JP6900347B2 - 切断可能な脂質 - Google Patents

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Description

核酸のリポソーム送達は、被包されたプラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、短鎖干渉ＲＮＡ、およびミクロＲＮＡに基づく療法の部位特異的送達のために採用されてきた。しかしながら、核酸の標的細胞および組織への効率的な送達、ならびにその後のそのような標的細胞および組織への形質移入は、依然技術的な課題のままである。治療薬の標的細胞および組織への送達を容易にするための多くのリポソームに基づく系およびビヒクルが利用可能であるにも関わらず、生体内および生体外用途の両方において、多くの問題が尚存在する。例えば、リポソーム送達系の大きな欠点は、所望の標的細胞および／または細胞内区画に達するのに十分な細胞培養または生体内安定性を有するリポソームの構築、およびそのようなリポソーム送達がその被包された材料をそのような標的細胞に効率的に放出する能力に関連する。さらに、そのようなリポソームに基づくビヒクルを構築するために採用されるカチオン性脂質の多くは、一般的に標的細胞に毒性であり、したがって、特に被包された材料をそのような標的細胞にうまく送達するのに必要な量において、使用が制限される場合がある。
前述の制限にも関わらず、そして被包された材料を保護し、それを１つ以上の標的細胞に送達するのを容易にするその能力の結果として、リポソームに基づくビヒクルは治療薬において魅力的な担体と考えられ、依然開発の努力が続けられている。カチオン性脂質成分を含むリポソームに基づくビヒクルは、被包、安定性、および部位局在化に関して有望な結果を示してきたが、リポソームに基づく送達系の改善の多大な必要性が残存する。特に、強化された効率で核酸等の巨大分子を幅広い細胞種類および組織に送達することができるカチオン性および脂質の改善の必要性が残存する。被包された核酸およびポリヌクレオチドを送達するために、多機能アプローチを組み込む新規脂質の特定の必要性も残存する。
よって、本発明は、新規化合物、そのような化合物を含む薬学的組成物、および関連するその使用方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される化合物は、リポソーム組成物として、または１つ以上の標的細胞への送達、および後のそれらへの形質移入を容易にするためのリポソーム組成物の成分として有用である。ある実施形態では、本明細書に開示される組成物は、カチオン性および／またはイオン化可能な脂質である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される化合物は、例えば、形質移入の効率を強化するために、または具体的な生物学的成果を促進するために、所望の特性または性質に基づき設計された。さらに、ある実施形態では、本明細書に記載される化合物は、被包された材料（例えば、１つ以上のポリヌクレオチド）の１つ以上の標的細胞への送達、および後のそれらへの形質移入を容易にするための多機能戦略を採用する。例えば、ある実施形態では、本明細書に記載される化合物は、そのような化合物に、他の同様に分類される脂質に対する利点を提供する、膜融合性、エンドソーム、またはリソソーム破壊および／または放出可能性質のうちの１つ以上を有することを特徴とする。
本明細書に開示される化合物は、一般的に、２つ以上の官能基または部分（例えば疎水性Ｒ１基および親水性Ｒ２基）に結合する（例えば、共有結合）１つ以上の切断可能な（例えば、酵素的に、または還元、酸化、もしくは加水分解により切断可能な）官能基を含む。例えば、切断可能なジスルフィド（Ｓ−Ｓ）官能基を含む化合物が本明細書において開示される。例えば生物学的条件に曝されるときに切断が可能であり、かつその目的のために、そのような基が、これらに限定されないが、エステルおよびエーテルを含み得る任意の官能基を含む化合物も想定される。ある実施形態では、化合物を含む２つ以上の官能基（例えば頭部基および尾部基）は、そのような化合物に両親媒性を付与する。例えば、ある実施形態では、官能基のうちの少なくとも１つは、非極性、親油性、または疎水性の尾部基（例えばコレステロールまたはＣ６−Ｃ２０アルキル等の天然に存在する脂質）である。ある実施形態では、官能基のうちの少なくとも１つは、極性または親水性の頭部基（例えばイミダゾール）である。
ある実施形態では、本明細書に記載される化合物（例えば、ＨＧＴ４００１、ＨＧＴ４００２、ＨＧＴ４００３、ＨＧＴ４００４、および／またはＨＧＴ４００５）は、被包された材料（例えば１つ以上の治療薬）の１つ以上の標的細胞への送達および放出を容易にする（例えば、透過またはそのような標的細胞の脂質膜との融合により）、または強化するためのリポソーム組成物の成分として使用され得るカチオン性またはイオン化可能な脂質である。ある実施形態では、そのような化合物を含む１つ以上の切断可能な官能基（例えばジスルフィド）は、例えば、親水性官能頭部基を（例えば、酸化、還元、または酸性条件に曝したとき）化合物の親油性官能尾部基から解離させ、それによって、１つ以上の標的細胞の脂質２重層における相転移を容易にする。例えば、リポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）が本明細書に開示される化合物のうちの１つ以上を含むとき、１つ以上の標的細胞の脂質２重層における相転移は、被包された材料（例えば脂質ナノ粒子中に被包された１つ以上の治療用ポリヌクレオチド）の１つ以上の標的細胞への送達を容易にする。同様に、リポソーム組成物を本明細書に開示される化合物のうちの１つ以上で富化することにより、そのようなリポソーム組成物の膜融合性を改善し、それによって、そのような化合物が細胞内でその中に被包された材料（例えばポリヌクレオチド）を送達する能力を強化することができる。
ある実施形態では、化合物は、式（Ｉ）
Figure 0006900347

の構造を有し、
式中、Ｒ１は、イミダゾール、グアニジウム、アミノ、イミン、エナミン、任意に置換されたアルキルアミノ（例えばジメチルアミノ等のアルキルアミノ）、およびピリジルからなる群から選択され、Ｒ２は、式ＩＩおよび式ＩＩＩ
Figure 0006900347

からなる群から選択され、
式中、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、任意に置換された可変的飽和もしくは不飽和Ｃ６−Ｃ２０アルキル、および任意に置換された可変的飽和もしくは不飽和Ｃ６−Ｃ２０アシルからなる群から選択され、ｎは０であるか、または任意の正の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上）である。ある実施形態では、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ、任意に置換された多価不飽和Ｃ１８アルキルであり、一方、他の実施形態では、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ、非置換の多価不飽和Ｃ１８アルキルである。ある実施形態では、Ｒ３およびＲ４のうちの１つ以上は、（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエンである。
本明細書において、式Ｉ（式中、Ｒ１は、イミダゾール、グアニジウム、アミノ、イミン、エナミン、任意に置換されたアルキルアミノ（例えばジメチルアミノ等のアルキルアミノ）、およびピリジルからなる群から選択され、Ｒ２は式ＩＩであり、ｎは０であるか、または任意の正の整数である）の化合物を含む薬学的組成物も開示する。本明細書において、式Ｉ（式中、Ｒ１は、イミダゾール、グアニジウム、アミノ、イミン、エナミン、任意に置換されたアルキルアミノ（例えばジメチルアミノ等のアルキルアミノ）、およびピリジルからなる群から選択され、Ｒ２は式ＩＩＩであり、式中、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、任意に置換された可変的飽和もしくは不飽和Ｃ６−Ｃ２０アルキル、および任意に置換された可変的飽和もしくは不飽和Ｃ６−Ｃ２０アシルからなる群から選択され、ｎは０であるか、任意の正の整数である）の化合物を含む薬学的組成物をさらに開示する。ある実施形態では、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ、任意に置換された多価不飽和Ｃ１８アルキルであり、一方、他の実施形態では、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ、置換された多価不飽和Ｃ１８アルキル（例えばオクタデカ−９，１２−ジエン）である。
ある実施形態では、Ｒ１基または頭部基は、極性または親水基（例えばイミダゾール基、グアニジウム基、およびアミノ基のうちの１つ以上）であり、例えば式Ｉに示されるジスルフィド（Ｓ−Ｓ）切断可能リンカー基によりＲ２脂質基に結合される。他の想定される切断可能リンカー基は、例えばアルキル基（例えばＣ１〜Ｃ１０アルキル）に結合された（例えば共有結合により）１つ以上のジスルフィド（Ｓ−Ｓ）リンカー基を含む組成物を含み得る。ある実施形態では、Ｒ１基は、Ｃ１−Ｃ２０アルキル基（例えば、ｎが１〜２０である場合）により切断可能なリンカー基に共有結合されるか、または別の方法とし
ては、切断可能なリンカー基に直接結合され得る（例えばｎが０の場合）。ある実施形態では、ジスルフィドリンカー基は、生体外および／または生体内で切断可能である（例えば、酵素的に切断可能であるか、または酸性もしくは還元条件に曝されるときに切断可能である）。
ある実施形態では、本発明は、式ＩＶ（本明細書において「ＨＧＴ４００１」と称される）の構造を有する、化合物５−（（（１０，１３−ジメチル−１７−（６−メチルヘプタン−２−イル）−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル）ジスルファニル）メチル）−１Ｈ−イミダゾールに関する。
Figure 0006900347

ある実施形態では、本発明は、式Ｖ（本明細書において「ＨＧＴ４００２」と称される）の構造を有する、化合物−（２−（（（３Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ）−１０，１３−ジメチル−１７−（（Ｒ）−６−メチルヘプタン−２−イル）−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル）ジスルファニル）エチル）グアニジンに関する。
Figure 0006900347
ある実施形態では、本発明は、式ＶＩ（本明細書において「ＨＧＴ４００３」と称される）の構造を有する、化合物２−（（２，３−ビス（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ）プロピル）ジスルファニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミンに関する。
Figure 0006900347

他の実施形態では、本発明は、式ＶＩＩ（本明細書において「ＨＧＴ４００４」と称される）の構造を有する、化合物５−（（（２，３−ビス（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ
−９，１２−ジエン−１−イルオキシ）プロピル）ジスルファニル）メチル）−１Ｈ−イミダゾールに関する。
Figure 0006900347

また他の実施形態では、本発明は、式ＶＩＩＩ（本明細書において「ＨＧＴ４００５」と称される）の構造を有する、化合物１−（（（２，３−ビス（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ）プロピル）ジスルファニル）メチル）グアニジンに関する。
Figure 0006900347

ある実施形態では、本明細書に開示される化合物は、リポソーム組成物または別の方法としてはリポソーム組成物の成分（例えば脂質ナノ粒子）として使用することができるカチオン性および／またはイオン化可能な脂質である。ある実施形態では、本明細書に開示される化合物は、リポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）を富化し、それによって改善された性質（例えば、被包されたポリヌクレオチドの１つ以上の標的細胞への送達の改善および／または生体内でのリポソーム組成物の毒性の減少）をそのような富化したリポソーム組成物に付与するために使用される。したがって、本明細書に開示される化合物のうちの１つ以上を含む、薬学的組成物、特にリポソーム組成物も想定される。ある実施形態では、そのような薬学的およびリポソーム組成物は、ＰＥＧ修飾された脂質、非カチオン性脂質、およびコレステロール等のヘルパー脂質のうちの１つ以上を含む。例えば、本明細書に開示される化合物（例えば、ＨＧＴ４００１、ＨＧＴ４００２、ＨＧＴ４００３、ＨＧＴ４００４、および／またはＨＧＴ４００５）のうちの１つ以上、および１つ以上のカチオン性脂質、非カチオン性脂質、ヘルパー脂質／コレステロール、およびＰＥＧ修飾された脂質成分を含む薬学的およびリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）が想定される。本明細書に開示される化合物のうちの１つ以上を含み、１つ以上の追加のカチオン性脂質をさらに含む薬学的およびリポソーム組成物も想定される。同様に、ＨＧＴ４００１、ＨＧＴ４００２、ＨＧＴ４００３、ＨＧＴ４００４および／またはＨＧＴ４００５化合物のうちの１つ以上、およびＣ１２−２００、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ、ＣＨＯＬ、ＤＯＰＥ、ＤＭＧ−ＰＥＧ−２０００、ＩＣＥ、ＤＳＰＣ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＴＡＰ、およびＣ８−ＰＥＧ−２０００のうちの１つ以上を含むリポソーム組成物及び薬学的組成物（例えば脂質ナノ粒子）も想定される。ある実施形態では、そのような薬学的組成物およびリポソーム組成物は、例えば１つ以上の生物学的に活性なポリヌクレオチド等の材料で充填されるか、ないしは別の方法で被包される。
ある実施形態では、本明細書に記載される薬学的およびリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）のうちの１つ以上は、本明細書に開示される化合物のうちの１つ以上、および
１つ以上の追加の脂質を含む。例えば、本明細書に開示される化合物のうちの１つ以上を含むか、ないしは別の方法でそれで富化される脂質ナノ粒子は、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＤＡＰ（１，２−ジオレイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、Ｃ１２−２００、およびＩＣＥのうちの１つ以上をさらに含み得る。一実施形態では、薬学的組成物は、ＨＧＴ４００１、ＤＯＰＥ、およびＤＭＧ−ＰＥＧ２０００を含む脂質ナノ粒子を含む。別の実施形態では、薬学的組成物は、ＨＧＴ４００３、ＤＯＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ−ＰＥＧ２０００を含む脂質ナノ粒子を含む。
ある実施形態では、本明細書に記載される薬学的組成物のうちの１つ以上は、１つ以上のＰＥＧ修飾された脂質を含み得る。例えば、本明細書に開示される化合物のうちの１つ以上を含むか、ないしは別の方法でそれで富化される脂質ナノ粒子は、１つ以上のＣ６−Ｃ２０アルキルを含む脂質に共有結合される、長さが最大５ｋＤａのポリ（エチレン）グリコール鎖を含むＰＥＧ修飾された脂質のうちの１つ以上をさらに含み得る。
同様に、本明細書に開示される薬学的組成物（例えば脂質ナノ粒子）は、本明細書に開示される化合物のうちの１つ以上を含み得るか、ないしは別の方法でそれで富化され得、ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール））、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＳＰＥ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＬＰＥ（１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＰＰＳ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン）、セラミド、スフィンゴミエリン、およびコレステロールからなる群から選択されるヘルパー脂質のうちの１つ以上をさらに含み得る。
ある実施形態では、化合物ならびにそのような化合物を含む薬学的およびリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）は、１つ以上のポリヌクレオチド（例えば被包されたＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む。他の実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチドは、少なくとも１つのロックド核酸（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１６、１８、２０以上のロックド核酸残基またはモノマー）を含む。１つ以上の被包されたポリヌクレオチドがＲＮＡを含む場合、そのようなＲＮＡは、例えばｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ミクロＲＮＡ、およびそれらの組み合わせを含み得る。
ある実施形態では、その薬学的およびリポソーム組成物に被包されたポリヌクレオチドは、例えば、機能性ポリペプチド、タンパク質、または酵素をコードするｍＲＮＡを含み、１つ以上の標的細胞によって発現される（すなわち翻訳される）とき、機能性ポリペプチド生成物（例えばタンパク質または酵素）が生成され、いくつかの場合では、標的細胞によって対象の末梢循環内に分泌される。ある実施形態では、本明細書に記載される化合物ならびに薬学的およびリポソーム組成物を含む（ないしは別の方法でその中に充填されるか、または被包される）ポリヌクレオチドのうちの１つ以上は、対象によって異常に発現される核酸（例えばポリペプチド）をコードする。ある実施形態では、そのような化合物ならびにリポソームまたは薬学的組成物（例えば脂質ナノ粒子）を含む被包されたポリヌクレオチドのうちの１つ以上は、尿素回路酵素（例えば、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、カルバモイル−リン酸シンセターゼ１（ＣＰＳ１）、アルギニノコハ
ク酸シンセターゼ（ＡＳＳ１）、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）、またはアルギナーゼ１（ＡＲＧ１））等の機能性酵素をコードする。ある実施形態では、被包されたポリヌクレオチドのうちの１つ以上は、リソソーム貯蔵障害に関連する酵素をコードするｍＲＮＡを含む（例えば、被包されたポリヌクレオチドは、αガラクトシターゼ、イズロネート−２−スルファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸トランスフェラーゼ、β−グルコシダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、およびグルコシダーゼα酸の酵素のうちの１つ以上をコードするｍＲＮＡである）。核酸がｍＲＮＡを含む他の実施形態では、そのようなｍＲＮＡは、１つ以上のタンパク質または酵素、例えば、対象において欠乏し得るタンパク質または酵素（例えば、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）、α−Ｌ−イズロニダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、α−グルコサミニド（ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄｅ）アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、ガラクトース−６−硫酸スルファターゼ、β−ガラクトシターゼ、β−グルクロニダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ヘパランスルファミダーゼ、およびヒアルロニダーゼからなる酵素の群から選択される酵素またはタンパク質）をコードし得る。
本明細書において、本明細書に開示される化合物のうちの１つ以上、および１つ以上のポリヌクレオチド（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）、特に１つ以上の化学修飾を含むポリヌクレオチドを含む薬学的およびリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）も想定される。例えば、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡである、ある実施形態では、そのような化学修飾は、ｍＲＮＡにより大きな安定性を付与し、例えば、ｍＲＮＡの５’または３’非翻訳領域の末端封鎖修飾（ｅｎｄ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含み得る。ある実施形態では、化学修飾は、例えば、配列番号１：
ＸＣＡＧＡＵＣＧＣＣＵＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＵＣＣＡＣＧＣＵＧＵＵＵＵＧＡＣＣＵＣＣＡＵＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＵＣＣＡＧＣＣＵＣＣＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＡＣＧＧＵＧＣＡＵＵＧＧＡＡＣＧＣＧＧＡＵＵＣＣＣＣＧＵＧＣＣＡＡＧＡＧＵＧＡＣＵＣＡＣＣＧＵＣＣＵＵＧＡＣＡＣＧ（存在する場合、ＸはＧＧＡである）（配列番号１）、
または配列番号１と少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％同一である配列等の、ＣＭＶ最初期１（ＩＥ１）遺伝子の部分配列をｍＲＮＡの５’非翻訳領域に包含することを含む。
他の実施形態では、化学修飾は、ポリＡ尾部をｍＲＮＡの３’非翻訳領域に包含することを含む。Ｃａｐ１構造をｍＲＮＡの５’非翻訳領域に包含することを含む化学修飾も想定される。また他の実施形態では、化学修飾は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子からの配列をｍＲＮＡのどちらかの３’非翻訳領域に包含することを含む。ｈＧＨ配列は、例えば、配列番号２
ＣＧＧＧＵＧＧＣＡＵＣＣＣＵＧＵＧＡＣＣＣＣＵＣＣＣＣＡＧＵＧＣＣＵＣＵＣＣＵＧＧＣＣＣＵＧＧＡＡＧＵＵＧＣＣＡＣＵＣＣＡＧＵＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＵＵＧＵＣＣＵＡＡＵＡＡＡＡＵＵＡＡＧＵＵＧＣＡＵＣ（配列番号２）
または配列番号２と少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％同一である配列を含み得る。
本明細書に記載される化合物および薬学的組成物は、１つ以上の標的細胞、組織、および器官を具体的に標的とする、および／またはそれらに形質移入されるように製剤化され得る。ある実施形態では、そのような化合物および薬学的組成物は、１つ以上の機構（例えば、膜融合に基づく放出および／または標的細胞の脂質２重層膜のプロトン−海綿質媒介破壊）により、そのような標的細胞への形質移入を容易にする。想定される標的細胞は、例えば、肝細胞、上皮細胞、造血細胞、上皮細胞、内皮細胞、肺細胞、骨細胞、幹細胞、間葉細胞、神経細胞、心細胞、脂肪細胞、血管平滑筋細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、β
細胞、下垂体細胞、滑液系統細胞、卵巣細胞、精巣細胞、線維芽細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、網状赤血球、白血球、顆粒球、および腫瘍細胞からなる群から選択される１つ以上の細胞を含む。
さらに本発明は、被包された含有物（例えばポリヌクレオチド）を１つ以上の標的細胞、組織、または器官に送達するのを達成するのに有用である、凍結乾燥されたリポソーム送達ビヒクルおよびリポソーム製剤を含む薬学的組成物（例えば脂質ナノ粒子）を提供する。本発明は、そのような薬学的組成物を調製するための関連する方法およびプロセス、ならびにそのような薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することにより、１つ以上の疾患または状態を治療する方法をさらに提供する。本明細書に記載される凍結乾燥された組成物（例えば脂質ナノ粒子）は、冷凍または周囲温度（例えば室温）のいずれかにより保管されたとき、改善された長期安定性を有することも期待される。
ある実施形態では、凍結乾燥されたナノ粒子またはリポソーム送達ビヒクルを含む薬学的組成物は、安定（例えば等価の凍結乾燥されないビヒクルを含む薬学的組成物と同様に安定）であることを特徴とする。凍結乾燥された送達ビヒクルの安定性は、例えばそのような組成物を含む脂質ナノ粒子の粒径に関して決定され得る。ある実施形態では、脂質ナノ粒子の凍結乾燥は、凍結乾燥および／または再構成後の脂質ナノ粒子の粒径をはっきりと変化または変更させない。例えば、本明細書において、再構成時に（例えば精製水で）、脂質ナノ粒子は凝結または凝集しないか、または別の方法としては限定された、または無視できるほどの凝結もしくは凝集を示した（例えば、再構成された脂質ナノ粒子の粒径によって決定された）、凍結乾燥された脂質送達ビヒクルを含む薬学的組成物が開示される。したがって、ある実施形態では、凍結乾燥された脂質ナノ粒子の再構成時に、脂質ナノ粒子は、約５００ｎｍ未満（例えば、約３００ｎｍ、２００ｎｍ、１５０ｎｍ、１２５ｎｍ、１２０ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍ、２５ｎｍ未満、またはそれより小さい）のＤｖ５０を有する。同様に、ある実施形態では、凍結乾燥された脂質ナノ粒子の再構成時に、脂質ナノ粒子は、約７５０ｎｍ未満（例えば、約７００ｎｍ、５００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、１５０ｎｍ、１２５ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍ、２５ｎｍ未満、またはそれより小さい）のＤｖ９０を有する。
他の実施形態では、凍結乾燥された脂質送達ビヒクルを含む薬学的組成物は、約１未満（例えば、０．９５、０．９、０．８、０．７５、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２５、０．２、０．１、０．０５未満、またはそれ以下）の多分散指数を有することを特徴とする。また他の実施形態では、凍結乾燥された脂質送達ビヒクルを含む薬学的組成物は、（例えば凍結乾燥中、または再構成時に）凝結、ないしは別の方法で凝集しにくいことを示す。例えば、再構成時に、脂質送達ビヒクルは、５００ｎｍ未満（例えば、ＰＢＳ溶液中で約４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、１７５ｎｍ、１５０ｎｍ、１２５ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍ、２５ｎｍ未満、またはそれより小さい）の平均粒径（Ｚ平均）を有し得る。
本明細書により提供される安定した凍結乾燥された脂質送達ビヒクル（例えば脂質ナノ粒子）は、その改善された保管性質も特徴とする。例えば、ある実施形態では、凍結乾燥された脂質送達ビヒクルは、冷凍により保管することができ、長期間安定した状態（例えば、約４℃で保管されるとき、少なくとも約１、２、３、４、５、６、９、１２、１８、２４、３６ヶ月以上の間安定）を保つ（例えば、意図される薬学的活性または生物活性における最小限の損失または損失がないことによって示される）。他の実施形態では、凍結乾燥された脂質送達ビヒクルは、冷凍することなく保管することができ、長期間安定した状態（例えば、約２５℃で保管されるとき、少なくとも約１、２、３、４、５、６、９、１２、１８、２４、３６ヶ月以上の間安定）を保つ。ある実施形態では、適切な再水和培地（例えば、精製水、脱イオン水、５％のデキストロース、および／または通常の生理食
塩水）で再構成されるとき、再構成された組成物は、凍結乾燥前に観察されたものと同等の薬理活性または生物活性を示す。例えば、ある実施形態では、被包されたポリヌクレオチドの薬理活性または生物活性は、組成物の凍結乾燥前に観察されたものと等価であるか、あるいは薬理活性または生物活性において無視できるほどの減少（例えば、被包されたポリヌクレオチドの薬理活性または生物活性において、約１％、２％、２．５％、４％、５％、７．５％、１０％、１２．５％、１５％、１８．５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、または５０％未満の減少）を示す。
本明細書において、１つ以上の凍結乾燥保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）（例えば、糖および／または炭水化物）をさらに含む、または別の方法としてはそれを用いて調製される、凍結乾燥された脂質送達ビヒクルを含む薬学的組成物（例えば、凍結乾燥された脂質ナノ粒子）も開示する。ある実施形態では、脂質ナノ粒子に１つ以上の凍結乾燥保護剤を含むことにより、凍結乾燥された脂質送達ビヒクル（例えば通常の保管条件下で）の安定性を改善する、ないしは別の方法で強化する、および／または再水和培地を用いて凍結乾燥された脂質送達ビヒクルの再構成を容易にし、それによって水性製剤を調製することができる。例えば、ある実施形態では、脂質ナノ粒子が調製され、凍結乾燥前に、リポソーム製剤中に存在する緩衝剤がスクロース溶液または懸濁液（例えば１〜５０％または１０〜２５％のスクロースを含む水溶液）等の凍結乾燥保護剤で（例えば遠心分離を介して）置換され得る。本明細書に記載される凍結乾燥された組成物を調製するために使用され得る他の好適な凍結乾燥保護剤は、例えば、トレハロース、デキストラン（例えば１．５ｋＤａ、５ｋＤａおよび／または４０ｋＤａ）、およびイヌリン（例えば１．８ｋＤａおよび／または４ｋＤａ）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される凍結乾燥された組成物は、そのような組成物に含まれる１つ以上の脂質ナノ粒子内に被包された含有物（例えばポリヌクレオチド）の持続放出を容易にすることもできる。例えば、再構成することなく組成物が対象に移植され得る（例えば膜またはディスク等の例えば皮下的に移植される）、凍結乾燥された脂質送達ビヒクルを含む薬学的組成物が想定される。そのような移植された凍結乾燥された組成物は、例えば、１つ以上の生物流体（例えば、血清、血液、脳脊髄液、粘液、汗、胃液分泌物、尿、および／または唾液）に曝されるとき、既定の速度で侵食、ないしは別の方法で分解され得る。ある実施形態では、凍結乾燥された脂質送達ビヒクルを含むそのような移植された薬学的組成物は、例えば、少なくとも１、２、７、１０、１４、２１、３０、４５、６０、９０、１２０日以上にわたって、被包されたポリヌクレオチドを放出する。別の方法としては、凍結乾燥された脂質送達ビヒクルを含むそのような移植された組成物は、例えば、少なくとも１、２、３、６、１２、１６、２４、３６ヶ月以上にわたって、被包されたポリヌクレオチドを放出する。
ある実施形態では、本明細書において、本発明によって提供される凍結乾燥された脂質送達ビヒクルを含む薬学的組成物は、対象（例えば哺乳類）に投与する前に再構成され得る。再構成時（例えば、再水和培地として精製水または５％のデキストロースを用いて）
、再構成された水性組成物は、次の投与経路：静脈内、経口的、直腸的、経膣的、経粘膜、舌下、硬膜下、経鼻的、筋肉内、皮下的、髄内注射、くも膜下腔内、脳室内、腹腔内、鼻腔内、眼部（ｏｐｔｈａｌｍｉｃａｌｌｙ）、および／または眼内のうちの１つ以上によって対象に投与され得る。
本発明が提供するのは、対象の疾患（例えば、遺伝子または核酸の異常発現に関連する疾患）を治療する方法でもあり、本方法は、本発明の化合物および／または薬学的組成物のうちの１つ以上を対象に投与することを含む。１つ以上の標的細胞に１つ以上のポリヌクレオチドを形質移入する方法も想定され、本方法は、１つ以上の標的細胞に１つ以上の被包されたポリヌクレオチドを形質移入するように、１つ以上の標的細胞を本明細書に記
載される化合物または薬学的組成物と接触させることを含む。
ある実施形態では、本明細書によって提供される治療の方法は、１つ以上の標的細胞および組織において異常に発現した核酸およびポリヌクレオチドの発現を調節することができる本発明の凍結乾燥された、または再構成された脂質送達ビヒクルを含む組成物を採用する。したがって、本明細書において、本明細書によって提供される凍結乾燥された脂質送達ビヒクルを含む有効量の薬学的組成物を対象に投与することによって（例えば、注射用に滅菌水等の再水和培地で再構成時）、対象の疾患を治療する方法も提供する。ある実施形態では、そのような方法は、１つ以上の標的細胞および組織（例えば肝細胞）において、ポリヌクレオチドの発現を強化（例えば増加）する、および／または機能性ポリペプチド生成物の生成および分泌を増加することができる。いくつかの実施形態では、標的細胞または組織は、本発明の凍結乾燥された脂質送達ビヒクル（例えば脂質ナノ粒子）のうちの１つ以上によって被包されたポリヌクレオチドを異常に発現する。
本発明は、１つ以上の標的細胞、組織、および器官において、１つ以上のポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）の発現を増加させる方法も提供される。一般に、そのような方法は、標的細胞を、１つ以上のポリヌクレオチドを含む、ないしは別の方法で被包する１つ以上の化合物および／または薬学的もしくはリポソーム組成物と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、１つ以上の細胞にポリヌクレオチドを形質移入する（例えば、凍結乾燥された組成物を再水和し、そのような１つ以上の細胞を再水和した組成物と接触させる工程を含む）方法にも関する。
本発明の上述および多くの他の特徴および付随する利点は、付随する実施例と合わされるとき、以下の本発明の詳細な説明を参照することによりさらに理解されるだろう。本明細書に記載される様々な実施形態は補足であり、本明細書に含まれる教示を考慮して当業者により理解される様式で組み合わされる、または一緒に使用され得る。
ＨＧＴ４００３に基づくホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）ｍＲＮＡ充填脂質ナノ粒子の静脈内投与後のマウスの肝臓および脾臓におけるホタルルシフェラーゼタンパク質の発光出力を図示する。投与されたＨＧＴ４００３に基づく脂質ナノ粒子は、脾臓よりも肝臓において、被包されたｍＲＮＡの富化をもたらす。値は、投与４時間後の総タンパク質の平均相対光単位（ＲＬＵ）／ｍｇとして示される。 ＨＧＴ４００３に基づくホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）ｍＲＮＡ充填脂質ナノ粒子の脳血管内（ＩＣＶ）およびくも膜下腔内（ＩＴ）投与後のマウスの脳および脊髄組織におけるホタルルシフェラーゼタンパク質の発光出力を図示する。投与されたＨＧＴ４００３に基づく脂質ナノ粒子は、ＩＴ投与経路と比較して、ＩＣＶ投与経路を用いた脳において、被包されたｍＲＮＡの富化をもたらす。値は、投与４時間後の総タンパク質の平均相対光単位（ＲＬＵ）／ｍｇとして示される。
例示的な実施形態の説明
本発明の化合物は、例えばリポソーム送達ビヒクルとして、またはリポソーム送達ビヒクルの成分として有用である。ある実施形態では、本明細書に開示される化合物は、リポソーム組成物、または別の方法としてはリポソーム組成物の成分として（例えば脂質ナノ粒子として）使用することができる。本発明の化合物は、薬学的組成物（例えば脂質ナノ粒子）、および疾患、障害、または状態を治療もしくは防止する、または治療用分子を送達するために、そのような薬学的組成物を投与する方法においても採用され得る。ある実施形態では、そのような化合物および組成物は、例えば被包された材料（例えばポリヌクレオチド）を１つ以上の標的細胞、組織、および器官に送達するのを容易にする。
本明細書に開示される化合物は、一般に、例えば、以下の式Ｉに示される１つ以上のジスルフィド（Ｓ−Ｓ）官能基等の１つ以上の切断可能な基を含む。用語「切断」および「切断可能な」とは、本明細書において、一般に、対象の官能基のまたはそれに隣接する原子間の１つ以上の化学結合（例えば、共有結合、水素結合、ファンデルワールスの力、および／またはイオン相互作用のうちの１つ以上）が破壊される（例えば加水分解される）か、または選択された条件に曝されたときに（例えば酵素状態に曝されたとき）破壊可能であることを意味するように使用される。ある実施形態では、切断可能な基はジスルフィド官能基であり、特定の実施形態では、選択された生物学的条件（例えば細胞内条件）に曝されたときに切断可能であるジスルフィド基である。ある実施形態では、切断可能な基は、選択された生物学的条件に曝されたときに切断可能であるエステル官能基である。例えばジスルフィド基は、酵素的に、または加水分解、酸化、または還元反応により切断され得る。そのようなジスルフィド官能基の切断時に、結合される１つ以上の官能部分または官能基（例えば頭部基および／または尾部基のうちの１つ以上）が遊離され得る。例示的な切断可能な基としては、ジスルフィド基、エステル基、エーテル基、およびそれらの誘導体（例えば、アルキルおよびアリールエステル）が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態では、切断可能な基は、エステル基またはエーテル基でない。
本明細書に記載される切断可能な基は、一般に、１つ以上の官能部分または官能基（例えば、少なくとも１つの頭部基および少なくとも１つの尾部基）に結合される（例えば、水素結合、ファンデルワールスの力、イオン相互作用、および共有結合のうちの１つ以上により結合される）。ある実施形態では、官能部分または官能基のうちの少なくとも１つは、親水性（例えば、イミダゾール、グアニジウム、アミノ、イミン、エナミン、任意に置換されたアルキルアミノ、およびピリジルのうちの１つ以上を含む親水性頭部基）である。本明細書で使用される、用語「親水性」とは、性質的な用語において、官能基が水を好み、典型的に、そのような基が水溶性であることを示すように使用される。例えば、本明細書において、１つ以上の親水性基（例えば、親水性頭部基）に結合する切断可能なジスルフィド（Ｓ−Ｓ）官能基を含む化合物が開示され、そのような親水性基は、イミダゾール、グアニジウム、アミノ、イミン、エナミン、任意に置換されるアルキルアミノ（例えば、ジメチルアミノ等のアルキルアミノ）、およびピリジルからなる群を含むか、またはそれから選択される。
ある実施形態では、選択された親水性官能基または官能部分は、性質を変更するか、ないしは別の方法で化合物、またはそのような化合物が成分である化合物またはリポソーム組成物に性質を付与することができる（例えば、化合物が成分である脂質ナノ粒子の形質移入効率を改善することにより）。例えば、親水性頭部基としてグアニジウムを本明細書に開示される化合物に組み込むことにより、１つ以上の標的細胞の細胞膜を用いてそのような化合物（またはそのような化合物が成分であるリポソーム組成物）の膜融合を促進し、それによって例えばそのような化合物の形質移入効率を強化することができる。親水性グアニジウム部分からの窒素は相互作用に安定性を与え、よって被包された材料の細胞取り込みを可能にする６員環転移状態を形成すると仮定されている（Ｗｅｎｄｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．（２００８）６０：４５２−４７２）。同様に、１つ以上のアミノ基またはアミノ部分を開示される化合物中に（例えば頭部基として）組み込むことにより、そのようなアミノ基の膜融合性を利用して、標的細胞のエンドソーム／リソソーム膜の破壊をさらに促進することができる。これは、組成物のアミノ基のｐＫａだけでなく、アミノ基が六方晶相転移を受け、標的細胞表面、すなわち小胞膜と融合する能力にも基づく。（Ｋｏｌｔｏｖｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）２８１：７８−８１）。その結果として、小胞膜の破壊を促進し、脂質ナノ粒子含有物を標的細胞内に放出すると考えられている。
同様に、ある実施形態では、親水性頭部基として例えばイミダゾールを本明細書に開示される化合物中に組み込むことにより、例えば本発明のリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）に被包される含有物のエンドソームまたはリソソーム放出を促進する働きをし得る。そのような放出の強化は、プロトン−海綿質媒介破壊機構および／または膜融合機構の強化のうちの１つまたはその両方により達成され得る。プロトン−海綿質機構は、化合物、特に化合物の官能部分または官能基がエンドソームの酸性化を緩衝する能力に基づく。これは、化合物のｐＫａまたはそのような化合物を含む官能基（例えばイミダゾール）のうちの１つ以上によって操作、ないしは別の方法で制御され得る。したがって、ある実施形態では、本明細書に開示される例えばイミダゾールに基づく化合物（例えば、ＨＧＴ４００１およびＨＧＴ４００４）の膜融合性は、他の従来のカチオン性脂質に対して低いｐＫａを有するそのようなイミダゾール基によって容易にされるエンドソーム破壊性質に関連する。そのようなエンドソーム破壊性質は、同時に浸透膨潤およびリポソーム膜の破壊を促進し、その後に充填された、または被包されたポリヌクレオチド材料の標的細胞への形質移入または細胞内放出が続く。この現象は、イミダゾール部分に加え、望ましいｐＫａプロファイルを有する様々な化合物に適用することができる。そのような実施形態は、ポリアミン、ポリ−ペプチド（ヒスチジン）、および窒素に基づく樹状構造等の多窒素に基づく官能基も含む。
本明細書に記載される化合物、特にイミダゾールに基づく化合物（例えば、ＨＧＴ４００１およびＨＧＴ４００４）はまた、特に従来の脂質およびカチオン性脂質に対するその減少した毒性を特徴とする。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される薬学的およびリポソーム組成物は、そのような薬学的またはリポソーム組成物中の他のより毒性のカチオン性脂質の相対的濃度が低下されるか、ないしは別の方法で排除され得るように、１つ以上のイミダゾールに基づくカチオン性脂質化合物を含む。イミダゾールに基づく化合物または脂質（例えば、ＨＧＴ４００１および／またはＨＧＴ４００４）は、本明細書に記載される薬学的およびリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）のうちの１つ以上において唯一のカチオン性脂質として使用されるか、または別の方法としては従来のカチオン性脂質（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮまたはＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ）、非カチオン性脂質、ヘルパー脂質／コレステロール、および／またはＰＥＧ修飾された脂質と組み合わせることができる。ある実施形態では、本明細書に記載される化合物、または別の方法としては薬学的およびリポソーム組成物の総カチオン性脂質成分は、そのような薬学的またはリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）中に存在する総脂質の約１％〜約９０％、約２〜約７０％、約５％〜約５０％、約１０％〜約４０％、または好ましくはそのような薬学的またはリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）中に存在する総脂質の約２０％〜約７０％のモル比を含み得る。
ある実施形態では、本明細書に開示される化合物を含む部分の官能基のうちの少なくとも１つは、本来疎水性（例えば、コレステロール等の天然に生じる脂質を含む疎水性尾部基）である。本明細書で使用される、用語「疎水性」とは、性質的な用語において、官能基が水避け、典型的に、そのような基が水溶性でないことを示すように使用される。例えば、本明細書において、１つ以上の疎水基に結合される切断可能な官能基（例えばジスルフィド（Ｓ−Ｓ）基）を含む化合物が開示され、そのような疎水基は、コレステロール等の１つ以上の天然に生じる脂質、ならびに／または任意に置換された可変的飽和または不飽和Ｃ６−Ｃ２０アルキル、および／もしくは任意に置換された可変的飽和または不飽和Ｃ６−Ｃ２０アシルを含む。
ある実施形態では、本明細書に開示される化合物は、例えば、少なくとも１つの親水性頭部基、および少なくとも１つの疎水性尾部基を含み、それぞれ少なくとも１つの切断可能な基に結合され、それによってそのような化合物に両親媒性を付与する。化合物または組成物を説明するために本明細書で使用される、用語「両親媒性」とは、極性（例えば水
）および非極性（例えば脂質）環境の両方に溶解する能力を意味する。例えば、ある実施形態では、本明細書に開示される化合物は、少なくとも１つの親油性尾部基（例えば、コレステロールまたはＣ６−Ｃ２０アルキル）、および少なくとも１つの親水性頭部基（例えばイミダゾール）を含み、それぞれ切断可能な基（例えばジスルフィド）に結合される。
本発明の化合物、特にそのような化合物を含む官能基を説明するために使用される、用語「頭部基」および「尾部基」とは、他の官能基に対する１つ以上の官能基の配向を説明するために参照しやすいように使用されることに留意するべきである。例えば、ある実施形態では、親水性頭部基（例えばグアニジウム）は、同時に疎水性尾部基（例えばコレステロール）に結合される切断可能な官能基（例えばジスルフィド基）に結合される（例えば、水素結合、ファンデルワールスの力、イオン相互作用、および共有結合のうちの１つ以上により）。
本明細書において、式Ｉ
Figure 0006900347

