KR20050035143A

KR20050035143A - 티오에스테르-종결된 수용해성 중합체, 및 그에 의한폴리펩티드의 ｎ-말단 변형 방법

Info

Publication number: KR20050035143A
Application number: KR1020047005261A
Authority: KR
Inventors: 마이클 제임스 로버츠; 지하오 팡
Original assignee: 넥타르 테라퓨틱스 에이엘, 코포레이션
Priority date: 2001-10-09
Filing date: 2002-10-09
Publication date: 2005-04-15
Also published as: EP1434589A4; US7511095B2; JP2010090387A; CA2463072A1; US8071678B2; ATE416773T1; EP1434589A2; US20120065330A1; US20100069571A1; EP1434589B1; KR100905676B1; US7078496B2; JP4474521B2; US7834088B2; US20110065862A1; MXPA04003340A; AU2002360257B2; CA2463072C; WO2003031581A2; US20030158333A1

Abstract

본 발명은 중합체를 폴리펩티드의 α-아민에 특이적으로 공액시키는 방법 및 시약을 제공한다. 본 발명은 N-말단에 시스테인 또는 히스티딘 잔기를 갖는 폴리펩티드의 α-아민에 특이적으로 공액시킬 수 있는, 단일관능성, 2관능성 및 다관능성 PEG, 및 말단 티오에스테르 부분을 갖는 관련 중합체를 제공한다. 본 발명은 폴리펩티드의 시스테인 또는 히스티딘 잔기와 적당한 반응성을 가져서 PEG 분자 및 폴리펩티드 사이의 아미드 결합을 생성하는, 반응성 티오에스테르-종결된 PEG 중합체를 제공한다.

Description

티오에스테르-종결된 수용해성 중합체, 및 그에 의한 폴리펩티드의 Ｎ-말단 변형 방법{THIOESTER-TERMINATED WATER SOLUBLE POLYMERS AND METHOD OF MODIFYING THE N-TERMINUS OF A POLYPEPTIDE THEREWITH}

본 발명은 폴리펩티드의 N-말단에 선택적으로 공액시키는데 유용한 수용해성 중합체에 관한 것이다.

폴리(에틸렌 옥시드) (약칭하여, PEO)로 또한 공지된, 친수성 중합체 폴리(에틸렌 글리콜) (약칭하여, PEG)의 분자 및 표면으로의 공유결합적 부착은 생물공학 및 약학에서 상당히 중요하다. PEG 는 물 및 수많은 유기 용매에 대한 용해성, 독성의 결여 및 면역원성의 결여에 관한 유용한 특성을 갖는 중합체이다. PEG 의 하나의 사용은 이 중합체를 수불용성 분자에 공유결합적으로 부착시켜 생성된 PEG-분자 공액체의 용해도를 향상시키는 것이다. 예를 들어, 수불용성 약물 파클리타셀 (paclitaxel)은 PEG 에 커플링되는 경우 수용해성으로 된다 (Greenwald 등, J. Org. Chem., 60: 331-336 (1995)). PEG 는 또한 폴리펩티드 및 단백질 치료제의 변형에서 더욱 더 사용되어 왔다.

주로 다양한 발현계로부터 인간 폴리펩티드의 개선된 재조합적 발현 방법 및 개선된 생체내 전달 방법 모두로 인해, 치료 적용을 위한 단백질을 포함하는 폴리펩티드의 사용이 최근 확장되고 있다. 짧은 순환 반감기, 면역원성 및 단백분해적 분해를 포함하는 폴리펩티드 치료제에 관련된 수많은 결점이 유전자 치료, 직접 또는 셔플링 돌연변이형성에 의한 에피토프 돌연변이, 천연 또는 합성 중합체에 의한 에피토프 영역의 실딩 (shielding), 융합 단백질, 및 보호용 및 서방용 약물 전달 운반제로의 폴리펩티드의 혼입을 포함하는 다양한 접근법으로 개선되어 왔다.

폴리(에틸렌 글리콜)의 공유결합적 부착과 같은 단백질의 중합체 변형은 치료학적으로 유용한 단백질의 약리학적 및 생물학적 특성을 개선하기 위한 방법으로 통상적이다. 예를 들어, 특정 폴리(에틸렌 글리콜) 공액된 단백질은, PEG화되지 않은 대응물과 비교하여, 상당히 강화된 혈장 반감기, 감소된 항원성 및 면역원성, 증가된 용해성 및 감소된 단백분해적 분해를 갖는 것으로 보여졌다. 상기 특성에 영향을 미치는 인자는 수없이 많으며, 단백질 그 자체의 성질, 단백질에 부착되는 폴리(에틸렌 글리콜) 및 기타 중합체 사슬의 갯수, 단백질에 부착되는 중합체 사슬의 분자량 및 구조, 단백질에 중합체를 부착하는데 사용되는 화학물질 (즉, 특정 연결자), 및 단백질 상에 중합체 변형시킨 부위의 위치를 포함한다.

PEG 를 단백질과 같은 분자에 커플링시키기 위하여, 이의 말단 위치에 관능기를 갖는 PEG 의 유도체를 제조하는 것에 의해 PEG 를 "활성화"시키는 것이 종종 필요하다. 상기 관능기는 PEG 에 커플링되는 분자 상의 이용가능한 반응성 기의 형태를 기준으로 하여 선택된다. 예를 들어, PEG-단백질 공액체를 형성하기 위하여, 단백질 상의 아미노기와 반응할 수 있는 관능기가 선택될 수 있다.

단백질에 폴리(에틸렌 글리콜)을 비특이적으로 또는 랜덤하게 부착시키기 위한 각종 방법이 개발되었다. 가장 통상적으로는, 친전자성으로 활성화된 폴리(에틸렌 글리콜)을 단백질의 발견된 친핵성 측쇄와 반응시킨다. 리신 상에서 그리고 N-말단에서 발견된 α-아민 및 ε-아민기에 활성화된 폴리(에틸렌 글리콜)을 부착시키는 것은, USP 6,057,292 에 기재된 공액체 산물의 혼합물을 초래한다. 예를 들어, 상기 공액체는, 단백질 분자에 0 내지 단백질 중의 α- 및 ε-아민기 갯수 범위의 다양한 갯수의 폴리(에틸렌 글리콜) 분자 ("PEGmer")가 부착된 공액 단백질의 집단으로 이루어질 수 있다. 종종, 랜덤 PEG화 접근은 생산된 PEG-mer 산물의 비율에 있어서의 가변성으로 인해, 그리고 특정 경우에 있어서는, 단일의 개별적인 PEG-단백질 공액체 산물에 대한 요구가 존재하므로, 바람직하지 않다. 부위 특이적이지 않은 방법론을 사용하여 단일 변형된 단백질 분자의 경우, 폴리(에틸렌 글리콜) 부분은 수많은 상이한 아민 부위 중 임의의 부위에 부착될 수 있다. 추가적으로, 이러한 형태의 비특이적 PEG 화는 공액 단백질, 특히 단백질에 하나 이상의 PEG 가 부착된 공액체의 치료적 유용성의 부분적 또는 완전한 손실을 초래할 수 있다.

PEG 의 부위-직접 또는 선택적 부착을 위한 몇몇 방법이 기술되어 왔다. 예를 들어, WO 99/45026 은 히드라지드 또는 반카르바지드 관능성에 의해 종결된 중합체와의 반응에 적합한 알데히드 관능성을 형성하기 위하여 N-말단 세린 잔기의 화학적 변형을 제안한다. USP 5,824,784 및 5,985,265 는, 환원 알킬화 조건하에, 그리고 N-말단에서의 선택적 공격을 촉진하는 pH 에서 단백질의 아미노 말단과 카르보닐기를 갖는 중합체의 반응을 제안한다. WO 99/03887 및 USP 5,206,344 및 5,766,897 은 단백질의 아미노산 서열로 가공된 시스테인 잔기 (시스테인 첨가 변형체)의 부위 직접 PEG화에 관한 것이다. 이들 방법은 비특이적 부착에 걸쳐 일부 장점을 제공하지만, 폴리펩티드의 화학적 변형 또는 특정 반응 조건, 예컨대 pH 의 주의깊은 조절을 요구하지 않는 부위-특이적 중합체 공액된 단백질을 제공하기 위한 개선된 방법 및 시약에 대한 지속적인 충족되지 않은 요구가 존재한다. 또한, 반응성 아미노 관능기에서 단백질을 변형시키는 것에 대한 높은 요구성으로 인해, PEG-중합체 PEGmer 의 혼합물은 아니지만 단백질 상의 단일의 동정된 부위에 PEG 가 부착된 단백질-중합체 공액체를 제조하기 위하여, 특정 단백질 아미노기, 예컨대 N-말단 아미노기와 선택적으로 반응하는 개선된 중합체 시약에 대한 요구가 존재한다.

발명의 개요

본 발명은 폴리펩티드의 α-아미노기에 특이적으로 중합체를 공액시키기 위한 방법 및 시약을 제공한다. 본 발명은 단일관능성, 2관능성 및 다관능성 PEG 및 N-말단에서 시스테인 또는 히스티딘을 갖는 폴리펩티드의 α-아민에 특이적으로 공액시킬 수 있는 티오에스테르 (또한, 티올 에스테르로도 언급됨) 부분을 갖는 관련 중합체를 제공한다. 따라서, 본 발명은 폴리펩티드의 N-말단 시스테인 또는 히스티딘 잔기와 부위 특이적으로 반응시켜 아미드-연결 PEG-폴리펩티드 공액체를 제조하는데 효과적인 반응성 티오에스테르-종결된 PEG 중합체를 제공하는 것이다.

하나의 측면에 의하면, 본 발명은 하기 화학식 I 의 구조에 결합된 하나 이상의 말단을 갖는 수용해성의 비펩티드성 중합체 골격을 포함하는 티오에스테르-종결된 반응성 중합체를 제공한다:

[식중,

L 은 수용해성의 비펩티드성 중합체 골격에 결합하는 지점이고;

Z 는 O, S, -NHCO-, -CONH-, -O₂C-, -NHCO₂- 또는 -O₂CNH- 와 같은 가수분해적으로 안정한 연결 또는 가수분해적으로 불안정한 연결이고;

a 는 0 또는 1 이고;

각각의 X 는 독립적으로 H 및 알킬, 예컨대 C1-C6 알킬로부터 선택되며;

m 은 0 내지 약 12, 바람직하게는 1 내지 약 4 이고;

Y 는 헤테로원자, 바람직하게는 O 또는 S 이고;

Q 는 바람직하게는 화학식 -S-R₁ (식중, R₁ 은 수소, 알킬, 치환 알킬, 시클로알킬, 치환 시클로알킬, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로사이클 또는 치환 헤테로사이클이다) 을 갖는 황 함유 이탈기이다].

