ES2904586T3

ES2904586T3 - Anticuerpos anti-PD-1

Info

Publication number: ES2904586T3
Application number: ES16834640T
Authority: ES
Inventors: Hemanta Baruah; Cheng Chen; Xiaolin Liu; Andy Tsun; Dechao Yu
Original assignee: Innovent Biologics Suzhou Co Ltd
Current assignee: Innovent Biologics Suzhou Co Ltd
Priority date: 2015-08-10
Filing date: 2016-08-09
Publication date: 2022-04-05
Anticipated expiration: 2036-08-09
Also published as: CY1124955T1; RS62897B1; TWI674275B; EP3334824A4; HUE058273T2; WO2017025016A1; AU2016307002B2; JP6513296B2; CA2990492A1; KR20180030580A; HRP20220111T1; RU2686612C1; MY199019A; LT3334824T; AU2016307002A1; TW201713698A; AR105489A1; CN110003339B; JP2018531986A; CN110003339A

Abstract

Un anticuerpo que se une a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), que comprende una cadena ligera (LC) y una cadena pesada (HC), en donde la cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) y la cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (HCVR), en donde: (1) la LCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 15, y la HCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 12; o (2) la LCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 15, y la HCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 13; o (3) la LCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 15, y la HCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 14.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-PD-1

La presente invención se refiere al campo de la medicina. Más particularmente, la presente invención se refiere a anticuerpos que se unen a la muerte celular programada humana 1 (PD-1) y pueden ser útiles para tratar el cáncer solos y en combinación con quimioterapia y otras terapias contra el cáncer.

Las células tumorales escapan a la detección y eliminación por parte del sistema inmunitario a través de múltiples mecanismos. Las vías de los puntos de control inmunitarios se utilizan en el mantenimiento de la auto-tolerancia y el control de las células T activadas, pero las células cancerosas pueden utilizar las vías para evitar la destrucción. La vía del ligando 1 de PD-1/muerte celular programada humana 1 (PD-L1) es uno de esos puntos de control inmunitarios. PD-1 humana se encuentra en las células T, y la unión de PD-L1 y el ligando 2 de muerte celular programada humana 1 (PD-L2) a PD-1 inhibe la proliferación de células T y la producción de citoquinas. Por lo tanto, la producción de células tumorales de PD-L1 y PD-L2 puede permitir escapar de la vigilancia de las células T.

Un anticuerpo IgG4 completamente humano (S228P) contra PD-1 humana, nivolumab, ha demostrado inhibir la unión de PD-1 a PD-L1 y PD-L2, y ha sido testado en diversos ensayos clínicos. (Documento WO2012/135408; Wang et al., Cancer Immunol Res (2014) 2(9):846). Se ha demostrado que un anticuerpo IgG4 humanizado (S228P) contra PD-1, pembrolizumab (anteriormente lambrolizumab), inhibe la unión de PD-1 a PD-L1 y PD-L2, y ha sido testado en diversos ensayos clínicos. (Documentos WO2008156712 , WO2013/019906 y Hamid et al., N Engl J Med (2013) 369:2).

Sigue existiendo la necesidad de proporcionar anticuerpos alternativos que se unan y neutralicen la interacción de PD-1 humana con PD-L1 y PD-L2. En particular, sigue existiendo la necesidad de proporcionar anticuerpos que se unan a PD-1 humana con mayor afinidad que determinados anticuerpos de la técnica anterior. También, sigue existiendo la necesidad de proporcionar anticuerpos que bloqueen más eficazmente la interacción de PD-1 humana con PD-L1 y PD-L2 que determinados anticuerpos de la técnica anterior. Una mayor afinidad y un mejor bloqueo, solos o juntos, pueden traducirse en una mayor actividad in vivo o en cantidades de dosificación requeridas más bajas.

Determinados anticuerpos de la presente invención se unen a PD-1 humana con mayor afinidad que nivolumab y pembrolizumab. Además, determinados anticuerpos de la presente invención median en la alorreactividad potenciada preferencial en comparación con nivolumab y pembrolizumab en un modelo in vivo.

En esta memoria se describe un anticuerpo que se une a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), que comprende una cadena ligera (LC) y una cadena pesada (HC), en donde la cadena ligera comprende regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera LCDR1, LCDR2 y LCDR3 que consisten en las secuencias de aminoácidos RASQGISSWLA (SEQ ID NO: 9), SAASSLQS (SEQ ID NO: 10) y QQANHLPFT (SEQ ID NO: 11), respectivamente, y en donde la cadena pesada comprende regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada HCDR1, HCDR2 y HCDR3, en donde HCDR1 consiste en las secuencias de aminoácidos KASGGTFSSYAIS (SEQ ID NO: ²) o KASGGTLSSYAIS (SEQ ID NO: 3), en donde HCDR2 consiste en las secuencias de aminoácidos LIIPMFGTAGYAQKFQG (SEQ ID NO: 4), LIIPMFDTAGYAQKFQG (SEQ ID NO: 5) o LIIPMFGAAGYAQRFQG (SEQ ID NO: 6), y en donde HCDR3 consiste en las secuencias de aminoácidos ARAEYSSTGTFDY (SEQ ID NO: 7) o ARAEHSSTGTFDY (SEQ ID NO: 8).

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un anticuerpo que comprende una cadena ligera (LC) y una cadena pesada (HC), en donde la cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) y la cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (HCVR), en donde la LCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 15 y la HCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14.

En realizaciones adicionales, la presente invención proporciona un anticuerpo, en donde la LCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 15, y la HCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 12. En realizaciones adicionales, la presente invención proporciona un anticuerpo, en donde la LCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 15, y la HCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 13. En realizaciones adicionales, la presente invención proporciona un anticuerpo, en donde la LCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 15, y la HCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 14.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un anticuerpo, en donde la LC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 21.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo, en donde la LC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 16. En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo, en donde la LC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 17. En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo, en donde la LC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 18. En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo, en donde la LC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 19. En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo, en donde la LC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 20 En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo, en donde la LC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 21.

En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo, en donde la LC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 23. En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo, en donde la LC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 24. En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo, en donde la LC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 25.

En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo, que comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, en donde cada una de las cadenas ligeras tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y cada una de las cadenas pesadas tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 21.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo, en donde cada una de las cadenas ligeras tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y cada una de las cadenas pesadas tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 16. En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo, en donde cada una de las cadenas ligeras tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y cada una de las cadenas pesadas tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 17. En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo, en donde cada una de las cadenas ligeras tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y cada una de las cadenas pesadas tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 18. En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo, en donde cada una de las cadenas ligeras tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y cada una de las cadenas pesadas tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 19. En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo, en donde cada una de las cadenas ligeras tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y cada una de las cadenas pesadas tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 20. En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo, en donde cada una de las cadenas ligeras tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y cada una de las cadenas pesadas tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 21.

En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo, que comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, en donde cada una de las cadenas ligeras tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y cada una de las cadenas pesadas tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 23. En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo que comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, en donde cada una de las cadenas ligeras tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y cada una de las cadenas pesadas tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 24. En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo que comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, en donde cada una de las cadenas ligeras tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y cada una de las cadenas pesadas tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 25.

En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo, en donde cada una de las cadenas pesadas forma un enlace disulfuro entre cadenas con una de las cadenas ligeras, y la otra cadena pesada forma un enlace disulfuro entre cadenas con la otra cadena ligera. y una de las cadenas pesadas forma dos enlaces disulfuro entre cadenas con la otra cadena pesada.

