JP2019170390A - 核酸分析のための方法、組成物およびキット - Google Patents
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Abstract
【課題】癌を評価するための方法およびキットを提供すること。【解決手段】本発明のいくつかの態様は、配列決定のためにサンプルライブラリーを調製するための方法およびキットに関する。本発明のいくつかの態様は、対立遺伝子検出のための方法およびキットに関する。本発明のいくつかの態様は、高い有効性のライゲーション方法およびキットに関する。本発明のいくつかの態様は、アンプリコンの感度のよい検出に関する。一局面において、癌を評価する方法が提供され、この方法は、(a)被験体中の流体サンプルに由来するサンプル中で遺伝子の各々のサブセットの存在、不在および/または量を決定する工程ならびに(b)工程(a)の結果から、上記被験体における上記癌の状態を決定する工程を包含する。【選択図】なし
Description
相互参照
この出願は、2013年2月21日に出願された米国仮出願第61/767,718号、2013年2月26日に出願された米国仮出願第61/769,683号、2013年3月12日に出願された米国仮出願第61/777,702号、2013年3月13日に出願された米国仮出願第61/780,578号、2013年5月17日に出願された米国仮出願第61/824,894号および2013年8月27日に出願された米国仮出願第61/870,634号(これらは、参考として本明細書に援用される)の利益を主張する。
この出願は、2013年2月21日に出願された米国仮出願第61/767,718号、2013年2月26日に出願された米国仮出願第61/769,683号、2013年3月12日に出願された米国仮出願第61/777,702号、2013年3月13日に出願された米国仮出願第61/780,578号、2013年5月17日に出願された米国仮出願第61/824,894号および2013年8月27日に出願された米国仮出願第61/870,634号(これらは、参考として本明細書に援用される)の利益を主張する。
(配列表)
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出され、かつその全体が参照によって本明細書に援用される配列表を含む。かかるASCIIのコピーは、2014年2月19日に作成され、44288−703.601_SL.txtと名付けられ、サイズは1,580,104バイトである。
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出され、かつその全体が参照によって本明細書に援用される配列表を含む。かかるASCIIのコピーは、2014年2月19日に作成され、44288−703.601_SL.txtと名付けられ、サイズは1,580,104バイトである。
(発明の背景)
癌は、現代の医学にとって深刻な課題を有する。2007年には、世界中の人類全体の死亡のうち約13%(790万例)を癌が引き起こしたと推定された。癌は、細胞増殖の上方制御に一般には関与する、種々の疾患のうち広範なグループを包含する。癌では、細胞は、制御不能に分裂し、かつ増殖し得、悪性腫瘍を形成し得、そして身体の近傍部位に侵襲し得る。また、癌は、例えば、リンパ系または血流を介して、身体のさらに遠隔部位にも伝播し得る。ヒトに罹る癌としては200を超える公知の様々な癌が存在する。多くの癌は、変異、例えば、癌関連の遺伝子における変異に関連する。癌の変異状況は、1例の個体被験体と別の被験体で、そして同じ被験体の1つの腫瘍細胞から別の腫瘍細胞でさえ、広範に変化し得る。これらの変異の知識は、癌治療の選択を助け、また疾患の診断および/または疾患の状態についての情報提供も補助し得る。腫瘍生検は、癌関連遺伝子の変異状況に関する情報を得るために配列決定され得る;しかし、腫瘍生検の手順は、外科的に侵襲的であり得、かつ患者にとっては費用がかさむ場合がある。さらに、腫瘍生検に対する信頼性は、被験体が生検するのが困難な腫瘍細胞を有する場合(例えば、腫瘍が小さい場合)は、その被験体の癌の状態をモニターするには有用性が限られたものである。
癌は、現代の医学にとって深刻な課題を有する。2007年には、世界中の人類全体の死亡のうち約13%(790万例)を癌が引き起こしたと推定された。癌は、細胞増殖の上方制御に一般には関与する、種々の疾患のうち広範なグループを包含する。癌では、細胞は、制御不能に分裂し、かつ増殖し得、悪性腫瘍を形成し得、そして身体の近傍部位に侵襲し得る。また、癌は、例えば、リンパ系または血流を介して、身体のさらに遠隔部位にも伝播し得る。ヒトに罹る癌としては200を超える公知の様々な癌が存在する。多くの癌は、変異、例えば、癌関連の遺伝子における変異に関連する。癌の変異状況は、1例の個体被験体と別の被験体で、そして同じ被験体の1つの腫瘍細胞から別の腫瘍細胞でさえ、広範に変化し得る。これらの変異の知識は、癌治療の選択を助け、また疾患の診断および/または疾患の状態についての情報提供も補助し得る。腫瘍生検は、癌関連遺伝子の変異状況に関する情報を得るために配列決定され得る;しかし、腫瘍生検の手順は、外科的に侵襲的であり得、かつ患者にとっては費用がかさむ場合がある。さらに、腫瘍生検に対する信頼性は、被験体が生検するのが困難な腫瘍細胞を有する場合(例えば、腫瘍が小さい場合)は、その被験体の癌の状態をモニターするには有用性が限られたものである。
血漿および血清中での無細胞DNA浮遊が腫瘍関連の変異を保有し得るという発見によって、無細胞DNAの分析が癌の診断を補助し得るという可能性が切り開かれた。しかし、無細胞腫瘍DNAの分析は、現在実施されているとおり、標的されていない配列決定または複雑なPCR増幅(例えば、磁気ビーズによる)を利用しており、高価な試薬およびシステムのせいで高コストになる。
変異の検出および/または測定は、ライフサイエンスで広範に行われている。例えば、一塩基多型(SNP)のような変異は、多数の疾患、例としては、例えば、癌、神経変性疾患、感染性疾患、自己免疫疾患、貧血、および嚢胞性線維症に関連する。変異を検出するための現行の方法は一般には、標的ポリヌクレオチドの増幅に関与する。例えば、標的特異的プライマーは、変異を保有すると疑われる領域を選択的に増幅し、得られたアンプリコンを配列決定して、変異を問い合わせてもよい。他の例では、アッセイは、二本鎖DNA(dsDNA)の存在下で蛍光を発するインターカレート色素を利用してもよいし、または特定のポリヌクレオチド配列に対して特異的にハイブリダイズするように設計されたTaqmanプローブを利用してもよい。これらのアッセイは一般には、小さいヌクレオチド配列にかかわる変異(例えば、SNPまたは小さい挿入/欠失)については特に、劣った特異性および/または感度に悩まされる。
検出の代表的な方法は、反応生成物に結合し、かつその検出を可能にするように設計されている検出可能プローブの使用を包含する。しばしば、検出可能プローブは、検出可能部分を含み、かつその検出可能部分が検出可能なシグナルを発することを阻害するクエンチャー部分をさらに含んでもよい。
このようなプローブアッセイは、リアルタイムPCRまたはエンドポイントデジタルPCRを利用してもよい。リアルタイムPCRアッセイとは一般には、PCRの各サイクルで検出を行う、アッセイを指す。エンドポイントデジタルPCRでは、テンプレート分子は一般には、各々が増幅および検出に必要な成分を含む、多数の区画にわたって分配される。PCRの終了後、その区画は、通常は首尾よい増幅の間に生成される、検出可能なシグナルの有無について個々に問い合わされ得る。デジタルPCRによって、シンプルな計数統計を適用して、サンプル中の目的のテンプレート核酸の極めて厳密かつ正確な定量を得ることが可能になり得る。目的の標的ポリヌクレオチドに特異的なシグナルを生じる任意の手段によって、エンドポイントデジタルPCRが影響を受けやすくなる場合がある。
代表的には、上記のアッセイは、PCR反応の間に標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズするように設計されているプローブの使用を行う。PCR反応は一般には、温度サイクリングのプロセスを含み、ここでは反応混合物を、PCR反応の別個の段階に相当する制御された温度シフトの反復性の熱サイクルに供する。代表的な熱サイクルの段階は、(i)変性段階(代表的には、反応混合物を高温(例えば、90〜100℃)まで加熱して、二本鎖核酸を一本鎖核酸まで融解する工程を包含する)(ii)アニーリング段階(代表的には、反応プライマーのTmよりもおよそ摂氏3〜5度まで(例えば、一本鎖テンプレートへのプライマーのアニーリングを可能にするために約55〜65℃まで)反応温度を低下させる工程を包含する)、および(iii)伸長段階(代表的には、反応温度を、ポリメラーゼによるプライマーの伸長のために最適な温度にさせる工程を包含する)を包含する。例えば、Taqポリメラーゼについて最適の伸長段階の温度は約72℃である。伸長段階の間、ポリメラーゼは代表的には、テンプレート鎖に対して相補的な新しい核酸鎖を合成する。PCRの温度サイクリングは、「ホットスタート(hot−start)」段階に進行されてもよく、ここで反応温度は代表的には、ポリメラーゼを熱活性化するために最大>90℃超にさせられる。温度サイクリングの後、反応混合物は、残りの一本鎖核酸が完全に伸長することを保証するために、最終の伸長段階を受けてもよい。温度サイクリングの後(例えば、最終伸長段階の後)、反応混合物の温度は、室温まで冷却されてもよいし、またはPCR反応を終わらせて、PCR生成物を安定化するために下げられてもよい。
PCR反応の間のプローブのアニーリングは、プライマーのアニーリングおよび伸長に影響し得る。なぜなら完全な伸長には、アニーリングされたプローブを加水分解するためにポリメラーゼの十分なヌクレオチド鎖切断活性を要するからである。したがって、PCR反応の間のプローブハイブリダイゼーションは、増幅効率にネガティブに影響し、かつ得られたデータの感度および正確性に強力に影響し得る。このような問題は、まれな変異(例えば、まれなコピー数変動の事象、まれなSNPなど)の検出および定量のために設計されるアッセイの感度を低下し得る。
さらに上記のアッセイは代表的には、PCRプライマーのTmに比較して高い融点(Tm)を有するプローブの使用を行う。このような高いTmのプローブは一般には、各々のPCRサイクルが検出可能シグナルの生成を生じることを保証するために、PCRの間に標的ポリヌクレオチドに対するプローブのハイブリダイゼーションを支援するために使用される。しかし、これらのTmの制限によって、高い識別能力を有する対立遺伝子特異的なプローブを設計することは困難になる。なぜなら、プローブ/テンプレートのミスマッチのエネルギーのペナルティーは、テンプレートに対するプローブの全体的結合エネルギーに比べれば比較的小さいからである。上述の制限によって、不正確な変異の呼び出しが生じ、かつ変異対立遺伝子の検出および/または定量が妨害され得る。
広範な分子生物学的適用が、核酸のライゲーションに関与する。ライゲーションは、普遍的な分子生物学のツールであって、核酸の標識、分子クローニング適用、アレイハイブリダイゼーション、核酸バーコード化、および核酸ライブラリーの調製(例えば、配列決定のため)に有用である。これらの適用は、バイオテクノロジーから診断、科学捜査、疫学および研究におよぶ広範な種々の目的に利用される。
ライゲーションは、一般には、リガーゼ酵素によって触媒される。例示的なライゲーション反応は、ヌクレオシド三リン酸依存性リガーゼによって触媒される、ヌクレオシド三リン酸依存性ライゲーションである。代表的なヌクレオシド三リン酸依存性ライゲーションは一般的には、ヌクレオシド三リン酸依存性リガーゼ(E)、「ドナー」核酸分子、「アクセプター」核酸分子、ATP、および他の反応成分を含む、単一の反応混合物中で生じる。このライゲーション反応は、アクセプターとドナーとの間の共有結合の形成を生じ得る。ヌクレオシド三リン酸依存性ライゲーションの機序は、一般的には、反応混合物中において3工程で進行する。第一工程は代表的には、ヌクレオシド三リン酸 (NTP)の存在下における、リガーゼの活性部位へのヌクレオシド一リン酸(NMP)の可逆性の移動を包含する。例えば、アデノシン一リン酸(AMP)は、ATPからリガーゼ(E)の活性部位へ移動されてもよく、これによってピロリン酸塩(PPi)を遊離して、このリガーゼを活性化する。あるいは、グアノシン一リン酸(GMP)は、GTPからリガーゼ(E)の活性部位へ移行され得る)。
(1)E+NTP⇔E−NMP+PPi(ここでN=A、C、G、Tである)。
(1)E+NTP⇔E−NMP+PPi(ここでN=A、C、G、Tである)。
活性なリガーゼは5’または3’のリン酸化「ドナー」核酸分子の存在下ならば、ドナーに結合し得、かつNMPをドナーのリン酸基に可逆的に移行し得、それによってそのドナーをアデニル化し得る。
(2)E−NMP+p−ドナー+⇔E:NMP.P−ドナー’。
(2)E−NMP+p−ドナー+⇔E:NMP.P−ドナー’。
3’または5’のOH基を含む「アクセプター」核酸分子の存在下では、次に、リガーゼは、ドナーのNMP・Pのリン酸塩とアクセプターのOH基との間のホスホジエステル結合の形成を触媒し、それによってNMPを遊離し得る。
(3)アクセプター−OH+E:NMP・P−ドナー⇒アクセプター−Pi−ドナー’+E+NMP
いくつかの分子生物学の適用では極めて普遍的であるが、ライゲーションは一般的には、高度に非効率的プロセスであって、<10%の収率が生じる。このような非効率的なプロセスによって、出発材料の有意な損失が生じ、収率を増大するには追加の工程(例えば、PCR増幅)が必要とされ得る場合が多く、それによって追加工程にともなうエラーの可能性がもたらされ、かつ一般には、結果の質、精度および正確性が低下する。
(3)アクセプター−OH+E:NMP・P−ドナー⇒アクセプター−Pi−ドナー’+E+NMP
いくつかの分子生物学の適用では極めて普遍的であるが、ライゲーションは一般的には、高度に非効率的プロセスであって、<10%の収率が生じる。このような非効率的なプロセスによって、出発材料の有意な損失が生じ、収率を増大するには追加の工程(例えば、PCR増幅)が必要とされ得る場合が多く、それによって追加工程にともなうエラーの可能性がもたらされ、かつ一般には、結果の質、精度および正確性が低下する。
単なる例であるが、ポリヌクレオチドの配列決定は、バイオテクノロジー、診断、科学捜査および疫学などの広範な種々の適用のためのライフサイエンスで広く利用されている。配列決定には、全体のゲノム配列決定または標的化配列決定を包含し、ここでは目的のゲノム領域が、配列決定の前にサンプルから選択的に捕獲される。いくつかの標的捕獲方法が開発され、ハイスループットの配列決定システム、例えば、次世代の配列決定法と統合されている。一般には、標的化配列決定法には、2つの別の工程、標的捕獲工程およびライブラリー調製工程を包含する。全ゲノム配列決定はまた一般には、ライブラリー調製工程を包含する。次世代の配列決定プラットフォームに対する配列決定のための核酸ライブラリーの調製は、正確に適合されているサンプル中の核酸分子のうち約1%を生じるように予測された多工程プロセスである、核酸分子に対する2つの別個のアダプターオリゴヌクレオチドのライゲーションに関与する場合が多い。非効率的なアダプターライゲーションに起因する、核酸のこの主な損失によって、得られたライブラリーにおける目的のいくつかのゲノム領域のゼロ提示が生じ得る。さらに、非効率的なアダプターライゲーションでは、所望の読み深さまで配列決定するために十分な材料を得るにはライブラリーメンバーの予備増幅を必要とし得る。この予備増幅工程は、最終ライブラリーのバイアスの主な原因であることが示されている。なぜならPCRの効率における固有の相違は、いくつかのゲノム領域の過剰な提示、および他のゲノム領域の過小な提示を生じ得るからである(例えば、Airdら、Genome Biology 2011,12:R18参照(その全体が参照によって本明細書に援用される))。さらに、核酸ライブラリーの予備増幅では、核酸ポリメラーゼの内因性の誤差率に起因して配列決定の誤差がもたらされ得る。予備増幅のバイアスおよび予備増幅から生じる誤差の導入によって、限られた出発サンプルからのまれな変異の正確な検出が望まれる場合が多い、診断的な配列決定適用に有害な結果になり得る。
(発明の要旨)
本発明の態様は、癌を評価するための方法およびキットに関する。本発明のいくつかの態様は、配列決定のためのサンプルライブラリーを調製するための方法およびキットに関する。本発明のいくつかの態様は、対立遺伝子検出のための方法およびキットに関する。本発明のいくつかの態様は、高い効率のライゲーション方法およびキットに関する。本発明のいくつかの態様は、アンプリコンの感度のよい検出に関する。
本発明の態様は、癌を評価するための方法およびキットに関する。本発明のいくつかの態様は、配列決定のためのサンプルライブラリーを調製するための方法およびキットに関する。本発明のいくつかの態様は、対立遺伝子検出のための方法およびキットに関する。本発明のいくつかの態様は、高い効率のライゲーション方法およびキットに関する。本発明のいくつかの態様は、アンプリコンの感度のよい検出に関する。
いくつかの場合には、本発明は、癌を評価する方法を提供し、この方法は以下を包含する。
(a)被験体由来のサンプルに由来するサンプル中で遺伝子の各々のサブセットの存在、不在および/または量を決定する工程であって、ここでこのサブセットは、(i)固体組織サンプルが、癌組織を含むことが公知であるか、または含むと疑われる被験体由来の固体組織サンプルで遺伝子のセットでの標的化配列決定を行うこと;(ii)この配列決定に基づいて遺伝子のセットについて遺伝学的異常のプロファイルを決定すること;および(iii)このセットについてのこのプロファイルに基づいて遺伝子のセットのうち、2、3、4のサブセット、しかし4以下の遺伝子を選択することであって、ここでこのサブセットがこの被験体に特異的であることと、によって決定される、工程;ならびに(b)工程(a)の結果から、この被験体における癌の状態を決定する工程。
この方法は、(a)被験体における流体サンプルに由来するサンプル中で遺伝子の各々のサブセットの存在、不在および/または量を決定する工程であって、ここでこのサブセットは、(i)固体組織サンプルが、癌組織を含むことが公知であるか、または含むと疑われる被験体由来の固定されていない固体組織サンプル由来の遺伝子のセットでの標的化配列決定を行うこと;(ii)この配列決定に基づいて遺伝子のセットについて遺伝学的異常のプロファイルを決定すること;および(iii)このセットについてのこのプロファイルに基づいて遺伝子のセットのサブセットを選択することであって、ここでこのサブセットが個々に特異的であること、によって決定される、工程;ならびに(b)工程(a)の結果から、この被験体における癌の状態を決定する工程、を包含し得る。
関連の実施形態では、この方法は、(a)被験体における流体サンプルに由来するサンプル中で遺伝子の各々のサブセットの存在、不在および/または量を決定する工程であって、ここでこのサブセットは、(i)体液サンプルが、腫瘍由来核酸を含むことが公知であるか、または含むと疑われる被験体由来の体液サンプル由来の遺伝子のセットに対して標的化配列決定を行うこと;(ii)この配列決定に基づいて遺伝子のセットについて遺伝学的異常のプロファイルを決定すること;ならびに(iii)このセットについてこのプロファイルに基づいて遺伝子のセットのサブセットを選択することであって、ここで、このサブセットが個体に特異的であることによって決定される、工程;ならびに(b)工程(a)の結果から、この被験体における癌の状態を決定する工程、を包含する。
本明細書に記載の任意の方法を行うには、遺伝子のセットは、少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、または1000個の遺伝子を含む。
遺伝子のセットは:ABCA1、BRAF、CHD5、EP300、FLT1、ITPA、MYC、PIK3R1、SKP2、TP53、ABCA7、BRCA1、CHEK1、EPHA3、FLT3、JAK1、MYCL1、PIK3R2、SLC19A1、TP73、ABCB1、BRCA2、CHEK2、EPHA5、FLT4、JAK2、MYCN、PKHD1、SLC1A6、TPM3、ABCC2、BRIP1、CLTC、EPHA6、FN1、JAK3、MYH2、PLCB1、SLC22A2、TPMT、ABCC3、BUB1B、COL1A1、EPHA7、FOS、JUN、MYH9、PLCG1、SLCO1B3、TPO、ABCC4、C1orf144、COPS5、EPHA8、FOXO1、KBTBD11、NAV3、PLCG2、SMAD2、TPR、ABCG2、CABLES1、CREB1、EPHB1、FOXO3、KDM6A、NBN、PML、SMAD3、TRIO、ABL1、CACNA2D1、CREBBP、EPHB4、FOXP4、KDR、NCOA2、PMS2、SMAD4、TRRAP、ABL2、CAMKV、CRKL、EPHB6、GAB1、KIT、NEK11、PPARG、SMARCA4、TSC1、ACVR1B、CARD11、CRLF2、EPO、GATA1、KLF6、NF1、PPARGC1A、SMARCB1、TSC2、ACVR2A、CARM1、CSF1R、ERBB2、GLI1、KLHDC4、NF2、PPP1R3A、SMO、TTK、ADCY9、CAV1、CSMD3、ERBB3、GLI3、KRAS、NKX2−1、PPP2R1A、SOCS1、TYK2、AGAP2、CBFA2T3、CSNK1G2、ERBB4、GNA11、LMO2、NOS2、PPP2R1B、SOD2、TYMS、AKT1、CBL、CTNNA1、ERCC1、GNAQ、LRP1B、NOS3、PRKAA2、SOS1、UGT1A1、AKT2、CCND1、CTNNA2、ERCC2、GNAS、LRP2、NOTCH1、PRKCA、SOX10、UMPS、AKT3、CCND2、CTNNB1、ERCC3、GPR124、LRP6、NOTCH2、PRKCZ、SOX2、USP9X、ALK、CCND3、CYFIP1、ERCC4、GPR133、LTK、NOTCH3、PRKDC、SP1、VEGF、ANAPC5、CCNE1、CYLD、ERCC5、GRB2、MAN1B1、NPM1、PTCH1、SPRY2、VEGFA、APC、CD40LG、CYP19A1、ERCC6、GSK3B、MAP2K1、NQO1、PTCH2、SRC、VHL、APC2、CD44、CYP1B1、ERG、GSTP1、MAP2K2、NR3C1、PTEN、ST6GAL2、WRN、AR、CD79A、CYP2C19、ERN2、GUCY1A2、MAP2K4、NRAS、PTGS2、STAT1、WT1、ARAF、CD79B、CYP2C8、ESR1、HDAC1、MAP2K7、NRP2、PTPN11、STAT3、XPA、ARFRP1、CDC42、CYP2D6、ESR2、HDAC2、MAP3K1、NTRK1、PTPRB、STK11、XPC、ARID1A、CDC42BPB、CYP3A4、ETV4、HGF、MAPK1、NTRK2、PTPRD、SUFU、ZFY、ATM、CDC73、CYP3A5、EWSR1、HIF1A、MAPK3、NTRK3、RAD50、SULT1A1、ZNF521、ATP5A1、CDH1、DACH2、EXT1、HM13、MAPK8、OMA1、RAD51、SUZ12、ATR、CDH10、DCC、EZH2、HMGA1、MARK3、OR10R2、RAF1、TAF1、AURKA、CDH2、DCLK3、FANCA、HNF1A、MCL1、PAK3、RARA、TBX22、AURKB、CDH20、DDB2、FANCD2、HOXA3、MDM2、PARP1、RB1、TCF12、BAI3、CDH5、DDR2、FANCE、HOXA9、MDM4、PAX5、REM1、TCF3、BAP1、CDK2、DGKB、FANCF、HRAS、MECOM、PCDH15、RET、TCF4、BARD1、CDK4、DGKZ、FAS、HSP90AA1、MEN1、PCDH18、RICTOR、TEK、BAX、CDK6、DIRAS3、FBXW7、IDH1、MET、PCNA、RIPK1、TEP1、BCL11A、CDK7、DLG3、FCGR3A、IDH2、MITF、PDGFA、ROR1、TERT、BCL2、CDK8、DLL1、FES、IFNG、MLH1、PDGFB、ROR2、TET2、BCL2A1、CDKN1A、DNMT1、FGFR1、IGF1R、MLL、PDGFRA、ROS1、TGFBR2、BCL2L1、CDKN1B、DNMT3A、FGFR2、IGF2R、MLL3、PDGFRB、RPS6KA2、THBS1、BCL2L2、CDKN2A、DNMT3B、FGFR3、IKBKE、MPL、PDZRN3、RPTOR、TNFAIP3、BCL3、CDKN2B、DOT1L、FGFR4、IKZF1、MRE11A、PHLPP2、RSPO2、TNKS、BCL6、CDKN2C、DPYD、FH、IL2RG、MSH2、PIK3C3、RSPO3、TNKS2、BCR、CDKN2D、E2F1、FHOD3、INHBA、MSH6、PIK3CA、RUNX1、TNNI3K、BIRC5、CDX2、EED、FIGF、INSR、MTHFR、PIK3CB、SDHB、TNR、BIRC6、CEBPA、EGF、FLG2、IRS1、MTOR、PIK3CD、SF3B1、TOP1、BLM、CERK、EGFR、FLNC、IRS2、MUTYH、PIK3CG、SHC1、およびTOP2Aからなる群より選択され得る。
このサンプルは:血液、血清、血漿、尿、汗、涙、唾液、痰、それらの成分、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択され得る。工程(a)および(b)は、癌の状態を時間をわたってモニターするために複数の時点で行われてもよい。1つの時点は、癌治療の最初の施行の前であってもよく、その後の時点は、第一の施行に続くものであってもよい。
この方法は、遺伝子のセットについて遺伝学的異常のプロファイルを連絡するレポートを作成する工程と、このレポートを介護者に連絡する工程とをさらに包含し得る。このレポートは、上記プロファイルに基づく1つ以上の治療候補のリストを包含し得る。このレポートは、固体組織サンプルの収集から2週内で作成され得る。いくつかの場合には、このレポートは、固体組織サンプルの収集から1週内で作成される。いくつかの実施形態では、このレポートは、遺伝子の上記セットのコピー数変更を含む。いくつかの実施形態では、このレポートは、異常を標的にする治療剤の説明を含む。この方法はさらに、複数の時点の各々で、遺伝子のサブセットのプロファイルを連絡するレポートを作成する工程を包含し得る。
本明細書の任意の方法のいくつかの実施形態では、決定する工程は、上記サンプルから個別の反応容積へ核酸分子を希釈する工程を包含し、ここでこの個別の反応容積は、このサンプル由来の平均で10、5、4、3、2または1未満の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、この個別の反応容積は、このサンプル由来の0〜10モルの核酸を含む。この個別の反応容積は、エマルジョン中の液滴であってもよい。この個別の反応容積はさらに、遺伝子のサブセット中の遺伝学的異常の対立遺伝子識別のためのプライマーを含んでもよい。
上記状態を決定する工程は、遺伝子の上記サブセット中の遺伝学的異常を保有している核酸の数を定量する工程を包含し得る。上記標的化配列決定の工程は、上記固体組織サンプルから、8、7、6、5または4時間未満でDNAライブラリーを調製する工程を包含し得る。いくつかの実施形態では、調製工程には、ライブラリーの配列決定の前に指数関数的PCR増幅は必要としない。いくつかの実施形態では、この調製工程は、線形増幅工程を包含する。いくつかの実施形態では、この調製する工程は、増幅を必要としない。
いくつかの実施形態では、上記標的化配列決定の工程は、(a)上記固体組織サンプル由来の一本鎖DNAフラグメントと、(i)ある癌関連遺伝子のある領域に特異的な領域、および(ii)ある配列決定プラットフォームにカップリングするために特異的なアダプター配列を含む標的特異的オリゴヌクレオチドとを接触させる工程と;(b)上記標的特異的オリゴヌクレオチドに対して相補性の領域を含む一本鎖DNAフラグメントに対して上記標的特異的オリゴヌクレオチドを結合するためのハイブリダイゼーション反応を行う工程と;(c)伸長反応を行って、上記領域を含み、かつ上記アダプターを含む伸長生成物を作成する工程と;(d)この伸長生成物を配列決定する工程と、
を包含する。この接触は、配列決定プラットフォームに対して結合された標的特異的オリゴヌクレオチドと生じ得る。この接触は、溶液中で遊離の標的特異的オリゴヌクレオチドと生じ得る。
を包含する。この接触は、配列決定プラットフォームに対して結合された標的特異的オリゴヌクレオチドと生じ得る。この接触は、溶液中で遊離の標的特異的オリゴヌクレオチドと生じ得る。
いくつかの態様では、本発明は、標的ポリヌクレオチド中の変異の感度のよい検出のための方法およびキットを提供する。本発明は、プローブ結合領域とテンプレート結合領域とを含む、オリゴヌクレオチドプライマーを提供する。いくつかの実施形態では、このテンプレート結合領域は、変異を保有することが疑われるテンプレート核酸に対して少なくとも50%相補性である。いくつかの実施形態では、テンプレート結合領域の一部は、変異が疑われる遺伝子座に少なくとも部分的を覆う。いくつかの実施形態では、このオリゴヌクレオチドプライマーは、テンプレート核酸に対するハイブリダイゼーションの際に、変異が存在する場合はポリメラーゼによって伸長可能であるが、変異が存在しない場合はポリメラーゼによって伸長可能ではない。いくつかの実施形態では、上記テンプレート結合領域は、変異遺伝子座を覆う3’末端領域を含む。いくつかの実施形態では、変異遺伝子座を覆う3’末端領域は、1、2、3、4、5、または5塩基を超えるテンプレート結合領域の3’末端を含む。いくつかの実施形態では、この変異は一塩基多型(SNP)である。
特定の実施形態では、この3’末端領域は、SNP遺伝子座を覆う塩基を含む。いくつかの実施形態では、この塩基は、SNP遺伝子座の変異体対立遺伝子に相補的である。いくつかの実施形態では、この塩基は、SNP遺伝子座の野性型対立遺伝子に対して相補性である。いくつかの実施形態では、上記プローブ結合領域は、被験体由来のいかなるゲノム配列に対してもハイブリダイズしない。いくつかの実施形態では、上記ポリメラーゼは、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を欠いているDNAポリメラーゼである。
本発明はまた:(a)オリゴヌクレオチドプライマーであって、(i)プローブ結合領域および変異を保有すると疑われるテンプレート核酸に対して少なくとも70%相補的であるテンプレート結合領域を含み、ここでこのテンプレート結合領域の一部が、変異が疑わしい遺伝子座を少なくとも部分的に覆い、ここでこのオリゴヌクレオチドプライマーは、テンプレート核酸に対するハイブリダイゼーションの際に、変異が存在する場合はポリメラーゼによって伸長可能であるが、変異が存在しない場合はポリメラーゼによって伸長可能ではない、オリゴヌクレオチドプライマーと;(b)使用説明書とを包含する、キットを提供する。いくつかの実施形態では、変異とは、一塩基多型(SNP)である。いくつかの実施形態では、テンプレート結合領域は、SNP遺伝子座を覆う3’末端塩基を含む。いくつかの実施形態では、この3’末端塩基は、SNP遺伝子座の変異対立遺伝子に相補的である。いくつかの実施形態では、この3’末端塩基は、SNP遺伝子座の野性型対立遺伝子に相補的である。いくつかの実施形態では、このプローブ結合領域は、被験体由来のいかなるゲノム配列に対してもハイブリダイズしない。いくつかの実施形態では、このキットはさらに、プローブ結合領域に対して少なくとも70%相補的なレポータープローブを含む。いくつかの実施形態では、このレポータープローブは、検出可能部分およびクエンチャー部分を含み、ここでこのクエンチャー部分は、このレポータープローブがインタクトである場合、検出可能部分の検出を抑制する。いくつかの実施形態では、このキットはさらに、上記遺伝子座の下流の逆相補配列に対して少なくとも70%相補的なリバースプライマーを含む。いくつかの実施形態では、このキットはポリメラーゼをさらに含む。
いくつかの実施形態では、このポリメラーゼは、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有し、かつ3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を有さない熱安定性ポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、このキットはさらに、(i)1つ以上の代替のオリゴヌクレオチドプライマーを含み、ここでこの1つ以上の代替のオリゴヌクレオチドプライマーは各々が、別個のプローブ結合領域および上記テンプレート核酸に対して少なくとも70%相補的であるテンプレート結合領域を含み、ここでこのテンプレート結合領域の一部は、少なくとも部分的に、上記遺伝子座を覆い、ここでこの代替のオリゴヌクレオチドプライマーは、テンプレート核酸に対するハイブリダイゼーションの際に、代替の対立遺伝子が存在する場合、ポリメラーゼによって伸長可能であるが、この代替の対立遺伝子が存在しない場合は、ポリメラーゼによって伸長可能ではない。いくつかの実施形態では、このキットはさらに、1つ以上の代替のレポータープローブを含み、ここでこの代替のレポータープローブの各々は、この別個のプローブ結合領域のうちの1つに対して少なくとも70%相補的であるが、このキットのいかなる他のプローブ結合領域に対しても相補的ではない。いくつかの実施形態では、この代替のレポータープローブの各々は、代替の検出可能部分およびクエンチャー部分を含み、ここでこのキットの検出可能部分の各々は、このキットの任意の他の検出可能部分とは検出可能に異なる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーおよびレポータープローブからなるハイブリダイゼーション生成物は、オリゴヌクレオチドプライマーおよびテンプレート核酸からなるハイブリダイゼーション生成物のTmよりも少なくとも10度高いTmを有する。
別の態様では、本発明は、標的ポリヌクレオチド領域における変異を検出する方法を提供し、この方法は:(a)この標的ポリヌクレオチド領域に対してオリゴヌクレオチドプライマーを選択的にハイブリダイズさせる工程であって、ここでこのオリゴヌクレオチドプライマーが、(i)プローブ結合領域と、(ii)変異を保有することが疑われるテンプレート核酸に対して少なくとも70%相補的なテンプレート結合領域とを含み、ここでこのテンプレート結合領域の一部が、この変異の疑わしい遺伝子座を少なくとも部分的に覆い、かつここでこのオリゴヌクレオチドプライマーが、テンプレート核酸に対するハイブリダイゼーションの際に、変異が存在する場合、ポリメラーゼによって伸長可能であるが、変異が存在しない場合、ポリメラーゼによって伸長可能ではない、工程と;(b)ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプライマーを伸長して、伸長生成物を形成する工程と;(c)伸長生成物を検出する工程であって、ここで検出する工程が、変異の存在を示す工程と、を包含する。いくつかの実施形態では、この伸長させる工程は、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を含まないDNAポリメラーゼで伸長させる工程を包含する。
いくつかの実施形態では、上記検出する工程は、レポータープローブを上記プローブ結合領域に対して選択的にハイブリダイズさせる工程を包含する。いくつかの実施形態では、上記レポータープローブは、検出可能部分およびクエンチャー部分を含み、ここでこのクエンチャー部分は、このレポータープローブがインタクトな場合、この検出可能部分の検出を抑制する。いくつかの実施形態では、この検出する工程はさらに、上記ハイブリダイズされたレポータープローブの上記クエンチャー部分から検出可能部分を分離する工程を包含する。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、上記伸長生成物を、上記遺伝子座の下流のこの伸長生成物のある領域に対してハイブリダイズ可能なリバースプライマーを用いて増幅する工程を包含する。いくつかの実施形態では、上記増幅する工程は、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を含むDNAポリメラーゼで増幅する工程を包含する。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、上記標的ポリヌクレオチド領域に対して1つ以上の代替のオリゴヌクレオチドプライマーを選択的にハイブリダイズさせる工程を包含し、ここでこの1つ以上の代替のオリゴヌクレオチドプライマーが各々、別個のプローブ結合領域および上記テンプレート核酸に対して少なくとも70%相補的であるテンプレート結合領域を含み、ここで上記テンプレート結合領域の一部が、上記遺伝子座を少なくとも部分的に覆い、ここでこの代替のオリゴヌクレオチドプライマーが、このテンプレート核酸に対するハイブリダイゼーションの際に、代替の対立遺伝子が存在する場合、ポリメラーゼによって伸長可能であるが、この代替の対立遺伝子が存在しない場合、ポリメラーゼによって伸長可能ではない。いくつかの実施形態では、検出する工程はさらに、この1つ以上の代替のオリゴヌクレオチドプライマーに対して1つ以上の代替のレポータープローブを選択的にハイブリダイズさせる工程を包含し、ここでこの代替のレポータープローブの各々が、上記別個のプローブ結合領域の1つに対して少なくとも70%相補的であるが、このプローブ結合領域の他のいずれに対しても相補的ではない。いくつかの実施形態では、上記代替のレポータープローブの各々は、代替の検出可能部分およびクエンチャー部分を含み、ここでこの代替の検出可能部分の各々は、この検出可能部分のいずれの他とも検出可能に異なる。いくつかの実施形態では、この変異は、一塩基多型(SNP)である。いくつかの実施形態では、テンプレート結合領域は、このSNP遺伝子座を覆う塩基を含む3’末端領域を含む。いくつかの実施形態では、この塩基は、SNP遺伝子座の変異体対立遺伝子に対して相補的である。
いくつかの実施形態では、この塩基は、上記SNP遺伝子座の野性型対立遺伝子に対して相補的である。いくつかの実施形態では、上記プローブ結合領域は、上記標的ポリヌクレオチド領域に対してハイブリダイズしない。いくつかの実施形態では、上記オリゴヌクレオチドプライマーおよびレポータープローブのハイブリダイゼーション生成物は、このオリゴヌクレオチドプライマーと標的ポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーション生成物のTmよりも少なくとも10度高いTmを有する。いくつかの実施形態では、このレポータープローブの濃度は、上記フォワードプライマーの濃度の少なくとも10×である。いくつかの実施形態では、上記核酸サンプルは、工程b〜cの前に複数の別個の反応容積に細かく分割される。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、反応容積の各々における上記検出可能な部分の検出を包含する。いくつかの実施形態では、この方法は、上記多数の反応容積をカウントする工程をさらに包含し、ここで上記検出可能部分が検出される。いくつかの実施形態では、この核酸サンプルは、複数の個別の反応容積が平均で1未満、1または1を超えるテンプレート核酸分子を含むように、細かく分割されている。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、結論を提供する工程およびネットワークをわたってこの結論を伝達する工程を包含する。
本発明はまた、(a)テンプレート核酸に対してハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドプライマーであって、ここでこのテンプレート核酸が、ある遺伝子座で野性型対立遺伝子を含み、ここでこのオリゴヌクレオチドプライマーの3’末端領域が、この遺伝子座を覆い、かつこの野性型対立遺伝子に相補的ではない、オリゴヌクレオチドプライマーと;(b)検出可能部分およびクエンチャー部分を含むインタクトなレポータープローブであって、ここでこのインタクトなレポータープローブが、このオリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズされる、レポーターと、を含む組成物を提供する。
本発明はまた:(a)ssDNAライブラリー中の一本鎖DNA(ssDNA)フラグメントに対して標的選択性オリゴヌクレオチド(TSO)をハイブリダイズして、ハイブリダイゼーション生成物を作成する工程と;(b)このハイブリダイゼーション生成物を伸長して、二本鎖伸長生成物を作成する工程であって、ここでこのTSOが、(i)単一の標的領域に対して相補的な配列と(ii)このTSOの第一の末端に位置するが、このTSOの両端には位置しない第一の一本鎖アダプター配列とを含み、ここでこのssDNAフラグメントが、第二の一本鎖アダプター配列を含むが、第一の一本鎖アダプター配列を含まない工程と、を包含する方法を提供する。いくつかの実施形態では、このssDNAフラグメントは、10%、50%、70%、または90%を超えるライゲーション効率を含むライゲーション方法によって第二の一本鎖アダプター配列に連結される。いくつかの実施形態では、このssDNAフラグメントは、一本鎖ライゲーション方法によって、第二の一本鎖アダプター配列に連結される。いくつかの実施形態では、この第二の一本鎖アダプター配列は、ssDNAフラグメントの第一の末端に位置するが、ssDNAフラグメントの両端には位置しない。いくつかの実施形態では、この増幅工程は、線形増幅を包含する。いくつかの実施形態では、この第二の一本鎖アダプター配列は、ssDNAフラグメントの第一の末端に位置するが、ssDNAフラグメントの両端には位置しない。いくつかの実施形態では、ssDNAフラグメントの第一の末端は、5’末端である。いくつかの実施形態では、この第一のアダプター配列はバーコード配列を含む。いくつかの実施形態では、この第一または第二のアダプター配列は、バーコード配列を含む。いくつかの実施形態では、TSOの上記第一の末端は5’末端である。いくつかの実施形態では、上記第一または第二のアダプター配列は、固体支持体にコンジュゲートされた支持体結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも70%同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、この固体支持体は、配列決定プラットフォームにカップリングされる。いくつかの実施形態では、この第一または第二のアダプター配列は、配列決定プライマーに対する結合部位を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、この支持体結合オリゴヌクレオチドに対して伸長生成物をアニーリングする工程をさらに包含する。いくつかの実施形態では、この方法は、このアニーリングされた伸長生成物を増幅する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態では、この方法は、このアニーリングされた伸長生成物を配列決定する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態では、上記ssDNAライブラリーはゲノムDNAフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、このssDNAライブラリーは、cDNAフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ハイブリダイズしていないTSOおよびハイブリダイズしていないssDNAライブラリーのメンバーを取り除く工程をさらに包含する。いくつかの実施形態では、工程a)およびb)は、ssDNAライブラリーのメンバーおよびTSOが溶液中で浮遊性である場合に行われる。
いくつかの実施形態では、上記単一の標的領域はゲノム領域に隣接する。いくつかの実施形態では、このゲノム領域は、癌関連遺伝子由来のエキソン領域の一部を含む。いくつかの実施形態では、この癌関連遺伝子は、ABCA1、BRAF、CHD5、EP300、FLT1、ITPA、MYC、PIK3R1、SKP2、TP53、ABCA7、BRCA1、CHEK1、EPHA3、FLT3、JAK1、MYCL1、PIK3R2、SLC19A1、TP73、ABCB1、BRCA2、CHEK2、EPHA5、FLT4、JAK2、MYCN、PKHD1、SLC1A6、TPM3、ABCC2、BRIP1、CLTC、EPHA6、FN1、JAK3、MYH2、PLCB1、SLC22A2、TPMT、ABCC3、BUB1B、COL1A1、EPHA7、FOS、JUN、MYH9、PLCG1、SLCO1B3、TPO、ABCC4、C1orf144、COPS5、EPHA8、FOXO1、KBTBD11、NAV3、PLCG2、SMAD2、TPR、ABCG2、CABLES1、CREB1、EPHB1、FOXO3、KDM6A、NBN、PML、SMAD3、TRIO、ABL1、CACNA2D1、CREBBP、EPHB4、FOXP4、KDR、NCOA2、PMS2、SMAD4、TRRAP、ABL2、CAMKV、CRKL、EPHB6、GAB1、KIT、NEK11、PPARG、SMARCA4、TSC1、ACVR1B、CARD11、CRLF2、EPO、GATA1、KLF6、NF1、PPARGC1A、SMARCB1、TSC2、ACVR2A、CARM1、CSF1R、ERBB2、GLI1、KLHDC4、NF2、PPP1R3A、SMO、TTK、ADCY9、CAV1、CSMD3、ERBB3、GLI3、KRAS、NKX2−1、PPP2R1A、SOCS1、TYK2、AGAP2、CBFA2T3、CSNK1G2、ERBB4、GNA11、LMO2、NOS2、PPP2R1B、SOD2、TYMS、AKT1、CBL、CTNNA1、ERCC1、GNAQ、LRP1B、NOS3、PRKAA2、SOS1、UGT1A1、AKT2、CCND1、CTNNA2、ERCC2、GNAS、LRP2、NOTCH1、PRKCA、SOX10、UMPS、AKT3、CCND2、CTNNB1、ERCC3、GPR124、LRP6、NOTCH2、PRKCZ、SOX2、USP9X、ALK、CCND3、CYFIP1、ERCC4、GPR133、LTK、NOTCH3、PRKDC、SP1、VEGF、ANAPC5、CCNE1、CYLD、ERCC5、GRB2、MAN1B1、NPM1、PTCH1、SPRY2、VEGFA、APC、CD40LG、CYP19A1、ERCC6、GSK3B、MAP2K1、NQO1、PTCH2、SRC、VHL、APC2、CD44、CYP1B1、ERG、GSTP1、MAP2K2、NR3C1、PTEN、ST6GAL2、WRN、AR、CD79A、CYP2C19、ERN2、GUCY1A2、MAP2K4、NRAS、PTGS2、STAT1、WT1、ARAF、CD79B、CYP2C8、ESR1、HDAC1、MAP2K7、NRP2、PTPN11、STAT3、XPA、ARFRP1、CDC42、CYP2D6、ESR2、HDAC2、MAP3K1、NTRK1、PTPRB、STK11、XPC、ARID1A、CDC42BPB、CYP3A4、ETV4、HGF、MAPK1、NTRK2、PTPRD、SUFU、ZFY、ATM、CDC73、CYP3A5、EWSR1、HIF1A、MAPK3、NTRK3、RAD50、SULT1A1、ZNF521、ATP5A1、CDH1、DACH2、EXT1、HM13、MAPK8、OMA1、RAD51、SUZ12、ATR、CDH10、DCC、EZH2、HMGA1、MARK3、OR10R2、RAF1、TAF1、AURKA、CDH2、DCLK3、FANCA、HNF1A、MCL1、PAK3、RARA、TBX22、AURKB、CDH20、DDB2、FANCD2、HOXA3、MDM2、PARP1、RB1、TCF12、BAI3、CDH5、DDR2、FANCE、HOXA9、MDM4、PAX5、REM1、TCF3、BAP1、CDK2、DGKB、FANCF、HRAS、MECOM、PCDH15、RET、TCF4、BARD1、CDK4、DGKZ、FAS、HSP90AA1、MEN1、PCDH18、RICTOR、TEK、BAX、CDK6、DIRAS3、FBXW7、IDH1、MET、PCNA、RIPK1、TEP1、BCL11A、CDK7、DLG3、FCGR3A、IDH2、MITF、PDGFA、ROR1、TERT、BCL2、CDK8、DLL1、FES、IFNG、MLH1、PDGFB、ROR2、TET2、BCL2A1、CDKN1A、DNMT1、FGFR1、IGF1R、MLL、PDGFRA、ROS1、TGFBR2、BCL2L1、CDKN1B、DNMT3A、FGFR2、IGF2R、MLL3、PDGFRB、RPS6KA2、THBS1、BCL2L2、CDKN2A、DNMT3B、FGFR3、IKBKE、MPL、PDZRN3、RPTOR、TNFAIP3、BCL3、CDKN2B、DOT1L、FGFR4、IKZF1、MRE11A、PHLPP2、RSPO2、TNKS、BCL6、CDKN2C、DPYD、FH、IL2RG、MSH2、PIK3C3、RSPO3、TNKS2、BCR、CDKN2D、E2F1、FHOD3、INHBA、MSH6、PIK3CA、RUNX1、TNNI3K、BIRC5、CDX2、EED、FIGF、INSR、MTHFR、PIK3CB、SDHB、TNR、BIRC6、CEBPA、EGF、FLG2、IRS1、MTOR、PIK3CD、SF3B1、TOP1、BLM、CERK、EGFR、FLNC、IRS2、MUTYH、PIK3CG、SHC1、およびTOP2Aからなる群より選択される。
いくつかの実施形態では、10%、50%、70%または90%の効率を超えるライゲーション方法は、一本鎖ライゲーション方法である。いくつかの実施形態では、このライゲーション方法は、RNAリガーゼの使用を含む。いくつかの実施形態では、RNAリガーゼは、CircLigaseまたはCircLigase IIである。
本発明はまた、一本鎖DNAライブラリーを調製する方法を提供し、この方法は:(a)二本鎖DNAフラグメントを一本鎖DNA(ssDNA)フラグメントに変性させる工程と;(b)このssDNAフラグメントから5’側のホスフェートを取り除く工程と;(c)一本鎖プライマードッキングオリゴヌクレオチド(pdo’s)を、このssDNAフラグメントの3’末端に連結する工程と;(d)プライマーをこのpdo’sにハイブリダイズさせる工程であって、ここで、このプライマーが、このアダプターオリゴヌクレオチド配列に対して相補的な配列を含み、かつ配列決定プラットフォームに対してカップリングされた支持体結合したオリゴヌクレオチドに対して少なくとも70%同一である、第一のアダプター配列を含む、工程と;(e)このハイブリダイズしたプライマーを伸長して、二重鎖を作成する工程であって、ここで各々の二重鎖が、ssフラグメントおよび伸長したプライマー鎖を含む工程と;(f)この二本鎖伸長生成物を変性する工程であって、ここでこの変性が、上記固定化された捕獲試薬からの上記伸長されたプライマー鎖の遊離と、上記固定化された捕獲試薬上のこのssDNAフラグメントの保持を生じる工程と;(g)この伸長されたプライマー鎖を収集する工程と、を包含する。いくつかの実施形態では、この方法は、線形増幅反応で工程d〜fを反復する工程であって、ここでこの伸長されたプライマー鎖がssDNAライブラリーを含む工程を包含する。いくつかの実施形態では、工程(c)は、上記pdo’sに対する上記ssDNAフラグメントのうち少なくとも50%のライゲーションを生じる。いくつかの実施形態では、このライゲーションは、ATP依存性リガーゼを用いて行われる。いくつかの実施形態では、上記ATP依存性リガーゼはRNAリガーゼである。いくつかの実施形態では、このRNAリガーゼは、CircLigaseまたはCircLigase IIである。いくつかの実施形態では、このpdo’sはアデニル化されている。いくつかの実施形態では、この伸長は、校正DNAポリメラーゼを用いて行われる。
本発明はまた、一本鎖DNAライブラリーを調製する方法を提供し、この方法は:二本鎖DNAフラグメントを一本鎖DNA(ssDNA)フラグメントに変性する工程と;第一の一本鎖アダプター配列を、このssDNAフラグメントの第一の末端に連結する工程と;第二の一本鎖アダプター配列をこのssDNAフラグメントの第二の末端に連結する工程と、を包含する。
本発明はまた、プライマードッキングオリゴヌクレオチド(pdo)と;プライマーであって、このプライマーが、このpdo配列に対して少なくとも70%相補性である配列を含み、かつ配列決定プラットフォームにカップリングされた第一の支持体結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも70%同一である、第一のアダプター配列をさらに含む、プライマーと;使用説明書と、を含む、キットを提供する。いくつかの実施形態では、このキットはさらに、ATP依存性リガーゼを含む。いくつかの実施形態では、このATP依存性リガーゼはRNAリガーゼである。いくつかの実施形態では、このRNAリガーゼは、CircLigaseまたはCircLigase IIである。いくつかの実施形態では、このキットはさらに、校正DNAポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態では、このキットはさらに、固定化された捕獲試薬を含む。いくつかの実施形態では、上記第一のアダプター配列は、第一の配列決定プライマーに対して少なくとも70%相補的である配列を含む。いくつかの実施形態では、上記第一のアダプター配列は、バーコード配列を含む。いくつかの実施形態では、このキットはさらに、標的選択性オリゴヌクレオチド(TSO)を含む。いくつかの実施形態では、上記TSOは、このTSOの第一の末端に位置するが、このTSOの第二の末端には位置しない第二のアダプター配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記TSOの上記第一の末端は5’末端である。いくつかの実施形態では、上記第二のアダプター配列は、配列決定プラットフォームに対してカップリングされた第二の支持体結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも70%同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、この第二のアダプター配列は、配列決定プライマーに対する結合部位を含む。
本発明はまた、キットであって:第一のアダプターオリゴヌクレオチドであって、ここでこの第一のアダプターが、配列決定プラットフォームに対してカップリングされた第一の支持体結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも70%相補的である配列を含む、第一のアダプターオリゴヌクレオチドと;第二のアダプターオリゴヌクレオチドであって、ここでこの第二のアダプターが、第一のアダプターオリゴヌクレオチドとは別個である配列を含む、第二のアダプターオリゴヌクレオチドと;RNAリガーゼと;使用説明書とを含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、この第二のアダプターは、配列決定プライマーに対して少なくとも70%相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、この第二のアダプターは、配列決定プラットフォームに対してカップリングされた第二の支持体結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも70%相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、上記第一のアダプターは、配列決定プライマーに対して少なくとも70%相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、上記第一または第二のアダプターの一方は、バーコード配列を含む。いくつかの実施形態では、この第一のアダプターは、3’末端塩基と別のヌクレオチドとの間の共有結合の形成を妨げる3’末端ブロック基を含む。いくつかの実施形態では、この3’末端ブロック基は、ジデオキシ−dNTP、アルキル、アミノ−アルキル、フルオロフォアジゴキシゲニン(digeoxygenin)、またはビオチンである。いくつかの実施形態では、この第一のアダプターは、5’ポリアデニル化配列を含む。いくつかの実施形態では、上記RNAリガーゼは、T4またはMth由来の短縮されたまたは変異されたリガーゼ2である。いくつかの実施形態では、このキットは、第二のRNAリガーゼをさらに含んでいる。いくつかの実施形態では、この第二のRNAリガーゼは、CircLigaseまたはCircLigase IIである。
本発明は、高効率のライゲーション反応を行うための方法およびキットを提供する。このような方法およびキットは、広範な適用に用いられ得る。
本発明は、複数のドナー核酸分子のうち少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%または90%の第一の末端に対して複数のアクセプター核酸分子を連結する工程を包含する、高効率のライゲーション反応を行う方法を提供する。いくつかの実施形態では、この複数のドナー核酸分子は、10nMを超える濃度で反応混合物中に存在する。
別の態様では、本発明は、複数のドナー核酸分子のうち10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%または90%を超える第一の末端に対して複数のアクセプター核酸分子を連結する工程を包含する、高効率のライゲーション反応を行う方法を提供し、ここで、ドナーまたはアクセプター核酸分子のうちの1つは120nt長を超える。
別の態様では、本発明は、複数のアクセプター核酸分子のうち少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%または90%の第一の末端に対して複数のドナー核酸分子を連結する工程を包含する、高効率のライゲーション反応を行う方法を提供する。いくつかの実施形態では、この複数のドナー核酸分子は、10nMを超える濃度で反応混合物中に存在する。
別の態様では、本発明は、複数のアクセプター核酸分子のうち少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%または90%の第一の末端に対して複数のドナー核酸分子を連結する工程を包含する、高効率のライゲーション反応を行う方法を提供し、ここでドナーまたはアクセプター核酸分子のうちの1つは120nt長を超える。
高効率のライゲーション方法のいくつかの実施形態では、このアクセプター核酸分子は、ドナー核酸分子である。いくつかの実施形態では、この方法は、(a)NMP担持ドナー核酸分子の蓄積を達成するのに十分な時間、反応混合物中で、ある量のドナー核酸分子にヌクレオシド一リン酸(NMP)を移動させる工程と;(b)NMP担持ドナー核酸分子とアクセプター核酸分子との間の共有結合の形成を達成する工程と、を包含し、ここで工程(a)および(b)は、この反応混合物中で逐次的に行われる。いくつかの実施形態では、上記移動は、上記ドナー核酸分子のうち少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%または90%までNMPの移動を生じる。いくつかの実施形態では、このドナー核酸分子の少なくとも1つのメンバーの3’末端領域は、未改変の3’末端領域である。いくつかの実施形態では、上記反応混合物は、(a)ドナー核酸分子の量に対して少なくとも等モルである量のヌクレオシド三リン酸(NTP)依存性リガーゼと;(b)上記ATP依存性リガーゼのミカエリス定数(Km)より少なくとも10倍高い量で存在するNTPと;を含む。いくつかの実施形態では、上記NTP依存性リガーゼはRNAリガーゼである。いくつかの実施形態では、このNTP依存性リガーゼはATP依存性RNAリガーゼである。いくつかの実施形態では、このRNAリガーゼは、好熱性のRNAリガーゼである。いくつかの実施形態では、このRNAリガーゼは、T4 RNAリガーゼである。いくつかの実施形態では、上記ATP依存性RNAリガーゼは、MthRn1、CircLigase、またはCircLigase IIである。いくつかの実施形態では、NTP依存性リガーゼは、GTP依存性リガーゼ、例えば、RtcBである。いくつかの実施形態では、ドナー核酸分子の3’末端領域は、3’末端ブロック基で改変されている。いくつかの実施形態では、共有結合の形成を達成する上記工程は、上記反応混合物に対して:上記アクセプター核酸分子と;Mn2+と、を添加する工程を包含する。いくつかの実施形態では、このMn2+は、少なくとも2.5mMの量で存在する。いくつかの実施形態では、この方法は、上記反応混合物中の上記NTPの濃度を低下させる工程をさらに包含する。いくつかの実施形態では、この濃度を低下させる工程は、NTPの濃度を少なくとも1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍または10倍低下させる工程を包含する。いくつかの実施形態では、この濃度を低下させる工程は、NTPを少なくとも1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍または10倍希釈するのに十分な量の液体を上記反応混合物に添加する工程を包含する。いくつかの実施形態では、上記ドナー核酸分子は、生物学的供給源から単離された核酸分子を含み、かつここで上記アクセプター核酸分子はアダプター配列を含む。いくつかの実施形態では、上記アクセプター核酸分子は、生物学的被験体から単離された核酸を含み、かつここで上記ドナー核酸分子はアダプター配列を含む。いくつかの実施形態では、このアクセプター核酸分子は、生物学的被験体から単離された核酸を含み、かつここで上記ドナー核酸分子はバーコード配列を含む。いくつかの実施形態では、このドナー核酸分子は、生物学的被験体から単離された核酸を含み、かつここで上記アクセプター核酸分子はバーコード配列を含む。いくつかの実施形態では、このアクセプター核酸分子またはドナー核酸分子は、検出可能タグを含む。いくつかの実施形態では、NMPはAMPである。いくつかの実施形態では、NMPはGMPである。いくつかの実施形態では、NTPはATPである。いくつかの実施形態では、NTPはGTPである。
別の態様では、本発明は、核酸ライブラリーを調製する方法を提供し、この方法は、複数のテンプレート核酸分子のうち少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%または90%の第一の末端に対してオリゴヌクレオチド配列を連結して、この核酸ライブラリーを作成する工程を包含し、ここでこのテンプレート核酸分子のうちの1つが120nt長を超える。いくつかの実施形態では、このオリゴヌクレオチド配列は、アダプター配列である。いくつかの実施形態では、この方法は、上記核酸ライブラリーを配列決定する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態では、上記オリゴヌクレオチド配列は検出可能標識を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、上記核酸ライブラリーをアレイハイブリダイゼーションによって分析する工程を包含する。
一態様では、本発明は、核酸ライブラリーを調製する方法を提供し、この方法は、(a)複数のテンプレート核酸分子のうちの少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%または90%の第一の末端に対してアダプター配列を連結して、核酸ライブラリーを作成する工程と;(b)この核酸ライブラリーを配列決定する工程と、を包含する。いくつかの実施形態では、この配列決定は、核酸ライブラリーの予備増幅なしで行われる。いくつかの実施形態では、上記複数のテンプレート核酸分子は、ゲノムDNA(gDNA)を含む。いくつかの実施形態では、このgDNAは、固体組織サンプルから単離される。いくつかの実施形態では、このgDNAは血漿、血清、痰、唾液、尿、または汗から単離される。いくつかの実施形態では、この複数のテンプレート核酸分子は、一本鎖核酸フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、上記複数のテンプレート核酸分子のうち少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%の第一の末端に対してアダプター配列を連結する工程を包含する。
いくつかの実施形態では、上記連結する工程は、以下の工程:(a)NMP担持反応物質1の蓄積を達成するのに十分な時間、第一の反応混合物中で核酸の第一の集団(反応物質1)の量までNMPを移動させる工程と;(b)NMP担持反応物質1と核酸の第二の集団(反応物質2)との間の共有結合の形成を達成する工程であって、ここでこの反応物質1が、(i)この複数のテンプレート核酸または(ii)配列決定アダプターのいずれかであって、ここでこの反応物質2が(i)この複数のテンプレート核酸または(ii)配列決定アダプターの他であり、かつここでこのアデニル化された反応物質1が共有結合の形成を達成するこの工程の前に精製されない工程と、を包含する。いくつかの実施形態では、この移動する工程が、上記反応物質1の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%または90%までNMPの移動を生じる。いくつかの実施形態では、この反応物質1の少なくとも1つのメンバーの3’末端領域が、未改変の3’末端領域である。いくつかの実施形態では、上記反応混合物は、(a)反応物質1の上記量に対して少なくとも等モルである量のNTP依存性リガーゼと;(b)上記ATP依存性リガーゼのミカエリス定数(Km)より少なくとも10倍高い量で存在するNTPと;を含む。このNTP依存性リガーゼは、前述のNTP依存性リガーゼのいずれであってもよい。いくつかの実施形態では、NTP依存性リガーゼは、RNAリガーゼである。いくつかの実施形態では、このRNAリガーゼは、好熱性のRNAリガーゼである。いくつかの実施形態では、このNTP依存性リガーゼはATP依存性RNAリガーゼである。いくつかの実施形態では、このATP依存性RNAリガーゼは、MthRnl、T4 RNAリガーゼ、CircLigase、またはCircLigase IIである。いくつかの実施形態では、このNTP依存性リガーゼは、GTP依存性リガーゼである。このGTP依存性リガーゼは、RtcBであってもよい。いくつかの実施形態では、反応物質1の少なくとも1つのメンバーの3’末端領域は、3’末端ブロック基で改変されている。いくつかの実施形態では、共有結合の形成を達成する工程は、上記第一の反応混合物に対して:陽イオンと;上記反応物質2と;上記NTPを少なくとも10倍希釈するのに十分な量の液体と、を添加する工程を包含する。いくつかの実施形態では、この陽イオンはMn2+である。いくつかの実施形態では、この方法は、上記複数のテンプレート核酸分子のうち少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%または90%の第二の末端に対して第二のアダプター配列を連結する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態では、この方法はさらに:(a)上記DNAライブラリーのメンバーに対して、標的選択性オリゴヌクレオチド(tso)をハイブリダイズさせる工程であって、この標的選択性オリゴヌクレオチドが、(i)gDNAのある領域に特異的な配列と、(ii)第二のアダプター配列とを含む工程と;(b)上記ハイブリダイズしたtsoを伸長して、上記第一および第二のアダプターを含む二本鎖ライブラリーのメンバーを作成する工程と、を包含する。いくつかの実施形態では、このtsoは、癌関連遺伝子のある領域に対して少なくとも70%の同一性または相補性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、この配列決定する工程は、大規模並列(massively parallel)配列決定を包含する。いくつかの実施形態では、上記連結は、3時間未満行われ得る、反応プロトコールを用いて行われる。
別の態様では、本発明は、高効率のライゲーションを行うためのキットを提供する。いくつかの実施形態では、このキットは、NTP依存性リガーゼと;陽イオンと;NTPと;本明細書に記載の任意の方法を行うための使用説明書と;を含む。
本発明はまた、被験体の腫瘍から単離された腫瘍ゲノムDNA(gDNA)およびこの被験体由来の非腫瘍組織から単離された正常なgDNAを用いて、腫瘍特異的な変異を追跡する方法を提供し、この方法は、(a)予備増幅なしでこの腫瘍gDNAから調製されたDNAライブラリーを配列決定して第一のデータセットを作成する工程と;(b)予備増幅なしでこの正常なgDNAから調製されたDNAライブラリーを配列決定して第二のデータセットを作成する工程と;(c)この第一および第二のデータセットを分析して、この被験体における1つ以上の腫瘍特異的な変異を特定する工程と;(d)この被験体由来の液体サンプルから単離された無細胞DNA中でこの腫瘍特異的な変異の存在または不在を検出する工程と、を包含する。いくつかの実施形態では、この流体サンプルは、血漿、血清、痰、唾液、尿、および汗からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、工程(a)または(b)のDNAライブラリーは、本明細書に記載の任意の方法を用いて調製される。いくつかの実施形態では、上記配列決定は、少なくとも200の癌関連遺伝子を配列決定する工程を包含する。いくつかの実施形態では、この癌関連遺伝子は、ABCA1、BRAF、CHD5、EP300、FLT1、ITPA、MYC、PIK3R1、SKP2、TP53、ABCA7、BRCA1、CHEK1、EPHA3、FLT3、JAK1、MYCL1、PIK3R2、SLC19A1、TP73、ABCB1、BRCA2、CHEK2、EPHA5、FLT4、JAK2、MYCN、PKHD1、SLC1A6、TPM3、ABCC2、BRIP1、CLTC、EPHA6、FN1、JAK3、MYH2、PLCB1、SLC22A2、TPMT、ABCC3、BUB1B、COL1A1、EPHA7、FOS、JUN、MYH9、PLCG1、SLCO1B3、TPO、ABCC4、C1orf144、COPS5、EPHA8、FOXO1、KBTBD11、NAV3、PLCG2、SMAD2、TPR、ABCG2、CABLES1、CREB1、EPHB1、FOXO3、KDM6A、NBN、PML、SMAD3、TRIO、ABL1、CACNA2D1、CREBBP、EPHB4、FOXP4、KDR、NCOA2、PMS2、SMAD4、TRRAP、ABL2、CAMKV、CRKL、EPHB6、GAB1、KIT、NEK11、PPARG、SMARCA4、TSC1、ACVR1B、CARD11、CRLF2、EPO、GATA1、KLF6、NF1、PPARGC1A、SMARCB1、TSC2、ACVR2A、CARM1、CSF1R、ERBB2、GLI1、KLHDC4、NF2、PPP1R3A、SMO、TTK、ADCY9、CAV1、CSMD3、ERBB3、GLI3、KRAS、NKX2−1、PPP2R1A、SOCS1、TYK2、AGAP2、CBFA2T3、CSNK1G2、ERBB4、GNA11、LMO2、NOS2、PPP2R1B、SOD2、TYMS、AKT1、CBL、CTNNA1、ERCC1、GNAQ、LRP1B、NOS3、PRKAA2、SOS1、UGT1A1、AKT2、CCND1、CTNNA2、ERCC2、GNAS、LRP2、NOTCH1、PRKCA、SOX10、UMPS、AKT3、CCND2、CTNNB1、ERCC3、GPR124、LRP6、NOTCH2、PRKCZ、SOX2、USP9X、ALK、CCND3、CYFIP1、ERCC4、GPR133、LTK、NOTCH3、PRKDC、SP1、VEGF、ANAPC5、CCNE1、CYLD、ERCC5、GRB2、MAN1B1、NPM1、PTCH1、SPRY2、VEGFA、APC、CD40LG、CYP19A1、ERCC6、GSK3B、MAP2K1、NQO1、PTCH2、SRC、VHL、APC2、CD44、CYP1B1、ERG、GSTP1、MAP2K2、NR3C1、PTEN、ST6GAL2、WRN、AR、CD79A、CYP2C19、ERN2、GUCY1A2、MAP2K4、NRAS、PTGS2、STAT1、WT1、ARAF、CD79B、CYP2C8、ESR1、HDAC1、MAP2K7、NRP2、PTPN11、STAT3、XPA、ARFRP1、CDC42、CYP2D6、ESR2、HDAC2、MAP3K1、NTRK1、PTPRB、STK11、XPC、ARID1A、CDC42BPB、CYP3A4、ETV4、HGF、MAPK1、NTRK2、PTPRD、SUFU、ZFY、ATM、CDC73、CYP3A5、EWSR1、HIF1A、MAPK3、NTRK3、RAD50、SULT1A1、ZNF521、ATP5A1、CDH1、DACH2、EXT1、HM13、MAPK8、OMA1、RAD51、SUZ12、ATR、CDH10、DCC、EZH2、HMGA1、MARK3、OR10R2、RAF1、TAF1、AURKA、CDH2、DCLK3、FANCA、HNF1A、MCL1、PAK3、RARA、TBX22、AURKB、CDH20、DDB2、FANCD2、HOXA3、MDM2、PARP1、RB1、TCF12、BAI3、CDH5、DDR2、FANCE、HOXA9、MDM4、PAX5、REM1、TCF3、BAP1、CDK2、DGKB、FANCF、HRAS、MECOM、PCDH15、RET、TCF4、BARD1、CDK4、DGKZ、FAS、HSP90AA1、MEN1、PCDH18、RICTOR、TEK、BAX、CDK6、DIRAS3、FBXW7、IDH1、MET、PCNA、RIPK1、TEP1、BCL11A、CDK7、DLG3、FCGR3A、IDH2、MITF、PDGFA、ROR1、TERT、BCL2、CDK8、DLL1、FES、IFNG、MLH1、PDGFB、ROR2、TET2、BCL2A1、CDKN1A、DNMT1、FGFR1、IGF1R、MLL、PDGFRA、ROS1、TGFBR2、BCL2L1、CDKN1B、DNMT3A、FGFR2、IGF2R、MLL3、PDGFRB、RPS6KA2、THBS1、BCL2L2、CDKN2A、DNMT3B、FGFR3、IKBKE、MPL、PDZRN3、RPTOR、TNFAIP3、BCL3、CDKN2B、DOT1L、FGFR4、IKZF1、MRE11A、PHLPP2、RSPO2、TNKS、BCL6、CDKN2C、DPYD、FH、IL2RG、MSH2、PIK3C3、RSPO3、TNKS2、BCR、CDKN2D、E2F1、FHOD3、INHBA、MSH6、PIK3CA、RUNX1、TNNI3K、BIRC5、CDX2、EED、FIGF、INSR、MTHFR、PIK3CB、SDHB、TNR、BIRC6、CEBPA、EGF、FLG2、IRS1、MTOR、PIK3CD、SF3B1、TOP1、BLM、CERK、EGFR、FLNC、IRS2、MUTYH、PIK3CG、SHC1、およびTOP2Aからなる群より選択される。
いくつかの実施形態では、この方法は、上記腫瘍特異的な変異のプロファイルを連絡するレポートを作成する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態では、被験体由来の液体サンプルから単離された無細胞DNA中の腫瘍特異的変異の存在または不在を検出する工程は、複数の時点で行われる。いくつかの実施形態では、1つの時点は、癌治療の最初の施行の前であり、かつ第二の時点はこの最初の施行に引き続く。いくつかの実施形態では、この方法は、上記複数の時点で腫瘍特異的な変異のプロファイルを連絡するレポートを作成する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態では、このレポートは、上記腫瘍特異的変異の1つを保有する遺伝子を標的にする1つ以上の治療候補のリストを含む。いくつかの実施形態では、このレポートは、上記gDNAを単離する工程から1週で作成される。いくつかの実施形態では、上記変異は、コピー数変動を含む。いくつかの実施形態では、上記検出する工程は、上記無細胞DNAを配列決定する工程を包含する。いくつかの実施形態では、上記方法は、無細胞DNA中に存在する少なくとも10個の癌関連遺伝子を配列決定する工程を包含し、ここでこの少なくとも10個の癌関連遺伝子のうちの1つが、腫瘍特異的な変異を保有していると同定される。いくつかの実施形態では、この方法は、無細胞DNA中に存在する少なくとも100個の癌関連遺伝子を配列決定する工程を包含し、ここでこの少なくとも100個の癌関連遺伝子のうちの1つが、腫瘍特異的な変異を保有していると同定される。いくつかの実施形態では、上記配列決定する工程は、本明細書に記載の任意の方法によって配列決定する工程を包含する。
いくつかの態様では、本発明は、低い融点(Tm)を有するオリゴヌクレオチドプローブ、例えば、低Tmプローブであって、検出可能部分と;クエンチャー部分と;50℃未満の融点(Tm)とを含む、プローブを提供する。いくつかの実施形態では、この低Tmプローブは、8〜30ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、この検出可能部分は、55℃以上の温度でクエンチされる。いくつかの実施形態では、この低Tmプローブは、55℃を超える周囲温度では相補的なテンプレート核酸に対してハイブリダイズしない。いくつかの実施形態では、クエンチャー部分は、上記プローブが、テンプレート鎖に対してハイブリダイズされない場合、検出可能部分をクエンチする。いくつかの実施形態では、低TmプローブのTmは、30℃〜45℃である。いくつかの実施形態では、フルオロフォア部分およびクエンチャー部分は低Tmプローブで、少なくとも7ヌクレオチド離れて隔てられる。いくつかの実施形態では、この低Tmプローブは、TMを増強する塩基を有するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、このTMを増強する塩基を有するヌクレオチドは、スーパーベース(Superbase)、ロックドヌクレオチド、または架橋ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、低Tmプローブの検出可能部分は、フルオロフォアを含む。
いくつかの実施形態では、上記低Tmプローブは、少なくとも15ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、この低Tmプローブは、少なくとも40%のGC含量を有する。いくつかの実施形態では、この低Tmプローブは、80%未満のGC含量を有する。いくつかの実施形態では、この低Tmプローブは、50%未満のGC含量を有する。いくつかの実施形態では、この低Tmプローブは、40%未満のGC含量を有する。
いくつかの実施形態では、この低Tmプローブは、15ヌクレオチド未満の長さを有する。いくつかの実施形態では、この低Tmプローブは、40%未満のGC含量を有する。いくつかの実施形態では、この低Tmプローブは、少なくとも40%のGC含量を有する。いくつかの実施形態では、この低Tmプローブは、40〜80%のGC含量を有する。いくつかの実施形態では、この低Tmプローブは、40%未満のGC含量を有し、さらに、超塩基(superbase)、ロックされるかまたは架橋されたヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、上記低Tmプローブは、ABCA1、BRAF、CHD5、EP300、FLT1、ITPA、MYC、PIK3R1、SKP2、TP53、ABCA7、BRCA1、CHEK1、EPHA3、FLT3、JAK1、MYCL1、PIK3R2、SLC19A1、TP73、ABCB1、BRCA2、CHEK2、EPHA5、FLT4、JAK2、MYCN、PKHD1、SLC1A6、TPM3、ABCC2、BRIP1、CLTC、EPHA6、FN1、JAK3、MYH2、PLCB1、SLC22A2、TPMT、ABCC3、BUB1B、COL1A1、EPHA7、FOS、JUN、MYH9、PLCG1、SLCO1B3、TPO、ABCC4、C1orf144、COPS5、EPHA8、FOXO1、KBTBD11、NAV3、PLCG2、SMAD2、TPR、ABCG2、CABLES1、CREB1、EPHB1、FOXO3、KDM6A、NBN、PML、SMAD3、TRIO、ABL1、CACNA2D1、CREBBP、EPHB4、FOXP4、KDR、NCOA2、PMS2、SMAD4、TRRAP、ABL2、CAMKV、CRKL、EPHB6、GAB1、KIT、NEK11、PPARG、SMARCA4、TSC1、ACVR1B、CARD11、CRLF2、EPO、GATA1、KLF6、NF1、PPARGC1A、SMARCB1、TSC2、ACVR2A、CARM1、CSF1R、ERBB2、GLI1、KLHDC4、NF2、PPP1R3A、SMO、TTK、ADCY9、CAV1、CSMD3、ERBB3、GLI3、KRAS、NKX2−1、PPP2R1A、SOCS1、TYK2、AGAP2、CBFA2T3、CSNK1G2、ERBB4、GNA11、LMO2、NOS2、PPP2R1B、SOD2、TYMS、AKT1、CBL、CTNNA1、ERCC1、GNAQ、LRP1B、NOS3、PRKAA2、SOS1、UGT1A1、AKT2、CCND1、CTNNA2、ERCC2、GNAS、LRP2、NOTCH1、PRKCA、SOX10、UMPS、AKT3、CCND2、CTNNB1、ERCC3、GPR124、LRP6、NOTCH2、PRKCZ、SOX2、USP9X、ALK、CCND3、CYFIP1、ERCC4、GPR133、LTK、NOTCH3、PRKDC、SP1、VEGF、ANAPC5、CCNE1、CYLD、ERCC5、GRB2、MAN1B1、NPM1、PTCH1、SPRY2、VEGFA、APC、CD40LG、CYP19A1、ERCC6、GSK3B、MAP2K1、NQO1、PTCH2、SRC、VHL、APC2、CD44、CYP1B1、ERG、GSTP1、MAP2K2、NR3C1、PTEN、ST6GAL2、WRN、AR、CD79A、CYP2C19、ERN2、GUCY1A2、MAP2K4、NRAS、PTGS2、STAT1、WT1、ARAF、CD79B、CYP2C8、ESR1、HDAC1、MAP2K7、NRP2、PTPN11、STAT3、XPA、ARFRP1、CDC42、CYP2D6、ESR2、HDAC2、MAP3K1、NTRK1、PTPRB、STK11、XPC、ARID1A、CDC42BPB、CYP3A4、ETV4、HGF、MAPK1、NTRK2、PTPRD、SUFU、ZFY、ATM、CDC73、CYP3A5、EWSR1、HIF1A、MAPK3、NTRK3、RAD50、SULT1A1、ZNF521、ATP5A1、CDH1、DACH2、EXT1、HM13、MAPK8、OMA1、RAD51、SUZ12、ATR、CDH10、DCC、EZH2、HMGA1、MARK3、OR10R2、RAF1、TAF1、AURKA、CDH2、DCLK3、FANCA、HNF1A、MCL1、PAK3、RARA、TBX22、AURKB、CDH20、DDB2、FANCD2、HOXA3、MDM2、PARP1、RB1、TCF12、BAI3、CDH5、DDR2、FANCE、HOXA9、MDM4、PAX5、REM1、TCF3、BAP1、CDK2、DGKB、FANCF、HRAS、MECOM、PCDH15、RET、TCF4、BARD1、CDK4、DGKZ、FAS、HSP90AA1、MEN1、PCDH18、RICTOR、TEK、BAX、CDK6、DIRAS3、FBXW7、IDH1、MET、PCNA、RIPK1、TEP1、BCL11A、CDK7、DLG3、FCGR3A、IDH2、MITF、PDGFA、ROR1、TERT、BCL2、CDK8、DLL1、FES、IFNG、MLH1、PDGFB、ROR2、TET2、BCL2A1、CDKN1A、DNMT1、FGFR1、IGF1R、MLL、PDGFRA、ROS1、TGFBR2、BCL2L1、CDKN1B、DNMT3A、FGFR2、IGF2R、MLL3、PDGFRB、RPS6KA2、THBS1、BCL2L2、CDKN2A、DNMT3B、FGFR3、IKBKE、MPL、PDZRN3、RPTOR、TNFAIP3、BCL3、CDKN2B、DOT1L、FGFR4、IKZF1、MRE11A、PHLPP2、RSPO2、TNKS、BCL6、CDKN2C、DPYD、FH、IL2RG、MSH2、PIK3C3、RSPO3、TNKS2、BCR、CDKN2D、E2F1、FHOD3、INHBA、MSH6、PIK3CA、RUNX1、TNNI3K、BIRC5、CDX2、EED、FIGF、INSR、MTHFR、HADH、RPP30、ZFP3、PIK3CB、SDHB、TNR、BIRC6、CEBPA、EGF、FLG2、IRS1、MTOR、PIK3CD、SF3B1、TOP1、BLM、CERK、EGFR、FLNC、IRS2、MUTYH、PIK3CG、SHC1、およびTOP2Aからなる群より選択される遺伝子中に含まれる少なくとも10連続のヌクレオチドのヌクレオチド配列に対して少なくとも70%の相補性または同一性を有する配列を含む。
いくつかの態様では、本発明はまた、少なくとも1つのプライマー/プローブセットを含む反応混合物を提供し、ここでこのプライマー/プローブセットは:第一の位置でゲノム領域に対してハイブリダイズするように設計されたフォワードプライマーと;本明細書に記載の低Tmプローブと、を含む。いくつかの実施形態では、この反応混合物は、上記ゲノム領域に対して第二の位置でハイブリダイズするように設計されたリバースプライマーをさらに含む。いくつかの実施形態では、この低Tmプローブは、上記フォワードプライマーのTmよりも少なくとも15℃低いTmを有する。いくつかの実施形態では、この低Tmプローブは、上記第一のプライマーのTmおよび上記第二のプライマーのTmの平均よりも少なくとも15℃低いTmを有する。いくつかの実施形態では、この低Tmプローブは、上記第一の位置と第二の位置との間に位置する第三の位置で上記ゲノム領域にハイブリダイズするように設計されている。いくつかの実施形態では、上記リバースプライマーは、上記フォワードプライマーの量よりも少なくとも2倍〜10倍少ない量で存在する。いくつかの実施形態では、このリバースプライマーは、フォワードプライマーの量とは2倍以下異なる量で存在する。
いくつかの実施形態では、上記反応混合物は、生物学的サンプルから単離された核酸サンプルをさらに含んでいる。いくつかの実施形態では、この生物学的サンプルは、被験体から単離されたサンプルである。いくつかの実施形態では、この被験体はヒト被験体である。いくつかの実施形態では、このヒト被験体は、ある疾患について診断されるか、有すると疑われるか、またはそのリスクが増大していると疑われる。いくつかの実施形態では、この疾患は癌である。いくつかの実施形態では、上記テンプレート核酸はゲノム領域を含む。いくつかの実施形態では、このテンプレート核酸は、DNA、RNAまたはcDNAを含む。いくつかの実施形態では、この反応混合物は、ポリメラーゼをさらに含んでいる。いくつかの実施形態では、このポリメラーゼは、DNAポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、この反応混合物は、(a)第一のテンプレート核酸と;(b)ある量のフォワードプライマーと;(c)リバースプライマーの量が、フォワードプライマーの量よりも少なくとも2倍〜10倍少ない、量のリバースプライマーと;(d)低Tmプローブと、を含む。
いくつかの実施形態では、上記反応混合物は、複数のプライマー/プローブセットを含む。いくつかの実施形態では、複数の各々のプライマー/プローブセットは、ゲノムDNAの異なる領域に特異的である。いくつかの実施形態では、このゲノム領域は、疾患関連の変異と関連している。いくつかの実施形態では、この変異は、コピー数変動を含む。いくつかの実施形態では、この変異は、一塩基多型(SNP)、挿入、欠失、または逆位を含む。いくつかの実施形態では、上記フォワードプライマーまたはリバースプライマーの1つが、このSNP、挿入、欠失、または逆位を覆う。いくつかの実施形態では、上記低Tmプローブは、このSNP、挿入、欠失、または逆位を覆う。いくつかの実施形態では、上記疾患は癌である。
いくつかの実施形態では、上記プライマー/プローブセットは、複数の低Tmプローブを含み、ここで各々の低Tmプローブは、上記ゲノム領域の任意の他の対立遺伝子を含む配列と比較して、このゲノム領域の1つの特定の対立遺伝子を含む配列に対して、より大きい親和性で結合するように設計された対立遺伝子特異的プローブであり、ここで各々の対立遺伝子特異的なプローブが、異なる対立遺伝子に特異的である。
いくつかの実施形態では、この対立遺伝子特異的なプローブの各々は、スペクトル的に別個のフルオロフォアを各々が含む。
いくつかの実施形態では、任意の他の対立遺伝子に対する上記対立遺伝子特異的プローブの結合エネルギーと比較した、上記1つの特異的な対立遺伝子に対する対立遺伝子特異的プローブの結合エネルギーにおける相違は、このゲノム領域に対する低Tmプローブの全体的な結合エネルギーの1%超である。いくつかの実施形態では、この低Tmプローブは、ビーコンプローブである。いくつかの実施形態では、この低Tmプローブは、Pleiadesプローブである。
関連の態様では、本発明は、本明細書に記載の低Tmプローブを含む反応混合物を複数の反応容積に分割する工程と;この反応容積中の少なくとも1つにおいて、複数回の温度サイクリングを含むPCR増幅反応を行う工程であって、ここでこの低Tmプローブが、このPCR増幅反応の有効性に影響しない工程と、を包含する、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、この低Tmプローブは、上記PCR増幅反応のアニーリング段階または伸長段階の間にテンプレート核酸またはPCR反応生成物に対してハイブリダイズしない。いくつかの実施形態では、この方法は、上記反応容積の少なくとも1つを50℃未満まで冷却する工程をさらに包含し、ここでこの冷却によって、テンプレート核酸またはPCR反応生成物に対する低Tmプローブのハイブリダイゼーションが可能になる。いくつかの実施形態では、このテンプレート核酸またはPCR反応生成物は、低Tmプローブに対して少なくとも70%の相補性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、この方法は、上記反応容積の少なくとも1つを37℃未満まで冷却する工程を包含し、ここでこの冷却によって、上記低Tmプローブに対して少なくとも70%の相補性を有する配列を含む核酸に対する、この低Tmプローブの量のうち少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%のハイブリダイゼーションが可能になる。いくつかの実施形態では、上記分画によって、平均でテンプレート核酸の1モル未満、1モルまたは1モル超を含む各々の反応容積が生じる。いくつかの実施形態では、この分画によって平均でテンプレート核酸の1モル以上を含む各々の反応容積が生じる。
いくつかの実施形態では、この方法は、指数関数的PCR増幅反応および線形PCR増幅反応を、少なくとも1つの上記反応容積中で行う工程を包含する。
いくつかの実施形態では、この指数関数的PCR増幅反応および上記線形PCR増幅反応は、上記反応容積中から成分を添加することも除去することもなく連続して起きる。
いくつかの実施形態では、このPCR増幅反応によって、増幅生成物のうち少なくとも1%、5%、10%、20%、30%、40%または50%が一本鎖増幅生成物になる。
いくつかの実施形態では、上記反応容積は液滴である。いくつかの実施形態では、上記ハイブリダイゼーションによって、上記低Tmプローブからの蛍光の放出が生じる。いくつかの実施形態では、この方法は、この反応容積のうちの少なくとも1つ中で蛍光の存在または不在を検出する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態では、この方法は、反応容積中の蛍光の強度を測定する工程を包含する。いくつかの実施形態では、この方法は、蛍光陽性の反応容積の数および/または画分を決定する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態では、この方法は、蛍光陽性の反応容積の数および/または画分に基づいて、上記サンプル中の1つ以上の変異の存在、不在または量を決定する工程を包含する。いくつかの実施形態では、この1つ以上の変異は、SNP、欠失、挿入、または逆位を含む。いくつかの実施形態では、この1つ以上の変異は、遺伝子のコピー数変動を含む。いくつかの実施形態では、この1つ以上の変異は、疾患関連の変異を含む。いくつかの実施形態では、この疾患は、癌である。いくつかの実施形態では、この1つ以上の変異は、ABCA1、BRAF、CHD5、EP300、FLT1、ITPA、MYC、PIK3R1、SKP2、TP53、ABCA7、BRCA1、CHEK1、EPHA3、FLT3、JAK1、MYCL1、PIK3R2、SLC19A1、TP73、ABCB1、BRCA2、CHEK2、EPHA5、FLT4、JAK2、MYCN、PKHD1、SLC1A6、TPM3、ABCC2、BRIP1、CLTC、EPHA6、FN1、JAK3、MYH2、PLCB1、SLC22A2、TPMT、ABCC3、BUB1B、COL1A1、EPHA7、FOS、JUN、MYH9、PLCG1、SLCO1B3、TPO、ABCC4、C1orf144、COPS5、EPHA8、FOXO1、KBTBD11、NAV3、PLCG2、SMAD2、TPR、ABCG2、CABLES1、CREB1、EPHB1、FOXO3、KDM6A、NBN、PML、SMAD3、TRIO、ABL1、CACNA2D1、CREBBP、EPHB4、FOXP4、KDR、NCOA2、PMS2、SMAD4、TRRAP、ABL2、CAMKV、CRKL、EPHB6、GAB1、KIT、NEK11、PPARG、SMARCA4、TSC1、ACVR1B、CARD11、CRLF2、EPO、GATA1、KLF6、NF1、PPARGC1A、SMARCB1、TSC2、ACVR2A、CARM1、CSF1R、ERBB2、GLI1、KLHDC4、NF2、PPP1R3A、SMO、TTK、ADCY9、CAV1、CSMD3、ERBB3、GLI3、KRAS、NKX2−1、PPP2R1A、SOCS1、TYK2、AGAP2、CBFA2T3、CSNK1G2、ERBB4、GNA11、LMO2、NOS2、PPP2R1B、SOD2、TYMS、AKT1、CBL、CTNNA1、ERCC1、GNAQ、LRP1B、NOS3、PRKAA2、SOS1、UGT1A1、AKT2、CCND1、CTNNA2、ERCC2、GNAS、LRP2、NOTCH1、PRKCA、SOX10、UMPS、AKT3、CCND2、CTNNB1、ERCC3、GPR124、LRP6、NOTCH2、PRKCZ、SOX2、USP9X、ALK、CCND3、CYFIP1、ERCC4、GPR133、LTK、NOTCH3、PRKDC、SP1、VEGF、ANAPC5、CCNE1、CYLD、ERCC5、GRB2、MAN1B1、NPM1、PTCH1、SPRY2、VEGFA、APC、CD40LG、CYP19A1、ERCC6、GSK3B、MAP2K1、NQO1、PTCH2、SRC、VHL、APC2、CD44、CYP1B1、ERG、GSTP1、MAP2K2、NR3C1、PTEN、ST6GAL2、WRN、AR、CD79A、CYP2C19、ERN2、GUCY1A2、MAP2K4、NRAS、PTGS2、STAT1、WT1、ARAF、CD79B、CYP2C8、ESR1、HDAC1、MAP2K7、NRP2、PTPN11、STAT3、XPA、ARFRP1、CDC42、CYP2D6、ESR2、HDAC2、MAP3K1、NTRK1、PTPRB、STK11、XPC、ARID1A、CDC42BPB、CYP3A4、ETV4、HGF、MAPK1、NTRK2、PTPRD、SUFU、ZFY、ATM、CDC73、CYP3A5、EWSR1、HIF1A、MAPK3、NTRK3、RAD50、SULT1A1、ZNF521、ATP5A1、CDH1、DACH2、EXT1、HM13、MAPK8、OMA1、RAD51、SUZ12、ATR、CDH10、DCC、EZH2、HMGA1、MARK3、OR10R2、RAF1、TAF1、AURKA、CDH2、DCLK3、FANCA、HNF1A、MCL1、PAK3、RARA、TBX22、AURKB、CDH20、DDB2、FANCD2、HOXA3、MDM2、PARP1、RB1、TCF12、BAI3、CDH5、DDR2、FANCE、HOXA9、MDM4、PAX5、REM1、TCF3、BAP1、CDK2、DGKB、FANCF、HRAS、MECOM、PCDH15、RET、TCF4、BARD1、CDK4、DGKZ、FAS、HSP90AA1、MEN1、PCDH18、RICTOR、TEK、BAX、CDK6、DIRAS3、FBXW7、IDH1、MET、PCNA、RIPK1、TEP1、BCL11A、CDK7、DLG3、FCGR3A、IDH2、MITF、PDGFA、ROR1、TERT、BCL2、CDK8、DLL1、FES、IFNG、MLH1、PDGFB、ROR2、TET2、BCL2A1、CDKN1A、DNMT1、FGFR1、IGF1R、MLL、PDGFRA、ROS1、TGFBR2、BCL2L1、CDKN1B、DNMT3A、FGFR2、IGF2R、MLL3、PDGFRB、RPS6KA2、THBS1、BCL2L2、CDKN2A、DNMT3B、FGFR3、IKBKE、MPL、PDZRN3、RPTOR、TNFAIP3、BCL3、CDKN2B、DOT1L、FGFR4、IKZF1、MRE11A、PHLPP2、RSPO2、TNKS、BCL6、CDKN2C、DPYD、FH、IL2RG、MSH2、PIK3C3、RSPO3、TNKS2、BCR、CDKN2D、E2F1、FHOD3、INHBA、MSH6、PIK3CA、RUNX1、TNNI3K、BIRC5、CDX2、EED、FIGF、INSR、MTHFR、HADH、RPP30、ZFP3、PIK3CB、SDHB、TNR、BIRC6、CEBPA、EGF、FLG2、IRS1、MTOR、PIK3CD、SF3B1、TOP1、BLM、CERK、EGFR、FLNC、IRS2、MUTYH、PIK3CG、SHC1、およびTOP2Aからなる群より選択される1つ以上の遺伝子の変異を含む。
いくつかの実施形態では、この1つ以上の変異は、DDR2、EGFR、AURKA、VEGFA、FGFR1、CDK4、EFBB2、CDK6、JAK2、MET、BRAF、ERBB3、およびSRCからなる群より選択される1つ以上の遺伝子の変異を含む。
いくつかの実施形態では、この方法は、上記サンプル中の上記変異の存在、不在および/またはレベルのプロファイルを連絡するレポートを作成する工程を包含する。いくつかの実施形態では、このレポートは、変異を標的にする治療剤の説明をさらに含む。
関連の態様では、本発明は、コンピュータシステムを提供し、このコンピュータシステムは:サンプルからデータを受容するように構成されたメモリユニットであって、ここでこのデータが低Tmプローブを使用して任意の前述の方法によって作成されるメモリユニットと;このデータの分析のためのコンピュータ実行可能な命令と;この分析に基づいて、このサンプル中の変異の存在、不在または量を決定するためのコンピュータ実行可能な命令と;を備える。いくつかの実施形態では、このコンピュータシステムは、サンプル中の変異の存在、不在または量のレポートを作成するためのコンピュータ実行可能な命令をさらに備える。いくつかの実施形態では、このコンピュータシステムは、サンプル中の変異の存在、不在または量に基づいて、治療の選択肢のレポートを作成するためのコンピュータ実行可能な命令をさらに備える。いくつかの実施形態では、このコンピュータシステムは、このレポートをユーザーに対して連絡または提示するように構成されたユーザーインターフェースをさらに備える。
さらに別の関連の態様では、本発明は、キットであって:少なくとも1つのプライマー/プローブセットであって、ここでこのプライマー/プローブセットが、(i)第一の位置でゲノム領域に対してハイブリダイズするように設計されたフォワードプライマー、(ii)第二の位置でこのゲノム領域に対してハイブリダイズするように設計されたリバースプライマー、および(iii)本明細書に記載の低Tmプローブであって、ここで低Tmプローブが、第三の位置でこのゲノム領域に対してハイブリダイズするように設計されているプローブを含む、プライマー/プローブセットと;を含む、キットを提供する。
