CN109562384B - 用于样品分析与处理的快速热循环 - Google Patents

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Abstract

用于核酸热处理的方法和设备。该设备使用反应器握持架以握持容纳反应材料的反应器，此反应材料含有核酸。该设备包括了一个第一浴槽，和一个第二浴槽，浴槽内的浴槽介质被分别保持在两个不同的温度；和一个转移装置以让反应器在多个热循环期间进入此二浴槽中以便交替地达到：一个预定的高目标温度THT，和一个预定的低目标温度TLT；以及往复装置，用于在反应器处于至少一个浴槽中时让握持架与至少一个浴槽互相进行往复运动，该设备通过振动浴槽，或振动握持架，或振动浴槽与握持架，来完成相对往复运动。

Description

用于样品分析与处理的快速热循环
技术领域
本发明涉及进行样品中核酸扩增反应的方法和装置。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)对于分子生物学，食品安全和环境监测日益重要。许多生物学研究人员在他们的核酸分析工作中使用PCR，因为PCR拥有高灵敏度和特异性。PCR的时间周期通常约为1小时，主要是由于耗时的PCR热循环过程，该过程将含有样品的反应器加热并冷却至不同的温度以进行DNA变性、退火和延伸。通常，热循环设备和方法为在两个加热浴槽之间移动反应器，所述两个加热浴槽的温度被设定为核酸扩增反应所需的目标温度。研究人员一直都在致力于加快热循环的速度。
热电冷却器(TEC)或珀尔帖冷却器也被用作加热/冷却元件。然而，它所提供典型的1-5℃/秒的升温速率在改变反应器温度方面算是缓慢的，这不利地加长了热循环的时间。
作为通过减少热质量来提高PCR速度的尝试，具有嵌入式薄膜加热器和传感器的微加工PCR反应器已被开发出来，以在74℃/秒的冷却速率和约60-90℃/秒的加热速率下实现更快的热循环。然而，这种用于制造PCR装置的晶片制造工艺非常昂贵，因此在满足生物测试中低成本一次性应用的要求方面不切实际。
也有报道指出，相比基于热电冷却器的热循环仪，在封闭容器中以热空气和冷空气交替冲洗反应器的方法可以获得更快的温度攀升。然而，从热传导的角度来看，空气的导热系数和热容量远比液体的低，因此空气循环仪的升温速度比液体的慢。TEC需要大量的时间来加热和冷却其本身以及TEC上方的加热块。此外，还需要克服加热块和反应器之间的接触热阻。
交替型水冲洗循环器也已被开发出来，以两个温度相异的水交替冲洗反应器以加快PCR的速度。但是，这些装置包含许多泵，阀门和管道连接器，这些连接器在处理高温和高压时增加了维护的复杂性并降低了可靠性。使用循环液体浴介质时，液体通常从浴槽中溢出。
传统水浴PCR循环仪利用水的高导热性和热容量来实现有效的温度加热和冷却。但是，这样的循环器使用了包含大量水的大加热槽，而高水量使注水和放水过程难以掌控，这也致使在热循环能开始之前，把浴槽介质加热到目标温度的所需时间太长。这样的循环器设备沉重且功耗高。槽内的水在使用过程中会蒸发，需要添加。此外，在热循环中，每次反应器被交替插入这些水浴槽中后，当反应器被从水浴槽中取出时，一层水附着在反应器上，从而拖慢反应器内部的温度变化。
研究人员还测试了以不同温度的移动加热辊交替接触反应器。然而，长管式反应器的使用不仅使安装和操作大量反应器麻烦，而且昂贵。当反应器处于大型阵列或面板中时，在所有反应器中实现加热均匀性可能具有挑战性。
本发明提供了一种已被改良的方法和装置，用于在不使用复杂和昂贵的部件或耗材的情况下以超快的速度和实惠的成本实现PCR。此装置坚固、轻便、使用方便、只需少量浴槽介质，能处理一次性反应材料，从而避免一个反应器与下一个反应器互相污染。本发明为生物分析领域带来了非常积极的影响。
发明内容
除非特别说明，否则术语“包括”和“包含”及其语法变体旨在表示“开放”或“包容性”语言，使得它们包括所记载的要素，但也允许包含额外的未列举的要素。单词“基本上”并不排除“完全”。术语“第一浴槽”，“第二浴槽”…“第六浴槽”并不构成按照顺序的相应浴槽，而仅用于根据它们个别的功能进行识别。这些浴槽可能并不代表独立的实体，因为其中一些浴槽可能是可共享的。
根据第一方面，本发明提供了一个用于在热曲线里进行核酸热处理的设备。该设备使用一个反应器握持架以握持盛有包含核酸的反应材料的反应器，反应器可以是任何形式的，包括管状容器或多孔板或芯片或卡盒，该设备包括：一个第一浴槽，和一个第二浴槽，浴槽内的浴槽介质可分别被保持在两个不同的温度；以及一个转移装置，以让反应器进入该二浴槽，以便在多次热循环中交替地达到：预定的高目标温度THT，和预定的低目标温度TLT；以及往复装置以在反应器处于至少一个浴槽中时让握持架能和至少一个浴槽之间有相对往复运动，要执行此相对往复运动，设备可以振动至少一个浴槽或振动握持架或振动握持架与至少一个浴槽。此往复运动增加了浴槽介质与反应器之间的对流导热率，也使浴槽内的热分布更均匀，从而使反应器之间的热分布更均匀。因此，往复运动提升了反应器内部的温度升降速率，从而提升了热循环的速度。通过使反应器在浴槽中朝一个方向移动，设备能达到相似的效果，但跟使用往复运动、仅需小浴槽的设备相比，前者所需的浴槽尺寸就大得许多。如此庞大的浴槽不但需要较长的时间、较大的功率来加热至核酸分析所需的目标温度，而且对现场应用所需的便携式设备来说也是过于沉重的。在本发明中因采用往复运动机制而使用的小浴槽大幅度缩小了所需浴槽介质的体积，而且也缩短了预先加热与冷却浴槽的所需时间，从而缩短了基因测试的整体时间。图10(a)和(b)中的实验图显示了反应器振动机制所提供的优点，其中40次热循环所使用的时间被缩短到少过一半。
