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Technisches Gebiet
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Die
Erfindung betrifft die allgemeinen Gebiete der Molekularbiologie
und Immunologie und betrifft allgemein für Nukleinsäure-Immunisierungs-Techniken
nützliche
Reagenzien. Genauer gesagt, betrifft die Erfindung trunkierte Formen
von Transkriptions-Promotor-Elementen, Nukleinsäuremoleküle, die derartige Promotorelemente
enthalten, und die Verwendung von derartige Nukleinsäuremoleküle enthaltenden
Reagenzien für
die Nukleinsäure-Immunisierung.
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Hintergrund
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Techniken
für die
Injektion von DNA und mRNA in Säugergewebe
für die
Zwecke der Immunisierung gegen ein Expressionsprodukt sind im Fachgebiet
beschrieben worden. Siehe, z. B., die Europäische Patentschrift
EP 0 500 799 und US Patent
Nr. 5 589 466. Die hierin als "Nukleinsäure-Immunisierung" bezeichneten Techniken
haben, wie gezeigt, sowohl humorale wie auch zellvermittelte Immunantworten
hervorgerufen. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass Seren von Mäusen, die
mit einem das Hüllglykoprotein
gp160 codierenden DNA-Konstrukt immunisiert worden waren, mit rekombinantem
gp 160 in Immunassays reagierten, und es wurde gezeigt, dass Lymphozyten
aus den injizierten Mäusen
in Antwort auf rekombinantes gp 120 proliferierten; Wang et al.
(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 4156–4160. In ähnlicher Weise wiesen mit einem
humanen Wachstumshormon(hGH)-Gen immunisierte Mäuse eine Antikörper-basierte
Immunantwort auf; Tang et al. (1992) Nature 356: 152–154. Die
intramuskuläre
Injektion von DNA, die ein Influenza-Nucleoprotein codiert, gesteuert
von einem Säugerpromotor,
ruft, wie gezeigt, eine CD8+-CTL-Antwort
hervor, welche Mäuse
gegen eine nachfolgende tödliche Herauforderung
mit Virus schützen
kann; Ulmer et al. (1993) Science 259: 1745–1749. Immunhistochemische
Untersuchungen der Injektionsstelle deckten auf, dass die DNA von
Myeloblasten aufgenommen worden war, und eine zytoplasmatische Herstellung des
viralen Proteins konnte für
mindestens 6 Monate nachgewiesen werden.
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Es
ist ein Hauptziel von in den Gebieten Gentherapie und Nukleinsäure-Immunisierung praktisch
tätigen
Fachleuten gewesen, Expressionssysteme zu identifizieren und zu
entwerten, die ein möglichst
hohes Niveau der Produktion hinsichtlich eines Gens oder einer Sequenz
von Interesse, welches/welche einer Wirtszelle zugeführt wurde,
bereitstellen. Hochniveauproduktion wird als eine notwendige Voraussetzung
für jedwedes
in der Gentherapie (zur Bereitstellung ausreichender Spiegel eines
therapeutischen Genprodukts) oder der Nukleinsäure-Immunisierung (zur Bereitstellung einer
ausreichenden Immunantwort gegen ein codiertes Antigenprodukt) verwendete
Expressionssystem betrachtet. Von mehreren Faktoren weiß man, dass
sie das aus derartigen transfizierten Wirtszellen erreichbare Produktionsniveau
beeinflussen, einschließlich
der Transfektionseffizienz (z. B., der Kopienzahl in der Zelle)
und der Effizienz, mit der das Gen oder die Sequenz von Interesse
transkribiert und die mRNA translatiert wird.
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Eine
Anzahl von Expressionssystemen ist demgemäß im Fachgebiet beschrieben
worden, von denen jedes typischerweise aus einem ein Gen oder eine
Nukleotidsequenz von Interesse enthaltenden Vektor besteht, welches/welche
in funktionsfähiger Weise
an Expressionssteuerungssequenzen, die die Expression des Gens oder
der Nukleotidsequenz regulieren, gebunden ist. Diese Steuerungssequenzen schließen Transkriptionspromotorsequenzen
und Transkriptions-Start- und
-Terminationssequenzen ein. Transkriptionspromotorsequenzen sind
allgemein direkt stromaufwärts
von Initiationsstellen für RNA-Transkripte
lokalisiert und schließen
eine "TATA"-Box und eine "CAAT"-Box ein, welche
etwa 30 bzw. 80 Nukleotide stromaufwärts (z. B. etwa an der -30-
und -80-Position), bezogen auf die Initiationsstelle, lokalisiert
sind; Corden et al. (1980) Science 209: 1406–1414; Chambon, P. (1981) Ann.
Rev. Biochem. 50: 349–383. Üblicherweise
verwendete Promotoren für
Säugerzellexpressionssysteme
schließen
den SV40-Early-Promotor, einen CMV-Promotor, wie den Immediate-Early-Promotor
von CMV (Chapman et al. (1991) Nucl. Acids Res. 19: 3979–3986), den
LTR-Promotor von Maus-Mammary-Tumorvirus, den
Major-Late-Promotor von Adenovirus (Ad MLP) und den Herpes-Simplex-Virus-Promotor,
neben anderen, ein. Nichtvirale Promotoren, wie ein aus dem Maus-Metallothionein-Gen
abgeleiteter Promotor, werden üblicherweise
für solche
Expressionssysteme auch verwendet. Diese Promotorsysteme werden normalerweise
ausgewählt,
um das höchstmögliche Expressionsniveau
für eine
gegebene Sequenz vorzusehen.
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Eine
Anzahl von Transkriptionsmodulator-Elementen, die mehr als 110 Nukleotide
stromaufwärts
(–110)
von verschiedenen Genen gefunden werden, ist üblicherweise im Fachgebiet
auch verwendet worden. Diese Stromaufwärts-Sequenzen werden als essentiell
für die
Expression von Früh(Early)-Genen
in Affen-, Maus- und Human-DNA-Viren
erachtet und werden üblicherweise als "Enhancer" bezeichnet. Enhancer
sind weitgefasst als ein cis-wirkendes Mittel definiert, das, wenn es
in funktionsfähiger
Weise an eine Promotor/Gen-Sequenz gebunden ist, die Transkription
jener Gensequenz dramatisch steigern wird. Enhancer können von
Positionen aus wirken, die viel weiter von einer Sequenz von Interesse
entfernt sind als andere Expressionssteuerungselemente (z. B. Promotoren), und
sie können
wirken, wenn sie in beiden Orientierungen, bezogen auf die Sequenz
von Interesse, positioniert sind; Banerji et al. (1981) Cell 27:
299–308, de
Filleirs et al. (1981) Nucleic Acids Research 9: 6251–6264. Enhancer
sind aus etlichen viralen Quellen identifiziert worden, einschließlich Polyoma-Virus,
BK-Virus, Cytomegalovirus (CMV), Adenovirus, Simian-Virus-40 (SV40),
Moloney-Sarkom-Virus, Rinderpapillom-Virus und Rous-Sarkom-Virus
(de Villeirs et al. obenstehend, Rosenthal et al. (1983) Science
222: 749–755,
Hearing et al. (1983) Cell 33: 695–703, Weeks et al. (1983) Mol.
Cell. Biol. 3: 1222–1234,
Levinson et al. (1982) Nature 295: 568–572 und Luciw et al. (1983)
Cell 33: 705–716). Diese
Enhancer-Elemente werden oft an homologe und heterologe Promotorsequenzen
gekoppelt, um Enhancer/Promotor-Paare für die Verwendung in Expressionssystemen
bereitzustellen. Das wahrscheinlich jedoch am häufigsten in der Gentherapie
und der Nukleinsäure-Immunisierung
verwendete Enhancer/Promotor-Paar ist das Immediate-Early-Enhancer/Promotor-Paar
vom hCMV; siehe z. B. US-Patent Nr. 5 168 062 und 5 385 839 von
Stinksi und die EP Patentschrift 0 323 997 B1. Das hCMV-Enhancer-Element
ist auch ohne das hCMV-Promotor-Element
verwendet worden, zum Beispiel, um eine heterologe Promotorsequenz
zu modulieren; siehe z. B. die EP Patentschrift 0 173 177 B1. Das
Immediate-Early-Enhancer/Promotor-Paar vom hCMV sieht eine robuste
Expression, von einer Vielzahl verschiedener Sequenzen von Interesse,
vor, und von diesem hohen Expressionsniveau wird üblicherweise
angenommen, dass es für
jedwedes gegebene Expressionssystem den "Goldstandard" etabliert.
