TW202035699A - 用於檢測樣本中的核酸的數位聚合酶連鎖反應方法 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及一種檢測樣品中核酸(NA)分子之方法。更具體而言，本發明涉及一種用於檢測特定核酸序列的改良的基於數位PCR之方法。本發明可用於研究及診斷應用，具提高的靈敏度及準確性。本發明還提供一種套組，用於執行本文所述之評估樣品中核酸之方法。

Description

用於檢測樣品中的核酸的數位聚合酶連鎖反應方法
相關申請案。本案根據美國專利法第119條(35 U.S.C. §119)主張於2018年10月9日提出申請之美國臨時申請案第62/743,149號之權益，其全部內容透過引用合併於本文。
本發明涉及一種檢測樣品中核酸(nucleic acid，NA)分子之方法。更具體而言，本發明涉及一種用於分析核酸片段的改良的基於數位PCR之方法。本發明可用於研究及診斷應用，具提高的靈敏度及準確性。本發明還提供一種套組，用於執行本文所述之檢測樣品中核酸之方法。
已經針對許多研究及診斷應用開發了用於核酸檢測的各種技術。數位聚合酶連鎖反應(digital polymerase chain reaction，dPCR)被認為是分析基因複製數變異(copy number variations，CNVs)、基因表現、遺傳突變及單核苷酸多型性(single-nucleotide polymorphisms，SNPs)的最精密的定量方法之一。它的受歡迎程度不斷提高。許多公司已經設計了公司特定的實驗方法，硬體及軟體應用程式(Dong等人，2015年；Morley，2014年；Zhao等人，2016年)。
最普遍的模型是基於液滴以及基於滴定盤的數位PCR方法。目前基於液滴的數位PCR是由Bio-Rad公司所販售。QX200 Droplet Digital PCR (ddPCR)儀是Bio-Rad公司最近販售的產品，是結合微流控與界面活性劑化學技術將PCR反應分為油包水液滴以進行絕對核酸定量的最先進模型之一 (Hindson等人，2011年)。這種方法允許每次運行每個樣品分析近20,000奈升大小的液滴，使其成為同類儀器中最有效之方法。另一方面，以Qiagen公司 (http://www.captodayonline.com/high-throughput-digital-pcr-system-1017/)為例，基於滴定盤的數位PCR在滴定盤上進行反應。對於這種方法，將DNA分子稀釋並分配到例如96孔滴定盤中，以進行獨立的PCR反應。擴增後，透過基因特異性序列探測並定量所有的孔，以鑑定具有陽性反應的孔。
作為基於PCR的核酸檢測技術，數位PCR通常需要成對的引子進行擴增，並需要使用探針來檢測目標核酸，將樣品稀釋並分配，以便分離其中的核酸片段以進行獨立的反應，每個獨立的反應具有非常有限數量的目標核酸分子。如此一來，可以在每個分區內分別進行PCR反應，並確定每個分區中的訊號為陰性或陽性，因此，可以基於泊松分佈（Poisson distribution），透過對正向分區(檢測到序列)與負向分區(未檢測到序列)的數量進行計數，以確定原始樣品中核酸序列複製的確切數量。通常，數位PCR的實驗過程包括以下幾個步驟：1) 稀釋目標DNA分子；2) 將充分分離的目標DNA片段分為離散的液滴/腔室，每個液滴/腔室還包含其他用於擴增及訊號檢測所需之成分；3) 使用針對目標基因「內部（internal）」區域的「成對（paired）」基因特異性引子進行PCR擴增；4) 使用螢光探針檢測螢光訊號；5) 基於泊松分佈對陽性與陰性反應進行定量；以及6) 交叉樣品比較以確定顯著性。
無細胞核酸樣品為易於獲得、非侵入性的遺傳材料，在診斷多種疾病中越來越受歡迎(Wagner，2012年)。這些遺傳物質從體內所有細胞釋放，包括正常細胞、患病細胞以及微生物。理論上，無細胞核酸可能存在於多種體液中，包括血液、唾液、尿液、白帶、精液、淋巴液以及汗液(Chiu與Yu，2019年；Nai等人，2017年；Wagner，2012年) 。儘管具有許多優點，但無細胞核酸樣品的數量通常很少，而造成這些樣品難以操作，因此容易在實驗過程中喪失。此外，無細胞核酸也會高度斷裂。這些都特別顯示出珍貴材料的嚴重問題。
現行的數位PCR在循環無細胞核酸分析方面仍然面臨許多挑戰。一些方法被提出來改善當前的數位PCR，例如適當保存核酸樣品以減少無細胞DNA (cell-free DNAs，cfDNAs)的降解，有效的純化例如矽膠膜收集足夠量的cfDNAs進行檢測，並透過高靈敏度毛細管電泳提高檢測靈敏度。現行的數位PCR還具有缺點，即基於特定的已知突變位點設計探針以檢測核酸中的某些突變，但其不能涵蓋所有遺傳變異，因此限制了對其他潛在變異或突變的測試。
因此，需要開發用於核酸檢測的改良的數位PCR方法。
本發明提供一種用於樣品中核酸檢測的改良的數位PCR，稱為數位T-寡引子PCR (數位TOP-PCR)。本發明之數位TOP-PCR的特徵在於使用與樣品中所有核酸片段的末端連接的均質銜接子(homogeneous adapter，HA)以及識別HA中互補序列的單一型引子(T/U 寡核苷酸)，並作為正向及反向引子以進行擴增。本發明之數位TOP-PCR可以擴增樣品中的所有核酸片段，進而可藉由增加的靈敏度，特別是降低偽陰性率，以實現目標核酸的後續檢測。
具體而言，本發明提供一種用於分析樣品中的核酸之方法，該樣品包含一或多個線性、雙鏈核酸片段(NA片段)，該方法包括以下步驟： (a) 使該樣品進行3'-A尾加工反應，允許在該NA片段的3'-尾添加腺嘌呤核苷酸(A)以產生3'-腺嘌呤核苷酸(3'-A)突出端核酸片段(3'-A突出的NA片段)； (b) 提供3'-胸腺嘧啶(T)或3'-尿嘧啶(U)核苷酸突出的雙鏈均質銜接子，其包含攜帶5'-磷酸的P寡核苷酸鏈以連接至該3'-A突出的NA片段以及帶有3'-T或3'-U而不帶有5'-磷酸的一T/U寡核苷酸鏈，其中該T/U寡核苷酸鏈與該P寡核苷酸鏈互補，除了在該T/U寡核苷酸鏈的3'-T或3'-U之外； (c) 使(a)的樣品進行連接反應，以使該均質銜接子在兩端與該3'-A突出的NA片段連接，以產生銜接子連接的核酸片段(銜接子連接的NA片段)； (d) 將(c)的樣品與聚合酶連鎖反應(PCR)試劑及檢測試劑結合以提供準備好擴增/檢測的樣品，其中該PCR試劑包括用於擴增的單一型引子，其具有該T/U寡核苷酸鏈的核酸序列，且該檢測試劑包括一或多種用於檢測的螢光探針，其產生螢光訊號並與該NA片段特異性雜交； (e) 將(d)的該準備好擴增/檢測的樣品分成多個分區，每個分區包含該銜接子連接的NA片段的有限個複製； (f) 以該銜接子連接的NA片段為模板，以該單一型引子作為正向及反向引子在每個分區中進行PCR，以擴增該銜接子連接的NA片段；以及 (g) 評估每個部分的該螢光訊號。
於一些具體實施例中，步驟(g)包括基於螢光訊號的強度確定液滴/級分為正或負，且隨後計算具有一正訊號的液滴/級分的總數(計數)。
於一些具體實施例中，在步驟(e)中，超過50%的分區包含不超過一個複製的該銜接子連接的NA片段。
於一些具體實施例中，在步驟(e)中，每個分區包含至少一個複製的該銜接子連接的NA片段。
於一些具體實施例中，該NA片段包含可指示該個體的健康/患病狀態的核酸序列。
於一些具體實施例中，步驟(b)的該均質銜接子不自體連接。
於一些具體實施例中，步驟(b)的該均質銜接子在其T/U寡核苷酸鏈中具有3'-T或3'U突出端，且在其P寡核苷酸鏈中具有3'-非A突出端。
於一些具體實施例中，步驟(b)的該均質銜接子的一端為3'-T突出端，另一端為鈍端。