の構造を有する化合物も開示され、
式中、Ｒ１は、イミダゾール、グアニジウム、アミノ、イミン、エナミン、任意に置換されたアルキルアミノ（例えばジメチルアミノ等のアルキルアミノ）、およびピリジルからなる群から選択され、Ｒ２は、式ＩＩおよび式ＩＩＩ
Figure 0006900347

からなる群から選択され、
式中、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、任意に置換された可変的飽和もしくは不飽和Ｃ６−Ｃ２０アルキル、および任意に置換された可変的飽和もしくは不飽和Ｃ６−Ｃ２０アシルからなる群から選択され、ｎは０であるか、または任意の正の整数（例えば、
１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上）である。ある実施形態では、Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、任意に置換された多価不飽和Ｃ１８アルキルを含み、一方、他の実施形態では、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ、非置換の多不飽和Ｃ１８アルキルである。ある実施形態では、Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエンである。ある実施形態では、ｎは、１（アルキルがエチルであるように）、２（アルキルがメチルであるように）、３（アルキルが例えばプロピルまたはイソ−プロピルであるように）、４（アルキルが例えばブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、またはｔｅｒ−ブチルであるように）、５（アルキルが例えばペンタンであるように）、６（アルキルが例えばヘキサンであるように）、７（アルキルが例えばヘプタンであるように）、８（アルキルが例えばオクタンであるように）、９（ｎアルキルが例えばノナンであるように）、または１０（アルキルが例えばデカンであるように）である。
本明細書で使用される、用語「アルキル」とは、直鎖および分枝鎖の両方のＣ１−Ｃ４０炭化水素（例えばＣ６−Ｃ２０炭化水素）を指し、飽和および不飽和炭化水素の両方を含む。ある実施形態では、アルキルは、１つ以上の環式アルキルおよび／または酸素、窒素、または硫黄等の１つ以上のヘテロ原子を含み得、任意に置換基（例えば、アルキル、ハロ、アルコキシル、ヒドロキシ、アミノ、アリール、エーテル、エステル、またはアミドのうちの１つ以上）で置換され得る。ある実施形態では、想定されるアルキルは、（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエンを含む。例えば「Ｃ６−Ｃ２０」等の記号表示の使用は、列挙される範囲の炭素原子を有するアルキル（例えば、直鎖または分枝鎖ならびにアルケンおよびアルキルを含む）を指すことが意図される。
本明細書で使用される、用語「アリール」とは、環部分に６〜１０個の炭素を含む芳香族基（例えば、単環式、二環式、および三環式構造）を指す。アリール基は、利用可能な炭素原子を通して任意に置換され得、ある実施形態では、酸素、窒素、または硫黄等の１つ以上のヘテロ原子を含み得る。
本明細書において、式Ｉ（式中、Ｒ１は、イミダゾール、グアニジウム、アミノ、イミン、エナミン、任意に置換されたアルキルアミノ（例えばジメチルアミノ）、およびピリジルからなる群から選択され、Ｒ２は式ＩＩであり、ｎは０であるか、または任意の正の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）である）の化合物を含む薬学的組成物も開示する。本明細書において、式Ｉ（式中、Ｒ１は、イミダゾール、グアニジウム、イミン、エナミン、アミノ、任意に置換されたアルキルアミノ（例えばジメチルアミノ）、およびピリジルからなる群から選択され、Ｒ２は式ＩＩＩであり、式中、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、任意に置換された可変的飽和もしくは不飽和Ｃ６−Ｃ２０アルキル、および任意に置換された可変的飽和もしくは不飽和Ｃ６−Ｃ２０アシルからなる群から選択され、ｎは０であるか、任意の正の整数である）の化合物を含む薬学的組成物をさらに開示する。ある実施形態では、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ、任意に置換された多価不飽和Ｃ１８アルキルであり、一方、他の実施形態では、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ、非置換の多価不飽和Ｃ１８アルキルである。ある実施形態では、想定されるアルキルは、（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエンを含む。
ある実施形態では、Ｒ１ 基または頭部基は、極性または親水基（例えばイミダゾール基、グアニジウム基、およびアミノ基のうちの１つ以上）であり、例えば式Ｉに図示されるジスルフィド（Ｓ−Ｓ）切断可能なリンカー基によりＲ２脂質基に結合される。Ｒ１基または頭部基は、アルキル基（例えば、ｎが１〜２０であるＣ１−Ｃ２０アルキル）により切断可能なリンカー基に共有結合されるか、または別の方法としては、切断可能なリンカー基（例えばｎが０である）に直接結合され得る。本明細書に開示される化合物および薬学的組成物は、選択された条件（例えば、適切な生物学的または酵素的条件）に曝され
たとき、切断可能なリンカー基（例えばジスルフィド基）が切断され、それによって結合される官能基または官能部分（例えば頭部基および／または尾部基）のうちの１つ以上を解離させるように調製され得る。官能基または官能部分（例えばイミダゾール等のＲ１親水基）の解離は、本明細書に開示される化合物のうちの１つ以上が成分であるリポソーム組成物において相転移をもたらし、それによってリポソームを不安定にし、１つ以上の標的細胞の膜との融合を容易にする。他の想定される切断可能なリンカー基は、例えばアルキル基（例えばＣ１〜Ｃ１０アルキル）に結合される（例えば共有結合される）１つ以上のジスルフィド（Ｓ−Ｓ）リンカー基を含む組成物を含み得る。
ある実施形態では、本発明は、式ＩＶ（本明細書において「ＨＧＴ４００１」と称される）の構造を有する、化合物５−（（（１０，１３−ジメチル−１７−（６−メチルヘプタン−２−イル）−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル）ジスルファニル）メチル）−１Ｈ−イミダゾールを提供する。
Figure 0006900347
ある実施形態では、本発明は、式Ｖ（本明細書において「ＨＧＴ４００２」と称される）の構造を有する、化合物１−（２−（（（３Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ）−１０，１３−ジメチル−１７−（（Ｒ）−６−メチルヘプタン−２−イル）−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル）ジスルファニル）エチル）グアニジンを提供する。
Figure 0006900347
ある実施形態では、本発明は、式ＶＩ（本明細書において「ＨＧＴ４００３」と称される）の構造を有する、化合物２−（（２，３−ビス（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ）プロピル）ジスルファニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミンを提供する。
Figure 0006900347

他の実施形態では、本発明は、式ＶＩＩ（本明細書において「ＨＧＴ４００４」と称される）の構造を有する、化合物５−（（（２，３−ビス（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ）プロピル）ジスルファニル）メチル）−１Ｈ−イミダゾールを提供する。
Figure 0006900347

また他の実施形態では、本発明は、式ＶＩＩＩ（本明細書において「ＨＧＴ４００５」と称される）の構造を有する、化合物１−（（（２，３−ビス（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ）プロピル）ジスルファニル）メチル）グアニジンを提供する。
Figure 0006900347