根据一项实施例，设备使用了一个第三浴槽，其中转移装置和往复装置让反应器处于第三浴槽中并执行往复运动以达到预定的中目标温度TMT。
往复运动基本沿水平方向进行。与沿着垂直方向进行的往复运动相比，沿水平方向进行的更有优势。前者除了沿反应器垂直面的热传导不固定之外，其振幅也被反应器较小的垂直长度所局限。只要将反应器充足地浸入浴槽介质中，就能缓和这项不足。但如此一来，反应器不含反应材料的上部也就浸入了浴槽介质，这提高了热质量，从而降低了热循环的速度。沿水平方向进行的往复运动能克服这些问题。往复运动以高于0.2赫兹的频率、多于1毫米的振幅进行。此频率范围基本改进了浴槽介质与反应器之间的热传导，从而加快了热循环速度，也通过以较慢的速度搅拌浴槽介质来维持较平均的浴槽温度分布。
根据一项实施例，当反应器接近目标温度时，往复装置减缓了往复运动的速度。这在反应器被从该浴槽中提离之前有效地减缓了其温度变化，以更好地控制反应器温度，以及防止它过度超越目标温度。
根据一项实施例，往复装置在设备为反应器进行荧光成像时停止往复运动。根据一项替代实施例，当照射反应材料和从反应材料采集发射光束的光学装置跟着反应器一起移动时，往复装置继续进行往复运动。这使热循环速度更快，因为设备能在不需要仅为成像目的而停止往复运动的情况下进行成像。
根据一项实施例，设备使用了一个第四浴槽以在热循环之前能进行附加处理，此附加处理为以下组的其中一项:逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、热启动处理和等温扩增反应，其中转移装置和往复装置让反应器在处于第四浴槽中时进行往复运动以达到附加处理的目标温度TAPT。第三和第四浴槽有利地提供了让反应器根据反应材料的种类和分析过程而达到各种热曲线的伸缩性。往复运动提升了反应器温度的升降速率，从而加快了热处理的速度。
根据一项实施例，设备使用了包含限制装置的反应器防护装置以局部围护反应器，以防止反应器在进入含有高导热率粉末和在进行往复运动时因浴槽介质的阻力和THIGH而变形。反应器防护装置的材料可优选地由金属或玻璃或高温塑料或陶瓷组成，以承受浴槽内具有阻力和高温的境况。为了将结构复杂性降到最低，优选的反应器防护装置为反应器握持架的延伸部分。根据一项实施例，反应器防护装置允许反应器的一部分暴露出来，以从底端的一个方向进行荧光成像。反应器限制装置优选地面对着往复运动的方向以承受由阻力所带来的冲击。
根据一项实施例，当浴槽介质为粉末时，该设备还在浴槽底部使用了底部支撑装置以在进行往复运动期间支撑反应器的底端，以便降低作用于反应器的弯矩。在此，设备通过以下任何一项来进行反应器的往复运动：振动反应器握持架、振动浴槽底部、以及让浴槽底部与反应器握持架互相往反方向振动，取决于哪个模式能最大程度地降低弯矩。
THT可为核酸的预变性和变性而被设定在85-99摄氏度的范围内，而TLT可为了将引物或探针退火于核酸或为引物延伸而被设定在45-75摄氏度的范围内，第一和第二浴槽被用于反应器热循环以实现聚合酶链式反应扩增或引物延伸。一般上，这两个温度在核酸扩增方面有用。
为了进行特定种类的核酸分析，该设备还可以使用第五浴槽来达到增设热曲线中的温度稳定步骤。当设备有利地不需要为温度稳定而设置特定的个别浴槽时，温度稳定步骤可被设置为其中一个目标温度。
该设备还可以使用：荧光成像装置或电化学检测，以在反应器处于任何浴槽或浴槽以外的空气中时进行核酸分析。
该往复装置可为反应器在第二浴槽中提供三步振动功能，先高速振动，然后在温度趋近于目标温度时进行低速振动，再停止振动以进行荧光成像。
该设备可进一步包括：一个把液体或热空气维持在40-80摄氏度的第六浴槽，其中浴槽壁的至少一部分为透明，以允许来自光源的照射光和从反应器发出的发射光进行透射。
为符合该应用，任何浴槽中的浴槽介质可以处于任何形式，包括气态、液态、固态、粉状以及任何这些形式的混合物。
该设备能进一步包括一个能够在热循环期间与反应器握持架一起移动的反应器温度传感器，以便更精准地监测反应器的实时温度。该设备还能包括一个含有封装反应器温度传感器的物质的容器，此容器和物质拥有与反应器和反应材料相似的结构或导热特性，以便更精准地监测反应器温度。
该设备能进一步包括一个能够接收反应器以及在热循环之后进行熔解曲线分析时被逐渐加热的第七浴槽。这有助于在热循环过后以整合流程形式所进行的深入分析，当任何为热循环或附加处理而设的浴槽可与逐渐加热机制共享以进行熔解曲线分析时，这尤其有利。
该设备能进一步包括改变装置，以在热循环期间改变任何浴槽的温度。此机制为热循环期间的热曲线设计提供了更高的伸缩性。
浴槽优选地具有高纵横比形状，长度与宽度的比例为2-10:1，以容纳拥有多个反应器、并进行往复运动的反应器握持架。此特征有利地降低了所需的浴槽介质数量，也节省了加热它们的所需能源。在反应器插入浴槽时，液体浴槽介质的溅射现象也被减轻。这将浴槽的体积最小化，缩短了浴槽加热时间，也缩短了热循环之前设备准备时间。加热装置优选的安装位置为浴槽纵向上较大的表面，利用短热传导距离来快速为浴槽加热，以达到较均匀且高效率的浴槽介质加热和与反应器之间的热传导。
根据第二方面，本发明提供了与第一方面对应的方法。
本发明也让整个核酸分析的热处理过程-从浴槽加热准备到反应器热循环和荧光信号采集-能在短短几分钟内完成。
附图说明
在接下来几张图中，相同的代表号码在全文泛指同一物件。图纸并不按比例绘制，而着重于描述概念。
图1是根据一个本发明实施例为含有核酸的反应材料进行热循环的设置的示意图。
图2是为图1中热循环设备而设的实施例的等距视图。
图3是图2中设备的反应器阵列、浴槽和光学模块的实施例的等距视图。
图4是图2中设备的反应器阵列转移装置与往复运动发动机的实施例的等距视图。
图5(a)是图4中往复运动发动机的往复机械模块的实施例的等距视图。
图5(b)是图5(a)接上反应器的等距视图。