반응성 중합체는 단일관능성 (예를 들어, mPEG), 이관능성 또는 다관능성일 수 있다. 중합체 골격은, 바람직하게는 폴리(알킬렌 글리콜), 예컨대 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(프로필렌 글리콜), 또는 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체가 있다. 기타 적당한 중합체 골격의 예에는, 폴리(옥시에틸화 폴리올), 폴리(올레핀성 알콜), 폴리(피닐피롤리돈), 폴리(α-히드록시산), 폴리(비닐 알콜), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리(N-아크릴로일모르폴린), 폴리아크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리사카라이드 및 이들의 공중합체, 삼원중합체 및 혼합물이 포함된다.

또다른 측면에 의하면, 본 발명은 N-말단에 시스테인 또는 히스티딘 분자를 갖는 폴리펩티드의 중합체 공액체를 제공하며, 상기 중합체 공액체는 하기 구조에 결합되는 하나 이상의 말단을 갖는 수용해성의 비펩티드성 중합체 골격을 포함한다:

[식중,

L, Z, m, Y, X 및 a 는 상술한 바와 같고,

W 는 -CH₂SH 또는 이며,

POLYPEPTIDE 는 -NH-C(W)-H- 가 폴리펩티드의 N-말단 시스테인 또는 히스티딘 잔기 (하나의 수소 원자의 부재)를 나타내는 폴리펩티드 분자이다].

본 발명의 티오에스테르-종결된 중합체에 공액될 수 있는 폴리펩티드의 예에는, 제한되지는 않지만, 단백질, 단백질-리간드, 효소, 시토카인, 헤마토포이에틴, 성장 인자, 호르몬, 항원, 항체, 항체 절편, 수용체 및 단백질 절편이 포함된다.

또다른 측면에 의하면, N-말단에 시스테인 또는 히스티딘을 갖는 폴리펩티드에 중합체 유도체를 공액시키는 방법이 또한 제공된다. 상기 방법은, N-말단에 시스테인 또는 히스티딘 분자를 갖는 폴리펩티드 및 상술한 티오에스테르-종결된 중합체를 모두 제공하는 것을 포함한다. 폴리펩티드는 티오에스테르-종결된 중합체와 반응하여, 부위 특이적 방식으로 N-말단 히스티딘 또는 시스테인 분자의 잔기와 반응성 중합체 사이의 아미드 연결을 갖는 공액체를 형성한다. 티오에스테르-종결된 중합체는, 폴리펩티드 내의 다른 위치에서 유리 아민기와 반응함 없이, 폴리펩티드의 히스티딘 또는 시스테인 잔기의 N-말단 아민기에 선택적으로 부착된다.

발명의 상세한 설명

본 발명을 더욱 충분하게 지금 후술할 것이다. 그러나, 본 발명은 수많은 다른 형태로 예시될 수 있으며, 본 발명이 본원에 기재된 구현예로 한정되기 보다는; 이들 구현예들은 본 개시를 철저하게 하고 구체화하기 위해 제공되며, 본 발명의 범위는 당업자에게 완전하게 이해될 것이다.

I. 정의

본원에 사용된 하기의 용어는 지시된 의미를 갖는다.

본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 단수 형태 "a", "an" 및 "the" 는 문맥에 명확히 다르게 지적된 바가 없다면 복수 관련물도 포함한다.

용어 "관능기", "활성 부분", "반응성 부위", "화학적 반응성 기" 및 "화학적 반응성 부분"는 당업계에 사용되고 있으며, 본원에서는 분자의 뚜렷한 정의가능한 부분 또는 단위로 언급된다. 이 용어들은 화학 분야에서 어느정도 동의어이며, 본원에서는 몇몇 기능 또는 활성을 수행하고 다른 분자에 반응성인 분자 부분을 나타내기 위해 사용된다. 용어 "활성" 은, 관능기와 조합하여 사용될 경우, 반응을 위해 강한 촉매 또는 상당히 실현불가능한 반응 조건을 요구하는 기 (즉, "비반응성" 또는 "비활성" 기) 와 반대로, 다른 분자 상의 친전자성 또는 친핵성 기와 용이하게 반응하는 관능기를 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 당업계에서 이해될 수 있는 용어 "활성 에스테르"는 아민과 같은 친핵성 기와 용이하게 반응하는 에스테르를 포함할 수 있다. 활성 에스테르의 예에는, N-히드록시숙신이미딜 에스테르 또는 1-벤조트리아졸릴 에스테르가 포함된다. 전형적으로는, 활성 에스테르는 분 단위로 수성 매질 중에서 아민과 반응하는 반면, 메틸 또는 에틸 에스테르와 같은 특정 에스테르는 친핵성 기와의 반응을 위해서 강한 촉매를 요구할 것이다. 본원에서 사용된 용어 "관능기"는 보호된 관능기를 포함한다.

용어 "보호된 관능기" 또는 "보호기" 또는 "보호성 기" 는 특정 반응 조건 하에서 분자 중의 특정 화학적 반응성 관능기의 반응을 억제 또는 차단하는 부분 (즉, 보호기)의 존재에 관한 것이다. 보호기는 보호될 화학적 반응성 기의 형태뿐만 아니라, 사용될 반응 조건, 및 존재할 경우 추가적인 반응성 기 또는 보호기의 존재에 의존한다. 당업계에 공지된 보호기는 문헌 [Greene, T.W. 등, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, 제 3 판, John Wiley & Sons, New York, NY (1999)] 에서 확인할 수 있다.

용어 "연결" 또는 "연결자" (L) 는, 바람직하게는 하나 이상의 공유결합에 의해서, 두 중합체 분절 또는 중합체 말단과 폴리펩티드와 같은 생물활성제 상에 존재하는 반응성 관능기와 같은 내부 연결 부분을 연결하기 위해 사용되는 원자 또는 원자 집합을 언급하기 위해 본원에서 사용된다. 본 발명의 연결자는 가수분해적으로 안정한 것일 수 있거나, 생리학적 가수분해가능하거나 효소적으로 분해가능한 연결을 포함할 수 있다.

"생리학적으로 가수분해가능한" 또는 "가수분해적으로 분해가능한" 결합은 생리학적 조건하에서 물과 반응하는 (즉, 가분분해되는) 약한 결합이다. pH 8 및 25℃ 에서 가수분해 반감기가 약 30 분 미만인 결합이 바람직하다. 물 중에서 가수분해하는 결합의 경향은, 두 개의 중심 원자를 연결하는 연결의 일반적인 형태뿐만 아니라, 이들 중심 원자에 부착된 치환체에도 또한 의존한다. 적절한 가수분해적으로 불안정하거나 분해가능한 연결에는, 한정되지는 않지만, 카르복실레이트 에스테르, 포스페이트 에스테르, 무수물, 아세탈, 케탈, 아실옥시알킬 에테르, 이민, 오르토에스테르, 펩티드 및 올리고뉴클레오타이드가 포함된다.

"가수분해적으로 안정한" 연결 또는 결합은 물 중에서 실질적으로 안정한, 즉 확장된 기간에 걸쳐 어떠한 상당한 정도로도 생리학적 조건 하에서 가수분해를 수행하지 않는 화학 결합, 전형적으로는 공유 결합에 관한 것이다. 가수분해적으로 안정한 연결의 예에는, 한정되지는 않지만, 하기가 포함된다: (예를 들어, 지방족 사슬에서의) 탄소-탄소 결합, 에테르, 아미드, 우레탄 등. 일반적으로, 가수분해적으로 안정한 연결은 생리학적 조건하에서 1일당 약 1-2% 미만의 가수분해 속도를 나타내는 것이다. 대표적인 화학 결합의 가수분해 속도는 대부분의 표준 화학 교과서에서 확인할 수 있다.

"효소적으로 불안정한" 또는 분해가능한 연결은 하나 이상의 효소에 의해서 분해될 수 있는 연결이다.

용어 "중합체 골격"은 중합체를 형성하는 반복 단량체 단위의 공유결합된 사슬에 관한 것이다. 예를 들어 PEG 의 중합체 골격은 하기와 같다:

[식중, n 은 전형적으로는 약 2 내지 약 4000 이다].

이해할 수 있는 바와 같이, 중합체 골격은, 말단 관능기 또는 중합체 골격을 따라 일정한 간격으로 배치되는 펜던트 관능화 측쇄에 공유결합적으로 부착될 수 있다.

용어 "반응성 중합체" 는 하나 이상의 반응성 관능기를 갖는 중합체에 관한 것이다.

다른 지적이 없다면, 분자량은 [식중, Ni 는 분자량 Mi 를 갖는 중합체 분자의 수 (또는 이러한 분자의 몰수)이다] 로서 정의된 수평균 분자량으로서 본원에서 표현된다.

용어 "알킬" 은 전형적으로는 탄소수가 약 1 내지 약 12, 바람직하게는 1 내지 약 6 인 길이의 탄화수소 사슬에 관한 것으로, 직쇄 및 분지쇄를 포함한다. 탄화수소 사슬은 포화 또는 불포화일 수 있다.

"시클로알킬" 은 포화 또는 불포화 시클릭 탄화수소 사슬로, 가교, 접합 또는 스피로 시클릭 화합물을 포함하며, 바람직하게는 3 내지 약 12 개의 탄소원자, 더욱 바람직하게는 3 내지 약 8 개의 탄소원자를 함유한다.

용어 "포화 알킬" 또는 "치환된 시클로알킬" 은 하나 이상의 비방해 치환기, 예를 들어 한정되지는 않지만 C3-C8 시클로알킬 (예를 들어, 시클로프로필, 시클로부틸 등); 아세틸렌; 시아노; 알콕시 (예를들어, 메톡시, 에톡시 등); 저급 알카노일옥시 (예를 들어, 아세톡시); 히드록시; 카르복실; 아미노; 저급 알킬아미노 (예를 들어, 메틸아미노); 케톤; 할로 (예를 들어, 클로로 또는 브로모); 페닐; 치환된 페닐 등으로 치환된 알킬 또는 시클로알킬에 관한 것이다.

"알콕시" 는 -O-R 기에 관한 것이며, 여기서 R 은 알킬 또는 치환된 알킬, 바람직하게는 C1-C6 알킬 (예를 들어, 메톡시 또는 에톡시)이다.

"아릴" 은 각각 5 내지 6 개의 중심 탄소 원자를 갖는 하나 이상의 방향족 고리를 의미한다. 다중 아릴 고리는 나프틸에서와 같이 접합되거나 비페닐에서와 같이 접합되지 않을 수 있다. 아릴 고리는 또한 하나 이상의 환식 탄화수소, 헤테로아릴 또는 헤테로시클릭 고리에 접합되거나 접합되지 않을 수 있다.

