CN103602659A - 一种高通量的连续性核酸扩增装置及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种PCR扩增反应用的装置,属于生化设备技术领域。扩增方法包括如下步骤:使PCR反应物料沿毛细管流动,通过毛细管外部设置的多个温控区域对反应物料的温度进行调节,使PCR反应物料依次经过变性、退火、延伸过程,完成PCR扩增反应。扩增装置包括有依次排列的三个温控区域,温控区域首尾相连成闭合结构,毛细管设置于温控区域,并沿着温控区域的闭合结构上缠绕,毛细管入口设置于执行变性反应的温控区域上,毛细管的出口设置于执行延伸反应的温控区域上,毛细管入口连接于输送装置。本发明PCR扩增方法和装置可以实现大批量的反应体系的连续性的扩增,而且可以实现多个反应体系或者多个样本的同时扩增和检测。
Description
技术领域
本发明提供了一种PCR扩增反应用的装置,属于生化设备技术领域。
背景技术
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链,在DNA聚合酶的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,加入设计引物,DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
PCR(聚合酶链式反应)是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链,低温(经常是60°C左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合,再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72°C左右),DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备,能在变性温度,复性温度,延伸温度之间很好地进行控制。
自perkin –elmercetus公司第一台pcr扩增仪问世以来,现已有几十家不同的厂家在国内外生产和销售pcr扩增仪。在短短的几年间,扩增仪经过几代的发展,不断采用新技术,并且进一步朝方便、实用、高智能化和自动化的方向发展。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;③引物的延伸:DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链,重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
荧光定量PCR( realtime fluores-cence quantitative PCR,RTFQ PCR) 是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术,它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度全同步。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;刚开始时, 探针结合在DNA任意一条单链上;PCR扩增时,Taq酶的5’端-3’端外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成。
目前PCR技术虽然的到了很大的发展,但是所有的PCR反应都必须在PCR反应管中实现,这样,单独的PCR反应的体系就不能超过200微升,这就限制了特定基因的大量制备;同时,目前的PCR仪器扩大扩增的通量主要依靠增大反应的孔的数目,目前高通量的PCR仪器已经做到了384孔,可以同时扩增或者定量384个样品,但是面对上千或者上万的样品的扩增和检测,就比较困难了;传统PCR反应时间通常为2小时以上,这其中大部分的时间被用在温度的变化上。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术当中PCR扩增操作步骤繁琐、扩增量受到限制、无法连续操作的问题,提供了一种具有高通量的连续性PCR扩增方法,采用了如下的技术方案:
一种高通量的连续性核酸扩增方法,包括如下步骤:使PCR反应物料沿毛细管流动,通过毛细管外部设置的多个温控区域对反应物料的温度进行调节,使PCR反应物料依次经过变性、退火、延伸过程,完成PCR扩增反应。
该技术方案基于如下原理:PCR扩增一般是分为三个过程,变性、退火、延伸,每个过程所需要的温度和时间都不相同,当PCR反应物料沿着毛细管流动时,会依次由多个温控区域对其进行变温,因此将这些温控区域分别设置为所需要的变性、退火、延伸温度时,即能实现物料的PCR反应;另外,由于反应物料是沿着毛细管中流动的,所以物料会依次进入到变性、退火、延伸区域,当完成这一段流动时,就完成了一个反应循环,如果多次通过变性、退火、延伸温控区域时,就完成了多个PCR反应循环,当物料流出毛细管时,即得到了反应完成的物料。
作为对上述方法的改进,温控区域的长度是可调节的。对于不同的PCR反应,其变性、退火、延伸所需的时间是不同的,如果温控区域的长度可调,则可以调节反应物料在温控区域内的停留时间,以此来实现反应时间的改变。
作为对上述方法的改进,温控区域之间依次排布并首尾相连构成闭合结构,毛细管是沿着闭合的温控结构缠绕。采用这样的结构时,就可以避免使用较多的温控装置,毛细管在温控区域组成的闭合结构上可以多次经过,即相当于多次进行了PCR扩增循环,而且在实际使用时,循环次数也较容易控制,将毛细管绕不同圈数的时候,就可以实现不同的循环次数。在使用时,毛细管的入口是设置于执行变性反应温度的温控区域上,毛细管的出口是设置于执行延伸反的温控区域上,此时,毛细管中的反应物刚被温控区域进行温度调整时,即进行了变性反应,最后当完成了最后一个循环的延伸反应后,离开毛细管。
作为对上述方法的改进,温控区域共有3个。将这3个温控区域首尾连接,每个区域分别属于变性、退火、延伸段,成一个闭合环时,毛细管每绕一圈,就是相当于一个PCR循环。
作为对上述方法的改进,在毛细管的入口处间隔加入反应物和隔离流体;所述的隔离流体是指与反应物不混溶的气体或者液体。通过这样的改进手段,可以利用隔离流体将反应物分隔为许多个小段,那么就可以实现不同的反应体系的同时扩增,例如:如果要对不同的DNA样本进行扩增时,可以将这些DNA样本加入到同一种反应液中,然后用隔离流体将这些反应体系分隔开,那么就实现了同时扩增不同来源的DNA样本;如果想要考察不同反应液对于扩增反应的影响时,可以配制不同的反应液,然后加入相同的DNA样本,就可以实现这些对于不同反应液的扩增性能的考察。隔离流体一般情况下,可以选用空气、惰性气体(氮气、氦气等),也可以是与反应液不相溶的液体等。
作为对上述方法的改进,在毛细管上还设置有检测装置。检测装置可以安装于毛细管中间段,也可以安装于毛细管的出口处,例如荧光检测装置。这样就可以实现对PCR扩增产物的连续性在线检测。
本发明的另一个目的是提供了一种高通量的连续性核酸扩增装置,包括有依次排列的三个温控区域,温控区域首尾相连成闭合结构,毛细管设置于温控区域上,并沿着温控区域的闭合结构上缠绕,毛细管入口设置于执行变性反应的温控区域上,毛细管的出口设置于执行延伸反应的温控区域上,毛细管入口连接于输送装置。
上述的输送装置可以是泵等常规部件。温控区域分别执行变性、退火、延伸的温度,可以改进毛细管中反应液的温度,以此来实现PCR扩增循环。
作为对上述装置的改进,温控区域的长度可调节。这样就可以实现反应液不同的扩增阶段的时间控制。
作为对上述装置的改进,温控区域是由多个独立的温控单元组成的。如果要将温控区域实现长度可调的话,通过机械装置自身结构的改变会使装置过于复杂。而如果温控区域是由许多个独立的温控单元构成的话,分别设置各个温控单元的温度,就可以在不改变温控区域本身的机械结构的条件下,实现温控区域长度的改变。
作为对上述装置的改进,在毛细管的入口处还设置有多个PCR反应物料输入管以及隔离流体输入管;所述的PCR反应物料输入管与隔离流体输入管的出口互相连通。
作为对上述装置的改进,在毛细管上还设置有荧光检测器。荧光检测器的位置可以是在毛细管的中部,也可以是在毛细管的出口处。
作为对上述装置的改进,所述的毛细管的材质可以选自玻璃、不锈钢、铜中的一种,管径优选是0.5 mm~5mm。
技术效果
本发明提供的高通量、连续性的PCR扩增方法和装置可以实现大批量的反应体系的连续性的扩增,避免了传统的扩增方法需要反复调节温度的问题,提高了工作效率,而且可以实现多个反应体系或者多个样本的同时扩增和检测。
附图说明
图1是普通的PCR扩增过程的温度变化图。
图2是PCR扩增装置一种实施方式的结构示意图。
图3是PCR扩增装置另一种实施方式的结构示意图。
图4是PCR扩增装置的输入管路的结构示意图。
图5是PCR扩增装置的输入、反应、检测部件连接的结构示意图。
图6是PCR扩增装置的整机结构视图。
图7是PCR扩增装置的整机结构视图。
图8是PCR扩增装置的主反应模块图。
图9是PCR扩增装置的温控区域的结构示意图。
图10是PCR扩增装置的温度控制圆盘的结构示意图。
其中,1、显示屏幕;2、样品收集处盖板;3、上盖;4、升降开关;5、样品加入处盖板;6、原样品储存罐;7、支架;8、泵;9、温度区域调节电机;10、温度控制圆盘;11、毛细管;12、检测窗口;13、温控单元;14、电刷带动圆盘;15、温度控制电刷;16、毛细管入口;17是毛细管出口;18是空气泵;19是空气输送管;20是原料输送管;21是温控区域。
具体实施方式
实施例1
普通的PCR扩增过程的温度和时间变化如图1所示。分为变性、退火、延伸过程,每个过程都有各自的时间和温度。
本发明提供的PCR扩增装置的核心结构模块如图2所示,是由三个温控区域21组成,这三个温控区域依次排布并且首尾相连成闭合环状结构,温控区域由分别执行变性、退火、延伸的步骤,在使用时分别将这些区域的温度设置为所需的反应温度即可,毛细管11缠绕于温控区域21构成的环状结构的外侧,毛细管入口16设置于执行变性反应的温控区域,毛细管出口17设置于执行延伸反应的温控区域,采用的是泵。
