JP2003299484A - 熱サイクルを併用する超臨界二酸化炭素利用型の遺伝子増幅装置 - Google Patents
熱サイクルを併用する超臨界二酸化炭素利用型の遺伝子増幅装置Info
- Publication number
- JP2003299484A JP2003299484A JP2001341271A JP2001341271A JP2003299484A JP 2003299484 A JP2003299484 A JP 2003299484A JP 2001341271 A JP2001341271 A JP 2001341271A JP 2001341271 A JP2001341271 A JP 2001341271A JP 2003299484 A JP2003299484 A JP 2003299484A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene amplification
- pressure
- temperature
- carbon dioxide
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】核酸を含む化合物を複数の温度サイクルによっ
て遺伝子増幅反応を行う装置についての方法に関する。 【解決手段】二酸化炭素等の超臨界流体、亜臨界流体、
高圧ガス、液体ならびにそれらと他の溶媒、ガスなどの
化学種の混合流体中での遺伝子増幅反応において、装置
自体を耐圧構造にし、超臨界流体中での遺伝子増幅反応
を図ると共に流体を用いた遺伝子増幅すべての系におい
て増幅容量も調節可能にできるようにした遺伝子増幅装
置を提供することにある。
て遺伝子増幅反応を行う装置についての方法に関する。 【解決手段】二酸化炭素等の超臨界流体、亜臨界流体、
高圧ガス、液体ならびにそれらと他の溶媒、ガスなどの
化学種の混合流体中での遺伝子増幅反応において、装置
自体を耐圧構造にし、超臨界流体中での遺伝子増幅反応
を図ると共に流体を用いた遺伝子増幅すべての系におい
て増幅容量も調節可能にできるようにした遺伝子増幅装
置を提供することにある。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、例えばＤＮＡ、酵素等
の反応混合物からなる試料を耐圧性遺伝子増幅セルに収
容し、このセルを加熱冷却する工程を繰り返すことによ
り、超臨界流体中でＤＮＡ等の核酸配列を増幅する遺伝
子増幅装置に関する。
の反応混合物からなる試料を耐圧性遺伝子増幅セルに収
容し、このセルを加熱冷却する工程を繰り返すことによ
り、超臨界流体中でＤＮＡ等の核酸配列を増幅する遺伝
子増幅装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、ＤＮＡ等の核酸配列を増幅する遺
伝子増幅装置としては種々のものが知られている。例え
ばＤＮＡ断片をＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉ
ｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によって増幅する方法が提案
されている（例えばＬｕｄｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ，Ｎａ
ｔｕｒｅ、３３８、３４８、１９８９、特開平７−２５
５４８２）。ＰＣＲ法を用いて遺伝子を増幅するには、
反応温度を操作することでアニーリング、伸長、変性の
サイクルを繰り返す必要がある。このため、ＰＣＲ法を
用いて遺伝子増幅を行うには、温度制御可能な反応装置
が必要である。この種々の遺伝子増幅装置は加熱冷却を
制御する温度勾配が極めて大きく、例えば１分間で５０
℃程度から９０℃程度まで、急速に温度上昇させる必要
があるとともに、反応時間に応じて変温パターンを高精
度にする必要がある。
伝子増幅装置としては種々のものが知られている。例え
ばＤＮＡ断片をＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉ
ｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によって増幅する方法が提案
されている（例えばＬｕｄｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ，Ｎａ
ｔｕｒｅ、３３８、３４８、１９８９、特開平７−２５
５４８２）。ＰＣＲ法を用いて遺伝子を増幅するには、
反応温度を操作することでアニーリング、伸長、変性の
サイクルを繰り返す必要がある。このため、ＰＣＲ法を
用いて遺伝子増幅を行うには、温度制御可能な反応装置
が必要である。この種々の遺伝子増幅装置は加熱冷却を
制御する温度勾配が極めて大きく、例えば１分間で５０
℃程度から９０℃程度まで、急速に温度上昇させる必要
があるとともに、反応時間に応じて変温パターンを高精
度にする必要がある。
【０００３】このため遺伝子増幅装置には、短時間での
試料の高速な加熱冷却能力、加熱冷却繰返し使用に耐え