本発明はまた、癌の処置を必要とする被験体における癌を処置する方法であって:(a)この被験体から生物学的サンプルを得る工程と;(b)この生物学的サンプルから単離された核酸サンプルから、MET、FGFR1、FGFR2、FLT3、HER3、EGFR、mTOR、CDK4、HER2、RET、HADH、ZFP3、DDR2、AURKA、VEGFA、CDK6、JAK2、BRAF、およびSRCからなる群より選択される少なくとも5つの遺伝子中でのコピー数変動(CNV)の存在または不在を決定する工程と;(c)この決定する工程に基づいて、被験体特異的なCNVプロファイルを作成する工程と;(d)この被験体特異的なCNVプロファイルに基づいて、この被験体の癌治療を選択する工程と;を包含する、方法を提供する。いくつかの実施形態では、このCNVの存在または不在を決定する工程は、任意の前述の方法の使用を包含する。いくつかの実施形態では、この決定する工程は、デジタルPCRアッセイを含む。いくつかの実施形態では、このデジタルPCRアッセイは、任意の前述のオリゴヌクレオチドプローブの使用を包含する。いくつかの実施形態では、このオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、91、94、97、100、103、106、109、112、115、または118のいずれかのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、このデジタルPCRアッセイは、任意の前述のプライマーの使用を包含する。いくつかの実施形態では、このプライマーは、配列番号59、60、62、63、65、66、68、69、71、72、74、75、77、78、80、81、83、84、86、87、89、90、92、93、95、96、98、99、101、102、104、105、107、108、110、111、113、114、116、または117のいずれかのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、少なくとも10、12または18の遺伝子中のCNVの存在または不在を決定する工程を包含する。いくつかの実施形態では、上記生物学的サンプルは、癌に由来する核酸を保有すると疑われる。いくつかの実施形態では、この生物学的サンプルは、固体組織サンプルである。いくつかの実施形態では、この固体組織サンプルは、ホルマリン固定され、パラフィン包埋されたサンプルである。いくつかの実施形態では、この生物学的サンプルは液体の生物学的サンプルである。いくつかの実施形態では、この液体の生物学的サンプルは、血液、血清、血漿、尿、汗、涙、唾液、および痰からなる群より選択される。
本発明はまた、コンピュータシステムであって:(a)サンプルからデータを受容するように構成されたメモリユニットであって、ここでこのデータが任意の前述の方法によって作成されるメモリユニットと;(b)上記データの分析のためのコンピュータ実行可能な命令と;(c)この分析に基づいて、このサンプル中の変異の存在、不在または量を決定するためのコンピュータ実行可能な命令と;を備える、コンピュータシステムを提供する。いくつかの実施形態では、このコンピュータシステムは、サンプル中の変異の存在、不在または量のレポートを作成するためのコンピュータ実行可能な命令をさらに備える。いくつかの実施形態では、このコンピュータシステムは、サンプル中の変異の存在、不在または量に基づいて治療の選択肢のレポートを作成するためのコンピュータ実行可能な命令をさらに備える。いくつかの実施形態では、このコンピュータシステムは、上記レポートをユーザーに対して連絡または提示するように構成されたユーザーインターフェースをさらに備える。
本発明はまた、キットであって:(a)少なくとも1つのプライマー/プローブセットであって、ここでこのプライマー/プローブセットが、(i)第一の位置でゲノム領域に対してハイブリダイズするように設計されたフォワードプライマー、(ii)第二の位置でこのゲノム領域に対してハイブリダイズするように設計されたリバースプライマー、および(iii)前に記載のようなオリゴヌクレオチドプローブであって、オリゴヌクレオチドプローブが、この第一の位置と第二の位置との間に位置する第三の位置でこのゲノム領域に対してハイブリダイズするように設計されているオリゴヌクレオチドプローブ、を含む、プライマー/プローブセットと;(b)使用説明書と、を含む、キットを提供する。
本発明はまた、配列番号4〜21、23、24、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、91、94、97、100、103、106、109、112、115、または118のいずれかに示されるオリゴヌクレオチドプローブを提供する。
本発明はまた、配列番号1948〜5593のいずれかに示される標的選択性オリゴヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号25または26に示される配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを提供する。
本発明はまた、配列番号1〜3、22、27〜58、59、60、62、63、65、66、68、69、71、72、74、75、77、78、80、81、83、84、86、87、89、90、92、93、95、96、98、99、101、102、104、105、107、108、110、111、113、114、116、または117のいずれかに示される配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを提供する。
(参照による援用)
本明細書に言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、各々の個々の刊行物、特許または特許出願が、参照によって詳細にかつ個々に援用されると示されているのと同じ程度まで、参照によって本明細書に援用される。
本明細書に言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、各々の個々の刊行物、特許または特許出願が、参照によって詳細にかつ個々に援用されると示されているのと同じ程度まで、参照によって本明細書に援用される。
本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に具体的に示される。本発明の特徴および利点の良好な理解は、本発明の原理を利用している、例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明、および添付の図面を参照して得られる。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する:
(項目1)
癌を評価する方法であって、以下:
(a)被験体中の流体サンプルに由来するサンプル中で遺伝子の各々のサブセットの存在、不在および/または量を決定する工程であって、ここで上記サブセットは、(i)固体組織サンプルが、癌性組織を含むことが公知であるか、または含むと疑われる被験体由来の上記固体組織サンプルでの遺伝子のセットに対して標的化配列決定を行うこと;(ii)上記標的化配列決定に基づいて遺伝子の上記セットについて遺伝学的異常のプロファイルを決定すること;ならびに(iii)上記セットについての上記プロファイルに基づいて遺伝子の上記セットのうち、2、3、4の、しかし4以下の遺伝子サブセットを選択することによって決定され、ここで上記サブセットは上記被験体に特異的である、工程;ならびに
(b)工程(a)の結果から、上記被験体における上記癌の状態を決定する工程;
を包含する、方法。
(項目2)
遺伝子の上記セットが少なくとも10の遺伝子を含む、項目1に記載の方法。
(項目3)
遺伝子の上記セットが少なくとも100の遺伝子を含む、項目2に記載の方法。
(項目4)
遺伝子の上記セットが少なくとも200の遺伝子を含む、項目2に記載の方法。
(項目5)
項目1に記載の方法であって、遺伝子の上記セットが、ABCA1、BRAF、CHD5、EP300、FLT1、ITPA、MYC、PIK3R1、SKP2、TP53、ABCA7、BRCA1、CHEK1、EPHA3、FLT3、JAK1、MYCL1、PIK3R2、SLC19A1、TP73、ABCB1、BRCA2、CHEK2、EPHA5、FLT4、JAK2、MYCN、PKHD1、SLC1A6、TPM3、ABCC2、BRIP1、CLTC、EPHA6、FN1、JAK3、MYH2、PLCB1、SLC22A2、TPMT、ABCC3、BUB1B、COL1A1、EPHA7、FOS、JUN、MYH9、PLCG1、SLCO1B3、TPO、ABCC4、C1orf144、COPS5、EPHA8、FOXO1、KBTBD11、NAV3、PLCG2、SMAD2、TPR、ABCG2、CABLES1、CREB1、EPHB1、FOXO3、KDM6A、NBN、PML、SMAD3、TRIO、ABL1、CACNA2D1、CREBBP、EPHB4、FOXP4、KDR、NCOA2、PMS2、SMAD4、TRRAP、ABL2、CAMKV、CRKL、EPHB6、GAB1、KIT、NEK11、PPARG、SMARCA4、TSC1、ACVR1B、CARD11、CRLF2、EPO、GATA1、KLF6、NF1、PPARGC1A、SMARCB1、TSC2、ACVR2A、CARM1、CSF1R、ERBB2、GLI1、KLHDC4、NF2、PPP1R3A、SMO、TTK、ADCY9、CAV1、CSMD3、ERBB3、GLI3、KRAS、NKX2−1、PPP2R1A、SOCS1、TYK2、AGAP2、CBFA2T3、CSNK1G2、ERBB4、GNA11、LMO2、NOS2、PPP2R1B、SOD2、TYMS、AKT1、CBL、CTNNA1、ERCC1、GNAQ、LRP1B、NOS3、PRKAA2、SOS1、UGT1A1、AKT2、CCND1、CTNNA2、ERCC2、GNAS、LRP2、NOTCH1、PRKCA、SOX10、UMPS、AKT3、CCND2、CTNNB1、ERCC3、GPR124、LRP6、NOTCH2、PRKCZ、SOX2、USP9X、ALK、CCND3、CYFIP1、ERCC4、GPR133、LTK、NOTCH3、PRKDC、SP1、VEGF、ANAPC5、CCNE1、CYLD、ERCC5、GRB2、MAN1B1、NPM1、PTCH1、SPRY2、VEGFA、APC、CD40LG、CYP19A1、ERCC6、GSK3B、MAP2K1、NQO1、PTCH2、SRC、VHL、APC2、CD44、CYP1B1、ERG、GSTP1、MAP2K2、NR3C1、PTEN、ST6GAL2、WRN、AR、CD79A、CYP2C19、ERN2、GUCY1A2、MAP2K4、NRAS、PTGS2、STAT1、WT1、ARAF、CD79B、CYP2C8、ESR1、HDAC1、MAP2K7、NRP2、PTPN11、STAT3、XPA、ARFRP1、CDC42、CYP2D6、ESR2、HDAC2、MAP3K1、NTRK1、PTPRB、STK11、XPC、ARID1A、CDC42BPB、CYP3A4、ETV4、HGF、MAPK1、NTRK2、PTPRD、SUFU、ZFY、ATM、CDC73、CYP3A5、EWSR1、HIF1A、MAPK3、NTRK3、RAD50、SULT1A1、ZNF521、ATP5A1、CDH1、DACH2、EXT1、HM13、MAPK8、OMA1、RAD51、SUZ12、ATR、CDH10、DCC、EZH2、HMGA1、MARK3、OR10R2、RAF1、TAF1、AURKA、CDH2、DCLK3、FANCA、HNF1A、MCL1、PAK3、RARA、TBX22、AURKB、CDH20、DDB2、FANCD2、HOXA3、MDM2、PARP1、RB1、TCF12、BAI3、CDH5、DDR2、FANCE、HOXA9、MDM4、PAX5、REM1、TCF3、BAP1、CDK2、DGKB、FANCF、HRAS、MECOM、PCDH15、RET、TCF4、BARD1、CDK4、DGKZ、FAS、HSP90AA1、MEN1、PCDH18、RICTOR、TEK、BAX、CDK6、DIRAS3、FBXW7、IDH1、MET、PCNA、RIPK1、TEP1、BCL11A、CDK7、DLG3、FCGR3A、IDH2、MITF、PDGFA、ROR1、TERT、BCL2、CDK8、DLL1、FES、IFNG、MLH1、PDGFB、ROR2、TET2、BCL2A1、CDKN1A、DNMT1、FGFR1、IGF1R、MLL、PDGFRA、ROS1、TGFBR2、BCL2L1、CDKN1B、DNMT3A、FGFR2、IGF2R、MLL3、PDGFRB、RPS6KA2、THBS1、BCL2L2、CDKN2A、DNMT3B、FGFR3、IKBKE、MPL、PDZRN3、RPTOR、TNFAIP3、BCL3、CDKN2B、DOT1L、FGFR4、IKZF1、MRE11A、PHLPP2、RSPO2、TNKS、BCL6、CDKN2C、DPYD、FH、IL2RG、MSH2、PIK3C3、RSPO3、TNKS2、BCR、CDKN2D、E2F1、FHOD3、INHBA、MSH6、PIK3CA、RUNX1、TNNI3K、BIRC5、CDX2、EED、FIGF、INSR、MTHFR、PIK3CB、SDHB、TNR、BIRC6、CEBPA、EGF、FLG2、IRS1、MTOR、PIK3CD、SF3B1、TOP1、BLM、CERK、EGFR、FLNC、IRS2、MUTYH、PIK3CG、SHC1、およびTOP2Aからなる群より選択される、方法。
(項目6)
上記流体サンプルが、血液、血清、血漿、尿、汗、涙、唾液、または痰からなる群より選択される、項目1に記載の方法。
(項目7)
工程(a)および(b)が、上記癌の状態を時間をわたってモニターするために複数の時点で行われる、項目1に記載の方法。
(項目8)
1つの時点が、癌治療の最初の施行の前であり、その後の時点が上記最初の施行に引き続く、項目7に記載の方法。
(項目9)
遺伝子の上記セットについて遺伝学的異常の上記プロファイルを連絡するレポートを作成する工程と、上記レポートを介護者に連絡する工程とをさらに包含する、項目1に記載の方法。
(項目10)
上記レポートが、上記プロファイルに基づく1つ以上の治療候補のリストを包含する、項目9に記載の方法。
(項目11)
上記レポートが、上記固体組織サンプルの収集から1週で作成される、項目9に記載の方法。
(項目12)
上記レポートが、遺伝子の上記セットのコピー数変更を含む、項目9に記載の方法。
(項目13)
上記レポートが、(腫瘍に由来する)上記遺伝学的異常の各々を標的にする治療剤の記述を含む、項目9に記載の方法。
(項目14)
各々の上記複数の時点での遺伝子の上記サブセットの上記プロファイルを連絡するレポートを作成する工程をさらに包含する、項目1に記載の方法。
(項目15)
上記決定する工程が、上記サンプルから個別の反応容積へ上記核酸分子を希釈する工程を包含し、ここで上記個別の反応容積は、上記サンプル由来の1〜10モルの上記核酸分子を含む、項目1に記載の方法。
(項目16)
上記個別の反応容積は、エマルジョン中の液滴である、項目15に記載の方法。
(項目17)
上記個別の反応容積がさらに、遺伝子の上記サブセット中の上記遺伝学的異常の対立遺伝子識別のためのプライマーを含む、項目15に記載の方法。
(項目18)
上記状態を決定する工程が、遺伝子の上記サブセット中の上記遺伝学的異常を保有している核酸の数を定量する工程を包含する、項目1に記載の方法。
(項目19)
上記標的化配列決定の工程が、上記固体組織サンプルからDNAライブラリーを調製する工程を包含し、ここで上記調製が、4時間、5時間、6時間および7時間からなる群より選択される時間数未満で完了され得る、項目1に記載の方法。
(項目20)
上記調製が、上記ライブラリーの配列決定の前に指数関数的PCR増幅を必要としない、項目19に記載の方法。
(項目21)
上記調製が、線形増幅工程を含む、項目19に記載の方法。
(項目22)
項目1に記載の方法であって、上記標的化配列決定の工程が、標的化ライブラリー調製工程を包含し、ここで上記標的化ライブラリー調製工程は、以下:
(a)上記固体組織サンプル由来の一本鎖DNAフラグメントと、(i)ある癌関連遺伝子のある領域に特異的な領域、および(ii)ある配列決定プラットフォームにカップリングするために特異的なアダプター配列を含む標的特異的オリゴヌクレオチドとを接触させる工程と;
(b)上記標的特異的オリゴヌクレオチドに対して相補性の領域を含む一本鎖DNAフラグメントに対して上記標的特異的オリゴヌクレオチドを連結するためのハイブリダイゼーション反応を行う工程と;
(c)伸長反応を行って、上記領域を含み、かつ上記アダプターを含む伸長生成物を作成する工程と;
(d)上記伸長生成物を配列決定する工程と、
を包含する、方法。
(項目23)
上記接触させる工程が、配列決定プラットフォームに対して結合された上記標的特異的オリゴヌクレオチドを用いて生じる、項目22に記載の方法。
(項目24)
上記接触させる工程が、溶液中で遊離の上記標的特異的オリゴヌクレオチドを用いて生じる、項目22に記載の方法。
(項目25)
以下:
(a)ssDNAライブラリー中の一本鎖DNA(ssDNA)フラグメントに対して標的選択性オリゴヌクレオチド(TSO)をハイブリダイズして、ハイブリダイゼーション生成物を作成する工程と;
(b)上記ハイブリダイゼーション生成物を伸長して、二本鎖伸長生成物を作成する工程であって、ここで上記TSOが、(i)単一の標的領域に対して相補的な配列と(ii)上記TSOの第一の末端に位置するが、上記TSOの両端には位置しない第一の一本鎖アダプター配列とを含み、ここで上記ssDNAフラグメントが、第二の一本鎖アダプター配列を含むが、上記第一の一本鎖アダプター配列を含まず、かつここで上記ssDNAフラグメントが、10%、50%、70%、または90%を超えるライゲーション効率を含むライゲーション方法によって第二の一本鎖アダプター配列に連結される、工程と、
を包含する、方法。
(項目26)
以下:
(a)ssDNAライブラリー中の一本鎖DNA(ssDNA)フラグメントに対して標的選択性オリゴヌクレオチド(TSO)をハイブリダイズして、ハイブリダイゼーション生成物を作成する工程と;
(b)上記ハイブリダイゼーション生成物を伸長して、二本鎖伸長生成物を作成する工程であって、ここで上記TSOが、(i)単一の標的領域に対して相補的な配列と(ii)上記TSOの第一の末端に位置するが、上記TSOの両端には位置しない第一の一本鎖アダプター配列とを含み、ここで上記ssDNAフラグメントが、第二の一本鎖アダプター配列を含むが、上記第一の一本鎖アダプター配列を含まず、かつここで上記ssDNAフラグメントが、一本鎖ライゲーション法によって第二の一本鎖アダプター配列に連結される、工程と、
を包含する、方法。
(項目27)
上記第二の一本鎖アダプター配列が、上記ssDNAフラグメントの第一の末端に位置するが、上記ssDNAフラグメントの両端には位置しない、項目25または26に記載の方法。
(項目28)
上記ssDNAフラグメントの上記第一の末端が、5’末端である、項目27に記載の方法。
(項目29)
上記第一のアダプター配列または上記第二のアダプター配列が、バーコード配列を含む、項目25または26に記載の方法。
(項目30)
上記TSOの上記第一の末端が5’末端である、項目25または26に記載の方法。
(項目31)
上記第一のアダプター配列または上記第二のアダプター配列が、固体支持体にコンジュゲートされた支持体結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも70%同一である配列を含む、項目25または26に記載の方法。
(項目32)
上記固体支持体が、配列決定プラットフォームにカップリングされる、項目31に記載の方法。
(項目33)
上記第一のアダプター配列または上記第二のアダプター配列が、配列決定プライマーに対する結合部位を含む、項目25または26に記載の方法。
(項目34)
上記支持体結合オリゴヌクレオチドに対して上記伸長生成物をアニーリングする工程をさらに包含する、項目31に記載の方法。
(項目35)
アニーリングされた上記伸長生成物を増幅する工程をさらに包含する、項目34に記載の方法。
(項目36)
アニーリングされた上記伸長生成物を配列決定する工程をさらに包含する、項目35に記載の方法。
(項目37)
上記ssDNAライブラリーがゲノムDNAフラグメントを含む、項目25または26に記載の方法。
(項目38)
上記ssDNAライブラリーが、cDNAフラグメントを含む、項目25または26に記載の方法。
(項目39)
ハイブリダイズしていないTSOおよびハイブリダイズしていないssDNAライブラリーのメンバーを取り除く工程をさらに包含する、項目25または26に記載の方法。
(項目40)
工程a)およびb)が、上記ssDNAライブラリーのメンバーおよび上記TSOが溶液中で浮遊性である場合に行われる、項目25または26に記載の方法。
(項目41)
上記単一の標的領域が、ゲノム領域に隣接する、項目25または26に記載の方法。
(項目42)
上記ゲノム領域が、癌関連遺伝子由来のエキソン領域の一部を含む、項目41に記載の方法。
(項目43)
項目42に記載の方法であって、上記癌関連遺伝子が、ABCA1、BRAF、CHD5、EP300、FLT1、ITPA、MYC、PIK3R1、SKP2、TP53、ABCA7、BRCA1、CHEK1、EPHA3、FLT3、JAK1、MYCL1、PIK3R2、SLC19A1、TP73、ABCB1、BRCA2、CHEK2、EPHA5、FLT4、JAK2、MYCN、PKHD1、SLC1A6、TPM3、ABCC2、BRIP1、CLTC、EPHA6、FN1、JAK3、MYH2、PLCB1、SLC22A2、TPMT、ABCC3、BUB1B、COL1A1、EPHA7、FOS、JUN、MYH9、PLCG1、SLCO1B3、TPO、ABCC4、C1orf144、COPS5、EPHA8、FOXO1、KBTBD11、NAV3、PLCG2、SMAD2、TPR、ABCG2、CABLES1、CREB1、EPHB1、FOXO3、KDM6A、NBN、PML、SMAD3、TRIO、ABL1、CACNA2D1、CREBBP、EPHB4、FOXP4、KDR、NCOA2、PMS2、SMAD4、TRRAP、ABL2、CAMKV、CRKL、EPHB6、GAB1、KIT、NEK11、PPARG、SMARCA4、TSC1、ACVR1B、CARD11、CRLF2、EPO、GATA1、KLF6、NF1、PPARGC1A、SMARCB1、TSC2、ACVR2A、CARM1、CSF1R、ERBB2、GLI1、KLHDC4、NF2、PPP1R3A、SMO、TTK、ADCY9、CAV1、CSMD3、ERBB3、GLI3、KRAS、NKX2−1、PPP2R1A、SOCS1、TYK2、AGAP2、CBFA2T3、CSNK1G2、ERBB4、GNA11、LMO2、NOS2、PPP2R1B、SOD2、TYMS、AKT1、CBL、CTNNA1、ERCC1、GNAQ、LRP1B、NOS3、PRKAA2、SOS1、UGT1A1、AKT2、CCND1、CTNNA2、ERCC2、GNAS、LRP2、NOTCH1、PRKCA、SOX10、UMPS、AKT3、CCND2、CTNNB1、ERCC3、GPR124、LRP6、NOTCH2、PRKCZ、SOX2、USP9X、ALK、CCND3、CYFIP1、ERCC4、GPR133、LTK、NOTCH3、PRKDC、SP1、VEGF、ANAPC5、CCNE1、CYLD、ERCC5、GRB2、MAN1B1、NPM1、PTCH1、SPRY2、VEGFA、APC、CD40LG、CYP19A1、ERCC6、GSK3B、MAP2K1、NQO1、PTCH2、SRC、VHL、APC2、CD44、CYP1B1、ERG、GSTP1、MAP2K2、NR3C1、PTEN、ST6GAL2、WRN、AR、CD79A、CYP2C19、ERN2、GUCY1A2、MAP2K4、NRAS、PTGS2、STAT1、WT1、ARAF、CD79B、CYP2C8、ESR1、HDAC1、MAP2K7、NRP2、PTPN11、STAT3、XPA、ARFRP1、CDC42、CYP2D6、ESR2、HDAC2、MAP3K1、NTRK1、PTPRB、STK11、XPC、ARID1A、CDC42BPB、CYP3A4、ETV4、HGF、MAPK1、NTRK2、PTPRD、SUFU、ZFY、ATM、CDC73、CYP3A5、EWSR1、HIF1A、MAPK3、NTRK3、RAD50、SULT1A1、ZNF521、ATP5A1、CDH1、DACH2、EXT1、HM13、MAPK8、OMA1、RAD51、SUZ12、ATR、CDH10、DCC、EZH2、HMGA1、MARK3、OR10R2、RAF1、TAF1、AURKA、CDH2、DCLK3、FANCA、HNF1A、MCL1、PAK3、RARA、TBX22、AURKB、CDH20、DDB2、FANCD2、HOXA3、MDM2、PARP1、RB1、TCF12、BAI3、CDH5、DDR2、FANCE、HOXA9、MDM4、PAX5、REM1、TCF3、BAP1、CDK2、DGKB、FANCF、HRAS、MECOM、PCDH15、RET、TCF4、BARD1、CDK4、DGKZ、FAS、HSP90AA1、MEN1、PCDH18、RICTOR、TEK、BAX、CDK6、DIRAS3、FBXW7、IDH1、MET、PCNA、RIPK1、TEP1、BCL11A、CDK7、DLG3、FCGR3A、IDH2、MITF、PDGFA、ROR1、TERT、BCL2、CDK8、DLL1、FES、IFNG、MLH1、PDGFB、ROR2、TET2、BCL2A1、CDKN1A、DNMT1、FGFR1、IGF1R、MLL、PDGFRA、ROS1、TGFBR2、BCL2L1、CDKN1B、DNMT3A、FGFR2、IGF2R、MLL3、PDGFRB、RPS6KA2、THBS1、BCL2L2、CDKN2A、DNMT3B、FGFR3、IKBKE、MPL、PDZRN3、RPTOR、TNFAIP3、BCL3、CDKN2B、DOT1L、FGFR4、IKZF1、MRE11A、PHLPP2、RSPO2、TNKS、BCL6、CDKN2C、DPYD、FH、IL2RG、MSH2、PIK3C3、RSPO3、TNKS2、BCR、CDKN2D、E2F1、FHOD3、INHBA、MSH6、PIK3CA、RUNX1、TNNI3K、BIRC5、CDX2、EED、FIGF、INSR、MTHFR、PIK3CB、SDHB、TNR、BIRC6、CEBPA、EGF、FLG2、IRS1、MTOR、PIK3CD、SF3B1、TOP1、BLM、CERK、EGFR、FLNC、IRS2、MUTYH、PIK3CG、SHC1、およびTOP2A、からなる群より選択される、方法。
(項目44)
上記ライゲーション方法が、一本鎖ライゲーション方法である、項目25に記載の方法。
(項目45)
上記一本鎖ライゲーション方法が、RNAリガーゼの使用を含む、項目26または44に記載の方法。
(項目46)
上記RNAリガーゼが、CircLigaseまたはCircLigase IIである、項目45に記載の方法。
(項目47)
一本鎖DNAライブラリーを調製する方法であって、上記方法は:
(a)二本鎖DNAフラグメントを一本鎖DNA(ssDNA)フラグメントに変性させる工程と;
(b)上記ssDNAフラグメントから5’側のホスフェートを取り除く工程と;
(c)一本鎖プライマードッキングオリゴヌクレオチド(pdo’s)を、上記ssDNAフラグメントの3’末端に連結する工程であって、ここで上記pdo’sが、固定化された捕獲試薬に結合可能な捕獲部分に対してコンジュゲートされる、工程と;
(d)プライマーを上記pdo’sにハイブリダイズさせる工程であって、上記プライマーが、アダプターオリゴヌクレオチド配列に対して相補的な配列を含み、かつ配列決定プラットフォームに対してカップリングされた支持体結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも70%同一である、第一のアダプター配列を含む、工程と;
(e)ハイブリダイズした上記プライマーを伸長して、二重鎖を作成する工程であって、ここで各々の二重鎖が、ssフラグメントおよび伸長したプライマー鎖を含む工程と;
(f)上記固定化された捕獲試薬に対して上記二重鎖を固定化する工程と;
(g)上記二本鎖伸長生成物を変性する工程であって、ここで上記変性が、上記固定化された捕獲試薬からの上記伸長されたプライマー鎖の遊離と、上記固定化された捕獲試薬上の上記ssDNAフラグメントの保持を生じる、工程と;
(h)上記伸長されたプライマー鎖を収集する工程であって、ここで上記伸長されたプライマー鎖が上記ssDNAライブラリーを含む、工程と、
を包含する、方法。
(項目48)
工程(c)が、上記pdo’sに対する上記ssDNAフラグメントのうち少なくとも50%のライゲーションを生じる、項目47に記載の方法。
(項目49)
上記連結する工程が、ATP依存性リガーゼを用いて行われる、項目47に記載の方法。
(項目50)
上記ATP依存性リガーゼがRNAリガーゼである、項目49に記載の方法。
(項目51)
上記RNAリガーゼが、CircLigaseまたはCircLigase IIである、項目50に記載の方法。
(項目52)
上記pdo’sがアデニル化されている、項目47に記載の方法。
(項目53)
上記伸長させる工程が、校正DNAポリメラーゼを用いて行われる、項目47に記載の方法。
(項目54)
一本鎖DNAライブラリーを調製する方法であって、上記方法は、以下:
(a)二本鎖DNAフラグメントを一本鎖DNA(ssDNA)フラグメントに変性する工程と;
(b)第一の一本鎖アダプター配列を上記ssDNAフラグメントの第一の末端に連結する工程と;
(c)第二の一本鎖アダプター配列を上記ssDNAフラグメントの第二の末端に連結する工程と、
を包含する、方法。
(項目55)
以下:
(a)プライマードッキングオリゴヌクレオチド(pdo)であって、上記pdoが、固定化された捕獲試薬に結合可能な捕獲部分にコンジュゲートされる、プライマードッキングオリゴヌクレオチド(pdo)と;
(b)プライマーであって、上記プライマーが、上記pdo配列に対して少なくとも70%相補性である配列を含み、かつ配列決定プラットフォームにカップリングされた第一の支持体結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも70%同一である、第一のアダプター配列をさらに含む、プライマーと;
(c)使用説明書と、
を含む、キット。
(項目56)
ATP依存性リガーゼをさらに含む、項目55に記載のキット。
(項目57)
上記ATP依存性リガーゼがRNAリガーゼである、項目56に記載のキット。
(項目58)
上記RNAリガーゼがCircLigaseまたはCircLigase IIである、項目57に記載のキット。
(項目59)
校正DNAポリメラーゼをさらに含む、項目55に記載のキット。
(項目60)
上記固定化された捕獲試薬をさらに含む、項目55に記載のキット。
(項目61)
上記第一のアダプター配列が、第一の配列決定プライマーに対して少なくとも70%相補的である配列を含む、項目55に記載のキット。
(項目62)
上記第一のアダプター配列が、バーコード配列を含む、項目55に記載のキット。
(項目63)
標的選択性オリゴヌクレオチド(TSO)をさらに含む、項目55に記載のキット。
(項目64)
上記TSOが、第一の末端に位置するが、第二の末端には位置しない第二のアダプター配列をさらに含む、項目63に記載のキット。
(項目65)
上記TSOの上記第一の末端が5’末端である、項目64に記載のキット。
(項目66)
上記第二のアダプター配列が、配列決定プラットフォームに対してカップリングされた第二の支持体結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも70%同一である配列を含む、項目64に記載のキット。
(項目67)
上記第二のアダプター配列が、配列決定プライマーに対する結合部位を含む、項目64に記載のキット。
(項目68)
以下:
(a)第一のアダプターオリゴヌクレオチドであって、ここで上記第一のアダプターが、配列決定プラットフォームに対してカップリングされた第一の支持体結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも70%相補性である配列を含む、第一のアダプターオリゴヌクレオチドと;
(b)第二のアダプターオリゴヌクレオチドであって、ここで上記第二のアダプターが、上記第一のアダプターオリゴヌクレオチドとは別個である配列を含む、第二のアダプターオリゴヌクレオチドと;
(c)RNAリガーゼと;
(d)使用説明書と、
を含む、キット。
(項目69)
上記第二のアダプターが、配列決定プライマーに対して少なくとも70%相補的な配列を含む、項目68に記載のキット。
(項目70)
上記第二のアダプターが、配列決定プラットフォームに対してカップリングされた第二の支持体結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも70%相補的な配列を含む、項目68に記載のキット。
(項目71)
上記第一のアダプターが、配列決定プライマーに対して少なくとも70%相補的な配列を含む、項目68に記載のキット。
(項目72)
上記第一のアダプターまたは上記第二のアダプターの1つが、バーコード配列を含む、項目68に記載のキット。
(項目73)
上記第一のアダプターが、3’末端塩基と別のヌクレオチドとの間の共有結合の形成を妨げる3’末端ブロック基を含む、項目68に記載のキット。
(項目74)
上記3’末端ブロック基が、ジデオキシ−dNTP、ビオチン、oアルキル、アミノ−アルキル、またはフルオロフォアジゴキシゲニン(digeoxygenin)である、項目73に記載のキット。
(項目75)
上記第一のアダプターが、5’ポリアデニル化配列を含む、項目68に記載のキット。(項目76)
上記RNAリガーゼが、T4またはMth由来の短縮されたまたは変異されたリガーゼ2である、項目68に記載のキット。
(項目77)
第二のRNAリガーゼをさらに含んでいる、項目68に記載のキット。
(項目78)
上記第二のRNAリガーゼがCircLigaseまたはCircLigase IIである、項目77に記載のキット。
(項目79)
オリゴヌクレオチドプライマーであって、以下:
(a)プローブ結合領域と;
(b)変異を保有すると疑われるテンプレート核酸に対して少なくとも50%相補的なテンプレート結合領域であって、ここで上記テンプレート結合領域の一部は、上記変異の疑わしい遺伝子座と少なくとも部分的を覆う、テンプレート結合領域と;を包含し、
(c)ここで、上記オリゴヌクレオチドプライマーは、上記テンプレート核酸に対するハイブリダイゼーションの際、上記変異が存在する場合は、ポリメラーゼによって伸長可能であるが、上記変異が存在しない場合は上記ポリメラーゼによって伸長可能ではない、オリゴヌクレオチドプライマー。
(項目80)
上記変異が、一塩基多型(SNP)である、項目79に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(項目81)
上記テンプレート結合領域が、上記SNP遺伝子座を覆う3’末端領域を含む、項目80に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(項目82)
上記3’末端領域が、上記SNP遺伝子座の変異体対立遺伝子に対して相補性である、項目81に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(項目83)
上記3’末端領域が、上記SNP遺伝子座の野性型対立遺伝子に対して相補性である、項目81に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(項目84)
上記プローブ結合領域が、被験体由来のいかなるゲノム配列に対してもハイブリダイズしない、項目79に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(項目85)
上記ポリメラーゼが、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を欠いているDNAポリメラーゼである、項目79に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(項目86)
以下:
(a)オリゴヌクレオチドプライマーであって、上記オリゴヌクレオチドプライマーが、(i)プローブ結合領域、および(ii)変異を保有すると疑われるテンプレート核酸に対して少なくとも70%相補的なテンプレート結合領域であって、ここで上記テンプレート結合領域の一部が上記変異の疑わしい遺伝子座を少なくとも部分的に覆い、ここで上記オリゴヌクレオチドプライマーが、上記テンプレート核酸に対するハイブリダイゼーションの際に、上記変異が存在する場合はポリメラーゼによって伸長可能であるが、上記変異が存在しない場合は、上記ポリメラーゼによって伸長可能ではない、テンプレート結合領域を含む、オリゴヌクレオチドプライマーと;
(b)使用説明書と、
を含む、キット。
(項目87)
上記変異が一塩基多型(SNP)である、項目86に記載のキット。
(項目88)
上記テンプレート結合領域が、上記SNP遺伝子座を覆う3’末端塩基を含む、項目87に記載のキット。
(項目89)
上記3’末端塩基が、上記SNP遺伝子座の変異体対立遺伝子に対して相補的である、項目88に記載のキット。
(項目90)
上記3’末端塩基が、上記SNP遺伝子座の野性型対立遺伝子に対して相補的である、項目88に記載のキット。
(項目91)
上記プローブ結合領域が、被験体由来のいかなるゲノム配列に対してもハイブリダイズしない、項目86に記載のキット。
(項目92)
上記プローブ結合領域に対して少なくとも70%相補的であるレポータープローブをさらに含む、項目86に記載のキット。
(項目93)
上記レポータープローブが、検出可能部分およびクエンチャー部分を含み、ここで上記クエンチャー部分は、上記レポータープローブがインタクトである場合、上記検出可能部分の検出を抑制する、項目92に記載のキット。
(項目94)
上記オリゴヌクレオチドプライマーおよび上記レポータープローブからなるハイブリダイゼーション生成物が、上記オリゴヌクレオチドプライマーおよび上記テンプレート核酸からなるハイブリダイゼーション生成物のTmよりも少なくとも10度高いTmを有する、項目92に記載のキット。
(項目95)
上記遺伝子座の下流の逆相補配列に対して少なくとも70%相補的なリバースプライマーをさらに含む、項目86に記載のキット。
(項目96)
上記ポリメラーゼをさらに含む、項目86に記載のキット。
(項目97)
上記ポリメラーゼが、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有し、かつ3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を有さない熱安定性ポリメラーゼである、項目96に記載のキット。(項目98)
項目86に記載のキットであって、さらに(i)1つ以上の代替のオリゴヌクレオチドプライマーを含み、ここで上記1つ以上の代替のオリゴヌクレオチドプライマーは各々が、別個のプローブ結合領域および上記テンプレート核酸に対して少なくとも70%相補的であるテンプレート結合領域を含み、ここで上記テンプレート結合領域の一部が、上記遺伝子座を少なくとも部分的に覆い、ここで上記代替のオリゴヌクレオチドプライマーが、上記テンプレート核酸に対するハイブリダイゼーションの際に、代替の対立遺伝子が存在する場合は、ポリメラーゼによって伸長可能であるが、上記代替の対立遺伝子が存在しない場合は、上記ポリメラーゼによって伸長可能ではない、キット。
(項目99)
項目98に記載のキットであって、さらに1つ以上の代替のレポータープローブを含み、ここで上記代替のレポータープローブの各々が、上記別個のプローブ結合領域のうちの1つに対して少なくとも70%相補的であるが、上記キットのいかなる他のプローブ結合領域に対しても相補的ではない、キット。
(項目100)
項目99に記載のキットであって、ここで上記代替のレポータープローブの各々が、代替の検出可能部分およびクエンチャー部分を含み、ここで上記キットの上記検出可能部分の各々が、上記キットの任意の他の検出可能部分とは検出可能に(detestably)異なる、キット。
(項目101)
標的ポリヌクレオチド領域中の変異を検出する方法であって、上記方法は、以下:
(a)上記標的ポリヌクレオチド領域に対してオリゴヌクレオチドプライマーを選択的にハイブリダイズさせる工程であって、ここで上記オリゴヌクレオチドプライマーが、(i)プローブ結合領域と、(ii)変異を保有することが疑われるテンプレート核酸に対して少なくとも70%相補的なテンプレート結合領域とを含み、ここで上記テンプレート結合領域の一部が、上記変異の疑わしい遺伝子座を少なくとも部分的に覆い、かつここで上記オリゴヌクレオチドプライマーが、上記テンプレート核酸に対するハイブリダイゼーションの際に、上記変異が存在する場合は、ポリメラーゼによって伸長可能であるが、上記変異が存在しない場合は、上記ポリメラーゼによって伸長可能ではない、工程と;
(b)ハイブリダイズした上記オリゴヌクレオチドプライマーを伸長して、伸長生成物を形成する工程と;
(c)上記伸長生成物を検出する工程であって、ここで上記検出する工程が、上記変異の存在を示す、工程と;
を包含する、方法。
(項目102)
上記伸長させる工程が、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を含まないDNAポリメラーゼで伸長させる工程を包含する、項目101に記載の方法。
(項目103)
上記検出する工程が、レポータープローブを上記プローブ結合領域に対して選択的にハイブリダイズさせる工程を包含する、項目101に記載の方法。
(項目104)
上記レポータープローブが、検出可能部分およびクエンチャー部分を含み、ここで上記クエンチャー部分は、上記レポータープローブがインタクトな場合、上記検出可能部分の検出を抑制する、項目103に記載の方法。
(項目105)
上記検出する工程がさらに、ハイブリダイズした上記レポータープローブの上記クエンチャー部分から上記検出可能部分を分離する工程を包含する、項目104に記載の方法。(項目106)
上記伸長生成物を、上記遺伝子座の下流の上記伸長生成物のある領域に対してハイブリダイズ可能なリバースプライマーを用いて増幅する工程をさらに包含する、項目103に記載の方法。
(項目107)
上記増幅する工程が、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を含むDNAポリメラーゼで増幅する工程を包含する、項目106に記載の方法。
(項目108)
上記オリゴヌクレオチドプライマーおよびレポータープローブのハイブリダイゼーション生成物が、上記オリゴヌクレオチドプライマーと標的ポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーション生成物のTmよりも少なくとも10度高いTmを有する、項目103に記載の方法。
(項目109)
上記レポータープローブの濃度が、上記フォワードプライマーの濃度の少なくとも10×である、項目103に記載の方法。
(項目110)
項目101に記載の方法であって、上記標的ポリヌクレオチド領域に対して1つ以上の代替のオリゴヌクレオチドプライマーを選択的にハイブリダイズさせる工程をさらに包含し、ここで上記1つ以上の代替のオリゴヌクレオチドプライマーが各々、別個のプローブ結合領域および上記テンプレート核酸に対して少なくとも70%相補的であるテンプレート結合領域を含み、ここで上記テンプレート結合領域の一部が、上記遺伝子座を少なくとも部分的に覆い、ここで上記代替のオリゴヌクレオチドプライマーが、上記テンプレート核酸に対するハイブリダイゼーションの際に、代替の対立遺伝子が存在する場合は、ポリメラーゼによって伸長可能であるが、上記代替の対立遺伝子が存在しない場合は、上記ポリメラーゼによって伸長可能ではない、方法。
(項目111)
上記検出する工程がさらに、上記1つ以上の代替のオリゴヌクレオチドプライマーに対して1つ以上の代替のレポータープローブを選択的にハイブリダイズさせる工程を包含し、ここで上記代替のレポータープローブの各々が、上記別個のプローブ結合領域の1つに対して少なくとも70%相補的であるが、上記プローブ結合領域の他のいずれに対しても相補的ではない、項目110に記載の方法。
(項目112)
上記代替のレポータープローブの各々が、代替の検出可能部分およびクエンチャー部分を含み、ここで上記代替の検出可能部分の各々が、上記検出可能部分の他のいずれとも検出可能に異なる、項目111に記載の方法。
(項目113)
上記変異が、一塩基多型(SNP)である、項目101に記載の方法。
(項目114)
上記テンプレート結合領域が、上記SNP遺伝子座を覆う塩基を有する3’末端領域を含む、項目113に記載の方法。
(項目115)
上記塩基が、上記SNP遺伝子座の変異体対立遺伝子に対して相補的である、項目114に記載の方法。
(項目116)
上記塩基が、上記SNP遺伝子座の野性型対立遺伝子に対して相補的である、項目114に記載の方法。
(項目117)
上記プローブ結合領域が、上記標的ポリヌクレオチド領域に対してハイブリダイズしない、項目101に記載の方法。
(項目118)
上記核酸サンプルが、工程b−cの前に複数の別個の反応容積に細かく分割される、項目101に記載の方法。
(項目119)
上記反応容積の各々において上記検出可能な部分の検出をさらに包含する、項目118に記載の方法。
(項目120)
多数の上記反応容積をカウントする工程をさらに包含し、ここで上記検出可能部分が検出される、項目119に記載の方法。
(項目121)
上記複数の個別の反応容積が平均で1未満のテンプレート核酸分子を含むように、上記核酸サンプルが細かく分割される、項目118に記載の方法。
(項目122)
結論を提供する工程およびネットワークをわたって上記結論を伝達する工程をさらに包含する、項目101に記載の方法。
(項目123)
以下:
(a)テンプレート核酸に対してハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドプライマーであって、ここで上記テンプレート核酸は、ある遺伝子座で野性型対立遺伝子を含み、ここで上記オリゴヌクレオチドプライマーの3’末端領域は、上記遺伝子座を覆い、かつ上記野性型対立遺伝子に相補的ではない、オリゴヌクレオチドプライマーと;
(b)検出可能部分およびクエンチャー部分を含むインタクトなレポータープローブであって、ここで上記インタクトなレポータープローブが、上記オリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズされる、レポータープローブと、
を含む、組成物。
(項目124)
高効率のライゲーション反応を行う方法であって、複数のドナー核酸分子のうち少なくとも10%の第一の末端に対して複数のアクセプター核酸分子を連結する工程を包含し、ここで上記ドナーまたはアクセプター核酸分子のうちの1つは、120nt長を超える、方法。
(項目125)
高効率のライゲーション反応を行う方法であって、複数のアクセプター核酸分子のうち少なくとも10%の第一の末端に対して複数のドナー核酸分子を連結する工程を包含し、ここで上記ドナーまたはアクセプター核酸分子のうちの1つは、120nt長を超える、方法。
(項目126)
上記アクセプター核酸分子が上記ドナー核酸分子である、項目124または125に記載の方法。
(項目127)
項目124または125に記載の方法であって:
(a)ヌクレオシド一リン酸(NMP)担持ドナー核酸分子の蓄積を達成するのに十分な時間、反応混合物中で、ある量のドナー核酸分子にNMPを移動させる工程と;
(b)NMP担持ドナー核酸分子とアクセプター核酸分子との間の共有結合の形成を達成する工程と、を包含し、
ここで工程(a)および(b)が上記反応混合物中で逐次的に行われる、方法。
(項目128)
上記移動させる工程が、上記ドナー核酸分子の少なくとも10%までNMPの移動を生じる、項目127に記載の方法。
(項目129)
上記移動させる工程が、上記ドナー核酸分子の少なくとも50%までNMPの移動を生じる、項目128に記載の方法。
(項目130)
上記移動させる工程が、上記ドナー核酸分子の少なくとも70%までNMPの移動を生じる、項目128に記載の方法。
(項目131)
上記移動させる工程が、上記ドナー核酸分子の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%までNMPの移動を生じる、項目128に記載の方法。
(項目132)
上記NMPがAMPである、項目127〜131のいずれかに記載の方法。
(項目133)
上記NMPがGMPである、項目127〜131のいずれかに記載の方法。
(項目134)
上記ドナー核酸分子の少なくとも1つのメンバーの3’末端領域が、未改変の3’末端領域である、項目127に記載の方法。
(項目135)
項目127に記載の方法であって、上記反応混合物が、以下:
(a)ドナー核酸分子の上記量に対して少なくとも等モルである量のヌクレオシド三リン酸(NTP)依存性リガーゼと;
(b)上記ATP依存性リガーゼのミカエリス定数(Km)より少なくとも10倍高い量で存在するNTPと;
を含む、方法。
(項目136)
上記NTP依存性リガーゼがRNAリガーゼである、項目135に記載の方法。
(項目137)
上記RNAリガーゼが、好熱性のRNAリガーゼである、項目135に記載の方法。
(項目138)
上記NTP依存性リガーゼがATP依存性RNAリガーゼである、項目135に記載の方法。
(項目139)
上記ATP依存性RNAリガーゼがMthRnl、T4 RNAリガーゼ、CircLigase、またはCircLigase IIである、項目138に記載の方法。
(項目140)
上記ATP依存性リガーゼがCircLigaseまたはCircLigase IIである、項目139に記載の方法。
(項目141)
上記NTP依存性リガーゼがGTP依存性RNAリガーゼである、項目135に記載の方法。
(項目142)
上記GTP依存性RNAリガーゼがRtcBである、項目141に記載の方法。
(項目143)
ドナー核酸分子の3’末端領域が、3’末端ブロック基で改変されている、項目135に記載の方法。
(項目144)
上記共有結合の形成を達成する工程が、上記反応混合物に対して、以下:
(a)上記アクセプター核酸分子と;
(b)Mn2+と、
を添加する工程を包含する、項目135に記載の方法。
(項目145)
上記Mn2+が、少なくとも2.5mMの量で存在する、項目144に記載の方法。
(項目146)
上記反応混合物中の上記NTPの濃度を低下させる工程をさらに包含する、項目144に記載の方法。
(項目147)
上記濃度を低下させる工程が、上記NTPの濃度を高くても10分の1に低下させる工程を包含する、項目146に記載の方法。
(項目148)
上記濃度を低下させる工程が、上記NTPを少なくとも10倍希釈するのに十分な量の液体を上記反応混合物に添加する工程を包含する、項目146に記載の方法。
(項目149)
上記ドナー核酸分子が、生物学的供給源から単離された核酸分子を含み、かつここで上記アクセプター核酸分子がアダプター配列を含む、項目127〜148のいずれかに記載の方法。
(項目150)
上記アクセプター核酸分子が、生物学的被験体から単離された核酸を含み、かつここで上記ドナー核酸分子がアダプター配列を含む、項目127〜149のいずれかに記載の方法。
(項目151)
上記アクセプター核酸分子が、生物学的被験体から単離された核酸を含み、かつここで上記ドナー核酸分子がバーコード配列を含む、項目127〜148のいずれかに記載の方法。
(項目152)
上記ドナー核酸分子が生物学的被験体から単離された核酸を含み、かつここで上記アクセプター核酸分子がバーコード配列を含む、項目127〜148のいずれかに記載の方法。
(項目153)
上記アクセプター核酸分子またはドナー核酸分子が、検出可能タグを含む、項目127〜148のいずれかに記載の方法。
(項目154)
核酸ライブラリーを調製する方法であって、複数のテンプレート核酸分子のうち少なくとも10%の第一の末端に対してオリゴヌクレオチド配列を連結して、上記核酸ライブラリーを作成する工程を包含し、ここで上記テンプレート核酸分子のうちの1つが120nt長を超える、方法。
(項目155)
上記複数のテンプレート核酸分子のうち少なくとも50%の第一の末端に対してオリゴヌクレオチド配列を連結する工程を包含する、項目154に記載の方法。
(項目156)
上記複数のテンプレート核酸分子のうち少なくとも70%の第一の末端に対してオリゴヌクレオチド配列を連結する工程を包含する、項目154に記載の方法。
(項目157)
上記複数のテンプレート核酸分子のうち少なくとも90%の第一の末端に対してオリゴヌクレオチド配列を連結する工程を包含する、項目154に記載の方法。
(項目158)
上記オリゴヌクレオチド配列が、アダプター配列である、項目154に記載の方法。
(項目159)
上記核酸ライブラリーを配列決定する工程をさらに包含する、項目158に記載の方法。
(項目160)
上記オリゴヌクレオチド配列が検出可能標識を含む、項目154に記載の方法。
(項目161)
上記核酸ライブラリーをアレイハイブリダイゼーションによって分析する工程をさらに包含する、項目160に記載の方法。
(項目162)
核酸ライブラリーを調製する方法であって、以下:
(a)複数のテンプレート核酸分子のうちの少なくとも10%の第一の末端に対してアダプター配列を連結して上記核酸ライブラリーを作成する工程と;
(b)上記核酸ライブラリーを配列決定する工程と;
を包含する、方法。
(項目163)
上記配列決定が、上記核酸ライブラリーの予備増幅なしで行われる、項目159または162に記載の方法。
(項目164)
上記複数のテンプレート核酸分子が、ゲノムDNA(gDNA)を含む、項目154または162に記載の方法。
(項目165)
上記gDNAが、固体組織サンプルから単離される、項目164に記載の方法。
(項目166)
上記gDNAが血漿、血清、痰、唾液、尿、または汗から単離される、項目164に記載の方法。
(項目167)
上記複数のテンプレート核酸分子が、一本鎖核酸フラグメントを含む、項目154または162に記載の方法。
(項目168)
上記複数のテンプレート核酸分子のうち少なくとも50%の第一の末端に対してアダプター配列を連結する工程を包含する、項目154または162に記載の方法。
(項目169)
上記複数のテンプレート核酸分子のうち少なくとも70%の第一の末端に対してアダプター配列を連結する工程を包含する、項目154または162に記載の方法。
(項目170)
上記複数のテンプレート核酸分子のうち少なくとも90%の第一の末端に対してアダプター配列を連結する工程を包含する、項目154または162に記載の方法。
(項目171)
上記複数のテンプレート核酸分子のうち少なくとも95%の第一の末端に対してアダプター配列を連結する工程を包含する、項目154または162に記載の方法。
(項目172)
項目154または162に記載の方法であって、上記連結する工程が、以下:
(a)ヌクレオシド一リン酸(NMP)担持反応物質1の蓄積を達成するのに十分な時間、第一の反応混合物中である量の核酸の第一の集団(反応物質1)までNMPを移動させる工程と;
(b)上記NMP担持反応物質1と核酸の第二の集団(反応物質2)との間の共有結合の形成を達成する工程を包含し、
ここで上記反応物質1が、(i)上記複数のテンプレート核酸または(ii)上記オリゴヌクレオチドもしくはアダプター配列の一方であり、ここで上記反応物質2が(i)上記複数のテンプレート核酸または(ii)上記オリゴヌクレオチドもしくはアダプター配列の他方であり、かつここでアデニル化された上記反応物質1が上記共有結合の形成を達成する工程の前に精製されない、方法。
(項目173)
上記移動させる工程が、上記反応物質1の少なくとも10%までNMPの移動を生じる、項目172に記載の方法。
(項目174)
上記移動させる工程が、上記反応物質1の少なくとも50%までNMPの移動を生じる、項目173に記載の方法。
(項目175)
上記移動させる工程が、上記反応物質1の少なくとも70%までNMPの移動を生じる、項目173に記載の方法。
(項目176)
上記移動させる工程が、上記反応物質1の少なくとも90%までNMPの移動を生じる、項目173に記載の方法。
(項目177)
上記反応物質1の少なくとも1つのメンバーの3’末端領域が、未改変の3’末端領域である、項目172に記載の方法。
(項目178)
項目172に記載の方法であって、上記第一の反応混合物が、以下:
(a)上記反応物質1の量に対して少なくとも等モルである量のNTP依存性リガーゼと;
(b)上記NTP依存性リガーゼのミカエリス定数(Km)より少なくとも10倍高い量で存在するNTPと;
を含む、方法。
(項目179)
上記NTP依存性リガーゼがRNAリガーゼである、項目178に記載の方法。
(項目180)
上記RNAリガーゼが、好熱性のRNAリガーゼである、項目179に記載の方法。
(項目181)
上記NTP依存性リガーゼがATP依存性RNAリガーゼである、項目179に記載の方法。
(項目182)
上記ATP依存性RNAリガーゼがMthRnl、T4 RNAリガーゼ、CircLigase、またはCircLigase IIである、項目181に記載の方法。
(項目183)
上記ATP依存性リガーゼがCircLigaseまたはCircLigase IIである、項目182に記載の方法。
(項目184)
上記NTP依存性リガーゼがGTP依存性RNAリガーゼである、項目179に記載の方法。
(項目185)
上記GTP依存性RNAリガーゼがRtcBである、項目184に記載の方法。
(項目186)
反応物質1の少なくとも1つのメンバーの3’末端領域が、3’末端ブロック基で改変されている、項目172に記載の方法。
(項目187)
上記共有結合の形成を達成する工程が、上記第一の反応混合物に対して、以下:
(a)陽イオンと;
(b)上記反応物質2と;
(c)上記NTPを少なくとも10倍希釈するのに十分な量の液体と、
を添加する工程を包含する、項目178に記載の方法。
(項目188)
上記陽イオンがMn2+である、項目187に記載の方法。
(項目189)
上記複数のテンプレート核酸分子のうち少なくとも10%の第二の末端に対して第二のアダプター配列を連結する工程をさらに包含する、項目154または162に記載の方法。
(項目190)
上記複数のテンプレート核酸分子のうち少なくとも50%の第二の末端に対して第二のアダプター配列を連結する工程をさらに包含する、項目154または162に記載の方法。
(項目191)
上記複数のテンプレート核酸分子のうち少なくとも70%の第二の末端に対して第二のアダプター配列を連結する工程をさらに包含する、項目154または162に記載の方法。
(項目192)
上記複数のテンプレート核酸分子のうち少なくとも90%の第二の末端に対して第二のアダプター配列を連結する工程をさらに包含する、項目154または162に記載の方法。
(項目193)
項目154または162に記載の方法であって、さらに以下:
(a)上記DNAライブラリーのメンバーに対して、標的選択性オリゴヌクレオチド(tso)をハイブリダイズさせる工程であって、上記標的選択性オリゴヌクレオチドが、(i)gDNAのある領域に特異的な配列と、(ii)第二のアダプター配列とを含む、工程と;
(b)ハイブリダイズした上記tsoを伸長して、上記第一および第二のアダプターを含む二本鎖ライブラリーのメンバーを作成する工程と、
を包含する、方法。
(項目194)
上記tsoが、癌関連遺伝子のある領域に対して少なくとも70%の同一性または相補性を有する配列を含む、項目193に記載の方法。
(項目195)
上記配列決定が、大規模並列配列決定を包含する、項目159または162のいずれかに記載の方法。
(項目196)
上記連結する工程が、3時間未満行われ得る、反応プロトコールを用いて行われる、項目154または162に記載の方法。
(項目197)
以下:
(a)NTP依存性リガーゼと;
(b)陽イオンと;
(c)NTPと;
(d)項目____のいずれかに記載の方法を行うための使用説明書と;
を含む、キット。
(項目198)
上記NTPがATPである、項目197に記載のキット。
(項目199)
上記NTP依存性リガーゼがATP依存性リガーゼである、項目198に記載のキット。
(項目200)
上記ATP依存性リガーゼがATP依存性RNAリガーゼである、項目199に記載のキット。
(項目201)
上記ATP依存性RNAリガーゼが、MthRnl、T4 RNAリガーゼ、CircLigase、またはCircLigase IIである、項目200に記載のキット。(項目202)
上記ATP依存性リガーゼがCircLigaseまたはCircLigase IIである、項目201に記載のキット。
(項目203)
上記NTPがGTPである、項目197に記載のキット。
(項目204)
上記NTP依存性リガーゼがGTP依存性リガーゼである、項目203に記載のキット。
(項目205)
上記GTP依存性リガーゼがGTP依存性RNAリガーゼである、項目204に記載のキット。
(項目206)
上記GTP依存性RNAリガーゼがRtcBである、項目205に記載のキット。
(項目207)
被験体の腫瘍から単離された腫瘍ゲノムDNA(gDNA)および上記被験体由来の非腫瘍組織から単離された正常なgDNAを用いて、腫瘍特異的な変異を追跡する方法であって、上記方法は、以下:
(a)予備増幅なしで上記腫瘍gDNAから調製されたDNAライブラリーを配列決定して第一のデータセットを作成する工程と;
(b)予備増幅なしで上記正常なgDNAから調製されたDNAライブラリーを配列決定して第二のデータセットを作成する工程と;
(c)上記第一のデータセットおよび上記第二のデータセットを分析して、上記被験体における1つ以上の腫瘍特異的な変異を同定する工程と;
(d)上記被験体由来の液体サンプルから単離された無細胞DNA中で上記腫瘍特異的な変異の存在または不在を検出する工程と、
を包含する、方法。
(項目208)
上記液体サンプルが、血漿、血清、痰、唾液、尿、および汗からなる群より選択される、項目207に記載の方法。
(項目209)
工程(a)または(b)の上記DNAライブラリーが、項目154または162に記載の方法を用いて調製される、項目207に記載の方法。
(項目210)
上記配列決定が、少なくとも200個の癌関連遺伝子を配列決定する工程を包含する、項目207に記載の方法。
(項目211)
上記癌関連遺伝子が、ABCA1、BRAF、CHD5、EP300、FLT1、ITPA、MYC、PIK3R1、SKP2、TP53、ABCA7、BRCA1、CHEK1、EPHA3、FLT3、JAK1、MYCL1、PIK3R2、SLC19A1、TP73、ABCB1、BRCA2、CHEK2、EPHA5、FLT4、JAK2、MYCN、PKHD1、SLC1A6、TPM3、ABCC2、BRIP1、CLTC、EPHA6、FN1、JAK3、MYH2、PLCB1、SLC22A2、TPMT、ABCC3、BUB1B、COL1A1、EPHA7、FOS、JUN、MYH9、PLCG1、SLCO1B3、TPO、ABCC4、C1orf144、COPS5、EPHA8、FOXO1、KBTBD11、NAV3、PLCG2、SMAD2、TPR、ABCG2、CABLES1、CREB1、EPHB1、FOXO3、KDM6A、NBN、PML、SMAD3、TRIO、ABL1、CACNA2D1、CREBBP、EPHB4、FOXP4、KDR、NCOA2、PMS2、SMAD4、TRRAP、ABL2、CAMKV、CRKL、EPHB6、GAB1、KIT、NEK11、PPARG、SMARCA4、TSC1、ACVR1B、CARD11、CRLF2、EPO、GATA1、KLF6、NF1、PPARGC1A、SMARCB1、TSC2、ACVR2A、CARM1、CSF1R、ERBB2、GLI1、KLHDC4、NF2、PPP1R3A、SMO、TTK、ADCY9、CAV1、CSMD3、ERBB3、GLI3、KRAS、NKX2−1、PPP2R1A、SOCS1、TYK2、AGAP2、CBFA2T3、CSNK1G2、ERBB4、GNA11、LMO2、NOS2、PPP2R1B、SOD2、TYMS、AKT1、CBL、CTNNA1、ERCC1、GNAQ、LRP1B、NOS3、PRKAA2、SOS1、UGT1A1、AKT2、CCND1、CTNNA2、ERCC2、GNAS、LRP2、NOTCH1、PRKCA、SOX10、UMPS、AKT3、CCND2、CTNNB1、ERCC3、GPR124、LRP6、NOTCH2、PRKCZ、SOX2、USP9X、ALK、CCND3、CYFIP1、ERCC4、GPR133、LTK、NOTCH3、PRKDC、SP1、VEGF、ANAPC5、CCNE1、CYLD、ERCC5、GRB2、MAN1B1、NPM1、PTCH1、SPRY2、VEGFA、APC、CD40LG、CYP19A1、ERCC6、GSK3B、MAP2K1、NQO1、PTCH2、SRC、VHL、APC2、CD44、CYP1B1、ERG、GSTP1、MAP2K2、NR3C1、PTEN、ST6GAL2、WRN、AR、CD79A、CYP2C19、ERN2、GUCY1A2、MAP2K4、NRAS、PTGS2、STAT1、WT1、ARAF、CD79B、CYP2C8、ESR1、HDAC1、MAP2K7、NRP2、PTPN11、STAT3、XPA、ARFRP1、CDC42、CYP2D6、ESR2、HDAC2、MAP3K1、NTRK1、PTPRB、STK11、XPC、ARID1A、CDC42BPB、CYP3A4、ETV4、HGF、MAPK1、NTRK2、PTPRD、SUFU、ZFY、ATM、CDC73、CYP3A5、EWSR1、HIF1A、MAPK3、NTRK3、RAD50、SULT1A1、ZNF521、ATP5A1、CDH1、DACH2、EXT1、HM13、MAPK8、OMA1、RAD51、SUZ12、ATR、CDH10、DCC、EZH2、HMGA1、MARK3、OR10R2、RAF1、TAF1、AURKA、CDH2、DCLK3、FANCA、HNF1A、MCL1、PAK3、RARA、TBX22、AURKB、CDH20、DDB2、FANCD2、HOXA3、MDM2、PARP1、RB1、TCF12、BAI3、CDH5、DDR2、FANCE、HOXA9、MDM4、PAX5、REM1、TCF3、BAP1、CDK2、DGKB、FANCF、HRAS、MECOM、PCDH15、RET、TCF4、BARD1、CDK4、DGKZ、FAS、HSP90AA1、MEN1、PCDH18、RICTOR、TEK、BAX、CDK6、DIRAS3、FBXW7、IDH1、MET、PCNA、RIPK1、TEP1、BCL11A、CDK7、DLG3、FCGR3A、IDH2、MITF、PDGFA、ROR1、TERT、BCL2、CDK8、DLL1、FES、IFNG、MLH1、PDGFB、ROR2、TET2、BCL2A1、CDKN1A、DNMT1、FGFR1、IGF1R、MLL、PDGFRA、ROS1、TGFBR2、BCL2L1、CDKN1B、DNMT3A、FGFR2、IGF2R、MLL3、PDGFRB、RPS6KA2、THBS1、BCL2L2、CDKN2A、DNMT3B、FGFR3、IKBKE、MPL、PDZRN3、RPTOR、TNFAIP3、BCL3、CDKN2B、DOT1L、FGFR4、IKZF1、MRE11A、PHLPP2、RSPO2、TNKS、BCL6、CDKN2C、DPYD、FH、IL2RG、MSH2、PIK3C3、RSPO3、TNKS2、BCR、CDKN2D、E2F1、FHOD3、INHBA、MSH6、PIK3CA、RUNX1、TNNI3K、BIRC5、CDX2、EED、FIGF、INSR、MTHFR、PIK3CB、SDHB、TNR、BIRC6、CEBPA、EGF、FLG2、IRS1、MTOR、PIK3CD、SF3B1、TOP1、BLM、CERK、EGFR、FLNC、IRS2、MUTYH、PIK3CG、SHC1、およびTOP2Aからなる群より選択される、項目210に記載の方法。
(項目212)
上記腫瘍特異的な変異のプロファイルを連絡するレポートを作成する工程をさらに包含する、項目207に記載の方法。
(項目213)
工程(d)が、複数の時点で行われる、項目207に記載の方法。
(項目214)
1つの時点が、癌治療の最初の施行の前であり、かつ第二の時点が上記最初の施行に引き続く、項目213に記載の方法。
(項目215)
上記複数の時点で腫瘍特異的な変異のプロファイルを連絡するレポートを作成する工程をさらに包含する、項目213に記載の方法。
(項目216)
上記レポートが、上記腫瘍特異的変異の1つを保有する遺伝子を標的にする1つ以上の治療候補のリストを含む、項目212または215に記載の方法。
(項目217)
上記レポートが上記gDNAを単離する工程から1週で作成される、項目212に記載の方法。
(項目218)
上記変異が、コピー数変動を含む、項目207に記載の方法。
(項目219)
上記検出する工程が、上記無細胞DNAを配列決定する工程を包含する、項目207に記載の方法。
(項目220)
項目219に記載の方法であって、上記無細胞DNA中に存在する少なくとも10個の癌関連遺伝子を配列決定する工程を包含し、ここで上記少なくとも10個の癌関連遺伝子のうちの1つが、項目207の工程c)において、腫瘍特異的な変異を保有していると同定される、方法。
(項目221)
項目219に記載の方法であって、上記無細胞DNA中に存在する少なくとも100個の癌関連遺伝子を配列決定する工程を包含し、ここで上記少なくとも100個の癌関連遺伝子のうちの1つが、項目207の工程c)において、腫瘍特異的な変異を保有していると同定される、方法。
(項目222)
上記配列決定する工程が、項目159または162に記載の方法を包含する、項目219に記載の方法。
(項目223)
アンプリコンの感度のよい検出のためのオリゴヌクレオチドプローブであって、以下:
(a)検出可能部分と;
(b)クエンチャー部分と;
(c)50℃未満の融点(Tm)と、
を含む、オリゴヌクレオチドプローブ。
(項目224)
上記プローブが、8〜30の長さのヌクレオチドを有する、項目223に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目225)
上記検出可能部分が、55℃以上の温度でクエンチされる、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目226)
上記プローブが、55℃を超える周囲温度で相補的なテンプレート核酸に対してハイブリダイズしない、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目227)
上記プローブが、テンプレート鎖に対してハイブリダイズされない場合、上記クエンチャー部分が、上記検出可能部分をクエンチする、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目228)
上記Tmが30℃〜45℃の間である、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目229)
フルオロフォア部分およびクエンチャー部分が、少なくとも7ヌクレオチド離れて隔てられる、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目230)
TMを増強する塩基ヌクレオチドを含む、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目231)
上記TMを増強する塩基ヌクレオチドが、ロックドヌクレオチドかまたは架橋ヌクレオチドである、項目230に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目232)
上記検出可能部分がフルオロフォアを含む、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目233)
少なくとも15ヌクレオチドの長さを有する、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目234)
少なくとも40%のGC含量を有している、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目235)
80%未満のGC含量を有している、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目236)
50%未満のGC含量を有している、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目237)
40%未満のGC含量を有している、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目238)
15ヌクレオチド未満の長さを有している、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目239)
40%未満のGC含量を有している、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目240)
少なくとも40%であるGC含量を有している、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目241)
40%〜80%の間であるGC含量を有している、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目242)
40%未満のGC含量を有しており、かつさらにロックドヌクレオチドまたは架橋されたヌクレオチドを含む、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目243)
上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブであって、ABCA1、BRAF、CHD5、EP300、FLT1、ITPA、MYC、PIK3R1、SKP2、TP53、ABCA7、BRCA1、CHEK1、EPHA3、FLT3、JAK1、MYCL1、PIK3R2、SLC19A1、TP73、ABCB1、BRCA2、CHEK2、EPHA5、FLT4、JAK2、MYCN、PKHD1、SLC1A6、TPM3、ABCC2、BRIP1、CLTC、EPHA6、FN1、JAK3、MYH2、PLCB1、SLC22A2、TPMT、ABCC3、BUB1B、COL1A1、EPHA7、FOS、JUN、MYH9、PLCG1、SLCO1B3、TPO、ABCC4、C1orf144、COPS5、EPHA8、FOXO1、KBTBD11、NAV3、PLCG2、SMAD2、TPR、ABCG2、CABLES1、CREB1、EPHB1、FOXO3、KDM6A、NBN、PML、SMAD3、TRIO、ABL1、CACNA2D1、CREBBP、EPHB4、FOXP4、KDR、NCOA2、PMS2、SMAD4、TRRAP、ABL2、CAMKV、CRKL、EPHB6、GAB1、KIT、NEK11、PPARG、SMARCA4、TSC1、ACVR1B、CARD11、CRLF2、EPO、GATA1、KLF6、NF1、PPARGC1A、SMARCB1、TSC2、ACVR2A、CARM1、CSF1R、ERBB2、GLI1、KLHDC4、NF2、PPP1R3A、SMO、TTK、ADCY9、CAV1、CSMD3、ERBB3、GLI3、KRAS、NKX2−1、PPP2R1A、SOCS1、TYK2、AGAP2、CBFA2T3、CSNK1G2、ERBB4、GNA11、LMO2、NOS2、PPP2R1B、SOD2、TYMS、AKT1、CBL、CTNNA1、ERCC1、GNAQ、LRP1B、NOS3、PRKAA2、SOS1、UGT1A1、AKT2、CCND1、CTNNA2、ERCC2、GNAS、LRP2、NOTCH1、PRKCA、SOX10、UMPS、AKT3、CCND2、CTNNB1、ERCC3、GPR124、LRP6、NOTCH2、PRKCZ、SOX2、USP9X、ALK、CCND3、CYFIP1、ERCC4、GPR133、LTK、NOTCH3、PRKDC、SP1、VEGF、ANAPC5、CCNE1、CYLD、ERCC5、GRB2、MAN1B1、NPM1、PTCH1、SPRY2、VEGFA、APC、CD40LG、CYP19A1、ERCC6、GSK3B、MAP2K1、NQO1、PTCH2、SRC、VHL、APC2、CD44、CYP1B1、ERG、GSTP1、MAP2K2、NR3C1、PTEN、ST6GAL2、WRN、AR、CD79A、CYP2C19、ERN2、GUCY1A2、MAP2K4、NRAS、PTGS2、STAT1、WT1、ARAF、CD79B、CYP2C8、ESR1、HDAC1、MAP2K7、NRP2、PTPN11、STAT3、XPA、ARFRP1、CDC42、CYP2D6、ESR2、HDAC2、MAP3K1、NTRK1、PTPRB、STK11、XPC、ARID1A、CDC42BPB、CYP3A4、ETV4、HGF、MAPK1、NTRK2、PTPRD、SUFU、ZFY、ATM、CDC73、CYP3A5、EWSR1、HIF1A、MAPK3、NTRK3、RAD50、SULT1A1、ZNF521、ATP5A1、CDH1、DACH2、EXT1、HM13、MAPK8、OMA1、RAD51、SUZ12、ATR、CDH10、DCC、EZH2、HMGA1、MARK3、OR10R2、RAF1、TAF1、AURKA、CDH2、DCLK3、FANCA、HNF1A、MCL1、PAK3、RARA、TBX22、AURKB、CDH20、DDB2、FANCD2、HOXA3、MDM2、PARP1、RB1、TCF12、BAI3、CDH5、DDR2、FANCE、HOXA9、MDM4、PAX5、REM1、TCF3、BAP1、CDK2、DGKB、FANCF、HRAS、MECOM、PCDH15、RET、TCF4、BARD1、CDK4、DGKZ、FAS、HSP90AA1、MEN1、PCDH18、RICTOR、TEK、BAX、CDK6、DIRAS3、FBXW7、IDH1、MET、PCNA、RIPK1、TEP1、BCL11A、CDK7、DLG3、FCGR3A、IDH2、MITF、PDGFA、ROR1、TERT、BCL2、CDK8、DLL1、FES、IFNG、MLH1、PDGFB、ROR2、TET2、BCL2A1、CDKN1A、DNMT1、FGFR1、IGF1R、MLL、PDGFRA、ROS1、TGFBR2、BCL2L1、CDKN1B、DNMT3A、FGFR2、IGF2R、MLL3、PDGFRB、RPS6KA2、THBS1、BCL2L2、CDKN2A、DNMT3B、FGFR3、IKBKE、MPL、PDZRN3、RPTOR、TNFAIP3、BCL3、CDKN2B、DOT1L、FGFR4、IKZF1、MRE11A、PHLPP2、RSPO2、TNKS、BCL6、CDKN2C、DPYD、FH、IL2RG、MSH2、PIK3C3、RSPO3、TNKS2、BCR、CDKN2D、E2F1、FHOD3、INHBA、MSH6、PIK3CA、RUNX1、TNNI3K、BIRC5、CDX2、EED、FIGF、INSR、MTHFR、HADH、RPP30、ZFP3、PIK3CB、SDHB、TNR、BIRC6、CEBPA、EGF、FLG2、IRS1、MTOR、PIK3CD、SF3B1、TOP1、BLM、CERK、EGFR、FLNC、IRS2、MUTYH、PIK3CG、SHC1、およびTOP2Aからなる群より選択される遺伝子中に含まれる少なくとも10個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列に対して少なくとも70%の相補性または同一性を有する配列を含む、オリゴヌクレオチドプローブ。
(項目244)
少なくとも1つのプライマー/プローブセットを含む反応混合物であって、ここで上記プライマー/プローブセットは、以下:
(a)第一の位置でゲノム領域に対してハイブリダイズするように設計されたフォワードプライマーと;
(b)項目1〜243のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブと、
を含む、反応混合物。
(項目245)
上記ゲノム領域に対して第二の位置でハイブリダイズするように設計されたリバースプライマーをさらに含んでいる、項目244に記載の反応混合物。
(項目246)
上記オリゴヌクレオチドプローブが、上記フォワードプライマーのTmよりも少なくとも15℃低いTmを有する、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目247)
上記オリゴヌクレオチドプローブが、上記第一のプライマーのTmおよび上記第二のプライマーのTmの平均よりも少なくとも15℃低いTmを有する、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目248)
上記オリゴヌクレオチドプローブが、上記第一の位置と上記第二の位置との間に位置する第三の位置で上記ゲノム領域にハイブリダイズするように設計されている、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目249)
上記リバースプライマーが、上記フォワードプライマーの量よりも少なくとも2倍〜10倍少ない量で存在する、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目250)
上記リバースプライマーが、上記フォワードプライマーの量とは2倍以下異なる量で存在する、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目251)
生物学的サンプルから単離された核酸サンプルをさらに含んでいる、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目252)
上記生物学的サンプルが、被験体から単離されたサンプルである、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目253)
上記被験体がヒト被験体である、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目254)
上記ヒト被験体が、ある疾患について診断されるか、ある疾患を有すると疑われるか、またはある疾患についてのリスクが増大していると疑われる、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目255)
上記疾患が癌である、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目256)
上記テンプレート核酸がゲノム領域を含む、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。(項目257)
上記テンプレート核酸がDNA、RNAまたはcDNAを含む、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目258)
ポリメラーゼをさらに含んでいる、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目259)
上記ポリメラーゼがDNAポリメラーゼである、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目260)
上記項目のいずれかに記載の反応混合物であって、以下:
(a)第一のテンプレート核酸と;
(b)ある量のフォワードプライマーと;
(c)第二の量のリバースプライマーであって、上記リバースプライマーの第二の量は、上記フォワードプライマーの上記量よりも少なくとも2倍〜10倍少ない、第二の量のリバースプライマーと;
(d)オリゴヌクレオチドプローブと、
を含む、反応混合物。
(項目261)
複数のプライマー/プローブセットを含む、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。(項目262)
上記複数のプライマー/プローブセットの各々が、ゲノムDNAの異なる領域に特異的である、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目263)
上記ゲノム領域が、疾患関連の変異と関連している、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目264)
上記変異が、コピー数変動を含む、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目265)
上記変異が、一塩基多型(SNP)、挿入、欠失、または逆位を含む、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目266)
上記フォワードプライマーまたは上記リバースプライマーの1つが、上記SNP、上記挿入、上記欠失、または上記逆位を覆う、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目267)
上記オリゴヌクレオチドプローブが、上記SNP、上記挿入、上記欠失、または上記逆位を覆う、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目268)
上記疾患が癌である、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目269)
上記項目のいずれかに記載の反応混合物であって、上記プライマー/プローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブを含み、ここで各々のオリゴヌクレオチドプローブが、上記ゲノム領域の任意の他の対立遺伝子を含む配列と比較して、上記ゲノム領域の1つの特異的対立遺伝子を含む配列に対して、より大きいアビディティで結合するように設計された対立遺伝子特異的プローブであり、ここで各々の対立遺伝子特異的なプローブが、異なる対立遺伝子に特異的である、反応混合物。
(項目270)
上記対立遺伝子特異的なプローブの各々が、スペクトル的に別個のフルオロフォアを各々含む、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目271)
上記項目のいずれかに記載の反応混合物であって、ここで任意の他の対立遺伝子に対する上記対立遺伝子特異的プローブの結合エネルギーと比較した、上記1つの特異的な対立遺伝子に対する対立遺伝子特異的プローブの結合エネルギーにおける相違は、上記ゲノム領域に対する上記プローブの全体的な結合エネルギーの1%超である、反応混合物。
(項目272)
上記オリゴヌクレオチドプローブが、ビーコンプローブである、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目273)
上記オリゴヌクレオチドプローブがプレアデス(Pleiades)プローブである、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目274)
以下:
(a)上記項目のいずれかに記載の反応混合物を複数の反応容積に分割する工程と;
(b)上記反応容積中の少なくとも1つにおいて、複数回の温度サイクリングを含むPCR増幅反応を行う工程であって、ここで上記オリゴヌクレオチドプローブが、上記PCR増幅反応の有効性に影響しない工程と、
を包含する、方法。
(項目275)
上記項目のいずれかに記載の方法であって、ここで上記オリゴヌクレオチドプローブが、上記PCR増幅反応のアニーリング段階または伸長段階の間にテンプレート核酸にもPCR反応生成物にもハイブリダイズしない、方法。
(項目276)
上記項目のいずれかに記載の方法であって、上記反応容積の少なくとも1つを50℃未満まで冷却する工程をさらに包含し、ここで上記冷却によって、オリゴヌクレオチドプローブに対して少なくとも70%の相補性を有する配列を含む核酸に対する、上記オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションが可能になる、方法。
(項目277)
上記項目のいずれかに記載の方法であって、上記反応容積の少なくとも1つを37℃未満まで冷却する工程をさらに包含し、ここで上記冷却によって、オリゴヌクレオチドプローブに対して少なくとも70%の相補性を有する配列を含む核酸に対する、上記オリゴヌクレオチドプローブの量のうち少なくとも70%のハイブリダイゼーションが可能になる、方法。
(項目278)
上記分割によって、平均で1分子未満のテンプレート核酸を含む各々の反応容積が生じる、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目279)
指数関数的PCR増幅反応および線形PCR増幅反応を、上記反応容積のうちの少なくとも1つの中で行う工程を包含する、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目280)
上記指数関数的PCR増幅反応および上記線形PCR増幅反応が、上記反応容積中から成分を添加することも除去することもなく逐次的に起こる、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目281)
上記PCR増幅反応によって、増幅生成物のうち少なくとも50%が一本鎖増幅生成物になる、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目282)
上記反応容積が液滴である、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目283)
上記ハイブリダイゼーションによって、上記オリゴヌクレオチドプローブからの蛍光の放出が生じる、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目284)
上記反応容積のうちの少なくとも1つの中で上記蛍光の存在または不在を検出する工程をさらに包含する、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目285)
上記反応容積中の上記蛍光の強度を測定する工程を包含する、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目286)
蛍光陽性の反応容積の数および/または画分を決定する工程をさらに包含する、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目287)
蛍光陽性の反応容積の上記数および/または画分に基づいて上記サンプル中の1つ以上の変異の存在、不在または量を決定する工程を包含する、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目288)
上記1つ以上の変異が、SNP、欠失、挿入、または逆位を含む、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目289)
上記1つ以上の変異が、遺伝子のコピー数変動を含む、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目290)
上記1つ以上の変異が、疾患関連の変異を含む、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目291)
上記疾患が癌である、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目292)
上記項目のいずれかに記載の方法であって、上記1つ以上の変異が、ABCA1、BRAF、CHD5、EP300、FLT1、ITPA、MYC、PIK3R1、SKP2、TP53、ABCA7、BRCA1、CHEK1、EPHA3、FLT3、JAK1、MYCL1、PIK3R2、SLC19A1、TP73、ABCB1、BRCA2、CHEK2、EPHA5、FLT4、JAK2、MYCN、PKHD1、SLC1A6、TPM3、ABCC2、BRIP1、CLTC、EPHA6、FN1、JAK3、MYH2、PLCB1、SLC22A2、TPMT、ABCC3、BUB1B、COL1A1、EPHA7、FOS、JUN、MYH9、PLCG1、SLCO1B3、TPO、ABCC4、C1orf144、COPS5、EPHA8、FOXO1、KBTBD11、NAV3、PLCG2、SMAD2、TPR、ABCG2、CABLES1、CREB1、EPHB1、FOXO3、KDM6A、NBN、PML、SMAD3、TRIO、ABL1、CACNA2D1、CREBBP、EPHB4、FOXP4、KDR、NCOA2、PMS2、SMAD4、TRRAP、ABL2、CAMKV、CRKL、EPHB6、GAB1、KIT、NEK11、PPARG、SMARCA4、TSC1、ACVR1B、CARD11、CRLF2、EPO、GATA1、KLF6、NF1、PPARGC1A、SMARCB1、TSC2、ACVR2A、CARM1、CSF1R、ERBB2、GLI1、KLHDC4、NF2、PPP1R3A、SMO、TTK、ADCY9、CAV1、CSMD3、ERBB3、GLI3、KRAS、NKX2−1、PPP2R1A、SOCS1、TYK2、AGAP2、CBFA2T3、CSNK1G2、ERBB4、GNA11、LMO2、NOS2、PPP2R1B、SOD2、TYMS、AKT1、CBL、CTNNA1、ERCC1、GNAQ、LRP1B、NOS3、PRKAA2、SOS1、UGT1A1、AKT2、CCND1、CTNNA2、ERCC2、GNAS、LRP2、NOTCH1、PRKCA、SOX10、UMPS、AKT3、CCND2、CTNNB1、ERCC3、GPR124、LRP6、NOTCH2、PRKCZ、SOX2、USP9X、ALK、CCND3、CYFIP1、ERCC4、GPR133、LTK、NOTCH3、PRKDC、SP1、VEGF、ANAPC5、CCNE1、CYLD、ERCC5、GRB2、MAN1B1、NPM1、PTCH1、SPRY2、VEGFA、APC、CD40LG、CYP19A1、ERCC6、GSK3B、MAP2K1、NQO1、PTCH2、SRC、VHL、APC2、CD44、CYP1B1、ERG、GSTP1、MAP2K2、NR3C1、PTEN、ST6GAL2、WRN、AR、CD79A、CYP2C19、ERN2、GUCY1A2、MAP2K4、NRAS、PTGS2、STAT1、WT1、ARAF、CD79B、CYP2C8、ESR1、HDAC1、MAP2K7、NRP2、PTPN11、STAT3、XPA、ARFRP1、CDC42、CYP2D6、ESR2、HDAC2、MAP3K1、NTRK1、PTPRB、STK11、XPC、ARID1A、CDC42BPB、CYP3A4、ETV4、HGF、MAPK1、NTRK2、PTPRD、SUFU、ZFY、ATM、CDC73、CYP3A5、EWSR1、HIF1A、MAPK3、NTRK3、RAD50、SULT1A1、ZNF521、ATP5A1、CDH1、DACH2、EXT1、HM13、MAPK8、OMA1、RAD51、SUZ12、ATR、CDH10、DCC、EZH2、HMGA1、MARK3、OR10R2、RAF1、TAF1、AURKA、CDH2、DCLK3、FANCA、HNF1A、MCL1、PAK3、RARA、TBX22、AURKB、CDH20、DDB2、FANCD2、HOXA3、MDM2、PARP1、RB1、TCF12、BAI3、CDH5、DDR2、FANCE、HOXA9、MDM4、PAX5、REM1、TCF3、BAP1、CDK2、DGKB、FANCF、HRAS、MECOM、PCDH15、RET、TCF4、BARD1、CDK4、DGKZ、FAS、HSP90AA1、MEN1、PCDH18、RICTOR、TEK、BAX、CDK6、DIRAS3、FBXW7、IDH1、MET、PCNA、RIPK1、TEP1、BCL11A、CDK7、DLG3、FCGR3A、IDH2、MITF、PDGFA、ROR1、TERT、BCL2、CDK8、DLL1、FES、IFNG、MLH1、PDGFB、ROR2、TET2、BCL2A1、CDKN1A、DNMT1、FGFR1、IGF1R、MLL、PDGFRA、ROS1、TGFBR2、BCL2L1、CDKN1B、DNMT3A、FGFR2、IGF2R、MLL3、PDGFRB、RPS6KA2、THBS1、BCL2L2、CDKN2A、DNMT3B、FGFR3、IKBKE、MPL、PDZRN3、RPTOR、TNFAIP3、BCL3、CDKN2B、DOT1L、FGFR4、IKZF1、MRE11A、PHLPP2、RSPO2、TNKS、BCL6、CDKN2C、DPYD、FH、IL2RG、MSH2、PIK3C3、RSPO3、TNKS2、BCR、CDKN2D、E2F1、FHOD3、INHBA、MSH6、PIK3CA、RUNX1、TNNI3K、BIRC5、CDX2、EED、FIGF、INSR、MTHFR、HADH、RPP30、ZFP3、PIK3CB、SDHB、TNR、BIRC6、CEBPA、EGF、FLG2、IRS1、MTOR、PIK3CD、SF3B1、TOP1、BLM、CERK、EGFR、FLNC、IRS2、MUTYH、PIK3CG、SHC1、およびTOP2Aからなる群より選択される1つ以上の遺伝子の変異を含む、方法。
(項目293)
上記1つ以上の変異が、DDR2、EGFR、AURKA、VEGFA、FGFR1、CDK4、EFBB2、CDK6、JAK2、MET、BRAF、ERBB3、SRC、HADH、RPP30、およびZFP3からなる群より選択される1つ以上の遺伝子の変異を含む、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目294)
上記サンプル中の上記変異の存在、不在および/またはレベルのプロファイルを連絡するレポートを作成する工程を包含する、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目295)
上記変異を標的にする治療剤の説明をさらに含む、上記項目のいずれかに記載の方法。(項目296)
癌の処置を必要とする被験体における癌を処置する方法であって、上記方法は、以下:
(a)上記被験体から生物学的サンプルを得る工程と;
(b)上記生物学的サンプルから単離された核酸サンプルから、MET、FGFR1、FGFR2、FLT3、HER3、EGFR、mTOR、CDK4、HER2、RET、HADH、ZFP3、DDR2、AURKA、VEGFA、CDK6、JAK2、BRAF、およびSRCからなる群より選択される少なくとも5つの遺伝子中でのコピー数変動(CNV)の存在または不在を決定する工程と;
(c)上記決定する工程に基づいて、被験体特異的なCNVプロファイルを作成する工程と;
(d)上記被験体特異的なCNVプロファイルに基づいて、上記被験体の癌治療を選択する工程と;
を包含する、方法。
(項目297)
上記CNVの存在または不在を決定する工程が、項目274〜289のいずれかに記載の方法の使用を包含する、項目296に記載の方法。
(項目298)
デジタルPCRアッセイが、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブの使用を包含する、項目296に記載の方法。
(項目299)
上記オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、91、94、97、100、103、106、109、112、115、または118のいずれかに記載のヌクレオチド配列を含む、項目298に記載の方法。
(項目300)
デジタルPCRアッセイが、上記項目のいずれかに記載のプライマーの使用を包含する、項目296に記載の方法。
(項目301)
上記プライマーが、配列番号59、60、62、63、65、66、68、69、71、72、74、75、77、78、80、81、83、84、86、87、89、90、92、93、95、96、98、99、101、102、104、105、107、108、110、111、113、114、116、または117のいずれかに記載のヌクレオチド配列を含む、項目300に記載の方法。
(項目302)
少なくとも10、12または18個の遺伝子中のCNVの存在または不在を決定する工程を包含する、項目296に記載の方法。
(項目303)
上記生物学的サンプルが、上記癌に由来する核酸を保有すると疑われる、項目296に記載の方法。
(項目304)
上記生物学的サンプルが、固体組織サンプルである、項目296に記載の方法。
(項目305)
上記固体組織サンプルが、ホルマリン固定され、パラフィン包埋されたサンプルである、項目296に記載の方法。
(項目306)
上記生物学的サンプルが液体の生物学的サンプルである、項目296に記載の方法。
(項目307)
上記液体の生物学的サンプルが、血液、血清、血漿、尿、汗、涙、唾液、および痰からなる群より選択される、項目296に記載の方法。
(項目308)
コンピュータシステムであって、以下:
(a)サンプルからデータを受容するように構成されたメモリユニットであって、ここで上記データが上記項目のいずれかに記載の方法によって作成される、メモリユニットと;
(b)上記データの分析のためのコンピュータ実行可能な命令と;
(c)上記分析に基づいて、上記サンプル中の変異の存在、不在または量を決定するためのコンピュータ実行可能な命令と;
を備える、コンピュータシステム。
(項目309)
上記項目のいずれかに記載のコンピュータシステムであって、上記サンプル中の変異の上記存在、不在または量のレポートを作成するためのコンピュータ実行可能な命令をさらに備える、コンピュータシステム。
(項目310)
上記項目のいずれかに記載のコンピュータシステムであって、上記サンプル中の変異の上記存在、不在または量に基づいて治療の選択肢のレポートを作成するためのコンピュータ実行可能な命令をさらに備える、コンピュータシステム。
(項目311)
上記項目のいずれかに記載のコンピュータシステムであって、上記レポートをユーザーに対して連絡または提示するように構成されたユーザーインターフェースをさらに備える、コンピュータシステム。
(項目312)
キットであって、以下:
(a)少なくとも1つのプライマー/プローブセットであって、ここで上記プライマー/プローブセットが、(i)第一の位置でゲノム領域に対してハイブリダイズするように設計されたフォワードプライマー、(ii)第二の位置で上記ゲノム領域に対してハイブリダイズするように設計されたリバースプライマー、および(iii)上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブであって、上記オリゴヌクレオチドプローブが、上記第一の位置と第二の位置との間に位置する第三の位置で上記ゲノム領域に対してハイブリダイズするように設計されているオリゴヌクレオチドプローブを含む、プライマー/プローブセットと;
(b)使用説明書と;
を含む、キット。
(項目313)
配列番号4〜21、23、24、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、91、94、97、100、103、106、109、112、115、または118のいずれかに示されるオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目314)
配列番号1948〜5593のいずれかに示される標的選択性オリゴヌクレオチド。
(項目315)
配列番号25または26に示される配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー。
(項目316)
