BR112018002274B1

BR112018002274B1 - Anticorpo anti-pd-1, seu processo de produção, seu uso, e composição farmacêutica compreendendo o mesmo

Info

Publication number: BR112018002274B1
Application number: BR112018002274-8A
Authority: BR
Inventors: Hemanta Baruah; Cheng Chen; Xiaolin Liu; Andy Tsun; Dechao M. Yu
Original assignee: Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd.
Priority date: 2015-08-10
Filing date: 2016-08-09
Publication date: 2021-12-07
Also published as: EP3334824A1; IL256844B; SI3334824T1; CN108473977A; LT3334824T; CA2990492C; MX365390B; AU2016307002B2; CA2990492A1; US20170044260A1; EP3334824A4; HUE058273T2; IL256844A; PT3334824T; RS62897B1; PL3334824T3; US10316089B2; ES2904586T3; KR102132100B1; CN110003339A

Abstract

a presente invenção refere-se a anticorpos que se ligam a células humanas programadas para morte celular 1 (pd-1) e a seu uso para o tratamento de câncer sozinhos ou em combinação com quimio-terapia e outras terapias para câncer.

Description

[001] A presente invenção refere-se ao campo da medicina. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a anticorpos que se ligam a células humanas programadas para morte celular 1 (DP-1) e que podem ser úteis para o tratamento de câncer sozinhos e em combinação com quimioterapia e outras terapias para câncer.

[002] As células tumorais escapam à detecção e à eliminação pelo sistema imunitário por meio de vários mecanismos. Vias de pontos de verificação imunológico são usadas na manutenção de autotolerância e controle de células T ativadas, mas as células cancerosas podem usar as vias para evitar a destruição. A via DP-1/ligante 1 de morte programada de células humanas 1 é uma via tal como ponto de verificação imunológico. PD-1 humana é verificada em células T, e a ligação de PD-L1 e ligante 2 de morte programada de células humanas 1 (PD-L2) a PD-1 inibe a proliferação de células T e produção de citocinas. A produção de células tumorais de PD-L1 e PD-L2 pode, por conseguinte, permitir o escape à vigilância de células T.

[003] Foi demonstrado que um anticorpo IgG4 (S228P) totalmente humano contra PD-1 humana, nivolumab, inibe a ligação de PD-1 a PD- L1 e PD-L2, e foi testado em vários ensaios clínicos. (Wang et al., Cancer Immunol Res (2014) 2 (9):846). Foi demonstrado que um anticorpo humanizado IgG4 (S228P) contra PD-1, pembrolizumab (anteriormente lambrolizumab), inibe a ligação de PD-1 a PD-L1 e PD- L2, e foi testado em vários ensaios clínicos. (WO2008156712 e Hamid et al., N Engl J Med (2013) 369:2).

[004] Continua a existir a necessidade de proporcionar anticorpos alternativos que se liguem e neutralizem a interação de PD-1 humana com PD-L1 e PD-L2. Em particular, continua a existir a necessidade de proporcionar anticorpos que se liguem a PD-1 humana com maior afinidade do que determinados anticorpos do estado da técnica. Além disso, continua a existir a necessidade de proporcionar anticorpos que bloqueiem de forma mais eficaz a interação de PD-1 humana com PD- L1 e PD-L2 do que certos anticorpos do estado da técnica. Maior afinidade e melhor bloqueio, isolada ou conjuntamente, podem se traduzir em maior atividade in vivo ou menores quantidades de dosagem necessárias.

[005] Certos anticorpos da presente invenção ligam-se a PD-1 humana com uma afinidade maior do que nivolumab e pembrolizumab. Além disso, certos anticorpos da presente invenção mediam aumento de alorreatividade preferencial em comparação com nivolumab e pembrolizumab em um modelo in vivo.

[006] Por conseguinte, em algumas modalidades, a presente invenção proporciona um anticorpo que se liga a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), que compreende uma cadeia leve (LC) e uma cadeia pesada (HC), em que a cadeia leve compreende regiões determinantes de complementaridade de cadeias leves LCDR1, LCDR2 e LCDR3 que consistem nas sequências de aminoácidos RASQGISSWLA (SEQ ID NO: 9), SAASSLQS (SEQ ID NO: 10) e QQANHLPFT (SEQ ID NO: 11), respectivamente, e em que a cadeia pesada compreende regiões determinantes da complementaridade de cadeias pesadas HCDR1, HCDR2 e HCDR3, em que HCDR1 consiste nas sequências de aminoácidos KASGGTFSSYAIS (SEQ ID NO: 2) ou KASGGTLSSYAIS (SEQ ID NO: 3), em que HCDR2 consiste nas sequências de aminoácidos LIIPMFGTAGYAQKFQG (SEQ ID NO: 4), LIIPMFDTAGYAQKFQG (SEQ ID NO: 5) ou LIIPMFGAAGYAQRFQG (SEQ ID NO: 6), e em que HCDR3 consiste nas sequências de aminoácidos ARAEYSSTGTFDY (SEQ ID NO: 7) ou ARAEHSSTGTFDY (SEQ ID NO: 8).

[007] Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona um anticorpo em que LCDR1, LCDR2 e LCDR3 consistem nas sequências de aminoácidos RASQGISSWLA (SEQ ID NO: 9), SAASSLQS (SEQ ID NO: 10) e QQANHLPFT (SEQ ID NO: 11), respectivamente, e em que HCDR1, HCDR2 e HCDR3 consistem nas sequências de aminoácidos KASGGTFSSYAIS (SEQ ID NO: 2), LIIPMFGTAGYAQKFQG (SEQ ID NO: 4) e ARAEYSSTGTFDY (SEQ ID NO: 7), respectivamente.

[008] Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona um anticorpo em que LCDR1, LCDR2 e LCDR3 consistem nas sequências de aminoácidos RASQGISSWLA (SEQ ID NO: 9), SAASSLQS (SEQ ID NO: 10) e QQANHLPFT (SEQ ID NO: 11), respectivamente, e em que HCDR1, HCDR2 e HCDR3 consistem nas sequências de aminoácidos KASGGTFSSYAIS (SEQ ID NO: 2), LIIPMFDTAGYAQKFQG (SEQ ID NO: 5) e ARAEHSSTGTFDY (SEQ ID NO: 8), respectivamente.

[009] Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona um anticorpo em que LCDR1, LCDR2 e LCDR3 consistem nas sequências de aminoácidos RASQGISSWLA (SEQ ID NO: 9), SAASSLQS (SEQ ID NO: 10) e QQANHLPFT (SEQ ID NO: 11), respectivamente, e em que HCDR1, HCDR2 e HCDR3 consistem nas sequências de aminoácidos KASGGTLSSYAIS (SEQ ID NO: 3), LIIPMFGAAGYAQRFQG (SEQ ID NO: 6) e ARAEHSSTGTFDY (SEQ ID NO: 8), respectivamente.

[0010] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um anticorpo que compreende uma cadeia leve (LC) e uma cadeia pesada (HC), em que a cadeia leve compreende uma região variável da cadeia leve (LCVR) e a cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada (HCVR), em que LCVR tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 15, e HCVR tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 14.

[0011] Em modalidades adicionais, a presente invenção propor ciona um anticorpo em que LCVR tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 15 e HCVR tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 12. Em outras modalidades, a presente invenção proporciona um anticorpo em que LCVR tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 15 e HCVR tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 13. Em outras modalidades, a presente invenção proporciona um anticorpo em que LCVR tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 15 e HCVR tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 14.

[0012] Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona um anticorpo em que a LC possui a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 22 e a HC tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 ou SEQ ID NO: 21.

[0013] Em uma modalidade adicional, a presente invenção proporciona um anticorpo em que a LC tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 22 e a HC tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 16. Em outra modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo em que a LC tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 22 e a HC tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 17. Em outra modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo em que a LC tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 22 e a HC tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 18. Em outra modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo em que a LC tem a sequência de aminoácido dada em SEQ ID NO: 22 e a HC tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 19. Em outra modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo em que a LC tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 22 e a HC tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 20. Em outra modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo em que a LC tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 22 e a HC tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 21.

[0014] Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo em que a LC tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 22 e a HC tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 23. Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo em que a LC tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 22 e a HC tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 24. Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo em que a LC tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 22 e a HC tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 25.

[0015] Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo que compreende duas cadeias leves e duas cadeias pesadas, em que cada cadeia leve tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 22 e cada cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 ou SEQ ID NO: 21.

[0016] Em uma modalidade adicional, a presente invenção proporciona um anticorpo em que cada cadeia leve tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 22 e cada cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 16. Em outra modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo em que cada cadeia leve tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 22 e cada cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 17. Em outra modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo em que cada cadeia leve tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 22 e cada cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 18. Em outra modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo em que cada cadeia leve tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 22 e cada cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 19. Em outra modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo em que cada cadeia leve tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 22 e cada cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 20. Em outra modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo em que cada cadeia leve tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 22 e cada cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 21.

[0017] Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo que compreende duas cadeias leves e duas cadeias pesadas, em que cada cadeia leve tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 22 e cada cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 23. Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo que compreende duas cadeias leves e duas cadeias pesadas, em que cada cadeia leve tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 22 e cada cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 24. Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo que compreende duas cadeias leves e duas cadeias pesadas, em que cada cadeia leve tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 22 e cada cadeia pesada possui a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 25.

[0018] Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo em que uma das cadeias pesadas forma uma ligação de dissulfeto intercadeias com uma das cadeias leves, e as outras cadeias pesadas formam uma ligação dissulfeto intercadeias com a outra cadeia leve, e uma das cadeias pesadas forma duas ligações dissulfeto intercadeias com a outra cadeia pesada.

[0019] Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo, em que o anticorpo é glicosilado.

[0020] Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo que se liga a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), compreendendo uma cadeia leve (LC) e uma cadeia pesada (HC), em que a cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve (LCVR) e a cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada (HCVR), em que LCVR tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 15 e a HCVR tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 14.

[0021] Em uma modalidade adicional, a presente invenção proporciona um anticorpo que se liga a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), em que LCVR tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 15 e a HCVR tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 12. Em uma modalidade adicional, a presente invenção proporciona um anticorpo que se liga a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), em que LCVR tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 15 e HCVR tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 13. Em uma modalidade adicional, a presente invenção proporciona um anticorpo que se liga a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), em que LCVR tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 15 e HCVR tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 14.