图6是一组显示往复运动的低惯性曲柄移动导杆机构的操作原理的视图。
图7(a)是一个根据本发明的实施例示出了高纵横比反应器阵列的往复运动与其相对应的高纵横比反应器阵列浴槽的示意图。
图7(b)是根据本发明的一个实施例来设置的一个2x 16高纵横比反应器阵列范例的示意图。
图8是使用了前述设备，在热循环期间反应器范例温度变化的图示。
图9是照射与荧光发射检测模块与拥有透明玻璃窗的低温反应器阵列浴槽和拥有透明封盖的反应器的实施例的透视图。
图10(a)是使用了前述设备，不振动反应器，在四十个热循环期间实验反应器温度随时间而变化的图示。
图10(b)是使用了前述设备，振动反应器，在四十个热循环期间实验反应器温度随时间而变化的图示。
图11是反应器在由浴槽底部提供额外支撑的情况下进行往复运动的立面横截面图。
图12(a)是被反应器防护装置局部围护的管状反应器阵列的横截面图。
图12(b)是图6中的反应器、反应器防护装置和反应器握持架的俯视图。
图13(a)和(b)是反应器为了在浴槽介质中进行往复运动而被安置于一个拥有专门设计边缘的卡片的透视图。
图13(c)是一个使用光纤成像的金属反应器的横截面图。
具体实施方式
下面的描述足够详细地呈现了本发明的几个优选实施例，使得本领域技术人员可以制造和使用本发明。
图1示出了一部分用于进行诸如PCR、引物延伸或其它酶促反应的热循环设备的实施例的示意图。该设备具有各自容纳浴槽介质75的两个浴槽50和51，一个浴槽加热器17和浴槽温度传感器39被安装在浴槽表面以控制浴槽介质75的温度。浴槽温度传感器39可被安装在浴槽50、51的内部。在此实施例中，浴槽50适用于变性步骤；而浴槽51适用于退火和/或延伸步骤。当浴槽51需要被主动冷却至室温以下时，冷却器16就能派上用场。为了前述冷却目的，该设备也可安装热电冷却器等主动冷却器或风扇。在此，浴槽介质75被显示为液体，但该设备也可以使用任何类型的流体或粉末或固体浴槽介质75。在一些实施例当中，如果低温浴槽51不需要被加热，则浴槽51上的浴槽加热器17是可选的。设备交替地将反应器15多次转移于浴槽50、51之间以进行热循环。为了快速将反应器插入浴槽介质75，纤细的的反应器15如玻璃毛细管是优选的。反应器15由密封剂或盖77密封，而为了荧光或探针激发和荧光成像，反应器的一部分是透明的，以让光线通过。一个温度监测单元34被安装在反应器握持架33，并与反应器15一起移动于浴槽50、51之间。温度监测单元34内有快速响应温度传感器38。为了让温度监测单元34的温度读数和温度响应与反应器15相似或一致，温度监测单元34拥有与反应器15相似的形状，而且被创建成拥有与反应器15类似或一致的稳态和瞬态热特性，除非另一个反应器15被用于该目的。例如，温度监测单元34可以是快速响应温度传感器38插入水或油或水上的一层油并且密封。尽管只示出了一个反应器15，根据其它实施例，反应器握持架33可容纳数个反应器15。反应器15可以处于被示出的管状形式，也可以是多孔板或芯片或卡盒。反应器转移装置85将反应器15和温度监测单元34以高速转移于浴槽50和51之间，依照热循环所需交替地将它们暴露于浴槽50和51的不同温度之中。反应器转移装置85可以有许多可能的设计。其中一个这样的机构包括了一个沿X轴线性导轨87移动的X台86，以将反应器15和温度监测单元34传送至浴槽50和51的上方，以及一个沿Z轴线性导轨89移动的Z台88，以将它们往下送入或往上提离浴槽介质75。这样的转移装置85也能包括旋转臂(未示出)，此旋转臂将反应器15和温度监测单元34沿角向移动以及将Z台88沿Z轴直线导轨89移动。反应器15具有用于装载和回收反应材料21的开口，而开口是可密封的。密封剂77可以由硅橡胶或UV固化的聚合物、在热循环过程中处于固相的热熔和/或蜡和/或凝胶制成。也可以使用液体如油、粘性聚合物和凝胶来实现密封。高粘性液体可以被施用在反应器15的开口和/或顶部，它能够阻止从反应材料21所产生的蒸汽泄漏出去。荧光成像的设置可以处于其技术领域中的任何形式。在此，浴槽51有个透明窗口25，以便让来自照射光源44的照射光抵达反应器15，以及让发射光束被接收器43接收。在浴槽50和51中，反应器15如箭头所示经历往复运动或振动，以便在反应器15的表面制造更高和强制性的对流热传导。在浴槽较小的范例中，反应器往复运动可沿垂直或往浴槽50/51的深处进行(未示出)。
图2示出了设备和转移装置85的等距视图，其中包括一个光学模块206，负责执行对反应器15内核酸的荧光探测，一个控制浴槽温度的温度控制模块205，一个控制所有运动的运动控制器207，以及一个系统控制器208以控制包含数据联系与处理、成像处理和数据分析的系统。当处于加热浴槽模块204内的浴槽中时，反应器振动装置振动反应器15和反应器温度监测单元34。浴槽模块204有五个浴槽50、51、52、53、54。它们彼此相邻，而且能各自保持在预定的温度。在此实施例中的光学模块206内，反应器15处于以空气或透明液体为浴槽介质75的低温浴槽51中。逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、热启动处理和等温扩增反应等附加过程也可以在热循环之前在任何可被设定为所需温度的浴槽中进行，再在以上附加处理完成之后重新设置为热循环的所需温度。图4解释了提供往复运动的反应器振动装置100。
