DE10349708B4

DE10349708B4 - Verfahren und Vorrichtung zur Durchführung einer Reaktion

Info

Publication number: DE10349708B4
Application number: DE10349708A
Authority: DE
Inventors: Jörg Dr. Hassmann; Hans Dr. Kosak; Dirk Dr. Kuhlmeier; Jürgen Dr. Krause; Markus Dr. Neugebauer; Ugur ÜLKER
Original assignee: November AG Novus Medicatus Bertling Gesellschaft fuer Molekular Medizin
Current assignee: November AG Novus Medicatus Bertling Gesellschaft fuer Molekular Medizin
Priority date: 2003-10-24
Filing date: 2003-10-24
Publication date: 2006-10-26
Anticipated expiration: 2023-10-25
Also published as: US20050106684A1; DE10349708A1

Abstract

Verfahren zur Durchführung einer Reaktion in einer nicht bewegten Flüssigkeit in einer bei der Reaktion zumindest einseitig offenen Kapillare, wobei sich bei der Reaktion in der Flüssigkeit Gasblasen bilden, wobei der Flüssigkeit zur Veränderung mindestens einer Eigenschaft der sich bildenden Gasblasen ein Detergenz zugesetzt wird und die Kapillare in zumindest einem solchen Winkel zur Horizontalen angeordnet wird oder angeordnet ist, dass die Gasblasen in der Kapillare an eine Oberfläche der Flüssigkeit steigen, wobei die Eigenschaft die Größe der sich bildenden Gasblasen, die Adhärenz der Gasblasen an einer Wandung der Kapillaren oder die Formstabilität der Gasblasen ist.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung einer Reaktion in einer Kapillare, eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens sowie die Verwendung eines Detergenz.

Die DE 695 25 036 T2 betrifft eine Vorrichtung zum Amplifizieren eines Polynukleotids in einer Probe durch Ausführen einer Polynukleotidamplifikationsreaktion. Die Vorrichtung enthält ein Substrat mit einer Polynukleotidamplifikationsreaktionskammer, welche eine Wand mit einem damit assoziierten Mittel umfasst. Das Mittel verringert die Inhibierung einer Polynukleotidreaktion in der Kammer durch diese Wand. Die Reaktionskammer wird während der Reaktion verschlossen.

Aus der WO 01/23093 A1 ist ein Verfahren zur Durchführung einer Vervielfältigungsreaktion bekannt. Dabei wird in einer Vertiefung einer Vorrichtung eine Probe bereitgestellt, welche eine Ziel-Nukleinsäure-Sequenz, Primer, Nukleotide, Enzyme für die Vervielfältigungsreaktion, ein Puffersystem und gegebenenfalls ein Detergenz enthält. Damit wird eine PCR-Reaktion durchgeführt. Die Vorrichtung umfasst eine thermisch leitende Schicht und eine Deckschicht mit mindestens einer Vertiefung von bis zu 1000 μm Tiefe. Die Vorrichtung wird vor der Durchführung der Reaktion druckdicht verschlossen. Ein Erhitzen auf die bei einer PCR üblichen Temperaturen würde ohne das Verschließen der Vorrichtung zur Gasblasenbildung führen. Die entstehenden Gasblasen würden bei der vorgeschlagenen Ausgestaltung der Vorrichtung die Reaktionsflüssigkeit zumindest teilweise aus der Vorrichtung herausdrücken.

Nachteilig bei dem Verfahren ist, dass es nicht mit einer offenen Vorrichtung durchgeführt wird. Bei einer automatisierten Prozessierung von Proben ist es ungünstig, wenn das Reaktionsgefäß jeweils druckdicht verschlossen werden muss. Beim druckdichten Verschließen kann es zu Störungen kommen. Weiterhin ist das druckdichte Verschließen bei automatisierten Verfahren, bei denen es auf einen hohen Probendurchsatz ankommt, neben dem anschließend erforderlichen Öffnen des Reaktionsgefäßes ein zusätzlicher Arbeitsschritt, der Zeit und gerätetechnischen Aufwand erfordert. Ein weiterer Nachteil des Verfahrens besteht darin, dass wegen der Notwendigkeit der Druckbeständigkeit an das Material der Vorrichtung hohe Anforderungen zu stellen sind, die sich kostensteigernd auf die Vorrichtung auswirken.

Aus der EP 0 636 413 B1 ist ein Verfahren zur Nukleinsäurevervielfältigung bekannt, das in zumindest einer offenen Kapillare durchgeführt wird. Ein Reaktionsgemisch wird dabei durch verschieden temperierte Bereiche der Kapillare gepumpt oder eine Wärmequelle wird entlang der Kapillare bewegt. Durch Blasenbildung kann es dazu kommen, dass ein Teil des Reaktionsgemischs in der Kapillare von einem anderen Teil getrennt wird. Das Problem wird gelöst durch eine schrittweise Bewegung des Reaktionsgemischs mittels eines Schrittmotors, die es erlaubt, dass der durch eine Blase abgetrennte Teil des Reaktionsgemischs zu dem Hauptteil des Reaktionsgemischs aufschließt. Weiterhin kann das Problem dadurch gelöst werden, dass der sonst nicht temperierte Teil der Kapillare auf einer erhöhten Temperatur gehalten wird. Weiterhin wird zur Lösung des Problems vorgeschlagen, eine interne Oberflächenrauheit der Kapillare zu verringern und/oder deren innere Wandung mit einem Polymer, wie Parylen, zu beschichten. Als weitere Alternative wird vorgeschlagen, ein denaturierendes Agens in das Reaktionsgemisch aufzunehmen. Das kann Formamid, Glyzerin oder Azetamid sein. Dadurch wird die Denaturierungs- und Annealing-/Verlängerungstemperatur um jeweils etwa 5°C gesenkt. Die PCR kann somit bei Temperaturen durchgeführt werden, bei denen die Gasblasenbildung reduziert ist.

Ein weiteres Problem, welches mit sich in einer offenen Kapillare in einer Flüssigkeit bildenden Gasblasen verbunden ist, besteht darin, dass an der Wandung der Kapillare anhaftende wachsende Gasblasen die Flüssigkeit in der Kapillare verdrängen können. Die Flüssigkeit kann dadurch aus der Kapillare herausgedrückt oder in einen Bereich der Kapillare gedrängt werden, in welchem eine gewünschte Reaktionsbedingung, wie z. B. eine bestimmte Temperatur, nicht vorliegt.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren bereitzustellen, welches das Problem der Flüssigkeitsverdrängung durch Gasblasenbildung bei in offenen Kapillaren durchgeführten Reaktionen verhindert. Weiterhin soll eine zur Durchführung des Verfahrens geeignete Vorrichtung sowie eine Verwendung angegeben werden.

Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1, 40 und 72 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 39, 41 bis 71 und 73 bis 78.