En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo, en donde el anticuerpo está glicosilado.

En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), que comprende una cadena ligera (LC) y una cadena pesada (HC), en donde la cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) y la cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (HCVR), en donde la LCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 15, y la HCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 12 , SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), en donde la LCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 15, y la HCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 12. En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), en donde la LCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 15, y la HCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 13. En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), en donde la LCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 15, y la HCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 14.

En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), en donde la LC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 21.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), en donde la LC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 16. En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), en donde la LC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22 , y la HC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 17. En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), en donde la LC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 18. En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), en donde la LC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 19. En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), en donde la LC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 20. En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), en donde la LC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 21.

En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), en donde la LC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 23. En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), en donde la LC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 24. En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), en donde la LC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 25.

En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), que comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, en donde cada una de las cadenas ligeras tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO : 22, y cada una de las cadenas pesadas tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 21.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), en donde cada una de las cadenas ligeras tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y cada una de las cadenas pesadas tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 16. En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), en donde cada una de las cadenas ligeras tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y cada una de las cadenas pesadas tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 17. En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), en donde cada una de las cadenas ligeras tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y cada una de las cadenas pesadas tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 18. En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), en donde cada una de las cadenas ligeras tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y cada una de las cadenas pesadas tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 19. En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), en donde cada una de las cadenas ligeras tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y cada una de las cadenas pesadas tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 20. En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), en donde cada una de las cadenas ligeras tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y cada una de las cadenas pesadas tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 21.

En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), que comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, en donde cada una de las cadenas ligeras tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y cada una de las cadenas pesadas tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 23. En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), que comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, en donde cada una de las cadenas ligeras tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y cada una de las cadenas pesadas tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 24. En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), que comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, en donde cada una de las cadenas ligeras tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y cada una de las cadenas pesadas tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 25.

En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), en donde una de las cadenas pesadas forma un enlace disulfuro entre cadenas con una de las cadenas ligeras, y la otra cadena pesada forma un enlace disulfuro entre cadenas con la otra cadena ligera, y una de las cadenas pesadas forma dos enlaces disulfuro entre cadenas con la otra cadena pesada.

En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), en donde el anticuerpo está glicosilado.

En una realización, la presente invención proporciona una célula de mamífero, que comprende una molécula de ADN que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 y una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 19, en donde la célula es capaz de expresar un anticuerpo que comprende una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ Id NO: 22 y una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 19.

En una realización, la presente invención proporciona una célula de mamífero, que comprende una molécula de ADN que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 y una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 20, en donde la célula es capaz de expresar un anticuerpo que comprende una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 y una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 20.

En una realización, la presente invención proporciona una célula de mamífero, que comprende una molécula de ADN que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 y una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 21, en donde la célula es capaz de expresar un anticuerpo que comprende una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 y una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 21.

En una realización, la presente invención proporciona un procedimiento para producir un anticuerpo que comprende una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 y una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 19, que comprende cultivar una célula de mamífero de la presente invención en condiciones tales que se expresa el anticuerpo, y recuperar el anticuerpo expresado.

En una realización, la presente invención proporciona un procedimiento para producir un anticuerpo que comprende una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 y una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 20, que comprende cultivar una célula de mamífero de la presente invención en condiciones tales que se expresa el anticuerpo, y recuperar el anticuerpo expresado.

En una realización, la presente invención proporciona un procedimiento para producir un anticuerpo, que comprende una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 y una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 21, que comprende cultivar una célula de mamífero de la presente invención en condiciones tales que se expresa el anticuerpo, y recuperar el anticuerpo expresado.

En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo producido por un procedimiento de la presente invención.

En una realización, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la presente invención, y un soporte, diluyente o excipiente aceptable.

En una realización, la presente invención proporciona un método de tratar el cáncer, que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un anticuerpo de la presente invención. En una realización adicional, la presente invención proporciona un método de tratar el cáncer, que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un anticuerpo de la presente invención, en donde el cáncer es melanoma, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer gástrico, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de ovario o carcinoma hepatocelular.

En una realización adicional, estos métodos comprenden la administración de una cantidad eficaz del anticuerpo de la presente invención en combinación simultánea, separada o secuencial con uno o más agentes antitumorales. Ejemplos no limitantes de agentes antitumorales incluyen ramucirumab, necitumumab, olaratumab, galunisertib, abemaciclib, cisplatino, carboplatino, dacarbazina, doxorrubicina liposomal, docetaxel, ciclofosfamida y doxorrubicina, navelbina, eribulina, paclitaxel, partículas unidas a proteínas de paclitaxel para la suspensión inyectable, ixabepilona, capecitabina, FOLFOX (leucovorina, fluorouracilo y oxaliplatino), FOLFIRI (leucovorina, fluorouracilo e irinotecán) y cetuximab.

En una realización adicional, estos métodos comprenden la administración de una cantidad eficaz del compuesto de la presente invención en combinación simultánea, separada o secuencial con uno o más agentes inmuno-oncológicos. Ejemplos no limitantes de agentes inmuno-oncológicos incluyen nivolumab, ipilimumab, pidilizumab, pembrolizumab, tremelimumab, urelumab, lirilumab, atezolizumab y durvalumab.

En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo de la presente invención para uso en terapia. En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo de la presente invención para uso en el tratamiento del cáncer. En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo de la presente invención para uso en el tratamiento del cáncer, en donde el cáncer es melanoma, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer gástrico, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de ovario o carcinoma hepatocelular. En una realización adicional, la presente invención proporciona el anticuerpo de la presente invención para uso en combinación simultánea, separada o secuencial con uno o más agentes antitumorales. En una realización adicional, la presente invención proporciona el anticuerpo de la presente invención para uso en combinación simultánea, separada o secuencial con uno o más agentes antitumorales seleccionados del grupo que consiste en ramucirumab, necitumumab, olaratumab, galunisertib, abemaciclib, cisplatino, carboplatino, dacarbazina, doxorrubicina liposomal, docetaxel, ciclofosfamida y doxorrubicina, navelbina, eribulina, paclitaxel, partículas unidas a proteínas de paclitaxel para suspensión inyectable, ixabepilona, capecitabina, FOLFOX (leucovorina, fluorouracilo y oxaliplatino), FOLFIRI (leucovorina, fluorouracilo e irinotecán), y cetuximab, en el tratamiento del cáncer.

En una realización adicional, la presente invención proporciona el anticuerpo de la presente invención para uso en combinación simultánea, separada o secuencial con uno o más agentes inmuno-oncológicos. En una realización adicional, la presente invención proporciona el anticuerpo de la presente invención para uso en combinación simultánea, separada o secuencial con uno o más agentes inmuno-oncológicos seleccionados del grupo que consiste en nivolumab, ipilimumab, pidilizumab, pembrolizumab, tremelimumab, urelumab , lirilumab, atezolizumab y durvalumab en el tratamiento del cáncer.

En una realización adicional, la presente invención proporciona el uso de un anticuerpo de la presente invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer. En una realización adicional, la presente invención proporciona el uso de un anticuerpo de la presente invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer, en donde el cáncer es melanoma, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer gástrico, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de ovario o carcinoma hepatocelular.