配列番号1〜3、22、27〜58、59、60、62、63、65、66、68、69、71、72、74、75、77、78、80、81、83、84、86、87、89、90、92、93、95、96、98、99、101、102、104、105、107、108、110、111、113、114、116、または117のいずれかに示される配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する:
(項目1)
癌を評価する方法であって、以下:
(a)被験体中の流体サンプルに由来するサンプル中で遺伝子の各々のサブセットの存在、不在および/または量を決定する工程であって、ここで上記サブセットは、(i)固体組織サンプルが、癌性組織を含むことが公知であるか、または含むと疑われる被験体由来の上記固体組織サンプルでの遺伝子のセットに対して標的化配列決定を行うこと;(ii)上記標的化配列決定に基づいて遺伝子の上記セットについて遺伝学的異常のプロファイルを決定すること;ならびに(iii)上記セットについての上記プロファイルに基づいて遺伝子の上記セットのうち、2、3、4の、しかし4以下の遺伝子サブセットを選択することによって決定され、ここで上記サブセットは上記被験体に特異的である、工程;ならびに
(b)工程(a)の結果から、上記被験体における上記癌の状態を決定する工程;
を包含する、方法。
(項目2)
遺伝子の上記セットが少なくとも10の遺伝子を含む、項目1に記載の方法。
(項目3)
遺伝子の上記セットが少なくとも100の遺伝子を含む、項目2に記載の方法。
(項目4)
遺伝子の上記セットが少なくとも200の遺伝子を含む、項目2に記載の方法。
(項目5)
項目1に記載の方法であって、遺伝子の上記セットが、ABCA1、BRAF、CHD5、EP300、FLT1、ITPA、MYC、PIK3R1、SKP2、TP53、ABCA7、BRCA1、CHEK1、EPHA3、FLT3、JAK1、MYCL1、PIK3R2、SLC19A1、TP73、ABCB1、BRCA2、CHEK2、EPHA5、FLT4、JAK2、MYCN、PKHD1、SLC1A6、TPM3、ABCC2、BRIP1、CLTC、EPHA6、FN1、JAK3、MYH2、PLCB1、SLC22A2、TPMT、ABCC3、BUB1B、COL1A1、EPHA7、FOS、JUN、MYH9、PLCG1、SLCO1B3、TPO、ABCC4、C1orf144、COPS5、EPHA8、FOXO1、KBTBD11、NAV3、PLCG2、SMAD2、TPR、ABCG2、CABLES1、CREB1、EPHB1、FOXO3、KDM6A、NBN、PML、SMAD3、TRIO、ABL1、CACNA2D1、CREBBP、EPHB4、FOXP4、KDR、NCOA2、PMS2、SMAD4、TRRAP、ABL2、CAMKV、CRKL、EPHB6、GAB1、KIT、NEK11、PPARG、SMARCA4、TSC1、ACVR1B、CARD11、CRLF2、EPO、GATA1、KLF6、NF1、PPARGC1A、SMARCB1、TSC2、ACVR2A、CARM1、CSF1R、ERBB2、GLI1、KLHDC4、NF2、PPP1R3A、SMO、TTK、ADCY9、CAV1、CSMD3、ERBB3、GLI3、KRAS、NKX2−1、PPP2R1A、SOCS1、TYK2、AGAP2、CBFA2T3、CSNK1G2、ERBB4、GNA11、LMO2、NOS2、PPP2R1B、SOD2、TYMS、AKT1、CBL、CTNNA1、ERCC1、GNAQ、LRP1B、NOS3、PRKAA2、SOS1、UGT1A1、AKT2、CCND1、CTNNA2、ERCC2、GNAS、LRP2、NOTCH1、PRKCA、SOX10、UMPS、AKT3、CCND2、CTNNB1、ERCC3、GPR124、LRP6、NOTCH2、PRKCZ、SOX2、USP9X、ALK、CCND3、CYFIP1、ERCC4、GPR133、LTK、NOTCH3、PRKDC、SP1、VEGF、ANAPC5、CCNE1、CYLD、ERCC5、GRB2、MAN1B1、NPM1、PTCH1、SPRY2、VEGFA、APC、CD40LG、CYP19A1、ERCC6、GSK3B、MAP2K1、NQO1、PTCH2、SRC、VHL、APC2、CD44、CYP1B1、ERG、GSTP1、MAP2K2、NR3C1、PTEN、ST6GAL2、WRN、AR、CD79A、CYP2C19、ERN2、GUCY1A2、MAP2K4、NRAS、PTGS2、STAT1、WT1、ARAF、CD79B、CYP2C8、ESR1、HDAC1、MAP2K7、NRP2、PTPN11、STAT3、XPA、ARFRP1、CDC42、CYP2D6、ESR2、HDAC2、MAP3K1、NTRK1、PTPRB、STK11、XPC、ARID1A、CDC42BPB、CYP3A4、ETV4、HGF、MAPK1、NTRK2、PTPRD、SUFU、ZFY、ATM、CDC73、CYP3A5、EWSR1、HIF1A、MAPK3、NTRK3、RAD50、SULT1A1、ZNF521、ATP5A1、CDH1、DACH2、EXT1、HM13、MAPK8、OMA1、RAD51、SUZ12、ATR、CDH10、DCC、EZH2、HMGA1、MARK3、OR10R2、RAF1、TAF1、AURKA、CDH2、DCLK3、FANCA、HNF1A、MCL1、PAK3、RARA、TBX22、AURKB、CDH20、DDB2、FANCD2、HOXA3、MDM2、PARP1、RB1、TCF12、BAI3、CDH5、DDR2、FANCE、HOXA9、MDM4、PAX5、REM1、TCF3、BAP1、CDK2、DGKB、FANCF、HRAS、MECOM、PCDH15、RET、TCF4、BARD1、CDK4、DGKZ、FAS、HSP90AA1、MEN1、PCDH18、RICTOR、TEK、BAX、CDK6、DIRAS3、FBXW7、IDH1、MET、PCNA、RIPK1、TEP1、BCL11A、CDK7、DLG3、FCGR3A、IDH2、MITF、PDGFA、ROR1、TERT、BCL2、CDK8、DLL1、FES、IFNG、MLH1、PDGFB、ROR2、TET2、BCL2A1、CDKN1A、DNMT1、FGFR1、IGF1R、MLL、PDGFRA、ROS1、TGFBR2、BCL2L1、CDKN1B、DNMT3A、FGFR2、IGF2R、MLL3、PDGFRB、RPS6KA2、THBS1、BCL2L2、CDKN2A、DNMT3B、FGFR3、IKBKE、MPL、PDZRN3、RPTOR、TNFAIP3、BCL3、CDKN2B、DOT1L、FGFR4、IKZF1、MRE11A、PHLPP2、RSPO2、TNKS、BCL6、CDKN2C、DPYD、FH、IL2RG、MSH2、PIK3C3、RSPO3、TNKS2、BCR、CDKN2D、E2F1、FHOD3、INHBA、MSH6、PIK3CA、RUNX1、TNNI3K、BIRC5、CDX2、EED、FIGF、INSR、MTHFR、PIK3CB、SDHB、TNR、BIRC6、CEBPA、EGF、FLG2、IRS1、MTOR、PIK3CD、SF3B1、TOP1、BLM、CERK、EGFR、FLNC、IRS2、MUTYH、PIK3CG、SHC1、およびTOP2Aからなる群より選択される、方法。
(項目6)
上記流体サンプルが、血液、血清、血漿、尿、汗、涙、唾液、または痰からなる群より選択される、項目1に記載の方法。
(項目7)
工程(a)および(b)が、上記癌の状態を時間をわたってモニターするために複数の時点で行われる、項目1に記載の方法。
(項目8)
1つの時点が、癌治療の最初の施行の前であり、その後の時点が上記最初の施行に引き続く、項目7に記載の方法。
(項目9)
遺伝子の上記セットについて遺伝学的異常の上記プロファイルを連絡するレポートを作成する工程と、上記レポートを介護者に連絡する工程とをさらに包含する、項目1に記載の方法。
(項目10)
上記レポートが、上記プロファイルに基づく1つ以上の治療候補のリストを包含する、項目9に記載の方法。
(項目11)
上記レポートが、上記固体組織サンプルの収集から1週で作成される、項目9に記載の方法。
(項目12)
上記レポートが、遺伝子の上記セットのコピー数変更を含む、項目9に記載の方法。
(項目13)
上記レポートが、(腫瘍に由来する)上記遺伝学的異常の各々を標的にする治療剤の記述を含む、項目9に記載の方法。
(項目14)
各々の上記複数の時点での遺伝子の上記サブセットの上記プロファイルを連絡するレポートを作成する工程をさらに包含する、項目1に記載の方法。
(項目15)
上記決定する工程が、上記サンプルから個別の反応容積へ上記核酸分子を希釈する工程を包含し、ここで上記個別の反応容積は、上記サンプル由来の1〜10モルの上記核酸分子を含む、項目1に記載の方法。
(項目16)
上記個別の反応容積は、エマルジョン中の液滴である、項目15に記載の方法。
(項目17)
上記個別の反応容積がさらに、遺伝子の上記サブセット中の上記遺伝学的異常の対立遺伝子識別のためのプライマーを含む、項目15に記載の方法。
(項目18)
上記状態を決定する工程が、遺伝子の上記サブセット中の上記遺伝学的異常を保有している核酸の数を定量する工程を包含する、項目1に記載の方法。
(項目19)
上記標的化配列決定の工程が、上記固体組織サンプルからDNAライブラリーを調製する工程を包含し、ここで上記調製が、4時間、5時間、6時間および7時間からなる群より選択される時間数未満で完了され得る、項目1に記載の方法。
(項目20)
上記調製が、上記ライブラリーの配列決定の前に指数関数的PCR増幅を必要としない、項目19に記載の方法。
(項目21)
上記調製が、線形増幅工程を含む、項目19に記載の方法。
(項目22)
項目1に記載の方法であって、上記標的化配列決定の工程が、標的化ライブラリー調製工程を包含し、ここで上記標的化ライブラリー調製工程は、以下:
(a)上記固体組織サンプル由来の一本鎖DNAフラグメントと、(i)ある癌関連遺伝子のある領域に特異的な領域、および(ii)ある配列決定プラットフォームにカップリングするために特異的なアダプター配列を含む標的特異的オリゴヌクレオチドとを接触させる工程と;
(b)上記標的特異的オリゴヌクレオチドに対して相補性の領域を含む一本鎖DNAフラグメントに対して上記標的特異的オリゴヌクレオチドを連結するためのハイブリダイゼーション反応を行う工程と;
(c)伸長反応を行って、上記領域を含み、かつ上記アダプターを含む伸長生成物を作成する工程と;
(d)上記伸長生成物を配列決定する工程と、
を包含する、方法。
(項目23)
上記接触させる工程が、配列決定プラットフォームに対して結合された上記標的特異的オリゴヌクレオチドを用いて生じる、項目22に記載の方法。
(項目24)
上記接触させる工程が、溶液中で遊離の上記標的特異的オリゴヌクレオチドを用いて生じる、項目22に記載の方法。
(項目25)
以下:
(a)ssDNAライブラリー中の一本鎖DNA(ssDNA)フラグメントに対して標的選択性オリゴヌクレオチド(TSO)をハイブリダイズして、ハイブリダイゼーション生成物を作成する工程と;
(b)上記ハイブリダイゼーション生成物を伸長して、二本鎖伸長生成物を作成する工程であって、ここで上記TSOが、(i)単一の標的領域に対して相補的な配列と(ii)上記TSOの第一の末端に位置するが、上記TSOの両端には位置しない第一の一本鎖アダプター配列とを含み、ここで上記ssDNAフラグメントが、第二の一本鎖アダプター配列を含むが、上記第一の一本鎖アダプター配列を含まず、かつここで上記ssDNAフラグメントが、10%、50%、70%、または90%を超えるライゲーション効率を含むライゲーション方法によって第二の一本鎖アダプター配列に連結される、工程と、
を包含する、方法。
(項目26)
以下:
(a)ssDNAライブラリー中の一本鎖DNA(ssDNA)フラグメントに対して標的選択性オリゴヌクレオチド(TSO)をハイブリダイズして、ハイブリダイゼーション生成物を作成する工程と;
(b)上記ハイブリダイゼーション生成物を伸長して、二本鎖伸長生成物を作成する工程であって、ここで上記TSOが、(i)単一の標的領域に対して相補的な配列と(ii)上記TSOの第一の末端に位置するが、上記TSOの両端には位置しない第一の一本鎖アダプター配列とを含み、ここで上記ssDNAフラグメントが、第二の一本鎖アダプター配列を含むが、上記第一の一本鎖アダプター配列を含まず、かつここで上記ssDNAフラグメントが、一本鎖ライゲーション法によって第二の一本鎖アダプター配列に連結される、工程と、
を包含する、方法。
(項目27)
上記第二の一本鎖アダプター配列が、上記ssDNAフラグメントの第一の末端に位置するが、上記ssDNAフラグメントの両端には位置しない、項目25または26に記載の方法。
(項目28)
上記ssDNAフラグメントの上記第一の末端が、5’末端である、項目27に記載の方法。
(項目29)
上記第一のアダプター配列または上記第二のアダプター配列が、バーコード配列を含む、項目25または26に記載の方法。
(項目30)
上記TSOの上記第一の末端が5’末端である、項目25または26に記載の方法。
(項目31)
上記第一のアダプター配列または上記第二のアダプター配列が、固体支持体にコンジュゲートされた支持体結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも70%同一である配列を含む、項目25または26に記載の方法。
(項目32)
上記固体支持体が、配列決定プラットフォームにカップリングされる、項目31に記載の方法。
(項目33)
上記第一のアダプター配列または上記第二のアダプター配列が、配列決定プライマーに対する結合部位を含む、項目25または26に記載の方法。
(項目34)
上記支持体結合オリゴヌクレオチドに対して上記伸長生成物をアニーリングする工程をさらに包含する、項目31に記載の方法。
(項目35)
アニーリングされた上記伸長生成物を増幅する工程をさらに包含する、項目34に記載の方法。
(項目36)
アニーリングされた上記伸長生成物を配列決定する工程をさらに包含する、項目35に記載の方法。
(項目37)
上記ssDNAライブラリーがゲノムDNAフラグメントを含む、項目25または26に記載の方法。
(項目38)
上記ssDNAライブラリーが、cDNAフラグメントを含む、項目25または26に記載の方法。
(項目39)
ハイブリダイズしていないTSOおよびハイブリダイズしていないssDNAライブラリーのメンバーを取り除く工程をさらに包含する、項目25または26に記載の方法。
(項目40)
工程a)およびb)が、上記ssDNAライブラリーのメンバーおよび上記TSOが溶液中で浮遊性である場合に行われる、項目25または26に記載の方法。
(項目41)
上記単一の標的領域が、ゲノム領域に隣接する、項目25または26に記載の方法。
(項目42)
上記ゲノム領域が、癌関連遺伝子由来のエキソン領域の一部を含む、項目41に記載の方法。
(項目43)
項目42に記載の方法であって、上記癌関連遺伝子が、ABCA1、BRAF、CHD5、EP300、FLT1、ITPA、MYC、PIK3R1、SKP2、TP53、ABCA7、BRCA1、CHEK1、EPHA3、FLT3、JAK1、MYCL1、PIK3R2、SLC19A1、TP73、ABCB1、BRCA2、CHEK2、EPHA5、FLT4、JAK2、MYCN、PKHD1、SLC1A6、TPM3、ABCC2、BRIP1、CLTC、EPHA6、FN1、JAK3、MYH2、PLCB1、SLC22A2、TPMT、ABCC3、BUB1B、COL1A1、EPHA7、FOS、JUN、MYH9、PLCG1、SLCO1B3、TPO、ABCC4、C1orf144、COPS5、EPHA8、FOXO1、KBTBD11、NAV3、PLCG2、SMAD2、TPR、ABCG2、CABLES1、CREB1、EPHB1、FOXO3、KDM6A、NBN、PML、SMAD3、TRIO、ABL1、CACNA2D1、CREBBP、EPHB4、FOXP4、KDR、NCOA2、PMS2、SMAD4、TRRAP、ABL2、CAMKV、CRKL、EPHB6、GAB1、KIT、NEK11、PPARG、SMARCA4、TSC1、ACVR1B、CARD11、CRLF2、EPO、GATA1、KLF6、NF1、PPARGC1A、SMARCB1、TSC2、ACVR2A、CARM1、CSF1R、ERBB2、GLI1、KLHDC4、NF2、PPP1R3A、SMO、TTK、ADCY9、CAV1、CSMD3、ERBB3、GLI3、KRAS、NKX2−1、PPP2R1A、SOCS1、TYK2、AGAP2、CBFA2T3、CSNK1G2、ERBB4、GNA11、LMO2、NOS2、PPP2R1B、SOD2、TYMS、AKT1、CBL、CTNNA1、ERCC1、GNAQ、LRP1B、NOS3、PRKAA2、SOS1、UGT1A1、AKT2、CCND1、CTNNA2、ERCC2、GNAS、LRP2、NOTCH1、PRKCA、SOX10、UMPS、AKT3、CCND2、CTNNB1、ERCC3、GPR124、LRP6、NOTCH2、PRKCZ、SOX2、USP9X、ALK、CCND3、CYFIP1、ERCC4、GPR133、LTK、NOTCH3、PRKDC、SP1、VEGF、ANAPC5、CCNE1、CYLD、ERCC5、GRB2、MAN1B1、NPM1、PTCH1、SPRY2、VEGFA、APC、CD40LG、CYP19A1、ERCC6、GSK3B、MAP2K1、NQO1、PTCH2、SRC、VHL、APC2、CD44、CYP1B1、ERG、GSTP1、MAP2K2、NR3C1、PTEN、ST6GAL2、WRN、AR、CD79A、CYP2C19、ERN2、GUCY1A2、MAP2K4、NRAS、PTGS2、STAT1、WT1、ARAF、CD79B、CYP2C8、ESR1、HDAC1、MAP2K7、NRP2、PTPN11、STAT3、XPA、ARFRP1、CDC42、CYP2D6、ESR2、HDAC2、MAP3K1、NTRK1、PTPRB、STK11、XPC、ARID1A、CDC42BPB、CYP3A4、ETV4、HGF、MAPK1、NTRK2、PTPRD、SUFU、ZFY、ATM、CDC73、CYP3A5、EWSR1、HIF1A、MAPK3、NTRK3、RAD50、SULT1A1、ZNF521、ATP5A1、CDH1、DACH2、EXT1、HM13、MAPK8、OMA1、RAD51、SUZ12、ATR、CDH10、DCC、EZH2、HMGA1、MARK3、OR10R2、RAF1、TAF1、AURKA、CDH2、DCLK3、FANCA、HNF1A、MCL1、PAK3、RARA、TBX22、AURKB、CDH20、DDB2、FANCD2、HOXA3、MDM2、PARP1、RB1、TCF12、BAI3、CDH5、DDR2、FANCE、HOXA9、MDM4、PAX5、REM1、TCF3、BAP1、CDK2、DGKB、FANCF、HRAS、MECOM、PCDH15、RET、TCF4、BARD1、CDK4、DGKZ、FAS、HSP90AA1、MEN1、PCDH18、RICTOR、TEK、BAX、CDK6、DIRAS3、FBXW7、IDH1、MET、PCNA、RIPK1、TEP1、BCL11A、CDK7、DLG3、FCGR3A、IDH2、MITF、PDGFA、ROR1、TERT、BCL2、CDK8、DLL1、FES、IFNG、MLH1、PDGFB、ROR2、TET2、BCL2A1、CDKN1A、DNMT1、FGFR1、IGF1R、MLL、PDGFRA、ROS1、TGFBR2、BCL2L1、CDKN1B、DNMT3A、FGFR2、IGF2R、MLL3、PDGFRB、RPS6KA2、THBS1、BCL2L2、CDKN2A、DNMT3B、FGFR3、IKBKE、MPL、PDZRN3、RPTOR、TNFAIP3、BCL3、CDKN2B、DOT1L、FGFR4、IKZF1、MRE11A、PHLPP2、RSPO2、TNKS、BCL6、CDKN2C、DPYD、FH、IL2RG、MSH2、PIK3C3、RSPO3、TNKS2、BCR、CDKN2D、E2F1、FHOD3、INHBA、MSH6、PIK3CA、RUNX1、TNNI3K、BIRC5、CDX2、EED、FIGF、INSR、MTHFR、PIK3CB、SDHB、TNR、BIRC6、CEBPA、EGF、FLG2、IRS1、MTOR、PIK3CD、SF3B1、TOP1、BLM、CERK、EGFR、FLNC、IRS2、MUTYH、PIK3CG、SHC1、およびTOP2A、からなる群より選択される、方法。
(項目44)
上記ライゲーション方法が、一本鎖ライゲーション方法である、項目25に記載の方法。
(項目45)
上記一本鎖ライゲーション方法が、RNAリガーゼの使用を含む、項目26または44に記載の方法。
(項目46)
上記RNAリガーゼが、CircLigaseまたはCircLigase IIである、項目45に記載の方法。
(項目47)
一本鎖DNAライブラリーを調製する方法であって、上記方法は:
(a)二本鎖DNAフラグメントを一本鎖DNA(ssDNA)フラグメントに変性させる工程と;
(b)上記ssDNAフラグメントから5’側のホスフェートを取り除く工程と;
(c)一本鎖プライマードッキングオリゴヌクレオチド(pdo’s)を、上記ssDNAフラグメントの3’末端に連結する工程であって、ここで上記pdo’sが、固定化された捕獲試薬に結合可能な捕獲部分に対してコンジュゲートされる、工程と;
(d)プライマーを上記pdo’sにハイブリダイズさせる工程であって、上記プライマーが、アダプターオリゴヌクレオチド配列に対して相補的な配列を含み、かつ配列決定プラットフォームに対してカップリングされた支持体結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも70%同一である、第一のアダプター配列を含む、工程と;
(e)ハイブリダイズした上記プライマーを伸長して、二重鎖を作成する工程であって、ここで各々の二重鎖が、ssフラグメントおよび伸長したプライマー鎖を含む工程と;
(f)上記固定化された捕獲試薬に対して上記二重鎖を固定化する工程と;
(g)上記二本鎖伸長生成物を変性する工程であって、ここで上記変性が、上記固定化された捕獲試薬からの上記伸長されたプライマー鎖の遊離と、上記固定化された捕獲試薬上の上記ssDNAフラグメントの保持を生じる、工程と;
(h)上記伸長されたプライマー鎖を収集する工程であって、ここで上記伸長されたプライマー鎖が上記ssDNAライブラリーを含む、工程と、
を包含する、方法。
(項目48)
工程(c)が、上記pdo’sに対する上記ssDNAフラグメントのうち少なくとも50%のライゲーションを生じる、項目47に記載の方法。
(項目49)
上記連結する工程が、ATP依存性リガーゼを用いて行われる、項目47に記載の方法。
(項目50)
上記ATP依存性リガーゼがRNAリガーゼである、項目49に記載の方法。
(項目51)
上記RNAリガーゼが、CircLigaseまたはCircLigase IIである、項目50に記載の方法。
(項目52)
上記pdo’sがアデニル化されている、項目47に記載の方法。
(項目53)
上記伸長させる工程が、校正DNAポリメラーゼを用いて行われる、項目47に記載の方法。
(項目54)
一本鎖DNAライブラリーを調製する方法であって、上記方法は、以下:
(a)二本鎖DNAフラグメントを一本鎖DNA(ssDNA)フラグメントに変性する工程と;
(b)第一の一本鎖アダプター配列を上記ssDNAフラグメントの第一の末端に連結する工程と;
(c)第二の一本鎖アダプター配列を上記ssDNAフラグメントの第二の末端に連結する工程と、
を包含する、方法。
(項目55)
以下:
(a)プライマードッキングオリゴヌクレオチド(pdo)であって、上記pdoが、固定化された捕獲試薬に結合可能な捕獲部分にコンジュゲートされる、プライマードッキングオリゴヌクレオチド(pdo)と;
(b)プライマーであって、上記プライマーが、上記pdo配列に対して少なくとも70%相補性である配列を含み、かつ配列決定プラットフォームにカップリングされた第一の支持体結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも70%同一である、第一のアダプター配列をさらに含む、プライマーと;
(c)使用説明書と、
を含む、キット。
(項目56)
ATP依存性リガーゼをさらに含む、項目55に記載のキット。
(項目57)
上記ATP依存性リガーゼがRNAリガーゼである、項目56に記載のキット。
(項目58)
上記RNAリガーゼがCircLigaseまたはCircLigase IIである、項目57に記載のキット。
(項目59)
校正DNAポリメラーゼをさらに含む、項目55に記載のキット。
(項目60)
上記固定化された捕獲試薬をさらに含む、項目55に記載のキット。
(項目61)
上記第一のアダプター配列が、第一の配列決定プライマーに対して少なくとも70%相補的である配列を含む、項目55に記載のキット。
(項目62)
上記第一のアダプター配列が、バーコード配列を含む、項目55に記載のキット。
(項目63)
標的選択性オリゴヌクレオチド(TSO)をさらに含む、項目55に記載のキット。
(項目64)
上記TSOが、第一の末端に位置するが、第二の末端には位置しない第二のアダプター配列をさらに含む、項目63に記載のキット。
(項目65)
上記TSOの上記第一の末端が5’末端である、項目64に記載のキット。
(項目66)
上記第二のアダプター配列が、配列決定プラットフォームに対してカップリングされた第二の支持体結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも70%同一である配列を含む、項目64に記載のキット。
(項目67)
上記第二のアダプター配列が、配列決定プライマーに対する結合部位を含む、項目64に記載のキット。
(項目68)
以下:
(a)第一のアダプターオリゴヌクレオチドであって、ここで上記第一のアダプターが、配列決定プラットフォームに対してカップリングされた第一の支持体結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも70%相補性である配列を含む、第一のアダプターオリゴヌクレオチドと;
(b)第二のアダプターオリゴヌクレオチドであって、ここで上記第二のアダプターが、上記第一のアダプターオリゴヌクレオチドとは別個である配列を含む、第二のアダプターオリゴヌクレオチドと;
(c)RNAリガーゼと;
(d)使用説明書と、
を含む、キット。
(項目69)
上記第二のアダプターが、配列決定プライマーに対して少なくとも70%相補的な配列を含む、項目68に記載のキット。
(項目70)
上記第二のアダプターが、配列決定プラットフォームに対してカップリングされた第二の支持体結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも70%相補的な配列を含む、項目68に記載のキット。
(項目71)
上記第一のアダプターが、配列決定プライマーに対して少なくとも70%相補的な配列を含む、項目68に記載のキット。
(項目72)
上記第一のアダプターまたは上記第二のアダプターの1つが、バーコード配列を含む、項目68に記載のキット。
(項目73)
上記第一のアダプターが、3’末端塩基と別のヌクレオチドとの間の共有結合の形成を妨げる3’末端ブロック基を含む、項目68に記載のキット。
(項目74)
上記3’末端ブロック基が、ジデオキシ−dNTP、ビオチン、oアルキル、アミノ−アルキル、またはフルオロフォアジゴキシゲニン(digeoxygenin)である、項目73に記載のキット。
(項目75)
上記第一のアダプターが、5’ポリアデニル化配列を含む、項目68に記載のキット。(項目76)
上記RNAリガーゼが、T4またはMth由来の短縮されたまたは変異されたリガーゼ2である、項目68に記載のキット。
(項目77)
第二のRNAリガーゼをさらに含んでいる、項目68に記載のキット。
(項目78)
上記第二のRNAリガーゼがCircLigaseまたはCircLigase IIである、項目77に記載のキット。
(項目79)
オリゴヌクレオチドプライマーであって、以下:
(a)プローブ結合領域と;
(b)変異を保有すると疑われるテンプレート核酸に対して少なくとも50%相補的なテンプレート結合領域であって、ここで上記テンプレート結合領域の一部は、上記変異の疑わしい遺伝子座と少なくとも部分的を覆う、テンプレート結合領域と;を包含し、
(c)ここで、上記オリゴヌクレオチドプライマーは、上記テンプレート核酸に対するハイブリダイゼーションの際、上記変異が存在する場合は、ポリメラーゼによって伸長可能であるが、上記変異が存在しない場合は上記ポリメラーゼによって伸長可能ではない、オリゴヌクレオチドプライマー。
(項目80)
上記変異が、一塩基多型(SNP)である、項目79に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(項目81)
上記テンプレート結合領域が、上記SNP遺伝子座を覆う3’末端領域を含む、項目80に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(項目82)
上記3’末端領域が、上記SNP遺伝子座の変異体対立遺伝子に対して相補性である、項目81に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(項目83)
上記3’末端領域が、上記SNP遺伝子座の野性型対立遺伝子に対して相補性である、項目81に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(項目84)
上記プローブ結合領域が、被験体由来のいかなるゲノム配列に対してもハイブリダイズしない、項目79に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(項目85)
上記ポリメラーゼが、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を欠いているDNAポリメラーゼである、項目79に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(項目86)
以下:
(a)オリゴヌクレオチドプライマーであって、上記オリゴヌクレオチドプライマーが、(i)プローブ結合領域、および(ii)変異を保有すると疑われるテンプレート核酸に対して少なくとも70%相補的なテンプレート結合領域であって、ここで上記テンプレート結合領域の一部が上記変異の疑わしい遺伝子座を少なくとも部分的に覆い、ここで上記オリゴヌクレオチドプライマーが、上記テンプレート核酸に対するハイブリダイゼーションの際に、上記変異が存在する場合はポリメラーゼによって伸長可能であるが、上記変異が存在しない場合は、上記ポリメラーゼによって伸長可能ではない、テンプレート結合領域を含む、オリゴヌクレオチドプライマーと;
(b)使用説明書と、
を含む、キット。
(項目87)
上記変異が一塩基多型(SNP)である、項目86に記載のキット。
(項目88)
上記テンプレート結合領域が、上記SNP遺伝子座を覆う3’末端塩基を含む、項目87に記載のキット。
(項目89)
上記3’末端塩基が、上記SNP遺伝子座の変異体対立遺伝子に対して相補的である、項目88に記載のキット。
(項目90)
上記3’末端塩基が、上記SNP遺伝子座の野性型対立遺伝子に対して相補的である、項目88に記載のキット。
(項目91)
上記プローブ結合領域が、被験体由来のいかなるゲノム配列に対してもハイブリダイズしない、項目86に記載のキット。
(項目92)
上記プローブ結合領域に対して少なくとも70%相補的であるレポータープローブをさらに含む、項目86に記載のキット。
(項目93)
上記レポータープローブが、検出可能部分およびクエンチャー部分を含み、ここで上記クエンチャー部分は、上記レポータープローブがインタクトである場合、上記検出可能部分の検出を抑制する、項目92に記載のキット。
(項目94)
上記オリゴヌクレオチドプライマーおよび上記レポータープローブからなるハイブリダイゼーション生成物が、上記オリゴヌクレオチドプライマーおよび上記テンプレート核酸からなるハイブリダイゼーション生成物のTmよりも少なくとも10度高いTmを有する、項目92に記載のキット。
(項目95)
上記遺伝子座の下流の逆相補配列に対して少なくとも70%相補的なリバースプライマーをさらに含む、項目86に記載のキット。
(項目96)
上記ポリメラーゼをさらに含む、項目86に記載のキット。
(項目97)
上記ポリメラーゼが、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有し、かつ3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を有さない熱安定性ポリメラーゼである、項目96に記載のキット。(項目98)
項目86に記載のキットであって、さらに(i)1つ以上の代替のオリゴヌクレオチドプライマーを含み、ここで上記1つ以上の代替のオリゴヌクレオチドプライマーは各々が、別個のプローブ結合領域および上記テンプレート核酸に対して少なくとも70%相補的であるテンプレート結合領域を含み、ここで上記テンプレート結合領域の一部が、上記遺伝子座を少なくとも部分的に覆い、ここで上記代替のオリゴヌクレオチドプライマーが、上記テンプレート核酸に対するハイブリダイゼーションの際に、代替の対立遺伝子が存在する場合は、ポリメラーゼによって伸長可能であるが、上記代替の対立遺伝子が存在しない場合は、上記ポリメラーゼによって伸長可能ではない、キット。
(項目99)
項目98に記載のキットであって、さらに1つ以上の代替のレポータープローブを含み、ここで上記代替のレポータープローブの各々が、上記別個のプローブ結合領域のうちの1つに対して少なくとも70%相補的であるが、上記キットのいかなる他のプローブ結合領域に対しても相補的ではない、キット。
(項目100)
項目99に記載のキットであって、ここで上記代替のレポータープローブの各々が、代替の検出可能部分およびクエンチャー部分を含み、ここで上記キットの上記検出可能部分の各々が、上記キットの任意の他の検出可能部分とは検出可能に(detestably)異なる、キット。
(項目101)
標的ポリヌクレオチド領域中の変異を検出する方法であって、上記方法は、以下:
(a)上記標的ポリヌクレオチド領域に対してオリゴヌクレオチドプライマーを選択的にハイブリダイズさせる工程であって、ここで上記オリゴヌクレオチドプライマーが、(i)プローブ結合領域と、(ii)変異を保有することが疑われるテンプレート核酸に対して少なくとも70%相補的なテンプレート結合領域とを含み、ここで上記テンプレート結合領域の一部が、上記変異の疑わしい遺伝子座を少なくとも部分的に覆い、かつここで上記オリゴヌクレオチドプライマーが、上記テンプレート核酸に対するハイブリダイゼーションの際に、上記変異が存在する場合は、ポリメラーゼによって伸長可能であるが、上記変異が存在しない場合は、上記ポリメラーゼによって伸長可能ではない、工程と;
(b)ハイブリダイズした上記オリゴヌクレオチドプライマーを伸長して、伸長生成物を形成する工程と;
(c)上記伸長生成物を検出する工程であって、ここで上記検出する工程が、上記変異の存在を示す、工程と;
を包含する、方法。
(項目102)
上記伸長させる工程が、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を含まないDNAポリメラーゼで伸長させる工程を包含する、項目101に記載の方法。
(項目103)
上記検出する工程が、レポータープローブを上記プローブ結合領域に対して選択的にハイブリダイズさせる工程を包含する、項目101に記載の方法。
(項目104)
上記レポータープローブが、検出可能部分およびクエンチャー部分を含み、ここで上記クエンチャー部分は、上記レポータープローブがインタクトな場合、上記検出可能部分の検出を抑制する、項目103に記載の方法。
(項目105)
上記検出する工程がさらに、ハイブリダイズした上記レポータープローブの上記クエンチャー部分から上記検出可能部分を分離する工程を包含する、項目104に記載の方法。(項目106)
上記伸長生成物を、上記遺伝子座の下流の上記伸長生成物のある領域に対してハイブリダイズ可能なリバースプライマーを用いて増幅する工程をさらに包含する、項目103に記載の方法。
(項目107)
上記増幅する工程が、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を含むDNAポリメラーゼで増幅する工程を包含する、項目106に記載の方法。
(項目108)
上記オリゴヌクレオチドプライマーおよびレポータープローブのハイブリダイゼーション生成物が、上記オリゴヌクレオチドプライマーと標的ポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーション生成物のTmよりも少なくとも10度高いTmを有する、項目103に記載の方法。
(項目109)
上記レポータープローブの濃度が、上記フォワードプライマーの濃度の少なくとも10×である、項目103に記載の方法。
(項目110)
項目101に記載の方法であって、上記標的ポリヌクレオチド領域に対して1つ以上の代替のオリゴヌクレオチドプライマーを選択的にハイブリダイズさせる工程をさらに包含し、ここで上記1つ以上の代替のオリゴヌクレオチドプライマーが各々、別個のプローブ結合領域および上記テンプレート核酸に対して少なくとも70%相補的であるテンプレート結合領域を含み、ここで上記テンプレート結合領域の一部が、上記遺伝子座を少なくとも部分的に覆い、ここで上記代替のオリゴヌクレオチドプライマーが、上記テンプレート核酸に対するハイブリダイゼーションの際に、代替の対立遺伝子が存在する場合は、ポリメラーゼによって伸長可能であるが、上記代替の対立遺伝子が存在しない場合は、上記ポリメラーゼによって伸長可能ではない、方法。
(項目111)
上記検出する工程がさらに、上記1つ以上の代替のオリゴヌクレオチドプライマーに対して1つ以上の代替のレポータープローブを選択的にハイブリダイズさせる工程を包含し、ここで上記代替のレポータープローブの各々が、上記別個のプローブ結合領域の1つに対して少なくとも70%相補的であるが、上記プローブ結合領域の他のいずれに対しても相補的ではない、項目110に記載の方法。
(項目112)
上記代替のレポータープローブの各々が、代替の検出可能部分およびクエンチャー部分を含み、ここで上記代替の検出可能部分の各々が、上記検出可能部分の他のいずれとも検出可能に異なる、項目111に記載の方法。
(項目113)
上記変異が、一塩基多型(SNP)である、項目101に記載の方法。
(項目114)
上記テンプレート結合領域が、上記SNP遺伝子座を覆う塩基を有する3’末端領域を含む、項目113に記載の方法。
(項目115)
上記塩基が、上記SNP遺伝子座の変異体対立遺伝子に対して相補的である、項目114に記載の方法。
(項目116)
上記塩基が、上記SNP遺伝子座の野性型対立遺伝子に対して相補的である、項目114に記載の方法。
(項目117)
上記プローブ結合領域が、上記標的ポリヌクレオチド領域に対してハイブリダイズしない、項目101に記載の方法。
(項目118)
上記核酸サンプルが、工程b−cの前に複数の別個の反応容積に細かく分割される、項目101に記載の方法。
(項目119)
上記反応容積の各々において上記検出可能な部分の検出をさらに包含する、項目118に記載の方法。
(項目120)
多数の上記反応容積をカウントする工程をさらに包含し、ここで上記検出可能部分が検出される、項目119に記載の方法。
(項目121)
上記複数の個別の反応容積が平均で1未満のテンプレート核酸分子を含むように、上記核酸サンプルが細かく分割される、項目118に記載の方法。
(項目122)
結論を提供する工程およびネットワークをわたって上記結論を伝達する工程をさらに包含する、項目101に記載の方法。
(項目123)
以下:
(a)テンプレート核酸に対してハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドプライマーであって、ここで上記テンプレート核酸は、ある遺伝子座で野性型対立遺伝子を含み、ここで上記オリゴヌクレオチドプライマーの3’末端領域は、上記遺伝子座を覆い、かつ上記野性型対立遺伝子に相補的ではない、オリゴヌクレオチドプライマーと;
(b)検出可能部分およびクエンチャー部分を含むインタクトなレポータープローブであって、ここで上記インタクトなレポータープローブが、上記オリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズされる、レポータープローブと、
を含む、組成物。
(項目124)
高効率のライゲーション反応を行う方法であって、複数のドナー核酸分子のうち少なくとも10%の第一の末端に対して複数のアクセプター核酸分子を連結する工程を包含し、ここで上記ドナーまたはアクセプター核酸分子のうちの1つは、120nt長を超える、方法。
(項目125)
高効率のライゲーション反応を行う方法であって、複数のアクセプター核酸分子のうち少なくとも10%の第一の末端に対して複数のドナー核酸分子を連結する工程を包含し、ここで上記ドナーまたはアクセプター核酸分子のうちの1つは、120nt長を超える、方法。
(項目126)
上記アクセプター核酸分子が上記ドナー核酸分子である、項目124または125に記載の方法。
(項目127)
項目124または125に記載の方法であって:
(a)ヌクレオシド一リン酸(NMP)担持ドナー核酸分子の蓄積を達成するのに十分な時間、反応混合物中で、ある量のドナー核酸分子にNMPを移動させる工程と;
(b)NMP担持ドナー核酸分子とアクセプター核酸分子との間の共有結合の形成を達成する工程と、を包含し、
ここで工程(a)および(b)が上記反応混合物中で逐次的に行われる、方法。
(項目128)
上記移動させる工程が、上記ドナー核酸分子の少なくとも10%までNMPの移動を生じる、項目127に記載の方法。
(項目129)
上記移動させる工程が、上記ドナー核酸分子の少なくとも50%までNMPの移動を生じる、項目128に記載の方法。
(項目130)
上記移動させる工程が、上記ドナー核酸分子の少なくとも70%までNMPの移動を生じる、項目128に記載の方法。
(項目131)
上記移動させる工程が、上記ドナー核酸分子の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%までNMPの移動を生じる、項目128に記載の方法。
(項目132)
上記NMPがAMPである、項目127〜131のいずれかに記載の方法。
(項目133)
上記NMPがGMPである、項目127〜131のいずれかに記載の方法。
(項目134)
上記ドナー核酸分子の少なくとも1つのメンバーの3’末端領域が、未改変の3’末端領域である、項目127に記載の方法。
(項目135)
項目127に記載の方法であって、上記反応混合物が、以下:
(a)ドナー核酸分子の上記量に対して少なくとも等モルである量のヌクレオシド三リン酸(NTP)依存性リガーゼと;
(b)上記ATP依存性リガーゼのミカエリス定数(Km)より少なくとも10倍高い量で存在するNTPと;
を含む、方法。
(項目136)
上記NTP依存性リガーゼがRNAリガーゼである、項目135に記載の方法。
(項目137)
上記RNAリガーゼが、好熱性のRNAリガーゼである、項目135に記載の方法。
(項目138)
上記NTP依存性リガーゼがATP依存性RNAリガーゼである、項目135に記載の方法。
(項目139)
上記ATP依存性RNAリガーゼがMthRnl、T4 RNAリガーゼ、CircLigase、またはCircLigase IIである、項目138に記載の方法。
(項目140)
上記ATP依存性リガーゼがCircLigaseまたはCircLigase IIである、項目139に記載の方法。
(項目141)
上記NTP依存性リガーゼがGTP依存性RNAリガーゼである、項目135に記載の方法。
(項目142)
上記GTP依存性RNAリガーゼがRtcBである、項目141に記載の方法。
(項目143)
ドナー核酸分子の3’末端領域が、3’末端ブロック基で改変されている、項目135に記載の方法。
(項目144)
上記共有結合の形成を達成する工程が、上記反応混合物に対して、以下:
(a)上記アクセプター核酸分子と;
(b)Mn2+と、
を添加する工程を包含する、項目135に記載の方法。
(項目145)
上記Mn2+が、少なくとも2.5mMの量で存在する、項目144に記載の方法。
(項目146)
上記反応混合物中の上記NTPの濃度を低下させる工程をさらに包含する、項目144に記載の方法。
(項目147)
上記濃度を低下させる工程が、上記NTPの濃度を高くても10分の1に低下させる工程を包含する、項目146に記載の方法。
(項目148)
上記濃度を低下させる工程が、上記NTPを少なくとも10倍希釈するのに十分な量の液体を上記反応混合物に添加する工程を包含する、項目146に記載の方法。
(項目149)
上記ドナー核酸分子が、生物学的供給源から単離された核酸分子を含み、かつここで上記アクセプター核酸分子がアダプター配列を含む、項目127〜148のいずれかに記載の方法。
(項目150)
上記アクセプター核酸分子が、生物学的被験体から単離された核酸を含み、かつここで上記ドナー核酸分子がアダプター配列を含む、項目127〜149のいずれかに記載の方法。
(項目151)
上記アクセプター核酸分子が、生物学的被験体から単離された核酸を含み、かつここで上記ドナー核酸分子がバーコード配列を含む、項目127〜148のいずれかに記載の方法。
(項目152)
上記ドナー核酸分子が生物学的被験体から単離された核酸を含み、かつここで上記アクセプター核酸分子がバーコード配列を含む、項目127〜148のいずれかに記載の方法。
(項目153)
上記アクセプター核酸分子またはドナー核酸分子が、検出可能タグを含む、項目127〜148のいずれかに記載の方法。
(項目154)
核酸ライブラリーを調製する方法であって、複数のテンプレート核酸分子のうち少なくとも10%の第一の末端に対してオリゴヌクレオチド配列を連結して、上記核酸ライブラリーを作成する工程を包含し、ここで上記テンプレート核酸分子のうちの1つが120nt長を超える、方法。
(項目155)
上記複数のテンプレート核酸分子のうち少なくとも50%の第一の末端に対してオリゴヌクレオチド配列を連結する工程を包含する、項目154に記載の方法。
(項目156)
上記複数のテンプレート核酸分子のうち少なくとも70%の第一の末端に対してオリゴヌクレオチド配列を連結する工程を包含する、項目154に記載の方法。
(項目157)
上記複数のテンプレート核酸分子のうち少なくとも90%の第一の末端に対してオリゴヌクレオチド配列を連結する工程を包含する、項目154に記載の方法。
(項目158)
上記オリゴヌクレオチド配列が、アダプター配列である、項目154に記載の方法。
(項目159)
上記核酸ライブラリーを配列決定する工程をさらに包含する、項目158に記載の方法。
(項目160)
上記オリゴヌクレオチド配列が検出可能標識を含む、項目154に記載の方法。
(項目161)
上記核酸ライブラリーをアレイハイブリダイゼーションによって分析する工程をさらに包含する、項目160に記載の方法。
(項目162)
核酸ライブラリーを調製する方法であって、以下:
(a)複数のテンプレート核酸分子のうちの少なくとも10%の第一の末端に対してアダプター配列を連結して上記核酸ライブラリーを作成する工程と;
(b)上記核酸ライブラリーを配列決定する工程と;
を包含する、方法。
(項目163)
上記配列決定が、上記核酸ライブラリーの予備増幅なしで行われる、項目159または162に記載の方法。
(項目164)
上記複数のテンプレート核酸分子が、ゲノムDNA(gDNA)を含む、項目154または162に記載の方法。
(項目165)
上記gDNAが、固体組織サンプルから単離される、項目164に記載の方法。
(項目166)
上記gDNAが血漿、血清、痰、唾液、尿、または汗から単離される、項目164に記載の方法。
(項目167)
上記複数のテンプレート核酸分子が、一本鎖核酸フラグメントを含む、項目154または162に記載の方法。
(項目168)
上記複数のテンプレート核酸分子のうち少なくとも50%の第一の末端に対してアダプター配列を連結する工程を包含する、項目154または162に記載の方法。
(項目169)
上記複数のテンプレート核酸分子のうち少なくとも70%の第一の末端に対してアダプター配列を連結する工程を包含する、項目154または162に記載の方法。
(項目170)
上記複数のテンプレート核酸分子のうち少なくとも90%の第一の末端に対してアダプター配列を連結する工程を包含する、項目154または162に記載の方法。
(項目171)
上記複数のテンプレート核酸分子のうち少なくとも95%の第一の末端に対してアダプター配列を連結する工程を包含する、項目154または162に記載の方法。
(項目172)
項目154または162に記載の方法であって、上記連結する工程が、以下:
(a)ヌクレオシド一リン酸(NMP)担持反応物質1の蓄積を達成するのに十分な時間、第一の反応混合物中である量の核酸の第一の集団(反応物質1)までNMPを移動させる工程と;
(b)上記NMP担持反応物質1と核酸の第二の集団(反応物質2)との間の共有結合の形成を達成する工程を包含し、
ここで上記反応物質1が、(i)上記複数のテンプレート核酸または(ii)上記オリゴヌクレオチドもしくはアダプター配列の一方であり、ここで上記反応物質2が(i)上記複数のテンプレート核酸または(ii)上記オリゴヌクレオチドもしくはアダプター配列の他方であり、かつここでアデニル化された上記反応物質1が上記共有結合の形成を達成する工程の前に精製されない、方法。
(項目173)
上記移動させる工程が、上記反応物質1の少なくとも10%までNMPの移動を生じる、項目172に記載の方法。
(項目174)
上記移動させる工程が、上記反応物質1の少なくとも50%までNMPの移動を生じる、項目173に記載の方法。
(項目175)
上記移動させる工程が、上記反応物質1の少なくとも70%までNMPの移動を生じる、項目173に記載の方法。
(項目176)
上記移動させる工程が、上記反応物質1の少なくとも90%までNMPの移動を生じる、項目173に記載の方法。
(項目177)
上記反応物質1の少なくとも1つのメンバーの3’末端領域が、未改変の3’末端領域である、項目172に記載の方法。
(項目178)
項目172に記載の方法であって、上記第一の反応混合物が、以下:
(a)上記反応物質1の量に対して少なくとも等モルである量のNTP依存性リガーゼと;
(b)上記NTP依存性リガーゼのミカエリス定数(Km)より少なくとも10倍高い量で存在するNTPと;
を含む、方法。
(項目179)
上記NTP依存性リガーゼがRNAリガーゼである、項目178に記載の方法。
(項目180)
上記RNAリガーゼが、好熱性のRNAリガーゼである、項目179に記載の方法。
(項目181)
上記NTP依存性リガーゼがATP依存性RNAリガーゼである、項目179に記載の方法。
(項目182)
上記ATP依存性RNAリガーゼがMthRnl、T4 RNAリガーゼ、CircLigase、またはCircLigase IIである、項目181に記載の方法。
(項目183)
上記ATP依存性リガーゼがCircLigaseまたはCircLigase IIである、項目182に記載の方法。
(項目184)
上記NTP依存性リガーゼがGTP依存性RNAリガーゼである、項目179に記載の方法。
(項目185)
上記GTP依存性RNAリガーゼがRtcBである、項目184に記載の方法。
(項目186)
反応物質1の少なくとも1つのメンバーの3’末端領域が、3’末端ブロック基で改変されている、項目172に記載の方法。
(項目187)
上記共有結合の形成を達成する工程が、上記第一の反応混合物に対して、以下:
(a)陽イオンと;
(b)上記反応物質2と;
(c)上記NTPを少なくとも10倍希釈するのに十分な量の液体と、
を添加する工程を包含する、項目178に記載の方法。
(項目188)
上記陽イオンがMn2+である、項目187に記載の方法。
(項目189)
上記複数のテンプレート核酸分子のうち少なくとも10%の第二の末端に対して第二のアダプター配列を連結する工程をさらに包含する、項目154または162に記載の方法。
(項目190)
上記複数のテンプレート核酸分子のうち少なくとも50%の第二の末端に対して第二のアダプター配列を連結する工程をさらに包含する、項目154または162に記載の方法。
(項目191)
上記複数のテンプレート核酸分子のうち少なくとも70%の第二の末端に対して第二のアダプター配列を連結する工程をさらに包含する、項目154または162に記載の方法。
(項目192)
上記複数のテンプレート核酸分子のうち少なくとも90%の第二の末端に対して第二のアダプター配列を連結する工程をさらに包含する、項目154または162に記載の方法。
(項目193)
項目154または162に記載の方法であって、さらに以下:
(a)上記DNAライブラリーのメンバーに対して、標的選択性オリゴヌクレオチド(tso)をハイブリダイズさせる工程であって、上記標的選択性オリゴヌクレオチドが、(i)gDNAのある領域に特異的な配列と、(ii)第二のアダプター配列とを含む、工程と;
(b)ハイブリダイズした上記tsoを伸長して、上記第一および第二のアダプターを含む二本鎖ライブラリーのメンバーを作成する工程と、
を包含する、方法。
(項目194)
上記tsoが、癌関連遺伝子のある領域に対して少なくとも70%の同一性または相補性を有する配列を含む、項目193に記載の方法。
(項目195)
上記配列決定が、大規模並列配列決定を包含する、項目159または162のいずれかに記載の方法。
(項目196)
上記連結する工程が、3時間未満行われ得る、反応プロトコールを用いて行われる、項目154または162に記載の方法。
(項目197)
以下:
(a)NTP依存性リガーゼと;
(b)陽イオンと;
(c)NTPと;
(d)項目____のいずれかに記載の方法を行うための使用説明書と;
を含む、キット。
(項目198)
上記NTPがATPである、項目197に記載のキット。
(項目199)
上記NTP依存性リガーゼがATP依存性リガーゼである、項目198に記載のキット。
(項目200)
上記ATP依存性リガーゼがATP依存性RNAリガーゼである、項目199に記載のキット。
(項目201)
上記ATP依存性RNAリガーゼが、MthRnl、T4 RNAリガーゼ、CircLigase、またはCircLigase IIである、項目200に記載のキット。(項目202)
上記ATP依存性リガーゼがCircLigaseまたはCircLigase IIである、項目201に記載のキット。
(項目203)
上記NTPがGTPである、項目197に記載のキット。
(項目204)
上記NTP依存性リガーゼがGTP依存性リガーゼである、項目203に記載のキット。
(項目205)
上記GTP依存性リガーゼがGTP依存性RNAリガーゼである、項目204に記載のキット。
(項目206)
上記GTP依存性RNAリガーゼがRtcBである、項目205に記載のキット。
(項目207)
被験体の腫瘍から単離された腫瘍ゲノムDNA(gDNA)および上記被験体由来の非腫瘍組織から単離された正常なgDNAを用いて、腫瘍特異的な変異を追跡する方法であって、上記方法は、以下:
(a)予備増幅なしで上記腫瘍gDNAから調製されたDNAライブラリーを配列決定して第一のデータセットを作成する工程と;
(b)予備増幅なしで上記正常なgDNAから調製されたDNAライブラリーを配列決定して第二のデータセットを作成する工程と;
(c)上記第一のデータセットおよび上記第二のデータセットを分析して、上記被験体における1つ以上の腫瘍特異的な変異を同定する工程と;
(d)上記被験体由来の液体サンプルから単離された無細胞DNA中で上記腫瘍特異的な変異の存在または不在を検出する工程と、
を包含する、方法。
(項目208)
上記液体サンプルが、血漿、血清、痰、唾液、尿、および汗からなる群より選択される、項目207に記載の方法。
(項目209)
工程(a)または(b)の上記DNAライブラリーが、項目154または162に記載の方法を用いて調製される、項目207に記載の方法。
(項目210)
上記配列決定が、少なくとも200個の癌関連遺伝子を配列決定する工程を包含する、項目207に記載の方法。
(項目211)
上記癌関連遺伝子が、ABCA1、BRAF、CHD5、EP300、FLT1、ITPA、MYC、PIK3R1、SKP2、TP53、ABCA7、BRCA1、CHEK1、EPHA3、FLT3、JAK1、MYCL1、PIK3R2、SLC19A1、TP73、ABCB1、BRCA2、CHEK2、EPHA5、FLT4、JAK2、MYCN、PKHD1、SLC1A6、TPM3、ABCC2、BRIP1、CLTC、EPHA6、FN1、JAK3、MYH2、PLCB1、SLC22A2、TPMT、ABCC3、BUB1B、COL1A1、EPHA7、FOS、JUN、MYH9、PLCG1、SLCO1B3、TPO、ABCC4、C1orf144、COPS5、EPHA8、FOXO1、KBTBD11、NAV3、PLCG2、SMAD2、TPR、ABCG2、CABLES1、CREB1、EPHB1、FOXO3、KDM6A、NBN、PML、SMAD3、TRIO、ABL1、CACNA2D1、CREBBP、EPHB4、FOXP4、KDR、NCOA2、PMS2、SMAD4、TRRAP、ABL2、CAMKV、CRKL、EPHB6、GAB1、KIT、NEK11、PPARG、SMARCA4、TSC1、ACVR1B、CARD11、CRLF2、EPO、GATA1、KLF6、NF1、PPARGC1A、SMARCB1、TSC2、ACVR2A、CARM1、CSF1R、ERBB2、GLI1、KLHDC4、NF2、PPP1R3A、SMO、TTK、ADCY9、CAV1、CSMD3、ERBB3、GLI3、KRAS、NKX2−1、PPP2R1A、SOCS1、TYK2、AGAP2、CBFA2T3、CSNK1G2、ERBB4、GNA11、LMO2、NOS2、PPP2R1B、SOD2、TYMS、AKT1、CBL、CTNNA1、ERCC1、GNAQ、LRP1B、NOS3、PRKAA2、SOS1、UGT1A1、AKT2、CCND1、CTNNA2、ERCC2、GNAS、LRP2、NOTCH1、PRKCA、SOX10、UMPS、AKT3、CCND2、CTNNB1、ERCC3、GPR124、LRP6、NOTCH2、PRKCZ、SOX2、USP9X、ALK、CCND3、CYFIP1、ERCC4、GPR133、LTK、NOTCH3、PRKDC、SP1、VEGF、ANAPC5、CCNE1、CYLD、ERCC5、GRB2、MAN1B1、NPM1、PTCH1、SPRY2、VEGFA、APC、CD40LG、CYP19A1、ERCC6、GSK3B、MAP2K1、NQO1、PTCH2、SRC、VHL、APC2、CD44、CYP1B1、ERG、GSTP1、MAP2K2、NR3C1、PTEN、ST6GAL2、WRN、AR、CD79A、CYP2C19、ERN2、GUCY1A2、MAP2K4、NRAS、PTGS2、STAT1、WT1、ARAF、CD79B、CYP2C8、ESR1、HDAC1、MAP2K7、NRP2、PTPN11、STAT3、XPA、ARFRP1、CDC42、CYP2D6、ESR2、HDAC2、MAP3K1、NTRK1、PTPRB、STK11、XPC、ARID1A、CDC42BPB、CYP3A4、ETV4、HGF、MAPK1、NTRK2、PTPRD、SUFU、ZFY、ATM、CDC73、CYP3A5、EWSR1、HIF1A、MAPK3、NTRK3、RAD50、SULT1A1、ZNF521、ATP5A1、CDH1、DACH2、EXT1、HM13、MAPK8、OMA1、RAD51、SUZ12、ATR、CDH10、DCC、EZH2、HMGA1、MARK3、OR10R2、RAF1、TAF1、AURKA、CDH2、DCLK3、FANCA、HNF1A、MCL1、PAK3、RARA、TBX22、AURKB、CDH20、DDB2、FANCD2、HOXA3、MDM2、PARP1、RB1、TCF12、BAI3、CDH5、DDR2、FANCE、HOXA9、MDM4、PAX5、REM1、TCF3、BAP1、CDK2、DGKB、FANCF、HRAS、MECOM、PCDH15、RET、TCF4、BARD1、CDK4、DGKZ、FAS、HSP90AA1、MEN1、PCDH18、RICTOR、TEK、BAX、CDK6、DIRAS3、FBXW7、IDH1、MET、PCNA、RIPK1、TEP1、BCL11A、CDK7、DLG3、FCGR3A、IDH2、MITF、PDGFA、ROR1、TERT、BCL2、CDK8、DLL1、FES、IFNG、MLH1、PDGFB、ROR2、TET2、BCL2A1、CDKN1A、DNMT1、FGFR1、IGF1R、MLL、PDGFRA、ROS1、TGFBR2、BCL2L1、CDKN1B、DNMT3A、FGFR2、IGF2R、MLL3、PDGFRB、RPS6KA2、THBS1、BCL2L2、CDKN2A、DNMT3B、FGFR3、IKBKE、MPL、PDZRN3、RPTOR、TNFAIP3、BCL3、CDKN2B、DOT1L、FGFR4、IKZF1、MRE11A、PHLPP2、RSPO2、TNKS、BCL6、CDKN2C、DPYD、FH、IL2RG、MSH2、PIK3C3、RSPO3、TNKS2、BCR、CDKN2D、E2F1、FHOD3、INHBA、MSH6、PIK3CA、RUNX1、TNNI3K、BIRC5、CDX2、EED、FIGF、INSR、MTHFR、PIK3CB、SDHB、TNR、BIRC6、CEBPA、EGF、FLG2、IRS1、MTOR、PIK3CD、SF3B1、TOP1、BLM、CERK、EGFR、FLNC、IRS2、MUTYH、PIK3CG、SHC1、およびTOP2Aからなる群より選択される、項目210に記載の方法。
(項目212)
上記腫瘍特異的な変異のプロファイルを連絡するレポートを作成する工程をさらに包含する、項目207に記載の方法。
(項目213)
工程(d)が、複数の時点で行われる、項目207に記載の方法。
(項目214)
1つの時点が、癌治療の最初の施行の前であり、かつ第二の時点が上記最初の施行に引き続く、項目213に記載の方法。
(項目215)
上記複数の時点で腫瘍特異的な変異のプロファイルを連絡するレポートを作成する工程をさらに包含する、項目213に記載の方法。
(項目216)
上記レポートが、上記腫瘍特異的変異の1つを保有する遺伝子を標的にする1つ以上の治療候補のリストを含む、項目212または215に記載の方法。
(項目217)
上記レポートが上記gDNAを単離する工程から1週で作成される、項目212に記載の方法。
(項目218)
上記変異が、コピー数変動を含む、項目207に記載の方法。
(項目219)
上記検出する工程が、上記無細胞DNAを配列決定する工程を包含する、項目207に記載の方法。
(項目220)
項目219に記載の方法であって、上記無細胞DNA中に存在する少なくとも10個の癌関連遺伝子を配列決定する工程を包含し、ここで上記少なくとも10個の癌関連遺伝子のうちの1つが、項目207の工程c)において、腫瘍特異的な変異を保有していると同定される、方法。
(項目221)
項目219に記載の方法であって、上記無細胞DNA中に存在する少なくとも100個の癌関連遺伝子を配列決定する工程を包含し、ここで上記少なくとも100個の癌関連遺伝子のうちの1つが、項目207の工程c)において、腫瘍特異的な変異を保有していると同定される、方法。
(項目222)
上記配列決定する工程が、項目159または162に記載の方法を包含する、項目219に記載の方法。
(項目223)
アンプリコンの感度のよい検出のためのオリゴヌクレオチドプローブであって、以下:
(a)検出可能部分と;
(b)クエンチャー部分と;
(c)50℃未満の融点(Tm)と、
を含む、オリゴヌクレオチドプローブ。
(項目224)
上記プローブが、8〜30の長さのヌクレオチドを有する、項目223に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目225)
上記検出可能部分が、55℃以上の温度でクエンチされる、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目226)
上記プローブが、55℃を超える周囲温度で相補的なテンプレート核酸に対してハイブリダイズしない、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目227)
上記プローブが、テンプレート鎖に対してハイブリダイズされない場合、上記クエンチャー部分が、上記検出可能部分をクエンチする、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目228)
上記Tmが30℃〜45℃の間である、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目229)
フルオロフォア部分およびクエンチャー部分が、少なくとも7ヌクレオチド離れて隔てられる、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目230)
TMを増強する塩基ヌクレオチドを含む、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目231)
上記TMを増強する塩基ヌクレオチドが、ロックドヌクレオチドかまたは架橋ヌクレオチドである、項目230に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目232)
上記検出可能部分がフルオロフォアを含む、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目233)
少なくとも15ヌクレオチドの長さを有する、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目234)
少なくとも40%のGC含量を有している、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目235)
80%未満のGC含量を有している、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目236)
50%未満のGC含量を有している、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目237)
40%未満のGC含量を有している、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目238)
15ヌクレオチド未満の長さを有している、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目239)
40%未満のGC含量を有している、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目240)
少なくとも40%であるGC含量を有している、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目241)
40%〜80%の間であるGC含量を有している、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目242)
40%未満のGC含量を有しており、かつさらにロックドヌクレオチドまたは架橋されたヌクレオチドを含む、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目243)
上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブであって、ABCA1、BRAF、CHD5、EP300、FLT1、ITPA、MYC、PIK3R1、SKP2、TP53、ABCA7、BRCA1、CHEK1、EPHA3、FLT3、JAK1、MYCL1、PIK3R2、SLC19A1、TP73、ABCB1、BRCA2、CHEK2、EPHA5、FLT4、JAK2、MYCN、PKHD1、SLC1A6、TPM3、ABCC2、BRIP1、CLTC、EPHA6、FN1、JAK3、MYH2、PLCB1、SLC22A2、TPMT、ABCC3、BUB1B、COL1A1、EPHA7、FOS、JUN、MYH9、PLCG1、SLCO1B3、TPO、ABCC4、C1orf144、COPS5、EPHA8、FOXO1、KBTBD11、NAV3、PLCG2、SMAD2、TPR、ABCG2、CABLES1、CREB1、EPHB1、FOXO3、KDM6A、NBN、PML、SMAD3、TRIO、ABL1、CACNA2D1、CREBBP、EPHB4、FOXP4、KDR、NCOA2、PMS2、SMAD4、TRRAP、ABL2、CAMKV、CRKL、EPHB6、GAB1、KIT、NEK11、PPARG、SMARCA4、TSC1、ACVR1B、CARD11、CRLF2、EPO、GATA1、KLF6、NF1、PPARGC1A、SMARCB1、TSC2、ACVR2A、CARM1、CSF1R、ERBB2、GLI1、KLHDC4、NF2、PPP1R3A、SMO、TTK、ADCY9、CAV1、CSMD3、ERBB3、GLI3、KRAS、NKX2−1、PPP2R1A、SOCS1、TYK2、AGAP2、CBFA2T3、CSNK1G2、ERBB4、GNA11、LMO2、NOS2、PPP2R1B、SOD2、TYMS、AKT1、CBL、CTNNA1、ERCC1、GNAQ、LRP1B、NOS3、PRKAA2、SOS1、UGT1A1、AKT2、CCND1、CTNNA2、ERCC2、GNAS、LRP2、NOTCH1、PRKCA、SOX10、UMPS、AKT3、CCND2、CTNNB1、ERCC3、GPR124、LRP6、NOTCH2、PRKCZ、SOX2、USP9X、ALK、CCND3、CYFIP1、ERCC4、GPR133、LTK、NOTCH3、PRKDC、SP1、VEGF、ANAPC5、CCNE1、CYLD、ERCC5、GRB2、MAN1B1、NPM1、PTCH1、SPRY2、VEGFA、APC、CD40LG、CYP19A1、ERCC6、GSK3B、MAP2K1、NQO1、PTCH2、SRC、VHL、APC2、CD44、CYP1B1、ERG、GSTP1、MAP2K2、NR3C1、PTEN、ST6GAL2、WRN、AR、CD79A、CYP2C19、ERN2、GUCY1A2、MAP2K4、NRAS、PTGS2、STAT1、WT1、ARAF、CD79B、CYP2C8、ESR1、HDAC1、MAP2K7、NRP2、PTPN11、STAT3、XPA、ARFRP1、CDC42、CYP2D6、ESR2、HDAC2、MAP3K1、NTRK1、PTPRB、STK11、XPC、ARID1A、CDC42BPB、CYP3A4、ETV4、HGF、MAPK1、NTRK2、PTPRD、SUFU、ZFY、ATM、CDC73、CYP3A5、EWSR1、HIF1A、MAPK3、NTRK3、RAD50、SULT1A1、ZNF521、ATP5A1、CDH1、DACH2、EXT1、HM13、MAPK8、OMA1、RAD51、SUZ12、ATR、CDH10、DCC、EZH2、HMGA1、MARK3、OR10R2、RAF1、TAF1、AURKA、CDH2、DCLK3、FANCA、HNF1A、MCL1、PAK3、RARA、TBX22、AURKB、CDH20、DDB2、FANCD2、HOXA3、MDM2、PARP1、RB1、TCF12、BAI3、CDH5、DDR2、FANCE、HOXA9、MDM4、PAX5、REM1、TCF3、BAP1、CDK2、DGKB、FANCF、HRAS、MECOM、PCDH15、RET、TCF4、BARD1、CDK4、DGKZ、FAS、HSP90AA1、MEN1、PCDH18、RICTOR、TEK、BAX、CDK6、DIRAS3、FBXW7、IDH1、MET、PCNA、RIPK1、TEP1、BCL11A、CDK7、DLG3、FCGR3A、IDH2、MITF、PDGFA、ROR1、TERT、BCL2、CDK8、DLL1、FES、IFNG、MLH1、PDGFB、ROR2、TET2、BCL2A1、CDKN1A、DNMT1、FGFR1、IGF1R、MLL、PDGFRA、ROS1、TGFBR2、BCL2L1、CDKN1B、DNMT3A、FGFR2、IGF2R、MLL3、PDGFRB、RPS6KA2、THBS1、BCL2L2、CDKN2A、DNMT3B、FGFR3、IKBKE、MPL、PDZRN3、RPTOR、TNFAIP3、BCL3、CDKN2B、DOT1L、FGFR4、IKZF1、MRE11A、PHLPP2、RSPO2、TNKS、BCL6、CDKN2C、DPYD、FH、IL2RG、MSH2、PIK3C3、RSPO3、TNKS2、BCR、CDKN2D、E2F1、FHOD3、INHBA、MSH6、PIK3CA、RUNX1、TNNI3K、BIRC5、CDX2、EED、FIGF、INSR、MTHFR、HADH、RPP30、ZFP3、PIK3CB、SDHB、TNR、BIRC6、CEBPA、EGF、FLG2、IRS1、MTOR、PIK3CD、SF3B1、TOP1、BLM、CERK、EGFR、FLNC、IRS2、MUTYH、PIK3CG、SHC1、およびTOP2Aからなる群より選択される遺伝子中に含まれる少なくとも10個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列に対して少なくとも70%の相補性または同一性を有する配列を含む、オリゴヌクレオチドプローブ。
(項目244)
少なくとも1つのプライマー/プローブセットを含む反応混合物であって、ここで上記プライマー/プローブセットは、以下:
(a)第一の位置でゲノム領域に対してハイブリダイズするように設計されたフォワードプライマーと;
(b)項目1〜243のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブと、
を含む、反応混合物。
(項目245)
上記ゲノム領域に対して第二の位置でハイブリダイズするように設計されたリバースプライマーをさらに含んでいる、項目244に記載の反応混合物。
(項目246)
上記オリゴヌクレオチドプローブが、上記フォワードプライマーのTmよりも少なくとも15℃低いTmを有する、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目247)
上記オリゴヌクレオチドプローブが、上記第一のプライマーのTmおよび上記第二のプライマーのTmの平均よりも少なくとも15℃低いTmを有する、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目248)
上記オリゴヌクレオチドプローブが、上記第一の位置と上記第二の位置との間に位置する第三の位置で上記ゲノム領域にハイブリダイズするように設計されている、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目249)
上記リバースプライマーが、上記フォワードプライマーの量よりも少なくとも2倍〜10倍少ない量で存在する、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目250)
上記リバースプライマーが、上記フォワードプライマーの量とは2倍以下異なる量で存在する、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目251)
生物学的サンプルから単離された核酸サンプルをさらに含んでいる、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目252)
上記生物学的サンプルが、被験体から単離されたサンプルである、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目253)
上記被験体がヒト被験体である、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目254)
上記ヒト被験体が、ある疾患について診断されるか、ある疾患を有すると疑われるか、またはある疾患についてのリスクが増大していると疑われる、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目255)
上記疾患が癌である、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目256)
上記テンプレート核酸がゲノム領域を含む、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。(項目257)
上記テンプレート核酸がDNA、RNAまたはcDNAを含む、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目258)
ポリメラーゼをさらに含んでいる、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目259)
上記ポリメラーゼがDNAポリメラーゼである、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目260)
上記項目のいずれかに記載の反応混合物であって、以下:
(a)第一のテンプレート核酸と;
(b)ある量のフォワードプライマーと;
(c)第二の量のリバースプライマーであって、上記リバースプライマーの第二の量は、上記フォワードプライマーの上記量よりも少なくとも2倍〜10倍少ない、第二の量のリバースプライマーと;
(d)オリゴヌクレオチドプローブと、
を含む、反応混合物。
(項目261)
複数のプライマー/プローブセットを含む、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。(項目262)
上記複数のプライマー/プローブセットの各々が、ゲノムDNAの異なる領域に特異的である、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目263)
上記ゲノム領域が、疾患関連の変異と関連している、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目264)
上記変異が、コピー数変動を含む、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目265)
上記変異が、一塩基多型(SNP)、挿入、欠失、または逆位を含む、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目266)
上記フォワードプライマーまたは上記リバースプライマーの1つが、上記SNP、上記挿入、上記欠失、または上記逆位を覆う、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目267)
上記オリゴヌクレオチドプローブが、上記SNP、上記挿入、上記欠失、または上記逆位を覆う、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目268)
上記疾患が癌である、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目269)
上記項目のいずれかに記載の反応混合物であって、上記プライマー/プローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブを含み、ここで各々のオリゴヌクレオチドプローブが、上記ゲノム領域の任意の他の対立遺伝子を含む配列と比較して、上記ゲノム領域の1つの特異的対立遺伝子を含む配列に対して、より大きいアビディティで結合するように設計された対立遺伝子特異的プローブであり、ここで各々の対立遺伝子特異的なプローブが、異なる対立遺伝子に特異的である、反応混合物。
(項目270)
上記対立遺伝子特異的なプローブの各々が、スペクトル的に別個のフルオロフォアを各々含む、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目271)
上記項目のいずれかに記載の反応混合物であって、ここで任意の他の対立遺伝子に対する上記対立遺伝子特異的プローブの結合エネルギーと比較した、上記1つの特異的な対立遺伝子に対する対立遺伝子特異的プローブの結合エネルギーにおける相違は、上記ゲノム領域に対する上記プローブの全体的な結合エネルギーの1%超である、反応混合物。
(項目272)
上記オリゴヌクレオチドプローブが、ビーコンプローブである、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目273)
上記オリゴヌクレオチドプローブがプレアデス(Pleiades)プローブである、上記項目のいずれかに記載の反応混合物。
(項目274)
以下:
(a)上記項目のいずれかに記載の反応混合物を複数の反応容積に分割する工程と;
(b)上記反応容積中の少なくとも1つにおいて、複数回の温度サイクリングを含むPCR増幅反応を行う工程であって、ここで上記オリゴヌクレオチドプローブが、上記PCR増幅反応の有効性に影響しない工程と、
を包含する、方法。
(項目275)
上記項目のいずれかに記載の方法であって、ここで上記オリゴヌクレオチドプローブが、上記PCR増幅反応のアニーリング段階または伸長段階の間にテンプレート核酸にもPCR反応生成物にもハイブリダイズしない、方法。
(項目276)
上記項目のいずれかに記載の方法であって、上記反応容積の少なくとも1つを50℃未満まで冷却する工程をさらに包含し、ここで上記冷却によって、オリゴヌクレオチドプローブに対して少なくとも70%の相補性を有する配列を含む核酸に対する、上記オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションが可能になる、方法。
(項目277)
上記項目のいずれかに記載の方法であって、上記反応容積の少なくとも1つを37℃未満まで冷却する工程をさらに包含し、ここで上記冷却によって、オリゴヌクレオチドプローブに対して少なくとも70%の相補性を有する配列を含む核酸に対する、上記オリゴヌクレオチドプローブの量のうち少なくとも70%のハイブリダイゼーションが可能になる、方法。
(項目278)
上記分割によって、平均で1分子未満のテンプレート核酸を含む各々の反応容積が生じる、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目279)
指数関数的PCR増幅反応および線形PCR増幅反応を、上記反応容積のうちの少なくとも1つの中で行う工程を包含する、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目280)
上記指数関数的PCR増幅反応および上記線形PCR増幅反応が、上記反応容積中から成分を添加することも除去することもなく逐次的に起こる、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目281)
上記PCR増幅反応によって、増幅生成物のうち少なくとも50%が一本鎖増幅生成物になる、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目282)
上記反応容積が液滴である、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目283)
上記ハイブリダイゼーションによって、上記オリゴヌクレオチドプローブからの蛍光の放出が生じる、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目284)
上記反応容積のうちの少なくとも1つの中で上記蛍光の存在または不在を検出する工程をさらに包含する、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目285)
上記反応容積中の上記蛍光の強度を測定する工程を包含する、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目286)
蛍光陽性の反応容積の数および/または画分を決定する工程をさらに包含する、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目287)
蛍光陽性の反応容積の上記数および/または画分に基づいて上記サンプル中の1つ以上の変異の存在、不在または量を決定する工程を包含する、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目288)
上記1つ以上の変異が、SNP、欠失、挿入、または逆位を含む、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目289)
上記1つ以上の変異が、遺伝子のコピー数変動を含む、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目290)
上記1つ以上の変異が、疾患関連の変異を含む、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目291)
上記疾患が癌である、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目292)
上記項目のいずれかに記載の方法であって、上記1つ以上の変異が、ABCA1、BRAF、CHD5、EP300、FLT1、ITPA、MYC、PIK3R1、SKP2、TP53、ABCA7、BRCA1、CHEK1、EPHA3、FLT3、JAK1、MYCL1、PIK3R2、SLC19A1、TP73、ABCB1、BRCA2、CHEK2、EPHA5、FLT4、JAK2、MYCN、PKHD1、SLC1A6、TPM3、ABCC2、BRIP1、CLTC、EPHA6、FN1、JAK3、MYH2、PLCB1、SLC22A2、TPMT、ABCC3、BUB1B、COL1A1、EPHA7、FOS、JUN、MYH9、PLCG1、SLCO1B3、TPO、ABCC4、C1orf144、COPS5、EPHA8、FOXO1、KBTBD11、NAV3、PLCG2、SMAD2、TPR、ABCG2、CABLES1、CREB1、EPHB1、FOXO3、KDM6A、NBN、PML、SMAD3、TRIO、ABL1、CACNA2D1、CREBBP、EPHB4、FOXP4、KDR、NCOA2、PMS2、SMAD4、TRRAP、ABL2、CAMKV、CRKL、EPHB6、GAB1、KIT、NEK11、PPARG、SMARCA4、TSC1、ACVR1B、CARD11、CRLF2、EPO、GATA1、KLF6、NF1、PPARGC1A、SMARCB1、TSC2、ACVR2A、CARM1、CSF1R、ERBB2、GLI1、KLHDC4、NF2、PPP1R3A、SMO、TTK、ADCY9、CAV1、CSMD3、ERBB3、GLI3、KRAS、NKX2−1、PPP2R1A、SOCS1、TYK2、AGAP2、CBFA2T3、CSNK1G2、ERBB4、GNA11、LMO2、NOS2、PPP2R1B、SOD2、TYMS、AKT1、CBL、CTNNA1、ERCC1、GNAQ、LRP1B、NOS3、PRKAA2、SOS1、UGT1A1、AKT2、CCND1、CTNNA2、ERCC2、GNAS、LRP2、NOTCH1、PRKCA、SOX10、UMPS、AKT3、CCND2、CTNNB1、ERCC3、GPR124、LRP6、NOTCH2、PRKCZ、SOX2、USP9X、ALK、CCND3、CYFIP1、ERCC4、GPR133、LTK、NOTCH3、PRKDC、SP1、VEGF、ANAPC5、CCNE1、CYLD、ERCC5、GRB2、MAN1B1、NPM1、PTCH1、SPRY2、VEGFA、APC、CD40LG、CYP19A1、ERCC6、GSK3B、MAP2K1、NQO1、PTCH2、SRC、VHL、APC2、CD44、CYP1B1、ERG、GSTP1、MAP2K2、NR3C1、PTEN、ST6GAL2、WRN、AR、CD79A、CYP2C19、ERN2、GUCY1A2、MAP2K4、NRAS、PTGS2、STAT1、WT1、ARAF、CD79B、CYP2C8、ESR1、HDAC1、MAP2K7、NRP2、PTPN11、STAT3、XPA、ARFRP1、CDC42、CYP2D6、ESR2、HDAC2、MAP3K1、NTRK1、PTPRB、STK11、XPC、ARID1A、CDC42BPB、CYP3A4、ETV4、HGF、MAPK1、NTRK2、PTPRD、SUFU、ZFY、ATM、CDC73、CYP3A5、EWSR1、HIF1A、MAPK3、NTRK3、RAD50、SULT1A1、ZNF521、ATP5A1、CDH1、DACH2、EXT1、HM13、MAPK8、OMA1、RAD51、SUZ12、ATR、CDH10、DCC、EZH2、HMGA1、MARK3、OR10R2、RAF1、TAF1、AURKA、CDH2、DCLK3、FANCA、HNF1A、MCL1、PAK3、RARA、TBX22、AURKB、CDH20、DDB2、FANCD2、HOXA3、MDM2、PARP1、RB1、TCF12、BAI3、CDH5、DDR2、FANCE、HOXA9、MDM4、PAX5、REM1、TCF3、BAP1、CDK2、DGKB、FANCF、HRAS、MECOM、PCDH15、RET、TCF4、BARD1、CDK4、DGKZ、FAS、HSP90AA1、MEN1、PCDH18、RICTOR、TEK、BAX、CDK6、DIRAS3、FBXW7、IDH1、MET、PCNA、RIPK1、TEP1、BCL11A、CDK7、DLG3、FCGR3A、IDH2、MITF、PDGFA、ROR1、TERT、BCL2、CDK8、DLL1、FES、IFNG、MLH1、PDGFB、ROR2、TET2、BCL2A1、CDKN1A、DNMT1、FGFR1、IGF1R、MLL、PDGFRA、ROS1、TGFBR2、BCL2L1、CDKN1B、DNMT3A、FGFR2、IGF2R、MLL3、PDGFRB、RPS6KA2、THBS1、BCL2L2、CDKN2A、DNMT3B、FGFR3、IKBKE、MPL、PDZRN3、RPTOR、TNFAIP3、BCL3、CDKN2B、DOT1L、FGFR4、IKZF1、MRE11A、PHLPP2、RSPO2、TNKS、BCL6、CDKN2C、DPYD、FH、IL2RG、MSH2、PIK3C3、RSPO3、TNKS2、BCR、CDKN2D、E2F1、FHOD3、INHBA、MSH6、PIK3CA、RUNX1、TNNI3K、BIRC5、CDX2、EED、FIGF、INSR、MTHFR、HADH、RPP30、ZFP3、PIK3CB、SDHB、TNR、BIRC6、CEBPA、EGF、FLG2、IRS1、MTOR、PIK3CD、SF3B1、TOP1、BLM、CERK、EGFR、FLNC、IRS2、MUTYH、PIK3CG、SHC1、およびTOP2Aからなる群より選択される1つ以上の遺伝子の変異を含む、方法。
(項目293)
上記1つ以上の変異が、DDR2、EGFR、AURKA、VEGFA、FGFR1、CDK4、EFBB2、CDK6、JAK2、MET、BRAF、ERBB3、SRC、HADH、RPP30、およびZFP3からなる群より選択される1つ以上の遺伝子の変異を含む、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目294)
上記サンプル中の上記変異の存在、不在および/またはレベルのプロファイルを連絡するレポートを作成する工程を包含する、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目295)
上記変異を標的にする治療剤の説明をさらに含む、上記項目のいずれかに記載の方法。(項目296)
癌の処置を必要とする被験体における癌を処置する方法であって、上記方法は、以下:
(a)上記被験体から生物学的サンプルを得る工程と;
(b)上記生物学的サンプルから単離された核酸サンプルから、MET、FGFR1、FGFR2、FLT3、HER3、EGFR、mTOR、CDK4、HER2、RET、HADH、ZFP3、DDR2、AURKA、VEGFA、CDK6、JAK2、BRAF、およびSRCからなる群より選択される少なくとも5つの遺伝子中でのコピー数変動(CNV)の存在または不在を決定する工程と;
(c)上記決定する工程に基づいて、被験体特異的なCNVプロファイルを作成する工程と;
(d)上記被験体特異的なCNVプロファイルに基づいて、上記被験体の癌治療を選択する工程と;
を包含する、方法。
(項目297)
上記CNVの存在または不在を決定する工程が、項目274〜289のいずれかに記載の方法の使用を包含する、項目296に記載の方法。
(項目298)
デジタルPCRアッセイが、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブの使用を包含する、項目296に記載の方法。
(項目299)
上記オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、91、94、97、100、103、106、109、112、115、または118のいずれかに記載のヌクレオチド配列を含む、項目298に記載の方法。
(項目300)
デジタルPCRアッセイが、上記項目のいずれかに記載のプライマーの使用を包含する、項目296に記載の方法。
(項目301)
上記プライマーが、配列番号59、60、62、63、65、66、68、69、71、72、74、75、77、78、80、81、83、84、86、87、89、90、92、93、95、96、98、99、101、102、104、105、107、108、110、111、113、114、116、または117のいずれかに記載のヌクレオチド配列を含む、項目300に記載の方法。
(項目302)
少なくとも10、12または18個の遺伝子中のCNVの存在または不在を決定する工程を包含する、項目296に記載の方法。
(項目303)
上記生物学的サンプルが、上記癌に由来する核酸を保有すると疑われる、項目296に記載の方法。
(項目304)
上記生物学的サンプルが、固体組織サンプルである、項目296に記載の方法。
(項目305)
上記固体組織サンプルが、ホルマリン固定され、パラフィン包埋されたサンプルである、項目296に記載の方法。
(項目306)
上記生物学的サンプルが液体の生物学的サンプルである、項目296に記載の方法。
(項目307)
上記液体の生物学的サンプルが、血液、血清、血漿、尿、汗、涙、唾液、および痰からなる群より選択される、項目296に記載の方法。
(項目308)
コンピュータシステムであって、以下:
(a)サンプルからデータを受容するように構成されたメモリユニットであって、ここで上記データが上記項目のいずれかに記載の方法によって作成される、メモリユニットと;
(b)上記データの分析のためのコンピュータ実行可能な命令と;
(c)上記分析に基づいて、上記サンプル中の変異の存在、不在または量を決定するためのコンピュータ実行可能な命令と;
を備える、コンピュータシステム。
(項目309)
上記項目のいずれかに記載のコンピュータシステムであって、上記サンプル中の変異の上記存在、不在または量のレポートを作成するためのコンピュータ実行可能な命令をさらに備える、コンピュータシステム。
(項目310)
上記項目のいずれかに記載のコンピュータシステムであって、上記サンプル中の変異の上記存在、不在または量に基づいて治療の選択肢のレポートを作成するためのコンピュータ実行可能な命令をさらに備える、コンピュータシステム。
(項目311)
上記項目のいずれかに記載のコンピュータシステムであって、上記レポートをユーザーに対して連絡または提示するように構成されたユーザーインターフェースをさらに備える、コンピュータシステム。
(項目312)
キットであって、以下:
(a)少なくとも1つのプライマー/プローブセットであって、ここで上記プライマー/プローブセットが、(i)第一の位置でゲノム領域に対してハイブリダイズするように設計されたフォワードプライマー、(ii)第二の位置で上記ゲノム領域に対してハイブリダイズするように設計されたリバースプライマー、および(iii)上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブであって、上記オリゴヌクレオチドプローブが、上記第一の位置と第二の位置との間に位置する第三の位置で上記ゲノム領域に対してハイブリダイズするように設計されているオリゴヌクレオチドプローブを含む、プライマー/プローブセットと;
(b)使用説明書と;
を含む、キット。
(項目313)
配列番号4〜21、23、24、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、91、94、97、100、103、106、109、112、115、または118のいずれかに示されるオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目314)
配列番号1948〜5593のいずれかに示される標的選択性オリゴヌクレオチド。
(項目315)
配列番号25または26に示される配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー。
(項目316)
配列番号1〜3、22、27〜58、59、60、62、63、65、66、68、69、71、72、74、75、77、78、80、81、83、84、86、87、89、90、92、93、95、96、98、99、101、102、104、105、107、108、110、111、113、114、116、または117のいずれかに示される配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー。
(発明の詳細な説明)
本発明の実践には、別段示さない限り、当該分野の技術の範囲内である分子生物学、微生物学および組み換えDNA技術の従来の技術を使用する。このような技術は、文献に詳細に説明されている。例えば、Sambrook,Fritsch & Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Fourth Edition(2012);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,編集、1984);Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins,eds.,1984);A Practical Guide to Molecular Cloning(B.Perbal,1984);およびシリーズ、Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)を参照のこと。本明細書に言及される全ての特許、特許出願、および刊行物は、前出および後出の両方とも、参照によって本明細書に援用される。
本発明の実践には、別段示さない限り、当該分野の技術の範囲内である分子生物学、微生物学および組み換えDNA技術の従来の技術を使用する。このような技術は、文献に詳細に説明されている。例えば、Sambrook,Fritsch & Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Fourth Edition(2012);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,編集、1984);Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins,eds.,1984);A Practical Guide to Molecular Cloning(B.Perbal,1984);およびシリーズ、Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)を参照のこと。本明細書に言及される全ての特許、特許出願、および刊行物は、前出および後出の両方とも、参照によって本明細書に援用される。
(定義)
詳細な説明および特許請求の範囲で用いる場合、単数形「1つの、ある(a、an:不定冠詞)」、および「この、その(the:定冠詞)」は、文脈上明らかに他を示すのでない限り、複数の言及を包含し得る。例えば、「細胞」という用語は、複数の細胞を包含し得、その混合物を包含する。
詳細な説明および特許請求の範囲で用いる場合、単数形「1つの、ある(a、an:不定冠詞)」、および「この、その(the:定冠詞)」は、文脈上明らかに他を示すのでない限り、複数の言及を包含し得る。例えば、「細胞」という用語は、複数の細胞を包含し得、その混合物を包含する。
「被験体」という用語は、本明細書において用いる場合、一般には発現された遺伝物質を含む生物学的実態を指す。この生物学的実態は、植物であっても、動物であってもまたは微生物であってもよく、これには、例えば、細菌、ウイルス、真菌および原生生物が挙げられる。被験体とは、インビボで得られるか、またはインビトロで培養された生物学的実態の組織、細胞およびそれらの子孫であり得る。被験体は、哺乳動物であってもよい。哺乳動物はヒトであってもよい。ヒトは、疾患について高リスクであると診断されるか、または疑われる場合がある。疾患とは癌であってもよい。ヒトは、ある疾患について高リスクであると診断もされず、疑われもしない場合もある。
本明細書において用いる場合、「サンプル」または「核酸サンプル」とは、核酸を含むか、または含むと推定される任意の物質を指す場合がある。このサンプルとは、被験体から得られる生物学的サンプルであってもよい。核酸は、RNA、DNA、例えば、ゲノムDNA、ミトコンドリアDNA、ウイルスDNA、合成DNA、またはRNAから逆転写されたcDNAであってもよい。核酸サンプル中の核酸は一般には、ハイブリダイズされたプライマーの伸長のためのテンプレートとして機能する。いくつかの実施形態では、生物学的サンプルは、流体サンプルである。流体サンプルとは、全血、血漿、血清、腹水、脳脊髄液、汗、尿、涙、唾液、口腔試料、体腔すすぎ液、または臓器すすぎ液であってもよい。流体サンプルは、本質的に、無細胞の流体サンプル(例えば、血漿、血清、汗、血漿、尿、汗、涙、唾液、痰)であってもよい。他の実施形態では、生物学的サンプルは、固体の生物学的サンプル、例えば、糞便または組織生検、例えば、腫瘍生検である。サンプルはまた、インビトロの細胞培養の構成要素(限定するものではないが、細胞培養培地、組み換え細胞および細胞成分中の細胞の増殖から得られる馴化培地を含む)を含み得る。サンプルは、単一細胞、例えば、癌細胞、循環腫瘍細胞、癌幹細胞などを含んでもよい。