图3示出了浴槽模块204和光学模块的透视图。反应器15阵列和温度监测单元34被转移于高纵横比(HAR)的浴槽50到54之间，各浴槽依窄边彼此相邻。常见的高纵横比(HAR)反应器15阵列方向与高纵横比(HAR)的浴槽51到54互相吻合。在此实施例中，浴槽51盛有空气或透明介质作为浴槽介质75，以及在底部有个透明窗口25以让照向反应器15的照射光和来自反应器15的发射光通过，如光路箭头所示。浴槽加热器17或冷却器16与浴槽壁相接。该设备可进一步包括一个热空气区域(未示出)以让反应器15在成像时处于其中。这简化了该设备。浴槽上的热空气区域可由电加热器或红外线加热器维持温度。加热器可以与反应器握持架33安装在一起，使得只有反应器15附近的空气被加热，同时反应器15在浴之间移动。此机制节省了能源，以及避免设备的其它部件受到不必要的加热。根据热曲线的要求，设备可应用各个浴槽50到54以完成热循环和热循环之前与之后的步骤。在一个三步热循环的热循环里，反应器15在各热循环进入三个浴槽当中。在浴槽50和51之间，反应器15与监测单元34可被插入处于中等温度的第三浴槽或被置于热空气长达一段退火或延伸所需的时间。在热循环之前，反应器15和监测单元34可被插入第四浴槽，此浴槽被维持在一个预定温度以在用于核酸扩增的热循环之前进行附加处理。在热循环之后，设备可使用一个浴槽以进行熔解曲线分析。
图4示出了一个低惯性运动机构或反应器转移模块85的实施例，其中一个低惯性X台86和Z台88被设计成与固定电机一起来驱动Z台88，以及一个使用凸轮臂112的驱动机构，以在不需要线性导轨和驱动螺丝的情况下驱动Z台88。图4示出了反应器振动装置的等距视图。电机驱动的振动台101与振动轴线性导轨102相接。振动台101与进一步握持反应器15和反应器温度监测单元34的握持架33相接。为了能够将反应器15在浴槽50和/或51之间以往复形式高速来回移动，反应器振动装置100被安装在Z轴上。有别于传统热循环所使用的水浴槽，反应振动摆装置100能在浴槽介质75中狭小且被局限的浴槽范围内以往复形式高速移动反应器15，以达到对于反应器15的强力对流热传递，从而缩短在浴槽50和/或51中达到目标温度的时间。反应器转移装置85有能力迅速移动X台86和不带动Z台电机的Z台88。为了移动低惯性X台86和Z台88，一个固定电机将与X台86连接的传动带105转动，而另一个固定电机转动旋转Z同步带轮(带动)107的Z滚珠花键轴106，进而通过带动Z同步带109来带动Z同步带轮(从动)108。Z同步带轮(从动)108的转动致使与其连接的凸轮臂112旋转，进而转动凸轮臂112上的连杆接头110，以及将凸轮连接杠杆111和Z台接头113上下移动，从而沿Z轴线性导轨89实现与Z台接头113连接的Z台88的Z轴运动。振动轴线性导轨102与Z台88连接，与反应器握持架33连接的振动电机103和振动台101为反应器15产生了高速往复运动。图5(a)示出了一个往复运动致动模块99的范例。振动器电机103的转轴上安装了一个曲柄移动导杆115和一根轭销116。振动器电机103被安装在Z台88，但曲柄移动导杆115并不与Z台88连接。当振动器电机103的转轴旋转时，曲柄移动导杆115也跟着旋转，致使轭销116左右移动。如图5(b)所示，Z台88上所安装的振动轴线性导轨102安装着振动台101，而轭销116伸入了振动台101上的凸轮槽114。当曲柄移动导杆115旋转时，凸轮槽114内的轭销116推动振动台101以往复形式左右移动，此过程在图6得到进一步阐述。
在我们的其中一项实验中，我们使用内径为1.1mm，外径为1.5mm的玻璃毛细管，注入10μl的PCR试剂，再将它浸入一个浴槽中。此浴槽长110mm，宽12mm，深25mm，盛有以75:25比例将甘油与水混合的混合物。我们将微小的热电偶伸入与反应器15和反应器转移装置85一起移动的玻璃毛细管内的底部，以测量反应器15内的温度。当上述反应器15如图5(a,b)与图6(a,b)所示以往复形式在浴槽50和51内的加热液体混合物以每分钟600循环的速率，以及沿狭窄浴槽的长边(或沿浴槽长度的方向)以6mm的行程在曲柄移动导杆机构下移动时，这等于让反应器以直线速度每秒
Figure BDA0001885707770000071
移动。我们发现在反应器15浸入设置在125℃的高温浴槽之后，反应器温度可在0.8-1.5秒内从退火温度58℃提升到变性温度95℃。在冷却相同反应器15的实验里，在反应器15浸入设置为25-40℃的低温浴槽之后，反应器温度可在0.8-1.5秒内从95℃递减至58℃。在上述实验，当进入浴槽时，反应器15于往复运动期间以每秒120mm的速度移动。若此运动以单方向形式进行(参考1：JaredS.Farrar and Carl T.Wittwer,Extreme PCR:Efficient and Specific DNAAmplification in 15–60Seconds.Clinical Chemistry 61:1p145–153(2015))，而非往复形式，而如果设备使用的是长100mm的反应器阵列，我们就需要一个长度至少为340mm(当在浴槽内移动长达2秒，则需240mm+反应器阵列的长度100mm)的长浴槽。如果使用往复方法，与本发明中长106mm的浴槽(6mm移动距离+100mm反应器阵列长度)相比，这浴槽就显得庞大，在实验室应用和实地应用方面不切实际。若无往复运动，反应器15应PCR退火步骤所需在浴槽内所逗留的时间越长，则反应器15在浴槽内以单方向移动所需的空间，即浴槽尺寸就越大。如此大的浴槽不只需要长时间与大功率来加热至核酸分析所需的目标温度，而且对许多实地便携式应用来说也太沉重了,因此不适于实际应用。此外，相关器材也变得庞大，而且不易管理如此大量的加热液体。由于使用往复运动，本发明中的小浴槽减少了所需加热和冷却的液体面积，因此仅需相对短得多的时间来预热浴槽以准备PCR，这缩短了基因测试的整体时间。上述的小液体面积也可在以简单移液方式在测试之前装入，并在测试之后移除，而相对较低的器材重量和器材大小使之在实地应用上更切实。往复运动的途径优选为高纵横比形状，而其方向与高纵横比形状的浴槽互相符合。而且在反应器15进入浴槽50、51之后，高纵横比形状的反应器阵列30也与高纵横比形状的浴槽50、51的方向符合。
