JPH0775544A

JPH0775544A - 核酸増幅反応を実施する装置、化学連鎖反応を実施する装置、変性、アニーリングおよびエクステンションプロセスを包含する核酸増幅反応を同時に実施する装置、ならびに核酸増幅反応を実施する方法

Info

Publication number: JPH0775544A
Application number: JP6177033A
Authority: JP
Inventors: Lawrence A Haff; エイ．ハフローレンス; Enrico Picozza; ピコッツァエンリコ; Will Bloch; ブロッチウィル; Robert Ragusa; ラグーザロバート; Joseph Dicesare; ディシザールジョゼフ; David Tracy; トレイシーデイヴィド; Paul Saviano; サヴィアーノポール; Timothy M Woudenberg; エム．ウードゥンバーグティモシー
Original assignee: Perkin Elmer Corp
Current assignee: Applied Biosystems Inc
Priority date: 1993-07-28
Filing date: 1994-07-28
Publication date: 1995-03-20
Anticipated expiration: 2021-03-29
Also published as: EP0636413A2; JP4119905B2; JP3759970B2; US5779977A; JP2005296017A; DE69429038D1; DE69429038T2; US5827480A; US6033880A; EP0636413B1; EP0636413A3; US5720923A; ATE208658T1

Abstract

(57)【要約】【目的】少なくとも１つの毛管中、反応混合物中で核
酸増幅反応、望ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）を実施する装置および方法を提供する。【構成】増幅反応に必要な熱サイクルを実施するため
に、試料を２つのサーモスタット付液体浴を通過する毛
管ループを通して循環させるか、毛管を２つの熱交換器
の間で交番に経路定めし、試料を管にたんに１回通過で
通すか、定置に維持した熱交換器の間で試料を移動させ
るか、あるいは毛管内に含有されている試料を通りすぎ
て熱交換器を自動的に移動または回転させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は熱サイクリングによる核
酸の増幅、とくにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のよ
うな増幅反応のための自動化装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）は、異なる
温度における若干のインキュベーションを包含するポリ
メラーゼ連鎖反応プロトコルのような、プロトコルによ
り特異的に構成された液体反応混合物を熱サイクリング
により増幅することができる。反応混合物は、増幅すべ
きＤＮＡ（標的）のような種々の成分および標的ＤＮＡ
の一部に対し相補するように選択された少なくとも２つ
のオリゴヌクレオチドプライマーからなっている。反応
混合物は、種々の緩衝液、酵素、およびｄＡＴＰ、ｄＣ
ＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰのようなデオキシリボヌ
クレオチド三リン酸をも含有する。二本鎖ＤＮＡ分子は
２つの相補的一本鎖に変性される。次いで、プライマー
は鎖にアニールし、次に、ＰＣＲにおいて、ヌクレオシ
ド一リン酸塩残基が、熱安定のＤＮＡポリメラーゼのよ
うな酵素の存在でプライマーに結合してプライマーエク
ステンション生成物をつくる。プライマーエクステンシ
ョン後、多数の二重らせんＤＮＡ分子が２倍も存在す
る。このプロセスを繰返し、毎度存在するＤＮＡ量がほ
ぼ倍加する。この結果は標的ＤＮＡの“増幅（ａｍｐｌ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎ）”として公知の、標的ＤＮＡの濃
度の指数関数的増加である。

【０００３】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、主と
して簡単で非常に融通性があり、かつ比較的低い操業費
を必要とするので、遺伝分析に対する驚異的成功である
ことが証明された。この成功のかぎは、熱サイクリング
の思想である：ＤＮＡ溶融工程、短かいプライマーをア
ニーリングして一本鎖を得る工程およびこれらのプライ
マーをエクステンドして二本鎖ＤＮＡの新しいコピーを
つくる工程の交番。

【０００４】ポリメラーゼ連鎖反応の方法論は、米国特
許第４６８３２０２号および米国特許第４６８３１９５
号に詳述されており、これらは引用により本明細書の内
容をなす。

【０００５】ポリメラーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲ）は、
小さいプラスチックの微量遠心管または試験管のような
使い捨て反応管中で実施され、これらの管は熱制御され
る熱交換器を含有する装置内に入れられる。これらの装
置の例は、米国特許第５０３８８５２号、米国特許出願
番号０７／７０９３７４号（１９９１年６月３日出願）
および米国特許出願番号０７／８７１２６４号（１９９
２年４月２０日出願）に記載されており、これらはすべ
て引用によってそれらの全体が本明細書の内容をなす。

【０００６】これら装置中の熱交換器は代表的には金属
ブロックである；しかし熱空気オーブンおよび水浴も使
用された。反応管内の反応混合物の温度は、混合物中に
変性、アニーリングおよびエクステンションを生起させ
るため周期的に変えられる。３つの別個のインキュベー
ション温度は、通例第１世代ＰＣＲ熱サイクリング適用
において使用された。これらは代表的には変性に対して
約９４℃、アニーリングに対して約５５℃、およびエク
ステンションに対しては約７２℃であった。最近、アニ
ーリングおよびエクステンションインキュベーションは
しばしば組合されて、２温度インキュベーション法（代
表的には変性に対して約９４℃およびアニーリングおよ
びエクステンションインキュベーションに対して約５０
〜６５℃）が生じた。しかし、最適のインキュベーショ
ン温度および時間は標的が異なると相違する。

【０００７】小規模の高速ＰＣＲ毛管装置も出現した。
たとえばアイダホテクノロジィ（ＩｄａｈｏＴｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ）は、反応混合物を毛管に入れ、次いで該
毛管を密封して、管内の反応混合物の温度が循環する熱
空気オーブンに入れる装置を導入した。類似のシステム
はウィトワー（Ｗｉｔｔｗｅｒ）等により“少量試料に
対し有効な熱伝達によるＤＮＡ増幅に必要な時間の最小
化”なる論文（ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｃｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ第１８６巻第３２８〜第３３１頁(１９９０
年））に記載された。細い毛管内に入れられた１００μ
ｌの試料が、加熱コイル、ソレノイド活性化ドアおよび
ファンを備えるオーブンに入れられた。空気は、熱伝達
媒体として使用された。非常に類似のシステムもウィト
ワー等により“熱空気による毛管内の自動化ポリメラー
ゼ連鎖反応”なるタイトルの論文（ＮｕｃｌｅｉｃＡ
ｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，第１７巻、Ｎｏ．１１、
第４３５３頁〜第５７頁（１９８９年））に記載されて
いる。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】ＰＣＲの体積は、反応
混合物が微量遠心管内に保存されていた、常用の加熱ブ
ロックまた液体浴熱交換ＰＣＲ装置の設計においては、
約１０μｌないし１．５ｍｌの範囲に制限されていた。
これらの体積を増大することは困難である。この困難
は、管に対する熱交換ブロック中のウエル（くぼみ孔）
の固定された大きさおよびすべてのウエルの間に均一な
熱伝達を達成することの困難さが、大きさが大きくなる
と漸増しかつ熱勾配の問題が一そう顕著になることによ
る。先行技術の反応容器は体積が増大すると、表面／体
積の割合が減少する。この変化が、各管内の反応混合物
の温度が迅速に変化する能力を減少する。それというの
も多くの熱交換は、管壁と試料ブロック中のウエルの壁
の間で起きるからである。

【０００９】先行技術の装置においては乏しい対流およ
び伝導により惹起される、ブロックに対し試料の温度に
実質的に漏れが存在したので、熱ランプが長かった。イ
ンキュベーション温度間の実質的な熱ランプ時間は、多
くの装置において使用される金属ブロックの大きい熱質
量のために生じる重要な温度勾配を防ぐためにしばしば
必要である。これらの温度勾配は、温度勾配に沿った幾
多の個所で添加される異なる試料に不均一な増幅を惹起
しうる。温度ランプを使用するための化学的または生物
学的理由は存在しない。

【００１０】毛管ＰＣＲ装置は、反応体積および試料収
納濃度を最小にすることができるので、迅速な熱インキ
ュベーショントラジションの利点を有する。かかる１つ
の装置は、米国特許第５１７６２０３号（発明者Ｄ．
Ｍ．Ｌａｒｚｅｌ）に記載されている。ラルズール（Ｌ
ａｒｚｕｌ）の特許は連続する毛管の閉ループまたはら
せん形コイル内に含有された液体試料の自動熱サイクリ
ング用のホィール形装置を記載する。管の各ループは３
つのサーモスタット調温ゾーンを通っている。試料は、
モータ付磁気系によりループを通して押され、該系にお
いては、回転中央アームの一端にある磁石が懸濁金属粒
子を含有する鉱油のスラッグ（Ｓｌｕｇ）を毛管を通し
て引く。スラッグは毛管内の試料に接するので、スラッ
グがループを通して試料を押す。モータ付系は、試料の
移動を所定のプロトコルにより調節するために制御され
たマイクロプロセッサであってもよい。

【００１１】

【課題を解決するための手段】ここでは、特定の共通の
利点を有する毛管ＰＣＲ装置の多数の実施形が提案され
ている。ここに記載した装置はすべて、微量遠心管とは
異なり、試料を保持するために薄壁毛管を使用する。こ
こで使用したような毛管は、３ｍｍよりも小さい内径を
有し、望ましくは内径が約１ｍｍ〜２ｍｍの大きさであ
る。これらの毛管は、ここに教示した実施形において
は、プログラマブルコンピュータ中へ供給された、特定
反応混合物の必要とするユーザ定義ＰＣＲプロトコルに
より加熱および冷却され、該コンピュータはまた、通常
の制御プログラミングを介してプロトコルを実行するた
め、試料処理（ｈａｎｄｌｉｎｇ）、流れ、速度、圧力
および温度を自動的に制御する。本発明の種々の実施形
の間の相異はＰＣＲ反応混合物を加熱および冷却するた
めに使用した異なる手段および反応混合物を移動させる
ために使用した異なる管および液体処理手段から起き
る。

【００１２】たとえば本発明の第１実施形は、反応混合
物を、２つの異なるサーモスタット付液体浴（１つは変
性温度、１つはアニール／エクステンド温度）を通る毛
管の連続ループを通して繰返し自動的にポンプ輸送す
る。付加的浴は、インキュベーション温度の数を増加す
るために加えることができる。

【００１３】第２実施形は、反応混合物を１つの毛管を
１回だけ、つまりシングル・パスで通す。毛管は、変性
温度に保たれた第１サーモスタット調温された熱交換器
とアニール／エクステンド温度に保たれた第２熱交換器
の間で前後に交番に通っている。また、アニール温度と
エクステンド温度が異なる場合、第３熱交換器を使用す
ることもできる。シングル・パス管を通して生成物捕集
容器中へ反応混合物を押出すために、容積形ポンプまた
は蠕動ポンプまたはシリンジが使用される。

【００１４】本発明の第３実施形は数個の液体浴配置中
の定置反応混合物を包含する。この実施形は、各試料に
対し単一ループの毛管を使用する。試料を含有するルー
プの部分は、反応室に封入されている。変性温度の熱い
液体は第１サーモスタット調温された液体浴からこの反
応室中へ圧送され、ここに変性インキュベーションの間
保たれる。アニール／エクステンド温度の液体は第２温
度安定浴から反応室中へ、アニール／エクステンドイン
キュベーションを実行するために第１温度安定浴から熱
い液体を除去した後に圧送される。このプロセスはＰＣ
Ｒプロトコルを完成するのに必要なだけ繰返される。

【００１５】第４実施形は２つまたは３つの温度安定液
体浴を使用し、それぞれの浴は液体が別個の導管を通っ
て絶えず循環する。各液体の流れは必要なＰＣＲインキ
ュベーション温度の１つにサーモスタット調温されてい
る。入力端に金網を備える単一の円筒熱交換室は、弁装
置を通して液体の流れに連結されている。金網は個々の
小さい毛管反応混合物容器を保持し、該容器は両端が、
熱交換室内の適所に密封されている。容器は、各毛管容
器の一端におけるシールが金網を通して嵌合するのには
大きすぎるので、金網により間隔を置いた関係または配
列に保持されている。弁装置は望ましくはコンピュータ
または他の自動化コントローラ下に、流れの１つを円筒
熱交換室を一度に通過させ、他の流れまたは２つの流れ
は該熱交換室を迂回してバイパスされるように選択する
ために使用される。たとえば、変性インキュベーション
を実施するためには、９４℃の液体の流れを熱交換室に
通すと共に、５５℃のアニール流れおよび７５℃のエク
ステンド流れは熱交換室を迂回する。

【００１６】第５実施形は、それぞれが変性およびアニ
ール／エクステンドインキュベーションに必要とされる
２つの温度の１つに安定化された温度を有する２つの金
属ブロックを使用する。端部の開いた薄壁の毛管は、こ
れら２つの金属ブロックの間および該ブロックを通って
いる。蠕動ポンプまたはプランジャーおよびシール装置
は、シリンジと同様、ＰＣＲプロトコルを実施するため
プログラミングされたコンピュータの制御下に、毛管の
一端に連結されている。ポンプまたはプランジャーは、
反応混合物を毛管中へ引込み、変性ブロックにより取囲
まれた区域中へ移動させるために活性化される、つまり
ブロックを変性温度に保ち、次いで反応混合物を毛管を
通して、アニール／エクステンド温度に保たれたブロッ
クにより取囲まれた毛管の区域中へ移動させる。このサ
イクルが、ＰＣＲプロトコルを完成するための必要な回
数繰返される。次いで、プランジャーはＰＣＲ生成物を
排出するために移動される。また、ブロック自体は、混
合物を熱サイクルするため混合物を含有する定置の毛管
に対して前後に移動させることができる。

【００１７】本発明による毛管ＰＣＲ装置の第６実施形
は、間隔を置いた金属の熱交換ブロックを使用する点
で、第５実施形と幾分類似である。この実施形は望まし
くは、１対の間隔を置いた熱交換ブロック、それぞれの
ブロックを通る複数の開放端毛管および自動化された試
料処理システムを有する。この処理システムは同時に、
各毛管の端部を反応混合物容器中へ挿入し、反応混合物
を毛管中へ吸上げ、次いで混合物は熱交換ブロックの間
で移動し、ＰＣＲ最終生成物を毛管から適当な容器中へ
排出する（すべてはコンピュータ制御下に）。その上、
処理システムは、毛管清浄化、すすぎおよび試料トレー
移動および持上げ機能を、すべてコンピュータ制御下に
実施するので、４８または９６試料のトレーは、必要に
応じて、グループで、たとえば１回に１２個、自動的に
熱サイクルすることができる。

【００１８】本発明の第７実施形は試料よりもむしろ熱
源を移動するように設計されている。この実施形は、可
動熱交換器（ｔｈｅｒｍａｌｈｅａｔｅｘｃｈａｎ
ｇｅｒ）を有し、望ましくは２つ、３つ、４つ、または
それ以上の軸方向に延びる放射状セグメントに分割され
た、円筒形の熱交換熱板（ｔｈｅｒｍａｌｐｌａｔ）
またはドラムを有する。各セグメントは、サーモスタッ
トにより変性、エクステンションまたはアニーリングの
ための適当なインキュベーション温度に制御されてい
る。２つだけのインキュベーション温度が要求されかつ
３つのセグメントが設けられている場合、第３セグメン
トはアニール／エクステンション温度から変性温度への
トランジションを促進するために使用することができ
る。同様に、４つのセグメントが設けられていて、２つ
のインキュベーション温度が必要とされる場合には、他
の２つのセグメントを、アニール／エクステンション温
度と変性温度の間でトランジションを双方向に促進する
ために使用することができる。

【００１９】それぞれのセグメントの弓形の外面は複数
の平行なみぞを有し、それぞれのみぞは毛管を収容する
ため整列されている。毛管は、望ましくは全部の管が１
つのセグメントのみぞの長さに沿って接するように経路
定めされている。処理装置も、第６実施形におけるよう
に包含されている。反応混合物を各毛管中へ吸込んで、
接触している円筒形熱交換セグメントに隣接する位置へ
もたらすために、蠕動ポンプまたはシリンジ型プランジ
ャーおよびシールアセンブリが使用される。次いで、Ｐ
ＣＲプロトコルが、円筒形熱交換板を、各セグメントが
望ましくは必要とされるインキュベーション時間毛管と
十分に接触している交番角位置の間で回転することによ
って実施される。

【００２０】ここに記載したすべての装置は、所望のＰ
ＣＲプロトコルを定義するデータを受取り、必要なポン
プおよび弁スイッチを操作するためおよび／または反応
混合物を加熱または冷却するのに必要な熱交換媒体の移
動を発生するための適当な制御信号を発することにより
プロトコルを実施するように適合された、ユーザプログ
ラマブルコンピュータ、たとえばパーソナルコンピュー
タ（ＰＣ）または通常の設計の制御装置を基礎とする内
部マイクロプロセッサにより、制御される。

【００２１】ここに記載したすべての装置は、反応混合
物をアニール／エクステンドインキュベーション温度と
変性温度の間で反応混合物を循環させるために、大きい
熱質量の温度を変える必要がないという利点を享受す
る。この簡易化が熱勾配の問題を減少し、装置の熱設計
を簡易化して、複数の反応混合物が全部、装置自体にお
ける不均一性により惹起される分散なしに、同時に同じ
ＰＣＲインキュベーションを受けることができるように
する。

【００２２】実質的の熱トランジエントを受ける本発明
の装置の主要部分は毛管壁である。装置のこれらの部分
の低い熱質量および高い熱伝導率のため、試料の非常に
迅速な熱サイクリングを実施することができる。ここに
記載した多くの装置における毛管の使用も、熱交換器設
計に対し処理される複数の試料間の温度の不均一性を最
小にする必要なしに、出来上った生成物の量を簡単に評
価できる。

【００２３】

【実施例】連続ループ毛管熱サイクラー図１に関し、本発明による毛管ＰＣＲ装置の第１実施形
が示されている。装置１０は２つの異なる熱安定な液体
浴を有し、それらの間で反応混合物が毛管ループでポン
プ輸送される。この実施形は約１ｍｌよりも大きい任意
の大きさの反応体積でＰＣＲが実施可能である。２つの
反応温度は、変性およびアニーリング／エクステンショ
ンインキュベーションのために使用される。それぞれの
温度におけるインキュベーション時間に関する完全な制
御は、ポンプ１２および各浴中の管長の比によって設け
られている。

