JP2016513959A

JP2016513959A - 核酸分析のための方法、組成物およびキット

Info

Publication number: JP2016513959A
Application number: JP2015559024A
Authority: JP
Inventors: オースティンソー，; マイケルワイ．ルセロ，
Original assignee: トマバイオサイエンシーズ，インコーポレイテッド
Priority date: 2013-02-21
Filing date: 2014-02-21
Publication date: 2016-05-19
Also published as: GB2526736A; GB201516569D0; EP2959016A4; US20160222427A1; CN105339507A; HK1217971A1; WO2014130890A1; JP2019170390A; SG11201506660RA; CA2902207A1; US20180148756A1; US20160186267A1; EP2959016A1

Abstract

本発明の態様は、癌を評価するための方法およびキットに関する。本発明のいくつかの態様は、配列決定のためにサンプルライブラリーを調製するための方法およびキットに関する。本発明のいくつかの態様は、対立遺伝子検出のための方法およびキットに関する。本発明のいくつかの態様は、高い有効性のライゲーション方法およびキットに関する。本発明のいくつかの態様は、アンプリコンの感度のよい検出に関する。一局面において、癌を評価する方法が提供され、この方法は、（ａ）被験体中の流体サンプルに由来するサンプル中で遺伝子の各々のサブセットの存在、不在および／または量を決定する工程ならびに（ｂ）工程（ａ）の結果から、上記被験体における上記癌の状態を決定する工程を包含する。

Description

相互参照
この出願は、２０１３年２月２１日に出願された米国仮出願第６１／７６７，７１８号、２０１３年２月２６日に出願された米国仮出願第６１／７６９，６８３号、２０１３年３月１２日に出願された米国仮出願第６１／７７７，７０２号、２０１３年３月１３日に出願された米国仮出願第６１／７８０，５７８号、２０１３年５月１７日に出願された米国仮出願第６１／８２４，８９４号および２０１３年８月２７日に出願された米国仮出願第６１／８７０，６３４号（これらは、参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。

（配列表）
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、かつその全体が参照によって本明細書に援用される配列表を含む。かかるＡＳＣＩＩのコピーは、２０１４年２月１９日に作成され、４４２８８−７０３．６０１＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、サイズは１，５８０，１０４バイトである。

（発明の背景）
癌は、現代の医学にとって深刻な課題を有する。２００７年には、世界中の人類全体の死亡のうち約１３％（７９０万例）を癌が引き起こしたと推定された。癌は、細胞増殖の上方制御に一般には関与する、種々の疾患のうち広範なグループを包含する。癌では、細胞は、制御不能に分裂し、かつ増殖し得、悪性腫瘍を形成し得、そして身体の近傍部位に侵襲し得る。また、癌は、例えば、リンパ系または血流を介して、身体のさらに遠隔部位にも伝播し得る。ヒトに罹る癌としては２００を超える公知の様々な癌が存在する。多くの癌は、変異、例えば、癌関連の遺伝子における変異に関連する。癌の変異状況は、１例の個体被験体と別の被験体で、そして同じ被験体の１つの腫瘍細胞から別の腫瘍細胞でさえ、広範に変化し得る。これらの変異の知識は、癌治療の選択を助け、また疾患の診断および／または疾患の状態についての情報提供も補助し得る。腫瘍生検は、癌関連遺伝子の変異状況に関する情報を得るために配列決定され得る；しかし、腫瘍生検の手順は、外科的に侵襲的であり得、かつ患者にとっては費用がかさむ場合がある。さらに、腫瘍生検に対する信頼性は、被験体が生検するのが困難な腫瘍細胞を有する場合（例えば、腫瘍が小さい場合）は、その被験体の癌の状態をモニターするには有用性が限られたものである。

血漿および血清中での無細胞ＤＮＡ浮遊が腫瘍関連の変異を保有し得るという発見によって、無細胞ＤＮＡの分析が癌の診断を補助し得るという可能性が切り開かれた。しかし、無細胞腫瘍ＤＮＡの分析は、現在実施されているとおり、標的されていない配列決定または複雑なＰＣＲ増幅（例えば、磁気ビーズによる）を利用しており、高価な試薬およびシステムのせいで高コストになる。

変異の検出および／または測定は、ライフサイエンスで広範に行われている。例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）のような変異は、多数の疾患、例としては、例えば、癌、神経変性疾患、感染性疾患、自己免疫疾患、貧血、および嚢胞性線維症に関連する。変異を検出するための現行の方法は一般には、標的ポリヌクレオチドの増幅に関与する。例えば、標的特異的プライマーは、変異を保有すると疑われる領域を選択的に増幅し、得られたアンプリコンを配列決定して、変異を問い合わせてもよい。他の例では、アッセイは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の存在下で蛍光を発するインターカレート色素を利用してもよいし、または特定のポリヌクレオチド配列に対して特異的にハイブリダイズするように設計されたＴａｑｍａｎプローブを利用してもよい。これらのアッセイは一般には、小さいヌクレオチド配列にかかわる変異（例えば、ＳＮＰまたは小さい挿入／欠失）については特に、劣った特異性および／または感度に悩まされる。

検出の代表的な方法は、反応生成物に結合し、かつその検出を可能にするように設計されている検出可能プローブの使用を包含する。しばしば、検出可能プローブは、検出可能部分を含み、かつその検出可能部分が検出可能なシグナルを発することを阻害するクエンチャー部分をさらに含んでもよい。

このようなプローブアッセイは、リアルタイムＰＣＲまたはエンドポイントデジタルＰＣＲを利用してもよい。リアルタイムＰＣＲアッセイとは一般には、ＰＣＲの各サイクルで検出を行う、アッセイを指す。エンドポイントデジタルＰＣＲでは、テンプレート分子は一般には、各々が増幅および検出に必要な成分を含む、多数の区画にわたって分配される。ＰＣＲの終了後、その区画は、通常は首尾よい増幅の間に生成される、検出可能なシグナルの有無について個々に問い合わされ得る。デジタルＰＣＲによって、シンプルな計数統計を適用して、サンプル中の目的のテンプレート核酸の極めて厳密かつ正確な定量を得ることが可能になり得る。目的の標的ポリヌクレオチドに特異的なシグナルを生じる任意の手段によって、エンドポイントデジタルＰＣＲが影響を受けやすくなる場合がある。

代表的には、上記のアッセイは、ＰＣＲ反応の間に標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズするように設計されているプローブの使用を行う。ＰＣＲ反応は一般には、温度サイクリングのプロセスを含み、ここでは反応混合物を、ＰＣＲ反応の別個の段階に相当する制御された温度シフトの反復性の熱サイクルに供する。代表的な熱サイクルの段階は、（ｉ）変性段階（代表的には、反応混合物を高温（例えば、９０〜１００℃）まで加熱して、二本鎖核酸を一本鎖核酸まで融解する工程を包含する）（ｉｉ）アニーリング段階（代表的には、反応プライマーのＴｍよりもおよそ摂氏３〜５度まで（例えば、一本鎖テンプレートへのプライマーのアニーリングを可能にするために約５５〜６５℃まで）反応温度を低下させる工程を包含する）、および（ｉｉｉ）伸長段階（代表的には、反応温度を、ポリメラーゼによるプライマーの伸長のために最適な温度にさせる工程を包含する）を包含する。例えば、Ｔａｑポリメラーゼについて最適の伸長段階の温度は約７２℃である。伸長段階の間、ポリメラーゼは代表的には、テンプレート鎖に対して相補的な新しい核酸鎖を合成する。ＰＣＲの温度サイクリングは、「ホットスタート（ｈｏｔ−ｓｔａｒｔ）」段階に進行されてもよく、ここで反応温度は代表的には、ポリメラーゼを熱活性化するために最大＞９０℃超にさせられる。温度サイクリングの後、反応混合物は、残りの一本鎖核酸が完全に伸長することを保証するために、最終の伸長段階を受けてもよい。温度サイクリングの後（例えば、最終伸長段階の後）、反応混合物の温度は、室温まで冷却されてもよいし、またはＰＣＲ反応を終わらせて、ＰＣＲ生成物を安定化するために下げられてもよい。

ＰＣＲ反応の間のプローブのアニーリングは、プライマーのアニーリングおよび伸長に影響し得る。なぜなら完全な伸長には、アニーリングされたプローブを加水分解するためにポリメラーゼの十分なヌクレオチド鎖切断活性を要するからである。したがって、ＰＣＲ反応の間のプローブハイブリダイゼーションは、増幅効率にネガティブに影響し、かつ得られたデータの感度および正確性に強力に影響し得る。このような問題は、まれな変異（例えば、まれなコピー数変動の事象、まれなＳＮＰなど）の検出および定量のために設計されるアッセイの感度を低下し得る。

さらに上記のアッセイは代表的には、ＰＣＲプライマーのＴｍに比較して高い融点（Ｔｍ）を有するプローブの使用を行う。このような高いＴｍのプローブは一般には、各々のＰＣＲサイクルが検出可能シグナルの生成を生じることを保証するために、ＰＣＲの間に標的ポリヌクレオチドに対するプローブのハイブリダイゼーションを支援するために使用される。しかし、これらのＴｍの制限によって、高い識別能力を有する対立遺伝子特異的なプローブを設計することは困難になる。なぜなら、プローブ／テンプレートのミスマッチのエネルギーのペナルティーは、テンプレートに対するプローブの全体的結合エネルギーに比べれば比較的小さいからである。上述の制限によって、不正確な変異の呼び出しが生じ、かつ変異対立遺伝子の検出および／または定量が妨害され得る。

広範な分子生物学的適用が、核酸のライゲーションに関与する。ライゲーションは、普遍的な分子生物学のツールであって、核酸の標識、分子クローニング適用、アレイハイブリダイゼーション、核酸バーコード化、および核酸ライブラリーの調製（例えば、配列決定のため）に有用である。これらの適用は、バイオテクノロジーから診断、科学捜査、疫学および研究におよぶ広範な種々の目的に利用される。

ライゲーションは、一般には、リガーゼ酵素によって触媒される。例示的なライゲーション反応は、ヌクレオシド三リン酸依存性リガーゼによって触媒される、ヌクレオシド三リン酸依存性ライゲーションである。代表的なヌクレオシド三リン酸依存性ライゲーションは一般的には、ヌクレオシド三リン酸依存性リガーゼ（Ｅ）、「ドナー」核酸分子、「アクセプター」核酸分子、ＡＴＰ、および他の反応成分を含む、単一の反応混合物中で生じる。このライゲーション反応は、アクセプターとドナーとの間の共有結合の形成を生じ得る。ヌクレオシド三リン酸依存性ライゲーションの機序は、一般的には、反応混合物中において３工程で進行する。第一工程は代表的には、ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）の存在下における、リガーゼの活性部位へのヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）の可逆性の移動を包含する。例えば、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）は、ＡＴＰからリガーゼ（Ｅ）の活性部位へ移動されてもよく、これによってピロリン酸塩（ＰＰｉ）を遊離して、このリガーゼを活性化する。あるいは、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）は、ＧＴＰからリガーゼ（Ｅ）の活性部位へ移行され得る）。
（１）Ｅ＋ＮＴＰ⇔Ｅ−ＮＭＰ＋ＰＰｉ（ここでＮ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔである）。

活性なリガーゼは５’または３’のリン酸化「ドナー」核酸分子の存在下ならば、ドナーに結合し得、かつＮＭＰをドナーのリン酸基に可逆的に移行し得、それによってそのドナーをアデニル化し得る。
（２）Ｅ−ＮＭＰ＋ｐ−ドナー＋⇔Ｅ：ＮＭＰ^．Ｐ−ドナー’。

３’または５’のＯＨ基を含む「アクセプター」核酸分子の存在下では、次に、リガーゼは、ドナーのＮＭＰ・Ｐのリン酸塩とアクセプターのＯＨ基との間のホスホジエステル結合の形成を触媒し、それによってＮＭＰを遊離し得る。
（３）アクセプター−ＯＨ＋Ｅ：ＮＭＰ・Ｐ−ドナー⇒アクセプター−Ｐｉ−ドナー’＋Ｅ＋ＮＭＰ
いくつかの分子生物学の適用では極めて普遍的であるが、ライゲーションは一般的には、高度に非効率的プロセスであって、＜１０％の収率が生じる。このような非効率的なプロセスによって、出発材料の有意な損失が生じ、収率を増大するには追加の工程（例えば、ＰＣＲ増幅）が必要とされ得る場合が多く、それによって追加工程にともなうエラーの可能性がもたらされ、かつ一般には、結果の質、精度および正確性が低下する。

単なる例であるが、ポリヌクレオチドの配列決定は、バイオテクノロジー、診断、科学捜査および疫学などの広範な種々の適用のためのライフサイエンスで広く利用されている。配列決定には、全体のゲノム配列決定または標的化配列決定を包含し、ここでは目的のゲノム領域が、配列決定の前にサンプルから選択的に捕獲される。いくつかの標的捕獲方法が開発され、ハイスループットの配列決定システム、例えば、次世代の配列決定法と統合されている。一般には、標的化配列決定法には、２つの別の工程、標的捕獲工程およびライブラリー調製工程を包含する。全ゲノム配列決定はまた一般には、ライブラリー調製工程を包含する。次世代の配列決定プラットフォームに対する配列決定のための核酸ライブラリーの調製は、正確に適合されているサンプル中の核酸分子のうち約１％を生じるように予測された多工程プロセスである、核酸分子に対する２つの別個のアダプターオリゴヌクレオチドのライゲーションに関与する場合が多い。非効率的なアダプターライゲーションに起因する、核酸のこの主な損失によって、得られたライブラリーにおける目的のいくつかのゲノム領域のゼロ提示が生じ得る。さらに、非効率的なアダプターライゲーションでは、所望の読み深さまで配列決定するために十分な材料を得るにはライブラリーメンバーの予備増幅を必要とし得る。この予備増幅工程は、最終ライブラリーのバイアスの主な原因であることが示されている。なぜならＰＣＲの効率における固有の相違は、いくつかのゲノム領域の過剰な提示、および他のゲノム領域の過小な提示を生じ得るからである（例えば、Ａｉｒｄら、ＧｅｎｏｍｅＢｉｏｌｏｇｙ２０１１，１２：Ｒ１８参照（その全体が参照によって本明細書に援用される））。さらに、核酸ライブラリーの予備増幅では、核酸ポリメラーゼの内因性の誤差率に起因して配列決定の誤差がもたらされ得る。予備増幅のバイアスおよび予備増幅から生じる誤差の導入によって、限られた出発サンプルからのまれな変異の正確な検出が望まれる場合が多い、診断的な配列決定適用に有害な結果になり得る。

（発明の要旨）
本発明の態様は、癌を評価するための方法およびキットに関する。本発明のいくつかの態様は、配列決定のためのサンプルライブラリーを調製するための方法およびキットに関する。本発明のいくつかの態様は、対立遺伝子検出のための方法およびキットに関する。本発明のいくつかの態様は、高い効率のライゲーション方法およびキットに関する。本発明のいくつかの態様は、アンプリコンの感度のよい検出に関する。

いくつかの場合には、本発明は、癌を評価する方法を提供し、この方法は以下を包含する。

（ａ）被験体由来のサンプルに由来するサンプル中で遺伝子の各々のサブセットの存在、不在および／または量を決定する工程であって、ここでこのサブセットは、（ｉ）固体組織サンプルが、癌組織を含むことが公知であるか、または含むと疑われる被験体由来の固体組織サンプルで遺伝子のセットでの標的化配列決定を行うこと；（ｉｉ）この配列決定に基づいて遺伝子のセットについて遺伝学的異常のプロファイルを決定すること；および（ｉｉｉ）このセットについてのこのプロファイルに基づいて遺伝子のセットのうち、２、３、４のサブセット、しかし４以下の遺伝子を選択することであって、ここでこのサブセットがこの被験体に特異的であることと、によって決定される、工程；ならびに（ｂ）工程（ａ）の結果から、この被験体における癌の状態を決定する工程。

この方法は、（ａ）被験体における流体サンプルに由来するサンプル中で遺伝子の各々のサブセットの存在、不在および／または量を決定する工程であって、ここでこのサブセットは、（ｉ）固体組織サンプルが、癌組織を含むことが公知であるか、または含むと疑われる被験体由来の固定されていない固体組織サンプル由来の遺伝子のセットでの標的化配列決定を行うこと；（ｉｉ）この配列決定に基づいて遺伝子のセットについて遺伝学的異常のプロファイルを決定すること；および（ｉｉｉ）このセットについてのこのプロファイルに基づいて遺伝子のセットのサブセットを選択することであって、ここでこのサブセットが個々に特異的であること、によって決定される、工程；ならびに（ｂ）工程（ａ）の結果から、この被験体における癌の状態を決定する工程、を包含し得る。

関連の実施形態では、この方法は、（ａ）被験体における流体サンプルに由来するサンプル中で遺伝子の各々のサブセットの存在、不在および／または量を決定する工程であって、ここでこのサブセットは、（ｉ）体液サンプルが、腫瘍由来核酸を含むことが公知であるか、または含むと疑われる被験体由来の体液サンプル由来の遺伝子のセットに対して標的化配列決定を行うこと；（ｉｉ）この配列決定に基づいて遺伝子のセットについて遺伝学的異常のプロファイルを決定すること；ならびに（ｉｉｉ）このセットについてこのプロファイルに基づいて遺伝子のセットのサブセットを選択することであって、ここで、このサブセットが個体に特異的であることによって決定される、工程；ならびに（ｂ）工程（ａ）の結果から、この被験体における癌の状態を決定する工程、を包含する。

本明細書に記載の任意の方法を行うには、遺伝子のセットは、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００個の遺伝子を含む。

遺伝子のセットは：ＡＢＣＡ１、ＢＲＡＦ、ＣＨＤ５、ＥＰ３００、ＦＬＴ１、ＩＴＰＡ、ＭＹＣ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＳＫＰ２、ＴＰ５３、ＡＢＣＡ７、ＢＲＣＡ１、ＣＨＥＫ１、ＥＰＨＡ３、ＦＬＴ３、ＪＡＫ１、ＭＹＣＬ１、ＰＩＫ３Ｒ２、ＳＬＣ１９Ａ１、ＴＰ７３、ＡＢＣＢ１、ＢＲＣＡ２、ＣＨＥＫ２、ＥＰＨＡ５、ＦＬＴ４、ＪＡＫ２、ＭＹＣＮ、ＰＫＨＤ１、ＳＬＣ１Ａ６、ＴＰＭ３、ＡＢＣＣ２、ＢＲＩＰ１、ＣＬＴＣ、ＥＰＨＡ６、ＦＮ１、ＪＡＫ３、ＭＹＨ２、ＰＬＣＢ１、ＳＬＣ２２Ａ２、ＴＰＭＴ、ＡＢＣＣ３、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＯＬ１Ａ１、ＥＰＨＡ７、ＦＯＳ、ＪＵＮ、ＭＹＨ９、ＰＬＣＧ１、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＴＰＯ、ＡＢＣＣ４、Ｃ１ｏｒｆ１４４、ＣＯＰＳ５、ＥＰＨＡ８、ＦＯＸＯ１、ＫＢＴＢＤ１１、ＮＡＶ３、ＰＬＣＧ２、ＳＭＡＤ２、ＴＰＲ、ＡＢＣＧ２、ＣＡＢＬＥＳ１、ＣＲＥＢ１、ＥＰＨＢ１、ＦＯＸＯ３、ＫＤＭ６Ａ、ＮＢＮ、ＰＭＬ、ＳＭＡＤ３、ＴＲＩＯ、ＡＢＬ１、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＣＲＥＢＢＰ、ＥＰＨＢ４、ＦＯＸＰ４、ＫＤＲ、ＮＣＯＡ２、ＰＭＳ２、ＳＭＡＤ４、ＴＲＲＡＰ、ＡＢＬ２、ＣＡＭＫＶ、ＣＲＫＬ、ＥＰＨＢ６、ＧＡＢ１、ＫＩＴ、ＮＥＫ１１、ＰＰＡＲＧ、ＳＭＡＲＣＡ４、ＴＳＣ１、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＣＡＲＤ１１、ＣＲＬＦ２、ＥＰＯ、ＧＡＴＡ１、ＫＬＦ６、ＮＦ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＳＭＡＲＣＢ１、ＴＳＣ２、ＡＣＶＲ２Ａ、ＣＡＲＭ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＥＲＢＢ２、ＧＬＩ１、ＫＬＨＤＣ４、ＮＦ２、ＰＰＰ１Ｒ３Ａ、ＳＭＯ、ＴＴＫ、ＡＤＣＹ９、ＣＡＶ１、ＣＳＭＤ３、ＥＲＢＢ３、ＧＬＩ３、ＫＲＡＳ、ＮＫＸ２−１、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＳＯＣＳ１、ＴＹＫ２、ＡＧＡＰ２、ＣＢＦＡ２Ｔ３、ＣＳＮＫ１Ｇ２、ＥＲＢＢ４、ＧＮＡ１１、ＬＭＯ２、ＮＯＳ２、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ、ＳＯＤ２、ＴＹＭＳ、ＡＫＴ１、ＣＢＬ、ＣＴＮＮＡ１、ＥＲＣＣ１、ＧＮＡＱ、ＬＲＰ１Ｂ、ＮＯＳ３、ＰＲＫＡＡ２、ＳＯＳ１、ＵＧＴ１Ａ１、ＡＫＴ２、ＣＣＮＤ１、ＣＴＮＮＡ２、ＥＲＣＣ２、ＧＮＡＳ、ＬＲＰ２、ＮＯＴＣＨ１、ＰＲＫＣＡ、ＳＯＸ１０、ＵＭＰＳ、ＡＫＴ３、ＣＣＮＤ２、ＣＴＮＮＢ１、ＥＲＣＣ３、ＧＰＲ１２４、ＬＲＰ６、ＮＯＴＣＨ２、ＰＲＫＣＺ、ＳＯＸ２、ＵＳＰ９Ｘ、ＡＬＫ、ＣＣＮＤ３、ＣＹＦＩＰ１、ＥＲＣＣ４、ＧＰＲ１３３、ＬＴＫ、ＮＯＴＣＨ３、ＰＲＫＤＣ、ＳＰ１、ＶＥＧＦ、ＡＮＡＰＣ５、ＣＣＮＥ１、ＣＹＬＤ、ＥＲＣＣ５、ＧＲＢ２、ＭＡＮ１Ｂ１、ＮＰＭ１、ＰＴＣＨ１、ＳＰＲＹ２、ＶＥＧＦＡ、ＡＰＣ、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＹＰ１９Ａ１、ＥＲＣＣ６、ＧＳＫ３Ｂ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＮＱＯ１、ＰＴＣＨ２、ＳＲＣ、ＶＨＬ、ＡＰＣ２、ＣＤ４４、ＣＹＰ１Ｂ１、ＥＲＧ、ＧＳＴＰ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＲ３Ｃ１、ＰＴＥＮ、ＳＴ６ＧＡＬ２、ＷＲＮ、ＡＲ、ＣＤ７９Ａ、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＥＲＮ２、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＭＡＰ２Ｋ４、ＮＲＡＳ、ＰＴＧＳ２、ＳＴＡＴ１、ＷＴ１、ＡＲＡＦ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＹＰ２Ｃ８、ＥＳＲ１、ＨＤＡＣ１、ＭＡＰ２Ｋ７、ＮＲＰ２、ＰＴＰＮ１１、ＳＴＡＴ３、ＸＰＡ、ＡＲＦＲＰ１、ＣＤＣ４２、ＣＹＰ２Ｄ６、ＥＳＲ２、ＨＤＡＣ２、ＭＡＰ３Ｋ１、ＮＴＲＫ１、ＰＴＰＲＢ、ＳＴＫ１１、ＸＰＣ、ＡＲＩＤ１Ａ、ＣＤＣ４２ＢＰＢ、ＣＹＰ３Ａ４、ＥＴＶ４、ＨＧＦ、ＭＡＰＫ１、ＮＴＲＫ２、ＰＴＰＲＤ、ＳＵＦＵ、ＺＦＹ、ＡＴＭ、ＣＤＣ７３、ＣＹＰ３Ａ５、ＥＷＳＲ１、ＨＩＦ１Ａ、ＭＡＰＫ３、ＮＴＲＫ３、ＲＡＤ５０、ＳＵＬＴ１Ａ１、ＺＮＦ５２１、ＡＴＰ５Ａ１、ＣＤＨ１、ＤＡＣＨ２、ＥＸＴ１、ＨＭ１３、ＭＡＰＫ８、ＯＭＡ１、ＲＡＤ５１、ＳＵＺ１２、ＡＴＲ、ＣＤＨ１０、ＤＣＣ、ＥＺＨ２、ＨＭＧＡ１、ＭＡＲＫ３、ＯＲ１０Ｒ２、ＲＡＦ１、ＴＡＦ１、ＡＵＲＫＡ、ＣＤＨ２、ＤＣＬＫ３、ＦＡＮＣＡ、ＨＮＦ１Ａ、ＭＣＬ１、ＰＡＫ３、ＲＡＲＡ、ＴＢＸ２２、ＡＵＲＫＢ、ＣＤＨ２０、ＤＤＢ２、ＦＡＮＣＤ２、ＨＯＸＡ３、ＭＤＭ２、ＰＡＲＰ１、ＲＢ１、ＴＣＦ１２、ＢＡＩ３、ＣＤＨ５、ＤＤＲ２、ＦＡＮＣＥ、ＨＯＸＡ９、ＭＤＭ４、ＰＡＸ５、ＲＥＭ１、ＴＣＦ３、ＢＡＰ１、ＣＤＫ２、ＤＧＫＢ、ＦＡＮＣＦ、ＨＲＡＳ、ＭＥＣＯＭ、ＰＣＤＨ１５、ＲＥＴ、ＴＣＦ４、ＢＡＲＤ１、ＣＤＫ４、ＤＧＫＺ、ＦＡＳ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＭＥＮ１、ＰＣＤＨ１８、ＲＩＣＴＯＲ、ＴＥＫ、ＢＡＸ、ＣＤＫ６、ＤＩＲＡＳ３、ＦＢＸＷ７、ＩＤＨ１、ＭＥＴ、ＰＣＮＡ、ＲＩＰＫ１、ＴＥＰ１、ＢＣＬ１１Ａ、ＣＤＫ７、ＤＬＧ３、ＦＣＧＲ３Ａ、ＩＤＨ２、ＭＩＴＦ、ＰＤＧＦＡ、ＲＯＲ１、ＴＥＲＴ、ＢＣＬ２、ＣＤＫ８、ＤＬＬ１、ＦＥＳ、ＩＦＮＧ、ＭＬＨ１、ＰＤＧＦＢ、ＲＯＲ２、ＴＥＴ２、ＢＣＬ２Ａ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＤＮＭＴ１、ＦＧＦＲ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＭＬＬ、ＰＤＧＦＲＡ、ＲＯＳ１、ＴＧＦＢＲ２、ＢＣＬ２Ｌ１、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＦＧＦＲ２、ＩＧＦ２Ｒ、ＭＬＬ３、ＰＤＧＦＲＢ、ＲＰＳ６ＫＡ２、ＴＨＢＳ１、ＢＣＬ２Ｌ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＦＧＦＲ３、ＩＫＢＫＥ、ＭＰＬ、ＰＤＺＲＮ３、ＲＰＴＯＲ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＢＣＬ３、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＤＯＴ１Ｌ、ＦＧＦＲ４、ＩＫＺＦ１、ＭＲＥ１１Ａ、ＰＨＬＰＰ２、ＲＳＰＯ２、ＴＮＫＳ、ＢＣＬ６、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＤＰＹＤ、ＦＨ、ＩＬ２ＲＧ、ＭＳＨ２、ＰＩＫ３Ｃ３、ＲＳＰＯ３、ＴＮＫＳ２、ＢＣＲ、ＣＤＫＮ２Ｄ、Ｅ２Ｆ１、ＦＨＯＤ３、ＩＮＨＢＡ、ＭＳＨ６、ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＵＮＸ１、ＴＮＮＩ３Ｋ、ＢＩＲＣ５、ＣＤＸ２、ＥＥＤ、ＦＩＧＦ、ＩＮＳＲ、ＭＴＨＦＲ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＳＤＨＢ、ＴＮＲ、ＢＩＲＣ６、ＣＥＢＰＡ、ＥＧＦ、ＦＬＧ２、ＩＲＳ１、ＭＴＯＲ、ＰＩＫ３ＣＤ、ＳＦ３Ｂ１、ＴＯＰ１、ＢＬＭ、ＣＥＲＫ、ＥＧＦＲ、ＦＬＮＣ、ＩＲＳ２、ＭＵＴＹＨ、ＰＩＫ３ＣＧ、ＳＨＣ１、およびＴＯＰ２Ａからなる群より選択され得る。

このサンプルは：血液、血清、血漿、尿、汗、涙、唾液、痰、それらの成分、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択され得る。工程（ａ）および（ｂ）は、癌の状態を時間をわたってモニターするために複数の時点で行われてもよい。１つの時点は、癌治療の最初の施行の前であってもよく、その後の時点は、第一の施行に続くものであってもよい。

この方法は、遺伝子のセットについて遺伝学的異常のプロファイルを連絡するレポートを作成する工程と、このレポートを介護者に連絡する工程とをさらに包含し得る。このレポートは、上記プロファイルに基づく１つ以上の治療候補のリストを包含し得る。このレポートは、固体組織サンプルの収集から２週内で作成され得る。いくつかの場合には、このレポートは、固体組織サンプルの収集から１週内で作成される。いくつかの実施形態では、このレポートは、遺伝子の上記セットのコピー数変更を含む。いくつかの実施形態では、このレポートは、異常を標的にする治療剤の説明を含む。この方法はさらに、複数の時点の各々で、遺伝子のサブセットのプロファイルを連絡するレポートを作成する工程を包含し得る。

本明細書の任意の方法のいくつかの実施形態では、決定する工程は、上記サンプルから個別の反応容積へ核酸分子を希釈する工程を包含し、ここでこの個別の反応容積は、このサンプル由来の平均で１０、５、４、３、２または１未満の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、この個別の反応容積は、このサンプル由来の０〜１０モルの核酸を含む。この個別の反応容積は、エマルジョン中の液滴であってもよい。この個別の反応容積はさらに、遺伝子のサブセット中の遺伝学的異常の対立遺伝子識別のためのプライマーを含んでもよい。

上記状態を決定する工程は、遺伝子の上記サブセット中の遺伝学的異常を保有している核酸の数を定量する工程を包含し得る。上記標的化配列決定の工程は、上記固体組織サンプルから、８、７、６、５または４時間未満でＤＮＡライブラリーを調製する工程を包含し得る。いくつかの実施形態では、調製工程には、ライブラリーの配列決定の前に指数関数的ＰＣＲ増幅は必要としない。いくつかの実施形態では、この調製工程は、線形増幅工程を包含する。いくつかの実施形態では、この調製する工程は、増幅を必要としない。

いくつかの実施形態では、上記標的化配列決定の工程は、（ａ）上記固体組織サンプル由来の一本鎖ＤＮＡフラグメントと、（ｉ）ある癌関連遺伝子のある領域に特異的な領域、および（ｉｉ）ある配列決定プラットフォームにカップリングするために特異的なアダプター配列を含む標的特異的オリゴヌクレオチドとを接触させる工程と；（ｂ）上記標的特異的オリゴヌクレオチドに対して相補性の領域を含む一本鎖ＤＮＡフラグメントに対して上記標的特異的オリゴヌクレオチドを結合するためのハイブリダイゼーション反応を行う工程と；（ｃ）伸長反応を行って、上記領域を含み、かつ上記アダプターを含む伸長生成物を作成する工程と；（ｄ）この伸長生成物を配列決定する工程と、
を包含する。この接触は、配列決定プラットフォームに対して結合された標的特異的オリゴヌクレオチドと生じ得る。この接触は、溶液中で遊離の標的特異的オリゴヌクレオチドと生じ得る。

いくつかの態様では、本発明は、標的ポリヌクレオチド中の変異の感度のよい検出のための方法およびキットを提供する。本発明は、プローブ結合領域とテンプレート結合領域とを含む、オリゴヌクレオチドプライマーを提供する。いくつかの実施形態では、このテンプレート結合領域は、変異を保有することが疑われるテンプレート核酸に対して少なくとも５０％相補性である。いくつかの実施形態では、テンプレート結合領域の一部は、変異が疑われる遺伝子座に少なくとも部分的を覆う。いくつかの実施形態では、このオリゴヌクレオチドプライマーは、テンプレート核酸に対するハイブリダイゼーションの際に、変異が存在する場合はポリメラーゼによって伸長可能であるが、変異が存在しない場合はポリメラーゼによって伸長可能ではない。いくつかの実施形態では、上記テンプレート結合領域は、変異遺伝子座を覆う３’末端領域を含む。いくつかの実施形態では、変異遺伝子座を覆う３’末端領域は、１、２、３、４、５、または５塩基を超えるテンプレート結合領域の３’末端を含む。いくつかの実施形態では、この変異は一塩基多型（ＳＮＰ）である。

特定の実施形態では、この３’末端領域は、ＳＮＰ遺伝子座を覆う塩基を含む。いくつかの実施形態では、この塩基は、ＳＮＰ遺伝子座の変異体対立遺伝子に相補的である。いくつかの実施形態では、この塩基は、ＳＮＰ遺伝子座の野性型対立遺伝子に対して相補性である。いくつかの実施形態では、上記プローブ結合領域は、被験体由来のいかなるゲノム配列に対してもハイブリダイズしない。いくつかの実施形態では、上記ポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠いているＤＮＡポリメラーゼである。

本発明はまた：（ａ）オリゴヌクレオチドプライマーであって、（ｉ）プローブ結合領域および変異を保有すると疑われるテンプレート核酸に対して少なくとも７０％相補的であるテンプレート結合領域を含み、ここでこのテンプレート結合領域の一部が、変異が疑わしい遺伝子座を少なくとも部分的に覆い、ここでこのオリゴヌクレオチドプライマーは、テンプレート核酸に対するハイブリダイゼーションの際に、変異が存在する場合はポリメラーゼによって伸長可能であるが、変異が存在しない場合はポリメラーゼによって伸長可能ではない、オリゴヌクレオチドプライマーと；（ｂ）使用説明書とを包含する、キットを提供する。いくつかの実施形態では、変異とは、一塩基多型（ＳＮＰ）である。いくつかの実施形態では、テンプレート結合領域は、ＳＮＰ遺伝子座を覆う３’末端塩基を含む。いくつかの実施形態では、この３’末端塩基は、ＳＮＰ遺伝子座の変異対立遺伝子に相補的である。いくつかの実施形態では、この３’末端塩基は、ＳＮＰ遺伝子座の野性型対立遺伝子に相補的である。いくつかの実施形態では、このプローブ結合領域は、被験体由来のいかなるゲノム配列に対してもハイブリダイズしない。いくつかの実施形態では、このキットはさらに、プローブ結合領域に対して少なくとも７０％相補的なレポータープローブを含む。いくつかの実施形態では、このレポータープローブは、検出可能部分およびクエンチャー部分を含み、ここでこのクエンチャー部分は、このレポータープローブがインタクトである場合、検出可能部分の検出を抑制する。いくつかの実施形態では、このキットはさらに、上記遺伝子座の下流の逆相補配列に対して少なくとも７０％相補的なリバースプライマーを含む。いくつかの実施形態では、このキットはポリメラーゼをさらに含む。

いくつかの実施形態では、このポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有し、かつ３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有さない熱安定性ポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、このキットはさらに、（ｉ）１つ以上の代替のオリゴヌクレオチドプライマーを含み、ここでこの１つ以上の代替のオリゴヌクレオチドプライマーは各々が、別個のプローブ結合領域および上記テンプレート核酸に対して少なくとも７０％相補的であるテンプレート結合領域を含み、ここでこのテンプレート結合領域の一部は、少なくとも部分的に、上記遺伝子座を覆い、ここでこの代替のオリゴヌクレオチドプライマーは、テンプレート核酸に対するハイブリダイゼーションの際に、代替の対立遺伝子が存在する場合、ポリメラーゼによって伸長可能であるが、この代替の対立遺伝子が存在しない場合は、ポリメラーゼによって伸長可能ではない。いくつかの実施形態では、このキットはさらに、１つ以上の代替のレポータープローブを含み、ここでこの代替のレポータープローブの各々は、この別個のプローブ結合領域のうちの１つに対して少なくとも７０％相補的であるが、このキットのいかなる他のプローブ結合領域に対しても相補的ではない。いくつかの実施形態では、この代替のレポータープローブの各々は、代替の検出可能部分およびクエンチャー部分を含み、ここでこのキットの検出可能部分の各々は、このキットの任意の他の検出可能部分とは検出可能に異なる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーおよびレポータープローブからなるハイブリダイゼーション生成物は、オリゴヌクレオチドプライマーおよびテンプレート核酸からなるハイブリダイゼーション生成物のＴｍよりも少なくとも１０度高いＴｍを有する。

別の態様では、本発明は、標的ポリヌクレオチド領域における変異を検出する方法を提供し、この方法は：（ａ）この標的ポリヌクレオチド領域に対してオリゴヌクレオチドプライマーを選択的にハイブリダイズさせる工程であって、ここでこのオリゴヌクレオチドプライマーが、（ｉ）プローブ結合領域と、（ｉｉ）変異を保有することが疑われるテンプレート核酸に対して少なくとも７０％相補的なテンプレート結合領域とを含み、ここでこのテンプレート結合領域の一部が、この変異の疑わしい遺伝子座を少なくとも部分的に覆い、かつここでこのオリゴヌクレオチドプライマーが、テンプレート核酸に対するハイブリダイゼーションの際に、変異が存在する場合、ポリメラーゼによって伸長可能であるが、変異が存在しない場合、ポリメラーゼによって伸長可能ではない、工程と；（ｂ）ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプライマーを伸長して、伸長生成物を形成する工程と；（ｃ）伸長生成物を検出する工程であって、ここで検出する工程が、変異の存在を示す工程と、を包含する。いくつかの実施形態では、この伸長させる工程は、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を含まないＤＮＡポリメラーゼで伸長させる工程を包含する。

いくつかの実施形態では、上記検出する工程は、レポータープローブを上記プローブ結合領域に対して選択的にハイブリダイズさせる工程を包含する。いくつかの実施形態では、上記レポータープローブは、検出可能部分およびクエンチャー部分を含み、ここでこのクエンチャー部分は、このレポータープローブがインタクトな場合、この検出可能部分の検出を抑制する。いくつかの実施形態では、この検出する工程はさらに、上記ハイブリダイズされたレポータープローブの上記クエンチャー部分から検出可能部分を分離する工程を包含する。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、上記伸長生成物を、上記遺伝子座の下流のこの伸長生成物のある領域に対してハイブリダイズ可能なリバースプライマーを用いて増幅する工程を包含する。いくつかの実施形態では、上記増幅する工程は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を含むＤＮＡポリメラーゼで増幅する工程を包含する。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、上記標的ポリヌクレオチド領域に対して１つ以上の代替のオリゴヌクレオチドプライマーを選択的にハイブリダイズさせる工程を包含し、ここでこの１つ以上の代替のオリゴヌクレオチドプライマーが各々、別個のプローブ結合領域および上記テンプレート核酸に対して少なくとも７０％相補的であるテンプレート結合領域を含み、ここで上記テンプレート結合領域の一部が、上記遺伝子座を少なくとも部分的に覆い、ここでこの代替のオリゴヌクレオチドプライマーが、このテンプレート核酸に対するハイブリダイゼーションの際に、代替の対立遺伝子が存在する場合、ポリメラーゼによって伸長可能であるが、この代替の対立遺伝子が存在しない場合、ポリメラーゼによって伸長可能ではない。いくつかの実施形態では、検出する工程はさらに、この１つ以上の代替のオリゴヌクレオチドプライマーに対して１つ以上の代替のレポータープローブを選択的にハイブリダイズさせる工程を包含し、ここでこの代替のレポータープローブの各々が、上記別個のプローブ結合領域の１つに対して少なくとも７０％相補的であるが、このプローブ結合領域の他のいずれに対しても相補的ではない。いくつかの実施形態では、上記代替のレポータープローブの各々は、代替の検出可能部分およびクエンチャー部分を含み、ここでこの代替の検出可能部分の各々は、この検出可能部分のいずれの他とも検出可能に異なる。いくつかの実施形態では、この変異は、一塩基多型（ＳＮＰ）である。いくつかの実施形態では、テンプレート結合領域は、このＳＮＰ遺伝子座を覆う塩基を含む３’末端領域を含む。いくつかの実施形態では、この塩基は、ＳＮＰ遺伝子座の変異体対立遺伝子に対して相補的である。

いくつかの実施形態では、この塩基は、上記ＳＮＰ遺伝子座の野性型対立遺伝子に対して相補的である。いくつかの実施形態では、上記プローブ結合領域は、上記標的ポリヌクレオチド領域に対してハイブリダイズしない。いくつかの実施形態では、上記オリゴヌクレオチドプライマーおよびレポータープローブのハイブリダイゼーション生成物は、このオリゴヌクレオチドプライマーと標的ポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーション生成物のＴｍよりも少なくとも１０度高いＴｍを有する。いくつかの実施形態では、このレポータープローブの濃度は、上記フォワードプライマーの濃度の少なくとも１０×である。いくつかの実施形態では、上記核酸サンプルは、工程ｂ〜ｃの前に複数の別個の反応容積に細かく分割される。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、反応容積の各々における上記検出可能な部分の検出を包含する。いくつかの実施形態では、この方法は、上記多数の反応容積をカウントする工程をさらに包含し、ここで上記検出可能部分が検出される。いくつかの実施形態では、この核酸サンプルは、複数の個別の反応容積が平均で１未満、１または１を超えるテンプレート核酸分子を含むように、細かく分割されている。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、結論を提供する工程およびネットワークをわたってこの結論を伝達する工程を包含する。

本発明はまた、（ａ）テンプレート核酸に対してハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドプライマーであって、ここでこのテンプレート核酸が、ある遺伝子座で野性型対立遺伝子を含み、ここでこのオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端領域が、この遺伝子座を覆い、かつこの野性型対立遺伝子に相補的ではない、オリゴヌクレオチドプライマーと；（ｂ）検出可能部分およびクエンチャー部分を含むインタクトなレポータープローブであって、ここでこのインタクトなレポータープローブが、このオリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズされる、レポーターと、を含む組成物を提供する。

本発明はまた：（ａ）ｓｓＤＮＡライブラリー中の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）フラグメントに対して標的選択性オリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）をハイブリダイズして、ハイブリダイゼーション生成物を作成する工程と；（ｂ）このハイブリダイゼーション生成物を伸長して、二本鎖伸長生成物を作成する工程であって、ここでこのＴＳＯが、（ｉ）単一の標的領域に対して相補的な配列と（ｉｉ）このＴＳＯの第一の末端に位置するが、このＴＳＯの両端には位置しない第一の一本鎖アダプター配列とを含み、ここでこのｓｓＤＮＡフラグメントが、第二の一本鎖アダプター配列を含むが、第一の一本鎖アダプター配列を含まない工程と、を包含する方法を提供する。いくつかの実施形態では、このｓｓＤＮＡフラグメントは、１０％、５０％、７０％、または９０％を超えるライゲーション効率を含むライゲーション方法によって第二の一本鎖アダプター配列に連結される。いくつかの実施形態では、このｓｓＤＮＡフラグメントは、一本鎖ライゲーション方法によって、第二の一本鎖アダプター配列に連結される。いくつかの実施形態では、この第二の一本鎖アダプター配列は、ｓｓＤＮＡフラグメントの第一の末端に位置するが、ｓｓＤＮＡフラグメントの両端には位置しない。いくつかの実施形態では、この増幅工程は、線形増幅を包含する。いくつかの実施形態では、この第二の一本鎖アダプター配列は、ｓｓＤＮＡフラグメントの第一の末端に位置するが、ｓｓＤＮＡフラグメントの両端には位置しない。いくつかの実施形態では、ｓｓＤＮＡフラグメントの第一の末端は、５’末端である。いくつかの実施形態では、この第一のアダプター配列はバーコード配列を含む。いくつかの実施形態では、この第一または第二のアダプター配列は、バーコード配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＳＯの上記第一の末端は５’末端である。いくつかの実施形態では、上記第一または第二のアダプター配列は、固体支持体にコンジュゲートされた支持体結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも７０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、この固体支持体は、配列決定プラットフォームにカップリングされる。いくつかの実施形態では、この第一または第二のアダプター配列は、配列決定プライマーに対する結合部位を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、この支持体結合オリゴヌクレオチドに対して伸長生成物をアニーリングする工程をさらに包含する。いくつかの実施形態では、この方法は、このアニーリングされた伸長生成物を増幅する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態では、この方法は、このアニーリングされた伸長生成物を配列決定する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態では、上記ｓｓＤＮＡライブラリーはゲノムＤＮＡフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、このｓｓＤＮＡライブラリーは、ｃＤＮＡフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ハイブリダイズしていないＴＳＯおよびハイブリダイズしていないｓｓＤＮＡライブラリーのメンバーを取り除く工程をさらに包含する。いくつかの実施形態では、工程ａ）およびｂ）は、ｓｓＤＮＡライブラリーのメンバーおよびＴＳＯが溶液中で浮遊性である場合に行われる。

いくつかの実施形態では、上記単一の標的領域はゲノム領域に隣接する。いくつかの実施形態では、このゲノム領域は、癌関連遺伝子由来のエキソン領域の一部を含む。いくつかの実施形態では、この癌関連遺伝子は、ＡＢＣＡ１、ＢＲＡＦ、ＣＨＤ５、ＥＰ３００、ＦＬＴ１、ＩＴＰＡ、ＭＹＣ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＳＫＰ２、ＴＰ５３、ＡＢＣＡ７、ＢＲＣＡ１、ＣＨＥＫ１、ＥＰＨＡ３、ＦＬＴ３、ＪＡＫ１、ＭＹＣＬ１、ＰＩＫ３Ｒ２、ＳＬＣ１９Ａ１、ＴＰ７３、ＡＢＣＢ１、ＢＲＣＡ２、ＣＨＥＫ２、ＥＰＨＡ５、ＦＬＴ４、ＪＡＫ２、ＭＹＣＮ、ＰＫＨＤ１、ＳＬＣ１Ａ６、ＴＰＭ３、ＡＢＣＣ２、ＢＲＩＰ１、ＣＬＴＣ、ＥＰＨＡ６、ＦＮ１、ＪＡＫ３、ＭＹＨ２、ＰＬＣＢ１、ＳＬＣ２２Ａ２、ＴＰＭＴ、ＡＢＣＣ３、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＯＬ１Ａ１、ＥＰＨＡ７、ＦＯＳ、ＪＵＮ、ＭＹＨ９、ＰＬＣＧ１、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＴＰＯ、ＡＢＣＣ４、Ｃ１ｏｒｆ１４４、ＣＯＰＳ５、ＥＰＨＡ８、ＦＯＸＯ１、ＫＢＴＢＤ１１、ＮＡＶ３、ＰＬＣＧ２、ＳＭＡＤ２、ＴＰＲ、ＡＢＣＧ２、ＣＡＢＬＥＳ１、ＣＲＥＢ１、ＥＰＨＢ１、ＦＯＸＯ３、ＫＤＭ６Ａ、ＮＢＮ、ＰＭＬ、ＳＭＡＤ３、ＴＲＩＯ、ＡＢＬ１、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＣＲＥＢＢＰ、ＥＰＨＢ４、ＦＯＸＰ４、ＫＤＲ、ＮＣＯＡ２、ＰＭＳ２、ＳＭＡＤ４、ＴＲＲＡＰ、ＡＢＬ２、ＣＡＭＫＶ、ＣＲＫＬ、ＥＰＨＢ６、ＧＡＢ１、ＫＩＴ、ＮＥＫ１１、ＰＰＡＲＧ、ＳＭＡＲＣＡ４、ＴＳＣ１、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＣＡＲＤ１１、ＣＲＬＦ２、ＥＰＯ、ＧＡＴＡ１、ＫＬＦ６、ＮＦ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＳＭＡＲＣＢ１、ＴＳＣ２、ＡＣＶＲ２Ａ、ＣＡＲＭ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＥＲＢＢ２、ＧＬＩ１、ＫＬＨＤＣ４、ＮＦ２、ＰＰＰ１Ｒ３Ａ、ＳＭＯ、ＴＴＫ、ＡＤＣＹ９、ＣＡＶ１、ＣＳＭＤ３、ＥＲＢＢ３、ＧＬＩ３、ＫＲＡＳ、ＮＫＸ２−１、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＳＯＣＳ１、ＴＹＫ２、ＡＧＡＰ２、ＣＢＦＡ２Ｔ３、ＣＳＮＫ１Ｇ２、ＥＲＢＢ４、ＧＮＡ１１、ＬＭＯ２、ＮＯＳ２、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ、ＳＯＤ２、ＴＹＭＳ、ＡＫＴ１、ＣＢＬ、ＣＴＮＮＡ１、ＥＲＣＣ１、ＧＮＡＱ、ＬＲＰ１Ｂ、ＮＯＳ３、ＰＲＫＡＡ２、ＳＯＳ１、ＵＧＴ１Ａ１、ＡＫＴ２、ＣＣＮＤ１、ＣＴＮＮＡ２、ＥＲＣＣ２、ＧＮＡＳ、ＬＲＰ２、ＮＯＴＣＨ１、ＰＲＫＣＡ、ＳＯＸ１０、ＵＭＰＳ、ＡＫＴ３、ＣＣＮＤ２、ＣＴＮＮＢ１、ＥＲＣＣ３、ＧＰＲ１２４、ＬＲＰ６、ＮＯＴＣＨ２、ＰＲＫＣＺ、ＳＯＸ２、ＵＳＰ９Ｘ、ＡＬＫ、ＣＣＮＤ３、ＣＹＦＩＰ１、ＥＲＣＣ４、ＧＰＲ１３３、ＬＴＫ、ＮＯＴＣＨ３、ＰＲＫＤＣ、ＳＰ１、ＶＥＧＦ、ＡＮＡＰＣ５、ＣＣＮＥ１、ＣＹＬＤ、ＥＲＣＣ５、ＧＲＢ２、ＭＡＮ１Ｂ１、ＮＰＭ１、ＰＴＣＨ１、ＳＰＲＹ２、ＶＥＧＦＡ、ＡＰＣ、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＹＰ１９Ａ１、ＥＲＣＣ６、ＧＳＫ３Ｂ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＮＱＯ１、ＰＴＣＨ２、ＳＲＣ、ＶＨＬ、ＡＰＣ２、ＣＤ４４、ＣＹＰ１Ｂ１、ＥＲＧ、ＧＳＴＰ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＲ３Ｃ１、ＰＴＥＮ、ＳＴ６ＧＡＬ２、ＷＲＮ、ＡＲ、ＣＤ７９Ａ、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＥＲＮ２、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＭＡＰ２Ｋ４、ＮＲＡＳ、ＰＴＧＳ２、ＳＴＡＴ１、ＷＴ１、ＡＲＡＦ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＹＰ２Ｃ８、ＥＳＲ１、ＨＤＡＣ１、ＭＡＰ２Ｋ７、ＮＲＰ２、ＰＴＰＮ１１、ＳＴＡＴ３、ＸＰＡ、ＡＲＦＲＰ１、ＣＤＣ４２、ＣＹＰ２Ｄ６、ＥＳＲ２、ＨＤＡＣ２、ＭＡＰ３Ｋ１、ＮＴＲＫ１、ＰＴＰＲＢ、ＳＴＫ１１、ＸＰＣ、ＡＲＩＤ１Ａ、ＣＤＣ４２ＢＰＢ、ＣＹＰ３Ａ４、ＥＴＶ４、ＨＧＦ、ＭＡＰＫ１、ＮＴＲＫ２、ＰＴＰＲＤ、ＳＵＦＵ、ＺＦＹ、ＡＴＭ、ＣＤＣ７３、ＣＹＰ３Ａ５、ＥＷＳＲ１、ＨＩＦ１Ａ、ＭＡＰＫ３、ＮＴＲＫ３、ＲＡＤ５０、ＳＵＬＴ１Ａ１、ＺＮＦ５２１、ＡＴＰ５Ａ１、ＣＤＨ１、ＤＡＣＨ２、ＥＸＴ１、ＨＭ１３、ＭＡＰＫ８、ＯＭＡ１、ＲＡＤ５１、ＳＵＺ１２、ＡＴＲ、ＣＤＨ１０、ＤＣＣ、ＥＺＨ２、ＨＭＧＡ１、ＭＡＲＫ３、ＯＲ１０Ｒ２、ＲＡＦ１、ＴＡＦ１、ＡＵＲＫＡ、ＣＤＨ２、ＤＣＬＫ３、ＦＡＮＣＡ、ＨＮＦ１Ａ、ＭＣＬ１、ＰＡＫ３、ＲＡＲＡ、ＴＢＸ２２、ＡＵＲＫＢ、ＣＤＨ２０、ＤＤＢ２、ＦＡＮＣＤ２、ＨＯＸＡ３、ＭＤＭ２、ＰＡＲＰ１、ＲＢ１、ＴＣＦ１２、ＢＡＩ３、ＣＤＨ５、ＤＤＲ２、ＦＡＮＣＥ、ＨＯＸＡ９、ＭＤＭ４、ＰＡＸ５、ＲＥＭ１、ＴＣＦ３、ＢＡＰ１、ＣＤＫ２、ＤＧＫＢ、ＦＡＮＣＦ、ＨＲＡＳ、ＭＥＣＯＭ、ＰＣＤＨ１５、ＲＥＴ、ＴＣＦ４、ＢＡＲＤ１、ＣＤＫ４、ＤＧＫＺ、ＦＡＳ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＭＥＮ１、ＰＣＤＨ１８、ＲＩＣＴＯＲ、ＴＥＫ、ＢＡＸ、ＣＤＫ６、ＤＩＲＡＳ３、ＦＢＸＷ７、ＩＤＨ１、ＭＥＴ、ＰＣＮＡ、ＲＩＰＫ１、ＴＥＰ１、ＢＣＬ１１Ａ、ＣＤＫ７、ＤＬＧ３、ＦＣＧＲ３Ａ、ＩＤＨ２、ＭＩＴＦ、ＰＤＧＦＡ、ＲＯＲ１、ＴＥＲＴ、ＢＣＬ２、ＣＤＫ８、ＤＬＬ１、ＦＥＳ、ＩＦＮＧ、ＭＬＨ１、ＰＤＧＦＢ、ＲＯＲ２、ＴＥＴ２、ＢＣＬ２Ａ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＤＮＭＴ１、ＦＧＦＲ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＭＬＬ、ＰＤＧＦＲＡ、ＲＯＳ１、ＴＧＦＢＲ２、ＢＣＬ２Ｌ１、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＦＧＦＲ２、ＩＧＦ２Ｒ、ＭＬＬ３、ＰＤＧＦＲＢ、ＲＰＳ６ＫＡ２、ＴＨＢＳ１、ＢＣＬ２Ｌ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＦＧＦＲ３、ＩＫＢＫＥ、ＭＰＬ、ＰＤＺＲＮ３、ＲＰＴＯＲ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＢＣＬ３、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＤＯＴ１Ｌ、ＦＧＦＲ４、ＩＫＺＦ１、ＭＲＥ１１Ａ、ＰＨＬＰＰ２、ＲＳＰＯ２、ＴＮＫＳ、ＢＣＬ６、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＤＰＹＤ、ＦＨ、ＩＬ２ＲＧ、ＭＳＨ２、ＰＩＫ３Ｃ３、ＲＳＰＯ３、ＴＮＫＳ２、ＢＣＲ、ＣＤＫＮ２Ｄ、Ｅ２Ｆ１、ＦＨＯＤ３、ＩＮＨＢＡ、ＭＳＨ６、ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＵＮＸ１、ＴＮＮＩ３Ｋ、ＢＩＲＣ５、ＣＤＸ２、ＥＥＤ、ＦＩＧＦ、ＩＮＳＲ、ＭＴＨＦＲ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＳＤＨＢ、ＴＮＲ、ＢＩＲＣ６、ＣＥＢＰＡ、ＥＧＦ、ＦＬＧ２、ＩＲＳ１、ＭＴＯＲ、ＰＩＫ３ＣＤ、ＳＦ３Ｂ１、ＴＯＰ１、ＢＬＭ、ＣＥＲＫ、ＥＧＦＲ、ＦＬＮＣ、ＩＲＳ２、ＭＵＴＹＨ、ＰＩＫ３ＣＧ、ＳＨＣ１、およびＴＯＰ２Ａからなる群より選択される。

いくつかの実施形態では、１０％、５０％、７０％または９０％の効率を超えるライゲーション方法は、一本鎖ライゲーション方法である。いくつかの実施形態では、このライゲーション方法は、ＲＮＡリガーゼの使用を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡリガーゼは、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅまたはＣｉｒｃＬｉｇａｓｅＩＩである。

本発明はまた、一本鎖ＤＮＡライブラリーを調製する方法を提供し、この方法は：（ａ）二本鎖ＤＮＡフラグメントを一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）フラグメントに変性させる工程と；（ｂ）このｓｓＤＮＡフラグメントから５’側のホスフェートを取り除く工程と；（ｃ）一本鎖プライマードッキングオリゴヌクレオチド（ｐｄｏ’ｓ）を、このｓｓＤＮＡフラグメントの３’末端に連結する工程と；（ｄ）プライマーをこのｐｄｏ’ｓにハイブリダイズさせる工程であって、ここで、このプライマーが、このアダプターオリゴヌクレオチド配列に対して相補的な配列を含み、かつ配列決定プラットフォームに対してカップリングされた支持体結合したオリゴヌクレオチドに対して少なくとも７０％同一である、第一のアダプター配列を含む、工程と；（ｅ）このハイブリダイズしたプライマーを伸長して、二重鎖を作成する工程であって、ここで各々の二重鎖が、ｓｓフラグメントおよび伸長したプライマー鎖を含む工程と；（ｆ）この二本鎖伸長生成物を変性する工程であって、ここでこの変性が、上記固定化された捕獲試薬からの上記伸長されたプライマー鎖の遊離と、上記固定化された捕獲試薬上のこのｓｓＤＮＡフラグメントの保持を生じる工程と；（ｇ）この伸長されたプライマー鎖を収集する工程と、を包含する。いくつかの実施形態では、この方法は、線形増幅反応で工程ｄ〜ｆを反復する工程であって、ここでこの伸長されたプライマー鎖がｓｓＤＮＡライブラリーを含む工程を包含する。いくつかの実施形態では、工程（ｃ）は、上記ｐｄｏ’ｓに対する上記ｓｓＤＮＡフラグメントのうち少なくとも５０％のライゲーションを生じる。いくつかの実施形態では、このライゲーションは、ＡＴＰ依存性リガーゼを用いて行われる。いくつかの実施形態では、上記ＡＴＰ依存性リガーゼはＲＮＡリガーゼである。いくつかの実施形態では、このＲＮＡリガーゼは、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅまたはＣｉｒｃＬｉｇａｓｅＩＩである。いくつかの実施形態では、このｐｄｏ’ｓはアデニル化されている。いくつかの実施形態では、この伸長は、校正ＤＮＡポリメラーゼを用いて行われる。

本発明はまた、一本鎖ＤＮＡライブラリーを調製する方法を提供し、この方法は：二本鎖ＤＮＡフラグメントを一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）フラグメントに変性する工程と；第一の一本鎖アダプター配列を、このｓｓＤＮＡフラグメントの第一の末端に連結する工程と；第二の一本鎖アダプター配列をこのｓｓＤＮＡフラグメントの第二の末端に連結する工程と、を包含する。

本発明はまた、プライマードッキングオリゴヌクレオチド（ｐｄｏ）と；プライマーであって、このプライマーが、このｐｄｏ配列に対して少なくとも７０％相補性である配列を含み、かつ配列決定プラットフォームにカップリングされた第一の支持体結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも７０％同一である、第一のアダプター配列をさらに含む、プライマーと；使用説明書と、を含む、キットを提供する。いくつかの実施形態では、このキットはさらに、ＡＴＰ依存性リガーゼを含む。いくつかの実施形態では、このＡＴＰ依存性リガーゼはＲＮＡリガーゼである。いくつかの実施形態では、このＲＮＡリガーゼは、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅまたはＣｉｒｃＬｉｇａｓｅＩＩである。いくつかの実施形態では、このキットはさらに、校正ＤＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態では、このキットはさらに、固定化された捕獲試薬を含む。いくつかの実施形態では、上記第一のアダプター配列は、第一の配列決定プライマーに対して少なくとも７０％相補的である配列を含む。いくつかの実施形態では、上記第一のアダプター配列は、バーコード配列を含む。いくつかの実施形態では、このキットはさらに、標的選択性オリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）を含む。いくつかの実施形態では、上記ＴＳＯは、このＴＳＯの第一の末端に位置するが、このＴＳＯの第二の末端には位置しない第二のアダプター配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記ＴＳＯの上記第一の末端は５’末端である。いくつかの実施形態では、上記第二のアダプター配列は、配列決定プラットフォームに対してカップリングされた第二の支持体結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも７０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、この第二のアダプター配列は、配列決定プライマーに対する結合部位を含む。

本発明はまた、キットであって：第一のアダプターオリゴヌクレオチドであって、ここでこの第一のアダプターが、配列決定プラットフォームに対してカップリングされた第一の支持体結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも７０％相補的である配列を含む、第一のアダプターオリゴヌクレオチドと；第二のアダプターオリゴヌクレオチドであって、ここでこの第二のアダプターが、第一のアダプターオリゴヌクレオチドとは別個である配列を含む、第二のアダプターオリゴヌクレオチドと；ＲＮＡリガーゼと；使用説明書とを含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、この第二のアダプターは、配列決定プライマーに対して少なくとも７０％相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、この第二のアダプターは、配列決定プラットフォームに対してカップリングされた第二の支持体結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも７０％相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、上記第一のアダプターは、配列決定プライマーに対して少なくとも７０％相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、上記第一または第二のアダプターの一方は、バーコード配列を含む。いくつかの実施形態では、この第一のアダプターは、３’末端塩基と別のヌクレオチドとの間の共有結合の形成を妨げる３’末端ブロック基を含む。いくつかの実施形態では、この３’末端ブロック基は、ジデオキシ−ｄＮＴＰ、アルキル、アミノ−アルキル、フルオロフォアジゴキシゲニン（ｄｉｇｅｏｘｙｇｅｎｉｎ）、またはビオチンである。いくつかの実施形態では、この第一のアダプターは、５’ポリアデニル化配列を含む。いくつかの実施形態では、上記ＲＮＡリガーゼは、Ｔ４またはＭｔｈ由来の短縮されたまたは変異されたリガーゼ２である。いくつかの実施形態では、このキットは、第二のＲＮＡリガーゼをさらに含んでいる。いくつかの実施形態では、この第二のＲＮＡリガーゼは、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅまたはＣｉｒｃＬｉｇａｓｅＩＩである。

本発明は、高効率のライゲーション反応を行うための方法およびキットを提供する。このような方法およびキットは、広範な適用に用いられ得る。

本発明は、複数のドナー核酸分子のうち少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の第一の末端に対して複数のアクセプター核酸分子を連結する工程を包含する、高効率のライゲーション反応を行う方法を提供する。いくつかの実施形態では、この複数のドナー核酸分子は、１０ｎＭを超える濃度で反応混合物中に存在する。

別の態様では、本発明は、複数のドナー核酸分子のうち１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％を超える第一の末端に対して複数のアクセプター核酸分子を連結する工程を包含する、高効率のライゲーション反応を行う方法を提供し、ここで、ドナーまたはアクセプター核酸分子のうちの１つは１２０ｎｔ長を超える。

別の態様では、本発明は、複数のアクセプター核酸分子のうち少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の第一の末端に対して複数のドナー核酸分子を連結する工程を包含する、高効率のライゲーション反応を行う方法を提供する。いくつかの実施形態では、この複数のドナー核酸分子は、１０ｎＭを超える濃度で反応混合物中に存在する。

別の態様では、本発明は、複数のアクセプター核酸分子のうち少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の第一の末端に対して複数のドナー核酸分子を連結する工程を包含する、高効率のライゲーション反応を行う方法を提供し、ここでドナーまたはアクセプター核酸分子のうちの１つは１２０ｎｔ長を超える。

高効率のライゲーション方法のいくつかの実施形態では、このアクセプター核酸分子は、ドナー核酸分子である。いくつかの実施形態では、この方法は、（ａ）ＮＭＰ担持ドナー核酸分子の蓄積を達成するのに十分な時間、反応混合物中で、ある量のドナー核酸分子にヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）を移動させる工程と；（ｂ）ＮＭＰ担持ドナー核酸分子とアクセプター核酸分子との間の共有結合の形成を達成する工程と、を包含し、ここで工程（ａ）および（ｂ）は、この反応混合物中で逐次的に行われる。いくつかの実施形態では、上記移動は、上記ドナー核酸分子のうち少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％までＮＭＰの移動を生じる。いくつかの実施形態では、このドナー核酸分子の少なくとも１つのメンバーの３’末端領域は、未改変の３’末端領域である。いくつかの実施形態では、上記反応混合物は、（ａ）ドナー核酸分子の量に対して少なくとも等モルである量のヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）依存性リガーゼと；（ｂ）上記ＡＴＰ依存性リガーゼのミカエリス定数（Ｋｍ）より少なくとも１０倍高い量で存在するＮＴＰと；を含む。いくつかの実施形態では、上記ＮＴＰ依存性リガーゼはＲＮＡリガーゼである。いくつかの実施形態では、このＮＴＰ依存性リガーゼはＡＴＰ依存性ＲＮＡリガーゼである。いくつかの実施形態では、このＲＮＡリガーゼは、好熱性のＲＮＡリガーゼである。いくつかの実施形態では、このＲＮＡリガーゼは、Ｔ４ＲＮＡリガーゼである。いくつかの実施形態では、上記ＡＴＰ依存性ＲＮＡリガーゼは、ＭｔｈＲｎ１、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ、またはＣｉｒｃＬｉｇａｓｅＩＩである。いくつかの実施形態では、ＮＴＰ依存性リガーゼは、ＧＴＰ依存性リガーゼ、例えば、ＲｔｃＢである。いくつかの実施形態では、ドナー核酸分子の３’末端領域は、３’末端ブロック基で改変されている。いくつかの実施形態では、共有結合の形成を達成する上記工程は、上記反応混合物に対して：上記アクセプター核酸分子と；Ｍｎ^２＋と、を添加する工程を包含する。いくつかの実施形態では、このＭｎ^２＋は、少なくとも２．５ｍＭの量で存在する。いくつかの実施形態では、この方法は、上記反応混合物中の上記ＮＴＰの濃度を低下させる工程をさらに包含する。いくつかの実施形態では、この濃度を低下させる工程は、ＮＴＰの濃度を少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍低下させる工程を包含する。いくつかの実施形態では、この濃度を低下させる工程は、ＮＴＰを少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍希釈するのに十分な量の液体を上記反応混合物に添加する工程を包含する。いくつかの実施形態では、上記ドナー核酸分子は、生物学的供給源から単離された核酸分子を含み、かつここで上記アクセプター核酸分子はアダプター配列を含む。いくつかの実施形態では、上記アクセプター核酸分子は、生物学的被験体から単離された核酸を含み、かつここで上記ドナー核酸分子はアダプター配列を含む。いくつかの実施形態では、このアクセプター核酸分子は、生物学的被験体から単離された核酸を含み、かつここで上記ドナー核酸分子はバーコード配列を含む。いくつかの実施形態では、このドナー核酸分子は、生物学的被験体から単離された核酸を含み、かつここで上記アクセプター核酸分子はバーコード配列を含む。いくつかの実施形態では、このアクセプター核酸分子またはドナー核酸分子は、検出可能タグを含む。いくつかの実施形態では、ＮＭＰはＡＭＰである。いくつかの実施形態では、ＮＭＰはＧＭＰである。いくつかの実施形態では、ＮＴＰはＡＴＰである。いくつかの実施形態では、ＮＴＰはＧＴＰである。

別の態様では、本発明は、核酸ライブラリーを調製する方法を提供し、この方法は、複数のテンプレート核酸分子のうち少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の第一の末端に対してオリゴヌクレオチド配列を連結して、この核酸ライブラリーを作成する工程を包含し、ここでこのテンプレート核酸分子のうちの１つが１２０ｎｔ長を超える。いくつかの実施形態では、このオリゴヌクレオチド配列は、アダプター配列である。いくつかの実施形態では、この方法は、上記核酸ライブラリーを配列決定する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態では、上記オリゴヌクレオチド配列は検出可能標識を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、上記核酸ライブラリーをアレイハイブリダイゼーションによって分析する工程を包含する。

一態様では、本発明は、核酸ライブラリーを調製する方法を提供し、この方法は、（ａ）複数のテンプレート核酸分子のうちの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の第一の末端に対してアダプター配列を連結して、核酸ライブラリーを作成する工程と；（ｂ）この核酸ライブラリーを配列決定する工程と、を包含する。いくつかの実施形態では、この配列決定は、核酸ライブラリーの予備増幅なしで行われる。いくつかの実施形態では、上記複数のテンプレート核酸分子は、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、このｇＤＮＡは、固体組織サンプルから単離される。いくつかの実施形態では、このｇＤＮＡは血漿、血清、痰、唾液、尿、または汗から単離される。いくつかの実施形態では、この複数のテンプレート核酸分子は、一本鎖核酸フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、上記複数のテンプレート核酸分子のうち少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％の第一の末端に対してアダプター配列を連結する工程を包含する。

いくつかの実施形態では、上記連結する工程は、以下の工程：（ａ）ＮＭＰ担持反応物質１の蓄積を達成するのに十分な時間、第一の反応混合物中で核酸の第一の集団（反応物質１）の量までＮＭＰを移動させる工程と；（ｂ）ＮＭＰ担持反応物質１と核酸の第二の集団（反応物質２）との間の共有結合の形成を達成する工程であって、ここでこの反応物質１が、（ｉ）この複数のテンプレート核酸または（ｉｉ）配列決定アダプターのいずれかであって、ここでこの反応物質２が（ｉ）この複数のテンプレート核酸または（ｉｉ）配列決定アダプターの他であり、かつここでこのアデニル化された反応物質１が共有結合の形成を達成するこの工程の前に精製されない工程と、を包含する。いくつかの実施形態では、この移動する工程が、上記反応物質１の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％までＮＭＰの移動を生じる。いくつかの実施形態では、この反応物質１の少なくとも１つのメンバーの３’末端領域が、未改変の３’末端領域である。いくつかの実施形態では、上記反応混合物は、（ａ）反応物質１の上記量に対して少なくとも等モルである量のＮＴＰ依存性リガーゼと；（ｂ）上記ＡＴＰ依存性リガーゼのミカエリス定数（Ｋｍ）より少なくとも１０倍高い量で存在するＮＴＰと；を含む。このＮＴＰ依存性リガーゼは、前述のＮＴＰ依存性リガーゼのいずれであってもよい。いくつかの実施形態では、ＮＴＰ依存性リガーゼは、ＲＮＡリガーゼである。いくつかの実施形態では、このＲＮＡリガーゼは、好熱性のＲＮＡリガーゼである。いくつかの実施形態では、このＮＴＰ依存性リガーゼはＡＴＰ依存性ＲＮＡリガーゼである。いくつかの実施形態では、このＡＴＰ依存性ＲＮＡリガーゼは、ＭｔｈＲｎｌ、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ、またはＣｉｒｃＬｉｇａｓｅＩＩである。いくつかの実施形態では、このＮＴＰ依存性リガーゼは、ＧＴＰ依存性リガーゼである。このＧＴＰ依存性リガーゼは、ＲｔｃＢであってもよい。いくつかの実施形態では、反応物質１の少なくとも１つのメンバーの３’末端領域は、３’末端ブロック基で改変されている。いくつかの実施形態では、共有結合の形成を達成する工程は、上記第一の反応混合物に対して：陽イオンと；上記反応物質２と；上記ＮＴＰを少なくとも１０倍希釈するのに十分な量の液体と、を添加する工程を包含する。いくつかの実施形態では、この陽イオンはＭｎ^２＋である。いくつかの実施形態では、この方法は、上記複数のテンプレート核酸分子のうち少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の第二の末端に対して第二のアダプター配列を連結する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態では、この方法はさらに：（ａ）上記ＤＮＡライブラリーのメンバーに対して、標的選択性オリゴヌクレオチド（ｔｓｏ）をハイブリダイズさせる工程であって、この標的選択性オリゴヌクレオチドが、（ｉ）ｇＤＮＡのある領域に特異的な配列と、（ｉｉ）第二のアダプター配列とを含む工程と；（ｂ）上記ハイブリダイズしたｔｓｏを伸長して、上記第一および第二のアダプターを含む二本鎖ライブラリーのメンバーを作成する工程と、を包含する。いくつかの実施形態では、このｔｓｏは、癌関連遺伝子のある領域に対して少なくとも７０％の同一性または相補性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、この配列決定する工程は、大規模並列（ｍａｓｓｉｖｅｌｙｐａｒａｌｌｅｌ）配列決定を包含する。いくつかの実施形態では、上記連結は、３時間未満行われ得る、反応プロトコールを用いて行われる。

別の態様では、本発明は、高効率のライゲーションを行うためのキットを提供する。いくつかの実施形態では、このキットは、ＮＴＰ依存性リガーゼと；陽イオンと；ＮＴＰと；本明細書に記載の任意の方法を行うための使用説明書と；を含む。

本発明はまた、被験体の腫瘍から単離された腫瘍ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）およびこの被験体由来の非腫瘍組織から単離された正常なｇＤＮＡを用いて、腫瘍特異的な変異を追跡する方法を提供し、この方法は、（ａ）予備増幅なしでこの腫瘍ｇＤＮＡから調製されたＤＮＡライブラリーを配列決定して第一のデータセットを作成する工程と；（ｂ）予備増幅なしでこの正常なｇＤＮＡから調製されたＤＮＡライブラリーを配列決定して第二のデータセットを作成する工程と；（ｃ）この第一および第二のデータセットを分析して、この被験体における１つ以上の腫瘍特異的な変異を特定する工程と；（ｄ）この被験体由来の液体サンプルから単離された無細胞ＤＮＡ中でこの腫瘍特異的な変異の存在または不在を検出する工程と、を包含する。いくつかの実施形態では、この流体サンプルは、血漿、血清、痰、唾液、尿、および汗からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、工程（ａ）または（ｂ）のＤＮＡライブラリーは、本明細書に記載の任意の方法を用いて調製される。いくつかの実施形態では、上記配列決定は、少なくとも２００の癌関連遺伝子を配列決定する工程を包含する。いくつかの実施形態では、この癌関連遺伝子は、ＡＢＣＡ１、ＢＲＡＦ、ＣＨＤ５、ＥＰ３００、ＦＬＴ１、ＩＴＰＡ、ＭＹＣ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＳＫＰ２、ＴＰ５３、ＡＢＣＡ７、ＢＲＣＡ１、ＣＨＥＫ１、ＥＰＨＡ３、ＦＬＴ３、ＪＡＫ１、ＭＹＣＬ１、ＰＩＫ３Ｒ２、ＳＬＣ１９Ａ１、ＴＰ７３、ＡＢＣＢ１、ＢＲＣＡ２、ＣＨＥＫ２、ＥＰＨＡ５、ＦＬＴ４、ＪＡＫ２、ＭＹＣＮ、ＰＫＨＤ１、ＳＬＣ１Ａ６、ＴＰＭ３、ＡＢＣＣ２、ＢＲＩＰ１、ＣＬＴＣ、ＥＰＨＡ６、ＦＮ１、ＪＡＫ３、ＭＹＨ２、ＰＬＣＢ１、ＳＬＣ２２Ａ２、ＴＰＭＴ、ＡＢＣＣ３、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＯＬ１Ａ１、ＥＰＨＡ７、ＦＯＳ、ＪＵＮ、ＭＹＨ９、ＰＬＣＧ１、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＴＰＯ、ＡＢＣＣ４、Ｃ１ｏｒｆ１４４、ＣＯＰＳ５、ＥＰＨＡ８、ＦＯＸＯ１、ＫＢＴＢＤ１１、ＮＡＶ３、ＰＬＣＧ２、ＳＭＡＤ２、ＴＰＲ、ＡＢＣＧ２、ＣＡＢＬＥＳ１、ＣＲＥＢ１、ＥＰＨＢ１、ＦＯＸＯ３、ＫＤＭ６Ａ、ＮＢＮ、ＰＭＬ、ＳＭＡＤ３、ＴＲＩＯ、ＡＢＬ１、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＣＲＥＢＢＰ、ＥＰＨＢ４、ＦＯＸＰ４、ＫＤＲ、ＮＣＯＡ２、ＰＭＳ２、ＳＭＡＤ４、ＴＲＲＡＰ、ＡＢＬ２、ＣＡＭＫＶ、ＣＲＫＬ、ＥＰＨＢ６、ＧＡＢ１、ＫＩＴ、ＮＥＫ１１、ＰＰＡＲＧ、ＳＭＡＲＣＡ４、ＴＳＣ１、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＣＡＲＤ１１、ＣＲＬＦ２、ＥＰＯ、ＧＡＴＡ１、ＫＬＦ６、ＮＦ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＳＭＡＲＣＢ１、ＴＳＣ２、ＡＣＶＲ２Ａ、ＣＡＲＭ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＥＲＢＢ２、ＧＬＩ１、ＫＬＨＤＣ４、ＮＦ２、ＰＰＰ１Ｒ３Ａ、ＳＭＯ、ＴＴＫ、ＡＤＣＹ９、ＣＡＶ１、ＣＳＭＤ３、ＥＲＢＢ３、ＧＬＩ３、ＫＲＡＳ、ＮＫＸ２−１、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＳＯＣＳ１、ＴＹＫ２、ＡＧＡＰ２、ＣＢＦＡ２Ｔ３、ＣＳＮＫ１Ｇ２、ＥＲＢＢ４、ＧＮＡ１１、ＬＭＯ２、ＮＯＳ２、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ、ＳＯＤ２、ＴＹＭＳ、ＡＫＴ１、ＣＢＬ、ＣＴＮＮＡ１、ＥＲＣＣ１、ＧＮＡＱ、ＬＲＰ１Ｂ、ＮＯＳ３、ＰＲＫＡＡ２、ＳＯＳ１、ＵＧＴ１Ａ１、ＡＫＴ２、ＣＣＮＤ１、ＣＴＮＮＡ２、ＥＲＣＣ２、ＧＮＡＳ、ＬＲＰ２、ＮＯＴＣＨ１、ＰＲＫＣＡ、ＳＯＸ１０、ＵＭＰＳ、ＡＫＴ３、ＣＣＮＤ２、ＣＴＮＮＢ１、ＥＲＣＣ３、ＧＰＲ１２４、ＬＲＰ６、ＮＯＴＣＨ２、ＰＲＫＣＺ、ＳＯＸ２、ＵＳＰ９Ｘ、ＡＬＫ、ＣＣＮＤ３、ＣＹＦＩＰ１、ＥＲＣＣ４、ＧＰＲ１３３、ＬＴＫ、ＮＯＴＣＨ３、ＰＲＫＤＣ、ＳＰ１、ＶＥＧＦ、ＡＮＡＰＣ５、ＣＣＮＥ１、ＣＹＬＤ、ＥＲＣＣ５、ＧＲＢ２、ＭＡＮ１Ｂ１、ＮＰＭ１、ＰＴＣＨ１、ＳＰＲＹ２、ＶＥＧＦＡ、ＡＰＣ、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＹＰ１９Ａ１、ＥＲＣＣ６、ＧＳＫ３Ｂ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＮＱＯ１、ＰＴＣＨ２、ＳＲＣ、ＶＨＬ、ＡＰＣ２、ＣＤ４４、ＣＹＰ１Ｂ１、ＥＲＧ、ＧＳＴＰ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＲ３Ｃ１、ＰＴＥＮ、ＳＴ６ＧＡＬ２、ＷＲＮ、ＡＲ、ＣＤ７９Ａ、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＥＲＮ２、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＭＡＰ２Ｋ４、ＮＲＡＳ、ＰＴＧＳ２、ＳＴＡＴ１、ＷＴ１、ＡＲＡＦ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＹＰ２Ｃ８、ＥＳＲ１、ＨＤＡＣ１、ＭＡＰ２Ｋ７、ＮＲＰ２、ＰＴＰＮ１１、ＳＴＡＴ３、ＸＰＡ、ＡＲＦＲＰ１、ＣＤＣ４２、ＣＹＰ２Ｄ６、ＥＳＲ２、ＨＤＡＣ２、ＭＡＰ３Ｋ１、ＮＴＲＫ１、ＰＴＰＲＢ、ＳＴＫ１１、ＸＰＣ、ＡＲＩＤ１Ａ、ＣＤＣ４２ＢＰＢ、ＣＹＰ３Ａ４、ＥＴＶ４、ＨＧＦ、ＭＡＰＫ１、ＮＴＲＫ２、ＰＴＰＲＤ、ＳＵＦＵ、ＺＦＹ、ＡＴＭ、ＣＤＣ７３、ＣＹＰ３Ａ５、ＥＷＳＲ１、ＨＩＦ１Ａ、ＭＡＰＫ３、ＮＴＲＫ３、ＲＡＤ５０、ＳＵＬＴ１Ａ１、ＺＮＦ５２１、ＡＴＰ５Ａ１、ＣＤＨ１、ＤＡＣＨ２、ＥＸＴ１、ＨＭ１３、ＭＡＰＫ８、ＯＭＡ１、ＲＡＤ５１、ＳＵＺ１２、ＡＴＲ、ＣＤＨ１０、ＤＣＣ、ＥＺＨ２、ＨＭＧＡ１、ＭＡＲＫ３、ＯＲ１０Ｒ２、ＲＡＦ１、ＴＡＦ１、ＡＵＲＫＡ、ＣＤＨ２、ＤＣＬＫ３、ＦＡＮＣＡ、ＨＮＦ１Ａ、ＭＣＬ１、ＰＡＫ３、ＲＡＲＡ、ＴＢＸ２２、ＡＵＲＫＢ、ＣＤＨ２０、ＤＤＢ２、ＦＡＮＣＤ２、ＨＯＸＡ３、ＭＤＭ２、ＰＡＲＰ１、ＲＢ１、ＴＣＦ１２、ＢＡＩ３、ＣＤＨ５、ＤＤＲ２、ＦＡＮＣＥ、ＨＯＸＡ９、ＭＤＭ４、ＰＡＸ５、ＲＥＭ１、ＴＣＦ３、ＢＡＰ１、ＣＤＫ２、ＤＧＫＢ、ＦＡＮＣＦ、ＨＲＡＳ、ＭＥＣＯＭ、ＰＣＤＨ１５、ＲＥＴ、ＴＣＦ４、ＢＡＲＤ１、ＣＤＫ４、ＤＧＫＺ、ＦＡＳ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＭＥＮ１、ＰＣＤＨ１８、ＲＩＣＴＯＲ、ＴＥＫ、ＢＡＸ、ＣＤＫ６、ＤＩＲＡＳ３、ＦＢＸＷ７、ＩＤＨ１、ＭＥＴ、ＰＣＮＡ、ＲＩＰＫ１、ＴＥＰ１、ＢＣＬ１１Ａ、ＣＤＫ７、ＤＬＧ３、ＦＣＧＲ３Ａ、ＩＤＨ２、ＭＩＴＦ、ＰＤＧＦＡ、ＲＯＲ１、ＴＥＲＴ、ＢＣＬ２、ＣＤＫ８、ＤＬＬ１、ＦＥＳ、ＩＦＮＧ、ＭＬＨ１、ＰＤＧＦＢ、ＲＯＲ２、ＴＥＴ２、ＢＣＬ２Ａ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＤＮＭＴ１、ＦＧＦＲ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＭＬＬ、ＰＤＧＦＲＡ、ＲＯＳ１、ＴＧＦＢＲ２、ＢＣＬ２Ｌ１、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＦＧＦＲ２、ＩＧＦ２Ｒ、ＭＬＬ３、ＰＤＧＦＲＢ、ＲＰＳ６ＫＡ２、ＴＨＢＳ１、ＢＣＬ２Ｌ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＦＧＦＲ３、ＩＫＢＫＥ、ＭＰＬ、ＰＤＺＲＮ３、ＲＰＴＯＲ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＢＣＬ３、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＤＯＴ１Ｌ、ＦＧＦＲ４、ＩＫＺＦ１、ＭＲＥ１１Ａ、ＰＨＬＰＰ２、ＲＳＰＯ２、ＴＮＫＳ、ＢＣＬ６、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＤＰＹＤ、ＦＨ、ＩＬ２ＲＧ、ＭＳＨ２、ＰＩＫ３Ｃ３、ＲＳＰＯ３、ＴＮＫＳ２、ＢＣＲ、ＣＤＫＮ２Ｄ、Ｅ２Ｆ１、ＦＨＯＤ３、ＩＮＨＢＡ、ＭＳＨ６、ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＵＮＸ１、ＴＮＮＩ３Ｋ、ＢＩＲＣ５、ＣＤＸ２、ＥＥＤ、ＦＩＧＦ、ＩＮＳＲ、ＭＴＨＦＲ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＳＤＨＢ、ＴＮＲ、ＢＩＲＣ６、ＣＥＢＰＡ、ＥＧＦ、ＦＬＧ２、ＩＲＳ１、ＭＴＯＲ、ＰＩＫ３ＣＤ、ＳＦ３Ｂ１、ＴＯＰ１、ＢＬＭ、ＣＥＲＫ、ＥＧＦＲ、ＦＬＮＣ、ＩＲＳ２、ＭＵＴＹＨ、ＰＩＫ３ＣＧ、ＳＨＣ１、およびＴＯＰ２Ａからなる群より選択される。

