JPH03500006A - 組換えｄｎａ法、ベクター及び宿主細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

組換えＤＮＡ法、ベクター及 び宿主細胞 本発明は、組換えＤＮＡ技術による蛋白産生のたわに宿主細胞として用Ｊ゛・る リンパ系セルラインの改良法に関する。また本発明は、この改良法に用いるベク ター及びこの改良法によって得られる宿主細胞に関する。 現在ではリンパ系セルラインは、組換えＤＮＡ技術によりイムノグロブリン、関 連ハイブリッドもしくはキメラ蛋白（工ｇ−タイプ分子〕あるいは他の組換え蛋 白を産生する際の宿主細胞として使用できるとされている。リンパ系細胞には、 ｉｎ　ＶｉＶＯで工ｇ分子を産生するＢセルと同様にいくつかのジエネラルタイ ゾ乞ゝ有するミエローマ細胞などが含まれており、従って、リンパ系細胞は工ｇ −タイプ分子の正しい構築及び分泌を行なうのに必要な分子内機構を元来有して いるものと考えられる。このようなリンパ系細＠は、組換えＤＭＥ技術により非 工ｇ−タイプ分子を産生するに際しても使用できると思われる。 ミエローマセルライン、Ｔセルリンパ腫などの多くのリンパ系セルラインは、グ ルタミン欠損培地ではｉｎ　ｖｉｔｒｏで生育できないことが知られている。リ ンパ系セルラインを形質転換してグルタミン非依存性にすることが可能となれば 、これによって形質転換セルラインを選択する有利な方法が提供されることにな る。 従ってグルタミン非依存性にすることは極めて有用であると考えられている。 このようなセルラインにグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）をコードする遺伝子を 導入することによってグルタミン非依存性に形質転換できると推測されている。 このような示唆はＥＰ−ＡＯ２５＋５０５５（Ｏｅ：Ｌ１ｔ＠ｃｈ　）明細書に 配電されている。しかしながら、その後、トランスフェクト体の同定が困難もし くは不可能な程度に高頻度で、グルタミン欠損培地で生育できる変異体がハイシ リドーマセルラインによって自然に産生されることが見出されている。ミエロー マセルラインｔＧＳ遺伝子でトランスフェクトし、グルタミン欠損培地で形質転 換体を生育せしめても有意な量で生存しつづけることができない。 従って、本発明の目的は、リンパ系セルラインをグルタミン非依存性に形質転換 する方法を提供することにある。 本発明によれば、リンパ系セルラインをグルタミン非依存性に形質転換する方法 であって、活性グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）遺伝子を含むベクターでリンパ 系セルラインヲ髪質転換し；形質転換セルラインｔグルタミンを含む培地で生育 し：次いで グルタミンが順次減少していく培地あるいはグルタミン欠損培地で該形質転換セ ルラインを生育し続づげる： ことからなる上記方法が提供される。 リンパ系セルラインはミエローマセルラインが好ましい。 グルタミン減少もしくは欠損培地はアスパラギンを含有しているのが好ましい。 あるいは、培地は、グルタミン欠損培地で形質転換セルラインの生存を可能とす るような他の栄養素を含有していてもよい。このような栄養素は、垣化アンモニ ウムなどのアンモニアドナーでもよい。 驚くべきことに、形質転換リンパ系セルラインを最初にグルタミン含有培地で生 育させない場合には、ベクターによって形質転換されていてもいなくてもいずれ のセルラインも生育できないことが見出された。本発明の方法を使用することに より、ベクターで形質転換されたリンパ系セルラインを選択することが可能であ る。 あるいは、リンパ系セルラインは、ｇｐｔ遺伝子などの他の選択マーカーをコー ドする遺伝子と活性ＧＳ遺るいは、ＧＳと選択マーカーをそれぞれコードする判 別のベクターで一緒に形質転換してもよい。次いで、培地中のグルタミンを減少 させる前に、選択マーカーを用いて形質転換宿主細胞を選択することができる。 この方法の利点は、毒性薬剤を使用することなくベクターの選択が可能となるこ とである。ベクターが除去された宿主細胞はグルタミン欠損培地では生存できな い。 この方法の更に他の利点は、宿主細胞の内因性ａＳ遺伝子を増幅させることなく 遺伝子増幅の選択が可能となることである。 培地中のグルタミンは、グルタミンを欠いたアスパラギンを含有する培地で希釈 することによって順次減少させて行くのが好ましい。 リンパ系セルラインを形質転換するのに用いるベクターは、リンパ系セルライ・ ンにとって異種の蛋白をコードする活性遺伝子を含有しているのが好ましい。あ るい（工、リンパ系セルラインｔ１異種蛋白ｔコードする活性遺伝子を含む他の ベクターと一緒に形質転換してもよい。 異種蛋白は一本鎖として発現される蛋白でもよい（それは発現後にマルチチェイ ンに開裂されるかもしれないが〕。このような一本鎖発現生底物の例としては、 組織プラスミノ−ｒンアクチベータ−（ｔＰＡ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ） 、メタロプロテイナーゼの組織抑制因子（ＴＩＭＰ）ｔＬどが挙げられる。 しかしながら、異種蛋白はＩｇタイプ分子が好ましい。この分子の場合には、２ つのペプチド鎖が別々に発現されることが必要であり、この２つのペプチド鎖は 発現後；ニー緒になって完全な分子を形成する。従って、セルラインは、Ｈ鎖（ もしくはＨ鎖アナログ）及びＬ鎖（もしくはＬ鎖アナログ）を別々にコードする 活性遺伝子で形質転換する必要がある。 Ｈ鎖及びＬ＠Ｙコードする遺伝子はＧＳ遺伝子と同様のベクター上に両者とも存 在しているのが好ましい。 あるいは、ＧＳ遺伝子を含有するベクターが更にＨ鎖もしくはＬ鎖遺伝子のいず れか１つを有し、他の遺伝子が別のベクター中に含まれていてもよい。あるいは また、Ｈ鎖及びＬ鎖遺伝子がＧＳ遺伝子を含有するベクター中に存在せず、両者 は同じあるいは別々のベクター中に存在していてもよい。 このような異種蛋白の発現（工、例えば選択剤としてメチオニンスルホキシミノ （ＭＳＫ）を用いた（）Ｓ遺伝子の選択的増幅によりかなり増ＶＤさせることが できる。 ＧＦ３遺伝子は比較的弱いプロモーターを有し、異種蛋白をコードする遺伝子は 比較的強いプロモーターを有し形質転換セルライン中での蛋白合成がＧＳ蛋白の 産生よりも異種蛋白もしくはペゾチドの産生：Ｃ優先的に回げられるようにする のが好ましい。更には、ＧＳ遺伝子が強いプロモーターよりもむしろ弱いプロモ ーターによってコントコールされている場合には、遺伝子の選択的増幅を行なう には低濃度のＭＳＸなどの選択剤を使用することが必要である。 弱いプロモーター？使用することにより、Ｇｓ遺伝子がｒツム中の特に有利な位 置に挿入された形質転換セルラインを選択することが可能となると考えられる。 これによって、Ｇ８遺伝子といずれの異種遺伝子もが有効に転写されることが保 証される。 