"치환된 아릴" 은 치환기로서 하나 이상의 비(非)방해기를 갖는 아릴이다. 페닐 고리 상의 치환에 있어서, 치환기는 임의의 위치 (즉, 오르토, 메타 또는 파라)에 존재할 수 있다.

"헤테로아릴" 은 1 내지 4 개의 헤테로원자, 바람직하게는 N, O 또는 S, 또는 이들의 조합을 함유하는 아릴기이며, 이때 헤테로아릴기는 탄소 또는 질소 원자(들)에서 C1-6 알킬, -CF₃, 페닐, 벤질 또는 티에닐로 임의 치환될 수 있거나, 헤테로아릴기 중의 탄소원자는 산소원자와 함께 카르보닐을 형성할 수 있거나, 헤테로아릴기는 페놀 고리에 임의로 접합될 수 있다.

헤테로아릴 고리는 또한 하나 이상의 시클릭 탄화수소, 헤테로시클릭, 아릴 또는 헤테로아릴 고리에 접합될 수 있다. 헤테로아릴은, 한정되지는 않지만, 하나의 헤테로 원자를 갖는 5원 헤테로아릴 (예를 들어, 티오펜, 피롤, 푸란); 1,2 또는 1,3 위치에 2 개의 헤테로원자를 갖는 5원 헤테로아릴 (예를 들어, 옥사졸, 피라졸, 이미다졸, 티아졸, 푸린); 3 개의 헤테로원자를 갖는 5원 헤테로아릴 (예를 들어, 트리아졸, 티아디아졸); 3 개의 헤테로원자를 갖는 5원 헤테로아릴; 하나의 헤테로원자를 갖는 6원 헤테로아릴 (예를 들어, 피리딘, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 페난트린, 5,6-시클로헵테노피리딘); 2 개의 헤테로원자를 갖는 6원 헤테로아릴 (예를 들어, 피리다진, 신놀린, 프탈라진, 피라진, 피리미딘, 퀴나졸린); 3 개의 헤테로원자를 갖는 6원 헤테로아릴 (예를 들어, 1,3,5-트리아진); 및 4 개의 헤테로원자를 갖는 6원 헤테로아릴을 포함한다.

"치환된 헤테로아릴" 은 치환기로서 하나 이상의 비방해기를 갖는 헤테로아릴이다.

"헤테로사이클" 또는 "헤테로시클릭" 은, 불포화 또는 방향족 특성이 존재하거나 존재하지 않고 하나 이상이 고리 원자가 탄소가 아닌, 5 내지 12 개의 원자, 바람직하게는 5 내지 7 개의 원자를 갖는 하나 이상의 고리를 의미한다. 바람직한 헤테로원자는 황, 산소 및 질소를 포함한다. 다중 고리는 퀴놀린 또는 벤조푸란에서와 같이 접합될 수 있다.

"치환된 헤테로사이클" 은 비방해 치환기로부터 형성된 하나 이상의 측쇄를 갖는 헤테로사이클이다.

"비방해 치환기" 는, 분자내에 존재할 경우, 분자내에 함유된 다른 관능기와 전형적으로는 비반응성인 기이다.

적당한 비방해 치환기 또는 라디칼은, 한정되지는 않지만, 할로, C1-C10 알킬, C2-C10 알킬, C2-C10 알케닐, C2-C10 알키닐, C1-C10 알콕시, C7-C12 아르알킬, C7-C12 알크아릴, C3-C10 시클로알킬, C3-C10 시클로알케닐, 페닐, 치환된 페닐, 톨루오일, 크실레닐, 비페닐, C2-C12 알콕시알킬, C7-C12 알콕시아릴, C7-C12 아릴옥시알킬, C7-C12 아릴옥시알킬, C6-C12 옥시아릴, C1-C6 알킬술피닐, C1-C10 알킬술포닐, -(CH₂)_m-O-(C1-C10 알킬) [식중, m 은 1 내지 8 이다], 아릴, 치환된 아릴, 치환된 알콕시, 플루오로알킬, 헤테로시클릭 라디칼, 치환된 헤테로시클릭 라디칼, 니트로알킬, -NO₂, -CN, -NRC(O)-(C1-C10 알킬), -C(O)-(C1-C10 알킬), C2-C10 티오알킬, -C(O)O-(C1-C10 알킬), -OH, -SO₂, =S, -COOH, -NR, 카르보닐, -C(O)-(C1-C10 알킬)-CF₃, -C(O)-CF₃, -C(O)NR₂, -(C1-C10 알킬)-S-(C6-C12 아릴), -C(O)-(C6-C12 아릴), -(CH₂)_m-O-(CH₂)_m-O-(C1-C10 알킬) [식중, 각각의 m 은 1 내지 8 이다], -C(O)NR, -C(S)NR-, -SO₂NR, -NRC(O)NR, -NRC(S)NR, 이의 염 등을 포함한다. 여기에서 사용된 각각의 R 은 H, 알킬 또는 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴, 아르알킬 또는 알크아릴이다.

"헤테로원자"는 탄화수소 유사체 화합물 중의 탄소가 아닌 임의의 원자를 의미한다. 예에는, 산소, 황, 질소, 인, 아르센, 실리콘, 셀레늄, 텔루륨, 주석 및 붕소가 포함된다.

용어 "약물", "생물학적 활성 분자", "생물학적 활성 부분" 또는 "생물학적 활성제" 는, 본원에서 사용될 경우, 한정되지는 않지만 바이러스, 박테리아, 균, 식물, 동물 및 인간을 포함하는 생물학적 유기체의 임의의 물리적 또는 생화학적 특성에 영향을 미칠 수 있는 임의의 물질을 의미한다. 특히, 본원에서 사용되는 생물학적 활성 분자는 인간 또는 다른 동물에게서의 질환의 진단, 치유 경감, 치료 또는 예방을 위해 의도되거나, 인간 또는 동물의 신체적 또는 정신적 건강을 강화하기 위한, 임의의 물질을 포함한다.

생물학적 활성 물질의 예에는, 한정되지는 않지만, 펩티드, 단백질, 효소, 소형 분자 약물, 염료, 지질, 뉴클레오사이드, 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, 핵산, 세포, 바이러스, 리포좀, 미세입자 및 미셀(micelle)이 포함된다. 본 발명에 사용하기 적합한 생물학적 활성제의 부류에는, 한정되지는 않지만, 항생제, 살균제, 항-바이러스제, 항염증제, 항종양제, 심혈관 약제, 항불안제, 호르몬, 성장인자, 스테로이드제 등이 포함된다.

"폴리올레핀성 알콜" 은 중합체 골격에 부착된 복수의 펜던트 히드록실기를 갖는 폴리올레핀 골격, 예컨대 폴리에틸렌을 포함하는 중합체이다. 폴리올레핀성 알콜의 예에는 폴리비닐 알콜이 있다.

본원에서 사용되는 "비펩티드성"은 펩티드 연결이 실질적으로는 없는 중합체 골격에 관한 것이다. 그러나, 상기 중합체 골격은, 상기 골격의 길이를 따라 일정 간격으로 배치된 소수의 펩티드 연결을 포함할 수 있다 (예를 들어, 약 50 개 단량체 단위 마다 약 1 개 이하의 펩티드 연결).

"폴리펩티드" 또는 "폴리(아미노산)" 은, 알파 탄소 골격을 따라 아미드 연결 (또한 '펩티드 연결'로도 언급됨)을 통해 연결된 일련의 아미노산 잔기, 전형적으로는 약 10 내지 20 개 잔기 이상을 포함하는 임의의 분자에 관한 것이다. 일부 경우에는 용어들이 본원에서 동의어로 사용될지라도, 폴리펩티드는 전형적으로는 약 10,000 Da 이하의 분자량을 갖는 펩티드인 반면, 상기 분자량을 초과하는 펩티드는 통상적으로 단백질로서 언급된다. 펩티드 측쇄의 변형이 글리코실화, 히드록실화 등과 함께 존재할 수 있다. 또한, 지질 및 소형 약물 분자를 포함하는 다른 비펩티드성 분자가 폴리펩티드에 부착될 수 있다. 폴리펩티드는 아미노산 잔기의 임의의 조합 또는 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 중합체는 폴리펩티드 및 단백질 모두로의 공유결합 부착에 적합하다.

"아미노산" 은 염기성 아민기 및 산성 카르복실기 모두를 함유하는 유기산에 관한 것이다. 이 용어는 필수 및 비필수 아미노산, 및 천연존재 및 합성 또는 변형 아미노산을 포함한다. 가장 통상적인 아미노산을, 이들의 총명칭에 의해, 또는 3문자 또는 단일문자 약자에 의해서 본원에서 나열한다: : 글리신 (Gly, G), 알라닌 (Ala, A), 발린 (Val, V), 루신 (Leu, L), 이소루신 (Ile,I), 메티오닌 (Met, M), 프롤린 (Pro, P), 페닐알라닌 (Phe, F), 트립토판 (Trp, W), 세린 (Ser, S), 트레오닌 (Thr, T), 아스파라긴 (Asn, N), 글루타민 (Gln, Q), 티로신 (Tyr, Y), 시스테인 (Cys, C), 리신 (Lys, K), 아르기닌 (Arg, R), 히스티딘 (His, H), 아스파트산 (Asp, D) 및 글루탐산 (Glu, E).

"잔기" 는 하나 이상의 분자와의 반응 후 잔존하는 분자의 부분을 의미한다. 예를 들어, 폴리펩티드 사슬 중의 아미노산 잔기는 이웃 아미노산 잔기와의 펩티드 연결을 형성한 후 잔존하는 아미노산의 일부를 의미한다.

"올리고머" 는 2 내지 약 10 개의 단량체 단위, 바람직하게는 2 내지 약 5 개의 단량체 단위를 포함하는 짧은 단량체 사슬에 관한 것이다.

용어 "공액체" 는 분자, 예컨대 생물학적 활성 분자의 반응성 중합체 분자, 바람직하게는 폴리(에틸렌 글리콜)로의 공유결합 부착의 결과로서 형성된 실체에 관한 것으로 의도된다.

용어 "이탈기" 는 원자 (예컨대, 탄소 원자)에 공유결합으로 부착되고 이의 결합 전자를 얻음으로써 상기 원자로부터 용이하게 이탈될 수 있는 원자 또는 원자의 집합에 관한 것이다. 전형적으로는, 이탈기는 음이온 또는 중성 분자이다. 우수한 이탈기일수록, 결합된 원자로부터 더욱 쉽게 이탈될 수 있다. 대표적인 우수한 이탈기는 강산의 공액체 염기인 것들이다.

본 발명의 중합체와 관련하여, "다관능성" 은 이에 부착된 3 개 이상의 관능기를 갖는 중합체를 의미하며, 여기에서 관능기는 동일하거나 상이할 수 있다. 본 발명의 다관능성 중합체는 전형적으로는 약 3 내지 100 개의 관능기, 3 내지 50 개의 관능기, 3 내지 25 개의 관능기, 3 내지 15 개의 관능기, 또는 3 내지 10 개의 관능기를 포함할 것이고, 또는 중합체 골격에 부착된 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 관능기를 함유할 것이다.