[0022] Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo que se liga a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), em que a LC tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 22 e a HC tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 ou SEQ ID NO: 21.

[0023] Em uma modalidade adicional, a presente invenção proporciona um anticorpo que se liga a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), em que a LC tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 22 e a HC tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 16. Em uma modalidade adicional, a presente invenção proporciona um anticorpo que se liga a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), em que a LC tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 22 e a HC tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 17. Em uma modalidade adicional, a presente invenção proporciona um anticorpo que se liga a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), em que a LC tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 22 e a HC tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 18. Em uma modalidade adicional, a presente invenção proporciona um anticorpo que se liga a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), em que a LC tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 22 e a HC tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 19. Em uma modalidade adicional, a presente invenção proporciona um anticorpo que se liga a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), em que a LC tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 22 e a HC tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 20. Em uma modalidade adicional, a presente invenção proporciona um anticorpo humano que se liga PD-1 (SEQ ID NO: 1), em que a LC tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 22 e a HC tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 21.

[0024] Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo que se liga a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), em que a LC tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 22 e a HC tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 23. Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo que se liga a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), em que a LC tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 22 e a HC tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 24. Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo que se liga a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), em que a LC tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 22 e a HC tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 25.

[0025] Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo que se liga a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), compreendendo duas cadeias leves e duas cadeias pesadas, em que cada cadeia leve tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 22 e cada cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 ou SEQ ID NO: 21.

[0026] Em uma modalidade adicional, a presente invenção proporciona um anticorpo que se liga a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), em que cada cadeia leve tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 22 e cada cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 16. Em uma modalidade adicional, a presente invenção proporciona um anticorpo que se liga a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), em que cada cadeia leve tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 22 e cada cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 17. Em uma modalidade adicional, a presente invenção proporciona um anticorpo que se liga a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), em que cada cadeia leve tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 22 e cada cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 18. Em uma modalidade adicional, a presente invenção proporciona um anticorpo que se liga a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), em que cada cadeia leve tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 22 e cada cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 19. Em uma modalidade adicional, a presente invenção proporciona um anticorpo que se liga a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), em que cada cadeia leve tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 22 e cada cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 20. Em uma modalidade adicional, a presente invenção proporciona um anticorpo que se liga a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), em que cada cadeia leve tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 22 e cada cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 21.

[0027] Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo que se liga a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), compreendendo duas cadeias leves e duas cadeias pesadas, em que cada cadeia leve tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 22 e cada cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 23. Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo que se liga a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), compreendendo duas cadeias leves e duas cadeias pesadas, em que cada cadeia leve tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 22 e cada cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 24. Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo que se liga a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), compreendendo duas cadeias leves e duas cadeias pesadas, em que cada cadeia leve tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 22 e cada cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 25.

[0028] Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo que se liga a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), em que uma das cadeias pesadas forma uma ligação dissulfeto intercadeias com uma das cadeias leves, e a outra cadeia pesada forma uma ligação dissulfeto intercadeias com a outra cadeia leve, e uma das cadeias pesadas forma duas ligações dissulfeto intercadeias com a outra cadeia pesada.

[0029] Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo que se liga a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), em que o anticorpo é glicosilado.

[0030] Em uma modalidade, a presente invenção fornece uma célula de mamífero que compreende uma molécula de DNA que é constituída de uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, e uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 19, em que a célula é capaz de expressar um anticorpo que compreende uma cadeia leve que apresenta uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 e uma cadeia pesada que apresenta uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 19.

[0031] Em uma modalidade, a presente invenção fornece uma célula de mamífero que compreende uma molécula de DNA que compreende uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, e uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 20, em que a célula é capaz de expressar um anticorpo que compreende uma cadeia leve que apresenta uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 e uma cadeia pesada que apresenta uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 20.

[0032] Em uma modalidade, a presente invenção fornece uma célula de mamífero que compreende uma molécula de DNA que compreende uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, e uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 21, em que a célula é capaz de expressar um anticorpo que compreende uma cadeia leve que apresenta uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 e uma cadeia pesada que apresenta uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 21.

[0033] Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um processo para a produção de um anticorpo que compreende uma cadeia leve que possui uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 e uma cadeia pesada que possui uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 19, compreendendo cultivar uma célula de mamífero da presente invenção sob condições tais que o anticorpo seja expresso, e recuperar o anticorpo expresso.

[0034] Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um processo para a produção de um anticorpo que compreende uma cadeia leve que apresenta uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 e uma cadeia pesada que possui uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 20, compreendendo cultivar uma célula de mamífero da presente invenção, sob condições tais que o anticorpo seja expresso, e recuperar o anticorpo expresso.

[0035] Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um processo para a produção de um anticorpo que compreende uma cadeia leve que apresenta uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 e uma cadeia pesada que apresenta uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 21, compreendendo cultivar uma célula de mamífero da presente invenção sob condições tais que o anticorpo seja expresso, e recuperar o anticorpo expresso.

[0036] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um anticorpo produzido por um processo da presente invenção.

[0037] Em uma modalidade, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo da presente invenção, e um veículo, diluente ou excipiente aceitável.

[0038] Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um método de tratamento de câncer que compreendendo administrar a um paciente que dele necessite uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção. Em uma modalidade adicional, a presente invenção proporciona um método de tratamento de câncer que compreende administrar a um paciente que dele necessite uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção, em que o câncer é melanoma, câncer de pulmão, câncer de cabeça e pescoço, câncer colorretal, câncer de pâncreas, câncer gástrico, câncer de rim, câncer de bexiga, câncer de próstata, câncer de mama, câncer de ovário ou carcinoma hepatocelular.

[0039] Em uma modalidade adicional da presente invenção, esses métodos compreendem a administração de uma quantidade eficaz do anticorpo da presente invenção em combinação simultânea, separada ou sequencial com um ou mais agentes antitumorais. Exemplos não limitativos de agentes antitumorais incluem ramucirumab, necitumumab, olaratumab, galunissertib, abemaciclib, cisplatina, carboplatina, dacarbazina, doxorrubicina lipossômica, docetaxel, ciclofosfamida e doxorrubicina, navelbina, eribulina, paclitaxel, partículas ligadas a proteínas de paclitaxel para suspensão injetável, ixabepilona, capecitabina, FOLFOX (leucovorina, fluoruracila e oxaliplatina), FOLFIRI (leucovorina, fluoruracila e irinotecano) e cetuximab.

[0040] Em uma modalidade adicional, esses métodos compreendem a administração de uma quantidade eficaz do composto da presente invenção em combinação simultânea, separada ou sequencial com um ou mais agentes imuno-oncológicos. Exemplos não limitativos de agentes imuno-oncológicos incluem nivolumab, ipilimumab, pidilizumab, pembrolizumab, tremelimumab, urelumab, lirilumab, atezolizumab e durvalumab.

[0041] Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo da presente invenção para uso em terapia. Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo da presente invenção para uso no tratamento de câncer. Em uma modalidade adicional, a presente invenção proporciona um anticorpo da presente invenção para uso no tratamento de câncer, em que o câncer é melanoma, câncer de pulmão, câncer de cabeça e pescoço, câncer colorretal, câncer de pâncreas, câncer gástrico, câncer de rim, câncer de bexiga, câncer de próstata, câncer de mama, câncer de ovário ou carcinoma hepatocelular. Em uma modalidade adicional, a presente invenção proporciona o anticorpo da presente invenção para uso em combinação simultânea, separada ou sequencial com um ou mais agentes antitumorais. Em uma modalidade adicional, a presente invenção proporciona o anticorpo da presente invenção para uso em combinação simultânea, separada ou sequencial com um ou mais agentes antitumorais. Em outra modalidade, a presente invenção proporciona o anticorpo da presente invenção para uso em combinação simultânea, separada ou sequencial com um ou mais agentes antitumorais selecionados do grupo que consiste em ramucirumab, necitumumab, olaratumab, galunissertib, abemaciclib, cisplatina, carboplatina, dacarbazina, doxorrubicina lipossômica, docetaxel, ciclofosfamida e doxorrubicina, navelbina, eribulina, paclitaxel, partículas ligadas a proteínas de paclitaxel para suspensão injetável, ixabepilona, capecitabina, FOLFOX (leucovorina, fluoruracila e oxaliplatina), FOLFIRI (leucovorina, fluoruracila e irinotecano) e cetuximab, no tratamento de câncer.

[0042] Em uma modalidade adicional, a presente invenção proporciona o anticorpo da presente invenção para uso em combinação simultânea, separada ou sequencial com um ou mais agentes imuno- oncológicos. Em uma modalidade adicional, a presente invenção proporciona o anticorpo da presente invenção para uso em combinação simultânea, separada ou sequencial com um ou mais agentes imuno- oncológicos selecionados do grupo que consiste em nivolumab, ipilimumab, pidilizumab, pembrolizumab, tremelimumab, urelumab, lirilumab, atezolizumab e durvalumab, no tratamento de câncer.

[0043] Em uma modalidade adicional, a presente invenção proporciona o uso de um anticorpo da presente invenção para a fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer. Em uma modalidade adicional, a presente invenção proporciona o uso de um anticorpo da presente invenção para a fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer, em que o câncer é melanoma, câncer de pulmão, câncer de cabeça e pescoço, câncer colorretal, câncer de pâncreas, câncer gástrico, câncer de rim, câncer de bexiga, câncer de próstata, câncer de mama, câncer de ovário ou carcinoma hepatocelular.

[0044] Em uma modalidade adicional, a presente invenção proporciona o uso de um anticorpo da presente invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer, em que o medicamento deve ser administrado simultaneamente, separadamente ou sequen-cialmente com um ou mais agentes antitumorais. Em uma modalidade adicional, a presente invenção proporciona o uso de um anticorpo da presente invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer, em que o medicamento deve ser administrado simultaneamente, separadamente ou sequencialmente com um ou mais agentes antitumorais selecionados do grupo que consiste em ramucirumab, necitumumab, olaratumab, galunissertib, abemaciclib, cisplatina, carboplatina, dacarbazina, doxorrubicina lipossômica, docetaxel, ciclofosfamida e doxorrubicina, navelbina, eribulina, paclitaxel, partículas ligadas a proteínas de paclitaxel para suspensão injetável, ixabepilona, capecitabina, FOLFOX (leucovorina, fluoruracila e oxaliplatina), FOLFIRI (leucovorina, fluoruracila e irinotecano) e cetuximab.