いくつかの実施形態では、この方法は、上記腫瘍特異的な変異のプロファイルを連絡するレポートを作成する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態では、被験体由来の液体サンプルから単離された無細胞ＤＮＡ中の腫瘍特異的変異の存在または不在を検出する工程は、複数の時点で行われる。いくつかの実施形態では、１つの時点は、癌治療の最初の施行の前であり、かつ第二の時点はこの最初の施行に引き続く。いくつかの実施形態では、この方法は、上記複数の時点で腫瘍特異的な変異のプロファイルを連絡するレポートを作成する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態では、このレポートは、上記腫瘍特異的変異の１つを保有する遺伝子を標的にする１つ以上の治療候補のリストを含む。いくつかの実施形態では、このレポートは、上記ｇＤＮＡを単離する工程から１週で作成される。いくつかの実施形態では、上記変異は、コピー数変動を含む。いくつかの実施形態では、上記検出する工程は、上記無細胞ＤＮＡを配列決定する工程を包含する。いくつかの実施形態では、上記方法は、無細胞ＤＮＡ中に存在する少なくとも１０個の癌関連遺伝子を配列決定する工程を包含し、ここでこの少なくとも１０個の癌関連遺伝子のうちの１つが、腫瘍特異的な変異を保有していると同定される。いくつかの実施形態では、この方法は、無細胞ＤＮＡ中に存在する少なくとも１００個の癌関連遺伝子を配列決定する工程を包含し、ここでこの少なくとも１００個の癌関連遺伝子のうちの１つが、腫瘍特異的な変異を保有していると同定される。いくつかの実施形態では、上記配列決定する工程は、本明細書に記載の任意の方法によって配列決定する工程を包含する。

いくつかの態様では、本発明は、低い融点（Ｔｍ）を有するオリゴヌクレオチドプローブ、例えば、低Ｔｍプローブであって、検出可能部分と；クエンチャー部分と；５０℃未満の融点（Ｔｍ）とを含む、プローブを提供する。いくつかの実施形態では、この低Ｔｍプローブは、８〜３０ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、この検出可能部分は、５５℃以上の温度でクエンチされる。いくつかの実施形態では、この低Ｔｍプローブは、５５℃を超える周囲温度では相補的なテンプレート核酸に対してハイブリダイズしない。いくつかの実施形態では、クエンチャー部分は、上記プローブが、テンプレート鎖に対してハイブリダイズされない場合、検出可能部分をクエンチする。いくつかの実施形態では、低ＴｍプローブのＴｍは、３０℃〜４５℃である。いくつかの実施形態では、フルオロフォア部分およびクエンチャー部分は低Ｔｍプローブで、少なくとも７ヌクレオチド離れて隔てられる。いくつかの実施形態では、この低Ｔｍプローブは、ＴＭを増強する塩基を有するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、このＴＭを増強する塩基を有するヌクレオチドは、スーパーベース（Ｓｕｐｅｒｂａｓｅ）、ロックドヌクレオチド、または架橋ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、低Ｔｍプローブの検出可能部分は、フルオロフォアを含む。

いくつかの実施形態では、上記低Ｔｍプローブは、少なくとも１５ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、この低Ｔｍプローブは、少なくとも４０％のＧＣ含量を有する。いくつかの実施形態では、この低Ｔｍプローブは、８０％未満のＧＣ含量を有する。いくつかの実施形態では、この低Ｔｍプローブは、５０％未満のＧＣ含量を有する。いくつかの実施形態では、この低Ｔｍプローブは、４０％未満のＧＣ含量を有する。

いくつかの実施形態では、この低Ｔｍプローブは、１５ヌクレオチド未満の長さを有する。いくつかの実施形態では、この低Ｔｍプローブは、４０％未満のＧＣ含量を有する。いくつかの実施形態では、この低Ｔｍプローブは、少なくとも４０％のＧＣ含量を有する。いくつかの実施形態では、この低Ｔｍプローブは、４０〜８０％のＧＣ含量を有する。いくつかの実施形態では、この低Ｔｍプローブは、４０％未満のＧＣ含量を有し、さらに、超塩基（ｓｕｐｅｒｂａｓｅ）、ロックされるかまたは架橋されたヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、上記低Ｔｍプローブは、ＡＢＣＡ１、ＢＲＡＦ、ＣＨＤ５、ＥＰ３００、ＦＬＴ１、ＩＴＰＡ、ＭＹＣ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＳＫＰ２、ＴＰ５３、ＡＢＣＡ７、ＢＲＣＡ１、ＣＨＥＫ１、ＥＰＨＡ３、ＦＬＴ３、ＪＡＫ１、ＭＹＣＬ１、ＰＩＫ３Ｒ２、ＳＬＣ１９Ａ１、ＴＰ７３、ＡＢＣＢ１、ＢＲＣＡ２、ＣＨＥＫ２、ＥＰＨＡ５、ＦＬＴ４、ＪＡＫ２、ＭＹＣＮ、ＰＫＨＤ１、ＳＬＣ１Ａ６、ＴＰＭ３、ＡＢＣＣ２、ＢＲＩＰ１、ＣＬＴＣ、ＥＰＨＡ６、ＦＮ１、ＪＡＫ３、ＭＹＨ２、ＰＬＣＢ１、ＳＬＣ２２Ａ２、ＴＰＭＴ、ＡＢＣＣ３、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＯＬ１Ａ１、ＥＰＨＡ７、ＦＯＳ、ＪＵＮ、ＭＹＨ９、ＰＬＣＧ１、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＴＰＯ、ＡＢＣＣ４、Ｃ１ｏｒｆ１４４、ＣＯＰＳ５、ＥＰＨＡ８、ＦＯＸＯ１、ＫＢＴＢＤ１１、ＮＡＶ３、ＰＬＣＧ２、ＳＭＡＤ２、ＴＰＲ、ＡＢＣＧ２、ＣＡＢＬＥＳ１、ＣＲＥＢ１、ＥＰＨＢ１、ＦＯＸＯ３、ＫＤＭ６Ａ、ＮＢＮ、ＰＭＬ、ＳＭＡＤ３、ＴＲＩＯ、ＡＢＬ１、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＣＲＥＢＢＰ、ＥＰＨＢ４、ＦＯＸＰ４、ＫＤＲ、ＮＣＯＡ２、ＰＭＳ２、ＳＭＡＤ４、ＴＲＲＡＰ、ＡＢＬ２、ＣＡＭＫＶ、ＣＲＫＬ、ＥＰＨＢ６、ＧＡＢ１、ＫＩＴ、ＮＥＫ１１、ＰＰＡＲＧ、ＳＭＡＲＣＡ４、ＴＳＣ１、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＣＡＲＤ１１、ＣＲＬＦ２、ＥＰＯ、ＧＡＴＡ１、ＫＬＦ６、ＮＦ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＳＭＡＲＣＢ１、ＴＳＣ２、ＡＣＶＲ２Ａ、ＣＡＲＭ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＥＲＢＢ２、ＧＬＩ１、ＫＬＨＤＣ４、ＮＦ２、ＰＰＰ１Ｒ３Ａ、ＳＭＯ、ＴＴＫ、ＡＤＣＹ９、ＣＡＶ１、ＣＳＭＤ３、ＥＲＢＢ３、ＧＬＩ３、ＫＲＡＳ、ＮＫＸ２−１、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＳＯＣＳ１、ＴＹＫ２、ＡＧＡＰ２、ＣＢＦＡ２Ｔ３、ＣＳＮＫ１Ｇ２、ＥＲＢＢ４、ＧＮＡ１１、ＬＭＯ２、ＮＯＳ２、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ、ＳＯＤ２、ＴＹＭＳ、ＡＫＴ１、ＣＢＬ、ＣＴＮＮＡ１、ＥＲＣＣ１、ＧＮＡＱ、ＬＲＰ１Ｂ、ＮＯＳ３、ＰＲＫＡＡ２、ＳＯＳ１、ＵＧＴ１Ａ１、ＡＫＴ２、ＣＣＮＤ１、ＣＴＮＮＡ２、ＥＲＣＣ２、ＧＮＡＳ、ＬＲＰ２、ＮＯＴＣＨ１、ＰＲＫＣＡ、ＳＯＸ１０、ＵＭＰＳ、ＡＫＴ３、ＣＣＮＤ２、ＣＴＮＮＢ１、ＥＲＣＣ３、ＧＰＲ１２４、ＬＲＰ６、ＮＯＴＣＨ２、ＰＲＫＣＺ、ＳＯＸ２、ＵＳＰ９Ｘ、ＡＬＫ、ＣＣＮＤ３、ＣＹＦＩＰ１、ＥＲＣＣ４、ＧＰＲ１３３、ＬＴＫ、ＮＯＴＣＨ３、ＰＲＫＤＣ、ＳＰ１、ＶＥＧＦ、ＡＮＡＰＣ５、ＣＣＮＥ１、ＣＹＬＤ、ＥＲＣＣ５、ＧＲＢ２、ＭＡＮ１Ｂ１、ＮＰＭ１、ＰＴＣＨ１、ＳＰＲＹ２、ＶＥＧＦＡ、ＡＰＣ、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＹＰ１９Ａ１、ＥＲＣＣ６、ＧＳＫ３Ｂ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＮＱＯ１、ＰＴＣＨ２、ＳＲＣ、ＶＨＬ、ＡＰＣ２、ＣＤ４４、ＣＹＰ１Ｂ１、ＥＲＧ、ＧＳＴＰ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＲ３Ｃ１、ＰＴＥＮ、ＳＴ６ＧＡＬ２、ＷＲＮ、ＡＲ、ＣＤ７９Ａ、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＥＲＮ２、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＭＡＰ２Ｋ４、ＮＲＡＳ、ＰＴＧＳ２、ＳＴＡＴ１、ＷＴ１、ＡＲＡＦ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＹＰ２Ｃ８、ＥＳＲ１、ＨＤＡＣ１、ＭＡＰ２Ｋ７、ＮＲＰ２、ＰＴＰＮ１１、ＳＴＡＴ３、ＸＰＡ、ＡＲＦＲＰ１、ＣＤＣ４２、ＣＹＰ２Ｄ６、ＥＳＲ２、ＨＤＡＣ２、ＭＡＰ３Ｋ１、ＮＴＲＫ１、ＰＴＰＲＢ、ＳＴＫ１１、ＸＰＣ、ＡＲＩＤ１Ａ、ＣＤＣ４２ＢＰＢ、ＣＹＰ３Ａ４、ＥＴＶ４、ＨＧＦ、ＭＡＰＫ１、ＮＴＲＫ２、ＰＴＰＲＤ、ＳＵＦＵ、ＺＦＹ、ＡＴＭ、ＣＤＣ７３、ＣＹＰ３Ａ５、ＥＷＳＲ１、ＨＩＦ１Ａ、ＭＡＰＫ３、ＮＴＲＫ３、ＲＡＤ５０、ＳＵＬＴ１Ａ１、ＺＮＦ５２１、ＡＴＰ５Ａ１、ＣＤＨ１、ＤＡＣＨ２、ＥＸＴ１、ＨＭ１３、ＭＡＰＫ８、ＯＭＡ１、ＲＡＤ５１、ＳＵＺ１２、ＡＴＲ、ＣＤＨ１０、ＤＣＣ、ＥＺＨ２、ＨＭＧＡ１、ＭＡＲＫ３、ＯＲ１０Ｒ２、ＲＡＦ１、ＴＡＦ１、ＡＵＲＫＡ、ＣＤＨ２、ＤＣＬＫ３、ＦＡＮＣＡ、ＨＮＦ１Ａ、ＭＣＬ１、ＰＡＫ３、ＲＡＲＡ、ＴＢＸ２２、ＡＵＲＫＢ、ＣＤＨ２０、ＤＤＢ２、ＦＡＮＣＤ２、ＨＯＸＡ３、ＭＤＭ２、ＰＡＲＰ１、ＲＢ１、ＴＣＦ１２、ＢＡＩ３、ＣＤＨ５、ＤＤＲ２、ＦＡＮＣＥ、ＨＯＸＡ９、ＭＤＭ４、ＰＡＸ５、ＲＥＭ１、ＴＣＦ３、ＢＡＰ１、ＣＤＫ２、ＤＧＫＢ、ＦＡＮＣＦ、ＨＲＡＳ、ＭＥＣＯＭ、ＰＣＤＨ１５、ＲＥＴ、ＴＣＦ４、ＢＡＲＤ１、ＣＤＫ４、ＤＧＫＺ、ＦＡＳ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＭＥＮ１、ＰＣＤＨ１８、ＲＩＣＴＯＲ、ＴＥＫ、ＢＡＸ、ＣＤＫ６、ＤＩＲＡＳ３、ＦＢＸＷ７、ＩＤＨ１、ＭＥＴ、ＰＣＮＡ、ＲＩＰＫ１、ＴＥＰ１、ＢＣＬ１１Ａ、ＣＤＫ７、ＤＬＧ３、ＦＣＧＲ３Ａ、ＩＤＨ２、ＭＩＴＦ、ＰＤＧＦＡ、ＲＯＲ１、ＴＥＲＴ、ＢＣＬ２、ＣＤＫ８、ＤＬＬ１、ＦＥＳ、ＩＦＮＧ、ＭＬＨ１、ＰＤＧＦＢ、ＲＯＲ２、ＴＥＴ２、ＢＣＬ２Ａ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＤＮＭＴ１、ＦＧＦＲ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＭＬＬ、ＰＤＧＦＲＡ、ＲＯＳ１、ＴＧＦＢＲ２、ＢＣＬ２Ｌ１、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＦＧＦＲ２、ＩＧＦ２Ｒ、ＭＬＬ３、ＰＤＧＦＲＢ、ＲＰＳ６ＫＡ２、ＴＨＢＳ１、ＢＣＬ２Ｌ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＦＧＦＲ３、ＩＫＢＫＥ、ＭＰＬ、ＰＤＺＲＮ３、ＲＰＴＯＲ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＢＣＬ３、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＤＯＴ１Ｌ、ＦＧＦＲ４、ＩＫＺＦ１、ＭＲＥ１１Ａ、ＰＨＬＰＰ２、ＲＳＰＯ２、ＴＮＫＳ、ＢＣＬ６、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＤＰＹＤ、ＦＨ、ＩＬ２ＲＧ、ＭＳＨ２、ＰＩＫ３Ｃ３、ＲＳＰＯ３、ＴＮＫＳ２、ＢＣＲ、ＣＤＫＮ２Ｄ、Ｅ２Ｆ１、ＦＨＯＤ３、ＩＮＨＢＡ、ＭＳＨ６、ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＵＮＸ１、ＴＮＮＩ３Ｋ、ＢＩＲＣ５、ＣＤＸ２、ＥＥＤ、ＦＩＧＦ、ＩＮＳＲ、ＭＴＨＦＲ、ＨＡＤＨ、ＲＰＰ３０、ＺＦＰ３、ＰＩＫ３ＣＢ、ＳＤＨＢ、ＴＮＲ、ＢＩＲＣ６、ＣＥＢＰＡ、ＥＧＦ、ＦＬＧ２、ＩＲＳ１、ＭＴＯＲ、ＰＩＫ３ＣＤ、ＳＦ３Ｂ１、ＴＯＰ１、ＢＬＭ、ＣＥＲＫ、ＥＧＦＲ、ＦＬＮＣ、ＩＲＳ２、ＭＵＴＹＨ、ＰＩＫ３ＣＧ、ＳＨＣ１、およびＴＯＰ２Ａからなる群より選択される遺伝子中に含まれる少なくとも１０連続のヌクレオチドのヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の相補性または同一性を有する配列を含む。

いくつかの態様では、本発明はまた、少なくとも１つのプライマー／プローブセットを含む反応混合物を提供し、ここでこのプライマー／プローブセットは：第一の位置でゲノム領域に対してハイブリダイズするように設計されたフォワードプライマーと；本明細書に記載の低Ｔｍプローブと、を含む。いくつかの実施形態では、この反応混合物は、上記ゲノム領域に対して第二の位置でハイブリダイズするように設計されたリバースプライマーをさらに含む。いくつかの実施形態では、この低Ｔｍプローブは、上記フォワードプライマーのＴｍよりも少なくとも１５℃低いＴｍを有する。いくつかの実施形態では、この低Ｔｍプローブは、上記第一のプライマーのＴｍおよび上記第二のプライマーのＴｍの平均よりも少なくとも１５℃低いＴｍを有する。いくつかの実施形態では、この低Ｔｍプローブは、上記第一の位置と第二の位置との間に位置する第三の位置で上記ゲノム領域にハイブリダイズするように設計されている。いくつかの実施形態では、上記リバースプライマーは、上記フォワードプライマーの量よりも少なくとも２倍〜１０倍少ない量で存在する。いくつかの実施形態では、このリバースプライマーは、フォワードプライマーの量とは２倍以下異なる量で存在する。

いくつかの実施形態では、上記反応混合物は、生物学的サンプルから単離された核酸サンプルをさらに含んでいる。いくつかの実施形態では、この生物学的サンプルは、被験体から単離されたサンプルである。いくつかの実施形態では、この被験体はヒト被験体である。いくつかの実施形態では、このヒト被験体は、ある疾患について診断されるか、有すると疑われるか、またはそのリスクが増大していると疑われる。いくつかの実施形態では、この疾患は癌である。いくつかの実施形態では、上記テンプレート核酸はゲノム領域を含む。いくつかの実施形態では、このテンプレート核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはｃＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、この反応混合物は、ポリメラーゼをさらに含んでいる。いくつかの実施形態では、このポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、この反応混合物は、（ａ）第一のテンプレート核酸と；（ｂ）ある量のフォワードプライマーと；（ｃ）リバースプライマーの量が、フォワードプライマーの量よりも少なくとも２倍〜１０倍少ない、量のリバースプライマーと；（ｄ）低Ｔｍプローブと、を含む。

いくつかの実施形態では、上記反応混合物は、複数のプライマー／プローブセットを含む。いくつかの実施形態では、複数の各々のプライマー／プローブセットは、ゲノムＤＮＡの異なる領域に特異的である。いくつかの実施形態では、このゲノム領域は、疾患関連の変異と関連している。いくつかの実施形態では、この変異は、コピー数変動を含む。いくつかの実施形態では、この変異は、一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入、欠失、または逆位を含む。いくつかの実施形態では、上記フォワードプライマーまたはリバースプライマーの１つが、このＳＮＰ、挿入、欠失、または逆位を覆う。いくつかの実施形態では、上記低Ｔｍプローブは、このＳＮＰ、挿入、欠失、または逆位を覆う。いくつかの実施形態では、上記疾患は癌である。

いくつかの実施形態では、上記プライマー／プローブセットは、複数の低Ｔｍプローブを含み、ここで各々の低Ｔｍプローブは、上記ゲノム領域の任意の他の対立遺伝子を含む配列と比較して、このゲノム領域の１つの特定の対立遺伝子を含む配列に対して、より大きい親和性で結合するように設計された対立遺伝子特異的プローブであり、ここで各々の対立遺伝子特異的なプローブが、異なる対立遺伝子に特異的である。

いくつかの実施形態では、この対立遺伝子特異的なプローブの各々は、スペクトル的に別個のフルオロフォアを各々が含む。

いくつかの実施形態では、任意の他の対立遺伝子に対する上記対立遺伝子特異的プローブの結合エネルギーと比較した、上記１つの特異的な対立遺伝子に対する対立遺伝子特異的プローブの結合エネルギーにおける相違は、このゲノム領域に対する低Ｔｍプローブの全体的な結合エネルギーの１％超である。いくつかの実施形態では、この低Ｔｍプローブは、ビーコンプローブである。いくつかの実施形態では、この低Ｔｍプローブは、Ｐｌｅｉａｄｅｓプローブである。

関連の態様では、本発明は、本明細書に記載の低Ｔｍプローブを含む反応混合物を複数の反応容積に分割する工程と；この反応容積中の少なくとも１つにおいて、複数回の温度サイクリングを含むＰＣＲ増幅反応を行う工程であって、ここでこの低Ｔｍプローブが、このＰＣＲ増幅反応の有効性に影響しない工程と、を包含する、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、この低Ｔｍプローブは、上記ＰＣＲ増幅反応のアニーリング段階または伸長段階の間にテンプレート核酸またはＰＣＲ反応生成物に対してハイブリダイズしない。いくつかの実施形態では、この方法は、上記反応容積の少なくとも１つを５０℃未満まで冷却する工程をさらに包含し、ここでこの冷却によって、テンプレート核酸またはＰＣＲ反応生成物に対する低Ｔｍプローブのハイブリダイゼーションが可能になる。いくつかの実施形態では、このテンプレート核酸またはＰＣＲ反応生成物は、低Ｔｍプローブに対して少なくとも７０％の相補性を有する配列を含む。

いくつかの実施形態では、この方法は、上記反応容積の少なくとも１つを３７℃未満まで冷却する工程を包含し、ここでこの冷却によって、上記低Ｔｍプローブに対して少なくとも７０％の相補性を有する配列を含む核酸に対する、この低Ｔｍプローブの量のうち少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％のハイブリダイゼーションが可能になる。いくつかの実施形態では、上記分画によって、平均でテンプレート核酸の１モル未満、１モルまたは１モル超を含む各々の反応容積が生じる。いくつかの実施形態では、この分画によって平均でテンプレート核酸の１モル以上を含む各々の反応容積が生じる。

いくつかの実施形態では、この方法は、指数関数的ＰＣＲ増幅反応および線形ＰＣＲ増幅反応を、少なくとも１つの上記反応容積中で行う工程を包含する。

いくつかの実施形態では、この指数関数的ＰＣＲ増幅反応および上記線形ＰＣＲ増幅反応は、上記反応容積中から成分を添加することも除去することもなく連続して起きる。

いくつかの実施形態では、このＰＣＲ増幅反応によって、増幅生成物のうち少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％または５０％が一本鎖増幅生成物になる。

いくつかの実施形態では、上記反応容積は液滴である。いくつかの実施形態では、上記ハイブリダイゼーションによって、上記低Ｔｍプローブからの蛍光の放出が生じる。いくつかの実施形態では、この方法は、この反応容積のうちの少なくとも１つ中で蛍光の存在または不在を検出する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態では、この方法は、反応容積中の蛍光の強度を測定する工程を包含する。いくつかの実施形態では、この方法は、蛍光陽性の反応容積の数および／または画分を決定する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態では、この方法は、蛍光陽性の反応容積の数および／または画分に基づいて、上記サンプル中の１つ以上の変異の存在、不在または量を決定する工程を包含する。いくつかの実施形態では、この１つ以上の変異は、ＳＮＰ、欠失、挿入、または逆位を含む。いくつかの実施形態では、この１つ以上の変異は、遺伝子のコピー数変動を含む。いくつかの実施形態では、この１つ以上の変異は、疾患関連の変異を含む。いくつかの実施形態では、この疾患は、癌である。いくつかの実施形態では、この１つ以上の変異は、ＡＢＣＡ１、ＢＲＡＦ、ＣＨＤ５、ＥＰ３００、ＦＬＴ１、ＩＴＰＡ、ＭＹＣ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＳＫＰ２、ＴＰ５３、ＡＢＣＡ７、ＢＲＣＡ１、ＣＨＥＫ１、ＥＰＨＡ３、ＦＬＴ３、ＪＡＫ１、ＭＹＣＬ１、ＰＩＫ３Ｒ２、ＳＬＣ１９Ａ１、ＴＰ７３、ＡＢＣＢ１、ＢＲＣＡ２、ＣＨＥＫ２、ＥＰＨＡ５、ＦＬＴ４、ＪＡＫ２、ＭＹＣＮ、ＰＫＨＤ１、ＳＬＣ１Ａ６、ＴＰＭ３、ＡＢＣＣ２、ＢＲＩＰ１、ＣＬＴＣ、ＥＰＨＡ６、ＦＮ１、ＪＡＫ３、ＭＹＨ２、ＰＬＣＢ１、ＳＬＣ２２Ａ２、ＴＰＭＴ、ＡＢＣＣ３、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＯＬ１Ａ１、ＥＰＨＡ７、ＦＯＳ、ＪＵＮ、ＭＹＨ９、ＰＬＣＧ１、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＴＰＯ、ＡＢＣＣ４、Ｃ１ｏｒｆ１４４、ＣＯＰＳ５、ＥＰＨＡ８、ＦＯＸＯ１、ＫＢＴＢＤ１１、ＮＡＶ３、ＰＬＣＧ２、ＳＭＡＤ２、ＴＰＲ、ＡＢＣＧ２、ＣＡＢＬＥＳ１、ＣＲＥＢ１、ＥＰＨＢ１、ＦＯＸＯ３、ＫＤＭ６Ａ、ＮＢＮ、ＰＭＬ、ＳＭＡＤ３、ＴＲＩＯ、ＡＢＬ１、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＣＲＥＢＢＰ、ＥＰＨＢ４、ＦＯＸＰ４、ＫＤＲ、ＮＣＯＡ２、ＰＭＳ２、ＳＭＡＤ４、ＴＲＲＡＰ、ＡＢＬ２、ＣＡＭＫＶ、ＣＲＫＬ、ＥＰＨＢ６、ＧＡＢ１、ＫＩＴ、ＮＥＫ１１、ＰＰＡＲＧ、ＳＭＡＲＣＡ４、ＴＳＣ１、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＣＡＲＤ１１、ＣＲＬＦ２、ＥＰＯ、ＧＡＴＡ１、ＫＬＦ６、ＮＦ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＳＭＡＲＣＢ１、ＴＳＣ２、ＡＣＶＲ２Ａ、ＣＡＲＭ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＥＲＢＢ２、ＧＬＩ１、ＫＬＨＤＣ４、ＮＦ２、ＰＰＰ１Ｒ３Ａ、ＳＭＯ、ＴＴＫ、ＡＤＣＹ９、ＣＡＶ１、ＣＳＭＤ３、ＥＲＢＢ３、ＧＬＩ３、ＫＲＡＳ、ＮＫＸ２−１、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＳＯＣＳ１、ＴＹＫ２、ＡＧＡＰ２、ＣＢＦＡ２Ｔ３、ＣＳＮＫ１Ｇ２、ＥＲＢＢ４、ＧＮＡ１１、ＬＭＯ２、ＮＯＳ２、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ、ＳＯＤ２、ＴＹＭＳ、ＡＫＴ１、ＣＢＬ、ＣＴＮＮＡ１、ＥＲＣＣ１、ＧＮＡＱ、ＬＲＰ１Ｂ、ＮＯＳ３、ＰＲＫＡＡ２、ＳＯＳ１、ＵＧＴ１Ａ１、ＡＫＴ２、ＣＣＮＤ１、ＣＴＮＮＡ２、ＥＲＣＣ２、ＧＮＡＳ、ＬＲＰ２、ＮＯＴＣＨ１、ＰＲＫＣＡ、ＳＯＸ１０、ＵＭＰＳ、ＡＫＴ３、ＣＣＮＤ２、ＣＴＮＮＢ１、ＥＲＣＣ３、ＧＰＲ１２４、ＬＲＰ６、ＮＯＴＣＨ２、ＰＲＫＣＺ、ＳＯＸ２、ＵＳＰ９Ｘ、ＡＬＫ、ＣＣＮＤ３、ＣＹＦＩＰ１、ＥＲＣＣ４、ＧＰＲ１３３、ＬＴＫ、ＮＯＴＣＨ３、ＰＲＫＤＣ、ＳＰ１、ＶＥＧＦ、ＡＮＡＰＣ５、ＣＣＮＥ１、ＣＹＬＤ、ＥＲＣＣ５、ＧＲＢ２、ＭＡＮ１Ｂ１、ＮＰＭ１、ＰＴＣＨ１、ＳＰＲＹ２、ＶＥＧＦＡ、ＡＰＣ、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＹＰ１９Ａ１、ＥＲＣＣ６、ＧＳＫ３Ｂ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＮＱＯ１、ＰＴＣＨ２、ＳＲＣ、ＶＨＬ、ＡＰＣ２、ＣＤ４４、ＣＹＰ１Ｂ１、ＥＲＧ、ＧＳＴＰ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＲ３Ｃ１、ＰＴＥＮ、ＳＴ６ＧＡＬ２、ＷＲＮ、ＡＲ、ＣＤ７９Ａ、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＥＲＮ２、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＭＡＰ２Ｋ４、ＮＲＡＳ、ＰＴＧＳ２、ＳＴＡＴ１、ＷＴ１、ＡＲＡＦ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＹＰ２Ｃ８、ＥＳＲ１、ＨＤＡＣ１、ＭＡＰ２Ｋ７、ＮＲＰ２、ＰＴＰＮ１１、ＳＴＡＴ３、ＸＰＡ、ＡＲＦＲＰ１、ＣＤＣ４２、ＣＹＰ２Ｄ６、ＥＳＲ２、ＨＤＡＣ２、ＭＡＰ３Ｋ１、ＮＴＲＫ１、ＰＴＰＲＢ、ＳＴＫ１１、ＸＰＣ、ＡＲＩＤ１Ａ、ＣＤＣ４２ＢＰＢ、ＣＹＰ３Ａ４、ＥＴＶ４、ＨＧＦ、ＭＡＰＫ１、ＮＴＲＫ２、ＰＴＰＲＤ、ＳＵＦＵ、ＺＦＹ、ＡＴＭ、ＣＤＣ７３、ＣＹＰ３Ａ５、ＥＷＳＲ１、ＨＩＦ１Ａ、ＭＡＰＫ３、ＮＴＲＫ３、ＲＡＤ５０、ＳＵＬＴ１Ａ１、ＺＮＦ５２１、ＡＴＰ５Ａ１、ＣＤＨ１、ＤＡＣＨ２、ＥＸＴ１、ＨＭ１３、ＭＡＰＫ８、ＯＭＡ１、ＲＡＤ５１、ＳＵＺ１２、ＡＴＲ、ＣＤＨ１０、ＤＣＣ、ＥＺＨ２、ＨＭＧＡ１、ＭＡＲＫ３、ＯＲ１０Ｒ２、ＲＡＦ１、ＴＡＦ１、ＡＵＲＫＡ、ＣＤＨ２、ＤＣＬＫ３、ＦＡＮＣＡ、ＨＮＦ１Ａ、ＭＣＬ１、ＰＡＫ３、ＲＡＲＡ、ＴＢＸ２２、ＡＵＲＫＢ、ＣＤＨ２０、ＤＤＢ２、ＦＡＮＣＤ２、ＨＯＸＡ３、ＭＤＭ２、ＰＡＲＰ１、ＲＢ１、ＴＣＦ１２、ＢＡＩ３、ＣＤＨ５、ＤＤＲ２、ＦＡＮＣＥ、ＨＯＸＡ９、ＭＤＭ４、ＰＡＸ５、ＲＥＭ１、ＴＣＦ３、ＢＡＰ１、ＣＤＫ２、ＤＧＫＢ、ＦＡＮＣＦ、ＨＲＡＳ、ＭＥＣＯＭ、ＰＣＤＨ１５、ＲＥＴ、ＴＣＦ４、ＢＡＲＤ１、ＣＤＫ４、ＤＧＫＺ、ＦＡＳ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＭＥＮ１、ＰＣＤＨ１８、ＲＩＣＴＯＲ、ＴＥＫ、ＢＡＸ、ＣＤＫ６、ＤＩＲＡＳ３、ＦＢＸＷ７、ＩＤＨ１、ＭＥＴ、ＰＣＮＡ、ＲＩＰＫ１、ＴＥＰ１、ＢＣＬ１１Ａ、ＣＤＫ７、ＤＬＧ３、ＦＣＧＲ３Ａ、ＩＤＨ２、ＭＩＴＦ、ＰＤＧＦＡ、ＲＯＲ１、ＴＥＲＴ、ＢＣＬ２、ＣＤＫ８、ＤＬＬ１、ＦＥＳ、ＩＦＮＧ、ＭＬＨ１、ＰＤＧＦＢ、ＲＯＲ２、ＴＥＴ２、ＢＣＬ２Ａ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＤＮＭＴ１、ＦＧＦＲ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＭＬＬ、ＰＤＧＦＲＡ、ＲＯＳ１、ＴＧＦＢＲ２、ＢＣＬ２Ｌ１、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＦＧＦＲ２、ＩＧＦ２Ｒ、ＭＬＬ３、ＰＤＧＦＲＢ、ＲＰＳ６ＫＡ２、ＴＨＢＳ１、ＢＣＬ２Ｌ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＦＧＦＲ３、ＩＫＢＫＥ、ＭＰＬ、ＰＤＺＲＮ３、ＲＰＴＯＲ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＢＣＬ３、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＤＯＴ１Ｌ、ＦＧＦＲ４、ＩＫＺＦ１、ＭＲＥ１１Ａ、ＰＨＬＰＰ２、ＲＳＰＯ２、ＴＮＫＳ、ＢＣＬ６、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＤＰＹＤ、ＦＨ、ＩＬ２ＲＧ、ＭＳＨ２、ＰＩＫ３Ｃ３、ＲＳＰＯ３、ＴＮＫＳ２、ＢＣＲ、ＣＤＫＮ２Ｄ、Ｅ２Ｆ１、ＦＨＯＤ３、ＩＮＨＢＡ、ＭＳＨ６、ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＵＮＸ１、ＴＮＮＩ３Ｋ、ＢＩＲＣ５、ＣＤＸ２、ＥＥＤ、ＦＩＧＦ、ＩＮＳＲ、ＭＴＨＦＲ、ＨＡＤＨ、ＲＰＰ３０、ＺＦＰ３、ＰＩＫ３ＣＢ、ＳＤＨＢ、ＴＮＲ、ＢＩＲＣ６、ＣＥＢＰＡ、ＥＧＦ、ＦＬＧ２、ＩＲＳ１、ＭＴＯＲ、ＰＩＫ３ＣＤ、ＳＦ３Ｂ１、ＴＯＰ１、ＢＬＭ、ＣＥＲＫ、ＥＧＦＲ、ＦＬＮＣ、ＩＲＳ２、ＭＵＴＹＨ、ＰＩＫ３ＣＧ、ＳＨＣ１、およびＴＯＰ２Ａからなる群より選択される１つ以上の遺伝子の変異を含む。

いくつかの実施形態では、この１つ以上の変異は、ＤＤＲ２、ＥＧＦＲ、ＡＵＲＫＡ、ＶＥＧＦＡ、ＦＧＦＲ１、ＣＤＫ４、ＥＦＢＢ２、ＣＤＫ６、ＪＡＫ２、ＭＥＴ、ＢＲＡＦ、ＥＲＢＢ３、およびＳＲＣからなる群より選択される１つ以上の遺伝子の変異を含む。

いくつかの実施形態では、この方法は、上記サンプル中の上記変異の存在、不在および／またはレベルのプロファイルを連絡するレポートを作成する工程を包含する。いくつかの実施形態では、このレポートは、変異を標的にする治療剤の説明をさらに含む。

関連の態様では、本発明は、コンピュータシステムを提供し、このコンピュータシステムは：サンプルからデータを受容するように構成されたメモリユニットであって、ここでこのデータが低Ｔｍプローブを使用して任意の前述の方法によって作成されるメモリユニットと；このデータの分析のためのコンピュータ実行可能な命令と；この分析に基づいて、このサンプル中の変異の存在、不在または量を決定するためのコンピュータ実行可能な命令と；を備える。いくつかの実施形態では、このコンピュータシステムは、サンプル中の変異の存在、不在または量のレポートを作成するためのコンピュータ実行可能な命令をさらに備える。いくつかの実施形態では、このコンピュータシステムは、サンプル中の変異の存在、不在または量に基づいて、治療の選択肢のレポートを作成するためのコンピュータ実行可能な命令をさらに備える。いくつかの実施形態では、このコンピュータシステムは、このレポートをユーザーに対して連絡または提示するように構成されたユーザーインターフェースをさらに備える。

さらに別の関連の態様では、本発明は、キットであって：少なくとも１つのプライマー／プローブセットであって、ここでこのプライマー／プローブセットが、（ｉ）第一の位置でゲノム領域に対してハイブリダイズするように設計されたフォワードプライマー、（ｉｉ）第二の位置でこのゲノム領域に対してハイブリダイズするように設計されたリバースプライマー、および（ｉｉｉ）本明細書に記載の低Ｔｍプローブであって、ここで低Ｔｍプローブが、第三の位置でこのゲノム領域に対してハイブリダイズするように設計されているプローブを含む、プライマー／プローブセットと；を含む、キットを提供する。

本発明はまた、癌の処置を必要とする被験体における癌を処置する方法であって：（ａ）この被験体から生物学的サンプルを得る工程と；（ｂ）この生物学的サンプルから単離された核酸サンプルから、ＭＥＴ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＬＴ３、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、ｍＴＯＲ、ＣＤＫ４、ＨＥＲ２、ＲＥＴ、ＨＡＤＨ、ＺＦＰ３、ＤＤＲ２、ＡＵＲＫＡ、ＶＥＧＦＡ、ＣＤＫ６、ＪＡＫ２、ＢＲＡＦ、およびＳＲＣからなる群より選択される少なくとも５つの遺伝子中でのコピー数変動（ＣＮＶ）の存在または不在を決定する工程と；（ｃ）この決定する工程に基づいて、被験体特異的なＣＮＶプロファイルを作成する工程と；（ｄ）この被験体特異的なＣＮＶプロファイルに基づいて、この被験体の癌治療を選択する工程と；を包含する、方法を提供する。いくつかの実施形態では、このＣＮＶの存在または不在を決定する工程は、任意の前述の方法の使用を包含する。いくつかの実施形態では、この決定する工程は、デジタルＰＣＲアッセイを含む。いくつかの実施形態では、このデジタルＰＣＲアッセイは、任意の前述のオリゴヌクレオチドプローブの使用を包含する。いくつかの実施形態では、このオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号６１、６４、６７、７０、７３、７６、７９、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１０９、１１２、１１５、または１１８のいずれかのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、このデジタルＰＣＲアッセイは、任意の前述のプライマーの使用を包含する。いくつかの実施形態では、このプライマーは、配列番号５９、６０、６２、６３、６５、６６、６８、６９、７１、７２、７４、７５、７７、７８、８０、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１６、または１１７のいずれかのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、少なくとも１０、１２または１８の遺伝子中のＣＮＶの存在または不在を決定する工程を包含する。いくつかの実施形態では、上記生物学的サンプルは、癌に由来する核酸を保有すると疑われる。いくつかの実施形態では、この生物学的サンプルは、固体組織サンプルである。いくつかの実施形態では、この固体組織サンプルは、ホルマリン固定され、パラフィン包埋されたサンプルである。いくつかの実施形態では、この生物学的サンプルは液体の生物学的サンプルである。いくつかの実施形態では、この液体の生物学的サンプルは、血液、血清、血漿、尿、汗、涙、唾液、および痰からなる群より選択される。

本発明はまた、コンピュータシステムであって：（ａ）サンプルからデータを受容するように構成されたメモリユニットであって、ここでこのデータが任意の前述の方法によって作成されるメモリユニットと；（ｂ）上記データの分析のためのコンピュータ実行可能な命令と；（ｃ）この分析に基づいて、このサンプル中の変異の存在、不在または量を決定するためのコンピュータ実行可能な命令と；を備える、コンピュータシステムを提供する。いくつかの実施形態では、このコンピュータシステムは、サンプル中の変異の存在、不在または量のレポートを作成するためのコンピュータ実行可能な命令をさらに備える。いくつかの実施形態では、このコンピュータシステムは、サンプル中の変異の存在、不在または量に基づいて治療の選択肢のレポートを作成するためのコンピュータ実行可能な命令をさらに備える。いくつかの実施形態では、このコンピュータシステムは、上記レポートをユーザーに対して連絡または提示するように構成されたユーザーインターフェースをさらに備える。

本発明はまた、キットであって：（ａ）少なくとも１つのプライマー／プローブセットであって、ここでこのプライマー／プローブセットが、（ｉ）第一の位置でゲノム領域に対してハイブリダイズするように設計されたフォワードプライマー、（ｉｉ）第二の位置でこのゲノム領域に対してハイブリダイズするように設計されたリバースプライマー、および（ｉｉｉ）前に記載のようなオリゴヌクレオチドプローブであって、オリゴヌクレオチドプローブが、この第一の位置と第二の位置との間に位置する第三の位置でこのゲノム領域に対してハイブリダイズするように設計されているオリゴヌクレオチドプローブ、を含む、プライマー／プローブセットと；（ｂ）使用説明書と、を含む、キットを提供する。

本発明はまた、配列番号４〜２１、２３、２４、６１、６４、６７、７０、７３、７６、７９、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１０９、１１２、１１５、または１１８のいずれかに示されるオリゴヌクレオチドプローブを提供する。

本発明はまた、配列番号１９４８〜５５９３のいずれかに示される標的選択性オリゴヌクレオチドを提供する。

本発明はまた、配列番号２５または２６に示される配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを提供する。

本発明はまた、配列番号１〜３、２２、２７〜５８、５９、６０、６２、６３、６５、６６、６８、６９、７１、７２、７４、７５、７７、７８、８０、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１６、または１１７のいずれかに示される配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを提供する。

（参照による援用）
本明細書に言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、各々の個々の刊行物、特許または特許出願が、参照によって詳細にかつ個々に援用されると示されているのと同じ程度まで、参照によって本明細書に援用される。

本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に具体的に示される。本発明の特徴および利点の良好な理解は、本発明の原理を利用している、例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明、および添付の図面を参照して得られる。

図１は、被験体における癌を評価するための方法の例示的なワークフローを示す。図２は、被験体における腫瘍細胞および正常細胞を配列決定するための方法の例示的なワークフローを示す。図２は、それぞれ、配列番号１１９〜１２０を出現順で開示する。図３は、被験体の腫瘍サンプルからＤＮＡライブラリーを調製する方法の例示的なワークフローを示す。図４は、被験体の腫瘍サンプルからＤＮＡライブラリーを調製する方法の例示的な実施形態を示す。図５は、被験体の血液サンプル由来の無細胞ＤＮＡ中の腫瘍特異的な変異を評価する方法の例示的な実施形態を示す。図６は、サンプル中の対立遺伝子検出のための例示的なワークフローを示す。図７は、サンプル中の野性型および変異体の対立遺伝子検出のための例示的なワークフローを示す。図８は、被験体における腫瘍特異的な変異の被験体特異的なレポートの例示的な実施形態を示す。図９は、本発明の例示的なコンピュータシステムを示す。図１０Ａは、本発明のライゲーション方法の例示的なワークフローを示す。図１０Ｂは、一本鎖ＤＮＡライブラリーを調製するための例示的な方法を示す。図１１は、本発明のライゲーション方法の例示的な実施形態を示す。図１２は、配列決定のための核酸ライブラリーを調製する方法の例示的なワークフローを示す。図１３Ａおよび図１３Ｂは、配列決定のための単一アダプター核酸ライブラリーを調製する方法の例示的な実施形態を示す。図１３Ａおよび図１３Ｂは、配列決定のための単一アダプター核酸ライブラリーを調製する方法の例示的な実施形態を示す。図１４Ａおよび図１４Ｂは、単一アダプター連結ライブラリーのメンバーに対して第二のアダプター配列を連結する方法の例示的な実施形態を示す。図１４Ａおよび図１４Ｂは、単一アダプター連結ライブラリーのメンバーに対して第二のアダプター配列を連結する方法の例示的な実施形態を示す。図１５は、高効率のライゲーション方法を用いてプラスミドベクター中でインサートをクローニングする例示的な方法を示す。図１６は、アプリコンの感度のよい検出のための方法の例示的なワークフローを示す。図１７は、アンプリコンの感度のよい検出のための方法の例示的な実施形態を示す。図１８は、アンプリコンの感度のよい検出のためのリアルタイム検出法の例示的な実施形態を示す。図１９は、アンプリコンの感度のよい検出のための指数関数的ＰＣＲベースの検出方法の例示的な実施形態を示す。図２０は、アンプリコンの感度のよい検出のための線形ＰＣＲベースの検出方法の例示的な実施形態を示す。図２１は、指数関数的増幅に続いて線形増幅を利用する、ＰＣＲベースの検出方法の例示的な実施形態を示す。図２２は、対立遺伝子識別アッセイの例示的な実施形態を示す。図２３は、対立遺伝子識別アッセイの別の例示的な実施形態を示す。図２４は、結腸癌を有する被験体において癌を評価するために用いられる方法を示す。図２５は、結腸癌を有する被験体における腫瘍特異的変異についてのバリデーションアッセイからの結果を示す。図２６は、結腸癌を有する被験体における腫瘍特異的変異についてのバリデーションアッセイからの結果を示す。図２７は、本明細書に記載されるライゲーション方法の効率を定量するための方法の例示的な実施形態を示す。図２８は、５’末端アダプターライゲーションおよび３’末端アダプターライゲーション反応についてのｄｄＰＣＲの結果を丁重に示す。図２９は、ライゲーション効率に対してアダプター長およびＰＥＧ−８０００を試験するライゲーション実験からの結果を示す。図３０は、Ｍｎ^２＋対インキュベーション温度の効果を試験するライゲーション実験の結果を示す。図３１は、ＩｌｌｕｍｉｎａＮＧＳプラットフォームを用いる配列決定の例示的な実施形態を示す。図３２は、標的選択性オリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）プライマーの例示的な実施形態を示す。図３２は、配列番号１２１〜１２４を、それぞれ、出現順に開示する。図３３は、標的選択性オリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）プライマーの例示的な実施形態を示す。図３３は、配列番号１２１〜１２４を、それぞれ、出現順に開示する。図３４Ａ〜図３４Ｄは、低Ｔｍプローブ設計の評価のための実験からの結果を示す。図３４Ａ〜図３４Ｄは、配列番号６〜８、１０、１２、９、１１、１３、１５〜１６、１４、１７〜１８、２０、１９および２１を、それぞれ、出現の順序で開示する。図３４Ａ〜図３４Ｄは、低Ｔｍプローブ設計の評価のための実験からの結果を示す。図３４Ａ〜図３４Ｄは、配列番号６〜８、１０、１２、９、１１、１３、１５〜１６、１４、１７〜１８、２０、１９および２１を、それぞれ、出現の順序で開示する。図３５Ａ〜図３５Ｂは、ＢＲＡＦ対立遺伝子の検出のための種々のプライマー／プローブ設計を試験するｄｄＰＣＲアッセイからの結果を示す。図３６Ａ〜図３６Ｂは、ＢＲＡＦ対立遺伝子の検出のための種々のプライマー／プローブ設計を試験するｄｄＰＣＲアッセイからの結果を示す。図３７Ａ〜図３７Ｂは、ＢＲＡＦ対立遺伝子の検出のための種々のプライマー／プローブ設計を試験するｄｄＰＣＲアッセイからの結果を示す。図３８Ａ〜図３８Ｂは、ＢＲＡＦ対立遺伝子の検出のための種々のプライマー／プローブ設計を試験するｄｄＰＣＲアッセイからの結果を示す。図３９は、バーコード化されたプライマーを用いるＢＲＡＦ低ＴＭユニバーサルプローブの検出限界を示す。図４０は、バーコード化されたプライマーを用いるＢＲＡＦ低ＴＭユニバーサルプローブの検出限界を示す。図４１は、２０，０００のパーティションデジタルＰＣＲ実験についての例示的な入力量を決定する数値的解析からの結果を示す。図４２Ａおよび図４２Ｂおよび図４３は、肝臓に転移した結腸癌を有する患者での有効な癌の処置を選択するためのＣＮＶｄｄＰＣＲパネルの使用を示す。図４３は、肝臓に転移した結腸癌を有する患者での有効な癌の処置を選択するためのＣＮＶｄｄＰＣＲパネルの使用を示す。図４４Ａ〜図４４Ｂは、ある遺伝子のコピー数変動および変異を検出し得る単独アッセイからの結果を示す。

（発明の詳細な説明）
本発明の実践には、別段示さない限り、当該分野の技術の範囲内である分子生物学、微生物学および組み換えＤＮＡ技術の従来の技術を使用する。このような技術は、文献に詳細に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＦｏｕｒｔｈＥｄｉｔｉｏｎ（２０１２）；ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，編集、１９８４）；ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８４）；ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ（Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，１９８４）；およびシリーズ、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）を参照のこと。本明細書に言及される全ての特許、特許出願、および刊行物は、前出および後出の両方とも、参照によって本明細書に援用される。

（定義）
詳細な説明および特許請求の範囲で用いる場合、単数形「１つの、ある（ａ、ａｎ：不定冠詞）」、および「この、その（ｔｈｅ：定冠詞）」は、文脈上明らかに他を示すのでない限り、複数の言及を包含し得る。例えば、「細胞」という用語は、複数の細胞を包含し得、その混合物を包含する。

「被験体」という用語は、本明細書において用いる場合、一般には発現された遺伝物質を含む生物学的実態を指す。この生物学的実態は、植物であっても、動物であってもまたは微生物であってもよく、これには、例えば、細菌、ウイルス、真菌および原生生物が挙げられる。被験体とは、インビボで得られるか、またはインビトロで培養された生物学的実態の組織、細胞およびそれらの子孫であり得る。被験体は、哺乳動物であってもよい。哺乳動物はヒトであってもよい。ヒトは、疾患について高リスクであると診断されるか、または疑われる場合がある。疾患とは癌であってもよい。ヒトは、ある疾患について高リスクであると診断もされず、疑われもしない場合もある。

本明細書において用いる場合、「サンプル」または「核酸サンプル」とは、核酸を含むか、または含むと推定される任意の物質を指す場合がある。このサンプルとは、被験体から得られる生物学的サンプルであってもよい。核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、例えば、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡであってもよい。核酸サンプル中の核酸は一般には、ハイブリダイズされたプライマーの伸長のためのテンプレートとして機能する。いくつかの実施形態では、生物学的サンプルは、流体サンプルである。流体サンプルとは、全血、血漿、血清、腹水、脳脊髄液、汗、尿、涙、唾液、口腔試料、体腔すすぎ液、または臓器すすぎ液であってもよい。流体サンプルは、本質的に、無細胞の流体サンプル（例えば、血漿、血清、汗、血漿、尿、汗、涙、唾液、痰）であってもよい。他の実施形態では、生物学的サンプルは、固体の生物学的サンプル、例えば、糞便または組織生検、例えば、腫瘍生検である。サンプルはまた、インビトロの細胞培養の構成要素（限定するものではないが、細胞培養培地、組み換え細胞および細胞成分中の細胞の増殖から得られる馴化培地を含む）を含み得る。サンプルは、単一細胞、例えば、癌細胞、循環腫瘍細胞、癌幹細胞などを含んでもよい。

「ヌクレオチド」および「ｎｔ」は、一般には核酸を形成し得る生物学的分子を指して、本明細書では互換可能に用いられる。ヌクレオチドは、公知のプリンおよびピリミジン塩基だけでなく、改変された他の複素環式塩基も含む部分を有してもよい。このような修飾としては、メチル化したプリンまたはピリミジン、アシル化したプリンまたはピリミジン、アルキル化したリボース、または他の複素環が挙げられる。さらに、「ヌクレオチド」という用語は、ハプテン、ビオチン、または蛍光標識を含み、かつ従来のリボースおよびデオキシリボース糖だけでなく、他の糖も同様に含み得る部分を包含する。修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドはまた、糖部分に対する修飾も包含し（例えば、ここでは、１つ以上のヒドロキシル基が、ハロゲン原子または脂肪族基で置き換えられる）、エーテル、アミンなどとして官能化される。修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドはまた、ペプチド核酸（ＰＮＡ）も含み得る。ペプチド核酸は、一般的には、オリゴヌクレオチドであって、デオキシリボース骨格がペプチド結合を有している骨格で置換されているオリゴヌクレオチドを指す。各々のサブユニットは一般には、天然に存在する塩基または天然に存在しない塩基を結合している。１つの例示的なＰＮＡ骨格は、アミド結合を通じて連結されたＮ−（２−アミノエチル）グリシンの反復単位から構築される。ＰＮＡは、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方に結合して、ＰＮＡ／ＤＮＡまたはＰＮＡ／ＲＮＡ二重鎖を形成し得る。得られたＰＮＡ／ＤＮＡまたはＰＮＡ／ＲＮＡ二重鎖は、それらの高い融点（Ｔｍ）で証明されるとおり、相当するＤＮＡ／ＤＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖よりも大きい親和性で結合され得る。ＰＮＡの天然の骨格ではまた、ＰＮＡ／ＤＮＡ（ＲＮＡ）二重鎖のＴｍを、反応混合物中の塩濃度にほとんど依存しないようにし得る。したがって、ＰＮＡ／ＤＮＡ二重鎖は、イオン強度に強く依存する、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖の相互作用を超える利点をもたらし得る。ＰＮＡの例示的な実施形態は、参照によって本明細書に援用される、米国特許第７，２２３，８３３号、および同第５，５３９，０８３号に記載される。

「ヌクレオチド」としてはまた、ＴＭを増強する塩基を含むヌクレオチド（例えば、Ｔｍ−塩基強化性ヌクレオチド）も挙げられる。例示的なＴＭを増強する塩基ヌクレオチドとしては、限定するものではないが、Ｓｕｐｅｒｂａｓｅｓ（商標）、ロックド核酸（ＬＮＡ）または架橋された核酸（ＢＮＡ）を有するヌクレオチドが挙げられる。ＢＮＡおよびＬＮＡは一般的には、修飾されたリボヌクレオチド（ここでリボース部分が、２’酸素および４’炭素を接続する架橋で修飾されている）を指す。一般的には、架橋は、リボースを、Ａ型の二重鎖で見いだされる場合が多い、３’−末端（Ｎｏｒｔｈ）構成で「ロックする」。「ロックド核酸」（ＬＮＡ）という用語は、一般的には、ＢＮＡのある分類を指し、ここでは、リボース環が、２’−Ｏ原子と４’−Ｃ原子とを接続するメチレン架橋で「ロックされている」。ＤＮＡおよびＲＮＡにみられる、６つの通常の核酸塩基（Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＵおよびｍＣ）を含むＬＮＡヌクレオシドは、標準的なワトソン−クリック塩基対の規則によってその相補的なヌクレオシドと塩基対を形成できる。したがって、ＴＭを増強する塩基ヌクレオチド、例えば、ＢＮＡおよびＬＮＡヌクレオチドは、望まれるならばいつでも、オリゴヌクレオチド中でＤＮＡまたはＲＮＡ塩基と混合されてもよい。ロックドリボース形状は、塩基のスタッキングおよび骨格のプレオーガニゼーション（ｐｒｅ−ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）を増強する。塩基スタッキングおよび骨格のプレオーガニゼーションは、二重鎖の熱安定性増大（例えば、Ｔｍ増大）および識別力を生じ得る。ＬＮＡは、他の核酸とでは不可能な状態下で単一塩基ミスマッチを識別し得る。ロックド核酸は、例えば、参照によって本明細書に援用される、ＷＯ９９／１４２２６に開示される。ヌクレオチドとしてはまた、参照によって本明細書に援用される欧州特許出願番号ＥＰ１９９５３３０に記載されるような修飾されたヌクレオチドも包含し得る。

他の修飾されたヌクレオチドとしては、５−Ｍｅ−ｄＣ−ＣＥホスホラミダイト、５−Ｍｅ−ｄＣ−ＣＰＧ、２−アミノ−ｄＡ−ＣＥホスホラミダイト、Ｎ４−Ｅｔ−ｄＣ−ＣＥホスホラミダイト、Ｎ４−Ａｃ−Ｎ４−Ｅｔ−ｄＣ−ＣＥホスホラミダイト、Ｎ６−Ｍｅ−ｄＡ−ＣＥホスホラミダイト、Ｎ６−Ａｃ−Ｎ６−Ｍｅ−ｄＡ−ＣＥホスホラミダイト、Ｚｉｐ核酸（ＺＮＡ（登録商標）、参照によって本明細書に援用される米国特許出願公開第１２／０８６，５９９に記載）、５’−トリメトキシスチルベンキャップホスホラミダイト（ＴｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｔｉｌｂｅｎｅＣａｐＰｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）、５’−ピレンキャップホスホラミダイト、３’−ＵａｑＣａｐＣＰＧ（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ）を挙げることができる。

さらに他の修飾されたヌクレオチドとしては、修飾ヌクレオシド塩基を有するヌクレオチド、例えば、２−アミノプリン、２、６−ジアミノプリン、５−ブロモ−デオキシウリジン、デオキシウリジン、インバーテッドｄＴ、インバーテッドｄｄＴ、ｄｄＣ、５−メチルデオキシシチジン、デオキシイノシン、５−ニトロインドール、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基、ヒドロキシメチルｄＣ、Ｉｓｏ−ｄＧおよびＩｓｏ−ｄＣ（ＥｒａｇｅｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ）、フッ素修飾リボースを有する２’フルオロ塩基を挙げることができる。

「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「ヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、相互に交換可能に用いられ得る。それらは、任意の長さのヌクレオチドの重合体型、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらのアナログを指してもよい。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有してもよく、任意の機能（公知または未知）を行い得る。以下が、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子フラグメントのコード領域または非コード領域、連鎖解析から定義される遺伝子座（単数または複数）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログを含んでもよい。存在する場合、ヌクレオチド構築物に対する修飾は、ポリマーのアセンブリの前に付与されてもまたは後に付与されてもよい。ヌクレオチドの配列は、ヌクレオチドでない成分で中断されてもよい。ポリヌクレオチドはさらに、標識成分とのコンジュゲーションなどによって重合化の後に修飾されてもよい。

「標的ポリヌクレオチド」、「標的領域」、または「標的」という用語は、本明細書において用いる場合、一般的には、研究中の目的のポリヌクレオチドを指す。特定の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、目的であって研究中の１つ以上の配列を含む。標的ポリヌクレオチドは、例えば、ゲノム配列を含んでもよい。この標的ポリヌクレオチドは、標的配列であって、その存在、量、および／もしくはヌクレオチド配列、またはそれらの変化が決定されることが所望される標的配列を含んでもよい。

この標的ポリヌクレオチドは、疾患と関連する遺伝子の領域であってもよい。いくつかの実施形態では、この領域はエキソンである。いくつかの実施形態では、この遺伝子は、ドラッガブル（ｄｒｕｇｇａｂｌｅ）標的である。「ドラッガブル標的」という用語は、本明細書において用いる場合、一般には、疾患の治療によって調整される遺伝子または細胞経路を指す。この疾患は癌であってもよい。したがって、遺伝子は、公知の癌関連遺伝子であり得る。いくつかの実施形態では、癌関連遺伝子は、ＡＢＣＡ１、ＢＲＡＦ、ＣＨＤ５、ＥＰ３００、ＦＬＴ１、ＩＴＰＡ、ＭＹＣ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＳＫＰ２、ＴＰ５３、ＡＢＣＡ７、ＢＲＣＡ１、ＣＨＥＫ１、ＥＰＨＡ３、ＦＬＴ３、ＪＡＫ１、ＭＹＣＬ１、ＰＩＫ３Ｒ２、ＳＬＣ１９Ａ１、ＴＰ７３、ＡＢＣＢ１、ＢＲＣＡ２、ＣＨＥＫ２、ＥＰＨＡ５、ＦＬＴ４、ＪＡＫ２、ＭＹＣＮ、ＰＫＨＤ１、ＳＬＣ１Ａ６、ＴＰＭ３、ＡＢＣＣ２、ＢＲＩＰ１、ＣＬＴＣ、ＥＰＨＡ６、ＦＮ１、ＪＡＫ３、ＭＹＨ２、ＰＬＣＢ１、ＳＬＣ２２Ａ２、ＴＰＭＴ、ＡＢＣＣ３、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＯＬ１Ａ１、ＥＰＨＡ７、ＦＯＳ、ＪＵＮ、ＭＹＨ９、ＰＬＣＧ１、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＴＰＯ、ＡＢＣＣ４、Ｃ１ｏｒｆ１４４、ＣＯＰＳ５、ＥＰＨＡ８、ＦＯＸＯ１、ＫＢＴＢＤ１１、ＮＡＶ３、ＰＬＣＧ２、ＳＭＡＤ２、ＴＰＲ、ＡＢＣＧ２、ＣＡＢＬＥＳ１、ＣＲＥＢ１、ＥＰＨＢ１、ＦＯＸＯ３、ＫＤＭ６Ａ、ＮＢＮ、ＰＭＬ、ＳＭＡＤ３、ＴＲＩＯ、ＡＢＬ１、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＣＲＥＢＢＰ、ＥＰＨＢ４、ＦＯＸＰ４、ＫＤＲ、ＮＣＯＡ２、ＰＭＳ２、ＳＭＡＤ４、ＴＲＲＡＰ、ＡＢＬ２、ＣＡＭＫＶ、ＣＲＫＬ、ＥＰＨＢ６、ＧＡＢ１、ＫＩＴ、ＮＥＫ１１、ＰＰＡＲＧ、ＳＭＡＲＣＡ４、ＴＳＣ１、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＣＡＲＤ１１、ＣＲＬＦ２、ＥＰＯ、ＧＡＴＡ１、ＫＬＦ６、ＮＦ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＳＭＡＲＣＢ１、ＴＳＣ２、ＡＣＶＲ２Ａ、ＣＡＲＭ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＥＲＢＢ２、ＧＬＩ１、ＫＬＨＤＣ４、ＮＦ２、ＰＰＰ１Ｒ３Ａ、ＳＭＯ、ＴＴＫ、ＡＤＣＹ９、ＣＡＶ１、ＣＳＭＤ３、ＥＲＢＢ３、ＧＬＩ３、ＫＲＡＳ、ＮＫＸ２−１、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＳＯＣＳ１、ＴＹＫ２、ＡＧＡＰ２、ＣＢＦＡ２Ｔ３、ＣＳＮＫ１Ｇ２、ＥＲＢＢ４、ＧＮＡ１１、ＬＭＯ２、ＮＯＳ２、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ、ＳＯＤ２、ＴＹＭＳ、ＡＫＴ１、ＣＢＬ、ＣＴＮＮＡ１、ＥＲＣＣ１、ＧＮＡＱ、ＬＲＰ１Ｂ、ＮＯＳ３、ＰＲＫＡＡ２、ＳＯＳ１、ＵＧＴ１Ａ１、ＡＫＴ２、ＣＣＮＤ１、ＣＴＮＮＡ２、ＥＲＣＣ２、ＧＮＡＳ、ＬＲＰ２、ＮＯＴＣＨ１、ＰＲＫＣＡ、ＳＯＸ１０、ＵＭＰＳ、ＡＫＴ３、ＣＣＮＤ２、ＣＴＮＮＢ１、ＥＲＣＣ３、ＧＰＲ１２４、ＬＲＰ６、ＮＯＴＣＨ２、ＰＲＫＣＺ、ＳＯＸ２、ＵＳＰ９Ｘ、ＡＬＫ、ＣＣＮＤ３、ＣＹＦＩＰ１、ＥＲＣＣ４、ＧＰＲ１３３、ＬＴＫ、ＮＯＴＣＨ３、ＰＲＫＤＣ、ＳＰ１、ＶＥＧＦ、ＡＮＡＰＣ５、ＣＣＮＥ１、ＣＹＬＤ、ＥＲＣＣ５、ＧＲＢ２、ＭＡＮ１Ｂ１、ＮＰＭ１、ＰＴＣＨ１、ＳＰＲＹ２、ＶＥＧＦＡ、ＡＰＣ、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＹＰ１９Ａ１、ＥＲＣＣ６、ＧＳＫ３Ｂ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＮＱＯ１、ＰＴＣＨ２、ＳＲＣ、ＶＨＬ、ＡＰＣ２、ＣＤ４４、ＣＹＰ１Ｂ１、ＥＲＧ、ＧＳＴＰ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＲ３Ｃ１、ＰＴＥＮ、ＳＴ６ＧＡＬ２、ＷＲＮ、ＡＲ、ＣＤ７９Ａ、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＥＲＮ２、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＭＡＰ２Ｋ４、ＮＲＡＳ、ＰＴＧＳ２、ＳＴＡＴ１、ＷＴ１、ＡＲＡＦ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＹＰ２Ｃ８、ＥＳＲ１、ＨＤＡＣ１、ＭＡＰ２Ｋ７、ＮＲＰ２、ＰＴＰＮ１１、ＳＴＡＴ３、ＸＰＡ、ＡＲＦＲＰ１、ＣＤＣ４２、ＣＹＰ２Ｄ６、ＥＳＲ２、ＨＤＡＣ２、ＭＡＰ３Ｋ１、ＮＴＲＫ１、ＰＴＰＲＢ、ＳＴＫ１１、ＸＰＣ、ＡＲＩＤ１Ａ、ＣＤＣ４２ＢＰＢ、ＣＹＰ３Ａ４、ＥＴＶ４、ＨＧＦ、ＭＡＰＫ１、ＮＴＲＫ２、ＰＴＰＲＤ、ＳＵＦＵ、ＺＦＹ、ＡＴＭ、ＣＤＣ７３、ＣＹＰ３Ａ５、ＥＷＳＲ１、ＨＩＦ１Ａ、ＭＡＰＫ３、ＮＴＲＫ３、ＲＡＤ５０、ＳＵＬＴ１Ａ１、ＺＮＦ５２１、ＡＴＰ５Ａ１、ＣＤＨ１、ＤＡＣＨ２、ＥＸＴ１、ＨＭ１３、ＭＡＰＫ８、ＯＭＡ１、ＲＡＤ５１、ＳＵＺ１２、ＡＴＲ、ＣＤＨ１０、ＤＣＣ、ＥＺＨ２、ＨＭＧＡ１、ＭＡＲＫ３、ＯＲ１０Ｒ２、ＲＡＦ１、ＴＡＦ１、ＡＵＲＫＡ、ＣＤＨ２、ＤＣＬＫ３、ＦＡＮＣＡ、ＨＮＦ１Ａ、ＭＣＬ１、ＰＡＫ３、ＲＡＲＡ、ＴＢＸ２２、ＡＵＲＫＢ、ＣＤＨ２０、ＤＤＢ２、ＦＡＮＣＤ２、ＨＯＸＡ３、ＭＤＭ２、ＰＡＲＰ１、ＲＢ１、ＴＣＦ１２、ＢＡＩ３、ＣＤＨ５、ＤＤＲ２、ＦＡＮＣＥ、ＨＯＸＡ９、ＭＤＭ４、ＰＡＸ５、ＲＥＭ１、ＴＣＦ３、ＢＡＰ１、ＣＤＫ２、ＤＧＫＢ、ＦＡＮＣＦ、ＨＲＡＳ、ＭＥＣＯＭ、ＰＣＤＨ１５、ＲＥＴ、ＴＣＦ４、ＢＡＲＤ１、ＣＤＫ４、ＤＧＫＺ、ＦＡＳ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＭＥＮ１、ＰＣＤＨ１８、ＲＩＣＴＯＲ、ＴＥＫ、ＢＡＸ、ＣＤＫ６、ＤＩＲＡＳ３、ＦＢＸＷ７、ＩＤＨ１、ＭＥＴ、ＰＣＮＡ、ＲＩＰＫ１、ＴＥＰ１、ＢＣＬ１１Ａ、ＣＤＫ７、ＤＬＧ３、ＦＣＧＲ３Ａ、ＩＤＨ２、ＭＩＴＦ、ＰＤＧＦＡ、ＲＯＲ１、ＴＥＲＴ、ＢＣＬ２、ＣＤＫ８、ＤＬＬ１、ＦＥＳ、ＩＦＮＧ、ＭＬＨ１、ＰＤＧＦＢ、ＲＯＲ２、ＴＥＴ２、ＢＣＬ２Ａ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＤＮＭＴ１、ＦＧＦＲ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＭＬＬ、ＰＤＧＦＲＡ、ＲＯＳ１、ＴＧＦＢＲ２、ＢＣＬ２Ｌ１、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＦＧＦＲ２、ＩＧＦ２Ｒ、ＭＬＬ３、ＰＤＧＦＲＢ、ＲＰＳ６ＫＡ２、ＴＨＢＳ１、ＢＣＬ２Ｌ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＦＧＦＲ３、ＩＫＢＫＥ、ＭＰＬ、ＰＤＺＲＮ３、ＲＰＴＯＲ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＢＣＬ３、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＤＯＴ１Ｌ、ＦＧＦＲ４、ＩＫＺＦ１、ＭＲＥ１１Ａ、ＰＨＬＰＰ２、ＲＳＰＯ２、ＴＮＫＳ、ＢＣＬ６、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＤＰＹＤ、ＦＨ、ＩＬ２ＲＧ、ＭＳＨ２、ＰＩＫ３Ｃ３、ＲＳＰＯ３、ＴＮＫＳ２、ＢＣＲ、ＣＤＫＮ２Ｄ、Ｅ２Ｆ１、ＦＨＯＤ３、ＩＮＨＢＡ、ＭＳＨ６、ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＵＮＸ１、ＴＮＮＩ３Ｋ、ＢＩＲＣ５、ＣＤＸ２、ＥＥＤ、ＦＩＧＦ、ＩＮＳＲ、ＭＴＨＦＲ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＳＤＨＢ、ＴＮＲ、ＢＩＲＣ６、ＣＥＢＰＡ、ＥＧＦ、ＦＬＧ２、ＩＲＳ１、ＭＴＯＲ、ＰＩＫ３ＣＤ、ＳＦ３Ｂ１、ＴＯＰ１、ＢＬＭ、ＣＥＲＫ、ＥＧＦＲ、ＦＬＮＣ、ＩＲＳ２、ＭＵＴＹＨ、ＰＩＫ３ＣＧ、ＳＨＣ１、およびＴＯＰ２Ａからなる群より選択される。

「ゲノム配列」という用語は、本明細書において用いる場合、一般には、ゲノム中に存在する配列を指す。ＲＮＡは、ゲノムから転写されるので、この用語は、生物体の核ゲノムに存在する配列、およびこのようなゲノムから転写されるＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）のｃＤＮＡコピーに存在する配列も包含する。

「アニーリングする」、「ハイブリダイズする」または「結合する」という用語は、２つのポリヌクレオチド配列、セグメントまたは鎖を指してもよく、相互に交換可能に用いられてもよく、当該分野で通常の意味を有する。２つの相補的な配列（例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）は、相補的塩基で水素結合を形成することによってアニーリングするか、またはハイブリダイズして、二本鎖ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの二本鎖領域を生じ得る。

本明細書において用いる場合、「相補性」という用語は一般的には、２つの逆平行の核酸配列の間の関係であって、ここでこの配列が以下の塩基対合の規則で関連する関係を指す：ＡはＴまたはＵと対になり、かつＣはＧと対になる。第二の配列またはセグメントに対して「完全に相補的」である第一の配列またはセグメントとは、その全長にわたって相補的であり、かつミスマッチはない。第一の配列またはセグメントは、その第一の配列からなるポリヌクレオチドが、第二の配列からなるポリヌクレオチドに対して特異的にハイブリダイズするのに十分に相補的である場合、セグメントのその第二の配列に対して「実質的に相補的」である。

「二重鎖」または「二重鎖の（二重鎖になった）」という用語は、本明細書において用いる場合、塩基が対になる、例えば、一緒にハイブリダイズする２つの相補的なポリヌクレオチドを記述し得る。

本明細書において用いる場合、「Ｔｍ」という用語は一般には、二重鎖の半分がハイブリダイズしたままで、かつ二重鎖の半分が一本鎖に解離する、オリゴヌクレオチド二重鎖の融点を指す。ＳａｍｂｒｏｏｋａｎｄＲｕｓｓｅｌｌ（２００１；ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第３版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＮ．Ｙ．，第１０章）を参照のこと。

本明細書において用いる場合、核酸配列の「増幅」とは一般的には、標的配列のコピー数を酵素的に増大するためのインビトロ技術を指す。増幅方法には、非対称（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ）法（ここでは、主な生成物は、一本鎖である）および従来の方法（ここでは、主な生成物は二本鎖である）の両方が挙げられる。増幅の「回」または「サイクル」とは、ＰＣＲサイクルであって、二本鎖のテンプレートＤＮＡ分子が、一本鎖テンプレートに変性され、フォワードおよびリバースプライマーが、一本鎖テンプレートにハイブリダイズされて、プライマー／テンプレート二重鎖を形成し、プライマーがこのプライマー／テンプレート二重鎖からＤＮＡポリメラーゼによって伸長されて、伸長生成物が形成されるサイクルを指してもよい。増幅のその後の回では、その伸長生成物は、一本鎖テンプレートに変性されて、サイクルが繰り返される。

「テンプレート」、「テンプレート鎖」、「テンプレートＤＮＡ」および「テンプレート核酸」という用語は、増幅サイクルによってコピーされるＤＮＡの鎖を指して、本明細書においては相互に交換可能に用いられ得る。

「変性（する）」という用語は、本明細書において用いる場合、一般的には、核酸二重鎖の２つの一本鎖への分離を指す。

「伸長（する）」という用語は、本明細書において用いる場合、一般的には、酵素、例えば、ポリメラーゼを用いるヌクレオチドの添加によって、テンプレート核酸にハイブリダイズされたプライマーの伸長を指す。

「プライマー」とは、一般的には、ヌクレオチド配列（例えば、オリゴヌクレオチド）であって、一般的には、遊離の３’−ＯＨ基を有し、テンプレート配列（例えば、標的ポリヌクレオチド、またはプライマー伸長生成物）とハイブリダイズし、かつテンプレートに対して相補的なポリヌクレオチドの重合を促進し得るヌクレオチド配列である。プライマーは例えば、テンプレートの配列（例えば、プライマー伸長生成物またはテンプレートＤＮＡ複合体のＲＮａｓｅ切断後に創出されたテンプレートのフラグメント）であって、テンプレート自体の配列にハイブリダイズされ（例えば、ヘアピンループとして）、ヌクレオチド重合を促進できる配列であってもよい。したがって、プライマーは、外因性（例えば、付加された）プライマーであっても、または内因性（例えば、テンプレートフラグメント）プライマーであってもよい。

「決定する（工程）」、「測定する（工程）」、「評価する（工程）（ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ）」、「評価する（工程）（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）」、「アッセイする（工程）」および「解析する、分析する（工程）」という用語は、本明細書において相互に交換可能に用いて、任意の形態の測定を指してもよく、そしてある要素が存在するか否かを決定する工程を包含し得る。これらの用語は、定量的決定および／または定性的な決定の両方を包含し得る。評価することは、相対的であってもまたは絶対的であってもよい。「〜の存在を評価すること（工程）」は、存在する何かの量を決定すること、およびそれが存在するか否かを決定することを包含し得る。

「溶液中でフリー（遊離）」という用語は、本明細書において用いる場合、固体支持体に結合も固着もされていない、ポリヌクレオチドのような分子を記述し得る。

「ゲノムフラグメント」という用語は、本明細書において用いる場合、ゲノム、例えば、動物または植物のゲノム、例えば、ヒト、サル、ラット、魚または昆虫または植物のゲノムのある領域を指す場合がある。ゲノムのフラグメントとはまた、連結されたアダプターであってもなくてもよい。ゲノムのフラグメントは、連結されたアダプター（この場合、これは、分子の少なくとも５’末端に対して、フラグメントの一端または両端に連結されたアダプターを有する）であってもよいし、または連結された非アダプターであってもよい。

「予備増幅」とは、本明細書において用いる場合、一般的には、核酸の非クローン的な増幅を指す。例えば、核酸ライブラリーの予備増幅は一般的には、ライブラリーのクローン増幅および／またはシーケンサーへのロードの前に行われる。

「リガーゼ」という用語は、本明細書において用いる場合、一般的には、ポリヌクレオチドを一緒に結合するために、または単一ポリヌクレオチドの末端に結合するために通常用いられる酵素を指す。

「ライゲーション、連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）」という用語は、本明細書において用いる場合、一般的には、連結される末端の間の共有結合の形成による、ポリヌクレオチドの２つの末端の連結、または単一ポリヌクレオチドの末端の連結を指す。共有結合は、ホスホジエステル結合であってもよい。

「ＡＴＰ依存性ライゲーション」という用語は、本明細書において用いる場合、一般的には、ＡＴＰ依存性リガーゼによるライゲーションを指す。ＡＴＰ依存性ライゲーションの例示的な機序は、本明細書に記載される。

「ドナー」および「アクセプター」核酸種とは、一般的には、ライゲーション反応で連結される核酸分子の２つの別個の集団を指す。「ドナー」種とは、一般的には、５’末端または３’末端のいずれかで、ヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）を受容し得る核酸分子の集団を指す。「アクセプター」種とは、一般的には、ドナー種の５’または３’末端のいずれかでＮＭＰを介して「ドナー」種に連結され得る３’または５’ＯＨ基を含む核酸分子の第二の集団を指す。

ドナーおよびアクセプター種は、任意の核酸種であってもよい。それらは、例えば、生物学的供給源から単離されたポリヌクレオチドであってもよい。この生物学的供給源は被験体であってもよい。例示的な生物学的供給源および被験体は本明細書に記載される。それらは、オリゴヌクレオチドであってもよい。特定の配列のオリゴヌクレオチドを調製するための方法は、当該分野で公知であり、これには、例えば、適切な配列のクローニングおよび制限、ならびに直接の化学合成が挙げられる。化学合成の方法としては、例えば、Ｎａｒａｎｇら、１９７９，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ６８：９０，に記載のホスホトリエステル法、Ｂｒｏｗｎら、１９７９，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ６８：１０９，に開示のホスホジエステル法、Ｂｅａｕｃａｇｅら、１９８１，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ２２：１８５９に開示のジエチルホスホラミダイト法、および米国特許第４，４５８，０６６に開示される固体支持体方法が挙げられる。それらは、ＲＮＡであっても、またはＤＮＡであってもよい。ＤＮＡは、部分的に変性されたＤＮＡであっても、または完全に変性されたＤＮＡであってもよい。ＤＮＡは、一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡであってもよい。部分的に変性されるとは、「フレイド（ｆｒａｙｅｄ）」末端が１、２、３、４、５、または５を超えるアニーリングされていないヌクレオチドを含み得るように、末端で「フレイド」されてもよい。

ドナーおよび／またはアクセプター核酸種は、例えば、１〜５０ｎｔ、１０〜１００ｎｔ、５０〜２００ｎｔ、１００〜４００ｎｔ、２００〜６００ｎｔ、５００〜１０００ｎｔ、８００〜２０００ｎｔ、または２０００ｎｔよりも多くにわたる任意の大きさのものであってもよい。いくつかの実施形態では、ドナーおよび／またはアクセプター核酸種は、１２０ｎｔ長を超える。

ドナーまたはアクセプター核酸種は、例えば、ゲノムの核酸、アダプター配列、および／またはバーコード配列を含んでもよい。このドナーまたはアクセプター核酸種は、オリゴヌクレオチドを含んでもよい。このドナーまたはアクセプター核酸種は、検出可能な標識またはアフィニティタグを含んでもよい。

検出可能標識は、検出すべき分子の検出を可能にする任意の分子であり得る。検出可能な標識の非限定的な例としては、例えば、キレーター、光活性剤、放射性部分（例えば、α、βおよびγ放射体）、蛍光剤、発光剤、常磁性イオン、または特定の試薬の存在下で検出性シグナルを生じる酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ）が挙げられる。

