JP3759970B2 - 核酸増幅反応を実施する装置、化学連鎖反応を実施する装置、変性、アニーリングおよびエクステンションプロセスを包含する核酸増幅反応を同時に実施する装置、ならびに核酸増幅反応を実施する方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は熱サイクリングによる核酸の増幅、とくにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅反応のための自動化装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）は、異なる温度における若干のインキュベーションを包含するポリメラーゼ連鎖反応プロトコルのような、プロトコルにより特異的に構成された液体反応混合物を熱サイクリングにより増幅することができる。反応混合物は、増幅すべきＤＮＡ（標的）のような種々の成分および標的ＤＮＡの一部に対し相補するように選択された少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーからなっている。反応混合物は、種々の緩衝液、酵素、およびｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰのようなデオキシリボヌクレオチド三リン酸をも含有する。二本鎖ＤＮＡ分子は２つの相補的一本鎖に変性される。次いで、プライマーは鎖にアニールし、次に、ＰＣＲにおいて、ヌクレオシド一リン酸塩残基が、熱安定のＤＮＡポリメラーゼのような酵素の存在でプライマーに結合してプライマーエクステンション生成物をつくる。プライマーエクステンション後、多数の二重らせんＤＮＡ分子が２倍も存在する。このプロセスを繰返し、毎度存在するＤＮＡ量がほぼ倍加する。この結果は標的ＤＮＡの“増幅（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）”として公知の、標的ＤＮＡの濃度の指数関数的増加である。
【０００３】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、主として簡単で非常に融通性があり、かつ比較的低い操業費を必要とするので、遺伝分析に対する驚異的成功であることが証明された。この成功のかぎは、熱サイクリングの思想である：ＤＮＡ溶融工程、短かいプライマーをアニーリングして一本鎖を得る工程およびこれらのプライマーをエクステンドして二本鎖ＤＮＡの新しいコピーをつくる工程の交番。
【０００４】
ポリメラーゼ連鎖反応の方法論は、米国特許第４６８３２０２号および米国特許第４６８３１９５号に詳述されており、これらは引用により本明細書の内容をなす。
【０００５】
ポリメラーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲ）は、小さいプラスチックの微量遠心管または試験管のような使い捨て反応管中で実施され、これらの管は熱制御される熱交換器を含有する装置内に入れられる。これらの装置の例は、米国特許第５０３８８５２号、米国特許出願番号０７／７０９３７４号（１９９１年６月３日出願）および米国特許出願番号０７／８７１２６４号（１９９２年４月２０日出願）に記載されており、これらはすべて引用によってそれらの全体が本明細書の内容をなす。
【０００６】
これら装置中の熱交換器は代表的には金属ブロックである；しかし熱空気オーブンおよび水浴も使用された。反応管内の反応混合物の温度は、混合物中に変性、アニーリングおよびエクステンションを生起させるため周期的に変えられる。３つの別個のインキュベーション温度は、通例第１世代ＰＣＲ熱サイクリング適用において使用された。これらは代表的には変性に対して約９４℃、アニーリングに対して約５５℃、およびエクステンションに対しては約７２℃であった。最近、アニーリングおよびエクステンションインキュベーションはしばしば組合されて、２温度インキュベーション法（代表的には変性に対して約９４℃およびアニーリングおよびエクステンションインキュベーションに対して約５０〜６５℃）が生じた。しかし、最適のインキュベーション温度および時間は標的が異なると相違する。
【０００７】
小規模の高速ＰＣＲ毛管装置も出現した。たとえばアイダホテクノロジィ（Ｉｄａｈｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）は、反応混合物を毛管に入れ、次いで該毛管を密封して、管内の反応混合物の温度が循環する熱空気オーブンに入れる装置を導入した。類似のシステムはウィトワー（Ｗｉｔｔｗｅｒ）等により“少量試料に対し有効な熱伝達によるＤＮＡ増幅に必要な時間の最小化”なる論文（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｃｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第１８６巻第３２８〜第３３１頁(１９９０年））に記載された。細い毛管内に入れられた１００μｌの試料が、加熱コイル、ソレノイド活性化ドアおよびファンを備えるオーブンに入れられた。空気は、熱伝達媒体として使用された。非常に類似のシステムもウィトワー等により“熱空気による毛管内の自動化ポリメラーゼ連鎖反応”なるタイトルの論文（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第１７巻、Ｎｏ．１１、第４３５３頁〜第５７頁（１９８９年））に記載されている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
ＰＣＲの体積は、反応混合物が微量遠心管内に保存されていた、常用の加熱ブロックまた液体浴熱交換ＰＣＲ装置の設計においては、約１０μｌないし１．５ｍｌの範囲に制限されていた。これらの体積を増大することは困難である。この困難は、管に対する熱交換ブロック中のウエル（くぼみ孔）の固定された大きさおよびすべてのウエルの間に均一な熱伝達を達成することの困難さが、大きさが大きくなると漸増しかつ熱勾配の問題が一そう顕著になることによる。先行技術の反応容器は体積が増大すると、表面／体積の割合が減少する。この変化が、各管内の反応混合物の温度が迅速に変化する能力を減少する。それというのも多くの熱交換は、管壁と試料ブロック中のウエルの壁の間で起きるからである。
【０００９】
先行技術の装置においては乏しい対流および伝導により惹起される、ブロックに対し試料の温度に実質的に漏れが存在したので、熱ランプが長かった。インキュベーション温度間の実質的な熱ランプ時間は、多くの装置において使用される金属ブロックの大きい熱質量のために生じる重要な温度勾配を防ぐためにしばしば必要である。これらの温度勾配は、温度勾配に沿った幾多の個所で添加される異なる試料に不均一な増幅を惹起しうる。温度ランプを使用するための化学的または生物学的理由は存在しない。
【００１０】
毛管ＰＣＲ装置は、反応体積および試料収納濃度を最小にすることができるので、迅速な熱インキュベーショントラジションの利点を有する。かかる１つの装置は、米国特許第５１７６２０３号（発明者Ｄ．Ｍ．Ｌａｒｚｅｌ）に記載されている。ラルズール（Ｌａｒｚｕｌ）の特許は連続する毛管の閉ループまたはらせん形コイル内に含有された液体試料の自動熱サイクリング用のホィール形装置を記載する。管の各ループは３つのサーモスタット調温ゾーンを通っている。試料は、モータ付磁気系によりループを通して押され、該系においては、回転中央アームの一端にある磁石が懸濁金属粒子を含有する鉱油のスラッグ（Ｓｌｕｇ）を毛管を通して引く。スラッグは毛管内の試料に接するので、スラッグがループを通して試料を押す。モータ付系は、試料の移動を所定のプロトコルにより調節するために制御されたマイクロプロセッサであってもよい。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
ここでは、特定の共通の利点を有する毛管ＰＣＲ装置の多数の実施形が提案されている。ここに記載した装置はすべて、微量遠心管とは異なり、試料を保持するために薄壁毛管を使用する。ここで使用したような毛管は、３ｍｍよりも小さい内径を有し、望ましくは内径が約１ｍｍ〜２ｍｍの大きさである。これらの毛管は、ここに教示した実施形においては、プログラマブルコンピュータ中へ供給された、特定反応混合物の必要とするユーザ定義ＰＣＲプロトコルにより加熱および冷却され、該コンピュータはまた、通常の制御プログラミングを介してプロトコルを実行するため、試料処理（ｈａｎｄｌｉｎｇ）、流れ、速度、圧力および温度を自動的に制御する。本発明の種々の実施形の間の相異はＰＣＲ反応混合物を加熱および冷却するために使用した異なる手段および反応混合物を移動させるために使用した異なる管および液体処理手段から起きる。
【００１２】
たとえば本発明の第１実施形は、反応混合物を、２つの異なるサーモスタット付液体浴（１つは変性温度、１つはアニール／エクステンド温度）を通る毛管の連続ループを通して繰返し自動的にポンプ輸送する。付加的浴は、インキュベーション温度の数を増加するために加えることができる。
【００１３】
第２実施形は、反応混合物を１つの毛管を１回だけ、つまりシングル・パスで通す。毛管は、変性温度に保たれた第１サーモスタット調温された熱交換器とアニール／エクステンド温度に保たれた第２熱交換器の間で前後に交番に通っている。また、アニール温度とエクステンド温度が異なる場合、第３熱交換器を使用することもできる。シングル・パス管を通して生成物捕集容器中へ反応混合物を押出すために、容積形ポンプまたは蠕動ポンプまたはシリンジが使用される。
【００１４】
本発明の第３実施形は数個の液体浴配置中の定置反応混合物を包含する。この実施形は、各試料に対し単一ループの毛管を使用する。試料を含有するループの部分は、反応室に封入されている。変性温度の熱い液体は第１サーモスタット調温された液体浴からこの反応室中へ圧送され、ここに変性インキュベーションの間保たれる。アニール／エクステンド温度の液体は第２温度安定浴から反応室中へ、アニール／エクステンドインキュベーションを実行するために第１温度安定浴から熱い液体を除去した後に圧送される。このプロセスはＰＣＲプロトコルを完成するのに必要なだけ繰返される。
【００１５】
第４実施形は２つまたは３つの温度安定液体浴を使用し、それぞれの浴は液体が別個の導管を通って絶えず循環する。各液体の流れは必要なＰＣＲインキュベーション温度の１つにサーモスタット調温されている。入力端に金網を備える単一の円筒熱交換室は、弁装置を通して液体の流れに連結されている。金網は個々の小さい毛管反応混合物容器を保持し、該容器は両端が、熱交換室内の適所に密封されている。容器は、各毛管容器の一端におけるシールが金網を通して嵌合するのには大きすぎるので、金網により間隔を置いた関係または配列に保持されている。弁装置は望ましくはコンピュータまたは他の自動化コントローラ下に、流れの１つを円筒熱交換室を一度に通過させ、他の流れまたは２つの流れは該熱交換室を迂回してバイパスされるように選択するために使用される。たとえば、変性インキュベーションを実施するためには、９４℃の液体の流れを熱交換室に通すと共に、５５℃のアニール流れおよび７５℃のエクステンド流れは熱交換室を迂回する。
【００１６】
第５実施形は、それぞれが変性およびアニール／エクステンドインキュベーションに必要とされる２つの温度の１つに安定化された温度を有する２つの金属ブロックを使用する。端部の開いた薄壁の毛管は、これら２つの金属ブロックの間および該ブロックを通っている。蠕動ポンプまたはプランジャーおよびシール装置は、シリンジと同様、ＰＣＲプロトコルを実施するためプログラミングされたコンピュータの制御下に、毛管の一端に連結されている。ポンプまたはプランジャーは、反応混合物を毛管中へ引込み、変性ブロックにより取囲まれた区域中へ移動させるために活性化される、つまりブロックを変性温度に保ち、次いで反応混合物を毛管を通して、アニール／エクステンド温度に保たれたブロックにより取囲まれた毛管の区域中へ移動させる。このサイクルが、ＰＣＲプロトコルを完成するための必要な回数繰返される。次いで、プランジャーはＰＣＲ生成物を排出するために移動される。また、ブロック自体は、混合物を熱サイクルするため混合物を含有する定置の毛管に対して前後に移動させることができる。
【００１７】
本発明による毛管ＰＣＲ装置の第６実施形は、間隔を置いた金属の熱交換ブロックを使用する点で、第５実施形と幾分類似である。この実施形は望ましくは、１対の間隔を置いた熱交換ブロック、それぞれのブロックを通る複数の開放端毛管および自動化された試料処理システムを有する。この処理システムは同時に、各毛管の端部を反応混合物容器中へ挿入し、反応混合物を毛管中へ吸上げ、次いで混合物は熱交換ブロックの間で移動し、ＰＣＲ最終生成物を毛管から適当な容器中へ排出する（すべてはコンピュータ制御下に）。その上、処理システムは、毛管清浄化、すすぎおよび試料トレー移動および持上げ機能を、すべてコンピュータ制御下に実施するので、４８または９６試料のトレーは、必要に応じて、グループで、たとえば１回に１２個、自動的に熱サイクルすることができる。
【００１８】
本発明の第７実施形は試料よりもむしろ熱源を移動するように設計されている。この実施形は、可動熱交換器（ｔｈｅｒｍａｌ ｈｅａｔ ｅｘｃｈａｎｇｅｒ）を有し、望ましくは２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の軸方向に延びる放射状セグメントに分割された、円筒形の熱交換熱板（ｔｈｅｒｍａｌ ｐｌａｔ）またはドラムを有する。各セグメントは、サーモスタットにより変性、エクステンションまたはアニーリングのための適当なインキュベーション温度に制御されている。２つだけのインキュベーション温度が要求されかつ３つのセグメントが設けられている場合、第３セグメントはアニール／エクステンション温度から変性温度へのトランジションを促進するために使用することができる。同様に、４つのセグメントが設けられていて、２つのインキュベーション温度が必要とされる場合には、他の２つのセグメントを、アニール／エクステンション温度と変性温度の間でトランジションを双方向に促進するために使用することができる。
【００１９】
それぞれのセグメントの弓形の外面は複数の平行なみぞを有し、それぞれのみぞは毛管を収容するため整列されている。毛管は、望ましくは全部の管が１つのセグメントのみぞの長さに沿って接するように経路定めされている。処理装置も、第６実施形におけるように包含されている。反応混合物を各毛管中へ吸込んで、接触している円筒形熱交換セグメントに隣接する位置へもたらすために、蠕動ポンプまたはシリンジ型プランジャーおよびシールアセンブリが使用される。次いで、ＰＣＲプロトコルが、円筒形熱交換板を、各セグメントが望ましくは必要とされるインキュベーション時間毛管と十分に接触している交番角位置の間で回転することによって実施される。
【００２０】