於一些具體實施例中，該樣品獲自體液，包括，但不限於，血液、尿液、唾液、眼淚、汗液、母乳、鼻分泌物、羊水、精液，以及陰道液。
於一些具體實施例中，該樣品中的該NA片段為無細胞DNA (cell-free DNAs，cfDNAs)。
於一些具體實施例中，在步驟(a)之前，本文所述之方法還包括對該NA片段進行末端修復反應。
於一些具體實施例中，步驟(f)的該PCR透過油乳劑或液滴PCR或基於孔的PCR進行。
於一些具體實施例中，步驟(g)的測定透過使用螢光探針的流式細胞分析法進行。
於一些具體實施例中，本發明之方法包括步驟(a)至(g)以及可任選的步驟(a)'：如果該NA片段包含線性、單鏈RNAs，在步驟(a)之前對該樣品進行反轉錄PCR (reverse transcription-PCR，RT-PCR)，以將該RNAs轉換為線性、雙鏈互補DNA (互補 DNA，cDNA) 。
本發明還提供一種用於執行如本文所述之檢測樣品中的核酸片段之方法的套組。特定而言，該套組包括 (i) 銜接子連接試劑，包括均質銜接子、連接緩衝液，以及連接酶，其中該均質銜接子包含帶有5'-磷酸的P寡核苷酸鏈以及帶有3'-T或3-U而不帶有5'-磷酸的T/U寡核苷酸鏈，其中該T/U寡核苷酸鏈與該P寡核苷酸鏈互補，除了在該T/U寡核苷酸鏈的3'-T或3'-U處，其中該均質銜接子能夠在兩端與該核酸片段連接，其中該核酸片段具有3'-A突出端； (ii) PCR試劑，包含具有該T/U寡核苷酸鏈的核酸序列的單一型引子(唯一的引子)、dNTPs、PCR緩衝液，以及DNA聚合酶；以及 (iii) 檢測試劑，包含一或多種可檢測探針，其具有與該核酸片段特異性雜交的互補序列。
於一些具體實施例中，該套組進一步包括使用說明書，其中該使用說明書包括用於執行包括本文所述之步驟(a)至(g)之方法的說明書。
在以下的描述中闡述了本發明之一或多個具體實施例的細節。透過以下幾個具體實施例的詳細描述以及所附申請專利範圍，本發明之其他特徵或優點將變得顯而易見。
除非另有定義，否則本文使用的所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域的技術人員通常所理解的相同含義。
如本文所用，冠詞「一」以及「一個」係指冠詞的語法對象中的一個或多個(即，至少一個)。舉例而言，「一個元件」係指一個元件或一個以上元件。
「包括(動詞)」或「包括(動名詞)」等詞通常以包含/包含的意義使用，其代表允許存在一種或多種特徵、成分或組成分。「包括(動詞)」或「包括(動名詞)」等詞涵蓋「組成」或「由...組成」等詞。
如本文所用，「大致」、「大約」或「大概」通常可以指給定值或範圍的20%以內，特別是10%以內，更特別是5%以內。在此給出的數值為近似的，表示如果沒有明確指出，則可以推斷出「大致」、「大約」或「大概」等詞。
「多核苷酸」或「核酸」等詞係指由核苷酸單元組成的聚合物。多核苷酸包括天然存在的核酸，例如去氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，「DNA」)以及核糖核酸(ribonucleic acid，「RNA」)以及核酸類似物，包括具有非天然存在的核苷酸的核酸類似物。可以使用例如自動DNA合成儀合成多核苷酸。「核酸」乙詞通常係指大的多核苷酸。將理解的是，當核苷酸序列由一DNA序列(即，A、T、G、C)表示時，其還包括其中以「U」替代「T」的RNA序列(即，A、U、G、C)。「寡核苷酸」乙詞指相對短的核酸片段，典型地小於或等於150個核苷酸長度，例如，5至150之間。寡核苷酸可以根據需要設計並合成。就引子而言，其長度通常為5至50個核苷酸，特別是8至30個核苷酸。就探針而言，其長度通常為10至100個核苷酸，特別是15至30個核苷酸。
如本文所用，「互補的」乙詞係指兩個多核苷酸的相互作用表面的拓撲相容性或匹配在一起。因此，這兩個分子可被描述為互補的，此外，接觸表面特性彼此互補。如果第一多核苷酸的核苷酸序列與第二多核苷酸的多核苷酸結合伴侶的核苷酸序列相同，則第一多核苷酸與第二多核苷酸互補。因此，序列5'-TATAC-3'的多核苷酸與序列5'-GTATA-3'的多核苷酸互補。
如本文所用，目標核酸可以指在一樣品中檢測到的特定目標核酸。目標核酸包括但不限於DNA，例如基因組DNA、線粒體DNA、cDNA及其類似物，以及RNA，例如mRNA、miRNA及其類似物。目標核酸可源自任何來源，包含天然來源或合成來源。例如，目標核酸可來自動物或病原體來源，包含，但不限於，哺乳動物如人類，以及病原體如細菌、病毒以及真菌。目標核酸可從任何體液或組織(例如，血液、尿液、皮膚、頭髮、糞便，以及黏液)或環境樣品(例如，水樣品或食物樣品)獲得。於一些具體實施例中，目標核酸可為相同來源(例如，來自正常或患病個體或病原體的相同基因)的核酸分子的集合，但是具有各種長度。例如，編碼B型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)的基因的許多片段可作為存在於測試樣品中的各種長度的「目標」核酸片段。由於每個目標核酸分子均包含至少一部分HBsAg基因，因此具有與HbsAg基因內各個位置對應(或互補)的序列的探針或引子可用於檢測目標核酸片段。再例如，目標核酸可為含有遺傳突變的核酸(例如，指示疾病如癌症的單核苷酸多型性(single nucleotide polymorphism，SNP)。
如本文所用，「引子」乙詞係指可用於擴增方法，例如，聚合酶連鎖反應(PCR)，中以擴增目標核苷酸序列的寡核苷酸。在傳統PCR中，需要至少一對引子，包括一個正向引子和一個反向引子來進行擴增。通常，對於由一(+)鏈以及一(-)鏈組成的要擴增的目標DNA序列，正向引子為一種寡核苷酸，可與該(-)鏈的3'端雜交，進而在反應條件下引發新的(+)鏈的聚合；而反向引子為另一種寡核苷酸，可在反應條件下與該(+)鏈的3'端雜交並因此可以在該反應條件下引發新的(-)鏈聚合。特定而言，例如，正向引子可具有與(+)鏈的5'端相同的序列，而反向引子可具有與(-)鏈的5'端相同的序列。通常，用於擴增目標核酸序列的正向引子以及反向引子的序列不同於彼此。如本文所用，一「單個」引子係指僅一種類型的引子，所有引子均具有相同的序列，而非一對具有不同序列的引子，一個為正向引子，另一個為反向引子。
如本文所用，「雜交」乙詞應包括核酸鏈透過鹼基配對與互補鏈結合的任何過程。相關方法為本領域所熟知的，且描述於，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第二版，冷泉港實驗室出版社(1989年)，以及Frederick MA等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley＆Sons公司(2001年)。通常，嚴格條件應選擇為在規定的離子強度以及pH值下，比指定序列的熱熔點(Tm )低約5至30o C。更典型地，在規定的離子強度以及pH值下，嚴格條件被選擇為比指定序列的Tm 低約5至15o C。例如，嚴格的雜交條件將是其中鹽濃度小於約1.0 M鈉(或其他鹽類)離子，通常為約0.01至約1 M鈉離子濃度，其在約pH 7.0至約pH 8.3下，且溫度為針對短探針(例如，10至50個核苷酸)至少約25o C，對於長探針(例如，大於50個核苷酸)至少約55o C。長探針(例如，大於50個核苷酸)的示例性非嚴格或低嚴格條件將包含20 mM Tris，pH 8.5、50 mM KCl，以及2 mM MgCl2 的緩衝液，反應溫度為25o C。