【００２４】代表的な２温度ＰＣＲは、反応混合物を約
６０℃〜９５℃の間で１〜３００秒の範囲内の滞留また
はインキュベーション時間で循環することを包含する。
３つの温度安定液体浴は、３つの別個のインキュベーシ
ョン時間のために使用することができる。キム（Ｋｉ
ｍ）およびスミシーズ（Ｓｍｉｔｈｉｅｓ）は、“ヌク
レイックアシッドリサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ
ｓＲｅｓｅａｒｃｈ）”第１６巻、第８８８７頁〜第
８９０３頁に、中間“エクステンション”温度における
インキュベーションは不必要であることを教示する論文
を発表した。従って、図１の実施形は、この研究に基づ
き、２つの温度、１つはアニーリングおよびエクステン
ションのための３７〜７２℃の範囲内および１つは変性
のための８５〜９８℃の範囲内の温度だけを使用する。

【００２５】第１実施形は潜在的に反応管ループの最大
体積以外に上限を設けずに、約１ｍｌ以上の体積を有す
る分取的大きさのＰＣＲ用に設計されている。望ましい
標的ＤＮＡセグメントは、約１００〜１００００の塩基
対（ｂｐ）を有していてもよい。第１実施形は、ＰＣＲ
反応混合物に必要な最も高価な試薬、つまり２つのプラ
イマーおよび化学量論的制限の最適消費のために設計さ
れている。

【００２６】図１には、高温浴が１６で示され、低温浴
は１８で示されている。これら２つの浴は、２つの浴１
６および１８の間の熱の流れを最小にするために選択さ
れた絶縁層２０によって分離されている。浴１６はユー
ザ定義温度、望ましくは８５〜９８℃±０．１〜０．５
℃にサーモスタットにより制御されている。浴１８は４
０〜７０℃の間、望ましくは同じ許容差内のユーザ定義
温度にサーモスタットで制御されている。各浴は、熱均
一性を達成するために、混合羽根等のような通常の手段
による乱流混合を使用するができる。

【００２７】反応容器２２はある長さの比較的薄壁のプ
ラスチック毛管からなり、該毛管は、２つの浴の間の壁
を、液面下に沈んでいる、２つのＯリング２４および２
６を通して貫通するループを形成する。反応管２２の内
径およびその長さは、反応体積の理論的上限を確定す
る。良好な温度制御を達成するためには大きい長さの狭
い管が望ましい。

【００２８】低温浴１８内の液体中には４路弁１４が浸
漬され、液体流路を、反応混合物試料を反応容器２２中
へ導入し、出来上ったＰＣＲ生成物を取出すために変え
るのに使用される。浴１８内に位置定めされた蠕動ポン
プ１２も、反応混合物を、反応容器２２中、外およびそ
れを通して循環させるために使用される。ポンプ１２は
厳密に制御され、校正された流量を有する。蠕動ポンプ
が選ばれ、反応混合物はプラスチックのみと接触する。

【００２９】双方の浴中で使用される管が同じ内径およ
び外径を有する場合、各浴中での反応混合物の滞留時間
は、２つの浴中の管長の比によって制御される。一般
に、浴１６中で５〜１５秒の変性インキュベーション時
間を使用し、浴１８中で数分までのアニーリング／エク
ステンションインキュベーション時間を使用するのが望
ましい。この第１実施形では単一連続反応管２２が２つ
の浴の間で漏れ止めＯリングシール２４，２６を通り、
両端は４路弁１４に接続している。反応管が滑動しうる
Ｏリングシール２４，２６の使用により、インキュベー
ション時間を、各浴中の管の相対的長さを調節するため
Ｏリングを通して管を引くことにより手動での調節が可
能となる。

【００３０】４路弁は、低温浴１８中の管２２の長さか
ら反応生成物が新しいサイクルを始めるため高温浴１６
中へ返送することのできる位置、ＰＣＲプロトコルの完
成時にＰＣＲ生成物を排出する位置、および反応管２２
をフラッシング、清掃するため適当な操作を実施した後
または必要に応じ反応管２２を交換した後、新しい反応
混合物を反応管２２に導入することのできる位置を有す
る。

【００３１】望ましくは１つのサイクルから別のサイク
ルへのＰＣＲ反応の進行をモニタするため、望ましくは
低温浴内にセンサを有する浸漬可能のファイバオプチク
スの分光光度計が包含されていてもよい。この分光測光
（ＵＶ）検出器２８は、ｄＮＴＰｓがＤＮＡ生成物中へ
組込まれたときに期待されるハイポクロミズムを検出す
る。限界差動信号のみが典型的に認められ、その後にＰ
ＣＲプロトコル中に後の熱サイクルが認められる。類似
のけい光検出器を、種々の“Ｔａｚｍａｎ”式測定の実
施に使用することもできる。

【００３２】反応管２２は、ポリテトラフルオロエチレ
ン（ＰＴＦＥ）、たとえばデュ・ポン社のテフロン（Ｔ
ｅｆｌｏｎ登録商標）のようなＰＣＲ相溶性材料からな
り、３ｍｍよりも小さく、望ましくは約１ｍｍ〜２ｍｍ
の間の内径を有する毛細管である。この管は０．２〜
０．５ｍｍの間、望ましくは約０．３ｍｍである壁厚を
有する。反応管２２の毛管寸法は、反応混合物が浴を通
過する際管壁を横断する熱伝達勾配の効果を最小にす
る。さらに、小さい寸法は、反応混合物試料体積の終端
を限定するための不連続部としておよび反応混合物を、
予測できるように、蠕動ポンプ１２および４路弁を経て
浴１６および１８を通して駆動するための推進体として
使用するための気泡または油のような混合しない液体の
使用を可能にする。

【００３３】反応管２２を不連続的に移動する気泡また
は他の液体は、液体不連続部の通過を検出するのに適当
な装置の使用により簡単な自動化可能のサイクルカウン
タを設けるのに使用することができる。不連続部の通過
を検出するのに適当な装置は再び双方の反応管２２に取
付けられた光電式または電気容量型センサ４２を包含す
る。

【００３４】第１実施形の操作は簡単である。反応混合
物を４路弁１４を通して管２２中へ導入した後、反応混
合物をサーモスタット制御された浴１６および１８を通
して連続的にポンプで、ポンプ１２の速度および管体積
によって定義される全サイクル時間で圧送する。完全な
ループを通る混合物の毎回の通過が、１つの完全なＰＣ
Ｒサイクルである。全反応体積は任意の１つの時間に単
一の温度では存在しないかも知れないが、反応混合物の
各体積要素は各温度においてほぼ均一な滞留時間を経験
する。比較的狭い管孔および表面粗さのため、混合部分
が管を通過する際混合部分内に若干の乱流混合が存在す
る。この混合が、温度制御の鮮鋭度を高める。所望数の
サイクルが完成した後、出来上ったＰＣＲ生成物を４路
弁によりポンプで排出する。

【００３５】市場で入手できるサーモスタット付浴は、
浴温度を０．１℃以内に制御することができ、これによ
り正確な温度調節が得られる。この実施形では特殊な流
れ調整またはソフトウエアは必要でない。それというの
も非常に正確な流量を有する蠕動ポンプも市場で購入で
きるからである。

【００３６】反応管２２中に大量の出来上った生成物が
蓄積しはじめた後、ＰＣＲプロトコルにおけるアニーリ
ング／エクステンションインキュベーション温度または
時間の遅れを自動的に変えるのが望ましい。ポンプ流量
または下方浴温整定値の自動的または手動的変更はポン
プ速度制御入力および浴温制御に適当なインタフェース
により結合している適当にプログラミングされたＣＰＵ
３０によって実行することができる。全経過時間と正比
例するように、全増幅期間にわたって変性温度を徐々に
増加するのが望ましい。このプロトコルは、高温浴の温
度制御入力およびサイクルカウンターに結合した適当に
プログラミングされたＣＰＵによって達成することがで
きる。かかる制御図式は、低温浴１８、蠕動ポンプ１２
および高温浴１６にそれぞれ結合した制御線路３２，３
４および３６と共に図１に点線で示したＣＰＵ３０によ
り概略的に表わされている。

【００３７】ＰＣＲプロトコルによるかまたは若干の別
の実施形におけるあとのサイクル中でｄＮＴＰｓ、酵素
またはプライマーのような補充的試薬添加物を供給する
のも望ましい。これは、制御母線４０における信号によ
り制御されるブロック３８により略示された試薬添加弁
操作機構を介してＣＰＵ３０の制御下に自動的に行なう
ことができる。試薬の連続的添加またはあとのサイクル
においてのみの添加のために、種々の実施形の弁装置が
設けられている。ＣＰＵ３０は、完成されたサイクル数
をモニタする必要のある実施形、たとえば試薬をＰＣＲ
プロトコルにおけるあとの特殊な時点で添加される実施
形においては、制御母線４４を介してサイクルカウンタ
に結合されている。プロトコルにおけるあとでの試薬添
加は総収率を最大にすることができる。たとえば、忠実
度はｄＮＴＰ濃度を１０〜５０ミクロモルの範囲内に保
つことにより改善することができるが、これらのレベル
はあとのサイクルにおいて化学量論的制限であることを
立証する。従って増幅プロトコルにおけるあとのＭｇ−
ｄＮＴＰ濃度のオーダ規模の飛躍は、忠実度に対する小
さい正味効果で、収率を劇的に改善することができる。
同様に、あとのサイクルにおけるプライマー濃度を増加
して総収率を上昇させることができる。この手段は生成
物純度を同様に改善する。

【００３８】毛細管の内面は、管壁に隣接する試料液部
分に対するかじりを形成する。気泡または他の液体不連
続部は、各試料の間で全試料を、細管流路に沿って１ユ
ニットとして押すのに有用である。他の場合には、毛管
を横断する放物面の流れ断面形が存在する。試料または
試料部分の間の気泡の使用は“スラッグ（Ｓｌｕｇ）”
流れを生じ、この中で試料“スラッグ”は毛管を通して
押される。

【００３９】単流路毛管熱サイクラー図２には、比較的大体積にＰＣＲを実施するための毛管
ＰＣＲ装置の第２実施形の概略図が示されている。この
実施形は、適当な温度の熱および冷源の内および外で多
数回経路定めされた毛管５０の長さを使用する。図２の
実施例は毛管５０の連続ループの形の反応室を使用す
る。各ループは平衡された熱ゾーン５２を通る部分およ
び平衡された冷ゾーン５４を通る部分を有する。代表的
には、熱ゾーン５２は、液体がＰＣＲプロセスにおける
変性を行なうのに必要な温度範囲内の一定温度、代表的
には約９５℃を有する液体浴である。同様に、冷ゾーン
は通常、アニーリングおよびエクステンションに必要な
温度範囲内の一定温度、代表的には約６０℃を維持する
ように制御された温度を有する液体を有する液体浴であ
る。

【００４０】他の温度は、変性およびアニーリング／エ
クステンド範囲内で使用することができ、熱および冷ゾ
ーン５２，５４のそれぞれは、金属ブロックのような管
５０が通過する温度制御された固体ブロックであっても
よい。また、熱ガスオーブンも変性のために使用するこ
とができ、冷ガスオーブンは冷ゾーンに対して使用され
る。しかし、熱および冷温度制御されたゾーンに対する
好ましい構造は、２つの温度制御された金属ブロックま
たは２つの温度制御された水浴のいずれかである。管５
０の長さ、その内径、熱および冷ゾーンの各々における
管の長さ、および管内での反応混合物の流量は、増幅の
制御におけるすべてのファクタである。

【００４１】図２の第２実施形においてはＰＣＲ反応混
合物が管５０に沿って移動するための移動力は、反応混
合物５３の大きい体積を保持しうる無菌の使い捨てシリ
ンジである。シリンジ５１は当業者に周知の反応混合物
成分および増幅される試料核酸が充てんされる。次い
で、シリンジ５１は手により圧縮ガスまたはシリンジポ
ンプ作用を使用して反応混合物５３を管５０中へおよび
これを通して移動させるために操作する。

【００４２】空気または鉱油のような混じらない液体を
含有するもう１つのシリンジ５５はシリンジ５１と並列
に管５０に結合することができる。シリンジ５５は断続
的に気泡または混じらない液体泡を管５０内の反応混合
物５３の流れ中へ注入するため操作する。これは、スラ
ッグ流れが流路を通じて支配し、反応混合物５３の各体
積要素が同じ数および期間の熱インキュベーションを経
験するのを確実にする。スラッグ流を惹起するため空気
の使用は、流体が存在する場合、出来上ったＰＣＲ生成
物のみが容器５６中に集められるので望ましい。シリン
ジ５５の使用は、分取スケールのＰＣＲに対しては、プ
ライマーの濃度を消尽するのに十分なサイクルを実施す
る限りおよび各ゾーン内で動的滞留時間が試料の多くを
インキュベーション温度に到達させるのに十分である限
り必要である。シリンジ５５は、“ホットスタート（ｈ
ｏｔｓｔａｒｔ）”を実施するためのそう失試薬（ｍ
ｉｓｓｉｎｇｒｅａｇｅｎｔ）を導入するために使用
することもできる。

【００４３】各ゾーン内の管５０の長さはそれぞれの時
間に単位体積の反応混合物が熱ゾーンを１回通過し、冷
ゾーンを１回通過し、１つの完全なサイクルが完成され
るように選択される。系中のループ数が、実施されるサ
イクルの数を定める。望ましい操作法は増幅されたすべ
ての生成物を強制的に完全に管を通して排出するためシ
リンジ５１の頂部にエアポケットの残留を包含する。

【００４４】反応管５０の管材料はガラス（適当なシラ
ン化剤で塗布）、金属またはＰＣＲ法に干渉しないタイ
プのプラスチックであってもよい。望ましくは、管材料
は１回使用のもの（使い捨てタイプ）である。プラスチ
ック、ポリプロピレンまたはテフロンが望ましい。しか
し、この実施形ではパリレン（ｐａｒｙｌｅｎｅ）で塗
布された金属管材料が望ましい。それというのも金属管
材料は良好な熱コンダクタンスを有し、曲げた後にその
形を保持し、管の内径はスラッグ流れの間、プラスチッ
ク管よりも多くの乱流混合を得るためより小さくてもよ
く、かつ金属は加熱されたブロックと、プラスチックよ
りも一そう熱的に相容性であるからである。

【００４５】図２に示した第２実施形の主要な利点は１
回通過（ワン・パス）で得ることのできる増幅された生
成物の大きい体積である。これは大量の増幅された生成
物を得るため多数の個々の１００μｌの反応混合物を製
造しなければならない通常型のＰＣＲ装置よりも操作が
一そう便利である。個々の反応混合物は通常、増幅し、
プールし、再分割しなければならず、これは冗長で時間
のかかる操作である。

【００４６】多重水浴毛管熱サイクラー図３には、毛管が存在する室の温度を変えるため水浴を
使用する比較的小規模の非常に迅速なＰＣＲを実施する
ための、本発明による毛管ＰＣＲ装置の第３実施形の図
が示されている。この装置においては液密の室６０は、
室から液密のグロメットを通って突出する両端６４およ
び６６を有する少なくとも１つの毛管反応室６２を含有
する。ここに記載したすべての毛管装置がそうであるよ
うに、毛管６２は望ましくはパリレンで塗装された金
属、またはプラスチック実施形に対して望まれるテフロ
ンまたはポリプロピレンで塗装されたプラスチックから
製造されていてもよい。ＰＣＲ反応混合物１〜２５μｌ
を、任意の適当な手段により室６０中の毛管６２の部分
中へ注入する。

【００４７】室６０は、２つまたは３つの温度制御され
た液体浴とは液体連絡されている。図３には２つの浴だ
けが示されている：高温浴６８は９５℃のような変性温
度範囲内の一定温度を保ち、冷温浴７０は、６０℃のよ
うなアニーリング／エクステンション範囲内の一定温度
を保つ。変性、アニーリングおよびエクステンション工
程に対する３つの別個のインキュベーションが望まれる
実施形は、図３に点線により指示した、第３の温度制御
された液体浴７２を必要とする。

【００４８】各液体浴は、浴６８に対し、管７４および
７６のような入力管および出力管に結合した、それ自身
の内蔵液体ポンプを有していてもよい。これらの実施形
においては浴６８から室６０中へ熱い液体を、変性工程
に対する所定時間（代表的には１秒から３分まで）、毛
管６２を十分に浸漬するのに十分なレベルにポンプで圧
送するために使用される。室中へおよび室からの水の流
れは代表的には、温度間の切換を急速にするため毎分少
なくとも１ｌに設定される。

【００４９】変性インキュベーションの完結後、適当な
制御信号が、室６０内の９５℃の液体を熱い液体浴６８
中へのポンプにより返送させるために発せられ、室６０
内の液体水位が十分に低い場合、浴７０からの冷たい液
体を室６０中へ圧送させるために適当な制御信号が発せ
られる。フロートスイッチ（図示せず）のような液体水
位センサ機構はアニール／エクステンドインキュベーシ
ョンを実施するため室６０をある温度の液体で充てんし
はじめるため溜め７０中のポンプにスイッチを入れる時
間を定めるために使用することができる。反応混合物
は、室６０が異なる温度の液体で充てんされる場合に温
度を迅速に変える。それというのも小さい熱質量を構成
する毛管が使用されるからである。この第３の実施形に
おいては、各水浴６８，７０または７２からの液体は、
該温度におけるインキュベーションが終った場合、その
もとの浴６８，７０，７２中へポンプで返送することが
できる。しかし、この操作は毛管６２を、次の浴から液
体が室６０に入る前に、一時的に空気中に懸吊状態にと
どめる。室６０および水浴の相対的体積は、室６０の体
積が水浴の体積に比べて非常に小さいようなものであ
る。このため、液体を室６０から水浴へ移動させ、該水
浴が、室６０の排水に先立つことなしに、次のインキュ
ベーションのための新しい液体を用意する。換言すれ
ば、液体は簡単にそれぞれの浴と各インキュベーション
用室の間の管路によって移送することができる。室６０
からの液体の温度が新しいインキュベーションのためポ
ンプで圧入される液体浴中の液体の温度と相違するとし
ても、水浴の熱質量は、浴温に著しい変化が存在しない
ほど大きく、浴の制御は一定の浴温を維持することがで
きる。この設計は代表的には１秒以下で温度変化を完成
するのを可能にする。

【００５０】図４は、任意の浴から液体を汲出すために
１つのポンプを使用する、図３に示した第３実施形と類
似の毛管ＰＣＲ装置のもう１つの実施形を表わす。図３
および図４における同じ番号を有する機素は、構造が同
じでありかつそれらが同じ機能を発揮することを意味す
る。図４において、単一の双方向ポンプ７８は入力管８
０および出力管８２によって室６０に結合されている。
このポンプは、入力管８６および出力管８８によって液
体マルチプレクサ８４の出力部に接続されている。液体
マルチプレクサ８４は、複数の入力部を有し、その各々
は２つまたは３つの温度制御された浴６８，７０および
７２の１つに接続されている。各入力部は、液体浴６８
の入力管８６および出力管８８のような２つの管によっ
て相応する液体浴に接続されている。

