JP7408061B2 - 切断可能な脂質 - Google Patents
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Description
チド、短鎖干渉RNA、およびミクロRNAに基づく療法の部位特異的送達のために採用
されてきた。しかしながら、核酸の標的細胞および組織への効率的な送達、ならびにその
後のそのような標的細胞および組織への形質移入は、依然技術的な課題のままである。治
療薬の標的細胞および組織への送達を容易にするための多くのリポソームに基づく系およ
びビヒクルが利用可能であるにも関わらず、生体内および生体外用途の両方において、多
くの問題が尚存在する。例えば、リポソーム送達系の大きな欠点は、所望の標的細胞およ
び/または細胞内区画に達するのに十分な細胞培養または生体内安定性を有するリポソー
ムの構築、およびそのようなリポソーム送達がその被包された材料をそのような標的細胞
に効率的に放出する能力に関連する。さらに、そのようなリポソームに基づくビヒクルを
構築するために採用されるカチオン性脂質の多くは、一般的に標的細胞に毒性であり、し
たがって、特に被包された材料をそのような標的細胞にうまく送達するのに必要な量にお
いて、使用が制限される場合がある。
に送達するのを容易にするその能力の結果として、リポソームに基づくビヒクルは治療薬
において魅力的な担体と考えられ、依然開発の努力が続けられている。カチオン性脂質成
分を含むリポソームに基づくビヒクルは、被包、安定性、および部位局在化に関して有望
な結果を示してきたが、リポソームに基づく送達系の改善の多大な必要性が残存する。特
に、強化された効率で核酸等の巨大分子を幅広い細胞種類および組織に送達することがで
きるカチオン性および脂質の改善の必要性が残存する。被包された核酸およびポリヌクレ
オチドを送達するために、多機能アプローチを組み込む新規脂質の特定の必要性も残存す
る。
るその使用方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される化合物は、
リポソーム組成物として、または1つ以上の標的細胞への送達、および後のそれらへの形
質移入を容易にするためのリポソーム組成物の成分として有用である。ある実施形態では
、本明細書に開示される組成物は、カチオン性および/またはイオン化可能な脂質である
。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される化合物は、例えば、形質移入の効率を
強化するために、または具体的な生物学的成果を促進するために、所望の特性または性質
に基づき設計された。さらに、ある実施形態では、本明細書に記載される化合物は、被包
された材料(例えば、1つ以上のポリヌクレオチド)の1つ以上の標的細胞への送達、お
よび後のそれらへの形質移入を容易にするための多機能戦略を採用する。例えば、ある実
施形態では、本明細書に記載される化合物は、そのような化合物に、他の同様に分類され
る脂質に対する利点を提供する、膜融合性、エンドソーム、またはリソソーム破壊および
/または放出可能性質のうちの1つ以上を有することを特徴とする。
性R1基および親水性R2基)に結合する(例えば、共有結合)1つ以上の切断可能な(
例えば、酵素的に、または還元、酸化、もしくは加水分解により切断可能な)官能基を含
む。例えば、切断可能なジスルフィド(S-S)官能基を含む化合物が本明細書において
開示される。例えば生物学的条件に曝されるときに切断が可能であり、かつその目的のた
めに、そのような基が、これらに限定されないが、エステルおよびエーテルを含み得る任
意の官能基を含む化合物も想定される。ある実施形態では、化合物を含む2つ以上の官能
基(例えば頭部基および尾部基)は、そのような化合物に両親媒性を付与する。例えば、
ある実施形態では、官能基のうちの少なくとも1つは、非極性、親油性、または疎水性の
尾部基(例えばコレステロールまたはC6-C20アルキル等の天然に存在する脂質)で
ある。ある実施形態では、官能基のうちの少なくとも1つは、極性または親水性の頭部基
(例えばイミダゾール)である。
002、HGT4003、HGT4004、および/またはHGT4005)は、被包さ
れた材料(例えば1つ以上の治療薬)の1つ以上の標的細胞への送達および放出を容易に
する(例えば、透過またはそのような標的細胞の脂質膜との融合により)、または強化す
るためのリポソーム組成物の成分として使用され得るカチオン性またはイオン化可能な脂
質である。ある実施形態では、そのような化合物を含む1つ以上の切断可能な官能基(例
えばジスルフィド)は、例えば、親水性官能頭部基を(例えば、酸化、還元、または酸性
条件に曝したとき)化合物の親油性官能尾部基から解離させ、それによって、1つ以上の
標的細胞の脂質2重層における相転移を容易にする。例えば、リポソーム組成物(例えば
脂質ナノ粒子)が本明細書に開示される化合物のうちの1つ以上を含むとき、1つ以上の
標的細胞の脂質2重層における相転移は、被包された材料(例えば脂質ナノ粒子中に被包
された1つ以上の治療用ポリヌクレオチド)の1つ以上の標的細胞への送達を容易にする
。同様に、リポソーム組成物を本明細書に開示される化合物のうちの1つ以上で富化する
ことにより、そのようなリポソーム組成物の膜融合性を改善し、それによって、そのよう
な化合物が細胞内でその中に被包された材料(例えばポリヌクレオチド)を送達する能力
を強化することができる。
の構造を有し、
されたアルキルアミノ(例えばジメチルアミノ等のアルキルアミノ)、およびピリジルか
らなる群から選択され、R2は、式IIおよび式III
からなる群から選択され、
飽和C6-C20アルキル、および任意に置換された可変的飽和もしくは不飽和C6-C
20アシルからなる群から選択され、nは0であるか、または任意の正の整数(例えば、
1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、1
7、18、19、20以上)である。ある実施形態では、R3およびR4はそれぞれ、任
意に置換された多価不飽和C18アルキルであり、一方、他の実施形態では、R3および
R4はそれぞれ、非置換の多価不飽和C18アルキルである。ある実施形態では、R3お
よびR4のうちの1つ以上は、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエンである
。
ン、エナミン、任意に置換されたアルキルアミノ(例えばジメチルアミノ等のアルキルア
ミノ)、およびピリジルからなる群から選択され、R2は式IIであり、nは0であるか
、または任意の正の整数である)の化合物を含む薬学的組成物も開示する。本明細書にお
いて、式I(式中、R1は、イミダゾール、グアニジウム、アミノ、イミン、エナミン、
任意に置換されたアルキルアミノ(例えばジメチルアミノ等のアルキルアミノ)、および
ピリジルからなる群から選択され、R2は式IIIであり、式中、R3およびR4は、そ
れぞれ独立して、任意に置換された可変的飽和もしくは不飽和C6-C20アルキル、お
よび任意に置換された可変的飽和もしくは不飽和C6-C20アシルからなる群から選択
され、nは0であるか、任意の正の整数である)の化合物を含む薬学的組成物をさらに開
示する。ある実施形態では、R3およびR4はそれぞれ、任意に置換された多価不飽和C
18アルキルであり、一方、他の実施形態では、R3およびR4はそれぞれ、置換された
多価不飽和C18アルキル(例えばオクタデカ-9,12-ジエン)である。
、グアニジウム基、およびアミノ基のうちの1つ以上)であり、例えば式Iに示されるジ
スルフィド(S-S)切断可能リンカー基によりR2脂質基に結合される。他の想定され
る切断可能リンカー基は、例えばアルキル基(例えばC1~C10アルキル)に結合され
た(例えば共有結合により)1つ以上のジスルフィド(S-S)リンカー基を含む組成物
を含み得る。ある実施形態では、R1基は、C1-C20アルキル基(例えば、nが1~
20である場合)により切断可能なリンカー基に共有結合されるか、または別の方法とし
ては、切断可能なリンカー基に直接結合され得る(例えばnが0の場合)。ある実施形態
では、ジスルフィドリンカー基は、生体外および/または生体内で切断可能である(例え
ば、酵素的に切断可能であるか、または酸性もしくは還元条件に曝されるときに切断可能
である)。
る)の構造を有する、化合物5-(((10,13-ジメチル-17-(6-メチルヘプ
タン-2-イル)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,1
6,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イル)ジ
スルファニル)メチル)-1H-イミダゾールに関する。
)の構造を有する、化合物-(2-(((3S,10R,13R)-10,13-ジメチ
ル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2-イル)-2,3,4,7,8,9,10
,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ
[a]フェナントレン-3-イル)ジスルファニル)エチル)グアニジンに関する。
る)の構造を有する、化合物2-((2,3-ビス((9Z,12Z)-オクタデカ-9
,12-ジエン-1-イルオキシ)プロピル)ジスルファニル)-N,N-ジメチルエタ
ンアミンに関する。
れる)の構造を有する、化合物5-(((2,3-ビス((9Z,12Z)-オクタデカ
-9,12-ジエン-1-イルオキシ)プロピル)ジスルファニル)メチル)-1H-イ
ミダゾールに関する。
と称される)の構造を有する、化合物1-(((2,3-ビス((9Z,12Z)-オク
タデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ)プロピル)ジスルファニル)メチル)グア
ニジンに関する。
としてはリポソーム組成物の成分(例えば脂質ナノ粒子)として使用することができるカ
チオン性および/またはイオン化可能な脂質である。ある実施形態では、本明細書に開示
される化合物は、リポソーム組成物(例えば脂質ナノ粒子)を富化し、それによって改善
された性質(例えば、被包されたポリヌクレオチドの1つ以上の標的細胞への送達の改善
および/または生体内でのリポソーム組成物の毒性の減少)をそのような富化したリポソ
ーム組成物に付与するために使用される。したがって、本明細書に開示される化合物のう
ちの1つ以上を含む、薬学的組成物、特にリポソーム組成物も想定される。ある実施形態
では、そのような薬学的およびリポソーム組成物は、PEG修飾された脂質、非カチオン
性脂質、およびコレステロール等のヘルパー脂質のうちの1つ以上を含む。例えば、本明
細書に開示される化合物(例えば、HGT4001、HGT4002、HGT4003、
HGT4004、および/またはHGT4005)のうちの1つ以上、および1つ以上の
カチオン性脂質、非カチオン性脂質、ヘルパー脂質/コレステロール、およびPEG修飾
された脂質成分を含む薬学的およびリポソーム組成物(例えば脂質ナノ粒子)が想定され
る。本明細書に開示される化合物のうちの1つ以上を含み、1つ以上の追加のカチオン性
脂質をさらに含む薬学的およびリポソーム組成物も想定される。同様に、HGT4001
、HGT4002、HGT4003、HGT4004および/またはHGT4005化合
物のうちの1つ以上、およびC12-200、DLinDMA、DLinKC2-DMA
、CHOL、DOPE、DMG-PEG-2000、ICE、DSPC、DODAP、D
OTAP、およびC8-PEG-2000のうちの1つ以上を含むリポソーム組成物及び
薬学的組成物(例えば脂質ナノ粒子)も想定される。ある実施形態では、そのような薬学
的組成物およびリポソーム組成物は、例えば1つ以上の生物学的に活性なポリヌクレオチ
ド等の材料で充填されるか、ないしは別の方法で被包される。
ナノ粒子)のうちの1つ以上は、本明細書に開示される化合物のうちの1つ以上、および
1つ以上の追加の脂質を含む。例えば、本明細書に開示される化合物のうちの1つ以上を
含むか、ないしは別の方法でそれで富化される脂質ナノ粒子は、DOTAP(1,2-ジ
オレイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン)、DODAP(1,2-ジオレイル-
3-ジメチルアンモニウムプロパン)、DOTMA(1,2-ジ-O-オクタデセニル-
3-トリメチルアンモニウムプロパン)、DLinDMA、DLin-KC2-DMA、
C12-200、およびICEのうちの1つ以上をさらに含み得る。一実施形態では、薬
学的組成物は、HGT4001、DOPE、およびDMG-PEG2000を含む脂質ナ
ノ粒子を含む。別の実施形態では、薬学的組成物は、HGT4003、DOPE、コレス
テロール、およびDMG-PEG2000を含む脂質ナノ粒子を含む。
のPEG修飾された脂質を含み得る。例えば、本明細書に開示される化合物のうちの1つ
以上を含むか、ないしは別の方法でそれで富化される脂質ナノ粒子は、1つ以上のC6-
C20アルキルを含む脂質に共有結合される、長さが最大5kDaのポリ(エチレン)グ
リコール鎖を含むPEG修飾された脂質のうちの1つ以上をさらに含み得る。
示される化合物のうちの1つ以上を含み得るか、ないしは別の方法でそれで富化され得、
DSPC(1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン)、DPPC(
1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン)、DOPE(1,2-ジ
オレイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン)、DPPE(1,2-ジパル
ミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン)、DMPE(1,2-ジミリ
ストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン)、DOPG(,2-ジオレオ
イル-sn-グリセロ-3-ホスホ-(1’-rac-グリセロール))、DOPE(1
,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン)、DSPE(1,
2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン)、DLPE(1,
2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン)、DPPS(1,2
-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン)、セラミド、スフィンゴ
ミエリン、およびコレステロールからなる群から選択されるヘルパー脂質のうちの1つ以
上をさらに含み得る。
成物(例えば脂質ナノ粒子)は、1つ以上のポリヌクレオチド(例えば被包されたDNA
またはRNA)を含む。他の実施形態では、1つ以上のポリヌクレオチドは、少なくとも
1つのロックド核酸(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、1
6、18、20以上のロックド核酸残基またはモノマー)を含む。1つ以上の被包された
ポリヌクレオチドがRNAを含む場合、そのようなRNAは、例えばmRNA、siRN
A、snoRNA、ミクロRNA、およびそれらの組み合わせを含み得る。
は、例えば、機能性ポリペプチド、タンパク質、または酵素をコードするmRNAを含み
、1つ以上の標的細胞によって発現される(すなわち翻訳される)とき、機能性ポリペプ
チド生成物(例えばタンパク質または酵素)が生成され、いくつかの場合では、標的細胞
によって対象の末梢循環内に分泌される。ある実施形態では、本明細書に記載される化合
物ならびに薬学的およびリポソーム組成物を含む(ないしは別の方法でその中に充填され
るか、または被包される)ポリヌクレオチドのうちの1つ以上は、対象によって異常に発
現される核酸(例えばポリペプチド)をコードする。ある実施形態では、そのような化合
物ならびにリポソームまたは薬学的組成物(例えば脂質ナノ粒子)を含む被包されたポリ
ヌクレオチドのうちの1つ以上は、尿素回路酵素(例えば、オルニチントランスカルバミ
ラーゼ(OTC)、カルバモイル-リン酸シンセターゼ1(CPS1)、アルギニノコハ
ク酸シンセターゼ(ASS1)、アルギニノコハク酸リアーゼ(ASL)、またはアルギ
ナーゼ1(ARG1))等の機能性酵素をコードする。ある実施形態では、被包されたポ
リヌクレオチドのうちの1つ以上は、リソソーム貯蔵障害に関連する酵素をコードするm
RNAを含む(例えば、被包されたポリヌクレオチドは、αガラクトシターゼ、イズロネ
ート-2-スルファターゼ、N-アセチルグルコサミン-1-リン酸トランスフェラーゼ
、β-グルコシダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、およびグルコシダーゼα酸の酵素の
うちの1つ以上をコードするmRNAである)。核酸がmRNAを含む他の実施形態では
、そのようなmRNAは、1つ以上のタンパク質または酵素、例えば、対象において欠乏
し得るタンパク質または酵素(例えば、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFT
R)、α-L-イズロニダーゼ、N-アセチルグルコサミニダーゼ、α-グルコサミニド
(glucosaminide)アセチルトランスフェラーゼ、N-アセチルグルコサミ
ン6-スルファターゼ、N-アセチルガラクトサミン-4-スルファターゼ、ガラクトー
ス-6-硫酸スルファターゼ、β-ガラクトシターゼ、β-グルクロニダーゼ、グルコセ
レブロシダーゼ、ヘパランスルファミダーゼ、およびヒアルロニダーゼからなる酵素の群
から選択される酵素またはタンパク質)をコードし得る。
ポリヌクレオチド(例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド)、特に1つ以上の化学修飾
を含むポリヌクレオチドを含む薬学的およびリポソーム組成物(例えば脂質ナノ粒子)も
想定される。例えば、ポリヌクレオチドがmRNAである、ある実施形態では、そのよう
な化学修飾は、mRNAにより大きな安定性を付与し、例えば、mRNAの5’または3
’非翻訳領域の末端封鎖修飾(end blocking modification)
を含み得る。ある実施形態では、化学修飾は、例えば、配列番号1:
XCAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUC
CAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGG
AACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGA
CUCACCGUCCUUGACACG(存在する場合、XはGGAである)(配列番号
1)、
または配列番号1と少なくとも90%もしくは少なくとも95%同一である配列等の、C
MV最初期1(IE1)遺伝子の部分配列をmRNAの5’非翻訳領域に包含することを
含む。
とを含む。Cap1構造をmRNAの5’非翻訳領域に包含することを含む化学修飾も想
定される。また他の実施形態では、化学修飾は、ヒト成長ホルモン(hGH)遺伝子から
の配列をmRNAのどちらかの3’非翻訳領域に包含することを含む。hGH配列は、例
えば、配列番号2
CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUG
GCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCC
UAAUAAAAUUAAGUUGCAUC(配列番号2)
または配列番号2と少なくとも90%もしくは少なくとも95%同一である配列を含み得
る。
び器官を具体的に標的とする、および/またはそれらに形質移入されるように製剤化され
得る。ある実施形態では、そのような化合物および薬学的組成物は、1つ以上の機構(例
えば、膜融合に基づく放出および/または標的細胞の脂質2重層膜のプロトン-海綿質媒
介破壊)により、そのような標的細胞への形質移入を容易にする。想定される標的細胞は
、例えば、肝細胞、上皮細胞、造血細胞、上皮細胞、内皮細胞、肺細胞、骨細胞、幹細胞
、間葉細胞、神経細胞、心細胞、脂肪細胞、血管平滑筋細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、β
細胞、下垂体細胞、滑液系統細胞、卵巣細胞、精巣細胞、線維芽細胞、B細胞、T細胞、
網状赤血球、白血球、顆粒球、および腫瘍細胞からなる群から選択される1つ以上の細胞
を含む。
、組織、または器官に送達するのを達成するのに有用である、凍結乾燥されたリポソーム
送達ビヒクルおよびリポソーム製剤を含む薬学的組成物(例えば脂質ナノ粒子)を提供す
る。本発明は、そのような薬学的組成物を調製するための関連する方法およびプロセス、
ならびにそのような薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することにより、1つ
以上の疾患または状態を治療する方法をさらに提供する。本明細書に記載される凍結乾燥
された組成物(例えば脂質ナノ粒子)は、冷凍または周囲温度(例えば室温)のいずれか
により保管されたとき、改善された長期安定性を有することも期待される。
的組成物は、安定(例えば等価の凍結乾燥されないビヒクルを含む薬学的組成物と同様に
安定)であることを特徴とする。凍結乾燥された送達ビヒクルの安定性は、例えばそのよ
うな組成物を含む脂質ナノ粒子の粒径に関して決定され得る。ある実施形態では、脂質ナ
ノ粒子の凍結乾燥は、凍結乾燥および/または再構成後の脂質ナノ粒子の粒径をはっきり
と変化または変更させない。例えば、本明細書において、再構成時に(例えば精製水で)
、脂質ナノ粒子は凝結または凝集しないか、または別の方法としては限定された、または
無視できるほどの凝結もしくは凝集を示した(例えば、再構成された脂質ナノ粒子の粒径
によって決定された)、凍結乾燥された脂質送達ビヒクルを含む薬学的組成物が開示され
る。したがって、ある実施形態では、凍結乾燥された脂質ナノ粒子の再構成時に、脂質ナ
ノ粒子は、約500nm未満(例えば、約300nm、200nm、150nm、125
nm、120nm、100nm、75nm、50nm、25nm未満、またはそれより小
さい)のDv50を有する。同様に、ある実施形態では、凍結乾燥された脂質ナノ粒子の
再構成時に、脂質ナノ粒子は、約750nm未満(例えば、約700nm、500nm、
300nm、200nm、150nm、125nm、100nm、75nm、50nm、
25nm未満、またはそれより小さい)のDv90を有する。
(例えば、0.95、0.9、0.8、0.75、0.7、0.6、0.5、0.4、0
.3、0.25、0.2、0.1、0.05未満、またはそれ以下)の多分散指数を有す
ることを特徴とする。また他の実施形態では、凍結乾燥された脂質送達ビヒクルを含む薬
学的組成物は、(例えば凍結乾燥中、または再構成時に)凝結、ないしは別の方法で凝集
しにくいことを示す。例えば、再構成時に、脂質送達ビヒクルは、500nm未満(例え
ば、PBS溶液中で約400nm、300nm、200nm、175nm、150nm、
125nm、100nm、75nm、50nm、25nm未満、またはそれより小さい)
の平均粒径(Z平均)を有し得る。
粒子)は、その改善された保管性質も特徴とする。例えば、ある実施形態では、凍結乾燥
された脂質送達ビヒクルは、冷凍により保管することができ、長期間安定した状態(例え
ば、約4℃で保管されるとき、少なくとも約1、2、3、4、5、6、9、12、18、
