JP4564924B2 - 生体試料分析装置 - Google Patents

Description

本発明は、生体試料の分析装置に関する。例えば、生体試料中に含まれる核酸を抽出し、それを増幅し、そして検出することにより、特定の塩基配列を有する核酸の有無を検出する生体試料検査装置に関する。

一般に生体試料から抽出した微量の核酸の検査を行うためには、生体試料から核酸を抽出する抽出工程、抽出された核酸を増幅して検出可能な濃度にまで増幅させる増幅工程、検出対象の核酸に対して蛍光ラベルを標識し、励起光の照射と蛍光の検知を行って対象となる核酸の有無，濃度を調べる検出工程から構成される。このうち、特に、増幅工程と検出工程では、工程中で必要とされる化学反応の温度範囲が狭い場合が多く、厳密な温度管理を要することがある。定温で核酸の増幅を行う方法の一つであるNucleic Acid
Sequence-Based Amplification（ＮＡＳＢＡ）法では、６５℃以上で一度核酸の熱変性を行った後、定温で増幅と検出を同時に行うが、この時４０から４２℃の間で一定温度に保持しながら増幅を行う必要がある。

また、特開平７−７５５４４号には、増幅反応に必要な熱サイクルを実施するために、試料を２つのサーモスタット付液体浴を通過する毛管ループを通して循環させるか、毛管を２つの熱交換器の間で交番に経路定めし、試料を管にたんに１回通過で通すか、定置に維持した熱交換器の間で試料を移動させるか、あるいは毛管内に含有されている試料を通りすぎて熱交換器を自動的に移動または回転させる技術が開示されている。

特開平７−７５５４４号公報

ＮＡＳＢＡ法では、一定温度での核酸増幅には酵素試薬が必要とされており、これら試薬は４０℃以上の温度域では急速に劣化する特性を有するため、熱変性時は前記酵素試薬保持部の温度は４０℃以下に保持されている必要がある。一方で４０〜４２℃での一定温度での増幅過程中は、保持温度の許容幅が熱変性時に比べて小さく、厳密な温度管理が要求される。

また、特開平７−７５５４４号に開示の技術では、核酸増幅の方法としてポリメラーゼ連鎖反応を前提としており、一連の増幅工程を局所的な部分の温度管理のみで行えるものの、複数の設定温度間の熱サイクルを必要とし、より複雑な温度制御システムを必要とする。

本発明の目的は、生体試料分析における厳密な温度制御を簡易な構成で行うことに関する。

本発明は、生体試料分析における各工程で温度制御のシステムを切替えることに関する。例えば、生体試料を保持する生体試料保持領域と、試薬を保持する試薬保持領域と、生体試料と試薬を反応させる反応領域とを備えた回転可能な構造体と、構造体の回転を制御する回転制御機構と、構造体の一部を局所的に温度制御できる第１の温度制御機構と、構造体の全体を温度制御できる第２の温度制御機構と、を備えた生体試料分析装置であって、抽出工程において構造体を回転させながら構造体の全体を温度制御し、熱変成工程において構造体を静止させ構造体の一部を局所的に温度制御し、増幅工程において構造体を回転させながら構造体の全体を温度制御する。

本発明により、生体試料分析における厳密な温度制御を簡易な構成で行うことが可能となる。

例えば、熱変性工程において、構造体の一部を局所的に温度制御することで、熱変性工程の熱により試薬が劣化することを防げる。また、増幅工程において、構造体の全体を温度制御することにより、簡易な構成で厳密な温度制御が可能となる。これにより、回転可能な構造体におけるＮＡＳＢＡ法を用いた自動遺伝子検査を、簡易な装置構成で行うことが可能となる。

以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について、図面を参酌して説明する。

図１から図６により本実施例について説明する。生体試料分析装置は温度制御可能な恒温槽１内部に、生体試料容器と試薬容器と反応容器とを備えた回転可能な構造体であるカートリッジ４と、構造体の回転を制御する回転制御機構である遠心ロータ２から構成される。遠心ロータ２は、モータ３により回転可能に支持されている。モータ３は回転伝達機構３ａを介して遠心ロータ２に接続しており、モータ３と回転伝達機構３ａは支持台３ｂに懸架される。また、カートリッジ４は、図２に示すように遠心ロータ２上の６箇所に放射状に配置されている。