ここに記載したすべての装置は、所望のＰＣＲプロトコルを定義するデータを受取り、必要なポンプおよび弁スイッチを操作するためおよび／または反応混合物を加熱または冷却するのに必要な熱交換媒体の移動を発生するための適当な制御信号を発することによりプロトコルを実施するように適合された、ユーザプログラマブルコンピュータ、たとえばパーソナルコンピュータ（ＰＣ）または通常の設計の制御装置を基礎とする内部マイクロプロセッサにより、制御される。
【００２１】
ここに記載したすべての装置は、反応混合物をアニール／エクステンドインキュベーション温度と変性温度の間で反応混合物を循環させるために、大きい熱質量の温度を変える必要がないという利点を享受する。この簡易化が熱勾配の問題を減少し、装置の熱設計を簡易化して、複数の反応混合物が全部、装置自体における不均一性により惹起される分散なしに、同時に同じＰＣＲインキュベーションを受けることができるようにする。
【００２２】
実質的の熱トランジエントを受ける本発明の装置の主要部分は毛管壁である。装置のこれらの部分の低い熱質量および高い熱伝導率のため、試料の非常に迅速な熱サイクリングを実施することができる。ここに記載した多くの装置における毛管の使用も、熱交換器設計に対し処理される複数の試料間の温度の不均一性を最小にする必要なしに、出来上った生成物の量を簡単に評価できる。
【００２３】
【実施例】
連続ループ毛管熱サイクラー
図１に関し、本発明による毛管ＰＣＲ装置の第１実施形が示されている。装置１０は２つの異なる熱安定な液体浴を有し、それらの間で反応混合物が毛管ループでポンプ輸送される。この実施形は約１ｍｌよりも大きい任意の大きさの反応体積でＰＣＲが実施可能である。２つの反応温度は、変性およびアニーリング／エクステンションインキュベーションのために使用される。それぞれの温度におけるインキュベーション時間に関する完全な制御は、ポンプ１２および各浴中の管長の比によって設けられている。
【００２４】
代表的な２温度ＰＣＲは、反応混合物を約６０℃〜９５℃の間で１〜３００秒の範囲内の滞留またはインキュベーション時間で循環することを包含する。３つの温度安定液体浴は、３つの別個のインキュベーション時間のために使用することができる。キム（Ｋｉｍ）およびスミシーズ（Ｓｍｉｔｈｉｅｓ）は、“ヌクレイックアシッドリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）”第１６巻、第８８８７頁〜第８９０３頁に、中間“エクステンション”温度におけるインキュベーションは不必要であることを教示する論文を発表した。従って、図１の実施形は、この研究に基づき、２つの温度、１つはアニーリングおよびエクステンションのための３７〜７２℃の範囲内および１つは変性のための８５〜９８℃の範囲内の温度だけを使用する。
【００２５】
第１実施形は潜在的に反応管ループの最大体積以外に上限を設けずに、約１ｍｌ以上の体積を有する分取的大きさのＰＣＲ用に設計されている。望ましい標的ＤＮＡセグメントは、約１００〜１００００の塩基対（ｂｐ）を有していてもよい。第１実施形は、ＰＣＲ反応混合物に必要な最も高価な試薬、つまり２つのプライマーおよび化学量論的制限の最適消費のために設計されている。
【００２６】
図１には、高温浴が１６で示され、低温浴は１８で示されている。これら２つの浴は、２つの浴１６および１８の間の熱の流れを最小にするために選択された絶縁層２０によって分離されている。浴１６はユーザ定義温度、望ましくは８５〜９８℃±０．１〜０．５℃にサーモスタットにより制御されている。浴１８は４０〜７０℃の間、望ましくは同じ許容差内のユーザ定義温度にサーモスタットで制御されている。各浴は、熱均一性を達成するために、混合羽根等のような通常の手段による乱流混合を使用するができる。
【００２７】
反応容器２２はある長さの比較的薄壁のプラスチック毛管からなり、該毛管は、２つの浴の間の壁を、液面下に沈んでいる、２つのＯリング２４および２６を通して貫通するループを形成する。反応管２２の内径およびその長さは、反応体積の理論的上限を確定する。良好な温度制御を達成するためには大きい長さの狭い管が望ましい。
【００２８】
低温浴１８内の液体中には４路弁１４が浸漬され、液体流路を、反応混合物試料を反応容器２２中へ導入し、出来上ったＰＣＲ生成物を取出すために変えるのに使用される。浴１８内に位置定めされた蠕動ポンプ１２も、反応混合物を、反応容器２２中、外およびそれを通して循環させるために使用される。ポンプ１２は厳密に制御され、校正された流量を有する。蠕動ポンプが選ばれ、反応混合物はプラスチックのみと接触する。
【００２９】
双方の浴中で使用される管が同じ内径および外径を有する場合、各浴中での反応混合物の滞留時間は、２つの浴中の管長の比によって制御される。一般に、浴１６中で５〜１５秒の変性インキュベーション時間を使用し、浴１８中で数分までのアニーリング／エクステンションインキュベーション時間を使用するのが望ましい。この第１実施形では単一連続反応管２２が２つの浴の間で漏れ止めＯリングシール２４，２６を通り、両端は４路弁１４に接続している。反応管が滑動しうるＯリングシール２４，２６の使用により、インキュベーション時間を、各浴中の管の相対的長さを調節するためＯリングを通して管を引くことにより手動での調節が可能となる。
【００３０】
４路弁は、低温浴１８中の管２２の長さから反応生成物が新しいサイクルを始めるため高温浴１６中へ返送することのできる位置、ＰＣＲプロトコルの完成時にＰＣＲ生成物を排出する位置、および反応管２２をフラッシング、清掃するため適当な操作を実施した後または必要に応じ反応管２２を交換した後、新しい反応混合物を反応管２２に導入することのできる位置を有する。
【００３１】
望ましくは１つのサイクルから別のサイクルへのＰＣＲ反応の進行をモニタするため、望ましくは低温浴内にセンサを有する浸漬可能のファイバオプチクスの分光光度計が包含されていてもよい。この分光測光（ＵＶ）検出器２８は、ｄＮＴＰｓがＤＮＡ生成物中へ組込まれたときに期待されるハイポクロミズムを検出する。限界差動信号のみが典型的に認められ、その後にＰＣＲプロトコル中に後の熱サイクルが認められる。類似のけい光検出器を、種々の“Ｔａｚｍａｎ”式測定の実施に使用することもできる。
【００３２】
反応管２２は、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、たとえばデュ・ポン社のテフロン（Ｔｅｆｌｏｎ登録商標）のようなＰＣＲ相溶性材料からなり、３ｍｍよりも小さく、望ましくは約１ｍｍ〜２ｍｍの間の内径を有する毛細管である。この管は０．２〜０．５ｍｍの間、望ましくは約０．３ｍｍである壁厚を有する。反応管２２の毛管寸法は、反応混合物が浴を通過する際管壁を横断する熱伝達勾配の効果を最小にする。さらに、小さい寸法は、反応混合物試料体積の終端を限定するための不連続部としておよび反応混合物を、予測できるように、蠕動ポンプ１２および４路弁を経て浴１６および１８を通して駆動するための推進体として使用するための気泡または油のような混合しない液体の使用を可能にする。
【００３３】
反応管２２を不連続的に移動する気泡または他の液体は、液体不連続部の通過を検出するのに適当な装置の使用により簡単な自動化可能のサイクルカウンタを設けるのに使用することができる。不連続部の通過を検出するのに適当な装置は再び双方の反応管２２に取付けられた光電式または電気容量型センサ４２を包含する。
【００３４】
第１実施形の操作は簡単である。反応混合物を４路弁１４を通して管２２中へ導入した後、反応混合物をサーモスタット制御された浴１６および１８を通して連続的にポンプで、ポンプ１２の速度および管体積によって定義される全サイクル時間で圧送する。完全なループを通る混合物の毎回の通過が、１つの完全なＰＣＲサイクルである。全反応体積は任意の１つの時間に単一の温度では存在しないかも知れないが、反応混合物の各体積要素は各温度においてほぼ均一な滞留時間を経験する。比較的狭い管孔および表面粗さのため、混合部分が管を通過する際混合部分内に若干の乱流混合が存在する。この混合が、温度制御の鮮鋭度を高める。所望数のサイクルが完成した後、出来上ったＰＣＲ生成物を４路弁によりポンプで排出する。
【００３５】
市場で入手できるサーモスタット付浴は、浴温度を０．１℃以内に制御することができ、これにより正確な温度調節が得られる。この実施形では特殊な流れ調整またはソフトウエアは必要でない。それというのも非常に正確な流量を有する蠕動ポンプも市場で購入できるからである。
【００３６】
反応管２２中に大量の出来上った生成物が蓄積しはじめた後、ＰＣＲプロトコルにおけるアニーリング／エクステンションインキュベーション温度または時間の遅れを自動的に変えるのが望ましい。ポンプ流量または下方浴温整定値の自動的または手動的変更はポンプ速度制御入力および浴温制御に適当なインタフェースにより結合している適当にプログラミングされたＣＰＵ３０によって実行することができる。全経過時間と正比例するように、全増幅期間にわたって変性温度を徐々に増加するのが望ましい。このプロトコルは、高温浴の温度制御入力およびサイクルカウンターに結合した適当にプログラミングされたＣＰＵによって達成することができる。かかる制御図式は、低温浴１８、蠕動ポンプ１２および高温浴１６にそれぞれ結合した制御線路３２，３４および３６と共に図１に点線で示したＣＰＵ３０により概略的に表わされている。
【００３７】
ＰＣＲプロトコルによるかまたは若干の別の実施形におけるあとのサイクル中でｄＮＴＰｓ、酵素またはプライマーのような補充的試薬添加物を供給するのも望ましい。これは、制御母線４０における信号により制御されるブロック３８により略示された試薬添加弁操作機構を介してＣＰＵ３０の制御下に自動的に行なうことができる。試薬の連続的添加またはあとのサイクルにおいてのみの添加のために、種々の実施形の弁装置が設けられている。ＣＰＵ３０は、完成されたサイクル数をモニタする必要のある実施形、たとえば試薬をＰＣＲプロトコルにおけるあとの特殊な時点で添加される実施形においては、制御母線４４を介してサイクルカウンタに結合されている。プロトコルにおけるあとでの試薬添加は総収率を最大にすることができる。たとえば、忠実度はｄＮＴＰ濃度を１０〜５０ミクロモルの範囲内に保つことにより改善することができるが、これらのレベルはあとのサイクルにおいて化学量論的制限であることを立証する。従って増幅プロトコルにおけるあとのＭｇ−ｄＮＴＰ濃度のオーダ規模の飛躍は、忠実度に対する小さい正味効果で、収率を劇的に改善することができる。同様に、あとのサイクルにおけるプライマー濃度を増加して総収率を上昇させることができる。この手段は生成物純度を同様に改善する。
【００３８】
毛細管の内面は、管壁に隣接する試料液部分に対するかじりを形成する。気泡または他の液体不連続部は、各試料の間で全試料を、細管流路に沿って１ユニットとして押すのに有用である。他の場合には、毛管を横断する放物面の流れ断面形が存在する。試料または試料部分の間の気泡の使用は“スラッグ（Ｓｌｕｇ）”流れを生じ、この中で試料“スラッグ”は毛管を通して押される。
【００３９】
単流路毛管熱サイクラー
図２には、比較的大体積にＰＣＲを実施するための毛管ＰＣＲ装置の第２実施形の概略図が示されている。この実施形は、適当な温度の熱および冷源の内および外で多数回経路定めされた毛管５０の長さを使用する。図２の実施例は毛管５０の連続ループの形の反応室を使用する。各ループは平衡された熱ゾーン５２を通る部分および平衡された冷ゾーン５４を通る部分を有する。代表的には、熱ゾーン５２は、液体がＰＣＲプロセスにおける変性を行なうのに必要な温度範囲内の一定温度、代表的には約９５℃を有する液体浴である。同様に、冷ゾーンは通常、アニーリングおよびエクステンションに必要な温度範囲内の一定温度、代表的には約６０℃を維持するように制御された温度を有する液体を有する液体浴である。
【００４０】
他の温度は、変性およびアニーリング／エクステンド範囲内で使用することができ、熱および冷ゾーン５２，５４のそれぞれは、金属ブロックのような管５０が通過する温度制御された固体ブロックであってもよい。また、熱ガスオーブンも変性のために使用することができ、冷ガスオーブンは冷ゾーンに対して使用される。しかし、熱および冷温度制御されたゾーンに対する好ましい構造は、２つの温度制御された金属ブロックまたは２つの温度制御された水浴のいずれかである。管５０の長さ、その内径、熱および冷ゾーンの各々における管の長さ、および管内での反応混合物の流量は、増幅の制御におけるすべてのファクタである。
【００４１】
図２の第２実施形においてはＰＣＲ反応混合物が管５０に沿って移動するための移動力は、反応混合物５３の大きい体積を保持しうる無菌の使い捨てシリンジである。シリンジ５１は当業者に周知の反応混合物成分および増幅される試料核酸が充てんされる。次いで、シリンジ５１は手により圧縮ガスまたはシリンジポンプ作用を使用して反応混合物５３を管５０中へおよびこれを通して移動させるために操作する。
【００４２】
空気または鉱油のような混じらない液体を含有するもう１つのシリンジ５５はシリンジ５１と並列に管５０に結合することができる。シリンジ５５は断続的に気泡または混じらない液体泡を管５０内の反応混合物５３の流れ中へ注入するため操作する。これは、スラッグ流れが流路を通じて支配し、反応混合物５３の各体積要素が同じ数および期間の熱インキュベーションを経験するのを確実にする。スラッグ流を惹起するため空気の使用は、流体が存在する場合、出来上ったＰＣＲ生成物のみが容器５６中に集められるので望ましい。シリンジ５５の使用は、分取スケールのＰＣＲに対しては、プライマーの濃度を消尽するのに十分なサイクルを実施する限りおよび各ゾーン内で動的滞留時間が試料の多くをインキュベーション温度に到達させるのに十分である限り必要である。シリンジ５５は、“ホットスタート（ｈｏｔ ｓｔａｒｔ）”を実施するためのそう失試薬（ｍｉｓｓｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ）を導入するために使用することもできる。
【００４３】
各ゾーン内の管５０の長さはそれぞれの時間に単位体積の反応混合物が熱ゾーンを１回通過し、冷ゾーンを１回通過し、１つの完全なサイクルが完成されるように選択される。系中のループ数が、実施されるサイクルの数を定める。望ましい操作法は増幅されたすべての生成物を強制的に完全に管を通して排出するためシリンジ５１の頂部にエアポケットの残留を包含する。
【００４４】
反応管５０の管材料はガラス（適当なシラン化剤で塗布）、金属またはＰＣＲ法に干渉しないタイプのプラスチックであってもよい。望ましくは、管材料は１回使用のもの（使い捨てタイプ）である。プラスチック、ポリプロピレンまたはテフロンが望ましい。しかし、この実施形ではパリレン（ｐａｒｙｌｅｎｅ）で塗布された金属管材料が望ましい。それというのも金属管材料は良好な熱コンダクタンスを有し、曲げた後にその形を保持し、管の内径はスラッグ流れの間、プラスチック管よりも多くの乱流混合を得るためより小さくてもよく、かつ金属は加熱されたブロックと、プラスチックよりも一そう熱的に相容性であるからである。
【００４５】
図２に示した第２実施形の主要な利点は１回通過（ワン・パス）で得ることのできる増幅された生成物の大きい体積である。これは大量の増幅された生成物を得るため多数の個々の１００μｌの反応混合物を製造しなければならない通常型のＰＣＲ装置よりも操作が一そう便利である。個々の反応混合物は通常、増幅し、プールし、再分割しなければならず、これは冗長で時間のかかる操作である。
