JP6797205B2 - 試料分析及び処理のための急速熱サイクル - Google Patents

Description

本発明は、試料中の核酸の増幅反応を行うための方法及び装置に関する。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、分子生物学、食品安全及び環境モニタリングにとってますます重要になっている。多くの生物学研究者らが、その高い感度及び特異性のために、核酸分析に関する研究においてＰＣＲを使用している。ＰＣＲの時間サイクルは、主に、ＤＮＡ変性、アニーリング及び伸長のために試料を含む反応器を異なる温度に加熱及び冷却するのに適合した時間のかかるＰＣＲ熱サイクルプロセスのために、典型的には約１時間である。典型的には、熱サイクル装置及び方法は、その温度を核酸増幅反応に必要とされる目標温度に設定した２つの加熱槽（ｂａｔｈ）の間で反応器を移動させることを使用する。研究者らは、熱サイクルの速度を上げるために常に努力してきた。

熱電クーラー（ＴＥＣ）又はペルチェ式クーラーもまた、加熱／冷却素子として使用される。しかしながら、それは、反応器の温度を変化させるのにかなり遅い１〜５℃／秒の典型的な勾配率を提供し、不利なことに熱サイクルの時間を増加させる。

熱質量を減少させることによってＰＣＲ速度を増加させる試みとして、埋め込まれた薄膜ヒーター及びセンサを有する微細加工されたＰＣＲ反応器が開発され、７４℃／秒の冷却速度及び約６０〜９０℃／秒の加熱速度でより速い熱サイクルを達成した。しかしながら、ＰＣＲ装置を製造するためのそのようなウエハ製造プロセスは非常に高価であり、従って、生物学的試験における低コストの使い捨て用途の要件を満たすには実用的ではない。

ＴＥＣベースの熱サイクラーよりも高い温度勾配を達成するために、閉鎖チャンバー内で反応器を交互にフラッシュする熱空気と冷空気が記述されている。しかしながら、熱伝達の観点から、空気は液体よりも熱伝導率及び熱容量がはるかに小さいため、空気サイクラーの温度勾配は液体の温度勾配よりも遅い。ＴＥＣは、それ自体及びＴＥＣ上部のヒートブロックを加熱及び冷却するのにかなりの時間を必要とする。さらに、ヒートブロックと反応器との間の接触熱抵抗を克服する必要もある。

２つの異なる温度の水が反応器を交互にフラッシュしてＰＣＲ速度を達成する交互水洗サイクラーも開発された。しかしながら、このような装置は、メンテナンスの複雑さを増大させて信頼性を低下させ、同時に高温及び高圧を取り扱う、多くのポンプ、バルブ、及びチューブ式コネクタを含む。循環液体槽媒体とともに、液体は一般に槽から流出する。

従来の水槽ＰＣＲサイクラーは、効率的な温度加熱及び冷却を達成するために、水の高い熱伝導率及び熱容量を利用する。しかしながら、このようなサイクラーは、充填及び処分の管理が困難である大量の水を含む大型の加熱槽を有しており、また、熱サイクルが開始できるようになる前の目標温度への加熱時間を非常に長くする。このようなサイクラーはまた、大きな装置重量及び高い電力消費を有する。水は使用に伴って気化する傾向があり、補充する必要がある。さらに、熱サイクルの間、反応器が槽内に交互に挿入される度に、各槽から取り出す際に反応器本体に水の層が付着した状態で残り、それにより、反応器内部の温度変化が望ましくないことに遅くなる。

研究者らはまた、異なる温度の加熱ローラーを移動させて交互に反応器と接触させる試験を行った。しかしながら、長いチューブ式反応器の使用は、大量の反応器のアレイを設置及び操作するのを面倒にするだけでなく、費用がかかる。反応器が大量のアレイ又はパネルにある場合、全ての反応器の間で加熱の均一性を達成することは困難であり得る。

本発明は、複雑で高価な部品又は消耗品を使用することなく、手頃なコストにおいて超高速でＰＣＲを可能にする改善された方法及び装置を提供する。本装置は、頑丈で軽量で使い易く、槽内で少量の槽媒体を必要とし、１つの反応器から次の反応器への相互汚染を回避するために反応物質用の使い捨て反応器を取り扱うことができる。本発明は、生物学的分析に非常に有益な効果を提供する。

別段の指定がない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」並びにその文法的変形は、それらが列挙された要素を含むだけでなく、追加の列挙されていない要素を含むことを可能にするような、「開かれた」又は「包括的な」言語を表すことを意図している。用語「実質的に」は、完全には排除しない。用語「第１の槽」、「第２の槽」・・・「第６の槽」は、順番に対応する槽の数を構成するのではなく、単にそれらが果たす目的に関して識別を容易にするための名前である。これらの槽は、それらの幾つかは共有し得るため、別個の物理的存在を表さないことがある。用語「熱処理」は、ａ）熱サイクルを含み、場合によっては、ｂ）熱サイクルの前及び／又は後の熱処理ステップを含む。用語「熱プロファイル」は、ａ）のみの間、又はｂ）を伴うａ）の間の反応器の温度−時間変化を指す。