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Die
WO 98/20041 betrifft ein im Promotor des endothelialen Proteins
C vorliegendes Regulationselement, das die Expression von Genen
in endothelialen Zellen steuert. Mohammadi et al., Gene Therapy
5, 76–84,
berichten über
eine transgene Regulation durch ein Konstrukt, das ein Enhancer-freies CMV-Promotor-/Tetracyclin-gesteuertes
Antwortelement umfasst. Hofman et al., PNAS USA 93, 5185–5190, 1996,
beschreiben die Verwendung eines CMV-Minimal-Promotors in einem
Retrovirus-Vektor-Konstrukt
zusammen mit einem Tetracyclin-Regulationselement. Die WO 98/37185
beschreibt einen auf Tetracyclin ansprechenden Expressionsvektor,
der einen Minimal-Promotor verwendet. Bohm et al., J. Immunol. Methods
193, 29–40,
1996, beschreiben DNA Vektor-Konstrukte, die Hepatitis B-Oberflächenantigen-spezifische cytotoxische
T-Lymphozyten- und Antikörper-Antworten in
Mäusen
nach intramuskulärer
Injektion primen.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Ein
Hauptziel der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Promotorsystems,
das eine bessere Expressionscharakteristik in Säugerzellen, insbesondere in
vivo, zur Verfügung
stellt. Es ist nun überraschenderweise
festgestellt worden, dass die Verwendung einer Promotorsequenz,
die normalerweise mit ihrer homologen Enhancersequenz in einem Expressionssystem
gepaart ist, eine in großem Ausmaß verstärkte Immunantwort
gegen ein codiertes Antigen bereitstellt, wenn der Promotor in einer trunkierten,
Enhancer-freien Form in einem Expressionssystem verwendet wird.
Die "Enhancer-freie" Promotorsequenz
wird hierin als "Minimal-Promotor" bezeichnet. Eine
verbesserte Immunantwort gegen eine Nukleinsäure-Impfstoff-Zusammensetzung,
die das Promotorsystem miteinbezieht, kann erreicht werden.
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Die
vorliegende Erfindung sieht demzufolge die Verwendung eines Nukleinsäurekonstrukts,
umfassend eine codierende Sequenz, die ein Antigen codiert, und
eine Promotorsequenz, die nicht an ihre native Enhancer-Sequenz
gekoppelt ist und welche in funktionsfähiger Weise an die codierende
Sequenz gebunden ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung
bei der Nukleinsäure-Immunisierung
eines Säuger-Subjektes
vor, wobei das Antigen ein Antigen eines viralen, bakteriellen,
parasitären
oder pilzlichen Pathogens ist, oder ein Tumor-spezifisches Antigen
oder ein mit einer Autoimmunerkrankung assoziiertes Antigen ist.
Die Erfindung stellt ebenfalls bereit:
- – beschichtete
Teilchen, die für
die Verwendung in einer Teilchen-vermittelten Nukleinsäure-Immunisierung
geeignet sind, wobei die Teilchen Trägerteilchen umfassen, die mit
einem Nukleinsäurekonstrukt,
das eine codierende Sequenz, die ein Antigen codiert, und eine Promotorsequenz,
die nicht an ihre native Enhancersequenz gekoppelt ist und welche
in funktionsfähiger
Weise an die codierende Sequenz gebunden ist, umfasst, wobei das
Antigen ein Antigen eines viralen, bakteriellen, parasitären oder
pilzlichen Pathogens ist, oder ein Tumor-spezifisches Antigen oder
ein mit einer Autoimmunerkrankung assoziiertes Antigen ist, beschichtet
sind, und
- – eine
Teilchenbeschleunigungs-Vorrichtung, die zur Teilchen-vermittelten
Nukleinsäure-Immunisierung
geeignet ist, wobei die Vorrichtung mit erfindungsgemäßen beschichteten
Teilchen beladen wird.
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Das
Nukleinsäurekonstrukt
kann in einem Vektorkonstrukt, beispielsweise in einem Plasmid-Vektor,
vorliegen. Ein zum Hervorrufen einer Immunantwort gegen ein Antigen
von Interesse fähiges Nukleinsäure-Immunisierungs-Reagenz
wird somit bereitgestellt, wobei das Reagenz ein Nukleinsäurekonstrukt,
das eine Nukleinsäuresequenz
von Interesse unter der transkriptionellen Regulierung einer Minimal-Promotor-Sequenz
einschließt,
umfasst. Expressionssysteme können
zur Verwendung bei Nukleinsäure-Immunisierung
konstruiert werden, um eine in großem Ausmaß verstärkte Immunantwort gegen ein
Antigen von Interesse vorzusehen.
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Diese
und andere Ziele, Aspekte, Ausführungsformen
und Vorteile der vorliegenden Erfindung, werden dem Durchschnittsfachmann
auf dem Gebiet angesichts der Beschreibung hierin ohne weiteres
ersichtlich sein.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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Die 1 stellt
einen Vergleich zwischen den Minimal-Promotor-Konstrukten der vorliegenden Erfindung
und deren zugehörigen
Enhancer-haltigen Promotor-Konstrukten
dar. Die in vivo-Leistungsfähigkeit
der Promotorkonstrukte wurde durch Messen der Antikörpererzeugung
gegen das Antigen von Interesse in Tieren, die eine Nukleinsäure-Immunisierung
mit den Konstrukten erhielten, beurteilt.
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Die 2 zeigt
einen Vergleich zwischen einem Minimal-Promotor-Konstrukt vom humanen
Cytomegalovirus (hCMV), hergestellt gemäß der vorliegenden Erfindung,
und dessen entsprechendem vollständigen
Enhancer-haltigen hCMV-Promotorkonstrukt.
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Die 3 und 4 stellen
ebenfalls Vergleichsergebnisse dar, die aus in vivo-Impfstudien unter
Verwendung der Minimal-Promotor-Konstrukte der vorliegenden Erfindung
und deren zugehörigen Enhancer-haltigen
Promotorkonstrukten erhalten wurden. Hierbei wurde die in vivo-Leistungsfähigkeit der
Promotorkonstrukte wiederum durch Messen der Antikörpererzeugung
gegen das Antigen von Interesse in Tieren, die eine Nukleinsäure-Immunisierung mit
den Konstrukten erhielten, beurteilt.
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Ausführliche Beschreibung der bevorzugten
Ausführungsformen
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Es
versteht sich, bevor die vorliegende Erfindung ausführlich beschrieben
wird, dass diese Erfindung nicht auf besonders veranschaulichte
Moleküle oder
Verfahrensschritte, da solche natürlich variieren können, begrenzt
ist. Es versteht sich auch, dass die hierin verwendete Terminologie
nur zum Zweck der Beschreibung besonderer Ausführungsformen der Erfindung
verwendet wird und nicht limitierend sein soll. Zusätzlich wird
die praktische Ausführung
der vorliegenden Erfindung, sofern nicht anders angegeben, herkömmliche
Verfahren der Virologie, Mikrobiologie, Molekularbiologie, rekombinanten
DNA-Techniken und Immunologie einsetzen, von denen alle innerhalb
der üblichen
Kenntnisse des Fachgebiets liegen. Solche Techniken sind in der
Literatur vollständig
erklärt.
Siehe, z. B., Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual (2. Ausgabe, 1989); DNA Cloning: A Practical Approach, Band
I & II (D. Glover,
Hrsg.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, Hrsg., 1984); A Practical
Guide to Molecular Cloning (1984); und Fundamental Virology, 2.
Ausgabe, Band I & II
(B. N. Fields und D. M. Knipe, Hrsg.).
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Es
soll festgestellt werden, dass, wie in dieser Beschreibung und den
beigefügten
Ansprüchen verwendet,
die Singularformen "ein/eine" und "der/die/das" Pluralbezüge, sofern
der Inhalt nicht etwas anderes klar vorgibt, einschließen.
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A. Definitionen
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Sofern
nicht anderweitig definiert, besitzen alle technischen und wissenschaftlichen
Ausdrücke dieselbe
Bedeutung, wie sie von einem Durchschnittsfachmann auf dem zur Erfindung
gehörenden Fachgebiet
verstanden wird. Obwohl eine Anzahl von, zu den hierin beschriebenen, ähnlichen
oder äquivalenten
Verfahren und Materialien bei der praktischen Ausführung der
vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, werden hierin die
bevorzugten Materialien und Verfahren beschrieben.
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Bei
der Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden die folgenden
Ausdrücke
verwendet werden und sollen wie unten angegeben definiert sein.
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Der
Ausdruck "Nukleinsäure-Immunisierung" wird hierin verwendet,
um die Einführung
eines Nukleinsäuremoleküls, das
eines oder mehrere ausgewählte
Antigene codiert, in eine Wirtszelle zur in vivo-Expression des
Antigens oder der Antigene zu bezeichnen. Das Nukleinsäuremolekül kann in
das empfangende Subjekt direkt, wie etwa mittels Injektion; transdermaler
Teilchenzuführung;
Inhalation; topisch, oder mittels Intranasal- oder Schleimhaut-Verabreichungswegen
zugeführt
werden.
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Ein "Antigen" bezeichnet ein beliebiges
Mittel, im Allgemeinen ein Makromolekül, das in einem Individuum
eine Immunantwort hervorrufen kann. Der Ausdruck kann zur Bezeichnung
eines individuellen Makromoleküls
oder einer homogenen oder heterogenen Population von antigenen Makromolekülen verwendet
werden. Wie hierin verwendet, wird "Antigen" im Allgemeinen zur Bezeichnung eines Proteinmoleküls oder
von einem Teil davon, der ein oder mehrere Epitope umfasst, verwendet.
