ºC. Las reacciones de ligadura fueron transformadas en células de E. coli. Los constructos PJV7077 y PJV7232 cortados no son capaces de crecer en las células huésped bacterianas bajo selección con antibiótico a menos que contengan un fragmento de un inserto apropiado. Por consiguiente, las colonias bacterianas que contienen los nuevos constructos de ADN recombinante (las secuencias de HbsAg promovidas por un promotor de hCMV, sCMV o PRV completo) fueron desarrolladas sobre una placa de agar, y el ADN fue aislado de estas colonias. El ADN fue analizado en cuanto a la ligadura apropiada de los diversos fragmentos. Los productos aislados bacterianos que albergan productos de ligadura correctos fueron amplificados en un gran cultivo líquido, sobre el cual se realizó la extracción de ADN a gran escala. El ADN resultante es utilizado después como lote de vacuna.

Con el fin de elaborar versiones del promotor mínimo correspondiente (sin intensificador) de los constructos hCMV-sAG, sCMV-sAG y PRV-sAG descritos antes, los ADN fueron cortados con pares de enzimas de restricción (SalI/BamHI, SalI/ScaI, o SalI/NotI, respectivamente). El ADN cortado fue tratado con ADN polimerasa de T4 para crear ADN con los extremos romos. El ADN con los extremos romos fue auto-ligado, transformado, analizado y amplificado utilizando las mismas condiciones expuestas antes. Este procedimiento producía lotes de vacuna en los que al menos la mayor parte de cada una de las secuencias intensificadoras era suprimida del promotor.

Los productos de vacuna de ADN se hicieron recubrir después partículas de oro portadoras y se administraron a sujetos murinos utilizando un mecanismo de liberación mediado por partículas. Específicamente, para cada constructo de ADN plasmídico que iba a ser sometido a ensayo, se pesaron 25 mg de polvo de oro de 2 \mum en un tubo de microcentrífuga. Tras la adición de una alícuota de 250 \mul de espermidina 50 mM (Aldrich), los tubos fueron sometidos a vórtice y brevemente sometidos a sonicación. Después el oro fue microcentrifugado, y la espermidina fue remplazada por una alícuota de 100 \mul de nueva aportación. El oro fue resuspendido después sometiéndolo a vórtice, después de lo cual se añadieron a los tubos 25 \mug de ADN y se mezcló. Mientras el tubo era sometido a vórtice ligero, se añadieron 100 \mul de CaCl al 10% (Fujisawa) USA, Inc.) para precipitar el ADN sobre las cuentas de oro. La reacción de precipitación se dejó continuar durante diez minutos en la parte superior del banco, después de lo cual el oro fue recogido mediante una breve centrifugación en microcentrífuga y lavado tres veces con etanol absoluto (Spectrum) para separar el exceso de reactivos de precipitación. El complejo de oro/ADN lavado fue resuspendido después con 0,5 mg/ml de polivinilpirrolidona (360 kD, Spectrum) en etanol absoluto. La suspensión resultante fue inyectada después en un tubo TEFZEL® (McMaster-Carr) albergado en una máquina de recubrimiento volteadora de tubos (PowderJect Vaccines, Inc., Madison WI) que recubre el interior del tubo con el complejo de oro/ADN. Esta máquina volteadora de tubos se describe en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.733.600. Una vez completado el procedimiento de recubrimiento, los tubos fueron cortados en "disparos" de 0,5 pulgadas que fueron cargados en un dispositivo para la liberación mediada por partículas (el dispositivo PowderJect XR1, PowderJect Vaccines, Inc., Madison, WI) para su liberación en ratones.

Para los procedimientos de vacunación, se anestesiaron ratones Balb/c de cuatro a seis semanas de edad con una mezcla de anestésicos KETASET® (Fort Dodge) y ROMPUN® (Bayer). Los vientres fueron afeitados con un par de tijeras eléctricas para eliminar el pelo, y se administraron dos "disparos" no solapantes de vacuna desde un dispositivo PowderJect XR1 (a 30,6 atm. (450 psi)) en el área afeitada. Los animales fueron devueltos a sus jaulas durante seis semanas después de lo cual se obtuvieron muestras de sangre para el análisis de los anticuerpos anti-HBsAg de los sueros.