「ヌクレオチド」および「nt」は、一般には核酸を形成し得る生物学的分子を指して、本明細書では互換可能に用いられる。ヌクレオチドは、公知のプリンおよびピリミジン塩基だけでなく、改変された他の複素環式塩基も含む部分を有してもよい。このような修飾としては、メチル化したプリンまたはピリミジン、アシル化したプリンまたはピリミジン、アルキル化したリボース、または他の複素環が挙げられる。さらに、「ヌクレオチド」という用語は、ハプテン、ビオチン、または蛍光標識を含み、かつ従来のリボースおよびデオキシリボース糖だけでなく、他の糖も同様に含み得る部分を包含する。修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドはまた、糖部分に対する修飾も包含し(例えば、ここでは、1つ以上のヒドロキシル基が、ハロゲン原子または脂肪族基で置き換えられる)、エーテル、アミンなどとして官能化される。修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドはまた、ペプチド核酸(PNA)も含み得る。ペプチド核酸は、一般的には、オリゴヌクレオチドであって、デオキシリボース骨格がペプチド結合を有している骨格で置換されているオリゴヌクレオチドを指す。各々のサブユニットは一般には、天然に存在する塩基または天然に存在しない塩基を結合している。1つの例示的なPNA骨格は、アミド結合を通じて連結されたN−(2−アミノエチル)グリシンの反復単位から構築される。PNAは、DNAおよびRNAの両方に結合して、PNA/DNAまたはPNA/RNA二重鎖を形成し得る。得られたPNA/DNAまたはPNA/RNA二重鎖は、それらの高い融点(Tm)で証明されるとおり、相当するDNA/DNAまたはDNA/RNA二重鎖よりも大きい親和性で結合され得る。PNAの天然の骨格ではまた、PNA/DNA(RNA)二重鎖のTmを、反応混合物中の塩濃度にほとんど依存しないようにし得る。したがって、PNA/DNA二重鎖は、イオン強度に強く依存する、DNA/DNA二重鎖の相互作用を超える利点をもたらし得る。PNAの例示的な実施形態は、参照によって本明細書に援用される、米国特許第7,223,833号、および同第5,539,083号に記載される。
「ヌクレオチド」としてはまた、TMを増強する塩基を含むヌクレオチド(例えば、Tm−塩基強化性ヌクレオチド)も挙げられる。例示的なTMを増強する塩基ヌクレオチドとしては、限定するものではないが、Superbases(商標)、ロックド核酸(LNA)または架橋された核酸(BNA)を有するヌクレオチドが挙げられる。BNAおよびLNAは一般的には、修飾されたリボヌクレオチド(ここでリボース部分が、2’酸素および4’炭素を接続する架橋で修飾されている)を指す。一般的には、架橋は、リボースを、A型の二重鎖で見いだされる場合が多い、3’−末端(North)構成で「ロックする」。「ロックド核酸」(LNA)という用語は、一般的には、BNAのある分類を指し、ここでは、リボース環が、2’−O原子と4’−C原子とを接続するメチレン架橋で「ロックされている」。DNAおよびRNAにみられる、6つの通常の核酸塩基(T、C、G、A、UおよびmC)を含むLNAヌクレオシドは、標準的なワトソン−クリック塩基対の規則によってその相補的なヌクレオシドと塩基対を形成できる。したがって、TMを増強する塩基ヌクレオチド、例えば、BNAおよびLNAヌクレオチドは、望まれるならばいつでも、オリゴヌクレオチド中でDNAまたはRNA塩基と混合されてもよい。ロックドリボース形状は、塩基のスタッキングおよび骨格のプレオーガニゼーション(pre−organization)を増強する。塩基スタッキングおよび骨格のプレオーガニゼーションは、二重鎖の熱安定性増大(例えば、Tm増大)および識別力を生じ得る。LNAは、他の核酸とでは不可能な状態下で単一塩基ミスマッチを識別し得る。ロックド核酸は、例えば、参照によって本明細書に援用される、WO99/14226に開示される。ヌクレオチドとしてはまた、参照によって本明細書に援用される欧州特許出願番号EP1995330に記載されるような修飾されたヌクレオチドも包含し得る。
他の修飾されたヌクレオチドとしては、5−Me−dC−CEホスホラミダイト、5−Me−dC−CPG、2−アミノ−dA−CEホスホラミダイト、N4−Et−dC−CEホスホラミダイト、N4−Ac−N4−Et−dC−CEホスホラミダイト、N6−Me−dA−CEホスホラミダイト、N6−Ac−N6−Me−dA−CEホスホラミダイト、Zip核酸(ZNA(登録商標)、参照によって本明細書に援用される米国特許出願公開第12/086,599に記載)、5’−トリメトキシスチルベン キャップ ホスホラミダイト(Trimethoxystilbene Cap Phosphoramidite)、5’−ピレン キャップ ホスホラミダイト、3’−Uaq Cap CPG(Glen Research)を挙げることができる。
さらに他の修飾されたヌクレオチドとしては、修飾ヌクレオシド塩基を有するヌクレオチド、例えば、2−アミノプリン、2、6−ジアミノプリン、5−ブロモ−デオキシウリジン、デオキシウリジン、インバーテッドdT、インバーテッドddT、ddC、5−メチルデオキシシチジン、デオキシイノシン、5−ニトロインドール、2’−O−メチルRNA塩基、ヒドロキシメチルdC、Iso−dGおよびIso−dC(Eragen Biosciences、Inc)、フッ素修飾リボースを有する2’フルオロ塩基を挙げることができる。
「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「ヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、相互に交換可能に用いられ得る。それらは、任意の長さのヌクレオチドの重合体型、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらのアナログを指してもよい。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有してもよく、任意の機能(公知または未知)を行い得る。以下が、ポリヌクレオチドの非限定的な例である:遺伝子または遺伝子フラグメントのコード領域または非コード領域、連鎖解析から定義される遺伝子座(単数または複数)、エキソン、イントロン、メッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRNA、リボソームRNA、リボザイム、cDNA、組み換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログを含んでもよい。存在する場合、ヌクレオチド構築物に対する修飾は、ポリマーのアセンブリの前に付与されてもまたは後に付与されてもよい。ヌクレオチドの配列は、ヌクレオチドでない成分で中断されてもよい。ポリヌクレオチドはさらに、標識成分とのコンジュゲーションなどによって重合化の後に修飾されてもよい。
「標的ポリヌクレオチド」、「標的領域」、または「標的」という用語は、本明細書において用いる場合、一般的には、研究中の目的のポリヌクレオチドを指す。特定の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、目的であって研究中の1つ以上の配列を含む。標的ポリヌクレオチドは、例えば、ゲノム配列を含んでもよい。この標的ポリヌクレオチドは、標的配列であって、その存在、量、および/もしくはヌクレオチド配列、またはそれらの変化が決定されることが所望される標的配列を含んでもよい。
この標的ポリヌクレオチドは、疾患と関連する遺伝子の領域であってもよい。いくつかの実施形態では、この領域はエキソンである。いくつかの実施形態では、この遺伝子は、ドラッガブル(druggable)標的である。「ドラッガブル標的」という用語は、本明細書において用いる場合、一般には、疾患の治療によって調整される遺伝子または細胞経路を指す。この疾患は癌であってもよい。したがって、遺伝子は、公知の癌関連遺伝子であり得る。いくつかの実施形態では、癌関連遺伝子は、ABCA1、BRAF、CHD5、EP300、FLT1、ITPA、MYC、PIK3R1、SKP2、TP53、ABCA7、BRCA1、CHEK1、EPHA3、FLT3、JAK1、MYCL1、PIK3R2、SLC19A1、TP73、ABCB1、BRCA2、CHEK2、EPHA5、FLT4、JAK2、MYCN、PKHD1、SLC1A6、TPM3、ABCC2、BRIP1、CLTC、EPHA6、FN1、JAK3、MYH2、PLCB1、SLC22A2、TPMT、ABCC3、BUB1B、COL1A1、EPHA7、FOS、JUN、MYH9、PLCG1、SLCO1B3、TPO、ABCC4、C1orf144、COPS5、EPHA8、FOXO1、KBTBD11、NAV3、PLCG2、SMAD2、TPR、ABCG2、CABLES1、CREB1、EPHB1、FOXO3、KDM6A、NBN、PML、SMAD3、TRIO、ABL1、CACNA2D1、CREBBP、EPHB4、FOXP4、KDR、NCOA2、PMS2、SMAD4、TRRAP、ABL2、CAMKV、CRKL、EPHB6、GAB1、KIT、NEK11、PPARG、SMARCA4、TSC1、ACVR1B、CARD11、CRLF2、EPO、GATA1、KLF6、NF1、PPARGC1A、SMARCB1、TSC2、ACVR2A、CARM1、CSF1R、ERBB2、GLI1、KLHDC4、NF2、PPP1R3A、SMO、TTK、ADCY9、CAV1、CSMD3、ERBB3、GLI3、KRAS、NKX2−1、PPP2R1A、SOCS1、TYK2、AGAP2、CBFA2T3、CSNK1G2、ERBB4、GNA11、LMO2、NOS2、PPP2R1B、SOD2、TYMS、AKT1、CBL、CTNNA1、ERCC1、GNAQ、LRP1B、NOS3、PRKAA2、SOS1、UGT1A1、AKT2、CCND1、CTNNA2、ERCC2、GNAS、LRP2、NOTCH1、PRKCA、SOX10、UMPS、AKT3、CCND2、CTNNB1、ERCC3、GPR124、LRP6、NOTCH2、PRKCZ、SOX2、USP9X、ALK、CCND3、CYFIP1、ERCC4、GPR133、LTK、NOTCH3、PRKDC、SP1、VEGF、ANAPC5、CCNE1、CYLD、ERCC5、GRB2、MAN1B1、NPM1、PTCH1、SPRY2、VEGFA、APC、CD40LG、CYP19A1、ERCC6、GSK3B、MAP2K1、NQO1、PTCH2、SRC、VHL、APC2、CD44、CYP1B1、ERG、GSTP1、MAP2K2、NR3C1、PTEN、ST6GAL2、WRN、AR、CD79A、CYP2C19、ERN2、GUCY1A2、MAP2K4、NRAS、PTGS2、STAT1、WT1、ARAF、CD79B、CYP2C8、ESR1、HDAC1、MAP2K7、NRP2、PTPN11、STAT3、XPA、ARFRP1、CDC42、CYP2D6、ESR2、HDAC2、MAP3K1、NTRK1、PTPRB、STK11、XPC、ARID1A、CDC42BPB、CYP3A4、ETV4、HGF、MAPK1、NTRK2、PTPRD、SUFU、ZFY、ATM、CDC73、CYP3A5、EWSR1、HIF1A、MAPK3、NTRK3、RAD50、SULT1A1、ZNF521、ATP5A1、CDH1、DACH2、EXT1、HM13、MAPK8、OMA1、RAD51、SUZ12、ATR、CDH10、DCC、EZH2、HMGA1、MARK3、OR10R2、RAF1、TAF1、AURKA、CDH2、DCLK3、FANCA、HNF1A、MCL1、PAK3、RARA、TBX22、AURKB、CDH20、DDB2、FANCD2、HOXA3、MDM2、PARP1、RB1、TCF12、BAI3、CDH5、DDR2、FANCE、HOXA9、MDM4、PAX5、REM1、TCF3、BAP1、CDK2、DGKB、FANCF、HRAS、MECOM、PCDH15、RET、TCF4、BARD1、CDK4、DGKZ、FAS、HSP90AA1、MEN1、PCDH18、RICTOR、TEK、BAX、CDK6、DIRAS3、FBXW7、IDH1、MET、PCNA、RIPK1、TEP1、BCL11A、CDK7、DLG3、FCGR3A、IDH2、MITF、PDGFA、ROR1、TERT、BCL2、CDK8、DLL1、FES、IFNG、MLH1、PDGFB、ROR2、TET2、BCL2A1、CDKN1A、DNMT1、FGFR1、IGF1R、MLL、PDGFRA、ROS1、TGFBR2、BCL2L1、CDKN1B、DNMT3A、FGFR2、IGF2R、MLL3、PDGFRB、RPS6KA2、THBS1、BCL2L2、CDKN2A、DNMT3B、FGFR3、IKBKE、MPL、PDZRN3、RPTOR、TNFAIP3、BCL3、CDKN2B、DOT1L、FGFR4、IKZF1、MRE11A、PHLPP2、RSPO2、TNKS、BCL6、CDKN2C、DPYD、FH、IL2RG、MSH2、PIK3C3、RSPO3、TNKS2、BCR、CDKN2D、E2F1、FHOD3、INHBA、MSH6、PIK3CA、RUNX1、TNNI3K、BIRC5、CDX2、EED、FIGF、INSR、MTHFR、PIK3CB、SDHB、TNR、BIRC6、CEBPA、EGF、FLG2、IRS1、MTOR、PIK3CD、SF3B1、TOP1、BLM、CERK、EGFR、FLNC、IRS2、MUTYH、PIK3CG、SHC1、およびTOP2Aからなる群より選択される。
「ゲノム配列」という用語は、本明細書において用いる場合、一般には、ゲノム中に存在する配列を指す。RNAは、ゲノムから転写されるので、この用語は、生物体の核ゲノムに存在する配列、およびこのようなゲノムから転写されるRNA(例えば、mRNA)のcDNAコピーに存在する配列も包含する。
「アニーリングする」、「ハイブリダイズする」または「結合する」という用語は、2つのポリヌクレオチド配列、セグメントまたは鎖を指してもよく、相互に交換可能に用いられてもよく、当該分野で通常の意味を有する。2つの相補的な配列(例えば、DNAおよび/またはRNA)は、相補的塩基で水素結合を形成することによってアニーリングするか、またはハイブリダイズして、二本鎖ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの二本鎖領域を生じ得る。
本明細書において用いる場合、「相補性」という用語は一般的には、2つの逆平行の核酸配列の間の関係であって、ここでこの配列が以下の塩基対合の規則で関連する関係を指す:AはTまたはUと対になり、かつCはGと対になる。第二の配列またはセグメントに対して「完全に相補的」である第一の配列またはセグメントとは、その全長にわたって相補的であり、かつミスマッチはない。第一の配列またはセグメントは、その第一の配列からなるポリヌクレオチドが、第二の配列からなるポリヌクレオチドに対して特異的にハイブリダイズするのに十分に相補的である場合、セグメントのその第二の配列に対して「実質的に相補的」である。
「二重鎖」または「二重鎖の(二重鎖になった)」という用語は、本明細書において用いる場合、塩基が対になる、例えば、一緒にハイブリダイズする2つの相補的なポリヌクレオチドを記述し得る。
本明細書において用いる場合、「Tm」という用語は一般には、二重鎖の半分がハイブリダイズしたままで、かつ二重鎖の半分が一本鎖に解離する、オリゴヌクレオチド二重鎖の融点を指す。Sambrook and Russell(2001;Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor N.Y.,第10章)を参照のこと。
本明細書において用いる場合、核酸配列の「増幅」とは一般的には、標的配列のコピー数を酵素的に増大するためのインビトロ技術を指す。増幅方法には、非対称(asymmetric)法(ここでは、主な生成物は、一本鎖である)および従来の方法(ここでは、主な生成物は二本鎖である)の両方が挙げられる。増幅の「回」または「サイクル」とは、PCRサイクルであって、二本鎖のテンプレートDNA分子が、一本鎖テンプレートに変性され、フォワードおよびリバースプライマーが、一本鎖テンプレートにハイブリダイズされて、プライマー/テンプレート二重鎖を形成し、プライマーがこのプライマー/テンプレート二重鎖からDNAポリメラーゼによって伸長されて、伸長生成物が形成されるサイクルを指してもよい。増幅のその後の回では、その伸長生成物は、一本鎖テンプレートに変性されて、サイクルが繰り返される。
「テンプレート」、「テンプレート鎖」、「テンプレートDNA」および「テンプレート核酸」という用語は、増幅サイクルによってコピーされるDNAの鎖を指して、本明細書においては相互に交換可能に用いられ得る。
「変性(する)」という用語は、本明細書において用いる場合、一般的には、核酸二重鎖の2つの一本鎖への分離を指す。
「伸長(する)」という用語は、本明細書において用いる場合、一般的には、酵素、例えば、ポリメラーゼを用いるヌクレオチドの添加によって、テンプレート核酸にハイブリダイズされたプライマーの伸長を指す。
「プライマー」とは、一般的には、ヌクレオチド配列(例えば、オリゴヌクレオチド)であって、一般的には、遊離の3’−OH基を有し、テンプレート配列(例えば、標的ポリヌクレオチド、またはプライマー伸長生成物)とハイブリダイズし、かつテンプレートに対して相補的なポリヌクレオチドの重合を促進し得るヌクレオチド配列である。プライマーは例えば、テンプレートの配列(例えば、プライマー伸長生成物またはテンプレートDNA複合体のRNase切断後に創出されたテンプレートのフラグメント)であって、テンプレート自体の配列にハイブリダイズされ(例えば、ヘアピンループとして)、ヌクレオチド重合を促進できる配列であってもよい。したがって、プライマーは、外因性(例えば、付加された)プライマーであっても、または内因性(例えば、テンプレートフラグメント)プライマーであってもよい。
「決定する(工程)」、「測定する(工程)」、「評価する(工程)(evaluating)」、「評価する(工程)(assessing)」、「アッセイする(工程)」および「解析する、分析する(工程)」という用語は、本明細書において相互に交換可能に用いて、任意の形態の測定を指してもよく、そしてある要素が存在するか否かを決定する工程を包含し得る。これらの用語は、定量的決定および/または定性的な決定の両方を包含し得る。評価することは、相対的であってもまたは絶対的であってもよい。「〜の存在を評価すること(工程)」は、存在する何かの量を決定すること、およびそれが存在するか否かを決定することを包含し得る。
「溶液中でフリー(遊離)」という用語は、本明細書において用いる場合、固体支持体に結合も固着もされていない、ポリヌクレオチドのような分子を記述し得る。
「ゲノムフラグメント」という用語は、本明細書において用いる場合、ゲノム、例えば、動物または植物のゲノム、例えば、ヒト、サル、ラット、魚または昆虫または植物のゲノムのある領域を指す場合がある。ゲノムのフラグメントとはまた、連結されたアダプターであってもなくてもよい。ゲノムのフラグメントは、連結されたアダプター(この場合、これは、分子の少なくとも5’末端に対して、フラグメントの一端または両端に連結されたアダプターを有する)であってもよいし、または連結された非アダプターであってもよい。
「予備増幅」とは、本明細書において用いる場合、一般的には、核酸の非クローン的な増幅を指す。例えば、核酸ライブラリーの予備増幅は一般的には、ライブラリーのクローン増幅および/またはシーケンサーへのロードの前に行われる。
「リガーゼ」という用語は、本明細書において用いる場合、一般的には、ポリヌクレオチドを一緒に結合するために、または単一ポリヌクレオチドの末端に結合するために通常用いられる酵素を指す。
「ライゲーション、連結(ligation)」という用語は、本明細書において用いる場合、一般的には、連結される末端の間の共有結合の形成による、ポリヌクレオチドの2つの末端の連結、または単一ポリヌクレオチドの末端の連結を指す。共有結合は、ホスホジエステル結合であってもよい。
「ATP依存性ライゲーション」という用語は、本明細書において用いる場合、一般的には、ATP依存性リガーゼによるライゲーションを指す。ATP依存性ライゲーションの例示的な機序は、本明細書に記載される。
「ドナー」および「アクセプター」核酸種とは、一般的には、ライゲーション反応で連結される核酸分子の2つの別個の集団を指す。「ドナー」種とは、一般的には、5’末端または3’末端のいずれかで、ヌクレオシド一リン酸(NMP)を受容し得る核酸分子の集団を指す。「アクセプター」種とは、一般的には、ドナー種の5’または3’末端のいずれかでNMPを介して「ドナー」種に連結され得る3’または5’OH基を含む核酸分子の第二の集団を指す。
ドナーおよびアクセプター種は、任意の核酸種であってもよい。それらは、例えば、生物学的供給源から単離されたポリヌクレオチドであってもよい。この生物学的供給源は被験体であってもよい。例示的な生物学的供給源および被験体は本明細書に記載される。それらは、オリゴヌクレオチドであってもよい。特定の配列のオリゴヌクレオチドを調製するための方法は、当該分野で公知であり、これには、例えば、適切な配列のクローニングおよび制限、ならびに直接の化学合成が挙げられる。化学合成の方法としては、例えば、Narangら、1979,Methods in Enzymology 68:90,に記載のホスホトリエステル法、Brownら、1979,Methods in Enzymology 68:109,に開示のホスホジエステル法、Beaucageら、1981,Tetrahedron Letters 22:1859に開示のジエチルホスホラミダイト法、および米国特許第4,458,066に開示される固体支持体方法が挙げられる。それらは、RNAであっても、またはDNAであってもよい。DNAは、部分的に変性されたDNAであっても、または完全に変性されたDNAであってもよい。DNAは、一本鎖(ss)DNAであってもよい。部分的に変性されるとは、「フレイド(frayed)」末端が1、2、3、4、5、または5を超えるアニーリングされていないヌクレオチドを含み得るように、末端で「フレイド」されてもよい。
ドナーおよび/またはアクセプター核酸種は、例えば、1〜50nt、10〜100nt、50〜200nt、100〜400nt、200〜600nt、500〜1000nt、800〜2000nt、または2000ntよりも多くにわたる任意の大きさのものであってもよい。いくつかの実施形態では、ドナーおよび/またはアクセプター核酸種は、120nt長を超える。
ドナーまたはアクセプター核酸種は、例えば、ゲノムの核酸、アダプター配列、および/またはバーコード配列を含んでもよい。このドナーまたはアクセプター核酸種は、オリゴヌクレオチドを含んでもよい。このドナーまたはアクセプター核酸種は、検出可能な標識またはアフィニティタグを含んでもよい。
検出可能標識は、検出すべき分子の検出を可能にする任意の分子であり得る。検出可能な標識の非限定的な例としては、例えば、キレーター、光活性剤、放射性部分(例えば、α、βおよびγ放射体)、蛍光剤、発光剤、常磁性イオン、または特定の試薬の存在下で検出性シグナルを生じる酵素(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ)が挙げられる。
例示的な蛍光化合物としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン(phycoerytherin)、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o−フタルアルデヒド、フルオレスカミン、および市販のフルオロフォア、例えば、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 488、Alexa
Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 647、DyLight色素、例えば、DyLight 488、DyLight 594、DyLight
647、およびBODIPY色素、例えば、BODIPY 493/503、BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY 530/550、BODIPY TMR、BODIPY 558/568、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY TR、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、カスケードブルー(Cascade Blue)、カスケードイエロー(Cascade Yellow)、Dansyl、リサミンローダミン(lissamine rhodamine)B、マリナブルー(Marina Blue)、Oregon Green 488、Oregon Green 514、Pacific Blue、ローダミン 6G、ローダミングリーン、ローダミンレッド、テトラメチルローダミンおよびテキサスレッド(Texas Red)が挙げられる。このような化合物は、市販されている(例えば、Molecular Probes、Inc.を参照のこと)。
Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 647、DyLight色素、例えば、DyLight 488、DyLight 594、DyLight
647、およびBODIPY色素、例えば、BODIPY 493/503、BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY 530/550、BODIPY TMR、BODIPY 558/568、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY TR、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、カスケードブルー(Cascade Blue)、カスケードイエロー(Cascade Yellow)、Dansyl、リサミンローダミン(lissamine rhodamine)B、マリナブルー(Marina Blue)、Oregon Green 488、Oregon Green 514、Pacific Blue、ローダミン 6G、ローダミングリーン、ローダミンレッド、テトラメチルローダミンおよびテキサスレッド(Texas Red)が挙げられる。このような化合物は、市販されている(例えば、Molecular Probes、Inc.を参照のこと)。
アフィニティータグは、捕獲部分に対して親和性を有するように選択され得る。このアフィニティータグは、非限定的な例に過ぎないが、ビオチン、デスチオビオチン、ヒスチジン、ポリヒスチジン、myc、ヘマグルチニン(HA)、FLAG、蛍光タグ、タンデムアフィニティー精製(TAP)タグ、FLAGタグ、グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)タグ、またはそれらの誘導体を含んでもよい。この捕獲部分は、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、Neutravidin(商標)、ニッケルまたはグルタチオンまたはアフィニティータグに結合し得る他の分子を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、アクセプター種およびドナー種は同じ種であってもよい。例えば、いくつかの実施形態では、ユーザーは、直鎖状の核酸を環状化することを望む場合もあるし、単一の核酸種のコンカテマーを形成する場合もある。
「反応混合物」という用語は、本明細書において用いる場合、一般には、所望の反応を達成するために必要な構成要素の混合物を指す。この混合物はさらに、緩衝液(例えば、Tris緩衝液)を含んでもよい。この反応混合物はさらに、一価の塩を含んでもよい。この反応混合物はさらに、陽イオン、例えば、Mg2+および/またはMn2+を含んでもよい。各々の構成要素の濃度は、当該分野では周知であり、さらに、当業者によって最適化され得る。いくつかの実施形態では、この反応混合物はまた、添加物、例としては、限定するものではないが、非特異的なバックグラウンド/ブロッキング核酸(例えば、サケ精子DNA)、非特異的なバックグラウンド/ブロッキングタンパク質(例えば、ウシ血清アルブミン、脱脂粉乳)、バイオ防腐剤(例えば、アジ化ナトリウム)、PCR増強剤(例えば、ベタイン、トレハロースなど)、およびインヒビター(例えば、RNAse阻害剤)を含む。いくつかの実施形態では、核酸サンプルが、反応混合物と混合される。
「プライマー結合部位」とは、プライマーが、オリゴヌクレオチドまたはその相補鎖中でハイブリダイズする部位を指してもよい。
「分離する」という用語は、本明細書で用いる場合、2つの要素の物理的分離(例えば、サイズ、親和性、1つの要素の分解などによる)を指してもよい。
「配列決定」という用語は、本明細書で用いる場合、ポリヌクレオチドの少なくとも10個の連続するヌクレオチドの同一性(例えば、少なくとも20個、少なくとも50個、少なくとも100個、少なくとも200個もしくは少なくとも500個またはそれ以上の連続するヌクレオチドの同一性)が得られる方法を指してもよい。
「アダプターを連結した(ライゲートした)」という用語は、本明細書で用いる場合、あるアダプターに連結された核酸を指してもよい。アダプターは、ある核酸分子の5’末端または3’末端に連結してもよいし、またはある核酸分子の内部領域に付加されてもよい。
「ブリッジPCR(架橋PCR)」という用語は、固相ポリメラーゼ連鎖反応であって、ここでは反応中に伸長されるプライマーがそれらの5’末端によって基質に係留される反応を指してもよい。増幅中、係留されたプライマーの間にアンプリコンが架橋を形成する。ブリッジPCR(また「クラスターPCR」と呼ばれる場合もある)は、Illumina社のSolexaプラットフォームにおいて用いられる。ブリッジPCRおよびIllumina社のSolexaプラットフォームは、様々な刊行物、例えば、Gudmundssonら(Nat.Genet.2009 41:1122〜6)、Outら(Hum.Mutat.2009 30:1703−12)、およびTurner(Nat.Methods 2009 6:315−6)、米国特許第7,115,400号、ならびに米国特許出願公開第20080160580号および同第20080286795号に一般的に記載される。
「バーコード配列」という用語は、本明細書で用いられる場合、一般には、アッセイについての情報をコードし得るヌクレオチドの固有の配列を指す。バーコード配列は、問い合わされる対立遺伝子の同定、標的ポリヌクレオチドまたはゲノム遺伝子座の同定、サンプル、被験体の同定、またはそれらに任意の組み合わせに関連する情報をコードし得る。バーコード配列は、プライマーの一部であっても、レポータープローブの一部であっても、またはその両方であってもよい。バーコード配列は、オリゴヌクレオチドの5’末端にあっても、もしくは3’末端にあってもよく、またはオリゴヌクレオチドのいずれの領域に位置してもよい。バーコード配列は、テンプレート配列の一部であってもそうでなくてもよい。バーコード配列は、サイズおよび組成において大きく異なってもよく;以下の参考文献は、特定の実施形態に適切なバーコード配列のセットを選択するための目安を提供する:Brenner,米国特許第5,635,400号、Brennerら、Proc.Natl.Acad.Sci.,97:1665〜1670(2000)、Shoemakerら、Nature Genetics,14:450〜456(1996)、Morrisら、欧州特許公開第0799897A1号、Wallace,米国特許第5,981,179号。バーコード配列は、約4〜36ヌクレオチド、約6〜30ヌクレオチド、または約8〜20ヌクレオチドの長さを有してもよい。
「変異」という用語は、本明細書において用いる場合、一般的には、ゲノムのヌクレオチド配列の変化を指す。変異とは、DNAの大きいセクションを包含し得る(例えば、コピー数変動)。変異は、染色体全体(例えば、異数性)を含み得る。変異は、DNAの小さいセクションを含み得る。DNAの小さいセクションに関与する変異の例としては、例えば、点変異、または一塩基多型、多重ヌクレオチド多型、挿入(例えば、ある遺伝子座での1つ以上のヌクレオチドの挿入)、多重ヌクレオチド変化、欠失(例えば、ある遺伝子座での1つ以上のヌクレオチドの欠失)、および逆位(例えば、1つ以上のヌクレオチドの配列の反転)が挙げられる。
「遺伝子座」という用語は、本明細書において用いる場合、染色体上の遺伝子、ヌクレオチドまたは配列の位置を指してもよい。遺伝子座の「対立遺伝子」とは本明細書において用いる場合、その遺伝子座でのヌクレオチドまたは配列の別の形態を指してもよい。「野性型対立遺伝子」とは一般的には、被験体の集団中で最高頻度を有する対立遺伝子を指す。「野性型」対立遺伝子は、一般的には、疾患に関連しない。「変異体対立遺伝子」とは一般には、「野性型対立遺伝子」よりも低頻度であって、疾患に関連し得る対立遺伝子を指す。「変異体対立遺伝子」は、疾患に関連する必要はない場合もある。「問い合わされる対立遺伝子」という用語は、一般には、検出のためにアッセイが設計される対立遺伝子を指す。
「一塩基多型」、または「SNP」という用語は、本明細書において用いる場合、一般的には、配列内の単一ヌクレオチドの置換から生じるある種のゲノム配列変動を指す。「SNP対立遺伝子」または「SNPの対立遺伝子」とは一般には、特定の遺伝子座でのSNPの代替的な形態を指す。「問い合わされるSNP対立遺伝子」という用語は、一般には、検出のためにアッセイが設計されるSNP対立遺伝子を指す。
「コピー数変動」または「CNV」という用語は、遺伝子情報のコピー数の相違を指す。多くの態様では、これは、ゲノム領域のゲノムコピー数あたりの相違を指す。例えば、二倍体生物では、常染色体のゲノム領域の予想されるコピー数は、1ゲノムあたり2コピーである。このようなゲノム領域は、細胞あたり2コピーで存在するはずである。近年のレビューに関しては、Zhangら、Annu.Rev.Genomics Hum.Genet.2009.10:451〜81を参照のこと。CNVは、ヒトでの遺伝的多様性の源であって、例えば、遺伝子の投与量、遺伝子の破壊、または遺伝子の融合を変化することによって、複雑な障害および疾患と関連し得る。それらはまた、良性の多型変異体であってもよい。CNVは、大きくても、例えば、1Mbより大きくてもよいが、多くは、より小さく、例えば、100塩基〜1Mbである。100塩基より大きい(および3Mb未満)の38,000を超えるCNVがヒトでは報告されている。SNPとともに、これらのCNVによって、個体間の相当量の表現型変異について説明される。有害な影響、例えば、疾患の発生を有することに加えて、それらはまた、有利な変動を生じ得る。
特定の場合には、本明細書に記載される方法で用いられるオリゴヌクレオチドは、参照ゲノム領域、すなわち、公知のヌクレオチド配列のゲノム領域、例えば、染色体領域(その配列がNCBIのGenbankデータベースまたは他のデータベースに寄託される)を例えば、用いて設計されてもよい。
「遺伝子型決定」という用語は、本明細書において用いる場合、一般的には、生物学的アッセイを用いて個体のDNA配列を検査すること、およびそれを別の個体の配列または参照配列と比較することによって、個体の遺伝子構造(遺伝子型)の相違を決定するプロセスを指す。
「複数」とは一般には、少なくとも2つのメンバーを含む。特定の場合には、複数とは、少なくとも10,少なくとも100、少なくとも100、少なくとも10,000、少なくとも100,000、少なくとも1000000、少なくとも10000000、少なくとも100000000もしくは少なくとも1000000000またはそれ以上のメンバーを有し得る。
「分離する」という用語は、本明細書において用いる場合、一般的には、2つの要素の物理的な分離(例えば、切断、加水分解または2つの要素のうちの1つの分解による)を指す。
「標識」および「検出可能部分」という用語は、検出可能シグナルを提供するために用いられ得、そして核酸またはタンパク質に結合され得る任意の原子または分子を指して、本明細書では相互に交換可能に用いられ得る。標識は、蛍光、放射性、比色分析、重量測定、X線回折または吸収、磁力、酵素活性などで検出可能なシグナルを提供し得る。
(概説)
本発明の態様は、疾患に罹患している被験体のモニタリングおよび処置を改善する方法およびキットに関する。この疾患は、癌、例えば、腫瘍、白血病、例えば、急性白血病、急性T細胞白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄球性(顆粒球)白血病、または慢性リンパ球性白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、例えば、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫または非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、固形腫瘍、肉腫、癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、リンパ管肉腫、内皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫など、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支の癌、腎細胞癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛腫、精上皮腫、胎生癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮性腫瘍、神経膠腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、子宮内膜癌、非小細胞肺癌であってもよい。
本発明の態様は、疾患に罹患している被験体のモニタリングおよび処置を改善する方法およびキットに関する。この疾患は、癌、例えば、腫瘍、白血病、例えば、急性白血病、急性T細胞白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄球性(顆粒球)白血病、または慢性リンパ球性白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、例えば、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫または非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、固形腫瘍、肉腫、癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、リンパ管肉腫、内皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫など、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支の癌、腎細胞癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛腫、精上皮腫、胎生癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮性腫瘍、神経膠腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、子宮内膜癌、非小細胞肺癌であってもよい。
被験体は、固形腫瘍を保有すると疑われるか、もしくは保有することが公知である場合もあり、または以前に固形腫瘍を保有した被験体である場合もある。
図1は、癌を評価するための方法の例示的なワークフローを示す。工程110では、この方法は、前記被験体から単離された腫瘍サンプルから癌関連遺伝子を配列決定する工程と、必要に応じて前記被験体から単離された正常細胞から癌関連遺伝子のセットを配列決定する工程とを包含する。この腫瘍サンプルは、固形腫瘍サンプルであってもよい。正常な細胞は、被験体由来の血液サンプルから単離された血球であってもよい。工程120では、腫瘍からの配列データを用いて、腫瘍特異的な配列プロファイルを決定してもよい。いくつかの実施形態では、腫瘍由来の配列データを、正常細胞由来の配列データと比較して、腫瘍特異的な配列プロファイルを作成する。いくつかの実施形態では、腫瘍特異的な配列プロファイルは、セット中の1つ以上の遺伝子の変異の状態を含む。この方法はさらに、腫瘍特異的な配列プロファイルを記述するレポートを作成する工程を包含し得る。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、さらなるモニタリングのための腫瘍特異的な変異を保有することが公知の2〜4個の遺伝子のサブセットを選択する工程を包含する。いくつかの実施形態では、この方法は、腫瘍特異的な変異を保有することが公知の4個以下の遺伝子のサブセットを選択する工程を包含する。工程130では、無細胞DNAを、処置(例えば、腫瘍除去または治療介入)前に、ならびに処置(腫瘍除去または治療介入)前に、ならびに後の時点で被験体から収集された血液サンプルから得る。工程140では、血液サンプル由来の無細胞DNAを、サブセット中で2〜4個の遺伝子についてアッセイして、腫瘍特異的な変異の定量的な測定を得る。
図2は、被験体における腫瘍細胞および正常細胞を配列決定するための、工程110〜120からの、図1に記載される方法の例示的なワークフローの描写である。
腫瘍サンプルは、ホルマリン溶液中での固定、続いてパラフィン中への包埋によって(例えば、FFPEサンプルである)、配列決定の前に処理してもよい。いくつかの実施形態では、腫瘍サンプルは、配列決定前に凍結される。いくつかの実施形態では、腫瘍サンプルは固定も凍結もされない。固定されていない未凍結の腫瘍サンプルは、室温での核酸の保存のために構成された貯蔵溶液中に貯蔵されてもよい。貯蔵溶液は、市販の貯蔵溶液であってもよい。例示的な貯蔵溶液としては、限定するものではないが、BiomatricaのDNA貯蔵溶液(例えば、WO/2012/018638、WO/2009/038853、米国特許出願公開第20080176209号を参照のこと)(参照によって本明細書に援用される)が挙げられる。
血液中の変異の状態を決定するための配列決定の方法およびアッセイのさらなる実施形態は、本明細書に記載されている。
(次世代の配列決定)
いくつかの実施形態では、被験体由来の腫瘍サンプルおよび正常細胞を配列決定する。いくつかの実施形態では、核酸は、当該分野で公知の任意の方法を用いて、腫瘍サンプルおよび正常細胞から単離される。核酸はDNAである。腫瘍サンプルおよび正常細胞由来のDNAを用いて、被験体特異的な腫瘍DNAライブラリーおよび/または正常なDNAライブラリーを調製してもよい。DNAライブラリーを、配列決定プラットフォームによる配列決定のために用いてもよい。この配列決定プラットフォームは、次世代の配列決定(NGS)プラットフォームであり得る。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、NGS技術を用いて核酸ライブラリーを配列決定する工程を包含する。NGS技術は、大規模並列(massively parallel)方式での、クローン増幅されたDNAテンプレートまたは単一のDNA分子の配列決定を包含し得る(例えば、Volkerdingら、Clin Chem 55:641〜658[2009];Metzker
M Nature Rev 11:31〜46 [2010]に記載のとおり)。ハイスループットの配列情報に加えて、NGSでは、各々の配列の読み取りが、個々のクローンDNAテンプレートまたは単一のDNA分子を示す計数可能な「配列タグ」であるという点で、デジタルの定量情報を提供する。
いくつかの実施形態では、被験体由来の腫瘍サンプルおよび正常細胞を配列決定する。いくつかの実施形態では、核酸は、当該分野で公知の任意の方法を用いて、腫瘍サンプルおよび正常細胞から単離される。核酸はDNAである。腫瘍サンプルおよび正常細胞由来のDNAを用いて、被験体特異的な腫瘍DNAライブラリーおよび/または正常なDNAライブラリーを調製してもよい。DNAライブラリーを、配列決定プラットフォームによる配列決定のために用いてもよい。この配列決定プラットフォームは、次世代の配列決定(NGS)プラットフォームであり得る。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、NGS技術を用いて核酸ライブラリーを配列決定する工程を包含する。NGS技術は、大規模並列(massively parallel)方式での、クローン増幅されたDNAテンプレートまたは単一のDNA分子の配列決定を包含し得る(例えば、Volkerdingら、Clin Chem 55:641〜658[2009];Metzker
M Nature Rev 11:31〜46 [2010]に記載のとおり)。ハイスループットの配列情報に加えて、NGSでは、各々の配列の読み取りが、個々のクローンDNAテンプレートまたは単一のDNA分子を示す計数可能な「配列タグ」であるという点で、デジタルの定量情報を提供する。
(次世代の配列決定プラットフォーム)
次世代の配列決定プラットフォームは、市販されているプラットフォームであり得る。市販のプラットフォームとしては、例えば、シーケンシング・バイ・シンテシス(sequencing−by−synthesis)のためのプラットフォーム、イオン半導体(ion seminconductor)シーケンシング、パイロシーケンシング(pyrosequencing)、リバーシブル・ダイ・ターミネーター・シーケンシング(reversible dye terminator sequencing)、ライゲーションによる配列決定、単一分子配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、およびナノポアシーケンシングが挙げられる。シーケンシング・バイ・シンテシスのためのプラットフォームは例えば、Illumina,454 Life Sciences,Helicos BiosciencesおよびQiagenから入手可能である。Illuminaプラットフォームには、例えば、Illumina’s Solexaプラットフォーム,Illumina’s Genome Analyzerが挙げられ、これは、Gudmundssonら、(Nat.Genet.2009 41:1122−6)、Outら(Hum.Mutat.2009 30:1703−12)およびTurner(Nat.Methods 2009 6:315−6)、米国特許出願公開第20080160580号および同第20080286795号、米国特許第6306597号、および同第7115400号、および同第7232656号に記載されている。454 Life Scienceプラットフォームには例えば、GS FlexおよびGS Juniorが挙げられ、米国特許第7,323,305号に記載される。Helicos Biosciencesのプラットフォームは、True Single
Molecule Sequencingプラットフォームを含む。イオン半導体シーケンシングのためのプラットフォームには、例えば、Ion Torrent Personal Genome Machine(PGM)を含み、かつ米国特許第7948015号に記載されている。パイロシーケンシングのためのプラットフォームには、GS Flex 454システムを含み、これは、米国特許第7211390号;同第7244559号;同第7264929号に記載される。ライゲーションによる配列決定のためのプラットフォームおよび方法には、例えば、SOLiD配列決定プラットフォームが挙げられ、これは、米国特許第5750341号に記載される。単一分子配列決定のためのプラットフォームには、Pacific BioscienceのSMRTシステム、およびHelicos True Single Molecule Sequencingプラットフォームが挙げられる。
次世代の配列決定プラットフォームは、市販されているプラットフォームであり得る。市販のプラットフォームとしては、例えば、シーケンシング・バイ・シンテシス(sequencing−by−synthesis)のためのプラットフォーム、イオン半導体(ion seminconductor)シーケンシング、パイロシーケンシング(pyrosequencing)、リバーシブル・ダイ・ターミネーター・シーケンシング(reversible dye terminator sequencing)、ライゲーションによる配列決定、単一分子配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、およびナノポアシーケンシングが挙げられる。シーケンシング・バイ・シンテシスのためのプラットフォームは例えば、Illumina,454 Life Sciences,Helicos BiosciencesおよびQiagenから入手可能である。Illuminaプラットフォームには、例えば、Illumina’s Solexaプラットフォーム,Illumina’s Genome Analyzerが挙げられ、これは、Gudmundssonら、(Nat.Genet.2009 41:1122−6)、Outら(Hum.Mutat.2009 30:1703−12)およびTurner(Nat.Methods 2009 6:315−6)、米国特許出願公開第20080160580号および同第20080286795号、米国特許第6306597号、および同第7115400号、および同第7232656号に記載されている。454 Life Scienceプラットフォームには例えば、GS FlexおよびGS Juniorが挙げられ、米国特許第7,323,305号に記載される。Helicos Biosciencesのプラットフォームは、True Single
Molecule Sequencingプラットフォームを含む。イオン半導体シーケンシングのためのプラットフォームには、例えば、Ion Torrent Personal Genome Machine(PGM)を含み、かつ米国特許第7948015号に記載されている。パイロシーケンシングのためのプラットフォームには、GS Flex 454システムを含み、これは、米国特許第7211390号;同第7244559号;同第7264929号に記載される。ライゲーションによる配列決定のためのプラットフォームおよび方法には、例えば、SOLiD配列決定プラットフォームが挙げられ、これは、米国特許第5750341号に記載される。単一分子配列決定のためのプラットフォームには、Pacific BioscienceのSMRTシステム、およびHelicos True Single Molecule Sequencingプラットフォームが挙げられる。
自動サンガー法は、「第一世代」の技術であるとみなされるが、自動サンガーシーケンシングを含むサンガーの配列決定はまた、本発明の方法によっても使用されてもよい。開発中の核酸画像化技術、例えば、原子間力顕微鏡(AFM)または透過電子顕微鏡(TEM)の使用を含む追加の配列決定法もまた、本発明の方法によって包含される。例示的な配列決定の技術は下に記載される。
DNA配列決定技術は、半導体技術と、シーケンシング化学を一緒にして、化学的にコードされた情報(A、C、G、T)を半導体チップ上のデジタル情報(0、1)に直接変換する、イオントーレント(Ion Torrent)シーケンシングプラットフォームを利用し得る。理論で束縛されることは望まないが、ヌクレオチドがポリメラーゼによってDNAの鎖に組み込まれる場合、水素イオンが副産物として放出される。イオントーレント(Ion Torrent)プラットフォームは、水素原子の放出をpHの変化として検出する。pHの検出された変化を用いて、ヌクレオチドの組み込みを示してもよい。イオントーレントプラットフォームは、大規模並列方式でこの生化学的プロセスを行うためにマイクロマシンのウェルの高密度のアレイを含む。各々のウェルは、異なるライブラリーのメンバーを保持し、これがクローンとして増幅され得る。ウェルの下がイオン感受性層であって、その下がイオンセンサーである。このプラットフォームは、連続してアレイを1つのヌクレオチドでまた引き続いて浸す。あるヌクレオチド、例えば、CがDNAテンプレートに追加されて、次にDNAの鎖に組み込まれる場合、水素イオンが放出される。そのイオンからの電荷によって、溶液のpHが変化し、これがイオントーレントのイオンセンサーによって特定され得る。ヌクレオチドが組み込まれていない場合、電圧変化が記録されて、コールされる塩基はない。DNA鎖の上に2つの同一の塩基があれば、電圧は倍になり、チップはコールされた2つの同一の塩基を記録する。直接の同定によって、ヌクレオチド組み込みの記録が秒単位で可能になる。イオントーレントプラットフォームのためのライブラリーの調製は一般には、DNAフラグメントの両端で2つの別個のアダプターのライゲーションを含む。
DNA配列決定技術は、Illuminaシーケンシングプラットフォームを利用しており、ここでは一般に、フローセルおよびシーケンシング・バイ・シンテシスのアプローチでのライブラリーメンバーのクラスター増幅を使用する。クラスター増幅のライブラリーメンバーは、ポリメラーゼ指向性単一塩基伸長の反復サイクルに供される。単一塩基伸長は、リバーシブルターミネーターdNTPの組み込みを包含し得る(各々のdNTPは、異なる除去可能なフルオロフォアで標識されている)。可逆性のターミネーターdNTPは一般には、ポリメラーゼによるさらなる伸長を防ぐように3’で修飾されている。組み込み後、組み込まれたヌクレオチドは、蛍光画像によって特定され得る。蛍光画像化の後、フルオロフォアは、取り外されてもよく、そして3’修飾は取り外されてもよく、その結果、3’ヒドロキシル基が生じ、それによって単一塩基伸長の別のサイクルが可能になる。Illuminaプラットフォームのためのライブラリー調製は一般的には、DNAフラグメントの両端での2つの別個のアダプターのライゲーションを含む。
本発明の1つ以上の方法で用いられるDNA配列決定技術は、Helicos True Single Molecule Sequencing(tSMS)であってもよく、これは、シーケンシング・バイ・シンテシス技術を使用し得る。tSMS技術では、ポリAアダプターを、DNAフラグメントの3’末端に連結してもよい。適合したフラグメントは、tSMSフローセル上に固定されたポリ−Tオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされ得る。ライブラリーのメンバーは、約1億個のテンプレート/cm2という密度でフローセル上に固定され得る。次いで、フローセルは、装置、例えば、HeliScope(商標)シーケンサーにロードされてもよく、レーザーは、フローセルの表面を照射して、各々のテンプレートの位置を明らかにする。CCDカメラは、フローセル表面上にテンプレートの位置をマッピングし得る。ライブラリーのメンバーは、ポリメラーゼ指向性の単一塩基伸長の反復サイクルに供され得る。この配列決定反応は、DNAポリメラーゼおよび蛍光標識ヌクレオチドを導入することによって開始する。ポリメラーゼは、標識されたヌクレオチドをプライマーに、テンプレート指向性方式で組み込み得る。ポリメラーゼおよび組み込まれていないヌクレオチドは、取り出されてもよい。蛍光標識されたヌクレオチドの指向性の組み込みを有するテンプレートは、フローセル表面を画像化することによって識別され得る。画像化後、切断工程で蛍光標識を取り外してもよく、このプロセスは、所望の読み取り長さが達成されるまで、他の蛍光標識されたヌクレオチドで反復され得る。配列情報は、各々のヌクレオチド追加工程で収集され得る。
DNA配列決定技術は、454配列決定プラットフォーム(Roche)(例えば、Margulies,M.ら、Nature 437:376〜380[2005]に記載)を利用し得る。454配列決定は一般的には、2工程を含む。第一工程では、DNAはフラグメントに剪断される。このフラグメントはブラントエンドであってもよい。オリゴヌクレオチドアダプターが、このフラグメントの末端に連結され得る。このアダプターは一般には、フラグメントの増幅および配列決定のためのプライマーとして機能する。少なくとも1つのアダプターは、捕獲試薬、例えば、ビオチンを含んでもよい。フラグメントは、DNA捕獲ビーズ、例えば、ストレプトアビジンコーティングビーズに付着されてもよい。ビーズに付着されたフラグメントは、油−水型のエマルジョンの液滴内で増幅されるPCRであってもよく、これによって各々のビーズ上でクローン増幅したDNAフラグメントの多数のコピーが生じる。第二工程では、ビーズは、ピコリットルのサイズであり得るウェルに捕獲され得る。パイロシーケンシングは、各々のDNAフラグメントで並行して行われ得る。パイロシーケンシングは一般的には、ヌクレオチド組み込みの際に、ピロリン酸塩(PPi)の放出を検出する。PPiは、アデノシン5’ホスホ硫酸の存在下でATPスルフリラーゼによってATPに変換され得る。ルシフェラーゼは、ATPを用いて、ルシフェリンをオキシルシフェリンに変換し得、それによって検出される光のシグナルを生じる。検出された光のシグナルを用いて、組み込まれたヌクレオチドを特定してもよい。
このDNA配列決定技術は、SOLiD(商標)技術(Applied Biosystems)を利用してもよい。SOLiDプラットフォームは一般には、シーケンシング・バイ・ライゲーションのアプローチを利用する。SOLiDプラットフォームでの使用のためのライブラリーの調製は一般には、フラグメントの5’末端および3’末端にアダプターが付着しているライゲーションを含み、フラグメントライブラリーを作製する。あるいは、フラグメントの5’末端および3’末端へのアダプターのライゲーションによって内部アダプターを導入して、フラグメントを環状化させ、この環状化フラグメントを消化して内部アダプターを作製し、得られたフラグメントの5’末端および3’末端にアダプターを付着させて、メイトペアライブラリーを作製してもよい。次に、クローン化ビーズ集団が、ビーズ、プライマー、テンプレートおよびPCR成分を含むマイクロリアクター中で調製され得る。PCR後、テンプレートは変性され得る。ビーズは伸長されてテンプレートを有するビーズについて富化され得る。選択されたビーズ上のテンプレートは、スライドガラスへの結合を可能にする3’修飾を施されてもよい。配列は、連続的ハイブリダイゼーションおよび中央決定塩基(または塩基の対)での部分的にランダムなオリゴヌクレオチドのライゲーションによって決定され得、これは、特異的フルオロフォアによって同定される。色が記録された後、連結されたオリゴヌクレオチドは、取り除かれて、次にこのプロセルスが繰り返されてもよい。
DNA配列決定技術は、1分子リアルタイム(SMRT(商標))配列決定プラットフォーム(Pacific Biosciences)を利用してもよい。SMRT配列決定においては、色素標識ヌクレオチドの連続的組み込みが、DNA合成の間に画像化され得る。1つのDNAポリメラーゼ分子が、個々の0モード波長識別子(ZMW識別子)の底表面に付着されてもよく、このZMW識別子は、リン酸基連結された(phospolinked)ヌクレオチドが成長中のプライマー鎖に組み込まれている間に、配列情報を得る。ZMWとは、一般的には、ZMWの外側に迅速に(マイクロ秒で)拡散する蛍光ヌクレオチドのバックグラウンドに対して、DNAポリメラーゼによる1つのヌクレオチドの組み込みの観察を可能にする閉じ込め構造を指す。対照的に、ヌクレオチドの組み込みには、一般に、数ミリ秒の時間尺度がかかる。この間に、蛍光標識は励起して、蛍光シグナルを発して、これが検出される。蛍光シグナルの検出を用いて、配列情報を作成してもよい。次いで、フルオロフォアを取り出して、このプロセスを繰り返してもよい。SMRTプラットフォームのためのライブラリー調製は一般には、DNAフラグメントの末端に対するヘアピンアダプターのライゲーションを包含する。
DNA配列決定技術は、ナノポア配列決定(例えばSoni GVおよびMeller
A.Clin Chem 53:1996−2001[2007]において記載される)を利用してもよい。ナノポア配列決定DNA解析技術は、Oxford Nanopore Technologies(英国、オックスフォード)を含む多くの会社によって産業的に開発されている。ナノポア配列決定は、1分子配列決定技術であり、ここで、1分子のDNAが、ナノポアを通過する際に直接的に配列決定される。ナノポアは、直径1ナノメートルのオーダーの小さな穴であってもよい。ナノポアの導伝性流体内への浸漬およびこれを横切る電位(電圧)の適用は、ナノポアを通るイオンの伝導に起因する僅かな電流を生じ得る。流れる電流の量は、ナノポアの大きさおよび形状、ならびに例えば、DNA分子による閉塞に感受性である。DNA分子がナノポアを通る際、DNA分子上の各ヌクレオチドが、ナノポアを異なる程度で塞ぎ、ナノポアを通る電流の大きさを、異なる程度で変える。したがって、DNA分子がナノポアを通る際の電流におけるこの変化は、DNA配列の読み取りに相当する。
A.Clin Chem 53:1996−2001[2007]において記載される)を利用してもよい。ナノポア配列決定DNA解析技術は、Oxford Nanopore Technologies(英国、オックスフォード)を含む多くの会社によって産業的に開発されている。ナノポア配列決定は、1分子配列決定技術であり、ここで、1分子のDNAが、ナノポアを通過する際に直接的に配列決定される。ナノポアは、直径1ナノメートルのオーダーの小さな穴であってもよい。ナノポアの導伝性流体内への浸漬およびこれを横切る電位(電圧)の適用は、ナノポアを通るイオンの伝導に起因する僅かな電流を生じ得る。流れる電流の量は、ナノポアの大きさおよび形状、ならびに例えば、DNA分子による閉塞に感受性である。DNA分子がナノポアを通る際、DNA分子上の各ヌクレオチドが、ナノポアを異なる程度で塞ぎ、ナノポアを通る電流の大きさを、異なる程度で変える。したがって、DNA分子がナノポアを通る際の電流におけるこの変化は、DNA配列の読み取りに相当する。
DNA配列決定技術は、化学的感受性電界効果トランジスタ(chemFET)アレイを利用してもよい(例えば、米国特許出願公開第20090026082号に記載される)。この技術の例では、DNA分子は、反応チャンバ内に置かれてもよく、そしてテンプレート分子は、ポリメラーゼに結合した配列決定プライマーにハイブリダイズされ得る。配列決定プライマーの3’末端における新たな核酸鎖への1つ以上の三リン酸の組み込みは、chemFETにより、電流の変化で認識され得る。1つのアレイは、多数のchemFETセンサーを有し得る。別の例では、1つの核酸は、ビーズに付着し得、そしてこの核酸は、ビーズ上で増幅され得、そして個々のビーズは、chemFETアレイ上の個々の反応チャンバ(それぞれのチャンバがchemFETセンサを有する)に移送され得て、核酸が配列決定され得る。
DNA配列決定技術は、透過電子顕微鏡(TEM)を利用してもよい。この方法は、個別分子配置迅速ナノ輸送(Individual Molecule Placement Rapid Nano Transfer(IMPRNT))と呼ばれ、一般には、重原子マーカーを用いて選択的に標識された高分子量(150kb以上)のDNAの1原子解析透過電子顕微鏡画像化、およびこれらの分子を超薄フィルム上に超高密度(鎖間3nm)平行アレイに、一定の塩基間隔で配列する工程を包含する。電子顕微鏡を用いて、フィルム上の分子を画像化し、重原子マーカーの位置を決定して、DNAから塩基配列情報を引き出す。この方法は、PCT特許公開WO2009/046445にさらに記載される。この方法によって、10分間未満での完全なヒトゲノムの配列決定が可能になる。
この方法は、ハイブリダイゼーションによる配列決定(sequencing by hybridization)(SBH)を利用し得る。SBHは一般的には、複数のポリヌクレオチド配列と複数のポリヌクレオチドプローブとを接触させる工程であって、ここで、各々の複数のポリヌクレオチドプローブは、必要に応じて基板に固定され得る工程を包含する。この基板は、公知のヌクレオチド配列のアレイを含む平坦な表面であってもよい。アレイに対するハイブリダイゼーションのパターンは、サンプル中に存在するポリヌクレオチドの配列を決定するために用いられ得る。他の実施形態では、各々のプローブがビーズ、例えば、磁気ビーズなどに固定される。ビーズに対するハイブリダイゼーションを特定し、これを用いて、サンプル内の複数のポリヌクレオチド配列を特定してもよい。
配列読み取りの長さは、利用される特定の配列決定技術次第で変化し得る。NGSプラットフォームは、数十塩基対〜数百塩基対、または数千塩基対までサイズが変動する配列読み取りを提供し得る。本明細書において記載される方法のいくつかの実施形態では、配列読み取りは、約20塩基長、約25塩基長、約30塩基長、約35塩基長、約40塩基長、約45塩基長、約50塩基長、約55塩基長、約60塩基長、約65塩基長、約70塩基長、約75塩基長、約80塩基長、約85塩基長、約90塩基長、約95塩基長、約100塩基長、約110塩基長、約120塩基長、約130、約140塩基長、約150塩基長、約200塩基長、約250塩基長、約300塩基長、約350塩基長、約400塩基長、約450塩基長、約500塩基長、約600塩基長、約700塩基長、約800塩基長、約900塩基長、約1000塩基長、または1000塩基長超である。
サンプル中に存在するDNAフラグメントの部分的な配列決定を行ってもよく、公知の参照ゲノムにマッピングする読み取りを含む配列タグをカウントしてもよい。参照ゲノムに対して特異的に整列する配列読み取りのみを配列タグとしてカウントしてもよい。一実施形態では、参照ゲノムはヒト参照ゲノムNCBI36/hg18配列であり、これはワールドワイドウェブ上で、genome.ucsc.edu/cgi−bin/hgGateway?org=Human&db=hgl 8&hgsid=166260105)で入手可能である。公的な配列情報の他のソースとしては、GenBank、dbEST、dbSTS、EMBL(欧州分子生物学研究所:European Molecular Biology Laboratory)、およびDDBJ(日本DNAデータバンク)が挙げられる。参照ゲノムはまた、ヒト参照ゲノムNCBI36/hgl 8配列および人工標的配列ゲノムを含み得、これには、多形性標的配列を含む。さらに別の実施形態では、この参照ゲノムは、多形性標的配列を含む人工標的配列ゲノムである。
配列タグのマッピングは、タグの配列と、参照ゲノムの配列とを比較して、配列決定された核酸(例えば、無細胞DNA)分子の染色体起源を決定することによって得ることが可能であり、特定の遺伝子配列情報は必要としない。多くのコンピュータアルゴリズムが、配列をアラインメントするために利用可能であり、これには限定するものではないが、BLAST(Altschulら、1990年)、BLITZ(MPsrch)(Sturrock&Collins、1993)、FASTA(Person&Lipman、1988)、BOWTIE(Langmeadら、Genome Biology 10:R25.1〜R25.10[2009])、またはELAND(Illumina,Inc.、San Diego,CA,USA)が挙げられる。一実施形態では、DNA分子のクローン増殖されたコピーの一端は、Illumina Genome Analyzer(Efficient Large−Scale Alignment of Nucleotide Databases(ELAND)ソフトウェアを用いる)のバイオインフォーマティックアラインメント解析によって配列決定され、処理される。追加のソフトウェアとしては、SAMtools(SAMtools,Bioinformatics,2009,25(16):2078−9)、およびBurroughs−Wheelerブロックソーティングコンプレッション(block sorting compression)手順(ブロックソーティングまたはプレプロセシングして、圧縮をより効率的にさせる工程を包含する)が挙げられる。
本明細書に記載される配列決定プラットフォームは一般には、固体支持体に対する配列決定ライブラリーのメンバーの捕獲および固定を可能にする表面結合オリゴヌクレオチド上に固定された固体支持体を含む。表面結合されたオリゴヌクレオチドは一般には、配列決定ライブラリーのアダプター表面に対する配列相補性を含む。
核酸サンプルを用いて、配列決定のための核酸ライブラリーを調製してもよい。核酸ライブラリーの調製は、当該分野で公知であるかまたは本明細書に記載のような任意の方法を含んでもよい。本明細書において用いる場合、「ライブラリー」または「配列決定ライブラリー」という用語は、本明細書では交換可能に用いられ、生物学的サンプルから得られる複数の核酸フラグメントを指してもよい。一般には、フラグメントは、配列決定プラットフォームに対するフラグメントのカップリング(例えば、捕獲および/または固定)に影響するアダプター配列で修飾される。アダプター配列は、配列決定プラットフォームに対するライブラリーのメンバーのカップリングに影響する規定のオリゴヌクレオチド配列を含んでもよい。単なる例であるが、アダプターは、固体支持体(例えば、配列決定フローセルまたはビーズ)に固定されたオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも25%相補性であるか、または同一である配列を含んでもよい。アダプター配列は、配列決定プライマーに対して少なくとも70%相補性であるか、または同一である既定のオリゴヌクレオチド配列を含んでもよい。この配列決定プライマーは、ポリメラーゼによるヌクレオチド組み込みを可能にし、ここではヌクレオチドの組み込みをモニターして、配列決定情報を得る。配列決定プライマーは、約15〜25塩基であってもよい。いくつかの実施形態では、この配列決定プライマーは、アダプターの3’末端にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、アダプターは、固体支持体に固定されたオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも25%相補性であるか、または同一である配列、および配列決定プライマーに対して少なくとも70%相補性であるか、または同一である配列を含む。カップリングはまた、連続的にアダプターを一緒にスティッチングすることを通じて達成され得る。スティッチされ得るアダプターの数は、1、2、3、4またはそれ以上であってもよい。このスティッチされたアダプターは、少なくとも35塩基、70塩基、105塩基、140塩基またはそれ以上であってもよい。
アダプターは、バーコード配列を含んでもよい。ライブラリー中の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、または100%の配列決定ライブラリーのメンバーが、同じアダプター配列を含んでもよい。ssDNAライブラリーのメンバーのうち少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、または100%が、第一の末端でアダプター配列を含み得るが、第二の末端では含まない。いくつかの実施形態では、第一の末端は5’末端である。いくつかの実施形態では、第一の末端は3’末端である。アダプター配列は、配列決定のために用いられる配列決定プラットフォームに従って、ユーザーによって選択され得る。単なる例に過ぎないが、合成プラットフォームによるIllumina配列決定は、固体支持体を含み、その上に固定された表面結合オリゴヌクレオチドの第一および第二の集団がある。このようなオリゴヌクレオチドは、第一および第二のIllumina特異的なアダプターオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイゼーションするため、および伸長反応をプライミングするための配列を含む。したがって、DNAライブラリーのメンバーは、Illuminaシステムの表面結合オリゴヌクレオチドの第一の集団に対して部分的にまたは完全に相補的である第一のIllumina特異的なアダプターを含んでもよい。他の例に過ぎないが、SOLiDシステム、およびイオントーレント(Ion Torrent)、GS FLEXシステムは、固体支持体をビーズの形態で含み、この上に表面結合したオリゴヌクレオチドの単一の集団が固定されている。したがって、いくつかの実施形態では、ssDNAライブラリーのメンバーは、SOLiDシステム、Ion Torrentシステム、またはGS Flexシステムの表面結合したオリゴヌクレオチドに相補的であるアダプター配列を含む。
したがって、一態様では、本発明は、核酸ライブラリーを調製する改善された方法を提供する。核酸ライブラリーは、DNAライブラリーであってもよい。この方法は、DNAフラグメントに対するアダプター配列のライゲーションを含んでもよい。この方法は、アダプターのライゲーションの効率を少なくとも10倍改善し得る。いくつかの実施形態では、核酸ライブラリーは、ssDNAライブラリーである。いくつかの実施形態では、核酸ライブラリーは部分的なssDNAライブラリーである。
(ssDNAフラグメント/ssDNAライブラリーの調製)
いくつかの実施形態では、ssDNAフラグメントは、ssDNAライブラリーのメンバーである。一本鎖核酸ライブラリーは、当該分野で公知であるか、または本明細書に記載の任意の手段を用いて二本鎖核酸のサンプルから調製される。
いくつかの実施形態では、ssDNAフラグメントは、ssDNAライブラリーのメンバーである。一本鎖核酸ライブラリーは、当該分野で公知であるか、または本明細書に記載の任意の手段を用いて二本鎖核酸のサンプルから調製される。
出発サンプルは、被験体から得られた生物学的サンプルであってもよい。例示的な被験体および生物学的サンプルは、本明細書に記載される。特定の実施形態では、このサンプルは、固体の生物学的サンプル、例えば、腫瘍サンプルである。いくつかの実施形態では、この固体の生物学的サンプルは、プローブベースのアッセイの前に処理される。処理には、ホルマリン溶液中での固定、続いてパラフィン中への包埋(例えば、FFPEサンプルである)を包含し得る。処理は、代わりに、プローブベースのアッセイを行う前のサンプルの凍結を包含してもよい。いくつかの実施形態では、サンプルは、固定も凍結もされていない。未固定の未凍結のサンプルは、例に過ぎないが、核酸の保存のために構成された貯蔵溶液中に貯蔵されてもよい。例示的な貯蔵溶液は本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、非核酸物質は、酵素処理を用いて(例えば、プロテアーゼで)出発材料から取り除かれてもよい。サンプルは必要に応じてホモジナイゼーション、超音波処理、フレンチプレス、ダウンス(dounce)、凍結/解凍に供されてもよく、その後に遠心分離を続けてもよい。遠心分離によって、非核酸含有画分から核酸含有画分を分離してもよい。いくつかの実施形態では、このサンプルは、液体の生物学的サンプルである。例示的な液体生物学的サンプルが本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、液体生物学的サンプルは、血液サンプル(例えば、全血、血漿、または血清)である。いくつかの実施形態では、全血サンプルは、参照によって本明細書に援用される、Fussら、Curr Protoc Immunol(2009)第7章:Unit7.1に詳細に記載されるFicoll試薬(reagentm)の使用によって無細胞成分(例えば、血漿、血清)および細胞成分に供される。
核酸は、当該分野で公知の任意の手段を用いて生物学的サンプルから単離されてもよい。例えば、核酸は、液体抽出(例えば、Trizol,DNAzol)技術を用いて生物学的サンプルから抽出されてもよい。核酸はまた、市販のキット(例えば、Qiagen
DNeasyキット,QIAampキット,Qiagen Midiキット,QIAprepスピンキット)を用いて抽出されてもよい。
DNeasyキット,QIAampキット,Qiagen Midiキット,QIAprepスピンキット)を用いて抽出されてもよい。
核酸は、単なる例であるが、遠心分離を含む公知の方法によって濃縮してもよい。核酸は、精製の目的のために選択性の膜(例えば、シリカ)に結合され得る。核酸はまた、所望の長さのフラグメント、例えば、1000、500、400、300、200または100の塩基対長未満であるフラグメントに関して富化されてもよい。サイズに基づくこのような富化は、例えば、PEG−誘発性の沈降、電気泳動ゲルまたはクロマトグラフィー材料(Huberら、(1993)Nucleic Acids Res.21:1061〜6)、ゲル濾過クロマトグラフィー、TSKゲル(Katoら、(1984)J.Biochem,95:83〜86)を用いて行われてもよい(この刊行物は、参照によって本明細書に援用される)。
生物学的サンプルから抽出されたポリヌクレオチドは、当該分野で公知の任意の方法を用いて選択的に沈殿されても、濃縮されてもよい。
核酸サンプルは、標的ポリヌクレオチドに関して富化されてもよい。標的富化は、当該分野で公知の任意の手段によってもよい。例えば、核酸サンプルは、標的特異的プライマーを用いて標的配列を増幅することによって富化されてもよい。標的増幅は、当該分野で公知の任意の方法またはシステムを用いて、デジタルPCR方式で行われてもよい。核酸サンプルは、アレイ(その上に標的選択性のオリゴヌクレオチドが固定されている)上への標的配列の捕獲によって富化され得る。この核酸サンプルは、溶液中、または固体支持体上で遊離の標的選択性オリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズすることによって富化され得る。オリゴヌクレオチドは、捕獲試薬による捕獲を可能にする捕獲部分を含んでもよい。例示的な捕獲部分および捕獲試薬は本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、核酸サンプルは、標的ポリヌクレオチドに関しては富化されず、例えば、全ゲノムに相当する。
したがって、いくつかの態様では、本発明は、一本鎖核酸ライブラリーを調製する方法を提供する。一本鎖核酸ライブラリーは、一本鎖DNAライブラリー(ssDNAライブラリー)であっても、またはRNAライブラリーであってもよい。ssDNAライブラリーを調製する方法は、二本鎖DNAフラグメントをssDNAフラグメントに変性する工程、プライマードッキング配列を、ssDNAフラグメントの一端に連結する工程、プライマーをプライマードッキング配列にハイブリダイズさせる工程を包含し得る。このプライマーは、次世代の配列決定プラットフォームにカップリングするアダプター配列の少なくとも一部を含んでもよい。この方法はさらに、二重鎖を作成するためのハイブリダイズしたプライマーの伸長を含んでもよく、ここでは二重鎖は、元のssDNAフラグメントおよび伸長したプライマー鎖を含む。伸長したプライマー鎖は、元のssDNAフラグメントから分離されてもよい。この伸長したプライマー鎖は収集されてもよい(ここでは、この伸長したプライマー鎖はssDNAライブラリーのメンバーである)。RNAライブラリーを調製する方法は、RNAフラグメントの一端に対してプライマードッキング配列を連結する工程と、プライマーをプライマードッキング配列にハイブリダイズさせる工程を包含する。このプライマーは、次世代配列決定プラットフォームにカップリングするアダプター配列の少なくとも一部を含んでもよい。この方法はさらに、二重鎖を作成するためにハイブリダイズされたプライマーの伸長を包含してもよく、ここでは二重鎖は、元のRNAフラグメントおよび伸長したプライマー鎖を含む。この伸長したプライマー鎖は、元のRNAフラグメントから分離されてもよい。この伸長したプライマー鎖は、収集されてもよい(ここでは、この伸長したプライマー鎖はRNAライブラリーのメンバーである)。
dsDNAは、当該分野で公知または本明細書で記載される任意の手段によって断片化され得る。dsDNAは、例えば、機械的剪断によって、噴霧化によって、または超音波処理によって断片化されてもよい。
いくつかの実施形態では、cDNAを、ランダムプライム逆転写(RNaseH+)を用いてRNAから生成して、ランダムなサイズのcDNAを生成する。
核酸フラグメント(例えば、dsDNAフラグメント、RNA、またはランダムなサイズのcDNA)は、1000bp未満、800bp未満、700bp未満、600bp未満、500bp未満、400bp未満、300bp未満、200bp未満、または100bp未満であってもよい。DNAフラグメントは、約40〜100bp、約50〜125bp、約100〜200bp、約150〜400bp、約300〜500bp、約100〜500、約400〜700bp、約500〜800bp、約700〜900bp、約800〜1000bp、または約100〜1000bpであってもよい。
dsDNAフラグメントの末端は、ポリッシュ(例えば、ブラントエンド化(平滑末端化))されてもよい。DNAフラグメントの末端は、ポリメラーゼでの処理によってポリッシング(polishing)されてもよい。ポリッシングは、3’オーバーハングの除去、5’オーバーハングの充填、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。ポリメラーゼは、校正(proof−reading)ポリメラーゼ(例えば、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を含む)であってもよい。この校正ポリメラーゼは例えば、T4 DNAポリメラーゼ、Pol 1 Klenowフラグメント、またはPfuポリメラーゼであってもよい。ポリッシングは、当該分野で公知の任意の手段を用いる損傷されたヌクレオチド(例えば、無塩基部位)の除去を包含し得る。
核酸フラグメントの3’末端に対するアダプターのライゲーションは、そのフラグメントの3’OH基とアダプターの5’リン酸塩との間の結合の形成を包含し得る。したがって、核酸フラグメントからの5’リン酸塩の除去によって、2つのライブラリーメンバーの異常なライゲーションが最小になり得る。したがって、いくつかの実施形態では、5’リン酸塩は、核酸フラグメントから除去される。いくつかの実施形態では、5’リン酸塩は、サンプル中の核酸フラグメントのうち少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または95%超から除去され得る。いくつかの実施形態では、実質的にすべてのリン酸基が、核酸フラグメントから除去される。いくつかの実施形態では、実質的にすべてのリン酸塩が、サンプル中の核酸フラグメントの少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または95%超から除去される。核酸サンプルからのリン酸基の除去は、当該分野で公知の任意の手段によってもよい。リン酸基の除去は、熱不安定性ホスファターゼでサンプルを処理する工程を包含し得る。いくつかの実施形態では、リン酸基は、核酸サンプルから除去されない。いくつかの実施形態では、核酸フラグメントの5’末端に対するアダプターのライゲーションが行われる。
(変性)
ssDNAは、当該分野における、または本明細書に記載の任意の手段によって、調製されるdsDNAフラグメントから単一の鎖への変性によって調製され得る。dsDNAの変性は、当該分野で公知の任意の手段、例としては、熱変性、塩基性pH中でのインキュベーション、尿素またはホルムアルデヒドによる変性によってもよい。
ssDNAは、当該分野における、または本明細書に記載の任意の手段によって、調製されるdsDNAフラグメントから単一の鎖への変性によって調製され得る。dsDNAの変性は、当該分野で公知の任意の手段、例としては、熱変性、塩基性pH中でのインキュベーション、尿素またはホルムアルデヒドによる変性によってもよい。
熱変性は、dsDNAサンプルを約60℃以上、約65℃以上、約70℃以上、約75℃以上、約80℃以上、約85℃以上、約90℃以上、約95℃以上または約98℃以上まで加熱することによって達成され得る。dsDNAサンプルは、当該分野で公知の任意の手段、例えば、水浴中でのインキュベーション、温度制御熱ブロック、サーマルサイクラーによって加熱されてもよい。いくつかの実施形態では、サンプルは、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または10分超加熱される。
塩基性のpHでのインキュベーションによる変性は、例えば、水酸化ナトリウム(NaOH)または水酸化カリウム(KOH)を含む溶液中でdsDNAサンプルのインキュベーションによって達成され得る。この溶液は、約1mMのNAOH、2mMのNAOH、5mMのNAOH、10mMのNAOH、20mMのNAOH、40mMのNAOH、60mMのNAOH、80mMのNAOH、100mMのNAOH、0.2MのNaOH、約0.3MのNaOH、約0.4MのNaOH、約0.5MのNaOH、約0.6MのNaOH、約0.7MのNaOH、約0.8MのNaOH、約0.9MのNaOH、約1.0MのNaOH、または1.0Mを超えるNaOHを含んでもよい。この溶液は、約1mMのKOH、2mMのKOH、5mMのKOH、10mMのKOH、20mMのKOH、40mMのKOH、60mMのKOH、80mMのKOH、100mMのKOH、0.2MのKOH、0.5MのKOH、1MのKOH、または1Mより多いKOHを含んでもよい。いくつかの実施形態では、dsDNAサンプルは、NaOHまたはKOH中で、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60分、または60分超の間インキュベートされる。dsDNAは、NaOHまたはKOHのインキュベーションの後、酢酸Na中でインキュベートされてもよい。酢酸Na中のインキュベーションは、NaOHまたはKOHを中和し得る。
尿素およびホルムアミドのような化合物は、ヌクレオチド塩基の電気陰性中心とH結合を形成し得る官能基を含む。高濃度(例えば、8M尿素または70%ホルムアミド)の変性剤では、H結合についての競合は、相補性塩基の間ではなく変性とN塩基との間の相互作用を支援し、それによって2つの鎖を分離する。
(プライマードッキングオリゴヌクレオチドのライゲーション)
プライマードッキングオリゴヌクレオチド(pdo)は、核酸フラグメント(例えば、ssDNA、RNA)の一端に連結されてもよい。pdoは、5’末端または3’末端に連結されてもよい。いくつかの実施形態では、pdoは、核酸フラグメントの3’末端に連結される。
プライマードッキングオリゴヌクレオチド(pdo)は、核酸フラグメント(例えば、ssDNA、RNA)の一端に連結されてもよい。pdoは、5’末端または3’末端に連結されてもよい。いくつかの実施形態では、pdoは、核酸フラグメントの3’末端に連結される。
pdoは一般的には、プライマーをアニーリングするためのテンプレートとして機能する配列を含む。pdoの配列は、NGSプラットフォームにカップリングするためのアダプター配列(NGSアダプター)の一部または全てに対して少なくとも70%相補的な配列を含み得る。pdoは、NGSアダプターの5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、または20超の連続のヌクレオチドに対して相補的であるかまたは同一である配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、pdoは、NGSアダプターの一部または全てに対して相補的な配列を含まない。
pdoは、5’末端でアデニル化されてもよい。pdoは、捕獲試薬との複合体を形成し得る捕獲部分にコンジュゲートされてもよい。この捕獲部分は、当該分野で公知の任意の手段によってアダプターオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされてもよい。捕獲部分/捕獲試薬の対は、当該分野で公知である。いくつかの実施形態では、捕獲試薬は、アビジン、ストレプトアビジン、またはニュートラアビジンであり、かつ捕獲部分はビオチンである。別の実施形態では、捕獲部分/捕獲試薬の対は、ジゴキシゲニン/コムギ胚芽凝集素である。
核酸フラグメントに対するpdoのライゲーションは、ATP依存性リガーゼによって達成され得る。いくつかの実施形態では、ATP依存性リガーゼは、RNAリガーゼである。RNAリガーゼは、ATP依存性リガーゼであってもよい。RNAリガーゼは、Rnl 1またはRnl 2のファミリーのリガーゼであってもよい。一般には、Rnl 1のファミリーのリガーゼは、tRNA中の一本鎖破壊を修復し得る。例示的なRnl 1ファミリーリガーゼとしては、例えば、T4 RNAリガーゼ、Thermus scitoductus bacteriophage TS2126由来の熱安定性RNAリガーゼ 1(CircLigase)、またはCircLigase IIが挙げられる。これらのリガーゼは一般的には、ヌクレオチド3−OH求核試薬と5’リン酸基との間のホスホジエステル結合のATP依存性の形成を触媒する。一般には、Rnl 2ファミリーリガーゼは、二重鎖RNA中のニックをシールし得る。例示的なRnl 2ファミリーリガーゼとしては、例えば、T4 RNAリガーゼ 2が挙げられる。このRNAリガーゼは、Archaeal RNAリガーゼ、例えば、好熱性の古細菌Methanobacterium thermoautotrophicum(MthRnl)由来の古細菌のRNAリガーゼであってもよい。
一本鎖核酸フラグメントに対するpdoのライゲーションは、核酸フラグメント、pdoおよびリガーゼを含む反応混合物を調製する工程を包含し得る。いくつかの実施形態では、この反応混合物を、ssDNAフラグメントに対するアダプターオリゴヌクレオチドのライゲーションを達成するまで加熱する。いくつかの実施形態では、この反応混合物を約50℃、約55℃、約60℃、約65℃、約70℃、または70℃超まで加熱する。いくつかの実施形態では、この反応混合物を、約60〜70℃まで加熱する。この反応混合物は、核酸フラグメントに対するpdoのライゲーションを達成するために十分な時間加熱してもよい。いくつかの実施形態では、この反応混合物を、約5分、約10分、約15分、約20分、約25分、約30分、約35分、約40分、約45分、約50分、約55分、約60分、約70分、約80分、約90分、約120分、約150分、約180分、約210分、約240分、または240分超、加熱する。
いくつかの実施形態では、pdo’sは、混合物中の核酸フラグメントの濃度よりも大きい濃度で反応混合物中に存在する。いくつかの実施形態では、pdo’sは、混合物中の核酸フラグメントの濃度よりも少なくとも10%、20%、30%、40%、60%、60%、70%、80%、90%、100%または100%超大きい濃度で存在する。pdo’sは、混合物中の核酸フラグメントの濃度よりも少なくとも10倍、100倍、1000倍、または10000倍大きい濃度で存在してもよい。pdo’sは、0.1uM、0.5uM、1uM、10uM超の最終濃度で存在してもよい。いくつかの実施形態では、リガーゼは、飽和量で反応混合物中に存在する。
反応混合物はさらに、高分子量の不活性分子、例えば、MW4000、6000、または8000のPEGを含んでもよい。この不活性分子は、約0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、または50(重量/容積)%を超える量で存在してもよい。いくつかの実施形態では、不活性分子は、約0.5〜2%、約1〜5%、約2〜15%、約10〜20%、約15〜30%、約20〜50%、または50(重量/容積)%を超える量で存在する。
ss核酸分子に対するアダプターのライゲーションを達成するために十分な時間の後、未反応のアダプターを、当該分野で公知の任意の手段によって、例えば、分子量カットオフによるろ過、サイズ排除クロマトグラフィー、スピンカラムの使用、ポリエチレングリコール(PEG)での選択的沈殿、シリカマトリックス上へのPEGでの選択的沈殿、アルコール沈殿、酢酸ナトリウム沈殿、PEGおよび塩沈、または高ストリンジェンシー洗浄によって除去してもよい。
いくつかの実施形態では、この方法はさらに、連結された核酸フラグメントを捕獲する工程を包含する。連結された核酸フラグメントの捕獲は、伸長の前に起きても、または伸長の後に生じてもよい。連結された核酸フラグメントは、固体支持体上に捕獲されてもよい。捕獲は、pdoおよび捕獲試薬にコンジュゲートされた捕獲部分を含む複合体の形成を包含し得る。いくつかの実施形態では、この捕獲試薬は、固体支持体上に固定されている。いくつかの実施形態では、この固体支持体は、捕獲部分を含む連結された核酸の量と比較して、過剰な捕獲試薬を含む。いくつかの実施形態では、この固体支持体は、捕獲部分を含む連結された核酸フラグメントの総数よりも5倍、10倍、または100倍多い利用可能な結合部位を含む。
(伸長)
いくつかの実施形態では、プライマーは、pdoを介して、連結された核酸フラグメントにハイブリダイズされる。プライマーは、NGSアダプター配列の一部または全体を含んでもよい。例示的なNGSアダプター配列は本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、プライマーを伸長して、元の核酸フラグメントおよび伸長されたプライマーを含む二重鎖を作成し、ここでこの伸長されたプライマーは、元の核酸フラグメントの逆相補体およびNGSアダプター配列を一端に含む。いくつかの実施形態では、NGSアダプターは5’末端である。例示的なNGSアダプター配列は本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、NGSアダプター配列は、NGSプラットフォームの表面結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも70%同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、NGSアダプター配列は、NGSプラットフォームの表面結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも70%相補性である配列を含む。いくつかの実施形態では、NGSアダプター配列は、NGSプラットフォームによる使用のための配列決定プライマーに対して少なくとも70%同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、NGSアダプター配列は、NGSプラットフォームによる使用のための配列決定プライマーに対して少なくとも70%相補性である配列を含む。伸長は、校正の中等温度好性のまたは好熱性のDNAポリメラーゼによって達成され得る。好ましくは、ポリメラーゼは、好熱性のポリメラーゼであって、5’−3’エキソヌクレアーゼ活性/エンドヌクレアーゼ活性(DNAポリメラーゼI、II、III)または3’−5’エキソヌクレアーゼ活性(ファミリーAまたはBのDNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼI、T4 DNAポリメラーゼ)を有する。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性(Taq)を有さなくてもよい。いくつかの場合では、ポリメラーゼは、固定された連結されたフラグメントの線形の増幅を達成し、これが固定された連結されたフラグメントの逆相補体の複数のコピーを生じる。他の場合には、1コピーの逆相補体だけが作成される。いくつかの実施形態では、この伸長されたプライマー分子は、元の核酸テンプレートから分離される(例えば、本明細書に記載のような変性によって)。この伸長されたプライマー分子は、溶液中で遊離(フリー)であるが、元の核酸テンプレート分子は、固体支持体上に固定されたままである。この伸長されたプライマー分子は、容易に回収され得、結果として、ライブラリーのメンバーのほとんどがNGSアダプターを含む核酸ライブラリー調製が行われる。ライブラリーメンバーのうち少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、または90%超、または実質的に全てがNGSアダプターを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、プライマーは、pdoを介して、連結された核酸フラグメントにハイブリダイズされる。プライマーは、NGSアダプター配列の一部または全体を含んでもよい。例示的なNGSアダプター配列は本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、プライマーを伸長して、元の核酸フラグメントおよび伸長されたプライマーを含む二重鎖を作成し、ここでこの伸長されたプライマーは、元の核酸フラグメントの逆相補体およびNGSアダプター配列を一端に含む。いくつかの実施形態では、NGSアダプターは5’末端である。例示的なNGSアダプター配列は本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、NGSアダプター配列は、NGSプラットフォームの表面結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも70%同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、NGSアダプター配列は、NGSプラットフォームの表面結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも70%相補性である配列を含む。いくつかの実施形態では、NGSアダプター配列は、NGSプラットフォームによる使用のための配列決定プライマーに対して少なくとも70%同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、NGSアダプター配列は、NGSプラットフォームによる使用のための配列決定プライマーに対して少なくとも70%相補性である配列を含む。伸長は、校正の中等温度好性のまたは好熱性のDNAポリメラーゼによって達成され得る。好ましくは、ポリメラーゼは、好熱性のポリメラーゼであって、5’−3’エキソヌクレアーゼ活性/エンドヌクレアーゼ活性(DNAポリメラーゼI、II、III)または3’−5’エキソヌクレアーゼ活性(ファミリーAまたはBのDNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼI、T4 DNAポリメラーゼ)を有する。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性(Taq)を有さなくてもよい。いくつかの場合では、ポリメラーゼは、固定された連結されたフラグメントの線形の増幅を達成し、これが固定された連結されたフラグメントの逆相補体の複数のコピーを生じる。他の場合には、1コピーの逆相補体だけが作成される。いくつかの実施形態では、この伸長されたプライマー分子は、元の核酸テンプレートから分離される(例えば、本明細書に記載のような変性によって)。この伸長されたプライマー分子は、溶液中で遊離(フリー)であるが、元の核酸テンプレート分子は、固体支持体上に固定されたままである。この伸長されたプライマー分子は、容易に回収され得、結果として、ライブラリーのメンバーのほとんどがNGSアダプターを含む核酸ライブラリー調製が行われる。ライブラリーメンバーのうち少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、または90%超、または実質的に全てがNGSアダプターを含んでもよい。
一本鎖核酸ライブラリー(例えば、ssDNAライブラリー)を調製するための例示的なワークフローを下に概説する。
図3は、生物学的サンプル(例えば、血液、血漿、尿、糞便、粘膜のサンプル)から単離された核酸(例えば、DNAまたはRNA)から核酸ライブラリーを調製するための方法の例示的な実施形態を示す。得られた核酸は、酵素的な方法または機械的な手段によって100〜1000bpの、しかし好ましくは100〜500bpのフラグメントに断片化され得る。核酸は、インサイチュで断片化されてもよい。核酸は、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織または循環中のDNAから断片化されてもよい。核酸は、FFPEおよび循環中からキット(Qiagen,Covaris)によって単離されてもよい。いくつかの実施形態では、核酸はDNAである。いくつかの実施形態では、DNAは、生物学的サンプルから単離されたRNAから生成されたcDNAであって、同じサンプルからランダムプライム逆転写(RNaseH+)を用いてランダムなサイズのcDNAを生成する。いくつかの実施形態では、その結果、核酸はRNAである。断片化されたDNAは、塩基除去修復酵素(base exicision repair enzyme)(Endo VIII,ホルムアミドピリミジン DNAグリコシラーゼ(FPG))で処理して、重合化を妨害し得る損傷された塩基を除去してもよい。次いで、DNAを、校正ポリメラーゼ(例えば、T4 DNAポリメラーゼ)で処理して、末端をポリッシュして、損傷したヌクレオチド(例えば、無塩基部位)を置き換える。いくつかの実施形態では、DNAは、末端をポリッシュして損傷したヌクレオチドを置き換えるために校正ポリメラーゼで処理されることはない。
工程1では、核酸(例えば、DNAまたはRNA)を、熱不安定性ホスファターゼで処理して、核酸からすべてのリン酸基を除去してもよい。反応混合物を、10分間80℃まで加熱して、ホスファターゼおよびポリメラーゼを不活化して、二本鎖DNAを一本鎖に変性してもよい。