全ての遺伝子が同じベクター中に存在している場合には、これらの遺伝子を正し く発現させるためには注意深くベクターｔデディンする必要があることが見出さ れた。 しかして、本発明の第２の局面によれば、リンパ系セルラインをグルタミン非依 存性に形質転換し異種蛋白産生な可能にするベクターであって、ＧＳ遺伝子と異 種蛋白をコードする遺伝子を含有し、異種蛋白をコードする配列を転写するプロ そ一ター／エンハンサーからの転写インター７エアレンスにより、Ｇ８遺伝子の 発現がグルタミン非依存性コロニーが産生されない種変には妨害されないように アレンジされている上記ベクターが提供される。 ベクター中の遺伝子はこのような方向性でアレンジされており、プロモーターは 転写インターフエアレンスな実質的に阻止するようにされているのが好ましい。 例えば、ＧＳ遺伝子は比較的弱いプロモーターＹＷＬ、異種蛋白ｔコードする遺 伝子は比較的強いプロモーターＹ−ＷＬ、ＧＳ遺伝子のプロモーターは異種蛋白 をコードする遺伝子のプロモーターの上流に位置し、あるいはＧＳ遺伝子のプロ モーターは異種蛋白をコードする遺伝子のプロモーターとは逆の方向で発現を誘 導するようにしてもよい。 驚くべきことに、上記のようにしてベクターをアレン シジすることによって、ＧＳ遺伝子の発現が十分な量で行なわれて選択が可能と なり、そして異種蛋白も他のベクターの場合よりもより効果的に発現されること が見出された。 例えば、異なるプロモーターを用い、あるいは異なる順序もしくは方向で遺伝子 を用いてベクターｔアレンジした場合には、ＧＳもしくは異種蛋白の産生レベル は極めて低くなるかあるいはゼロになることが観察−ターを含むＧＳ遺伝子の上 流においた場合には、上流遺伝子の転写は下流遺伝子にまで及び、下流プローモ ーターが閉塞されることが考えられる（本件出願人はこの考えに限定されたくな いが）。形質転換コロニーの頻度は０８遺伝子の発現レベルに依存しているため 、このようなプロモーターの閉塞によりトランスフェクト体の回収頻度が著しく 減少する。 弱いプロモーターと強いプロモーターとの組み合わせは、５Ｖ４Ｑ初期領域とｈ （：！ＭＹ−ＭＩＥプロモーター（ｈＯＭＶ−ＭＩＥ＝ヒトサイトメガロウィル ス主要即時初期遺伝子）との組合わせが好ましい。しかしながら、他の適当なプ ロそ一ターの組合わせも当業者には明らかであろう。 本発明のベクターの好ましい態様は、弱いプロモーターを有するＧＳ遺伝子の下 流に強いプロモーターを有するＲ銀様遺伝子があり、ＧＳ遺伝子のプロモーター 及びＨ銀様遺伝子のプロモーターと逆の方向で強いプロモーターを有するＬ銀様 遺伝子が存在するベクターである。 あるい：工、プロモーターの閉塞は、遺伝子の間に転写終止シグナルを設けるこ とによって防ぐことができる。 あるい１；、遺伝子の間に非反復制限騨素部位を設けてもよい。この場合には、 ベクターを宿主細胞中に導入する前に、この部位を利用してベクターを線状化す る。これによって、形質転換宿主細胞中にてプロモーターの閉塞が起きないよう にすることができる。 ベクター中に異種蛋白？コードする遺伝子が２つ以上ある場合には、これらの遺 伝子が転写インターフエアレンスを促進しないようにすることが必要である。 例えば、ベクターがＧＳ遺伝子、Ｈ鎖遺伝子及びＬ鎖遺伝子を含有する場合には 、これら３つの遺伝子のいずれもが同じ方向で転写されＧＳ遺伝子は他の２つの 遺伝子の上流にあるのが好ましく、あるいは、ＧＳ遺伝子と他の遺伝子の１つは 同じ方向で転写されＧＳ遺伝子は他の第１の遺伝子の上流にあつ篤２の遺伝子は 他の方向で転写されそして第２の遺伝子のプロモーター１工ＧＳ遺伝子のプロモ ーターに接しているのが好ましい。 ベクターは、ラムダファージナトのウィルスベクターからなるものでもよく、あ るいに、例えば周知のｐＢＲ３２２プラスミドに基づくプラスミドベクターから なるものでもよい。しかしながら、当業界において周知のいずれのベクターも、 慣用的組換えＤＮＡ技術を用いて本発明に採用することができる。 また、本発明は、本発明の方法によって産生される宿主細胞もしくは本発明のベ クターを含有する宿主細胞を包含する。 特に本発明は、ａＳ遺伝子を含むベクターと異種蛋白ｔコードする遺伝子を含む ベクターとで一緒に形質転換されたリンパ系セルラインであって、これらのベク ターは、グルタミン非依存性コロニーが産生できない程度にはＧＳ遺伝子が転写 インターフエアレンスにより訪客されないようにアレンジされているベクターで ある上記リンパ系セルラインを包含する。 以下に添付した図面を参照して例により本発明を説篤１図は、プラスミド１）Ａ Ｂ２　ＧＳでトランスフェクトされたＩＳＯ細胞から分泌される蛋白のウェスタ ンプロットによる分析を示し、このウェスタンプロットでは、培養上清あるいに コントロール組織培養培地２５μ２１に１０％５ＤＩＩ還元メリアクリルアミド デルに付し、ニトロセルロースにプロットし、ヒトエｇｆａを認識する抗血清で プローブし、次いで１２５ニーラベル化ゾクテインＡでプローブした。 ｔＩ／Ｅ２図ハ、デー）ｘミドｐＢ７２ＧＢＱＬＱの構造を示す。 第３図は、プラスミドｐＢ７６の構造を示す。 第４図は、＊　ルライｙ　５ｖ２ｅｓｘｓｏ及びＣＭＧＳＩＪ８０ノｒツムＤＮ Ａのサデンデａット分析を示す。 纂１図では、レーン１は精製キメラＢ７２．３抗体を示し、ｒｇＬａ及びＨ鎖の 位置を表わし、レーン２−５は異なるトランスフェクトクローンの培養上清を示 し、レーン６はネガティブコントロールの培養上清を示す。 第２図では、Ｅは＋９Ｖ４Ｑ初期領域プロモーター、ＧＳｋｚ　ａ　ＥＩ　０Ｄ ＮＡ　：ｘ　−）［ａ列、イントロン＋ＰＡはスモールｔ−インドｏンと５Ｖ４ Ｑの初期領域ポリアデニル化シクナル、ｈｃＭｖｔｚ　ｂｃＭｖ−ＭＩＸ　ｆ　 ａ　−ｖ−−／　−−ｘ　ンハンサー、０ＩａＯはＢ　７２．３として知られて いると二−マナイズ抗体のキメラＬ鎖のコード配列、ｐＡはＢＶ４Ｑ初期ポリア デニル化シグナルを示す。 第３図テハ、ｈ（！ＭＹ　ｋ’ｓ　ｈｃＭＶ−ＭＩＸプｆｆｆモーター二ン”ン ｔ＝　（２，１ｋｂ　）　ｙ　５グメント、ｃ　Ｅｔｃｈｓ　Ｂ　７２．３抗体 のキメラＨ鎖コード配列、ｃＬｃは３７２．３抗体のキメラＬ鎖コード配列を示 す。ポリＡは５ｖ４ｏ初期ポリアデニル化シグナルを含む。工＋ＦＡはＢＶ４Ｑ の’Ｘ　−１ｉ−−ｋ　ｔ　イントロンと初期領域ポリアデニル化シグナルを含 む。８７には５ｖ４０初期プロモーターを示す。 バクテリアプラスミドの複與オリジン及びアンピミリン耐性遺伝子はｐＢＲ３２ ２から得た。 第４図では、ＭＳＸで選択前及び選択後のＮｅｏ細胞中の０８−ベクターのコー ー数分析を示す、ＤＭＡサンプルはＢｇｊ　Ｉ及びＢｇｊ　ＩＩで消化し、１％ ７．？ロースゲル上で電気泳動し、ニトロセルロースにトランスファーし、Ｇ３ ０ＤＮＡから単離されたｐＧＢｃ　４５（１１’１の０．５　ｋｂ５’Ｐｓｔｊ 　ＤＮＡ　７ラグメントでゾ＊−テＬ、ｆ、：。 ＤＮＡサンプルに以下の通りである。 