本明細書に記載される化合物は、被包された材料（例えば、１つ以上の治療用ポリヌクレオチド）の、１つ以上の標的細胞への送達および放出（例えば、そのような標的細胞の脂質膜を透過する、またはそれと融合することにより）を容易にする、または強化するリポソーム組成物を構築するために使用され得る。ある実施形態では、そのような化合物を含む１つ以上の切断可能な官能基は、例えば、親水性官能頭部基を（例えば、還元または酸性条件に曝したとき）化合物の親油性官能尾部基から解離させ、それによって、１つ以上の標的細胞の脂質２重層における相転移を容易にする。例えば、リポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）が本明細書に開示される化合物のうちの１つ以上を含む、ないしは別の方法で富化されるとき、１つ以上の標的細胞の脂質２重層における相転移は、被包された材料（例えば脂質ナノ粒子中に被包された１つ以上の治療用ポリヌクレオチド）の１つ以上の標的細胞への送達を容易にする。
ある実施形態では、本明細書に記載される化合物は、そのような化合物に、他の同様に分類される脂質に対する利点を提供する１つ以上の性質を有することを特徴とする。例えば、ある実施形態では、本明細書に開示される化合物は、リポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）が成分であるその性質を制御および製作することを可能にする。特に、本明細書に開示される化合物は、形質移入の効率および特定の生物学的成果を誘発するその能力の強化を特徴とし得る。そのような成果は、例えば、細胞取り込みの強化、エンドソーム／リソソーム破壊機能、および／または細胞内での被包された材料（例えばポリヌクレオチド）の放出の促進を含み得る。
ある実施形態では、本明細書に記載される化合物（ならびにそのような化合物を含む薬学的およびリポソーム組成物）は、被包された材料（例えば１つ以上のポリヌクレオチド）の、１つ以上の標的細胞への送達、および後のそれらへの形質移入を容易にするための
多機能戦略を採用する。例えば、ある実施形態では、本明細書に記載される化合物（ならびにそのような化合物を含む薬学的およびリポソーム組成物）は、そのような化合物に、受容体媒介飲食作用、クラスリン媒介およびカベオラ媒介飲食作用、食作用およびマクロ飲作用、膜融合、エンドソームまたはリソソーム破壊、ならびに／または他の同様に分類される脂質に対する利点をもたらす放出可能性質のうちの１つ以上を有することを特徴とする。
ある実施形態では、化合物ならびにそのような化合物が成分（例えば脂質ナノ粒子）である薬学的およびリポソーム組成物は、１つ以上の標的細胞に形質移入する強化された（例えば増加された）能力を呈する。したがって、本明細書において、１つ以上の標的細胞に形質移入する方法も提供される。そのような方法は、一般に、１つ以上の標的細胞が被包された材料（例えば１つ以上のポリヌクレオチド）を形質移入するように、１つ以上の標的細胞を、本明細書に開示される化合物および／または薬学的組成物（例えば、１つ以上のポリヌクレオチドを被包するＨＧＴ４００３に基づく脂質ナノ粒子）と接触させる工程を含む。本明細書で使用される、用語「形質移入する」または「形質移入」とは、１つ以上の被包された材料（例えば核酸および／またはポリヌクレオチド）を細胞、好ましくは標的細胞内に細胞内導入することを指す。導入されたポリヌクレオチドは安定であるか、または標的細胞内に一過的に維持され得る。用語「形質移入の効率」とは、そのような被包された材料（例えばポリヌクレオチド）が形質移入を受ける標的細胞によって取り込まれる、その中に導入される、および／またはそれによって発現される相対的な量を指す。実際に、形質移入の効率は、形質移入後、標的細胞によって生成されたリポーターポリヌクレオチド生成物の量によって推定される。ある実施形態では、本明細書に開示される化合物および薬学的組成物は、高い形質移入の効率を示し、それによって、被包された材料（例えば１つ以上のポリヌクレオチド）の適切な投薬量が病変の部位に送達され、後に発現し、一方、同時に全身性有害作用の可能性を最小限にする可能性を改善する。
薬学的または治療効果を与えることができる広範囲の材料が、本発明の化合物、組成物、および方法を用いて、標的細胞に送達することができる。したがって、本明細書に記載される化合物ならびに薬学的およびリポソーム組成物は、細胞内送達に適する任意の材料を被包するために使用され得る。ある実施形態では、そのような被包された材料は、そのような材料が送達される細胞に対して、治療または診断利益を付与することができ、任意の薬物、生物製剤、および／または診断薬を含み得る。材料は有機または無機であり得る。有機分子は、ペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、ステロール、核酸（ペプチド核酸を含む）、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。ある実施形態では、本明細書に開示される薬学的およびリポソーム組成物は、２種類以上の材料、例えば、タンパク質、酵素、および／またはステロイドをコードする２つ以上の異なるポリヌクレオチド配列を含む、ないしは別の方法で被包することができる。ある実施形態では、被包された材料は１つ以上のポリヌクレオチドおよび核酸である。
本明細書で使用される、用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」とは、遺伝的材料（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）を指すように互換的に使用され、そのような用語が本明細書に記載される化合物および組成物（例えば脂質ナノ粒子）に関して使用されるとき、一般に、そのような化合物および組成物（例えば脂質ナノ粒子）によって被包される遺伝的材料を指す。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。好適なＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、およびｓｎｏＲＮＡを含む。想定されるポリヌクレオチドは、一般にタンパク質をコードしないが、むしろ例えば免疫シグナル伝達、幹細胞生物学、および疾患の発達において機能する大きな遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）も含む。（例えば、Ｇｕｔｔｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，４５８：２２３−２２７（２００９）、およびＮｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ４２：１０３５−１０３６（２０１０）を参照のこと、その内容は参照により本明細書に
組み込まれる）。好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。ある実施形態では、本発明の化合物または薬学的およびリポソーム組成物によって被包されるポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはタンパク質もしくは酵素をコードする安定化されたＲＮＡ（例えば、αガラクトシターゼをコードするｍＲＮＡ）を含む。本発明は、標的細胞による発現が可能であり、それによって国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５８４５７号および米国仮出願第６１／４９４，８８１号（２０１１年６月８日出願）等に開示される（その両方の教示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）そのような標的細胞による機能酵素またはタンパク質の生成（およびある場合では、分泌）を容易にする治療薬としてのそのようなポリヌクレオチド（および特にＲＮＡまたは安定化されたＲＮＡ）の使用を想定する。例えば、ある実施形態では、標的細胞による１つ以上のポリヌクレオチドが発現されるとき、対象が欠乏する機能酵素またはタンパク質（例えば尿素回路酵素またはリソソーム貯蔵障害に関連する酵素）の生成が観察され得る。タンパク質または酵素を限定するために本明細書で使用される、用語「機能」とは、タンパク質または酵素が、生物活性を有するか、または別の方法としては、未変性もしくは正常に機能するタンパク質または酵素と同じもしくは類似する機能を実行することができることを意味する。
本発明との関連において、用語「発現」は、その広い意味において、特定の遺伝子もしくはポリヌクレオチドが少なくとも１つのｍＲＮＡ転写物へ転写される、または少なくとも１つのｍＲＮＡもしくはポリヌクレオチドがタンパク質または酵素に翻訳されるかのいずれかを指すように使用される。例えば、ある実施形態では、本明細書に記載される化合物ならびに薬学的もしくはリポソーム組成物は、機能タンパク質または酵素をコードするポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）を含む。そのようなｍＲＮＡポリヌクレオチドとの関連において、用語「発現」は、そのようなｍＲＮＡが翻訳され（例えば標的細胞により）、それによってコードされるポリペプチドもしくはタンパク質を生成することを指す。
ある実施形態では、本明細書に提供される化合物および薬学的組成物は、１つ以上の標的細胞および組織において異常に発現した核酸およびポリヌクレオチドを調節することができる。したがって、本明細書において、本明細書に記載される有効量の化合物および／または薬学的もしくはリポソーム組成物を対象に投与することにより、対象の疾患を治療する方法も提供される。ある実施形態では、そのような方法は、１つ以上の標的細胞および組織（例えば肝細胞）において、ポリヌクレオチドの発現を強化（例えば増加）する、および／または機能性ポリペプチド生成物の生成および分泌を増加することができる。いくつかの実施形態では、標的細胞または組織は、本明細書に記載される化合物または薬学的およびリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）のうちの１つ以上によって被包されたポリヌクレオチドを異常に発現する。本明細書において、１つ以上の標的細胞、組織、および器官において、１つ以上のポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）の発現を増加させる方法も提供される。一般に、そのような方法は、標的細胞を、１つ以上のポリヌクレオチドを含む、ないしは別の方法で被包する１つ以上の化合物および／または薬学的もしくはリポソーム組成物と接触させることを含む。
ある実施形態では、本明細書に開示される化合物は、リポソームとして、またはリポソームの成分として使用され得る。具体的には、ある実施形態では、本明細書に開示される化合物は、リポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）の脂質（例えばカチオン性脂質）成分として使用され得る。そのようなリポソームは、材料を被包し、そのような材料の、１つ以上の標的細胞、組織、および器官への送達を容易にするために使用され得る。本明細書で使用される、用語「リポソーム」とは、一般に、１つ以上の球状２重層または２重層に配置された脂質（例えば両親媒性脂質）から構成される小胞を指す。ある実施形態では、リポソームは、脂質ナノ粒子（例えば、本明細書に開示されるカチオン性脂質化合物のうちの１つ以上を含む脂質ナノ粒子）である。そのようなリポソームは、親油性材料から形成された膜、および１つ以上の標的細胞、組織、および器官に送達される被包された材
料（例えばポリヌクレオチド）を含む水性内部を有する単層または多層の小胞であり得る。ある実施形態では、本明細書に記載される薬学的およびリポソーム組成物は、１つ以上の脂質ナノ粒子を含む。想定されるリポソームは、脂質ナノ粒子を含む。本明細書において想定されるリポソームおよび脂質ナノ粒子を形成するために使用され得る好適な脂質（例えばカチオン性脂質）の例としては、本明細書に開示される化合物（例えば、ＨＧＴ４００１、ＨＧＴ４００２、ＨＧＴ４００３、ＨＧＴ４００４、および／またはＨＧＴ４００５）のうちの１つ以上が挙げられる。そのようなリポソームおよび脂質ナノ粒子は、Ｃ１２−２００、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、および／またはＨＧＴ５００１、非カチオン性脂質、ヘルパー／コレステロールに基づく脂質、ＰＥＧ修飾された脂質等の追加のカチオン性脂質、ならびにホスファチジル化合物（例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、およびガングリオシド）、および前述の組み合わせまたは混合物も含み得る。
いくつかのカチオン性脂質が文献に記載されており、その多くは商業的に入手可能である。ある実施形態では、そのようなカチオン性脂質は、本明細書に開示される化合物または脂質（例えばＨＧＴ４００３）のうちの１つ以上に加え、本明細書に記載される薬学的またはリポソーム組成物に含まれる。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウムまたは「ＤＯＴＭＡ」が使用される（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４，７４１３（１９８７）、米国特許第４，８９７，３５５）。ＤＯＴＭＡは単独で製剤化されるか、または中性脂肪、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンもしくは「ＤＯＰＥ」、または他のカチオン性もしくは非カチオン性脂質を用いて脂質ナノ粒子内に組み合わされ得る。他の好適なカチオン性脂質は、例えば（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−１５，１８−ジエン−１−アミン（ＨＧＴ５０００）、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−４，１５，１８−トリエン−１−アミン（ＨＧＴ５００１）、および（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−５，１５，１８−トリエン−１−アミン（ＨＧＴ５００２）等の、例えば米国仮特許出願第６１／６１７，４６８号（２０１２年３月２９日出願）（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるイオン化可能なカチオン性脂質、Ｃ１２−２００（第ＷＯ２０１０／０５３５７２号）、２−（２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）−１，３−ジオキソラン−４−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン（ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ））（第ＷＯ２０１０／０４２８７７号、Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２８：１７２−１７６（２０１０）を参照）、２−（２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）−１，３−ジオキソラン−４−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン（「ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ」）、（３Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１７Ｒ）−１０，１３−ジメチル−１７−（（Ｒ）−６−メチルヘプタン−２−イル）−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）プロパン酸塩（「ＩＣＥ」）、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−１５，１８−ジエン−１−アミン（「ＨＧＴ５０００」）、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−ｌ−イル）テトラコサ−４，１５，１８−トリエン−１−アミン（「ＨＧＴ５００１」）、および（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−５，１５，１８−トリエン−１−アミン（「ＨＧＴ５００２」）、５−カルボキシスペルミルグリシン−ジオクタデシルアミドまたは「ＤＯＧ
Ｓ」、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミン−カルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムまたは「ＤＯＳＰＡ」（Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，６９８２（１９８９）、米国特許第５，１７１，６７８号、米国特許第５，３３４，７６１号）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパンまたは「ＤＯＤＡＰ」、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパンまたは「ＤＯＴＡＰ」を含む。想定されるカチオン性脂質は、１，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンもしくは「ＤＳＤＭＡ」、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンもしくは「ＤＯＤＭＡ」、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンもしくは「ＤＬｉｎＤＭＡ」、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンもしくは「ＤＬｅｎＤＭＡ」、Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチル塩化アンモニウムもしくは「ＤＯＤＡＣ」、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチル臭化アンモニウムもしくは「ＤＤＡＢ」、Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロプ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ‐ヒドロキシエチル臭化アンモニウムもしくは「ＤＭＲＩＥ」、３−ジメチルアミノ−２−（コレスト−５−エン−３−β−オキシブタン−４−オキシ）−１−（シス，シス−９，１２−オクタデカジエンオキシ）プロパンもしくは「ＣＬｉｎＤＭＡ」、２−［５’−（コレスト−５−エン−３−β−オキシ）−３’−オキサペントキシ）−３−ジメチル−１−（シス，シス−９’，１−２’−オクタデカジエンオキシ）プロパンもしくは「ＣｐＬｉｎＤＭＡ」、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミンもしくは「ＤＭＯＢＡ」、１，２−Ｎ，Ｎ’−ジオレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパンもしくは「ＤＯｃａｒｂＤＡＰ」、２，３−ジリノレオイルオキシ−Ν，Ν−ジメチルプロピルアミンもしくは「ＤＬｉｎＤＡＰ」、１，２−Ｎ，Ｎ’−ジリノレオイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパンもしくは「ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ」、１，２−ジリノレオイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパンもしくは「ＤＬｉｎＣＤＡＰ」、２，２−ジリノレオイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソランもしくは「ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ」、２，２−ジリノレオイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソランもしくは「ＤＬｉｎ−Ｋ−ＸＴＣ２−ＤＭＡ」、またはそれらの組み合わせも含む（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ
Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ１０７：２７６−２８７（２００５）、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，ＤＶ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（８）：１００３−１００７（２００５）、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／１２１３４８Ａ１号）。組成物（例えば脂質ナノ粒子）を製剤化するためのコレステロールに基づくカチオン性脂質の使用も本発明により想定される。そのようなコレステロールに基づくカチオン性脂質は、単独で、または他のカチオン性もしくは非カチオン性脂質との組み合わせのいずれかで使用され得る。好適なコレステロールに基づくカチオン性脂質は、例えばＤＣ−Ｃｈｏｌ（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−エチルカルボキサミドコレステロール），１，４−ビス（３−Ｎ−オレイルアミノ−プロピル）ピペラジンを含む（Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９，２８０（１９９１）、Ｗｏｌｆ ｅｔ
ａｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２３，１３９（１９９７）、米国特許第５，７４４，３３５号）。
ジアルキルアミノに基づく、イミダゾールに基づく、およびグアニジウムに基づく脂質等のカチオン性脂質も想定される。例えば、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５８４５７号に開示される（参照により本明細書に組み込まれる）、カチオン性脂質（３Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１７Ｒ）−１０，１３−ジメチル−１７−（（Ｒ）−６−メチルヘプタン−２−イル）−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）プロパン酸もしくは「ＩＣＥ」の使用も想定される。
好ましくは本明細書に開示される化合物および脂質のうちの１つ以上との組み合わせで
、本明細書に記載されるリポソームおよび薬学的組成物にＮ−オクタノイル−スフィンゴシン−１−［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）−２０００］（Ｃ８ ＰＥＧ−２０００セラミド）を含む、誘導体化されたセラミド（ＰＥＧ−ＣＥＲ）等のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾されたリン脂質および誘導化された脂質の使用および包含も想定される。想定されるＰＥＧ修飾された脂質は、長さがＣ６−Ｃ２０のアルキル鎖（複数可）で脂質に共有結合される、長さが最大５ｋＤａのポリエチレングリコール鎖を含むが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法に採用されるＰＥＧ修飾された脂質は、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロール，メトキシポリエチレングリコール（２０００ＭＷ ＰＥＧ）（「ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００」）である。ＰＥＧ修飾された脂質を脂質送達ビヒクルに添加することにより、複雑な凝集を防止することができ、循環寿命を増加させ、脂質−ポリヌクレオチド組成物の標的組織への送達を増加させるための手段も提供するか（Ｋｌｉｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（１９９０）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２６８（１）：２３５−２３７）、またはそれらは生体内で製剤から外に迅速に交換されるように選択され得る（米国特許第５，８８５，６１３号を参照）。特に有用な交換可能脂質は、短いアシル鎖（例えばＣ１４またはＣ１８）を有するＰＥＧ−セラミドである。本発明のＰＥＧ修飾されたリン脂質および誘導化された脂質は、リポソーム脂質ナノ粒子に存在する総脂質の約０％〜約２０％、約０．５％〜約２０％、約１％〜約１５％、約４％〜約１０％、または約２％のモル比を含み得る。
本発明は、薬学的またはリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）のうちの１つ以上における非カチオン性脂質の使用も想定する。そのような非カチオン性脂質は、好ましくは、本明細書に開示される化合物および脂質のうちの１つ以上と組み合わせて使用される。本明細書で使用される、句「非カチオン性脂質」とは、任意の中性、双極性イオン、またはアニオン性の脂質を指す。本明細書で使用される、句「アニオン性脂質」とは、生理学的ｐＨ等の選択されたｐＨで、正味負電荷を持つ多くの脂質種のいずれかを指す。非カチオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸塩（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ＤＬＰＥ（１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＰＰＳ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−トランスＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、セラミド、スフィンゴミエリン、コレステロール、またはそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。そのような非カチオン性脂質は単独で使用することができるが、好ましくは、他の賦形剤、例えば本明細書に開示されるカチオン性脂質化合物（例えばＨＧＴ４００１、ＨＧＴ４００２、ＨＧＴ４００３、ＨＧＴ４００４、および／またはＨＧＴ４００５）のうちの１つと組み合わせて使用される。カチオン性脂質と組み合わせて使用されるとき、非カチオン性脂質は、脂質ナノ粒子に存在する総脂質の５％〜約９０％、または好ましくは約１０％〜約７０％のモル比を含み得る。
本明細書に記載される薬学的またはリポソーム組成物を含む脂質ナノ粒子にポリマーを含むことも想定される。好適なポリマーは、例えば、ポリアクリレート、ポリアルキシアノアクリレート、ポリアクチド、ポリアクチド−ポリグリコシドコポリマー、ポリカプロラクトン、デキストラン、アルブミン、ゼラチン、アルギン酸塩、コラーゲン、キトサン
、シクロデキストリン、およびポリエチレンイミンを含み得る。そのようなポリマーは単独で使用することができるが、好ましくは、他の賦形剤、例えば本明細書に開示されるカチオン性脂質化合物（例えばＨＧＴ４００１、ＨＧＴ４００２、ＨＧＴ４００３、ＨＧＴ４００４、および／またはＨＧＴ４００５）のうちの１つと組み合わせて使用される。
ある実施形態では、薬学的およびリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）は、一部、標的細胞への形質移入（例えばポリヌクレオチドの）を容易にするその能力に基づき製剤化される。別の実施形態では、薬学的およびリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）は、ポリヌクレオチドの標的細胞、組織、または器官への送達を最適化するように選択および／または調製され得る。例えば、標的細胞が肝細胞である場合、薬学的および／またはリポソーム組成物（例えば大きさ、電荷、および／またはｐＨ）の性質は、そのような組成物（例えば脂質ナノ粒子）を標的細胞または器官に効率的に送達する、免疫クリアランスを低下させる、および／またはその標的器官における保持を促進するように最適化され得る。別の方法としては、標的組織が中枢神経系である場合、薬学的およびリポソーム組成物の選択および調製は、血液脳関門に浸透させる、およびその内に保持する、ならびに／またはそのような組成物（例えば脂質ナノ粒子）をそのような標的組織に直接送達する代替え手段（例えば脳血管内投与を介して）を使用することを考慮しなければならない。ある実施形態では、薬学的もしくはリポソーム組成物またはその構成要素である脂質ナノ粒子は、被包された材料の移動を容易にする薬剤（例えば、血液脳関門への浸透を妨害または改善し、それによってそのような被包されたポリヌクレオチドの標的細胞への移動を強化する薬剤）と組み合わされ得る。本明細書に記載される薬学的およびリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）は、１つ以上のポリヌクレオチド等の被包された材料の標的細胞への導入を容易にすることができ、ポリカチオン（例えばポリＬ−リジンおよびプロタミン）を、例えばコポリマーとして薬学的組成物を含む脂質ナノ粒子のうちの１つ以上に付加することによっても容易にすることができ、いくつかの場合では、生体外および生体内における多くの細胞系において、いくつかの種類のカチオン性リポソームの形質移入の効率を２〜２８倍顕著に強化する。（Ｎ．Ｊ．Ｃａｐｌｅｎ，ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９５；２：６０３、Ｓ．Ｌｉ，ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９７；４，８９１を参照。）
本発明のある実施形態では、薬学的およびリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）は、１つ以上の材料または治療薬（例えばポリヌクレオチド）を被包するように調製される。所望の治療薬（例えばｍＲＮＡ）をリポソームまたは脂質ナノ粒子中に組み込むプロセスは、本明細書において、「充填」または「被包」と称される（Ｌａｓｉｃ，ｅｔ ａｌ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，３１２：２５５−２５８，１９９２）。脂質ナノ粒子充填または被包された材料（例えばポリヌクレオチド）は、脂質ナノ粒子の内部空間、脂質ナノ粒子の２重層膜内に完全に、または部分的に位置するか、または脂質ナノ粒子の外表面に会合し得る。
例えばポリヌクレオチドを脂質ナノ粒子中に充填または被包することにより、そのようなポリヌクレオチドを迅速に排出させる、そのようなポリヌクレオチドおよび／または系もしくは受容体を分解する酵素もしくは化学物質（例えば血清）を含み得る環境からポリヌクレオチドを保護する働きをする可能性がある。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物は、特にそのようなポリヌクレオチドが曝される環境に関して、それによって被包されたポリヌクレオチド（複数可）の安定性を強化することができる。例えばポリヌクレオチド等の材料を、本明細書に記載される薬学的およびリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）のうちの１つ以上の中に被包することにより、そのようなポリヌクレオチドの標的細胞および組織内への送達も容易にする。例えば、本明細書に記載される脂質化合物のうちの１つ以上を含む脂質ナノ粒子は、被包されたポリヌクレオチドを標的細胞に到達させことができるか、または被包されたポリヌクレオチドを優先的
に標的細胞または器官に差別的に到達させることができる（例えば脂質ナノ粒子は、そのような脂質ナノ粒子が投与される対象の肝臓または脾臓において濃縮され得る）。別の方法としては、脂質ナノ粒子は、被包されたポリヌクレオチドの、被包されたポリヌクレオチドの存在が望ましくない、または利用を限定するものであり得る他の非標的細胞または器官への送達を制限することができる。
ある実施形態では、本明細書に記載される薬学的およびリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）は、複数の脂質成分（例えば、本明細書に開示される化合物のうちの１つ以上）を１つ以上のポリマー成分と組み合わせることにより調製される。例えば、脂質ナノ粒子は、ＨＧＴ４００３、ＤＯＰＥ、ＣＨＯＬ、およびＤＭＧ−ＰＥＧ２０００を用いて調製され得る。脂質ナノ粒子は、例えばＨＧＴ４００１、ＤＯＰＥ、およびＤＭＧ−ＰＥＧ２０００を含む、様々な割合の追加の脂質の組み合わせから構成され得る。脂質ナノ粒子を含むカチオン性脂質、非カチオン性脂質、および／またはＰＥＧ修飾された脂質の選択、ならびにそのような脂質の相互に対する相対的モル比は、選択された脂質（複数可）の特性、意図される標的細胞または組織の性質、および脂質ナノ粒子によって送達される材料またはポリヌクレオチドの特性に基づく。さらなる考慮事項は、例えば、アルキル鎖の飽和、ならびに選択された脂質（複数可）の大きさ、電荷、ｐＨ、ｐＫａ、膜融合性、および毒性を含む。
本明細書で使用するための薬学的およびリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）は、現在当該技術分野において既知である様々な技法により調製され得る。多層小胞（ＭＬＶ）は、例えば、脂質を適切な溶剤に溶解し、次いで溶剤を蒸発させ、器の内部上に薄いフィルムを残すことにより、または噴霧乾燥により、選択された脂質を好適な容器もしくは器の内壁上に堆積させることによる従来の技法により調製され得る。次いで、ＭＬＶの形成をもたらす渦動運動している器に水相が添加され得る。次いで、単層小胞（ＵＬＶ）は、均質化、音波処理、または多層小胞の押出により形成され得る。加えて、単層小胞は洗剤除去法により形成され得る。
ある実施形態では、本発明の薬学的およびリポソーム組成物は、被包されたポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）が脂質ナノ粒子の両表面上に会合され、同じ脂質ナノ粒子内に被包される、脂質ナノ粒子を含む。例えば、本発明の組成物の調製中、本明細書に記載され、脂質ナノ粒子を含むカチオン性脂質化合物のうちの１つ以上は、ポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）と、そのようなポリヌクレオチドとの静電相互作用を通して会合し得る。
ある実施形態では、本発明の薬学的およびリポソーム組成物は、生体外および生体内用途の両方で検出可能である診断用放射性核種、蛍光材料、または他の材料で充填され得る。例えば、本発明に使用するための好適な診断材料は、ローダミン−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（Ｒｈ−ＰＥ）、緑色蛍光タンパク質ｍＲＮＡ（ＧＦＰ ｍＲＮＡ）、ウミシイタケルシフェラーゼｍＲＮＡ、およびホタルルシフェラーゼｍＲＮＡを含み得る（配列番号１）。
本明細書に記載されるリポソーム組成物の調製中、水溶性の担体薬剤も、水和溶液にそれらを含むことにより水性内部に被包され得、親油性分子は、脂質製剤に含まれることにより脂質２重層中に組み込まれ得る。ある分子（例えば、カチオン性またはアニオン性の親油性ポリヌクレオチド）の場合において、ポリヌクレオチドの予め形成された脂質ナノ粒子またはリポソーム内への充填は、例えば、米国特許第４，９４６，６８３号に記載される方法（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）により達成され得る。ポリヌクレオチドの被包後、脂質ナノ粒子は、ゲルクロマトグラフィー、膜分離精製法、または限外濾過等のプロセスを通して被包されていないｍＲＮＡを除去するために処理され得る
。例えば、本明細書に記載されるリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）の表面から外部的に結合されたポリヌクレオチドを除去することが望ましい場合、そのような脂質ナノ粒子は、ジエチルアミノエチルＳＥＰＨＡＣＥＬカラムに曝すことができる。
被包された材料（例えばポリヌクレオチドまたは１つ以上の治療薬もしくは診断剤）に加え、脂質ナノ粒子に含まれるか、または被包され得る。例えば、そのような追加治療薬は、脂質ナノ粒子の表面と会合し得、脂質製剤に含む、または予め形成された脂質ナノ粒子内に充填することにより、脂質ナノ粒子の脂質２重層中に組み込まれ得る（米国特許第５，１９４，６５４号および第５，２２３，２６３号を参照、参照により本明細書に組み込まれる）。
本明細書に開示されるリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）の大きさを減少させる、または「寸法決定」するための方法がいくつかあり、寸法決定が本発明の一部として使用されるとき、一般に、それらの方法のいずれかを採用することができる。押出方法は、リポソーム寸法決定の一方法である。（Ｈｏｐｅ，Ｍ Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｓｉｚｅ ａｎｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｂｙ Ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｉｎ：Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｅｄ．）Ｖｏｌ．１．ｐ１２３（１９９３））。本方法は、リポソームの大きさを比較的明確に定義された大きさ分布に減少させるために、小さい細孔のポリカーボネート膜または非対称セラミック膜を通してリポソームを押出すことからなる。典型的に、所望のリポソームの大きさ分布が達成されるまで、膜を通して１回以上懸濁液が巡回される。リポソームは、リポソームの大きさの漸進的な減少を達成するように、連続的により小さい細孔膜を通して押出され得る。
脂質ナノ粒子の集団を寸法決定するために、当該技術分野において既知の様々な代替え方法が利用可能である。そのような寸法決定の一方法は、米国特許第４，７３７，３２３号に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。槽またはプローブ超音波処理のいずれかによるリポソームまたは脂質ナノ粒子懸濁液を超音波処理することにより、直径が約０．０５ミクロン未満の小さいＵＬＶに漸進的に大きさの減少をもたらす。均質化は、大きいリポソームをより小さいものに細分化するための、せん断エネルギーに依存する別の方法である。典型的な均質化手順において、ＭＬＶは、典型的に約０．１〜０．５ミクロンの選択されたリポソームの大きさが観察されるまで、標準的なエマルジョンホモジナイザーを通して再循環される。脂質ナノ粒子の大きさは、Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０：４２１−４５０（１９８１）（参照により本明細書に組み込まれる）に記載される擬電場光散乱（ＱＥＬＳ）により決定され得る。平均脂質ナノ粒子直径は、形成された脂質ナノ粒子の音波処理により減少させることができる。間欠超音波処理周期は、十分なリポソーム合成を誘導するためにＱＥＬＳ評価と交互に行われてもよい。
本明細書に記載されるリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）の適切な大きさの選択は、標的細胞または組織の部位、およびある程度脂質ナノ粒子が作製される用途を考慮しなければならない。本明細書で使用される、句「標的細胞」とは、本明細書に記載される薬学的およびリポソーム組成物のうちの１つ以上が誘導される、または標的とされる細胞を指す。いくつかの実施形態では、標的細胞は、特定の組織または器官を含む。いくつかの実施形態では、標的細胞は、関心のタンパク質または酵素が欠乏している。例えば、ポリヌクレオチドを肝細胞に送達することが所望される場合、肝細胞は標的細胞を表す。いくつかの実施形態では、本発明の薬学的またはリポソーム組成物（および例えばその中に被包されたポリヌクレオチド材料）は、非差別的に標的細胞に形質移入される（すなわち、非標的細胞に形質移入されない）。本発明の組成物および方法は、肝細胞、上皮細胞、
造血細胞、上皮細胞、内皮細胞、肺細胞、骨細胞、幹細胞、間葉細胞、神経細胞（例えば、髄膜、星状膠細胞、運動神経、後根神経節および前角運動神経の細胞）、光受容細胞（例えば、杆体錐体）、網膜色素上皮細胞、分泌細胞、心細胞、脂肪細胞、血管平滑筋細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、β細胞、下垂体細胞、滑液系統細胞、卵巣細胞、精巣細胞、線維芽細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、網状赤血球、白血球、顆粒球、および腫瘍細胞を含むがこれらに限定されない、様々な標的細胞を優先的に標的とするように調製され得る。
例えば、本明細書に開示される薬学的またはリポソーム組成物を含む１つ以上の脂質ナノ粒子に被包されたポリヌクレオチドによる１つ以上の標的細胞への形質移入後、そのようなポリヌクレオチドによってコードされた生成物（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）の生成が、好ましくは刺激され得、そのような標的細胞がポリヌクレオチドを発現し、例えば関心のポリペプチドまたはタンパク質を生成する能力が強化される。例えば、ｍＲＮＡを被包する１つ以上の化合物または薬学的組成物による標的細胞への形質移入は、そのようなｍＲＮＡによってコードされるタンパク質または酵素の生成を強化（すなわち増加）する。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドのある細胞または組織への形質移入を制限することが望ましい場合がある。例えば、肝臓は、一部、代謝およびタンパク質の生成におけるその中心的な役割のため、本発明の組成物に重要な標的器官を表し、したがって肝臓特異的遺伝子生成物（例えば尿素回路障害）における異常により生じる疾患は、細胞（例えば肝細胞）の特異的標的によって利益を得る場合がある。したがって、本発明のある実施形態では、標的組織の構造的特性は、本発明の薬学的およびリポソーム組成物（例えばＨＧＴ４００１に基づく脂質ナノ粒子）をそのような標的組織に直接分布されるのを誘導するために利用され得る。例えば、肝細胞を標的とするために、本明細書に記載される薬学的またはリポソーム組成物を含む脂質ナノ粒子のうちの１つ以上は、その寸法が肝臓の内皮層系統肝類洞の開窓よりも小さいように寸法決定され得、したがって、そのような脂質ナノ粒子のうちの１つ以上は、そのような内皮開窓を容易に透過し、標的肝細胞に到達することができる。別の方法としては、脂質ナノ粒子は、リポソームの寸法がある細胞または組織内への分布を制限する、または明確に回避するのに十分な直径のものであるように寸法決定され得る。例えば、本明細書に記載される薬学的およびリポソーム組成物を含む脂質ナノ粒子は、その直径が内皮層系統肝類洞の開窓より大きく、それによってリポソーム脂質ナノ粒子の幹細胞への分布を制限するように寸法決定され得る。そのような実施形態では、大きいリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）は、内皮開窓を容易に透過せず、代わりに、肝臓の類洞を覆うマクロファージクッパー細胞により除去されるだろう。したがって、例えば薬学的組成物を含む脂質ナノ粒子の寸法決定は、被包されたポリヌクレオチドの発現が１つ以上の標的細胞において強化され得る程度をさらに操作し、正確に制御する機会を提供することができる。一般に、本発明の薬学的およびリポソーム組成物を含む脂質ナノ粒子のうちの少なくとも１つの大きさは、約２５〜２５０ｎｍの範囲内、好ましくは約２５０ｎｍ、１７５ｎｍ、１５０ｎｍ、１２５ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍ、２５ｎｍ、または１０ｎｍ未満である。
同様に、本発明の組成物は、心臓、肺、腎臓、脾臓等の他の標的組織、細胞、または器官に優先的に分布されるように調製され得る。例えば、本発明の脂質ナノ粒子は、標的細胞および組織への送達の強化を達成するように調製され得る。したがって、本発明の組成物は、組織または細胞をさらに標的とするために、追加のカチオン性、非カチオン性、およびＰＥＧ修飾された脂質で富化され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される化合物ならびに薬学的およびリポソーム組成物（例えばＨＧＴ４００２に基づく脂質ナノ粒子）は、その中に被包されたポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）の送達、形質移入、および後の肝臓の細胞および組織によ
る発現、ならびにそのようなポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドまたはタンパク質の対応する生成を強化するために、肝臓の細胞および組織に分布される。そのような組成物は肝臓の細胞および組織内に優先的に分布されるが、発現したポリヌクレオチドの治療効果およびそれによってコードされたタンパク質の後の生成は、標的細胞および組織に制限される必要はない。例えば、標的幹細胞は、例えば、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５８４５７号および米国仮出願第６１／４９４，８８１号（その教示は両方とも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示される機能タンパク質もしくは酵素を発現または生成し、全身的もしくは抹消的に排出することができる「リザーバ」または「貯蔵所」として機能することができる。したがって、本発明のある実施形態では、本明細書に記載される薬学的およびリポソーム組成物を含む脂質ナノ粒子（例えばＨＧＴ４００５に基づく脂質ナノ粒子）のうちの１つ以上は、肝細胞を標的とし、かつ／または送達時に肝臓の細胞および組織に優先的に分布され得る。そのような脂質ナノ粒子のうちの１つ以上に被包されたポリヌクレオチドによる標的幹細胞への形質移入後、そのような機能生成物が所望の治療効果を及ぼすことが可能である場所に、そのようなポリヌクレオチドが発現し（例えば翻される）、機能生成物（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）が分泌され、全身的に分布される。
本明細書に記載される化合物または薬学的およびリポソーム組成物のうちの１つ以上に被包されたポリヌクレオチドは、標的細胞または組織に送達および／または形質移入され得る。いくつかの実施形態では、被包されたポリヌクレオチドは発現することができ、機能ポリペプチド生成物が標的細胞によって生成され（いくつかの場合では分泌される）、それによって例えば標的細胞または組織に有益な性質を付与する。そのような被包されたポリヌクレオチドは、例えば、ホルモン、酵素、受容体、ポリペプチド、ペプチド、または関心の他のタンパク質をコードすることができる。ある実施形態では、そのような被包されたポリヌクレオチドは、内因性核酸または遺伝子の発現を調節する、ないしは別の方法で減少させる、または排除する目的のために、低干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡをコードすることもできる。ある実施形態では、そのような被包されたポリヌクレオチドは本来天然であるか、または組み換えであってもよく、センスまたはアンチセンスのいずれかの機構の作用を用いて（例えば標的遺伝子または核酸の発現を調節することにより）、治療活性を及ぼすことができる。
いくつかの実施形態では、被包されたポリヌクレオチド（例えば、欠乏タンパク質をコードするｍＲＮＡ）は、任意に、例えばそのようなポリヌクレオチドの安定性および／もしくは半減期を改善する、またはそのようなポリヌクレオチドの翻訳を改善する、ないしは別の方法で容易にする化学修飾または生物学的修飾を含む。
例えば２つの独特の治療薬またはポリヌクレオチドを単一脂質ナノ粒子に組み合わせることによって、本発明に記載される化合物または薬学的およびリポソーム組成物により、１つ以上の独特のポリヌクレオチドを標的細胞に共送達することも本明細書により想定される。単一の障害または欠乏を治療するために、１つ以上の被包されたポリヌクレオチドを１つ以上の標的細胞に送達することも想定され、それぞれのそのようなポリヌクレオチドは異なる機構の作用によって機能する。例えば、本発明の薬学的またはリポソーム組成物は、例えば脂質ナノ粒子に被包され、内因性タンパク質または酵素欠乏を補正することが意図される第１のポリヌクレオチドと、機能不全の内因性ポリヌクレオチドおよびそのタンパク質もしくは酵素生成物を不活性化または「ノックダオウン」することが意図される第２のポリヌクレオチドとを含み得る。そのような被包されたポリヌクレオチドは、例えばｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡをコードすることができる。
生体外転写されたポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）は標的細胞内に形質移入され得るが、そのようなポリヌクレオチドは、生体内で細胞により容易にかつ効率的に分解され
得、よってそのようなポリヌクレオチドを無効にする。さらに、いくつかのポリヌクレオチドは、体液において（特にヒトの血清）不安定であり、標的細胞に到達しないうちに分解または消化され得る。加えて、細胞内で、天然のｍＲＮＡは、３０分〜数日の半減期で減衰し得る。したがって、ある実施形態では、本明細書に提供される被包されたポリヌクレオチド、特に本明細書に提供されるｍＲＮＡポリヌクレオチドは、好ましくは、１つ以上の標的細胞内で発現するか、または翻訳され、それによって機能タンパク質または酵素を生成する少なくともいくつかの能力を保持する。
ある実施形態では、薬学的およびリポソーム組成物は、本明細書に開示される脂質化合物のうちの１つ以上と、遺伝子の発現を調節する、または１つ以上の標的細胞内で機能ポリペプチドもしくはタンパク質を生成するように発現または翻訳され得る、１つ以上の安定したポリヌクレオチド（例えば、生体内ヌクレアーゼ消化または分解に対して安定化されたｍＲＮＡ）を含む、または被包する１つ以上の脂質ナノ粒子とを含む。ある実施形態では、そのような被包されたポリヌクレオチド（例えば機能タンパク質または酵素をコードするｍＲＮＡ）の活性は、長期間にわたり延長される。例えば、ポリヌクレオチドの活性は、薬学的組成物が半週または隔週で、またはより好ましくは毎月、隔月、４半期、または年１回、対象に投与され得るように延長される。本発明の薬学的組成物、特に被包されたｍＲＮＡの活性の拡張または延長は、そのようなｍＲＮＡから翻訳された機能タンパク質または酵素の量に直接関係する。同様に、本発明の組成物の活性は、ｍＲＮＡポリヌクレオチドの翻訳をさらに改善または強化するために行われる化学修飾によってさらに拡張または延長され得る。例えば、コザックコンセンサス配列はタンパク質の翻訳の開始に関与し、そのようなコザックコンセンサス配列を被包されたｍＲＮＡポリヌクレオチドに含むことにより、ｍＲＮＡポリヌクレオチドの活性をさらに拡張または延長させることができる。さらに、標的細胞によって生成された機能タンパク質または酵素の量は、標的細胞に送達されたポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）の量、およびそのようなポリヌクレオチドの安定性の関数である。本発明の化合物または組成物によって被包されたポリヌクレオチドの安定性が、改善または強化され得る程度において、半減期、翻訳されたタンパク質または酵素の活性、および化合物の投与頻度がさらに拡張され得る。
ある実施形態では、ポリヌクレオチドは、安定性（例えば、野生型または天然に存在するｍＲＮＡの型および／または標的細胞に天然に内因性であるｍＲＮＡの型に対する安定性）を付与するために、化学的に修飾され得る。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に提供される被包されたポリヌクレオチドは、例えば生体内でのヌクレアーゼ消化に対する耐性の改善を含む、増加または強化された安定性をポリヌクレオチドに与える少なくとも１つの化学修飾を含む。本明細書で使用される、句「化学修飾」および「化学的に修飾された」は、そのような用語が本明細書に提供されるポリヌクレオチドに関するとき、好ましくは安定性を強化し、野生型または天然に生じるそのポリヌクレオチドの型よりも安定性（例えばヌクレアーゼ消化に対する耐性）をポリヌクレオチドに付与する少なくとも１つの変更を含む。用語「安定した」および「安定性」は、そのような用語が本発明の化合物または薬学的およびリポソーム組成物によって被包されたポリヌクレオチドに関するとき、特にｍＲＮＡに対するとき、通常そのようなＲＮＡを分解することが可能であるヌクレアーゼ（すなわち、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ）による分解に対して増加または強化された耐性を指す。安定性の増加は、例えば、加水分解、あるいは内因性酵素（例えば、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ）または標的細胞もしくは組織内の状態による他の破壊に対する低感受性、それによって標的細胞、組織、対象、および／または細胞質におけるそのようなポリヌクレオチドの耐性を増加または強化することを含み得る。本明細書に提供される安定化されたポリヌクレオチド分子は、その天然に存在する未修飾の対応物（例えばポリヌクレオチドの野生型の型）よりも長い半減期を示す。
例えばタンパク質の翻訳開始において機能する配列（例えばコザックコンセンサス配列）の包含を含む、ｍＲＮＡポリヌクレオチドの翻訳を改善または強化する変更も、句「化学修飾」および「化学的に修飾された」によって、そのような用語が本発明の化合物または薬学的およびリポソーム組成物により被包されたポリヌクレオチドに関するとき、想定される。（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ１５（２０）：８１２５−４８（１９８７））。本明細書で使用される、句「化学修飾」は、天然に存在するポリヌクレオチドに見られるものと異なる化学物質を導入する修飾、例えば、修飾されたヌクレオチドの導入（例えば、ヌクレオチド類似体、またはそのようなポリヌクレオチド分子において天然に見られないペンダント基の包含）等の共有結合修飾も含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つ以上の脂質ナノ粒子における被包前に、それらにより安定性を付与するために、化学修飾または生物学的修飾を受けた。ポリヌクレオチドに対する例示的な化学修飾は、塩基の欠失（例えば、１つのヌクレオチドの欠失により、または１つのヌクレオチドを別のものと置換することにより）、または塩基の化学修飾を含む。
加えて、好適な修飾は、コドンが同じアミノ酸をコードするが、ポリヌクレオチドの野生型の型に見られるコドンより安定するように、コドンの１つ以上のヌクレオチドにおける変更を含む。例えば、ＲＮＡの安定性と高い数のシチジン（Ｃ）および／またはウリジン（Ｕ）残基との間の反比例関係が示され、ＣおよびＵ残基を欠失するＲＮＡは、大半のＲＮａｓｅｓに対して安定であることが分かった（Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２６９，２１３１−８（１９９４））。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ配列におけるＣおよび／またはＵ残基の数が減少した。別の実施形態では、Ｃおよび／またはＵ残基の数は、特定のアミノ酸をコードする１つのコドンを、同じまたは関連するアミノ酸をコードする別のコドンと置換することによって減少する。本発明の化合物または薬学的およびリポソーム組成物により被包されたｍＲＮＡポリヌクレオチドに対して想定される修飾は、プソイドウリジンの組み込みも含む。プソイドウリジンを、本発明の化合物または薬学的およびリポソーム組成物により被包されたｍＲＮＡポリヌクレオチドの中に組み込むことにより、安定性および翻訳能力ならびに生体内の免疫原性の縮小を強化することができる。（例えば、Ｋａｒｉｋｏ’，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ１６（１１）：１８３３−１８４０（２００８）を参照）。本発明の化合物または薬学的およびリポソーム組成物によって被包されたポリヌクレオチドに対する置換および修飾は、容易に当業者に既知の方法によって実施され得る。
配列におけるＣおよびＵ残基の数の減少に対する制限は、非翻訳領域と比較して、ｍＲＮＡのコード領域内で大きい可能性がある（すなわち、メッセージが所望のアミノ酸配列をコードする能力をなお維持しながら、メッセージに存在するＣおよびＵ残基の全てを排除することは不可能であり得る）。しかしながら、遺伝コードの縮退は、同じコード能を保持しながら、配列に存在するＣおよび／またはＵ残基の数を減少させる機会を提示する（すなわち、どのアミノ酸がコドンによってコードされるかに依存し、ＲＮＡ配列の修飾のいくつかの異なる可能性が可能であり得る）。例えば、Ｇｌｙのコドンは、ＧＧＵまたはＧＧＣの代わりに、ＧＧＡまたはＧＧＧに変更され得る。
用語「化学修飾」は、例えば非ヌクレオチド連結または修飾されたヌクレオチドを本発明のポリヌクレオチド配列（例えば、機能タンパク質または酵素をコードするｍＲＮＡ分子の３’および５’のうちの１つまたはその両方に対する末端遮断修飾）の組み込みも含む。そのような修飾は、塩基のポリヌクレオチド配列への付加（例えば、ポリＡ末端またはより長いポリＡ末端の包含）、３’ＵＴＲまたは５’ＵＴＲの変更、ポリヌクレオチドの薬剤（例えば、タンパク質または相補的ポリヌクレオチド分子）との複合化、および（例えば二次構造を形成する）ポリヌクレオチド分子の構造を変更する要素の包含を含み得る。
ポリＡ末端は、天然メッセンジャーおよび合成センスＲＮＡを安定化させると考えられる。したがって、ある実施形態では、長いポリＡ末端は、ｍＲＮＡ分子に付加され、よってＲＮＡにより安定性を付与することができる。ポリＡ末端は、様々な当該技術分野で認識される技法を用いて付加することができる。例えば、長いポリＡ末端は、ポリＡポリメラーゼを用いて合成または生体外転写されたＲＮＡに付加することができる（Ｙｏｋｏｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１９９６；１４：１２５２−１２５６）。転写ベクターも長いポリＡ末端をコードすることができる。加えて、ポリＡ末端は、ＰＣＲ生成物から直接転写することによって付加することができる。ポリＡは、ＲＮＡリガーゼを用いてセンスＲＮＡの３’端にも連結され得る（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，ｅｄ． ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：１９９１ ｅｄｉｔｉｏｎ）を参照）。ある実施形態では、ポリＡ末端の長さは、少なくとも約９０、２００、３００、４００、少なくとも５００ヌクレオチドである。ある実施形態では、ポリＡ末端の長さは、本発明の修飾されたセンスｍＲＮＡ分子の安定性、よってタンパク質の転写を制御するために調節される。例えば、ポリＡ末端の長さはセンスｍＲＮＡ分子の半減期に影響を及ぼすことができるため、ポリＡ末端の長さは、ｍＲＮＡのヌクレアーゼに対する耐性のレベルを変更し、それによって標的細胞におけるポリヌクレオチドの発現およびタンパク質の生成の経過時間を制御するように調節され得る。ある実施形態では、安定化されたポリヌクレオチド分子は、生体内での分解に対して十分に耐性であるため（例えばヌクレアーゼによって）それらは脂質ナノ粒子なしで標的細胞に送達され得る。
ある実施形態では、化学修飾は、本発明の薬学的組成物を含む１つ以上のポリヌクレオチドの末端遮断修飾である。例えば、そのようなポリヌクレオチドは、野生型ポリヌクレオチドにおいて天然に見られない３’および／または５’非翻訳（ＵＴＲ）配列を組み込むことによって修飾され得る。ある実施形態では、天然にｍＲＮＡに隣接し、第２の無関係なタンパク質をコードする３’および／または５’隣接配列は、それを修飾するために、タンパク質または機能タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の中に組み込むことができる。例えば、安定しているｍＲＮＡ分子からの３’または５配列（例えば、グロビン、アクチン、ＧＡＰＤＨ、チューブリン、ヒストン、またはクエン酸回路酵素）は、センスｍＲＮＡ分子の安定性を増加させるために、センスｍＲＮＡポリヌクレオチド分子の３’および／または５’領域の中に組み込むことができる。
ポリヌクレオチドの３’端および５’端のうちの１つまたは両方に行われたポリヌクレオチド配列に対する修飾も、本発明によって想定される。例えば、本発明は、ヌクレアーゼ耐性を改善する、および／またはポリヌクレオチド（例えば配列番号１等）の半減期を改善するために、ＣＭＶ最初期１（ＩＥ１）遺伝子またはその断片の部分配列を含む、ポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）の３’端および／または５’端に対する修飾を想定する。ｍＲＮＡポリヌクレオチド配列の安定性の増加に加え、ＣＭＶ最初期１（ＩＥ１）遺伝子の部分配列を（例えば、ｍＲＮＡの５’非翻訳領域および３’非翻訳領域のうちの１つ以上に）含むことにより、ｍＲＮＡの翻訳をさらに強化することが意外にも分かった。ポリヌクレオチド（例えば配列番号２等）をさらに安定化させるために、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子からの配列またはその断片を、ポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）の３’端および５’端のうちの１つまたは両方に含むことも想定される。一般に、想定される化学修飾は、その未修飾対応物よりもポリヌクレオチドの安定性および／または薬物動態性質（例えば半減期）を改善し、例えば、生体内でのヌクレアーゼ消化に対するそのようなポリヌクレオチドの耐性を改善するために行われる修飾を含む。
いくつかの実施形態では、薬学的組成物、その中に含まれる２つ以上の脂質ナノ粒子、
またはそのような脂質ナノ粒子によって被包されるポリヌクレオチドは、安定化試薬を含み得る。組成物は、ポリヌクレオチドに直接または間接的に結合し、ポリヌクレオチドを安定化させ、それによって標的細胞の細胞質における滞留時間を強化する１つ以上の製剤試薬を含み得る。そのような試薬は、好ましくは、標的細胞において、ポリヌクレオチドの半減期の改善をもたらす。例えば、ｍＲＮＡの安定性および翻訳の効率は、細胞内で天然に生じるポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）と複合体を形成する「安定化試薬」の組み込みにより増加させることができる（例えば米国特許第５，６７７，１２４号を参照）。安定化試薬の組み込みは、例えば薬学的組成物を含む１つ以上の脂質ナノ粒子内にｍＲＮＡを充填または被包する前に、ポリＡおよびタンパク質を生体外で安定化されるｍＲＮＡと組み合わせることにより達成され得る。例示的な安定化試薬は、１つ以上のタンパク質、ペプチド、アプタマー、翻訳補助タンパク質、ｍＲＮＡ結合タンパク質、および／または翻訳開始因子を含む。
本明細書に記載される薬学およびリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）の安定化は、脂質ナノ粒子に化学的または物理的に結合される、ないしは別の方法で組み込まれる（例えば、脂質可溶性アンカーの膜自体内への挿入により、または膜脂質の活性基に直接結合することにより）典型的に大きい親水性ポリマーであるオプソニン化阻害部分の使用によっても改善され得る。これらのオプソニン化阻害親水性ポリマーは、マクロファージ−単球系および細網内皮系によるリポソームの取り込みを著しく減少させる保護表面層を形成する（例えば米国特許第４，９２０，０１６号に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる）。例えば、細網内皮系による脂質ナノ粒子の取り込みにおける遅延は、細網内皮系によるリポソームに基づく脂質ナノ粒子の認識および取り込みを遮蔽するために、脂質ナノ粒子上に、またはその中に親水性ポリマー表面コーティングを付加することにより容易にすることができる。例えば、ある実施形態では、本明細書に開示される薬学的組成物を含む脂質ナノ粒子のうちの１つ以上は、そのような脂質ナノ粒子の標的細胞および組織への送達をさらに強化するために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーまたはＰＥＧ修飾された脂質を含む。
ＲＮＡが相補的ポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）とハイブリッド形成するとき、ヌクレアーゼから保護され得る。（Ｋｒｉｅｇ，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｌｔｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．１９８７；１５５，３９７−４１５）。ハイブリッド形成されたｍＲＮＡの安定性は、大半のＲＮａｓｅｓの固有の１本鎖特異性による可能性が高い。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを複合化するように選択された安定化試薬は、真核生物のタンパク質（例えば哺乳類のタンパク質）である。さらに別の実施形態では、センス療法に使用するポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）は、第２のポリヌクレオチド分子とハイブリッド形成することにより修飾され得る。全ｍＲＮＡ分子が相補的ポリヌクレオチド分子とハイブリッド形成する場合、翻訳開始が減少し得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ分子の５’非翻訳領域およびＡＵＧ開始領域は、任意に、ハイブリッド形成されないままであってよい。翻訳開始後、リボソーム複合体の巻き戻し活性は、翻訳が進行することができるように高親和性２本鎖上でも機能することができる。（Ｌｉｅｂｈａｂｅｒ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９２；２２６：２−１３、Ｍｏｎｉａ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９３；２６８：１４５１４−２２。）ポリヌクレオチドの安定性を強化するための上述の方法のいずれも、単独で、または他の上述の方法および／または組成物のいずれかのうちの１つ以上と組み合わせて使用することができることを理解する。
ある実施形態では、本発明の薬学的組成物は、脂質ナノ粒子−被包されたポリヌクレオチドの１つ以上の標的細胞、組織、または器官への送達を強化する。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的細胞への送達の強化は、標的細胞に接触する、ないしは別の方法でそれに送達されるポリヌクレオチドの量を増加することを含む。いくつかの実施形態では
、標的細胞への送達の強化は、非標的細胞と接触するポリヌクレオチドの量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、標的細胞への送達の強化は、少なくともいくつかの標的細胞に被包されたポリヌクレオチドを形質移入させることを含む。いくつかの実施形態では、本薬学的組成物およびそれによってコードされた機能タンパク質または酵素の対応する生成物を含む脂質ナノ粒子によって被包されたポリヌクレオチドの発現レベルは、標的細胞において増加する。
本発明の化合物または薬学的およびリポソーム組成物により被包されたポリヌクレオチドは、任意に、例えば、ポリヌクレオチドの標的細胞または組織への送達の決定を容易にするレポーター遺伝子（例えば、ポリヌクレオチドのコード領域の上流または下流）と組み合わせられ得る。好適なレポーター遺伝子は、例えば緑色蛍光タンパク質ｍＲＮＡ（ＧＦＰ ｍＲＮＡ）、ウミシイタケルシフェラーゼｍＲＮＡ（ルシフェラーゼｍＲＮＡ）、ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号１）、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。例えば、ＧＦＰ ｍＲＮＡは、標的細胞、組織、または器官におけるｍＲＮＡ局在化の確認を容易にするために、ＯＴＣ ｍＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと縮合され得る。
いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物は、脂質ナノ粒子からのポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、およびｓｎｏＲＮＡ）を標的細胞の細胞内区画に移動させるのを容易にする１つ以上の追加分子（例えば、タンパク質、ペプチド、アプタマー、またはオリゴヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、追加分子は、ポリヌクレオチドの、例えば標的細胞の細胞ゾル、リソソーム、ミトコンドリア、核、核小体、またはプロテアソーム内への送達を容易にする。その小器官における欠乏を治療するために、細胞質からの関心の翻訳されたタンパク質をその正常な細胞内位置（例えばミトコンドリアにおいて）に輸送するのを容易にする薬剤も含まれる。いくつかの実施形態では、薬剤は、タンパク質、ペプチド、アプタマー、およびオリゴヌクレオチドからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、対象の１つ以上の機能タンパク質および／または酵素の内因生成、特にその組み換えにより調製された対応物に対して少ない免疫原性を示すタンパク質および／または酵素の生成を容易にする。本発明のある実施形態では、脂質ナノ粒子は、欠乏タンパク質または酵素のｍＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む。そのような組成物が標的組織に分布され、後にそのような標的細胞に形質移入されるとき、組成物を含む脂質ナノ粒子内に充填または被包された外因性ｍＲＮＡは、そのような被包されたｍＲＮＡによってコードされる機能タンパク質または酵素（例えば、対象が欠乏するタンパク質または酵素）を生成するように、生体内で翻訳され得る。したがって、ある実施形態では、本発明の組成物は、外因的にまたは組み換えにより調製されたｍＲＮＡが外因的に翻訳されたタンパク質または酵素を生成し、それによって機能タンパク質または酵素を生成する（適用可能な場合、排出する）対象の能力を利用する。翻訳されたタンパク質または酵素は、組み換えにより調製されたタンパク質または酵素において不在である場合が多い未変性翻訳後修飾を生体内に含み、それによって翻訳されたタンパク質または酵素の免疫原性をさらに減少させることも特徴とし得る。
ｍＲＮＡの脂質ナノ粒子内への被包およびそのような脂質ナノ粒子を含む薬学的組成物の投与は、標的細胞内の特定の小器官（例えばミトコンドリア）にｍＲＮＡを送達する必要性を回避する。むしろ、標的細胞の形質移入時および被包されたｍＲＮＡの標的細胞の細胞質への送達時、脂質ナノ粒子のｍＲＮＡ含有物が翻訳され、機能タンパク質または酵素が生成され得る。
本発明は、受動的または能動的の両方の標的手段により、１つ以上の標的細胞および組
織の差別的標的も想定する。受動的標的の現象は、１つ以上の標的細胞による脂質ナノ粒子の認識を強化するための追加の賦形剤の使用に依存することなく、生体内での脂質ナノ粒子の自然な分布パターンを利用する。例えば、細網内皮系の細胞による食作用を受ける脂質ナノ粒子は、肝臓または脾臓に蓄積される可能性が高く、したがって、組成物のそのような標的細胞への送達を受動的に誘導するための手段を提供することができる。
別の方法としては、本発明は、脂質ナノ粒子に結合して（共有結合的または非共有結合的に）、ある標的細胞または標的組織でそのような脂質ナノ粒子の局在化を助長することができる、本明細書において「標的リガンド」と称される追加の賦形剤の使用を伴う能動的標的を想定する。例えば、標的は、標的細胞または組織への分布を助長するために、１つ以上の内因性標的リガンド（例えばアポリポタンパク質Ｅ）を脂質ナノ粒子に、またはその上に含むことにより媒介され得る。標的組織による標的リガンドの認識は、標的細胞および組織による脂質ナノ粒子および／またはその含有物への組織分布およびその細胞取り込みを積極的に容易にする。例えば、ある実施形態では、医薬製剤を含む脂質ナノ粒子のうちの１つ以上は、そのような脂質ナノ粒子を認識する、および例えば肝細胞によって発現される内因性低密度リポタンパク質受容体に結合することを容易にする、または助長するそのような脂質ナノ粒子に、またはその上にアポリポタンパク質−Ｅ標的リガンドを含み得る。本明細書に提供される、組成物は、１つ以上の標的細胞に対する組成物の親和性を強化することが可能なリガンドを含み得る。標的リガンドは、製剤化中または製剤化後に、脂質ナノ粒子の外側の２重層に連結され得る。これらの方法は当該技術分野において既知である。加えて、いくつかの脂質ナノ粒子は、ＰＥＡＡ、赤血球凝集素、他のリポペプチド等の膜融合ポリマー（米国特許出願第０８／８３５，２８１号および第６０／０８３，２９４号を参照、参照により本明細書に組み込まれる）、および生体内および／または細胞内送達に有用な他の特徴を含み得る。他の実施形態では、本発明の組成物は改善された形質移入の効率を示し、かつ／または関心の標的細胞または組織に対する強化された選択性を示す。したがって、１つ以上の標的細胞または組織に対して組成物またはその構成要素である脂質ナノ粒子およびそのポリヌクレオチド含有物の親和性を強化することが可能である１つ以上のリガンド（例えば、ペプチド、アプタマー、オリゴヌクレオチド、ビタミン、または他の分子）を含む組成物または脂質ナノ粒子が想定される。好適なリガンドは、任意に、脂質ナノ粒子の表面に結合または連結され得る。いくつかの実施形態では、標的リガンドは、脂質ナノ粒子の表面に及ぶか、または脂質ナノ粒子内に被包され得る。好適なリガンドは、その物理的、化学的、または生物学的性質（例えば選択的な親和性および／または標的細胞表面マーカーもしくは特徴の認識）に基づき選択される。細胞特異的標的部位およびその対応する標的リガンドは広く変動し得る。好適な標的リガンドは、標的細胞の独特な特性が利用され、よって組成物が標的細胞を非標的細胞と区別することができるように選択される。例えば、本発明の組成物は、肝細胞の認識またはそれに対する親和性を選択的に強化する（例えば、そのような表面マーカーの受容体媒介による認識およびそれへの結合により）表面マーカー（例えばアポリポタンパク質−Ｂまたはアポリポタンパク質−Ｅ）を有し得る。加えて、標的リガンドとしてのガラクトースの使用は、本発明の組成物を柔肝細胞に誘導することが予測されるか、または別の方法としては、標的リガンドとしての糖残基を含むマンノースの使用（例えば、肝細胞に存在するアシアロ糖タンパク質受容体に優先的に結合することができる糖残基を含むマンノース）は、本発明の組成物を肝臓内皮細胞に誘導することが予測されるだろう。（Ｈｉｌｌｅｒｙ
ＡＭ，ｅｔ ａｌ．“Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔｓ”（２００２）Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｉｎｃ．を参照）。したがって、脂質ナノ粒子に存在する部分に接合されたそのような標的リガンドの存在は、１つ以上の標的細胞および組織による本発明のリポソーム組成物の認識または取り込みを容易にする。好適な標的リガンドの例としては、１つ以上のペプチド、タンパク質、アプタマー、ビタミン、およびオリゴヌクレオチドが挙げられる。
本明細書で使用される、用語「対象」とは、本発明の化合物、薬学的またはリポソーム組成物および方法が投与され得る、ヒト、ヒト以外の霊長類、げっ歯類等を含むが、これらに限定されない任意の動物（例えば哺乳類）を指す。典型的に、用語「対象」および「患者」は、本明細書において、ヒト対象に関して互換的に使用される。
本明細書に記載される化合物および薬学的またはリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）が被包されたポリヌクレオチドの発現およびポリペプチドもしくはタンパク質の生成を調節または強化する能力は、疾患または病的状態の宿主の治療のために、ポリペプチドおよびタンパク質の生体内生成をもたらす新しい、より効率的な手段を提供する。そのような脂質ナノ粒子組成物は、タンパク質または酵素をコードする核酸の異常発現に関連する疾患または病的状態の治療に特に適している。例えば、ｍＲＮＡ等のポリヌクレオチドの、肝臓、特に幹細胞等の標的器官への成功裏の送達は、肝臓に局在化する代謝の先天性異常の治療および補正に使用され得る。したがって、本明細書に記載される化合物、薬学的組成物、および関連する方法は、広範囲の疾患および病的状態、特にタンパク質または酵素欠乏によるそれらの疾患を治療するために採用され得る。本明細書に記載される化合物または薬学的およびリポソーム組成物によって被包されたポリヌクレオチド（例えばＨＧＴ４００４に基づく脂質ナノ粒子）は、機能生成物（例えば、タンパク質、酵素、ポリペプチド、ペプチド、機能ＲＮＡ、および／またはアンチセンス分子）をコードし得、好ましくは生体内生成が望まれる生成物をコードする。
本発明の化合物、薬学的組成物、および関連する方法は、多くの障害を治療するための、ポリヌクレオチド等の治療薬、特にｍＲＮＡの送達に広く適用可能である。特に、本発明のそのような化合物、組成物、および関連する方法は、タンパク質および／または酵素の欠乏に関連する疾患または障害の治療に適している。ある実施形態では、脂質ナノ粒子−被包されたポリヌクレオチドは、１つ以上の標的細胞によって、周囲の細胞外流体（例えばホルモンおよび神経伝達物質をコードするｍＲＮＡ）内に排出または分泌される機能タンパク質または酵素をコードする。別の方法として、別の実施形態では、本発明の化合物または薬学的およびリポソーム組成物によって被包されるポリヌクレオチドは、１つ以上の標的細胞（例えば尿素回路またはリソソーム貯蔵代謝障害に関連する酵素をコードするｍＲＮＡ）の細胞質ゾルに残存する機能タンパク質または酵素をコードする。本発明の化合物、薬学的組成物、および関連する方法が有用である他の障害は、ＳＭＮ１関連脊髄性筋萎縮（ＳＭＡ）等の障害、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ＧＡＬＴ関連ガラクトース血症、嚢胞性線維症（ＣＦ）、ＳＬＣ３Ａ１関連障害（シスチン尿症を含む）、ＣＯＬ４Ａ５関連障害（アルポート症候群を含む）、ガラクトセレブロシダーゼ欠乏症、Ｘ連鎖副腎白質ジストロフィーおよび副腎脊髄神経障害、ハンチントン病、パーキンソン病、筋ジストロフィー（例えばデュシェンヌおよびベッカー）、血友病障害（例えば、血友病Ｂ（ＦＩＸ）および血友病Ａ（ＦＶＩＩＩ）等）、フリードライヒ失調症、ペリツェウス−メルツバッヘル病、ＴＳＣ１およびＴＳＣ２関連結節性硬化症、サンフィリポＢ症候群（ＭＰＳ ＩＩＩＢ）、ＣＴＮＳ関連シスチン症、ＦＭＲ１関連障害（脆弱Ｘ症候群、脆弱Ｘ関連振戦／運動失調症候群、および脆弱Ｘ早期閉経症候群を含む）、プラダー−ウィリー症候群、ファブリー病、遺伝性出血性抹消血管拡張症（ＡＴ）、ニーマン−ピック病Ｃ１型、神経セロイドリポフスチン症関連障害（若年型神経セロイドリポフスチン症（ＪＮＣＬ）、若年型バッテン病、サンタヴオリ−ハルティア（Ｓａｎｔａｖｕｏｒｉ−Ｈａｌｔｉａ）疾患、ヤンスキー−ビールショースキー障害、ならびにＰＴＴ−１およびＴＰＰ１欠乏症を含む）、中枢神経系エミリン形成不全／白質消滅を伴うＥＩＦ２Ｂ１、ＥＩＦ２Ｂ２、ＥＩＦ２Ｂ３、ＥＩＦ２Ｂ４、およびＥＩＦ２Ｂ５関連小児期運動失調、ＣＡＣＮＡ１ＡおよびＣＡＣＮＢ４関連発作性運動失調２型、ＭＥＣＰ２関連障害（古典型レット症候群を含む）、ＭＥＣＰ２関連の重度の新生児脳症およびＰＰＭ−Ｘ症候群、ＣＤＫＬ５関連異型レット症候群、ケネディー病（ＳＢＭＡ）、ノッチ３関連皮質下梗塞および
白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症（ＣＡＤＡＳＩＬ）、ＳＣＮ１ＡおよびＳＣＮ１Ｂ関連発作性障害、ポリメラーゼＧ関連障害（アルパース−フッテンロッハー症候群、ＰＯＬＧ関連感覚性失調性神経障害、構音障害、および眼麻痺を含む）、ならびにミトコンドリアＤＮＡ欠失を伴う常染色体優性および劣性の進行性外眼筋麻痺、Ｘ連鎖副腎発育不全、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症、ウィルソン病、ならびにファブリー病を含むが、これらに限定されない。ある実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、特にｍＲＮＡは、機能タンパク質または酵素をコードすることができる。例えば、本発明の組成物は、アガルシダーゼα、エリスロポエチン、α１−アンチトリプシン、カルボキシペプチダーゼＮ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート−２−スルファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸トランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、α−グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、β−グルコシダーゼ、ガラクトース−６−硫酸スルファターゼ、β−ガラクトシターゼ、β−グルクロニダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ヘパランスルファミダーゼ、ヒアルロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、またはヒト成長ホルモンをコードするｍＲＮＡを含むことができる。
本明細書に記載される化合物および薬学的組成物は、対象に投与することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、１つ以上の追加のポリヌクレオチド、担体、標的リガンド、もしくは安定化試薬、または他の好適な賦形剤と組み合わせて製剤化される。薬物の製剤化および投与の技法は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，”Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．の最新版に見出すことができる。
本発明の化合物ならびに薬学的およびリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）は、対象の臨床状態、被包された材料の性質、投与の部位および方法、投与予定、対象の年齢、性別、体重、ならびに当該技術分野の臨床医に関する他の要因を考慮して、現在の医行為に従い投与および投薬され得る。本明細書の目的において、「有効量」は、実験臨床研究、薬理学、および医療分野の当業者に既知である、そのような関連する考慮事項によって決定され得る。いくつかの実施形態では、投与される量は、疾患の進行、後退、または改善の適切な処置として当業者により選択される、少なくともある程度の症状の安定化、改善または排除、および他の指標を達成するのに十分である。例えば、好適な量および投与レジメンは、標的細胞における１つ以上のポリヌクレオチドの少なくとも一過性の発現をもたらすものである。
本明細書に開示される化合物および薬学的組成物の好適な投与経路は、例えば、経口、直腸、膣、経粘膜、または腸管投与、非経口送達（筋肉内、皮下、髄内注射、ならびにくも膜下腔内、脳室内、直接的な脳室内、静脈内、腹腔内、経鼻、または眼内注射もしくは注入を含む）を含む。ある実施形態では、対象に本明細書に記載される化合物または組成物（例えば脂質ナノ粒子）を投与することにより、そのような化合物または組成物を１つ以上の標的細胞、組織、または器官に接触させることを容易にする。
代替的に、本発明の化合物および組成物は、標的細胞の構成要素である脂質ナノ粒子への接触をさらに容易にすることができるように、例えば、薬学的組成物の標的組織への直接注射または注入を介して、好ましくはデポ製剤または持続放出製剤で、全身よりもむしろ局所様式で投与され得る。局所送達は、標的とされる組織により、様々な方法で影響を受ける場合がある。例えば、本発明の組成物を含むエアロゾルは吸引され得る（鼻、気管、または気管支送達用）、本発明の組成物は例えば外傷、疾患徴候、または痛みの部位内に注射され得る、組成物は経口、気管、もしくは食道用途用にロゼンジ剤で提供され得る、胃もしくは腸に投与するために液体、錠剤、もしくはカプセルの形態で供給され得る、直腸もしくは膣用途用に坐剤形態で供給され得る、またはクリーム、滴剤、またはさらに
は注射の使用により眼にも送達され得る。治療用分子またはリガンドと複合される本発明の化合物を含む製剤は、例えば、組成物を移植の部位から周囲細胞に拡散させることができるポリマーまたは他の構造もしくは物質と関連して外科的にも投与され得る。別の方法としては、そのような組成物は、ポリマーまたは支持体を使用することなく外科的に適用され得る。
ある実施形態では、本発明の組成物は、それらが例えばその中に被包されたポリヌクレオチドまたは核酸の持続放出に適するように製剤化される。そのような持続放出組成物は、延長された投与間隔で、適宜対象に投与され得る。例えば、ある実施形態では、本発明の組成物は、１日２回、１日１回、または２日に１回、対象に投与される。ある実施形態では、本発明の組成物は、１週間に２回、１週間に１回、１０日に１回、２週間に１回、３週間に１回、または好ましくは４週間に１回、１ヶ月に１回、６週間に１回、８週間に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、４ヶ月に１回、６ヶ月に１回、８ヶ月に１回、９ヶ月に１回、または１年に１回、対象に投与される。長期間にわたりポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）の送達または放出のいずれかを行うために、デポ投与（例えば、筋肉内に、皮下に、硝子体内に）用に製剤化される組成物および脂質ナノ粒子も想定される。好ましくは、採用される持続放出手段は、安定性を強化するために、ポリヌクレオチド内に導入される修飾（例えば化学修飾）と組み合わされる。
本発明のある化合物、組成物、および方法がある実施形態に従い具体的に記載されてきたが、以下の実施例は、単に本発明の化合物を図示するのに役立ち、それを限定することは意図されない。本発明の背景を説明し、その実践に関する追加の詳細を提供するために参照される刊行物、参考資料等のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
凍結乾燥された脂質送達ビヒクル
本発明は、凍結乾燥されたリポソーム送達ビヒクルを含む薬学的組成物、および被包された含有物（例えばポリヌクレオチド）の、１つ以上の標的細胞、組織、または器官への送達をもたらすことができるリポソーム製剤を提供する。例えば被包されたポリヌクレオチドの１つ以上の標的細胞への送達時、そのようなポリヌクレオチドは、標的細胞におけるポリヌクレオチドまたは核酸の発現を調節する（例えば発現を増加させる）ことができる。本明細書において、そのような薬学的組成物を調製するための関連する方法およびプロセス、ならびにそのような薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することにより、１つ以上の疾患または状態を治療する方法も開示する。本明細書に記載される凍結乾燥された組成物（例えば脂質ナノ粒子）は、冷凍または周囲温度（例えば室温）のいずれかにより保管されるとき、改善された長期安定性（例えば少なくとも１、２、３、６、９、１２、１８、２４、３０ヶ月以上）を有することも予測される。
リポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）を指すために本明細書で使用される、用語「凍結乾燥」および「凍結乾燥された」とは、そのようなリポソーム組成物が急速冷凍により、ある場合では、１つ以上の乾燥工程により（例えば、真空状態に曝されることにより）乾燥形態に調製され、それによって、さらなる生物学的もしくは化学反応を排除する、または別の方法としては制限するために、そのようなリポソーム組成物中の水の濃度を減少させるプロセスを指す。
リポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）の凍結乾燥は、例えば実施例に提供される凍結乾燥サイクルに従い、任意の適切な方法によって実施され得る。リポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）の急速冷凍後、リポソーム組成物は、１次または２次真空乾燥条件への曝露等の、１つ以上の好適な方法によって乾燥させることができる。いくつかの実施形態では、リポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）は、実施形態に提供される温度および
真空条件で乾燥される。本明細書に記載される凍結乾燥条件への曝露後、凍結乾燥された脂質ナノ粒子組成物は、例えば好適な水性再水和培地（例えば、減菌水、通常の生理食塩水、および／または５％のデキストロース）を用いて再水和され、対象に投与され得る。
ある実施形態では、本明細書に記載される凍結乾燥された薬学的組成物は、安定している（例えば凍結乾燥されない薬学的組成物に対して）ことを特徴とする。本明細書に記載される凍結乾燥されたリポソーム組成物を説明するために使用される、用語「安定している」とは、そのようなリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）が凝集または凝結する（例えば再構成後）のを防止することを指す。そのような凍結乾燥された薬学的組成物の安定性は、多くの物理的特性を参照して決定される。例えば、安定性は、そのような組成物を含む脂質ナノ粒子の粒径を参照に決定され得る。好ましくは、本明細書に開示される凍結乾燥された組成物の再水和後、再構成された組成物の大きさ分布および物理的特性は、凍結乾燥前の組成物と同一であるか、または別の方法としてはそれと同等である。したがって、ある実施形態では、脂質ナノ粒子の凍結乾燥は、凍結乾燥および／または再構成後の脂質ナノ粒子の粒径をはっきりと変化または変更させない。例えば、再構成時（精製水を用いて）、凍結乾燥された薬学的組成物を含む脂質ナノ粒子は、凝結もしくは凝集しないか、または別の方法としては、制限されたもしくは無視できるほどの凝結または凝集を示す（例えば再構成された脂質ナノ粒子の粒径により決定される）。
ある実施形態では、本発明の再構成されたリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）は、１つ以上の標的細胞に形質移入される強化された（例えば増加された）能力を呈する。したがって、本明細書において、１つ以上の標的細胞に形質移入する方法も提供する。そのような方法は、一般に、１つ以上の標的細胞が被包された材料（例えば１つ以上のポリヌクレオチド）を形質移入するように、１つ以上の標的細胞を、例えば本発明の再構成された凍結乾燥された薬学的組成物（例えば１つ以上のポリヌクレオチドを被包する凍結乾燥されたＨＧＴ４００３に基づく脂質ナノ粒子）と接触させる工程を含む。
ある実施形態では、１つ以上の脂質（例えばカチオン性脂質）は、リポソームとして、または別の方法としては本発明の組成物に使用される脂質送達ビヒクルの成分（例えば脂質ナノ粒子）として使用され得る。上述のように、好適な脂質送達ビヒクルは、核酸、例えば上述のＨＧＴ４００１、ＨＧＴ４００２、ＨＧＴ４００３、ＨＧＴ４００４、およびＨＧＴ４００５等の例えば切断可能なカチオン性脂質等のカチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子であるか、またはＣ１２−２００、ＩＣＥ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＴＡＰ、ＤＳＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＤＡＢ、ＤＭＲＩＥ、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＣｐＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ、ＤＯｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＣＤＡＰ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＸＴＣ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＨＧＴ５００２、もしくはそれらの混合物からなる群から選択される。
脂質送達ビヒクルの他の好適な成分としては、例えば上述のコレステロールおよびＰＥＧ修飾された脂質等の非カチオン性脂質、ヘルパー脂質が挙げられる。例えば、脂質ナノ粒子は、ＨＧＴ４００３、ＤＯＰＥ、ＣＨＯＬ、およびＤＭＧ−ＰＥＧ２０００を用いて調製され得る。脂質ナノ粒子は、例えばＨＧＴ４００１、ＤＯＰＥ、およびＤＭＧ−ＰＥＧ２０００を含む、様々な割合の追加の脂質の組み合わせから構成され得る。脂質ナノ粒子を含むカチオン性脂質、非カチオン性脂質、および／またはＰＥＧ修飾された脂質の選択、ならびにそのような脂質の相互に対する相対的モル比は、選択された脂質（複数可）の特性、意図される標的細胞または組織の性質、および脂質ナノ粒子により送達される材料またはポリヌクレオチドの特性に基づく。さらなる考慮事項は、例えばアルキル鎖の飽和、ならびに選択された脂質（複数可）の大きさ、電荷、ｐＨ、ｐＫａ、膜融合性、および毒性を含む。
一実施形態では、凍結乾燥された脂質送達ビヒクルは、少なくとも１つの凍結乾燥保護剤をさらに含む。用語「凍結乾燥保護剤」とは、本明細書において、本明細書に記載されるリポソーム化合物のうちの１つ以上の調製物と組み合わされる、またはそれに含まれるとき、そのようなリポソーム化合物の凍結乾燥中、保管または再構成中、リポソーム化合物（例えば脂質ナノ粒子）の化学および／または物理的安定性を強化する（例えば増加させる）１つ以上の化合物を指すように使用される。例えば、ある実施形態では、脂質ナノ粒子に１つ以上の凍結乾燥保護剤を含むことにより、凍結乾燥された組成物の安定性（例えば通常の保管条件下で）を改善する、ないしは別の方法で強化する、および／または再水和培地を用いて凍結乾燥された組成物の再構成を容易にし、それによって水性製剤を調製することができる。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子が調製され、凍結乾燥前に、リポソーム製剤中に存在する緩衝液が（例えば遠心分離を介して）好適な凍結乾燥保護剤（例えば約１〜５０％または１０〜２５％のスクロースを含むスクロース水溶液）で置換され得る。いくつかの実施形態では、凍結乾燥保護剤は、リポソーム製剤が調製または凍結乾燥される（例えば水和、膜分離精製、および／または希釈中）緩衝液または培地の一部として含まれる。本明細書に記載される凍結乾燥された組成物を調製するために使用され得る好適な凍結乾燥保護剤の例としては、例えばトレハロース、デキストラン（例えば１，５ｋＤａ、５ｋＤａ、および／または４０ｋＤａ）、イヌリン（例えば１．８ｋＤａおよび／または４ｋＤａ）、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
凍結乾燥中に糖凍結乾燥保護剤を含むことは、凍結乾燥された組成物の安定化に役立ち得ると考えられる。（Ａｎｃｈｏｒｄｏｑｕｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．（２０００）８９：２８９−２９６を参照。）観察された安定化の可能な説明の１つとしては、リポソーム粒子間の物理的バリアとして作用する糖マトリックスの形成を指す粒子単離仮説を挙げることができる。
本明細書で使用される凍結乾燥された薬学的および成分リポソーム（例えば脂質ナノ粒子）は、現在当該技術分野において既知である様々な技法により調製され得る。多層小胞（ＭＬＶ）は、例えば、脂質を適切な溶剤に溶解し、次いで溶剤を蒸発させ、器の内部上に薄いフィルムを残すことにより、または噴霧乾燥により、選択された脂質を好適な容器もしくは器の内壁上に堆積させることによる従来の技法により調製され得る。次いで、ＭＬＶの形成をもたらす渦動運動している器に水相が添加され得る。次いで、単層小胞（ＵＬＶ）は、均質化、音波処理、または多層小胞の押出により形成され得る。加えて、単層小胞は洗剤除去法により形成され得る。
本明細書および特許請求の範囲において、本明細書で使用される、冠詞「ａ」および「ａｎ」は、特に逆が明確に記載されない限り、複数対象を含むように理解されるべきである。群の１つ以上のメンバー間に「ｏｒ」を含む特許請求の範囲または説明は、逆が記載されない、ないしは別の方法で内容から明らかでない限り、１つ、２つ以上、または全ての群のメンバーが所与の生成物またはプロセスに存在する、採用される、ないしは別の方法で関係する場合満たされたと考えられる。本発明は、正確に群のうちの１つのメンバーが所与の生成物またはプロセスに存在する、採用される、ないしは別の方法で関係する実施形態を含む。本発明は、２つ以上または全群のメンバーが所与の生成物またはプロセスに存在する、採用される、ないしは別の方法で関係する実施形態も含む。さらに、本発明は、特に記載されない限り、または矛盾または不一致が生じることが当業者に明らかでない限り、列挙される特許請求の範囲のうちの１つ以上からの１つ以上の制限、要素、条項、記述用語等が同じ基本特許請求に依存する（または関連する任意の他の特許請求として）別の特許請求に導入される全ての変形、組み合わせ、および置換を包含することを理解する。要素がリスト（例えばマルクーシュ群または同様の形式で）として提示される場合、要素のそれぞれの小群も開示され、任意の要素（複数可）は群から取り除かれ得ること
を理解する。一般に、本発明または本発明の態様は、特定の要素、特徴等を含むものと見なされ、本発明のある実施形態または本発明の態様は、そのような要素、特徴等からなるか、または本質的にそれらからなることも理解するべきである。簡潔化する目的のため、これらの実施形態は、全ての場合において、本明細書において明確に、具体的に記述されない。本発明の任意の実施形態または態様は、特定の除外が本明細書に列挙されるか否かに関わらず、特許請求の範囲から明示的に除外され得ることも理解するべきである。本発明の背景を説明し、その実践に関する追加の詳細を提供するために参照される刊行物および他の参考資料は、参照により本明細書に組み込まれる。
実施例
実施例１−ＨＧＴ４００１の調製
化合物５−（（（１０，１３−ジメチル−１７−（６−メチルヘプタン−２−イル）−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル）ジスルファニル）メチル）−１Ｈ−イミダゾール（イミダゾール−コレステロールジスルフィド）（本明細書において「ＨＧＴ４００１」と称される）は、反応１に示される以下に示される一般合成スキームに従い調製された。
反応１
Figure 0006900347
化合物（３）として識別された中間体化合物２−（（（３Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１７Ｒ）−１０，１３−ジメチル−１７−（（Ｒ）−６−メチルヘプタン−２−イル）−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル）ジスルファニル）ピリジン（ピリジルコレステロールジスルフィド）は以下のように調製された。クロロホルム（３５ｍｌ）中に３．０ｇ（７．４５ｍｍｏｌｓ）の化合物（１）および１．８ｇ（８．１７ｍｍｏｌｓ）の化合物（２）を含む溶液を調製し、室温で４日間攪拌した。溶剤を蒸発させ、メタノール（５０ｍｌ）を残留物に添加し、蒸発させた。得られた固体をメタノール（５０ｍｌ）中に懸濁し、室温で一晩攪拌した。濾過によりピリジルコレステロールジスルフィド生成物（３）を収集し、メタノールで洗浄し、高真空下で乾燥させた。収率：３．６ｇ（９５％）。１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．４３（ｍ，１Ｈ）
、７．７６（ｍ，１Ｈ）、７．６２（ｍ，１Ｈ）、７．０５（ｍ，１Ｈ）、５．３２（ｂｄ，Ｊ＝４Ｈｚ，１Ｈ）、２．７５（ｍ，１Ｈ）、２．３５（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，２Ｈ）、２．０５−１．７（ｍ，５Ｈ），１．７−１．２（ｍ，８Ｈ）、１．２−０．８（ｍ，２５Ｈ），０．６５（ｓ，３Ｈ）。ＭＳ（ＡＰＣＩ，Ｐｏｓ）：５１２（Ｍ＋１）。
反応１において化合物（６）として識別された中間体化合物４−（（ベンジルチオ）メチル）−１Ｈ−イミダゾールを以下のように調製した。氷酢酸（２００ｍｌ）中に１２．１５ｇ（１２３．９ｍｍｏｌ）の化合物（４）および１５．５ｍｌ（１３２ｍｍｏｌ）の（５）を含む溶液を調製し、２４時間、還流温度に加熱した。反応混合物を一晩冷却させた。溶剤を蒸発させ、残留物をクロロホルム（８００ｍｌ）に溶解した。得られた溶液を希釈したアンモニア（４：１水：濃縮アンモニア、２００ｍｌ）および鹹水（２００ｍｌ）で洗浄した。有機相を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、溶剤を蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル５００ｇ、クロロホルム中５〜７％のメタノール）により、９１％の収率を表す２３ｇの所望の生成物４−（（ベンジルチオ）メチル）−１Ｈ−イミダゾール（化合物（６））を得た。ＮＭＲは少量の不純物（４重量％）の存在を示し、これは酢酸塩と識別され、以下の化合物（８）と識別された。化合物６の材料は、さらに精製することなく、ＨＧＴ４００１を生成するために使用された。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ７．６０（ｄ，Ｊ＝１Ｈｚ，１Ｈ）、７．３５−７．２（ｍ，５Ｈ）、６．９０（ｄ，Ｊ＝１Ｈｚ，１Ｈ）、３．６７（ｓ，２Ｈ）、３．６２（ｓ，２Ｈ）。ＭＳ（ＡＰＣＩ，Ｐｏｓ）：２０５（Ｍ＋１）。
Figure 0006900347