カートリッジ４は、図３に示すように透明板状の基材に対し凹部を形成して複数の試料保持ポート４ａ，試薬保持ポート４ｂ、および反応セル５を備え、それらは基材表面に設けられた溝部である液体流路４ｃにより相互に接続されている。カートリッジ表面は非浸透性の樹脂膜により被覆され、生体試料，試薬の各ポート４ａ，４ｂ，反応セル５，流路４ｃからの液漏れを防止する。

遠心ロータ２は、１〜２０rpm の回転速度で回転し、任意の位置に静止し、カートリッジ４に内蔵する反応セル内部の試料，試薬に対して蛍光測定部６による蛍光測定，局所温度制御などの操作を行える状態とする。また、１〜１０,０００rpmの回転速度で回転し、カートリッジ４内に遠心力を発生させることにより、試薬、および試料の流動制御を行う機能を有する。また、試料が血液など、密度による分離操作を必要とする場合は前記の回転操作により遠心分離操作を行える。

前記恒温槽は、図４，図５に示すように空気循環ダクト７に接続している。空気循環ダクト７は、吸／放熱板８，９を設けたペルチエ素子１０を介して放熱ダクト１１と接続し、放熱送風ファン１４，１５により吸／放熱板８，９からの排熱を装置外に排出し、恒温槽内に予め設定した温度に制御した空気を空気循環送風ファン１２，１３により循環させる。恒温槽内の測定温度が外気温より高い場合８が吸熱、９が放熱となる。逆に、恒温槽内の測定温度が外気温より低い場合８が放熱、９が吸熱に設定が切替わる。このように空気循環ダクト７により供給される温度制御された気流により、恒温槽１内部は一様に２０℃〜５０℃までの任意の一定温度に制御される。

前記カートリッジ内の反応セルでは電磁誘導加熱によりセル内部の液体のみを加熱するために、図６（ａ），（ｂ）に示すように反応セル５を囲う形に磁性体材料で構成された加熱リング１６を設けており、加熱リング１６は各反応セルに固定される。一方遠心ロータ２が初期位置に静止している場合にカートリッジ４に対応する位置６ヶ所の、恒温槽底部には前記加熱リング１６に対し誘導電流を誘起するための電磁誘導コイル１７と、反応セル内部の温度を測定するための放射温度センサ１８を配置している。放射温度センサとしてはセンサ素子として焦電効果素子，サーモパイルなどが使用可能であるが、高速応答が可能で、構成を簡易にできることからサーモパイル方式の放射温度センサが本装置では適している。電磁誘導加熱装置は昇降機１９上に配置され、待機時に対して駆動時は上昇して加熱リング１６下部に近接できるように構成されている。前記電磁誘導コイルは駆動回路により０〜５００ｋＨｚまでの周波数の交流電流が通電され、それより加熱リング中に誘導電流が誘起され発熱する。

蛍光測定部６は、光電子増倍管を検出素子とする蛍光検知部６ａと、励起光源である発光ダイオード６ｂ、および集光レンズ系６ｃとからなる。本実施例では２つの蛍光測定部を備え、２種類の蛍光体の検出を可能としている。予め定量された核酸、あるいは核酸を含む合成物からなる内部コントロールと、検査対象の核酸抽出溶液に対し、それぞれの核酸に対応する２種の蛍光試薬を含む増幅試薬を反応させ、各試薬からの蛍光強度を測定することにより、内部コントロールの増幅曲線との比較から検査対象の核酸濃度の定量が可能となる。