工程2では、3’末端の12〜50塩基長のアフィニティータグ(例えば、ビオチン)を含む化学的にまたは酵素的にリン酸化されたpdoを、平均分子量4000、6000または8000の10〜20%(w/v)のポリエチレングリコールの存在下で、飽和量のATP依存性RNAリガーゼ(T4 RNAリガーゼ、しかし好ましくは、好熱性リガーゼ、例えば、CircLigase、CircLigase II)を用いて、0.5uM以上の最終濃度で、断片化した一本鎖核酸に連結してもよい。その反応は、60〜70℃で1時間インキュベートしてもよい。pdoは、以下を含んでもよい:(i)Illuminaフローセルクラスター生成のための表面結合オリゴヌクレオチドに相当する配列が全て、一部または無し、(ii)アフィニティーリガンドと結合したレセプターとの間の相互作用の立体障害を最小化するために十分な距離(10原子以上)でオリゴヌクレオチドに連結されているライゲーション反応に関与できない3’末端アフィニティー基。
pdoは、当該分野で公知の任意の手段によってアデニル化されてもよい。アデニル化アダプターを用いる場合、いくつかの実施形態では、ATP依存性RNAリガーゼは、CircLigaseでも、CircLigase IIでもない。この反応を、サイズによって精製して未反応のアダプターを取り除いてもよい。これは、10Kまたは3Kという分子サイズカットオフによる精密ろ過ユニット(例えば、microcon YM−10もしくはYM3、またはnanosep omega)を使用して達成され得る。あるいは、アダプター除去は、10Kまたはそれ未満のサイズ排除カットオフでのサイズ排除脱塩カラム(アガロース、ポリアクリルアミド)の通過により、スピンカラムの使用により、PEG、アルコールまたは塩での選択的沈殿、高ストリンジェンシー洗浄、または変性ゲル電気泳動により、達成され得る。
工程6では、オリゴヌクレオチドプライマーは、その3’末端でアダプターに完全に相補的であるか、またはその3’末端でアダプターに部分的に相補的であるかであるが、Illuminaフローセルオリゴヌクレオチドに相当する配列を完全に保有するならば、これを用いて校正の中等温度好性のDNAポリメラーゼを用いて結合したライブラリーの逆相補体を作成してもよい。好ましくは、5’−3’のエキソヌクレアーゼ活性/エンドヌクレアーゼ活性(ファミリーAのDNAポリメラーゼ,例えば、DNAポリメラーゼ I)または3’−5’エキソヌクレアーゼ活性(ファミリーBのDNAポリメラーゼ,Vent,Phusion,Pfuおよびそれらの改変体)を有する好熱性のポリメラーゼを用いて、ライブラリーの線形増幅を可能にする。
工程7では、回収された物質は次に、アフィニティー樹脂または3’末端アフィニティータグに結合できる支持体にバッチ方式で結合され得る。回収された物質は、タグ付けされたアダプター分子の総数の少なくとも10倍過剰、かつ好ましくは100倍多い利用可能な結合部位を含む0.2mlの管中で事前にすすいでおいた支持体中に入れてもよい。
工程8では、結合したライブラリーのコピーからなる上清を回収して、定量してもよい。
図4は、ssDNAライブラリーを調製するための図3に記載の例示的なワークフローの図である。工程410では、dsDNAは断片化される。工程420では、dsDNAフラグメントを、脱リン酸化し、一本鎖に熱変性する。工程430では、プライマードッキング配列431を含むビオチン化pdo’sを核酸フラグメントと接触させる。工程440では、pdo’sを、ssDNAフラグメントの3’末端に連結して、ライブラリーのメンバーの前駆体を作成する。工程450では、pdo451に相補的な配列およびアダプター配列452を含むプライマーを、pdosを介してssDNAに対して工程560でハイブリダイズする。工程460では、ハイブリダイズしたプライマーをテンプレートのssDNAフラグメントにそって伸長して、二重鎖を作成する。この二重鎖を、固体支持体(例えば、ストレプトアビジンコーティングビーズ)上に固定する。熱変性によって、最終のライブラリーのメンバーを溶液中に放出するが元のssDNAフラグメントはビーズ上に残す。
(ssDNAライブラリー調製の代替的な実施形態)
別の態様では、本発明は、ssDNAライブラリーを調製する方法を提供し、この方法は、dsDNAフラグメントをssDNAに変性する工程、およびアダプター配列を、ssDNA分子の両端に連結する工程を包含する。dsDNAを断片化する方法は、本明細書に記載される。dsDNAフラグメントを変性する方法は本明細書に記載される。
別の態様では、本発明は、ssDNAライブラリーを調製する方法を提供し、この方法は、dsDNAフラグメントをssDNAに変性する工程、およびアダプター配列を、ssDNA分子の両端に連結する工程を包含する。dsDNAを断片化する方法は、本明細書に記載される。dsDNAフラグメントを変性する方法は本明細書に記載される。
この方法は、第一の表面結合オリゴヌクレオチドに対して、少なくとも70%相補的なまたは同一な配列を含む第一のアダプターを連結する工程を包含し得る。この第一の表面結合オリゴヌクレオチドは、NGSプラットフォーム特異的な表面結合オリゴヌクレオチドであってもよい。この第一のアダプターは、表面結合オリゴヌクレオチドの5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、または20超の連続のヌクレオチドに対して、相補的なまたは同一な配列を含んでもよい。この第一のアダプターはさらに、第一の配列決定プライマーに対して少なくとも70%相補的な配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、この第一のアダプターは、本明細書に記載の方法、または当該分野で公知の任意の方法を用いてssDNAフラグメントの3’末端に連結される。いくつかの実施形態では、ssDNAフラグメントは、5’リン酸基を欠く。特定の実施形態では、この第一のアダプターは、ATP依存性リガーゼによってssDNAフラグメントの3’末端に連結される。他の実施形態では、この第一のアダプターは、3’末端ブロック基を含む。一般には、この3’末端ブロック基は、3’末端塩基と別のヌクレオチドとの間の共有結合の形成を妨げる。いくつかの実施形態では、3’末端ブロック基はジデオキシ−dNTPまたはビオチンである。この第一のアダプターは、5’アデニル化されていてもよい。いくつかの実施形態では、この第一のアダプターは、本明細書で記載されるようなRNAリガーゼによってssDNAフラグメントの3’末端に連結される。RNAリガーゼは、T4またはMth由来の短縮または変異したRNAリガーゼ2であってもよい。この方法はさらに、第二のアダプター配列を、ssDNAフラグメントの5’末端に連結する工程を包含する。この第二のアダプター配列は、第一のアダプター配列とは別個であってもよい。第二のアダプター配列は、第二の表面結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも70%相補的である配列を含んでもよい。この第二の表面結合オリゴヌクレオチドは、NGSプラットフォーム特異的な表面結合オリゴヌクレオチドであってもよい。この第二のアダプターは、表面結合オリゴヌクレオチドの5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、または20超連続のヌクレオチドに対して相補的なまたは同一な配列を含んでもよい。この第二のアダプターはさらに、第二の配列決定プライマーに対して少なくとも70%相補的な配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、この第二のアダプターは、RNAリガーゼ、例えば、本明細書に記載のCircLigaseを用いてssDNAフラグメントに連結される。いくつかの実施形態では、この第一および第二のアダプターは、両方とも、第一および第二の表面結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも70%相補的である。他の実施形態では、この第一および第二のアダプターは両方とも、第一および第二の表面結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも70%同一である。
本明細書に記載される方法を用いて生成されるssDNAライブラリーは、全ゲノム配列決定または標的化配列決定に用いてもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を用いて生成されるssDNAライブラリーは、配列決定の前に目的の標的ポリヌクレオチドについて富化される。
(標的富化)
別の態様では、本発明は、標的富化核酸ライブラリーを調製するための方法を提供する。この方法は、一本鎖DNA(ssDNA)フラグメントに対して標的選択性オリゴヌクレオチド(TSO)をハイブリダイズして、ハイブリダイゼーション生成物を作成する工程と、このハイブリダイゼーション生成物を単回の増幅で増幅して、伸長鎖を作成する工程とを包含する。
別の態様では、本発明は、標的富化核酸ライブラリーを調製するための方法を提供する。この方法は、一本鎖DNA(ssDNA)フラグメントに対して標的選択性オリゴヌクレオチド(TSO)をハイブリダイズして、ハイブリダイゼーション生成物を作成する工程と、このハイブリダイゼーション生成物を単回の増幅で増幅して、伸長鎖を作成する工程とを包含する。
標的富化の方法は、参照によって本明細書に援用される、米国特許出願公開第20120157322に記載のとおりであり得る。
このハイブリダイゼーションおよび増幅の工程は、反応混合物中で生じ得る。「反応混合物」という用語は、本明細書において用いる場合、一般には、核酸テンプレート分子から少なくとも1つのアンプリコンを増幅するために必要な成分の混合物を指す。この混合物は、ヌクレオチド(dNTP)、ポリメラーゼおよび標的選択性オリゴヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、この混合物は、複数の標的選択性オリゴヌクレオチドを含む。この混合物はさらに、Tris緩衝液、一価の塩、およびMg2+を含んでもよい。各々の構成要素の濃度は、当該分野で周知であって、さらに当業者によって最適化され得る。反応混合物はまた、限定するものではないが、非特異的なバックグラウンド/ブロッキング核酸(例えば、サケ精子DNA)、バイオ防腐剤(例えば、アジ化ナトリウム)、PCR増強剤(例えば、ベタイン、トレハロースなど)、およびインヒビター(例えば、RNAse阻害剤)を含む添加物を含んでもよい。いくつかの実施形態では、核酸サンプル(例えば、ssDNAフラグメントを含むサンプル)が、反応混合物と混合される。したがって、いくつかの実施形態では、この反応混合物はさらに、核酸サンプルを含む。
ssDNAフラグメントは、ssDNAライブラリーのメンバーであり得る。ssDNAライブラリーは、本明細書に記載の方法を用いて調製され得る。ssDNAフラグメントは、第一の末端に位置するが第二の末端には位置しない、第一の一本鎖アダプター配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、この第一の末端は、5’末端である。いくつかの実施形態では、TSOは、第一の末端に位置するが、第二の末端には位置しない第二の一本鎖アダプター配列を含む。この第一の末端は、5’末端であってもよい。いくつかの実施形態では、第一のアダプター配列は、第一の表面結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも70%同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、この第一のアダプター配列は、配列決定プライマーに対して少なくとも70%の同一性である配列を含む。いくつかの実施形態では、この第一のアダプターはさらに、バーコード配列を含む。いくつかの実施形態では、この第二のアダプターは、第二の表面結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも70%同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、この第二のアダプターは、配列決定プライマーに対して少なくとも70%同一である配列を含む。
この標的選択性オリゴヌクレオチド(tso)は、目的の標的ポリヌクレオチドに対して少なくとも部分的にハイブリダイズするように設計されてもよい。いくつかの実施形態では、tsoは、標的ポリヌクレオチドに対して選択的にハイブリダイズするように設計される。tsoは、標的ポリヌクレオチドにおける配列に対して少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、または95%超相補的であってもよい。いくつかの実施形態では、tsoは標的ポリヌクレオチドの配列に対して100%相補的である。ハイブリダイゼーションは、あるTmを有するtso/標的二重鎖を生じ得る。tso/標的二重鎖のTmは、0〜100℃、20〜90℃、40〜80℃、50〜70℃、または55〜65℃であってもよい。tsoは一般的には、ポリメラーゼの存在下で伸長生成物の合成をプライムするのに十分長い。tsoの正確な長さおよび組成は、多くの要因、例としては、アニーリング反応の温度、供給源、およびプライマーの組成、ならびにプライマー:プローブ濃度の比に依存し得る。tsoは、例えば、8〜50、10〜40、または12〜24ヌクレオチド長であってもよい。
(増幅)
この方法は、反応混合物中の標的の増幅を含んでもよい。増幅は、tso/標的二重鎖中においてtsoでプライムされ得る。いくつかの実施形態では、増幅は、核酸ポリメラーゼを利用して行われる。核酸ポリメラーゼは、DNAポリメラーゼであってもよい。特定の実施形態では、DNAポリメラーゼは、熱安定性DNAポリメラーゼである。このポリメラーゼは、AまたはBファミリーのDNA校正ポリメラーゼのメンバー(Vent,Pfu,Phusion、およびそれらの改変体)、DNAポリメラーゼホロ酵素(DNA pol III ホロ酵素)、Taqポリメラーゼ、またはそれらの組み合わせであってもよい。
この方法は、反応混合物中の標的の増幅を含んでもよい。増幅は、tso/標的二重鎖中においてtsoでプライムされ得る。いくつかの実施形態では、増幅は、核酸ポリメラーゼを利用して行われる。核酸ポリメラーゼは、DNAポリメラーゼであってもよい。特定の実施形態では、DNAポリメラーゼは、熱安定性DNAポリメラーゼである。このポリメラーゼは、AまたはBファミリーのDNA校正ポリメラーゼのメンバー(Vent,Pfu,Phusion、およびそれらの改変体)、DNAポリメラーゼホロ酵素(DNA pol III ホロ酵素)、Taqポリメラーゼ、またはそれらの組み合わせであってもよい。
増幅は、自動化された過程で行われてもよく、ここではテンプレートDNAを含む反応混合物は、変性工程、プライマーアニーリング工程、および合成工程を通じてサイクリングされ、これによって切断および置換が、プライマー依存性のテンプレート伸長と同時に生じる。自動化された過程は、PCRサーマルサイクラーを用いて行ってもよい。市販のサーマルサイクラーシステムとしては、なかでも、Bio−Rad Laboratories,Life technologies,Perkin−Elmerのシステムが挙げられる。いくつかの実施形態では、1サイクルの増幅を行う。
tso/標的二重鎖の増幅は、標的配列を含む元のssDNAフラグメントを含む伸長生成物、ならびに第二のアダプター配列、tso、標的配列の逆相補体、および第一のアダプター配列の逆相補体を含む伸長された鎖を生じ得る。元のssDNAフラグメントの第一のアダプター配列が第一の表面結合したオリゴヌクレオチドに対して70%以上同一であったならば、伸長した鎖は、第一の表面結合オリゴヌクレオチドに対して70%以上の相補性である第一のアダプター配列を含み、それによって第一の表面結合オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。この伸長されたた鎖は、標的富化されたライブラリーを含んでもよい。
反応混合物中の伸長生成物は変性され得る。この変性された伸長生成物は、少なくとも第一の表面結合オリゴヌクレオチド上に固定された表面と接触され得る。いくつかの実施形態では、この伸長した鎖は、伸長した鎖の第一のアダプター配列にアニーリングし得る第一の表面結合オリゴヌクレオチドによって捕獲される。
第一の表面結合オリゴヌクレオチドは、捕獲された伸長した鎖の伸長をプライムし得る。いくつかの実施形態では、捕獲された伸長した鎖の伸長は、捕獲された伸長生成物を生じる。この捕獲された伸長生成物は、第一の表面結合したオリゴヌクレオチド、標的配列、および第二の表面結合したオリゴヌクレオチドに対して少なくとも70%以上相補的である第二のアダプター配列を含む。
いくつかの実施形態では、この捕獲された伸長生成物は、第二の表面結合オリゴヌクレオチドにハイブリダイズして、架橋を形成する。いくつかの実施形態では、この架橋は、ブリッジPCRによって増幅される。ブリッジPCR法は、当該分野で公知の方法を用いて行われてもよい。
(ライブラリー調製および標的富化のためのキット)
本明細書に記載されるようなライブラリー調製または本明細書に記載されるような標的富化の方法を行うためのキットも提供される。
本明細書に記載されるようなライブラリー調製または本明細書に記載されるような標的富化の方法を行うためのキットも提供される。
一態様では、本発明は、ssDNAライブラリーを調製するためのキットを提供する。一実施形態では、このキットは、本明細書に記載のようなpdoを含む。いくつかの実施形態では、このキットは、説明書、例えば、ssDNAフラグメントに対してpdoを連結するための説明書を含む。このキットはさらに、リガーゼを含んでもよい。このリガーゼは、本明細書に記載されるような、Rnl 1またはRnl 2ファミリーリガーゼであってもよい。このキットはさらに、pdoにハイブリダイズできるプライマーを含んでもよい。pdoにハイブリダイズ可能なプライマーは、本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、このキットは、固体支持体、例えば、捕獲試薬の上に固定されたビーズを提供する。いくつかの実施形態では、このキットは、伸長反応を行うためのポリメラーゼを提供する。いくつかの実施形態では、このキットは、伸長反応を行うためのdNTPを提供する。
別の実施形態では、このキットは、配列決定プラットフォームにカップリングされた第一支持体結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも70%相補的な配列を含む第一のアダプターオリゴヌクレオチド、第一のアダプターとは別個の配列を含む第二のアダプターオリゴヌクレオチド、RNAリガーゼ、および使用説明書、例えば、本発明の方法を実施するための説明書を含む。いくつかの実施形態では、この第一のアダプターは、3’末端塩基と別のヌクレオチドとの間の共有結合の形成を妨げる3’末端ブロック基を含む。3’末端ブロック基は本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、この第一は、5’アデニル化されている。いくつかの実施形態では、この第一のアダプターは、配列決定プライマーに対して少なくとも70%相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、この第二のアダプターは、配列決定プライマーに対して少なくとも70%相補性である配列を含む。いくつかの実施形態では、この第二のアダプターは、配列決定プラットフォームに対してカップリングされた第二の支持体結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも70%相補的な配列を含む。
本発明は、標的富化されたDNAライブラリーを調製するためのキットを提供する。いくつかの実施形態では、このキットは、pdo、リガーゼ、pdoにハイブリダイズし得るプライマー、捕獲試薬を含む固体支持体、ポリメラーゼ、dNTP、またはそれらの任意の組み合わせを包含する。いくつかの実施形態では、このキットはさらに、tsoを含む。tsoは、参照によって本明細書に援用される、米国特許出願公開第20120157322号に記載のように、NGSプラットフォーム上での配列決定のためにカップリングされた固体支持体上に固定されてもよい。
いくつかの実施形態では、本発明のキットは、包装資材を含む。本明細書において用いる場合、「包装資材、パッケージング材(packaging material)」という用語は、キットの構成要素を収容する物理的構造を指してもよい。包装資材は、キット構成要素の無菌性を維持し得、かつこのような目的のために通常用いられる資材(例えば、紙、段ボール、ガラス、プラスチック、ホイル、アンプルなど)から構成され得る。キットはまた、緩衝材、防腐剤、またはタンパク質/核酸安定化剤を含んでもよい。
(配列決定)
いくつかの実施形態では、標的富化されたライブラリーは、当該分野で公知のまたは本明細書に記載の任意の方法を用いて配列決定される。配列決定は、セット中の1つ以上の癌関連遺伝子の変異の存在を明らかにし得る。いくつかの実施形態では、変異を保有している2、3、4の遺伝子のサブセットを、後の時点で、被験体から単離された流体サンプル中で無細胞DNAのアセスメントによってさらにモニタリングするために選択する。いくつかの実施形態では、変異を保有している4つ以下の遺伝子のサブセットを、後の時点で、被験体から単離された流体サンプル中で無細胞DNAの評価によってさらにモニタリングするために選択する。
いくつかの実施形態では、標的富化されたライブラリーは、当該分野で公知のまたは本明細書に記載の任意の方法を用いて配列決定される。配列決定は、セット中の1つ以上の癌関連遺伝子の変異の存在を明らかにし得る。いくつかの実施形態では、変異を保有している2、3、4の遺伝子のサブセットを、後の時点で、被験体から単離された流体サンプル中で無細胞DNAのアセスメントによってさらにモニタリングするために選択する。いくつかの実施形態では、変異を保有している4つ以下の遺伝子のサブセットを、後の時点で、被験体から単離された流体サンプル中で無細胞DNAの評価によってさらにモニタリングするために選択する。
(無細胞DNAの経時的な評価)
いくつかの実施形態では、無細胞のDNAのアセスメントは、図5に示されるような、遺伝子のサブセットの対立遺伝子の検出および/または測定を包含する。図5は、被験体の血流に入る腫瘍DNA601を示す。対立遺伝子の検出は、当該分野において公知か、または本明細書に記載の任意の手段によってであってもよい。検出は、米国特許第5538848号に記載の方法(例えば、Taqmanアッセイを用いる)または本明細書に記載の方法によってであってもよい。
いくつかの実施形態では、無細胞のDNAのアセスメントは、図5に示されるような、遺伝子のサブセットの対立遺伝子の検出および/または測定を包含する。図5は、被験体の血流に入る腫瘍DNA601を示す。対立遺伝子の検出は、当該分野において公知か、または本明細書に記載の任意の手段によってであってもよい。検出は、米国特許第5538848号に記載の方法(例えば、Taqmanアッセイを用いる)または本明細書に記載の方法によってであってもよい。
したがって、本発明は、標的ポリヌクレオチド中の変異の感度のよい検出のための方法およびキットを提供する。いくつかの態様では、本発明の方法およびキットは、標的ポリヌクレオチド中の対立遺伝子の識別のために用いられ得る。例えば、本発明は、高い野性型対立遺伝子比のバックグラウンド中の変異体対立遺伝子の検出のための方法およびキットを提供する。別の実施例に関して、本発明は、複数の対立遺伝子の検出のための方法およびキットを提供する。いくつかの実施形態では、対立遺伝子の検出は、問い合わされる対立遺伝子が存在する場合、検出可能シグナルの放出または活性化によって可能である。
(対立遺伝子検出のための方法)
いくつかの態様では、本明細書に記載されるような対立遺伝子検出のための1つ以上の方法は、変異を保有することが疑われる標的ポリヌクレオチド領域に対してオリゴヌクレオチドプライマーが結合する能力に関する。このオリゴヌクレオチドプライマーは、変異が疑われる遺伝子座を部分的に覆い得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーは、変異に完全を覆う。したがって、いくつかの実施形態では、この変異は、あるオリゴヌクレオチドプライマーによって包含されるのに十分小さい。変異は一塩基多型(SNP)であってもよい。この変異はまた、複数のヌクレオチド多型(例えば、二重変異または三重変異)を含んでもよい。この変異は、1つ以上のヌクレオチドの挿入であってもよい。変異は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13,14、15、16、17、18、19、20、50、100、500、1000、10000、100000、1000000個のヌクレオチドの挿入であってもよい。変異は、1〜5、2〜10、5〜15、または10〜20ヌクレオチドの挿入であってもよい。いくつかの実施形態では、変異は、1つ以上のヌクレオチドの欠失である。変異は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個のヌクレオチドの欠失であってもよい。変異は、1〜5、2〜10、5〜15、または10〜20ヌクレオチドの欠失であってもよい。変異は2つ以上のヌクレオチドの逆位であってもよい。いくつかの実施形態では、2、3、4、5、またはそれ以上のヌクレオチドが反転される。いくつかの実施形態では、変異はコピー数変動(例えば、SNPまたは野性型対立遺伝子のコピー数変動)である。
いくつかの態様では、本明細書に記載されるような対立遺伝子検出のための1つ以上の方法は、変異を保有することが疑われる標的ポリヌクレオチド領域に対してオリゴヌクレオチドプライマーが結合する能力に関する。このオリゴヌクレオチドプライマーは、変異が疑われる遺伝子座を部分的に覆い得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーは、変異に完全を覆う。したがって、いくつかの実施形態では、この変異は、あるオリゴヌクレオチドプライマーによって包含されるのに十分小さい。変異は一塩基多型(SNP)であってもよい。この変異はまた、複数のヌクレオチド多型(例えば、二重変異または三重変異)を含んでもよい。この変異は、1つ以上のヌクレオチドの挿入であってもよい。変異は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13,14、15、16、17、18、19、20、50、100、500、1000、10000、100000、1000000個のヌクレオチドの挿入であってもよい。変異は、1〜5、2〜10、5〜15、または10〜20ヌクレオチドの挿入であってもよい。いくつかの実施形態では、変異は、1つ以上のヌクレオチドの欠失である。変異は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個のヌクレオチドの欠失であってもよい。変異は、1〜5、2〜10、5〜15、または10〜20ヌクレオチドの欠失であってもよい。変異は2つ以上のヌクレオチドの逆位であってもよい。いくつかの実施形態では、2、3、4、5、またはそれ以上のヌクレオチドが反転される。いくつかの実施形態では、変異はコピー数変動(例えば、SNPまたは野性型対立遺伝子のコピー数変動)である。
一態様では、本発明は、標的ポリヌクレオチド領域中の変異を検出する方法を提供し、この方法は:(a)核酸サンプルと反応混合物とを対立遺伝子検出のために接触する工程であって、ここで対立遺伝子検出のための反応混合物が標的ポリヌクレオチド領域に対してハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドプライマーを含み、このオリゴヌクレオチドプライマーが、プローブ結合領域およびテンプレート結合領域(変異を保有すると疑われる遺伝子座を少なくとも部分的に覆い、ポリメラーゼによって対立遺伝子特異的な伸長が可能である)を含む工程と;(b)オリゴヌクレオチドプライマーを伸長して伸長生成物を形成する工程と;(c)伸長生成物を検出し、それによって変異の存在を示す伸長生成物を検出する工程とを包含する。
対立遺伝子検出のためのプライマー
オリゴヌクレオチドプライマー(例えば、フォワードプライマー)は、変異を保有すると疑われる標的ポリヌクレオチドに対して少なくとも部分的にハイブリダイズするように設計され得る。いくつかの実施形態では、フォワードプライマーのテンプレート結合領域は、標的ポリヌクレオチドに対して選択的にハイブリダイズするように設計される。ハイブリダイゼーションは、あるTmを有するフォワードプライマー/テンプレート二重鎖を生じてもよい。プライマー/テンプレート二重鎖のTmは、0〜100℃、20〜90℃、40〜80℃、50〜70℃、または55〜65℃であってもよい。フォワードプライマーのテンプレート結合領域は、8〜50、10〜40、または12〜24ヌクレオチド長であってもよい。フォワードプライマーのテンプレート結合領域は、変異を保有すると疑われる特定の遺伝子座と少なくとも部分的を覆うように設計され得る。フォワードプライマーのテンプレート結合領域は、例えば、変異を保有すると疑われる遺伝子座のうち、少なくとも0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、20%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%を覆い得る。フォワードプライマーのテンプレート結合領域は、変異を保有すると疑われる遺伝子座の少なくとも約0.5〜2%、1〜10%、5〜20%、10〜50%、30〜70%、50〜80%、60〜90%、または80〜100%を覆い得る。テンプレート結合領域は、フォワードプライマーの3’領域に位置し得る。いくつかの実施形態では、この遺伝子座を覆うテンプレート結合領域の領域は、3’末端領域である。いくつかの実施形態では、変異遺伝子座を覆う3’末端領域は、テンプレート結合領域の3’末端の1、2、3、4、5、または5超の塩基を含む。いくつかの実施形態では、フォワードプライマーの3’末端塩基はこの遺伝子座を覆う。いくつかの実施形態では、フォワードプライマーの3’末端領域は、問い合わされた対立遺伝子に対して相補的である。フォワードプライマーの3’末端塩基は、問い合わされる対立遺伝子に対して相補的でなくてもよい。いくつかの実施形態では、1つ以上のミスマッチが3’末端塩基に対して隣接する3’領域に導入される(例えば、n−1、n−2、n−3など)。これらのミスマッチは、プライマー伸長に対するこのミスマッチの影響を増大するかまたは低下するヌクレオチドであっても、または修飾されたヌクレオチドであってもよい。
オリゴヌクレオチドプライマー(例えば、フォワードプライマー)は、変異を保有すると疑われる標的ポリヌクレオチドに対して少なくとも部分的にハイブリダイズするように設計され得る。いくつかの実施形態では、フォワードプライマーのテンプレート結合領域は、標的ポリヌクレオチドに対して選択的にハイブリダイズするように設計される。ハイブリダイゼーションは、あるTmを有するフォワードプライマー/テンプレート二重鎖を生じてもよい。プライマー/テンプレート二重鎖のTmは、0〜100℃、20〜90℃、40〜80℃、50〜70℃、または55〜65℃であってもよい。フォワードプライマーのテンプレート結合領域は、8〜50、10〜40、または12〜24ヌクレオチド長であってもよい。フォワードプライマーのテンプレート結合領域は、変異を保有すると疑われる特定の遺伝子座と少なくとも部分的を覆うように設計され得る。フォワードプライマーのテンプレート結合領域は、例えば、変異を保有すると疑われる遺伝子座のうち、少なくとも0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、20%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%を覆い得る。フォワードプライマーのテンプレート結合領域は、変異を保有すると疑われる遺伝子座の少なくとも約0.5〜2%、1〜10%、5〜20%、10〜50%、30〜70%、50〜80%、60〜90%、または80〜100%を覆い得る。テンプレート結合領域は、フォワードプライマーの3’領域に位置し得る。いくつかの実施形態では、この遺伝子座を覆うテンプレート結合領域の領域は、3’末端領域である。いくつかの実施形態では、変異遺伝子座を覆う3’末端領域は、テンプレート結合領域の3’末端の1、2、3、4、5、または5超の塩基を含む。いくつかの実施形態では、フォワードプライマーの3’末端塩基はこの遺伝子座を覆う。いくつかの実施形態では、フォワードプライマーの3’末端領域は、問い合わされた対立遺伝子に対して相補的である。フォワードプライマーの3’末端塩基は、問い合わされる対立遺伝子に対して相補的でなくてもよい。いくつかの実施形態では、1つ以上のミスマッチが3’末端塩基に対して隣接する3’領域に導入される(例えば、n−1、n−2、n−3など)。これらのミスマッチは、プライマー伸長に対するこのミスマッチの影響を増大するかまたは低下するヌクレオチドであっても、または修飾されたヌクレオチドであってもよい。
テンプレート結合領域は、コピー数変動を有すると疑われる遺伝子座を少なくとも部分的に覆い得る。いくつかの実施形態では、フォワードプライマーのテンプレート結合領域は、コピー数変動を有すると疑われる遺伝子座のうち少なくとも約0.5〜2%、1〜10%、5〜20%、10〜50%、30〜70%、50〜80%、60〜90%、または80〜100%を覆い得る。
フォワードプライマーの3’末端領域は、ホスホロチオエート結合によって連結されるヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、フォワードプライマーの3’末端領域で少なくとも2、3、4、5、またはそれ以上のヌクレオチドがホスホロチオエート結合によって連結される。
フォワードプライマーは、さらに、プローブ結合領域を含む。一般には、フォワードプライマーのプローブ結合領域は、テンプレートとは独立したレポータープローブの使用を可能にする。プローブ結合領域は、テンプレート核酸にハイブリダイズしない固有の配列またはバーコードを含んでもよい。プローブ結合領域は、例えば、目的の生物体の公知のゲノム配列に対する有意な配列類似性または相補性を回避するように設計され得る。このような固有の配列は、例えば、コンピュータ読み取り可能なメディアによって、無作為に生成されてもよく、そしてBLASTingによって、例えば、EMBL、GenBank、またはDDBJのような公知のヌクレオチドデータベースに対して選択されてもよい。バーコード配列はまた、二次構造を回避するように設計されてもよい。プローブ設計のためのツールは、当該分野で公知であり、これには例えば、mFold、Primer Expressが挙げられる。プローブ結合領域は、5〜50、6〜40、または7〜30ヌクレオチド長であってもよい。プローブ結合領域は、フォワードプライマーのテンプレート結合領域から1〜20、3〜15、または6〜8ヌクレオチド離れてもよい。プローブ結合領域は、テンプレート結合領域の5’に位置してもよい。
いくつかの実施形態では、この方法はさらに、核酸サンプルとリバースプライマーとを接触させる工程を包含する。このリバースプライマーは、フォワードプライマーの下流であるテンプレート核酸のある領域に相当するオリゴヌクレオチドプライマーであってもよい。いくつかの実施形態では、このリバースプライマーは、問い合わされる対立遺伝子の下流である。リバースプライマーは、標的ポリヌクレオチドの逆相補鎖に結合し得る。フォワード/リバースプライマー対は、変異を保有すると疑われる標的領域にまたがってもよい。いくつかの実施形態では、この標的領域は、14〜1000、20〜800、40〜600、50〜500、70〜300、90〜200、または100〜150ヌクレオチド長である。
プライマーまたは本発明で用いられる他のオリゴヌクレオチドはさらに、バーコード配列を含んでもよい。バーコード配列が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、バーコード配列は、問い合わされた対立遺伝子の同一性、標的ポリヌクレオチドもしくはゲノム遺伝子座の同一性、サンプルの同一性、被験体、またはそれらの任意の組み合わせに関連する情報をコードする。バーコード配列は、プライマーの一部、レポータープローブ、またはその両方であってもよい。バーコード配列は、オリゴヌクレオチドの5’末端であってももしくは3’末端であってもよく、またはオリゴヌクレオチドの任意の領域に配置されてもよい。バーコード配列は一般的には、テンプレート配列の一部ではない。バーコード配列は、サイズおよび組成物が広範に変化し得る;以下の参照によって、特定の実施形態について適切なバーコード配列のセットを選択するための手引きが得られる;Brenner,米国特許第5,635,400号;Brennerら、Proc.Natl.Acad.Sci.,97:1665−1670(2000);Shoemakerら、Nature Genetics,14:450−456(1996);Morrisら、European patent刊行物 0799897A1;Wallace,米国特許第5,981,179。バーコード配列は、約4〜36ヌクレオチド、約6〜30ヌクレオチド、または約8〜20ヌクレオチドの長さを有し得る。
本発明で用いられるプライマーは一般には、重合化のための因子の存在下で伸長生成物の合成をプライムするために十分な長さである。プライマーの正確な長さおよび組成物は、アニーリング反応の温度、プライマーの供給源および組成物、ならびにプライマー:プローブ濃度の比を含めて多くの要因に依存し得る。プライマー長は、例えば、約5〜100、10〜50、または20〜30ヌクレオチドであってもよいが、プライマーは、それより多くまたは少なくヌクレオチドを含んでもよい。
(レポータープローブ)
いくつかの実施形態では、反応混合物はさらに、レポータープローブを含む。一般には、本発明のレポータープローブは、問い合わせされた対立遺伝子の存在を示す検出可能シグナルを生成するために設計される。
いくつかの実施形態では、反応混合物はさらに、レポータープローブを含む。一般には、本発明のレポータープローブは、問い合わせされた対立遺伝子の存在を示す検出可能シグナルを生成するために設計される。
レポータープローブは、検出可能部分およびクエンチャー部分を含んでもよい。この検出可能部分は色素であってもよい。この色素は、蛍光色素、例えば、フルオロフォアであってもよい。蛍光色素は、連結部分を介してプローブの末端の3’炭素または末端の5’炭素に対する結合のために誘導体化された色素であり得る。この色素は、連結部分を介したプローブの末端5’炭素に対する結合のために誘導体化され得る。クエンチングは、フルオロフォアとクエンチャーとの間のエネルギーの移動を包含し得る。フルオロフォアの発光スペクトルおよびクエンチャーの吸収スペクトルは重複し得る。プローブがインタクトである場合、検出可能な部分からの蛍光シグナルは、クエンチャーによって実質的に抑制され得る。例えば、加水分解によるレポータープローブの切断は、検出可能部分をクエンチャー部分から分離し得る。この分離によって蛍光部分は、検出可能な蛍光シグナルを生じ得る。
このレポータープローブは、Livakら、「Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for
detecting PCR product and nucleic acid hybridization」PCR Methods Appl.1995 4:357−362によって設計され得る。
detecting PCR product and nucleic acid hybridization」PCR Methods Appl.1995 4:357−362によって設計され得る。
特定のプローブについてのレポーター−クエンチャー部分の対は、例えば、Pesceら編,Fluorescence Spectroscopy(Marcel Dekker,New York,1971);Whiteら、Fluorescence Analysis:A Practical Approach(Marcel Dekker,New York,1970によって選択されてもよい。レポーター−クエンチャー対で用いられ得る例示的な蛍光および色素生産性分子は、例えば、Berlman,Handbook of Fluorescence Sprectra of Aromatic Molecules,第2版(Academic Press,New York,1971);Griffiths,Colour and Constitution of Organic Molecules(Academic Press,New York,1976);Bishop,編,Indicators(Pergamon Press,Oxford,1972);Haugland,Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals(Molecular Probes,Eugene,1992);Pringsheim,Fluorescence and Phosphorescence(Interscience Publishers,New York,1949)に記載される。
広範な種類の反応性の蛍光性レポーター色素を、それらが本発明のクエンチャー色素によってクエンチされる限り用いてもよい。フルオロフォアは、芳香族化合物であっても、または芳香族複素環化合物であってもよい。フルオロフォアは、例えば、ピレン、アントラセン、ナフタレン、アクリジン、スチルベン、ベンゾオキサゾール、インドール、ベンズインドール、オキサゾール、チアゾール、ベンゾチアゾール、ケイナイン(canine)、カルボシアニン、サチリル酸塩、アントラニル酸塩、キサンテン色素、クマリンであってもよい。例示的なキサンテン色素としては、例えば、フルオレセインおよびローダミン色素が挙げられる。例示的なフルオレセインおよびローダミン色素としては、限定するものではないが、6−カルボキシフルオレセイン(FAM)、2’7’−ジメトキシ−4’5’−ジクロロ−6−カルボキシフルオレセイン(JOE)、テトラクロロフルオレセイン(TET)、6−カルボキシローダミン(R6G)、N,N,N;N’−テトラメチル−6−カルボキシローダミン(TAMRA)、6−カルボキシ−X−ローダミン(ROX)が挙げられる。適切な蛍光性レポーターとしてはまた、α位置またはβ位置におけるアミノ基を有するナフチルアミン色素が挙げられる。例えば、ナフチルアミノ化合物としては、1−ジメチルアミノナフチル−5−スルホナート、1−アニリノ−8−ナフタレンスルホナートおよび2−p−トルイジニル−6−ナフタレンスルホナート,5−(2’−アミノエチル)アミノナフタレン−1−スルホン酸(EDANS)が挙げられる。例示的なクマリンとしては、例えば、3−フェニル−7−イソシアナートクマリン;アクリジン、例えば、9−イソチオシアナートアクリジンおよびアクリジンオレンジ;N−(p−(2−ベンゾオキサゾリル)フェニル)マレイミド;シアニン類、例えば、インドジカルボシアニン3(Cy3)、インドジカルボシアニン5(Cy5)、インドジカルボシアニン5.5(Cy5.5)、3−(−カルボキシ−ペンチル)−3’−エチル−5,5’−ジメチルオキサカルボシアニン(CyA)など;1H,5H,11H,15H−キサンテノ[2,3,4−ij:5,6,7−i’j’]ジキノリジン−18−イウム、9−[2(または4)−[[[6−[2,5−ジオキソ−1−ピロリジニル)オキシ]−6−オキソヘキシル]アミノ]スルホニル]−4(または2)−スルホフェニル]−2,3,6,7,12,13,16,17−オクタヒドロ−内部塩(TRまたはTexas Red);またはBODIPY(商標)色素が挙げられる。例示的な蛍光性部分およびクエンチャー部分は、例えば、参照によって本明細書に援用される、WO/2005/049849に記載される。
当該分野で公知のような、適切なクエンチャーは、フルオレッサー(fluorescer)によって選択される。例示的なレポーターおよびクエンチャーはさらに、参照によって本明細書に援用されるAndersonら、米国特許第7,601,821号に記載される。
クエンチャーはまた、種々の商業的供給源から入手できる。例示的な市販のクエンチャーとしては、例えば、Biosearch TechnologiesのBlack Hole Quenchers(登録商標)およびIntegrated DNA Technologies,IncのIowa Black(登録商標)またはZENクエンチャーが挙げられる。
いくつかの実施形態では、レポータープローブは、2つのクエンチャー部分を含む。2つのクエンチャー部分を含む例示的なプローブとしては、Integrated DNA
TechnologiesのZenプローブが挙げられる。このようなプローブは、検出可能部分から約9塩基離れて位置する内部クエンチャー部分を含み、かつ一般には、伝統的なレポーター/クエンチャープローブに関連するバックグラウンドシグナルを低下する。
TechnologiesのZenプローブが挙げられる。このようなプローブは、検出可能部分から約9塩基離れて位置する内部クエンチャー部分を含み、かつ一般には、伝統的なレポーター/クエンチャープローブに関連するバックグラウンドシグナルを低下する。
検出可能部分およびクエンチャー部分は、共通の反応基または連結部分を介したオリゴヌクレオチドに対する共有結合のために誘導され得る。検出可能部分およびクエンチャー部分の誘導体化のための方法は、例えば、Ullmanら、米国特許第3,996,345号;Khannaら、米国特許第4,351,760号;Eckstein,編,Oligonucleotides and Analogues:A Practical
Approach(IRL Press,Oxford,1991);Zuckermanら、Nucleic Acids Research,15:5305−5321(1987)(オリゴヌクレオチド上の3’チオール基);Sharmaら、Nucleic Acids Research,19:3019(1991)(3’スルフヒドリル);Giustiら、PCR Methods and Applications,2:223−227(1993)およびFungら、米国特許第4,757,141号(Applied Biosystems,Foster City,Calif.から入手できるAminolink(商標)IIを介した5’ホスホアミノ基);Stabinsky,米国特許第4,739,044号(3’アミノアルキルホスホリル基);Agrawalら、Tetrahedron Letters,31:1543−1546(1990)(ホスホラミダイト連結を介した結合);Sproatら、Nucleic Acids Research,15:4837(1987)(5’メルカプト基);Nelsonら、Nucleic Acids Research,17:7187−7194(1989)(3’アミノ基)(そのすべてが参照によって本明細書に援用される)に記載される。
Approach(IRL Press,Oxford,1991);Zuckermanら、Nucleic Acids Research,15:5305−5321(1987)(オリゴヌクレオチド上の3’チオール基);Sharmaら、Nucleic Acids Research,19:3019(1991)(3’スルフヒドリル);Giustiら、PCR Methods and Applications,2:223−227(1993)およびFungら、米国特許第4,757,141号(Applied Biosystems,Foster City,Calif.から入手できるAminolink(商標)IIを介した5’ホスホアミノ基);Stabinsky,米国特許第4,739,044号(3’アミノアルキルホスホリル基);Agrawalら、Tetrahedron Letters,31:1543−1546(1990)(ホスホラミダイト連結を介した結合);Sproatら、Nucleic Acids Research,15:4837(1987)(5’メルカプト基);Nelsonら、Nucleic Acids Research,17:7187−7194(1989)(3’アミノ基)(そのすべてが参照によって本明細書に援用される)に記載される。
いくつかの実施形態では、市販されている連結部分、例えば、Clontech Laboratories(Palo Alto,Calif.)から入手可能な連結部分が、合成の間にオリゴヌクレオチドに結合されてもよい。単なる例に過ぎないが、ローダミンおよびフルオレセイン色素は、オリゴヌクレオチドの5’ヒドロキシルに対する結合のためのホスホラミダイト部分で誘導体化され得る(例えば、その全体が参照によって本明細書に援用される、Wooら、米国特許第5,231,191号;およびHobbs,Jr.米国特許第4,997,928号を参照のこと)。
いくつかの実施形態では、検出可能部分は、非蛍光シグナルを生じる。例えば、プローブのテンプレートへの加水分解が、検出プローブ−アンプリコン複合体からのシグナル部分の検出可能な分離を生じる任意のプローブを用いてもよい。例えば、シグナル部分の放出は、電子的に(例えば、シグナル部分が検出プローブ/アンプリコン複合体から放出される時、電極表面荷電摂動として)、量子ドット検知よって、発光によって、または化学的に(例えば、シグナル部分が溶液中に放出されるにつれて溶液中のpHの変化によって)検出され得る。同様に、プローブ結合領域に結合し、シグナル中の変化がクエンチャー部分から検出可能部分の分離の際に検出され得る、任意のプローブを用いてもよい。例えば、分子ビーコンプローブ、MGBプローブ、または他のプローブが本発明における使用のために検討される。分子ビーコンプローブは、参照によって本明細書に援用される、例えば、米国特許第5,925,517号および同第6,103,406号に記載される。MGBプローブは、例えば、参照によって本明細書に援用される米国特許第7,381,818号に記載される。
このレポータープローブは、本明細書に記載のプライマーのプローブ結合領域に選択的にハイブリダイズするように設計され得る。したがって、いくつかの実施形態では、レポータープローブは、プローブ結合領域の少なくとも一部に相補的である配列を含む。レポータープローブは、5〜50、6〜40、または7〜30ヌクレオチド長であってもよい。このハイブリダイゼーションは、あるTmを有するプローブ/プライマー二重鎖を生じ得る。プローブ/プライマー二重鎖のTmは、プライマー/テンプレート二重鎖のTmより高くてもよい。プローブ/プライマー二重鎖のTmは、プライマー/テンプレート二重鎖のTmよりも1、2、3、4、5、6、7、8 9、10、または10℃超高くてもよい。
いくつかの実施形態では、レポータープローブは、プライマーのテンプレート結合領域から少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、または20ヌクレオチド離れているプローブ結合領域中の配列に選択的にハイブリダイズする。
レポータープローブは、フォワードプライマーの濃度より高い濃度で存在してもよい。レポータープローブは、例えば、フォワードプライマーの濃度よりも、例えば、1〜10倍または1〜5倍高い濃度で存在してもよい。レポータープローブは、プローブによって占有されるフォワードプライマーのうち少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または約100%を生じる濃度で存在してもよい。
本発明のプライマーおよびプローブは、任意の適切な方法によって調製され得る。特定の配列のオリゴヌクレオチドを調製する方法は、当該分野で公知であり、これには、例えば、適切な配列および直接の化学合成のクローニングおよび制限が挙げられる。化学合成法としては、例えば、Narangら、1979,Methods in Enzymology 68:90に記載のホスホトリエステル法、Brownら、1979,Methods in Enzymology 68:109に記載のホスホジエステル法、Beaucageら、1981,Tetrahedron Letters 22:1859に開示されるジエチルホスホラミダイト方法、および米国特許第4,458,066号に開示される固体支持体方法(その刊行物のすべてが、参照によって本明細書に援用される)が挙げられ得る。
いくつかの実施形態では、テンプレート結合領域およびプローブ結合領域を含むフォワードプライマーは、それぞれ、テンプレート結合領域およびプローブ結合領域に対応する2つの異なるオリゴヌクレオチドを用いて調製され得る。2つのオリゴヌクレオチドは、酵素的に連結されてもよい。ライゲーションは、RNAリガーゼによってであってもよい。RNAリガーゼは、ATP依存性リガーゼであってもよい。RNAリガーゼは、Rnl
1ファミリーリガーゼであってもよい。一般には、Rnl 1ファミリーリガーゼは、tRNA中の一本鎖破壊を修復し得る。例示的なRnl 1ファミリーリガーゼとしては、例えば、T4 RNAリガーゼ、Thermus scitoductusバクテリオファージTS2126由来の熱安定性RNAリガーゼ 1(CircLigase)、またはCircLigase IIが挙げられる。一般的には、Rnl 2ファミリーリガーゼは、二重鎖RNA中のニックをシールし得る。例示的なRnl 2ファミリーリガーゼとしては、例えば、T4 RNAリガーゼ2が挙げられる。RNAリガーゼは、Archaeal RNAリガーゼ、例えば、好熱性の古細菌Methanobacterium thermoautotrophicum(MthRnl)由来の古細菌のRNAリガーゼであってもよい。ライゲーションはまた、それぞれ、テンプレート結合およびプローブ結合領域に相当する2つのオリゴヌクレオチドにまたがるスプリントオリゴヌクレオチドの使用によってもたらされ得る。いくつかの実施形態では、スプリントオリゴヌクレオチドを用いるライゲーションは、T4 DNAリガーゼの使用を包含し得る。あるいは、ライゲーションは、ATP非依存性リガーゼによって媒介され得る。例示的なATP非依存性リガーゼとしては、例えば、RNA3’−ホスフェートサイクラーゼ(RtcA)、RNAリガーゼRtcB、またはその製造された改変体が挙げられる。いくつかの実施形態では、ライゲーションは、間接的に2工程のプロセスを通じて行われ、ここではテンプレート結合領域はアデニル化されており(例えば、合成の間に化学的に、またはリガーゼを用いて酵素的にアデニル化される)、アデニル化されているテンプレート結合配列は、プローブ結合領域にコンジュゲートされている。
1ファミリーリガーゼであってもよい。一般には、Rnl 1ファミリーリガーゼは、tRNA中の一本鎖破壊を修復し得る。例示的なRnl 1ファミリーリガーゼとしては、例えば、T4 RNAリガーゼ、Thermus scitoductusバクテリオファージTS2126由来の熱安定性RNAリガーゼ 1(CircLigase)、またはCircLigase IIが挙げられる。一般的には、Rnl 2ファミリーリガーゼは、二重鎖RNA中のニックをシールし得る。例示的なRnl 2ファミリーリガーゼとしては、例えば、T4 RNAリガーゼ2が挙げられる。RNAリガーゼは、Archaeal RNAリガーゼ、例えば、好熱性の古細菌Methanobacterium thermoautotrophicum(MthRnl)由来の古細菌のRNAリガーゼであってもよい。ライゲーションはまた、それぞれ、テンプレート結合およびプローブ結合領域に相当する2つのオリゴヌクレオチドにまたがるスプリントオリゴヌクレオチドの使用によってもたらされ得る。いくつかの実施形態では、スプリントオリゴヌクレオチドを用いるライゲーションは、T4 DNAリガーゼの使用を包含し得る。あるいは、ライゲーションは、ATP非依存性リガーゼによって媒介され得る。例示的なATP非依存性リガーゼとしては、例えば、RNA3’−ホスフェートサイクラーゼ(RtcA)、RNAリガーゼRtcB、またはその製造された改変体が挙げられる。いくつかの実施形態では、ライゲーションは、間接的に2工程のプロセスを通じて行われ、ここではテンプレート結合領域はアデニル化されており(例えば、合成の間に化学的に、またはリガーゼを用いて酵素的にアデニル化される)、アデニル化されているテンプレート結合配列は、プローブ結合領域にコンジュゲートされている。
ライゲーションはまた、「クリック化学」で行われてもよい。クリック化学は、単純な化学でより小さいサブユニットを連結する工程を包含する概念である。より小さいサブユニットは、大きい方の分子の小さい構築ブロック、例えば、DNA塩基、RNAヌクレオチド、直鎖または環状のDNAまたはRNAオリゴヌクレオチドを指してもよい。1,2,3−トリアゾール環の形成を生じるアジド基とアルキン基との間の(3+2)環化付加(例えば、銅触媒のアルキン−アジドカップリング反応)が一般には、代表的なクリック化学反応とみなされる。他の化学ライゲーション法としては、臭化シアン、ホスホロチオエート−ヨードアセチル、および天然のライゲーション技術(ここでC−末端α−チオエステルがN末端Cys残基を含む非保護ペプチドと化学選択的方式で反応される)の使用が挙げられる。
プライマーおよび/またはレポータープローブはまた、Operon Technologies,Amersham Pharmacia Biotech,Sigma,IDT Technologies、およびLife Technologiesのような商業的な供給源からも得られる。プライマーは、同一の融点を有してもよい。プライマーの長さを、5’末端または3’末端で伸長するか、または短縮して、所望の融点を有するプライマーを生じてもよい。またプライマー対の配列および長さが所望の融点を生じるように、各々のプライマー対のアニーリング位置が設計されてもよい。25塩基対より小さいプライマーの融点を決定するための最も単純な式は、Wallace Rule(Td=2(A+T)+4(G+C))である。また、限定するものではないが、Array Designer Software(Arrayit Inc.)、遺伝子解析用オリゴヌクレオチドプローブ配列設計ソフトウェア(Oligonucleotide Probe Sequence Design Software for Genetic
Analysis)(Olympus Optical Co.),NetPrimer、およびDNAsis(日立ソフトウェアエンジニアリング)を含む、コンピュータプログラムを用いて、プライマーを設計してもよい。各々のプライマーのTm(融点またはアニーリング温度)は、Invitrogen Corpから入手できるOligo Designのようなソフトウェアプログラムを用いて算出され得る。
Analysis)(Olympus Optical Co.),NetPrimer、およびDNAsis(日立ソフトウェアエンジニアリング)を含む、コンピュータプログラムを用いて、プライマーを設計してもよい。各々のプライマーのTm(融点またはアニーリング温度)は、Invitrogen Corpから入手できるOligo Designのようなソフトウェアプログラムを用いて算出され得る。
プライマーのアニーリング温度は、限定するものではないが、サイクル1、2、3、4、5、サイクル6〜10、サイクル10〜15、サイクル15〜20、サイクル20〜25、サイクル25〜30、サイクル30〜35、またはサイクル35〜40を含む任意の増幅サイクル後に再計算されて増大され得る。最初のサイクルの増幅後、プライマーの一部が、目的の各々の遺伝子座から生成物中に組み込まれてもよく、これによってTMは、生成物中に組み込まれるプライマーの一部に基づいて再計算され得る。
(対立遺伝子検出のための反応混合物)
「対立遺伝子検出のための反応混合物」という用語は、本明細書において用いる場合一般には、核酸テンプレート分子から少なくとも1つのアンプリコンを増幅するために必要な構成要素の混合物を指す。対立遺伝子検出のための混合物は、ヌクレオチド(dNTP)、ポリメラーゼおよびプライマーを含んでもよい。対立遺伝子検出のための混合物はさらに、Tris緩衝液、一価の塩、およびMg2+を含んでもよい。各々の成分の濃度は、当該分野で周知であり、さらに当業者によって最適化され得る。いくつかの実施形態では、対立遺伝子検出のための反応混合物はまた、限定するものではないが、非特異的なバックグラウンド/ブロッキング核酸(例えば、サケ精子DNA)、バイオ防腐剤(例えば、アジ化ナトリウム)、PCR増強剤(例えば、ベタイン、トレハロースなど)、およびインヒビター(例えば、RNAse阻害剤)が挙げられる添加物も含む。いくつかの実施形態では、核酸サンプルが、対立遺伝子検出のための反応混合物と混合される。したがって、いくつかの実施形態では、対立遺伝子検出のための反応混合物はさらに、核酸サンプルを含む。
「対立遺伝子検出のための反応混合物」という用語は、本明細書において用いる場合一般には、核酸テンプレート分子から少なくとも1つのアンプリコンを増幅するために必要な構成要素の混合物を指す。対立遺伝子検出のための混合物は、ヌクレオチド(dNTP)、ポリメラーゼおよびプライマーを含んでもよい。対立遺伝子検出のための混合物はさらに、Tris緩衝液、一価の塩、およびMg2+を含んでもよい。各々の成分の濃度は、当該分野で周知であり、さらに当業者によって最適化され得る。いくつかの実施形態では、対立遺伝子検出のための反応混合物はまた、限定するものではないが、非特異的なバックグラウンド/ブロッキング核酸(例えば、サケ精子DNA)、バイオ防腐剤(例えば、アジ化ナトリウム)、PCR増強剤(例えば、ベタイン、トレハロースなど)、およびインヒビター(例えば、RNAse阻害剤)が挙げられる添加物も含む。いくつかの実施形態では、核酸サンプルが、対立遺伝子検出のための反応混合物と混合される。したがって、いくつかの実施形態では、対立遺伝子検出のための反応混合物はさらに、核酸サンプルを含む。
(増幅)
この方法は、対立遺伝子検出のための反応混合物中のテンプレート核酸の増幅を包含し得る。いくつかの実施形態では、増幅は、核酸ポリメラーゼを利用して行われる。この核酸ポリメラーゼは、DNAポリメラーゼであってもよい。DNAポリメラーゼは、熱安定性DNAポリメラーゼであってもよい。
この方法は、対立遺伝子検出のための反応混合物中のテンプレート核酸の増幅を包含し得る。いくつかの実施形態では、増幅は、核酸ポリメラーゼを利用して行われる。この核酸ポリメラーゼは、DNAポリメラーゼであってもよい。DNAポリメラーゼは、熱安定性DNAポリメラーゼであってもよい。
本明細書に記載される対立遺伝子検出法のいくつかの態様は、DNAポリメラーゼがレポータープローブ中で検出可能部分とクエンチャー部分とを分離する能力に関する。例示的なレポータープローブは本明細書に記載されている。検出可能部分およびクエンチャー部分の分離は、DNAポリメラーゼによるレポータープローブの切断によって生じ得る。レポータープローブの切断は、DNAポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性によって生じ得る。したがって、いくつかの実施形態では、DNAポリメラーゼは、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を含む。本明細書において用いる場合、「5’→3’(5’O3’)ヌクレアーゼ活性」または「5’→3’(5’to3’)ヌクレアーゼ活性」
とは、テンプレート特異的な核酸ポリメラーゼの活性を指してもよく、これによってヌクレオチドは、連続的な方式でオリゴヌクレオチドの5’末端から除去される。5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼは、当該分野で公知であり、これには、例えば、サーマス・アクアチクス(Thermus aquaticus)から単離されたDNAポリメラーゼ(Taq DNAポリメラーゼ)が挙げられる。
とは、テンプレート特異的な核酸ポリメラーゼの活性を指してもよく、これによってヌクレオチドは、連続的な方式でオリゴヌクレオチドの5’末端から除去される。5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼは、当該分野で公知であり、これには、例えば、サーマス・アクアチクス(Thermus aquaticus)から単離されたDNAポリメラーゼ(Taq DNAポリメラーゼ)が挙げられる。
本明細書で記載される対立遺伝子検出方法のいくつかの態様はさらに、プライマーの末端の3’塩基とそのハイブリダイズしたテンプレートポリヌクレオチドとの間のミスマッチの有無に応じて、増幅工程で、プライマーが核酸ポリメラーゼ(例えば、DNAポリメラーゼ)によって伸長される識別能に関する。プライマーの末端の3’塩基とテンプレートヌクレオチドとの間にミスマッチのない場合、DNAポリメラーゼによるプライマーの伸長は、増幅反応の間に効率的に生じ得る。プライマーの末端の3’塩基とテンプレートヌクレオチドとの間にミスマッチがある(例えば、塩基が相補性ではない)場合、DNAポリメラーゼによるプライマーの伸長は、生じない。いくつかの実施形態では、ミスマッチのプライマーの伸長は、DNAポリメラーゼが3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を欠く場合には生じない。3’→5’エキソヌクレアーゼ活性は、本明細書において用いる場合、一般には、DNAポリメラーゼの活性を指し、これによってポリメラーゼは、ミスマッチした塩基対を認識して、1塩基ずつ後ろ向きに移動して、不正確なヌクレオチドを切除する。したがって、DNAポリメラーゼは、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を欠いてもよい。3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を欠いている例示的なDNAポリメラーゼとしては限定するものではないが、BST DNAポリメラーゼI、BST DNAポリメラーゼ I(大きいフラグメント)、Taqポリメラーゼ、Streptococcus pneumoniae DNAポリメラーゼ I、クレノウフラグメント(Klenow Fragment)(3’→5’エキソ−)、PyroPhage(登録商標)3173 DNAポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼマイナス(Exonuclease Minus)(Exo−)(Lucigenから入手可能)、T4 DNAポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼマイナス(Exonuclease Minus)(Lucigen)が挙げられる。いくつかの実施形態では、DNAポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性を欠くように設計された組み換えDNAポリメラーゼである。
他の実施形態では、DNAポリメラーゼによるミスマッチしたプライマーの伸長は起こらず、ここではDNAポリメラーゼは3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を有する。特定の実施形態では、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を有しているDNAポリメラーゼによるミスマッチしたプライマーの伸長は、ミスマッチプライマーの3’末端領域がホスホロチオエート結合によって連結されるヌクレオチドを含む場合には生じない。ホスホロチオエート結合によって連結されるヌクレオチドを含む例示的なプライマーは本明細書に記載される。
いくつかの実施形態では、PCRプロセスは、自動化されたプロセスとして行われ、ここでは、テンプレートDNAを含む反応混合物が変性工程、レポータープローブおよびプライマーアニーリング工程、および合成工程を通じてサイクルされ、それによって切断および置換がプライマー依存性テンプレート伸長と同時に生じる。自動化されたプロセスは、PCRサーマルサイクラーを用いて行われてもよい。市販のサーマルサイクラーシステムとしては、なかでも、Bio−Rad Laboratories,Life technologies,Perkin−Elmerのシステムが挙げられる。
変性、プライマー/プローブアニーリング、プライマー伸長およびレポータープローブ切断の反復サイクルは、検出可能シグナルの指数関数的蓄積で生じ得る。十分なサイクルを行って、検出可能シグナルの検出を達成し、これはバックグラウンドシグナルよりも数桁大きい規模であり得る。
しかし、本発明は、他の増幅システム、例えば、転写増幅システム(ここでは、PCRプライマーの1つが、標的配列のRNAコピーを作成するために用いられるプロモーターをコードする)と適合する。同様の方式で、本発明は、自己保持配列複製(self−sustained sequence replication(3SR)システム)(ここでは、種々の酵素を用いて、RNA転写物を作成し、次にこれを用いてDNAコピーを作成する(全て単一の温度で))で用いられてもよい。5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼをリガーゼ連鎖反応(LCR)システムに、適切なプライマー/プローブセットと一緒に組み込むことによって、本発明を使用して、LCR生成物を検出することも可能である。
図6は、本発明の方法の例示的な実施形態を示す。第一の工程601では、テンプレートDNA分子602および603を含むDNAサンプルを、dNTP(示さず)、熱安定性DNAポリメラーゼ609(5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を含み、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を含まない)、フォワードプライマーF1(プローブ結合領域605およびテンプレート結合領域606を含む)、およびリバースプライマーRを含む反応混合物と接触させる。フォワードプライマーF1の3’末端塩基は、テンプレート分子602に存在する変異体対立遺伝子607に対して相補的である。対照的に、テンプレート分子603は、野性型対立遺伝子608を有し、これは、フォワードプライマーF1の3’末端塩基に対してミスマッチである。また反応混合物には、レポータープローブPも含まれる(これは、5’蛍光性部分(三角)および3’クエンチャー部分(丸)を含む)。初回の増幅(工程620)では、アニーリング工程が行われ、ここではレポータープローブPが、プローブ結合領域605にハイブリダイズして、プライマー/レポーター二重鎖P/F1を生じる。さらに、F1が、テンプレート分子602および603にハイブリダイズして、複合体P/F1/102およびP/F1/103が生じる。合成工程の間に、DNAポリメラーゼ609は、変異体対立遺伝子607とのF1の3’末端塩基の相補性に起因して、P/F1/102複合体の効果的な伸長を促進する。テンプレート分子602からのF1の伸長は、伸長したプライマーF1およびハイブリダイズしたレポータープローブPを含むキメラ伸長生成物を生じる。この伸長したプライマーF1はさらに、リバースプライマーRについてのプライマー結合部位を含む。対照的に、P/F1/103の伸長は、野性型対立遺伝子608とF1の3’末端塩基との間のミスマッチのおかげで生じない。したがって、野性型対立遺伝子を含むテンプレート分子から生成される、伸長されたプライマーF1およびハイブリダイズしたレポータープローブPを含むキメラ伸長生成物はない。増幅の2回目(および任意の引き続く回)(工程630)では、リバースプライマーRは、キメラ伸長生成物にハイブリダイズする。DNAポリメラーゼ609は、リバースプライマーRの伸長を促進し、ポリメラーゼ609の5’→3’エキソヌクレアーゼ活性は、例えば、加水分解によってクエンチャー部分から蛍光部分を分離して、検出可能シグナルを生じる。
いくつかの実施形態では、反応混合物は、複数のプライマーおよび多重検出のためのプローブを含んでもよい。単なる例であるが、反応混合物は、共通のリバースプライマーおよび2つ以上のフォワードプライマーを含んでもよく、ここで各々のフォワードプライマーは、テンプレートポリヌクレオチド中の同じ領域にハイブリダイズするが、5’プローブ結合領域の他のフォワードプライマーとは異なり、ここでは各々のフォワードプライマーは、固有のプローブ結合領域を含み、かつここではフォワードプライマーの各々のテンプレート結合領域は、3’末端塩基中の他のフォワードプライマーとは異なり、これは、野性型対立遺伝子または1つもしくは別の変異体対立遺伝子のいずれかに対して相補的である。したがって、反応混合物はまた、2つ以上の異なるレポータープローブを含んでもよく、各々のプローブは、2つ以上のフォワードプライマー上の2つ以上の固有のプローブ結合領域のうちの1つに相当する配列を有しており、反応混合物中の任意の他の検出可能な部分とは検出可能に別個である別個の検出化可能部分を含む。単一の遺伝子座で複数の対立遺伝子を検出する多重アッセイの例示的な実施形態は、図7に示される。第一工程740では、テンプレートDNA分子702および703を含むDNAサンプルを、dNTP(示さず)、熱安定性DNAポリメラーゼ709(5’−>3’エキソヌクレアーゼ活性を含み、3’−>5’エキソヌクレアーゼ活性を含まない)、フォワードプライマーF1(プローブ結合領域705およびテンプレート結合領域706を含む)、フォワードプライマーF2(プローブ結合領域710およびテンプレート結合領域711を含む)を含む反応混合物と接触させる。テンプレート結合領域706および711は、3’末端塩基(これは、F1では、テンプレート分子702に存在する変異体対立遺伝子707に対して相補的であり、F2では、テンプレート分子703に存在する野性型対立遺伝子708に対して相補的である)を除いて同一である。したがって、706の3’末端塩基と、野性型対立遺伝子708との間のミスマッチ、および711の3’末端塩基と変異体対立遺伝子707との間のミスマッチがある。また、この反応混合物中には、レポータープローブP1(これは、5’蛍光性部分(三角)および3’クエンチャー部分(丸)を含む)、およびレポータープローブP2(これは、スペクトル的に別個の5’蛍光性部分(四角)および3’クエンチャー部分(丸)を含む)を含む。レポータープローブP1は、プローブ結合領域705にハイブリダイズして、P1/F1二重鎖を生じ、レポータープローブP2はプローブ結合領域710にハイブリダイズして、P2/F2二重鎖を生じる。増幅の初回(工程750)では、FlおよびF2は、テンプレート分子702および703にハイブリダイズして、これがP1/F1/702、P1/F1/703、P2/F2/702、およびP2/F2/703複合体を生じ得る。DNAポリメラーゼ709は、P1/F1/702およびP2/F2/703の効率的な伸長を促進し得、これが、それぞれ、伸長したプライマーF1およびハイブリダイズしたレポータープローブP1(F1−P1)および/または伸長したプライマーF2およびハイブリダイズしたレポータープローブP2(F2−P2)を含むキメラ伸長生成物を生じ得る。この伸長したプライマーF1−P1およびF2−P2は各々がさらに、リバースプライマーRのプライマー結合部位を含んでもよい。対照的に、P1/F1/703またはP2/F2/702の伸長は、フォワードプライマーの3’末端塩基とテンプレートDNAとの間のミスマッチの存在に起因して生じない。したがって、伸長したプライマーF1およびハイブリダイズしたレポータープローブP2を含むか、または伸長したプライマーF2およびハイブリダイズしたレポーターP1を含むキメラ伸長生成物は生成されない。増幅の2回目(および任意の引き続く回)(工程760)では、リバースプライマーRは、キメラ伸長生成物F1−P1およびF2−P2にハイブリダイズし得る。DNAポリメラーゼ709は、リバースプライマーRの伸長を促進し、かつポリメラーゼ709の5’→3’エキソヌクレアーゼ活性は、各々のプローブP1およびP2のクエンチャー部分から蛍光部分を分離し、これがスペクトル的に別個のシグナル731および732を生じる。
単なる例であるが、反応混合物は、複数のプライマー/プローブセットを含んでもよく、ここでは各々のセットが特定の遺伝子座で複数の対立遺伝子の検出のための複数のフォワードプライマーを含み、各々のフォワードプライマーは、固有のプローブ結合配列およびテンプレート結合領域を保有し、テンプレート結合領域の3’末端塩基は、このセット中の遺伝子座の対立遺伝子、共通のリバースプライマー、および各々のフォワードプライマーに特異的な検出可能に別個のレポータープローブに相当する。このような反応混合物は、複数の遺伝子座での複数の対立遺伝子の多重検出のために用いられ得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、単一の多重のアッセイ中で、最大で2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100個までの対立遺伝子を検出する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、反応混合物は、複数のプライマー/プローブセットを含み、ここでは各々のセットは、フォワードプライマー(固有のプローブ結合配列およびテンプレート結合領域を保有している)、リバースプライマー(このようなフォワードプライマーの下流領域に結合する)、およびこのフォワードプライマーに特異的な検出可能に別個のレポータープローブを含む。このような反応混合物は、複数の遺伝子座の多重検出のために用いられ得る。複数の遺伝子座の多重検出を用いて、コピー数変動をアッセイしてもよい。例えば、第一の遺伝子座は、コピー数変動を有すると疑われる領域であってもよく、第二の遺伝子座は、コピー数変動を有さないと予想される領域であってもよい。第一および第二の遺伝子座に相当する検出可能シグナルの比較は、コピー数変動を測定するために用いられ得る。
検出可能シグナルは、各々の増幅サイクルの間にリアルタイムでモニターされ得る。本明細書において用いる場合、「リアルタイムPCR」とは、検出可能シグナルの量がPCRの各々のサイクルでモニターされるPCR法を指してもよい。いくつかの実施形態では、検出可能シグナルが検出可能レベルに達するサイクルの閾値(Ct)が決定される。一般には、Ct値が低いほど、問い合わされる対立遺伝子の濃度は大きくなる。一般には、データは、PCRの指数関数的増殖(対数)相の間に収集され、ここでは、PCR生成物の量はテンプレート核酸の量に対して正比例する。リアルタイムPCRのためのシステムは、当該分野で公知であり、これには、例えば、ABI7700および7900HT配列検出システム(Sequence Detection Systems)(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)が挙げられる。PCRの指数関数相の間のシグナルの増大は、変異体対立遺伝子を含むテンプレートの量の定量的測定を提供し得る。
他の実施形態では、検出可能シグナルは、増幅サイクルが終了した後にモニターされる(例えば、エンドポイント検出)。
(分割/デジタルPCR)
この方法はまた、反応混合物および核酸サンプルを、増幅前に個別の容積に分割する工程を包含し得る。個別の容積は、出発核酸サンプル由来のテンプレート核酸分子を含んでもよい。出発核酸サンプルは、別個の容積が平均で5、4、3、2、または1つ未満の核酸分子を含むように希釈され得る。区分は、核酸分子を含まなくてもよい。核酸なしの区分は、ポアソン統計を使用して、元の入力DNA濃度を決定し得る。いくつかの実施形態では、別個の容積は、反応混合物を含んでもよい。反応混合物は本明細書に記載されている。この方法は、核酸サンプルを1セットの別の容積に分割する工程と、反応混合物を第二のセットの別個の容積に分割する工程と、第一のセット由来の単一の別個の容積を、第二のセット由来の単一の別個の容積と合併して、テンプレート核酸分子と反応混合物とを含む合併した別個の容積を生成する工程とを包含し得る。他の実施形態では、この方法は、核酸サンプルと、反応混合物とを混合して、混合物を生成する工程と、この混合物を別個の容積に分割する工程とを包含する。別個の容積は、1つ以上の対立遺伝子の検出のために独立してアッセイされてもよい。
この方法はまた、反応混合物および核酸サンプルを、増幅前に個別の容積に分割する工程を包含し得る。個別の容積は、出発核酸サンプル由来のテンプレート核酸分子を含んでもよい。出発核酸サンプルは、別個の容積が平均で5、4、3、2、または1つ未満の核酸分子を含むように希釈され得る。区分は、核酸分子を含まなくてもよい。核酸なしの区分は、ポアソン統計を使用して、元の入力DNA濃度を決定し得る。いくつかの実施形態では、別個の容積は、反応混合物を含んでもよい。反応混合物は本明細書に記載されている。この方法は、核酸サンプルを1セットの別の容積に分割する工程と、反応混合物を第二のセットの別個の容積に分割する工程と、第一のセット由来の単一の別個の容積を、第二のセット由来の単一の別個の容積と合併して、テンプレート核酸分子と反応混合物とを含む合併した別個の容積を生成する工程とを包含し得る。他の実施形態では、この方法は、核酸サンプルと、反応混合物とを混合して、混合物を生成する工程と、この混合物を別個の容積に分割する工程とを包含する。別個の容積は、1つ以上の対立遺伝子の検出のために独立してアッセイされてもよい。
分割するための特定の方法は、本発明の実施には重要ではない。例えば、分割は、手動のピペッティングで行われてもよい。特定の実施例では、反応混合物および核酸サンプルは、個々のチューブまたはウェルに手動のピペットで分配されてもよい。別の実施例では、ロボット法を分割工程に用いてもよい。分割工程のためにはまたマイクロ流体法を用いてもよい。
別個の容積は、例えば、米国特許第7,041,481号に記載のように、チューブ、ウェル、穿孔した穴、反応チャンバ、または液滴、例えば、不混和性液体中で分散された水相の液滴であってもよい。別個の容積は、別個の容積のアレイに配列されてもよい。例示的なアレイとしては、Life Technologiesによるオープンアレイデジタル(Open array digital)PCRシステム(http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/cms_088717.pdfに記載される)およびFluidigm(www.fluidigm.com)によるアレイシステムが挙げられる。
サンプルを小さい反応容積に分割する工程は、多くの利点をもたらし得る。例えば、分割は、低下した量の試薬の使用を可能にし得、それによって分析の材料費を低下する。他の例では、分割はまた、検出の感度も改善し得る。理論によって束縛されることは望まないが、反応混合物およびテンプレートDNAを別個の反応容積に分割する工程は、反応試薬に対してまれな分子の割合をより大きくし得、それによってまれな分子の検出を増強する。例えば、分割は、高い野性型対立遺伝子比のバックグラウンドで、まれな対立遺伝子の検出を可能にし得る。したがって、いくつかの実施形態では、反応容積は、1ml未満、500マイクロリットル(ul)未満、100ul未満、10ul未満、1ul未満、0.5ul未満、0.1ul未満、50nl未満、10nl未満、1nl未満、0.1nl未満、0.01nl未満、0.001nl未満、0.0001nl未満、0.00001nl未満、または0.000001nl未満であり得る。いくつかの実施形態では、反応容積は、1〜100ピコリットル(pl)、50〜500pl、0.1〜10ナノリットル(nl)、1〜100nl、50〜500nl、0.1〜10マイクロリットル(ul)、5〜100ul、100〜1000ul、または1000ul超であってもよい。いくつかの実施形態では、この反応容積は、液滴である。理論で拘束されることは望まないが、小さい液滴の使用によって、多数の反応物の処理が並行して可能になる。したがって、いくつかの場合には、この液滴は、平均で約0.000000000000001、0.0000000000001、0.00000000001、0.000000001、0.0000001、0.000001、0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.05、0.1、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、100、120、130、140、150、160、180、200、300、400、または500ミクロンの直径を有する。
いくつかの実施形態では、この方法は、デジタルPCRによる対立遺伝子の検出および/または測定を包含する。「デジタルPCR」という用語は、本明細書において用いる場合、一般的には、PCR増幅であって、これは、名目上単一の、選択されたテンプレート分子上で行われ、ここでは多数の個々の単一の分子が各々、別個の反応容積に単離されるPCR増幅を指す。いくつかの実施形態では、多数の反応容積を用いて、高い統計学的有意性を得る。一般には、少なくとも単一のテンプレートを含む反応容積中のPCR増幅(例えば、ウェル、チャンバ、ビーズ、エマルジョンなど)は、陰性の結果(例えば、出発分子が存在しない場合、検出可能シグナルはない)、または陽性の結果(例えば、標的の出発分子が存在する場合、検出可能シグナル)のいずれを有してもよい。陽性の結果を示す多数の反応領域を分析することによって、出発分子の数への洞察を得てもよい。このような分析は、サンプル中の野性型または変異体対立遺伝子の量の測定のために用いられてもよいし、またはサンプル中の遺伝子座のコピー数変動の測定のために用いられてもよい。
特定の実施形態では、本方法は、液滴のデジタルPCR法を含む。「液滴デジタルPCR」は一般的には、デジタルPCRを指し、ここでは反応容積は液滴である。本明細書に提供される液滴は、反応容積の間の混合を妨げ得る。
本明細書に記載の液滴は、エマルジョン組成物を含んでもよい。「エマルジョン」という用語は、本明細書において用いる場合、一般的には、不混和液体の混合物(例えば、オイルおよび水溶液、例えば、水)を指す。いくつかの実施形態では、このエマルジョンは、連続油相内の水性の液滴を含む。他の実施形態では、このエマルジョンは、連続水相内に油滴を含む。本明細書に記載される混合物またはエマルジョンは安定であっても、不安定であってもよい。好ましい実施形態では、このエマルジョンは比較的安定である。
いくつかの実施形態では、このエマルジョンは、最小の合体を示す。「合体(coalescence)」とは、液滴が合わさって、進行的に大きい液滴を形成する過程を指す。いくつかの場合には、0.00001%、0.00005%、0.00010%、0.00050%、0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、6%、7%、8%、9%、または10%未満の液滴が合体を示す。エマルジョンとはまた、フラスコ中で分散相の懸濁が解除される、凝集の限定のプロセスを示す。いくつかの場合には、0.00001%、0.00005%、0.00010%、0.00050%、0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、6%、7%、8%、9%、または10%未満の液滴が凝集を示す。
液滴は、単分散(例えば、実質的に同様のサイズおよび次元の単分散)であっても、多分散(例えば、実質的に可変のサイズおよび寸法の多分散)であってもよい。いくつかの実施形態では、この液滴は、単分散液滴である。いくつかの場合では、この液滴は、その液滴のサイズが液滴の平均サイズの±5%を超えてまで変化しないように生成される。いくつかの場合では、この液滴は、その液滴のサイズが液滴の平均サイズの±2%を超えてまで変化しないように生成される。いくつかの場合では、この液滴の生成装置は、単一のサンプルから液滴の集団を生成し、ここでは液滴の総集団の平均サイズの±0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、または10%を超えてまでサイズが変化する液滴はない。
いくつかの実施形態では、本発明は、液滴生成のためのシステム、デバイスおよび方法を提供する。いくつかの実施形態では、マイクロ流体システムは、単分散液滴を生成するように構成される(例えば、Kissら、Anal Chem.2008 December 1;80(23):8975〜8981を参照のこと)。いくつかの実施形態では、本発明は、サンプルを操作および/または分割するためのマイクロ流体システムを提供する。
いくつかの実施形態では、マイクロ流体システムは、1つ以上のチャネル、バルブ、ポンプなどを包含する(その全体が参照によって本明細書に援用される、米国特許第7,842,248号)。いくつかの実施形態では、マイクロ流体システムは、連続フローマイクロ流体システムである(例えば、参照によって本明細書に援用される、Koppら、Science,vol.280,1046〜1048頁,1998を参照のこと)。いくつかの実施形態では、本発明の微小構造としては、限定するものではないが、マイクロチャネル、マイクロ流体プレート、固定マイクロチャネル、マイクロチャネルのネットワーク、内部ポンプ;外側ポンプ、バルブ、遠心力要素などが挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の微小構造(例えば、液滴マイクロアクチュエータ、マイクロ流体プラットフォーム、および/または連続フローマイクロ流体)は、限定するものではないが、電気的手段(例えば、静電アクチュエーション、誘電泳動)、磁気的手段、熱的手段(例えば、熱マランゴニ効果、サーモキャピラリー)、機械的手段(例えば、表面弾性波、マイクロポンピング、蠕動性)、光学的手段(例えば、オプトエレクトロウエッティング、光ピンセット)、および化学的手段(例えば、化学的勾配)を含む、液滴操作技術で補完されるか、または補充される。いくつかの実施形態では、液滴マイクロアクチュエータは、マイクロ流体プラットフォーム(例えば、連続フロー成分)で補充され、別個の液滴操作およびマイクロ流体要素を含むこのような組み合わせのアプローチは、本発明の範囲内である。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、液滴マイクロアクチュエータを利用する。いくつかの実施形態では、液滴マイクロアクチュエータは、液滴の操作および/または作業、例えば、分散、スプリット、移入、合併、混合、攪拌などを達成し得る。いくつかの実施形態では、本発明は、例えば、米国特許第6,911,132号、同第6,773,566号、および同第6,565,727号;米国特許出願第11/343,284号、および米国特許出願公開第20060254933号(全てが参照によって本明細書に援用される)に記載される液滴操作の構造および技術を使用する。
液滴デジタルPCR技術によって、高密度の別個のPCR増幅反応が単一容積中で可能になる。いくつかの実施形態では、1ulあたり100,000、500,000、1,000,000、1,500,000、2,000,000、2,500,000、5,000,000、または10,000,000を超える分離反応が生じ得る。
(検出)
蛍光検出は、蛍光装置によって吸収され得る励起光を生じるためのモジュール、および蛍光装置によって放出される光を検出するためのモジュールを装備された種々の検出デバイスを用いて達成され得る。いくつかの場合には、サンプル(例えば、液滴)はバルクで検出され得る。例えば、サンプルは、プラスチックチューブからのバルク蛍光を測定する検出器中に位置するプラスチックチューブ中に割り当てられ得る。サンプルは、単層に分配されてもよい。単層分配サンプルは、ユーザーが高解像度スキャナー(例えば、マイクロアレイスキャナー、GenePix 4000B Microarray Scanner(Molecular Devices)、SureScan Microarray Scanner(Agilent))をスキャンすることによって検出され得る。サンプルが複数の層に分配される場合、そのサンプルは、共焦点画像化(例えば、共焦点顕微鏡、スピニングディスク共焦点顕微鏡、共焦点レーザースキャニング顕微鏡)で検出され得る。いくつかの場合では、1つ以上のサンプル(例えば、液滴)を、1つ以上のウェルのプレート、例えば、96ウェルまたは384ウェルプレートに分割してもよく、個々のウェルの蛍光は、蛍光プレートリーダーを用いて検出してもよい。
蛍光検出は、蛍光装置によって吸収され得る励起光を生じるためのモジュール、および蛍光装置によって放出される光を検出するためのモジュールを装備された種々の検出デバイスを用いて達成され得る。いくつかの場合には、サンプル(例えば、液滴)はバルクで検出され得る。例えば、サンプルは、プラスチックチューブからのバルク蛍光を測定する検出器中に位置するプラスチックチューブ中に割り当てられ得る。サンプルは、単層に分配されてもよい。単層分配サンプルは、ユーザーが高解像度スキャナー(例えば、マイクロアレイスキャナー、GenePix 4000B Microarray Scanner(Molecular Devices)、SureScan Microarray Scanner(Agilent))をスキャンすることによって検出され得る。サンプルが複数の層に分配される場合、そのサンプルは、共焦点画像化(例えば、共焦点顕微鏡、スピニングディスク共焦点顕微鏡、共焦点レーザースキャニング顕微鏡)で検出され得る。いくつかの場合では、1つ以上のサンプル(例えば、液滴)を、1つ以上のウェルのプレート、例えば、96ウェルまたは384ウェルプレートに分割してもよく、個々のウェルの蛍光は、蛍光プレートリーダーを用いて検出してもよい。
いくつかの実施形態では、液滴の増幅は、例えば、サーマルサイクル中で、多数の液滴中で1つ以上の検出可能シグナルの生成を生じる。増幅反応の間、問い合わされる対立遺伝子を含むテンプレートDNA分子を含む液滴は、問い合わされた対立遺伝子を含まない液滴に対して蛍光の増大を示し得る。液滴は、個々に処理されてもよく、蛍光データが液滴から収集され得る。例えば、スペクトル的に別個のフルオロフォア由来の蛍光性シグナルに関連するデータは、各々の液滴から収集され得る。
多数の市販の装置が、蛍光標識物質の分析に利用可能である。例えば、ABI Gene Analyzerを用いて、ROX(6−カルボキシ−X−ローダミン)、ローダミン−NHS、TAMRA(5/6−カルボキシテトラメチル ローダミン NHS)、およびFAM(5’−カルボキシフルオレセインNHS)などのフルオロフォアでタグ化されたアトモル量のDNAを分析し得る。これらの化合物を、プローブ上で5’−アルキルアミンを通じて結合されたアミンによってプローブに結合する。結合はまた、アミノ誘導体化ポリマー、特にオリゴヌクレオチドをコンジュゲートする方法である、ホスホラミダイト前駆体(例えば、2−メトキシ−3−トリフルオロアセチル−1,3,2−オキサザホスファシクロペンタンまたはN−(3−(N’,N’−ジイソプロピルアミノメトキシホスフィニルオキシ)プロピル)−2,2,2−トリフルオロアセトアミド)を通じて生じる場合もある。他の有用なフルオロフォアとしては、CNHS(7−アミノ−4−メチル−クマリン−3−酢酸、スクシンイミジルエステル)が挙げられ、またこれを、アミド結合を用いて結合させてもよい。
デジタルPCRの後、特定の対立遺伝子を有する陽性サンプルの数、および任意の他の対立遺伝子(例えば、野性型対立遺伝子)を有する陽性サンプルの数をカウントしてもよい。いくつかの場合には、定量的決定は、個々の画分の蛍光強度を測定することによって行うが、他の場合には、測定は、検出可能なシグナルを含む区画の数をカウントすることによって行う。いくつかの実施形態では、コントロールサンプルを含んで、バックグラウンド蛍光について説明するために全ての測定から差引きされ得るバックグラウンド測定を行ってもよい。他の実施形態では、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または10を超える、異なる色を用いて、異なる配列を認識するプローブに対して適合する異なるPCRプライマー上の異なる色のフルオロフォアを用いることなどによって、異なる対立遺伝子を検出および測定してもよい。
本発明の別の実施形態では、加水分解されたレポータープローブの検出は、例えば、発光(例えば、EDTAのイットリウムまたはベリリウムコンジュゲートを用いる)、時間分解蛍光分光法(蛍光が励起後の時間の関数としてモニターされる技術)、または蛍光分極(分子タンブリングに基づいて大きい分子と小さい分子との間を識別する技術)を用いて達成され得る。大分子(例えば、インタクトな標識されたプローブ)は溶液中で、低分子よりもかなり緩徐に回転(タンブリング)する。目的の分子(例えば、標識されたプローブの5’末端)への蛍光部分の連結の際には、この蛍光部分は、分子タンブリングに基づいて測定され(分化され)得、それによってインタクトなプローブと消化されたプローブとの間が区別される。検出はPCRの間に直接測定されてもよいし、またはPCR後に行われてもよい。
(対立遺伝子検出のためのキット)
本発明ではまた、ある遺伝子座の1つ以上の対立遺伝子の検出のためのキットも提供される。キットは、本明細書に記載のような1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを含んでもよく、ここでは、プライマーの各々が、ある遺伝子座の個々の対立遺伝子を選択的に検出し得る。キットはまた、本明細書に記載のような、1つ以上のレポータープローブを含んでもよい。キットは、例えば、1つ以上のプライマー/プローブセットを含んでもよい。例示的なプライマー/プローブセットが本明細書に記載されている。キットはさらに、1つ以上のプライマー/プローブセットのための使用説明書、例えば、本発明の方法を行うための説明書を含んでもよい。いくつかの実施形態では、このキットは、包装資材を含む。本明細書において用いる場合、「包装資材」という用語は、キットの構成要素を収容する物理的構造を指してもよい。包装資材は、キットの構成要素の無菌性を維持し得、かつこのような目的のために通常用いられる資材(例えば、紙、段ボール、ガラス、プラスチック、ホイル、アンプルなど)から構成されてもよい。キットはまた、緩衝剤、防腐剤、またはタンパク質/核酸安定化剤を含んでもよい。キットはまた、本明細書に記載されるような反応混合物の他の構成要素を含んでもよい。例えば、キットは、本明細書に記載のような熱安定性DNAポリメラーゼの1つ以上のアリコート、および/またはdNTPの1つ以上のアリコートを含んでもよい。キットはまた、ある遺伝子座の個々の対立遺伝子を保有する既知量のテンプレートDNA分子のコントロールサンプルを含んでもよい。いくつかの実施形態では、このキットは、陰性のコントロールサンプル、例えば、遺伝子座の個々の対立遺伝子を保有するDNA分子を含まないサンプルを含む。いくつかの実施形態では、このキットは、陽性コントロールサンプル、例えば、遺伝子座の個々の対立遺伝子のうちの1つ以上の既知の量を含有するサンプルを含む。
本発明ではまた、ある遺伝子座の1つ以上の対立遺伝子の検出のためのキットも提供される。キットは、本明細書に記載のような1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを含んでもよく、ここでは、プライマーの各々が、ある遺伝子座の個々の対立遺伝子を選択的に検出し得る。キットはまた、本明細書に記載のような、1つ以上のレポータープローブを含んでもよい。キットは、例えば、1つ以上のプライマー/プローブセットを含んでもよい。例示的なプライマー/プローブセットが本明細書に記載されている。キットはさらに、1つ以上のプライマー/プローブセットのための使用説明書、例えば、本発明の方法を行うための説明書を含んでもよい。いくつかの実施形態では、このキットは、包装資材を含む。本明細書において用いる場合、「包装資材」という用語は、キットの構成要素を収容する物理的構造を指してもよい。包装資材は、キットの構成要素の無菌性を維持し得、かつこのような目的のために通常用いられる資材(例えば、紙、段ボール、ガラス、プラスチック、ホイル、アンプルなど)から構成されてもよい。キットはまた、緩衝剤、防腐剤、またはタンパク質/核酸安定化剤を含んでもよい。キットはまた、本明細書に記載されるような反応混合物の他の構成要素を含んでもよい。例えば、キットは、本明細書に記載のような熱安定性DNAポリメラーゼの1つ以上のアリコート、および/またはdNTPの1つ以上のアリコートを含んでもよい。キットはまた、ある遺伝子座の個々の対立遺伝子を保有する既知量のテンプレートDNA分子のコントロールサンプルを含んでもよい。いくつかの実施形態では、このキットは、陰性のコントロールサンプル、例えば、遺伝子座の個々の対立遺伝子を保有するDNA分子を含まないサンプルを含む。いくつかの実施形態では、このキットは、陽性コントロールサンプル、例えば、遺伝子座の個々の対立遺伝子のうちの1つ以上の既知の量を含有するサンプルを含む。
(対立遺伝子検出のためのシステム)
本発明ではまた、サンプル中の1つ以上の対立遺伝子の検出のためのシステムも提供される。このシステムは、本明細書に記載の反応混合物を提供し得る。いくつかの実施形態では、この反応混合物は、DNAサンプルと混合され、テンプレートDNAを含む。いくつかの実施形態では、このシステムはさらに、液滴生成装置を設け、これがテンプレートDNA分子、プローブ、プライマーおよび他の反応混合物成分を、油中水型エマルジョン内の複数の液滴に分画する。本開示で有用ないくつかの液滴生成装置の例は、国際出願番号PCT/US2009/005317に示される。このシステムはさらに、サーモサイクラーを設けてもよく、これは液滴を、例えば、PCRを介して反応させて、1つ以上の検出可能シグナルの増幅および生成を可能にする。増幅反応の間、問い合わされる対立遺伝子を含むテンプレートDNA分子を含む液滴は、問い合わされた対立遺伝子を含まない液滴に対して蛍光の増大を呈する。いくつかの実施形態では、このシステムはさらに、液滴読み取り装置(リーダー)を設け、これは液滴を個々に処理して、その液滴から蛍光データを収集する。この液滴読み取り装置は、例えば、スペクトル的に別個のフルオロフォアから蛍光性シグナルを検出し得る。いくつかの実施形態では、この液滴リーダーはさらに、液滴サンプルについての取り扱い能力を備え、個々の液滴が検出器に入り、検出を受け、次いで検出器を出ていく。例えば、フローサイトメトリー装置を、液滴サンプルからの蛍光の検出での使用のために適合させてもよい。いくつかの場合には、液滴の移動を制御するためのポンプを装備したマイクロ流体デバイスを用いて、単一のファイル中で液滴からの蛍光を検出する。いくつかの場合では、液滴を二次元表面に整列させて、検出器は、表面に対して移動して、単一液滴を含む各々の位置で蛍光を検出する。本開示で有用な例示的な液滴リーダーは、国際出願番号PCT/US2009/005317に示される。