スキーム１において化合物（７）として識別された中間体化合物（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）メタンチオールを以下のように調製した。液体アンモニア（２００ｍｌ）の溶液は、エーテル（３０ｍｌ）中に１５ｇの化合物（６）（７０．５ｍｍｏｌ）を含む懸濁液を通して濃縮された。混合物が濃青色に留まるまで、この得られた黄色の溶液に５ｇのナトリウム（２１７ｍｍｏｌ）を少しずつ添加した。次いで４０分間攪拌した。色が消えるまで約１０〜１５ｇの固形ＮＨ４Ｃｌを添加し、窒素流を用いて溶剤を蒸発させて、粗化合物（７）を得、これは精製することなく使用された。
ＨＧＴ４００１は、３．６ｇの化合物（３）（７ｍｍｏｌ）および１０ｍｌのトリエチルアミン（７１．８ｍｍｏｌ）をクロロホルム（２００ｍｌ）に添加することにより調製され、真空および窒素を用いて得られた溶液を脱気し、すぐに化合物（７）に添加し、得られた混合物を窒素下で室温で攪拌した。３日後、２００ｍｌの水を添加し、混合物をクロロホルム（２×５００ｍｌ）で抽出した。有機抽出物を鹹水（２００ｍｌ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、溶剤を蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル２００ｇ、クロロホルム中１％のトリエチルアミンを用いて中和、クロロホルム中２〜５％のエタノール）により１．２５ｇのＨＧＴ４００１を得た（２工程において３５％の収率）。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ７．６１（ｓ，１Ｈ）、７．００（ｓ，１Ｈ）、５．３３（ｄ，１Ｈ）、３．９３（ｓ，２Ｈ）、２．５８−２．４６（ｍ，１Ｈ）、２．２９（ｄ，２Ｈ）、１．９１（ｍ，５Ｈ）、１．６１−０．８
４（ｍ，３３Ｈ）、０．６６（ｓ，３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ１４１．６、１３５．３、１３４．３、１２１．４、１１８．１、５６．８、５６．２、５０．３、５０．２、４２．４、３９．８、３９．６、３９．１、３６．８、３６．２、３５．８、３１．９、２９．１、２８．３、２８．１、２４．４、２３．９、２２．９、２２．６、２１．０、１９．４、１８．８、１１．９。ＭＳ（ＡＰＣＩ，Ｐｏｓ）５１５（Ｍ＋１）。元素分析：Ｃ３１Ｈ５０Ｎ２Ｓ２、Ｃ（７２．３２ 計算値）、実測値７２．０４、Ｈ（９．７９ 計算値）、実測値９．８４、Ｎ（５．４４，計算値）、実測値５．４１．
実施例２−ＨＧＴ４００２の調製
反応２に示される以下に示される一般合成スキームに従い、化合物１−（２−（（（３Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ）−１０，１３−ジメチル−１７−（（Ｒ）−６−メチルヘプタン−２−イル）−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル）ジスルファニル）エチル）グアニジン（本明細書において「ＨＧＴ４００２」と称される）を調製した。
反応２
Figure 0006900347
上記の反応２において化合物（１０）として識別された中間体化合物ｔｅｒｔ−ブチル（２−（ピリジン−２−イルジスルファニル）エチル）カルバメートは、５．０ｇの化合物（９）（２８．２ｍｍｏｌ）および６．８２ｇの化合物（２）（３１ｍｍｏｌ）を１００ｍｌのクロロホルム（１００ｍｌ）に添加し、室温で４日間攪拌して溶液を形成することにより調製された。溶剤を蒸発させ、得られた黄色の固体をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ヘキサン中５０〜１００％の酢酸エチル）により精製し、９．０ｇの不純化合物（１０）を得た。ＮＭＲは、以下に識別された出発材料化合物（２）（２４％）およびジスルフィド化合物（１１）（２０％）と共に、所望の材料（５６重量％）の存在を示した。得られた混合物は、さらに精製することなく、次の工程に使用された。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．５５−８．４５（ｍ，１Ｈ）、７．９−７．８（ｍ，２Ｈ）、７．３−７．２（ｍ，１Ｈ）、７．０７（ｂｔ，Ｊ＝５Ｈｚ，１Ｈ
）、３：２５−３．１５（ｍ，２Ｈ）、２．８７（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ）、１．３７（ｓ，９Ｈ）。ＭＳ（ＡＰＣＩ，Ｐｏｓ）２８７（Ｍ＋１）、２３１（Ｍ＋１−Ｃ４Ｈ８）。
Figure 0006900347

中間体化合物ビスＮ，Ｎ’−ｔｅｒｔブチル−１−（２−（ピリジン−２−イルジスルファニル）エチル）グアニジンカルバメート（１４）は、２．０ｇの化合物（１０）（５６％純度、３．９ｍｍｏｌ）を、無水ジクロロメタン（１２ｍｌ）に添加した後、これにＴＦＡ（６ｍｌ）を添加し、得られた溶液を室温で５時間攪拌することにより調製された。溶剤を蒸発させ、残留物を高真空下で乾燥させ、粗化合物（１３）（ＴＦＡ塩）を得た。化合物（１３）塩を２５ｍｌの無水ジクロロメタンに溶解し、過剰トリエチルアミン（７ｍｌ）を添加し、続いて２．７ｇの化合物（１２）（７．０ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で一晩攪拌し、続いてクロロホルム（１７５ｍｌ）で希釈し、水（２×５０ｍｌ）および鹹水（５０ｍｌ）で洗浄した。有機溶液を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、溶剤を蒸発させた。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、クロロホルム中０〜１０％のメタノール）により精製し、１．９ｇの不純化合物（１４）を得た。ＮＭＲは、以下に識別されたジスルフィド化合物（１５）（２７重量％）と共に、所望の化合物（１４）（７３重量％）の存在を示した。混合物は、さらに精製することなく、次の工程に使用された。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１１．４８（ｂｓ，１Ｈ）、８．８６（ｂｔ，１Ｈ）、８．５５−８．５（ｍ，１Ｈ）、７．６５−７．６（ｍ，２Ｈ）、７．２５−７．１５（ｍ，１Ｈ）、３．８−３．６５（ｍ，２Ｈ）、２．９９（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ）、１．５１（ｓ，９Ｈ）、１．４９（ｓ，９Ｈ）。ＭＳ（ＡＰＣＩ，Ｐｏｓ）：複合体、（Ｍ＋１）は検出されず。
Figure 0006900347

上記の反応２において化合物（１６）として識別された中間体化合物１−（２−（ピリジン−２−イルジスルファニル）エチル）グアニジントリフルオロ酢酸塩は、１．６ｇの化合物（１４）（７３％純度、２．８ｍｍｏｌｓ）を無水ジクロロメタン（３３ｍｌ）に添加し、これにＴＦＡ（１１ｍｌ）を添加し、得られた溶液を室温で一晩攪拌することにより調製された。溶剤を蒸発させ、残留物を高真空下で乾燥させ、精製することなく次の工程に後に使用された粗化合物（１６）（ＴＦＡ塩）を得た。
ＨＧＴ４００２は、化合物（１６）のＴＦＡ塩を無水ジクロロメタン（５０ｍｌ）に溶解し、続いて過剰のトリエチルアミン（５ｍｌ）を添加することにより調製された。１．１３ｇのチオコレステロール（１）（２．８ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で一晩攪拌し、続いてクロロホルム（２００ｍｌ）で希釈し、水（２×５０ｍｌ）および鹹水（１００ｍｌ）で洗浄した。得られた有機溶液を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、溶剤を蒸発させた。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、クロロホルム中０〜３０％のエタノール）により精製し、アセトン中に倍散し、８０ｍｇのＨＧＴ４００２を得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．６０−６．９０（ブロード，４Ｈ）、５．３５（ｄ，１Ｈ）、３．３９（ｔ，２Ｈ）、２．８４（ｔ，２Ｈ）、２．７２（ｍ，１Ｈ）、２．２８（ｍ，２Ｈ）、１．９１（ｍ，５Ｈ）、１．５８−１．２８（ｍ，１０Ｈ）、１．２０−０．８２（ｍ，２３Ｈ）、０．６５（ｓ，３Ｈ）．）。１３Ｃ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１５７．５、１４１．５、１２１．５、５６．７、５６．１、５０．１、４９．６、４２．４、３８．３、３６．７、３６．２、３５．７、３１．９、２９．０、２８．３、２７．９、２４．４、２３．７、２３．２、２２．９、２１．０、１９．５、１９．１、１２．２。ＭＳ（ＡＰＣＩ，Ｐｏｓ）：５２０（Ｍ＋１）。元素分析：Ｃ３０Ｈ５３Ｎ３Ｓ２−ＳｉＯ２、Ｃ（６２．１３，計算値）、実測値６２．３３；Ｈ（９．２１，計算値）、実測値９．０８；Ｎ（７．２５，計算値）、実測値７．０７；Ｓ（１１．０６，計算値）、実測値１０．８３。
実施例３−ＨＧＴ４００３の調製
化合物２−（（２，３−ビス（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ）プロピル）ジスルファニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン（本明細書において「ＨＧＴ４００３」と称される）は、反応３に示される以下の一般合成スキームに従い調製された。
反応３
Figure 0006900347
上記の反応３において化合物（１９）として識別された中間体化合物３−（ベンジルチ
オ）プロパン−１，２−ジオールは、滴下により１１．３７ｇの化合物（１８）（９０．３ｍｍｏｌ）を、６０ｍＬのＡＣＮ中の攪拌した９．７３ｇの化合物（１７）（９０．３ｍｍｏｌ）と１８．６４ｇのＫ２ＣＯ３（１３５．１ｍｍｏｌ）の混合物に添加することにより調製された。得られた混合物を還流で２時間加熱し、反応混合物を室温に冷却した後、反応混合物を濾過し、固体を２０ｍＬのＡＣＮですすいだ。濾過液を蒸発させ、淡色の液体残留物をカラムクロマトグラフィー（溶出液：ヘキサン中１０〜１００％のＥｔＯＡｃ）により精製し、透明の液体として１７．０３ｇの化合物（１９）を得た（９５％）。
上記の反応３において化合物（２１）として識別された中間体化合物ベンジル（２，３−ビス（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ）プロピル）スルファンは、Ｎ２下で、ＮａＨ（鉱油中６０％、０．８２ｇ、２０．５ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（２００ｍＬ）中の攪拌した１．５６ｇの化合物（１９）（７．８８ｍｍｏｌ）と６．９１ｇの化合物（２０）（２１．００ｍｍｏｌ）の混合物に添加することにより調製された。得られた混合物を還流で４４時間加熱した。室温に冷却した後、反応混合物をＥｔ２Ｏ（４００ｍＬ）で希釈し、水（３００ｍＬ）および鹹水（３００ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、蒸発させ、黄色の液体残留物をカラムクロマトグラフィー（溶出液：ヘキサン中０〜２０％のＥｔＯＡｃ）により精製し、淡黄色の液体として化合物（２１）を得た（２．０４ｇ、３７．３％）。
上記の反応３において化合物（２２）として識別された中間体化合物２，３−ビス（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ）プロパン−１−チオールは、化合物（２１）（０．７ｇ、１．０１ｍｍｏｌ）のＥｔ２Ｏ（３０ｍＬ）溶液を液体ＮＨ３（３０ｍＬ）に添加し、Ｎ２下で、−７８℃で２つ首ＲＢＦに濃縮し、続いてＮａ（９０ｍｇ、３．９１ｍｍｏｌ）の小片を添加することにより調製された。ＴＬＣが、化合物（２１）が完全に消失したことを示したとき、得られた混合物を−７８℃で３０分間攪拌し、３４０ｍｇのＮＨ４Ｃｌ（６．３４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物の濃い青色は１０分以内に淡黄色に薄れ、ドライアイスのアセトン浴は取り外された。徐々に室温に加温しながら、反応混合物をＮ２でパージした。ＮＨ３の大半がＮ２によって飛ばされた後（反応混合物の容積は約２０ｍＬに減少した）、水性ＨＣｌ（３Ｎ、３０ｍＬ）を添加した。この混合物をＤＣＭ（６０ｍＬ）で溶出した。ＤＣＭ抽出物を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、蒸発させた。黄色の液体残留物をカラムクロマトグラフィー（溶出液：ヘキサン中０〜２０％のＥｔＯＡｃ）により精製し、淡黄色の液体として４９０ｍｇの化合物（２２）を得た（８０％）。
上記の反応３において化合物（２４）として識別された中間体化合物Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−（ピリジン−２−イルジスルファニル）エタンアミン、および２．８ｇの化合物（２）（１２．７ｍｍｏｌ）、および１．４１ｇの化合物（２３）（１０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（３０ｍＬ）中に混合した。１０分間Ν２によってパージしながら、混合物を攪拌し、１．５ｍＬのＥｔ３Ｎ（１１．２ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液を室温で１６時間攪拌し、２３０ｇのシリカゲルカラム上に適用した。カラムを４０〜１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン、続いて８〜１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶出し、黄色の液体として０．７２ｇの化合物（２４）を得た（３４％）。
ＨＧＴ４００３は、４８７ｍｇの化合物（２２）（０．８１ｍｍｏｌ）および１８０ｍｇの化合物（２４）（０．８４ｍｍｏｌ）を２ｍＬのＤＣＭ中で混合し、続いてＮ２下で、１６時間室温で攪拌することにより調製された。反応溶液をカラムクロマトグラフィー（溶出液：ヘキサン中２０〜１００％のＥｔＯＡｃ）により３回精製し、淡黄色の液体として２５２ｍｇのＨＧＴ４００３を得た（４４％）。以下の反応４において識別された２１３ｍｇの化合物（２５）（３７％）も、カラムクロマトグラフィー精製から得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ５．３６−５．３３（ｍ，８Ｈ）、３．６５（ｍ，１Ｈ）、３．５６−３．５０（ｍ，４Ｈ）、３．４３（ｔｄ，２Ｈ）、２．９６−２．７４（ｍ，８Ｈ）、２．６０（ｔ，２Ｈ）、２．２５（ｓ，６Ｈ）、２．０４（ｍ，８Ｈ）、１．６２−１．５０（ｍ，５Ｈ）、１．３９−１．２２（ｍ，３２Ｈ）、０．８８（ｔ，６Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１３０．３、１２８．０、７１．８、７１．６、７０．６、５８．８、４５．５、４１．４、３６．９、３１．６、３０．１、２９．７、２９．５、２９．４、２７．３、２６．２、２５．７、２２．６、１４．２。ＭＳ（ＡＰＣＩ，Ｐｏｓ）：７０９（Ｍ＋１）。元素分析：Ｃ４３Ｈ８１ＮＯ２Ｓ２、Ｃ（７２．９２ 計算値）、実測値７２．７５；Ｈ（１１．５３ 計算値）、実測値１１．５０；Ｎ（１．９８，計算値）、実測値２．０８；Ｓ（９．０５，計算値）、実測値８．９５。
反応４
Figure 0006900347
ピリジルジスルフィドビス（アルキル）中間体を採用するＨＧＴ４００３の代替え合成経路を上記の反応４に示す。上記の反応４において化合物（２５）として識別された中間体化合物２−（（２，３−ビス（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ）プロピル）ジスルファニル）ピリジンは、１０ｍＬのＣＨＣｌ３中で１．３５ｇの化合物（２２）（２．２４ｍｍｏｌ）および０．５４ｇの化合物（２）（２．４５ｍｍｏｌ）を混合し、Ｎ２下で１６時間、室温で攪拌することにより調製された。反応溶液をカラムクロマトグラフィー（溶出液：ヘキサン中０〜２０％のＥｔＯＡｃ）により３回精製し、淡黄色の液体として１．１ｇの化合物（２５）を得た（６７％）。次いで、１．０９ｇの化合物（２３）（７．７１ｍｍｏｌ）を、化合物（２５）（１．１ｇ、１．５４ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（２．６ｍＬ、１８．５ｍｍｏｌ）のＣＨＣｌ３（２０ｍＬ）溶液に添加し、Ｎ２下で攪拌した。１６時間後のＴＬＣは、化合物（２５）が完全に消失したことを示した。次いで、反応溶液を水性ＮａＯＨ（１Ｎ、２０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、蒸発させた。黄色の液体残留物をカラムクロマトグラフィー（溶出液： ヘキサン中５〜１００％のＥｔＯＡｃ）により精製し、淡黄色の液体として０．３７ｇのＨＧＴ４００３を得た（３４％）。
実施例４
ＨＧＴ４００１、ＤＯＰＥ、およびＤＭＧ−ＰＥＧ２０００を含み、コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）ｍＲＮＡ（配列番号１）を被包する脂質ナノ粒子を、標準的なエタノール注入法を介して形成した。（Ｐｏｎｓａ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．（１９９３）９５：５１−５６。）脂質のエタノール性原液は、５０ｍｇ／ｍＬの濃度で事前に調製され、−２０℃で保管された。
コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）ｍＲＮＡは、遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡテンプレートから生体外で形質移入され、これに続いて、５’キャップ構造（Ｃａｐ１）（Ｆｅｃｈｔｅｒ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００５）８６：１２３９−１２４９）およびゲル電気泳動により決定された長さが約２００ヌクレオチドの３’ポリ（Ａ）末端を付加することにより合成された。それぞれのＦＦＬ ｍＲＮＡ生成物に存在する５’および３’非翻訳領域は、以下に示される配列番
号４において、それぞれ、ＸおよびＹとして表される。
コドン最適化されたホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号３）：
ＸＡＵＧＧＡＡＧＡＵＧＣＣＡＡＡＡＡＣＡＵＵＡＡＧＡＡＧＧＧＣＣＣＡＧＣＧＣＣＡＵＵＣＵＡＣＣＣＡＣＵＣＧＡＡＧＡＣＧＧＧＡＣＣＧＣＣＧＧＣＧＡＧＣＡＧＣＵＧＣＡＣＡＡＡＧＣＣＡＵＧＡＡＧＣＧＣＵＡＣＧＣＣＣＵＧＧＵＧＣＣＣＧＧＣＡＣＣＡＵＣＧＣＣＵＵＵＡＣＣＧＡＣＧＣＡＣＡＵＡＵＣＧＡＧＧＵＧＧＡＣＡＵＵＡＣＣＵＡＣＧＣＣＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡＧＡＵＧＡＧＣＧＵＵＣＧＧＣＵＧＧＣＡＧＡＡＧＣＵＡＵＧＡＡＧＣＧＣＵＡＵＧＧＧＣＵＧＡＡＵＡＣＡＡＡＣＣＡＵＣＧＧＡＵＣＧＵＧＧＵＧＵＧＣＡＧＣＧＡＧＡＡＵＡＧＣＵＵＧＣＡＧＵＵＣＵＵＣＡＵＧＣＣＣＧＵＧＵＵＧＧＧＵＧＣＣＣＵＧＵＵＣＡＵＣＧＧＵＧＵＧＧＣＵＧＵＧＧＣＣＣＣＡＧＣＵＡＡＣＧＡＣＡＵＣＵＡＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＧＡＧＣＵＧＣＵＧＡＡＣＡＧＣＡＵＧＧＧＣＡＵＣＡＧＣＣＡＧＣＣＣＡＣＣＧＵＣＧＵＡＵＵＣＧＵＧＡＧＣＡＡＧＡＡＡＧＧＧＣＵＧＣＡＡＡＡＧＡＵＣＣＵＣＡＡＣＧＵＧＣＡＡＡＡＧＡＡＧＣＵＡＣＣＧＡＵＣＡＵＡＣＡＡＡＡＧＡＵＣＡＵＣＡＵＣＡＵＧＧＡＵＡＧＣＡＡＧＡＣＣＧＡＣＵＡＣＣＡＧＧＧＣＵＵＣＣＡＡＡＧＣＡＵＧＵＡＣＡＣＣＵＵＣＧＵＧＡＣＵＵＣＣＣＡＵＵＵＧＣＣＡＣＣＣＧＧＣＵＵＣＡＡＣＧＡＧＵＡＣＧＡＣＵＵＣＧＵＧＣＣＣＧＡＧＡＧＣＵＵＣＧＡＣＣＧＧＧＡＣＡＡＡＡＣＣＡＵＣＧＣＣＣＵＧＡＵＣＡＵＧＡＡＣＡＧＵＡＧＵＧＧＣＡＧＵＡＣＣＧＧＡＵＵＧＣＣＣＡＡＧＧＧＣＧＵＡＧＣＣＣＵＡＣＣＧＣＡＣＣＧＣＡＣＣＧＣＵＵＧＵＧＵＣＣＧＡＵＵＣＡＧＵＣＡＵＧＣＣＣＧＣＧＡＣＣＣＣＡＵＣＵＵＣＧＧＣＡＡＣＣＡＧＡＵＣＡＵＣＣＣＣＧＡＣＡＣＣＧＣＵＡＯＣＣＵＣＡＧＣＧＵＧＧＵＧＣＣＡＵＵＵＣＡＣＣＡＣＧＧＣＵＵＣＧＧＣＡＵＧＵＵＣＡＣＣＡＣＧＣＵＧＧＧＣＵＡＣＵＵＧＡＵＣＵＧＣＧＧＣＵＵＵＣＧＧＧＵＣＧＵＧＣＵＣＡＵＧＵＡＣＣＧＣＵＵＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＣＵＡＵＵＣＵＵＧＣＧＣＡＧＣＵＵＧＣＡＡＧＡＣＵＡＵＡＡＧＡＵＵＣＡＡＵＣＵＧＣＣＣＵＧＣＵＧＧＵＧＣＣＣＡＣＡＣＵＡＵＵＵＡＧＣＵＵＣＵＵＣＧＣＵＡＡＧＡＧＣＡＣＵＣＵＣＡＵＣＧＡＣＡＡＧＵＡＣＧＡＣＣＵＡＡＧＣＡＡＣＵＵＧＣＡＣＧＡＧＡＵＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＧＧＣＧＣＣＧＣＵＣＡＧＣＡＡＧＧＡＧＧＵＡＧＧＵＧＡＧＧＣＣＧＵＧＧＣＣＡＡＡＣＧＣＵＵＣＣＡＣＣＵＡＣＣＡＧＧＣＡＵＣＣＧＣＣＡＧＧＧＣＵＡＣＧＧＣＣＵＧＡＣＡＧＡＡＡＣＡＡＣＣＡＧＣＧＣＣＡＵＵＣＵＧＡＵＣＡＣＣＣＣＣＧＡＡＧＧＧＧＡＣＧＡＣＡＡＧＣＣＵＧＧＣＧＣＡＧＵＡＧＧＣＡＡＧＧＵＧＧＵＧＣＣＣＵＵＣＵＵＣＧＡＧＧＣＵＡＡＧＧＵＧＧＵＧＧＡＣＵＵＧＧＡＣＡＣＣＧＧＵＡＡＧＡＣＡＣＵＧＧＧＵＧＵＧＡＡＣＣＡＧＣＧＣＧＧＣＧＡＧＣＵＧＵＧＣＧＵＣＣＧＵＧＧＣＣＣＣＡＵＧＡＵＣＡＵＧＡＧＣＧＧＣＵＡＣＧＵＵＡＡＣＡＡＣＣＣＣＧＡＧＧＣＵＡＣＡＡＡＣＧＣＵＣＵＣＡＵＣＧＡＣＡＡＧＧＡＣＧＧＣＵＧＧＣＵＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＧＡＣＡＵＣＧＣＣＵＡＣＵＧＧＧＡＣＧＡＧＧＡＣＧＡＧＣＡＣＵＵＣＵＵＣＡＵＣＧＵＧＧＡＣＣＧＧＣＵＧＡＡＧＡＧＣＣＵＧＡＵＣＡＡＡＵＡＣＡＡＧＧＧＣＵＡＣＣＡＧＧＵＡＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＡＡＣＵＧＧＡＧＡＧＣＡＵＣＣＵＧＣＵＧＣＡＡＣＡＣＣＣＣＡＡＣＡＵＣＵＵＣＧＡＣＧＣＣＧＧＧＧＵＣＧＣＣＧＧＣＣＵＧＣＣＣＧＡＣＧＡＣＧＡＵＧＣＣＧＧＣＧＡＧＣＵＧＣＣＣＧＣＣＧＣＡＧＵＣＧＵＣＧＵＧＣＵＧＧＡＡＣＡＣＧＧＵＡＡＡＡＣＣＡＵＧＡＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＵＣＧＵＧＧＡＣＵＡＵＧＵＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＵＵＡＣＡＡＣＣＧＣＣＡＡＧＡＡＧＣＵＧＣＧＣＧＧＵＧＧＵＧＵＵＧＵＧＵＵＣＧＵＧＧＡＣＧＡＧＧＵＧＣＣＵＡＡＡＧＧＡＣＵＧＡＣＣＧＧＣＡＡＧＵＵＧＧＡＣＧＣＣＣＧＣＡＡＧＡＵＣＣＧＣＧＡＧＡＵＵＣＵＣＡＵＵＡＡＧＧＣＣＡＡＧＡＡＧＧＧＣＧＧＣＡＡＧＡＵＣＧＣＣＧＵＧＵＡＡＹ