次に図７に蛍光測定部を除く本実施例の制御系の構成を示す。電磁誘導コイル１７は直流電源２８，スイッチングＦＥＴ２９，パルス発生回路３０からなるインバータ回路に接続している。パルス発生回路３０により生成されるパルス信号は、スイッチングＦＥＴ
２９のＯＮ／ＯＦＦを行う。その際、電磁誘導コイル１７には前記パルス信号に応じた周波数の半波交流電流が流れる。これにより発生した交流磁界により、加熱リング１６に誘導電流が流れ、誘導電流により生じたジュール熱により反応セル５内の溶液が加熱される。パルス発生回路３０はＤ／Ａ変換ユニット３２を介してプログラマブルコントローラ
２３に接続している。プログラマブルコントローラ２３からの制御に応じてパルス信号のＯＮ時間のデューティー比、もしくは周波数を変更可能である。これにより加熱リングで発生するジュール熱の増減を制御することができる。

一方ペルチエ素子ドライバ回路３１は、プログラマブルコントローラ２３からの信号に応じてペルチエ素子１０の吸熱量／放熱量を制御する。ペルチエ素子の吸熱量／放熱量の制御により空気循環ダクトによる恒温槽１全体の温度制御を行う。恒温槽の温度は、ペルチエ素子ドライバ回路３１を介して制御する。また一方で遠心ロータ２静止時の反応セル５内の温度制御ではスイッチングＦＥＴ２９を介して加熱量の制御を行う。これら制御のための温度測定は、反応セル内の溶液温度を放射温度センサ１８で、恒温槽内の気温測定を熱電対２１により検知し、それらの信号出力をＡ／Ｄ変換ユニット２２を介して行う。電磁誘導加熱による反応セルへの加熱時はモータドライバ２５を介して昇降機１９に接続するパルスモータを駆動、昇降機１９上に固定された電磁誘導コイル１７を加熱リング
１６に近接させ、遠心ロータ２の回転時は待機位置に戻るよう制御される。モータドライバ２５は遠心ロータ２の回転制御用のモータドライバ２６と合わせてパルスコントローラ２７を介してプログラマブルコントローラ２３に接続する。プログラマブルコントローラ２３は以下に述べるプロセスを記述したプログラムを実装し、蛍光測定部を含めた各部の制御を行い遺伝子検査を実施する。

次に本実施例による遺伝子検査のプロセスを示す。

本実施例に記載の生体試料検査装置は、生体試料中に検査対象とする細菌、もしくはウイルスの遺伝子が存在するか否かの判定、および存在した場合の濃度測定を行うものである。

生体試料検査装置は、試料から核酸分子を抽出し、それらが検査対象とする細菌、もしくはウイルスの遺伝子の塩基配列に対応するプライマを用いた増幅処理を行い、増幅するか否かを測定することにより対象遺伝子の有無を判定する。また、増幅した場合は、対象遺伝子の増幅曲線を測定することにより、対象遺伝子の濃度について測定を行う。増幅法としては定温増幅法の一種であるＮＡＳＢＡ法を採用している。遺伝子検査のプロセスは、熱変成処理と増幅処理から構成されている。

最初に生体試料から抽出された核酸溶液が反応セル内に移動し、保持されている状態で、カートリッジを含む恒温槽内部は４１℃±０.５℃ の一定温度に維持されている。

次に試薬ポートから反応セルに対して遠心ロータの回転による遠心力で試薬を流動させ、試薬とＤＮＡ，ＲＮＡを混合し、反応セル内のＤＮＡ，ＲＮＡの熱変成処理を行う。
ＲＮＡの熱変成処理では液温を６５℃±１℃、ＤＮＡの熱変成処理では９５℃±１℃に保持する必要があるのに対して、熱変成処理の後に行う増幅処理で必要とされる液温は４１℃±０.５℃ で、かつ増幅処理で使用される試薬は４１℃より高い温度では急速に劣化する特性をもつ。このため、熱変成処理の時点では反応セル内部の温度のみ前記の６５℃±１℃、もしくは９５℃±１℃に局所的に制御し、熱変成処理後の定温での増幅工程では反応セルの温度を恒温槽内と等温の４１℃±０.５℃ にするのが望ましい。上記のように熱変成時に要求される温度制御では増幅での制御温度と比較して精度を要求されない。また、増幅処理時には、蛍光標識された核酸の濃度変化を蛍光強度の測定により検出を行うため、２ヶ所の蛍光測定部の配置してある位置に６個のカートリッジが順次配置されるよう、遠心ロータを１〜２０rpm で回転させる。これらの温度制御を行うため、熱変成処理時は恒温槽底部に設けた電磁誘導コイルを昇降機により反応セルに近接させ、６５℃±１℃、もしくは９５℃±１℃に加熱し、局所温度制御を行うとともに、熱変成処理終了後、電磁誘導加熱を停止して電磁誘導コイルを降下させ、反応セルを含めカートリッジは恒温槽により温度制御される。