本発明ではまた、サンプル中の1つ以上の対立遺伝子の検出のためのシステムも提供される。このシステムは、本明細書に記載の反応混合物を提供し得る。いくつかの実施形態では、この反応混合物は、DNAサンプルと混合され、テンプレートDNAを含む。いくつかの実施形態では、このシステムはさらに、液滴生成装置を設け、これがテンプレートDNA分子、プローブ、プライマーおよび他の反応混合物成分を、油中水型エマルジョン内の複数の液滴に分画する。本開示で有用ないくつかの液滴生成装置の例は、国際出願番号PCT/US2009/005317に示される。このシステムはさらに、サーモサイクラーを設けてもよく、これは液滴を、例えば、PCRを介して反応させて、1つ以上の検出可能シグナルの増幅および生成を可能にする。増幅反応の間、問い合わされる対立遺伝子を含むテンプレートDNA分子を含む液滴は、問い合わされた対立遺伝子を含まない液滴に対して蛍光の増大を呈する。いくつかの実施形態では、このシステムはさらに、液滴読み取り装置(リーダー)を設け、これは液滴を個々に処理して、その液滴から蛍光データを収集する。この液滴読み取り装置は、例えば、スペクトル的に別個のフルオロフォアから蛍光性シグナルを検出し得る。いくつかの実施形態では、この液滴リーダーはさらに、液滴サンプルについての取り扱い能力を備え、個々の液滴が検出器に入り、検出を受け、次いで検出器を出ていく。例えば、フローサイトメトリー装置を、液滴サンプルからの蛍光の検出での使用のために適合させてもよい。いくつかの場合には、液滴の移動を制御するためのポンプを装備したマイクロ流体デバイスを用いて、単一のファイル中で液滴からの蛍光を検出する。いくつかの場合では、液滴を二次元表面に整列させて、検出器は、表面に対して移動して、単一液滴を含む各々の位置で蛍光を検出する。本開示で有用な例示的な液滴リーダーは、国際出願番号PCT/US2009/005317に示される。
本発明の方法での使用のための他の例示的なシステムは、例えば、PCT特許出願公開WO2007/091228(USSN12/092,261);WO2007/091230(USSN12/093,132);およびWO2008/038259に記載される。本発明を行うのに有用なシステムとしては、例えば、Stokes Bio(www.stokebio.ie)、Fluidigm(www.fluidigm.com)、Bio−Rad Laboratories(www.bio−rad.com)、RainDance Technologies(www.raindancetechnologies.com)、Microfluidic Systems(www.microfluidicsystems.com);Nanostream(www.nanostream.com);およびCaliper Life Sciences(www.caliperls.com)のシステムが挙げられる。本発明の方法での使用に適切な他の例示的なシステムは、例えば、Zhangら、Nucleic Acids
Res.,35(13):4223〜4237(2007),Wangら、J.Micromech.Microeng.,15:1369〜1377(2005);Jiaら、38:2143〜2149(2005);Kimら、Biochem.Eng.J.,29:91〜97;Chenら、Anal.Chem.,77:658〜666;Chenら、Analyst,130:931〜940(2005);Munchowら、Expert Rev.Mol.Diagn.,5:613〜620(2005);およびCharbertら、Anal.Chem.,78:7722〜7728(2006);およびDorfmanら、Anal.Chem,77:3700−3704(2005)に記載される。
Res.,35(13):4223〜4237(2007),Wangら、J.Micromech.Microeng.,15:1369〜1377(2005);Jiaら、38:2143〜2149(2005);Kimら、Biochem.Eng.J.,29:91〜97;Chenら、Anal.Chem.,77:658〜666;Chenら、Analyst,130:931〜940(2005);Munchowら、Expert Rev.Mol.Diagn.,5:613〜620(2005);およびCharbertら、Anal.Chem.,78:7722〜7728(2006);およびDorfmanら、Anal.Chem,77:3700−3704(2005)に記載される。
いくつかの実施形態では、このシステムはさらに、データを記憶して処理するコンピュータを備える。コンピュータ実行可能なロジックを使用して、バックグラウンド蛍光の差引き、標的および/または参照配列の割り当て、ならびにデータの定量化のような機能を行ってもよい。例えば、サンプル中の特定の対立遺伝子(例えば、変異体対立遺伝子)の存在に応答する蛍光を含む液滴の数をカウントして、遺伝子座の別の対立遺伝子(例えば、野性型対立遺伝子など)の存在に相当する蛍光を含む液滴の数と比較してもよい。
(被験体特異的なレポート)
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のような癌を評価する方法はさらに、腫瘍プロファイルに対する被験体特異的なレポートを作成する工程を包含する。腫瘍プロファイルは、配列決定された遺伝子のセット中の1つ以上の遺伝子の変異状態を含み得る。この方法はさらに、経時的な遺伝子のサブセットの変異状態に対する被験体特異的なレポートの作成を包含し得る。この被験体特異的なレポートは、遺伝子のサブセット中の変異を保有している無細胞DNAのレベルにおける経時的な変化に基づいた、腫瘍の動態に対する経時的な情報を含んでもよい。変異を保有している無細胞DNAの経時的な増大は、保有している腫瘍または癌の増大を示し得る。変異を保有している無細胞DNAの経時的な減少は、保有している腫瘍または癌の減少を示し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のような癌を評価する方法はさらに、腫瘍プロファイルに対する被験体特異的なレポートを作成する工程を包含する。腫瘍プロファイルは、配列決定された遺伝子のセット中の1つ以上の遺伝子の変異状態を含み得る。この方法はさらに、経時的な遺伝子のサブセットの変異状態に対する被験体特異的なレポートの作成を包含し得る。この被験体特異的なレポートは、遺伝子のサブセット中の変異を保有している無細胞DNAのレベルにおける経時的な変化に基づいた、腫瘍の動態に対する経時的な情報を含んでもよい。変異を保有している無細胞DNAの経時的な増大は、保有している腫瘍または癌の増大を示し得る。変異を保有している無細胞DNAの経時的な減少は、保有している腫瘍または癌の減少を示し得る。
いくつかの実施形態では、このレポートは、被験体の腫瘍特異的なプロファイルに基づいて、被験体についての処置の選択肢の階層化および/またはアノテーションを示す。階層化および/またはアノテーションは、被験体の臨床情報に基づく場合があり得る。階層化は、有効性が低確率である薬物処置の選択肢よりも有効性の高い高確率の、または1つ以上の分子マーカーの決定された状態で被験体を処置する工程に関して、情報が存在しない、薬物処置選択肢を順位付ける工程を包含し得る。階層化には、科学情報によって、被験体由来の1つ以上の腫瘍特異的な変異の状態に基づいて、1つ以上の薬物処置選択肢が、被験体で有効であることが示唆される、1つ以上の薬物処置選択肢をレポートで示す工程を包含し得る。この階層化は、被験体由来のサンプル中の1つ以上の腫瘍特異的な変異の状態に基づいて、いくつかの科学情報によれば、1つ以上の薬物処置選択肢が、その被験体で有効であることが示唆され、そしていくつかの科学情報によれば、1つ以上の薬物処置選択肢が、その被験体で有効でないことが示唆される、1つ以上の薬物処置選択肢をレポートで示す工程を包含し得る。この階層化は、科学情報によって、被験体由来のサンプル中の1つ以上の腫瘍特異的な変異の状態に基づいて、1つ以上の薬物処置選択肢が、その被験体に有効でないことを示す、1つ以上の薬物処置選択肢をあるレポートで示す工程を包含し得る。この階層化は、薬物処置選択肢の予測される有効性のランクに基づいて、レポートに列挙された薬物処置選択肢をコードする色を包含し得る。
アノテーションは、NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology(商標)またはAmerican Society of Clinical Oncology(ASCO)の臨床実施ガイドラインにおけるある条件についてのレポートのアノテーションを包含し得る。アノテーションは、FDAの認可外の用途についての1つ以上のFDAの承認した薬物の列挙、Centers for Medicare and Medicaid Services(CMS)抗癌処置概要に列挙された1つ以上の薬物、および/または科学論文に見出される1つ以上の実験薬物をレポート中に包含し得る。アノテーションは、列挙された薬物処置選択肢を、その薬物処置選択肢に関する科学情報を含む参照と関連付ける工程を包含し得る。科学情報は、医学雑誌の論評の対象となる文献由来であってもよい。アノテーションは、Ingenuity(登録商標)システムによって提供される情報を用いる工程を包含し得る。アノテーションは、レポート中の薬物処置選択肢について臨床試験の情報に対するリンクを提供する工程を包含し得る。アノテーションは、電子的なレポートで、提供された薬物処置選択肢に近いポップアップボックスまたはフライオーバーボックスで情報を提示する工程を包含し得る。アノテーションは、1つ以上の薬物処置選択肢、1つ以上の薬物処置選択肢を関連付ける科学的情報、1つ以上の薬物処置選択肢に関する科学情報に対する1つ以上のリンク、1つ以上の薬物処置選択肢に関する科学情報についての引用に対する1つ以上のリンク、および1つ以上の薬物処置選択肢に関する臨床試験情報からなる群より選択されるレポートで情報を追加する工程を包含し得る。被験体特異的なレポートの例示的な実施形態は、図8に示される。
(コンピュータシステム)
別の態様では、本発明は、癌をモニタリングするか、被験体レポートを作成するか、および/または介護者にそのレポートを連絡するためのコンピュータシステムを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、癌についての治療の予後をそれを必要とする被験体で決定するか、またはその有効性を決定するためのコンピュータシステムを提供する。このコンピュータシステムは、前記癌について、前記予後または治療の有効性を連絡するレポートを提供し得る。いくつかの実施形態では、コンピュータシステムは、コンピュータ読み取り可能なメディアに含まれる説明書を実行する。いくつかの実施形態では、プロセッサが、1つ以上の制御装置、計算ユニット、および/またはコンピュータシステムの他のユニットと関連するか、またはファームウェアに埋め込まれる。いくつかの実施形態では、この方法の1つ以上の工程は、ハードウェアで実行される。いくつかの実施形態では、この方法の1つ以上の工程は、ソフトウェアで実行される。ソフトウェアのルーティンは、本明細書に記載されるか、または当該分野で公知のフラッシュメモリ、RAM、ROM、磁気ディスク、レーザーディスクまたは他の記憶メディアなどの任意のコンピュータ読み取り可能なメモリユニットに記憶されてもよい。ソフトウェアは、任意の公知の連絡方法、例としては、例えば、電話線、インターネット、ワイヤレス接続のような通信回路にまたがって、またはコンピュータ読み取り可能なディスク、フラッシュドライブなどのような携行性のメディアによって、コンピュータデバイスに連絡されてもよい。本明細書に記載される方法の1つ以上の工程は、種々の操作、ツール、ブロック、モジュールおよび技術として実行されてもよく、これが次に、ファームウェア、ハードウェア、ソフトウェア、またはファームウェア、ハードウェア、ソフトウェアの任意の組み合わせにおいて行われてもよい。ハードウェアで実行される場合、ブロック、操作、技術などのうちのいくつかまたは全ては、例えば、特定用途向け集積回路(application specific integrated circuit)(ASIC)、カスタム集積回路(custom integrated circuit)(IC)、フィールドプログラマブル論理アレイ(FPGA)、またはプログラマブル論理アレイ(PLA)で実行され得る。
別の態様では、本発明は、癌をモニタリングするか、被験体レポートを作成するか、および/または介護者にそのレポートを連絡するためのコンピュータシステムを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、癌についての治療の予後をそれを必要とする被験体で決定するか、またはその有効性を決定するためのコンピュータシステムを提供する。このコンピュータシステムは、前記癌について、前記予後または治療の有効性を連絡するレポートを提供し得る。いくつかの実施形態では、コンピュータシステムは、コンピュータ読み取り可能なメディアに含まれる説明書を実行する。いくつかの実施形態では、プロセッサが、1つ以上の制御装置、計算ユニット、および/またはコンピュータシステムの他のユニットと関連するか、またはファームウェアに埋め込まれる。いくつかの実施形態では、この方法の1つ以上の工程は、ハードウェアで実行される。いくつかの実施形態では、この方法の1つ以上の工程は、ソフトウェアで実行される。ソフトウェアのルーティンは、本明細書に記載されるか、または当該分野で公知のフラッシュメモリ、RAM、ROM、磁気ディスク、レーザーディスクまたは他の記憶メディアなどの任意のコンピュータ読み取り可能なメモリユニットに記憶されてもよい。ソフトウェアは、任意の公知の連絡方法、例としては、例えば、電話線、インターネット、ワイヤレス接続のような通信回路にまたがって、またはコンピュータ読み取り可能なディスク、フラッシュドライブなどのような携行性のメディアによって、コンピュータデバイスに連絡されてもよい。本明細書に記載される方法の1つ以上の工程は、種々の操作、ツール、ブロック、モジュールおよび技術として実行されてもよく、これが次に、ファームウェア、ハードウェア、ソフトウェア、またはファームウェア、ハードウェア、ソフトウェアの任意の組み合わせにおいて行われてもよい。ハードウェアで実行される場合、ブロック、操作、技術などのうちのいくつかまたは全ては、例えば、特定用途向け集積回路(application specific integrated circuit)(ASIC)、カスタム集積回路(custom integrated circuit)(IC)、フィールドプログラマブル論理アレイ(FPGA)、またはプログラマブル論理アレイ(PLA)で実行され得る。
図9は、ユーザーが患者のデータを検出、分析、および処理することを可能にするために適合されたコンピュータシステム900を示す。このシステム900は、本明細書に記載される例示的な方法を行うようにプログラムされている中央コンピュータサーバー901を備える。このサーバー901は、中央プロセッシングユニット(処理装置)(CPU、「プロセッサ」とも呼ばれる)905を備え、これは、単一のコアプロセッサ、マルチコアプロセッサ、または並列処理のための複数のプロセッサであってもよい。サーバー901はまた、メモリ910(例えば、ランダム・アクセス・メモリ、リード・オンリ・メモリ、フラッシュメモリ);電子的記憶装置915(例えば、ハードディスク);1つ以上の他のシステムとの連絡のためのコミュニケーションインターフェース920(例えば、ネットワークアダプター);および周辺機器925(これは、キャッシュ、他のメモリ、データ記憶および/または電子的ディスプレイアダプターを含んでもよい)も備える。メモリ910、記憶装置915、インターフェース920、および周辺機器925は、マザーボードなどのコミュニケーションバス(実線)を通じてプロセッサ905と連絡している。記憶装置915は、データを記憶するためのデータ記憶装置であってもよい。サーバー901は、コミュニケーションインターフェース920の補助でコンピュータネットワーク(「ネットワーク」)930に対して作動可能に接続される。ネットワーク930は、インターネットであっても、イントラネットであっても、および/またはエクストラネットであっても、インターネットと連絡しているイントラッネットおよび/またはエクストラネットであっても、遠隔通信であっても、あるいはデータネットワークであってもよい。ネットワーク930は、いくつかの場合には、サーバー901の補助によって、ピアツーピア(peer−to−peer)ネットワークを行ってもよく、これによってデバイスをサーバー901に接続して、クライアントまたはサーバーとして挙動することが可能になる場合がある。
記憶装置915は、ファイル、例えば、被験体レポート、および/または介護者とのコミュニケーション、配列決定データ、個体に関するデータ、または本発明に関連するデータの任意の態様を記憶し得る。
サーバーは、ネットワーク930を通じて1つ以上の遠隔コンピュータシステムと連絡し得る。この1つ以上の遠隔コンピュータシステムは、例えば、パーソナルコンピュータ、ラップトップ、タブレット、電話、スマートフォン、または個人情報端末であってもよい。
いくつかの状況では、システム900は、単独のサーバー901を備える。他の状況では、このシステムは、イントラネット、エクストラネットおよび/またはインターネットを通じて互いと連絡している複数のサーバーを備える。
サーバー901は、配列決定情報、または患者情報、例えば、多型、変異、患者の病歴および人口統計データ、および/または潜在的関連性の他の情報を記憶するように適合され得る。このような情報は、記憶装置915またはサーバー901に記憶されてもよく、そのようなデータは、ネットワークを通じて伝達され得る。
本明細書に記載されるような方法は、例えば、メモリ910、または電子的記憶装置915などのような、サーバー901の電子的記憶位置に記憶される機械(またはコンピュータプロセッサ)実行可能なコード(またはソフトウェア)によって実行されてもよい。使用の間、このコードは、プロセッサ905によって実行され得る。いくつかの場合には、このコードは、記憶装置915から読み出されて、プロセッサ905による即時的アクセスのためにメモリ910に記憶され得る。いくつかの状況では、電子的記憶装置915は、除外されてもよく、機械の実行可能な命令は、メモリ910に記憶される。あるいは、このコードは、第二のコンピュータシステム940上で実行されてもよい。
サーバー901のような本明細書に提供されるシステムおよび方法の態様は、プログラミングで実現されてもよい。種々の態様の技術は、「製品」または「製造物」として、代表的には機械読み取り可能な種類のメディアで行われるか、または実現される機械(またはプロセッサ)実行可能なコードおよび/または関連のデータの形態であると考えられ得る。機械実行可能なコードは、メモリ(例えば、リード・オンリ・メモリ、ランダム・アクセス・メモリ、フラッシュメモリ)またはハードディスクのような電子的記憶装置に記憶されてもよい。「記憶」型のメディアとしては、コンピュータ、プロセッサなどの任意のもしくは全ての有形のメモリ、またはその関連のモジュール、例えば、種々の半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブなどが挙げられ、これらは、ソフトウェアプログラミングのために任意の時点で一時的でない記憶を提供し得る。ソフトウェアの全てまたは一部は、インターネットまたは種々の他の遠隔通信ネットワークを通じて時折連絡され得る。このようなコミュニケーションは、例えば、一方のコンピュータまたはプロセッサから他方への、例えば、管理サーバーまたはホストコンピュータからアプリケーションサーバーのコンピュータプラットフォームへのソフトウェアのロードを可能にし得る。したがって、ソフトウェア要素を保有し得る別種の媒体としては、有線および光学の地上の通信線のネットワークを通じた、および種々のエアリンクにまたがった、ローカルデバイスの間の物理的インターフェースにまたがって用いられるような、光学、電気および電磁波が挙げられる。このような波、例えば、有線または無線など、光学的リンクなどを担持する物理的要素はまた、ソフトウェアを保有している媒体としてみなされ得る。本明細書において用いる場合、持続的に制限されない限り、有形の「記憶」メディアという用語、例えば、コンピュータまたは機械「読み取り可能メディア」とは、実行のためのプロセッサに命令を送るのに関与する任意のメディアを指してもよい。
したがって、機械読み取り可能なメディア、例えば、コンピュータ実行可能なコードは、多くの形態をとってもよく、これには限定するものではないが、有形の記憶媒体、搬送波メディア、または物理的伝送媒体が挙げられる。不揮発性記憶媒体としては、このシステムを実行するために用いられ得るような、例えば、光学ディスク、または磁気ディスク、例えば、任意のコンピュータ(単数または複数)などの任意の記憶装置が挙げられる。有形の伝送媒体としては以下を挙げることができる:同軸ケーブル、銅線および光ファイバー(コンピュータシステム内にバスを含むワイヤを含む)。搬送波伝送媒体は、電気信号もしくは電磁的信号の形態をとっても、または音響波、もしくは光波、例えば、高周波(RF)および赤外(IR)データ通信の間に生じるものなどの形態をとってもよい。したがって、コンピュータ読み取り可能な媒体の一般的な形態としては例えば、以下が挙げられる:フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、任意の他の磁気メディア、CD−ROM、DVD、DVD−ROM、任意の他の光学メディア、パンチカード、紙テープ、任意の他の物理的記憶媒体(穴のパターンを有する)、RAM、ROM、PROMおよびEPROM、FLASH−EPROM、任意の他のメモリチップ、またはカートリッジ、データもしくは命令を伝達する搬送波、ケーブルまたはこのような搬送波を伝達するリンク、またはコンピュータがプログラミングコードおよび/またはデータを読み取り得る任意の他の媒体。これらの形態の多くのコンピュータ読み取り可能なメディアは、1つ以上の命令の1つ以上の順序を実行のためにプロセッサに搬送する工程に関与し得る。
癌のモニタリング、被験体レポートの作成、および/または介護者へのこのレポートの連絡の結果は、グラフィカルユーザーインターフェースなどのユーザーインターフェースの補助によって、ユーザーに提示され得る。
コンピュータシステムは、1つ以上の工程について用いられ得、この工程としては、例えば、サンプルの収集、サンプルの処理、配列決定、対立遺伝子検出、患者の病歴または医学的記録の受け取り、被験体または被験体から入手したサンプル中の腫瘍特異的変異の検出されたレベルに関する測定データの受け取りおよび記録、診断、予後診断または治療有効性を決定する前記測定データの分析、レポートの作成、および受取者への結果の報告が挙げられる。
クライアント−サーバーおよび/またはリレーショナルデータベース構造を本発明では用いてもよい。一般には、クライアント−サーバー構造は、ネットワーク構造であって、ここではネットワーク上の各々のコンピュータまたはプロセスが、クライアントまたはサーバーのいずれかである。サーバーコンピュータは、ディスクドライブ(ファイルサーバー)、プリンタ(プリントサーバー)、またはネットワーク通信量(ネットワークサーバー)を管理する専用の強力なコンピュータであり得る。クライアントコンピュータは、PC(パーソナルコンピュータ)またはワークステーションを含んでもよく、ここでユーザーは、アプリケーション、および本明細書に開示されるような例示的な出力装置を実行する。クライアントコンピュータは、ファイル、デバイスおよびさらには処理能力のようなリソースについてサーバーコンピュータに依拠し得る。サーバーコンピュータは、全てのデータベース機能を取扱う。クライアントコンピュータは、初期段階のデータ管理を取扱い、ユーザーからのデータ入力を受容するソフトウェアを有してもよい。
計算を行った後、プロセッサは、ある計算などからの出力を提供し、例えば、入力装置または記憶装置に、同じもしくは異なるコンピュータシステムの別の記憶装置に、または出力装置に戻し得る。プロセッサからの出力は、データディスプレイ、例えば、ディスプレイスクリーン(例えば、デジタル装置上のモニターまたはスクリーン)、プリントアウト、データシグナル(例えば、パケット)、グラフィカルユーザーインターフェース(例えば、ウェブページ)、アラーム(例えば、点滅する光または音)、または任意の上記の組み合わせによって提示されてもよい。ある実施形態では、出力は、ネットワーク(例えば、ワイヤレスネットワーク)にまたがって出力装置に伝達される。出力装置は、データ・プロセシング・コンピュータ・システムから出力を受容するためにユーザーによって用いられてもよい。出力がユーザーに受容された後、ユーザーは、作用の経過を決定してもよいし、または作用(例えば、ユーザーが医療関係者である場合は医療処置)の経過を行ってもよい。いくつかの実施形態では、出力装置は、入力装置と同じ装置である。例示的な出力装置としては、限定するものではないが、電話、無線電話、携帯電話、PDA、フラッシュメモリドライブ、光源、音波発生装置、FAX装置、コンピュータ、コンピュータモニター、プリンタ、iPod、およびウェブページが挙げられる。ユーザーステーションは、サーバーによって処理された情報を出力するためにプリンタまたはディスプレイモニターと連絡していてもよい。このようなディスプレイ、出力装置、およびユーザーステーションを用いて、被験体に対して、またはその介護者に対して警告を発してもよい。
本開示に関連するデータは、受取者による受容および/またはレビューのためにネットワークまたは接続にまたがって伝達されてもよい。この受取者は、レポートが関連する被験体;またはその介護人、例えば、ヘルスケア提供者、マネージャー、他のヘルスケア専門家、または他の介護者;遺伝子型決定分析を行うかおよび/または指図した人または実体;遺伝カウンセラーであってもよいが、それに限定されない。この受取者はまた、このようなレポートを記憶するためのローカルまたは遠隔のシステムであってもよい(例えば、「クラウドコンピューティング」構造のサーバーまたは他のシステム)。一実施形態では、コンピュータ読み取り可能なメディアとしては、生物学的サンプルの分析の結果の伝達に適切なメディアが挙げられる。
被験体特異的なレポートの例示的な実施形態は、図8に示される。コンピュータシステムは、ユーザーのアクセス可能なモジュールを含んでもよく、このモジュールによって、サービスが行われるように臨床家が要求する能力が可能になる。臨床家は、患者の個体群統計学および医学的既往歴の情報をコンピュータシステムに入力し得る。このコンピュータシステムは、入力された情報を処理して、分析されているサンプルに適用され得るバーコード標識を作成し得る。バーコードのサンプルは、分析のために第三者の分析者へ送られる。バーコード化された情報は、Health Insurance Portability and Accountability Act(HIPAA)コンプライアンスでの説明責任を維持するために第三者の分析者にはアクセスしにくい。匿名にできる情報は、第三者の分析者にもアクセス可能である。バーコードを用いて、分析ワークフローを通じてサンプルの進行を追跡してもよく、それによって暗号化された最終レポートが生成される。暗号化された最終レポートは、解読されて、サンプル情報を最初に入力した臨床家にはアクセス可能にされ得る。
(ライゲーション方法:)
いくつかの態様では、本発明は、高度に効率的なライゲーション反応を行うための方法およびキットを提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、アクセプター核酸に対するドナー核酸のライライゲーションを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ライゲーションの効率を、現行の方法と比較して2倍超、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、または1000倍超まで改善する。本明細書に記載される方法は、例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%、または99.9%の効率を超えるまでライゲーションの効率を増大し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ライゲーション反応の特異性を増大し得、これによって望ましくないライゲーション生成物(例えば、望ましくないドナー−ドナーの、またはアクセプター−アクセプターのコンカテマー)と比較して、例えば30%超、40%超、50%超、60%超、70%、80%超、85%、90%超、95%超、97%超、98%超、99%超、99.5%超、99.9%、または実質的に全ての、望ましいドナー−アクセプターライゲーションから生じるライゲーション生成物を生じる。本明細書において記載される方法は、アクセプターまたはドナー核酸分子に対して、50%超、60%超、70%超、80%超、85%超、90%超、95%超、97%超、98%超、99%超、99.5%超、99.9%超または実質的に全ての、それぞれ、複数のドナーまたはアクセプター核酸分子のライゲーションを生じ得る。ライゲーション反応における核酸分子(ドナーまたはアクセプター)は、120ヌクレオチド長を超えてもよい。このような高度に効率的なライゲーション方法を用いて、広範なアプリケーション(そのいくつかは、実施例によって本明細書に記載される)を改善してもよい。
いくつかの態様では、本発明は、高度に効率的なライゲーション反応を行うための方法およびキットを提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、アクセプター核酸に対するドナー核酸のライライゲーションを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ライゲーションの効率を、現行の方法と比較して2倍超、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、または1000倍超まで改善する。本明細書に記載される方法は、例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%、または99.9%の効率を超えるまでライゲーションの効率を増大し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ライゲーション反応の特異性を増大し得、これによって望ましくないライゲーション生成物(例えば、望ましくないドナー−ドナーの、またはアクセプター−アクセプターのコンカテマー)と比較して、例えば30%超、40%超、50%超、60%超、70%、80%超、85%、90%超、95%超、97%超、98%超、99%超、99.5%超、99.9%、または実質的に全ての、望ましいドナー−アクセプターライゲーションから生じるライゲーション生成物を生じる。本明細書において記載される方法は、アクセプターまたはドナー核酸分子に対して、50%超、60%超、70%超、80%超、85%超、90%超、95%超、97%超、98%超、99%超、99.5%超、99.9%超または実質的に全ての、それぞれ、複数のドナーまたはアクセプター核酸分子のライゲーションを生じ得る。ライゲーション反応における核酸分子(ドナーまたはアクセプター)は、120ヌクレオチド長を超えてもよい。このような高度に効率的なライゲーション方法を用いて、広範なアプリケーション(そのいくつかは、実施例によって本明細書に記載される)を改善してもよい。
図10Aは、本発明の方法の例示的な実施形態を示す。第一の工程(1)では、この方法は、NMP担持ドナー核酸分子の蓄積を達成するのに十分な時間、反応混合物中である量のドナー核酸分子にヌクレオチド一リン酸(NMP)を移動させる工程を包含する。いくつかの実施形態では、N=Aである。いくつかの実施形態では、N=Gである。ドナー核酸分子は、5’または3’リン酸基を含んでもよい。いくつかの実施形態では、N=Aであり、かつドナー核酸分子は、5’リン酸基を含む。いくつかの実施形態では、N=Gであり、かつドナー核酸分子は、3’リン酸基を含む。いくつかの実施形態では、この反応は、反応混合物中に存在するドナー核酸分子のうち少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%へのNMPの移動を生じる。第二の工程(2)では、この方法はさらに、アクセプター核(酸)分子(nucleic
molecule)とNMP担持ドナー核酸分子との間の共有結合の形成を達成する工程(例えば、NMP担持ドナー核酸分子に対してアクセプター核酸分子をライゲーションする工程)を包含する。いくつかの実施形態では、アデニル化およびライゲーション工程を、単一の反応混合物中で連続して行う。いくつかの実施形態では、アデニル化されているドナー核酸分子は、第二工程(例えば、ライゲーション工程)の前に反応混合物から分離されない。いくつかの実施形態では、この第一および第二の工程は、反応混合物中で逐次的に行われる。いくつかの実施形態では、このライゲーション工程は、アデニル化工程の終了後に行われる。いくつかの実施形態では、10%超、20%超、30%超、40%超、50%超、60%超、70%超、80%超、90%超、95%超、97%超、98%超、99%超、99.5%超、99.9%、または実質的に全てのドナー核酸分子が、ライゲーション工程の開始の際にNMP分子を担持している。
molecule)とNMP担持ドナー核酸分子との間の共有結合の形成を達成する工程(例えば、NMP担持ドナー核酸分子に対してアクセプター核酸分子をライゲーションする工程)を包含する。いくつかの実施形態では、アデニル化およびライゲーション工程を、単一の反応混合物中で連続して行う。いくつかの実施形態では、アデニル化されているドナー核酸分子は、第二工程(例えば、ライゲーション工程)の前に反応混合物から分離されない。いくつかの実施形態では、この第一および第二の工程は、反応混合物中で逐次的に行われる。いくつかの実施形態では、このライゲーション工程は、アデニル化工程の終了後に行われる。いくつかの実施形態では、10%超、20%超、30%超、40%超、50%超、60%超、70%超、80%超、90%超、95%超、97%超、98%超、99%超、99.5%超、99.9%、または実質的に全てのドナー核酸分子が、ライゲーション工程の開始の際にNMP分子を担持している。
いくつかの実施形態では、ドナーおよび/またはアクセプター核酸分子は、完全にまたは部分的に変性される。完全または部分的な変性が、当該分野で公知の任意の手段によって達成され得、この手段としては、例えば、熱変性、塩基性pH中でのインキュベーション、ホルミアミド中での変性、および/または尿素変性が挙げられる。熱変性は、核酸サンプルを、約60℃以上、約65℃以上、約70℃以上、約75℃以上、約80℃以上、約85℃以上、約90℃以上、約95℃以上、または約100℃以上まで加熱することによって達成され得る。核酸サンプルは、当該分野で公知の任意の手段によって加熱されてもよく、この手段としては、水浴中でのインキュベーション、温度制御熱ブロック、またはサーマルサイクラーが挙げられる。
塩基性のpH中でのインキュベーションによる変性は、pH8以上、9以上、10以上、11以上、12以上の任意の溶液(例えば、緩衝液)中の核酸サンプルのインキュベーションを含み得る。塩基性pH中でのインキュベーションによる変性は、例えば、水酸化ナトリウム(NaOH)、水酸化カリウム(KOH)、炭酸水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、Trisを含む溶液中での核酸サンプルのインキュベーションによって達成され得る。この溶液は、約1mMのNAOH、2mMのNAOH、5mMのNAOH、10mMのNAOH、20mMのNAOH、40mMのNAOH、60mMのNAOH、80mMのNAOH、100mMのNAOH、0.2MのNaOH、約0.3MのNaOH、約0.4MのNaOH、約0.5MのNaOH、約0.6MのNaOH、約0.7MのNaOH、約0.8MのNaOH、約0.9MのNaOH、約1.0MのNaOH、または1.0M超のNaOHを含んでもよい。この溶液は約1mMのKOH、2mMのKOH、5mMのKOH、10mMのKOH、20mMのKOH、40mMのKOH、60mMのKOH、80mMのKOH、100mMのKOH、0.2MのKOH、0.5MのKOH、1MのKOH、または1M超のKOHを含んでもよい。いくつかの実施形態では、この核酸サンプルは、NaOHまたはKOHの中で、約0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、または30分間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、核酸サンプルは、NaOHまたはKOHインキュベーション後に酢酸ナトリウム中でインキュベートする。
尿素およびホルムアミドのような化合物は、ヌクレオチド塩基の電気陰性の中心と水素結合を形成し得る官能基を含む。高濃度の変性剤(例えば、8M尿素または70%ホルムアミド)では、水素結合の競合は、相補性の塩基の間よりも変性剤とN塩基との間の相互作用を支持し、それによって2つの鎖を分離する。
理論で拘束されることは望まないが、代表的なライゲーション方法では、(1)NMPをリガーゼに移動させる工程、および(2)NMPをドナー核酸分子に移動させる工程という中間工程が一般的には、ライゲーション工程(3)と同時に生じて、中性のpHでは可逆性である。3つの全ての工程の同時発生、ならびに工程(1)および(2)の可逆性によって、ライゲーション効率の低下、およびライゲーション生成物の特異性の低下が、いくつかの要因、例えば、ドナー種およびアクセプター種の両方にNMPを移行する可能性(例えば、アデニル化、グアニル化)、リガーゼおよび/またはリガーゼのドナー(またはアクセプター)種からのNMPの除去(例えば、脱アデニル化または脱グアニリル化)、ならびに/あるいはドナー(またはアクセプター)種の脱アデニル化または脱グアニリル化(ライゲーションが生じ得る前)などに起因して生じ得る。しかし、ドナー核酸分子にNMPを移動させる工程、および連続したライゲーションの工程を行うことによって、アクセプター種に対するライゲーションの前に、NMP担持ドナー核酸分子の蓄積を達成することによって、ライゲーション効率を増大することが可能である。
いくつかの実施形態では、中間工程1&2の可逆性は、反応の転帰を制御するために開発される。いくつかの実施形態では、可逆性は、反応混合物の各々の成分(例えば、リガーゼ、ヌクレオシド三リン酸(NTP)、ドナーおよびアクセプター)の相対濃度を調整して、例えば、アデニル化を脱アデニル化よりも促進することによって制御される。単なる例であるが、ドナーおよびアクセプター核酸種が、アデニル化反応に存在し、かつリン酸化5’末端を含む場合、アデニル化工程は、ドナーおよびアクセプター種に非特異的になり、これは望ましくないライゲーション生成物の非特異的な形成をもたらし得る。しかし、アデニル化工程にドナー種のみが存在するならば、アデニル化はドナー種に特異的になり得る。このような場合、ATPおよびリガーゼの量はまた、アデニル化対脱アデニル化の優位性に影響する。例えば、ドナー種の自己ライゲーションは、低濃度のリガーゼで優勢になり得、ここでは高濃度のATP(例えば、ドナー核酸分子の量未満)は、望ましくない濃度のドナー種をもたらし得る。ATPの量を制限することは、観察される濃度の程度を制御し得る。したがって、いくつかの実施形態では、NMP移行工程は、ある量のドナー核酸分子、およびドナー核酸分子の量に少なくとも等モルであるか過剰である量のリガーゼを含む反応混合物中で生じる。ライゲーション工程の前の反応混合物中のドナー核酸分子は、0.1〜10、5〜30、10〜50、20〜100、50〜200、100〜500、200〜1000ng/μlの量で存在し得る。ライゲーション工程の前の反応混合物中のドナー核酸分子は、約0.01pmol、0.05pmol、0.1pmol、0.15pmol、0.2pmol、0.25pmol、0.5pmol、0.55pmol、0.6pmol、0.65pmol、0.7pmol、0.75pmol、0.8pmol、0.85pmol、0.9pmol、0.95pmol、1pmol、1.1pmol、1.2pmol、1.3pmol、1.4pmol、1.5pmol、1.6pmol、1.7pmol、1.8pmol、1.9pmol、2pmol、5pmol、10pmol、15pmol、20pmol、25pmol、30pmol、35pmol、40pmol、45pmol、50pmol、55pmol、60pmol、65pmol、70pmol、75pmol、80pmol、85pmol、90pmol、95pmol、100pmol、110pmol、120pmol、130pmol、140pmol、150pmol、160pmol、170pmol、180pmol、190pmol、200pmol、300pmol、400pmol、500pmol、600pmol、700pmol、800pmol、900pmol、1000pmol(1nmol)、2nmol、5nmol、10nmol、または10nmol超の5’末端を提供する量で存在してもよい。いくつかの実施形態では、リガーゼの量は、ドナー核酸分子の量の少なくとも1×、1.25×、1.5×、2×、3×、4×、5×、7.5×、10×、15×、20×、または20×超である。いくつかの実施形態では、リガーゼの量は、ドナー核酸分子の量の1〜5×、2〜10×、5〜20×または20×超である。いくつかの実施形態では、反応混合物中のリガーゼの量は、約0.01、0.05、0.1、0.5 1、1.5、2、4、6、8、10、または10μM超である。いくつかの実施形態では、アデニル化工程は、ある量のドナー核酸分子と、ドナー核酸分子の量よりも少なくとも0.25倍高い、0.5倍高い、1倍高い、1.5倍高い、2倍高い、3倍高い、4倍高い、5倍高い、6倍高い、7倍高い、8倍高い、9倍高い、10倍高い、15倍高い、20倍高い、または20倍超高い量のリガーゼを含む反応混合物中で生じる。
リガーゼは、ATP依存性リガーゼであってもよい。ATP依存性リガーゼは、RNAリガーゼであってもよい。RNAリガーゼは、例えば、古細菌(Archaeal)のRNAリガーゼ、例えば、好熱性の古細菌Methanobacterium thermoautotrophicum由来の古細菌RNAリガーゼ(MthRnl)であってもよい。このRNAリガーゼは、Rnl 1ファミリーリガーゼであってもよい。一般には、Rnl 1ファミリーリガーゼは、tRNA中の一本鎖破壊を修復し得る。例示的なRnl 1ファミリーリガーゼとしては、例えば、T4 RNAリガーゼ、Thermus
scitoductusバクテリオファージTS2126由来の熱安定性RNAリガーゼ1(CircLigase)、またはCircLigase II)が挙げられる。このようなリガーゼは、参照によって本明細書に援用される、WIPOの国際特許出願公開WO2010094040に記載され得る。RNAリガーゼは、Rnl 2ファミリーのリガーゼであってもよい。一般には、Rnl 2ファミリーのリガーゼは、二重鎖RNA中のニックをシールし得る。例示的なRnl 2ファミリーのリガーゼとしては、例えば、T4 RNAリガーゼ2が挙げられる。いくつかの実施形態では、ATP依存性リガーゼは、ATP依存性DNAリガーゼである。ATP依存性DNAリガーゼは、T4 DNAリガーゼであってもよい。これらのリガーゼは一般的には、ヌクレオチド3’−OH求核試薬と5’AMP・P基のリン酸塩との間のホスホジエステル結合のATP依存性形成を触媒する。
scitoductusバクテリオファージTS2126由来の熱安定性RNAリガーゼ1(CircLigase)、またはCircLigase II)が挙げられる。このようなリガーゼは、参照によって本明細書に援用される、WIPOの国際特許出願公開WO2010094040に記載され得る。RNAリガーゼは、Rnl 2ファミリーのリガーゼであってもよい。一般には、Rnl 2ファミリーのリガーゼは、二重鎖RNA中のニックをシールし得る。例示的なRnl 2ファミリーのリガーゼとしては、例えば、T4 RNAリガーゼ2が挙げられる。いくつかの実施形態では、ATP依存性リガーゼは、ATP依存性DNAリガーゼである。ATP依存性DNAリガーゼは、T4 DNAリガーゼであってもよい。これらのリガーゼは一般的には、ヌクレオチド3’−OH求核試薬と5’AMP・P基のリン酸塩との間のホスホジエステル結合のATP依存性形成を触媒する。
いくつかの実施形態では、リガーゼは、GTP依存性リガーゼである。GTP依存性リガーゼは、RNAリガーゼであってもよい。GTP依存性RNAリガーゼは、RtcB RNAリガーゼであってもよい。RtcBリガーゼは、3’GMP・P基のリン酸塩とヌクレオチド5’−OH求核試薬との間のホスホジエステル結合のGTP=依存性形成を触媒し得る。
いくつかの実施形態では、この反応混合物は、ドナー核酸分子からのNMPの除去を上回るドナー核酸分子に対するNMPの移行を促進する(例えば、脱アデニル化または脱グアニリル化を上回ってアデニル化またはグアニリル化を促進する)のに十分な量のNTPを含む。いくつかの実施形態では、NTPの量は、アデニル化されているドナー核酸分子の間の共有結合の形成を阻害するのに十分である。いくつかの実施形態では、アデニル化工程は、ある量のドナー核酸分子、ある量のNTP依存性リガーゼ、およびNTP依存性リガーゼのミカエリス定数(Km)よりも少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、または10倍高い量のNTPを含む反応混合物中で生じる。いくつかの実施形態では、このアデニル化工程は、ある量のドナー核酸分子、ドナー核酸分子の量に少なくとも等モルであるか、または過剰な量のNTP−ミカエリス定数(Km)依存性リガーゼ、およびNTP依存性リガーゼのミカエリス定数(Km)よりも少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、または10倍高い量のNTPを含む反応混合物中で生じる。特定の実施形態では、約10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM、900μM、1000μMのNTPが、この反応混合物中に存在する。このような量のNTPは、ライゲーション工程を阻害し得る。
アデニル化が生じる反応混合物はさらに、陽イオンを含んでもよい。この陽イオンは、Mg2+であってもよいし、またはMn2+であってもよい。いくつかの実施形態では、陽イオンは、Mg2+である。Mg2+は、反応混合物中に、0.1mM〜1mM、1mM〜10mM、5〜20mM、10〜50mM、30〜100mM、または100mM超の最終濃度で存在してもよい。Mg2は、反応混合物中に、約10mMの最終濃度で存在し得る。いくつかの実施形態では、陽イオンは、リガーゼのアデニル化および引き続くドナー核酸分子のアデニル化を触媒するのに十分な量で存在する。
いくつかの実施形態では、反応混合物はさらに、高分子量の不活性分子、例えば、MW4000、6000、または8000のPEGを含む。いくつかの実施形態では、この不活性分子は、約0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、7.5%、10%、12.5%、13%、13.5%、14%、14.5%、15%、15.5%、16%、16,5%、17%、17.5%、18%、18.5%、19%、19.5%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、または50%超(重量/容積)の量で存在する。いくつかの実施形態では、この不活性分子は、約0.5〜2%、約1〜5%、約2〜15%、約10〜20%、約15〜30%、約20〜50%、または50%超(重量/容積)の量で存在する。
本明細書に記載されるNMP移行工程は、NMP担持ドナー核酸分子の蓄積を達成し得る。NMP担持ドナー核酸分子の蓄積は、NMPを担持する反応混合物中に存在する複数のドナー核酸分子のうち少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.9%、または実質的に全てを生じ得る。
NMP移行工程の間、例えば、ドナー/ドナー環化または連結から生じる望ましくないライゲーション生成物は、任意の手段によって最小化または防止され得る。望ましくないライゲーションは、例えば、アデニル化されたドナー核酸分子の間の共有結合(例えば、ライゲーション)の形成を阻害するのに十分な量のNTPの存在下でアデニル化反応を行うことによって最小化または防止され得る。ライゲーションを阻害し得るNTPの例示的な量は本明細書に記載されている。望ましくないライゲーションはまた、ドナー核酸分子の3’末端基の修飾によって防止されてもよい。ドナー核酸分子の3’末端基は、当該分野で公知の任意の手段によって3’末端ブロック基で修飾されてもよい。一般には、3’末端ブロック基は、3’末端基と別のヌクレオチドとの間の共有結合の形成を防止する。いくつかの実施形態では、3’末端ブロック基は、ジデオキシ−dNTP、ビオチン、3’アミノ部分、「逆転した」ヌクレオシド塩基である。いくつかの実施形態では、このリガーゼは、T4 RNAリガーゼであり、かつドナー核酸分子は、修飾された3’末端基を含む。他の実施形態では、リガーゼは、T4 RNAリガーゼであり、かつドナー核酸分子は、未改変の3’末端基を含む。さらに他の実施形態では、リガーゼは、T4 RNAリガーゼではなく、ドナー核酸分子は、未改変の3’末端基を含む。
いくつかの実施形態では、アデニル化は、アデニル化されているドナー核酸分子の蓄積を達成するのに十分な時間、反応混合物中で生じる。いくつかの実施形態では、反応混合物は、約1分、約2分、約3分、約4分、5分、約10分、約15分、約20分、約25分、約30分、約35分、約40分、約45分、約50分、約55分、約60分、約70分、約80分、約90分、約120分、約150分、約180分、約210分、約240分、または240分超、インキュベートされる。いくつかの実施形態では、反応混合物は、2〜10分、5〜20分、10〜30分、20〜60分、30〜90分、60〜150分、120〜240分、または240分超インキュベートされる。
いくつかの実施形態では、反応混合物は、ドナー核酸分子のアデニル化を容易にするために所望の温度でインキュベートされる。いくつかの実施形態では、この反応混合物は、約50℃、約51℃、約52℃、約53℃、約54℃、約55℃、約56℃、約57℃、約58℃、約59℃、約60℃、約61℃、約62℃、約63℃、約64℃、約65℃、約66℃、約67℃、約68℃、約69℃、約70℃、または70℃超まで加熱される。いくつかの実施形態では、この反応混合物は、約60〜70℃まで加熱される。他の実施形態ではアデニル化は、室温(例えば、20〜25℃)で生じる場合もあるし、または約35〜40℃(例えば、37℃)で生じる場合もある。いくつかの実施形態では、反応混合物は、0〜4℃、4〜15℃、または10〜20℃でインキュベートされる。いくつかの実施形態では、反応混合物は、約5分、約10分、約15分、約20分、約25分、約30分、約35分、約40分、約45分、約50分、約55分、約60分、約70分、約80分、約90分、約120分、約150分、約180分、約210分、約240分、または240分超インキュベートされる。いくつかの実施形態では、この反応混合物は、2〜10分、5〜20分、10〜30分、20〜60分、30〜90分、60〜150分、120〜240分、または240分超インキュベートされる。特定の実施形態では、この反応混合物は、65℃まで約60分間加熱される。
アデニル化されているドナー核酸分子の蓄積後、アデニル化されているドナー核酸分子へのアクセプター核酸分子のライゲーションは、反応混合物からアデニル化されているドナー核酸分子を分離(例えば、精製)することなく達成され得る。いくつかの実施形態では、ライゲーションは、NTPを希釈するために十分な量で反応混合物液中にさらに添加することによって達成される。いくつかの実施形態では、NTPは、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、20倍、50倍、100倍、または100倍超希釈される。この液体は、水、緩衝液、一価イオン、陽イオン、高分子量の不活性分子、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。例えば、緩衝液、一価イオン、陽イオン、高分子量の不活性分子、またはそれらの任意の組み合わせのさらなる量を、反応混合物に添加して、NTPの希釈の際にこれらの反応混合物成分の元の濃度を保存してもよい。NTPの希釈は、リガーゼのNTP媒介性の阻害を放出し得、それによってライゲーション工程が進行することを可能にする。いくつかの実施形態では、ライゲーションは、反応混合物に対して陽イオンをさらに添加することによって達成される。陽イオンは、Mg2+であっても、またはMn2+であってもよい。いくつかの実施形態では、陽イオンはMn2+である。いくつかの実施形態では、陽イオンは、ライゲーション工程を容易にする。いくつかの実施形態では、Mn2+は、0mM〜2mM、1mM〜2.5mM、2.5mM〜5mM、5mM〜7.5mM、または7.5mM超の最終濃度で反応混合物中に存在する。いくつかの実施形態では、Mn2+は、反応混合物中に、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、5mM、5.5mM、6mM、6.5mM、7mM、7.5mM、または7.5mM超の最終濃度で存在する。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、反応混合物中に、ある量のアクセプター核酸分子を添加する工程を包含する。いくつかの実施形態では、このアクセプター核酸分子は、ドナー核酸分子の量と比較して過剰な量で添加される。例えば、このアクセプター核酸分子は、ドナー核酸分子の量の1.5×〜10×、2×〜50×、5×〜100×、50×〜500×、500×超の量で反応混合物中に添加され得る。他の実施形態では、このアクセプター核酸分子は、ドナー核酸分子の量が、アクセプター核酸分子の量に比べて過剰であるような量で添加される。例えば、ドナー核酸分子は、アクセプター核酸分子の量の1.5×〜10×、2×〜50×、5×〜100×、50×〜500×、または500×超の量で反応混合物中に存在してもよい。いくつかの実施形態では、リガーゼの追加の量が反応混合物に添加されてもよい。いくつかの実施形態では、反応混合物に追加されるリガーゼはない。
いくつかの実施形態では、この反応混合物は、アクセプター核酸分子に対するNMP担持ドナー核酸分子のライゲーションを達成するのに十分な時間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、この反応混合物は、約5分、約10分、約15分、約20分、約25分、約30分、約35分、約40分、約45分、約50分、約55分、約60分、約70分、約80分、約90分、約120分、約150分、約180分、約210分、約240分、または240分超インキュベートされる。いくつかの実施形態では、この反応混合物は、2〜10分、5〜20分、10〜30分、20〜60分、30〜90分、60〜150分、120〜240分、または240分超インキュベートされる。
いくつかの実施形態では、この反応混合物を、ライゲーションを容易にするために所望の温度でインキュベートする。いくつかの実施形態では、この反応混合物を、約50℃、約51℃、約52℃、約53℃、約54℃、約55℃、約56℃、約57℃、約58℃、約59℃、約60℃、約61℃、約62℃、約63℃、約64℃、約65℃、約66℃、約67℃、約68℃、約69℃、約70℃、または70℃超まで加熱する。いくつかの実施形態では、この反応混合物は、約60〜70℃まで加熱される。他の実施形態ではライゲーションは、冷温(例えば、約0〜4℃、約4℃、約4〜15℃、約12℃、約10〜20℃)で、室温(例えば、20〜25℃)で起きてもよいし、または約35〜40℃(例えば、37℃)で起きてもよい。いくつかの実施形態では、この反応混合物は、所望の温度で、約5分、約10分、約15分、約20分、約25分、約30分、約35分、約40分、約45分、約50分、約55分、約60分、約70分、約80分、約90分、約120分、約150分、約180分、約210分、約240分、または240分超インキュベートされる。いくつかの実施形態では、この反応混合物は、所望の温度で2〜10分、5〜20分、10〜30分、20〜60分、30〜90分、60〜150分、120〜240分、または240分超インキュベートされる。特定の実施形態では、この反応混合物は、65℃まで約60分間加熱される。
インキュベーション後、この方法はさらに、当該分野で公知の任意の手段によってリガーゼを不活性化する工程を包含し得る。リガーゼの不活性化は、熱不活性化によって達成し得る。例えば、反応混合物を、65、70、75、80、85、90、95℃、または95℃超まで、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分、または10分超加熱してもよい。特定の実施形態では、この反応混合物は、80℃まで10分間、続いて95℃で3分加熱される。リガーゼの不活性化はまた、例えば、EDTAとのインキュベーション、ホルムアミドとのインキュベーション、尿素とのインキュベーション、またはプロテアーゼとのインキュベーションによって達成されてもよい。
リガーゼの不活性化後、所望のライゲーション生成物を、当該分野で公知の任意の手段によって反応混合物から精製しても、または分離してもよい。例えば、反応混合物のタンパク質は、例えば、この反応混合物を、プロテアーゼを用いて処理することによって除去され得る。プロテアーゼの処理は、反応混合物を、プロテアーゼを用いて約1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60分、または60分超の間、20〜25℃、35〜40℃(例えば、37℃)、または40℃超でインキュベートする工程を包含し得る。このプロテアーゼを次いで、例えば、75℃で10〜20分間インキュベートすることによって、不活性化してもよい。この所望の反応生成物をさらに、例えば、沈殿によって、カラム精製によって、遠心分離によって、または当該分野で公知の任意の他の方法によって精製してもよい。
高効率のライゲーションのための方法の例示的な実施形態は、図10に示される。第一の工程(任意)では、二本鎖DNAフラグメント(例えば、ドナー)を部分的に変性して、T4ポリヌクレオチドキナーゼで処理する。T4ポリヌクレオチドキナーゼは、ドナー核酸分子の5’末端に対するリン酸基の追加、およびドナー核酸分子の3’末端からのリン酸基の除去を触媒する。ドナーは、このポイントで精製されても、または精製されなくてもよい。次の工程では、このドナー分子は、過剰のATP依存性RNAリガーゼ、過剰のATP、およびMg2+を含む反応混合物に添加される。リガーゼは、ドナー分子の5’リン酸塩へのアデニリル一リン酸の移行を触媒して、PPiを放出する。この反応混合物を、アデニル化されているドナー核酸分子の蓄積を達成するのに十分な条件下でインキュベートする。次の工程では、アデニル化後に、液体を反応混合物に添加して、ATPを少なくとも10倍希釈する。その液体はさらなる成分を含んでもよく、これには限定するものではないが、水、一価の塩、Mg2+、PEGが挙げられる。また、ドナー分子に連結されるべき核酸分子(例えば、アクセプター)およびMn2+も反応混合物に添加される。アクセプター核酸は、検出可能タグ(例えば、ビオチン)を含んでも含まなくてもよい。検出可能タグは、検出および/またはアフィニティー結合のために用いられ得る。ATPの希釈およびMn2+の添加は両方とも、ライゲーション反応の終了を駆動し、結果としてアクセプター−ドナー分子を含むライゲーション生成物を生じる。
高効率のライゲーションのための方法の別の例示的な実施形態は、図11に示される。第一の工程(任意)では、二本鎖DNAフラグメント(例えば、ドナー)は部分的に変性されて、ドナー核酸分子の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%の末端の3’アデニル化へのリン酸基の付加およびドナー核酸分子の5’末端からのリン酸基の除去を触媒する酵素で処理される。このドナーは、このポイントで精製されてもされなくてもよい。次の工程では、ドナー分子を、過剰のGTP依存性RNAリガーゼ(例えば、RtcB)、過剰のGTP、およびMn2+を含む反応混合物に添加する。リガーゼは、ドナー分子の3’リン酸塩に対するグアニリル一リン酸の移行を触媒して、PPiを放出する。反応混合物を、グアニリル化ドナー核酸分子の蓄積を達成するのに十分な条件下でインキュベートする。次の工程では、アデニル化後、液体を反応混合物に添加して、GTPを少なくとも10倍希釈する。その液体はさらなる成分を含んでもよく、この成分としては限定するものではないが、水、一価の塩、Mg2+、PEGが挙げられる。また、ドナー分子に連結されるべき核酸分子(例えば、アクセプター)およびMn2+も反応混合物に添加される。アクセプター核酸は、検出可能タグ(例えば、ビオチン)を含んでも含まなくてもよい。検出可能タグは、検出および/またはアフィニティー結合のために用いられ得る。GTPの希釈およびMn2+の添加の両方とも、ライゲーション反応の終了を駆動し、結果としてアクセプター−ドナー分子を含むライゲーション生成物を生じる。
(例示的な適応)
高効率のライゲーション方法は、広範な適用に有用である。例えば、高効率ライゲーション方法は、核酸を検出可能タグまたはアフィニティータグを用いてタグ付けする工程が望ましい任意の適用に有用である。他の例に関しては、高効率ライゲーション方法は、1つの核酸種の別の核酸への連結が所望される任意の適用に有用である。高効率のライゲーション方法はまた、分析、例えば、比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)アッセイを含む、アレイハイブリダイゼーションアッセイによる、配列決定による分析のための核酸ライブラリーの調製のためにも有用である。このような高効率の調製方法は、例えば、出発材料の有意な損失なく核酸の出発サンプルの直接分析を可能にすることによって、予備増幅を要することなく核酸の直接分析を可能にすることによって、予備増幅に関連し得る標識または増幅のバイアスを誘導することなく核酸の分析を可能にし、潜在的なバイオインフォマティクスの負荷を低下することによって、多くの利点を下流の分析に付与し得る。このような高効率のライゲーション方法およびキットはまた、例えば、分子クローニング目的のため、またはバーコード化アプリケーションのためにも有用であり得る。
高効率のライゲーション方法は、広範な適用に有用である。例えば、高効率ライゲーション方法は、核酸を検出可能タグまたはアフィニティータグを用いてタグ付けする工程が望ましい任意の適用に有用である。他の例に関しては、高効率ライゲーション方法は、1つの核酸種の別の核酸への連結が所望される任意の適用に有用である。高効率のライゲーション方法はまた、分析、例えば、比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)アッセイを含む、アレイハイブリダイゼーションアッセイによる、配列決定による分析のための核酸ライブラリーの調製のためにも有用である。このような高効率の調製方法は、例えば、出発材料の有意な損失なく核酸の出発サンプルの直接分析を可能にすることによって、予備増幅を要することなく核酸の直接分析を可能にすることによって、予備増幅に関連し得る標識または増幅のバイアスを誘導することなく核酸の分析を可能にし、潜在的なバイオインフォマティクスの負荷を低下することによって、多くの利点を下流の分析に付与し得る。このような高効率のライゲーション方法およびキットはまた、例えば、分子クローニング目的のため、またはバーコード化アプリケーションのためにも有用であり得る。
配列決定アプリケーション/高効率ライブラリー調製
高効率ライゲーション方法およびキットは、本明細書において記載される場合、配列決定のための核酸ライブラリーの調製に適用され得る。このような調製方法によって、特にエマルジョンベースの配列決定プラットフォームを利用する配列決定のために、出発材料の有意な損失なく核酸のデジタル配列決定をすることが可能になる。このような調製方法によってまた、重亜硫酸塩処置の使用なしでDNAメチル化の検出が可能になる。DNAメチル化検出の例示的な方法は、Flusbergら、Nature Methods 2010 June:7(6):461〜465(参照によって本明細書に援用される)に記載される。したがって、本発明のさらなる態様は、高効率の核酸ライブラリー調製のための方法、キットおよびシステムに関する。この核酸ライブラリーは、配列決定プラットフォームによる配列決定のために用いられ得る。この配列決定プラットフォームは、次世代の配列決定(NGS)プラットフォームであってもよい。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、NGS技術を用いて核酸ライブラリーを配列決定する工程を包含する。例示的なNGS技術および配列決定プラットフォームは本明細書に記載される。
高効率ライゲーション方法およびキットは、本明細書において記載される場合、配列決定のための核酸ライブラリーの調製に適用され得る。このような調製方法によって、特にエマルジョンベースの配列決定プラットフォームを利用する配列決定のために、出発材料の有意な損失なく核酸のデジタル配列決定をすることが可能になる。このような調製方法によってまた、重亜硫酸塩処置の使用なしでDNAメチル化の検出が可能になる。DNAメチル化検出の例示的な方法は、Flusbergら、Nature Methods 2010 June:7(6):461〜465(参照によって本明細書に援用される)に記載される。したがって、本発明のさらなる態様は、高効率の核酸ライブラリー調製のための方法、キットおよびシステムに関する。この核酸ライブラリーは、配列決定プラットフォームによる配列決定のために用いられ得る。この配列決定プラットフォームは、次世代の配列決定(NGS)プラットフォームであってもよい。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、NGS技術を用いて核酸ライブラリーを配列決定する工程を包含する。例示的なNGS技術および配列決定プラットフォームは本明細書に記載される。
一態様では、本発明は、生物学的供給源から単離された複数のテンプレート核酸から核酸ライブラリーを調製する方法を提供する。この複数のテンプレート核酸は、ゲノム材料を含んでもよい。このゲノム材料は、ゲノムDNA(gDNA)、RNA、またはRNAから逆転写されたcDNAを含んでもよい。この核酸ライブラリーは、DNAライブラリー、RNAライブラリー、一本鎖DNAライブラリー、または二本鎖DNAライブラリーであってもよい。いくつかの実施形態では、この方法は、テンプレート核酸に対するアダプター配列のライゲーションを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、アダプターライゲーションの効率を10倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、または1000倍超改善する。本明細書に記載される方法は、例えば、アダプターライゲーション効率を、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%、または99.9%の効率を超えて増大し得る。いくつかの実施形態では、この方法は、複数のテンプレート核酸のうち80%超、85%超、90%超、95%超、97%超、98%超、99%超、99.5%超、99.9%超、または実質的に全てに対するアダプターの正確なライゲーションを生じる。このような高効率のライゲーション方法は、本明細書に記載のとおり、生物学的供給源から単離された所望の核酸(例えば、gDNA、RNA、またはcDNA)の実質的に全てに正確に相当する核酸ライブラリーの調製を可能にし得る。さらに、本明細書に記載の方法は、ライブラリー予備増幅の必要性を省き、予備増幅のバイアスの導入および予備増幅から生じる配列決定の誤差の導入を回避し得る。このような方法は、デジタル配列決定能力、例えば、生物学的供給源から単離された各々の個々のテンプレート核酸について配列読み取りのデジタル読み出しを提供する可能性の道を切り開き得、そしてまれな変異(例えば、まれな一塩基多型(SNP)またはまれなコピー数改変体)の検出の感度を改善し得る。したがって、いくつかの態様では、本発明は、生物学的供給源から単離された複数の核酸を配列決定する方法を提供し、この方法は、複数の核酸のうち少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、または実質的に全てに対して配列決定アダプターを連結し、それによって核酸ライブラリーを作成する工程と、ライブラリーの予備増幅なしで核酸ライブラリーを配列決定する工程とを包含する。
いくつかの実施形態では、この方法は、複数のテンプレート核酸のうち少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%の第一の末端に対してアダプター配列を連結し、それによって核酸ライブラリーを作成する工程を包含する。アダプター配列は、配列決定プラットフォームに対するライブラリーメンバーのカップリングを達成する、規定のオリゴヌクレオチド配列を含んでもよい。単なる例であるが、アダプターは、固体支持体(例えば、配列決定フローセルまたはビーズ)に固定されたオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも70%相補性であるかまたは同一である配列を含んでもよい。アダプター配列は、配列決定プライマーに対して少なくとも70%相補性であるかまたは同一である規定のオリゴヌクレオチド配列を含んでもよい。この配列決定プライマーは、ポリメラーゼによるヌクレオチド組み込みを可能にし得、ここでヌクレオチドの組み込みは、配列決定情報を提供するためにモニターされる。いくつかの実施形態では、アダプターは、固体支持体上に固定されたオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも70%相補的なまたは同一の配列と、配列決定プライマーに対して少なくとも70%相補的なまたは同一の配列とを含む。いくつかの実施形態では、アダプターは、バーコード配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ライブラリー中の配列決定ライブラリーのメンバーのうち少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%が、同じアダプター配列を含む。いくつかの実施形態では、配列決定ライブラリーのメンバーのうち少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%が、アダプター配列を第一の末端では含むが、第二の末端では含まない。いくつかの実施形態では、この第一の末端は、5’末端である。いくつかの実施形態では、この第一の末端は、3’末端である。いくつかの実施形態では、配列決定ライブラリーのメンバーのうち少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%が、アダプター配列を第一のおよび第二の末端で含む。第一の末端におけるアダプター配列は、第二の末端におけるアダプター配列とは別個であってもよい。このアダプター配列は、配列決定のために用いられる配列決定プラットフォームに従ってユーザーによって選択され得る。いくつかの実施形態では、アダプターを核酸の第一の末端に連結する方法は、本明細書に記載の高効率のライゲーション方法を包含する。
いくつかの実施形態では、テンプレート核酸の第一の末端での第一のアダプターのライゲーションの後、テンプレート核酸の第二の末端での第二のアダプターのライゲーションを、本明細書に記載の任意の方法を用いて行う。単なる例であるが、合成プラットフォームによるIllumina配列決定は、固体支持体を含み、その上に固定された表面結合オリゴヌクレオチドの第一および第二の集団を有する。このようなオリゴヌクレオチドは、第一および第二のIllumina特異的なアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして、伸長反応をプライミングするための配列を含む。したがって、いくつかの実施形態では、このライブラリーのメンバーは、Illuminaシステムの表面結合オリゴヌクレオチドの第一の集団に対して部分的にまたは完全に相補的である第一のIllumina特異的なアダプターを含む。このライブラリーのメンバーはさらに、Illuminaシステムの表面結合オリゴヌクレオチドの第二の集団に対して部分的にまたは完全に相補的である第二のIllumina特異的なアダプターを含んでもよい。単なる例に過ぎないが、SOLiDシステム、およびIon Torrent、GS FLEXシステムは、固体支持体を、ビーズの形態で含み、その上に表面結合オリゴヌクレオチドが固定されている。したがって、いくつかの実施形態では、この核酸ライブラリーのメンバーは、SOLiDシステム、Ion Torrentシステム、またはGS FLEXシステムの表面結合オリゴヌクレオチドに相補的であるアダプター配列を含む。
複数のテンプレート核酸は、120nt長を超えるテンプレート核酸を含んでもよい。複数のテンプレート核酸は、>120nt長を超える平均長を有してもよい。複数のテンプレート核酸は、50〜100、75〜125、120〜150、130〜170、150〜250、200〜500、300〜700、500〜1000、800〜2000、1500〜5000、4000〜10000nt、または10000nt超の平均長を有し得る。複数のテンプレート核酸はゲノムDNAを含んでもよい。複数のテンプレート核酸は、一本鎖(ss)核酸フラグメント、例えば、ssDNAなどを含んでもよい。いくつかの実施形態では、この方法は、この複数のテンプレート核酸のうち少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、または99.5%超の第一の末端に対するアダプター配列のライゲーションを生じ得る。
図12は、核酸ライブラリーを調製するための例示的なワークフローを示す。第一の工程1210では、核酸は、生物学的供給源から得られる。この生物学的供給源は、被験体であってもよい。例示的な生物学的供給源および被験体は、本明細書に記載される。第二の工程1220では、アダプターが、本明細書に記載の任意の方法を用いて得られた核酸の90%に連結される。第三の工程1230(任意)では、このライブラリーは、配列決定されてもよく、または本明細書に記載の任意の方法を用いて第二のアダプターに対してアダプター連結されてもよく、または標的選択性ライブラリー調製を受けてもよい。標的選択性のライブラリー調製は、当該分野で公知の任意の手段によってであってもよい。例示的な標的選択性ライブラリー調製方法は、例えば、米国特許第6,063,604号;同第6,090,591号;同第8,349,563号;米国特許出願公開第2009010508号、同第20110244455号、同第2012003657号、同第20120157322号、同第20130045872、およびPCT公開番号WO2012103154(その全てが参照によって本明細書に援用される)に記載されている。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、本明細書に記載のような標的富化された核酸ライブラリーを調製するための方法に供される。
図13Aは、核酸ライブラリーを調製するための方法の例示的な実施形態を示しており、この方法は、核酸フラグメントの5’末端に対して第一のアダプターを連結する工程を包含する。第一の工程1310では、5’リン酸塩を含む複数のテンプレート核酸フラグメント(例えば、DNAフラグメント)を過剰量のリガーゼおよび過剰のATPを含む反応混合物中でインキュベートする。テンプレートDNAフラグメントは、完全にまたは部分的に変性され得る。リガーゼは、テンプレート核酸フラグメントの5’リン酸塩へのAMPの移行を触媒し(例えば、テンプレートDNAフラグメントをアデニル化する)、この過程でPPiを放出する。この反応は、テンプレート核酸フラグメントの少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%のアデニル化を生じるのに十分な条件下でインキュベートされる。次の工程1320では、液体を、反応混合物に対して、ATPを少なくとも10倍希釈するのに十分な量で添加する。その液体は、例えば、水、一価の塩、Mg2+、PEGなどの成分を含んでもよい。また、反応混合物に対しては、ドナー分子に対して連結されるアダプターオリゴヌクレオチド(例えば、アダプター1)およびMn2+も添加される。アダプターオリゴヌクレオチドは、検出可能タグを含んでもよいし、含まなくてもよい。検出可能タグは、検出および/またはアフィニティー結合に用いられてもよい。アダプターオリゴヌクレオチドは、3’OH基を含んでもよい。ATPの希釈およびMn2+の添加の両方とも、ライゲーション反応の終了を駆動し得、結果として5’−3’方向にアダプター1−テンプレート核酸を含むライゲーション生成物を生じる。このライゲーション生成物は、次に収集されて、必要に応じてさらに工程1330で、配列決定によって、3’末端への第二のアダプター配列のライゲーション(例えば、図14Aに記載)によって、続いて、配列決定によって、または本明細書に記載の標的選択性ライブラリー調製によって処理され得る。いくつかの実施形態では、このライブラリーは、本明細書に記載のような標的富化された核酸ライブラリーを調製する方法に供される。
図13Bは、核酸ライブラリーを調製するための方法の別の例示的な実施形態を示し、これには、核酸フラグメントの3’末端に対して第一のアダプターを連結する工程を包含する。第一の工程1350では、5’リン酸塩を含む複数のオリゴヌクレオチドアダプター(例えば、アダプター)を、過剰量のリガーゼおよび過剰のATPを含む反応混合物中でインキュベートする。アダプターオリゴヌクレオチドは、完全に変性されても、または部分的に変性されてもよい。アダプターオリゴヌクレオチドは、検出可能タグを含んでも、または含まなくてもよい。この検出可能タグは、検出および/またはアフィニティー結合のために用いられ得る。このリガーゼは、アダプター1オリゴヌクレオチドの5’リン酸塩へのAMPの移行を触媒し(例えば、アダプター1をアデニル化する)、このプロセスでPPiを放出する。この反応を、アダプターの少なくとも90%のアデニル化を生じるのに十分な条件下でインキュベートする。次の工程1360では、液体を反応混合物に対して、ATPを少なくとも10倍希釈するのに十分な量で添加する。その液体は、例えば、水、一価の塩、Mg2+、PEGなどの成分を含んでもよい。また、反応混合物に対しては、テンプレート核酸のサンプル(例えば、テンプレート)およびMn2+も添加される。テンプレート核酸は、3’OH基を含んでもよい。ATPの希釈およびMn2+の添加の両方とも、ライゲーション反応の終了を駆動し得、結果として5’−3’方向にテンプレート−DNA−アダプターを含むライゲーション生成物を生じる。このライゲーション生成物は、次に収集されて、必要に応じてさらに、配列決定によって、3’末端への第二のアダプター配列のライゲーションによって、続いて、配列決定によって、または本明細書に記載の標的選択性ライブラリー調製によって処理され得る。ATPの希釈およびMn2+の添加の両方とも、ライゲーション反応の終了を駆動し得、結果として5’−3’方向に、テンプレート核酸−アダプターを含むライゲーション生成物を生じる。このライゲーション生成物は、次に収集されて、必要に応じてさらに、工程1370において、配列決定によって、図14Bに記載の5’末端への第二のアダプター配列のライゲーションによって、続いて、配列決定によって、または本明細書に記載の標的選択性ライブラリー調製によって処理され得る。いくつかの実施形態では、このライブラリーは、本明細書に記載のような標的富化核酸ライブラリーを調製するための方法に供される。
図14Aは、図13Aに記載されるように調製されたアダプター1−テンプレート核酸分子に対して第二のアダプター配列を連結するための方法の例示的な実施形態を示す。第一の工程1410では、5’リン酸塩を含む第二のアダプター配列(「アダプター2」)を含む複数のオリゴヌクレオチドは、過剰量のリガーゼおよび過剰のATPを含む反応混合物中でインキュベートされる。このオリゴヌクレオチドは、完全に変性されても、または部分的に変性されてもよい。リガーゼは、オリゴヌクレオチドの5’リン酸塩へのAMPの移行を触媒し(例えば、アダプター2オリゴヌクレオチドをアデニル化し)、このプロセスでPPiを放出する。この反応物を、アダプター2オリゴヌクレオチドのうち少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%のアデニル化を生じるのに十分な条件下でインキュベートする。次の工程1420では、液体を反応混合物に対して、ATPを少なくとも10倍希釈するのに十分な量で添加する。その液体は、例えば、水、一価の塩、Mg2+、PEGなどの成分を含んでもよい。また、反応混合物に対しては、アダプター−1テンプレート核酸分子(例えば、図4Aに記載)およびMn2+も添加される。アダプター1−テンプレート核酸分子は、3’OH基を含んでもよい。ATPの希釈およびMn2+の添加の両方とも、ライゲーション反応の終了を駆動し得、結果としてアダプター1−テンプレート核酸−アダプター2ライブラリーのメンバーを含むライゲーション生成物を生じる。このライゲーション生成物は、必要に応じて配列決定され得る。
図14Bは、図13Bに記載されるように調製した、テンプレート核酸−アダプター1分子に対して、第二のアダプター配列を連結するための方法の例示的な実施形態を示す。第一の工程1450では、5’リン酸塩を含むテンプレート−アダプター1分子を、過剰量のリガーゼおよび過剰のATPを含む反応混合物中でインキュベートする。テンプレート−アダプター1分子は完全に変性されても、または部分的に変性されてもよい。リガーゼは、テンプレート−アダプター1分子の5’リン酸塩へのAMPの移行を触媒し(例えば、テンプレート−アダプター1分子をアデニル化し)、このプロセスでPPiを放出する。この反応を、テンプレート−アダプター1分子のうち少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%のアデニル化を生じるのに十分な条件下でインキュベートする。次の工程1460では、液体を反応混合物に対して、ATPを少なくとも10倍希釈するのに十分な量で添加する。その液体は、例えば、水、一価の塩、Mg2+、PEGなどの成分を含んでもよい。また、反応混合物に対しては、第二のアダプター配列およびMn2+を含むアダプター2オリゴヌクレオチドも添加される。アダプター2オリゴヌクレオチドは、3’OH基を含んでもよい。ATPの希釈およびMn2+の添加の両方とも、ライゲーション反応の終了を駆動し得、結果としてアダプター2−テンプレート−アダプター1ライブラリーのメンバーを含むライゲーション生成物を生じる。このライブラリーのメンバーはまた、本明細書に記載のような方法を用いてアダプター1−テンプレート−アダプター2として構築され得る。このライゲーション生成物は、必要に応じて配列決定され得る。
(標的富化されたライブラリー調製)
別の態様では、本発明は、標的富化されたDNAライブラリーを調製するための方法を提供する。この方法は、配列決定ライブラリーのメンバーに対して標的選択性オリゴヌクレオチドをハイブリダイズして、ハイブリダイゼーション生成物を生成する工程を包含し得る。この方法はさらに、初回の増幅においてハイブリダイゼーション生成物を増幅して、伸長鎖を作成する工程を包含し得る。
別の態様では、本発明は、標的富化されたDNAライブラリーを調製するための方法を提供する。この方法は、配列決定ライブラリーのメンバーに対して標的選択性オリゴヌクレオチドをハイブリダイズして、ハイブリダイゼーション生成物を生成する工程を包含し得る。この方法はさらに、初回の増幅においてハイブリダイゼーション生成物を増幅して、伸長鎖を作成する工程を包含し得る。
標的富化の方法は、参照によって本明細書に援用される米国特許出願公開第20120157322に記載されるものであってもよい。
ハイブリダイゼーションおよび増幅は、反応混合物中で生じ得る。この混合物は、ヌクレオチド(dNTP)、ポリメラーゼおよび標的選択性オリゴヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、この混合物は、複数の標的選択性オリゴヌクレオチドを含む。この混合物は、例えば、1〜10、5〜20、10〜50、40〜100、80〜200、150〜500、300〜1000、800〜2000、1000〜5000、4000〜10000、8000〜20000個、または20000個超の標的選択性オリゴヌクレオチドを含み得る。この混合物はさらに、Tris緩衝液,一価の塩、およびMg2+を含んでもよい。各々の成分の濃度は、当業者によって最適化され得る。反応混合物はまた、限定するものではないが、非特異的なバックグラウンド/ブロッキング核酸(例えば、サケ精子DNA)、バイオ防腐剤(例えば、アジ化ナトリウム)、PCR増強剤(例えば、ベタイン、トレハロースなど)、およびインヒビター(例えば、RNAse阻害剤)を含む添加物を含んでもよい。いくつかの実施形態では、核酸サンプル(例えば、ライブラリーメンバーを含むサンプル)を反応混合物と混合する。
ライブラリーメンバーは、完全に変性されても、または部分的に変性されてもよい。ライブラリーメンバーは、第一の末端には位置するが、第二の末端には位置しない第一の一本鎖アダプター配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、この第一の末端は、5’末端である。いくつかの実施形態では、5’末端で第一のアダプター配列を含むライブラリーメンバーは、図13Aに記載のとおり調製される。他の実施形態では、第一のアダプター配列を含むライブラリーメンバーは、図13Bに記載される核酸(例えば、gDNAフラグメント)の3’末端に対して逆相補的なアダプター配列を連結することによって、続いて完全なアダプター配列を含んでおり、逆相補体に対してハイブリダイズ可能なプライマーを用いて得られたライゲーション生成物の線形の増幅によって、記載のとおり調製される。いくつかの実施形態では、標的選択性オリゴヌクレオチドは、第一の末端に位置するが、第二の末端には位置しない第二の一本鎖アダプター配列を含む。標的選択性オリゴヌクレオチドの第一の末端は、5’末端であってもよい。いくつかの実施形態では、この第一のアダプター配列は、第一の表面結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも70%同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、この第一のアダプター配列は、配列決定プライマーに対して少なくとも70%同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、この第一のアダプターはさらに、バーコード配列を含む。いくつかの実施形態では、この第二のアダプターは、第二の表面結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも70%同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、この第二のアダプターは、配列決定プライマーに対して少なくとも70%同一である配列を含む。
標的選択性オリゴヌクレオチドは、目的の標的ポリヌクレオチドに対して少なくとも部分的にハイブリダイズするように設計され得る。いくつかの実施形態では、標的選択性オリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドに対して選択的にハイブリダイズするように設計される。標的選択性オリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド中の配列に対して少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、または95%超相補的であり得る。いくつかの実施形態では、標的選択性オリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド中の配列に対して100%相補的である。このハイブリダイゼーションは、あるTmを有する標的選択性オリゴヌクレオチド/標的二重鎖を生じ得る。標的選択性オリゴヌクレオチド/標的二重鎖のTmは、0〜100℃、20〜90℃、40〜80℃、50〜70℃、または55〜65℃であってもよい。標的選択性オリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼの存在下で伸長生成物の合成をプライムするために十分に長くてもよい。標的選択性オリゴヌクレオチドの正確な長さおよび組成物は、多くの要因、例としては、アニーリング反応の温度、供給源、およびプライマーの組成、ならびにプライマー:プローブ濃度の比に依存し得る。標的選択性オリゴヌクレオチドは、例えば、8〜50、10〜40、または12〜24ヌクレオチド長であり得る。
この方法は、反応混合物中の標的の伸長を包含し得る。この伸長は、標的選択性オリゴヌクレオチド/標的二重鎖中で標的選択性オリゴヌクレオチドによってプライミングされ得る。いくつかの実施形態では、伸長は、核酸ポリメラーゼを利用して行われる。この核酸ポリメラーゼは、DNAポリメラーゼであってもよい。特定の実施形態では、このDNAポリメラーゼは、熱安定性DNAポリメラーゼである。このポリメラーゼは、BファミリーのDNA校正ポリメラーゼのメンバー(Vent、Pfu、Phusion、およびそれらの改変体)、DNAポリメラーゼホロ酵素(DNA pol IIIホロ酵素)、Taqポリメラーゼ、またはそれらの組み合わせであってもよい。
伸長は、テンプレートDNAを含む反応混合物が、変性工程、アニーリング工程、および合成工程を通じてサイクルされる自動化された過程として行われ得る。この自動化された過程は、PCRサーマルサイクラーを用いて行われてもよい。市販のサーマルサイクラーシステムとしては、とりわけ、Bio−Rad Laboratories、Life
technologies、Perkin−Elmerのシステムが挙げられる。いくつかの実施形態では、増幅の1つのサイクルを行う。
technologies、Perkin−Elmerのシステムが挙げられる。いくつかの実施形態では、増幅の1つのサイクルを行う。
標的選択性オリゴヌクレオチド/標的二重鎖の伸長は、(1)標的配列を含む元のssDNAフラグメント、ならびに(2)第二のアダプター配列、標的選択性オリゴヌクレオチド、標的配列の逆相補体、および第一のアダプター配列の逆相補体を含む伸長した鎖、を含む二本鎖伸長生成物を生じ得る。元のssDNAフラグメントの第一のアダプター配列が、第一の表面結合オリゴヌクレオチドに対して70%以上同一であるならば、その伸長した鎖は、第一の表面結合オリゴヌクレオチドに対して70%以上相補性である第一のアダプター配列を含み、それによって、第一の表面結合オリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズし得る。この伸長した鎖は、標的富化されたライブラリーを含んでもよく、ここでは各々のライブラリーメンバーは、第一の末端において第一のアダプターを、および第二の末端において第二のアダプターを含む。
標的富化されたライブラリーは配列決定され得る。この標的富化されたライブラリーのメンバーは変性されてもよい。この変性されたライブラリーのメンバーは、その上に固定された表面と、少なくとも第一の表面結合オリゴヌクレオチドで接触され得る。いくつかの実施形態では、この伸長した鎖は、伸長した鎖の上の第一のアダプター配列に対してアニーリングし得る、第一の表面結合オリゴヌクレオチドによって捕獲される。
この第一の表面結合オリゴヌクレオチドは、捕獲された伸長した鎖の伸長をプライムし得る。いくつかの実施形態では、捕獲された伸長した鎖の伸長は、捕獲された伸長生成物を生じる。この捕獲された伸長生成物は、第一の表面結合オリゴヌクレオチド、標的配列、および第二の表面結合オリゴヌクレオチドに対して少なくとも70%以上相補的な第二のアダプター配列を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、捕獲された伸長生成物は、第二の表面結合オリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、架橋を形成する。いくつかの実施形態では、この架橋は、ブリッジPCRによって増幅される。ブリッジPCR法は、当該分野で公知の方法を用いて行われてもよい。当業者は、本明細書に記載される方法が、ビーズ上での増幅のような任意の固相増幅法に適合され得ることを理解する。
アレイ・ハイブリダイゼーション・アプリケーション
本明細書に記載される高効率ライゲーション方法およびキットはまた、アレイハイブリダイゼーション(例えば、核酸マイクロアレイ)のための核酸サンプルの調製のために用いられ得る。核酸マイクロアレイ技術は、一般的には、固体または半固体の表面上に固定されたオリゴヌクレオチドプローブのアレイに対する核酸のハイブリダイゼーションに依拠する技術を指す。サンプルから単離された核酸(例えば、DNA)は、一般的には、検出可能標識で標識することによって調製される。この標識された核酸は次に、固体表面のアドレス可能な位置に固定された公知の配列の複数のオリゴヌクレオチド(例えば、プローブ)を含むアレイに適用され得る。このオリゴヌクレオチドプローブは、複数の目的の標的領域にハイブリダイズされ得る。いくつかの実施形態では、このオリゴヌクレオチドプローブは、1つ以上のアダプター配列にハイブリダイズされ得る。特定のアドレス可能な位置での検出可能シグナルの量は、サンプル中の標的領域を含む核酸の量を示し得る。例示的なマイクロアレイシステムとしては、例えば、ビーズアレイシステム(Illumina,Inc、Lynx Therapeutics、Luminex,Inc.,Exiqon,Mycroarray),SNPアレイ(例えば、Agilent Technologies、Illumina,Inc.、Affymetrix,Inc.、Life Technologies,Inc.、Nimblegen,Exiqon,Mycroarrayから入手可能)、および比較ゲノムハイブリダイゼーションアレイ(例えば、Agilent Technologies,Illumina,Inc.,Affymetrix,Inc.,Life Technologies,Inc.,Exiqon,Mycroarrayから入手可能)が挙げられる。ビーズアレイシステム(例えば、Illumina,Lynx Therapeutics,Luminex,Inc.から入手可能)とは一般的には、オリゴヌクレオチドプローブの複数のコピーで浸漬された微小球ビーズを含むアレイシステムを指す。ビーズは、マイクロウェルへの沈着によって、またはフルオロフォアの固有の組み合わせを有するバーコード化のいずれかによって、アドレス可能である場合があり、これは、例えば、フローサイトメトリーを含む、当該分野で公知の任意の手段によって分類され、かつ特定され得る。例示的なビーズ・アレイ・システムおよび方法は、参照によって本明細書に援用される、米国特許第8,399,192号および同第8,198,028号に記載される。SNPアレイは一般的には、SNP対立遺伝子を検出するために構成されるアレイおよびシステムを指す。例示的なSNPアレイは、その全てが参照によって本明細書に援用される、例えば、米国特許第6,410,231号;同第6,858,394号;米国特許出願公開第20090062138号、および欧州特許出願番号EP1207209に記載されている。比較のゲノムハイブリダイゼーション(CGH)は一般的には、分節のゲノムコピー数変動(CNV)の高解像度ゲノムワイドスクリーニングを可能にするアレイおよびシステムを指す。CGHプラットフォームは、異数性、微小欠損/微小重複症候群、および染色体再配置を検出し得る。例示的なCGHアレイおよびアレイ方法は、例えば、参照によって本明細書に援用される、米国特許第6,410,243号に記載される。
本明細書に記載される高効率ライゲーション方法およびキットはまた、アレイハイブリダイゼーション(例えば、核酸マイクロアレイ)のための核酸サンプルの調製のために用いられ得る。核酸マイクロアレイ技術は、一般的には、固体または半固体の表面上に固定されたオリゴヌクレオチドプローブのアレイに対する核酸のハイブリダイゼーションに依拠する技術を指す。サンプルから単離された核酸(例えば、DNA)は、一般的には、検出可能標識で標識することによって調製される。この標識された核酸は次に、固体表面のアドレス可能な位置に固定された公知の配列の複数のオリゴヌクレオチド(例えば、プローブ)を含むアレイに適用され得る。このオリゴヌクレオチドプローブは、複数の目的の標的領域にハイブリダイズされ得る。いくつかの実施形態では、このオリゴヌクレオチドプローブは、1つ以上のアダプター配列にハイブリダイズされ得る。特定のアドレス可能な位置での検出可能シグナルの量は、サンプル中の標的領域を含む核酸の量を示し得る。例示的なマイクロアレイシステムとしては、例えば、ビーズアレイシステム(Illumina,Inc、Lynx Therapeutics、Luminex,Inc.,Exiqon,Mycroarray),SNPアレイ(例えば、Agilent Technologies、Illumina,Inc.、Affymetrix,Inc.、Life Technologies,Inc.、Nimblegen,Exiqon,Mycroarrayから入手可能)、および比較ゲノムハイブリダイゼーションアレイ(例えば、Agilent Technologies,Illumina,Inc.,Affymetrix,Inc.,Life Technologies,Inc.,Exiqon,Mycroarrayから入手可能)が挙げられる。ビーズアレイシステム(例えば、Illumina,Lynx Therapeutics,Luminex,Inc.から入手可能)とは一般的には、オリゴヌクレオチドプローブの複数のコピーで浸漬された微小球ビーズを含むアレイシステムを指す。ビーズは、マイクロウェルへの沈着によって、またはフルオロフォアの固有の組み合わせを有するバーコード化のいずれかによって、アドレス可能である場合があり、これは、例えば、フローサイトメトリーを含む、当該分野で公知の任意の手段によって分類され、かつ特定され得る。例示的なビーズ・アレイ・システムおよび方法は、参照によって本明細書に援用される、米国特許第8,399,192号および同第8,198,028号に記載される。SNPアレイは一般的には、SNP対立遺伝子を検出するために構成されるアレイおよびシステムを指す。例示的なSNPアレイは、その全てが参照によって本明細書に援用される、例えば、米国特許第6,410,231号;同第6,858,394号;米国特許出願公開第20090062138号、および欧州特許出願番号EP1207209に記載されている。比較のゲノムハイブリダイゼーション(CGH)は一般的には、分節のゲノムコピー数変動(CNV)の高解像度ゲノムワイドスクリーニングを可能にするアレイおよびシステムを指す。CGHプラットフォームは、異数性、微小欠損/微小重複症候群、および染色体再配置を検出し得る。例示的なCGHアレイおよびアレイ方法は、例えば、参照によって本明細書に援用される、米国特許第6,410,243号に記載される。
アレイハイブリダイゼーションのための核酸サンプル(例えば、gDNAサンプル)のライブラリー調製は一般に、検出可能標識を用いて個々の核酸フラグメントを標識する工程を包含する。この標識方法は伝統的に、核酸フラグメントに対するランダムプライマーのハイブリダイゼーション、続いて、ポリメラーゼによるランダムプライマーの伸長を包含する。この伸長反応は、標識されたヌクレオチドを伸長生成物に組み込む。このポリメラーゼによる伸長による標識の方法は、得られたライブラリーへ標識のバイアスを導入し得る。
本明細書に記載の高効率のライゲーション方法は、ランダム・プライマー・ハイブリダイゼーションおよび伸長の必要性を省くことによってアレイハイブリダイゼーションのための伝統的なライブラリー調製方法の限界を克服し得る。したがって、いくつかの態様では、本発明は、アレイハイブリダイゼーションのために核酸ライブラリーを調製するための方法およびキットを提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、本明細書に記載の任意の方法を利用して、サンプル中に存在する核酸のうち少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%に対して少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%の標識されたオリゴヌクレオチドを連結する工程を包含する(例えば、図10を参照のこと)。この標識されたオリゴヌクレオチドは、検出可能標識または捕獲部分を含んでもよい。例示的な検出可能標識および捕獲部分は本明細書に記載される。
バーコード化の適用
分子バーコード化は、個々の核酸分子、核酸分子のサブクラス、または核酸のサンプルの追跡、同定および/または検索に有用である。分子バーコード化は一般には、オリゴヌクレオチド配列で核酸分子をタグ付けする工程を包含する。このオリゴヌクレオチド配列は、ユーザーによって望まれる場合、サンプル間で、サブクラス間で、または個々の核酸の間で、固有であり得る。例示的なバーコードが本明細書に記載される。