Ｘ＝ＧＧＧＡＵＣＣＵＡＣＣ（配列番号５）
Ｙ＝ＵＵＵＧＡＡＵＵ（配列番号６）
ＦＦＬ ｍＲＮＡは、使用時間まで、１ｍｇ／ｍＬの最終濃度で、−８０℃で水中で保
管された。全てのｍＲＮＡ濃度は、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を介して決定された。ｍＲＮＡの被包は、０．１％のトリトン−Ｘ１００の存在および不在下でＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイを実施することにより計算された。粒径（動的光散乱（ＤＬＳ））およびゼータ電位は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ機器を用いて、それぞれ、１×ＰＢＳおよび１ｍＭ ＫＣｌの溶液中で決定された。
イミダゾールに基づくカチオン性脂質ＨＧＴ４００１、ＤＯＰＥ、およびＤＭＧ−ＰＥＧ２０００の５０ｍｇ／ｍＬのエタノール性溶液のアリコートを混合し、エタノールで３ｍＬの最終容積に希釈した。別個に、ＦＦＬ ｍＲＮＡの水性緩衝溶液（１０ｍＭのクエン酸塩／１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ４．５）を１ｍｇ／ｍＬの原液から調製した。脂質溶液を水性ｍＲＮＡ溶液の中に迅速に注入し、振盪し、２０％のエタノール中に最終懸濁液を得た。得られたナノ粒子懸濁液を濾過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析濾過し、濃縮し、２〜８℃で保管した。最終濃度＝０．６９ｍｇ／ｍＬのＣＯ−ＦＦ ｍＲＮＡ（被包）。Ｚ平均＝７０．３ｎｍ（Ｄｖ（５０）＝４３．２ｎｍ；Ｄｖ（９０）＝８０．３ｎｍ）。
実施例５
本実施例は、ＨＧＴ４００３に基づく脂質ナノ粒子がポリヌクレオチド構築物を１つ以上の標的細胞、組織、および器官に送達する高度に効率的な手段を提供することを図示する。ＨＧＴ４００３に基づく脂質ナノ粒子は、標準的なエタノール注入法を介して形成された。（Ｐｏｎｓａ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．（１９９３）９５：５１
−５６。）脂質のエタノール性原液は、５０ｍｇ／ｍＬの濃度で事前に調製され、−２０℃で保管された。
コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）ｍＲＮＡは、遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡテンプレートから生体外で形質移入され、これに続いて、５’キャップ構造（Ｃａｐ１）（Ｆｅｃｈｔｅｒ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００５）８６：１２３９−１２４９）およびゲル電気泳動により決定された長さが約２００ヌクレオチドの３’ポリ（Ａ）末端を付加することにより合成された。それぞれのｍＲＮＡ生成物に存在する５’および３’非翻訳領域は、配列番号４において、それぞれ、ＸおよびＹとして表される。ＦＦＬ ｍＲＮＡは、使用時間まで、１ｍｇ／ｍＬの最終濃度で、−８０℃で水中で保管された。全てのｍＲＮＡ濃度は、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を介して決定された。ｍＲＮＡの被包は、０．１％のトリトン−Ｘ１００の存在および不在下でＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイを実施することにより計算された。粒径（動的光散乱（ＤＬＳ）およびゼータ電位は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ機器を用いて、それぞれ、１×ＰＢＳおよび１ｍＭ ＫＣｌの溶液中で決定された。
ＨＧＴ４００３、ＤＯＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ−ＰＥＧ２０００の５０ｍｇ／ｍＬのエタノール性溶液のアリコートを混合し、エタノールで３ｍＬの最終容積に希釈した。別個に、ＦＦＬ ｍＲＮＡの水性緩衝溶液（１０ｍＭのクエン酸塩／１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ４．５）を１ｍｇ／ｍＬの原液から調製した。脂質溶液を水性ｍＲＮＡ溶液の中に迅速に注入し、振盪し、２０％のエタノール中に最終懸濁液を得た。得られたナノ粒子懸濁液を濾過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析濾過し、濃縮し、２〜８℃で保管した。最終濃度＝１．２７ｍｇ／ｍＬのＣＯ−ＦＦ ｍＲＮＡ（被包）。Ｚ平均＝６０．９ｎｍ（Ｄｖ（５０）＝４７．９ｎｍ；Ｄｖ（９０）＝７５．３ｎｍ）。
ＨＧＴ４００３に基づく脂質ナノ粒子が被包されたポリヌクレオチド構築物を１つ以上の標的細胞に送達することができるか否かを決定するために、ＣＤ−１マウスは、単回用量のＨＧＴ４００３に基づくＦＦＬ ｍＲＮＡ被包された脂質ナノ粒子を注射され、４時
間後に屠殺された。以下に説明するように単回用量のＨＧＴ４００３に基づくＦＦＬ ｍＲＮＡ被包された脂質ナノ粒子は、静脈内（ＩＶ）、脳室内（ＩＣＶ）、またはくも膜下腔内（ＩＴ）の投与経路のうちの１つを介して動物に投与された。ＦＦＬ ｍＲＮＡの発現後の動物の肝臓、脾臓、脳、および脊髄で生成されたホタルルシフェラーゼタンパク質の活性は、生物発光アッセイにおいて決定された。
簡潔に、生物発光アッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（アイテム＃Ｅ１５００／Ｅ４５００ Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行われた。組織調製は、次のように実施された：所望の組織サンプル（急速凍結）の一部を解凍し、ＲＯ／ＤＩ水で洗浄し、セラミックのビード均質化管に設置した。組織を溶解緩衝液で処理し、均質化した。凍結／解凍サイクルを５回、続いて４℃で遠心分離を受けたら、上清を新しいマイクロ遠心管に移した。繰り返し、組織抽出物を−８０℃で保管した。
ルシフェラーゼアッセイ試薬は、１０ｍＬのルシフェラーゼアッセイ緩衝液をルシフェラーゼアッセイ基質に添加し、ボルテックスを介して混合することにより調製された。２０μＬのホモジネートサンプルを９６ウェルプレート、続いてそれぞれのサンプルに２０μＬのプレート対照を充填した。別個に、１２０μＬのルシフェラーゼアッセイ試薬を９６ウェル平底プレートのそれぞれのウェルに充填し、Ｂｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ２機器を用いてそれぞれのプレートを適切なチャンバに挿入し、相対的光単位（ＲＬＵ）で発光を測定した。
本明細書に記載されるＨＧＴ４００３に基づくＦＦＬ ｍＲＮＡ被包された脂質ナノ粒子製剤は、単一ボーラス静脈内（ＩＶ）注射薬を、試験される動物に投与することにより評価された。４時間後、動物を屠殺し、肝臓および脾臓をそれぞれの動物から採取した。送達された外因性ＦＦＬメッセージから生成されたＦＦＬタンパク質を介して発光が検出され、分析された。図１は、ＨＧＴ４００３に基づく脂質ナノ粒子系を用いて静脈内投与された実施例を図示し、脾臓と比較したとき、肝臓において生成されたＦＦＬタンパク質が１桁を超えて富化されたことを示し（それぞれ、２．３４×１０６ＲＬＵ／ｍｇタンパク質対１．７１×１０５ＲＬＵ／ｍｇタンパク質）、ＨＧＴ４００３に基づくナノ粒子の使用が脾臓よりも肝臓において被包された材料の富化をもたらすことを図示する。
加えて、脂質ナノ粒子製剤を被包するＨＧＴ４００３に基づくＦＦＬ ｍＲＮＡは、試験される動物への脳室内（ＩＣＶ）またはくも膜下腔内（ＩＴ）のいずれかの経路により、単一ボーラス注射薬を中枢神経系に投与することにより評価された。４時間後、動物を屠殺し、それぞれの動物から脳および脊髄を採取した。送達された外因性ＦＦＬメッセージから生成されたＦＦＬタンパク質を介して発光が検出され、分析された。図２に図示されるように、ＨＧＴ４００３に基づく脂質ナノ粒子の投与後、ＦＦＬタンパク質生成物は、ＩＴ 投与経路と比較して、ＩＣＶ投与経路後の脳において富化された。
選択された投与経路に関係なく、基準を超える検出可能な発光シグナルがＨＧＴ４００３に基づくＦＦＬ−ｍＲＮＡ被包された脂質ナノ粒子製剤を投与した全ての動物において観察された。背景に対する発光シグナルの存在は、外部的に投与されたＦＦＬ ｍＲＮＡの発現およびそのようなＦＦＬ ｍＲＮＡからのホタルルシフェラーゼタンパク質の生成を推測する。動物の肝臓において観察された発光は、脾臓において観察された類似するシグナルよりも強化され、肝臓の細胞および組織における脂質ナノ粒子の富化を示唆する。同様に、ＨＧＴ４００３に基づくＦＦＬ ｍＲＮＡ被包されたナノ粒子はＩＣＶ投与経路を介して投与され、ＦＦＬタンパク質生成は、後のＩＴ投与経路に対して脳において富化された。したがって、本実施例は、ＨＧＴ４００３に基づく脂質ナノ粒子がポリヌクレオチド構築物を１つ以上の標的細胞、組織、および器官に送達する高度に効率的な手段を提供することを図示する。
実施例６−凍結乾燥されたリポソーム製剤
脂質ナノ粒子は、標準的なエタノール注入法を介して形成された（Ｐｏｎｓａ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．（１９９３）９５：５１−５６。）脂質のエタノール性原液は、５０ｍｇ／ｍＬの濃度で事前に調製され、−２０℃で保管された。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）ｍＲＮＡ（配列番号３）は、使用時間まで、１ｍｇ／ｍＬの最終濃度で、−８０℃で水中で保管された。
全てのＦＦＬ ｍＲＮＡ濃度は、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を介して決定された。ｍＲＮＡの被包は、０．１％のトリトン−Ｘ１００の存在および不在下でＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイを実施することにより計算された。粒径（動的光散乱（ＤＬＳ）および粒径は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ機器を用いて、それぞれ、１×ＰＢＳおよび１ｍＭ ＫＣｌの溶液中で決定された。被包されたｍＲＮＡ製剤の生体外活性は２９３Ｔ細胞を用いて評価され、選択された製剤と同等の１０μｇのｍＲＮＡは３７℃で８時間、２９３Ｔ細胞と共にインキュベートされた。ルシフェラーゼの生成は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＢｒｉｔｅＬｉｔｅ Ｐｌｕｓキットを用いて測定された。
一般に、脂質ナノ粒子の凍結乾燥は、調製されたリポソームを凍結乾燥保護剤（スクロース）を含む溶液中で凍結し、後に真空下での昇華によりあらゆる水または水分を取り除くことにより行われた。特に、凍結乾燥前、リポソーム製剤に存在する緩衝液は、遠心分離を介して１０％のスクロースで置換された。次いで、得られた脂質ナノ粒子溶液は、下の表１に識別される、凍結、一次乾燥、および二次乾燥工程の特定のパラメータを特徴とする凍結乾燥プロセスを受けた。凍結乾燥されたケーキは、以下に記載される、物理的な特徴付けおよび生化学分析を受ける前に、適切な量の精製水で再構成された。
Figure 0006900347

実施例７
Ｃ１２−２００：ＤＯＰＥ：ＣＨＯＬ：ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００（４０：３０：２０：１０，Ｎ／Ｐ２）脂質ナノ粒子に被包されたホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ（ＦＦＬ）を含む脂質ナノ粒子の製剤が調製された。次いで、表１に記述されるプロトコルに従い、調製した脂質ナノ粒子製剤のバッチの一部が凍結乾燥された。
新鮮な（未凍結乾燥）脂質ナノ粒子製剤と凍結乾燥された脂質ナノ粒子製剤の観察された物理的性質は、上述のプロトコルに従い比較され、一貫していることが分かった。下の表２に図示される、新鮮な脂質ナノ粒子と凍結乾燥された脂質ナノ粒子の平均粒径（Ｚ平均）は、それぞれ、１０３．８ｎｍおよび１１７．０ｎｍであった。新鮮な脂質ナノ粒子の多分散指数（ＰＤＩ）は、凍結乾燥された脂質ナノ粒子の０．２４７と比較して、０．２３６であった。それぞれ、凍結乾燥された脂質ナノ粒子の４９．０ｎｍおよび１７６ｎｍのＤｖ５０およびＤｖ９０と比較して、新鮮な脂質ナノ粒子のＤｖ５０およびＤｖ９０は、それぞれ、６０．２ｎｍおよび１５６ｎｍであった。したがって、観察された物理的特性は、新鮮な脂質ナノ粒子と凍結乾燥された脂質ナノ粒子の両方が安定しており、さらに粒径が比較的同等に留まったことも示唆する。
Figure 0006900347

実施例８
ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ：ＤＯＰＥ：ＣＨＯＬ：ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００（５０：２５：２０：５，Ｎ／Ｐ５）脂質ナノ粒子に被包されたホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ（ＦＦＬ）を含む脂質ナノ粒子の製剤が調製された。次いで、下の表５に記述されるプロトコルに従い、調製した脂質ナノ粒子製剤のバッチの１つが凍結乾燥された。
凍結乾燥プロセスは、調製されたリポソームを、凍結乾燥保護剤（スクロース）を含む溶液中で凍結し、後に真空下での昇華によりあらゆる水または水分を取り除くことにより行われた。特に、凍結乾燥前、リポソーム製剤中の緩衝液は、遠心分離を介して１０％のスクロースで置換された。次いで、得られたリポソーム溶液は、下の表３に識別される、凍結、一次乾燥、および二次乾燥工程の特定のパラメータを特徴とする凍結乾燥プロセスを受けた。凍結乾燥されたケーキは、以下に記載する、物理的な特徴付けおよび生化学分析前に、適切な量の精製水で再構成された。
Figure 0006900347
調製された新鮮な（未凍結乾燥）製剤および凍結乾燥された製剤は、被包されたＦＦＬ
ｍＲＮＡを２９３Ｔ細胞に送達するために使用され、発光は、上述のプロトコルに従い
決定された。下の表４に図示される、４．２１×１０６の発光値は、凍結乾燥された製剤の再構成後に観察された２．６５×１０６と比較して、凍結乾燥前の新鮮な脂質ナノ粒子において観察された。
新鮮な脂質ナノ粒子と凍結乾燥された脂質ナノ粒子の平均粒径（Ｚ平均）は、それぞれ、８９．１１ｎｍおよび９６．４１ｎｍであった。新鮮な脂質ナノ粒子の多分散指数（ＰＤＩ）は、凍結乾燥された脂質ナノ粒子の０．２０４と比較して、０．２０５であった。それぞれ、凍結乾燥された脂質ナノ粒子の６５．１ｎｍおよび１３５ｎｍのＤｖ５０およびＤｖ９０と比較して、新鮮な脂質ナノ粒子のＤｖ５０およびＤｖ９０は、それぞれ、６３．８ｎｍおよび１１７ｎｍであった。表６に示されるように、粒径および被包効率の両方は、凍結乾燥中、良好に維持された。ＦＦＬ ｍＲＮＡの被包効率は、新鮮な脂質ナノ粒子および凍結乾燥された脂質ナノ粒子において、それぞれ、９３％および８７％であった。加えて、観察された物理的特性は、新鮮な脂質ナノ粒子と凍結乾燥された脂質ナノ粒子の両方が安定しており、さらに粒径が比較的同等に留まったことを示唆する。
Figure 0006900347

実施例９
５’端および３’端で、それぞれ配列番号１および配列番号２の横に配置されるエリスロポエチン（ＥＰＯ）ｍＲＮＡ（配列番号４）を含み、ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ：ＤＯＰＥ：ＣＨＯＬ：ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００（５０：２５：２０：５，Ｎ／Ｐ５）脂質ナノ粒子に被包された脂質ナノ粒子の製剤が調製された。次いで、表３に記述されるプロトコルに従い、調製した脂質ナノ粒子製剤のバッチの１つが凍結乾燥された。
ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）ｍＲＮＡ（配列番号４）
ＡＵＧＧＧＧＧＵＧＣＡＣＧＡＡＵＧＵＣＣＵＧＣＣＵＧＧＣＵＧＵＧＧＣＵＵＣＵＣＣＵＧＱＣＣＣＵＧＣＵＧＵＣＧＣＵＣＣＣＵＣＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＡＧＵＣＣＵＧＧＧＣＧＣＣＣＣＡＣＣＡＣＧＣＣＵＣＡＵＣＵＧＵＧＡＣＡＧＣＣＧＡＧＵＣＣ ＵＧＧＡＧＡＧＧＵＡＣＣＵＣＵＵＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＡＡＵＡＵＣＡＣＧＡＣＧＧＧＣＵＧＵＧＣＵＧＡＡＣＡＣＵＧＣＡＧＣＵＵＧＡＡＵＧＡＧＡＡＵＡＵＣＡＣＵＧＵＣＣＣＡＧＡＣＡＣＣＡＡＡＧＵＵＡＡＵＵＵＣＵＡＵＧＣＣＵＧＧＡＡＧＡＧＧＡＵＧＧＡＧＧＵＣＧＧＧＣＡＧＣＡＧＧＣＣＧＵＡＧＡＡＧＵＣＵＧＧＣＡＧＧＧＣＣＵＧＧＣＣＣＵＧＣＵＧＵＣＧＧＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＧＣＧＧＧＧＣＣＡＧＧＣＣＣＵＧＵＵＧＧＵＣＡＡＣＵＣＵＵＣＣＣＡＧＣＣＧＵＧＧＧＡＧＣＣＣＣＵＧＣＡＧＣＵＧＣＡＵＧＵＧＧＡＵＡＡＡＧＣＣＧＵＣＡＧＵＧＧＣＣＵＵＣＧＣＡＧＣＣＵＣＡＣＣＡＣＵＣＱＧＣＵＵＣＧＧＧＣＵＣＵＧＧＧＡＧＣＣＣＡＧＡＡＧＧＡＡＧＣＣＡＵＣＵＣＣＣＣＵＣＣＡＧＡＵＧＣＧＧＣＣＵＣＡＧＣＵＧＣＵＣＣＡＣＵＣＣＧＡＡＣＡＡＵＣＡＣＵＧＣＵＧＡＣＡＣＵＵＵＣＣＧＣＡＡＡＣＵＣＵＵＣＣＧＡＧＵＣＵＡＣＵＣＣＡＡＵＵＵＣＣＵＣＣＧＧＧＧＡＡＡＧＣＵＧＡＡＧＣＵＧＵＡＣＡＣＡＧＧＧＧＡＧＧＣＣＯＧＣＡＧＧＡＣＡＧＧＧＧＡＣＡＧＡＵＧＡ
凍結乾燥前と後の両方での脂質ナノ粒子製剤の観察された物理的特性は、上述のプロト
コルに従い比較され、一貫していることが分かった。下の表５に図示する、新鮮な（未凍結乾燥）脂質ナノ粒子と凍結乾燥された脂質ナノ粒子の平均粒径（Ｚ平均）は、それぞれ、８５．９ｎｍおよび９５．４ｎｍであり、新鮮な脂質ナノ粒子と凍結乾燥された脂質ナノ粒子の両方が安定していたことを示唆する。新鮮な脂質ナノ粒子の多分散指数（ＰＤＩ）は、凍結乾燥された脂質ナノ粒子の０．２３１と比較して、０．１８８であった。新鮮な脂質ナノ粒子のＤｖ５０およびＤｖ９０は、それぞれ、凍結乾燥された脂質ナノ粒子の６７．２ｎｍおよび１３４ｎｍのＤｖ５０およびＤｖ９０と比較して、それぞれ、６１．０ｎｍおよび１１２ｎｍであった。ＥＰＯ ｍＲＮＡの被包効率は、新鮮な脂質ナノ粒子および凍結乾燥された脂質ナノ粒子において、それぞれ、９４％および８６％であった。表７にも示されるように、粒径および被包効率の両方は、凍結乾燥中、良好に維持された。
最後に、２９３Ｔ細胞により生成されたエリスロポエチンタンパク質は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｈｕｍａｎ ＥＰＯ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＩＶＤ ＥＬＩＳＡキットを用いて測定された。表５に示されるように、凍結乾燥前と後での製剤の両方におけるＥＰＯ ｍＲＮＡを２９３Ｔ細胞に送達した後に生成されたエリスロポエチンタンパク質は同等であり、凍結乾燥前と後の両方の脂質ナノ粒子製剤と比較したとき、エリスロポエチンタンパク質の生成において有意差はなかった。
Figure 0006900347