[0045] Um anticorpo da presente invenção é um complexo polipeptídico engenheirado, de ocorrência não natural. Uma molécula de DNA da presente invenção é uma molécula de DNA de ocorrência não natural que compreende uma sequência polinucleotídica que codifica um polipeptídeo que apresenta a sequência de aminoácidos de um dos polipeptídeos em um anticorpo da presente invenção.

[0046] Um anticorpo da presente invenção é desenhado para ter CDRs engenheiradas e apresentar algumas porções do anticorpo (todo ou partes das regiões de frameworks, regiões de articulação e re-giões constantes) para ser de origem humana, as quais são idênticas ou substancialmente idênticas (substancialmente humanas) às regiões de frameworks e regiões constantes derivados de sequências genômicas humanas.Regiões de frameworks, regiões de articulação e regiões constantes totalmente humanos são as sequências de linha germinativa humana, bem como sequências com mutações somáticas que ocorrem naturalmente e aquelas com mutações provenientes de modificação genética. Um anticorpo da presente invenção pode compreender região de framework, região de articulação ou região constante derivados de uma região de framework, região de articulação ou região constante totalmente humanas contendo uma ou mais substituições de aminoácidos, eliminações ou adições. Além disso, um anticorpo da presente invenção é de preferência substancialmente não imunogênico em humanos.

[0047] O anticorpo da presente invenção é um anticorpo do tipo IgG e tem cadeias “pesadas” e cadeias “leves” que são reticuladas por meio de ligações dissulfeto intra e intercadeias. Cada cadeia pesada é compreendida de uma região HCVR com término N e uma região constante de cadeia pesada (“HCCR”). Cada cadeia leve é compreendida de uma região LCVR e uma região constante de cadeia leve (“LCCR”). Quando expressos em certos sistemas biológicos, anticorpos que possuem sequências nativas humanas Fc são glicosilados na região Fc. Tipicamente, a glicosilação ocorre na região Fc do anticorpo em um sítio de N-glicosilação altamente conservado. N- glicanos tipicamente ligam-se à asparagina. Os anticorpos podem ser glicosilados em outras posições também.

[0048] Opcionalmente, o anticorpo da presente invenção contém uma porção Fc que é derivada de região Fc de IgG humana devido a uma capacidade reduzida para envolver mecanismos inflamatórios mediados pelo receptor de Fc ou ativar complemento resultando em função efetora reduzida.

[0049] Certos anticorpos da presente invenção contêm uma porção IgG4-Fc que tem uma mutação de serina para prolina na posição 228. Além disso, certos anticorpos da presente invenção contêm uma porção Fc de IgG4-PAA. A porção Fc de IgG4-PAA tem uma mutação de serina para prolina na posição 228, uma mutação de fenilalanina para alanina na posição 234 e uma mutação de leucina para alanina na posição 235. A mutação S228P é uma mutação de articulação que evita a formação de meio-anticorpo (fenômeno de troca dinâmica de meias moléculas em anticorpos a de IgG4). As mutações F234A e L235A reduzem adicionalmente a função efetora do já baixo isótopo de IgG4 humana. Além disso, certos anticorpos da presente invenção contêm uma porção Fc de IgG4-PAA com a lisina de término C removida (des-Lys) da cadeia pesada.

[0050] As regiões HCVR e LCVR podem ainda ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (“CDRs”), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões estruturais (“FRs”). Cada HCVR e LCVR é composta de três CDRs e quatro FRs, dispostas de término amino a término carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Aqui, as três CDRs da cadeia pesada são referidas como “HCDR1, HCDR2 e HCDR3” e as três CDRs da cadeia leve são referidas como “LCDR1, LCDR2 e LCDR3”. As CDRs contêm a maioria dos resíduos que formam interações específicas com o antígeno. Existem atualmente três sistemas de atribuições de CDRs para anticorpos que são usados para a delineação de sequência. A definição de CDR de Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) baseia-se na variabilidade de sequências dos anticorpos. A definição de Chothia para CDR (Chothia et al., Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins, Journal of Molecular Biology, 196, 901-917 (1987); Al-Lazikani et al., Standard conformations for the canônical structures of immunoglobulins, Journal of Molecular Biology, 273, 927948 (1997)) baseia-se em estruturas tridimensionais de anticorpos e topologias dos laços de CDRs. As definições de CDR de Chothia são idênticas às definições de CDR de Kabat, com exceção de HCOR1 e HCOR2. A definição de CDR de North (North et al., A New Clustering of Anticorpo CDR Loop Conformations, Journal of Molecular Biology, 406, 228-256 (2011)) baseia-se na propagação de agrupamentos por afinidade com um grande número de estruturas cristalinas. Para os fins da presente invenção, são usadas as definições de CDR de North.

[0051] Um DNA isolado que codifica uma região HCVR pode ser convertido em um gene de cadeia pesada de comprimento total ligando operacionalmente o DNA que codifica HCVR a outra molécula de DNA que codifica regiões constantes da cadeia pesada. As sequências de genes da região constante da cadeia pesada humana, bem como de outros mamíferos, são conhecidas no estado da técnica. Fragmentos de DNA que abrangem essas regiões podem ser obtidos, por exemplo, por amplificação por PCR padrão.

[0052] Um DNA isolado que codifica uma região LCVR pode ser convertido em um gene de cadeia leve de comprimento total, ligando operativamente o DNA que codifica LCVR a outra molécula de DNA que codifica uma região constante da cadeia leve. As sequências de genes da região constante da cadeia leve humana, bem como de outros mamíferos, são conhecidas na técnica. Fragmentos de DNA que abrangem essas regiões podem ser obtidos por amplificação por PCR padrão. A região constante da cadeia leve pode ser uma região constante capa ou lambda.

[0053] Os polinucleotídeos da presente invenção serão expressos numa célula hospedeira após as sequências terem sido operacionalmente ligadas a uma sequência de controle de expressão. Os vetores de expressão são tipicamente replicáveis nos organismos hospedeiros, quer como epissomas ou como uma parte integrante do DNA cromossômico do hospedeiro. Comumente, vetores de expressão conterão marcadores de seleção, por exemplo, tetraciclina, neomicina e di-hidrofolato redutase, para permitir a detecção dessas células transformadas com as sequências de DNA desejadas.

[0054] O anticorpo da presente invenção pode ser facilmente produzido em células de mamíferos tais como células CHO, NS0, HEK293 ou COS. As células hospedeiras são cultivadas usando técnicas bem conhecidas na técnica.

[0055] Os vetores que contêm as sequências polinucleotídicas de interesse (por exemplo, os polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos das sequências do anticorpo e de controle de expressão) podem ser transferidos para a célula hospedeira por métodos bem conhecidos, que variam dependendo do tipo de hospedeiro celular.

[0056] Vários métodos de purificação de proteínas podem ser utilizados e tais métodos são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, in Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-89 (1990), e Scopes, Protein Purification: Principles and Practice,3a Edição, Springer, NI (1994).

[0057] Em outra modalidade da presente invenção, o anticorpo, ou os ácidos nucleicos que codificam o mesmo, é fornecido na forma isolada. Como aqui empregado, o termo “isolado” refere-se a uma proteína, peptídeo ou ácido nucleico que é livre ou substancialmente livre de quaisquer outras espécies macromoleculares encontradas em um meio celular. “Substancialmente livre”, como aqui usado, significa que a proteína, peptídeo ou ácido nucleico de interesse compreende mais de 80% (numa base molar) das espécies macromoleculares presentes, preferencialmente mais de 90%, e mais preferencialmente mais de 95%.

[0058] O anticorpo da presente invenção, ou composições farmacêuticas que compreendem o mesmo, podem ser administrados por vias parenterais (por exemplo, subcutânea e intravenosa). Um anticorpo da presente invenção pode ser administrado a um paciente isoladamente com veículos, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis em doses únicas ou múltiplas. As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser preparadas por métodos bem conhecidos no estado da técnica (por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy,19aed. (1995), A. Gennaro et al., Mack Publishing Co.) e compreender um anticorpo, como aqui descrito, e um ou mais veículos, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

[0059] O termo "em tratamento" (ou "tratar" ou "tratamento") refere- se a retardamento, interrupção, controle, alívio, parada, redução ou reversão da progressão ou gravidade de um sintoma, distúrbio, condição ou doença existente.

[0060] "Se liga", como aqui utilizado em referência à afinidade de um anticorpo para PD-1 humana, pretende significar, a menos que indicado de outro modo, uma KD menor que cerca de 1 x 10-6 M, de preferência inferior a cerca de 1 x 10-9 M, tal como determinado por métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo o uso de um biossensor de ressonância de plasmons de superfície (SPR) a 37°C essen-cialmente como aqui descrito.

[0061] Para os propósitos da presente divulgação, o termo "alta afinidade" refere-se a uma KD menor que cerca de 150 pM para PD-1 humana conforme determinado por MSD ou SPR. Os valores de KD são estabelecidos por cinética de ligação, conforme descrito em "Binding kinetics and affinity" na seção Ensaios.

[0062] "Quantidade eficaz" significa a quantidade de um anticorpo da presente invenção ou composição farmacêutica que compreende um anticorpo da presente invenção que induzirá a resposta biológica ou médica ou o efeito terapêutico desejado sobre um tecido, sistema, animal, mamífero ou humano, resposta ou efeito este que está sendo buscado pelo pesquisador, médico ou outro clínico. Uma quantidade eficaz do anticorpo pode variar de acordo com fatores tais como o estado da doença, idade, sexo e peso do indivíduo, e a capacidade do anticorpo em induzir uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade eficaz é também aquela em que qualquer efeito tóxico ou prejudicial do anticorpo é compensado pelos efeitos terapeuticamente benéficos.

[0063] Esta invenção é ainda ilustrada pelo seguinte exemplo não limitativo.