例示的な蛍光化合物としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｅｒｉｎ）、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、フルオレスカミン、および市販のフルオロフォア、例えば、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ３５０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５６８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、ＤｙＬｉｇｈｔ色素、例えば、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８、ＤｙＬｉｇｈｔ５９４、ＤｙＬｉｇｈｔ６４７、およびＢＯＤＩＰＹ色素、例えば、ＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹＦＬ、ＢＯＤＩＰＹＲ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ６５０／６６５、カスケードブルー（ＣａｓｃａｄｅＢｌｕｅ）、カスケードイエロー（ＣａｓｃａｄｅＹｅｌｌｏｗ）、Ｄａｎｓｙｌ、リサミンローダミン（ｌｉｓｓａｍｉｎｅｒｈｏｄａｍｉｎｅ）Ｂ、マリナブルー（ＭａｒｉｎａＢｌｕｅ）、ＯｒｅｇｏｎＧｒｅｅｎ４８８、ＯｒｅｇｏｎＧｒｅｅｎ５１４、ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ、ローダミン６Ｇ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、テトラメチルローダミンおよびテキサスレッド（ＴｅｘａｓＲｅｄ）が挙げられる。このような化合物は、市販されている（例えば、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．を参照のこと）。

アフィニティータグは、捕獲部分に対して親和性を有するように選択され得る。このアフィニティータグは、非限定的な例に過ぎないが、ビオチン、デスチオビオチン、ヒスチジン、ポリヒスチジン、ｍｙｃ、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ＦＬＡＧ、蛍光タグ、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）タグ、ＦＬＡＧタグ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、またはそれらの誘導体を含んでもよい。この捕獲部分は、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ（商標）、ニッケルまたはグルタチオンまたはアフィニティータグに結合し得る他の分子を含んでもよい。

いくつかの実施形態では、アクセプター種およびドナー種は同じ種であってもよい。例えば、いくつかの実施形態では、ユーザーは、直鎖状の核酸を環状化することを望む場合もあるし、単一の核酸種のコンカテマーを形成する場合もある。

「反応混合物」という用語は、本明細書において用いる場合、一般には、所望の反応を達成するために必要な構成要素の混合物を指す。この混合物はさらに、緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ緩衝液）を含んでもよい。この反応混合物はさらに、一価の塩を含んでもよい。この反応混合物はさらに、陽イオン、例えば、Ｍｇ^２＋および／またはＭｎ^２＋を含んでもよい。各々の構成要素の濃度は、当該分野では周知であり、さらに、当業者によって最適化され得る。いくつかの実施形態では、この反応混合物はまた、添加物、例としては、限定するものではないが、非特異的なバックグラウンド／ブロッキング核酸（例えば、サケ精子ＤＮＡ）、非特異的なバックグラウンド／ブロッキングタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン、脱脂粉乳）、バイオ防腐剤（例えば、アジ化ナトリウム）、ＰＣＲ増強剤（例えば、ベタイン、トレハロースなど）、およびインヒビター（例えば、ＲＮＡｓｅ阻害剤）を含む。いくつかの実施形態では、核酸サンプルが、反応混合物と混合される。

「プライマー結合部位」とは、プライマーが、オリゴヌクレオチドまたはその相補鎖中でハイブリダイズする部位を指してもよい。

「分離する」という用語は、本明細書で用いる場合、２つの要素の物理的分離（例えば、サイズ、親和性、１つの要素の分解などによる）を指してもよい。

「配列決定」という用語は、本明細書で用いる場合、ポリヌクレオチドの少なくとも１０個の連続するヌクレオチドの同一性（例えば、少なくとも２０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個もしくは少なくとも５００個またはそれ以上の連続するヌクレオチドの同一性）が得られる方法を指してもよい。

「アダプターを連結した（ライゲートした）」という用語は、本明細書で用いる場合、あるアダプターに連結された核酸を指してもよい。アダプターは、ある核酸分子の５’末端または３’末端に連結してもよいし、またはある核酸分子の内部領域に付加されてもよい。

「ブリッジＰＣＲ（架橋ＰＣＲ）」という用語は、固相ポリメラーゼ連鎖反応であって、ここでは反応中に伸長されるプライマーがそれらの５’末端によって基質に係留される反応を指してもよい。増幅中、係留されたプライマーの間にアンプリコンが架橋を形成する。ブリッジＰＣＲ（また「クラスターＰＣＲ」と呼ばれる場合もある）は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＳｏｌｅｘａプラットフォームにおいて用いられる。ブリッジＰＣＲおよびＩｌｌｕｍｉｎａ社のＳｏｌｅｘａプラットフォームは、様々な刊行物、例えば、Ｇｕｄｍｕｎｄｓｓｏｎら（Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２００９４１：１１２２〜６）、Ｏｕｔら（Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．２００９３０：１７０３−１２）、およびＴｕｒｎｅｒ（Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２００９６：３１５−６）、米国特許第７，１１５，４００号、ならびに米国特許出願公開第２００８０１６０５８０号および同第２００８０２８６７９５号に一般的に記載される。

「バーコード配列」という用語は、本明細書で用いられる場合、一般には、アッセイについての情報をコードし得るヌクレオチドの固有の配列を指す。バーコード配列は、問い合わされる対立遺伝子の同定、標的ポリヌクレオチドまたはゲノム遺伝子座の同定、サンプル、被験体の同定、またはそれらに任意の組み合わせに関連する情報をコードし得る。バーコード配列は、プライマーの一部であっても、レポータープローブの一部であっても、またはその両方であってもよい。バーコード配列は、オリゴヌクレオチドの５’末端にあっても、もしくは３’末端にあってもよく、またはオリゴヌクレオチドのいずれの領域に位置してもよい。バーコード配列は、テンプレート配列の一部であってもそうでなくてもよい。バーコード配列は、サイズおよび組成において大きく異なってもよく；以下の参考文献は、特定の実施形態に適切なバーコード配列のセットを選択するための目安を提供する：Ｂｒｅｎｎｅｒ，米国特許第５，６３５，４００号、Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９７：１６６５〜１６７０（２０００）、Ｓｈｏｅｍａｋｅｒら、ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ，１４：４５０〜４５６（１９９６）、Ｍｏｒｒｉｓら、欧州特許公開第０７９９８９７Ａ１号、Ｗａｌｌａｃｅ，米国特許第５，９８１，１７９号。バーコード配列は、約４〜３６ヌクレオチド、約６〜３０ヌクレオチド、または約８〜２０ヌクレオチドの長さを有してもよい。

「変異」という用語は、本明細書において用いる場合、一般的には、ゲノムのヌクレオチド配列の変化を指す。変異とは、ＤＮＡの大きいセクションを包含し得る（例えば、コピー数変動）。変異は、染色体全体（例えば、異数性）を含み得る。変異は、ＤＮＡの小さいセクションを含み得る。ＤＮＡの小さいセクションに関与する変異の例としては、例えば、点変異、または一塩基多型、多重ヌクレオチド多型、挿入（例えば、ある遺伝子座での１つ以上のヌクレオチドの挿入）、多重ヌクレオチド変化、欠失（例えば、ある遺伝子座での１つ以上のヌクレオチドの欠失）、および逆位（例えば、１つ以上のヌクレオチドの配列の反転）が挙げられる。

「遺伝子座」という用語は、本明細書において用いる場合、染色体上の遺伝子、ヌクレオチドまたは配列の位置を指してもよい。遺伝子座の「対立遺伝子」とは本明細書において用いる場合、その遺伝子座でのヌクレオチドまたは配列の別の形態を指してもよい。「野性型対立遺伝子」とは一般的には、被験体の集団中で最高頻度を有する対立遺伝子を指す。「野性型」対立遺伝子は、一般的には、疾患に関連しない。「変異体対立遺伝子」とは一般には、「野性型対立遺伝子」よりも低頻度であって、疾患に関連し得る対立遺伝子を指す。「変異体対立遺伝子」は、疾患に関連する必要はない場合もある。「問い合わされる対立遺伝子」という用語は、一般には、検出のためにアッセイが設計される対立遺伝子を指す。

「一塩基多型」、または「ＳＮＰ」という用語は、本明細書において用いる場合、一般的には、配列内の単一ヌクレオチドの置換から生じるある種のゲノム配列変動を指す。「ＳＮＰ対立遺伝子」または「ＳＮＰの対立遺伝子」とは一般には、特定の遺伝子座でのＳＮＰの代替的な形態を指す。「問い合わされるＳＮＰ対立遺伝子」という用語は、一般には、検出のためにアッセイが設計されるＳＮＰ対立遺伝子を指す。

「コピー数変動」または「ＣＮＶ」という用語は、遺伝子情報のコピー数の相違を指す。多くの態様では、これは、ゲノム領域のゲノムコピー数あたりの相違を指す。例えば、二倍体生物では、常染色体のゲノム領域の予想されるコピー数は、１ゲノムあたり２コピーである。このようなゲノム領域は、細胞あたり２コピーで存在するはずである。近年のレビューに関しては、Ｚｈａｎｇら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．ＧｅｎｏｍｉｃｓＨｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２００９．１０：４５１〜８１を参照のこと。ＣＮＶは、ヒトでの遺伝的多様性の源であって、例えば、遺伝子の投与量、遺伝子の破壊、または遺伝子の融合を変化することによって、複雑な障害および疾患と関連し得る。それらはまた、良性の多型変異体であってもよい。ＣＮＶは、大きくても、例えば、１Ｍｂより大きくてもよいが、多くは、より小さく、例えば、１００塩基〜１Ｍｂである。１００塩基より大きい（および３Ｍｂ未満）の３８，０００を超えるＣＮＶがヒトでは報告されている。ＳＮＰとともに、これらのＣＮＶによって、個体間の相当量の表現型変異について説明される。有害な影響、例えば、疾患の発生を有することに加えて、それらはまた、有利な変動を生じ得る。

特定の場合には、本明細書に記載される方法で用いられるオリゴヌクレオチドは、参照ゲノム領域、すなわち、公知のヌクレオチド配列のゲノム領域、例えば、染色体領域（その配列がＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋデータベースまたは他のデータベースに寄託される）を例えば、用いて設計されてもよい。

「遺伝子型決定」という用語は、本明細書において用いる場合、一般的には、生物学的アッセイを用いて個体のＤＮＡ配列を検査すること、およびそれを別の個体の配列または参照配列と比較することによって、個体の遺伝子構造（遺伝子型）の相違を決定するプロセスを指す。

「複数」とは一般には、少なくとも２つのメンバーを含む。特定の場合には、複数とは、少なくとも１０，少なくとも１００、少なくとも１００、少なくとも１０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも１００００００、少なくとも１０００００００、少なくとも１００００００００もしくは少なくとも１０００００００００またはそれ以上のメンバーを有し得る。

「分離する」という用語は、本明細書において用いる場合、一般的には、２つの要素の物理的な分離（例えば、切断、加水分解または２つの要素のうちの１つの分解による）を指す。

「標識」および「検出可能部分」という用語は、検出可能シグナルを提供するために用いられ得、そして核酸またはタンパク質に結合され得る任意の原子または分子を指して、本明細書では相互に交換可能に用いられ得る。標識は、蛍光、放射性、比色分析、重量測定、Ｘ線回折または吸収、磁力、酵素活性などで検出可能なシグナルを提供し得る。

（概説）
本発明の態様は、疾患に罹患している被験体のモニタリングおよび処置を改善する方法およびキットに関する。この疾患は、癌、例えば、腫瘍、白血病、例えば、急性白血病、急性Ｔ細胞白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄球性（顆粒球）白血病、または慢性リンパ球性白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、例えば、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫または非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、固形腫瘍、肉腫、癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、リンパ管肉腫、内皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫など、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支の癌、腎細胞癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛腫、精上皮腫、胎生癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮性腫瘍、神経膠腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、子宮内膜癌、非小細胞肺癌であってもよい。

被験体は、固形腫瘍を保有すると疑われるか、もしくは保有することが公知である場合もあり、または以前に固形腫瘍を保有した被験体である場合もある。

図１は、癌を評価するための方法の例示的なワークフローを示す。工程１１０では、この方法は、前記被験体から単離された腫瘍サンプルから癌関連遺伝子を配列決定する工程と、必要に応じて前記被験体から単離された正常細胞から癌関連遺伝子のセットを配列決定する工程とを包含する。この腫瘍サンプルは、固形腫瘍サンプルであってもよい。正常な細胞は、被験体由来の血液サンプルから単離された血球であってもよい。工程１２０では、腫瘍からの配列データを用いて、腫瘍特異的な配列プロファイルを決定してもよい。いくつかの実施形態では、腫瘍由来の配列データを、正常細胞由来の配列データと比較して、腫瘍特異的な配列プロファイルを作成する。いくつかの実施形態では、腫瘍特異的な配列プロファイルは、セット中の１つ以上の遺伝子の変異の状態を含む。この方法はさらに、腫瘍特異的な配列プロファイルを記述するレポートを作成する工程を包含し得る。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、さらなるモニタリングのための腫瘍特異的な変異を保有することが公知の２〜４個の遺伝子のサブセットを選択する工程を包含する。いくつかの実施形態では、この方法は、腫瘍特異的な変異を保有することが公知の４個以下の遺伝子のサブセットを選択する工程を包含する。工程１３０では、無細胞ＤＮＡを、処置（例えば、腫瘍除去または治療介入）前に、ならびに処置（腫瘍除去または治療介入）前に、ならびに後の時点で被験体から収集された血液サンプルから得る。工程１４０では、血液サンプル由来の無細胞ＤＮＡを、サブセット中で２〜４個の遺伝子についてアッセイして、腫瘍特異的な変異の定量的な測定を得る。

図２は、被験体における腫瘍細胞および正常細胞を配列決定するための、工程１１０〜１２０からの、図１に記載される方法の例示的なワークフローの描写である。

腫瘍サンプルは、ホルマリン溶液中での固定、続いてパラフィン中への包埋によって（例えば、ＦＦＰＥサンプルである）、配列決定の前に処理してもよい。いくつかの実施形態では、腫瘍サンプルは、配列決定前に凍結される。いくつかの実施形態では、腫瘍サンプルは固定も凍結もされない。固定されていない未凍結の腫瘍サンプルは、室温での核酸の保存のために構成された貯蔵溶液中に貯蔵されてもよい。貯蔵溶液は、市販の貯蔵溶液であってもよい。例示的な貯蔵溶液としては、限定するものではないが、ＢｉｏｍａｔｒｉｃａのＤＮＡ貯蔵溶液（例えば、ＷＯ／２０１２／０１８６３８、ＷＯ／２００９／０３８８５３、米国特許出願公開第２００８０１７６２０９号を参照のこと）（参照によって本明細書に援用される）が挙げられる。

血液中の変異の状態を決定するための配列決定の方法およびアッセイのさらなる実施形態は、本明細書に記載されている。

（次世代の配列決定）
いくつかの実施形態では、被験体由来の腫瘍サンプルおよび正常細胞を配列決定する。いくつかの実施形態では、核酸は、当該分野で公知の任意の方法を用いて、腫瘍サンプルおよび正常細胞から単離される。核酸はＤＮＡである。腫瘍サンプルおよび正常細胞由来のＤＮＡを用いて、被験体特異的な腫瘍ＤＮＡライブラリーおよび／または正常なＤＮＡライブラリーを調製してもよい。ＤＮＡライブラリーを、配列決定プラットフォームによる配列決定のために用いてもよい。この配列決定プラットフォームは、次世代の配列決定（ＮＧＳ）プラットフォームであり得る。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、ＮＧＳ技術を用いて核酸ライブラリーを配列決定する工程を包含する。ＮＧＳ技術は、大規模並列（ｍａｓｓｉｖｅｌｙｐａｒａｌｌｅｌ）方式での、クローン増幅されたＤＮＡテンプレートまたは単一のＤＮＡ分子の配列決定を包含し得る（例えば、Ｖｏｌｋｅｒｄｉｎｇら、ＣｌｉｎＣｈｅｍ５５：６４１〜６５８［２００９］；ＭｅｔｚｋｅｒＭＮａｔｕｒｅＲｅｖ１１：３１〜４６［２０１０］に記載のとおり）。ハイスループットの配列情報に加えて、ＮＧＳでは、各々の配列の読み取りが、個々のクローンＤＮＡテンプレートまたは単一のＤＮＡ分子を示す計数可能な「配列タグ」であるという点で、デジタルの定量情報を提供する。

（次世代の配列決定プラットフォーム）
次世代の配列決定プラットフォームは、市販されているプラットフォームであり得る。市販のプラットフォームとしては、例えば、シーケンシング・バイ・シンテシス（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）のためのプラットフォーム、イオン半導体（ｉｏｎｓｅｍｉｎｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）シーケンシング、パイロシーケンシング（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、リバーシブル・ダイ・ターミネーター・シーケンシング（ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅｄｙｅｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、ライゲーションによる配列決定、単一分子配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、およびナノポアシーケンシングが挙げられる。シーケンシング・バイ・シンテシスのためのプラットフォームは例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，４５４ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＨｅｌｉｃｏｓＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓおよびＱｉａｇｅｎから入手可能である。Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームには、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ’ｓＳｏｌｅｘａプラットフォーム，Ｉｌｌｕｍｉｎａ’ｓＧｅｎｏｍｅＡｎａｌｙｚｅｒが挙げられ、これは、Ｇｕｄｍｕｎｄｓｓｏｎら、（Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２００９４１：１１２２−６）、Ｏｕｔら（Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．２００９３０：１７０３−１２）およびＴｕｒｎｅｒ（Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２００９６：３１５−６）、米国特許出願公開第２００８０１６０５８０号および同第２００８０２８６７９５号、米国特許第６３０６５９７号、および同第７１１５４００号、および同第７２３２６５６号に記載されている。４５４ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅプラットフォームには例えば、ＧＳＦｌｅｘおよびＧＳＪｕｎｉｏｒが挙げられ、米国特許第７，３２３，３０５号に記載される。ＨｅｌｉｃｏｓＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのプラットフォームは、ＴｒｕｅＳｉｎｇｌｅＭｏｌｅｃｕｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇプラットフォームを含む。イオン半導体シーケンシングのためのプラットフォームには、例えば、ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔＰｅｒｓｏｎａｌＧｅｎｏｍｅＭａｃｈｉｎｅ（ＰＧＭ）を含み、かつ米国特許第７９４８０１５号に記載されている。パイロシーケンシングのためのプラットフォームには、ＧＳＦｌｅｘ４５４システムを含み、これは、米国特許第７２１１３９０号；同第７２４４５５９号；同第７２６４９２９号に記載される。ライゲーションによる配列決定のためのプラットフォームおよび方法には、例えば、ＳＯＬｉＤ配列決定プラットフォームが挙げられ、これは、米国特許第５７５０３４１号に記載される。単一分子配列決定のためのプラットフォームには、ＰａｃｉｆｉｃＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのＳＭＲＴシステム、およびＨｅｌｉｃｏｓＴｒｕｅＳｉｎｇｌｅＭｏｌｅｃｕｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇプラットフォームが挙げられる。

自動サンガー法は、「第一世代」の技術であるとみなされるが、自動サンガーシーケンシングを含むサンガーの配列決定はまた、本発明の方法によっても使用されてもよい。開発中の核酸画像化技術、例えば、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）または透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）の使用を含む追加の配列決定法もまた、本発明の方法によって包含される。例示的な配列決定の技術は下に記載される。

ＤＮＡ配列決定技術は、半導体技術と、シーケンシング化学を一緒にして、化学的にコードされた情報（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）を半導体チップ上のデジタル情報（０、１）に直接変換する、イオントーレント（ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ）シーケンシングプラットフォームを利用し得る。理論で束縛されることは望まないが、ヌクレオチドがポリメラーゼによってＤＮＡの鎖に組み込まれる場合、水素イオンが副産物として放出される。イオントーレント（ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ）プラットフォームは、水素原子の放出をｐＨの変化として検出する。ｐＨの検出された変化を用いて、ヌクレオチドの組み込みを示してもよい。イオントーレントプラットフォームは、大規模並列方式でこの生化学的プロセスを行うためにマイクロマシンのウェルの高密度のアレイを含む。各々のウェルは、異なるライブラリーのメンバーを保持し、これがクローンとして増幅され得る。ウェルの下がイオン感受性層であって、その下がイオンセンサーである。このプラットフォームは、連続してアレイを１つのヌクレオチドでまた引き続いて浸す。あるヌクレオチド、例えば、ＣがＤＮＡテンプレートに追加されて、次にＤＮＡの鎖に組み込まれる場合、水素イオンが放出される。そのイオンからの電荷によって、溶液のｐＨが変化し、これがイオントーレントのイオンセンサーによって特定され得る。ヌクレオチドが組み込まれていない場合、電圧変化が記録されて、コールされる塩基はない。ＤＮＡ鎖の上に２つの同一の塩基があれば、電圧は倍になり、チップはコールされた２つの同一の塩基を記録する。直接の同定によって、ヌクレオチド組み込みの記録が秒単位で可能になる。イオントーレントプラットフォームのためのライブラリーの調製は一般には、ＤＮＡフラグメントの両端で２つの別個のアダプターのライゲーションを含む。

ＤＮＡ配列決定技術は、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングプラットフォームを利用しており、ここでは一般に、フローセルおよびシーケンシング・バイ・シンテシスのアプローチでのライブラリーメンバーのクラスター増幅を使用する。クラスター増幅のライブラリーメンバーは、ポリメラーゼ指向性単一塩基伸長の反復サイクルに供される。単一塩基伸長は、リバーシブルターミネーターｄＮＴＰの組み込みを包含し得る（各々のｄＮＴＰは、異なる除去可能なフルオロフォアで標識されている）。可逆性のターミネーターｄＮＴＰは一般には、ポリメラーゼによるさらなる伸長を防ぐように３’で修飾されている。組み込み後、組み込まれたヌクレオチドは、蛍光画像によって特定され得る。蛍光画像化の後、フルオロフォアは、取り外されてもよく、そして３’修飾は取り外されてもよく、その結果、３’ヒドロキシル基が生じ、それによって単一塩基伸長の別のサイクルが可能になる。Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームのためのライブラリー調製は一般的には、ＤＮＡフラグメントの両端での２つの別個のアダプターのライゲーションを含む。

本発明の１つ以上の方法で用いられるＤＮＡ配列決定技術は、ＨｅｌｉｃｏｓＴｒｕｅＳｉｎｇｌｅＭｏｌｅｃｕｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ｔＳＭＳ）であってもよく、これは、シーケンシング・バイ・シンテシス技術を使用し得る。ｔＳＭＳ技術では、ポリＡアダプターを、ＤＮＡフラグメントの３’末端に連結してもよい。適合したフラグメントは、ｔＳＭＳフローセル上に固定されたポリ−Ｔオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされ得る。ライブラリーのメンバーは、約１億個のテンプレート／ｃｍ２という密度でフローセル上に固定され得る。次いで、フローセルは、装置、例えば、ＨｅｌｉＳｃｏｐｅ（商標）シーケンサーにロードされてもよく、レーザーは、フローセルの表面を照射して、各々のテンプレートの位置を明らかにする。ＣＣＤカメラは、フローセル表面上にテンプレートの位置をマッピングし得る。ライブラリーのメンバーは、ポリメラーゼ指向性の単一塩基伸長の反復サイクルに供され得る。この配列決定反応は、ＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光標識ヌクレオチドを導入することによって開始する。ポリメラーゼは、標識されたヌクレオチドをプライマーに、テンプレート指向性方式で組み込み得る。ポリメラーゼおよび組み込まれていないヌクレオチドは、取り出されてもよい。蛍光標識されたヌクレオチドの指向性の組み込みを有するテンプレートは、フローセル表面を画像化することによって識別され得る。画像化後、切断工程で蛍光標識を取り外してもよく、このプロセスは、所望の読み取り長さが達成されるまで、他の蛍光標識されたヌクレオチドで反復され得る。配列情報は、各々のヌクレオチド追加工程で収集され得る。

ＤＮＡ配列決定技術は、４５４配列決定プラットフォーム（Ｒｏｃｈｅ）（例えば、Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ４３７：３７６〜３８０［２００５］に記載）を利用し得る。４５４配列決定は一般的には、２工程を含む。第一工程では、ＤＮＡはフラグメントに剪断される。このフラグメントはブラントエンドであってもよい。オリゴヌクレオチドアダプターが、このフラグメントの末端に連結され得る。このアダプターは一般には、フラグメントの増幅および配列決定のためのプライマーとして機能する。少なくとも１つのアダプターは、捕獲試薬、例えば、ビオチンを含んでもよい。フラグメントは、ＤＮＡ捕獲ビーズ、例えば、ストレプトアビジンコーティングビーズに付着されてもよい。ビーズに付着されたフラグメントは、油−水型のエマルジョンの液滴内で増幅されるＰＣＲであってもよく、これによって各々のビーズ上でクローン増幅したＤＮＡフラグメントの多数のコピーが生じる。第二工程では、ビーズは、ピコリットルのサイズであり得るウェルに捕獲され得る。パイロシーケンシングは、各々のＤＮＡフラグメントで並行して行われ得る。パイロシーケンシングは一般的には、ヌクレオチド組み込みの際に、ピロリン酸塩（ＰＰｉ）の放出を検出する。ＰＰｉは、アデノシン５’ホスホ硫酸の存在下でＡＴＰスルフリラーゼによってＡＴＰに変換され得る。ルシフェラーゼは、ＡＴＰを用いて、ルシフェリンをオキシルシフェリンに変換し得、それによって検出される光のシグナルを生じる。検出された光のシグナルを用いて、組み込まれたヌクレオチドを特定してもよい。

このＤＮＡ配列決定技術は、ＳＯＬｉＤ（商標）技術（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を利用してもよい。ＳＯＬｉＤプラットフォームは一般には、シーケンシング・バイ・ライゲーションのアプローチを利用する。ＳＯＬｉＤプラットフォームでの使用のためのライブラリーの調製は一般には、フラグメントの５’末端および３’末端にアダプターが付着しているライゲーションを含み、フラグメントライブラリーを作製する。あるいは、フラグメントの５’末端および３’末端へのアダプターのライゲーションによって内部アダプターを導入して、フラグメントを環状化させ、この環状化フラグメントを消化して内部アダプターを作製し、得られたフラグメントの５’末端および３’末端にアダプターを付着させて、メイトペアライブラリーを作製してもよい。次に、クローン化ビーズ集団が、ビーズ、プライマー、テンプレートおよびＰＣＲ成分を含むマイクロリアクター中で調製され得る。ＰＣＲ後、テンプレートは変性され得る。ビーズは伸長されてテンプレートを有するビーズについて富化され得る。選択されたビーズ上のテンプレートは、スライドガラスへの結合を可能にする３’修飾を施されてもよい。配列は、連続的ハイブリダイゼーションおよび中央決定塩基（または塩基の対）での部分的にランダムなオリゴヌクレオチドのライゲーションによって決定され得、これは、特異的フルオロフォアによって同定される。色が記録された後、連結されたオリゴヌクレオチドは、取り除かれて、次にこのプロセルスが繰り返されてもよい。

ＤＮＡ配列決定技術は、１分子リアルタイム（ＳＭＲＴ（商標））配列決定プラットフォーム（ＰａｃｉｆｉｃＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を利用してもよい。ＳＭＲＴ配列決定においては、色素標識ヌクレオチドの連続的組み込みが、ＤＮＡ合成の間に画像化され得る。１つのＤＮＡポリメラーゼ分子が、個々の０モード波長識別子（ＺＭＷ識別子）の底表面に付着されてもよく、このＺＭＷ識別子は、リン酸基連結された（ｐｈｏｓｐｏｌｉｎｋｅｄ）ヌクレオチドが成長中のプライマー鎖に組み込まれている間に、配列情報を得る。ＺＭＷとは、一般的には、ＺＭＷの外側に迅速に（マイクロ秒で）拡散する蛍光ヌクレオチドのバックグラウンドに対して、ＤＮＡポリメラーゼによる１つのヌクレオチドの組み込みの観察を可能にする閉じ込め構造を指す。対照的に、ヌクレオチドの組み込みには、一般に、数ミリ秒の時間尺度がかかる。この間に、蛍光標識は励起して、蛍光シグナルを発して、これが検出される。蛍光シグナルの検出を用いて、配列情報を作成してもよい。次いで、フルオロフォアを取り出して、このプロセスを繰り返してもよい。ＳＭＲＴプラットフォームのためのライブラリー調製は一般には、ＤＮＡフラグメントの末端に対するヘアピンアダプターのライゲーションを包含する。

ＤＮＡ配列決定技術は、ナノポア配列決定（例えばＳｏｎｉＧＶおよびＭｅｌｌｅｒＡ．ＣｌｉｎＣｈｅｍ５３：１９９６−２００１［２００７］において記載される）を利用してもよい。ナノポア配列決定ＤＮＡ解析技術は、ＯｘｆｏｒｄＮａｎｏｐｏｒｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（英国、オックスフォード）を含む多くの会社によって産業的に開発されている。ナノポア配列決定は、１分子配列決定技術であり、ここで、１分子のＤＮＡが、ナノポアを通過する際に直接的に配列決定される。ナノポアは、直径１ナノメートルのオーダーの小さな穴であってもよい。ナノポアの導伝性流体内への浸漬およびこれを横切る電位（電圧）の適用は、ナノポアを通るイオンの伝導に起因する僅かな電流を生じ得る。流れる電流の量は、ナノポアの大きさおよび形状、ならびに例えば、ＤＮＡ分子による閉塞に感受性である。ＤＮＡ分子がナノポアを通る際、ＤＮＡ分子上の各ヌクレオチドが、ナノポアを異なる程度で塞ぎ、ナノポアを通る電流の大きさを、異なる程度で変える。したがって、ＤＮＡ分子がナノポアを通る際の電流におけるこの変化は、ＤＮＡ配列の読み取りに相当する。

ＤＮＡ配列決定技術は、化学的感受性電界効果トランジスタ（ｃｈｅｍＦＥＴ）アレイを利用してもよい（例えば、米国特許出願公開第２００９００２６０８２号に記載される）。この技術の例では、ＤＮＡ分子は、反応チャンバ内に置かれてもよく、そしてテンプレート分子は、ポリメラーゼに結合した配列決定プライマーにハイブリダイズされ得る。配列決定プライマーの３’末端における新たな核酸鎖への１つ以上の三リン酸の組み込みは、ｃｈｅｍＦＥＴにより、電流の変化で認識され得る。１つのアレイは、多数のｃｈｅｍＦＥＴセンサーを有し得る。別の例では、１つの核酸は、ビーズに付着し得、そしてこの核酸は、ビーズ上で増幅され得、そして個々のビーズは、ｃｈｅｍＦＥＴアレイ上の個々の反応チャンバ（それぞれのチャンバがｃｈｅｍＦＥＴセンサを有する）に移送され得て、核酸が配列決定され得る。

ＤＮＡ配列決定技術は、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）を利用してもよい。この方法は、個別分子配置迅速ナノ輸送（ＩｎｄｉｖｉｄｕａｌＭｏｌｅｃｕｌｅＰｌａｃｅｍｅｎｔＲａｐｉｄＮａｎｏＴｒａｎｓｆｅｒ（ＩＭＰＲＮＴ））と呼ばれ、一般には、重原子マーカーを用いて選択的に標識された高分子量（１５０ｋｂ以上）のＤＮＡの１原子解析透過電子顕微鏡画像化、およびこれらの分子を超薄フィルム上に超高密度（鎖間３ｎｍ）平行アレイに、一定の塩基間隔で配列する工程を包含する。電子顕微鏡を用いて、フィルム上の分子を画像化し、重原子マーカーの位置を決定して、ＤＮＡから塩基配列情報を引き出す。この方法は、ＰＣＴ特許公開ＷＯ２００９／０４６４４５にさらに記載される。この方法によって、１０分間未満での完全なヒトゲノムの配列決定が可能になる。

この方法は、ハイブリダイゼーションによる配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｂｙｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）（ＳＢＨ）を利用し得る。ＳＢＨは一般的には、複数のポリヌクレオチド配列と複数のポリヌクレオチドプローブとを接触させる工程であって、ここで、各々の複数のポリヌクレオチドプローブは、必要に応じて基板に固定され得る工程を包含する。この基板は、公知のヌクレオチド配列のアレイを含む平坦な表面であってもよい。アレイに対するハイブリダイゼーションのパターンは、サンプル中に存在するポリヌクレオチドの配列を決定するために用いられ得る。他の実施形態では、各々のプローブがビーズ、例えば、磁気ビーズなどに固定される。ビーズに対するハイブリダイゼーションを特定し、これを用いて、サンプル内の複数のポリヌクレオチド配列を特定してもよい。

配列読み取りの長さは、利用される特定の配列決定技術次第で変化し得る。ＮＧＳプラットフォームは、数十塩基対〜数百塩基対、または数千塩基対までサイズが変動する配列読み取りを提供し得る。本明細書において記載される方法のいくつかの実施形態では、配列読み取りは、約２０塩基長、約２５塩基長、約３０塩基長、約３５塩基長、約４０塩基長、約４５塩基長、約５０塩基長、約５５塩基長、約６０塩基長、約６５塩基長、約７０塩基長、約７５塩基長、約８０塩基長、約８５塩基長、約９０塩基長、約９５塩基長、約１００塩基長、約１１０塩基長、約１２０塩基長、約１３０、約１４０塩基長、約１５０塩基長、約２００塩基長、約２５０塩基長、約３００塩基長、約３５０塩基長、約４００塩基長、約４５０塩基長、約５００塩基長、約６００塩基長、約７００塩基長、約８００塩基長、約９００塩基長、約１０００塩基長、または１０００塩基長超である。

サンプル中に存在するＤＮＡフラグメントの部分的な配列決定を行ってもよく、公知の参照ゲノムにマッピングする読み取りを含む配列タグをカウントしてもよい。参照ゲノムに対して特異的に整列する配列読み取りのみを配列タグとしてカウントしてもよい。一実施形態では、参照ゲノムはヒト参照ゲノムＮＣＢＩ３６／ｈｇ１８配列であり、これはワールドワイドウェブ上で、ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｈｇＧａｔｅｗａｙ？ｏｒｇ＝Ｈｕｍａｎ＆ｄｂ＝ｈｇｌ８＆ｈｇｓｉｄ＝１６６２６０１０５）で入手可能である。公的な配列情報の他のソースとしては、ＧｅｎＢａｎｋ、ｄｂＥＳＴ、ｄｂＳＴＳ、ＥＭＢＬ（欧州分子生物学研究所：ＥｕｒｏｐｅａｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）、およびＤＤＢＪ（日本ＤＮＡデータバンク）が挙げられる。参照ゲノムはまた、ヒト参照ゲノムＮＣＢＩ３６／ｈｇｌ８配列および人工標的配列ゲノムを含み得、これには、多形性標的配列を含む。さらに別の実施形態では、この参照ゲノムは、多形性標的配列を含む人工標的配列ゲノムである。

配列タグのマッピングは、タグの配列と、参照ゲノムの配列とを比較して、配列決定された核酸（例えば、無細胞ＤＮＡ）分子の染色体起源を決定することによって得ることが可能であり、特定の遺伝子配列情報は必要としない。多くのコンピュータアルゴリズムが、配列をアラインメントするために利用可能であり、これには限定するものではないが、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０年）、ＢＬＩＴＺ（ＭＰｓｒｃｈ）（Ｓｔｕｒｒｏｃｋ＆Ｃｏｌｌｉｎｓ、１９９３）、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ、１９８８）、ＢＯＷＴＩＥ（Ｌａｎｇｍｅａｄら、ＧｅｎｏｍｅＢｉｏｌｏｇｙ１０：Ｒ２５．１〜Ｒ２５．１０［２００９］）、またはＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）が挙げられる。一実施形態では、ＤＮＡ分子のクローン増殖されたコピーの一端は、ＩｌｌｕｍｉｎａＧｅｎｏｍｅＡｎａｌｙｚｅｒ（ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＬａｒｇｅ−ＳｃａｌｅＡｌｉｇｎｍｅｎｔｏｆＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＤａｔａｂａｓｅｓ（ＥＬＡＮＤ）ソフトウェアを用いる）のバイオインフォーマティックアラインメント解析によって配列決定され、処理される。追加のソフトウェアとしては、ＳＡＭｔｏｏｌｓ（ＳＡＭｔｏｏｌｓ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００９，２５（１６）：２０７８−９）、およびＢｕｒｒｏｕｇｈｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒブロックソーティングコンプレッション（ｂｌｏｃｋｓｏｒｔｉｎｇｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）手順（ブロックソーティングまたはプレプロセシングして、圧縮をより効率的にさせる工程を包含する）が挙げられる。

本明細書に記載される配列決定プラットフォームは一般には、固体支持体に対する配列決定ライブラリーのメンバーの捕獲および固定を可能にする表面結合オリゴヌクレオチド上に固定された固体支持体を含む。表面結合されたオリゴヌクレオチドは一般には、配列決定ライブラリーのアダプター表面に対する配列相補性を含む。

核酸サンプルを用いて、配列決定のための核酸ライブラリーを調製してもよい。核酸ライブラリーの調製は、当該分野で公知であるかまたは本明細書に記載のような任意の方法を含んでもよい。本明細書において用いる場合、「ライブラリー」または「配列決定ライブラリー」という用語は、本明細書では交換可能に用いられ、生物学的サンプルから得られる複数の核酸フラグメントを指してもよい。一般には、フラグメントは、配列決定プラットフォームに対するフラグメントのカップリング（例えば、捕獲および／または固定）に影響するアダプター配列で修飾される。アダプター配列は、配列決定プラットフォームに対するライブラリーのメンバーのカップリングに影響する規定のオリゴヌクレオチド配列を含んでもよい。単なる例であるが、アダプターは、固体支持体（例えば、配列決定フローセルまたはビーズ）に固定されたオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも２５％相補性であるか、または同一である配列を含んでもよい。アダプター配列は、配列決定プライマーに対して少なくとも７０％相補性であるか、または同一である既定のオリゴヌクレオチド配列を含んでもよい。この配列決定プライマーは、ポリメラーゼによるヌクレオチド組み込みを可能にし、ここではヌクレオチドの組み込みをモニターして、配列決定情報を得る。配列決定プライマーは、約１５〜２５塩基であってもよい。いくつかの実施形態では、この配列決定プライマーは、アダプターの３’末端にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、アダプターは、固体支持体に固定されたオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも２５％相補性であるか、または同一である配列、および配列決定プライマーに対して少なくとも７０％相補性であるか、または同一である配列を含む。カップリングはまた、連続的にアダプターを一緒にスティッチングすることを通じて達成され得る。スティッチされ得るアダプターの数は、１、２、３、４またはそれ以上であってもよい。このスティッチされたアダプターは、少なくとも３５塩基、７０塩基、１０５塩基、１４０塩基またはそれ以上であってもよい。

アダプターは、バーコード配列を含んでもよい。ライブラリー中の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の配列決定ライブラリーのメンバーが、同じアダプター配列を含んでもよい。ｓｓＤＮＡライブラリーのメンバーのうち少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％が、第一の末端でアダプター配列を含み得るが、第二の末端では含まない。いくつかの実施形態では、第一の末端は５’末端である。いくつかの実施形態では、第一の末端は３’末端である。アダプター配列は、配列決定のために用いられる配列決定プラットフォームに従って、ユーザーによって選択され得る。単なる例に過ぎないが、合成プラットフォームによるＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定は、固体支持体を含み、その上に固定された表面結合オリゴヌクレオチドの第一および第二の集団がある。このようなオリゴヌクレオチドは、第一および第二のＩｌｌｕｍｉｎａ特異的なアダプターオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイゼーションするため、および伸長反応をプライミングするための配列を含む。したがって、ＤＮＡライブラリーのメンバーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａシステムの表面結合オリゴヌクレオチドの第一の集団に対して部分的にまたは完全に相補的である第一のＩｌｌｕｍｉｎａ特異的なアダプターを含んでもよい。他の例に過ぎないが、ＳＯＬｉＤシステム、およびイオントーレント（ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ）、ＧＳＦＬＥＸシステムは、固体支持体をビーズの形態で含み、この上に表面結合したオリゴヌクレオチドの単一の集団が固定されている。したがって、いくつかの実施形態では、ｓｓＤＮＡライブラリーのメンバーは、ＳＯＬｉＤシステム、ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔシステム、またはＧＳＦｌｅｘシステムの表面結合したオリゴヌクレオチドに相補的であるアダプター配列を含む。

したがって、一態様では、本発明は、核酸ライブラリーを調製する改善された方法を提供する。核酸ライブラリーは、ＤＮＡライブラリーであってもよい。この方法は、ＤＮＡフラグメントに対するアダプター配列のライゲーションを含んでもよい。この方法は、アダプターのライゲーションの効率を少なくとも１０倍改善し得る。いくつかの実施形態では、核酸ライブラリーは、ｓｓＤＮＡライブラリーである。いくつかの実施形態では、核酸ライブラリーは部分的なｓｓＤＮＡライブラリーである。

（ｓｓＤＮＡフラグメント／ｓｓＤＮＡライブラリーの調製）
いくつかの実施形態では、ｓｓＤＮＡフラグメントは、ｓｓＤＮＡライブラリーのメンバーである。一本鎖核酸ライブラリーは、当該分野で公知であるか、または本明細書に記載の任意の手段を用いて二本鎖核酸のサンプルから調製される。

出発サンプルは、被験体から得られた生物学的サンプルであってもよい。例示的な被験体および生物学的サンプルは、本明細書に記載される。特定の実施形態では、このサンプルは、固体の生物学的サンプル、例えば、腫瘍サンプルである。いくつかの実施形態では、この固体の生物学的サンプルは、プローブベースのアッセイの前に処理される。処理には、ホルマリン溶液中での固定、続いてパラフィン中への包埋（例えば、ＦＦＰＥサンプルである）を包含し得る。処理は、代わりに、プローブベースのアッセイを行う前のサンプルの凍結を包含してもよい。いくつかの実施形態では、サンプルは、固定も凍結もされていない。未固定の未凍結のサンプルは、例に過ぎないが、核酸の保存のために構成された貯蔵溶液中に貯蔵されてもよい。例示的な貯蔵溶液は本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、非核酸物質は、酵素処理を用いて（例えば、プロテアーゼで）出発材料から取り除かれてもよい。サンプルは必要に応じてホモジナイゼーション、超音波処理、フレンチプレス、ダウンス（ｄｏｕｎｃｅ）、凍結／解凍に供されてもよく、その後に遠心分離を続けてもよい。遠心分離によって、非核酸含有画分から核酸含有画分を分離してもよい。いくつかの実施形態では、このサンプルは、液体の生物学的サンプルである。例示的な液体生物学的サンプルが本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、液体生物学的サンプルは、血液サンプル（例えば、全血、血漿、または血清）である。いくつかの実施形態では、全血サンプルは、参照によって本明細書に援用される、Ｆｕｓｓら、ＣｕｒｒＰｒｏｔｏｃＩｍｍｕｎｏｌ（２００９）第７章：Ｕｎｉｔ７．１に詳細に記載されるＦｉｃｏｌｌ試薬（ｒｅａｇｅｎｔｍ）の使用によって無細胞成分（例えば、血漿、血清）および細胞成分に供される。

核酸は、当該分野で公知の任意の手段を用いて生物学的サンプルから単離されてもよい。例えば、核酸は、液体抽出（例えば、Ｔｒｉｚｏｌ，ＤＮＡｚｏｌ）技術を用いて生物学的サンプルから抽出されてもよい。核酸はまた、市販のキット（例えば、ＱｉａｇｅｎＤＮｅａｓｙキット，ＱＩＡａｍｐキット，ＱｉａｇｅｎＭｉｄｉキット，ＱＩＡｐｒｅｐスピンキット）を用いて抽出されてもよい。

核酸は、単なる例であるが、遠心分離を含む公知の方法によって濃縮してもよい。核酸は、精製の目的のために選択性の膜（例えば、シリカ）に結合され得る。核酸はまた、所望の長さのフラグメント、例えば、１０００、５００、４００、３００、２００または１００の塩基対長未満であるフラグメントに関して富化されてもよい。サイズに基づくこのような富化は、例えば、ＰＥＧ−誘発性の沈降、電気泳動ゲルまたはクロマトグラフィー材料（Ｈｕｂｅｒら、（１９９３）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２１：１０６１〜６）、ゲル濾過クロマトグラフィー、ＴＳＫゲル（Ｋａｔｏら、（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，９５：８３〜８６）を用いて行われてもよい（この刊行物は、参照によって本明細書に援用される）。

生物学的サンプルから抽出されたポリヌクレオチドは、当該分野で公知の任意の方法を用いて選択的に沈殿されても、濃縮されてもよい。

核酸サンプルは、標的ポリヌクレオチドに関して富化されてもよい。標的富化は、当該分野で公知の任意の手段によってもよい。例えば、核酸サンプルは、標的特異的プライマーを用いて標的配列を増幅することによって富化されてもよい。標的増幅は、当該分野で公知の任意の方法またはシステムを用いて、デジタルＰＣＲ方式で行われてもよい。核酸サンプルは、アレイ（その上に標的選択性のオリゴヌクレオチドが固定されている）上への標的配列の捕獲によって富化され得る。この核酸サンプルは、溶液中、または固体支持体上で遊離の標的選択性オリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズすることによって富化され得る。オリゴヌクレオチドは、捕獲試薬による捕獲を可能にする捕獲部分を含んでもよい。例示的な捕獲部分および捕獲試薬は本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、核酸サンプルは、標的ポリヌクレオチドに関しては富化されず、例えば、全ゲノムに相当する。

したがって、いくつかの態様では、本発明は、一本鎖核酸ライブラリーを調製する方法を提供する。一本鎖核酸ライブラリーは、一本鎖ＤＮＡライブラリー（ｓｓＤＮＡライブラリー）であっても、またはＲＮＡライブラリーであってもよい。ｓｓＤＮＡライブラリーを調製する方法は、二本鎖ＤＮＡフラグメントをｓｓＤＮＡフラグメントに変性する工程、プライマードッキング配列を、ｓｓＤＮＡフラグメントの一端に連結する工程、プライマーをプライマードッキング配列にハイブリダイズさせる工程を包含し得る。このプライマーは、次世代の配列決定プラットフォームにカップリングするアダプター配列の少なくとも一部を含んでもよい。この方法はさらに、二重鎖を作成するためのハイブリダイズしたプライマーの伸長を含んでもよく、ここでは二重鎖は、元のｓｓＤＮＡフラグメントおよび伸長したプライマー鎖を含む。伸長したプライマー鎖は、元のｓｓＤＮＡフラグメントから分離されてもよい。この伸長したプライマー鎖は収集されてもよい（ここでは、この伸長したプライマー鎖はｓｓＤＮＡライブラリーのメンバーである）。ＲＮＡライブラリーを調製する方法は、ＲＮＡフラグメントの一端に対してプライマードッキング配列を連結する工程と、プライマーをプライマードッキング配列にハイブリダイズさせる工程を包含する。このプライマーは、次世代配列決定プラットフォームにカップリングするアダプター配列の少なくとも一部を含んでもよい。この方法はさらに、二重鎖を作成するためにハイブリダイズされたプライマーの伸長を包含してもよく、ここでは二重鎖は、元のＲＮＡフラグメントおよび伸長したプライマー鎖を含む。この伸長したプライマー鎖は、元のＲＮＡフラグメントから分離されてもよい。この伸長したプライマー鎖は、収集されてもよい（ここでは、この伸長したプライマー鎖はＲＮＡライブラリーのメンバーである）。

ｄｓＤＮＡは、当該分野で公知または本明細書で記載される任意の手段によって断片化され得る。ｄｓＤＮＡは、例えば、機械的剪断によって、噴霧化によって、または超音波処理によって断片化されてもよい。

いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡを、ランダムプライム逆転写（ＲＮａｓｅＨ＋）を用いてＲＮＡから生成して、ランダムなサイズのｃＤＮＡを生成する。

核酸フラグメント（例えば、ｄｓＤＮＡフラグメント、ＲＮＡ、またはランダムなサイズのｃＤＮＡ）は、１０００ｂｐ未満、８００ｂｐ未満、７００ｂｐ未満、６００ｂｐ未満、５００ｂｐ未満、４００ｂｐ未満、３００ｂｐ未満、２００ｂｐ未満、または１００ｂｐ未満であってもよい。ＤＮＡフラグメントは、約４０〜１００ｂｐ、約５０〜１２５ｂｐ、約１００〜２００ｂｐ、約１５０〜４００ｂｐ、約３００〜５００ｂｐ、約１００〜５００、約４００〜７００ｂｐ、約５００〜８００ｂｐ、約７００〜９００ｂｐ、約８００〜１０００ｂｐ、または約１００〜１０００ｂｐであってもよい。

ｄｓＤＮＡフラグメントの末端は、ポリッシュ（例えば、ブラントエンド化（平滑末端化））されてもよい。ＤＮＡフラグメントの末端は、ポリメラーゼでの処理によってポリッシング（ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）されてもよい。ポリッシングは、３’オーバーハングの除去、５’オーバーハングの充填、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。ポリメラーゼは、校正（ｐｒｏｏｆ−ｒｅａｄｉｎｇ）ポリメラーゼ（例えば、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を含む）であってもよい。この校正ポリメラーゼは例えば、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｏｌ１Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、またはＰｆｕポリメラーゼであってもよい。ポリッシングは、当該分野で公知の任意の手段を用いる損傷されたヌクレオチド（例えば、無塩基部位）の除去を包含し得る。

核酸フラグメントの３’末端に対するアダプターのライゲーションは、そのフラグメントの３’ＯＨ基とアダプターの５’リン酸塩との間の結合の形成を包含し得る。したがって、核酸フラグメントからの５’リン酸塩の除去によって、２つのライブラリーメンバーの異常なライゲーションが最小になり得る。したがって、いくつかの実施形態では、５’リン酸塩は、核酸フラグメントから除去される。いくつかの実施形態では、５’リン酸塩は、サンプル中の核酸フラグメントのうち少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５％超から除去され得る。いくつかの実施形態では、実質的にすべてのリン酸基が、核酸フラグメントから除去される。いくつかの実施形態では、実質的にすべてのリン酸塩が、サンプル中の核酸フラグメントの少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５％超から除去される。核酸サンプルからのリン酸基の除去は、当該分野で公知の任意の手段によってもよい。リン酸基の除去は、熱不安定性ホスファターゼでサンプルを処理する工程を包含し得る。いくつかの実施形態では、リン酸基は、核酸サンプルから除去されない。いくつかの実施形態では、核酸フラグメントの５’末端に対するアダプターのライゲーションが行われる。

（変性）
ｓｓＤＮＡは、当該分野における、または本明細書に記載の任意の手段によって、調製されるｄｓＤＮＡフラグメントから単一の鎖への変性によって調製され得る。ｄｓＤＮＡの変性は、当該分野で公知の任意の手段、例としては、熱変性、塩基性ｐＨ中でのインキュベーション、尿素またはホルムアルデヒドによる変性によってもよい。

熱変性は、ｄｓＤＮＡサンプルを約６０℃以上、約６５℃以上、約７０℃以上、約７５℃以上、約８０℃以上、約８５℃以上、約９０℃以上、約９５℃以上または約９８℃以上まで加熱することによって達成され得る。ｄｓＤＮＡサンプルは、当該分野で公知の任意の手段、例えば、水浴中でのインキュベーション、温度制御熱ブロック、サーマルサイクラーによって加熱されてもよい。いくつかの実施形態では、サンプルは、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０分超加熱される。

塩基性のｐＨでのインキュベーションによる変性は、例えば、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）または水酸化カリウム（ＫＯＨ）を含む溶液中でｄｓＤＮＡサンプルのインキュベーションによって達成され得る。この溶液は、約１ｍＭのＮＡＯＨ、２ｍＭのＮＡＯＨ、５ｍＭのＮＡＯＨ、１０ｍＭのＮＡＯＨ、２０ｍＭのＮＡＯＨ、４０ｍＭのＮＡＯＨ、６０ｍＭのＮＡＯＨ、８０ｍＭのＮＡＯＨ、１００ｍＭのＮＡＯＨ、０．２ＭのＮａＯＨ、約０．３ＭのＮａＯＨ、約０．４ＭのＮａＯＨ、約０．５ＭのＮａＯＨ、約０．６ＭのＮａＯＨ、約０．７ＭのＮａＯＨ、約０．８ＭのＮａＯＨ、約０．９ＭのＮａＯＨ、約１．０ＭのＮａＯＨ、または１．０Ｍを超えるＮａＯＨを含んでもよい。この溶液は、約１ｍＭのＫＯＨ、２ｍＭのＫＯＨ、５ｍＭのＫＯＨ、１０ｍＭのＫＯＨ、２０ｍＭのＫＯＨ、４０ｍＭのＫＯＨ、６０ｍＭのＫＯＨ、８０ｍＭのＫＯＨ、１００ｍＭのＫＯＨ、０．２ＭのＫＯＨ、０．５ＭのＫＯＨ、１ＭのＫＯＨ、または１Ｍより多いＫＯＨを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ｄｓＤＮＡサンプルは、ＮａＯＨまたはＫＯＨ中で、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０分、または６０分超の間インキュベートされる。ｄｓＤＮＡは、ＮａＯＨまたはＫＯＨのインキュベーションの後、酢酸Ｎａ中でインキュベートされてもよい。酢酸Ｎａ中のインキュベーションは、ＮａＯＨまたはＫＯＨを中和し得る。

尿素およびホルムアミドのような化合物は、ヌクレオチド塩基の電気陰性中心とＨ結合を形成し得る官能基を含む。高濃度（例えば、８Ｍ尿素または７０％ホルムアミド）の変性剤では、Ｈ結合についての競合は、相補性塩基の間ではなく変性とＮ塩基との間の相互作用を支援し、それによって２つの鎖を分離する。

（プライマードッキングオリゴヌクレオチドのライゲーション）
プライマードッキングオリゴヌクレオチド（ｐｄｏ）は、核酸フラグメント（例えば、ｓｓＤＮＡ、ＲＮＡ）の一端に連結されてもよい。ｐｄｏは、５’末端または３’末端に連結されてもよい。いくつかの実施形態では、ｐｄｏは、核酸フラグメントの３’末端に連結される。

ｐｄｏは一般的には、プライマーをアニーリングするためのテンプレートとして機能する配列を含む。ｐｄｏの配列は、ＮＧＳプラットフォームにカップリングするためのアダプター配列（ＮＧＳアダプター）の一部または全てに対して少なくとも７０％相補的な配列を含み得る。ｐｄｏは、ＮＧＳアダプターの５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、または２０超の連続のヌクレオチドに対して相補的であるかまたは同一である配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ｐｄｏは、ＮＧＳアダプターの一部または全てに対して相補的な配列を含まない。

ｐｄｏは、５’末端でアデニル化されてもよい。ｐｄｏは、捕獲試薬との複合体を形成し得る捕獲部分にコンジュゲートされてもよい。この捕獲部分は、当該分野で公知の任意の手段によってアダプターオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされてもよい。捕獲部分／捕獲試薬の対は、当該分野で公知である。いくつかの実施形態では、捕獲試薬は、アビジン、ストレプトアビジン、またはニュートラアビジンであり、かつ捕獲部分はビオチンである。別の実施形態では、捕獲部分／捕獲試薬の対は、ジゴキシゲニン／コムギ胚芽凝集素である。

核酸フラグメントに対するｐｄｏのライゲーションは、ＡＴＰ依存性リガーゼによって達成され得る。いくつかの実施形態では、ＡＴＰ依存性リガーゼは、ＲＮＡリガーゼである。ＲＮＡリガーゼは、ＡＴＰ依存性リガーゼであってもよい。ＲＮＡリガーゼは、Ｒｎｌ１またはＲｎｌ２のファミリーのリガーゼであってもよい。一般には、Ｒｎｌ１のファミリーのリガーゼは、ｔＲＮＡ中の一本鎖破壊を修復し得る。例示的なＲｎｌ１ファミリーリガーゼとしては、例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ、ＴｈｅｒｍｕｓｓｃｉｔｏｄｕｃｔｕｓｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅＴＳ２１２６由来の熱安定性ＲＮＡリガーゼ１（ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ）、またはＣｉｒｃＬｉｇａｓｅＩＩが挙げられる。これらのリガーゼは一般的には、ヌクレオチド３−ＯＨ求核試薬と５’リン酸基との間のホスホジエステル結合のＡＴＰ依存性の形成を触媒する。一般には、Ｒｎｌ２ファミリーリガーゼは、二重鎖ＲＮＡ中のニックをシールし得る。例示的なＲｎｌ２ファミリーリガーゼとしては、例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２が挙げられる。このＲＮＡリガーゼは、ＡｒｃｈａｅａｌＲＮＡリガーゼ、例えば、好熱性の古細菌Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（ＭｔｈＲｎｌ）由来の古細菌のＲＮＡリガーゼであってもよい。

一本鎖核酸フラグメントに対するｐｄｏのライゲーションは、核酸フラグメント、ｐｄｏおよびリガーゼを含む反応混合物を調製する工程を包含し得る。いくつかの実施形態では、この反応混合物を、ｓｓＤＮＡフラグメントに対するアダプターオリゴヌクレオチドのライゲーションを達成するまで加熱する。いくつかの実施形態では、この反応混合物を約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、または７０℃超まで加熱する。いくつかの実施形態では、この反応混合物を、約６０〜７０℃まで加熱する。この反応混合物は、核酸フラグメントに対するｐｄｏのライゲーションを達成するために十分な時間加熱してもよい。いくつかの実施形態では、この反応混合物を、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、約６０分、約７０分、約８０分、約９０分、約１２０分、約１５０分、約１８０分、約２１０分、約２４０分、または２４０分超、加熱する。

いくつかの実施形態では、ｐｄｏ’ｓは、混合物中の核酸フラグメントの濃度よりも大きい濃度で反応混合物中に存在する。いくつかの実施形態では、ｐｄｏ’ｓは、混合物中の核酸フラグメントの濃度よりも少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、６０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％または１００％超大きい濃度で存在する。ｐｄｏ’ｓは、混合物中の核酸フラグメントの濃度よりも少なくとも１０倍、１００倍、１０００倍、または１００００倍大きい濃度で存在してもよい。ｐｄｏ’ｓは、０．１ｕＭ、０．５ｕＭ、１ｕＭ、１０ｕＭ超の最終濃度で存在してもよい。いくつかの実施形態では、リガーゼは、飽和量で反応混合物中に存在する。

反応混合物はさらに、高分子量の不活性分子、例えば、ＭＷ４０００、６０００、または８０００のＰＥＧを含んでもよい。この不活性分子は、約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、７．５％、１０％、１２．５％、１５％、１７．５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、または５０（重量／容積）％を超える量で存在してもよい。いくつかの実施形態では、不活性分子は、約０．５〜２％、約１〜５％、約２〜１５％、約１０〜２０％、約１５〜３０％、約２０〜５０％、または５０（重量／容積）％を超える量で存在する。

ｓｓ核酸分子に対するアダプターのライゲーションを達成するために十分な時間の後、未反応のアダプターを、当該分野で公知の任意の手段によって、例えば、分子量カットオフによるろ過、サイズ排除クロマトグラフィー、スピンカラムの使用、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）での選択的沈殿、シリカマトリックス上へのＰＥＧでの選択的沈殿、アルコール沈殿、酢酸ナトリウム沈殿、ＰＥＧおよび塩沈、または高ストリンジェンシー洗浄によって除去してもよい。

いくつかの実施形態では、この方法はさらに、連結された核酸フラグメントを捕獲する工程を包含する。連結された核酸フラグメントの捕獲は、伸長の前に起きても、または伸長の後に生じてもよい。連結された核酸フラグメントは、固体支持体上に捕獲されてもよい。捕獲は、ｐｄｏおよび捕獲試薬にコンジュゲートされた捕獲部分を含む複合体の形成を包含し得る。いくつかの実施形態では、この捕獲試薬は、固体支持体上に固定されている。いくつかの実施形態では、この固体支持体は、捕獲部分を含む連結された核酸の量と比較して、過剰な捕獲試薬を含む。いくつかの実施形態では、この固体支持体は、捕獲部分を含む連結された核酸フラグメントの総数よりも５倍、１０倍、または１００倍多い利用可能な結合部位を含む。

（伸長）
いくつかの実施形態では、プライマーは、ｐｄｏを介して、連結された核酸フラグメントにハイブリダイズされる。プライマーは、ＮＧＳアダプター配列の一部または全体を含んでもよい。例示的なＮＧＳアダプター配列は本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、プライマーを伸長して、元の核酸フラグメントおよび伸長されたプライマーを含む二重鎖を作成し、ここでこの伸長されたプライマーは、元の核酸フラグメントの逆相補体およびＮＧＳアダプター配列を一端に含む。いくつかの実施形態では、ＮＧＳアダプターは５’末端である。例示的なＮＧＳアダプター配列は本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、ＮＧＳアダプター配列は、ＮＧＳプラットフォームの表面結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも７０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＧＳアダプター配列は、ＮＧＳプラットフォームの表面結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも７０％相補性である配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＧＳアダプター配列は、ＮＧＳプラットフォームによる使用のための配列決定プライマーに対して少なくとも７０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＧＳアダプター配列は、ＮＧＳプラットフォームによる使用のための配列決定プライマーに対して少なくとも７０％相補性である配列を含む。伸長は、校正の中等温度好性のまたは好熱性のＤＮＡポリメラーゼによって達成され得る。好ましくは、ポリメラーゼは、好熱性のポリメラーゼであって、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性／エンドヌクレアーゼ活性（ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩ）または３’−５’エキソヌクレアーゼ活性（ファミリーＡまたはＢのＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ）を有する。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性（Ｔａｑ）を有さなくてもよい。いくつかの場合では、ポリメラーゼは、固定された連結されたフラグメントの線形の増幅を達成し、これが固定された連結されたフラグメントの逆相補体の複数のコピーを生じる。他の場合には、１コピーの逆相補体だけが作成される。いくつかの実施形態では、この伸長されたプライマー分子は、元の核酸テンプレートから分離される（例えば、本明細書に記載のような変性によって）。この伸長されたプライマー分子は、溶液中で遊離（フリー）であるが、元の核酸テンプレート分子は、固体支持体上に固定されたままである。この伸長されたプライマー分子は、容易に回収され得、結果として、ライブラリーのメンバーのほとんどがＮＧＳアダプターを含む核酸ライブラリー調製が行われる。ライブラリーメンバーのうち少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９０％超、または実質的に全てがＮＧＳアダプターを含んでもよい。

一本鎖核酸ライブラリー（例えば、ｓｓＤＮＡライブラリー）を調製するための例示的なワークフローを下に概説する。

図３は、生物学的サンプル（例えば、血液、血漿、尿、糞便、粘膜のサンプル）から単離された核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）から核酸ライブラリーを調製するための方法の例示的な実施形態を示す。得られた核酸は、酵素的な方法または機械的な手段によって１００〜１０００ｂｐの、しかし好ましくは１００〜５００ｂｐのフラグメントに断片化され得る。核酸は、インサイチュで断片化されてもよい。核酸は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織または循環中のＤＮＡから断片化されてもよい。核酸は、ＦＦＰＥおよび循環中からキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｏｖａｒｉｓ）によって単離されてもよい。いくつかの実施形態では、核酸はＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、生物学的サンプルから単離されたＲＮＡから生成されたｃＤＮＡであって、同じサンプルからランダムプライム逆転写（ＲＮａｓｅＨ＋）を用いてランダムなサイズのｃＤＮＡを生成する。いくつかの実施形態では、その結果、核酸はＲＮＡである。断片化されたＤＮＡは、塩基除去修復酵素（ｂａｓｅｅｘｉｃｉｓｉｏｎｒｅｐａｉｒｅｎｚｙｍｅ）（ＥｎｄｏＶＩＩＩ，ホルムアミドピリミジンＤＮＡグリコシラーゼ（ＦＰＧ））で処理して、重合化を妨害し得る損傷された塩基を除去してもよい。次いで、ＤＮＡを、校正ポリメラーゼ（例えば、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ）で処理して、末端をポリッシュして、損傷したヌクレオチド（例えば、無塩基部位）を置き換える。いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、末端をポリッシュして損傷したヌクレオチドを置き換えるために校正ポリメラーゼで処理されることはない。

工程１では、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を、熱不安定性ホスファターゼで処理して、核酸からすべてのリン酸基を除去してもよい。反応混合物を、１０分間８０℃まで加熱して、ホスファターゼおよびポリメラーゼを不活化して、二本鎖ＤＮＡを一本鎖に変性してもよい。

工程２では、３’末端の１２〜５０塩基長のアフィニティータグ（例えば、ビオチン）を含む化学的にまたは酵素的にリン酸化されたｐｄｏを、平均分子量４０００、６０００または８０００の１０〜２０％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコールの存在下で、飽和量のＡＴＰ依存性ＲＮＡリガーゼ（Ｔ４ＲＮＡリガーゼ、しかし好ましくは、好熱性リガーゼ、例えば、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅＩＩ）を用いて、０．５ｕＭ以上の最終濃度で、断片化した一本鎖核酸に連結してもよい。その反応は、６０〜７０℃で１時間インキュベートしてもよい。ｐｄｏは、以下を含んでもよい：（ｉ）Ｉｌｌｕｍｉｎａフローセルクラスター生成のための表面結合オリゴヌクレオチドに相当する配列が全て、一部または無し、（ｉｉ）アフィニティーリガンドと結合したレセプターとの間の相互作用の立体障害を最小化するために十分な距離（１０原子以上）でオリゴヌクレオチドに連結されているライゲーション反応に関与できない３’末端アフィニティー基。

ｐｄｏは、当該分野で公知の任意の手段によってアデニル化されてもよい。アデニル化アダプターを用いる場合、いくつかの実施形態では、ＡＴＰ依存性ＲＮＡリガーゼは、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅでも、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅＩＩでもない。この反応を、サイズによって精製して未反応のアダプターを取り除いてもよい。これは、１０Ｋまたは３Ｋという分子サイズカットオフによる精密ろ過ユニット（例えば、ｍｉｃｒｏｃｏｎＹＭ−１０もしくはＹＭ３、またはｎａｎｏｓｅｐｏｍｅｇａ）を使用して達成され得る。あるいは、アダプター除去は、１０Ｋまたはそれ未満のサイズ排除カットオフでのサイズ排除脱塩カラム（アガロース、ポリアクリルアミド）の通過により、スピンカラムの使用により、ＰＥＧ、アルコールまたは塩での選択的沈殿、高ストリンジェンシー洗浄、または変性ゲル電気泳動により、達成され得る。

工程６では、オリゴヌクレオチドプライマーは、その３’末端でアダプターに完全に相補的であるか、またはその３’末端でアダプターに部分的に相補的であるかであるが、Ｉｌｌｕｍｉｎａフローセルオリゴヌクレオチドに相当する配列を完全に保有するならば、これを用いて校正の中等温度好性のＤＮＡポリメラーゼを用いて結合したライブラリーの逆相補体を作成してもよい。好ましくは、５’−３’のエキソヌクレアーゼ活性／エンドヌクレアーゼ活性（ファミリーＡのＤＮＡポリメラーゼ，例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩ）または３’−５’エキソヌクレアーゼ活性（ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼ，Ｖｅｎｔ，Ｐｈｕｓｉｏｎ，Ｐｆｕおよびそれらの改変体）を有する好熱性のポリメラーゼを用いて、ライブラリーの線形増幅を可能にする。

工程７では、回収された物質は次に、アフィニティー樹脂または３’末端アフィニティータグに結合できる支持体にバッチ方式で結合され得る。回収された物質は、タグ付けされたアダプター分子の総数の少なくとも１０倍過剰、かつ好ましくは１００倍多い利用可能な結合部位を含む０．２ｍｌの管中で事前にすすいでおいた支持体中に入れてもよい。

工程８では、結合したライブラリーのコピーからなる上清を回収して、定量してもよい。

図４は、ｓｓＤＮＡライブラリーを調製するための図３に記載の例示的なワークフローの図である。工程４１０では、ｄｓＤＮＡは断片化される。工程４２０では、ｄｓＤＮＡフラグメントを、脱リン酸化し、一本鎖に熱変性する。工程４３０では、プライマードッキング配列４３１を含むビオチン化ｐｄｏ’ｓを核酸フラグメントと接触させる。工程４４０では、ｐｄｏ’ｓを、ｓｓＤＮＡフラグメントの３’末端に連結して、ライブラリーのメンバーの前駆体を作成する。工程４５０では、ｐｄｏ４５１に相補的な配列およびアダプター配列４５２を含むプライマーを、ｐｄｏｓを介してｓｓＤＮＡに対して工程５６０でハイブリダイズする。工程４６０では、ハイブリダイズしたプライマーをテンプレートのｓｓＤＮＡフラグメントにそって伸長して、二重鎖を作成する。この二重鎖を、固体支持体（例えば、ストレプトアビジンコーティングビーズ）上に固定する。熱変性によって、最終のライブラリーのメンバーを溶液中に放出するが元のｓｓＤＮＡフラグメントはビーズ上に残す。

（ｓｓＤＮＡライブラリー調製の代替的な実施形態）
別の態様では、本発明は、ｓｓＤＮＡライブラリーを調製する方法を提供し、この方法は、ｄｓＤＮＡフラグメントをｓｓＤＮＡに変性する工程、およびアダプター配列を、ｓｓＤＮＡ分子の両端に連結する工程を包含する。ｄｓＤＮＡを断片化する方法は、本明細書に記載される。ｄｓＤＮＡフラグメントを変性する方法は本明細書に記載される。

この方法は、第一の表面結合オリゴヌクレオチドに対して、少なくとも７０％相補的なまたは同一な配列を含む第一のアダプターを連結する工程を包含し得る。この第一の表面結合オリゴヌクレオチドは、ＮＧＳプラットフォーム特異的な表面結合オリゴヌクレオチドであってもよい。この第一のアダプターは、表面結合オリゴヌクレオチドの５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、または２０超の連続のヌクレオチドに対して、相補的なまたは同一な配列を含んでもよい。この第一のアダプターはさらに、第一の配列決定プライマーに対して少なくとも７０％相補的な配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、この第一のアダプターは、本明細書に記載の方法、または当該分野で公知の任意の方法を用いてｓｓＤＮＡフラグメントの３’末端に連結される。いくつかの実施形態では、ｓｓＤＮＡフラグメントは、５’リン酸基を欠く。特定の実施形態では、この第一のアダプターは、ＡＴＰ依存性リガーゼによってｓｓＤＮＡフラグメントの３’末端に連結される。他の実施形態では、この第一のアダプターは、３’末端ブロック基を含む。一般には、この３’末端ブロック基は、３’末端塩基と別のヌクレオチドとの間の共有結合の形成を妨げる。いくつかの実施形態では、３’末端ブロック基はジデオキシ−ｄＮＴＰまたはビオチンである。この第一のアダプターは、５’アデニル化されていてもよい。いくつかの実施形態では、この第一のアダプターは、本明細書で記載されるようなＲＮＡリガーゼによってｓｓＤＮＡフラグメントの３’末端に連結される。ＲＮＡリガーゼは、Ｔ４またはＭｔｈ由来の短縮または変異したＲＮＡリガーゼ２であってもよい。この方法はさらに、第二のアダプター配列を、ｓｓＤＮＡフラグメントの５’末端に連結する工程を包含する。この第二のアダプター配列は、第一のアダプター配列とは別個であってもよい。第二のアダプター配列は、第二の表面結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも７０％相補的である配列を含んでもよい。この第二の表面結合オリゴヌクレオチドは、ＮＧＳプラットフォーム特異的な表面結合オリゴヌクレオチドであってもよい。この第二のアダプターは、表面結合オリゴヌクレオチドの５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、または２０超連続のヌクレオチドに対して相補的なまたは同一な配列を含んでもよい。この第二のアダプターはさらに、第二の配列決定プライマーに対して少なくとも７０％相補的な配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、この第二のアダプターは、ＲＮＡリガーゼ、例えば、本明細書に記載のＣｉｒｃＬｉｇａｓｅを用いてｓｓＤＮＡフラグメントに連結される。いくつかの実施形態では、この第一および第二のアダプターは、両方とも、第一および第二の表面結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも７０％相補的である。他の実施形態では、この第一および第二のアダプターは両方とも、第一および第二の表面結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも７０％同一である。

本明細書に記載される方法を用いて生成されるｓｓＤＮＡライブラリーは、全ゲノム配列決定または標的化配列決定に用いてもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を用いて生成されるｓｓＤＮＡライブラリーは、配列決定の前に目的の標的ポリヌクレオチドについて富化される。

（標的富化）
別の態様では、本発明は、標的富化核酸ライブラリーを調製するための方法を提供する。この方法は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）フラグメントに対して標的選択性オリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）をハイブリダイズして、ハイブリダイゼーション生成物を作成する工程と、このハイブリダイゼーション生成物を単回の増幅で増幅して、伸長鎖を作成する工程とを包含する。

標的富化の方法は、参照によって本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１２０１５７３２２に記載のとおりであり得る。

このハイブリダイゼーションおよび増幅の工程は、反応混合物中で生じ得る。「反応混合物」という用語は、本明細書において用いる場合、一般には、核酸テンプレート分子から少なくとも１つのアンプリコンを増幅するために必要な成分の混合物を指す。この混合物は、ヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、ポリメラーゼおよび標的選択性オリゴヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、この混合物は、複数の標的選択性オリゴヌクレオチドを含む。この混合物はさらに、Ｔｒｉｓ緩衝液、一価の塩、およびＭｇ２＋を含んでもよい。各々の構成要素の濃度は、当該分野で周知であって、さらに当業者によって最適化され得る。反応混合物はまた、限定するものではないが、非特異的なバックグラウンド／ブロッキング核酸（例えば、サケ精子ＤＮＡ）、バイオ防腐剤（例えば、アジ化ナトリウム）、ＰＣＲ増強剤（例えば、ベタイン、トレハロースなど）、およびインヒビター（例えば、ＲＮＡｓｅ阻害剤）を含む添加物を含んでもよい。いくつかの実施形態では、核酸サンプル（例えば、ｓｓＤＮＡフラグメントを含むサンプル）が、反応混合物と混合される。したがって、いくつかの実施形態では、この反応混合物はさらに、核酸サンプルを含む。

ｓｓＤＮＡフラグメントは、ｓｓＤＮＡライブラリーのメンバーであり得る。ｓｓＤＮＡライブラリーは、本明細書に記載の方法を用いて調製され得る。ｓｓＤＮＡフラグメントは、第一の末端に位置するが第二の末端には位置しない、第一の一本鎖アダプター配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、この第一の末端は、５’末端である。いくつかの実施形態では、ＴＳＯは、第一の末端に位置するが、第二の末端には位置しない第二の一本鎖アダプター配列を含む。この第一の末端は、５’末端であってもよい。いくつかの実施形態では、第一のアダプター配列は、第一の表面結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも７０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、この第一のアダプター配列は、配列決定プライマーに対して少なくとも７０％の同一性である配列を含む。いくつかの実施形態では、この第一のアダプターはさらに、バーコード配列を含む。いくつかの実施形態では、この第二のアダプターは、第二の表面結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも７０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、この第二のアダプターは、配列決定プライマーに対して少なくとも７０％同一である配列を含む。

この標的選択性オリゴヌクレオチド（ｔｓｏ）は、目的の標的ポリヌクレオチドに対して少なくとも部分的にハイブリダイズするように設計されてもよい。いくつかの実施形態では、ｔｓｏは、標的ポリヌクレオチドに対して選択的にハイブリダイズするように設計される。ｔｓｏは、標的ポリヌクレオチドにおける配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５％超相補的であってもよい。いくつかの実施形態では、ｔｓｏは標的ポリヌクレオチドの配列に対して１００％相補的である。ハイブリダイゼーションは、あるＴｍを有するｔｓｏ／標的二重鎖を生じ得る。ｔｓｏ／標的二重鎖のＴｍは、０〜１００℃、２０〜９０℃、４０〜８０℃、５０〜７０℃、または５５〜６５℃であってもよい。ｔｓｏは一般的には、ポリメラーゼの存在下で伸長生成物の合成をプライムするのに十分長い。ｔｓｏの正確な長さおよび組成は、多くの要因、例としては、アニーリング反応の温度、供給源、およびプライマーの組成、ならびにプライマー：プローブ濃度の比に依存し得る。ｔｓｏは、例えば、８〜５０、１０〜４０、または１２〜２４ヌクレオチド長であってもよい。

（増幅）
この方法は、反応混合物中の標的の増幅を含んでもよい。増幅は、ｔｓｏ／標的二重鎖中においてｔｓｏでプライムされ得る。いくつかの実施形態では、増幅は、核酸ポリメラーゼを利用して行われる。核酸ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼであってもよい。特定の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである。このポリメラーゼは、ＡまたはＢファミリーのＤＮＡ校正ポリメラーゼのメンバー（Ｖｅｎｔ，Ｐｆｕ，Ｐｈｕｓｉｏｎ、およびそれらの改変体）、ＤＮＡポリメラーゼホロ酵素（ＤＮＡｐｏｌＩＩＩホロ酵素）、Ｔａｑポリメラーゼ、またはそれらの組み合わせであってもよい。

増幅は、自動化された過程で行われてもよく、ここではテンプレートＤＮＡを含む反応混合物は、変性工程、プライマーアニーリング工程、および合成工程を通じてサイクリングされ、これによって切断および置換が、プライマー依存性のテンプレート伸長と同時に生じる。自動化された過程は、ＰＣＲサーマルサイクラーを用いて行ってもよい。市販のサーマルサイクラーシステムとしては、なかでも、Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒのシステムが挙げられる。いくつかの実施形態では、１サイクルの増幅を行う。

ｔｓｏ／標的二重鎖の増幅は、標的配列を含む元のｓｓＤＮＡフラグメントを含む伸長生成物、ならびに第二のアダプター配列、ｔｓｏ、標的配列の逆相補体、および第一のアダプター配列の逆相補体を含む伸長された鎖を生じ得る。元のｓｓＤＮＡフラグメントの第一のアダプター配列が第一の表面結合したオリゴヌクレオチドに対して７０％以上同一であったならば、伸長した鎖は、第一の表面結合オリゴヌクレオチドに対して７０％以上の相補性である第一のアダプター配列を含み、それによって第一の表面結合オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。この伸長されたた鎖は、標的富化されたライブラリーを含んでもよい。

反応混合物中の伸長生成物は変性され得る。この変性された伸長生成物は、少なくとも第一の表面結合オリゴヌクレオチド上に固定された表面と接触され得る。いくつかの実施形態では、この伸長した鎖は、伸長した鎖の第一のアダプター配列にアニーリングし得る第一の表面結合オリゴヌクレオチドによって捕獲される。

第一の表面結合オリゴヌクレオチドは、捕獲された伸長した鎖の伸長をプライムし得る。いくつかの実施形態では、捕獲された伸長した鎖の伸長は、捕獲された伸長生成物を生じる。この捕獲された伸長生成物は、第一の表面結合したオリゴヌクレオチド、標的配列、および第二の表面結合したオリゴヌクレオチドに対して少なくとも７０％以上相補的である第二のアダプター配列を含む。

いくつかの実施形態では、この捕獲された伸長生成物は、第二の表面結合オリゴヌクレオチドにハイブリダイズして、架橋を形成する。いくつかの実施形態では、この架橋は、ブリッジＰＣＲによって増幅される。ブリッジＰＣＲ法は、当該分野で公知の方法を用いて行われてもよい。

（ライブラリー調製および標的富化のためのキット）
本明細書に記載されるようなライブラリー調製または本明細書に記載されるような標的富化の方法を行うためのキットも提供される。

一態様では、本発明は、ｓｓＤＮＡライブラリーを調製するためのキットを提供する。一実施形態では、このキットは、本明細書に記載のようなｐｄｏを含む。いくつかの実施形態では、このキットは、説明書、例えば、ｓｓＤＮＡフラグメントに対してｐｄｏを連結するための説明書を含む。このキットはさらに、リガーゼを含んでもよい。このリガーゼは、本明細書に記載されるような、Ｒｎｌ１またはＲｎｌ２ファミリーリガーゼであってもよい。このキットはさらに、ｐｄｏにハイブリダイズできるプライマーを含んでもよい。ｐｄｏにハイブリダイズ可能なプライマーは、本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、このキットは、固体支持体、例えば、捕獲試薬の上に固定されたビーズを提供する。いくつかの実施形態では、このキットは、伸長反応を行うためのポリメラーゼを提供する。いくつかの実施形態では、このキットは、伸長反応を行うためのｄＮＴＰを提供する。

別の実施形態では、このキットは、配列決定プラットフォームにカップリングされた第一支持体結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも７０％相補的な配列を含む第一のアダプターオリゴヌクレオチド、第一のアダプターとは別個の配列を含む第二のアダプターオリゴヌクレオチド、ＲＮＡリガーゼ、および使用説明書、例えば、本発明の方法を実施するための説明書を含む。いくつかの実施形態では、この第一のアダプターは、３’末端塩基と別のヌクレオチドとの間の共有結合の形成を妨げる３’末端ブロック基を含む。３’末端ブロック基は本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、この第一は、５’アデニル化されている。いくつかの実施形態では、この第一のアダプターは、配列決定プライマーに対して少なくとも７０％相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、この第二のアダプターは、配列決定プライマーに対して少なくとも７０％相補性である配列を含む。いくつかの実施形態では、この第二のアダプターは、配列決定プラットフォームに対してカップリングされた第二の支持体結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも７０％相補的な配列を含む。

本発明は、標的富化されたＤＮＡライブラリーを調製するためのキットを提供する。いくつかの実施形態では、このキットは、ｐｄｏ、リガーゼ、ｐｄｏにハイブリダイズし得るプライマー、捕獲試薬を含む固体支持体、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、またはそれらの任意の組み合わせを包含する。いくつかの実施形態では、このキットはさらに、ｔｓｏを含む。ｔｓｏは、参照によって本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１２０１５７３２２号に記載のように、ＮＧＳプラットフォーム上での配列決定のためにカップリングされた固体支持体上に固定されてもよい。

いくつかの実施形態では、本発明のキットは、包装資材を含む。本明細書において用いる場合、「包装資材、パッケージング材（ｐａｃｋａｇｉｎｇｍａｔｅｒｉａｌ）」という用語は、キットの構成要素を収容する物理的構造を指してもよい。包装資材は、キット構成要素の無菌性を維持し得、かつこのような目的のために通常用いられる資材（例えば、紙、段ボール、ガラス、プラスチック、ホイル、アンプルなど）から構成され得る。キットはまた、緩衝材、防腐剤、またはタンパク質／核酸安定化剤を含んでもよい。

（配列決定）
いくつかの実施形態では、標的富化されたライブラリーは、当該分野で公知のまたは本明細書に記載の任意の方法を用いて配列決定される。配列決定は、セット中の１つ以上の癌関連遺伝子の変異の存在を明らかにし得る。いくつかの実施形態では、変異を保有している２、３、４の遺伝子のサブセットを、後の時点で、被験体から単離された流体サンプル中で無細胞ＤＮＡのアセスメントによってさらにモニタリングするために選択する。いくつかの実施形態では、変異を保有している４つ以下の遺伝子のサブセットを、後の時点で、被験体から単離された流体サンプル中で無細胞ＤＮＡの評価によってさらにモニタリングするために選択する。