レーｙ１　：　１００コセ−／セルに相当するシラスミドｐｓ７２０ｓ　； レーン２　：　１０コセー／セルに相当するプラスミ　ド　ｐｓＶ２Ｇ８　； レーン３　：　１：Ｆピー／セルに相当するプラスミドｐｓＶ２Ｇ８　； ｖ−ｙ４　：　１ＯＰｇ　Ｎ５ＯＰ）ＡＤＮＡ＊レーン６　：　１ＯＰｇＳＶ２ ｏｓＭｓｏ（１００μＭＭＳＫ耐性）デノムＤＮＡ； レーン７　：　１００コセー／セルに相当するシラスミドｐｃＭＧｓ　； レーン８　：　１０コピー／セルに相当するプラスミ　ド　ｐ（！ＭＧＥｉ　； レーン９　：　１コピー／セルに相当するシラスミドｐＯＭＧｓ　； レーア１０　：　１０１１ｇ　（！ＭＧＳＮＳＣ１ｒ”／ムＤＮＡ　；レーｙ１ １　：　１０μｇｃＭＧｓｎｓｏ（１００μＭＭＩＸ耐性）？／ムＤＮＡ； ｍ、ｗ、　：　（ＪｕＩで消化したλフアージＤＮＡ；分子量マーカー。。 引用文献のリストは最後に示した。以下では引用文献はカギカッコで囲った番号 で示した。 ベクター 以下の例では、比較のためにＥｐ−Ａ−０２５６０５５に記載された２つのプラ スミドを用いた。これら（ニブラスミドｐｓＶＬ（）８１とｐｓＶ２Ｇｓである 。プラスミドｐｓＶＬＧｓ　ｉ　！Ｘ　Ｇ　Ｓミニ遺伝子を含んでおり、５ｖ４ ０後期領域プロモーターのコントロール下にＣＤＮＡとゲノムＤＮＡ配列Ｙ［し ている。プラスミドｐｓＶ２Ｇｓは５ｖ４Ｑ初期領域プロモーターのコントロー ル下にＧＳｔコードするＣ　ＤＮＡ配列を含有している。 合成オリゴヌクレオチドリンカーを付加してｐ８Ｖ２Ｇｓの非反復ｐｖｕ　■部 位Ｙ　ＢａｍＨＩ部位に変換することによりベクターｐｓ’Ｖ）ＢａｍＧＳ　ｆ 得た。 合成オリゴヌクレオチドリンカーを用いて、主要即時初期遺伝子プロモーター、 エンハンサ−及びヒトサイトメガロウィルス（ｈｃＭＶ−Ｍｌｌ）の完全５′〜 非翻訳配列（残りの５′非翻訳配列を再構築するために合成オリイヌクレオチド とともにｐｓｔ　−１ｍフラグメントＣ１）　）　ｖｐｓｖ２Ｇｓ　ノＮｃｏｉ 　部位（７）　間Ｋ　挿入Ｌ　テ、ｈｃＭＶ−Ｍｌｌ　７０ａモーターが０８コ 一ド配列の発現を誘導するようにした。得られるプラスミドをｐｃＭＧｓとした 。 シラスミドｐ８Ｖ２ＢａｍＧ８　ｆ　Ｂａｍ　Ｈ（で消化し、転写カセットを含 む２．１　ｋｂフラグメントＶ得た。 他の発現プラスミドの構築を容易に行なうために基本ベクターｐＫＥ６’に用い た。シラスミドｐΣＥ６には１シラスミドｐｃ！Ｔ５４１”２）のｚｍｎＩ−Ｂ Ｏ２１ｙ　ラｒ　／　ント・及びＨｌｎｄｌｌｌとｚｃｏＲＩ部位との間に挿入 さｎたシラスミドｐ８Ｐ　６４　（３）のポリリンカーが含まれており、Ｂａｍ １ｉｉと５Ａ４１部位と１工このポリリンカーによって除かれている。ＢＯ２１ −ＢａｍＨＩフラグメントは２３７　ｂｐ　ｓｖ４［１初期遺伝子のポリアデニ ル化シグナｋＣＥ３Ｖ４Ｑｘクレオチド２７７０−２５３３）である。ＢａｍＨ ｉ−ＢｇＪ）フラグメントはプラスミドｐＢＲ３２２Ｃ４］　（］ヌクレオチド ２７５−２４２２から得られたものであるが、５ａＪｌとＡＶ＆　１部位との間 （ヌクレオチド６５１−１４２５）は欠失しており、ＡｖａＩ部位に５ａＪ−■ リンカーが付加されている。ＢｇＪＩ部位力ごらＸｍｎ　１部位までの配列はシ ラスミドｐＥ３Ｐ６Ａ〔３〕のβ−ラクタマーゼ遺伝子からのものである。 デ５１　Ｘ　ｉ　）”　ｐＥＥ　６　ｇｐｔ　Ｋ　ｋＺ、ブラフ、ミドｐｓＶ２ ｇｐｔ〔５〕のシングルＰＴｕ　［部位にＢａｍＨＩリンカ−！付加してＢａｍ Ｈ（フラグメントとしてプラスミドｐＺＥ６中にクローン化されたプラスミドｐ ｓｖ２ｇｐｔから得たキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ （ｇｐｔ　）をコードする転写ユニットが含まれている。同様にして、ｐＥＥ６ ｇｐｔからキサンチンーグアニンホスホリゼシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ　 ）の転写カセットを含有するプラスミドｐａｎｅｓの誘導体？構築した。このプ ラスミドｌ’　：ｐＣＭＧ８ｇｐｔとした。 プラスミドｐＩＣＥ　６ｈＣＭＶには、オリがヌクレオチドリンカーによってプ ラスミドｐＫＥ　６のＨｌｎｄ　ＩＩＩ部位に挿入すれたｈＯＭｖ−Ｍ工Ｅゾロ ゛モーター−エンハンサ−と完全５′非翻訳配列が倉荷されている。 プラスミドｐＥＴｉ６ｈｃＭｖ　ＢｇＪ　ＩＩ　Ｉ（ｐＥＥ　６　ｈＣＭＶ　ｆ ）誘導体であって、ｈＣＭＶエン−１ンサーの上流のＨｌｎｄ　ＤＩ部位が、プ ラント末端化及び合成オリがヌクレオチドリンカーの付加によりＢｇｊＬＩＩ部 位に変換されている。 シラスミドｐＥ’Ｋ　６　Ｈｅ　ＬＣＢｇ　Ｇ！、Ｂ　７２．３抗体〔６〕のマ ウスーヒトキメラエｇＬ鎖をコードする配列がｈＣＭＶ　−Ｍ工Ｅ７’ロモータ ーーエンハンサーのコントロール下に該り鎖が位置するようにｐＥｘ　６　ｈｃ ｕｖのｍｃｏＨ１部位に挿入されたｐＥＫ＜５ｈＣＭＶから得られるベクターで ある（上流のＨｌｎｄ　Ｉ［Ｉ部位はスタンダード法によってＢｇｊＩｒ部位に 変換されている）。ｐｓＶ２Ｂａｍ（）８１７）２．１　ｋｂ　Ｂａ！ＩＩＩＨ ｉ　７？グ／　ン）　ｋ　ｐＫＩｃ６ＨｃＬＯＢｇに挿入し、シラスミドｐｃＬ ｃ２ｏｓ　Ｙ得た。このプラスミドでは、Ｌ鎖遺伝子の下流のＧＥ３遺伝子とと もにｘｇＬ鎖とａＳ遺伝子とが同じ方向で転写される。 ｐＥＥｉｃＨ）ＩＣＩ、は、ｈｃＭＶ−Ｍ工ＸデＣ１モーｐ　−−ｚ　７ハンサ ーのコントロール化にキメ９　Ｂ　７２．３抗体（６）のＨ鎖及びＬ鎖の両者を コードする配列を含有するベクターである。ｐ８Ｖ２ＢａｍＧｓの２．１　ｋｂ 　ＢａｍＨ１断片１ｐＥＫ５Ｈｃ！ＨＨＣ！Ｌに挿入して、Ｈ鎖、Ｌ鎖及びＧＳ 遺伝子がこの順序で同じ方向で転写されるシラスミドｐＡｂ２ｏｓ　Ｙ得た。 ｐＦ］！：６ＨｃＬｃＢｇ（７）　３．１　ｋｂ　Ｂｇｊ　ＩＩ　−Ｂａｍ　Ｈ Ｉフラグメントンルミｖ）Ｏ８のＢａｍＨ１部位へ挿入し、Ｌ鎖遺伝子の上流の ＧＳ遺伝子とともにキメラＬ鎖遺伝子と３８遺伝子とが同じ方向で転写されるシ ラスミドｐｓＶ２ＧｓＯＬ（！が得られた。 同様にして、ｐＥＩｃ（５ＨＯＬＯＢｇの３．１に１）のＢｇｊｌｌ−Ｂａｍ　 Ｔｉ　■断片ＹｐＣＭＧＳのＢａｍＨＩ部位へ挿入して、両者の遺伝子が再び同 じ方向のシラスミドｐ（！ＭＧＳ　、　０１０を得た。 ｐＥＥ：に６ＣＨＣＢｇ　％Ｚ、ｈＣＭＶ−ＭＩＸプＯ−１−−ｐ　−−ｚ　ｙ ハンザ−コントロール下のキメラＢ７２．３抗体［６）のＨ鎖遺伝子及びＢＶ４ Ｑポリアデニル化シグナルを含有するプラスミドである。このプラスミドから、 ｈｃＭ’Ｖ−ＭＩＥ鎖終止ユニット’！’　４．７　ｋｂ　部分１（１ｎ（ｌ　 ［［−ＢａｍＨＩフラグメントとして切出し、Ｈｌｎｄ　■−ＢａｍＨｌオリが ヌクレオチドアダプターによりｐＢ７２０Ｂ（４，０のシング＃　Ｂａｎ　ＨＩ 部位に挿入しでｐ８７２ＧｓＣＩ、ｃｃＨｃ　ｆ得た。