Exemplo 1: Expressão e purificação de anticorpos

[0064] Os polipeptídeos das regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve, as sequências completas de aminoácidos da cadeia pesada e da cadeia leve de Anticorpo A - Anticorpo I, e as sequências de nucleotídeos que codificam os mesmos, estão listados abaixo na seção intitulada “Sequências de Aminoácidos e de Nucleotídeos”. Além disso, as SEQ ID NOs para a cadeia leve, a cadeia pesada, a região variável da cadeia leve e a região variável da cadeia pesada de Anticorpo A - Anticorpo I são mostradas na Tabela 1.

[0065] Os anticorpos da presente invenção, incluindo, mas sem limitação, Anticorpo A - Anticorpo I, podem ser feitos e purificados essencialmente como segue. Uma célula hospedeira apropriada, tal como HEK 293 ou CHO, pode ser transitória ou estavelmente transfectada com um sistema de expressão para secretar anticorpos utilizando uma razão predeterminada ótima de vetor HC:LC ou um sistema de vetor único que codifica tanto HC quanto LC. Meios clarificados, em que o anticorpo foi secretado, podem ser purificados usando qualquer uma de muitas técnicas comumente utilizadas. Por exemplo, o meio pode ser convenientemente aplicado em uma coluna MabSelect (GE Healthcare), ou uma coluna KappaSelect (GE Healthcare), para fragmento Fab, que foi equilibrada com um tampão compatível, tal como solução salina tamponada com fosfato (pH 7,4). A coluna pode ser

[0066] lavada para remover os componentes de ligação não específicos. O anticorpo ligado pode ser eluído, por exemplo, por gradiente de pH (tal como tampão Tris 20 mM, pH 7, a tampão de citrato de sódio 10 mM, pH 3,0, ou solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4, um tampão de glicina 100 mM, pH 3,0). Frações de anticorpos podem ser detectadas, por exemplo, por SDS-PAGE, e, em seguida, podem ser reunidas. Purificação adicional é opcional, dependendo do uso pretendido. O anticorpo pode ser concentrado e/ou filtrado estéril utilizando técnicas comuns. Agregado solúvel e multímeros podem ser eficazmente removidos por técnicas comuns, incluindo exclusão por tamanho, interação hidrófoba, troca iônica, multimodal ou cromatografia em hidroxiapatita. A pureza do anticorpo após essas etapas de cromatografia é maior do que 95%. O produto pode ser imediatamente congelado a -70°C ou pode ser liofilizado. Tabela 1: SEQ ID NOs

Ensaios Atividade in vivo - Ensaio de WINN

[0067] Os anticorpos da presente invenção podem ser medidos em relação a uma atividade imunomoduladora in vivo com o ensaio de Winn. No ensaio de Winn, células tumorais humanas e células imunitárias humanas (alogênicas) são injetadas em conjunto num camundongo imunodeficiente e, depois, seguidas de administração de um agente imunomodulador. O volume do tumor é medido para determinar o efeito do agente no ensaio.

[0068] Aumento da resposta imune a aloantígenos por anticorpos da presente invenção pode ser testado no modelo de xenoenxerto de NSCLC humano com NCI-H292. No dia 0, camundongos NSG de Jackson Laboratories (7 semanas de idade, fêmeas, em grupos de 8-10 camundongos) recebem implantes subcutâneos no flanco de 2 x106 células H292, ou uma mistura de 2 x 106células H292 e 1 x 106PBMCs humanos em HBSS (0,2 ml de volume total). Começando no 1° dia, camundongos são tratados com uma injeção i.p. de IgG humana de 10 mg/kg, uma vez por semana. Bem-estar e comportamento dos animais, incluindo aliciamento e deambulação, são monitorados pelo menos duas vezes por semana. O peso corporal e o volume do tumor são medidos duas vezes por semana. Peso corporal e volume tumoral são medidos duas vezes por semana.

[0069] Em experimentos realizados essencialmente como descrito neste ensaio, Anticorpo A ou Anticorpo D administrados em doses de 10 mg/kg, qw, ip, são bem tolerados e seguros, conforme monitorado por observações clínicas e de peso corporal. Crescimento tumoral e resultados de T/C% são mostrados na Tabela 2. Tumores em camundongos coimplantados com NCI-H292 e PBMCs e administrados com Anticorpo A ou Anticorpo D em doses de 10 mg/kg qw cresceram significativamente mais devagar e regrediram ao longo do tempo. Nessas condições, Anticorpo A e Anticorpo D mediam aumento de alorreatividade preferencial em comparação com nivolumab e pembrolizumab. Tabela 2: Ensaio de WINN

* T/C% é a relação de volume do tumor sob controle (hlgG + hPBMC) versus camundongos tratados em um tempo especificado.

Cinética e afinidade da ligação

[0070] A cinética e a constante de dissociação em equilíbrio (KD) para PD-1 humana são determinadas para anticorpos da presente invenção utilizando MSD, ressonância de plasmons de superfície (Biacore) e métodos de ensaio por interferometria de biocamadas (ForteBio).

[0071] Como aqui utilizado, nivolumab é um anticorpo anti-PD-1 humano a IgG4 expresso transitoriamente pelas requerentes em células 293 HEK, o qual usa cadeias as sequências da cadeia pesada e da cadeia leve de Proposta INN: Lista 107 (N° CAS 946414-94-4). Como aqui utilizado, pembrolizumab é um anticorpo anti-PD-1 humano a IgG4 expresso transitoriamente pelas requerentes em células 293 HEK o qual utiliza as sequências da cadeia pesada e da cadeia leve da Proposta INN: Lista 72.

Ensaio de MSD

[0072] Medições de afinidade em equilíbrio são realizadas como anteriormente descrito (Estep, P. et al., MAbs, 2013. 5(2): p. 270-8). Titulações de equilíbrio de soluções (SET) são realizadas em PBS + BSA sem IgG 0,1% (PBSF) em que o antígeno (monômero b-PD-1) é mantido constante a 10-100 pM e é incubado com diluições em série 3 a 5 vezes de Fab ou mAb, partindo de 5-100 nM (a condição experimental é dependente da amostra). Anticorpos diluídos em 20 nM em PBS são revestidos sobre placas MSD-ECL de ligação padrão durante a noite a 4üQ ou a temperatura ambiente durante 30 min. As placas são bloqueadas com BSA durante 30 minutos, enquanto se agita a 700 rpm. As placas são então lavadas 3x com tampão de lavagem (PBSF + Tween 20 0,05%). Amostras SET são aplicadas e incubadas nas placas durante 150 s com agitação a 700 rpm, seguidas de uma lavagem. Antígeno capturado numa placa é

[0073] detectado com 250 ng/mL de estreptavidina marcado com sulfotag em PBSF por incubação na placa durante 3 min. As placas são lavadas três vezes com tampão de lavagem e são, em seguida, lidas no instrumento MSD Sector Imager 2400 usando 1x Read Buffer T com tensoativo. A percentagem de antígeno livre é representada graficamente como uma função do anticorpo titulado em Prism e ajustada em uma equação quadrática para extrair a KD. Para melhorar o rendimento, robôs de manipulação de líquidos são usados em todos os experimentos MSD-SET, incluindo para preparação de amostras para SET.

[0074] Em experimentos realizados essencialmente como descrito neste ensaio, Anticorpos D e G num formato IgG1 e expressos em levedura ligam-se a PD-1 humana com uma KD de 12 pM e 14 pM, respectivamente. Pembrolizumab e nivolumab, ambos em um formato IgG1, ligam-se a PD-1 com uma KD de 130 pM e 640 pM respectivamente. Medições de avidez para Anticorpos D e G resultam em uma KD de aproximadamente 0,9 pM e 1 pM, respectivamente. Pembroli-zumab e nivolumab ligam-se a PD-1 humana com uma KD de aproximadamente 3 pM e 5 pM, respectivamente. Tabela 3: Ligação por MSD de anticorpos da invenção no formato IgG1

Interferometria de Biocamadas

[0075] Medições de afinidade ForteBiosão realizadas geralmente como descrito anteriormente (Estep, P. et al., High throughput solutionbased measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning. MAbs, 2013. 5(2): p. 270-8). Resumidamente, as medições de afinidade ForteBiosão realizadas carregando IgGs on-line em sensores AHQ. Sensores são equilibrados fora de linha no tampão de ensaio durante 30 min e depois monitorados online por 60 segundos para o estabelecimento da referência. Os sensores com IgG carregada são expostos a antígeno 100 nM durante 5 min, depois são transferidos para tampão de ensaio durante 5 min para medição de taxa extra. A cinética é analisada usando o modelo de ligação 1:1. Tabela 4: Ligação por interferometria de Biocamadas de anticorpos da invenção

[0076] Em experimentos realizados essencialmente como descrito neste ensaio, Anticorpos D e G ligam-se a PD-1_Fc humana com uma KD aproximadamente três a quatro vezes inferior a nivolumab e pembrolizumab quando PD-1_Fc estava na ponta do sensor. Quando o anticorpo estava na ponta do sensor, os anticorpos D e G ligam-se a PD-1_Fc humana com uma KD aproximadamente quatro a seis vezes menor que nivolumab e pembrolizumab. Os anticorpos D e G ligam-se a cynoPD-1_Fc com uma KD semelhante a nivolumab e pembrolizumab.

Ressonância de Plasmons Superfície (SPR)

[0077] Imobilização de DP-1-Fc humana (R&D Systems) como ligante na superfície do chipdo sensor foi realizada a 25°C. Os anticorpos da presente invenção são utilizados como analitos e injetados na superfície do chip do sensor de PD-1-Fc humana imobilizada. Todos os analitos da amostra são executados em diluições em série 3 vezes a partir de sua concentração de partida (90 nM), 8 diluições totais com uma duplicata em uma concentração média e uma zero. A análise é realizada a 37°C. O tempo de contato para cada amostra é de 180 s a 30 μl/min. O tempo de dissociação: 300 segundos para 5 concentrações mais baixas e 1.200 (FAB), ou 2.400 (T = 0) ou 3.000 (4 semanas a 4°C, 25°C, 40°C) segundos para três concentrações mais elevadas. A superfície imobilizada é regenerada por 6-8 segundos com SDS 0,4% sob 30 μl/min e, em seguida, estabilizada por 5 segundos. A cinética de ligação é analisada utilizando o software Biacore T200 Evaluation (Versão 3.0). Os dados são referenciados com uma célula de fluxo em branco, e os dados são ajustados em um modelo de ligação 1:1.