En una realización adicional, la presente invención proporciona el uso de un anticuerpo de la presente invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer, en donde dicho medicamento debe administrarse simultáneamente, por separado o secuencialmente con uno o más agentes antitumorales. En una realización adicional, la presente invención proporciona el uso de un anticuerpo de la presente invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer, en donde dicho medicamento debe administrarse simultáneamente, por separado o secuencialmente con uno o más agentes antitumorales. seleccionados del grupo que consiste en ramucirumab, necitumumab, olaratumab, galunisertib, abemaciclib, cisplatino, carboplatino, dacarbazina, doxorrubicina liposomal, docetaxel, ciclofosfamida y doxorrubicina, navelbina, eribulina, paclitaxel, partículas unidas a proteínas de paclitaxel para suspensión inyectable, ixabepilona, capecitabina, FOLFOX (leucovorina, fluorouracilo y oxaliplatino), FOLFIRI (leucovorina, fluorouracilo e irinotecán) y cetuximab.

Un anticuerpo de la presente invención es un complejo polipeptídico modificado, que no se produce de forma natural. Una molécula de ADN de la presente invención es una molécula de ADN que no se produce de forma natural que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de uno de los polipéptidos en un anticuerpo de la presente invención.

Un anticuerpo de la presente invención está diseñado para tener CDRs modificadas y para tener algunas porciones del anticuerpo (todas o partes de los marcos, regiones bisagra y regiones constantes) para que sean de origen humano que son idénticas o sustancialmente idénticas (sustancialmente humanas) con marcos y regiones constantes derivadas de secuencias genómicas humanas. Marcos completamente humanos, regiones bisagra y regiones constantes son aquellas secuencias de la línea germinal humana, así como secuencias con mutaciones somáticas que se producen de forma natural y aquellas con mutaciones modificadas. Un anticuerpo de la presente invención puede comprender regiones de marco, bisagra o constantes derivadas de una región de marco, bisagra o constante completamente humana que contiene una o más sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en la misma. Además, preferiblemente un anticuerpo de la presente invención es sustancialmente no inmunogénico en seres humanos.

El anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo de tipo IgG y tiene cadenas "pesadas" y cadenas "ligeras" que están reticuladas mediante enlaces disulfuro entre- e intra-cadenas. Cada una de las cadenas pesadas está compuesta por un HCVR N-terminal y una región constante de la cadena pesada ("HCCR"). Cada una de las cadenas ligeras está compuesta por una LCVR y una región constante de la cadena ligera ("LCCR"). Cuando se expresan en determinados sistemas biológicos, los anticuerpos que tienen secuencias Fc humanas nativas se glicosilan en la región Fc. Típicamente, la glicosilación se produce en la región Fc del anticuerpo en un sitio de N-glicosilación altamente conservado. Los N-glicanos se adhieren típicamente a asparagina. Los anticuerpos también se pueden glicosilar en otras posiciones.

Opcionalmente, el anticuerpo de la presente invención contiene una porción Fc que se deriva de la región Fc de IgG4 humana, debido a una capacidad reducida de participar en mecanismos inflamatorios mediados por el receptor Fc o de activar el complemento que resulta en una función efectora reducida.

Determinados anticuerpos de la presente invención contienen una porción Fc de IgG4 que tiene una mutación de serina a prolina en la posición 228. Además, determinados anticuerpos de la presente invención contienen una porción Fc de IgG4-PAA. La porción Fc de IgG4-PAA tiene una mutación de serina a prolina en la posición 228, una mutación de fenilalanina a alanina en la posición 234 y una mutación de leucina a alanina en la posición 235. La mutación S228P es una mutación bisagra que impide la formación de la mitad del anticuerpo (fenómeno de intercambio dinámico de semi-moléculas en anticuerpos IgG⁴). Las mutaciones F234A y L235A reducen adicionalmente la función efectora del isotipo IgG4 humano ya bajo. Además, determinados anticuerpos de la presente invención contienen una porción Fc de IgG4-PAA con la lisina C-terminal eliminada (des-Lys) de la cadena pesada.

Las regiones HCVR y LCVR pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hiper-variabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad ("CDRs"), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco ("FR"). Cada una de las HCVR y LCVR se compone de tres CDRs y cuatro FRs, dispuestos desde el extremo amino hasta el extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. En esta memoria, a las tres CDRs de la cadena pesada se las alude como "HCDR1, HCDR2 y h Cd R3" y a las tres CDRs de la cadena ligera se las alude como "LCDR1, LCDR2 y LCDR3". Las CDRs contienen la mayoría de los residuos que forman interacciones específicas con el antígeno. Actualmente existen tres sistemas de asignaciones de CDR para anticuerpos que se utilizan para la delimitación de secuencias. La definición de CDR de Kabat (Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Md (1991)) se basa en la variabilidad de la secuencia de anticuerpos. La definición de CDR de Chothia (Chothia et al., "Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins", Journal of Molecular Biology, 196, 901-917 (1987); Al-Lazikani et al., "Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins", Journal of Molecular Biology, 273, 927-948 (1997)) se basa en estructuras tridimensionales de anticuerpos y topologías de los bucles de CDR. Las definiciones de CDR de Chothia son idénticas a las definiciones de CDR de Kabat, con la excepción de HCDR1 y HCDR2. La definición de CDR de North (North et al., "A New Clustering of Antibody c Dr Loop Conformations", Journal of Molecular Biology, 406, 228-256 (2011)) se basa en la agrupación de propagación por afinidad con un gran número de estructuras cristalinas. Para los fines de la presente invención, se utilizan las definiciones de CDR de North.

Un ADN aislado que codifica una región HCVR puede ser convertido en un gen de la cadena pesada de longitud completa enlazando operativamente el ADN que codifica la HCVR a otra molécula de ADN que codifica regiones constantes de la cadena pesada. Las secuencias de los genes de la región constante de la cadena pesada humana, así como de otros mamíferos, son conocidas en la técnica. Fragmentos de ADN que abarcan estas regiones se pueden obtener, p. ej., mediante amplificación por PCR estándar.

Un ADN aislado que codifica una región LCVR puede ser convertido en un gen de la cadena ligera de longitud completa enlazando operativamente el ADN que codifica la LCVR a otra molécula de ADN que codifica una región constante de la cadena ligera. Las secuencias de los genes de la región constante de la cadena ligera humana, así como de otros mamíferos, son conocidas en la técnica. Fragmentos de ADN que abarcan estas regiones se pueden obtener mediante amplificación por PCR estándar. La región constante de la cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda.

Los polinucleótidos de la presente invención se expresarán en una célula huésped después de que las secuencias se hayan enlazado de forma operativa a una secuencia de control de la expresión. Los vectores de expresión son típicamente replicables en los organismos huéspedes como episomas o como una parte integral del ADN cromosómico del huésped. Comúnmente, los vectores de expresión contendrán marcadores de selección, p. ej., tetraciclina, neomicina y dihidrofolato reductasa, para permitir la detección de las células transformadas con las secuencias de ADN deseadas.

El anticuerpo de la presente invención se puede producir fácilmente en células de mamífero, tales como células CHO, NS0, HEK293 o COS. Las células huésped se cultivan utilizando técnicas bien conocidas en la técnica.

Los vectores que contienen las secuencias de polinucleótidos de interés (p. ej., los polinucleótidos que codifican los polipéptidos de las secuencias de anticuerpos y control de la expresión) pueden transferirse a la célula huésped mediante métodos bien conocidos, que varían dependiendo del tipo de huésped celular.

Se pueden emplear diversos métodos de purificación de proteínas y métodos de este tipo son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-89 (1990) y Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 3a Edición, Springer, Nueva York (1994).

En otra realización de la presente invención, el anticuerpo o los ácidos nucleicos que codifica el mismo, se proporcionan en forma aislada. Tal como se utiliza en esta memoria, el término "aislado" se refiere a una proteína, péptido o ácido nucleico que está libre o sustancialmente libre de cualquier otra especie macromolecular que se encuentre en un entorno celular. "Sustancialmente libre", tal como se utiliza en esta memoria, significa que la proteína, el péptido o el ácido nucleico de interés comprende más del 80 % (sobre una base molar) de las especies macromoleculares presentes, preferiblemente más del 90 % y más preferiblemente más del 95 %.

El anticuerpo de la presente invención, o composiciones farmacéuticas que comprenden el mismo, se puede administrar por vías parenterales (p. ej., subcutánea e intravenosa). Un anticuerpo de la presente invención se puede administrar a un paciente solo con soportes, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables en dosis únicas o múltiples. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden preparar mediante métodos bien conocidos en la técnica (p. ej., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a ed. (1995), A. Gennaro et al., Mack Publishing Co.) y comprenden un anticuerpo, tal como se describe en esta memoria, y uno o más soportes, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables.

El término "tratando" (o "tratar" o "tratamiento") se refiere a ralentizar, interrumpir, detener, aliviar, detener, reducir o revertir la progresión o gravedad de un síntoma, trastorno, afección o enfermedad existente.

"Se une", tal como se utiliza en esta memoria en referencia a la afinidad de un anticuerpo por PD-1 humana, significa, a menos que se indique lo contrario, una K^dde menos de aproximadamente 1 x 10-6 M, preferiblemente, menos de aproximadamente 1 x 10-9 M según se determina por métodos comunes conocidos en la técnica, incluyendo el uso de un biosensor de resonancia de plasmón de superficie (SPR) a 37 °C esencialmente como se describe en esta memoria.

Para los fines de la presente descripción, la expresión "alta afinidad" se refiere a una K^dmenor que aproximadamente 150 pM para PD-1 humana según se determina por MSD o SPR. Los valores de K^dse establecen mediante la cinética de unión tal como se describe en "Binding kinetics and affinity " en la sección de Ensayos.

"Cantidad efectiva" significa la cantidad de un anticuerpo de la presente invención o composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la presente invención que provocará la respuesta biológica o médica o el efecto terapéutico deseado en un tejido, sistema, animal, mamífero o ser humano que está siendo buscado por el investigador, médico u otro terapeuta. Una cantidad eficaz del anticuerpo puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo de provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad eficaz también es aquella en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo se ve compensado por los efectos terapéuticamente beneficiosos.

Esta invención se ilustra adicionalmente mediante el siguiente ejemplo no limitativo.

Ejemplo 1: Expresión y purificación de anticuerpos

Los polipéptidos de las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera, las secuencias completas de aminoácidos de la cadena pesada y de la cadena ligera del Anticuerpo A - Anticuerpo I, y las secuencias de nucleótidos que las codifican, se enumeran más adelante en la sección titulada "Secuencias de Aminoácidos y Nucleótidos". Además, los SEQ ID NOs para la cadena ligera, la cadena pesada, la región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada del Anticuerpo A - Anticuerpo I se muestran en la Tabla 1.

Los anticuerpos de la presente invención, incluyendo, pero no limitados a Anticuerpo A - Anticuerpo I se pueden preparar y purificar esencialmente como sigue. Una célula huésped adecuada, tal como HEK 293 o CHO, se puede transfectar de forma transitoria o estable con un sistema de expresión para secretar anticuerpos utilizando una relación de vector HC:LC predeterminada óptima o un sistema de vector único que codifica tanto HC como LC. Los medios clarificados, en los que se ha secretado el anticuerpo, se pueden purificar utilizando cualquiera de las muchas técnicas comúnmente utilizadas. Por ejemplo, el medio se puede aplicar convenientemente a una columna MabSelect (GE Healthcare) o una columna KappaSelect (GE Healthcare) para el fragmento Fab, que ha sido equilibrado con un tampón compatible, tal como una solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4). La columna se puede lavar para eliminar los componentes de unión no específicos. El anticuerpo unido se puede eluir, por ejemplo, por gradiente de pH (tal como tampón Tris 20 mM pH 7 a tampón citrato de sodio 10 mM pH 3,0, o solución salina tamponada con fosfato pH 7,4 a tampón glicina 100 mM pH 3,0). Las fracciones de anticuerpos pueden detectarse, tal como mediante SDS-PAGE, y luego pueden agruparse. La purificación adicional es opcional, dependiendo del uso previsto. El anticuerpo se puede concentrar y/o esterilizar por filtración utilizando técnicas comunes. Agregados solubles y multímeros se pueden eliminar de manera efectiva mediante técnicas comunes, que incluyen exclusión por tamaño, interacción hidrófoba, intercambio iónico, multimodal o cromatografía de hidroxiapatita. La pureza del anticuerpo después de estas etapas de cromatografía es superior al 95 %. El producto se puede congelar inmediatamente a -70°C o se puede liofilizar.

Tabla 1: SEQ ID NOs

Ensayos

Actividad in vivo - ensayo de WINN

Los anticuerpos de la presente invención se pueden medir para la actividad inmunomoduladora in vivo con el ensayo de Winn. En el ensayo de Winn, células tumorales humanas y células inmunitarias humanas (alogénicas) se inyectan juntas en un ratón inmunodeficiente y luego se administra una dosis con un agente inmunomodulador. Se mide el volumen del tumor para determinar el efecto del agente en el ensayo.

La potenciación de la respuesta inmunitaria a los alo-antígenos mediante anticuerpos de la presente invención se puede testar en el modelo de xenoinjerto de NSCLC humano NCI-H292. El día 0, a ratones NSG de Jackson Laboratories (7 semanas de edad, hembras, en grupos de 8-10 ratones) se les implantan en el flanco por vía subcutánea 2 x106 células H292, o una mezcla de 2 x106 células H292 y 1 x 106 PBMCs humanas en HBSS (0,2 ml de volumen total). Comenzando el Día 1, los ratones se tratan con una inyección i.p. de IgG humana a razón de 10 mg/kg, una vez por semana. El bienestar y el comportamiento de los animales, incluyendo el aseo y la deambulación, se controlan al menos dos veces por semana. El peso corporal y el volumen del tumor se miden dos veces por semana.

En experimentos llevados a cabo esencialmente como se describe en este ensayo, Anticuerpo A o Anticuerpo D dosificado a razón de 10 mg/kg, una vez a la semana, ip son bien tolerados y seguros como se controla por el peso corporal y observaciones clínicas. Los resultados del crecimiento del tumor y T/C % se muestran en la Tabla 2. Los tumores en ratones co-implantados con NCI-H292 y PBMC y dosificados con Anticuerpo A o Anticuerpo D a razón de 10 mg/kg, una vez a la semana, crecieron de forma significativamente más lenta y retrocedieron con el tiempo. En estas condiciones, Anticuerpo A y Anticuerpo D median en la alorreactividad preferencial potenciada en comparación con nivolumab y pembrolizumab.

Tabla 2: ensayo de WINN

Cinética de unión y afinidad

La constante cinética y equilibrio de disociación (K d ) para PD-1 humano se determina para anticuerpos de la presente invención utilizando MSD, de plasmón de superficie de resonancia (Biacore), y bio-capa de la interferometría (ForteBio) métodos de ensayo.

Tal como se utiliza en esta memoria, nivolumab es un anticuerpo IgG4 PD-1 humano expresado transitoriamente por la solicitante en células 293 HEK que utiliza las secuencias de la cadena pesada y la cadena ligera de la INN propuesta: Lista 107 (n° CAS 946414-94-4). Tal como se utiliza en esta memoria, pembrolizumab es un anticuerpo IgG4 PD-1 humano expresado transitoriamente por la solicitante en células 293 HEK que utiliza las secuencias de la cadena pesada y la cadena ligera de la INN propuesta: Lista 72.

Ensayo MSD

Las mediciones de afinidad de equilibrio se realizan como se describió previamente (Estep, P., et al., MAbs, 2013.

5(2): p. 270-8). Las titulaciones de equilibrio de la solución (SET) se realizan en PBS BSA al 0,1 % libre de IgG (PBSF), en que el antígeno (monómero b-PD-1) se mantiene constante a 10-100 pM y se incuba con diluciones en serie de 3 a 5 veces de Fab o mAbs a partir de 5-100 nM (las condiciones experimentales dependen de la muestra). Los anticuerpos diluidos a 20 nM en PBS se recubren sobre placas MSD-ECL de unión estándar durante la noche a 4 °C o a temperatura ambiente durante 30 min. Las placas se bloquean con BSA durante 30 min mientras se agitan a 700 rpm. A continuación, las placas se lavan 3 veces con tampón de lavado (PBSF Tween 20 al 0,05 %). Las muestras SET se aplican y se incuban en las placas durante 150 s con agitación a 700 rpm, seguido de un lavado. El antígeno capturado en una placa se detecta con 250 ng/mL de estreptavidina marcada con sulfotag en PBSF mediante incubación en la placa durante 3 min. Las placas se lavan tres veces con tampón de lavado y luego se leen en el instrumento MSD Sector Imager 2400 utilizando Tampón de Lectura T 1x con surfactante. El porcentaje de antígeno libre se representa en función del anticuerpo titulado en Prism y se ajusta a una ecuación cuadrática para extraer la KD. Para mejorar el rendimiento, se utilizan robots de manipulación de líquidos en los experimentos MSD-SET, incluyendo la preparación de muestras SET.

En experimentos realizados esencialmente como se describe en este ensayo, Antibodies D y G en un formato de IgG1 y expresado en levadura, se unen a PD-1 humana con una K^dde 12 pM y 14 pM, respectivamente. Pembrolizumab y nivolumab, ambos en un formato IgG1, se unen a PD-1 con una K^dde 130 pM y 640 pM, respectivamente. Las medidas de avidez para los Anticuerpos D y G dan como resultado una K^dde aproximadamente 0,9 pM y 1 pM, respectivamente. Pembrolizumab y nivolumab se unen a PD-1 humana con una K^dde aproximadamente 3 pM y 5 pM, respectivamente.

Tabla 3: Unión por MSD de anticuerpos de la invención en formato IgG1

Interferometría de biocapa

Las mediciones de afinidad ForteBio se llevan a cabo generalmente como se ha descrito previamente (Estep, P., et al, High throughput solution-based measurement of antibody-antigen Affinity and epitope binning MAbs, 2013. 5(2): p 270-8.). Brevemente, las mediciones de afinidad ForteBio se llevan a cabo cargando las IgGs en línea en sensores AHQ. Los sensores se equilibran fuera de línea en tampón de ensayo durante 30 min y luego se controlan en línea durante 60 segundos para el establecimiento del valor de referencia. Los sensores con las IgGs cargadas se exponen a antígeno 100 nM durante 5 min, después de lo cual se transfieren a tampón de ensayo durante 5 min para la medición de la velocidad de desconexión. Las cinéticas se analizan utilizando el modelo de unión 1:1.

Tabla 4: Unión por interferometría de bio-capa de anticuerpos de la invención

En experimentos realizados esencialmente como se describe en este ensayo, los Anticuerpos D y G se unen a PD-1_Fc humana con una K^daproximadamente tres veces a cuatro veces inferior que nivolumab y pembrolizumab cuando PD-1_Fc estaba en la punta del sensor. Cuando el anticuerpo estaba en la punta del sensor, los Anticuerpos D y G se unen a PD-1_Fc humana con una K^daproximadamente cuatro a seis veces menor que nivolumab y pembrolizumab. Los Anticuerpos D y G se unen a cynoPD-1_Fc con una K^dsimilar a nivolumab y pembrolizumab.

Resonancia de plasmón de superficie (SPR)

La inmovilización de PD-1-Fc humana (R&D Systems) como ligando sobre la superficie del chip sensor se realiza a 25 °C. Los anticuerpos de la presente invención se utilizan como analito y se inyectan sobre la superficie del chip sensor inmovilizado de PD-1-Fc humana. Todos los analitos de la muestra se procesan en diluciones en serie de 3 veces desde su concentración de partida (90 nM), 8 diluciones en total con un duplicado en una concentración media y en cero. El análisis se realiza a 37 °C. El tiempo de contacto para cada una de las muestras es de 180 segundos a 30 gl/min. El tiempo de disociación: 300 segundos para 5 concentraciones más bajas y 1200 (Fab), o 2400 (T=0) o 3000 (4 semanas 4 °C, 25 °C, 40 °C) segundos para 3 concentraciones más altas. La superficie inmovilizada se regenera durante 6-8 segundos con SDS al 0,4% a 30 gl/min y luego se estabiliza durante 5 segundos. Las cinéticas de unión se analizaron utilizando el software Biacore T200 Evaluation (versión 3.0). Los datos están referidos a una celda de flujo en blanco, y los datos se ajustan a un modelo de unión 1:1.

En experimentos realizados esencialmente como se describe en este ensayo, el Anticuerpo D se une con una K^da PD-1 humana de 102 pM, nivolumab con una K^dde 246 pM y pembrolizumab con una K^dde 181 pM. Como se muestra en la Tabla 6, Anticuerpo D mantuvo la actividad de unión a las 4 semanas en condiciones de temperatura elevada.

Tabla 5: Unión por SPR del Anticuerpo D a tiempos y temperaturas prolongados

Bloqueo por Elisa de PD-1 humana a PD-L1 y PD-L2.

Para el ensayo de bloqueo de receptor-ligando, se mezclan cantidades variables (de anticuerpo anti-PD-1 o IgG control con una cantidad fija de proteína de fusión PD-1-Fc biotinilada (100 ng/mL) y se incuban a temperatura ambiente durante 1 hora La mezcla se transfiere a placas de 96 pocillos recubiertas previamente con PD-L1-Fc (100 ng/pocillo) o PD-L2-Fc (100 ng/pocillo) y luego se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora adicional. Las placas se lavan y se añade conjugado de estreptavidina HRP. Las placas se leen a una absorbancia de 450 nm. La CI50 representa la concentración de anticuerpo requerida para el 50 % de inhibición de la unión de PD-1 a PD-L1 o de unión a PD-L2.

En experimentos realizados esencialmente como se describe, Anticuerpo D bloquea la interacción de PD-1 con PD-L1 con una CI50 de 0,30 nM, y la interacción de PD-1 con PD-L2 con una CI50 de 0,34 nM.

Tabla 6: Ensayo de Bloqueo Elisa de PD-1 humana

Unión a PD-1 humana en células CHO

La unión de un anticuerpo de la presente invención a PD-1 humana se puede medir en un ensayo de citometría de flujo.

Células CHO (0,2 x 106) se incuban con anticuerpo de título 200 nM 19x por un factor de 2 a la concentración más baja de 3,185 pM durante 30 min en PBS BSA al 1 % en hielo. Las células se lavan a continuación 3 veces y se incuban con un anticuerpo secundario (marcado con PE, a una concentración final de 5 jg/m l) en PBS BSA al 1 % durante 30 min en hielo (protegido de la luz). Las células se lavan 3 veces y se analizan mediante citometría de flujo. La citometría de flujo se realiza en un sistema Accuri C6 (BD Biosciences) y las MFIs se calculan sobre el software C6. Las CE50 se calculan sobre el software GraphPad.

En experimentos realizados esencialmente como se describe en este ensayo, Anticuerpo G se une a PD-1 de una manera dependiente de la dosis, con un valor CE50 (n=1) de 1,756 nM y pembrolizumab se une a PD-1 con un valor CE50 (n =1) de 1,429 nM. Anticuerpo D se une a PD-1 de una manera dependiente de la dosis, con un valor CE50 (n=1) de 0,9784 nM, pembrolizumab con un valor CE50 (n=1) de 0,9510 nM y nivolumab con un valor CE50 (n=1) de 0,9675 nM. Anticuerpo D y Anticuerpo G se unen con una CE50 similar a PD-1 humana como nivolumab y pembrolizumab en estas condiciones.

Bloqueo de PD-1 humana a PD-L2 en células CHO.

La capacidad de un anticuerpo de la presente invención de bloquear la unión de PD-1 humana a PD-L1 y PD-L2 puede ser medida por citometría de flujo.

Células CHO (0,2 x 106) se incuban con el anticuerpo experimental 100 nM durante 30 min en PBS BSA al 1 % en hielo. A continuación, las células se lavan 3 veces y se incuban con PD-L2 enlazado a NHS-fluoresceína (Promega) en PBS BSA al 1 % durante 30 min en hielo (protegido de la luz). Las células se lavan 3 veces y se analizan mediante citometría de flujo. La citometría de flujo se realiza en un sistema Accuri C6 (BD Biosciences) y la intensidad de fluorescencia media (MFI) se calcula en el software C6.

En experimentos realizados esencialmente como se describe en este ensayo, los Anticuerpos D y G en formato IgG1, expresados en levaduras, bloquearon la unión de PD-L2-FITC humana, dando como resultado un MFI de 24.697,7 y 31.390,5, respectivamente en comparación con la IgG control que dio como resultado un MFI de 182.959,1. Pembrolizumab y nivolumab resultaron en un menor bloqueo de la unión de PD-L2 a PD-1 que los Anticuerpos D y G con un MFI de 46.245,9 y 54.509,8, respectivamente.

Tabla 7: Bloqueo de PD-1 humana en células CHO

Reacción de Linfocitos Mixtos

El bloqueo de señales de PD-1 por los anticuerpos de la presente invención se puede evaluar midiendo la liberación de señales inhibidoras durante la activación de células T. Se espera que aumenten los niveles de determinadas citoquinas, tales como IL-2, si se fomenta la proliferación de células T mediante el tratamiento con anticuerpos de la presente invención.

2 x 106 PBMC se siembran por pocillo en una placa de cultivo tisular de 6 pocillos o matraz de cultivo tisular T25 en los medios de células T completos. Las células se incuban durante 2-3 horas para permitir la adherencia de monocitos. Si la adherencia es insuficiente, se utilizan medios sin suero. Las células no fijadas se eliminan agitando suavemente el matraz con medio 3X reciente.

Las DCs mieloides inmaduras se generan cultivando monocitos (1 x 106 células/ml) de PBMC en medio X-VIVO 15 que contiene suero AB al 1 %, HEPES 10 mM, p-Me 50 pM, IL-4 (1000 U/ml) y GM-CSF (1000 U/ml), o 25-50 ng/ml de cada uno. Después de 2 días se añade medio reciente complementado con IL-4 y GM-CSF. El día 5, las células se congelan o se induce la maduración mediante la adición de un cóctel de estimulación que contiene rTNFa (1000 U/ml), IL-1b (5 ng/ml), IL-6 (10 ng/ml) y PGE²1 pM durante 2 días a una densidad celular de 3 x 105 células/ml.

El aislamiento de células T se realiza según las instrucciones del fabricante en el kit de aislamiento de células T CD4+ Untouched (Invitrogen). Se utiliza un imán dotado de una gradilla para tubos de 1,5 ml para eliminar las perlas magnéticas no deseadas (QIAGEN).

100.000-200.000 células T aisladas se mezclan con 10.000-20.000 moDCs alogénicas en un volumen total de 200 pl en placas de cultivo de tejido de fondo redondo de 96 pocillos durante 4-5 días a 37 °C. Las células T se estimulan utilizando DynaBeads anti-CD3/CD28 en una relación de 3:1 (células:esferas) como control positivo; las perlas se preparan de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los anticuerpos de prueba se agregan al comienzo de la MLR y se incuban durante todo el período de cultivo.

La detección de IL-2 e IFN-y se lleva a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (eBioscience). Las mediciones de la DO se determinan en un sistema Multiskan FC (Thermo).

En experimentos llevados a cabo esencialmente como se describe en este ensayo, Anticuerpo D en cada concentración aumentó IL-2 más que nivolumab y pembrolizumab. Anticuerpos D y G dieron como resultado un aumento de I FN-y equiparable al de nivolumab y pembrolizumab.

Tabla 8: Múltiplo de cambio de la secreción de IL-2 frente a IgG control

Tabla 9: Múltiplo de cambio de la secreción de IFN-y frente a IgG control

Secuencias de Aminoácidos y Nucleótidos

SEQ ID NO: 1 (PD-1 humana)

MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFT

CSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFH

MSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPA

GQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVP

VFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYAT1VFPSGMGTSSPARRGSADGPR

SAQPLRPEDGHCSWPL SEQ ID NO: 2 (HCDR1 de Anticuerpo A, B, C, D, E y F)

KASGGTFSSYAIS SEQ ID NO: 3 (HCDR1 de Anticuerpo G, H e I)

KASGGTLSSYAIS SEQ ID NO: 4 (HCDR2 de Anticuerpo A, B y C)

LIIPMFGTAGYAQKFQG

SEQ ID NO: 5 (HCDR2 de Anticuerpo D, E y F)

LIIPMFDTAGYAQKFQG SEQ ID NO: 6 (HCDR2 de Anticuerpo G, H e I)

LIIPMFGAAGYAQRFQG SEQ ID NO: 7 (HCDR3 de Anticuerpo A, B y C)

ARAEYSSTGTFDY SEQ ID NO: 8 (HCDR3 de Anticuerpo D, E, F, G, H e I)

ARAEHSSTGTFDY SEQ ID NO: 9 (LCDR1 de Anticuerpo A - Anticuerpo I)

RASQGISSWLA SEQ ID NO: 10 (LCDR2 de Anticuerpo A - Anticuerpo I)

SAASSLQS SEQ ID NO: 11 (LCDR3 de Anticuerpo A - Anticuerpo I)

QQANHLPFT SEQ ID NO: 12 (HCVR de Anticuerpo A, B y C) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGLIIPM FGTAGYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAEYSSTGTFDY WGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 13 (HCVR de Anticuerpo D, E y F) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGLIIPM FDTAGYAQKFQGRVAITVDESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAEHSSTGTFD YWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 14 (HCVR de Anticuerpo G, H e I) QVQLVQSGAEVKKPGSSVRVSCKASGGTLSSYAISWVRQAPGQGLEWMGLDPM FGAAG Y AQRF QGRVTIT ADES ASTAYMEL S SLRSEDTA V YYC ARAEHS STGTFD YWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 15 (LCVR de Anticuerpo A - Anticuerpo I) DIQMTQSPSSVSASVGDRVTTTCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLISAASSLQS GVPSKFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANHLPFTFGGGTKVEIK SEQ ID NO: 16 (HC de Anticuerpo A - IgG4 S228P) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGLITPM FGTAGYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAEYSSTGTFDY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFP AVLQ S SGLYSLS S VVTVP SS SLGTKT YTCN VDHKPSNTK VDKRVE SKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKG LPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSLGK

SEQ ID NO: 17 (HC de Anticuerpo D - IgG4 S228P)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGLIIPM FDTAGYAQKFQGRVAITVDESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAEHSSTGTFD YWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRV ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQ FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK GLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSLGK

SEQ ID NO: 18 (HC de Anticuerpo G - IgG4 S228P)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVRVSCKASGGTLSSYAISWVRQAPGQGLEWMGLIIPM FGAAGYAQRFQGRVTITADESASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAEHSSTGTFD YWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRV ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSWLFPPKPKDTLMTSRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQ FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK GLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSLGK

SEQ ID NO: 19 (HC de Anticuerpo B - IgG4 des-Lys PAA)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGLITPM FGTAGYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAEYSSTGTFDY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVE SKY GPPCPPCP APE AAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPE VTC V VVD VSQEDPE V QF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKG LPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSLG

SEQ ID NO: 20 (HC de anticuerpo E - IgG4 des-Lys PAA)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGLIIPM FDTAGYAQKFQGRVAITVDESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAEHSSTGTFD YWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRV ESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQ FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK GLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSLG

SEQ ID NO: 21 (HC de anticuerpo H - IgG4 des-Lys PAA)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVRVSCKASGGTLSSYAISWVRQAPGQGLEWMGLIIPM FGAAGYAQRFQGRVTITADESASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAEHSSTGTFD YWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRV ESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQ FNWYVDGVEVFÍNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK GLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSLG

SEQ ID NO: 22 (LC de anticuerpo A - Anticuerpo I)

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTTTCRASQGTSSWLAWYQQKPGKAPKLLISAASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDEATYYCQQANHLPFTFGGGTKVEIKRTVAA PSWIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 23 (HC de anticuerpo C - IgG4 VK1 -12)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGLITPM FGTAGYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAEYSSTGTFDY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVE SKYGPPCPSCPAPEFLGGPSWLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKG LPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSLGK

SEQ ID NO: 24 (HC de anticuerpo F - IgG4 VK1-12)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGLIIPM FDTAGYAQKFQGRVAITVDESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAEHSSTGTFD YWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRV ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSWLFPPKPKDTLMTSRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQ FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK GLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSLGK

SEQ ID NO: 25 (HC de anticuerpo I - IgG4 VK1 -12)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVRVSCKASGGTLSSYAISWVRQAPGQGLEWMGLIIPM FGAAGYAQRFQGRVTITADESASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAEHSSTGTFD YWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRV ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQ FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK GLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTFPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSLGK

SEQ ID NO: 26 (ADN de HC de Anticuerpo A - IgG4 S228P)

CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGCTCCAGCG TGAAGGTGTCCTGCAAAGCCTCCGGCGGCACCTTCAGCTCCTACGCTATCAGC TGGGTGAGGCAGGCTCCTGGCCAGGGACTGGAGTGGATGGGCCTGATCATCC CCATGTTCGGCACCGCTGGCTACGCCCAGAAGTTCCAGGGCAGGGTGACCAT CACCGCCGACGAGTCCACCTCCACCGCCTACATGGAGCTGTCCTCCCTGAGGT CCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGGGCCGAGTACTCCTCCACCGG CACCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGTCAGCTCCGCCAGC ACAAAGGGCCCCAGCGTGTTTCCCCTGGCCCCTTGCAGCAGGAGCACATCCG AGAGCACCGCTGCCCTGGGATGTCTGGTGAAGGACTATTTCCCCGAGCCCGT GACAGTGAGCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGAGTGCACACCTTCCCT GCCGTGCTGCAGAGCAGCGGACTGTACAGCCTGTCCAGCGTGGTGACAGTGC CTTCCTCCAGCCTCGGCACAAAGACCTACACCTGCAACGTGGACCACAAGCC CTCCAACACCAAAGTGGACAAGCGGGTGGAAAGCAAGTATGGACCCCCTTGC CCTCCTTGTCCCGCCCCTGAGTTCCTGGGAGGCCCTTCCGTCTTCCTGTTTCCC CCCAAGCCCAAGGACACACTCATGATTTCCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCG TCGTGGTCGACGTGAGCCAGGAGGACCCCGAGGTGCAGTTTAACTGGTATGT GGACGGCGTGGAGGTCCACAATGCCAAAACCAAGCCCAGGGAGGAACAGTT CAACTCCACCTATAGGGTGGTCAGCGTGCTGACCGTCCTGCACCAGGACTGG CTGAACGGAAAGGAGTATAAGTGCAAAGTCTCCAACAAGGGCCTGCCTAGCA GCATCGAGAAGACCATCTCCAAAGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGT TTATACTCTGCCCCCTTCCCAGGAGGAGATGACCAAGAATCAGGTGTCCCTGA CCTGCCTGGTGAAAGGCTTTTACCCCTCCGACATCGCTGTGGAGTGGGAGAGC AATGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGATAGCG ATGGCAGCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTGACCGTGGATAAGAGCAGGTGGCA GGAGGGCAACGTGTTTTCCTGCTCCGTGATGCATGAGGCCCTCCACAACCATT ACACACAGAAAAGCCTGAGCCTGAGCCTGGGCAAGTGATGA SEQ ID NO: 27 (ADN de HC de Anticuerpo D - IgG4 S228P)

CAAGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCTGAGGTGAAAAAACCCGGATCCTCCG TCAAGGTGTCCTGTAAAGCCAGCGGCGGCACATTCAGCAGCTACGCCATCTC CTGGGTGAGGCAAGCTCCTGGACAGGGCCTGGAATGGATGGGCCTGATCATC CCCATGTTCGACACCGCCGGCTACGCTCAGAAATTCCAGGGCCGGGTCGCCA TT AC AGTGGATGAGAGC ACC AGC AC AGCCT AC ATGGAGCTC AGCTCCCTGAG GAGCGAAGATACCGCCGTCTACTATTGTGCCCGGGCTGAGCATAGCAGCACC GGCACCTTCGACTATTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACAGTGAGCTCCGCTTC CACAAAAGGCCCCAGCGTGTTTCCCCTGGCCCCTTGTAGCAGGTCCACCTCCG AAAGCACAGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGATTACTTCCCCGAGCCCGT GACCGTGTCCTGGAATAGCGGCGCTCTCACATCCGGAGTGCATACCTTTCCTG CCGTGCTCCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGAGCTCCGTGGTGACCGTCCCT TCCAGCTCCCTGGGCACCAAGACCTATACCTGTAACGTGGACCACAAGCCCTC CAATACCAAGGTGGATAAGCGGGTCGAGTCCAAGTACGGACCCCCTTGCCCT CCTTGTCCTGCTCCTGAATTCCTCGGCGGACCTAGCGTCTTTCTCTTCCCCCCC AAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCCAGGACCCCCGAGGTGACATGCGTCG TGGTCGATGTGTCCCAGGAGGATCCTGAAGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGA CGGCGTCGAAGTGCATAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTTCAA CTCCACCTATCGGGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCATCAGGACTGGCTCA ACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAGGGACTCCCCTCCAGCAT CGAGAAGACCATTAGCAAGGCCAAAGGCCAACCCAGGGAGCCTCAGGTATAT ACGCTGCCCCCCAGCCAGGAGGAGATGACCAAAAACCAGGTCAGCCTCACCT GTCTGGTCAAGGGCTTCTACCCTAGCGACATTGCTGTCGAGTGGGAGAGCAA CGGCCAGCCCGAGAACAACTATAAAACCACCCCCCCTGTCCTGGACTCCGAC GGATCCTTCTTCCTGTACTCCAGGCTGACAGTCGACAAGTCCCGGTGGCAAGA GGGAAACGTCTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAAGCTCTCCACAACCACTACA CCCAGAAGAGCCTCAGCCTGTCCCTGGGCAAATGATGA

SEQ ID NO: 28 (ADN de HC de Anticuerpo G - lgG4 S228P) CAAGTCCAGCTCGTGCAAAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAACCCGGCAGCTCCG TGCGGGTGAGCTGTAAGGCCTCCGGAGGCACCCTGTCCAGCTATGCTATCAG CTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGACAGGGCCTGGAATGGATGGGACTGATCATC CCTATGTTTGGAGCCGCCGGCTATGCTCAGAGGTTCCAGGGCCGGGTCACCAT CACCGCTGACGAGAGCGCCAGCACCGCCTATATGGAGCTGTCCTCCCTGAGG AGCGAGGATACCGCTGTCTACTACTGTGCCAGGGCCGAGCACTCCTCCACAG GAACCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCCTCCGCCTCC ACCAAGGGCCCTTCCGTGTTTCCTCTGGCTCCTTGCTCCCGGTCCACCAGCGA GTCCACAGCCGCTCTGGGCTGTCTGGTGAAGGACTATTTCCCCGAGCCTGTGA CCGTCAGCTGGAATAGCGGCGCCCTGACCTCCGGAGTGCACACATTCCCCGC CGTCCTGCAGAGCAGCGGACTCTACTCCCTGAGCTCCGTGGTGACCGTGCCTT CCAGCAGCCTGGGAACCAAGACCTACACCTGCAATGTGGACCACAAACCCAG CAACACCAAGGTGGATAAGCGGGTGGAATCCAAGTACGGCCCTCCCTGTCCC CCTTGTCCCGCTCCCGAATTCCTGGGCGGACCTAGCGTGTTCCTGTTTCCCCCT AAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCCAGGACCCCCGAAGTCACCTGCGTCG TCGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCTGAAGTCCAGTTTAATTGGTACGTCGAC GGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACAAAGCCTCGGGAGGAGCAGTTCAAC AGCACCTACAGGGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGA ACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGGCCTGCCCTCCTCCAT CGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAAGGCCAGCCGAGGGAGCCCCAGGTGTA CACCCTGCCCCCTAGCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCTCCCTGACC TGCCTGGTGAAGGGATTCTATCCCAGCGACATTGCCGTGGAGTGGGAGTCCA ACGGCCAGCCCGAGAATAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGA CGGGAGCTTCTTCCTGTATTCCCGGCTGACCGTCGACAAGTCCCGGTGGCAGG AGGGCAACGTGTTTAGCTGCAGCGTGATGCACGAAGCCCTCCACAACCACTA TACCCAGAAGAGCCTGTCCCTGTCCCTGGGCAAGTGATGA SEQ ID NO: 29 (ADN de HC de Anticuerpo E - lgG4 des-Lys PAA) CAGGTGCAGCTGGTCCAGTCAGGGGCTGAAGTGAAGAAGCCCGGCAGCTCCG TGAAGGTGTCTTGCAAGGCCAGCGGCGGAACATTCTCCAGTTACGCCATCTCT TGGGTGCGGCAGGCTCCAGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCCTGATCATCC CCATGTTCGACACCGCCGGGTATGCCCAGAAGTTTCAGGGCAGAGTGGCAAT CACAGTGGACGAGAGCACCTCCACAGCCTACATGGAGCTGTCTAGCCTGAGA TCCGAGGATACCGCCGTGTATTATTGTGCCCGGGCCGAACACAGCTCTACAG GGACTTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCCTCTGCTAGC ACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTCGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGA GAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTG ACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGG CTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCC TCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCA GCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCC ACCCTGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCC CAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGT GGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTATGTT GAT GGCGT GG AGGT GC AT AAT GCC A AG AC AA AGC CGCGGGAGG AGCAGTT C AACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCT GAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCC ATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGT ACACCCTGCCCCCATCCCAAGAAGAAATGACCAAAAACCAAGTCAGCCTGAC CTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAAAGC AATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCG ACGGCTCCTTCTTCCTCT ACTCCCGTCT AACCGTGGACA AGAGC AGGTGGC AG GAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTA CACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGT SEQ ID NO: 30 (ADN de LC de Anticuerpo A - Anticuerpo I)

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo que se une a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), que comprende una cadena ligera (LC) y una cadena pesada (HC), en donde la cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) y la cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (HCVR), en donde:

(1) la LCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 15, y la HCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 12; o

(2) la LCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 15, y la HCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 13; o

(3) la LCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 15, y la HCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 14.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde la LC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 21.

3. El anticuerpo de la reivindicación 2, en donde:

(1) la LC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 16; o

(2) la LC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 17; o

(3) la LC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 18; o

(4) la LC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 19; o

(5) la LC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 20; o

(6) la LC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 21.

4. El anticuerpo de la reivindicación 2, que comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, en donde cada una de las cadenas ligeras tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y cada una de las cadenas pesadas tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 16 , SEQ ID NO: 17, SEq ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 21.

5. El anticuerpo de la reivindicación 4, en donde:

(1) cada una de las cadenas ligeras tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y cada una de las cadenas pesadas tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 16; o

(2) cada una de las cadenas ligeras tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y cada una de las cadenas pesadas tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 17; o

(3) cada una de las cadenas ligeras tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y cada una de las cadenas pesadas tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 18; o

(4) cada una de las cadenas ligeras tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y cada una de las cadenas pesadas tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 19; o

(5) cada una de las cadenas ligeras tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y cada una de las cadenas pesadas tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 20; o

(6) cada una de las cadenas ligeras tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22, y cada una de las cadenas pesadas tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 21.

6. El anticuerpo de la reivindicación 4 o 5, en donde una de las cadenas pesadas forma un enlace disulfuro entre cadenas con una de las cadenas ligeras, y la otra cadena pesada forma un enlace disulfuro entre cadenas con la otra cadena ligera, y una de las cadenas pesadas forma dos enlaces disulfuro entre cadenas con la otra cadena pesada.

7. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el anticuerpo está glicosilado.

8. Una célula de mamífero que comprende una molécula de ADN que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 y una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 20, en donde la célula es capaz de expresar un anticuerpo que comprende una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 y una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 20.

9. Un procedimiento para producir un anticuerpo que comprende una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 y una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 20, que comprende cultivar la célula de mamífero de la reivindicación 8 en condiciones tales que el anticuerpo se exprese y recuperar el anticuerpo expresado.

10. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y un soporte, diluyente o excipiente aceptable.

11. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para uso en terapia, preferiblemente para uso en el tratamiento del cáncer, más preferiblemente, en donde el cáncer es melanoma, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer gástrico, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de ovario o carcinoma hepatocelular.

12. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para uso en combinación simultánea, separada o secuencial con uno o más agentes anti-tumorales, en el tratamiento del cáncer, preferiblemente, en donde el cáncer es melanoma, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer gástrico, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de ovario o carcinoma hepatocelular.