【００５１】液体マルチプレクサ８４およびポンプ７８
は、順次インキュベーションの所望のＰＣＲプロトコル
を実施するため、ポンプ７８によるポンプ作用の方向の
適当な切換および液体流出力部へ接続するため液体流入
力部の１つの適当な位置選択を有する通常の適当なプロ
グラマブル制御装置（図示せず）によって制御される。

【００５２】図３および４に示した装置は、混合物はＰ
ＣＲプロトコルの間一定不変であるので、油または他の
液体不連続手段を使用することなく、１０μｌ以下の体
積でＰＣＲ増幅を実施することができる。図３および４
に示した装置は１秒のような短かい時間内にＰＣＲイン
キュベーション工程を実施することもでき、２つのイン
キュベーションＰＣＲプロトコルサイクルの合計時間は
１秒の変性時間および７〜３０秒のアニール／エクステ
ンド時間の使用により８秒のような短時間に減少するこ
とができる。しかし、アニール／エクステンド時間が短
かい場合には、試料体積中に、大濃度のＴａｑポリメラ
ーゼのような熱安定酵素が必要とされうる。

【００５３】定常循環液体浴毛管熱サイクラー本発明の毛管ＰＣＲ装置の第４実施形は図５に示されて
いる。この図示された実施形は、３つのサーモスタット
を備える液体浴および反応混合物試料を保持する密封毛
管を有する単一の反応室を有する。しかし、ＰＣＲプロ
トコルに対し２つの温度だけが必要な場合には、第３浴
は省略することができる。第３浴を完全のためここに記
載する。

【００５４】第１浴９８は、大部分の液体を、５５℃の
ようなアニーリング温度の範囲内の若干の温度に維持す
る。第２浴１００はそれに含有されている液体の温度
を、エクステンションインキュベーションに対し有効な
温度範囲内の温度、たとえば７５℃に維持する。第３浴
１０２は、それに含有されている液体の温度を、変性に
有効な温度範囲内の温度：代表的には９５℃に維持す
る。各液体浴はその中にポンプを有し、該ポンプは、液
体を出力管１０８から、反応室１０６の入力側にある弁
装置１０４により浴中へ圧送する。同様に、浴１００の
出力管１１０および浴１０２の出力管１１２も弁装置１
０４に接続する。反応室１０６からの液体は出力弁装置
１２０によりその浴に戻り、各浴は帰り管、つまりそれ
ぞれ浴９８，１００および１０２に対する管１１４，１
１６および１１８を包含する。

【００５５】コンピュータ１２２は、望ましい実施形に
おいて液体流量を制御するため、制御母線を介して種々
の浴のポンプに結合されている。一定流量は別の実施形
において使用することもでき、この場合にはコンピュー
タ１２２にポンプを連結するのは必要でない。それとい
うのもポンプは同じ流量で連続的に回転するからであ
る。

【００５６】コンピュータ１２２は入力弁装置１０４お
よび出力弁装置１２０にも結合されている。弁装置のコ
ンピュータ制御の目的は選択的に１つの温度の液体の流
れを反応室１０６中へ向け、所望のＰＣＲプロトコルを
定義するコンピュータ１２２に記憶されたデータにより
他の流れをバイパスすることである。

【００５７】米国特許分類番号Ｎｏ．０７／８７１２６
４号（１９２２年４月２０日出願）に記載されているよ
うな他のＰＣＲ装置のように、ＰＣＲプロトコルはすべ
ての所望のＰＣＲインキュベーションの温度および時
間、実施されるサイクル数を定義するチェックポイント
データおよび与えられたプロトコルの完結した際に他の
所望のプロトコルに結合して操作されるデータによって
定義することができる。所望のプロトコルを定義するデ
ータはユーザによって入力することもできるし、または
あらかじめ定義されたプログラムであってもよい。

【００５８】ＰＣＲプロトコルは、コンピュータ１２２
により、入力弁装置１０４を制御して、１つの浴からの
１つの流れだけが任意の特定時間に反応室を通過するよ
うに志向され、すべての他の流れは、反応室１０６を通
過しない別の流路によりバイパスされるようにすること
により実施される。弁装置１０４は、当業者に周知の円
筒または回転ソレノイド操作または空気圧式のマルチポ
ート弁であってもよい。流れの順序は、反応室１０６の
１つの配列および種々のバイパス状態における別の流路
を示す図６〜９につき良好に理解される。

【００５９】管反応室１０６は、望ましくは、室（管
状）１０６の外側に取付けられた２つまたは３つの浴か
らのバイパス管路を有する。弁装置１０４および１２０
は、室１０６の反対側端部に存在する。この装置を横断
する断面図は、バイパス管路により取囲まれた室１０６
の内部を示す。この断面図は、図６ないし図９に略示さ
れている。

【００６０】アニールおよびエクステンション温度が同
じ場合には、２つの浴およびバイパス流路のみが必要で
あり、図５ないし図９における装置は３つのバイパス流
路よりむしろ２つのバイパス流路を必要とするにすぎな
い。

【００６１】図６は、３つの流れ全部が、その別の流路
を通ってバイパスされている、空の反応室１０６を示
す。アニール温度の液体はバイパス流路１３０を通って
流れ、エクステンション温度の液体はバイパス流路１３
４を通って流れる。

【００６２】図７は、アニールインキュベーションのた
めの弁装置を示す。このインキュベーションにおいて
は、浴９８からの５５℃の液体は、反応室１０６を通過
するようにするため、コンピュータ１２２を介して、弁
装置１０４中のソレノイド操作弁によって切換えられ
る。この場合、反応室中の毛管内の反応混合物の温度は
急速に５５℃に平衡化される。浴１００からの７５℃の
液体および浴１０２からの９５℃の液体の双方は、それ
ぞれのバイパス流路１３２および１３４に結合されたま
まである。

【００６３】適当なアニーリングインキュベーション時
間が経過した後、コンピュータ１２２が弁装置１０４お
よび１２０を活性化して、図８に示した装置への流れを
エクステンションインキュベーションを実施するために
切換える。このインキュベーションにおいては、９５℃
および５５℃の液体の流れはバイパスされ、７５℃の流
れは反応室１０６を通過するように切換えられる。

【００６４】エクステンションインキュベーションの完
結の際、二本鎖のエクステンション生成物を、次のサイ
クルのための一本鎖の鋳型に分割するための変性を行な
わねばならない。コンピュータ１２２は再び弁１０４お
よび１２０を活性化し、流れを図９に示した形状に切換
える。ここで５５℃の液体の流れおよび７５℃の液体の
流れはバイパスされ、９５℃の液体の流れは反応室１０
６を通過するように切換えられる。この工程が１つのＰ
ＣＲサイクルを完成する。次いでコンピュータ１２２
は、代表的には、ＰＣＲプロトコルを完成するため、サ
イクルを所望の回数繰返す。

【００６５】反応室１０６は反応室中、入力端に、横に
取付けられた金網を有する管状室である。反応混合物
は、完成生成物の所望体積により種々の直径の、不活性
でパンクなしの継目なしプラスチック毛管の薄壁（０．
１〜０．３ｍｍ）の区間に蓄積される。２ｍｍまでの内
径および０．０７５ｍｍのような小さい内径が有効であ
る。管は代表的には３００℃の最大連続使用温度定格を
有し、大量の液体によって影響を受けない。たとえば、
この目的のために使用することのできる管は、Ｍｉｃｒ
ｏＭＬＴｕｂｉｎｇＳａｌｅｓ社（４５−１０
９４ｔｈＳｔｒｅｅｔ，Ｅｌｍｈｕｒｓｔ，ＮＹ１１
３７３）から購入できる。

【００６６】反応混合物は、管のそれぞれに注入され、
各管は両端で、望ましくは管の端部から反応混合物を隔
離するために、各端部で気泡で閉鎖されている。１端部
におけるクランプまたは他のクロージャーは金網を通し
て適合させるため十分に小さい。他端部におけるクラン
プは、望ましくは金網を通して適合させるため十分に大
きい。所望のように多数の管中へ反応混合物を注入した
後、複数の毛管を金網を通してねじ締めし、金網により
懸吊する。管の束および金網を反応室１０６中に取付
け、室を閉じて密封する。クランプ１４４は簡単には、
拡大されたクランプを形成する毛管の溶封された端部で
ある。次いで、コンピュータを活性化して、上述したよ
うに液体の流れが毛管をめぐって室１０６を通るように
切換えを開始させる。

【００６７】図１０は、反応室１０６中の典型的毛管の
配置を示す。この図中で、単一の毛管１４０は、反応室
１０６の一端を横切る金網１４２により適所に保持され
て示されている。毛管１４０の上流側端部における管ク
ランプ１４４は毛管１４０を、反応室１０６内の乱流の
流れに振動することのない下流側端部の適所に保持す
る。それというのも上述したように、金網１４２の継目
を通して適合するためには大きすぎるからである。毛管
１４０の端部における気泡１４６および１４８は、反応
混合物１５０を毛管の端部から隔離する。この望ましい
実施形においては、上流側クランプ１４４は、符号を付
したタブまたは試料を識別するのに役立つスタンプを有
する。また、パドル形クランプ１４４は液体流れ中で動
揺し、こうして循環する液体がそれを通過する際に乱流
を生成する。

【００６８】図１１は、毛管１４０に既知量のＰＣＲ反
応混合物を装入し、処理後ＰＣＲ生成物を取出すための
系を示す。シリンジ１５１は気密嵌合を有する毛管１４
０のマウス１５２中へ挿入される。毛管１４０はそれ自
体目盛を有していてもよいし、または図示のように管に
近接して、目盛を有するホルダ１５４中に置くこともで
きる。毛管１４０の開放端部は、反応混合物の溜め１５
０中へ浸漬している。次いで、シリンジのプランジャー
を引出し、毛管からその中の圧力を大気圧以下にさげる
のに十分な空気を吸込む。この場合、ＰＣＲ反応混合物
は、反応混合物溜めに働く外側の高い大気圧によって毛
管１４０中へ押込まれる。反応混合物の水位または量
は、毛管１４０内のメニスカスの位置によって定められ
る。メニスカスの位置は、±２〜５％内で体積の消費を
指示する。毛管１４０を満たした後、端部を密封し、締
付けるかまたは蓋締めし、ＰＣＲ処理を続行する。出来
上ったＰＣＲ生成物の取出しは、毛管１４０の端部クラ
ンプを切取り、上記操作を逆にすることによって達成さ
れる。この方法においては、毛管１４０はそれ自体のピ
ペットであることに注意。シリンジは決して反応液に触
れず、これにより相互汚染の機会は最小になる。

【００６９】図５ないし９に関連して記載した第４実施
形は、分析的大きさからセミプレプおよび分取的大きさ
までの異なる試料体積をすべて同時に処理できるという
利点を有する。処理される体積は、毛管の長さ、反応室
内の毛管の数および／または管の内径を変えることによ
って変えることができる。また、反応室内の乱流は、あ
る温度工程後の反応混合物の温度平衡を促進する。望ま
しくは、反応室の体積は、それぞれの浴の体積の１０％
よりも小さい。コンピュータによる、反応室を通る流量
の可変制御は、異なる数の毛管およ試料体積（この場合
反応室の異なる割合が試料管によって占められる）に対
して作用するＰＣＲランの間のタイムレスポンスおよび
温度平衡時間の最適化を可能にする。毛管内の反応混合
物の温度における非常に迅速かつ正確に制御された温度
変化は高い精度の浴温制御、たとえば±０．１℃の浴精
度が市場で利用しうるので達成することができる。これ
に加えて、毛管の低い熱容量、反応混合物と熱交換液の
間の高い熱流量、毛管をめぐる乱流、および室１０６中
に空所の不在のすべてが、全ＰＣＲプロトコル時間を最
小にするのを助ける。

【００７０】図５に示した装置のすぐれた利点は、上述
した多数の他の毛管ＰＣＲ装置のように、製造された出
来上った生成物の体積を、金属のブロック熱交換器に対
する新しい熱計画を設計する必要なしにかつ熱サイクル
パラメーターを妨げることなしに、増大することができ
ることである。この柔軟性は、ＰＣＲ基礎製造方法に対
し従前技術のＰＣＲ装置を使用する複雑さを軽減しう
る。図５に示した装置の設計は、実質的にすべてのその
成分、たとえば水浴、パーソナルコンピュータソレノイ
ド弁、毛管、シリンジ等は容易に購入しうる（特註でな
い）ので、組立が廉価である。

【００７１】金属ブロック毛管熱サイクラー本発明による毛管ＰＣＲ熱サイクラーの第４実施形は、
図１２に示されている。その最も簡単な形では、この装
置は絶縁材の層１７４により分離された２つの金属ブロ
ック熱交換器１７０および１７２を包含する。熱交換器
１７０および１７２は、サーモスタットで制御される一
定温度の液体浴のような他のタイプの熱交換器であって
もよい。各金属ブロック熱交換器１７０および１７２
は、望ましくは、その中の温度勾配を最小にするため、
アルミニウムまたは若干の他の良熱伝導性金属からなっ
ていてもよい。

【００７２】各金属ブロックの温度は、金属ブロック１
７０に対しボックス１７６および金属ブロック１７２に
対しボックス１７８によって象徴されるように、適当な
温度制御系により一定温度に維持される。金属ブロック
熱交換器１７０の温度は、温度制御系１７６によりＰＣ
Ｒ変性に適当な温度範囲、代表的には９４℃に維持され
る。金属ブロック熱交換器１７２の温度は、温度制御系
１７８により、ＰＣＲアニーリングおよびエクステンシ
ョンに適当な温度範囲内（代表的には５０〜７５℃）に
ほぼ一定に維持される。使用することのできる適当にプ
ログラムしうる制御系は、米国特許第５０３８８５２号
および米国特許出願Ｎｏ０７／８７１２６４号（１９９
２年４月２０日出願）に記載されている。

【００７３】金属ブロックの温度を制御するためにはペ
ルティエ（Ｐｅｌｔｉｅｒ）の装置が理想的である。そ
れというのもこれらの金属ブロック熱交換器がそれぞれ
一定温度に維持されるからである。適当な公知温度検出
およびフィードバック制御回路（図示せず）は、ブロッ
クが熱すぎる場合に熱を取出し、冷すぎる場合に熱を加
えることにより、ブロック温度を一定に維持するためペ
ルティエ装置を流れる電流の方向を制御するのに必要で
ある。ブロックに対しては、抵抗加熱装置および／また
は金属ブロック内の通路を循環する加熱／冷却された液
体（冷却された液体は、ブロックの所望温度に依存し
て、水道水または冷却回路のフレオンを循環することに
より冷却される不凍液である）のような他の温度制御系
も働く。温度制御系は図１２に１回だけ示し、不必要な
反覆をさけるため、引き続き記載された装置を用いてＰ
ＣＲ方法を実施する工程を図面につき説明するのは省略
する。

【００７４】この実施形においては、少なくとも１つの
薄壁毛管反応室１８０は２つの金属ブロック１７０およ
び１７２を通り、金属ブロック熱交換器１７０により取
囲まれた管１８０の一部分および金属ブロック熱交換器
１７２により取囲まれた他の部分で働く。薄壁毛管はプ
ラスチック、金属またはガラスであってもよく、プラス
チックが望ましい。ガラスは、鋳型鎖またはポリメラー
ゼを壁に粘着させることによりＰＣＲ反応に干渉し、こ
れによりアニーリング／エクステンドプロセスに干渉し
うる。望ましくは、毛管と金属ブロック熱交換器の間の
相互連結は、管およびブロックが相互に定置にとどまる
ように設計されている場合には軽い摩擦嵌合であって、
毛管１８０は迅速かつ容易に、新しい毛管を金属ブロッ
ク中へ溶入することにより交換することができ、これに
より該毛管は投棄される。この特徴は、相互汚染の危険
を最小にし、ＰＣＲ実験の間毛管を洗浄および／または
滅菌する必要性を省略することにより装置の使用を簡単
にする。また、管はＰＣＲ実験の間清浄にすることもで
きる。

【００７５】反応混合物試料の導入および毛管１８０内
での移動は、シリンジまたは蠕動ポンプのような容量置
換型ポンプ装置を用いて達成しうる。さらに、容量置換
型ポンプ装置と反応混合物試料の間に、空気または液体
緩衝剤を使用することもできる。

【００７６】管１８０中への試料および反応混合物の導
入は図１２に示したように、自動シリンジにより達成さ
れる。その一端にピストン１８４を形成する細いロッド
１８２を、ステップモータ１８６によりブロック１７０
および１７２を通して毛管１８０中へ挿入する。ピスト
ン１８４は毛管１８０の壁とシールを形成する。このス
テップモータ１８６は、適当にプログラミングされたコ
ンピュータ１８８のような制御装置によって制御され
る。ステップモータ１８６の機能は、空気圧系によって
行なうこともできる。毛管１８０の一端１９０は、混合
物導入の間試料および反応混合物の溜め（図示せず）と
液体連通している。ステップモータ１８６はピストン１
８４を毛管１８０で通して引出すために動作し、これに
よってその中の圧力は大気圧以下に低下する。この工程
は、反応混合物１９２を毛管１８０中へ、図１３および
図１４に示したように、１つのブロック内の毛管体積を
完全に充てんするのに十分な反応混合物が毛管１８０中
に存在するまで、押したり引いたりさせる。

【００７７】変性の間、図１３に示したように、制御装
置１８８およびステップモータ１８６はロッド１８２の
位置をとり、ピストン１８４は熱交換器１７０の左縁に
あるので、毛管１８０内の反応混合物１９２は熱交換器
１７０内に包含されている。こうして、反応混合物１９
２は急速に９４℃に加熱される。ピストン１８４はＰＣ
Ｒプロトコルの１サイクルの変性インキュベーションに
所望の時間を定義するコンピュータ１８８内に記憶され
たデータによって定められた時間この位置にとどまる。
これらのデータは使用者により、ユーザインタフェース
によって制御装置中にプログラミングすることができる
かまたは永久的に制御装置のメモリに記憶することもで
きる。

【００７８】アニール／エクステンドインキュベーショ
ンは、コンピュータ１８８およびステップモータ１８６
がロッド１８２およびピストン１８４を、図１４に示し
たように熱交換器１７２により完全に取囲まれている毛
管内の位置に反応混合物１９２を押す方向に動かす場合
に始動する。ここで、反応混合物は、プライマーを一本
鎖鋳型にアニールさせ、長いエクステンション生成物の
形成を開始させるため、７０〜７０℃の間の温度、代表
的には６０℃に急速に冷却される。アニール／エクステ
ンドインキュベーションの完結時に、混合物１９２は二
本鎖エクステンション生成物を一本鎖鋳型に分断するた
め、図１３に示したように、新しい変性サイクルの用意
ができている。

【００７９】次に、制御装置およびステップモータはロ
ッド１８４およびピストン１８２を熱交換器１７０中へ
引戻して、他の変性インキュベーションを開始する。イ
ンキュベーションのサイクルは、ユーザによりプログラ
ミングされたかまたはコンピュータ１８８のデータベー
スに永久的に記憶された回数繰返される。

【００８０】ＰＣＲプロトコルが完成した後、反応混合
物１８２は図１５に示したような適当な容器中へ排出さ
れる。ピストンはブロック１７０および１７２を通して
混合物１９２を押し、毛管１８０から容器１９４中へ排
出する。

【００８１】図１６〜１９は、ロッド１８２およびピス
トン１８４の機能が不活性油２０３に代えられている点
を除き、上述したものと類似の毛管ＰＣＲ装置の別の第
５実施形を表わす。不活性油２０３は、油溜め２０４か
ら試料弁ループ２０２を通って導かれる。油は、ＰＣＲ
反応混合物をブロック１７０と毛管１７２の間でその前
面で、前後に押しかつ引くために試料弁ループ２０２を
通して空気圧下に圧送または駆動することができる。油
に対するこのポンプ作用または空気力作用は、所望のＰ
ＣＲプロトコルを規定する記憶されたデータに応答する
コンピュータ結合の制御装置（図示せず）の制御下にあ
る。弁ループ位置および溜め圧力は、毛管１８０が図１
６に示したように油で完全に充てんするため最初にステ
ップモータを介してコンピュータ制御される。次いで、
反応混合物試料１９２は、油２０３が、溜め２０４中へ
引戻されるときに、管１８０中へ引込まれて、反応混合
物試料１９２は、変性インキュベーションにつき図１７
に示したように、熱交換器１７０により完全に取囲まれ
る。

【００８２】変性インキュベーションが完結した後、油
２０３は再び、ＰＣＲ反応混合物が、図１８に示したよ
うに熱交換器１７２によって完全に取囲まれている毛管
内の位置に押すように、制御装置によりさらに圧送され
る。ここで、混合物は迅速にアニール／エクステンド温
度に冷却される。アニール／エクステンドインキュベー
ションの完結の際、制御装置（図示せず）は、ＰＣＲ反
応混合物を熱交換器１７０中へ引込んで新しいサイクル
を開始するため不活性油の方向を逆にする。このインキ
ュベーションのサイクルは、プログラマブル制御装置に
記憶されたＰＣＲプロトコルデータ中に指定された回数
繰返される。所望のサイクル数が完結した後、制御装置
は毛管１８０を通して十分に油を圧送する制御信号を発
して、出来上った生成物を補集容器１９４中へ放出する
かまたは試料弁ループ２０２に結合していない毛管の端
部に結合している試料検出系中へ放出する。

【００８３】試料は、静止位置につき上述したように毛
管中へ引込むことができ、次いで毛管または熱交換ブロ
ックを相互に相対的に移動させて反応混合物試料に対し
て熱サイクルを実施する。かかる１実施形において、毛
管および試料は静止のままであり、ブロックを前後に移
動させる。もう１つの実施形においては、ブロックは静
止のままであり、試料混合物を含有する毛管はその間で
移動される。これらの実施形においては、ブロックと細
い毛管との間の摩擦は移動を容易にするため比較的低く
なければならない。この特徴はブロックと毛管との間の
熱コンダクタンスを減少し、そのため熱応答を制限し、
こうして全サイクル回数を増加する。熱コンダクタンス
はこれらの実施形においては、熱伝導グリースまたは鉱
油またはエチレングリコールポリマーのような潤滑剤の
使用によって最大にすることができる。

【００８４】金属ブロック多重毛管熱サイクラー本発明の第６実施形の“ブレッドボード”レイアウトは
図２０に表わされている。ブレッドボード毛管熱循環装
置２１０は、少なくとも２つの金属ブロック熱交換器２
１２および２１４を包含し、これらは、この予備設計に
おいては、台板２１６に固定されている。図２０に点線
で示した第３熱交換器２１８は別個のアニーリング温度
およびエクステンション温度を要求するプロトコルを利
用する場合には熱交換器２１２と２１４の間に位置定め
されていてもよい。熱交換器２１２および２１４は、２
つの熱交換器を相互に絶縁する空隙によって分離されて
いる。また、これら熱交換器は、ガラス、ウールまたは
発泡ポリマーのような適当な絶縁層によって分離されて
いてもよい。パーソナルコンピュータ２２０は、入力制
御データを、線路２２２を介してサーモスタット制御装
置２２４および２２６に送信する。これらの制御装置は
それぞれの熱交換器２１２および２１４を、変性のため
の一定温度（代表的には９４℃または９５℃）またはア
ニーリングおよびエクステンションのための一定温度
（約３７〜６５℃の間、代表的には６０℃）に維持す
る。複数の毛管２２８は、試料移動装置２３０から、支
持クランプ２３２、それぞれの熱交換器２１２および２
１４および管リフトアセンブリ２３６におけるクランプ
バー２３４を通るように経路定めされている。

【００８５】各毛管は、デュ・ポン社のテフロン（Ｔｅ
ｆｌｏｎ登録商標）からなり、望ましくは約１．５ｍｍ
の内径および約０．３ｍｍの壁厚を有する。この管はゼ
ウス・インダストリアル・プロダクツ社（ＺｅｕｓＩ
ｎｄｕｓｔｒｉａｌＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ）から
購入することができる。毛管２２８の先端２３８は、管
リフトアセンブリ２３６により微量滴定トレー２４０の
垂直上方へ線形列で配置される。コンピュータ制御のス
テップモータ２４２はクランプバー２３４を上げたり下
げたりする親ねじを回転し、管先端２３８をトレー２４
０と共に配置された試料容器２４４の列中へおよび列か
ら順番に上下する。この実施形においては、９５ウエル
の微量滴定トレー２４０中のウエル（くぼみ）中の試料
容器の１つの完全な列を同時に処理できるようにするた
め１２個の毛管２２８が設けられている。しかし、同時
に操作する反応管の他の数は明らかに本発明とむじゅん
しない。

【００８６】ブレッドボード装置２１０は、熱交換器２
１２および２１４中に埋設されたカートリッジヒーター
を使用する。カートリッジヒーター用温度制御装置２２
４および２２６は、ワトロウ（Ｗａｔｌｏｗ）社の９２
２Ａ２１０リアルタイム比例制御装置であり、該装置は
熱サイクラーブロック２１２および２１４中に埋設され
たＲＴＤまたはサーモカップル温度センサ（図示せず）
を有する。表面取付けの電気ヒータまたは一定温度の溜
めから循環される液体のような他の調節される熱源を使
用することもできる。

【００８７】微量滴定トレー２４０は、代表的には８×
１２アレーのウエルを有するプラスチックトレーであ
る。トレー２４０は可動プレートまたは移動アセンブリ
の部分であるすべりステージ２４６に取付けられてい
る。移動アセンブリ２４７は、ステージ２４６、台板２
１６に取付けられたステップモータおよび親ねじ２５０
を包含する。ステップモータ２４８はコンピュータ２２
０により制御され、親ねじを通して、ステージ２４６に
取付けられている固定アーム２５２に連結している。ス
テップモータ２４８は親ねじを回転して、ステージ２４
６をリフトアセンブリ２３６下方の種々の位置へ前後に
割送りする。ステップモータ２４８およびステップモー
タ２４２は、線路２５３を介してコンピュータ２２０に
よりプログラマブルに制御されている。

【００８８】ステージ２４６上の微量滴定トレー２４０
に隣接して清浄トレー２５４が取付けられている。ステ
ージ２４６およびトレー２４０および２５４の拡大部分
側面図は図２１に示されている。トレー２５４は３つの
平行なトラフＣ，ＲおよびＷを有する。これらのトラフ
はそれぞれ洗浄液、すすぎ液および廃液を含有する。洗
浄液は１０％の塩素漂白液であってもよい。すすぎ液
は、プリンス（Ｐｒｉｎｃｅ，Ａ．Ｍ．）およびアンド
ルス（Ａｎｄｒｕｓ，Ｌ．）［“ＰＣＲ：Ｈｏｗｔｏ
ｋｉｌｌｕｎｗａｎｔｅｄＤＮＡ”、ＢｉｏＴｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓ，第１２巻、３号、第３５８頁〜第３
６０頁（１９９２年）］に記載されているような２．８
モルのチオ硫酸ナトリウム溶液であってもよい。このト
レー２５４は、ステージ２４６が試料容器２４４の列の
間へ割送りされる前に、毛管２２８を清浄およびすすぐ
ために使用される。清浄トレー２５４は、清浄およびす
すぎトラフを充満状態に保ちかつ廃液容器を廃液ドレン
から廃液流出分を受取る状態に保つため液体供給溜めに
連結することができる。トレー２４０および２５４は、
試料ステージ２４６に取外し可能に取付けられている。
試料ステージ２４６は、毛管先端２３８の列を適当なト
ラフまたは試料の列の上方に整列させるために、コンピ
ュータ制御下に線路２５３を介してステップモータ２４
８へ前後に割送りされる。

【００８９】管リフトアセンブリ２３６は、１対の親ね
じ２５８で回転する軸受けに乗っている駆動バー２５６
を包含する。親ねじ２５８は、駆動バー２５６を上げ下
げするため、コンピュータ制御のステップモータ２４２
により同期的に駆動される。クランプバー２３４は駆動
バー２５６にボルト締めされかつ清浄トレー２５４およ
び微量滴定トレー２４０を水平に位置定めする移動アセ
ンブリ２４７の上方で垂直整列で毛管２２８の先端２３
８を固定するボルト締め板を包含する。

【００９０】このブレッドボード設計における試料移送
装置２３０は、図２２にカバーを取外して一そう明瞭に
示されている。試料移送装置２３０は、毛管２２８に連
結されかつ固定ステージ２６０に間隔を置いた配列で水
平に取付けられ、固定されたシリンジを１２個まで有す
る。シリンジ２６２のシリンダ２６４は、毛管２２８の
端部に個々に連結されていてもよく、一緒にグループに
まとめられていてもよい。たとえば、合計６個のシリン
ジ２６２は、２個の毛管２２８に供給する各シリンジと
共に使用することができる。

【００９１】プランジャ２６６は可動プランジャ、締付
板２６８とクランプバー２７０の間に捕獲されている。
締付板２６８は、ステップモータ２７４により駆動され
る水平に滑動可能のステージ２７２上に取付けられてい
る。ステップモータ２７４は、コンピュータ２２０によ
り線路２７５を介して制御され、ステージ２７２を、Ｐ
ＣＲ反応混合物試料を吸引、移送し、それぞれの毛管２
２８中へ排出するため、ステージ２７２を前後に動か
す。場合により、シリンジは同じ機能を実施するため１
つ以上の蠕動ポンプに代えることもできる。

【００９２】この第６実施形は、１列の試料に対し各Ｐ
ＣＲプロトコルを実施する前に、コンピュータ制御下
に、毛管清浄サイクルにより操作する。第一に、試料ス
テージステップモータ２４８は、毛管先端２３８が直接
に清浄トラフＣ上にある位置へ試料ステージ２４６を割
送りする。次に、リフトアセンブリ２３６、ステップモ
ータ２４２は管先端２３８をトラフＣ中へ下げる。次い
で、試料移送装置２３０中のステップモータ２７４が付
勢され、プランジャ２６６を引出して、熱板２１２およ
び２１４を通過した位置で、漂白液のような清浄液のス
ラッグを毛管２２８中へ吸引する。次に、リフトアセン
ブリ２３６が、トラフＣ中の液体から先端２３８を引上
げる。次いで、試料ステージ２４６が、ステップモータ
２４８により、廃液トラフＷを毛管先端２３８の下方に
位置定めするため水平に移動する。次に、試料移送装置
２３０が前後に振動して、完全な清浄を確保するため、
所定数の時間および間隔で、清浄液を毛管２２８中で前
後に移動させる。この清浄サイクルが終ったとき、リフ
トアセンブリ２３６が先端２３８をステップモータ２４
２により、トラフ“Ｗ”中へ下げる。この時点で、試料
移送装置２３０はプランジャ２６６を押込み、清浄液を
毛管２２８から廃液トラフＷ中へ吐出する。

【００９３】第二に、リフトアセンブリ２３６が管先端
２３８を廃液トラフ“Ｗ”から持上げ、次いで試料ステ
ージ２４６が、すすぎトラフ“Ｒ”上へ毛管先端２３８
を位置定めするため割送りされる。次いで、リフトアセ
ンブリ２３６が先端２３８をすすぎトラフ“Ｒ”中へ下
げ、次に試料移送装置２３０がすすぎ液を毛管２２８中
へ吸引する。すすぎ液は、管状態を次のＰＣＲランの準
備中に回復するためチオ硫酸ナトリウムのような還元剤
を含有しうる。次に、管先端２２８が持上げられ、試料
移送装置２３０は、毛管を有効にすすぐことが要求され
る場合、再び前後に振動しうる。次いで、リフトアセン
ブリ２３６、移送装置２３０および移動アセンブリ２４
７は毛管先端２３８の列を廃液トラフ“Ｗ”の上方へ位
置定めし、すすぎ液を毛管２２８から廃液トラフ中へ排
出するため操作される。

【００９４】第三に、リフトアセンブリ２３６および移
動アセンブリ２４７は、コンピュータ２２０の命令下に
操作されて、試料容器２４４の列を毛管先端２３８の下
方に位置定めする。

【００９５】次いで、リフトアセンブリ２３６が管先端
２３８を試料容器２４４中へ下げ、試料移送装置２３０
のステップモータ２７４がプランジャ２６６を引戻し
て、所定量の反応混合物試料が各毛管２２８内の最初の
位置へ吸引される。次に、リフトアセンブリ２３６のス
テップモータ２４２が逆に動作して、先端２３８を試料
容器２４４の列から持上げる。

【００９６】次いで、ステップモータ２７４はプランジ
ャ２６６を引出し続け、毛管２２８内のこれら反応混合
物試料を熱交換器２１４を通して引き、試料が完全に熱
交換器２１２内に存在する位置にもたらす。ステップモ
ータ２７４は、管先端２３８と熱交換器２１４の間で試
料を緩慢に動かすため間欠的に操作される。間欠運動
は、試料スラグの真正メニスカスにある液体が、毛管内
に分離気泡を形成せずに、試料スラッグの大部分をつか
み上げるのを可能にする。この表面張力の効果は、熱交
換器２１２および２１４の外部の毛管長さを高めた温度
に維持することにより、最小にすることができる。しか
し、ここに記載したブレッドボード装置２１０は室温環
境で操作されたので、モータ２７４の間欠的運動は、メ
ニスカスにある液体が試料スラッグの大部分をつかみ上
げるのを許容するために必要とされた。この現象は、し
ばしば“ドラッグアウト（ｄｒａｇｏｕｔ）”と呼ばれ
る。ドラッグアウトは、管材料の内部表面のあらさを最
小にしおよび／または内壁をパリレンのようなポリマー
で塗装することにより最小にすることもできる。

【００９７】試料が一度熱交換器２１４に達したら、試
料を完全に熱交換器２１２内に位置定めするために連続
的に運転することができる。試料が完全に熱交換器２１
２内に位置定めされている場合、ＰＣＲプロトコルの最
初のインキュベーションがはじまる。次いで、プランジ
ャ２６６は、コンピュータ２２０内に記憶されたＰＣＲ
プロトコルにより、熱交換器２１２と２１４の間で反応
混合物試料を移送するため、ステップモータ２７４を介
して交互に挿入および引出される。プロトコルの完了時
に、リフトアセンブリ２３０のステップモータ２４２は
再び毛管先端２７８を試料容器２４４中へ下げる。次い
で、ステップモータ２７４が付勢されて、プランジャ２
６６を挿入し、ＰＣＲ生成物を再び試料容器２４４中へ
排出する。

【００９８】次いで、清浄サイクルおよび熱サイクル工
程が、微量滴定トレー２４０中の試料容器２４４の次の
列に対し、上述したように繰返される。上記工程におけ
るステップモータの運転は、ユーザによりコンピュータ
中にプログラミングされる。プログラミングされた工程
は変えることができ、ＰＣＲ生成物を、上述したと異な
る試料容器の列への排出を包含しうる。上記の順序は説
明のためのみである。

【００９９】場合により、微量滴定トレー２４０と清浄
トレー２５４の間に、毛管圧力シール固定装置２８０が
取付けられる。固定装置２８０は図２１に示され、拡大
断面図が図２８に示されている。このシール固定装置２
８０は、毛管先端２３８の列に隣接して整列されていて
もよい１２個のウエル２８４の１列を有するプラスチッ
クまたは金属ブロック２８２である。各ウエル２８４は
ブロック２８２の頂面における凹所内に支承されたＯリ
ングシール２８６によって取囲まれていてもよいし、ま
たは１つの連続Ｏリング２８６が１２個のウエル２８４
全部のわまりに延びていてもよい。ブロック２８２は、
図２８に示したように、クランプバー２３４の底面が、
その間に圧縮されたＯリングシール２８６およびウエル
２８４内に入れられた管先端２３８と係合するように設
計されている。毛管２２８は１つのクランプバー２３４
によってプレスばめされているか、またはクランプバー
２３４は、図２８に示されているように、各毛管２２８
を取囲む上方の部片と下方の部片の間にサンドイッチさ
れたＯリングシール２８８を有する２部片配置であって
もよい。

【０１００】圧力シール固定装置２８０は、毛管内の試
料が、ＰＣＲプロトコルの間加圧された環境中へ移すの
を可能にする。この固定装置は望ましくは、装置を、反
応混合物試料の沸点がＰＣＲプロトコルにおいて要求さ
れる変性温度に等しいかまたはそれよりも低い高い標高
地で操作する場合に使用される。しかし、この固定装置
の使用は、反応混合物にホルムアミドのような変性剤の
添加によってさけることができる。変性剤の添加は、変
性に必要な温度を下げ、溶液の沸点を僅かに上げる。