ｐｓＶ２Ｇ８ｃＬｃｃＨ ｃのｈＣＭ’Ｖ−ＭＩＥ−ＣｊＨ鎖転写二二ットの上流のＢａｍ　Ｈ１部位ｆ　 Ｂａｍ　Ｈｌの部分消化により除去し、ＤＮＡポリメラーゼＪで充填し再連結し てｐｓＴ６を得た。 分子ｔ９　Ｑ　ｋＤの新りい？ａ維素溶解酵素ｔコードする遺伝子’ｒ：　２． ５　ｋｂ　Ｈｌｎｄ　■−ＢｇＪ−ｎ　、ラグメントとして単離した。次いでこ れを発現シラスミドｐ”６ｈＣＭＶＢｇ２■のヨｉｎｄ［［とＢｃＪ　１部位と の間に適当な方向で挿入し、ｈｃＭｖ　７’　ｏモーターがこの遺伝子の転写を 誘導するようにした。８Ｖ４Ｑ初期−ａＳ転写ユニット’ｇｐ８’Ｖ２Ｇｓから ＢａｍＨＩフラグメントとして切出し、ｐＥＥ６ｈｃＭＶＢｇＪＩＩのｈＯＭＶ 配列の５′末端のＢｇｊ　ｎ部位に適当な方向で挿入し、ｈｃＭＶプロモーター と５Ｖ４Ｑ初期ゾａモーターとからの転写が同じ方向となるようにした。これに よりデラスミとｐＫｌ　６９０　ｘｏｓが得られた。 セルライン 例では以下のセルフインを用いた。 Ｎ８０とＰ５−Ｘ６３Ａｇ８．６５３　：　マｏｘＰ３−ｖつｘプラズマサイト ーマラインの非産生変異体；５ｐ２１０　：非産生マウスハイプリドーマセルラ イン；ＹＢ２１０　：非産生ラット／１イデリドーマセルライン。 培地 ２　ｍＭグルタきン、１００μＭ非必須アミノ酸、１０％？ｔｆ３児ウシ血清及 びストレプトマイシン／ベニシリ／を含有する非選択培地ダルベツコ最少必須培 地（ＤＭＥＭ　）　；グルタメート及ゴアスパライン’ｒそれぞれ５００μｍ１ アデノシン、グアノシン、シチジン及びウリジンをそれぞれ３０μｖ、１０μＭ チミジン、１００μＭ非必須アミノ駿、１０％透析胎児ウシ血清及びストレプト マイシン／ペニシリン？含有スルグルタミンフリ−ＤＭＥＭ（Ｇ−ＤＭＥＭ）　 ；あるいはこれら各種の添加物を欠いたＧ　−ＤＭＥＭ誘導培地で全ての細胞を 生育させた。 あるいに、以下の濾過滅菌ストック溶液を用いて作成されるｇｐｔ選択培地で細 胞を培養した。 （１）　ヒボキサンチン及びチミジンをそれぞれ５０ｘ；（２＋５０Ｘキサンチ ン（０，Ｚ　Ｍ　ｎａｏａ中１２．５ｍｐ／−）； （３）　マイコフェノール酸（ＭＰＡ　、　０．Ｉ　Ｍ　ＮａＯＨ中２５０μｇ 　／　ｍｉ　）　ｐ （４１１Ｍ　ＨＪ　０ ｇｐｔ選択培地は、上記した非選択培地９３−１溶液（１）２−１溶液；３）２ −及び溶液！４）　０．６　ｔｄ　’ｒ混合して作成した。２　Ｘ　ｇｐｔは、 非選択培地８６−と、上記した量の２倍の溶液ｉｌ＋　−（４）とを混合して作 成した。 プラスミドｖｉ胞に導入するために、全てのシラスミドを、プラスミド中のシン グル部位で切断する制限酵素従って哺乳動物細胞中での遺伝子の転写に妨害を与 えない適当な制限酵素を用いて消化して線状化した。 典型的には、４０μｇの環状のプラスミド１に４００μＪの制限酵素バッファー で消化した。シラスミドの線状化に用いた酵素は表１に示した。 ｐ　ＢＶＬＧＢ　、Ｉ　Ｐｖｕ工 ｐ８Ｖ２．ＧＳ　Ｐｖｕｌ ｐ８Ｖ２．Ｂａｍ　ＧＳ　Ｐｖｕｘ ｐｃ！ＭＧ８　ＰｖｕＩ ｐｃＭＧＢ、ｇｐｔ　Ｐｖｕｌ ｐＥＦｌｉ６．ｇｐｔ　８ａｌ工 ｐ（Ｌａ２Ｏ２５ａｕ ｐＡｂ２ｅｓ　Ｓａｄ工 ｐｓＶ２．Ｇ８（Ｌｃ　Ｔｔｈｌｌ工 ｐｃＭＧｓ、ｃＬｃ　Ｔｔｈエエエ ｐ　８７６　ＢａｍＨ工 ｐＩ！］Ｅｉ６９０ＫＧＳ　Ｂａ１ｌ 細胞のエレクトロポレーション 指数関数的に増殖する時期の細胞を採取し、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）中で ペンチ遠心機で１２０Ｏｒｐｍで遠心して１回洗浄し、新鮮な氷冷ＰＢＳ中た１ ０フセル／−の密度で懸濁した。細胞懸濁液１−を消化したプラスミドＤＮＡ　 （制限酵素バッファー溶液Ｑ、４　ｄ　）に加え、氷上で５−１０分間インキュ ベートした。次いで、１４μＦのキャパシタンスを有する通常のエレクトロボレ ー”ジョン装置を用いて約ｉｃｍ離れたアルミニウム電極の間の２０００ボルト の２パルスに細胞−ＤＮＡ混合物を付した。次いで細胞を氷に５−１０分間もど し、非選択培地（ＤＭＥＭ）に懸濁し、２４ウエルカルチヤートレー中に分注し た。次いで、以下に記述するように選択培地（Ｇ−ＤＭＩＩ：Ｍ）　’＆添加し た。 例１ Ｃ！ＨＯ−Ｋｌ細胞中で選択マーカーとして有効に使用できるシラスミドｐｓＶ ＬＧｓ１　（ＩＰ−Ａ−０２５６０５５号明細書参照）は、予備実験で（工、Ｎ ｅｏ細胞中に導入すれて有効な割合いでグルタミン弁体性を有するコロニーを与 えないことが示された。１０７細胞についテ約６ｆｌ！ｌのトランスフェクトコ ロニーという極めて低頻度でしか目的とする：２ｃに一は得られなかった。これ は、　ｐＫ’に６ｇｐｔのキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラ ーゼ（ｇｐｔ　）選択マーカーを用い、キサンチン、ヒポキサンチン及びチミジ ンを含有する培地でマイコフェノール酸に対する耐性によって選択される１／１ ０４　）　：７ンスフ工クト細胞以上のトランスフェクト頻度に匹適する。 Ｇ５０ＤＮＡがｈＣ！ＭＹ−Ｍ工ＥｆｃＩモーターから発現されるｐＯＭＧＢｋ 用いた予備実験ではずっと高い頻度でグルタミン非依存性コロニーを得、ＳＶ４ ０初期領域ゾロモーター？利用したｐｓ’Ｖ２ＧＳでは中程度の頻度でトランス フェクト体を得た。 選択に用いるための適当なプロトコールを確立するために、線状化ｐｃＭＧｓ　 ２０　＃ｇ　ト線状化ｐＫＥ６ｇｐｔ　２０μｇとを混合し、とも１ｃ１０７個 のＩＳＯ細胞に導入した。１０７個の細胞の別のマリコー）ＹＤＮＡを添加せず にエレクトロポレーションにょっ゛偽りの（Ｍｏｃｋ）″トランスフェクトを竹 なった。 細胞を、上記した０、５−非選代培地（ＤＭＥＭ）中の２４ウエルプレートにプ レートし、２４時間後に、”ｙｏｃｋ”トランス７エクトプレートとＤＮＡ）ラ ンスフエクトプレートのウェルについて以下のようにして選択を行なった。 Ａ　：　Ｇ−ＤＭＥＭ　１　ｄＹ添加し、プレートを調べる前に７日間放置した ； Ｂ：　１日目にＧ−ＤＭＫＭ　１　ｄ’＆添７７１１１　［、、，２日目に吸引 し新鮮なＧ　−ＤＭＥＭで置換した；Ｃ：　１日目に２００μＭグルタミンを含 むＧ　−ＤＭＥＭｌ−を加え、更に２日間放置し次いで吸引してＧ　−ＤＭＥＭ で置換した； Ｄ：　１日目に放置し、２日目にＧ−ＤＭＥＭ　１　ｔｎｌ”ａ−加えた。３日 目に吸引し新鮮なＧ　−ＤＭＥＭで置換しに；Ｆ、：１日目に放置し、２日目に 吸引しＧ　−ＤＭＥＭｌ−で置換した。ウェルを４日目に再び吸引し、新鮮なＧ 　−ＤＭＥＭで置換した； Ｆ：　マイコフェノール酸選択：　ｇｐｔ選択培地ｏ、５ｆｎｌを加え、２日目 に２　Ｘ　ｇｐｔ選択培地０．５．ｄ’＆加えた。 それぞれの選択プロトコールについて少なくとも３つのウェル中のそれぞれの生 存コロニー数をトランスフェクション７−１０日後に記録し、得られる平均瀘を 表２に示した。 これらの結果から、７０ａトコールＡ（）ランスフエクション１日後にＧ−ＤＭ ＥＭ１ｍｊＹ添加）により、トランスフェクトコロニーの最も高い生存数が得ら れ、ＧＳ遺伝子を導入した場合の選択について得られた頻度は、ｇｐｔ遺伝子の 選択について測定されたトランスフェクション効果（プロトコールＦ）と同じで あることが判る。少量のグルタミンを添加し２日以上後に吸引しＧ　−ＤＭ”Ｋ Ｍのみで置換した場合には（プロトコールＯ）、２番目に高い頻度でグルタミン 非依存性コロニーが得られる。しかしながら、吸引により培地を除去した場合に は従ってグルタミンを完全に除去した場合（デａトコールＢ、Ｄ及Ｅ）ｉｃは、 生存コロニー数は著しく減少した。従って、培地中のグルタミンを除徐に除くこ とによって、選択が促進されることが判る。 従って、以下の全ての実験ではプロトコールＡＶ用いた。 ｂｃＭＶ−Ｍ工Ｅ７°ロモーターなどの強いプロモーターにより高レベルのＧＳ 発現が達成され、従って選択的遺伝子増幅のために高レベルのＭＩＫが必要とな る。 Ｇ　Ｓ　ＱＤＮＡ　ｌ’発現させてグルタミン非依存性形質転換体を得るのにｈ ｃＭｖ−Ｍ工ＩＣ７ｇ′ロモーターーエンハンサーよりも弱いｆｏモモ−−を用 いることができるがどうかｔ調べるため、０８発現用に５ｖ４０初期領域プロモ ーターを用いた線状化ｐｓＶ２ＢａｍＧｓ　４０　ｐｇをＮｅｏ細胞に導入し、 プロトコールＡを用いて選択し平均コロニー数／ ２０μｇＩ）ＣＭＧＢ　Ｉ　ＤＯ ２０μｇ　ｐｌ！Ｆｉ６ｇｐｔ　Ｐ　４　［］Ｏ４Ｑ　ｐｇｐｓＶ２ＢａｍＧｓ 　Ａ　２０″Ｍｏｃｋ”　ＡＯ これらの結果から、ｐｓ’Ｖ’２ＢａｍＧ８でのＧＳ−転写ユニットはＮｅｏ細 胞での選択マーカーとして使用できるが、ｐｃＭＧｓよりも低頻度でしかグルタ ミン非依存性コロニーが得られないことが判る。 異種ＤＮＡをＩＳＯ細胞へ導入するための選択マーカーとしてｐｓＶ２Ｂａｍ　 Ｇ　Ｓ中のＯ８遺伝子が使用できるかどうかをテストするために、ｈｃＭｖ　Ｍ ＩＥ　７ｐａモーター−エンハンサ−のコントロール下にある異なる非選択性連 結遺伝子を含存する３つの異なるシラスミドを構築した。これらは、キメラＢ　 ７２．３イムノグロデリンＬ鎖遺伝子を含有するｐｃＬｅ２０ｓ　；メタクプロ テイナーぜの組織抑制因子の遺伝子（ＴＩＭア）を含有する一ｏＴ工Ｍｙｐａｓ 　；及びキメラＢ　７２．３モノクローナル抗体のＨ鎖及びＬ鎖遺伝子の両方を 含有するｐＡｂ２ｏｓである。ｐｃｂｃ２ｅｓ　４０　ｐｇ　、　ｐＴ工ＭＰ０ ８４０μｇ　、　ｐＡｂ２Ｇ８８０μｇをそれぞれ１０１個トランスフェクト細 胞当り用いて、線状化シラスミドとしてＮＳｏ細胞に導入した。トランスフェク ション頻ＩｆはｐＡｂ　２０８で＆＄４／１Ｑフセルであり、他の２つのシラス ミドについてはいずれもコロニーは得られなかった。ｐＡｂ　２　Ｇ　Ｂでトラ ンスフェクトされたうちの４個のコロニーを大量培養により生育せしめ、その培 養上清を用いて、抗Ｈ鎖抗体及び抗り鎖抗体によるウェスタンプロット分析を行 なった。 この結果を第１図に示した。４つの全てのコロニーはＨ鎖及びＬ鎖の両者？分泌 したが非常に低レベルでしットは、異種遺伝子なＮｓｏ細胞に導入するための選 択マーカーとして使用できるが、これら特定のプラスミド構築体中のこのような 遺伝子の存在によって、トランスフェクトコロニーが単離される頻度はかなり減 少すると思われる。これはプラスミド中の各種転写ユニット間のインター７エア レ／スによるものと考えられる。従って、ＧＳ転写ユニットの上流の遺伝子が何 んらかの理由で例外的にわずかにしか発現されないほんのわずかのコロニーシか 生存するに十分なＧＳｉ産生ずることができなかった。 ベクター中の遺伝子の位置によってグルタミン非依存性への形質転換頻度が著し く減少するのが否かをテストするために、上記の実験とは相違してＧＳ遺伝子転 写ユニットがｃＬ鎖遺伝子の上流にあるプラスミドを構築した。２つのプラスミ ドとして、Ｇｓ遺伝子が’ｈｃＭＶ−Ｍ工Ｅプロモーターのコントロール下にあ るｐｃＭＧｓｃＬｃとｐＳＶ２ＧｓｃＬｃとを選択した。これらのプラスミドを ＩＳＯ細胞に導入し、ゾロトコールＡを用いてトランスフェクト体を選択した。 得られるコロニー数は表４に示した通りである。 表４ ｐｃＭＧｓ　２５０ ｐｃＭＧｓ、ｅＬＣ３００ ｐｓＶ２．Ｇｓ　１８ ｐＳＶ２Ｇｓ、ｃＬｃ　９ ｐｃＬｃ２ａｓ　Ｏ これらの結果により、ＧＳ遺伝子がＱＬＣ遺伝子の下流にあるｐｃＬｃ　２　Ｇ 　Ｓによってはグルタミン非依存性コロニー１工得られなかったが、これとは逆 にａＳ遺伝子が上流にあるプラスミドｐｓＶ２Ｇｓ（ｅＬＣによって、Ｇｓ遺伝 子のみｔ用いて（ｐｓｖ２ｏｓ）得ら・れる形質転換頻度に匹敵する形質転換頻 度が得られることが判った。 これにより、ＧＳ発現に用いた５ｖ４０初期プロモーターによるインター７エア レ／ス；工その下流に強いｈｃＭＢ−Ｍ工ＥｆＩ：Ｉモーターを置くことによっ て減少することが示唆される。表４の結果から、ｐＯＭＧｓに比べてｐｃＭＧｓ ｃＬｏによって得られる形質転換効果は有意な相違？有していないことが判り、 このことはＧＳ発現によってインター７エアレンスを受ケナいＣトｂプラスミド ｐｃＭＧｓｃＬＱ及びｐｓ７２Ｇｓ　ＣＬＩ：！　％：用いて得られるトランス フェクト体について、消費培養培地中のヒトカッパ鎖抗原活性用のｚＬｘｓ′Ａ アッセイによりＯＬ鎖分泌をアッセイした。ｐｃＭＧＦ３ｃＬＱ　）ランスフエ クト体の全ての培養ウェル１：それぞれ多くのトランスフェクトコロニーを含有 しており、有意量の抗Ｋを実際に分泌した。ｐｓＶ２（）８ＣＬＱ　）ランスフ ェクト体の１０個のウェルのうち７個のウェルが多くのコロニーを含有し、検出 可能なレベルでＬ＠’に分泌・した。 これは、ｈＯＭ’Ｖ−Ｍ工Ｅｆａモーターによってコントロールされている篤２ の遺伝子の下流にＧＢ遺伝子があるプラスミドの結果とは対照的であり、このこ とは、シラスきドが適当にデディンされる限りＧ８遺伝子はこのタイプの細胞の 有効な選択マーカーとして使用可能であることｔ示している。 ｐ８ｖ２Ｇｓは異種遺伝子を挿入するのに特に好適なベクターであり、ｐｓ７２ ＧｓｃＬｃ　Ｙ第２図に示した。 ＧＳ）ランスフエクト体の生育にとってＧ−ＤＭＥＭ培地中にいずれの添加物が 存在していることが必須であるかをテストするために、プラスミドｐｃＭＧＩ９ ｃＬｃＹ含ｇするトランスフェクト細胞をプールし、１０％透析胎児ウシ血清及 び以下のＧ　−ＤＭＥＭ中の添加物を可能な組合わせで含有するＤＭＥＭ　Ｙ含 む２４ウ工ル組織培養トレーに分注した。 （ａ）　非必須アミノ酸； （→　グルタメート： （Ｃ）　アスパライン； ｃｄ）　アデノシン、グアノシ／、シチジン、ウリジン及びチミジン。 ４日後の生育を記録し、結果を表５に示した。 これらの結果から、５００μＭアスパラヤンが、Ｇ−ＤＭＥＭ中の池の添加物の 非存在下でＧＳ）ランス７工クト体の生育維持に十分であることが判る。驚くべ きことに、ＧＳの基質であるグルタメートによっては、その濃度が２　ｍＭに上 昇してもこれらの細胞の生育を維持できない。これらのトランスフェクト体の生 育乞サポートするために、ＳＯＯμＭアスパラギンの代わりに非必須アミノ酸を 用いることができる。