Für die Zwecke
der vorliegenden Erfindung können
Antigene aus jedwedem bekannten Virus-, Bakterien-, Parasiten- oder
Pilz-Pathogen erhalten oder abgeleitet werden. Der Ausdruck zielt
auch auf jedwedes der verschiedenen tumorspezifischen Antigene und
mit Autoimmunerkrankungen assoziierten Antigene ab. Für die Zwecke
der vorliegenden Erfindung schließt ein "Antigen" weiterhin ein Protein mit Modifikationen, wie
Deletionen, Additionen und Substitutionen (im Allgemeinen von konservativer
Natur) zur nativen Sequenz, ein, solange das Protein eine ausreichende
Immunogenität
beibehält.
Diese Modifikationen können
absichtlich, beispielsweise durch ortsgerichtete Mutagenese, oder
können
zufällig,
wie durch Mutationen bei den die Antigene herstellenden Wirten,
sein.
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In
verschiedenen Aspekten der Erfindung enthalten die Antigene ein
oder mehrere T-Zell-Epitope.
Ein "T-Zell-Epitop" bezeichnet im Allgemeinen jene
Eigenschaften einer Peptidstruktur, die zur Induktion einer T-Zell-Antwort
in der Lage sind. Diesbezüglich
ist es im Fachgebiet akzeptiert, dass T-Zell-Epitope lineare Peptid-Determinanten
umfassen, die gestreckte Konformationen innerhalb der Peptidbindungsfurche
von MHC-Molekülen
annehmen, (Unanue et al. (1987) Science 236: 551–557). Wie hierin verwendet,
steht ein T-Zell-Epitop im Allgemeinen für ein Peptid mit mindestens
3–5 Aminosäureresten,
und vorzugsweise mindestens 5–10 oder
mehr Aminosäureresten.
Die Fähigkeit
eines bestimmten Antigens zur Stimulierung einer zellvermittelten
Immunantwort kann durch eine Anzahl gut bekannter Assays, wie durch
Lymphoproliferations(Lymphozyten-Aktivierungs)-Assays, Assays zytotoxischer
CTL-Zellen, oder
durch Bestimmen von für
das Antigen spezifischen T-Lymphozyten in einem sensibilisierten
Subjekt ermittelt werden. Siehe, z. B., Erickson et al. (1993) J.
Immunol. 151: 4189–4199; und
Doe et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24: 2369–2376.
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In
anderen Aspekten der Erfindung enthält das Antigen ein oder mehrere
B-Zell-Epitope.
Ein "B-Zell-Epitop" bezeichnet im Allgemeinen
die Stelle auf einem Antigen, an welche ein spezifisches Antikörper-Molekül bindet.
Die Identifizierung von Epitopen, die dazu fähig sind, eine Antikörper-Antwort
hervorzurufen, wird unter Verwendung von im Fachgebiet gut bekannten
Techniken einfach bewerkstelligt; siehe, z. B., Geysen et al. (1984)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998–4002 (allgemeines Verfahren
der schnellen Synthese von Peptiden zur Bestimmung der Lokalisierung
von immunogenen Epitopen in einem gegebenen Antigen); US Patent
Nr. 4 708 871 (Verfahren zur Identifizierung und chemischen Synthese
von Epitopen von Antigenen); und Geysen et al. (1986) Molecular
Immunology 23: 709–715
(Technik zur Identifizierung von Peptiden mit hoher Affinität für einen
gegebenen Antikörper).
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Eine "Immunantwort" gegen ein Antigen
von Interesse besteht in der Entwicklung einer humoralen und/oder
einer zellulären
Immunantwort gegen dieses Antigen in einem Individuum. Für die Zwecke
der vorliegenden Erfindung bezeichnet eine "humorale Immunantwort" eine durch Antikörper-Moleküle vermittelte
Immunantwort, während
eine "zelluläre Immunantwort" eine solche ist,
die durch T-Lymphozyten und/oder andere weiße Blutzellen vermittelt wird.
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Eine "codierende Sequenz" oder eine Sequenz,
die ein Polypeptid "codiert" ist ein Nukleinsäuremolekül, das in
vivo transkribiert (im Fall von DNA) und in ein Polypeptid translatiert
(im Fall von mRNA) wird, wenn es unter die Steuerung geeigneter
regulatorischer Sequenzen gestellt wird. Die Grenzen der codierenden
Sequenz werden durch ein Startcodon am 5'(Amino)-Ende und ein Translations-Stop-Codon am 3'(Carboxy)-Ende bestimmt.
Für die
Zwecke der Erfindung kann eine codierende Sequenz cDNA aus viraler,
prokaryotischer oder eukaryotischer mRNA, genomische DNA-Sequenzen
aus viraler oder prokaryotischer DNA, und sogar synthetische DNA-Sequenzen
einschließen,
ist jedoch nicht darauf begrenzt. Eine Transkriptionsterminationssequenz kann
in 3'-Lage zur codierenden
Sequenz angeordnet sein.
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Ein "Nukleinsäure"-Molekül kann prokaryotische
Sequenzen, eukaryotische mRNA, cDNA aus eukaryotischer mRNA, genomische
DNA-Sequenzen aus eukaryotischer (z. B. Säuger-) DNA und sogar synthetische
DNA-Sequenzen einschließen,
ist jedoch nicht darauf begrenzt. Der Ausdruck bezieht auch Sequenzen
ein, die beliebige der bekannten Basenanaloga von DNA und RNA einschließen.
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"In funktionsfähiger Weise
gebunden" bezeichnet
eine Anordnung von Elementen, in der die so beschriebenen Komponenten
zur Ausübung
ihrer üblichen
Funktion konfiguriert sind. Ein gegebener Promotor, der in funktionsfähiger Weise
an eine codierende Sequenz gebunden ist, ist somit in der Lage,
die Expression der codierenden Sequenz zu bewirken, wenn die geeigneten
Enzyme anwesend sind. Der Promotor muss nicht benachbart zur codierenden
Sequenz sein, solange er zur Steuerung der Expression davon funktioniert.
Es können
somit beispielsweise intervenierende untranslatierte jedoch transkribierte
Sequenzen zwischen der Promotorsequenz und der codierenden Sequenz
vorliegen, und die Promotorsequenz kann noch als "in funktionsfähiger Weise" an die codierende
Sequenz "gebunden" betrachtet werden.
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"Rekombinant", wie hierin verwendet,
um ein Nukleinsäuremolekül zu beschreiben,
bedeutet ein Polynukleotid von genomischer Herkunft, Herkunft aus
cDNA, halbsynthetischer oder synthetischer Herkunft, das aufgrund
seiner Herkunft oder Manipulation: (1) nicht mit dem Ganzen oder
einem Teil des Polynukleotids, mit dem es in der Natur assoziiert
ist, assoziiert ist; und/oder (2) an ein anderes Polynukleotid gebunden
ist als an das, an welches es in der Natur gebunden ist.
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Zwei
Nukleinsäuresequenzen
sind "im Wesentlichen
homolog", wenn mindestens
etwa 70%, vorzugsweise mindestens etwa 80–90%, und am meisten bevorzugt
mindestens etwa 95% der Nukleotide über eine definierte Länge des
Moleküls übereinstimmen.
Wie hierin verwendet, bezeichnet "im Wesentlichen homolog" auch Sequenzen,
die Identität
zur spezifizierten Nukleinsäure
aufweisen. Nukleinsäuresequenzen,
die im Wesentlichen homolog sind, können in einem Southern-Hybridisierungsexperiment,
zum Beispiel unter stringenten Bedingungen, wie sie für das besondere
System definiert sind, identifiziert werden. Die Definition geeigneter
Hybridisierungsbedingungen liegt innerhalb der Erfahrung des Fachgebiets;
siehe, z. B., Sambrook et al., obenstehend; DNA Cloning, Bände I & II, obenstehend; Nucleic
Acid Hybridization, obenstehend. Derartige Sequenzen können auch
durch direkte Sequenzierung von PCR-Produkten bestätigt und
weiter charakterisiert werden.
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Die
Ausdrücke "Individuum" und "Subjekt" werden hierin austauschbar
verwendet, um ein beliebiges Mitglied des Unterstamms der Chordata,
einschließlich,
ohne Begrenzung, Menschen und andere Primaten, einschließlich nichtmenschliche
Primaten, wie Schimpansen und andere Affen und Affenarten; Nutztiere
wie Rinder, Schafe, Schweine, Ziegen und Pferde; Haustiere, wie
Hunde und Katzen; Labortiere, einschließlich Nager, wie Mäuse, Ratten
und Meerschweinchen; Vögel,
einschließlich
Haus-, Frei- und Wildgeflügel,
wie Hühner,
Truthähne
und andere hühnerartige
Vögel,
Enten, Gänse,
und dergleichen. Die Ausdrücke
kennzeichnen kein bestimmtes Alter. Sowohl ausgewachsene als auch
neugeborene Individuen sollen somit abgedeckt werden. Die hierin
beschriebenen Verfahren sind für
die Anwendung in einer beliebigen der obigen Wirbeltierspezies gedacht, da
die Immunsysteme von allen diesen Wirbeltieren in ähnlicher
Weise arbeiten.