在图1中,执行变性、退火、延伸的3个温控区域21环绕成圆形,毛细管11在这个圆形的温控区域上缠绕,根据PCR反应需要的循环次数,可以将环绕的圈数设定为循环次数,PCR扩增的反应物(模板、引物、dNTP、水,聚合酶等)在温控区域上环绕一圈就是相当于一个扩增循环,毛细管入口16处是设置于执行变性步骤的温控区域上,毛细管出口17设置于执行延伸步骤的温控区域上,相当于可以使反应物料从变性开始进行反应,至离开毛细管出口17时刚好完成延伸反应,物料在圆形的温控区域外循环的圈数即是PCR反应循环次数。
另外,通过改变温控区域的长度,就可以调整PCR反应的时间。为了使长度更易调节,温控区域最好是按照图3这样的结构,温控区域是由许多独立的温控单元13组成,即可以将温控区域“微分化”,通过改变这些温控单元的温度,就能使温控区域的长度得到调整,比如:将某一段温度相同的温控单元的数量增加,就相当于使这一段温控区域得到了加长。
毛细管11的入口是需要连接于原料供应装置的,如图4所示,在毛细管11的入口处连接有泵8,泵8不断地将原料通过原料输送管20输送入毛细管11,原料输送管20可以包括有多根,并且同时连接于毛细管11的同一位置上,这样就可以实现同时将多股物料混合后输送进毛细管11。在本实施例中,在原料输送管20与毛细管11相连接的位置上还通过空气输送管19连接于一个空气泵18,当原料输送管20连续向毛细管11内输送原料时,空气泵18间歇性的向毛细管11中输入空气,就可以将毛细管11中的物料通过空气间隔分为多个反应段,各个段中如果加入不同的DNA样本,就可以实现多个样本的同时连续扩增;也可以通过在原料输送管20中依次加入不同的反应液,并由空气泵的间歇性供给,实现通过空气将这些具有不同组成的反应液隔离开的效果,进而可以实现不同反应体系的同时连续性扩增,可以用这种方法考察反应中某一原料对扩增反应结果的影响。
如图5,在毛细管11上,还可以安装有一个光路检测系统,检测样品经过此位置时的状态,给出信号,样品经过扩增系统扩增后,并且光路检测系统给控制系统指令,收集系统对样品收集。在实际应用时,反应体系中加入荧光染料,通过微流控技术将特定的分隔介质(气体、不溶性的液体等)按照要求注入毛细管中,将PCR反应体系分隔开,再将需要PCR反应体系的某些成分加入这个小的反应体系中,通过毛细管和圆盘组成的反应系统,在毛细管上增加荧光加测传感器,因为微反应体系的数量可以控制,所以可以实现很高通量的荧光定量PCR反应的扩增。
实施例2
上述的装置可以如图6和图7这样安装成一体机,其中包括有显示屏幕1,样品收集处盖板2,上盖3,升降开关4,样品加入处盖板5,原样品储存罐6等部件。
内部的扩增系统核心部件如图8、图9和图10所示,包括有支架7、泵8、检测窗口12(将荧光检测器安装于此处),温控单元13沿圆形排列,圆形的中间是温度区域调节电机9,电机上设置有3组圆盘14,圆盘14可以分别转动,圆盘14上分别设置有电刷15,电刷15与温控单元13连接,通过电刷15的转动可以控制加热或者制冷模块的接入数量达到加热或者制冷的区域范围的目的。
Claims (10)
1. 一种高通量的连续性核酸扩增方法,包括如下步骤:使PCR反应物料沿毛细管流动,通过毛细管外部设置的多个温控区域对反应物料的温度进行调节,使PCR反应物料依次经过变性、退火、延伸过程,完成PCR扩增反应。
2. 根据权利要求1所述的高通量的连续性核酸扩增方法,其特征在于:所述的温控区域的长度是可调节的。
3. 根据权利要求1所述的高通量的连续性核酸扩增方法,其特征在于:温控区域之间依次排布并首尾相连构成闭合结构,毛细管是沿着闭合的温控结构缠绕。
4. 根据权利要求1所述的高通量的连续性核酸扩增方法,其特征在于:所述的在毛细管的入口处间隔加入反应物和隔离流体;所述的隔离流体是指与反应物不混溶的气体或者液体。
5. 根据权利要求1所述的高通量的连续性核酸扩增方法,其特征在于:在毛细管上还设置有检测装置。
6. 一种高通量的连续性核酸扩增装置,其特征在于:包括有依次排列的三个温控区域,温控区域首尾相连成闭合结构,毛细管设置于温控区域,并沿着温控区域的闭合结构上缠绕,毛细管入口设置于执行变性反应的温控区域上,毛细管的出口设置于执行延伸反应的温控区域上,毛细管入口连接于输送装置。
7. 根据权利要求6所述的高通量的连续性核酸扩增装置,其特征在于:所述的温控区域的长度可调节。
8. 根据权利要求6所述的高通量的连续性核酸扩增装置,其特征在于:所述的温控区域是由多个独立的温控单元组成的。
9. 根据权利要求6所述的高通量的连续性核酸扩增装置,其特征在于:所述的在毛细管的入口处还设置有多个PCR反应物料输入管以及隔离流体输入管;所述的PCR反应物料输入管与隔离流体输入管的出口互相连通。
10. 根据权利要求6所述的高通量的连续性核酸扩增装置,其特征在于:所述的毛细管上还设置有荧光检测器。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140226 |