第１の態様によれば、熱プロファイルにおいて核酸を熱処理するための方法が提供され、本方法は、第１の槽及び第２の槽であって、槽内の槽媒体はそれぞれ、２つの異なる温度で維持可能である、第１の槽及び第２の槽を少なくとも使用し、本方法はさらに、それぞれが核酸を含む反応物質を収容する反応器を保持するための反応器ホルダと、チューブ又はウェルプレート又はチップ又はカートリッジなどの任意の形態である反応器とを使用し、本方法は、複数の熱サイクルで反応器を２つの槽内に交互に配置して、所定の高い目標温度Ｔ_ＨＴと所定の低い目標温度Ｔ_ＬＴとに交互に到達することを可能にするステップを含み、ここで、槽の少なくとも１つにおける槽媒体は、高熱伝導性粉末である。液体槽媒体に対して、高熱伝導性粉末は、反応器への伝導熱伝達を向上させ、槽内の温度場を均質化し、反応器に沿った温度均一性を改善する。槽の所定の温度への初期加熱時間もまた、著しく減少する。粉末はまた、反応器が槽間を移動する際に、それにより槽の温度及びその較正における望ましくない変動を引き起こす、反応器の表面への液体付着の問題を排除する。このような液体付着はまた、望ましくないことに、槽から取り出された後でさえも反応器が持続して槽温を保持する原因となる。これは、粉末によって回避することができる。反応器が液体槽媒体中に挿入される際の望ましくない飛散は、粉末によって顕著に低減される。さらに、粉末は時間や使用に伴って気化せず、それにより、液体の場合のように詰め替えを必要としない。

有利な実施形態によれば、本方法は、第１の槽において、反応器がＴ_ＨＴに到達することを可能にするステップであって、Ｔ_ＨＴは、核酸の予備変性及び変性のために８５〜９９℃の領域にある、ステップと、第２の槽において、反応器がＴ_ＬＴに到達することを可能にするステップであって、Ｔ_ＬＴは、核酸上へのプライマー又はプローブのアニーリング又はプライマー伸長のために４５〜７５℃の領域にある、ステップとを含み、第１及び第２の槽は、反応器を熱サイクルしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の増幅又はプライマー伸長を達成するためのものである。

有利な実施形態によれば、本方法はさらに、第３の槽を使用し、この方法は、熱サイクルの間、第３の槽内の槽媒体を中温で維持するステップと、反応器を第３の槽内に配置し、核酸中でのプライマーの伸長又は核酸上へのプライマー又はプローブのアニーリングに対応する所定の中間目標温度Ｔ_ＭＴに到達することを可能にするステップとを含む。本方法はさらに、第４の槽を使用することができ、この方法は、熱サイクル前に反応器を第４の槽内に配置し、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ホットスタートプロセス、及び等温増幅反応からなる群からの反応器に対する追加プロセスを可能にするステップを含む。第３及び／又は第４の槽は、有利には、反応物質のタイプ及び分析プロセスに応じて、様々な熱プロファイルを達成する柔軟性を可能にする。第３及び第４の槽内の槽媒体はまた、第１の態様下で説明した利点のために、高熱伝導性粉末であってもよい。本方法はまた、熱サイクルの間、反応器を空気ゾーン内に配置して、核酸の蛍光画像化又は電気化学的検出を行うことを可能にするステップを含むことができる。空気ゾーンは、粉末を有する槽によって提供されない、光画像化プロセスのための透明媒体を提供する。代替実施形態では、本方法は、照明光源から反応物質への光伝送のために第１の光ファイバ手段を使用するステップと、反応物質から光検出器への光伝送のために第２の光ファイバ手段を使用するステップとを含む。この特徴は、反応器が金属チューブからなる場合、及び反応器が粉末内にある際に画像化を行う必要がある場合に、特に有用である。

高熱伝導性粉末は、金属粉末、又は油又はグリセロール又は水又はそれらの任意の混合物などの液体中に分散された金属粉末であってもよいが、なぜなら、それは粉末中の微粒子間の空隙を埋め、液体は空気よりもはるかに高い熱伝導率及び熱容量を有するからである。液体はまた、槽から取り出された際に反応器の表面に付着している油／グリセロールを犠牲にしても、反応器を受け入れる間の摩擦抵抗を減少させる。粉末は、反応器を受け入れる間の摩擦抵抗を減少させるために、実質的に球形の金属粒子を含むことができる。粉末は、有利には、１μｍ〜５ｍｍの範囲の粒径の銅粉末であることができる。銅粉末は、非常に高い熱伝導率を有すると知られており、記載された粒径では、０．１ｍｍ〜５ｍｍの直径を有する市販の反応器において摩擦抵抗が低いことが分かっている。槽内の粒径は、反応器の挿入のし易さと熱伝達率との間で最適化されるように変化してもよい。

一実施形態によれば、本方法は、チューブ又はウェルプレートの形態である場合に、粉末が反応器を受け入れている間の摩擦抵抗を減少させるために、反応器の底部先端にある金属層と、反応器の残りの部分よりも小さい断面積を有してよりシャープである反応器の底部先端とからなる群からの少なくとも１つの特徴を有する反応器を使用するステップを含む。

一実施形態によれば、本方法は、熱サイクルの後に、反応器を第５の槽内で徐々に加熱させるステップと、熱サイクル後の後続の研究のために、徐々に加熱しながら融解曲線分析を行うステップとをさらに含む。

有利には、本方法は、反応器が粉末内に受け入れられている際の抵抗力及びＴ_ＨＴ下での反応器の変形又は破壊を防止するために、反応器を部分的に閉じ込める反応器ガードを使用するステップを含むことができる。金属粉末のコンパクト性が高いほど、望ましくは熱伝達率が高くなるが、犠牲として抵抗が増加する。