しかしながらこの添加物は１００μＭアスパラヤンを含有 しているため、アスパラギンのこの濃度で十分に生育をサポートするのが可能で ある。 １８０セルラインは、グルタミンフリー培地中で生育できるためには不十分な活 性ａＳ酵素な含有していなげればならず、　ｐｃＭＧｓなどのプラスミドはこれ らの細胞中で発現される時にはグルタミン非依存性コロニーＶ生育させるのに十 分なＧｓ’ｉ産生ずることが明らかである。５Ｖ４Ｑ初期プロモーターなどの弱 いプロモーターのコントロール下でＧＳ遺伝子を発現するクローンは、平均して わずかのＧＳ酵素しか発現できず、わずかの割合いのトランスフェクト体しかグ ルタミンフリー培地中で生存できない。 ＧＳ−ベクターを用いて他のリンパ系Ｉａ胞をグルタミン非依存性で生育できる ようにすることができるかどうか馨テストするために、グルタミンフリー培地中 で更に他の３つのセルラインの生育を調べた。 Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ　８．６５３　（Ｗウスミ！　Ｏ−？　）はＧ−ＤＭＥＭ培地 中培土中く生育できないことが見出された。１０７個細胞Ｙ２４ウェルプレート にプレートしプロトコールＡにより選択した時に、グルタミン非依存性変異体は 単離されなかった。これに対し、非分泌性マウスハイプリドーマ５ｐ２１０によ り、約１／１０５プレートセルの頻度でＧ　−ＤＭＥＭ培地中培土中できる変異 体が得られた。このセルラインでのトランスフェクションｉＭ　度（ｐＥＥ６ｇ ｐｔ　’ｒ：用いて）は約１／ＩＱ５プレートセルであるので、このセルライン ）；このプロトコールを用いた選択用の宿主としてに不適当である。 ラット非分泌性ハイブリドーマＹＢ２１０４１／１０２の高い頻度でグルタミン 非依存性変異体を与えたため、このセルラインも上記の開発されたＧＳ−選択プ ロト。−ヤタ使用するのに不適当である。ＹＢ２／［１（７）グルタミン非依存 性変異体をクローン化し、ＹＯＧ−ＦｌＯと命名したクローナルセルラインを太 ｉ培養により生育せしめ、液体窒素中で凍結ストックとして保存した。 ＳＰＧ＞−Ｅ４と命名された同様のセルライン、即ち９Ｐ２１０のグルタミン非 依存性変異体も液体窒素中で保存した。このようなセルラインは、ＥＰ−Ａ−０ ２５６０５５明細書に記載された方法によってＧＳ遺伝子を含有するベクターの 導入に好適なものである。 プラスミドベクターｋ　Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ　８．６５３に導入するためにグルタ ミン非依存性形質転換体選択を用いることができるかどうかｔテストするために 、４０μｇの線状化ｐｃＭＧｓｇｐｔ　（ｐｃＭＧｓのＧＥ３−転写ユニットと ｐＥＢ６ｇｐｔのｇｐｔ遺伝子を含有するベクター）をエレクトロボレー’７８ ７により１０７個（１）　Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ　８．６５３細胞に導入した。結果 を表６に示した。 表６ フ０ＭＧ５４ｐｔ　Ａ　１２０ ｙ　２４ ＭｏＣｋ″　Ａ　Ｑ かくして、ｈｃｙｖ−ｏｓ転写ユニットとＮｓｏ細胞の選択プロトコールＡを用 いて、ｇｐｔ選択！用いて得られるのと同じ大きさくより高い可能性あり）の頻 度で少なくともグルタミン非依存性Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ　８．６５３Ｙ得ることが できる。２つの転写ユニット間でのインターフエ丁しンス（＃プロモーター閉塞 ”）はｇｐｔ　ＲＲコロニーが低頻度で生ずる種度であることは注目すべきであ る。 ＧＳ−発現プラスミドによるトランスフェクションにより、ミｘ　ｏ　−’ｗセ ルラインＮＢＯとＰ　３−　Ｘ　６３　Ａｇ８．６５３が形質転換されてグルタ ミン非依存性となっテ生育できた。これに対して、ハイプリドーマセル２インＹ Ｂ２１０及びｓｐ２／Ｄにより、ＧＳ−プラスミドがこれらの細胞中で選択マー カーとしてこの方法で使用できる種度に高頻度でグルタミン非依存性変異体が産 生された。また、ｐＢＶ２Ｇ’ＢなどのＧＳ−発現プラスミドを用いて、Ｂ７２ ．３キメラ抗体をコードする遺伝子などの非選択性遺伝子’ａ’Ｎ８０ａ胞ｊ（ 導入できることも証明された。プラスミド中での遺伝子のアレンジにより、これ ら遺伝子によって違区される発現レベルが著しい影響を受ける。従って、最適発 現ベクターをデザインするに際してはこのことｔ考慮するのが重要である。ｂｃ ｕｖ−Ｍｘｗ　ｆ　ｏモーターなどの強いプロモーターからの転写は、両者の遺 伝子が例えば転写終止期プロモーターなどの弱いプロモーターから発現される遺 伝子にまで進行しない。 例２ ｐｃＭＧｓ及びｐｓＶ２ＢａｍＧＩ９７．Ｃどのプラスミドにおけるｏｓ−Ｅ写 ユニットがミエローマセルフイン中で増幅可能な選択マーカーとして作用できる こと七Ｎ認するタメニ、エレクトロポレーションによってＮＳＯ細胞へ導入され たベクターＤＮＡのコピー数ｔ、メチオニンスルホキシイミン（ＭＳ！　）を用 いたＧＳ−遺伝子増幅の選択前及び後で分析した。 Ｎ５ｏＩＷｌ胞％：　ｐ　Ｓ　Ｖ　２　ＢＡｍＧ　Ｓ又はｐＧＭＧ８で上記した ようにしてトランスフェクトし、トランスフェクトコロニーｔプールしくそれぞ れのトラ“／スフエクションから少なくとも２０コロ邑−）、培養液中に広げ、 セ＃　２　イｙ　５Ｖ２ＧＳＮＳＯトＣ！ＭＯ８ＮＳＯトＹ形放シタ。ｍれら２ つの細胞プールＹ、　Ｇ−ＤＭＥＭ培地中約１０５セル／ウェルの細胞密度で２ ４−ウェル細胞培養トレー中に分注した。ＭＳＸを、終濃度２０−８０μＭでウ ェルに添加した。数日間インキュベーション後、全てのウェルについて細胞の死 亡を観察し、２−３週間後に、８ｖ２ＧＳＮＳＯセルラインでは６０μＭまでの 濃度のＭＳＸで、ＣＭＧＳＮＳＩＯセルラインでは８０μＭまでの濃度のＭＳＸ で、ＭＳ！耐性コロニーが観察された。これらの濃度のＭＳＸで単離された細胞 を２４−ウェルトレー中に約１０５セル／ウエルの濃度で再びプレートし、１１ ００ｐまでの密度で選択を再び行なった。両者の場合において、１００μＭでか なりの細胞が生存していた。１００μＭＭＳＸ耐住細胞プールを培養液に広げ、 最初のトランスフェクト体及び１００μＭＭＳＸに耐性の細胞プールから全ゲノ ムＤＭＡを調製した。 ＤＮＡサンプルをＢｇＪ　Ｉ及びＢｇＪ　ＩＩ制限酵素で消化し、ＤＮＡサンプ ルのサデンブａット’ｋ　ｐ（）Ｓｃ４５　［７］の０．５　ｋｋ＋　５’　Ｐ Ｂｔ　Ｉ　Ｇ　Ｓ　−ｅＤＮＡフラグメントでゾロープした。サデンプロット分 析を第３図に示した。ＤＮＡゾローデは、ｌ５ＯＩＩＢ胞の内因性マウスａＳ− 遺伝子と交差ハイブリダイズし、これは、非トランスフエク）ＩＳＯコントロー ルＤＮＡと同様に全てのトランスフェクトセルライン中の約６にｂの１つのフラ グメント及び約２．８　ｋｂのフラグメントと考えられる。