如本文所用，「突出端」係指在線性雙鏈核酸分子的末端的單個未配對核苷酸的片段或更長的未配對核苷酸的片段。未配對的核苷酸可以在3'或5'端，分別產生3'或5'突出端。「3'-A突出端」係指未配對的核苷酸存在於3’端，並且由一或多個腺嘌呤(A)核苷酸組成。「3'-非A突出端」係指未配對的核苷酸存在於3'端，並且不包括任何腺嘌呤(A)核苷酸。「3-T突出端」係指未配對的核苷酸存在於3’端，並且由一或多個胸腺嘧啶(T)核苷酸組成。
「單一（single）」、「同質（homogenous）」或「通用（universal）」引子係指在PCR反應中僅存在一種具有相同序列的引子，而非一對引子。「異質引子（heterogenous primers）」乙詞係指在PCR反應中存在至少一對配對的引子，每個引子具有不同於彼此的序列。
如本文所用，「銜接子」乙詞係指可連接至雙鏈核酸分子末端的寡核苷酸。銜接子的長度可為10至50個鹼基，較佳為10至30個鹼基，更佳為10至20個鹼基。少於10個核苷酸的長度可能會降低退火的特異性。長度超過20個核苷酸可能並不划算。一「均質（homogenous）」銜接子乙詞係指用於連接至雙鏈核酸分子的兩端的單一類型的銜接子。「異質（heterogenous）」銜接子乙詞係指至少兩種類型的銜接子，它們具有不同於彼此的核苷酸序列，一種用於連接至該雙鏈核酸分子的5'端，另一種用於連接至該雙鏈核酸分子的3'端。
為了擴增樣品中的核酸片段，我們已經開發了一種以T寡核苷酸為基礎的聚合酶連鎖反應(TOP-PCR)技術，該方法係使用由P寡核苷酸與T寡核苷酸所組成並連接到所有核酸片段末端的均質銜接子，然後將T寡核苷酸作為單一引子，以無差別地擴增樣品中的所有核酸片段。參見美國專利第10,407,720號，其全部內容透過引用併入本文。
於本發明中，發現透過使用TOP-PCR技術可顯著改善傳統的數位PCR。透過使用TOP-PCR進行擴增，以數位方式執行本發明之方法以進行核酸檢測，以使反應中的所有核酸均等比例地擴增，並且可以透過一或多個序列特異性探針以更高的靈敏度檢測目標核酸。如以下提供之實施例所示，相較於使用配對PCR引子進行擴增的傳統數位PCR，本發明之方法顯示出增加至少約14%的靈敏度。
圖1為顯示本發明之方法的過程的圖。
核酸樣品
DNA樣品(例如，cfDNA樣品)可獲自含有待檢測的特定目標核酸的任何樣品，例如，體液或組織，例如，血液、尿液、皮膚、頭髮、糞便，以及黏液，或環境樣品，例如，水樣品或食物樣品。可透過傳統程序(例如，苯酚-氯仿萃取或Qiagen公司套組)對樣品進行處理，以從中分離並純化DNA。本發明之方法可用於DNA及RNA目標。針對DNA樣品，DNA聚合酶可直接用於擴增。針對RNA樣品，首先需要使用反轉錄酶進行反轉錄步驟。
末端修復以及 A 尾加工
樣品中的DNA片段經過末端修復，在每個3’端都加上一個「A」，以提供3'A突出的DNA片段。可使用傳統方法或套組執行末端修復以及A尾加工步驟，例如NEBNext® Ultra End Repair/dA-Tailing Module (NEB公司，E7442S/L)。
用於 T/U 寡引子 PCR (TOP-PCR) 擴增的均質銜接子
設計均質銜接子用於TOP-PCR擴增。在均質銜接子中，一條鏈稱為T/U寡核苷酸，在3'端具有一個額外的胸腺嘧啶或尿嘧啶核苷酸(T/U)；另一條鏈稱為P寡核苷酸，在5'端具有磷酸基，其3'端核苷酸沒有多餘的T或U。該銜接子可為鈍黏性的(即一端是鈍的，另一端是黏性的)或雙黏性(即兩端都是黏性的)銜接子。於一些具體實施例中，針對「鈍黏性」銜接子，P寡核苷酸短一個鹼基，並且與T/U寡核苷酸互補，除了在T/U寡核苷酸的3'端T/U處。於一些具體實施例中，針對「雙黏性」銜接子，P寡核苷酸長於T/U寡核苷酸。本文使用之均質銜接子需要 (i) T/U寡核苷酸具有額外的3'-T/U (即，3'端的「T」或「U」突出端)並且沒有5'-磷酸鹽；(ii) P寡核苷酸需要5'-磷酸；以及(iii) T/U寡核苷酸與P寡核苷酸互補，但除了T/U寡核苷酸的3'-T/U突出端。T/U寡核苷酸以及P寡核苷酸的長度及序列可能有所不同。於一些實施例中，P寡核苷酸序列為5’-GTCGGAGTCTgcgc-3’ (SEQ ID NO: 24)，且T/U寡核苷酸序列為5’-AGACTCCGAC(T)-3’ (SEQ ID NO: 23)。於一些實施例中，P寡核苷酸序列為5'-GT CGG AGT CTA GCG CT -3' (SEQ ID NO: 2)，且T/U寡核苷酸序列為5'-AGC GCT AGA CTC CGA CT -3' (SEQ ID NO: 1)。此外，於一些具體實施例中，可使用「3'-U」而非「3'-T」，進而可以在擴增後透過使用「用戶酶 (user enzyme)」(尿嘧啶特異性切除試劑(Uracil-Specific Excision Reagent)，NEB公司)將雙鏈半銜接子(half adapter，HA)完全修剪掉。
均質銜接子與 DNA 片段之連接
在末端修復以及A-尾加工步驟之後，將均質銜接子連接至3'A-突出DNA片段的兩個末端，以產生銜接子連接的DNA片段，其中該銜接子的T/U寡核苷酸的3'-T/U與3'-A突出DNA片段的3-'A突出互補。可以在適當的條件下，例如，在熱循環儀中約25o C整夜，在含有銜接子、3′-A突出DNA片段、連接酶，以及連接緩衝液的適當的連接混合物中進行連接。連接混合物可以直接進行PCR擴增，可以進行或不進行DNA純化。
PCR/ 檢測試劑
連接後，將樣品與PCR/檢測試劑合併以提供可擴增/檢測的樣品。 PCR試劑通常包括引子、核苷酸、聚合酶，以及緩衝液。檢測試劑通常包括一或多種可檢測探針。這些輸入試劑可以單獨添加到樣品中的單獨試劑之形式提供，或者可以將某些或全部試劑作為以預混合形式添加到樣品中的試劑混合物來提供。PCR試劑通常包括選擇用於促進擴增反應的緩衝液。鎂離子，例如MgCl2 有用地包含在緩衝液中。PCR試劑還包括核苷酸。通常以等莫耳濃度提供四種dNTPs (dATP、dCTP、dGTP，以及dTTP)。各種PCR聚合酶可用於同一擴增中。合適的聚合酶通常將在約75o C下具有最佳活性，並且在長時間作用後(例如，在高於95o C的溫度下)保持該活性的能力。有用的聚合酶可包括，例如，Taq DNA聚合酶，例如AmpliTaq®、AmpliTaqGold®、AmpliTaq®的Stoffel片段等。特定而言，PCR試劑包括具有如本文所述之T/U寡核苷酸鏈的核酸序列的單一型引子，作為用於擴增的正向與反向引子。可以將包括對目標核酸具有特異性的探針的檢測試劑添加到樣品中，並且可以檢測到可檢測的訊號，例如由探針降解引起的螢光訊號。
區份（ fractionation ）餾 / 稀釋（ dilution ）
準備好擴增/檢測的樣品被分成多個分區，每個分區包含有限數目複製的銜接子連接的NA片段。特定而言，大多數分區可能不包含任何複製，其他分區僅包含一個複製，其他分區可能包含兩個複製，三個複製，甚至更多數量的複製。每個分區的複製可以根據需要進行調整。於一些具體實施例中，進行區份的程度使得超過50%的分區包含不超過一個複製的銜接子連接的NA片段。於一些具體實施例中，進行區份的程度為每個分區包含至少一個複製的銜接子連接的NA片段，例如每個分區1-5個複製。區份可以如本領域已知的方式，在乳液液滴中或在多孔中進行，例如，Lodrini等人，2017年，以及美國專利申請公開號2009/0053719以及20150099644中所述，其透過引用併入本文。於一些具體實施例中，透過水油乳化技術將樣品分成油滴中的多個小反應。油滴使用液滴發生器產生。通常，從每20微升樣品中大約形成20,000個油滴。