Más concretamente, las muestras de sangre fueron recogidas de los animales vacunados. Después se colocaron alícuotas de hasta 200 \mul de suero aislado de las muestras de sangre en pocillos de un recipiente de reacción suministrado con el AUSAB® EIA Diagnostic Kit (Abbott Laboratories). La cantidad de suero añadido dependía del título de anticuerpo de la muestra, y cada muestra fue diluida con tampón para dilución de la muestra para que entraran en los valores que son legibles por el estuche de inmunoanálisis. Se añadieron alícuotas de 200 \mul de muestras del panel de normalización a los pocillos del recipiente de reacción. Se añadió una cuenta a cada pocillo, después de lo cual el recipiente fue sellado e incubado durante dos horas a 40ºC. Después los pocillos fueron lavados de todos los componentes de reacción líquidos. Luego se añadieron alícuotas de 200 \mul de la mezcla de producto conjugado a cada pocillo lavado, después de lo cual el recipiente fue sellado e incubado durante dos horas de nuevo a 40ºC. Los pocillos fueron lavados después de todos los componentes de reacción líquidos, y la cuenta fue transferida a nuevos tubos de reacción después de lo cual se añadieron 300 \mul de tampón para desarrollo de color. Al cabo de 30 minutos, la reacción para el desarrollo de color fue detenida mediante la adición de H_{2}SO_{4} 1 M, y la absorbancia fue medida a 490 nm utilizando un espectrofotómetro Quantum II®. El espectrofotómetro fue utilizado para calcular los niveles de anticuerpo de cada muestra mediante comparación de la absorbancia de la muestra frente a la curva patrón generada con un panel de normalización. Los niveles de anticuerpo fueron corregidos después para cualquier factor de dilución, y los datos finales fueron referidos como los títulos medios geométricos de todos los animales vacunados con un constructo de vacuna de ADN concreto.

Los resultados de estos estudios se representan en las Figuras 2-4. La Figura 2 muestra una comparación entre el sistema promotor de hCMV totalmente intensificado y el sistema promotor de hCMV mínimo de la presente invención. Como se puede observar, el sistema promotor mínimo daba una mejora de aproximadamente tres veces en el título de anticuerpo sobre el sistema promotor totalmente intensificado (los resultados fueron reunidos a partir de cuatro experimentos independientes de 8 ratones por grupo). Las Figuras 3 y 4 muestran resultados similares de comparaciones entre los promotores completos (intensificados) y sus correspondientes derivados promotores mínimos (sin intensificador).

Por consiguiente, se han descrito sistemas promotores mínimos novedosos y reactivos de ácido nucleico que comprenden estos sistemas. Aunque las realizaciones preferidas de la invención sujeto han sido descritas con cierto detalle, se entiende que se pueden realizar variaciones obvias sin apartarse del alcance de la invención como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Claims (20)

1. El uso de un constructo de ácido nucleico que comprende una secuencia codificadora que codifica un antígeno y una secuencia promotora que no está acoplada con su secuencia intensificadora natural y que está conectada operablemente a la secuencia codificadora, para la fabricación de un medicamento para su uso en la inmunización con ácido nucleico de un sujeto mamífero, donde dicho antígeno es un antígeno de un patógeno viral, bacteriano, parasítico o fúngico, o es un antígeno específico de tumores o un antígeno asociado con una enfermedad autoinmunitaria.

2. El uso según la reivindicación 1, donde el antígeno es el antígeno del virus de la hepatitis B.

3. El uso según la reivindicación 1 o 2, donde el antígeno es el antígeno de superficie de la hepatits B.

4. El uso según la reivindicación 1, donde el antígeno es un antígeno de HIV.

5. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el antígeno comprende un epítopo de las células B o un epítopo de las células T.

6. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el constructo es liberado directamente en dicho sujeto.

7. El uso según la reivindicación 6, donde el constructo es liberado mediante una inyección, liberación de partículas transdérmica, inhalación, tópicamente, intranasalmente o transmucosalmente.

8. El uso según la reivindicación 7, donde el constructo es liberado mediante inyección sin aguja.

9. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el constructo recubre partículas portadoras para la liberación del constructo en dicho sujeto.

10. El uso según la reivindicación 9, donde las partículas portadoras son partículas de tungsteno u oro.

11. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho sujeto es un humano.

12. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el constructo es un constructo de ADN.

13. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la secuencia promotora consta esencialmente de una secuencia promotora inmediata de citomegalovirus humano (hCMV), una región promotora temprana del virus de la pseudorrabia (PRV), una secuencia promotor temprana inmediata de citomegalovirus de simios (sCMV) o una variante funcional de las mismas.

14. El uso según la reivindicación 13, donde la secuencia promotora consta esencialmente de la secuencia que abarca las posiciones 0 a 118 de la región promotora temprana inmediata de hCMV o una variante funcional de dicha secuencia que abarca.

15. Partículas recubiertas adecuadas para su uso en la inmunización con ácido nucleico mediada por partículas, cuyas partículas comprenden partículas portadoras recubiertas con un constructo de ácido nucleico que comprende una secuencia codificadora que codifica un antígeno y una secuencia promotora que no está acoplada a su secuencia intensificadora natural y que está conectada operablemente a la secuencia codificadora, donde dicho antígeno es un antígeno de un patógeno viral, bacteriano, parasítico o fúngico, o es un antígeno específico de un tumor o un antígeno asociado con una enfermedad autoinmunitaria.

16. Las partículas recubiertas según la reivindicación 15, donde las partículas portadoras son partículas de tungsteno u oro.

17. Las partículas recubiertas según la reivindicación 15 o 16, donde el antígeno se define en una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5.

18. Las partículas recubiertas según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, donde el constructo es un constructo de ADN.

19. Las partículas recubiertas según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, donde la secuencia promotora se define como en la reivindicación 13 o 14.

20. Un dispositivo para la aceleración de partículas adecuado para la inmunización con ácido nucleico mediada por partículas, estando cargado dicho dispositivo con partículas recubiertas como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19.