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B. Allgemeine Verfahren
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Ein
Mimimal-Promotor wird in der vorliegenden Erfindung verwendet. Die
Minimal-Promotor-Sequenz
ist im Allgemeinen von einem DNA-Virus abgeleitet. Der Promotor
ist typischerweise ein Promotor, der mit einem Early-Virus-Gen assoziiert
ist und üblicherweise
durch ein stromaufwärts
oder stromabwärts
gelegenes Enhancer-Element moduliert wird. In der vorliegenden Erfindung
jedoch wird die Promotorsequenz in ihrer Enhancer-freien Form verwendet (d.
h., sie ist nicht an ihre native Enhancersequenz gekoppelt, wenn
sie im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung verwendet wird, sie
kann jedoch in einem Konstrukt, welches andere heterologe Enhancersequenzen
enthält,
verwendet werden). Die Minimal-Promotoren
der vorliegenden Erfindung werden somit typischerweise aus einer
Nukleotidsequenz von etwa 130 Basen oder weniger bestehen, wobei diese
Sequenz der Sequenz entsprechen wird, welche die Positionen –1 bis etwa –130, bezogen
auf den Start der RNA-Synthese des nativen Early-Virus-Gens, überspannt.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
wird der Minimal-Promotor aus einem Mitglied der Virusfamilie der
Herpesviren erhalten oder abgeleitet. In besonderen Ausführungsformen
besteht der Minimal-Promotor im Wesentlichen aus einer Enhancer-freien
Promotorsequenz aus einem Affen-, Maus- oder Human-CMV-Virus (zum
Beispiel des sCMV- oder hCMV-Immediate-Early-Promotors), einer Enhancer-freien Promotorsequenz
aus einem RSV-Virus, einer Enhancer-freien Promotorsequenz aus einem
Pseudorabies-Virus (PRV), wie die PRV-Early-Promotor-Region, oder
einer funktionellen Variante davon. Die Minimal-Promotorsequenz
kann daher im Wesentlichen aus einer Immediate-Early-Promotorsequenz
vom humanen Cytomegalovirus (hCMV), einer Early-Promotor-Sequenz
vom Pseudorabies-Virus (PRV) oder einer funktionellen Variante davon
bestehen.
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Die
Sequenz einer funktionellen Variante kann von einer nativen Promotorsequenz
durch eine oder mehrere Basen-Substitutionen, -Deletionen oder -Insertionen
abweichen. Es können
von 1 bis 30, zum Beispiel von 5 bis 20, Basensubstitutionen und/oder
von 1 bis 30, zum Beispiel von 5 bis 20, Basendeletionen und/oder
von 1 bis 30, zum Beispiel von 5 bis 20, Baseninsertionen vorhanden
sein. Funktionelle Fragmente einer nativen Promotorsequenz können verwendet
werden.
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Variantensequenzen
können
einfach mithilfe von Routineverfahrensweisen, wie ortsgerichteter Mutagenese,
konstruiert werden. Das Vermögen
einer Variantensequenz, als Promotor zu wirken, und somit die Funktion
beizubehalten, kann durch Experimentieren ermittelt werden. Eine
Variantensequenz kann an ein Reportergen in einem geeigneten Expressionssystem
gekoppelt und das Vorkommen oder das Fehlen von Expression ermittelt
werden. Die vorliegende Erfindung ist insbesondere auf Menschen
anwendbar, so dass man das Vermögen
einer Variantensequenz, die Expression in einer humanen Zelllinie
in vitro zu steuern, untersuchen kann.
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Die
Minimal-Promotor-Sequenz wird an eine heterologe Nukleotidsequenz
von Interesse gekoppelt, spezifisch eine codierende Sequenz für ein Antigen
eines viralen, bakteriellen, parasitären oder pilzlichen Pathogens,
oder ein tumorspezifisches Antigen oder ein mit einer Autoimmunerkrankung
assoziiertes Antigen. Der Minimal-Promotor wird somit in funktionsfähiger Weise
an eine codierende Sequenz gebunden sein, die ein Antigen von Interesse
codiert. Das Antigen von Interesse wird vorzugsweise mit einem Pathogen,
wie einem viralen, bakteriellen, oder einem parasitären Pathogen,
assoziiert sein, oder das Antigen kann ein tumorspezifisches Antigen sein.
Das Antigen kann ein Volllängenprotein
sein. Alternativ kann das Antigen im Wesentlichen genau aus einem
B-Zell-Epitop oder einem T-Zell-Epitop eines Antigens bestehen.
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Tumorspezifische
Antigene schließen
beliebige der verschiedenen MAGEs (Melanom-assoziiertes Antigen
E), einschließlich
MAGE 1, MAGE 2, MAGE 3 (HLA-A1-Peptid),
MAGE 4, etc.; beliebige der verschiedenen Tyrosinasen (HLA-A2-Peptid); ras-Mutanten;
p53-Mutanten; und p97-Melanom-Antigen ein, sind jedoch nicht darauf
beschränkt.
Andere tumorspezifische Antigene schließen das mit fortgeschrittenen
Krebsarten assoziierte Ras-Peptid und p53-Peptid, die mit Zervikal-Krebsarten assoziierten HPV16/18-
und E6/E7-Antigene, das mit Brustkrebs assoziierte MUC1-KLH-Antigen,
das mit Kolorektal-Krebs assoziierte CEA (Carcinoembryonales Antigen),
die mit Melanom assoziierten gp 100- oder MART1-Antigene und das mit Prostatakrebs assoziierte
PSA-Antigen ein. Die p53- Gensequenz
ist bekannt (siehe z. B. Harris et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:
4650–4656)
und ist bei GenBank unter der Zugangs-Nr. M14694 hinterlegt.
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Geeignete
virale Antigene umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Polynukleotidsequenzen,
die Antigene aus der Hepatitis-Virusfamilie, einschließlich Hepatitis
A-Virus (HAV), Hepatitis B-Virus (HBV), Hepatitis C-Virus (HCV),
das Delta-Hepatitis-Virus
(HDV), Hepatitis E-Virus (HEV) und Hepatitis G-Virus (HGV), codieren.
Zum Beispiel ist die Virusgenomsequenz von HBV bekannt, wie es Verfahren
zum Erhalten von Antigen-codierenden Sequenzen daraus sind; siehe,
z. B., Ganem et al. (1987) Annu. Rev. Biochem. 56: 651–693; Hollinger,
F. B. (1990) Hepatitis 8 virus, Band II, S. 2171–2235, in Fields et al. (Hrsg.),
Virology, 2. Ausgabe, Raven Press, New York, NY; und Valenzuela
et al. (1980) The nucleotide Sequence of the Hepatitis 8 viral Genome
and the Identification of the Major Viral Genes, S. 57–70, in
Fields et al. (Hrsg.), Animal Virus Genetics, Academic Press, New
York, NY). Das HBV-Genom codiert verschiedene virale Proteine, einschließlich der
Groß-,
Mittel- und Hauptoberflächen-Antigen-Polypeptide,
des X-Gen-Polypeptids und des Kern-Polypeptids. Siehe, z. B., Yokosuka
et al. (1986) N. Engl. J. Med. 315: 1187–1192; Imazeki et al. (1987)
Hepatology 7: 753–757;
Kaneko et al. (1988) J. Virol. 62: 3979–3984; und Ou et al. (1990) J.
Virol. 64: 4578–4581.
In ähnlicher
Weise ist die Virusgenomsequenz von HCV bekannt, wie es Verfahren
zum Erhalten der Sequenz sind. Siehe, z. B., Internationale Veröffentlichungen
Nr. WO 89/04669; WO 90/11089; und WO 90/14436. Das HCV-Genom codiert
mehrere virale Proteine, einschließlich E1 und E2. Siehe, z.
B., Houghton et al. (1991) Hepatology 14: 381–388. Die Sequenzen, die diese
HBV- und HCV-Proteine, wie auch antigene Fragmente davon, codieren,
werden in den vorliegenden Verfahren Verwendung finden. In ähnlicher
Weise ist die codierende Sequenz für das δ-Antigen aus HDV bekannt (siehe,
z. B., U.S.-Patent Nr. 5 378 814).
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In ähnlicher
Weise können
Sequenzen, die eine breite Vielfalt von Proteinantigenen aus der
Herpesvirus-Familie codieren, in der vorliegenden Erfindung verwendet
werden, einschließlich
Antigenen, die abgeleitet sind aus den Herpes Simplex-Virus(HSV)-Typen
1 und 2, wie die HSV-1- und HSV-2-Glykoproteine gB, gD und gH; Antigenen
aus Varicella Zoster-Virus (VZV), Epstein-Barr-Virus (EBV) und Cytomegalovirus
(CMV), einschließlich CMV-gB
und -gH; und Antigenen aus anderen humanen Herpesviren, wie HHV6
und HHV7. (Siehe, z. B., Chee et al. (1990) Cytomegaloviruses (J.