在另一实施例中，Z台88，或X台86，或Z台88与X台86，可被可选地用作往复运动发动机，移动反应器15以产生强力对流。
以下部分进一步描述与量化在反应器15导热方面的加强，以供参考。操作中的其中一种反应器是包含反应液体的反应器管状容器。管状容器的材料和该液体各有不同的热属性与其它属性。为了说明装了反应液体的反应器在热循环期间浸入浴槽内的浴槽介质时的导热特性，我们约略假设装了反应液体、浸入浴槽介质的反应器管状容器为以同质材料制造的圆柱体，此圆柱体拥有外表面积As、半径R、长度L、浸没的圆柱体的体积V、密度ρ、热容量cp。为了估计浸没的圆柱体在热循环期间浸入高温浴槽时从低目标温度TLT加热到高目标温度THT的时间，我们利用圆柱体的平均表面温度Ts,avg来确定牛顿冷却定律里的平均热传导率
Figure BDA0001885707770000081
[参考1：Y.A.Cengel与A.J.Ghajar,Heat And Mass Transfer:FundamentalsAnd Applications,Fifth Edition In SI Units by McGraw-Hill Education,2015]。那就是，
Figure BDA0001885707770000082
其中As为圆柱体的外表面积，TH为高温浴槽内浴槽介质的温度，Ts,avg＝(TLT+THT)/2。一般在实际应用或仪器条件下，TH≠THT。备注：低目标温度TLT的一个例子是PCR内的退火温度；而高目标温度THT的一个例子是PCR内的变性温度。接下来，我们确定来自圆柱体的总导热量[参考1]，即在圆柱体从TLT加热至THT时的能量变化。
Qtotal＝Vcp(THT–TLT),………等式(2)
在此运算当中，我们假设整个圆柱体的温度在圆柱形的区域都是均匀的。根据这项假设，将圆柱体从TLT加热至THT，即Δt的时间为
Figure BDA0001885707770000083
由于上述的假设，等式(3)并不能产生准确的温度数值，但它揭示了影响圆柱体加热时间的因素。
在等式(3)中的传热系数h与反应器的振动或移动速度相关，这可从以下从圆柱体外侧流过的对流导热分析[参考1]中获取:
穿过圆柱体的平均努塞尔数可被简洁地表示为
Nu＝CRe mPr n，.........[参考1]的等式(7-37)
其中常数C、m和n与雷诺数Re相关，其定义为
Figure BDA0001885707770000091
其中D为圆柱体的直径，ρ为浴槽内液体的密度，μ为浴槽内液体的粘稠度，而υ为圆柱体在浴槽内的移动速度。
例如，当本发明中的反应器由电机振动器带动，以往复形式，在每分钟600循环的速度以及6mm的行程移动时，这相等于反应器沿直线以每秒
Figure BDA0001885707770000092
的速度移动，Re可被计算为
Figure BDA0001885707770000093
其中以上表达雷诺数的数值D、ρ、μ、和υ都被估计为温度90℃。
若Re数值处于40-4,000之间，则参考1中的等式(7-37)可被重写为
Nu＝0.683Re 0.466Pr 1/3.......等式(4)，
如Cengel与Ghajar的书中表7-1所示。
既然
Figure BDA0001885707770000094
其中h为圆柱体表面上的导热系数，D为圆柱体的直径，而k为浴槽内液体的导热率，等式(4)可被重写为
Figure BDA0001885707770000095
将等式(5)代入等式(3)，可得
Figure BDA0001885707770000096
等式(6)显示了振动速度v越高，将圆柱体从TLT加热至THT的时间Δt就越短。
同理，将圆柱体从THT冷却至TLT的时间Δt被确定为
Figure BDA0001885707770000097
其中TL为低温浴槽内浴槽介质的温度。等式(7)显示了振动速度v越高，将圆柱体从THT冷却至TLT的时间Δt就越短。
以上描述所使用的术语“液体”和整体描述是指“加热介质”的通用术语，包括不同形式的加热介质，如液体、与溶剂或其它化学流体或其它固态粒子混合的水、固态粒子、金属粒子、铜粒子和粉末。
如图7(a)和(b)所示，反应器15被置入高纵横比的反应器阵列30中，其中反应器15在阵列30中的纵行数远高于横行数。这使设备能采用相应高纵横比的浴槽形状(如图3所示)，以降低浴槽50或51内浴槽介质75的热质量。高纵横比浴槽形状指的是狭窄形状，而在浴槽50或51顶面为了让反应器15进入而设的开口是狭窄的。高纵横比反应器阵列30的一个例子为1乘8或2乘8阵列、玻璃毛细管形式的反应器15，而各玻璃毛细管通常垂直放置，内径为0.9mm-1.1mm而外径为1.2mm，毛细管底端被密封，顶端有个为注入样品而设的开口，注入样品后可密封以进行热循环。高纵横比反应器阵列30的形状与狭窄浴槽50和51的形状相符，浴槽的顶端开口位于长方浴槽的狭窄边，浴槽50和51可设得深一些，以配合长长的反应器15。
图8所示的实施例描述了进行热循环的方法。在进入低温浴槽51之后，反应器15以往复方向快速移动，以加速冷却。当反应器15的温度降至TLT或TLT附近时，反应器15停止或减慢往复运动，以减低与周围加热介质之间的强迫式对流热传递，从而让反应器15的温度停留在用于退火和延伸所需的TLT附近长达较长的时间t。接着，反应器15移至高温浴槽50以继续热循环。此法也可应用于高温浴槽50之例。