【００４６】
多重水浴毛管熱サイクラー
図３には、毛管が存在する室の温度を変えるため水浴を使用する比較的小規模の非常に迅速なＰＣＲを実施するための、本発明による毛管ＰＣＲ装置の第３実施形の図が示されている。この装置においては液密の室６０は、室から液密のグロメットを通って突出する両端６４および６６を有する少なくとも１つの毛管反応室６２を含有する。ここに記載したすべての毛管装置がそうであるように、毛管６２は望ましくはパリレンで塗装された金属、またはプラスチック実施形に対して望まれるテフロンまたはポリプロピレンで塗装されたプラスチックから製造されていてもよい。ＰＣＲ反応混合物１〜２５μｌを、任意の適当な手段により室６０中の毛管６２の部分中へ注入する。
【００４７】
室６０は、２つまたは３つの温度制御された液体浴とは液体連絡されている。図３には２つの浴だけが示されている：高温浴６８は９５℃のような変性温度範囲内の一定温度を保ち、冷温浴７０は、６０℃のようなアニーリング／エクステンション範囲内の一定温度を保つ。変性、アニーリングおよびエクステンション工程に対する３つの別個のインキュベーションが望まれる実施形は、図３に点線により指示した、第３の温度制御された液体浴７２を必要とする。
【００４８】
各液体浴は、浴６８に対し、管７４および７６のような入力管および出力管に結合した、それ自身の内蔵液体ポンプを有していてもよい。これらの実施形においては浴６８から室６０中へ熱い液体を、変性工程に対する所定時間（代表的には１秒から３分まで）、毛管６２を十分に浸漬するのに十分なレベルにポンプで圧送するために使用される。室中へおよび室からの水の流れは代表的には、温度間の切換を急速にするため毎分少なくとも１ ｌに設定される。
【００４９】
変性インキュベーションの完結後、適当な制御信号が、室６０内の９５℃の液体を熱い液体浴６８中へのポンプにより返送させるために発せられ、室６０内の液体水位が十分に低い場合、浴７０からの冷たい液体を室６０中へ圧送させるために適当な制御信号が発せられる。フロートスイッチ（図示せず）のような液体水位センサ機構はアニール／エクステンドインキュベーションを実施するため室６０をある温度の液体で充てんしはじめるため溜め７０中のポンプにスイッチを入れる時間を定めるために使用することができる。反応混合物は、室６０が異なる温度の液体で充てんされる場合に温度を迅速に変える。それというのも小さい熱質量を構成する毛管が使用されるからである。この第３の実施形においては、各水浴６８，７０または７２からの液体は、該温度におけるインキュベーションが終った場合、そのもとの浴６８，７０，７２中へポンプで返送することができる。しかし、この操作は毛管６２を、次の浴から液体が室６０に入る前に、一時的に空気中に懸吊状態にとどめる。室６０および水浴の相対的体積は、室６０の体積が水浴の体積に比べて非常に小さいようなものである。このため、液体を室６０から水浴へ移動させ、該水浴が、室６０の排水に先立つことなしに、次のインキュベーションのための新しい液体を用意する。換言すれば、液体は簡単にそれぞれの浴と各インキュベーション用室の間の管路によって移送することができる。室６０からの液体の温度が新しいインキュベーションのためポンプで圧入される液体浴中の液体の温度と相違するとしても、水浴の熱質量は、浴温に著しい変化が存在しないほど大きく、浴の制御は一定の浴温を維持することができる。この設計は代表的には１秒以下で温度変化を完成するのを可能にする。
【００５０】
図４は、任意の浴から液体を汲出すために１つのポンプを使用する、図３に示した第３実施形と類似の毛管ＰＣＲ装置のもう１つの実施形を表わす。図３および図４における同じ番号を有する機素は、構造が同じでありかつそれらが同じ機能を発揮することを意味する。図４において、単一の双方向ポンプ７８は入力管８０および出力管８２によって室６０に結合されている。このポンプは、入力管８６および出力管８８によって液体マルチプレクサ８４の出力部に接続されている。液体マルチプレクサ８４は、複数の入力部を有し、その各々は２つまたは３つの温度制御された浴６８，７０および７２の１つに接続されている。各入力部は、液体浴６８の入力管８６および出力管８８のような２つの管によって相応する液体浴に接続されている。
【００５１】
液体マルチプレクサ８４およびポンプ７８は、順次インキュベーションの所望のＰＣＲプロトコルを実施するため、ポンプ７８によるポンプ作用の方向の適当な切換および液体流出力部へ接続するため液体流入力部の１つの適当な位置選択を有する通常の適当なプログラマブル制御装置（図示せず）によって制御される。
【００５２】
図３および４に示した装置は、混合物はＰＣＲプロトコルの間一定不変であるので、油または他の液体不連続手段を使用することなく、１０μｌ以下の体積でＰＣＲ増幅を実施することができる。図３および４に示した装置は１秒のような短かい時間内にＰＣＲインキュベーション工程を実施することもでき、２つのインキュベーションＰＣＲプロトコルサイクルの合計時間は１秒の変性時間および７〜３０秒のアニール／エクステンド時間の使用により８秒のような短時間に減少することができる。しかし、アニール／エクステンド時間が短かい場合には、試料体積中に、大濃度のＴａｑポリメラーゼのような熱安定酵素が必要とされうる。
【００５３】
定常循環液体浴毛管熱サイクラー
本発明の毛管ＰＣＲ装置の第４実施形は図５に示されている。この図示された実施形は、３つのサーモスタットを備える液体浴および反応混合物試料を保持する密封毛管を有する単一の反応室を有する。しかし、ＰＣＲプロトコルに対し２つの温度だけが必要な場合には、第３浴は省略することができる。第３浴を完全のためここに記載する。
【００５４】
第１浴９８は、大部分の液体を、５５℃のようなアニーリング温度の範囲内の若干の温度に維持する。第２浴１００はそれに含有されている液体の温度を、エクステンションインキュベーションに対し有効な温度範囲内の温度、たとえば７５℃に維持する。第３浴１０２は、それに含有されている液体の温度を、変性に有効な温度範囲内の温度：代表的には９５℃に維持する。各液体浴はその中にポンプを有し、該ポンプは、液体を出力管１０８から、反応室１０６の入力側にある弁装置１０４により浴中へ圧送する。同様に、浴１００の出力管１１０および浴１０２の出力管１１２も弁装置１０４に接続する。反応室１０６からの液体は出力弁装置１２０によりその浴に戻り、各浴は帰り管、つまりそれぞれ浴９８，１００および１０２に対する管１１４，１１６および１１８を包含する。
【００５５】
コンピュータ１２２は、望ましい実施形において液体流量を制御するため、制御母線を介して種々の浴のポンプに結合されている。一定流量は別の実施形において使用することもでき、この場合にはコンピュータ１２２にポンプを連結するのは必要でない。それというのもポンプは同じ流量で連続的に回転するからである。
【００５６】
コンピュータ１２２は入力弁装置１０４および出力弁装置１２０にも結合されている。弁装置のコンピュータ制御の目的は選択的に１つの温度の液体の流れを反応室１０６中へ向け、所望のＰＣＲプロトコルを定義するコンピュータ１２２に記憶されたデータにより他の流れをバイパスすることである。
【００５７】
米国特許分類番号Ｎｏ．０７／８７１２６４号（１９２２年４月２０日出願）に記載されているような他のＰＣＲ装置のように、ＰＣＲプロトコルはすべての所望のＰＣＲインキュベーションの温度および時間、実施されるサイクル数を定義するチェックポイントデータおよび与えられたプロトコルの完結した際に他の所望のプロトコルに結合して操作されるデータによって定義することができる。所望のプロトコルを定義するデータはユーザによって入力することもできるし、またはあらかじめ定義されたプログラムであってもよい。
【００５８】
ＰＣＲプロトコルは、コンピュータ１２２により、入力弁装置１０４を制御して、１つの浴からの１つの流れだけが任意の特定時間に反応室を通過するように志向され、すべての他の流れは、反応室１０６を通過しない別の流路によりバイパスされるようにすることにより実施される。弁装置１０４は、当業者に周知の円筒または回転ソレノイド操作または空気圧式のマルチポート弁であってもよい。流れの順序は、反応室１０６の１つの配列および種々のバイパス状態における別の流路を示す図６〜９につき良好に理解される。
【００５９】
管反応室１０６は、望ましくは、室（管状）１０６の外側に取付けられた２つまたは３つの浴からのバイパス管路を有する。弁装置１０４および１２０は、室１０６の反対側端部に存在する。この装置を横断する断面図は、バイパス管路により取囲まれた室１０６の内部を示す。この断面図は、図６ないし図９に略示されている。
【００６０】
アニールおよびエクステンション温度が同じ場合には、２つの浴およびバイパス流路のみが必要であり、図５ないし図９における装置は３つのバイパス流路よりむしろ２つのバイパス流路を必要とするにすぎない。
【００６１】
図６は、３つの流れ全部が、その別の流路を通ってバイパスされている、空の反応室１０６を示す。アニール温度の液体はバイパス流路１３０を通って流れ、エクステンション温度の液体はバイパス流路１３４を通って流れる。
【００６２】
図７は、アニールインキュベーションのための弁装置を示す。このインキュベーションにおいては、浴９８からの５５℃の液体は、反応室１０６を通過するようにするため、コンピュータ１２２を介して、弁装置１０４中のソレノイド操作弁によって切換えられる。この場合、反応室中の毛管内の反応混合物の温度は急速に５５℃に平衡化される。浴１００からの７５℃の液体および浴１０２からの９５℃の液体の双方は、それぞれのバイパス流路１３２および１３４に結合されたままである。
【００６３】
適当なアニーリングインキュベーション時間が経過した後、コンピュータ１２２が弁装置１０４および１２０を活性化して、図８に示した装置への流れをエクステンションインキュベーションを実施するために切換える。このインキュベーションにおいては、９５℃および５５℃の液体の流れはバイパスされ、７５℃の流れは反応室１０６を通過するように切換えられる。
【００６４】
エクステンションインキュベーションの完結の際、二本鎖のエクステンション生成物を、次のサイクルのための一本鎖の鋳型に分割するための変性を行なわねばならない。コンピュータ１２２は再び弁１０４および１２０を活性化し、流れを図９に示した形状に切換える。ここで５５℃の液体の流れおよび７５℃の液体の流れはバイパスされ、９５℃の液体の流れは反応室１０６を通過するように切換えられる。この工程が１つのＰＣＲサイクルを完成する。次いでコンピュータ１２２は、代表的には、ＰＣＲプロトコルを完成するため、サイクルを所望の回数繰返す。
【００６５】
反応室１０６は反応室中、入力端に、横に取付けられた金網を有する管状室である。反応混合物は、完成生成物の所望体積により種々の直径の、不活性でパンクなしの継目なしプラスチック毛管の薄壁（０．１〜０．３ｍｍ）の区間に蓄積される。２ｍｍまでの内径および０．０７５ｍｍのような小さい内径が有効である。管は代表的には３００℃の最大連続使用温度定格を有し、大量の液体によって影響を受けない。たとえば、この目的のために使用することのできる管は、Ｍｉｃｒｏ ＭＬ Ｔｕｂｉｎｇ Ｓａｌｅｓ社（４５−１０ ９４ｔｈ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｅｌｍｈｕｒｓｔ，ＮＹ１１３７３）から購入できる。
【００６６】
反応混合物は、管のそれぞれに注入され、各管は両端で、望ましくは管の端部から反応混合物を隔離するために、各端部で気泡で閉鎖されている。１端部におけるクランプまたは他のクロージャーは金網を通して適合させるため十分に小さい。他端部におけるクランプは、望ましくは金網を通して適合させるため十分に大きい。所望のように多数の管中へ反応混合物を注入した後、複数の毛管を金網を通してねじ締めし、金網により懸吊する。管の束および金網を反応室１０６中に取付け、室を閉じて密封する。クランプ１４４は簡単には、拡大されたクランプを形成する毛管の溶封された端部である。次いで、コンピュータを活性化して、上述したように液体の流れが毛管をめぐって室１０６を通るように切換えを開始させる。
【００６７】
図１０は、反応室１０６中の典型的毛管の配置を示す。この図中で、単一の毛管１４０は、反応室１０６の一端を横切る金網１４２により適所に保持されて示されている。毛管１４０の上流側端部における管クランプ１４４は毛管１４０を、反応室１０６内の乱流の流れに振動することのない下流側端部の適所に保持する。それというのも上述したように、金網１４２の継目を通して適合するためには大きすぎるからである。毛管１４０の端部における気泡１４６および１４８は、反応混合物１５０を毛管の端部から隔離する。この望ましい実施形においては、上流側クランプ１４４は、符号を付したタブまたは試料を識別するのに役立つスタンプを有する。また、パドル形クランプ１４４は液体流れ中で動揺し、こうして循環する液体がそれを通過する際に乱流を生成する。
【００６８】
図１１は、毛管１４０に既知量のＰＣＲ反応混合物を装入し、処理後ＰＣＲ生成物を取出すための系を示す。シリンジ１５１は気密嵌合を有する毛管１４０のマウス１５２中へ挿入される。毛管１４０はそれ自体目盛を有していてもよいし、または図示のように管に近接して、目盛を有するホルダ１５４中に置くこともできる。毛管１４０の開放端部は、反応混合物の溜め１５０中へ浸漬している。次いで、シリンジのプランジャーを引出し、毛管からその中の圧力を大気圧以下にさげるのに十分な空気を吸込む。この場合、ＰＣＲ反応混合物は、反応混合物溜めに働く外側の高い大気圧によって毛管１４０中へ押込まれる。反応混合物の水位または量は、毛管１４０内のメニスカスの位置によって定められる。メニスカスの位置は、±２〜５％内で体積の消費を指示する。毛管１４０を満たした後、端部を密封し、締付けるかまたは蓋締めし、ＰＣＲ処理を続行する。出来上ったＰＣＲ生成物の取出しは、毛管１４０の端部クランプを切取り、上記操作を逆にすることによって達成される。この方法においては、毛管１４０はそれ自体のピペットであることに注意。シリンジは決して反応液に触れず、これにより相互汚染の機会は最小になる。
【００６９】
図５ないし９に関連して記載した第４実施形は、分析的大きさからセミプレプおよび分取的大きさまでの異なる試料体積をすべて同時に処理できるという利点を有する。処理される体積は、毛管の長さ、反応室内の毛管の数および／または管の内径を変えることによって変えることができる。また、反応室内の乱流は、ある温度工程後の反応混合物の温度平衡を促進する。望ましくは、反応室の体積は、それぞれの浴の体積の１０％よりも小さい。コンピュータによる、反応室を通る流量の可変制御は、異なる数の毛管およ試料体積（この場合反応室の異なる割合が試料管によって占められる）に対して作用するＰＣＲランの間のタイムレスポンスおよび温度平衡時間の最適化を可能にする。毛管内の反応混合物の温度における非常に迅速かつ正確に制御された温度変化は高い精度の浴温制御、たとえば±０．１℃の浴精度が市場で利用しうるので達成することができる。これに加えて、毛管の低い熱容量、反応混合物と熱交換液の間の高い熱流量、毛管をめぐる乱流、および室１０６中に空所の不在のすべてが、全ＰＣＲプロトコル時間を最小にするのを助ける。