次いで遠心ロータの回転による遠心力で試薬ポートから増幅試薬を反応セルに流動させた後、増幅処理に移行する。増幅処理中は１０秒に１回６０°ずつ遠心ロータを回転させることにより各カートリッジとも１分間に１回ずつ蛍光測定を行う。以上のプロセスにより、対象とする遺伝子の検査を行う。

本実施例により、遺伝子検査の核酸抽出，熱変成，核酸増幅，検出の各工程において、それぞれ最適な温度制御手順を適用し、工程の進行に応じてそれらを順次切替えることにより、簡易な装置構成で上記工程の温度管理を行い、定温での核酸増幅法であるNASBA 法を用いた自動化された遺伝子検査を行うことが可能となる。

次に図８（ａ），（ｂ）により第２の実施例について説明する。以下、実施例１との主な相違点についてのみ説明する。

本実施例では電磁誘導加熱装置をカートリッジに対して上方に配置し、熱変成処理実行時の局所加熱を行う際には電磁誘導コイルを待機位置から降下させ、熱変成処理終了と共に上昇させて待機位置に戻す。カートリッジ上面に電磁誘導コイル１７が位置する場合、加熱リング１６と電磁誘導コイル１７の間にカートリッジの上部壁面４ｄが入るため、両者を近接させることが難しい。このため、本実施例では図７に示すように加熱リングに突起を設け、突起部をカートリッジ表面に露出させるように配置することとし、これにより電磁誘導コイルと加熱リングを近接させることが可能となる。また、本実施例において放射温度計を電磁誘導コイルに対応する位置で恒温槽底面に６箇所配置し、各反応セルの温度測定と加熱を同時に行う。本実施例では、電磁誘導コイルをカートリッジ上面側に配置できるため、電磁誘導コイルが遠心ロータ２より下側に配置してある場合と比較してその位置調整が容易となる。

次に図９により第３の実施例について説明する。以下、実施例１及び実施例２との主な相違点についてのみ説明する。

第３の実施例では反応セルの局所温度制御を行うために、光方式の加熱装置を用いるもので、加熱光源３３，光シャッタ３４，集光レンズ系３５から構成される。本実施例による温度制御では、熱変成処理実行時に加熱光源３３を点灯させ、放射温度センサ１８での測定結果から光シャッタの開閉、もしくは光源への印加電力制御により温度上昇のコントロールを行う。加熱光源３３としてはキセノンランプ、もしくはハロゲンランプの適用が考えられるが、サーモパイル方式の放射温度センサ１８の短波長側使用波長端が８μｍ付近であることから、ハロゲンランプを使用する場合光源からの入射光の影響を避けるため、加熱光源に８μｍ以上の波長を遮断するフィルタを組み込む必要がある。本実施例では局所加熱への切替えに際し、光シャッタの開閉のみで加熱装置そのものの昇降は必要としない。

生体試料検査装置の正面図。 遠心ロータ上での蛍光測定部，カートリッジの配置下面図。 カートリッジ構成図。 生体試料検査装置の側面図。 空気循環ダクト，放熱ダクトの背面図。 遠心ロータ，電磁誘導加熱部の構成を示す断面図。 制御系の構成図。 第２の実施例における遠心ロータ，電磁誘導加熱部の構成を示す断面図。 第３の実施例における遠心ロータ，光加熱部の構成を示す断面図。