24、36ヶ月以上の間安定)を保つ(例えば、意図される薬学的活性または生物活性に
おける最小限の損失または損失がないことによって示される)。他の実施形態では、凍結
乾燥された脂質送達ビヒクルは、冷凍することなく保管することができ、長期間安定した
状態(例えば、約25℃で保管されるとき、少なくとも約1、2、3、4、5、6、9、
12、18、24、36ヶ月以上の間安定)を保つ。ある実施形態では、適切な再水和培
地(例えば、精製水、脱イオン水、5%のデキストロース、および/または通常の生理食
塩水)で再構成されるとき、再構成された組成物は、凍結乾燥前に観察されたものと同等
の薬理活性または生物活性を示す。例えば、ある実施形態では、被包されたポリヌクレオ
チドの薬理活性または生物活性は、組成物の凍結乾燥前に観察されたものと等価であるか
、あるいは薬理活性または生物活性において無視できるほどの減少(例えば、被包された
ポリヌクレオチドの薬理活性または生物活性において、約1%、2%、2.5%、4%、
5%、7.5%、10%、12.5%、15%、18.5%、20%、25%、30%、
35%、40%、または50%未満の減少)を示す。
ば、糖および/または炭水化物)をさらに含む、または別の方法としてはそれを用いて調
製される、凍結乾燥された脂質送達ビヒクルを含む薬学的組成物(例えば、凍結乾燥され
た脂質ナノ粒子)も開示する。ある実施形態では、脂質ナノ粒子に1つ以上の凍結乾燥保
護剤を含むことにより、凍結乾燥された脂質送達ビヒクル(例えば通常の保管条件下で)
の安定性を改善する、ないしは別の方法で強化する、および/または再水和培地を用いて
凍結乾燥された脂質送達ビヒクルの再構成を容易にし、それによって水性製剤を調製する
ことができる。例えば、ある実施形態では、脂質ナノ粒子が調製され、凍結乾燥前に、リ
ポソーム製剤中に存在する緩衝剤がスクロース溶液または懸濁液(例えば1~50%また
は10~25%のスクロースを含む水溶液)等の凍結乾燥保護剤で(例えば遠心分離を介
して)置換され得る。本明細書に記載される凍結乾燥された組成物を調製するために使用
され得る他の好適な凍結乾燥保護剤は、例えば、トレハロース、デキストラン(例えば1
.5kDa、5kDaおよび/または40kDa)、およびイヌリン(例えば1.8kD
aおよび/または4kDa)を含む。
組成物に含まれる1つ以上の脂質ナノ粒子内に被包された含有物(例えばポリヌクレオチ
ド)の持続放出を容易にすることもできる。例えば、再構成することなく組成物が対象に
移植され得る(例えば膜またはディスク等の例えば皮下的に移植される)、凍結乾燥され
た脂質送達ビヒクルを含む薬学的組成物が想定される。そのような移植された凍結乾燥さ
れた組成物は、例えば、1つ以上の生物流体(例えば、血清、血液、脳脊髄液、粘液、汗
、胃液分泌物、尿、および/または唾液)に曝されるとき、既定の速度で侵食、ないしは
別の方法で分解され得る。ある実施形態では、凍結乾燥された脂質送達ビヒクルを含むそ
のような移植された薬学的組成物は、例えば、少なくとも1、2、7、10、14、21
、30、45、60、90、120日以上にわたって、被包されたポリヌクレオチドを放
出する。別の方法としては、凍結乾燥された脂質送達ビヒクルを含むそのような移植され
た組成物は、例えば、少なくとも1、2、3、6、12、16、24、36ヶ月以上にわ
たって、被包されたポリヌクレオチドを放出する。
送達ビヒクルを含む薬学的組成物は、対象(例えば哺乳類)に投与する前に再構成され得
る。再構成時(例えば、再水和培地として精製水または5%のデキストロースを用いて)
、再構成された水性組成物は、次の投与経路:静脈内、経口的、直腸的、経膣的、経粘
膜、舌下、硬膜下、経鼻的、筋肉内、皮下的、髄内注射、くも膜下腔内、脳室内、腹腔内
、鼻腔内、眼部(opthalmically)、および/または眼内のうちの1つ以上
によって対象に投与され得る。
疾患)を治療する方法でもあり、本方法は、本発明の化合物および/または薬学的組成物
のうちの1つ以上を対象に投与することを含む。1つ以上の標的細胞に1つ以上のポリヌ
クレオチドを形質移入する方法も想定され、本方法は、1つ以上の標的細胞に1つ以上の
被包されたポリヌクレオチドを形質移入するように、1つ以上の標的細胞を本明細書に記
載される化合物または薬学的組成物と接触させることを含む。
よび組織において異常に発現した核酸およびポリヌクレオチドの発現を調節することがで
きる本発明の凍結乾燥された、または再構成された脂質送達ビヒクルを含む組成物を採用
する。したがって、本明細書において、本明細書によって提供される凍結乾燥された脂質
送達ビヒクルを含む有効量の薬学的組成物を対象に投与することによって(例えば、注射
用に滅菌水等の再水和培地で再構成時)、対象の疾患を治療する方法も提供する。ある実
施形態では、そのような方法は、1つ以上の標的細胞および組織(例えば肝細胞)におい
て、ポリヌクレオチドの発現を強化(例えば増加)する、および/または機能性ポリペプ
チド生成物の生成および分泌を増加することができる。いくつかの実施形態では、標的細
胞または組織は、本発明の凍結乾燥された脂質送達ビヒクル(例えば脂質ナノ粒子)のう
ちの1つ以上によって被包されたポリヌクレオチドを異常に発現する。
チド(例えばmRNA)の発現を増加させる方法も提供される。一般に、そのような方法
は、標的細胞を、1つ以上のポリヌクレオチドを含む、ないしは別の方法で被包する1つ
以上の化合物および/または薬学的もしくはリポソーム組成物と接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、1つ以上の細胞にポリヌクレオチドを形質移入する
(例えば、凍結乾燥された組成物を再水和し、そのような1つ以上の細胞を再水和した組
成物と接触させる工程を含む)方法にも関する。
るとき、以下の本発明の詳細な説明を参照することによりさらに理解されるだろう。本明
細書に記載される様々な実施形態は補足であり、本明細書に含まれる教示を考慮して当業
者により理解される様式で組み合わされる、または一緒に使用され得る。
本発明の化合物は、例えばリポソーム送達ビヒクルとして、またはリポソーム送達ビヒ
クルの成分として有用である。ある実施形態では、本明細書に開示される化合物は、リポ
ソーム組成物、または別の方法としてはリポソーム組成物の成分として(例えば脂質ナノ
粒子として)使用することができる。本発明の化合物は、薬学的組成物(例えば脂質ナノ
粒子)、および疾患、障害、または状態を治療もしくは防止する、または治療用分子を送
達するために、そのような薬学的組成物を投与する方法においても採用され得る。ある実
施形態では、そのような化合物および組成物は、例えば被包された材料(例えばポリヌク
レオチド)を1つ以上の標的細胞、組織、および器官に送達するのを容易にする。
スルフィド(S-S)官能基等の1つ以上の切断可能な基を含む。用語「切断」および「
切断可能な」とは、本明細書において、一般に、対象の官能基のまたはそれに隣接する原
子間の1つ以上の化学結合(例えば、共有結合、水素結合、ファンデルワールスの力、お
よび/またはイオン相互作用のうちの1つ以上)が破壊される(例えば加水分解される)
か、または選択された条件に曝されたときに(例えば酵素状態に曝されたとき)破壊可能
であることを意味するように使用される。ある実施形態では、切断可能な基はジスルフィ
ド官能基であり、特定の実施形態では、選択された生物学的条件(例えば細胞内条件)に
曝されたときに切断可能であるジスルフィド基である。ある実施形態では、切断可能な基
は、選択された生物学的条件に曝されたときに切断可能であるエステル官能基である。例
えばジスルフィド基は、酵素的に、または加水分解、酸化、または還元反応により切断さ
れ得る。そのようなジスルフィド官能基の切断時に、結合される1つ以上の官能部分また
は官能基(例えば頭部基および/または尾部基のうちの1つ以上)が遊離され得る。例示
的な切断可能な基としては、ジスルフィド基、エステル基、エーテル基、およびそれらの
誘導体(例えば、アルキルおよびアリールエステル)が挙げられるが、これらに限定され
ない。ある実施形態では、切断可能な基は、エステル基またはエーテル基でない。
えば、少なくとも1つの頭部基および少なくとも1つの尾部基)に結合される(例えば、
水素結合、ファンデルワールスの力、イオン相互作用、および共有結合のうちの1つ以上
により結合される)。ある実施形態では、官能部分または官能基のうちの少なくとも1つ
は、親水性(例えば、イミダゾール、グアニジウム、アミノ、イミン、エナミン、任意に
置換されたアルキルアミノ、およびピリジルのうちの1つ以上を含む親水性頭部基)であ
る。本明細書で使用される、用語「親水性」とは、性質的な用語において、官能基が水を
好み、典型的に、そのような基が水溶性であることを示すように使用される。例えば、本
明細書において、1つ以上の親水性基(例えば、親水性頭部基)に結合する切断可能なジ
スルフィド(S-S)官能基を含む化合物が開示され、そのような親水性基は、イミダゾ
ール、グアニジウム、アミノ、イミン、エナミン、任意に置換されるアルキルアミノ(例
えば、ジメチルアミノ等のアルキルアミノ)、およびピリジルからなる群を含むか、また
はそれから選択される。
いしは別の方法で化合物、またはそのような化合物が成分である化合物またはリポソーム
組成物に性質を付与することができる(例えば、化合物が成分である脂質ナノ粒子の形質
移入効率を改善することにより)。例えば、親水性頭部基としてグアニジウムを本明細書
に開示される化合物に組み込むことにより、1つ以上の標的細胞の細胞膜を用いてそのよ
うな化合物(またはそのような化合物が成分であるリポソーム組成物)の膜融合を促進し
、それによって例えばそのような化合物の形質移入効率を強化することができる。親水性
グアニジウム部分からの窒素は相互作用に安定性を与え、よって被包された材料の細胞取
り込みを可能にする6員環転移状態を形成すると仮定されている(Wender,et
al.,Adv.Drug Del.Rev.(2008)60:452-472)。同
様に、1つ以上のアミノ基またはアミノ部分を開示される化合物中に(例えば頭部基とし
て)組み込むことにより、そのようなアミノ基の膜融合性を利用して、標的細胞のエンド
ソーム/リソソーム膜の破壊をさらに促進することができる。これは、組成物のアミノ基
のpKaだけでなく、アミノ基が六方晶相転移を受け、標的細胞表面、すなわち小胞膜と
融合する能力にも基づく。(Koltover,et al.Science(1998
)281:78-81)。その結果として、小胞膜の破壊を促進し、脂質ナノ粒子含有物
を標的細胞内に放出すると考えられている。
される化合物中に組み込むことにより、例えば本発明のリポソーム組成物(例えば脂質ナ
ノ粒子)に被包される含有物のエンドソームまたはリソソーム放出を促進する働きをし得
る。そのような放出の強化は、プロトン-海綿質媒介破壊機構および/または膜融合機構
の強化のうちの1つまたはその両方により達成され得る。プロトン-海綿質機構は、化合
物、特に化合物の官能部分または官能基がエンドソームの酸性化を緩衝する能力に基づく
。これは、化合物のpKaまたはそのような化合物を含む官能基(例えばイミダゾール)
のうちの1つ以上によって操作、ないしは別の方法で制御され得る。したがって、ある実
施形態では、本明細書に開示される例えばイミダゾールに基づく化合物(例えば、HGT
4001およびHGT4004)の膜融合性は、他の従来のカチオン性脂質に対して低い
pKaを有するそのようなイミダゾール基によって容易にされるエンドソーム破壊性質に
関連する。そのようなエンドソーム破壊性質は、同時に浸透膨潤およびリポソーム膜の破
壊を促進し、その後に充填された、または被包されたポリヌクレオチド材料の標的細胞へ
の形質移入または細胞内放出が続く。この現象は、イミダゾール部分に加え、望ましいp
Kaプロファイルを有する様々な化合物に適用することができる。そのような実施形態は
、ポリアミン、ポリ-ペプチド(ヒスチジン)、および窒素に基づく樹状構造等の多窒素
に基づく官能基も含む。
01およびHGT4004)はまた、特に従来の脂質およびカチオン性脂質に対するその
減少した毒性を特徴とする。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される薬学的およ
びリポソーム組成物は、そのような薬学的またはリポソーム組成物中の他のより毒性のカ
チオン性脂質の相対的濃度が低下されるか、ないしは別の方法で排除され得るように、1
つ以上のイミダゾールに基づくカチオン性脂質化合物を含む。イミダゾールに基づく化合
物または脂質(例えば、HGT4001および/またはHGT4004)は、本明細書に
記載される薬学的およびリポソーム組成物(例えば脂質ナノ粒子)のうちの1つ以上にお
いて唯一のカチオン性脂質として使用されるか、または別の方法としては従来のカチオン
性脂質(例えば、LIPOFECTINまたはLIPOFECTAMINE)、非カチオ
ン性脂質、ヘルパー脂質/コレステロール、および/またはPEG修飾された脂質と組み
合わせることができる。ある実施形態では、本明細書に記載される化合物、または別の方
法としては薬学的およびリポソーム組成物の総カチオン性脂質成分は、そのような薬学的
またはリポソーム組成物(例えば脂質ナノ粒子)中に存在する総脂質の約1%~約90%
、約2~約70%、約5%~約50%、約10%~約40%、または好ましくはそのよう
な薬学的またはリポソーム組成物(例えば脂質ナノ粒子)中に存在する総脂質の約20%
~約70%のモル比を含み得る。
も1つは、本来疎水性(例えば、コレステロール等の天然に生じる脂質を含む疎水性尾部
基)である。本明細書で使用される、用語「疎水性」とは、性質的な用語において、官能
基が水避け、典型的に、そのような基が水溶性でないことを示すように使用される。例え
ば、本明細書において、1つ以上の疎水基に結合される切断可能な官能基(例えばジスル
フィド(S-S)基)を含む化合物が開示され、そのような疎水基は、コレステロール等
の1つ以上の天然に生じる脂質、ならびに/または任意に置換された可変的飽和または不
飽和C6-C20アルキル、および/もしくは任意に置換された可変的飽和または不飽和
C6-C20アシルを含む。
頭部基、および少なくとも1つの疎水性尾部基を含み、それぞれ少なくとも1つの切断可
能な基に結合され、それによってそのような化合物に両親媒性を付与する。化合物または
組成物を説明するために本明細書で使用される、用語「両親媒性」とは、極性(例えば水
)および非極性(例えば脂質)環境の両方に溶解する能力を意味する。例えば、ある実施
形態では、本明細書に開示される化合物は、少なくとも1つの親油性尾部基(例えば、コ
レステロールまたはC6-C20アルキル)、および少なくとも1つの親水性頭部基(例
えばイミダゾール)を含み、それぞれ切断可能な基(例えばジスルフィド)に結合される
。
語「頭部基」および「尾部基」とは、他の官能基に対する1つ以上の官能基の配向を説明
するために参照しやすいように使用されることに留意するべきである。例えば、ある実施
形態では、親水性頭部基(例えばグアニジウム)は、同時に疎水性尾部基(例えばコレス
テロール)に結合される切断可能な官能基(例えばジスルフィド基)に結合される(例え
ば、水素結合、ファンデルワールスの力、イオン相互作用、および共有結合のうちの1つ
以上により)。
の構造を有する化合物も開示され、
式中、R1は、イミダゾール、グアニジウム、アミノ、イミン、エナミン、任意に置換さ
れたアルキルアミノ(例えばジメチルアミノ等のアルキルアミノ)、およびピリジルから
なる群から選択され、R2は、式IIおよび式III
からなる群から選択され、
飽和C6-C20アルキル、および任意に置換された可変的飽和もしくは不飽和C6-C
20アシルからなる群から選択され、nは0であるか、または任意の正の整数(例えば、
1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、1
7、18、19、20以上)である。ある実施形態では、R3およびR4のそれぞれは、
任意に置換された多価不飽和C18アルキルを含み、一方、他の実施形態では、R3およ
びR4はそれぞれ、非置換の多不飽和C18アルキルである。ある実施形態では、R3お
よびR4のそれぞれは、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエンである。ある
実施形態では、nは、1(アルキルがエチルであるように)、2(アルキルがメチルであ
るように)、3(アルキルが例えばプロピルまたはイソ-プロピルであるように)、4(
アルキルが例えばブチル、イソ-ブチル、sec-ブチル、またはter-ブチルである
ように)、5(アルキルが例えばペンタンであるように)、6(アルキルが例えばヘキサ
ンであるように)、7(アルキルが例えばヘプタンであるように)、8(アルキルが例え
ばオクタンであるように)、9(nアルキルが例えばノナンであるように)、または10
(アルキルが例えばデカンであるように)である。
0炭化水素(例えばC6-C20炭化水素)を指し、飽和および不飽和炭化水素の両方を
含む。ある実施形態では、アルキルは、1つ以上の環式アルキルおよび/または酸素、窒
素、または硫黄等の1つ以上のヘテロ原子を含み得、任意に置換基(例えば、アルキル、
ハロ、アルコキシル、ヒドロキシ、アミノ、アリール、エーテル、エステル、またはアミ
ドのうちの1つ以上)で置換され得る。ある実施形態では、想定されるアルキルは、(9
Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエンを含む。例えば「C6-C20」等の記号
表示の使用は、列挙される範囲の炭素原子を有するアルキル(例えば、直鎖または分枝鎖
ならびにアルケンおよびアルキルを含む)を指すことが意図される。
族基(例えば、単環式、二環式、および三環式構造)を指す。アリール基は、利用可能な
炭素原子を通して任意に置換され得、ある実施形態では、酸素、窒素、または硫黄等の1
つ以上のヘテロ原子を含み得る。
ン、エナミン、任意に置換されたアルキルアミノ(例えばジメチルアミノ)、およびピリ
ジルからなる群から選択され、R2は式IIであり、nは0であるか、または任意の正の
整数(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10以上)である)の化合物を含
む薬学的組成物も開示する。本明細書において、式I(式中、R1は、イミダゾール、グ
アニジウム、イミン、エナミン、アミノ、任意に置換されたアルキルアミノ(例えばジメ
チルアミノ)、およびピリジルからなる群から選択され、R2は式IIIであり、式中、
R3およびR4は、それぞれ独立して、任意に置換された可変的飽和もしくは不飽和C6
-C20アルキル、および任意に置換された可変的飽和もしくは不飽和C6-C20アシ
ルからなる群から選択され、nは0であるか、任意の正の整数である)の化合物を含む薬
学的組成物をさらに開示する。ある実施形態では、R3およびR4はそれぞれ、任意に置
換された多価不飽和C18アルキルであり、一方、他の実施形態では、R3およびR4は
それぞれ、非置換の多価不飽和C18アルキルである。ある実施形態では、想定されるア
ルキルは、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエンを含む。
基、グアニジウム基、およびアミノ基のうちの1つ以上)であり、例えば式Iに図示され
るジスルフィド(S-S)切断可能なリンカー基によりR2脂質基に結合される。R1基
または頭部基は、アルキル基(例えば、nが1~20であるC1-C20アルキル)によ
り切断可能なリンカー基に共有結合されるか、または別の方法としては、切断可能なリン
カー基(例えばnが0である)に直接結合され得る。本明細書に開示される化合物および
薬学的組成物は、選択された条件(例えば、適切な生物学的または酵素的条件)に曝され
たとき、切断可能なリンカー基(例えばジスルフィド基)が切断され、それによって結合
される官能基または官能部分(例えば頭部基および/または尾部基)のうちの1つ以上を
解離させるように調製され得る。官能基または官能部分(例えばイミダゾール等のR1親
水基)の解離は、本明細書に開示される化合物のうちの1つ以上が成分であるリポソーム
組成物において相転移をもたらし、それによってリポソームを不安定にし、1つ以上の標
的細胞の膜との融合を容易にする。他の想定される切断可能なリンカー基は、例えばアル
キル基(例えばC1~C10アルキル)に結合される(例えば共有結合される)1つ以上
のジスルフィド(S-S)リンカー基を含む組成物を含み得る。
る)の構造を有する、化合物5-(((10,13-ジメチル-17-(6-メチルヘプ
タン-2-イル)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,1
6,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イル)ジ
スルファニル)メチル)-1H-イミダゾールを提供する。
)の構造を有する、化合物1-(2-(((3S,10R,13R)-10,13-ジメ
チル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2-イル)-2,3,4,7,8,9,1
0,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペン
タ[a]フェナントレン-3-イル)ジスルファニル)エチル)グアニジンを提供する。
る)の構造を有する、化合物2-((2,3-ビス((9Z,12Z)-オクタデカ-9
,12-ジエン-1-イルオキシ)プロピル)ジスルファニル)-N,N-ジメチルエタ
ンアミンを提供する。
れる)の構造を有する、化合物5-(((2,3-ビス((9Z,12Z)-オクタデカ
-9,12-ジエン-1-イルオキシ)プロピル)ジスルファニル)メチル)-1H-イ
ミダゾールを提供する。
と称される)の構造を有する、化合物1-(((2,3-ビス((9Z,12Z)-オク
タデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ)プロピル)ジスルファニル)メチル)グア
ニジンを提供する。
レオチド)の、1つ以上の標的細胞への送達および放出(例えば、そのような標的細胞の
脂質膜を透過する、またはそれと融合することにより)を容易にする、または強化するリ
ポソーム組成物を構築するために使用され得る。ある実施形態では、そのような化合物を
含む1つ以上の切断可能な官能基は、例えば、親水性官能頭部基を(例えば、還元または
酸性条件に曝したとき)化合物の親油性官能尾部基から解離させ、それによって、1つ以
上の標的細胞の脂質2重層における相転移を容易にする。例えば、リポソーム組成物(例
えば脂質ナノ粒子)が本明細書に開示される化合物のうちの1つ以上を含む、ないしは別
の方法で富化されるとき、1つ以上の標的細胞の脂質2重層における相転移は、被包され
た材料(例えば脂質ナノ粒子中に被包された1つ以上の治療用ポリヌクレオチド)の1つ
以上の標的細胞への送達を容易にする。
分類される脂質に対する利点を提供する1つ以上の性質を有することを特徴とする。例え
ば、ある実施形態では、本明細書に開示される化合物は、リポソーム組成物(例えば脂質
ナノ粒子)が成分であるその性質を制御および製作することを可能にする。特に、本明細
書に開示される化合物は、形質移入の効率および特定の生物学的成果を誘発するその能力
の強化を特徴とし得る。そのような成果は、例えば、細胞取り込みの強化、エンドソーム
/リソソーム破壊機能、および/または細胞内での被包された材料(例えばポリヌクレオ
チド)の放出の促進を含み得る。
学的およびリポソーム組成物)は、被包された材料(例えば1つ以上のポリヌクレオチド
)の、1つ以上の標的細胞への送達、および後のそれらへの形質移入を容易にするための
多機能戦略を採用する。例えば、ある実施形態では、本明細書に記載される化合物(なら
びにそのような化合物を含む薬学的およびリポソーム組成物)は、そのような化合物に、
受容体媒介飲食作用、クラスリン媒介およびカベオラ媒介飲食作用、食作用およびマクロ
飲作用、膜融合、エンドソームまたはリソソーム破壊、ならびに/または他の同様に分類
される脂質に対する利点をもたらす放出可能性質のうちの1つ以上を有することを特徴と
する。
ある薬学的およびリポソーム組成物は、1つ以上の標的細胞に形質移入する強化された(
例えば増加された)能力を呈する。したがって、本明細書において、1つ以上の標的細胞
に形質移入する方法も提供される。そのような方法は、一般に、1つ以上の標的細胞が被
包された材料(例えば1つ以上のポリヌクレオチド)を形質移入するように、1つ以上の
標的細胞を、本明細書に開示される化合物および/または薬学的組成物(例えば、1つ以
上のポリヌクレオチドを被包するHGT4003に基づく脂質ナノ粒子)と接触させる工
程を含む。本明細書で使用される、用語「形質移入する」または「形質移入」とは、1つ
以上の被包された材料(例えば核酸および/またはポリヌクレオチド)を細胞、好ましく
は標的細胞内に細胞内導入することを指す。導入されたポリヌクレオチドは安定であるか
、または標的細胞内に一過的に維持され得る。用語「形質移入の効率」とは、そのような
被包された材料(例えばポリヌクレオチド)が形質移入を受ける標的細胞によって取り込
まれる、その中に導入される、および/またはそれによって発現される相対的な量を指す
。実際に、形質移入の効率は、形質移入後、標的細胞によって生成されたリポーターポリ
ヌクレオチド生成物の量によって推定される。ある実施形態では、本明細書に開示される
化合物および薬学的組成物は、高い形質移入の効率を示し、それによって、被包された材
料(例えば1つ以上のポリヌクレオチド)の適切な投薬量が病変の部位に送達され、後に
発現し、一方、同時に全身性有害作用の可能性を最小限にする可能性を改善する。
、および方法を用いて、標的細胞に送達することができる。したがって、本明細書に記載
される化合物ならびに薬学的およびリポソーム組成物は、細胞内送達に適する任意の材料
を被包するために使用され得る。ある実施形態では、そのような被包された材料は、その
ような材料が送達される細胞に対して、治療または診断利益を付与することができ、任意
の薬物、生物製剤、および/または診断薬を含み得る。材料は有機または無機であり得る
。有機分子は、ペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、ステロール、核酸(ペプチド核
酸を含む)、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。ある実施形態では、本明細書
に開示される薬学的およびリポソーム組成物は、2種類以上の材料、例えば、タンパク質
、酵素、および/またはステロイドをコードする2つ以上の異なるポリヌクレオチド配列
を含む、ないしは別の方法で被包することができる。ある実施形態では、被包された材料
は1つ以上のポリヌクレオチドおよび核酸である。
例えばDNAまたはRNA)を指すように互換的に使用され、そのような用語が本明細書
に記載される化合物および組成物(例えば脂質ナノ粒子)に関して使用されるとき、一般
に、そのような化合物および組成物(例えば脂質ナノ粒子)によって被包される遺伝的材
料を指す。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはRNAである。好適なRNAは
、mRNA、siRNA、miRNA、snRNA、およびsnoRNAを含む。想定さ
れるポリヌクレオチドは、一般にタンパク質をコードしないが、むしろ例えば免疫シグナ
ル伝達、幹細胞生物学、および疾患の発達において機能する大きな遺伝子間非コードRN
A(lincRNA)も含む。(例えば、Guttman,et al.,458:22
3-227(2009)、およびNg,et al.,Nature Genetics
42:1035-1036(2010)を参照のこと、その内容は参照により本明細書に
組み込まれる)。好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドはmRNAである。ある実施
形態では、本発明の化合物または薬学的およびリポソーム組成物によって被包されるポリ
ヌクレオチドは、RNAまたはタンパク質もしくは酵素をコードする安定化されたRNA
(例えば、αガラクトシターゼをコードするmRNA)を含む。本発明は、標的細胞によ
る発現が可能であり、それによって国際出願第PCT/US2010/058457号お
よび米国仮出願第61/494,881号(2011年6月8日出願)等に開示される(
その両方の教示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)そのような標的細胞に
よる機能酵素またはタンパク質の生成(およびある場合では、分泌)を容易にする治療薬
としてのそのようなポリヌクレオチド(および特にRNAまたは安定化されたRNA)の
使用を想定する。例えば、ある実施形態では、標的細胞による1つ以上のポリヌクレオチ
ドが発現されるとき、対象が欠乏する機能酵素またはタンパク質(例えば尿素回路酵素ま
たはリソソーム貯蔵障害に関連する酵素)の生成が観察され得る。タンパク質または酵素
を限定するために本明細書で使用される、用語「機能」とは、タンパク質または酵素が、
生物活性を有するか、または別の方法としては、未変性もしくは正常に機能するタンパク
質または酵素と同じもしくは類似する機能を実行することができることを意味する。
くはポリヌクレオチドが少なくとも1つのmRNA転写物へ転写される、または少なくと
も1つのmRNAもしくはポリヌクレオチドがタンパク質または酵素に翻訳されるかのい
ずれかを指すように使用される。例えば、ある実施形態では、本明細書に記載される化合
物ならびに薬学的もしくはリポソーム組成物は、機能タンパク質または酵素をコードする
ポリヌクレオチド(例えばmRNA)を含む。そのようなmRNAポリヌクレオチドとの
関連において、用語「発現」は、そのようなmRNAが翻訳され(例えば標的細胞により
)、それによってコードされるポリペプチドもしくはタンパク質を生成することを指す。
的細胞および組織において異常に発現した核酸およびポリヌクレオチドを調節することが
できる。したがって、本明細書において、本明細書に記載される有効量の化合物および/
または薬学的もしくはリポソーム組成物を対象に投与することにより、対象の疾患を治療
する方法も提供される。ある実施形態では、そのような方法は、1つ以上の標的細胞およ
び組織(例えば肝細胞)において、ポリヌクレオチドの発現を強化(例えば増加)する、
および/または機能性ポリペプチド生成物の生成および分泌を増加することができる。い
くつかの実施形態では、標的細胞または組織は、本明細書に記載される化合物または薬学
的およびリポソーム組成物(例えば脂質ナノ粒子)のうちの1つ以上によって被包された
ポリヌクレオチドを異常に発現する。本明細書において、1つ以上の標的細胞、組織、お
よび器官において、1つ以上のポリヌクレオチド(例えばmRNA)の発現を増加させる
方法も提供される。一般に、そのような方法は、標的細胞を、1つ以上のポリヌクレオチ
ドを含む、ないしは別の方法で被包する1つ以上の化合物および/または薬学的もしくは
リポソーム組成物と接触させることを含む。
ームの成分として使用され得る。具体的には、ある実施形態では、本明細書に開示される
化合物は、リポソーム組成物(例えば脂質ナノ粒子)の脂質(例えばカチオン性脂質)成
分として使用され得る。そのようなリポソームは、材料を被包し、そのような材料の、1
つ以上の標的細胞、組織、および器官への送達を容易にするために使用され得る。本明細
書で使用される、用語「リポソーム」とは、一般に、1つ以上の球状2重層または2重層
に配置された脂質(例えば両親媒性脂質)から構成される小胞を指す。ある実施形態では
、リポソームは、脂質ナノ粒子(例えば、本明細書に開示されるカチオン性脂質化合物の
うちの1つ以上を含む脂質ナノ粒子)である。そのようなリポソームは、親油性材料から
形成された膜、および1つ以上の標的細胞、組織、および器官に送達される被包された材
料(例えばポリヌクレオチド)を含む水性内部を有する単層または多層の小胞であり得る
。ある実施形態では、本明細書に記載される薬学的およびリポソーム組成物は、1つ以上
の脂質ナノ粒子を含む。想定されるリポソームは、脂質ナノ粒子を含む。本明細書におい
て想定されるリポソームおよび脂質ナノ粒子を形成するために使用され得る好適な脂質(
例えばカチオン性脂質)の例としては、本明細書に開示される化合物(例えば、HGT4
001、HGT4002、HGT4003、HGT4004、および/またはHGT40
05)のうちの1つ以上が挙げられる。そのようなリポソームおよび脂質ナノ粒子は、C
12-200、DLin-KC2-DMA、および/またはHGT5001、非カチオン
性脂質、ヘルパー/コレステロールに基づく脂質、PEG修飾された脂質等の追加のカチ
オン性脂質、ならびにホスファチジル化合物(例えば、ホスファチジルグリセロール、ホ
スファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィ
ンゴ脂質、セレブロシド、およびガングリオシド)、および前述の組み合わせまたは混合
物も含み得る。
る。ある実施形態では、そのようなカチオン性脂質は、本明細書に開示される化合物また
は脂質(例えばHGT4003)のうちの1つ以上に加え、本明細書に記載される薬学的
またはリポソーム組成物に含まれる。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質N-[1
-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム
または「DOTMA」が使用される(Felgner et al.(Proc.Nat
’l Acad.Sci.84,7413(1987)、米国特許第4,897,355
)。DOTMAは単独で製剤化されるか、または中性脂肪、ジオレオイルホスファチジル
エタノールアミンもしくは「DOPE」、または他のカチオン性もしくは非カチオン性脂
質を用いて脂質ナノ粒子内に組み合わされ得る。他の好適なカチオン性脂質は、例えば(
15Z,18Z)-N,N-ジメチル-6-(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-
ジエン-1-イル)テトラコサ-15,18-ジエン-1-アミン(HGT5000)、
(15Z,18Z)-N,N-ジメチル-6-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,1
2-ジエン-1-イル)テトラコサ-4,15,18-トリエン-1-アミン(HGT5
001)、および(15Z,18Z)-N,N-ジメチル-6-((9Z,12Z)-オ
クタデカ-9,12-ジエン-1-イル)テトラコサ-5,15,18-トリエン-1-
アミン(HGT5002)等の、例えば米国仮特許出願第61/617,468号(20
12年3月29日出願)(参照により本明細書に組み込まれる)に記載されるイオン化可
能なカチオン性脂質、C12-200(第WO2010/053572号)、2-(2,
2-ジ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)-1,3-ジオ
キソラン-4-イル)-N,N-ジメチルエタンアミン(DLinKC2-DMA))(
第WO2010/042877号、Semple et al.,nature Bio
tech.28:172-176(2010)を参照)、2-(2,2-ジ((9Z,1
2Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)-1,3-ジオキソラン-4-イル
)-N,N-ジメチルエタンアミン(「DLin-KC2-DMA」)、(3S,10R
,13R,17R)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2
-イル)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17
-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イル3-(1H-
イミダゾール-4-イル)プロパン酸塩(「ICE」)、(15Z,18Z)-N,N-
ジメチル-6-(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)テトラコ
サ-15,18-ジエン-1-アミン(「HGT5000」)、(15Z,18Z)-N
,N-ジメチル-6-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-l-イル)
テトラコサ-4,15,18-トリエン-1-アミン(「HGT5001」)、および(
15Z,18Z)-N,N-ジメチル-6-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12
-ジエン-1-イル)テトラコサ-5,15,18-トリエン-1-アミン(「HGT5
002」)、5-カルボキシスペルミルグリシン-ジオクタデシルアミドまたは「DOG
S」、2,3-ジオレイルオキシ-N-[2(スペルミン-カルボキサミド)エチル]-
N,N-ジメチル-1-プロパンアミニウムまたは「DOSPA」(Behr et a
l.Proc.Nat.’l Acad.Sci.86,6982(1989)、米国特
許第5,171,678号、米国特許第5,334,761号)、1,2-ジオレオイル
-3-ジメチルアンモニウム-プロパンまたは「DODAP」、1,2-ジオレオイル-
3-トリメチルアンモニウム-プロパンまたは「DOTAP」を含む。想定されるカチオ
ン性脂質は、1,2-ジステアリルオキシ-N,N-ジメチル-3-アミノプロパンもし
くは「DSDMA」、1,2-ジオレイルオキシ-N,N-ジメチル-3-アミノプロパ
ンもしくは「DODMA」、1,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチル-3-アミ
ノプロパンもしくは「DLinDMA」、1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチ
ル-3-アミノプロパンもしくは「DLenDMA」、N-ジオレイル-N,N-ジメチ
ル塩化アンモニウムもしくは「DODAC」、N,N-ジステアリル-N,N-ジメチル
臭化アンモニウムもしくは「DDAB」、N-(1,2-ジミリスチルオキシプロプ-3
-イル)-N,N-ジメチル-N‐ヒドロキシエチル臭化アンモニウムもしくは「DMR
IE」、3-ジメチルアミノ-2-(コレスト-5-エン-3-β-オキシブタン-4-
オキシ)-1-(シス,シス-9,12-オクタデカジエンオキシ)プロパンもしくは「
CLinDMA」、2-[5’-(コレスト-5-エン-3-β-オキシ)-3’-オキ
サペントキシ)-3-ジメチル-1-(シス,シス-9’,1-2’-オクタデカジエン
オキシ)プロパンもしくは「CpLinDMA」、N,N-ジメチル-3,4-ジオレイ
ルオキシベンジルアミンもしくは「DMOBA」、1,2-N,N’-ジオレイルカルバ
ミル-3-ジメチルアミノプロパンもしくは「DOcarbDAP」、2,3-ジリノレ
オイルオキシ-Ν,Ν-ジメチルプロピルアミンもしくは「DLinDAP」、1,2-
N,N’-ジリノレオイルカルバミル-3-ジメチルアミノプロパンもしくは「DLin
carbDAP」、1,2-ジリノレオイルカルバミル-3-ジメチルアミノプロパンも
しくは「DLinCDAP」、2,2-ジリノレオイル-4-ジメチルアミノメチル-[
1,3]-ジオキソランもしくは「DLin-K-DMA」、2,2-ジリノレオイル-
4-ジメチルアミノエチル-[1,3]-ジオキソランもしくは「DLin-K-XTC
2-DMA」、またはそれらの組み合わせも含む(Heyes,J.,et al.,J
Controlled Release107:276-287(2005)、Mor
rissey,DV.,et al.,Nat.Biotechnol.23(8):1
003-1007(2005)、PCT公開第WO2005/121348A1号)。組
成物(例えば脂質ナノ粒子)を製剤化するためのコレステロールに基づくカチオン性脂質
の使用も本発明により想定される。そのようなコレステロールに基づくカチオン性脂質は
、単独で、または他のカチオン性もしくは非カチオン性脂質との組み合わせのいずれかで
使用され得る。好適なコレステロールに基づくカチオン性脂質は、例えばDC-Chol
(N,N-ジメチル-N-エチルカルボキサミドコレステロール),1,4-ビス(3-
N-オレイルアミノ-プロピル)ピペラジンを含む(Gao,et al.Bioche
m.Biophys.Res.Comm.179,280(1991)、Wolf et
al.BioTechniques23,139(1997)、米国特許第5,744
,335号)。
等のカチオン性脂質も想定される。例えば、国際出願第PCT/US2010/0584
57号に開示される(参照により本明細書に組み込まれる)、カチオン性脂質(3S,1
0R,13R,17R)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン
-2-イル)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,
17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イル3-(1
H-イミダゾール-4-イル)プロパン酸もしくは「ICE」の使用も想定される。
、本明細書に記載されるリポソームおよび薬学的組成物にN-オクタノイル-スフィンゴ
シン-1-[スクシニル(メトキシポリエチレングリコール)-2000](C8 PE
G-2000セラミド)を含む、誘導体化されたセラミド(PEG-CER)等のポリエ
チレングリコール(PEG)修飾されたリン脂質および誘導化された脂質の使用および包
含も想定される。想定されるPEG修飾された脂質は、長さがC6-C20のアルキル鎖
(複数可)で脂質に共有結合される、長さが最大5kDaのポリエチレングリコール鎖を
含むが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法に採
用されるPEG修飾された脂質は、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロール,メト
キシポリエチレングリコール(2000MW PEG)(「DMG-PEG2000」)
である。PEG修飾された脂質を脂質送達ビヒクルに添加することにより、複雑な凝集を
防止することができ、循環寿命を増加させ、脂質-ポリヌクレオチド組成物の標的組織へ
の送達を増加させるための手段も提供するか(Klibanov et al.(199
0)FEBS Letters,268(1):235-237)、またはそれらは生体
内で製剤から外に迅速に交換されるように選択され得る(米国特許第5,885,613
号を参照)。特に有用な交換可能脂質は、短いアシル鎖(例えばC14またはC18)を
有するPEG-セラミドである。本発明のPEG修飾されたリン脂質および誘導化された
脂質は、リポソーム脂質ナノ粒子に存在する総脂質の約0%~約20%、約0.5%~約
20%、約1%~約15%、約4%~約10%、または約2%のモル比を含み得る。
おける非カチオン性脂質の使用も想定する。そのような非カチオン性脂質は、好ましくは
、本明細書に開示される化合物および脂質のうちの1つ以上と組み合わせて使用される。
本明細書で使用される、句「非カチオン性脂質」とは、任意の中性、双極性イオン、また
はアニオン性の脂質を指す。本明細書で使用される、句「アニオン性脂質」とは、生理学
的pH等の選択されたpHで、正味負電荷を持つ多くの脂質種のいずれかを指す。非カチ
オン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ジオレオイルホスフ
ァチジルコリン(DOPC)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジオ
レオイルホスファチジルグリセロール(DOPG)、ジパルミトイルホスファチジルグリ
セロール(DPPG)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、パ
ルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)、パルミトイルオレオイル-ホ
スファチジルエタノールアミン(POPE)、ジオレオイル-ホスファチジルエタノール
アミン4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボン酸塩(DOPE-
mal)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)、ジミリストイ
ルホスホエタノールアミン(DMPE)、ジステアロイル-ホスファチジル-エタノール
アミン(DSPE)、DLPE(1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエ
タノールアミン)、DPPS(1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-
L-セリン)、16-O-モノメチルPE、16-O-ジメチルPE、18-1-トラン
スPE、1-ステアロイル-2-オレオイル-ホスファチジエタノールアミン(SOPE
)、セラミド、スフィンゴミエリン、コレステロール、またはそれらの混合物を含むが、
これらに限定されない。そのような非カチオン性脂質は単独で使用することができるが、
好ましくは、他の賦形剤、例えば本明細書に開示されるカチオン性脂質化合物(例えばH
GT4001、HGT4002、HGT4003、HGT4004、および/またはHG
T4005)のうちの1つと組み合わせて使用される。カチオン性脂質と組み合わせて使
用されるとき、非カチオン性脂質は、脂質ナノ粒子に存在する総脂質の5%~約90%、
または好ましくは約10%~約70%のモル比を含み得る。
含むことも想定される。好適なポリマーは、例えば、ポリアクリレート、ポリアルキシア
ノアクリレート、ポリアクチド、ポリアクチド-ポリグリコシドコポリマー、ポリカプロ
ラクトン、デキストラン、アルブミン、ゼラチン、アルギン酸塩、コラーゲン、キトサン
、シクロデキストリン、およびポリエチレンイミンを含み得る。そのようなポリマーは単
独で使用することができるが、好ましくは、他の賦形剤、例えば本明細書に開示されるカ
チオン性脂質化合物(例えばHGT4001、HGT4002、HGT4003、HGT
4004、および/またはHGT4005)のうちの1つと組み合わせて使用される。
標的細胞への形質移入(例えばポリヌクレオチドの)を容易にするその能力に基づき製剤
化される。別の実施形態では、薬学的およびリポソーム組成物(例えば脂質ナノ粒子)は
、ポリヌクレオチドの標的細胞、組織、または器官への送達を最適化するように選択およ
び/または調製され得る。例えば、標的細胞が肝細胞である場合、薬学的および/または
リポソーム組成物(例えば大きさ、電荷、および/またはpH)の性質は、そのような組
成物(例えば脂質ナノ粒子)を標的細胞または器官に効率的に送達する、免疫クリアラン
スを低下させる、および/またはその標的器官における保持を促進するように最適化され
得る。別の方法としては、標的組織が中枢神経系である場合、薬学的およびリポソーム組
成物の選択および調製は、血液脳関門に浸透させる、およびその内に保持する、ならびに
/またはそのような組成物(例えば脂質ナノ粒子)をそのような標的組織に直接送達する
代替え手段(例えば脳血管内投与を介して)を使用することを考慮しなければならない。
ある実施形態では、薬学的もしくはリポソーム組成物またはその構成要素である脂質ナノ
粒子は、被包された材料の移動を容易にする薬剤(例えば、血液脳関門への浸透を妨害ま
たは改善し、それによってそのような被包されたポリヌクレオチドの標的細胞への移動を
強化する薬剤)と組み合わされ得る。本明細書に記載される薬学的およびリポソーム組成
物(例えば脂質ナノ粒子)は、1つ以上のポリヌクレオチド等の被包された材料の標的細
胞への導入を容易にすることができ、ポリカチオン(例えばポリL-リジンおよびプロタ
ミン)を、例えばコポリマーとして薬学的組成物を含む脂質ナノ粒子のうちの1つ以上に
付加することによっても容易にすることができ、いくつかの場合では、生体外および生体
内における多くの細胞系において、いくつかの種類のカチオン性リポソームの形質移入の
効率を2~28倍顕著に強化する。(N.J.Caplen,et al,Gene T
her.1995;2:603、S.Li,et al,Gene Ther.1997
;4,891を参照。)
、1つ以上の材料または治療薬(例えばポリヌクレオチド)を被包するように調製される
。所望の治療薬(例えばmRNA)をリポソームまたは脂質ナノ粒子中に組み込むプロセ
スは、本明細書において、「充填」または「被包」と称される(Lasic,et al
,FEBS Lett.,312:255-258,1992)。脂質ナノ粒子充填また
は被包された材料(例えばポリヌクレオチド)は、脂質ナノ粒子の内部空間、脂質ナノ粒
子の2重層膜内に完全に、または部分的に位置するか、または脂質ナノ粒子の外表面に会
合し得る。
なポリヌクレオチドを迅速に排出させる、そのようなポリヌクレオチドおよび/または系
もしくは受容体を分解する酵素もしくは化学物質(例えば血清)を含み得る環境からポリ
ヌクレオチドを保護する働きをする可能性がある。したがって、いくつかの実施形態では
、本明細書に記載される組成物は、特にそのようなポリヌクレオチドが曝される環境に関
して、それによって被包されたポリヌクレオチド(複数可)の安定性を強化することがで
きる。例えばポリヌクレオチド等の材料を、本明細書に記載される薬学的およびリポソー
ム組成物(例えば脂質ナノ粒子)のうちの1つ以上の中に被包することにより、そのよう
なポリヌクレオチドの標的細胞および組織内への送達も容易にする。例えば、本明細書に
記載される脂質化合物のうちの1つ以上を含む脂質ナノ粒子は、被包されたポリヌクレオ
チドを標的細胞に到達させことができるか、または被包されたポリヌクレオチドを優先的
に標的細胞または器官に差別的に到達させることができる(例えば脂質ナノ粒子は、その
ような脂質ナノ粒子が投与される対象の肝臓または脾臓において濃縮され得る)。別の方
法としては、脂質ナノ粒子は、被包されたポリヌクレオチドの、被包されたポリヌクレオ
チドの存在が望ましくない、または利用を限定するものであり得る他の非標的細胞または
器官への送達を制限することができる。
ナノ粒子)は、複数の脂質成分(例えば、本明細書に開示される化合物のうちの1つ以上
)を1つ以上のポリマー成分と組み合わせることにより調製される。例えば、脂質ナノ粒
子は、HGT4003、DOPE、CHOL、およびDMG-PEG2000を用いて調
製され得る。脂質ナノ粒子は、例えばHGT4001、DOPE、およびDMG-PEG
2000を含む、様々な割合の追加の脂質の組み合わせから構成され得る。脂質ナノ粒子
を含むカチオン性脂質、非カチオン性脂質、および/またはPEG修飾された脂質の選択
、ならびにそのような脂質の相互に対する相対的モル比は、選択された脂質(複数可)の
特性、意図される標的細胞または組織の性質、および脂質ナノ粒子によって送達される材
料またはポリヌクレオチドの特性に基づく。さらなる考慮事項は、例えば、アルキル鎖の
飽和、ならびに選択された脂質(複数可)の大きさ、電荷、pH、pKa、膜融合性、お
よび毒性を含む。
現在当該技術分野において既知である様々な技法により調製され得る。多層小胞(MLV
)は、例えば、脂質を適切な溶剤に溶解し、次いで溶剤を蒸発させ、器の内部上に薄いフ
ィルムを残すことにより、または噴霧乾燥により、選択された脂質を好適な容器もしくは
器の内壁上に堆積させることによる従来の技法により調製され得る。次いで、MLVの形
成をもたらす渦動運動している器に水相が添加され得る。次いで、単層小胞(ULV)は
、均質化、音波処理、または多層小胞の押出により形成され得る。加えて、単層小胞は洗
剤除去法により形成され得る。
オチド(例えばmRNA)が脂質ナノ粒子の両表面上に会合され、同じ脂質ナノ粒子内に
被包される、脂質ナノ粒子を含む。例えば、本発明の組成物の調製中、本明細書に記載さ
れ、脂質ナノ粒子を含むカチオン性脂質化合物のうちの1つ以上は、ポリヌクレオチド(
例えばmRNA)と、そのようなポリヌクレオチドとの静電相互作用を通して会合し得る
。
途の両方で検出可能である診断用放射性核種、蛍光材料、または他の材料で充填され得る
。例えば、本発明に使用するための好適な診断材料は、ローダミン-ジオレオイルホスフ
ァチジルエタノールアミン(Rh-PE)、緑色蛍光タンパク質mRNA(GFP mR
NA)、ウミシイタケルシフェラーゼmRNA、およびホタルルシフェラーゼmRNAを
含み得る(配列番号1)。
れらを含むことにより水性内部に被包され得、親油性分子は、脂質製剤に含まれることに
より脂質2重層中に組み込まれ得る。ある分子(例えば、カチオン性またはアニオン性の
親油性ポリヌクレオチド)の場合において、ポリヌクレオチドの予め形成された脂質ナノ
粒子またはリポソーム内への充填は、例えば、米国特許第4,946,683号に記載さ
れる方法(その開示は参照により本明細書に組み込まれる)により達成され得る。ポリヌ
クレオチドの被包後、脂質ナノ粒子は、ゲルクロマトグラフィー、膜分離精製法、または
限外濾過等のプロセスを通して被包されていないmRNAを除去するために処理され得る
。例えば、本明細書に記載されるリポソーム組成物(例えば脂質ナノ粒子)の表面から外
部的に結合されたポリヌクレオチドを除去することが望ましい場合、そのような脂質ナノ
粒子は、ジエチルアミノエチルSEPHACELカラムに曝すことができる。
加え、脂質ナノ粒子に含まれるか、または被包され得る。例えば、そのような追加治療薬
は、脂質ナノ粒子の表面と会合し得、脂質製剤に含む、または予め形成された脂質ナノ粒
子内に充填することにより、脂質ナノ粒子の脂質2重層中に組み込まれ得る(米国特許第
5,194,654号および第5,223,263号を参照、参照により本明細書に組み
込まれる)。
、または「寸法決定」するための方法がいくつかあり、寸法決定が本発明の一部として使
用されるとき、一般に、それらの方法のいずれかを採用することができる。押出方法は、
リポソーム寸法決定の一方法である。(Hope,M J et al.Reducti
on of Liposome Size and Preparation of U
nilamellar Vesicles by Extrusion Techniq
ues.In:Liposome Technology(G.Gregoriadis
,Ed.)Vol.1.p123(1993))。本方法は、リポソームの大きさを比較
的明確に定義された大きさ分布に減少させるために、小さい細孔のポリカーボネート膜ま
たは非対称セラミック膜を通してリポソームを押出すことからなる。典型的に、所望のリ
ポソームの大きさ分布が達成されるまで、膜を通して1回以上懸濁液が巡回される。リポ
ソームは、リポソームの大きさの漸進的な減少を達成するように、連続的により小さい細
孔膜を通して押出され得る。
方法が利用可能である。そのような寸法決定の一方法は、米国特許第4,737,323
号に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。槽またはプローブ超音波処理
のいずれかによるリポソームまたは脂質ナノ粒子懸濁液を超音波処理することにより、直
径が約0.05ミクロン未満の小さいULVに漸進的に大きさの減少をもたらす。均質化
は、大きいリポソームをより小さいものに細分化するための、せん断エネルギーに依存す
る別の方法である。典型的な均質化手順において、MLVは、典型的に約0.1~0.5
ミクロンの選択されたリポソームの大きさが観察されるまで、標準的なエマルジョンホモ
ジナイザーを通して再循環される。脂質ナノ粒子の大きさは、Bloomfield,A
nn.Rev.Biophys.Bioeng.,10:421-450(1981)(
参照により本明細書に組み込まれる)に記載される擬電場光散乱(QELS)により決定
され得る。平均脂質ナノ粒子直径は、形成された脂質ナノ粒子の音波処理により減少させ
ることができる。間欠超音波処理周期は、十分なリポソーム合成を誘導するためにQEL
S評価と交互に行われてもよい。
は、標的細胞または組織の部位、およびある程度脂質ナノ粒子が作製される用途を考慮し
なければならない。本明細書で使用される、句「標的細胞」とは、本明細書に記載される
薬学的およびリポソーム組成物のうちの1つ以上が誘導される、または標的とされる細胞
を指す。いくつかの実施形態では、標的細胞は、特定の組織または器官を含む。いくつか
の実施形態では、標的細胞は、関心のタンパク質または酵素が欠乏している。例えば、ポ
リヌクレオチドを肝細胞に送達することが所望される場合、肝細胞は標的細胞を表す。い
くつかの実施形態では、本発明の薬学的またはリポソーム組成物(および例えばその中に
被包されたポリヌクレオチド材料)は、非差別的に標的細胞に形質移入される(すなわち
、非標的細胞に形質移入されない)。本発明の組成物および方法は、肝細胞、上皮細胞、
造血細胞、上皮細胞、内皮細胞、肺細胞、骨細胞、幹細胞、間葉細胞、神経細胞(例えば
、髄膜、星状膠細胞、運動神経、後根神経節および前角運動神経の細胞)、光受容細胞(
例えば、杆体錐体)、網膜色素上皮細胞、分泌細胞、心細胞、脂肪細胞、血管平滑筋細胞
、心筋細胞、骨格筋細胞、β細胞、下垂体細胞、滑液系統細胞、卵巣細胞、精巣細胞、線
維芽細胞、B細胞、T細胞、網状赤血球、白血球、顆粒球、および腫瘍細胞を含むがこれ
らに限定されない、様々な標的細胞を優先的に標的とするように調製され得る。
ノ粒子に被包されたポリヌクレオチドによる1つ以上の標的細胞への形質移入後、そのよ
うなポリヌクレオチドによってコードされた生成物(例えば、ポリペプチドまたはタンパ
ク質)の生成が、好ましくは刺激され得、そのような標的細胞がポリヌクレオチドを発現
し、例えば関心のポリペプチドまたはタンパク質を生成する能力が強化される。例えば、
mRNAを被包する1つ以上の化合物または薬学的組成物による標的細胞への形質移入は
、そのようなmRNAによってコードされるタンパク質または酵素の生成を強化(すなわ
ち増加)する。
することが望ましい場合がある。例えば、肝臓は、一部、代謝およびタンパク質の生成に
おけるその中心的な役割のため、本発明の組成物に重要な標的器官を表し、したがって肝
臓特異的遺伝子生成物(例えば尿素回路障害)における異常により生じる疾患は、細胞(
例えば肝細胞)の特異的標的によって利益を得る場合がある。したがって、本発明のある
実施形態では、標的組織の構造的特性は、本発明の薬学的およびリポソーム組成物(例え
ばHGT4001に基づく脂質ナノ粒子)をそのような標的組織に直接分布されるのを誘
導するために利用され得る。例えば、肝細胞を標的とするために、本明細書に記載される
薬学的またはリポソーム組成物を含む脂質ナノ粒子のうちの1つ以上は、その寸法が肝臓
の内皮層系統肝類洞の開窓よりも小さいように寸法決定され得、したがって、そのような
脂質ナノ粒子のうちの1つ以上は、そのような内皮開窓を容易に透過し、標的肝細胞に到
達することができる。別の方法としては、脂質ナノ粒子は、リポソームの寸法がある細胞
または組織内への分布を制限する、または明確に回避するのに十分な直径のものであるよ
うに寸法決定され得る。例えば、本明細書に記載される薬学的およびリポソーム組成物を
含む脂質ナノ粒子は、その直径が内皮層系統肝類洞の開窓より大きく、それによってリポ
ソーム脂質ナノ粒子の幹細胞への分布を制限するように寸法決定され得る。そのような実
施形態では、大きいリポソーム組成物(例えば脂質ナノ粒子)は、内皮開窓を容易に透過
せず、代わりに、肝臓の類洞を覆うマクロファージクッパー細胞により除去されるだろう
。したがって、例えば薬学的組成物を含む脂質ナノ粒子の寸法決定は、被包されたポリヌ
クレオチドの発現が1つ以上の標的細胞において強化され得る程度をさらに操作し、正確
に制御する機会を提供することができる。一般に、本発明の薬学的およびリポソーム組成
物を含む脂質ナノ粒子のうちの少なくとも1つの大きさは、約25~250nmの範囲内
、好ましくは約250nm、175nm、150nm、125nm、100nm、75n
m、50nm、25nm、または10nm未満である。
官に優先的に分布されるように調製され得る。例えば、本発明の脂質ナノ粒子は、標的細
胞および組織への送達の強化を達成するように調製され得る。したがって、本発明の組成
物は、組織または細胞をさらに標的とするために、追加のカチオン性、非カチオン性、お
よびPEG修飾された脂質で富化され得る。
ム組成物(例えばHGT4002に基づく脂質ナノ粒子)は、その中に被包されたポリヌ
クレオチド(例えばmRNA)の送達、形質移入、および後の肝臓の細胞および組織によ
る発現、ならびにそのようなポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドまたは
タンパク質の対応する生成を強化するために、肝臓の細胞および組織に分布される。その
ような組成物は肝臓の細胞および組織内に優先的に分布されるが、発現したポリヌクレオ
チドの治療効果およびそれによってコードされたタンパク質の後の生成は、標的細胞およ
び組織に制限される必要はない。例えば、標的幹細胞は、例えば、国際出願第PCT/U
S2010/058457号および米国仮出願第61/494,881号(その教示は両
方とも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に開示される機能タンパク質もし
くは酵素を発現または生成し、全身的もしくは抹消的に排出することができる「リザーバ
」または「貯蔵所」として機能することができる。したがって、本発明のある実施形態で
は、本明細書に記載される薬学的およびリポソーム組成物を含む脂質ナノ粒子(例えばH
GT4005に基づく脂質ナノ粒子)のうちの1つ以上は、肝細胞を標的とし、かつ/ま
たは送達時に肝臓の細胞および組織に優先的に分布され得る。そのような脂質ナノ粒子の
うちの1つ以上に被包されたポリヌクレオチドによる標的幹細胞への形質移入後、そのよ
うな機能生成物が所望の治療効果を及ぼすことが可能である場所に、そのようなポリヌク
レオチドが発現し(例えば翻される)、機能生成物(例えば、ポリペプチドまたはタンパ
ク質)が分泌され、全身的に分布される。
被包されたポリヌクレオチドは、標的細胞または組織に送達および/または形質移入され
得る。いくつかの実施形態では、被包されたポリヌクレオチドは発現することができ、機
能ポリペプチド生成物が標的細胞によって生成され(いくつかの場合では分泌される)、
それによって例えば標的細胞または組織に有益な性質を付与する。そのような被包された
ポリヌクレオチドは、例えば、ホルモン、酵素、受容体、ポリペプチド、ペプチド、また
は関心の他のタンパク質をコードすることができる。ある実施形態では、そのような被包
されたポリヌクレオチドは、内因性核酸または遺伝子の発現を調節する、ないしは別の方
法で減少させる、または排除する目的のために、低干渉RNA(siRNA)またはアン
チセンスRNAをコードすることもできる。ある実施形態では、そのような被包されたポ
リヌクレオチドは本来天然であるか、または組み換えであってもよく、センスまたはアン
チセンスのいずれかの機構の作用を用いて(例えば標的遺伝子または核酸の発現を調節す
ることにより)、治療活性を及ぼすことができる。
ードするmRNA)は、任意に、例えばそのようなポリヌクレオチドの安定性および/も
しくは半減期を改善する、またはそのようなポリヌクレオチドの翻訳を改善する、ないし
は別の方法で容易にする化学修飾または生物学的修飾を含む。
ことによって、本発明に記載される化合物または薬学的およびリポソーム組成物により、
1つ以上の独特のポリヌクレオチドを標的細胞に共送達することも本明細書により想定さ
れる。単一の障害または欠乏を治療するために、1つ以上の被包されたポリヌクレオチド
を1つ以上の標的細胞に送達することも想定され、それぞれのそのようなポリヌクレオチ
ドは異なる機構の作用によって機能する。例えば、本発明の薬学的またはリポソーム組成
物は、例えば脂質ナノ粒子に被包され、内因性タンパク質または酵素欠乏を補正すること
が意図される第1のポリヌクレオチドと、機能不全の内因性ポリヌクレオチドおよびその
タンパク質もしくは酵素生成物を不活性化または「ノックダオウン」することが意図され
る第2のポリヌクレオチドとを含み得る。そのような被包されたポリヌクレオチドは、例
えばmRNAおよびsiRNAをコードすることができる。
るが、そのようなポリヌクレオチドは、生体内で細胞により容易にかつ効率的に分解され
得、よってそのようなポリヌクレオチドを無効にする。さらに、いくつかのポリヌクレオ
チドは、体液において(特にヒトの血清)不安定であり、標的細胞に到達しないうちに分
解または消化され得る。加えて、細胞内で、天然のmRNAは、30分~数日の半減期で
減衰し得る。したがって、ある実施形態では、本明細書に提供される被包されたポリヌク
レオチド、特に本明細書に提供されるmRNAポリヌクレオチドは、好ましくは、1つ以
上の標的細胞内で発現するか、または翻訳され、それによって機能タンパク質または酵素
を生成する少なくともいくつかの能力を保持する。
物のうちの1つ以上と、遺伝子の発現を調節する、または1つ以上の標的細胞内で機能ポ
リペプチドもしくはタンパク質を生成するように発現または翻訳され得る、1つ以上の安
定したポリヌクレオチド(例えば、生体内ヌクレアーゼ消化または分解に対して安定化さ
れたmRNA)を含む、または被包する1つ以上の脂質ナノ粒子とを含む。ある実施形態
では、そのような被包されたポリヌクレオチド(例えば機能タンパク質または酵素をコー
ドするmRNA)の活性は、長期間にわたり延長される。例えば、ポリヌクレオチドの活
性は、薬学的組成物が半週または隔週で、またはより好ましくは毎月、隔月、4半期、ま
たは年1回、対象に投与され得るように延長される。本発明の薬学的組成物、特に被包さ
れたmRNAの活性の拡張または延長は、そのようなmRNAから翻訳された機能タンパ
ク質または酵素の量に直接関係する。同様に、本発明の組成物の活性は、mRNAポリヌ
クレオチドの翻訳をさらに改善または強化するために行われる化学修飾によってさらに拡
張または延長され得る。例えば、コザックコンセンサス配列はタンパク質の翻訳の開始に
関与し、そのようなコザックコンセンサス配列を被包されたmRNAポリヌクレオチドに
含むことにより、mRNAポリヌクレオチドの活性をさらに拡張または延長させることが
できる。さらに、標的細胞によって生成された機能タンパク質または酵素の量は、標的細
胞に送達されたポリヌクレオチド(例えばmRNA)の量、およびそのようなポリヌクレ
オチドの安定性の関数である。本発明の化合物または組成物によって被包されたポリヌク
レオチドの安定性が、改善または強化され得る程度において、半減期、翻訳されたタンパ
ク質または酵素の活性、および化合物の投与頻度がさらに拡張され得る。
るmRNAの型および/または標的細胞に天然に内因性であるmRNAの型に対する安定
性)を付与するために、化学的に修飾され得る。したがって、いくつかの実施形態では、
本明細書に提供される被包されたポリヌクレオチドは、例えば生体内でのヌクレアーゼ消
化に対する耐性の改善を含む、増加または強化された安定性をポリヌクレオチドに与える
少なくとも1つの化学修飾を含む。本明細書で使用される、句「化学修飾」および「化学
的に修飾された」は、そのような用語が本明細書に提供されるポリヌクレオチドに関する
とき、好ましくは安定性を強化し、野生型または天然に生じるそのポリヌクレオチドの型
よりも安定性(例えばヌクレアーゼ消化に対する耐性)をポリヌクレオチドに付与する少
なくとも1つの変更を含む。用語「安定した」および「安定性」は、そのような用語が本
発明の化合物または薬学的およびリポソーム組成物によって被包されたポリヌクレオチド
に関するとき、特にmRNAに対するとき、通常そのようなRNAを分解することが可能
であるヌクレアーゼ(すなわち、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ)による
分解に対して増加または強化された耐性を指す。安定性の増加は、例えば、加水分解、あ
るいは内因性酵素(例えば、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ)または標的
細胞もしくは組織内の状態による他の破壊に対する低感受性、それによって標的細胞、組
織、対象、および/または細胞質におけるそのようなポリヌクレオチドの耐性を増加また
は強化することを含み得る。本明細書に提供される安定化されたポリヌクレオチド分子は
、その天然に存在する未修飾の対応物(例えばポリヌクレオチドの野生型の型)よりも長
い半減期を示す。
)の包含を含む、mRNAポリヌクレオチドの翻訳を改善または強化する変更も、句「化
学修飾」および「化学的に修飾された」によって、そのような用語が本発明の化合物また
は薬学的およびリポソーム組成物により被包されたポリヌクレオチドに関するとき、想定
される。(Kozak,M.,Nucleic Acids Res15(20):81
25-48(1987))。本明細書で使用される、句「化学修飾」は、天然に存在する
ポリヌクレオチドに見られるものと異なる化学物質を導入する修飾、例えば、修飾された
ヌクレオチドの導入(例えば、ヌクレオチド類似体、またはそのようなポリヌクレオチド
分子において天然に見られないペンダント基の包含)等の共有結合修飾も含む。いくつか
の実施形態では、ポリヌクレオチドは、1つ以上の脂質ナノ粒子における被包前に、それ
らにより安定性を付与するために、化学修飾または生物学的修飾を受けた。ポリヌクレオ
チドに対する例示的な化学修飾は、塩基の欠失(例えば、1つのヌクレオチドの欠失によ
り、または1つのヌクレオチドを別のものと置換することにより)、または塩基の化学修
飾を含む。
生型の型に見られるコドンより安定するように、コドンの1つ以上のヌクレオチドにおけ
る変更を含む。例えば、RNAの安定性と高い数のシチジン(C)および/またはウリジ
ン(U)残基との間の反比例関係が示され、CおよびU残基を欠失するRNAは、大半の
RNasesに対して安定であることが分かった(Heidenreich,et al
.J Biol Chem269,2131-8(1994))。いくつかの実施形態で
は、mRNA配列におけるCおよび/またはU残基の数が減少した。別の実施形態では、
Cおよび/またはU残基の数は、特定のアミノ酸をコードする1つのコドンを、同じまた
は関連するアミノ酸をコードする別のコドンと置換することによって減少する。本発明の
化合物または薬学的およびリポソーム組成物により被包されたmRNAポリヌクレオチド
に対して想定される修飾は、プソイドウリジンの組み込みも含む。プソイドウリジンを、
本発明の化合物または薬学的およびリポソーム組成物により被包されたmRNAポリヌク
レオチドの中に組み込むことにより、安定性および翻訳能力ならびに生体内の免疫原性の
縮小を強化することができる。(例えば、Kariko’,K.,et al.,Mol
ecular Therapy16(11):1833-1840(2008)を参照)
。本発明の化合物または薬学的およびリポソーム組成物によって被包されたポリヌクレオ
チドに対する置換および修飾は、容易に当業者に既知の方法によって実施され得る。
NAのコード領域内で大きい可能性がある(すなわち、メッセージが所望のアミノ酸配列
をコードする能力をなお維持しながら、メッセージに存在するCおよびU残基の全てを排
除することは不可能であり得る)。しかしながら、遺伝コードの縮退は、同じコード能を
保持しながら、配列に存在するCおよび/またはU残基の数を減少させる機会を提示する
(すなわち、どのアミノ酸がコドンによってコードされるかに依存し、RNA配列の修飾
のいくつかの異なる可能性が可能であり得る)。例えば、Glyのコドンは、GGUまた
はGGCの代わりに、GGAまたはGGGに変更され得る。
明のポリヌクレオチド配列(例えば、機能タンパク質または酵素をコードするmRNA分
子の3’および5’のうちの1つまたはその両方に対する末端遮断修飾)の組み込みも含
む。そのような修飾は、塩基のポリヌクレオチド配列への付加(例えば、ポリA末端また
はより長いポリA末端の包含)、3’UTRまたは5’UTRの変更、ポリヌクレオチド
の薬剤(例えば、タンパク質または相補的ポリヌクレオチド分子)との複合化、および(
例えば二次構造を形成する)ポリヌクレオチド分子の構造を変更する要素の包含を含み得
る。
る。したがって、ある実施形態では、長いポリA末端は、mRNA分子に付加され、よっ
てRNAにより安定性を付与することができる。ポリA末端は、様々な当該技術分野で認
識される技法を用いて付加することができる。例えば、長いポリA末端は、ポリAポリメ
ラーゼを用いて合成または生体外転写されたRNAに付加することができる(Yokoe
,et al.,Nature Biotechnology.1996;14:125
2-1256)。転写ベクターも長いポリA末端をコードすることができる。加えて、ポ
リA末端は、PCR生成物から直接転写することによって付加することができる。ポリA
は、RNAリガーゼを用いてセンスRNAの3’端にも連結され得る(例えば、Mole
cular Cloning A Laboratory Manual,2nd Ed
.,ed. by Sambrook,Fritsch and Maniatis(C
old Spring Harbor Laboratory Press:1991
edition)を参照)。ある実施形態では、ポリA末端の長さは、少なくとも約90
、200、300、400、少なくとも500ヌクレオチドである。ある実施形態では、
ポリA末端の長さは、本発明の修飾されたセンスmRNA分子の安定性、よってタンパク
質の転写を制御するために調節される。例えば、ポリA末端の長さはセンスmRNA分子
の半減期に影響を及ぼすことができるため、ポリA末端の長さは、mRNAのヌクレアー
ゼに対する耐性のレベルを変更し、それによって標的細胞におけるポリヌクレオチドの発
現およびタンパク質の生成の経過時間を制御するように調節され得る。ある実施形態では
、安定化されたポリヌクレオチド分子は、生体内での分解に対して十分に耐性であるため
(例えばヌクレアーゼによって)それらは脂質ナノ粒子なしで標的細胞に送達され得る。
チドの末端遮断修飾である。例えば、そのようなポリヌクレオチドは、野生型ポリヌクレ
オチドにおいて天然に見られない3’および/または5’非翻訳(UTR)配列を組み込
むことによって修飾され得る。ある実施形態では、天然にmRNAに隣接し、第2の無関
係なタンパク質をコードする3’および/または5’隣接配列は、それを修飾するために
、タンパク質または機能タンパク質をコードするmRNA分子のヌクレオチド配列の中に
組み込むことができる。例えば、安定しているmRNA分子からの3’または5配列(例
えば、グロビン、アクチン、GAPDH、チューブリン、ヒストン、またはクエン酸回路
酵素)は、センスmRNA分子の安定性を増加させるために、センスmRNAポリヌクレ
オチド分子の3’および/または5’領域の中に組み込むことができる。
オチド配列に対する修飾も、本発明によって想定される。例えば、本発明は、ヌクレアー
ゼ耐性を改善する、および/またはポリヌクレオチド(例えば配列番号1等)の半減期を
改善するために、CMV最初期1(IE1)遺伝子またはその断片の部分配列を含む、ポ
リヌクレオチド(例えばmRNA)の3’端および/または5’端に対する修飾を想定す
る。mRNAポリヌクレオチド配列の安定性の増加に加え、CMV最初期1(IE1)遺
伝子の部分配列を(例えば、mRNAの5’非翻訳領域および3’非翻訳領域のうちの1
つ以上に)含むことにより、mRNAの翻訳をさらに強化することが意外にも分かった。
ポリヌクレオチド(例えば配列番号2等)をさらに安定化させるために、ヒト成長ホルモ
ン(hGH)遺伝子からの配列またはその断片を、ポリヌクレオチド(例えばmRNA)
の3’端および5’端のうちの1つまたは両方に含むことも想定される。一般に、想定さ
れる化学修飾は、その未修飾対応物よりもポリヌクレオチドの安定性および/または薬物
動態性質(例えば半減期)を改善し、例えば、生体内でのヌクレアーゼ消化に対するその
ようなポリヌクレオチドの耐性を改善するために行われる修飾を含む。
またはそのような脂質ナノ粒子によって被包されるポリヌクレオチドは、安定化試薬を含
み得る。組成物は、ポリヌクレオチドに直接または間接的に結合し、ポリヌクレオチドを
安定化させ、それによって標的細胞の細胞質における滞留時間を強化する1つ以上の製剤
試薬を含み得る。そのような試薬は、好ましくは、標的細胞において、ポリヌクレオチド
の半減期の改善をもたらす。例えば、mRNAの安定性および翻訳の効率は、細胞内で天
然に生じるポリヌクレオチド(例えばmRNA)と複合体を形成する「安定化試薬」の組
み込みにより増加させることができる(例えば米国特許第5,677,124号を参照)
。安定化試薬の組み込みは、例えば薬学的組成物を含む1つ以上の脂質ナノ粒子内にmR
NAを充填または被包する前に、ポリAおよびタンパク質を生体外で安定化されるmRN
Aと組み合わせることにより達成され得る。例示的な安定化試薬は、1つ以上のタンパク
質、ペプチド、アプタマー、翻訳補助タンパク質、mRNA結合タンパク質、および/ま
たは翻訳開始因子を含む。
、脂質ナノ粒子に化学的または物理的に結合される、ないしは別の方法で組み込まれる(
例えば、脂質可溶性アンカーの膜自体内への挿入により、または膜脂質の活性基に直接結
合することにより)典型的に大きい親水性ポリマーであるオプソニン化阻害部分の使用に
よっても改善され得る。これらのオプソニン化阻害親水性ポリマーは、マクロファージ-
単球系および細網内皮系によるリポソームの取り込みを著しく減少させる保護表面層を形
成する(例えば米国特許第4,920,016号に記載され、その開示は参照により本明
細書に組み込まれる)。例えば、細網内皮系による脂質ナノ粒子の取り込みにおける遅延
は、細網内皮系によるリポソームに基づく脂質ナノ粒子の認識および取り込みを遮蔽する
ために、脂質ナノ粒子上に、またはその中に親水性ポリマー表面コーティングを付加する
ことにより容易にすることができる。例えば、ある実施形態では、本明細書に開示される
薬学的組成物を含む脂質ナノ粒子のうちの1つ以上は、そのような脂質ナノ粒子の標的細
胞および組織への送達をさらに強化するために、ポリエチレングリコール(PEG)ポリ
マーまたはPEG修飾された脂質を含む。
形成するとき、ヌクレアーゼから保護され得る。(Krieg,et al.Melto
n.Methods in Enzymology.1987;155,397-415
)。ハイブリッド形成されたmRNAの安定性は、大半のRNasesの固有の1本鎖特
異性による可能性が高い。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを複合化するよう
に選択された安定化試薬は、真核生物のタンパク質(例えば哺乳類のタンパク質)である
。さらに別の実施形態では、センス療法に使用するポリヌクレオチド(例えばmRNA)
は、第2のポリヌクレオチド分子とハイブリッド形成することにより修飾され得る。全m
RNA分子が相補的ポリヌクレオチド分子とハイブリッド形成する場合、翻訳開始が減少
し得る。いくつかの実施形態では、mRNA分子の5’非翻訳領域およびAUG開始領域
は、任意に、ハイブリッド形成されないままであってよい。翻訳開始後、リボソーム複合
体の巻き戻し活性は、翻訳が進行することができるように高親和性2本鎖上でも機能する
ことができる。(Liebhaber.J.Mol.Biol.1992;226:2-
13、Monia,et al.J Biol Chem.1993;268:1451
4-22。)ポリヌクレオチドの安定性を強化するための上述の方法のいずれも、単独で
、または他の上述の方法および/または組成物のいずれかのうちの1つ以上と組み合わせ
て使用することができることを理解する。
チドの1つ以上の標的細胞、組織、または器官への送達を強化する。いくつかの実施形態
では、1つ以上の標的細胞への送達の強化は、標的細胞に接触する、ないしは別の方法で
それに送達されるポリヌクレオチドの量を増加することを含む。いくつかの実施形態では
、標的細胞への送達の強化は、非標的細胞と接触するポリヌクレオチドの量を減少させる
ことを含む。いくつかの実施形態では、標的細胞への送達の強化は、少なくともいくつか
の標的細胞に被包されたポリヌクレオチドを形質移入させることを含む。いくつかの実施
形態では、本薬学的組成物およびそれによってコードされた機能タンパク質または酵素の
対応する生成物を含む脂質ナノ粒子によって被包されたポリヌクレオチドの発現レベルは
、標的細胞において増加する。
ドは、任意に、例えば、ポリヌクレオチドの標的細胞または組織への送達の決定を容易に
するレポーター遺伝子(例えば、ポリヌクレオチドのコード領域の上流または下流)と組
み合わせられ得る。好適なレポーター遺伝子は、例えば緑色蛍光タンパク質mRNA(G
FP mRNA)、ウミシイタケルシフェラーゼmRNA(ルシフェラーゼmRNA)、
ホタルルシフェラーゼmRNA(配列番号1)、またはそれらの任意の組み合わせを含み
得る。例えば、GFP mRNAは、標的細胞、組織、または器官におけるmRNA局在
化の確認を容易にするために、OTC mRNAをコードするポリヌクレオチドと縮合さ
れ得る。
チド(例えば、mRNA、miRNA、snRNA、およびsnoRNA)を標的細胞の
細胞内区画に移動させるのを容易にする1つ以上の追加分子(例えば、タンパク質、ペプ
チド、アプタマー、またはオリゴヌクレオチド)を含む。いくつかの実施形態では、追加
分子は、ポリヌクレオチドの、例えば標的細胞の細胞ゾル、リソソーム、ミトコンドリア
、核、核小体、またはプロテアソーム内への送達を容易にする。その小器官における欠乏
を治療するために、細胞質からの関心の翻訳されたタンパク質をその正常な細胞内位置(
例えばミトコンドリアにおいて)に輸送するのを容易にする薬剤も含まれる。いくつかの
実施形態では、薬剤は、タンパク質、ペプチド、アプタマー、およびオリゴヌクレオチド
からなる群から選択される。
/または酵素の内因生成、特にその組み換えにより調製された対応物に対して少ない免疫
原性を示すタンパク質および/または酵素の生成を容易にする。本発明のある実施形態で
は、脂質ナノ粒子は、欠乏タンパク質または酵素のmRNAをコードするポリヌクレオチ
ドを含む。そのような組成物が標的組織に分布され、後にそのような標的細胞に形質移入
されるとき、組成物を含む脂質ナノ粒子内に充填または被包された外因性mRNAは、そ
のような被包されたmRNAによってコードされる機能タンパク質または酵素(例えば、
対象が欠乏するタンパク質または酵素)を生成するように、生体内で翻訳され得る。した
がって、ある実施形態では、本発明の組成物は、外因的にまたは組み換えにより調製され
たmRNAが外因的に翻訳されたタンパク質または酵素を生成し、それによって機能タン
パク質または酵素を生成する(適用可能な場合、排出する)対象の能力を利用する。翻訳
されたタンパク質または酵素は、組み換えにより調製されたタンパク質または酵素におい
て不在である場合が多い未変性翻訳後修飾を生体内に含み、それによって翻訳されたタン
パク質または酵素の免疫原性をさらに減少させることも特徴とし得る。
の投与は、標的細胞内の特定の小器官(例えばミトコンドリア)にmRNAを送達する必
要性を回避する。むしろ、標的細胞の形質移入時および被包されたmRNAの標的細胞の
細胞質への送達時、脂質ナノ粒子のmRNA含有物が翻訳され、機能タンパク質または酵
素が生成され得る。
織の差別的標的も想定する。受動的標的の現象は、1つ以上の標的細胞による脂質ナノ粒
子の認識を強化するための追加の賦形剤の使用に依存することなく、生体内での脂質ナノ
粒子の自然な分布パターンを利用する。例えば、細網内皮系の細胞による食作用を受ける
脂質ナノ粒子は、肝臓または脾臓に蓄積される可能性が高く、したがって、組成物のその
ような標的細胞への送達を受動的に誘導するための手段を提供することができる。
的に)、ある標的細胞または標的組織でそのような脂質ナノ粒子の局在化を助長すること
ができる、本明細書において「標的リガンド」と称される追加の賦形剤の使用を伴う能動
的標的を想定する。例えば、標的は、標的細胞または組織への分布を助長するために、1
つ以上の内因性標的リガンド(例えばアポリポタンパク質E)を脂質ナノ粒子に、または
その上に含むことにより媒介され得る。標的組織による標的リガンドの認識は、標的細胞
および組織による脂質ナノ粒子および/またはその含有物への組織分布およびその細胞取
り込みを積極的に容易にする。例えば、ある実施形態では、医薬製剤を含む脂質ナノ粒子
のうちの1つ以上は、そのような脂質ナノ粒子を認識する、および例えば肝細胞によって
発現される内因性低密度リポタンパク質受容体に結合することを容易にする、または助長
するそのような脂質ナノ粒子に、またはその上にアポリポタンパク質-E標的リガンドを
含み得る。本明細書に提供される、組成物は、1つ以上の標的細胞に対する組成物の親和
性を強化することが可能なリガンドを含み得る。標的リガンドは、製剤化中または製剤化
後に、脂質ナノ粒子の外側の2重層に連結され得る。これらの方法は当該技術分野におい
て既知である。加えて、いくつかの脂質ナノ粒子は、PEAA、赤血球凝集素、他のリポ
ペプチド等の膜融合ポリマー(米国特許出願第08/835,281号および第60/0
83,294号を参照、参照により本明細書に組み込まれる)、および生体内および/ま
たは細胞内送達に有用な他の特徴を含み得る。他の実施形態では、本発明の組成物は改善
された形質移入の効率を示し、かつ/または関心の標的細胞または組織に対する強化され
た選択性を示す。したがって、1つ以上の標的細胞または組織に対して組成物またはその
構成要素である脂質ナノ粒子およびそのポリヌクレオチド含有物の親和性を強化すること
が可能である1つ以上のリガンド(例えば、ペプチド、アプタマー、オリゴヌクレオチド
、ビタミン、または他の分子)を含む組成物または脂質ナノ粒子が想定される。好適なリ
ガンドは、任意に、脂質ナノ粒子の表面に結合または連結され得る。いくつかの実施形態
では、標的リガンドは、脂質ナノ粒子の表面に及ぶか、または脂質ナノ粒子内に被包され
得る。好適なリガンドは、その物理的、化学的、または生物学的性質(例えば選択的な親
和性および/または標的細胞表面マーカーもしくは特徴の認識)に基づき選択される。細
胞特異的標的部位およびその対応する標的リガンドは広く変動し得る。好適な標的リガン
ドは、標的細胞の独特な特性が利用され、よって組成物が標的細胞を非標的細胞と区別す
ることができるように選択される。例えば、本発明の組成物は、肝細胞の認識またはそれ
に対する親和性を選択的に強化する(例えば、そのような表面マーカーの受容体媒介によ
る認識およびそれへの結合により)表面マーカー(例えばアポリポタンパク質-Bまたは
アポリポタンパク質-E)を有し得る。加えて、標的リガンドとしてのガラクトースの使
用は、本発明の組成物を柔肝細胞に誘導することが予測されるか、または別の方法として
は、標的リガンドとしての糖残基を含むマンノースの使用(例えば、肝細胞に存在するア
シアロ糖タンパク質受容体に優先的に結合することができる糖残基を含むマンノース)は
、本発明の組成物を肝臓内皮細胞に誘導することが予測されるだろう。(Hillery
AM,et al.“Drug Delivery and Targeting:F
or Pharmacists and Pharmaceutical Scient
ists”(2002)Taylor&Francis,Inc.を参照)。したがって
、脂質ナノ粒子に存在する部分に接合されたそのような標的リガンドの存在は、1つ以上
の標的細胞および組織による本発明のリポソーム組成物の認識または取り込みを容易にす
る。好適な標的リガンドの例としては、1つ以上のペプチド、タンパク質、アプタマー、
ビタミン、およびオリゴヌクレオチドが挙げられる。
組成物および方法が投与され得る、ヒト、ヒト以外の霊長類、げっ歯類等を含むが、これ
らに限定されない任意の動物(例えば哺乳類)を指す。典型的に、用語「対象」および「
患者」は、本明細書において、ヒト対象に関して互換的に使用される。
子)が被包されたポリヌクレオチドの発現およびポリペプチドもしくはタンパク質の生成
を調節または強化する能力は、疾患または病的状態の宿主の治療のために、ポリペプチド
およびタンパク質の生体内生成をもたらす新しい、より効率的な手段を提供する。そのよ
うな脂質ナノ粒子組成物は、タンパク質または酵素をコードする核酸の異常発現に関連す
る疾患または病的状態の治療に特に適している。例えば、mRNA等のポリヌクレオチド
の、肝臓、特に幹細胞等の標的器官への成功裏の送達は、肝臓に局在化する代謝の先天性
異常の治療および補正に使用され得る。したがって、本明細書に記載される化合物、薬学
的組成物、および関連する方法は、広範囲の疾患および病的状態、特にタンパク質または
酵素欠乏によるそれらの疾患を治療するために採用され得る。本明細書に記載される化合
物または薬学的およびリポソーム組成物によって被包されたポリヌクレオチド(例えばH
GT4004に基づく脂質ナノ粒子)は、機能生成物(例えば、タンパク質、酵素、ポリ
ペプチド、ペプチド、機能RNA、および/またはアンチセンス分子)をコードし得、好
ましくは生体内生成が望まれる生成物をコードする。
くつかの実施形態では、組成物は、1つ以上の追加のポリヌクレオチド、担体、標的リガ
ンド、もしくは安定化試薬、または他の好適な賦形剤と組み合わせて製剤化される。薬物
の製剤化および投与の技法は、“Remington’s Pharmaceutica
l Sciences,”Mack Publishing Co.,Easton,P
a.の最新版に見出すことができる。
象の臨床状態、被包された材料の性質、投与の部位および方法、投与予定、対象の年齢、
性別、体重、ならびに当該技術分野の臨床医に関する他の要因を考慮して、現在の医行為
に従い投与および投薬され得る。本明細書の目的において、「有効量」は、実験臨床研究
、薬理学、および医療分野の当業者に既知である、そのような関連する考慮事項によって
決定され得る。いくつかの実施形態では、投与される量は、疾患の進行、後退、または改
善の適切な処置として当業者により選択される、少なくともある程度の症状の安定化、改
善または排除、および他の指標を達成するのに十分である。例えば、好適な量および投与
レジメンは、標的細胞における1つ以上のポリヌクレオチドの少なくとも一過性の発現を
もたらすものである。
直腸、膣、経粘膜、または腸管投与、非経口送達(筋肉内、皮下、髄内注射、ならびにく
も膜下腔内、脳室内、直接的な脳室内、静脈内、腹腔内、経鼻、または眼内注射もしくは
注入を含む)を含む。ある実施形態では、対象に本明細書に記載される化合物または組成
物(例えば脂質ナノ粒子)を投与することにより、そのような化合物または組成物を1つ
以上の標的細胞、組織、または器官に接触させることを容易にする。
の接触をさらに容易にすることができるように、例えば、薬学的組成物の標的組織への直
接注射または注入を介して、好ましくはデポ製剤または持続放出製剤で、全身よりもむし
ろ局所様式で投与され得る。局所送達は、標的とされる組織により、様々な方法で影響を
受ける場合がある。例えば、本発明の組成物を含むエアロゾルは吸引され得る(鼻、気管
、または気管支送達用)、本発明の組成物は例えば外傷、疾患徴候、または痛みの部位内
に注射され得る、組成物は経口、気管、もしくは食道用途用にロゼンジ剤で提供され得る
、胃もしくは腸に投与するために液体、錠剤、もしくはカプセルの形態で供給され得る、
直腸もしくは膣用途用に坐剤形態で供給され得る、またはクリーム、滴剤、またはさらに
は注射の使用により眼にも送達され得る。治療用分子またはリガンドと複合される本発明
の化合物を含む製剤は、例えば、組成物を移植の部位から周囲細胞に拡散させることがで
きるポリマーまたは他の構造もしくは物質と関連して外科的にも投与され得る。別の方法
としては、そのような組成物は、ポリマーまたは支持体を使用することなく外科的に適用
され得る。
オチドまたは核酸の持続放出に適するように製剤化される。そのような持続放出組成物は
、延長された投与間隔で、適宜対象に投与され得る。例えば、ある実施形態では、本発明
の組成物は、1日2回、1日1回、または2日に1回、対象に投与される。ある実施形態
では、本発明の組成物は、1週間に2回、1週間に1回、10日に1回、2週間に1回、
3週間に1回、または好ましくは4週間に1回、1ヶ月に1回、6週間に1回、8週間に
1回、2ヶ月に1回、3ヶ月に1回、4ヶ月に1回、6ヶ月に1回、8ヶ月に1回、9ヶ
月に1回、または1年に1回、対象に投与される。長期間にわたりポリヌクレオチド(例
えばmRNA)の送達または放出のいずれかを行うために、デポ投与(例えば、筋肉内に
、皮下に、硝子体内に)用に製剤化される組成物および脂質ナノ粒子も想定される。好ま
しくは、採用される持続放出手段は、安定性を強化するために、ポリヌクレオチド内に導
入される修飾(例えば化学修飾)と組み合わされる。
たが、以下の実施例は、単に本発明の化合物を図示するのに役立ち、それを限定すること
は意図されない。本発明の背景を説明し、その実践に関する追加の詳細を提供するために
参照される刊行物、参考資料等のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込ま
れる。
凍結乾燥された脂質送達ビヒクル
れた含有物(例えばポリヌクレオチド)の、1つ以上の標的細胞、組織、または器官への
送達をもたらすことができるリポソーム製剤を提供する。例えば被包されたポリヌクレオ
チドの1つ以上の標的細胞への送達時、そのようなポリヌクレオチドは、標的細胞におけ
るポリヌクレオチドまたは核酸の発現を調節する(例えば発現を増加させる)ことができ
る。本明細書において、そのような薬学的組成物を調製するための関連する方法およびプ
ロセス、ならびにそのような薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することによ
り、1つ以上の疾患または状態を治療する方法も開示する。本明細書に記載される凍結乾
燥された組成物(例えば脂質ナノ粒子)は、冷凍または周囲温度(例えば室温)のいずれ
かにより保管されるとき、改善された長期安定性(例えば少なくとも1、2、3、6、9
、12、18、24、30ヶ月以上)を有することも予測される。
凍結乾燥」および「凍結乾燥された」とは、そのようなリポソーム組成物が急速冷凍によ
り、ある場合では、1つ以上の乾燥工程により(例えば、真空状態に曝されることにより
)乾燥形態に調製され、それによって、さらなる生物学的もしくは化学反応を排除する、
または別の方法としては制限するために、そのようなリポソーム組成物中の水の濃度を減
少させるプロセスを指す。
結乾燥サイクルに従い、任意の適切な方法によって実施され得る。リポソーム組成物(例
えば脂質ナノ粒子)の急速冷凍後、リポソーム組成物は、1次または2次真空乾燥条件へ
の曝露等の、1つ以上の好適な方法によって乾燥させることができる。いくつかの実施形
態では、リポソーム組成物(例えば脂質ナノ粒子)は、実施形態に提供される温度および
真空条件で乾燥される。本明細書に記載される凍結乾燥条件への曝露後、凍結乾燥された
脂質ナノ粒子組成物は、例えば好適な水性再水和培地(例えば、減菌水、通常の生理食塩
水、および/または5%のデキストロース)を用いて再水和され、対象に投与され得る。
る(例えば凍結乾燥されない薬学的組成物に対して)ことを特徴とする。本明細書に記載
される凍結乾燥されたリポソーム組成物を説明するために使用される、用語「安定してい
る」とは、そのようなリポソーム組成物(例えば脂質ナノ粒子)が凝集または凝結する(
例えば再構成後)のを防止することを指す。そのような凍結乾燥された薬学的組成物の安
定性は、多くの物理的特性を参照して決定される。例えば、安定性は、そのような組成物
を含む脂質ナノ粒子の粒径を参照に決定され得る。好ましくは、本明細書に開示される凍
結乾燥された組成物の再水和後、再構成された組成物の大きさ分布および物理的特性は、
凍結乾燥前の組成物と同一であるか、または別の方法としてはそれと同等である。したが
って、ある実施形態では、脂質ナノ粒子の凍結乾燥は、凍結乾燥および/または再構成後
の脂質ナノ粒子の粒径をはっきりと変化または変更させない。例えば、再構成時(精製水
を用いて)、凍結乾燥された薬学的組成物を含む脂質ナノ粒子は、凝結もしくは凝集しな
いか、または別の方法としては、制限されたもしくは無視できるほどの凝結または凝集を
示す(例えば再構成された脂質ナノ粒子の粒径により決定される)。
、1つ以上の標的細胞に形質移入される強化された(例えば増加された)能力を呈する。
したがって、本明細書において、1つ以上の標的細胞に形質移入する方法も提供する。そ
のような方法は、一般に、1つ以上の標的細胞が被包された材料(例えば1つ以上のポリ
ヌクレオチド)を形質移入するように、1つ以上の標的細胞を、例えば本発明の再構成さ
れた凍結乾燥された薬学的組成物(例えば1つ以上のポリヌクレオチドを被包する凍結乾
燥されたHGT4003に基づく脂質ナノ粒子)と接触させる工程を含む。
または別の方法としては本発明の組成物に使用される脂質送達ビヒクルの成分(例えば脂
質ナノ粒子)として使用され得る。上述のように、好適な脂質送達ビヒクルは、核酸、例
えば上述のHGT4001、HGT4002、HGT4003、HGT4004、および
HGT4005等の例えば切断可能なカチオン性脂質等のカチオン性脂質を含む脂質ナノ
粒子であるか、またはC12-200、ICE、DOTMA、DOGS、DOSPA、D
ODAP、DOTAP、DSDMA、DODMA、DLinDMA、DLenDMA、D
DAB、DMRIE、CLinDMA、CpLinDMA、DMOBA、DOcarbD
AP、DLinDAP、DLincarbDAP、DLinCDAP、DLin-K-D
MA、DLin-K-XTC2-DMA、DLinKC2-DMA、HGT5000、H
GT5001、HGT5002、もしくはそれらの混合物からなる群から選択される。
G修飾された脂質等の非カチオン性脂質、ヘルパー脂質が挙げられる。例えば、脂質ナノ
粒子は、HGT4003、DOPE、CHOL、およびDMG-PEG2000を用いて
調製され得る。脂質ナノ粒子は、例えばHGT4001、DOPE、およびDMG-PE
G2000を含む、様々な割合の追加の脂質の組み合わせから構成され得る。脂質ナノ粒
子を含むカチオン性脂質、非カチオン性脂質、および/またはPEG修飾された脂質の選
択、ならびにそのような脂質の相互に対する相対的モル比は、選択された脂質(複数可)
の特性、意図される標的細胞または組織の性質、および脂質ナノ粒子により送達される材
料またはポリヌクレオチドの特性に基づく。さらなる考慮事項は、例えばアルキル鎖の飽
和、ならびに選択された脂質(複数可)の大きさ、電荷、pH、pKa、膜融合性、およ
び毒性を含む。
剤をさらに含む。用語「凍結乾燥保護剤」とは、本明細書において、本明細書に記載され
るリポソーム化合物のうちの1つ以上の調製物と組み合わされる、またはそれに含まれる
とき、そのようなリポソーム化合物の凍結乾燥中、保管または再構成中、リポソーム化合
物(例えば脂質ナノ粒子)の化学および/または物理的安定性を強化する(例えば増加さ
せる)1つ以上の化合物を指すように使用される。例えば、ある実施形態では、脂質ナノ
粒子に1つ以上の凍結乾燥保護剤を含むことにより、凍結乾燥された組成物の安定性(例
えば通常の保管条件下で)を改善する、ないしは別の方法で強化する、および/または再
水和培地を用いて凍結乾燥された組成物の再構成を容易にし、それによって水性製剤を調
製することができる。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子が調製され、凍結乾燥前に
、リポソーム製剤中に存在する緩衝液が(例えば遠心分離を介して)好適な凍結乾燥保護
剤(例えば約1~50%または10~25%のスクロースを含むスクロース水溶液)で置
換され得る。いくつかの実施形態では、凍結乾燥保護剤は、リポソーム製剤が調製または
凍結乾燥される(例えば水和、膜分離精製、および/または希釈中)緩衝液または培地の
一部として含まれる。本明細書に記載される凍結乾燥された組成物を調製するために使用
され得る好適な凍結乾燥保護剤の例としては、例えばトレハロース、デキストラン(例え
ば1,5kDa、5kDa、および/または40kDa)、イヌリン(例えば1.8kD
aおよび/または4kDa)、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
得ると考えられる。(Anchordoquy,et al.,J.Pharm.Sci
.(2000)89:289-296を参照。)観察された安定化の可能な説明の1つと
しては、リポソーム粒子間の物理的バリアとして作用する糖マトリックスの形成を指す粒
子単離仮説を挙げることができる。
子)は、現在当該技術分野において既知である様々な技法により調製され得る。多層小胞
(MLV)は、例えば、脂質を適切な溶剤に溶解し、次いで溶剤を蒸発させ、器の内部上
に薄いフィルムを残すことにより、または噴霧乾燥により、選択された脂質を好適な容器
もしくは器の内壁上に堆積させることによる従来の技法により調製され得る。次いで、M
LVの形成をもたらす渦動運動している器に水相が添加され得る。次いで、単層小胞(U
LV)は、均質化、音波処理、または多層小胞の押出により形成され得る。加えて、単層
小胞は洗剤除去法により形成され得る。
an」は、特に逆が明確に記載されない限り、複数対象を含むように理解されるべきであ
る。群の1つ以上のメンバー間に「or」を含む特許請求の範囲または説明は、逆が記載
されない、ないしは別の方法で内容から明らかでない限り、1つ、2つ以上、または全て
の群のメンバーが所与の生成物またはプロセスに存在する、採用される、ないしは別の方
法で関係する場合満たされたと考えられる。本発明は、正確に群のうちの1つのメンバー
が所与の生成物またはプロセスに存在する、採用される、ないしは別の方法で関係する実
施形態を含む。本発明は、2つ以上または全群のメンバーが所与の生成物またはプロセス
に存在する、採用される、ないしは別の方法で関係する実施形態も含む。さらに、本発明
は、特に記載されない限り、または矛盾または不一致が生じることが当業者に明らかでな
い限り、列挙される特許請求の範囲のうちの1つ以上からの1つ以上の制限、要素、条項
、記述用語等が同じ基本特許請求に依存する(または関連する任意の他の特許請求として
)別の特許請求に導入される全ての変形、組み合わせ、および置換を包含することを理解
する。要素がリスト(例えばマルクーシュ群または同様の形式で)として提示される場合
、要素のそれぞれの小群も開示され、任意の要素(複数可)は群から取り除かれ得ること
を理解する。一般に、本発明または本発明の態様は、特定の要素、特徴等を含むものと見
なされ、本発明のある実施形態または本発明の態様は、そのような要素、特徴等からなる
か、または本質的にそれらからなることも理解するべきである。簡潔化する目的のため、
これらの実施形態は、全ての場合において、本明細書において明確に、具体的に記述され
ない。本発明の任意の実施形態または態様は、特定の除外が本明細書に列挙されるか否か
に関わらず、特許請求の範囲から明示的に除外され得ることも理解するべきである。本発
明の背景を説明し、その実践に関する追加の詳細を提供するために参照される刊行物およ
び他の参考資料は、参照により本明細書に組み込まれる。
実施例
実施例1-HGT4001の調製
2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデ
カヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イル)ジスルファニル)メチ
ル)-1H-イミダゾール(イミダゾール-コレステロールジスルフィド)(本明細書に
おいて「HGT4001」と称される)は、反応1に示される以下に示される一般合成ス
キームに従い調製された。
反応1
)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2-イル)-2,3
,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒド
ロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イル)ジスルファニル)ピリジン(
ピリジルコレステロールジスルフィド)は以下のように調製された。クロロホルム(35
ml)中に3.0g(7.45mmols)の化合物(1)および1.8g(8.17m
mols)の化合物(2)を含む溶液を調製し、室温で4日間攪拌した。溶剤を蒸発させ
、メタノール(50ml)を残留物に添加し、蒸発させた。得られた固体をメタノール(
50ml)中に懸濁し、室温で一晩攪拌した。濾過によりピリジルコレステロールジスル
フィド生成物(3)を収集し、メタノールで洗浄し、高真空下で乾燥させた。収率:3.
6g(95%)。1H NMR(300 MHz,CDCl3)δ8.43(m,1H)
、7.76(m,1H)、7.62(m,1H)、7.05(m,1H)、5.32(b
d,J=4Hz,1H)、2.75(m,1H)、2.35(d,J=8Hz,2H)、
2.05-1.7(m,5H),1.7-1.2(m,8H)、1.2-0.8(m,2
5H),0.65(s,3H)。MS(APCI,Pos):512(M+1)。
チル)-1H-イミダゾールを以下のように調製した。氷酢酸(200ml)中に12.
15g(123.9mmol)の化合物(4)および15.5ml(132mmol)の
(5)を含む溶液を調製し、24時間、還流温度に加熱した。反応混合物を一晩冷却させ
た。溶剤を蒸発させ、残留物をクロロホルム(800ml)に溶解した。得られた溶液を
希釈したアンモニア(4:1水:濃縮アンモニア、200ml)および鹹水(200ml
)で洗浄した。有機相を乾燥させ(Na2SO4)、濾過し、溶剤を蒸発させた。フラッ
シュクロマトグラフィー(シリカゲル500g、クロロホルム中5~7%のメタノール)
により、91%の収率を表す23gの所望の生成物4-((ベンジルチオ)メチル)-1
H-イミダゾール(化合物(6))を得た。NMRは少量の不純物(4重量%)の存在を
示し、これは酢酸塩と識別され、以下の化合物(8)と識別された。化合物6の材料は、
さらに精製することなく、HGT4001を生成するために使用された。1H NMR(
300MHz、CDCl3)δ7.60(d,J=1Hz,1H)、7.35-7.2(
m,5H)、6.90(d,J=1Hz,1H)、3.67(s,2H)、3.62(s
,2H)。MS(APCI,Pos):205(M+1)。
-4-イル)メタンチオールを以下のように調製した。液体アンモニア(200ml)の
溶液は、エーテル(30ml)中に15gの化合物(6)(70.5mmol)を含む懸
濁液を通して濃縮された。混合物が濃青色に留まるまで、この得られた黄色の溶液に5g
のナトリウム(217mmol)を少しずつ添加した。次いで40分間攪拌した。色が消
えるまで約10~15gの固形NH4Clを添加し、窒素流を用いて溶剤を蒸発させて、
粗化合物(7)を得、これは精製することなく使用された。
ルアミン(71.8mmol)をクロロホルム(200ml)に添加することにより調製
され、真空および窒素を用いて得られた溶液を脱気し、すぐに化合物(7)に添加し、得
られた混合物を窒素下で室温で攪拌した。3日後、200mlの水を添加し、混合物をク
ロロホルム(2×500ml)で抽出した。有機抽出物を鹹水(200ml)で洗浄し、
乾燥させ(Na2SO4)、濾過し、溶剤を蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィー
(シリカゲル200g、クロロホルム中1%のトリエチルアミンを用いて中和、クロロホ
ルム中2~5%のエタノール)により1.25gのHGT4001を得た(2工程におい
て35%の収率)。1H NMR(300MHz、CDCl3)δ7.61(s,1H)
、7.00(s,1H)、5.33(d,1H)、3.93(s,2H)、2.58-2
.46(m,1H)、2.29(d,2H)、1.91(m,5H)、1.61-0.8
4(m,33H)、0.66(s,3H)。13C NMR(300MHz、CDCl3
)δ141.6、135.3、134.3、121.4、118.1、56.8、56.
2、50.3、50.2、42.4、39.8、39.6、39.1、36.8、36.
2、35.8、31.9、29.1、28.3、28.1、24.4、23.9、22.
9、22.6、21.0、19.4、18.8、11.9。MS(APCI,Pos)5
15(M+1)。元素分析:C31H50N2S2、C(72.32 計算値)、実測値
72.04、H(9.79 計算値)、実測値9.84、N(5.44,計算値)、実測
値5.41.
実施例2-HGT4002の調製
S,10R,13R)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン-
2-イル)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,1
7-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イル)ジスルフ
ァニル)エチル)グアニジン(本明細書において「HGT4002」と称される)を調製
した。
反応2
(2-(ピリジン-2-イルジスルファニル)エチル)カルバメートは、5.0gの化合
物(9)(28.2mmol)および6.82gの化合物(2)(31mmol)を10
0mlのクロロホルム(100ml)に添加し、室温で4日間攪拌して溶液を形成するこ
とにより調製された。溶剤を蒸発させ、得られた黄色の固体をフラッシュクロマトグラフ
ィー(SiO2、ヘキサン中50~100%の酢酸エチル)により精製し、9.0gの不
純化合物(10)を得た。NMRは、以下に識別された出発材料化合物(2)(24%)
およびジスルフィド化合物(11)(20%)と共に、所望の材料(56重量%)の存在
を示した。得られた混合物は、さらに精製することなく、次の工程に使用された。1H
NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.55-8.45(m,1H)、7.9-
7.8(m,2H)、7.3-7.2(m,1H)、7.07(bt,J=5Hz,1H
)、3:25-3.15(m,2H)、2.87(t,J=7Hz,2H)、1.37(
s,9H)。MS(APCI,Pos)287(M+1)、231(M+1-C4H8)
。
ファニル)エチル)グアニジンカルバメート(14)は、2.0gの化合物(10)(5
6%純度、3.9mmol)を、無水ジクロロメタン(12ml)に添加した後、これに
TFA(6ml)を添加し、得られた溶液を室温で5時間攪拌することにより調製された
。溶剤を蒸発させ、残留物を高真空下で乾燥させ、粗化合物(13)(TFA塩)を得た
。化合物(13)塩を25mlの無水ジクロロメタンに溶解し、過剰トリエチルアミン(
7ml)を添加し、続いて2.7gの化合物(12)(7.0mmol)を添加し、反応
混合物を室温で一晩攪拌し、続いてクロロホルム(175ml)で希釈し、水(2×50
ml)および鹹水(50ml)で洗浄した。有機溶液を乾燥させ(Na2SO4)、濾過
し、溶剤を蒸発させた。残留物をフラッシュクロマトグラフィー(SiO2、クロロホル
ム中0~10%のメタノール)により精製し、1.9gの不純化合物(14)を得た。N
MRは、以下に識別されたジスルフィド化合物(15)(27重量%)と共に、所望の化
合物(14)(73重量%)の存在を示した。混合物は、さらに精製することなく、次の
工程に使用された。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ11.48(bs,1
H)、8.86(bt,1H)、8.55-8.5(m,1H)、7.65-7.6(m
,2H)、7.25-7.15(m,1H)、3.8-3.65(m,2H)、2.99
(t,J=6Hz,2H)、1.51(s,9H)、1.49(s,9H)。MS(AP
CI,Pos):複合体、(M+1)は検出されず。
ジン-2-イルジスルファニル)エチル)グアニジントリフルオロ酢酸塩は、1.6gの
化合物(14)(73%純度、2.8mmols)を無水ジクロロメタン(33ml)に
添加し、これにTFA(11ml)を添加し、得られた溶液を室温で一晩攪拌することに
より調製された。溶剤を蒸発させ、残留物を高真空下で乾燥させ、精製することなく次の
工程に後に使用された粗化合物(16)(TFA塩)を得た。
解し、続いて過剰のトリエチルアミン(5ml)を添加することにより調製された。1.
13gのチオコレステロール(1)(2.8mmol)を添加し、反応混合物を室温で一
晩攪拌し、続いてクロロホルム(200ml)で希釈し、水(2×50ml)および鹹水
(100ml)で洗浄した。得られた有機溶液を乾燥させ(Na2SO4)、濾過し、溶
剤を蒸発させた。残留物をフラッシュクロマトグラフィー(SiO2、クロロホルム中0
~30%のエタノール)により精製し、アセトン中に倍散し、80mgのHGT4002
を得た。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ7.60-6.90(ブロー
ド,4H)、5.35(d,1H)、3.39(t,2H)、2.84(t,2H)、2
.72(m,1H)、2.28(m,2H)、1.91(m,5H)、1.58-1.2
8(m,10H)、1.20-0.82(m,23H)、0.65(s,3H).)。1
3C NMR(300MHz,DMSO-d6)δ157.5、141.5、121.5
、56.7、56.1、50.1、49.6、42.4、38.3、36.7、36.2
、35.7、31.9、29.0、28.3、27.9、24.4、23.7、23.2
、22.9、21.0、19.5、19.1、12.2。MS(APCI,Pos):5
20(M+1)。元素分析:C30H53N3S2-SiO2、C(62.13,計算値
)、実測値62.33;H(9.21,計算値)、実測値9.08;N(7.25,計算
値)、実測値7.07;S(11.06,計算値)、実測値10.83。
実施例3-HGT4003の調製
-イルオキシ)プロピル)ジスルファニル)-N,N-ジメチルエタンアミン(本明細書
において「HGT4003」と称される)は、反応3に示される以下の一般合成スキーム
に従い調製された。
反応3
オ)プロパン-1,2-ジオールは、滴下により11.37gの化合物(18)(90.
3mmol)を、60mLのACN中の攪拌した9.73gの化合物(17)(90.3
mmol)と18.64gのK2CO3(135.1mmol)の混合物に添加すること
により調製された。得られた混合物を還流で2時間加熱し、反応混合物を室温に冷却した
後、反応混合物を濾過し、固体を20mLのACNですすいだ。濾過液を蒸発させ、淡色
の液体残留物をカラムクロマトグラフィー(溶出液:ヘキサン中10~100%のEtO
Ac)により精製し、透明の液体として17.03gの化合物(19)を得た(95%)
。
-ビス((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ)プロピル
)スルファンは、N2下で、NaH(鉱油中60%、0.82g、20.5mmol)を
、THF(200mL)中の攪拌した1.56gの化合物(19)(7.88mmol)
と6.91gの化合物(20)(21.00mmol)の混合物に添加することにより調
製された。得られた混合物を還流で44時間加熱した。室温に冷却した後、反応混合物を
Et2O(400mL)で希釈し、水(300mL)および鹹水(300mL)で洗浄し
た。有機層を無水Na2SO4上で乾燥させ、蒸発させ、黄色の液体残留物をカラムクロ
マトグラフィー(溶出液:ヘキサン中0~20%のEtOAc)により精製し、淡黄色の
液体として化合物(21)を得た(2.04g、37.3%)。
9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ)プロパン-1-チオ
ールは、化合物(21)(0.7g、1.01mmol)のEt2O(30mL)溶液を
液体NH3(30mL)に添加し、N2下で、-78℃で2つ首RBFに濃縮し、続いて
Na(90mg、3.91mmol)の小片を添加することにより調製された。TLCが
、化合物(21)が完全に消失したことを示したとき、得られた混合物を-78℃で30
分間攪拌し、340mgのNH4Cl(6.34mmol)を添加した。反応混合物の濃
い青色は10分以内に淡黄色に薄れ、ドライアイスのアセトン浴は取り外された。徐々に
室温に加温しながら、反応混合物をN2でパージした。NH3の大半がN2によって飛ば
された後(反応混合物の容積は約20mLに減少した)、水性HCl(3N、30mL)
を添加した。この混合物をDCM(60mL)で溶出した。DCM抽出物を無水Na2S
O4上で乾燥させ、蒸発させた。黄色の液体残留物をカラムクロマトグラフィー(溶出液
:ヘキサン中0~20%のEtOAc)により精製し、淡黄色の液体として490mgの
化合物(22)を得た(80%)。
-2-(ピリジン-2-イルジスルファニル)エタンアミン、および2.8gの化合物(
2)(12.7mmol)、および1.41gの化合物(23)(10mmol)をDC
M(30mL)中に混合した。10分間Ν2によってパージしながら、混合物を攪拌し、
1.5mLのEt3N(11.2mmol)を添加した。得られた溶液を室温で16時間
攪拌し、230gのシリカゲルカラム上に適用した。カラムを40~100%のEtOA
c/ヘキサン、続いて8~10%のMeOH/DCMで溶出し、黄色の液体として0.7
2gの化合物(24)を得た(34%)。
gの化合物(24)(0.84mmol)を2mLのDCM中で混合し、続いてN2下で
、16時間室温で攪拌することにより調製された。反応溶液をカラムクロマトグラフィー
(溶出液:ヘキサン中20~100%のEtOAc)により3回精製し、淡黄色の液体と
して252mgのHGT4003を得た(44%)。以下の反応4において識別された2
13mgの化合物(25)(37%)も、カラムクロマトグラフィー精製から得られた。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ5.36-5.33(m,8H)、3.6
5(m,1H)、3.56-3.50(m,4H)、3.43(td,2H)、2.96
-2.74(m,8H)、2.60(t,2H)、2.25(s,6H)、2.04(m
,8H)、1.62-1.50(m,5H)、1.39-1.22(m,32H)、0.
88(t,6H)。13C NMR(300MHz,CDCl3)δ130.3、128
.0、71.8、71.6、70.6、58.8、45.5、41.4、36.9、31
.6、30.1、29.7、29.5、29.4、27.3、26.2、25.7、22
.6、14.2。MS(APCI,Pos):709(M+1)。元素分析:C43H8
1NO2S2、C(72.92 計算値)、実測値72.75;H(11.53 計算値
)、実測値11.50;N(1.98,計算値)、実測値2.08;S(9.05,計算
値)、実測値8.95。
反応4
経路を上記の反応4に示す。上記の反応4において化合物(25)として識別された中間
体化合物2-((2,3-ビス((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1
-イルオキシ)プロピル)ジスルファニル)ピリジンは、10mLのCHCl3中で1.
35gの化合物(22)(2.24mmol)および0.54gの化合物(2)(2.4
5mmol)を混合し、N2下で16時間、室温で攪拌することにより調製された。反応
溶液をカラムクロマトグラフィー(溶出液:ヘキサン中0~20%のEtOAc)により
3回精製し、淡黄色の液体として1.1gの化合物(25)を得た(67%)。次いで、
1.09gの化合物(23)(7.71mmol)を、化合物(25)(1.1g、1.
54mmol)およびEt3N(2.6mL、18.5mmol)のCHCl3(20m
L)溶液に添加し、N2下で攪拌した。16時間後のTLCは、化合物(25)が完全に
消失したことを示した。次いで、反応溶液を水性NaOH(1N、20mL)で洗浄し、
無水Na2SO4上で乾燥させ、蒸発させた。黄色の液体残留物をカラムクロマトグラフ
ィー(溶出液: ヘキサン中5~100%のEtOAc)により精製し、淡黄色の液体と
して0.37gのHGT4003を得た(34%)。
実施例4
たホタルルシフェラーゼ(FFL)mRNA(配列番号1)を被包する脂質ナノ粒子を、
標準的なエタノール注入法を介して形成した。(Ponsa,et al.,Int.J
.Pharm.(1993)95:51-56。)脂質のエタノール性原液は、50mg
/mLの濃度で事前に調製され、-20℃で保管された。
プラスミドDNAテンプレートから生体外で形質移入され、これに続いて、5’キャップ
構造(Cap1)(Fechter,P.et al.,J.Gen.Virology
(2005)86:1239-1249)およびゲル電気泳動により決定された長さが約
200ヌクレオチドの3’ポリ(A)末端を付加することにより合成された。それぞれの
FFL mRNA生成物に存在する5’および3’非翻訳領域は、以下に示される配列番
号4において、それぞれ、XおよびYとして表される。
コドン最適化されたホタルルシフェラーゼmRNA(配列番号3):
XAUGGAAGAUGCCAAAAACAUUAAGAAGGGCCCAGCGCCA
UUCUACCCACUCGAAGACGGGACCGCCGGCGAGCAGCUGC
ACAAAGCCAUGAAGCGCUACGCCCUGGUGCCCGGCACCAU
CGCCUUUACCGACGCACAUAUCGAGGUGGACAUUACCUAC
GCCGAGUACUUCGAGAUGAGCGUUCGGCUGGCAGAAGCUA
UGAAGCGCUAUGGGCUGAAUACAAACCAUCGGAUCGUGGU
GUGCAGCGAGAAUAGCUUGCAGUUCUUCAUGCCCGUGUUG
GGUGCCCUGUUCAUCGGUGUGGCUGUGGCCCCAGCUAACG
ACAUCUACAACGAGCGCGAGCUGCUGAACAGCAUGGGCAU
CAGCCAGCCCACCGUCGUAUUCGUGAGCAAGAAAGGGCUG
CAAAAGAUCCUCAACGUGCAAAAGAAGCUACCGAUCAUAC
AAAAGAUCAUCAUCAUGGAUAGCAAGACCGACUACCAGGG
CUUCCAAAGCAUGUACACCUUCGUGACUUCCCAUUUGCCA
CCCGGCUUCAACGAGUACGACUUCGUGCCCGAGAGCUUCG
ACCGGGACAAAACCAUCGCCCUGAUCAUGAACAGUAGUGG
CAGUACCGGAUUGCCCAAGGGCGUAGCCCUACCGCACCGC
ACCGCUUGUGUCCGAUUCAGUCAUGCCCGCGACCCCAUCU
UCGGCAACCAGAUCAUCCCCGACACCGCUAOCCUCAGCGU
GGUGCCAUUUCACCACGGCUUCGGCAUGUUCACCACGCUG
GGCUACUUGAUCUGCGGCUUUCGGGUCGUGCUCAUGUACC
GCUUCGAGGAGGAGCUAUUCUUGCGCAGCUUGCAAGACUA
UAAGAUUCAAUCUGCCCUGCUGGUGCCCACACUAUUUAGC
UUCUUCGCUAAGAGCACUCUCAUCGACAAGUACGACCUAA
GCAACUUGCACGAGAUCGCCAGCGGCGGGGCGCCGCUCAG
CAAGGAGGUAGGUGAGGCCGUGGCCAAACGCUUCCACCUA
CCAGGCAUCCGCCAGGGCUACGGCCUGACAGAAACAACCA
GCGCCAUUCUGAUCACCCCCGAAGGGGACGACAAGCCUGG
CGCAGUAGGCAAGGUGGUGCCCUUCUUCGAGGCUAAGGUG
GUGGACUUGGACACCGGUAAGACACUGGGUGUGAACCAGC
GCGGCGAGCUGUGCGUCCGUGGCCCCAUGAUCAUGAGCGG
CUACGUUAACAACCCCGAGGCUACAAACGCUCUCAUCGAC
AAGGACGGCUGGCUGCACAGCGGCGACAUCGCCUACUGGG
ACGAGGACGAGCACUUCUUCAUCGUGGACCGGCUGAAGAG
CCUGAUCAAAUACAAGGGCUACCAGGUAGCCCCAGCCGAA
CUGGAGAGCAUCCUGCUGCAACACCCCAACAUCUUCGACG
CCGGGGUCGCCGGCCUGCCCGACGACGAUGCCGGCGAGCU
GCCCGCCGCAGUCGUCGUGCUGGAACACGGUAAAACCAUG
ACCGAGAAGGAGAUCGUGGACUAUGUGGCCAGCCAGGUUA
CAACCGCCAAGAAGCUGCGCGGUGGUGUUGUGUUCGUGGA
CGAGGUGCCUAAAGGACUGACCGGCAAGUUGGACGCCCGC
AAGAUCCGCGAGAUUCUCAUUAAGGCCAAGAAGGGCGGCA
AGAUCGCCGUGUAAY
X=GGGAUCCUACC(配列番号5)
Y=UUUGAAUU(配列番号6)
管された。全てのmRNA濃度は、Ribogreenアッセイ(Invitrogen
)を介して決定された。mRNAの被包は、0.1%のトリトン-X100の存在および
不在下でRibogreenアッセイを実施することにより計算された。粒径(動的光散
乱(DLS))およびゼータ電位は、Malvern Zetasizer機器を用いて
、それぞれ、1×PBSおよび1mM KClの溶液中で決定された。
G2000の50mg/mLのエタノール性溶液のアリコートを混合し、エタノールで3
mLの最終容積に希釈した。別個に、FFL mRNAの水性緩衝溶液(10mMのクエ
ン酸塩/150mMのNaCl、pH4.5)を1mg/mLの原液から調製した。脂質
溶液を水性mRNA溶液の中に迅速に注入し、振盪し、20%のエタノール中に最終懸濁
液を得た。得られたナノ粒子懸濁液を濾過し、1×PBS(pH7.4)で透析濾過し、
濃縮し、2~8℃で保管した。最終濃度=0.69mg/mLのCO-FF mRNA(
被包)。Z平均=70.3nm(Dv(50)=43.2nm;Dv(90)=80.3
nm)。
実施例5
上の標的細胞、組織、および器官に送達する高度に効率的な手段を提供することを図示す
る。HGT4003に基づく脂質ナノ粒子は、標準的なエタノール注入法を介して形成さ
れた。(Ponsa,et al.,Int.J.Pharm.(1993)95:51
-56。)脂質のエタノール性原液は、50mg/mLの濃度で事前に調製され、-2
0℃で保管された。
プラスミドDNAテンプレートから生体外で形質移入され、これに続いて、5’キャップ
構造(Cap1)(Fechter,P.et al.,J.Gen.Virology
(2005)86:1239-1249)およびゲル電気泳動により決定された長さが約
200ヌクレオチドの3’ポリ(A)末端を付加することにより合成された。それぞれの
mRNA生成物に存在する5’および3’非翻訳領域は、配列番号4において、それぞれ
、XおよびYとして表される。FFL mRNAは、使用時間まで、1mg/mLの最終
濃度で、-80℃で水中で保管された。全てのmRNA濃度は、Ribogreenアッ
セイ(Invitrogen)を介して決定された。mRNAの被包は、0.1%のトリ
トン-X100の存在および不在下でRibogreenアッセイを実施することにより
計算された。粒径(動的光散乱(DLS)およびゼータ電位は、Malvern Zet
asizer機器を用いて、それぞれ、1×PBSおよび1mM KClの溶液中で決定
された。
g/mLのエタノール性溶液のアリコートを混合し、エタノールで3mLの最終容積に希
釈した。別個に、FFL mRNAの水性緩衝溶液(10mMのクエン酸塩/150mM
のNaCl、pH4.5)を1mg/mLの原液から調製した。脂質溶液を水性mRNA
溶液の中に迅速に注入し、振盪し、20%のエタノール中に最終懸濁液を得た。得られた
ナノ粒子懸濁液を濾過し、1×PBS(pH7.4)で透析濾過し、濃縮し、2~8℃で
保管した。最終濃度=1.27mg/mLのCO-FF mRNA(被包)。Z平均=6
0.9nm(Dv(50)=47.9nm;Dv(90)=75.3nm)。
の標的細胞に送達することができるか否かを決定するために、CD-1マウスは、単回用
量のHGT4003に基づくFFL mRNA被包された脂質ナノ粒子を注射され、4時
間後に屠殺された。以下に説明するように単回用量のHGT4003に基づくFFL m
RNA被包された脂質ナノ粒子は、静脈内(IV)、脳室内(ICV)、またはくも膜下
腔内(IT)の投与経路のうちの1つを介して動物に投与された。FFL mRNAの発
現後の動物の肝臓、脾臓、脳、および脊髄で生成されたホタルルシフェラーゼタンパク質
の活性は、生物発光アッセイにおいて決定された。
System(アイテム#E1500/E4500 Promega)を用いて行われた
。組織調製は、次のように実施された:所望の組織サンプル(急速凍結)の一部を解凍し
、RO/DI水で洗浄し、セラミックのビード均質化管に設置した。組織を溶解緩衝液で
処理し、均質化した。凍結/解凍サイクルを5回、続いて4℃で遠心分離を受けたら、上
清を新しいマイクロ遠心管に移した。繰り返し、組織抽出物を-80℃で保管した。
ラーゼアッセイ基質に添加し、ボルテックスを介して混合することにより調製された。2
0μLのホモジネートサンプルを96ウェルプレート、続いてそれぞれのサンプルに20
μLのプレート対照を充填した。別個に、120μLのルシフェラーゼアッセイ試薬を9
6ウェル平底プレートのそれぞれのウェルに充填し、Biotek Synergy2機
器を用いてそれぞれのプレートを適切なチャンバに挿入し、相対的光単位(RLU)で発
光を測定した。
子製剤は、単一ボーラス静脈内(IV)注射薬を、試験される動物に投与することにより
評価された。4時間後、動物を屠殺し、肝臓および脾臓をそれぞれの動物から採取した。
送達された外因性FFLメッセージから生成されたFFLタンパク質を介して発光が検出
され、分析された。図1は、HGT4003に基づく脂質ナノ粒子系を用いて静脈内投与
された実施例を図示し、脾臓と比較したとき、肝臓において生成されたFFLタンパク質
が1桁を超えて富化されたことを示し(それぞれ、2.34×106RLU/mgタンパ
ク質対1.71×105RLU/mgタンパク質)、HGT4003に基づくナノ粒子の
使用が脾臓よりも肝臓において被包された材料の富化をもたらすことを図示する。
験される動物への脳室内(ICV)またはくも膜下腔内(IT)のいずれかの経路により
、単一ボーラス注射薬を中枢神経系に投与することにより評価された。4時間後、動物を
屠殺し、それぞれの動物から脳および脊髄を採取した。送達された外因性FFLメッセー
ジから生成されたFFLタンパク質を介して発光が検出され、分析された。図2に図示さ
れるように、HGT4003に基づく脂質ナノ粒子の投与後、FFLタンパク質生成物は
、IT 投与経路と比較して、ICV投与経路後の脳において富化された。
3に基づくFFL-mRNA被包された脂質ナノ粒子製剤を投与した全ての動物において
観察された。背景に対する発光シグナルの存在は、外部的に投与されたFFL mRNA
の発現およびそのようなFFL mRNAからのホタルルシフェラーゼタンパク質の生成
を推測する。動物の肝臓において観察された発光は、脾臓において観察された類似するシ
グナルよりも強化され、肝臓の細胞および組織における脂質ナノ粒子の富化を示唆する。
同様に、HGT4003に基づくFFL mRNA被包されたナノ粒子はICV投与経路
を介して投与され、FFLタンパク質生成は、後のIT投与経路に対して脳において富化
された。したがって、本実施例は、HGT4003に基づく脂質ナノ粒子がポリヌクレオ
チド構築物を1つ以上の標的細胞、組織、および器官に送達する高度に効率的な手段を提
供することを図示する。
実施例6-凍結乾燥されたリポソーム製剤
al.,Int.J.Pharm.(1993)95:51-56。)脂質のエタノール
性原液は、50mg/mLの濃度で事前に調製され、-20℃で保管された。コドン最適
化されたホタルルシフェラーゼ(FFL)mRNA(配列番号3)は、使用時間まで、1
mg/mLの最終濃度で、-80℃で水中で保管された。
)を介して決定された。mRNAの被包は、0.1%のトリトン-X100の存在および
不在下でRibogreenアッセイを実施することにより計算された。粒径(動的光散
乱(DLS)および粒径は、Malvern Zetasizer機器を用いて、それぞ
れ、1×PBSおよび1mM KClの溶液中で決定された。被包されたmRNA製剤の
生体外活性は293T細胞を用いて評価され、選択された製剤と同等の10μgのmRN
Aは37℃で8時間、293T細胞と共にインキュベートされた。ルシフェラーゼの生成
は、Perkin Elmer BriteLite Plusキットを用いて測定され
た。
ース)を含む溶液中で凍結し、後に真空下での昇華によりあらゆる水または水分を取り除
くことにより行われた。特に、凍結乾燥前、リポソーム製剤に存在する緩衝液は、遠心分
離を介して10%のスクロースで置換された。次いで、得られた脂質ナノ粒子溶液は、下
の表1に識別される、凍結、一次乾燥、および二次乾燥工程の特定のパラメータを特徴と
する凍結乾燥プロセスを受けた。凍結乾燥されたケーキは、以下に記載される、物理的な
特徴付けおよび生化学分析を受ける前に、適切な量の精製水で再構成された。
実施例7
10,N/P2)脂質ナノ粒子に被包されたホタルルシフェラーゼmRNA(FFL)を
含む脂質ナノ粒子の製剤が調製された。次いで、表1に記述されるプロトコルに従い、調
製した脂質ナノ粒子製剤のバッチの一部が凍結乾燥された。
た物理的性質は、上述のプロトコルに従い比較され、一貫していることが分かった。下の
表2に図示される、新鮮な脂質ナノ粒子と凍結乾燥された脂質ナノ粒子の平均粒径(Z平
均)は、それぞれ、103.8nmおよび117.0nmであった。新鮮な脂質ナノ粒子
の多分散指数(PDI)は、凍結乾燥された脂質ナノ粒子の0.247と比較して、0.
236であった。それぞれ、凍結乾燥された脂質ナノ粒子の49.0nmおよび176n
mのDv50およびDv90と比較して、新鮮な脂質ナノ粒子のDv50およびDv90
は、それぞれ、60.2nmおよび156nmであった。したがって、観察された物理的
特性は、新鮮な脂質ナノ粒子と凍結乾燥された脂質ナノ粒子の両方が安定しており、さら
に粒径が比較的同等に留まったことも示唆する。
実施例8
:20:5,N/P5)脂質ナノ粒子に被包されたホタルルシフェラーゼmRNA(FF
L)を含む脂質ナノ粒子の製剤が調製された。次いで、下の表5に記述されるプロトコル
に従い、調製した脂質ナノ粒子製剤のバッチの1つが凍結乾燥された。
溶液中で凍結し、後に真空下での昇華によりあらゆる水または水分を取り除くことにより
行われた。特に、凍結乾燥前、リポソーム製剤中の緩衝液は、遠心分離を介して10%の
スクロースで置換された。次いで、得られたリポソーム溶液は、下の表3に識別される、
凍結、一次乾燥、および二次乾燥工程の特定のパラメータを特徴とする凍結乾燥プロセス
を受けた。凍結乾燥されたケーキは、以下に記載する、物理的な特徴付けおよび生化学分
析前に、適切な量の精製水で再構成された。
mRNAを293T細胞に送達するために使用され、発光は、上述のプロトコルに従い
決定された。下の表4に図示される、4.21×106の発光値は、凍結乾燥された製剤
の再構成後に観察された2.65×106と比較して、凍結乾燥前の新鮮な脂質ナノ粒子
において観察された。
、89.11nmおよび96.41nmであった。新鮮な脂質ナノ粒子の多分散指数(P
DI)は、凍結乾燥された脂質ナノ粒子の0.204と比較して、0.205であった。
それぞれ、凍結乾燥された脂質ナノ粒子の65.1nmおよび135nmのDv50およ
びDv90と比較して、新鮮な脂質ナノ粒子のDv50およびDv90は、それぞれ、6
3.8nmおよび117nmであった。表6に示されるように、粒径および被包効率の両
方は、凍結乾燥中、良好に維持された。FFL mRNAの被包効率は、新鮮な脂質ナノ
粒子および凍結乾燥された脂質ナノ粒子において、それぞれ、93%および87%であっ
た。加えて、観察された物理的特性は、新鮮な脂質ナノ粒子と凍結乾燥された脂質ナノ粒
子の両方が安定しており、さらに粒径が比較的同等に留まったことを示唆する。
実施例9
ロポエチン(EPO)mRNA(配列番号4)を含み、DLinKC2-DMA:DOP
E:CHOL:DMG-PEG2000(50:25:20:5,N/P5)脂質ナノ粒
子に被包された脂質ナノ粒子の製剤が調製された。次いで、表3に記述されるプロトコル
に従い、調製した脂質ナノ粒子製剤のバッチの1つが凍結乾燥された。
ヒトエリスロポエチン(EPO)mRNA(配列番号4)
AUGGGGGUGCACGAAUGUCCUGCCUGGCUGUGGCUUCUCC
UGQCCCUGCUGUCGCUCCCUCUGGGCCUCCCAGUCCUGGG
CGCCCCACCACGCCUCAUCUGUGACAGCCGAGUCC UGGA
GAGGUACCUCUUGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAAUAUCACG
ACGGGCUGUGCUGAACACUGCAGCUUGAAUGAGAAUAUCA
CUGUCCCAGACACCAAAGUUAAUUUCUAUGCCUGGAAGAG
GAUGGAGGUCGGGCAGCAGGCCGUAGAAGUCUGGCAGGGC
CUGGCCCUGCUGUCGGAAGCUGUCCUGCGGGGCCAGGCCC
UGUUGGUCAACUCUUCCCAGCCGUGGGAGCCCCUGCAGCU
GCAUGUGGAUAAAGCCGUCAGUGGCCUUCGCAGCCUCACC
ACUCQGCUUCGGGCUCUGGGAGCCCAGAAGGAAGCCAUCU
CCCCUCCAGAUGCGGCCUCAGCUGCUCCACUCCGAACAAU
CACUGCUGACACUUUCCGCAAACUCUUCCGAGUCUACUCC
AAUUUCCUCCGGGGAAAGCUGAAGCUGUACACAGGGGAGG
CCOGCAGGACAGGGGACAGAUGA
コルに従い比較され、一貫していることが分かった。下の表5に図示する、新鮮な(未凍
結乾燥)脂質ナノ粒子と凍結乾燥された脂質ナノ粒子の平均粒径(Z平均)は、それぞれ
、85.9nmおよび95.4nmであり、新鮮な脂質ナノ粒子と凍結乾燥された脂質ナ
ノ粒子の両方が安定していたことを示唆する。新鮮な脂質ナノ粒子の多分散指数(PDI
)は、凍結乾燥された脂質ナノ粒子の0.231と比較して、0.188であった。新鮮
な脂質ナノ粒子のDv50およびDv90は、それぞれ、凍結乾燥された脂質ナノ粒子の
67.2nmおよび134nmのDv50およびDv90と比較して、それぞれ、61.
0nmおよび112nmであった。EPO mRNAの被包効率は、新鮮な脂質ナノ粒子
および凍結乾燥された脂質ナノ粒子において、それぞれ、94%および86%であった。
表7にも示されるように、粒径および被包効率の両方は、凍結乾燥中、良好に維持された
。
stems Human EPO Quantikine IVD ELISAキットを
用いて測定された。表5に示されるように、凍結乾燥前と後での製剤の両方におけるEP
O mRNAを293T細胞に送達した後に生成されたエリスロポエチンタンパク質は同
等であり、凍結乾燥前と後の両方の脂質ナノ粒子製剤と比較したとき、エリスロポエチン
タンパク質の生成において有意差はなかった。
実施例10
験が行われた。CD-1マウスにおける粒径分布、mRNA被包効率、ならびにEPOの
発現が決定された。
50:25:20:5)に被包されたEPO mRNAを含んだ。N/P比(カチオン性
脂質中の窒素の数に対する核酸中のリン酸の数の割合として定義される)は5であった。
保管条件において制御されなかった。
で再構成された。
におけるmRNAの被包効率は、RiboGreenアッセイキットを用いて決定された
。被包されなかったmRNAは直接検出された。総mRNAは、0.45%w/vのトリ
トンX-100の存在下で、脂質ナノ粒子の溶解後に測定された。被包効率は、(総mR
NA-被包されなかったmRNA)/総mRNA×100%として計算された。
相対的発現を評価するために、野生型CD-1マウスが使用された。血清中のEPOのレ
ベルは、用量投与6時間後に測定された。本試験に、7週齢の4匹のCD-1マウス(雄
2匹、雌2匹)を使用した。到着後、動物を、1群に2匹の動物を含む(雄1匹、雌2匹
)2つの治療群に無作為化した。1日目に動物を量り、体重を記録した。それぞれのマウ
スは、300μL/動物の用量容積で、99μgのmRNA/動物の単回IV用量を摂取
された。用量投与6時間後、CO2窒息によりマウスを安楽死させ、続いて開胸術を行い
、得られる最大血液量を収集し、血清用に処理した。投与された全治療は、単回IV投与
後、CD-1マウスにおいて良好に忍容された。hEPOの血清レベルは、ELISAに
より測定された。製剤のいずれかを摂取された試験動物の全てからの血清において、EP
Oが観察された。
ヶ月間保管した後の粒径分布において、有意な変化は観察されなかった。加えて、脂質ナ
ノ粒子におけるmRNAの被包効率は、本質的に、保管中、未変化のままであった。これ
らの結果は、脂質粒子の完全性が凍結乾燥された構成での保管中、良好に維持されたこと
を示す。加速条件の室温下での6ヶ月の安定性は、冷凍条件下での2年の貯蔵寿命の可能
性を支持する。さらに、冷凍または室温のいずれかで保管された後の凍結乾燥された脂質
ナノ粒子の再構成された懸濁液の静脈内注射6時間後に、血清hEPOが野生型CD-1
マウスにおいて検出された。これらの結果は、脂質粒子の完全性が凍結乾燥された構成で
の保管中、効率的に保護されたことを示す。
略記:1)Zave(Z平均)は強度分布からの平均値である;2)PDI(多分散指数
)は分布幅を説明する;3)Dv50は容積分布の中央値である;4)Dv90はこの値
より下に位置する容積分布の90パーセントを意味する。
実施例11
NA被包された脂質ナノ粒子に対する凍結乾燥試験を行った。比較のために、スクロース
凍結保護剤も評価された。
EG2K(40:30:25:5)脂質粒子内に被包された。N/P比は20であった。
製剤中の緩衝液は、凍結乾燥前に遠心分離を介して、適切な量のスクロースまたは2-ヒ
ドロキシプロピル-β-シクロデキストリンを含む水溶液で置換された。得られた溶液は
、凍結、一次乾燥、および二次乾燥工程の特定のパラメータを特徴とする凍結乾燥プロセ
スを受けた。表7は、製剤を含むスクロースの凍結乾燥サイクルを記載する。表8は、製
剤を含む2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンの凍結乾燥サイクルを記載す
る。物理的特徴付けおよび生化学分析前に、凍結乾燥されたケーキを適切な量の精製水で
再構成した。粒径はMalvern Zetasizer Nano-ZSを用いて得た
。脂質粒子におけるmRNAの被包効率は、RiboGreenアッセイキットを用いて
決定された。被包されなかったmRNAは直接検出された。総mRNAは、0.45%w
/vのトリトンX-100の存在下で、脂質ナノ粒子の溶解後に測定された。被包効率は
、(総mRNA-被包されなかったmRNA)/総mRNA×100%として計算された
。
けるEPOの相対的発現を評価するために、野生型CD-1マウスが使用された。血清中
のEPOのレベルは、用量投与6時間後に測定された。それぞれの群において、7週齢の
3匹の雄CD-1マウスを使用した。到着後、動物を、1群に3匹の動物を含む治療群に
無作為化した。1日目に動物を量り、体重を記録した。それぞれのマウスは、50μL/
動物の用量容積で、15μgのmRNA/動物の単回IV用量を摂取された。用量投与6
時間後、CO2窒息によりマウスを安楽死させ、続いて開胸術を行い、得られる最大血液
量を収集し、血清用に処理した。投与された全治療は、単回IV投与後、CD-1マウス
において良好に忍容された。EPOの血清レベルは、ELISAにより測定された。製剤
のいずれかを摂取された試験動物の全てからの血清において、EPOが観察された。
燥保護剤として使用されたとき、凍結乾燥中、粒径の成長が観察された。しかしながら、
粒径は、2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンが代わりに使用されたとき、
5:1の比較的低重量比においても良好に維持された。N/Pは20であった。加えて、
脂質ナノ粒子におけるmRNAの被包効率は、凍結乾燥中、良好に維持された。これらの
結果は、脂質粒子の完全性が凍結乾燥中効率的に保護されたことを示唆する。さらに、用
量投与6時間後の野生型CD-1マウスにおける血清hEPOレベルは、凍結乾燥前と後
で同等である。要約すれば、2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンは、C1
2-200脂質で製剤化されたmRNA被包された脂質ナノ粒子の有効な凍結乾燥保護剤
である。
略記:1)Zave(Z平均)は強度分布からの平均値である;2)PDI(多分散指数
)は分布幅を説明する;3)Dv50は容積分布の中央値である;4)Dv90はこの値
より下に位置する容積分布の90パーセントを意味する。
径、および被包効率を含む、調製された凍結乾燥された脂質ナノ粒子に対して同等または
等価の物理的特性を示したことを図示する。被包されたmRNAポリヌクレオチドに関し
て、凍結乾燥された脂質ナノ粒子は、同等のタンパク質生成も示した。例えば、評価され
た凍結乾燥された脂質ナノ粒子組成物のいくつかは、発光シグナルの存在によって決定さ
れる同等のホタルルシフェラーゼタンパク質の生成を示し、それによって外部的に投与さ
れた被包されたmRNAの発現および/または生成を推測する。前述の結果は、本明細書
に記載される凍結乾燥された脂質ナノ粒子組成物および製剤が安定しており、被包された
化合物(例えばポリヌクレオチド)の分解を最小にすることが可能であることを示唆する
。そのような凍結乾燥された脂質ナノ粒子組成物は、冷凍および周囲温度条件下の両方で
の保管時に増加した貯蔵寿命を有することが予測され、それによって、そのような薬学的
組成物に関連する利用可能性および潜在的な費用を改善する魅力的な手段を提示する。
(項1)
構造
を有する化合物であって、式中、R1が、イミダゾール、グアニジウム、イミン、エナ
ミン、アミノ、任意に置換されたアルキルアミノ(例えば、ジメチルアミノ等のアルキル
アミノ)、およびピリジルからなる群から選択され、
R2が、
からなる群から選択され、
式中、R3およびR4が、それぞれ独立して、任意に置換された可変的飽和もしくは不
飽和C6-C20アルキル、および任意に置換された可変的飽和もしくは不飽和C6-C
20アシルからなる群から選択され、
nが、0、または任意の正の整数である、化合物。
(項2)
R2が、
である、上記項1に記載の化合物。
(項3)
R1がイミダゾールである、上記項2に記載の化合物。
(項4)
R1がイミダゾールであり、
R2が、
であり、
nが1である、上記項1に記載の化合物。
(項5)
R1がグアニジウムであり、上記項2に記載の化合物。
(項6)
R1がグアニジウムであり、
R2が、
であり、
nが1である、上記項1に記載の化合物。
(項7)
R2が、
であり、
式中、R3およびR4が、それぞれ独立して、任意に置換された可変的飽和もしくは不飽
和C6-C20アルキル、および任意に置換された可変的飽和もしくは不飽和C6-C2
0アシルからなる群から選択される、上記項1に記載の化合物。
(項8)
R3およびR4がそれぞれ、任意に置換された可変的飽和または不飽和C6-C20アル
キルである、上記項7に記載の化合物。
(項9)
R3およびR4がそれぞれ、任意に置換された多不飽和C6-C20アルキルである、上
記項7に記載の化合物。
(項10)
R3およびR4がそれぞれ、任意に置換された多不飽和C18アルキルである、上記項7
に記載の化合物。
(項11)
R3およびR4がそれぞれ、非置換の多不飽和C18アルキルである、上記項7に記載の
化合物。
(項12)
R1がアミノである、上記項7に記載の化合物。
(項13)
R3およびR4がそれぞれ、非置換の多不飽和C18アルキルである、上記項12に記載
の化合物。
(項14)
nが1である、上記項13に記載の化合物。
(項15)
R1がジメチルアミノであり、
R2が、
であり、
式中、R3およびR4がそれぞれ、非置換の多不飽和C18アルキルであり、
nが1である、上記項1に記載の化合物。
(項16)
R1がイミダゾールである、上記項7に記載の化合物。
(項17)
R3およびR4がそれぞれ、非置換の多不飽和C18アルキルである、上記項16に記載
の化合物。
(項18)
nが1である、上記項17に記載の化合物。
(項19)
R1がイミダゾールであり、
R2が、
であり、
式中、R3およびR4がそれぞれ、非置換の多不飽和C18アルキルであり、
nが1である、上記項1に記載の化合物。
(項20)
R1がグアニジウムである、上記項7に記載の化合物。
(項21)
R3およびR4がそれぞれ、非置換の多不飽和C18アルキルである、上記項20に記載
の化合物。
(項22)
nが1である、上記項21に記載の化合物。
(項23)
R1がグアニジウムであり、
R2が、
であり、
式中、R3およびR4がそれぞれ、非置換の多不飽和C18アルキルであり、
nが1である、上記項1に記載の化合物。
(項24)
構造
を有する、化合物。
(項25)
構造
を有する、化合物。
(項26)
構造
を有する、化合物。
(項27)
構造
を有する、化合物。
(項28)
構造
を有する、化合物。
(項29)
上記項1~28のいずれか1項に記載の化合物を含む、ナノ粒子。
(項30)
カチオン性脂質、PEG修飾された脂質、非カチオン性脂質、およびヘルパー脂質からな
る群から選択される1つ以上の化合物をさらに含む、上記項29に記載のナノ粒子。
(項31)
1つ以上のポリヌクレオチドをさらに含む、上記項29または上記項30に記載のナノ粒
子。
(項32)
前記ポリヌクレオチドのうちの1つ以上が、化学修飾を含む、上記項31に記載のナノ粒
子。
(項33)
前記1つ以上のポリヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、m
iRNA、snRNA、snoRNA、およびそれらの組み合わせからなる群から選択さ
れる、上記項31に記載のナノ粒子。
(項34)
前記1つ以上のポリヌクレオチドが、1つ以上のLNAを含む、上記項31に記載のナノ
粒子。
(項35)
前記1つ以上のポリヌクレオチドがDNAを含む、上記項31に記載のナノ粒子。
(項36)
前記1つ以上のポリヌクレオチドがRNAを含む、上記項31に記載のナノ粒子。
(項37)
前記RNAが、mRNA、siRNA、snoRNA、マイクロRNA、およびそれらの
組み合わせからなる群から選択される、上記項36に記載のナノ粒子。
(項38)
前記RNAが酵素をコードする、上記項36に記載のナノ粒子。
(項39)
前記酵素が、アガルシダーゼα、α-L-イズロニダーゼ、イズロネート-2-スルファ
ターゼ、N-アセチルグルコサミン-1-リン酸トランスフェラーゼ、N-アセチルグル
コサミニダーゼ、α-グルコサミニド(glucosaminide)アセチルトランス
フェラーゼ、N-アセチルグルコサミン6-スルファターゼ、N-アセチルガラクトサミ
ン-4-スルファターゼ、β-グルコシダーゼ、ガラクトース-6-硫酸スルファターゼ
、β-ガラクトシターゼ、β-グルクロニダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ヘパランス
ルファミダーゼ、ヒアルロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、オルニチントランスカ
ルバミラーゼ(OTC)、カルバモイル-リン酸シンセターゼ1(CPS1)、アルギニ
ノコハク酸シンセターゼ(ASS1)、アルギニノコハク酸リアーゼ(ASL)、および
アルギナーゼ1(ARG1)からなる群から選択される、上記項38に記載のナノ粒子。
(項40)
上記項1~28のいずれか1項に記載の化合物、または上記項29~39のいずれか1項
に記載のナノ粒子を含む、薬学的組成物。
(項41)
対象の疾患を治療する方法であって、有効量の上記項40に記載の薬学的組成物を前記対
象に投与することを含む、方法。
(項42)
1つ以上の標的細胞にポリヌクレオチドを形質移入する方法であって、前記1つ以上の標
的細胞にポリヌクレオチドが形質移入されるように、前記1つ以上の標的細胞を上記項4
0に記載の前記薬学的組成物と接触させることを含む、方法。
(項43)
凍結乾燥された脂質ナノ粒子を含む薬学的組成物であって、前記脂質ナノ粒子がmRNA
を含む、薬学的組成物。
(項44)
前記mRNAが安定性を改善するために修飾される、上記項43に記載の薬学的組成物。
(項45)
前記脂質ナノ粒子が、再構成時に凝集しない、上記項43に記載の薬学的組成物。
(項46)
前記脂質ナノ粒子が、再構成時に約150nm未満のDv50を有する、上記項43に記
載の薬学的組成物。
(項47)
前記脂質ナノ粒子が、再構成時に約200nm未満のDv90を有する、上記項43に記
載の薬学的組成物。
(項48)
前記脂質ナノ粒子が、再構成時に約0.25未満の多分散指数値を有する、上記項43に
記載の薬学的組成物。
(項49)
前記脂質ナノ粒子が、再構成時にPBS溶液中で125nm未満の平均粒径を有する、請
求項43に記載の薬学的組成物。
(項50)
前記脂質ナノ粒子が、1つ以上のカチオン性脂質を含む、上記項43に記載の薬学的組成
物。
(項51)
前記1つ以上のカチオン性脂質が、C12-200、DOTAP(1,2-ジオレイル-
3-トリメチルアンモニウムプロパン)、DODAP(1,2-ジオレイル-3-ジメチ
ルアンモニウムプロパン)、DOTMA(1,2-ジ-O-オクタデセニル-3-トリメ
チルアンモニウムプロパン)、DLinDMA、DLinKC2-DMA、HGT400
3、HGT5001、およびICEからなる群から選択される、上記項50に記載の薬学
的組成物。
(項52)
前記脂質ナノ粒子が、1つ以上のPEG修飾された脂質を含む、上記項43に記載の薬学
的組成物。
(項53)
前記1つ以上のPEG修飾された脂質が、長さがC6-C20の1つ以上のアルキル鎖を
含む脂質に共有結合された、長さが最大5kDaのポリ(エチレン)グリコール鎖を含む
、上記項52に記載の薬学的組成物。
(項54)
前記脂質ナノ粒子が、C12-200、DOPE、コレステロール、およびDMG-PE
G-2000を含む、上記項43に記載の薬学的組成物。
(項55)
前記脂質ナノ粒子が、DLinKC2-DMA、DOPE、コレステロール、およびDM
G-PEG2000を含む、上記項43に記載の薬学的組成物。
(項56)
前記mRNAが酵素をコードする、上記項43に記載の薬学的組成物。
(項57)
前記酵素が、アガルシダーゼα、α-L-イズロニダーゼ、イズロネート-2-スルファ
ターゼ、N-アセチルグルコサミン-1-リン酸トランスフェラーゼ、N-アセチルグル
コサミニダーゼ、α-グルコサミニド(glucosaminide)アセチルトランス
フェラーゼ、N-アセチルグルコサミン6-スルファターゼ、N-アセチルガラクトサミ
ン-4-スルファターゼ、β-グルコシダーゼ、ガラクトース-6-硫酸スルファターゼ
、β-ガラクトシターゼ、β-グルクロニダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ヘパランス
ルファミダーゼ、ヒアルロニダーゼ、およびガラクトセレブロシダーゼ、オルニチントラ
ンスカルバミラーゼ(OTC)、カルバモイル-リン酸シンセターゼ1(CPS1)、ア
ルギニノコハク酸シンセターゼ(ASS1)、アルギニノコハク酸リアーゼ(ASL)、
およびアルギナーゼ1(ARG1)からなる群から選択される、上記項56に記載の薬学
的組成物。
(項58)
前記組成物が、1つ以上の凍結乾燥保護剤(lyoprotectant)をさらに含む
、上記項43に記載の薬学的組成物。
(項59)
前記1つ以上の凍結乾燥保護剤が、糖および炭水化物からなる群から選択される、上記項
58に記載の薬学的組成物。
(項60)
前記凍結乾燥保護剤が、約10%のスクロースを含む、上記項58に記載の薬学的組成物。
(項61)
前記1つ以上の凍結乾燥保護剤が、スクロース、トレハロース、デキストラン、およびイ
ヌリンからなる群から選択される、上記項58に記載の薬学的組成物。
(項62)
前記組成物が、約4oCで保管されるとき、少なくとも約1ヶ月安定である、上記項43
に記載の薬学的組成物。
(項63)
前記組成物が、約4oCで保管されるとき、少なくとも約6ヶ月安定である、上記項43
に記載の薬学的組成物。
(項64)
前記組成物が、約25oCで保管されるとき、少なくとも約6ヶ月安定である、上記項4
3に記載の薬学的組成物。
(項65)
前記mRNAの生物活性が、前記組成物の凍結乾燥前に観察された前記生物活性の約75
%を超える、上記項43に記載の薬学的組成物。
(項66)
前記脂質ナノ粒子が、カチオン性脂質、PEG修飾された脂質、非カチオン性脂質、およ
びコレステロールを含む、上記項43に記載の薬学的組成物。
(項67)
前記組成物が、対象に移植される、上記項43に記載の薬学的組成物。
(項68)
前記組成物が、再構成時に、次の投与経路:静脈内、経口的、直腸的、経膣的、経粘膜、
舌下、硬膜下、経鼻的、筋肉内、皮下的、髄内注射、くも膜下腔内、脳室内、腹腔内、鼻
腔内、眼部(opthalmically)、および眼内のうちの1つ以上によって対象
に投与される、上記項43に記載の薬学的組成物。
Claims (13)
- 凍結乾燥された脂質ナノ粒子を調製するための方法であって、前記方法は、
(a)スクロースおよびトレハロースからなる群から選択される1つ以上の凍結乾燥保護剤を含む水溶液中の脂質ナノ粒子を提供する工程であって、ここで、前記脂質ナノ粒子が、mRNAを被包するリポソームであり、そしてカチオン性脂質、非カチオン性脂質、PEG修飾された脂質およびコレステロールを含む、工程;および
(b)前記脂質ナノ粒子を凍結乾燥する工程であって、ここで、前記脂質ナノ粒子を凍結乾燥する工程が、前記脂質ナノ粒子の急速冷凍、その後、一次および二次真空乾燥への曝露により前記脂質ナノ粒子を乾燥することを含む、凍結乾燥する工程
を含む、方法。 - 前記凍結乾燥保護剤がスクロースである、請求項1に記載の方法。
- 前記凍結乾燥保護剤がトレハロースである、請求項1に記載の方法。
- 前記カチオン性脂質が、C12-200、ICE、DOTMA、DOGS、DOSPA、DODAP、DOTAP、DSDMA、DODMA、DLinDMA、DLenDMA、DDAB、DMRIE、CLinDMA、CpLinDMA、DMOBA、DOcarbDAP、DLinDAP、DLincarbDAP、DLinCDAP、DLin-K
-DMA、DLin-K-XTC2-DMA、DLinKC2-DMA、HGT5000、HGT5001、HGT5002、HGT4001、HGT4002、HGT4003、HGT4004およびHGT4005からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。 - 請求項1に記載の方法であって、ここで、前記非カチオン性脂質が、DSPC(1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン)、DPPC(1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン)、DOPE(1,2-ジオレイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン)、DPPE(1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン)、DMPE(1,2-ジミリストイル-sn-
グリセロ-3-ホスホエタノールアミン)、DOPG(1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-(1’-rac-グリセロール))、DOPE(1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン)、DSPE(1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン)、DLPE(1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン)、DPPS(1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン)、セラミド、スフィンゴミエリンおよびコレステロールからなる群から選択され;そして
前記PEG修飾された脂質が、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロール,メトキシポリエチレングリコール,2000MW PEG(DMG-PEG2000)である、方法。 - 前記非カチオン性脂質がDOPE(1,2-ジオレイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン)である、請求項5に記載の方法。
- 総カチオン性脂質が、前記脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の20~70%である量で存在する、請求項1または4に記載の方法。
- 前記PEG修飾された脂質が、前記脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の4~10%である量で存在する、請求項1または5に記載の方法。
- 請求項1~8のいずれか1項に記載の方法であって、ここで:
a)再構成時に、前記脂質ナノ粒子が、100nm、75nm、50nm、25nm未満、またはそれよりも小さいDv50を有する;
b)再構成時に、前記脂質ナノ粒子が、200nm、150nm、125nm、100nm、75nm、50nm、25nm未満、またはそれよりも小さいDv90を有する;
c)再構成時に、前記脂質ナノ粒子が、1、0.95、0.9、0.8、0.75、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.25、0.2、0.1、0.05未満、またはそれよりも小さい多分散指数値を有する、および/または
d)再構成時に、前記脂質ナノ粒子が、PBS溶液中で、100nm、75nm、50nm、25nm未満、またはそれよりも小さい平均粒径を有し、
上記a)~d)において、前記脂質ナノ粒子が、精製水で再構成される、
方法。 - 請求項1または4に記載の方法であって、ここで:
(i)前記1つ以上のカチオン性脂質が、C12-200、DOTAP(1,2-ジオレイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン)、DODAP(1,2-ジオレイル-3-ジメチルアンモニウムプロパン)、DOTMA(1,2-ジ-O-オクタデセニル-3-トリメチルアンモニウムプロパン)、DLinDMA、DLinKC2-DMA、HGT4003、HGT5001、およびICEからなる群から選択される、および/または
(ii)前記1つ以上のPEG修飾された脂質が、長さがC6-C20の1つ以上のアルキル鎖を含む脂質に共有結合された、長さが最大5kDaのポリ(エチレン)グリコール鎖を含む、
方法。 - 前記脂質ナノ粒子が、(i)Cl2-200、DOPE、コレステロールおよびDMG-PEG-2000、または(ii)DLinKC2-DMA、DOPE、コレステロールおよびDMG-PEG2000を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記凍結乾燥保護剤が、10%のスクロースを含む、請求項1または2に記載の方法。
- 粒径が、動的光散乱(DLS)により測定される、請求項9に記載の方法。
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