MXPA04003340A - Polimeros acuosolubles terminados en tioester y metodos de modificar con estos, el n-terminus de un polipeptido. - Google Patents

Polimeros acuosolubles terminados en tioester y metodos de modificar con estos, el n-terminus de un polipeptido.

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Abstract

La invencion proporciona reactivos y metodos para conjugar un polimero especificamente en el ?-amina de un polipeptido. La invencion proporciona PEGs monofuncionales, bifuncionales, y multifuncionales y polimeros relacionados que tiene una porcion tioester terminal capaz de conjugar especificamente en la ?-amiona de un polipeptido que tenga un residuo cisteina o histidina en el N-terminus. La invencion proporciona polimeros PEG terminados en tiosester que tienen reactividad adecuada con un residuo cisteina o histidina N-terminal de un polipeptido para producir un enlace amida entre la molecula del PEG y el polipeptido.

Description

POLIMEROS ACUOSOLUBLES TERMINADOS EN TIOESTER Y METODOS DE MODIFICAR CON ESTOS, EL N-TERMINUS DE UN POLIPEPTIDO CAMPO DE LA INVENCION La presente invención concierne a polímeros acuosolubles útiles para conjugar selectivamente al N-terminus de un polipéptido.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION La fijación covalente del polímero poli(etilen glicol) hidrofílico, abreviado PEG, también conocido como poli (óxido de etileno) , abreviado PEO, a moléculas y superficies se considera de utilidad en biotecnología y medicina. El PEG es un polímero que tiene las propiedades benéficas de solubilidad en agua y en muchos solventes orgánicos, carece de toxicidad, y carece de inmunogenicidad. Un uso de PEG es fijar covalentemente el polímero a moléculas insolubles en agua para mejorar la solubilidad del conjugado molécula-PEG resultante. Por ejemplo, se ha mostrado que el fármaco paclitaxel insoluble en agua, cuando se acopla a PEG, se vuelve acuosoluble. Greenwald, y colaboradores, J. Org. Chem., 60-331-336(1995) . El PEG también se ha usado crecientemente en la modificación de polipéptidos y proteínas terapéuticas. El uso de polipéptidos, incluyendo proteínas, para aplicaciones terapéuticas se ha extendido en años recientes principalmente debido tanto a métodos mejorados para expresión recombinante de polipéptidos humanos de varios sistemas de expresión como a métodos mejorados de liberación in vivo. Muchos de los inconvenientes asociados con polipéptidos terapéuticos incluyen corta vida media circulante, inmunogenicidad y degradación proteolítica, han mejorado por medio de varios procedimientos que incluyen la terapia genética, mutaciones de epítope por mutagénesis dirigida o de redistribución, protegiendo las regiones de epítope por medio de polímeros sintéticos o naturales, proteínas de fusión e incorporación del polipéptido en vehículos de liberación de fármaco para protección y liberación lenta. La modificación polimérica de proteínas, tales como la fijación covalente de poli (etilen glicol) , ha ganado popularidad como un método para mejorar las propiedades biológicas y farmacológicas de las proteínas útiles terapéuticamente. Por ejemplo, ciertas proteínas conjugadas con poli (etilen glicol) han mostrado tener vida media de plasma significativamente mejorada, antigenicidad e inmunogenicidad reducidas, solubilidad incrementada y degradación proteolítica disminuida en comparación con su contrapartida no conjugada al poli (etilen glicol) . Los factores que afectan las propiedades anteriores son numerosos e incluyen la naturaleza de la proteina misma, el número de poli (etilen glicol) u otra cadena polimérica fijada a la proteína, el peso y la estructura molecular de la cadena polimérica fijada a la proteína, la química (es decir, las enlazadores particulares), usados para fijar el polímero a la proteína, y la localización de los sitios modificados con el polímero sobre la proteína. Para acoplar PEG a una molécula, tal como una proteína, a menudo es necesario "activar" el PEG al preparar un derivado del PEG que tenga un grupo funcional en un terminus de éste. El grupo funcional es seleccionado con base en el tipo de grupo reactivo disponible sobre la molécula que será acoplada al PEG. Por ejemplo, el grupo funcional podría ser seleccionado para reaccionar con un grupo amino sobre una proteína a fin de formar un conjugado de proteína-PEG . Se han desarrollado una variedad de métodos para fijar poli (etilen glicol) no específica o aleatoriamente a proteínas. Más comúnmente, el poli (etilen glicol) activado electrofílicamente es hecho reaccionar con las cadenas laterales nucleofílicas encontradas de proteínas. Fijar un poli (etilen glicol activado a los grupos a-amina y e-amina encontrados sobre los residuos lisina y en el N-terminus da como resultado una mezcla de productos conjugados como se describe en la Patente U. S. 6,057,792. Por ejemplo, el conjugado puede consistir de una población de proteínas conjugadas que tienen números variables de moléculas de poli (etilen glicol) fijadas a la molécula de proteína ("PEGmeros) , que varían desde cero hasta el número de grupos a- y e- amina en la proteína. A menudo los procedimientos de PEGilación son indeseables, debido a variaciones en las proporciones de productos PEGmeros producidos, y el deseo, en ciertos casos, por un solo producto conjugado de proteína-PEG discreto. Para una molécula de proteína que ha sido únicamente modificada empleando una metodología de PEGilación de sitio no específico, la porción de poli (etilen glicol) puede ser fijada a uno cualquiera de un número de sitios de amina diferentes. Adicionalmente, el tipo de PEGilación no específica puede dar como resultado la pérdida parcial o completa de la utilidad terapéutica de la proteína conjugada, particularmente para conjugados que tengan más de un PEG fijado a la proteína. Se han descrito varios métodos para fijación selectiva o en sitio dirigido de PEG. Por ejemplo, WO 99/45026 sugiere la modificación química de un residuo serina N-terminal para formar un aldehido funcionalmente adecuado para reacción con un polímero terminado con una funcionalidad de hidrazida o semicarbazida . Las Patentes U.S. Nos. 5,824,784 y 5,985,265 sugiere hacer reaccionar un polímero que posea un grupo carbonilo con el terminus amino de una proteina bajo condiciones de alquilación reductoras y a un pH que promueva el ataque selectivo al N-terminus. WO 99/038887 y las Patentes US Nos. 5,206,344 y 5,766,897 conciernen a la PEGilación en sitio dirigido de residuos cisteína que han sido diseñados en la secuencia de aminoácidos de proteínas (variantes con cisteína añadida) . Mientras que estos métodos ofrecen algunas ventajas sobre la fijación no específica, hay una necesidad insatisfecha continua de métodos mejorados y de reactivos para proporcionar proteínas conjugadas a polímero en sitio específico que no requieran la modificación química del polipéptido o control cuidadoso de ciertas condiciones de reacción, tales como pH. Adicionalmente, debido a la alta deseabilidad para modificar una proteína en sus funcionalidades amono reactivas, hay una necesidad de reactivos poliméricos mejorados que reaccionen selectivamente con un grupo amino de proteína específica, tal como el grupo amino N-terminal, por preparación de conjugados de polímero-proteína que no sean una mezcla del PEGmero polímero-PEG pero que mas bien tengan a PEG fijado en un sitio único, identificado sobre la proteína.