（無細胞ＤＮＡの経時的な評価）
いくつかの実施形態では、無細胞のＤＮＡのアセスメントは、図５に示されるような、遺伝子のサブセットの対立遺伝子の検出および／または測定を包含する。図５は、被験体の血流に入る腫瘍ＤＮＡ６０１を示す。対立遺伝子の検出は、当該分野において公知か、または本明細書に記載の任意の手段によってであってもよい。検出は、米国特許第５５３８８４８号に記載の方法（例えば、Ｔａｑｍａｎアッセイを用いる）または本明細書に記載の方法によってであってもよい。

したがって、本発明は、標的ポリヌクレオチド中の変異の感度のよい検出のための方法およびキットを提供する。いくつかの態様では、本発明の方法およびキットは、標的ポリヌクレオチド中の対立遺伝子の識別のために用いられ得る。例えば、本発明は、高い野性型対立遺伝子比のバックグラウンド中の変異体対立遺伝子の検出のための方法およびキットを提供する。別の実施例に関して、本発明は、複数の対立遺伝子の検出のための方法およびキットを提供する。いくつかの実施形態では、対立遺伝子の検出は、問い合わされる対立遺伝子が存在する場合、検出可能シグナルの放出または活性化によって可能である。

（対立遺伝子検出のための方法）
いくつかの態様では、本明細書に記載されるような対立遺伝子検出のための１つ以上の方法は、変異を保有することが疑われる標的ポリヌクレオチド領域に対してオリゴヌクレオチドプライマーが結合する能力に関する。このオリゴヌクレオチドプライマーは、変異が疑われる遺伝子座を部分的に覆い得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーは、変異に完全を覆う。したがって、いくつかの実施形態では、この変異は、あるオリゴヌクレオチドプライマーによって包含されるのに十分小さい。変異は一塩基多型（ＳＮＰ）であってもよい。この変異はまた、複数のヌクレオチド多型（例えば、二重変異または三重変異）を含んでもよい。この変異は、１つ以上のヌクレオチドの挿入であってもよい。変異は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３，１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、５０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、１００００００個のヌクレオチドの挿入であってもよい。変異は、１〜５、２〜１０、５〜１５、または１０〜２０ヌクレオチドの挿入であってもよい。いくつかの実施形態では、変異は、１つ以上のヌクレオチドの欠失である。変異は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個のヌクレオチドの欠失であってもよい。変異は、１〜５、２〜１０、５〜１５、または１０〜２０ヌクレオチドの欠失であってもよい。変異は２つ以上のヌクレオチドの逆位であってもよい。いくつかの実施形態では、２、３、４、５、またはそれ以上のヌクレオチドが反転される。いくつかの実施形態では、変異はコピー数変動（例えば、ＳＮＰまたは野性型対立遺伝子のコピー数変動）である。

一態様では、本発明は、標的ポリヌクレオチド領域中の変異を検出する方法を提供し、この方法は：（ａ）核酸サンプルと反応混合物とを対立遺伝子検出のために接触する工程であって、ここで対立遺伝子検出のための反応混合物が標的ポリヌクレオチド領域に対してハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドプライマーを含み、このオリゴヌクレオチドプライマーが、プローブ結合領域およびテンプレート結合領域（変異を保有すると疑われる遺伝子座を少なくとも部分的に覆い、ポリメラーゼによって対立遺伝子特異的な伸長が可能である）を含む工程と；（ｂ）オリゴヌクレオチドプライマーを伸長して伸長生成物を形成する工程と；（ｃ）伸長生成物を検出し、それによって変異の存在を示す伸長生成物を検出する工程とを包含する。

対立遺伝子検出のためのプライマー
オリゴヌクレオチドプライマー（例えば、フォワードプライマー）は、変異を保有すると疑われる標的ポリヌクレオチドに対して少なくとも部分的にハイブリダイズするように設計され得る。いくつかの実施形態では、フォワードプライマーのテンプレート結合領域は、標的ポリヌクレオチドに対して選択的にハイブリダイズするように設計される。ハイブリダイゼーションは、あるＴｍを有するフォワードプライマー／テンプレート二重鎖を生じてもよい。プライマー／テンプレート二重鎖のＴｍは、０〜１００℃、２０〜９０℃、４０〜８０℃、５０〜７０℃、または５５〜６５℃であってもよい。フォワードプライマーのテンプレート結合領域は、８〜５０、１０〜４０、または１２〜２４ヌクレオチド長であってもよい。フォワードプライマーのテンプレート結合領域は、変異を保有すると疑われる特定の遺伝子座と少なくとも部分的を覆うように設計され得る。フォワードプライマーのテンプレート結合領域は、例えば、変異を保有すると疑われる遺伝子座のうち、少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、２０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％を覆い得る。フォワードプライマーのテンプレート結合領域は、変異を保有すると疑われる遺伝子座の少なくとも約０．５〜２％、１〜１０％、５〜２０％、１０〜５０％、３０〜７０％、５０〜８０％、６０〜９０％、または８０〜１００％を覆い得る。テンプレート結合領域は、フォワードプライマーの３’領域に位置し得る。いくつかの実施形態では、この遺伝子座を覆うテンプレート結合領域の領域は、３’末端領域である。いくつかの実施形態では、変異遺伝子座を覆う３’末端領域は、テンプレート結合領域の３’末端の１、２、３、４、５、または５超の塩基を含む。いくつかの実施形態では、フォワードプライマーの３’末端塩基はこの遺伝子座を覆う。いくつかの実施形態では、フォワードプライマーの３’末端領域は、問い合わされた対立遺伝子に対して相補的である。フォワードプライマーの３’末端塩基は、問い合わされる対立遺伝子に対して相補的でなくてもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上のミスマッチが３’末端塩基に対して隣接する３’領域に導入される（例えば、ｎ−１、ｎ−２、ｎ−３など）。これらのミスマッチは、プライマー伸長に対するこのミスマッチの影響を増大するかまたは低下するヌクレオチドであっても、または修飾されたヌクレオチドであってもよい。

テンプレート結合領域は、コピー数変動を有すると疑われる遺伝子座を少なくとも部分的に覆い得る。いくつかの実施形態では、フォワードプライマーのテンプレート結合領域は、コピー数変動を有すると疑われる遺伝子座のうち少なくとも約０．５〜２％、１〜１０％、５〜２０％、１０〜５０％、３０〜７０％、５０〜８０％、６０〜９０％、または８０〜１００％を覆い得る。

フォワードプライマーの３’末端領域は、ホスホロチオエート結合によって連結されるヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、フォワードプライマーの３’末端領域で少なくとも２、３、４、５、またはそれ以上のヌクレオチドがホスホロチオエート結合によって連結される。

フォワードプライマーは、さらに、プローブ結合領域を含む。一般には、フォワードプライマーのプローブ結合領域は、テンプレートとは独立したレポータープローブの使用を可能にする。プローブ結合領域は、テンプレート核酸にハイブリダイズしない固有の配列またはバーコードを含んでもよい。プローブ結合領域は、例えば、目的の生物体の公知のゲノム配列に対する有意な配列類似性または相補性を回避するように設計され得る。このような固有の配列は、例えば、コンピュータ読み取り可能なメディアによって、無作為に生成されてもよく、そしてＢＬＡＳＴｉｎｇによって、例えば、ＥＭＢＬ、ＧｅｎＢａｎｋ、またはＤＤＢＪのような公知のヌクレオチドデータベースに対して選択されてもよい。バーコード配列はまた、二次構造を回避するように設計されてもよい。プローブ設計のためのツールは、当該分野で公知であり、これには例えば、ｍＦｏｌｄ、ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓが挙げられる。プローブ結合領域は、５〜５０、６〜４０、または７〜３０ヌクレオチド長であってもよい。プローブ結合領域は、フォワードプライマーのテンプレート結合領域から１〜２０、３〜１５、または６〜８ヌクレオチド離れてもよい。プローブ結合領域は、テンプレート結合領域の５’に位置してもよい。

いくつかの実施形態では、この方法はさらに、核酸サンプルとリバースプライマーとを接触させる工程を包含する。このリバースプライマーは、フォワードプライマーの下流であるテンプレート核酸のある領域に相当するオリゴヌクレオチドプライマーであってもよい。いくつかの実施形態では、このリバースプライマーは、問い合わされる対立遺伝子の下流である。リバースプライマーは、標的ポリヌクレオチドの逆相補鎖に結合し得る。フォワード／リバースプライマー対は、変異を保有すると疑われる標的領域にまたがってもよい。いくつかの実施形態では、この標的領域は、１４〜１０００、２０〜８００、４０〜６００、５０〜５００、７０〜３００、９０〜２００、または１００〜１５０ヌクレオチド長である。

プライマーまたは本発明で用いられる他のオリゴヌクレオチドはさらに、バーコード配列を含んでもよい。バーコード配列が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、バーコード配列は、問い合わされた対立遺伝子の同一性、標的ポリヌクレオチドもしくはゲノム遺伝子座の同一性、サンプルの同一性、被験体、またはそれらの任意の組み合わせに関連する情報をコードする。バーコード配列は、プライマーの一部、レポータープローブ、またはその両方であってもよい。バーコード配列は、オリゴヌクレオチドの５’末端であってももしくは３’末端であってもよく、またはオリゴヌクレオチドの任意の領域に配置されてもよい。バーコード配列は一般的には、テンプレート配列の一部ではない。バーコード配列は、サイズおよび組成物が広範に変化し得る；以下の参照によって、特定の実施形態について適切なバーコード配列のセットを選択するための手引きが得られる；Ｂｒｅｎｎｅｒ，米国特許第５，６３５，４００号；Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９７：１６６５−１６７０（２０００）；Ｓｈｏｅｍａｋｅｒら、ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ，１４：４５０−４５６（１９９６）；Ｍｏｒｒｉｓら、Ｅｕｒｏｐｅａｎｐａｔｅｎｔ刊行物０７９９８９７Ａ１；Ｗａｌｌａｃｅ，米国特許第５，９８１，１７９。バーコード配列は、約４〜３６ヌクレオチド、約６〜３０ヌクレオチド、または約８〜２０ヌクレオチドの長さを有し得る。

本発明で用いられるプライマーは一般には、重合化のための因子の存在下で伸長生成物の合成をプライムするために十分な長さである。プライマーの正確な長さおよび組成物は、アニーリング反応の温度、プライマーの供給源および組成物、ならびにプライマー：プローブ濃度の比を含めて多くの要因に依存し得る。プライマー長は、例えば、約５〜１００、１０〜５０、または２０〜３０ヌクレオチドであってもよいが、プライマーは、それより多くまたは少なくヌクレオチドを含んでもよい。

（レポータープローブ）
いくつかの実施形態では、反応混合物はさらに、レポータープローブを含む。一般には、本発明のレポータープローブは、問い合わせされた対立遺伝子の存在を示す検出可能シグナルを生成するために設計される。

レポータープローブは、検出可能部分およびクエンチャー部分を含んでもよい。この検出可能部分は色素であってもよい。この色素は、蛍光色素、例えば、フルオロフォアであってもよい。蛍光色素は、連結部分を介してプローブの末端の３’炭素または末端の５’炭素に対する結合のために誘導体化された色素であり得る。この色素は、連結部分を介したプローブの末端５’炭素に対する結合のために誘導体化され得る。クエンチングは、フルオロフォアとクエンチャーとの間のエネルギーの移動を包含し得る。フルオロフォアの発光スペクトルおよびクエンチャーの吸収スペクトルは重複し得る。プローブがインタクトである場合、検出可能な部分からの蛍光シグナルは、クエンチャーによって実質的に抑制され得る。例えば、加水分解によるレポータープローブの切断は、検出可能部分をクエンチャー部分から分離し得る。この分離によって蛍光部分は、検出可能な蛍光シグナルを生じ得る。

このレポータープローブは、Ｌｉｖａｋら、「ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｗｉｔｈｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｄｙｅｓａｔｏｐｐｏｓｉｔｅｅｎｄｓｐｒｏｖｉｄｅａｑｕｅｎｃｈｅｄｐｒｏｂｅｓｙｓｔｅｍｕｓｅｆｕｌｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎｇＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔａｎｄｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓＡｐｐｌ．１９９５４：３５７−３６２によって設計され得る。

特定のプローブについてのレポーター−クエンチャー部分の対は、例えば、Ｐｅｓｃｅら編，ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＳｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９７１）；Ｗｈｉｔｅら、ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ（ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９７０によって選択されてもよい。レポーター−クエンチャー対で用いられ得る例示的な蛍光および色素生産性分子は、例えば、Ｂｅｒｌｍａｎ，ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＳｐｒｅｃｔｒａｏｆＡｒｏｍａｔｉｃＭｏｌｅｃｕｌｅｓ，第２版（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９７１）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ＣｏｌｏｕｒａｎｄＣｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｏｆＯｒｇａｎｉｃＭｏｌｅｃｕｌｅｓ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９７６）；Ｂｉｓｈｏｐ，編，Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ（ＰｅｒｇａｍｏｎＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９７２）；Ｈａｕｇｌａｎｄ，ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｂｅｓａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈＣｈｅｍｉｃａｌｓ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，１９９２）；Ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍ，ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｎｄＰｈｏｓｐｈｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（ＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９４９）に記載される。

広範な種類の反応性の蛍光性レポーター色素を、それらが本発明のクエンチャー色素によってクエンチされる限り用いてもよい。フルオロフォアは、芳香族化合物であっても、または芳香族複素環化合物であってもよい。フルオロフォアは、例えば、ピレン、アントラセン、ナフタレン、アクリジン、スチルベン、ベンゾオキサゾール、インドール、ベンズインドール、オキサゾール、チアゾール、ベンゾチアゾール、ケイナイン（ｃａｎｉｎｅ）、カルボシアニン、サチリル酸塩、アントラニル酸塩、キサンテン色素、クマリンであってもよい。例示的なキサンテン色素としては、例えば、フルオレセインおよびローダミン色素が挙げられる。例示的なフルオレセインおよびローダミン色素としては、限定するものではないが、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、２’７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ；Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）が挙げられる。適切な蛍光性レポーターとしてはまた、α位置またはβ位置におけるアミノ基を有するナフチルアミン色素が挙げられる。例えば、ナフチルアミノ化合物としては、１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホナート、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホナートおよび２−ｐ−トルイジニル−６−ナフタレンスルホナート，５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）が挙げられる。例示的なクマリンとしては、例えば、３−フェニル−７−イソシアナートクマリン；アクリジン、例えば、９−イソチオシアナートアクリジンおよびアクリジンオレンジ；Ｎ−（ｐ−（２−ベンゾオキサゾリル）フェニル）マレイミド；シアニン類、例えば、インドジカルボシアニン３（Ｃｙ３）、インドジカルボシアニン５（Ｃｙ５）、インドジカルボシアニン５．５（Ｃｙ５．５）、３−（−カルボキシ−ペンチル）−３’−エチル−５，５’−ジメチルオキサカルボシアニン（ＣｙＡ）など；１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ，１５Ｈ−キサンテノ［２，３，４−ｉｊ：５，６，７−ｉ’ｊ’］ジキノリジン−１８−イウム、９−［２（または４）−［［［６−［２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ］−６−オキソヘキシル］アミノ］スルホニル］−４（または２）−スルホフェニル］−２，３，６，７，１２，１３，１６，１７−オクタヒドロ−内部塩（ＴＲまたはＴｅｘａｓＲｅｄ）；またはＢＯＤＩＰＹ（商標）色素が挙げられる。例示的な蛍光性部分およびクエンチャー部分は、例えば、参照によって本明細書に援用される、ＷＯ／２００５／０４９８４９に記載される。

当該分野で公知のような、適切なクエンチャーは、フルオレッサー（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒ）によって選択される。例示的なレポーターおよびクエンチャーはさらに、参照によって本明細書に援用されるＡｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第７，６０１，８２１号に記載される。

クエンチャーはまた、種々の商業的供給源から入手できる。例示的な市販のクエンチャーとしては、例えば、ＢｉｏｓｅａｒｃｈＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＢｌａｃｋＨｏｌｅＱｕｅｎｃｈｅｒｓ（登録商標）およびＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＩｎｃのＩｏｗａＢｌａｃｋ（登録商標）またはＺＥＮクエンチャーが挙げられる。

いくつかの実施形態では、レポータープローブは、２つのクエンチャー部分を含む。２つのクエンチャー部分を含む例示的なプローブとしては、ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＺｅｎプローブが挙げられる。このようなプローブは、検出可能部分から約９塩基離れて位置する内部クエンチャー部分を含み、かつ一般には、伝統的なレポーター／クエンチャープローブに関連するバックグラウンドシグナルを低下する。

検出可能部分およびクエンチャー部分は、共通の反応基または連結部分を介したオリゴヌクレオチドに対する共有結合のために誘導され得る。検出可能部分およびクエンチャー部分の誘導体化のための方法は、例えば、Ｕｌｌｍａｎら、米国特許第３，９９６，３４５号；Ｋｈａｎｎａら、米国特許第４，３５１，７６０号；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，編，ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｎｄＡｎａｌｏｇｕｅｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９１）；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１５：５３０５−５３２１（１９８７）（オリゴヌクレオチド上の３’チオール基）；Ｓｈａｒｍａら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１９：３０１９（１９９１）（３’スルフヒドリル）；Ｇｉｕｓｔｉら、ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２：２２３−２２７（１９９３）およびＦｕｎｇら、米国特許第４，７５７，１４１号（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．から入手できるＡｍｉｎｏｌｉｎｋ（商標）ＩＩを介した５’ホスホアミノ基）；Ｓｔａｂｉｎｓｋｙ，米国特許第４，７３９，０４４号（３’アミノアルキルホスホリル基）；Ａｇｒａｗａｌら、ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ，３１：１５４３−１５４６（１９９０）（ホスホラミダイト連結を介した結合）；Ｓｐｒｏａｔら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１５：４８３７（１９８７）（５’メルカプト基）；Ｎｅｌｓｏｎら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１７：７１８７−７１９４（１９８９）（３’アミノ基）（そのすべてが参照によって本明細書に援用される）に記載される。

いくつかの実施形態では、市販されている連結部分、例えば、ＣｌｏｎｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＰａｌｏＡｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）から入手可能な連結部分が、合成の間にオリゴヌクレオチドに結合されてもよい。単なる例に過ぎないが、ローダミンおよびフルオレセイン色素は、オリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシルに対する結合のためのホスホラミダイト部分で誘導体化され得る（例えば、その全体が参照によって本明細書に援用される、Ｗｏｏら、米国特許第５，２３１，１９１号；およびＨｏｂｂｓ，Ｊｒ．米国特許第４，９９７，９２８号を参照のこと）。

いくつかの実施形態では、検出可能部分は、非蛍光シグナルを生じる。例えば、プローブのテンプレートへの加水分解が、検出プローブ−アンプリコン複合体からのシグナル部分の検出可能な分離を生じる任意のプローブを用いてもよい。例えば、シグナル部分の放出は、電子的に（例えば、シグナル部分が検出プローブ／アンプリコン複合体から放出される時、電極表面荷電摂動として）、量子ドット検知よって、発光によって、または化学的に（例えば、シグナル部分が溶液中に放出されるにつれて溶液中のｐＨの変化によって）検出され得る。同様に、プローブ結合領域に結合し、シグナル中の変化がクエンチャー部分から検出可能部分の分離の際に検出され得る、任意のプローブを用いてもよい。例えば、分子ビーコンプローブ、ＭＧＢプローブ、または他のプローブが本発明における使用のために検討される。分子ビーコンプローブは、参照によって本明細書に援用される、例えば、米国特許第５，９２５，５１７号および同第６，１０３，４０６号に記載される。ＭＧＢプローブは、例えば、参照によって本明細書に援用される米国特許第７，３８１，８１８号に記載される。

このレポータープローブは、本明細書に記載のプライマーのプローブ結合領域に選択的にハイブリダイズするように設計され得る。したがって、いくつかの実施形態では、レポータープローブは、プローブ結合領域の少なくとも一部に相補的である配列を含む。レポータープローブは、５〜５０、６〜４０、または７〜３０ヌクレオチド長であってもよい。このハイブリダイゼーションは、あるＴｍを有するプローブ／プライマー二重鎖を生じ得る。プローブ／プライマー二重鎖のＴｍは、プライマー／テンプレート二重鎖のＴｍより高くてもよい。プローブ／プライマー二重鎖のＴｍは、プライマー／テンプレート二重鎖のＴｍよりも１、２、３、４、５、６、７、８９、１０、または１０℃超高くてもよい。

いくつかの実施形態では、レポータープローブは、プライマーのテンプレート結合領域から少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０ヌクレオチド離れているプローブ結合領域中の配列に選択的にハイブリダイズする。

レポータープローブは、フォワードプライマーの濃度より高い濃度で存在してもよい。レポータープローブは、例えば、フォワードプライマーの濃度よりも、例えば、１〜１０倍または１〜５倍高い濃度で存在してもよい。レポータープローブは、プローブによって占有されるフォワードプライマーのうち少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または約１００％を生じる濃度で存在してもよい。

本発明のプライマーおよびプローブは、任意の適切な方法によって調製され得る。特定の配列のオリゴヌクレオチドを調製する方法は、当該分野で公知であり、これには、例えば、適切な配列および直接の化学合成のクローニングおよび制限が挙げられる。化学合成法としては、例えば、Ｎａｒａｎｇら、１９７９，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ６８：９０に記載のホスホトリエステル法、Ｂｒｏｗｎら、１９７９，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ６８：１０９に記載のホスホジエステル法、Ｂｅａｕｃａｇｅら、１９８１，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ２２：１８５９に開示されるジエチルホスホラミダイト方法、および米国特許第４，４５８，０６６号に開示される固体支持体方法（その刊行物のすべてが、参照によって本明細書に援用される）が挙げられ得る。

いくつかの実施形態では、テンプレート結合領域およびプローブ結合領域を含むフォワードプライマーは、それぞれ、テンプレート結合領域およびプローブ結合領域に対応する２つの異なるオリゴヌクレオチドを用いて調製され得る。２つのオリゴヌクレオチドは、酵素的に連結されてもよい。ライゲーションは、ＲＮＡリガーゼによってであってもよい。ＲＮＡリガーゼは、ＡＴＰ依存性リガーゼであってもよい。ＲＮＡリガーゼは、Ｒｎｌ１ファミリーリガーゼであってもよい。一般には、Ｒｎｌ１ファミリーリガーゼは、ｔＲＮＡ中の一本鎖破壊を修復し得る。例示的なＲｎｌ１ファミリーリガーゼとしては、例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ、ＴｈｅｒｍｕｓｓｃｉｔｏｄｕｃｔｕｓバクテリオファージＴＳ２１２６由来の熱安定性ＲＮＡリガーゼ１（ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ）、またはＣｉｒｃＬｉｇａｓｅＩＩが挙げられる。一般的には、Ｒｎｌ２ファミリーリガーゼは、二重鎖ＲＮＡ中のニックをシールし得る。例示的なＲｎｌ２ファミリーリガーゼとしては、例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２が挙げられる。ＲＮＡリガーゼは、ＡｒｃｈａｅａｌＲＮＡリガーゼ、例えば、好熱性の古細菌Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（ＭｔｈＲｎｌ）由来の古細菌のＲＮＡリガーゼであってもよい。ライゲーションはまた、それぞれ、テンプレート結合およびプローブ結合領域に相当する２つのオリゴヌクレオチドにまたがるスプリントオリゴヌクレオチドの使用によってもたらされ得る。いくつかの実施形態では、スプリントオリゴヌクレオチドを用いるライゲーションは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの使用を包含し得る。あるいは、ライゲーションは、ＡＴＰ非依存性リガーゼによって媒介され得る。例示的なＡＴＰ非依存性リガーゼとしては、例えば、ＲＮＡ３’−ホスフェートサイクラーゼ（ＲｔｃＡ）、ＲＮＡリガーゼＲｔｃＢ、またはその製造された改変体が挙げられる。いくつかの実施形態では、ライゲーションは、間接的に２工程のプロセスを通じて行われ、ここではテンプレート結合領域はアデニル化されており（例えば、合成の間に化学的に、またはリガーゼを用いて酵素的にアデニル化される）、アデニル化されているテンプレート結合配列は、プローブ結合領域にコンジュゲートされている。

ライゲーションはまた、「クリック化学」で行われてもよい。クリック化学は、単純な化学でより小さいサブユニットを連結する工程を包含する概念である。より小さいサブユニットは、大きい方の分子の小さい構築ブロック、例えば、ＤＮＡ塩基、ＲＮＡヌクレオチド、直鎖または環状のＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドを指してもよい。１，２，３−トリアゾール環の形成を生じるアジド基とアルキン基との間の（３＋２）環化付加（例えば、銅触媒のアルキン−アジドカップリング反応）が一般には、代表的なクリック化学反応とみなされる。他の化学ライゲーション法としては、臭化シアン、ホスホロチオエート−ヨードアセチル、および天然のライゲーション技術（ここでＣ−末端α−チオエステルがＮ末端Ｃｙｓ残基を含む非保護ペプチドと化学選択的方式で反応される）の使用が挙げられる。

プライマーおよび／またはレポータープローブはまた、ＯｐｅｒｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ，Ｓｉｇｍａ，ＩＤＴＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、およびＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのような商業的な供給源からも得られる。プライマーは、同一の融点を有してもよい。プライマーの長さを、５’末端または３’末端で伸長するか、または短縮して、所望の融点を有するプライマーを生じてもよい。またプライマー対の配列および長さが所望の融点を生じるように、各々のプライマー対のアニーリング位置が設計されてもよい。２５塩基対より小さいプライマーの融点を決定するための最も単純な式は、ＷａｌｌａｃｅＲｕｌｅ（Ｔｄ＝２（Ａ＋Ｔ）＋４（Ｇ＋Ｃ））である。また、限定するものではないが、ＡｒｒａｙＤｅｓｉｇｎｅｒＳｏｆｔｗａｒｅ（ＡｒｒａｙｉｔＩｎｃ．）、遺伝子解析用オリゴヌクレオチドプローブ配列設計ソフトウェア（ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＰｒｏｂｅＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｓｉｇｎＳｏｆｔｗａｒｅｆｏｒＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｓｉｓ）（ＯｌｙｍｐｕｓＯｐｔｉｃａｌＣｏ．），ＮｅｔＰｒｉｍｅｒ、およびＤＮＡｓｉｓ（日立ソフトウェアエンジニアリング）を含む、コンピュータプログラムを用いて、プライマーを設計してもよい。各々のプライマーのＴｍ（融点またはアニーリング温度）は、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐから入手できるＯｌｉｇｏＤｅｓｉｇｎのようなソフトウェアプログラムを用いて算出され得る。

プライマーのアニーリング温度は、限定するものではないが、サイクル１、２、３、４、５、サイクル６〜１０、サイクル１０〜１５、サイクル１５〜２０、サイクル２０〜２５、サイクル２５〜３０、サイクル３０〜３５、またはサイクル３５〜４０を含む任意の増幅サイクル後に再計算されて増大され得る。最初のサイクルの増幅後、プライマーの一部が、目的の各々の遺伝子座から生成物中に組み込まれてもよく、これによってＴＭは、生成物中に組み込まれるプライマーの一部に基づいて再計算され得る。

（対立遺伝子検出のための反応混合物）
「対立遺伝子検出のための反応混合物」という用語は、本明細書において用いる場合一般には、核酸テンプレート分子から少なくとも１つのアンプリコンを増幅するために必要な構成要素の混合物を指す。対立遺伝子検出のための混合物は、ヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、ポリメラーゼおよびプライマーを含んでもよい。対立遺伝子検出のための混合物はさらに、Ｔｒｉｓ緩衝液、一価の塩、およびＭｇ２＋を含んでもよい。各々の成分の濃度は、当該分野で周知であり、さらに当業者によって最適化され得る。いくつかの実施形態では、対立遺伝子検出のための反応混合物はまた、限定するものではないが、非特異的なバックグラウンド／ブロッキング核酸（例えば、サケ精子ＤＮＡ）、バイオ防腐剤（例えば、アジ化ナトリウム）、ＰＣＲ増強剤（例えば、ベタイン、トレハロースなど）、およびインヒビター（例えば、ＲＮＡｓｅ阻害剤）が挙げられる添加物も含む。いくつかの実施形態では、核酸サンプルが、対立遺伝子検出のための反応混合物と混合される。したがって、いくつかの実施形態では、対立遺伝子検出のための反応混合物はさらに、核酸サンプルを含む。

（増幅）
この方法は、対立遺伝子検出のための反応混合物中のテンプレート核酸の増幅を包含し得る。いくつかの実施形態では、増幅は、核酸ポリメラーゼを利用して行われる。この核酸ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼであってもよい。ＤＮＡポリメラーゼは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであってもよい。

本明細書に記載される対立遺伝子検出法のいくつかの態様は、ＤＮＡポリメラーゼがレポータープローブ中で検出可能部分とクエンチャー部分とを分離する能力に関する。例示的なレポータープローブは本明細書に記載されている。検出可能部分およびクエンチャー部分の分離は、ＤＮＡポリメラーゼによるレポータープローブの切断によって生じ得る。レポータープローブの切断は、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によって生じ得る。したがって、いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を含む。本明細書において用いる場合、「５’→３’（５’O３’）ヌクレアーゼ活性」または「５’→３’（５’ｔｏ３’）ヌクレアーゼ活性」とは、テンプレート特異的な核酸ポリメラーゼの活性を指してもよく、これによってヌクレオチドは、連続的な方式でオリゴヌクレオチドの５’末端から除去される。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、当該分野で公知であり、これには、例えば、サーマス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）から単離されたＤＮＡポリメラーゼ（ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ）が挙げられる。

本明細書で記載される対立遺伝子検出方法のいくつかの態様はさらに、プライマーの末端の３’塩基とそのハイブリダイズしたテンプレートポリヌクレオチドとの間のミスマッチの有無に応じて、増幅工程で、プライマーが核酸ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）によって伸長される識別能に関する。プライマーの末端の３’塩基とテンプレートヌクレオチドとの間にミスマッチのない場合、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの伸長は、増幅反応の間に効率的に生じ得る。プライマーの末端の３’塩基とテンプレートヌクレオチドとの間にミスマッチがある（例えば、塩基が相補性ではない）場合、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの伸長は、生じない。いくつかの実施形態では、ミスマッチのプライマーの伸長は、ＤＮＡポリメラーゼが３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く場合には生じない。３’→５’エキソヌクレアーゼ活性は、本明細書において用いる場合、一般には、ＤＮＡポリメラーゼの活性を指し、これによってポリメラーゼは、ミスマッチした塩基対を認識して、１塩基ずつ後ろ向きに移動して、不正確なヌクレオチドを切除する。したがって、ＤＮＡポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠いてもよい。３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠いている例示的なＤＮＡポリメラーゼとしては限定するものではないが、ＢＳＴＤＮＡポリメラーゼＩ、ＢＳＴＤＮＡポリメラーゼＩ（大きいフラグメント）、Ｔａｑポリメラーゼ、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウフラグメント（ＫｌｅｎｏｗＦｒａｇｍｅｎｔ）（３’→５’エキソ−）、ＰｙｒｏＰｈａｇｅ（登録商標）３１７３ＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼマイナス（ＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＭｉｎｕｓ）（Ｅｘｏ−）（Ｌｕｃｉｇｅｎから入手可能）、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼマイナス（ＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＭｉｎｕｓ）（Ｌｕｃｉｇｅｎ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性を欠くように設計された組み換えＤＮＡポリメラーゼである。

他の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼによるミスマッチしたプライマーの伸長は起こらず、ここではＤＮＡポリメラーゼは３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。特定の実施形態では、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有しているＤＮＡポリメラーゼによるミスマッチしたプライマーの伸長は、ミスマッチプライマーの３’末端領域がホスホロチオエート結合によって連結されるヌクレオチドを含む場合には生じない。ホスホロチオエート結合によって連結されるヌクレオチドを含む例示的なプライマーは本明細書に記載される。

いくつかの実施形態では、ＰＣＲプロセスは、自動化されたプロセスとして行われ、ここでは、テンプレートＤＮＡを含む反応混合物が変性工程、レポータープローブおよびプライマーアニーリング工程、および合成工程を通じてサイクルされ、それによって切断および置換がプライマー依存性テンプレート伸長と同時に生じる。自動化されたプロセスは、ＰＣＲサーマルサイクラーを用いて行われてもよい。市販のサーマルサイクラーシステムとしては、なかでも、Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒのシステムが挙げられる。

変性、プライマー／プローブアニーリング、プライマー伸長およびレポータープローブ切断の反復サイクルは、検出可能シグナルの指数関数的蓄積で生じ得る。十分なサイクルを行って、検出可能シグナルの検出を達成し、これはバックグラウンドシグナルよりも数桁大きい規模であり得る。

しかし、本発明は、他の増幅システム、例えば、転写増幅システム（ここでは、ＰＣＲプライマーの１つが、標的配列のＲＮＡコピーを作成するために用いられるプロモーターをコードする）と適合する。同様の方式で、本発明は、自己保持配列複製（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ（３ＳＲ）システム）（ここでは、種々の酵素を用いて、ＲＮＡ転写物を作成し、次にこれを用いてＤＮＡコピーを作成する（全て単一の温度で））で用いられてもよい。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼをリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）システムに、適切なプライマー／プローブセットと一緒に組み込むことによって、本発明を使用して、ＬＣＲ生成物を検出することも可能である。

図６は、本発明の方法の例示的な実施形態を示す。第一の工程６０１では、テンプレートＤＮＡ分子６０２および６０３を含むＤＮＡサンプルを、ｄＮＴＰ（示さず）、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ６０９（５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を含み、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を含まない）、フォワードプライマーＦ１（プローブ結合領域６０５およびテンプレート結合領域６０６を含む）、およびリバースプライマーＲを含む反応混合物と接触させる。フォワードプライマーＦ１の３’末端塩基は、テンプレート分子６０２に存在する変異体対立遺伝子６０７に対して相補的である。対照的に、テンプレート分子６０３は、野性型対立遺伝子６０８を有し、これは、フォワードプライマーＦ１の３’末端塩基に対してミスマッチである。また反応混合物には、レポータープローブＰも含まれる（これは、５’蛍光性部分（三角）および３’クエンチャー部分（丸）を含む）。初回の増幅（工程６２０）では、アニーリング工程が行われ、ここではレポータープローブＰが、プローブ結合領域６０５にハイブリダイズして、プライマー／レポーター二重鎖Ｐ／Ｆ１を生じる。さらに、Ｆ１が、テンプレート分子６０２および６０３にハイブリダイズして、複合体Ｐ／Ｆ１／１０２およびＰ／Ｆ１／１０３が生じる。合成工程の間に、ＤＮＡポリメラーゼ６０９は、変異体対立遺伝子６０７とのＦ１の３’末端塩基の相補性に起因して、Ｐ／Ｆ１／１０２複合体の効果的な伸長を促進する。テンプレート分子６０２からのＦ１の伸長は、伸長したプライマーＦ１およびハイブリダイズしたレポータープローブＰを含むキメラ伸長生成物を生じる。この伸長したプライマーＦ１はさらに、リバースプライマーＲについてのプライマー結合部位を含む。対照的に、Ｐ／Ｆ１／１０３の伸長は、野性型対立遺伝子６０８とＦ１の３’末端塩基との間のミスマッチのおかげで生じない。したがって、野性型対立遺伝子を含むテンプレート分子から生成される、伸長されたプライマーＦ１およびハイブリダイズしたレポータープローブＰを含むキメラ伸長生成物はない。増幅の２回目（および任意の引き続く回）（工程６３０）では、リバースプライマーＲは、キメラ伸長生成物にハイブリダイズする。ＤＮＡポリメラーゼ６０９は、リバースプライマーＲの伸長を促進し、ポリメラーゼ６０９の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は、例えば、加水分解によってクエンチャー部分から蛍光部分を分離して、検出可能シグナルを生じる。

いくつかの実施形態では、反応混合物は、複数のプライマーおよび多重検出のためのプローブを含んでもよい。単なる例であるが、反応混合物は、共通のリバースプライマーおよび２つ以上のフォワードプライマーを含んでもよく、ここで各々のフォワードプライマーは、テンプレートポリヌクレオチド中の同じ領域にハイブリダイズするが、５’プローブ結合領域の他のフォワードプライマーとは異なり、ここでは各々のフォワードプライマーは、固有のプローブ結合領域を含み、かつここではフォワードプライマーの各々のテンプレート結合領域は、３’末端塩基中の他のフォワードプライマーとは異なり、これは、野性型対立遺伝子または１つもしくは別の変異体対立遺伝子のいずれかに対して相補的である。したがって、反応混合物はまた、２つ以上の異なるレポータープローブを含んでもよく、各々のプローブは、２つ以上のフォワードプライマー上の２つ以上の固有のプローブ結合領域のうちの１つに相当する配列を有しており、反応混合物中の任意の他の検出可能な部分とは検出可能に別個である別個の検出化可能部分を含む。単一の遺伝子座で複数の対立遺伝子を検出する多重アッセイの例示的な実施形態は、図７に示される。第一工程７４０では、テンプレートＤＮＡ分子７０２および７０３を含むＤＮＡサンプルを、ｄＮＴＰ（示さず）、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ７０９（５’−＞３’エキソヌクレアーゼ活性を含み、３’−＞５’エキソヌクレアーゼ活性を含まない）、フォワードプライマーＦ１（プローブ結合領域７０５およびテンプレート結合領域７０６を含む）、フォワードプライマーＦ２（プローブ結合領域７１０およびテンプレート結合領域７１１を含む）を含む反応混合物と接触させる。テンプレート結合領域７０６および７１１は、３’末端塩基（これは、Ｆ１では、テンプレート分子７０２に存在する変異体対立遺伝子７０７に対して相補的であり、Ｆ２では、テンプレート分子７０３に存在する野性型対立遺伝子７０８に対して相補的である）を除いて同一である。したがって、７０６の３’末端塩基と、野性型対立遺伝子７０８との間のミスマッチ、および７１１の３’末端塩基と変異体対立遺伝子７０７との間のミスマッチがある。また、この反応混合物中には、レポータープローブＰ１（これは、５’蛍光性部分（三角）および３’クエンチャー部分（丸）を含む）、およびレポータープローブＰ２（これは、スペクトル的に別個の５’蛍光性部分（四角）および３’クエンチャー部分（丸）を含む）を含む。レポータープローブＰ１は、プローブ結合領域７０５にハイブリダイズして、Ｐ１／Ｆ１二重鎖を生じ、レポータープローブＰ２はプローブ結合領域７１０にハイブリダイズして、Ｐ２／Ｆ２二重鎖を生じる。増幅の初回（工程７５０）では、ＦｌおよびＦ２は、テンプレート分子７０２および７０３にハイブリダイズして、これがＰ１／Ｆ１／７０２、Ｐ１／Ｆ１／７０３、Ｐ２／Ｆ２／７０２、およびＰ２／Ｆ２／７０３複合体を生じ得る。ＤＮＡポリメラーゼ７０９は、Ｐ１／Ｆ１／７０２およびＰ２／Ｆ２／７０３の効率的な伸長を促進し得、これが、それぞれ、伸長したプライマーＦ１およびハイブリダイズしたレポータープローブＰ１（Ｆ１−Ｐ１）および／または伸長したプライマーＦ２およびハイブリダイズしたレポータープローブＰ２（Ｆ２−Ｐ２）を含むキメラ伸長生成物を生じ得る。この伸長したプライマーＦ１−Ｐ１およびＦ２−Ｐ２は各々がさらに、リバースプライマーＲのプライマー結合部位を含んでもよい。対照的に、Ｐ１／Ｆ１／７０３またはＰ２／Ｆ２／７０２の伸長は、フォワードプライマーの３’末端塩基とテンプレートＤＮＡとの間のミスマッチの存在に起因して生じない。したがって、伸長したプライマーＦ１およびハイブリダイズしたレポータープローブＰ２を含むか、または伸長したプライマーＦ２およびハイブリダイズしたレポーターＰ１を含むキメラ伸長生成物は生成されない。増幅の２回目（および任意の引き続く回）（工程７６０）では、リバースプライマーＲは、キメラ伸長生成物Ｆ１−Ｐ１およびＦ２−Ｐ２にハイブリダイズし得る。ＤＮＡポリメラーゼ７０９は、リバースプライマーＲの伸長を促進し、かつポリメラーゼ７０９の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は、各々のプローブＰ１およびＰ２のクエンチャー部分から蛍光部分を分離し、これがスペクトル的に別個のシグナル７３１および７３２を生じる。

単なる例であるが、反応混合物は、複数のプライマー／プローブセットを含んでもよく、ここでは各々のセットが特定の遺伝子座で複数の対立遺伝子の検出のための複数のフォワードプライマーを含み、各々のフォワードプライマーは、固有のプローブ結合配列およびテンプレート結合領域を保有し、テンプレート結合領域の３’末端塩基は、このセット中の遺伝子座の対立遺伝子、共通のリバースプライマー、および各々のフォワードプライマーに特異的な検出可能に別個のレポータープローブに相当する。このような反応混合物は、複数の遺伝子座での複数の対立遺伝子の多重検出のために用いられ得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、単一の多重のアッセイ中で、最大で２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００個までの対立遺伝子を検出する方法を提供する。

いくつかの実施形態では、反応混合物は、複数のプライマー／プローブセットを含み、ここでは各々のセットは、フォワードプライマー（固有のプローブ結合配列およびテンプレート結合領域を保有している）、リバースプライマー（このようなフォワードプライマーの下流領域に結合する）、およびこのフォワードプライマーに特異的な検出可能に別個のレポータープローブを含む。このような反応混合物は、複数の遺伝子座の多重検出のために用いられ得る。複数の遺伝子座の多重検出を用いて、コピー数変動をアッセイしてもよい。例えば、第一の遺伝子座は、コピー数変動を有すると疑われる領域であってもよく、第二の遺伝子座は、コピー数変動を有さないと予想される領域であってもよい。第一および第二の遺伝子座に相当する検出可能シグナルの比較は、コピー数変動を測定するために用いられ得る。

検出可能シグナルは、各々の増幅サイクルの間にリアルタイムでモニターされ得る。本明細書において用いる場合、「リアルタイムＰＣＲ」とは、検出可能シグナルの量がＰＣＲの各々のサイクルでモニターされるＰＣＲ法を指してもよい。いくつかの実施形態では、検出可能シグナルが検出可能レベルに達するサイクルの閾値（Ｃｔ）が決定される。一般には、Ｃｔ値が低いほど、問い合わされる対立遺伝子の濃度は大きくなる。一般には、データは、ＰＣＲの指数関数的増殖（対数）相の間に収集され、ここでは、ＰＣＲ生成物の量はテンプレート核酸の量に対して正比例する。リアルタイムＰＣＲのためのシステムは、当該分野で公知であり、これには、例えば、ＡＢＩ７７００および７９００ＨＴ配列検出システム（ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｓ）（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。ＰＣＲの指数関数相の間のシグナルの増大は、変異体対立遺伝子を含むテンプレートの量の定量的測定を提供し得る。

他の実施形態では、検出可能シグナルは、増幅サイクルが終了した後にモニターされる（例えば、エンドポイント検出）。

（分割／デジタルＰＣＲ）
この方法はまた、反応混合物および核酸サンプルを、増幅前に個別の容積に分割する工程を包含し得る。個別の容積は、出発核酸サンプル由来のテンプレート核酸分子を含んでもよい。出発核酸サンプルは、別個の容積が平均で５、４、３、２、または１つ未満の核酸分子を含むように希釈され得る。区分は、核酸分子を含まなくてもよい。核酸なしの区分は、ポアソン統計を使用して、元の入力ＤＮＡ濃度を決定し得る。いくつかの実施形態では、別個の容積は、反応混合物を含んでもよい。反応混合物は本明細書に記載されている。この方法は、核酸サンプルを１セットの別の容積に分割する工程と、反応混合物を第二のセットの別個の容積に分割する工程と、第一のセット由来の単一の別個の容積を、第二のセット由来の単一の別個の容積と合併して、テンプレート核酸分子と反応混合物とを含む合併した別個の容積を生成する工程とを包含し得る。他の実施形態では、この方法は、核酸サンプルと、反応混合物とを混合して、混合物を生成する工程と、この混合物を別個の容積に分割する工程とを包含する。別個の容積は、１つ以上の対立遺伝子の検出のために独立してアッセイされてもよい。

分割するための特定の方法は、本発明の実施には重要ではない。例えば、分割は、手動のピペッティングで行われてもよい。特定の実施例では、反応混合物および核酸サンプルは、個々のチューブまたはウェルに手動のピペットで分配されてもよい。別の実施例では、ロボット法を分割工程に用いてもよい。分割工程のためにはまたマイクロ流体法を用いてもよい。

別個の容積は、例えば、米国特許第７，０４１，４８１号に記載のように、チューブ、ウェル、穿孔した穴、反応チャンバ、または液滴、例えば、不混和性液体中で分散された水相の液滴であってもよい。別個の容積は、別個の容積のアレイに配列されてもよい。例示的なアレイとしては、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるオープンアレイデジタル（Ｏｐｅｎａｒｒａｙｄｉｇｉｔａｌ）ＰＣＲシステム（ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｆｓ／ｍａｎｕａｌｓ／ｃｍｓ＿０８８７１７．ｐｄｆに記載される）およびＦｌｕｉｄｉｇｍ（ｗｗｗ．ｆｌｕｉｄｉｇｍ．ｃｏｍ）によるアレイシステムが挙げられる。

サンプルを小さい反応容積に分割する工程は、多くの利点をもたらし得る。例えば、分割は、低下した量の試薬の使用を可能にし得、それによって分析の材料費を低下する。他の例では、分割はまた、検出の感度も改善し得る。理論によって束縛されることは望まないが、反応混合物およびテンプレートＤＮＡを別個の反応容積に分割する工程は、反応試薬に対してまれな分子の割合をより大きくし得、それによってまれな分子の検出を増強する。例えば、分割は、高い野性型対立遺伝子比のバックグラウンドで、まれな対立遺伝子の検出を可能にし得る。したがって、いくつかの実施形態では、反応容積は、１ｍｌ未満、５００マイクロリットル（ｕｌ）未満、１００ｕｌ未満、１０ｕｌ未満、１ｕｌ未満、０．５ｕｌ未満、０．１ｕｌ未満、５０ｎｌ未満、１０ｎｌ未満、１ｎｌ未満、０．１ｎｌ未満、０．０１ｎｌ未満、０．００１ｎｌ未満、０．０００１ｎｌ未満、０．００００１ｎｌ未満、または０．０００００１ｎｌ未満であり得る。いくつかの実施形態では、反応容積は、１〜１００ピコリットル（ｐｌ）、５０〜５００ｐｌ、０．１〜１０ナノリットル（ｎｌ）、１〜１００ｎｌ、５０〜５００ｎｌ、０．１〜１０マイクロリットル（ｕｌ）、５〜１００ｕｌ、１００〜１０００ｕｌ、または１０００ｕｌ超であってもよい。いくつかの実施形態では、この反応容積は、液滴である。理論で拘束されることは望まないが、小さい液滴の使用によって、多数の反応物の処理が並行して可能になる。したがって、いくつかの場合には、この液滴は、平均で約０．００００００００００００００１、０．００００００００００００１、０．００００００００００１、０．００００００００１、０．００００００１、０．０００００１、０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．０５、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１８０、２００、３００、４００、または５００ミクロンの直径を有する。

いくつかの実施形態では、この方法は、デジタルＰＣＲによる対立遺伝子の検出および／または測定を包含する。「デジタルＰＣＲ」という用語は、本明細書において用いる場合、一般的には、ＰＣＲ増幅であって、これは、名目上単一の、選択されたテンプレート分子上で行われ、ここでは多数の個々の単一の分子が各々、別個の反応容積に単離されるＰＣＲ増幅を指す。いくつかの実施形態では、多数の反応容積を用いて、高い統計学的有意性を得る。一般には、少なくとも単一のテンプレートを含む反応容積中のＰＣＲ増幅（例えば、ウェル、チャンバ、ビーズ、エマルジョンなど）は、陰性の結果（例えば、出発分子が存在しない場合、検出可能シグナルはない）、または陽性の結果（例えば、標的の出発分子が存在する場合、検出可能シグナル）のいずれを有してもよい。陽性の結果を示す多数の反応領域を分析することによって、出発分子の数への洞察を得てもよい。このような分析は、サンプル中の野性型または変異体対立遺伝子の量の測定のために用いられてもよいし、またはサンプル中の遺伝子座のコピー数変動の測定のために用いられてもよい。

特定の実施形態では、本方法は、液滴のデジタルＰＣＲ法を含む。「液滴デジタルＰＣＲ」は一般的には、デジタルＰＣＲを指し、ここでは反応容積は液滴である。本明細書に提供される液滴は、反応容積の間の混合を妨げ得る。

本明細書に記載の液滴は、エマルジョン組成物を含んでもよい。「エマルジョン」という用語は、本明細書において用いる場合、一般的には、不混和液体の混合物（例えば、オイルおよび水溶液、例えば、水）を指す。いくつかの実施形態では、このエマルジョンは、連続油相内の水性の液滴を含む。他の実施形態では、このエマルジョンは、連続水相内に油滴を含む。本明細書に記載される混合物またはエマルジョンは安定であっても、不安定であってもよい。好ましい実施形態では、このエマルジョンは比較的安定である。

いくつかの実施形態では、このエマルジョンは、最小の合体を示す。「合体（ｃｏａｌｅｓｃｅｎｃｅ）」とは、液滴が合わさって、進行的に大きい液滴を形成する過程を指す。いくつかの場合には、０．００００１％、０．００００５％、０．０００１０％、０．０００５０％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％未満の液滴が合体を示す。エマルジョンとはまた、フラスコ中で分散相の懸濁が解除される、凝集の限定のプロセスを示す。いくつかの場合には、０．００００１％、０．００００５％、０．０００１０％、０．０００５０％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％未満の液滴が凝集を示す。

液滴は、単分散（例えば、実質的に同様のサイズおよび次元の単分散）であっても、多分散（例えば、実質的に可変のサイズおよび寸法の多分散）であってもよい。いくつかの実施形態では、この液滴は、単分散液滴である。いくつかの場合では、この液滴は、その液滴のサイズが液滴の平均サイズの±５％を超えてまで変化しないように生成される。いくつかの場合では、この液滴は、その液滴のサイズが液滴の平均サイズの±２％を超えてまで変化しないように生成される。いくつかの場合では、この液滴の生成装置は、単一のサンプルから液滴の集団を生成し、ここでは液滴の総集団の平均サイズの±０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、または１０％を超えてまでサイズが変化する液滴はない。

いくつかの実施形態では、本発明は、液滴生成のためのシステム、デバイスおよび方法を提供する。いくつかの実施形態では、マイクロ流体システムは、単分散液滴を生成するように構成される（例えば、Ｋｉｓｓら、ＡｎａｌＣｈｅｍ．２００８Ｄｅｃｅｍｂｅｒ１；８０（２３）：８９７５〜８９８１を参照のこと）。いくつかの実施形態では、本発明は、サンプルを操作および／または分割するためのマイクロ流体システムを提供する。

いくつかの実施形態では、マイクロ流体システムは、１つ以上のチャネル、バルブ、ポンプなどを包含する（その全体が参照によって本明細書に援用される、米国特許第７，８４２，２４８号）。いくつかの実施形態では、マイクロ流体システムは、連続フローマイクロ流体システムである（例えば、参照によって本明細書に援用される、Ｋｏｐｐら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２８０，１０４６〜１０４８頁，１９９８を参照のこと）。いくつかの実施形態では、本発明の微小構造としては、限定するものではないが、マイクロチャネル、マイクロ流体プレート、固定マイクロチャネル、マイクロチャネルのネットワーク、内部ポンプ；外側ポンプ、バルブ、遠心力要素などが挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の微小構造（例えば、液滴マイクロアクチュエータ、マイクロ流体プラットフォーム、および／または連続フローマイクロ流体）は、限定するものではないが、電気的手段（例えば、静電アクチュエーション、誘電泳動）、磁気的手段、熱的手段（例えば、熱マランゴニ効果、サーモキャピラリー）、機械的手段（例えば、表面弾性波、マイクロポンピング、蠕動性）、光学的手段（例えば、オプトエレクトロウエッティング、光ピンセット）、および化学的手段（例えば、化学的勾配）を含む、液滴操作技術で補完されるか、または補充される。いくつかの実施形態では、液滴マイクロアクチュエータは、マイクロ流体プラットフォーム（例えば、連続フロー成分）で補充され、別個の液滴操作およびマイクロ流体要素を含むこのような組み合わせのアプローチは、本発明の範囲内である。

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、液滴マイクロアクチュエータを利用する。いくつかの実施形態では、液滴マイクロアクチュエータは、液滴の操作および／または作業、例えば、分散、スプリット、移入、合併、混合、攪拌などを達成し得る。いくつかの実施形態では、本発明は、例えば、米国特許第６，９１１，１３２号、同第６，７７３，５６６号、および同第６，５６５，７２７号；米国特許出願第１１／３４３，２８４号、および米国特許出願公開第２００６０２５４９３３号（全てが参照によって本明細書に援用される）に記載される液滴操作の構造および技術を使用する。

液滴デジタルＰＣＲ技術によって、高密度の別個のＰＣＲ増幅反応が単一容積中で可能になる。いくつかの実施形態では、１ｕｌあたり１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、１，５００，０００、２，０００，０００、２，５００，０００、５，０００，０００、または１０，０００，０００を超える分離反応が生じ得る。

（検出）
蛍光検出は、蛍光装置によって吸収され得る励起光を生じるためのモジュール、および蛍光装置によって放出される光を検出するためのモジュールを装備された種々の検出デバイスを用いて達成され得る。いくつかの場合には、サンプル（例えば、液滴）はバルクで検出され得る。例えば、サンプルは、プラスチックチューブからのバルク蛍光を測定する検出器中に位置するプラスチックチューブ中に割り当てられ得る。サンプルは、単層に分配されてもよい。単層分配サンプルは、ユーザーが高解像度スキャナー（例えば、マイクロアレイスキャナー、ＧｅｎｅＰｉｘ４０００ＢＭｉｃｒｏａｒｒａｙＳｃａｎｎｅｒ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）、ＳｕｒｅＳｃａｎＭｉｃｒｏａｒｒａｙＳｃａｎｎｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ））をスキャンすることによって検出され得る。サンプルが複数の層に分配される場合、そのサンプルは、共焦点画像化（例えば、共焦点顕微鏡、スピニングディスク共焦点顕微鏡、共焦点レーザースキャニング顕微鏡）で検出され得る。いくつかの場合では、１つ以上のサンプル（例えば、液滴）を、１つ以上のウェルのプレート、例えば、９６ウェルまたは３８４ウェルプレートに分割してもよく、個々のウェルの蛍光は、蛍光プレートリーダーを用いて検出してもよい。

いくつかの実施形態では、液滴の増幅は、例えば、サーマルサイクル中で、多数の液滴中で１つ以上の検出可能シグナルの生成を生じる。増幅反応の間、問い合わされる対立遺伝子を含むテンプレートＤＮＡ分子を含む液滴は、問い合わされた対立遺伝子を含まない液滴に対して蛍光の増大を示し得る。液滴は、個々に処理されてもよく、蛍光データが液滴から収集され得る。例えば、スペクトル的に別個のフルオロフォア由来の蛍光性シグナルに関連するデータは、各々の液滴から収集され得る。

多数の市販の装置が、蛍光標識物質の分析に利用可能である。例えば、ＡＢＩＧｅｎｅＡｎａｌｙｚｅｒを用いて、ＲＯＸ（６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、ローダミン−ＮＨＳ、ＴＡＭＲＡ（５／６−カルボキシテトラメチルローダミンＮＨＳ）、およびＦＡＭ（５’−カルボキシフルオレセインＮＨＳ）などのフルオロフォアでタグ化されたアトモル量のＤＮＡを分析し得る。これらの化合物を、プローブ上で５’−アルキルアミンを通じて結合されたアミンによってプローブに結合する。結合はまた、アミノ誘導体化ポリマー、特にオリゴヌクレオチドをコンジュゲートする方法である、ホスホラミダイト前駆体（例えば、２−メトキシ−３−トリフルオロアセチル−１，３，２−オキサザホスファシクロペンタンまたはＮ−（３−（Ｎ’，Ｎ’−ジイソプロピルアミノメトキシホスフィニルオキシ）プロピル）−２，２，２−トリフルオロアセトアミド）を通じて生じる場合もある。他の有用なフルオロフォアとしては、ＣＮＨＳ（７−アミノ−４−メチル−クマリン−３−酢酸、スクシンイミジルエステル）が挙げられ、またこれを、アミド結合を用いて結合させてもよい。

デジタルＰＣＲの後、特定の対立遺伝子を有する陽性サンプルの数、および任意の他の対立遺伝子（例えば、野性型対立遺伝子）を有する陽性サンプルの数をカウントしてもよい。いくつかの場合には、定量的決定は、個々の画分の蛍光強度を測定することによって行うが、他の場合には、測定は、検出可能なシグナルを含む区画の数をカウントすることによって行う。いくつかの実施形態では、コントロールサンプルを含んで、バックグラウンド蛍光について説明するために全ての測定から差引きされ得るバックグラウンド測定を行ってもよい。他の実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０を超える、異なる色を用いて、異なる配列を認識するプローブに対して適合する異なるＰＣＲプライマー上の異なる色のフルオロフォアを用いることなどによって、異なる対立遺伝子を検出および測定してもよい。

本発明の別の実施形態では、加水分解されたレポータープローブの検出は、例えば、発光（例えば、ＥＤＴＡのイットリウムまたはベリリウムコンジュゲートを用いる）、時間分解蛍光分光法（蛍光が励起後の時間の関数としてモニターされる技術）、または蛍光分極（分子タンブリングに基づいて大きい分子と小さい分子との間を識別する技術）を用いて達成され得る。大分子（例えば、インタクトな標識されたプローブ）は溶液中で、低分子よりもかなり緩徐に回転（タンブリング）する。目的の分子（例えば、標識されたプローブの５’末端）への蛍光部分の連結の際には、この蛍光部分は、分子タンブリングに基づいて測定され（分化され）得、それによってインタクトなプローブと消化されたプローブとの間が区別される。検出はＰＣＲの間に直接測定されてもよいし、またはＰＣＲ後に行われてもよい。

（対立遺伝子検出のためのキット）
本発明ではまた、ある遺伝子座の１つ以上の対立遺伝子の検出のためのキットも提供される。キットは、本明細書に記載のような１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを含んでもよく、ここでは、プライマーの各々が、ある遺伝子座の個々の対立遺伝子を選択的に検出し得る。キットはまた、本明細書に記載のような、１つ以上のレポータープローブを含んでもよい。キットは、例えば、１つ以上のプライマー／プローブセットを含んでもよい。例示的なプライマー／プローブセットが本明細書に記載されている。キットはさらに、１つ以上のプライマー／プローブセットのための使用説明書、例えば、本発明の方法を行うための説明書を含んでもよい。いくつかの実施形態では、このキットは、包装資材を含む。本明細書において用いる場合、「包装資材」という用語は、キットの構成要素を収容する物理的構造を指してもよい。包装資材は、キットの構成要素の無菌性を維持し得、かつこのような目的のために通常用いられる資材（例えば、紙、段ボール、ガラス、プラスチック、ホイル、アンプルなど）から構成されてもよい。キットはまた、緩衝剤、防腐剤、またはタンパク質／核酸安定化剤を含んでもよい。キットはまた、本明細書に記載されるような反応混合物の他の構成要素を含んでもよい。例えば、キットは、本明細書に記載のような熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの１つ以上のアリコート、および／またはｄＮＴＰの１つ以上のアリコートを含んでもよい。キットはまた、ある遺伝子座の個々の対立遺伝子を保有する既知量のテンプレートＤＮＡ分子のコントロールサンプルを含んでもよい。いくつかの実施形態では、このキットは、陰性のコントロールサンプル、例えば、遺伝子座の個々の対立遺伝子を保有するＤＮＡ分子を含まないサンプルを含む。いくつかの実施形態では、このキットは、陽性コントロールサンプル、例えば、遺伝子座の個々の対立遺伝子のうちの１つ以上の既知の量を含有するサンプルを含む。

（対立遺伝子検出のためのシステム）
本発明ではまた、サンプル中の１つ以上の対立遺伝子の検出のためのシステムも提供される。このシステムは、本明細書に記載の反応混合物を提供し得る。いくつかの実施形態では、この反応混合物は、ＤＮＡサンプルと混合され、テンプレートＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、このシステムはさらに、液滴生成装置を設け、これがテンプレートＤＮＡ分子、プローブ、プライマーおよび他の反応混合物成分を、油中水型エマルジョン内の複数の液滴に分画する。本開示で有用ないくつかの液滴生成装置の例は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００５３１７に示される。このシステムはさらに、サーモサイクラーを設けてもよく、これは液滴を、例えば、ＰＣＲを介して反応させて、１つ以上の検出可能シグナルの増幅および生成を可能にする。増幅反応の間、問い合わされる対立遺伝子を含むテンプレートＤＮＡ分子を含む液滴は、問い合わされた対立遺伝子を含まない液滴に対して蛍光の増大を呈する。いくつかの実施形態では、このシステムはさらに、液滴読み取り装置（リーダー）を設け、これは液滴を個々に処理して、その液滴から蛍光データを収集する。この液滴読み取り装置は、例えば、スペクトル的に別個のフルオロフォアから蛍光性シグナルを検出し得る。いくつかの実施形態では、この液滴リーダーはさらに、液滴サンプルについての取り扱い能力を備え、個々の液滴が検出器に入り、検出を受け、次いで検出器を出ていく。例えば、フローサイトメトリー装置を、液滴サンプルからの蛍光の検出での使用のために適合させてもよい。いくつかの場合には、液滴の移動を制御するためのポンプを装備したマイクロ流体デバイスを用いて、単一のファイル中で液滴からの蛍光を検出する。いくつかの場合では、液滴を二次元表面に整列させて、検出器は、表面に対して移動して、単一液滴を含む各々の位置で蛍光を検出する。本開示で有用な例示的な液滴リーダーは、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００５３１７に示される。

本発明の方法での使用のための他の例示的なシステムは、例えば、ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ２００７／０９１２２８（ＵＳＳＮ１２／０９２，２６１）；ＷＯ２００７／０９１２３０（ＵＳＳＮ１２／０９３，１３２）；およびＷＯ２００８／０３８２５９に記載される。本発明を行うのに有用なシステムとしては、例えば、ＳｔｏｋｅｓＢｉｏ（ｗｗｗ．ｓｔｏｋｅｂｉｏ．ｉｅ）、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ（ｗｗｗ．ｆｌｕｉｄｉｇｍ．ｃｏｍ）、Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ｗｗｗ．ｂｉｏ−ｒａｄ．ｃｏｍ）、ＲａｉｎＤａｎｃｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ｗｗｗ．ｒａｉｎｄａｎｃｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．ｃｏｍ）、ＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃＳｙｓｔｅｍｓ（ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ）；Ｎａｎｏｓｔｒｅａｍ（ｗｗｗ．ｎａｎｏｓｔｒｅａｍ．ｃｏｍ）；およびＣａｌｉｐｅｒＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ（ｗｗｗ．ｃａｌｉｐｅｒｌｓ．ｃｏｍ）のシステムが挙げられる。本発明の方法での使用に適切な他の例示的なシステムは、例えば、Ｚｈａｎｇら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，３５（１３）：４２２３〜４２３７（２００７），Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｍｅｃｈ．Ｍｉｃｒｏｅｎｇ．，１５：１３６９〜１３７７（２００５）；Ｊｉａら、３８：２１４３〜２１４９（２００５）；Ｋｉｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｊ．，２９：９１〜９７；Ｃｈｅｎら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７７：６５８〜６６６；Ｃｈｅｎら、Ａｎａｌｙｓｔ，１３０：９３１〜９４０（２００５）；Ｍｕｎｃｈｏｗら、ＥｘｐｅｒｔＲｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．，５：６１３〜６２０（２００５）；およびＣｈａｒｂｅｒｔら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７８：７７２２〜７７２８（２００６）；およびＤｏｒｆｍａｎら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ，７７：３７００−３７０４（２００５）に記載される。

いくつかの実施形態では、このシステムはさらに、データを記憶して処理するコンピュータを備える。コンピュータ実行可能なロジックを使用して、バックグラウンド蛍光の差引き、標的および／または参照配列の割り当て、ならびにデータの定量化のような機能を行ってもよい。例えば、サンプル中の特定の対立遺伝子（例えば、変異体対立遺伝子）の存在に応答する蛍光を含む液滴の数をカウントして、遺伝子座の別の対立遺伝子（例えば、野性型対立遺伝子など）の存在に相当する蛍光を含む液滴の数と比較してもよい。

（被験体特異的なレポート）
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のような癌を評価する方法はさらに、腫瘍プロファイルに対する被験体特異的なレポートを作成する工程を包含する。腫瘍プロファイルは、配列決定された遺伝子のセット中の１つ以上の遺伝子の変異状態を含み得る。この方法はさらに、経時的な遺伝子のサブセットの変異状態に対する被験体特異的なレポートの作成を包含し得る。この被験体特異的なレポートは、遺伝子のサブセット中の変異を保有している無細胞ＤＮＡのレベルにおける経時的な変化に基づいた、腫瘍の動態に対する経時的な情報を含んでもよい。変異を保有している無細胞ＤＮＡの経時的な増大は、保有している腫瘍または癌の増大を示し得る。変異を保有している無細胞ＤＮＡの経時的な減少は、保有している腫瘍または癌の減少を示し得る。

いくつかの実施形態では、このレポートは、被験体の腫瘍特異的なプロファイルに基づいて、被験体についての処置の選択肢の階層化および／またはアノテーションを示す。階層化および／またはアノテーションは、被験体の臨床情報に基づく場合があり得る。階層化は、有効性が低確率である薬物処置の選択肢よりも有効性の高い高確率の、または１つ以上の分子マーカーの決定された状態で被験体を処置する工程に関して、情報が存在しない、薬物処置選択肢を順位付ける工程を包含し得る。階層化には、科学情報によって、被験体由来の１つ以上の腫瘍特異的な変異の状態に基づいて、１つ以上の薬物処置選択肢が、被験体で有効であることが示唆される、１つ以上の薬物処置選択肢をレポートで示す工程を包含し得る。この階層化は、被験体由来のサンプル中の１つ以上の腫瘍特異的な変異の状態に基づいて、いくつかの科学情報によれば、１つ以上の薬物処置選択肢が、その被験体で有効であることが示唆され、そしていくつかの科学情報によれば、１つ以上の薬物処置選択肢が、その被験体で有効でないことが示唆される、１つ以上の薬物処置選択肢をレポートで示す工程を包含し得る。この階層化は、科学情報によって、被験体由来のサンプル中の１つ以上の腫瘍特異的な変異の状態に基づいて、１つ以上の薬物処置選択肢が、その被験体に有効でないことを示す、１つ以上の薬物処置選択肢をあるレポートで示す工程を包含し得る。この階層化は、薬物処置選択肢の予測される有効性のランクに基づいて、レポートに列挙された薬物処置選択肢をコードする色を包含し得る。

アノテーションは、ＮＣＣＮＣｌｉｎｉｃａｌＰｒａｃｔｉｃｅＧｕｉｄｅｌｉｎｅｓｉｎＯｎｃｏｌｏｇｙ（商標）またはＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＯｎｃｏｌｏｇｙ（ＡＳＣＯ）の臨床実施ガイドラインにおけるある条件についてのレポートのアノテーションを包含し得る。アノテーションは、ＦＤＡの認可外の用途についての１つ以上のＦＤＡの承認した薬物の列挙、ＣｅｎｔｅｒｓｆｏｒＭｅｄｉｃａｒｅａｎｄＭｅｄｉｃａｉｄＳｅｒｖｉｃｅｓ（ＣＭＳ）抗癌処置概要に列挙された１つ以上の薬物、および／または科学論文に見出される１つ以上の実験薬物をレポート中に包含し得る。アノテーションは、列挙された薬物処置選択肢を、その薬物処置選択肢に関する科学情報を含む参照と関連付ける工程を包含し得る。科学情報は、医学雑誌の論評の対象となる文献由来であってもよい。アノテーションは、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ（登録商標）システムによって提供される情報を用いる工程を包含し得る。アノテーションは、レポート中の薬物処置選択肢について臨床試験の情報に対するリンクを提供する工程を包含し得る。アノテーションは、電子的なレポートで、提供された薬物処置選択肢に近いポップアップボックスまたはフライオーバーボックスで情報を提示する工程を包含し得る。アノテーションは、１つ以上の薬物処置選択肢、１つ以上の薬物処置選択肢を関連付ける科学的情報、１つ以上の薬物処置選択肢に関する科学情報に対する１つ以上のリンク、１つ以上の薬物処置選択肢に関する科学情報についての引用に対する１つ以上のリンク、および１つ以上の薬物処置選択肢に関する臨床試験情報からなる群より選択されるレポートで情報を追加する工程を包含し得る。被験体特異的なレポートの例示的な実施形態は、図８に示される。

（コンピュータシステム）
別の態様では、本発明は、癌をモニタリングするか、被験体レポートを作成するか、および／または介護者にそのレポートを連絡するためのコンピュータシステムを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、癌についての治療の予後をそれを必要とする被験体で決定するか、またはその有効性を決定するためのコンピュータシステムを提供する。このコンピュータシステムは、前記癌について、前記予後または治療の有効性を連絡するレポートを提供し得る。いくつかの実施形態では、コンピュータシステムは、コンピュータ読み取り可能なメディアに含まれる説明書を実行する。いくつかの実施形態では、プロセッサが、１つ以上の制御装置、計算ユニット、および／またはコンピュータシステムの他のユニットと関連するか、またはファームウェアに埋め込まれる。いくつかの実施形態では、この方法の１つ以上の工程は、ハードウェアで実行される。いくつかの実施形態では、この方法の１つ以上の工程は、ソフトウェアで実行される。ソフトウェアのルーティンは、本明細書に記載されるか、または当該分野で公知のフラッシュメモリ、ＲＡＭ、ＲＯＭ、磁気ディスク、レーザーディスクまたは他の記憶メディアなどの任意のコンピュータ読み取り可能なメモリユニットに記憶されてもよい。ソフトウェアは、任意の公知の連絡方法、例としては、例えば、電話線、インターネット、ワイヤレス接続のような通信回路にまたがって、またはコンピュータ読み取り可能なディスク、フラッシュドライブなどのような携行性のメディアによって、コンピュータデバイスに連絡されてもよい。本明細書に記載される方法の１つ以上の工程は、種々の操作、ツール、ブロック、モジュールおよび技術として実行されてもよく、これが次に、ファームウェア、ハードウェア、ソフトウェア、またはファームウェア、ハードウェア、ソフトウェアの任意の組み合わせにおいて行われてもよい。ハードウェアで実行される場合、ブロック、操作、技術などのうちのいくつかまたは全ては、例えば、特定用途向け集積回路（ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｃｉｒｃｕｉｔ）（ＡＳＩＣ）、カスタム集積回路（ｃｕｓｔｏｍｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｃｉｒｃｕｉｔ）（ＩＣ）、フィールドプログラマブル論理アレイ（ＦＰＧＡ）、またはプログラマブル論理アレイ（ＰＬＡ）で実行され得る。

図９は、ユーザーが患者のデータを検出、分析、および処理することを可能にするために適合されたコンピュータシステム９００を示す。このシステム９００は、本明細書に記載される例示的な方法を行うようにプログラムされている中央コンピュータサーバー９０１を備える。このサーバー９０１は、中央プロセッシングユニット（処理装置）（ＣＰＵ、「プロセッサ」とも呼ばれる）９０５を備え、これは、単一のコアプロセッサ、マルチコアプロセッサ、または並列処理のための複数のプロセッサであってもよい。サーバー９０１はまた、メモリ９１０（例えば、ランダム・アクセス・メモリ、リード・オンリ・メモリ、フラッシュメモリ）；電子的記憶装置９１５（例えば、ハードディスク）；１つ以上の他のシステムとの連絡のためのコミュニケーションインターフェース９２０（例えば、ネットワークアダプター）；および周辺機器９２５（これは、キャッシュ、他のメモリ、データ記憶および／または電子的ディスプレイアダプターを含んでもよい）も備える。メモリ９１０、記憶装置９１５、インターフェース９２０、および周辺機器９２５は、マザーボードなどのコミュニケーションバス（実線）を通じてプロセッサ９０５と連絡している。記憶装置９１５は、データを記憶するためのデータ記憶装置であってもよい。サーバー９０１は、コミュニケーションインターフェース９２０の補助でコンピュータネットワーク（「ネットワーク」）９３０に対して作動可能に接続される。ネットワーク９３０は、インターネットであっても、イントラネットであっても、および／またはエクストラネットであっても、インターネットと連絡しているイントラッネットおよび／またはエクストラネットであっても、遠隔通信であっても、あるいはデータネットワークであってもよい。ネットワーク９３０は、いくつかの場合には、サーバー９０１の補助によって、ピアツーピア（ｐｅｅｒ−ｔｏ−ｐｅｅｒ）ネットワークを行ってもよく、これによってデバイスをサーバー９０１に接続して、クライアントまたはサーバーとして挙動することが可能になる場合がある。

記憶装置９１５は、ファイル、例えば、被験体レポート、および／または介護者とのコミュニケーション、配列決定データ、個体に関するデータ、または本発明に関連するデータの任意の態様を記憶し得る。

サーバーは、ネットワーク９３０を通じて１つ以上の遠隔コンピュータシステムと連絡し得る。この１つ以上の遠隔コンピュータシステムは、例えば、パーソナルコンピュータ、ラップトップ、タブレット、電話、スマートフォン、または個人情報端末であってもよい。

いくつかの状況では、システム９００は、単独のサーバー９０１を備える。他の状況では、このシステムは、イントラネット、エクストラネットおよび／またはインターネットを通じて互いと連絡している複数のサーバーを備える。

サーバー９０１は、配列決定情報、または患者情報、例えば、多型、変異、患者の病歴および人口統計データ、および／または潜在的関連性の他の情報を記憶するように適合され得る。このような情報は、記憶装置９１５またはサーバー９０１に記憶されてもよく、そのようなデータは、ネットワークを通じて伝達され得る。

本明細書に記載されるような方法は、例えば、メモリ９１０、または電子的記憶装置９１５などのような、サーバー９０１の電子的記憶位置に記憶される機械（またはコンピュータプロセッサ）実行可能なコード（またはソフトウェア）によって実行されてもよい。使用の間、このコードは、プロセッサ９０５によって実行され得る。いくつかの場合には、このコードは、記憶装置９１５から読み出されて、プロセッサ９０５による即時的アクセスのためにメモリ９１０に記憶され得る。いくつかの状況では、電子的記憶装置９１５は、除外されてもよく、機械の実行可能な命令は、メモリ９１０に記憶される。あるいは、このコードは、第二のコンピュータシステム９４０上で実行されてもよい。

サーバー９０１のような本明細書に提供されるシステムおよび方法の態様は、プログラミングで実現されてもよい。種々の態様の技術は、「製品」または「製造物」として、代表的には機械読み取り可能な種類のメディアで行われるか、または実現される機械（またはプロセッサ）実行可能なコードおよび／または関連のデータの形態であると考えられ得る。機械実行可能なコードは、メモリ（例えば、リード・オンリ・メモリ、ランダム・アクセス・メモリ、フラッシュメモリ）またはハードディスクのような電子的記憶装置に記憶されてもよい。「記憶」型のメディアとしては、コンピュータ、プロセッサなどの任意のもしくは全ての有形のメモリ、またはその関連のモジュール、例えば、種々の半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブなどが挙げられ、これらは、ソフトウェアプログラミングのために任意の時点で一時的でない記憶を提供し得る。ソフトウェアの全てまたは一部は、インターネットまたは種々の他の遠隔通信ネットワークを通じて時折連絡され得る。このようなコミュニケーションは、例えば、一方のコンピュータまたはプロセッサから他方への、例えば、管理サーバーまたはホストコンピュータからアプリケーションサーバーのコンピュータプラットフォームへのソフトウェアのロードを可能にし得る。したがって、ソフトウェア要素を保有し得る別種の媒体としては、有線および光学の地上の通信線のネットワークを通じた、および種々のエアリンクにまたがった、ローカルデバイスの間の物理的インターフェースにまたがって用いられるような、光学、電気および電磁波が挙げられる。このような波、例えば、有線または無線など、光学的リンクなどを担持する物理的要素はまた、ソフトウェアを保有している媒体としてみなされ得る。本明細書において用いる場合、持続的に制限されない限り、有形の「記憶」メディアという用語、例えば、コンピュータまたは機械「読み取り可能メディア」とは、実行のためのプロセッサに命令を送るのに関与する任意のメディアを指してもよい。

したがって、機械読み取り可能なメディア、例えば、コンピュータ実行可能なコードは、多くの形態をとってもよく、これには限定するものではないが、有形の記憶媒体、搬送波メディア、または物理的伝送媒体が挙げられる。不揮発性記憶媒体としては、このシステムを実行するために用いられ得るような、例えば、光学ディスク、または磁気ディスク、例えば、任意のコンピュータ（単数または複数）などの任意の記憶装置が挙げられる。有形の伝送媒体としては以下を挙げることができる：同軸ケーブル、銅線および光ファイバー（コンピュータシステム内にバスを含むワイヤを含む）。搬送波伝送媒体は、電気信号もしくは電磁的信号の形態をとっても、または音響波、もしくは光波、例えば、高周波（ＲＦ）および赤外（ＩＲ）データ通信の間に生じるものなどの形態をとってもよい。したがって、コンピュータ読み取り可能な媒体の一般的な形態としては例えば、以下が挙げられる：フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、任意の他の磁気メディア、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、任意の他の光学メディア、パンチカード、紙テープ、任意の他の物理的記憶媒体（穴のパターンを有する）、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭおよびＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ−ＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリチップ、またはカートリッジ、データもしくは命令を伝達する搬送波、ケーブルまたはこのような搬送波を伝達するリンク、またはコンピュータがプログラミングコードおよび／またはデータを読み取り得る任意の他の媒体。これらの形態の多くのコンピュータ読み取り可能なメディアは、１つ以上の命令の１つ以上の順序を実行のためにプロセッサに搬送する工程に関与し得る。

癌のモニタリング、被験体レポートの作成、および／または介護者へのこのレポートの連絡の結果は、グラフィカルユーザーインターフェースなどのユーザーインターフェースの補助によって、ユーザーに提示され得る。

コンピュータシステムは、１つ以上の工程について用いられ得、この工程としては、例えば、サンプルの収集、サンプルの処理、配列決定、対立遺伝子検出、患者の病歴または医学的記録の受け取り、被験体または被験体から入手したサンプル中の腫瘍特異的変異の検出されたレベルに関する測定データの受け取りおよび記録、診断、予後診断または治療有効性を決定する前記測定データの分析、レポートの作成、および受取者への結果の報告が挙げられる。

クライアント−サーバーおよび／またはリレーショナルデータベース構造を本発明では用いてもよい。一般には、クライアント−サーバー構造は、ネットワーク構造であって、ここではネットワーク上の各々のコンピュータまたはプロセスが、クライアントまたはサーバーのいずれかである。サーバーコンピュータは、ディスクドライブ（ファイルサーバー）、プリンタ（プリントサーバー）、またはネットワーク通信量（ネットワークサーバー）を管理する専用の強力なコンピュータであり得る。クライアントコンピュータは、ＰＣ（パーソナルコンピュータ）またはワークステーションを含んでもよく、ここでユーザーは、アプリケーション、および本明細書に開示されるような例示的な出力装置を実行する。クライアントコンピュータは、ファイル、デバイスおよびさらには処理能力のようなリソースについてサーバーコンピュータに依拠し得る。サーバーコンピュータは、全てのデータベース機能を取扱う。クライアントコンピュータは、初期段階のデータ管理を取扱い、ユーザーからのデータ入力を受容するソフトウェアを有してもよい。

計算を行った後、プロセッサは、ある計算などからの出力を提供し、例えば、入力装置または記憶装置に、同じもしくは異なるコンピュータシステムの別の記憶装置に、または出力装置に戻し得る。プロセッサからの出力は、データディスプレイ、例えば、ディスプレイスクリーン（例えば、デジタル装置上のモニターまたはスクリーン）、プリントアウト、データシグナル（例えば、パケット）、グラフィカルユーザーインターフェース（例えば、ウェブページ）、アラーム（例えば、点滅する光または音）、または任意の上記の組み合わせによって提示されてもよい。ある実施形態では、出力は、ネットワーク（例えば、ワイヤレスネットワーク）にまたがって出力装置に伝達される。出力装置は、データ・プロセシング・コンピュータ・システムから出力を受容するためにユーザーによって用いられてもよい。出力がユーザーに受容された後、ユーザーは、作用の経過を決定してもよいし、または作用（例えば、ユーザーが医療関係者である場合は医療処置）の経過を行ってもよい。いくつかの実施形態では、出力装置は、入力装置と同じ装置である。例示的な出力装置としては、限定するものではないが、電話、無線電話、携帯電話、ＰＤＡ、フラッシュメモリドライブ、光源、音波発生装置、ＦＡＸ装置、コンピュータ、コンピュータモニター、プリンタ、ｉＰｏｄ、およびウェブページが挙げられる。ユーザーステーションは、サーバーによって処理された情報を出力するためにプリンタまたはディスプレイモニターと連絡していてもよい。このようなディスプレイ、出力装置、およびユーザーステーションを用いて、被験体に対して、またはその介護者に対して警告を発してもよい。

本開示に関連するデータは、受取者による受容および／またはレビューのためにネットワークまたは接続にまたがって伝達されてもよい。この受取者は、レポートが関連する被験体；またはその介護人、例えば、ヘルスケア提供者、マネージャー、他のヘルスケア専門家、または他の介護者；遺伝子型決定分析を行うかおよび／または指図した人または実体；遺伝カウンセラーであってもよいが、それに限定されない。この受取者はまた、このようなレポートを記憶するためのローカルまたは遠隔のシステムであってもよい（例えば、「クラウドコンピューティング」構造のサーバーまたは他のシステム）。一実施形態では、コンピュータ読み取り可能なメディアとしては、生物学的サンプルの分析の結果の伝達に適切なメディアが挙げられる。

被験体特異的なレポートの例示的な実施形態は、図８に示される。コンピュータシステムは、ユーザーのアクセス可能なモジュールを含んでもよく、このモジュールによって、サービスが行われるように臨床家が要求する能力が可能になる。臨床家は、患者の個体群統計学および医学的既往歴の情報をコンピュータシステムに入力し得る。このコンピュータシステムは、入力された情報を処理して、分析されているサンプルに適用され得るバーコード標識を作成し得る。バーコードのサンプルは、分析のために第三者の分析者へ送られる。バーコード化された情報は、ＨｅａｌｔｈＩｎｓｕｒａｎｃｅＰｏｒｔａｂｉｌｉｔｙａｎｄＡｃｃｏｕｎｔａｂｉｌｉｔｙＡｃｔ（ＨＩＰＡＡ）コンプライアンスでの説明責任を維持するために第三者の分析者にはアクセスしにくい。匿名にできる情報は、第三者の分析者にもアクセス可能である。バーコードを用いて、分析ワークフローを通じてサンプルの進行を追跡してもよく、それによって暗号化された最終レポートが生成される。暗号化された最終レポートは、解読されて、サンプル情報を最初に入力した臨床家にはアクセス可能にされ得る。