K. McDougall, Hrsg:, Springer-Verlag, S. 125–169; McGeoch et al. (1988)
J. Gen. Virol. 69: 1531–1574;
US Patent Nr. 5 171 568; Baer et al. (1984) Nature 310: 207–211; und
Davison et al. (1986) J. Gen. Virol. 67: 1759–1816.)
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HIV-Antigene,
wie die gp 120-Sequenzen für eine
Vielzahl von HIV-1- und HIV-2-Isolaten,
einschließlich
Mitgliedern der verschiedenen genetischen Subtypen von HIV, sind
bekannt und wurden berichtet (siehe, z. B., Myers et al., Los Alamos
Database, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, New Mexico
(1992); und Modrow et al. (1987) J. Virol. 61: 570–578), und
aus beliebigen dieser Isolate abgeleitete Antigene werden in den
vorliegenden Verfahren Verwendung finden. Darüber hinaus ist die Erfindung
ebenso auf andere immunogene Einheiten, die aus beliebigen der verschiedenenartigen
HIV-Isolate abgeleitet sind, einschließlich beliebigen der verschiedenen
Hüllproteine,
wie gp 160 und gp 41, gag-Antigenen, wie p24gag und p55gag, wie
auch von aus den pol-, env-, tat-, vif-, rev-, nef-, vpr-, vpu- und
LTR-Regionen von HIV abgeleiteten Proteinen, anwendbar.
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Sequenzen,
die aus anderen Viren abgeleitete oder erhaltene Antigene codieren,
werden auch in den beanspruchten Verfahren Verwendung finden, wie,
ohne Einschränkung,
Sequenzen aus Mitgliedern der Familien der Picornaviridae (z. B.
Polioviren, etc.); Caliciviridae; Togaviridae (z. B. Rubella-Virus, Degue-Virus,
etc.); Flaviviridae; Coronaviridae; Reoviridae; Birnaviridae; Rhabodoviridae
(z. B. Rabies-Virus,
etc.); Filoviridae; Paramyxoviridae (z. B., Mumps-Virus, Masern-Virus,
Respiratory-Syncytial-Virus, etc.); Bunyaviridae; Arenaviridae;
Retroviridae (z. B. HTLV-I; HTLV-II; HIV-1 (auch als HTLV-III, LAV,
ARV, hTLR, etc. bekannt)), einschließlich, aber nicht begrenzt
auf, Antigene, unter anderen, aus den Isolaten HIVIIIb,
HIVSF2, HIVLAV,
HIVLAI, HIVMN); HIV-1CM235, HIV-1US4;
HIV-2. Siehe, z. B., Virology, 3. Ausgabe (W.K. Joklik, Hrsg., 1988);
Fundamental Virology, 2. Ausgabe (B.N. Fields und D.M. Knipe, Hrsg.,
1991), wegen einer Beschreibung dieser und anderer Viren.
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Sequenzen,
die geeignete Bakterien- und Parasiten-Antigene codieren, werden
aus bekannten verursachenden Agenzien erhalten oder abgeleitet, die
verantwortlich sind für
Erkrankungen, wie Diphterie, Keuchhusten, Tetanus, Tuberkulose, Bakterien- oder
Pilz-Pneumonie, Cholera, Typhus, Pest, Shigellose oder Salmonellose,
Legionärskrankheit,
Lyme-Krankheit, Lepra, Malaria, Hakenwurmkrankheit, Onchozerkiasis,
Schistosomiasis, Trypamasomiasis, Lesmaniasis, Giardia, Amoebiasis,
Filariasis, Borelia und Trichinose. Noch weitere Antigene können aus unüblichen
Viren oder virusähnlichen
Agenzien erhalten oder abgeleitet werden, wie den verursachenden
Agenzien von Kuru, der Creutzfeldt-Jacob-Krankheit (CJD), Scrapie,
der übertragbaren Nerz-Enzephalopathie
und der Chronic-Wasting-Disease, oder aus proteinösen infektiösen Partikeln, wie
Prionen, die mit Rinderwahnsinn assoziiert sind.
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Sowohl
die Sequenz für
den Minimal-Promotor wie auch die codierende Sequenz von Interesse können unter
Verwendung bekannter Verfahren erhalten und/oder hergestellt werden.
Zum Beispiel können
im Wesentlichen reine Antigenpräparate
unter Verwendung von molekularbiologischen Standardwerkzeugen erhalten
werden. Dies bedeutet, dass die oben beschriebenen Antigene codierende Polynukleotidsequenzen
unter Verwendung rekombinanter Verfahren erhalten werden können, wie
durch das Screenen von cDNA-Bibliotheken und genomischen Bibliotheken
aus Zellen, die das Gen exprimieren, oder durch Ableiten des Gens
aus einem Vektor, von dem bekannt ist, dass er dasselbe beinhaltet.
Die gewünschte
Gen- oder Promotor-Sequenz kann darüber hinaus direkt aus dieselbe
enthaltenden Zellen und Geweben unter Verwendung von Standardtechniken,
wie Phenolextraktion und PCR von cDNA oder genomischer DNA, isoliert
werden. Siehe, z. B., Sambrook et al., obenstehend, wegen einer
Beschreibung von zum Erhalt und zur Isolierung von DNA verwendeten
Techniken. Polynukleotidsequenzen können auch synthetisch anstatt
durch Klonierung hergestellt werden.
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Noch
ein anderes zweckmäßiges Verfahren zum
Isolieren spezifischer Nukleinsäuremoleküle besteht
in der Polymerasekettenreaktion (PCR); Mullis et al. (1987) Methods
Enzymol. 155:335–350.
Diese Technik verwendet DNA-Polymerase, üblicherweise eine thermostabile
DNA-Polymerase, um eine gewünschte
DNA-Region zu replizieren.
Die zu replizierende DNA-Region wird durch Oligonukleotide von spezifizierter
Sequenz, die zu gegenüberliegenden Enden
und gegenüberliegenden
Strängen
der gewünschten
DNA komplementär
sind, um die Replikationsreaktion zu primen, identifiziert. Das
Produkt der ersten Replikationsrunde ist selbst eine Matrize für die nachfolgende
Replikation, und somit führen
wiederholte aufeinander folgende Replikationszyklen zu einer geometrischen
Amplifikation des durch das verwendete Primerpaar eingegrenzten
DNA-Fragments.
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Sobald
die Sequenzen für
den Minimal-Promotor und die codierende Sequenz von Interesse erhalten
worden sind, werden sie in funktionsfähiger Weise unter Verwendung
von Standardtechniken der Klonierung oder Molekularbiologie aneinander
gebunden, um ein Nukleinsäuremolekül bereitzustellen; siehe,
z. B., Edge (1981) Nature 292: 756; Nambair et al. (1984) Science
223: 1299; und Jay et al. (1984) J. Biol. Chem. 259: 6311. Das Nukleinsäuremolekül wird dann
in einen geeigneten Vektor, wie ein Expressionsplasmid oder ein
virales Vektorkonstrukt, inseriert.
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Das
den Minimal-Promotor und eine ausgewählte codierende Sequenz umfassende
Nukleinsäurekonstrukt
umfasst im Allgemeinen auch andere Steuerungssequenzen. Diese anderen
Steuerungssequenzen umfassen typischerweise eine Terminator- und/oder eine Translations-Initiationssequenz
(z. B. GCCACCATGG oder GCCCCCATGG) und/oder ein Translations-Stopcodon
(z. B. TAA, TAG oder TGA) und/oder ein Polyadenylierungs-Signal und/oder
eine RNA-Pausierungs-Stelle. Der native Enhancer für die Promotorsequenz
ist jedoch nicht anwesend. Im Allgemeinen ist überhaupt kein Enhancer anwesend.
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Sobald
vollständig,
werden die Konstrukte für
die Nukleinsäure-Immunisierung
unter Verwendung von Standardprotokollen für die Genzuführung verwendet.
Verfahren für
die Genzuführung
sind im Fachgebiet bekannt. Siehe, z. B., U.S.-Patente Nr. 5 399
346, 5 580 859, 5 589 466. Gene können somit einem Subjekt direkt
zugeführt
werden.
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Liposomale
Zubereitungen können
für die Zuführung der
Nukleinsäuremoleküle der Erfindung verwendet
werden. Nützliche
liposomale Zubereitungen schließen
kationische (positiv geladene), anionische (negativ geladene) und
neutrale Zubereitungen ein, wobei kationische Liposomen besonders
bevorzugt sind. Kationische Liposomen vermitteln, wie gezeigt worden
ist, die intrazelluläre
Zuführung
von Plasmid-DNA (Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
84: 7413–7416)
und mRNA (Malone et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6077–6081).
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Die
Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung
können
alternativ eingekapselt, an oder mit teilchenförmigen Trägern adsorbiert bzw. assoziiert werden.
Geeignete teilchenförmige
Träger
schließen sowohl
diejenigen ein, die von Polymethylmethacrylat-Polymeren abgeleitetet
sind, wie auch von Poly(lactiden) und Poly(lactid-co-glykoliden)
abgeleitete PLG-Mikropartikel. Siehe, z. B., Jeffery et al. (1993)
Pharm. Res. 10: 362–368.