II. 티오에스테르 중합체

하나의 측면에 의하면, 본 발명은 폴리펩티드의 N-말단 아민기와 선택적으로 반응하여 N-말단에 부착된 단일 수용해성 중합체 사슬을 포함하는 중합체-폴리펩티드 공액체를 형성할 수 있는 티오에스테르-종결된 수용해성 중합체를 제공한다. 이러한 중합체-폴리펩티드 공액체는 본원에서는 단일 치환된 것으로 언급된다 (이는 중합체 사슬이 폴리펩티드의 단지 하나의 부위에서만 치환된 것을 의미한다). 단지 하나의 부위에서의 폴리펩티드의 변형은, 중합체 사슬의 존재로 인한 생물활성의 현저한 감소의 가능성이 폴리펩티드 사슬 중의 다양한 복수 부위에서의 차별 또는 랜덤 중합체 부착과 비교하여 낮아지기 때문에 유용하다. 또한, 부위-특이적 공액체를 형성하기 위해 본원에서 제공된 중합체 및 방법은, 중합체 내에 함유된 다른 반응성기/위치에 관련된 중합체의 반응을 억제하기 위한 다중 보호/탈보호 단계를 필요로하지 않기 때문에, 통상적으로 사용되는 선행기술의 방법을 넘어선 추가의 잇점을 제공한다. 또한, 이러한 부위 선택적 변형은 특정한 (예를 들어, 단일 PEG화된) 공액체 종을 단리하기 위한 추가적인 공액체 정제 단계의 필요성이 없다. 따라서, 본 발명의 티오에스테르 중합체의 사용은 상기한 잇점을 제공할 수 있으며, 추가로 수용해성 중합체 부착의 유용한 특성, 예컨대 비변형된 폴리펩티드와 비교하여 증가된 수용해성, 강화된 혈장 반감기, 및 단백분해적 분해의 감소를 제공한다.

하기에서 더욱 상세히 기술된 바와 같이, 본 발명의 티오에스테르-종결된 중합체는 폴리펩티드의 N-말단 시스테인 또는 히스티딘 잔기와 선택적으로 반응한다. 이론에 의해 한정되지는 않지만, 상기 반응은 시스테인 잔기의 티올 측쇄 또는 히스티딘 잔기의 이미다졸 측쇄에 의한 티오에스테르기의 친핵성 공격으로 티오에스테르 중간체를 형성하는 것을 포함한다. 이어서, 티오에스테르 중간체는 중합체 아실기의 폴리펩티드의 말단 아민기로의 이동을 초래하는 빠른 재배열을 수행함으로써, 중합체 및 폴리펩티드의 N-말단 사이에 펩티드 결합을 생성한다. 이해할 수 있는 바와 같이, 단지 N-말단 시스테인 또는 히스티딘 잔기만이 초기 반응 단계 (N-말단 시스테인을 갖는 단백질의 반응성 티올기에 의한 중합체 티오에스테르 카르보닐 탄소 상으로의 공격)에 요구되는 측쇄를 제공할 수 있기 때문에, 본 발명의 중합체는 분자 재배열을 통해 폴리펩티드 분자내에 존재할 수 있는 임의의 다른 측쇄 아민기와의 반응 없이 N-말단 아민에 특이적으로 부착할 것이다. 본 발명은, 심지어 비폴딩된 상태에서도, 하나 초과의 유리 시스테인 또는 히스티딘을 함유하는 폴리펩티드의 부위 특이적 PEG 부착에 특히 유용하다. 본 발명의 중합체 및 공액화 방법은 폴딩되지 않은 상태인 불용성 폴리펩티드가 본래 형태로 재폴딩되도록 돕기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 티오에스테르-종결된 중합체는 중합체 골격의 말단 및 티오에스테르기 사이에 임의로 점재된 연결로 티오에스테르기에 부착된 중합체 골격을 포함한다. 본 발명의 티오에스테르-종결된 중합체는 하기 화학식 I 의 구조를 갖는다:

[화학식 I]

[식중,

m 은 0 내지 약 12, 바람직하게는 1 내지 약 4 이고;

a 는 0 또는 1 이고;

Y 는 헤테로원자, 바람직하게는 O 또는 S 이고;

A. 중합체 골격

일반적으로, 수용해성의 비펩티드성 중합체 골격은 비독성이고 생물적합성이어야만 하고, 이는 중합체가 위해성의 유발 없이 생체 조직 또는 유기체와 공존할 수 있다는 것을 의미한다. 본원에서 티오에스테르-종결된 중합체 골격이 언급되는 경우, 중합체 골격은 하기에 기재된 것과 같은 수많은 수용해성의 비펩티드성 중합체 중 임의의 것일 수 있음이 이해되어야만 한다. 바람직하게는, 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG) 가 중합체 골격이다. 용어 PEG 는, 선형 형태 (예를 들어, 알콕시 PEG 또는 2관능성 PEG), 분지형 또는 다중 분지 형태 (예를 들어, 포크형 PEG 또는 폴리올 코어에 부착된 PEG), 펜던트 PEG, 또는 내부에 분해가능한 연결을 갖는 PEG 를 포함하는 수많은 기학적 배열 또는 형태 중 임의의 것인 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하며, 하기에 더욱 상세하게 기술한다.

가장 단순한 형태로, PEG 는 하기 화학식을 갖는다:

[식중, n 은 약 10 내지 4000, 전형적으로는 약 20 내지 약 2000 이다].

PEG 중합체 골격의 수평균 분자량은 다양할지라도, 약 100 Da 내지 약 100,000 Da, 바람직하게는 약 5,000 Da 내지 약 60,000 Da 의 수평균 분자량을 갖는 PEG 가 특히 유용하다. 예를 들어, 약 100 Da, 약 200 Da, 약 300 Da, 약 500 Da, 약 800 Da, 약 1,000 Da, 약 2,000 Da, 약 3,000 Da, 약 4,000 Da, 약 5,000 Da, 약 10,000 Da, 약 15,000 Da, 약 20,000 Da, 약 30,000 Da 및 약 40,000 Da 의 분자량을 갖는 PEG 가 본 발명에 유용하다.

하나 이상의 말단이 상대적으로 비활성인 기 (예를 들어, 알콕시기)로 캡핑된 중합체를 의미하는, 말단-캡핑된(end-capped) 중합체가, 본 발명의 중합체 골격으로써 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 메톡시-PEG-OH (간단히, mPEG)는, 중합체 골격의 하나의 말단이 메톡시 기에 결합되어 있고 다른 말단은 용이한 화학적 변형을 수행하는 히드록시기인 PEG 의 형태이다. mPEG 의 구조는 하기와 같다:

[식중, n 은 상기한 바와 같다].

전형적으로, 약 100 내지 약 100,000 Da, 더욱 바람직하게는 약 2,000 내지 약 60,000 Da 의 수평균 분자량을 갖는 모노메톡시-종결된 PEG 분자가 단백질로의 공액화에 바람직하다. mPEG 와 같은 단일관능성 중합체의 사용은, 이관능성 또는 다관능성 시약을 사용할 경우 종종 발생하는 단백질의 가교연결을 억제한다. 본 발명에 의하면, mPEG-티오에스테르는 단일 단백질 분자에 부착된 단일 PEG 분자를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 그러나, 다른 구현예에 의하면, 적절한 비율로 동종 2관능성 PEG-티오에스테르를 이용하는 것은, 심지어 단백질이 다수의 유리 시스테인 잔기를 함유하는 경우에도, 단일 PEG 분자에 두 개의 단백질 분자가 부착된 공액체를 초래할 것이다. PEG 유도체가 반응하는 것으로 여겨지는 방식으로 인해 (즉, N-말단 시스테인 잔기의 이용가능한 티올기를 통한 초기 연결, 및 그 후의 재배열을 통한 아미드 연결의 형성), 본 발명의 티오에스테르 중합체 유도체가 가교연결된 단백질을 생성하는 것은 가능하지 않으며, 이는 다른 유리 시스테인 잔기가 이용가능한 티올기 및 이용가능한 아민기를 모두 갖지 않기 때문이다. 따라서, 본 발명의 또다른 잇점은 폴리펩티드와의 바람직하지 않은 가교연결 없이 본원에 기재된 형태의 복수 관능기를 갖는 중합체를 사용하는 능력이다.

복수-분지형 또는 분지형 PEG 분자, 예컨대 USP 5,932,462 에 기재된 것들은 PEG 중합체로써 또한 사용될 수 있다 (상기 문헌은 참고문헌으로 본원에 전체가 통합된다). 예를 들어, PEG 중합체 골격은 하기 구조를 가질 수 있다:

[식중,

poly_a 및 poly_b 는 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)과 같은 PEG 골격이고;

R" 는 H, 메틸 또는 PEG 골격과 같은 비반응성 부분이고;

P 및 Q 는 비반응성 연결이다].

바람직한 구현예에 의하면, 분지형 PEG 중합체는 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)로 이중치환된 리신이다.

PEG 중합체는 다르게는 포크형 PEG 를 포함할 수 있다. 포크형 PEG 의 예는 PEG-YCHZ₂ [식중, Y 는 연결기이고, Z 는 정의된 길이의 원자를 갖는 사슬에 의해 CH 에 연결된 활성화 말단기, 예컨대 본 발명의 알데히드기이다] 로 나타내어진다. 국제특허출원 PCT/US99/05333 은 본 발명에 사용할 수 있는 다양한 포크형 PEG 구조를 개시한다 (상기 출원의 내용은 참고로 본원에 통합된다). Z 관능기를 분지 탄소 원자에 연결하는 원자의 사슬은 사슬기 (tethering group)로서 역할하고, 예를 들어 알킬 사슬, 에테르 연결, 에스테르 연결, 아미드 연결 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

PEG 중합체는 PEG 사슬의 말단에서 보다는 PEG 골격의 길이를 따라 공유결합으로 부착된 카르복실과 같은 반응성 기를 갖는 펜던트 PEG 분자를 포함할 수 있다. 펜던트 반응성 기는 알킬렌 기와 같은 연결 부분을 통해 또는 직접적으로 PEG 골격에 부착될 수 있다.