得る装置の耐久性、各試料間の高い温度分布精度の維持
並びに装置の小型化などが要求されている。これまでの
遺伝子増幅装置のうち、機構的な信頼性を重視した遺伝
子増幅装置としては、冷却手段としてコンプレッサを使
用したものが知られている。また、小型化を重視した遺
伝子増幅装置としてはペルチェ素子で加熱冷却せしめる
ものが知られている（特願平６−１３７８４３）。
試料の高速な加熱冷却能力、加熱冷却繰返し使用に耐え
得る装置の耐久性、各試料間の高い温度分布精度の維持
並びに装置の小型化などが要求されている。これまでの
遺伝子増幅装置のうち、機構的な信頼性を重視した遺伝
子増幅装置としては、冷却手段としてコンプレッサを使
用したものが知られている。また、小型化を重視した遺
伝子増幅装置としてはペルチェ素子で加熱冷却せしめる
ものが知られている（特願平６−１３７８４３）。
【０００４】しかしながら、ＰＣＲ法ではポリメラーゼ
を用いた酵素反応を利用しているため、十分な反応速度
を得るためには、ポリメラーゼに応じた最適な温度サイ
クル等を達成する必要があった。一方、酵素反応を高速
に進行させる方法として超臨界流体を反応媒体として用
いる手法が検討されているが（例えば特開平０９−００
０２８３）、温度サイクルの制御や装置の小型化が困難
なことから遺伝子増幅反応への適用は困難なようであ
る。
を用いた酵素反応を利用しているため、十分な反応速度
を得るためには、ポリメラーゼに応じた最適な温度サイ
クル等を達成する必要があった。一方、酵素反応を高速
に進行させる方法として超臨界流体を反応媒体として用
いる手法が検討されているが（例えば特開平０９−００
０２８３）、温度サイクルの制御や装置の小型化が困難
なことから遺伝子増幅反応への適用は困難なようであ
る。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上述した従来の遺伝子
増幅装置のうち、多くが水溶液用のプラスチック製の試
料容器を用いており、超臨界流体などに耐えうるステン
レス製等の高温高圧流体用の耐圧試料容器を用いること
ができないという問題がある。
増幅装置のうち、多くが水溶液用のプラスチック製の試
料容器を用いており、超臨界流体などに耐えうるステン
レス製等の高温高圧流体用の耐圧試料容器を用いること
ができないという問題がある。
【０００６】また、超臨界流体中で遺伝子増幅を行う場
合、上述の遺伝子増幅装置と同程度の１０−６リットル
オーダーの量で増幅しようとしても、超臨界流体などの
高温高圧に耐えうる耐圧性の１０−６リットルオーダー
の容器が無いという問題点がある。
合、上述の遺伝子増幅装置と同程度の１０−６リットル
オーダーの量で増幅しようとしても、超臨界流体などの
高温高圧に耐えうる耐圧性の１０−６リットルオーダー
の容器が無いという問題点がある。
【０００７】さらに、前記の遺伝子増幅装置では反応制
御に関して、いずれの装置も加熱冷却を行って、温度サ
イクルをかけることによって遺伝子増幅を行っており、
温度以外の因子により遺伝子増幅の高速化等を図ること
が困難であるという問題点がある。
御に関して、いずれの装置も加熱冷却を行って、温度サ
イクルをかけることによって遺伝子増幅を行っており、
温度以外の因子により遺伝子増幅の高速化等を図ること
が困難であるという問題点がある。
【０００８】そこで、この発明の目的は、装置自体を超
臨界流体中でも使用可能にし、耐圧性試料容器を用いて
も十分な熱伝導を可能にするとともに、ＤＮＡ等の核酸
配列を従来の遺伝子増幅装置と同程度微小な量、さらに
は大量に増幅することも可能である遺伝子増幅装置を提
供することにある。
臨界流体中でも使用可能にし、耐圧性試料容器を用いて
も十分な熱伝導を可能にするとともに、ＤＮＡ等の核酸
配列を従来の遺伝子増幅装置と同程度微小な量、さらに
は大量に増幅することも可能である遺伝子増幅装置を提
供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明の要旨は、独立し
た２個またはそれ以上の温度制御機能をもつ温度制御装
置より、温度制御装置内の熱媒体を任意の時間に装置内
の耐圧性遺伝子増幅セルの周囲を循環させることでセル
に温度サイクルをかけ、ＤＮＡ等の核酸配列の増幅を行
う遺伝子増幅装置を用いることで、遺伝子増幅部の反応
媒体に高温高圧流体を使用可能とした。さらに、本発明
では反応媒体に超臨界流体を用いることで、その超臨界
流体の圧力を操作することによっても遺伝子増幅速度を
制御することが可能になった。
た２個またはそれ以上の温度制御機能をもつ温度制御装
置より、温度制御装置内の熱媒体を任意の時間に装置内
の耐圧性遺伝子増幅セルの周囲を循環させることでセル
に温度サイクルをかけ、ＤＮＡ等の核酸配列の増幅を行
う遺伝子増幅装置を用いることで、遺伝子増幅部の反応
媒体に高温高圧流体を使用可能とした。さらに、本発明
では反応媒体に超臨界流体を用いることで、その超臨界
流体の圧力を操作することによっても遺伝子増幅速度を
制御することが可能になった。
【００１０】また、本発明の要旨は、上記方法におい
て、ＤＮＡ等を大量増幅使用する場合にも、試料容器の
プレート部を交換するだけで、従来法より数万倍以上の
大容量の試料容器を採用でき、増幅目的に合わせた増幅
量の調節が可能になるところにもある。
て、ＤＮＡ等を大量増幅使用する場合にも、試料容器の
プレート部を交換するだけで、従来法より数万倍以上の
大容量の試料容器を採用でき、増幅目的に合わせた増幅
量の調節が可能になるところにもある。
【００１１】本発明に使用する独立した温度制御装置内
を循環させる際に用いる素材としては、特に限定され
ず、例えば、シリコンオイル、ヒーターブルオイル等の
オイルまたは水等の流体状のもの、温度制御の可能な循
環オイルとして実用性を有することが知られている化合
物をチャンバー内に循環させることで用いることができ
る。
を循環させる際に用いる素材としては、特に限定され
ず、例えば、シリコンオイル、ヒーターブルオイル等の
オイルまたは水等の流体状のもの、温度制御の可能な循
環オイルとして実用性を有することが知られている化合
物をチャンバー内に循環させることで用いることができ
る。
【００１２】さらに、これらの温度制御に用いる流体は
循環させることのみに使用し、基本的に消耗されないの
で、耐用年数ごとに交換または修理等のメンテナンスを
行うことで長期間の使用に耐えうる。
循環させることのみに使用し、基本的に消耗されないの
で、耐用年数ごとに交換または修理等のメンテナンスを
行うことで長期間の使用に耐えうる。
【００１３】本発明に使用するＤＮＡ等の遺伝子は、特
に限定されず一般に使用されている遺伝子を挙げること
ができる。このようなものとして、例えば、ナイロンデ
オキシリボ核酸及びリボ核酸の構成成分であるプリン塩
基、ピリミジン塩基、ヌクレオシド及びヌクレオチドを
少なくとも１種以上含む化合物を挙げることができる。
に限定されず一般に使用されている遺伝子を挙げること
ができる。このようなものとして、例えば、ナイロンデ
オキシリボ核酸及びリボ核酸の構成成分であるプリン塩
基、ピリミジン塩基、ヌクレオシド及びヌクレオチドを
少なくとも１種以上含む化合物を挙げることができる。
【００１４】本発明で適用できる耐熱性の核酸合成酵素
は特に限定されず一般に使用されている耐熱性の核酸合
成酵素を挙げることができる。このようなものとして、
例えば、ＰＦＵポリメラーゼ（ピロコカス フリオサス
由来）、タックポリメラーゼ（サーマス アクアティカ
ス由来）、Ｔｔｈポリメラーゼ（サーマス サーモフィ
リウスＨＢＢ由来）またはＫＯＤポリメラーゼ（ピロコ
カス コダカラエンシス由来）を挙げることができる。
は特に限定されず一般に使用されている耐熱性の核酸合
成酵素を挙げることができる。このようなものとして、
例えば、ＰＦＵポリメラーゼ（ピロコカス フリオサス
由来）、タックポリメラーゼ（サーマス アクアティカ
ス由来）、Ｔｔｈポリメラーゼ（サーマス サーモフィ
リウスＨＢＢ由来）またはＫＯＤポリメラーゼ（ピロコ
カス コダカラエンシス由来）を挙げることができる。
【００１５】本発明において、二酸化炭素などの超臨界
流体、高圧ガス、液体ならびにそれらと他の溶媒、ガス
などの化学種の混合流体中にて遺伝子を増幅するときに
も使用でき、遺伝子増幅部での流体の圧力制御を可能に
し、また、独立した温度制御装置から循環させる流体を
遺伝子増幅部に接触させることで遺伝子増幅を行う装置
である。
流体、高圧ガス、液体ならびにそれらと他の溶媒、ガス
などの化学種の混合流体中にて遺伝子を増幅するときに
も使用でき、遺伝子増幅部での流体の圧力制御を可能に
し、また、独立した温度制御装置から循環させる流体を
遺伝子増幅部に接触させることで遺伝子増幅を行う装置
である。
【００１６】本発明で使用する増幅装置としては、例え
ば図１に示すような熱サイクルを用いた超臨界流体遺伝
子増幅装置を使用することが出来る。上記増幅装置は、
ボンベ１から逆止弁９までの遺伝子昇圧部、ストップバ
ルブＶ５から耐圧性遺伝子増幅セル１２までの遺伝子増
幅部、およびその下流の２槽の異なる温度制御を行うオ
イルバス１７Ａ、１７Ｂを有する温度制御部からなる。
ば図１に示すような熱サイクルを用いた超臨界流体遺伝
子増幅装置を使用することが出来る。上記増幅装置は、
ボンベ１から逆止弁９までの遺伝子昇圧部、ストップバ
ルブＶ５から耐圧性遺伝子増幅セル１２までの遺伝子増
幅部、およびその下流の２槽の異なる温度制御を行うオ
イルバス１７Ａ、１７Ｂを有する温度制御部からなる。
【００１７】図１においては独立した温度制御装置を２
槽のオイルバスとして例を示しているが、槽の数は１個
以上であれば特に限定されない。また独立した温度制御
装置の種類または手段においても特に限定されない。
槽のオイルバスとして例を示しているが、槽の数は１個
以上であれば特に限定されない。また独立した温度制御
装置の種類または手段においても特に限定されない。
【００１８】昇圧部はバルブＶ５、Ｖ６を介して遺伝子
増幅部に接続している。昇圧部は、二酸化炭素用と溶液
用の２つの昇圧用ポンプ４Ａ、送液ポンプ４Ｂを有す
る。ボンベ１は、液体二酸化炭素を昇圧用ポンプ４Ａへ
送るためサイフォン式を用いた。ボンベ１から送られる
液体二酸化炭素中の水分を除去するために、ボンベ１と
昇圧用ポンプ４Ａの間に乾燥管２を置いた。乾燥管２の
仕様は、材質ＳＵＳ３１６、最高使用圧力２０ＭＰａ、
内径３５．５ｍｍ、長さ３１０ｍｍである。また、乾燥
剤には、ジーエルサイエンス（株）製のモレキュラーシ
ーブ（１／１６インチ ペレット）を使用した。乾燥管
２により水分を除去された液体二酸化炭素は、冷却ユニ
ット６（ヤマト科学製ＢＬ−２２）によって約−５℃に
保たれたエチレングリコールにより冷却され、昇圧用ポ
ンプ４Ａに送られる。
増幅部に接続している。昇圧部は、二酸化炭素用と溶液
用の２つの昇圧用ポンプ４Ａ、送液ポンプ４Ｂを有す
る。ボンベ１は、液体二酸化炭素を昇圧用ポンプ４Ａへ
送るためサイフォン式を用いた。ボンベ１から送られる
液体二酸化炭素中の水分を除去するために、ボンベ１と
昇圧用ポンプ４Ａの間に乾燥管２を置いた。乾燥管２の
仕様は、材質ＳＵＳ３１６、最高使用圧力２０ＭＰａ、
内径３５．５ｍｍ、長さ３１０ｍｍである。また、乾燥
剤には、ジーエルサイエンス（株）製のモレキュラーシ
ーブ（１／１６インチ ペレット）を使用した。乾燥管
２により水分を除去された液体二酸化炭素は、冷却ユニ
ット６（ヤマト科学製ＢＬ−２２）によって約−５℃に
保たれたエチレングリコールにより冷却され、昇圧用ポ
ンプ４Ａに送られる。
【００１９】昇圧用ポンプ４Ａは、ジーエルサイエンス
（株）製の高圧用シングルプランジャーポンプＡＰＳ−
５Ｌ（最大圧力５８．８ＭＰａ、常用圧力４９．０ＭＰ
ａ、流量０．５〜５．２ｍｌ・ｍｉｎ−１）を使用し
た。昇圧用ポンプ４Ａのヘッド部分には、液体二酸化炭
素の気化を防ぐために冷却ユニット６を装着している。
脱保護剤または縮合剤を試料瓶７に入れ、送液ポンプ４
Ｂの上流に設置した。送液ポンプ４Ｂにより昇圧された
溶離液はストップバルブＶ２を通り、ストップバルブＶ
４の前で、二酸化炭素と混合され、耐圧性遺伝子増幅セ
ル１２へ供給される。さらに、溶離液の排出用として、
ストップバルブＶ３を設置した。ストップバルブＶ２〜
Ｖ７には、ホワイティー製のボンネット一体型流量調節
ストップバルブＳＳ−ＯＫＳ２ＢＫＢを用いた。また、
乾燥管２と冷却ユニット６の間に、ゴミなどの不純物が
混入することを防ぐためにフィルター３Ａとして、ジー
エルサイエンス（株）製ＦＴ４−１０型を使用した。フ
ィルタの細孔平均径は約１０μｍである。
（株）製の高圧用シングルプランジャーポンプＡＰＳ−
５Ｌ（最大圧力５８．８ＭＰａ、常用圧力４９．０ＭＰ
ａ、流量０．５〜５．２ｍｌ・ｍｉｎ−１）を使用し
た。昇圧用ポンプ４Ａのヘッド部分には、液体二酸化炭
素の気化を防ぐために冷却ユニット６を装着している。
脱保護剤または縮合剤を試料瓶７に入れ、送液ポンプ４
Ｂの上流に設置した。送液ポンプ４Ｂにより昇圧された
溶離液はストップバルブＶ２を通り、ストップバルブＶ
４の前で、二酸化炭素と混合され、耐圧性遺伝子増幅セ
ル１２へ供給される。さらに、溶離液の排出用として、
ストップバルブＶ３を設置した。ストップバルブＶ２〜
Ｖ７には、ホワイティー製のボンネット一体型流量調節
ストップバルブＳＳ−ＯＫＳ２ＢＫＢを用いた。また、
乾燥管２と冷却ユニット６の間に、ゴミなどの不純物が
混入することを防ぐためにフィルター３Ａとして、ジー
エルサイエンス（株）製ＦＴ４−１０型を使用した。フ
ィルタの細孔平均径は約１０μｍである。
【００２０】系内の圧力は、圧力調整弁Ｖ１により任意
の圧力に設定される。圧力調整弁Ｖ１はテスコム製の２
６−１７２２−２４を使用した。このバルブは±０．１
ＭＰａで系内の圧力を制御でき、最大使用圧力は４１．
５ＭＰａ（４１５ｂａｒ）である。系内の圧力は、ブル
ドン式の圧力計５（ジーエルサイエンス（株）製ＬＣＧ
−３５０；最大使用圧力３４．３Ｍｐａ）で測定した。
この圧力計５には、上限接点出力端子が付いており、指
定圧力で昇圧用ポンプ４Ａの電源を切るように設定し
た。また、この圧力計５の検定に司測研（株）製エコノ
ミー圧力計ＰＥ−３３−Ａ（歪ゲージ式、精度±０．３
％）を使用した。
の圧力に設定される。圧力調整弁Ｖ１はテスコム製の２
６−１７２２−２４を使用した。このバルブは±０．１
ＭＰａで系内の圧力を制御でき、最大使用圧力は４１．
５ＭＰａ（４１５ｂａｒ）である。系内の圧力は、ブル
ドン式の圧力計５（ジーエルサイエンス（株）製ＬＣＧ
−３５０；最大使用圧力３４．３Ｍｐａ）で測定した。
この圧力計５には、上限接点出力端子が付いており、指
定圧力で昇圧用ポンプ４Ａの電源を切るように設定し
た。また、この圧力計５の検定に司測研（株）製エコノ
ミー圧力計ＰＥ−３３−Ａ（歪ゲージ式、精度±０．３
％）を使用した。
【００２１】昇圧部の圧力を制御するために、昇圧部と
遺伝子増幅部の間にストップバルブＶ４を設置した。ス
トップバルブＶ４には、ジーエルサイエンス（株）製の
２ウェイ バルブ０２−０１２０（最大使用圧力９８．
０ＭＰａ）を用いた。また、昇圧部には、安全性を確保
するために、安全弁８を設置した。安全弁８は、ヌプロ
製のスプリング式のもので、系内の圧力が３４．３ＭＰ
ａで作動するように調整・検定してある。なお、昇圧部
のボンベ１からフィルター３Ａまでの区間以外の配管に
は、１／１６インチのステンレス管（材質ＳＵＳ３１
６、外径１．５８８ｍｍ、内径０．８ｍｍ）を用い、他
の部分はすべて１／８インチのステンレス管（材質ＳＵ
Ｓ３１６、外径３．１７５ｍｍ、内径２．１７ｍｍ）を
用いた。
遺伝子増幅部の間にストップバルブＶ４を設置した。ス
トップバルブＶ４には、ジーエルサイエンス（株）製の
２ウェイ バルブ０２−０１２０（最大使用圧力９８．
０ＭＰａ）を用いた。また、昇圧部には、安全性を確保
するために、安全弁８を設置した。安全弁８は、ヌプロ
製のスプリング式のもので、系内の圧力が３４．３ＭＰ
ａで作動するように調整・検定してある。なお、昇圧部
のボンベ１からフィルター３Ａまでの区間以外の配管に
は、１／１６インチのステンレス管（材質ＳＵＳ３１
６、外径１．５８８ｍｍ、内径０．８ｍｍ）を用い、他
の部分はすべて１／８インチのステンレス管（材質ＳＵ
Ｓ３１６、外径３．１７５ｍｍ、内径２．１７ｍｍ）を
用いた。
【００２２】昇圧部から供給される液体二酸化炭素と溶
離液は、予熱カラム１０へ送られる。予熱カラム１０
は、溶媒（二酸化炭素等）を平衡温度まで加熱し超臨界
流体にするためのものであり、１／８インチステンレス
管（材質ＳＵＳ３１６，外径３．１７５ｍｍ，内径２．
１７ｍｍ，長さは約４ｍ）を直径５５ｍｍ、長さ１４０
ｍｍのスパイラル状に変形して、恒温槽内に設置した。
予熱カラム１０により超臨界流体とした二酸化炭素は反
応溶液と共に、流体の逆流を防止する逆止弁９（ヌプロ
製ＳＳ−ＣＨＳ４−１０：最大使用圧力４１．２ＭＰ
ａ）を通過し、遺伝子増幅部の耐圧性遺伝子増幅セル１
２に導入される。
離液は、予熱カラム１０へ送られる。予熱カラム１０
は、溶媒（二酸化炭素等）を平衡温度まで加熱し超臨界
流体にするためのものであり、１／８インチステンレス
管（材質ＳＵＳ３１６，外径３．１７５ｍｍ，内径２．
１７ｍｍ，長さは約４ｍ）を直径５５ｍｍ、長さ１４０
ｍｍのスパイラル状に変形して、恒温槽内に設置した。
予熱カラム１０により超臨界流体とした二酸化炭素は反
応溶液と共に、流体の逆流を防止する逆止弁９（ヌプロ
製ＳＳ−ＣＨＳ４−１０：最大使用圧力４１．２ＭＰ
ａ）を通過し、遺伝子増幅部の耐圧性遺伝子増幅セル１
２に導入される。
【００２３】遺伝子増幅部は、チャンバー１１、耐圧性
遺伝子増幅セル１２からなり、チャンバーには独立に温
度制御されたオイルバス１７Ａ、１７Ｂが接続してお
り、それぞれ目的とする温度に調節されて循環してい
る。載置プレート１３は、温度制御手段として独立した
温度制御装置から流体が循環ポンプ１４により供給され
ていると共に温度センサー１５が埋設されている。循環
ポンプ１４並びに温度センサー１５は時間温度切り替え
制御装置１６に接続されている。循環ポンプ１４によっ
て供給される流体によってチャンバー１１が加熱される
と共に温度センサー１５で温度が検出されるものであ
る。チャンバー１１とオイルバス１７Ａ、１７Ｂの間に
は電磁弁Ｅ１、Ｅ２が接続している。時間温度切り替え
装置１６において目的サイクル時間を設定し、設定時間
に合わせて電磁弁制御信号を送ることにより電磁弁Ｅ１
〜Ｅ４と循環ポンプ１４を制御し、チャンバー１１内の
温度切り替えを行う。
遺伝子増幅セル１２からなり、チャンバーには独立に温
度制御されたオイルバス１７Ａ、１７Ｂが接続してお
り、それぞれ目的とする温度に調節されて循環してい
る。載置プレート１３は、温度制御手段として独立した
温度制御装置から流体が循環ポンプ１４により供給され
ていると共に温度センサー１５が埋設されている。循環
ポンプ１４並びに温度センサー１５は時間温度切り替え
制御装置１６に接続されている。循環ポンプ１４によっ
て供給される流体によってチャンバー１１が加熱される
と共に温度センサー１５で温度が検出されるものであ
る。チャンバー１１とオイルバス１７Ａ、１７Ｂの間に
は電磁弁Ｅ１、Ｅ２が接続している。時間温度切り替え
装置１６において目的サイクル時間を設定し、設定時間
に合わせて電磁弁制御信号を送ることにより電磁弁Ｅ１
〜Ｅ４と循環ポンプ１４を制御し、チャンバー１１内の
温度切り替えを行う。
【００２４】上記構成により、耐圧性遺伝子増幅用セル
１２に予め試料を収容し、複数装着して準備する。次い
でカバーを開放して複数の耐圧性遺伝子増幅セル１２を
装着し載置プレート１３上に載せる。
１２に予め試料を収容し、複数装着して準備する。次い
でカバーを開放して複数の耐圧性遺伝子増幅セル１２を
装着し載置プレート１３上に載せる。
【００２５】温度制御部は、チャンバー１１内のオイル
循環を切り替える制御時間の設定を温度切り替え制御部
から送られる制御信号により切り替え、チャンバー１１
内に組み込まれた白金測温抵抗体（チノー製ＳＵＳ３１
６ Ｋ Ｃｌａｓｓ２：常用限度８５０℃）が接続され
た小型デジタル指示調節計（チノー製ＧＫ１００：測定
レンジ０〜９９９℃）を用いてチャンバー１１内温度監
視を行いながら、温度サイクルをかけることで耐圧性遺
伝子増幅セル１２内で遺伝子増幅反応を行う。
循環を切り替える制御時間の設定を温度切り替え制御部
から送られる制御信号により切り替え、チャンバー１１
内に組み込まれた白金測温抵抗体（チノー製ＳＵＳ３１
６ Ｋ Ｃｌａｓｓ２：常用限度８５０℃）が接続され
た小型デジタル指示調節計（チノー製ＧＫ１００：測定
レンジ０〜９９９℃）を用いてチャンバー１１内温度監
視を行いながら、温度サイクルをかけることで耐圧性遺
伝子増幅セル１２内で遺伝子増幅反応を行う。
【００２６】
【実施例】以下に本発明の実施例に揚げて更に詳しく説
明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものでは
ない。
明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものでは
ない。
【００２７】実施例１増幅反応部にある耐圧性遺伝子増
幅セル１２内に増幅を目的とする遺伝子断片ｐブルース
クリプトＳＫ＋（２７０塩基対）を５０ｎｇ、プライマ
ーＭ１３（ｌａｃＺ）５’−ＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣ
ＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡ−３’，ＲｅｖｅｒｓｅｍＭ１３
（ｌａｃＺ）Ｐｒｉｍｅｒ５’−ＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡ
ＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＧＧ−３’を各３０ｐｍｏｌ、ｄ
ＮＴＰｍｉｘを０．２ｍＭ、界面活性剤であるイソオク
チルソディウムサルファサクシネートで被覆した耐熱性
の核酸合成酵素タックポリメラーゼを２．５μｌ分取
し、耐圧性遺伝子増幅セル１２に仕込んだ。
幅セル１２内に増幅を目的とする遺伝子断片ｐブルース
クリプトＳＫ＋（２７０塩基対）を５０ｎｇ、プライマ
ーＭ１３（ｌａｃＺ）５’−ＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣ
ＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡ−３’，ＲｅｖｅｒｓｅｍＭ１３
（ｌａｃＺ）Ｐｒｉｍｅｒ５’−ＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡ
ＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＧＧ−３’を各３０ｐｍｏｌ、ｄ
ＮＴＰｍｉｘを０．２ｍＭ、界面活性剤であるイソオク
チルソディウムサルファサクシネートで被覆した耐熱性
の核酸合成酵素タックポリメラーゼを２．５μｌ分取
し、耐圧性遺伝子増幅セル１２に仕込んだ。
【００２８】ストップバルブＶ５、Ｖ６を開けてセル内
に二酸化炭素を導入し、セル内圧力を８ＭＰａとした。
このとき、上限圧力は、ストップバルブＶ４で調整し
た。また、二酸化炭素の温度制御器を３５℃に、ストッ
プバルブＶ４を８０℃に温度調整した。
に二酸化炭素を導入し、セル内圧力を８ＭＰａとした。
このとき、上限圧力は、ストップバルブＶ４で調整し
た。また、二酸化炭素の温度制御器を３５℃に、ストッ
プバルブＶ４を８０℃に温度調整した。
【００２９】系内の温度を制御するために、独立したそ
れぞれのオイルバス１７Ａ、１７Ｂは例えば、９４℃、
６４℃に常時保たれている。
れぞれのオイルバス１７Ａ、１７Ｂは例えば、９４℃、
６４℃に常時保たれている。
【００３０】したがって、９４℃から６４℃にする際に
は、電磁弁制御信号を電磁弁Ｅ１〜Ｅ４に送り、６４℃
の温度制御装置中の流体を循環ポンプ１４によりチャン
バー１１内に循環させる。また、同様に６４℃から９４
℃に加熱する際には９４℃の温度制御装置中の流体をチ
ャンバー１１内に循環させる。いずれも電磁弁Ｅ１〜Ｅ
４の開閉によって電子信号によって循環させ、循環時間
温度切り替え装置１６において設定するものとする。
は、電磁弁制御信号を電磁弁Ｅ１〜Ｅ４に送り、６４℃
の温度制御装置中の流体を循環ポンプ１４によりチャン
バー１１内に循環させる。また、同様に６４℃から９４
℃に加熱する際には９４℃の温度制御装置中の流体をチ
ャンバー１１内に循環させる。いずれも電磁弁Ｅ１〜Ｅ
４の開閉によって電子信号によって循環させ、循環時間
温度切り替え装置１６において設定するものとする。
【００３１】９４℃と６４℃のサイクルを２５回以上繰
り返した後、増幅を目的とする遺伝子断片ｐブルースク
リプトＳＫ＋を含む化合物を回収した。
り返した後、増幅を目的とする遺伝子断片ｐブルースク
リプトＳＫ＋を含む化合物を回収した。
【００３２】本装置と比較するために、市販されている
一般的な遺伝子増幅装置（パーキンエルマー社製：ジー
ンＡｍｐＰＣＲシステム２４００）を用いて同条件で遺
伝子増幅反応を行った。
一般的な遺伝子増幅装置（パーキンエルマー社製：ジー
ンＡｍｐＰＣＲシステム２４００）を用いて同条件で遺
伝子増幅反応を行った。
【００３３】超臨界二酸化炭素中で増幅させた遺伝子を
用いて、アガロースゲル電気泳動をした。得られたアガ