一実施形態によれば、本方法は、熱サイクル中に反応器温度センサによって感知されたリアルタイム温度に基づいて動作可能な温度誘導作動制御手段（ＴｅＧＭＣＭ；ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｇｕｉｄｅｄ ｍｏｔｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｍｅａｎｓ）によって目標温度を達成するステップをさらに含む。本方法は、精度の高い熱サイクルを提供し、ユーザーの較正を必要としないが、非常に高速な温度サンプリング及び信号処理エレクトロニクス、反応器移送機構との高速データ通信、及び反応器移送機構内のモーターやアクチュエーターなどの非常に応答性の高い機械的動作部品の要件のために、装置の費用及び複雑性が高い。代替実施形態では、本方法は、反応器が槽内に配置される時間周期に基づいて動作可能な時間誘導作動制御手段（ＴｉＧＭＣＭ；ｔｉｍｅ ｇｕｉｄｅｄ ｍｏｔｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｍｅａｎｓ）によって目標温度を達成するステップをさらに含む。本方法は、時間周期に対してＴｉＧＭＣＭを較正するステップをさらに含むことができる。この実施形態は、装置が持続時間に応じて動作するので、装置のより低い複雑さを必要とし、従って、ユーザーの較正を必要とするが、応答性の高い設備を必要としない。本方法は、反応器の過熱又は過冷却を不必要に引き起こす動作上の電気機械的遅れを相殺するために、反応器がＴ_ＨＴよりも低い第１のリフトオフ温度及びＴ_ＬＴよりも高い第２のリフトオフ温度に到達する場合に反応器の槽からのリフトオフを開始するように、移送手段を較正するステップをさらに含むことができる。

第２の態様によれば、方法の請求項に対応する装置の請求項が提供される。本装置は、槽内に反応器を挿入する間に、槽、反応器、及びａ）及びｂ）の両方からなる群からの少なくとも１つを振動させるための振動手段をさらに含んでもよく、従って、加熱されている反応器部分の長さは変化しないが、反応器の粉末内への挿入抵抗が低減される。

第３の態様によれば、反応器ガードは、高熱伝導性粉末を含む槽媒体内に反応器が受け入れられている際の抵抗力及びＴ_ＨＴ下での反応器の変形を防止するために、反応器を部分的に閉じ込める閉じ込め手段を含んで提供される。ガードは、粉末を容易に貫通して反応器が粉末槽内に受け入れられるための道をあけるように十分な強度を有する金属又はガラス又は高温プラスチック又はセラミックを含む材料で構成することができる。反応器ガードは、複雑さの少ない利便性のために、反応器ホルダの延長部であってもよい。

第４の態様によれば、反応器は、チューブ又はウェルプレートの形態である場合に、高熱伝導性粉末が反応器を受け入れる間の摩擦抵抗を減少させるために、反応器の底部先端にある金属層と、反応器の残りの部分よりも小さい断面積を有してよりシャープである反応器の底部先端とからなる群からの少なくとも１つの特徴とともに提供される。

本発明はまた、ＰＣＲをベースとする核酸分析のプロセス全体を、槽の加熱準備から反応器の熱サイクル及び蛍光シグナルの取得まで数分の非常に短い時間で完了させることを可能にする。

以下の図面では、同じ参照番号は通常、全体を通して同じ部分を指す。図面は縮尺通りではなく、代わりに概念を説明することに重点が置かれている。

本発明の一実施形態による、槽媒体として銅粉末を使用する核酸を含む反応物質の熱サイクルのための設備の概略図である。 図１における熱サイクルのプロセスのための装置の一実施形態の等角図である。 図２における装置の光学モジュールを有する反応器アレイ及び槽の一実施形態の等角図である。 融解曲線分析を伴う典型的な２ステップＰＣＲプロセスの例示的なグラフ表示である。 融解曲線分析を伴う典型的な３ステップＰＣＲプロセスの例示的なグラフ表示である。 本発明の一実施形態による、反応器ホルダによって保持され、その底面先端が金属層によって被覆されている、チューブ状反応器のアレイの断面図である。 反応器ガード内に部分的に閉じ込められたチューブ状反応器のアレイの断面図である。 反応器ガード及び反応器ホルダを伴う、図６の１つの反応器の上面図である。 粉体槽媒体とともに使用するためのバイオチップに収容されている反応器の透視図である。 粉体槽媒体とともに使用するためのバイオチップに収容されている反応器の透視図である。 一実施形態による、粉末槽媒体に特に適した不透明チューブ状反応器を有する照明及び蛍光発光検出モジュールを示す断面図である。 一実施形態による、粉末槽を有する照明及び蛍光発光検出モジュールを示す側面図である。

以下の説明は、当業者が本発明を作製し使用できるように、本発明の幾つかの好ましい実施形態を十分に詳細に提示する。

図１は、核酸又は核酸の断片を増幅するためのＰＣＲ又は他の酵素反応のための熱サイクル装置の一部の一実施形態の概略図を示す。本装置は、槽媒体７５として銅粉末を含む２つの槽５０及び５１を有する。各槽５０又は５１は、槽媒体７５の温度を制御することができるように、槽表面に沿って取り付けられた槽ヒーター１７及び槽温センサ３９を有する。別の実施形態によれば、槽温センサ３９を槽５０、５１の内部に配置することができる。槽５０は変性のステップに適した温度に設定され、槽５１はアニーリング及び／又は伸長のステップに適した温度に設定される。クーラー１６は、槽５１を室温未満に積極的に冷却する必要がある場合に有用である。銅粉末槽媒体７５は、液体槽媒体で達成できるよりもより速くより正確な反応器１５の温度の上昇及び下降を可能にする。幾つかの実施形態では、槽５１を加熱する必要がない場合、低温槽５１上の槽ヒーター１７は任意である。熱サイクルのために、反応器１５は、槽５０、５１の間で複数回交互に移送される。反応器１５の槽媒体７５内への高速押し込みを可能にするために、ガラスキャピラリーなどの細い反応器１５が好ましい。反応器１５はシーラント又はキャップ７７で密閉されており、反応器１５の一部は透明であり、反応器が銅粉末槽媒体７５内にない場合に、色素又はプローブの励起及び蛍光画像化のための光の通過を可能にする。温度監視ユニット３４は、反応器ホルダ３３上に取り付けられており、反応器１５とともに槽５０、５１間を移動する。温度監視ユニット３４は、内部に高速応答温度センサ３８を含む。温度監視ユニット３４は、反応器１５と同様の形状を有し、反応器１５と同様又は同一の定常状態及び過渡的な熱特性を有するように構成されており、温度読取り及び熱応答についても、別の反応器１５自体がその目的のために使用されない限り、反応器１５と同様又は同一である。例えば、温度監視ユニット３４は、水又は油又は水の上の油の層２２内に挿入され密閉された、高速応答温度センサ３８を有することができる。１つの反応器１５のみが示されているが、他の実施形態によれば、反応器ホルダ３３は、複数の反応器１５を収容することができる。反応器１５は、図示のようなチューブ状形態であってもよいし、ウェルプレート又はチップ又はカートリッジの形態であってもよい。反応器移送機構８５は、反応器１５及び温度監視ユニット３４を槽５０及び５１の間で高速で移送し、熱サイクルで必要とされる槽５０及び５１内の異なる温度にそれらを交互に曝す。反応器移送機構８５には、多くの可能な設計がある。そのような機構の１つは、反応器１５及び温度監視ユニット３４を槽５０及び５１の上部の領域に到達させるためのＸ軸線形ガイド８７に沿って移動するＸステージ８６と、反応器１５を下方に移動させて槽媒体７５に入れるか又は槽媒体７５から引き抜くためのＺ軸線形ガイド８９に沿って移動するＺステージ８８とから構成される。このような移送機構８５はまた、Ｚ軸線形ガイド８９に沿って移動するＺステージ８８とともに、反応器１５及び温度監視ユニット３４を角度方向に移動させる回転アーム（図示せず）から構成することもできる。反応器１５は、反応物質２１を充填及び内部から回収するための開口部を有し、その開口部は密閉可能である。シーラント７７は、熱サイクル中に固相であるシリコーンゴム又はＵＶ硬化ポリマー、ホットメルト及び／又はワックス及び／又はゲルで作製することができる。密閉はまた、油、粘性ポリマー、及びゲルなどの液体を使用して達成することもできる。高粘性の液体は、反応器１５の開口部及び／又は上部分に適用することができ、反応物質２１から発生した蒸気の漏出を阻止することができる。

熱サイクルの別の実施形態（図示せず）では、槽５０と５１との間に、温度監視ユニット３４を有する反応器１５を、中間目標温度である槽媒体を含む第３の槽に挿入するか、又は、アニーリング及び／又は伸長に必要とされる時間、熱空気内に配置することができる。ここで、熱サイクルは、各熱サイクル内で３つの槽内に反応器１５を挿入することによって、３ステップで行われる。

さらなる別の実施形態（図示せず）によれば、第４の槽を所定の温度Ｔ_ＡＰに維持し、熱サイクルの前に、温度監視ユニット３４を有する反応器１５を第４の槽に挿入し、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）及び等温増幅反応からなる群からの少なくとも１つの追加プロセスを可能にする。ＲＴ−ＰＣＲは、核酸増幅のための熱サイクルの前に行われる。

反応器１５を対応する目標温度に到達するまで槽５０〜５４内に滞留させる装置では、反応器１５によって得られる所定の目標温度のより良い精度を維持するために、好ましくは温度誘導作動制御手段（ＴｅＧＭＣＭ）（図示せず）が使用され得る。反応器１５の過熱又は過冷却を回避するために、反応器１５が温度監視ユニット３４によって感知されるように目標温度にまさに到達しようとしている際に、ＴｅＧＭＣＭに事前信号が提供され得る。本方法を有する熱サイクルは、より高い精度を提供し、ユーザーの較正を必要としないが、非常に高速な温度サンプリング及び信号処理エレクトロニクス、反応器移送機構との高速データ通信、及び反応器移送機構内のモーターやアクチュエーターなどの非常に応答性の高い機械的動作部品の要件のために、装置の費用及び複雑性が高い。代わりに、反応器が槽内に配置される時間周期に基づいて動作可能な時間誘導作動制御手段（ＴｉＧＭＣＭ）が使用されてもよい。ＴｉＧＭＣＭは、時間周期に対してユーザーが較正することができる。この実施形態は、装置が持続時間に応じて動作するので、装置のより低い複雑さを必要とし、従って、ユーザーの較正を必要とするが、応答性の高い設備を必要としない。

図２は、反応器移送機構８５、槽モジュール２０４、光学モジュール２０６、２０５、２０７及び２０８を有する装置の等角図を示す。槽モジュール２０４は、互いに隣接して配置されてそれぞれが所定の温度に維持される、５つの槽５０、５１、５２、５３、５４を備えるように示されている。光学モジュール２０６は、この実施形態において反応器１５が槽媒体７５として空気又は透明液体を有する低い目標温度槽５１内に配置されている際に、反応器１５の内部で核酸の蛍光検出を行う。温度制御モジュール２０５は槽温を制御する。作動制御モジュール２０７は全ての作動を制御し、システム制御モジュール２０８は、データ通信及び処理、画像処理及びデータ分析を用いてシステムを制御する。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ホットスタートプロセス及び等温増幅反応などの追加プロセスもまた、熱サイクルのための槽の何れかで行うことができ、それを、熱サイクル前に所望の温度に設定し、上記の追加プロセスの完了後に熱サイクルのための温度に再設定することができる。

図３は、槽モジュール２０４及び光学モジュール２０６の拡大図を示す。光学モジュール２０６は、照明器４４及び蛍光検出器４３を含む。入射ビーム４６が反応器１５内の反応物質２１に到達する。反応物質２１からの反射ビーム４７がその後捕捉される。温度監視ユニット３４を有する反応器１５のアレイは、槽５０〜５４の間で移送される。この実施形態では、槽５１は、反応器１５への照射光及び反応器１５からの放出光を通過させる底部の透明な窓２５とともに、槽媒体７５として空気又は透明液体を有する。槽ヒーター１７又はクーラー１６は、槽の側壁に接続されている。本装置はさらに、特に画像化の間に反応器１５を配置するための熱空気ゾーン（図示せず）を含んでもよい。これは、装置を単純化する。本方法は、槽の上部又は槽の内部に熱空気ゾーンを形成するために、電気ヒーター又は赤外ヒーターを使用してもよい。ヒーターは、反応器ホルダ３３に取り付けられることができ、従って、反応器１５が槽間を移動する間に反応器１５の周辺の空気のみが加熱される。この特徴は、エネルギーを節約し、装置の他の部分が望ましくなく加熱されることを防ぐ。

図４ａ及び４ｂは、（ＰＣＲ、プライマー伸長などのための）典型的な２ステップ及び３ステップ熱サイクルプロセスと、それに続く融解曲線分析との、例示的な時間−温度グラフ表示である。図４ａでは、２つの槽を使用した温度Ｔ_ＨＴでの変性及び温度Ｔ_ＬＴでのアニーリングのプロセスに関して、３サイクルのみが示されており、図４ｂでは、３つの槽を使用して温度Ｔ_ＭＴでの伸長のための追加ステップを有して、３サイクルのみが示されている。熱サイクルの後、反応器１５は、少なくとも部分的に透明な槽媒体内に配置され、それが徐々に加熱されながら、融解曲線分析が行われる。反応器１５からの蛍光シグナルは、複数の温度で取得され、融解曲線分析のための蛍光−温度曲線を形成する。

図５は、本発明の一実施形態による、反応器ホルダ３３によって保持され、その底面先端が金属層５によって被覆されている、チューブ状反応器１５のアレイの断面図である。少なくとも１つの槽内の槽媒体７５が金属粉末である場合、反応器１５の金属粉末内への挿入能力を高めるために、反応器１５は底部先端に金属層５を備え、底部先端は、反応器１５の残りの部分よりも小さい断面積を有してよりシャープである。

図６は、任意に使用され得る反応器ガード７内に部分的に閉じ込められたチューブ状反応器１５のアレイの断面図である。反応器ガード７は、反応器１５が粉末槽媒体７５内に挿入されている際の、抵抗力及びＴ_ＨＴ下でのプラスチック反応器１５の変形又は抵抗力下でのガラス反応器１５の破壊を防止するために、物理的支援を提供する。典型的に、このような力は、反応器１５が粉末槽媒体７５内に挿入されている場合、反応器先端で最大になる。反応器ガード７は、金属又はガラス又は高温プラスチック又はセラミックを含む材料から構成され得る。図７は、反応器ガード７及び反応器ホルダ３３を伴う１つの反応器１５の上面図を示す。図示のように、反応器ガード７は反応器１５のごく一部のみを被覆するため、蛍光画像化を妨害しない。

図８（ａ）は、チャネル３１５を有しない、ウェルの形態である反応器１５のみからなるバイオチップ３１である。反応物質２１は、反応器１５の開口部から分配され、カバー又は密閉流体３０によって密閉される。そして、バイオチップ３１は反応器ホルダ３３上に取り付けられる。図８ｂは、槽とともに使用するためのバイオチップ３１に収容されている反応器１５の透視図である。ここで、バイオチップ３１内には複数の反応器１５が配置されている。バイオチップ３１の端部は、高Ｔ_ＨＴ及び粉末槽媒体７５とともに使用する際に剛性を保持する材料（図示せず）を有して配置されてもよい。チャネル３１５のネットワークを介して反応器１５と流体連通する少なくとも１つの入口３１３がある。試験されるべき反応物質２１は、続いて反応器１５内に流入する入口３１５内に充填することができる。粉末槽媒体７５の内部で移動するためである。

図９は、反応器１５が槽媒体７５としての金属粉末に適した金属チューブで作製されている一実施形態を示す。蛍光画像化のために、光ファイバ３０９は、ＬＥＤなどの照明光源（図示せず）からの光を反応器１５内の反応物質２１に伝送する。光ファイバ３１０は、反応物質２１から光検出器（図示せず）への光伝送のためのものである。シーラント又はキャップ７７は、光ファイバ３０９、３１０を保持する。これにより、不透明な反応器１５に対する光検出が容易になる。

図１０は、一実施形態による、不透明な粉末槽媒体７５を有する照明及び蛍光発光検出モジュール２０６を示す側面図である。光学モジュール２０６は、照明器４４、蛍光検出器４３、光学フィルタ８１及びダイクロイックミラー８２を含み、入射ビーム４６を生成して反応器１５内の反応物質２１に到達させ、その後、反応物質２１からの反射ビーム４７を捕捉する。画像化機構は、光学配置から明らかである。反応器１５が槽媒体７５の内部にある間の反応器１５の蛍光画像化は重要であるが、なぜなら、反応器１５は、多重検出のため又は対照遺伝子の蛍光画像を取得するために異なる波長の複数の画像を撮る場合に、長時間にわたってアニーリング又は伸長温度に維持しなければならないことがあるからである。反応器キャップ３２は、画像化のために光透過性である。

異なる槽は、所望の特定の利点のために異なる槽媒体７５を含むことができる。反応器１５は、プラスチック、エラストマー、ガラス、金属、セラミック及びそれらの組み合わせから構成されてもよく、ここでプラスチックは、ポリプロピレン及びポリカーボネートを含む。ガラス反応器１５は、０．１ｍｍ〜３ｍｍのＯＤ及び０．０２ｍｍ〜２ｍｍのＩＤのような小さい直径のガラスキャピラリーの形態で作製することができ、金属は、薄膜、細い空洞、及びキャピラリーの形態のアルミニウムであり得る。反応器の材料は、化学的又は生物学的安定性を有する非生物活性物質から作製することができる。反応器１５の少なくとも一部は透明であることが好ましい。別の実施形態では、反応器１５は、反応器アレイチップ又はマイクロ流体反応器チップ又はアレイチップの形態であり得る。例えば、反応器１５は、基板プレートのウェル又はチャネルの形態であってもよく、場合によっては、固体材料層で覆われて反応流体又は反応系が配置された閉鎖反応チャンバーを形成してもよい。反応器ホルダ３３における全ての反応器１５内の反応物質２１は同一でなくてもよい。槽温が適切である場合、異なる物質２１に対して同時ＰＣＲを有利に行うことができる。反応器壁の少なくとも一部は、厚さ１μｍ〜２ｍｍの金属シートで作製することができる。この特徴は、槽と反応物質２１との間の熱伝達率を高める。反応器壁の少なくとも一部は、厚さ０．５μｍ〜５００μｍのプラスチック又はガラスシートで作製することができる。反応器壁の少なくとも一部は、画像化及び検出プロセスを可能にするように透明材料で作製される。上記の核酸分析及び処理のための装置を使用する場合、反応物質２１には、少なくとも１つの酵素、核酸及び／又は少なくとも１つの核酸を含む粒子を含む反応成分、ＰＣＲのためのプライマー、等温増幅のためのプライマー、他の核酸の増幅及び処理のためのプライマー、ｄＮＴＰ、Ｍｇ^２＋、蛍光色素及びプローブ、コントロールＤＮＡ、コントロールＲＮＡ、コントロール細胞、コントロール微生物、及び核酸の増幅、処理、及び分析に必要とされる他の試薬が含まれる。上記の核酸を含む粒子は、少なくとも１つの細胞ウイルス、白血球細胞及び間質細胞、循環腫瘍細胞、胚細胞を含む。１つの用途は、複数の試料を試験するなど、同じセットのプライマー及びプローブに対して異なる種類の反応物質２１を試験するために本装置を使用することであってもよい。このような用途のために、標的プライマー及び／又はプローブを含まない異なる種類の反応物質２１が、反応器アレイ内の１つの反応器１５にそれぞれ充填されるが、ここで、全ての反応器１５には１つ又は複数の同じセットのＰＣＲプライマー及び／又はプローブが予め充填されている。同じ用途のために、それぞれのＰＣＲ標的プライマー及び／又はプローブと予め混合された異なる種類の反応物質２１が、反応器アレイ内の１つの反応器１５にそれぞれ充填され、ここで、全ての反応器１５には同じセットのＰＣＲプライマー及び／又はプローブが予め充填されていない。反応物質２１は、制御遺伝子及び／又は細胞及び対応する蛍光色素又はプローブを含むことができる。上記の状況では、異なるプローブは異なる波長の光を発する。本方法及び装置の別の用途は、異なるセットのプライマー及びプローブに対して同じ反応物質２１を試験するために使用される。このような用途の１つの例は、１つのタイプの試料を複数の目的のために試験することである。この用途のために、少なくとも１つの異なるセットのＰＣＲプライマー及び／又はプローブがそれぞれ充填された反応器１５に、単一の反応物質２１が添加される。反応物質２１は、制御遺伝子及び／又は細胞及び対応する蛍光色素又はプローブを含むことができる。上記の状況では、異なるプローブは異なる波長の光を発する。上記の反応物質２１は、ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ＰＣＲ、エンドポイントＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応、核酸シーケンシングの前増幅又は標的富化、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のバリエーション、等温増幅、線形増幅、シーケンシングのためのライブラリー調製物、シーケンシングに使用されるブリッジ増幅において使用される。上記のポリメラーゼ連鎖反応のバリエーションは、逆転写ＰＣＲ、リアルタイム蛍光定量的ポリメラーゼ連鎖増幅反応及びリアルタイム蛍光定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖増幅反応、逆ポリメラーゼ連鎖増幅反応、固定ポリメラーゼ連鎖増幅反応、非対称ポリメラーゼ連鎖増幅反応、マルチプレックスＰＣＲ、色相補性ポリメラーゼ連鎖増幅反応、免疫ポリメラーゼ連鎖増幅反応、ネステッドポリメラーゼ連鎖増幅反応、前増幅又は核酸シーケンシングの標的富化、ＥＬＩＳＡ−ＰＣＲを含む。

前述の説明から、特許請求の範囲に定義された本発明から逸脱することなく、設計、構成及び動作の詳細の多くの変形又は修正がなされ得ることが、当業者に理解されるであろう。

５ 金属層
７ 反応器ガード
１５ 反応器
１６ クーラー
１７ 槽ヒーター
２１ 反応物質
２２ 水又は油又は水の上の油の層
２５ 透明な窓
３０ 密閉流体
３１ バイオチップ
３２ 反応器キャップ
３３ 反応器ホルダ
３４ 温度監視ユニット
３８ 高速応答温度センサ
３９ 槽温センサ
４３ 蛍光検出器
４４ 照明器
４６ 入射ビーム
４７ 反射ビーム
５０ 槽
５１ 槽
５２ 槽
５３ 槽
５４ 槽
７５ 槽媒体
７７ シーラント又はキャップ
８１ 光学フィルタ
８２ ダイクロイックミラー
８５ 反応器移送機構
８６ Ｘステージ
８７ Ｘ軸線形ガイド
８８ Ｚステージ
８９ Ｚ軸線形ガイド
２０４ 槽モジュール
２０５ 温度制御モジュール
２０６ 光学モジュール
２０７ 作動制御モジュール
２０８ システム制御モジュール
３０９ 光ファイバ
３１０ 光ファイバ
３１３ 入口
３１５ チャネル

Claims (37)