Erfindungsgemäß ist ein Verfahren zur Durchführung einer Reaktion in einer nicht bewegten Flüssigkeit in einer zumindest einseitig offenen Kapillare vorgesehen, wobei sich in der Flüssigkeit Gasblasen bilden. Der Flüssigkeit wird zur Veränderung mindestens einer Eigenschaft der sich bildenden Gasblasen ein Detergenz zugesetzt und die Kapillare wird oder ist in zumindest einem solchen Winkel zur Horizontalen angeordnet, dass die Gasblasen in der Kapillare an eine Oberfläche der Flüssigkeit steigen. Eine Flüssigkeit ist nicht bewegt im Sinne der Erfindung, wenn sie als Ganzes in der Kapillare nicht bewegt wird. Ein Bewegen als Ganzes wäre z.B. ein Hin- und/oder Herbewegen oder ein Transportieren der Flüssigkeit durch eine Pumpe. Das schließt jedoch Bewegungen innerhalb der Flüssigkeit, z. B. durch Konvektion oder durch das Aufsteigen von Gasblasen, nicht aus. Unter der Oberfläche der Flüssigkeit ist die höchstgelegenen Begrenzungsfläche der Flüssigkeit in der Kapillare zu verstehen. Unter einer Kapillare wird hier ein dünnes Rohr verstanden, dessen lichte Weite so groß ist, dass sie von einer sich in der Flüssigkeit in Abwesenheit von Detergenz bildenden Gasblase ausgefüllt werden kann. Eine Kapillare kann hier ein Rohr sein, das einen solch geringen Innendurchmesser aufweist, dass es sich durch Kapillarkräfte teilweise mit Flüssigkeit füllt, es kann aber auch ein Rohr mit größerem Innendurchmesser sein. Unter "lichter Weite" wird hier und im Folgenden der größte Abstand von einer Innenseite einer Wandung zur anderen Innenseite der Wandung im Querschnitt verstanden. Bei einem kreisrunden Querschnitt ist das der Innendurchmesser. Die Eigenschaft, die durch das Detergenz verändert wird, kann die Größe der sich bildenden Gasblasen, die Adhärenz der Gasblasen an der Wandung der Kapillaren oder die Formstabilität der Gasblasen sein.

Der Zusatz des Detergenz bewirkt, dass sich die Gasblasen meist bei einer geringeren Größe als ohne Detergenz lösen, an die Oberfläche der Flüssigkeit steigen und dort zerplatzen. Somit erreichen die Gasblasen häufig keine Größe, welche das Innere der Kapillare so durchspannt, dass dadurch ein Teil von einem anderen Teil der in der Kapillare enthaltenen Flüssigkeit getrennt wird. Selbst wenn eine Gasblase jedoch eine das Innere der Kapillare durchspannende Größe erreichen sollte, drückt sie beim Aufsteigen in der Kapillare in Gegenwart von Detergenz keine Flüssigkeit aus der Kapillare heraus. Die Gasblase ist in Gegenwart von Detergenz so flexibel bzw. leicht verformbar, dass die Flüssigkeit beim Aufsteigen der Gasblase in der Kapillare an der Gasblase vorbeifließen kann. Weiterhin bewirkt das Detergenz, dass die Gasblasen eine geringere Neigung haben, an der Wandung der Kapillare anzuhaften. Es fördert damit das Aufsteigen der Gasblasen an die Oberfläche der Flüssigkeit. Der Zusatz des Detergenz bewirkt weiterhin, dass sich bildende Gasblasen auch von hydrophoben Gefäßoberflächen, wie z. B. Kunststoffoberflächen, leichter und damit oft auch bei einer geringeren Größe lösen, als ohne Detergenz. Die Gasblasen stören beim erfindungsgemäßen Verfahren nicht eine automatisierte Probenverarbeitung.

Eine Quelle für die Gasblasen kann in der Flüssigkeit gelöste Luft sein. Das Problem der Gasblasenbildung kann üblicherwei se dadurch verringert werden, dass die Flüssigkeit vor der Durchführung der Reaktion unter Vakuum entgast wird. Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass ein solches Entgasen nicht erforderlich ist. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass es nicht erforderlich ist, zur Vermeidung von Gasblasen die Flüssigkeit in der Kapillare druckdicht einzuschließen. Das erfindungsgemäße Verfahren verringert damit erheblich den apparativen Aufwand bei der automatisierten Probenverarbeitung. Dadurch, dass die Kapillare keinem erhöhten Druck standhalten muss, kann sie sehr dünnwandig und mit einfachen Materialien und somit kostengünstig, insbesondere als Bestandteil einer in ein automatisiertes Gerät zur Probenverarbeitung einzusetzenden Einwegeinheit, ausgestaltet werden. Die Dünnwandigkeit ermöglicht vorteilhafterweise auch eine gute und schnelle Übertragung von Wärme von außen in die Kapillare. Unter einer Einwegeinheit wird eine Vorrichtung verstanden, die für eine einmalige Durchführung des Verfahrens geeignet und vorgesehen ist und danach üblicherweise nicht weiter verwendet wird.

Die Gasblasen können sich durch eine gasbildende Reaktion, durch Sieden oder durch Ausgasen eines in der Flüssigkeit gelösten Gases bilden. Sie bilden sich insbesondere beim Erwärmen der Flüssigkeit auf eine Temperatur. Diese Temperatur kann auch unterhalb des Siedepunkts der Flüssigkeit liegen. Das Erwärmen der Flüssigkeit auf eine Temperatur kann durch Wärmezufuhr von außen oder dadurch erfolgen, dass die Reaktion exotherm ist. Die Flüssigkeit kann bei der Reaktion, beispielsweise einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR), auch wiederholt auf die Temperatur erwärmt werden. Vorzugsweise wird die Reaktion unter konstantem Druck, insbesondere Atmosphärendruck, durchgeführt. Die Durchführung der Reaktion unter Atmosphärendruck vermindert, insbesondere bei einem automatisierten Prozessieren der Flüssigkeit, erheblich den apparativen Aufwand.

Der Winkel zur Horizontalen kann zwischen 10° und 90°, insbesondere zwischen 45° und 90°, bevorzugt zwischen 80° und 90°, vorzugsweise 90°, betragen. Bei einem Winkel von 90° können die sich bildenden Gasblasen in der Kapillare senkrecht aufsteigen. Je größer der Winkel der Kapillaren zur Horizontalen ist, desto leichter lösen sich die Gasblasen von der Wandung und steigen zur Oberfläche. Je leichter sich die Gasblasen von der Wandung lösen, desto geringer ist ihre Größe beim Lösen.

Das Detergenz kann ein nichtionisches Detergenz, insbesondere Tween 20, Nonidet P40 oder Triton X-100, sein. Der Flüssigkeit kann so viel Detergenz zugesetzt werden, dass die Konzentration des Detergenz in der Flüssigkeit 0,01 bis 5 % (w/v), bevorzugt 0,02 bis 5 % (w/v), höchst bevorzugt 0,05 bis 5 % (w/v), insbesondere 0,1 bis 5 % (w/v) oder 0,5 bis 5 % (w/v), beträgt. Erstaunlicherweise hat sich gezeigt, dass diese Detergenzkonzentration bereits ein störungsfreies Aufsteigen der Gasblasen gewährleistet. 5 % (w/v) Detergenz in der Flüssigkeit stören erstaunlicherweise viele Reaktionen, wie beispielsweise eine Polymerasekettenreaktion, nicht. Das Detergenz kann der Flüssigkeit vor der Reaktion, insbesondere zusammen mit Reagenzien für die Durchführung der Reaktion, zugesetzt werden. Insbesondere können die Reagenzien für die Durchführung der Reaktion und/oder das Detergenz, bevorzugt in trockener Form, in der Kapillare vorgelegt werden. Sie werden dann der Flüssigkeit zugesetzt, indem die Flüssigkeit in die Kapillare eingebracht wird. Die Flüssigkeit kann in die Kapillare eingebracht werden, indem sie durch Kapillarkräfte oder durch Anlegen von Unterdruck hineingesaugt oder durch Überdruck hineingedrückt wird.