Andere teilchenförmige
Systeme und Polymere können
auch verwendet werden, zum Beispiel Polymere, wie Polylysin, Polyarginin,
Polyornithin, Spermin, Spermidin, wie auch Konjugate dieser Moleküle.
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Die
Formulierung einer die obigen Nukleinsäuremoleküle umfassenden Zusammensetzung kann
unter Verwendung von standardmäßigen Chemieverfahren
und Verfahrensweisen für
die pharmazeutische Formulierung, von denen alle dem normal ausgebildeten
Fachmann leicht zugänglich
sind, durchgeführt
werden. Beispielsweise können
ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle enthaltende
Zusammensetzungen mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren
Exzipientien oder Vehikeln kombiniert werden. Hilfsstoffe, wie Netz-
oder Emulgiermittel, pH-Puffersubstanzen
und dergleichen, können
in dem Exzipiens oder Vehikel vorliegen. Diese Exzipientien, Vehikel
und Hilfsstoffe sind im Allgemeinen pharmazeutische Mittel, die
in dem die Zusammensetzung empfangenden Individuum keine Immunantwort
induzieren, und die ohne unangemessene Toxizität verabreicht werden können. Pharmazeutisch
annehmbare Exzipientien umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein,
Flüssigkeiten,
wie Wasser, Salzlösung,
Polyethylenglykol, Hyaluronsäure,
Glyzerin und Ethanol. Pharmazeutisch annehmbare Salze können auch
darin eingeschlossen werden, wie, zum Beispiel, Mineralsäuresalze,
wie Hydrochloride, Hydrobromide, Phosphate, Sulfate, und dergleichen;
und die Salze von organischen Säuren,
wie Acetate, Propionate, Malonate, Benzoate, und dergleichen. Bestimmte
Mittel zur Erleichterung der Nukleinsäureaufnahme und/oder der Expression können auch
in die Zusammensetzungen eingeschlossen werden, zum Beispiel Erleichterungsmittel,
wie Bupivacain, Cardiotoxin und Saccharose. Eine gründliche
Erläuterung
von pharmazeutisch annehmbaren Exzipientien, Vehikeln und Hilfsstoffen
ist in REMINGTON'S
PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N. J. 1991) verfügbar, was
hierin zur Bezugnahme einbezogen ist.
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Bei
Verwendung für
Nukleinsäure-Immunisierungen
werden die formulierten Zusammensetzungen eine Menge des Antigens
von Interesse beinhalten, die ausreichend ist, um eine Immunantwort, wie
oben definiert, entstehen zu lassen. Eine geeignete wirksame Menge
kann leicht von einem Fachmann im Fachgebiet ermittelt werden. Eine
solche Menge wird in einen relativ breiten Bereich, der durch Routineversuche
ermittelt werden kann, fallen. Die Zusammensetzungen können von
etwa 0,1% bis etwa 99,9% des Antigens enthalten und können dem Subjekt
direkt unter Anwendung von Verfahren, die den Fachleuten auf dem
Gebiet bekannt sind, verabreicht werden. Verfahren für die in
vivo-Zuführung können die
Injektion unter Verwendung einer üblichen Spritze mit sich bringen.
Die Konstrukte können entweder
subkutan, epidermal, intradermal, in die Schleimhaut, wie nasal,
rektal und vaginal, intraperitoneal, intravenös, oral oder intramuskulär injiziert werden.
Andere Verabreichungsarten umfassen transdermale Anwendungen.
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Es
ist jedoch bevorzugt, dass die Nukleinsäuremoleküle unter Verwendung einer Teilchenbeschleunigungs-Vorrichtung
zugeführt
werden, die Nukleinsäure-beschichtete
Mikropartikel in Zielgewebe schießt, oder teilchenförmige Nukleinsäure-Zusammensetzungen
transdermal zuführt.
Diesbezüglich
ist gezeigt worden, dass die Teilchen-vermittelte (manchmal als "Gene Gun" bezeichnet) Nukleinsäure-Immunisierung
sowohl humorale wie auch Cytotoxische-T-Lymphozyten-Immunantworten
nach epidermaler Zuführung
von DNA in Nanogrammmengen hervorrufen kann; Pertmer et al. (1995)
Vaccine 13: 1427–1430.
Teilchen-vermittelte Zuführungstechniken
sind mit anderen Typen von Nukleinsäureimpfung verglichen und als
deutlich überlegen
befunden worden; Fynan et al. (1995) Int. J. Immunopharmacology
17: 79–83,
Fynan et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11478–11482,
und Raz et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9519–9523. Solche Untersuchungen
haben die Teilchen-vermittelte Zuführung von Nukleinsäure-basierten
Impfstoffen sowohl in oberflächliche
Haut wie auch in Muskelgewebe untersucht.
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Teilchen-vermittelte
Verfahren für
die Zuführung
von Nukleinsäurepräparationen
sind im Fachgebiet bekannt. Sobald sie hergestellt und in geeigneter Weise
gereinigt worden sind, können
die oben beschriebenen Nukleinsäuremoleküle somit
unter Anwendung einer Auswahl von im Fachgebiet bekannten Techniken
auf Trägerpartikel
beschichtet werden. Trägerpartikel
werden aus Materialien ausgewählt, die eine
geeignete Dichte in dem Bereich von Teilchengrößen aufweisen, welche typischerweise
für die
intrazelluläre
Zuführung
aus einer "Gene-Gun"-Vorrichtung verwendet
werden. Die optimale Trägerpartikelgröße wird
natürlich
vom Durchmesser der Zielzellen abhängen.
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Für die Zwecke
der Erfindung können
Wolfram-, Gold-, Platin- und Iridium-Trägerpartikel verwendet werden.
Wolfram- und Goldpartikel werden bevorzugt. Wolframpartikel sind
leicht in Durchschnittsgrößen von
0,5 bis 2,0 μm
Durchmesser erhältlich.
Goldpartikel oder mikrokristallines Gold (z. B., Goldpulver A1570,
erhältlich
von Engelhard Corp., East Newark, NJ) werden/wird auch bei der vorliegenden
Erfindung Verwendung finden. Goldpartikel bieten Größengleichförmigkeit
(verfügbar
von Alpha Chemicals in Teilchengrößen von 1–3 μm, oder verfügbar von Degussa, South Plainfield,
NJ, in einem Bereich von Teilchengrößen, einschließlich 0,95 μm). Mikrokristallines
Gold bietet eine verschiedenartige Teilchengrößenverteilung, typischerweise
im Bereich von 0,5–5 μm. Jedoch
sorgt der unregelmäßige Oberflächenbereich
von mikrokristallinem Gold für eine
hocheffiziente Beschichtung mit Nukleinsäuren.
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Etliche
Verfahren für
die Beschichtung oder Präzipitation
von DNA oder RNA auf Gold- oder Wolframpartikel sind bekannt und
sind beschrieben worden. Die meisten derartigen Verfahren kombinieren im
Allgemeinen eine vorbestimmte Menge Gold oder Wolfram mit Plasmid-DNA,
CaCl2 und Spermidin. Die entstehende Lösung wird
während
der Beschichtungsprozedur kontinuierlich gevortext, um Einheitlichkeit
der Reaktionsmischung zu gewährleisten. Nach
Präzipitation
der Nukleinsäure
können
die beschichteten Partikel auf geeignete Membranen übertragen
werden und vor der Verwendung trocknen gelassen werden, auf Oberflächen eines
Proben-Moduls oder einer -Kassette aufbeschichtet werden, oder in
eine Zuführungskassette
zur Verwendung in speziellen Gene-Gun-Gerätschaften geladen werden.
-
Verschiedene
für die
Teilchen-vermittelte Zuführung
geeignete Teilchenbeschleunigungs-Vorrichtungen sind im Fachgebiet
bekannt, und alle sind für die
Verwendung bei der praktischen Ausführung der Erfindung geeignet.
Derzeitige Geräteauslegungen verwenden
eine explosive, elektrische oder gasförmige Entladung, um die beschichteten
Trägerpartikel
zu den Zielzellen vorwärts
zu treiben. Die beschichteten Trägerpartikel
können
ihrerseits ablösbar
auf einem beweglichen Trägerblatt
angeheftet sein, oder entfernbar an einer Oberfläche, an der entlang ein Gasstrom
passiert, der die Teilchen von der Oberfläche abhebt und sie zum Ziel
hin beschleunigt, angeheftet sein. Ein Beispiel einer Gas-Entladungsvorrichtung ist
im U.S.-Patent Nr. 5 204 253 beschrieben. Eine Vorrichtung vom Explosions-Typ
ist im U.S.-Patent Nr. 4 945 050 beschrieben. Ein Beispiel einer
Teilchenbeschleunigungs-Vorrichtung
vom Helium-Entladungs-Typ ist das PowderJect XR®-Instrument (PowderJect
Vaccines, Inc., Madison), WI, wobei dieses Instrument im US Patent
Nr. 5 120 657 beschrieben ist. Eine für die Verwendung hierin geeignete elektrische
Entladungsvorrichtung ist im U.S.-Patent Nr. 5 149 655 beschrieben.