如图9所示，浴槽加热器17和/或冷却器16可优选地安装于高纵横比浴槽50的较大表面50b，而非较小表面50a。由于有效热传导属性长度305短，设备可为浴槽51内的浴槽介质75做到迅速热传递，从而在热循环中迅速达到稳定的目标温度。关于高温浴槽50，将冷反应器15从低温浴槽51中移出的过程倾向于降低高温浴槽50内浴槽介质的温度，因此快速地由位于较大表面50b上的浴槽加热器17所抵消。关于低温浴槽51，将热反应器15从高温浴槽50中移出的过程倾向于提升低温浴槽51内浴槽介质的温度。因此，较大表面50b上的浴槽冷却器16迅速地帮助将由热反应器15所带入的额外热能去除，而非依赖自然散热来去除该额外热能。在另一实施例中，反应器阵列30并不依高纵横比布局来排列。同样地，浴槽并无高纵横比形状。在此也描述了为反应器15成像的设备和方法。该设备包括了一个照明灯44a和一个荧光检测器43。照明灯44a可包含如LED之类的发光器材和光学过滤器81，以发射拥有特定波长的光线来激发反应器15内的染料和探针。荧光检测器43可包含如照相机或光电二极管或光电倍增管和光学过滤器81以检测来自反应器15并拥有特定波长的光线。过滤器81、照明灯44a和检测器43可被安装在电动轮上以进行多重荧光检测。在一项优选的实施例中，于针对反应器15内扩增子的荧光检测期间，反应器15被置于低温浴槽51内的浴槽介质75中，此时反应器15以往复形式所进行的振动已被停止。当所使用的检测器43有能力以高速捕捉影像时，反应器15的荧光成像才可在反应器15以往复形式振动的同时进行。由于反应器在照相机拍摄多张不同波长的影像或获取控制基因的荧光影像时可能必须延长被保持在退火或延伸温度的时间，所以当反应器15处于浴槽51中时，反应器15的荧光成像是重要的。在另一项实施例中，在针对反应器15内的扩增子进行荧光检测的过程中，反应器15被置于低温浴槽51内的浴槽介质75之外。为了避免反应器温度下降至明显低于退火或延伸温度，当从低温浴槽51移出时，设备可将加热后的空气施用于反应器15。照明光46通过了带通滤波器81，从二向色镜82往下反射，通过反应器15上的透明盖32抵达反应器15内的反应材料21，而来自反应材料的发射光47通过了二向色镜82和带通滤波器81再抵达至少一个检测器43或PMT或照相机。在另一项实施例中，为了反应器15的照明和成像，低温浴槽51的其中一部分具有透明窗口，而照明器44b和照明光46被以虚线显示。一项优选的实施例使用了反应器15在低温浴槽51中的三步振动方法，那就是，第一步：当来自高温浴槽50的反应器15进入低温浴槽51时，用高速振动来迅速冷却反应器15，和第二步：当反应器温度趋近于低目标温度TLT或退火温度时，降低反应器振动速度，以及第三步：在反应器15被转移回到高温浴槽50之前，使反应器15静止不动以进行荧光成像。在上述三步振动法中，第二步中的减速使反应器15在为荧光成像而停止移动时能更达到在每个循环之间更精准、可重复性更高的定位。
图10(a)是当使用之前所述设备时，实验反应器在不使用振动方法时，其温度在四十个热循环期间无振动随时间变化的图示。如时间轴所示，耗时1450秒。图10(b)是当使用之前所述设备时，实验反应器在使用振动方法时，其温度在四十个热循环期间随时间变化的图示，如时间轴所示，耗时仅680秒。因此，通过将时间减少至少于一半，反应器振动机制能明显加快热循环的速度。在这实验当中，振动幅度被维持在3mm，频率为6赫兹，设备使用了粒子尺寸为60目的铜粉为浴槽介质75。通过尝试其它振幅和频率，以及其它种类的浴槽介质75或大小为其它目数的铜粉，热循环的速度提升可被进一步探讨。
图11显示了另一个反应器往复运动的实施例，其中在浴槽底部69使用了底部支撑区73以降低作用于反应器15上的弯矩，在浴槽介质75内进行往复运动时，此弯矩有可能使反应器15断裂。在此实施例中，如虚线箭头所示，当反应器握持架33为反应器15提供往复运动时，反应器15可接触底部支撑区73的浴槽底部69。相似地，如实线箭头所示，不只反应器握持架33可以为反应器15提供往复运动，浴槽底部69也可以为反应器15提供往复运动，以在执行往复动作时降低作用于反应器15上的弯矩。在另一项实施例中，浴槽底部69和反应器握持架33可互相以相反方向执行往复运动。支撑区73、74为反应器15提供了充足的伸缩性以进行往复运动。在其它之前所描述的实施例中，在由反应器握持架33所提供的往复运动期间，反应器15并没有接触浴槽底部69，而反应器15上只有一个顶部支撑区74，这能产生足以使反应器15断裂于顶部支撑区74的弯矩。
图12(a)是管状反应器阵列被局限于可选应用的反应器防护装置7内的横截面图。反应器防护装置7提供了物理支撑，防止塑料反应器15在阻力和THIGH下变形，或防止玻璃反应器15在插入粉末浴槽介质75时，以及之后在粉末浴槽介质内进行往复运动时由于作用于反应器15个体上的阻力而断裂。一般上，当反应器15被插入粉末浴槽介质75时，作用于反应器底端81的此力处于最大值。反应器防护装置7可由金属或玻璃或高温塑料或陶瓷等组成的材料支撑，并面向往复运动的方向。图12(b)为一个反应器15与反应器防护装置7和反应器握持架33的俯视图。如图所示，反应器防护装置7只覆盖反应器15的一小部分，因此不阻碍荧光成像。
图13(a)是由反应器15以多孔形式所组成的生物芯片31。反应材料21由反应器15的开口分配进入，然后由盖或密封液体30密封。然后，生物芯片31被安装在反应器握持架33上。图13(b)是反应器15被容纳于卡31内以跟浴槽一起应用的透视图。在此，数个反应器15被安置于卡31中。卡31边缘可采用一种能在THIGH和往复运动时，以及在与粉末浴槽介质75一起使用时保持刚性的材料。至少一个入口313与反应器15通过渠道315网络保持流体沟通。被测试的反应材料21可被装进入口315，随后流入反应器15。以便在粉末浴槽介质75中移动。图13(c)显示了一项实施例，其中反应器15由适用于以金属粉末为浴槽介质75的金属管。关于荧光成像，光纤309将来自如LED等的照明光源(未示出)的光线传送入反应器15内的反应材料21。光纤310负责把来自反应材料21的光线传送至光电探测器(未示出)。密封剂或盖77负责固定光纤309、310。这使非透明反应器的光学检测得以进行。图13(c)显示在另一项实施例中，一组光纤可引导照明光线46进入各反应器15，而第二组光纤可将发射光线47从各反应器15引导到至少一个光检测器43。