【００７０】
図５に示した装置のすぐれた利点は、上述した多数の他の毛管ＰＣＲ装置のように、製造された出来上った生成物の体積を、金属のブロック熱交換器に対する新しい熱計画を設計する必要なしにかつ熱サイクルパラメーターを妨げることなしに、増大することができることである。この柔軟性は、ＰＣＲ基礎製造方法に対し従前技術のＰＣＲ装置を使用する複雑さを軽減しうる。図５に示した装置の設計は、実質的にすべてのその成分、たとえば水浴、パーソナルコンピュータソレノイド弁、毛管、シリンジ等は容易に購入しうる（特註でない）ので、組立が廉価である。
【００７１】
金属ブロック毛管熱サイクラー
本発明による毛管ＰＣＲ熱サイクラーの第４実施形は、図１２に示されている。その最も簡単な形では、この装置は絶縁材の層１７４により分離された２つの金属ブロック熱交換器１７０および１７２を包含する。熱交換器１７０および１７２は、サーモスタットで制御される一定温度の液体浴のような他のタイプの熱交換器であってもよい。各金属ブロック熱交換器１７０および１７２は、望ましくは、その中の温度勾配を最小にするため、アルミニウムまたは若干の他の良熱伝導性金属からなっていてもよい。
【００７２】
各金属ブロックの温度は、金属ブロック１７０に対しボックス１７６および金属ブロック１７２に対しボックス１７８によって象徴されるように、適当な温度制御系により一定温度に維持される。金属ブロック熱交換器１７０の温度は、温度制御系１７６によりＰＣＲ変性に適当な温度範囲、代表的には９４℃に維持される。金属ブロック熱交換器１７２の温度は、温度制御系１７８により、ＰＣＲアニーリングおよびエクステンションに適当な温度範囲内（代表的には５０〜７５℃）にほぼ一定に維持される。使用することのできる適当にプログラムしうる制御系は、米国特許第５０３８８５２号および米国特許出願Ｎｏ０７／８７１２６４号（１９９２年４月２０日出願）に記載されている。
【００７３】
金属ブロックの温度を制御するためにはペルティエ（Ｐｅｌｔｉｅｒ）の装置が理想的である。それというのもこれらの金属ブロック熱交換器がそれぞれ一定温度に維持されるからである。適当な公知温度検出およびフィードバック制御回路（図示せず）は、ブロックが熱すぎる場合に熱を取出し、冷すぎる場合に熱を加えることにより、ブロック温度を一定に維持するためペルティエ装置を流れる電流の方向を制御するのに必要である。ブロックに対しては、抵抗加熱装置および／または金属ブロック内の通路を循環する加熱／冷却された液体（冷却された液体は、ブロックの所望温度に依存して、水道水または冷却回路のフレオンを循環することにより冷却される不凍液である）のような他の温度制御系も働く。温度制御系は図１２に１回だけ示し、不必要な反覆をさけるため、引き続き記載された装置を用いてＰＣＲ方法を実施する工程を図面につき説明するのは省略する。
【００７４】
この実施形においては、少なくとも１つの薄壁毛管反応室１８０は２つの金属ブロック１７０および１７２を通り、金属ブロック熱交換器１７０により取囲まれた管１８０の一部分および金属ブロック熱交換器１７２により取囲まれた他の部分で働く。薄壁毛管はプラスチック、金属またはガラスであってもよく、プラスチックが望ましい。ガラスは、鋳型鎖またはポリメラーゼを壁に粘着させることによりＰＣＲ反応に干渉し、これによりアニーリング／エクステンドプロセスに干渉しうる。望ましくは、毛管と金属ブロック熱交換器の間の相互連結は、管およびブロックが相互に定置にとどまるように設計されている場合には軽い摩擦嵌合であって、毛管１８０は迅速かつ容易に、新しい毛管を金属ブロック中へ溶入することにより交換することができ、これにより該毛管は投棄される。この特徴は、相互汚染の危険を最小にし、ＰＣＲ実験の間毛管を洗浄および／または滅菌する必要性を省略することにより装置の使用を簡単にする。また、管はＰＣＲ実験の間清浄にすることもできる。
【００７５】
反応混合物試料の導入および毛管１８０内での移動は、シリンジまたは蠕動ポンプのような容量置換型ポンプ装置を用いて達成しうる。さらに、容量置換型ポンプ装置と反応混合物試料の間に、空気または液体緩衝剤を使用することもできる。
【００７６】
管１８０中への試料および反応混合物の導入は図１２に示したように、自動シリンジにより達成される。その一端にピストン１８４を形成する細いロッド１８２を、ステップモータ１８６によりブロック１７０および１７２を通して毛管１８０中へ挿入する。ピストン１８４は毛管１８０の壁とシールを形成する。このステップモータ１８６は、適当にプログラミングされたコンピュータ１８８のような制御装置によって制御される。ステップモータ１８６の機能は、空気圧系によって行なうこともできる。毛管１８０の一端１９０は、混合物導入の間試料および反応混合物の溜め（図示せず）と液体連通している。ステップモータ１８６はピストン１８４を毛管１８０で通して引出すために動作し、これによってその中の圧力は大気圧以下に低下する。この工程は、反応混合物１９２を毛管１８０中へ、図１３および図１４に示したように、１つのブロック内の毛管体積を完全に充てんするのに十分な反応混合物が毛管１８０中に存在するまで、押したり引いたりさせる。
【００７７】
変性の間、図１３に示したように、制御装置１８８およびステップモータ１８６はロッド１８２の位置をとり、ピストン１８４は熱交換器１７０の左縁にあるので、毛管１８０内の反応混合物１９２は熱交換器１７０内に包含されている。こうして、反応混合物１９２は急速に９４℃に加熱される。ピストン１８４はＰＣＲプロトコルの１サイクルの変性インキュベーションに所望の時間を定義するコンピュータ１８８内に記憶されたデータによって定められた時間この位置にとどまる。これらのデータは使用者により、ユーザインタフェースによって制御装置中にプログラミングすることができるかまたは永久的に制御装置のメモリに記憶することもできる。
【００７８】
アニール／エクステンドインキュベーションは、コンピュータ１８８およびステップモータ１８６がロッド１８２およびピストン１８４を、図１４に示したように熱交換器１７２により完全に取囲まれている毛管内の位置に反応混合物１９２を押す方向に動かす場合に始動する。ここで、反応混合物は、プライマーを一本鎖鋳型にアニールさせ、長いエクステンション生成物の形成を開始させるため、７０〜７０℃の間の温度、代表的には６０℃に急速に冷却される。アニール／エクステンドインキュベーションの完結時に、混合物１９２は二本鎖エクステンション生成物を一本鎖鋳型に分断するため、図１３に示したように、新しい変性サイクルの用意ができている。
【００７９】
次に、制御装置およびステップモータはロッド１８４およびピストン１８２を熱交換器１７０中へ引戻して、他の変性インキュベーションを開始する。インキュベーションのサイクルは、ユーザによりプログラミングされたかまたはコンピュータ１８８のデータベースに永久的に記憶された回数繰返される。
【００８０】
ＰＣＲプロトコルが完成した後、反応混合物１８２は図１５に示したような適当な容器中へ排出される。ピストンはブロック１７０および１７２を通して混合物１９２を押し、毛管１８０から容器１９４中へ排出する。
【００８１】
図１６〜１９は、ロッド１８２およびピストン１８４の機能が不活性油２０３に代えられている点を除き、上述したものと類似の毛管ＰＣＲ装置の別の第５実施形を表わす。不活性油２０３は、油溜め２０４から試料弁ループ２０２を通って導かれる。油は、ＰＣＲ反応混合物をブロック１７０と毛管１７２の間でその前面で、前後に押しかつ引くために試料弁ループ２０２を通して空気圧下に圧送または駆動することができる。油に対するこのポンプ作用または空気力作用は、所望のＰＣＲプロトコルを規定する記憶されたデータに応答するコンピュータ結合の制御装置（図示せず）の制御下にある。弁ループ位置および溜め圧力は、毛管１８０が図１６に示したように油で完全に充てんするため最初にステップモータを介してコンピュータ制御される。次いで、反応混合物試料１９２は、油２０３が、溜め２０４中へ引戻されるときに、管１８０中へ引込まれて、反応混合物試料１９２は、変性インキュベーションにつき図１７に示したように、熱交換器１７０により完全に取囲まれる。
【００８２】
変性インキュベーションが完結した後、油２０３は再び、ＰＣＲ反応混合物が、図１８に示したように熱交換器１７２によって完全に取囲まれている毛管内の位置に押すように、制御装置によりさらに圧送される。ここで、混合物は迅速にアニール／エクステンド温度に冷却される。アニール／エクステンドインキュベーションの完結の際、制御装置（図示せず）は、ＰＣＲ反応混合物を熱交換器１７０中へ引込んで新しいサイクルを開始するため不活性油の方向を逆にする。このインキュベーションのサイクルは、プログラマブル制御装置に記憶されたＰＣＲプロトコルデータ中に指定された回数繰返される。所望のサイクル数が完結した後、制御装置は毛管１８０を通して十分に油を圧送する制御信号を発して、出来上った生成物を補集容器１９４中へ放出するかまたは試料弁ループ２０２に結合していない毛管の端部に結合している試料検出系中へ放出する。
【００８３】
試料は、静止位置につき上述したように毛管中へ引込むことができ、次いで毛管または熱交換ブロックを相互に相対的に移動させて反応混合物試料に対して熱サイクルを実施する。かかる１実施形において、毛管および試料は静止のままであり、ブロックを前後に移動させる。もう１つの実施形においては、ブロックは静止のままであり、試料混合物を含有する毛管はその間で移動される。これらの実施形においては、ブロックと細い毛管との間の摩擦は移動を容易にするため比較的低くなければならない。この特徴はブロックと毛管との間の熱コンダクタンスを減少し、そのため熱応答を制限し、こうして全サイクル回数を増加する。熱コンダクタンスはこれらの実施形においては、熱伝導グリースまたは鉱油またはエチレングリコールポリマーのような潤滑剤の使用によって最大にすることができる。
【００８４】
金属ブロック多重毛管熱サイクラー
本発明の第６実施形の“ブレッドボード”レイアウトは図２０に表わされている。ブレッドボード毛管熱循環装置２１０は、少なくとも２つの金属ブロック熱交換器２１２および２１４を包含し、これらは、この予備設計においては、台板２１６に固定されている。図２０に点線で示した第３熱交換器２１８は別個のアニーリング温度およびエクステンション温度を要求するプロトコルを利用する場合には熱交換器２１２と２１４の間に位置定めされていてもよい。熱交換器２１２および２１４は、２つの熱交換器を相互に絶縁する空隙によって分離されている。また、これら熱交換器は、ガラス、ウールまたは発泡ポリマーのような適当な絶縁層によって分離されていてもよい。パーソナルコンピュータ２２０は、入力制御データを、線路２２２を介してサーモスタット制御装置２２４および２２６に送信する。これらの制御装置はそれぞれの熱交換器２１２および２１４を、変性のための一定温度（代表的には９４℃または９５℃）またはアニーリングおよびエクステンションのための一定温度（約３７〜６５℃の間、代表的には６０℃）に維持する。複数の毛管２２８は、試料移動装置２３０から、支持クランプ２３２、それぞれの熱交換器２１２および２１４および管リフトアセンブリ２３６におけるクランプバー２３４を通るように経路定めされている。
【００８５】
各毛管は、デュ・ポン社のテフロン（Ｔｅｆｌｏｎ登録商標）からなり、望ましくは約１．５ｍｍの内径および約０．３ｍｍの壁厚を有する。この管はゼウス・インダストリアル・プロダクツ社（Ｚｅｕｓ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ）から購入することができる。毛管２２８の先端２３８は、管リフトアセンブリ２３６により微量滴定トレー２４０の垂直上方へ線形列で配置される。コンピュータ制御のステップモータ２４２はクランプバー２３４を上げたり下げたりする親ねじを回転し、管先端２３８をトレー２４０と共に配置された試料容器２４４の列中へおよび列から順番に上下する。この実施形においては、９５ウエルの微量滴定トレー２４０中のウエル（くぼみ）中の試料容器の１つの完全な列を同時に処理できるようにするため１２個の毛管２２８が設けられている。しかし、同時に操作する反応管の他の数は明らかに本発明とむじゅんしない。
【００８６】
ブレッドボード装置２１０は、熱交換器２１２および２１４中に埋設されたカートリッジヒーターを使用する。カートリッジヒーター用温度制御装置２２４および２２６は、ワトロウ（Ｗａｔｌｏｗ）社の９２２Ａ２１０リアルタイム比例制御装置であり、該装置は熱サイクラーブロック２１２および２１４中に埋設されたＲＴＤまたはサーモカップル温度センサ（図示せず）を有する。表面取付けの電気ヒータまたは一定温度の溜めから循環される液体のような他の調節される熱源を使用することもできる。
【００８７】
微量滴定トレー２４０は、代表的には８×１２アレーのウエルを有するプラスチックトレーである。トレー２４０は可動プレートまたは移動アセンブリの部分であるすべりステージ２４６に取付けられている。移動アセンブリ２４７は、ステージ２４６、台板２１６に取付けられたステップモータおよび親ねじ２５０を包含する。ステップモータ２４８はコンピュータ２２０により制御され、親ねじを通して、ステージ２４６に取付けられている固定アーム２５２に連結している。ステップモータ２４８は親ねじを回転して、ステージ２４６をリフトアセンブリ２３６下方の種々の位置へ前後に割送りする。ステップモータ２４８およびステップモータ２４２は、線路２５３を介してコンピュータ２２０によりプログラマブルに制御されている。
【００８８】
ステージ２４６上の微量滴定トレー２４０に隣接して清浄トレー２５４が取付けられている。ステージ２４６およびトレー２４０および２５４の拡大部分側面図は図２１に示されている。トレー２５４は３つの平行なトラフＣ，ＲおよびＷを有する。これらのトラフはそれぞれ洗浄液、すすぎ液および廃液を含有する。洗浄液は１０％の塩素漂白液であってもよい。すすぎ液は、プリンス（Ｐｒｉｎｃｅ，Ａ．Ｍ．）およびアンドルス（Ａｎｄｒｕｓ，Ｌ．）［“ＰＣＲ：Ｈｏｗｔｏ ｋｉｌｌ ｕｎｗａｎｔｅｄ ＤＮＡ”、Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第１２巻、３号、第３５８頁〜第３６０頁（１９９２年）］に記載されているような２．８モルのチオ硫酸ナトリウム溶液であってもよい。このトレー２５４は、ステージ２４６が試料容器２４４の列の間へ割送りされる前に、毛管２２８を清浄およびすすぐために使用される。清浄トレー２５４は、清浄およびすすぎトラフを充満状態に保ちかつ廃液容器を廃液ドレンから廃液流出分を受取る状態に保つため液体供給溜めに連結することができる。トレー２４０および２５４は、試料ステージ２４６に取外し可能に取付けられている。試料ステージ２４６は、毛管先端２３８の列を適当なトラフまたは試料の列の上方に整列させるために、コンピュータ制御下に線路２５３を介してステップモータ２４８へ前後に割送りされる。
【００８９】
管リフトアセンブリ２３６は、１対の親ねじ２５８で回転する軸受けに乗っている駆動バー２５６を包含する。親ねじ２５８は、駆動バー２５６を上げ下げするため、コンピュータ制御のステップモータ２４２により同期的に駆動される。クランプバー２３４は駆動バー２５６にボルト締めされかつ清浄トレー２５４および微量滴定トレー２４０を水平に位置定めする移動アセンブリ２４７の上方で垂直整列で毛管２２８の先端２３８を固定するボルト締め板を包含する。
【００９０】
このブレッドボード設計における試料移送装置２３０は、図２２にカバーを取外して一そう明瞭に示されている。試料移送装置２３０は、毛管２２８に連結されかつ固定ステージ２６０に間隔を置いた配列で水平に取付けられ、固定されたシリンジを１２個まで有する。シリンジ２６２のシリンダ２６４は、毛管２２８の端部に個々に連結されていてもよく、一緒にグループにまとめられていてもよい。たとえば、合計６個のシリンジ２６２は、２個の毛管２２８に供給する各シリンジと共に使用することができる。
【００９１】
プランジャ２６６は可動プランジャ、締付板２６８とクランプバー２７０の間に捕獲されている。締付板２６８は、ステップモータ２７４により駆動される水平に滑動可能のステージ２７２上に取付けられている。ステップモータ２７４は、コンピュータ２２０により線路２７５を介して制御され、ステージ２７２を、ＰＣＲ反応混合物試料を吸引、移送し、それぞれの毛管２２８中へ排出するため、ステージ２７２を前後に動かす。場合により、シリンジは同じ機能を実施するため１つ以上の蠕動ポンプに代えることもできる。
【００９２】
この第６実施形は、１列の試料に対し各ＰＣＲプロトコルを実施する前に、コンピュータ制御下に、毛管清浄サイクルにより操作する。第一に、試料ステージステップモータ２４８は、毛管先端２３８が直接に清浄トラフＣ上にある位置へ試料ステージ２４６を割送りする。次に、リフトアセンブリ２３６、ステップモータ２４２は管先端２３８をトラフＣ中へ下げる。次いで、試料移送装置２３０中のステップモータ２７４が付勢され、プランジャ２６６を引出して、熱板２１２および２１４を通過した位置で、漂白液のような清浄液のスラッグを毛管２２８中へ吸引する。次に、リフトアセンブリ２３６が、トラフＣ中の液体から先端２３８を引上げる。次いで、試料ステージ２４６が、ステップモータ２４８により、廃液トラフＷを毛管先端２３８の下方に位置定めするため水平に移動する。次に、試料移送装置２３０が前後に振動して、完全な清浄を確保するため、所定数の時間および間隔で、清浄液を毛管２２８中で前後に移動させる。この清浄サイクルが終ったとき、リフトアセンブリ２３６が先端２３８をステップモータ２４２により、トラフ“Ｗ”中へ下げる。この時点で、試料移送装置２３０はプランジャ２６６を押込み、清浄液を毛管２２８から廃液トラフＷ中へ吐出する。
【００９３】
第二に、リフトアセンブリ２３６が管先端２３８を廃液トラフ“Ｗ”から持上げ、次いで試料ステージ２４６が、すすぎトラフ“Ｒ”上へ毛管先端２３８を位置定めするため割送りされる。次いで、リフトアセンブリ２３６が先端２３８をすすぎトラフ“Ｒ”中へ下げ、次に試料移送装置２３０がすすぎ液を毛管２２８中へ吸引する。すすぎ液は、管状態を次のＰＣＲランの準備中に回復するためチオ硫酸ナトリウムのような還元剤を含有しうる。次に、管先端２２８が持上げられ、試料移送装置２３０は、毛管を有効にすすぐことが要求される場合、再び前後に振動しうる。次いで、リフトアセンブリ２３６、移送装置２３０および移動アセンブリ２４７は毛管先端２３８の列を廃液トラフ“Ｗ”の上方へ位置定めし、すすぎ液を毛管２２８から廃液トラフ中へ排出するため操作される。
【００９４】
第三に、リフトアセンブリ２３６および移動アセンブリ２４７は、コンピュータ２２０の命令下に操作されて、試料容器２４４の列を毛管先端２３８の下方に位置定めする。
【００９５】
次いで、リフトアセンブリ２３６が管先端２３８を試料容器２４４中へ下げ、試料移送装置２３０のステップモータ２７４がプランジャ２６６を引戻して、所定量の反応混合物試料が各毛管２２８内の最初の位置へ吸引される。次に、リフトアセンブリ２３６のステップモータ２４２が逆に動作して、先端２３８を試料容器２４４の列から持上げる。
【００９６】
次いで、ステップモータ２７４はプランジャ２６６を引出し続け、毛管２２８内のこれら反応混合物試料を熱交換器２１４を通して引き、試料が完全に熱交換器２１２内に存在する位置にもたらす。ステップモータ２７４は、管先端２３８と熱交換器２１４の間で試料を緩慢に動かすため間欠的に操作される。間欠運動は、試料スラグの真正メニスカスにある液体が、毛管内に分離気泡を形成せずに、試料スラッグの大部分をつかみ上げるのを可能にする。この表面張力の効果は、熱交換器２１２および２１４の外部の毛管長さを高めた温度に維持することにより、最小にすることができる。しかし、ここに記載したブレッドボード装置２１０は室温環境で操作されたので、モータ２７４の間欠的運動は、メニスカスにある液体が試料スラッグの大部分をつかみ上げるのを許容するために必要とされた。この現象は、しばしば“ドラッグアウト（ｄｒａｇｏｕｔ）”と呼ばれる。ドラッグアウトは、管材料の内部表面のあらさを最小にしおよび／または内壁をパリレンのようなポリマーで塗装することにより最小にすることもできる。
【００９７】
試料が一度熱交換器２１４に達したら、試料を完全に熱交換器２１２内に位置定めするために連続的に運転することができる。試料が完全に熱交換器２１２内に位置定めされている場合、ＰＣＲプロトコルの最初のインキュベーションがはじまる。次いで、プランジャ２６６は、コンピュータ２２０内に記憶されたＰＣＲプロトコルにより、熱交換器２１２と２１４の間で反応混合物試料を移送するため、ステップモータ２７４を介して交互に挿入および引出される。プロトコルの完了時に、リフトアセンブリ２３０のステップモータ２４２は再び毛管先端２７８を試料容器２４４中へ下げる。次いで、ステップモータ２７４が付勢されて、プランジャ２６６を挿入し、ＰＣＲ生成物を再び試料容器２４４中へ排出する。
【００９８】
次いで、清浄サイクルおよび熱サイクル工程が、微量滴定トレー２４０中の試料容器２４４の次の列に対し、上述したように繰返される。上記工程におけるステップモータの運転は、ユーザによりコンピュータ中にプログラミングされる。プログラミングされた工程は変えることができ、ＰＣＲ生成物を、上述したと異なる試料容器の列への排出を包含しうる。上記の順序は説明のためのみである。
【００９９】
場合により、微量滴定トレー２４０と清浄トレー２５４の間に、毛管圧力シール固定装置２８０が取付けられる。固定装置２８０は図２１に示され、拡大断面図が図２８に示されている。このシール固定装置２８０は、毛管先端２３８の列に隣接して整列されていてもよい１２個のウエル２８４の１列を有するプラスチックまたは金属ブロック２８２である。各ウエル２８４はブロック２８２の頂面における凹所内に支承されたＯリングシール２８６によって取囲まれていてもよいし、または１つの連続Ｏリング２８６が１２個のウエル２８４全部のわまりに延びていてもよい。ブロック２８２は、図２８に示したように、クランプバー２３４の底面が、その間に圧縮されたＯリングシール２８６およびウエル２８４内に入れられた管先端２３８と係合するように設計されている。毛管２２８は１つのクランプバー２３４によってプレスばめされているか、またはクランプバー２３４は、図２８に示されているように、各毛管２２８を取囲む上方の部片と下方の部片の間にサンドイッチされたＯリングシール２８８を有する２部片配置であってもよい。
【０１００】
圧力シール固定装置２８０は、毛管内の試料が、ＰＣＲプロトコルの間加圧された環境中へ移すのを可能にする。この固定装置は望ましくは、装置を、反応混合物試料の沸点がＰＣＲプロトコルにおいて要求される変性温度に等しいかまたはそれよりも低い高い標高地で操作する場合に使用される。しかし、この固定装置の使用は、反応混合物にホルムアミドのような変性剤の添加によってさけることができる。変性剤の添加は、変性に必要な温度を下げ、溶液の沸点を僅かに上げる。
【０１０１】
試料がプロトコルの実施の間加圧された環境で循環させることが必要な場合、さきに記載した試料処理順序が僅かに変更される。プロトコルを開始するため熱交換器２１２中へ試薬混合試料を引出す代りに、試料移送装置２３０が試料を熱交換器２１２の後方所定の距離に存在する位置に吸引し続ける。次に、リフトアセンブリ２３６および移動アセンブリ２４７が、管先端２３８を固定装置２８０の上方へ位置定めするために動き、次いで先端２３８をウエル２８２中へ、Ｏリングシール２８６が固定装置２８０とクランプバー２３４の下側面の間に圧縮されるまで下げる。この位置において、管２２８は環境圧から分離されている。次いで、試料移送装置２３０が毛管２２８内の試料を、最初の変性インキュベーションのために熱交換器２１２中へ押戻し、同時に試料体積、毛管内の空気および試料ウエル内の管先端２３８の下方の封入された空気体積を大気圧よりも僅かに高い圧力に加圧する。次いで、試料移送装置２３０は、コンピュータ２２０中へユーザによって提供された命令データセットにより熱サイクリングプロトコルを実施するため、試料を交番に熱交換器２１２と２１４の間に位置定めするために操作される。
【０１０２】
回転熱板毛管ＰＣＲ熱サイクラー
本発明による毛管熱サイクラー装置の第７実施形は図２３〜図２７に示されている。この実施形は、熱交換ブロック２１２および２１４が回転円筒ドラム熱交換アセンブリ３００により代えられていることを除き、上述した第６実施形と類似である。第７実施形２９８の操作は、試料処理の面で記載した第６実施形と同一である。重要な相違は熱交換アセンブリ３００の操作にある。熱交換アセンブリ３００はこの実施形では毛管２２８に対し相対的に動かされ、毛管２２８内の試料は静止したままである。
【０１０３】
第６実施形からの同一の番号は、下記の記載における第７実施形において同じ成分を表わす。この第７実施形の簡略化側面図は図２３に示されている。装置２９８の斜視図は図２４に示されている。
【０１０４】
この装置２９８中の微量滴定トレー２４０、圧力シール固定装置２８０および清浄トラフプレート２５４は、移動アセンブリ２４７により、前述したように、パーソナルコンピュータ２２０から母線２５３を介してコンピュータ制御下に、毛管先端リフトアセンブリ２３６の下方で前後に、移動アセンブリ２４７により移動される。試料移送装置２３０は反応混合物試料を毛管先端２３８中へ引込み、次いで熱交換器３００の直接下方の位置へ引戻すように動作される。しかし、この実施形において、試料はＰＣＲプロトコルの間前後に移動されない。試料は静止状態にとどまり、熱交換アセンブリ３００は、試料にプロトコルの種々の温度インキュベーションを実施するために回転される。第６実施形におけるように、第７実施形の熱サイクリング装置２９８は、図２２に示したような、試料移送装置２３０、ガングシリンジアセンブリを利用する。試料移送装置２３０は蠕動ポンプ装置または空気力ポンプ装置（いずれもコンピュータ２２０により母線２７５を介して自動的に制御される）であってもよい。移動アセンブリ２４７は、微量滴定トレー２４０、清浄トレー２５４および毛管先端２３８の列下方の加圧固定装置２８０を割送る。リフトアセンブリ２３６は毛管先端２３８を、上述したように、試料容器２４０、トラフＣ、ＲおよびＷおよび試料ウエル２８６中へおよびこれから上げ下げする。
【０１０５】
熱交換器３００は軸方向に延びる、４つのくさび形セグメント３０２，３０３，３０４および３０６に分割された円筒ドラム形ボデイであり、各セグメントは“Ｘ”形の放射状絶縁層３０８の脚によって他方から分離されている。ドラムセグメント３０２および３０６はＰＣＲインキュベーションに利用される。セグメント３０２は、温度制御装置３０１により、代表的には、約６０℃およびアニーリングおよびエクステンションに相応する他の温度に維持される。セグメント３０６は、温度制御装置３０５により、変性温度、代表的には９５℃に維持される。他の２つのセグメント３０３および３０４は、トランジションセグメントである。これらセグメントの温度は、インキュベーションセグメント３０２および３０６よりも２℃〜２０℃高いかまたは低い範囲である。セグメント３０４は約９５℃の変性温度よりも２℃〜２０℃高い温度に維持され、セグメント３０６はこの温度に維持され、代表的には温度制御装置３０７により約１００℃に維持される。セグメント３０４はトランジションを促進する、つまりアニーリング／エクステンション温度から変性温度へのランプ速度を増加し、全プロトコル時間を最小にするために使用される。これに対して、残りのセグメント３０３は、代表的には約６０℃のアニーリングおよびエクステンション温度よりも著しく低い温度に維持される。セグメント３０３はトランジション温度よりも約２℃〜２０℃低い範囲内に維持され、代表的には温度制御装置３０９により約５０℃に維持される。
【０１０６】
４つの熱交換セグメント３０２，３０３，３０４および３０６を有する第７実施形は、単一の変性インキュベーション温度および単一のアニーリング／エクステンションインキュベーション温度が使用されるＰＣＲプロトコルに対して最適であると信じられる。それぞれインキュベーション温度よりも高い温度および低い温度に保たれる第３および第４セグメントは、アニーリング／エクステンション温度と変性温度の間のランプの上下を有効に最大にするために望まれる。その理由はこれらのトランジション回数は与えられた時間内に反応生成物の生産を最大にするためには最小にしなければならいからである。実施するのに必要とされる特別のプロトコルに依存して、２、３またはそれ以上のセグメントのような異なる数のセグメントを有する別の実施形も考えられることは明らかである。たとえば、５または６セグメントの熱交換器は、２−または３温度インキュベーションプロトコルに対して最適である。
【０１０７】
熱交換アセンブリ３００は望ましくは、セグメントへの液体および／または電気的接続の複雑さを最小にするために温度を所望の範囲内に維持するため前後に回転する。例示したブレッドボード実施形２９８においては、セグメントは各アルミニウムセグメントに埋設されたヒータにより温度に維持される。さらに、ＲＴＤまたはサーモカップルは、温度制御装置３０１，３０５，３０７および３０９に対する必要な制御信号を提供するために、各セグメントに埋設されている。また、熱交換アセンブリ３００は、ヒータ電流を供給しかつ温度検出および制御を提供するために、適当なスリップリング電気接続が行なわれる場合、一方向に連続的に回転させることができる。この別法は、リード線疲労を最小にするため製造機械において望ましい。
【０１０８】