（ライゲーション方法：）
いくつかの態様では、本発明は、高度に効率的なライゲーション反応を行うための方法およびキットを提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、アクセプター核酸に対するドナー核酸のライライゲーションを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ライゲーションの効率を、現行の方法と比較して２倍超、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、または１０００倍超まで改善する。本明細書に記載される方法は、例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の効率を超えるまでライゲーションの効率を増大し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ライゲーション反応の特異性を増大し得、これによって望ましくないライゲーション生成物（例えば、望ましくないドナー−ドナーの、またはアクセプター−アクセプターのコンカテマー）と比較して、例えば３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％、８０％超、８５％、９０％超、９５％超、９７％超、９８％超、９９％超、９９．５％超、９９．９％、または実質的に全ての、望ましいドナー−アクセプターライゲーションから生じるライゲーション生成物を生じる。本明細書において記載される方法は、アクセプターまたはドナー核酸分子に対して、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９７％超、９８％超、９９％超、９９．５％超、９９．９％超または実質的に全ての、それぞれ、複数のドナーまたはアクセプター核酸分子のライゲーションを生じ得る。ライゲーション反応における核酸分子（ドナーまたはアクセプター）は、１２０ヌクレオチド長を超えてもよい。このような高度に効率的なライゲーション方法を用いて、広範なアプリケーション（そのいくつかは、実施例によって本明細書に記載される）を改善してもよい。

図１０Ａは、本発明の方法の例示的な実施形態を示す。第一の工程（１）では、この方法は、ＮＭＰ担持ドナー核酸分子の蓄積を達成するのに十分な時間、反応混合物中である量のドナー核酸分子にヌクレオチド一リン酸（ＮＭＰ）を移動させる工程を包含する。いくつかの実施形態では、Ｎ＝Ａである。いくつかの実施形態では、Ｎ＝Ｇである。ドナー核酸分子は、５’または３’リン酸基を含んでもよい。いくつかの実施形態では、Ｎ＝Ａであり、かつドナー核酸分子は、５’リン酸基を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ＝Ｇであり、かつドナー核酸分子は、３’リン酸基を含む。いくつかの実施形態では、この反応は、反応混合物中に存在するドナー核酸分子のうち少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％へのＮＭＰの移動を生じる。第二の工程（２）では、この方法はさらに、アクセプター核（酸）分子（ｎｕｃｌｅｉｃｍｏｌｅｃｕｌｅ）とＮＭＰ担持ドナー核酸分子との間の共有結合の形成を達成する工程（例えば、ＮＭＰ担持ドナー核酸分子に対してアクセプター核酸分子をライゲーションする工程）を包含する。いくつかの実施形態では、アデニル化およびライゲーション工程を、単一の反応混合物中で連続して行う。いくつかの実施形態では、アデニル化されているドナー核酸分子は、第二工程（例えば、ライゲーション工程）の前に反応混合物から分離されない。いくつかの実施形態では、この第一および第二の工程は、反応混合物中で逐次的に行われる。いくつかの実施形態では、このライゲーション工程は、アデニル化工程の終了後に行われる。いくつかの実施形態では、１０％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超、９７％超、９８％超、９９％超、９９．５％超、９９．９％、または実質的に全てのドナー核酸分子が、ライゲーション工程の開始の際にＮＭＰ分子を担持している。

いくつかの実施形態では、ドナーおよび／またはアクセプター核酸分子は、完全にまたは部分的に変性される。完全または部分的な変性が、当該分野で公知の任意の手段によって達成され得、この手段としては、例えば、熱変性、塩基性ｐＨ中でのインキュベーション、ホルミアミド中での変性、および／または尿素変性が挙げられる。熱変性は、核酸サンプルを、約６０℃以上、約６５℃以上、約７０℃以上、約７５℃以上、約８０℃以上、約８５℃以上、約９０℃以上、約９５℃以上、または約１００℃以上まで加熱することによって達成され得る。核酸サンプルは、当該分野で公知の任意の手段によって加熱されてもよく、この手段としては、水浴中でのインキュベーション、温度制御熱ブロック、またはサーマルサイクラーが挙げられる。

塩基性のｐＨ中でのインキュベーションによる変性は、ｐＨ８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上の任意の溶液（例えば、緩衝液）中の核酸サンプルのインキュベーションを含み得る。塩基性ｐＨ中でのインキュベーションによる変性は、例えば、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、炭酸水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、Ｔｒｉｓを含む溶液中での核酸サンプルのインキュベーションによって達成され得る。この溶液は、約１ｍＭのＮＡＯＨ、２ｍＭのＮＡＯＨ、５ｍＭのＮＡＯＨ、１０ｍＭのＮＡＯＨ、２０ｍＭのＮＡＯＨ、４０ｍＭのＮＡＯＨ、６０ｍＭのＮＡＯＨ、８０ｍＭのＮＡＯＨ、１００ｍＭのＮＡＯＨ、０．２ＭのＮａＯＨ、約０．３ＭのＮａＯＨ、約０．４ＭのＮａＯＨ、約０．５ＭのＮａＯＨ、約０．６ＭのＮａＯＨ、約０．７ＭのＮａＯＨ、約０．８ＭのＮａＯＨ、約０．９ＭのＮａＯＨ、約１．０ＭのＮａＯＨ、または１．０Ｍ超のＮａＯＨを含んでもよい。この溶液は約１ｍＭのＫＯＨ、２ｍＭのＫＯＨ、５ｍＭのＫＯＨ、１０ｍＭのＫＯＨ、２０ｍＭのＫＯＨ、４０ｍＭのＫＯＨ、６０ｍＭのＫＯＨ、８０ｍＭのＫＯＨ、１００ｍＭのＫＯＨ、０．２ＭのＫＯＨ、０．５ＭのＫＯＨ、１ＭのＫＯＨ、または１Ｍ超のＫＯＨを含んでもよい。いくつかの実施形態では、この核酸サンプルは、ＮａＯＨまたはＫＯＨの中で、約０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、または３０分間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、核酸サンプルは、ＮａＯＨまたはＫＯＨインキュベーション後に酢酸ナトリウム中でインキュベートする。

尿素およびホルムアミドのような化合物は、ヌクレオチド塩基の電気陰性の中心と水素結合を形成し得る官能基を含む。高濃度の変性剤（例えば、８Ｍ尿素または７０％ホルムアミド）では、水素結合の競合は、相補性の塩基の間よりも変性剤とＮ塩基との間の相互作用を支持し、それによって２つの鎖を分離する。

理論で拘束されることは望まないが、代表的なライゲーション方法では、（１）ＮＭＰをリガーゼに移動させる工程、および（２）ＮＭＰをドナー核酸分子に移動させる工程という中間工程が一般的には、ライゲーション工程（３）と同時に生じて、中性のｐＨでは可逆性である。３つの全ての工程の同時発生、ならびに工程（１）および（２）の可逆性によって、ライゲーション効率の低下、およびライゲーション生成物の特異性の低下が、いくつかの要因、例えば、ドナー種およびアクセプター種の両方にＮＭＰを移行する可能性（例えば、アデニル化、グアニル化）、リガーゼおよび／またはリガーゼのドナー（またはアクセプター）種からのＮＭＰの除去（例えば、脱アデニル化または脱グアニリル化）、ならびに／あるいはドナー（またはアクセプター）種の脱アデニル化または脱グアニリル化（ライゲーションが生じ得る前）などに起因して生じ得る。しかし、ドナー核酸分子にＮＭＰを移動させる工程、および連続したライゲーションの工程を行うことによって、アクセプター種に対するライゲーションの前に、ＮＭＰ担持ドナー核酸分子の蓄積を達成することによって、ライゲーション効率を増大することが可能である。

いくつかの実施形態では、中間工程１＆２の可逆性は、反応の転帰を制御するために開発される。いくつかの実施形態では、可逆性は、反応混合物の各々の成分（例えば、リガーゼ、ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）、ドナーおよびアクセプター）の相対濃度を調整して、例えば、アデニル化を脱アデニル化よりも促進することによって制御される。単なる例であるが、ドナーおよびアクセプター核酸種が、アデニル化反応に存在し、かつリン酸化５’末端を含む場合、アデニル化工程は、ドナーおよびアクセプター種に非特異的になり、これは望ましくないライゲーション生成物の非特異的な形成をもたらし得る。しかし、アデニル化工程にドナー種のみが存在するならば、アデニル化はドナー種に特異的になり得る。このような場合、ＡＴＰおよびリガーゼの量はまた、アデニル化対脱アデニル化の優位性に影響する。例えば、ドナー種の自己ライゲーションは、低濃度のリガーゼで優勢になり得、ここでは高濃度のＡＴＰ（例えば、ドナー核酸分子の量未満）は、望ましくない濃度のドナー種をもたらし得る。ＡＴＰの量を制限することは、観察される濃度の程度を制御し得る。したがって、いくつかの実施形態では、ＮＭＰ移行工程は、ある量のドナー核酸分子、およびドナー核酸分子の量に少なくとも等モルであるか過剰である量のリガーゼを含む反応混合物中で生じる。ライゲーション工程の前の反応混合物中のドナー核酸分子は、０．１〜１０、５〜３０、１０〜５０、２０〜１００、５０〜２００、１００〜５００、２００〜１０００ｎｇ／μｌの量で存在し得る。ライゲーション工程の前の反応混合物中のドナー核酸分子は、約０．０１ｐｍｏｌ、０．０５ｐｍｏｌ、０．１ｐｍｏｌ、０．１５ｐｍｏｌ、０．２ｐｍｏｌ、０．２５ｐｍｏｌ、０．５ｐｍｏｌ、０．５５ｐｍｏｌ、０．６ｐｍｏｌ、０．６５ｐｍｏｌ、０．７ｐｍｏｌ、０．７５ｐｍｏｌ、０．８ｐｍｏｌ、０．８５ｐｍｏｌ、０．９ｐｍｏｌ、０．９５ｐｍｏｌ、１ｐｍｏｌ、１．１ｐｍｏｌ、１．２ｐｍｏｌ、１．３ｐｍｏｌ、１．４ｐｍｏｌ、１．５ｐｍｏｌ、１．６ｐｍｏｌ、１．７ｐｍｏｌ、１．８ｐｍｏｌ、１．９ｐｍｏｌ、２ｐｍｏｌ、５ｐｍｏｌ、１０ｐｍｏｌ、１５ｐｍｏｌ、２０ｐｍｏｌ、２５ｐｍｏｌ、３０ｐｍｏｌ、３５ｐｍｏｌ、４０ｐｍｏｌ、４５ｐｍｏｌ、５０ｐｍｏｌ、５５ｐｍｏｌ、６０ｐｍｏｌ、６５ｐｍｏｌ、７０ｐｍｏｌ、７５ｐｍｏｌ、８０ｐｍｏｌ、８５ｐｍｏｌ、９０ｐｍｏｌ、９５ｐｍｏｌ、１００ｐｍｏｌ、１１０ｐｍｏｌ、１２０ｐｍｏｌ、１３０ｐｍｏｌ、１４０ｐｍｏｌ、１５０ｐｍｏｌ、１６０ｐｍｏｌ、１７０ｐｍｏｌ、１８０ｐｍｏｌ、１９０ｐｍｏｌ、２００ｐｍｏｌ、３００ｐｍｏｌ、４００ｐｍｏｌ、５００ｐｍｏｌ、６００ｐｍｏｌ、７００ｐｍｏｌ、８００ｐｍｏｌ、９００ｐｍｏｌ、１０００ｐｍｏｌ（１ｎｍｏｌ）、２ｎｍｏｌ、５ｎｍｏｌ、１０ｎｍｏｌ、または１０ｎｍｏｌ超の５’末端を提供する量で存在してもよい。いくつかの実施形態では、リガーゼの量は、ドナー核酸分子の量の少なくとも１×、１．２５×、１．５×、２×、３×、４×、５×、７．５×、１０×、１５×、２０×、または２０×超である。いくつかの実施形態では、リガーゼの量は、ドナー核酸分子の量の１〜５×、２〜１０×、５〜２０×または２０×超である。いくつかの実施形態では、反応混合物中のリガーゼの量は、約０．０１、０．０５、０．１、０．５１、１．５、２、４、６、８、１０、または１０μＭ超である。いくつかの実施形態では、アデニル化工程は、ある量のドナー核酸分子と、ドナー核酸分子の量よりも少なくとも０．２５倍高い、０．５倍高い、１倍高い、１．５倍高い、２倍高い、３倍高い、４倍高い、５倍高い、６倍高い、７倍高い、８倍高い、９倍高い、１０倍高い、１５倍高い、２０倍高い、または２０倍超高い量のリガーゼを含む反応混合物中で生じる。

リガーゼは、ＡＴＰ依存性リガーゼであってもよい。ＡＴＰ依存性リガーゼは、ＲＮＡリガーゼであってもよい。ＲＮＡリガーゼは、例えば、古細菌（Ａｒｃｈａｅａｌ）のＲＮＡリガーゼ、例えば、好熱性の古細菌Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ由来の古細菌ＲＮＡリガーゼ（ＭｔｈＲｎｌ）であってもよい。このＲＮＡリガーゼは、Ｒｎｌ１ファミリーリガーゼであってもよい。一般には、Ｒｎｌ１ファミリーリガーゼは、ｔＲＮＡ中の一本鎖破壊を修復し得る。例示的なＲｎｌ１ファミリーリガーゼとしては、例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ、ＴｈｅｒｍｕｓｓｃｉｔｏｄｕｃｔｕｓバクテリオファージＴＳ２１２６由来の熱安定性ＲＮＡリガーゼ１（ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ）、またはＣｉｒｃＬｉｇａｓｅＩＩ）が挙げられる。このようなリガーゼは、参照によって本明細書に援用される、ＷＩＰＯの国際特許出願公開ＷＯ２０１００９４０４０に記載され得る。ＲＮＡリガーゼは、Ｒｎｌ２ファミリーのリガーゼであってもよい。一般には、Ｒｎｌ２ファミリーのリガーゼは、二重鎖ＲＮＡ中のニックをシールし得る。例示的なＲｎｌ２ファミリーのリガーゼとしては、例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＡＴＰ依存性リガーゼは、ＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼである。ＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼであってもよい。これらのリガーゼは一般的には、ヌクレオチド３’−ＯＨ求核試薬と５’ＡＭＰ・Ｐ基のリン酸塩との間のホスホジエステル結合のＡＴＰ依存性形成を触媒する。

いくつかの実施形態では、リガーゼは、ＧＴＰ依存性リガーゼである。ＧＴＰ依存性リガーゼは、ＲＮＡリガーゼであってもよい。ＧＴＰ依存性ＲＮＡリガーゼは、ＲｔｃＢＲＮＡリガーゼであってもよい。ＲｔｃＢリガーゼは、３’ＧＭＰ・Ｐ基のリン酸塩とヌクレオチド５’−ＯＨ求核試薬との間のホスホジエステル結合のＧＴＰ＝依存性形成を触媒し得る。

いくつかの実施形態では、この反応混合物は、ドナー核酸分子からのＮＭＰの除去を上回るドナー核酸分子に対するＮＭＰの移行を促進する（例えば、脱アデニル化または脱グアニリル化を上回ってアデニル化またはグアニリル化を促進する）のに十分な量のＮＴＰを含む。いくつかの実施形態では、ＮＴＰの量は、アデニル化されているドナー核酸分子の間の共有結合の形成を阻害するのに十分である。いくつかの実施形態では、アデニル化工程は、ある量のドナー核酸分子、ある量のＮＴＰ依存性リガーゼ、およびＮＴＰ依存性リガーゼのミカエリス定数（Ｋｍ）よりも少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍高い量のＮＴＰを含む反応混合物中で生じる。いくつかの実施形態では、このアデニル化工程は、ある量のドナー核酸分子、ドナー核酸分子の量に少なくとも等モルであるか、または過剰な量のＮＴＰ−ミカエリス定数（Ｋｍ）依存性リガーゼ、およびＮＴＰ依存性リガーゼのミカエリス定数（Ｋｍ）よりも少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍高い量のＮＴＰを含む反応混合物中で生じる。特定の実施形態では、約１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、４００μＭ、５００μＭ、６００μＭ、７００μＭ、８００μＭ、９００μＭ、１０００μＭのＮＴＰが、この反応混合物中に存在する。このような量のＮＴＰは、ライゲーション工程を阻害し得る。

アデニル化が生じる反応混合物はさらに、陽イオンを含んでもよい。この陽イオンは、Ｍｇ^２＋であってもよいし、またはＭｎ^２＋であってもよい。いくつかの実施形態では、陽イオンは、Ｍｇ^２＋である。Ｍｇ^２＋は、反応混合物中に、０．１ｍＭ〜１ｍＭ、１ｍＭ〜１０ｍＭ、５〜２０ｍＭ、１０〜５０ｍＭ、３０〜１００ｍＭ、または１００ｍＭ超の最終濃度で存在してもよい。Ｍｇ^２は、反応混合物中に、約１０ｍＭの最終濃度で存在し得る。いくつかの実施形態では、陽イオンは、リガーゼのアデニル化および引き続くドナー核酸分子のアデニル化を触媒するのに十分な量で存在する。

いくつかの実施形態では、反応混合物はさらに、高分子量の不活性分子、例えば、ＭＷ４０００、６０００、または８０００のＰＥＧを含む。いくつかの実施形態では、この不活性分子は、約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、７．５％、１０％、１２．５％、１３％、１３．５％、１４％、１４．５％、１５％、１５．５％、１６％、１６，５％、１７％、１７．５％、１８％、１８．５％、１９％、１９．５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、または５０％超（重量／容積）の量で存在する。いくつかの実施形態では、この不活性分子は、約０．５〜２％、約１〜５％、約２〜１５％、約１０〜２０％、約１５〜３０％、約２０〜５０％、または５０％超（重量／容積）の量で存在する。

本明細書に記載されるＮＭＰ移行工程は、ＮＭＰ担持ドナー核酸分子の蓄積を達成し得る。ＮＭＰ担持ドナー核酸分子の蓄積は、ＮＭＰを担持する反応混合物中に存在する複数のドナー核酸分子のうち少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、または実質的に全てを生じ得る。

ＮＭＰ移行工程の間、例えば、ドナー／ドナー環化または連結から生じる望ましくないライゲーション生成物は、任意の手段によって最小化または防止され得る。望ましくないライゲーションは、例えば、アデニル化されたドナー核酸分子の間の共有結合（例えば、ライゲーション）の形成を阻害するのに十分な量のＮＴＰの存在下でアデニル化反応を行うことによって最小化または防止され得る。ライゲーションを阻害し得るＮＴＰの例示的な量は本明細書に記載されている。望ましくないライゲーションはまた、ドナー核酸分子の３’末端基の修飾によって防止されてもよい。ドナー核酸分子の３’末端基は、当該分野で公知の任意の手段によって３’末端ブロック基で修飾されてもよい。一般には、３’末端ブロック基は、３’末端基と別のヌクレオチドとの間の共有結合の形成を防止する。いくつかの実施形態では、３’末端ブロック基は、ジデオキシ−ｄＮＴＰ、ビオチン、３’アミノ部分、「逆転した」ヌクレオシド塩基である。いくつかの実施形態では、このリガーゼは、Ｔ４ＲＮＡリガーゼであり、かつドナー核酸分子は、修飾された３’末端基を含む。他の実施形態では、リガーゼは、Ｔ４ＲＮＡリガーゼであり、かつドナー核酸分子は、未改変の３’末端基を含む。さらに他の実施形態では、リガーゼは、Ｔ４ＲＮＡリガーゼではなく、ドナー核酸分子は、未改変の３’末端基を含む。

いくつかの実施形態では、アデニル化は、アデニル化されているドナー核酸分子の蓄積を達成するのに十分な時間、反応混合物中で生じる。いくつかの実施形態では、反応混合物は、約１分、約２分、約３分、約４分、５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、約６０分、約７０分、約８０分、約９０分、約１２０分、約１５０分、約１８０分、約２１０分、約２４０分、または２４０分超、インキュベートされる。いくつかの実施形態では、反応混合物は、２〜１０分、５〜２０分、１０〜３０分、２０〜６０分、３０〜９０分、６０〜１５０分、１２０〜２４０分、または２４０分超インキュベートされる。

いくつかの実施形態では、反応混合物は、ドナー核酸分子のアデニル化を容易にするために所望の温度でインキュベートされる。いくつかの実施形態では、この反応混合物は、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、約５５℃、約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、または７０℃超まで加熱される。いくつかの実施形態では、この反応混合物は、約６０〜７０℃まで加熱される。他の実施形態ではアデニル化は、室温（例えば、２０〜２５℃）で生じる場合もあるし、または約３５〜４０℃（例えば、３７℃）で生じる場合もある。いくつかの実施形態では、反応混合物は、０〜４℃、４〜１５℃、または１０〜２０℃でインキュベートされる。いくつかの実施形態では、反応混合物は、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、約６０分、約７０分、約８０分、約９０分、約１２０分、約１５０分、約１８０分、約２１０分、約２４０分、または２４０分超インキュベートされる。いくつかの実施形態では、この反応混合物は、２〜１０分、５〜２０分、１０〜３０分、２０〜６０分、３０〜９０分、６０〜１５０分、１２０〜２４０分、または２４０分超インキュベートされる。特定の実施形態では、この反応混合物は、６５℃まで約６０分間加熱される。

アデニル化されているドナー核酸分子の蓄積後、アデニル化されているドナー核酸分子へのアクセプター核酸分子のライゲーションは、反応混合物からアデニル化されているドナー核酸分子を分離（例えば、精製）することなく達成され得る。いくつかの実施形態では、ライゲーションは、ＮＴＰを希釈するために十分な量で反応混合物液中にさらに添加することによって達成される。いくつかの実施形態では、ＮＴＰは、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１５倍、２０倍、５０倍、１００倍、または１００倍超希釈される。この液体は、水、緩衝液、一価イオン、陽イオン、高分子量の不活性分子、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。例えば、緩衝液、一価イオン、陽イオン、高分子量の不活性分子、またはそれらの任意の組み合わせのさらなる量を、反応混合物に添加して、ＮＴＰの希釈の際にこれらの反応混合物成分の元の濃度を保存してもよい。ＮＴＰの希釈は、リガーゼのＮＴＰ媒介性の阻害を放出し得、それによってライゲーション工程が進行することを可能にする。いくつかの実施形態では、ライゲーションは、反応混合物に対して陽イオンをさらに添加することによって達成される。陽イオンは、Ｍｇ^２＋であっても、またはＭｎ^２＋であってもよい。いくつかの実施形態では、陽イオンはＭｎ^２＋である。いくつかの実施形態では、陽イオンは、ライゲーション工程を容易にする。いくつかの実施形態では、Ｍｎ^２＋は、０ｍＭ〜２ｍＭ、１ｍＭ〜２．５ｍＭ、２．５ｍＭ〜５ｍＭ、５ｍＭ〜７．５ｍＭ、または７．５ｍＭ超の最終濃度で反応混合物中に存在する。いくつかの実施形態では、Ｍｎ^２＋は、反応混合物中に、２．５ｍＭ、３ｍＭ、３．５ｍＭ、４ｍＭ、４．５ｍＭ、５ｍＭ、５．５ｍＭ、６ｍＭ、６．５ｍＭ、７ｍＭ、７．５ｍＭ、または７．５ｍＭ超の最終濃度で存在する。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、反応混合物中に、ある量のアクセプター核酸分子を添加する工程を包含する。いくつかの実施形態では、このアクセプター核酸分子は、ドナー核酸分子の量と比較して過剰な量で添加される。例えば、このアクセプター核酸分子は、ドナー核酸分子の量の１．５×〜１０×、２×〜５０×、５×〜１００×、５０×〜５００×、５００×超の量で反応混合物中に添加され得る。他の実施形態では、このアクセプター核酸分子は、ドナー核酸分子の量が、アクセプター核酸分子の量に比べて過剰であるような量で添加される。例えば、ドナー核酸分子は、アクセプター核酸分子の量の１．５×〜１０×、２×〜５０×、５×〜１００×、５０×〜５００×、または５００×超の量で反応混合物中に存在してもよい。いくつかの実施形態では、リガーゼの追加の量が反応混合物に添加されてもよい。いくつかの実施形態では、反応混合物に追加されるリガーゼはない。

いくつかの実施形態では、この反応混合物は、アクセプター核酸分子に対するＮＭＰ担持ドナー核酸分子のライゲーションを達成するのに十分な時間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、この反応混合物は、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、約６０分、約７０分、約８０分、約９０分、約１２０分、約１５０分、約１８０分、約２１０分、約２４０分、または２４０分超インキュベートされる。いくつかの実施形態では、この反応混合物は、２〜１０分、５〜２０分、１０〜３０分、２０〜６０分、３０〜９０分、６０〜１５０分、１２０〜２４０分、または２４０分超インキュベートされる。

いくつかの実施形態では、この反応混合物を、ライゲーションを容易にするために所望の温度でインキュベートする。いくつかの実施形態では、この反応混合物を、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、約５５℃、約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、または７０℃超まで加熱する。いくつかの実施形態では、この反応混合物は、約６０〜７０℃まで加熱される。他の実施形態ではライゲーションは、冷温（例えば、約０〜４℃、約４℃、約４〜１５℃、約１２℃、約１０〜２０℃）で、室温（例えば、２０〜２５℃）で起きてもよいし、または約３５〜４０℃（例えば、３７℃）で起きてもよい。いくつかの実施形態では、この反応混合物は、所望の温度で、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、約６０分、約７０分、約８０分、約９０分、約１２０分、約１５０分、約１８０分、約２１０分、約２４０分、または２４０分超インキュベートされる。いくつかの実施形態では、この反応混合物は、所望の温度で２〜１０分、５〜２０分、１０〜３０分、２０〜６０分、３０〜９０分、６０〜１５０分、１２０〜２４０分、または２４０分超インキュベートされる。特定の実施形態では、この反応混合物は、６５℃まで約６０分間加熱される。

インキュベーション後、この方法はさらに、当該分野で公知の任意の手段によってリガーゼを不活性化する工程を包含し得る。リガーゼの不活性化は、熱不活性化によって達成し得る。例えば、反応混合物を、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５℃、または９５℃超まで、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０分、または１０分超加熱してもよい。特定の実施形態では、この反応混合物は、８０℃まで１０分間、続いて９５℃で３分加熱される。リガーゼの不活性化はまた、例えば、ＥＤＴＡとのインキュベーション、ホルムアミドとのインキュベーション、尿素とのインキュベーション、またはプロテアーゼとのインキュベーションによって達成されてもよい。

リガーゼの不活性化後、所望のライゲーション生成物を、当該分野で公知の任意の手段によって反応混合物から精製しても、または分離してもよい。例えば、反応混合物のタンパク質は、例えば、この反応混合物を、プロテアーゼを用いて処理することによって除去され得る。プロテアーゼの処理は、反応混合物を、プロテアーゼを用いて約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０分、または６０分超の間、２０〜２５℃、３５〜４０℃（例えば、３７℃）、または４０℃超でインキュベートする工程を包含し得る。このプロテアーゼを次いで、例えば、７５℃で１０〜２０分間インキュベートすることによって、不活性化してもよい。この所望の反応生成物をさらに、例えば、沈殿によって、カラム精製によって、遠心分離によって、または当該分野で公知の任意の他の方法によって精製してもよい。

高効率のライゲーションのための方法の例示的な実施形態は、図１０に示される。第一の工程（任意）では、二本鎖ＤＮＡフラグメント（例えば、ドナー）を部分的に変性して、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理する。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼは、ドナー核酸分子の５’末端に対するリン酸基の追加、およびドナー核酸分子の３’末端からのリン酸基の除去を触媒する。ドナーは、このポイントで精製されても、または精製されなくてもよい。次の工程では、このドナー分子は、過剰のＡＴＰ依存性ＲＮＡリガーゼ、過剰のＡＴＰ、およびＭｇ^２＋を含む反応混合物に添加される。リガーゼは、ドナー分子の５’リン酸塩へのアデニリル一リン酸の移行を触媒して、ＰＰｉを放出する。この反応混合物を、アデニル化されているドナー核酸分子の蓄積を達成するのに十分な条件下でインキュベートする。次の工程では、アデニル化後に、液体を反応混合物に添加して、ＡＴＰを少なくとも１０倍希釈する。その液体はさらなる成分を含んでもよく、これには限定するものではないが、水、一価の塩、Ｍｇ^２＋、ＰＥＧが挙げられる。また、ドナー分子に連結されるべき核酸分子（例えば、アクセプター）およびＭｎ^２＋も反応混合物に添加される。アクセプター核酸は、検出可能タグ（例えば、ビオチン）を含んでも含まなくてもよい。検出可能タグは、検出および／またはアフィニティー結合のために用いられ得る。ＡＴＰの希釈およびＭｎ^２＋の添加は両方とも、ライゲーション反応の終了を駆動し、結果としてアクセプター−ドナー分子を含むライゲーション生成物を生じる。

高効率のライゲーションのための方法の別の例示的な実施形態は、図１１に示される。第一の工程（任意）では、二本鎖ＤＮＡフラグメント（例えば、ドナー）は部分的に変性されて、ドナー核酸分子の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の末端の３’アデニル化へのリン酸基の付加およびドナー核酸分子の５’末端からのリン酸基の除去を触媒する酵素で処理される。このドナーは、このポイントで精製されてもされなくてもよい。次の工程では、ドナー分子を、過剰のＧＴＰ依存性ＲＮＡリガーゼ（例えば、ＲｔｃＢ）、過剰のＧＴＰ、およびＭｎ^２＋を含む反応混合物に添加する。リガーゼは、ドナー分子の３’リン酸塩に対するグアニリル一リン酸の移行を触媒して、ＰＰｉを放出する。反応混合物を、グアニリル化ドナー核酸分子の蓄積を達成するのに十分な条件下でインキュベートする。次の工程では、アデニル化後、液体を反応混合物に添加して、ＧＴＰを少なくとも１０倍希釈する。その液体はさらなる成分を含んでもよく、この成分としては限定するものではないが、水、一価の塩、Ｍｇ^２＋、ＰＥＧが挙げられる。また、ドナー分子に連結されるべき核酸分子（例えば、アクセプター）およびＭｎ^２＋も反応混合物に添加される。アクセプター核酸は、検出可能タグ（例えば、ビオチン）を含んでも含まなくてもよい。検出可能タグは、検出および／またはアフィニティー結合のために用いられ得る。ＧＴＰの希釈およびＭｎ^２＋の添加の両方とも、ライゲーション反応の終了を駆動し、結果としてアクセプター−ドナー分子を含むライゲーション生成物を生じる。

（例示的な適応）
高効率のライゲーション方法は、広範な適用に有用である。例えば、高効率ライゲーション方法は、核酸を検出可能タグまたはアフィニティータグを用いてタグ付けする工程が望ましい任意の適用に有用である。他の例に関しては、高効率ライゲーション方法は、１つの核酸種の別の核酸への連結が所望される任意の適用に有用である。高効率のライゲーション方法はまた、分析、例えば、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）アッセイを含む、アレイハイブリダイゼーションアッセイによる、配列決定による分析のための核酸ライブラリーの調製のためにも有用である。このような高効率の調製方法は、例えば、出発材料の有意な損失なく核酸の出発サンプルの直接分析を可能にすることによって、予備増幅を要することなく核酸の直接分析を可能にすることによって、予備増幅に関連し得る標識または増幅のバイアスを誘導することなく核酸の分析を可能にし、潜在的なバイオインフォマティクスの負荷を低下することによって、多くの利点を下流の分析に付与し得る。このような高効率のライゲーション方法およびキットはまた、例えば、分子クローニング目的のため、またはバーコード化アプリケーションのためにも有用であり得る。

配列決定アプリケーション／高効率ライブラリー調製
高効率ライゲーション方法およびキットは、本明細書において記載される場合、配列決定のための核酸ライブラリーの調製に適用され得る。このような調製方法によって、特にエマルジョンベースの配列決定プラットフォームを利用する配列決定のために、出発材料の有意な損失なく核酸のデジタル配列決定をすることが可能になる。このような調製方法によってまた、重亜硫酸塩処置の使用なしでＤＮＡメチル化の検出が可能になる。ＤＮＡメチル化検出の例示的な方法は、Ｆｌｕｓｂｅｒｇら、ＮａｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓ２０１０Ｊｕｎｅ：７（６）：４６１〜４６５（参照によって本明細書に援用される）に記載される。したがって、本発明のさらなる態様は、高効率の核酸ライブラリー調製のための方法、キットおよびシステムに関する。この核酸ライブラリーは、配列決定プラットフォームによる配列決定のために用いられ得る。この配列決定プラットフォームは、次世代の配列決定（ＮＧＳ）プラットフォームであってもよい。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、ＮＧＳ技術を用いて核酸ライブラリーを配列決定する工程を包含する。例示的なＮＧＳ技術および配列決定プラットフォームは本明細書に記載される。

一態様では、本発明は、生物学的供給源から単離された複数のテンプレート核酸から核酸ライブラリーを調製する方法を提供する。この複数のテンプレート核酸は、ゲノム材料を含んでもよい。このゲノム材料は、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＲＮＡ、またはＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡを含んでもよい。この核酸ライブラリーは、ＤＮＡライブラリー、ＲＮＡライブラリー、一本鎖ＤＮＡライブラリー、または二本鎖ＤＮＡライブラリーであってもよい。いくつかの実施形態では、この方法は、テンプレート核酸に対するアダプター配列のライゲーションを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、アダプターライゲーションの効率を１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、または１０００倍超改善する。本明細書に記載される方法は、例えば、アダプターライゲーション効率を、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の効率を超えて増大し得る。いくつかの実施形態では、この方法は、複数のテンプレート核酸のうち８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９７％超、９８％超、９９％超、９９．５％超、９９．９％超、または実質的に全てに対するアダプターの正確なライゲーションを生じる。このような高効率のライゲーション方法は、本明細書に記載のとおり、生物学的供給源から単離された所望の核酸（例えば、ｇＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡ）の実質的に全てに正確に相当する核酸ライブラリーの調製を可能にし得る。さらに、本明細書に記載の方法は、ライブラリー予備増幅の必要性を省き、予備増幅のバイアスの導入および予備増幅から生じる配列決定の誤差の導入を回避し得る。このような方法は、デジタル配列決定能力、例えば、生物学的供給源から単離された各々の個々のテンプレート核酸について配列読み取りのデジタル読み出しを提供する可能性の道を切り開き得、そしてまれな変異（例えば、まれな一塩基多型（ＳＮＰ）またはまれなコピー数改変体）の検出の感度を改善し得る。したがって、いくつかの態様では、本発明は、生物学的供給源から単離された複数の核酸を配列決定する方法を提供し、この方法は、複数の核酸のうち少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または実質的に全てに対して配列決定アダプターを連結し、それによって核酸ライブラリーを作成する工程と、ライブラリーの予備増幅なしで核酸ライブラリーを配列決定する工程とを包含する。

いくつかの実施形態では、この方法は、複数のテンプレート核酸のうち少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の第一の末端に対してアダプター配列を連結し、それによって核酸ライブラリーを作成する工程を包含する。アダプター配列は、配列決定プラットフォームに対するライブラリーメンバーのカップリングを達成する、規定のオリゴヌクレオチド配列を含んでもよい。単なる例であるが、アダプターは、固体支持体（例えば、配列決定フローセルまたはビーズ）に固定されたオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％相補性であるかまたは同一である配列を含んでもよい。アダプター配列は、配列決定プライマーに対して少なくとも７０％相補性であるかまたは同一である規定のオリゴヌクレオチド配列を含んでもよい。この配列決定プライマーは、ポリメラーゼによるヌクレオチド組み込みを可能にし得、ここでヌクレオチドの組み込みは、配列決定情報を提供するためにモニターされる。いくつかの実施形態では、アダプターは、固体支持体上に固定されたオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％相補的なまたは同一の配列と、配列決定プライマーに対して少なくとも７０％相補的なまたは同一の配列とを含む。いくつかの実施形態では、アダプターは、バーコード配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ライブラリー中の配列決定ライブラリーのメンバーのうち少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％が、同じアダプター配列を含む。いくつかの実施形態では、配列決定ライブラリーのメンバーのうち少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％が、アダプター配列を第一の末端では含むが、第二の末端では含まない。いくつかの実施形態では、この第一の末端は、５’末端である。いくつかの実施形態では、この第一の末端は、３’末端である。いくつかの実施形態では、配列決定ライブラリーのメンバーのうち少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％が、アダプター配列を第一のおよび第二の末端で含む。第一の末端におけるアダプター配列は、第二の末端におけるアダプター配列とは別個であってもよい。このアダプター配列は、配列決定のために用いられる配列決定プラットフォームに従ってユーザーによって選択され得る。いくつかの実施形態では、アダプターを核酸の第一の末端に連結する方法は、本明細書に記載の高効率のライゲーション方法を包含する。

いくつかの実施形態では、テンプレート核酸の第一の末端での第一のアダプターのライゲーションの後、テンプレート核酸の第二の末端での第二のアダプターのライゲーションを、本明細書に記載の任意の方法を用いて行う。単なる例であるが、合成プラットフォームによるＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定は、固体支持体を含み、その上に固定された表面結合オリゴヌクレオチドの第一および第二の集団を有する。このようなオリゴヌクレオチドは、第一および第二のＩｌｌｕｍｉｎａ特異的なアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして、伸長反応をプライミングするための配列を含む。したがって、いくつかの実施形態では、このライブラリーのメンバーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａシステムの表面結合オリゴヌクレオチドの第一の集団に対して部分的にまたは完全に相補的である第一のＩｌｌｕｍｉｎａ特異的なアダプターを含む。このライブラリーのメンバーはさらに、Ｉｌｌｕｍｉｎａシステムの表面結合オリゴヌクレオチドの第二の集団に対して部分的にまたは完全に相補的である第二のＩｌｌｕｍｉｎａ特異的なアダプターを含んでもよい。単なる例に過ぎないが、ＳＯＬｉＤシステム、およびＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ、ＧＳＦＬＥＸシステムは、固体支持体を、ビーズの形態で含み、その上に表面結合オリゴヌクレオチドが固定されている。したがって、いくつかの実施形態では、この核酸ライブラリーのメンバーは、ＳＯＬｉＤシステム、ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔシステム、またはＧＳＦＬＥＸシステムの表面結合オリゴヌクレオチドに相補的であるアダプター配列を含む。

複数のテンプレート核酸は、１２０ｎｔ長を超えるテンプレート核酸を含んでもよい。複数のテンプレート核酸は、＞１２０ｎｔ長を超える平均長を有してもよい。複数のテンプレート核酸は、５０〜１００、７５〜１２５、１２０〜１５０、１３０〜１７０、１５０〜２５０、２００〜５００、３００〜７００、５００〜１０００、８００〜２０００、１５００〜５０００、４０００〜１００００ｎｔ、または１００００ｎｔ超の平均長を有し得る。複数のテンプレート核酸はゲノムＤＮＡを含んでもよい。複数のテンプレート核酸は、一本鎖（ｓｓ）核酸フラグメント、例えば、ｓｓＤＮＡなどを含んでもよい。いくつかの実施形態では、この方法は、この複数のテンプレート核酸のうち少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．５％超の第一の末端に対するアダプター配列のライゲーションを生じ得る。

図１２は、核酸ライブラリーを調製するための例示的なワークフローを示す。第一の工程１２１０では、核酸は、生物学的供給源から得られる。この生物学的供給源は、被験体であってもよい。例示的な生物学的供給源および被験体は、本明細書に記載される。第二の工程１２２０では、アダプターが、本明細書に記載の任意の方法を用いて得られた核酸の９０％に連結される。第三の工程１２３０（任意）では、このライブラリーは、配列決定されてもよく、または本明細書に記載の任意の方法を用いて第二のアダプターに対してアダプター連結されてもよく、または標的選択性ライブラリー調製を受けてもよい。標的選択性のライブラリー調製は、当該分野で公知の任意の手段によってであってもよい。例示的な標的選択性ライブラリー調製方法は、例えば、米国特許第６，０６３，６０４号；同第６，０９０，５９１号；同第８，３４９，５６３号；米国特許出願公開第２００９０１０５０８号、同第２０１１０２４４４５５号、同第２０１２００３６５７号、同第２０１２０１５７３２２号、同第２０１３００４５８７２、およびＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１２１０３１５４（その全てが参照によって本明細書に援用される）に記載されている。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、本明細書に記載のような標的富化された核酸ライブラリーを調製するための方法に供される。

図１３Ａは、核酸ライブラリーを調製するための方法の例示的な実施形態を示しており、この方法は、核酸フラグメントの５’末端に対して第一のアダプターを連結する工程を包含する。第一の工程１３１０では、５’リン酸塩を含む複数のテンプレート核酸フラグメント（例えば、ＤＮＡフラグメント）を過剰量のリガーゼおよび過剰のＡＴＰを含む反応混合物中でインキュベートする。テンプレートＤＮＡフラグメントは、完全にまたは部分的に変性され得る。リガーゼは、テンプレート核酸フラグメントの５’リン酸塩へのＡＭＰの移行を触媒し（例えば、テンプレートＤＮＡフラグメントをアデニル化する）、この過程でＰＰｉを放出する。この反応は、テンプレート核酸フラグメントの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％のアデニル化を生じるのに十分な条件下でインキュベートされる。次の工程１３２０では、液体を、反応混合物に対して、ＡＴＰを少なくとも１０倍希釈するのに十分な量で添加する。その液体は、例えば、水、一価の塩、Ｍｇ^２＋、ＰＥＧなどの成分を含んでもよい。また、反応混合物に対しては、ドナー分子に対して連結されるアダプターオリゴヌクレオチド（例えば、アダプター１）およびＭｎ^２＋も添加される。アダプターオリゴヌクレオチドは、検出可能タグを含んでもよいし、含まなくてもよい。検出可能タグは、検出および／またはアフィニティー結合に用いられてもよい。アダプターオリゴヌクレオチドは、３’ＯＨ基を含んでもよい。ＡＴＰの希釈およびＭｎ^２＋の添加の両方とも、ライゲーション反応の終了を駆動し得、結果として５’−３’方向にアダプター１−テンプレート核酸を含むライゲーション生成物を生じる。このライゲーション生成物は、次に収集されて、必要に応じてさらに工程１３３０で、配列決定によって、３’末端への第二のアダプター配列のライゲーション（例えば、図１４Ａに記載）によって、続いて、配列決定によって、または本明細書に記載の標的選択性ライブラリー調製によって処理され得る。いくつかの実施形態では、このライブラリーは、本明細書に記載のような標的富化された核酸ライブラリーを調製する方法に供される。

図１３Ｂは、核酸ライブラリーを調製するための方法の別の例示的な実施形態を示し、これには、核酸フラグメントの３’末端に対して第一のアダプターを連結する工程を包含する。第一の工程１３５０では、５’リン酸塩を含む複数のオリゴヌクレオチドアダプター（例えば、アダプター）を、過剰量のリガーゼおよび過剰のＡＴＰを含む反応混合物中でインキュベートする。アダプターオリゴヌクレオチドは、完全に変性されても、または部分的に変性されてもよい。アダプターオリゴヌクレオチドは、検出可能タグを含んでも、または含まなくてもよい。この検出可能タグは、検出および／またはアフィニティー結合のために用いられ得る。このリガーゼは、アダプター１オリゴヌクレオチドの５’リン酸塩へのＡＭＰの移行を触媒し（例えば、アダプター１をアデニル化する）、このプロセスでＰＰｉを放出する。この反応を、アダプターの少なくとも９０％のアデニル化を生じるのに十分な条件下でインキュベートする。次の工程１３６０では、液体を反応混合物に対して、ＡＴＰを少なくとも１０倍希釈するのに十分な量で添加する。その液体は、例えば、水、一価の塩、Ｍｇ^２＋、ＰＥＧなどの成分を含んでもよい。また、反応混合物に対しては、テンプレート核酸のサンプル（例えば、テンプレート）およびＭｎ^２＋も添加される。テンプレート核酸は、３’ＯＨ基を含んでもよい。ＡＴＰの希釈およびＭｎ^２＋の添加の両方とも、ライゲーション反応の終了を駆動し得、結果として５’−３’方向にテンプレート−ＤＮＡ−アダプターを含むライゲーション生成物を生じる。このライゲーション生成物は、次に収集されて、必要に応じてさらに、配列決定によって、３’末端への第二のアダプター配列のライゲーションによって、続いて、配列決定によって、または本明細書に記載の標的選択性ライブラリー調製によって処理され得る。ＡＴＰの希釈およびＭｎ^２＋の添加の両方とも、ライゲーション反応の終了を駆動し得、結果として５’−３’方向に、テンプレート核酸−アダプターを含むライゲーション生成物を生じる。このライゲーション生成物は、次に収集されて、必要に応じてさらに、工程１３７０において、配列決定によって、図１４Ｂに記載の５’末端への第二のアダプター配列のライゲーションによって、続いて、配列決定によって、または本明細書に記載の標的選択性ライブラリー調製によって処理され得る。いくつかの実施形態では、このライブラリーは、本明細書に記載のような標的富化核酸ライブラリーを調製するための方法に供される。

図１４Ａは、図１３Ａに記載されるように調製されたアダプター１−テンプレート核酸分子に対して第二のアダプター配列を連結するための方法の例示的な実施形態を示す。第一の工程１４１０では、５’リン酸塩を含む第二のアダプター配列（「アダプター２」）を含む複数のオリゴヌクレオチドは、過剰量のリガーゼおよび過剰のＡＴＰを含む反応混合物中でインキュベートされる。このオリゴヌクレオチドは、完全に変性されても、または部分的に変性されてもよい。リガーゼは、オリゴヌクレオチドの５’リン酸塩へのＡＭＰの移行を触媒し（例えば、アダプター２オリゴヌクレオチドをアデニル化し）、このプロセスでＰＰｉを放出する。この反応物を、アダプター２オリゴヌクレオチドのうち少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％のアデニル化を生じるのに十分な条件下でインキュベートする。次の工程１４２０では、液体を反応混合物に対して、ＡＴＰを少なくとも１０倍希釈するのに十分な量で添加する。その液体は、例えば、水、一価の塩、Ｍｇ^２＋、ＰＥＧなどの成分を含んでもよい。また、反応混合物に対しては、アダプター−１テンプレート核酸分子（例えば、図４Ａに記載）およびＭｎ^２＋も添加される。アダプター１−テンプレート核酸分子は、３’ＯＨ基を含んでもよい。ＡＴＰの希釈およびＭｎ^２＋の添加の両方とも、ライゲーション反応の終了を駆動し得、結果としてアダプター１−テンプレート核酸−アダプター２ライブラリーのメンバーを含むライゲーション生成物を生じる。このライゲーション生成物は、必要に応じて配列決定され得る。

図１４Ｂは、図１３Ｂに記載されるように調製した、テンプレート核酸−アダプター１分子に対して、第二のアダプター配列を連結するための方法の例示的な実施形態を示す。第一の工程１４５０では、５’リン酸塩を含むテンプレート−アダプター１分子を、過剰量のリガーゼおよび過剰のＡＴＰを含む反応混合物中でインキュベートする。テンプレート−アダプター１分子は完全に変性されても、または部分的に変性されてもよい。リガーゼは、テンプレート−アダプター１分子の５’リン酸塩へのＡＭＰの移行を触媒し（例えば、テンプレート−アダプター１分子をアデニル化し）、このプロセスでＰＰｉを放出する。この反応を、テンプレート−アダプター１分子のうち少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％のアデニル化を生じるのに十分な条件下でインキュベートする。次の工程１４６０では、液体を反応混合物に対して、ＡＴＰを少なくとも１０倍希釈するのに十分な量で添加する。その液体は、例えば、水、一価の塩、Ｍｇ^２＋、ＰＥＧなどの成分を含んでもよい。また、反応混合物に対しては、第二のアダプター配列およびＭｎ^２＋を含むアダプター２オリゴヌクレオチドも添加される。アダプター２オリゴヌクレオチドは、３’ＯＨ基を含んでもよい。ＡＴＰの希釈およびＭｎ^２＋の添加の両方とも、ライゲーション反応の終了を駆動し得、結果としてアダプター２−テンプレート−アダプター１ライブラリーのメンバーを含むライゲーション生成物を生じる。このライブラリーのメンバーはまた、本明細書に記載のような方法を用いてアダプター１−テンプレート−アダプター２として構築され得る。このライゲーション生成物は、必要に応じて配列決定され得る。

（標的富化されたライブラリー調製）
別の態様では、本発明は、標的富化されたＤＮＡライブラリーを調製するための方法を提供する。この方法は、配列決定ライブラリーのメンバーに対して標的選択性オリゴヌクレオチドをハイブリダイズして、ハイブリダイゼーション生成物を生成する工程を包含し得る。この方法はさらに、初回の増幅においてハイブリダイゼーション生成物を増幅して、伸長鎖を作成する工程を包含し得る。

標的富化の方法は、参照によって本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１２０１５７３２２に記載されるものであってもよい。

ハイブリダイゼーションおよび増幅は、反応混合物中で生じ得る。この混合物は、ヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、ポリメラーゼおよび標的選択性オリゴヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、この混合物は、複数の標的選択性オリゴヌクレオチドを含む。この混合物は、例えば、１〜１０、５〜２０、１０〜５０、４０〜１００、８０〜２００、１５０〜５００、３００〜１０００、８００〜２０００、１０００〜５０００、４０００〜１００００、８０００〜２００００個、または２００００個超の標的選択性オリゴヌクレオチドを含み得る。この混合物はさらに、Ｔｒｉｓ緩衝液，一価の塩、およびＭｇ^２＋を含んでもよい。各々の成分の濃度は、当業者によって最適化され得る。反応混合物はまた、限定するものではないが、非特異的なバックグラウンド／ブロッキング核酸（例えば、サケ精子ＤＮＡ）、バイオ防腐剤（例えば、アジ化ナトリウム）、ＰＣＲ増強剤（例えば、ベタイン、トレハロースなど）、およびインヒビター（例えば、ＲＮＡｓｅ阻害剤）を含む添加物を含んでもよい。いくつかの実施形態では、核酸サンプル（例えば、ライブラリーメンバーを含むサンプル）を反応混合物と混合する。

ライブラリーメンバーは、完全に変性されても、または部分的に変性されてもよい。ライブラリーメンバーは、第一の末端には位置するが、第二の末端には位置しない第一の一本鎖アダプター配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、この第一の末端は、５’末端である。いくつかの実施形態では、５’末端で第一のアダプター配列を含むライブラリーメンバーは、図１３Ａに記載のとおり調製される。他の実施形態では、第一のアダプター配列を含むライブラリーメンバーは、図１３Ｂに記載される核酸（例えば、ｇＤＮＡフラグメント）の３’末端に対して逆相補的なアダプター配列を連結することによって、続いて完全なアダプター配列を含んでおり、逆相補体に対してハイブリダイズ可能なプライマーを用いて得られたライゲーション生成物の線形の増幅によって、記載のとおり調製される。いくつかの実施形態では、標的選択性オリゴヌクレオチドは、第一の末端に位置するが、第二の末端には位置しない第二の一本鎖アダプター配列を含む。標的選択性オリゴヌクレオチドの第一の末端は、５’末端であってもよい。いくつかの実施形態では、この第一のアダプター配列は、第一の表面結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも７０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、この第一のアダプター配列は、配列決定プライマーに対して少なくとも７０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、この第一のアダプターはさらに、バーコード配列を含む。いくつかの実施形態では、この第二のアダプターは、第二の表面結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも７０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、この第二のアダプターは、配列決定プライマーに対して少なくとも７０％同一である配列を含む。

標的選択性オリゴヌクレオチドは、目的の標的ポリヌクレオチドに対して少なくとも部分的にハイブリダイズするように設計され得る。いくつかの実施形態では、標的選択性オリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドに対して選択的にハイブリダイズするように設計される。標的選択性オリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド中の配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５％超相補的であり得る。いくつかの実施形態では、標的選択性オリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド中の配列に対して１００％相補的である。このハイブリダイゼーションは、あるＴｍを有する標的選択性オリゴヌクレオチド／標的二重鎖を生じ得る。標的選択性オリゴヌクレオチド／標的二重鎖のＴｍは、０〜１００℃、２０〜９０℃、４０〜８０℃、５０〜７０℃、または５５〜６５℃であってもよい。標的選択性オリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼの存在下で伸長生成物の合成をプライムするために十分に長くてもよい。標的選択性オリゴヌクレオチドの正確な長さおよび組成物は、多くの要因、例としては、アニーリング反応の温度、供給源、およびプライマーの組成、ならびにプライマー：プローブ濃度の比に依存し得る。標的選択性オリゴヌクレオチドは、例えば、８〜５０、１０〜４０、または１２〜２４ヌクレオチド長であり得る。

この方法は、反応混合物中の標的の伸長を包含し得る。この伸長は、標的選択性オリゴヌクレオチド／標的二重鎖中で標的選択性オリゴヌクレオチドによってプライミングされ得る。いくつかの実施形態では、伸長は、核酸ポリメラーゼを利用して行われる。この核酸ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼであってもよい。特定の実施形態では、このＤＮＡポリメラーゼは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである。このポリメラーゼは、ＢファミリーのＤＮＡ校正ポリメラーゼのメンバー（Ｖｅｎｔ、Ｐｆｕ、Ｐｈｕｓｉｏｎ、およびそれらの改変体）、ＤＮＡポリメラーゼホロ酵素（ＤＮＡｐｏｌＩＩＩホロ酵素）、Ｔａｑポリメラーゼ、またはそれらの組み合わせであってもよい。

伸長は、テンプレートＤＮＡを含む反応混合物が、変性工程、アニーリング工程、および合成工程を通じてサイクルされる自動化された過程として行われ得る。この自動化された過程は、ＰＣＲサーマルサイクラーを用いて行われてもよい。市販のサーマルサイクラーシステムとしては、とりわけ、Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒのシステムが挙げられる。いくつかの実施形態では、増幅の１つのサイクルを行う。

標的選択性オリゴヌクレオチド／標的二重鎖の伸長は、（１）標的配列を含む元のｓｓＤＮＡフラグメント、ならびに（２）第二のアダプター配列、標的選択性オリゴヌクレオチド、標的配列の逆相補体、および第一のアダプター配列の逆相補体を含む伸長した鎖、を含む二本鎖伸長生成物を生じ得る。元のｓｓＤＮＡフラグメントの第一のアダプター配列が、第一の表面結合オリゴヌクレオチドに対して７０％以上同一であるならば、その伸長した鎖は、第一の表面結合オリゴヌクレオチドに対して７０％以上相補性である第一のアダプター配列を含み、それによって、第一の表面結合オリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズし得る。この伸長した鎖は、標的富化されたライブラリーを含んでもよく、ここでは各々のライブラリーメンバーは、第一の末端において第一のアダプターを、および第二の末端において第二のアダプターを含む。

標的富化されたライブラリーは配列決定され得る。この標的富化されたライブラリーのメンバーは変性されてもよい。この変性されたライブラリーのメンバーは、その上に固定された表面と、少なくとも第一の表面結合オリゴヌクレオチドで接触され得る。いくつかの実施形態では、この伸長した鎖は、伸長した鎖の上の第一のアダプター配列に対してアニーリングし得る、第一の表面結合オリゴヌクレオチドによって捕獲される。

この第一の表面結合オリゴヌクレオチドは、捕獲された伸長した鎖の伸長をプライムし得る。いくつかの実施形態では、捕獲された伸長した鎖の伸長は、捕獲された伸長生成物を生じる。この捕獲された伸長生成物は、第一の表面結合オリゴヌクレオチド、標的配列、および第二の表面結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも７０％以上相補的な第二のアダプター配列を含んでもよい。

いくつかの実施形態では、捕獲された伸長生成物は、第二の表面結合オリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、架橋を形成する。いくつかの実施形態では、この架橋は、ブリッジＰＣＲによって増幅される。ブリッジＰＣＲ法は、当該分野で公知の方法を用いて行われてもよい。当業者は、本明細書に記載される方法が、ビーズ上での増幅のような任意の固相増幅法に適合され得ることを理解する。

アレイ・ハイブリダイゼーション・アプリケーション
本明細書に記載される高効率ライゲーション方法およびキットはまた、アレイハイブリダイゼーション（例えば、核酸マイクロアレイ）のための核酸サンプルの調製のために用いられ得る。核酸マイクロアレイ技術は、一般的には、固体または半固体の表面上に固定されたオリゴヌクレオチドプローブのアレイに対する核酸のハイブリダイゼーションに依拠する技術を指す。サンプルから単離された核酸（例えば、ＤＮＡ）は、一般的には、検出可能標識で標識することによって調製される。この標識された核酸は次に、固体表面のアドレス可能な位置に固定された公知の配列の複数のオリゴヌクレオチド（例えば、プローブ）を含むアレイに適用され得る。このオリゴヌクレオチドプローブは、複数の目的の標的領域にハイブリダイズされ得る。いくつかの実施形態では、このオリゴヌクレオチドプローブは、１つ以上のアダプター配列にハイブリダイズされ得る。特定のアドレス可能な位置での検出可能シグナルの量は、サンプル中の標的領域を含む核酸の量を示し得る。例示的なマイクロアレイシステムとしては、例えば、ビーズアレイシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ、ＬｙｎｘＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｌｕｍｉｎｅｘ，Ｉｎｃ．，Ｅｘｉｑｏｎ，Ｍｙｃｒｏａｒｒａｙ），ＳＮＰアレイ（例えば、ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ，Ｅｘｉｑｏｎ，Ｍｙｃｒｏａｒｒａｙから入手可能）、および比較ゲノムハイブリダイゼーションアレイ（例えば、ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．，ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｘｉｑｏｎ，Ｍｙｃｒｏａｒｒａｙから入手可能）が挙げられる。ビーズアレイシステム（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，ＬｙｎｘＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｌｕｍｉｎｅｘ，Ｉｎｃ．から入手可能）とは一般的には、オリゴヌクレオチドプローブの複数のコピーで浸漬された微小球ビーズを含むアレイシステムを指す。ビーズは、マイクロウェルへの沈着によって、またはフルオロフォアの固有の組み合わせを有するバーコード化のいずれかによって、アドレス可能である場合があり、これは、例えば、フローサイトメトリーを含む、当該分野で公知の任意の手段によって分類され、かつ特定され得る。例示的なビーズ・アレイ・システムおよび方法は、参照によって本明細書に援用される、米国特許第８，３９９，１９２号および同第８，１９８，０２８号に記載される。ＳＮＰアレイは一般的には、ＳＮＰ対立遺伝子を検出するために構成されるアレイおよびシステムを指す。例示的なＳＮＰアレイは、その全てが参照によって本明細書に援用される、例えば、米国特許第６，４１０，２３１号；同第６，８５８，３９４号；米国特許出願公開第２００９００６２１３８号、および欧州特許出願番号ＥＰ１２０７２０９に記載されている。比較のゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）は一般的には、分節のゲノムコピー数変動（ＣＮＶ）の高解像度ゲノムワイドスクリーニングを可能にするアレイおよびシステムを指す。ＣＧＨプラットフォームは、異数性、微小欠損／微小重複症候群、および染色体再配置を検出し得る。例示的なＣＧＨアレイおよびアレイ方法は、例えば、参照によって本明細書に援用される、米国特許第６，４１０，２４３号に記載される。

アレイハイブリダイゼーションのための核酸サンプル（例えば、ｇＤＮＡサンプル）のライブラリー調製は一般に、検出可能標識を用いて個々の核酸フラグメントを標識する工程を包含する。この標識方法は伝統的に、核酸フラグメントに対するランダムプライマーのハイブリダイゼーション、続いて、ポリメラーゼによるランダムプライマーの伸長を包含する。この伸長反応は、標識されたヌクレオチドを伸長生成物に組み込む。このポリメラーゼによる伸長による標識の方法は、得られたライブラリーへ標識のバイアスを導入し得る。

本明細書に記載の高効率のライゲーション方法は、ランダム・プライマー・ハイブリダイゼーションおよび伸長の必要性を省くことによってアレイハイブリダイゼーションのための伝統的なライブラリー調製方法の限界を克服し得る。したがって、いくつかの態様では、本発明は、アレイハイブリダイゼーションのために核酸ライブラリーを調製するための方法およびキットを提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、本明細書に記載の任意の方法を利用して、サンプル中に存在する核酸のうち少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％に対して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の標識されたオリゴヌクレオチドを連結する工程を包含する（例えば、図１０を参照のこと）。この標識されたオリゴヌクレオチドは、検出可能標識または捕獲部分を含んでもよい。例示的な検出可能標識および捕獲部分は本明細書に記載される。

バーコード化の適用
分子バーコード化は、個々の核酸分子、核酸分子のサブクラス、または核酸のサンプルの追跡、同定および／または検索に有用である。分子バーコード化は一般には、オリゴヌクレオチド配列で核酸分子をタグ付けする工程を包含する。このオリゴヌクレオチド配列は、ユーザーによって望まれる場合、サンプル間で、サブクラス間で、または個々の核酸の間で、固有であり得る。例示的なバーコードが本明細書に記載される。

一態様では、高効率ライゲーション方法を用いて、複数の核酸分子をバーコード化してもよい。いくつかの実施形態では、この方法は、本明細書に記載の任意の方法を用いて、核酸分子に対してバーコード配列を連結する工程を包含する。本明細書に記載の方法は、バーコード化されるサンプル中の核酸分子の８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９７％超、９８％超、９９％超、９９．５％超、９９．９％超、または実質的に全てが、バーコード配列に連結されることを保証し得る。いくつかの実施形態では、複数の核酸サンプルの各々が、サンプルに対して固有の単一のバーコード配列に対するライゲーションによってバーコード化される。このようなバーコード化によって、サンプル起源がアッセイ中で同定されることが可能になる。他の実施形態では、複数の核酸が、サンプル中の各々の個々の核酸が固有のバーコード配列に連結されるようにバーコード化される。このようなバーコード化によって、サンプル中の個々の核酸の追跡および同定が可能になる。いずれかの方法では、サンプル中の核酸は、本明細書に記載のような反応混合物中でアデニル化され、続いて本明細書に記載のようにバーコード配列に対してライゲーションされる。

クローニングの適用
分子クローニングは、ベクター、例えば、プラスミドベクター中へのインサートＤＮＡ配列のライゲーションを包含する場合が多い。一般には、インサートＤＮＡおよびベクターは、制限消化によって調製され、ここでは制限酵素がインサートＤＮＡまたはベクター内のパリンドローム配列を認識し、かつそれを消化し得、互換性の粘着末端（ｓｔｉｃｋｙｅｎｄｓ）を生成する。次いで、消化されたインサートおよびベクターを、ライゲーション反応で一緒にインキュベートし、これはインサートへのベクターの互換性の粘着末端をアニーリングするという目的であって、ベクターおよびインサートを含む所望の生成物を生成する。しかし、パリンドロームの粘着末端のせいで、疑似ライゲーション生成物も、ライゲーション過程の間に作成され、これには、例えば、インサート−インサートライゲーションおよびベクター／ベクターのライゲーションを含む。これによって、ライゲーション反応の有効性および特異性が低下する。結果として、ユーザーは、多数の形質転換された細菌のコロニーを選択し、次いでそれらをスクリーニングして（例えば、制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）によって）、所望のライゲーション生成物を選択するのにかなりの量の時間および労力を費やさなければならない場合が多い。

本明細書に記載の高効率のライゲーション方法を用いて、クローニング反応の特異性を改善してもよい。例示的な実施形態は、図１５に示す。ベクターは、任意の手段によって、例えば、単一部位での制限消化によって直線化されてもよい。直線化されたベクターの末端は、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ）によってブラントエンド（平滑末端）化されてもよい。直線化されたベクターの５’末端は、例えば、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによってリン酸化されてもよい。この直線化されたベクターは、完全に変性されても、または部分的に変性されてもよく、少なくとも一本鎖の（例えば、フレイド（ｆｒａｙｅｄ））末端、または一本鎖の直鎖ＤＮＡを生じる。本明細書に記載の任意の方法を用いる高効率のライゲーションを行って、完全にまたは部分的に変性されたベクターの３’末端上に非パリンドロームの短いｓｓＤＮＡ配列（「ｓｓＤＮＡ」）を連結してもよい。インサートＤＮＡフラグメントはまた、ブラントエンドであって、上記のように５’リン酸化されてもよい。このインサートＤＮＡフラグメントは、完全に変性されても、または部分的に変性されてもよい。本明細書に記載の任意の方法を用いる高効率のライゲーションを行って、完全にまたは部分的に変性されたインサートの３’末端に、非パリンドロームの短いｓｓＤＮＡ配列（「ｓｓＤＮＡｒｅｖ」）を挿入する。改変されたベクターおよびインサートを次に、標準的なライゲーションプロトコールを用いて連結してもよい。ｓｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡｒｅｖは、非パリンドロームの配列であるので、疑似ベクター／ベクターまたはインサート／インサート生成物の形成は生じず、任意のライゲーションが単一のベクターと単一のインサートとの間にある。あるいは、非パリンドロームの短いｓｓＤＮＡ配列が、ベクターまたはインサートの５’末端上に連結され得る。このような特異性は、ＲＦＬＰ技術によってコロニーをスクリーニングする必要性を省き、分子クローニングのワークフローを大きく向上し得る。

診断／治療の適用
本明細書に記載される、高効率ライゲーションの方法およびキットは、多くの診断／治療の適用に一般的な有用性を有する。例えば、本発明の高効率のライゲーション方法は、核酸の配列分析のために一般的に有用であり、これは、疾患の診断、モニタリングおよび処置にますます重要な役割を果たしてきている。例えば、本発明の方法は、例えば、疾患を発症する確率の増大した被験体の同定において、疾患の診断のために、疾患診断の正確性を改善するために、疾患の進行をモニタリングするために、被験体の疾患についての治療レジメンの選択を補助するために、被験体の疾患予後予測を評価するために、利用され得る。

本発明の方法から利点を得る場合がある診断的／治療的な適用または疾患の種類は限定されないことが理解される。単なる例であるが、癌をモニタリングするためのワークフローに対する本発明の方法の適用は本明細書に記載される。

したがって、本発明は、疾患に罹患している被験体のモニタリングおよび処置を改善する方法およびキットを提供する。この疾患は、癌、例えば、腫瘍、白血病、例えば急性白血病、急性Ｔ細胞白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄球性（顆粒球）白血病、または慢性リンパ球性白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、例えば、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫または非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、固形腫瘍、肉腫、癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、リンパ管肉腫、内皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛腫、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮性腫瘍、神経膠腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、子宮内膜癌、または非小細胞肺癌などであってもよい。

被験体は、固形腫瘍を保有すると疑われる場合もあるし、もしくは固形腫瘍を保有することが公知である場合もあり、または以前に固形腫瘍を保有していた被験体であってもよい。

この方法は、被験体から単離された腫瘍サンプルから癌関連遺伝子のセットを配列決定する工程、および必要に応じて被験体から単離された正常細胞から癌関連遺伝子のセットを配列決定する工程を包含し得る。腫瘍サンプルは、固形腫瘍サンプルであってもよい。正常細胞は、例えば、被験体由来の血液サンプルから単離された血球であってもよい。

一般には、被験体から単離された核酸のライブラリーが配列決定される。標準的な配列決定プロトコールは、所望の読み取り深さを達成するために核酸ライブラリーの予備増幅を含む場合が多い。しかし、予備増幅は、個々の核酸ライブラリーメンバーの増幅有効性の変動に起因して増幅のバイアスを導入する場合があり、これによって、いくつかのゲノム領域の過剰提示、および他のゲノム領域（例えば、高ＧＣ含量または低ＧＣ含量の領域）の過小提示が生じ得る。予備増幅はまた、ＰＣＲに用いられるポリメラーゼの内因性の誤差率に起因して配列決定の誤差を導入し得る。したがって、本発明は、いくつかの態様では、ライブラリーの予備増幅なしで生物学的供給源から単離された核酸のライブラリーを配列決定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、このライブラリーは、シーケンサーに対するロードの前には予備増幅されない。

配列決定の際、腫瘍由来の配列データを、正常な細胞由来の配列データと比較して、腫瘍特異的配列プロフィールを生成してもよい。いくつかの実施形態では、腫瘍特異的な配列プロファイルは、セット中に１つ以上の遺伝子の変異状態を含む。この変異状態は、ＳＮＰまたはＣＮＶ同定を包含し得る。この方法はさらに、腫瘍特異的配列プロフィールを記載するレポートを作成する工程を包含し得る。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、さらなるモニタリングのための腫瘍特異的変異を保有することが公知の２〜４遺伝子のサブセットを選択する工程を包含する。他の実施形態では、この方法は、さらなるモニタリングのために、腫瘍特異的変異を保有することが公知の４〜１５、１０〜３０、２０〜５０、４０〜８０、７０〜１２５、１００〜２００、または２００超の遺伝子のサブセットを選択する工程を包含する。いくつかの実施形態では、この方法は、さらなるモニタリングのために癌関連遺伝子のセットの全体を選択する工程を包含する。他の実施形態では、この方法は、さらなるモニタリングの目的のための全ゲノム配列決定の使用を包含する
（アンプリコンの感度のよい検出）
本発明は、標的ポリヌクレオチド中の変異の鋭敏、正確な検出および／または定量のための試薬、方法およびキットを提供する。例えば、本発明は、ＰＣＲ反応の有効性に対するプローブの影響を実質的に省く、プローブベースのＰＣＲアッセイのための試薬、方法およびキットを提供する。本発明は、ＰＣＲ反応の動態に対するプローブの影響を実質的に省く、プローブベースのＰＣＲアッセイのための試薬、方法およびキットを提供する。このような試薬、方法、およびキットは、従来のプローブベースのアッセイと比較して検出の正確性および感度を改善し得、したがって、生命科学において、遺伝子型決定アプローチにおいて、および診断的／治療的アプローチにおいて、広範な適用性を有し得る。

本発明の態様は、プローブベースのＰＣＲアッセイに関し、ここではプローブは、ＰＣＲの間、プライマーアニーリングにもプライマー伸長にも影響しない。理論で拘束されることは望まないが、ＰＣＲの間のテンプレート核酸に対するプローブのハイブリダイゼーションは、プライマー伸長の動態を変更し得、したがってＰＣＲ反応の有効性を変更し得る。さらに、アニーリングされたプライマーの下流のテンプレート核酸に対するプローブの結合は、ポリメラーゼによるプライマーの伸長に影響し得る。なぜならアニーリングされたプローブを提示するには、十分なエンドヌクレアーゼ活性が必要であり得るからである。したがって、ＰＣＲアニーリングおよび／または伸長段階の間、プローブハイブリダイゼーションを省くために設計されたプローブが本明細書に記載される。このようなプローブは、ＰＣＲ増幅の有効性を増大し得る。このようなプローブは、ＰＣＲアニーリングおよび／または伸長段階の間、プローブ結合に関連する伸長バイアスを最小化し得る。

本明細書に記載されるようなアンプリコンの感度のよい検出のためのプローブは、変異の極めて正確かつ感度のよい検出を提供し得る。この変異は、一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入、欠失、転座、および／またはコピー数変動であってもよい。本発明のプローブは、異種サンプル中のまれな変異を検出し得る。アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブは、サンプルのうち５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００５％、０．００１％、０．０００５％、０．０００１％、０．００００５％、０．００００１％、０．０００００５％、０．０００００１％、０．００００００５％、０．００００００１％未満という頻度である、サンプル中のまれな変異を検出し得る。例えば、アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブは、サンプルのうち５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００５％、０．００１％、０．０００５％、０．０００１％、０．００００５％、０．００００１％、０．０００００５％、０．０００００１％、０．００００００５％、０．００００００１％未満という頻度であるサンプル中のまれなＳＮＰを検出し得る。例えば、アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブは、サンプルのうち５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００５％、０．００１％、０．０００５％、０．０００１％、０．００００５％、０．００００１％、０．０００００５％、０．０００００１％、０．００００００５％、０．００００００１％未満という頻度である、サンプル中のまれな挿入変異を検出し得る。例えば、アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブは、サンプル中の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００５％、０．００１％、０．０００５％、０．０００１％、０．００００５％、０．００００１％、０．０００００５％、０．０００００１％、０．００００００５％、０．００００００１％未満という頻度を有する、サンプル中のまれな欠失変異を検出し得る。例えば、アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブは、サンプルのうち５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００５％、０．００１％、０．０００５％、０．０００１％、０．００００５％、０．００００１％、０．０００００５％、０．０００００１％、０．００００００５％、０．００００００１％未満という頻度の、サンプル中のまれな逆位変異を検出し得る。例えば、アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブは、サンプル中の遺伝子のまれなコピー数変動であって、１．０１倍程度の低いコピー数の倍数変化を含むまれなコピー数変動を検出し得る。

また、本明細書には、サンプルのうち５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００５％、０．００１％、０．０００５％、０．０００１％、０．００００５％、０．００００１％、０．０００００５％、０．０００００１％、０．００００００５％、０．００００００１％未満の頻度を有する、サンプル中のまれな変異の検出のための方法も提供される。例えば、本発明の方法は、サンプルのうち５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００５％、０．００１％、０．０００５％、０．０００１％、０．００００５％、０．００００１％、０．０００００５％、０．０００００１％、０．００００００５％、０．００００００１％未満の頻度を有する、サンプル中のまれなＳＮＰを検出し得る。例えば、本発明の方法は、サンプルのうち５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００５％、０．００１％、０．０００５％、０．０００１％、０．００００５％、０．００００１％、０．０００００５％、０．０００００１％、０．００００００５％、０．００００００１％未満の頻度を有する、サンプル中のまれな挿入変異を検出し得る。例えば、本発明の方法は、サンプルのうち５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００５％、０．００１％、０．０００５％、０．０００１％、０．００００５％、０．００００１％、０．０００００５％、０．０００００１％、０．００００００５％、０．００００００１％未満の頻度を有しているサンプル中のまれな欠失変異を検出し得る。例えば、本発明の方法は、サンプルのうち５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００５％、０．００１％、０．０００５％、０．０００１％、０．００００５％、０．００００１％、０．０００００５％、０．０００００１％、０．００００００５％、０．００００００１％未満の頻度を有する、サンプル中のまれな逆位変異を検出し得る。例えば、本発明の方法は、サンプル中の遺伝子のまれなコピー数変動であって、１．０１倍程度の低いコピー数の倍数変化を含むまれなコピー数変動を検出し得る。

（アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブ）
本発明は、プローブベースのハイブリダイゼーションアッセイのためのプローブを提供する。このプローブベースのハイブリダイゼーションアッセイは、プローブベースのＰＣＲアッセイであってもよい、しかし任意のプローブベースのハイブリダイゼーションアッセイが考慮される。いくつかの実施形態では、プローブは、ＰＣＲ増幅反応の動態および／または有効性に対して最小限からゼロの影響を有するように設計する。ＰＣＲ増幅反応の動態および／または有効性に対するプローブの影響は、ＰＣＲ反応のアニーリングおよび／または伸長段階の間、プローブが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする能力、またはハイブリダイズしない能力に関連し得る。ＰＣＲ増幅反応の動態および／または有効性に対するプローブの影響は、ＰＣＲ温度サイクリングの間、プローブが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする能力またはハイブリダイズしない能力に関連し得る。例えば、アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブは、ＰＣＲ増幅反応のアニーリングおよび／または伸長段階の間、テンプレート核酸に対して感知できるほどハイブリダイズしないことによって、ＰＣＲ増幅反応の動態および／または有効性に対して最小またはゼロの影響を有し得る。

ＰＣＲ反応のアニーリングおよび／または伸長段階の間、プローブが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする能力、またはハイブリダイズしない能力は、そのプローブの融点（Ｔｍ）に関連し得る。アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブは、ＰＣＲプローブベースのアッセイで用いられるＰＣＲプライマーのＴｍよりも高くない融点（Ｔｍ）を有し得る。アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブは、プローブベースのＰＣＲアッセイでの使用のためのＰＣＲプライマーの平均Ｔｍよりも少なくとも５〜１０℃高くない融点（Ｔｍ）を有し得る。

一般的には、ＰＣＲアニーリング温度よりも低いＴｍを有するプローブは、ＰＣＲアニーリング段階の間、低下したプローブハイブリダイゼーションを示すことが期待される。アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブは、ＰＣＲアニーリング段階の温度よりも高くない融点（Ｔｍ）を有し得る。アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブは、ＰＣＲアニーリング段階の温度よりも低い融点（Ｔｍ）を有し得る。ＰＣＲアニーリング温度よりも少なくとも５度低いＴｍを有するプローブは、ＰＣＲアニーリング段階の間、有意に低下したハイブリダイゼーションを呈することが予測され得る。したがって、アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブのＴｍは、ＰＣＲアニーリング段階の温度よりも少なくとも５℃低くても、少なくとも１０℃低くても、少なくとも１５℃低くても、少なくとも２０℃低くても、または２０℃超低くてもよい。アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブは、低Ｔｍプローブであってもよい。低ＴｍプローブのＴｍは、ＰＣＲ温度サイクリングのラウンドのアニーリング温度よりも少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０℃、または４０℃超低くてもよい。低ＴｍプローブのＴｍは、ＰＣＲ温度サイクリングのラウンドのアニーリング温度よりも約５〜１０℃低くても、約１０〜１５℃低くても、約１５〜２０℃低くても、約２０〜２５℃低くても、約２５〜３０℃低くてもよい。いくつかの場合には、低Ｔｍプローブは、５５℃超、６０℃超、６５℃超、または７０℃超の周囲温度で相補的なテンプレート核酸にハイブリダイズしない。

低Ｔｍプローブは、５５℃未満、５４℃未満、５３℃未満、５２℃未満、５１℃未満、５０℃、４９℃未満、４８℃未満、４７℃未満、４６℃未満、４４℃未満、４３℃未満、４２℃未満、４１℃未満、４０℃未満、３９℃未満、３８℃未満、３７℃未満、３６℃未満、３５℃未満、３４℃未満、３３℃未満、３２℃未満、３１℃未満、または３０℃未満のＴｍを有してもよい。

低Ｔｍプローブは、ほぼ室温でテンプレート核酸に対して容易にハイブリダイズするように設計され得る。このようなプローブの設計は、プローブの適切な検出を可能にするようにその標的ポリヌクレオチドに対するプローブの十分なハイブリダイゼーションを可能にし得る。一般には、プローブは、プローブ／テンプレート二重鎖のＴｍが室温より高い場合に、ほぼ室温でテンプレート核酸に対して容易にハイブリダイズし得る。したがって、低Ｔｍプローブは、室温（例えば、２５℃の室温）よりも５℃高い、１０℃高い、１５℃高い、または２０℃高い、または２０℃超高いＴｍを有するように設計され得る。このようなＴｍは、室温でテンプレート核酸に対するプローブハイブリダイゼーションの少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または約１００％を保証し得る。いくつかの実施形態では、低Ｔｍプローブは、２５℃超、２６℃超、２７℃超、２８℃超、２９℃超、３０℃超、３１℃超、３２℃超、３３℃超、３４℃超、３５℃超、３６℃超、３７℃超、３８℃超、３９℃超、４０℃超、４１℃超、４２℃超、４３℃超、４４℃超、または４５℃超であるＴｍを有する。

いくつかの実施形態では、低Ｔｍプローブは、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、または約５０℃であるＴｍを有する。この低Ｔｍプローブは、３０〜３５℃、３３〜４０℃、３６〜４５℃、または４０〜５０℃であるＴｍを有し得る。この低Ｔｍプローブは、３０〜４５℃であるＴｍを有し得る。

アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブは、検出可能部分およびクエンチャー部分を含んでもよい。検出可能部分は、化学発光、放射活性、金属イオン、化学リガンド、蛍光、もしくは比色定量部分であってもよいし、または酵素学的な基であってもよく、これは、適切な基質とのインキュベーションの際に、化学発光、蛍光、放射活性、電気または比色定量のシグナルを提供する。いくつかの場合には、検出可能部分は色素である。色素は、蛍光色素、例えば、フルオロフォアであってもよい。この蛍光色素は、連結部分を介してプローブの末端３’炭素または末端５’炭素への結合のために誘導体化された色素であってもよい。いくつかの実施形態では、この色素は、連結部分を介したプローブの末端５’炭素への結合のために誘導体化され得る。クエンチャーは蛍光色素であってもよい。あるいは、クエンチャーは、非蛍光部分であってもよい。クエンチングは、フルオロフォアとクエンチャーとの間のエネルギーの移行を包含し得る。フルオロフォアの発光スペクトルおよびクエンチャーの吸収スペクトルは重複し得る。

アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブは、参照によって本明細書に援用される、Ｌｉｖａｋら、「ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｗｉｔｈｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｄｙｅｓａｔｏｐｐｏｓｉｔｅｅｎｄｓｐｒｏｖｉｄｅａｑｕｅｎｃｈｅｄｐｒｏｂｅｓｙｓｔｅｍｕｓｅｆｕｌｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎｇＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔａｎｄｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」、ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓＡｐｐｌ．１９９５４：３５７−３６２によって設計され得る。

特定のプローブについてのレポーター−クエンチャー部分対は、例えば、Ｐｅｓｃｅら、編、ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＳｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９７１）；Ｗｈｉｔｅら、ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ（ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９７０）によって選択され得る。レポーター−クエンチャー対で用いられ得る例示的な蛍光性および色素生産性分子は、例えば、Ｂｅｒｌｍａｎ，ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＳｐｒｅｃｔｒａｏｆＡｒｏｍａｔｉｃＭｏｌｅｃｕｌｅｓ，第２版（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９７１）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ＣｏｌｏｕｒａｎｄＣｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｏｆＯｒｇａｎｉｃＭｏｌｅｃｕｌｅｓ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９７６）；Ｂｉｓｈｏｐ，編、Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ（ＰｅｒｇａｍｏｎＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９７２）；Ｈａｕｇｌａｎｄ，ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｂｅｓａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈＣｈｅｍｉｃａｌｓ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，１９９２）；Ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍ，ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｎｄＰｈｏｓｐｈｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（ＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９４９）（参照によって本明細書に援用される）に記載される。