PEG 의 상기 기술된 형태 외에, 중합체는 또한, 상기 기술한 임의의 중합체를 포함하는 중합체 골격 중의 하나 이상의 약한 또는 분해가능한 연결로 제조될 수 있다. 예를 들어, PEG 는 가수분해를 수행하는 중합체 골격 중의 에스테르 연결로 제조될 수 있다. 하기에서 보는 바와 같이, 이런 가수분해는 저분자량을 갖는 절편으로의 중합체의 절단을 초래한다:

중합체 골격 내의 분해가능한 연결로서 유용한 기타 가수분해적으로 분해가능한 연결은, 카보네이트 연결; 예를 들어 아민과 알데히드의 반응으로부터 초래되는 이민 연결 (예를 들어 Ouchi 등, Polymer Preprints, 38 (1): 582-3 (1997) 참조, 이는 참고문헌으로 본원에 통합됨) ; 예를 들어 알콜과 포스페이트기의 반응에 의해 형성되는 포스페이트 에스테르 연결; 전형적으로는 히드라지드와 알데히드의 반응에 의해 형성되는 히드라존 연결; 전형적으로는 알데히드 및 알콜 사이의 반응에 의해 형성되는 아세탈 연결; 예를 들어 포르메이트와 알콜 사이의 반응에 의해 형성되는 오르토 에스테르 연결; 예를 들어 PEG 와 같은 중합체 말단의 아민기와 펩티드의 카르복실기에 의해서 형성되는 펩티드 연결; 및 예를 들어, 중합체 말단의 포스포라미다이트기와 올리고뉴클레오타이드의 5'-히드록시기에 의해서 형성되는 올리고뉴클레오타이드 연결을 포함한다.

용어 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 PEG 는 상기 모든 형태의 PEG 를 나타내거나 포함한다는 것은 당업자에 의해 이해된다.

수많은 다른 중합체도 또한 본 발명에 적합하다. 비펩티드성이고 수용해성인 임의의 다양한 단일관능성, 2관능성 또는 다관능성 중합체 골격이, 본 발명에 사용될 수 있다. 중합체 골격은 선형일 수 있거나, 상기 기술된 임의의 형태 (예를 들어, 분지형, 포크형 등)일 수 있다. 적합한 중합체의 예에는, 한정되지는 않지만, 다른 폴리(알킬렌 글리콜), 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리(올레핀성 알콜), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(히드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(히드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(사카라이드), 폴리(α-히드록시산), 폴리(비닐 알콜), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리(N-아크릴로일모르폴린), 예컨대 USP 5,629,384 에 기술된 것 (이는 참고문헌으로 본원에 그 전체가 통합된다), 및 이들의 공중합체, 삼원중합체 및 혼합물이 포함된다.

B. 중합체 골격 및 티오에스테르 사이의 연결

중합체 골격의 말단과 티오에스테르 사이에 삽입된 연결은, 중합체 골격을 말단 티오에스테르 기에 커플링시키는 중합체 골격 상의 관능기의 잔기이다. 따라서, 이해될 수 있는 바와 같이, 연결 구조는 중합체 골격의 관능기의 구조에 따라 다양할 것이다. 상기 연결은, 가수분해적으로 안정한 연결, 예컨대 아미드, 우레탄, 에테르, 티오에테르 또는 우레아를 포함할 수 있다. 다르게는, 상기 연결은 가수분해적으로 불안정한 연결, 예컨대 카르복실레이트 에스테르, 포스페이트 에스테르, 오르토에스테르, 무수물, 이민, 아세탈, 케탈, 올리고뉴클레오타이드 또는 펩티드를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에 의하면, 가수분해적으로 안정하거나 불안정한 연결 외에, 중합체 골격 및 티오에스테르 사이의 연결은 (CHX)_m 으로서 본원에서 지칭되는 임의의 알킬렌 간격자 (spacer)를 포함한다.

화학식 I 로 상기에서 보여진 바와 같이, 상기 연결은 하기의 구조를 갖는 것이 바람직하다:

[식중,

Z 는 가수분해적으로 안정하거나 불안정한 연결, 예컨대 O, S, -NHCO-, -CONH-, -O₂C-, -NHCO₂- 또는 -O₂CNH- 이고;

m 은 0 내지 약 12, 바람직하게는 1 내지 약 4 이고;

각각의 X 는 독립적으로 H 및 알킬, 예컨대 C1-C6 알킬로부터 선택되고;

a 는 0 또는 1 이다].

알킬렌 사슬의 길이 (즉, m 값)는 0 내지 약 12 로 다양할 수 있다. 예를 들어, m 은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 일 수 있다. 바람직하게는, m 은 0, 1, 2, 3 또는 4 일 수 있다. 알킬렌 사슬의 각각의 X 는 바람직하게는 수소, 메틸 또는 에틸이다. 바람직한 구현예에 의하면, a 는 1 이고 Z 는 헤테로원자, 예컨대 O 또는 S 이다.

C. 티오에스테르 관능기

티오에스테르 관능기는 수용해성 중합체의 하나 이상의 말단에 공유결합으로 부착된다. 상기 티오에스테르기는 하기의 구조를 갖는다:

[식중,

Y 는 헤테로원자, 바람직하게는 O 또는 S 이고;

Q 는 바람직하게는 화학식 -S-R₁ (식중, R₁ 은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로사이클 또는 치환된 헤테로사이클이다) 을 갖는 황 함유 친전자성 이탈기이다].

사용되는 구체적인 R₁ 은 다양할 수 있다. R₁ 기는, 황 원자에 연결되어, 폴리펩티드의 N-말단 아미노산 잔기의 티올 또는 이미다졸 측쇄에 의한 카르보닐기의 친핵성 공격 동안의 이탈에 적합한 친전자성 이탈기를 형성한다. 바람직한 R₁ 기는 페놀, 니트로페놀, 벤조산, 피리딘, 피리딘카르복실산 및 니트로피리딘으로부터 유도된 치환기를 포함한다. 치환되거나 비치환된 피리디닐이 특히 바람직하다. 실시예 1 내지 3 은 티오피리디닐 이탈기를 갖는 티오에스테르-종결된 PEG 중합체를 예시한다.

D. 예시적인 중합체 구조

본 발명의 선형 중합체의 구현예는 하기에서 보여지는 바와 같이 구조적으로 나타내어질 수 있다:

[식중, POLY 는 수용해성의 비펩티드성 중합체 골격을 나타내고, R 은 캡핑기 또는 관능기이며, Z, X, Y, m, a 및 Q 는 상기 정의된 바와 같다].

바람직한 구현예에 의하면, R 은 메톡시이고, POLY 는 폴리(에틸렌 글리콜)이며, a 는 1 이고, Z 는 O 이며, m 은 1 내지 약 3 이고, Y 는 O 이며, 각각의 X 는 H 또는 CH₃ 이다.

R 기는 상대적으로 비활성인 캡핑기, 예컨대 알콜시기 (예를 들어, 메톡시 또는 에톡시), 알킬, 벤질, 아릴 또는 아릴옥시 (예를 들어, 벤질옥시)일 수 있다. 다르게는, R 기는 생물학적 활성 분자 상의 관능기와 용이하게 반응할 수 있는 관능기일 수 있다. 예시적인 관능기에는, 히드록시, 활성 에스테르 (예를 들어, N-히드록시숙신이미딜 에스테르 또는 1-벤조트리아졸릴 에스테르), 활성 카보네이트 (예를 들어, N-히드록시숙신이미딜 카보네이트 및 1-벤조트리아졸릴 카보네이트), 아세탈, 알데히드, 알데히드 수화물, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 활성 술폰, 아민, 히드라지드, 티올, 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐술폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세트아미드, 에폭시드, 글리옥살, 디온, 메실레이트, 토실레이트 또는 트레실레이트가 포함된다. 본 발명의 중합체 골격에 대한 말단 관능기의 특정예는, N-숙신이미딜 카보네이트 (예를 들어, USP 5,281,698, 5,468,478 참조), 아민 (예를 들어, Buckmann 등, Makromol.Chem. 182: 1379 (1981), Zalipsky 등, Eur. Polym. J. 19:1177 (1983) 참조), 히드라지드 (예를 들어, Andresz 등, Makromol. Chem. 179:301 (1978) 참조), 숙신이미딜 프로피오네이트 및 숙신이미딜 부타노에이트 (예를 들어, Olson 등, in Poly(ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, pp 170- 181, Harris & Zalipsky Eds., ACS, Washington, DC, 1997 참조; 또한 USP 5,672,662 참조), 숙신이미딜 숙시네이트 (예를 들어, Abuchowski 등, Cancer Biochem. Biophys. 7: 175 (1984) and Joppich 등,, Makromol. Chem. 180:1381 (1979) 참조), 숙신이미딜 에스테르 (예를 들어, USP 4,670,417 참조), 벤조트리아졸 카보네이트 (예를 들어, USP 5,650,234 참조), 글리시딜 에테르 (예를 들어, Pitha 등, Eur. J. Biochem. 94:11 (1979), Elling 등, Biotech. Appl. Biochem. 13:354 (1991) 참조), 옥시카르보닐이미다졸 (예를 들어, Beauchamp, 등, Anal. Biochem. 131:25 (1983), Tondelli 등 J. Controlled Release 1:251 (1985) 참조), p-니트로페닐 카보네이트 (예를 들어, Veronese, 등, Appl. Biochem. Biotech., 11:141 (1985); 및 Sartore 등, Appl. Biochem. Biotech., 27:45 (1991) 참조), 알데히드 (예를 들어, Harris 등 J. Polym. Sci. Chem. Ed. 22:341 (1984), USP 5,824,784, USP 5,252,714 참조), 말레이미드 (예를 들어, Goodson 등 Bio/Technology 8:343 (1990), Romani 등 in Chemistry of Peptides and Proteins 2:29 (1984), 및 Kogan, Synthetic Cornm. 22:2417 (1992) 참조), 오르토피리딜-디술피드 (예를 들어, Woghiren, 등 Bioconj. Chem. 4:314 (1993) 참조), 아크릴올 (예를 들어, Sawhney 등, Macromolecules, 26:581 (1993) 참조), 비닐술폰 (예를 들어, USP 5,900,461 참조). 상기 참조문헌 모두는 참조로 본원에 통합된다.

화학식 V 의 동종 2관능성 구현예에 의하면, R 은 화학식 -(Z)_a-(CXH)_m-CO-S-R₁ [식중, Z, a, X, m, 및 R₁ 은 상기 정의된 바와 같다] 의 티오에스테르 함유 부분이다.

본 발명의 선형 중합체의 일부 특정예는 하기에서 보는 바와 같다:

[식중, R₁ 및 n 은 상기에서 정의된 바와 같다].

본 발명의 티오에스테르-종결된 중합체의 다중-분지 구현예 중 하나의 예는 하기의 구조를 갖는다:

[식중, 각각의 POLY 는 수용해성의 비펩티드성 중합체 골격이고, R' 는 중심 코어 분자이며, y 는 약 3 내지 약 100, 바람직하게는 약 3 내지 약 25 이며, Z, X, Y, m, a 및 R₁ 은 상기 정의된 바와 같다].