SUMARIO DE LA INVENCION Esta invención proporciona reactivos y métodos para conjugar polímeros específicamente en el grupo -amino de un polipéptido. La invención proporciona PEGs monofuncionales, bifuncionales, y multifuncionales y polímeros relacionados que tengan una porción tioéster (también mencionado como un éster tiol) capaz de conjugar específicamente al -amino de un polipéptido que tenga una cisteína o histidina en el N-terminus. Así, la invención proporciona polímeros PEG terminados en tioéster reactivos efectivos para reaccionar específicamente en sitio con un residuo cisteína o histidina N-terminal de un polipéptido para producir un conjugado de polipéptido-PEG unido a amida . En un aspecto, la invención proporciona un polímero reactivo terminado en tioéster, que comprende una estructura polimérica principal no peptídica y acuosoluble que tenga al menos un terminus enlazado a la estructura: Fórmula I en donde, L es el punto de enlace a una estructura polimérica principal no peptidica y acuosoluble; Z es un enlace estable hidrolíticamente o un enlace inestable hidrolíticamente, tales como O, S, -NHCO-, -CONH-, -02C-, -NHCC -, o -02CNH~; a es 0 o 1; cada X es independientemente seleccionada de H y alquilo, tal como Ci-C6 alquilo; m es desde 0 hasta aproximadamente 12, preferiblemente 1 hasta aproximadamente 4; Y es un heteroátomo, preferiblemente O o S; y Q es un grupo desplazable que contiene azufre preferiblemente que tenga la fórmula -S-Ri, en donde Ri es hidrógeno, alquilo, alquilo substituido, cicloalquilo, cicloalquilo substituido, arilo, arilo substituido, heteroarilo, heteroarilo substituido, heterociclo, o heterociclo substituido. El polímero reactivo puede ser monofuncional (por ejemplo, mPEG) , bifuncional, o multifuncional . La estructura polimérica principal es preferiblemente un poli (alquilen glicol), tal como poli (etilen glicol) , poli (propilen glicol), o un copolímero de etilen glicol y propilen glicol. Ejemplos de otras estructuras principales poliméricas adecuadas incluyen poli (poliol oxietilado) , poli (alcohol olefínico) , poli ( inilpirrolidona) , poli (ácido -hidroxi), poli (alcohol vinílico) , polifosfazeno, polioxazolina, poli (N-acriloilmorfolina) , poliacrilato, poliacrilamidas , polisacáridos, y copolimeros, terpolímeros, y mezclas de los mismos. En otro aspecto, la invención proporciona un conjugado polimérico de un polipéptido que tenga una molécula de cisteina o histidina en el N-terminus, el conjugado polimérico que comprende una estructura polimérica principal no peptidica y acuosoluble que tenga al menos un terminus enlazado a la estructura: en donde L, Z, m, Y, X y a son como se definieron POLIPEPTIDO es una molécula de polipéptido, donde - NH-C(W)H- representa el residuo histidina o cisteina N- terminal (ausente un átomo de hidrógeno) del polipéptido. Ejemplos de polipéptidos que pueden ser conjugados a los polímeros terminados en tioéster de la invención incluyen, pero no se limitan a, proteínas, ligandos de proteínas, enzimas, citoquinas, hematopoyetinas, factores de crecimiento, hormonas, antigenos, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, receptores, y fragmentos de proteínas. En aún otro aspecto, se proporciona también un método de conjugar un polímero derivativo a un polipéptido que tenga una molécula de histidina o cisteína al N-terminus. El método comprende proporcionar tanto un polipéptido que tenga una molécula de cisteína o de histina en el N-terminus como un polímero terminado en tioéster como se describió anteriormente. Se hace reaccionar el polipéptido con el polímero terminado en tioéster para formar, de una manera en sitio específico, un conjugado que tenga una amida enlazada entre el residuo de la molécula de cisteína o de histidina N-terminal y el polímero reactivo. El polímero terminado en tioéster selectivamente fijado al grupo amina N-terminal del residuo histidina o cisteína del polipéptido sin reaccionar con los grupos amina libres en otras posiciones en el polipéptido.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención se describirá ahora más completamente en lo sucesivo. Esta invención puede, sin embargo, ser modalizada de muchas formas diferentes y no se construirá como limitada a las modalidades expuestas en la presente: más bien, estas modalidades se proporcionan de modo que esta descripción concienzuda y completa, y transmitirá completamente el alcance de la invención a los expertos en la materia. I. Definiciones Los siguientes términos como se usan en la presente tienen el significado indicado. Como se usa en la especificación, y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "uno", "el", la", incluye los plurales correspondientes a menos que el contexto dicte claramente de otra manera. Los términos "grupo funcional", "porción activa", "sitio reactivo", "grupo químicamente reactivo" y "porción reactiva químicamente" se usan en el arte y en la presente para referirse a porciones distintas definibles o a unidades de una molécula. Los términos son algo sinónimos en el arte químico y se usan en la presente para indicar las porciones de moléculas que efectúan algunas funciones o actividades y son reactivas con otras moléculas. El término "activa" cuando se usa con grupos funcionales, se pretende que incluya aquellos grupos funcionales que reaccionan fácilmente con grupos electrofílieos o nucleofílieos u otras moléculas, en contraste a los grupos que requieren catalizadores fuertes o condiciones de reacción muy imprácticos a fin de reaccionar (es decir, grupos "no reactivos" o "inertes"). Por ejemplo, como se comprenderá en el arte, el término "éster activo podría incluir aquellos esteres que reaccionan fácilmente con grupos nucleofílieos tales como aminas. Los ésteres activos ejemplares incluyen N-hidroxisuccinimidil ésteres o 1-benzotriazol ésteres. Típicamente, un éster activo reaccionará con una amina en medio acuoso en cuestión de minutos, mientras que ciertos ésteres, tales como metil o etil ésteres, requieren un catalizador fuerte a fin de reaccionar con un grupo nucleofílico . Como se usa en la presente, el término "grupo funcional" incluye grupos funcionales protegidos. El término "grupo funcional protegido" o "grupo protector" o "grupo protectivo" se refiere a la presencia de una porción (es decir, el grupo protector) que previene o bloquea la reacción de un grupo funcional reactivo químicamente particular en una molécula bajo ciertas condiciones de reacción. El grupo protector variará dependiendo del tipo de grupo reactivo químicamente que es protegido así como también las condiciones de reacción a ser empleadas y la presencia de grupos protectores o reactivos adicionales en la molécula, si hay alguno. Los grupos protectores conocidos en el arte pueden encontrarse en Greene, T. W., y colaboradores, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, 3a. Ed., John Wiley & Sons, New York, NY (1999) .
El término "enlace" o "enlazador" (L) como se usa en la presente para referirse a un átomo o a una colección de átomos usados para enlazar, preferiblemente por medio de uno o más enlaces covalentes, interconectar porciones tales como dos segmentos de polímeros o un terminus de un polímero y un grupo funcional reactivo presente sobre un agente bioactivo, tal como un polipéptido. Un enlazador de la invención puede ser estable hidrolíticamente o puede incluir un enlace degradable enzimáticamente o fisiológicamente hidrolizable. Un enlace "fisiológicamente hidrolizable" o hidrolíticamente degradable" es un enlace débil que reacciona con agua (es decir, es hidrolizado) bajo condiciones fisiológicas. Se prefieren enlaces que tengan una vida media de hidrólisis a pH de 8, 25 °C de menos de aproximadamente 30 minutos. La tendencia de un enlace a hidrolizar en agua dependerá no solamente del tipo general de enlace que conecta dos átomos centrales sino también de los substituyentes fijados a estos átomos centrales. Enlaces degradables o inestables hidrolíticamente apropiados incluyen pero no se limitan a éster carboxilato, fosfato éster, anhídridos, acétales, cetales, aciloxialquil éter, iminas, ortoésteres, péptidos y oligonucleótidos . Un enlace "estable hidrolíticamente" o enlace, se refiere a un enlace químico, típicamente un enlace covalente, que es substancialmente estable en agua, es decir, que no sufra hidrólisis bajo condiciones fisiológicas en cualquier medida apreciable durante un período de tiempo prolongado. Ejemplos de enlaces estables hidrolíticamente incluyen pero no se limitan a los siguiente: enlaces carbono-carbono (por ejemplo, en cadenas alifáticas) , éteres, amidas, uretanos, y los similares. Generalmente, un enlace estable hidrolíticamente es uno que exhibe una proporción de hidrólisis de menos de aproximadamente 1 - 2 % por día bajo condiciones fisiológicas. Las proporciones de hidrólisis de enlaces químicos representativos pueden encontrarse en la mayoría de los manuales químicos estándares . Un enlace "inestable enzimáticamente" o degradable es un enlace que puede ser degradado por una o más enzimas. El término "estructura polimérica principal" se refiere a la cadena enlazada covalentemente de unidades monoméricas de repetición que forman el polímero. Por ejemplo, la estructura polimérica principal de PEG es: -CH2CH20- (C¾CH20) n-CH2CH2- donde n varía típicamente desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 4000. Como se comprenderá, la estructura polimérica principal puede ser fijada covalentemente a grupos funcionales terminales o cadenas laterales funcionalizadas colgantes espaciadas a lo largo de la estructura polimérica principal. El término polímero reactivo", se refiere a un polímero que posee al menos un grupo funcional reactivo. A menos que se haga notar de otra manera, el peso molecular es expresado en la presente como el número que expresa en peso molecular promedio (MN) , que se define como ?NÍMÍ/?NÍ, en donde Ni es el número de moléculas de polímero (o el número de moles de las moléculas) que tengan el peso Mi. El término "alquilo", se refiere a cadenas de hidrocarburos que varían típicamente desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 12 átomos de carbono de longitud, preferiblemente 1 a aproximadamente 6 átomos, e incluye cadenas rectas y ramificadas. Las cadenas de hidrocarburos pueden ser saturadas o insaturadas. "Cicloalquilo", se refiere a una cadena de hidrocarburo cíclico insaturada o saturada, que incluye compuestos cíclicos en espira, fusionados, puenteados, que comprenden preferiblemente 3 a aproximadamente 12 átomos de carbono, más preferiblemente 3 a aproximadamente 8. El término "alquilo substituido" o "cicloalquilo substituido" se refiera a un grupo alquilo o cicloalquilo substituido con uno o más substituyentes que no interfieran, tales como, pero no limitadas a, C3-C8 cicloalquilo, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, y los similares; acetileno; ciano; alcoxi, por ejemplo, metoxi, etoxi, y los similares; alcanoiloxi inferiores, por ejemplo acetoxi; hidroxi; carboxilo; amino; alquilamino inferior, por ejemplo, metilamino; cetona; halo, por ejemplo cloro o bromo; fenilo; fenilo substituido, y los similares. "Alcoxi", se refiere a un grupo -0-R, en donde R es alquilo o alquilo substituido, preferiblemente C1-C6 alquilo (por ejemplo, metoxi o etoxi). "Arilo", significa uno o más anillos aromáticos, cada uno de 5 o 5 átomos de carbono en el núcleo. Los anillos arilo múltiples pueden ser fusionados, como en naftilo o sin fusionar, como en bifenilo. Los anillos arilo pueden también ser fusionados o no fusionados con uno o más hidrocarburos cíclicos, heteroarilo, o anillos heterocíclicos . "Arilo substituido" es el arilo que tiene uno o más grupos que no interfieran como substituyentes . Para substituciones sobre un anillo fenilo, los substituyentes pueden estar en cualquier orientación (es decir, orto, meta, para) . "Heteroarilo", es un grupo arilo que contenga desde uno hasta cuatro heteroátomos, preferiblemente N, 0, o S, o una combinación de los mismos, dicho grupo heteroarilo es opcionalmente substituido en los átomos de carbono o de nitrógeno con Ci-C6 alquilo, -CF3, fenilo, bencilo, o tienilo, o un átomo de carbono en el grupo heteroarilo junto con un átomo de oxigeno forman un grupo carbonilo, o dicho grupo heteroarilo es opcionalmente fusionado con un anillo fenilo. Los anillos heteroarilo pueden también ser fusionados con uno o más hidrocarburos cíclicos, heterocíclicos, anillos arilo o heteroarilo. El heteroarilo incluye, pero no se limitan a, heteroarilos de 5 elementos que tengan uno o más heteroátomos (por ejemplo, tiofenos, pirróles, furanos) ; heteroarilos de 5 elementos que tengan dos heteroátomos en las posiciones 1,2 o 1,3 (por ejemplo, oxazoles, pirazoles, imidazoles, tiazoles, purinas) heteroarilos que tengan 5 elementos que tengan tres heteroátomos (por ejemplo, tiadiazoles) ; heteroarilos de 5 elementos que tengan tres heteroátomos; heteroarilos de 6 elementos con un heteroátomo (por ejemplo, piridina, quinolina, isoquinolina, fenantrina, 5, 6-cicloheptenopiridina) ; heteroarilos de 6 elementos con dos heteroátomos (por ejemplo, piridazinas, cinolinas, ftalazinas, pirazinas, pirimidinas, quinazolinas) ; heteroarilos de 6 elementos con tres heteroátomos (por ejemplo, 1, 3, 5-triazina) ; y heteroarilos de 6 elementos con cuatro heteroátomos.
"Heteroarilo substituido" es el heteroarilo que tiene uno o más grupos que no interfieran como substituyentes . "Heterociclo" o "heterocíclico" significa uno o más anillos de 5-12 átomos, preferiblemente 5-7 átomos, con o sin insaturación o carácter aromático y al menos un átomo del anillo que no sea carbono. Los heteroátomos preferidos incluyen azufre, oxigeno, y nitrógeno. Anillos múltiples pueden ser fusionados, como en quinolina o benzofurano. "Heterociclo substituido" es el heterociclo que tenga uno o más cadenas laterales formadas desde substituyentes que no interfieran. "Substituyentes que no interfieran", son aquellos grupos que, cuando están presentes en una molécula, son típicamente no reactivos con otros grupos funcionales contenidos en la molécula. Los substituyentes o radicales que no interfieran adecuados incluyen, pero no se limitan a, halo, CI-CIQ alquilo, C2-Ci0 alquenilo, C2-Ci0 alquinilo, Ci-Ci0 alcoxi, C7-C12 aralquilo, C7-C12 alcarilo, C3-C10 cicloalquilo, C3-C10 cicloalquenilo, fenilo, fenilo substituido, toluoilo, xilenilo, bifenilo, C2-Ci2 alcoxialquilo, C7-C12 alcoxiarilo, C7-C12 ariloxialquilo, C6-Ci2 oxiarilo, C1-C6 alquilsulfinilo, C1-C10 alquilsulfonilo, - (CH2) m-0 (C1-C10 alquilo) en donde m es desde 1 a 8, arilo, arilo substituido, alcoxi substituido, fluoroalquilo, radical heterocíclico, radical heterocíclico substituido, nitroalquilo, -N02, -CN, -NRC (O) - (C1-C10 alquilo), -C(0)- (C1-C10 alquilo), C2-Ci0 tioalquilo, -C (O) 0- (C1-C10 alquilo), -OH, -S02, =S, -C00H, -NR, carbonilo, -C (0) - (C1-C10 alquilo) -CF3, -C(0)-CF3/ -C(0)NR2, - (C1-C10 alquilo) -S- (C6-C12 arilo) , -C (O) - (C6-Ci2 arilo) , - (CH2) m-0- (CH2) m-0- (C1-C10 alquilo) en donde cada m es desde 1 hasta 8, -C(0)NR, -C(S)NR, -SONR, -NRC(0)NR, -NRC(S)NR, sales de los mismos, y los similares. Cada R como se usa en la presente es H, alquilo o alquilo substituido, arilo o arilo substituido, aralquilo, o alcarilo. "Heteroátomo" significa cualquier átomo diferente de carbono en un compuesto análogo a hidrocarburo. Los ejemplos incluyen oxigeno, azufre, nitrógeno, fósforo, arsénico, silicio, selenio, telurio, estaño, y boro. El término "fármaco", "molécula activa biológicamente", "porción activa biológicamente" o "agente activo biológicamente", cuando se usa en la presente significa cualquier substancia que pueda afectar algunas propiedades bioquímicas o físicas de un organismo biológico, que incluye pero no se limita a virus, bacteria, hongos, vegetales, animales, y humanos. En particular, como se usa en la presente, moléculas activas biológicamente incluyen cualquier substancia proyectada para diagnóstico, mitigación de la curación, tratamiento o prevención de enfermedades en humanos u otros animales o para mejorar de otra manera el bienestar físico o mental de humanos o animales. Ejemplos de moléculas activas biológicamente incluyen, pero no se limitan a, péptidos, proteínas, enzimas, fármacos de moléculas pequeñas, colorantes, lípidos, nucleósidos, oligonucleósidos, polinucleótidos, ácidos nucleicos, células, virus, liposomas, micropartículas y micelas. Las clases de agentes activos biológicamente que son adecuados para uso con la invención incluyen, pero no se limitan a, antibióticos, fungicidas, agentes antivirales, agentes anti-inflamatorios , agentes anti-tumorales, agentes cardiovasculares, agentes anti-ansiedad, hormonas, factores de crecimiento, agentes esteroidales, y los similares . "Alcohol poliolefínico", se refiere a un polímero que comprende una estructura principal poliolefínica tal como polietileno, que tenga grupos hidroxilo colgantes múltiples fijados a la estructura polimérica principal. Un alcohol poliolefínico ejemplar es alcohol polivinílico . Como se usa en la presente, "no peptídico", se refiere a una estructura polimérica substancialmente libre de enlaces peptídicos. No obstante, la estructura polimérica principal puede incluir un número menor de enlaces peptídicos espaciados a lo largo de la extensión de la estructura principal, tal como, por ejemplo, no más de aproximadamente 1 enlace peptidico por aproximadamente 50 unidades monoméricas. "Polipéptido" o "poli (amino ácidos)" se refiere a cualquier molécula que comprenda una serie de residuos de aminoácidos, típicamente al menos aproximadamente 10 - 20 residuos, enlazados a través de enlaces amida (también mencionados como enlaces peptídicos) a lo largo de la estructura principal del carbono alfa. Aunque en algunos casos los términos pueden ser usados sinónimamente en la presente, un polipéptido es un péptido que tiene típicamente un peso molecular hasta de aproximadamente 10,000 Da, aunque los péptidos que tienen un peso molecular superior a los mencionados comúnmente para las proteínas. Las modificaciones de las cadenas laterales peptídicas pueden estar presentes, junto con la glicosilación, hidroxilación, y los similares. Adicionalmente, otras moléculas no peptídicas, que incluyen lípidos y moléculas de fármacos pequeñas, pueden ser fijadas al polipéptido. El polipéptido puede comprender cualquier combinación o secuencia de residuos de aminoácidos. Los polímeros de la invención son adecuados para fijación covalente tanto a polipéptidos como a proteínas. "Aminoácido", se refiere a ácidos orgánicos que contienen tanto un grupo amino básico como un grupo carboxilo ácido. El término abarca aminoácidos esenciales y no esenciales y tanto los aminoácidos que se encuentran de manera natural como los sintéticos o modificados. La mayor parte de los aminoácidos comunes están enlistados en la presente ya sea por su nombre completo o por las abreviaciones de una sola letra o de tres letras. Glicina (Gly, G) , Alanina (Ala, A), Valina (Val, V), Leucina (Leu, L) , Isoleucina (lie, I), Metionina (Met, M) , Prolina (Pro, P) , Fenilalanina (Phe, F) , Triptofano (Trp, W) , Serina (Ser, S) , Treonina (Thr, T) , Asparagina (Asn, N) , Glutamina (Gln, Q) , Tirosina (Tyr, Y) , Cisteina (Cys, C) , Lisina (Lys, K) , Arginina (Arg, R) , Histidina (His, H) , Acido Aspártico (Asp, D) , y Acido Glutámico (Glu, E) . Por "residuo" se quiere decir la porción de una molécula que permanece después de la reacción con una o más moléculas. Por ejemplo, un residuo de aminoácido es una cadena polipeptidica es la porción de un aminoácido que permanece, después de formar enlaces peptidicos con los residuos de aminoácidos adyacentes. "Oligómero", se refiere a cadenas cortas de monómeros que comprenden 2 hasta aproximadamente 10 unidades monoméricas, preferiblemente 2 hasta aproximadamente 5 unidades monoméricas. El término "conjugado" se refiere a la entidad formada como un resultado de la fijación covalente de una molécula, tal como una molécula activa biológicamente, a una molécula polimérica reactiva, preferiblemente poli(etilen glicol) . El término "grupo desplazable" se refiere a un átomo o colección de átomos fijados covalentemente a un átomo (tal como un átomo de carbono) y que puede ser fácilmente desplazada del átomo, tomada con sus electrones de enlace. Típicamente, el grupo desplazable es un átomo o molécula neutra. El mejor grupo desplazable, es el que más probablemente se aleje del átomo al cual está fijado. Buenos grupos desplazables representativos son aquellos que son la base conjugada de un ácido fuerte. "Multifuncional", en el contexto de un polímero de la invención significa un polímero que tiene 3 o más grupos funcionales fijados al mismos, donde los grupos funcionales pueden ser iguales o diferentes. Polímeros multifuncionales de la invención comprenderán típicamente desde aproximadamente 3 - 100 grupos funcionales, o desde 3- 50 grupos funcionales, o desde 3- 25 grupos funcionales, o desde 3-15 grupos funcionales, o desde 3 a 10 grupos funcionales, o contendrá 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 grupos funcionales fijados a la estructura polimérica principal . II. Polímeros con Tioésteres En un aspecto, la presente invención proporciona polímeros acuosolubles terminados en tioéster capaces de reaccionar selectivamente con el grupo amino N-terminal de un polipéptido para formar un conjugado polímero-polipéptido que comprende una sola cadena polimérica soluble en agua fijada al N-terminus. Dicho conjugado polímero-polipéptido es mencionado en la presente como mono-substituido (significa que una cadena polimérica es substituida en solamente un sitio del polipéptido) . Las modificaciones de un polipéptido en solamente un sitio único son benéficas porque la verosimilitud de una reducción significativa en la bioactividad debida a la presencia de la cadena polimérica es aminorada en comparación con la fijación aleatoria o indiscriminada del polímero a varios y múltiple sitios a lo largo de la cadena polipeptídica . Además, los polímeros y métodos proporcionados en la presente para formar conjugados en sitio específico proporcionan una ventaja adicional sobre los métodos comúnmente usados en el arte previo ya que son innecesarias las múltiples etapas de protección/desprotección para prevenir la reacción del polímero con otros grupos/posiciones reactivas contenidas en el polipéptido. Dicha modificación en sitio selectivo elimina la necesidad de etapas de purificación del conjugado adicionales para aislar especies conjugadas particulares (por ejemplo, monoPEGiladas ) . Así, el uso de los polímeros con tioéster de la invención puede ofrecer las ventajas anteriores mientras que proporciona adicionalmente las propiedades benéficas de la fijación del polímero acuosoluble, tales como solubilidad en agua incrementada, vida media plasmática mejorada, y disminución en la degradación proteolítica en comparación con un polipéptido sin modificar. Como se explica posteriormente con más detalle, los polímeros terminados en poliéster de la invención reaccionan selectivamente con un residuo histidina o cisteína N-terminal de un polipéptido. Sin adoptar teoría alguna, la reacción involucra el ataque nucleofílico del grupo tioéster ya sea por la cadena lateral tiol de un residuo cisteína o la cadena lateral imidazol de un residuo histidina para formar el tioéster intermedio. El tioéster intermedio que sufre una redistribución rápida que da como resultado la transferencia del grupo acilo del polímero al grupo amina N-terminal del polipéptido, produciendo así un enlace peptídico entre el polímero y el N-terminus del polipéptido. Como se comprenderá, ya que solamente un residuo cisteína o histidina N-terminal proporcionaría la cadena lateral necesaria para la etapa de reacción inicial (por ejemplo, ataque sobre el carbono del carbonilo del tioéster polimérico por medio de un grupo tiol reactivo de una proteina que tenga una cisteina N-terminal) , el polímero de la invención será, vía una redistribución molecular, fijada específicamente a la amina N-terminal sin reaccionar con cualesquier otros grupos amino de la cadena lateral que puedan estar presentes en la molécula polipeptídica . La presente invención es particularmente útil para la fijación de PEG en sitio específico de polipéptidos que contengan más de una cisteina o histidina, aún en estado desplegado. Los métodos de conjugación y los polímeros de la presente invención pueden ser usados para auxiliar a polipéptidos insolubles que están en estado desplegado para replegarse a su conformación nativa. Los polímeros terminados en tioésteres de la invención comprenden una estructura polimérica principa] fijada a un grupo tioéster con un enlace opcional que interviene entre el terminus de la estructura polimérica principal y el grupo tioéster. El polímero terminado en tioéster de la invención tiene la estructura: X Y / II L— (Z)a-(CH)m— C-Q Fórmula I en donde, L es el punto de enlace a una estructura polimérica principal no peptidica y acuosoluble; Z es un enlace estable hidrolíticamente o un enlace inestable hidroliticamente, tales como 0, S, -NHCO-, -CONH-, -02C-, -NHC02-, o -02CNH-; m es desde 0 hasta aproximadamente 12, preferiblemente 1 hasta aproximadamente 4; cada X es independientemente seleccionada de H y alquilo, tal como Ci-C6 alquilo; a es 0 o 1; Y es un heteroátomo, preferiblemente O o S; y Q es un grupo desplazable que contiene azufre preferiblemente que tenga la fórmula -S-Rl, en donde Rl es hidrógeno, alquilo, alquilo substituido, cicloalquilo, cicloalquilo substituido, arilo, arilo substituido, heteroarilo, heteroarilo substituido, heterociclo, o heterociclo substituido. A. Estructura Polimérica Principal En general, la estructura polimérica principal no peptidica y acuosoluble seria no tóxica y biocompatible, lo que significa que el polímero es capaz de co-existencia con tejidos u organismos vivientes sin causar daño. Cuando se refiere a una estructura polimérica principal terminada en tioéster en la presente, se entiende que la estructura polimérica principal puede ser de un número cualquiera de polímeros no peptídicos acuosolubles, tales como los descritos posteriormente. Preferiblemente, la estructura polimérica principal es poli (etilen glicol) (PEG. El término PEG incluye poli (etilen glicol) en cualquiera de numerosas geometrías y formas, que incluyen las formas lineales (por ejemplo, alcoxiPEG o PEG bifuncional ) , de forma ramificada o de ramales múltiples (por ejemplo PEG bifurcado o PEG fijado a un núcleo poliol) , PEG colgante, o PEG con enlaces degradables en él, que se describirán posteriormente con más detalle. En su forma más simple, PEG tiene la fórmula -CH2C¾0- (CH2CH20) m-CH2CH2- Fórmula II en donde n es desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 4000, típicamente desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 2000. Aunque el número que expresa el peso molecular promedio de la estructura polimérica principal de PEG puede variar, PEGs que tienen un número que expresa el peso molecular promedio desde aproximadamente 100 Da hasta aproximadamente 100,000 Da, preferiblemente desde aproximadamente 5,000 Da hasta aproximadamente 60,000 Da son particularmente útiles. Por ejemplo, polímeros PRG que tienen un peso molecular desde aproximadamente 100 Da, aproximadamente 200 Da, aproximadamente 300 Da, aproximadamente 500 Da, aproximadamente 800 Da, aproximadamente 1,000 Da, aproximadamente 2,000 Da, aproximadamente 3,000 Da, aproximadamente 4,000 Da, aproximadamente 5,000 Da, aproximadamente 10,000 Da, aproximadamente 15,000 Da, aproximadamente 20,000 Da, aproximadamente 30,000 Da y aproximadamente 40,000 Da son útiles en la presente invención. Polímeros encubiertos, significa polímeros que tengan al menos un terminus cubierto con un grupo relativamente inerte (por ejemplo, un grupo alcoxi), pueden también usarse como la estructura polimérica principal de la invención. Por ejemplo, metoxi-PEG-OH, o mPEG abreviado, es una forma de PEG en donde un terminus de la estructura polimérica principal es enlazada a un grupo metoxi, mientras que el otro terminus es un grupo hidroxilo que fue sometido ya a modificación química. La estructura de mPEG se da a continuación. CH30- (CH2CH20) n-CH2CH2-OH Fórmula III en donde n es como se describió anteriormente. Moléculas de PEG terminadas en monometoxi que tienen un número que expresa el peso molecular promedio de aproximadamente 100 hasta apro imadamente 10,000 Da, más preferiblemente aproximadamente 2,000 hasta aproximadamente 60,000 Da, son típicamente preferidas para conjugar a proteínas. El uso de un polímero monofuncional tal como mPEG previene la reticulación de la proteina que tiene lugar a menudo cuando se usan reactivos bifuncionales o multifuncionales . En la presente invención, puede usarse mPEG-tioéster para producir una sola molécula de PEG fijada a una sola molécula de proteina. No obstante, en una modalidad alterna, utilizar un tioéster-PEG homofuncional en las proporciones adecuadas dará como resultado un conjugado que tenga dos moléculas de proteina fijadas a una sola molécula de PEG, aún en el caso de que la proteina contenga múltiples residuos cisteina libres. Debido a la manera en la cual el derivado de PEG se cree que reacciona (es decir inicialmente enlace a través del grupo tiol disponible del residuo cisteina N-terminal y luego redistribuir para formar el enlace amida) , no es posible para los derivados poliméricos con tioéster de la invención dar una proteina reticulada porque otros residuos cisteina libres no tendrán tanto un grupo tiol disponible como un grupo amina disponible. Asi, otra ventaja de la presente invención es la habilidad para usar polímeros con múltiples grupos funcionales del tipo descrito en la presente sin la reticulación indeseable con el polipéptido. Pueden también usarse moléculas de PEG ramificadas o multi-ramificadas , tales como las descritas en la Patente U.S. No. 5,932,462, que se incorporan íntegramente a la presente como referencia, como el polímero PEG. Por ejemplo, la estructura polimérica principal de PEG puede tener la estructura: polia p R"—C I polib Q Fórmula IV en donde : polia, y polib son estructuras principales de PEG, tales como metoxi poli (etilen glicol); R" es una porción no reactiva, tal como H, metilo o una estructura principal de PEG; y P y Q son enlaces no reactivos. En una modalidad preferida, el polímero PEG ramificado es metoxi (poli etilen glicol) lisina disusbstituído . El polímero PEG puede comprender alternativamente un PEG bifurcado. Un ejemplo de un PEG bifurcado está representado por PEG-YCHZ2, donde Y es un grupo de enlace y Z es un grupo terminal activado, tal como el grupo aldehido de la presente invención, enlazado a CH por medio de una cadena de átomos de longitud definida. La Solicitud Internacional No. PCT/US 99/05333, el contenido de la cual se incorpora a la presente como referencia, describe varias estructuras de PEG bifurcadas capaces de ser usadas en la presente invención. La cadena de átomos que enlaza a los grupos funcionales Z al átomo de carbono ramificado sirve como un grupo de atadura y puede comprender, por ejemplo, una cadena alquilo, enlace éter, enlace éster, enlace amida, o combinación de los mismos. El polímero PEG puede comprender una molécula de PEG colgante que tenga grupos reactivos, tales como carboxilo, fijados covalentemente a lo largo de la extensión de la estructura principal de PEG en vez de en el extremo de la cadena de PEG. Los grupos reactivos colgantes pueden ser fijados a la estructura principal de PEG directamente o a través de una porción de enlace, tal como un grupo alquileno . Además de las formas anteriormente descritas de PEG, el polímero puede también prepararse con uno o más enlaces débiles o degradables en la estructura polimérica principal, que incluyen cualquiera de los polímeros descritos anteriormente. Por ejemplo, PEG puede ser preparado con enlaces éster en la estructura polimérica principal que son sometidos a hidrólisis. Como se muestra posteriormente, esta hidrólisis da como resultado la fragmentación del polímero en fragmentos de peso molecular inferior : -PEG-CO,-PEG- + H20 -» -PEG-CO^H + HO-PEG- Otros enlaces degradables hidrolíticamente, útiles como un enlace degradable en una estructura polimérica principal, incluye enlaces carbonato; enlaces imina resultantes, por ejemplo, de la reacción de una amina y de un aldehido (ver, por ejemplo, Ouchi y colaboradores, Polymer Preprints, 38 ( 1 ): 582-3 ( 1997 ) , el cual es incorporado a la presente como referencia) ; enlaces de fosfato éster formados, por ejemplo, al hacer reaccionar un alcohol con un grupo fosfato; enlaces hidrazona los cuales se forman al hacer reaccionar una hidrazida y un aldehido, enlaces acetal que son típicamente formados al hacer reaccionar un aldehido y un alcohol, enlaces orto ésteres que son, por ejemplo, formados al hacer reaccionar un formiato y un alcohol; enlaces peptídicos formados por un grupo amina, por ejemplo en un extremo de un polímero tal como PEG, y un grupo carboxilo de un péptido; y un enlace oligonucleótido formado por, por ejemplo, un grupo fosforamidina, por ejemplo, en el extremo de un polímero, y un grupo 5'hidroxilo de un oligonucleótido. Los expertos en la materia comprenderán que el término poli (etilen glicol) o PEG representa o incluye todas las formas anteriores de PEG. Muchos otros polímeros son también adecuados para la invención. Podrían usarse en la presente invención cualquiera de una variedad de estructuras poliméricas principales monofuncionales, bifuncionales o muíti funcionales que sean acuosolubles y no peptidicas. La estructura polimérica principal puede ser lineal, o puede ser cualquiera de las formas anteriormente descritas (por ejemplo, ramificada, bifurcada, y los similares) . Ejemplos de polímeros adecuados incluyen, pero no se limitan a otros poli (alquilen glicoles), copolímeros de etilen glicol y propilen glicol, poli (alcohol olefínico) , poli (vinilpirrolidona) , poli (hidroxilaquil metacrilamida) , poli (hidroxilaquil metacrilato) , poli (sacáridos) , poli (ácido a-hidroxi), poli (alcohol vinílico) , polifosfazeno, polioxazolina, poli (N-acriloilmorfolina) , tal como los descritos en la Patente U.S. No. 5,629,384, que se incorpora íntegramente a la presente como referencia, y copolímeros, terpolímeros, y mezclas de los mismos . B. Enlace entre la Estructura Polimérica Principal y el Tioéster El enlace que interviene entre el terminus de la estructura polimérica principal y el grupo tioéster es el residuo del grupo funcional sobre la estructura polimérica principal que acopla a la estructura polimérica principal al grupo tioéster terminal. Así, como se comprenderá, la estructura del enlace variará dependiendo de la estructura del grupo funcional de la estructura polimérica principal. El enlace puede comprender un enlace estable idroliticamente, tal como amida, uretano, éter, tioéter, o urea. Alternativamente, el enlace puede comprender un enlace inestable hidroliticamente, tal como carboxilato éster. Fosfato éster, ortoéster, anhídrido, imina, acetal, cetal, oligonucleótido, o péptido. En una modalidad, además del enlace estable o inestable hidroliticamente, el enlace entre la estructura polimérica principal y el tioéster incluye un espaciador alquileno opcional, designado en la presente como (CHX)m. Como se mostró anteriormente en la Fórmula I, el enlace preferiblemente tiene la estructura: Fórmula la en donde : Z es el enlace estable o inestable hidroliticamente, tal como O, S, -NHCO-, -CONH-, -02C-, -NHC02-, o -02CNH-; m es desde 0 hasta 12, preferiblemente 1 hasta aproximadamente 4; cada X es independientemente seleccionado de H y alquilo, tal como Ci-C6 alquilo; y a es 0 o 1. La longitud de la cadena alquileno (es decir, el valor de m) puede variar desde 0 hasta aproximadamente 12. Por ejemplo, m puede ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12. Preferiblemente, m es 0, 1, 2, 3 o 4. Cada X de la cadena alquileno es preferiblemente hidrógeno, metilo o etilo. En una modalidad preferida, a es 1 y Z es un heteroátomo, tal como O o S. C. Grupo Funcional Tioéster El grupo funcional tioéster está covalentemente fijado al menos a un terminus del polímero acuosoluble. El grupo tioéster tiene la estructura: Y II — C— Q Fórmula Ib en donde : Y es un heteroátomo, preferiblemente O o S; y Q es un grupo desplazable electrofílico que contiene azufre, preferiblemente que tenga la fórmula -SR1, en donde Ri es hidrógeno, alquilo, alquilo substituido, cicloalquilo, cicloalquilo substituido, arilo, arilo substituido, heteroarilo, heteroarilo substituidos, heterociclo, o heterociclo substituido. El grupo Ri particular empleado puede variar. El grupo Ri, conjuntamente con el átomo de azufre, forma un grupo desplazable electrofílico adecuado para desplazamiento durante el ataque nucleofílico del carbono del carbonilo por medio del tiol o la cadena lateral imidazol del residuo aminoácido N- terminal de un polipéptido. Grupos Ri preferidos incluyen substituyentes derivados de fenol, nitrofenol, ácido benzoico, piridina, ácido piridincarboxilico, y nitropiridina . Es prefiere de manera particular el piridinilo substituido o no substituido. Los Ejemplos 1-3 ilustran polímeros PEG terminados en tioéster que poseen un grupo desplazable tiopiridinilo . D. Estructuras Poliméricas Ejemplares Una modalidad de un polímero lineal de la invención puede representarse estructuralmente como sigue: X Y II R-POLI—(Z)a-(CH),m C—Q Fórmula V en donde POLI es una estructura polimérica principal no peptídica y acuosoluble, R es un grupo encubridor o un grupo funcional, y Z, X, Y, m y Q son como se definieron anteriormente. En una modalidad preferida, R es metoxi, POLI es poli(etilen glicol) , a es 1, Z es 0, m es 1 a aproximadamente 3, Y es 0, y cada X es H o CH3- . El grupo R puede ser un grupo encubridor relativamente inerte, tal como alcoxi (por ejemplo, metoxi o etoxi) , alquilo, bencilo, arilo, o ariloxi (por ejemplo benciloxi) . Alternativamente, el grupo R puede ser un grupo funcional capaz de reaccionar fácilmente con un grupo funcional sobre una molécula activa biológicamente. Grupos funcionales ejemplares incluyen hidroxilo, éster activo (por ejemplo N-hidroxisuccinimidil éster o 1-benzotriazolil éster) , carbonato activo (por ejemplo, N-hidroxisuccinimidil carbonato y 1-benzotriazolil carbonato) , acetal, aldehido, hidrato de aldehido, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona activa, amina, hidrazida, tiol, ácido carboxilico, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, iodoacetamida, epoxida, glioxal, diona, mesilato, tosilato, o tresilato. Ejemplos específicos de grupos funcionales terminales para las estructuras poli éricas de la invención incluyen carbonato de N-succinimidilo (ver por ejemplo, Patentes U.S. Nos. 5,281,698, 5,468,478), amina (ver por ejemplo, Buckmann y colaboradores Makromol. Chem. 182: 1379 (1981), Zalipsky y colaboradores Eur. Polym. J. 19: 1177 (1983)), hidrazida (ver, Andresz y colaboradores Makromol. Chem. 179:301 (1978)), propionato de succinimidilo y butanoato de succinimidilo (ver, por ejemplo, Olson y colaboradores en Poly (ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, págs 170-181, Harris & Zalipsky Eds . , ACS, Washington, DC, 1997; ver también la Patente U.S. No. 5,672,662), succinato de succinimidilo (ver por ejemplo, Abucho ski y colaboradores Cáncer Biochem. Biophys. 7:175(1984) y Joppich y colaboradores, Makromol. Chem. 180:1381 (1979), succinimidil éster (ver, por ejemplo la Patente U.S. No. 4,670,417), carbonato de benzotriazol (ver, por ejemplo, la Patente U.S. No. 5, 650,234), glicil éter (ver, por ejemplo, Pit a y colaboradores Eur. J. Biochem. 94:11(1979), Elling y colaboradores, Biotech. Appl . Biochem. 13: 354 (1991), oxicarbonildiimidazol (ver, por ejemplo, Beauchamps, y colaboradores, Anal. Biochem. 131:25 (1983), Tondelli y colaboradores J. Controlled Reléase 1:251 (1985)), carbonato de p-nitrofenilo (ver, por ejemplo, Veronese, y colaboradores, Ap l. Biochem. Biotech., 11:141 (1985); y Sartore, Appl. Biochem. Biotech., 27:45 (1991)), aldehido (ver por ejemplo, Harris y colaboradores J. Polym. Sci. Chem. Ed. 22:341 (1984), Patente U.S. No. 5,824,784, Patente U.S. 5,252,714), maleimida (ver, por ejemplo, Goodson y colaboradores Bio/Technology 8:343 (1990), Romani y colaboradores en Chemistry of Peptides and Proteins 2:29 (1984)), y Kogan, Synthetic Comm. 22:2417 (1992)), ortopiridil-disulfuro (ver, por ejemplo. Woghiren, y colaboradores Biocon . Chem. 4: 314 (1993)), acriloil (ver por ejemplo, Sawhney y colaboradores, Macromolecules, 26:581 (1993)), vinilsulfona (ver, por ejemplo, la Patente U.S. No. 5,900,461) . Todas las referencias anteriores se incorporan a la presente como referencia. En una modalidad homobi funcional de Fórmula V, R es una porción que contiene tioéster de fórmula - (Z) n- (CXH) m-CO-S-Ri, en donde Z, a, x, m, y Ri son como se definieron anteriormente . Algunos ejemplos específicos de polímeros lineales de la invención se muestran a continuación: O CH3O— CH2GH2— (OCH2CH2)n-0-(CH2)2— C-S-B O CH30—CH2CH2— (OCHaCH^-O-CHz-C-S-Ri en donde Rx y n son como se definieron anteriormente. Un ejemplo de modalidad multiramales del polímero terminado en tioéster de la invención tiene la estructura: X / RTPOL ] (Z)ft-(CH)m C-S-Rj Fórmula VI en donde cada POLI es una estructura polimérica principal no peptidica y acuosoluble, R' es una molécula de núcleo central, y es desde 3 hasta 100, preferiblemente 25, y Z, X, Y, m y Ri son como se definieron anteriormente. La porción del núcleo, R' , es un residuo de una molécula seleccionada del grupo que consiste de polioles, poliaminas, y moléculas que tienen una combinación de alcohol y grupos amina. Los ejemplos específicos de moléculas con núcleo central incluyen glicerol, oligómeros de glicerol, pentaeritritol , sorbitol, y lisina. La molécula de núcleo central es preferiblemente un residuo de un poliol que tiene al menos tres grupos hidroxilo adecuados para la fijación del polímero. Un "poliol" es una molécula que comprende una pluralidad de grupos hidroxilo adecuados. Dependiendo del número de ramales de polímero deseados, el poliol comprenderá típicamente 3 hasta aproximadamente 25 grupos hidroxilo. El poliol puede incluir otros grupos funcionales protegidos o no protegidos también sin alejarse de la invención. Aunque el espaciador entre los grupos hidroxilo variará de poliol a poliol, hay típicamente 1 a aproximadamente 20 átomos, tales como átomos de carbono, entre cada grupo hidroxilo, preferiblemente 1 a aproximadamente 5. Los polioles preferidos incluyen glicerol, azúcares reductores tales como sorbitol, pentaeritritol, y oligómeros de glicerol, tales como hexaglicerol . Un oligómero de 21 ramales puede ser sintetizado usando hidroxipropil-p-ciclodextrina, la cual tiene 21 grupos hidroxilo disponibles. El poliol particular seleccionado dependerá del número de grupos hidroxilo deseado necesarios para fijación a los ramales del polímero. E. Método de Formar Polímeros con Tioéster Los polímeros con tioéster de la invención pueden ser formados por derivatización de un polímero no peptídico acuosoluble por medio de cualquiera de numerosos procedimientos sintéticos para formar tioésteres conocidos en el arte. Ver, por ejemplo, Field, L. Synthesis, 1972, 106. Por ejemplo, un tioéster puede ser preparado desde el polímero terminado en el cloruro ácido correspondiente por medio de la reacción con una sal de talio (I) de un tiolato (Spessard G. y colaboradores Organic Synthesis Collection, Vol 7, 87) . Para la derivatización del tioéster de un polímero que tiene grupos funcionales adicionales contenidos en la molécula, tales como hidroxi u otros grupos funcionales, se emplean procedimientos alternativos tales como los siguientes. Por ejemplo, un polímero terminado en tioéster como se describe en la presente puede formarse desde el polímero terminado en el ácido carboxilico correspondiente por medio de la reacción del ácido con el fosfoclorhidrato de difenilo o de dialquilo para formar el anhídrido, el cual puede entonces ser convertido al tioéster correspondiente. (Masamune, S. y colaboradores, Can. J. Chem., 1975, 53, 3693; Yamada, S., y colaboradores, Chem. Pharm. Bull. 1977, 25, 2423) . En aún otro procedimiento sintético, un polímero terminado en tioéster puede ser preparado por medio de la reacción de una imidazolida de un ácido carboxilico (preparada por medio de la reacción del ácido carboxilico correspondiente con N, N-carboxildiimidazol) con un tiol relativamente ácido (Masamune, S., y colaboradores, J. Amin. Chem. Soc, 1976, 98, 7874) . Alternativamente, un disulfuro y trifenilfosfina pueden ser usados para convertir un ácido carboxilico, terminus de un polímero al tioéster correspondiente (Mukaiyama, T. Y colaboradores, Bull. Chem. Soc. Jpn., 1970, 43, 1271) . Otros métodos que pueden ser usados para preparar tioésteres desde ácidos carboxílicos incluyen el uso de tiocianatos de arilo (Grieco, P., y colaboradores, J. Org. Chem., 1978, 43, 1283), cloroformiato de tiopiridilo (Corey, E. J., y colaboradores, Tetrahedron Lett., 1979, 2875), tosilato de 2-fluoro-N-metilpiridinio (Watanabe, Y., y colaboradores, Chem. Lett., 1976, 741), 1-hidroxibenzotriazol (Horiki, K., Synth. Commun. , 1977, 7, 251), y tiolato de boro (Peller, A. Y colaboradores, J. Chem. Soc. Perkin Trans . I., 1977, 1672) . Alternativamente, un polímero que tiene un terminus O-éster puede ser convertido en el S-éster correspondiente por medio de reactivos de aluminio y boro.
Un método preferido de formar los polímeros con tioéster de la invención involucra la reacción catalizada con una base de un ácido carboxílico terminal, o un éster activo del mismo, de un polímero reactivo con un compuesto tiol de fórmula Ri-SH, en donde Ri es como se definió anteriormente. Los polímeros reactivos preferidos que poseen un grupo ácido carboxílico terminal incluyen poli(etilen glicol) terminado con un grupo carboximetilo, ácido propiónico, o ácido butanoico. Cualquier otro método conocido en el arte para acoplar un grupo tioéster a un terminus de una estructura polimérica principal, tal como cualquiera de las descritas anteriormente, puede ser usada sin alejarse de la presente invención. Métodos ejemplares de formar polímeros terminados en tioéster se ilustran en los Ejemplos 1-3. III. Conjugados Polímero/Polipéptido A. Estructura del Conjugado Polímero/Polipéptido Los polímeros con tioéster de la invención reaccionan selectivamente con la a-amina de un polipéptido que tiene una molécula de histidina o de cisteína en el N-terminus para formar un enlace amida entre el polímero y el polipéptido. En una modalidad preferida, el conjugado polimero-polipéptido comprende una estructura polimérica principal no peptidica acuosoluble que tiene al menos un terminus enlazado a la estructura: X L—(¾-(CH C—POLIPEPTIDO H Fórmula VII en donde : L, Z, Y, m, X y a son como se definieron anteriormente ; dependiendo de si el ácido amino terminal es cisteina o histidina; y POLIPEPTIDO, es la molécula del polipéptido. La estructura polimérica principal puede comprender cualquiera de las estructuras poliméricas discutidas anteriormente, tales como PEG en cualquiera de sus formas.
El polipéptido puede ser cualquier polipéptido que tenga un residuo cisteina o histidina N-terminal, independientemente de si la cisteina o histidina N-terminal se encuentra de manera natural en el polipéptido o fue introducida por modificación de la secuencia del polipéptido. La molécula del polipéptido es preferiblemente seleccionada del grupo que consiste de proteínas, ligandos de proteínas, enzimas, citoquinas, hematopoyetinas, factores de crecimiento, hormonas, antígenos, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, receptores, y fragmentos de proteínas. Los siguiente es ilustrativo, aunque no significa una lista exhaustiva de moléculas de polipéptido que incluyen, o podrían ser modificadas para incluir, un residuo cisteína o histidina N-terminal : calcitonina, hormona paratiroidea, interferon alfa, interferon beta, interferon gama, interleuquinas 1-21, factor estimulador de la colonia de granulocito, factor estimulador de la colonia de macrófago, factor estimulador de las colonias de macrófago y de granulocito, factor de células germinales, factor inhibidor de la leucemia, ligando de kit, ligando de fit-3, eritropoyetina, trombopoyetina, factor de necrosis de tumor alfa, factor de necrosis de tumor beta, factor de crecimiento transformador, proteínas morfogénicas óseas, osteoprotegerina, activador plasminógeno de tejido, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento de fibroblasto, factor de crecimiento de queratocito, factor de crecimiento epidérmico, hormona de crecimiento humano, insulina, ligando inductor de apoptosis relacionada con el factor de necrosis de tumor (TRAIL) , DNAsa, receptores, enzimas, proteínas de fusión, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos completos, fragmentos Fab, fragmentos F(ab' ) 2, fragmentos Fv, y fragmentos ScFv. En una modalidad preferida, el polipéptido es una molécula de interferon. Una modalidad ejemplar de un conjugado de polímero lineal de la invención tiene la estructura: X Y w R-POLI—(Z)a-(CH)m C—N—C POLIPEPTIDO H H Fórmula VI la en donde R, POLI, Z, a, X, m, Y y W son como se definieron anteriormente. En una modalidad alternativa donde el polímero es un polímero multi-ramales, un conjugado de polímero ejemplar de la invención tiene la estructura: R .'¦[—POL Fórmula VI Ib en donde R' , y, POLI, Z, a, X, m, Y y W son como se definieron anteriormente.
Los conjugados de polipéptidos de conformidad con la invención poseerán un enlace amida formado por medio de la reacción con una cisteina o histidina N-terminal del polipéptido, donde la porción del polímero del conjugado puede tener cualquiera de numerosas geometrías diferentes (por ejemplo, lineal, ramificada, bifurcada, y los similares) , pesos moleculares, enlaces degradables opcionales, etc., como se describe con detalle en la presente y en los ejemplos que se incluyen. Se porporcionan en los Ejemplos 4-7, conjugados representativos preparados de conformidad con la invención . B. Método de Formar el Conjugado Polímero/Polipéptido La presente invención usa un polímero terminado en tioéster, tal como PEG terminado en tioéster, para modificar específicamente la a-amina de una cisteina o histidina N-terminal sin modificar permanentemente el grupo funcional libre restante (por ejemplo, el grupo tiol de un residuo cisteina) sobre el aminoácido terminal o modificar otros grupos amina presentes en la cadena polipeptídica . Aunque no esta relacionada con alguna teoría particular, el Esquema de Reacción I posterior, ilustra la reacción que se cree tiene lugar entre un polipéptido que tiene una molécula de cisteina N-terminal y un polímero reactivo de la invención. Como se muestra, se cree que el polímero terminado en tioéster reacciona inicialmente con el grupo tiol libre de la cisteína y después sufre una redistribución intramolecular para formar un enlace amida con el grupo amina N-terminal, desplazando así al grupo tiol disponible para modificación adicional si se desea. El intercambio tioéster-tiol es afectado preferiblemente por el uso de una trialquilfosfina, tal como tris (2-carboxietil ) fosfina o trietilfosfina, y opcionalmente un tiol, tal como ácido mercaptopropiónico .
Esquema de Reacción I Opcionalmente, en el caso de una molécula de cisteína N-terminal, un segundo polímero reactivo con tiol (por ejemplo, PEG reactivo con tiol) puede ser hecho reaccionar con el grupo tiol libre a fin de formar una estructura ramificada en el N-terminus del polipéptido como se muestra en el Esquema de Reacción I, en donde 1/ es el enlazador que resulta de la reacción del grupo funcional terminal reactivo con el tiol del segundo polímero PEG con el grupo tiol libre sobre la molécula de cisteína. En una modalidad, solamente dos estructuras poliméricas principales están fijadas al polipéptido. Ejemplos de grupos funcionales reactivos con tiol incluyen vinilsulfona, maleimida, disulfuro de ortopiridilo y iodoacetamida . Ejemplos del enlace L' incluyen: (que resulta del grupo funcional vinilsulfona) (que resulta del grupo funcional maleimida) — s — s — (que resulta del grupo funcional disulfuro de ortopiridilo) (que resulta del grupo funcional iodoacetamida) Como comprenderá fácilmente un experto en la materia, el método de la invención podría usarse para acoplar los derivados del polímero anteriormente descrito a una porción ya sea peptídica o no, que tenga un grupo -CH(W)-NH2 terminal, en donde W es como se definió anteriormente. IV. Ejemplos Los siguientes Ejemplos se dan para ilustrar la invención, pero no deberán considerarse como limitantes de la invención. Por ejemplo, aunque se usa mPEG en los ejemplos para ilustrar la invención, otras formas de polímeros similares que son útiles en la práctica de 1 a invención son abarcados por la misma como se discutió anteriormente . Todos los reactivos de PEG mencionados en los ejemplos anexos están disponibles de Shearwater Corporation of Huntsville, AL. Todos los datos de +HNMR fueron generados por un espectrómetro de MR a 300 o 400 MHz fabricado por Bruker. Los Ejemplos 1-3 ilustran métodos de formar un polímero terminado en tioéster de la invención. Los Ejemplos 4-7 ilustran la reacción de un polímero terminado en tioéster de la invención con un polipéptido ejemplar que tenga un residuo cisteina N-terminal. Como se indica posteriormente, el uso de polímeros con tioésteres de la invención da como resultado la fijación selectiva del polímero en la amina N-terminal del polipéptido. EJEMPLO 1 Preparación de ácido PEG ( 5000 ) -g-metoxi-ro-propiónico, (PEG-PA-OPTE) 2-piridiltioéster Se añadieron 2-mercaptopiridina (40.0 mg, 0.36 mmoles) , 1-hidroxibenzotriazol (4.0 mg, 0.030 inmoles) , 4- (dimetilamino) piridina (36.7 mg, 0.30 mmoles) y 1,3-diciclohexilcarbodiimida (disuelta en 2 mi de diclorometano anhidro, 84.0 mg, 0.41 mmoles) a una solución de ácido PEG (5000) -a-metoxi-tn-propiónico (1.5 g, 0.27 mmoles) en acetonitrilo anhidro (20 mi) . La solución de reacción se agitó toda la noche a temperatura ambiente bajo argón. La solución se concentró entonces hasta casi sequedad a presión reducida, seguida por la adición de tolueno anhidro (50 mi) . La mezcla se agitó a temperatura ambiente por treinta minutos, se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida hasta casi sequedad. Se añadió acetato de etilo (200 mi) y la mezcla se calentó hasta que el contenido se disolvió completamente. La solución se enfrió entonces a temperatura ambiente mientras se agitaba. Se añadió éter etílico (50 mi) y se formó un precipitado. El producto fue filtrado y enjuagado con éter etílico hasta que el producto se volvió blanco. El producto fue luego secado al alto vacío. Producto: 1.1 g. NMR (d6-DMSO) : d 2.98 ppm (t, 2H, -CH2-C0S-) , 83.51 ppm (s, Estructura principal de PEG) , d 7.46 ppm (m, mal resuelto, 1H, H5 (piridilo) ) , d 7.64 ppm (d, 1H, H3 (piridilo) ) , d 7.91 ppm (t, 1H, H4 (piridilo)), d 8.60 ppm (d, 1H, H6 (piridilo) ) . EJEMPLO 2 Preparación de PEG (5000)- a- benciloxi (BZO) - ro- carboximetilo, 2-piridiltioéster (PEG-CM-OPTE) Se añadieron 2-mercaptopiridina (40.0 mg, 0.36 nucióles) , 1-hidroxibenzotriazol (5.0 mg, 0.035 mmoles) , y 1 , 3-diciclohexilcarbodiimida (disueltos en 2 mi de diclorometano anhidro, 74.3 mg, 0.36 mmoles) a una solución de PEG ( 5000) -a-benciloxi-uj-carboximetilo (1.5 g, 0.30 mmoles) en acetonitrilo anhidro (20 mi) . La solución de reacción se agitó toda la noche a temperatura ambiente bajo argón. Se concentró entonces la solución hasta casi sequedad a presión reducida, seguido por adición de tolueno anhidro (30 mi) . La mezcla se agitó a temperatura ambiente por treinta minutos, se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida hasta casi sequedad. Se añadió acetato de etilo (150 mi) y la mezcla se calentó hasta que los contenidos se disolvieron completamente. La solución se enfrió entonces a temperatura ambiente mientras se agitaba. Se añadió éter etílico (50 mi) a la solución y se formó un precipitado. El producto se filtró y se enjuagó con éter etílico hasta que el producto se volvió blanco. El producto se secó entonces al alto vacío. Producto: 1.1 g. NMR (d6-DMSO) : d 3.51 ppm (s, estructura principal de PEG) . d 4.39 ppm (s, 2H, -OC¾COS-), d 4.49 ppm (s, 2H, -OCH2- (benciloxi) ) , d 7.33 ppm (m , mal resuelto, 5H, CeH5 (benciloxi)), d 7.46 ppm (m, mal resuelto, 1H, H5 (piridilo) ) , d 7.63 ppm (d, 1H, H3 (piridilo) ) , d 7.91 ppm (t, 1H, ¾ (piridilo)), d 8.60 ppm (d, 1H, H6 (piridilo) ) . EJEMPLO 3 Preparación del ácido PEG (5000) -g-metoxi-,ro-2-metil butanoico, 2-piridiltioéster Se añadieron 2-mercaptopiridina (44.5 mg, 0.40 mmoles), 1- hdroxibenzotriazol (4.7 mg, 0.033 inmoles) , 4- (dimetilamino) piridina (40.7 mg, 0.33 mmoles) y 1,3-diciclohexilcarbodiimida (disueltos en 2 mi de diclorometano anhidro, 92.8 mg, 0.45 mmoles) a una solución de ácido PEG ( 5000 ) -a-metoxi-n-2-metil butanoico (1.5 g, 0.30 mmoles) en acetonitrilo anhidro (20 mi) . La solución de reacción se agitó toda la noche a temperatura ambiente bajo argón. La solución se concentró entonces hasta casi sequedad a presión reducida, seguido por la adición de tolueno anhidro (50 mi) . La mezcla se agitó a temperatura ambiente por treinta minutos, se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida hasta casi sequedad. Se añadió acetato de etilo (150 mi) y la mezcla se calentó hasta que los contenidos se disolvieron completamente. La solución se enfrió entonces a temperatura ambiente mientras que se agitaba. Se formó un precipitado al añadir 2-propanol (50 mi) , seguido por la adición de éter etílico (50 mi) . El producto se separó por filtración, se enjuagó con 2-propanol hasta que el producto se volvió blanco. El producto se secó entonces al alto vacío. Producto: 1.2 g. NMR (d6-DMS0) : d 1.19 ppm (d, 3H, -0-CH2-CH2-CH (CH3) -COS-) , d 1.66 ppm y d 1.92 ppm (mm, 2H, -O-CH2-CH2-CH (CH3) -COS-) , d 2.89 ppm (m, 1H, -0-CH2-CH2-CH (CH3) -COS-) , d 3.51 ppm (s, estructura principal de PEG) , d 7.46 ppm (m, mal resuelto, 1H, H5 (piridilo) ) , d 7.63 ppm (d, 1H, H3 (piridilo) ) , d 7.90 ppm (t, 1H, E4 (piridilo)), d 8.60 ppm (d, 1H, H6 (piridilo)) . EJEMPLO 4 Conjugación de PEG-CM-OPTE al Interferon El Interferon Tau (0.45 mg) , el cual tiene una cisterna como aminoácido N-terminal, se formuló para 0.3 mg/ml en Tris 1M, 0.7 mM de TCEP (clorhidrato de Tris [2-carboxietilfosfina] 1 M y 3 mM de ácido mercaptopropiónico a pH de 7.75. Se añadieron aproximadamente 1.0 mg de mPEG5K-CM-OPTE (del Ejemplo 2) a la solución de interferon y se dejó reaccionar a temperatura ambiente por 4 horas. La mezcla de reacción se dializó contra agua desionizada toda la noche. Se analizó el producto por medio de MALDI-MS. El espectro de masa mostró PEG libre a 5000 Da, interferon sin conjugar a 19,979 Da y un solo conjugado de PEG en un peso molecular de 25, 065 Da, lo que significa que el producto PEGilado tiene solamente una molécula de PRG única fijada al polipéptido en el N-terminus. EJEMPLO 5 Conjugación de PEG-PA-OPTE al Interferon El Interferon Tau (0.45 mg) fue formulado para 0.3 mg/ml en Tris 0.33 M, 0.7 mM de TCEP (clorhidrato de (Tris[2-carboxietilfosfina]) a pH de 7.75. Se añadió aproximadamente 1.0 mg de mPEG5K-PA-OPTE (ortopiridil éster del ácido propiónico del Ejemplo 1) , a la solución de interferon y se dejó reaccionar a temperatura ambiente por 4 horas. El producto se analizó por medio de SDS-PAGE. El gel mostró dos bandas correspondientes al interferon conjugado (~ 20 kDa) e interferon conjugados a PEG únicamente (~ 29 kDa) (es decir, un polipéptido fijado a una molécula de PEG única) . La migración más lenta del conjugado interferon-PEG es debida al volumen hidrodinámico más grande de la cadena PEG en comparación con una proteina de peso molecular correspondiente. EJEMPLO 6 Conjugación de PEG CM-OPTE a un polipéptido El polipéptido CRASKSVSSSGYSYMHWYQQ (PM = 2355 Da) (SEC ID NO: 1) fue formulado para 0.67 mg/ml en Tris 0.67 M, 1.3 mM de TCEP (clorhidrato de Tris[2-carboxietilfosfina]) y urea 5.3 M a pH de 7.75. Se añadieron aproximadamente 21.0 mg de mPEG5K-CM-0PTE (del Ejemplo 2) a la solución del polipéptido y se dejó reaccionar a temperatura ambiente por 4 horas. La mezcla de reacción se dializó contra agua desionizada toda la noche. Se analizó el producto por medio de MALDI-MS. El espectro de masa mostró un conjugado que comprende una única molécula de PEG fijada al polipéptido y que tiene un peso molecular de 7555 Da. Esto demuestra que el polímero terminado en tioéster no reaccionó aleatoriamente con otros grupos amina libres en la molécula, tales como los grupos amina de los residuos lisina o arginina. EJEMPLO 7 Conjugación de PEG-PA-OPTE a un polipéptido El polipéptido CRASKSVSSSGYSYMHWYQQ (PM = 2355 Da) (SEC ID NO: 1) fue formulado para 0.67 mg/ml en Tris 0.67 M, 1.3 mM de TCEP (clorhidrato de Tris [2-carboxietilfosfina]) y urea 5.3 M a pH de 7.75. Se añadieron aproximadamente 21.0 mg de mPEG5 -PA-OPTE (del Ejemplo 1) a la solución del polipéptido y se dejó reaccionar a temperatura ambiente por 4 horas. Muchas modificaciones y otras modalidades de la invención vendrán a la mente de un experto en la materia a las cuales pertenece esta invención, que tengan el beneficio de las enseñanzas presentadas en la descripción anterior. Por consiguiente, se comprenderá que la invención no se limite a las modalidades específicas descritas y que se pretende incluir modificaciones y otras modalidades en el alcance de las reivindicaciones anexas. Aunque se emplean términos específicos en la presente, se usan en un sentido genérico y descriptivo solamente y no para propósitos de limitación.
LISTADO DE SECUENCIAS <110> Robert, Michael J. Fang, Zhihao <120> POLIMEROS ACUOSOLUBLES TERMINADOS EN TIOESTER Y METODOS DE MODIFICAR CON ESTOS, EL N-TERMINUS DE UN POLIPEPTIDO <130> 34848-254468 <150> 09/973,318 <151> 2001-10-09 <160> 1 <170> FastSEQ para Windows Versión 4.0 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Polipéptido que tiene 20 residuos de aminoácidos y una cisteina N-terminal . <400> 1 Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Ser Ser Gly Tyr S 1 5 10 Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln 15 20

Claims (28)

NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES :
1. Un polímero reactivo terminado en tioéster, caracterizado porque comprende una estructura polimérica principal no peptxdica y acuosoluble que tenga al menos un terminus enlazado a la estructura:
X / (Z)a-(CH), en donde: L es el punto de enlace a la estructura polimérica principal; Z es un enlazador; m es desde 0 hasta aproximadamente 12; Y es un heteroátomo; Cada X es seleccionada independientemente desde H y alquilo; a es 0 o 1; y Q es un grupo desplazable que contiene azufre. 2. El polímero reactivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque cada X es H o Ci-C6 alquilo.
3. El polímero reactivo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque X es H o metilo.
4. El polímero reactivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque Y es O o S .
5. El polímero reactivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque Q tiene la fórmula -S-Ri, en donde Ri es seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo, alquilo substituido, cicloalquilo, cicloalquilo substituido, arilo, arilo substituido, heteroarilo, heteroarilo substituido, heterociclo, y heterociclo substituido.
6. El polímero reactivo de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque Ri es seleccionado del grupo que consiste de fenol, nitrofenol, ácido benzoico, piridina, ácido piridincarboxílico, y nitropiridina .
7. El polímero reactivo de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque Ri es piridina substituida o no substituida.
8. El polímero reactivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque a es 1 y Z es seleccionada del grupo que consiste de -0-, -S-, -NHCO-, -CONH-, -02C-, -NHCO2-, y -O2-C H-.
9. El polímero reactivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la estructura polimérica principal es seleccionada del grupo que consiste de poli (alquilen glicol), poli (poliol oxietilado), poli (alcohol olefinico) , poli (vinilpirrolidona) , poli (ácido a-hidroxi) , poli (alcohol vinilico) , polifosfazeno, polioxazolina, poli (N-acriloilmorfolina) , poliacrilato, poliacrilamidas, polisacáridos, y copolímeros, terpolímeros, y mezclas de los mismos.
10. El polímero reactivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la estructura polimérica principal no peptídica y acuosoluble es seleccionada del grupo que consiste de poli(etilen glicol), poli (propilen glicol), y copolímeros de etilen glicol y propilen glicol.
11. El polímero reactivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la estructura polimérica principal es poli (etilen glicol) que tiene un número que expresa el peso molecular promedio de aproximadamente 100 Da a aproximadamente 100,000 Da.
12. El polímero reactivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque m es 1 a aproximadamente 4.
13. El polímero reactivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque tiene la estructura: X o -PQLI—(Z)a-(CH)m—C-S—Ri en donde POLI, es una estructura polimérica principal no peptidica y acuosoluble; R es un grupo encubridor o un grupo funcional; y Ri es seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo, alquilo substituido, cicloalquilo, cicloalquilo substituido, arilo, arilo substituido, heteroarilo, heteroarilo substituido, heterociclo, y heterociclo substituido.
14. El polímero reactivo de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque R es seleccionado del grupo que consiste de alcoxi, alquilo, benci lo, arilo, ariloxi, hidroxilo, éster activo, carbonato activo, acetal, aldehido, hidrato de aldehido, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona activa, amina, hidrazida, tiol, ácido carboxílico, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, iodoacetamida, epoxida, glioxal, diona, mesilato, tosilato, tresilato y (Z) a- (CXH) m-CO-S-Ri .
15. El polímero reactivo de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque POLI es (poli(etilen glicol) .
16. El polímero reactivo de conformidad con reivindicación 1, caracterizado porque tiene estructura: en donde : cada POLI es una estructura polimérica principal no peptídica y acuosoluble; R' es una molécula con núcleo central; Y es desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 100; y Ri es seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo, alquilo substituido, cicloalquilo, cicloalquilo substituido, arilo, arilo substituido, heteroarilo, heteroarilo substituido, heterociclo, y heterociclo substituido.}
17. El polímero reactivo de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque POLI es poli (etilen glicol) .
18. El polímero reactivo de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque R' es un residuo de una molécula seleccionada del grupo que consiste de polioles, poliaminas, y moléculas que tengan una combinación de grupos amina y alcoholes.
19. El polímero reactivo de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque R' es un residuo de una molécula seleccionada del grupo que consiste de glicerol, oligómeros de glicerol, pentaeritritol, sorbitol y lisina.
20. Un conjugado de polímero de un polipéptido, que tiene un residuo cisteína o histidina en el N-terminus, el conjugado de polímero comprende una estructura polimérica principal no peptídica y acuosoluble que tiene al menos un terminus enlazado a la estructura: caracterizado porque tiene: L es el punto de enlace a la estructura polimérica principal ; Z es un enlazador; Y es un heteroátomo; m es desde 0 a aproximadamente 12; cada X es seleccionada independientemente de H y alquilo; a es 0 o 1 ; W es -CH2SH o POLIPEPTIDO es la molécula de polipéptido.
21. El conjugado de polímero de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la estructura polimérica principal es poli (etilen glicol) .
22. El conjugado de polímero de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque POLIPEPTIDO es seleccionado del grupo que consiste de proteínas, ligandos de proteínas, enzimas, citoquinas, hematopoyetinas, factores de crecimiento, hormonas, antígenos, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, receptores, y fragmentos de proteína.
23. El conjugado de polímero de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque POLIPEPTIDO es una molécula de interferon.
24. Un método de conjugar un derivado polimérico a un polipéptido que tiene un residuo cisteína o histidina en el N-terminus, el método está caracterizado porque comprende : proporcionar un polipéptido que tenga un residuo cisteína o histidina en el N-terminus; proporcionar un polímero terminado en tioéster, el polímero que comprende una estructura polimérica principal no peptidica y acuosoluble que tiene al menos un terminus enlazado a la estructura: en donde : L es el punto de enlace a la estructura polimérica principal ; Z es un enlazador; m es desde 0 a aproximadamente 12; Y es un heteroátomo; cada X es seleccionada independientemente de H y alquilo; a es 0 o 1; y Q es un grupo desplazable que contiene azufre; hacer reaccionar el polímero terminado en tioéster con el polipéptido para formar un conjugado que tenga la estructura : en donde POLIPEPTIDO es la molécula del polipéptido, W es -CH2SH o
25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la estructura polimérica principal es poli(etilen glicol) .
26. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el POLIPEPTIDO es seleccionado del grupo que consiste de ligandos de proteina, enzimas, citoquinas, hematopoyetinas, factores de crecimiento, hormonas, antigenos, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, receptores, y fragmentos de proteínas.
27. Un conjugado de polímero de un polipéptido que tiene una molécula de cisteína en el N-terminus, el conjugado de polímero comprende dos estructuras poliméricas principales no peptídicas y acuosolubles fijadas en el N-terminus, el conjugado tiene la estructura : caracterizada porque: L es el punto de enlace a cada una de las dos estructuras peptídicas principales, L' y Z son enlazadores, Y es un heteroátomo; m es desde 0 a aproximadamente 12; cada X es seleccionada independientemente de H y alquilo; a es 0 o 1; y POLIPEPTIDO es la molécula del polipéptido.
28. El conjugado de polímero de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque L' es seleccionado del grupo que consiste de
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