分子バーコード化は、個々の核酸分子、核酸分子のサブクラス、または核酸のサンプルの追跡、同定および/または検索に有用である。分子バーコード化は一般には、オリゴヌクレオチド配列で核酸分子をタグ付けする工程を包含する。このオリゴヌクレオチド配列は、ユーザーによって望まれる場合、サンプル間で、サブクラス間で、または個々の核酸の間で、固有であり得る。例示的なバーコードが本明細書に記載される。
一態様では、高効率ライゲーション方法を用いて、複数の核酸分子をバーコード化してもよい。いくつかの実施形態では、この方法は、本明細書に記載の任意の方法を用いて、核酸分子に対してバーコード配列を連結する工程を包含する。本明細書に記載の方法は、バーコード化されるサンプル中の核酸分子の80%超、85%超、90%超、95%超、97%超、98%超、99%超、99.5%超、99.9%超、または実質的に全てが、バーコード配列に連結されることを保証し得る。いくつかの実施形態では、複数の核酸サンプルの各々が、サンプルに対して固有の単一のバーコード配列に対するライゲーションによってバーコード化される。このようなバーコード化によって、サンプル起源がアッセイ中で同定されることが可能になる。他の実施形態では、複数の核酸が、サンプル中の各々の個々の核酸が固有のバーコード配列に連結されるようにバーコード化される。このようなバーコード化によって、サンプル中の個々の核酸の追跡および同定が可能になる。いずれかの方法では、サンプル中の核酸は、本明細書に記載のような反応混合物中でアデニル化され、続いて本明細書に記載のようにバーコード配列に対してライゲーションされる。
クローニングの適用
分子クローニングは、ベクター、例えば、プラスミドベクター中へのインサートDNA配列のライゲーションを包含する場合が多い。一般には、インサートDNAおよびベクターは、制限消化によって調製され、ここでは制限酵素がインサートDNAまたはベクター内のパリンドローム配列を認識し、かつそれを消化し得、互換性の粘着末端(sticky ends)を生成する。次いで、消化されたインサートおよびベクターを、ライゲーション反応で一緒にインキュベートし、これはインサートへのベクターの互換性の粘着末端をアニーリングするという目的であって、ベクターおよびインサートを含む所望の生成物を生成する。しかし、パリンドロームの粘着末端のせいで、疑似ライゲーション生成物も、ライゲーション過程の間に作成され、これには、例えば、インサート−インサートライゲーションおよびベクター/ベクターのライゲーションを含む。これによって、ライゲーション反応の有効性および特異性が低下する。結果として、ユーザーは、多数の形質転換された細菌のコロニーを選択し、次いでそれらをスクリーニングして(例えば、制限フラグメント長多型(RFLP)によって)、所望のライゲーション生成物を選択するのにかなりの量の時間および労力を費やさなければならない場合が多い。
分子クローニングは、ベクター、例えば、プラスミドベクター中へのインサートDNA配列のライゲーションを包含する場合が多い。一般には、インサートDNAおよびベクターは、制限消化によって調製され、ここでは制限酵素がインサートDNAまたはベクター内のパリンドローム配列を認識し、かつそれを消化し得、互換性の粘着末端(sticky ends)を生成する。次いで、消化されたインサートおよびベクターを、ライゲーション反応で一緒にインキュベートし、これはインサートへのベクターの互換性の粘着末端をアニーリングするという目的であって、ベクターおよびインサートを含む所望の生成物を生成する。しかし、パリンドロームの粘着末端のせいで、疑似ライゲーション生成物も、ライゲーション過程の間に作成され、これには、例えば、インサート−インサートライゲーションおよびベクター/ベクターのライゲーションを含む。これによって、ライゲーション反応の有効性および特異性が低下する。結果として、ユーザーは、多数の形質転換された細菌のコロニーを選択し、次いでそれらをスクリーニングして(例えば、制限フラグメント長多型(RFLP)によって)、所望のライゲーション生成物を選択するのにかなりの量の時間および労力を費やさなければならない場合が多い。
本明細書に記載の高効率のライゲーション方法を用いて、クローニング反応の特異性を改善してもよい。例示的な実施形態は、図15に示す。ベクターは、任意の手段によって、例えば、単一部位での制限消化によって直線化されてもよい。直線化されたベクターの末端は、例えば、DNAポリメラーゼ(例えば、T4 DNAポリメラーゼ)によってブラントエンド(平滑末端)化されてもよい。直線化されたベクターの5’末端は、例えば、T4ポリヌクレオチドキナーゼによってリン酸化されてもよい。この直線化されたベクターは、完全に変性されても、または部分的に変性されてもよく、少なくとも一本鎖の(例えば、フレイド(frayed))末端、または一本鎖の直鎖DNAを生じる。本明細書に記載の任意の方法を用いる高効率のライゲーションを行って、完全にまたは部分的に変性されたベクターの3’末端上に非パリンドロームの短いssDNA配列(「ssDNA」)を連結してもよい。インサートDNAフラグメントはまた、ブラントエンドであって、上記のように5’リン酸化されてもよい。このインサートDNAフラグメントは、完全に変性されても、または部分的に変性されてもよい。本明細書に記載の任意の方法を用いる高効率のライゲーションを行って、完全にまたは部分的に変性されたインサートの3’末端に、非パリンドロームの短いssDNA配列(「ssDNArev」)を挿入する。改変されたベクターおよびインサートを次に、標準的なライゲーションプロトコールを用いて連結してもよい。ssDNAおよびssDNArevは、非パリンドロームの配列であるので、疑似ベクター/ベクターまたはインサート/インサート生成物の形成は生じず、任意のライゲーションが単一のベクターと単一のインサートとの間にある。あるいは、非パリンドロームの短いssDNA配列が、ベクターまたはインサートの5’末端上に連結され得る。このような特異性は、RFLP技術によってコロニーをスクリーニングする必要性を省き、分子クローニングのワークフローを大きく向上し得る。
診断/治療の適用
本明細書に記載される、高効率ライゲーションの方法およびキットは、多くの診断/治療の適用に一般的な有用性を有する。例えば、本発明の高効率のライゲーション方法は、核酸の配列分析のために一般的に有用であり、これは、疾患の診断、モニタリングおよび処置にますます重要な役割を果たしてきている。例えば、本発明の方法は、例えば、疾患を発症する確率の増大した被験体の同定において、疾患の診断のために、疾患診断の正確性を改善するために、疾患の進行をモニタリングするために、被験体の疾患についての治療レジメンの選択を補助するために、被験体の疾患予後予測を評価するために、利用され得る。
本明細書に記載される、高効率ライゲーションの方法およびキットは、多くの診断/治療の適用に一般的な有用性を有する。例えば、本発明の高効率のライゲーション方法は、核酸の配列分析のために一般的に有用であり、これは、疾患の診断、モニタリングおよび処置にますます重要な役割を果たしてきている。例えば、本発明の方法は、例えば、疾患を発症する確率の増大した被験体の同定において、疾患の診断のために、疾患診断の正確性を改善するために、疾患の進行をモニタリングするために、被験体の疾患についての治療レジメンの選択を補助するために、被験体の疾患予後予測を評価するために、利用され得る。
本発明の方法から利点を得る場合がある診断的/治療的な適用または疾患の種類は限定されないことが理解される。単なる例であるが、癌をモニタリングするためのワークフローに対する本発明の方法の適用は本明細書に記載される。
したがって、本発明は、疾患に罹患している被験体のモニタリングおよび処置を改善する方法およびキットを提供する。この疾患は、癌、例えば、腫瘍、白血病、例えば急性白血病、急性T細胞白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄球性(顆粒球)白血病、または慢性リンパ球性白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、例えば、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫または非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、固形腫瘍、肉腫、癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、リンパ管肉腫、内皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛腫、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮性腫瘍、神経膠腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、子宮内膜癌、または非小細胞肺癌などであってもよい。
被験体は、固形腫瘍を保有すると疑われる場合もあるし、もしくは固形腫瘍を保有することが公知である場合もあり、または以前に固形腫瘍を保有していた被験体であってもよい。
この方法は、被験体から単離された腫瘍サンプルから癌関連遺伝子のセットを配列決定する工程、および必要に応じて被験体から単離された正常細胞から癌関連遺伝子のセットを配列決定する工程を包含し得る。腫瘍サンプルは、固形腫瘍サンプルであってもよい。正常細胞は、例えば、被験体由来の血液サンプルから単離された血球であってもよい。
一般には、被験体から単離された核酸のライブラリーが配列決定される。標準的な配列決定プロトコールは、所望の読み取り深さを達成するために核酸ライブラリーの予備増幅を含む場合が多い。しかし、予備増幅は、個々の核酸ライブラリーメンバーの増幅有効性の変動に起因して増幅のバイアスを導入する場合があり、これによって、いくつかのゲノム領域の過剰提示、および他のゲノム領域(例えば、高GC含量または低GC含量の領域)の過小提示が生じ得る。予備増幅はまた、PCRに用いられるポリメラーゼの内因性の誤差率に起因して配列決定の誤差を導入し得る。したがって、本発明は、いくつかの態様では、ライブラリーの予備増幅なしで生物学的供給源から単離された核酸のライブラリーを配列決定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、このライブラリーは、シーケンサーに対するロードの前には予備増幅されない。
配列決定の際、腫瘍由来の配列データを、正常な細胞由来の配列データと比較して、腫瘍特異的配列プロフィールを生成してもよい。いくつかの実施形態では、腫瘍特異的な配列プロファイルは、セット中に1つ以上の遺伝子の変異状態を含む。この変異状態は、SNPまたはCNV同定を包含し得る。この方法はさらに、腫瘍特異的配列プロフィールを記載するレポートを作成する工程を包含し得る。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、さらなるモニタリングのための腫瘍特異的変異を保有することが公知の2〜4遺伝子のサブセットを選択する工程を包含する。他の実施形態では、この方法は、さらなるモニタリングのために、腫瘍特異的変異を保有することが公知の4〜15、10〜30、20〜50、40〜80、70〜125、100〜200、または200超の遺伝子のサブセットを選択する工程を包含する。いくつかの実施形態では、この方法は、さらなるモニタリングのために癌関連遺伝子のセットの全体を選択する工程を包含する。他の実施形態では、この方法は、さらなるモニタリングの目的のための全ゲノム配列決定の使用を包含する
(アンプリコンの感度のよい検出)
本発明は、標的ポリヌクレオチド中の変異の鋭敏、正確な検出および/または定量のための試薬、方法およびキットを提供する。例えば、本発明は、PCR反応の有効性に対するプローブの影響を実質的に省く、プローブベースのPCRアッセイのための試薬、方法およびキットを提供する。本発明は、PCR反応の動態に対するプローブの影響を実質的に省く、プローブベースのPCRアッセイのための試薬、方法およびキットを提供する。このような試薬、方法、およびキットは、従来のプローブベースのアッセイと比較して検出の正確性および感度を改善し得、したがって、生命科学において、遺伝子型決定アプローチにおいて、および診断的/治療的アプローチにおいて、広範な適用性を有し得る。
(アンプリコンの感度のよい検出)
本発明は、標的ポリヌクレオチド中の変異の鋭敏、正確な検出および/または定量のための試薬、方法およびキットを提供する。例えば、本発明は、PCR反応の有効性に対するプローブの影響を実質的に省く、プローブベースのPCRアッセイのための試薬、方法およびキットを提供する。本発明は、PCR反応の動態に対するプローブの影響を実質的に省く、プローブベースのPCRアッセイのための試薬、方法およびキットを提供する。このような試薬、方法、およびキットは、従来のプローブベースのアッセイと比較して検出の正確性および感度を改善し得、したがって、生命科学において、遺伝子型決定アプローチにおいて、および診断的/治療的アプローチにおいて、広範な適用性を有し得る。
本発明の態様は、プローブベースのPCRアッセイに関し、ここではプローブは、PCRの間、プライマーアニーリングにもプライマー伸長にも影響しない。理論で拘束されることは望まないが、PCRの間のテンプレート核酸に対するプローブのハイブリダイゼーションは、プライマー伸長の動態を変更し得、したがってPCR反応の有効性を変更し得る。さらに、アニーリングされたプライマーの下流のテンプレート核酸に対するプローブの結合は、ポリメラーゼによるプライマーの伸長に影響し得る。なぜならアニーリングされたプローブを提示するには、十分なエンドヌクレアーゼ活性が必要であり得るからである。したがって、PCRアニーリングおよび/または伸長段階の間、プローブハイブリダイゼーションを省くために設計されたプローブが本明細書に記載される。このようなプローブは、PCR増幅の有効性を増大し得る。このようなプローブは、PCRアニーリングおよび/または伸長段階の間、プローブ結合に関連する伸長バイアスを最小化し得る。
本明細書に記載されるようなアンプリコンの感度のよい検出のためのプローブは、変異の極めて正確かつ感度のよい検出を提供し得る。この変異は、一塩基多型(SNP)、挿入、欠失、転座、および/またはコピー数変動であってもよい。本発明のプローブは、異種サンプル中のまれな変異を検出し得る。アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブは、サンプルのうち50%、40%、30%、20%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%、0.001%、0.0005%、0.0001%、0.00005%、0.00001%、0.000005%、0.000001%、0.0000005%、0.0000001%未満という頻度である、サンプル中のまれな変異を検出し得る。例えば、アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブは、サンプルのうち50%、40%、30%、20%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%、0.001%、0.0005%、0.0001%、0.00005%、0.00001%、0.000005%、0.000001%、0.0000005%、0.0000001%未満という頻度であるサンプル中のまれなSNPを検出し得る。例えば、アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブは、サンプルのうち50%、40%、30%、20%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%、0.001%、0.0005%、0.0001%、0.00005%、0.00001%、0.000005%、0.000001%、0.0000005%、0.0000001%未満という頻度である、サンプル中のまれな挿入変異を検出し得る。例えば、アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブは、サンプル中の50%、40%、30%、20%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%、0.001%、0.0005%、0.0001%、0.00005%、0.00001%、0.000005%、0.000001%、0.0000005%、0.0000001%未満という頻度を有する、サンプル中のまれな欠失変異を検出し得る。例えば、アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブは、サンプルのうち50%、40%、30%、20%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%、0.001%、0.0005%、0.0001%、0.00005%、0.00001%、0.000005%、0.000001%、0.0000005%、0.0000001%未満という頻度の、サンプル中のまれな逆位変異を検出し得る。例えば、アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブは、サンプル中の遺伝子のまれなコピー数変動であって、1.01倍程度の低いコピー数の倍数変化を含むまれなコピー数変動を検出し得る。
また、本明細書には、サンプルのうち50%、40%、30%、20%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%、0.001%、0.0005%、0.0001%、0.00005%、0.00001%、0.000005%、0.000001%、0.0000005%、0.0000001%未満の頻度を有する、サンプル中のまれな変異の検出のための方法も提供される。例えば、本発明の方法は、サンプルのうち50%、40%、30%、20%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%、0.001%、0.0005%、0.0001%、0.00005%、0.00001%、0.000005%、0.000001%、0.0000005%、0.0000001%未満の頻度を有する、サンプル中のまれなSNPを検出し得る。例えば、本発明の方法は、サンプルのうち50%、40%、30%、20%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%、0.001%、0.0005%、0.0001%、0.00005%、0.00001%、0.000005%、0.000001%、0.0000005%、0.0000001%未満の頻度を有する、サンプル中のまれな挿入変異を検出し得る。例えば、本発明の方法は、サンプルのうち50%、40%、30%、20%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%、0.001%、0.0005%、0.0001%、0.00005%、0.00001%、0.000005%、0.000001%、0.0000005%、0.0000001%未満の頻度を有しているサンプル中のまれな欠失変異を検出し得る。例えば、本発明の方法は、サンプルのうち50%、40%、30%、20%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%、0.001%、0.0005%、0.0001%、0.00005%、0.00001%、0.000005%、0.000001%、0.0000005%、0.0000001%未満の頻度を有する、サンプル中のまれな逆位変異を検出し得る。例えば、本発明の方法は、サンプル中の遺伝子のまれなコピー数変動であって、1.01倍程度の低いコピー数の倍数変化を含むまれなコピー数変動を検出し得る。
(アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブ)
本発明は、プローブベースのハイブリダイゼーションアッセイのためのプローブを提供する。このプローブベースのハイブリダイゼーションアッセイは、プローブベースのPCRアッセイであってもよい、しかし任意のプローブベースのハイブリダイゼーションアッセイが考慮される。いくつかの実施形態では、プローブは、PCR増幅反応の動態および/または有効性に対して最小限からゼロの影響を有するように設計する。PCR増幅反応の動態および/または有効性に対するプローブの影響は、PCR反応のアニーリングおよび/または伸長段階の間、プローブが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする能力、またはハイブリダイズしない能力に関連し得る。PCR増幅反応の動態および/または有効性に対するプローブの影響は、PCR温度サイクリングの間、プローブが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする能力またはハイブリダイズしない能力に関連し得る。例えば、アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブは、PCR増幅反応のアニーリングおよび/または伸長段階の間、テンプレート核酸に対して感知できるほどハイブリダイズしないことによって、PCR増幅反応の動態および/または有効性に対して最小またはゼロの影響を有し得る。
本発明は、プローブベースのハイブリダイゼーションアッセイのためのプローブを提供する。このプローブベースのハイブリダイゼーションアッセイは、プローブベースのPCRアッセイであってもよい、しかし任意のプローブベースのハイブリダイゼーションアッセイが考慮される。いくつかの実施形態では、プローブは、PCR増幅反応の動態および/または有効性に対して最小限からゼロの影響を有するように設計する。PCR増幅反応の動態および/または有効性に対するプローブの影響は、PCR反応のアニーリングおよび/または伸長段階の間、プローブが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする能力、またはハイブリダイズしない能力に関連し得る。PCR増幅反応の動態および/または有効性に対するプローブの影響は、PCR温度サイクリングの間、プローブが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする能力またはハイブリダイズしない能力に関連し得る。例えば、アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブは、PCR増幅反応のアニーリングおよび/または伸長段階の間、テンプレート核酸に対して感知できるほどハイブリダイズしないことによって、PCR増幅反応の動態および/または有効性に対して最小またはゼロの影響を有し得る。
PCR反応のアニーリングおよび/または伸長段階の間、プローブが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする能力、またはハイブリダイズしない能力は、そのプローブの融点(Tm)に関連し得る。アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブは、PCRプローブベースのアッセイで用いられるPCRプライマーのTmよりも高くない融点(Tm)を有し得る。アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブは、プローブベースのPCRアッセイでの使用のためのPCRプライマーの平均Tmよりも少なくとも5〜10℃高くない融点(Tm)を有し得る。
一般的には、PCRアニーリング温度よりも低いTmを有するプローブは、PCRアニーリング段階の間、低下したプローブハイブリダイゼーションを示すことが期待される。アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブは、PCRアニーリング段階の温度よりも高くない融点(Tm)を有し得る。アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブは、PCRアニーリング段階の温度よりも低い融点(Tm)を有し得る。PCRアニーリング温度よりも少なくとも5度低いTmを有するプローブは、PCRアニーリング段階の間、有意に低下したハイブリダイゼーションを呈することが予測され得る。したがって、アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブのTmは、PCRアニーリング段階の温度よりも少なくとも5℃低くても、少なくとも10℃低くても、少なくとも15℃低くても、少なくとも20℃低くても、または20℃超低くてもよい。アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブは、低Tmプローブであってもよい。低TmプローブのTmは、PCR温度サイクリングのラウンドのアニーリング温度よりも少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40℃、または40℃超低くてもよい。低TmプローブのTmは、PCR温度サイクリングのラウンドのアニーリング温度よりも約5〜10℃低くても、約10〜15℃低くても、約15〜20℃低くても、約20〜25℃低くても、約25〜30℃低くてもよい。いくつかの場合には、低Tmプローブは、55℃超、60℃超、65℃超、または70℃超の周囲温度で相補的なテンプレート核酸にハイブリダイズしない。
低Tmプローブは、55℃未満、54℃未満、53℃未満、52℃未満、51℃未満、50℃、49℃未満、48℃未満、47℃未満、46℃未満、44℃未満、43℃未満、42℃未満、41℃未満、40℃未満、39℃未満、38℃未満、37℃未満、36℃未満、35℃未満、34℃未満、33℃未満、32℃未満、31℃未満、または30℃未満のTmを有してもよい。
低Tmプローブは、ほぼ室温でテンプレート核酸に対して容易にハイブリダイズするように設計され得る。このようなプローブの設計は、プローブの適切な検出を可能にするようにその標的ポリヌクレオチドに対するプローブの十分なハイブリダイゼーションを可能にし得る。一般には、プローブは、プローブ/テンプレート二重鎖のTmが室温より高い場合に、ほぼ室温でテンプレート核酸に対して容易にハイブリダイズし得る。したがって、低Tmプローブは、室温(例えば、25℃の室温)よりも5℃高い、10℃高い、15℃高い、または20℃高い、または20℃超高いTmを有するように設計され得る。このようなTmは、室温でテンプレート核酸に対するプローブハイブリダイゼーションの少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または約100%を保証し得る。いくつかの実施形態では、低Tmプローブは、25℃超、26℃超、27℃超、28℃超、29℃超、30℃超、31℃超、32℃超、33℃超、34℃超、35℃超、36℃超、37℃超、38℃超、39℃超、40℃超、41℃超、42℃超、43℃超、44℃超、または45℃超であるTmを有する。
いくつかの実施形態では、低Tmプローブは、約30℃、約31℃、約32℃、約33℃、約34℃、約35℃、約36℃、約37℃、約38℃、約39℃、約40℃、約41℃、約42℃、約43℃、約44℃、約45℃、約46℃、約47℃、約48℃、約49℃、または約50℃であるTmを有する。この低Tmプローブは、30〜35℃、33〜40℃、36〜45℃、または40〜50℃であるTmを有し得る。この低Tmプローブは、30〜45℃であるTmを有し得る。
アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブは、検出可能部分およびクエンチャー部分を含んでもよい。検出可能部分は、化学発光、放射活性、金属イオン、化学リガンド、蛍光、もしくは比色定量部分であってもよいし、または酵素学的な基であってもよく、これは、適切な基質とのインキュベーションの際に、化学発光、蛍光、放射活性、電気または比色定量のシグナルを提供する。いくつかの場合には、検出可能部分は色素である。色素は、蛍光色素、例えば、フルオロフォアであってもよい。この蛍光色素は、連結部分を介してプローブの末端3’炭素または末端5’炭素への結合のために誘導体化された色素であってもよい。いくつかの実施形態では、この色素は、連結部分を介したプローブの末端5’炭素への結合のために誘導体化され得る。クエンチャーは蛍光色素であってもよい。あるいは、クエンチャーは、非蛍光部分であってもよい。クエンチングは、フルオロフォアとクエンチャーとの間のエネルギーの移行を包含し得る。フルオロフォアの発光スペクトルおよびクエンチャーの吸収スペクトルは重複し得る。
アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブは、参照によって本明細書に援用される、Livakら、「Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization」、PCR Methods Appl.1995 4:357−362によって設計され得る。
特定のプローブについてのレポーター−クエンチャー部分対は、例えば、Pesceら、編、Fluorescence Spectroscopy(Marcel Dekker,New York,1971);Whiteら、Fluorescence Analysis:A Practical Approach(Marcel Dekker,New York,1970)によって選択され得る。レポーター−クエンチャー対で用いられ得る例示的な蛍光性および色素生産性分子は、例えば、Berlman,Handbook of Fluorescence Sprectra of Aromatic Molecules,第2版(Academic Press,New York,1971);Griffiths,Colour and Constitution of Organic Molecules(Academic Press,New York,1976);Bishop,編、Indicators(Pergamon Press,Oxford,1972);Haugland,Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals(Molecular Probes,Eugene,1992);Pringsheim,Fluorescence and Phosphorescence(Interscience Publishers,New York,1949)(参照によって本明細書に援用される)に記載される。
広範な反応性蛍光性レポーター色素が、それらが本発明のクエンチャー色素によってクエンチされる限り、用いられてもよい。そのフルオロフォアは、芳香族化合物であってもまたは芳香族複素環化合物であってもよい。フルオロフォアは、例えば、ピレン、アントラセン、ナフタレン、アクリジン、スチルベン、ベンゾオキサゾール(benzoxaazole)、インドール、ベンズインドール、オキサゾール、チアゾール、ベンゾチアゾール、ケイナイン(canine)、カルボシアニン、サチリル酸塩、アントラニル酸塩、キサンテン色素、またはクマリンであってもよい。例示的なキサンテン色素としては、例えば、フルオレセインおよびローダミン色素が挙げられる。例示的なフルオレセインおよびローダミン色素としては、限定するものではないが、6−カルボキシフルオレセイン(FAM)、2’7’−ジメトキシ−4’5’−ジクロロ−6−カルボキシフルオレセイン(JOE)、テトラクロロフルオレセイン(TET)、6−カルボキシローダミン(R6G)、N,N,N;N’−テトラメチル−6−カルボキシローダミン(TAMRA)、6−カルボキシ−X−ローダミン(ROX)が挙げられる。適切な蛍光性レポーターとしてはまた、α位置またはβ位置におけるアミノ基を有するナフチルアミン色素が挙げられる。例えば、ナフチルアミノ化合物としては、1−ジメチルアミノナフチル−5−スルホナート、1−アニリノ−8−ナフタレンスルホナートおよび2−p−トルイジニル−6−ナフタレンスルホナート,5−(2’−アミノエチル)アミノナフタレン−1−スルホン酸(EDANS)が挙げられる。例示的なクマリンとしては、例えば、3−フェニル−7−イソシアナートクマリン;アクリジン、例えば、9−イソチオシアナートアクリジンおよびアクリジンオレンジ;N−(p−(2−ベンゾオキサゾリル)フェニル)マレイミド;シアニン類、例えば、インドジカルボシアニン3(Cy3)、インドジカルボシアニン5(Cy5)、インドジカルボシアニン5.5(Cy5.5)、3−(−カルボキシ−ペンチル)−3’−エチル−5,5’−ジメチルオキサカルボシアニン(CyA)など;1H,5H,11H,15H−キサンテノ[2,3,4−ij:5,6,7−i’j’]ジキノリジン−18−イウム、9−[2(または4)−[[[6−[2,5−ジオキソ−1−ピロリジニル)オキシ]−6−オキソヘキシル]アミノ]スルホニル]−4(または2)−スルホフェニル]−2,3,6,7,12,13,16,17−オクタヒドロ−内部塩(TRまたはTexas Red);またはBODIPY(商標)色素が挙げられる。例示的な蛍光性部分およびクエンチャー部分は、例えば、参照によって本明細書に援用される、WO/2005/049849に記載される。
当該分野で公知のような、適切なクエンチャーは、蛍光部分によって選択される。例示的なレポーターおよびクエンチャーはさらに、参照によって本明細書に援用されるAndersonら、米国特許第7,601,821号に記載される。
クエンチャーはまた、種々の商業的供給源から入手できる。例示的な市販のクエンチャーとしては、Biosearch TechnologiesのBlack Hole Quenchers(登録商標)およびIntegrated DNA Technologies,IncのIowa Black(登録商標)またはZENクエンチャーが挙げられる。
いくつかの実施形態では、アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブは、2つのクエンチャー部分を含む。2つのクエンチャー部分を含む例示的なプローブとしては、Integrated DNA TechnologiesのZenプローブが挙げられる。このようなプローブは、検出可能部分から約9塩基離れて位置する内部クエンチャー部分を含み、かつ一般には、伝統的なレポーター/クエンチャープローブに関連するバックグラウンドシグナルを低下する。
検出可能部分およびクエンチャー部分は、共通の反応基または連結部分を介したオリゴヌクレオチドに対する共有結合のために誘導体化され得る。検出可能部分およびクエンチャー部分の誘導体化のための方法は、例えば、Ullmanら、米国特許第3,996,345号;Khannaら、米国特許第4,351,760号;Eckstein,編,Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach(IRL Press,Oxford,1991);Zuckermanら、Nucleic Acids Research,15:5305−5321(1987)(オリゴヌクレオチド上の3’チオール基);Sharmaら、Nucleic Acids Research,19:3019(1991)(3’スルフヒドリル);Giustiら、PCR Methods and Applications,2:223−227(1993)およびFungら、米国特許第4,757,141号(Applied Biosystems,Foster City,Calif.から入手できるAminolink(商標)IIを介した5’ホスホアミノ基);Stabinsky,米国特許第4,739,044号(3’アミノアルキルホスホリル基);Agrawalら、Tetrahedron Letters,31:1543−1546(1990)(ホスホラミダイト連結を介した結合);Sproatら、Nucleic Acids Research,15:4837(1987)(5’メルカプト基);Nelsonら、Nucleic Acids Research,17:7187−7194(1989)(3’アミノ基)(そのすべてが参照によって本明細書に援用される)に記載される。
いくつかの実施形態では、市販されている連結部分、例えば、Clontech Laboratories(Palo Alto,Calif.)から入手可能な連結部分が、合成の間にオリゴヌクレオチドに結合されてもよい。
単なる例に過ぎないが、ローダミンおよびフルオレセイン色素は、オリゴヌクレオチドの5’ヒドロキシルに対する結合のためのホスホラミダイト部分で誘導体化され得る(例えば、その全体が参照によって本明細書に援用される、Wooら、米国特許第5,231,191号;およびHobbs,Jr.米国特許第4,997,928号を参照のこと)。
いくつかの実施形態では、検出可能部分は、非蛍光シグナルを生じる。例えば、プローブのテンプレートへのハイブリダイゼーションが、クエンチング部分からの検出可能な部分の検出可能な分離を生じる任意のプローブを用いてもよい。例えば、検出可能部分の放出は、電気的に、量子ドット検知によって、発光によって、または化学的に(例えば、プローブハイブリダイゼーションから生じる溶液中のpHの変化によって)検出され得る。同様に、プローブ結合領域に結合し、シグナル中の変化がクエンチャー部分からの検出可能部分の分離の際に検出され得る、任意のプローブを用いてもよい。例えば、分子ビーコンプローブ、MGBプローブ、プレアデス(Pleiades)プローブ、スコーピオン(Scorpion)プローブまたは他のプローブが本発明における使用について考慮される。
分子ビーコンプローブは、参照によって本明細書に援用される、例えば、米国特許第5,925,517号および同第6,103,406号に記載される。分子ビーコンプローブは、一般には、ヘアピンまたは二分子のオリゴヌクレオチドプローブを指す。ヘアピン分子ビーコンプローブは、ヘアピンの一端で検出可能部分、ヘアピンの他の末端でクエンチャー部分を含んでもよく、ここではヘアピンは、テンプレート結合領域を含む。理論で拘束されることは望まないが、テンプレートへのテンプレート結合領域のハイブリダイゼーションは、プローブのヘアピン構造を分離し、かつ検出可能部分をクエンチャー部分から分離し得、これによって検出可能部分の検出を可能にする。二分子のビーコンプローブは、それぞれ、5’末端および3’で互いに相補的である配列を有している2つのオリゴヌクレオチド鎖を含んでもよい。相補的な配列は、各々が、検出可能部分およびクエンチャー部分にそれぞれコンジュゲートされ得る。2つのオリゴヌクレオチド鎖の各々が、標的配列の異なる領域に結合するテンプレート結合配列をさらに含んでもよい。相補鎖の間のワトソンクリック結合の形成は、Y構造の形成を生じ得、検出可能部分をクエンチャー部分と近位にして、検出可能部分のクエンチを生じ得る。標的ポリヌクレオチドに対するテンプレート結合配列のハイブリダイゼーションは、相補的配列の間の二重鎖を破壊し得、それによってクエンチャー部分から検出可能部分を分離し、検出可能部分の脱クエンチングを生じる。
MGBプローブは、参照によって本明細書に援用される、例えば、米国特許第7,582739号;同第7,381,818号;同第6,492,346号;同第6,321,894号;同第6,303,312号;および同第6,221,589号に記載される。MGBプローブとは、マイナー・グルーブ・バインダー(minor groove binder)(MGB)を含むオリゴヌクレオチドプローブを指す。「マイナー・グルーブ・バインダー(minor groove binder)」という用語は、本明細書において用いる場合、一般的には、二本鎖DNA、二本鎖RNA、DNA−RNAハイブリッド、DNA−PNAハイブリッド、ハイブリッド(1つの鎖がPNA/DNAキメラである)ならびに/またはポリマー(プリンおよび/またはピリミジン塩基および/またはそれらのアナログを含む)のマイナーグルーブ(minor groove)内で結合し得る分子であって、塩基対合して、マイナーグルーブを含む二重鎖、三重鎖またはより高次の構造を形成し得る分子を指す。プローブのMGBドメインは、プローブとその対応するテンプレートポリヌクレオチドとの間で形成される二重鎖を安定化し得る。MGBの組み込みは、短いプローブの使用を可能にし得、プローブ/テンプレート二重鎖の安定性を向上し得、かつ対立遺伝子特異的なプローブの特異性を保持する。MGBプローブは、MGBリガンド、およびクエンチャー(プローブの3’末端に位置する)を有してもよく、フルオロフォアが、プローブの5’末端に結合される。あるいは、MGBプローブは、MGBリガンド、およびクエンチャー(プローブの5’末端に位置する)およびフルオロフォア(プローブの3’末端で)を有してもよい。
プレアデス(pleiades)プローブは、参照によって本明細書に援用される、米国特許出願公開第20046727356号、同第20077205105号および同第20090111100号に記載される。プレアデスプローブとは一般的には、検出可能部分、例えば、プローブの第一端でMGBに近位のフルオロフォア、およびプローブの第二端でクエンチャー部分を含むMGBプローブを指す。この検出可能部分は、クエンチャー部分によってクエンチされてもよく、さらに、MGBによってさらにクエンチされてもよい。
アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブは、ある長さを有するように設計されてもよい。アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブの長さは、プローブが溶液中でフリーである(例えば、非ハイブリダイズ状態である)場合、検出可能な部分をクエンチするように、十分に長くてもよく、検出可能部分およびクエンチャーが十分に近位である。単なる例であるが、アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブは、そのハイブリダイズしていない状態で、完全にハイブリダイズした状態のプローブと比較して、50%未満、40%未満、30%未満、20%未満、10%未満、5%未満、4%未満、3%未満、2%未満、1%未満、0.5%未満、0.1%未満、0.01%未満、0.001%未満、または0.0001%未満の蛍光を示し得る。理論で拘束されることは望まないが、このようなプローブのハイブリダイゼーションは、プローブのコイル状態を喪失させ、かつ完全に伸展させ得、プローブの検出可能部分とクエンチャー部分との間の距離を増大し、それによって検出可能部分を活性化する。このようなハイブリダイゼーション依存性の活性化可能なプローブは、例えば、米国特許第6,030,787号、米国特許第5,723,591号、米国特許第7,485,442号、および米国特許出願番号10/165,410)(参照によって本明細書に援用される)に記載される。検出可能部分およびクエンチャーは、少なくとも7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、または30超ヌクレオチド離間してもよい。この検出可能部分およびクエンチャーは、約7〜10、9〜15、12〜20、20〜30、または30超ヌクレオチド離れて間隔を空けられてもよい。プローブの全長は、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、または30超ヌクレオチドであってもよい。プローブの全長は、約7〜12、12〜20、20〜30、または30超のヌクレオチドであってもよい。
いくつかの実施形態では、プローブは、TMを増強する塩基を有するヌクレオチドを含む。このプローブは、Superbase(商標)、ロックド核酸、または架橋核酸を含んでもよい。例示的なロックド核酸または架橋核酸は、本明細書に記載される。
プローブは、目的の標的ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするように設計してもよい。プローブは、標的ポリヌクレオチドに対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、または100%の相補性を有するように設計され得る。
いくつかの実施形態では、プローブは、15、14、13、12、11、または10ヌクレオチド未満の長さを有するように設計されてもよい。いくつかの実施形態では、このようなプローブは、25%超、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、または最大80%までのGC含量を有する。いくつかの実施形態では、15、14、13、12、11、または10ヌクレオチド未満の長さを有するプローブは、40%超、例えば、40〜80%などのGC含量を含む。いくつかの場合には、15、14、13、12、11、または10ヌクレオチド未満の長さ、および25%超、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、または最大80%であるGC含量を有しているプローブは、架橋またはロックドヌクレオチドなどの修飾されたヌクレオチドを含まない。他の実施形態では、15、14、13、12、11、または10ヌクレオチド未満の長さを有するプローブは、40%、35%、30%、25%未満のGC含量を含む。特定の実施形態では、このようなプローブはさらに、修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの場合には、修飾されたヌクレオチドは、ロックドヌクレオチドまたは架橋ヌクレオチドである。いくつかの場合には、このようなプローブは、ペプチド核酸を含む。このような場合、プローブは、修飾されたヌクレオチドを必ずしも含まない。
他の実施形態では、プローブは、15以上、16、以上、17以上、18以上、19以上、20以上、21以上、22以上、23以上、24以上、25以上、または30以上のヌクレオチドの長さを有するように設計される。特定の実施形態では、このようなプローブは、80%未満のGC含量を有する。例えば、このようなプローブは、80%未満、75%未満、70%未満、65%未満、60%未満、55%未満、50%未満、45%未満、40%未満、35%未満、または30%未満のGC含量を有し得る。特定の実施形態では、15以上、16,以上、17以上、18以上、19以上、20以上、21以上、22以上、23以上、24以上、25以上のヌクレオチドの長さを有するアンプリコンの感度のよい検出のためのプローブはまた、約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、または70%であるGC含量を有する。
アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブは、高度に鋭敏な対立遺伝子の識別のために設計されてもよく、例えば、対立遺伝子特異的なプローブであってもよい。このようなプローブは、例えば、SNP、挿入、欠失、または逆位などの変異を保有すると疑われる遺伝子座と部分的にまたは完全を覆うように設計され得る。対立遺伝子特異的なプローブは、ある遺伝子座で特定の対立遺伝子を含むテンプレート核酸に対して完全にマッチする(例えば、完全に相補的である)が、その遺伝子座の任意の他の対立遺伝子に対するミスマッチを含むように設計され得る。このミスマッチは、1、2、3、4、5、または5超のヌクレオチドのミスマッチであってもよい。いくつかの実施形態では、対立遺伝子特異的なプローブは、ある遺伝子座で特定の対立遺伝子を含む完全にテンプレートの核酸と二重鎖を形成し得る。いくつかの実施形態では、このプローブ/完全にマッチしたテンプレート二重鎖は、第一のTmを有する。この対立遺伝子特異的なプローブはまた、同じ遺伝子座で異なる対立遺伝子を含むミスマッチのテンプレート核酸との二重鎖を形成し得る。いくつかの実施形態では、このプローブ/ミスマッチのテンプレート二重鎖は、第二のTmを有する。第一のTmと第二のTmとの間の相違(例えば、ミスマッチの結合ペナルティ)は、テンプレートに対するプローブの総結合エネルギーの少なくとも1%であり得る。
プローブは、SNP、挿入、欠失、または逆位などの変異を保有すると疑われない標的ポリヌクレオチドの鋭敏かつ正確な検出のために設計され得る。例えば、標的ポリヌクレオチドは、コピー数変動を有すると疑われる場合がある。このような場合には、プローブは、標的ポリヌクレオチドに対するミスマッチを有するように必ずしも設計されない。いくつかの場合には、プローブは、標的ポリヌクレオチドに対して完全にマッチするように設計される。
プローブは、PCRの間、その標的テンプレート核酸にハイブリダイズしないように設計され得る。PCRは一般的には、反復回数の温度サイクリングを包含する。プローブは、反復回数の温度サイクリングの間にハイブリダイズしないように設計され得る。ユーザーは、温度サイクリングパラメータを、反復サイクルを含むように設定してもよく、この反復サイクルは、変性工程、アニーリング工程、および伸長工程を包含する。いくつかの実施形態では、この反復性のサイクルは、50℃未満のいかなる温度段階も含まない。反復サイクルの後、ユーザーはまた、最終の伸長工程を含んでもよい。いくつかの実施形態では、この最終の伸長工程は、50℃未満ではない。特定の実施形態では、この最終の伸長工程は、約65〜75℃である。反復サイクルの後、ユーザーは、最終の伸長工程および/または冷却工程を包含してもよく、ここではこの反応温度は、45℃未満、40℃未満、35℃未満、30℃未満、または25℃もしくはそれ未満(at or below)まで低下される。いくつかの実施形態では、本発明のプローブは、冷却工程の間のその標的テンプレート核酸に対してハイブリダイズする。このような場合、ユーザーは、標的アンプリコンのエンドポイント検出を行ってもよい。いくつかの実施形態では、この冷却する工程は、制御された冷却工程を包含してもよく、ここでは反応温度は一定速度で冷却する。この一定速度は、0.01℃/秒、0.02℃/秒、0.03℃/秒、0.04℃/秒、0.05℃/秒、0.06℃/秒、0.07℃/秒、0.08℃/秒、0.09℃/秒、0.10℃/秒、0.2℃/秒、0.3℃/秒、0.4℃/秒、0.5℃/秒、0.6℃/秒、0.7℃/秒、0.8℃/秒、0.9℃/秒、または1℃/秒であってもよい。いくつかの場合には、ユーザーは蛍光が検出される温度に注意し得る。いくつかの場合には、蛍光が検出される温度は、標的核酸の変異状態に関してユーザーに情報を提供し得る。
あるいは、ユーザーは、反復性のサイクルの間に冷却工程を包含してもよい。例えば、反復性のサイクルは、変性、アニーリング、伸長および冷却工程を包含し得る。いくつかの実施形態では、反復性サイクルの冷却工程は、反応温度を、45℃未満、40℃未満、35℃未満、30℃未満、または25℃もしくはそれ未満まで下げる工程を包含する。いくつかの実施形態では、本発明のプローブは、冷却工程の間、その標的テンプレート核酸にハイブリダイズする。このような場合、ユーザーは、標的アンプリコンのリアルタイム検出を行ってもよい。
(アンプリコンの感度のよい検出のための反応混合物)
別の態様では、本発明は、アンプリコンの感度のよい検出のための反応混合物を提供する。アンプリコンの感度のよい検出のための反応混合物は、PCR反応を行うための成分を含んでもよい。アンプリコンの感度のよい検出のための反応混合物は、核酸テンプレート分子から少なくとも1つのアンプリコンを増幅するのに必要な成分を含んでもよい。アンプリコンの感度のよい検出のための反応混合物は、ヌクレオチド(dNTP)、ポリメラーゼ、1つ以上のプライマー、および本発明のプローブを含んでもよい。アンプリコンの感度のよい検出のための反応混合物はさらに、Tris緩衝液、一価の塩、および1つ以上の陽イオンを含んでもよい。この1つ以上の陽イオンは、Mg2+であっても、および/またはMn2+であってもよい。いくつかの実施形態では、アンプリコンの感度のよい検出のための反応混合物は、Mg2+およびMn2+を含む。各々の成分の濃度は、当業者によって最適化され得る。いくつかの実施形態では、アンプリコンの感度のよい検出のための反応混合物はまた、限定するものではないが、非特異的なバックグラウンド/ブロッキング核酸(例えば、サケ精子DNA)、バイオ防腐剤(例えば、アジ化ナトリウム)、PCR増強剤(例えば、ベタイン、トレハロースなど)、およびインヒビター(例えば、RNAse阻害剤)を含む添加物を含む。いくつかの実施形態では、核酸サンプルは、アンプリコンの感度のよい検出のために反応混合物と混合される。したがって、いくつかの実施形態では、アンプリコンの感度のよい検出のための反応混合物はさらに、核酸サンプルを含む。
別の態様では、本発明は、アンプリコンの感度のよい検出のための反応混合物を提供する。アンプリコンの感度のよい検出のための反応混合物は、PCR反応を行うための成分を含んでもよい。アンプリコンの感度のよい検出のための反応混合物は、核酸テンプレート分子から少なくとも1つのアンプリコンを増幅するのに必要な成分を含んでもよい。アンプリコンの感度のよい検出のための反応混合物は、ヌクレオチド(dNTP)、ポリメラーゼ、1つ以上のプライマー、および本発明のプローブを含んでもよい。アンプリコンの感度のよい検出のための反応混合物はさらに、Tris緩衝液、一価の塩、および1つ以上の陽イオンを含んでもよい。この1つ以上の陽イオンは、Mg2+であっても、および/またはMn2+であってもよい。いくつかの実施形態では、アンプリコンの感度のよい検出のための反応混合物は、Mg2+およびMn2+を含む。各々の成分の濃度は、当業者によって最適化され得る。いくつかの実施形態では、アンプリコンの感度のよい検出のための反応混合物はまた、限定するものではないが、非特異的なバックグラウンド/ブロッキング核酸(例えば、サケ精子DNA)、バイオ防腐剤(例えば、アジ化ナトリウム)、PCR増強剤(例えば、ベタイン、トレハロースなど)、およびインヒビター(例えば、RNAse阻害剤)を含む添加物を含む。いくつかの実施形態では、核酸サンプルは、アンプリコンの感度のよい検出のために反応混合物と混合される。したがって、いくつかの実施形態では、アンプリコンの感度のよい検出のための反応混合物はさらに、核酸サンプルを含む。
本発明で用いられるプライマーは、目的の標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズするように設計されているテンプレート結合領域を含んでもよい。本発明で用いられるプライマーは一般には、重合化のための因子の存在下において伸長生成物の合成をプライミングするために十分に長い。プライマーの正確な長さおよび組成物は、多くの要因、例としては、アニーリング反応の温度、供給源、およびプライマーの組成、ならびにプライマー:プローブ濃度の比に依存し得る。プライマー長は、例えば、約5〜100、10〜50、15〜30、または18〜22ヌクレオチドであってもよいが、プライマーは、それより多いヌクレオチドを含んでも、それより少ないヌクレオチドを含んでもよい。
本発明で用いられるプライマーはまた、プローブ結合領域を含んでもよい。例示的なプローブ結合領域は、本明細書に記載される。
本発明で用いられるプライマーはさらに、バーコード配列を含んでもよい。「バーコード配列」という用語は、本明細書において用いる場合、一般的には、あるアッセイについての情報をコードし得るヌクレオチドの固有の配列を指す。いくつかの実施形態では、あるバーコード配列は、問い合わされた対立遺伝子の同定、標的ポリヌクレオチドまたはゲノム遺伝子座の同定、サンプル、被験体の同定、またはそれらの任意の組み合わせに関連する情報をコードする。いくつかの実施形態では、バーコード配列は、テンプレート核酸にハイブリダイズしない。バーコード配列は、例えば、目的の生物体の公知のゲノム配列に対して有意な配列類似性または相補性を回避するように設計されてもよい。このような固有の配列は、例えば、コンピュータ読み取り可能な媒体によってランダムに生成されて、例えば、EMBL、GenBank、またはDDBJのような公知のヌクレオチドデータベースに対してBLASTingによって選択されてもよい。このバーコード配列はまた、二次的構造を回避するように設計されてもよい。バーコード配列は、プライマーの3’末端またはさらに好ましくは5’末端であってもよい。バーコード配列は、サイズおよび組成物が広範に変化し得る;以下の参考文献は、特定の実施形態について適切なバーコード配列のセットを選択するための手引きを提供する:Brenner,米国特許第5,635,400号;Brennerら、Proc.Natl.Acad.Sci.,97:1665〜1670(2000);Shoemakerら、Nature Genetics,14:450〜456(1996);Morrisら、欧州特許刊行物0799897A1;Wallace,米国特許第5,981,179号(その全てが参照によって本明細書に援用される)。特定の実施形態では、バーコード配列は、約4〜36ヌクレオチド、約6〜30ヌクレオチド、または約8〜20ヌクレオチドの長さを有し得る。このバーコード配列は、任意の長さを有してもよい。いくつかの実施形態では、プライマーは、本明細書に記載のようなプローブ結合領域を含んでもよい。
プライマーおよび/またはプローブは、任意の適切な方法で調製されてもよい。特定の配列のオリゴヌクレオチドを調製するための方法は、当該分野で公知であり、これには、例えば、適切な配列のクローニングおよび制限、ならびに直接の化学合成が挙げられる。化学合成法としては、例えば、Narangら、1979,Methods in Enzymology 68:90に記載のホスホトリエステル法、Brownら、1979,Methods in Enzymology 68:109に開示のホスホジエステル法、Beaucageら、1981,Tetrahedron Letters 22:1859に開示のジエチルホスホラミダイト法、および米国特許第4,458,066号に開示される固体支持体方法が挙げられる。上記の引用文献は、参照によって本明細書に援用される。
プライマーおよび/またはプローブは、例えば、Operon Technologies,Amersham Pharmacia Biotech,Sigma,IDT Technologies、およびLife Technologiesなどの商業的供給源から得ることができる。プライマーは、同一または類似の融点を有してもよい。プライマーの長さは、所望の融点を有するプライマーを生成するために、5’末端または3’末端で伸長されてもまたは短縮されてもよい。また、各々のプライマー対および/または各々のプローブのアニーリング位置は、プライマー対および/またはプローブの配列および長さが所望の融点を生じるように、設計され得る。
プライマーおよび/またはプローブの融点は、経験的に、例えば、融解曲線解析を行うことによって決定され得る。融解曲線解析を行ってプライマーおよび/またはプローブのTmを経験的に決定する方法は、当業者には公知である。プライマーおよび/またはプローブの融点もまた予想され得る。単なる例であるが、25塩基対より小さいプライマーの融点を予測するための最も単純な式は、ウォレス(Wallace)の公式である:
(Td=2(A+T)+4(G+C))。
である。
(Td=2(A+T)+4(G+C))。
である。
オリゴヌクレオチドのTmを算出するための別の方法は、最近傍法である。この最近傍法は一般には、塩濃度およびDNA濃度のような特定の変数を組み込む。この方法は、例えば、50mMの一価の塩および0.5μMプライマーなどの、PCR適用で典型的には見出される反応混合物条件を組み込んでもよい。一般には、DNAおよびRNAベースのオリゴヌクレオチドについての最近傍式は以下である:
Tm=(1000ΔH)/A+ΔS+Rln(C/4)−273.15+16.6log[Na+]、ここで
ΔH(Kcal/モル)は、ハイブリッドの最近傍エンタルピー変化の合計であり、Aはらせん開始のための補正を含む定数であり、ΔSは、最近傍エントロピー変化の合計であり、Rは、気体定数(1.99 cal K−1mol−1)であり、かつCは、オリゴヌクレオチドの濃度である。
Tm=(1000ΔH)/A+ΔS+Rln(C/4)−273.15+16.6log[Na+]、ここで
ΔH(Kcal/モル)は、ハイブリッドの最近傍エンタルピー変化の合計であり、Aはらせん開始のための補正を含む定数であり、ΔSは、最近傍エントロピー変化の合計であり、Rは、気体定数(1.99 cal K−1mol−1)であり、かつCは、オリゴヌクレオチドの濃度である。
DNAおよびRNAの最近傍相互作用についてのΔHおよびΔSの値を、表1(下)に示す。
例えば、5.0〜9.0の間のpHで、例えば、50塩基より長いDNAオリゴヌクレオチドのTmを予測するために一般に用いられる別の式は、GC%法である。
Tm=81.5+16.6log[Na+]+41(XG+XC)−500/L−0.62F
ここで、[Na+]は、一価の陽イオン(この場合は、Na+)のモル濃度であり、XGおよびXCはオリゴヌクレオチド中のGおよびCのモル画分であり、Lは、二重鎖の中の最小鎖の長さであり、Fは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルミアミドの割合である。
ここで、[Na+]は、一価の陽イオン(この場合は、Na+)のモル濃度であり、XGおよびXCはオリゴヌクレオチド中のGおよびCのモル画分であり、Lは、二重鎖の中の最小鎖の長さであり、Fは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルミアミドの割合である。
Tmはまた、オリゴヌクレオチド配列以外の要因にも依存し得ることを当業者は理解する。Tmは、例えば、反応混合物の塩濃度、反応混合物中で用いられる緩衝液の種類、テンプレート濃度に対するプライマーまたはプローブの相対濃度、および他の要因に依存し得る。また限定するものではないが、Array Designer Software(Arrayit Inc.)、Oligonucleotide Probe Sequence Design Software for Genetic Analysis(Olympus Optical Co.)、NetPrimer、PrimerExpress、および日立ソフトウェアエンジニアリング(Hitachi Software Engineering)のDNAsisを含むコンピュータプログラムを用いて、プライマーを設計してもよい。各々のプライマーのTm(融点またはアニーリング温度)は、なかでも、例えば、Invitrogen Corpから入手可能なOligo Design、PromegaのBioMath Calculators(http://www.promega.com/techserv/tools/biomath/calc11.htm)、New England BiolabsのTm Calculator、Integrated DNA TechnologiesのOligoAnalyzerのようなソフトウェアプログラムを用いて算出され得る。
アンプリコンの感度のよい検出のための反応混合物は、線形増幅を行うための反応成分を含んでもよい。一般には、線形増幅の間、二本鎖テンプレート核酸のうち一本の鎖のみを1サイクルについて増幅して、一本鎖伸長生成物を生じる。線形増幅を可能にするために、反応混合物は、例えば、1つの標的ポリヌクレオチドあたり1つだけのプライマーを含んでもよい。
あるいは、アンプリコンの感度のよい検出のための反応混合物を、指数関数的増幅のために構成してもよい。一般的には、指数関数的増幅の間、二本鎖テンプレート核酸の両方の鎖を1サイクルについて増幅して、標的ポリヌクレオチドの2nのコピーの生成を得、ここではnはPCR反応中のサイクルの数である。指数関数的増幅を可能にするために、反応混合物は、1標的ポリヌクレオチドあたり1つのフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含んでもよい。代表的には、指数関数的増幅のためには、フォワードおよびリバースプライマーが、反応混合物中に、1:3〜3:1の比、1:2〜2:1の比、好ましくは2:3〜3:2の比、さらに好ましくは3:4〜4:3の比、またそれよりさらに好ましくは約1:1の比で存在する。
いくつかの場合には、アンプリコンの感度のよい検出のための反応混合物は、指数関数的増幅に続いて線形増幅のために構成されてもよい。このような場合、フォワードプライマー/リバースプライマーセットのうち1つのプライマーは、フォワードプライマー/リバースプライマーセットの他のプライマーに比較して過剰な濃度または量で存在してもよい。いくつかの実施形態では、過剰のプライマーの濃度は、制限プライマーの少なくとも2×、3×、4×、5×、6×、7×、8×、9×、10×の濃度である。いくつかの実施形態では、過剰のプライマーの濃度は、制限プライマーの濃度の約2〜10×、5〜50×、20〜100×、50〜500×、100〜1000×、500〜2000×、1000〜5000×、2000〜10000×、または10000×超の濃度である。このような場合には、指数関数的増幅は、制限プライマーの消耗まで進行し、この際、反応混合物または別個の反応容積中に残っている過剰のプライマーを用いて線形増幅が進行する。理論で拘束されることは望まないが、指数関数的増幅−続いて−線形の増幅によって、(1)検出可能シグナルを生じるのに十分な増幅生成物が生成されること、(2)PCR反応生成物が優先的に一本鎖伸長生成物であり、これは反応温度を例えば、50℃より下まで冷却する際に、例えば、その逆相補鎖の代わりに検出プローブに結合できること、が保証される。したがって、いくつかの実施形態では、PCR温度サイクリングの終了の際に、一本鎖伸長生成物は、反応生成物の総量の少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または95%超の割合を占める。いくつかの実施形態では、一本鎖伸長生成物が、反応生成物の総量の少なくとも50%を占めることはない。いくつかの実施形態では、PCR温度サイクリングの終了の際、PCR伸長生成物のうち少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または95%超が過剰プライマーの伸長である。このような場合、線形増幅は、ユーザーが反応混合物に成分を追加することも除去することもなく、指数関数的増幅後に行われ得る。
アンプリコンの感度のよい検出のための反応混合物はポリメラーゼを含んでもよい。いくつかの実施形態では、このポリメラーゼはDNAポリメラーゼである。特定の実施形態では、このDNAポリメラーゼは熱安定性ポリメラーゼである。この熱安定性ポリメラーゼは、好熱性の細菌由来であっても、または古細菌由来であってもよい。例示的な熱安定性ポリメラーゼとしては、限定するものではないが、Thermus aquaticus(Taqポリメラーゼ)、Pyrococcus furiosus(Pfuポリメラーゼ)、Vent(登録商標)DNAポリメラーゼ遺伝子(Thermococcus litoralis由来)、Deep Vent(商標)ポリメラーゼ(Pyrococcus sp.由来)、Platinum(登録商標)Pfxポリメラーゼ、Tfiポリメラーゼ(Thermus filiformis由来)、Pwoポリメラーゼ、DNA結合タンパク質を含むキメラDNAポリメラーゼ(例えば、Phusion、iProof)、トポイソメラーゼが挙げられる。いくつかの実施形態では、このポリメラーゼは、等温性の増幅が可能である。このポリメラーゼは例えば、Bst DNAポリメラーゼ、Bca DNAポリメラーゼ、大腸菌DNAポリメラーゼI、大腸菌DNAポリメラーゼIのKlenowフラグメント、Taq DNAポリメラーゼ、T7 DNAポリメラーゼ(Sequenase)であってもよい。
いくつかの実施形態では、DNAポリメラーゼは、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を含む。本明細書において用いる場合、「5’→3’ヌクレアーゼ活性」または「5’→3’ヌクレアーゼ活性」とは、テンプレート特異的な核酸ポリメラーゼの活性であって、それによってヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの5’末端から連続して取り除かれる活性を指し得る。5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼは、当該分野で公知であって、これには、例えば、Thermus aquaticusから単離されたDNAポリメラーゼ(Taq DNAポリメラーゼ)が挙げられる。いくつかの実施形態では、このDNAポリメラーゼは、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を欠く。3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を欠いている例示的なDNAポリメラーゼとしては限定するものではないが、BST DNAポリメラーゼI、BST DNAポリメラーゼ I(大フラグメント)、Taqポリメラーゼ、Streptococcus pneumoniae DNAポリメラーゼ I、クレノウフラグメント(3’→5’エキソ−)、PyroPhage(登録商標)3173DNAポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼマイナス(Exonuclease Minus)(Exo−)(Lucigenから入手可能)、T4 DNAポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼマイナス(Exonuclease
Minus)(Lucigen)が挙げられる。いくつかの実施形態では、DNAポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性を欠くように遺伝子操作された組み換えDNAポリメラーゼである。
Minus)(Lucigen)が挙げられる。いくつかの実施形態では、DNAポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性を欠くように遺伝子操作された組み換えDNAポリメラーゼである。
いくつかの実施形態では、アンプリコンの感度のよい検出のための反応混合物は、多重検出のための複数のプライマーおよびプローブを包含し得る。単なる例であるが、アンプリコン反応混合物の感度のよい検出のための反応混合物は、プライマー/プローブセットを含み得る。いくつかの実施形態では、プライマー/プローブセットは、共通のフォワードプライマーおよび必要に応じてリバースプライマー(ある遺伝子座で変異を保有することが疑われる標的ポリヌクレオチドを増幅するように設計された)を含み、さらに複数のプローブを含み、ここでは各々のプローブは、遺伝子座の特異的な対立遺伝子に対して特異的である。プライマー/プローブセット中の各々のプローブはさらに、反応混合物中の任意の他の検出可能部分とは検出可能に別個である別個の検出可能部分を含んでもよい。他の例では、反応混合物は、複数のプライマー/プローブセットを含んでもよく、ここでは各々のプライマー/プローブセットは、異なる標的ポリヌクレオチド、例えば、異なる遺伝子座に特異的である。
いくつかの実施形態では、このプライマー/プローブセットは、共通のリバースプライマー、第一の対立遺伝子特異的なフォワードプライマー、および少なくとも第二の対立遺伝子特異的なフォワードプライマー(ある遺伝子座である変異を保有することが疑われる標的ポリヌクレオチドを増幅するように設計された)を含む。このフォワードプライマーは互いにテンプレート結合領域を含んでもよい。このテンプレート結合領域は、ある変異を覆い得る。このフォワードプライマーは各々、プローブ結合領域(例えば、バーコード領域)をさらに含んでもよい。フォワードプライマーの1つは、変異を覆う部位で野性型対立遺伝子に対して相補的である、野性型特異的なフォワードプライマーであってもよい。この野性型特異的なフォワードプライマーはさらに、テンプレート核酸に一般にはハイブリダイズしない野性型バーコード領域を含んでもよい。野性型バーコード領域は、野性型低Tmプローブに特異的にハイブリダイズするが、変異体低Tmプローブには実質的にハイブリダイズしない野性型バーコード配列を含んでもよい。フォワードプライマーの1つは、変異を覆う部位で変異対立遺伝子に対して相補的である変異体特異的なフォワードプライマーであってもよい。この変異体特異的なフォワードプライマーはさらに、テンプレート核酸に一般にはハイブリダイズしない変異体バーコード領域を含んでもよい。この変異体バーコード領域は、変異体低Tmプローブに特異的にハイブリダイズするが、野性型低Tmプローブには実質的にハイブリダイズしない変異体バーコード配列を含んでもよい。フォワードプライマー(野性型および変異体フォワードプライマー)はさらに、変異を覆うnt由来の1〜3ヌクレオチドに隣接するか、またはその中の意図的なミスマッチヌクレオチドを含んでもよい。しかし、いくつかの場合には、フォワードプライマーは、変異を覆うnt由来の1〜3ヌクレオチドに隣接するか、またはその中の意図的なミスマッチヌクレオチドをさらには含まない。プライマー/プローブセットはさらに、野性型低Tmプローブおよび変異体低Tmプローブを含んでもよい。野性型低Tmプローブは、野性型バーコード領域に特異的にハイブリダイズするように設計されてもよい。変異体低Tmプローブは、変異体バーコード領域に特異的にハイブリダイズするように設計されてもよい。野性型および変異体の低Tmプローブは、スペクトル的に別個のフルオロフォアを含んでもよい。このプライマー/プローブセットはさらに、共通のリバースプライマーを含んでもよい。
(アンプリコンの感度のよい検出のための方法)
図16は、アンプリコンの感度のよい検出のための方法について例示的なワークフロー1600を示しており、これには、反応混合物中でプローブベースのPCRアッセイを行う第一の工程1610を包含し、ここでこのプローブベースのPCRアッセイは、温度サイクリングを含み、このプローブは、PCR増幅反応の動態または有効性に対して有する影響が最小からゼロになるように設計されている。いくつかの実施形態では、このプローブは、PCR反応の間、テンプレート核酸にハイブリダイズしない。いくつかの実施形態では、このオリゴヌクレオチドプローブは、PCR反応の終了後にテンプレート核酸にハイブリダイズする。PCR反応の終わりは、標的ポリヌクレオチドへのプローブのハイブリダイゼーションを可能にする温度まで反応混合物を冷却することを可能にするという次の工程1620を包含し得る。いくつかの実施形態では、プローブハイブリダイゼーションによって、ハイブリダイズしたプローブの検出が可能になる。この方法はさらに、プローブの検出という次の工程1630を包含し得る。
図16は、アンプリコンの感度のよい検出のための方法について例示的なワークフロー1600を示しており、これには、反応混合物中でプローブベースのPCRアッセイを行う第一の工程1610を包含し、ここでこのプローブベースのPCRアッセイは、温度サイクリングを含み、このプローブは、PCR増幅反応の動態または有効性に対して有する影響が最小からゼロになるように設計されている。いくつかの実施形態では、このプローブは、PCR反応の間、テンプレート核酸にハイブリダイズしない。いくつかの実施形態では、このオリゴヌクレオチドプローブは、PCR反応の終了後にテンプレート核酸にハイブリダイズする。PCR反応の終わりは、標的ポリヌクレオチドへのプローブのハイブリダイゼーションを可能にする温度まで反応混合物を冷却することを可能にするという次の工程1620を包含し得る。いくつかの実施形態では、プローブハイブリダイゼーションによって、ハイブリダイズしたプローブの検出が可能になる。この方法はさらに、プローブの検出という次の工程1630を包含し得る。
(増幅)
いくつかの実施形態では、増幅は、核酸ポリメラーゼを利用して行われる。いくつかの実施形態では、この核酸ポリメラーゼはDNAポリメラーゼである。特定の実施形態では、DNAポリメラーゼは、熱安定性DNAポリメラーゼである。他の実施形態では、DNAポリメラーゼは、等温性増幅が可能である。例示的なDNAポリメラーゼは本明細書に記載されている。
いくつかの実施形態では、増幅は、核酸ポリメラーゼを利用して行われる。いくつかの実施形態では、この核酸ポリメラーゼはDNAポリメラーゼである。特定の実施形態では、DNAポリメラーゼは、熱安定性DNAポリメラーゼである。他の実施形態では、DNAポリメラーゼは、等温性増幅が可能である。例示的なDNAポリメラーゼは本明細書に記載されている。
いくつかの実施形態では、この反応混合物を、PCR増幅反応に供する。PCR増幅には、反復性の温度サイクリングを包含し得る。温度サイクリングは、自動化されたプロセスとして行われてもよい。この自動化されたプロセスは、PCRサーマルサイクラーを用いて行われてもよい。市販のサーマルサイクラーシステムとしては、とりわけ、Bio−Rad Laboratories、Life Technologies、Perkin−Elmerのシステムが挙げられる。
温度サイクリングは、変性、プライマーアニーリングおよびプライマー伸長という反復性の工程を通じてサイクリングする工程を包含し得る。3つの工程のための温度および時間は、例えば、変性について90〜100℃で5秒以上、アニーリング段階について50〜65℃で10〜60秒間、およびプライマー伸長については50〜75℃で15〜120秒であり得る。いくつかの実施形態では、プライマーアニーリングおよびプライマー伸長を、単一温度の工程(例えば、60℃)で組み合わせる。温度サイクリングの前、PCR反応は、ポリメラーゼを活性化するために「ホットスタート(hot−start)」開始段階を含んでもよい。この「ホットスタート」段階は、反応混合物を90〜100℃まで加熱する工程を包含し得る。反復サイクルの後、ユーザーはまた、PCR反応の一部として最終の伸長工程を包含し得る。この最終の伸長工程は、例えば、5、6、7、8、9、10、または10分超の間、50〜75℃の反応温度を含んでもよい。
温度サイクリングパラメータは、ユーザーによって設定され得る。いくつかの実施形態では、ユーザーは、温度サイクリングパラメータを、低Tmプローブのエンドポイント検出を可能にするように設定する。例えば、ユーザーは、反復性のサイクルが50℃より下でなんら温度工程を含まないように、温度サイクリングパラメータを設定し得る。このようなパラメータは、PCR反応の間に低Tmプローブのハイブリダイゼーションを最小化し得る。反復性のサイクルの後、ユーザーはまた、最終の伸長工程を含んでもよい。いくつかの実施形態では、この最終の伸長工程は、50℃より下ではない。特定の実施形態では、この最終の伸長工程は、約50〜75℃である。反復性のサイクルの後、ユーザーは、最終の伸長工程および/または冷却工程を含んでもよく、ここでは反応温度は、45℃未満、40℃未満、35℃未満、30℃未満、または25℃もしくはそれ未満まで低下される。いくつかの実施形態では、低Tmプローブは、冷却工程の間に、その標的テンプレート核酸にハイブリダイズする。このような場合、ユーザーは、標的アンプリコンのエンドポイント検出を行い得る。いくつかの実施形態では、冷却工程は、反応温度が一定速度で冷却される、制御冷却工程を包含し得る。この一定速度は、本明細書に記載され得る。このような場合、ユーザーは蛍光が検出される温度を気づき得る。いくつかの場合には、蛍光が検出される温度によって、標的核酸の変異状態に関してユーザーに情報が提供され得る。
図17は、本発明のエンドポイント検出方法に関する例示的なワークフロー1700を示しており、これは、複数の反応容積中でPCR反応を行うという第一の工程1710を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の反応容積は、蛍光性部分およびクエンチャー部分を含む、アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブ(例えば、低Tmプローブ)を含む。いくつかの実施形態では、このプローブは、PCRアニーリングまたは伸長段階の間、ハイブリダイズしていないままで保持されるように構成される。いくつかの実施形態では、PCR温度サイクリング段階は、低TmプローブのTmを上回ることが5℃未満である温度段階をなんら含まない。いくつかの実施形態では、PCR反応は、増幅生成物の生成を生じる。次の工程1720では、増幅生成物へのTmプローブのハイブリダイゼーションを可能にする温度まで、反応容積を冷却する。いくつかの実施形態では、低Tmプローブのその標的ポリヌクレオチドへの選択的なハイブリダイゼーションによって、プローブの検出可能部分からの蛍光発光の脱クエンチングが可能になる。次の工程1730では、検出可能蛍光を有する反応容積を列挙する。
あるいは、ユーザーは、反復性の熱サイクルへ冷却工程を導入してもよい。例えば、反復性のサイクルは、変性工程、アニーリング工程、伸長工程、および冷却工程を含んでもよい。別の実施例では、反復性のサイクルは、第一の変性工程、アニーリング工程、伸長工程、第二の変性工程、および冷却工程を含んでもよい。いくつかの実施形態では、この反復性のサイクルの冷却工程は、反応温度を、45℃未満、40℃未満、35℃未満、30℃未満、または25℃もしくはそれ未満まで下げる工程を包含する。いくつかの実施形態では、低Tmプローブは、冷却工程の間に、その標的テンプレート核酸にハイブリダイズする。このような場合、ユーザーは、各々の冷却工程の間に、ハイブリダイズしたプローブのレベルを検出することによって標的アンプリコンのリアルタイムPCR検出を行ってもよい。本明細書において用いる場合、「リアルタイムPCR」とは、ある量の検出可能シグナルがPCRの各々のサイクルでモニターされるPCR方法を指す。いくつかの実施形態では、検出可能シグナルが検出可能レベルに達するサイクルの閾値(Ct)が決定される。一般的には、Ct値が低いほど、問い合わされる対立遺伝子の濃度は大きい。リアルタイムPCRのためのシステムは、当該分野で公知であり、これには例えば、ABI 7700および 7900HT Sequence Detection Systems(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)が挙げられる。PCRの指数関数的段階の間のシグナルの増大は、変異体対立遺伝子を含むテンプレートの量の定量的測定を提供し得る。
図18は、リアルタイム検出を含む本発明の例示的な方法を示しており、これには、温度サイクリング反応混合物1801を含み、この混合物は、テンプレート核酸1802、フォワードプライマーおよびリバースプライマー(それぞれF1およびR1)、プローブ1803(蛍光部分Fおよびクエンチャー部分Qを含む、アンプリコンの感度のよい検出のため)、dNTP(示さず)、およびPCR反応を行うために必要な任意の他の反応成分(例えば、ポリメラーゼ(示さず))を含む。いくつかの実施形態では、プローブの蛍光性部分は、このプローブがハイブリダイズしていない状態である場合、クエンチされる(Fiによって示される)。PCR反応は、「ホットスタート」(示さず)によって開始されても、または開始されなくてもよい。温度サイクリングは、「ホットスタート」後に開始され得る。反復性の熱サイクルは、第一の変性段階1810を備えてもよく、これが、二本鎖テンプレート核酸を一本鎖テンプレート鎖1811および1812に変性する。この第一の変性段階の次には、プライマーアニーリング段階1820が続いてもよく、ここでは、フォワードプライマーおよびリバースプライマー(F1およびR1)が、それらの標的鎖1811および1812にハイブリダイズすることが可能になる。アニーリング段階の間、アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブ1803は一般には、その標的テンプレートに対して有意なハイブリダイゼーションを示さない。アニーリング段階の後に、伸長段階1830が続いてもよく、ここではポリメラーゼが、F1およびR1プライマーを伸長し、それによって、2コピーの標的ポリヌクレオチド1831および1832が生成される。この段階の間、アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブ1803は、一般には、テンプレート核酸にハイブリダイズしない。伸長段階の後には、第二の変性段階1840が続いてもよく、これが二本鎖テンプレート核酸を一本鎖テンプレート鎖1841に変性する。この第二の変性段階の後には、冷却段階、例えば、50℃未満まで冷却する工程、またはほぼ室温まで冷却する工程が続いてもよい。反応混合物を冷却することによって、標的ポリヌクレオチドに対する低Tmプローブのハイブリダイゼーションが可能になり得る。プローブのハイブリダイゼーションは、プローブの全伸長を生じ、かつクエンチャー部分の影響から検出可能部分を解放し得る(*Fで示される検出可能部分)。したがって、この検出可能部分は、各々の熱サイクルの間に検出され得る。
いくつかの実施形態では、変性の反復性のサイクル、プライマーアニーリング、およびプライマー伸長は、標的ポリヌクレオチドを含むアンプリコンの蓄積を生じる。アンプリコンは一本鎖であっても二本鎖であってもよい。検出可能なレベルのプローブのハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な標的ポリヌクレオチドを含む量のアンプリコンを蓄積するために、十分なサイクルを行ってもよい。得られた検出可能シグナルは、バックグラウンドシグナルよりも2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、または10000倍大きいか、または数桁大きくてもよい。
いくつかの実施形態では、PCR増幅反応は、指数関数的増幅反応である。指数関数的増幅を含む方法の例示的な実施形態は、図19に示される。出発の反応混合物または容積1901は、テンプレート核酸1902(二本鎖テンプレート核酸であってもよい)、プローブ1903(本明細書に記載のアンプリコンの感度のよい検出のためであって、このプローブ1903は、蛍光性部分およびクエンチャー部分を含む)、フォワードプライマーおよびリバースプライマー(F1およびR1)(標的ポリヌクレオチドを増幅するために設計された)、dNTP(示さず)、およびPCR反応を行うために必要な任意の他の反応成分(例えば、ポリメラーゼ,示さず)を含んでもよい。いくつかの実施形態では、プローブの蛍光性部分は、このプローブがハイブリダイズしていない状態である場合、クエンチされる(Fiによって示される)。PCR反応は、「ホットスタート」(示さず)によって開始されてもよいし、開始されなくてもよい。次いで、反応混合物は、温度サイクリングを開始し得る。各々の熱サイクルは、変性段階1910を含んでもよく、ここでは二本鎖テンプレート核酸が、部分的にまたは完全に、一本鎖1911および1912に変性される。一般的には、この変性段階の間、プライマーハイブリダイゼーションも、プローブハイブリダイゼーションも起こらない。変性後、アニーリング段階1920が開始されてもよく、ここではF1プライマーおよびR1プライマーは、標的ポリヌクレオチドの一本鎖にアニーリングする。この段階の間、アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブ1903は一般的には、テンプレート核酸にはハイブリダイズしない。アニーリング段階の後、伸長段階1930が開始されてもよく、ここではポリメラーゼがF1およびR1プライマーを伸長し、それによって2つのコピーの標的ポリヌクレオチド1931および1932が作成される。この段階の間、アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブ1903は一般的には、テンプレート核酸にハイブリダイズしない。したがって、熱サイクルの繰り返しによって、標的ポリヌクレオチドの指数関数的増幅が生じ得る。最終の反復性のサイクルの後、最終の変性工程1940が開始され得る。最終の変性工程は、完全にまたは部分的に、任意の二本鎖標的ポリヌクレオチドを一本鎖1941に変性し得る。最終の変性工程後、その反応混合物は、冷却工程1950で冷却され、例えば、50℃未満まで、またはほぼ室温まで冷却され得る。反応混合物を冷却する工程によって、最終の冷却された段階1960において標的ポリヌクレオチドに対する本発明のプローブのハイブリダイゼーションが可能になる。プローブのハイブリダイゼーションは、プローブの完全な伸長を生じ、かつクエンチャー部分の影響から検出可能部分を解放し得る。したがって、この検出可能部分が検出され得る。
いくつかの実施形態では、PCR増幅反応は線形増幅反応である。線形増幅を含む方法の例示的な実施形態は、図20に示される。出発反応混合物または容積2001は、テンプレート核酸2002(二本鎖テンプレート核酸であってもよい)、プローブ2003(本明細書に記載されるアンプリコンの感度のよい検出のためであって、このプローブ2003は、蛍光性部分およびクエンチャー部分を含む)、およびプライマーF1(鎖特異的方式で、標的ポリヌクレオチドを含む単一テンプレート鎖にハイブリダイズするように設計されている)、dNTP(示さず)、およびPCR反応を行うのに必要な任意の他の反応成分(例えば、ポリメラーゼ,示さず)を含んでもよい。いくつかの実施形態では、プローブの蛍光性部分は、このプローブがハイブリダイズしていない状態である場合、クエンチされる(Fiによって示される)。PCR反応は、「ホットスタート」(示さず)によって開始されてもよいし、開始されなくてもよい。次いで、反応混合物は、温度サイクリングを開始し得る。各々の熱サイクルは、変性段階2010を含んでもよく、ここでは二本鎖テンプレート核酸が、部分的にまたは完全に、一本鎖2011および2012に変性される。一般的には、この変性段階の間、プライマーハイブリダイゼーションも、プローブハイブリダイゼーションも起こらない。変性後、アニーリング段階2020が開始されてもよく、ここではF1プライマーが、標的ポリヌクレオチドの変性された鎖2012に対して鎖特異的な方式でアニーリングする。この段階の間、アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブ2003は一般的には、テンプレート核酸にはハイブリダイズしない。アニーリング段階の後、伸長段階2030が開始されてもよく、ここではポリメラーゼがF1プライマーを伸長し、それによって標的ポリヌクレオチド2031のコピーが作成される。この段階の間、アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブ2003は一般的には、テンプレート核酸にハイブリダイズしない。この段階の間、一本鎖2011は一般には増幅されない。したがって、変性、アニーリング、および伸長の熱サイクルの繰り返しによって、標的ポリヌクレオチドを含む一本鎖アンプリコン2041の線形の蓄積が生じ得る。一本鎖生成物2041の蓄積を生じ得る、温度サイクリングの終了の際、その反応混合物は、冷却工程2040で冷却され、例えば、50℃未満まで、またはほぼ室温まで冷却され得る。反応混合物を冷却する工程によって、最終の冷却された段階2050において標的ポリヌクレオチドに対する本発明のプローブのハイブリダイゼーションが可能になる。プローブのハイブリダイゼーションは、プローブの完全な伸長を生じ、かつクエンチャー部分の影響から検出可能部分を解放し得る。したがって、この検出可能部分が検出され得る。
いくつかの実施形態では、PCR増幅反応は、非対称のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)である。非対称のPCR反応は、最初の指数関数的増幅段階に続いて、線形の増幅段階を含んでもよい。いくつかの場合には、指数関数的増幅段階から線形増幅段階への移行は、反応混合物への反応成分の添加も、反応混合物からの成分の除去もなく生じる。いくつかの場合には、非対称のPCR反応には、反応混合物を反復性の熱サイクルに供する工程を包含し、ここではこの反応混合物は、ポリヌクレオチドテンプレート標的、PCRプライマーの対、dNTP、本発明のプローブ、および熱安定性ポリメラーゼを含む。この熱サイクルは、変性、プライマーアニーリングおよびプライマー伸長というPCR工程に相当し得、ここではPCR反応の発生では、PCRプライマー対は、制限プライマーおよび過剰のプライマーを含む。この過剰のプライマーは、制限プライマーよりも少なくとも2倍高い、少なくとも3倍高い、少なくとも4倍高い、少なくとも5倍高い、少なくとも10倍高い、少なくとも20倍高い、少なくとも30倍高い、少なくとも40倍高い、少なくとも50倍高い、少なくとも100倍高い、少なくとも200倍高い、少なくとも300倍高い、少なくとも400倍高い、少なくとも500倍高い、または少なくとも1000倍高い濃度で存在してもよい。この過剰のプライマーは、制限プライマーの濃度よりも2〜8×高い、5〜10×高い、10〜100×高い、100〜500×高い濃度で存在してもよい。
例えば、制限プライマーの出発モル濃度は、過剰なプライマーの出発モル濃度未満であってもよい。制限プライマーに対する過剰なプライマーの出発濃度の比は、少なくとも2:1、3:1、4:1、5:1、10:1、20:1、または100:1であってもよい。制限プライマーに対する過剰のプライマーの比は、5:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1、または100:1であってもよい。いくつかの実施形態では、その比は、20:1〜100:1の範囲である。
指数関数的増幅に続いて線形増幅を含む方法の例示的な実施形態は、図21に示される。出発反応混合物または容積2101は、テンプレート核酸2102(二本鎖テンプレート核酸であってもよい)、プローブ2103(本明細書に記載されるアンプリコンの感度のよい検出のためであって、本発明のプローブは、蛍光性部分およびクエンチャー部分を含む)、過剰プライマー2104、および制限プライマー2105(標的ポリヌクレオチドの反対鎖にハイブリダイズするように設計されている)、dNTP(示さず)、およびPCR反応を行うのに必要な任意の他の反応成分(例えば、ポリメラーゼ(示さず))を含んでもよい。いくつかの実施形態では、プローブの蛍光性部分は、このプローブがハイブリダイズしていない状態である場合、クエンチされる(Fiによって示される)。PCR反応は、「ホットスタート」(示さず)によって開始されてもよいし、開始されなくてもよい。次いで、この反応混合物は、温度サイクリングを開始し得る。各々の熱サイクルは、変性段階2110を含んでもよく、ここでは二本鎖テンプレート核酸が、部分的にまたは完全に、一本鎖2111および2112に変性される。一般的には、この変性段階の間、プライマーハイブリダイゼーションも、プローブハイブリダイゼーションも起こらない。変性後、アニーリング段階2120が開始されてもよく、ここではプライマー2104および2105が、標的ポリヌクレオチドの一本鎖に対してアニーリングする。この段階の間、アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブ2103は一般的には、テンプレート核酸にはハイブリダイズしない。アニーリング段階の後、伸長段階2130が開始されてもよく、ここではポリメラーゼがプライマー2104および2105を伸長し、それによって標的ポリヌクレオチド2131および2132の2つのコピーが作成される。この段階の間、アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブ2103は一般的には、テンプレート核酸にハイブリダイズしない。したがって、熱サイクルの繰り返しによって、標的ポリヌクレオチドの指数関数的増幅が、制限プライマー2105が消耗されるまで生じ得、その後に、熱サイクルが、標的ポリヌクレオチドの線形増幅を生じ得る。線形増幅の熱サイクルは、上記されるような変性、アニーリングおよび伸長という同じ反復性サイクルを含んでもよい。変性段階2140では、二本鎖の標的ポリヌクレオチド2131および2132が増幅され、一本鎖2141および2142に変性される。一般的には、この変性段階の間、プライマーハイブリダイゼーションも、プローブハイブリダイゼーションも起こらない。変性後、アニーリング段階2150が開始されてもよく、ここでは過剰のプライマー2104が、一本鎖2142に対してアニーリングする。この段階の間、アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブ2103は一般的には、テンプレート核酸にはハイブリダイズしない。アニーリング段階の後、伸長段階2160が開始されてもよく、ここではポリメラーゼがプライマー2104を伸長し、それによって標的ポリヌクレオチド2161のコピーが作成される。この段階の間、本発明のプローブは一般的には、テンプレート核酸にハイブリダイズしない。この段階の間、一本鎖2141は一般には増幅されない。したがって、熱サイクルの繰り返しによって、標的ポリヌクレオチドの線形増幅および一本鎖生成物2171の蓄積が生じ得る。一本鎖生成物2171の蓄積が生じる温度サイクリングの終了の際、その反応混合物は、冷却工程2180で冷却され、例えば、50℃未満まで冷却され、またはほぼ室温まで冷却され得る。反応混合物を冷却する工程によって、最終の冷却された段階2190において標的ポリヌクレオチドに対するプローブ2103のハイブリダイゼーションが可能になる。プローブのハイブリダイゼーションは、プローブの完全な伸長を生じ、かつクエンチャー部分の影響から検出可能部分を解放し得る。したがって、この検出可能部分が検出され得る(F*として示される)。
本明細書に記載される方法は、対立遺伝子の識別アッセイに用いられ得る。図22は、対立遺伝子の識別のための方法の例示的な実施形態を示す。図22、パネルAでは、反応混合物または反応容積は、テンプレート核酸、フォワードプライマーおよび必要に応じて遺伝子座を含む領域を増幅するために設計されたリバースプライマーを包含し得る。この遺伝子座は、変異を保有すると疑われ得る。この反応混合物はさらに、溶液中でフリーである場合、一般的には検出可能シグナルを発しない、アンプリコンの感度のよい検出のためのプローブを包含し得る。このプローブは、ある遺伝子座の特定の対立遺伝子を保有する標的に対して完全にマッチするように設計されている対立遺伝子特異的プローブであってもよい。工程2210では、PCR増幅は、完全にマッチした標的を含む複数のアンプリコンの生成を生じ得る。いくつかの場合には、このアンプリコンは、一本鎖アンプリコンを含む。いくつかの場合では、このアンプリコンは、二本鎖アンプリコンであってもよい。このような場合、PCR増幅後、二本鎖アンプリコンは、例えば、反応混合物を90〜100℃(示さず)まで加熱することによって、変性され得る。いくつかの場合では、PCR増幅サイクリングパラメータは、PCR反応の間、完全にマッチしたテンプレートに対するプローブのハイブリダイゼーションを最小化するように構成される。次の工程2220では、反応混合物を冷却して、完全にマッチした標的へのプローブのハイブリダイゼーションを可能にする。いくつかの場合には、プローブのハイブリダイゼーションは、検出可能部分とクエンチャーとの間の距離を増大し、検出可能部分の検出を可能にする。図22、パネルBでは、この標的は、遺伝子座の異なる対立遺伝子を保有する。したがって、この標的は、プローブに対してミスマッチである。工程2210では、PCR増幅は、ミスマッチの標的を含む複数のアンプリコンの生成を生じ得る。いくつかの場合には、このアンプリコンは、一本鎖アンプリコンを含む。いくつかの場合には、このアンプリコンは、二本鎖アンプリコンであってもよい。このような場合、PCR増幅後、二本鎖アンプリコンは、例えば、反応混合物を90〜100℃まで加熱することによって(示さず)変性され得る。いくつかの場合には、PCR増幅サイクリングパラメータは、PCR反応の間、テンプレートに対するプローブのハイブリダイゼーションを最小化するように構成される。次の工程2220では、反応混合物を冷却して、標的へのプローブのハイブリダイゼーションを可能にする。しかし、プローブ/テンプレートミスマッチに起因して、標的に対するプローブのハイブリダイゼーションは、減少されるか、および/または最小化され得る。このような場合、このプローブは、溶液中でかなりフリーのままであり、従ってクエンチされたままであり得る。いくつかの実施形態では、反応混合物は、複数のプローブを含み得る。特定の実施形態では、複数のプローブの各々のプローブは、ある遺伝子座の特異的な対立遺伝子に特異的である。いくつかの実施形態では、複数のプローブの各々のプローブは、プローブの他の部分とは検出可能に異なる別個の検出可能部分を含む。