Bevorzugt ist die Reaktion einer Nukleinsäurevervielfältigungsreaktion, insbesondere eine Polymerasekettenreaktion (PCR). Dabei ist es notwendig, die Flüssigkeit immer wieder auf eine Temperatur zu erwärmen, bei der sich Gasblasen bilden können. Die Temperatur kann dabei zwischen 80°C und 100°C, insbesondere zwischen 85°C und 97°C, vorzugsweise 95°C, betragen. Die Kapillare kann aus Glas bestehen. Bevorzugt besteht sie jedoch aus einem, insbesondere hydrophoben, vorzugsweise starren, Kunststoff. Hydrophobe Kunststoffe erlauben die Herstellung einer zur Durchführung der Reaktion, insbesondere einer PCR, geeigneten Vorrichtung als preiswerten Einwegartikel.

Vorzugsweise ist der Kunststoff ein die PCR nicht hemmender Kunststoff, bevorzugt Polycarbonat, Polypropylen oder Polyethylen. Der Kunststoff ist so zu wählen, dass er bei den bei der PCR auftretenden Temperaturen thermisch stabil ist, d. h. sich bei diesen Temperaturen nicht wesentlich verformt. Ob ein Kunststoff ein die PCR nicht hemmender Kunststoff ist, muss für den jeweiligen Kunststoff bzw. die jeweilige Sorte des Kunststoffs im Einzelfall überprüft werden. Selbst bei scheinbar aus demselben Material bestehenden Kunststoffen kann eine Charge des Kunststoffs die PCR hemmen, während eine andere Charge mit der PCR kompatibel ist. Die Ursache dafür ist unklar.

Vorteilhaft ist es, wenn die Kapillare so geformt ist, dass die Gasblasen bei ihrem Aufsteigen an die Oberfläche der Flüssigkeit nicht an einem Vorsprung, einem lokalen Hochpunkt oder einer Stelle der Kapillare zurückgehalten werden, welche keinen ausreichenden Winkel zur Horizontalen aufweist, um die Gasblasen von dort weiter an die Oberfläche der Flüssigkeit steigen zu lassen. Insbesondere kann die Kapillare linear ausgebildet sein. Die lichte Weite der Kapillare kann zumindest 0,2 mm, bevorzugt zumindest 0,3 mm, und höchstens 3 mm, insbesondere höchstens 2 mm betragen. Diese Abmessungen haben sich, insbesondere zur Durchführung einer PCR, bei welcher der Flüssigkeit im Inneren der Kapillare von außen Wärme zugeführt wird, als besonders vorteilhaft erwiesen. Die Querschnittsfläche der Kapillare kann maximal 10 mm², insbesondere maximal 4 mm², vorzugsweise maximal 2 mm² betragen. Als vorteilhaft hat sich eine Länge der Kapillare von 10 bis 100 mm, insbesondere 20 bis 30 mm, vorzugsweise 25 mm, erwiesen. Die genannten Abmessungen sind besonders günstig für die Durchführung einer PCR in der Kapillare. Das Volumen der Flüssigkeit kann 0,5 bis 500 μl, insbesondere 5 bis 50 μl, bevorzugt 10 bis 30 μl, betragen.

Die Kapillare kann vor der Durchführung der Reaktion dadurch gebildet werden, dass eine offene Längsseite einer länglichen kanalförmigen Vertiefung in einem, vorzugsweise aus dem Kunststoff bestehenden, Substrat mit einer, insbesondere selbstklebenden, Kunststofffolie verschlossen wird. Das ermöglicht eine einfache Herstellung. Weiterhin ermöglicht die Kunststofffolie, insbesondere dadurch, dass sie sehr dünn ausgestaltet werden kann, eine gute Wärmeübertragung von einem Heizelement in das Innere der Kapillare. Vorzugsweise ist die Kunststofffolie 0,01 bis 0,5 mm, insbesondere 0,2 bis 0,5 mm, bevorzugt 0,3 bis 0,4 mm, dick. Die Kunststofffolie kann mindestens 1/5, vorzugsweise mindestens 1/4, insbesondere mindestens 1/3 der Fläche der Längswandung der Kapillare bilden. Die Kunststofffolie kann aus einem weichen, flexiblen oder auch aus einem harten, nicht flexiblen und insbesondere demselben Material wie das Substrat bestehen. Die Kunststofffolie kann mittels eines Klebers, insbesondere eines Heißklebers, bevorzugt durch Laminieren mit dem Substrat verbunden werden. Das ermöglicht eine besonders einfache und kostengünstige Herstellung der Kapillare. Beim Laminieren wird die Kunststofffolie auf das Substrat aufgelegt. Entweder die Kunststofffolie oder das Substrat ist mit einem Heißkleber beschichtet. Dann wird von außen so viel Wärme zugeführt, dass der Heißkleber schmilzt. Gleichzeitig werden die Kunst stofffolie und das Substrat zusammengepresst. Nach dem anschließenden Abkühlen sind Substrat und Kunststofffolie fest miteinander verbunden. Die Kunststofffolie kann auch durch, insbesondere thermisches, Verschmelzen mit dem Substrat verbunden werden. Dazu können die Kunststofffolie und/oder das Substrat in einem noch von der Herstellung her heißen und verschmelzbaren Zustand oder nachdem die Kunststofffolie und/oder das Substrat durch Erwärmen angeschmolzen worden sind zusammengefügt werden. Die Dicke der Kunststofffolie kann noch dadurch verringert werden, dass sie in heißem Zustand auf dem Substrat unter Ausübung von Druck gewalzt wird.

Die Kapillare weist vorzugsweise eine erste und eine zweite, insbesondere an entgegengesetzten Enden der Kapillare angeordnete, Öffnung auf. Sie kann über die erste Öffnung mit Flüssigkeit gefüllt und über die erste oder die zweite Öffnung entleert werden. Das Füllen und/oder Entleeren kann mittels Druck oder Unterdruck erfolgen. Die erste Öffnung ist dabei vorzugsweise unterhalb der Oberfläche der Flüssigkeit und die zweite Öffnung oberhalb der Oberfläche der Flüssigkeit angeordnet. Die zweite Öffnung kann zum Druckausgleich mit der Umgebung dienen. Zur Durchführung der Reaktion kann die erste Öffnung verschlossen werden. Die zweite Öffnung kann eine lichte Weite aufweisen, die kleiner ist, als die lichte Weite der Kapillare. Dadurch kann ein Entweichen verdampfter Flüssigkeit reduziert werden. Die Flüssigkeit kann in dem Bereich um die zweite Öffnung herum kondensieren. Die lichte Weite der zweiten Öffnung kann höchstens 0,3 mm, vorzugsweise höchstens 0,2 mm, betragen. An die erste und/oder zweite Öffnung kann, insbesondere über in der Vorrichtung enthaltene flüssigkeitsleitende Kanäle, ein Gerät zur automatisierten Prozessierung von Proben angeschlossen sein. Das Befüllen und Entleeren der Kapillare kann dann ebenso wie ein Beheizen oder Kühlen der Kapillare automatisiert erfolgen. Vorzugsweise wird die Flüssigkeit erwärmt, indem ihr Wärme von einem Heizelement durch die Kunststofffolie hindurch zugeführt wird oder indem ihr Wärme durch ein innerhalb der Kapillare, innerhalb einer Wandung der Kapillare oder innerhalb der Kunststofffolie angeordnetes Heizelement zugeführt wird. Die Flüssigkeit kann auch erwärmt oder gekühlt werden, indem die Kapillare mit einem Gas- oder Luftstrom entsprechender Temperatur angeblasen wird.