実施例１０
凍結乾燥されたＥＰＯ ｍＲＮＡ被包された脂質ナノ粒子に対して、６ヶ月の安定性試験が行われた。ＣＤ−１マウスにおける粒径分布、ｍＲＮＡ被包効率、ならびにＥＰＯの発現が決定された。
脂質製剤は、実施例９に記載されるＫＣ２：ＤＯＰＥ：ＣＨＯＬ：ＤＭＧＰＥＧ２Ｋ（５０：２５：２０：５）に被包されたＥＰＯ ｍＲＮＡを含んだ。Ｎ／Ｐ比（カチオン性脂質中の窒素の数に対する核酸中のリン酸の数の割合として定義される）は５であった。
バイアル１つを２〜８℃で保管した。バイアル１つを室温で保管した。湿度は、両方の保管条件において制御されなかった。
凍結乾燥されたケーキは、物理的特徴付けおよび動物試験前に、注射用に適切な量の水で再構成された。
粒径はＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ−ＺＳを用いて得た。脂質粒子におけるｍＲＮＡの被包効率は、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎアッセイキットを用いて決定された。被包されなかったｍＲＮＡは直接検出された。総ｍＲＮＡは、０．４５％ｗ／ｖのトリトンＸ−１００の存在下で、脂質ナノ粒子の溶解後に測定された。被包効率は、（総ｍＲＮＡ−被包されなかったｍＲＮＡ）／総ｍＲＮＡ×１００％として計算された。
ｈＥＰＯ ｍＲＮＡ被包された脂質ナノ粒子の２つの製剤の単回ＩＶ投与後のＥＰＯの相対的発現を評価するために、野生型ＣＤ−１マウスが使用された。血清中のＥＰＯのレベルは、用量投与６時間後に測定された。本試験に、７週齢の４匹のＣＤ−１マウス（雄２匹、雌２匹）を使用した。到着後、動物を、１群に２匹の動物を含む（雄１匹、雌２匹）２つの治療群に無作為化した。１日目に動物を量り、体重を記録した。それぞれのマウスは、３００μＬ／動物の用量容積で、９９μｇのｍＲＮＡ／動物の単回ＩＶ用量を摂取された。用量投与６時間後、ＣＯ２窒息によりマウスを安楽死させ、続いて開胸術を行い、得られる最大血液量を収集し、血清用に処理した。投与された全治療は、単回ＩＶ投与後、ＣＤ−１マウスにおいて良好に忍容された。ｈＥＰＯの血清レベルは、ＥＬＩＳＡにより測定された。製剤のいずれかを摂取された試験動物の全てからの血清において、ＥＰＯが観察された。
試験結果を表６に要約する。凍結乾燥された脂質ナノ粒子を冷凍および室温の両方で６ヶ月間保管した後の粒径分布において、有意な変化は観察されなかった。加えて、脂質ナノ粒子におけるｍＲＮＡの被包効率は、本質的に、保管中、未変化のままであった。これらの結果は、脂質粒子の完全性が凍結乾燥された構成での保管中、良好に維持されたことを示す。加速条件の室温下での６ヶ月の安定性は、冷凍条件下での２年の貯蔵寿命の可能性を支持する。さらに、冷凍または室温のいずれかで保管された後の凍結乾燥された脂質ナノ粒子の再構成された懸濁液の静脈内注射６時間後に、血清ｈＥＰＯが野生型ＣＤ−１マウスにおいて検出された。これらの結果は、脂質粒子の完全性が凍結乾燥された構成での保管中、効率的に保護されたことを示す。
Figure 0006900347

略記：１）Ｚａｖｅ（Ｚ平均）は強度分布からの平均値である；２）ＰＤＩ（多分散指数）は分布幅を説明する；３）Ｄｖ５０は容積分布の中央値である；４）Ｄｖ９０はこの値より下に位置する容積分布の９０パーセントを意味する。
実施例１１
凍結乾燥保護剤として２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを用いたｍＲＮＡ被包された脂質ナノ粒子に対する凍結乾燥試験を行った。比較のために、スクロース凍結保護剤も評価された。
ｍＲＮＡは、エタノール希釈法によりＣ１２−２００：ＤＯＰＥ：ＣＨＯＬ：ＤＭＧＰＥＧ２Ｋ（４０：３０：２５：５）脂質粒子内に被包された。Ｎ／Ｐ比は２０であった。製剤中の緩衝液は、凍結乾燥前に遠心分離を介して、適切な量のスクロースまたは２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを含む水溶液で置換された。得られた溶液は、凍結、一次乾燥、および二次乾燥工程の特定のパラメータを特徴とする凍結乾燥プロセスを受けた。表７は、製剤を含むスクロースの凍結乾燥サイクルを記載する。表８は、製剤を含む２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンの凍結乾燥サイクルを記載する。物理的特徴付けおよび生化学分析前に、凍結乾燥されたケーキを適切な量の精製水で再構成した。粒径はＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ−ＺＳを用いて得た。脂質粒子におけるｍＲＮＡの被包効率は、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎアッセイキットを用いて決定された。被包されなかったｍＲＮＡは直接検出された。総ｍＲＮＡは、０．４５％ｗ／ｖのトリトンＸ−１００の存在下で、脂質ナノ粒子の溶解後に測定された。被包効率は、（総ｍＲＮＡ−被包されなかったｍＲＮＡ）／総ｍＲＮＡ×１００％として計算された。
ＥＰＯ ｍＲＮＡ被包された脂質ナノ粒子の２つの製剤の単回ＩＶ投与後のマウスにおけるＥＰＯの相対的発現を評価するために、野生型ＣＤ−１マウスが使用された。血清中のＥＰＯのレベルは、用量投与６時間後に測定された。それぞれの群において、７週齢の３匹の雄ＣＤ−１マウスを使用した。到着後、動物を、１群に３匹の動物を含む治療群に無作為化した。１日目に動物を量り、体重を記録した。それぞれのマウスは、５０μＬ／動物の用量容積で、１５μｇのｍＲＮＡ／動物の単回ＩＶ用量を摂取された。用量投与６時間後、ＣＯ２窒息によりマウスを安楽死させ、続いて開胸術を行い、得られる最大血液量を収集し、血清用に処理した。投与された全治療は、単回ＩＶ投与後、ＣＤ−１マウスにおいて良好に忍容された。ＥＰＯの血清レベルは、ＥＬＩＳＡにより測定された。製剤のいずれかを摂取された試験動物の全てからの血清において、ＥＰＯが観察された。
Figure 0006900347

Figure 0006900347
全ての試験結果を表９に要約する。総脂質に対して６：１重量比でスクロースが凍結乾燥保護剤として使用されたとき、凍結乾燥中、粒径の成長が観察された。しかしながら、粒径は、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンが代わりに使用されたとき、５：１の比較的低重量比においても良好に維持された。Ｎ／Ｐは２０であった。加えて、脂質ナノ粒子におけるｍＲＮＡの被包効率は、凍結乾燥中、良好に維持された。これらの結果は、脂質粒子の完全性が凍結乾燥中効率的に保護されたことを示唆する。さらに、用量投与６時間後の野生型ＣＤ−１マウスにおける血清ｈＥＰＯレベルは、凍結乾燥前と後で同等である。要約すれば、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンは、Ｃ１２−２００脂質で製剤化されたｍＲＮＡ被包された脂質ナノ粒子の有効な凍結乾燥保護剤である。
Figure 0006900347

略記：１）Ｚａｖｅ（Ｚ平均）は強度分布からの平均値である；２）ＰＤＩ（多分散指数）は分布幅を説明する；３）Ｄｖ５０は容積分布の中央値である；４）Ｄｖ９０はこの値より下に位置する容積分布の９０パーセントを意味する。
前述の実施例は、凍結乾燥された脂質ナノ粒子製剤が、同等の安定性、脂質ナノ粒子粒径、および被包効率を含む、調製された凍結乾燥された脂質ナノ粒子に対して同等または等価の物理的特性を示したことを図示する。被包されたｍＲＮＡポリヌクレオチドに関して、凍結乾燥された脂質ナノ粒子は、同等のタンパク質生成も示した。例えば、評価された凍結乾燥された脂質ナノ粒子組成物のいくつかは、発光シグナルの存在によって決定される同等のホタルルシフェラーゼタンパク質の生成を示し、それによって外部的に投与された被包されたｍＲＮＡの発現および／または生成を推測する。前述の結果は、本明細書に記載される凍結乾燥された脂質ナノ粒子組成物および製剤が安定しており、被包された化合物（例えばポリヌクレオチド）の分解を最小にすることが可能であることを示唆する。そのような凍結乾燥された脂質ナノ粒子組成物は、冷凍および周囲温度条件下の両方での保管時に増加した貯蔵寿命を有することが予測され、それによって、そのような薬学的組成物に関連する利用可能性および潜在的な費用を改善する魅力的な手段を提示する。
本発明の好ましい実施形態によれば、例えば、以下が提供される。
（項１）
構造
Figure 0006900347

を有する化合物であって、式中、Ｒ１が、イミダゾール、グアニジウム、イミン、エナミン、アミノ、任意に置換されたアルキルアミノ（例えば、ジメチルアミノ等のアルキルアミノ）、およびピリジルからなる群から選択され、
Ｒ２が、
Figure 0006900347

からなる群から選択され、
式中、Ｒ３およびＲ４が、それぞれ独立して、任意に置換された可変的飽和もしくは不飽和Ｃ６−Ｃ２０アルキル、および任意に置換された可変的飽和もしくは不飽和Ｃ６−Ｃ２０アシルからなる群から選択され、
ｎが、０、または任意の正の整数である、化合物。
（項２）
Ｒ２が、
Figure 0006900347

である、上記項１に記載の化合物。
（項３）
Ｒ１がイミダゾールである、上記項２に記載の化合物。
（項４）
Ｒ１がイミダゾールであり、
Ｒ２が、
Figure 0006900347

であり、
ｎが１である、上記項１に記載の化合物。
（項５）
Ｒ１がグアニジウムであり、上記項２に記載の化合物。
（項６）
Ｒ１がグアニジウムであり、
Ｒ２が、
Figure 0006900347

であり、
ｎが１である、上記項１に記載の化合物。
（項７）
Ｒ２が、
Figure 0006900347

であり、
式中、Ｒ３およびＲ４が、それぞれ独立して、任意に置換された可変的飽和もしくは不飽和Ｃ６−Ｃ２０アルキル、および任意に置換された可変的飽和もしくは不飽和Ｃ６−Ｃ２０アシルからなる群から選択される、上記項１に記載の化合物。
（項８）
Ｒ３およびＲ４がそれぞれ、任意に置換された可変的飽和または不飽和Ｃ６−Ｃ２０アルキルである、上記項７に記載の化合物。
（項９）
Ｒ３およびＲ４がそれぞれ、任意に置換された多不飽和Ｃ６−Ｃ２０アルキルである、上記項７に記載の化合物。
（項１０）
Ｒ３およびＲ４がそれぞれ、任意に置換された多不飽和Ｃ１８アルキルである、上記項７に記載の化合物。
（項１１）
Ｒ３およびＲ４がそれぞれ、非置換の多不飽和Ｃ１８アルキルである、上記項７に記載の化合物。
（項１２）
Ｒ１がアミノである、上記項７に記載の化合物。
（項１３）
Ｒ３およびＲ４がそれぞれ、非置換の多不飽和Ｃ１８アルキルである、上記項１２に記載の化合物。
（項１４）
ｎが１である、上記項１３に記載の化合物。
（項１５）
Ｒ１がジメチルアミノであり、
Ｒ２が、
Figure 0006900347

であり、
式中、Ｒ３およびＲ４がそれぞれ、非置換の多不飽和Ｃ１８アルキルであり、
ｎが１である、上記項１に記載の化合物。
（項１６）
Ｒ１がイミダゾールである、上記項７に記載の化合物。
（項１７）
Ｒ３およびＲ４がそれぞれ、非置換の多不飽和Ｃ１８アルキルである、上記項１６に記載の化合物。
（項１８）
ｎが１である、上記項１７に記載の化合物。
（項１９）
Ｒ１がイミダゾールであり、
Ｒ２が、
Figure 0006900347

であり、
式中、Ｒ３およびＲ４がそれぞれ、非置換の多不飽和Ｃ１８アルキルであり、
ｎが１である、上記項１に記載の化合物。
（項２０）
Ｒ１がグアニジウムである、上記項７に記載の化合物。
（項２１）
Ｒ３およびＲ４がそれぞれ、非置換の多不飽和Ｃ１８アルキルである、上記項２０に記載の化合物。
（項２２）
ｎが１である、上記項２１に記載の化合物。
（項２３）
Ｒ１がグアニジウムであり、
Ｒ２が、
Figure 0006900347

であり、
式中、Ｒ３およびＲ４がそれぞれ、非置換の多不飽和Ｃ１８アルキルであり、
ｎが１である、上記項１に記載の化合物。
（項２４）
構造
Figure 0006900347

を有する、化合物。
（項２５）
構造
Figure 0006900347

を有する、化合物。
（項２６）
構造
Figure 0006900347

を有する、化合物。
（項２７）
構造
Figure 0006900347

を有する、化合物。
（項２８）
構造
Figure 0006900347

を有する、化合物。
（項２９）
上記項１〜２８のいずれか１項に記載の化合物を含む、ナノ粒子。
（項３０）
カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾された脂質、非カチオン性脂質、およびヘルパー脂質からなる群から選択される１つ以上の化合物をさらに含む、上記項２９に記載のナノ粒子。
（項３１）
１つ以上のポリヌクレオチドをさらに含む、上記項２９または上記項３０に記載のナノ粒子。
（項３２）
前記ポリヌクレオチドのうちの１つ以上が、化学修飾を含む、上記項３１に記載のナノ粒子。
（項３３）
前記１つ以上のポリヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記項３１に記載のナノ粒子。
（項３４）
前記１つ以上のポリヌクレオチドが、１つ以上のＬＮＡを含む、上記項３１に記載のナノ粒子。
（項３５）
前記１つ以上のポリヌクレオチドがＤＮＡを含む、上記項３１に記載のナノ粒子。
（項３６）
前記１つ以上のポリヌクレオチドがＲＮＡを含む、上記項３１に記載のナノ粒子。
（項３７）
前記ＲＮＡが、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記項３６に記載のナノ粒子。
（項３８）
前記ＲＮＡが酵素をコードする、上記項３６に記載のナノ粒子。
（項３９）
前記酵素が、アガルシダーゼα、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート−２−スルファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸トランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、α−グルコサミニド（ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄｅ）アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、β−グルコシダーゼ、ガラクトース−６−硫酸スルファターゼ、β−ガラクトシターゼ、β−グルクロニダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ヘパランスルファミダーゼ、ヒアルロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、カルバモイル−リン酸シンセターゼ１（ＣＰＳ１）、アルギニノコハク酸シンセターゼ（ＡＳＳ１）、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）、およびアルギナーゼ１（ＡＲＧ１）からなる群から選択される、上記項３８に記載のナノ粒子。
（項４０）
上記項１〜２８のいずれか１項に記載の化合物、または上記項２９〜３９のいずれか１項に記載のナノ粒子を含む、薬学的組成物。
（項４１）
対象の疾患を治療する方法であって、有効量の上記項４０に記載の薬学的組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
（項４２）
１つ以上の標的細胞にポリヌクレオチドを形質移入する方法であって、前記１つ以上の標的細胞にポリヌクレオチドが形質移入されるように、前記１つ以上の標的細胞を上記項４０に記載の前記薬学的組成物と接触させることを含む、方法。
（項４３）
凍結乾燥された脂質ナノ粒子を含む薬学的組成物であって、前記脂質ナノ粒子がｍＲＮＡを含む、薬学的組成物。
（項４４）
前記ｍＲＮＡが安定性を改善するために修飾される、上記項４３に記載の薬学的組成物。（項４５）
前記脂質ナノ粒子が、再構成時に凝集しない、上記項４３に記載の薬学的組成物。
（項４６）
前記脂質ナノ粒子が、再構成時に約１５０ｎｍ未満のＤｖ５０を有する、上記項４３に記載の薬学的組成物。
（項４７）
前記脂質ナノ粒子が、再構成時に約２００ｎｍ未満のＤｖ９０を有する、上記項４３に記載の薬学的組成物。
（項４８）
前記脂質ナノ粒子が、再構成時に約０．２５未満の多分散指数値を有する、上記項４３に記載の薬学的組成物。
（項４９）
前記脂質ナノ粒子が、再構成時にＰＢＳ溶液中で１２５ｎｍ未満の平均粒径を有する、請求項４３に記載の薬学的組成物。
（項５０）
前記脂質ナノ粒子が、１つ以上のカチオン性脂質を含む、上記項４３に記載の薬学的組成物。
（項５１）
前記１つ以上のカチオン性脂質が、Ｃ１２−２００、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＤＡＰ（１，２−ジオレイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ、ＨＧＴ４００３、ＨＧＴ５００１、およびＩＣＥからなる群から選択される、上記項５０に記載の薬学的組成物。
（項５２）
前記脂質ナノ粒子が、１つ以上のＰＥＧ修飾された脂質を含む、上記項４３に記載の薬学的組成物。
（項５３）
前記１つ以上のＰＥＧ修飾された脂質が、長さがＣ６−Ｃ２０の１つ以上のアルキル鎖を含む脂質に共有結合された、長さが最大５ｋＤａのポリ（エチレン）グリコール鎖を含む、上記項５２に記載の薬学的組成物。
（項５４）
前記脂質ナノ粒子が、Ｃ１２−２００、ＤＯＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ−ＰＥＧ−２０００を含む、上記項４３に記載の薬学的組成物。
（項５５）
前記脂質ナノ粒子が、ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＯＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ−ＰＥＧ２０００を含む、上記項４３に記載の薬学的組成物。
（項５６）
前記ｍＲＮＡが酵素をコードする、上記項４３に記載の薬学的組成物。
（項５７）
前記酵素が、アガルシダーゼα、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート−２−スルファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸トランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、α−グルコサミニド（ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄｅ）アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、β−グルコシダーゼ、ガラクトース−６−硫酸スルファターゼ、β−ガラクトシターゼ、β−グルクロニダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ヘパランスルファミダーゼ、ヒアルロニダーゼ、およびガラクトセレブロシダーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、カルバモイル−リン酸シンセターゼ１（ＣＰＳ１）、アルギニノコハク酸シンセターゼ（ＡＳＳ１）、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）、およびアルギナーゼ１（ＡＲＧ１）からなる群から選択される、上記項５６に記載の薬学的組成物。
（項５８）
前記組成物が、１つ以上の凍結乾燥保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）をさらに含む、上記項４３に記載の薬学的組成物。
（項５９）
前記１つ以上の凍結乾燥保護剤が、糖および炭水化物からなる群から選択される、上記項５８に記載の薬学的組成物。
（項６０）
前記凍結乾燥保護剤が、約１０％のスクロースを含む、上記項５８に記載の薬学的組成物。
（項６１）
前記１つ以上の凍結乾燥保護剤が、スクロース、トレハロース、デキストラン、およびイヌリンからなる群から選択される、上記項５８に記載の薬学的組成物。
（項６２）
前記組成物が、約４ｏＣで保管されるとき、少なくとも約１ヶ月安定である、上記項４３に記載の薬学的組成物。
（項６３）
前記組成物が、約４ｏＣで保管されるとき、少なくとも約６ヶ月安定である、上記項４３に記載の薬学的組成物。
（項６４）
前記組成物が、約２５ｏＣで保管されるとき、少なくとも約６ヶ月安定である、上記項４３に記載の薬学的組成物。
（項６５）
前記ｍＲＮＡの生物活性が、前記組成物の凍結乾燥前に観察された前記生物活性の約７５％を超える、上記項４３に記載の薬学的組成物。
（項６６）
前記脂質ナノ粒子が、カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾された脂質、非カチオン性脂質、およびコレステロールを含む、上記項４３に記載の薬学的組成物。
（項６７）
前記組成物が、対象に移植される、上記項４３に記載の薬学的組成物。
（項６８）
前記組成物が、再構成時に、次の投与経路：静脈内、経口的、直腸的、経膣的、経粘膜、舌下、硬膜下、経鼻的、筋肉内、皮下的、髄内注射、くも膜下腔内、脳室内、腹腔内、鼻腔内、眼部（ｏｐｔｈａｌｍｉｃａｌｌｙ）、および眼内のうちの１つ以上によって対象に投与される、上記項４３に記載の薬学的組成物。

Claims (15)

  1. 脂質ナノ粒子および凍結乾燥保護剤を含む凍結乾燥された薬学的組成物であって、
    ここで、前記脂質ナノ粒子が、ｍＲＮＡ、イオン化可能なカチオン性脂質、非カチオン性脂質、コレステロール、およびＰＥＧ修飾された脂質を含み、
    前記凍結乾燥保護剤がスクロースまたはトレハロースであり、そして
    ここで、前記ｍＲＮＡが前記脂質ナノ粒子内に被包される、
    凍結乾燥された薬学的組成物。
  2. 前記凍結乾燥保護剤がスクロースである、請求項１に記載の凍結乾燥された薬学的組成物。
  3. 前記凍結乾燥保護剤がトレハロースである、請求項１に記載の凍結乾燥された薬学的組成物。
  4. 前記脂質ナノ粒子が、ＩＣＥ（（３Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１７Ｒ）−１０，１３−ジメチル−１７−（（Ｒ）−６−メチルヘプタン−２−イル）−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）プロパン酸）、Ｃ１２−２００、またはＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ（２−（２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）−１，３−ジオキソラン−４−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン）であるカチオン性脂質を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の凍結乾燥された薬学的組成物。
  5. 前記脂質ナノ粒子が、ＩＣＥ（（３Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１７Ｒ）−１０，１３−ジメチル−１７−（（Ｒ）−６−メチルヘプタン−２−イル）−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）プロパン酸）であるカチオン性脂質を含む、請求項４に記載の凍結乾燥された薬学的組成物。
  6. 前記非カチオン性脂質が、
    ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール））、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＳＰＥ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＬＰＥ（１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＰＰＳ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン）、セラミド、スフィンゴミエリン、およびコレステロールからなる群から選択され、そして
    前記ＰＥＧ修飾された脂質が、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロール，メトキシポリエチレングリコール，２０００ＭＷ ＰＥＧ（ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００）である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の凍結乾燥された薬学的組成物。
  7. 前記非カチオン性脂質が、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）である、請求項６に記載の凍結乾燥された薬学的組成物。
  8. 総カチオン性脂質が、前記脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の２０％〜７０％である量で存在する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の凍結乾燥された薬学的組成物。
  9. 前記ＰＥＧ修飾された脂質が、前記脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の４％〜１０％である量で存在する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の凍結乾燥された薬学的組成物。
  10. 前記ｍＲＮＡのヌクレオチド配列が、アガルシダーゼα、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート−２−スルファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸トランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、α−グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、β−グルコシダーゼ、ガラクトース−６−硫酸スルファターゼ、β−ガラクトシターゼ、β−グルクロニダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ヘパランスルファミダーゼ、ヒアルロニダーゼおよびガラクトセレブロシダーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、カルバモイル−リン酸シンセターゼ１（ＣＰＳ１）、アルギニノコハク酸シンセターゼ（ＡＳＳ１）、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）、およびアルギナーゼ１（ＡＲＧ１）からなる群から選択される酵素をコードする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の凍結乾燥された薬学的組成物。
  11. 前記ｍＲＮＡのヌクレオチド配列が、酵素オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）をコードする、請求項１０に記載の凍結乾燥された薬学的組成物。
  12. 前記ｍＲＮＡのヌクレオチド配列が、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）またはα−Ｌ−イズロニダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、α−グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、ガラクトース−６−硫酸スルファターゼ、β−ガラクトシターゼ、β−グルクロニダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ヘパランスルファミダーゼ、およびヒアルロニダーゼからなる群から選択される酵素をコードする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の凍結乾燥された薬学的組成物。
  13. 前記ｍＲＮＡのヌクレオチド配列が、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）をコードする、請求項１２に記載の凍結乾燥された薬学的組成物。
  14. 前記組成物が、静脈内に、経口的に、直腸的に、経膣的に、経粘膜で、舌下に、硬膜下に、経鼻的に、筋肉内に、皮下的に、髄内注射で、くも膜下腔内に、脳室内に、腹腔内に、鼻腔内に、眼部に、または眼内に投与される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の凍結乾燥された薬学的組成物。
  15. １つ以上の細胞に形質移入するための請求項１〜１４のいずれか一項に記載の凍結乾燥された薬学的組成物であって、前記細胞に前記ｍＲＮＡが形質移入されるように、前記凍結乾燥された薬学的組成物が、再水和され、そして前記１つ以上の細胞と接触することを特徴とする、凍結乾燥された薬学的組成物。
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