符号の説明

１…恒温槽、２…遠心ロータ、３…モータ、３ａ…回転伝達機構、３ｂ…支持台、４…カートリッジ、４ａ…試料保持ポート、４ｂ…試薬保持ポート、４ｃ…液体流路、５…反応セル、６…蛍光測定部、６ａ…蛍光検知部、６ｂ…発光ダイオード、６ｃ，３５…集光レンズ系、７…空気循環ダクト、８，９…吸／放熱板、１０…ペルチエ素子、１１…放熱ダクト、１２，１３…空気循環送風ファン、１４，１５…放熱送風ファン、１６…加熱リング、１７…電磁誘導コイル、１８…放射温度センサ、１９…昇降機、２０…センサアンプ、２１…熱電対、２２…Ａ／Ｄ変換ユニット、２３…プログラマブルコントローラ、
２４…パルスモータ、２５，２６…モータドライバ、２７…パルスコントローラ、２８…直流電源、２９…スイッチングＦＥＴ、３０…パルス発生回路、３１…ペルチエ素子ドライバ回路、３２…Ｄ／Ａ変換ユニット、３３…加熱光源、３４…光シャッタ。

Claims (9)

1. 生体試料を保持する生体試料容器と、試薬を保持する試薬容器と、生体試料と試薬を反応させる反応容器とを備えた回転可能な構造体と、
   構造体の回転を制御する回転制御機構と、
   構造体を内部に配置する恒温槽と、
   構造体の一部を温度制御する第１の温度制御機構と、
   恒温槽の内部を温度制御する第２の温度制御機構と、を備えた生体試料分析装置であって、
   構造体を静止させ、第１の温度制御機構により構造体の一部を温度制御し、
   構造体を回転させ、第２の温度制御機構により恒温槽の内部を温度制御することを特徴とする生体試料分析装置。
2. 請求項１記載の生体試料分析装置であって、
   生体試料から核酸を摘出する際に、構造体を回転させ、第２の温度制御機構により恒温槽の内部を温度制御し、
   核酸を熱変性する際に、構造体を静止させ、第１の温度制御機構により構造体の一部を温度制御することを特徴とする生体試料分析装置。
3. 請求項１記載の生体試料分析装置であって、
   生体試料から核酸を摘出する際に、構造体を回転させ、第２の温度制御機構により恒温槽の内部を温度制御し、
   核酸を増幅する際に、構造体を回転させ、第２の温度制御機構により恒温槽の内部を温度制御することを特徴とする生体試料分析装置。
4. 請求項１記載の生体試料分析装置であって、
   核酸を分析する分析機構を備え、
   核酸を分析する際に、構造体を回転させ、第２の温度制御機構により恒温槽の内部を温度制御することを特徴とする生体試料分析装置。
5. 請求項１記載の生体試料分析装置であって、
   第１の温度制御機構が反応容器を温度制御することを特徴とする生体試料分析装置。
6. 請求項１記載の生体試料分析装置であって、
   第１の温度制御機構が、構造体に設けられた磁性材と、構造体の外部に設けられた電磁誘導コイルとを含み、
   電磁誘導方式により磁性材を加熱することを特徴とする生体試料検査装置。
7. 請求項１記載の生体試料分析装置であって、
   第２の温度制御機構が、装置外部との熱交換器と、恒温槽と熱交換器に接続する配管と、配管内の送気機構とを含み、
   装置外部と熱交換することにより、恒温槽の内部の温度制御を行うことを特徴とする生体試料検査装置。
8. 生体試料を保持する生体試料保持領域と、試薬を保持する試薬保持領域と、生体試料と試薬を反応させる反応領域とを備えた回転可能な構造体と、
   構造体の回転を制御する回転制御機構と、
   構造体の一部を局所的に温度制御できる第１の温度制御機構と、
   構造体の全体を温度制御できる第２の温度制御機構と、を備えた生体試料分析装置であって、
   生体試料から核酸を摘出する際に、構造体を回転させ、構造体の全体を温度制御し、
   核酸を熱変性する際に、構造体を静止させ、構造体の一部を局所的に温度制御し、
   核酸を増幅する際に、構造体を回転させ、構造体の全体を温度制御することを特徴とする生体試料分析装置。
9. 請求項８記載の生体試料分析装置であって、
   核酸を分析する分析機構を備え、
   核酸を分析する際に、構造体を回転させ、構造体の全体を温度制御することを特徴とする生体試料分析装置。
   

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