Die Beschreibung von allen diesen Patenten ist zur Bezugnahme hierin
einbezogen.
-
Die
teilchenförmigen
Nukleinsäure-Zusammensetzungen
können
alternativ transdermal unter Verwendung einer nadelfreien Spritzenvorrichtung verabreicht
werden. Zum Beispiel kann eine die Nukleinsäurekonstrukte der vorliegenden
Erfindung umfassende teilchenförmige
Zusammensetzung unter Verwendung allgemeiner pharmazeutischer Verfahren,
wie einfache Verdampfung (Kristallisation), Vakuumtrocknung, Sprühtrocknung
oder Lyophilisation, erhalten werden. Falls gewünscht, können die Teilchen unter Anwendung
der Techniken, die beschrieben werden in der im gemeinsamen Besitz
befindlichen Internationalen Veröffentlichung
Nr. WO 97/48485, welche hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist,
weiter verdichtet werden. Diese teilchenförmigen Zusammensetzungen können dann aus
einem nadelfreien Spritzensystem, wie jenen, die in den im gemeinsamen
Besitz befindlichen Internationalen Veröffentlichungen Nr. WO 94/24263,
WO 96/04947, WO 96/12513 und WO 96/20022 beschrieben sind, von denen
alle durch Bezugnahme hierin eingeschlossen sind, zugeführt werden.
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Die
Partikelzusammensetzungen oder beschichteten Partikel werden dem
Individuum in einer Weise, die mit der Dosisformulierung verträglich ist, und
in einer Menge, die für
die Zwecke der Erfindung wirksam sein wird, verabreicht. Die Menge
der zuzuführenden
Zusammensetzung hängt
von dem Individuum ab, das getestet werden soll. Die exakte nötige Menge
wird abhängig
vom Alter und vom Allgemeinzustand des zu behandelnden Individuums
variieren, und eine geeignete wirksame Menge kann von einem Fachmann
auf dem Gebiet beim Lesen der vorliegenden Patentschrift leicht
bestimmt werden.
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C. Experimentelle Beispiele
-
Untenstehend
werden Beispiele für
spezifische Ausführungsformen
zur Durchführung
der vorliegenden Erfindung angegeben. Die Beispiele werden ausschließlich für Erläuterungszwecke
vorgestellt und sollen den Umfang der vorliegenden Erfindung nicht
beschränken.
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Es
wurden Anstrengungen zur Gewährleistung
der Genauigkeit hinsichtlich der verwendeten Zahlenangaben (z. B.
Mengen, Temperaturen, etc.), unternommen, jedoch sollten natürlich ein
gewisser Versuchsfehler und eine gewisse Versuchsabweichung eingeräumt werden.
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Beispiel 1
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Eine
Anzahl von Expressionssystemen wurde konstruiert, um die Antigenexpression
von Vektoren aus, die eine Antigen-codierende Sequenz unter der
transkriptionellen Kontrolle eines Enhancer-haltigen Promotors und
des korrespondierenden Minimal-Promotors
enthalten, zu vergleichen (unter Verwendung von in vitro-Expressionstestverfahren).
Die Immunogenität
derselben Vektorkonstrukte (Fähigkeit
eine Antikörperantwort
gegen das Antigen hervorzurufen) wurde dann unter Verwendung von
in vivo-Nukleinsäure-Immunisierungs-Testverfahren
bewertet.
-
Insbesondere
wurden Vektoren, die den Promotor vom Affen-CMV mit ("sCMV") und ohne ("mP-sCMV") dessen Enhancer
enthielten, Vektoren, die den Immediate-Early-Promotor vom humanen CMV mit ("CMV") und ohne ("mp" oder "mp-CMV") dessen Enhancer
enthielten, und Vektoren, die den PRV-Promotor mit ("PRV") und ohne ("mP-PRV") dessen Enhancer
enthielten, sowohl hinsichtlich Antigenproduktion (in vitro-Expression)
als auch Antikörperproduktion
(in vivo-Immunogenität)
bewertet. Die Ergebnisse sind in der beigefügten 1 dargestellt.
Die Entfernung der Enhancersequenzen reduzierte in allen Fällen die
Expressionsspiegel aus den Minimal-Promotor-Konstrukten (im Vergleich
mit den Enhancer-haltigen Promotoren) (nicht abgebildet). Wie jedoch
in der Figur zu sehen ist, sorgten die Minimal-Promotor-Konstrukte für eine dramatisch
gesteigerte Antikörperproduktion
(im Vergleich mit den Enhancer-haltigen Promotoren) in dem in vivo-Teil der
Untersuchung.
-
Beispiel 2
-
Um
die Wirkung der Verwendung eines Enhancer-freien Promotorsystems
in einem Nukleinsäure-Immunisierungs-Protokoll
zusätzlich
zu bewerten, wurde eine Anzahl von Experimenten zum Vergleich der
Immunogenität
von Antigenkonstrukten, die (Enhancer-haltige) Volllängen-Promotorsysteme und
die (Enhancer-freien) Minimal-Promotorsysteme der
vorliegenden Erfindung enthielten, durchgeführt.
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Genauer
gesagt, wurde eine Reihe von Hepatitis B-Oberflächenantigen(HBsAg)-Konstrukten folgendermaßen konstruiert.
Zur Erzeugung der HbsAg-codierenden Region wurde das pAM6-Konstrukt
(erhalten von der American Type Culture Collection "ATCC") mit Nco1 geschnitten
und mit Mungbohnen-Nuklease behandelt, um das Startcodon des X-Antigens
zu entfernen. Die resultierende DNA wurde dann mit BamH1 geschnitten
und mit T4 DNA-Polymerase behandelt, um die DNA glattendig zu machen
und eine HBsAg-Expressionskassette zu schaffen. Die HBsAg-Expressionskassette
liegt in dem 1,2 kB-Fragment vor. Das Plasmidkonstrukt PJV7077 (Schmaljohn
et al. (1997) J. Virol. 71: 9563–9569), das den Volllängen-Immediate-Early-Promotor (mit Enhancer)
vom humanen CMV (Towne-Stamm) enthält, wurde mit Hind3 und Bgl2
geschnitten und dann mit T4 DNA-Polymerase und Kälber-Alkalische-Phosphatase zur Schaffung
glattendiger benachbarter DNA behandelt.
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Das
PJV7232-Wirtsplasmid (ein Derivat des oben beschriebenen PJV7077-Konstrukts) enthält eine
Promotor-Insertionsregion, flankiert von einer Sal1- und BamH1-Stelle.
Neue Promotoren wurden durch PCR erzeugt, ausgehend von Virus-Stammkulturen, infizierten
Zellen, Plasmiden, etc., unter Verwendung von zu den Promotorregionen
von Interesse homologen Primern. Diese Primer wurden mit Sal1- und BamH1-Restriktionsstellen
an den terminalen Enden so entworfen, dass das PCR-Fragment mit
diesen Enzymen geschnitten werden kann, um eine einfache Insertion
in das ähnlich
geschnittene PJV7232-Konstrukt zu erleichtern. Dieses Verfahren wurde
dann angewandt, um HBsAg-Expressionskassetten zu konstruieren, welche
von Volllängen(Enhancer-haltigen)-Affen-CMV(sCMV)-
und Pseudorabies-Virus(PRV)-Promotorsystemen
gesteuert wurden. Sämtliche
PCR-Reaktionen wurden zur Amplifikation der Promotorelemente aus
den Zielsequenzen gemäß den Herstelleranweisungen
unter Standardbedingungen durchgeführt, insbesondere:
1 × PCR-Grundpuffer
mit 15 mM MgCl2;
0,4 μM jeweils
vom Sinn- und Antisinn-Primer;
200 μM von jedem dNTP;
2,5 μg Taq-Polymerase;
0,1–1,0 μg Ziel-Probe
(ATCC# VR706 für
sCMV und ATCC# VR135 für
PRV);
Wasser zu 100 μl;
und
Mineralöl-Deckschicht.
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Der
Thermocycler war für
den folgenden Routineablauf programmiert:
4 Minuten bei 95°C;
30
Zyklen von (1 Minute bei 95°C
+ 1 Minute und 15 Sekunden bei 55°C
+ 1 Minute bei 72°C);
10
Minuten bei 72°C;
und
Anhalten bei 4°C.
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Nach
Abschluss des Thermozyklierens wurde die Taq-Polymerase mittels
Phenol/-Chloroform-Extraktion
und Ethanol-Präzipitation
der PCR-Produkte entfernt. Diese amplifizierte DNA, wie auch das
PJV7232-Konstrukt, wurden dann mit den Sal1- und BamH1-Restriktionsenzymen
geschnitten.