【０１０１】試料がプロトコルの実施の間加圧された環
境で循環させることが必要な場合、さきに記載した試料
処理順序が僅かに変更される。プロトコルを開始するた
め熱交換器２１２中へ試薬混合試料を引出す代りに、試
料移送装置２３０が試料を熱交換器２１２の後方所定の
距離に存在する位置に吸引し続ける。次に、リフトアセ
ンブリ２３６および移動アセンブリ２４７が、管先端２
３８を固定装置２８０の上方へ位置定めするために動
き、次いで先端２３８をウエル２８２中へ、Ｏリングシ
ール２８６が固定装置２８０とクランプバー２３４の下
側面の間に圧縮されるまで下げる。この位置において、
管２２８は環境圧から分離されている。次いで、試料移
送装置２３０が毛管２２８内の試料を、最初の変性イン
キュベーションのために熱交換器２１２中へ押戻し、同
時に試料体積、毛管内の空気および試料ウエル内の管先
端２３８の下方の封入された空気体積を大気圧よりも僅
かに高い圧力に加圧する。次いで、試料移送装置２３０
は、コンピュータ２２０中へユーザによって提供された
命令データセットにより熱サイクリングプロトコルを実
施するため、試料を交番に熱交換器２１２と２１４の間
に位置定めするために操作される。

【０１０２】回転熱板毛管ＰＣＲ熱サイクラー本発明による毛管熱サイクラー装置の第７実施形は図２
３〜図２７に示されている。この実施形は、熱交換ブロ
ック２１２および２１４が回転円筒ドラム熱交換アセン
ブリ３００により代えられていることを除き、上述した
第６実施形と類似である。第７実施形２９８の操作は、
試料処理の面で記載した第６実施形と同一である。重要
な相違は熱交換アセンブリ３００の操作にある。熱交換
アセンブリ３００はこの実施形では毛管２２８に対し相
対的に動かされ、毛管２２８内の試料は静止したままで
ある。

【０１０３】第６実施形からの同一の番号は、下記の記
載における第７実施形において同じ成分を表わす。この
第７実施形の簡略化側面図は図２３に示されている。装
置２９８の斜視図は図２４に示されている。

【０１０４】この装置２９８中の微量滴定トレー２４
０、圧力シール固定装置２８０および清浄トラフプレー
ト２５４は、移動アセンブリ２４７により、前述したよ
うに、パーソナルコンピュータ２２０から母線２５３を
介してコンピュータ制御下に、毛管先端リフトアセンブ
リ２３６の下方で前後に、移動アセンブリ２４７により
移動される。試料移送装置２３０は反応混合物試料を毛
管先端２３８中へ引込み、次いで熱交換器３００の直接
下方の位置へ引戻すように動作される。しかし、この実
施形において、試料はＰＣＲプロトコルの間前後に移動
されない。試料は静止状態にとどまり、熱交換アセンブ
リ３００は、試料にプロトコルの種々の温度インキュベ
ーションを実施するために回転される。第６実施形にお
けるように、第７実施形の熱サイクリング装置２９８
は、図２２に示したような、試料移送装置２３０、ガン
グシリンジアセンブリを利用する。試料移送装置２３０
は蠕動ポンプ装置または空気力ポンプ装置（いずれもコ
ンピュータ２２０により母線２７５を介して自動的に制
御される）であってもよい。移動アセンブリ２４７は、
微量滴定トレー２４０、清浄トレー２５４および毛管先
端２３８の列下方の加圧固定装置２８０を割送る。リフ
トアセンブリ２３６は毛管先端２３８を、上述したよう
に、試料容器２４０、トラフＣ、ＲおよびＷおよび試料
ウエル２８６中へおよびこれから上げ下げする。

【０１０５】熱交換器３００は軸方向に延びる、４つの
くさび形セグメント３０２，３０３，３０４および３０
６に分割された円筒ドラム形ボデイであり、各セグメン
トは“Ｘ”形の放射状絶縁層３０８の脚によって他方か
ら分離されている。ドラムセグメント３０２および３０
６はＰＣＲインキュベーションに利用される。セグメン
ト３０２は、温度制御装置３０１により、代表的には、
約６０℃およびアニーリングおよびエクステンションに
相応する他の温度に維持される。セグメント３０６は、
温度制御装置３０５により、変性温度、代表的には９５
℃に維持される。他の２つのセグメント３０３および３
０４は、トランジションセグメントである。これらセグ
メントの温度は、インキュベーションセグメント３０２
および３０６よりも２℃〜２０℃高いかまたは低い範囲
である。セグメント３０４は約９５℃の変性温度よりも
２℃〜２０℃高い温度に維持され、セグメント３０６は
この温度に維持され、代表的には温度制御装置３０７に
より約１００℃に維持される。セグメント３０４はトラ
ンジションを促進する、つまりアニーリング／エクステ
ンション温度から変性温度へのランプ速度を増加し、全
プロトコル時間を最小にするために使用される。これに
対して、残りのセグメント３０３は、代表的には約６０
℃のアニーリングおよびエクステンション温度よりも著
しく低い温度に維持される。セグメント３０３はトラン
ジション温度よりも約２℃〜２０℃低い範囲内に維持さ
れ、代表的には温度制御装置３０９により約５０℃に維
持される。

【０１０６】４つの熱交換セグメント３０２，３０３，
３０４および３０６を有する第７実施形は、単一の変性
インキュベーション温度および単一のアニーリング／エ
クステンションインキュベーション温度が使用されるＰ
ＣＲプロトコルに対して最適であると信じられる。それ
ぞれインキュベーション温度よりも高い温度および低い
温度に保たれる第３および第４セグメントは、アニーリ
ング／エクステンション温度と変性温度の間のランプの
上下を有効に最大にするために望まれる。その理由はこ
れらのトランジション回数は与えられた時間内に反応生
成物の生産を最大にするためには最小にしなければなら
いからである。実施するのに必要とされる特別のプロト
コルに依存して、２、３またはそれ以上のセグメントの
ような異なる数のセグメントを有する別の実施形も考え
られることは明らかである。たとえば、５または６セグ
メントの熱交換器は、２−または３温度インキュベーシ
ョンプロトコルに対して最適である。

【０１０７】熱交換アセンブリ３００は望ましくは、セ
グメントへの液体および／または電気的接続の複雑さを
最小にするために温度を所望の範囲内に維持するため前
後に回転する。例示したブレッドボード実施形２９８に
おいては、セグメントは各アルミニウムセグメントに埋
設されたヒータにより温度に維持される。さらに、ＲＴ
Ｄまたはサーモカップルは、温度制御装置３０１，３０
５，３０７および３０９に対する必要な制御信号を提供
するために、各セグメントに埋設されている。また、熱
交換アセンブリ３００は、ヒータ電流を供給しかつ温度
検出および制御を提供するために、適当なスリップリン
グ電気接続が行なわれる場合、一方向に連続的に回転さ
せることができる。この別法は、リード線疲労を最小に
するため製造機械において望ましい。

【０１０８】回転熱交換アセンブリ３００の側面図は、
図２６に示されている。熱交換アセンブリの背面図は図
２７に示されている。熱交換アセンブリ３００は、２つ
の定置の支持ポスト３１０により、ブレッドボード台板
２１６から水平かつ回転可能に支持されている。各支持
ポストは軸受（図示せず）を収容し、該軸受はまた軸方
向シャフト３１２を回転可能に支持する。軸方向シャフ
ト３１２は一端に固定されたプーリ３１４を有し、該プ
ーリはまたベルト３１６を介して図２５の端面図に示し
たようにステップモータ３１８に連結されている。ステ
ップモータ３１８はコンピュータ２２０に連結され、制
御されている。セグメント３０２，３０３，３０４およ
び３０６の各々は、くさび形の固形アルミニウムセグメ
ントであり、相対する端部が円形端板３２０にボルト締
めされている。端板３２０はまたそれぞれ、定置の支持
ポスト３１０により保持された軸受に支承された軸方向
シャフト３１２に固定されている。

【０１０９】プーリ３１４に隣接するシャフト３１２に
は割出し板３２２が固定されている。この割出し板は、
シャフト３１２のプーリ端で、定置のポスト３１０に取
付けられた光位置センサ３２４に結合されている。位置
センサ３２４は、コンピュータ２２０を通してステップ
駆動モータ３１８に連結されている。光位置センサは、
熱交換ドラム３００が正しく位置定めされていることを
指示するため、割出し板３２２におけるノッチ３２６の
存在を検知する。

【０１１０】セグメント３０２，３０３，３０４および
３０６はそれぞれは望ましくは、セグメントの長さに沿
って等間隔に存在する、１２の平行な半円形みぞ３３０
を有する湾曲外面３２８を有する。各みぞ３３０は毛管
２２８の１つを収容するように寸法定めされているの
で、管２２８の円周の少なくとも半分は十分にセグメン
トの外面３２８と接触している。各セグメントの間の間
隔は、望ましくはファイバガラス、プラスチックまたは
空気のような熱絶縁材料で充てんされている。目的は、
セグメント３０２，３０３，３０４および３０６間の熱
伝達を最小にすることである。

【０１１１】各セグメント３０２，３０３，３０４およ
び３０６は、発熱体３３４を収容する軸方向に延びる通
し孔３３２を有する。単一の抵抗発熱体３３４は、図示
の実施形２９８においては各セグメント内で利用され
る。しかし、双対の発熱体を使用することもできる。各
セグメントは温度制御用のＲＴＤまたはサーモカップル
温度検出器のための凹みを含有する。それに加えてまた
は二者択一的に、各セグメントはそれを貫通する１つ以
上に流路を有することができ、該流路を通って所望の範
囲内のセグメント温度を維持するために一定温度の液体
が循環する。各発熱体および温度検出器は、その制御装
置３０１，３０５，３０７または３０９に通常のリード
線３３６を介して接続されている。

【０１１２】熱交換ドラム３００および試料は熱サイク
ルの間静止位置に維持されるているので、操作の間毛管
２２８における摩耗を減少させ、管と熱交換器の間の不
変の熱接触を確保するために引張り装置４００および４
０２が設けられている。図２５に関して、引張り装置４
００および４０２はそれぞれ、台板２１６に取付けられ
た、傾斜した定置の支持ブロック４０４およびすべりブ
ロック４０６、およびブロック４０６にボルト締めされ
たキャップ４０８を包含し、該キャップは毛管２２８を
平行位置に締付ける。ブロック４０６およびキャップ４
０８は、熱交換アセンブリ３００のセグメントの表面３
２８内のみぞ３３０に対する接線に沿って毛管２２８を
位置定めする。すべりブロック４０６はそれぞれ、コイ
ルばね４１０により接線方向に熱交換器３００から離れ
るようにばね負荷されている。定置の支持ブロック４０
４のそれぞれの傾斜した上面に対して各すべりブロック
を保持するために、ブロック４０６の表面に対して垂直
に働く１対の止めばね４１２が使用される。

【０１１３】引張り装置４００および４０２は台板２１
６上に位置定めされているので、それぞれの毛管２２８
は、それぞれのセグメントが、図２４および図２５に示
されているように“６時”の位置に位置定めされている
場合、各特定のセグメント３０２，３０３，３０４およ
び３０６の湾曲した外面３２８のみぞの全長に接触す
る。ばね４１０および４１２は協力して、熱交換器３０
０下方の毛管２２８の部分が各セグメントの外面３２８
と良好な熱接触状態に維持されかつ各管がそのみぞ３３
０内に保持されているのを確保する。

【０１１４】引張られた毛管２２８における摩耗を減少
させるために、ステップモータ４２２により駆動される
引張り力レリーズ装置４２０が、熱交換セグメントの間
で回転する間、管２２８における引張り力を自動的にレ
リーズする。コンピュータ２２０を介し母線４２３によ
りモータ４２２によって駆動される水平に取付けられた
回転シャフト４２４は、すべりブロック４０６に対し偏
心ローブ４２６を、ばね４１０のばね負荷に抗して位置
定めする。偏心ローブ４２６はすべりブロック４０６を
熱交換器３００に向って押し、コンピュータ２２０から
熱交換ステップモータ３１８に伝達される駆動信号と同
時にまたは直前に毛管２２８における引張り力をレリー
ズする。

【０１１５】光学的に透明な熱シールド３４０を、毛管
２２８と接触しているセグメントの下方で密に隣接して
位置定めすることができる。この熱シールド３４０はＤ
ＮＡ増幅工程の間反応生成物の生産をモニタするため、
図２６および図３０に示したように、熱交換器３００の
下方に取付けられたけい光検出器３５０に対する窓とし
て作用することもできる。

【０１１６】臭化エチジウム（挿入染料）を反応混合物
に、ＰＣＲと干渉しないレベルで溶かす。エチジウムイ
オンは、ＤＮＡ中に挿入した場合、約６１５ｎｍで、溶
液中に存在しない場合よりも高い強さでけい光を発す
る。それ故、けい光の強さは、増幅したＤＮＡ集団の濃
度の尺度として使用することができる。

【０１１７】検出器３５０は、インキュベーションの間
毛管２２８の１２個すべてからのけい光を同時に検出す
るホトダイオードアレー（ＰＤＡ）を使用する。検出器
３５０は図３０に略示されている。ドラム３００の下方
で引張り装置４００と４０２の間には紫外線光源３５４
およびミラー３５６を含有しかつ支持するハウジング３
５２が取付けられている。ＵＶ光源３５４はドラム３０
０と接触している１２個の毛管の部分に向けられてい
る。ミラーは、ドラム３００の下方で毛管により放射さ
れるかまたは毛管から反射された光がハウジング３５２
中の窓３５８および集束レンズ３６０を通ってホトダイ
オードアレー３６２に向けられるように位置定めされて
いる。ホトダイオードアレー３６２の出力は、通常の増
幅回路３６４を通ってデイスプレー用コンピュータ２２
０に供給される。

【０１１８】このブレッドボード設計においては、１２
個の毛管のそれぞれからの光はアレー中の別個のホトダ
イオードに向けられるので、各毛管内での増幅は同時に
かつ個々にモニタすることができる。使用されるこのダ
イオードアレーは、直線配列の３５個のダイオードから
なる。それぞれの第３ダイオードは、光学的に信号ダイ
オードとして毛管２２８の１つに結合されている。

【０１１９】ドラム３００のアニーリング／エクステン
ション区間は、モニタする間毛管２２８に対して位置定
めされている。検出されたけい光強さは、ＰＣＲプロト
コルの間のＰＣＲ生成物の成長のリアルタイムモニタを
生じる。この情報は、増幅の大部分の間、成長速度は簡
単な指数プロセスであるので、増幅に先立ち、最初に存
在していた標的ＤＮＡの量を見積るのに使用することも
できる。

【０１２０】ハウジング３５２の内部は、散乱光を吸収
するため均一なブラックに塗装され、外界光を排除する
ため、ドラム３００の底に隣接して密に嵌合されてい
る。アニーリング／エクステンションセグメント３０２
の外面３２８も、散乱光を吸収するため均一なブラック
に塗装されている。各アニーリング／エクステンション
セグメント３０２の湾曲面は、けい光の最大量を反射す
るようにするためミラー仕上げに磨かれている。

【０１２１】また、他のセグメントも検出のために使用
することができる。しかし、長時間のアニーリング／エ
クステンションインキュベーションは、サイクルごとに
蓄積するＰＣＲ生成物をモニタするためには最適の機会
を与えるように感じられる。検出系３５０中では、けい
光データがアニーリング／エクステンションインキュベ
ーションの間毎秒１回受信される。さらに、全検出系は
望ましくはそれ自体製造装置中に含有されている。

【０１２２】上記の検出系は、ＵＶ光および可視光が通
るように、毛管が比較的透明である限り、ここに記載し
た多数の実施形に取付けることができる。さらに、検出
系信号は最適インキュベーション時間を計算および調節
するための入力として使用することができる。また、検
出器出力は、ＰＣＲプロトコルに対する終端信号を提供
するために使用することができる。換言すれば、現在技
術におけるプラスチックであるようなサイクルの総数よ
りもむしろＰＣＲ生成物の所望量をコンピュータ２２０
に指定することができる。最後に、他の検出系も利用す
ることができる。たとえば、分解能および感度を高める
ため、ダイオードアレーの代りに、ＣＣＤ装置を使用す
ることができる。検出器も、ポリクロメータに結合する
ことができ、異なる発光スペクトルを有する若干のけい
光を、反応混合物の種々の成分を識別するために使用す
ることができる。たとえば、ＤＮＡ増幅と干渉しない染
料により発せられた１つのけい光信号を、けい光光学素
子を連続的に再校正するために使用することができる。
光校正染料は光退色に耐えるかまたはＤＮＡリポーター
染料が光退色する場合には、類似の感光性を示すように
選択すべきである。エチジウムのようなデュフレックス
ＤＮＡに結合する際に強いけい光増強を経験する染料
（核酸分析法において周知の挿入染料）または二重らせ
んＤＮＡの小溝に結合することが知られている、多数の
ビス−ベンズイミド部類の染料によって第２けい光信号
を提供することができる。樋口（Ｈｉｇｕｃｈｉ等）
（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第１０巻（１９９２年
４月）第４１３頁〜第４１７頁、“特殊なＤＮＡ配列の
同時増幅および検出”）は、エチジウムはＰＣＲ混合物
中でリアルタイムに二重らせんＤＮＡの蓄積をモニタす
るために使用することができたことを示した。この第２
けい光信号に対し選択的に、染料およびけい光消光剤
を、ＰＣＲ鋳型にアニーリングするプローブに、ＰＣＲ
が５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポ
リメラーゼを用いて行なわれる場合、ポリメラーゼのニ
ックトランスレーション活性がプローブを消化するよう
に結合することができる。ホランド（Ｈｏｌｌａｎｄ
等）［ＰＣＴＰｕｂｌ．Ｎｏ．ＷＯ９２／０２６３
８］により記載されたように、この消化活性は、染料が
消光剤から分離する際にけい光信号を発する。異なる鋳
型に対し特異的なプローブに結合した、スペクトルが異
なる、若干のけい光消光剤対を使用すれば、若干のＰＣ
Ｒ生成物の蓄積を同時にモニタすることが可能である。

【０１２３】装置２９８は、コンピュータ２２０の制御
下に、下記のように自動的に動作する。反応混合物の試
料は、上述したように、リフトセグメント２３６および
試料移送装置２３０を介して毛管２２８のそれぞれに引
込まれる。試料は、試料容器２４４から毛管２２８中へ
吸引され、熱交換ドラム３００のすぐ下の位置に達す
る。図２４に示したように、セグメント３０６は試料を
含有する毛管２２８の区間と接触する。毛管２２８内の
試料の温度は、９５℃の変性温度にまで迅速に上昇す
る。毛管内の変性温度は必要なインキュベーション時間
維持される。

【０１２４】この時間の終りに、セグメント３００を時
計方向に９０°回転して、セグメント３０３が反応混合
物試料を含有する毛管区間と接触する位置にもたらす。
セグメント３０３は約５０℃に維持されるので、試料は
約６０℃の温度に迅速に冷却する。適当な時間に、セグ
メント３００を時計方向にさらに９０°回転して、セグ
メント３０２を、試料を含有する毛管区間に向合う位置
にもたらす。セグメント３０２は６０℃に維持される。
アセンブリは再び、ＰＣＲプロトコルにより指示される
必要なインキュベーション時間この位置にとどまる。ア
ニーリングおよびエクステンションインキュベーション
の終りに、ドラムを時計方向にさらに９０°回転し、そ
の結果セグメント３０４（代表的には１００℃の温度を
有する）は毛管２２８と、反応混合物温度を迅速に約９
５℃に上げるのに必要な時間接触している。９５℃に達
した際、熱交換アセンブリ３００を反時計方向に迅速に
さらに２７０°回転して、セグメント３０６を再び、次
の必要な変性インキュベーションのため毛管２２８と接
触する位置にもたらす。このプロセスを、ＰＣＲプロト
コルを完成するのに必要であるように繰返す。各回転時
間の間偏心カム４２６をモータ４２２により回転して、
セグメントの外面３２８から毛管２２８をゆるめる。回
転が停止した場合、インキュベーションの間適切な熱接
触を確保するため、偏心カム４２６を回転して引張り装
置４００および４０２を再係合する。

【０１２５】上述した第６実施形におけるように、熱交
換アセンブリおよびセグメントの温度制御の回転調整お
よび制御はコンピュータ２２０によって維持される。Ｐ
ＣＲプロトコルの終りに、コンピュータ２２０は、試料
移送装置２３０に、プランジャ２６６を挿入して反応生
成物を微量滴定トレー２４０中のウエルにある試料容器
２４４中へ戻すように指示する。次いで、第６実施形に
関して記載した清浄およびすすぎの工程配列を、毛管か
ら汚染物および処理した試料の残留物をフラッシングす
るために実施する。次に、移動アセンブリ２４７が、微
量滴定トレー２４０を次列のウエル保持試料容器２４４
に再位置定めし、全工程を繰返す。

【０１２６】上述した第６および第７実施形における毛
管先端２３８は、図２９に先端２３８の拡大図で示した
ように、特殊な物理的配置を有する。毛管を単に管の軸
に対して横方向に切断する場合、排出される試料の最終
滴はしばしば管端にぶらさがる。こうして、試料ウエル
中への反応生成物の完全な排出が阻止される。先端壁２
９０を図２９に示したように先細にすることによって、
反応生成物の最終滴は毛管２２８の末端２３８から確実
に排出される。

【０１２７】試料は第６実施形において熱交換器の間で
前後に移動するので、毛管２２８内の試料の、第７実施
形における熱交換ドラム３００下方の位置への“ドラッ
グアウト（Ｄｒａｇｏｕｔ）”は、最小の内面あらさを
有するテフロン管においては、管壁に隣接する液体が管
壁に進行的に管壁に付着する傾向があり、試料スラッグ
の端部に一般に放物線の細長い断面形を形成する毛管内
の表面張力現象を最小になる。ドラッグアウトが厳しい
場合、引きずる端部はスラッグ移動の間大部分の試料ス
ラッグから分離するかまたは“ドラッグアウト”し、合
体し、場合により試料の末端部分の間気泡を捕えること
ができ、こうして試料の全長が延びる。前述したよう
に、毛管内の試料の外界温度条件はドラッグアウトに寄
与する。従って毛管中への吸込みの間試料および毛管の
高めた温度を維持すると、ドラッグアウトを最小にする
ことができる。ドラッグアウトを最小にするもう１つの
有効な手段は、試料を、多数の離散過程および休止期の
位置へ試料を吸込むプロセスを中断することである。こ
れらの休止期は、試料のひきずり端が毛管内の試料の大
部分を捕えるのを可能にする。

【０１２８】水の沸点が９３．５℃に低下するデンバ
ー、コロラドのような高地において加圧固定装置を使用
する別法が存在する。この別法は、反応混合物へホルム
アミドのような変性剤の添加であるこの手段は、パナジ
オ（Ｐａｎａｄｄｉｏ等）（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ、第１４巻、Ｎｏ２（１９９３年）、第２３８頁〜第
２４３頁、“ＦｏｌｔＰＣＲ：全血から直接にＤＮＡ
を増幅するための簡単なＰＣＲプロトコル”）に提案さ
れている。著者は、Ｔａｑポリメラーゼよりむしろ熱安
定のＴｔｈポリメラーゼを使用し、９５°−５０°−７
０℃プロトコルはホルムアミド１８％を含有する反応混
合物に対して８５°−４０°−６０℃プロトコルに変え
ることができることを示した。

【０１２９】Ｔａｑポリメラーゼは、グリセロールおよ
びアセトアミドを包含する多数のＤＮＡ変性剤を寛容す
る。実際に、上述した本発明の第７実施形において使用
した反応混合物試料中の２．５％のホルムアミドは、８
９℃の変性温度および６３℃のアニーリング／エクステ
ンション温度において満足な増幅を生じ、プロトコル温
度を一律に約５℃下げる。

【０１３０】以下の節は、本発明の第７実施形の操作を
制御するために使用されるソフトウエアの系統図を提示
する図３１〜図３４に関する。コンピュータ２２０中の
ソフトウエアは、５つのステップモータを制御する。こ
れらのステップモータは次のものである：ポンプ２３０
中のシリンジ２６２を操作するモータ２７４；熱交換ド
ラム３００を駆動するステップモータ３１８；試料ステ
ージ２４６を水平に移動するステップモータ２４８；毛
管２２８の先端２３８を垂直に上下するステップモータ
２４２；および熱交換ドラム３００に対して毛管２２８
を引張りおよびためカムを回転するステップモータ４２
２。

【０１３１】ソフトウエアはベーシックでまたは当業者
に公知の常用のプログラミング言語でプログラミングさ
れていてもよい。下記に記載したブレッドボード設計は
ベーシックでプログラミングされている。

【０１３２】図３１に関し、ユーザはブロック５０１で
開始し、熱サイクリングプロトコルに必要な変数を負荷
する。これらの変数は、変性温度、アニーリング温度、
変性温度におけるインキュベーション時間、アニーリン
グ温度におけるインキュベーション時間、熱サイクル
Ａ、ＢおよびＣにおけるサイクル数、試料体積、オーバ
シュートインキュベーション時間、アンダシュートイン
キュベーション時間、熱交換ドラム３００の下方で６時
の位置に試料の真中を正確に置く絶対ポンプ配置、負荷
時のポンプ回転速度、無負荷時のポンプ回転速度および
検出時間を包含する。これらすべての変数がエラーなし
に入力された場合、ソフトウエアはブロック５０２に進
み、検出器ポートがコンピュータ２２０に開かれる。

【０１３３】次いで、処理は図３２に示した試料負荷サ
ブルーチン５０３に移る。このサブルーチン５０３は、
付勢されるステップモータ２４２で、毛管先端２３８を
微量滴定トレー２４０中の管の少なくとも約１ｃｍ上方
の位置へ持上げはじめる。ブロック５０３において、シ
リンジポンプ２３０の回転速度が設定される。ステップ
モータ２７４の回転速度は、ブロック５０６においてシ
リンジポンプ２３０を閉じるため動作する。この作用は
シリンジプランジャ２６６を十分に挿入する。

【０１３４】次いで、ステップモータ２４８は、ブロッ
ク５０７において母線２５３を介して付勢されて微量滴
定プレート２４０を、試料管または容器の所定列の最初
のものが管先端２３８の直接下方に位置するように位置
定めする。次に、ブロック５０８において、シリンジポ
ンプ２３０が作動される。ここで、ステップモータ２７
４が逆方向に動いて、ＰＣＲプロトコルの終りに管２２
８から試料を完全に吐出するのに使用することのできる
シリンダ内の空気体積が存在するのを確実にするため、
プランジャ２６６を僅かな引戻し位置にもたらす。

【０１３５】次いで、コンピュータ２２０は信号を母線
２２２を介してステップモータ２４２に送って、ブロッ
ク５０９において管先端２３８を下げる。毛管先端２３
８は、試料管中へほとんど管の底に下げられる。この工
程は、管先端を、試料反応混合物の最大体積を毛管２２
８中へ引上げるように位置定めする。

【０１３６】次いで、シリンジポンプ２３０が、ブロッ
ク５１０において、望ましくは５０μｌの試料を毛管２
２８中へ吸上げるため動作される。次いで、シリンダに
より必要量が吸上げられた場合、ブロック５１１におい
てステップモータ２４２が付勢されて管先端２３８を試
料管から持上げる。この操作が、図３２に示した負荷サ
ブルーチン５０３を完結する。

【０１３７】再び図３１に関して、制御はブロック５０
３に戻り、ブロック５１２に進む。ブロック５１２にお
いて、ステップモータ４２２が、毛管２２８とドラム３
００の間の引張り力をレリーズするために動作される。
とくに、ステップモータ４２２はカム４２６を回転し
て、すべりブロック４０６を熱サイクリングドラム３０
０に向って、毛管を変性するのに十分な数ｍｍ動かす。
引張り力がレリーズされると、ブロック５１３におい
て、熱サイクリングドラム３００がステップモータ３１
８により回転され、最低温度にあるセグメント３０３
は、６時の位置に対称に位置定めされている位置もたら
される。この位置において、毛管２２８はこのセグメン
ト中のみぞ３３０を十分に覆う。

【０１３８】ドラム３００がセグメント３０３を正確に
６時位置に位置定めすると直ちに、制御はブロック５１
４に進む。ここで、ステップモータ４２２が再び動作さ
れ、カム４２６をすべてブロック４０６と引き続き係合
しないように回転し、ばね４１０が管２２８を６時の位
置にあるドラムのこのセグメント中でみぞ３３０の表面
に対して伸張するのを許す。次いで、ステップモータ２
７４が、ブロック５１５において間欠的に“緩速負荷
（ｓｌｏｗｌｏａｄ）”方式で付勢されて、試料を毛
管先端２３８上方から６時の位置にあるセグメント３０
３に直接隣接する毛管内の位置へ移動する。プランジャ
２２６を少し引上げ、次いで所定時間、代表的に数秒間
待ってステップモータ２７４を付勢するこの順序は、試
料を４０または５０の短かい工程の連続で移動させ、代
表的には試料をドラム３００の下方の近接位置へ動かす
のに約２分かかる。この間欠的運動は、“ドラッグアウ
ト”現象が試料体積の後端を分離させ、気泡の形成を阻
止するのに必要である。かかる気泡は試料体積を有効に
伸長し、試料中の核酸の増幅を悪化しうる。この緩速負
荷法は、毛管の内面をパリレンで塗布するかまたは毛管
の長さを予備加熱すれば必要でない。

【０１３９】最後に、ブロック５１６において、ステッ
プモータ２７４が、試料をセグメント３０３の下方で正
確かつ対称に位置定めするため動作される。

【０１４０】再び図３１に関して、熱サイクリングサブ
ルーチンが実施される。熱サクリングプロトコルは、代
表的には交番する変性インキュベーションおよびアニー
リング／エクステンションインキュベーションからなる
２０〜３０の熱サイクルである。このブレッドボード設
計においては、プロトコルは３つのシーケンスＡ，Ｂお
よびＣに分割されており、これらは各シーケンス中のサ
イクルの数を除き同一である。図３３に示された熱サイ
クリングサブルーチンのブロック図は、それぞれの順序
で使用される。第一に、熱サイクルＡにおいて実施され
るべきサイクルの数はカウンタＮ（ブロック５１９）中
にセットされている。毛管に対する引張り力は、上述し
たように、ステップモータ４２６を付勢することによっ
てレリーズされる（ブロック５２０）。次に、ドラム３
００がステップモータ３１８を介して時計方向に回転さ
れ、セグメント３０４を６時の位置に位置定めする（ブ
ロック５２１）。ドラム３００は最初、セグメント３０
３と共に６時の位置に位置定めされるので、第１サイク
ル回転は時計方向に１８０°である。次のサイクルにお
ける回転（ブロック５２１）は、セグメント３０２が６
時の位置にあるアニーリング／エクステンションインキ
ュベーション位置から時計方向に９０°である。ステッ
プモータ４２２が再び付勢され、カム４２６をすべりブ
ロック４０６と係合しないように回転して、毛管２２８
に再び引張り力を復元するブロック５２２）。ブロック
５２３は試料温度を９５℃の変位温度に急速にランプす
るのに必要な、セグメント３０４が毛管と接触している
待ち時間を表わす。この時間は、比較的短いく、数秒の
大きさである。セグメント３０４の温度が高ければ高い
ほど、必要な時間はますます短かくなる。

【０１４１】必要な待つ時間後、毛管２２８における引
張り力はレリーズされる（ブロック５２４）。次いで、
ブロック５２５においてドラム３００が時計方向に９０
°回転され、セグメント３０６を６時の位置に位置定め
する。ブロック５２６において、ステップモータ４２２
が再び付勢されて、カム４２６が回転し、すべりブロッ
ク４０６がレリーズされ、毛管２２８とドラム３００の
底の間の引張り力が復元される。この過程が、ブロック
５２７に象徴された変性インキュベーションを開始す
る。この変性インキュベーションは、代表的には１分の
大きさである。このインキュベーションの終りに、ステ
ップモータ４２２が再び付勢されて、毛管２２８とドラ
ム３００の間の引張り力がレリーズされる（ブロック５
２８）。次いで、ドラム３００は、反時計方向に２７０
°回転して、冷セグメントを６時の位置に戻す（ブロッ
ク５２９）。

【０１４２】順次に時計方向に２７０°回転し、反時計
方向に戻すのは、温度制御装置からのリード線がドラム
３００のまわりに巻付くのを阻止する。ドラム３００
が、セグメント３０３が６時の位置にある位置に達した
場合、引張り力が再び復元される（ブロック５３０）。
ドラムセグメント３０３と接触すると、試料の温度は迅
速に６０℃のアニーリング／エクステンション温度に下
がる。従って、待ち（ブロック５３１）は比較的短か
い。再び、ブロック５３１における待ちの後、管に対す
る引張り力はレリーズされ（ブロック５３２）、ドラム
３００時計方向に９０°回転してセグメント３０２を６
時の位置に位置定めする。ブロック５３４において、管
２２８とドラム３００の間の引張り力は再び復元され
る。ブロック５３５において、けい光検出がはじまり、
代表的に約１１９秒の時間、アニーリング／エクステン
ションインキュベーションの間継続する。アニーリング
およびエクステンションのインキュベーションは、ブロ
ック５３６において実施される。アニーリング／エクス
テンションインキュベーション時間および検出時間はほ
ぼ同じである。

【０１４３】アニーリング／エクステンションインキュ
ベーションの終りに、管２２８とドラム３００の間の引
張り力は上記のように再びレリーズされる（ブロック５
３７）。ブロック５３８においてカウンタは減分され、
ゼロに照会される。カウンタがゼロに等しい場合、サブ
ルーチンは主プログラムに戻る（ブロック５４０）。カ
ウンタがゼロでない場合、制御は再びブロック５２０に
志向される。

【０１４４】ブロック５４０において、ポンプ２３０
は、試料を前後におよび再び後に押して気泡を試料から
追出するために動作される。変性温度とアニーリング／
エクステンション温度の間の連続的熱サイクリングの
間、試料は小気泡を生成し、該気泡が試料の末端を伸張
するかまたは相互に引離し、こうして試料体積はセグメ
ントの下方から部分的に離れる。試料を２５μｌ、５０
μｌだけ前後に動かし、それから後に５０μｌ動かす
と、これらの気泡が試料から追出され、こうして試料体
積はそのもとの大きさに復元することが判明した。気泡
掃引ブロック５４０が完了すると、熱サイクルＢシーケ
ンスがブロック５４１に示したように開始される。

【０１４５】熱サイクルＢは操作過程においては上述し
た熱サイクルＡと同一である。再び熱サイクルＢ後、気
泡は“気泡掃引（ｂｕｂｂｌｅｓｗｅｅｐ）”で試料
を前後に動かすことによって掃引される。（ブロック５
４２）。

【０１４６】代表的には熱サイクルＡは約５つのサイク
ルからなり、熱サイクルＢは約１０のサイクルからな
る。熱サイクルＣは、ブロック５４３に示したように、
プロトコル中の残存サイクル、プロトコルにおける３０
〜３５サイクルに対し代表的には１５〜２０の間のサイ
クルを包含する。熱サイクルＣの完結後、管２２８と熱
サイクルドラム３００の間の引張り力は、ブロック５４
４において指示したようにレリーズされ、必要に応じ、
ドラム３００が回転して、ブロック３０３を６時の位置
に位置定めする（ブロック５４５）。

【０１４７】試料無負荷サブルーチンがブロック５４６
において行なわれる。このサブルーチンは図３４に示さ
れている。はじめに、毛管の先端２３８は、熱サイクリ
ングの間、上昇位置にある。第一に、微量滴定トレー２
４０がユーザによりプログラミングされたように次の列
または他の列に割送りされる（ブロック５４７）。ブロ
ック５４８及び５４９においては、毛管先端を上方位置
に持上げ、ポンプ回転速度がセットする（ステップモー
タ２７４）命令が与えられる。無負荷時のパンピング速
度は、負荷サブルーチンにおけるよりも迅速である。そ
れというのも絶対的位置定めおよびドラッグアウト効果
は重要ではないからである。さらに、ブロック５５０に
おいてはバックラッシは中断されている。バックラッシ
は、シリンジの交番挿入および引戻しの間に蓄積する種
々の許容誤差を考慮するため相関因子がステップモータ
２７４に適用される。無負荷サブルーチンにおいては、
試料の末端位置は毛管から排出されようとする。従っ
て、絶対位置は重要でない。それ故、パンピングアセン
ブリにおけるバックラッシの補償は、このサブル−チン
においては必要でない。

【０１４８】ブロック５５１においては試料約２０ｍｌ
を６時の位置におけるその現在の位置から移動させるた
めに、ポンプ２３０（ステップモータ２７４）が動作さ
れる。ブロック５５２においては試料は、毛管内の気泡
形成からドラッグアウトを阻止するために、負荷順序と
類似に、緩速“無負荷（ｕｎｌｏａｄ）”法においてポ
ンプ２３０を介して輸送される。緩速度無負荷法におい
てはポンプが試料を約８ｍｌ動かし、次いで１秒間待
つ、次いで、ポンプ２３０が再び動作して、毛管内でさ
らに８ｍｌの距離を、試料が微量滴定トレー２４０内の
試料管中へ排出されるまで移動させる。最後に、ブロッ
ク５５３において、シリンジポンプ２３０が完全に閉じ
られ、管の先端２３８から試料の最後の残留量を、図３
２に示した試料負荷サブルーチンのブロック５０８にお
いて、シリンジの最初の弁動作からの空気スラッグで試
料中へ押込む。