[0078] Em experimentos realizados essencialmente como descrito neste ensaio, Anticorpo D liga-se a PD-1 humana com uma KD de 102 pM, nivolumab, com uma KD de 246 pM, e pembrolizumab, com uma KD de 181 pM. Conforme mostrado na Tabela 6, o anticorpo D manteve a atividade de ligação 4 semanas sob condições de temperatura elevada. Tabela 5: Ligação por SPR de Anticorpo D em tempos e temperaturas prolongadas

Bloqueio de PD-1 humana a PD-L1 e PD-L2

[0079] Para o ensaio de bloqueio receptor-ligante, quantidades variáveis (de anticorpo anti-PD-1 ou IgG de controle) são misturadas com uma quantidade fixa de proteína de fusão PD-1-Fc biotinilada (100 ng/mL) e incubadas a temperatura ambiente durante 1 hora. A mistura é transferida para placas de 96 poços pré-revestidos com PD-L1-Fc (100 ng/poço) ou PD-L2-Fc (100 ng/poço) e depois incubada a temperatura ambiente durante mais 1 hora. As placas são lavadas e conjugado estreptavidina-HRP é adicionado. As placas são lidas sob uma absorvância a 450 nm. IC50 representa a concentração de anticorpo requerida para 50% de inibição da ligação de PD-1 a PD-L1 ou ligação a PD-L2.

[0080] Em experimentos realizados essencialmente como descrito, Anticorpo D bloqueia a interação de PD-1 com PD-L1 com uma IC50 de 0,30 nM, e a interação de PD-1 com PD-L2 com uma IC50 de 0,34 nM. Tabela 6: Ensaio de bloqueio de PD-1 humana por Elisa

Ligação a PD-1 humana em células CHO

[0081] A ligação de um anticorpo da presente invenção a PD-1 humana pode ser medida num ensaio de citometria de fluxo.

[0082] Células CHO (0,2 x 106) são incubadas com anticorpo de 200 nM titulado 19x por um fator de 2 até a menor concentração de 3,185 pM durante 30 min em PBS BSA 1% em gelo. As células são então lavadas 3x e são incubadas com um anticorpo secundário (marcado com PE, em uma concentração final de 5 μg/ml) em PBS BSA 1% durante 30 min em gelo (protegido da luz). As células são lavadas 3x e analisadas por citometria de fluxo. A citometria de fluxo é realizada em um sistema Accuri C6 (BD Biosciences) e as MFIs são calculadas no software C6. As EC50s são calculadas no software Graphpad.

[0083] Em experimentos realizados essencialmente como descrito neste ensaio, Anticorpo G liga-se a PD-1 de modo dependente da dose, com um valor de EC50 (n = 1) de 1,756 nM, e pembrolizumab liga-se a PD-1 com um valor de EC50 (n = 1) de 1,429 nM. Anticorpo D liga-se a PD-1 de modo dependente da dose, com um valor de EC50 (n = 1) de 0,9784 nM, pembrolizumab com um valor de EC50 (n = 1) de 0,9510 nM e nivolumab com um valor de EC50 (n = 1) de 0,9675 nM. Anticorpo D e Anticorpo G ligam-se com uma EC50 similar à de PD-1 humana, do mesmo modo que nivolumab e pembrolizumab sob essas condições.

Bloqueio de PD-1 humana a PD-L2 em células CHO

[0084] A capacidade de um anticorpo da presente invenção bloquear ligação de PD-1 humana a PD-L1 e PD-L2 pode ser medida por citometria de fluxo.

[0085] Células CHO (0,2 x 106) são incubadas com o anticorpo experimental 100 nM durante 30 min em PBS BSA 1% em gelo. As células são então lavadas 3X e incubadas com PD-L2 ligado a NHS- FIuoresceína( Promega) em PBS BSA 1% durante 30 min em gelo (protegido da luz). As células foram lavadas 3x e analisadas por citometria de fluxo. Citometria de fluxo é realizada em um sistema Accuri C6 (BD Biosciences) e a intensidade média de fluorescência (MFI) é calculada no softwarede C6.

[0086] Em experimentos realizados essencialmente como descrito neste ensaio, Anticorpos D e G no formato IgG1, expressos em levedura, bloquearam a ligação PD-L2-FITC humana, resultando em uma MFI de 24.697,7 e 31.390,5, respectivamente, em comparação com IgG de controle, o que resultou em uma MFI de 182.959,1. Pembrolizumab e nivolumab resultaram em menos bloqueio da ligação de PD-L2 a PD-1 do que Anticorpos D e G, com MFIs de 46.245,9 e 54.509,8, respectivamente. Tabela 7: Bloqueio de PD-1 humana em células CHO

Reação de Linfócitos Mistos

[0087] O bloqueio de sinais de PD-1 por anticorpos da presente invenção pode ser avaliado medindo a libertação de sinais inibitórios durante a ativação de células T. Os níveis de certas citocinas, tal como IL-2, deverão aumentar se a proliferação de células T for promovida por tratamento com anticorpos da presente invenção.

[0088] 2 x 106 de PBMCs são plaqueados por poço em uma placa de cultura de 6 poços ou frasco de cultura de tecido T25 em meio de células T completo. As células são incubadas durante 2-3 horas, para permitir a aderência de monócitos. Se a aderência for insuficiente, é usado meio sem soro. Células não ligadas são removidas por agitação suave do frasco com meio fresco 3X.

[0089] DCs mieloides imaturos são gerados por cultura de monócitos (1 x 106 células/ml) de PBMC em meio X-VIVO 15 contendo soro AB 1%, HEPES 10 mM, β-Me 50 μM, IL-4 (1.000 U/ml) e GM-CSF (1.000 U/ml), ou 25-50 ng/ml de cada um. Após dois dias, meio fresco suplementado com IL-4 e GM-CSF é adicionado. No 5° dia, as células são congeladas ou maturação é induzida por adição de um coquetel de estimulação contendo rTNFa (1.000 U/ml), IL-1b (5 ng/ml), IL-6 (10 ng/ml) e PGE2 1 μM durante 2 dias sob uma densidade celular de 3 x 105 células/ml.

[0090] Isolamento de células T é realizado de acordo com as instruções do fabricante no kit de isolamento de células T Untouched CD4+ (Invitrogen). Um ímã equipado com um suporte para tubos de 1,5 ml é utilizado para remover grânulos magnéticos indesejados (QIAGEN).

[0091] 100.000-200.000 de células T isoladas são misturadas com 10.000-20.000 de moDCs alogênicos em um volume total de 200 μl em placas de cultura de tecido de fundo redondo de 96 poços durante 4-5 dias a 37°C. As células T são estimuladas usando DynaBeads anti- CD3/CD28 numa proporção de 3:1 (células:grânulos) como controle positivo; os grânulos são preparados de acordo com as instruções do fabricante. Anticorpos de teste são adicionados no início da MLR e incubadas durante todo o período de cultura.

[0092] Detecção de IL-2 e IFN-Y é realizada de acordo com as instruções do fabricante (eBioscience). Medições de DO são determinadas em um sistema Multiskan FC (Thermo).

[0093] Em experimentos realizados essencialmente como descrito neste ensaio. Anticorpo D em cada concentração aumentou IL-2 mais que nivolumab e pembrolizumab. Anticorpos D e G resultaram em um aumento comparável de IFN-Y com nivolumab e pembrolizumab. Tabela 8: Mudança dupla de secreção de IL-2 versus controle de IgG

Tabela 9: Mudança dupla de secreção de IFN-Y versuscontrole de IgG

Sequências de Aminoácidos e Nucleotídeos SEQ ID NO: 1 (PD-1 humana) MQl PQ A P W P V V W A VLQ L G WRPGWF L DS PDRP WNP •’ T FSPAL LWTEG DN ATFT CSFSNTSESFVUíWYRMSPSNQTDKLAAFPEaRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFJI MSWRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLR AEUIVTERR AEVFTAEIPSPSP RPA GQFQ1LWGWGGL LGSLV LLV WVLAV ICSRAARG [ iGARRTGQPLKFDPSAVI* VFSVD YGELDFQWREKTPEPPVPC VPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARKGSADGPR SAQP[.RPr.DíilK'SWPl. SEQ ID NO: 2 (HCDR1 dos Anticorpos A, B, C, D, E e F) KASGGl FSSYAIS SEQ ID NO: 3 (HCDR1 dos Anticorpos G, H e I) KASGGTLSSYA1S SEQ ID NO: 4 (HCDR2 dos Anticorpos A, B e C) I [JPMFGTAGYAQKFQG SEQ ID NO: 5 (HCDR2 dos Anticorpos D, E e F) LIIPMFDTAGYAQKFQO SEQ ID NO: 6 (HCDR2 dos Anticorpos G, H e I) L. 11P M }■ GA A G Y AQ RFQG SEQ ID NO: 7 (HCDR3 dos Anticorpos A, B e C) ARAEYSSTG FDY SEQ ID NO: 8 (HCDR3 dos Anticorpos D, E, F, G, H e I) ARAI USS FGTFDY SEQ ID NO: 9 (LCDR1 do Anticorpo A - Anticorpo I) RASQGISSWLA SEQ ID NO: 10 (LCDR2 do Anticorpo A - Anticorpo I) SAASSI QS SEQ ID NO: 11 (LCDR3 do Anticorpo A - Anticorpo I) QQAMILPF I SEQ ID NO: 12 (HCVR dos Anticorpos A, B e C) QVQLVQSGAEVKKPG9SVK.VSCKASGGTF9SYAISWVRQAPGQGLE WMGLlffM FGTAGY AQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAE YS S TGTFDY WGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 13 (HCVR dos Anticorpos D, E e F) Q VQLVQSG A E VKKPGSSVK VSCK ASGG TFSS Y AISWVRQ A PGQGI EW MG I IIPM FDTAGYAQKFQGR V AITVDESTST A YMF E^SSLRSEDTAVYYC ARAF EdSSTGTFD Y WGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 14 (HCVR dos Anticorpos G, H e I) Q VQLVQSG AE VKKFGSSVKVSCKASÚL j TLSSYAISWVRQ APGQGLE WMG L11 PM FG AAG Y A Q RFQG R V TITA DES AST AY M ELSSLR SEDTA VYYC ARAEIIS STGTFD Y WGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 15 (LCVR do Anticorpo A - Anticorpo I) DIQMTQSPSSVS ASVGDRVTTTCRASQGISS WLAWYQQKPGKAPKL LISAASSLQS G v ESR FSG SG SG T DFTLTISS LQP E ] IF AT Y YCQQA N EILPFTF GGGTK V EIK SEQ ID NO: 16 (HC do Anticorpo A - S228P IgG4) QVQI.VQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAÍSWVR QAPGQGLEWMGJ TTPM Ft 1 TA GY AQKFQGRVT1TA DESTST AYMELSSL R SEDTA V Y YC A R A EYS STGTFDY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPI -AFCSRSTSESTA Al GCI. VKDYFPEPVTVSWNSG AJ TSGVH TFPAVLQSSGLYSLSSVVTVFSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVF SKYGPPCPPCFAPF F LGGPSVF E F PPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQF NWYVDGVEVHN AKTKPREEÇ FNSTYRWS VLTVLHQDWLNGKE YKCKVSNKG LFSSfl EKTISK AKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTT LV KGFY PSD[ A V EWES NGQPENNYKTTPP VLDSDGSF FLYSRLT V DKSRWQEGNVF 5CS VMH E A LHN EIYT QK$L$L$LGK SEQ ID NO: 17 (HC do Anticorpo D - S228P IgG4) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASOGTFSSYA[SWVR Q A PGQGJ EWMGLTTPM FDTAGYAJQKFQGRV AITVDESTSTAYMELSSLRSE [3TAVYYCARAE IISSTCSTF D Y WOQO T L VTVSS ASTKGPSVFP L A FCS R STS E ST AA LC > C ’L VK D Y FPE PV TVS WN S G ALTSG VFITFPA VLQSSGLYS LSSWTVPSSSLC STKTYTCNVDIIKPSNTKVDKRV ESKYGPPCPPCPAPEFLOGPS V F LFPPEPKDTLMISRT P E VTCWVDVSQEDPEVQ FNWYV1X3 VEVHNA KTKFREEQFNST Y R. WS VLTVLIIQD1VLNGKEYKC KVSN K GLPSSIE. K 7ISKAKGQPR E PQV YT].P PSQ E EM T K N QV SI .Tt ’ L V KG F Y PSE ] A VE WE SNQQPENNYKTT PPVLDSDOSFFLYBK LTV DKSRWQEGNVFSCS VM I EA LHNHY rQKSLSLSLGK SEQ ID NO: 18 (HC do Anticorpo G - S228P IgG4) Q VQLVQSG AEVKKPGSSVRVSCKASGGTLSSYAISWVRQAFGQGLEWM GLIIPM F(3AAGYAÇRFQ( iRVTITADESASTAYMI.LSSLRSEZJ ÍAVYYCARAEIISSTGIFD Y WGQQT L VTVSS ÃSTKGPS VFPLATC SHSTSESTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNS G A LTSG VI ITI TA VLQSSG L Y S LSS V VT V PSS S L G TKTY TC N VD11K PSNTK V D K R V ESKYGPPCP PCPAFEFLGÜPS VF LFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVWΠVSQEDF EVQ FNWYVDGVEVHNAKTKFREEQFNST Y RWS VLTVLI [QD WLNGKEYKÜ KVSN K GI I ‘ S SIE K TISK AKGQPR E PQ V YTL P PSQ EEM T K N Q V S t. TC'L V KGF Y ESDI A V E WE SN GQ PI N Y KTT P P V LDSDGSFF L Y S R LT V DKS R W'QEGN V F SCS VM 11E A LI IN11Y TQKSLSLSLGK SEQ ID NO: 19 (HC do Anticorpo B - PAA IgG4 des-Lys) Q VQLVQSG A E VKKTGSSVK VSCKASGGTFSSYA1S WV RQ A PGQGI EWMGL TTPM FGTA G Y AQK FQCTRVT [TA D ESTSTAYMELS SI R SEDTA VY YCARAF.YSSTGTFDY WGQGTLVTVSSASTKGFS VETLAPCSRSTSESTA ALGC [ VK DYFPE PVT VS WNSG ALTSGVHTFPA VLGSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTK.TYTCNVDHKFSNT K.VDKRVE SK Y<. PPCPPC P APE A AGGPS V F [. F PPK PK DT L MIS R.T ?E VTC V V V D VSQ E DP E VQI • N WYVDGVEVHNAKTKPKEEQFNST YRWSVLTVLIIQD WLNGKEYKCKVSNKC LPSSJ EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCL VKG FYPSDIA VE WES NGQPENNYKTTPP VL DSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVM] IEALHNHYT QKSLSLSLG SEQ ID NO: 20 (HC do Anticorpo E - PAA IgG4 des-Lys) Q VQLVQSGAEVKKPGSS VKVSCKASGGTFSSY AIS WVRQ APGQGL E WM GL11P M FDTAGY AQ KFQG R VAITV D ESTSTAY MI • CSS LRSI • DTAVYYCA R A E11S STGTFD Y WGQGTLVT VSSASTKGPSVFPLA PCSRSTSESTAALGCL VKDYFPEPVT VS WNS GA L TSÜ VI1TFPA VLQSSGLYSLSS WTVPSSSLG' [’KTYTC NV D J LKPSNTKVDKRV ESKYGPE’CPPCPAPEAAGGPSVFLFPE’KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQ FN w Y V| X VEVHNAKT K.PRE EQFNSTY RWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK GLPSSlE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSQ E EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV Ê WE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRL FVDKSRWQEGNVFSCSVM I lEALHNl IY TQKSLSLSLG SEQ ID NO: 21 (HC do Anticorpo H - PAA IgG4 des-Lys) Q VQL VQSGAEVKKPGSS VR VSCK ASGGTLSS Y A IS WVRQ APGQG1,E WMGI IIPM FGAAGYAQRFQGRVTITADESAS TAYMELSSLRSEDTAVYYCARAEE ISSTGTFD YWGQGTL V T VSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSE STAALGCL VKDY F PEFVTVS WNS GAI FSGVHTFPAVLQSSG1 YSLSSWTVPSSSIGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRV ESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLM1SRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQ FNWYVDG VEVHNAKT KPREEQE NSTYRWSVLTVLl ÍQDWLNG KE YKCKVSNK GLPSSlEKTKKAKGQPR EPQVYTLPPSQE ÊMTKNQVSLTCLVKGF YPSDlA V HWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMI lEALHNl IY TQKSLSLSLG SEQ ID NO: 22 (LC do Anticorpo A - Anticorpo I) □IQMTQSPSSVS AS VG QRVT ITCRASQGlSS WLAWYQQKPGKAPKL LISA ASS LQS GVPSRFSGSGSGTΠFTLTISSLQPE DF ATYYCQQAN HIT FT FGGGTKVEΠCRTV A A PSVFIFPPSΠEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQ W K VΠNALQSGNSQESVTEQD SK DST YSLSSTL TLS K ADV I ■ (CH KV Y AC I • VT EIQG LSSP VTK S FX RG EC ’ SEQ ID NO: 23 (HC do Anticorpo C - VK1-12 IgG4) QVQLVQSGA EVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYA f SWVRQAPGQGI EWMGL TTPM FGT AGYAQKFQGR VTITA DESTST A YMELSSLRSEDT A VY YCARAEY8STGTFDY WC iQGT LVTVSS ASTKGFS VFPLAPCSRSTSESTA AIXJCLVKDYFPEPVTVSWNSG Al.TSGV] I rFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTKTY-TCNVDIIKPSNTKVDKRVE SK YÚI» I’CPSCP APE F LGG PS VFI. FPP K PK DTL MISRTPE VTC V V VD V SQE DPI •: VQF N WY VDGV Ei VHNAKTKPR EblQFNST YRWSVLTVL HiQD WLNGKEYKCKVSNKG LPSS J EKΠS KAKGQPR EPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVE WES NGQI^ENNY KTTPPV L DSDGSFFLYSRLTVDKSRWQLGNVFSCSVMH L ALHNH YJI QKSLSLSLGK SEQ ID NO: 24 (HC do Anticorpo F - VK1-12 IgG4) Q VQLVQSG AEVKKPGSS VKVSCKASGGTFSSY Al SWVRQ APGQGL E WMGL11P M FDTAGYAQKFQGRV AITVDEST5TAYMELSSLRSEDT AVYYCARAE] ISSTGTFD YWGQGTLVTVSSAS FKGPSVF PLAPCSRSTSESTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNS GALTSGVII FPAVLQSSG LYSLSS VVTVPSSSLGTKTÍTCNVD] IKPSNTKVDKRV ESKYGPPCPSCPAPEFL ,G MISRT PEVTCWVDVSQEDPEVQ FNWYVTCVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTV LI IQDWLNGKEYKCK.VSNK GLPSSl E KTISKAKGQP REPQVYTLPPSQ E EMTKNQ VSLTCLVKGFYPSD1 AV E WE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFL YSEtLTVDKSRWQEGNVFSCSV.VJ JI E ALHN11Y TQKSLSLSLGK SEQ ID NO: 25 (HC do Anticorpo I - VK1-12 IgG4) QVQLVQSGAEVKKPGSSVRVSCKASGGTLSSYAISWVRQA PGQGl EWMGIIIPM FGAAGYAQRFQGRVTITADESASTAYMELSSLRSED TAVYYCARAEH&STGEFD YWGQGTI VTVSSASTKC■ PSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKI)YFPEFVTVSWNS GA] rSGVIl FPAVLQSSGLYS LSS WTVPSSSLG1 KTYTCNVDHKPSNTKVDKRV ESKYGiPPCPSCPAPEFL GGPSVFI