浴槽介质75可由各种材料构成，包括液体和/或固态粉末和/或液体与固态粉末或珠子的混合物。单一硅粉和铜粉可被置于加热浴槽中，但硅粉和铜粉的硬度可能会使反应器15破裂。浴槽介质75也可以是空气。浴槽介质75也可是以下组合中的一个或多个选择，此组合包括水、油、甘油、化学液体、液态金属、气体、空气、金属粉末和碳化硅粉末和/或珠子，以及它们的混合物。构成反应器15的材料可以是塑料、弹性体、玻璃、金属、陶瓷和它们的综合体，其中塑料包括聚丙烯和聚碳酸酯；玻璃反应器15可由小直径玻璃毛细管形式制成，例如外径0.1mm-3mm和内径0.02mm-2mm；而金属可以是处于薄膜、薄空腔、和毛细管的形式的铝。反应材料可由具有化学或生物稳定性的非生物活性物质制成。反应器15的至少一部分优选为透明。至少一个反应器的容量可处于1μL到500μL的范围内。容量越小，往复运动就能越快，PCR速度就越快，而且所需的浴槽尺寸就越小，设备也就越精简。在反应器握持架33中所有反应器15内的反应材料可以各不相同。如果浴槽温度适合，设备可有利地同时为不同的反应材料进行PCR。
在反应器运动中使用往复形式可带来许多好处：
a)例如，在图1.4(a)里的高纵横比浴槽30中的1x4反应器阵列和图1.4(b)里反应器阵列长度M于宽度N被分别设定，使用小浴槽宽度，H，当使用往复运动时，设备可实现浴槽30的小容量和高纵横比L/H。例如，反应器15沿高纵横比反应器阵列的长度方向所进行的往复运动产生了小振动幅度，这能显著缩小浴槽尺寸，因为L＝M+l+2，无视运动速度。这显著降低了浴槽30内浴槽介质的热质量，即实现在热循环之前将浴槽温度快速预热至目标温度，或快速浴槽准备，以及缩短基因测试的整体时间和缩小设备尺寸以增进便携性。拥有庞大热质量以及相应庞大的传统水浴槽是无法实现在热循环之前如此快速的浴槽准备的。例如，除了使用往复运动，参考2[Jared S.Farrar与Carl T.Wittwer,Extreme PCR:Efficient and Specific DNA Amplification in 15–60Seconds.Clinical Chemistry61:1p145–153(2015)]描述了一种高速单向线性运动或“扫过运动”以增强反应器15周围的热传递。为了让反应器在浴槽里停留得够久，尤其是用来进行退火或延伸，它们的单向直线“扫过运动”需要很大的l数值，其中l可被运算为l＝vt，其中v为反应器在浴槽内运动的速度，而t为反应器在“扫过运动”期间停留在浴槽内的时间。因此，为了拥有高速度v以实现强力对流热传递和足够持久的时间t，这通常为PCR的退火步骤所需，反应器15需要停留在浴槽30内，l数值变大，这代表此法需要创建很长的浴槽30(L＝M+l+2)，造成许多在使用上的问题，比如对于大量水的管理、PCR之前许久的预热过程、以及巨大且沉重的设备。若使用小和薄形浴槽，本发明中的低热质量也能在热循环期间与快速响应的温度控制相辅相成。
b)另一个小且具有高纵横比浴槽形状的好处是使用者可更轻易地管理浴槽介质。例如，既然浴槽中的浴槽介质数量少，使用者可轻易地针对各热循环操作来注入和移除所有浴槽中的浴槽介质，而无需像在使用传统水浴循环器时那样担心移除大量水和为了新的实验而注入大量水，再长时间等待大浴槽被加热至目标温度以进行新的热循环处理。
当使用上述方法和设备来进行核酸分析和处理时，反应系统包含了反应成分，此反应成分包括了至少一种酶、含有至少一种核酸的核酸和/或粒子、PCR所用的引物、等温扩增所用的引物、其它核酸扩增和处理的引物、dNTP、Mg2+、荧光染料和探针、控制DNA、控制RNA、控制细胞、控制微生物，和其它核酸扩增、处理和分析所需的试剂。上述含有核酸的粒子包含至少一个细胞病毒、白血球和基质细胞、循环肿瘤细胞、胚胎细胞。其中一项应用可以是使用该方法和设备来针对相同一组引物和探针测试各种不同的反应系统，例如测试多于一种样品。在这种应用当中，不包含目标引物和/或探针的各种不同的反应材料21各自被置入一个反应器阵列30中的反应器15，而所有反应器15内都预先置入了相同组的PCR引物和/或探针。在相同的应用当中，各种不同的反应材料被与相应的PCR目标引物和/或探针预先混合，各自被置入反应器阵列30里的一个反应器15，而所有反应器15内都并没有预先被置入相同组的PCR引物和/或探针。该反应材料21可包括控制基因和/或细胞和相应的荧光染料或探针。在上述情况下，不同的探针发射出不同波长的光。该方法和设备的另一项应用为针对不同组的引物和探针测试相同的反应系统。这项应用的一个例子为测试一种样品来达到多于一个目的。在这项应用当中，一个单一反应材料21被加入各自装有至少一组相异的PCR引物和/或探针的反应器15。例如，第一反应器15内可装有引物与探针组合1；而第二反应器15内可装有引物与探针组合2。这项应用的另一个例子是第一反应器15内装有引物与探针组合1和2；而第二反应器15内可装有引物与探针组合2、4和5。该反应材料可包括控制基因和/或细胞和相应的荧光染料或探针。在上述情况下，不同的探针发射出不同波长的光。上述反应材料21被用于聚合酶链式反应、逆转录-聚合酶链式反应、终点PCR、连接酶链式反应、核酸测序或各聚合酶链式反应(PCR)的变化的预扩增或模板富集、等温扩增、线性扩增、用于测序的文库制备、用于测序的桥扩增。上述聚合酶链式反应的变化包括逆转录-PCR、实时荧光定量聚合酶链式扩增反应和实时荧光定量逆转录聚合酶链式扩增反应、反向聚合酶链式扩增反应、锚定聚合酶链式扩增反应、不对称聚合酶链式扩增反应、多重PCR、色彩互补聚合酶链式扩增反应、免疫聚合酶链式扩增反应、巢式聚合酶链式扩增反应、预扩增或核酸测序的模板富集、ELISA-PCR。