Besonders vorteilhaft ist es, wenn die Kapillare nur teilweise, insbesondere nur maximal zu 80 % ihres Volumens, mit der Flüssigkeit gefüllt wird. Der Kapillare kann dann nur in einem flüssigkeitsgefüllten Bereich der Kapillare Wärme zugeführt werden, so dass die bei der Reaktion verdunstete Flüssigkeit in einem restlichen, insbesondere unterhalb der zweiten Öffnung angeordneten, Bereich der Kapillare kondensieren und in die verbleibende Flüssigkeit zurückfließen kann. Das Kondensieren kann dadurch unterstützt werden, dass der restliche Bereich der Kapillare, insbesondere mittels eines Peltier-Elements oder einer vergrößerten wärmeabstrahlenden Oberfläche, gekühlt wird.

Vorzugsweise dient das Verfahren der automatisierten Probenaufarbeitung, Synthese und/oder Analyse von Biopolymeren. Die Kapillare kann ein Bestandteil einer, insbesondere in ein Gerät zur automatisierten Prozessierung von Proben eingesetzten, Einwegeinheit sein. Das Gerät zur automatisierten Prozessierung kann dabei, insbesondere das Befüllen und Entleeren der Kapillare mit der Flüssigkeit, die Bereitstellung und den Weitertransport der Flüssigkeit und das Temperieren der Kapillare bewirken.

Vorteilhaft ist es, wenn ein Wärmeabfluss von der Kapillare in Teile des Substrats dadurch vermindert wird, dass im Substrat ein Mittel zur Unterbrechung der Wärmeübertragung, insbesondere durch eine im Wesentlichen parallel zur Kapillare verlaufende Aussparung, zwischen der Kapillare und den Teilen des Substrats angeordnet wird. Durch die Unterbrechung der Wärmeübertragung wird die thermische Trägheit der Kapillare verringert und eine ungewollte Erwärmung anderer Komponenten, welche in den Teilen des Substrats angeordnet sind, verhindert oder verringert.

Die Erfindung betrifft weiterhin eine Vorrichtung zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens enthaltend zumindest eine mindestens eine erste Öffnung aufweisende längliche Reaktionskammer, wobei zumindest ein Teil der Längswandung der Reaktionskammer durch eine Kunststofffolie gebildet ist. Die Kunststofffolie ermöglicht eine sehr einfache Herstellung, insbesondere einer Vorrichtung mit einer Mehrzahl parallel angeordneter Reaktionskammern, bei denen eine gemeinsame Kunststofffolie jeweils einen Teil der Reaktionskammer bildet. Weiterhin ermöglicht die Kunststofffolie, insbesondere bei dünner Ausgestaltung, eine sehr gute Wärmeübertragung. Da die Kunststofffolie bei dem erfindungsgemäßen Verfahren keinem Überdruck standhalten muss, kann sie sehr dünn ausgebildet sein. Vorzugsweise weist sie eine Dicke von 0,01 bis 0,5 mm, insbesondere 0,2 bis 0,5 mm, bevorzugt 0,3 bis 0,4 mm, auf. Die Kunststofffolie kann aus einem weichen, flexiblen oder auch aus einem harten, nicht flexiblen Material, insbesondere aus demselben Material wie das Substrat, bestehen. Die Reaktionskammer kann in einem Substrat durch mindestens eine längliche kanalförmige ganz oder teilweise mit der Kunststofffolie verschlossene Vertiefung gebildet sein. Das Substrat kann aus einem, insbesondere hydrophoben, vorzugsweise starren Kunststoff bestehen. Zur Durchführung einer PCR ist es günstig, wenn der Kunststoff ein die PCR nicht hemmender Kunststoff, bevorzugt Polycarbonat, Polypropylen oder Polyethylen, ist. Das Substrat kann ebenso wie die Kunststofffolie ein Spritzgussteil sein. Die Vertiefung kann in dem Substrat bereits beim Spritzgießen oder danach durch Prägen, Stanzen, Fräsen oder Ätzen gebildet werden. Die Kunststofffolie ist bevorzugt selbstklebend. In einer erfindungsgemäßen Ausgestaltung ist die Kunststofffolie durch, insbesondere thermisches, Verschmelzen oder mittels eines Klebers, insbesondere eines Heißklebers, bevorzugt durch Laminieren, mit dem Substrat verbunden. Die Reaktionskammer kann von einem Rohr mit rundem oder kantigem Querschnitt gebildet sein. Vorzugsweise ist das Rohr eine Kapillare. Vorteilhafte Abmessungen der Kapillare können den obigen Ausführungen zum erfindungsgemäßen Verfahren entnommen werden. Vorzugsweise bildet die Kunststofffolie mindestens 1/5, vorzugsweise mindestens 1/4, insbesondere mindestens 1/3 der Fläche der Längswandung der Kapillare. Das Volumen der Reaktionskammer kann 0,5 bis 500 μl, insbesondere 5–50 μl, bevorzugt 10 bis 30 μl, betragen. Die Reaktionskammer kann eine erste und eine zweite Öffnung aufweisen, die vorzugsweise an entgegengesetzten Enden der Reaktionskammer angeordnet sind. Bevorzugt ist/sind die erste und/oder die zweite Öffnung im Substrat, d.h. nicht in der Kunststofffolie, angeordnet. In dem Substrat kann ein Mittel zur Unterbrechung der Wärmeübertragung von der Kapillare in Teile des Substrats, insbesondere eine im Wesentlichen parallel zur Kapillare verlaufende Aussparung, zwischen der Kapillare und den Teilen des Substrats vorgesehen sein. Die erste Öffnung ist bevorzugt in einem für die Aufnahme von Flüssigkeit vorgesehenem Teil der Reaktionskammer und die zweite Öffnung im anderen Teil der Reaktionskammer angeordnet. Die lichte Weite der zweiten Öffnung ist vorzugsweise kleiner als die lichte Weite der Kapillare. Insbesondere kann die lichte Weite der zweiten Öffnung höchstens 0,3 mm, vorzugsweise höchstens 0,2 mm, betragen. Weiterhin kann die Vorrichtung, insbesondere innerhalb der Reaktionskammer, innerhalb einer Wandung der Reaktionskammer oder innerhalb der Kunststofffolie, ein Heizelement enthalten. Dadurch kann dem Inneren der Reaktionskammer Wärme zugeführt werden. Besonders günstig ist es, dem Inneren der Reaktionskammer über die Kunststofffolie Wärme zuzuführen.

Vorteilhaft ist es, wenn das Heizelement so angeordnet ist, dass dadurch nur einem für die Aufnahme von Flüssigkeit vorgesehenen Bereich der Reaktionskammer Wärme zugeführt werden kann, so dass in dem anderen Bereich der Reaktionskammer verdampfte Flüssigkeit kondensieren kann. An dem anderen Bereich der Reaktionskammer kann ein Kühlelement, insbesondere ein Peltier-Element oder eine vergrößerte wärmeabstrahlende Oberfläche, vorgesehen sein. Die Reaktionskammer ist vorzugsweise so geformt, dass darin in der Flüssigkeit gebildete Gasblasen bei einem ausreichenden Winkel der Reaktionskammer zur Horizontalen an die Oberfläche der Flüssigkeit aufsteigen können, ohne dabei an einem Vorsprung, einem lokalen Hochpunkt oder einer Stelle der Reaktionskammer ohne ausreichendem Winkel zur Horizontalen zurückgehalten zu werden. Vorzugsweise weist die Reaktionskammer dazu einen Winkel zur Horizontalen zwischen 10° und 90°, insbesondere zwischen 45° und 90°, bevorzugt zwischen 80° und 90°, vorzugsweise 90°, auf. Vorteilhafterweise ist die Reaktionskammer linear ausgebildet.