코어 부분인 R' 는 폴리올, 폴리아민, 및 알콜과 아민기의 조합을 갖는 분자로 이루어진 기로부터 선택된 분자의 잔기이다. 중심 코어 분자의 특정예는 글리세롤, 글리세롤 올리고머, 펜타에리트리톨, 소르비톨 및 리신을 포함한다.

중심 코어 분자는 바람직하게는 중합체 부착에 이용가능한 3 개 이상의 히드록실기를 갖는 폴리올의 잔기이다. "폴리올" 은 복수의 이용가능한 히드록실기를 포함하는 분자이다. 중합체 분지의 목적하는 수에 따라, 폴리올은 전형적으로는 3 내지 약 25 개의 히드록실기를 포함할 것이다. 폴리올은 본 발명으로부터 벗어남 없이 또한 다른 보호된 또는 비보호된 관능기를 포함할 수 있다. 히드록실기들 간의 간격은 폴리올마다 다양할지라도, 전형적으로는 1 내지 약 20 개의 원자, 바람직하게는 1 내지 약 5 개의 원자, 예컨대 탄소원자가 각각의 히드록실기 사이에 존재한다. 바람직한 폴리올은 글리세롤, 소르비톨과 같은 환원당, 펜타에리트리톨 및 헥사글리세롤과 같은 글리세롤 올리고머를 포함한다. 21-분지 중합체는, 21 개의 이용가능한 히드록실기를 갖는 히드록시프로필-β-시클로덱스트린을 이용하여 합성될 수 있다. 선택되는 구체적인 폴리올은 중합체 분지로의 부착에 요구되는 히드록실기의 목적하는 갯수에 의존할 것이다.

E. 티오에스테르의 형성 방법

본 발명의 티오에스테르는, 당업계에 공지된 티오에스테르 형성을 위한 수많은 합성 접근법 중 임의의 것에 의한 수용해성의 비펩티드성 중합체의 유도에 의해 형성될 수 있다. 예를 들어 Field, L. Synthesis, 1972, 106 참조. 예를 들어, 티오에스테르는, 티올레이트의 탈륨(I) 염과의 반응에 의해서, 대응하는 산 클로라이드-종결된 중합체로부터 제조될 수 있다 (Spessard, G. 등, Organic Synthesis Collection, Vol. 7, 87). 분자내에 함유된 추가적인 관능기 (예컨대, 히드록시 또는 기타 관능기)를 갖는 중합체의 티오에스테르 유도를 위하여, 하기와 같은 다른 접근법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 티오에스테르-종결된 중합체는, 디알킬 또는 디페닐 포스포로클로리데이트와 산을 반응시켜, 무수물을 형성함으로써 (이는, 이어서 대응하는 티오에스테르로 전환될 수 있다), 대응하는 카르복실산-종결된 중합체로부터 형성될 수 있다 (Masamune, S., 등, Can. J. Chem., 1975, 53, 3693; Yamada, S., 등,, Chem. Pharm. Bull. 1977, 25, 2423). 또다른 합성 접근법에 의하면, 티오에스테르-종결된 중합체는 (N,N-카르보닐디이미다졸과 대응하는 카르복실산의 반응에 의해 제조되는) 카르복실산의 이미다졸리드와 상대적으로 산성인 티올과의 반응에 의해서 제조될 수 있다 (Masamune, S., 등,, J. Am. Chem. Soc., 1976, 98, 7874). 다르게는, 디술피드 및 트리페닐포스핀이 중합체의 카르복실산 말단을 대응하는 티오에스테르로 전환하기 위하여 사용될 수 있다 (Mukaiyama, T., 등, Bull. Chem. Soc. Jpn., 1970, 43, 1271). 카르복실산으로부터 티오에스테르를 제조하기 위해 사용될 수 있는 다른 방법은, 아릴 티오시아네이트의 사용 (Grieco, P., 등, J. Org. Chem., 1978, 43, 1283), 티오피리딜 클로로포르메이트의 사용 (Corey, E. J., 등, Tetrahedron Lett., 1979, 2875), 2-플루오로-N-메틸피리디늄 토실레이트의 사용 (Watanabe, Y., 등, Chem. Lett. 1976, 741), 1-히드록시벤조트리아졸의 사용 (Horiki, K., Synth. Commun. 1977, 7, 251), 및 붕소 티올레이트의 사용 (Pelter, A., 등, J. Chem. Soc., Perkin Trans. I, 1977, 1672)을 포함한다. 다르게는, O-에스테르 말단을 갖는 중합체가 알루미늄 및 붕소 시약에 의해서 대응하는 S-에스테르로 전환될 수 있다.

본 발명의 티오에스테르 중합체의 바람직한 형성 방법은 말단 카르복실기 또는 이의 활성 에스테르의 염기-촉매 반응, 또는 반응성 중합체와 화학식 R₁-SH [식중, R₁ 은 상기 정의된 바와 같다] 의 티올 화합물의 염기-촉매 반응을 포함한다. 말단 카르복실산 기를 갖는 바람직한 반응성 중합체는, 카르복시메틸, 프로피온산 또는 부탄산 기로 종결된 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함한다. 티오에스테르기를 상기 정의된 것 중 임의의 것과 같은 중합체 골격의 말단에 커플링시키기 위한, 당업계에 공지된 임의의 다른 방법이, 또한 본 발명으로부터 벗어남 없이 사용될 수 있다. 티오에스테르-종결된 중합체의 예시적인 형성 방법을 실시예 1 내지 3 에 예시한다.

III. 중합체/폴리펩티드 공액체

A. 중합체/폴리펩티드 공액체의 구조

본 발명의 티오에스테르 중합체는 N-말단에 히스티딘 또는 시스테인 분자를 갖는 폴리펩티드의 α-아민과 선택적으로 반응하여, 중합체와 폴리펩티드 사이에 아미드 연결을 형성한다. 바람직한 구현예에 의하면, 중합체-폴리펩티드 공액체는 하기의 구조에 결합된 하나 이상의 말단을 갖는 수용해성의 비펩티드성 중합체 골격을 포함한다:

[식중,

L, Z, Y, m, X 및 a 는 상기에 정의되어 있고;

W 는, 말단 아미노기가 시스테인 또는 히스티딘인지의 여부에 따라, -CH₂SH 또는 이고;

POLYPEPTIDE 는 폴리펩티드 분자이다].

중합체 골격은 임의의 형태의 PEG 와 같은 상기 언급된 임의의 중합체 구조를 포함할 수 있다.

폴리펩티드는, N-말단 시스테인 또는 히스티딘이 폴리펩티드 중에 본래 존재하거나 폴리펩티드 서열의 변형에 의해 도입되었는지에 상관 없이, N-말단 시스테인 또는 히스티딘 잔기를 갖는 임의의 폴리펩티드일 수 있다. 폴리펩티드 분자는, 바람직하게는 단백질, 단백질-리간드, 효소, 시토카인, 헤마토포이에틴, 성장 인자, 호르몬, 항원, 항체, 항체 절편, 수용체 및 단백질 절편으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 하기는 N-말단 시스테인 또는 히스티딘 잔기를 포함하거나 포함하도록 변형될 수 있는 폴리펩티드의 예시일 뿐, 결코 완전한 나열이 아니다: 칼시토닌, 부갑상선 호르몬, 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터루킨 1-21, 과립구-콜로니 자극 인자, 대식세포-콜로니 자극 인자, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자, 줄기 세포 인자, 백혈병 억제 인자, kit-리간드, flt-3 리간드, 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴, 종양괴사인자 알파, 종양괴사인자 베타, 형질전환 성장인자, 골 형태형성 단백질, 오스테오프로테게린(osteoprotegerin), 조직 플라스미노겐 활성화제, 혈소판 유도 성장 인자, 섬유아세포 성장인자, 케라티노사이트 성장인자, 표피 성장인자, 인간 성장 호르몬, 인슐린, 종양괴사인자-관련 아폽토시스-유도 리간드 (TRAIL), DNAse, 수용체, 효소, 융합 단백질, 키메라 항체, 인간화 항체, 전장 인간 항체, Fab 절편, F(ab')₂ 절편, Fv 절편 및 scFv 절편. 하나의 바람직한 구현예에 의하면, 폴리펩티드는 인터페론 분자이다.

본 발명의 선형 중합체 공액체의 예시적 구현예는 하기의 구조를 갖는다:

[식중, R, POLY, Z, a, X, m, Y 및 W 는 상기 정의된 바와 같다].

중합체가 다중-분지 중합체인 다른 구현예에 의하면, 본 발명의 예시적인 중합체 공액체는 하기의 구조를 갖는다:

[식중, R', y, POLY, Z, a, X, m, Y 및 W 는 상기 정의된 바와 같다].

본 발명에 따른 폴리펩티드 공액체는 폴리펩티드의 N-말단 시스테인 또는 히스티딘과의 반응에 의해 형성되는 아미드 연결을 가질 것이고, 이때 상기 공액체의 중합체 부분은 본원 및 첨부된 실시예에서 상세히 기술한 수많은 다른 기학적 배열 (예를 들어, 선형, 분지형, 포크형 등), 분자량, 임의로 분해가능한 연결 등을 임의로 가질 수 있다. 본 발명에 따라 제조된 대표적인 공액체를 실시예 4-7 에 제공한다.

B. 중합체/폴리펩티드 공액체의 형성 방법

본 발명은, 말단 아미노산 상의 잔존하는 유리 관능기 (예컨대, 시스테인 잔기의 티올기)를 영구적으로 변형시키거나 폴리펩티드 사슬 내에 존재하는 기타 아민기를 변형함 없이, N-말단 시스테인 또는 히스티딘의 α-아민을 특이적으로 변형하기 위해서, 티오에스테르-종결된 중합체, 예컨대 티오에스테르-종결된 PEG 를 사용한다. 임의의 구체적인 이론에 한정되지 않을지라도, 하기 반응식 I 은 N-말단 시스테인 분자를 갖는 폴리펩티드와 본 발명의 반응성 중합체 사이의 발생하는 것으로 여겨지는 반응을 예시한다. 보여진 바와 같이, 티오에스테르-종결된 중합체는 초기에 시스테인의 유리 티올기와 반응한 후에 분자내 재배열을 수행하여 N-말단 아민기와의 아미드 연결을 형성하고, 요구된다면 추가의 변형을 위해 이용가능한 티올기가 이탈될 수 있는 것으로 여겨진다. 티올-티오에스테르 교환은 바람직하게는 트리알킬포스핀, 예컨대 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 또는 트리에틸포스핀, 및 임의로는 티올, 예컨대 메르캅토프로피온산의 사용에 의해 수행된다.