-
Nach
dem Schneiden mit den geeigneten Restriktionsenzymen (und dem Glätten der
Enden, falls erforderlich) wurden die DNAs auf einem Agarosegel
zur Trennung, Reinigung und Isolierung der DNA-Banden von Interesse
laufen gelassen. Diese isolierten Banden wurden dann in einer Ligase-Reaktion
zusammengemischt und über
Nacht bei 16°C
inkubiert. Die Ligations-Reaktionsansätze wurden in E. coli-Zellen transformiert.
Die geschnittenen PJV7077- oder PJV7232-Konstrukte sind nicht in
der Lage, in den bakteriellen Wirtszellen unter antibiotischer Selektion
zu wachsen, wenn sie nicht ein geeignetes Insert-Fragment enthalten.
Demgemäß wurden
Bakterienkolonien, welche die neuen rekombinanten DNA-Konstrukte
(die HbsAG-Sequenz unter der Promoterwirkung eines Volllängen-hCMV-, sCMV-
oder PRV-Promotors) enthielten, auf einer Agarplatte gezüchtet, und
die DNA wurde aus diesen Kolonien isoliert. Die DNA wurde hinsichtlich
der ordnungsgemäßen Ligation
der verschiedenen Fragmente analysiert. Bakterielle Isolate, die
korrekte Ligationsprodukte beherbergen, wurden in einer großen Flüssigkultur
amplifiziert, mit welcher eine DNA-Extraktion in großem Maßstab durchgeführt wurde.
Die resultierende DNA wird anschließend als eine Impfstoffcharge
verwendet.
-
Um
korrespondierende (Enhancer-freie) Minimalpromotor-Versionen der
oben beschriebenen hCMV-sAG-, sCMV-sAG- und PRV-sAG-Konstrukte herzustellen,
wurden die DNAs mit Restriktionsenzympaaren (Sal1/Bam1, Sal1/Sca1
bzw. Sal1/Not1) geschnitten. Die geschnittene DNA wurde mit T4 DNA-Polymerase
zur Schaffung glattendiger DNA behandelt. Die glattendige DNA wurde
unter Verwendung der gleichen Bedingungen wie hierin oben dargelegt
selbst-ligiert, transformiert, analysiert und amplifiziert. Diese
Vorgehensweise produzierte Impfstoffchargen, wobei zumindest der
Großteil
von jeder Enhancer-Sequenz aus dem Promotor deletiert worden war.
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Die
DNA-Impfstoff-Produkte wurden dann auf Goldträgerpartikel aufbeschichtet
und Maus-Subjekten unter Verwendung einer Teilchen-vermittelten Zuführungstechnik
verabreicht. Spezifisch wurden für
jedes zu testende Plasmid-DNA-Konstrukt 25 mg von 2-μm-Goldpulver
in ein Mikrozentrifugenröhrchen
eingewogen. Nach Zugabe eines 250 μl großen Aliquots von 50 mM Spermidin
(Aldrich) wurden die Röhrchen
gevortext und kurz schallbehandelt. Das Gold wurde dann mit der
Mikrozentrifuge abzentrifugiert, und das Spermidin durch ein frisches 100-μl-Aliquot
ersetzt. Das Gold wurde dann durch Vortexen resuspendiert, wonach
25 μg DNA
den Röhrchen
zugesetzt wurden, und es wurde gemischt. Während das Röhrchen leicht gevortext wurde,
wurden 100 μl
10%-iges CaCl2 (Fujisawa) USA, Inc.) zugesetzt,
um die DNA auf die Gold-Kügelchen
zu präzipitieren.
Die Präzipitationsreaktion
wurde auf dem Labortisch während
zehn Minuten ablaufen gelassen, wonach das Gold mittels eines kurzen
Mikrozentrifugenlaufs gesammelt und drei Mal mit absolutem Ethanol
(Spectrum) gewaschen wurde, um überschüssige Präzipitationsreagenzien
zu entfernen. Der gewaschene Gold/DNA-Komplex wurde dann mit 0,05
mg/ml Polyvinylpyrrolidon (360 kD, Spectrum) in absolutem Ethanol
resuspendiert. Die resultierende Aufschlämmung wurde dann in ein TEFZEL®-Röhrchen (McMaster-Carr), das in einer
Röhrchendreher-Beschichtungsmaschine
(PowderJect Vaccines, Inc., Madison WI) eingebracht war, injiziert, die
die Innenseite des Röhrchens
mit dem Gold/DNA-Komplex beschichtet. Diese Röhrchendreher-Maschine ist im
U.S.-Patent Nr. 5 733 600 beschrieben. Nach dem Abschluss der Beschichtungs prozedur
wurden die Röhrchen
in 0,5 Inch große "Schüsse" geschnitten, die
in eine Vorrichtung zur Teilchen-vermittelten Zuführung (die
PowderJect XR1-Vorrichtung, PowderJect Vaccines, Inc., Madison,
WI) für
eine Zuführung
in die Mäuse
beladen wurden.
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Für die Impfprozeduren
wurden vier bis sechs Wochen alte Balb/c-Mäuse mit einer Mischung von
KETASET®(Fort
Dodge)- und ROMPUN®(Bayer)-Betäubungsmitteln
anästhetisiert.
Die Bäuche wurden
zur Entfernung der Haare mit einer elektrischen Schere geschoren,
und zwei nicht überlappende "Schüsse" des Impfstoffs wurden
von der PowderJect XR1-Vorrichtung (bei 450 psi) auf den geschorenen
Bereich abgegeben. Die Tiere wurden für sechs Wochen in ihre Käfige zurückgegeben,
und nach dieser Zeit wurden Blutproben für die Analyse von Seren hinsichtlich
Anti-HBsAg-Antikörpern erhalten.
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Genauer
gesagt, wurden Blutproben aus den geimpften Tieren abgesammelt.
Aliquots von bis zu 200 μl
von aus den Blutproben isoliertem Serum wurden dann in die Vertiefungen
eines Reaktionsgefäßes gegeben,
das mit dem AUSAB®EIA-Diagnostic Kit (Abbott
Laboratories) geliefert worden war. Die Menge der zugesetzten Seren
hing von dem Antikörpertiter
der Probe ab, und jede Probe wurde mit Probenverdünnungspuffer
verdünnt,
damit sie innerhalb der von dem Immunassay-Kit ablesbaren Werte
lag. 200-μl-Aliquots
von Proben einer Standardisierungs-Reihe wurden zu den Vertiefungen
des Reaktionsgefäßes zugesetzt.
Eine Kugel wurde zu jeder Vertiefung zugesetzt, wonach das Gefäß verschlossen
und während
zwei Stunden bei 40°C
inkubiert wurde. Die Vertiefungen wurden dann von allen flüssigen Reaktionskomponenten
frei gewaschen. 200-μl-Aliquots
der Konjugatmischung wurden dann zu jeder gewaschenen Vertiefung
zugefügt,
wonach das Gefäß wieder
verschlossen und während
zwei Stunden bei 40°C
inkubiert wurde. Die Vertiefungen wurden dann von allen flüssigen Reaktionskomponenten
frei gewaschen, und die Kugel in neue Reaktionsröhrchen überführt, wonach 300 μl des Farbentwicklungspuffers
zugesetzt wurden. Nach 30 Minuten wurde die Farbentwicklungsreaktion
durch Zugabe von 1M H2SO4 gestoppt,
und die Absorption bei 490 nm wurde unter Verwendung eines Quantum IITM-Spektrophotometers gemessen. Das Spektrophotometer
wurde verwendet, um die Antikörperspiegel
jeder Probe durch Vergleich der Absorption der Probe gegenüber der
mit der Standardisierungs-Reihe erzeugten Standardkurve zu berechnen.
Die Antikörperspiegel
wurden dann um jegliche Verdünnungsfaktoren
korrigiert, und die Endwerte als geometrische Mittelwert-Titer von
allen mit einem bestimmten DNA-Impfstoff-Konstrukt geimpften Tieren aufgezeichnet.
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Die
Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in den 2–4 dargestellt.
Die 2 zeigt einen Vergleich zwischen dem vollständig Enhancer-haltigen
hCMV-Promotorsystem und dem hCMV-Minimal-Promotorsystem der vorliegenden
Erfindung. Wie ersichtlich ist, gab das Minimal-Promotorsystem einen
ungefähr
3-fachen Anstieg in Bezug auf den Antikörper-Titer gegenüber dem
vollständig
Enhancer-haltigen Promotorsystem (die Ergebnisse wurden aus vier
unabhängigen
Experimenten mit 8 Mäusen
pro Gruppe zusammengenommen). Die 3 und 4 zeigen ähnliche
Ergebnisse aus Vergleichen zwischen (Enhancer-haltigen) Volllängen-Promotoren
und ihren korrespondierenden (Enhancer-freien) Minimalpromotor-Derivaten.
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Es
sind dementsprechend neuartige Minimal-Promotor-Systeme und diese
Systeme umfassende Nukleinsäure-Reagenzien
beschrieben worden. Obwohl bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung in einiger Ausführlichkeit
beschrieben worden sind, versteht es sich, dass offensichtliche
Variationen vorgenommen werden können, ohne
von dem Umfang der Erfindung, wie durch die beigefügten Ansprüchen definiert,
abzuweichen.