回転熱交換アセンブリ３００の側面図は、図２６に示されている。熱交換アセンブリの背面図は図２７に示されている。熱交換アセンブリ３００は、２つの定置の支持ポスト３１０により、ブレッドボード台板２１６から水平かつ回転可能に支持されている。各支持ポストは軸受（図示せず）を収容し、該軸受はまた軸方向シャフト３１２を回転可能に支持する。軸方向シャフト３１２は一端に固定されたプーリ３１４を有し、該プーリはまたベルト３１６を介して図２５の端面図に示したようにステップモータ３１８に連結されている。ステップモータ３１８はコンピュータ２２０に連結され、制御されている。セグメント３０２，３０３，３０４および３０６の各々は、くさび形の固形アルミニウムセグメントであり、相対する端部が円形端板３２０にボルト締めされている。端板３２０はまたそれぞれ、定置の支持ポスト３１０により保持された軸受に支承された軸方向シャフト３１２に固定されている。
【０１０９】
プーリ３１４に隣接するシャフト３１２には割出し板３２２が固定されている。この割出し板は、シャフト３１２のプーリ端で、定置のポスト３１０に取付けられた光位置センサ３２４に結合されている。位置センサ３２４は、コンピュータ２２０を通してステップ駆動モータ３１８に連結されている。光位置センサは、熱交換ドラム３００が正しく位置定めされていることを指示するため、割出し板３２２におけるノッチ３２６の存在を検知する。
【０１１０】
セグメント３０２，３０３，３０４および３０６はそれぞれは望ましくは、セグメントの長さに沿って等間隔に存在する、１２の平行な半円形みぞ３３０を有する湾曲外面３２８を有する。各みぞ３３０は毛管２２８の１つを収容するように寸法定めされているので、管２２８の円周の少なくとも半分は十分にセグメントの外面３２８と接触している。各セグメントの間の間隔は、望ましくはファイバガラス、プラスチックまたは空気のような熱絶縁材料で充てんされている。目的は、セグメント３０２，３０３，３０４および３０６間の熱伝達を最小にすることである。
【０１１１】
各セグメント３０２，３０３，３０４および３０６は、発熱体３３４を収容する軸方向に延びる通し孔３３２を有する。単一の抵抗発熱体３３４は、図示の実施形２９８においては各セグメント内で利用される。しかし、双対の発熱体を使用することもできる。各セグメントは温度制御用のＲＴＤまたはサーモカップル温度検出器のための凹みを含有する。それに加えてまたは二者択一的に、各セグメントはそれを貫通する１つ以上に流路を有することができ、該流路を通って所望の範囲内のセグメント温度を維持するために一定温度の液体が循環する。各発熱体および温度検出器は、その制御装置３０１，３０５，３０７または３０９に通常のリード線３３６を介して接続されている。
【０１１２】
熱交換ドラム３００および試料は熱サイクルの間静止位置に維持されるているので、操作の間毛管２２８における摩耗を減少させ、管と熱交換器の間の不変の熱接触を確保するために引張り装置４００および４０２が設けられている。図２５に関して、引張り装置４００および４０２はそれぞれ、台板２１６に取付けられた、傾斜した定置の支持ブロック４０４およびすべりブロック４０６、およびブロック４０６にボルト締めされたキャップ４０８を包含し、該キャップは毛管２２８を平行位置に締付ける。ブロック４０６およびキャップ４０８は、熱交換アセンブリ３００のセグメントの表面３２８内のみぞ３３０に対する接線に沿って毛管２２８を位置定めする。すべりブロック４０６はそれぞれ、コイルばね４１０により接線方向に熱交換器３００から離れるようにばね負荷されている。定置の支持ブロック４０４のそれぞれの傾斜した上面に対して各すべりブロックを保持するために、ブロック４０６の表面に対して垂直に働く１対の止めばね４１２が使用される。
【０１１３】
引張り装置４００および４０２は台板２１６上に位置定めされているので、それぞれの毛管２２８は、それぞれのセグメントが、図２４および図２５に示されているように“６時”の位置に位置定めされている場合、各特定のセグメント３０２，３０３，３０４および３０６の湾曲した外面３２８のみぞの全長に接触する。ばね４１０および４１２は協力して、熱交換器３００下方の毛管２２８の部分が各セグメントの外面３２８と良好な熱接触状態に維持されかつ各管がそのみぞ３３０内に保持されているのを確保する。
【０１１４】
引張られた毛管２２８における摩耗を減少させるために、ステップモータ４２２により駆動される引張り力レリーズ装置４２０が、熱交換セグメントの間で回転する間、管２２８における引張り力を自動的にレリーズする。コンピュータ２２０を介し母線４２３によりモータ４２２によって駆動される水平に取付けられた回転シャフト４２４は、すべりブロック４０６に対し偏心ローブ４２６を、ばね４１０のばね負荷に抗して位置定めする。偏心ローブ４２６はすべりブロック４０６を熱交換器３００に向って押し、コンピュータ２２０から熱交換ステップモータ３１８に伝達される駆動信号と同時にまたは直前に毛管２２８における引張り力をレリーズする。
【０１１５】
光学的に透明な熱シールド３４０を、毛管２２８と接触しているセグメントの下方で密に隣接して位置定めすることができる。この熱シールド３４０はＤＮＡ増幅工程の間反応生成物の生産をモニタするため、図２６および図３０に示したように、熱交換器３００の下方に取付けられたけい光検出器３５０に対する窓として作用することもできる。
【０１１６】
臭化エチジウム（挿入染料）を反応混合物に、ＰＣＲと干渉しないレベルで溶かす。エチジウムイオンは、ＤＮＡ中に挿入した場合、約６１５ｎｍで、溶液中に存在しない場合よりも高い強さでけい光を発する。それ故、けい光の強さは、増幅したＤＮＡ集団の濃度の尺度として使用することができる。
【０１１７】
検出器３５０は、インキュベーションの間毛管２２８の１２個すべてからのけい光を同時に検出するホトダイオードアレー（ＰＤＡ）を使用する。検出器３５０は図３０に略示されている。ドラム３００の下方で引張り装置４００と４０２の間には紫外線光源３５４およびミラー３５６を含有しかつ支持するハウジング３５２が取付けられている。ＵＶ光源３５４はドラム３００と接触している１２個の毛管の部分に向けられている。ミラーは、ドラム３００の下方で毛管により放射されるかまたは毛管から反射された光がハウジング３５２中の窓３５８および集束レンズ３６０を通ってホトダイオードアレー３６２に向けられるように位置定めされている。ホトダイオードアレー３６２の出力は、通常の増幅回路３６４を通ってデイスプレー用コンピュータ２２０に供給される。
【０１１８】
このブレッドボード設計においては、１２個の毛管のそれぞれからの光はアレー中の別個のホトダイオードに向けられるので、各毛管内での増幅は同時にかつ個々にモニタすることができる。使用されるこのダイオードアレーは、直線配列の３５個のダイオードからなる。それぞれの第３ダイオードは、光学的に信号ダイオードとして毛管２２８の１つに結合されている。
【０１１９】
ドラム３００のアニーリング／エクステンション区間は、モニタする間毛管２２８に対して位置定めされている。検出されたけい光強さは、ＰＣＲプロトコルの間のＰＣＲ生成物の成長のリアルタイムモニタを生じる。この情報は、増幅の大部分の間、成長速度は簡単な指数プロセスであるので、増幅に先立ち、最初に存在していた標的ＤＮＡの量を見積るのに使用することもできる。
【０１２０】
ハウジング３５２の内部は、散乱光を吸収するため均一なブラックに塗装され、外界光を排除するため、ドラム３００の底に隣接して密に嵌合されている。アニーリング／エクステンションセグメント３０２の外面３２８も、散乱光を吸収するため均一なブラックに塗装されている。各アニーリング／エクステンションセグメント３０２の湾曲面は、けい光の最大量を反射するようにするためミラー仕上げに磨かれている。
【０１２１】
また、他のセグメントも検出のために使用することができる。しかし、長時間のアニーリング／エクステンションインキュベーションは、サイクルごとに蓄積するＰＣＲ生成物をモニタするためには最適の機会を与えるように感じられる。検出系３５０中では、けい光データがアニーリング／エクステンションインキュベーションの間毎秒１回受信される。さらに、全検出系は望ましくはそれ自体製造装置中に含有されている。
【０１２２】
上記の検出系は、ＵＶ光および可視光が通るように、毛管が比較的透明である限り、ここに記載した多数の実施形に取付けることができる。さらに、検出系信号は最適インキュベーション時間を計算および調節するための入力として使用することができる。また、検出器出力は、ＰＣＲプロトコルに対する終端信号を提供するために使用することができる。換言すれば、現在技術におけるプラスチックであるようなサイクルの総数よりもむしろＰＣＲ生成物の所望量をコンピュータ２２０に指定することができる。最後に、他の検出系も利用することができる。たとえば、分解能および感度を高めるため、ダイオードアレーの代りに、ＣＣＤ装置を使用することができる。検出器も、ポリクロメータに結合することができ、異なる発光スペクトルを有する若干のけい光を、反応混合物の種々の成分を識別するために使用することができる。たとえば、ＤＮＡ増幅と干渉しない染料により発せられた１つのけい光信号を、けい光光学素子を連続的に再校正するために使用することができる。光校正染料は光退色に耐えるかまたはＤＮＡリポーター染料が光退色する場合には、類似の感光性を示すように選択すべきである。エチジウムのようなデュフレックスＤＮＡに結合する際に強いけい光増強を経験する染料（核酸分析法において周知の挿入染料）または二重らせんＤＮＡの小溝に結合することが知られている、多数のビス−ベンズイミド部類の染料によって第２けい光信号を提供することができる。樋口（Ｈｉｇｕｃｈｉ等）（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第１０巻（１９９２年４月）第４１３頁〜第４１７頁、“特殊なＤＮＡ配列の同時増幅および検出”）は、エチジウムはＰＣＲ混合物中でリアルタイムに二重らせんＤＮＡの蓄積をモニタするために使用することができたことを示した。この第２けい光信号に対し選択的に、染料およびけい光消光剤を、ＰＣＲ鋳型にアニーリングするプローブに、ＰＣＲが５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて行なわれる場合、ポリメラーゼのニックトランスレーション活性がプローブを消化するように結合することができる。ホランド（Ｈｏｌｌａｎｄ等）［ＰＣＴ Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．ＷＯ９２／０２６３８］により記載されたように、この消化活性は、染料が消光剤から分離する際にけい光信号を発する。異なる鋳型に対し特異的なプローブに結合した、スペクトルが異なる、若干のけい光消光剤対を使用すれば、若干のＰＣＲ生成物の蓄積を同時にモニタすることが可能である。
【０１２３】
装置２９８は、コンピュータ２２０の制御下に、下記のように自動的に動作する。反応混合物の試料は、上述したように、リフトセグメント２３６および試料移送装置２３０を介して毛管２２８のそれぞれに引込まれる。試料は、試料容器２４４から毛管２２８中へ吸引され、熱交換ドラム３００のすぐ下の位置に達する。図２４に示したように、セグメント３０６は試料を含有する毛管２２８の区間と接触する。毛管２２８内の試料の温度は、９５℃の変性温度にまで迅速に上昇する。毛管内の変性温度は必要なインキュベーション時間維持される。
【０１２４】
この時間の終りに、セグメント３００を時計方向に９０°回転して、セグメント３０３が反応混合物試料を含有する毛管区間と接触する位置にもたらす。セグメント３０３は約５０℃に維持されるので、試料は約６０℃の温度に迅速に冷却する。適当な時間に、セグメント３００を時計方向にさらに９０°回転して、セグメント３０２を、試料を含有する毛管区間に向合う位置にもたらす。セグメント３０２は６０℃に維持される。アセンブリは再び、ＰＣＲプロトコルにより指示される必要なインキュベーション時間この位置にとどまる。アニーリングおよびエクステンションインキュベーションの終りに、ドラムを時計方向にさらに９０°回転し、その結果セグメント３０４（代表的には１００℃の温度を有する）は毛管２２８と、反応混合物温度を迅速に約９５℃に上げるのに必要な時間接触している。９５℃に達した際、熱交換アセンブリ３００を反時計方向に迅速にさらに２７０°回転して、セグメント３０６を再び、次の必要な変性インキュベーションのため毛管２２８と接触する位置にもたらす。このプロセスを、ＰＣＲプロトコルを完成するのに必要であるように繰返す。各回転時間の間偏心カム４２６をモータ４２２により回転して、セグメントの外面３２８から毛管２２８をゆるめる。回転が停止した場合、インキュベーションの間適切な熱接触を確保するため、偏心カム４２６を回転して引張り装置４００および４０２を再係合する。
【０１２５】
上述した第６実施形におけるように、熱交換アセンブリおよびセグメントの温度制御の回転調整および制御はコンピュータ２２０によって維持される。ＰＣＲプロトコルの終りに、コンピュータ２２０は、試料移送装置２３０に、プランジャ２６６を挿入して反応生成物を微量滴定トレー２４０中のウエルにある試料容器２４４中へ戻すように指示する。次いで、第６実施形に関して記載した清浄およびすすぎの工程配列を、毛管から汚染物および処理した試料の残留物をフラッシングするために実施する。次に、移動アセンブリ２４７が、微量滴定トレー２４０を次列のウエル保持試料容器２４４に再位置定めし、全工程を繰返す。
【０１２６】
上述した第６および第７実施形における毛管先端２３８は、図２９に先端２３８の拡大図で示したように、特殊な物理的配置を有する。毛管を単に管の軸に対して横方向に切断する場合、排出される試料の最終滴はしばしば管端にぶらさがる。こうして、試料ウエル中への反応生成物の完全な排出が阻止される。先端壁２９０を図２９に示したように先細にすることによって、反応生成物の最終滴は毛管２２８の末端２３８から確実に排出される。
【０１２７】
試料は第６実施形において熱交換器の間で前後に移動するので、毛管２２８内の試料の、第７実施形における熱交換ドラム３００下方の位置への“ドラッグアウト（Ｄｒａｇｏｕｔ）”は、最小の内面あらさを有するテフロン管においては、管壁に隣接する液体が管壁に進行的に管壁に付着する傾向があり、試料スラッグの端部に一般に放物線の細長い断面形を形成する毛管内の表面張力現象を最小になる。ドラッグアウトが厳しい場合、引きずる端部はスラッグ移動の間大部分の試料スラッグから分離するかまたは“ドラッグアウト”し、合体し、場合により試料の末端部分の間気泡を捕えることができ、こうして試料の全長が延びる。前述したように、毛管内の試料の外界温度条件はドラッグアウトに寄与する。従って毛管中への吸込みの間試料および毛管の高めた温度を維持すると、ドラッグアウトを最小にすることができる。ドラッグアウトを最小にするもう１つの有効な手段は、試料を、多数の離散過程および休止期の位置へ試料を吸込むプロセスを中断することである。これらの休止期は、試料のひきずり端が毛管内の試料の大部分を捕えるのを可能にする。
【０１２８】
水の沸点が９３．５℃に低下するデンバー、コロラドのような高地において加圧固定装置を使用する別法が存在する。この別法は、反応混合物へホルムアミドのような変性剤の添加であるこの手段は、パナジオ（Ｐａｎａｄｄｉｏ等）（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第１４巻、Ｎｏ２（１９９３年）、第２３８頁〜第２４３頁、“Ｆｏｌｔ ＰＣＲ：全血から直接にＤＮＡを増幅するための簡単なＰＣＲプロトコル”）に提案されている。著者は、Ｔａｑポリメラーゼよりむしろ熱安定のＴｔｈポリメラーゼを使用し、９５°−５０°−７０℃プロトコルはホルムアミド１８％を含有する反応混合物に対して８５°−４０°−６０℃プロトコルに変えることができることを示した。
【０１２９】
Ｔａｑポリメラーゼは、グリセロールおよびアセトアミドを包含する多数のＤＮＡ変性剤を寛容する。実際に、上述した本発明の第７実施形において使用した反応混合物試料中の２．５％のホルムアミドは、８９℃の変性温度および６３℃のアニーリング／エクステンション温度において満足な増幅を生じ、プロトコル温度を一律に約５℃下げる。
【０１３０】
以下の節は、本発明の第７実施形の操作を制御するために使用されるソフトウエアの系統図を提示する図３１〜図３４に関する。コンピュータ２２０中のソフトウエアは、５つのステップモータを制御する。これらのステップモータは次のものである：ポンプ２３０中のシリンジ２６２を操作するモータ２７４；熱交換ドラム３００を駆動するステップモータ３１８；試料ステージ２４６を水平に移動するステップモータ２４８；毛管２２８の先端２３８を垂直に上下するステップモータ２４２；および熱交換ドラム３００に対して毛管２２８を引張りおよびためカムを回転するステップモータ４２２。
【０１３１】
ソフトウエアはベーシックでまたは当業者に公知の常用のプログラミング言語でプログラミングされていてもよい。下記に記載したブレッドボード設計はベーシックでプログラミングされている。
【０１３２】
図３１に関し、ユーザはブロック５０１で開始し、熱サイクリングプロトコルに必要な変数を負荷する。これらの変数は、変性温度、アニーリング温度、変性温度におけるインキュベーション時間、アニーリング温度におけるインキュベーション時間、熱サイクルＡ、ＢおよびＣにおけるサイクル数、試料体積、オーバシュートインキュベーション時間、アンダシュートインキュベーション時間、熱交換ドラム３００の下方で６時の位置に試料の真中を正確に置く絶対ポンプ配置、負荷時のポンプ回転速度、無負荷時のポンプ回転速度および検出時間を包含する。これらすべての変数がエラーなしに入力された場合、ソフトウエアはブロック５０２に進み、検出器ポートがコンピュータ２２０に開かれる。
【０１３３】
次いで、処理は図３２に示した試料負荷サブルーチン５０３に移る。このサブルーチン５０３は、付勢されるステップモータ２４２で、毛管先端２３８を微量滴定トレー２４０中の管の少なくとも約１ｃｍ上方の位置へ持上げはじめる。ブロック５０３において、シリンジポンプ２３０の回転速度が設定される。ステップモータ２７４の回転速度は、ブロック５０６においてシリンジポンプ２３０を閉じるため動作する。この作用はシリンジプランジャ２６６を十分に挿入する。
【０１３４】
次いで、ステップモータ２４８は、ブロック５０７において母線２５３を介して付勢されて微量滴定プレート２４０を、試料管または容器の所定列の最初のものが管先端２３８の直接下方に位置するように位置定めする。次に、ブロック５０８において、シリンジポンプ２３０が作動される。ここで、ステップモータ２７４が逆方向に動いて、ＰＣＲプロトコルの終りに管２２８から試料を完全に吐出するのに使用することのできるシリンダ内の空気体積が存在するのを確実にするため、プランジャ２６６を僅かな引戻し位置にもたらす。
【０１３５】
次いで、コンピュータ２２０は信号を母線２２２を介してステップモータ２４２に送って、ブロック５０９において管先端２３８を下げる。毛管先端２３８は、試料管中へほとんど管の底に下げられる。この工程は、管先端を、試料反応混合物の最大体積を毛管２２８中へ引上げるように位置定めする。
【０１３６】
次いで、シリンジポンプ２３０が、ブロック５１０において、望ましくは５０μｌの試料を毛管２２８中へ吸上げるため動作される。次いで、シリンダにより必要量が吸上げられた場合、ブロック５１１においてステップモータ２４２が付勢されて管先端２３８を試料管から持上げる。この操作が、図３２に示した負荷サブルーチン５０３を完結する。
【０１３７】
再び図３１に関して、制御はブロック５０３に戻り、ブロック５１２に進む。ブロック５１２において、ステップモータ４２２が、毛管２２８とドラム３００の間の引張り力をレリーズするために動作される。とくに、ステップモータ４２２はカム４２６を回転して、すべりブロック４０６を熱サイクリングドラム３００に向って、毛管を変性するのに十分な数ｍｍ動かす。引張り力がレリーズされると、ブロック５１３において、熱サイクリングドラム３００がステップモータ３１８により回転され、最低温度にあるセグメント３０３は、６時の位置に対称に位置定めされている位置もたらされる。この位置において、毛管２２８はこのセグメント中のみぞ３３０を十分に覆う。
【０１３８】
ドラム３００がセグメント３０３を正確に６時位置に位置定めすると直ちに、制御はブロック５１４に進む。ここで、ステップモータ４２２が再び動作され、カム４２６をすべてブロック４０６と引き続き係合しないように回転し、ばね４１０が管２２８を６時の位置にあるドラムのこのセグメント中でみぞ３３０の表面に対して伸張するのを許す。次いで、ステップモータ２７４が、ブロック５１５において間欠的に“緩速負荷（ｓｌｏｗ ｌｏａｄ）”方式で付勢されて、試料を毛管先端２３８上方から６時の位置にあるセグメント３０３に直接隣接する毛管内の位置へ移動する。プランジャ２２６を少し引上げ、次いで所定時間、代表的に数秒間待ってステップモータ２７４を付勢するこの順序は、試料を４０または５０の短かい工程の連続で移動させ、代表的には試料をドラム３００の下方の近接位置へ動かすのに約２分かかる。この間欠的運動は、“ドラッグアウト”現象が試料体積の後端を分離させ、気泡の形成を阻止するのに必要である。かかる気泡は試料体積を有効に伸長し、試料中の核酸の増幅を悪化しうる。この緩速負荷法は、毛管の内面をパリレンで塗布するかまたは毛管の長さを予備加熱すれば必要でない。
【０１３９】
最後に、ブロック５１６において、ステップモータ２７４が、試料をセグメント３０３の下方で正確かつ対称に位置定めするため動作される。
【０１４０】
再び図３１に関して、熱サイクリングサブルーチンが実施される。熱サクリングプロトコルは、代表的には交番する変性インキュベーションおよびアニーリング／エクステンションインキュベーションからなる２０〜３０の熱サイクルである。このブレッドボード設計においては、プロトコルは３つのシーケンスＡ，ＢおよびＣに分割されており、これらは各シーケンス中のサイクルの数を除き同一である。図３３に示された熱サイクリングサブルーチンのブロック図は、それぞれの順序で使用される。第一に、熱サイクルＡにおいて実施されるべきサイクルの数はカウンタＮ（ブロック５１９）中にセットされている。毛管に対する引張り力は、上述したように、ステップモータ４２６を付勢することによってレリーズされる（ブロック５２０）。次に、ドラム３００がステップモータ３１８を介して時計方向に回転され、セグメント３０４を６時の位置に位置定めする（ブロック５２１）。ドラム３００は最初、セグメント３０３と共に６時の位置に位置定めされるので、第１サイクル回転は時計方向に１８０°である。次のサイクルにおける回転（ブロック５２１）は、セグメント３０２が６時の位置にあるアニーリング／エクステンションインキュベーション位置から時計方向に９０°である。ステップモータ４２２が再び付勢され、カム４２６をすべりブロック４０６と係合しないように回転して、毛管２２８に再び引張り力を復元するブロック５２２）。ブロック５２３は試料温度を９５℃の変位温度に急速にランプするのに必要な、セグメント３０４が毛管と接触している待ち時間を表わす。この時間は、比較的短いく、数秒の大きさである。セグメント３０４の温度が高ければ高いほど、必要な時間はますます短かくなる。
【０１４１】
必要な待つ時間後、毛管２２８における引張り力はレリーズされる（ブロック５２４）。次いで、ブロック５２５においてドラム３００が時計方向に９０°回転され、セグメント３０６を６時の位置に位置定めする。ブロック５２６において、ステップモータ４２２が再び付勢されて、カム４２６が回転し、すべりブロック４０６がレリーズされ、毛管２２８とドラム３００の底の間の引張り力が復元される。この過程が、ブロック５２７に象徴された変性インキュベーションを開始する。この変性インキュベーションは、代表的には１分の大きさである。このインキュベーションの終りに、ステップモータ４２２が再び付勢されて、毛管２２８とドラム３００の間の引張り力がレリーズされる（ブロック５２８）。次いで、ドラム３００は、反時計方向に２７０°回転して、冷セグメントを６時の位置に戻す（ブロック５２９）。
【０１４２】
順次に時計方向に２７０°回転し、反時計方向に戻すのは、温度制御装置からのリード線がドラム３００のまわりに巻付くのを阻止する。ドラム３００が、セグメント３０３が６時の位置にある位置に達した場合、引張り力が再び復元される（ブロック５３０）。ドラムセグメント３０３と接触すると、試料の温度は迅速に６０℃のアニーリング／エクステンション温度に下がる。従って、待ち（ブロック５３１）は比較的短かい。再び、ブロック５３１における待ちの後、管に対する引張り力はレリーズされ（ブロック５３２）、ドラム３００時計方向に９０°回転してセグメント３０２を６時の位置に位置定めする。ブロック５３４において、管２２８とドラム３００の間の引張り力は再び復元される。ブロック５３５において、けい光検出がはじまり、代表的に約１１９秒の時間、アニーリング／エクステンションインキュベーションの間継続する。アニーリングおよびエクステンションのインキュベーションは、ブロック５３６において実施される。アニーリング／エクステンションインキュベーション時間および検出時間はほぼ同じである。
【０１４３】
アニーリング／エクステンションインキュベーションの終りに、管２２８とドラム３００の間の引張り力は上記のように再びレリーズされる（ブロック５３７）。ブロック５３８においてカウンタは減分され、ゼロに照会される。カウンタがゼロに等しい場合、サブルーチンは主プログラムに戻る（ブロック５４０）。カウンタがゼロでない場合、制御は再びブロック５２０に志向される。
【０１４４】
ブロック５４０において、ポンプ２３０は、試料を前後におよび再び後に押して気泡を試料から追出するために動作される。変性温度とアニーリング／エクステンション温度の間の連続的熱サイクリングの間、試料は小気泡を生成し、該気泡が試料の末端を伸張するかまたは相互に引離し、こうして試料体積はセグメントの下方から部分的に離れる。試料を２５μｌ、５０μｌだけ前後に動かし、それから後に５０μｌ動かすと、これらの気泡が試料から追出され、こうして試料体積はそのもとの大きさに復元することが判明した。気泡掃引ブロック５４０が完了すると、熱サイクルＢシーケンスがブロック５４１に示したように開始される。
【０１４５】
熱サイクルＢは操作過程においては上述した熱サイクルＡと同一である。再び熱サイクルＢ後、気泡は“気泡掃引（ｂｕｂｂｌｅ ｓｗｅｅｐ）”で試料を前後に動かすことによって掃引される。（ブロック５４２）。
【０１４６】
代表的には熱サイクルＡは約５つのサイクルからなり、熱サイクルＢは約１０のサイクルからなる。熱サイクルＣは、ブロック５４３に示したように、プロトコル中の残存サイクル、プロトコルにおける３０〜３５サイクルに対し代表的には１５〜２０の間のサイクルを包含する。熱サイクルＣの完結後、管２２８と熱サイクルドラム３００の間の引張り力は、ブロック５４４において指示したようにレリーズされ、必要に応じ、ドラム３００が回転して、ブロック３０３を６時の位置に位置定めする（ブロック５４５）。
【０１４７】
試料無負荷サブルーチンがブロック５４６において行なわれる。このサブルーチンは図３４に示されている。はじめに、毛管の先端２３８は、熱サイクリングの間、上昇位置にある。第一に、微量滴定トレー２４０がユーザによりプログラミングされたように次の列または他の列に割送りされる（ブロック５４７）。ブロック５４８及び５４９においては、毛管先端を上方位置に持上げ、ポンプ回転速度がセットする（ステップモータ２７４）命令が与えられる。無負荷時のパンピング速度は、負荷サブルーチンにおけるよりも迅速である。それというのも絶対的位置定めおよびドラッグアウト効果は重要ではないからである。さらに、ブロック５５０においてはバックラッシは中断されている。バックラッシは、シリンジの交番挿入および引戻しの間に蓄積する種々の許容誤差を考慮するため相関因子がステップモータ２７４に適用される。無負荷サブルーチンにおいては、試料の末端位置は毛管から排出されようとする。従って、絶対位置は重要でない。それ故、パンピングアセンブリにおけるバックラッシの補償は、このサブル−チンにおいては必要でない。
【０１４８】
ブロック５５１においては試料約２０ｍｌを６時の位置におけるその現在の位置から移動させるために、ポンプ２３０（ステップモータ２７４）が動作される。ブロック５５２においては試料は、毛管内の気泡形成からドラッグアウトを阻止するために、負荷順序と類似に、緩速“無負荷（ｕｎｌｏａｄ）”法においてポンプ２３０を介して輸送される。緩速度無負荷法においてはポンプが試料を約８ｍｌ動かし、次いで１秒間待つ、次いで、ポンプ２３０が再び動作して、毛管内でさらに８ｍｌの距離を、試料が微量滴定トレー２４０内の試料管中へ排出されるまで移動させる。最後に、ブロック５５３において、シリンジポンプ２３０が完全に閉じられ、管の先端２３８から試料の最後の残留量を、図３２に示した試料負荷サブルーチンのブロック５０８において、シリンジの最初の弁動作からの空気スラッグで試料中へ押込む。
【０１４９】
最後に、ブロック５５４においてバックラッシが復元され、ブロック５５５において検出器ポートが閉じられる。ブロック５５６において、プログラムが他の試料ランへの連結を探索する。他の試料ランが要求される場合には、ブロック５５７により象徴されている清浄サブルーチンが実施される。清浄サブルーチンはたんに、微量滴定トレー移送ステージ２４７を適当な洗滌、すすぎまたは排水トラフ上へ位置定めし、管先端２３８を清浄トレー中へ下し、清浄液のスラッグを、熱交換ドラム３００の後方位置へ毛管２２８中へ吸込み、毛管２２８の内面を乱流的にこするため、ポンプ２３０を前後に振動することを包含する。次に、清浄液を排水トラフ中へ放出させる。次に、すすぎ液を毛管中へ吸込み、前後に振動し、次いで排水する。最後に、コンデショニング液を次のサイクルのため準備中の毛管中へ吸込む。このコンデショニング液が排水された後、ソフトウエア制御は、熱サイクルされる試料の次の列のためブロック５０２に戻る。
【０１５０】
上記の記載は本発明のすぐれた実施形の説明であるが、本発明による毛管サイクル装置の発明思想は詳述したとは別の方法で実施できることは明らかである。たとえば、本発明による熱サイクリング装置の種々の実施形はＰＣＲのほかに、少なくとも１つの熱サイクリングを必要とする他の核酸増幅および／または反応技術に適用できる。上記例はたんに説明的なものにすぎない。
【０１５１】
これらの技術は、リガーゼ連鎖反応およびエーブラムソン（Ａｂｒａｍｓｏｎ）当（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９３年、第４巻第４１頁、“核酸増幅技術”）に討議されているような修復連鎖反応を包含する。リガーゼ連鎖反応は、バラニイ（Ｆｒａｎｃｉｓ Ｂａｒａｎｙ）により（ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｃｎｓ１：５−１６（１９９１年））の“ＰＣＲの世界におけるリガーゼ連鎖反応”においても討議されている。本発明が使用することのできる他の方法は、フェイ(Ｆａｈｙ）等（ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｃｎｓ１：２５〜３３（１９９１年）、“自己支持されるシーケンス複製”：ＰＣＲに対する等温度転写を基礎とする増幅系別法）により討議された３ＳＲ法およびウオーカー（Ｗａｌｋｅｒ）等により（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：３９２−３９６（１９９２年）、“制限酵素／ＤＮＡポリメターゼ系によるＤＮＡの等温的試験管内増幅”）において討議された標準置換検定（ＳＤＡ）を包含しうる。
【０１５２】
これらの反応はいずれも、反応混合物が変性、アニーリングおよびエクステンションプロセスを受ける。これらは主として、アニーリングされたオリゴヌクレオチドが標的鎖を複製するためエクステンドされるプライマーエクステンション法において使用される特異的エクステンション機構のみが異なる。修復連鎖反応およびＬＣＲは反覆熱サイクリングを包含する。３ＳＲおよびＳＤＡ法は最初の変性工程、それに続くアニーリングおよびエクステンションプロセスのための等温インキュベーションを包含する。
【０１５３】
上述した装置の他の可能な適用例は、ＰＣＲに先立つｃＤＮＡ合成、ＤＮＡの連結およびキナージング、および引き続くインキュベーションまたは熱サイクリングの間試薬の添加が要求されうる酵素処理を包含しうる。こうして、本発明の実施形は、特許請求の範囲の本来の範囲および公平な意味を逸脱することなく、修正、変更および変化で加えられる。従って、特許請求の範囲の思想および広い範囲に入るすべてのかかる変更、修正および変化を包含するものとする。ここで引用したすべての特許明細書、特許および刊行物は、引用によってその全体が組込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１実施形による毛管ＰＣＲ熱サイクラー装置のブロック図。
【図２】本発明の第２実施形による毛管ＰＣＲ装置のブロック図。
【図３】小規模の迅速ＰＣＲを実施するための、本発明の第３実施形による毛管ＰＣＲ装置のブロック図。
【図４】本発明の別の第３実施形による毛管装置のブロック図。
【図５】３つのサーモスタット付循環液体浴および単一反応室を使用する、本発明の第４実施形による毛管ＰＣＲ装置のブロック図。
【図６】すべての流れがバイパスされた、図５に示した装置の反応室の線６−６による概略断面図。
【図７】５５℃の流れが反応室を通り、他のすべての流れがバイパスされている、図６におけるような装置の反応室の概略断面図。
【図８】７５℃の流れが反応室を通り、他のすべての流れがバイパスされている、図６におけるような装置の反応室の概略断面図。
【図９】９５℃の流れが反応室を通り、他のすべての流れがバイパスされている、図６に示した装置の反応室の概略断面図。
【図１０】金網により適所に保持された例示的な単一毛管反応管を示す、図５に示した装置の反応室の概略図。
【図１１】毛管中へ反応混合物を漸変量で注入する装置の図。
【図１２】一定温度に保たれた２つの金属ブロック熱交換器およびその間に延びる、反応混合物が前後にパンピングされる毛管反応室を使用する第５実施形の毛管ＰＣＲ装置の概念図。
【図１３】ＰＣＲプロトコルの変性ステージによる、図１２に示したＰＣＲの図。
【図１４】ＰＣＲプロトコルのアニール／エクステンドステージにおける図１２に示したＰＣＲ装置の図。
【図１５】ＰＣＲプロトコルの完成した生成物排出ステージにおける、図１２に示したＰＣＲ装置の図。
【図１６】ＰＣＲプロトコルの試料導入ステージにおける、図１２に示したＰＣＲ装置の別の第５実施形の図。
【図１７】ＰＣＲプロトコルの変性ステージにおける、図１６に示したＰＣＲ装置の図。
【第１８】ＰＣＲプロトコルのアニール／エクステンドステージにおける、図１６に示したＰＣＲ装置の図。
【図１９】ＰＣＲプロトコルの試料排出ステージにおける、図１６に示したＰＣＲ装置の図。
【図２０】本発明による毛細反応管アレーのＰＣＲ装置の第６実施形概略斜視図。
【図２１】図２０に示した装置中の試料移動アセンブリを拡大して示す部分的側面図。
【図２２】図２０に示した装置中の試料移送装置の拡大側面図。
【図２３】本発明による毛細反応管配列用回転ドラム熱交換器を有する毛管ＰＣＲ装置の第７実施形の概略側面図。
【図２４】図２３に示した毛管ＰＣＲ装置のブレッドボードバージョンの斜視図。
【図２５】図２４に示した装置中の回転ドラム熱交換アセンブリの拡大して示す部分的正面図。
【図２６】図２４に示した回転熱交換アセンブリの部分的側面図。
【図２７】本発明による図２４に示した熱交換アセンブリの拡大部分的背面図。
【図２８】図２０および図２４に示した試料処理アセンブリの部分的断面図。
【図２９】図２８に示した毛管先端の拡大して示す断面図。
【図３０】本発明による第７実施形に結合した検出系の略図。
【図３１】本発明の第７実施形のための制御ソフトウエアの系統図。
【図３２】図３１に示した図の試料負荷サブルーチンの系統図。
【図３３】図３１に関する熱サイクリングサブルーチンの系統図。
【図３４】図３１に関する試料無負荷サブルーチンの系統図。
【符号の説明】
１０ 装置
１２ ポンプ
１６，１８ 浴
２０ 絶縁層
２２ 反応管
２４，２６ Ｏリングシール
２８ 分光測光検出器
３０ ＣＰＵ
３２，３４，３６ 制御線路
３８ ブロック
４０，４４ 制御母線
５０ 毛管
５１，５５ シリンダ
５２ 熱ゾーン
５３ 反応混合部
５４ 冷ゾーン
５６ 容器
６０ 液密室
６２ 毛管
６４，６６ 両端部
６８ 高温浴
７０ 低温浴
７８ ポンプ
８４ 液体マルチプレクサ
８６，１１０ 入力管
８８，１１２ 出力管
９８，１００，１０２ 浴
１０４，１２０ 弁装置
１０６ 反応室
１１２，１１４，１１６，１１８ 管
１２２ コンピュータ
１２４ 制御母線
１３２，１３４ バイパス流路
１４０ 毛管
１４２ 金網
１４４ クランプ
１５２ マウス
１５４ ホルダ
１７０，１７２ 金属ブロック熱交換器
１７６，１７８ 温度制御装置
１８０ 毛管
１８２ ロッド
１８４ ピストン
１８６ ステップモータ
１９４ 容器
２０２ 試料弁ループ
２０４ 溜め
２１２，２１４ 金属ブロック熱交換器
２２４，２２６ サーモスタット制御装置
２３０ 試料移送装置
２３２ 支持クランプ
２３４，２７０ クランプバー
２３６ 管リフトアセンブリ
２３８ 管先端
２４０ 微量滴定トレー
２４２，２４８ ステップモータ
２４７ 移動アセンブリ
２４８，２７４ ステップモータ
２５４ 清浄トレー
２５８ 親ねじ
２６６ プランジャ
２８０ 圧力シール固定装置
２８４ ウエブ
２８６ Ｏリングシール
３００ 熱交換アセンブリ（ドラム）
３０２，３０３，３０４，３０６ 熱交換セグメント
３１０ 支持板
３１２ シャフト
３１６ ベルト
３２０ 端板
３２２ 割送り円板
３２４ 位置センサ
３２８ 湾曲外面
３５０ 検出器
３５４ ＵＶ光線
３６２ ホトダイオードアレー
４００，４０２ 引張り装置

Claims (25)

1. 変性、アニーリングおよびエクステンションプロセスを包含する、標的核酸セグメントを含有する反応混合物中で核酸増幅反応を実施する装置において、
   反応混 合物を含有するのに適合された部分を有する開放毛管反応室；
   反応混合物中で変性プロセスを生起させるのに適当な第１温度を反応混合物に受けさせるため、毛管反応室の部分と接触させるのに適合した第１加熱手段；
   混合物中でアニーリングおよびエクステンションプロセスを生起させるのに適当な第２温度を混合物に受けさせるため、毛管反応室の部分と接触させるのに適合した第２加熱手段；
   反応混合物を毛管反応室中および外へ自動的に移動させるため、毛管反応室に連結した試料処理手段；および
   毛管反応室の部分と接触している第１および第２加熱手段を自動的に位置定めするための位置定め手段
   を包含する核酸増幅反応を実施する装置であって、ここで、
   該第１加熱手段および該第２加熱手段はそれぞれ、円筒熱交換ドラムの放射状セグメントである、
   装置。
2. 毛管の部分に第１温度以上の温度を受けさせるため該部分と接触するのに適合した第３加熱手段を包含する、請求項１記載の装置。
3. 円筒熱交換ドラムが少なくとも２つの軸方向に延びる放射状セグメントであり、それぞれが熱絶縁材層によって相互に分離されている、請求項１記載の装置。
4. それぞれのセグメントが弓形外面および弓形外面内のみぞを有し、それぞれ毛管反応室の部分を収容するのに適合されている、請求項３記載の装置。
5. ドラムはその中心軸のまわりでそれぞれのセグメントが毛管反応室の部分と接触する位置の間で回転可能である、請求項４記載の装置。
6. 加熱手段および回転可能なドラムに連結され、加熱および冷却手段の温度およびドラムの位置をユーザ定義パラメーターにより制御するため操作しうるプログラマブルコンピュータを包含する、請求項５記載の装置。
7. それぞれが反応混合物を収容するのに適合した部分を有する複数の開放毛管反応室を包含する、請求項１記載の装置。
8. それぞれの加熱手段は、サーモスタットにより制御される、円筒熱交換ドラムのセグメントである、請求項７記載の装置。
9. それぞれのセグメントは、弓形外面および弓形外面内の複数の平行なみぞを有し、それぞれは毛管反応室の１つの位置を受取るのに適合している、請求項８記載の装置。
10. ドラムはその中心軸のまわりで、それぞれのセグメントが、各毛管反応室の少なくとも１つの部分と接触する位置の間で回転可能である、請求項９記載の装置。
11. 加熱手段および回転可能なドラムに連結されたプログラマブルコンピュータを包含し、該コンピュータがドラムの回転位置をユーザ定義パラメーターにより制御する、請求項１０記載の装置。
12. 毛管中で、標的核酸を含有する反応混合物中で、変性、アニーリングおよびエクステンションプロセスを包含する核酸増幅反応を実施する装置において、
    反応混合物を含有するための毛管反応室；
    反応混合物中で変性プロセスを生起させるのに適当な第１温度を毛管の第１部分に受けさせるため、毛管に結合した第１加熱手段；
    反応混合物中でアニーリングおよびエクステンションプロセスを生起させるのに適当な第２温度を毛管の第２部分に受けさせるため毛管に結合した第２加熱手段；
    反応混合物を毛管反応室中および外へおよび２つの部分の間で自動的に移動させる手段；および
    毛管反応室の部分と接触している第１および第２加熱手段を自動的に位置定めするための位置定め手段
    を包含する、標的核酸を含有する反応混合物中で核酸増幅反応を実施する装置。
13. 毛管反応室が１つの開放端を有する、請求項１２記載の装置。
14. 自動的に移動させる手段がコンピュータ制御の蠕動ポンプである、請求項１２記載の装置。
15. 毛管中の反応混合物中で、変性、アニーリングおよびエクステンションプロセスを包含する核酸増幅反応を実施する装置において、
    （ａ）反応混合物中で変性プロセスを生起させるのに適当な温度範囲内の温度に、第１熱交換器の温度を安定化するための温度調節系を含有する第１熱交換器；
    （ｂ）反応混合物内でアニーリングおよびエクステンションプロセスを生起させるのに適当な温度範囲内の温度に、第２熱交換器の温度を安定化するための温度調節系を含有する第２熱交換器；
    （ｃ）第１熱交換器と熱接触している第１部分および第２熱交換器と熱接触している第２部分を有するように径路定めされている毛管；
    （ｄ）管中へ反応混合物を収容するため毛管に結合した入力ポートおよび管から出来上った反応生成物を送出するための出力ポートを有し、新しい反応混合物を第１位置へ注入し、反応混合物を毛管中で第２位置で第１および第２熱交換器の間で循環させ、出来上った反応生成物を第３位置で排出するのを許す弁アセンブリ；
    （ｅ）反応混合物を毛管中で、反応混合物が第１および第２熱交換器を順次にかつ周期的に通過するように循環させるため、毛管に結合した熱交換器の１つ中のポンプ装置；および
    （ｆ）毛管反応室の部分と接触している第１および第２熱交換器を自動的に位置定めするための位置定め手段
    を包含する、毛管内の反応混合物中で核酸増幅反応を実施する装置。
16. 核酸増幅反応の間、反応混合物中の変化を表わすデータを発生するため毛管に光学的に結合した分光光度検出器を包含する、請求項１５記載の装置。
17. 試薬、付加的プライマーまたは付加的酵素を毛管中の反応混合物に添加することのできる入力ポートを設けるため毛管に結合した弁装置を包含する、請求項１５記載の装置。
18. 毛管中の反応混合物に隣接して不連続部を混入するための手段を有する、請求項１５記載の装置。
19. 不連続部の通過をカウントするため毛管に結合されたサイクルカウンタを有する、請求項１８記載の装置。
20. コンピュータ志向制御装置に記憶されたデータにより核酸増幅反応プロトコルを自動的に実行するため、ポンプ装置および弁アセンブリに制御信号を発生するため、ポンプ装置および弁アセンブリに結合したコンピュータ志向制御装置を包含する、請求項１５記載の装置。
21. コンピュータ志向制御装置がユーザプログラマブルであり、異なる核酸増幅反応プロトコルを定義するデータがユーザにより入力することができる、請求項２１記載の装置。
22. 反応混合物中で核酸増幅反応を実施する装置が、反応混合物中で変性プロセスを生起させるのに適当な第１温度に第１熱交換器を維持するための第１熱交換器手段；
    反応混合物中でアニーリングプロセスを生起させるのに適当な第２温度に第２熱交換器を維持するための第２熱交換器手段；
    反応混合物中でエクステンションプロセスを生起させるのに適当な温度に第３熱交換器を維持するための第３熱交換器手段；
    第１、第２および第３熱交換器手段を通る反応混合物を含有する開放毛管；
    反応混合物に第１、第２および第３温度を連続的に繰返し受けさせ、反応混合物中に核酸増幅反応が生起するようにするため、反応混合物を毛管を通しておよび熱交換器の間で移動させるため、反応混合物と連通しかつ毛管の一端に結合した手段；および
    毛管の部分と接触している第１、第２および第３熱交換器を自動的に位置定めするための位置定め手段
    を包含する、反応混合物中で核酸増幅反応を実施する装置。
23. 反応混合物を毛管を通して流す手段がシリンジポンプ装置である、請求項２２記載の装置。
24. 熱交換器が金属ブロックである、請求項２２記載の装置。
25. 生起手段が毛管に接続されたコンピュータ制御のポンプ装置を包含する、請求項２２記載の装置。

Images