【０１４９】最後に、ブロック５５４においてバックラ
ッシが復元され、ブロック５５５において検出器ポート
が閉じられる。ブロック５５６において、プログラムが
他の試料ランへの連結を探索する。他の試料ランが要求
される場合には、ブロック５５７により象徴されている
清浄サブルーチンが実施される。清浄サブルーチンはた
んに、微量滴定トレー移送ステージ２４７を適当な洗
滌、すすぎまたは排水トラフ上へ位置定めし、管先端２
３８を清浄トレー中へ下し、清浄液のスラッグを、熱交
換ドラム３００の後方位置へ毛管２２８中へ吸込み、毛
管２２８の内面を乱流的にこするため、ポンプ２３０を
前後に振動することを包含する。次に、清浄液を排水ト
ラフ中へ放出させる。次に、すすぎ液を毛管中へ吸込
み、前後に振動し、次いで排水する。最後に、コンデシ
ョニング液を次のサイクルのため準備中の毛管中へ吸込
む。このコンデショニング液が排水された後、ソフトウ
エア制御は、熱サイクルされる試料の次の列のためブロ
ック５０２に戻る。

【０１５０】上記の記載は本発明のすぐれた実施形の説
明であるが、本発明による毛管サイクル装置の発明思想
は詳述したとは別の方法で実施できることは明らかであ
る。たとえば、本発明による熱サイクリング装置の種々
の実施形はＰＣＲのほかに、少なくとも１つの熱サイク
リングを必要とする他の核酸増幅および／または反応技
術に適用できる。上記例はたんに説明的なものにすぎな
い。

【０１５１】これらの技術は、リガーゼ連鎖反応および
エーブラムソン（Ａｂｒａｍｓｏｎ）当（Ｃｕｒｒｅｎ
ｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ，１９９３年、第４巻第４１頁、“核酸増幅技術”）
に討議されているような修復連鎖反応を包含する。リガ
ーゼ連鎖反応は、バラニイ（ＦｒａｎｃｉｓＢａｒａ
ｎｙ）により（ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐ
ｐｌｉｃａｔｉｃｎｓ１：５−１６（１９９１年））の
“ＰＣＲの世界におけるリガーゼ連鎖反応”においても
討議されている。本発明が使用することのできる他の方
法は、フェイ(Ｆａｈｙ）等（ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓ
ａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｃｎｓ１：２５〜３３
（１９９１年）、“自己支持されるシーケンス複製”：
ＰＣＲに対する等温度転写を基礎とする増幅系別法）に
より討議された３ＳＲ法およびウオーカー（Ｗａｌｋｅ
ｒ）等により（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：３９２−３９６（１９９２
年）、“制限酵素／ＤＮＡポリメターゼ系によるＤＮＡ
の等温的試験管内増幅”）において討議された標準置換
検定（ＳＤＡ）を包含しうる。

【０１５２】これらの反応はいずれも、反応混合物が変
性、アニーリングおよびエクステンションプロセスを受
ける。これらは主として、アニーリングされたオリゴヌ
クレオチドが標的鎖を複製するためエクステンドされる
プライマーエクステンション法において使用される特異
的エクステンション機構のみが異なる。修復連鎖反応お
よびＬＣＲは反覆熱サイクリングを包含する。３ＳＲお
よびＳＤＡ法は最初の変性工程、それに続くアニーリン
グおよびエクステンションプロセスのための等温インキ
ュベーションを包含する。

【０１５３】上述した装置の他の可能な適用例は、ＰＣ
Ｒに先立つｃＤＮＡ合成、ＤＮＡの連結およびキナージ
ング、および引き続くインキュベーションまたは熱サイ
クリングの間試薬の添加が要求されうる酵素処理を包含
しうる。こうして、本発明の実施形は、特許請求の範囲
の本来の範囲および公平な意味を逸脱することなく、修
正、変更および変化で加えられる。従って、特許請求の
範囲の思想および広い範囲に入るすべてのかかる変更、
修正および変化を包含するものとする。ここで引用した
すべての特許明細書、特許および刊行物は、引用によっ
てその全体が組込まれる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の第１実施形による毛管ＰＣＲ熱サイク
ラー装置のブロック図。

【図２】本発明の第２実施形による毛管ＰＣＲ装置のブ
ロック図。

【図３】小規模の迅速ＰＣＲを実施するための、本発明
の第３実施形による毛管ＰＣＲ装置のブロック図。

【図４】本発明の別の第３実施形による毛管装置のブロ
ック図。

【図５】３つのサーモスタット付循環液体浴および単一
反応室を使用する、本発明の第４実施形による毛管ＰＣ
Ｒ装置のブロック図。

【図６】すべての流れがバイパスされた、図５に示した
装置の反応室の線６−６による概略断面図。

【図７】５５℃の流れが反応室を通り、他のすべての流
れがバイパスされている、図６におけるような装置の反
応室の概略断面図。

【図８】７５℃の流れが反応室を通り、他のすべての流
れがバイパスされている、図６におけるような装置の反
応室の概略断面図。

【図９】９５℃の流れが反応室を通り、他のすべての流
れがバイパスされている、図６に示した装置の反応室の
概略断面図。

【図１０】金網により適所に保持された例示的な単一毛
管反応管を示す、図５に示した装置の反応室の概略図。

【図１１】毛管中へ反応混合物を漸変量で注入する装置
の図。

【図１２】一定温度に保たれた２つの金属ブロック熱交
換器およびその間に延びる、反応混合物が前後にパンピ
ングされる毛管反応室を使用する第５実施形の毛管ＰＣ
Ｒ装置の概念図。

【図１３】ＰＣＲプロトコルの変性ステージによる、図
１２に示したＰＣＲの図。

【図１４】ＰＣＲプロトコルのアニール／エクステンド
ステージにおける図１２に示したＰＣＲ装置の図。

【図１５】ＰＣＲプロトコルの完成した生成物排出ステ
ージにおける、図１２に示したＰＣＲ装置の図。

【図１６】ＰＣＲプロトコルの試料導入ステージにおけ
る、図１２に示したＰＣＲ装置の別の第５実施形の図。

【図１７】ＰＣＲプロトコルの変性ステージにおける、
図１６に示したＰＣＲ装置の図。

【第１８】ＰＣＲプロトコルのアニール／エクステンド
ステージにおける、図１６に示したＰＣＲ装置の図。

【図１９】ＰＣＲプロトコルの試料排出ステージにおけ
る、図１６に示したＰＣＲ装置の図。

【図２０】本発明による毛細反応管アレーのＰＣＲ装置
の第６実施形概略斜視図。

【図２１】図２０に示した装置中の試料移動アセンブリ
を拡大して示す部分的側面図。

【図２２】図２０に示した装置中の試料移送装置の拡大
側面図。

【図２３】本発明による毛細反応管配列用回転ドラム熱
交換器を有する毛管ＰＣＲ装置の第７実施形の概略側面
図。

【図２４】図２３に示した毛管ＰＣＲ装置のブレッドボ
ードバージョンの斜視図。

【図２５】図２４に示した装置中の回転ドラム熱交換ア
センブリの拡大して示す部分的正面図。

【図２６】図２４に示した回転熱交換アセンブリの部分
的側面図。

【図２７】本発明による図２４に示した熱交換アセンブ
リの拡大部分的背面図。

【図２８】図２０および図２４に示した試料処理アセン
ブリの部分的断面図。

【図２９】図２８に示した毛管先端の拡大して示す断面
図。

【図３０】本発明による第７実施形に結合した検出系の
略図。

【図３１】本発明の第７実施形のための制御ソフトウエ
アの系統図。

【図３２】図３１に示した図の試料負荷サブルーチンの
系統図。

【図３３】図３１に関する熱サイクリングサブルーチン
の系統図。

【図３４】図３１に関する試料無負荷サブルーチンの系
統図。

【符号の説明】

１０装置１２ポンプ１６，１８浴２０絶縁層２２反応管２４，２６Ｏリングシール２８分光測光検出器３０ＣＰＵ３２，３４，３６制御線路３８ブロック４０，４４制御母線５０毛管５１，５５シリンダ５２熱ゾーン５３反応混合部５４冷ゾーン５６容器６０液密室６２毛管６４，６６両端部６８高温浴７０低温浴７８ポンプ８４液体マルチプレクサ８６，１１０入力管８８，１１２出力管９８，１００，１０２浴１０４，１２０弁装置１０６反応室１１２，１１４，１１６，１１８管１２２コンピュータ１２４制御母線１３２，１３４バイパス流路１４０毛管１４２金網１４４クランプ１５２マウス１５４ホルダ１７０，１７２金属ブロック熱交換器１７６，１７８温度制御装置１８０毛管１８２ロッド１８４ピストン１８６ステップモータ１９４容器２０２試料弁ループ２０４溜め２１２，２１４金属ブロック熱交換器２２４，２２６サーモスタット制御装置２３０試料移送装置２３２支持クランプ２３４，２７０クランプバー２３６管リフトアセンブリ２３８管先端２４０微量滴定トレー２４２，２４８ステップモータ２４７移動アセンブリ２４８，２７４ステップモータ２５４清浄トレー２５８親ねじ２６６プランジャ２８０圧力シール固定装置２８４ウエブ２８６Ｏリングシール３００熱交換アセンブリ（ドラム）３０２，３０３，３０４，３０６熱交換セグメント３１０支持板３１２シャフト３１６ベルト３２０端板３２２割送り円板３２４位置センサ３２８湾曲外面３５０検出器３５４ＵＶ光線３６２ホトダイオードアレー４００，４０２引張り装置

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ウィルブロッチアメリカ合衆国カリフォルニアサンマテオナンバーエイノースクレアモントストリート 607 (72)発明者ロバートラグーザアメリカ合衆国コネチカットニュータウンウィリーレーン３ (72)発明者ジョゼフディシザールアメリカ合衆国コネチカットレディングガロウズヒルロード 37 (72)発明者デイヴィドトレイシーアメリカ合衆国コネチカットノーウォークベルドンヒルロード 581 (72)発明者ポールサヴィアーノアメリカ合衆国コネチカットノーウォークヒルクレストプレイス１ (72)発明者ティモシーエム．ウードゥンバーグアメリカ合衆国コネチカットベセルホィットロックアヴェニュー 26 (54)【発明の名称】核酸増幅反応を実施する装置、化学連鎖反応を実施する装置、変性、アニーリングおよびエクステンションプロセスを包含する核酸増幅反応を同時に実施する装置、ならびに核酸増幅反応を実施する方法