T/U 寡核苷酸為基礎的 PCR 擴增
區份後，使用游離T/U寡核苷酸作為唯一的PCR引子進行PCR擴增。如本文所用，游離T/U寡核苷酸是具有如本文所述之T/U寡核苷酸鏈的核酸序列的單個引子。游離T/U寡核苷酸係指未在銜接子中與其互補的P寡核苷酸形成的T/U寡核苷酸。以此方式，在兩端與銜接子連接的所有DNA片段均等比例擴增。
檢測 / 定量
目標DNA的檢測可以透過本領域已知的許多方法進行，例如使用螢光探針的流式細胞分析法。
於某些具體實施例中，具有可檢測標記的探針例如螢光團(例如，FAM、6-螢光素亞醯胺)被用於檢測。螢光探針具有與目標核酸片段特異性雜交的互補序列，其中螢光團在該目標核酸片段以PCR擴增時從該探針釋放出來(產生陽性訊號，表示檢測到序列)，而如果不存在目標核酸片段或沒有目標核酸片段被擴增，則螢光團不從探針釋放出來(生成陰性訊號，表示未檢測到序列)。於一些具體實施例中，PCR混合物中存在可檢測的探針。
傳統的數位PCR使用通常基於目標核酸內部區域中的一特定位點(例如，突變位置)設計的探針，該目標核酸使用配對引子擴增；這樣的探針不能涵蓋所有的遺傳變異，因此限制了在核酸中其它潛在生物標記的檢測。相較之下，本發明之方法允許擴增樣品中的所有核酸片段，因此可以使用能夠與目標核酸內的任何區域特異性雜交的獵槍探針，並可透過提高靈敏度來實現檢測目標核酸。請參閱圖2的一特定具體實施例。根據本發明，不僅片段「g」(覆蓋兩個引子結合位點)，而且還有其他片段「a」至「f」(僅具有一個引子結合位點或甚至沒有任何引子結合位點)，可以偵測全部源自相同目標病原菌的核酸，例如使用帶有可偵測標記、能夠與在該目標DNA內的任何區域特異性雜交的獵槍探針，進而增加檢測靈敏度以及使偽陰性降至最低。
在檢測之後，對陽性分區(檢測到序列)相對於陰性分區(未檢測到序列)的數量進行計數，以確定樣品中目標核酸片段的預估量。可以根據本領域已知的方法進行定量，例如，如Lodrini等人，2017年所述。於某些具體實施例中，可以在QX200 ddPCR液滴讀取儀中測量PCR擴增後的液滴，並使用QuantaSoft分析軟體分析目標複製數。
還提供用於執行如本文所述之檢測樣品中的核酸片段之方法的套組。具體而言，該套組包括 (i) 銜接子連接試劑，包括均質銜接子、連接緩衝液，以及連接酶，其中該均質銜接子包含帶有5'-磷酸的P寡核苷酸鏈以及帶有3'-T或3-U而不帶有5'-磷酸的T/U寡核苷酸鏈，其中該T/U寡核苷酸鏈與該P寡核苷酸鏈互補，除了在該T/U寡核苷酸鏈的3'-T或3'-U處，其中該均質銜接子能夠在兩端與該核酸片段連接，其中該核酸片段具有3'-A突出端； (ii) PCR試劑，包括具有該T/U寡核苷酸鏈的核酸序列的單一型引子，dNTP (dATP、dCTP、dGTP，以及dTTP)、PCR緩衝液，以及DNA聚合酶；以及 (iii) 檢測試劑，包含一或多種具有與該核酸片段特異性雜交的互補序列的可檢測探針。
於一些具體實施例中，該套組進一步包含使用說明書。特定而言，該使用說明書包括用於執行本發明之方法的說明，包括步驟(a)至(g)。
本發明之實用性及優點
本發明之方法可用於診斷或預後，特別是在基於cfDNA的檢測中。已經描述了檢測包含cfDNA的體液樣品的非侵入性方法，其可用於診斷基因缺陷、傳染源以及疾病，特別是對於早期檢測以及至少預後具有價值，因為即使患病的組織，例如腫瘤，被去除後，仍可獲得cfDNA。但是，傳統的PCR，包括qPCR或dPCR，被設計為依賴模板，需要至少一對引子，因此不適合cfDNA檢測，因為cfDNA作為模板的品質與數量通常不高，因此靈敏度有限，如果PCR循環數增加，則可能會發生偏差。本發明之方法，透過使用由P寡核苷酸與T/U寡核苷酸所組成的均質銜接子，連接至DNA，以及該T/U寡核苷酸作為單一引子，能夠以任何初始數量等比例擴增一樣品中的所有DNA，並可以使用特定探針檢測目標DNA，以提高靈敏度，而不會產生重大偏差(偽陰性)。
透過以下實施例進一步說明本發明，提供這些實施例是為了說明而非限制。根據本公開，本領域技術人員應當理解的是，可在所公開的特定具體實施例中進行許多改變，並且在不脫離本發明之精神與範圍的情況下仍可獲得類似或相似之結果。
實施例
儘管數位PCR (dPCR)是分析遺傳突變與複製數變異(copy number variations，CNVs)的有力方法，但由於cfDNA片段的數量少且高度斷裂，這可能會造成使用雙引子擴增的傳統數位PCR方法產生偽陰性，因此不適合用於臨床樣品中的無細胞DNA (cfDNAs)分析。為解決該問題，我們開發了液滴數位T/U寡聚引子聚合酶連鎖反應(droplet digital T/U oligo-primed polymerase chain reaction，ddTOP-PCR)，該反應有賴於銜接子、無差異性地擴增所有cfDNA片段，然後使用標記FAM或HEX的寡聚探針進行檢測，FAM或HEX在延伸過程中從特定目標生成發色團。隨後透過QX200 ddPCR儀檢測螢光訊號。結果顯示，ddTOP-PCR能夠檢測5'引子結合位點缺失的N-myc序列，而ddPCR不能。以含有5'引子結合位點缺失的構築體及/或雙重引子結合位點完整的N-myc構築體的片段的樣品進行的進一步測試顯示，ddTOP-PCR相較於傳統ddPCR的靈敏度提高了約14%，儘管訊號強度有所降低。這些概念驗證實驗證明了在液體活組織檢體中分析cfDNA方面，ddTOP-PCR優於其相對之方法。
1. 材料與方法
1.1. 選殖 N-myc 序列作為分析標準
為了優化實驗條件以及為分析複製數變異提供標準，基於由NCBI資料庫檢索的人類第2號染色體GRCh38.p12初級組合(登錄號：NC_000002.12)，使用針對人類N-myc序列的引子，以構築帶有N-myc基因序列的載體。使用正向引子5'-AAG GGG TGC TCT CCA ATT CT-3' (SEQ ID NO: 13)以及反向引子5’-CGG TTT AGC CAC CAA CTT TC-3’ (SEQ ID NO: 14)由Be2C細胞株的基因組DNA中選殖/擴增N-myc擴增子(157 bp)。使用正向引子5'-CCC CTT TCC CGC TAT ATC TT-3' (SEQ ID NO: 15)以及反向引子5’-ATG CAG GGT TTG ATG GGA TA-3’ (SEQ ID NO: 16)由Be2C細胞株的基因組DNA中選殖/擴增NAGK擴增子(172 bp)。使用Q5 High-Fidelity 2X Master Mix (NEB公司，麻州，美國)進行聚合酶連鎖反應(PCR)，以擴增目標擴增子。在含有相應引子對、Be2C基因組DNA (10 ng)、1 x Q5 High-Fidelity Master Mix的混合物(50 µl)中進行PCR反應。然後將混合物於98o C作用1分鐘，然後於98o C作用20秒，60o C作用30秒，以及72°C作用10秒，共30個循環。混合物隨後在72o C下作用2分鐘以進行最終延伸。然後分析PCR產物，並按照說明手冊，使用QIAquick凝膠萃取套組(Qiagen公司，NW，德國)從2%瓊脂糖凝膠中萃取具有預期大小的擴增子，然後進行凝膠DNA萃取。
1.2 將半銜接子 ( half-adapter ， HA) 連接到 N-myc 以及 NAGK 標準模板