从前面的描述，本领域中的技术人员将会理解，在不偏离权利要求书中所阐明的本发明的情况下，可对设计、构造和操作上的细节进行许多变化或修改。

Claims (22)

1.一种用于按照热曲线对核酸进行热处理的设备，该设备使用反应器握持架来握持各自容纳反应材料的反应器，所述反应材料含有核酸，而反应器处于管状容器或多孔板或芯片或卡盒中，该设备包括:
一个第一浴槽；和
一个第二浴槽，浴槽中的浴槽介质可被分别保持在两个不同的温度；以及
一个转移装置，负责让反应器在多个热循环中进入该二浴槽以交替达到:
-预定的高目标温度THT，和
-预定的低目标温度TLT；
一个包含反应器限制装置的反应器防护装置，以部分地防护反应器来防止反应器在进入含有高导热率粉末的浴槽介质时和在进行往复运动时因浴槽介质的阻力和THT而变形，反应器限制装置面朝往复运动的方向；以及
往复装置，负责在反应器处于至少一个浴槽中时让握持架能与至少一个浴槽之间进行相对往复运动，设备可通过振动以下配件来执行该相对往复运动：
a)至少一个浴槽，或
b)握持架，或
c)握持架和至少一个浴槽；
往复运动的频率高于0.2赫兹，而振幅高于1mm；
其中往复装置包括用于振动握持架的反应器振动器，该振动独立于由转移装置为握持架所提供的任何动作。
2.根据权利要求1所述的设备，进一步包括:
一个第三浴槽，让转移装置和往复装置能以往复形式将反应器置入第三浴槽中来达到预定的中目标温度TMT。
3.根据权利要求1所述的设备，其中往复运动基本上沿水平或垂直方向进行。
4.根据权利要求1所述的设备，其中往复装置在反应器接近目标温度时降低往复运动的速度。
5.根据权利要求1所述的设备，其中往复装置在设备为反应器进行荧光成像时停止往复运动。
6.根据权利要求1所述的设备，其中当用于照射反应材料和接收来自反应材料的发射光的光学装置跟反应器一起移动时，往复装置在为反应器进行荧光成像时继续进行往复运动。
7.根据权利要求1所述的设备，其中反应器防护装置由包括金属或玻璃或高温塑料或陶瓷的材料所制成。
8.根据权利要求1所述的设备，其中反应器防护装置为反应器握持架的延伸部分。
9.根据权利要求1所述的设备，进一步包括：
位于浴槽底部的底部支撑，用于在浴槽介质为粉末时在往复运动期间支撑反应器的底端，其中装置通过以下任何一项方法为反应器提供往复运动：
a)移动反应器握持架，
b)移动浴槽底部，和
c)将浴槽底部和反应器握持架互相往反方向移动。
10.根据权利要求9所述的设备，其中温度稳定步骤处于其中一个目标温度。
11.根据权利要求1所述的设备，其中往复装置为反应器提供在第二浴槽中三个阶段的振动，先高速振动，然后低速振动，再停止振动以进行荧光成像。
12.根据权利要求1所述的设备，进一步包括：
一个第六浴槽，以容纳可维持在40-80摄氏度的液体或空气，其中浴槽壁的至少一部分是透明的，以便让来自光源的照射光，以及让来自反应器的发射光透射。
13.根据权利要求1所述的设备，其中任何浴槽内的浴槽介质处于任何相位，包括空气、液体、固体、粉末以及它们之中的混合物。
14.根据权利要求1所述的设备，进一步包括一个能够在热循环期间跟着反应器握持架一起移动的反应器温度传感器，以监测反应器的温度。
15.根据权利要求14所述的设备，进一步包括一个容器，此容器容纳一种物质，以便封装反应器温度传感器，该容器和物质拥有与反应器和反应材料相似的结构或导热特性。
16.根据权利要求1所述的设备，具有至少一个具备高纵横比形状的浴槽，其长宽比为(2-10):1，而往复运动沿其长度方向进行。
17.根据权利要求1所述的设备，其中转移装置包括了往复装置，而在操作期间，握持架的振动由转移装置执行。
18.根据权利要求1所述的设备，其中频率和振幅由以下组中选择：
i)高于0.2赫兹的频率和高于5mm的振幅，
ii)高于1赫兹的频率和高于5mm的振幅，以及
iii)高于3赫兹的频率和高于5mm的振幅。
19.在热曲线中利用热处理设备进行核酸热处理的方法，所述热处理设备使用反应器握持架来握持各自容纳反应材料的反应器，所述反应材料含有核酸，而反应器处于管状容器或多孔板或芯片或卡盒中，该设备包括:
一个第一浴槽；和
一个第二浴槽，浴槽中的浴槽介质可被分别保持在两个不同的温度；以及
一个转移装置，负责让反应器在多个热循环中进入该二浴槽以交替达到:
-预定的高目标温度THT，和
-预定的低目标温度TLT；
一个包含反应器限制装置的反应器防护装置；以及
往复装置，负责在反应器处于至少一个浴槽中时让握持架能与至少一个浴槽之间进行相对往复运动，设备可通过振动以下配件来执行该相对往复运动：
a)至少一个浴槽，或
b)握持架，或
c)握持架和至少一个浴槽；
往复运动的频率高于0.2赫兹，而振幅高于1mm；
其中往复装置包括用于振动握持架的反应器振动器，该振动独立于由转移装置为握持架所提供的任何动作
所述方法包括：
用所述反应器防护装置来部分地防护反应器来防止反应器在进入包含高导热率粉末的浴槽介质时和在进行往复运动时因阻力和THT而变形，反应器防护装置面朝往复运动的方向。
20.根据权利要求19所述的方法，其中反应器防护装置由包括金属或玻璃或高温塑料或陶瓷的材料所支撑。
21.根据权利要求19所述的方法，其中反应器防护装置为反应器握持架的延伸部分。
22.根据权利要求19的方法，其中反应器处于一端封闭的毛细管的形式。
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