広範な反応性蛍光性レポーター色素が、それらが本発明のクエンチャー色素によってクエンチされる限り、用いられてもよい。そのフルオロフォアは、芳香族化合物であってもまたは芳香族複素環化合物であってもよい。フルオロフォアは、例えば、ピレン、アントラセン、ナフタレン、アクリジン、スチルベン、ベンゾオキサゾール（ｂｅｎｚｏｘａａｚｏｌｅ）、インドール、ベンズインドール、オキサゾール、チアゾール、ベンゾチアゾール、ケイナイン（ｃａｎｉｎｅ）、カルボシアニン、サチリル酸塩、アントラニル酸塩、キサンテン色素、またはクマリンであってもよい。例示的なキサンテン色素としては、例えば、フルオレセインおよびローダミン色素が挙げられる。例示的なフルオレセインおよびローダミン色素としては、限定するものではないが、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、２’７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ；Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）が挙げられる。適切な蛍光性レポーターとしてはまた、α位置またはβ位置におけるアミノ基を有するナフチルアミン色素が挙げられる。例えば、ナフチルアミノ化合物としては、１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホナート、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホナートおよび２−ｐ−トルイジニル−６−ナフタレンスルホナート，５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）が挙げられる。例示的なクマリンとしては、例えば、３−フェニル−７−イソシアナートクマリン；アクリジン、例えば、９−イソチオシアナートアクリジンおよびアクリジンオレンジ；Ｎ−（ｐ−（２−ベンゾオキサゾリル）フェニル）マレイミド；シアニン類、例えば、インドジカルボシアニン３（Ｃｙ３）、インドジカルボシアニン５（Ｃｙ５）、インドジカルボシアニン５．５（Ｃｙ５．５）、３−（−カルボキシ−ペンチル）−３’−エチル−５，５’−ジメチルオキサカルボシアニン（ＣｙＡ）など；１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ，１５Ｈ−キサンテノ［２，３，４−ｉｊ：５，６，７−ｉ’ｊ’］ジキノリジン−１８−イウム、９−［２（または４）−［［［６−［２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ］−６−オキソヘキシル］アミノ］スルホニル］−４（または２）−スルホフェニル］−２，３，６，７，１２，１３，１６，１７−オクタヒドロ−内部塩（ＴＲまたはＴｅｘａｓＲｅｄ）；またはＢＯＤＩＰＹ（商標）色素が挙げられる。例示的な蛍光性部分およびクエンチャー部分は、例えば、参照によって本明細書に援用される、ＷＯ／２００５／０４９８４９に記載される。

当該分野で公知のような、適切なクエンチャーは、蛍光部分によって選択される。例示的なレポーターおよびクエンチャーはさらに、参照によって本明細書に援用されるＡｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第７，６０１，８２１号に記載される。

クエンチャーはまた、種々の商業的供給源から入手できる。例示的な市販のクエンチャーとしては、ＢｉｏｓｅａｒｃｈＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＢｌａｃｋＨｏｌｅＱｕｅｎｃｈｅｒｓ（登録商標）およびＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＩｎｃのＩｏｗａＢｌａｃｋ（登録商標）またはＺＥＮクエンチャーが挙げられる。

いくつかの実施形態では、アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブは、２つのクエンチャー部分を含む。２つのクエンチャー部分を含む例示的なプローブとしては、ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＺｅｎプローブが挙げられる。このようなプローブは、検出可能部分から約９塩基離れて位置する内部クエンチャー部分を含み、かつ一般には、伝統的なレポーター／クエンチャープローブに関連するバックグラウンドシグナルを低下する。

検出可能部分およびクエンチャー部分は、共通の反応基または連結部分を介したオリゴヌクレオチドに対する共有結合のために誘導体化され得る。検出可能部分およびクエンチャー部分の誘導体化のための方法は、例えば、Ｕｌｌｍａｎら、米国特許第３，９９６，３４５号；Ｋｈａｎｎａら、米国特許第４，３５１，７６０号；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，編，ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｎｄＡｎａｌｏｇｕｅｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９１）；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１５：５３０５−５３２１（１９８７）（オリゴヌクレオチド上の３’チオール基）；Ｓｈａｒｍａら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１９：３０１９（１９９１）（３’スルフヒドリル）；Ｇｉｕｓｔｉら、ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２：２２３−２２７（１９９３）およびＦｕｎｇら、米国特許第４，７５７，１４１号（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．から入手できるＡｍｉｎｏｌｉｎｋ（商標）ＩＩを介した５’ホスホアミノ基）；Ｓｔａｂｉｎｓｋｙ，米国特許第４，７３９，０４４号（３’アミノアルキルホスホリル基）；Ａｇｒａｗａｌら、ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ，３１：１５４３−１５４６（１９９０）（ホスホラミダイト連結を介した結合）；Ｓｐｒｏａｔら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１５：４８３７（１９８７）（５’メルカプト基）；Ｎｅｌｓｏｎら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１７：７１８７−７１９４（１９８９）（３’アミノ基）（そのすべてが参照によって本明細書に援用される）に記載される。

いくつかの実施形態では、市販されている連結部分、例えば、ＣｌｏｎｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＰａｌｏＡｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）から入手可能な連結部分が、合成の間にオリゴヌクレオチドに結合されてもよい。

単なる例に過ぎないが、ローダミンおよびフルオレセイン色素は、オリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシルに対する結合のためのホスホラミダイト部分で誘導体化され得る（例えば、その全体が参照によって本明細書に援用される、Ｗｏｏら、米国特許第５，２３１，１９１号；およびＨｏｂｂｓ，Ｊｒ．米国特許第４，９９７，９２８号を参照のこと）。

いくつかの実施形態では、検出可能部分は、非蛍光シグナルを生じる。例えば、プローブのテンプレートへのハイブリダイゼーションが、クエンチング部分からの検出可能な部分の検出可能な分離を生じる任意のプローブを用いてもよい。例えば、検出可能部分の放出は、電気的に、量子ドット検知によって、発光によって、または化学的に（例えば、プローブハイブリダイゼーションから生じる溶液中のｐＨの変化によって）検出され得る。同様に、プローブ結合領域に結合し、シグナル中の変化がクエンチャー部分からの検出可能部分の分離の際に検出され得る、任意のプローブを用いてもよい。例えば、分子ビーコンプローブ、ＭＧＢプローブ、プレアデス（Ｐｌｅｉａｄｅｓ）プローブ、スコーピオン（Ｓｃｏｒｐｉｏｎ）プローブまたは他のプローブが本発明における使用について考慮される。

分子ビーコンプローブは、参照によって本明細書に援用される、例えば、米国特許第５，９２５，５１７号および同第６，１０３，４０６号に記載される。分子ビーコンプローブは、一般には、ヘアピンまたは二分子のオリゴヌクレオチドプローブを指す。ヘアピン分子ビーコンプローブは、ヘアピンの一端で検出可能部分、ヘアピンの他の末端でクエンチャー部分を含んでもよく、ここではヘアピンは、テンプレート結合領域を含む。理論で拘束されることは望まないが、テンプレートへのテンプレート結合領域のハイブリダイゼーションは、プローブのヘアピン構造を分離し、かつ検出可能部分をクエンチャー部分から分離し得、これによって検出可能部分の検出を可能にする。二分子のビーコンプローブは、それぞれ、５’末端および３’で互いに相補的である配列を有している２つのオリゴヌクレオチド鎖を含んでもよい。相補的な配列は、各々が、検出可能部分およびクエンチャー部分にそれぞれコンジュゲートされ得る。２つのオリゴヌクレオチド鎖の各々が、標的配列の異なる領域に結合するテンプレート結合配列をさらに含んでもよい。相補鎖の間のワトソンクリック結合の形成は、Ｙ構造の形成を生じ得、検出可能部分をクエンチャー部分と近位にして、検出可能部分のクエンチを生じ得る。標的ポリヌクレオチドに対するテンプレート結合配列のハイブリダイゼーションは、相補的配列の間の二重鎖を破壊し得、それによってクエンチャー部分から検出可能部分を分離し、検出可能部分の脱クエンチングを生じる。

ＭＧＢプローブは、参照によって本明細書に援用される、例えば、米国特許第７，５８２７３９号；同第７，３８１，８１８号；同第６，４９２，３４６号；同第６，３２１，８９４号；同第６，３０３，３１２号；および同第６，２２１，５８９号に記載される。ＭＧＢプローブとは、マイナー・グルーブ・バインダー（ｍｉｎｏｒｇｒｏｏｖｅｂｉｎｄｅｒ）（ＭＧＢ）を含むオリゴヌクレオチドプローブを指す。「マイナー・グルーブ・バインダー（ｍｉｎｏｒｇｒｏｏｖｅｂｉｎｄｅｒ）」という用語は、本明細書において用いる場合、一般的には、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ−ＰＮＡハイブリッド、ハイブリッド（１つの鎖がＰＮＡ／ＤＮＡキメラである）ならびに／またはポリマー（プリンおよび／またはピリミジン塩基および／またはそれらのアナログを含む）のマイナーグルーブ（ｍｉｎｏｒｇｒｏｏｖｅ）内で結合し得る分子であって、塩基対合して、マイナーグルーブを含む二重鎖、三重鎖またはより高次の構造を形成し得る分子を指す。プローブのＭＧＢドメインは、プローブとその対応するテンプレートポリヌクレオチドとの間で形成される二重鎖を安定化し得る。ＭＧＢの組み込みは、短いプローブの使用を可能にし得、プローブ／テンプレート二重鎖の安定性を向上し得、かつ対立遺伝子特異的なプローブの特異性を保持する。ＭＧＢプローブは、ＭＧＢリガンド、およびクエンチャー（プローブの３’末端に位置する）を有してもよく、フルオロフォアが、プローブの５’末端に結合される。あるいは、ＭＧＢプローブは、ＭＧＢリガンド、およびクエンチャー（プローブの５’末端に位置する）およびフルオロフォア（プローブの３’末端で）を有してもよい。

プレアデス（ｐｌｅｉａｄｅｓ）プローブは、参照によって本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００４６７２７３５６号、同第２００７７２０５１０５号および同第２００９０１１１１００号に記載される。プレアデスプローブとは一般的には、検出可能部分、例えば、プローブの第一端でＭＧＢに近位のフルオロフォア、およびプローブの第二端でクエンチャー部分を含むＭＧＢプローブを指す。この検出可能部分は、クエンチャー部分によってクエンチされてもよく、さらに、ＭＧＢによってさらにクエンチされてもよい。

アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブは、ある長さを有するように設計されてもよい。アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブの長さは、プローブが溶液中でフリーである（例えば、非ハイブリダイズ状態である）場合、検出可能な部分をクエンチするように、十分に長くてもよく、検出可能部分およびクエンチャーが十分に近位である。単なる例であるが、アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブは、そのハイブリダイズしていない状態で、完全にハイブリダイズした状態のプローブと比較して、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．１％未満、０．０１％未満、０．００１％未満、または０．０００１％未満の蛍光を示し得る。理論で拘束されることは望まないが、このようなプローブのハイブリダイゼーションは、プローブのコイル状態を喪失させ、かつ完全に伸展させ得、プローブの検出可能部分とクエンチャー部分との間の距離を増大し、それによって検出可能部分を活性化する。このようなハイブリダイゼーション依存性の活性化可能なプローブは、例えば、米国特許第６，０３０，７８７号、米国特許第５，７２３，５９１号、米国特許第７，４８５，４４２号、および米国特許出願番号１０／１６５，４１０）（参照によって本明細書に援用される）に記載される。検出可能部分およびクエンチャーは、少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３０超ヌクレオチド離間してもよい。この検出可能部分およびクエンチャーは、約７〜１０、９〜１５、１２〜２０、２０〜３０、または３０超ヌクレオチド離れて間隔を空けられてもよい。プローブの全長は、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３０超ヌクレオチドであってもよい。プローブの全長は、約７〜１２、１２〜２０、２０〜３０、または３０超のヌクレオチドであってもよい。

いくつかの実施形態では、プローブは、ＴＭを増強する塩基を有するヌクレオチドを含む。このプローブは、Ｓｕｐｅｒｂａｓｅ（商標）、ロックド核酸、または架橋核酸を含んでもよい。例示的なロックド核酸または架橋核酸は、本明細書に記載される。

プローブは、目的の標的ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするように設計してもよい。プローブは、標的ポリヌクレオチドに対して少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％の相補性を有するように設計され得る。

いくつかの実施形態では、プローブは、１５、１４、１３、１２、１１、または１０ヌクレオチド未満の長さを有するように設計されてもよい。いくつかの実施形態では、このようなプローブは、２５％超、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または最大８０％までのＧＣ含量を有する。いくつかの実施形態では、１５、１４、１３、１２、１１、または１０ヌクレオチド未満の長さを有するプローブは、４０％超、例えば、４０〜８０％などのＧＣ含量を含む。いくつかの場合には、１５、１４、１３、１２、１１、または１０ヌクレオチド未満の長さ、および２５％超、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または最大８０％であるＧＣ含量を有しているプローブは、架橋またはロックドヌクレオチドなどの修飾されたヌクレオチドを含まない。他の実施形態では、１５、１４、１３、１２、１１、または１０ヌクレオチド未満の長さを有するプローブは、４０％、３５％、３０％、２５％未満のＧＣ含量を含む。特定の実施形態では、このようなプローブはさらに、修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの場合には、修飾されたヌクレオチドは、ロックドヌクレオチドまたは架橋ヌクレオチドである。いくつかの場合には、このようなプローブは、ペプチド核酸を含む。このような場合、プローブは、修飾されたヌクレオチドを必ずしも含まない。

他の実施形態では、プローブは、１５以上、１６、以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、２５以上、または３０以上のヌクレオチドの長さを有するように設計される。特定の実施形態では、このようなプローブは、８０％未満のＧＣ含量を有する。例えば、このようなプローブは、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、または３０％未満のＧＣ含量を有し得る。特定の実施形態では、１５以上、１６，以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、２５以上のヌクレオチドの長さを有するアンプリコンの感度のよい検出のためのプローブはまた、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％であるＧＣ含量を有する。

アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブは、高度に鋭敏な対立遺伝子の識別のために設計されてもよく、例えば、対立遺伝子特異的なプローブであってもよい。このようなプローブは、例えば、ＳＮＰ、挿入、欠失、または逆位などの変異を保有すると疑われる遺伝子座と部分的にまたは完全を覆うように設計され得る。対立遺伝子特異的なプローブは、ある遺伝子座で特定の対立遺伝子を含むテンプレート核酸に対して完全にマッチする（例えば、完全に相補的である）が、その遺伝子座の任意の他の対立遺伝子に対するミスマッチを含むように設計され得る。このミスマッチは、１、２、３、４、５、または５超のヌクレオチドのミスマッチであってもよい。いくつかの実施形態では、対立遺伝子特異的なプローブは、ある遺伝子座で特定の対立遺伝子を含む完全にテンプレートの核酸と二重鎖を形成し得る。いくつかの実施形態では、このプローブ／完全にマッチしたテンプレート二重鎖は、第一のＴｍを有する。この対立遺伝子特異的なプローブはまた、同じ遺伝子座で異なる対立遺伝子を含むミスマッチのテンプレート核酸との二重鎖を形成し得る。いくつかの実施形態では、このプローブ／ミスマッチのテンプレート二重鎖は、第二のＴｍを有する。第一のＴｍと第二のＴｍとの間の相違（例えば、ミスマッチの結合ペナルティ）は、テンプレートに対するプローブの総結合エネルギーの少なくとも１％であり得る。

プローブは、ＳＮＰ、挿入、欠失、または逆位などの変異を保有すると疑われない標的ポリヌクレオチドの鋭敏かつ正確な検出のために設計され得る。例えば、標的ポリヌクレオチドは、コピー数変動を有すると疑われる場合がある。このような場合には、プローブは、標的ポリヌクレオチドに対するミスマッチを有するように必ずしも設計されない。いくつかの場合には、プローブは、標的ポリヌクレオチドに対して完全にマッチするように設計される。

プローブは、ＰＣＲの間、その標的テンプレート核酸にハイブリダイズしないように設計され得る。ＰＣＲは一般的には、反復回数の温度サイクリングを包含する。プローブは、反復回数の温度サイクリングの間にハイブリダイズしないように設計され得る。ユーザーは、温度サイクリングパラメータを、反復サイクルを含むように設定してもよく、この反復サイクルは、変性工程、アニーリング工程、および伸長工程を包含する。いくつかの実施形態では、この反復性のサイクルは、５０℃未満のいかなる温度段階も含まない。反復サイクルの後、ユーザーはまた、最終の伸長工程を含んでもよい。いくつかの実施形態では、この最終の伸長工程は、５０℃未満ではない。特定の実施形態では、この最終の伸長工程は、約６５〜７５℃である。反復サイクルの後、ユーザーは、最終の伸長工程および／または冷却工程を包含してもよく、ここではこの反応温度は、４５℃未満、４０℃未満、３５℃未満、３０℃未満、または２５℃もしくはそれ未満（ａｔｏｒｂｅｌｏｗ）まで低下される。いくつかの実施形態では、本発明のプローブは、冷却工程の間のその標的テンプレート核酸に対してハイブリダイズする。このような場合、ユーザーは、標的アンプリコンのエンドポイント検出を行ってもよい。いくつかの実施形態では、この冷却する工程は、制御された冷却工程を包含してもよく、ここでは反応温度は一定速度で冷却する。この一定速度は、０．０１℃／秒、０．０２℃／秒、０．０３℃／秒、０．０４℃／秒、０．０５℃／秒、０．０６℃／秒、０．０７℃／秒、０．０８℃／秒、０．０９℃／秒、０．１０℃／秒、０．２℃／秒、０．３℃／秒、０．４℃／秒、０．５℃／秒、０．６℃／秒、０．７℃／秒、０．８℃／秒、０．９℃／秒、または１℃／秒であってもよい。いくつかの場合には、ユーザーは蛍光が検出される温度に注意し得る。いくつかの場合には、蛍光が検出される温度は、標的核酸の変異状態に関してユーザーに情報を提供し得る。

あるいは、ユーザーは、反復性のサイクルの間に冷却工程を包含してもよい。例えば、反復性のサイクルは、変性、アニーリング、伸長および冷却工程を包含し得る。いくつかの実施形態では、反復性サイクルの冷却工程は、反応温度を、４５℃未満、４０℃未満、３５℃未満、３０℃未満、または２５℃もしくはそれ未満まで下げる工程を包含する。いくつかの実施形態では、本発明のプローブは、冷却工程の間、その標的テンプレート核酸にハイブリダイズする。このような場合、ユーザーは、標的アンプリコンのリアルタイム検出を行ってもよい。

（アンプリコンの感度のよい検出のための反応混合物）
別の態様では、本発明は、アンプリコンの感度のよい検出のための反応混合物を提供する。アンプリコンの感度のよい検出のための反応混合物は、ＰＣＲ反応を行うための成分を含んでもよい。アンプリコンの感度のよい検出のための反応混合物は、核酸テンプレート分子から少なくとも１つのアンプリコンを増幅するのに必要な成分を含んでもよい。アンプリコンの感度のよい検出のための反応混合物は、ヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、ポリメラーゼ、１つ以上のプライマー、および本発明のプローブを含んでもよい。アンプリコンの感度のよい検出のための反応混合物はさらに、Ｔｒｉｓ緩衝液、一価の塩、および１つ以上の陽イオンを含んでもよい。この１つ以上の陽イオンは、Ｍｇ^２＋であっても、および／またはＭｎ^２＋であってもよい。いくつかの実施形態では、アンプリコンの感度のよい検出のための反応混合物は、Ｍｇ^２＋およびＭｎ^２＋を含む。各々の成分の濃度は、当業者によって最適化され得る。いくつかの実施形態では、アンプリコンの感度のよい検出のための反応混合物はまた、限定するものではないが、非特異的なバックグラウンド／ブロッキング核酸（例えば、サケ精子ＤＮＡ）、バイオ防腐剤（例えば、アジ化ナトリウム）、ＰＣＲ増強剤（例えば、ベタイン、トレハロースなど）、およびインヒビター（例えば、ＲＮＡｓｅ阻害剤）を含む添加物を含む。いくつかの実施形態では、核酸サンプルは、アンプリコンの感度のよい検出のために反応混合物と混合される。したがって、いくつかの実施形態では、アンプリコンの感度のよい検出のための反応混合物はさらに、核酸サンプルを含む。

本発明で用いられるプライマーは、目的の標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズするように設計されているテンプレート結合領域を含んでもよい。本発明で用いられるプライマーは一般には、重合化のための因子の存在下において伸長生成物の合成をプライミングするために十分に長い。プライマーの正確な長さおよび組成物は、多くの要因、例としては、アニーリング反応の温度、供給源、およびプライマーの組成、ならびにプライマー：プローブ濃度の比に依存し得る。プライマー長は、例えば、約５〜１００、１０〜５０、１５〜３０、または１８〜２２ヌクレオチドであってもよいが、プライマーは、それより多いヌクレオチドを含んでも、それより少ないヌクレオチドを含んでもよい。

本発明で用いられるプライマーはまた、プローブ結合領域を含んでもよい。例示的なプローブ結合領域は、本明細書に記載される。

本発明で用いられるプライマーはさらに、バーコード配列を含んでもよい。「バーコード配列」という用語は、本明細書において用いる場合、一般的には、あるアッセイについての情報をコードし得るヌクレオチドの固有の配列を指す。いくつかの実施形態では、あるバーコード配列は、問い合わされた対立遺伝子の同定、標的ポリヌクレオチドまたはゲノム遺伝子座の同定、サンプル、被験体の同定、またはそれらの任意の組み合わせに関連する情報をコードする。いくつかの実施形態では、バーコード配列は、テンプレート核酸にハイブリダイズしない。バーコード配列は、例えば、目的の生物体の公知のゲノム配列に対して有意な配列類似性または相補性を回避するように設計されてもよい。このような固有の配列は、例えば、コンピュータ読み取り可能な媒体によってランダムに生成されて、例えば、ＥＭＢＬ、ＧｅｎＢａｎｋ、またはＤＤＢＪのような公知のヌクレオチドデータベースに対してＢＬＡＳＴｉｎｇによって選択されてもよい。このバーコード配列はまた、二次的構造を回避するように設計されてもよい。バーコード配列は、プライマーの３’末端またはさらに好ましくは５’末端であってもよい。バーコード配列は、サイズおよび組成物が広範に変化し得る；以下の参考文献は、特定の実施形態について適切なバーコード配列のセットを選択するための手引きを提供する：Ｂｒｅｎｎｅｒ，米国特許第５，６３５，４００号；Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９７：１６６５〜１６７０（２０００）；Ｓｈｏｅｍａｋｅｒら、ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ，１４：４５０〜４５６（１９９６）；Ｍｏｒｒｉｓら、欧州特許刊行物０７９９８９７Ａ１；Ｗａｌｌａｃｅ，米国特許第５，９８１，１７９号（その全てが参照によって本明細書に援用される）。特定の実施形態では、バーコード配列は、約４〜３６ヌクレオチド、約６〜３０ヌクレオチド、または約８〜２０ヌクレオチドの長さを有し得る。このバーコード配列は、任意の長さを有してもよい。いくつかの実施形態では、プライマーは、本明細書に記載のようなプローブ結合領域を含んでもよい。

プライマーおよび／またはプローブは、任意の適切な方法で調製されてもよい。特定の配列のオリゴヌクレオチドを調製するための方法は、当該分野で公知であり、これには、例えば、適切な配列のクローニングおよび制限、ならびに直接の化学合成が挙げられる。化学合成法としては、例えば、Ｎａｒａｎｇら、１９７９，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ６８：９０に記載のホスホトリエステル法、Ｂｒｏｗｎら、１９７９，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ６８：１０９に開示のホスホジエステル法、Ｂｅａｕｃａｇｅら、１９８１，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ２２：１８５９に開示のジエチルホスホラミダイト法、および米国特許第４，４５８，０６６号に開示される固体支持体方法が挙げられる。上記の引用文献は、参照によって本明細書に援用される。

プライマーおよび／またはプローブは、例えば、ＯｐｅｒｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ，Ｓｉｇｍａ，ＩＤＴＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、およびＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓなどの商業的供給源から得ることができる。プライマーは、同一または類似の融点を有してもよい。プライマーの長さは、所望の融点を有するプライマーを生成するために、５’末端または３’末端で伸長されてもまたは短縮されてもよい。また、各々のプライマー対および／または各々のプローブのアニーリング位置は、プライマー対および／またはプローブの配列および長さが所望の融点を生じるように、設計され得る。

プライマーおよび／またはプローブの融点は、経験的に、例えば、融解曲線解析を行うことによって決定され得る。融解曲線解析を行ってプライマーおよび／またはプローブのＴｍを経験的に決定する方法は、当業者には公知である。プライマーおよび／またはプローブの融点もまた予想され得る。単なる例であるが、２５塩基対より小さいプライマーの融点を予測するための最も単純な式は、ウォレス（Ｗａｌｌａｃｅ）の公式である：
（Ｔｄ＝２（Ａ＋Ｔ）＋４（Ｇ＋Ｃ））。
である。

オリゴヌクレオチドのＴｍを算出するための別の方法は、最近傍法である。この最近傍法は一般には、塩濃度およびＤＮＡ濃度のような特定の変数を組み込む。この方法は、例えば、５０ｍＭの一価の塩および０．５μＭプライマーなどの、ＰＣＲ適用で典型的には見出される反応混合物条件を組み込んでもよい。一般には、ＤＮＡおよびＲＮＡベースのオリゴヌクレオチドについての最近傍式は以下である：
Ｔｍ＝（１０００ΔＨ）／Ａ＋ΔＳ＋Ｒｌｎ（Ｃ／４）−２７３．１５＋１６．６ｌｏｇ［Ｎａ＋］、ここで
ΔＨ（Ｋｃａｌ／モル）は、ハイブリッドの最近傍エンタルピー変化の合計であり、Ａはらせん開始のための補正を含む定数であり、ΔＳは、最近傍エントロピー変化の合計であり、Ｒは、気体定数（１．９９ｃａｌＫ−１ｍｏｌ−１）であり、かつＣは、オリゴヌクレオチドの濃度である。

ＤＮＡおよびＲＮＡの最近傍相互作用についてのΔＨおよびΔＳの値を、表１（下）に示す。

例えば、５．０〜９．０の間のｐＨで、例えば、５０塩基より長いＤＮＡオリゴヌクレオチドのＴｍを予測するために一般に用いられる別の式は、ＧＣ％法である。

Ｔｍ＝８１．５＋１６．６ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋４１（Ｘ_Ｇ＋Ｘ_Ｃ）−５００／Ｌ−０．６２Ｆ
ここで、［Ｎａ＋］は、一価の陽イオン（この場合は、Ｎａ＋）のモル濃度であり、Ｘ_ＧおよびＸ_Ｃはオリゴヌクレオチド中のＧおよびＣのモル画分であり、Ｌは、二重鎖の中の最小鎖の長さであり、Ｆは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルミアミドの割合である。

Ｔｍはまた、オリゴヌクレオチド配列以外の要因にも依存し得ることを当業者は理解する。Ｔｍは、例えば、反応混合物の塩濃度、反応混合物中で用いられる緩衝液の種類、テンプレート濃度に対するプライマーまたはプローブの相対濃度、および他の要因に依存し得る。また限定するものではないが、ＡｒｒａｙＤｅｓｉｇｎｅｒＳｏｆｔｗａｒｅ（ＡｒｒａｙｉｔＩｎｃ．）、ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＰｒｏｂｅＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｓｉｇｎＳｏｆｔｗａｒｅｆｏｒＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｓｉｓ（ＯｌｙｍｐｕｓＯｐｔｉｃａｌＣｏ．）、ＮｅｔＰｒｉｍｅｒ、ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓ、および日立ソフトウェアエンジニアリング（ＨｉｔａｃｈｉＳｏｆｔｗａｒｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）のＤＮＡｓｉｓを含むコンピュータプログラムを用いて、プライマーを設計してもよい。各々のプライマーのＴｍ（融点またはアニーリング温度）は、なかでも、例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐから入手可能なＯｌｉｇｏＤｅｓｉｇｎ、ＰｒｏｍｅｇａのＢｉｏＭａｔｈＣａｌｃｕｌａｔｏｒｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｓｅｒｖ／ｔｏｏｌｓ／ｂｉｏｍａｔｈ／ｃａｌｃ１１．ｈｔｍ）、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓのＴｍＣａｌｃｕｌａｔｏｒ、ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒのようなソフトウェアプログラムを用いて算出され得る。

アンプリコンの感度のよい検出のための反応混合物は、線形増幅を行うための反応成分を含んでもよい。一般には、線形増幅の間、二本鎖テンプレート核酸のうち一本の鎖のみを１サイクルについて増幅して、一本鎖伸長生成物を生じる。線形増幅を可能にするために、反応混合物は、例えば、１つの標的ポリヌクレオチドあたり１つだけのプライマーを含んでもよい。

あるいは、アンプリコンの感度のよい検出のための反応混合物を、指数関数的増幅のために構成してもよい。一般的には、指数関数的増幅の間、二本鎖テンプレート核酸の両方の鎖を１サイクルについて増幅して、標的ポリヌクレオチドの２^ｎのコピーの生成を得、ここではｎはＰＣＲ反応中のサイクルの数である。指数関数的増幅を可能にするために、反応混合物は、１標的ポリヌクレオチドあたり１つのフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含んでもよい。代表的には、指数関数的増幅のためには、フォワードおよびリバースプライマーが、反応混合物中に、１：３〜３：１の比、１：２〜２：１の比、好ましくは２：３〜３：２の比、さらに好ましくは３：４〜４：３の比、またそれよりさらに好ましくは約１：１の比で存在する。

いくつかの場合には、アンプリコンの感度のよい検出のための反応混合物は、指数関数的増幅に続いて線形増幅のために構成されてもよい。このような場合、フォワードプライマー／リバースプライマーセットのうち１つのプライマーは、フォワードプライマー／リバースプライマーセットの他のプライマーに比較して過剰な濃度または量で存在してもよい。いくつかの実施形態では、過剰のプライマーの濃度は、制限プライマーの少なくとも２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×の濃度である。いくつかの実施形態では、過剰のプライマーの濃度は、制限プライマーの濃度の約２〜１０×、５〜５０×、２０〜１００×、５０〜５００×、１００〜１０００×、５００〜２０００×、１０００〜５０００×、２０００〜１００００×、または１００００×超の濃度である。このような場合には、指数関数的増幅は、制限プライマーの消耗まで進行し、この際、反応混合物または別個の反応容積中に残っている過剰のプライマーを用いて線形増幅が進行する。理論で拘束されることは望まないが、指数関数的増幅−続いて−線形の増幅によって、（１）検出可能シグナルを生じるのに十分な増幅生成物が生成されること、（２）ＰＣＲ反応生成物が優先的に一本鎖伸長生成物であり、これは反応温度を例えば、５０℃より下まで冷却する際に、例えば、その逆相補鎖の代わりに検出プローブに結合できること、が保証される。したがって、いくつかの実施形態では、ＰＣＲ温度サイクリングの終了の際に、一本鎖伸長生成物は、反応生成物の総量の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５％超の割合を占める。いくつかの実施形態では、一本鎖伸長生成物が、反応生成物の総量の少なくとも５０％を占めることはない。いくつかの実施形態では、ＰＣＲ温度サイクリングの終了の際、ＰＣＲ伸長生成物のうち少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５％超が過剰プライマーの伸長である。このような場合、線形増幅は、ユーザーが反応混合物に成分を追加することも除去することもなく、指数関数的増幅後に行われ得る。

アンプリコンの感度のよい検出のための反応混合物はポリメラーゼを含んでもよい。いくつかの実施形態では、このポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼである。特定の実施形態では、このＤＮＡポリメラーゼは熱安定性ポリメラーゼである。この熱安定性ポリメラーゼは、好熱性の細菌由来であっても、または古細菌由来であってもよい。例示的な熱安定性ポリメラーゼとしては、限定するものではないが、Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑポリメラーゼ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕポリメラーゼ）、Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来）、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（商標）ポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．由来）、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｐｆｘポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｕｓｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ由来）、Ｐｗｏポリメラーゼ、ＤＮＡ結合タンパク質を含むキメラＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｐｈｕｓｉｏｎ、ｉＰｒｏｏｆ）、トポイソメラーゼが挙げられる。いくつかの実施形態では、このポリメラーゼは、等温性の増幅が可能である。このポリメラーゼは例えば、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、ＢｃａＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）であってもよい。

いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を含む。本明細書において用いる場合、「５’→３’ヌクレアーゼ活性」または「５’→３’ヌクレアーゼ活性」とは、テンプレート特異的な核酸ポリメラーゼの活性であって、それによってヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの５’末端から連続して取り除かれる活性を指し得る。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、当該分野で公知であって、これには、例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓから単離されたＤＮＡポリメラーゼ（ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、このＤＮＡポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く。３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠いている例示的なＤＮＡポリメラーゼとしては限定するものではないが、ＢＳＴＤＮＡポリメラーゼＩ、ＢＳＴＤＮＡポリメラーゼＩ（大フラグメント）、Ｔａｑポリメラーゼ、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウフラグメント（３’→５’エキソ−）、ＰｙｒｏＰｈａｇｅ（登録商標）３１７３ＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼマイナス（ＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＭｉｎｕｓ）（Ｅｘｏ−）（Ｌｕｃｉｇｅｎから入手可能）、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼマイナス（ＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＭｉｎｕｓ）（Ｌｕｃｉｇｅｎ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性を欠くように遺伝子操作された組み換えＤＮＡポリメラーゼである。

いくつかの実施形態では、アンプリコンの感度のよい検出のための反応混合物は、多重検出のための複数のプライマーおよびプローブを包含し得る。単なる例であるが、アンプリコン反応混合物の感度のよい検出のための反応混合物は、プライマー／プローブセットを含み得る。いくつかの実施形態では、プライマー／プローブセットは、共通のフォワードプライマーおよび必要に応じてリバースプライマー（ある遺伝子座で変異を保有することが疑われる標的ポリヌクレオチドを増幅するように設計された）を含み、さらに複数のプローブを含み、ここでは各々のプローブは、遺伝子座の特異的な対立遺伝子に対して特異的である。プライマー／プローブセット中の各々のプローブはさらに、反応混合物中の任意の他の検出可能部分とは検出可能に別個である別個の検出可能部分を含んでもよい。他の例では、反応混合物は、複数のプライマー／プローブセットを含んでもよく、ここでは各々のプライマー／プローブセットは、異なる標的ポリヌクレオチド、例えば、異なる遺伝子座に特異的である。

いくつかの実施形態では、このプライマー／プローブセットは、共通のリバースプライマー、第一の対立遺伝子特異的なフォワードプライマー、および少なくとも第二の対立遺伝子特異的なフォワードプライマー（ある遺伝子座である変異を保有することが疑われる標的ポリヌクレオチドを増幅するように設計された）を含む。このフォワードプライマーは互いにテンプレート結合領域を含んでもよい。このテンプレート結合領域は、ある変異を覆い得る。このフォワードプライマーは各々、プローブ結合領域（例えば、バーコード領域）をさらに含んでもよい。フォワードプライマーの１つは、変異を覆う部位で野性型対立遺伝子に対して相補的である、野性型特異的なフォワードプライマーであってもよい。この野性型特異的なフォワードプライマーはさらに、テンプレート核酸に一般にはハイブリダイズしない野性型バーコード領域を含んでもよい。野性型バーコード領域は、野性型低Ｔｍプローブに特異的にハイブリダイズするが、変異体低Ｔｍプローブには実質的にハイブリダイズしない野性型バーコード配列を含んでもよい。フォワードプライマーの１つは、変異を覆う部位で変異対立遺伝子に対して相補的である変異体特異的なフォワードプライマーであってもよい。この変異体特異的なフォワードプライマーはさらに、テンプレート核酸に一般にはハイブリダイズしない変異体バーコード領域を含んでもよい。この変異体バーコード領域は、変異体低Ｔｍプローブに特異的にハイブリダイズするが、野性型低Ｔｍプローブには実質的にハイブリダイズしない変異体バーコード配列を含んでもよい。フォワードプライマー（野性型および変異体フォワードプライマー）はさらに、変異を覆うｎｔ由来の１〜３ヌクレオチドに隣接するか、またはその中の意図的なミスマッチヌクレオチドを含んでもよい。しかし、いくつかの場合には、フォワードプライマーは、変異を覆うｎｔ由来の１〜３ヌクレオチドに隣接するか、またはその中の意図的なミスマッチヌクレオチドをさらには含まない。プライマー／プローブセットはさらに、野性型低Ｔｍプローブおよび変異体低Ｔｍプローブを含んでもよい。野性型低Ｔｍプローブは、野性型バーコード領域に特異的にハイブリダイズするように設計されてもよい。変異体低Ｔｍプローブは、変異体バーコード領域に特異的にハイブリダイズするように設計されてもよい。野性型および変異体の低Ｔｍプローブは、スペクトル的に別個のフルオロフォアを含んでもよい。このプライマー／プローブセットはさらに、共通のリバースプライマーを含んでもよい。

（アンプリコンの感度のよい検出のための方法）
図１６は、アンプリコンの感度のよい検出のための方法について例示的なワークフロー１６００を示しており、これには、反応混合物中でプローブベースのＰＣＲアッセイを行う第一の工程１６１０を包含し、ここでこのプローブベースのＰＣＲアッセイは、温度サイクリングを含み、このプローブは、ＰＣＲ増幅反応の動態または有効性に対して有する影響が最小からゼロになるように設計されている。いくつかの実施形態では、このプローブは、ＰＣＲ反応の間、テンプレート核酸にハイブリダイズしない。いくつかの実施形態では、このオリゴヌクレオチドプローブは、ＰＣＲ反応の終了後にテンプレート核酸にハイブリダイズする。ＰＣＲ反応の終わりは、標的ポリヌクレオチドへのプローブのハイブリダイゼーションを可能にする温度まで反応混合物を冷却することを可能にするという次の工程１６２０を包含し得る。いくつかの実施形態では、プローブハイブリダイゼーションによって、ハイブリダイズしたプローブの検出が可能になる。この方法はさらに、プローブの検出という次の工程１６３０を包含し得る。

（増幅）
いくつかの実施形態では、増幅は、核酸ポリメラーゼを利用して行われる。いくつかの実施形態では、この核酸ポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼである。特定の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである。他の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、等温性増幅が可能である。例示的なＤＮＡポリメラーゼは本明細書に記載されている。

いくつかの実施形態では、この反応混合物を、ＰＣＲ増幅反応に供する。ＰＣＲ増幅には、反復性の温度サイクリングを包含し得る。温度サイクリングは、自動化されたプロセスとして行われてもよい。この自動化されたプロセスは、ＰＣＲサーマルサイクラーを用いて行われてもよい。市販のサーマルサイクラーシステムとしては、とりわけ、Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒのシステムが挙げられる。

温度サイクリングは、変性、プライマーアニーリングおよびプライマー伸長という反復性の工程を通じてサイクリングする工程を包含し得る。３つの工程のための温度および時間は、例えば、変性について９０〜１００℃で５秒以上、アニーリング段階について５０〜６５℃で１０〜６０秒間、およびプライマー伸長については５０〜７５℃で１５〜１２０秒であり得る。いくつかの実施形態では、プライマーアニーリングおよびプライマー伸長を、単一温度の工程（例えば、６０℃）で組み合わせる。温度サイクリングの前、ＰＣＲ反応は、ポリメラーゼを活性化するために「ホットスタート（ｈｏｔ−ｓｔａｒｔ）」開始段階を含んでもよい。この「ホットスタート」段階は、反応混合物を９０〜１００℃まで加熱する工程を包含し得る。反復サイクルの後、ユーザーはまた、ＰＣＲ反応の一部として最終の伸長工程を包含し得る。この最終の伸長工程は、例えば、５、６、７、８、９、１０、または１０分超の間、５０〜７５℃の反応温度を含んでもよい。

温度サイクリングパラメータは、ユーザーによって設定され得る。いくつかの実施形態では、ユーザーは、温度サイクリングパラメータを、低Ｔｍプローブのエンドポイント検出を可能にするように設定する。例えば、ユーザーは、反復性のサイクルが５０℃より下でなんら温度工程を含まないように、温度サイクリングパラメータを設定し得る。このようなパラメータは、ＰＣＲ反応の間に低Ｔｍプローブのハイブリダイゼーションを最小化し得る。反復性のサイクルの後、ユーザーはまた、最終の伸長工程を含んでもよい。いくつかの実施形態では、この最終の伸長工程は、５０℃より下ではない。特定の実施形態では、この最終の伸長工程は、約５０〜７５℃である。反復性のサイクルの後、ユーザーは、最終の伸長工程および／または冷却工程を含んでもよく、ここでは反応温度は、４５℃未満、４０℃未満、３５℃未満、３０℃未満、または２５℃もしくはそれ未満まで低下される。いくつかの実施形態では、低Ｔｍプローブは、冷却工程の間に、その標的テンプレート核酸にハイブリダイズする。このような場合、ユーザーは、標的アンプリコンのエンドポイント検出を行い得る。いくつかの実施形態では、冷却工程は、反応温度が一定速度で冷却される、制御冷却工程を包含し得る。この一定速度は、本明細書に記載され得る。このような場合、ユーザーは蛍光が検出される温度を気づき得る。いくつかの場合には、蛍光が検出される温度によって、標的核酸の変異状態に関してユーザーに情報が提供され得る。

図１７は、本発明のエンドポイント検出方法に関する例示的なワークフロー１７００を示しており、これは、複数の反応容積中でＰＣＲ反応を行うという第一の工程１７１０を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の反応容積は、蛍光性部分およびクエンチャー部分を含む、アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブ（例えば、低Ｔｍプローブ）を含む。いくつかの実施形態では、このプローブは、ＰＣＲアニーリングまたは伸長段階の間、ハイブリダイズしていないままで保持されるように構成される。いくつかの実施形態では、ＰＣＲ温度サイクリング段階は、低ＴｍプローブのＴｍを上回ることが５℃未満である温度段階をなんら含まない。いくつかの実施形態では、ＰＣＲ反応は、増幅生成物の生成を生じる。次の工程１７２０では、増幅生成物へのＴｍプローブのハイブリダイゼーションを可能にする温度まで、反応容積を冷却する。いくつかの実施形態では、低Ｔｍプローブのその標的ポリヌクレオチドへの選択的なハイブリダイゼーションによって、プローブの検出可能部分からの蛍光発光の脱クエンチングが可能になる。次の工程１７３０では、検出可能蛍光を有する反応容積を列挙する。

あるいは、ユーザーは、反復性の熱サイクルへ冷却工程を導入してもよい。例えば、反復性のサイクルは、変性工程、アニーリング工程、伸長工程、および冷却工程を含んでもよい。別の実施例では、反復性のサイクルは、第一の変性工程、アニーリング工程、伸長工程、第二の変性工程、および冷却工程を含んでもよい。いくつかの実施形態では、この反復性のサイクルの冷却工程は、反応温度を、４５℃未満、４０℃未満、３５℃未満、３０℃未満、または２５℃もしくはそれ未満まで下げる工程を包含する。いくつかの実施形態では、低Ｔｍプローブは、冷却工程の間に、その標的テンプレート核酸にハイブリダイズする。このような場合、ユーザーは、各々の冷却工程の間に、ハイブリダイズしたプローブのレベルを検出することによって標的アンプリコンのリアルタイムＰＣＲ検出を行ってもよい。本明細書において用いる場合、「リアルタイムＰＣＲ」とは、ある量の検出可能シグナルがＰＣＲの各々のサイクルでモニターされるＰＣＲ方法を指す。いくつかの実施形態では、検出可能シグナルが検出可能レベルに達するサイクルの閾値（Ｃｔ）が決定される。一般的には、Ｃｔ値が低いほど、問い合わされる対立遺伝子の濃度は大きい。リアルタイムＰＣＲのためのシステムは、当該分野で公知であり、これには例えば、ＡＢＩ７７００および７９００ＨＴＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｓ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。ＰＣＲの指数関数的段階の間のシグナルの増大は、変異体対立遺伝子を含むテンプレートの量の定量的測定を提供し得る。

図１８は、リアルタイム検出を含む本発明の例示的な方法を示しており、これには、温度サイクリング反応混合物１８０１を含み、この混合物は、テンプレート核酸１８０２、フォワードプライマーおよびリバースプライマー（それぞれＦ１およびＲ１）、プローブ１８０３（蛍光部分Ｆおよびクエンチャー部分Ｑを含む、アンプリコンの感度のよい検出のため）、ｄＮＴＰ（示さず）、およびＰＣＲ反応を行うために必要な任意の他の反応成分（例えば、ポリメラーゼ（示さず））を含む。いくつかの実施形態では、プローブの蛍光性部分は、このプローブがハイブリダイズしていない状態である場合、クエンチされる（Ｆｉによって示される）。ＰＣＲ反応は、「ホットスタート」（示さず）によって開始されても、または開始されなくてもよい。温度サイクリングは、「ホットスタート」後に開始され得る。反復性の熱サイクルは、第一の変性段階１８１０を備えてもよく、これが、二本鎖テンプレート核酸を一本鎖テンプレート鎖１８１１および１８１２に変性する。この第一の変性段階の次には、プライマーアニーリング段階１８２０が続いてもよく、ここでは、フォワードプライマーおよびリバースプライマー（Ｆ１およびＲ１）が、それらの標的鎖１８１１および１８１２にハイブリダイズすることが可能になる。アニーリング段階の間、アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブ１８０３は一般には、その標的テンプレートに対して有意なハイブリダイゼーションを示さない。アニーリング段階の後に、伸長段階１８３０が続いてもよく、ここではポリメラーゼが、Ｆ１およびＲ１プライマーを伸長し、それによって、２コピーの標的ポリヌクレオチド１８３１および１８３２が生成される。この段階の間、アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブ１８０３は、一般には、テンプレート核酸にハイブリダイズしない。伸長段階の後には、第二の変性段階１８４０が続いてもよく、これが二本鎖テンプレート核酸を一本鎖テンプレート鎖１８４１に変性する。この第二の変性段階の後には、冷却段階、例えば、５０℃未満まで冷却する工程、またはほぼ室温まで冷却する工程が続いてもよい。反応混合物を冷却することによって、標的ポリヌクレオチドに対する低Ｔｍプローブのハイブリダイゼーションが可能になり得る。プローブのハイブリダイゼーションは、プローブの全伸長を生じ、かつクエンチャー部分の影響から検出可能部分を解放し得る（＊Ｆで示される検出可能部分）。したがって、この検出可能部分は、各々の熱サイクルの間に検出され得る。

いくつかの実施形態では、変性の反復性のサイクル、プライマーアニーリング、およびプライマー伸長は、標的ポリヌクレオチドを含むアンプリコンの蓄積を生じる。アンプリコンは一本鎖であっても二本鎖であってもよい。検出可能なレベルのプローブのハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な標的ポリヌクレオチドを含む量のアンプリコンを蓄積するために、十分なサイクルを行ってもよい。得られた検出可能シグナルは、バックグラウンドシグナルよりも２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、または１００００倍大きいか、または数桁大きくてもよい。

いくつかの実施形態では、ＰＣＲ増幅反応は、指数関数的増幅反応である。指数関数的増幅を含む方法の例示的な実施形態は、図１９に示される。出発の反応混合物または容積１９０１は、テンプレート核酸１９０２（二本鎖テンプレート核酸であってもよい）、プローブ１９０３（本明細書に記載のアンプリコンの感度のよい検出のためであって、このプローブ１９０３は、蛍光性部分およびクエンチャー部分を含む）、フォワードプライマーおよびリバースプライマー（Ｆ１およびＲ１）（標的ポリヌクレオチドを増幅するために設計された）、ｄＮＴＰ（示さず）、およびＰＣＲ反応を行うために必要な任意の他の反応成分（例えば、ポリメラーゼ，示さず）を含んでもよい。いくつかの実施形態では、プローブの蛍光性部分は、このプローブがハイブリダイズしていない状態である場合、クエンチされる（Ｆｉによって示される）。ＰＣＲ反応は、「ホットスタート」（示さず）によって開始されてもよいし、開始されなくてもよい。次いで、反応混合物は、温度サイクリングを開始し得る。各々の熱サイクルは、変性段階１９１０を含んでもよく、ここでは二本鎖テンプレート核酸が、部分的にまたは完全に、一本鎖１９１１および１９１２に変性される。一般的には、この変性段階の間、プライマーハイブリダイゼーションも、プローブハイブリダイゼーションも起こらない。変性後、アニーリング段階１９２０が開始されてもよく、ここではＦ１プライマーおよびＲ１プライマーは、標的ポリヌクレオチドの一本鎖にアニーリングする。この段階の間、アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブ１９０３は一般的には、テンプレート核酸にはハイブリダイズしない。アニーリング段階の後、伸長段階１９３０が開始されてもよく、ここではポリメラーゼがＦ１およびＲ１プライマーを伸長し、それによって２つのコピーの標的ポリヌクレオチド１９３１および１９３２が作成される。この段階の間、アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブ１９０３は一般的には、テンプレート核酸にハイブリダイズしない。したがって、熱サイクルの繰り返しによって、標的ポリヌクレオチドの指数関数的増幅が生じ得る。最終の反復性のサイクルの後、最終の変性工程１９４０が開始され得る。最終の変性工程は、完全にまたは部分的に、任意の二本鎖標的ポリヌクレオチドを一本鎖１９４１に変性し得る。最終の変性工程後、その反応混合物は、冷却工程１９５０で冷却され、例えば、５０℃未満まで、またはほぼ室温まで冷却され得る。反応混合物を冷却する工程によって、最終の冷却された段階１９６０において標的ポリヌクレオチドに対する本発明のプローブのハイブリダイゼーションが可能になる。プローブのハイブリダイゼーションは、プローブの完全な伸長を生じ、かつクエンチャー部分の影響から検出可能部分を解放し得る。したがって、この検出可能部分が検出され得る。

いくつかの実施形態では、ＰＣＲ増幅反応は線形増幅反応である。線形増幅を含む方法の例示的な実施形態は、図２０に示される。出発反応混合物または容積２００１は、テンプレート核酸２００２（二本鎖テンプレート核酸であってもよい）、プローブ２００３（本明細書に記載されるアンプリコンの感度のよい検出のためであって、このプローブ２００３は、蛍光性部分およびクエンチャー部分を含む）、およびプライマーＦ１（鎖特異的方式で、標的ポリヌクレオチドを含む単一テンプレート鎖にハイブリダイズするように設計されている）、ｄＮＴＰ（示さず）、およびＰＣＲ反応を行うのに必要な任意の他の反応成分（例えば、ポリメラーゼ，示さず）を含んでもよい。いくつかの実施形態では、プローブの蛍光性部分は、このプローブがハイブリダイズしていない状態である場合、クエンチされる（Ｆｉによって示される）。ＰＣＲ反応は、「ホットスタート」（示さず）によって開始されてもよいし、開始されなくてもよい。次いで、反応混合物は、温度サイクリングを開始し得る。各々の熱サイクルは、変性段階２０１０を含んでもよく、ここでは二本鎖テンプレート核酸が、部分的にまたは完全に、一本鎖２０１１および２０１２に変性される。一般的には、この変性段階の間、プライマーハイブリダイゼーションも、プローブハイブリダイゼーションも起こらない。変性後、アニーリング段階２０２０が開始されてもよく、ここではＦ１プライマーが、標的ポリヌクレオチドの変性された鎖２０１２に対して鎖特異的な方式でアニーリングする。この段階の間、アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブ２００３は一般的には、テンプレート核酸にはハイブリダイズしない。アニーリング段階の後、伸長段階２０３０が開始されてもよく、ここではポリメラーゼがＦ１プライマーを伸長し、それによって標的ポリヌクレオチド２０３１のコピーが作成される。この段階の間、アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブ２００３は一般的には、テンプレート核酸にハイブリダイズしない。この段階の間、一本鎖２０１１は一般には増幅されない。したがって、変性、アニーリング、および伸長の熱サイクルの繰り返しによって、標的ポリヌクレオチドを含む一本鎖アンプリコン２０４１の線形の蓄積が生じ得る。一本鎖生成物２０４１の蓄積を生じ得る、温度サイクリングの終了の際、その反応混合物は、冷却工程２０４０で冷却され、例えば、５０℃未満まで、またはほぼ室温まで冷却され得る。反応混合物を冷却する工程によって、最終の冷却された段階２０５０において標的ポリヌクレオチドに対する本発明のプローブのハイブリダイゼーションが可能になる。プローブのハイブリダイゼーションは、プローブの完全な伸長を生じ、かつクエンチャー部分の影響から検出可能部分を解放し得る。したがって、この検出可能部分が検出され得る。

いくつかの実施形態では、ＰＣＲ増幅反応は、非対称のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。非対称のＰＣＲ反応は、最初の指数関数的増幅段階に続いて、線形の増幅段階を含んでもよい。いくつかの場合には、指数関数的増幅段階から線形増幅段階への移行は、反応混合物への反応成分の添加も、反応混合物からの成分の除去もなく生じる。いくつかの場合には、非対称のＰＣＲ反応には、反応混合物を反復性の熱サイクルに供する工程を包含し、ここではこの反応混合物は、ポリヌクレオチドテンプレート標的、ＰＣＲプライマーの対、ｄＮＴＰ、本発明のプローブ、および熱安定性ポリメラーゼを含む。この熱サイクルは、変性、プライマーアニーリングおよびプライマー伸長というＰＣＲ工程に相当し得、ここではＰＣＲ反応の発生では、ＰＣＲプライマー対は、制限プライマーおよび過剰のプライマーを含む。この過剰のプライマーは、制限プライマーよりも少なくとも２倍高い、少なくとも３倍高い、少なくとも４倍高い、少なくとも５倍高い、少なくとも１０倍高い、少なくとも２０倍高い、少なくとも３０倍高い、少なくとも４０倍高い、少なくとも５０倍高い、少なくとも１００倍高い、少なくとも２００倍高い、少なくとも３００倍高い、少なくとも４００倍高い、少なくとも５００倍高い、または少なくとも１０００倍高い濃度で存在してもよい。この過剰のプライマーは、制限プライマーの濃度よりも２〜８×高い、５〜１０×高い、１０〜１００×高い、１００〜５００×高い濃度で存在してもよい。

例えば、制限プライマーの出発モル濃度は、過剰なプライマーの出発モル濃度未満であってもよい。制限プライマーに対する過剰なプライマーの出発濃度の比は、少なくとも２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１、２０：１、または１００：１であってもよい。制限プライマーに対する過剰のプライマーの比は、５：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１、６５：１、７０：１、７５：１、８０：１、８５：１、９０：１、９５：１、または１００：１であってもよい。いくつかの実施形態では、その比は、２０：１〜１００：１の範囲である。

指数関数的増幅に続いて線形増幅を含む方法の例示的な実施形態は、図２１に示される。出発反応混合物または容積２１０１は、テンプレート核酸２１０２（二本鎖テンプレート核酸であってもよい）、プローブ２１０３（本明細書に記載されるアンプリコンの感度のよい検出のためであって、本発明のプローブは、蛍光性部分およびクエンチャー部分を含む）、過剰プライマー２１０４、および制限プライマー２１０５（標的ポリヌクレオチドの反対鎖にハイブリダイズするように設計されている）、ｄＮＴＰ（示さず）、およびＰＣＲ反応を行うのに必要な任意の他の反応成分（例えば、ポリメラーゼ（示さず））を含んでもよい。いくつかの実施形態では、プローブの蛍光性部分は、このプローブがハイブリダイズしていない状態である場合、クエンチされる（Ｆｉによって示される）。ＰＣＲ反応は、「ホットスタート」（示さず）によって開始されてもよいし、開始されなくてもよい。次いで、この反応混合物は、温度サイクリングを開始し得る。各々の熱サイクルは、変性段階２１１０を含んでもよく、ここでは二本鎖テンプレート核酸が、部分的にまたは完全に、一本鎖２１１１および２１１２に変性される。一般的には、この変性段階の間、プライマーハイブリダイゼーションも、プローブハイブリダイゼーションも起こらない。変性後、アニーリング段階２１２０が開始されてもよく、ここではプライマー２１０４および２１０５が、標的ポリヌクレオチドの一本鎖に対してアニーリングする。この段階の間、アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブ２１０３は一般的には、テンプレート核酸にはハイブリダイズしない。アニーリング段階の後、伸長段階２１３０が開始されてもよく、ここではポリメラーゼがプライマー２１０４および２１０５を伸長し、それによって標的ポリヌクレオチド２１３１および２１３２の２つのコピーが作成される。この段階の間、アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブ２１０３は一般的には、テンプレート核酸にハイブリダイズしない。したがって、熱サイクルの繰り返しによって、標的ポリヌクレオチドの指数関数的増幅が、制限プライマー２１０５が消耗されるまで生じ得、その後に、熱サイクルが、標的ポリヌクレオチドの線形増幅を生じ得る。線形増幅の熱サイクルは、上記されるような変性、アニーリングおよび伸長という同じ反復性サイクルを含んでもよい。変性段階２１４０では、二本鎖の標的ポリヌクレオチド２１３１および２１３２が増幅され、一本鎖２１４１および２１４２に変性される。一般的には、この変性段階の間、プライマーハイブリダイゼーションも、プローブハイブリダイゼーションも起こらない。変性後、アニーリング段階２１５０が開始されてもよく、ここでは過剰のプライマー２１０４が、一本鎖２１４２に対してアニーリングする。この段階の間、アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブ２１０３は一般的には、テンプレート核酸にはハイブリダイズしない。アニーリング段階の後、伸長段階２１６０が開始されてもよく、ここではポリメラーゼがプライマー２１０４を伸長し、それによって標的ポリヌクレオチド２１６１のコピーが作成される。この段階の間、本発明のプローブは一般的には、テンプレート核酸にハイブリダイズしない。この段階の間、一本鎖２１４１は一般には増幅されない。したがって、熱サイクルの繰り返しによって、標的ポリヌクレオチドの線形増幅および一本鎖生成物２１７１の蓄積が生じ得る。一本鎖生成物２１７１の蓄積が生じる温度サイクリングの終了の際、その反応混合物は、冷却工程２１８０で冷却され、例えば、５０℃未満まで冷却され、またはほぼ室温まで冷却され得る。反応混合物を冷却する工程によって、最終の冷却された段階２１９０において標的ポリヌクレオチドに対するプローブ２１０３のハイブリダイゼーションが可能になる。プローブのハイブリダイゼーションは、プローブの完全な伸長を生じ、かつクエンチャー部分の影響から検出可能部分を解放し得る。したがって、この検出可能部分が検出され得る（Ｆ^＊として示される）。

本明細書に記載される方法は、対立遺伝子の識別アッセイに用いられ得る。図２２は、対立遺伝子の識別のための方法の例示的な実施形態を示す。図２２、パネルＡでは、反応混合物または反応容積は、テンプレート核酸、フォワードプライマーおよび必要に応じて遺伝子座を含む領域を増幅するために設計されたリバースプライマーを包含し得る。この遺伝子座は、変異を保有すると疑われ得る。この反応混合物はさらに、溶液中でフリーである場合、一般的には検出可能シグナルを発しない、アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブを包含し得る。このプローブは、ある遺伝子座の特定の対立遺伝子を保有する標的に対して完全にマッチするように設計されている対立遺伝子特異的プローブであってもよい。工程２２１０では、ＰＣＲ増幅は、完全にマッチした標的を含む複数のアンプリコンの生成を生じ得る。いくつかの場合には、このアンプリコンは、一本鎖アンプリコンを含む。いくつかの場合では、このアンプリコンは、二本鎖アンプリコンであってもよい。このような場合、ＰＣＲ増幅後、二本鎖アンプリコンは、例えば、反応混合物を９０〜１００℃（示さず）まで加熱することによって、変性され得る。いくつかの場合では、ＰＣＲ増幅サイクリングパラメータは、ＰＣＲ反応の間、完全にマッチしたテンプレートに対するプローブのハイブリダイゼーションを最小化するように構成される。次の工程２２２０では、反応混合物を冷却して、完全にマッチした標的へのプローブのハイブリダイゼーションを可能にする。いくつかの場合には、プローブのハイブリダイゼーションは、検出可能部分とクエンチャーとの間の距離を増大し、検出可能部分の検出を可能にする。図２２、パネルＢでは、この標的は、遺伝子座の異なる対立遺伝子を保有する。したがって、この標的は、プローブに対してミスマッチである。工程２２１０では、ＰＣＲ増幅は、ミスマッチの標的を含む複数のアンプリコンの生成を生じ得る。いくつかの場合には、このアンプリコンは、一本鎖アンプリコンを含む。いくつかの場合には、このアンプリコンは、二本鎖アンプリコンであってもよい。このような場合、ＰＣＲ増幅後、二本鎖アンプリコンは、例えば、反応混合物を９０〜１００℃まで加熱することによって（示さず）変性され得る。いくつかの場合には、ＰＣＲ増幅サイクリングパラメータは、ＰＣＲ反応の間、テンプレートに対するプローブのハイブリダイゼーションを最小化するように構成される。次の工程２２２０では、反応混合物を冷却して、標的へのプローブのハイブリダイゼーションを可能にする。しかし、プローブ／テンプレートミスマッチに起因して、標的に対するプローブのハイブリダイゼーションは、減少されるか、および／または最小化され得る。このような場合、このプローブは、溶液中でかなりフリーのままであり、従ってクエンチされたままであり得る。いくつかの実施形態では、反応混合物は、複数のプローブを含み得る。特定の実施形態では、複数のプローブの各々のプローブは、ある遺伝子座の特異的な対立遺伝子に特異的である。いくつかの実施形態では、複数のプローブの各々のプローブは、プローブの他の部分とは検出可能に異なる別個の検出可能部分を含む。

図２３は、対立遺伝子検出のためのデジタルＰＣＲ法の別の例示的な実施形態を示し、これは、（１）テンプレート結合領域、および（２）プローブ結合領域を含む、本明細書に記載されるようなオリゴヌクレオチドプライマーと組み合わせて、アンプリコンの感度のよい検出のために、本明細書で記載されるような低Ｔｍプローブを利用する。図２３では、反応混合物または反応容積は、野性型対立遺伝子２３０７または変異体対立遺伝子２３０８のいずれかを含む、テンプレート核酸２３０２を含んでもよい。この反応混合物はさらに、複数の対立遺伝子特異的なフォワードプライマーを含んでもよい。この対立遺伝子特異的なフォワードプライマーは、ある遺伝子座で変異を保有すると疑われる標的ポリヌクレオチド２３０２を増幅するように各々が設計された、第一の対立遺伝子特異的なフォワードプライマーＦｗｄ１（例えば、野性型対立遺伝子に特異的）、および少なくとも第二の対立遺伝子特異的なフォワードプライマーＦｗｄ２（例えば、変異体対立遺伝子に特異的）を含んでもよい。Ｆｗｄ１は、テンプレート核酸２３０２に対して一般的にハイブリダイズしない野性型バーコード領域２３０５を含んでもよい。野性型バーコード領域２３０５は、野性型低Ｔｍプローブに特異的にハイブリダイズするが、変異体低Ｔｍプローブには実質的にハイブリダイズしない野性型バーコード配列を含んでもよい。Ｆｗｄ１はさらに、標的ポリヌクレオチド２３０２に対してハイブリダイズするように設計されており、野性型対立遺伝子２３０７に相補的である３’末端で、またはその近位で（例えば、１〜３ｎｔ内で）ｎｔを含む、テンプレート結合領域２３０６を含んでもよい。フォワードプライマーのうち１つは、変異を覆う部位で変異体対立遺伝子に相補的である変異体特異的なフォワードプライマーであってもよい。Ｆｗｄ２は、テンプレート核酸に対して一般にはハイブリダイズしない変異体バーコード領域２３１０を含んでもよい。この変異体バーコード領域は、変異体低Ｔｍプローブに特異的にハイブリダイズするが、野性型低Ｔｍプローブには実質的にハイブリダイズしない、変異体バーコード配列を含んでもよい。Ｆｗｄ２はさらに、標的ポリヌクレオチド２３０２にハイブリダイズするように設計されており、野性型対立遺伝子２３０８に対して相補的である３’末端で、またはその近位で（例えば、１〜３ｎｔ内で）ｎｔを含む、テンプレート結合領域２３１１を含んでもよい。フォワードプライマーＦｗｄ１およびＦｗｄ２は各々がさらに、変異を覆うｎｔに隣接するか、または１〜３ヌクレオチド内で意図的なミスマッチヌクレオチドを含んでもよい。しかし、いくつかの場合には、このフォワードプライマーは、変異を覆うｎｔに隣接するか、または１〜３ヌクレオチド内で意図的なミスマッチヌクレオチドをさらに含むことはない。この反応混合物はさらに、野性型低Ｔｍプローブ２３０３および変異体低Ｔｍプローブ２３０９を含んでもよい。この野性型低Ｔｍプローブ２３０３は、野性型バーコード領域２３０５の逆相補体に特異的にハイブリダイズするように設計されてもよい。変異体低Ｔｍプローブ２３０９は、変異体バーコード領域２３１０の逆相補体に特異的にハイブリダイズするように設計されてもよい。野性型および変異体の低Ｔｍプローブ２３０３および２３０９は、スペクトル的に別個のフルオロフォアＦ１およびＦ２を含んでもよい。この反応混合物はさらに、リバースプライマー（「Ｒｅｖ」）を含んでもよい。リバースプライマーは、限られた量で存在するフォワードプライマーの量と比較して過剰量で存在してもよい。この反応混合物はさらに、安定なＤＮＡポリメラーゼ「Ｐｏｌ」、およびｄＮＴＰおよび増幅反応を行うための他の成分を含んでもよい。第一の工程では、テンプレートＤＮＡ分子は、上記の反応混合物と接触される。フォワードプライマーＦｗｄ１およびＦｗｄ２は、野性型対立遺伝子２３０７および／または変異体対立遺伝子２３０８のいずれかを含むテンプレートＤＮＡにハイブリダイズし得る。したがって、２３０６の３’末端塩基と変異体対立遺伝子２３０８との間のミスマッチ、および２３１１の３’末端塩基と野性型対立遺伝子２３０７との間のミスマッチが存在する。次の工程では、ＤＮＡポリメラーゼ「Ｐｏｌ」は、２３０７野性型対立遺伝子を含むテンプレートＤＮＡにアニーリングしたＦｗｄ１プライマーの効率的な伸長を促進し得るが、２３０８変異体対立遺伝子を含むテンプレートＤＮＡに対してアニーリングするＦｗｄ１プライマーの効果的な伸長は促進しない（Ｆｗｄ１と２３０８との間のより大きいミスマッチに起因）。同様に、ポリメラーゼ「Ｐｏｌ」は、２３０８変異体対立遺伝子を含むテンプレートＤＮＡにアニーリングしたＦｗｄ２プライマーの効率的な伸長を促進し得るが、２３０７野性型対立遺伝子を含むテンプレートＤＮＡに対してアニーリングされたＦｗｄ２プライマーの効果的な伸長は促進しない（Ｆｗｄ２と２３０７との間のより大きいミスマッチに起因）。効率的な伸長は、野性型バーコード２３０５の逆相補体、または変異体バーコード２３１０の逆相補体を含む伸長生成物を生じる。第二の（かつ任意のその後の回の）増幅では、過剰のＲｅｖプライマーは、２３０５または２３１０のいずれかを含む伸長生成物に対してアニーリングし得（制限プライマーＦｗｄ１およびＦｗｄ２の伸長後）、バーコード２３０５または２３１０のいずれかを含む伸長生成物の線形増幅を促進し得る。増幅サイクルの間、野性型および変異体プローブ低−ＴＭプローブ２３０３および２３０９は、バーコード２３０５および／または２３１０にハイブリダイズしない。増幅サイクルが完了した後、その反応混合物は、例えば、約２５℃まで冷却されてもよく、それによってプローブ２３０３および２３０９を、それらのそれぞれのバーコード２３０５および２３１０にハイブリダイズすることが可能になる。それらのそれぞれのバーコード領域に対するプローブのハイブリダイゼーションは、それらのクエンチャー（Ｑ）からフルオロフォアＦ１およびＦ２を放出し、フルオロフォアの蛍光を促進する。

（アンプリコンの感度のよい検出の適用）
本発明の方法およびキットは、被験体から単離された核酸の鋭敏かつ正確な分析のために用いられ得る。このような検出および分析は、限定するものではないが、診断および／または治療の目的を含む、広範囲の適用について有用であり得る。単なる例に過ぎないが、この検出方法は、被験体における変異の検出のため、被験体における疾患を診断するため、被験体における疾患進行をモニタリングするため、被験体における疾患の治療レジメンの選択における補助のため、被験体における疾患を標的化する治療の有効性を決定するため、または被験体における疾患進行を評価するために用いられ得る。例示的な被験体は、本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、被験体から単離された生物学的サンプル由来の核酸は、アンプリコンの感度のよい検出のために、本明細書に記載の方法および／またはキットを用いて分析される。

例示的な生物学的サンプルは本明細書で記載されている。特定の実施形態では、このサンプルは腫瘍サンプルである。いくつかの実施形態では、この腫瘍サンプルは、プローブベースのアッセイの前に処理される。処理には、ホルマリン溶液中での固定、続いてパラフィン中への包埋（例えば、ＦＦＰＥサンプルである）を包含し得る。処理は、代わりに、プローブベースのアッセイを行う前のサンプルの凍結を包含してもよい。いくつかの実施形態では、サンプルは、固定も凍結もされていない。未固定の未凍結のサンプルは、例に過ぎないが、核酸の保存のために構成された貯蔵溶液中に貯蔵されてもよい。

いくつかの実施形態では、非核酸物質は、酵素処理を用いて（例えば、プロテアーゼで）出発材料から取り除かれてもよい。サンプルは必要に応じてホモジナイゼーション、超音波処理、フレンチプレス、ダウンス（ｄｏｕｎｃｅ）、凍結／解凍に供されてもよく、その後に遠心分離を続けてもよい。遠心分離によって、非核酸含有画分から核酸含有画分を分離してもよい。

核酸は、当該分野で公知の任意の手段を用いて生物学的サンプルから単離されてもよい。例えば、核酸は、液体抽出（例えば、Ｔｒｉｚｏｌ、ＤＮＡｚｏｌ）技術を用いて生物学的サンプルから抽出されてもよい。核酸はまた、市販のキット（例えば、ＱｉａｇｅｎＤＮｅａｓｙキット，ＱＩＡａｍｐキット，ＱｉａｇｅｎＭｉｄｉキット，ＱＩＡｐｒｅｐスピンキット）を用いて抽出されてもよい。

核酸は、単なる例であるが、遠心分離を含む公知の方法によって濃縮してもよい。核酸は、精製の目的のために選択性の膜（例えば、シリカ）に結合され得る。核酸はまた、所望の長さのフラグメント、例えば、１０００、５００、４００、３００、２００または１００の塩基対の長さ未満であるフラグメントに関して富化されてもよい。サイズに基づくこのような富化は、例えば、ＰＥＧ沈殿、電気泳動ゲルまたはクロマトグラフィー材料（Ｈｕｂｅｒら、（１９９３）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２１：１０６１〜６）、ゲル濾過クロマトグラフィー、ＴＳＫゲル（Ｋａｔｏら、（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，９５：８３〜８６）を用いて行われてもよい（この刊行物は、参照によって本明細書に援用される）。

アンプリコンの感度のよい検出のために本明細書で記載されるプローブ、反応混合物、キット、方法、およびシステムは、被験体における疾患の評価で利用され得る。いくつかの実施形態では、この疾患は癌である。この方法は、目的の多数の遺伝子中の変異の存在または不在またはレベルを決定する工程を包含し得る。例えば、この方法は、目的の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、または２００超の遺伝子中の変異の存在または不在またはレベルを決定する工程を包含し得る。この方法は、目的の１〜３、２〜５、４〜１０、５〜２０、１０〜５０、３０〜１００、５０〜１５０、７０〜２００、または２００超の遺伝子中の変異の存在または不在またはレベルを決定する工程を包含し得る。目的の遺伝子は、当該分野で公知の任意の癌関連遺伝子を包含し得る。癌関連遺伝子は本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子は、ＳＮＰ、挿入、欠失、または転座を保有すると疑われる遺伝子である。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子は、コピー数変動を保有していると疑われる遺伝子である。

この方法は、遺伝子のサブセット中のコピー数変動の有無またはレベルを決定する工程を包含し得る。この方法は、参照遺伝子のセットに対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、または５０超の遺伝子、例えば、癌関連遺伝子中のコピー数変動を決定する工程を包含し得る。いくつかの場合には、この方法は、１つ以上の遺伝子（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９遺伝子）のコピー数変動を決定する工程を包含する。この遺伝子は、ＭＥＴ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＬＴ３、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、ｍＴＯＲ、ＣＤＫ４、ＨＥＲ２、ＲＥＴ、ＤＤＲ２、ＡＵＲＫＡ、ＶＥＧＦＡ、ＣＤＫ６、ＪＡＫ２、ＢＲＡＦ、およびＳＲＣからなる群より選択され得る。いくつかの場合には、この方法は、ＥＧＦＲ、ＡＵＲＫＡ、ＶＥＧＦＡ、ＦＧＦＲ１、ＣＤＫ４、ＥＦＢＢ２、ＣＤＫ６、ＪＡＫ２、ＭＥＴ、ＢＲＡＦ、ＥＲＢＢ３、およびＳＲＣからなる群より選択される１つ以上の遺伝子（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３遺伝子）のコピー数変動を決定する工程を包含し得る。この参照遺伝子は、例えば、ＨＡＤＨ、ＺＦＰ３、ＲＮａｓｅＰであってもよい。癌を評価する方法は、本明細書に記載のようなアンプリコンの感度のよい検出のためのプローブを用いて、本明細書に記載のようなアンプリコンの感度のよい検出のためのプローブベースのアッセイを行う工程を包含し得る。

本発明の１つ以上の方法は、コピー数変動分析のために用いられ得る。コピー数変動に関する方法は、２つのアッセイを含んでもよい。この２つのアッセイは、標的アッセイであっても、参照アッセイであってもよい。この標的アッセイは、コピー数変動を保有すると疑われる標的領域に特異的なプライマー／プローブセットを利用し得る。参照アッセイは、コピー数変動を保有しないことが公知であるか、または疑われる参照領域について特異的であるプライマー／プローブセットを利用し得る。標的および参照領域は、同じ染色体上であっても、または異なる染色体上であってもよい。この標的領域は、任意の染色体中の領域、例えば、ヒト染色体第１３、第１８、第２１、Ｘ、またはＹの領域であってもよい。標的領域のコピー数変動は、当該分野で公知の任意の手段によって、例えば、推定の標的対参照の濃度の間の比によって、または標的対参照領域の濃度における相違の統計学的分析によって、推定され得る。

いくつかの実施形態では、癌を評価するための方法は、それを必要とするヒト被験体に由来するＤＮＡサンプル中のＶＥＧＦＡ、ＥＧＦＲ、ＣＤＫ６、ＭＥＴ、ＢＲＡＦ、ＦＧＦＲ１、ＪＡＫ２、ＨＥＲ３、ＣＤＫ４、ＨＥＲ２、ＳＲＣ、およびＡＵＲＫＡからなる群より選択される１２の遺伝子のコピー数変動の分析を包含する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡサンプルは、腫瘍生検、または腫瘍ＤＮＡを保有すると疑われる組織生検由来である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡサンプルは、被験体から単離された液体生物学的サンプル由来である。例示的な液体生物学的サンプルは、本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、ＤＮＡサンプルは、複数の反応混合物に分割される。ＤＮＡサンプルは、各々の反応混合物が、０−２のＤＮＡテンプレート分子を含むように分割され得る。各々の反応混合物は、本明細書に記載されるようなアンプリコンの感度のよい検出のためのプライマー／プローブセットを含んでもよい。プライマー／プローブセットは、コピー数変動（例えば、遺伝子増幅）を有することが疑われる遺伝子内の目的の領域を増幅するように設計され得る。各々のプライマー／プローブセットは、フォワードプライマー、リバースプライマー、およびプローブを含んでもよい。特定の実施形態では、各々のプライマー／プローブセットは、あるプライマーを、限られた量のリバースプライマー（例えば、制限プライマー）に比較して過剰量で含む（例えば、過剰プライマー）。各々のプライマー／プローブセットは、過剰のプライマーと制限プライマーとの間に位置する領域に対して選択的にハイブリダイズするように設計されている低Ｔｍプローブを含んでもよい。いくつかの実施形態では、コピー数変動を有していると疑われる領域はまた、公知の変異の部位を保有する。いくつかの実施形態では、低Ｔｍプローブは、変異部位を覆うように設計される。いくつかの実施形態では、この低Ｔｍプローブは、野性型対立遺伝子に対応するように設計される。いくつかの実施形態では、このＴｍプローブは、野性型対立遺伝子に対してよりも変異体対立遺伝子に対して多数のミスマッチを有するように設計される。いくつかの実施形態では、各々の反応混合物はまた、参照遺伝子についてプライマー／プローブセットを含む。この参照遺伝子は、例えば、ＲＮａｓｅＰ３０、ＨＡＤＨ、ＺＦＰ３であってもよい。いくつかの実施形態では、この参照プライマー／プローブセットは、フォワードプライマー、リバースプライマー、およびプローブを含む。特定の実施形態では、この参照プライマー／プローブセットは、過剰のプライマーおよび制限プライマー（参照遺伝子のある領域を増幅するように設計されている）を含む。いくつかの実施形態では、この参照プライマー／プローブセットはさらに、この過剰プライマーと制限プライマーとの間に位置する参照遺伝子のある領域に対してハイブリダイズするように設計されている低Ｔｍプローブを含む。いくつかの実施形態では、分割された反応混合物は、増幅反応に供される。いくつかの実施形態では、この増幅反応は、ＰＣＲサイクルを包含し、ここではこのＰＣＲサイクルは、低Ｔｍプローブの実質的なアニーリングを生じる温度工程を包含しない。いくつかの実施形態では、十分な数のＰＣＲサイクルを行って、制限プライマーを消費し、これによって、過剰なプライマーを利用する線形の増幅を生じる。いくつかの実施形態では、ＰＣＲサイクルの後、その反応混合物を、増幅生成物に対する低Ｔｍプローブのアニーリングを可能にする温度まで冷却する。いくつかの実施形態では、低Ｔｍプローブのアニーリング後、その反応混合物を、アニーリングした低Ｔｍプローブの蛍光検出のために評価して列挙する。いくつかの実施形態では、ＣＮＶのコールを、評価および列挙に基づいて生成する。

いくつかの実施形態では、アンプリコンの感度のよい検出のための１つ以上の方法は、反応混合物および核酸サンプルを増幅の前に別個の容積に分割する工程を包含する。例えば、１つ以上の方法は、デジタルＰＣＲを含んでもよい。分割／デジタルＰＣＲのための方法、キット、およびシステムは本明細書に記載される。

（アンプリコンの感度のよい検出のためのキット）
また本発明では、アンプリコンの感度のよい検出のためのキットも提供される。キットは本明細書に記載のような１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを含んでもよい。いくつかの実施形態では、このプライマーおよび／またはプローブは、遺伝子座の個々の対立遺伝子を選択的に検出し得る。キットは、例えば、１つ以上のプライマー／プローブセットを含んでもよい。例示的なプライマー／プローブセットは、本明細書に記載されている。例えば、キットには、ＭＥＴ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＬＴ３、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、ｍＴＯＲ、ＣＤＫ４、ＨＥＲ２、ＲＥＴ、ＨＡＤＨ、ＺＦＰ３、ＤＤＲ２、ＡＵＲＫＡ、ＶＥＧＦＡ、ＣＤＫ６、ＪＡＫ２、ＢＲＡＦ、ＳＲＣおよびＲＰＰ３０のためのプライマー／プローブセットを含んでもよい。キットはさらに、１つ以上のプライマー／プローブセットの使用説明書、例えば、本発明の方法を行うための説明書を含んでもよい。いくつかの実施形態では、キットは、包装資材を含む。本明細書において用いる場合、「包装資材」という用語は、キットの構成要素を収容する物理的構造を指す。包装資材は、キットの構成要素の無菌性を維持し得、かつこのような目的のために通常用いられる資材（例えば、紙、段ボール、ガラス、プラスチック、ホイル、アンプルなど）から構成されてもよい。キットはまた、緩衝剤、防腐剤、またはタンパク質／核酸安定化剤を含んでもよい。キットはまた、本明細書に記載されるような反応混合物の他の構成要素を含んでもよい。例えば、キットは、本明細書に記載のような熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの１つ以上のアリコート、および／またはｄＮＴＰの１つ以上のアリコートを含んでもよい。キットはまた、ある遺伝子座の個々の対立遺伝子を保有する既知量のテンプレートＤＮＡ分子のコントロールサンプルを含んでもよい。いくつかの実施形態では、このキットは、陰性のコントロールサンプル、例えば、ある遺伝子座の個々の対立遺伝子を保有するＤＮＡ分子を含まないサンプルを含む。いくつかの実施形態では、このキットは、陽性コントロールサンプル、例えば、遺伝子座の個々の対立遺伝子のうちの１つ以上の既知の量を含有するサンプルを含む。

（アンプリコンの感度のよい検出のためのシステム）
本発明ではまた、アンプリコンの感度のよい検出のためのシステムも提供される。いくつかの実施形態では、このシステムは、本明細書に記載のようなアンプリコンの感度のよい検出のための反応混合物を提供する。いくつかの実施形態では、この反応混合物は、ＤＮＡサンプルと混合されて、テンプレートＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、このシステムはさらに、液滴発生装置（ｄｒｏｐｌｅｔｇｅｎｅｒａｔｏｒ）を設けており、これがテンプレートＤＮＡ分子、プローブ、プライマー、および他の反応混合物成分を油中水型エマルジョン中で複数の液滴に分割する。例示的な液滴発生装置は、本明細書に記載される。

（実施例１）
図２４は、被験体中で癌を評価するために用いられる方法を示す。被験体は、結腸鏡検査を行い、結腸腫瘍を保有することが発見される。腫瘍生検および血液採取は、０の時点で被験体から収集され、その被験体での結腸癌の診断を補助するのに用いられる。第一の血液採取からの腫瘍および正常細胞を配列決定した。配列決定によって、被験体の腫瘍中の３つの変異の存在が明らかになった。変異は、ＡＰＣ、ＫＲＡＳ、およびＴＰ５３の遺伝子における点変異であった。被験体の癌のステージを決定した。被験体は、腫瘍を除くために第一の処置（手術）を受けた。第一の処置の際、第二の血液採取を行った。これで被験体の腫瘍が転移したことを確認した。被験体は、その癌を管理するために第二の治療（化学療法）を施された。引き続く血液採取を行って、血液由来の無細胞ＤＮＡ中の３つの遺伝子の変異状態を評価する。