首先透過退火16個單體單元的P寡核苷酸(5’-pGTCGGAGTCTAGCGCT-3C6-3’) (SEQ ID NO: 2)以及17單體單元T/U寡核苷酸(5’-AmC6-AGCGCTAGACTCCGACT-3’) (SEQ ID NO: 1)，以1:1的莫耳比在95o C下作用5分鐘，然後使用熱循環儀將溫度逐漸降低至4o C，製備半銜接子(HA)。
連接前，以用於Illumina定序的NEBNext® UltraTM II DNA庫製備套組(NEB公司，麻州，美國)稍微修改，首先對10 ng的157 bp N-myc擴增子以及172 bp NAGK擴增子進行末端修復以及3'A尾加工。然後，使用例如HA與擴增子的比例為50:1進行連接，並將反應在熱循環儀中於16o C作用整夜。
需要時，無需純化即可對連接混合物進行直接TOP-PCR。反應在一混合物(50 µl)中進行，該混合物使用T/U寡核苷酸(5'-AGCGCTAGACTCCGACT-3') (SEQ ID NO: 1) 1 µM，連接混合物(5 µ)，1 x Phusion HF反應緩衝液(Thermo Fisher Scientific公司，麻州，美國)，該緩衝液包含Mg2+ (1.5 mM)、Phusion高保真熱啟動DNA聚合酶(1 U)以及dNTPs (1 mM)。然後該混合物於98o C下作用1分鐘，然後於98o C作用20秒，57o C作用30秒，以及72°C針對剪切的gDNA作用1分鐘、針對標準模板作用10秒，共30個循環。混合物隨後在72o C下作用5分鐘以進行最終延伸。使用QIAquick PCR純化套組(Qiagen公司，NW，德國)根據說明書指示純化TOP-PCR擴增的N-myc與NAGK，亦即分別為HA-N-myc-HA以及HA-NAGK-HA，並使用Qubit dsDNA HS分析套組(Thermo Fisher Scientific公司，麻州，美國)進行定量。
1.3 標準模板之構築
為了測試T/U寡核苷酸與探針特異性。製備pHE-N-myc-HA與pHE-NAGK-HA模板的不同比例組合。製備10倍序列稀釋的pHE-N-myc-HA與pHE-NAGK-HA模板的比例為100:1至1:100。以稍微修改的方法製備ddPCR混合物。在液滴產生之前，ddPCR反應(20 µl)包括T/U寡核苷酸引子(8 µM)、Mpb1+2 (0.25 µM)、Npb2 (0.25 µM)、DNA模板(4.0 µl)、1×ddPCRTM 探針超混合物(無dUTP)(Bio-Rad公司，加州，美國)。製備ddPCR液滴混合物，並如上所述進行ddPCR反應。
1.4 gDNA-HA 之測試
使用ddTOP-PCR 進行gDNA混合物中N-myc與NAGK目標的特異性擴增。使用上述ddPCR參數將構築的gDNA-HA模板用於本實驗。本實驗使用10倍序列稀釋的100 ng至100 pg範圍內的不同輸入量的剪切gDNA-HA。在液滴產生之前，ddPCR反應(20 µl)包含T/U寡核苷酸引子(8 µM)、Mpb1+2 (0.25 µM)、Npb2 (0.25 µM)、gDNA-HA模板(100 ng至100 pg)、1×ddPCRTM 探針超混合物(無dUTP)(Bio-Rad公司，加州，美國)。製備ddPCR液滴混合物，並如上所述進行ddPCR反應。
1.5 構築帶有 HA-N myc-HA 以及 HA-NAGK-HA 序列的載體以作為分析標準
然後使用HE Swift選殖套組(Toolbiotech公司，台灣)選殖HA-N myc-HA以及HA-NAGK-HA構築體，然後轉化為DH5α勝任細胞，並鋪在胺芐青黴素LB瓊脂培養盤上。篩選細菌菌落並透過Sanger定序法定序，以使用QIAprep Spin Miniprep套組(Qiagen公司，NW，德國)在質體萃取後驗證序列。
ddTOP-PCR的標準模板是透過在100 µl PCR反應中擴增具有正確HA-N myc-HA以及HA-NAGK-HA序列的重組質體而產生的，該PCR反應含有pHE-F引子(5’-CGA CTC ACT ATA GGG AGA GCG GC-3’；SEQ ID NO: 17，0.5 µM)、pHE-R引子(5’-AA GAA CAT CGA TTT TCC ATG GCA G-3’；SEQ ID NO: 18，0.5 µM)、DNA (1 ng)、1 x Q5 High-Fidelity Master Mix。然後將混合物於98o C下作用1分鐘，然後於98o C作用20秒，64o C作用30秒，以及72°C作用10秒，共30個循環。混合物隨後在72°C下作用2分鐘以進行最終延伸。使用QIAquick PCR純化套組(Qiagen公司，NW，德國)純化大小分別為309 bp以及325 bp的pHE-HA-N myc-HA與pHE-HA-NAGK-HA PCR擴增子並定量。
1.6 構築 5' 缺失的 N-myc 以及 NAGK 構築體以作為分析標準
N-myc的5'引子結合位點缺失的構築體以正向引子(5’-AGC GCT AGA CTC CGA CTT CAC TAA AGT TCC TTC CAC CCT CTC CTG GGG AG-3’) (SEQ ID NO: 19)以及反向引子(5’-AGC GCT AGA CTC CGA CTT AGC CAC CAA CTT TCT CCA ATT TTA TTC CTC AG-3’) (SEQ ID NO: 20)由Q5 High-Fidelity Master Mix進行擴增。NAGK的5'引子結合位點缺失的構築體以正向引子(5’-AGC GCT AGA CTC CGA CTG TGT TGC CCG AGA TTG ACC CGG TGA GTT GAG GT-3’) (SEQ ID NO: 21)以及反向引子(5’-AGC GCT AGA CTC CGA CTA TGC AGG GTT TGA TGG GAT AGT CCC ATC-3’) (SEQ ID NO: 22) 由Q5 High-Fidelity Master Mix進行擴增。大小分別為160 bp以及146 bp的HA-N myc-F del-HA以及HA-NAGK-F del-HA PCR擴增子以QIAquick PCR純化套組(Qiagen公司，NW，德國)純化並定量。
1.7 用於擴增的 PCR 引子
從Lodrini等人得到ddPCR的配對引子序列，但其序列略有修飾(Lodrini等人，2017年)。引子與探針由Integrated DNA Technology公司(IDT)合成。實際上，為了擴增N-myc序列，使用正向引子(5’-GTG CTC TCC AAT TCT CGC CT-3’) (SEQ ID NO: 3)以及反向引子(5’-GAT GGC CTA GAG GAG GGC T-3’) (SEQ ID NO: 4)。
1.8 檢測用探針
為了檢測N-myc擴增，設計了3個探針(如下所示)。這些包括1) 探針Mpb1 (FAM-N-myc探針): /56-FAM/CAC TAA AGT/ZEN/TCC TTC CAC CCT CTC CT/3IABkFQ/(SEQ ID NO: 10)；2) 探針Mpb1+1 (FAM-N-myc探針+ 1nt)：/56-FAM/CAC TAA AGT/ZEN/TCC TTC CAC CCT CTC CTG/3IABkFQ/(SEQ ID NO: 11)；3) 探針Mpb1+2 (FAM-N-myc探針+ 2nt)：/56-FAM/CAC TAA AGT/ZEN/TCC TTC CAC CCT CTC CTG G/3IABkFQ/(SEQ ID NO: 12)。該初始測試使用的是探針Mpb1+1。
1.9 ddPCR 與 ddTOP-PCR 的條件