임의로는, N-말단 시스테인 분자의 경우에, 제 2 의 티올-반응성 중합체 (예컨대, 티올-반응성 PEG) 는 유리 티올기와 반응하여, 반응식 I [식중, L' 는 시스테인 분자 상에 유리 티올기를 갖는 제 2 의 PEG 중합체의 티올-반응성 말단 관능기의 반응으로부터 생성되는 연결자이다] 에 나타낸 바와 같이, 폴리펩티드의 N-말단에서 분지형 구조를 형성할 수 있다. 하나의 구현예에 의하면, 단지 두 개의 중합체 골격이 폴리펩티드에 부착된다.

티올-반응성 관능기의 예에는, 비닐술폰, 말레이미드, 오르토피리딜 디술피드 및 요오도아세트아미드가 포함된다. L' 연결의 예에는 하기가 포함된다:

(비닐술폰 관능기로부터 생성됨);

(말레이미드 관능기로부터 생성됨);

(오르토피리딜 디술피드 관능기로부터 생성됨);

(요오도아세트아미드 관능기로부터 생성됨).

당업자에 의해 용이하게 이해될 수 있는 바와 같이, 본 발명의 방법은 상술한 중합체 유도체를, 펩티드성인지 또는 아니든지 간에 말단 -CH(W)-NH₂ 기 [식중, W 는 상술한 바와 같다]를 갖는 임의의 부분에 커플링시키기 위해 사용될 수 있다.

IV. 실시예

하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위해 제공되지만, 본 발명을 한정하는 것으로 고려되어서는 않된다. 예를 들어, mPEG 가 본 발명을 예시하기 위해 실시예에서 사용될지라도, PEG 의 다른 형태 및 본 발명의 실시에 유용한 유사한 중합체는 상기 언급된 본 발명에 포함된다.

첨부된 실시예에 관한 모든 PEG 시약은 Huntsville, AL 소재의 Shearwater Corporation 에서 시판되는 것이다. 모든 ⁺HNMR 데이터는 Bruker 에 의해 제조된 300 또는 400 MHz NMR 분광계에 의해 생성되었다.

실시예 1-3 은 본 발명의 티오에스테르-종결된 중합체를 형성하는 방법을 예시한다. 실시예 4-7 은 본 발명의 티오에스테르-종결된 중합체와 N-말단 시스테인 잔기를 갖는 예시적인 폴리펩티드와의 반응을 예시한다. 하기에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 티오에스테르 중합체의 사용은 폴리펩티드의 N-말단 아민으로의 중합체의 선택적인 부착을 초래한다.

실시예 1

PEG(5000)-α-메톡시-ω-프로피온산, 2-피리딜티오에스테르 (PEG-PA-OPTE) 의 제조

2-메르캅토피리딘 (40.0 mg, 0.36 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸 (4.0 mg, 0.030 mmol), 4-(디메틸아미노)피리딘 (36.7 mg, 0.30 mmol) 및 1,3-디시클로헥실카르보디이미드 (2 ㎖ 의 무수 디클로로메탄 (84.0 mg, 0.41 mmol) 중에 용해됨)을 무수 아세토니트릴 (20 ㎖) 중의 PEG(5000)-α-메톡시-ω-프로피온산 (1.5 g, 0.27 mmol) 의 용액에 첨가하였다. 반응 용액을 아르곤하에 주변온도에서 하룻밤동안 교반하였다. 이어서, 용액을 거의 건조되도록 감압하에 농축한 후, 무수 톨루엔 (50 ㎖)를 첨가하였다. 이 혼합물을 30 분 동안 상온에서 교반하고, 여과한 다음, 여액을 거의 건조되도록 감압하에 농축하였다. 에틸 아세테이트 (200 ㎖)를 첨가하고, 이 혼합물을 고형분이 완전히 용해될때까지 가온하였다. 이어서, 용액을 교반하면서 상온으로 냉각하였다. 에틸 에테르 (50 ㎖)를 첨가하고, 침전물을 형성시켰다. 생성물을 여과하고, 생성물이 백색으로 될 때까지 에틸 에테르로 헹구었다. 이어서, 생성물을 고진공하에서 건조시켰다. 수율: 1.1 g. NMR (d6-DMSO): δ2.98 ppm (t, 2H, -CH₂-COS-), δ3.51 ppm(s, PEG 골격), δ7.46 ppm (m, 빈약한 해상도, 1H, H₅ (피리딜)), δ7.64 ppm (d, 1H, H₃ (피리딜)), δ7.91 ppm (t, 1H, H₄ (피리딜)), δ8.60 ppm (d, 1H, H₆ (피리딜)).

실시예 2

PEG(5000)-α-벤질옥시(BZO)-ω-카르복시메틸, 2-피리딜티오에스테르 (PEG-CM-OPTE) 의 제조

2-메르캅토피리딘 (40.0 mg, 0.36 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸 (5.0 mg, 0.035 mmol) 및 1,3-디시클로헥실카르보디이미드 (2 ㎖ 의 무수 디클로로메탄 (74.3 mg, 0.36 mmol) 중에 용해됨)을 무수 아세토니트릴 (20 ㎖) 중의 PEG(5000)-α-벤질옥시-ω-카르복시메틸 (1.5 g, 0.30 mmol) 의 용액에 첨가하였다. 반응 용액을 아르곤하에 주변온도에서 하룻밤동안 교반하였다. 이어서, 용액을 거의 건조되도록 감압하에 농축한 후, 무수 톨루엔 (30 ㎖)를 첨가하였다. 이 혼합물을 30 분 동안 상온에서 교반하고, 여과한 다음, 여액을 거의 건조되도록 감압하에 농축하였다. 에틸 아세테이트 (150 ㎖)를 첨가하고, 이 혼합물을 고형분이 완전히 용해될때까지 가온하였다. 이어서, 용액을 교반하면서 상온으로 냉각하였다. 에틸 에테르 (50 ㎖)를 용액에 첨가하고, 침전물을 형성시켰다. 생성물을 여과하고, 생성물이 백색으로 될 때까지 에틸 에테르로 헹구었다. 이어서, 생성물을 고진공하에서 건조시켰다. 수율: 1.1 g. NMR (d6-DMSO): δ3.51 ppm (s, PEG 골격), δ4.39 ppm (s, 2H, -OCH₂COS-), δ4.49 ppm (s, 2H, -OCH₂-(벤질옥시)), δ7.33 ppm (m, 빈약한 해상도, 5H, C₆H₅ (벤질옥시)), δ7.46 ppm (m, 빈약한 해상도, 1H, H₅ (피리딜)), δ7.63 ppm (d, 1H, H₃ (피리딜)), δ7.91 ppm (t, 1H, H₄ (피리딜)), δ8.60 ppm (d, 1H, H₆ (피리딜)).

실시예 3

PEG(5000)-α-메톡시-ω-2-메틸 부탄산, 2-피리딜티오에스테르의 제조

2-메르캅토피리딘 (44.5 mg, 0.40 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸 (4.7 mg, 0.033 mmol), 4-(디메틸아미노)피리딘 (40.7 mg, 0.33 mmol) 및 1,3-디시클로헥실카르보디이미드 (2 ㎖ 의 무수 디클로로메탄 (92.8 mg, 0.45 mmol) 중에 용해됨)을 무수 아세토니트릴 (20 ㎖) 중의 PEG(5000)-α-메톡시-ω-2-메틸 부탄산 (1.5 g, 0.30 mmol) 의 용액에 첨가하였다. 반응 용액을 아르곤하에 주변온도에서 하룻밤동안 교반하였다. 이어서, 용액을 거의 건조되도록 감압하에 농축한 후, 무수 톨루엔 (50 ㎖)를 첨가하였다. 이 혼합물을 30 분 동안 상온에서 교반하고, 여과한 다음, 여액을 거의 건조되도록 감압하에 농축하였다. 에틸 아세테이트 (150 ㎖)를 첨가하고, 이 혼합물을 고형분이 완전히 용해될때까지 가온하였다. 이어서, 용액을 교반하면서 상온으로 냉각하였다. 2-프로파놀 (50 ㎖)을 첨가한 다음 에틸 에테르 (50 ㎖)를 첨가하여 침전물을 형성시켰다. 생성물을 여과하고, 생성물이 백색으로 될 때까지 2-프로파놀로 헹구었다. 이어서, 생성물을 고진공하에서 건조시켰다. 수율: 1.2 g. NMR (d6-DMSO): δ1.19 ppm (d, 3H, -O-CH₂-CH₂-CH(CH ₃ )-COS-), δ1.66 ppm 및 δ1.92 ppm (mm, 2H, -O-CH₂-CH ₂ -CH(CH₃)-COS-), δ2.89 ppm (m, 1H, -O-CH₂-CH₂-CH(CH₃)-COS-), δ3.51 ppm (s, PEG 골격), δ7.46 ppm (m, 빈약한 해상도, 1H, H₅ (피리딜)), δ7.63 ppm (d, 1H, H₃ (피리딜)), δ7.90 ppm (t, 1H, H₄ (피리딜)), δ8.60 (d, 1H, H₆ (피리딜)).

실시예 4

PEG-CM-OPTE 의 인터페론으로의 공액화

N-말단 아미노산으로서 시스테인을 갖는 인터페론 타우 (0.45 mg)를, 1M Tris, 0.7 mM TCEP (트리스[2-카르복시에틸포스핀]히드로클로라이드) 및 3 mM 메르캅토프로피온산 (pH 7.75) 중 0.3 mg/㎖ 로 제형화하였다. 대략 1.0 mg 의 mPEG_5K-CM-OPTE (실시예 2 의 것)를 인터페론 용액에 첨가하고, 상온에서 4 시간 동안 반응시켰다. 반응 혼합물을 탈이온수에 대해 하룻밤 동안 투석하였다. 생성물을 MALDI-MS 로 분석하였다. 질량 분광은 5000 Da 의 유리 PEG, 19,979 Da 의 비공액 인터페론 및 25,065 Da 의 분자량의 단일 PEG 공액체를 나타내었고, 이는 PEG화 산물이 단지 하나의 PEG 분자가 N-말단에서 폴리펩티드에 부착된 PEG화 산물을 의미한다.

실시예 5

PEG-PA-OPTE 의 인터페론으로의 공액화

인터페론 타우 (0.45 mg)를, 0.33 M Tris, 0.7 mM TCEP (트리스[2-카르복시에틸포스핀]히드로클로라이드) (pH 7.75) 중 0.3 mg/㎖ 로 제형화하였다. 대략 1.0 mg 의 mPEG_5K-PA-OPTE (실시예 1 로부터의 프로피온산의 오르토피리딜 티오에스테르)를 인터페론 용액에 첨가하고, 상온에서 4 시간 동안 반응시켰다. 생성물을 SDS-PAGE 로 분석하였다. 겔은, 비공액 인터페론 (∼ 20 kDa) 및 단일 PEG-공액된 인터페론 (∼ 29 kDa) (즉, 단일 PEG 분자에 부착된 폴리펩티드)에 해당하는 두 개의 밴드를 나타내었다. PEG-인터페론 공액체의 더욱 느린 이동은 상응하는 분자량의 단백질에 비해 PEG 사슬의 더욱 큰 유체역학적 부피에 기인한다.

실시예 6

PEG-CM-OPTE 의 폴리펩티드로의 공액화

폴리펩티드 CRASKSVSSSGYSYMHWYQQ (MW = 2355 Da) (서열번호 1)을 0.67 M Tris, 1.3 mM TCEP (트리스[2-카르복시에틸포스핀]히드로클로라이드) 및 5.3 M 유레아 (pH 7.75) 중 0.67 mg/㎖ 로 제형화하였다. 대략 21.0 mg 의 mPEG_5K-CM-OPTE (실시예 2 로부터의 것)를 폴리펩티드 용액에 첨가하고, 상온에서 4 시간 동안 반응시켰다. 반응 혼합물을 탈이온수에 대해 하룻밤 동안 투석하였다. 생성물을 MALDI-MS 로 분석하였다. 질량 분광은, 단일 PEG 분자가 부착된 폴리펩티드를 포함하고 7555 Da 분자량을 갖는 공액체를 나타내었다. 이는, 티오에스테르-종결된 중합체가 분자내의 다른 유리 아민기, 예컨대 리신 또는 아르기닌 잔기의 아민기와 랜덤하게 반응하지 않는다는 것을 나타낸다.

실시예 7

PEG-PA-OPTE 의 폴리펩티드로의 공액화

폴리펩티드 CRASKSVSSSGYSYMHWYQQ (MW = 2355 Da) (서열번호 1)을 0.67 M Tris, 1.3 mM TCEP (트리스[2-카르복시에틸포스핀]히드로클로라이드) 및 5.3 M 유레아 (pH 7.75) 중 0.67 mg/㎖ 로 제형화하였다. 대략 21.0 mg 의 mPEG_5K-PA-OPTE (실시예 1 로부터의 것)를 폴리펩티드 용액에 첨가하고, 상온에서 4 시간 동안 반응시켰다.

상기한 상세한 설명에 나타낸 교시의 잇점을 갖는 본 발명에 관련된 본 발명의 수많은 변형 및 다른 구현예가 당업자에 의해 만들어질 수 있다. 따라서, 본 발명이 개시된 특정 구현예로 한정되지 않는다는 것과, 변형 및 다른 구현예가 첨부된 청구범위의 범위내에 포함되는 것으로 의도된다는 것이 이해되어야만 한다. 특정 용어가 본원에서 사용될지라도, 이들은 포괄적이고 서술적인 관점에서 사용된 것이며, 한정을 목적하지는 않는다.

<110> Roberts, Michael J. Fang, Zhihao <120> Thioester-Terminated Water Soluble Polymers and Method of Modifying the N-Terminus of a Polypeptide Therewith <130> 34848-254468 <150> 09/973,318 <151> 2001-10-09 <160> 1 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide having 20 amino acid residues and an N-terminal cycteine. <400> 1 Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Ser Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His 1 5 10 15 Trp Tyr Gln Gln 20

Claims

하기의 구조에 결합되는 하나 이상의 말단을 갖는, 수용해성의 비펩티드성 중합체 골격을 포함하는 티오에스테르-종결된 반응성 중합체:

[식중,

L 은 중합체 골격에 결합하는 지점이고;

Z 는 연결자이고;

m 은 0 내지 약 12 이고;

Y 는 헤테로원자이고;

각각의 X 는 H 및 알킬로부터 독립적으로 선택되고;

a 는 0 또는 1 이고;

Q 는 황 함유 이탈기이다].
제 1 항에 있어서, 각각의 X 는 H 또는 C1-C6 알킬인 반응성 중합체.
제 2 항에 있어서, 각각의 X 는 H 또는 메틸인 반응성 중합체.
제 1 항에 있어서, Y 가 O 또는 S 인 반응성 중합체.
제 1 항에 있어서, Q 가 화학식 -S-R₁ [식중, R₁ 은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로사이클 및 치환된 헤테로사이클로 이루어진 군으로부터 선택된다] 을 갖는 반응성 중합체.
제 5 항에 있어서, R₁ 이 페놀, 니트로페놀, 벤조산, 피리딘, 피리딘카르복실산 및 니트로피리딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 반응성 중합체.
제 5 항에 있어서, R₁ 이 치환 또는 비치환된 피리딘인 반응성 중합체.
제 1 항에 있어서, a 가 1 이고, Z 가 -O-, -S-, -NHCO-, -CONH-, -O₂C-, -NHCO₂- 및 -O₂CNH- 로 이루어진 군으로부터 선택되는 반응성 중합체.
제 1 항에 있어서, 중합체 골격이 폴리(알킬렌 글리콜), 폴리(옥시에틸화 폴리올), 폴리(올레핀성 알콜), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(α-히드록시산), 폴리(비닐알콜), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리(N-아크릴로일모르폴린), 폴리아크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리사카라이드, 및 이의 공중합체, 삼원중합체 및 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 반응성 중합체.
제 1 항에 있어서, 상기 수용해성의 비펩티드성 중합체 골격이 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(프로필렌 글리콜), 및 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 반응성 중합체.
제 1 항에 있어서, 상기 중합체 골격이 약 100 Da 내지 약 100,000 Da 의 수평균 분자량을 갖는 폴리(에틸렌 글리콜)인 반응성 중합체.
제 1 항에 있어서, m 이 1 내지 약 4 인 반응성 중합체.
제 1 항에 있어서, 하기의 구조를 갖는 반응성 중합체:

[식중,

POLY 는 수용해성의 비펩티드성 중합체 골격이고;

R 은 캡핑기(capping group) 또는 관능기이고;

R₁ 은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로사이클 및 치환된 헤테로사이클로 이루어진 군으로부터 선택된다].
제 13 항에 있어서, R 이 알콕시, 알킬, 벤질, 아릴, 아릴옥시, 히드록실, 활성 에스테르, 활성 카보네이트, 아세탈, 알데히드, 알데히드 히드레이트, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 활성 술폰, 아민, 히드라지드, 티올, 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐술폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세트아미드, 에폭시드, 글리옥살, 디온, 메실레이트, 토실레이트, 트레실레이트 및 -(Z)_a-(CXH)_m-CO-S-R₁ 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 반응성 중합체.
제 13 항에 있어서, POLY 가 폴리(에틸렌 글리콜)인 반응성 중합체.
제 1 항에 있어서, 하기의 구조를 갖는 반응성 중합체:

[식중,

각각의 POLY 는 수용해성의 비펩티드성 중합체 골격이고;

R' 는 중심 코어 분자이고;

y 는 약 3 내지 약 100 이고;

R₁ 은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로사이클 및 치환된 헤테로사이클로 이루어진 군으로부터 선택된다].
제 16 항에 있어서, POLY 가 폴리(에틸렌 글리콜)인 반응성 중합체.
제 16 항에 있어서, R' 가 폴리올, 폴리아민, 및 알콜과 아민기의 조합을 갖는 분자로 이루어진 군으로부터 선택된 분자의 잔기인 반응성 중합체.
제 16 항에 있어서, R' 가 글리세롤, 글리세롤 올리고머, 펜타에리트리톨, 소르비톨 및 리신으로 이루어진 군으로부터 선택된 분자의 잔기인 반응성 중합체.
N-말단에 시스테인 또는 히스티딘 잔기를 갖는 폴리펩티드의 중합체 공액체에 있어서, 상기 중합체 공액체는 하기의 구조에 결합되는 하나 이상의 말단을 갖는 수용해성의 비펩티드성 중합체 골격을 포함하는 중합체 공액체:

[식중,

L 은 중합체 골격에 결합하는 지점이고;

Z 는 연결자이고;

Y 는 헤테로원자이고;

m 은 0 내지 약 12 이고;

각각의 X 는 H 및 알킬로부터 독립적으로 선택되고;

a 는 0 또는 1 이고;

W 는 -CH₂SH 또는 이고;

POLYPEPTIDE 는 폴리펩티드 분자이다].
제 20 항에 있어서, 중합체 골격이 폴리(에틸렌 글리콜)인 중합체 공액체.
제 20 항에 있어서, POLYPEPTIDE 가 단백질, 단백질-리간드, 효소, 시토카인, 헤마토포이에틴, 성장 인자, 호르몬, 항원, 항체, 항체 절편, 수용체 및 단백질 절편인 중합체 공액체.
제 20 항에 있어서, POLYPEPTIDE 가 인터페론 분자인 중합체 공액체.
하기 단계를 포함하는, N-말단에서 시스테인 또는 히스티딘 잔기를 갖는 폴리펩티드에 중합체 유도체를 공액시키는 방법:

N-말단에 시스테인 또는 히스티딘 잔기를 갖는 폴리펩티드를 제공하는 단계;

하기의 구조에 결합하는 하나 이상의 말단을 갖는 수용해성의 비펩티드성 중합체 골격을 포함하는, 티오에스테르-종결된 중합체를 제공하는 단계:

[식중,

L 은 중합체 골격에 결합하는 지점이고;

Z 는 연결자이고;

m 은 0 내지 약 12 이고;

Y 는 헤테로원자이고;

각각의 X 는 H 및 알킬로부터 독립적으로 선택되고;

a 는 0 또는 1 이고;

Q 는 황 함유 이탈기이다];

상기 폴리펩티드와 티오에스테르-종결된 중합체를 반응시켜 하기의 구조를 갖는 공액체를 형성하는 단계:

[식중,

POLYPEPTIDE 는 폴리펩티드 분자이고;

W 는 -CH₂SH 또는 이다].
제 24 항에 있어서, 폴리펩티드 골격이 폴리(에틸렌 글리콜)인 방법.
제 24 항에 있어서, POLYPEPTIDE 가 단백질 리간드, 효소, 시토카인, 헤마토포이에틴, 성장 인자, 호르몬, 항원, 항체, 항체 절편, 수용체 및 단백질 절편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
N-말단에 시스테인 분자를 갖는 폴리펩티드의 중합체 공액체에 있어서, 상기 중합체 공액체가 N-말단에 부착되는 수용해성의 비펩티드성 중합체 골격을 두 개 포함하고, 상기 공액체가 하기의 구조를 갖는 중합체 공액체:

[식중,

L 은 상기 두 개의 중합체 골격 각각에 결합하는 지점이고;

L' 및 Z 는 연결자이고;

Y 는 헤테로원자이고;

m 은 0 또는 약 12 이고;

각각의 X 는 H 및 알킬로부터 독립적으로 선택되고;

a 는 0 내지 1 이고;

POLYPEPTIDE 는 폴리펩티드 분자이다].
제 27 항에 있어서, L' 가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 중합체 공액체: