KR102132100B1

KR102132100B1 - Pd-1 항체

Info

Publication number: KR102132100B1
Application number: KR1020187003720A
Authority: KR
Inventors: 헤만타 바루아; 쳉 첸; 샤오린 리우; 앤디 춘; 데챠오 엠. 위
Original assignee: 이노벤트 바이오로직스 (쑤저우) 컴퍼니, 리미티드
Priority date: 2015-08-10
Filing date: 2016-08-09
Publication date: 2020-07-08
Also published as: RU2686612C1; CA2990492C; CN110003339A; JP6513296B2; NZ738979A; LT3334824T; CN110003339B; MX365390B; BR112018002274A2; WO2017024465A1; ES2904586T3; HK1255195B; SI3334824T1; EP3334824A1; TW201713698A; AR105489A1; DK3334824T3; CN108473977B; EP3334824B1; MY199019A

Abstract

인간 프로그램화된 세포 사멸 1 (PD-1)에 결합하는 항체, 및 단독으로 또는 화학요법 및 다른 암 치료제와 조합하여 암을 치료하기 위한 그의 용도가 본원에 제공된다.

Description

PD-1 항체

본 발명은 의약의 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 인간 프로그램화된 세포 사멸 1 (PD-1)에 결합하는 항체에 관한 것이고, 단독으로 및 화학요법 및 다른 암 치료제와 조합하여 암을 치료하는데 유용할 수 있다.

종양 세포는 다중 메카니즘을 통해 면역계에 의한 검출 및 제거를 회피한다. 면역 체크포인트 경로는 자기-관용 유지 및 활성화된 T 세포 제어에서 사용되지만, 암 세포는 경로를 파괴를 방지하기 위해 사용할 수 있다. PD-1 / 인간 프로그램화된 세포 사멸 1 리간드 1 (PD-L1) 경로는 하나의 이러한 면역 체크포인트이다. 인간 PD-1은 T 세포에서 발견되고, PD-L1 및 인간 프로그램화된 세포 사멸 1 리간드 2 (PD-L2)의 PD-1에 대한 결합은 T 세포 증식 및 시토카인 생산을 억제한다. 따라서 PD-L1 및 PD-L2의 종양 세포 생산은 T 세포 감시로부터의 회피를 가능하게 한다.

인간 PD-1에 대한 완전 인간 IgG4 (S228P) 항체, 니볼루맙은 PD-1의 PD-L1 및 PD-L2에 대한 결합을 억제하는 것으로 밝혀졌고, 다양한 임상 시험에서 시험되었다 (Wang et al., Cancer Immunol Res (2014) 2(9):846). PD-1에 대한 인간화 IgG4 (S228P) 항체, 펨브롤리주맙 (이전에 람브롤리주맙)은 PD-1의 PD-L1 및 PD-L2에 대한 결합을 억제하는 것으로 밝혀졌고, 다양한 임상 시험에서 시험되었다 (WO2008156712 및 Hamid et al., N Engl J Med (2013) 369:2).

인간 PD-1에 결합하여 그의 PD-L1 및 PD-L2와의 상호작용을 중화시키는 대안적 항체를 제공할 필요가 남아 있다. 특히, 특정 선행 기술 항체보다 더 높은 친화도로 인간 PD-1에 결합하는 항체를 제공할 필요가 남아 있다. 또한, 특정 선행 기술 항체보다 PD-L1 및 PD-L2와의 인간 PD-1 상호작용을 더 효과적으로 차단하는 항체를 제공할 필요가 남아 있다. 더 높은 친화도 및 더 우수한 차단은, 단독으로 또는 함께, 더 큰 생체내 활성 또는 더 낮은 요구 투여량으로 전환될 수 있다.

본 발명의 특정 항체는 니볼루맙 및 펨브롤리주맙보다 더 높은 친화도로 인간 PD-1에 결합한다. 또한, 본 발명의 특정 항체는 생체내 모델에서 니볼루맙 및 펨브롤리주맙에 비해 우선적인 증진된 동종반응성을 매개한다.

따라서, 일부 실시양태에서 본 발명은 경쇄 (LC) 및 중쇄 (HC)를 포함하는 인간 PD-1 (서열식별번호(SEQ ID NO): 1)에 결합하는 항체를 제공하며, 여기서 경쇄는 각각 아미노산 서열 RASQGISSWLA (서열식별번호: 9), SAASSLQS (서열식별번호: 10), 및 QQANHLPFT (서열식별번호: 11)로 이루어진 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하고, 중쇄는 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하며, 여기서 HCDR1은 아미노산 서열 KASGGTFSSYAIS (서열식별번호: 2) 또는 KASGGTLSSYAIS (서열식별번호: 3)로 이루어지고, HCDR2는 아미노산 서열 LIIPMFGTAGYAQKFQG (서열식별번호: 4), LIIPMFDTAGYAQKFQG (서열식별번호: 5) 또는 LIIPMFGAAGYAQRFQG (서열식별번호: 6)로 이루어지고, HCDR3은 아미노산 서열 ARAEYSSTGTFDY (서열식별번호: 7) 또는 ARAEHSSTGTFDY (서열식별번호: 8)로 이루어진다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3이 각각 아미노산 서열 RASQGISSWLA (서열식별번호: 9), SAASSLQS (서열식별번호: 10), 및 QQANHLPFT (서열식별번호: 11)로 이루어지고, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3이 각각 아미노산 서열 KASGGTFSSYAIS (서열식별번호: 2), LIIPMFGTAGYAQKFQG (서열식별번호: 4), 및 ARAEYSSTGTFDY (서열식별번호: 7)로 이루어지는 항체를 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3이 각각 아미노산 서열 RASQGISSWLA (서열식별번호: 9), SAASSLQS (서열식별번호: 10), 및 QQANHLPFT (서열식별번호: 11)로 이루어지고, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3이 각각 아미노산 서열 KASGGTFSSYAIS (서열식별번호: 2), LIIPMFDTAGYAQKFQG (서열식별번호: 5), 및 ARAEHSSTGTFDY (서열식별번호: 8)로 이루어지는 항체를 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3이 각각 아미노산 서열 RASQGISSWLA (서열식별번호: 9), SAASSLQS (서열식별번호: 10), 및 QQANHLPFT (서열식별번호: 11)로 이루어지고, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3이 각각 아미노산 서열 KASGGTLSSYAIS (서열식별번호: 3), LIIPMFGAAGYAQRFQG (서열식별번호: 6), 및 ARAEHSSTGTFDY (서열식별번호: 8)로 이루어지는 항체를 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 경쇄 (LC) 및 중쇄 (HC)를 포함하는 항체를 제공하며, 여기서 경쇄는 경쇄 가변 영역 (LCVR)을 포함하고 중쇄는 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함하며, 여기서 LCVR은 서열식별번호: 15에 제시된 아미노산 서열을 갖고, HCVR은 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 또는 서열식별번호: 14에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.

추가 실시양태에서, 본 발명은 LCVR이 서열식별번호: 15에 제시된 아미노산 서열을 갖고, HCVR이 서열식별번호: 12에 제시된 아미노산 서열을 갖는 항체를 제공한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 LCVR이 서열식별번호: 15에 제시된 아미노산 서열을 갖고, HCVR이 서열식별번호: 13에 제시된 아미노산 서열을 갖는 항체를 제공한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 LCVR이 서열식별번호: 15에 제시된 아미노산 서열을 갖고, HCVR이 서열식별번호: 14에 제시된 아미노산 서열을 갖는 항체를 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 LC가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, HC가 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 18, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20, 또는 서열식별번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 갖는 항체를 제공한다.

추가 실시양태에서, 본 발명은 LC가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, HC가 서열식별번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 갖는 항체를 제공한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 LC가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, HC가 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 갖는 항체를 제공한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 LC가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, HC가 서열식별번호: 18에 제시된 아미노산 서열을 갖는 항체를 제공한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 LC가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, HC가 서열식별번호: 19에 제시된 아미노산 서열을 갖는 항체를 제공한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 LC가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, HC가 서열식별번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 갖는 항체를 제공한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 LC가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, HC가 서열식별번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 갖는 항체를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 LC가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, HC가 서열식별번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 갖는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 LC가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, HC가 서열식별번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 갖는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 LC가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, HC가 서열식별번호: 25에 제시된 아미노산 서열을 갖는 항체를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하는 항체를 제공하며, 여기서 각 경쇄는 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 각 중쇄는 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 18, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20, 또는 서열식별번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.

추가 실시양태에서, 본 발명은 각 경쇄가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 각 중쇄가 서열식별번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 갖는 항체를 제공한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 각 경쇄가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 각 중쇄가 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 갖는 항체를 제공한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 각 경쇄가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 각 중쇄가 서열식별번호: 18에 제시된 아미노산 서열을 갖는 항체를 제공한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 각 경쇄가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 각 중쇄가 서열식별번호: 19에 제시된 아미노산 서열을 갖는 항체를 제공한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 각 경쇄가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 각 중쇄가 서열식별번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 갖는 항체를 제공한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 각 경쇄가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 각 중쇄가 서열식별번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 갖는 항체를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하는 항체를 제공하며, 여기서 각 경쇄는 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 각 중쇄는 서열식별번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 한 실시양태에서, 본 발명은 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하는 항체를 제공하며, 여기서 각 경쇄는 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 각 중쇄는 서열식별번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 한 실시양태에서, 본 발명은 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하는 항체를 제공하며, 여기서 각 경쇄는 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 각 중쇄는 서열식별번호: 25에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.

한 실시양태에서, 본 발명은 중쇄 중 하나가 경쇄 중 하나와 쇄간 디술피드 결합을 형성하고, 다른 중쇄는 다른 경쇄와 쇄간 디술피드 결합을 형성하고, 중쇄 중 하나가 다른 중쇄와 2개의 쇄간 디술피드 결합을 형성하는 항체를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 글리코실화된 항체를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 경쇄 (LC) 및 중쇄 (HC)를 포함하는, 인간 PD-1 (서열식별번호: 1)에 결합하는 항체를 제공하며, 여기서 경쇄는 경쇄 가변 영역 (LCVR)을 포함하고 중쇄는 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함하며, 여기서 LCVR은 서열식별번호: 15에 제시된 아미노산 서열을 갖고, HCVR은 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 또는 서열식별번호: 14에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.

추가 실시양태에서, 본 발명은 LCVR이 서열식별번호: 15에 제시된 아미노산 서열을 갖고, HCVR이 서열식별번호: 12에 제시된 아미노산 서열을 갖는, 인간 PD-1 (서열식별번호: 1)에 결합하는 항체를 제공한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 LCVR이 서열식별번호: 15에 제시된 아미노산 서열을 갖고, HCVR이 서열식별번호: 13에 제시된 아미노산 서열을 갖는, 인간 PD-1 (서열식별번호: 1)에 결합하는 항체를 제공한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 LCVR이 서열식별번호: 15에 제시된 아미노산 서열을 갖고, HCVR이 서열식별번호: 14에 제시된 아미노산 서열을 갖는, 인간 PD-1 (서열식별번호: 1)에 결합하는 항체를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 LC가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, HC가 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 18, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20, 또는 서열식별번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 갖는, 인간 PD-1 (서열식별번호: 1)에 결합하는 항체를 제공한다.

추가 실시양태에서, 본 발명은 LC가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, HC가 서열식별번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 갖는, 인간 PD-1 (서열식별번호: 1)에 결합하는 항체를 제공한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 LC가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, HC가 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 갖는, 인간 PD-1 (서열식별번호: 1)에 결합하는 항체를 제공한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 LC가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, HC가 서열식별번호: 18에 제시된 아미노산 서열을 갖는, 인간 PD-1 (서열식별번호: 1)에 결합하는 항체를 제공한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 LC가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, HC가 서열식별번호: 19에 제시된 아미노산 서열을 갖는, 인간 PD-1 (서열식별번호: 1)에 결합하는 항체를 제공한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 LC가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, HC가 서열식별번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 갖는, 인간 PD-1 (서열식별번호: 1)에 결합하는 항체를 제공한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 LC가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, HC가 서열식별번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 갖는, 인간 PD-1 (서열식별번호: 1)에 결합하는 항체를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 LC가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, HC가 서열식별번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 갖는, 인간 PD-1 (서열식별번호: 1)에 결합하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 LC가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, HC가 서열식별번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 갖는, 인간 PD-1 (서열식별번호: 1)에 결합하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 LC가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, HC가 서열식별번호: 25에 제시된 아미노산 서열을 갖는, 인간 PD-1 (서열식별번호: 1)에 결합하는 항체를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하는, 인간 PD-1 (서열식별번호: 1)에 결합하는 항체를 제공하며, 여기서 각 경쇄는 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 각 중쇄는 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 18, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20, 또는 서열식별번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.

추가 실시양태에서, 본 발명은 각 경쇄가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 각 중쇄가 서열식별번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 갖는, 인간 PD-1 (서열식별번호: 1)에 결합하는 항체를 제공한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 각 경쇄가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 각 중쇄가 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 갖는, 인간 PD-1 (서열식별번호: 1)에 결합하는 항체를 제공한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 각 경쇄가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 각 중쇄가 서열식별번호: 18에 제시된 아미노산 서열을 갖는, 인간 PD-1 (서열식별번호: 1)에 결합하는 항체를 제공한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 각 경쇄가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 각 중쇄가 서열식별번호: 19에 제시된 아미노산 서열을 갖는, 인간 PD-1 (서열식별번호: 1)에 결합하는 항체를 제공한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 각 경쇄가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 각 중쇄가 서열식별번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 갖는, 인간 PD-1 (서열식별번호: 1)에 결합하는 항체를 제공한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 각 경쇄가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 각 중쇄가 서열식별번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 갖는, 인간 PD-1 (서열식별번호: 1)에 결합하는 항체를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하는, 인간 PD-1 (서열식별번호: 1)에 결합하는 항체를 제공하며, 여기서 각 경쇄는 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 각 중쇄는 서열식별번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 한 실시양태에서, 본 발명은 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하는, 인간 PD-1 (서열식별번호: 1)에 결합하는 항체를 제공하며, 여기서 각 경쇄는 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 각 중쇄는 서열식별번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 한 실시양태에서, 본 발명은 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하는, 인간 PD-1 (서열식별번호: 1)에 결합하는 항체를 제공하며, 여기서 각 경쇄는 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 각 중쇄는 서열식별번호: 25에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.

한 실시양태에서, 본 발명은 중쇄 중 하나가 경쇄 중 하나와 쇄간 디술피드 결합을 형성하고, 다른 중쇄가 다른 경쇄와 쇄간 디술피드 결합을 형성하고, 중쇄 중 하나가 다른 중쇄와 2개의 쇄간 디술피드 결합을 형성하는, 인간 PD-1 (서열식별번호: 1)에 결합하는 항체를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 글리코실화된, 인간 PD-1 (서열식별번호: 1)에 결합하는 항체를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 22의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 16 또는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자를 포함하는 포유동물 세포를 제공하며, 여기서 세포는 서열식별번호: 22의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열식별번호: 16 또는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 항체를 발현할 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 22의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 17 또는 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자를 포함하는 포유동물 세포를 제공하며, 여기서 세포는 서열식별번호: 22의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열식별번호: 17 또는 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 항체를 발현할 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 22의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 18 또는 서열식별번호 21의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자를 포함하는 포유동물 세포를 제공하며, 여기서 세포는 서열식별번호: 22의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열식별번호: 18 또는 서열식별번호: 21의 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 항체를 발현할 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 22의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열식별번호: 16 또는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 항체를 생산하는 방법이며, 항체가 발현되도록 하는 조건 하에 본 발명의 포유동물 세포를 배양하고, 발현된 항체를 회수하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 22의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열식별번호: 17 또는 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 항체를 생산하는 방법이며, 항체가 발현되도록 하는 조건 하에 본 발명의 포유동물 세포를 배양하고, 발현된 항체를 회수하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 22의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열식별번호: 18 또는 서열식별번호: 21의 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 항체를 생산하는 방법이며, 항체가 발현되도록 하는 조건 하에 본 발명의 포유동물 세포를 배양하고, 발현된 항체를 회수하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 생산된 항체를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체, 및 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체를 암의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체를 암의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 암은 흑색종, 폐암, 두경부암, 결장직장암, 췌장암, 위암, 신장암, 방광암, 전립선암, 유방암, 난소암, 또는 간세포성 암종이다.

추가 실시양태에서, 이들 방법은 유효량의 본 발명의 항체를 1종 이상의 항종양제와 동시, 개별, 또는 순차적 조합으로 투여하는 것을 포함한다. 항종양제의 비제한적 예는 라무시루맙, 네시투무맙, 올라라투맙, 갈루니세르팁, 아베마시클립, 시스플라틴, 카르보플라틴, 다카르바진, 리포솜 독소루비신, 도세탁셀, 시클로포스파미드 및 독소루비신, 나벨빈, 에리불린, 파클리탁셀, 주사가능 현탁액용 파클리탁셀 단백질-결합 입자, 익사베필론, 카페시타빈, FOLFOX (류코보린, 플루오로우라실, 및 옥살리플라틴), FOLFIRI (류코보린, 플루오로우라실, 및 이리노테칸), 및 세툭시맙을 포함한다.

추가 실시양태에서, 이들 방법은 유효량의 본 발명의 화합물을 1종 이상의 면역-항암제와 동시, 개별, 또는 순차적 조합으로 투여하는 것을 포함한다. 면역-항암제의 비제한적 예는 니볼루맙, 이필리무맙, 피딜리주맙, 펨브롤리주맙, 트레멜리무맙, 우렐루맙, 리릴루맙, 아테졸리주맙, 및 두르발루맙을 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 요법에 사용하기 위한 본 발명의 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 암의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체를 제공한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 암의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체를 제공하며, 여기서 암은 흑색종, 폐암, 두경부암, 결장직장암, 췌장암, 위암, 신장암, 방광암, 전립선암, 유방암, 난소암, 또는 간세포성 암종이다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 항종양제와 동시, 개별, 또는 순차적 조합으로 사용하기 위한 본 발명의 항체를 제공한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 암의 치료에서, 라무시루맙, 네시투무맙, 올라라투맙, 갈루니세르팁, 아베마시클립, 시스플라틴, 카르보플라틴, 다카르바진, 리포솜 독소루비신, 도세탁셀, 시클로포스파미드 및 독소루비신, 나벨빈, 에리불린, 파클리탁셀, 주사가능 현탁액용 파클리탁셀 단백질-결합 입자, 익사베필론, 카페시타빈, FOLFOX (류코보린, 플루오로우라실, 및 옥살리플라틴), FOLFIRI (류코보린, 플루오로우라실, 및 이리노테칸), 및 세툭시맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 항종양제와 동시, 개별, 또는 순차적 조합으로 사용하기 위한 본 발명의 항체를 제공한다.

추가 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 면역-항암제와 동시, 개별, 또는 순차적 조합으로 사용하기 위한 본 발명의 항체를 제공한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 암의 치료에서, 니볼루맙, 이필리무맙, 피딜리주맙, 펨브롤리주맙, 트레멜리무맙, 우렐루맙, 리릴루맙, 아테졸리주맙, 및 두르발루맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 면역-항암제와 동시, 개별, 또는 순차적 조합으로 사용하기 위한 본 발명의 항체를 제공한다.

추가 실시양태에서, 본 발명은 암의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 본 발명의 항체의 용도를 제공한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 암의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 본 발명의 항체의 용도를 제공하며, 여기서 암은 흑색종, 폐암, 두경부암, 결장직장암, 췌장암, 위암, 신장암, 방광암, 전립선암, 유방암, 난소암, 또는 간세포성 암종이다.

추가 실시양태에서, 본 발명은 암의 치료를 위한 의약의 제조에서의 본 발명의 항체의 용도를 제공하며, 여기서 상기 의약은 1종 이상의 항종양제와 동시에, 개별적으로, 또는 순차적으로 투여된다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 암의 치료를 위한 의약의 제조에서의 본 발명의 항체의 용도를 제공하며, 여기서 상기 의약은 라무시루맙, 네시투무맙, 올라라투맙, 갈루니세르팁, 아베마시클립, 시스플라틴, 카르보플라틴, 다카르바진, 리포솜 독소루비신, 도세탁셀, 시클로포스파미드 및 독소루비신, 나벨빈, 에리불린, 파클리탁셀, 주사가능 현탁액용 파클리탁셀 단백질-결합 입자, 익사베필론, 카페시타빈, FOLFOX (류코보린, 플루오로우라실, 및 옥살리플라틴), FOLFIRI (류코보린, 플루오로우라실, 및 이리노테칸), 및 세툭시맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 항종양제와 동시에, 개별적으로, 또는 순차적으로 투여된다.

본 발명의 항체는 조작된, 비-자연 발생 폴리펩티드 복합체이다. 본 발명의 DNA 분자는 본 발명의 항체에서의 폴리펩티드 중 하나의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 비-자연 발생 DNA 분자이다.

본 발명의 항체는 조작된 CDR을 갖고 항체의 일부 부분 (프레임워크, 힌지 영역, 및 불변 영역의 모두 또는 일부)이 인간 게놈 서열로부터 유래된 프레임워크 및 불변 영역과 동일하거나 실질적으로 동일한 인간 기원 (실질적으로 인간)의 것이 되도록 설계된다. 완전 인간 프레임워크, 힌지 영역, 및 불변 영역은 그러한 인간 배선 서열뿐만 아니라 자연-발생 체세포 돌연변이를 갖는 서열 및 조작된 돌연변이를 갖는 서열이다. 본 발명의 항체는 그 안에 1개 이상의 아미노산 치환, 결실, 또는 부가를 함유하는 완전 인간 프레임워크, 힌지, 또는 불변 영역으로부터 유래된 프레임워크, 힌지, 또는 불변 영역을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 바람직하게는 인간에서 실질적으로 비-면역원성이다.

본 발명의 항체는 IgG 유형 항체이고 쇄내 및 쇄간 디술피드 결합을 통해 가교되는 "중"쇄 및 "경"쇄를 갖는다. 각 중쇄는 N-말단 HCVR 및 중쇄 불변 영역 ("HCCR")으로 구성된다. 각 경쇄는 LCVR 및 경쇄 불변 영역 ("LCCR")으로 구성된다. 특정 생물학적 시스템에서 발현될 때, 천연 인간 Fc 서열을 갖는 항체는 Fc 영역에서 글리코실화된다. 전형적으로, 글리코실화는 항체의 Fc 영역에서의 고도로 보존된 N-글리코실화 부위에서 발생한다. N-글리칸은 전형적으로 아스파라긴에 부착된다. 항체는 또한 다른 위치에서도 글리코실화될 수 있다.

임의로, 본 발명의 항체는 Fc 수용체-매개 염증 메카니즘에 관여하거나 보체를 활성화시키는 능력의 감소와 이에 따른 이펙터 기능의 감소 때문에 인간 IgG₄ Fc 영역으로부터 유래된 Fc 부분을 함유한다.

본 발명의 특정 항체는 위치 228에 세린의 프롤린으로의 돌연변이를 갖는 IgG₄-Fc 부분을 함유한다. 또한, 본 발명의 특정 항체는 IgG₄-PAA Fc 부분을 함유한다. IgG₄-PAA Fc 부분은 위치 228에 세린의 프롤린으로의 돌연변이, 위치 234에 페닐알라닌의 알라닌으로의 돌연변이, 및 위치 235에 류신의 알라닌으로의 돌연변이를 갖는다. S228P 돌연변이는 절반-항체 형성 (IgG₄ 항체에서의 절반-분자의 동적 교환의 현상)을 방지하는 힌지 돌연변이이다. F234A 및 L235A 돌연변이는 이미 낮은 인간 IgG₄ 이소형의 이펙터 기능을 추가로 감소시킨다. 또한, 본 발명의 특정 항체는 중쇄로부터 제거된 C-말단 리신 (des-Lys)을 갖는 IgG₄-PAA Fc 부분을 함유한다.

HCVR 및 LCVR 영역은 프레임워크 영역 ("FR")으로 칭하는 보다 더 보존되어 있는 영역 사이에 배치된, 상보성 결정 영역 ("CDR")으로 칭하는 초가변성의 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 HCVR 및 LCVR은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되며, 아미노-말단에서 카르복시-말단까지 하기의 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 배열된다. 본원에서, 중쇄의 3개의 CDR은 "HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3"으로 지칭되고 경쇄의 3개의 CDR은 "LCDR1, LCDR2 및 LCDR3"으로 지칭된다. CDR은 항원과 특이적 상호작용을 형성하는 잔기 중 대부분을 함유한다. 현재 서열 기술에 사용되는, 항체에 대한 3개의 CDR 배정 시스템이 존재한다. 카바트 (Kabat) CDR 정의 (Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))는 항체 서열 가변성에 기초한다. 코티아(Chothia) CDR 정의 (Chothia et al., "Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins", Journal of Molecular Biology, 196, 901-917 (1987); Al-Lazikani et al., "Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins", Journal of Molecular Biology, 273, 927-948 (1997))는 항체의 3차원 구조 및 CDR 루프의 위상학에 기초한다. 코티아 CDR 정의는 HCDR1 및 HCDR2를 제외하고 카바트 CDR 정의와 동일하다. 노스(North) CDR 정의 (North et al., "A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations", Journal of Molecular Biology, 406, 228-256 (2011))는 다수의 결정 구조를 사용하는 친화도 전파 클러스터링에 기초한다. 본 발명의 목적을 위해, 노스 CDR 정의가 사용된다.

HCVR 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 HCVR-코딩 DNA를 중쇄 불변 영역을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결시킴으로써 전장 중쇄 유전자로 전환될 수 있다. 인간뿐만 아니라 다른 포유동물의 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이들 영역을 포괄하는 DNA 단편은 예를 들어, 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다.

LCVR 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 LCVR-코딩 DNA를 경쇄 불변 영역을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결시킴으로써 전장 경쇄 유전자로 전환될 수 있다. 인간뿐만 아니라 다른 포유동물의 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이들 영역을 포괄하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열이 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된 후에 숙주 세포에서 발현될 것이다. 발현 벡터는 전형적으로 숙주 유기체에서 에피솜으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 필수 부분으로서 복제가능하다. 통상적으로, 발현 벡터는 목적하는 DNA 서열로 형질전환된 이들 세포의 검출을 허용하기 위한 선택 마커, 예를 들어, 테트라시클린, 네오마이신, 및 디히드로폴레이트 리덕타제를 함유할 것이다.

본 발명의 항체는 포유동물 세포, 예컨대 CHO, NS0, HEK293 또는 COS 세포에서 용이하게 생산될 수 있다. 숙주 세포는 관련 기술분야에 널리 공지된 기술을 사용하여 배양된다.

관심 폴리뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 항체의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 발현 제어 서열)을 함유하는 벡터는 세포 숙주의 종류에 따라 다른, 널리 공지된 방법에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다.

다양한 단백질 정제 방법이 사용될 수 있고 이러한 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고 예를 들어, 문헌 [Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-89 (1990) 및 Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 3rd Edition, Springer, NY (1994)]에 기재되어 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 항체, 또는 이를 코딩하는 핵산은 단리된 형태로 제공된다. 본원에 사용된 용어 "단리된"은 세포 환경에서 발견되는 임의의 다른 거대분자 종이 없는 또는 실질적으로 없는 단백질, 펩티드, 또는 핵산을 지칭한다. 본원에 사용된 "실질적으로 없는"은 관심 단백질, 펩티드, 또는 핵산이 제시된 거대분자 종을 80% 초과 (몰 기준), 바람직하게는 90% 초과, 보다 바람직하게는 95% 초과로 포함한다는 것을 의미한다.

본 발명의 항체, 또는 이를 포함하는 제약 조성물은 비경구 경로 (예를 들어, 피하 및 정맥내)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 항체는 환자에게 단일 또는 다중 용량으로 제약상 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제와 함께 투여될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 관련 기술분야에 널리 공지된 방법 (예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19^th ed. (1995), A. Gennaro et al., Mack Publishing Co.])에 의해 제조될 수 있고, 본원에 개시된 바와 같은 항체, 및 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함한다.

용어 "치료하는" (또는 "치료하다" 또는 "치료")은 기존 증상, 장애, 상태, 또는 질환의 진행 또는 중증도를 둔화, 차단, 저지, 완화, 정지, 감소, 또는 역전시키는 것을 지칭한다.

인간 PD-1에 대한 항체의 친화도와 관련하여 본원에 사용된 "결합하다"는 달리 나타내지 않는 한, 본질적으로 본원에 기재된 바와 같이 37℃에서 표면 플라스몬 공명 (SPR) 바이오센서의 사용을 포함하여 관련 기술분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 결정되는 경우에, 약 1 x 10^-6 M 미만, 바람직하게는, 약 1 x 10^-9 M 미만의 K_D를 의미하는 것으로 의도된다.

본 개시내용의 목적을 위해, 용어 "고친화도"는 MSD 또는 SPR에 의해 결정되는 경우에, 인간 PD-1에 대한 약 150 pM 미만의 K_D를 지칭한다. K_D 값은 검정 섹션에서 "결합 동역학 및 친화도"에 기재된 바와 같은 결합 동역학에 의해 확립된다.

"유효량"은 연구원, 의사, 또는 다른 임상의가 추구하는 조직, 시스템, 동물, 포유동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응 또는 그들에 대한 목적하는 치료 효과를 도출할, 본 발명의 항체 또는 본 발명의 항체를 포함하는 제약 조성물의 양을 의미한다. 항체의 유효량은 인자 예컨대 개체의 질환 상태, 연령, 성별, 및 체중, 및 개체에서 목적하는 반응을 도출해내는 항체의 능력에 따라 달라질 수 있다. 유효량은 또한 항체의 임의의 독성 또는 유해 효과를 치료상 유익한 효과가 능가하는 것이다.

본 발명은 하기 비-제한적인 실시예에 의해 추가로 예시된다.

실시예 1: 항체 발현 및 정제

항체 A - 항체 I의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 폴리펩티드, 완전한 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열, 및 그를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 하기 "아미노산 및 뉴클레오티드 서열"이라는 제목의 섹션에 열거된다. 또한, 항체 A - 항체 I의 경쇄, 중쇄, 경쇄 가변 영역, 및 중쇄 가변 영역에 대한 서열식별번호가 표 1에 제시된다.

항체 A - 항체 I를 포함하나 이에 제한되지는 않는 본 발명의 항체는 본질적으로 하기와 같이 제조하고 정제할 수 있다. 적절한 숙주 세포, 예컨대 HEK 293 또는 CHO는 미리 결정된 최적의 HC:LC 벡터 비, 또는 HC 및 LC 둘 다를 코딩하는 단일 벡터 시스템을 사용하여 항체를 분비하기 위한 발현 시스템에 의해 일시적으로 또는 안정적으로 형질감염시킬 수 있다. 항체가 분비된 정화된 배지는 많은 통용되는 기술 중 임의의 것을 사용하여 정제할 수 있다. 예를 들어, 배지는 상용 완충제, 예컨대 포스페이트 완충 염수 (pH 7.4)로 평형화된 맙셀렉트(MabSelect) 칼럼 (지이 헬스케어(GE Healthcare)), 또는 Fab 단편을 위한 카파셀렉트(KappaSelect) 칼럼 (지이 헬스케어)에 편리하게 적용될 수 있다. 칼럼은 비특이적 결합 성분을 제거하기 위해 세척할 수 있다. 결합된 항체는 예를 들어, pH 구배 (예컨대 20 mM 트리스(Tris) 완충제 pH 7에서 10 mM 시트르산나트륨 완충제 pH 3.0, 또는 포스페이트 완충 염수 pH 7.4에서 100 mM 글리신 완충제 pH 3.0)에 의해 용리할 수 있다. 항체 분획은 예컨대 SDS-PAGE에 의해 검출할 수 있고, 이어서 풀링할 수 있다. 추가 정제는 의도되는 용도에 따라 임의적이다. 항체는 통상적인 기술을 사용하여 농축시키고/거나 멸균 여과할 수 있다. 가용성 응집체 및 다량체는 크기 배제, 소수성 상호작용, 이온 교환, 다중모드, 또는 히드록시아파타이트 크로마토그래피를 포함하여 통상적인 기술에 의해 효과적으로 제거할 수 있다. 이들 크로마토그래피 단계 후의 항체의 순도는 95% 초과이다. 생성물은 -70℃에서 즉시 동결시킬 수 있거나 또는 동결건조시킬 수 있다.

표 1: 서열식별번호

검정

생체내 활성 - WINN 검정

본 발명의 항체는 Winn 검정으로 생체내 면역조정 활성에 대해 측정할 수 있다. Winn 검정에서, 인간 종양 세포 및 인간 면역 세포 (동종)가 면역결핍 마우스 내로 함께 주입되고, 이어서 면역조정제가 투여된다. 검정에서 작용제의 효과를 결정하기 위해 종양 부피가 측정된다.

본 발명의 항체에 의한 동종-항원에 대한 면역 반응의 증진은 NCI-H292 인간 NSCLC 이종이식편 모델에서 시험할 수 있다. 제0일에, 잭슨 래보러토리즈(Jackson Laboratories)로부터의 NSG 마우스 (7주령, 암컷, 8-10 마리의 마우스 군 중)에 2 x10⁶개 H292 세포, 또는 HBSS 중 2 x10⁶개 H292 세포 및 1 x 10⁶개 인간 PBMC의 혼합물 (0.2 ml 총 부피)을 측복부에 피하로 이식한다. 제1일에 시작하여, 마우스를 주당 1회, 10 mg/kg의 인간 IgG의 i.p. 주사로 처리한다. 털 손질 및 보행을 포함하는 동물 웰빙 및 행동을 주당 적어도 2회 모니터링한다. 체중 및 종양 부피를 주당 2회 측정한다.

본질적으로 본 검정에 기재된 바와 같이 수행된 실험에서, 10 mg/kg, qw, ip로 투여된 항체 A 또는 항체 D는 체중 및 임상 관찰에 의해 모니터링된 바와 같이 내약성이 우수하고 안전하다. 종양 성장 및 T/C% 결과는 표 2에 제시된다. NCI-H292 및 PBMC를 공동-이식하고 10 mg/kg qw로 항체 A 또는 항체 D를 투여한 마우스에서의 종양은 유의하게 더 느리게 성장하였고 시간 경과에 따라 퇴행하였다. 이들 조건 하에, 항체 A 및 항체 D는 둘 다 니볼루맙 및 펨브롤리주맙에 비해 우선적인 증진된 동종반응성을 매개한다.

표 2: WINN 검정

* T/C%는 명시된 시점에 대조군 (hIgG + hPBMC) 대 처리된 마우스에서의 종양 부피의 비이다.

결합 동역학 및 친화도

인간 PD-1에 대한 동역학 및 평형 해리 상수 (K_D)를 본 발명의 항체에 대해 MSD, 표면 플라즈몬 공명 (비아코어(Biacore)), 및 생물-층 간섭측정법 (포르테바이오(ForteBio)) 검정 방법을 사용하여 결정한다.

본원에 사용된 니볼루맙은 제안된 INN: 목록 107 (CAS #946414-94-4)로부터의 중쇄 및 경쇄 서열을 이용하는, 293 HEK 세포에서 출원인에 의해 일시적으로 발현된 인간 IgG4 PD-1 항체이다. 본원에 사용된 펨브롤리주맙은 제안된 INN: 목록 72로부터의 중쇄 및 경쇄 서열을 이용하는, 293 HEK 세포에서 출원인에 의해 일시적으로 발현된 인간 IgG4 PD-1 항체이다.

MSD 검정

평형 친화도 측정을 이전에 기재된 바와 같이 수행한다 (Estep, P., et al., MAbs, 2013. 5(2): p. 270-8). 용액 평형 적정 (SET)은 PBS + 0.1% IgG-무함유 BSA (PBSF)에서 수행하며, 여기서 항원 (b-PD-1 단량체)이 10-100 pM에서 일정하게 유지되고 5-100 nM에서 시작하는 Fab 또는 mAb의 3- 내지 5-배 연속 희석물과 인큐베이션된다 (실험 조건은 샘플 의존적임). PBS에 20 nM로 희석된 항체를 4℃에서 밤새 또는 실온에서 30분 동안 표준 결합 MSD-ECL 플레이트 상에서 코팅한다. 플레이트를 700 rpm에서 진탕시키면서 30분 동안 BSA로 차단한다. 이어서 플레이트를 세척 완충제 (PBSF + 0.05% 트윈(Tween) 20)로 3x 세척한다. SET 샘플을 적용하고 700 rpm에서 진탕시키면서 150초 동안 플레이트 상에서 인큐베이션하고 이어서 1회 세척한다. 플레이트 상에 포획된 항원을 3분 동안 플레이트 상에서 인큐베이션함으로써 PBSF 중 250 ng/mL 술포태그-표지된 스트렙타비딘으로 검출한다. 플레이트를 세척 완충제로 3회 세척하고 이어서 계면활성제를 함유하는 1x 판독 완충제 T를 사용하여 MSD 섹터 이미저(Sector Imager) 2400 기기 상에서 판독한다. 유리 항원 퍼센트를 프리즘(Prism)에서 적정된 항체의 함수로서 플롯팅하고 K_D를 추출하기 위해 2차 방정식에 피팅한다. 처리량을 개선하기 위해, 액체 취급 로봇을 SET 샘플 제조를 포함하여 MSD-SET 실험 전반에 걸쳐 사용한다.

본질적으로 본 검정에 기재된 바와 같이 수행된 실험에서, IgG1 포맷이고 효모에서 발현된 항체 D 및 G는 인간 PD-1에 각각 12 pM 및 14 pM의 K_D로 결합한다. 둘 다 IgG1 포맷인 펨브롤리주맙 및 니볼루맙은 PD-1에 각각 130 pM 및 640 pM의 K_D로 결합한다. 항체 D 및 G에 대한 결합력은 각각 대략 0.9 pM 및 1 pM의 K_D로 측정된다. 펨브롤리주맙 및 니볼루맙은 인간 PD-1에 각각 대략 3 pM 및 5 pM의 K_D로 결합한다.

표 3: IgG1 포맷의 본 발명의 항체의 MSD에 의한 결합

생물-층 간섭측정법

포르테바이오 친화도 측정을 일반적으로 이전에 기재된 바와 같이 수행한다 (Estep, P., et al., High throughput solution-based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning. MAbs, 2013. 5(2): p. 270-8). 간략하게, 포르테바이오 친화도 측정을 AHQ 센서 상에 IgG를 온라인으로 로딩함으로써 수행한다. 센서를 30분 동안 검정 완충제에서 오프-라인으로 평형화시키고 이어서 기준선 확립을 위해 60초 동안 온-라인으로 모니터링한다. IgG가 로딩된 센서를 5분 동안 100 nM 항원에 노출시키고, 그 후 이들을 오프-레이트 측정을 위해 5분 동안 검정 완충제로 옮긴다. 동역학을 1:1 결합 모델을 사용하여 분석한다.

표 4: 본 발명의 항체의 생물-층 간섭측정법에 의한 결합

본질적으로 본 검정에 기재된 바와 같이 수행된 실험에서, 항체 D 및 G는 PD-1_Fc가 센서 팁 상에 있을 때 니볼루맙 및 펨브롤리주맙보다 대략 3배 내지 4배 더 낮은 K_D로 인간 PD-1_Fc에 결합한다. 항체가 센서 팁 상에 있을 때, 항체 D 및 G는 니볼루맙 및 펨브롤리주맙보다 대략 4배 내지 6배 더 낮은 K_D로 인간 PD-1_Fc에 결합한다. 항체 D 및 G는 니볼루맙 및 펨브롤리주맙과 유사한 K_D로 시노PD-1_Fc에 결합한다.

표면 플라즈몬 공명 (SPR)

센서 칩 표면 상에서 리간드로서의 인간 PD-1-Fc (알앤디 시스템즈(R&D Systems))의 고정화를 25℃에서 수행한다. 본 발명의 항체를 분석물로서 사용하고, 인간 PD-1-Fc 고정화된 센서 칩 표면 상에 주입한다. 모든 샘플 분석물을 그의 출발 농도 (90 nM)로부터 3-배 연속 희석물로서, 중간 농도 및 0에서의 하나의 중복을 포함한 총 8개의 희석물에서 실행한다. 분석을 37℃에서 수행한다. 각 샘플에 대한 접촉 시간은 30 μl/분에서 180초이다. 해리 시간: 5개의 보다 낮은 농도에 대해 300초 및 3개의 보다 높은 농도에 대해 1200 (Fab), 또는 2400 (T=0) 또는 3000 (4주 4℃, 25℃, 40℃)초. 고정화된 표면을 30 μl/분에서 0.4% SDS로 6-8초 동안 재생시키고, 이어서 5초 동안 안정화시킨다. 결합 동역학을 비아코어 T200 이밸류에이션 소프트웨어 (버전 3.0)를 사용하여 분석한다. 데이터를 블랭크 플로우 셀을 참조하도록 하고, 데이터를 1:1 결합 모델에 피팅한다.

본질적으로 본 검정에 기재된 바와 같이 수행된 실험에서, 항체 D는 인간 PD-1에 102 pM의 K_D로, 니볼루맙은 246 pM의 K_D로, 펨브롤리주맙은 181 pM의 K_D로 결합한다. 표 6에 제시된 바와 같이, 항체 D는 승온 조건 하에 결합 활성을 4주 간 유지한다.

표 5: 확장된 기간 및 온도에서의 항체 D의 SPR에 의한 결합

인간 PD-1의 PD-L1 및 PD-L2에 대한 Elisa 차단

수용체-리간드 차단 검정을 위해, 변화하는 양의 항-PD-1 항체 또는 대조군 IgG를 고정된 양의 비오티닐화된 PD-1-Fc 융합 단백질 (100 ng/mL)과 혼합하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 혼합물을 PD-L1-Fc (100 ng/웰) 또는 PD-L2-Fc (100 ng/웰)로 사전-코팅된 96-웰 플레이트로 옮기고 이어서 실온에서 추가의 1시간 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 세척하고 스트렙타비딘 HRP 접합체를 첨가한다. 플레이트를 450 nm의 흡광도에서 판독한다. IC50은 PD-1의 PD-L1에 대한 결합 또는 PD-L2에 대한 결합의 50% 억제에 요구되는 항체 농도를 나타낸다.

본질적으로 기재된 바와 같이 수행된 실험에서, 항체 D는 PD-1의 PD-L1과의 상호작용을 0.30 nM의 IC50으로, PD-1의 PD-L2와의 상호작용을 0.34 nM의 IC50으로 차단한다.

표 6: 인간 PD-1의 Elisa 차단 검정

CHO 세포에서의 인간 PD-1에 대한 결합

인간 PD-1에 대한 본 발명의 항체의 결합은 유동 세포측정법 검정에서 측정할 수 있다.

CHO 세포 (0.2 x 10⁶개)를 얼음 상에서 PBS 1% BSA 중에서 30분 동안 200 nM로부터 3.185 pM의 최저 농도로 2배율로 19x 적정된 항체와 인큐베이션한다. 이어서 세포를 3x 세척하고, 얼음 상에서 30분 동안 PBS 1% BSA 중에서 2차 항체 (PE-표지됨, 5 μg/ml의 최종 농도)와 인큐베이션한다 (광으로부터 보호됨). 세포를 3x 세척하고 유동 세포측정법을 통해 분석한다. 유동 세포측정법을 애큐리(Accuri) C6 시스템 (비디 바이오사이언시스(BD Biosciences)) 상에서 수행하고 MFI를 C6 소프트웨어 상에서 계산한다. EC50을 그래프패드(Graphpad) 소프트웨어 상에서 계산한다.

본질적으로 본 검정에 기재된 바와 같이 수행된 실험에서, 항체 G는 용량-의존성 방식으로, 1.756 nM의 EC50 값 (n=1)으로 PD-1에 결합하고 펨브롤리주맙은 1.429 nM의 EC50 값 (n=1)으로 PD-1에 결합한다. 항체 D는 용량-의존성 방식으로, 0.9784 nM의 EC50 값 (n=1)으로, 펨브롤리주맙은 0.9510 nM의 EC50 값 (n=1)으로, 니볼루맙은 0.9675 nM의 EC50 값 (n=1)으로 PD-1에 결합한다. 항체 D 및 항체 G는 이들 조건 하에 니볼루맙 및 펨브롤리주맙과 유사한 EC50으로 인간 PD-1에 결합한다.

CHO 세포에서의 인간 PD-1의 PD-L2에 대한 차단

인간 PD-1의 PD-L1 및 PD-L2에 대한 결합을 차단하는 본 발명의 항체의 능력은 유동 세포측정법에 의해 측정할 수 있다.

CHO 세포 (0.2 x 10⁶개)를 얼음 상에서 PBS 1% BSA 중에서 30분 동안 실험 항체 100 nM과 인큐베이션한다. 이어서 세포를 3X 세척하고, 얼음 상에서 30분 동안 PBS 1% BSA 중에서 NHS-플루오레세인 (프로메가(Promega))과 연결된 PD-L2와 인큐베이션한다 (광으로부터 보호됨). 세포를 3x 세척하고 유동 세포측정법을 통해 분석한다. 유동 세포측정법을 애큐리 C6 시스템 (비디 바이오사이언시스) 상에서 수행하고 평균 형광 강도 (MFI)를 C6 소프트웨어 상에서 계산한다.

본질적으로 본 검정에 기재된 바와 같이 수행된 실험에서, IgG1 포맷이고 효모에서 발현된 항체 D 및 G는 182,959.1의 MFI를 나타내는 대조군 IgG에 비해 각각 24,697.7 및 31,390.5의 MFI를 나타내며 인간 PD-L2-FITC 결합을 차단하였다. 펨브롤리주맙 및 니볼루맙은 각각 46,245.9 및 54,509.8의 MFI로, 항체 D 및 G보다 PD-1에 대한 PD-L2 결합을 더 적게 차단하였다.

표 7: CHO 세포에서의 인간 PD-1의 차단

혼합 림프구 반응

본 발명의 항체에 의한 PD-1 신호의 차단은 T 세포 활성화 동안 억제 신호의 방출을 측정함으로써 평가할 수 있다. 특정 시토카인, 예컨대 IL-2의 수준은 T 세포 증식이 본 발명의 항체로의 처리에 의해 촉진되면 증가할 것으로 예상된다.

웰당 2 x 10⁶개 PBMC를 6 웰 조직 배양 플레이트 또는 T25 조직 배양 플라스크에서 완전 T 세포 배지 중에 플레이팅한다. 세포를 2-3시간 동안 인큐베이션하여, 단핵구를 부착시킨다. 부착이 불충분하면, 무혈청 배지를 사용한다. 미부착된 세포를 신선한 배지 3X가 담긴 플라스크를 부드럽게 와류시킴으로써 제거한다.

미성숙 골수성 DC는 1% AB 혈청, 10 mM HEPES, 50 μM β-Me, IL-4 (1000 U/ml) 및 GM-CSF (1000 U/ml), 또는 각각의 25-50 ng/ml를 함유하는 X-VIVO 15 배지에서 PBMC로부터 단핵구 (1 x 10⁶개 세포/ml)를 배양함으로써 생성한다. 2일 후에 IL-4 및 GM-CSF로 보충된 신선한 배지를 첨가한다. 제5일에, 세포를 동결시키거나 또는 3 x 10⁵개 세포/ml의 세포 밀도로 2일 동안 rTNFa (1000U/ml), IL-1b (5 ng/ml), IL-6 (10ng/ml) 및 1 μM PGE₂를 함유하는 자극 칵테일을 첨가함으로써 성숙을 유도한다.

T 세포 단리를 무훼손 CD4+ T 세포 단리 키트 (인비트로젠(Invitrogen))에서 제조업체의 지침에 따라 수행한다. 1.5 ml 튜브 랙이 장착된 자석을 사용하여 원치 않는 자기 비드 (퀴아젠(QIAGEN))를 제거한다.

100,000-200,000개의 단리된 T 세포를 37℃에서 4-5일 동안 96-둥근 바닥 조직 배양 플레이트에서 200 μl의 총 부피로 10,000-20,000개의 동종 moDC와 혼합한다. 3:1 (세포:비드) 비의 항-CD3/CD28 디나비즈(DynaBeads)를 양성 대조군으로 사용하여 T 세포를 자극하며; 비드는 제조업체의 지침에 따라 제조한다. 시험 항체를 MLR 시작 시에 첨가하고 배양 기간 전반에 걸쳐 인큐베이션한다.

IL-2 및 IFN-γ의 검출을 제조업체의 지침 (이바이오사이언스(eBioscience))에 따라 수행한다. OD 측정값은 멀티스칸(Multiskan) FC 시스템 (써모(Thermo)) 상에서 결정한다.

본질적으로 본 검정에 기재된 바와 같이 수행된 실험에서, 각 농도에서의 항체 D는 니볼루맙 및 펨브롤리주맙보다 더 많이 IL-2를 증가시켰다. 항체 D 및 G는 니볼루맙 및 펨브롤리주맙과 대등하게 IFN-γ를 증가시켰다.

표 8: IL-2 분비 배수 변화 vs. IgG 대조군

표 9: IFN-γ 분비 배수 변화 vs. IgG 대조군

아미노산 및 뉴클레오티드 서열

서열식별번호: 1 (인간 PD-1)

서열식별번호: 2 (항체 A, B, C, D, E, 및 F의 HCDR1)

서열식별번호: 3 (항체 G, H, 및 I의 HCDR1)

서열식별번호: 4 (항체 A, B, 및 C의 HCDR2)

서열식별번호: 5 (항체 D, E, 및 F의 HCDR2)

서열식별번호: 6 (항체 G, H, 및 I의 HCDR2)

서열식별번호: 7 (항체 A, B, 및 C의 HCDR3)

서열식별번호: 8 (항체 D, E, F, G, H, 및 I의 HCDR3)

서열식별번호: 9 (항체 A - 항체 I의 LCDR1)

서열식별번호: 10 (항체 A - 항체 I의 LCDR2)

서열식별번호: 11 (항체 A - 항체 I의 LCDR3)

서열식별번호: 12 (항체 A, B, 및 C의 HCVR)

서열식별번호: 13 (항체 D, E, 및 F의 HCVR)

서열식별번호: 14 (항체 G, H, 및 I의 HCVR)

서열식별번호: 15 (항체 A - 항체 I의 LCVR)

서열식별번호: 16 (항체 A - S228P IgG4의 HC)

서열식별번호: 17 (항체 D - S228P IgG4의 HC)

서열식별번호: 18 (항체 G - S228P IgG4의 HC)

서열식별번호: 19 (항체 B - PAA IgG4 des-Lys의 HC)

서열식별번호: 20 (항체 E - PAA IgG4 des-Lys의 HC)

서열식별번호: 21 (항체 H - PAA IgG4 des-Lys의 HC)

서열식별번호: 22 (항체 A - 항체 I의 LC)

서열식별번호: 23 (항체 C - VK1-12 IgG4의 HC)

서열식별번호: 24 (항체 F - VK1-12 IgG4의 HC)

서열식별번호: 25 (항체 I - VK1-12 IgG4의 HC)

서열식별번호: 26 (항체 A - S228P IgG4의 HC의 DNA)

서열식별번호: 27 (항체 D - S228P IgG4의 HC의 DNA)

서열식별번호: 28 (항체 G - S228P IgG4의 HC의 DNA)

서열식별번호: 29 (항체 E - PAA IgG4 des-Lys의 HC의 DNA)

서열식별번호: 30 (항체 A - 항체 I의 LC의 DNA)

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ccaacaaggg cctgcctagc agcatcgaga agaccatctc caaagccaag 1020 ggccagccca gggagcccca ggtttatact ctgccccctt cccaggagga gatgaccaag 1080 aatcaggtgt ccctgacctg cctggtgaaa ggcttttacc cctccgacat cgctgtggag 1140 tgggagagca atggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccccgt gctggatagc 1200 gatggcagct tcttcctcta cagcaggctg accgtggata agagcaggtg gcaggagggc 1260 aacgtgtttt cctgctccgt gatgcatgag gccctccaca accattacac acagaaaagc 1320 ctgagcctga gcctgggcaa gtgatga 1347 <210> 27 <211> 1347 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 27 caagtgcagc tggtgcagtc cggcgctgag gtgaaaaaac ccggatcctc cgtcaaggtg 60 tcctgtaaag ccagcggcgg cacattcagc agctacgcca tctcctgggt gaggcaagct 120 cctggacagg gcctggaatg gatgggcctg atcatcccca tgttcgacac cgccggctac 180 gctcagaaat tccagggccg ggtcgccatt acagtggatg agagcaccag cacagcctac 240 atggagctca gctccctgag gagcgaagat accgccgtct actattgtgc ccgggctgag 300 catagcagca ccggcacctt cgactattgg ggccagggaa ccctggtcac agtgagctcc 360 gcttccacaa aaggccccag cgtgtttccc ctggcccctt gtagcaggtc cacctccgaa 420 agcacagccg ctctgggctg cctggtcaag gattacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480 tggaatagcg gcgctctcac atccggagtg catacctttc ctgccgtgct ccagtcctcc 540 ggcctgtact ccctgagctc cgtggtgacc gtcccttcca gctccctggg caccaagacc 600 tatacctgta acgtggacca caagccctcc aataccaagg tggataagcg ggtcgagtcc 660 aagtacggac ccccttgccc tccttgtcct gctcctgaat tcctcggcgg acctagcgtc 720 tttctcttcc cccccaagcc caaggatacc ctgatgatct ccaggacccc cgaggtgaca 780 tgcgtcgtgg tcgatgtgtc ccaggaggat cctgaagtgc agttcaactg gtacgtggac 840 ggcgtcgaag tgcataacgc caagaccaag cccagggagg agcagttcaa ctccacctat 900 cgggtggtga gcgtgctgac cgtgctgcat caggactggc tcaacggcaa agagtacaag 960 tgcaaggtct ccaacaaggg actcccctcc agcatcgaga agaccattag caaggccaaa 1020 ggccaaccca gggagcctca ggtatatacg ctgcccccca gccaggagga gatgaccaaa 1080 aaccaggtca gcctcacctg tctggtcaag ggcttctacc ctagcgacat tgctgtcgag 1140 tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tataaaacca ccccccctgt cctggactcc 1200 gacggatcct tcttcctgta ctccaggctg acagtcgaca agtcccggtg gcaagaggga 1260 aacgtcttct cctgctccgt gatgcacgaa gctctccaca accactacac ccagaagagc 1320 ctcagcctgt ccctgggcaa atgatga 1347 <210> 28 <211> 1347 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 28 caagtccagc tcgtgcaaag cggagccgag gtgaagaaac ccggcagctc cgtgcgggtg 60 agctgtaagg cctccggagg caccctgtcc agctatgcta tcagctgggt gaggcaggcc 120 cccggacagg gcctggaatg gatgggactg atcatcccta tgtttggagc cgccggctat 180 gctcagaggt tccagggccg ggtcaccatc accgctgacg agagcgccag caccgcctat 240 atggagctgt cctccctgag gagcgaggat accgctgtct actactgtgc cagggccgag 300 cactcctcca caggaacctt cgactactgg ggccagggca ccctggtgac agtgtcctcc 360 gcctccacca agggcccttc cgtgtttcct ctggctcctt gctcccggtc caccagcgag 420 tccacagccg ctctgggctg tctggtgaag gactatttcc ccgagcctgt gaccgtcagc 480 tggaatagcg gcgccctgac ctccggagtg cacacattcc ccgccgtcct gcagagcagc 540 ggactctact ccctgagctc cgtggtgacc gtgccttcca gcagcctggg aaccaagacc 600 tacacctgca atgtggacca caaacccagc aacaccaagg tggataagcg ggtggaatcc 660 aagtacggcc ctccctgtcc cccttgtccc gctcccgaat tcctgggcgg acctagcgtg 720 ttcctgtttc cccctaagcc caaggatacc ctgatgatct ccaggacccc cgaagtcacc 780 tgcgtcgtcg tggacgtgtc ccaggaggac cctgaagtcc agtttaattg gtacgtcgac 840 ggcgtggagg tgcacaacgc caagacaaag cctcgggagg agcagttcaa cagcacctac 900 agggtggtga gcgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa agagtacaag 960 tgcaaggtga gcaacaaggg cctgccctcc tccatcgaga agaccatctc caaggccaaa 1020 ggccagccga gggagcccca ggtgtacacc ctgcccccta gccaggagga gatgaccaag 1080 aaccaggtct ccctgacctg cctggtgaag ggattctatc ccagcgacat tgccgtggag 1140 tgggagtcca acggccagcc cgagaataac tacaagacca ccccccctgt gctggacagc 1200 gacgggagct tcttcctgta ttcccggctg accgtcgaca agtcccggtg gcaggagggc 1260 aacgtgttta gctgcagcgt gatgcacgaa gccctccaca accactatac ccagaagagc 1320 ctgtccctgt ccctgggcaa gtgatga 1347 <210> 29 <211> 1338 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 29 caggtgcagc tggtccagtc aggggctgaa gtgaagaagc ccggcagctc cgtgaaggtg 60 tcttgcaagg ccagcggcgg aacattctcc agttacgcca tctcttgggt gcggcaggct 120 ccaggccagg gcctggagtg gatgggcctg atcatcccca tgttcgacac cgccgggtat 180 gcccagaagt ttcagggcag agtggcaatc acagtggacg agagcacctc cacagcctac 240 atggagctgt ctagcctgag atccgaggat accgccgtgt attattgtgc ccgggccgaa 300 cacagctcta cagggacttt cgactactgg ggccagggca ccctggtgac agtgtcctct 360 gctagcacca agggcccatc ggtcttcccg ctcgcgccct gctccaggag cacctccgag 420 agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 600 tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 660 aaatatggtc ccccatgccc accctgccca gcacctgagg ccgccggggg accatcagtc 720 ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 780 tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtatgttgat 840 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 900 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 960 tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020 gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaagaaga aatgaccaaa 1080 aaccaagtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 1140 tgggaaagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200 gacggctcct tcttcctcta ctcccgtcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 1260 aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 1320 ctctccctgt ctctgggt 1338 <210> 30 <211> 648 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 30 gacatccaga tgacacagtc ccctagctcc gtgtccgctt ccgtgggaga cagggtgaca 60 atcacatgca gggcttccca gggcatcagc agctggctgg cttggtatca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatcagcgct gctagctccc tgcagtccgg agtgccttcc 180 aggttctccg gctccggaag cggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccaacag gccaaccacc tgcccttcac cttcggcggc 300 ggcaccaagg tggagatcaa gaggaccgtg gccgccccct ccgtgttcat ctttcccccc 360 agcgacgagc agctgaagag cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa caacttctat 420 ccccgggagg ccaaggtgca gtggaaggtc gacaatgccc tgcagagcgg caactcccag 480 gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac tccacctact ccctgagctc caccctgaca 540 ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac acaccagggc 600 ctgagctccc ccgtgaccaa gtccttcaac aggggcgagt gctgatga 648

Claims

경쇄 (LC) 및 중쇄 (HC)를 포함하며, 여기서 경쇄는 각각 아미노산 서열 RASQGISSWLA (서열식별번호: 9), SAASSLQS (서열식별번호: 10), 및 QQANHLPFT (서열식별번호: 11)로 이루어진 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하고, 중쇄는 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하며,
여기서 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 아미노산 서열 KASGGTFSSYAIS (서열식별번호: 2), LIIPMFGTAGYAQKFQG (서열식별번호: 4), 및 ARAEYSSTGTFDY (서열식별번호: 7)로 이루어지거나; 또는
HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 아미노산 서열 KASGGTFSSYAIS (서열식별번호: 2), LIIPMFDTAGYAQKFQG (서열식별번호: 5), 및 ARAEHSSTGTFDY (서열식별번호: 8)로 이루어지거나; 또는
HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 아미노산 서열 KASGGTLSSYAIS (서열식별번호: 3), LIIPMFGAAGYAQRFQG (서열식별번호: 6), 및 ARAEHSSTGTFDY (서열식별번호: 8)로 이루어진 것인, 인간 PD-1 (서열식별번호: 1)에 결합하는 항체.
제1항에 있어서, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3이 각각 아미노산 서열 RASQGISSWLA (서열식별번호: 9), SAASSLQS (서열식별번호: 10), 및 QQANHLPFT (서열식별번호: 11)로 이루어지고, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3이 각각 아미노산 서열 KASGGTFSSYAIS (서열식별번호: 2), LIIPMFGTAGYAQKFQG (서열식별번호: 4), 및 ARAEYSSTGTFDY (서열식별번호: 7)로 이루어진 것인 항체.
제1항에 있어서, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3이 각각 아미노산 서열 RASQGISSWLA (서열식별번호: 9), SAASSLQS (서열식별번호: 10), 및 QQANHLPFT (서열식별번호: 11)로 이루어지고, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3이 각각 아미노산 서열 KASGGTFSSYAIS (서열식별번호: 2), LIIPMFDTAGYAQKFQG (서열식별번호: 5), 및 ARAEHSSTGTFDY (서열식별번호: 8)로 이루어진 것인 항체.
제1항에 있어서, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3이 각각 아미노산 서열 RASQGISSWLA (서열식별번호: 9), SAASSLQS (서열식별번호: 10), 및 QQANHLPFT (서열식별번호: 11)로 이루어지고, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3이 각각 아미노산 서열 KASGGTLSSYAIS (서열식별번호: 3), LIIPMFGAAGYAQRFQG (서열식별번호: 6), 및 ARAEHSSTGTFDY (서열식별번호: 8)로 이루어진 것인 항체.
경쇄 (LC) 및 중쇄 (HC)를 포함하며, 여기서 경쇄는 경쇄 가변 영역 (LCVR)을 포함하고 중쇄는 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함하며, 여기서 LCVR은 서열식별번호: 15에 제시된 아미노산 서열을 갖고, HCVR은 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 또는 서열식별번호: 14에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것인 항체.
제5항에 있어서, LCVR이 서열식별번호: 15에 제시된 아미노산 서열을 갖고, HCVR이 서열식별번호: 12에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것인 항체.
제5항에 있어서, LCVR이 서열식별번호: 15에 제시된 아미노산 서열을 갖고, HCVR이 서열식별번호: 13에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것인 항체.
제5항에 있어서, LCVR이 서열식별번호: 15에 제시된 아미노산 서열을 갖고, HCVR이 서열식별번호: 14에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것인 항체.
제5항에 있어서, LC가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, HC가 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 18, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20, 또는 서열식별번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것인 항체.
제9항에 있어서, LC가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, HC가 서열식별번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것인 항체.
제9항에 있어서, LC가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, HC가 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것인 항체.
제9항에 있어서, LC가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, HC가 서열식별번호: 18에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것인 항체.
제9항에 있어서, LC가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, HC가 서열식별번호: 19에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것인 항체.
제9항에 있어서, LC가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, HC가 서열식별번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것인 항체.
제9항에 있어서, LC가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, HC가 서열식별번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것인 항체.
제9항에 있어서, 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하며, 여기서 각 경쇄는 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 각 중쇄는 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 18, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20, 또는 서열식별번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것인 항체.
제16항에 있어서, 각 경쇄가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 각 중쇄가 서열식별번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것인 항체.
제16항에 있어서, 각 경쇄가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 각 중쇄가 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것인 항체.
제16항에 있어서, 각 경쇄가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 각 중쇄가 서열식별번호: 18에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것인 항체.
제16항에 있어서, 각 경쇄가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 각 중쇄가 서열식별번호: 19에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것인 항체.
제16항에 있어서, 각 경쇄가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 각 중쇄가 서열식별번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것인 항체.
제16항에 있어서, 각 경쇄가 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 각 중쇄가 서열식별번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것인 항체.
제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 중 하나가 경쇄 중 하나와 쇄간 디술피드 결합을 형성하고, 다른 중쇄는 다른 경쇄와 쇄간 디술피드 결합을 형성하고, 중쇄 중 하나가 다른 중쇄와 2개의 쇄간 디술피드 결합을 형성하는 것인 항체.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 글리코실화된 항체.
서열식별번호: 22의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 17 또는 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자를 포함하는 포유동물 세포이며, 여기서 세포는 서열식별번호: 22의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열식별번호: 17 또는 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 항체를 발현할 수 있는 것인 포유동물 세포.
서열식별번호: 22의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열식별번호: 17 또는 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 항체가 발현되도록 하는 조건 하에 제25항의 포유동물 세포를 배양하고, 발현된 항체를 회수하는 것을 포함하는, 상기 항체를 생산하는 방법.
제26항의 방법에 의해 생산되는 항체.
유효량의 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는, 암을 치료하기 위한 제약 조성물.
제28항에 있어서, 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
제28항에 있어서, 암이 흑색종, 폐암, 두경부암, 결장직장암, 췌장암, 위암, 신장암, 방광암, 전립선암, 유방암, 난소암, 또는 간세포성 암종인 제약 조성물.
제28항에 있어서, 1종 이상의 항종양제와 동시, 개별, 또는 순차적 조합으로 사용되는 제약 조성물.
제30항에 있어서, 1종 이상의 항종양제와 동시, 개별, 또는 순차적 조합으로 사용되는 제약 조성물.
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