（実施例２）：結腸癌を有する被験体での腫瘍特異的な変異についての検証解析
ＫＲＡＳＧ１２Ａ変異（ｍｕ）を保有しているＮＣＩ−Ｈ１５７３（ＣＲＬ−５８７７）細胞株は、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）の凍結ストックとして得た。ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）は、製造業者の示唆したプロトコールに従って、市販されているキット（ＤＮｅａｓｙＢｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅキット，ＱＩＡＧＥＮ）を用いて細胞株材料から調製した。ＤＮＡ濃度の推定は、ＯＤ２６０を測定することによって分光光度的に得た（ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｃ．）。

ＮＡ１８５０７細胞株由来のゲノムＤＮＡを、野性型ＤＮＡ（ｗｔ）の代用として用いて、精製されたストックとして得た（Ｃｏｒｉｅｌｌ）。ｗｔ（３０ｎｇ）およびｍｕ（６ｎｇ）ＤＮＡを含む２マイクロリットルの混合物を、２×ｄｄＰＣＲスーパーミックス（プローブのため）、０．２ｕＭの最終の各々のフォワードプライマー（ｗｔ：５’−ＡＧＡＴＴＡＣＧＣＧＧＣＡＡＴＡＡＧＧＣＴＣＧＧＴＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＴＡＣＴＡＣＴＴＧＣＣＴＡＣＧＣＣＡＣＣ−３’（配列番号１））；ｍｕ：５’ＡＡＴＡＧＣＴＧＣＣＴＡＣＡＴＴＧＧＧＴＴＣＧＧＴＣＧＴＡＡＣＴＴＡＧＧＡＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡＣＧＣＣＡＧＣ−３’（配列番号２）、０．４ｕＭのリバースプライマー（５’−ＣＣＴＧＣＴＧＡＡａＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴ−３’（配列番号３））、および１ｕＭの各々のレポータープローブ（ｗｔ：５’−ＨＥＸ−ＣＣＡＡＣＣＧＡＧ／ＺＥＮ／ＣＣＴＴＡＴＴＧＣＣＧ−ＩＡＢｋＦＱ−３’（配列番号４）；ｍｕ：５’−ＦＡＭ−ＡＧＴＴＡＣＧＡＣ／ＺＥＮ／ＣＧＡＡＣＣＣＡＡＴＧＴＡＧＧ−ＩＡＢｋＦＱ−３’（配列番号５））から、２０μｌのｄｄＰＣＲ反応ミックスへ、アセンブルした。次に、各々のＰＣＲ混合物を、製造業者の示唆に従って、ＱＸ１００ｄｄＰＣＲシステムを介して分析のために液滴に変換した。アニーリング温度を変更して、ｗｔ（ＨＥＸ）およびｍｕ（ＦＡＭ）の液滴シグナルを分離して定量するための最適条件を決定した（図２５）。得られたクラスターを、ｍｕまたはｗｔとして各々のクラスターのメンバーシップを割り当てるために、ｍｕのみ（２６Ａ）、ｗｔのみ（２６Ｂ）、または両方のプローブ（２６Ｃ）を含むｄｄＰＣＲ混合物を用いることによって、デコンボリューションした（図２６）。

（実施例３）：標的富化ライブラリー調製のためのＤＮＡサンプル処理
断片化されたか、および／または損傷されたＤＮＡ（例えば、ＦＦＰＥサンプル由来）の１００ｎｇ（約３３０００ゲノム等価物）を、最初に、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、１ｍＭのＡＴＰ、および１５％ＰＥＧ−８０００（１×リガーゼ反応緩衝液中）の存在下で、で１００ｕｌの最終の反応容積で、修復酵素（ＥｎｄｏＶＩＩＩ、Ｆｐｇ、およびＵＤＧ）のカクテルを使用して酸化型および無塩基部位を切り出すことによって修復して、ＤＮＡフラグメント（５’−リン酸塩および３’−ＯＨで終わる）を生成した。

修復されたＤＮＡを、市販されているキット（ＧｅｎｅＪｅｔ；ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて精製した。次いで、溶出したＤＮＡ（５０ｕｌ）を、ＬＰＡおよびＴｒｉｓ緩衝液（１０ｍＭのＭｇ^２＋を含有）の存在下で、ＰＥＧ−８０００（最終２０％）での沈殿を介して濃縮した。得られたペレットを０．５ｍｌの７０％エタノールで１回リンスして、５分間風乾した。

（実施例４）：ＤＮＡフラグメントの５’アダプターライゲーション
上記のように調製された修復されたＤＮＡを、２ｕｌのヌクレアーゼフリーの水中に再懸濁した。次いで、修復されたＤＮＡを、アルカリ（ＮａＯＨまたはＫＯＨ）での短い処理、続いて酢酸ナトリウムでの中和を通じて、完全に、または部分的にいずれかで化学的に変性させてもよく；または好ましくは氷上での急速冷却で熱変性させてもよい（９５℃で３分）。

修復されたＤＮＡを、表２に示されるようなアデニル化反応混合物中で以下の成分を組み合わせることによって事前アデニル化した：

６５℃で１時間のインキュベーション後、以下の成分（表２）をアデニル化反応混合物に添加した。追加のリガーゼの効果を試験するために、ライゲーション混合物に、２μｌのリガーゼを添加するか、または追加のリガーゼは添加しなかった。

その反応は、６５℃で１時間インキュベートし、続いて８０℃で１０分間、次いで９５℃で３分熱不活性化した。次いで、１μｌのプロテアーゼを添加して、その反応物を３７℃で３０分間インキュベートし、続いて７５℃で１５分間熱不活性化した。得られたライゲーション生成物を沈殿して、未反応のアダプターを取り除き、上記のように洗浄した。

（実施例５）：３’末端アダプターライゲーション
実施例１で調製される修復されたＤＮＡ、または実施例２で調製された５’−適合したＤＮＡライブラリーを、２μｌのヌクレアーゼフリーの水に再懸濁した。次いで、これを、アルカリ（ＮａＯＨまたはＫＯＨ）での短い処理、続いて酢酸ナトリウムでの中和を通じて、完全に、もしくは部分的にいずれかで化学的に変性させてもよく；または好ましくは氷上での急速冷却で熱変性させてもよい（９５℃で３分）。

３’アダプターＤＮＡを、表４に示されるアデニル化反応混合物中で以下の成分を組み合わせて、事前アデニル化した。

６５℃で１時間のインキュベーション後、以下の成分（表４）を、アデニル化反応混合物に添加した。変性されたＤＮＡとは、実施例１で調製された修復ＤＮＡ、または実施例２で調製された５’適合したＤＮＡのいずれかを指す。追加のリガーゼの影響を試験するために、２μｌのリガーゼをライゲーション混合物に添加するか、または追加のリガーゼをライゲーション混合物に添加しなかった。

反応物を６５℃で１時間インキュベートし、続いて８０℃で１０分間、次に９５℃で３分熱不活性化した。

１μｌのプロテアーゼを添加し、その反応物を３７℃で３０分間インキュベートし、続いて７５℃で１５分間熱不活性化する。

得られたライゲーション生成物を、沈降させて、上記のように洗浄して未反応のアダプターを除き、０．１％のＢＳＡを含有する１０μｌの１×ＮＥＢ４中に再懸濁した。

（実施例６）：ｄｄＰＣＲを介したライゲーションの有効性の定量
図２７は、本明細書に記載のライゲーション方法の効率を定量するための方法の例示的な実施形態を示す。ビオチン化したオリゴヌクレオチド（５’または３’アダプター）に対する核酸分子（ＮＡ）のライゲーションは、上記のように行った。ライゲーション反応は、サンプル核酸に共有結合したビオチン化オリゴヌクレオチドを含むライゲーション生成物（ライゲーションしたＮＡ）を生じ得、かつ可能性としてはまた、ライゲーションしていないサンプル核酸（未ライゲーションＮＡ）も生じ得る。ライゲーション生成物は、２０分間２２，０００ｇで遠心分離することによって沈降させた。上清を除去して、ペレットを５ｕｌの０．１×ＴＥＴ緩衝液（１ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０、ｐＨ＝８）中に再懸濁した。再懸濁したペレットを、１×ＮＥＢ＋０．１％ＢＳＡおよび１×ＮＥＢ４で事前洗浄した、ストレプトアビジンコンジュゲートの磁性粒子（ＭａｇＣｅｌｌｅｃｔ，Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を含む、１０μｌのストレプトアビジン−磁性流体中で５０μｌの最終容積にさせた。室温で１５分間のインキュベーション後、混合物を５分間磁化した。遊離であり、したがって連結されていないサンプル核酸を含む上清を除去した。ライゲーション生成物を含む残りの結合物質を５０μｌの１×ＮＥＢ４＋０．１％ＢＳＡ中で再懸濁した。５マイクロリットルの結合した画分および未結合の画分を、ＲＮａｓｅＰ遺伝子の遺伝子座に対して設計されたｔａｑｍａｎアッセイによってｄｄＰＣＲを介して問い合わせた。ライゲーション効率は、［結合シグナル］／（［結合シグナル］＋［未結合シグナル］）として算出した。

５’および３’アダプターライブラリー調製のライゲーション効率（実施例２および３）は、上記のように定量した。図２８は、それぞれ、５’末端アダプターライゲーションおよび３’末端アダプターライゲーション反応についてのｄｄＰＣＲの結果を示す。図２８の上のパネルに示す結果は、２工程の５’末端アダプターライゲーション反応（ここでアデニル化およびライゲーション工程が逐次的に行われる）は高度に効率的であったことを示している。追加のリガーゼなしで、結合したシグナルの平均濃度は、４５．３５コピー／μｌであったが、未結合シグナルの平均濃度は、４．５０５コピー／μｌであって、このことは９０．９％というライゲーション効率を示している。追加のリガーゼでは、結合したシグナルの平均濃度は、３６．６コピー／μｌであったが、未結合シグナルの平均濃度は、４．４３コピー／μｌであって、このことは、約８９％というライゲーション効率を示している。

図２８、底部のパネルに示す結果によって、２工程の３’末端アダプターライゲーション反応（ここではアデニル化およびライゲーション工程が連続して行われた）は高い効率であったことが示される。伝統的な１工程のライゲーション反応（ここでは、アデニル化およびライゲーション工程が１つの反応で同時に生じる）に関しては、結合されたシグナルの平均濃度は、１４．２５コピー／μｌであったが、未結合シグナルの平均濃度は、３６．５５コピー／μｌであって、このことは、２８％というライゲーション効率を示している。対照的に、リガーゼのさらなる追加なしで行われた２工程の３’末端アダプターライゲーションについては、結合したシグナルの平均濃度は、７３．７５コピー／μｌであって、一方未結合シグナルの平均濃度は、１．４９コピー／μｌであって、これは９８％というライゲーション効率を示している。アデニル化後にリガーゼのさらなる追加なしで行われた２工程の３’末端アダプターライゲーションについては、結合したシグナルの平均濃度は、７１．７コピー／μｌであったが、一方未結合シグナルの平均濃度は、２．３８コピー／μｌであって、これは９６．８％というライゲーション効率を示している。これらの結果から、アデニル化およびライゲーション反応を単一の反応混合物中で連続して行うことの可能性が実証された。さらに、２工程のプロセス（アデニル化およびライゲーションが単一の反応混合物中で別々に行われる）がライゲーション効率を大きく向上することが確認された。

別の驚くべき結果は、ＡＴＰだけでなく、リガーゼ濃度も、ライゲーション工程の開始の際に反応成分（例えば、水、緩衝液、ＰＥＧ、Ｍｎ^２＋）のさらなる添加によって同じ程度まで希釈されるという事実にかかわらず、アデニル化後の反応混合物に対するリガーゼのさらなる添加が、ライゲーション効率を向上するとは思われないということである。理論で拘束されることは望まないが、アデニル化されているドナー核酸分子は、リガーゼ酵素に対して複合型のままである可能性がある。ＡＴＰの希釈およびアクセプター核酸分子の添加の際、複合型のリガーゼ酵素は、阻害から解放され得、アデニル化されている核酸分子に対するアクセプター核酸分子のライゲーションを触媒し得る。

（実施例７）：ライゲーション効率に対するアダプター長およびＰＥＧ−８０００の効果
サンプルＤＮＡは、１５または２０％のＰＥＧ−８０００を含む反応混合物中で実施例２に記載されるように調製され、アデニル化された。アデニル化後、長さ１９ｎｔ、４１ｎｔ、または６１ｎｔのアダプターが、実施例４に記載のようなアデニル化ＤＮＡに連結された。ＭｔｈＲＮＡリガーゼまたはＣｉｒｃＬｉｇａｓｅＩＩのいずれも、ＡＴＰ依存性ＲＮＡリガーゼとして用いられた。図２９は、上記のライゲーション反応条件についてのｄｄＰＣＲの結果を示す。その結果によって、アダプター長がライゲーション効率に影響し得ること、およびＣｉｒｃＬｉｇａｓｅＩＩがＲＮＡリガーゼとして用いられる場合、２０％のＰＥＧ−８０００が長い（例えば、６１ｎｔ）アダプターライゲーション反応の効率を増大するために用いられ得ることが示される。

（実施例８）：ライゲーション効率に対する２０％のＰＥＧ−８０００におけるＭｎ^２＋対インキュベーション温度の影響
サンプルＤＮＡは、２０％のＰＥＧ−８０００を含む反応混合物中で、実施例４に記載の２工程アデニル化／ライゲーション方法を用いて調製され、アデニル化された。ＭｔｈＲＮＡリガーゼ、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅＩＩ、またはＴ４ＲＮＡリガーゼ（市販されているＡＴＰ依存性ＲＮＡリガーゼに相当する）のいずれかを用いた。アデニル化およびライゲーション反応は、３７、６０、６５、または７０℃で各々１時間インキュベートした。そのライゲーション反応は、０、２．５ｍＭ、５ｍＭ、または７．５ｍＭのＭｎ^２＋の存在下で行った。図３０は、上記のライゲーション反応条件についてｄｄＰＣＲの結果を示す。Ｙ軸は、対数目盛で示される。したがって、Ｙ軸のグリッド線（例えば、Ｙ軸上に表示される）の間の距離よりも大きい、結合シグナル対フリーのシグナルのなんらかの相違は、９０％以上のライゲーション効率を示す。これらの結果、全ての市販のＡＴＰ依存性ＲＮＡリガーゼについて９０％を超えるライゲーション効率を生じるように反応条件が仕立てられ得ること、およびＭｎ^２＋がライゲーション工程を容易にすると思われることが示される。

（実施例９）：３’末端適合したライブラリーの（任意の）線形増幅
実施例３によって調製された再懸濁された３’末端ライブラリーの５μｌのアリコートを、線形増幅のために以下の混合物（表６）にアセンブルする：

適合したライブラリーは、以下のサイクリングパラメータによって増幅される：９８℃で３分；９８℃で１０秒、６８℃で１０秒、７２℃で５分、２０サイクル；７２℃で５分；４℃で保持。

完了の際、全体的な反応は、１×ＮＥＢ４で、３７℃で３０分間事前洗浄された、ストレプトアビジン−コンジュゲートした磁性粒子（ＭａｇＣｅｌｌｅｃｔ，Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を含む１０μｌのストレプトアビジン磁性流体とともにインキュベートする。

この溶液を、５分間磁化して、増幅されたライブラリーメンバーを含む溶液相を取り出す。

その溶液相を、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）を用いて抽出し、その水層を、１容積の５ＭＮＨ４・酢酸、および１容積のイソプロパノールで沈殿させる。

−２０℃で２０分間インキュベーションした後、溶液を３０分間、４℃で２２，０００ｇで遠心分離する。

得られたペレットを５００μｌの７０％エタノールを用いて１回洗浄し、５分間風乾する。

（実施例１０）：オリゴ選択性仕上げ（リバースＯＳ−ｓｅｑ）
単一の５’アダプター配列を含むＤＮＡライブラリーのメンバーは、３’アダプター配列の標的選択性追加を受ける場合がある。所望の標的領域に対する３’アダプター配列の付加のための方法は、参照によって本明細書に援用される、例えば、米国特許出願公開第２０１２０１５７３２２号に記載される。実施例４によって調製され、必要に応じて実施例９に応じて増幅された、５’適合したライブラリーを、以下の混合物に添加された、０．１％ＢＳＡを含む１×ＮＥＢ４中に再懸濁する（表７）：

上記の反応混合物を、以下のパラメータの下で変性して、アニーリングする：９５℃で２分；９５℃で１０秒；−１℃／サイクル、０．１℃／ｓ、２４サイクル；７２℃で３０分。

次いで、アニーリングされた混合物を、以下のポリメラーゼ混合物を添加することによって伸長する（表８）：

７２℃で１０分間のインキュベーション後、反応物を３７℃にさせる。

次いで、未完成のフラグメントおよび伸長されていないオリゴヌクレオチドを、必要に応じて、ＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩまたはＥｘｏ−ＳＡＰＩＴを用いて３０分間インキュベーションすることによって除去してもよい。

１μｌのプロテアーゼを添加し、その反応物を３０分間３７℃インキュベートし、続いて７５℃で１５分熱不活性化する。

次いで、反応物を１容積の２×ＰＥＧｐｐｔ溶液（１×ＮＥＢ４，１０ｕｇのＬＰＡ，３０％のＰＥＧ−８０００）による沈降によって精製する。

（実施例１１）：増幅によるオリゴ選択性の仕上げ（リバースＯＳ−ｓｅｑ）
実施例４に従って調製され、必要に応じて実施例９に従って増幅された５’適合したライブラリーを、実施例１０に記載のようにアニーリングする。

７２℃で１０分間のインキュベーション後、生成物は、以下のサイクリングパラメータによって直ちに増幅される：９８℃で１０秒、６８℃で１０秒、７２℃で２分、２０サイクル；７２℃で５分間；４℃で保持。

次いで、伸長した生成物を、伸長プライマーの添加によって二本鎖にする。

次いで、未完成のフラグメントおよび伸長されていないオリゴヌクレオチドを、ＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩまたはＥｘｏ−ＳＡＰＩＴでの３０分間のインキュベーションによって取り除く。

（実施例１２）：ライブラリーの環化
第一の末端で単一のアダプター配列を含むＤＮＡライブラリーのメンバーは、ライブラリー環化方法を用いて第二の末端で第二のアダプター配列の標的選択性の添加を受ける場合がある。例示的なライブラリー環化方法は、参照によって本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１２０００３６５７号に記載される。３’末端適合したライブラリーフラグメントは、上記のように、非パリンドロームのヘキサマーを用いて調製される（例えば、米国特許出願公開第２０１２０００３６５７号に記載のとおり、３’アダプターとして。

Ｔ７プロモーター配列および３’末端アダプターに相補的な３’オーバーハングを保有する、環化アダプター（米国特許出願公開第２０１２０００３６５７号における）を、１０倍モル過剰で３’適合したライブラリーフラグメントにアニーリングする。

次いで、そのフラグメントを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの追加によって連結し、標的領域保有環状生成物を作成する。あるいは、ポリメラーゼを用いて、標的領域保有環状生成物を作成してもよい。

直鎖状生成物を、ＥｘｏＩＩＩおよびＥｘｏＩのカクテルとのインキュベーションを通じて取り除く。

（実施例１３）：蛍光的に標識されたライブラリー
５’末端適合したライブラリーフラグメントを、実施例４において上記されたように、蛍光的に標識された（Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＡＭ、ＨＥＸなど）オリゴ−ｄＴヘキサマーを、５’アダプターとして用いて調製する。得られたライゲーション生成物を、アレイＣＧＨシステム、ビーズアレイシステムなどに対してハイブリダイズしてもよい。

（実施例１４）：直接配列決定
３’末端ブロック基「ｘ」（ジデオキシ−ｄＮＴＰ、ビオチン化など）で終わり、プライマー部位を保有している５’−アデニル化されたオリゴヌクレオチド（化学的にまたは酵素的に）、ならびに、表面結合オリゴヌクレオチドに相補的な領域（フローセルまたはビーズ）を、実施例３に記載のように、Ｔ４またはＭｔｈから、短縮されたまたは変異されたＲＮＡリガーゼ２によって媒介される天然のＤＮＡの３’末端に連結する：
５’−Ｐ−ＤＮＡ−ＯＨ−３’＋５’−Ａｄ−アダプターＢ−ｘ−３’＝＞５’−Ｐ−ＤＮＡ−アダプターＢ−ｘ−３’。

次いで、この後に、ＲＮＡリガーゼまたはＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（第二のプライマー部位を含む）および他の表面結合オリゴヌクレオチド（フローセルまたはビーズ）に相補的な領域を用いる第二のｓｓＤＮＡアダプターの連結を続け、直接配列決定され得る全長生成物を作成する。第二のライゲーションは、実施例２に記載のとおり行ってもよい：
５’−ＨＯ−アダプターＡ−ＯＨ−３’＋５’−Ｐ−ＤＮＡ−アダプターＢ−ｘ−３’＝＞５’−ＨＯ−アダプターＡ−ＤＮＡ−アダプターＢ−ｘ３’。

あるいは、断片化されたＤＮＡは、修復の際に脱リン酸化されてもよい（上記のとおり）：
５’−Ｐ−ＤＮＡ−ＯＨ−３’＝＞５’−ＨＯ−ＤＮＡ−ＯＨ−３’
脱リン酸化および変性（アルカリまたは熱）の後、リン酸化アダプター（化学的にまたは酵素的に）は、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅを用いて、断片化されたＤＮＡに連結され得る：
５’−ＨＯ−ＤＮＡ−ＯＨ−３’＋５’−Ｐ−アダプターＢ−ｘ−３’ ＝＞５’−ＨＯ−ＤＮＡ−アダプターＢ−ｘ−３’。

次いで、このアダプター修飾ライブラリーは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで酵素的にリン酸化され得る：
５’−ＨＯ−ＤＮＡ−アダプターＢ−ｘ−３’＝＞５’−Ｐ−ＤＮＡ−アダプターＢ−ｘ−３’。

次いで、第二のアダプターが、Ｃｉｒｃｌｉｇａｓｅによるライゲーションによって導入されてもよい：
５’−Ｐ−ＤＮＡ−アダプターＢ−ｘ−３’＋５’−ＨＯ−アダプターＡ−ＯＨ−３’＝＞５’−ＨＯ−アダプターＡ−ＤＮＡ−アダプターＢ−ｘ−３’
次いで、得られたライブラリーメンバーを、以下のとおりＩｌｌｕｍｉｎａフローセルシステムまたはビーズベースのシステム（Ｉｏｎ−ｔｏｒｒｅｎｔ／Ｒｏｃｈｅ４５４）のいずれかを用いて直接配列決定してもよい。図３１は、ＩｌｌｕｍｉｎａＮＧＳプラットフォームを用いる配列決定の例示的な実施形態を示す。

（実施例１５）：標的配列の捕獲および富化のためのオリゴヌクレオチドプライマーの調製
一連のｐｙｔｈｏｎスクリプトを作成して、核酸サンプルから標的配列の捕獲および富化のためのオリゴヌクレオチドプライマーのセットを生成した。下の表９に列挙される遺伝子に相当するエキソンの位置は、ＣＣＤＳリリース１５から整理した。

重複するエキソン位置を有するエントリーを合併して、重複するエキソンにまたがる単一のエントリーを作成した。次いで、生成された座標を用いて、５’末端および３’末端の両方で６００塩基のパッドを有する対応するヒト参照ゲノム構築物（ＧＲＣｈ３７．ｐ１３）から配列を抽出した。次いで、エキソンに隣接するセンスおよびリバースの相補鎖の両方についてのオリゴヌクレオチド配列を、以下の基準にしたがって同定した：（１）１０ヌクレオチド〜３６ヌクレオチド長；（２）５６〜６０℃の間の７０％画分アニーリング温度を保有すること；（３）３０％〜７０％のＧＣ含量を保有すること；（４）４連続塩基未満のＣまたはＧホモポリマーストレッチを保有すること；（５）６以上のパリンドローム配列がないこと；（６）５０％未満の自己相補性。エキソン隣接オリゴの同定の際、エキソン隣接オリゴヌクレオチドの間の距離が３００超である場合、偶数の（＋）および（−）のオリゴヌクレオチドプローブが作成され得るように、３００塩基未満の最大のプローブ間距離が算出され、その領域が、最小の、目的の領域を分割する偶数のプローブを有するように、２つの隣接オリゴの間の領域がさらに分割される。これらの位置を用いてウインドウを検索し、上記で概説した基準に従ってオリゴヌクレオチドプローブを同定した。表Ｘ（上記）の遺伝子のエキソンに相当するセンス鎖およびアンチセンス鎖のおよそ３００ｎｔごとをタイル表示するように設計された捕獲配列を同定した（例えば、配列番号１２５〜１９４７）。

オリゴヌクレオチド捕獲配列を、標準的なバーコード化されたＩｌｌｕｍｉｎａＰ５アダプター配列の３’末端に付加して、センスおよびリバースの相補鎖受容の固有バーコードを標的にする標的選択性オリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）プライマーのセットを作成した。例示的なＴＳＯプライマーの図解を図３２に示す。プライマーは、例えば、３’末端で２ホスホロチオエート結合および最後から２番目の塩基を用いる標準的なホスホロアミダイト化学を用いて個々に合成された（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。ＴＳＯプライマーを、鎖によってプールした。全てのセンス鎖ＴＳＯを、ＴＳＯＳｅｔ１プライマー（配列番号１９４８−３７７０）としてプールした。全てのリバース鎖ＴＳＯを、ＴＳＯＳｅｔ２プライマー（配列番号３７７１〜５５９３）としてプールした。

（実施例１６）：バーコード化による多重標的化配列決定
複数の精製されたＤＮＡサンプルを同時に処理するために、以下のプロトコールを設計する。これらのサンプルは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＰＥＴ）材料から、新鮮凍結組織（ＦＦＴ）から、または流体サンプル（例えば、全血または実質的に無細胞のサンプル、例えば、血漿または血清、尿、粘液などからもたらされ得る。サンプル中のＤＮＡは、せん断によって断片化される。断片化されたＤＮＡの平均長は、平均で約１００〜５００塩基対（ｂｐ）である。

ステージ１：ＤＮＡ修復（適切な時間１．５時間）
断片化されたＤＮＡサンプルは、修復酵素ホルムアミドピリミジン［ｆａｐｙ］−ＤＮＡグリコシラーゼ）（Ｆｐｇ，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ（ＥｎｄｏＶＩＩＩ，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）、およびＲＮａｓｅ１ｆ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を含む反応混合物中で混合する。次いでサンプルを３７℃でインキュベートし、次いで製造業者の指示に従って、７５℃で熱不活化する。この反応は、サンプルから損傷した塩基を除くように、かつ混入しているＲＮＡを除くように働く。反応の完了の際に、次に、サンプルをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）とともにインキュベートして、ＤＮＡフラグメントの５’末端をリン酸化する。ＰＮＫ反応の完了の際、次にはサンプルを末端ヌクレオチジル（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｔｙｌ）トランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）とともにインキュベートして、ジデオキシヌクレオチドの添加によってＤＮＡフラグメントの３’ヒドロキシル基を保護する。

ＴｄＴ反応の完了の際、５’側のホスフェートおよび保護された３’ヒドロキシル基を含む修復されたＤＮＡフラグメントを磁性ビーズ（ＳｅｒａＭＡＧ，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いて精製し、次いで、例えば、ＤｒｏｐｌｅｔＤｉｇｉｔａｌＰＣＲＰｒｉｍｅＰＣＲＲＰＰ３０アッセイ（＃１００−３１２４３）またはＱｕｂｉｔｓｓＤＮＡアッセイキット（Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ／Ｅｘｐｅｒｉｏｎシステムと組み合わせる）を用いて定量する。

サンプルＤＮＡのアダプターライゲーション
精製され、かつ定量されたＤＮＡサンプルを、サンプル特異的なバーコードを含むアダプターオリゴヌクレオチドに連結する。アダプターオリゴヌクレオチドは一般的には、図３３に示される配列構造を有する。１００−３００ｎｇの修復されたおよび５’リン酸化サンプルのＤＮＡおよびアダプターを、９５℃まで加熱することによって別のチューブ中で熱変性して、一本鎖サンプルＤＮＡおよび一本鎖アダプターを生じる。次いで、サンプルｓｓＤＮＡを、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅＩＩ、０．１ｍＭのＡＴＰ、１５％のＰＥＧ−８０００、および他の緩衝液成分を含むアデニル化反応混合物と混合する。次いで、サンプルＤＮＡを含むアデニル化反応混合物を、６５℃で少なくとも５分間インキュベートして、サンプルｓｓＤＮＡの高効率のアデニル化を達成する。その一方で、アダプターｓｓＤＮＡを、５ｍＭのＭｎＣｌ_２、１５％のＰＥＧ−８０００、および他の緩衝液成分を含む希釈緩衝液と混合する。次いで、アダプターｓｓＤＮＡを含む希釈緩衝液を、６５℃で少なくとも５分間インキュベートする。アデニル化反応の終了の際、アデニル化されているサンプルｓｓＤＮＡを、アダプターｓｓＤＮＡを含む希釈緩衝液で少なくとも１０倍希釈する。この結果、０．０１ｍＭの最終ＡＴＰ濃度および反応物に対するＭｎ^２＋の添加を生じ、これが効率的にライゲーション反応を駆動して完了させる。サンプルｓｓＤＮＡに対する一本鎖アダプターのライゲーションによって、ｓｓＤＮＡライブラリーの作成が生じる。アデニル化およびライゲーション反応は一緒になって、ほぼ１．５時間で完了され得る。次いで、ｓｓＤＮＡライブラリーのメンバーは、磁性ビーズを用いて精製される（ＳｅｒａＭＡＧ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）。

標的富化（ほぼ２時間）
５０−１５０ｎｇのｓｓＤＮＡライブラリーのメンバーを、実施例１５由来のＴＳＯＳｅｔ１プライマーまたはＴＳＯＳｅｔ２プライマーのいずれかの０．５μＭを含む別々の増幅反応混合物中でインキュベートする。ＴＳＯＳｅｔ１プライマーおよびＴＳＯＳｅｔ２プライマーの分離によって、標的領域の線形の増幅のみが生じることを確実にする。増幅反応混合物はまた、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｈｕｓｉｏｎＨｏｔＳｔａｒｔＩＩ，ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ｄＮＴＰ、および増幅反応を行うのに必要な他の反応成分も含む。４０サイクルの増幅は、サーモサイクラーを用いて行う。線形増幅によって、表Ｘの９６の癌遺伝子のエキソンに相当する選択された標的領域の捕獲および富化が生じ、ここで各々の捕獲された標的領域は、第一の末端でサンプルインデックスバーコードを含む第一のアダプター、および他の末端で鎖特異的バーコードを含む第二のアダプターを含む。捕獲された標的は、本明細書に記載のとおり定量して、ＭｉＳｅｑシーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）での配列決定のために１ｎＭ（または１２×１０^６コピー／μＬ）に正規化する。

（実施例１７）：低Ｔｍプローブ設計の評価
ゲノムＤＮＡを、配列決定を介して決定されるとおり、ＡＰＣ遺伝子（ｃ３９１６Ｇ＞Ｔ）のコドン１３０６中で終止変異を保有することが公知の腫瘍サンプルから回収した。同様に、野性型ＤＮＡ（ＮＡ１８５０７）を、Ｃｏｒｉｅｌｌから入手した。両方のサンプルとも、ＲＰＰ３０を用いてｄｄＰＣＲで定量した。ＡＰＣ変異を標的にする種々のプローブ設計の能力を評価するため、一連のプローブを、下の表１０に示されるように設計した。

プローブを、下に示される表１１に示されるようなｄｄＰＣＲ反応混合物に組み込んで、液滴に形成した。

サーモサイクリングプロトコールは以下のとおりであった：
９５℃で１０分；９５℃で３０秒、５８℃で１分、４０サイクル；９８℃で１０分間；１２℃で保持。

サーモサイクリング後、反応物を、ＱＸ１００リーダーで分析した。図３４、パネルＡは、ＡＰＣ標的についての標準的な５’ヌクレアーゼプローブの使用を示す。図３４、パネルＢは、分析のためのプレアデス（Ｐｌｅｉａｄｅｓ）プローブの３バージョンの使用を示し、これは標準的なヌクレアーゼアッセイに対して能力が劣っていることを示す。図３４のパネルＣは、ミニプローブの２バージョンの使用を示し、これは、野性型（緑）および変異体（青）のクラスターの分離によって示されるとおり、プレアデスプローブおよび標準的な５’ヌクレアーゼプローブに対して得られた高い特異性を示している。

ミニプローブの使用が十分な長さのプローブを必要とするだけだったか否かを決定するために、ＲＮａｓｅＰ遺伝子座（ＲＰＰ３０）に対する一対のプローブを以下のとおり設計した：

プローブは上記のとおり評価した。図３４、パネルＤに示すとおり、ミニプローブ（右のパネル）が、より高いバックグラウンドの蛍光を示したが、１５マー対それより短い１１マーのプレアデス（Ｐｌｅｉａｄｅｓ）ベースのミニプローブのクエンチングが劣っていることにおそらく起因して、分離は、別個のクラスターを識別するのに十分であって、標準的な５’−ヌクレアーゼプローブに対して再現性の濃度コールを可能にする。

（実施例１８）：低Ｔｍプローブおよびバーコード化されたプライマーを用いる対立遺伝子識別アッセイ
ｃ．１７９９Ｔ＞Ａ（Ｖ６００Ｅ）ＢＲＡＦ変異をアッセイするためのプライマー／プローブセットを生成して、試験した。試験した各々のプライマー／プローブセットは、共通のアンチセンスプライマーＣＡＴＧＡＡＧＡＣＣＴＣＡＣＡＧＴＡＡＡ（配列番号２２）、野性型プローブＨＥＸ−ＴＡＡＧＧＣＴＣＧＧＴＴ−ＢＨＱ（配列番号２３）、および変異体プローブＦＡＭ−ＴＴＧＧＧＴＴＣＧＧＴＣ−ＢＨＱ（配列番号２４）を含んだ。野性型および変異体のセンスプライマーの種々の設計を試験した。全ての野性型センスプライマーは、バーコード配列ＧＧＣＡＡＴＡＡＧＧＣＴＣＧＧＴＴＧＧＣＡＴＴＧＧ（配列番号２５）（野性型プローブ配列に相当する）を含み、かつ全ての変異体センスプライマーは、バーコード配列ＡＣＡＴＴＧＧＧＴＴＣＧＧＴＣＧＴＡＡＣＴＴＡＧＧＡＡ（配列番号２６）（変異体プローブ配列に相当する）を含む。

野性型特異的なセンスプライマーは、変異部位が究極点（０）または最後から２番目の（−１）塩基となるように、設計された。したがって、プライマーは、変異部位から１〜３ｎｔ離れて意図的なミスマッチを含むように、またはなんら追加のミスマッチを含まないように設計された。

以下のＢＲＡＦ野性型センスプライマーを、下の表１３によって設計した。

以下のＢＲＡＦ変異体センスプライマーを、下の表１４に従って設計した。

変異体を野性型種からこれらのプライマー／プローブセットを用いて識別する能力を、デジタルＰＣＲによって評価した。２０×ストックのプライマー／プローブセットは以下のとおり作成した。

サンプルＤＮＡを調製するため、野性型（ＮＡ１８５０７，Ｃｏｒｉｅｌｌ）ゲノムＤＮＡ中の１０％変異体（ＲＫＯ−１，ＡＴＣＣ）の混合物を作成した（それぞれ、約２５０および約２５００コピー／μｌ）。あるいは、野性型コントロール（全血から精製されたゲノムＤＮＡ）のバックグラウンドにおける変異体ＤＮＡ（ＲＫＯ−１）の希釈系列を作成した。

ｄｄＰＣＲ反応を下の表１６に示されるようにアセンブルした。

ｄｄＰＣＲ反応混合物を、液滴に変換して、以下のパラメータに従ってＣ１０００サーモサイクラー（Ｂｉｏ−ｒａｄ）でサイクルした：９５℃で１０分；５０〜６０℃で１分、４５サイクル；７０℃で５分；４℃で保持。次いで、温度サイクルされた反応を、ＱＸ−１００ｄｄＰＣＲリーダーを用いてＱｕａｎｔａｓｏｆｔｖ１．４で分析した。結果を図３５〜４０に示す。図３５〜図３８の全てのパネルＡのグラフについて、Ｙ軸は、チャネル１蛍光（変異プローブの蛍光、ＦＡＭ）の強度を示し、Ｘ軸は、チャネル２蛍光（野性型プローブの蛍光，ＨＥＸ）の強度を示す。グリッドラインは、５００強度単位ずつ離れており、ＸおよびＹ軸は３０００強度単位で最大である。ＦＡＭ蛍光陽性の液滴は、黒い楕円で囲み、ＨＥＸ蛍光陽性の液滴は、灰色の楕円で囲み、ＨＥＸおよびＦＡＭの両方について陽性である液滴は、並行斜線の陰影付きの楕円で囲まれる。図３５〜３８の全てのパネルＢのグラフについて、濃い灰色のデータポイントは、変異体対立遺伝子の濃度をコピー／μｌとして示し、淡い灰色のデータポイントは、野性型対立遺伝子の濃度をコピー／μｌとして示す。

図３５は、センスプライマーが、究極点（０）塩基で変異部位を覆うように、かつ変異部位（−１）に直接隣接する塩基でミスマッチを含むか、またはさらなるミスマッチを含まないように設計された、ｄｄＰＣＲアッセイからの結果を示す。究極点（０）塩基で変異部位を覆うように、かつ変異部位に隣接する１つのｎｔミスマッチを有するように設計されたプローブは、野性型および変異種の識別可能なクラスターを生じ、低温度（例えば、−５０〜−５８℃）ではクラスターの分離は大きかった。

図３６は、センスプライマーが、究極点（０）塩基で変異部位を覆うように、かつ変異部位（−２）から２塩基離れてミスマッチを含むか、またはさらなるミスマッチを含まないように設計された、ｄｄＰＣＲアッセイからの結果を示す。図３６は、アッセイからの結果を示す。０塩基で変異を覆い、かつ−２塩基でＴからＣへの置換を含む、センスプライマーは、野性型および変異種の最も高度に識別可能なクラスターを、特に−５０〜−５４℃の温度範囲で生じた。図３７〜図３８では、最後から２番目の（−１）塩基で変異部位を覆うように設計されたプライマーは、行わず、同様に、究極点（０）塩基で変異部位を覆うプライマーも行わなかったことが示される。

ＢＲＡＦｄｄＰＣＲアッセイの検出限界を決定するために、野性型コントロール（全血から精製されたゲノムＤＮＡ）のバックグラウンド中の変異体ＤＮＡ（ＲＫＯ−１）の希釈系列は、希釈ごとに２倍薄めた変異体ＤＮＡで作成した。−ＢＲＡＦ＿１７９９Ｔ＿（０ａ：−２ｔ＞ｃ）および−ＢＲＡＦ＿１７９９Ｔ＞Ａ＿（０ａ＞ｔ：−２ｃ）の混合物からなるアッセイを用いて、５４℃のアニーリング温度を用いて野性型ＤＮＡのバックグラウンド中の変異体ＢＲＡＦゲノムＤＮＡの混合物を代用した。図３９〜図４０によって、バーコードプライマーでのＢＲＡＦ低Ｔｍユニバーサルプローブの検出限界が示される。図３９は、各々のサンプルについての野性型および変異体の濃度コールを示す。野性型濃度コールは、各々のサンプルについて約１７００コピー／μｌであった。各々の希釈されたサンプルについての変異体濃度コールは一貫して低下し、約１．８１コピー／μｌが定量の最下限であった。図４０は、ｄｄＰＣＲアッセイによって決定された、野性型バックグラウンドにおける変異体ＤＮＡの豊富な画分を示す。図４０では、ｄｄＰＣＲアッセイがＢＲＡＦ変異体ＤＮＡの豊富な０．１％画分を検出し得ることが示される。

（実施例１９）：ＣＮＶｄｄＰＣＲパネル
デジタルＰＣＲプローブ／プライマーセットを、１９個の癌遺伝子（ＭＥＴ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＬＴ３、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、ｍＴＯＲ、ＣＤＫ４、ＨＥＲ２、ＲＥＴ、ＨＡＤＨ、ＺＦＰ３、ＤＤＲ２、ＡＵＲＫＡ、ＶＥＧＦＡ、ＣＤＫ６、ＪＡＫ２、ＢＲＡＦ、ＳＲＣ）のコピー数変動をアッセイするために設計した。１９個の癌遺伝子のうち、９個が、癌関連遺伝子増幅を示す領域内の変異も保有することが公知である（ＭＥＴ、ＦＧＦＲ２、ＥＧＦＲ、ＲＥＴ、ＤＤＲ２、ＣＤＫ６、ＪＡＫ２、ＢＲＡＦ、ＳＲＣ）。これらの９個の遺伝子について、プローブを、変異部位を覆うように、かつ変異体対立遺伝子に対してよりも野性型対立遺伝子に対して大きい相補性を有するように設計した。プローブ／プライマーセットはまた、ハウスキーピング遺伝子ＲＮａｓｅＰについても含まれた。ＣＮＶパネルについてのプローブ／プライマーセット、およびそれらが対応する遺伝子を、表１７に示す。

数値的な分析を行って、２０，０００区画のデジタルＰＣＲ実験についての最小入力要件を決定した。この分析によって、種々のレベルの腫瘍負荷を有するサンプルについて腫瘍集団内の標的遺伝子と参照遺伝子との間の濃度の２倍の相違を検出する能力を試験した。数的解析の結果を図３９に示す。次いで、０．０００１未満のｐ値（ｚ−スコア≧３．８９１）を保証する有意差の上限および下限を、種々の入力濃度で決定した。０．０００１未満のｐ値を有する標的遺伝子と参照遺伝子との間の濃度の２倍の相違が、４０％の腫瘍負荷を有する組織サンプルに由来するＤＮＡサンプル中で検出され得、ここではＤＮＡサンプルは、０．０６ｎｇ／μＬのＤＮＡに相当する、２０コピー／μＬのＲＮａｓｅＰを含む（図４１）。同様に、０．０００１未満のｐ値を有する標的遺伝子と参照遺伝子との間の濃度の２倍の相違が、２０％の腫瘍負荷を有する組織サンプルに由来するＤＮＡサンプル中で検出され得、ここではＤＮＡサンプルは、０．１５ｎｇ／μＬのＤＮＡに相当する、５０コピー／μＬのＲＮａｓｅＰを含む。２．２μＬのサンプルをアッセイ容積２２μＬあたりに導入するので、ＣＮＶｄｄＰＣＲアッセイでは、０．６ｎｇ／μＬと同じ程度に少ない精製されたＦＰＥＴＤＮＡ物質からの遺伝子増幅を検出し得ることが推定される。

ＣＮＶアッセイは、標的遺伝子μ_ｉの予想される値が参照遺伝子μ_ｊの予想される値と同じである場合、標的遺伝子ｉを「非増幅」に割り当てる。

ヌル仮説が満たされない場合、標的遺伝子ｉは、「増幅された」に割り当てられる。しかし、陽性および陰性のカウントの数は二項分布に従うので、採用の基準は、それぞれ標的遺伝子ｉおよび参照遺伝子ｊ由来の陰性の液滴ｐ＿（ｉ，ｎｅｇ）およびｐ＿（ｊ，ｎｅｇ）の割合に対するｔ検定の適用によって評価して、標準の（ｚｉ）スコアを導いてもよい。

ヌル仮説が満たされない場合、標的遺伝子ｉは、「増幅された」に割り当てられる。しかし、陽性および陰性のカウントの数は二項分布に従うので、採用の基準は、それぞれ標的遺伝子ｉおよび参照遺伝子ｊ由来の陰性の液滴

の割合に対するｔ検定の適用によって評価して、標準の（ｚｉ）スコア：

を導いてもよい。

標準的なスコアｚｉ≧３．８９１であるならば、標的遺伝子ｉは、ｐ＜０．０００１（すなわち、９９．９９％ＣＩ）で「増幅される」。

ＢＲＡＦ遺伝子に関しては、アッセイは、Ｘ染色体上の領域にオフターゲット相同性を有する第７染色体上のＢＲＡＦ遺伝子上の領域に対して設計される。したがって、観察されたＢＲＡＦの総濃度は、両方の標的の寄与である：

ここでｍは、増幅倍数対参照値に相当し、ｎは、Ｘ染色体上のコピー数に相当する。これは、ポアソン空間中の期待値に関連し得る：

「正常な」サンプルについては、ｍ＝１である。Ｘ染色体上のＢＲＡＦについての偽遺伝子の存在に起因して、雄性に関してはｎ＝０．５であり、雌性に関してはｎ＝１である。したがって、ＢＲＡＦの予期される「正常な」値は、１＋ｎ＝１．５または２．０の場合に生じる。

標準的なスコアｚ_ｉが≧３．８９１であるならば、標的遺伝子ｉは、ｐ＜０．０００１（すなわち、９９．９９％のＣＩ）で「増幅される」。

（実施例２０）：有効な癌処置を選択するためのＣＮＶｄｄＰＣＲパネルの使用
ある患者は、転移性結腸癌を呈した。結腸癌は、患者の肝臓に転移した。５つの異なる種類の化学療法処置は、成功に至らなかった。癌性組織を含むことが疑われる肝生検を、患者から入手して新鮮凍結した。ＤＮＡを、肝生検から抽出して、定量した。次に患者由来のサンプルＤＮＡを、表１６（上記）に概説されるＶＥＧＦＡ、ＥＧＦＲ、ＣＤＫ６、ＭＥＴ、ＢＲＡＦ、ＦＧＦＲ１、ＪＡＫ２、ＨＥＲ３、ＣＤＫ４、ＨＥＲ２、ＳＲＣ、およびＡＵＲＫＡについてのプライマー／プローブセットを用いてｄｄＰＣＲに供した。ＰＣＲサーモサイクラー条件は、以下のとおりであった：９５℃で１０分（１００％傾斜率）、続いて４５サイクルの（９５℃で３０秒、６０℃で６０秒）、続いて７０℃で５分、続いて２５℃で保持。液滴をＱｕａｎｔａｓｏｆｔによって数え上げた。標的および参照遺伝子の濃度を、各々の遺伝子ｉについて以下の式を用いて算出した：

ここで

は、陰性の液滴の割合であって、ここで

は、陰性の事象の数であり、

は、比率測定の標準偏差であり、

は、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔによって決定された各々の遺伝子ｉの許容される事象の数であり、
かつ

は、比率測定の下限および上限である。
各々の種ｃの濃度は、以下の関係による濃度単位（コピー／μＬ）に変換された：

ここで、Ｖは、分画／液滴の容積である。

ＣＮＶｄｄＰＣＲアッセイの結果を図４２に示す。パネルＡは、ＣＮＶ癌遺伝子のうち１２の濃度を示しており、パネルＢは、患者のサンプル中の１２の遺伝子のコピー数を示す。ＨＥＲ２遺伝子の劇的な増幅は、ＣＮＶｄｄＰＣＲアッセイによって明らかになった。ＨＥＲ２増幅は、患者の医師に報告された。ＣＮＶｄｄＰＣＲアッセイの結果に基づき、医師は、乳癌薬物Ｔ−ＤＭＩを処方した。図４３は、化学療法処置レジメン１および２の後に撮った（パネルＡ）、化学療法処置レジメン３−５の後に撮った（パネルＢ）、Ｔ−ＤＭＩの２用量を投与された患者の後に撮った（パネルＣ）、およびＴ−ＤＭＩの３用量を投与された患者の後に撮った（パネルＤ）、患者の肝臓の画像スキャンを示す。パネルＡは、癌性組織の指標である、肝臓における２つの暗いスポットを表す。パネルＢでは、化学療法レジメン３〜５にかかわらず、癌増殖はサイズを劇的に増大したことが明らかになる。パネルＣでは、Ｔ−ＤＭＩの２用量の後に、癌増殖が少なくとも約５０％収縮したことが明らかになる。パネルＤでは、Ｔ−ＤＭＩの３用量の後に、癌増殖が画像スキャンで検出不能であったことが明らかになる。

（実施例２１）：単一のアッセイを用いる、コピー数変動および遺伝子変異の検出
表１に示されるようなＥＧＦＲのＣＮＶプライマー／プローブセットを用いて、癌患者サンプル中の変異体ＥＧＦＲのコピー数変動および存在の両方をアッセイした。ＥＧＦＲプローブは、癌関連変異を保有することが公知の部位を覆い、野性型対立遺伝子に対応する配列を有する。ｄｄＰＣＲは、上記のとおり行われた（例えば、実施例２０を参照のこと）。図４４、パネルＡは、アッセイの結果を示す。ＥＧＦＲプローブと変異体対立遺伝子との間のミスマッチのおかげで、このプローブは、変異体対立遺伝子に対して低い結合効率を有し、結果として識別可能に低い蛍光強度を有するｄｄＰＣＲ液滴のクラスターを生じた。図４４、パネルＢは、アッセイからの定量結果を示す。ＥＧＦＲ陽性液滴の高強度のクラスターを、野性型として数え、ＥＧＦＲ陽性液滴の低強度クラスターは、変異体として数えた。サンプルは、総ＥＧＦＲ（ｗｔ＋ｍｕ）の１μｌあたり２６７コピーを含み、ｗｔおよびｍｕＥＧＦＲの割合は等しいことが確認された。ＥＧＦＲはまた、２から４．１２へ２倍の遺伝子増幅も示した。