1. 熱プロファイルを用いて核酸を熱処理する方法であって、前記方法は、少なくとも第１の槽及び第２の槽を使用し、前記方法はさらに、核酸を含む反応物質を収容する反応器を保持する反応器ホルダと、チューブ又はウェルプレート又はチップ又はカートリッジなどの任意の形態である反応器とを使用し、前記方法は、
   槽内の槽媒体を２つの異なる温度で維持するステップと、
   複数の熱サイクルで前記反応器を２つの前記槽内に交互に配置して、
   −所定の高い目標温度Ｔ_ＨＴと、
   −所定の低い目標温度Ｔ_ＬＴと
   に交互に到達することを可能にするステップと
   を含み、
   前記槽の少なくとも１つにおける槽媒体は、高熱伝導性粉末であり、
   前記高熱伝導性粉末は、金属粉末又は液体中に分散された金属粉末である、方法。
2. 核酸の変性のために、Ｔ_ＨＴを８５〜９９℃の領域に維持するステップと、
   核酸上へのプライマー又はプローブのアニーリング又はプライマー伸長のために、Ｔ_ＬＴを４５〜７５℃の領域に維持するステップと
   をさらに含み、
   前記第１及び第２の槽は、前記反応器を熱サイクルしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の増幅又はプライマー伸長を達成するためのものである、請求項１に記載の方法。
3. さらに第３の槽を使用し、前記方法は、前記反応器を前記第３の槽内に配置し、核酸中でのプライマーの伸長又は核酸上へのプライマー又はプローブのアニーリングに対応する所定の中間目標温度Ｔ_ＭＴに到達することを可能にするステップを含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記第３の槽内の槽媒体は、高熱伝導性粉末又は空気である、請求項３に記載の方法。
5. さらに第４の槽を使用し、前記方法は、熱サイクル前に前記反応器を前記第４の槽内に配置して、
   ａ）逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、
   ｂ）ホットスタートプロセス、及び
   ｃ）等温増幅反応
   からなる群からの追加プロセスを可能にするステップを含む、請求項１に記載の方法。
6. 前記第４の槽内の槽媒体は、高熱伝導性粉末又は空気である、請求項５に記載の方法。
7. 熱サイクルの間、前記反応器を空気ゾーン内に配置して、核酸の蛍光画像化又は電気化学的検出を行うことを可能にするステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
8. 照明光源から前記反応物質への光伝送のために第１の光ファイバ手段を使用するステップと、
   前記反応物質から光検出器への光伝送のために第２の光ファイバ手段を使用するステップと
   をさらに含む、請求項１に記載の方法。
9. 前記液体は、油又はグリセロール又は水又はそれらの任意の混合物である、請求項１に記載の方法。
10. 前記粉末は、実質的に球形である金属粉末を含む、請求項１に記載の方法。
11. 前記粉末は、粒径が１μｍ〜５ｍｍである銅粉末である、請求項１０に記載の方法。
12. チューブ又はウェルプレートの形態である場合に、粉末が反応器を受け入れている間の摩擦抵抗を減少させるために、
    ａ）反応器の底部先端にある金属層と、
    ｂ）反応器の残りの部分よりも小さい断面積を有してよりシャープである反応器の底部先端と
    からなる群からの少なくとも１つの特徴を有する反応器を使用するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
13. 熱サイクルの後に、前記反応器を第５の槽内で徐々に加熱させるステップと、
    徐々に加熱しながら融解曲線分析を行うステップと
    をさらに含む、請求項１に記載の方法。
14. 反応器が粉末内に受け入れられている際の槽媒体の抵抗力及びＴ_ＨＴ下での前記反応器の変形を防止するために、前記反応器を部分的に閉じ込める反応器ガードを使用するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
15. 熱サイクル中に反応器温度センサによって感知されたリアルタイム温度に基づいて動作可能な温度誘導作動制御手段（ＴｅＧＭＣＭ）によって目標温度を達成するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
16. 前記反応器が前記槽内に配置される時間周期に基づいて動作可能な時間誘導作動制御手段（ＴｉＧＭＣＭ）によって目標温度を達成するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
17. 時間周期に対してＴｉＧＭＣＭを較正するステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
18. 前記反応器の過熱又は過冷却を不必要に引き起こす動作上の電気機械的遅れを相殺するために、前記反応器がＴ_ＨＴよりも低い第１のリフトオフ温度及びＴ_ＬＴよりも高い第２のリフトオフ温度に到達する場合に前記反応器の前記槽からのリフトオフを開始するように、反応器移動機構を較正するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
19. 熱プロファイルを用いて核酸を熱処理する装置であって、前記装置は、核酸を含む反応物質を収容する反応器を保持する反応器ホルダと、チューブ又はウェルプレート又はチップ又はカートリッジなどの任意の形態である反応器とを使用し、前記装置は、
    第１の槽及び第２の槽であって、槽内の槽媒体はそれぞれ、２つの異なる温度で維持可能である、第１の槽及び第２の槽と、
    複数の熱サイクルで前記反応器を２つの前記槽内に配置して、
    −所定の高い目標温度Ｔ_ＨＴと、
    −所定の低い目標温度Ｔ_ＬＴと
    に交互に到達することを可能にするための反応器移動機構と、
    前記槽の少なくとも１つにおける槽媒体としての役割を果たす、高熱伝導性粉末と、
    前記装置の一部であってもなくてもよい、反応器ホルダと
    を含み、
    前記高熱伝導性粉末は、金属粉末又は液体中に分散された金属粉末である、装置。
20. 高熱伝導性粉末を含む槽媒体内に反応器が受け入れられている際の槽媒体の抵抗力及びＴ_ＨＴ下での反応器の変形を防止するために、前記反応器を部分的に閉じ込める反応器閉じ込め手段を有する反応器ガードをさらに含む、請求項１９に記載の装置。
21. 前記反応器ガードは、金属又はガラス又は高温プラスチック又はセラミックを含む材料から構成される、請求項２０に記載の装置。
22. 前記反応器ガードは、前記反応器ホルダの延長部である、請求項２０に記載の装置。
23. さらに第３の槽を含み、前記反応器移動機構は、前記反応器の熱サイクルの間、前記反応器が所定の中間目標温度Ｔ_ＭＴに到達することを可能にし、Ｔ_ＭＴは、核酸中でのプライマーの伸長又は核酸上へのプライマー又はプローブのアニーリングに対応する、請求項１９に記載の装置。
24. 粉末又は空気は、前記第３の槽内の槽媒体としての役割を果たす、請求項２３に記載の装置。
25. さらに第４の槽を含み、熱サイクルの前に、前記反応器移動機構は、
    ａ）逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、
    ｂ）ホットスタートプロセス、及び
    ｃ）等温増幅反応
    からなる群からの追加プロセスのための温度Ｔ_ＡＰに前記反応器が到達することを可能にする、請求項１９に記載の装置。
26. 粉末又は空気は、前記第４の槽内の槽媒体としての役割を果たす、請求項２５に記載の装置。
27. さらに空気ゾーンを含み、前記反応器移動機構は、熱サイクルの間、核酸の蛍光画像化又は電気化学的検出を行うために前記反応器を配置する、請求項１９に記載の装置。
28. 照明光源から前記反応物質への光伝送のための第１の光ファイバ手段と、
    前記反応物質から光検出器への光伝送のための第２の光ファイバ手段と
    をさらに含む、請求項１９に記載の装置。
29. 前記液体は、油又はグリセロール又は水又はそれらの任意の混合物である、請求項１９に記載の装置。
30. 前記粉末は、実質的に球形である金属粉末を含む、請求項１９に記載の装置。
31. 前記粉末は、粒径が１μｍ〜５ｍｍである銅粉末である、請求項３０に記載の装置。
32. 前記反応器を熱サイクルしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の増幅又はプライマー伸長を達成するために、Ｔ_ＨＴは、核酸の変性のために８５〜９９℃の領域にあり、Ｔ_ＬＴは、核酸上へのプライマー又はプローブのアニーリング又はプライマー伸長のために４５〜７５℃の領域にある、請求項１９に記載の装置。
33. 熱サイクル後に前記反応物質の融解曲線分析を行いながら徐々に加熱されることができる第５の槽をさらに含む、請求項１９に記載の装置。
34. 反応器温度センサと、
    熱サイクル中に前記反応器温度センサによって感知されたリアルタイム温度に基づいて動作可能な温度誘導作動制御手段（ＴｅＧＭＣＭ）、及び
    前記反応器が前記槽内に配置される時間周期に基づいて動作可能な時間誘導作動制御手段（ＴｉＧＭＣＭ）
    からなる群からの少なくとも１つの手段と
    をさらに含み、前記反応器移動機構は、前記少なくとも１つの手段によって動作可能である、請求項１９に記載の装置。
35. ＴｉＧＭＣＭは、時間周期に対してユーザーが較正することができる、請求項３４に記載の装置。
36. 使用の際、前記反応器の過熱又は過冷却を不必要に引き起こす動作上の電気機械的遅れを相殺するために、前記反応器移動機構は、前記反応器がＴ_ＨＴよりも低い第１のリフトオフ温度及びＴ_ＬＴよりも高い第２のリフトオフ温度に到達する場合に前記反応器の前記槽からのリフトオフを開始するように較正することができる、請求項１９に記載の装置。
37. ａ）前記槽、
    ｂ）前記反応器、及び
    ｃ）前記槽内に反応器を挿入している間、ａ）及びｂ）の両方
    からなる群からの少なくとも１つを振動させるための振動手段をさらに含む、請求項１９に記載の装置。