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】変性、アニーリングおよびエクステンシ
ョンプロセスを包含する、標的核酸セグメントを含有す
る反応混合物中で核酸増幅反応を実施する装置におい
て、反応混合物を含有するのに適合された部分を有する開放
毛管反応室；反応混合物中で変性プロセスを生起させる
のに適当な第１温度を反応混合物に受けさせるため、毛
管反応室の部分と接触させるのに適合した第１加熱手
段；混合物中でアニーリングおよびエクステンションプ
ロセスを生起させるのに適当な第２温度を混合物に受け
させるため、毛管反応室の部分と接触させるのに適合し
た第２加熱手段；反応混合物を毛管反応室中および外へ
自動的に移動させるため、毛管反応室に連結した試料処
理手段；および毛管反応室の部分と接触している第１お
よび第２加熱手段を自動的に位置定めするための位置定
め手段を包含する核酸増幅反応を実施する装置。
【請求項２】毛管の部分に第１温度以上の温度を受け
させるため該部分と接触するのに適合した第３加熱手段
を包含する、請求項１記載の装置。
【請求項３】それぞれの加熱手段は、円筒熱交換ドラ
ムの放射状セグメントである、請求項１記載の装置。
【請求項４】円筒熱交換ドラムが少なくとも２つの軸
方向に延びる放射状セグメントであり、それぞれが熱絶
縁材層によって相互に分離されている、請求項３記載の
装置。
【請求項５】それぞれのセグメントが弓形外面および
弓形外面内のみぞを有し、それぞれ毛管反応室の部分を
収容するのに適合されている、請求項４記載の装置。
【請求項６】ドラムはその中心軸のまわりでそれぞれ
のセグメントが毛管反応室の部分と接触する位置の間で
回転可能である、請求項５記載の装置。
【請求項７】加熱手段および回転可能なドラムに連結
され、加熱および冷却手段の温度およびドラムの位置を
ユーザ定義パラメーターにより制御するため操作しうる
プログラマブルコンピュータを包含する、請求項６記載
の装置。
【請求項８】それぞれが反応混合物を収容するのに適
合した部分を有する複数の開放毛管反応室を包含する、
請求項１記載の装置。
【請求項９】それぞれの加熱手段は、サーモスタット
により制御される、円筒熱交換ドラムのセグメントであ
る、請求項８記載の装置。
【請求項１０】それぞれのセグメントは、弓形外面お
よび弓形外面内の複数の平行なみぞを有し、それぞれは
毛管反応室の１つの位置を受取るのに適合している、請
求項９記載の装置。
【請求項１１】ドラムはその中心軸のまわりで、それ
ぞれのセグメントが、各毛管反応室の少なくとも１つの
部分と接触する位置の間で回転可能である、請求項１０
記載の装置。
【請求項１２】加熱手段および回転可能なドラムに連
結されたプログラマブルコンピュータを包含し、該コン
ピュータがドラムの回転位置をユーザ定義パラメーター
により制御する、請求項１１記載の装置。
【請求項１３】毛管中で、標的核酸を含有する反応混
合物中で、変性、アニーリングおよびエクステンション
プロセスを包含する連鎖反応を実施する装置において、反応混合物を含有するための毛管反応室；反応混合物中
で変性プロセスを生起させるのに適当な第１温度を毛管
の第１部分に受けさせるため、毛管に結合した第１加熱
手段；反応混合物中でアニーリングおよびエクステンシ
ョンプロセスを生起させるのに適当な第２温度を毛管の
第２部分に受けさせるため毛管に結合した第２加熱手
段；反応混合物を毛管反応室中および外へおよび２つの
部分の間で自動的に移動させる手段を包含する、標的核
酸を含有する反応混合物中で連鎖反応を実施する装置。
【請求項１４】毛管反応室が１つの開放端を有する、
請求項１３記載の装置。
【請求項１５】自動的に移動させる手段がコンピュー
タ制御の蠕動ポンプである、請求項１３記載の装置。
【請求項１６】毛管中の反応混合物中で、変性、アニ
ーリングおよびエクステンションプロセスを包含する核
酸増幅反応を実施する装置において、（ａ）反応混合物中で変性プロセスを生起させるのに適
当な温度範囲内の温度に、第１熱交換器の温度を安定化
するための温度調節系を含有する第１熱交換器；（ｂ）反応混合物内でアニーリングおよびエクステンシ
ョンプロセスを生起させるのに適当な温度範囲内の温度
に、第２熱交換器の温度を安定化するための温度調節系
を含有する第２熱交換器；（ｃ）第１熱交換器と熱接触している第１部分および第
２熱交換器と熱接触している第２部分を有するように径
路定めされている毛管；（ｄ）管中へ反応混合物を収容するため毛管に結合した
入力ポートおよび管から出来上った反応生成物を送出す
るための出力ポートを有し、新しい反応混合物を第１位
置へ注入し、反応混合物を毛管中で第２位置で第１およ
び第２熱交換器の間で循環させ、出来上った反応生成物
を第３位置で排出するのを許す弁アセンブリ；および（ｅ）反応混合物を毛管中で、反応混合物が第１および
第２熱交換器を順次にかつ周期的に通過するように循環
させるため、毛管に結合した熱交換器の１つ中のポンプ
装置を包含する、毛管内の反応混合物中で核酸増幅反応
を実施する装置。
【請求項１７】核酸増幅反応の間、反応混合物中の変
化を表わすデータを発生するため毛管に光学的に結合し
た分光光度検出器を包含する、請求項１６記載の装置。
【請求項１８】試薬、付加的プライマーまたは付加的
酵素を毛管中の反応混合物に添加することのできる入力
ポートを設けるため毛管に結合した弁装置を包含する、
請求項１６記載の装置。
【請求項１９】毛管中の反応混合物に隣接して不連続
部を混入するための手段を有する、請求項１６記載の装
置。
【請求項２０】不連続部の通過をカウントするため毛
管に結合されたサイクルカウンタを有する、請求項１９
記載の装置。
【請求項２１】コンピュータ志向制御装置に記憶され
たデータにより核酸増幅反応プロトコルを自動的に実行
するため、ポンプ装置および弁アセンブリに制御信号を
発生するため、ポンプ装置および弁アセンブリに結合し
たコンピュータ志向制御装置を包含する、請求項１６記
載の装置。
【請求項２２】コンピュータ志向制御装置がユーザプ
ログラマブルであり、異なる核酸増幅反応プロトコルを
定義するデータがユーザにより入力することができる、
請求項２１記載の装置。
【請求項２３】反応混合物中で核酸増幅反応を実施す
る装置が、反応混合物中で変性プロセスを生起させるの
に適当な第１温度に第１熱交換器を維持するための第１
熱交換器系；反応混合物中でアニーリングプロセスを生
起させるのに適当な第２温度に第２熱交換器を維持する
ための第２熱交換器系；反応混合物中でエクステンショ
ンプロセスを生起させるのに適当な温度に第３熱交換器
を維持するための第３熱交換器系；第１、第２および第
３熱交換器を通る反応混合物を含有する開放毛管；反応
混合物に第１、第２および第３温度を連続的に繰返し受
けさせ、反応混合物中に核酸増幅反応が生起するように
するため、反応混合物を毛管を通しておよび熱交換器の
間で移動させるため、反応混合物と連通しかつ毛管の一
端に結合した手段を包含する、反応混合物中で核酸増幅
反応を実施する装置。
【請求項２４】反応混合物を毛管を通して流す手段が
シリンジポンプ装置である、請求項２３記載の装置。
【請求項２５】熱交換器が金属ブロックである、請求
項２３記載の装置。
【請求項２６】生起手段が毛管に接続されたコンピュ
ータ制御のポンプ装置を包含する、請求項２３記載の装
置。
【請求項２７】反応混合物を含有するための毛管；異
なる温度の液体を収容するための少なくとも１つの入力
ポートおよび液体を室から取出すことのできる少なくと
も１つの出力ポートを有する、毛管を取囲む室；入力お
よび出力ポートを通して室に結合され、反応混合物中に
核酸変性を生起させるのに適当な温度に温度安定化され
た大部分の液体を含有する、第１サーモスタット付浴；
反応混合物中に核酸アニーリングおよびエクステンショ
ンを生起させるのに適当な温度に温度安定化された大部
分の液体を含有する、室の入力および出力ポートに結合
した第２サーモスタット付浴；および反応混合物が変性
およびアニーリング温度を交番に受けるように、第１お
よび第２浴からの液体を室中へおよび外へ交番に移動さ
せるためのポンプ装置を有する、反応混合物中で核酸増
幅反応を実施する装置。
【請求項２８】パンピング手段が、第１および第２浴
のそれぞれに１つのポンプを有し、それぞれが室の別個
の入力および出力ポートに結合しておりかつそれぞれが
液体を室の中および外へ選択的にポンプ輸送するため、
コンピュータ志向制御装置によって制御される、請求項
２７記載の装置。
【請求項２９】パンピング手段が、室の１つのポート
に結合されかつ液体マルチプレクサに結合した単一の共
有双方向ポンプであり、該マルチプレクサは、浴の１つ
をポンプに選択的に結合するため、第１浴に結合した１
つの双方向ポートおよび第２浴に結合した第２の双方向
ポートを有し、ポンプおよびマルチプレクサは、液体を
第１および第２浴から室中へ周期的かつ交番に選択的に
ポンプ輸送して、コンピュータ志向制御装置に記憶され
たデータにより定義された核酸増幅反応プロトコルを実
行するように、ポンプおよび液体マルチプレクサを制御
するためのコンピュータ志向制御装置の制御下にある、
請求項２８記載の装置。
【請求項３０】入力ポートおよび出力ポートを有しか
つ少なくとも室の横断面部分を横切る金網を有する細長
い室；室を迂回する液体流路を提供する少なくとも第１
および第２液体バイパス管；反応混合物中に変性を生起
させるのに適当な温度に大部分の液体の温度を維持する
ための第１サーモスタット付浴；反応混合物中にアニー
リングおよびエクステンション反応を生起させるのに適
当な温度に大部分の液体の温度を維持するための第２サ
ーモスタット付浴；第１および第２浴のそれぞれから室
へ液体をポンプ輸送するため室とそれぞれの浴の間を連
結しているパンピング手段；浴の１つからの液体の流れ
が室を通り、第２浴からの液体のもう１つの流れがバイ
パス管の１つを通るように選択的に結合し、次いで第２
浴からパンピング手段によって圧送される流れが室を通
り、第１浴からパンピング手段によって圧送される流れ
がバイパス管の他の１つを通るように結合するための弁
装置を包含する、毛管中で化学的連鎖反応を実施する装
置。
【請求項３１】第１金属ブロック熱交換器；反応混合
物中で変性を生起させるのに適当な第１温度に第１金属
ブロック熱交換器を維持するため、第１金属ブロックに
連結された第１熱制御系；第２金属ブロック熱交換器；
反応混合物中でアニーリングおよび／またはエクステン
ションプロセスを生起させるのに適当な第２温度に第２
金属ブロック熱交換器の温度を維持するため第２熱交換
器に連結された第２熱制御系；第１および第２金属ブロ
ックを分離する熱絶縁層；それぞれが第１および第２金
属ブロックと接触しかつ絶縁層を通る複数の毛管；およ
びＰＣＲ反応混合物を毛管中へ導入するためおよび核酸
増幅反応プロトコルを定義する記憶されたデータにより
第１および第２金属ブロックに対し反応混合物を位置定
めするため管に連結され、反応混合物が交番に、記憶さ
れたデータにより特定されたインキュベーション時間、
第１および第２金属ブロックの温度を受けるようにする
試料処理手段を包含する、複数の毛管中に含有された複
数の反応混合物中で核酸増幅反応プロセスを実施する装
置。
【請求項３２】試料処理手段が、管およびプログラマ
ブル制御装置により制御される、ステップモータに結合
した少なくとも１つのシリンジポンプを包含する、請求
項３１記載の装置。
【請求項３３】それぞれの毛管は１つの開放端を有
し、試料処理手段はさらに、管の開放端を少なくとも１
つの予選された試料容器中および外へ自動的および選択
的に移動させる手段を包含する、請求項３２記載の装
置。
【請求項３４】複数の毛管中の反応混合物中で変性、
アニーリングおよびエクステンドプロセスを包含する核
酸増幅反応を実施する装置において、核酸増幅反応で標的核酸コピーをつくらせるのに適当な
反応混合物を含有するのに適合された、複数の開放端毛
管；混合物中で核酸増幅反応における変性プロセスを生
起させるのに適当な第１温度を、それぞれの毛管の少な
くとも１つの部分に同時に受けさせる第１手段；混合物
中で核酸増幅反応におけるアニーリングおよびエクステ
ンションプロセスを生起させるのに適当な第２温度を、
それぞれの毛管の少なくとも１つの部分に同時に受けさ
せる第２手段；および反応混合物に第１および第２温度
を受けさせる手段を有する、複数の毛管中で核酸増幅反
応を同時に実施する装置。
【請求項３５】それぞれの毛管の開放端を、反応混合
物を含有する相応する反応管に操作可能に連結しかつ毛
管を清浄にするための処理手段を包含する、請求項３４
記載の装置。
【請求項３６】処理手段が反応管配列並進および持上
系を包含する、請求項３５記載の装置。
【請求項３７】処理手段が、それぞれの反応管からそ
れぞれの毛管を挿入および取出すための装置を包含す
る、請求項３４記載の装置。
【請求項３８】生起手段が、処理手段および第１およ
び第２手段を、ユーザ定義のパラメーター組により受け
させるため制御するプログラマブルコンピュータを包含
する、請求項３５記載の装置。
【請求項３９】複数の毛管に含有されている複数の反
応混合物に、核酸増幅反応生成物を生成するための変
性、アニーリングおよびエクステンションプロセスを包
含する核酸増幅反応を実施する装置において、複数の反応混合物中で核酸増幅反応における変性プロセ
スを生起させるのに適当な温度範囲内の温度に、第１熱
交換器の温度を安定化させるための熱制御装置を有する
第１熱交換器；混合物中で核酸増幅反応におけるアニー
リングおよびエクステンションプロセスを生起させるの
に適当な温度範囲内の温度に、第２熱交換器の温度を安
定化するための他の熱制御装置を有する第２熱交換器；
それぞれの毛管が第１および第２熱交換器の少なくとも
１つと熱接触している位置を有するように経路をとる複
数の毛管；反応混合物を管中へ引込むためおよび出来上
った反応生成物を管から排出するためのそれぞれの毛管
に結合している手段；および毛管内の混合物中で核酸増
幅反応を生起させるために、第１および第２熱交換器
を、毛管の部分内の混合物と熱接触するように順次に位
置定めするための手段を有する、複数の毛管に含有され
ている複数の反応混合物中で同時に核酸増幅反応を実施
する装置。
【請求項４０】混合物中の光学的変化を検出するた
め、毛管に光学的に結合された検出手段を有する請求項
３９記載の装置。
【請求項４１】検出手段がホトダイオードアレイを含
有する、請求項４０記載の装置。
【請求項４２】検出手段が分光光度計に結合されてい
る、請求項４０記載の装置。
【請求項４３】検出手段が、核酸増幅反応の一部の間
混合物中に起きるけい光変化を検出する、請求項４０記
載の装置。
【請求項４４】検出手段が、コンピュータに結合され
たホトダイオードデバイスまたはＣＣＤ検出器を含有す
る、請求項４３記載の装置。
【請求項４５】第１および第２熱交換器が細長い回転
可能ドラムの各部分である請求項４２記載の装置。
【請求項４６】それぞれの熱交換器が円筒ドラムの弓
形セグメントであり、各セグメントが弓形外面を有す
る、請求項４５記載の装置。
【請求項４７】表面が、複数の毛管の部分を収容する
複数の平行なみぞを有する、請求項４６記載の装置。
【請求項４８】熱交換セグメントが絶縁層により分離
されている、請求項４７記載の装置。
【請求項４９】みぞが円周にある、請求項４８記載の
装置。
【請求項５０】位置定め手段が、回転可能の円筒ドラ
ムに結合したコンピュータ制御ステップモータであり、
該モータはドラムを、第１熱交換器が毛管の各部分と熱
接触している第１角位置および第２熱交換器が毛管の各
部分と熱接触している第２角位置の間で回転する、請求
項４９記載の装置。
【請求項５１】モータが円筒ドラムを、第１および第
２熱交換セグメントよりも高い温度を有する第３熱交換
セグメントが管の部分と接触する第３角位置に回転する
ために操作しうる、請求項４９記載の装置。
【請求項５２】モータが円筒ドラムを、第１、第２ま
たは第３熱交換セグメントよりも低い温度を有する第４
熱交換セグメントが管の部分と接触する第４角位置に回
転するために操作しうる、請求項５０記載の装置。
【請求項５３】引込むための手段が、毛管に連結して
いる少なくとも１つのシリンジポンプを有する、請求項
４０記載の装置。
【請求項５４】引込むための手段が、各管の一端を少
なくとも１つの試料容器中および外へ挿入および引戻す
ため、各毛管の開放端に結合したリフト装置を有する、
請求項５３記載の装置。
【請求項５５】引戻すための手段が、管の端を間隔を
置いた配置で保持する持上げクランプバーに機械的に連
結した、コンピュータ制御ステップモータを有する、請
求項５４記載の装置。
【請求項５６】試料容器を、毛管の少なくとも１つの
端部と整列している位置へおよびそれから割送りするた
めに操作しうるステージに結合した移動装置を有する、
請求項５５記載の装置。
【請求項５７】ステージが清浄液容器を含有し、移動
装置は、管端が清浄液容器と整列している、清浄および
すすぎ位置制御可能に位置定めするために操作しうる、
請求項５６記載の装置。
【請求項５８】第１および第２熱交換器に操作結合し
たプログラマブルコンピュータ、リフト装置、移動装
置、位置定め手段、および反応混合物を自動的に操作
し、反応生成物を生成するためのユーザ定義パラメータ
ーにより、反応混合物に対し核酸増幅反応を実施するた
めの熱制御システムを有する、請求項５７記載の装置。
【請求項５９】第１および第２熱交換器がそれぞれ定
置の金属ブロックである、請求項３９記載の装置。
【請求項６０】それぞれの熱交換器が一般に長方形の
ブロックである、請求項５９記載の装置。
【請求項６１】それぞれの熱交換器が、複数の毛管の
部分を収容する複数の平行なみぞを有する平坦な表面を
有する、請求項６０記載の装置。
【請求項６２】熱交換器が絶縁層により分離されてい
る、請求項６１記載の装置。
【請求項６３】絶縁層が空気である、請求項６２記載
の装置。
【請求項６４】位置定め手段が、それぞれの管に結合
したコンピュータ制御シリンジポンプであり、該ポンプ
が反応混合物を熱交換器の間で、核酸増幅反応を実施す
る工程のユーザ定義順序により移動させる、請求項６３
記載の装置。
【請求項６５】複数の毛管中に含有されている複数の
反応混合物中で同時に変性、アニーリングおよびエクス
テンションを包含する核酸増幅反応を実施し、各混合物
が増幅すべき標的核酸を含有する方法において、（ａ）試料を複数の毛管の第１部分中へ引込む工程；（ｂ）第１部分を、反応混合物中にエクステンションプ
ロセスを生起させるのに有効なエクステンション温度に
加熱する工程；（ｃ）第１部分を、反応混合物中に変性プロセスを生起
させるのに有効な変性温度に加熱する工程；（ｄ）毛管の第１部分を、毛管の第１部分内の反応混合
物中にアニーリングプロセスを生起させるのに有効な温
度範囲内のアニーリング温度に冷却する工程、および（ｅ）工程（ｂ）〜（ｄ）を、試料中に核酸が所望量に
達するのに所望回数繰返す工程を包含する、複数の毛管
中に含有されている複数の反応混合物中に同時に核酸増
幅反応を実施する方法。
【請求項６６】工程（ｃ）が、（ｉ）毛管の第１部分
に、変性温度よりも高い温度を、反応混合物を変性温度
にランプさせるのに必要な時間だけ受けさせ、次いで
（ｉ）混合物中に生起する変性プロセスのための所定時
間混合物中に変性温度を保持する工程を包含する、請求
項６５記載の方法。
【請求項６７】冷却工程（ｄ）が、（ｉ）毛管の第１
部分にアニーリング温度よりも低い温度を、反応混合物
の温度をアニーリング温度にランプさせるのに有効な時
間受けさせ、（ｉｉ）第１部分を、反応混合物中にアニ
ーリングプロセスを生起させるのに有効な時間アニーリ
ング温度に維持する工程を包含する、請求項６５記載の
方法。
【請求項６８】冷却工程（ｄ）が、（ｉ）毛管の第一
部分に、アニーリング温度よりも低い温度を、反応混合
物の温度をアニーリング温度にランプするのに有効な時
間を受けさせ、（ｉｉ）第１部分を、混合物中にアニー
リングプロセスを生起させるのに有効な時間アニーリン
グ温度に維持する工程を包含する、請求項６６記載の方
法。
【請求項６９】複数の反応混合物のそれぞれ１つにお
いて少なくとも１つの標的核酸シーケンスを、核酸増幅
反応（変性、アニーリングおよびエクステンションプロ
セスを包含するＰＣＲ）により増幅する方法において、（ａ）混合物を複数の毛管の第一部分中へ引込む工程；（ｂ）混合物を、混合物中にエクステンションプロセス
を生起させるのに適当な温度に維持する可動熱交換器の
第１表面部分に対し、毛管の第２部分に位置定めする工
程；（ｃ）熱交換器を、変性温度よりも高い温度を有する熱
交換器の第２表面部分が毛管の第２部分と接触する第２
部分へ移動させる工程；（ｄ）熱交換器を、混合物中に変性プロセスを生起させ
るのに有効な温度範囲内の温度を有する熱交換器の第３
表面部分が毛管の第２部分と接触する第３部分へ移動さ
せる工程；（ｅ）熱交換器を、混合物中でアニーリング反応を生起
させるのに適当な温度範囲内の温度を有する熱交換器の
第４表面部分が毛管の第２部分と接触する第４部分へ移
動させる工程；（ｆ）工程（ｂ）〜（ｅ）を、標的核酸の量を所望量に
増幅するのに十分な回数繰返す工程を包含する、複数の
反応混合物のそれぞれ１つ中で少なくとも１つの標的核
酸シーケンスを、核酸増幅反応によって増幅する方法。
【請求項７０】移動工程（ｄ）が、可動熱交換器を第
３位置に所定時間保持する工程を包含する、請求項６９
記載の方法。
【請求項７１】移動工程（ｅ）が、熱交換器を第４位
置に所定時間保持する工程を包含する、請求項６９記載
の方法。
【請求項７２】移動工程（ｅ）が、熱交換器を第４位
置に所定時間保持する工程を包含する、請求項７０記載
の方法。
【請求項７３】第１表面部分および第２表面部分が同
じである、請求項７１記載の方法。
【請求項７４】第１表面部分および第２表面部分が同
じである、請求項７２記載の方法。
【請求項７５】複数のの反応混合物のそれぞれ１つ中
で、少なくとも１つの標的核酸シーケンスを、変性、ア
ニーリングおよびエクステンションプロセスを包含する
核酸増幅反応により増幅する方法において、（ａ）混合物を複数の毛管の第１部分中へ引込む工程；（ｂ）混合物を、混合物中でエクステンションプロセス
を生起させるのに適当な温度に維持する回転可能の熱交
換器の第１表面部分に対し毛管の第２部分に位置定めす
る工程；（ｃ）熱交換器を中心軸のまわりで回転させて、混合物
中で変性プロセスを生起させるのに有効な温度範囲以上
の温度を有する熱交換器の第２表面部分が毛管の第２部
分と接触する第２位置にもたらす工程；（ｄ）熱交換器を、混合物中で変性プロセスを生起させ
るのに有効な温度範囲内の温度を有する熱交換器の第３
表面部分が毛管の第２部分と接触する第３位置に回転さ
せる工程；（ｅ）熱交換器を、混合物中でアニーリングプロセスを
生起させるのに適当な温度範囲内の温度を有する熱交換
器の第４表面部分が毛管の第２部分と接触させる工程；（ｆ）工程（ｂ）〜（ｅ）を、標的核酸シーケンスの量
を所望量増幅するのに十分な回数繰返す工程を包含す
る、複数の反応混合物のそれぞれ１つ中で、少なくとも
１つの標的核酸シーケンスを核酸増幅反応により増幅す
る方法。
【請求項７６】回転工程（ｄ）が、回転可能な熱交換
器を第３位置に所定時間保持する工程を包含する、請求
項７５記載の方法。
【請求項７７】回転工程（ｅ）が、熱交換器を第４位
置に所定時間保持する工程を包含する、請求項７５記載
の方法。
【請求項７８】回転工程（ｅ）が、熱交換器を第４位
置に所定時間保持する工程を包含する、請求項７６記載
の方法。
【請求項７９】第１表面部分および第２表面部分が同
じである、請求項７７記載の方法。
【請求項８０】第１表面部分および第２表面部分が同
じである、請求項７８記載の方法。
【請求項８１】増幅すべき標的核酸セグメントを含有
する毛管内の反応混合物中で、変性、アニーリングおよ
びエクステンションプロセスを包含する核酸増幅反応を
自動的に実施する方法において、（ａ）反応混合物を容器から、反応混合物を含有するの
に適合した部分を有する開放毛管反応室中へ自動的に移
動させる工程；（ｂ）毛管反応室中の混合物を、混合物中で変性プロセ
スを生起させるのに適当な温度範囲内の第１温度に加熱
する工程；（ｃ）混合物を、混合物中でアニーリングおよびエクス
テンションプロセスを惹起させるのに適当な第２温度に
冷却する工程；（ｄ）工程（ｂ）および（ｃ）をユーザ定義回数繰返す
工程；（ｅ）反応混合物を、毛管反応室から容器中へ自動的に
排出する工程；（ｆ）異なる反応混合物を、他の容器から反応室部分中
へ自動的に移動させる工程、および（ｇ）工程（ｂ）〜（ｅ）を自動的に繰返す工程を包含
する、増幅すべき標的核酸セグメントを含有する毛管内
の反応混合物中で核酸増幅反応を自動的に実施する方
法。