ロースゲル電気泳動図を図２に示した。図２より、一般
的な遺伝子増幅装置である常圧で増幅させた遺伝子断片
ｐブルースクリプトＳＫ＋（Ａ）と同等のラインに、図
１に示している本発明装置を用いて常圧で増幅させた遺
伝子断片ｐブルースクリプトＳＫ＋（Ｂ）本装置での高
圧状態の超臨界二酸化炭素中で増幅させた遺伝子断片ｐ
ブルースクリプトＳＫ＋（Ｃ）のバンドを確認できたこ
とから、本発明による装置で遺伝子断片が増幅できたこ
とが示された。
用いて、アガロースゲル電気泳動をした。得られたアガ
ロースゲル電気泳動図を図２に示した。図２より、一般
的な遺伝子増幅装置である常圧で増幅させた遺伝子断片
ｐブルースクリプトＳＫ＋（Ａ）と同等のラインに、図
１に示している本発明装置を用いて常圧で増幅させた遺
伝子断片ｐブルースクリプトＳＫ＋（Ｂ）本装置での高
圧状態の超臨界二酸化炭素中で増幅させた遺伝子断片ｐ
ブルースクリプトＳＫ＋（Ｃ）のバンドを確認できたこ
とから、本発明による装置で遺伝子断片が増幅できたこ
とが示された。
【００３４】
【発明の効果】本研究によれば、二酸化炭素などの超臨
界流体、亜臨界流体、高圧ガス、液体ならびにそれらと
他の溶媒、ガスなどの化学種の混合流体を反応媒体とし
て使用可能な遺伝子増幅反応であり、独立した温度制御
器で一定に保たれている流体を遺伝子増幅部に循環させ
ることで、温度サイクルをかけて遺伝子を増幅させるこ
とができる。また、安定した温度制御が可能になり、従
来法より大容量の遺伝子増幅に使用可能で、かつ、遺伝
子増幅を使用圧力、温度及び組成の操作により制御する
ことができる。
界流体、亜臨界流体、高圧ガス、液体ならびにそれらと
他の溶媒、ガスなどの化学種の混合流体を反応媒体とし
て使用可能な遺伝子増幅反応であり、独立した温度制御
器で一定に保たれている流体を遺伝子増幅部に循環させ
ることで、温度サイクルをかけて遺伝子を増幅させるこ
とができる。また、安定した温度制御が可能になり、従
来法より大容量の遺伝子増幅に使用可能で、かつ、遺伝
子増幅を使用圧力、温度及び組成の操作により制御する
ことができる。
【図１】２個の温度制御装置を備えたい熱サイクルを利
用した遺伝子増幅装置
用した遺伝子増幅装置
【図２】アガロースゲル電気泳動図（Ａ）通常増幅、
（Ｂ）本装置での増幅
（Ｂ）本装置での増幅
【図３】上記装置において温度制御サイクルを示すグラ
フ
フ
１ ボンベ
２ 乾燥管
３ フィルター
４Ａ 昇圧用ポンプ
４Ｂ 送液ポンプ
５ 圧力計
６ 冷却ユニット（冷却器）
７ 試料瓶
８ 安全弁
９ 逆止弁
１０ 予熱カラム
１１ チャンバー
１２ 耐圧性遺伝子増幅セル
１３ 載置プレート
１４ 循環ポンプ
１５ 温度センサー
１６ 時間温度制御切り替え装置
１７Ａ高温オイルバス
１７Ｂ低温オイルバス
１８ 冷却水
Ｖ１ 圧力調整弁
Ｖ２〜Ｖ６ ストップバルブ
Ｅ１〜Ｅ４ 電磁弁
Claims (2)
- 【請求項１】ＤＮＡ等の核酸配列の増幅を超臨界流体中
でおこなう遺伝子増幅装置であって、二酸化炭素中でＤ
ＮＡを増幅する耐圧反応容器を内部に載置し、その周囲
を温度制御する熱媒体を循環させることで耐圧反応容器
全体を温度制御する。遺伝子増殖用酵素反応を行う温度
域とＤＮＡの対を解離する温度域に耐圧反応容器全体を
温度制御できる装置であり、耐圧反応容器の外部に設け
られた熱媒体溜めを複数設置しており、それらからの温
度の異なる熱媒体を交互に切り替えて耐圧反応容器部に
循環させることを特徴とする遺伝子増幅反応装置。 - 【請求項２】請求項１記載の熱媒体として、シリコンオ
イル、ヒーターブルオイル等の潤滑オイルまたは水等を
用いて温度制御する装置であることを特徴とする請求項
１記載の超臨界流体使用可能な遺伝子増幅装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001341271A JP2003299484A (ja) | 2001-10-01 | 2001-10-01 | 熱サイクルを併用する超臨界二酸化炭素利用型の遺伝子増幅装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001341271A JP2003299484A (ja) | 2001-10-01 | 2001-10-01 | 熱サイクルを併用する超臨界二酸化炭素利用型の遺伝子増幅装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003299484A true JP2003299484A (ja) | 2003-10-21 |
Family
ID=29386613
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001341271A Pending JP2003299484A (ja) | 2001-10-01 | 2001-10-01 | 熱サイクルを併用する超臨界二酸化炭素利用型の遺伝子増幅装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003299484A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2019505228A (ja) * | 2016-06-10 | 2019-02-28 | スター・アレイ・ピーティーイー・リミテッド | 試料分析及び処理のための急速熱サイクル |
-
2001
- 2001-10-01 JP JP2001341271A patent/JP2003299484A/ja active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2019505228A (ja) * | 2016-06-10 | 2019-02-28 | スター・アレイ・ピーティーイー・リミテッド | 試料分析及び処理のための急速熱サイクル |
| CN109562385A (zh) * | 2016-06-10 | 2019-04-02 | 星阵私人有限公司 | 用于样品分析与处理的快速热循环 |
| CN109562384A (zh) * | 2016-06-10 | 2019-04-02 | 星阵私人有限公司 | 用于样品分析与处理的快速热循环 |
| CN109562383A (zh) * | 2016-06-10 | 2019-04-02 | 星阵私人有限公司 | 用于样品分析与处理的快速热循环 |
| CN109641212A (zh) * | 2016-06-10 | 2019-04-16 | 星阵私人有限公司 | 用于样品分析与处理的快速热循环 |
| CN109641212B (zh) * | 2016-06-10 | 2021-05-04 | 星阵私人有限公司 | 用于样品分析与处理的快速热循环 |
| CN109562384B (zh) * | 2016-06-10 | 2021-09-28 | 星阵私人有限公司 | 用于样品分析与处理的快速热循环 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4357962B2 (ja) | 熱対流を利用した核酸配列増幅方法及び装置 | |
| US8334117B2 (en) | Temperature control device with a flexible temperature control surface | |
| JP3899360B2 (ja) | Ｄｎａ増幅装置 | |
| JP4758891B2 (ja) | 微小流体デバイス上の加熱、冷却および熱サイクリングのためのシステムおよび方法 | |
| JP2002522065A (ja) | 核酸ハイブリダイズ用熱及び流体循環装置 | |
| US20170114380A1 (en) | Systems and methods for the amplification of dna | |
| JP2009148232A (ja) | 核酸増幅装置 | |
| KR20100070977A (ko) | 일회용 멀티플렉스 중합효소 연쇄 반응(ｐｃｒ)용 칩 및 장치 | |
| WO2010047619A1 (ru) | Способ определения нуклеиновых кислот методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени и устройство для его осуществления | |
| JP3851672B2 (ja) | Ｄｎａ増幅装置 | |
| HU204080B (en) | Equipment and process for multiplying nucleic acids | |
| JP2003299484A (ja) | 熱サイクルを併用する超臨界二酸化炭素利用型の遺伝子増幅装置 | |
| US20090275034A1 (en) | Temperature control system | |
| JP4756880B2 (ja) | Ｐｃｒ反応液の温度制御装置 | |
| JP3120466B2 (ja) | デオキシリボ核酸の増幅装置及び増幅方法 | |
| CN112175816A (zh) | 一种试剂控温的核酸测序系统 | |
| KR100492285B1 (ko) | 중합효소 연쇄반응 기계 | |
| CN210367711U (zh) | 一种试剂控温的核酸测序系统 | |
| CN218539695U (zh) | 一种快速pcr核酸检测控温装置 | |
| CN219032195U (zh) | 流体预控温设备及核酸检测控温系统 | |
| JP4097523B2 (ja) | 遺伝子の増幅方法 | |
| US20210299668A1 (en) | Sequencing system with preheating | |
| US20230131184A1 (en) | Intermittent warming of a biologic sample including a nucleic acid | |
| EP4162998A1 (en) | Evaporator | |
| JP2524901Y2 (ja) | 遺伝子増幅装置 |