これらのバンドは、 ゲル上のそれぞれのトラック中の同量のＤＮＡ１負荷するための内部コントロー ルとなる。 ｐｓＶ２ＢａｍＧｓでトランスフェクトされた細胞では、ベクターＤＮＡについ て予想されるサイズの１．２に′ｂＢｇＪ　ＩＩ断片（！ＥＩＶ４　ＱプＯモー 　ター　ｆ）　Ｂｇ’　Ｉ　ｎ　位カラＧ５ＣＤＮＡの３′末端のＢｇＪ　１１ 部位まで）も検出された。 隣接するトラック中に負荷された既知の量のベクターＤＮＡと比較することによ り、５Ｖ２ＧＳＮＳＯプール中の平均ベクターコピー数は約１コピー／セルであ ると評価された。１００μＭＭＳＸで選択後、コピー数は平均約５コピー／セル まで上昇した。 同様に、ＮＳＯ細胞にｐＧＭＧｓを導入することにより、約１Ｂ４’−／セルの 平均レベルでＣＭＧＳＮＳＯＤＮＡのサデンプロット分析において２．１ｋｂベ クターフラグメントが観察された。１００μＭＭＳＸで選択することにより約１ ０コピー／セルまでコぎ一数が上昇した。 この実験により、ＮＳＯ細胞へ導入されたｐｃＭＧｓとｐＳＶ２Ｂａｍ　Ｇ　Ｓ はＭＳＸによる選択により増幅されることが判る。内因性マウスＧＳ遺伝子の増 幅１；観察されなかった。 例３ 例１に記載したＭＳＸ選択法の組換え生成物についての過゛剰生産の効果乞テス トするために、ＧＳ選択ビ用いたＩＳＯ細胞へ導入されたＢ７２．３ＯＬ鎖の発 現’ｇ、ＭＳＸによる選択前及び後で測定した。ｐ８Ｖ２ＧｓｃＬｃではトラン スフェクション頻度は約２Ｘ１０−５コロニー／トランスフエクト細胞であり、 ｐｃＭＧｓｃＬｃでは約１０−３であった。 ｐｓＶ２ＧｓｃＬｃでトランスフェクトされた２つＮＳ。 誘導セルライン及びｐｌ：ｉＭＧＥｌｃＬｃでトランスフェクトされた２つのセ ルラインは全て高レベルでｃＬａを分泌し、これらを限界希釈法により最初に再 クローン化した。最も高い４つの産生非依存性コロニーからのＯＬ鎖の発現を、 光学密度Ｃ０Ｄ２８０　）測定法により定量したＢ　７２．３　ＣＬ鎖の精裂傾 準調製物と比較してＥＬＩＳＡ法により測定した。これらの結果を、例１に記載 したようにして得られるこれらのクローン化セルラインから得られるＭＳＸ耐性 プールの産生割合いとともに表７に示した。耐性コロニーゾール（工、３つのセ ルラインについては４０μＭＭＳ！で、セルラインｃ２−２７については１００ μＭＭＳ！で単離した。。 表７ ＧＳ−遺伝子増幅による選択前及び後でのトランス５ｖＧｓｃＬｃ−Ｂ４．２４ 　４．６　１３　２０−Ｃ！２．２７　Ｃｌ３　３ ０ＭＧ３．ＣＬＣ−９／６　１．５　０．２Ｍ５ＸＩＣ対する耐油に基づき選択 した結果、４つのセルラインのうち３つについて生産性が有意に上昇したことが 判る。 最も高い分泌割合いを有する細胞プールＢ　４．２４（４０μＭ）を限界希釈法 によりクローン化し、２０μｇ／セル／日の割合いでＣＬ鎖を分泌するクローナ ルセルラインを単離した。これはもとのトランスフェクト細胞の発現レベルに対 して４倍高い発現レベルを示し、これによって、ＧＳ遺伝子の増幅に基づく選択 により、目的とする組換え生成物の改良された生産法が可能となることが判る。 例４ ミエローマセルラインから完全なイムノグロブリン分子を発現させるために、Ｂ 　７２．３抗体のＯＨ及びＣＬ鎖の遺伝子を含有するＧＳ−ベクターでＮＳｏ細 胞をトランスフェクトした。 プラスミドｐｓＴ−６はＣＨ及びＣＬ鎖コード配列をそれぞれｈＣＭＶプロモー ターのコントロール下に含有し、更にｐｓＶ２ＢａｍＧ　Ｂ（１）　Ｓ　Ｖ　４ ０ポリＡ−／グナル及び５ｖ４０初期ＧＳ−転写ユニツ）Ｙ含有する。このプラ スミドｆ　Ｓａｆ　Ｉで線状化し、上記したようにしてエレクトロポレーション によりＮＳｏ細胞に導入した。トランスフェクション頻度（・；約２　Ｘ　１０ −５コロニー／トランスフエクト細胞であった。トランスフェクトラインについ て、抗体コートプラスチックプレートラ用いた結合アッセイにより機能的抗体の 分泌なスクリーニングした。 次いで分泌された抗体を乞、意図するイムノグロブリンのみを検出するようにデ ディンされたＥＬ工ＳＡにより定量した。３つの最も高い発現を有するクローン 化セルライン及びこれらから得られた耐性プールの抗体分泌割合いを表８に示し た。 表８ 分泌割合い（ｐｇ／セル／日） ６ＡＩ　、１．５　３．２　１００ ６−１１Ｄ３　１．２　０．６　８０ ６−１１Ｄ５　０．４　・　０　８０ ”ＭＢＸ＠度は、増幅プールが耐性ビ示す濃度である。 カくシて、分析した３つのセルラインの１つにおいて、抗体の発現がＧＳ遺伝子 増幅による選択により有意に上昇した。プラスミドｐｓＴ−６を用いて得られる 表８の結果は、例１のｐＡｂ２ＧＳ’ｉ用いて得られる結果と著しく相違してい る。例１では、トランス７エクトコロニーが単離される頻度はｆｃ１モーターイ ンター７エアレンスにより著しく減少する。ｐＡｂ　２　Ｇ　８によるトランス フェクションでＦＸ、ＧＳ遺伝子の上流のイムノグロブリン遺伝子が例外的にわ ずかに発現されるわずかのコミニーによってのみ、十分な生存のためのＧＳが得 られる。従って、単離された形質転換体は、わずかの抗体しか産生しない。１） ＳＴ−６を用いて、より高い抗体を分泌するセルラインを単離することが可能で ある。ベクター中の遺伝子のアレンジ乞更に変更することによって、転写インタ ー７エアレンスを更に減少させて抗体の発現を更に有利にすることが当業者には 明らかであろう。 例５ 例１と同様にして、エレクトロポレーションによりした。９６ウエルプレートに プレート後、グルタミンフリー培地（Ｇ−ＤＭＥＭ）で生育させてトランスフェ クト体を選択した。トランスフェクション効果は、１０５トランスブエクト細胞 について約１個であった。 ジングルコミニ−を含有する細胞培養トレーのウェルについて、フィプリンアが −アツセイ〔８〕により９０　ＫＤのＭ＆維素溶解薄紫の分泌を分析した。アッ セイした３３個のウェルのうち、２６個のウェルが繊維素溶解活性が明らかにポ ジティブであった。ポジティブトランスフェクト体Ｙ培養液に広げ、生産物分泌 割合いの分析に付した。 この方法によって単離されたセルラインは、組織プラスミノ−ｒン活性化因子（ ｔＰＡ）と比較してブイプリンプレートアッセイにより評価した所、０．０２− ３．７５℃ｇ／セルフ日で分泌していた。最も高い分泌割合いｔ示す６個のセル ラインを表９に示した。繊維素溶解活性は、Ｄｏ＋ｌの方法

〔９〕により実施し た所、デイモグラフィーにより期待されｒｓ　９０　ＫＤの分子量を示した。 最も高い分泌割合いｔ示す５つのセルラインについて、例１と同様にして、２０ −８０μＭの範囲のＭＳＸｔ用いてＧ８遺伝子増幅により選択な実施した。ＭＢ Ｋ耐性細胞ゾールの比産生速度をブイプリンプレートアッセイにより測定し結果 を表１０に示した。 ５　０．７５ ２２　１．７ 表１０ １　４０μＭＳ、８４．５ ５　６０　μＭ１．２ ９　８０μＭ　４　１０−５ １２　８０μＭ　５．６５ ２２　４０μＭ　４．７５　６ ２３　６０　μＭ７．５ 例２に示されているように第１回目の増幅ゾールを用いて更にＭＩＸの濃度を上 昇させて、ｌ！２回目のベクター増幅の選択を実施した。再び比産生割合いを測 定し、表１１に示した。この第２回目の選択により、テストしたそれぞれのセル フインゾールの生産性は上昇していた。しかし、これらのラインのクローンを分 析した所、最も高い分泌割合いは、Ｇ８増幅の第１回目あるいは第２回目の選択 後に単離されてもいずれも約ＩＱｐｇ／セル／日を示した。これにより、このセ ルラインについては分泌レベルは飽和に達したことが判る。 これらの結果から、ＭＳＸ耐性変異体の分泌により発現レベルが上昇することが 判る。８０μＭＭＳＸに耐性として選択された２イン９のクローンは、Ｇ５ｆｆ １伝子増唱による選択後に１．４　ｐｇ　／セル／日−１０，，５ｐｇ／セル／ 日の分泌割合いを有しており、７．５倍上昇した。 １４０　１００ｐＭ　７．７５ ９”　３００μＭ６．５ １２”　ＡＤＤμＭ　７．２　１０ ２２４°　３００μＭ　、６．４　８ ２３”　２ＤＯｐＭ　８．０ 本発明は単に説明のために以上に説明されたものであって、本発明の範囲内で詳 細な修正が可能であることは当業者には明らかであろう。 引用文献 １、Ｂｏｓｈａｒｔ、　Ｍ、　、　Ｗｅｂθｒ、　？、　、　Ｇｅｒｈａｒｄ、 　：ｆ、　、　Ｄｏｒｓｃｈ−Ｈａｓｌｅｒ。 Ｋ、　、　Ｆｌｅｃｋｅｎｓｔｅｉｎ、　Ｉｔ、　ａｎａ　５Ｃｈａｆｆｎｅｒ 、　Ｗ、、　ｃｅｌｌ、　４Ｌ５２１−５３０．１９８５ ２、　Ｅｍｔａｇｅ、　Ｊ、　Ｓ、　、　Ａｎｇａｌ、　Ｓ、　、　Ｄｏｅｓ、 　Ｍ、　Ｔ、　、　Ｈａｒｒｉｓ、　Ｔ、　Ｊ、　Ｒ。 Ｊｅｎｋｉｎｓ、Ｂ、、Ｌｉｄユａｙ、ａ、ａｎｄ　Ｌｏｗθ、Ｐ、ん、ｐＮＡ ｓ−ｔｒｓＡ、Ｅ江し３６７１−３６７５．１９８３．。 ３、　Ｍｕｌｌｉｇａｎ、　Ｒ，Ｃ，ａｎｄ　Ｂｅｒｇ、　Ｐ、　、　ＰＮＡＳ −ＵＳＡ、　７８．２０７２−２０７６、１９８１゜ ４、Ｈａｌｔｏｎ、Ｄ、Ａ、、Ｋｒｉｅｇ、Ｐ、Ａ、、Ｒｅｂａｇユ１ａｔｉ、 Ｍ、Ｒ，＋Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、　、　Ｚｉｎｎ、　Ｌ　ａｎｄ　Ｇｒｅｅ ｎ、　Ｍ、　Ｒ，、Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　。 ５、　５ｏ１）ｅｒｏｎ、Ｘ、、Ｃｏｖａｒｒｕｂｉａｓ、　Ｌ、ａｎｄ　Ｂｏ ユ１ｖａｒ、Ｆ、、Ｇｅｎｅ。 ９、２８７−３０５．１９８０゜ ６、　Ｗｈｉｔｔｌｅ、　Ｎ、　、　Ａｄａｉｒ、　、ｒ、　、　Ｌ１０７ｄ、 　Ｃ，、Ｊｅｎｋｉｎｓ、　’ｆ、１Ｄｅｖｉｎｅ、　Ｊ、　、　５ｃｈｌｏｚ 、　Ｊ、　、　Ｒａｕｂｉｔｓｃｈｅｋ、ん、　ｃｏｌｃｈｅｒ、　Ｄ。 ７、Ｈａｙｗａ：＋４．　Ｂ、　Ｋ、　、　Ｈｕｓｓａｉｎ、　Ａ、　、　Ｗｉ ｌＳＯｎ、　Ｒ，Ｈ，、Ｌ７０ｎｓ。 Ａ、　、　Ｗｏｏｄｃ　ｏａｋ、　ｖ、　、　Ｍｅ工ｎｔｏｓｈ、　Ｂ、　ａｎ ｄ　Ｈａｒｒｉｓ、　Ｔ、　、：ｒ、　Ｒ，、Ｎｕｃ。 ８、　Ｂ１１１ｈＯｐ、Ｒ，、Ｅｂｅｒｔ、Ｅ（、、ＧｉユＣｈｒｉｌｉｔ、Ｇ 、、５ｈａｎ１）ｒｏｎ、Ｒａｎｄ　Ｆｒｋｅｔｅ、　Ｌ、　、　’ｒｈｒｏｍ ’ｂｏｓ、　Ｄｉａｔｈｅｓ、　Ｅｌａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃａ。 浄ゴ（ｐｇ容に変更なし） 手続補正書（自発） 平成２年　１月１２日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）リンパ系セルラインをグルタミン非依存性に形質転換する方法であって； 活性グルタミンシンセ夕ーゼ（ＱＳ）遺伝子を含有するベクターでリンパ系セル ラインを形質転換し；グルタミンを含有する培地で形質転換セルラィンを生育せ しめ；次いで グルタミンが順次減少する培地あるいはグルタミン欠損培地で形質転換セルライ ンを生育し続づける；ことからなる上記方法。 （２）リンパ系セルラインがミエローマセルラインである請求の範囲第１項の方 法。 （３）グルタミン減少もしくはグルタミンフリー培地がアスパラギンを含む請求 の範囲第１項又は第２項の方法。 （４）リンパ系セルラインを、活性ＧＳ遺伝子とｇｐｔ遺伝子などの他の１つの 選択マーカーをコードする遺伝子の両者を含有するベクターで形質転換するか、 あるいは、ＱＳ及び選択マーカーをそれぞれコードする別々のベクターで一緒に 形質転換する請求の範囲第１項一第３項のいずれかの方法。 （１５）培地中のグルタミンが、アスパラギンを含むがグルタミンは含まない培 地で希釈されて順次減少する請求の範囲第１項−第４項のいずれかの方法。 （６）リンパ系セルラインを形質転換するために用いるベクターが、リンパ系セ ルラインにとって異種の蛋白をコードする活性遺伝子を含む請求の範囲第１項− 第５項のいずれかの方法。 （７）リンパ系セルラインを、異種蛋白をコードする活性遺伝子を含む別のベク ターで一緒に形質転換する請求の範囲第１項−第６項のいずれかの方法。 （８）異種蛋白がＩｇタイプ分子である請求の範囲第６項又は第７項の方法。 （９）ＱＳ遺伝子が比較的弱いプロモーターを有し、異種蛋白をコードする遺伝 子が比較的強いプロモーターを有し、形質転換セルラインにおいて、蛋白合成が ＱＳ産生よりもむしろ異種蛋白もしくはペプチドの産生に優先的に向けられてい る請求の範囲第６項−第８項のいずれかの方法。 （１０）リンパ系セルラインをグルタミン非依存性に形質転換し且つ異種蛋白の 産生を可能にするベクターであって、ＧＳ遺伝子と異種蛋白をコードする遺伝子 とを含有し、異種蛋白をコードする配列を転写するプロモーター／エンハンサー からの転写インターツエファレンズによって、グルタミン非依存性コロニーが産 生されない程度にはＧＳ遺伝子の発現が防害さない上記ベクター。 （１１）ＱＳ遺伝子が比較的弱いプロモーターを有し、異種蛋白をコードする遺 伝子が比較的強いプロモーターを有し、ＱＳ遺伝子のフロモーターが異種蛋白を コードする遺伝子のノロモーターの上流にあるかあるいは、ＱＳ遺伝子のプロモ ーターが異種蛋白をコードする遺伝子のプロモーターとは逆方向で発現を誘導す る請求の範囲第１０項のベクター。 （１２）弱いプロモーターと強いプロモーターとの組合わせがＳＶ４０初期領域 とｈｃＭＶ−Ｍ工Ｅプロモーターとである請求の範囲第１１項のベクター。 （１３）ベクターが弱いプロモーターを有するＱＳ遺伝子を含有し、その下流に 、強いプロモーターを有するＨ鎖様遺伝子を有し、ベクター中においてＬ鎖様遺 伝子は、ＱＳのプロモーター及びＨ鎖様遺伝子と逆の方向の強いプロモーターを 有する請求の範囲第１０項又は第１１項のベクター。 （１４）ＱＳ遺伝子は弱いプロモーターを有し、ベクターはＬ鎖様遺伝子及びＨ 鎖様遺伝子を有し、Ｈ及びＬ鎖様遺伝子は強いプロモーターを有し、３つの遺伝 子は同じ方向で転写され、ＱＳ遺伝子は他の２つの遺伝子の上流にある請求の範 囲第１０項又は第１１項のベクター。