FPPKPKDTLMISR7 PEVTCVWDVSQEDPEVQ TO WWLXi VEVHN AKTKPREE^ SrYRWSVLTVLHQDWLNG KE YKCKVSNK GLPSSIEKnSKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSI Cl VKGFYPSI5IAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFL YSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVM H E ALHNLIY TQKSLSLSt.GK SEQ ID NO: 26 (DNA de HC do Anticorpo A - IgG4 S228P) CAGGTGCAGC TGG1 GCAGAGCGGCGC1GAGGTGAAGAAGCCTGGCTCCAGCG IGAAGGTG I CC FGCAAAGCCTCCf K KXSGCACC I CAGCTCCTACGCTATCAGC FGGGTGAGGCAGGCTCCTGGCCAGGGAC FGGAGTGGATGGGCC FGATCATCC CCATGTTCGGCACCGCTGGCTACGCCCAG AAGTTCCAGGGC AGGGTG ACC Al CACCGCCG AOGAGTCC ACCTCC ACCGCCTACATGG AGCTGTCCTCCCTGAGGT CCG AGGAC ACCGCCGJGTACTACTGTGOC AGGGCCG AGT ACTCCTCC AOCGG C ACCTTCG A CT ACTG( i (SC iCX’AG< it] CAC AC I’t ’(i T< 1 ACCG TCAGCTCCGCC AGC ACAAAGGGCCCCAÍsec ;TGTTTCCCCT(ÍGCCCCTTGc AGCAC i G A GCAC AT I • CG AGAGCACCGCTGCCCTGGGATGTCTGGTGAAGGAÇTAT π CCCCGAGCCCGT GACAGT GAGCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGA t 3 TGCÁCACCTTCCCT GCCGTGCT’GCAGAGCAGCGGACTG ITACAGCC I’GTCCAGCG TGGTGACÀG rue CTTCCTCCAGCC7CGGCACA A AG ACCFACACCTGCAACGTGGACCACAAGCC CTCCAACACCA A AGTGGAC AAGCGGGTGGAAAGC AAGTATGGACCCCCTT GC CCTCCTTGTCCCGCCCCTGAGTIXXTGGGAGGCCCTTCCGTCTTCC I GT] CCCC CCC A AG COCAAGG ACACACTC Al (i A TTTCC AGG ACCCC OGAGGTGACCTG (. G rCGTGGTCGACGTG AGCC AGGAGG ACCCCG AGGTGC AGTTT A ACTGGT ATGT GGACGGCGTGGAGG IOCACAATGCCAAAACCA AGCCCAGGGAÍ TGAACAGI I CAACTCCAOCTATAGGGTGGTCAt IC( 1TGCTGACCG IU IGCAC £ A<.GAU GG CTGAACGGAAAGGAGTATAAGTGCAAAGTC I CCAACAAGGGCCTGCCTAGCA GCA TCGAGAAG ACCATCTCCAAAGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCOCAGGT r rATACTCTGCCCCC'r rCCCAGGAGGAGATGACCA AGAATCAGC. Tf - TOCCTGA CCTGCCTGG TG A A AGGCTTTT A CCCCTCCG ACATCGCTGTGGAG TGGG AG AGC A ATGGOCAGCCCGAG A ACAACTACAAG ACC ACC COCCCCGTGC 'TGG. MAGCG ATGGCAGCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTGACCG ÍGGATA AGAGC AGGTGGCA GGAGGGCAACGTG FT FTCCTGCrCCGTGATGCATGAGGCCCTCCACAACCATT ACACACAGAAAAGCCTαAGCCTGAGCC F<JGGCAAGTGATGA SEQ ID NO: 27 (DNA de HC do Anticorpo D - S228P IgG4) CA AGTGC AGCTGGTGC AGTCCGGCGCTG AGGTG A AA A A AOCCGGA rCCTCCG TCAAGGTCrTCCTGTAAAGÜCAGCGGOGGCACA - I CAGCAGC I ACGCCATC I C C FGGGTGAGGCAAGC FCCTGG AC AGGGCCTGGAATGGATGGGOCTGATCATC CCCATGTTCGAC ACCGCCGGCTACGCTCAGAAATTCC AGGGCCGGGTCGCCA TTA CA GTGG ATG AGAGCACCA GC AC AGCCT AC ATGG AGCTC A GCTCCCTGAG GAGCGAAG AT ACCGCCGTCTACTATTGTGCCCGGGCTG AGCATAGCAGCAOC GGCACCT FCGACTATTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACAGFCAGCTCCGCTTC CACAAAAGGCCCCAGCG rGTTTCOCCTGGCCOCTTGTAGCAGGTCCACCTCCG AAAGCACACiCCGCTC GGG C FGCCTGGTCAAGGA FAC I IL T. (. CGAGCCCGT GACCGTGTCCTGGAATAGCGGC GCTCTC ACATOCGG AGTGC AT ACCTTTCC ’ TG CCGTGCTCCA GTCCTCCGGCCTG FACTCC C TGAGC TCCGTGGTGACCGTCCCT rCCAGCTCCCTGGGCACCAAGACCTAT ACCTG TAACGTGC TACCACAAGCCCTC C A A T ACC A AGGTGGAT A AGCGGGTCG AGTCC AA GTACGG ACCCCCTTGCCC'I'CCTTGTCCTGCTCCTGAATTCCTC GGCGGACCTAGCti J [. I - FCTCTTCCCCCCC AAGCC CAAGGATACCCTGATGATCTCCAGGACOOCOGAGGTGACATGCG I CC . 11 .<? FCGA I (IT< i I CCCAGGAGGATCCTGAAC ■ I GCAÍ i I CAACTGG I ACGTGGA CGGCGICGAAGTGCATAACGCCAAGACCAAGCCCAGÍ i<xAG( JAGCAGITCAA CTCCACt. I ATCGGG I GG'i GAGCGTGC TGACCGTGCTGCATC ACiGACTGfiCTCA ACGGCAAAGAC । rACAAGTGCAAGG rcTCCAACAAGGGACTCCCCTCCAGCAT CG AG A AG ACC.Al I’AGCAAGGCCAAAGGCCAACCCAGGGAGCC ICAGGTATA I'ACG CTGCC CCCC A GCC AGG AG G AG Al G ACC A A A A ACCAGCi TCAGCCTCACC1' GTC TOGTC AAGGGCTTCTACCCTAG CGACATTGCFGTCG AGTGGGAGAGCAA CÜGCC AGCCCG A G A AC AACTA T A A A ACC ACCCCC CCTGTCCTGG ACTCCG AC GGATC f 'T IT T IT T Ft J FAC FCCAGGC' FGACAGTOGACA AGTCÍ CGGTGGCA AGA GGG AAACGTCTTCTCCTGCTCCG TG ATGCACXJ A AGCTCT CC ACA ACCACTA C A CCC AG A AGA G CCTCAGCCTG TCCCTG (.GC A A A TG ATG A SEQ ID NO: 28 (DNA de HC do Anticorpo G - IgG4 S228P) CAAGTCCAGT TCGTGC ^AAGCGGAGCC GAGGTGA AGAA ACWGGCAGCTCCG TÍ; CGG Gi x; AGÍ T GT A AÍ SGCCTCCGC ; AG GC ACCCTG TCCAGC T ATÍ Í CT ATC A<Í CTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGACAGGGCCTGGAATGGATGGGACTGATCATC OCT A TGTT TGG AGCCGCCGG CTATGCTCAGAGGTTCCAGGG CCGGGTCACCAT C XCCGCTGACGAGAGCGCCAGCACCGCCTAIATGGAGCTGTCÍ ICCCTGAGG AGCGAGGATACCGCTGTCTACTACTGTGCCAGGGCCGAGCACTCCTCCACAG GAACCT TCGAC 1'ACTÜGGGCCAGGGCACCC 1'GGTÜACAGTGTÜCTCCGCC ICC Aí C A AGGGCCC Tt CCG 1 GTTTCCTC 1 GGC TCCTTGC [ CCCÜ G ICC ACC AG CG A GTCC AC AG CCG CTC [ ü GGC [ GTCTGG IGAAGGACTA I ITCCCCG AGCC TGT G A CCGTCAGCTGG A A I AGCGGCGCCC [’G ACC [CCG GAGTG CACACATTCCCCGC CGTCCTGCAGAGCAGCGGACTCTACTCCCTGAGC I CCGTG C: [ G ACCG'TGCCTT CCAGCAGCC TGGGAACCAAÜACC TACACCI GCAATGTGGACCACAAACCCAG CA A CA ( CA AGGTGG ATA AGCGGG TGG A ATCC A AGTACGGCCC IT Ct TGTCCC CCTTG TCCC GCTCCCG A ATTCC TGGGCGG A OCT AGOGTG T ICCTGTTTCXCCCT AAGCCCAAGGATACCC i (SATGATCTCCAGGACCCCCGAAC i TCACC FGCG PCG rCGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCTGAAGTCCAGT rTAATTGGTACG ÍOGAC GGCGTGG AGGTGC A C A AOGCCA AG AC A A AGCCTCGGGA GG AGOAGTTCA AC AGCACCTACA G GGTGGTG AGCGTGCTG ACCGTGCTGC ACC AGGACTGGCTGA ACGOCAAAGA£ 3 TACAAGTGC AA GGTG AGC A .AC A AGGGCCTGCCCTCCTCÍ'AT C<IAGÀAGACCATC TCCAACIGCCAÀAGGCCAGCCGAGGGAGCCCCAGGTGTA CAÍ X ’CTGCCCCCT AG C(' AGÍ i AG 0 Aí i ATÍ i ACC A Aí 3 A ACC At SGTCTCCCTG ACC ■ TGCCTGt 71X 5 A AG GG Al [X 1 ATCCCAGCG AC A ITGCCí i ÍX í G Aí iTÍ ■ < i G AíiTCCA ACGOCCAGCCCGAO A AT A AC TACAAí i ACC AC X X CCCCTG TGCTGGACAGCGA CÍX i GAG( T TCT [X X ’T GTATTCCCC 3GCTÍJACCGTCGACAAGTCCCG GTGGCAGí i AGGí 1CAACG Tí; 1 TTAGCTGCAGCí 1T<; ATGCACC; A AGCCCTCÍ: AÍ : A ACC ACT A TACCCAGAAGAGCCTG' 1'CCCTÍ i ICCCTGÜ ÜCAAGTGATGA SEQ ID NO: 29 (DNA de HC do Anticorpo E - PAA IgG4 des-Lys) CAGGTQC AtXTGGTCC AGTCAGGOGCTG AAGTÜ AAGAAGCCCGGC AGCTCCG TC ÍAAOGTC;rcT TGCAAGÜCCAGCGGCGGAACAT FCTCCAGTTACGCCATCTCT TGC; G TGCGGCAGGCKXTAÍÍGCCAÜGGCCTGGAGTG GATGGGCC TGATCATCC CCATGTTCGACACCGCCGGG TA TGC CCAGAAGTTTCAGGGCAG AGTüGCAAT CACAÍ i TGGACGAGAGCACCTOCACAGCCTACATGGAGCTG rCTAGCCTGAGA Tí ’ CG AGG AT ACCGCCGTC JT ATT A TTG r GCCCGGGCCG A AC AC AGCTCT ACAG GG AC [T TCG AC IA CTG GGGCC AGÜ GCACCCTG GTü AC AG 1GTCCK TGC [ A GC ACC A AGGGCCC ATCGG1C [• rCCCÚC TCG CGCCCrGt • rc CAÚG AG CACC [’CCG A GAGCACAGCCGCCCFGGGCTGCC FGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACXGGTG ACGGTG TC GTGG A AC TCAGGC GCCCTG AC C. AGC GGCGTGCA CA CCTTCCCGG CTG TCCTAC AGTCCTC AGG ACTCT ACTCCCTC AGGAGCGTGGTGACCGTC.CCC rc ’ CAGC AGCTTGGGCA CG AAG A CCTAC ACCTGCAACGT A GATC AC A AGCCCA GCAACACCAAGGTGGACAAGAGA GTTG. GTCC AA ATATGGTCCCCCATGCOC ACCCTGCCCAGC ACCTG AGGCCGCCGGGGGACC ATC AGTCTTCCTGTTCCCCC CAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTQAGGTCACGTGCGT GGTGG TG G ACGTGAGCCA GG A AG ACCCCG AGGTCC AGTTC A ACTGGTATGTT GATGGCG FGGAGG TGCATAA rüCCAAGAC.AAAGCCGCGGGAGüAGCAGTTC A AC AC SC AC( i T ACCC iTGT í SGTCAGCGTC C TC ACCGTÍ CTG C AC CA C XIACTCJG CT G AACGGC A AC >ü AGTA C A AG 1GC A AG G [ C TCCA AC A A AGGCC TCCCGICC TCC ATCG AGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCG AGíAGCCACAGGTGT AC ACCCTGCCCCC ATCCC AAGAAGAAATG ACCAAAAACC AAGTC AGCCTGAC CTGCCTGGTCAAAGGC TCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAAAGC AATGt iGCAC }CC( ÍGAGAACAACTACAAGACCACGCCICCCGTGCTGGACTCOG ACGGC] CC I C I I CC I <TACTCCCG I C AACCí i (JGACAAGAGCAGÍ i TGGCAC ।GAGGGGAAT G'i CT rCTCATGCTOOGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTA CACACAGAAGAGCCT CTCOC l’G TC TCTGGGT SEQ ID NO: 30 (DNA de LC do Anticorpo A - Anticorpo I) GA CATCC AG ATG AC ACAGTC CCCTAGCTCCGTGTCCGCTTCCGTGGG AG AC A GGG TG AC A ATC ACATGCAGGGCTTCCC AGGGC' ATCAG<AGCTGGCTGGCTTG GTATC AGCA G A AGCCCGGCA A GGCCCCCA AGCTGCTG ATC A GCGCTGCTAGC rCCCTGCAGTCCGGA<>TGCCTTCCAC i G Í T(' I’CCG GCTCCGG A AGCGG CACCGA CTTCACC'(■ I’GACCArCTCCAGCCTGCAGCCCGAGGATTTC GCCACCTACTACT GCC AAC AGGCCAACC ACCTGCCCTTCACCTTCGGCGGCGGC ACC A AGGTGG A G ATC A AC3 AGG ACCGTG G CC?G C CCC X "11XZGTG ""I 'C A'f (T "I “I (X'CXX’C AC iCG AC(, AGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCC ICXGTGGTGTGCC'I’GCTGAACAACTFCTA π"CCCG GG \ GGCCA AGGTGCAGTGGA AGGJCGACAATGCCCTGCAGAGCGGC AACTCCC AGG AGAGCGTG ACCGAGCAGG ACAGCAAGG ACTCC ACCTACTCOC ’ IT i AG CTCC ACCGTG AC? ACTG TCC AAG CJCCG ACT A C G AC! A AC SCACA AG GTG 7 A CGCCTGCGAGC iTC iACACACCAGC i( iC.’CTGAGCTCCCCCGTC i.ACCAACSTCX’TTC AACAÚGC GCC AC ÍTC XTG ATC i A

Claims

1. Anticorpo que se liga a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia leve (LC) e uma cadeia pesada (HC), em que a cadeia leve compreende regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve LCDR1, LCDR2 e LCDR3 e em que a cadeia pesada compreende regiões determinantes da complementaridade de cadeia pesada HCDR1, HCDR2 e HCDR3, em que LCDR1, LCDR2 e LCDR3 consistem nas sequências de aminoácidos RASQGISSWLA (SEQ ID NO: 9), SAASSLQS (SEQ ID NO: 10) e QQANHLPFT (SEQ ID NO: 11), respectivamente, e em que HCDR1, HCDR2 e HCDR3 consistem nas sequências de aminoácidos KASGGTFSSYAIS (SEQ ID NO: 2), LIIPMFGTAGYAQKFQG (SEQ ID NO: 4) e ARAEYSSTGTFDY (SEQ ID NO: 7), respectivamente; ou em que LCDR1, LCDR2 e LCDR3 consistem nas sequências de aminoácidos RASQGISSWLA (SEQ ID NO: 9), SAASSLQS (SEQ ID NO: 10) e QQANHLPFT (SEQ ID NO: 11), respectivamente, e em que HCDR1, HCDR2 e HCDR3 consistem nas sequências de aminoácidos KASGGTFSSYAIS (SEQ ID NO: 2), LIIPMFDTAGYAQKFQG (SEQ ID NO: 5) e ARAEHSSTGTFDY (SEQ ID NO: 8), respectivamente; ou em que LCDR1, LCDR2 e LCDR3 consistem nas sequências de aminoácidos RASQGISSWLA (SEQ ID NO: 9), SAASSLQS (SEQ ID NO: 10) e QQANHLPFT (SEQ ID NO: 11), respectivamente, e em que HCDR1, HCDR2 e HCDR3 consistem nas sequências de aminoácidos KASGGTLSSYAIS (SEQ ID NO: 3), LIIPMFGAAGYAQRFQG (SEQ ID NO: 6) e ARAEHSSTGTFDY (SEQ ID NO: 8), respectivamente.

2. Anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia leve (LC) e uma cadeia pesada (HC), em que a cadeia leve compreende uma região variável da cadeia leve (LCVR) e a cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada (HCVR), em que a LCVR tem a sequência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 15, e a HCVR tem a sequência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 14.

3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a LCVR tem a sequência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 15 e a HCVR tem a sequência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 12.

4. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a LCVR tem a sequência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 15 e a HCVR tem a sequência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 13.

5. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a LCVR tem a sequência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 15 e a HCVR tem a sequência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 14.

6. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a LC tem a sequência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 22 e a HC tem a sequência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 ou SEQ ID NO: 21.

7. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que: (1) a LC tem a sequência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 22 e a HC tem a sequência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 16; (2) a LC tem a sequência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 22 e a HC tem a sequência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 17; (3) a LC tem a sequência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 22 e a HC tem a sequência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 18; (4) a LC tem a sequência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 22 e a HC tem a sequência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 19; (5) a LC tem a sequência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 22 e a HC tem a sequência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 20; ou (6) a LC tem a sequência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 22 e a HC tem a sequência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 21.

8. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende duas cadeias leves e duas cadeias pesadas, em que cada cadeia leve tem a sequência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 22, e cada cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 ou SEQ ID NO: 21.

9. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que: (1) cada cadeia leve tem a sequência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 22 e cada cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 16; (2) cada cadeia leve tem a sequência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 22 e cada cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 17; (3) cada cadeia leve tem a sequência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 22 e cada cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 18; (4) cada cadeia leve tem a sequência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 22 e cada cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 19; (5) cada cadeia leve tem a sequência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 22 e cada cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 20; ou (6) cada cadeia leve tem a sequência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 22 e cada cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 21.

10. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que uma das cadeias pesadas forma uma ligação dissulfeto intercadeias com uma das cadeias leves, e a outra cadeia pesada forma uma ligação dissulfeto intercadeias com a outra cadeia leve, e uma das cadeias pesadas forma duas ligações dissulfeto intercadeias com a outra cadeia pesada.

11. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é glicosilado.

12. Processo para a produção de um anticorpo compreendendo uma cadeia leve que apresenta uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 e uma cadeia pesada que apresenta uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 20, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar uma célula de mamífero sob condições tais que o anticorpo seja expresso, e recuperar o anticorpo expresso, em que a célula de mamífero compreende uma molécula de DNA que compreende uma sequência de polinucleotídeos de SEQ ID NO: 30 ou sequências de polinucleotídeos degeneradas da mesma que codifica as mesmas sequências de aminoácidos, e uma sequência de polinucleotídeos de SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 29 ou sequências de polinucleotídeos degeneradas da mesma que codifica as mesmas sequências de aminoácidos, em que a célula é capaz de expressar um anticorpo que compreende uma cadeia leve que apresenta uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, e uma cadeia pesada que apresenta uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 20.

13. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, e um veículo, diluente ou excipiente aceitável.

14. Uso de um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento ou uma composição farmacêutica para tratar câncer.

15. Uso, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o câncer é melanoma, câncer de pulmão, câncer de cabeça e pescoço, câncer colorretal, câncer de pâncreas, câncer gástrico, câncer de rim, câncer de bexiga, câncer de próstata, câncer de mama, câncer de ovário ou carcinoma hepatocelular.