為了實現ddTOP-PCR的可行狀態並最終優化其靈敏度及特異性，必須測試PCR引子及螢光探針的長度以及實驗條件。此外，必需同時運行傳統ddPCR以作為初始設置的陽性對照，因此優化及實驗條件都應用於ddTOP-PCR與ddPCR。
根據初步結果，我們確定對基因特異性引子(ddPCR對照)使用濃度為0.9 µM的引子，對T/U寡核苷酸(ddTOP-PCR)使用濃度為32 µM的引子。總共20 µl PCR反應包含一或多個引子(用於ddPCR對照的配對引子或用於ddTOP-PCR的T/U寡核苷酸引子)、0.25 µM探針、DNA模板(2.0 µl)，1×ddPCR探針超混合物(無dUTP)(Bio-Rad公司)。透過將製備的PCR反應混合物(20 µl)與70 µl液滴數位PCR油(Bio-Rad公司)混合來產生液滴。將總共40 µl ddPCR液滴混合物轉移至96孔盤，並在以Bio-Rad T-100熱循環儀(Bio-Rad公司)進行PCR反應之前密封。然後將ddPCR以及ddTOP-PCR製備物都置於Bio-Rad PCR儀中，用於在以下條件下擴增並產生發色團：95o C作用10分鐘，然後於94o C作用30秒以及58o C作用60秒共40個循環。透過在98o C下作用10分鐘來終止反應。PCR反應後，使用QX200 ddPCR液滴讀取儀進行陽性液滴的定量，並使用QuantaSoft分析軟體(版本1.7.4，Bio-Rad公司)進行分析。
2. 結果
2.1 使用 ddPCR 以及 ddTOP-PCR 檢測 N-myc 基因序列進行比較
進行最初的測試以證明此一概念，即透過以TOP-PCR代替傳統PCR，應當能夠提高靈敏度，這表示為QX200 ddPCR儀中陽性計數的增加。
僅包含NAGK或N-myc序列的樣品提供了易於驗證的系統來改善條件，在此條件下可以根據實驗結果調整實驗條件(例如，樣品製備、PCR成分濃度，以及反應條件)。
為了進行測試，我們準備了兩種類型的含N-myc序列的片段：一種帶有兩個引子結合位點，而另一種則缺失了5'引子結合位點，僅保留了3'結合位點，還有NAGK 缺失5'引子結合位點的對照(表 1 )。
表 1. 實驗設計
模板識別號與序列 ddPCR 引子 ddTOP-PCR 引子
N-myc 全長構築：HA-pHE-N myc-HA (190 bp, SEQ ID NO: 7):  AGC GCT AGA CTC CGA CT AAG GGG TGC TCT CCA ATT CTC GCC T T C ACT AAA GTT CCT TCC ACC CTC TCC TG G GGA GCC CTC CTC TAG GCC ATC ACG GGC CCT CAC CCG GTC CCC CAC CTC TCT TTT GCA GCG CAG TCT GAG GAA TAA AAT TGG AGA AAG TTG GTG GCT AAA CCG A GT CGG AGT CTA GCG CT   N-myc序列(157 bp)(底線) 探針對應區域(雙底線)   N-myc正向引子： GTG CTC TCC AAT TCT CGC CT (與左框中的粗體鹼基相同) (SEQ ID NO: 3)   N-myc 反向引子： GAT GGC CTA GAG GAG GGC T (與左框中的第二粗體鹼基「反向互補」) (SEQ ID NO: 4)               T寡核苷酸： 5’-AGC GCT AGA CTC CGA CT -3’ (SEQ ID NO: 1)   (P寡核苷酸： 5’-GT CGG AGT CTA GCG CT -3’，用於製作半銜接子)。 (SEQ ID NO: 2)   注意：T與P寡核苷酸在第一列中顯示的模板序列中均以斜體標示。 -
5’-缺失的N-myc 構築體：HA-N myc-F del-HA (160 bp): SEQ ID NO: 8  AGC GCT AGA CTC CGA CT T CA CTA AAG TTC CTT CCA CCC TCT CCT G GG GAG CCC TCC TCT AGG CCA TC A CGG GCC CTC ACC CGG TCC CCC ACC TCT CTT TTG CAG CGC AGT CTG AGG AAT AAA ATT GGA GAA AGT TGG TGG CTA A GT CGG AGT CTA GCG CT   N myc-F del序列(127 bp) (底線) 探針對應區域(雙底線)   N-myc正向引子： GTG CTC TCC AAT TCT CGC CT (不再出現於左框中) (SEQ ID NO: 3)   N-myc 反向引子： GAT GGC CTA GAG GAG GGC T (與左框中的粗體鹼基「反向互補」) (SEQ ID NO: 4)
5’-缺失的NAGK 構築體：HA-NAGK-F del-HA (146 bp): SEQ ID NO: 9  AGC GCT AGA CTC CGA CT GTG TTG CCC GAG ATT GAC CCG GTG AGT TGA GGT GGG AGT GAA GGT G GG GAG CTG CTG GGT GAG GAG TGG TCC TTT CCC ACT GTG GAT GGG ACT ATC CCA TCA AAC CCT GCA T A GT CGG AGT CTA GCG CT   NAGK-F del 序列(113 bp) (底線)   NAGK正向引子： TGG GCA GAC ACA TCG TAG CA (不再出現於左框中) (SEQ ID NO: 5)   NAGK 反向引子： CAC CTT CAC TCC CAC CTC AAC (與左框中的粗體鹼基「反向互補」) (SEQ ID NO: 6)  
突出顯示的區域為N-myc (底線)或NAGK (底線)的基因序列，兩側為T寡核苷酸(左)以及P寡核苷酸(右)。所有實驗均使用相同的探針 ：/56-FAM/CAC TAA AGT/ZEN/TCC TTC CAC CCT CTC CTG/3IABkFQ/，其命名為Mpb1+1 (SEQ ID NO: 11)。
我們將QX200 ddPCR儀用於不同的程序，ddPCR或ddTOP-PCR，以證明ddTOP-PCR在檢測有缺陷引子結合位點的片段中是具有潛力的，這些片段可能存在於cfNA樣品池中。
對於概念驗證測試，我們準備了包含可變百分比的上述5'引子結合位點缺失模板的樣品。計算得出每個樣品的初始輸入總量約為12,000個複製，所有實驗均由QX200 ddPCR儀使用Lodrini等人報告的設置進行，但進行了小部分修改(Lodrini等人，2017年)。Lodrini等人使用的相同的N-myc寡核苷酸探針序列也用於該實驗。
結果顯示，一般而言，使用T寡核苷酸作為用於擴增之唯一引子的ddTOP-PCR方法比使用雙重內部引子的ddPCR的計數更高(圖3)。
為了比較ddTOP-PCR與ddPCR的靈敏度，我們估算了原始樣品中的複製數輸入(使用Qubit)以及相應檢測出的複製數，然後計算出檢測出的百分比(表2)。
表2. ddPCR以及ddTOP-PCR之間的靈敏度比較。
識別號 全長 % 全長輸入複製數 以 ddPCR 檢測 靈敏度 ( 半長 + 全長 ) 輸入複製數 以 ddTOP-PCR 檢測 靈敏度
1 0% - - - 12,000 10,620 88.5%
2 10% 1,200 578 48.2% 12,000 7,820 65.2%
3 20% 2,400 1,128 47.0% 12,000 7,760 64.7%
4 40% 4,800 2,220 46.3% 12,000 7,660 63.8%
5 60% 7,200 3,600 50.0% 12,000 7,000 58.3%
6 80% 9,600 4,340 45.2% 12,000 5,860 48.8%
7 100% 12,000 6,560 54.7% 12,000 6,000 50.0%
如果不包括1，則平均值為 48.6% 如果不包括1，則平均值為 58.5%
    如果包括1，則平均值為 62.8%
結果顯示，ddPCR能夠檢測到約48.6%的模板，而ddTOP-PCR能夠檢測到約58.5%-62.8%的模板，這表示從ddPCR到ddTOP-PCR的靈敏度提高了10%-15%。請注意，儘管準確性受量化設備(例如Qubit)、個人技術、QX200機器本身等因素造成的偏差/變化的影響，但每種方法的總體趨勢都具有一定程度的可靠性。
計算標準偏差
但是，ddTOP-PCR的更高靈敏度受到更多分散訊號強度的影響(圖4)。ddTOP-PCR液滴中的大多數陽性訊號強度均低於ddPCR液滴。推測是由於使用雙重內部引子導致較短而明確的擴增範圍，進而使ddPCR產生比ddTOP-PCR更高均勻度的訊號，而ddTOP-PCR的擴增始於側翼銜接子，其遠離雙引子位置。
如圖4的所有混合樣品所示，從ddTOP-PCR產生的液滴的顏色強度可以比從ddPCR產生的液滴的顏色強度更高或更低，並且更分散。如第4道所示，ddPCR無法檢測到5'引子結合位點缺失的片段，而ddTOP-PCR卻能高效檢測到該片段。圖中的前兩個泳道表示NAGK模板的偽陽性較低。先前的觀察結果顯示，對於ddTOP-PCR以及ddPCR方法，空白背景均具有乾淨計數(0)(數據未顯示)。
如ddPCR所示，內部雙引子的擴增產生更均一的結果，而另一方面，基於銜接子的ddTOP-PCR的擴增具有更高的靈敏度，但強度較低。
這些數據還表示需要進一步優化。而且，較短的片段似乎比較長的片段具有優勢。
3. 結論
這項概念驗證研究提供了初步數據來證明ddTOP-PCR的發展，並透過實驗證明使用ddTOP-PCR來提高基於cfDNA的複製數變異(CNV)、基因突變以及疾病基因表現以及SNP改變之分析的準確性的可行性。
相較於傳統的ddPCR，ddTOP-PCR具有許多優點：1) 數位PCR不適合cfDNA分析，因為作為模板依賴性方法，傳統PCR需要兩個引子結合位點共同存在於同一片段中。另一方面，作為依賴於銜接子的PCR方法，ddTOP-PCR沒有這種限制，因此能夠檢測部分片段。2) 在ddTOP-PCR實驗之前，可以單獨使用TOP-PCR保存低定量樣品，而傳統PCR不能。由於cfDNA樣品的數量可能非常少，因此必須有一個好的方法才能在分析中募集所有cfDNA片段。因此，無差別地保存微小的DNA片段非常重要。3) ddTOP-PCR可能也適合於癌症以及其他疾病的早期檢測，而傳統ddPCR則不能。
無細胞的DNA片段被源自正常或未患病細胞的非特異性DNA片段嚴重稀釋。每個液滴具有單個DNA片段的傳統設計是無成本效益的，因此是不切實際的。相反的，每個液滴有多個複製更適合cfDNA。我們從每個液滴約4個複製的DNA片段開始，以在QX200儀中進行ddTOP-PCR的初始測試。
目前的結果還顯示，定量裝置及方法的進一步改進將有所幫助。參考資料 Chiu, K.P., and Yu, A.L. (2019). Application of cell-free DNA sequencing in characterization of bloodborne microbes and the study of microbe-disease interactions. PeerJ7 , e7426. Dong, L., Meng, Y., Sui, Z., Wang, J., Wu, L., and Fu, B. (2015). Comparison of four digital PCR platforms for accurate quantification of DNA copy number of a certified plasmid DNA reference material. Sci Rep5 , 13174. Hindson, B.J., Ness, K.D., Masquelier, D.A., Belgrader, P., Heredia, N.J., Makarewicz, A.J., Bright, I.J., Lucero, M.Y., Hiddessen, A.L., Legler, T.C., et al. (2011). High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem83 , 8604-8610. Lodrini, M., Sprussel, A., Astrahantseff, K., Tiburtius, D., Konschak, R., Lode, H.N., Fischer, M., Keilholz, U., Eggert, A., and Deubzer, H.E. (2017). Using droplet digital PCR to analyze MYCN and ALK copy number in plasma from patients with neuroblastoma. Oncotarget8 , 85234-85251. Morley, A.A. (2014). Digital PCR: A brief history. Biomol Detect Quantif1 , 1-2. Nai, Y.S., Chen, T.H., Huang, Y.F., Midha, M.K., Shiau, H.C., Shen, C.Y., Chen, C.J., Yu, A.L., and Chiu, K.P. (2017). T Oligo-Primed Polymerase Chain Reaction (TOP-PCR): A Robust Method for the Amplification of Minute DNA Fragments in Body Fluids. Sci Rep7 , 40767. Taylor, S.C., Laperriere, G., and Germain, H. (2017). Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Sci Rep7 , 2409. Vogelstein, B., and Kinzler, K.W. (1999). Digital PCR. Proc Natl Acad Sci U S A96 , 9236-9241. Wagner, J. (2012). Free DNA--new potential analyte in clinical laboratory diagnostics? Biochem Med (Zagreb)22 , 24-38. Zhao, Y., Xia, Q., Yin, Y., and Wang, Z. (2016). Comparison of Droplet Digital PCR and Quantitative PCR Assays for Quantitative Detection of 　　Xanthomonas citri Subsp. citri. PLoS One11 , e0159004.
無
當結合附圖閱讀時，將更好地理解前述發明內容以及以下對本發明之詳細描述。為了說明本發明，在附圖中示出了目前較佳的具體實施例。然而，應當理解的是，本發明不限於所示的精確佈置及手段。
圖1所示為本發明之方法的程序。P寡核苷酸：5’-GTCGGAGTCTgcgc-3’ (SEQ ID NO: 24)。T-寡核苷酸：5′-AGACTCCGAC(T)-3′ (SEQ ID NO: 23)。
圖2所示為本發明之方法與傳統的基於PCR的檢測方法之間的差異。cfDNA樣品包含一組cfDNA片段，這些片段帶有來自基因組來源的隨機斷裂。在傳統的基於PCR的檢測方法中，僅覆蓋第一給定引子結合位點與第二給定引子結合位點的cfDNAs片段「g」可被擴增及檢測。結果，檢測的靈敏度受到限制，特別是當核酸含量低時，靈敏度甚至會更差。相反地，於本發明之方法中，所有cfDNA片段皆可被均勻且普遍地擴增，且在這種擴增之後，不僅片段「g」而且還有其他片段「a」至「f」(僅具有一個引子結合位點，或甚至沒有任何引子結合位點)被擴增，可以檢測到所有皆來自相同目標致病核酸(相同基因組來源)，例如，使用一或多種帶有可檢測標記的探針，該標記能夠與目標病原性核酸內的任何區域特異性雜交；結果，由於檢測前的擴增同樣(非特異性地)適用於所有核酸片段，因此提高了檢測的靈敏度並且可以最小化偽陰性，因此每個擴增的核酸片段的相對量可以代表原始樣品中存在的相對量。
圖3所示為使用包含不同含量的部分及完整模板的樣品，從傳統ddPCR以及ddTOP-PCR方法產生的陽性液滴的計數。泳道1與2 (A05與A06對照)為分別使用T/U寡核苷酸引子以及N-myc基因特異性引子從5'引子結合位點缺失的NAGK基因序列所擴增而產生，其餘部分(泳道3-16或B05– H06)是由混合模板所產生的，該模板包含不同含量(100% - 0%)的部分(標記為「H」，或5'引子結合位點缺失)以及完整(標記為「F」，或帶有兩個引子結合位點)的模板。所有樣品均使用相同的N-myc探針進行檢測。ddTOP-PCR的計數在字母後標有「05」，而其對應的ddPCR的計數則並排標有「06」。圖中的數位代表計數(複製數/微升)。每個樣品總共20微升，用於QX200 ddPCR儀計數。 Ch1，通道1，由QX200定義。
圖4所示為ddPCR與ddTOP-PCR之間螢光訊號強度的比較。與圖3相同，泳道1與2 (A05與A06對照)為分別使用T/U寡核苷酸引子以及N-myc引子從5'引子結合位點缺失的NAGK模板所擴增而產生，其餘部分(泳道3-16或B05– H06)是由混合模板所產生的，該模板包含不同含量(100%-0%)的部分(標記為「H」，或5'引子結合位點缺失)以及完整(標記為「F」，或帶有兩個引子結合位點)的模板。所有樣品均使用相同的N-myc寡核苷酸探針進行檢測。請注意，顯示為黑點的液滴不被視為正液滴，因為其強度低於預設的閾值。
圖5所示為表1中列出的序列。T寡核苷酸：5'-AGC GCT AGA CTC CGA CT-3' (SEQ ID NO: 1)。P寡聚核苷酸，5'-GT CGG AGT CTA GCG CT-3' (SEQ ID NO: 2)。
無
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006

Claims (16)

  1. 一種分析樣品中核酸之方法，該樣品包含一或多個線性、雙鏈核酸片段(NA片段)，該方法包括以下步驟： (a) 使該樣品進行3'-A尾加工反應，允許在該NA片段的3'-尾添加腺嘌呤核苷酸(A)以產生3'-腺嘌呤核苷酸(3'-A)突出端核酸片段(3'-A突出的NA片段)； (b) 提供3'-胸腺嘧啶(T)或3'-尿嘧啶(U)核苷酸突出的雙鏈均質銜接子，其包含帶有5'-磷酸的P寡核苷酸鏈以連接至該3'-A突出的NA片段以及帶有3'-T或3'-U而不帶有5'-磷酸的T/U寡核苷酸鏈，其中該T/U寡核苷酸鏈與該P寡核苷酸鏈互補，除了在該T/U寡核苷酸鏈的3'-T或3'-U之外； (c) 使(a)的樣品進行連接反應，以使該均質銜接子在兩端與該3'-A突出的NA片段連接，以產生銜接子連接的核酸片段(銜接子連接的NA片段)； (d) 將(c)的樣品與聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction，PCR)試劑以及檢測試劑組合以提供準備好擴增/檢測的樣品，其中該PCR試劑包括用於擴增的具有該T/U寡核苷酸鏈的核酸序列的單一型引子，且該檢測試劑包括產生螢光訊號並與該NA片段特異性雜交的一或多種螢光探針； (e) 將(d)的該準備好擴增/檢測的樣品分成複數個分區，每個分區包含該銜接子連接的NA片段的有限個複製； (f) 以該銜接子連接的NA片段為模板，以該單一型引子作為正向及反向引子在每個分區中進行PCR，以擴增該銜接子連接的NA片段；以及 (g) 評估每個部分的螢光訊號。
  2. 如請求項1之方法，其中步驟(g)包括檢測包含擴增的銜接子連接的NA片段的所有分區的螢光顏色(訊號)，並計數具有預期螢光顏色的分區之數量，進而確定該樣品中的NA片段的預估量。
  3. 如請求項1之方法，其中在步驟(e)中，超過50%的分區含有不超過一個複製的銜接子連接的NA片段。
  4. 如請求項1之方法，其中在步驟(e)中，每個分區包含至少一個複製的該銜接子連接的NA片段。
  5. 如請求項1之方法，其中該NA片段包含可指示該個體的健康/疾病狀態的核酸序列。
  6. 如請求項1之方法，其中步驟(b)的該均質銜接子不自體連接。
  7. 如請求項1之方法，其中步驟(b)的該均質銜接子在該T/U寡核苷酸鏈中具有3'-T或3'-U突出端，且在該P寡核苷酸鏈中具有3'-非-A突出端。
  8. 如請求項1之方法，其中步驟(b)的該均質銜接子的一端為3'-T突出端，另一端為鈍端。
  9. 如請求項1之方法，其中該樣品係由體液樣品所獲得。
  10. 如請求項1之方法，其中該樣品中的該NA片段為無細胞DNAs。
  11. 如請求項1之方法，其中在步驟(a)之前，進一步包括對該NA片段進行末端修復反應。
  12. 如請求項1之方法，其中步驟(f)的該PCR透過油乳劑或液滴PCR，或基於孔的PCR進行。
  13. 如請求項1之方法，其中步驟(g)的該測定係使用螢光探針透過流式細胞分析法進行。
  14. 如請求項1之方法，進一步包括在步驟(a)之前對該樣品進行反轉錄-PCR (reverse transcription-PCR，RT-PCR)以將該RNA轉化為線性、雙鏈互補DNA (complementary DNA，cDNA)。
  15. 一種用於執行測量樣品中核酸片段數量之方法的套組，包括 (i) 銜接子連接試劑，包含均質銜接子、連接緩衝液，以及連接酶，其中該銜接子包含帶有5'-磷酸的P寡核苷酸鏈以及帶有3'-T或3-U且不帶有5'-磷酸的T/U寡核苷酸鏈，其中該T/U寡核苷酸鏈與該P寡核苷酸鏈互補，除了在該T/U寡核苷酸鏈的3'-T或3'-U處之外，其中該均質銜接子能夠在兩端與該核酸片段連接，其中該核酸片段具有3'-A突出端； (ii) PCR試劑，包含單一型引子以作為唯一的引子，其具有該T/U寡核苷酸鏈的核酸序列、dNTPs、PCR緩衝液，以及DNA聚合酶；以及 (iii) 檢測試劑，包含一或多種可檢測探針，其具有與該核酸片段特異性雜交的互補序列。
  16. 如請求項15之套組，進一步包括使用說明書，其中該使用說明書包括用於執行包括以下步驟之方法的說明書： (a) 使該樣品進行3'-A尾加工反應，允許在該NA片段的3'-尾添加腺嘌呤核苷酸(A)以產生3'-腺嘌呤核苷酸(3'-A)突出端核酸片段(3'-A突出的NA片段)； (b) 提供3'-胸腺嘧啶(T)或3'-尿嘧啶(U)核苷酸突出的雙鏈均質銜接子，其包含攜帶5'-磷酸的P寡核苷酸鏈以連接至該3'-A突出的NA片段，以及帶有3'-T或3'-U而不帶有5'-磷酸的T/U寡核苷酸鏈，其中該T/U寡核苷酸鏈與該P寡核苷酸鏈互補，除了在該T/U寡核苷酸鏈的3'-T或3'-U處之外； (c) 使(a)的該樣品進行連接反應，以使該均質銜接子在兩端與該3'-A突出的NA片段連接，以產生銜接子連接的核酸片段(銜接子連接的NA片段)； (d) 將(c)的該樣品與聚合酶連鎖反應(PCR)試劑以及檢測試劑組合以提供準備好擴增/檢測的樣品，其中該PCR試劑包括用於擴增的具有該T/U寡核苷酸鏈的核酸序列的單一型引子，以及用於檢測的檢測試劑，其包括產生螢光訊號並與該NA片段特異性雜交的一或多種螢光探針； (e) 將(d)的該準備好擴增/檢測的樣品分成複數個分區，每個分區包含有限個複製的該銜接子連接的NA片段； (f) 以該銜接子連接的NA片段為模板，以該單一型引子作為正向及反向引子在每個分區中進行PCR，以擴增該銜接子連接的NA片段；以及 (g) 評估每個部分的螢光訊號。
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