図23は、対立遺伝子検出のためのデジタルPCR法の別の例示的な実施形態を示し、これは、(1)テンプレート結合領域、および(2)プローブ結合領域を含む、本明細書に記載されるようなオリゴヌクレオチドプライマーと組み合わせて、アンプリコンの感度のよい検出のために、本明細書で記載されるような低Tmプローブを利用する。図23では、反応混合物または反応容積は、野性型対立遺伝子2307または変異体対立遺伝子2308のいずれかを含む、テンプレート核酸2302を含んでもよい。この反応混合物はさらに、複数の対立遺伝子特異的なフォワードプライマーを含んでもよい。この対立遺伝子特異的なフォワードプライマーは、ある遺伝子座で変異を保有すると疑われる標的ポリヌクレオチド2302を増幅するように各々が設計された、第一の対立遺伝子特異的なフォワードプライマーFwd1(例えば、野性型対立遺伝子に特異的)、および少なくとも第二の対立遺伝子特異的なフォワードプライマーFwd2(例えば、変異体対立遺伝子に特異的)を含んでもよい。Fwd1は、テンプレート核酸2302に対して一般的にハイブリダイズしない野性型バーコード領域2305を含んでもよい。野性型バーコード領域2305は、野性型低Tmプローブに特異的にハイブリダイズするが、変異体低Tmプローブには実質的にハイブリダイズしない野性型バーコード配列を含んでもよい。Fwd1はさらに、標的ポリヌクレオチド2302に対してハイブリダイズするように設計されており、野性型対立遺伝子2307に相補的である3’末端で、またはその近位で(例えば、1〜3nt内で)ntを含む、テンプレート結合領域2306を含んでもよい。フォワードプライマーのうち1つは、変異を覆う部位で変異体対立遺伝子に相補的である変異体特異的なフォワードプライマーであってもよい。Fwd2は、テンプレート核酸に対して一般にはハイブリダイズしない変異体バーコード領域2310を含んでもよい。この変異体バーコード領域は、変異体低Tmプローブに特異的にハイブリダイズするが、野性型低Tmプローブには実質的にハイブリダイズしない、変異体バーコード配列を含んでもよい。Fwd2はさらに、標的ポリヌクレオチド2302にハイブリダイズするように設計されており、野性型対立遺伝子2308に対して相補的である3’末端で、またはその近位で(例えば、1〜3nt内で)ntを含む、テンプレート結合領域2311を含んでもよい。フォワードプライマーFwd1およびFwd2は各々がさらに、変異を覆うntに隣接するか、または1〜3ヌクレオチド内で意図的なミスマッチヌクレオチドを含んでもよい。しかし、いくつかの場合には、このフォワードプライマーは、変異を覆うntに隣接するか、または1〜3ヌクレオチド内で意図的なミスマッチヌクレオチドをさらに含むことはない。この反応混合物はさらに、野性型低Tmプローブ2303および変異体低Tmプローブ2309を含んでもよい。この野性型低Tmプローブ2303は、野性型バーコード領域2305の逆相補体に特異的にハイブリダイズするように設計されてもよい。変異体低Tmプローブ2309は、変異体バーコード領域2310の逆相補体に特異的にハイブリダイズするように設計されてもよい。野性型および変異体の低Tmプローブ2303および2309は、スペクトル的に別個のフルオロフォアF1およびF2を含んでもよい。この反応混合物はさらに、リバースプライマー(「Rev」)を含んでもよい。リバースプライマーは、限られた量で存在するフォワードプライマーの量と比較して過剰量で存在してもよい。この反応混合物はさらに、安定なDNAポリメラーゼ「Pol」、およびdNTPおよび増幅反応を行うための他の成分を含んでもよい。第一の工程では、テンプレートDNA分子は、上記の反応混合物と接触される。フォワードプライマーFwd1およびFwd2は、野性型対立遺伝子2307および/または変異体対立遺伝子2308のいずれかを含むテンプレートDNAにハイブリダイズし得る。したがって、2306の3’末端塩基と変異体対立遺伝子2308との間のミスマッチ、および2311の3’末端塩基と野性型対立遺伝子2307との間のミスマッチが存在する。次の工程では、DNAポリメラーゼ「Pol」は、2307野性型対立遺伝子を含むテンプレートDNAにアニーリングしたFwd1プライマーの効率的な伸長を促進し得るが、2308変異体対立遺伝子を含むテンプレートDNAに対してアニーリングするFwd1プライマーの効果的な伸長は促進しない(Fwd1と2308との間のより大きいミスマッチに起因)。同様に、ポリメラーゼ「Pol」は、2308変異体対立遺伝子を含むテンプレートDNAにアニーリングしたFwd2プライマーの効率的な伸長を促進し得るが、2307野性型対立遺伝子を含むテンプレートDNAに対してアニーリングされたFwd2プライマーの効果的な伸長は促進しない(Fwd2と2307との間のより大きいミスマッチに起因)。効率的な伸長は、野性型バーコード2305の逆相補体、または変異体バーコード2310の逆相補体を含む伸長生成物を生じる。第二の(かつ任意のその後の回の)増幅では、過剰のRevプライマーは、2305または2310のいずれかを含む伸長生成物に対してアニーリングし得(制限プライマーFwd1およびFwd2の伸長後)、バーコード2305または2310のいずれかを含む伸長生成物の線形増幅を促進し得る。増幅サイクルの間、野性型および変異体プローブ低−TMプローブ2303および2309は、バーコード2305および/または2310にハイブリダイズしない。増幅サイクルが完了した後、その反応混合物は、例えば、約25℃まで冷却されてもよく、それによってプローブ2303および2309を、それらのそれぞれのバーコード2305および2310にハイブリダイズすることが可能になる。それらのそれぞれのバーコード領域に対するプローブのハイブリダイゼーションは、それらのクエンチャー(Q)からフルオロフォアF1およびF2を放出し、フルオロフォアの蛍光を促進する。
(アンプリコンの感度のよい検出の適用)
本発明の方法およびキットは、被験体から単離された核酸の鋭敏かつ正確な分析のために用いられ得る。このような検出および分析は、限定するものではないが、診断および/または治療の目的を含む、広範囲の適用について有用であり得る。単なる例に過ぎないが、この検出方法は、被験体における変異の検出のため、被験体における疾患を診断するため、被験体における疾患進行をモニタリングするため、被験体における疾患の治療レジメンの選択における補助のため、被験体における疾患を標的化する治療の有効性を決定するため、または被験体における疾患進行を評価するために用いられ得る。例示的な被験体は、本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、被験体から単離された生物学的サンプル由来の核酸は、アンプリコンの感度のよい検出のために、本明細書に記載の方法および/またはキットを用いて分析される。
本発明の方法およびキットは、被験体から単離された核酸の鋭敏かつ正確な分析のために用いられ得る。このような検出および分析は、限定するものではないが、診断および/または治療の目的を含む、広範囲の適用について有用であり得る。単なる例に過ぎないが、この検出方法は、被験体における変異の検出のため、被験体における疾患を診断するため、被験体における疾患進行をモニタリングするため、被験体における疾患の治療レジメンの選択における補助のため、被験体における疾患を標的化する治療の有効性を決定するため、または被験体における疾患進行を評価するために用いられ得る。例示的な被験体は、本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、被験体から単離された生物学的サンプル由来の核酸は、アンプリコンの感度のよい検出のために、本明細書に記載の方法および/またはキットを用いて分析される。
例示的な生物学的サンプルは本明細書で記載されている。特定の実施形態では、このサンプルは腫瘍サンプルである。いくつかの実施形態では、この腫瘍サンプルは、プローブベースのアッセイの前に処理される。処理には、ホルマリン溶液中での固定、続いてパラフィン中への包埋(例えば、FFPEサンプルである)を包含し得る。処理は、代わりに、プローブベースのアッセイを行う前のサンプルの凍結を包含してもよい。いくつかの実施形態では、サンプルは、固定も凍結もされていない。未固定の未凍結のサンプルは、例に過ぎないが、核酸の保存のために構成された貯蔵溶液中に貯蔵されてもよい。
いくつかの実施形態では、非核酸物質は、酵素処理を用いて(例えば、プロテアーゼで)出発材料から取り除かれてもよい。サンプルは必要に応じてホモジナイゼーション、超音波処理、フレンチプレス、ダウンス(dounce)、凍結/解凍に供されてもよく、その後に遠心分離を続けてもよい。遠心分離によって、非核酸含有画分から核酸含有画分を分離してもよい。
核酸は、当該分野で公知の任意の手段を用いて生物学的サンプルから単離されてもよい。例えば、核酸は、液体抽出(例えば、Trizol、DNAzol)技術を用いて生物学的サンプルから抽出されてもよい。核酸はまた、市販のキット(例えば、Qiagen
DNeasyキット,QIAampキット,Qiagen Midiキット,QIAprepスピンキット)を用いて抽出されてもよい。
DNeasyキット,QIAampキット,Qiagen Midiキット,QIAprepスピンキット)を用いて抽出されてもよい。
核酸は、単なる例であるが、遠心分離を含む公知の方法によって濃縮してもよい。核酸は、精製の目的のために選択性の膜(例えば、シリカ)に結合され得る。核酸はまた、所望の長さのフラグメント、例えば、1000、500、400、300、200または100の塩基対の長さ未満であるフラグメントに関して富化されてもよい。サイズに基づくこのような富化は、例えば、PEG沈殿、電気泳動ゲルまたはクロマトグラフィー材料(Huberら、(1993)Nucleic Acids Res.21:1061〜6)、ゲル濾過クロマトグラフィー、TSKゲル(Katoら、(1984)J.Biochem,95:83〜86)を用いて行われてもよい(この刊行物は、参照によって本明細書に援用される)。
生物学的サンプルから抽出されたポリヌクレオチドは、当該分野で公知の任意の方法を用いて選択的に沈殿されても、濃縮されてもよい。
アンプリコンの感度のよい検出のために本明細書で記載されるプローブ、反応混合物、キット、方法、およびシステムは、被験体における疾患の評価で利用され得る。いくつかの実施形態では、この疾患は癌である。この方法は、目的の多数の遺伝子中の変異の存在または不在またはレベルを決定する工程を包含し得る。例えば、この方法は、目的の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、または200超の遺伝子中の変異の存在または不在またはレベルを決定する工程を包含し得る。この方法は、目的の1〜3、2〜5、4〜10、5〜20、10〜50、30〜100、50〜150、70〜200、または200超の遺伝子中の変異の存在または不在またはレベルを決定する工程を包含し得る。目的の遺伝子は、当該分野で公知の任意の癌関連遺伝子を包含し得る。癌関連遺伝子は本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子は、SNP、挿入、欠失、または転座を保有すると疑われる遺伝子である。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子は、コピー数変動を保有していると疑われる遺伝子である。
この方法は、遺伝子のサブセット中のコピー数変動の有無またはレベルを決定する工程を包含し得る。この方法は、参照遺伝子のセットに対して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、または50超の遺伝子、例えば、癌関連遺伝子中のコピー数変動を決定する工程を包含し得る。いくつかの場合には、この方法は、1つ以上の遺伝子(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、または19遺伝子)のコピー数変動を決定する工程を包含する。この遺伝子は、MET、FGFR1、FGFR2、FLT3、HER3、EGFR、mTOR、CDK4、HER2、RET、DDR2、AURKA、VEGFA、CDK6、JAK2、BRAF、およびSRCからなる群より選択され得る。いくつかの場合には、この方法は、EGFR、AURKA、VEGFA、FGFR1、CDK4、EFBB2、CDK6、JAK2、MET、BRAF、ERBB3、およびSRCからなる群より選択される1つ以上の遺伝子(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、または13遺伝子)のコピー数変動を決定する工程を包含し得る。この参照遺伝子は、例えば、HADH、ZFP3、RNasePであってもよい。癌を評価する方法は、本明細書に記載のようなアンプリコンの感度のよい検出のためのプローブを用いて、本明細書に記載のようなアンプリコンの感度のよい検出のためのプローブベースのアッセイを行う工程を包含し得る。
本発明の1つ以上の方法は、コピー数変動分析のために用いられ得る。コピー数変動に関する方法は、2つのアッセイを含んでもよい。この2つのアッセイは、標的アッセイであっても、参照アッセイであってもよい。この標的アッセイは、コピー数変動を保有すると疑われる標的領域に特異的なプライマー/プローブセットを利用し得る。参照アッセイは、コピー数変動を保有しないことが公知であるか、または疑われる参照領域について特異的であるプライマー/プローブセットを利用し得る。標的および参照領域は、同じ染色体上であっても、または異なる染色体上であってもよい。この標的領域は、任意の染色体中の領域、例えば、ヒト染色体第13、第18、第21、X、またはYの領域であってもよい。標的領域のコピー数変動は、当該分野で公知の任意の手段によって、例えば、推定の標的対参照の濃度の間の比によって、または標的対参照領域の濃度における相違の統計学的分析によって、推定され得る。
いくつかの実施形態では、癌を評価するための方法は、それを必要とするヒト被験体に由来するDNAサンプル中のVEGFA、EGFR、CDK6、MET、BRAF、FGFR1、JAK2、HER3、CDK4、HER2、SRC、およびAURKAからなる群より選択される12の遺伝子のコピー数変動の分析を包含する。いくつかの実施形態では、DNAサンプルは、腫瘍生検、または腫瘍DNAを保有すると疑われる組織生検由来である。いくつかの実施形態では、DNAサンプルは、被験体から単離された液体生物学的サンプル由来である。例示的な液体生物学的サンプルは、本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、DNAサンプルは、複数の反応混合物に分割される。DNAサンプルは、各々の反応混合物が、0−2のDNAテンプレート分子を含むように分割され得る。各々の反応混合物は、本明細書に記載されるようなアンプリコンの感度のよい検出のためのプライマー/プローブセットを含んでもよい。プライマー/プローブセットは、コピー数変動(例えば、遺伝子増幅)を有することが疑われる遺伝子内の目的の領域を増幅するように設計され得る。各々のプライマー/プローブセットは、フォワードプライマー、リバースプライマー、およびプローブを含んでもよい。特定の実施形態では、各々のプライマー/プローブセットは、あるプライマーを、限られた量のリバースプライマー(例えば、制限プライマー)に比較して過剰量で含む(例えば、過剰プライマー)。各々のプライマー/プローブセットは、過剰のプライマーと制限プライマーとの間に位置する領域に対して選択的にハイブリダイズするように設計されている低Tmプローブを含んでもよい。いくつかの実施形態では、コピー数変動を有していると疑われる領域はまた、公知の変異の部位を保有する。いくつかの実施形態では、低Tmプローブは、変異部位を覆うように設計される。いくつかの実施形態では、この低Tmプローブは、野性型対立遺伝子に対応するように設計される。いくつかの実施形態では、このTmプローブは、野性型対立遺伝子に対してよりも変異体対立遺伝子に対して多数のミスマッチを有するように設計される。いくつかの実施形態では、各々の反応混合物はまた、参照遺伝子についてプライマー/プローブセットを含む。この参照遺伝子は、例えば、RNaseP30、HADH、ZFP3であってもよい。いくつかの実施形態では、この参照プライマー/プローブセットは、フォワードプライマー、リバースプライマー、およびプローブを含む。特定の実施形態では、この参照プライマー/プローブセットは、過剰のプライマーおよび制限プライマー(参照遺伝子のある領域を増幅するように設計されている)を含む。いくつかの実施形態では、この参照プライマー/プローブセットはさらに、この過剰プライマーと制限プライマーとの間に位置する参照遺伝子のある領域に対してハイブリダイズするように設計されている低Tmプローブを含む。いくつかの実施形態では、分割された反応混合物は、増幅反応に供される。いくつかの実施形態では、この増幅反応は、PCRサイクルを包含し、ここではこのPCRサイクルは、低Tmプローブの実質的なアニーリングを生じる温度工程を包含しない。いくつかの実施形態では、十分な数のPCRサイクルを行って、制限プライマーを消費し、これによって、過剰なプライマーを利用する線形の増幅を生じる。いくつかの実施形態では、PCRサイクルの後、その反応混合物を、増幅生成物に対する低Tmプローブのアニーリングを可能にする温度まで冷却する。いくつかの実施形態では、低Tmプローブのアニーリング後、その反応混合物を、アニーリングした低Tmプローブの蛍光検出のために評価して列挙する。いくつかの実施形態では、CNVのコールを、評価および列挙に基づいて生成する。
いくつかの実施形態では、アンプリコンの感度のよい検出のための1つ以上の方法は、反応混合物および核酸サンプルを増幅の前に別個の容積に分割する工程を包含する。例えば、1つ以上の方法は、デジタルPCRを含んでもよい。分割/デジタルPCRのための方法、キット、およびシステムは本明細書に記載される。
(アンプリコンの感度のよい検出のためのキット)
また本発明では、アンプリコンの感度のよい検出のためのキットも提供される。キットは本明細書に記載のような1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを含んでもよい。いくつかの実施形態では、このプライマーおよび/またはプローブは、遺伝子座の個々の対立遺伝子を選択的に検出し得る。キットは、例えば、1つ以上のプライマー/プローブセットを含んでもよい。例示的なプライマー/プローブセットは、本明細書に記載されている。例えば、キットには、MET、FGFR1、FGFR2、FLT3、HER3、EGFR、mTOR、CDK4、HER2、RET、HADH、ZFP3、DDR2、AURKA、VEGFA、CDK6、JAK2、BRAF、SRCおよびRPP30のためのプライマー/プローブセットを含んでもよい。キットはさらに、1つ以上のプライマー/プローブセットの使用説明書、例えば、本発明の方法を行うための説明書を含んでもよい。いくつかの実施形態では、キットは、包装資材を含む。本明細書において用いる場合、「包装資材」という用語は、キットの構成要素を収容する物理的構造を指す。包装資材は、キットの構成要素の無菌性を維持し得、かつこのような目的のために通常用いられる資材(例えば、紙、段ボール、ガラス、プラスチック、ホイル、アンプルなど)から構成されてもよい。キットはまた、緩衝剤、防腐剤、またはタンパク質/核酸安定化剤を含んでもよい。キットはまた、本明細書に記載されるような反応混合物の他の構成要素を含んでもよい。例えば、キットは、本明細書に記載のような熱安定性DNAポリメラーゼの1つ以上のアリコート、および/またはdNTPの1つ以上のアリコートを含んでもよい。キットはまた、ある遺伝子座の個々の対立遺伝子を保有する既知量のテンプレートDNA分子のコントロールサンプルを含んでもよい。いくつかの実施形態では、このキットは、陰性のコントロールサンプル、例えば、ある遺伝子座の個々の対立遺伝子を保有するDNA分子を含まないサンプルを含む。いくつかの実施形態では、このキットは、陽性コントロールサンプル、例えば、遺伝子座の個々の対立遺伝子のうちの1つ以上の既知の量を含有するサンプルを含む。
また本発明では、アンプリコンの感度のよい検出のためのキットも提供される。キットは本明細書に記載のような1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを含んでもよい。いくつかの実施形態では、このプライマーおよび/またはプローブは、遺伝子座の個々の対立遺伝子を選択的に検出し得る。キットは、例えば、1つ以上のプライマー/プローブセットを含んでもよい。例示的なプライマー/プローブセットは、本明細書に記載されている。例えば、キットには、MET、FGFR1、FGFR2、FLT3、HER3、EGFR、mTOR、CDK4、HER2、RET、HADH、ZFP3、DDR2、AURKA、VEGFA、CDK6、JAK2、BRAF、SRCおよびRPP30のためのプライマー/プローブセットを含んでもよい。キットはさらに、1つ以上のプライマー/プローブセットの使用説明書、例えば、本発明の方法を行うための説明書を含んでもよい。いくつかの実施形態では、キットは、包装資材を含む。本明細書において用いる場合、「包装資材」という用語は、キットの構成要素を収容する物理的構造を指す。包装資材は、キットの構成要素の無菌性を維持し得、かつこのような目的のために通常用いられる資材(例えば、紙、段ボール、ガラス、プラスチック、ホイル、アンプルなど)から構成されてもよい。キットはまた、緩衝剤、防腐剤、またはタンパク質/核酸安定化剤を含んでもよい。キットはまた、本明細書に記載されるような反応混合物の他の構成要素を含んでもよい。例えば、キットは、本明細書に記載のような熱安定性DNAポリメラーゼの1つ以上のアリコート、および/またはdNTPの1つ以上のアリコートを含んでもよい。キットはまた、ある遺伝子座の個々の対立遺伝子を保有する既知量のテンプレートDNA分子のコントロールサンプルを含んでもよい。いくつかの実施形態では、このキットは、陰性のコントロールサンプル、例えば、ある遺伝子座の個々の対立遺伝子を保有するDNA分子を含まないサンプルを含む。いくつかの実施形態では、このキットは、陽性コントロールサンプル、例えば、遺伝子座の個々の対立遺伝子のうちの1つ以上の既知の量を含有するサンプルを含む。
(アンプリコンの感度のよい検出のためのシステム)
本発明ではまた、アンプリコンの感度のよい検出のためのシステムも提供される。いくつかの実施形態では、このシステムは、本明細書に記載のようなアンプリコンの感度のよい検出のための反応混合物を提供する。いくつかの実施形態では、この反応混合物は、DNAサンプルと混合されて、テンプレートDNAを含む。いくつかの実施形態では、このシステムはさらに、液滴発生装置(droplet generator)を設けており、これがテンプレートDNA分子、プローブ、プライマー、および他の反応混合物成分を油中水型エマルジョン中で複数の液滴に分割する。例示的な液滴発生装置は、本明細書に記載される。
本発明ではまた、アンプリコンの感度のよい検出のためのシステムも提供される。いくつかの実施形態では、このシステムは、本明細書に記載のようなアンプリコンの感度のよい検出のための反応混合物を提供する。いくつかの実施形態では、この反応混合物は、DNAサンプルと混合されて、テンプレートDNAを含む。いくつかの実施形態では、このシステムはさらに、液滴発生装置(droplet generator)を設けており、これがテンプレートDNA分子、プローブ、プライマー、および他の反応混合物成分を油中水型エマルジョン中で複数の液滴に分割する。例示的な液滴発生装置は、本明細書に記載される。
(実施例1)
図24は、被験体中で癌を評価するために用いられる方法を示す。被験体は、結腸鏡検査を行い、結腸腫瘍を保有することが発見される。腫瘍生検および血液採取は、0の時点で被験体から収集され、その被験体での結腸癌の診断を補助するのに用いられる。第一の血液採取からの腫瘍および正常細胞を配列決定した。配列決定によって、被験体の腫瘍中の3つの変異の存在が明らかになった。変異は、APC、KRAS、およびTP53の遺伝子における点変異であった。被験体の癌のステージを決定した。被験体は、腫瘍を除くために第一の処置(手術)を受けた。第一の処置の際、第二の血液採取を行った。これで被験体の腫瘍が転移したことを確認した。被験体は、その癌を管理するために第二の治療(化学療法)を施された。引き続く血液採取を行って、血液由来の無細胞DNA中の3つの遺伝子の変異状態を評価する。
図24は、被験体中で癌を評価するために用いられる方法を示す。被験体は、結腸鏡検査を行い、結腸腫瘍を保有することが発見される。腫瘍生検および血液採取は、0の時点で被験体から収集され、その被験体での結腸癌の診断を補助するのに用いられる。第一の血液採取からの腫瘍および正常細胞を配列決定した。配列決定によって、被験体の腫瘍中の3つの変異の存在が明らかになった。変異は、APC、KRAS、およびTP53の遺伝子における点変異であった。被験体の癌のステージを決定した。被験体は、腫瘍を除くために第一の処置(手術)を受けた。第一の処置の際、第二の血液採取を行った。これで被験体の腫瘍が転移したことを確認した。被験体は、その癌を管理するために第二の治療(化学療法)を施された。引き続く血液採取を行って、血液由来の無細胞DNA中の3つの遺伝子の変異状態を評価する。
(実施例2):結腸癌を有する被験体での腫瘍特異的な変異についての検証解析
KRAS G12A変異(mu)を保有しているNCI−H1573(CRL−5877)細胞株は、American Type Culture Collection(ATCC)の凍結ストックとして得た。ゲノムDNA(gDNA)は、製造業者の示唆したプロトコールに従って、市販されているキット(DNeasy Blood & Tissue キット,QIAGEN)を用いて細胞株材料から調製した。DNA濃度の推定は、OD260を測定することによって分光光度的に得た(NanoDrop1000,Thermo Fisher Scientific Inc.)。
KRAS G12A変異(mu)を保有しているNCI−H1573(CRL−5877)細胞株は、American Type Culture Collection(ATCC)の凍結ストックとして得た。ゲノムDNA(gDNA)は、製造業者の示唆したプロトコールに従って、市販されているキット(DNeasy Blood & Tissue キット,QIAGEN)を用いて細胞株材料から調製した。DNA濃度の推定は、OD260を測定することによって分光光度的に得た(NanoDrop1000,Thermo Fisher Scientific Inc.)。
NA18507細胞株由来のゲノムDNAを、野性型DNA(wt)の代用として用いて、精製されたストックとして得た(Coriell)。wt(30ng)およびmu(6ng)DNAを含む2マイクロリットルの混合物を、2×ddPCRスーパーミックス(プローブのため)、0.2uMの最終の各々のフォワードプライマー(wt:5’−AGATTACGCGGCAATAAGGCTCGGTTGGCATTGGATACTACTTGCCTACGCCACC−3’(配列番号1));mu:5’AATAGCTGCCTACATTGGGTTCGGTCGTAACTTAGGAACTCTTGCCTACGCCAGC−3’(配列番号2)、0.4uMのリバースプライマー(5’−CCTGCTGAAaAATGACTGAAT−3’(配列番号3))、および1uMの各々のレポータープローブ(wt:5’−HEX−CCAACCGAG/ZEN/CCTTATTGCCG−IABkFQ−3’(配列番号 4);mu:5’−FAM−AGTTACGAC/ZEN/CGAACCCAATGTAGG−IABkFQ−3’(配列番号5))から、20μlのddPCR反応ミックスへ、アセンブルした。次に、各々のPCR混合物を、製造業者の示唆に従って、QX100 ddPCRシステムを介して分析のために液滴に変換した。アニーリング温度を変更して、wt(HEX)およびmu(FAM)の液滴シグナルを分離して定量するための最適条件を決定した(図25)。得られたクラスターを、muまたはwtとして各々のクラスターのメンバーシップを割り当てるために、muのみ(26A)、wtのみ(26B)、または両方のプローブ(26C)を含むddPCR混合物を用いることによって、デコンボリューションした(図26)。
(実施例3):標的富化ライブラリー調製のためのDNAサンプル処理
断片化されたか、および/または損傷されたDNA(例えば、FFPEサンプル由来)の100ng(約33000ゲノム等価物)を、最初に、T4ポリヌクレオチドキナーゼ、1mMのATP、および15% PEG−8000(1×リガーゼ反応緩衝液中)の存在下で、で100ulの最終の反応容積で、修復酵素(Endo VIII、Fpg、およびUDG)のカクテルを使用して酸化型および無塩基部位を切り出すことによって修復して、DNAフラグメント(5’−リン酸塩および3’−OHで終わる)を生成した。
断片化されたか、および/または損傷されたDNA(例えば、FFPEサンプル由来)の100ng(約33000ゲノム等価物)を、最初に、T4ポリヌクレオチドキナーゼ、1mMのATP、および15% PEG−8000(1×リガーゼ反応緩衝液中)の存在下で、で100ulの最終の反応容積で、修復酵素(Endo VIII、Fpg、およびUDG)のカクテルを使用して酸化型および無塩基部位を切り出すことによって修復して、DNAフラグメント(5’−リン酸塩および3’−OHで終わる)を生成した。
修復されたDNAを、市販されているキット(GeneJet;Thermo Scientific)を用いて精製した。次いで、溶出したDNA(50ul)を、LPAおよびTris緩衝液(10mMのMg2+を含有)の存在下で、PEG−8000(最終20%)での沈殿を介して濃縮した。得られたペレットを0.5mlの70%エタノールで1回リンスして、5分間風乾した。
(実施例4):DNAフラグメントの5’アダプターライゲーション
上記のように調製された修復されたDNAを、2ulのヌクレアーゼフリーの水中に再懸濁した。次いで、修復されたDNAを、アルカリ(NaOHまたはKOH)での短い処理、続いて酢酸ナトリウムでの中和を通じて、完全に、または部分的にいずれかで化学的に変性させてもよく;または好ましくは氷上での急速冷却で熱変性させてもよい(95℃で3分)。
上記のように調製された修復されたDNAを、2ulのヌクレアーゼフリーの水中に再懸濁した。次いで、修復されたDNAを、アルカリ(NaOHまたはKOH)での短い処理、続いて酢酸ナトリウムでの中和を通じて、完全に、または部分的にいずれかで化学的に変性させてもよく;または好ましくは氷上での急速冷却で熱変性させてもよい(95℃で3分)。
修復されたDNAを、表2に示されるようなアデニル化反応混合物中で以下の成分を組み合わせることによって事前アデニル化した:
65℃で1時間のインキュベーション後、以下の成分(表2)をアデニル化反応混合物に添加した。追加のリガーゼの効果を試験するために、ライゲーション混合物に、2μlのリガーゼを添加するか、または追加のリガーゼは添加しなかった。
その反応は、65℃で1時間インキュベートし、続いて80℃で10分間、次いで95℃で3分熱不活性化した。次いで、1μlのプロテアーゼを添加して、その反応物を37℃で30分間インキュベートし、続いて75℃で15分間熱不活性化した。得られたライゲーション生成物を沈殿して、未反応のアダプターを取り除き、上記のように洗浄した。
(実施例5):3’末端アダプターライゲーション
実施例1で調製される修復されたDNA、または実施例2で調製された5’−適合したDNAライブラリーを、2μlのヌクレアーゼフリーの水に再懸濁した。次いで、これを、アルカリ(NaOHまたはKOH)での短い処理、続いて酢酸ナトリウムでの中和を通じて、完全に、もしくは部分的にいずれかで化学的に変性させてもよく;または好ましくは氷上での急速冷却で熱変性させてもよい(95℃で3分)。
実施例1で調製される修復されたDNA、または実施例2で調製された5’−適合したDNAライブラリーを、2μlのヌクレアーゼフリーの水に再懸濁した。次いで、これを、アルカリ(NaOHまたはKOH)での短い処理、続いて酢酸ナトリウムでの中和を通じて、完全に、もしくは部分的にいずれかで化学的に変性させてもよく;または好ましくは氷上での急速冷却で熱変性させてもよい(95℃で3分)。
3’アダプターDNAを、表4に示されるアデニル化反応混合物中で以下の成分を組み合わせて、事前アデニル化した。
65℃で1時間のインキュベーション後、以下の成分(表4)を、アデニル化反応混合物に添加した。変性されたDNAとは、実施例1で調製された修復DNA、または実施例2で調製された5’適合したDNAのいずれかを指す。追加のリガーゼの影響を試験するために、2μlのリガーゼをライゲーション混合物に添加するか、または追加のリガーゼをライゲーション混合物に添加しなかった。
反応物を65℃で1時間インキュベートし、続いて80℃で10分間、次に95℃で3分熱不活性化した。
1μlのプロテアーゼを添加し、その反応物を37℃で30分間インキュベートし、続いて75℃で15分間熱不活性化する。
得られたライゲーション生成物を、沈降させて、上記のように洗浄して未反応のアダプターを除き、0.1%のBSAを含有する10μlの1×NEB4中に再懸濁した。
(実施例6):ddPCRを介したライゲーションの有効性の定量
図27は、本明細書に記載のライゲーション方法の効率を定量するための方法の例示的な実施形態を示す。ビオチン化したオリゴヌクレオチド(5’または3’アダプター)に対する核酸分子(NA)のライゲーションは、上記のように行った。ライゲーション反応は、サンプル核酸に共有結合したビオチン化オリゴヌクレオチドを含むライゲーション生成物(ライゲーションしたNA)を生じ得、かつ可能性としてはまた、ライゲーションしていないサンプル核酸(未ライゲーションNA)も生じ得る。ライゲーション生成物は、20分間22,000gで遠心分離することによって沈降させた。上清を除去して、ペレットを5ulの0.1×TET緩衝液(1mMのTrisHCl、0.1mMのEDTA、0.05%のTween−20、pH=8)中に再懸濁した。再懸濁したペレットを、1×NEB+0.1%BSAおよび1×NEB4で事前洗浄した、ストレプトアビジンコンジュゲートの磁性粒子(MagCellect,R&D Systems,Minneapolis,MN)を含む、10μlのストレプトアビジン−磁性流体中で50μlの最終容積にさせた。室温で15分間のインキュベーション後、混合物を5分間磁化した。遊離であり、したがって連結されていないサンプル核酸を含む上清を除去した。ライゲーション生成物を含む残りの結合物質を50μlの1×NEB4+0.1%BSA中で再懸濁した。5マイクロリットルの結合した画分および未結合の画分を、RNaseP遺伝子の遺伝子座に対して設計されたtaqmanアッセイによってddPCRを介して問い合わせた。ライゲーション効率は、[結合シグナル]/([結合シグナル]+[未結合シグナル])として算出した。
図27は、本明細書に記載のライゲーション方法の効率を定量するための方法の例示的な実施形態を示す。ビオチン化したオリゴヌクレオチド(5’または3’アダプター)に対する核酸分子(NA)のライゲーションは、上記のように行った。ライゲーション反応は、サンプル核酸に共有結合したビオチン化オリゴヌクレオチドを含むライゲーション生成物(ライゲーションしたNA)を生じ得、かつ可能性としてはまた、ライゲーションしていないサンプル核酸(未ライゲーションNA)も生じ得る。ライゲーション生成物は、20分間22,000gで遠心分離することによって沈降させた。上清を除去して、ペレットを5ulの0.1×TET緩衝液(1mMのTrisHCl、0.1mMのEDTA、0.05%のTween−20、pH=8)中に再懸濁した。再懸濁したペレットを、1×NEB+0.1%BSAおよび1×NEB4で事前洗浄した、ストレプトアビジンコンジュゲートの磁性粒子(MagCellect,R&D Systems,Minneapolis,MN)を含む、10μlのストレプトアビジン−磁性流体中で50μlの最終容積にさせた。室温で15分間のインキュベーション後、混合物を5分間磁化した。遊離であり、したがって連結されていないサンプル核酸を含む上清を除去した。ライゲーション生成物を含む残りの結合物質を50μlの1×NEB4+0.1%BSA中で再懸濁した。5マイクロリットルの結合した画分および未結合の画分を、RNaseP遺伝子の遺伝子座に対して設計されたtaqmanアッセイによってddPCRを介して問い合わせた。ライゲーション効率は、[結合シグナル]/([結合シグナル]+[未結合シグナル])として算出した。
5’および3’アダプターライブラリー調製のライゲーション効率(実施例2および3)は、上記のように定量した。図28は、それぞれ、5’末端アダプターライゲーションおよび3’末端アダプターライゲーション反応についてのddPCRの結果を示す。図28の上のパネルに示す結果は、2工程の5’末端アダプターライゲーション反応(ここでアデニル化およびライゲーション工程が逐次的に行われる)は高度に効率的であった ことを示している。追加のリガーゼなしで、結合したシグナルの平均濃度は、45.35コピー/μlであったが、未結合シグナルの平均濃度は、4.505コピー/μlであって、このことは90.9%というライゲーション効率を示している。追加のリガーゼでは、結合したシグナルの平均濃度は、36.6コピー/μlであったが、未結合シグナルの平均濃度は、4.43コピー/μlであって、このことは、約89%というライゲーション効率を示している。
図28、底部のパネルに示す結果によって、2工程の3’末端アダプターライゲーション反応(ここではアデニル化およびライゲーション工程が連続して行われた)は高い効率であったことが示される。伝統的な1工程のライゲーション反応(ここでは、アデニル化およびライゲーション工程が1つの反応で同時に生じる)に関しては、結合されたシグナルの平均濃度は、14.25コピー/μlであったが、未結合シグナルの平均濃度は、36.55コピー/μlであって、このことは、28%というライゲーション効率を示している。対照的に、リガーゼのさらなる追加なしで行われた2工程の3’末端アダプターライゲーションについては、結合したシグナルの平均濃度は、73.75コピー/μlであって、一方未結合シグナルの平均濃度は、1.49コピー/μlであって、これは98%というライゲーション効率を示している。アデニル化後にリガーゼのさらなる追加なしで行われた2工程の3’末端アダプターライゲーションについては、結合したシグナルの平均濃度は、71.7コピー/μlであったが、一方未結合シグナルの平均濃度は、2.38コピー/μlであって、これは96.8%というライゲーション効率を示している。これらの結果から、アデニル化およびライゲーション反応を単一の反応混合物中で連続して行うことの可能性が実証された。さらに、2工程のプロセス(アデニル化およびライゲーションが単一の反応混合物中で別々に行われる)がライゲーション効率を大きく向上することが確認された。
別の驚くべき結果は、ATPだけでなく、リガーゼ濃度も、ライゲーション工程の開始の際に反応成分(例えば、水、緩衝液、PEG、Mn2+)のさらなる添加によって同じ程度まで希釈されるという事実にかかわらず、アデニル化後の反応混合物に対するリガーゼのさらなる添加が、ライゲーション効率を向上するとは思われないということである。理論で拘束されることは望まないが、アデニル化されているドナー核酸分子は、リガーゼ酵素に対して複合型のままである可能性がある。ATPの希釈およびアクセプター核酸分子の添加の際、複合型のリガーゼ酵素は、阻害から解放され得、アデニル化されている核酸分子に対するアクセプター核酸分子のライゲーションを触媒し得る。
(実施例7):ライゲーション効率に対するアダプター長およびPEG−8000の効果
サンプルDNAは、15または20%のPEG−8000を含む反応混合物中で実施例2に記載されるように調製され、アデニル化された。アデニル化後、長さ19nt、41nt、または61ntのアダプターが、実施例4に記載のようなアデニル化DNAに連結された。Mth RNAリガーゼまたはCircLigase IIのいずれも、ATP依存性RNAリガーゼとして用いられた。図29は、上記のライゲーション反応条件についてのddPCRの結果を示す。その結果によって、アダプター長がライゲーション効率に影響し得ること、およびCircLigase IIがRNAリガーゼとして用いられる場合、20%のPEG−8000が長い(例えば、61nt)アダプターライゲーション反応の効率を増大するために用いられ得ることが示される。
サンプルDNAは、15または20%のPEG−8000を含む反応混合物中で実施例2に記載されるように調製され、アデニル化された。アデニル化後、長さ19nt、41nt、または61ntのアダプターが、実施例4に記載のようなアデニル化DNAに連結された。Mth RNAリガーゼまたはCircLigase IIのいずれも、ATP依存性RNAリガーゼとして用いられた。図29は、上記のライゲーション反応条件についてのddPCRの結果を示す。その結果によって、アダプター長がライゲーション効率に影響し得ること、およびCircLigase IIがRNAリガーゼとして用いられる場合、20%のPEG−8000が長い(例えば、61nt)アダプターライゲーション反応の効率を増大するために用いられ得ることが示される。
(実施例8):ライゲーション効率に対する20%のPEG−8000におけるMn2+対インキュベーション温度の影響
サンプルDNAは、20%のPEG−8000を含む反応混合物中で、実施例4に記載の2工程アデニル化/ライゲーション方法を用いて調製され、アデニル化された。Mth
RNAリガーゼ、CircLigase II、またはT4 RNAリガーゼ(市販されているATP依存性RNAリガーゼに相当する)のいずれかを用いた。アデニル化およびライゲーション反応は、37、60、65、または70℃で各々1時間インキュベートした。そのライゲーション反応は、0、2.5mM、5mM、または7.5mMのMn2+の存在下で行った。図30は、上記のライゲーション反応条件についてddPCRの結果を示す。Y軸は、対数目盛で示される。したがって、Y軸のグリッド線(例えば、Y軸上に表示される)の間の距離よりも大きい、結合シグナル対フリーのシグナルのなんらかの相違は、90%以上のライゲーション効率を示す。これらの結果、全ての市販のATP依存性RNAリガーゼについて90%を超えるライゲーション効率を生じるように反応条件が仕立てられ得ること、およびMn2+がライゲーション工程を容易にすると思われることが示される。
サンプルDNAは、20%のPEG−8000を含む反応混合物中で、実施例4に記載の2工程アデニル化/ライゲーション方法を用いて調製され、アデニル化された。Mth
RNAリガーゼ、CircLigase II、またはT4 RNAリガーゼ(市販されているATP依存性RNAリガーゼに相当する)のいずれかを用いた。アデニル化およびライゲーション反応は、37、60、65、または70℃で各々1時間インキュベートした。そのライゲーション反応は、0、2.5mM、5mM、または7.5mMのMn2+の存在下で行った。図30は、上記のライゲーション反応条件についてddPCRの結果を示す。Y軸は、対数目盛で示される。したがって、Y軸のグリッド線(例えば、Y軸上に表示される)の間の距離よりも大きい、結合シグナル対フリーのシグナルのなんらかの相違は、90%以上のライゲーション効率を示す。これらの結果、全ての市販のATP依存性RNAリガーゼについて90%を超えるライゲーション効率を生じるように反応条件が仕立てられ得ること、およびMn2+がライゲーション工程を容易にすると思われることが示される。
(実施例9):3’末端適合したライブラリーの(任意の)線形増幅
実施例3によって調製された再懸濁された3’末端ライブラリーの5μlのアリコートを、線形増幅のために以下の混合物(表6)にアセンブルする:
実施例3によって調製された再懸濁された3’末端ライブラリーの5μlのアリコートを、線形増幅のために以下の混合物(表6)にアセンブルする:
適合したライブラリーは、以下のサイクリングパラメータによって増幅される:98℃で3分;98℃で10秒、68℃で10秒、72℃で5分、20サイクル;72℃で5分;4℃で保持。
完了の際、全体的な反応は、1×NEB4で、37℃で30分間事前洗浄された、ストレプトアビジン−コンジュゲートした磁性粒子(MagCellect,R&D Systems,Minneapolis,MN)を含む10μlのストレプトアビジン磁性流体とともにインキュベートする。
この溶液を、5分間磁化して、増幅されたライブラリーメンバーを含む溶液相を取り出す。
その溶液相を、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)を用いて抽出し、その水層を、1容積の5M NH4・酢酸、および1容積のイソプロパノールで沈殿させる。
−20℃で20分間インキュベーションした後、溶液を30分間、4℃で22,000gで遠心分離する。
得られたペレットを500μlの70%エタノールを用いて1回洗浄し、5分間風乾する。
(実施例10):オリゴ選択性仕上げ(リバース OS−seq)
単一の5’アダプター配列を含むDNAライブラリーのメンバーは、3’アダプター配列の標的選択性追加を受ける場合がある。所望の標的領域に対する3’アダプター配列の付加のための方法は、参照によって本明細書に援用される、例えば、米国特許出願公開第20120157322号に記載される。実施例4によって調製され、必要に応じて実施例9に応じて増幅された、5’適合したライブラリーを、以下の混合物に添加された、0.1%BSAを含む1×NEB4中に再懸濁する(表7):
単一の5’アダプター配列を含むDNAライブラリーのメンバーは、3’アダプター配列の標的選択性追加を受ける場合がある。所望の標的領域に対する3’アダプター配列の付加のための方法は、参照によって本明細書に援用される、例えば、米国特許出願公開第20120157322号に記載される。実施例4によって調製され、必要に応じて実施例9に応じて増幅された、5’適合したライブラリーを、以下の混合物に添加された、0.1%BSAを含む1×NEB4中に再懸濁する(表7):
上記の反応混合物を、以下のパラメータの下で変性して、アニーリングする:95℃で2分;95℃で10秒;−1℃/サイクル、0.1℃/s、24サイクル;72℃で30分。
次いで、アニーリングされた混合物を、以下のポリメラーゼ混合物を添加することによって伸長する(表8):
72℃で10分間のインキュベーション後、反応物を37℃にさせる。
次いで、未完成のフラグメントおよび伸長されていないオリゴヌクレオチドを、必要に応じて、Exonuclease IまたはExo−SAP ITを用いて30分間インキュベーションすることによって除去してもよい。
1μlのプロテアーゼを添加し、その反応物を30分間37℃インキュベートし、続いて75℃で15分熱不活性化する。
次いで、反応物を1容積の2×PEGppt溶液(1×NEB4,10ugのLPA,30%のPEG−8000)による沈降によって精製する。
(実施例11):増幅によるオリゴ選択性の仕上げ(リバースOS−seq)
実施例4に従って調製され、必要に応じて実施例9に従って増幅された5’適合したライブラリーを、実施例10に記載のようにアニーリングする。
実施例4に従って調製され、必要に応じて実施例9に従って増幅された5’適合したライブラリーを、実施例10に記載のようにアニーリングする。
72℃で10分間のインキュベーション後、生成物は、以下のサイクリングパラメータによって直ちに増幅される:98℃で10秒、68℃で10秒、72℃で2分、20サイクル;72℃で5分間;4℃で保持。
次いで、伸長した生成物を、伸長プライマーの添加によって二本鎖にする。
次いで、未完成のフラグメントおよび伸長されていないオリゴヌクレオチドを、Exonuclease IまたはExo−SAP ITでの30分間のインキュベーションによって取り除く。
1μlのプロテアーゼを添加し、その反応物を37℃で30分間インキュベートし、続いて75℃で15分間熱不活性化する。
次いで、反応物を1容積の2×PEGppt溶液(1×NEB4,10ugのLPA,30%のPEG−8000)による沈降によって精製する。
(実施例12):ライブラリーの環化
第一の末端で単一のアダプター配列を含むDNAライブラリーのメンバーは、ライブラリー環化方法を用いて第二の末端で第二のアダプター配列の標的選択性の添加を受ける場合がある。例示的なライブラリー環化方法は、参照によって本明細書に援用される、米国特許出願公開第20120003657号に記載される。3’末端適合したライブラリーフラグメントは、上記のように、非パリンドロームのヘキサマーを用いて調製される(例えば、米国特許出願公開第20120003657号に記載のとおり、3’アダプターとして。
第一の末端で単一のアダプター配列を含むDNAライブラリーのメンバーは、ライブラリー環化方法を用いて第二の末端で第二のアダプター配列の標的選択性の添加を受ける場合がある。例示的なライブラリー環化方法は、参照によって本明細書に援用される、米国特許出願公開第20120003657号に記載される。3’末端適合したライブラリーフラグメントは、上記のように、非パリンドロームのヘキサマーを用いて調製される(例えば、米国特許出願公開第20120003657号に記載のとおり、3’アダプターとして。
T7プロモーター配列および3’末端アダプターに相補的な3’オーバーハングを保有する、環化アダプター(米国特許出願公開第20120003657号における)を、10倍モル過剰で3’適合したライブラリーフラグメントにアニーリングする。
次いで、そのフラグメントを、T4 DNAリガーゼの追加によって連結し、標的領域保有環状生成物を作成する。あるいは、ポリメラーゼを用いて、標的領域保有環状生成物を作成してもよい。
直鎖状生成物を、ExoIIIおよびExoIのカクテルとのインキュベーションを通じて取り除く。
(実施例13):蛍光的に標識されたライブラリー
5’末端適合したライブラリーフラグメントを、実施例4において上記されたように、蛍光的に標識された(Cy3、Cy5、FAM、HEXなど)オリゴ−dTヘキサマーを、5’アダプターとして用いて調製する。得られたライゲーション生成物を、アレイCGHシステム、ビーズアレイシステムなどに対してハイブリダイズしてもよい。
5’末端適合したライブラリーフラグメントを、実施例4において上記されたように、蛍光的に標識された(Cy3、Cy5、FAM、HEXなど)オリゴ−dTヘキサマーを、5’アダプターとして用いて調製する。得られたライゲーション生成物を、アレイCGHシステム、ビーズアレイシステムなどに対してハイブリダイズしてもよい。
(実施例14):直接配列決定
3’末端ブロック基「x」(ジデオキシ−dNTP、ビオチン化など)で終わり、プライマー部位を保有している5’−アデニル化されたオリゴヌクレオチド(化学的にまたは酵素的に)、ならびに、表面結合オリゴヌクレオチドに相補的な領域(フローセルまたはビーズ)を、実施例3に記載のように、T4またはMthから、短縮されたまたは変異されたRNAリガーゼ2によって媒介される天然のDNAの3’末端に連結する:
5’−P−DNA−OH−3’+5’−Ad−アダプターB−x−3’=>5’−P−DNA−アダプターB−x−3’。
3’末端ブロック基「x」(ジデオキシ−dNTP、ビオチン化など)で終わり、プライマー部位を保有している5’−アデニル化されたオリゴヌクレオチド(化学的にまたは酵素的に)、ならびに、表面結合オリゴヌクレオチドに相補的な領域(フローセルまたはビーズ)を、実施例3に記載のように、T4またはMthから、短縮されたまたは変異されたRNAリガーゼ2によって媒介される天然のDNAの3’末端に連結する:
5’−P−DNA−OH−3’+5’−Ad−アダプターB−x−3’=>5’−P−DNA−アダプターB−x−3’。
次いで、この後に、RNAリガーゼまたはCircLigase(第二のプライマー部位を含む)および他の表面結合オリゴヌクレオチド(フローセルまたはビーズ)に相補的な領域を用いる第二のssDNAアダプターの連結を続け、直接配列決定され得る全長生成物を作成する。第二のライゲーションは、実施例2に記載のとおり行ってもよい:
5’−HO−アダプターA−OH−3’+5’−P−DNA−アダプターB−x−3’=>5’−HO−アダプターA−DNA−アダプターB−x3’。
5’−HO−アダプターA−OH−3’+5’−P−DNA−アダプターB−x−3’=>5’−HO−アダプターA−DNA−アダプターB−x3’。
あるいは、断片化されたDNAは、修復の際に脱リン酸化されてもよい(上記のとおり):
5’−P−DNA−OH−3’=>5’−HO−DNA−OH−3’
脱リン酸化および変性(アルカリまたは熱)の後、リン酸化アダプター(化学的にまたは酵素的に)は、CircLigaseを用いて、断片化されたDNAに連結され得る:
5’−HO−DNA−OH−3’+5’−P−アダプターB−x−3’ => 5’−HO−DNA−アダプターB−x−3’。
5’−P−DNA−OH−3’=>5’−HO−DNA−OH−3’
脱リン酸化および変性(アルカリまたは熱)の後、リン酸化アダプター(化学的にまたは酵素的に)は、CircLigaseを用いて、断片化されたDNAに連結され得る:
5’−HO−DNA−OH−3’+5’−P−アダプターB−x−3’ => 5’−HO−DNA−アダプターB−x−3’。
次いで、このアダプター修飾ライブラリーは、T4ポリヌクレオチドキナーゼで酵素的にリン酸化され得る:
5’−HO−DNA−アダプターB−x−3’=>5’−P−DNA−アダプターB−x−3’。
5’−HO−DNA−アダプターB−x−3’=>5’−P−DNA−アダプターB−x−3’。
次いで、第二のアダプターが、Circligaseによるライゲーションによって導入されてもよい:
5’−P−DNA−アダプターB−x−3’+5’−HO−アダプターA−OH−3’=>5’−HO−アダプターA−DNA−アダプターB−x−3’
次いで、得られたライブラリーメンバーを、以下のとおりIlluminaフローセルシステムまたはビーズベースのシステム(Ion−torrent/Roche 454)のいずれかを用いて直接配列決定してもよい。図31は、Illumina NGSプラットフォームを用いる配列決定の例示的な実施形態を示す。
5’−P−DNA−アダプターB−x−3’+5’−HO−アダプターA−OH−3’=>5’−HO−アダプターA−DNA−アダプターB−x−3’
次いで、得られたライブラリーメンバーを、以下のとおりIlluminaフローセルシステムまたはビーズベースのシステム(Ion−torrent/Roche 454)のいずれかを用いて直接配列決定してもよい。図31は、Illumina NGSプラットフォームを用いる配列決定の例示的な実施形態を示す。
(実施例15):標的配列の捕獲および富化のためのオリゴヌクレオチドプライマーの調製
一連のpythonスクリプトを作成して、核酸サンプルから標的配列の捕獲および富化のためのオリゴヌクレオチドプライマーのセットを生成した。下の表9に列挙される遺伝子に相当するエキソンの位置は、CCDSリリース15から整理した。
一連のpythonスクリプトを作成して、核酸サンプルから標的配列の捕獲および富化のためのオリゴヌクレオチドプライマーのセットを生成した。下の表9に列挙される遺伝子に相当するエキソンの位置は、CCDSリリース15から整理した。
重複するエキソン位置を有するエントリーを合併して、重複するエキソンにまたがる単一のエントリーを作成した。次いで、生成された座標を用いて、5’末端および3’末端の両方で600塩基のパッドを有する対応するヒト参照ゲノム構築物(GRCh37.p13)から配列を抽出した。次いで、エキソンに隣接するセンスおよびリバースの相補鎖の両方についてのオリゴヌクレオチド配列を、以下の基準にしたがって同定した:(1)10ヌクレオチド〜36ヌクレオチド長;(2)56〜60℃の間の70%画分アニーリング温度を保有すること;(3)30%〜70%のGC含量を保有すること;(4)4連続塩基未満のCまたはGホモポリマーストレッチを保有すること;(5)6以上のパリンドローム配列がないこと;(6)50%未満の自己相補性。エキソン隣接オリゴの同定の際、エキソン隣接オリゴヌクレオチドの間の距離が300超である場合、偶数の(+)および(−)のオリゴヌクレオチドプローブが作成され得るように、300塩基未満の最大のプローブ間距離が算出され、その領域が、最小の、目的の領域を分割する偶数のプローブを有するように、2つの隣接オリゴの間の領域がさらに分割される。これらの位置を用いてウインドウを検索し、上記で概説した基準に従ってオリゴヌクレオチドプローブを同定した。表X(上記)の遺伝子のエキソンに相当するセンス鎖およびアンチセンス鎖のおよそ300ntごとをタイル表示するように設計された捕獲配列を同定した(例えば、配列番号125〜1947)。
オリゴヌクレオチド捕獲配列を、標準的なバーコード化されたIllumina P5アダプター配列の3’末端に付加して、センスおよびリバースの相補鎖受容の固有バーコードを標的にする標的選択性オリゴヌクレオチド(TSO)プライマーのセットを作成した。例示的なTSOプライマーの図解を図32に示す。プライマーは、例えば、3’末端で2ホスホロチオエート結合および最後から2番目の塩基を用いる標準的なホスホロアミダイト化学を用いて個々に合成された(Integrated DNA Technologies)。TSOプライマーを、鎖によってプールした。全てのセンス鎖TSOを、TSO Set1プライマー(配列番号1948−3770)としてプールした。全てのリバース鎖TSOを、TSO Set2プライマー(配列番号 3771〜5593)としてプールした。
(実施例16):バーコード化による多重標的化配列決定
複数の精製されたDNAサンプルを同時に処理するために、以下のプロトコールを設計する。これらのサンプルは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織(FPET)材料から、新鮮凍結組織(FFT)から、または流体サンプル(例えば、全血または実質的に無細胞のサンプル、例えば、血漿または血清、尿、粘液などからもたらされ得る。サンプル中のDNAは、せん断によって断片化される。断片化されたDNAの平均長は、平均で約100〜500塩基対(bp)である。
複数の精製されたDNAサンプルを同時に処理するために、以下のプロトコールを設計する。これらのサンプルは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織(FPET)材料から、新鮮凍結組織(FFT)から、または流体サンプル(例えば、全血または実質的に無細胞のサンプル、例えば、血漿または血清、尿、粘液などからもたらされ得る。サンプル中のDNAは、せん断によって断片化される。断片化されたDNAの平均長は、平均で約100〜500塩基対(bp)である。
ステージ1:DNA修復(適切な時間1.5時間)
断片化されたDNAサンプルは、修復酵素ホルムアミドピリミジン[fapy]−DNAグリコシラーゼ)(Fpg,New England Biolabs)、ウラシル−DNAグリコシラーゼ(UDG,New England Biolabs)、エンドヌクレアーゼVIII(EndoVIII,New England Biolabs)、およびRNase 1f(New England Biolabs)を含む反応混合物中で混合する。次いでサンプルを37℃でインキュベートし、次いで製造業者の指示に従って、75℃で熱不活化する。この反応は、サンプルから損傷した塩基を除くように、かつ混入しているRNAを除くように働く。反応の完了の際に、次に、サンプルをT4ポリヌクレオチドキナーゼ(PNK,New England Biolabs)とともにインキュベートして、DNAフラグメントの5’末端をリン酸化する。PNK反応の完了の際、次にはサンプルを末端ヌクレオチジル(nucleotidtyl)トランスフェラーゼ(TdT)酵素(New England Biolabs)とともにインキュベートして、ジデオキシヌクレオチドの添加によってDNAフラグメントの3’ヒドロキシル基を保護する。
断片化されたDNAサンプルは、修復酵素ホルムアミドピリミジン[fapy]−DNAグリコシラーゼ)(Fpg,New England Biolabs)、ウラシル−DNAグリコシラーゼ(UDG,New England Biolabs)、エンドヌクレアーゼVIII(EndoVIII,New England Biolabs)、およびRNase 1f(New England Biolabs)を含む反応混合物中で混合する。次いでサンプルを37℃でインキュベートし、次いで製造業者の指示に従って、75℃で熱不活化する。この反応は、サンプルから損傷した塩基を除くように、かつ混入しているRNAを除くように働く。反応の完了の際に、次に、サンプルをT4ポリヌクレオチドキナーゼ(PNK,New England Biolabs)とともにインキュベートして、DNAフラグメントの5’末端をリン酸化する。PNK反応の完了の際、次にはサンプルを末端ヌクレオチジル(nucleotidtyl)トランスフェラーゼ(TdT)酵素(New England Biolabs)とともにインキュベートして、ジデオキシヌクレオチドの添加によってDNAフラグメントの3’ヒドロキシル基を保護する。
TdT反応の完了の際、5’側のホスフェートおよび保護された3’ヒドロキシル基を含む修復されたDNAフラグメントを磁性ビーズ(SeraMAG,Thermofisher)を用いて精製し、次いで、例えば、Droplet Digital PCR PrimePCR RPP30アッセイ(#100−31243)またはQubit ssDNAアッセイキット(Bioanalyzer/Experionシステムと組み合わせる)を用いて定量する。
サンプルDNAのアダプターライゲーション
精製され、かつ定量されたDNAサンプルを、サンプル特異的なバーコードを含むアダプターオリゴヌクレオチドに連結する。アダプターオリゴヌクレオチドは一般的には、図33に示される配列構造を有する。100−300ngの修復されたおよび5’リン酸化サンプルのDNAおよびアダプターを、95℃まで加熱することによって別のチューブ中で熱変性して、一本鎖サンプルDNAおよび一本鎖アダプターを生じる。次いで、サンプルssDNAを、CircLigase II、0.1mMのATP、15%のPEG−8000、および他の緩衝液成分を含むアデニル化反応混合物と混合する。次いで、サンプルDNAを含むアデニル化反応混合物を、65℃で少なくとも5分間インキュベートして、サンプルssDNAの高効率のアデニル化を達成する。その一方で、アダプターssDNAを、5mMのMnCl2、15%のPEG−8000、および他の緩衝液成分を含む希釈緩衝液と混合する。次いで、アダプターssDNAを含む希釈緩衝液を、65℃で少なくとも5分間インキュベートする。アデニル化反応の終了の際、アデニル化されているサンプルssDNAを、アダプターssDNAを含む希釈緩衝液で少なくとも10倍希釈する。この結果、0.01mMの最終ATP濃度および反応物に対するMn2+の添加を生じ、これが効率的にライゲーション反応を駆動して完了させる。サンプルssDNAに対する一本鎖アダプターのライゲーションによって、ssDNAライブラリーの作成が生じる。アデニル化およびライゲーション反応は一緒になって、ほぼ1.5時間で完了され得る。次いで、ssDNAライブラリーのメンバーは、磁性ビーズを用いて精製される(SeraMAG,ThermoFisher)。
精製され、かつ定量されたDNAサンプルを、サンプル特異的なバーコードを含むアダプターオリゴヌクレオチドに連結する。アダプターオリゴヌクレオチドは一般的には、図33に示される配列構造を有する。100−300ngの修復されたおよび5’リン酸化サンプルのDNAおよびアダプターを、95℃まで加熱することによって別のチューブ中で熱変性して、一本鎖サンプルDNAおよび一本鎖アダプターを生じる。次いで、サンプルssDNAを、CircLigase II、0.1mMのATP、15%のPEG−8000、および他の緩衝液成分を含むアデニル化反応混合物と混合する。次いで、サンプルDNAを含むアデニル化反応混合物を、65℃で少なくとも5分間インキュベートして、サンプルssDNAの高効率のアデニル化を達成する。その一方で、アダプターssDNAを、5mMのMnCl2、15%のPEG−8000、および他の緩衝液成分を含む希釈緩衝液と混合する。次いで、アダプターssDNAを含む希釈緩衝液を、65℃で少なくとも5分間インキュベートする。アデニル化反応の終了の際、アデニル化されているサンプルssDNAを、アダプターssDNAを含む希釈緩衝液で少なくとも10倍希釈する。この結果、0.01mMの最終ATP濃度および反応物に対するMn2+の添加を生じ、これが効率的にライゲーション反応を駆動して完了させる。サンプルssDNAに対する一本鎖アダプターのライゲーションによって、ssDNAライブラリーの作成が生じる。アデニル化およびライゲーション反応は一緒になって、ほぼ1.5時間で完了され得る。次いで、ssDNAライブラリーのメンバーは、磁性ビーズを用いて精製される(SeraMAG,ThermoFisher)。
標的富化(ほぼ2時間)
50−150ngのssDNAライブラリーのメンバーを、実施例15由来のTSO Set1プライマーまたはTSO Set2プライマーのいずれかの0.5μMを含む別々の増幅反応混合物中でインキュベートする。TSO Set1プライマーおよびTSO
Set2プライマーの分離によって、標的領域の線形の増幅のみが生じることを確実にする。増幅反応混合物はまた、高忠実度DNAポリメラーゼ(Phusion Hot Start II,Thermo Scientific)、dNTP、および増幅反応を行うのに必要な他の反応成分も含む。40サイクルの増幅は、サーモサイクラーを用いて行う。線形増幅によって、表Xの96の癌遺伝子のエキソンに相当する選択された標的領域の捕獲および富化が生じ、ここで各々の捕獲された標的領域は、第一の末端でサンプルインデックスバーコードを含む第一のアダプター、および他の末端で鎖特異的バーコードを含む第二のアダプターを含む。捕獲された標的は、本明細書に記載のとおり定量して、MiSeqシーケンサー(Illumina)での配列決定のために1nM(または12×106コピー/μL)に正規化する。
50−150ngのssDNAライブラリーのメンバーを、実施例15由来のTSO Set1プライマーまたはTSO Set2プライマーのいずれかの0.5μMを含む別々の増幅反応混合物中でインキュベートする。TSO Set1プライマーおよびTSO
Set2プライマーの分離によって、標的領域の線形の増幅のみが生じることを確実にする。増幅反応混合物はまた、高忠実度DNAポリメラーゼ(Phusion Hot Start II,Thermo Scientific)、dNTP、および増幅反応を行うのに必要な他の反応成分も含む。40サイクルの増幅は、サーモサイクラーを用いて行う。線形増幅によって、表Xの96の癌遺伝子のエキソンに相当する選択された標的領域の捕獲および富化が生じ、ここで各々の捕獲された標的領域は、第一の末端でサンプルインデックスバーコードを含む第一のアダプター、および他の末端で鎖特異的バーコードを含む第二のアダプターを含む。捕獲された標的は、本明細書に記載のとおり定量して、MiSeqシーケンサー(Illumina)での配列決定のために1nM(または12×106コピー/μL)に正規化する。
(実施例17):低Tmプローブ設計の評価
ゲノムDNAを、配列決定を介して決定されるとおり、APC遺伝子(c3916G>T)のコドン1306中で終止変異を保有することが公知の腫瘍サンプルから回収した。同様に、野性型DNA(NA18507)を、Coriellから入手した。両方のサンプルとも、RPP30を用いてddPCRで定量した。APC変異を標的にする種々のプローブ設計の能力を評価するため、一連のプローブを、下の表10に示されるように設計した。
ゲノムDNAを、配列決定を介して決定されるとおり、APC遺伝子(c3916G>T)のコドン1306中で終止変異を保有することが公知の腫瘍サンプルから回収した。同様に、野性型DNA(NA18507)を、Coriellから入手した。両方のサンプルとも、RPP30を用いてddPCRで定量した。APC変異を標的にする種々のプローブ設計の能力を評価するため、一連のプローブを、下の表10に示されるように設計した。
プローブを、下に示される表11に示されるようなddPCR反応混合物に組み込んで、液滴に形成した。
サーモサイクリングプロトコールは以下のとおりであった:
95℃で10分;95℃で30秒、58℃で1分、40サイクル;98℃で10分間;12℃で保持。
サーモサイクリング後、反応物を、QX100リーダーで分析した。図34、パネルAは、APC標的についての標準的な5’ヌクレアーゼプローブの使用を示す。図34、パネルBは、分析のためのプレアデス(Pleiades)プローブの3バージョンの使用を示し、これは標準的なヌクレアーゼアッセイに対して能力が劣っていることを示す。図34のパネルCは、ミニプローブの2バージョンの使用を示し、これは、野性型(緑)および変異体(青)のクラスターの分離によって示されるとおり、プレアデスプローブおよび標準的な5’ヌクレアーゼプローブに対して得られた高い特異性を示している。
ミニプローブの使用が十分な長さのプローブを必要とするだけだったか否かを決定するために、RNaseP遺伝子座(RPP30)に対する一対のプローブを以下のとおり設計した:
プローブは上記のとおり評価した。図34、パネルDに示すとおり、ミニプローブ(右のパネル)が、より高いバックグラウンドの蛍光を示したが、15マー対それより短い11マーのプレアデス(Pleiades)ベースのミニプローブのクエンチングが劣っていることにおそらく起因して、分離は、別個のクラスターを識別するのに十分であって、標準的な5’−ヌクレアーゼプローブに対して再現性の濃度コールを可能にする。
(実施例18):低Tmプローブおよびバーコード化されたプライマーを用いる対立遺伝子識別アッセイ
c.1799T>A(V600E)BRAF変異をアッセイするためのプライマー/プローブセットを生成して、試験した。試験した各々のプライマー/プローブセットは、共通のアンチセンスプライマーCATGAAGACCTCACAGTAAA(配列番号22)、野性型プローブHEX−TAAGGCTCGGTT−BHQ(配列番号23)、および変異体プローブFAM−TTGGGTTCGGTC−BHQ(配列番号24)を含んだ。野性型および変異体のセンスプライマーの種々の設計を試験した。全ての野性型センスプライマーは、バーコード配列GGCAATAAGGCTCGGTTGGCATTGG(配列番号25)(野性型プローブ配列に相当する)を含み、かつ全ての変異体センスプライマーは、バーコード配列ACATTGGGTTCGGTCGTAACTTAGGAA(配列番号26)(変異体プローブ配列に相当する)を含む。
c.1799T>A(V600E)BRAF変異をアッセイするためのプライマー/プローブセットを生成して、試験した。試験した各々のプライマー/プローブセットは、共通のアンチセンスプライマーCATGAAGACCTCACAGTAAA(配列番号22)、野性型プローブHEX−TAAGGCTCGGTT−BHQ(配列番号23)、および変異体プローブFAM−TTGGGTTCGGTC−BHQ(配列番号24)を含んだ。野性型および変異体のセンスプライマーの種々の設計を試験した。全ての野性型センスプライマーは、バーコード配列GGCAATAAGGCTCGGTTGGCATTGG(配列番号25)(野性型プローブ配列に相当する)を含み、かつ全ての変異体センスプライマーは、バーコード配列ACATTGGGTTCGGTCGTAACTTAGGAA(配列番号26)(変異体プローブ配列に相当する)を含む。
野性型特異的なセンスプライマーは、変異部位が究極点(0)または最後から2番目の(−1)塩基となるように、設計された。したがって、プライマーは、変異部位から1〜3nt離れて意図的なミスマッチを含むように、またはなんら追加のミスマッチを含まないように設計された。
以下のBRAF野性型センスプライマーを、下の表13によって設計した。
以下のBRAF変異体センスプライマーを、下の表14に従って設計した。
変異体を野性型種からこれらのプライマー/プローブセットを用いて識別する能力を、デジタルPCRによって評価した。20×ストックのプライマー/プローブセットは以下のとおり作成した。
サンプルDNAを調製するため、野性型(NA18507,Coriell)ゲノムDNA中の10%変異体(RKO−1,ATCC)の混合物を作成した(それぞれ、約250および約2500コピー/μl)。あるいは、野性型コントロール(全血から精製されたゲノムDNA)のバックグラウンドにおける変異体DNA(RKO−1)の希釈系列を作成した。
ddPCR反応を下の表16に示されるようにアセンブルした。
ddPCR反応混合物を、液滴に変換して、以下のパラメータに従ってC1000サーモサイクラー(Bio−rad)でサイクルした:95℃で10分;50〜60℃で1分、45サイクル;70℃で5分;4℃で保持。次いで、温度サイクルされた反応を、QX−100 ddPCRリーダーを用いてQuantasoft v1.4で分析した。結果を図35〜40に示す。図35〜図38の全てのパネルAのグラフについて、Y軸は、チャネル1蛍光(変異プローブの蛍光、FAM)の強度を示し、X軸は、チャネル2蛍光(野性型プローブの蛍光,HEX)の強度を示す。グリッドラインは、500強度単位ずつ離れており、XおよびY軸は3000強度単位で最大である。FAM蛍光陽性の液滴は、黒い楕円で囲み、HEX蛍光陽性の液滴は、灰色の楕円で囲み、HEXおよびFAMの両方について陽性である液滴は、並行斜線の陰影付きの楕円で囲まれる。図35〜38の全てのパネルBのグラフについて、濃い灰色のデータポイントは、変異体対立遺伝子の濃度をコピー/μlとして示し、淡い灰色のデータポイントは、野性型対立遺伝子の濃度をコピー/μlとして示す。
図35は、センスプライマーが、究極点(0)塩基で変異部位を覆うように、かつ変異部位(−1)に直接隣接する塩基でミスマッチを含むか、またはさらなるミスマッチを含まないように設計された、ddPCRアッセイからの結果を示す。究極点(0)塩基で変異部位を覆うように、かつ変異部位に隣接する1つのntミスマッチを有するように設計されたプローブは、野性型および変異種の識別可能なクラスターを生じ、低温度(例えば、−50〜−58℃)ではクラスターの分離は大きかった。
図36は、センスプライマーが、究極点(0)塩基で変異部位を覆うように、かつ変異部位(−2)から2塩基離れてミスマッチを含むか、またはさらなるミスマッチを含まないように設計された、ddPCRアッセイからの結果を示す。図36は、アッセイからの結果を示す。0塩基で変異を覆い、かつ−2塩基でTからCへの置換を含む、センスプライマーは、野性型および変異種の最も高度に識別可能なクラスターを、特に−50〜−54℃の温度範囲で生じた。図37〜図38では、最後から2番目の(−1)塩基で変異部位を覆うように設計されたプライマーは、行わず、同様に、究極点(0)塩基で変異部位を覆うプライマーも行わなかったことが示される。
BRAF ddPCRアッセイの検出限界を決定するために、野性型コントロール(全血から精製されたゲノムDNA)のバックグラウンド中の変異体DNA(RKO−1)の希釈系列は、希釈ごとに2倍薄めた変異体DNAで作成した。−BRAF_1799T_(0a:−2t>c)および−BRAF_1799T>A_(0a>t:−2c)の混合物からなるアッセイを用いて、54℃のアニーリング温度を用いて野性型DNAのバックグラウンド中の変異体BRAFゲノムDNAの混合物を代用した。図39〜図40によって、バーコードプライマーでのBRAF低Tmユニバーサルプローブの検出限界が示される。図39は、各々のサンプルについての野性型および変異体の濃度コールを示す。野性型濃度コールは、各々のサンプルについて約1700コピー/μlであった。各々の希釈されたサンプルについての変異体濃度コールは一貫して低下し、約1.81コピー/μlが定量の最下限であった。図40は、ddPCRアッセイによって決定された、野性型バックグラウンドにおける変異体DNAの豊富な画分を示す。図40では、ddPCRアッセイがBRAF変異体DNAの豊富な0.1%画分を検出し得ることが示される。
(実施例19):CNV ddPCRパネル
デジタルPCRプローブ/プライマーセットを、19個の癌遺伝子(MET、FGFR1、FGFR2、FLT3、HER3、EGFR、mTOR、CDK4、HER2、RET、HADH、ZFP3、DDR2、AURKA、VEGFA、CDK6、JAK2、BRAF、SRC)のコピー数変動をアッセイするために設計した。19個の癌遺伝子のうち、9個が、癌関連遺伝子増幅を示す領域内の変異も保有することが公知である(MET、FGFR2、EGFR、RET、DDR2、CDK6、JAK2、BRAF、SRC)。これらの9個の遺伝子について、プローブを、変異部位を覆うように、かつ変異体対立遺伝子に対してよりも野性型対立遺伝子に対して大きい相補性を有するように設計した。プローブ/プライマーセットはまた、ハウスキーピング遺伝子RNasePについても含まれた。CNVパネルについてのプローブ/プライマーセット、およびそれらが対応する遺伝子を、表17に示す。
デジタルPCRプローブ/プライマーセットを、19個の癌遺伝子(MET、FGFR1、FGFR2、FLT3、HER3、EGFR、mTOR、CDK4、HER2、RET、HADH、ZFP3、DDR2、AURKA、VEGFA、CDK6、JAK2、BRAF、SRC)のコピー数変動をアッセイするために設計した。19個の癌遺伝子のうち、9個が、癌関連遺伝子増幅を示す領域内の変異も保有することが公知である(MET、FGFR2、EGFR、RET、DDR2、CDK6、JAK2、BRAF、SRC)。これらの9個の遺伝子について、プローブを、変異部位を覆うように、かつ変異体対立遺伝子に対してよりも野性型対立遺伝子に対して大きい相補性を有するように設計した。プローブ/プライマーセットはまた、ハウスキーピング遺伝子RNasePについても含まれた。CNVパネルについてのプローブ/プライマーセット、およびそれらが対応する遺伝子を、表17に示す。
数値的な分析を行って、20,000区画のデジタルPCR実験についての最小入力要件を決定した。この分析によって、種々のレベルの腫瘍負荷を有するサンプルについて腫瘍集団内の標的遺伝子と参照遺伝子との間の濃度の2倍の相違を検出する能力を試験した。数的解析の結果を図39に示す。次いで、0.0001未満のp値(z−スコア≧3.891)を保証する有意差の上限および下限を、種々の入力濃度で決定した。0.0001未満のp値を有する標的遺伝子と参照遺伝子との間の濃度の2倍の相違が、40%の腫瘍負荷を有する組織サンプルに由来するDNAサンプル中で検出され得、ここではDNAサンプルは、0.06ng/μLのDNAに相当する、20コピー/μLのRNasePを含む(図41)。同様に、0.0001未満のp値を有する標的遺伝子と参照遺伝子との間の濃度の2倍の相違が、20%の腫瘍負荷を有する組織サンプルに由来するDNAサンプル中で検出され得、ここではDNAサンプルは、0.15ng/μLのDNAに相当する、50コピー/μLのRNasePを含む。2.2μLのサンプルをアッセイ容積22μLあたりに導入するので、CNV ddPCRアッセイでは、0.6ng/μLと同じ程度に少ない精製されたFPET DNA物質からの遺伝子増幅を検出し得ることが推定される。
CNVアッセイは、標的遺伝子μiの予想される値が参照遺伝子μjの予想される値と同じである場合、標的遺伝子iを「非増幅」に割り当てる。
ヌル仮説が満たされない場合、標的遺伝子iは、「増幅された」に割り当てられる。しかし、陽性および陰性のカウントの数は二項分布に従うので、採用の基準は、それぞれ標的遺伝子iおよび参照遺伝子j由来の陰性の液滴p_(i,neg)およびp_(j,neg)の割合に対するt検定の適用によって評価して、標準の(zi)スコアを導いてもよい。
ヌル仮説が満たされない場合、標的遺伝子iは、「増幅された」に割り当てられる。しかし、陽性および陰性のカウントの数は二項分布に従うので、採用の基準は、それぞれ標的遺伝子iおよび参照遺伝子j由来の陰性の液滴
の割合に対するt検定の適用によって評価して、標準の(zi)スコア:
を導いてもよい。
標準的なスコアzi≧3.891であるならば、標的遺伝子iは、p<0.0001(すなわち、99.99% CI)で「増幅される」。
BRAF遺伝子に関しては、アッセイは、X染色体上の領域にオフターゲット相同性を有する第7染色体上のBRAF遺伝子上の領域に対して設計される。したがって、観察されたBRAFの総濃度は、両方の標的の寄与である:
ここでmは、増幅倍数対参照値に相当し、nは、X染色体上のコピー数に相当する。これは、ポアソン空間中の期待値に関連し得る:
「正常な」サンプルについては、m=1である。X染色体上のBRAFについての偽遺伝子の存在に起因して、雄性に関してはn=0.5であり、雌性に関してはn=1である。したがって、BRAFの予期される「正常な」値は、1+n=1.5または2.0の場合に生じる。
標準的なスコアziが≧3.891であるならば、標的遺伝子iは、p<0.0001(すなわち、99.99%のCI)で「増幅される」。
(実施例20):有効な癌処置を選択するためのCNV ddPCRパネルの使用
ある患者は、転移性結腸癌を呈した。結腸癌は、患者の肝臓に転移した。5つの異なる種類の化学療法処置は、成功に至らなかった。癌性組織を含むことが疑われる肝生検を、患者から入手して新鮮凍結した。DNAを、肝生検から抽出して、定量した。次に患者由来のサンプルDNAを、表16(上記)に概説されるVEGFA、EGFR、CDK6、MET、BRAF、FGFR1、JAK2、HER3、CDK4、HER2、SRC、およびAURKAについてのプライマー/プローブセットを用いてddPCRに供した。PCRサーモサイクラー条件は、以下のとおりであった:95℃で10分(100%傾斜率)、続いて45サイクルの(95℃で30秒、60℃で60秒)、続いて70℃で5分、続いて25℃で保持。液滴をQuantasoftによって数え上げた。標的および参照遺伝子の濃度を、各々の遺伝子iについて以下の式を用いて算出した:
ある患者は、転移性結腸癌を呈した。結腸癌は、患者の肝臓に転移した。5つの異なる種類の化学療法処置は、成功に至らなかった。癌性組織を含むことが疑われる肝生検を、患者から入手して新鮮凍結した。DNAを、肝生検から抽出して、定量した。次に患者由来のサンプルDNAを、表16(上記)に概説されるVEGFA、EGFR、CDK6、MET、BRAF、FGFR1、JAK2、HER3、CDK4、HER2、SRC、およびAURKAについてのプライマー/プローブセットを用いてddPCRに供した。PCRサーモサイクラー条件は、以下のとおりであった:95℃で10分(100%傾斜率)、続いて45サイクルの(95℃で30秒、60℃で60秒)、続いて70℃で5分、続いて25℃で保持。液滴をQuantasoftによって数え上げた。標的および参照遺伝子の濃度を、各々の遺伝子iについて以下の式を用いて算出した:
ここで
は、陰性の液滴の割合であって、ここで
は、陰性の事象の数であり、
は、比率測定の標準偏差であり、
は、QuantaSoftによって決定された各々の遺伝子iの許容される事象の数であり、
かつ
は、比率測定の下限および上限である。
各々の種cの濃度は、以下の関係による濃度単位(コピー/μL)に変換された:
ここで、Vは、分画/液滴の容積である。
CNV ddPCRアッセイの結果を図42に示す。パネルAは、CNV癌遺伝子のうち12の濃度を示しており、パネルBは、患者のサンプル中の12の遺伝子のコピー数を示す。HER2遺伝子の劇的な増幅は、CNV ddPCRアッセイによって明らかになった。HER2増幅は、患者の医師に報告された。CNV ddPCRアッセイの結果に基づき、医師は、乳癌薬物T−DMIを処方した。図43は、化学療法処置レジメン1および2の後に撮った(パネルA)、化学療法処置レジメン3−5の後に撮った(パネルB)、T−DMIの2用量を投与された患者の後に撮った(パネルC)、およびT−DMIの3用量を投与された患者の後に撮った(パネルD)、患者の肝臓の画像スキャンを示す。パネルAは、癌性組織の指標である、肝臓における2つの暗いスポットを表す。パネルBでは、化学療法レジメン3〜5にかかわらず、癌増殖はサイズを劇的に増大したことが明らかになる。パネルCでは、T−DMIの2用量の後に、癌増殖が少なくとも約50%収縮したことが明らかになる。パネルDでは、T−DMIの3用量の後に、癌増殖が画像スキャンで検出不能であったことが明らかになる。
(実施例21):単一のアッセイを用いる、コピー数変動および遺伝子変異の検出
表1に示されるようなEGFRのCNVプライマー/プローブセットを用いて、癌患者サンプル中の変異体EGFRのコピー数変動および存在の両方をアッセイした。EGFRプローブは、癌関連変異を保有することが公知の部位を覆い、野性型対立遺伝子に対応する配列を有する。ddPCRは、上記のとおり行われた(例えば、実施例20を参照のこと)。図44、パネルAは、アッセイの結果を示す。EGFRプローブと変異体対立遺伝子との間のミスマッチのおかげで、このプローブは、変異体対立遺伝子に対して低い結合効率を有し、結果として識別可能に低い蛍光強度を有するddPCR液滴のクラスターを生じた。図44、パネルBは、アッセイからの定量結果を示す。EGFR陽性液滴の高強度のクラスターを、野性型として数え、EGFR陽性液滴の低強度クラスターは、変異体として数えた。サンプルは、総EGFR(wt+mu)の1μlあたり267コピーを含み、wtおよびmu EGFRの割合は等しいことが確認された。EGFRはまた、2から4.12へ2倍の遺伝子増幅も示した。
表1に示されるようなEGFRのCNVプライマー/プローブセットを用いて、癌患者サンプル中の変異体EGFRのコピー数変動および存在の両方をアッセイした。EGFRプローブは、癌関連変異を保有することが公知の部位を覆い、野性型対立遺伝子に対応する配列を有する。ddPCRは、上記のとおり行われた(例えば、実施例20を参照のこと)。図44、パネルAは、アッセイの結果を示す。EGFRプローブと変異体対立遺伝子との間のミスマッチのおかげで、このプローブは、変異体対立遺伝子に対して低い結合効率を有し、結果として識別可能に低い蛍光強度を有するddPCR液滴のクラスターを生じた。図44、パネルBは、アッセイからの定量結果を示す。EGFR陽性液滴の高強度のクラスターを、野性型として数え、EGFR陽性液滴の低強度クラスターは、変異体として数えた。サンプルは、総EGFR(wt+mu)の1μlあたり267コピーを含み、wtおよびmu EGFRの割合は等しいことが確認された。EGFRはまた、2から4.12へ2倍の遺伝子増幅も示した。
Claims (72)
- a.一本鎖核酸フラグメントを第一の一本鎖アダプター配列に連結する工程;
b.標的選択的オリゴヌクレオチド(TSO)を、該第一の一本鎖アダプター配列に連結した該一本鎖核酸フラグメントにハイブリダイズして、ハイブリダイゼーション生成物を作製する工程であって、該TSOは、
i.該一本鎖核酸フラグメントに選択的に相補的である配列、および
ii.第二の一本鎖アダプター配列
を含む工程;ならびに
c.該TSOを伸長させて、該TSOおよび該第一の一本鎖アダプター配列の逆相補体を含む伸長された鎖を生成する工程
を含む方法。 - 前記一本鎖核酸フラグメントが、5’ヌクレオチド一リン酸(NMP)を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記5’ヌクレオチド一リン酸が、アデノシン一リン酸(AMP)を含む、請求項2に記載の方法。
- 前記一本鎖核酸フラグメントが、DNAを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記一本鎖核酸フラグメントが、RNAを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第一の一本鎖アダプターが、DNAを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第一の一本鎖アダプターが、RNAを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記一本鎖核酸フラグメントが、50ヌクレオチド〜200ヌクレオチドを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記一本鎖核酸フラグメントが、200ヌクレオチド〜600ヌクレオチドを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記一本鎖核酸フラグメントが、500ヌクレオチド〜1000ヌクレオチドを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記一本鎖核酸フラグメントが、800ヌクレオチド〜2000ヌクレオチドを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記一本鎖核酸フラグメントが、50ヌクレオチド〜2000ヌクレオチドを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第一の一本鎖アダプター配列が、50ヌクレオチド〜200ヌクレオチドを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第一の一本鎖アダプター配列が、200ヌクレオチド〜600ヌクレオチドを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第一の一本鎖アダプター配列が、500ヌクレオチド〜1000ヌクレオチドを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第一の一本鎖アダプター配列が、800ヌクレオチド〜2000ヌクレオチドを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第一の一本鎖アダプター配列が、50ヌクレオチド〜2000ヌクレオチドを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記一本鎖核酸フラグメントが、3’末端ブロック基を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記末端ブロック基が、ジデオキシ−NTPを含む、請求項18に記載の方法。
- 末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)を使用して3’末端ブロック基を前記一本鎖核酸フラグメントに添加する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記NMPを前記一本鎖核酸フラグメントのうちの少なくとも10%に移動させる工程をさらに含む、請求項2に記載の方法。
- 前記NMPを前記一本鎖核酸フラグメントのうちの少なくとも50%に移動させる工程をさらに含む、請求項21に記載の方法。
- 前記一本鎖核酸フラグメントの5’末端をリン酸化する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記リン酸化する工程が、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(PNK)の使用を含む、請求項23に記載の方法。
- 前記一本鎖核酸フラグメントが、生物学的供給源から単離されたものである、請求項1に記載の方法。
- 工程a)が、Mn2+の存在下で行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記Mn2+の最終濃度が、2.5mM〜7.5mMである、請求項26に記載の方法。
- 複数の一本鎖核酸フラグメントを複数の第一の一本鎖アダプター配列に連結する工程をさらに含み、該複数の一本鎖核酸フラグメントを該連結する効率が、10%を超える、請求項1に記載の方法。
- 前記複数の一本鎖核酸フラグメントを前記連結する前記効率が、30%を超える、請求項28に記載の方法。
- 前記複数の一本鎖核酸フラグメントを前記連結する前記効率が、50%を超える、請求項28に記載の方法。
- 前記複数の一本鎖核酸フラグメントを前記連結する前記効率が、60%を超える、請求項28に記載の方法。
- 前記連結する工程が、ATP依存性リガーゼの使用を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記移動させる工程が、ATP依存性リガーゼの使用を含む、請求項21または22に記載の方法。
- 前記ATP依存性リガーゼが、RNAリガーゼを含む、請求項32または33に記載の方法。
- 前記ATP依存性リガーゼが、好熱性のRNAリガーゼを含む、請求項34に記載の方法。
- 前記ATP依存性リガーゼが、古細菌のRNAリガーゼを含む、請求項34に記載の方法。
- 前記古細菌のRNAリガーゼが、好熱性の古細菌に由来する、請求項36に記載の方法。
- 前記好熱性の古細菌が、Methanobacterium thermoautotrophicumを含む、請求項37に記載の方法。
- 前記RNAリガーゼが、MthRnlを含む、請求項34に記載の方法。
- 前記RNAリガーゼが、T4 RNAリガーゼを含む、請求項34に記載の方法。
- 前記RNAリガーゼが、Thermus scotoductus bacteriophage TS2126のリガーゼを含む、請求項34に記載の方法。
- 前記RNAリガーゼが、Thermus scotoductus bacteriophage TS2126のリガーゼ1を含む、請求項34に記載の方法。
- 前記RNAリガーゼが、好熱性のRNAリガーゼを含む、請求項34に記載の方法。
- 前記連結する工程が、前記NMPを含む前記一本鎖核酸フラグメントの5’末端を前記第一の一本鎖アダプター配列の3’末端に連結することを含む、請求項2に記載の方法。
- 工程a)が反応混合物中で行われ、前記反応混合物中のリガーゼの量が、該反応混合物中の前記一本鎖核酸フラグメントの量に対して少なくとも等モルである、請求項1に記載の方法。
- 前記第一の一本鎖アダプター配列が、前記一本鎖核酸フラグメントの5’末端に連結されている、請求項1に記載の方法。
- 前記第二のアダプター配列が、前記TSOの5’末端にある、請求項1に記載の方法。
- 前記一本鎖核酸フラグメントおよび前記TSOが、反応混合物中で浮遊性である、請求項1に記載の方法。
- 工程a)の前に、二本鎖核酸フラグメントを変性させて、前記一本鎖核酸フラグメントを生成する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記二本鎖核酸フラグメントがDNAを含む、請求項49に記載の方法。
- 二本鎖核酸を断片化して前記二本鎖核酸フラグメントを生成する工程をさらに含む、請求項49に記載の方法。
- 前記二本鎖核酸フラグメントが、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)サンプルに由来する、請求項49に記載の方法。
- 前記二本鎖核酸フラグメントが、全血、血漿、血清、腹水、脳脊髄液、汗、尿、涙、唾液、口腔試料、体腔すすぎ液および臓器すすぎ液からなる群から選択される液体サンプルに由来する、請求項49に記載の方法。
- 前記液体サンプルが血漿サンプルを含む、請求項53に記載の方法。
- 前記液体サンプルが、脳脊髄サンプルを含む、請求項53に記載の方法。
- 前記二本鎖核酸フラグメントが、凍結サンプル由来である、請求項49に記載の方法。
- 前記二本鎖核酸フラグメントが、腫瘍サンプル由来である、請求項49に記載の方法。
- 前記伸長させる工程が、校正DNAポリメラーゼを使用して行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記第一の一本鎖アダプターが、バーコード配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第一の一本鎖アダプター配列が、固体支持体に固定されたオリゴヌクレオチド配列に少なくとも70%同一である配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第一の一本鎖アダプター配列が、配列決定プライマーに対して少なくとも70%同一である配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第二の一本鎖アダプター配列が、固体支持体に固定されたオリゴヌクレオチド配列に少なくとも70%同一である配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第二の一本鎖アダプター配列が、配列決定プライマーに対して少なくとも70%同一である配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第一の一本鎖アダプターに連結させた前記一本鎖核酸フラグメント由来の前記伸長された鎖を変性させる工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記伸長された鎖を第一の表面結合オリゴヌクレオチドと接触させる工程をさらに含む、請求項64に記載の方法。
- 前記伸長された鎖を増幅する工程をさらに含む、請求項64に記載の方法。
- 前記増幅が、架橋ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含む、請求項66に記載の方法。
- 前記伸長された鎖を配列決定する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記配列決定する工程が、リバーシブル・ターミネーターdNTPの組み込みを含む、請求項68に記載の方法。
- 前記一本鎖核酸フラグメントが、ゲノム領域を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記一本鎖核酸フラグメントが、癌関連遺伝子由来のエキソンを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記癌関連遺伝子が、ABCA1、BRAF、CHD5、EP300、FLT1、ITPA、MYC、P1K3R1、SKP2、TP53、ABCA7、BRCA1、CHEK1、EPHA3、FLT3、JAK1、MYCL1、PIK3R2、SLC19A1、TP73、ABCB1、BRCA2、CHEK2、EPHA5、FLT4、JAK2、MYCN、PKHD1、SLC1A6、TPM3、ABCC2、BRIP1、CLTC、EPHA6、FN1、JAK3、MYH2、PLCB1、SLC22A2、TPMT、ABCC3、BUB1B、COL1A1、EPHA7、FOS、JUN、MYH9、PLCG1、SLCO1B3、TPO、ABCC4、C1orf144、COPS5、EPHA8、FOXO1、KBTBD11、NAV3、PLCG2、SMAD2、TPR、ABCG2、CABLES1、CREB1、EPHB1、FOXO3、KDM6A、NBN、PML、SMAD3、TRIO、ABL1、CACNA2D1、CREBBP、EPHB4、FOXP4、KDR、NCOA2、PMS2、SMAD4、TRRAP、ABL2、CAMKV、CRKL、EPHB6、GAB1、KIT、NEK11、PPARG、SMARCA4、TSC1、ACVR1B、CARD11、CRLF2、EPO、GATA1、KLF6、NF1、PPARGC1A、SMARCB1、TSC2、ACVR2A、CARM1、CSF1R、ERBB2、GLI1、KLHDC4、NF2、PPP1R3A、SMO、TTK、ADCY9、CAV1、CSMD3、ERBB3、GLI3、KRAS、NKX2−1、PPP2R1A、SOCS1、TYK2、AGAP2、CBFA2T3、CSNK1G2、ERBB4、GNA11、LMO2、NOS2、PPP2R1B、SOD2、TYMS、AKT1、CBL、CTNNA1、ERCC1、GNAQ、LRP1B、NOS3、PRKAA2、SOS1、UGT1A1、AKT2、CCND1、CTNNA2、ERCC2、GNAS、LRP2、NOTCH1、PRKCA、SOX10、UMPS、AKT3、CCND2、CTNNB1、ERCC3、GPR124、LRP6、NOTCH2、PRKCZ、SOX2、USP9X、ALK、CCND3、CYFIP1、ERCC4、GPR133、LTK、NOTCH3、PRKDC、SP1、VEGF、ANAPC5、CCNE1、CYLD、ERCC5、GRB2、MAN1B1、NPM1、PTCH1、SPRY2、VEGFA、APC、CD40LG、CYP19A1、ERCC6、GSK3B、MAP2K1、NQO1、PTCH2、SRC、VHL、APC2、CD44、CYP1B1、ERG、GSTP1、MAP2K2、NR3C1、PTEN、ST6GAL2、WRN、AR、CD79A、CYP2C19、ERN2、GUCY1A2、MAP2K4、NRAS、PTGS2、STAT1、WT1、ARAF、CD79B、CYP2C8、ESR1、HDAC1、MAP2K7、NRP2、PTPN11、STAT3、XPA、ARFRP1、CDC42、CYP2D6、ESR2、HDAC2、MAP3K1、NTRK1、PTPRB、STK11、XPC、ARID1A、CDC42BPB、CYP3A4、ETV4、HGF、MAPK1、NTRK2、PTPRD、SUFU、ZFY、ATM、CDC73、CYP3A5、EWSR1、HIF1A、MAPK3、NTRK3、RAD50、SULT1A1、ZNF521、ATP5A1、CDH1、DACH2、EXT1、HM13、MAPK8、OMA1、RAD51、SUZ12、ATR、CDH10、DCC、EZH2、HMGA1、MARK3、OR10R2、RAFT、TAF1、AURKA、CDH2、DCLK3、FANCA、HNF1A、MCL1、PAK3、RARA、TBX22、AURKB、CDH20、DDB2、FANCD2、HOXA3、MDM2、PARP1、RB1、TCF12、BAI3、CDH5、DDR2、FANCE、HOXA9、MDM4、PAX5、REM1、TCF3、BAP1、CDK2、DGKB、FANCF、HRAS、MECOM、PCDH15、RET、TCF4、BARD1、CDK4、DGKZ、FAS、HSP90AA1、MEN1、PCDH18、RICTOR、TEK、BAX、CDK6、DIRAS3、FBXW7、IDH1、MET、PCNA、RIPK1、TEP1、BCL11A、CDK7、DLG3、FCGR3A、IDH2、MITF、PDGFA、ROR1、TERT、BCL2、CDK8、DLL1、FES、IFNG、MLH1、PDGFB、ROR2、TET2、BCL2A1、CDKN1A、DNMT1、FGFR1、IGF1R、MLL、PDGFRA、ROS1、TGFBR2、BCL2L1、CDKN1B、DNMT3A、FGFR2、IGF2R、MLL3、PDGFRB、RPS6KA2、THBS1、BCL2L2、CDKN2A、DNMT3B、FGFR3、IKBKE、MPL、PDZRN3、RPTOR、TNFAIP3、BCL3、CDKN2B、DOT1L、FGFR4、IKZF1、MRE11A、PHLPP2、RSPO2、TNKS、BCL6、CDKN2C、DPYD、FH、IL2RG、MSH2、PIK3C3、RSPO3、TNKS2、BCR、CDKN2D、E2F1、FHOD3、INHBA、MSH6、PIK3CA、RUNX1、TNNI3K、BIRC5、CDX2、EED、FIGF、INSR、MTHFR、PIK3CB、SDHB、TNR、BIRC6、CEBPA、EGF、FLG2、IRS1、MTOR、PIK3CD、SF3B1、TOP1、BLM、CERK、EGFR、FLNC、IRS2、MUTYH、PIK3CG、SHC1およびTOP2Aからなる群より選択される、請求項71に記載の方法。
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