Bei dem mittels der Vorrichtung durchzuführenden Verfahren handelt es sich vorzugsweise um eine Nukleinsäurevervielfältigungsreaktion, insbesondere eine Polymerasekettenreaktion. Die Reaktionskammer, die Kunststofffolie und der gegebenenfalls vorhandene Klebstoff sind vorteilhafterweise so gewählt, dass sie einer Temperatur zwischen 80°C und 100°C, insbesondere zwischen 85°C und 97°C, vorzugsweise 95°C, standhalten. Standhalten bedeutet, dass keine wesentliche Verformung, Erweichung oder im Falle des Klebstoffs Verminderung seiner Klebkraft bei dieser Temperatur auftritt.

Vorteilhafterweise ist die Reaktionskammer an der ersten und/oder der zweiten Öffnung, insbesondere über in der Vor richtung enthaltene flüssigkeitsleitende Kanäle, an ein Gerät zur automatisierten Prozessierung von Proben angeschlossen oder kann daran, insbesondere durch Einsetzen in das Gerät, angeschlossen werden. Das Gerät kann beispielsweise so ausgebildet sein, dass es in der Vorrichtung enthaltene Kolben betätigt, um dadurch Flüssigkeit in die oder aus der Reaktionskammer zu fördern.

Die Vorrichtung kann mehrere, insbesondere parallel zueinander angeordnete, Reaktionskammern aufweisen. Besonders vorteilhaft ist es, wenn sich die Kunststofffolie über mehrere der Reaktionskammern erstreckt und bei jeder dieser Reaktionskammern jeweils einen Teil der Längswandung bildet. Auf diese Art und Weise können viele Reaktionskammern in einem Arbeitsschritt bereitgestellt werden. Vorteilhafterweise enthält die Vorrichtung in zumindest einer der Reaktionskammern Reagenzien für die Durchführung des Verfahrens, insbesondere Reagenzien für die Durchführung einer PCR und/oder ein Detergenz, vorzugsweise in trockener Form.

Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung eines Detergenz zur Veränderung einer Eigenschaft von sich bei einer Reaktion in einer nicht bewegten Flüssigkeit in einer zumindest einseitig offenen Kapillare bildenden Gasblasen, wobei die Kapillare zumindest einen solchen Winkel zur Horizontalen aufweist, dass die Gasblasen in der Kapillare an eine Oberfläche der Flüssigkeit steigen. Das Detergenz kann ein nichtionisches Detergenz, insbesondere Tween 20, Nonidet P40 oder Triton X-100, sein. Das Detergenz kann in den bereits erwähnten Konzentrationen eingesetzt werden. Die Reaktion kann Teil einer automatisierten probenaufarbeitung, Synthese und/oder Analyse von Biopolymeren sein. Die Kapillare kann Bestandteil einer, insbesondere in ein Gerät zur automatisierten Prozessierung eingesetzten, Einwegeinheit sein. Vorzugsweise wird das Detergenz in einem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet.

Weiterhin ist es vorteilhaft, wenn die Kapillare durch eine erfindungsgemäße Vorrichtung bereitgestellt wird.
Nachfolgend werden vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung anhand eines Ausführungsbeispiels erläutert.
Es zeigt:
1 einen schematischen Aufbau einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit einem Heizelement,
2 Fotografien einer erfindungsgemäßen Vorrichtung vor und nach der Erwärmung darin enthaltener wässriger Flüssigkeiten,
3 Fotografie einer erfindungsgemäßen Vorrichtung bei der Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens mit verschiedenen Detergenzkonzentrationen,
4 eine gelelektrophoretische Auftrennung von PCR-Produkten, die nach Durchführung einer herkömmlichen PCR in PCR-Reaktionsgefäßen in Gegenwart verschiedener Detergenzien unterschiedlicher Konzentrationen erhalten worden sind,
5 eine gelelektrophoretische Auftrennung von Produkten der Amplifikation eines ersten Gens mittels PCR und
6 eine gelelektrophoretische Auftrennung von Produkten der Amplifikation eines zweiten Gens mittels PCR.
In ein Substrat 10 aus Polycarbonat wurde eine lineare Reaktionskammer 12 als 1,0 mm × 1,3 mm × 25 mm messende Vertiefung ausgefräst und mit einer selbstklebenden Kunststofffolie 14 verschlossen. Bei der Kunststofffolie kann es sich beispielsweise um "Polyester Film Tape 850 Transparent" der Firma 3M, Industrial Tape and Specialties Division, 3M Center, Building 220-7W-03, St. Paul, Mn 55144-1000, USA, handeln. In dem Substrat wurde eine erste Öffnung 16 und eine zweite Öffnung 18 mit einem Durchmesser von jeweils 1 mm zu der Reaktionskammer 12 gebohrt. Nach dem Einfüllen einer Testlösung bis auf 213 des Volumens der Reaktionskammer 12 wurde die erste Öffnung 16 und die zweite Öffnung 18 jeweils mit einer weiteren selbstklebenden Kunststofffolie 20, 22 abgedichtet. Durch die die zweite Öffnung 18 verschließende Kunststofffolie 22 wurde ein Loch von 0,3 mm Durchmesser gestochen, um bei der Reaktion einen Druckausgleich zu gewährleisten. Die Temperierung der Reaktionskammer 12 erfolgte durch die selbstklebende Kunststofffolie 14 hindurch mittels eines vertikal ausgerichteten Heizelements 24 eines in situ-Thermocyclers des Typs "Cyclone Gradient" der Firma PEQLAB Biotechnologie GmbH, Carl-Thiersch-Str. 2b, D-91052 Erlangen, Deutschland.
In die erfindungsgemäße Vorrichtung wurde zur Simulation einer PCR zunächst eine Lösung von 150 mmol/l NaCl in H₂O eingefüllt, die zur besseren Visualisierung 0,03 % (w/v) des Farbstoffs Amaranth enthielt. Diese Lösung wurde mittels eines Heizelements eines in situ-Thermocyclers temperiert. Es wurde folgender Temperaturzyklus durchlaufen:

Schritt 1: 5 min 95°C

Schritt 2: 1 min 95°C

Schritt 3: 1 min 55°C

Schritt 4: 1 min 72°C

Schritt 5: 2 min 72°C
Die Schritte Ziff. 2 bis Ziff. 4 wurden 35 mal wiederholt.
2 zeigt bei A die Vorrichtung vor der Temperierung, bei B nach der ersten Temperierung auf 95°C und bei C nach Durchlaufen mehrerer Temperaturzyklen. Das zeigt, dass die Blasenbildung mit zunehmender Zahl der Temperaturzyklen störend wirkt und die Flüssigkeit aus der Vorrichtung herausdrückt. 2 zeigt bei D die Vorrichtung nach Durchlaufen der gleichen Zahl der Temperaturzyklen wie bei C, wobei in der Lösung zusätzlich 5 % (w/v) des nichtionischen Detergenz Triton X-100 enthalten war. Die gebildeten Gasblasen sind hier bei geringer Größe zur Oberfläche der Flüssigkeit aufgestiegen. Sie blieben nicht an der Wandung der Reaktionskammer haften und haben nicht die in der Reaktionskammer enthaltene Lösung verdrängt.
3 zeigt vier parallel in einem Polycarbonat-Substrat angeordnete Reaktionskammern. Diese sind gefüllt mit einer Lösung von 0,03 % (w/v) Amaranth, 150 mmol/l NaCl in H₂O, wobei weiterhin die jeweils in Prozent (w/v) angegebenen Konzentrationen des nichtionischen Detergenz Tween 20 enthalten sind. Gezeigt sind die Reaktionskammern nach Durchlaufen von 35 der oben beschriebenen Temperaturzyklen. Die in der Lösung ohne Detergenz gebildeten Blasen verdrängen durch ihre Größe und ihr Verbleiben in der Reaktionskammer ohne aufzusteigen nach einigen Zyklen die Farbstofflösung aus der Reaktionskammer. Im Gegensatz dazu erweisen sich Konzentrationen von 0,05, 0,5 und 5 % (w/v) Tween 20 als gleichermaßen effizient, um ein zuverlässiges Aufsteigen der gebildeten kleinen Gasblasen zu gewährleisten, so dass es hier zu keiner Verdrängung der Lösung aus den Reaktionskammern kommt.
Die im Folgenden beschriebenen Polymerasekettenreaktionen wurden in folgenden Reaktionsansätzen in einem jeweiligen Volumen von 30 μl durchgeführt:
200 μmol/l von jedem dNTP
0,33 μmol/l Primer 1 (sense)
0,33 μmol/l Primer 2 (antisense)
1,5 U Taq DNA-Polymerase ("SAWADY Taq-DNA-Polymerase" der Firma PEQLAB Biotechnologie GmbH)
1 × PCR-Puffer Y ("Reaktionspuffer Y" der Firma PEQLAB Biotechnologie GmbH)
17 ng humangenomische DNA
Detergenz: wie jeweils angegeben
Es wurde folgender Temperaturzyklus durchlaufen:

Schritt 1: 5 min 95°C

Schritt 2: 1 min 95°C

Schritt 3: 1 min xx°C

Schritt 4: 1 min 72°C

Schritt 5: 2 min 72°C
xx°C bezeichnet die jeweils angegebene Annealingtemperatur. Die Schritte Ziff. 2 bis Ziff. 4 wurden 35 mal wiederholt.
Nach der PCR wurden die Reaktionslösungen in 2 % (w/v) Agarosegelen einer Elektrophorese unterzogen und enthaltene DNA durch Ethidiumbromidfärbung und UV-Lichtbestrahlung sichtbar gemacht.
Zur Überprüfung der Frage, ob eine PCR auch in Gegenwart unterschiedlicher Detergenzien in verschiedenen Konzentrationen durchführbar ist, wurde ein 169 Basenpaare langes Fragment einer für Faktor II (Prothrombin) kodierenden humangenomi schen DNA in Gegenwart dieser Detergenzien amplifiziert. Als Primer dienten Oligonukleotide mit den Sequenzen SEQ ID NO 1 und SEQ ID NO 2 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll. Die Annealingtemperatur betrug 55°C. Als Positivkontrolle ("pos. Kontr.") wurde die PCR ohne Detergenz und als Negativkontrolle ("neg. Kontr.") ohne die zu amplifizierende DNA durchgeführt. Das Ergebnis ist in 4 dargestellt. Daraus ist ersichtlich, dass der Zusatz der repräsentativ ausgewählten Detergenzien Tween 20, Triton X-100 und Nonidet P40 (NP 40) bis zu einer Konzentration von 5 % (w/v) keine Inhibierung der spezifischen Amplifikation gegenüber der Positivkontrolle bewirkte.
In einer weiteren PCR wurde ein Fragment des für humanes TNFα (Tumornekrosefaktor alpha) kodierenden Gens amplifiziert. Dazu sind als Primer Oligonukleotide mit den Sequenzen SEQ ID NO 3 und SEQ ID NO 4 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll eingesetzt worden. Die Reaktion I ist in einer Kapillare einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit einer Annealingtemperatur von 55°C durchgeführt worden. Der Winkel der Kapillare zur Horizontalen betrug 90°. Als Kontrolle +K₀ ist die gleiche Reaktion in einem herkömmlichen PCR-Reaktionsgefäß durchgeführt worden. Die gelelektrophoretisch aufgetrennten Reaktionsansätze nach der Durchführung der PCR sind in 5 dargestellt. Dabei zeigte sich sowohl bei +K₀ als auch bei I ein spezifisch amplifiziertes 131 Basenpaare langes DNA-Fragment.
6 zeigt das Ergebnis von in der erfindungsgemäßen Vorrichtung in drei parallelen Reaktionskammern durchgeführten PCR-Reaktionen I, II und III und einer zur Kontrolle in einem PCR-Reaktionsgefäß durchgeführte Reaktion +K₀. Die Annealingtemperatur betrug jeweils 58°C. Der Winkel der Reaktionskammer zur Horizontalen betrug 90°. Amplifiziert wurde ein Fragment des für humanen Faktor V (Proaccelerin) kodierenden Gens. Dazu wurden als Primer Oligonukleotide mit den Sequenzen SEQ ID NO 5 und SEQ ID NO 6 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll eingesetzt. Die Spuren +K₀, I, II und III zeigen jeweils ein spezifisches Reaktionsprodukt mit einer Länge von 267 Basenpaaren.
Die in den 5 und 6 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die Polymerasekettenreaktionen in erfindungsgemäßen Vorrichtungen ebenso effizient und spezifisch durchgeführt werden können, wie in herkömmlichen PCR-Reaktionsgefäßen. SEQUENZPROTOKOLL

10: Substrat
12: Reaktionskammer
14: Kunststofffolie
16: erste Öffnung
18: zweite Öffnung
20: selbstklebende Kunststofffolie
22: weitere selbstklebende Kunststofffolie
24: Heizelement

Claims

Verfahren zur Durchführung einer Reaktion in einer nicht bewegten Flüssigkeit in einer bei der Reaktion zumindest einseitig offenen Kapillare, wobei sich bei der Reaktion in der Flüssigkeit Gasblasen bilden, wobei der Flüssigkeit zur Veränderung mindestens einer Eigenschaft der sich bildenden Gasblasen ein Detergenz zugesetzt wird und die Kapillare in zumindest einem solchen Winkel zur Horizontalen angeordnet wird oder angeordnet ist, dass die Gasblasen in der Kapillare an eine Oberfläche der Flüssigkeit steigen, wobei die Eigenschaft die Größe der sich bildenden Gasblasen, die Adhärenz der Gasblasen an einer Wandung der Kapillaren oder die Formstabilität der Gasblasen ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei sich die Gasblasen beim Erwärmen der Flüssigkeit auf eine Temperatur, insbesondere bis unterhalb des Siedepunkts der Flüssigkeit, bilden.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Flüssigkeit bei der Reaktion wiederholt auf die Temperatur erwärmt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Reaktion unter konstantem Druck, insbesondere Atmosphärendruck, durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Winkel zwischen 10° und 90°, insbesondere zwischen 45° und 90°, bevorzugt zwischen 80° und 90°, vorzugsweise 90°, beträgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Detergenz ein nichtionisches Detergenz, insbesondere Tween 20, Nonidet P40 oder Triton X-100, ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Flüssigkeit so viel Detergenz zugesetzt wird, dass die Konzentration des Detergenz in der Flüssigkeit 0,01 bis 5 % (w/v), bevorzugt 0,02 bis 5 % (w/v), höchst bevorzugt 0,05 bis 5 % (w/v), insbesondere 0,1 bis 5 % (w/v) oder 0,5 bis 5 % (w/v), beträgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Detergenz der Flüssigkeit vor der Reaktion, insbesondere zusammen mit Reagenzien für die Durchführung der Reaktion, zugesetzt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei Reagenzien für die Durchführung der Reaktion und/oder das Detergenz, insbesondere in trockener Form, in der Kapillare vorgelegt werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Reaktion eine Nukleinsäurevervielfältigungsreaktion, insbesondere eine Polymerasekettenreaktion (PCR), ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Temperatur zwischen 80°C und 100°C, insbesondere zwischen 85°C und 97°C, vorzugsweise 95°C, beträgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Kapillare aus einem, insbesondere hydrophoben, vorzugsweise starren, Kunststoff besteht.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Kunststoff ein die PCR nicht hemmender Kunststoff, bevorzugt Polycarbonat, Polypropylen oder Polyethylen, ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Kapillare so geformt ist, dass die Gasblasen bei ihrem Aufsteigen an die Oberfläche der Flüssigkeit nicht an einem Vorsprung, einem lokalen Hochpunkt oder einer Stelle der Kapillare zurückgehalten werden, welche keinen ausreichenden Winkel zur Horizontalen aufweist, um die Gasblasen von dort weiter an die Oberfläche der Flüssigkeit steigen zu lassen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Kapillare linear ausgebildet ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die lichte Weite der Kapillare zumindest 0,2 mm, bevorzugt zumindest 0,3 mm, beträgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die lichte Weite der Kapillare höchstens 3 mm, insbesondere höchstens 2 mm, beträgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Querschnittsfläche der Kapillare maximal 10 mm², insbesondere maximal 4 mm², vorzugsweise maximal 2 mm², beträgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Kapillare eine Länge von 10 bis 100 mm, insbesondere 20 bis 30 mm, vorzugsweise 25 mm, aufweist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Volumen der Flüssigkeit 0,5 bis 500 μl, insbesondere 5 bis 50 μl, bevorzugt 10 bis 30 μl, beträgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Kapillare vor der Durchführung der Reaktion dadurch gebildet wird, dass eine offene Längsseite einer länglichen kanalförmigen Vertiefung in einem, vorzugsweise aus dem Kunststoff bestehenden, Substrat (10) mit einer, insbesondere selbstklebenden, Kunststofffolie (14) verschlossen wird.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Kunststofffolie (14) mindestens 1/5, vorzugsweise mindestens 1/4, insbesonde re mindestens 1/3, der Fläche der Längswandung der Kapillare bildet.
Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, wobei die Kunststofffolie (14) durch, insbesondere thermisches, Verschmelzen oder mittels eines Klebers, insbesondere eines Heißklebers, bevorzugt durch Laminieren, mit dem Substrat (10) verbunden wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Kapillare eine erste (16) und eine zweite, vorzugsweise an entgegengesetzten Enden der Kapillare angeordnete, Öffnung (18) aufweist.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Kapillare über die erste Öffnung (16) mit Flüssigkeit gefüllt und über die erste (16) oder die zweite Öffnung (18) entleert wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Kapillare mittels Druck oder Unterdruck mit der Flüssigkeit gefüllt und/oder entleert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 26, wobei die erste Öffnung (16) unterhalb der Oberfläche der Flüssigkeit und die zweite Öffnung (18) oberhalb der Oberfläche der Flüssigkeit angeordnet ist.
Verfahren nach Anspruch 24 bis 27, wobei die erste Öffnung (16) zur Durchführung der Reaktion verschlossen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 28, wobei die zweite Öffnung (18) eine lichte Weite aufweist, die kleiner ist als die lichte Weite der Kapillare.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei die lichte Weite der zweiten Öffnung (18) höchstens 0,3 mm, vorzugsweise höchstens 0,2 mm, beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 30, wobei an die erste (16) und/oder die zweite Öffnung (18), insbesondere über in der Vorrichtung enthaltene flüssigkeitsleitende Kanäle, ein Gerät zur automatisierten Prozessierung von Proben angeschlossen ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Flüssigkeit erwärmt wird, indem ihr Wärme von einem Heizelement (24) durch die Kunststofffolie (14) hindurch zugeführt wird oder indem ihr Wärme durch ein innerhalb der Kapillare, innerhalb einer Wandung der Kapillare oder innerhalb der Kunststofffolie (14) angeordnetes Heizelement (24) zugeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Flüssigkeit erwärmt oder gekühlt wird, indem die Kapillare mit einem Gas- oder Luftstrom entsprechender Temperatur angeblasen wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Kapillare nur teilweise, insbesondere nur maximal zu 80 % ihres Volumens, mit der Flüssigkeit gefüllt wird.
Verfahren nach Anspruch 34, wobei der Kapillare nur in einem flüssigkeitsgefüllten Bereich der Kapillare Wärme zugeführt wird, so dass die bei der Reaktion verdunstete Flüssigkeit in einem restlichen, insbesondere unterhalb der zweiten Öffnung (18) angeordneten, Bereich der Kapillare kondensieren und in die verbliebene Flüssigkeit zurückfließen kann.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei der restliche Bereich der Kapillare, insbesondere mittels eines Peltier-Elements oder einer vergrößerten wärmeabstrahlenden Oberfläche, gekühlt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verfahren der automatisierten Probenaufarbeitung, Synthese und/oder Analyse von Biopolymeren dient.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Kapillare ein Bestandteil einer, insbesondere in ein Gerät zur automatisierten Prozessierung von Proben eingesetzten, Einwegeinheit ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei ein Wärmeabfluss von der Kapillare in Teile des Substrats (10) vermindert wird, indem im Substrat (10) ein Mittel zur Unterbrechung der Wärmeübertragung, insbesondere eine im Wesentlichen parallel zur Kapillare verlaufende Aussparung, zwischen der Kapillare und den Teilen des Substrats angeordnet wird.
Vorrichtung zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 39 enthaltend zumindest eine mindestens eine erste Öffnung (16) aufweisende längliche Reaktionskammer (12), wobei zumindest ein Teil der Längswandung der Reaktionskammer (12) durch eine Kunststofffolie (14) gebildet ist, wobei die Reaktionskammer (12) von einer Kapillare mit rundem oder kantigem Querschnitt in einem Substrat (10) durch mindestens eine längliche kanalförmige ganz oder teilweise mit der Kunststofffolie (14) verschlossene Vertiefung gebildet ist, wobei im Substrat (10) ein Mittel zur Unterbrechung der Wärmeübertragung von der Kapillare in Teile des Substrats (10) zwischen der Kapillare und den Teilen des Substrats (10) vorgesehen ist.
Vorrichtung nach Anspruch 40, wobei das Substrat (10) aus einem, insbesondere hydrophoben, vorzugsweise starren, Kunststoff besteht.
Vorrichtung nach Anspruch 41, wobei der Kunststoff ein eine Polymerasekettenreaktion (PCR) nicht hemmender Kunststoff, bevorzugt Polycarbonat, Polypropylen oder Polyethylen, ist.
Vorrichtung nach einen der Ansprüche 40 bis 42, wobei das Substrat (10) ein Spritzgussteil ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 40 bis 43, wobei die Vertiefung in dem Substrat (10) beim Spritzgießen oder danach durch Prägen, Stanzen, Fräsen oder Ätzen gebildet ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 40 bis 44, wobei die Kunststofffolie (14) selbstklebend ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 40 bis 45, wobei die Kunststofffolie (14) durch, insbesondere thermisches, Verschmelzen oder mittels eines Klebers, insbesondere eines Heißklebers, bevorzugt durch Laminieren, mit dem Substrat (10) verbunden ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 40 bis 46, wobei die lichte Weite der Kapillare zumindest 0,2 mm, bevorzugt zumindest 0,3 mm, beträgt
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 40 bis 47, wobei die lichte Weite der Kapillare höchstens 3 mm, insbesondere höchstens 2 mm, beträgt.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 40 bis 48, wobei die Querschnittsfläche der Kapillare maximal 10 mm², insbesondere maximal 4 mm², vorzugsweise maximal 2 mm², beträgt.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 40 bis 49, wobei die Kapillare eine Länge von 10 bis 100 mm, insbesondere 20 bis 30 mm, vorzugsweise 25 mm aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 40 bis 50, wobei die Kunststofffolie (14) mindestens 1/5, vorzugsweise mindestens 1/4, insbesondere mindestens 1/3, der Fläche der Längswandung der Kapillare bildet.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 40 bis 51, wobei das Volumen der Reaktionskammer (12) 0,5 bis 500 μl, insbesondere 5 bis 50 μl, bevorzugt 10 bis 30 μl, beträgt.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 40 bis 52, wobei die Reaktionskammer (12) eine erste (16) und eine zweite Öffnung (18) aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 53, wobei die erste (16) und die zweite Öffnung (18) an entgegengesetzten Enden der Reaktionskammer (12) angeordnet sind.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 40 bis 54, wobei die erste (16) und/oder die zweite Öffnung (18) im Substrat (10) angeordnet ist/sind.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 40 bis 55, wobei das Mittel zur Unterbrechung der Wärmeübertragung von der Kapillare in Teile des Substrats (10) eine im Wesentlichen parallel zur Kapillare verlaufende Aussparung ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 40 bis 56, wobei die erste Öffnung (16) in einem für die Aufnahme von Flüssigkeit vorgesehenen Teil der Reaktionskammer (12) und die zweite Öffnung (18) im anderen Teil der Reaktionskammer (12) angeordnet ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 40 bis 57, wobei die zweite Öffnung (18) eine lichte Weite aufweist, die kleiner ist als die lichte Weite der Kapillare.
Vorrichtung nach Anspruch 58, wobei die lichte Weite der zweiten Öffnung (18) höchstens 0,3 mm, vorzugsweise höchstens 0,2 mm, beträgt.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 40 bis 59, wobei die Vorrichtung, insbesondere innerhalb der Reaktionskammer (12), innerhalb einer Wandung der Reaktionskammer (12) oder innerhalb der Kunststofffolie (14), ein Heizelement (24) enthält.
Vorrichtung nach Anspruch 60, wobei das Heizelement (24) so angeordnet ist, dass dadurch nur einem für die Aufnahme von Flüssigkeit vorgesehenen Bereich der Reaktionskammer (12) Wärme zugeführt werden kann, so dass in einem restlichen Bereich der Reaktionskammer (12) verdampfte Flüssigkeit kondensieren kann.
Vorrichtung nach Anspruch 61, wobei an dem restlichen Bereich der Reaktionskammer (12) ein Kühlelement, insbesondere ein Peltier-Element oder eine vergrößerte wärmeabstrahlende Oberfläche, vorgesehen ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 40 bis 62, wobei die Reaktionskammer (12) so geformt ist, dass darin in der Flüssigkeit gebildete Gasblasen bei einem ausreichenden Winkel der Reaktionskammer (12) zur Horizontalen an die Oberfläche der Flüssigkeit aufsteigen können, ohne dabei an einem Vorsprung, einem lokalen Hochpunkt oder einer Stelle der Reaktionskammer (12) ohne ausreichenden Winkel zur Horizontalen zurückgehalten zu werden.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 40 bis 63, wobei die Reaktionskammer (12) bei deren bestimmungsgemäßer Verwendung zur Horizontalen einen Winkel zwischen 10° und 90°, insbesondere zwischen 45° und 90°, bevorzugt zwischen 80° und 90°, vorzugsweise 90°, aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 40 bis 64, wobei die Reaktionskammer (12) linear ausgebildet ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 40 bis 65, wobei bei dem Verfahren eine Nukleinsäurevervielfältigungsreaktion, insbesondere eine Polymerasekettenreaktion (PCR), durchgeführt wird.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 40 bis 66, wobei die Reaktionskammer (12), die Kunststofffolie (14) und der gegebenenfalls vorhandene Klebstoff so gewählt sind, dass sie ei ner Temperatur zwischen 80°C und 100°C, insbesondere zwischen 85°C und 97°C, vorzugsweise 95°C, standhalten.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 40 bis 67, wobei die Reaktionskammer (12) an der ersten (16) und/oder der zweiten Öffnung (18), insbesondere über in der Vorrichtung enthaltene flüssigkeitsleitende Kanäle, an ein Gerät zur automatisierten Prozessierung von Proben angeschlossen ist oder daran, insbesondere durch Einsetzen in das Gerät, angeschlossen werden kann.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 40 bis 68, wobei die Vorrichtung mehrere, insbesondere parallel zueinander angeordnete, Reaktionskammern (12) aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 69, wobei sich die Kunststofffolie (14) über mehrere der Reaktionskammern (12) erstreckt und bei jeder dieser Reaktionskammern (12) jeweils einen Teil der Längswandung bildet.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 40 bis 70, wobei in zumindest einer der Reaktionskammern (12) Reagenzien für die Durchführung des Verfahrens, insbesondere Reagenzien für die Durchführung einer PCR und/oder ein Detergenz, vorzugsweise in trockener Form, enthalten sind.
Verwendung eines Detergenz zur Veränderung mindestens einer Eigenschaft von sich bei einer Reaktion in einer nicht bewegten Flüssigkeit in einer zumindest einseitig offenen Kapillare bei der Reaktion bildenden Gasblasen, wobei die Kapillare zumindest einen solchen Winkel zur Horizontalen aufweist, dass die Gasblasen in der Kapillare an eine Oberfläche der Flüssigkeit steigen, wobei die Eigenschaft die Größe der sich bildenden Gasblasen, die Adhärenz der Gasblasen an einer Wandung der Kapillaren oder die Formstabilität der Gasblasen ist.
Verwendung nach Anspruch 72, wobei das Detergenz ein nichtionisches Detergenz, insbesondere Tween 20, Nonidet P40 oder Triton X-100, ist.
Verwendung nach Anspruch 72 oder 73, wobei das Detergenz in einer Konzentration von 0,01 bis 5 % (w/v), bevorzugt 0,02 bis 5 % (w/v), höchst bevorzugt 0,05 bis 5 % (w/v), insbesondere 0,1 bis 5 % (w/v) oder 0,5 bis 5 % (w/v), verwendet wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 72 bis 74, wobei die Reaktion Teil einer automatisierten Probenaufarbeitung, Synthese und/oder Analyse von Biopolymeren ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 72 bis 75, wobei die Kapillare Bestandteil einer, insbesondere in ein Gerät zur automatisierten Prozessierung eingesetzten, Einwegeinheit ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 72 bis 76, wobei das Detergenz in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 39 verwendet wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 72 bis 77, wobei die Kapillare durch eine Vorrichtung nach einem der Ansprüche 40 bis 71 bereitgestellt wird.