Claims

癌を評価する方法であって、以下：
（ａ）被験体中の流体サンプルに由来するサンプル中で遺伝子の各々のサブセットの存在、不在および／または量を決定する工程であって、ここで前記サブセットは、（ｉ）固体組織サンプルが、癌性組織を含むことが公知であるか、または含むと疑われる被験体由来の前記固体組織サンプルでの遺伝子のセットに対して標的化配列決定を行うこと；（ｉｉ）前記標的化配列決定に基づいて遺伝子の前記セットについて遺伝学的異常のプロファイルを決定すること；ならびに（ｉｉｉ）前記セットについての前記プロファイルに基づいて遺伝子の前記セットのうち、２、３、４の、しかし４以下の遺伝子サブセットを選択することによって決定され、ここで前記サブセットは前記被験体に特異的である、工程；ならびに
（ｂ）工程（ａ）の結果から、前記被験体における前記癌の状態を決定する工程；
を包含する、方法。
遺伝子の前記セットが少なくとも１０の遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
遺伝子の前記セットが少なくとも１００の遺伝子を含む、請求項２に記載の方法。
遺伝子の前記セットが少なくとも２００の遺伝子を含む、請求項２に記載の方法。
請求項１に記載の方法であって、遺伝子の前記セットが、ＡＢＣＡ１、ＢＲＡＦ、ＣＨＤ５、ＥＰ３００、ＦＬＴ１、ＩＴＰＡ、ＭＹＣ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＳＫＰ２、ＴＰ５３、ＡＢＣＡ７、ＢＲＣＡ１、ＣＨＥＫ１、ＥＰＨＡ３、ＦＬＴ３、ＪＡＫ１、ＭＹＣＬ１、ＰＩＫ３Ｒ２、ＳＬＣ１９Ａ１、ＴＰ７３、ＡＢＣＢ１、ＢＲＣＡ２、ＣＨＥＫ２、ＥＰＨＡ５、ＦＬＴ４、ＪＡＫ２、ＭＹＣＮ、ＰＫＨＤ１、ＳＬＣ１Ａ６、ＴＰＭ３、ＡＢＣＣ２、ＢＲＩＰ１、ＣＬＴＣ、ＥＰＨＡ６、ＦＮ１、ＪＡＫ３、ＭＹＨ２、ＰＬＣＢ１、ＳＬＣ２２Ａ２、ＴＰＭＴ、ＡＢＣＣ３、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＯＬ１Ａ１、ＥＰＨＡ７、ＦＯＳ、ＪＵＮ、ＭＹＨ９、ＰＬＣＧ１、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＴＰＯ、ＡＢＣＣ４、Ｃ１ｏｒｆ１４４、ＣＯＰＳ５、ＥＰＨＡ８、ＦＯＸＯ１、ＫＢＴＢＤ１１、ＮＡＶ３、ＰＬＣＧ２、ＳＭＡＤ２、ＴＰＲ、ＡＢＣＧ２、ＣＡＢＬＥＳ１、ＣＲＥＢ１、ＥＰＨＢ１、ＦＯＸＯ３、ＫＤＭ６Ａ、ＮＢＮ、ＰＭＬ、ＳＭＡＤ３、ＴＲＩＯ、ＡＢＬ１、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＣＲＥＢＢＰ、ＥＰＨＢ４、ＦＯＸＰ４、ＫＤＲ、ＮＣＯＡ２、ＰＭＳ２、ＳＭＡＤ４、ＴＲＲＡＰ、ＡＢＬ２、ＣＡＭＫＶ、ＣＲＫＬ、ＥＰＨＢ６、ＧＡＢ１、ＫＩＴ、ＮＥＫ１１、ＰＰＡＲＧ、ＳＭＡＲＣＡ４、ＴＳＣ１、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＣＡＲＤ１１、ＣＲＬＦ２、ＥＰＯ、ＧＡＴＡ１、ＫＬＦ６、ＮＦ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＳＭＡＲＣＢ１、ＴＳＣ２、ＡＣＶＲ２Ａ、ＣＡＲＭ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＥＲＢＢ２、ＧＬＩ１、ＫＬＨＤＣ４、ＮＦ２、ＰＰＰ１Ｒ３Ａ、ＳＭＯ、ＴＴＫ、ＡＤＣＹ９、ＣＡＶ１、ＣＳＭＤ３、ＥＲＢＢ３、ＧＬＩ３、ＫＲＡＳ、ＮＫＸ２−１、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＳＯＣＳ１、ＴＹＫ２、ＡＧＡＰ２、ＣＢＦＡ２Ｔ３、ＣＳＮＫ１Ｇ２、ＥＲＢＢ４、ＧＮＡ１１、ＬＭＯ２、ＮＯＳ２、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ、ＳＯＤ２、ＴＹＭＳ、ＡＫＴ１、ＣＢＬ、ＣＴＮＮＡ１、ＥＲＣＣ１、ＧＮＡＱ、ＬＲＰ１Ｂ、ＮＯＳ３、ＰＲＫＡＡ２、ＳＯＳ１、ＵＧＴ１Ａ１、ＡＫＴ２、ＣＣＮＤ１、ＣＴＮＮＡ２、ＥＲＣＣ２、ＧＮＡＳ、ＬＲＰ２、ＮＯＴＣＨ１、ＰＲＫＣＡ、ＳＯＸ１０、ＵＭＰＳ、ＡＫＴ３、ＣＣＮＤ２、ＣＴＮＮＢ１、ＥＲＣＣ３、ＧＰＲ１２４、ＬＲＰ６、ＮＯＴＣＨ２、ＰＲＫＣＺ、ＳＯＸ２、ＵＳＰ９Ｘ、ＡＬＫ、ＣＣＮＤ３、ＣＹＦＩＰ１、ＥＲＣＣ４、ＧＰＲ１３３、ＬＴＫ、ＮＯＴＣＨ３、ＰＲＫＤＣ、ＳＰ１、ＶＥＧＦ、ＡＮＡＰＣ５、ＣＣＮＥ１、ＣＹＬＤ、ＥＲＣＣ５、ＧＲＢ２、ＭＡＮ１Ｂ１、ＮＰＭ１、ＰＴＣＨ１、ＳＰＲＹ２、ＶＥＧＦＡ、ＡＰＣ、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＹＰ１９Ａ１、ＥＲＣＣ６、ＧＳＫ３Ｂ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＮＱＯ１、ＰＴＣＨ２、ＳＲＣ、ＶＨＬ、ＡＰＣ２、ＣＤ４４、ＣＹＰ１Ｂ１、ＥＲＧ、ＧＳＴＰ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＲ３Ｃ１、ＰＴＥＮ、ＳＴ６ＧＡＬ２、ＷＲＮ、ＡＲ、ＣＤ７９Ａ、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＥＲＮ２、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＭＡＰ２Ｋ４、ＮＲＡＳ、ＰＴＧＳ２、ＳＴＡＴ１、ＷＴ１、ＡＲＡＦ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＹＰ２Ｃ８、ＥＳＲ１、ＨＤＡＣ１、ＭＡＰ２Ｋ７、ＮＲＰ２、ＰＴＰＮ１１、ＳＴＡＴ３、ＸＰＡ、ＡＲＦＲＰ１、ＣＤＣ４２、ＣＹＰ２Ｄ６、ＥＳＲ２、ＨＤＡＣ２、ＭＡＰ３Ｋ１、ＮＴＲＫ１、ＰＴＰＲＢ、ＳＴＫ１１、ＸＰＣ、ＡＲＩＤ１Ａ、ＣＤＣ４２ＢＰＢ、ＣＹＰ３Ａ４、ＥＴＶ４、ＨＧＦ、ＭＡＰＫ１、ＮＴＲＫ２、ＰＴＰＲＤ、ＳＵＦＵ、ＺＦＹ、ＡＴＭ、ＣＤＣ７３、ＣＹＰ３Ａ５、ＥＷＳＲ１、ＨＩＦ１Ａ、ＭＡＰＫ３、ＮＴＲＫ３、ＲＡＤ５０、ＳＵＬＴ１Ａ１、ＺＮＦ５２１、ＡＴＰ５Ａ１、ＣＤＨ１、ＤＡＣＨ２、ＥＸＴ１、ＨＭ１３、ＭＡＰＫ８、ＯＭＡ１、ＲＡＤ５１、ＳＵＺ１２、ＡＴＲ、ＣＤＨ１０、ＤＣＣ、ＥＺＨ２、ＨＭＧＡ１、ＭＡＲＫ３、ＯＲ１０Ｒ２、ＲＡＦ１、ＴＡＦ１、ＡＵＲＫＡ、ＣＤＨ２、ＤＣＬＫ３、ＦＡＮＣＡ、ＨＮＦ１Ａ、ＭＣＬ１、ＰＡＫ３、ＲＡＲＡ、ＴＢＸ２２、ＡＵＲＫＢ、ＣＤＨ２０、ＤＤＢ２、ＦＡＮＣＤ２、ＨＯＸＡ３、ＭＤＭ２、ＰＡＲＰ１、ＲＢ１、ＴＣＦ１２、ＢＡＩ３、ＣＤＨ５、ＤＤＲ２、ＦＡＮＣＥ、ＨＯＸＡ９、ＭＤＭ４、ＰＡＸ５、ＲＥＭ１、ＴＣＦ３、ＢＡＰ１、ＣＤＫ２、ＤＧＫＢ、ＦＡＮＣＦ、ＨＲＡＳ、ＭＥＣＯＭ、ＰＣＤＨ１５、ＲＥＴ、ＴＣＦ４、ＢＡＲＤ１、ＣＤＫ４、ＤＧＫＺ、ＦＡＳ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＭＥＮ１、ＰＣＤＨ１８、ＲＩＣＴＯＲ、ＴＥＫ、ＢＡＸ、ＣＤＫ６、ＤＩＲＡＳ３、ＦＢＸＷ７、ＩＤＨ１、ＭＥＴ、ＰＣＮＡ、ＲＩＰＫ１、ＴＥＰ１、ＢＣＬ１１Ａ、ＣＤＫ７、ＤＬＧ３、ＦＣＧＲ３Ａ、ＩＤＨ２、ＭＩＴＦ、ＰＤＧＦＡ、ＲＯＲ１、ＴＥＲＴ、ＢＣＬ２、ＣＤＫ８、ＤＬＬ１、ＦＥＳ、ＩＦＮＧ、ＭＬＨ１、ＰＤＧＦＢ、ＲＯＲ２、ＴＥＴ２、ＢＣＬ２Ａ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＤＮＭＴ１、ＦＧＦＲ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＭＬＬ、ＰＤＧＦＲＡ、ＲＯＳ１、ＴＧＦＢＲ２、ＢＣＬ２Ｌ１、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＦＧＦＲ２、ＩＧＦ２Ｒ、ＭＬＬ３、ＰＤＧＦＲＢ、ＲＰＳ６ＫＡ２、ＴＨＢＳ１、ＢＣＬ２Ｌ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＦＧＦＲ３、ＩＫＢＫＥ、ＭＰＬ、ＰＤＺＲＮ３、ＲＰＴＯＲ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＢＣＬ３、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＤＯＴ１Ｌ、ＦＧＦＲ４、ＩＫＺＦ１、ＭＲＥ１１Ａ、ＰＨＬＰＰ２、ＲＳＰＯ２、ＴＮＫＳ、ＢＣＬ６、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＤＰＹＤ、ＦＨ、ＩＬ２ＲＧ、ＭＳＨ２、ＰＩＫ３Ｃ３、ＲＳＰＯ３、ＴＮＫＳ２、ＢＣＲ、ＣＤＫＮ２Ｄ、Ｅ２Ｆ１、ＦＨＯＤ３、ＩＮＨＢＡ、ＭＳＨ６、ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＵＮＸ１、ＴＮＮＩ３Ｋ、ＢＩＲＣ５、ＣＤＸ２、ＥＥＤ、ＦＩＧＦ、ＩＮＳＲ、ＭＴＨＦＲ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＳＤＨＢ、ＴＮＲ、ＢＩＲＣ６、ＣＥＢＰＡ、ＥＧＦ、ＦＬＧ２、ＩＲＳ１、ＭＴＯＲ、ＰＩＫ３ＣＤ、ＳＦ３Ｂ１、ＴＯＰ１、ＢＬＭ、ＣＥＲＫ、ＥＧＦＲ、ＦＬＮＣ、ＩＲＳ２、ＭＵＴＹＨ、ＰＩＫ３ＣＧ、ＳＨＣ１、およびＴＯＰ２Ａからなる群より選択される、方法。
前記流体サンプルが、血液、血清、血漿、尿、汗、涙、唾液、または痰からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
工程（ａ）および（ｂ）が、前記癌の状態を時間をわたってモニターするために複数の時点で行われる、請求項１に記載の方法。
１つの時点が、癌治療の最初の施行の前であり、その後の時点が前記最初の施行に引き続く、請求項７に記載の方法。
遺伝子の前記セットについて遺伝学的異常の前記プロファイルを連絡するレポートを作成する工程と、前記レポートを介護者に連絡する工程とをさらに包含する、請求項１に記載の方法。
前記レポートが、前記プロファイルに基づく１つ以上の治療候補のリストを包含する、請求項９に記載の方法。
前記レポートが、前記固体組織サンプルの収集から１週で作成される、請求項９に記載の方法。
前記レポートが、遺伝子の前記セットのコピー数変更を含む、請求項９に記載の方法。
前記レポートが、（腫瘍に由来する）前記遺伝学的異常の各々を標的にする治療剤の記述を含む、請求項９に記載の方法。
各々の前記複数の時点での遺伝子の前記サブセットの前記プロファイルを連絡するレポートを作成する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
前記決定する工程が、前記サンプルから個別の反応容積へ前記核酸分子を希釈する工程を包含し、ここで前記個別の反応容積は、前記サンプル由来の１〜１０モルの前記核酸分子を含む、請求項１に記載の方法。
前記個別の反応容積は、エマルジョン中の液滴である、請求項１５に記載の方法。
前記個別の反応容積がさらに、遺伝子の前記サブセット中の前記遺伝学的異常の対立遺伝子識別のためのプライマーを含む、請求項１５に記載の方法。
前記状態を決定する工程が、遺伝子の前記サブセット中の前記遺伝学的異常を保有している核酸の数を定量する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
前記標的化配列決定の工程が、前記固体組織サンプルからＤＮＡライブラリーを調製する工程を包含し、ここで前記調製が、４時間、５時間、６時間および７時間からなる群より選択される時間数未満で完了され得る、請求項１に記載の方法。
前記調製が、前記ライブラリーの配列決定の前に指数関数的ＰＣＲ増幅を必要としない、請求項１９に記載の方法。
前記調製が、線形増幅工程を含む、請求項１９に記載の方法。
請求項１に記載の方法であって、前記標的化配列決定の工程が、標的化ライブラリー調製工程を包含し、ここで前記標的化ライブラリー調製工程は、以下：
（ａ）前記固体組織サンプル由来の一本鎖ＤＮＡフラグメントと、（ｉ）ある癌関連遺伝子のある領域に特異的な領域、および（ｉｉ）ある配列決定プラットフォームにカップリングするために特異的なアダプター配列を含む標的特異的オリゴヌクレオチドとを接触させる工程と；
（ｂ）前記標的特異的オリゴヌクレオチドに対して相補性の領域を含む一本鎖ＤＮＡフラグメントに対して前記標的特異的オリゴヌクレオチドを連結するためのハイブリダイゼーション反応を行う工程と；
（ｃ）伸長反応を行って、前記領域を含み、かつ前記アダプターを含む伸長生成物を作成する工程と；
（ｄ）前記伸長生成物を配列決定する工程と、
を包含する、方法。
前記接触させる工程が、配列決定プラットフォームに対して結合された前記標的特異的オリゴヌクレオチドを用いて生じる、請求項２２に記載の方法。
前記接触させる工程が、溶液中で遊離の前記標的特異的オリゴヌクレオチドを用いて生じる、請求項２２に記載の方法。
以下：
（ａ）ｓｓＤＮＡライブラリー中の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）フラグメントに対して標的選択性オリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）をハイブリダイズして、ハイブリダイゼーション生成物を作成する工程と；
（ｂ）前記ハイブリダイゼーション生成物を伸長して、二本鎖伸長生成物を作成する工程であって、ここで前記ＴＳＯが、（ｉ）単一の標的領域に対して相補的な配列と（ｉｉ）前記ＴＳＯの第一の末端に位置するが、前記ＴＳＯの両端には位置しない第一の一本鎖アダプター配列とを含み、ここで前記ｓｓＤＮＡフラグメントが、第二の一本鎖アダプター配列を含むが、前記第一の一本鎖アダプター配列を含まず、かつここで前記ｓｓＤＮＡフラグメントが、１０％、５０％、７０％、または９０％を超えるライゲーション効率を含むライゲーション方法によって第二の一本鎖アダプター配列に連結される、工程と、
を包含する、方法。
以下：
（ａ）ｓｓＤＮＡライブラリー中の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）フラグメントに対して標的選択性オリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）をハイブリダイズして、ハイブリダイゼーション生成物を作成する工程と；
（ｂ）前記ハイブリダイゼーション生成物を伸長して、二本鎖伸長生成物を作成する工程であって、ここで前記ＴＳＯが、（ｉ）単一の標的領域に対して相補的な配列と（ｉｉ）前記ＴＳＯの第一の末端に位置するが、前記ＴＳＯの両端には位置しない第一の一本鎖アダプター配列とを含み、ここで前記ｓｓＤＮＡフラグメントが、第二の一本鎖アダプター配列を含むが、前記第一の一本鎖アダプター配列を含まず、かつここで前記ｓｓＤＮＡフラグメントが、一本鎖ライゲーション法によって第二の一本鎖アダプター配列に連結される、工程と、
を包含する、方法。
前記第二の一本鎖アダプター配列が、前記ｓｓＤＮＡフラグメントの第一の末端に位置するが、前記ｓｓＤＮＡフラグメントの両端には位置しない、請求項２５または２６に記載の方法。
前記ｓｓＤＮＡフラグメントの前記第一の末端が、５’末端である、請求項２７に記載の方法。
前記第一のアダプター配列または前記第二のアダプター配列が、バーコード配列を含む、請求項２５または２６に記載の方法。
前記ＴＳＯの前記第一の末端が５’末端である、請求項２５または２６に記載の方法。
前記第一のアダプター配列または前記第二のアダプター配列が、固体支持体にコンジュゲートされた支持体結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも７０％同一である配列を含む、請求項２５または２６に記載の方法。
前記固体支持体が、配列決定プラットフォームにカップリングされる、請求項３１に記載の方法。
前記第一のアダプター配列または前記第二のアダプター配列が、配列決定プライマーに対する結合部位を含む、請求項２５または２６に記載の方法。
前記支持体結合オリゴヌクレオチドに対して前記伸長生成物をアニーリングする工程をさらに包含する、請求項３１に記載の方法。
アニーリングされた前記伸長生成物を増幅する工程をさらに包含する、請求項３４に記載の方法。
アニーリングされた前記伸長生成物を配列決定する工程をさらに包含する、請求項３５に記載の方法。
前記ｓｓＤＮＡライブラリーがゲノムＤＮＡフラグメントを含む、請求項２５または２６に記載の方法。
前記ｓｓＤＮＡライブラリーが、ｃＤＮＡフラグメントを含む、請求項２５または２６に記載の方法。
ハイブリダイズしていないＴＳＯおよびハイブリダイズしていないｓｓＤＮＡライブラリーのメンバーを取り除く工程をさらに包含する、請求項２５または２６に記載の方法。
工程ａ）およびｂ）が、前記ｓｓＤＮＡライブラリーのメンバーおよび前記ＴＳＯが溶液中で浮遊性である場合に行われる、請求項２５または２６に記載の方法。
前記単一の標的領域が、ゲノム領域に隣接する、請求項２５または２６に記載の方法。
前記ゲノム領域が、癌関連遺伝子由来のエキソン領域の一部を含む、請求項４１に記載の方法。
請求項４２に記載の方法であって、前記癌関連遺伝子が、ＡＢＣＡ１、ＢＲＡＦ、ＣＨＤ５、ＥＰ３００、ＦＬＴ１、ＩＴＰＡ、ＭＹＣ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＳＫＰ２、ＴＰ５３、ＡＢＣＡ７、ＢＲＣＡ１、ＣＨＥＫ１、ＥＰＨＡ３、ＦＬＴ３、ＪＡＫ１、ＭＹＣＬ１、ＰＩＫ３Ｒ２、ＳＬＣ１９Ａ１、ＴＰ７３、ＡＢＣＢ１、ＢＲＣＡ２、ＣＨＥＫ２、ＥＰＨＡ５、ＦＬＴ４、ＪＡＫ２、ＭＹＣＮ、ＰＫＨＤ１、ＳＬＣ１Ａ６、ＴＰＭ３、ＡＢＣＣ２、ＢＲＩＰ１、ＣＬＴＣ、ＥＰＨＡ６、ＦＮ１、ＪＡＫ３、ＭＹＨ２、ＰＬＣＢ１、ＳＬＣ２２Ａ２、ＴＰＭＴ、ＡＢＣＣ３、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＯＬ１Ａ１、ＥＰＨＡ７、ＦＯＳ、ＪＵＮ、ＭＹＨ９、ＰＬＣＧ１、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＴＰＯ、ＡＢＣＣ４、Ｃ１ｏｒｆ１４４、ＣＯＰＳ５、ＥＰＨＡ８、ＦＯＸＯ１、ＫＢＴＢＤ１１、ＮＡＶ３、ＰＬＣＧ２、ＳＭＡＤ２、ＴＰＲ、ＡＢＣＧ２、ＣＡＢＬＥＳ１、ＣＲＥＢ１、ＥＰＨＢ１、ＦＯＸＯ３、ＫＤＭ６Ａ、ＮＢＮ、ＰＭＬ、ＳＭＡＤ３、ＴＲＩＯ、ＡＢＬ１、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＣＲＥＢＢＰ、ＥＰＨＢ４、ＦＯＸＰ４、ＫＤＲ、ＮＣＯＡ２、ＰＭＳ２、ＳＭＡＤ４、ＴＲＲＡＰ、ＡＢＬ２、ＣＡＭＫＶ、ＣＲＫＬ、ＥＰＨＢ６、ＧＡＢ１、ＫＩＴ、ＮＥＫ１１、ＰＰＡＲＧ、ＳＭＡＲＣＡ４、ＴＳＣ１、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＣＡＲＤ１１、ＣＲＬＦ２、ＥＰＯ、ＧＡＴＡ１、ＫＬＦ６、ＮＦ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＳＭＡＲＣＢ１、ＴＳＣ２、ＡＣＶＲ２Ａ、ＣＡＲＭ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＥＲＢＢ２、ＧＬＩ１、ＫＬＨＤＣ４、ＮＦ２、ＰＰＰ１Ｒ３Ａ、ＳＭＯ、ＴＴＫ、ＡＤＣＹ９、ＣＡＶ１、ＣＳＭＤ３、ＥＲＢＢ３、ＧＬＩ３、ＫＲＡＳ、ＮＫＸ２−１、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＳＯＣＳ１、ＴＹＫ２、ＡＧＡＰ２、ＣＢＦＡ２Ｔ３、ＣＳＮＫ１Ｇ２、ＥＲＢＢ４、ＧＮＡ１１、ＬＭＯ２、ＮＯＳ２、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ、ＳＯＤ２、ＴＹＭＳ、ＡＫＴ１、ＣＢＬ、ＣＴＮＮＡ１、ＥＲＣＣ１、ＧＮＡＱ、ＬＲＰ１Ｂ、ＮＯＳ３、ＰＲＫＡＡ２、ＳＯＳ１、ＵＧＴ１Ａ１、ＡＫＴ２、ＣＣＮＤ１、ＣＴＮＮＡ２、ＥＲＣＣ２、ＧＮＡＳ、ＬＲＰ２、ＮＯＴＣＨ１、ＰＲＫＣＡ、ＳＯＸ１０、ＵＭＰＳ、ＡＫＴ３、ＣＣＮＤ２、ＣＴＮＮＢ１、ＥＲＣＣ３、ＧＰＲ１２４、ＬＲＰ６、ＮＯＴＣＨ２、ＰＲＫＣＺ、ＳＯＸ２、ＵＳＰ９Ｘ、ＡＬＫ、ＣＣＮＤ３、ＣＹＦＩＰ１、ＥＲＣＣ４、ＧＰＲ１３３、ＬＴＫ、ＮＯＴＣＨ３、ＰＲＫＤＣ、ＳＰ１、ＶＥＧＦ、ＡＮＡＰＣ５、ＣＣＮＥ１、ＣＹＬＤ、ＥＲＣＣ５、ＧＲＢ２、ＭＡＮ１Ｂ１、ＮＰＭ１、ＰＴＣＨ１、ＳＰＲＹ２、ＶＥＧＦＡ、ＡＰＣ、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＹＰ１９Ａ１、ＥＲＣＣ６、ＧＳＫ３Ｂ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＮＱＯ１、ＰＴＣＨ２、ＳＲＣ、ＶＨＬ、ＡＰＣ２、ＣＤ４４、ＣＹＰ１Ｂ１、ＥＲＧ、ＧＳＴＰ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＲ３Ｃ１、ＰＴＥＮ、ＳＴ６ＧＡＬ２、ＷＲＮ、ＡＲ、ＣＤ７９Ａ、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＥＲＮ２、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＭＡＰ２Ｋ４、ＮＲＡＳ、ＰＴＧＳ２、ＳＴＡＴ１、ＷＴ１、ＡＲＡＦ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＹＰ２Ｃ８、ＥＳＲ１、ＨＤＡＣ１、ＭＡＰ２Ｋ７、ＮＲＰ２、ＰＴＰＮ１１、ＳＴＡＴ３、ＸＰＡ、ＡＲＦＲＰ１、ＣＤＣ４２、ＣＹＰ２Ｄ６、ＥＳＲ２、ＨＤＡＣ２、ＭＡＰ３Ｋ１、ＮＴＲＫ１、ＰＴＰＲＢ、ＳＴＫ１１、ＸＰＣ、ＡＲＩＤ１Ａ、ＣＤＣ４２ＢＰＢ、ＣＹＰ３Ａ４、ＥＴＶ４、ＨＧＦ、ＭＡＰＫ１、ＮＴＲＫ２、ＰＴＰＲＤ、ＳＵＦＵ、ＺＦＹ、ＡＴＭ、ＣＤＣ７３、ＣＹＰ３Ａ５、ＥＷＳＲ１、ＨＩＦ１Ａ、ＭＡＰＫ３、ＮＴＲＫ３、ＲＡＤ５０、ＳＵＬＴ１Ａ１、ＺＮＦ５２１、ＡＴＰ５Ａ１、ＣＤＨ１、ＤＡＣＨ２、ＥＸＴ１、ＨＭ１３、ＭＡＰＫ８、ＯＭＡ１、ＲＡＤ５１、ＳＵＺ１２、ＡＴＲ、ＣＤＨ１０、ＤＣＣ、ＥＺＨ２、ＨＭＧＡ１、ＭＡＲＫ３、ＯＲ１０Ｒ２、ＲＡＦ１、ＴＡＦ１、ＡＵＲＫＡ、ＣＤＨ２、ＤＣＬＫ３、ＦＡＮＣＡ、ＨＮＦ１Ａ、ＭＣＬ１、ＰＡＫ３、ＲＡＲＡ、ＴＢＸ２２、ＡＵＲＫＢ、ＣＤＨ２０、ＤＤＢ２、ＦＡＮＣＤ２、ＨＯＸＡ３、ＭＤＭ２、ＰＡＲＰ１、ＲＢ１、ＴＣＦ１２、ＢＡＩ３、ＣＤＨ５、ＤＤＲ２、ＦＡＮＣＥ、ＨＯＸＡ９、ＭＤＭ４、ＰＡＸ５、ＲＥＭ１、ＴＣＦ３、ＢＡＰ１、ＣＤＫ２、ＤＧＫＢ、ＦＡＮＣＦ、ＨＲＡＳ、ＭＥＣＯＭ、ＰＣＤＨ１５、ＲＥＴ、ＴＣＦ４、ＢＡＲＤ１、ＣＤＫ４、ＤＧＫＺ、ＦＡＳ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＭＥＮ１、ＰＣＤＨ１８、ＲＩＣＴＯＲ、ＴＥＫ、ＢＡＸ、ＣＤＫ６、ＤＩＲＡＳ３、ＦＢＸＷ７、ＩＤＨ１、ＭＥＴ、ＰＣＮＡ、ＲＩＰＫ１、ＴＥＰ１、ＢＣＬ１１Ａ、ＣＤＫ７、ＤＬＧ３、ＦＣＧＲ３Ａ、ＩＤＨ２、ＭＩＴＦ、ＰＤＧＦＡ、ＲＯＲ１、ＴＥＲＴ、ＢＣＬ２、ＣＤＫ８、ＤＬＬ１、ＦＥＳ、ＩＦＮＧ、ＭＬＨ１、ＰＤＧＦＢ、ＲＯＲ２、ＴＥＴ２、ＢＣＬ２Ａ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＤＮＭＴ１、ＦＧＦＲ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＭＬＬ、ＰＤＧＦＲＡ、ＲＯＳ１、ＴＧＦＢＲ２、ＢＣＬ２Ｌ１、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＦＧＦＲ２、ＩＧＦ２Ｒ、ＭＬＬ３、ＰＤＧＦＲＢ、ＲＰＳ６ＫＡ２、ＴＨＢＳ１、ＢＣＬ２Ｌ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＦＧＦＲ３、ＩＫＢＫＥ、ＭＰＬ、ＰＤＺＲＮ３、ＲＰＴＯＲ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＢＣＬ３、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＤＯＴ１Ｌ、ＦＧＦＲ４、ＩＫＺＦ１、ＭＲＥ１１Ａ、ＰＨＬＰＰ２、ＲＳＰＯ２、ＴＮＫＳ、ＢＣＬ６、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＤＰＹＤ、ＦＨ、ＩＬ２ＲＧ、ＭＳＨ２、ＰＩＫ３Ｃ３、ＲＳＰＯ３、ＴＮＫＳ２、ＢＣＲ、ＣＤＫＮ２Ｄ、Ｅ２Ｆ１、ＦＨＯＤ３、ＩＮＨＢＡ、ＭＳＨ６、ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＵＮＸ１、ＴＮＮＩ３Ｋ、ＢＩＲＣ５、ＣＤＸ２、ＥＥＤ、ＦＩＧＦ、ＩＮＳＲ、ＭＴＨＦＲ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＳＤＨＢ、ＴＮＲ、ＢＩＲＣ６、ＣＥＢＰＡ、ＥＧＦ、ＦＬＧ２、ＩＲＳ１、ＭＴＯＲ、ＰＩＫ３ＣＤ、ＳＦ３Ｂ１、ＴＯＰ１、ＢＬＭ、ＣＥＲＫ、ＥＧＦＲ、ＦＬＮＣ、ＩＲＳ２、ＭＵＴＹＨ、ＰＩＫ３ＣＧ、ＳＨＣ１、およびＴＯＰ２Ａ、からなる群より選択される、方法。
前記ライゲーション方法が、一本鎖ライゲーション方法である、請求項２５に記載の方法。
前記一本鎖ライゲーション方法が、ＲＮＡリガーゼの使用を含む、請求項２６または４４に記載の方法。
前記ＲＮＡリガーゼが、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅまたはＣｉｒｃＬｉｇａｓｅＩＩである、請求項４５に記載の方法。
一本鎖ＤＮＡライブラリーを調製する方法であって、前記方法は：
（ａ）二本鎖ＤＮＡフラグメントを一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）フラグメントに変性させる工程と；
（ｂ）前記ｓｓＤＮＡフラグメントから５’側のホスフェートを取り除く工程と；
（ｃ）一本鎖プライマードッキングオリゴヌクレオチド（ｐｄｏ’ｓ）を、前記ｓｓＤＮＡフラグメントの３’末端に連結する工程であって、ここで前記ｐｄｏ’ｓが、固定化された捕獲試薬に結合可能な捕獲部分に対してコンジュゲートされる、工程と；
（ｄ）プライマーを前記ｐｄｏ’ｓにハイブリダイズさせる工程であって、前記プライマーが、アダプターオリゴヌクレオチド配列に対して相補的な配列を含み、かつ配列決定プラットフォームに対してカップリングされた支持体結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも７０％同一である、第一のアダプター配列を含む、工程と；
（ｅ）ハイブリダイズした前記プライマーを伸長して、二重鎖を作成する工程であって、ここで各々の二重鎖が、ｓｓフラグメントおよび伸長したプライマー鎖を含む工程と；
（ｆ）前記固定化された捕獲試薬に対して前記二重鎖を固定化する工程と；
（ｇ）前記二本鎖伸長生成物を変性する工程であって、ここで前記変性が、前記固定化された捕獲試薬からの前記伸長されたプライマー鎖の遊離と、前記固定化された捕獲試薬上の前記ｓｓＤＮＡフラグメントの保持を生じる、工程と；
（ｈ）前記伸長されたプライマー鎖を収集する工程であって、ここで前記伸長されたプライマー鎖が前記ｓｓＤＮＡライブラリーを含む、工程と、
を包含する、方法。
工程（ｃ）が、前記ｐｄｏ’ｓに対する前記ｓｓＤＮＡフラグメントのうち少なくとも５０％のライゲーションを生じる、請求項４７に記載の方法。
前記連結する工程が、ＡＴＰ依存性リガーゼを用いて行われる、請求項４７に記載の方法。
前記ＡＴＰ依存性リガーゼがＲＮＡリガーゼである、請求項４９に記載の方法。
前記ＲＮＡリガーゼが、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅまたはＣｉｒｃＬｉｇａｓｅＩＩである、請求項５０に記載の方法。
前記ｐｄｏ’ｓがアデニル化されている、請求項４７に記載の方法。
前記伸長させる工程が、校正ＤＮＡポリメラーゼを用いて行われる、請求項４７に記載の方法。
一本鎖ＤＮＡライブラリーを調製する方法であって、前記方法は、以下：
（ａ）二本鎖ＤＮＡフラグメントを一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）フラグメントに変性する工程と；
（ｂ）第一の一本鎖アダプター配列を前記ｓｓＤＮＡフラグメントの第一の末端に連結する工程と；
（ｃ）第二の一本鎖アダプター配列を前記ｓｓＤＮＡフラグメントの第二の末端に連結する工程と、
を包含する、方法。
以下：
（ａ）プライマードッキングオリゴヌクレオチド（ｐｄｏ）であって、前記ｐｄｏが、固定化された捕獲試薬に結合可能な捕獲部分にコンジュゲートされる、プライマードッキングオリゴヌクレオチド（ｐｄｏ）と；
（ｂ）プライマーであって、前記プライマーが、前記ｐｄｏ配列に対して少なくとも７０％相補性である配列を含み、かつ配列決定プラットフォームにカップリングされた第一の支持体結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも７０％同一である、第一のアダプター配列をさらに含む、プライマーと；
（ｃ）使用説明書と、
を含む、キット。
ＡＴＰ依存性リガーゼをさらに含む、請求項５５に記載のキット。
前記ＡＴＰ依存性リガーゼがＲＮＡリガーゼである、請求項５６に記載のキット。
前記ＲＮＡリガーゼがＣｉｒｃＬｉｇａｓｅまたはＣｉｒｃＬｉｇａｓｅＩＩである、請求項５７に記載のキット。
校正ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項５５に記載のキット。
前記固定化された捕獲試薬をさらに含む、請求項５５に記載のキット。
前記第一のアダプター配列が、第一の配列決定プライマーに対して少なくとも７０％相補的である配列を含む、請求項５５に記載のキット。
前記第一のアダプター配列が、バーコード配列を含む、請求項５５に記載のキット。
標的選択性オリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）をさらに含む、請求項５５に記載のキット。
前記ＴＳＯが、第一の末端に位置するが、第二の末端には位置しない第二のアダプター配列をさらに含む、請求項６３に記載のキット。
前記ＴＳＯの前記第一の末端が５’末端である、請求項６４に記載のキット。
前記第二のアダプター配列が、配列決定プラットフォームに対してカップリングされた第二の支持体結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも７０％同一である配列を含む、請求項６４に記載のキット。
前記第二のアダプター配列が、配列決定プライマーに対する結合部位を含む、請求項６４に記載のキット。
以下：
（ａ）第一のアダプターオリゴヌクレオチドであって、ここで前記第一のアダプターが、配列決定プラットフォームに対してカップリングされた第一の支持体結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも７０％相補性である配列を含む、第一のアダプターオリゴヌクレオチドと；
（ｂ）第二のアダプターオリゴヌクレオチドであって、ここで前記第二のアダプターが、前記第一のアダプターオリゴヌクレオチドとは別個である配列を含む、第二のアダプターオリゴヌクレオチドと；
（ｃ）ＲＮＡリガーゼと；
（ｄ）使用説明書と、
を含む、キット。
前記第二のアダプターが、配列決定プライマーに対して少なくとも７０％相補的な配列を含む、請求項６８に記載のキット。
前記第二のアダプターが、配列決定プラットフォームに対してカップリングされた第二の支持体結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも７０％相補的な配列を含む、請求項６８に記載のキット。
前記第一のアダプターが、配列決定プライマーに対して少なくとも７０％相補的な配列を含む、請求項６８に記載のキット。
前記第一のアダプターまたは前記第二のアダプターの１つが、バーコード配列を含む、請求項６８に記載のキット。
前記第一のアダプターが、３’末端塩基と別のヌクレオチドとの間の共有結合の形成を妨げる３’末端ブロック基を含む、請求項６８に記載のキット。
前記３’末端ブロック基が、ジデオキシ−ｄＮＴＰ、ビオチン、ｏアルキル、アミノ−アルキル、またはフルオロフォアジゴキシゲニン（ｄｉｇｅｏｘｙｇｅｎｉｎ）である、請求項７３に記載のキット。
前記第一のアダプターが、５’ポリアデニル化配列を含む、請求項６８に記載のキット。
前記ＲＮＡリガーゼが、Ｔ４またはＭｔｈ由来の短縮されたまたは変異されたリガーゼ２である、請求項６８に記載のキット。
第二のＲＮＡリガーゼをさらに含んでいる、請求項６８に記載のキット。
前記第二のＲＮＡリガーゼがＣｉｒｃＬｉｇａｓｅまたはＣｉｒｃＬｉｇａｓｅＩＩである、請求項７７に記載のキット。
オリゴヌクレオチドプライマーであって、以下：
（ａ）プローブ結合領域と；
（ｂ）変異を保有すると疑われるテンプレート核酸に対して少なくとも５０％相補的なテンプレート結合領域であって、ここで前記テンプレート結合領域の一部は、前記変異の疑わしい遺伝子座と少なくとも部分的を覆う、テンプレート結合領域と；を包含し、
（ｃ）ここで、前記オリゴヌクレオチドプライマーは、前記テンプレート核酸に対するハイブリダイゼーションの際、前記変異が存在する場合は、ポリメラーゼによって伸長可能であるが、前記変異が存在しない場合は前記ポリメラーゼによって伸長可能ではない、
オリゴヌクレオチドプライマー。
前記変異が、一塩基多型（ＳＮＰ）である、請求項７９に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
前記テンプレート結合領域が、前記ＳＮＰ遺伝子座を覆う３’末端領域を含む、請求項８０に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
前記３’末端領域が、前記ＳＮＰ遺伝子座の変異体対立遺伝子に対して相補性である、請求項８１に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
前記３’末端領域が、前記ＳＮＰ遺伝子座の野性型対立遺伝子に対して相補性である、請求項８１に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
前記プローブ結合領域が、被験体由来のいかなるゲノム配列に対してもハイブリダイズしない、請求項７９に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
前記ポリメラーゼが、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠いているＤＮＡポリメラーゼである、請求項７９に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
以下：
（ａ）オリゴヌクレオチドプライマーであって、前記オリゴヌクレオチドプライマーが、（ｉ）プローブ結合領域、および（ｉｉ）変異を保有すると疑われるテンプレート核酸に対して少なくとも７０％相補的なテンプレート結合領域であって、ここで前記テンプレート結合領域の一部が前記変異の疑わしい遺伝子座を少なくとも部分的に覆い、ここで前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記テンプレート核酸に対するハイブリダイゼーションの際に、前記変異が存在する場合はポリメラーゼによって伸長可能であるが、前記変異が存在しない場合は、前記ポリメラーゼによって伸長可能ではない、テンプレート結合領域を含む、オリゴヌクレオチドプライマーと；
（ｂ）使用説明書と、
を含む、キット。
前記変異が一塩基多型（ＳＮＰ）である、請求項８６に記載のキット。
前記テンプレート結合領域が、前記ＳＮＰ遺伝子座を覆う３’末端塩基を含む、請求項８７に記載のキット。
前記３’末端塩基が、前記ＳＮＰ遺伝子座の変異体対立遺伝子に対して相補的である、請求項８８に記載のキット。
前記３’末端塩基が、前記ＳＮＰ遺伝子座の野性型対立遺伝子に対して相補的である、請求項８８に記載のキット。
前記プローブ結合領域が、被験体由来のいかなるゲノム配列に対してもハイブリダイズしない、請求項８６に記載のキット。
前記プローブ結合領域に対して少なくとも７０％相補的であるレポータープローブをさらに含む、請求項８６に記載のキット。
前記レポータープローブが、検出可能部分およびクエンチャー部分を含み、ここで前記クエンチャー部分は、前記レポータープローブがインタクトである場合、前記検出可能部分の検出を抑制する、請求項９２に記載のキット。
前記オリゴヌクレオチドプライマーおよび前記レポータープローブからなるハイブリダイゼーション生成物が、前記オリゴヌクレオチドプライマーおよび前記テンプレート核酸からなるハイブリダイゼーション生成物のＴｍよりも少なくとも１０度高いＴｍを有する、請求項９２に記載のキット。
前記遺伝子座の下流の逆相補配列に対して少なくとも７０％相補的なリバースプライマーをさらに含む、請求項８６に記載のキット。
前記ポリメラーゼをさらに含む、請求項８６に記載のキット。
前記ポリメラーゼが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有し、かつ３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有さない熱安定性ポリメラーゼである、請求項９６に記載のキット。
請求項８６に記載のキットであって、さらに（ｉ）１つ以上の代替のオリゴヌクレオチドプライマーを含み、ここで前記１つ以上の代替のオリゴヌクレオチドプライマーは各々が、別個のプローブ結合領域および前記テンプレート核酸に対して少なくとも７０％相補的であるテンプレート結合領域を含み、ここで前記テンプレート結合領域の一部が、前記遺伝子座を少なくとも部分的に覆い、ここで前記代替のオリゴヌクレオチドプライマーが、前記テンプレート核酸に対するハイブリダイゼーションの際に、代替の対立遺伝子が存在する場合は、ポリメラーゼによって伸長可能であるが、前記代替の対立遺伝子が存在しない場合は、前記ポリメラーゼによって伸長可能ではない、キット。
請求項９８に記載のキットであって、さらに１つ以上の代替のレポータープローブを含み、ここで前記代替のレポータープローブの各々が、前記別個のプローブ結合領域のうちの１つに対して少なくとも７０％相補的であるが、前記キットのいかなる他のプローブ結合領域に対しても相補的ではない、キット。
請求項９９に記載のキットであって、ここで前記代替のレポータープローブの各々が、代替の検出可能部分およびクエンチャー部分を含み、ここで前記キットの前記検出可能部分の各々が、前記キットの任意の他の検出可能部分とは検出可能に（ｄｅｔｅｓｔａｂｌｙ）異なる、キット。
標的ポリヌクレオチド領域中の変異を検出する方法であって、前記方法は、以下：
（ａ）前記標的ポリヌクレオチド領域に対してオリゴヌクレオチドプライマーを選択的にハイブリダイズさせる工程であって、ここで前記オリゴヌクレオチドプライマーが、（ｉ）プローブ結合領域と、（ｉｉ）変異を保有することが疑われるテンプレート核酸に対して少なくとも７０％相補的なテンプレート結合領域とを含み、ここで前記テンプレート結合領域の一部が、前記変異の疑わしい遺伝子座を少なくとも部分的に覆い、かつここで前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記テンプレート核酸に対するハイブリダイゼーションの際に、前記変異が存在する場合は、ポリメラーゼによって伸長可能であるが、前記変異が存在しない場合は、前記ポリメラーゼによって伸長可能ではない、工程と；
（ｂ）ハイブリダイズした前記オリゴヌクレオチドプライマーを伸長して、伸長生成物を形成する工程と；
（ｃ）前記伸長生成物を検出する工程であって、ここで前記検出する工程が、前記変異の存在を示す、工程と；
を包含する、方法。
前記伸長させる工程が、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を含まないＤＮＡポリメラーゼで伸長させる工程を包含する、請求項１０１に記載の方法。
前記検出する工程が、レポータープローブを前記プローブ結合領域に対して選択的にハイブリダイズさせる工程を包含する、請求項１０１に記載の方法。
前記レポータープローブが、検出可能部分およびクエンチャー部分を含み、ここで前記クエンチャー部分は、前記レポータープローブがインタクトな場合、前記検出可能部分の検出を抑制する、請求項１０３に記載の方法。
前記検出する工程がさらに、ハイブリダイズした前記レポータープローブの前記クエンチャー部分から前記検出可能部分を分離する工程を包含する、請求項１０４に記載の方法。
前記伸長生成物を、前記遺伝子座の下流の前記伸長生成物のある領域に対してハイブリダイズ可能なリバースプライマーを用いて増幅する工程をさらに包含する、請求項１０３に記載の方法。
前記増幅する工程が、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を含むＤＮＡポリメラーゼで増幅する工程を包含する、請求項１０６に記載の方法。
前記オリゴヌクレオチドプライマーおよびレポータープローブのハイブリダイゼーション生成物が、前記オリゴヌクレオチドプライマーと標的ポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーション生成物のＴｍよりも少なくとも１０度高いＴｍを有する、請求項１０３に記載の方法。
前記レポータープローブの濃度が、前記フォワードプライマーの濃度の少なくとも１０×である、請求項１０３に記載の方法。
請求項１０１に記載の方法であって、前記標的ポリヌクレオチド領域に対して１つ以上の代替のオリゴヌクレオチドプライマーを選択的にハイブリダイズさせる工程をさらに包含し、ここで前記１つ以上の代替のオリゴヌクレオチドプライマーが各々、別個のプローブ結合領域および前記テンプレート核酸に対して少なくとも７０％相補的であるテンプレート結合領域を含み、ここで前記テンプレート結合領域の一部が、前記遺伝子座を少なくとも部分的に覆い、ここで前記代替のオリゴヌクレオチドプライマーが、前記テンプレート核酸に対するハイブリダイゼーションの際に、代替の対立遺伝子が存在する場合は、ポリメラーゼによって伸長可能であるが、前記代替の対立遺伝子が存在しない場合は、前記ポリメラーゼによって伸長可能ではない、方法。
前記検出する工程がさらに、前記１つ以上の代替のオリゴヌクレオチドプライマーに対して１つ以上の代替のレポータープローブを選択的にハイブリダイズさせる工程を包含し、ここで前記代替のレポータープローブの各々が、前記別個のプローブ結合領域の１つに対して少なくとも７０％相補的であるが、前記プローブ結合領域の他のいずれに対しても相補的ではない、請求項１１０に記載の方法。
前記代替のレポータープローブの各々が、代替の検出可能部分およびクエンチャー部分を含み、ここで前記代替の検出可能部分の各々が、前記検出可能部分の他のいずれとも検出可能に異なる、請求項１１１に記載の方法。
前記変異が、一塩基多型（ＳＮＰ）である、請求項１０１に記載の方法。
前記テンプレート結合領域が、前記ＳＮＰ遺伝子座を覆う塩基を有する３’末端領域を含む、請求項１１３に記載の方法。
前記塩基が、前記ＳＮＰ遺伝子座の変異体対立遺伝子に対して相補的である、請求項１１４に記載の方法。
前記塩基が、前記ＳＮＰ遺伝子座の野性型対立遺伝子に対して相補的である、請求項１１４に記載の方法。
前記プローブ結合領域が、前記標的ポリヌクレオチド領域に対してハイブリダイズしない、請求項１０１に記載の方法。
前記核酸サンプルが、工程ｂ−ｃの前に複数の別個の反応容積に細かく分割される、請求項１０１に記載の方法。
前記反応容積の各々において前記検出可能な部分の検出をさらに包含する、請求項１１８に記載の方法。
多数の前記反応容積をカウントする工程をさらに包含し、ここで前記検出可能部分が検出される、請求項１１９に記載の方法。
前記複数の個別の反応容積が平均で１未満のテンプレート核酸分子を含むように、前記核酸サンプルが細かく分割される、請求項１１８に記載の方法。
結論を提供する工程およびネットワークをわたって前記結論を伝達する工程をさらに包含する、請求項１０１に記載の方法。
以下：
（ａ）テンプレート核酸に対してハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドプライマーであって、ここで前記テンプレート核酸は、ある遺伝子座で野性型対立遺伝子を含み、ここで前記オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端領域は、前記遺伝子座を覆い、かつ前記野性型対立遺伝子に相補的ではない、オリゴヌクレオチドプライマーと；
（ｂ）検出可能部分およびクエンチャー部分を含むインタクトなレポータープローブであって、ここで前記インタクトなレポータープローブが、前記オリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズされる、レポータープローブと、
を含む、組成物。
高効率のライゲーション反応を行う方法であって、複数のドナー核酸分子のうち少なくとも１０％の第一の末端に対して複数のアクセプター核酸分子を連結する工程を包含し、ここで前記ドナーまたはアクセプター核酸分子のうちの１つは、１２０ｎｔ長を超える、方法。
高効率のライゲーション反応を行う方法であって、複数のアクセプター核酸分子のうち少なくとも１０％の第一の末端に対して複数のドナー核酸分子を連結する工程を包含し、ここで前記ドナーまたはアクセプター核酸分子のうちの１つは、１２０ｎｔ長を超える、方法。
前記アクセプター核酸分子が前記ドナー核酸分子である、請求項１２４または１２５に記載の方法。
請求項１２４または１２５に記載の方法であって：
（ａ）ヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）担持ドナー核酸分子の蓄積を達成するのに十分な時間、反応混合物中で、ある量のドナー核酸分子にＮＭＰを移動させる工程と；
（ｂ）ＮＭＰ担持ドナー核酸分子とアクセプター核酸分子との間の共有結合の形成を達成する工程と、を包含し、
ここで工程（ａ）および（ｂ）が前記反応混合物中で逐次的に行われる、方法。
前記移動させる工程が、前記ドナー核酸分子の少なくとも１０％までＮＭＰの移動を生じる、請求項１２７に記載の方法。
前記移動させる工程が、前記ドナー核酸分子の少なくとも５０％までＮＭＰの移動を生じる、請求項１２８に記載の方法。
前記移動させる工程が、前記ドナー核酸分子の少なくとも７０％までＮＭＰの移動を生じる、請求項１２８に記載の方法。
前記移動させる工程が、前記ドナー核酸分子の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％までＮＭＰの移動を生じる、請求項１２８に記載の方法。
前記ＮＭＰがＡＭＰである、請求項１２７〜１３１のいずれかに記載の方法。
前記ＮＭＰがＧＭＰである、請求項１２７〜１３１のいずれかに記載の方法。
前記ドナー核酸分子の少なくとも１つのメンバーの３’末端領域が、未改変の３’末端領域である、請求項１２７に記載の方法。
請求項１２７に記載の方法であって、前記反応混合物が、以下：
（ａ）ドナー核酸分子の前記量に対して少なくとも等モルである量のヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）依存性リガーゼと；
（ｂ）前記ＡＴＰ依存性リガーゼのミカエリス定数（Ｋｍ）より少なくとも１０倍高い量で存在するＮＴＰと；
を含む、方法。
前記ＮＴＰ依存性リガーゼがＲＮＡリガーゼである、請求項１３５に記載の方法。
前記ＲＮＡリガーゼが、好熱性のＲＮＡリガーゼである、請求項１３５に記載の方法。
前記ＮＴＰ依存性リガーゼがＡＴＰ依存性ＲＮＡリガーゼである、請求項１３５に記載の方法。
前記ＡＴＰ依存性ＲＮＡリガーゼがＭｔｈＲｎｌ、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ、またはＣｉｒｃＬｉｇａｓｅＩＩである、請求項１３８に記載の方法。
前記ＡＴＰ依存性リガーゼがＣｉｒｃＬｉｇａｓｅまたはＣｉｒｃＬｉｇａｓｅＩＩである、請求項１３９に記載の方法。
前記ＮＴＰ依存性リガーゼがＧＴＰ依存性ＲＮＡリガーゼである、請求項１３５に記載の方法。
前記ＧＴＰ依存性ＲＮＡリガーゼがＲｔｃＢである、請求項１４１に記載の方法。
ドナー核酸分子の３’末端領域が、３’末端ブロック基で改変されている、請求項１３５に記載の方法。
前記共有結合の形成を達成する工程が、前記反応混合物に対して、以下：
（ａ）前記アクセプター核酸分子と；
（ｂ）Ｍｎ^２＋と、
を添加する工程を包含する、請求項１３５に記載の方法。
前記Ｍｎ^２＋が、少なくとも２．５ｍＭの量で存在する、請求項１４４に記載の方法。
前記反応混合物中の前記ＮＴＰの濃度を低下させる工程をさらに包含する、請求項１４４に記載の方法。
前記濃度を低下させる工程が、前記ＮＴＰの濃度を少なくとも１０分の１に低下させる工程を包含する、請求項１４６に記載の方法。
前記濃度を低下させる工程が、前記ＮＴＰを少なくとも１０倍希釈するのに十分な量の液体を前記反応混合物に添加する工程を包含する、請求項１４６に記載の方法。
前記ドナー核酸分子が、生物学的供給源から単離された核酸分子を含み、かつここで前記アクセプター核酸分子がアダプター配列を含む、請求項１２７〜１４８のいずれかに記載の方法。
前記アクセプター核酸分子が、生物学的被験体から単離された核酸を含み、かつここで前記ドナー核酸分子がアダプター配列を含む、請求項１２７〜１４９のいずれかに記載の方法。
前記アクセプター核酸分子が、生物学的被験体から単離された核酸を含み、かつここで前記ドナー核酸分子がバーコード配列を含む、請求項１２７〜１４８のいずれかに記載の方法。
前記ドナー核酸分子が生物学的被験体から単離された核酸を含み、かつここで前記アクセプター核酸分子がバーコード配列を含む、請求項１２７〜１４８のいずれかに記載の方法。
前記アクセプター核酸分子またはドナー核酸分子が、検出可能タグを含む、請求項１２７〜１４８のいずれかに記載の方法。
核酸ライブラリーを調製する方法であって、複数のテンプレート核酸分子のうち少なくとも１０％の第一の末端に対してオリゴヌクレオチド配列を連結して、前記核酸ライブラリーを作成する工程を包含し、ここで前記テンプレート核酸分子のうちの１つが１２０ｎｔ長を超える、方法。
前記複数のテンプレート核酸分子のうち少なくとも５０％の第一の末端に対してオリゴヌクレオチド配列を連結する工程を包含する、請求項１５４に記載の方法。
前記複数のテンプレート核酸分子のうち少なくとも７０％の第一の末端に対してオリゴヌクレオチド配列を連結する工程を包含する、請求項１５４に記載の方法。
前記複数のテンプレート核酸分子のうち少なくとも９０％の第一の末端に対してオリゴヌクレオチド配列を連結する工程を包含する、請求項１５４に記載の方法。
前記オリゴヌクレオチド配列が、アダプター配列である、請求項１５４に記載の方法。
前記核酸ライブラリーを配列決定する工程をさらに包含する、請求項１５８に記載の方法。
前記オリゴヌクレオチド配列が検出可能標識を含む、請求項１５４に記載の方法。
前記核酸ライブラリーをアレイハイブリダイゼーションによって分析する工程をさらに包含する、請求項１６０に記載の方法。
核酸ライブラリーを調製する方法であって、以下：
（ａ）複数のテンプレート核酸分子のうちの少なくとも１０％の第一の末端に対してアダプター配列を連結して前記核酸ライブラリーを作成する工程と；
（ｂ）前記核酸ライブラリーを配列決定する工程と；
を包含する、方法。
前記配列決定が、前記核酸ライブラリーの予備増幅なしで行われる、請求項１５９または１６２に記載の方法。
前記複数のテンプレート核酸分子が、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を含む、請求項１５４または１６２に記載の方法。
前記ｇＤＮＡが、固体組織サンプルから単離される、請求項１６４に記載の方法。
前記ｇＤＮＡが血漿、血清、痰、唾液、尿、または汗から単離される、請求項１６４に記載の方法。
前記複数のテンプレート核酸分子が、一本鎖核酸フラグメントを含む、請求項１５４または１６２に記載の方法。
前記複数のテンプレート核酸分子のうち少なくとも５０％の第一の末端に対してアダプター配列を連結する工程を包含する、請求項１５４または１６２に記載の方法。
前記複数のテンプレート核酸分子のうち少なくとも７０％の第一の末端に対してアダプター配列を連結する工程を包含する、請求項１５４または１６２に記載の方法。
前記複数のテンプレート核酸分子のうち少なくとも９０％の第一の末端に対してアダプター配列を連結する工程を包含する、請求項１５４または１６２に記載の方法。
前記複数のテンプレート核酸分子のうち少なくとも９５％の第一の末端に対してアダプター配列を連結する工程を包含する、請求項１５４または１６２に記載の方法。
請求項１５４または１６２に記載の方法であって、前記連結する工程が、以下：
（ａ）ヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）担持反応物質１の蓄積を達成するのに十分な時間、第一の反応混合物中である量の核酸の第一の集団（反応物質１）までＮＭＰを移動させる工程と；
（ｂ）前記ＮＭＰ担持反応物質１と核酸の第二の集団（反応物質２）との間の共有結合の形成を達成する工程を包含し、
ここで前記反応物質１が、（ｉ）前記複数のテンプレート核酸または（ｉｉ）前記オリゴヌクレオチドもしくはアダプター配列の一方であり、ここで前記反応物質２が（ｉ）前記複数のテンプレート核酸または（ｉｉ）前記オリゴヌクレオチドもしくはアダプター配列の他方であり、かつここでアデニル化された前記反応物質１が前記共有結合の形成を達成する工程の前に精製されない、方法。
前記移動させる工程が、前記反応物質１の少なくとも１０％までＮＭＰの移動を生じる、請求項１７２に記載の方法。
前記移動させる工程が、前記反応物質１の少なくとも５０％までＮＭＰの移動を生じる、請求項１７３に記載の方法。
前記移動させる工程が、前記反応物質１の少なくとも７０％までＮＭＰの移動を生じる、請求項１７３に記載の方法。
前記移動させる工程が、前記反応物質１の少なくとも９０％までＮＭＰの移動を生じる、請求項１７３に記載の方法。
前記反応物質１の少なくとも１つのメンバーの３’末端領域が、未改変の３’末端領域である、請求項１７２に記載の方法。
請求項１７２に記載の方法であって、前記第一の反応混合物が、以下：
（ａ）前記反応物質１の量に対して少なくとも等モルである量のＮＴＰ依存性リガーゼと；
（ｂ）前記ＮＴＰ依存性リガーゼのミカエリス定数（Ｋｍ）より少なくとも１０倍高い量で存在するＮＴＰと；
を含む、方法。
前記ＮＴＰ依存性リガーゼがＲＮＡリガーゼである、請求項１７８に記載の方法。
前記ＲＮＡリガーゼが、好熱性のＲＮＡリガーゼである、請求項１７９に記載の方法。
前記ＮＴＰ依存性リガーゼがＡＴＰ依存性ＲＮＡリガーゼである、請求項１７９に記載の方法。
前記ＡＴＰ依存性ＲＮＡリガーゼがＭｔｈＲｎｌ、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ、またはＣｉｒｃＬｉｇａｓｅＩＩである、請求項１８１に記載の方法。
前記ＡＴＰ依存性リガーゼがＣｉｒｃＬｉｇａｓｅまたはＣｉｒｃＬｉｇａｓｅＩＩである、請求項１８２に記載の方法。
前記ＮＴＰ依存性リガーゼがＧＴＰ依存性ＲＮＡリガーゼである、請求項１７９に記載の方法。
前記ＧＴＰ依存性ＲＮＡリガーゼがＲｔｃＢである、請求項１８４に記載の方法。
反応物質１の少なくとも１つのメンバーの３’末端領域が、３’末端ブロック基で改変されている、請求項１７２に記載の方法。
前記共有結合の形成を達成する工程が、前記第一の反応混合物に対して、以下：
（ａ）陽イオンと；
（ｂ）前記反応物質２と；
（ｃ）前記ＮＴＰを少なくとも１０倍希釈するのに十分な量の液体と、
を添加する工程を包含する、請求項１７８に記載の方法。
前記陽イオンがＭｎ^２＋である、請求項１８７に記載の方法。
前記複数のテンプレート核酸分子のうち少なくとも１０％の第二の末端に対して第二のアダプター配列を連結する工程をさらに包含する、請求項１５４または１６２に記載の方法。
前記複数のテンプレート核酸分子のうち少なくとも５０％の第二の末端に対して第二のアダプター配列を連結する工程をさらに包含する、請求項１５４または１６２に記載の方法。
前記複数のテンプレート核酸分子のうち少なくとも７０％の第二の末端に対して第二のアダプター配列を連結する工程をさらに包含する、請求項１５４または１６２に記載の方法。
前記複数のテンプレート核酸分子のうち少なくとも９０％の第二の末端に対して第二のアダプター配列を連結する工程をさらに包含する、請求項１５４または１６２に記載の方法。
請求項１５４または１６２に記載の方法であって、さらに以下：
（ａ）前記ＤＮＡライブラリーのメンバーに対して、標的選択性オリゴヌクレオチド（ｔｓｏ）をハイブリダイズさせる工程であって、前記標的選択性オリゴヌクレオチドが、（ｉ）ｇＤＮＡのある領域に特異的な配列と、（ｉｉ）第二のアダプター配列とを含む、工程と；
（ｂ）ハイブリダイズした前記ｔｓｏを伸長して、前記第一および第二のアダプターを含む二本鎖ライブラリーのメンバーを作成する工程と、
を包含する、方法。
前記ｔｓｏが、癌関連遺伝子のある領域に対して少なくとも７０％の同一性または相補性を有する配列を含む、請求項１９３に記載の方法。
前記配列決定が、大規模並列配列決定を包含する、請求項１５９または１６２のいずれかに記載の方法。
前記連結する工程が、３時間未満行われ得る、反応プロトコールを用いて行われる、請求項１５４または１６２に記載の方法。
以下：
（ａ）ＮＴＰ依存性リガーゼと；
（ｂ）陽イオンと；
（ｃ）ＮＴＰと；
（ｄ）請求項＿＿＿＿のいずれかに記載の方法を行うための使用説明書と；
を含む、キット。
前記ＮＴＰがＡＴＰである、請求項１９７に記載のキット。
前記ＮＴＰ依存性リガーゼがＡＴＰ依存性リガーゼである、請求項１９８に記載のキット。
前記ＡＴＰ依存性リガーゼがＡＴＰ依存性ＲＮＡリガーゼである、請求項１９９に記載のキット。
前記ＡＴＰ依存性ＲＮＡリガーゼが、ＭｔｈＲｎｌ、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ、またはＣｉｒｃＬｉｇａｓｅＩＩである、請求項２００に記載のキット。
前記ＡＴＰ依存性リガーゼがＣｉｒｃＬｉｇａｓｅまたはＣｉｒｃＬｉｇａｓｅＩＩである、請求項２０１に記載のキット。
前記ＮＴＰがＧＴＰである、請求項１９７に記載のキット。
前記ＮＴＰ依存性リガーゼがＧＴＰ依存性リガーゼである、請求項２０３に記載のキット。
前記ＧＴＰ依存性リガーゼがＧＴＰ依存性ＲＮＡリガーゼである、請求項２０４に記載のキット。
前記ＧＴＰ依存性ＲＮＡリガーゼがＲｔｃＢである、請求項２０５に記載のキット。
被験体の腫瘍から単離された腫瘍ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）および前記被験体由来の非腫瘍組織から単離された正常なｇＤＮＡを用いて、腫瘍特異的な変異を追跡する方法であって、前記方法は、以下：
（ａ）予備増幅なしで前記腫瘍ｇＤＮＡから調製されたＤＮＡライブラリーを配列決定して第一のデータセットを作成する工程と；
（ｂ）予備増幅なしで前記正常なｇＤＮＡから調製されたＤＮＡライブラリーを配列決定して第二のデータセットを作成する工程と；
（ｃ）前記第一のデータセットおよび前記第二のデータセットを分析して、前記被験体における１つ以上の腫瘍特異的な変異を同定する工程と；
（ｄ）前記被験体由来の液体サンプルから単離された無細胞ＤＮＡ中で前記腫瘍特異的な変異の存在または不在を検出する工程と、
を包含する、方法。
前記液体サンプルが、血漿、血清、痰、唾液、尿、および汗からなる群より選択される、請求項２０７に記載の方法。
工程（ａ）または（ｂ）の前記ＤＮＡライブラリーが、請求項１５４または１６２に記載の方法を用いて調製される、請求項２０７に記載の方法。
前記配列決定が、少なくとも２００個の癌関連遺伝子を配列決定する工程を包含する、請求項２０７に記載の方法。
前記癌関連遺伝子が、ＡＢＣＡ１、ＢＲＡＦ、ＣＨＤ５、ＥＰ３００、ＦＬＴ１、ＩＴＰＡ、ＭＹＣ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＳＫＰ２、ＴＰ５３、ＡＢＣＡ７、ＢＲＣＡ１、ＣＨＥＫ１、ＥＰＨＡ３、ＦＬＴ３、ＪＡＫ１、ＭＹＣＬ１、ＰＩＫ３Ｒ２、ＳＬＣ１９Ａ１、ＴＰ７３、ＡＢＣＢ１、ＢＲＣＡ２、ＣＨＥＫ２、ＥＰＨＡ５、ＦＬＴ４、ＪＡＫ２、ＭＹＣＮ、ＰＫＨＤ１、ＳＬＣ１Ａ６、ＴＰＭ３、ＡＢＣＣ２、ＢＲＩＰ１、ＣＬＴＣ、ＥＰＨＡ６、ＦＮ１、ＪＡＫ３、ＭＹＨ２、ＰＬＣＢ１、ＳＬＣ２２Ａ２、ＴＰＭＴ、ＡＢＣＣ３、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＯＬ１Ａ１、ＥＰＨＡ７、ＦＯＳ、ＪＵＮ、ＭＹＨ９、ＰＬＣＧ１、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＴＰＯ、ＡＢＣＣ４、Ｃ１ｏｒｆ１４４、ＣＯＰＳ５、ＥＰＨＡ８、ＦＯＸＯ１、ＫＢＴＢＤ１１、ＮＡＶ３、ＰＬＣＧ２、ＳＭＡＤ２、ＴＰＲ、ＡＢＣＧ２、ＣＡＢＬＥＳ１、ＣＲＥＢ１、ＥＰＨＢ１、ＦＯＸＯ３、ＫＤＭ６Ａ、ＮＢＮ、ＰＭＬ、ＳＭＡＤ３、ＴＲＩＯ、ＡＢＬ１、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＣＲＥＢＢＰ、ＥＰＨＢ４、ＦＯＸＰ４、ＫＤＲ、ＮＣＯＡ２、ＰＭＳ２、ＳＭＡＤ４、ＴＲＲＡＰ、ＡＢＬ２、ＣＡＭＫＶ、ＣＲＫＬ、ＥＰＨＢ６、ＧＡＢ１、ＫＩＴ、ＮＥＫ１１、ＰＰＡＲＧ、ＳＭＡＲＣＡ４、ＴＳＣ１、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＣＡＲＤ１１、ＣＲＬＦ２、ＥＰＯ、ＧＡＴＡ１、ＫＬＦ６、ＮＦ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＳＭＡＲＣＢ１、ＴＳＣ２、ＡＣＶＲ２Ａ、ＣＡＲＭ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＥＲＢＢ２、ＧＬＩ１、ＫＬＨＤＣ４、ＮＦ２、ＰＰＰ１Ｒ３Ａ、ＳＭＯ、ＴＴＫ、ＡＤＣＹ９、ＣＡＶ１、ＣＳＭＤ３、ＥＲＢＢ３、ＧＬＩ３、ＫＲＡＳ、ＮＫＸ２−１、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＳＯＣＳ１、ＴＹＫ２、ＡＧＡＰ２、ＣＢＦＡ２Ｔ３、ＣＳＮＫ１Ｇ２、ＥＲＢＢ４、ＧＮＡ１１、ＬＭＯ２、ＮＯＳ２、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ、ＳＯＤ２、ＴＹＭＳ、ＡＫＴ１、ＣＢＬ、ＣＴＮＮＡ１、ＥＲＣＣ１、ＧＮＡＱ、ＬＲＰ１Ｂ、ＮＯＳ３、ＰＲＫＡＡ２、ＳＯＳ１、ＵＧＴ１Ａ１、ＡＫＴ２、ＣＣＮＤ１、ＣＴＮＮＡ２、ＥＲＣＣ２、ＧＮＡＳ、ＬＲＰ２、ＮＯＴＣＨ１、ＰＲＫＣＡ、ＳＯＸ１０、ＵＭＰＳ、ＡＫＴ３、ＣＣＮＤ２、ＣＴＮＮＢ１、ＥＲＣＣ３、ＧＰＲ１２４、ＬＲＰ６、ＮＯＴＣＨ２、ＰＲＫＣＺ、ＳＯＸ２、ＵＳＰ９Ｘ、ＡＬＫ、ＣＣＮＤ３、ＣＹＦＩＰ１、ＥＲＣＣ４、ＧＰＲ１３３、ＬＴＫ、ＮＯＴＣＨ３、ＰＲＫＤＣ、ＳＰ１、ＶＥＧＦ、ＡＮＡＰＣ５、ＣＣＮＥ１、ＣＹＬＤ、ＥＲＣＣ５、ＧＲＢ２、ＭＡＮ１Ｂ１、ＮＰＭ１、ＰＴＣＨ１、ＳＰＲＹ２、ＶＥＧＦＡ、ＡＰＣ、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＹＰ１９Ａ１、ＥＲＣＣ６、ＧＳＫ３Ｂ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＮＱＯ１、ＰＴＣＨ２、ＳＲＣ、ＶＨＬ、ＡＰＣ２、ＣＤ４４、ＣＹＰ１Ｂ１、ＥＲＧ、ＧＳＴＰ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＲ３Ｃ１、ＰＴＥＮ、ＳＴ６ＧＡＬ２、ＷＲＮ、ＡＲ、ＣＤ７９Ａ、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＥＲＮ２、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＭＡＰ２Ｋ４、ＮＲＡＳ、ＰＴＧＳ２、ＳＴＡＴ１、ＷＴ１、ＡＲＡＦ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＹＰ２Ｃ８、ＥＳＲ１、ＨＤＡＣ１、ＭＡＰ２Ｋ７、ＮＲＰ２、ＰＴＰＮ１１、ＳＴＡＴ３、ＸＰＡ、ＡＲＦＲＰ１、ＣＤＣ４２、ＣＹＰ２Ｄ６、ＥＳＲ２、ＨＤＡＣ２、ＭＡＰ３Ｋ１、ＮＴＲＫ１、ＰＴＰＲＢ、ＳＴＫ１１、ＸＰＣ、ＡＲＩＤ１Ａ、ＣＤＣ４２ＢＰＢ、ＣＹＰ３Ａ４、ＥＴＶ４、ＨＧＦ、ＭＡＰＫ１、ＮＴＲＫ２、ＰＴＰＲＤ、ＳＵＦＵ、ＺＦＹ、ＡＴＭ、ＣＤＣ７３、ＣＹＰ３Ａ５、ＥＷＳＲ１、ＨＩＦ１Ａ、ＭＡＰＫ３、ＮＴＲＫ３、ＲＡＤ５０、ＳＵＬＴ１Ａ１、ＺＮＦ５２１、ＡＴＰ５Ａ１、ＣＤＨ１、ＤＡＣＨ２、ＥＸＴ１、ＨＭ１３、ＭＡＰＫ８、ＯＭＡ１、ＲＡＤ５１、ＳＵＺ１２、ＡＴＲ、ＣＤＨ１０、ＤＣＣ、ＥＺＨ２、ＨＭＧＡ１、ＭＡＲＫ３、ＯＲ１０Ｒ２、ＲＡＦ１、ＴＡＦ１、ＡＵＲＫＡ、ＣＤＨ２、ＤＣＬＫ３、ＦＡＮＣＡ、ＨＮＦ１Ａ、ＭＣＬ１、ＰＡＫ３、ＲＡＲＡ、ＴＢＸ２２、ＡＵＲＫＢ、ＣＤＨ２０、ＤＤＢ２、ＦＡＮＣＤ２、ＨＯＸＡ３、ＭＤＭ２、ＰＡＲＰ１、ＲＢ１、ＴＣＦ１２、ＢＡＩ３、ＣＤＨ５、ＤＤＲ２、ＦＡＮＣＥ、ＨＯＸＡ９、ＭＤＭ４、ＰＡＸ５、ＲＥＭ１、ＴＣＦ３、ＢＡＰ１、ＣＤＫ２、ＤＧＫＢ、ＦＡＮＣＦ、ＨＲＡＳ、ＭＥＣＯＭ、ＰＣＤＨ１５、ＲＥＴ、ＴＣＦ４、ＢＡＲＤ１、ＣＤＫ４、ＤＧＫＺ、ＦＡＳ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＭＥＮ１、ＰＣＤＨ１８、ＲＩＣＴＯＲ、ＴＥＫ、ＢＡＸ、ＣＤＫ６、ＤＩＲＡＳ３、ＦＢＸＷ７、ＩＤＨ１、ＭＥＴ、ＰＣＮＡ、ＲＩＰＫ１、ＴＥＰ１、ＢＣＬ１１Ａ、ＣＤＫ７、ＤＬＧ３、ＦＣＧＲ３Ａ、ＩＤＨ２、ＭＩＴＦ、ＰＤＧＦＡ、ＲＯＲ１、ＴＥＲＴ、ＢＣＬ２、ＣＤＫ８、ＤＬＬ１、ＦＥＳ、ＩＦＮＧ、ＭＬＨ１、ＰＤＧＦＢ、ＲＯＲ２、ＴＥＴ２、ＢＣＬ２Ａ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＤＮＭＴ１、ＦＧＦＲ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＭＬＬ、ＰＤＧＦＲＡ、ＲＯＳ１、ＴＧＦＢＲ２、ＢＣＬ２Ｌ１、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＦＧＦＲ２、ＩＧＦ２Ｒ、ＭＬＬ３、ＰＤＧＦＲＢ、ＲＰＳ６ＫＡ２、ＴＨＢＳ１、ＢＣＬ２Ｌ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＦＧＦＲ３、ＩＫＢＫＥ、ＭＰＬ、ＰＤＺＲＮ３、ＲＰＴＯＲ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＢＣＬ３、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＤＯＴ１Ｌ、ＦＧＦＲ４、ＩＫＺＦ１、ＭＲＥ１１Ａ、ＰＨＬＰＰ２、ＲＳＰＯ２、ＴＮＫＳ、ＢＣＬ６、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＤＰＹＤ、ＦＨ、ＩＬ２ＲＧ、ＭＳＨ２、ＰＩＫ３Ｃ３、ＲＳＰＯ３、ＴＮＫＳ２、ＢＣＲ、ＣＤＫＮ２Ｄ、Ｅ２Ｆ１、ＦＨＯＤ３、ＩＮＨＢＡ、ＭＳＨ６、ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＵＮＸ１、ＴＮＮＩ３Ｋ、ＢＩＲＣ５、ＣＤＸ２、ＥＥＤ、ＦＩＧＦ、ＩＮＳＲ、ＭＴＨＦＲ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＳＤＨＢ、ＴＮＲ、ＢＩＲＣ６、ＣＥＢＰＡ、ＥＧＦ、ＦＬＧ２、ＩＲＳ１、ＭＴＯＲ、ＰＩＫ３ＣＤ、ＳＦ３Ｂ１、ＴＯＰ１、ＢＬＭ、ＣＥＲＫ、ＥＧＦＲ、ＦＬＮＣ、ＩＲＳ２、ＭＵＴＹＨ、ＰＩＫ３ＣＧ、ＳＨＣ１、およびＴＯＰ２Ａからなる群より選択される、請求項２１０に記載の方法。
前記腫瘍特異的な変異のプロファイルを連絡するレポートを作成する工程をさらに包含する、請求項２０７に記載の方法。
工程（ｄ）が、複数の時点で行われる、請求項２０７に記載の方法。
１つの時点が、癌治療の最初の施行の前であり、かつ第二の時点が前記最初の施行に引き続く、請求項２１３に記載の方法。
前記複数の時点で腫瘍特異的な変異のプロファイルを連絡するレポートを作成する工程をさらに包含する、請求項２１３に記載の方法。
前記レポートが、前記腫瘍特異的変異の１つを保有する遺伝子を標的にする１つ以上の治療候補のリストを含む、請求項２１２または２１５に記載の方法。
前記レポートが前記ｇＤＮＡを単離する工程から１週で作成される、請求項２１２に記載の方法。
前記変異が、コピー数変動を含む、請求項２０７に記載の方法。
前記検出する工程が、前記無細胞ＤＮＡを配列決定する工程を包含する、請求項２０７に記載の方法。
請求項２１９に記載の方法であって、前記無細胞ＤＮＡ中に存在する少なくとも１０個の癌関連遺伝子を配列決定する工程を包含し、ここで前記少なくとも１０個の癌関連遺伝子のうちの１つが、請求項２０７の工程ｃ）において、腫瘍特異的な変異を保有していると同定される、方法。
請求項２１９に記載の方法であって、前記無細胞ＤＮＡ中に存在する少なくとも１００個の癌関連遺伝子を配列決定する工程を包含し、ここで前記少なくとも１００個の癌関連遺伝子のうちの１つが、請求項２０７の工程ｃ）において、腫瘍特異的な変異を保有していると同定される、方法。
前記配列決定する工程が、請求項１５９または１６２に記載の方法を包含する、請求項２１９に記載の方法。
アンプリコンの感度のよい検出のためのオリゴヌクレオチドプローブであって、以下：
（ａ）検出可能部分と；
（ｂ）クエンチャー部分と；
（ｃ）５０℃未満の融点（Ｔｍ）と、
を含む、オリゴヌクレオチドプローブ。
前記プローブが、８〜３０の長さのヌクレオチドを有する、請求項２２３に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
前記検出可能部分が、５５℃以上の温度でクエンチされる、前記請求項のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
前記プローブが、５５℃を超える周囲温度で相補的なテンプレート核酸に対してハイブリダイズしない、前記請求項のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
前記プローブが、テンプレート鎖に対してハイブリダイズされない場合、前記クエンチャー部分が、前記検出可能部分をクエンチする、前記請求項のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
前記Ｔｍが３０℃〜４５℃の間である、前記請求項のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
フルオロフォア部分およびクエンチャー部分が、少なくとも７ヌクレオチド離れて隔てられる、前記請求項のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
ＴＭを増強する塩基ヌクレオチドを含む、前記請求項のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
前記ＴＭを増強する塩基ヌクレオチドが、ロックドヌクレオチドかまたは架橋ヌクレオチドである、請求項２３０に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
前記検出可能部分がフルオロフォアを含む、前記請求項のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
少なくとも１５ヌクレオチドの長さを有する、前記請求項のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
少なくとも４０％のＧＣ含量を有している、前記請求項のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
８０％未満のＧＣ含量を有している、前記請求項のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
５０％未満のＧＣ含量を有している、前記請求項のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
４０％未満のＧＣ含量を有している、前記請求項のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
１５ヌクレオチド未満の長さを有している、前記請求項のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
４０％未満のＧＣ含量を有している、前記請求項のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
少なくとも４０％であるＧＣ含量を有している、前記請求項のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
４０％〜８０％の間であるＧＣ含量を有している、前記請求項のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
４０％未満のＧＣ含量を有しており、かつさらにロックドヌクレオチドまたは架橋されたヌクレオチドを含む、前記請求項のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
前記請求項のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブであって、ＡＢＣＡ１、ＢＲＡＦ、ＣＨＤ５、ＥＰ３００、ＦＬＴ１、ＩＴＰＡ、ＭＹＣ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＳＫＰ２、ＴＰ５３、ＡＢＣＡ７、ＢＲＣＡ１、ＣＨＥＫ１、ＥＰＨＡ３、ＦＬＴ３、ＪＡＫ１、ＭＹＣＬ１、ＰＩＫ３Ｒ２、ＳＬＣ１９Ａ１、ＴＰ７３、ＡＢＣＢ１、ＢＲＣＡ２、ＣＨＥＫ２、ＥＰＨＡ５、ＦＬＴ４、ＪＡＫ２、ＭＹＣＮ、ＰＫＨＤ１、ＳＬＣ１Ａ６、ＴＰＭ３、ＡＢＣＣ２、ＢＲＩＰ１、ＣＬＴＣ、ＥＰＨＡ６、ＦＮ１、ＪＡＫ３、ＭＹＨ２、ＰＬＣＢ１、ＳＬＣ２２Ａ２、ＴＰＭＴ、ＡＢＣＣ３、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＯＬ１Ａ１、ＥＰＨＡ７、ＦＯＳ、ＪＵＮ、ＭＹＨ９、ＰＬＣＧ１、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＴＰＯ、ＡＢＣＣ４、Ｃ１ｏｒｆ１４４、ＣＯＰＳ５、ＥＰＨＡ８、ＦＯＸＯ１、ＫＢＴＢＤ１１、ＮＡＶ３、ＰＬＣＧ２、ＳＭＡＤ２、ＴＰＲ、ＡＢＣＧ２、ＣＡＢＬＥＳ１、ＣＲＥＢ１、ＥＰＨＢ１、ＦＯＸＯ３、ＫＤＭ６Ａ、ＮＢＮ、ＰＭＬ、ＳＭＡＤ３、ＴＲＩＯ、ＡＢＬ１、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＣＲＥＢＢＰ、ＥＰＨＢ４、ＦＯＸＰ４、ＫＤＲ、ＮＣＯＡ２、ＰＭＳ２、ＳＭＡＤ４、ＴＲＲＡＰ、ＡＢＬ２、ＣＡＭＫＶ、ＣＲＫＬ、ＥＰＨＢ６、ＧＡＢ１、ＫＩＴ、ＮＥＫ１１、ＰＰＡＲＧ、ＳＭＡＲＣＡ４、ＴＳＣ１、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＣＡＲＤ１１、ＣＲＬＦ２、ＥＰＯ、ＧＡＴＡ１、ＫＬＦ６、ＮＦ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＳＭＡＲＣＢ１、ＴＳＣ２、ＡＣＶＲ２Ａ、ＣＡＲＭ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＥＲＢＢ２、ＧＬＩ１、ＫＬＨＤＣ４、ＮＦ２、ＰＰＰ１Ｒ３Ａ、ＳＭＯ、ＴＴＫ、ＡＤＣＹ９、ＣＡＶ１、ＣＳＭＤ３、ＥＲＢＢ３、ＧＬＩ３、ＫＲＡＳ、ＮＫＸ２−１、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＳＯＣＳ１、ＴＹＫ２、ＡＧＡＰ２、ＣＢＦＡ２Ｔ３、ＣＳＮＫ１Ｇ２、ＥＲＢＢ４、ＧＮＡ１１、ＬＭＯ２、ＮＯＳ２、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ、ＳＯＤ２、ＴＹＭＳ、ＡＫＴ１、ＣＢＬ、ＣＴＮＮＡ１、ＥＲＣＣ１、ＧＮＡＱ、ＬＲＰ１Ｂ、ＮＯＳ３、ＰＲＫＡＡ２、ＳＯＳ１、ＵＧＴ１Ａ１、ＡＫＴ２、ＣＣＮＤ１、ＣＴＮＮＡ２、ＥＲＣＣ２、ＧＮＡＳ、ＬＲＰ２、ＮＯＴＣＨ１、ＰＲＫＣＡ、ＳＯＸ１０、ＵＭＰＳ、ＡＫＴ３、ＣＣＮＤ２、ＣＴＮＮＢ１、ＥＲＣＣ３、ＧＰＲ１２４、ＬＲＰ６、ＮＯＴＣＨ２、ＰＲＫＣＺ、ＳＯＸ２、ＵＳＰ９Ｘ、ＡＬＫ、ＣＣＮＤ３、ＣＹＦＩＰ１、ＥＲＣＣ４、ＧＰＲ１３３、ＬＴＫ、ＮＯＴＣＨ３、ＰＲＫＤＣ、ＳＰ１、ＶＥＧＦ、ＡＮＡＰＣ５、ＣＣＮＥ１、ＣＹＬＤ、ＥＲＣＣ５、ＧＲＢ２、ＭＡＮ１Ｂ１、ＮＰＭ１、ＰＴＣＨ１、ＳＰＲＹ２、ＶＥＧＦＡ、ＡＰＣ、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＹＰ１９Ａ１、ＥＲＣＣ６、ＧＳＫ３Ｂ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＮＱＯ１、ＰＴＣＨ２、ＳＲＣ、ＶＨＬ、ＡＰＣ２、ＣＤ４４、ＣＹＰ１Ｂ１、ＥＲＧ、ＧＳＴＰ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＲ３Ｃ１、ＰＴＥＮ、ＳＴ６ＧＡＬ２、ＷＲＮ、ＡＲ、ＣＤ７９Ａ、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＥＲＮ２、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＭＡＰ２Ｋ４、ＮＲＡＳ、ＰＴＧＳ２、ＳＴＡＴ１、ＷＴ１、ＡＲＡＦ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＹＰ２Ｃ８、ＥＳＲ１、ＨＤＡＣ１、ＭＡＰ２Ｋ７、ＮＲＰ２、ＰＴＰＮ１１、ＳＴＡＴ３、ＸＰＡ、ＡＲＦＲＰ１、ＣＤＣ４２、ＣＹＰ２Ｄ６、ＥＳＲ２、ＨＤＡＣ２、ＭＡＰ３Ｋ１、ＮＴＲＫ１、ＰＴＰＲＢ、ＳＴＫ１１、ＸＰＣ、ＡＲＩＤ１Ａ、ＣＤＣ４２ＢＰＢ、ＣＹＰ３Ａ４、ＥＴＶ４、ＨＧＦ、ＭＡＰＫ１、ＮＴＲＫ２、ＰＴＰＲＤ、ＳＵＦＵ、ＺＦＹ、ＡＴＭ、ＣＤＣ７３、ＣＹＰ３Ａ５、ＥＷＳＲ１、ＨＩＦ１Ａ、ＭＡＰＫ３、ＮＴＲＫ３、ＲＡＤ５０、ＳＵＬＴ１Ａ１、ＺＮＦ５２１、ＡＴＰ５Ａ１、ＣＤＨ１、ＤＡＣＨ２、ＥＸＴ１、ＨＭ１３、ＭＡＰＫ８、ＯＭＡ１、ＲＡＤ５１、ＳＵＺ１２、ＡＴＲ、ＣＤＨ１０、ＤＣＣ、ＥＺＨ２、ＨＭＧＡ１、ＭＡＲＫ３、ＯＲ１０Ｒ２、ＲＡＦ１、ＴＡＦ１、ＡＵＲＫＡ、ＣＤＨ２、ＤＣＬＫ３、ＦＡＮＣＡ、ＨＮＦ１Ａ、ＭＣＬ１、ＰＡＫ３、ＲＡＲＡ、ＴＢＸ２２、ＡＵＲＫＢ、ＣＤＨ２０、ＤＤＢ２、ＦＡＮＣＤ２、ＨＯＸＡ３、ＭＤＭ２、ＰＡＲＰ１、ＲＢ１、ＴＣＦ１２、ＢＡＩ３、ＣＤＨ５、ＤＤＲ２、ＦＡＮＣＥ、ＨＯＸＡ９、ＭＤＭ４、ＰＡＸ５、ＲＥＭ１、ＴＣＦ３、ＢＡＰ１、ＣＤＫ２、ＤＧＫＢ、ＦＡＮＣＦ、ＨＲＡＳ、ＭＥＣＯＭ、ＰＣＤＨ１５、ＲＥＴ、ＴＣＦ４、ＢＡＲＤ１、ＣＤＫ４、ＤＧＫＺ、ＦＡＳ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＭＥＮ１、ＰＣＤＨ１８、ＲＩＣＴＯＲ、ＴＥＫ、ＢＡＸ、ＣＤＫ６、ＤＩＲＡＳ３、ＦＢＸＷ７、ＩＤＨ１、ＭＥＴ、ＰＣＮＡ、ＲＩＰＫ１、ＴＥＰ１、ＢＣＬ１１Ａ、ＣＤＫ７、ＤＬＧ３、ＦＣＧＲ３Ａ、ＩＤＨ２、ＭＩＴＦ、ＰＤＧＦＡ、ＲＯＲ１、ＴＥＲＴ、ＢＣＬ２、ＣＤＫ８、ＤＬＬ１、ＦＥＳ、ＩＦＮＧ、ＭＬＨ１、ＰＤＧＦＢ、ＲＯＲ２、ＴＥＴ２、ＢＣＬ２Ａ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＤＮＭＴ１、ＦＧＦＲ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＭＬＬ、ＰＤＧＦＲＡ、ＲＯＳ１、ＴＧＦＢＲ２、ＢＣＬ２Ｌ１、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＦＧＦＲ２、ＩＧＦ２Ｒ、ＭＬＬ３、ＰＤＧＦＲＢ、ＲＰＳ６ＫＡ２、ＴＨＢＳ１、ＢＣＬ２Ｌ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＦＧＦＲ３、ＩＫＢＫＥ、ＭＰＬ、ＰＤＺＲＮ３、ＲＰＴＯＲ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＢＣＬ３、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＤＯＴ１Ｌ、ＦＧＦＲ４、ＩＫＺＦ１、ＭＲＥ１１Ａ、ＰＨＬＰＰ２、ＲＳＰＯ２、ＴＮＫＳ、ＢＣＬ６、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＤＰＹＤ、ＦＨ、ＩＬ２ＲＧ、ＭＳＨ２、ＰＩＫ３Ｃ３、ＲＳＰＯ３、ＴＮＫＳ２、ＢＣＲ、ＣＤＫＮ２Ｄ、Ｅ２Ｆ１、ＦＨＯＤ３、ＩＮＨＢＡ、ＭＳＨ６、ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＵＮＸ１、ＴＮＮＩ３Ｋ、ＢＩＲＣ５、ＣＤＸ２、ＥＥＤ、ＦＩＧＦ、ＩＮＳＲ、ＭＴＨＦＲ、ＨＡＤＨ、ＲＰＰ３０、ＺＦＰ３、ＰＩＫ３ＣＢ、ＳＤＨＢ、ＴＮＲ、ＢＩＲＣ６、ＣＥＢＰＡ、ＥＧＦ、ＦＬＧ２、ＩＲＳ１、ＭＴＯＲ、ＰＩＫ３ＣＤ、ＳＦ３Ｂ１、ＴＯＰ１、ＢＬＭ、ＣＥＲＫ、ＥＧＦＲ、ＦＬＮＣ、ＩＲＳ２、ＭＵＴＹＨ、ＰＩＫ３ＣＧ、ＳＨＣ１、およびＴＯＰ２Ａからなる群より選択される遺伝子中に含まれる少なくとも１０個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の相補性または同一性を有する配列を含む、オリゴヌクレオチドプローブ。
少なくとも１つのプライマー／プローブセットを含む反応混合物であって、ここで前記プライマー／プローブセットは、以下：
（ａ）第一の位置でゲノム領域に対してハイブリダイズするように設計されたフォワードプライマーと；
（ｂ）請求項１〜２４３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブと、
を含む、反応混合物。
前記ゲノム領域に対して第二の位置でハイブリダイズするように設計されたリバースプライマーをさらに含んでいる、請求項２４４に記載の反応混合物。
前記オリゴヌクレオチドプローブが、前記フォワードプライマーのＴｍよりも少なくとも１５℃低いＴｍを有する、前記請求項のいずれかに記載の反応混合物。
前記オリゴヌクレオチドプローブが、前記第一のプライマーのＴｍおよび前記第二のプライマーのＴｍの平均よりも少なくとも１５℃低いＴｍを有する、前記請求項のいずれかに記載の反応混合物。
前記オリゴヌクレオチドプローブが、前記第一の位置と前記第二の位置との間に位置する第三の位置で前記ゲノム領域にハイブリダイズするように設計されている、前記請求項のいずれかに記載の反応混合物。
前記リバースプライマーが、前記フォワードプライマーの量よりも少なくとも２倍〜１０倍少ない量で存在する、前記請求項のいずれかに記載の反応混合物。
前記リバースプライマーが、前記フォワードプライマーの量とは２倍以下異なる量で存在する、前記請求項のいずれかに記載の反応混合物。
生物学的サンプルから単離された核酸サンプルをさらに含んでいる、前記請求項のいずれかに記載の反応混合物。
前記生物学的サンプルが、被験体から単離されたサンプルである、前記請求項のいずれかに記載の反応混合物。
前記被験体がヒト被験体である、前記請求項のいずれかに記載の反応混合物。
前記ヒト被験体が、ある疾患について診断されるか、ある疾患を有すると疑われるか、またはある疾患についてのリスクが増大していると疑われる、前記請求項のいずれかに記載の反応混合物。
前記疾患が癌である、前記請求項のいずれかに記載の反応混合物。
前記テンプレート核酸がゲノム領域を含む、前記請求項のいずれかに記載の反応混合物。
前記テンプレート核酸がＤＮＡ、ＲＮＡまたはｃＤＮＡを含む、前記請求項のいずれかに記載の反応混合物。
ポリメラーゼをさらに含んでいる、前記請求項のいずれかに記載の反応混合物。
前記ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼである、前記請求項のいずれかに記載の反応混合物。
前記請求項のいずれかに記載の反応混合物であって、以下：
（ａ）第一のテンプレート核酸と；
（ｂ）ある量のフォワードプライマーと；
（ｃ）第二の量のリバースプライマーであって、前記リバースプライマーの第二の量は、前記フォワードプライマーの前記量よりも少なくとも２倍〜１０倍少ない、第二の量のリバースプライマーと；
（ｄ）オリゴヌクレオチドプローブと、
を含む、反応混合物。
複数のプライマー／プローブセットを含む、前記請求項のいずれかに記載の反応混合物。
前記複数のプライマー／プローブセットの各々が、ゲノムＤＮＡの異なる領域に特異的である、前記請求項のいずれかに記載の反応混合物。
前記ゲノム領域が、疾患関連の変異と関連している、前記請求項のいずれかに記載の反応混合物。
前記変異が、コピー数変動を含む、前記請求項のいずれかに記載の反応混合物。
前記変異が、一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入、欠失、または逆位を含む、前記請求項のいずれかに記載の反応混合物。
前記フォワードプライマーまたは前記リバースプライマーの１つが、前記ＳＮＰ、前記挿入、前記欠失、または前記逆位を覆う、前記請求項のいずれかに記載の反応混合物。
前記オリゴヌクレオチドプローブが、前記ＳＮＰ、前記挿入、前記欠失、または前記逆位を覆う、前記請求項のいずれかに記載の反応混合物。
前記疾患が癌である、前記請求項のいずれかに記載の反応混合物。
前記請求項のいずれかに記載の反応混合物であって、前記プライマー／プローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブを含み、ここで各々のオリゴヌクレオチドプローブが、前記ゲノム領域の任意の他の対立遺伝子を含む配列と比較して、前記ゲノム領域の１つの特異的対立遺伝子を含む配列に対して、より大きいアビディティで結合するように設計された対立遺伝子特異的プローブであり、ここで各々の対立遺伝子特異的なプローブが、異なる対立遺伝子に特異的である、反応混合物。
前記対立遺伝子特異的なプローブの各々が、スペクトル的に別個のフルオロフォアを各々含む、前記請求項のいずれかに記載の反応混合物。
前記請求項のいずれかに記載の反応混合物であって、ここで任意の他の対立遺伝子に対する前記対立遺伝子特異的プローブの結合エネルギーと比較した、前記１つの特異的な対立遺伝子に対する対立遺伝子特異的プローブの結合エネルギーにおける相違は、前記ゲノム領域に対する前記プローブの全体的な結合エネルギーの１％超である、反応混合物。
前記オリゴヌクレオチドプローブが、ビーコンプローブである、前記請求項のいずれかに記載の反応混合物。
前記オリゴヌクレオチドプローブがプレアデス（Ｐｌｅｉａｄｅｓ）プローブである、前記請求項のいずれかに記載の反応混合物。
以下：
（ａ）前記請求項のいずれかに記載の反応混合物を複数の反応容積に分割する工程と；
（ｂ）前記反応容積中の少なくとも１つにおいて、複数回の温度サイクリングを含むＰＣＲ増幅反応を行う工程であって、ここで前記オリゴヌクレオチドプローブが、前記ＰＣＲ増幅反応の有効性に影響しない工程と、
を包含する、方法。
前記請求項のいずれかに記載の方法であって、ここで前記オリゴヌクレオチドプローブが、前記ＰＣＲ増幅反応のアニーリング段階または伸長段階の間にテンプレート核酸にもＰＣＲ反応生成物にもハイブリダイズしない、方法。
前記請求項のいずれかに記載の方法であって、前記反応容積の少なくとも１つを５０℃未満まで冷却する工程をさらに包含し、ここで前記冷却によって、オリゴヌクレオチドプローブに対して少なくとも７０％の相補性を有する配列を含む核酸に対する、前記オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションが可能になる、方法。
前記請求項のいずれかに記載の方法であって、前記反応容積の少なくとも１つを３７℃未満まで冷却する工程をさらに包含し、ここで前記冷却によって、オリゴヌクレオチドプローブに対して少なくとも７０％の相補性を有する配列を含む核酸に対する、前記オリゴヌクレオチドプローブの量のうち少なくとも７０％のハイブリダイゼーションが可能になる、方法。
前記分割によって、平均で１分子未満のテンプレート核酸を含む各々の反応容積が生じる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
指数関数的ＰＣＲ増幅反応および線形ＰＣＲ増幅反応を、前記反応容積のうちの少なくとも１つの中で行う工程を包含する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
前記指数関数的ＰＣＲ増幅反応および前記線形ＰＣＲ増幅反応が、前記反応容積中から成分を添加することも除去することもなく逐次的に起こる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
前記ＰＣＲ増幅反応によって、増幅生成物のうち少なくとも５０％が一本鎖増幅生成物になる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
前記反応容積が液滴である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
前記ハイブリダイゼーションによって、前記オリゴヌクレオチドプローブからの蛍光の放出が生じる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
前記反応容積のうちの少なくとも１つの中で前記蛍光の存在または不在を検出する工程をさらに包含する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
前記反応容積中の前記蛍光の強度を測定する工程を包含する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
蛍光陽性の反応容積の数および／または画分を決定する工程をさらに包含する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
蛍光陽性の反応容積の前記数および／または画分に基づいて前記サンプル中の１つ以上の変異の存在、不在または量を決定する工程を包含する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
前記１つ以上の変異が、ＳＮＰ、欠失、挿入、または逆位を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
前記１つ以上の変異が、遺伝子のコピー数変動を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
前記１つ以上の変異が、疾患関連の変異を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
前記疾患が癌である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
前記請求項のいずれかに記載の方法であって、前記１つ以上の変異が、ＡＢＣＡ１、ＢＲＡＦ、ＣＨＤ５、ＥＰ３００、ＦＬＴ１、ＩＴＰＡ、ＭＹＣ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＳＫＰ２、ＴＰ５３、ＡＢＣＡ７、ＢＲＣＡ１、ＣＨＥＫ１、ＥＰＨＡ３、ＦＬＴ３、ＪＡＫ１、ＭＹＣＬ１、ＰＩＫ３Ｒ２、ＳＬＣ１９Ａ１、ＴＰ７３、ＡＢＣＢ１、ＢＲＣＡ２、ＣＨＥＫ２、ＥＰＨＡ５、ＦＬＴ４、ＪＡＫ２、ＭＹＣＮ、ＰＫＨＤ１、ＳＬＣ１Ａ６、ＴＰＭ３、ＡＢＣＣ２、ＢＲＩＰ１、ＣＬＴＣ、ＥＰＨＡ６、ＦＮ１、ＪＡＫ３、ＭＹＨ２、ＰＬＣＢ１、ＳＬＣ２２Ａ２、ＴＰＭＴ、ＡＢＣＣ３、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＯＬ１Ａ１、ＥＰＨＡ７、ＦＯＳ、ＪＵＮ、ＭＹＨ９、ＰＬＣＧ１、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＴＰＯ、ＡＢＣＣ４、Ｃ１ｏｒｆ１４４、ＣＯＰＳ５、ＥＰＨＡ８、ＦＯＸＯ１、ＫＢＴＢＤ１１、ＮＡＶ３、ＰＬＣＧ２、ＳＭＡＤ２、ＴＰＲ、ＡＢＣＧ２、ＣＡＢＬＥＳ１、ＣＲＥＢ１、ＥＰＨＢ１、ＦＯＸＯ３、ＫＤＭ６Ａ、ＮＢＮ、ＰＭＬ、ＳＭＡＤ３、ＴＲＩＯ、ＡＢＬ１、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＣＲＥＢＢＰ、ＥＰＨＢ４、ＦＯＸＰ４、ＫＤＲ、ＮＣＯＡ２、ＰＭＳ２、ＳＭＡＤ４、ＴＲＲＡＰ、ＡＢＬ２、ＣＡＭＫＶ、ＣＲＫＬ、ＥＰＨＢ６、ＧＡＢ１、ＫＩＴ、ＮＥＫ１１、ＰＰＡＲＧ、ＳＭＡＲＣＡ４、ＴＳＣ１、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＣＡＲＤ１１、ＣＲＬＦ２、ＥＰＯ、ＧＡＴＡ１、ＫＬＦ６、ＮＦ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＳＭＡＲＣＢ１、ＴＳＣ２、ＡＣＶＲ２Ａ、ＣＡＲＭ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＥＲＢＢ２、ＧＬＩ１、ＫＬＨＤＣ４、ＮＦ２、ＰＰＰ１Ｒ３Ａ、ＳＭＯ、ＴＴＫ、ＡＤＣＹ９、ＣＡＶ１、ＣＳＭＤ３、ＥＲＢＢ３、ＧＬＩ３、ＫＲＡＳ、ＮＫＸ２−１、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＳＯＣＳ１、ＴＹＫ２、ＡＧＡＰ２、ＣＢＦＡ２Ｔ３、ＣＳＮＫ１Ｇ２、ＥＲＢＢ４、ＧＮＡ１１、ＬＭＯ２、ＮＯＳ２、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ、ＳＯＤ２、ＴＹＭＳ、ＡＫＴ１、ＣＢＬ、ＣＴＮＮＡ１、ＥＲＣＣ１、ＧＮＡＱ、ＬＲＰ１Ｂ、ＮＯＳ３、ＰＲＫＡＡ２、ＳＯＳ１、ＵＧＴ１Ａ１、ＡＫＴ２、ＣＣＮＤ１、ＣＴＮＮＡ２、ＥＲＣＣ２、ＧＮＡＳ、ＬＲＰ２、ＮＯＴＣＨ１、ＰＲＫＣＡ、ＳＯＸ１０、ＵＭＰＳ、ＡＫＴ３、ＣＣＮＤ２、ＣＴＮＮＢ１、ＥＲＣＣ３、ＧＰＲ１２４、ＬＲＰ６、ＮＯＴＣＨ２、ＰＲＫＣＺ、ＳＯＸ２、ＵＳＰ９Ｘ、ＡＬＫ、ＣＣＮＤ３、ＣＹＦＩＰ１、ＥＲＣＣ４、ＧＰＲ１３３、ＬＴＫ、ＮＯＴＣＨ３、ＰＲＫＤＣ、ＳＰ１、ＶＥＧＦ、ＡＮＡＰＣ５、ＣＣＮＥ１、ＣＹＬＤ、ＥＲＣＣ５、ＧＲＢ２、ＭＡＮ１Ｂ１、ＮＰＭ１、ＰＴＣＨ１、ＳＰＲＹ２、ＶＥＧＦＡ、ＡＰＣ、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＹＰ１９Ａ１、ＥＲＣＣ６、ＧＳＫ３Ｂ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＮＱＯ１、ＰＴＣＨ２、ＳＲＣ、ＶＨＬ、ＡＰＣ２、ＣＤ４４、ＣＹＰ１Ｂ１、ＥＲＧ、ＧＳＴＰ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＲ３Ｃ１、ＰＴＥＮ、ＳＴ６ＧＡＬ２、ＷＲＮ、ＡＲ、ＣＤ７９Ａ、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＥＲＮ２、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＭＡＰ２Ｋ４、ＮＲＡＳ、ＰＴＧＳ２、ＳＴＡＴ１、ＷＴ１、ＡＲＡＦ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＹＰ２Ｃ８、ＥＳＲ１、ＨＤＡＣ１、ＭＡＰ２Ｋ７、ＮＲＰ２、ＰＴＰＮ１１、ＳＴＡＴ３、ＸＰＡ、ＡＲＦＲＰ１、ＣＤＣ４２、ＣＹＰ２Ｄ６、ＥＳＲ２、ＨＤＡＣ２、ＭＡＰ３Ｋ１、ＮＴＲＫ１、ＰＴＰＲＢ、ＳＴＫ１１、ＸＰＣ、ＡＲＩＤ１Ａ、ＣＤＣ４２ＢＰＢ、ＣＹＰ３Ａ４、ＥＴＶ４、ＨＧＦ、ＭＡＰＫ１、ＮＴＲＫ２、ＰＴＰＲＤ、ＳＵＦＵ、ＺＦＹ、ＡＴＭ、ＣＤＣ７３、ＣＹＰ３Ａ５、ＥＷＳＲ１、ＨＩＦ１Ａ、ＭＡＰＫ３、ＮＴＲＫ３、ＲＡＤ５０、ＳＵＬＴ１Ａ１、ＺＮＦ５２１、ＡＴＰ５Ａ１、ＣＤＨ１、ＤＡＣＨ２、ＥＸＴ１、ＨＭ１３、ＭＡＰＫ８、ＯＭＡ１、ＲＡＤ５１、ＳＵＺ１２、ＡＴＲ、ＣＤＨ１０、ＤＣＣ、ＥＺＨ２、ＨＭＧＡ１、ＭＡＲＫ３、ＯＲ１０Ｒ２、ＲＡＦ１、ＴＡＦ１、ＡＵＲＫＡ、ＣＤＨ２、ＤＣＬＫ３、ＦＡＮＣＡ、ＨＮＦ１Ａ、ＭＣＬ１、ＰＡＫ３、ＲＡＲＡ、ＴＢＸ２２、ＡＵＲＫＢ、ＣＤＨ２０、ＤＤＢ２、ＦＡＮＣＤ２、ＨＯＸＡ３、ＭＤＭ２、ＰＡＲＰ１、ＲＢ１、ＴＣＦ１２、ＢＡＩ３、ＣＤＨ５、ＤＤＲ２、ＦＡＮＣＥ、ＨＯＸＡ９、ＭＤＭ４、ＰＡＸ５、ＲＥＭ１、ＴＣＦ３、ＢＡＰ１、ＣＤＫ２、ＤＧＫＢ、ＦＡＮＣＦ、ＨＲＡＳ、ＭＥＣＯＭ、ＰＣＤＨ１５、ＲＥＴ、ＴＣＦ４、ＢＡＲＤ１、ＣＤＫ４、ＤＧＫＺ、ＦＡＳ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＭＥＮ１、ＰＣＤＨ１８、ＲＩＣＴＯＲ、ＴＥＫ、ＢＡＸ、ＣＤＫ６、ＤＩＲＡＳ３、ＦＢＸＷ７、ＩＤＨ１、ＭＥＴ、ＰＣＮＡ、ＲＩＰＫ１、ＴＥＰ１、ＢＣＬ１１Ａ、ＣＤＫ７、ＤＬＧ３、ＦＣＧＲ３Ａ、ＩＤＨ２、ＭＩＴＦ、ＰＤＧＦＡ、ＲＯＲ１、ＴＥＲＴ、ＢＣＬ２、ＣＤＫ８、ＤＬＬ１、ＦＥＳ、ＩＦＮＧ、ＭＬＨ１、ＰＤＧＦＢ、ＲＯＲ２、ＴＥＴ２、ＢＣＬ２Ａ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＤＮＭＴ１、ＦＧＦＲ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＭＬＬ、ＰＤＧＦＲＡ、ＲＯＳ１、ＴＧＦＢＲ２、ＢＣＬ２Ｌ１、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＦＧＦＲ２、ＩＧＦ２Ｒ、ＭＬＬ３、ＰＤＧＦＲＢ、ＲＰＳ６ＫＡ２、ＴＨＢＳ１、ＢＣＬ２Ｌ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＦＧＦＲ３、ＩＫＢＫＥ、ＭＰＬ、ＰＤＺＲＮ３、ＲＰＴＯＲ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＢＣＬ３、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＤＯＴ１Ｌ、ＦＧＦＲ４、ＩＫＺＦ１、ＭＲＥ１１Ａ、ＰＨＬＰＰ２、ＲＳＰＯ２、ＴＮＫＳ、ＢＣＬ６、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＤＰＹＤ、ＦＨ、ＩＬ２ＲＧ、ＭＳＨ２、ＰＩＫ３Ｃ３、ＲＳＰＯ３、ＴＮＫＳ２、ＢＣＲ、ＣＤＫＮ２Ｄ、Ｅ２Ｆ１、ＦＨＯＤ３、ＩＮＨＢＡ、ＭＳＨ６、ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＵＮＸ１、ＴＮＮＩ３Ｋ、ＢＩＲＣ５、ＣＤＸ２、ＥＥＤ、ＦＩＧＦ、ＩＮＳＲ、ＭＴＨＦＲ、ＨＡＤＨ、ＲＰＰ３０、ＺＦＰ３、ＰＩＫ３ＣＢ、ＳＤＨＢ、ＴＮＲ、ＢＩＲＣ６、ＣＥＢＰＡ、ＥＧＦ、ＦＬＧ２、ＩＲＳ１、ＭＴＯＲ、ＰＩＫ３ＣＤ、ＳＦ３Ｂ１、ＴＯＰ１、ＢＬＭ、ＣＥＲＫ、ＥＧＦＲ、ＦＬＮＣ、ＩＲＳ２、ＭＵＴＹＨ、ＰＩＫ３ＣＧ、ＳＨＣ１、およびＴＯＰ２Ａからなる群より選択される１つ以上の遺伝子の変異を含む、方法。
前記１つ以上の変異が、ＤＤＲ２、ＥＧＦＲ、ＡＵＲＫＡ、ＶＥＧＦＡ、ＦＧＦＲ１、ＣＤＫ４、ＥＦＢＢ２、ＣＤＫ６、ＪＡＫ２、ＭＥＴ、ＢＲＡＦ、ＥＲＢＢ３、ＳＲＣ、ＨＡＤＨ、ＲＰＰ３０、およびＺＦＰ３からなる群より選択される１つ以上の遺伝子の変異を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
前記サンプル中の前記変異の存在、不在および／またはレベルのプロファイルを連絡するレポートを作成する工程を包含する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
前記変異を標的にする治療剤の説明をさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
癌の処置を必要とする被験体における癌を処置する方法であって、前記方法は、以下：
（ａ）前記被験体から生物学的サンプルを得る工程と；
（ｂ）前記生物学的サンプルから単離された核酸サンプルから、ＭＥＴ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＬＴ３、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、ｍＴＯＲ、ＣＤＫ４、ＨＥＲ２、ＲＥＴ、ＨＡＤＨ、ＺＦＰ３、ＤＤＲ２、ＡＵＲＫＡ、ＶＥＧＦＡ、ＣＤＫ６、ＪＡＫ２、ＢＲＡＦ、およびＳＲＣからなる群より選択される少なくとも５つの遺伝子中でのコピー数変動（ＣＮＶ）の存在または不在を決定する工程と；
（ｃ）前記決定する工程に基づいて、被験体特異的なＣＮＶプロファイルを作成する工程と；
（ｄ）前記被験体特異的なＣＮＶプロファイルに基づいて、前記被験体の癌治療を選択する工程と；
を包含する、方法。
前記ＣＮＶの存在または不在を決定する工程が、請求項２７４〜２８９のいずれかに記載の方法の使用を包含する、請求項２９６に記載の方法。
デジタルＰＣＲアッセイが、前記請求項のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブの使用を包含する、請求項２９６に記載の方法。
前記オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号６１、６４、６７、７０、７３、７６、７９、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１０９、１１２、１１５、または１１８のいずれかに記載のヌクレオチド配列を含む、請求項２９８に記載の方法。
デジタルＰＣＲアッセイが、前記請求項のいずれかに記載のプライマーの使用を包含する、請求項２９６に記載の方法。
前記プライマーが、配列番号５９、６０、６２、６３、６５、６６、６８、６９、７１、７２、７４、７５、７７、７８、８０、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１６、または１１７のいずれかに記載のヌクレオチド配列を含む、請求項３００に記載の方法。
少なくとも１０、１２または１８個の遺伝子中のＣＮＶの存在または不在を決定する工程を包含する、請求項２９６に記載の方法。
前記生物学的サンプルが、前記癌に由来する核酸を保有すると疑われる、請求項２９６に記載の方法。
前記生物学的サンプルが、固体組織サンプルである、請求項２９６に記載の方法。
前記固体組織サンプルが、ホルマリン固定され、パラフィン包埋されたサンプルである、請求項２９６に記載の方法。
前記生物学的サンプルが液体の生物学的サンプルである、請求項２９６に記載の方法。
前記液体の生物学的サンプルが、血液、血清、血漿、尿、汗、涙、唾液、および痰からなる群より選択される、請求項２９６に記載の方法。
コンピュータシステムであって、以下：
（ａ）サンプルからデータを受容するように構成されたメモリユニットであって、ここで前記データが前記請求項のいずれかに記載の方法によって作成される、メモリユニットと；
（ｂ）前記データの分析のためのコンピュータ実行可能な命令と；
（ｃ）前記分析に基づいて、前記サンプル中の変異の存在、不在または量を決定するためのコンピュータ実行可能な命令と；
を備える、コンピュータシステム。
前記請求項のいずれかに記載のコンピュータシステムであって、前記サンプル中の変異の前記存在、不在または量のレポートを作成するためのコンピュータ実行可能な命令をさらに備える、コンピュータシステム。
前記請求項のいずれかに記載のコンピュータシステムであって、前記サンプル中の変異の前記存在、不在または量に基づいて治療の選択肢のレポートを作成するためのコンピュータ実行可能な命令をさらに備える、コンピュータシステム。
前記請求項のいずれかに記載のコンピュータシステムであって、前記レポートをユーザーに対して連絡または提示するように構成されたユーザーインターフェースをさらに備える、コンピュータシステム。
キットであって、以下：
（ａ）少なくとも１つのプライマー／プローブセットであって、ここで前記プライマー／プローブセットが、（ｉ）第一の位置でゲノム領域に対してハイブリダイズするように設計されたフォワードプライマー、（ｉｉ）第二の位置で前記ゲノム領域に対してハイブリダイズするように設計されたリバースプライマー、および（ｉｉｉ）前記請求項のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブであって、前記オリゴヌクレオチドプローブが、前記第一の位置と第二の位置との間に位置する第三の位置で前記ゲノム領域に対してハイブリダイズするように設計されているオリゴヌクレオチドプローブを含む、プライマー／プローブセットと；
（ｂ）使用説明書と；
を含む、キット。
配列番号４〜２１、２３、２４、６１、６４、６７、７０、７３、７６、７９、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１０９、１１２、１１５、または１１８のいずれかに示されるオリゴヌクレオチドプローブ。
配列番号１９４８〜５５９３のいずれかに示される標的選択性オリゴヌクレオチド。
配列番号２５または２６に示される配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号１〜３、２２、２７〜５８、５９、６０、６２、６３、６５、６６、６８、６９、７１、７２、７４、７５、７７、７８、８０、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１６、または１１７のいずれかに示される配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー。