JP2020055842A - ヒト化抗ヒトｃｄ１９抗体及び使用方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ヒト化抗ヒトＣＤ１９抗体において、改善された安定性、特に重鎖ＨＶＲ及び軽鎖ＨＶＲのＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｌ１の脱アミド化安定性を有する単離されたヒト化抗体の提供。【解決手段】ヒト化抗ヒトＣＤ１９抗体における複数の脱アミド化ホットスポットを除去するためには１つの突然変異で十分であるという知見に部分的に基づいて変異を導入した、特定のアミノ酸配列を有するヒトＣＤ１９に特異的に結合する抗体。【選択図】なし

Description

発明の分野
本発明は、ヒトＣＤ１９に対するヒト化抗体（抗ヒトＣＤ１９抗体）、それらの生産方法、これらの抗体を含有する医薬組成物、及びその使用に関する。

背景
ヒトＣＤ１９は、Ｂ細胞及び濾胞性樹状細胞上で専ら発現される９５kDaの膜貫通タンパク質（Ｂ細胞コレセプター）である。ＣＤ１９は、ＣＤ２１及びＣＤ８１に関連して見出される。ＣＤ１９及びＣＤ２１は、正常なＢ細胞分化に必要である（Carter, R.H., et al., Immunol. Res. 26 (2002) 45-54）。ＣＤ１９に対する抗体は、いくつかの臨床試験において使用されている（例えば、Hekman, A., et al., Cancer Immunol. Immunother. 32 (191) 364-372; Vlasfeld, L.T., et al., Cancer Immunol. Immunother. 40 (1995) 37-47; Conry, R.M., et al., J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 18 (1995) 231-241; Manzke, O., et al., Int. J. Cancer 91 (2001) 516-522を参照のこと）。

ＣＤ１９に対する抗体は、例えば、国際公開公報第２００４／１０６３８１号、国際公開公報第２００５／０１２４９３号、国際公開公報第２００６／０８９１３３号、国際公開公報第２００７／００２２２３号、国際公開公報第２００６／１３３４５０号、国際公開公報第２００６／１２１８５２号、国際公開公報第２００３／０４８２０９号、米国特許第７，１０９，３０４号、米国特許出願公開第２００６／０２３３７９１号、米国特許出願公開第２００６／０２８０７３８号、米国特許出願公開第２００６／０２６３３５７号、米国特許出願公開第２００６／０２５７３９８号、欧州特許出願公開第１６４８５１２号、欧州特許出願公開第１６２９０１２号、米国特許出願公開第２００８／０１３８３３６号、国際公開公報第２００８／０２２１５２号及びBruenke, J., et al., Br. J. Hematol. 130 (2005) 218-228; Vallera, D.A., et al., Cancer Biother. Radiopharm. 19 (2004) 11-23; Ghetie, M.A., et al., Blood 104 (2004) 178-183; Lang, P., et al., Blood 103 (2004) 3982-3985; Loeffler, A., et al., Blood 95 (2000) 2098-2103; Le Gall, F., et al., FEBS Lett. 453 (1999) 164-168; Li, Q., et al., Cancer Immunol. Immunother. 47 (1998) 121-130; Eberl, G., et al., Clin. Exp. Immunol. 114 (1998) 173-178; Pietersz, G.A., et al., Cancer Immunol. Immunother. 41 (1995) 53-60; Myers, D.E., et al., Leuk. Lymphoma. 18 (1995) 93-102; Bejcek, B.E., et al., Cancer Res. 55 (1995) 2346-2351; Hagen, I.A., et al, Blood 85 (1995) 3208-3212; Vlasfeld, L.T., et al., Cancer Immunol. Immunother. 40 (1995) 37-47; Rhodes, E.G. et al., Bone Marrow Transplant. 10 (1992) 485-489; Zola, H., et al., Immunol. Cell Biol. 69 (1991) 411-422; Watanabe, M., et al., Cancer Res. 50 (1990) 3245-3248; Uckun, F.M., et al., Blood 71 (1988) 13-29; Pezzutto, A., et al.; J Immunol. 138 (1987) 2793-2799において言及されている。モノクローナル抗体ＳＪ２５−Ｃ１は市販されている（Product No. 4737, Sigma-Aldrich Co. USA、配列番号：２１〜２４）。ＦｃγＲＩＩＩＡに対する増加した親和性を有する抗体は、国際公開公報第２００８／０２２１５２号において言及されている。

ＣＤ１９に対する抗体は、Ｂ細胞活性化に対して阻害効果又は刺激効果を有し得る。マイトジェン刺激Ｂ細胞に対するＣＤ１９抗体の結合は、その後のＣａ２＋の上昇を阻害し、その結果、これらの細胞の活性化及び増殖並びにＢ細胞の増殖及び分化は、使用されるマイトジェン刺激及び抗体による架橋度に応じて、ＣＤ１９抗体によって阻害又は増強され得る。

国際公開公報第２００４／１０６３８１号では、Ｂ細胞関連障害を処置するための、二重特異性抗ＣＤ３抗ＣＤ１９抗体構築物を含む医薬組成物が報告されている。国際公開公報第２００５／０１２４９３号では、抗ＣＤ１９抗体が報告されている。国際公開公報第２００６／０８９１３３号では、抗ＣＤ１９抗体及び腫瘍学における使用が報告されている。国際公開公報第２００７／００２２２３号では、抗ＣＤ１９抗体及びそれらの使用が報告されている。国際公開公報第２００６／１３３４５０号では、移植のための抗ＣＤ１９抗体療法が報告されている。

国際公開公報第２０１１／１４７８３４号では、ＣＤ１９に対する抗体及びその使用が報告されている。

概要
（ヒト）ＣＤ１９に対する抗体であって、自己免疫疾患、関節リウマチ、狼瘡、乾癬若しくは骨疾患の処置のための、又は腫瘍処置のための治療剤として有用な抗体が本明細書で提供される。

本発明は、ヒト化抗ヒトＣＤ１９抗体における複数の脱アミド化ホットスポットを除去するために、１つの突然変異で十分であるという知見に部分的に基づくものである。

本明細書で報告される抗体は、Ｂ細胞の病的増加に関連する疾患を患っている患者に利益をもたらす特性を有する。

本明細書で報告される一態様は、ヒトＣＤ１９に特異的に結合する抗体であって、
（ａ）配列番号：０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｂ）配列番号：１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｃ）配列番号：０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｄ）配列番号：２０又は２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｅ）配列番号：０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｆ）配列番号：０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む抗体である。

一実施態様では、抗体は、モノクローナル抗体である。

一実施態様では、抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体である。

一実施態様では、抗体は、ヒトＣＤ１９に特異的に結合する抗体フラグメントである。

一実施態様では、抗体は、
（ａ）配列番号：０９のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列、及び配列番号：１９のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、又は
（ｂ）配列番号：０９のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列、及び配列番号：２７のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、又は
（ｃ）（ａ）若しくは（ｂ）の通りのＶＨ配列及びＶＬ配列
を含む。

一実施態様では、抗体は、ヒトＣＤ１９及び第２の異なる抗原に特異的に結合する二重特異性抗体である。

本明細書で報告される一態様は、本明細書で報告される抗体、及び薬学的に許容し得る担体を含む医薬製剤である。

本明細書で報告される一態様は、Ｂ細胞悪性腫瘍を処置するための、本明細書で報告される抗体である。一実施態様では、Ｂ細胞悪性腫瘍は、ＣＬＬ、ＮＨＬ及びＤＬＢＣＬからなる群より選択される。

本明細書で報告される一態様は、医薬として使用するための、本明細書で報告される抗体である。

一実施態様では、医薬は、Ｂ細胞ガン、炎症性疾患、自己免疫疾患、関節リウマチ、狼瘡、乾癬又は骨疾患を処置するためのものである。一実施態様では、医薬は、Ｂ細胞を枯渇させるためのものである。

本明細書で報告される一態様は、Ｂ細胞ガン、炎症性疾患、自己免疫疾患、関節リウマチ、狼瘡、乾癬又は骨疾患の処置において使用するための、本明細書で報告される抗体である。

本明細書で報告される一態様は、Ｂ細胞の枯渇において使用するための、本明細書で報告される抗体である。

本明細書で報告される一態様は、医薬の製造における、本明細書で報告される抗体の使用である。一実施態様では、医薬は、Ｂ細胞ガン、炎症性疾患、自己免疫疾患、関節リウマチ、狼瘡、乾癬又は骨疾患を処置するためのものである。一実施態様では、医薬は、Ｂ細胞を枯渇させるためのものである。

本明細書で報告される一態様は、Ｂ細胞ガンを有する個体を処置する方法であって、有効量の本明細書で報告される抗体を該個体に投与することを含む方法である。

本明細書で報告される一態様は、個体におけるＢ細胞を枯渇させる方法であって、有効量の本明細書で報告される抗体を該個体に投与することを含む方法である。

本明細書で報告される一態様は、疾患を処置するための医薬であって、本明細書で報告される抗体を含む医薬を製造するための方法である。一実施態様では、疾患は、Ｂ細胞ガン、炎症性疾患、自己免疫疾患、関節リウマチ、狼瘡、乾癬又は骨疾患である。

本明細書で報告される一態様は、本明細書で報告される抗体をコードする単離された核酸である。

本明細書で報告される一態様は、本明細書で報告される核酸を含む宿主細胞である。

本明細書で報告される一態様は、抗体を生産する方法であって、該抗体が産生されるように、該抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養すること、該細胞又は培養培地から該抗体を回収すること、及び該抗体を精製することを含む方法である。

本明細書で報告される一態様は、本明細書で報告される抗体、及び細胞傷害剤を含むイムノコンジュゲートである。

発明の実施態様の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書の目的のために、「アクセプターヒトフレームワーク」は、以下に定義されるように、ヒト免役グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免役グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含み得るか、又はアミノ酸配列変化を含有し得る。いくつかの実施態様では、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下又は２以下である。いくつかの実施態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、配列において、ＶＬヒト免役グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と同一である。

「親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合性相互作用の合計強度を指す。特に指示がない限り、本明細書で使用される「結合親和性」は、結合ペア（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の一対一相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般的に、解離定数（ｋ_ｄ）により表現され得る。親和性は、本明細書に記載されるものを含む当技術分野で公知の一般的な方法により測定され得る。

「親和性成熟」抗体は、抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす変化を有しない親抗体と比較して、１つ以上の超可変領域（ＨＶＲ）において１つ以上の変化を有する抗体を指す。

「抗ヒトＣＤ１９抗体」及び「ヒトＣＤ１９に特異的に結合する抗体」という用語は、抗体がヒトＣＤ１９のターゲティングにおける診断剤及び／又は治療剤として有用であるような十分な親和性で、ヒトＣＤ１９に結合することができる抗体を指す。一実施態様では、無関係の非ＣＤ１９タンパク質に対する抗ヒトＣＤ１９抗体の結合の程度は、表面プラズモン共鳴によって測定した場合には、ヒトＣＤ１９に対する該抗体の結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、ヒトＣＤ１９に特異的に結合する抗体は、１０^−８Ｍ以下の解離定数（Ｋ_Ｄ）を有する。

本明細書における「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す限り、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）及び抗体フラグメントを含む様々な抗体構造を包含する。

「抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）」という用語は、Ｆｃレセプター結合によって媒介される機能であり、エフェクター細胞の存在下における本明細書で報告される抗体によるターゲット細胞の溶解を指す。一実施態様では、ＡＤＣＣは、エフェクター細胞、例えば新たに単離されたＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）又はバフィコートから精製されたエフェクター細胞、例えば単球又はＮＫ（ナチュラルキラー）細胞の存在下で、ＣＤ１９を発現する赤血球系細胞（例えば、リコンビナントヒトＣＤ１９を発現するＫ５６２細胞）の調製物を、本明細書で報告される抗体で処置することによって測定される。ターゲット細胞を^５１Ｃｒで標識し、続いて、抗体と共にインキュベーションする。標識細胞をエフェクター細胞と共にインキュベーションし、放出された^５１Ｃｒについて上清を分析する。コントロールは、抗体ではなくエフェクター細胞と共にターゲット内皮細胞をインキュベーションすることを含む。ＡＤＣＣを媒介する初期段階を誘導する抗体の能力は、Ｆｃγレセプターを発現する細胞、例えばＦｃγＲＩ及び／若しくはＦｃγＲＩＩＡをリコンビナント発現する細胞又は（ＦｃγＲＩＩＩＡを本質的に発現する）ＮＫ細胞に対するそれらの結合を測定することによって調査される。好ましい一実施態様では、ＮＫ細胞上のＦｃγＲに対する結合が測定される。

「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２；ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；及び抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が挙げられる。

「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の供給源又は種に由来するが、重鎖及び／又は軽鎖の残りの部分が異なる供給源又は種に由来する抗体を指す。

抗体の「クラス」は、その重鎖が有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体には５つの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１及びＩｇＡ_２にさらに分類され得る。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ及びμと称される。

本明細書で使用される「細胞傷害剤」という用語は、細胞機能を阻害若しくは抑制する、及び／又は細胞死若しくは破壊を引き起こす物質を指す。細胞傷害剤としては、限定されないが、放射性同位体（例えば、Ａｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８、Ｓｍ^１５３、Ｂｉ^２１２、Ｐ^３２、Ｐｂ^２１２及びＬｕの放射性同位体）；化学療法剤又は化学療法薬（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他のインターカレート剤）；成長阻害剤；酵素及びそのフラグメント、例えば核酸分解酵素；抗生物質；毒素、例えば小分子毒素又は細菌、真菌、植物若しくは動物起源の酵素的に活性な毒素（そのフラグメント及び／又は変異体を含む）；並びに以下で開示される様々な抗腫瘍剤又は抗ガン剤が挙げられる。

「補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）」という用語は、補体の存在下で、本明細書で報告される抗体によって誘導される細胞の溶解を指す。一実施態様では、ＣＤＣは、補体の存在下で、ＣＤ１９を発現するヒト内皮細胞を、本明細書で報告される抗体で処置することによって測定される。一実施態様では、細胞は、カルセインで標識される。抗体が３０μg/mlの濃度でターゲット細胞の２０％以上の溶解を誘導する場合、ＣＤＣが見られる。補体因子Ｃ１ｑに対する結合は、ＥＬＩＳＡで測定され得る。このようなアッセイでは、原則として、ＥＬＩＳＡプレートは、精製ヒトＣ１ｑ又はヒト血清が追加される濃度範囲の抗体でコーティングされる。Ｃ１ｑ結合は、Ｃ１ｑに対する抗体、続いてペルオキシダーゼ標識コンジュゲートによって検出される。結合の検出（最大結合Ｂ_ｍａｘ）は、ペルオキシダーゼ基質ABTS（登録商標）（２，２’−アジノ−ジ−［３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホナート（６）］）の４０５nm（ＯＤ４０５）における光学密度として測定される。

「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性であって、抗体クラスにより異なる生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃレセプター結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；ファゴサイトーシス；細胞表面レセプター（例えば、Ｂ細胞レセプター）のダウンレギュレーション；並びにＢ細胞活性化が挙げられる。

Ｆｃレセプター結合依存性エフェクター機能は、抗体のＦｃ領域と、造血細胞上の特殊な細胞表面レセプターであるＦｃレセプター（ＦｃＲ）との相互作用によって媒介され得る。Ｆｃレセプターは免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、免疫複合体のファゴサイトーシスによる抗体コーティング病原体の除去と、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）による、赤血球及び対応する抗体でコーティングされた様々な他の細胞ターゲット（例えば、腫瘍細胞）の溶解との両方を媒介することが示されている（例えば、Van de Winkel, J.G. and Anderson, C.L., J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511-524を参照のこと）。ＦｃＲは、免疫グロブリンアイソタイプに対するそれらの特異性によって定義される：ＩｇＧ抗体のＦｃレセプターは、ＦｃγＲと称される。Ｆｃレセプター結合は、例えば、Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492; Capel, P.J., et al., Immunomethods 4 (1994) 25-34; de Haas, M., et al., J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341;及びGessner, J.E., et al., Ann. Hematol. 76 (1998) 231-248に記載されている。

ＩｇＧ抗体のＦｃ領域のレセプター（ＦｃγＲ）の架橋は、ファゴサイトーシス、抗体依存性細胞傷害、及び炎症メディエーターの放出、並びに免疫複合体のクリアランス及び抗体産生のレギュレーションを含む多種多様なエフェクター機能をトリガーする。ヒトでは、以下であるＦｃγＲの３つのクラスが特性評価されている：
−ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）は、高親和性で単量体ＩｇＧに結合し、マクロファージ、単球、好中球及び好酸球上で発現される。少なくともアミノ酸残基Ｅ２３３〜Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７及びＰ３２９（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）の１つにおけるＦｃ領域ＩｇＧの改変は、ＦｃγＲＩに対する結合を減少させる。ＩｇＧ１及びＩｇＧ４に置換された２３３〜２３６位のＩｇＧ２残基は、ＦｃγＲＩに対する結合を１０^３倍減少させ、抗体感作赤血球に対するヒト単球応答を排除した（Armour, K.L., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624）。
−ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）は、中〜低親和性で複合体化ＩｇＧに結合し、広く発現される。このレセプターは、２つのサブタイプ（ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢ）に分類され得る。ＦｃγＲＩＩＡは、殺傷に関与する多くの細胞（例えば、マクロファージ、単球、好中球）上に見られ、殺傷プロセスを活性化することができると思われる。ＦｃγＲＩＩＢは、阻害プロセスにおいて役割を果たすと思われ、Ｂ細胞、マクロファージ並びに肥満細胞及び好酸球上に見られる。Ｂ細胞上では、それは、さらなる免疫グロブリン産生と、例えばＩｇＥクラスへのアイソタイプスイッチングとを抑制するように機能すると思われる。マクロファージ上では、ＦｃγＲＩＩＢは、ＦｃγＲＩＩＡを介して媒介されるファゴサイトーシスを阻害するように作用する。好酸球及び肥満細胞上では、Ｂ型は、その別のレセプターに対するＩｇＥ結合を介して、これらの細胞の活性化を抑制するのに役立ち得る。ＦｃγＲＩＩＡに対する結合の減少は、例えば、少なくともアミノ酸残基Ｅ２３３〜Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｒ２９２及びＫ４１４（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）の１つにおいて突然変異を有するＩｇＧ Ｆｃ領域を含む抗体について見られる。

−ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は、中〜低親和性でＩｇＧに結合し、２つのタイプとして存在する。ＦｃγＲＩＩＩＡは、ＮＫ細胞、マクロファージ、好酸球並びにいくつかの単球及びＴ細胞上に見られ、ＡＤＣＣを媒介する。ＦｃγＲＩＩＩＢは、好中球上で高発現される。ＦｃγＲＩＩＩＡに対する結合の減少は、例えば、少なくともアミノ酸残基Ｅ２３３〜Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｓ２３９、Ｅ２６９、Ｅ２９３、Ｙ２９６、Ｖ３０３、Ａ３２７、Ｋ３３８及びＤ３７６（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）の１つにおいて突然変異を有するＩｇＧ Ｆｃ領域を含む抗体について見られる。

Ｆｃレセプターに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位のマッピング、上記突然変異部位、並びにＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＡに対する結合を測定するための方法は、Shields, R.L., et al. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604に記載されている。

薬剤（例えば、医薬製剤）の「有効量」は、必要な投与量及び期間で、所望の治療的結果又は予防的結果を達成するために有効な量を指す。

本明細書で使用される「Ｆｃレセプター」という用語は、レセプターに関連する細胞質ＩＴＡＭ配列の存在を特徴とする活性化レセプターを指す（例えば、Ravetch, J.V. and Bolland, S., Annu. Rev. Immunol. 19 (2001) 275-290を参照のこと）。このようなレセプターは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＩＡである。「ＦｃγＲの非結合」という用語は、１０μg/mlの抗体濃度において、ＮＫ細胞に対する本明細書で報告される抗体の結合が、国際公開公報第２００６／０２９８７９号で報告されている抗ＯＸ４０Ｌ抗体ＬＣ．００１の場合に見られる結合の１０％以下であることを表す。

ＩｇＧ４は減少したＦｃＲ結合を示すが、他のＩｇＧサブクラスの抗体は強い結合を示す。しかしながら、Ｐｒｏ２３８、Ａｓｐ２６５、Ａｓｐ２７０、Ａｓｎ２９７（Ｆｃ糖鎖の欠如）、Ｐｒｏ３２９及び２３４、２３５、２３６及び２３７ Ｉｌｅ２５３、Ｓｅｒ２５４、Ｌｙｓ２８８、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｎ４３４並びにＨｉｓ４３５は、変化された場合であっても減少したＦｃＲ結合を提供する残基である（Shields, R.L., et al. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324；及び欧州特許出願公開第０３０７４３４号）。一実施態様では、本明細書で報告される抗体は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２サブクラスのものであり、突然変異ＰＶＡ２３６、ＧＬＰＳＳ３３１及び／又はＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａを含む。一実施態様では、本明細書で報告される抗体は、ＩｇＧ４サブクラスのものであり、突然変異Ｌ２３５Ｅを含む。一実施態様では、抗体は、突然変異Ｓ２２８Ｐをさらに含む。

本明細書では、「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、ネイティブな配列のＦｃ領域及び変異体のＦｃ領域を含む。一実施態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端に及ぶ。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リシン（Ｌｙｓ４４７）は存在してもよいし、又は存在しなくてもよい。本明細書では特に指定がない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242に記載されているＥＵインデックスとも称されるＥＵナンバリングシステムに従う。

一実施態様では、本明細書で報告される抗体は、Ｆｃ領域としてヒト起源由来のＦｃ領域を含む。一実施態様では、Ｆｃ領域は、ヒト定常領域の全ての部分を含む。抗体のＦｃ領域は、補体活性化、Ｃ１ｑ結合、Ｃ３活性化及びＦｃレセプター結合に直接関与する。補体系に対する抗体の影響は特定の条件に依存するが、Ｃ１ｑに対する結合は、Ｆｃ領域における規定の結合部位によって引き起こされる。このような結合部位は現状技術で公知であり、例えば、Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R., and Cebra, J. J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M., et al., J. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324；及び欧州特許出願公開第０３０７４３４号に記載されている。このような結合部位は、例えば、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１及びＰ３２９である（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う；本明細書では特に指定がない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242に記載されているＥＵインデックスとも称されるＥＵナンバリングシステムに従う）。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ３の抗体は、通常、補体活性化、Ｃ１ｑ結合及びＣ３活性化を示すのに対して、ＩｇＧ４は補体系を活性化せず、Ｃ１ｑに結合せず、Ｃ３を活性化しない。「抗体のＦｃ領域」は当業者に周知の用語であり、抗体のパパイン切断に基づいて定義される。一実施態様では、Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域である。一実施態様では、Ｆｃ領域は、突然変異Ｓ２２８Ｐ及び／又はＬ２３５Ｅを含むヒトＩｇＧ４サブクラスのものである（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。一実施態様では、Ｆｃ領域は、突然変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含むヒトＩｇＧ１サブクラスのものである（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。

「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に、４つのＦＲドメインＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般的に、ＶＨ（又はＶＬ）において以下の配列で現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。

「全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」という用語は、本明細書では、ネイティブな抗体構造と実質的に同様の構造を有するか、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指すために互換的に使用される。

「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」という用語は互換的に使用され、外来性核酸が導入された細胞（このような細胞の子孫を含む）を指す。宿主細胞は、継代数にかかわらず、初代トランスフォーメーション細胞及びそれに由来する子孫を含む「トランスフォーマント」及び「トランスフォーメーション細胞」を含む。子孫は、核酸含量が親細胞と完全に同一ではなくてもよいが、突然変異を含有し得る。最初にトランスフォーメーションされた細胞においてスクリーニング又は選択されたのと同じ機能又は生物学的活性を有する突然変異体子孫は、本明細書に含まれる。

「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免役グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も多く存在するアミノ酸残基に相当するフレームワークである。一般的に、ヒト免役グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからのものである。一般的に、配列のサブグループは、Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3のようなサブグループである。一実施態様では、ＶＬの場合、サブグループは、Kabat et al（前掲）の通りのサブグループカッパＩである。一実施態様では、ＶＨの場合、サブグループは、Kabat et al（前掲）の通りのサブグループＩＩＩである。

「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲに由来するアミノ酸残基と、ヒトＦＲに由来するアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。特定の実施態様では、ヒト化抗体は、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のものに対応する少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。ヒト化抗体は、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を場合により含み得る。抗体、例えば非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。

本明細書で使用される「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、配列が超可変性である（「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」）、及び／又は構造的に定義されたループ（超可変ループ）を形成する、及び／又は抗原接触残基（「抗原接触点」）を含有するアミノ酸残基ストレッチを含む抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、抗体は、６つのＨＶＲ（ＶＨにおいて３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬにおいて３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３））を含む。

ＨＶＲは、
（ａ）アミノ酸残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）、２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）及び９６〜１０１（Ｈ３）において存在する超可変ループ（Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917）；
（ｂ）アミノ酸残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、８９〜９７（Ｌ３）、３１〜３５ｂ（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）及び９５〜１０２（Ｈ３）において存在するＣＤＲ（Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.）；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ〜３６（Ｌ１）、４６〜５５（Ｌ２）、８９〜９６（Ｌ３）、３０〜３５ｂ（Ｈ１）、４７〜５８（Ｈ２）及び９３〜１０１（Ｈ３）において存在する抗原接触点（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)）；並びに
（ｄ）アミノ酸残基４６〜５６（Ｌ２）、４７〜５６（Ｌ２）、４８〜５６（Ｌ２）、４９〜５６（Ｌ２）、２６〜３５（Ｈ１）、２６〜３５ｂ（Ｈ１）、４９〜６５（Ｈ２）、９３〜１０２（Ｈ３）及び９４〜１０２（Ｈ３）を含む（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）の組み合わせ
を含む。

特に指示がない限り、可変ドメイン中のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書では、Kabat et al（前掲）に従ってナンバリングされる。

「イムノコンジュゲート」は、限定されないが、細胞傷害剤を含む１つ以上の異種分子にコンジュゲートされている抗体である。

「個体」又は「被験体」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、限定されないが、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及び非ヒト霊長類、例えばサル）、ウサギ及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられる。特定の実施態様では、個体又は被験体は、ヒトである。

「単離された」抗体は、その天然環境の構成成分から分離された抗体である。いくつかの実施態様では、抗体は、例えば、電気泳動法（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフ法（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）によって決定した場合に、９５％超又は９９％超の純度まで精製される。抗体の純度の評価方法の概説については、例えば、Flatman, S. et al., J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87を参照のこと。

「単離された」核酸は、その天然環境の構成成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含有する細胞内に含まれる核酸分子を含むが、該核酸分子は、染色体外に、又はその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。

「抗ヒトＣＤ１９抗体をコードする単離された核酸」は、抗体重鎖及び軽鎖（又はそれらのフラグメント）をコードする１つ以上の核酸分子（単一のベクター又は別個のベクター中のこのような核酸分子、及び宿主細胞内の１つ以上の位置に存在するこのような核酸分子を含む）を指す。

本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体集団から得られた抗体を指す。すなわち、例えば、天然に存在する突然変異を含有するか、又はモノクローナル抗体調製物の生産中に生じる可能な変異体抗体であって、一般に微量で存在する変異体を除いて、集団を含む個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）を対象とする異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、１つの抗原上の単一の決定基を対象とする。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体集団から得られたものであるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の生産を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用すべきモノクローナル抗体は、限定されないが、ハイブリドーマ法、リコンビナントＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリンローカスの全部又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な技術によって作製され得、このような方法、及びモノクローナル抗体を作製するための他の例示的な方法は、本明細書に記載される。

「ネイキッドな抗体」は、異種部分（例えば、細胞傷害性部分）又は放射性標識にコンジュゲートされていない抗体を指す。ネイキッドな抗体は、医薬製剤中に存在し得る。

「ネイティブな抗体」は、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、ネイティブなＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合されている２本の同一の軽鎖及び２本の同一の重鎖から構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に向かって、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも称される可変領域（ＶＨ）とそれに続く３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）とを有し、それにより、第１及び第２の定常ドメイン間にヒンジ領域が位置する。同様に、Ｎ末端からＣ末端に向かって、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも称される可変領域（ＶＬ）とそれに続く定常軽鎖（ＣＬ）ドメインとを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と称される２種類の１つに割り当てられ得る。

「添付文書」という用語は、治療製品の適応症、使用法、投与量、投与、併用療法、禁忌についての情報及び／又はその使用に関する警告を含有する治療製品の市販パッケージに通例含まれる説明書を指すために使用される。

参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列をアライメントし、必要な場合にはギャップを導入して、最大の配列同一性パーセントを実現した後の、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一の候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義され、いかなる保存的置換も配列同一性の部分とみなさない。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアライメントは、当技術分野の技能の範囲内である様々な方法において、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなど公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して達成され得る。当業者であれば、比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアライメントするための適切なパラメータを決定し得る。しかしながら、本明細書における目的のために、アミノ酸配列同一性％の値は、配列比較コンピュータープログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。配列比較コンピュータープログラムＡＬＩＧＮ−２は、Genentech, Inc.の著作物であり、ソースコードは、ユーザーマニュアルと共にU.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559に提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Genentech, Inc., South San Francisco, Californiaから公的に入手可能であり、又はソースコードからコンパイルされ得る。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステムで使用するためにコンパイルされるべきである。配列比較パラメータは全て、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変化しない。

ＡＬＩＧＮ−２がアミノ酸配列比較のために用いられる状況では、所定のアミノ酸配列Ｂに対する所定のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（あるいは、所定のアミノ酸配列Ｂに対する特定のアミノ酸配列同一性％を有するか、又は含む所定のアミノ酸配列Ａと表現され得る）は、以下のように計算される。
１００×分数Ｘ／Ｙ
（式中、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２によって、そのプログラムによるＡ及びＢのアラインメントにおいて同一のマッチとしてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である）。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さに等しくない場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性％は、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一性％と等しくないと認識されよう。特に明記されない限り、本明細書で使用されるアミノ酸配列同一性％の値は全て、直前の段落に記載されているように、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータープログラムを使用して得られる。

「医薬製剤」という用語は、その中に含まれる有効成分の生物学的活性が有効になるのを可能にするような形態の調製物であって、該製剤が投与される被験体に対して許容し得ないほど毒性のさらなる成分を含有しない調製物を指す。

「薬学的に許容し得る担体」は、医薬製剤中の有効成分以外の成分であって、被験体に対して非毒性の成分を指す。薬学的に許容し得る担体としては、限定されないが、バッファー、賦形剤、安定化剤又は保存剤が挙げられる。

本明細書で使用される「ＣＤ１９」という用語は、ヒトＢリンパ球抗原ＣＤ１９（別名は、分化抗原ＣＤ１９、Ｂリンパ球表面抗原Ｂ４、Ｔ細胞表面抗原Ｌｅｕ−１２；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ１５３９１−１（アイソフォーム１；配列番号：３３）及びＰ１５３９１−２（アイソフォーム２；配列番号：３４））を指す。この用語は、本明細書で報告される抗体がヒトＣＤ１９に結合する限り、プロセシングされていない「全長」ヒトＣＤ１９、及び細胞内のプロセシングから生じる任意の形態のヒトＣＤ１９を包含する。

本明細書で使用される「処置」（及びその文法的変化形、例えば「処置する」又は「処置すること」）は、処置される個体の自然経過を変化させようとする臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床的病状の経過中に実施され得る。処置の望ましい効果としては、限定されないが、疾患の発生又は再発の予防、症候の軽減、疾患の直接的又は間接的な任意の病理学的転帰の減少、転移の予防、疾患の進行速度の減少、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後改善が挙げられる。いくつかの実施態様では、本明細書で報告される抗体は、疾患の発症を遅延させるために、又は疾患の進行を遅らせるために使用される。

「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗原に対する抗体の結合に関与する抗体重鎖又は抗体軽鎖のドメインを指す。一般的に、ネイティブな抗体の重鎖及び軽鎖（それぞれＶＨ及びＶＬ）の可変ドメインは類似構造を有し、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。（例えば、Kindt, T.J., et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91を参照のこと）。１つのＶＨドメイン又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を与えるのに十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体を、その抗原に結合する抗体に由来するＶＨドメイン又はＶＬドメインを使用して単離して、それぞれ相補的ＶＬドメイン又はＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングし得る。例えば、Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628を参照のこと）。

本明細書で使用される「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を増殖させることができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、及びそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、それらが作動可能に連結された核酸の発現を指令することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。

ＩＩ．組成物及び方法
一態様では、本発明は、ヒト化抗ヒトＣＤ１９抗体における複数の脱アミド化ホットスポットを除去するために、１つの突然変異で十分であるという知見に部分的に基づくものである。特定の実施態様では、ヒトＣＤ１９に結合する抗体が提供される。本明細書で報告される抗体は、例えば、診断又は処置に有用である。

Ａ．例示的な抗ヒトＣＤ１９抗体
野生型ヒト化抗ヒトＣＤ１９抗体は、ＨＶＲ−Ｌ１において３つの脱アミド化ホットスポットを有することが見出されている：ＮＳＮＧＮＴ（配列番号：３６）。加えて、ＨＶＲ−Ｈ２において、さらなる脱アミド化ホットスポットが存在することが見出されている：ＫＦＮＧ（配列番号：３７）。

一態様では、ヒトＣＤ１９に特異的に結合する単離されたヒト化抗体であって、他のヒト化変異体と比較して改善された安定性、特に重鎖ＨＶＲ及び軽鎖ＨＶＲのＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｌ１の脱アミド化安定性を有する単離されたヒト化抗体が本明細書で提供される。この改善されたヒト化抗ヒトＣＤ１９抗体では、親マウス抗体のヒト／カニクイザル交差反応性は保持される。

ＨＶＲ−Ｈ２における脱アミド化ホットスポットに対処するために、６４位のＮ（Ａｓｎ）〜Ｑ（Ｇｌｎ）点突然変異（ナンバリングは、Kabatに従う）が導入されている。したがって、本明細書で報告される抗体は、アミノ酸配列ＴＥＫＦＱＧ（配列番号：３８）を含むＨＶＲ−Ｈ２を有する。好ましい一実施態様では、ヒト化抗ヒトＣＤ１９抗体は、アミノ酸配列ＹＩＮＰＹＮＤＧＳＫ ＹＴＥＫＦＱＧ（配列番号：１１）を有するＨＶＲ−Ｈ２を含む。

軽鎖における脱アミド化ホットスポットに対処し、改善された脱アミド化安定性を有するヒト化抗ヒトＣＤ１９抗体を得るために、Kabatの２７ｄ位、２７ｅ位、２８位及び２９位における個々の突然変異と、２７ｅ位及び２８位における二重突然変異（ナンバリングは、Kabatに従う）とを導入した。合計で、野生型ヒト化抗体（ｖａｒ．０；配列番号：５９及び６９）の９つの変異体（ｖａｒ．１〜ｖａｒ．９；配列番号：６０〜６８及び７０）を作製した。

Kabatの２７ｅ位における１つの突然変異によって、Ｓ（セリン）からＰ（プロリン）まで、ＨＶＲ−Ｌ１における全ての脱アミド化ホットスポットに対処し得ることが見出された。これは、脱アミド化の傾向があるＮ（アスパラギン）残基の突然変異ではなく、隣接残基の突然変異である。

したがって、本明細書で報告される抗体は、アミノ酸配列ＬＥＮＰＮＧＮＴ（配列番号：３９）を含むＨＶＲ−Ｌ１を有する。一実施態様では、ヒト化抗ヒトＣＤ１９抗体は、アミノ酸配列ＬＥＮＰＳＧＮＴ（配列番号：４０）を有するＨＶＲ−Ｌ１を含む。好ましい一実施態様では、ヒト化抗ヒトＣＤ１９抗体は、アミノ酸配列ＲＳＳＱＳＬＥＮＰＮ ＧＮＴＹＬＮ（配列番号：２０）を有するＨＶＲ−Ｌ１を含む。好ましい一実施態様では、ヒト化抗ヒトＣＤ１９抗体は、アミノ酸配列ＲＳＳＱＳＬＥＮＰＳ ＧＮＴＹＬＮ（配列番号：２８）を有するＨＶＲ−Ｌ１を含む。

加えて、以下の表に示されているように、これらの抗体は、カニクイザルＣＤ１９に対する交差反応性を維持する。

したがって、一実施態様では、抗ヒトＣＤ１９抗体は、ヒトＣＤ１９及びカニクイザルＣＤ１９に特異的に結合する。

野生型ヒト化抗ヒトＣＤ１９抗体（ｖａｒ．０）は、精製後に約７．５％の脱アミド化を示す。ｐＨ７．４で２週間保存した後、脱アミド化抗体の量は約１８．５％に増加する。Ｓ２７ｅＰ突然変異を有する変異体抗体（ｖａｒ．５）は、精製後に約２％の脱アミド化及び２％スクシンイミド形成を示す。ｐＨ７．４で２週間保存する間、約７．５％の脱アミド化抗体しか存在しない。

一態様では、ヒトＣＤ１９及びカニクイザルＣＤ１９に特異的に結合する単離されたヒト化抗体であって、配列番号：１１のＨＶＲ−Ｈ２及び配列番号：２０又は２８のＨＶＲ−Ｌ１を含む単離されたヒト化抗体が本明細書で提供される。

一態様では、（ａ）配列番号：０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号：０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号：０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号：０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのＨＶＲを含む抗ヒトＣＤ１９抗体が本明細書で提供される。

一態様では、（ａ）配列番号：０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号：０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号：２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号：０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号：０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのＨＶＲを含む抗ヒトＣＤ１９抗体が本明細書で提供される。

一態様では、（ａ）配列番号：０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む抗ヒトＣＤ１９抗体が本明細書で提供される。一実施態様では、抗体は、配列番号：０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。別の実施態様では、抗体は、配列番号：０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、及び配列番号：０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。さらなる実施態様では、抗体は、配列番号：０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号：０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号：１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。さらなる実施態様では、抗体は、（ａ）配列番号：０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。

別の態様では、（ａ）配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含む抗体が本明細書で提供される。一実施態様では、抗体は、（ａ）配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。

別の態様では、（ａ）配列番号：２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含む抗体が本明細書で提供される。一実施態様では、抗体は、（ａ）配列番号：２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。

別の態様では、本明細書で報告される抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号：０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号：１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：０５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号：０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。

別の態様では、本明細書で報告される抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号：０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号：１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：０５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号：２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号：０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。

別の態様では、（ａ）配列番号：０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号：０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号：０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号：０８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体が本明細書で提供される。

別の態様では、（ａ）配列番号：０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号：０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号：２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号：０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号：０８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体が本明細書で提供される。

本明細書で報告される抗ヒトＣＤ１９抗体は、ヒト化抗体である。一実施態様では、ヒト化抗ヒトＣＤ１９抗体は、上記実施態様のいずれかの通りのＨＶＲを含み、アクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリン（生殖系列）フレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークをさらに含む。

別の態様では、抗ヒトＣＤ１９抗体は、配列番号：０９のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比べて置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含有するが、その配列を含む抗ヒトＣＤ１９抗体は、ヒトＣＤ１９に結合する能力を保持する。特定の実施態様では、配列番号：０９において、合計１〜１０アミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されている。特定の実施態様では、置換、挿入又は欠失は、ＨＶＲの外側の領域において（すなわち、ＦＲにおいて）起こる。場合により、抗ヒトＣＤ１９抗体は、配列番号：０９のＶＨ配列（その配列の翻訳後修飾を含む）を含む。特定の実施態様では、ＶＨは、（ａ）配列番号：０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される１つ、２つ又は３つ全てのＨＶＲを含む。

別の態様では、配列番号：１９又は配列番号：２７（配列番号：１９及び配列番号：２７は、１つのアミノ酸位置において異なる）のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗ヒトＣＤ１９抗体が提供される。特定の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列と比べて置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含有するが、その配列を含む抗ヒトＣＤ１９抗体は、ヒトＣＤ１９に結合する能力を保持する。特定の実施態様では、配列番号：１９又は配列番号：２７において、合計１〜１０アミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されている。特定の実施態様では、置換、挿入又は欠失は、ＨＶＲの外側の領域において（すなわち、ＦＲにおいて）起こる。場合により、抗ヒトＣＤ１９抗体は、配列番号：１９のＶＬ配列（その配列の翻訳後修飾を含む）を含む。場合により、抗ヒトＣＤ１９抗体は、配列番号：２７のＶＬ配列（その配列の翻訳後修飾を含む）を含む。特定の実施態様では、ＶＬは、（ａ）配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される１つ、２つ又は３つのＨＶＲを含む。特定の実施態様では、ＶＬは、（ａ）配列番号：２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される１つ、２つ又は３つのＨＶＲを含む。

別の態様では、上記で提供される実施態様のいずれかの通りのＶＨ、及び上記で提供される実施態様のいずれかの通りのＶＬを含む抗ヒトＣＤ１９抗体が提供される。一実施態様では、抗体は、それぞれ配列番号：０９及び配列番号：１９又は２７のＶＨ及びＶＬ配列（これらの配列の翻訳後修飾を含む）を含む。

さらなる態様では、本明細書で報告される抗ヒトＣＤ１９抗体と同じエピトープに結合する抗体が本明細書で提供される。例えば、特定の実施態様では、配列番号：０９のＶＨ配列及び配列番号：１９のＶＬ配列を含む抗ヒトＣＤ１９抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。

一実施態様では、上記実施態様のいずれかの抗ヒトＣＤ１９抗体は、モノクローナル抗体である。一実施態様では、抗ヒトＣＤ１９抗体は、抗体フラグメント、例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ又はＦ（ａｂ’）_２フラグメントである。別の実施態様では、抗体は、全長抗体、例えばインタクトなＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４抗体又は本明細書で定義される他の抗体クラス若しくはアイソタイプである。

全ての態様の一実施態様では、抗体は、
ｉ）ヒトＩｇＧ１サブクラスのホモ二量体Ｆｃ領域であって、場合により突然変異Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有するホモ二量体Ｆｃ領域、又は
ｉｉ）ヒトＩｇＧ４サブクラスのホモ二量体Ｆｃ領域であって、場合により突然変異Ｐ３２９Ｇ、Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅを有するホモ二量体Ｆｃ領域、又は
ｉｉｉ）ヒトＩｇＧ１サブクラスのホモ二量体Ｆｃ領域であって、突然変異（Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ、若しくは突然変異（Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを有するホモ二量体Ｆｃ領域、又は
ｉｖ）ヘテロ二量体Ｆｃ領域であって、
ａ）一方のＦｃ領域ポリペプチドが突然変異Ｔ３６６Ｗを含み、他方のＦｃ領域ポリペプチドが突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含むか、又は
ｂ）一方のＦｃ領域ポリペプチドが突然変異Ｔ３６６Ｗ及びＹ３４９Ｃを含み、他方のＦｃ領域ポリペプチドが突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＳ３５４Ｃを含むか、又は
ｃ）一方のＦｃ領域ポリペプチドが突然変異Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含み、他方のＦｃ領域ポリペプチドが突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを含むヘテロ二量体Ｆｃ領域、
又は
ｖ）ヒトＩｇＧ１サブクラスのヘテロ二量体Ｆｃ領域であって、両方のＦｃ領域ポリペプチドが突然変異Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含み、
ａ）一方のＦｃ領域ポリペプチドが突然変異Ｔ３６６Ｗを含み、他方のＦｃ領域ポリペプチドが突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含むか、又は
ｂ）一方のＦｃ領域ポリペプチドが突然変異Ｔ３６６Ｗ及びＹ３４９Ｃを含み、他方のＦｃ領域ポリペプチドが突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＳ３５４Ｃを含むか、又は
ｃ）一方のＦｃ領域ポリペプチドが突然変異Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含み、他方のＦｃ領域ポリペプチドが突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを含むヘテロ二量体Ｆｃ領域、
又は
ｖｉ）ヒトＩｇＧ４サブクラスのヘテロ二量体Ｆｃ領域であって、両方のＦｃ領域ポリペプチドが突然変異Ｐ３２９Ｇ、Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅを含み、
ａ）一方のＦｃ領域ポリペプチドが突然変異Ｔ３６６Ｗを含み、他方のＦｃ領域ポリペプチドが突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含むか、又は
ｂ）一方のＦｃ領域ポリペプチドが突然変異Ｔ３６６Ｗ及びＹ３４９Ｃを含み、他方のＦｃ領域ポリペプチドが突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＳ３５４Ｃを含むか、又は
ｃ）一方のＦｃ領域ポリペプチドが突然変異Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含み、他方のＦｃ領域ポリペプチドが突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを含むヘテロ二量体Ｆｃ領域、
又は
ｖｉｉ）ｉｉｉ）の１つとｖｉ）、ｖ）及びｖｉ）の１つとの組み合わせ
を含む（全ての位置は、KabatのＥＵインデックスに従う）。

本明細書で報告される一態様は、二価二重特異性抗体であって、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖及び第１の重鎖、並びに
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖及び第２の重鎖であって、第２の軽鎖及び第２の重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに交換されている第２の軽鎖及び第２の重鎖
を含み、
第１の抗原又は第２の抗原がヒトＣＤ１９である二価二重特異性抗体である。

ａ）の抗体は、ｂ）で報告される改変を含有せず、ａ）の重鎖及び軽鎖は、独立した鎖である。

ｂ）の抗体では、
軽鎖内において、
可変軽鎖ドメインＶＬは、前記抗体の可変重鎖ドメインＨＶで交換されており、
及び
重鎖内において、
可変重鎖ドメインＶＨは、前記抗体の可変軽鎖ドメインＶＬで交換されている。

一実施態様では、
ｉ）ａ）の第１の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸（ナンバリングは、Kabatに従う）は、正電荷アミノ酸で置換されており、ａ）の第１の重鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）は、負電荷アミノ酸で置換されており、
又は、
ｉｉ）ｂ）の第２の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸（ナンバリングは、Kabatに従う）は、正電荷アミノ酸で置換されており、ｂ）の第２の重鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）は、負電荷アミノ酸で置換されている。

好ましい一実施態様では、
ｉ）ａ）の第１の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（ナンバリングは、Kabatに従う）で独立して（好ましい一実施態様では、リシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）で独立して）置換されており、ａ）の第１の重鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）で独立して置換されており、
又は
ｉｉ）ｂ）の第２の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（ナンバリングは、Kabatに従う）で独立して（好ましい一実施態様では、リシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）で独立して）置換されており、ｂ）の第２の重鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）で独立して置換されている。

一実施態様では、第２の重鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位及び１２３位のアミノ酸は、Ｋで置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。

一実施態様では、第２の軽鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７位及び２１３位のアミノ酸は、Ｅで置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。

好ましい一実施態様では、第１の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位及び１２３位のアミノ酸は、それぞれＲ及びＫで置換されており、第１の重鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７位及び２１３位のアミノ酸は、Ｅで置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。

一実施態様では、第２の重鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位及び１２３位のアミノ酸は、Ｋで置換されており、第２の軽鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７位及び２１３位のアミノ酸は、Ｅで置換されており、第１の軽鎖の可変ドメインＶＬにおいて、３８位のアミノ酸は、Ｋで置換されており、第１の重鎖の可変ドメインＶＨにおいて、３９位のアミノ酸は、Ｅで置換されており、第２の重鎖の可変ドメインＶＬにおいて、３８位のアミノ酸は、Ｋで置換されており、第２の軽鎖の可変ドメインＶＨにおいて、３９位のアミノ酸は、Ｅで置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。

本明細書で報告される一態様は、二価二重特異性抗体であって、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖及び第１の重鎖、並びに
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖及び第２の重鎖であって、第２の軽鎖及び第２の重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに交換されており、第２の軽鎖及び第２の重鎖の定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されている第２の軽鎖及び第２の重鎖
を含み、
第１の抗原又は第２の抗原がヒトＣＤ１９である二価二重特異性抗体である。

ａ）の抗体は、ｂ）で報告される改変を含有せず、ａ）の重鎖及び軽鎖は、独立した鎖である。

ｂ）の抗体では、
軽鎖内において、
可変軽鎖ドメインＶＬは、前記抗体の可変重鎖ドメインＨＶで交換されており、定常軽鎖ドメインＣＬは、前記抗体の定常重鎖ドメインＣＨ１で交換されており、
並びに
重鎖内において、
可変重鎖ドメインＶＨは、前記抗体の可変軽鎖ドメインＶＬで交換されており、定常重鎖ドメインＣＨ１は、前記抗体の定常軽鎖ドメインＣＬで交換されている。

本明細書で報告される一態様は、二価二重特異性抗体であって、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖及び第１の重鎖、及び
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖及び第２の重鎖であって、第２の軽鎖及び第２の重鎖の定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されている第２の軽鎖及び第２の重鎖
を含み、
第１の抗原又は第２の抗原がヒトＣＤ１９である二価二重特異性抗体である。

ａ）の抗体は、ｂ）で報告される改変を含有せず、ａ）の重鎖及び軽鎖は、独立した鎖である。

ｂ）の抗体では、
軽鎖内において、
定常軽鎖ドメインＣＬは、前記抗体の定常重鎖ドメインＣＨ１で交換されており、
及び
重鎖内において、
定常重鎖ドメインＣＨ１は、前記抗体の定常軽鎖ドメインＣＬで交換されている。

本明細書で報告される一態様は、多重特異性抗体であって、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する全長抗体であって、２本の抗体重鎖及び２本の抗体軽鎖からなる全長抗体、並びに
ｂ）１〜４つのさらなる抗原に特異的に結合する（すなわち、第２の及び／又は第３の及び／又は第４の及び／又は第５の抗原、好ましくは１つのさらなる抗原、すなわち第２の抗原に特異的に結合する）１つ、２つ、３つ又は４つの一本鎖Ｆａｂフラグメント
を含み、
前記ｂ）の一本鎖Ｆａｂフラグメントが、全長抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端又はＮ末端において、ペプチドリンカーを介して、前記ａ）の全長抗体に融合されており、
第１の抗原又はさらなる抗原の１つがヒトＣＤ１９である多重特異性抗体である。

一実施態様では、第２の抗原に結合する１つ又は２つの同一の一本鎖Ｆａｂフラグメントは、全長抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端において、ペプチドリンカーを介して、全長抗体に融合されている。

一実施態様では、第２の抗原に結合する１つ又は２つの同一の一本鎖Ｆａｂフラグメントは、全長抗体の重鎖のＣ末端において、ペプチドリンカーを介して、全長抗体に融合されている。

一実施態様では、第２の抗原に結合する１つ又は２つの同一の一本鎖Ｆａｂフラグメントは、全長抗体の軽鎖のＣ末端において、ペプチドリンカーを介して、全長抗体に融合されている。

一実施態様では、第２の抗原に結合する２つの同一の一本鎖Ｆａｂフラグメントは、全長抗体の各重鎖又は軽鎖のＣ末端において、ペプチドリンカーを介して、全長抗体に融合されている。

一実施態様では、第２の抗原に結合する２つの同一の一本鎖Ｆａｂフラグメントは、前記全長抗体の各重鎖のＣ末端において、ペプチドリンカーを介して、全長抗体に融合されている。

一実施態様では、第２の抗原に結合する２つの同一の一本鎖Ｆａｂフラグメントは、全長抗体の各軽鎖のＣ末端において、ペプチドリンカーを介して、全長抗体に融合されている。

本明細書で報告される一態様は、三価二重特異性抗体であって、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する全長抗体であって、２本の抗体重鎖及び２本の抗体軽鎖からなる全長抗体、
ｂ）
ｂａ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、
又は
ｂｂ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）
からなる第１のポリペプチドであって、
そのＶＨドメインのＮ末端において、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体の２本の重鎖の一方のＣ末端に融合されている第１のポリペプチド、
ｃ）
ｃａ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、
又は
ｃｂ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）
からなる第２のポリペプチドであって、
ＶＬドメインのＮ末端において、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体の２本の重鎖の他方のＣ末端に融合されている第２のポリペプチド、
を含み、
並びに
第１のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び第２のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が一緒になって、第２の抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、
並びに
第１の抗原又は第２の抗原がヒトＣＤ１９である三価二重特異性抗体である。

一実施態様では、ｂ）のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及びｃ）のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、以下の位置間：
ｉ）重鎖可変ドメインの４４位〜軽鎖可変ドメインの１００位、又は
ｉｉ）重鎖可変ドメインの１０５位〜軽鎖可変ドメインの４３位、又は
ｉｉｉ）重鎖可変ドメインの１０１位〜軽鎖可変ドメインの１００位（ナンバリングは常に、KabatのＥＵインデックスに従う）
へのジスルフィド結合の導入による鎖間ジスルフィド架橋を介して連結及び安定化されている。

安定化のための非天然ジスルフィド架橋を導入する技術は、例えば、国際公開公報第９４／０２９３５０号、Rajagopal, V., et al., Prot. Eng. (1997) 1453-59; Kobayashi, H., et al., Nuclear Medicine & Biology, Vol. 25, (1998) 387-393;又はSchmidt, M., et al., Oncogene (1999) 18 1711-1721に記載されている。一実施態様では、ｂ）及びｃ）のポリペプチドの可変ドメイン間の任意選択のジスルフィド結合は、重鎖可変ドメインの４４位と軽鎖可変ドメインの１００位との間にある。一実施態様では、ｂ）及びｃ）のポリペプチドの可変ドメイン間の任意選択のジスルフィド結合は、重鎖可変ドメインの１０５位と軽鎖可変ドメインの４３位との間にある（ナンバリングは常に、Kabatに従う）。一実施態様では、一本鎖Ｆａｂフラグメントの可変ドメインＶＨとＶＬとの間の前記任意選択のジスルフィド安定化を有しない三価二重特異性抗体が好ましい。

本明細書で報告される一態様は、三重特異性又は四重特異性抗体であって、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する全長抗体の第１の軽鎖及び第１の重鎖、並びに
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する全長抗体の第２の（改変）軽鎖及び第２の（改変）重鎖であって、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに交換されており、並びに／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されている第２の（改変）軽鎖及び第２の（改変）重鎖、並びに
を含み、
ｃ）１つ又は２つのさらなる抗原（すなわち、第３の及び／又は第４の抗原）に特異的に結合する１〜４つの抗原結合ペプチドが、ペプチドリンカーを介して、ａ）及び／又はｂ）の軽鎖又は重鎖のＣ末端又はＮ末端に融合されており、
第１の抗原又は第２の抗原又はさらなる抗原の１つがヒトＣＤ１９である三重特異性又は四重特異性抗体である。

ａ）の抗体は、ｂ）で報告される改変を含有せず、ａ）の重鎖及び軽鎖は、独立した鎖である。

一実施態様では、三重特異性又は四重特異性抗体は、ｃ）において、１つ又は２つのさらなる抗原に特異的に結合する１つ又は２つの抗原結合ペプチドを含む。

一実施態様では、抗原結合ペプチドは、ｓｃＦｖフラグメント及びｓｃＦａｂフラグメントの群より選択される。

一実施態様では、抗原結合ペプチドは、ｓｃＦｖフラグメントである。

一実施態様では、抗原結合ペプチドは、ｓｃＦａｂフラグメントである。

一実施態様では、抗原結合ペプチドは、ａ）及び／又はｂ）の重鎖のＣ末端に融合されている。

一実施態様では、三重特異性又は四重特異性抗体は、ｃ）において、１つのさらなる抗原に特異的に結合する１つ又は２つの抗原結合ペプチドを含む。

一実施態様では、三重特異性又は四重特異性抗体は、ｃ）において、第３の抗原に特異的に結合する２つの同一の抗原結合ペプチドを含む。好ましい一実施態様では、このような２つの同一の抗原結合ペプチドは両方とも、同じペプチドリンカーを介して、ａ）及びｂ）の重鎖のＣ末端に融合されている。好ましい一実施態様では、２つの同一の抗原結合ペプチドは、ｓｃＦｖフラグメント又はｓｃＦａｂフラグメントのいずれかである。

一実施態様では、三重特異性又は四重特異性抗体は、ｃ）において、第３の及び第４の抗原に特異的に結合する２つの抗原結合ペプチドを含む。一実施態様では、前記２つの抗原結合ペプチドは両方とも、同じペプチドコネクターを介して、ａ）及びｂ）の重鎖のＣ末端に融合されている。好ましい一実施態様では、前記２つの抗原結合ペプチドは、ｓｃＦｖフラグメント又はｓｃＦａｂフラグメントのいずれかである。

本明細書で報告される一態様は、二重特異性四価抗体であって
ａ）第１の抗原に特異的に結合する（及び２つのＦａｂフラグメントを含む）抗体の２本の軽鎖及び２本の重鎖、
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する抗体の２つのさらなるＦａｂフラグメントであって、ペプチドリンカーを介して、ａ）の重鎖のＣ末端又はＮ末端のいずれかに両方とも融合されている２つのさらなるＦａｂフラグメント
を含み、
並びに
該Ｆａｂフラグメントにおいて、以下の改変
ｉ）ａ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、又はｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに交換されており、並びに／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されており、
又は
ｉｉ）ａ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに交換されており、並びに定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されており、
並びに
ｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに交換されており、又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されており、
又は
ｉｉｉ）ａ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに交換されており、又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されており、
並びに
ｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに交換されており、並びに定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されており、
又は
ｉｖ）ａ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに交換されており、並びにｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されており、
又は
ｖ）ａ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されており、並びにｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに交換されている
が実施されており、
第１の抗原又は第２の抗原がヒトＣＤ１９である二重特異性四価抗体である。

一実施態様では、前記さらなるＦａｂフラグメントは両方とも、ペプチドリンカーを介して、ａ）の重鎖のＣ末端又はａ）の重鎖のＮ末端のいずれかに融合されている。

一実施態様では、前記さらなるＦａｂフラグメントは両方とも、ペプチドリンカーを介して、ａ）の重鎖のＣ末端のいずれかに融合されている。

一実施態様では、前記さらなるＦａｂフラグメントは両方とも、ペプチドコネクターを介して、ａ）の重鎖のＮ末端に融合されている。

一実施態様では、Ｆａｂフラグメントにおいて、以下の改変が実施されている：
ｉ）ａ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、又はｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに交換されており、
並びに／又は
定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されている。

一実施態様では、Ｆａｂフラグメントにおいて、以下の改変が実施されている：
ｉ）ａ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに交換されており、
並びに／又は
定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されている。

一実施態様では、Ｆａｂフラグメントにおいて、以下の改変が実施されている：
ｉ）ａ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されている。

一実施態様では、Ｆａｂフラグメントにおいて、以下の改変が実施されている：
ｉ）ｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに交換されており、
並びに／又は
定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されている。

一実施態様では、Ｆａｂフラグメントにおいて、以下の改変が実施されている：
ｉ）ｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されている。

本明細書で報告される一態様は、二重特異性四価抗体であって
ａ）第１の抗原に特異的に結合しかつ第１のＶＨ−ＣＨ１ドメインペアを含む第１の抗体の（改変）重鎖であって、前記第１の抗体の第２のＶＨ−ＣＨ１ドメインペアのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して、前記重鎖のＣ末端に融合されている（改変）重鎖、
ｂ）前記ａ）の第１の抗体の２本の軽鎖、
ｃ）第２の抗原に特異的に結合しかつ第１のＶＨ−ＣＬドメインペアを含む第２の抗体の（改変）重鎖であって、前記第２の抗体の第２のＶＨ−ＣＬドメインペアのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して、前記重鎖のＣ末端に融合されている（改変）重鎖、及び
ｄ）前記ｃ）の第２の抗体の２本の（改変）軽鎖であって、それぞれがＣＬ−ＣＨ１ドメインペアを含む２本の（改変）軽鎖
を含み、
第１の抗原又は第２の抗原がヒトＣＤ１９である二重特異性四価抗体である。

本明細書で報告される一態様は、二重特異性抗体であって
ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１の全長抗体の重鎖及び軽鎖、並びに
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２の全長抗体の重鎖及び軽鎖であって、該重鎖のＮ末端が、ペプチドリンカーを介して、該軽鎖のＣ末端に接続されている重鎖及び軽鎖、
を含み、
第１の抗原又は第２の抗原がヒトＣＤ１９である二重特異性抗体である。

ａ）の抗体は、ｂ）で報告される改変を含有せず、重鎖及び軽鎖は、独立した鎖である。

本明細書で報告される一態様は、二重特異性抗体であって
ａ）第１の抗原に特異的に結合する全長抗体であって、２本の抗体重鎖及び２本の抗体軽鎖からなる全長抗体、並びに
ｂ）ＶＨ^２ドメイン及びＶＬ^２ドメインを含む第２の抗原に特異的に結合するＦｖフラグメントであって、両ドメインが、ジスルフィド架橋を介して、互いに接続されているＦｖフラグメント
を含み、
該ＶＨ^２ドメイン又は該ＶＬ^２ドメインのいずれかのみが、ペプチドリンカーを介して、第１の抗原に特異的に結合する全長抗体の重鎖又は軽鎖に融合されており、
第１の抗原又は第２の抗原がヒトＣＤ１９である二重特異性抗体である。

二重特異性抗体では、ａ）の重鎖及び軽鎖は、独立した鎖である。

一実施態様では、ＶＨ^２ドメイン及びＶＬ^２ドメインの他方は、ペプチドリンカーを介して、第１の抗原に特異的に結合する全長抗体の重鎖又は軽鎖に融合されていない。

本明細書で報告される全ての態様では、第１の軽鎖は、ＶＬドメイン及びＣＬドメインを含み、第１の重鎖は、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。

本明細書で報告される一態様は、二重特異性三価抗体であって、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する２つのＦａｂフラグメント、
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する１つのＣｒｏｓｓＦａｂフラグメントであって、ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインが互いに交換されているＣｒｏｓｓＦａｂフラグメント、
ｃ）第１のＦｃ領域重鎖及び第２のＦｃ領域重鎖を含む１つのＦｃ領域
を含み、
該２つのＦａｂフラグメントのＣＨ１ドメインのＣ末端が重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドのＮ末端に接続されており、
該ＣｒｏｓｓＦａｂフラグメントのＣＬドメインのＣ末端が該Ｆａｂフラグメントの一方のＶＨドメインのＮ末端に接続されており、
第１の抗原又は第２の抗原がヒトＣＤ１９である二重特異性三価抗体である。

本明細書で報告される一態様は、二重特異性三価抗体であって、
ａ）それぞれが第１の抗原に特異的に結合する第１及び第２のＦａｂフラグメント、
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する１つのＣｒｏｓｓＦａｂフラグメントであって、ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインが互いに交換されているＣｒｏｓｓＦａｂフラグメント、
ｃ）第１のＦｃ領域重鎖及び第２のＦｃ領域重鎖を含む１つのＦｃ領域
を含み、
第１のＦａｂフラグメントのＣＨ１ドメインのＣ末端が重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドの一方のＮ末端に接続されており、該ＣｒｏｓｓＦａｂフラグメントのＣＬドメインのＣ末端が他方の重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドのＮ末端に接続されており、
第２のＦａｂフラグメントのＣＨ１ドメインのＣ末端が第１のＦａｂフラグメントのＶＨドメインのＮ末端に、又は該ＣｒｏｓｓＦａｂフラグメントのＶＨドメインのＮ末端に接続されており、
第１の抗原又は第２の抗原がヒトＣＤ１９である二重特異性三価抗体である。

本明細書で報告される一態様は、二重特異性三価抗体であって、
ａ）それぞれが第１の抗原に特異的に結合する第１及び第２のＦａｂフラグメント、
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する１つのＣｒｏｓｓＦａｂフラグメントであって、ＶＨドメイン及びＶＬドメインが互いに交換されているＣｒｏｓｓＦａｂフラグメント、
ｃ）第１のＦｃ領域重鎖及び第２のＦｃ領域重鎖を含む１つのＦｃ領域
を含み、
第１のＦａｂフラグメントのＣＨ１ドメインのＣ末端が重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドの一方のＮ末端に接続されており、該ＣｒｏｓｓＦａｂフラグメントのＣＨ１ドメインのＣ末端が他方の重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドのＮ末端に接続されており、
第２のＦａｂフラグメントのＣＨ１ドメインのＣ末端が第１のＦａｂフラグメントのＶＨドメインのＮ末端に、又は該ＣｒｏｓｓＦａｂフラグメントのＶＬドメインのＮ末端に接続されており、
第１の抗原又は第２の抗原がヒトＣＤ１９である二重特異性三価抗体である。

本明細書で報告される一態様は、二重特異性抗体であって、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する全長抗体であって、２本の抗体重鎖及び２本の抗体軽鎖からなる全長抗体、並びに
ｂ）第２の抗原に特異的に結合するＦａｂフラグメントであって、重鎖フラグメント及び軽鎖フラグメントを含むＶＨ^２ドメイン及びＶＬ^２ドメインを含むＦａｂフラグメント、
を含み、
該軽鎖フラグメント内において、
該可変軽鎖ドメインＶＬ^２が、前記抗体の可変重鎖ドメインＶＨ^２で交換されており、
及び
該重鎖フラグメント内において、
該可変重鎖ドメインＶＨ^２が、前記抗体の可変軽鎖ドメインＶＬ^２で交換されており、
該重鎖Ｆａｂフラグメントが、該全長抗体の重鎖の一方のＣＨ１ドメインと、該全長抗体の各Ｆｃ領域との間に挿入されており、該軽鎖ＦａｂフラグメントのＮ末端が、該重鎖Ｆａｂフラグメントが挿入されている該全長抗体の重鎖とペア形成した該全長抗体の軽鎖のＣ末端にコンジュゲートされており、
第１の抗原又は第２の抗原がヒトＣＤ１９である二重特異性抗体である。

本明細書で報告される一態様は、二重特異性抗体であって、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する全長抗体であって、２本の抗体重鎖及び２本の抗体軽鎖からなる全長抗体、並びに
ｂ）第２の抗原に特異的に結合するＦａｂフラグメントであって、重鎖フラグメント及び軽鎖フラグメントを含むＶＨ^２ドメイン及びＶＬ^２ドメインを含むＦａｂフラグメント、
を含み、
該軽鎖フラグメント内において、
該可変軽鎖ドメインＶＬ^２が、前記抗体の可変重鎖ドメインＶＨ^２で交換されており、
及び
該重鎖フラグメント内において、
該可変重鎖ドメインＶＨ^２が、前記抗体の該可変軽鎖ドメインＶＬ^２で交換されており、
該Ｆａｂフラグメントの該重鎖フラグメントのＣ末端が、該全長抗体の重鎖の一方のＮ末端にコンジュゲートされており、該Ｆａｂフラグメントの該軽鎖フラグメントのＣ末端が、該Ｆａｂフラグメントの該重鎖フラグメントがコンジュゲートされている該全長抗体の重鎖とペア形成した該全長抗体の軽鎖のＮ末端にコンジュゲートされており、
第１の抗原又は第２の抗原がヒトＣＤ１９である二重特異性抗体である。

全ての態様の一実施態様では、本明細書で報告される抗体は、少なくとも２つの重鎖ポリペプチドのヘテロ二量体化を必要とする多重特異性抗体であって、ヒトトランスフェリンレセプター及び第２の非ヒトトランスフェリンレセプター抗原に特異的に結合する多重特異性抗体である。

ヘテロ二量体化を支援するためのＣＨ３改変のための複数アプローチは、例えば、国際公開公報第９６／２７０１１号、国際公開公報第９８／０５０４３１号、欧州特許出願公開第１８７０４５９号、国際公開公報第２００７／１１０２０５号、国際公開公報第２００７／１４７９０１号、国際公開公報第２００９／０８９００４号、国際公開公報第２０１０／１２９３０４号、国際公開公報第２０１１／９０７５４号、国際公開公報第２０１１／１４３５４５号、国際公開公報第２０１２／０５８７６８号、国際公開公報第２０１３／１５７９５４号、国際公開公報第２０１３／０９６２９１号（これらは、参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている。典型的には、当技術分野で公知のアプローチでは、第１の重鎖のＣＨ３ドメイン及び第２の重鎖のＣＨ３ドメインは両方とも、１つの操作ＣＨ３ドメインを含む重鎖が同じ構造の別の重鎖ともはやホモ二量体化し得ない（例えば、第１のＣＨ３操作重鎖が、別の第１のＣＨ３操作重鎖ともはやホモ二量体化し得ず、第２のＣＨ３操作重鎖が別の第２のＣＨ３操作重鎖ともはやホモ二量体化し得ない）ように相補的に操作されている。それにより、１つの操作ＣＨ３ドメインを含む重鎖は、相補的に操作されているＣＨ３ドメインを含む別の重鎖と強制的にヘテロ二量体化される。この実施態様では、第１の重鎖のＣＨ３ドメイン及び第２の重鎖のＣＨ３ドメインは、第１の重鎖及び第２の重鎖が強制的にヘテロ二量体化されるように、一方で、第１の重鎖及び第２の重鎖が（例えば、立体的な理由により）もはやホモ二量体化し得ないように、アミノ酸置換によって相補的に操作される。

上記で引用されており、上記に挙げられている当技術分野で公知の重鎖ヘテロ二量体化を支援するための様々なアプローチは、上記特定のアミノ酸置換と組み合わせて、第１の抗原に特異的に結合する第１の抗体由来の「非交差Ｆａｂ領域」と、第２の抗原に特異的に結合する第２の抗体由来の「交差Ｆａｂ領域」とを含む本明細書で報告される多重特異性抗体の提供において使用される異なる代替手段として企図される。

本明細書で報告される多重特異性抗体のＣＨ３ドメインは、例えば、国際公開公報第９６／０２７０１１号、Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621;及びMerchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681に複数の例を用いて詳細に記載されている「ノブ・イントゥ・ホール」技術により変化され得る。この方法では、２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面は、これら２つのＣＨ３ドメインを含有する両重鎖のヘテロ二量体化を増加させるように変化される。（２本の重鎖の）２つの各ＣＨ３ドメインは「ノブ」であり得る一方、他のものは「ホール」である。ジスルフィド架橋の導入は、ヘテロ二量体をさらに安定化し（Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35）、収量を増加させる。

好ましい一実施態様では、本明細書で報告される多重特異性抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおいてＴ３６６Ｗ突然変異を含み、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおいてＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含む（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。例えば、Ｙ３４９Ｃ突然変異を「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインに導入し、Ｅ３５６Ｃ突然変異又はＳ３５４Ｃ突然変異を「ホール鎖」のＣＨ３ドメインに導入することによって、ＣＨ３ドメイン間のさらなる鎖間ジスルフィド架橋も使用され得る（Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681）。したがって、別の好ましい実施態様では、本明細書で報告される多重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方においてＹ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗ突然変異を含み、２つのＣＨ３ドメインの他方においてＥ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ突然変異を含み、又は本明細書で報告される多重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方においてＹ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗ突然変異を含み、２つのＣＨ３ドメインの他方においてＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ突然変異を含む（一方のＣＨ３ドメインにおけるさらなるＹ３４９Ｃ突然変異、及び他方のＣＨ３ドメインにおけるさらなるＥ３５６Ｃ又はＳ３５４Ｃ突然変異は、鎖間ジスルフィド架橋を形成する）（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。

しかし、また、欧州特許出願公開第１８７０４５９Ａ１号に記載されている他のノブ・イン・ホール技術が代替的又は追加的に使用され得る。一実施態様では、本明細書で報告される多重特異性抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおいてＲ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｅ突然変異を含み、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおいてＤ３９９Ｋ及びＥ３５７Ｋ突然変異を含む（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。

一実施態様では、本明細書で報告される多重特異性抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおいてＴ３６６Ｗ突然変異を含み、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおいてＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ突然変異を含み、加えて「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおいてＲ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｅ突然変異を含み、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおいてＤ３９９Ｋ及びＥ３５７Ｋ突然変異を含む（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。

一実施態様では、本明細書で報告される多重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方においてＹ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗ突然変異を含み、２つのＣＨ３ドメインの他方においてＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ突然変異を含み、又は本明細書で報告される多重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方においてＹ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗ突然変異を含み、２つのＣＨ３ドメインの他方においてＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ突然変異を含み、加えて「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおいてＲ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｅ突然変異を含み、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおいてＤ３９９Ｋ及びＥ３５７Ｋ突然変異を含む（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。

「ノブ・イントゥ・ホール技術」とは別に、ヘテロ二量体化を強制するように多重特異性抗体の重鎖のＣＨ３ドメインを改変するための他の技術が、当技術分野で公知である。これらの技術、特に、国際公開公報第９６／２７０１１号、国際公開公報第９８／０５０４３１号、欧州特許出願公開第１８７０４５９号、国際公開公報第２００７／１１０２０５号、国際公開公報第２００７／１４７９０１号、国際公開公報第２００９／０８９００４号、国際公開公報第２０１０／１２９３０４号、国際公開公報第２０１１／９０７５４号、国際公開公報第２０１１／１４３５４５号、国際公開公報第２０１２／０５８７６８号、国際公開公報第２０１３／１５７９５４号及び国際公開公報第２０１３／０９６２９１号に記載されているものは、本明細書で報告される多重特異性抗体と組み合わせて「ノブ・イントゥ・ホール技術」の代替手段として本明細書で企図される。

本明細書で報告される多重特異性抗体の一実施態様では、欧州特許出願公開第１８７０４５９号に記載されているアプローチが、多重特異性抗体の第１の重鎖及び第２の重鎖のヘテロ二量体化を支援するために使用される。このアプローチは、逆電荷を有する電荷アミノ酸を、第１の及び第２の重鎖の両方の間のＣＨ３／ＣＨ３ドメインインターフェイスの特定のアミノ酸位置に導入することに基づくものである。

したがって、この実施態様は、本明細書で報告される多重特異性抗体であって、抗体の三次構造において、第１の重鎖のＣＨ３ドメイン及び第２の重鎖のＣＨ３ドメインが、各抗体ＣＨ３ドメイン間に位置するインターフェイスを形成し、第１の重鎖のＣＨ３ドメイン及び第２の重鎖のＣＨ３ドメインの各アミノ酸配列がそれぞれ、抗体の三次構造において前記インターフェイス内に位置するアミノ酸のセットを含み、一方の重鎖のＣＨ３ドメイン中のインターフェイスに位置するアミノ酸のセットから、第１のアミノ酸が正電荷アミノ酸で置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメイン中のインターフェイスに位置するアミノ酸のセットから、第２のアミノ酸が負電荷アミノ酸で置換されている多重特異性抗体に関する。この実施態様の多重特異性抗体は、本明細書では「ＣＨ３（＋／−）操作多重特異性抗体」とも称される（「＋／−」という略語は、各ＣＨ３ドメインに導入された逆電荷アミノ酸を表す）。

本明細書で報告される前記ＣＨ３（＋／−）操作多重特異性抗体の一実施態様では、正電荷アミノ酸は、Ｋ、Ｒ及びＨから選択され、負電荷アミノ酸は、Ｅ又はＤから選択される。

本明細書で報告される前記ＣＨ３（＋／−）操作多重特異性抗体の一実施態様では、正電荷アミノ酸は、Ｋ及びＲから選択され、負電荷アミノ酸は、Ｅ又はＤから選択される。

本明細書で報告される前記ＣＨ３（＋／−）操作多重特異性抗体の一実施態様では、正電荷アミノ酸はＫであり、負電荷アミノ酸はＥである。

本明細書で報告される前記ＣＨ３（＋／−）操作多重特異性抗体の一実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、４０９位のアミノ酸Ｒは、Ｄで置換されており、位のアミノ酸Ｋは、Ｅで置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３９９位のアミノ酸Ｄは、Ｋで置換されており、３５７位のアミノ酸Ｅは、Ｋで置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。

本明細書で報告される多重特異性抗体の一実施態様では、国際公開公報第２０１３／１５７９５３号に記載されているアプローチが、多重特異性抗体の第１の重鎖及び第２の重鎖のヘテロ二量体化を支援するために使用される。本明細書で報告される前記多重特異性抗体の一実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のアミノ酸Ｔは、Ｋで置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３５１位のアミノ酸Ｌは、Ｄで置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。本明細書で報告される前記多重特異性抗体の別の実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のアミノ酸Ｔは、Ｋで置換されており、３５１位のアミノ酸Ｌは、Ｋで置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３５１位のアミノ酸Ｌは、Ｄで置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。

本明細書で報告される前記多重特異性抗体の別の実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のアミノ酸Ｔは、Ｋで置換されており、３５１位のアミノ酸Ｌは、Ｋで置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３５１位のアミノ酸Ｌは、Ｄで置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。加えて、以下の置換の少なくとも１つは、他方の重鎖のＣＨ３ドメインに含まれる：３４９位のアミノ酸Ｙは、Ｅで置換されており、３４９位のアミノ酸Ｙは、Ｄで置換されており、３６８位のアミノ酸Ｌは、Ｅで置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。一実施態様では、３６８位のアミノ酸Ｌは、Ｅで置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。

本明細書で報告される多重特異性抗体の一実施態様では、国際公開公報第２０１２／０５８７６８号に記載されているアプローチが、多重特異性抗体の第１の重鎖及び第２の重鎖のヘテロ二量体化を支援するために使用される。本明細書で報告される前記多重特異性抗体の一実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３５１位のアミノ酸Ｌは、Ｙで置換されており、４０７位のアミノ酸Ｙは、Ａで置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のアミノ酸Ｔは、Ａで置換されており、４０９位のアミノ酸Ｋは、Ｆで置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。別の実施態様では、上記置換に加えて、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、４１１位（元々はＴ）、３９９位（元々はＤ）、４００位（元々はＳ）、４０５位（元々はＦ）、３９０位（元々はＮ）及び３９２位（元々はＫ）のアミノ酸の少なくとも１つが、置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。好ましい置換は、
−Ｎ、Ｒ、Ｑ、Ｋ、Ｄ、Ｅ及びＷから選択されるアミノ酸による、４１１位のアミノ酸Ｔの置換（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）、
−Ｒ、Ｗ、Ｙ及びＫから選択されるアミノ酸による、３９９位のアミノ酸Ｄの置換（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）、
−Ｅ、Ｄ、Ｒ及びＫから選択されるアミノ酸による、４００位のアミノ酸Ｓの置換（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）、
−Ｉ、Ｍ、Ｔ、Ｓ、Ｖ及びＷから選択されるアミノ酸による、４０５位のアミノ酸Ｆの置換（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）、
−Ｒ、Ｋ及びＤから選択されるアミノ酸による、３９０位のアミノ酸Ｎの置換（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）、並びに
−Ｖ、Ｍ、Ｒ、Ｌ、Ｆ及びＥから選択されるアミノ酸による、３９２位のアミノ酸Ｋの置換（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）である。

（国際公開公報第２０１２／０５８７６８号にしたがって操作された）本明細書で報告される前記多重特異性抗体の別の実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３５１位のアミノ酸Ｌは、Ｙで置換されており、４０７位のアミノ酸Ｙは、Ａで置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のアミノ酸Ｔは、Ｖで置換されており、４０９位のアミノ酸Ｋは、Ｆで置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。本明細書で報告される前記多重特異性抗体の別の実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のアミノ酸Ｙは、Ａで置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のアミノ酸Ｔは、Ａで置換されており、４０９位のアミノ酸Ｋは、Ｆで置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。前記の最後の上記実施態様では、前記他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３９２位のアミノ酸Ｋは、Ｅで置換されており、４１１位のアミノ酸Ｔは、Ｅで置換されており、３９９位のアミノ酸Ｄは、Ｒで置換されており、４００位のアミノ酸Ｓは、Ｒで置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。

本明細書で報告される多重特異性抗体の一実施態様では、国際公開公報第２０１１／１４３５４５号に記載されているアプローチが、多重特異性抗体の第１の重鎖及び第２の重鎖のヘテロ二量体化を支援するために使用される。本明細書で報告される前記多重特異性抗体の一実施態様では、両重鎖のＣＨ３ドメイン中のアミノ酸改変が、３６８位及び／又は４０９位に導入される（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。

本明細書で報告される多重特異性抗体の一実施態様では、国際公開公報第２０１１／０９０７６２号に記載されているアプローチが、多重特異性抗体の第１の重鎖及び第２の重鎖のヘテロ二量体化を支援するために使用される。国際公開公報第２０１１／０９０７６２号は、「ノブ・イントゥ・ホール」技術によるアミノ酸改変に関する。本明細書で報告される前記ＣＨ３（ＫｉＨ）操作多重特異性抗体の一実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のアミノ酸Ｔは、Ｗで置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のアミノ酸Ｙは、Ａで置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。本明細書で報告される前記ＣＨ３（ＫｉＨ）操作多重特異性抗体の別の実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のアミノ酸Ｔは、Ｙで置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のアミノ酸Ｙは、Ｔで置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。

ＩｇＧ２アイソタイプである本明細書で報告される多重特異性抗体の一実施態様では、国際公開公報第２０１１／０９０７６２号に記載されているアプローチが、多重特異性抗体の第１の重鎖及び第２の重鎖のヘテロ二量体化を支援するために使用される。

本明細書で報告される多重特異性抗体の一実施態様では、国際公開公報第２００９／０８９００４号に記載されているアプローチが、多重特異性抗体の第１の重鎖及び第２の重鎖のヘテロ二量体化を支援するために使用される。本明細書で報告される前記多重特異性抗体の一実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３９２位のアミノ酸Ｋ又はＮは、負電荷アミノ酸で（好ましい一実施態様ではＥ又はＤで、好ましい一実施態様ではＤで）置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３９９位のアミノ酸Ｄ、３５６位のアミノ酸Ｅ若しくはＤ、又は３５７位のアミノ酸Ｅは、正電荷アミノ酸で置換されている（好ましい一実施態様ではＫ又はＲ、好ましい一実施態様ではＫで、好ましい一実施態様では３９９位又は３５６位のアミノ酸は、Ｋで置換されている）（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。さらなる一実施態様では、上記置換に加えて、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、４０９位のアミノ酸Ｋ又はＲは、負電荷アミノ酸で（好ましい一実施態様ではＥ又はＤで、好ましい一実施態様ではＤで）置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。なおさらなる一実施態様では、上記置換に加えて、又は上記置換に代えて、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、４３９位のアミノ酸Ｋ及び／又は３７０位のアミノ酸Ｋは、負電荷アミノ酸で（好ましい一実施態様ではＥ又はＤで、好ましい一実施態様ではＤで）互いに独立して置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。

本明細書で報告される多重特異性抗体の一実施態様では、国際公開公報第２００７／１４７９０１号に記載されているアプローチが、多重特異性抗体の第１の重鎖及び第２の重鎖のヘテロ二量体化を支援するために使用される。本明細書で報告される前記多重特異性抗体の一実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、２５３位のアミノ酸Ｋは、Ｅで置換されており、２８２位のアミノ酸Ｄは、Ｋで置換されており、３２２位のアミノ酸Ｋは、Ｄで置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、２３９位のアミノ酸Ｄは、Ｋで置換されており、２４０位のアミノ酸Ｅは、Ｋで置換されており、２９２位のアミノ酸Ｋは、Ｄで置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。

本明細書で報告される多重特異性抗体の一実施態様では、国際公開公報第２００７／１１０２０５号に記載されているアプローチが、多重特異性抗体の第１の重鎖及び第２の重鎖のヘテロ二量体化を支援するために使用される。

本明細書で報告される全ての態様及び実施態様の一実施態様では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体又は三重特異性抗体である。好ましい一実施態様では、多重特性抗体は、二重特異性抗体である。

本明細書で報告される全ての態様の一実施態様では、抗体は、二価又は三価抗体である。一実施態様では、抗体は、二価抗体である。

本明細書で報告される全ての態様の一実施態様では、多重特異性抗体は、ＩｇＧ型抗体の定常ドメイン構造を有する。本明細書で報告される全ての態様のさらなる一実施態様では、多重特異性抗体は、ヒトサブクラスＩｇＧ１のものであるか、又は突然変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有するヒトサブクラスＩｇＧ１のものであることを特徴とする。本明細書で報告される全ての態様のさらなる一実施態様では、多重特異性抗体は、ヒトサブクラスＩｇＧ２のものであることを特徴とする。本明細書で報告される全ての態様のさらなる一実施態様では、多重特異性抗体は、ヒトサブクラスＩｇＧ３のものであることを特徴とする。本明細書で報告される全ての態様のさらなる一実施態様では、多重特異性抗体は、ヒトサブクラスＩｇＧ４のものであるか、又はさらなる突然変異Ｓ２２８Ｐを有するヒトサブクラスＩｇＧ４のものであることを特徴とする。本明細書で報告される全ての態様のさらなる一実施態様では、多重特異性抗体は、ヒトサブクラスＩｇＧ１又はヒトサブクラスＩｇＧ４のものであることを特徴とする。本明細書で報告される全ての態様のさらなる一実施態様では、多重特異性抗体は、突然変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有するヒトサブクラスＩｇＧ１のものであることを特徴とする（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。本明細書で報告される全ての態様のさらなる一実施態様では、多重特異性抗体は、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを有するヒトサブクラスＩｇＧ１のものであることを特徴とする（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。本明細書で報告される全ての態様のさらなる一実施態様では、多重特異性抗体は、突然変異Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅを有するヒトサブクラスＩｇＧ４のものであることを特徴とする（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。本明細書で報告される全ての態様のさらなる一実施態様では、多重特異性抗体は、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを有するヒトサブクラスＩｇＧ４のものであることを特徴とする（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。

本明細書で報告される全ての態様の一実施態様では、本明細書で特定されるＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む抗体は、さらなるＣ末端グリシン−リシンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）を含む。本明細書で報告される全ての態様の一実施態様では、本明細書で特定されるＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む抗体は、さらなるＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）を含む。

一実施態様では、本明細書で報告される抗体は、突然変異ＰＶＡ２３６、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ及び／又はＧＬＰＳＳ３３１（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）を有するヒトサブクラスＩｇＧ１のものであるか、又はサブクラスＩｇＧ４のものであることを特徴とする。さらなる実施態様では、抗体は、任意のＩｇＧクラスのものであることを特徴とし、一実施態様では、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ａ３２７、Ａ３３０、Ｐ３３１及び／又はＰ３２９（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）において少なくとも１つの突然変異を含有するＩｇＧ１又はＩｇＧ４であることを特徴とする。さらに、一実施態様では、ＩｇＧ４サブクラスの抗体は、突然変異Ｓ２２８Ｐ又は突然変異Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅ（Angal, S., et al., Mol. Immunol. 30 (1993) 105-108）（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）を含有する。

本明細書で報告される抗体の重鎖のＣ末端は、アミノ酸残基ＰＧＫで終わる完全なＣ末端であり得る。重鎖のＣ末端は、Ｃ末端アミノ酸残基の１つ又は２つが除去された短縮型Ｃ末端であり得る。好ましい一実施態様では、重鎖のＣ末端は、ＰＧで終わる短縮型Ｃ末端である。

特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で公知の容易に入手可能な１つ以上の血液脳関門シャトルモジュールを含有するようにさらに改変され得る。

血液脳関門シャトルモジュールは、血液脳関門レセプターに対する結合特異性を有することを特徴とする。この結合特異性は、血液脳関門シャトルモジュールを本明細書で報告される抗ヒトＣＤ１９抗体に融合させることによって得られ得るか、又はそれは、ヒトＣＤ１９に特異的に結合する多重特異性抗体であって、したがって本明細書で報告される抗ヒトＣＤ１９抗体の結合特異性と、血液脳関門レセプターに対する結合特異性とを含む多重特異性抗体の結合特異性の１つとして、結合特異性を血液脳関門レセプターに導入することによって得られ得る。

１つ以上の血液脳関門シャトルモジュールは、本明細書で報告される抗ヒトＣＤ１９抗体の軽鎖又は重鎖のいずれかの末端に融合され得る。好ましい一実施態様では、血液脳関門シャトルモジュールは、重鎖のＣ末端に融合される。

１つ以上の血液脳関門シャトルモジュールは直接的に、又はリンカーペプチドを介して各抗体鎖に融合され得る。好ましい一実施態様では、リンカーペプチドは、アミノ酸配列ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号：４１）を有する。

血液脳関門シャトルモジュールは、抗体ｓｃＦｖフラグメントであり得る。一実施態様では、血液脳関門シャトルモジュールは、Ｎ末端からＣ末端の方向に軽鎖可変ドメイン−軽鎖定常ドメイン−リンカーペプチド−重鎖可変ドメイン−重鎖定常ドメイン１を含むｓｃＦｖである。

好ましい一実施態様では、血液脳関門シャトルモジュールは、（Ｇ４Ｓ）_６リンカーペプチドを有する抗トランスフェリンレセプター抗体８Ｄ３又はそのヒト化変異体のｓｃＦｖフラグメントである。

そのヒト化変異体という用語は、マウス８Ｄ３抗体のＣＤＲをヒトフレームワークにグラフトすることによって得られた分子を表し、１〜３つの突然変異が、互いに独立してフレームワーク領域（ＦＲ）及び／又は超可変領域（ＨＶＲ）のそれぞれに場合により導入される。

一態様では、抗ヒトＣＤ１９抗体と、２つのペプチドリンカーと、血液脳関門レセプターに結合する２つの一価結合実体とを含む抗ヒトＣＤ１９抗体融合ポリペプチドであって、該リンカーが、血液脳関門レセプターに結合する一価結合実体に抗ヒトＣＤ１９抗体をカップリングする抗ヒトＣＤ１９抗体融合ポリペプチドが本明細書で提供される。

一態様では、抗ヒトＣＤ１９抗体と、ペプチドリンカーと、血液脳関門レセプターに結合する１つの一価結合実体とを含む抗ヒトＣＤ１９抗体融合ポリペプチドであって、該リンカーが、血液脳関門レセプターに結合する一価結合実体に抗ヒトＣＤ１９抗体をカップリングする抗ヒトＣＤ１９抗体融合ポリペプチドが本明細書で提供される。

一実施態様では、血液脳関門レセプターに結合する一価結合実体は、タンパク質、ポリペプチド及びペプチドからなる群より選択される。

一実施態様では、血液脳関門レセプターに結合する一価結合実体は、血液脳関門レセプターリガンド、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｓｃＦａｂ、ＶＨＨ、好ましい一実施態様ではｓｃＦｖ又はｓｃＦａｂからなる群より選択される分子を含む。

一実施態様では、血液脳関門レセプターは、トランスフェリンレセプター、インスリンレセプター、インスリン様成長因子レセプター、低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質８、低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質１及びヘパリン結合上皮成長因子様成長因子からなる群より選択される。好ましい一実施態様では、血液脳関門レセプターは、トランスフェリンレセプターである。

一実施態様では、血液脳関門レセプターに結合する一価結合実体は、トランスフェリンレセプターに対する１つのｓｃＦａｂ又は１つのｓｃＦｖ、より具体的には、配列番号：４２、４３及び４４のアミノ酸配列内に含まれるトランスフェリンレセプター中のエピトープを認識するｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖを含む。

一実施態様では、血液脳関門レセプターに結合する一価結合実体は、リンカーによって、抗ヒトＣＤ１９抗体の重鎖のＣ末端にカップリングされる。

一実施態様では、ペプチドリンカーは、少なくとも１５アミノ酸長、より好ましくは１８〜２５アミノ酸長のアミノ酸配列である。

一実施態様では、抗ヒトＣＤ１９抗体は、全長抗体、好ましい一実施態様では全長ＩｇＧである。全長抗体という用語は、２つの抗体軽鎖ポリペプチド及び２つの抗体重鎖ポリペプチドからなる抗体を表し、２つの抗体重鎖ポリペプチドにおいて、Ｃ末端リシン残基（Ｋ）は存在してもよいし、又は存在しなくてもよい。

好ましい一実施態様では、抗ヒトＣＤ１９抗体融合ポリペプチドは、脳エフェクター実体として全長ＩｇＧ抗ヒトＣＤ１９抗体と、配列ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号：４１）のリンカーと、血液脳レセプターとしてのヒトトランスフェリンレセプターに結合する一価結合実体として１つのｓｃＦａｂとを含み、該ｓｃＦａｂは、リンカーによって、該全長抗ヒトＣＤ１９抗体の重鎖の一方の（Ｆｃ部分の）Ｃ末端にカップリングされており、該ｓｃＦａｂは、配列番号：５２、５３及び５４のアミノ酸配列内に含まれるヒトトランスフェリンレセプター中のエピトープを認識する。

好ましい一実施態様では、抗ヒトＣＤ１９抗体融合ポリペプチドは、脳エフェクター実体として全長ＩｇＧ抗ヒトＣＤ１９抗体と、配列ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号：４１）のリンカーと、血液脳レセプターとしてのヒトトランスフェリンレセプターに結合する一価結合実体として１つのｓｃＦｖとを含み、該ｓｃＦａｂは、リンカーによって、該全長抗ヒトＣＤ１９抗体の重鎖の一方の（Ｆｃ部分の）Ｃ末端にカップリングされており、該ｓｃＦａｂは、配列番号：４２、４３及び４４のアミノ酸配列内に含まれるヒトトランスフェリンレセプター中のエピトープを認識する。

一実施態様では、抗ヒトＣＤ１９抗体の第１の重鎖は、第１の二量体化モジュールを含み、抗体の第２の重鎖は、第２の二量体化モジュールを含み、２本の重鎖のヘテロ二量体化を可能にする。

一実施態様では、（ノブ・イントゥ・ホール戦略によれば）抗ヒトＣＤ１９抗体の第１の重鎖の第１の二量体化モジュールはノブ重鎖であり、抗ヒトＣＤ１９抗体の第２の重鎖の二量体化モジュールはホール重鎖である。

本明細書で報告される抗ヒトＣＤ１９抗体融合ポリペプチドは、血液脳関門を越えて抗ヒトＣＤ１９抗体を輸送するために使用され得る。

一実施態様では、Ｆｃ領域のそのＣ末端において、ヒトトランスフェリンレセプターに結合する一価結合実体としてのｓｃＦａｂにカップリングされた抗ヒトＣＤ１９抗体の重鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に以下の構造を有する：
・ＩｇＧ重鎖、
・ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域のＣ末端をｓｃＦａｂのＶＬドメインのＮ末端にカップリングするペプチドリンカー。好ましい一実施態様では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号：４１）を有する、
・ｓｃＦａｂの可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）及びＣカッパ軽鎖ドメイン、
・ｓｃＦａｂのＣカッパ軽鎖ドメインのＣ末端をｓｃＦａｂのＶＨドメインのＮ末端にカップリングするペプチドリンカー。好ましい一実施態様では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列（Ｇ_４Ｓ）_６ＧＧ（配列番号：４５）を有する、
・ｓｃＦａｂ抗体の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及びＩｇＧ ＣＨ１重鎖ドメイン。

一実施態様では、Ｆｃ領域のそのＣ末端において、ヒトトランスフェリンレセプターに結合する一価結合実体としてのｓｃＦｖにカップリングされた抗ヒトＣＤ１９抗体の重鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に以下の構造を有する：
・ＩｇＧ重鎖、
・ＩｇＧ重鎖のＦｃ部分のＣ末端をｓｃＦｖ抗体フラグメントのＶＬドメインのＮ末端にカップリングするペプチドリンカー。好ましい一実施態様では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号：４１）を有するペプチドである、
・可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）、
・可変軽鎖ドメインのＣ末端をｓｃＦｖのＶＨドメインのＮ末端にカップリングするペプチドリンカー。好ましい一実施態様では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列（Ｇ_４Ｓ）_６ＧＧ（配列番号：４５）を有するペプチドである、
・ｓｃＦｖ抗体フラグメントの可変重鎖ドメイン（ＶＨ）。

一実施態様では、血液脳関門シャトルモジュール／血液脳関門レセプターに対するｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖは、ヒト化抗トランスフェリンレセプター抗体８Ｄ３に由来する（例えば、Boado, R.J., et al., Biotechnol. Bioeng. 102 (2009) 1251-1258を参照のこと）。マウス重鎖可変ドメインは、

（配列番号：４６）のアミノ酸配列を有する。

マウス軽鎖可変ドメイン（変異体１）は、

（配列番号：４７）のアミノ酸配列を有し、
マウス軽鎖可変ドメイン（変異体２）は、

（配列番号：４８）のアミノ酸配列を有する。

一実施態様では、抗トランスフェリンレセプター抗体又はトランスフェリンレセプター結合特異性は、（ａ）配列番号：５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：５３、５４又は５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。

一実施態様では、抗トランスフェリンレセプター抗体は、トランスフェリンレセプターの結合部位を形成する、配列番号：４９の重鎖可変ドメインと配列番号：５０の軽鎖可変ドメインとの少なくとも１つのペアを含む。

１つの血液脳関門シャトルモジュール
一態様では、抗ヒトＣＤ１９抗体又は抗ヒトＣＤ１９抗体融合ポリペプチドは、正確に１つの血液脳関門結合特異性又はシャトルモジュールを含むので、少なくとも二重特異性であり、血液脳関門結合特異性又はシャトルモジュールは、抗ヒトトランスフェリンレセプター抗体８Ｄ３のヒト化可変ドメイン又は配列番号：４９の重鎖可変ドメインと配列番号：５０の軽鎖可変ドメインとのペアを含み、それにより、血液脳関門結合特異性又はシャトルモジュールは、血液脳関門を越えて抗ヒトＣＤ１９抗体を輸送する。

１つ又は２つの血液脳関門シャトルモジュール
一態様では、抗ヒトＣＤ１９抗体又は抗ヒトＣＤ１９抗体融合ポリペプチドは、１つ又は２つの血液脳関門結合特異性又はシャトルモジュールを含むので、少なくとも二重特異性であり、血液脳関門シャトル結合部位又はモジュールは、低親和性で血液脳関門レセプター（ＢＢＢ−Ｒ、ＢＢＢ−Ｒ結合特異性）に結合する抗体に由来し、それにより、低親和性で血液脳関門レセプターに結合する抗体に由来する血液脳関門結合特異性又はシャトルモジュールは、血液脳関門を越えて抗ヒトＣＤ１９抗体を輸送する。

一実施態様では、ＢＢＢ−Ｒは、トランスフェリンレセプター（ＴｆＲ）、インスリンレセプター、インスリン様成長因子レセプター（ＩＧＦレセプター）、低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質８（ＬＲＰ８）、低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質１（ＬＲＰ１）及びヘパリン結合上皮成長因子様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）からなる群より選択される。別のこのような態様では、ＢＢＢ−Ｒは、ヒトＢＢＢ−Ｒである。このような一態様では、ＢＢＢ−Ｒは、ＴｆＲである。別のこのような態様では、ＢＢＢ−ＲはＴｆＲであり、抗体はＴｆＲ活性を阻害しない。別のこのような態様では、ＢＢＢ−ＲはＴｆＲであり、抗体は、トランスフェリンに対するＴｆＲの結合を阻害しない。

一実施態様では、抗体は、そのネイティブリガンドの１つ以上に対するＢＢＢ−Ｒの結合を損なわない。このような一実施態様では、抗体は、ヒトトランスフェリンに対するｈＴｆＲの結合を阻害しないように、ヒトトランスフェリンレセプター（ｈＴｆＲ）に特異的に結合する。

一実施態様では、ＢＢＢ−Ｒ結合特異性は、ＢＢＢ−Ｒに対して約１nM〜約１００μMのＩＣ_５０を有する。一実施態様では、ＩＣ_５０は、約５nM〜約１００μMである。一実施態様では、ＩＣ_５０は、約５０nM〜約１００μMである。一実施態様では、ＩＣ_５０は、約１００nM〜約１００μMである。一実施態様では、ＢＢＢ−Ｒ結合特異性は、ＢＢＢ−Ｒに対して約５nM〜約１０μMの親和性を有する。一実施態様では、ＢＢＢ−Ｒ結合特異性は、抗ヒトＣＤ１９にコンジュゲートされるか又はそれに含まれる場合、ＢＢＢ−Ｒに対して約３０nM〜約１μMの親和性を有する。一実施態様では、ＢＢＢ−Ｒ結合特異性は、抗ヒトＣＤ１９抗体にコンジュゲートされるか又はそれに含まれる場合、ＢＢＢ−Ｒに対して約５０nM〜約１μMの親和性を有する。一実施態様では、ＢＢＢ−Ｒ結合特異性又はＢＢＢ−Ｒに対する抗ヒトＣＤ１９抗体融合ポリペプチドの親和性は、スキャッチャード分析を使用して測定される。一実施態様では、ＢＢＢ−Ｒ結合特異性又はＢＢＢ−Ｒに対する抗ヒトＣＤ１９抗体融合ポリペプチドの親和性は、BIACORE分析を使用して測定される。一実施態様では、ＢＢＢ−Ｒ結合特異性又はＢＢＢ−Ｒに対する抗ヒトＣＤ１９抗体融合ポリペプチドの親和性は、競合ＥＬＩＳＡを使用して測定される。

抗体融合ポリペプチドを含有する血液脳関門シャトルの使用
別の実施態様では、抗ヒトＣＤ１９抗体へのＣＮＳの曝露を増加させる方法であって、低親和性でＢＢＢ−Ｒに結合する抗体又は抗体フラグメントに抗ヒトＣＤ１９抗体をカップリングし、それにより、抗ヒトＣＤ１９抗体へのＣＮＳの曝露を増加させる方法が本明細書で提供される。「カップリングされた」という用語は、抗ＢＢＢ−Ｒ抗体結合特異性が、第２の結合特異性として少なくとも二重特異性抗ヒトＣＤ１９／ＢＢＢ−Ｒ抗体に導入される場合を含む。一実施態様では、抗ヒトＣＤ１９抗体へのＣＮＳ曝露の増加は、ＢＢＢ−Ｒに対する親和性が低下していない典型的な抗体とカップリングされた抗ヒトＣＤ１９抗体のＣＮＳ曝露と比べて測定される。一実施態様では、抗ヒトＣＤ１９抗体へのＣＮＳ曝露の増加は、投与後に血清中に見られる量に対するＣＮＳに見られる抗ヒトＣＤ１９抗体の量の比として測定される。一実施態様では、ＣＮＳ曝露の増加は、０．１％超の比をもたらす。一実施態様では、抗ヒトＣＤ１９抗体へのＣＮＳ曝露の増加は、カップリングされた抗ＢＢＢ−Ｒ抗体の非存在下で抗ヒトＣＤ１９抗体のＣＮＳ曝露と比べて測定される。一実施態様では、抗ヒトＣＤ１９抗体へのＣＮＳ曝露の増加は、イメージングによって測定される。一実施態様では、抗ヒトＣＤ１９抗体へのＣＮＳ曝露の増加は、１つ以上の生理学的症候の改変などの間接的な読み出しによって測定される。

被験体に投与された抗ヒトＣＤ１９抗体のＣＮＳにおける保持を増加させる方法では、抗ヒトＣＤ１９抗体のＣＮＳにおける保持を増加させるように、低親和性でＢＢＢ−Ｒに結合する抗体又は抗体フラグメントに抗ヒトＣＤ１９抗体をカップリングする。

別の実施態様では、抗ヒトＣＤ１９抗体の薬物動態及び／又は薬物動力が被験体のＣＮＳにおいて有効であるように最適化する方法であって、低親和性でＢＢＢ−Ｒに結合する抗体又は抗体フラグメントに抗ヒトＣＤ１９抗体をカップリングする方法が本明細書で提供され、該抗体又は抗体フラグメントは、該抗ヒトＣＤ１９抗体へのカップリング後のそのＢＢＢ−Ｒに対する親和性が、該抗ヒトＣＤ１９抗体にコンジュゲートされた抗体又は抗体フラグメントのＢＢＢを越える一定量の輸送をもたらして、ＣＮＳにおける抗ヒトＣＤ１９抗体の薬物動態及び／又は薬物動力が最適化されるように選択される。

別の実施態様では、哺乳動物における神経学的障害を処置する方法であって、ＢＢＢ−Ｒに結合する抗体又は抗体フラグメントであって、抗ヒトＣＤ１９抗体にカップリングされた抗体又は抗体フラグメントで該哺乳動物を処置することを含む方法が本明細書で提供され、該抗体は、低いＢＢＢ−Ｒに対する親和性を有するように選択されたものであり、それにより、該抗体及びカップリングされた抗ヒトＣＤ１９抗体のＣＮＳ取り込みを改善する。一実施態様では、処置は、障害の症候の軽減又は排除をもたらす。別の態様では、処置は、神経学的障害の改善をもたらす。

全ての先の態様の一実施態様では、抗ＢＢＢ−Ｒ抗体は、ＢＢＢ−Ｒに対して約１nM〜約１００μMのＩＣ_５０を有する。別のこのような実施態様では、ＩＣ_５０は、約５nM〜約１００μMである。別のこのような実施態様では、ＩＣ_５０は、約５０nM〜約１００μMである。別のこのような実施態様では、ＩＣ_５０は、約１００nM〜約１００μMである。別の実施態様では、抗体は、ＢＢＢ−Ｒに対して約５nM〜約１０μMの親和性を有する。別の実施態様では、抗体は、抗ヒトＣＤ１９抗体にカップリングされる場合、ＢＢＢ−Ｒに対して約３０nM〜約１μMの親和性を有する。別の実施態様では、抗体は、抗ヒトＣＤ１９抗体にカップリングされる場合、ＢＢＢ−Ｒに対して約５０nM〜約１μMの親和性を有する。一実施態様では、ＢＢＢ−Ｒに対する抗ＢＢＢ−Ｒ抗体又は抗ヒトＣＤ１９抗体融合ポリペプチドの親和性は、スキャッチャード分析を使用して測定される。別の実施態様では、抗ＢＢＢ−Ｒ抗体又はＢＢＢ−Ｒに対する抗ヒトＣＤ１９抗体融合ポリペプチドの親和性は、BIACORE分析を使用して測定される。別の実施態様では、抗ＢＢＢ−Ｒ抗体又はＢＢＢ−Ｒに対する抗ヒトＣＤ１９抗体融合ポリペプチドの親和性は、競合ＥＬＩＳＡを使用して測定される。

別の実施態様では、抗ヒトＣＤ１９抗体融合ポリペプチドは標識される。別の実施態様では、抗ＢＢＢ−Ｒ抗体又はフラグメントは、そのネイティブリガンドの１つ以上に対するＢＢＢ−Ｒの結合を損なわない。別の実施態様では、抗ＢＢＢ−Ｒ抗体は、ヒトトランスフェリンに対するｈＴｆＲの結合を阻害しないように、ｈＴｆＲに特異的に結合する。別の実施態様では、抗ヒトＣＤ１９抗体融合ポリペプチドは、哺乳動物に投与される。別の実施態様では、哺乳動物はヒトである。別の実施態様では、哺乳動物は、神経学的障害を有する。別の実施態様では、神経学的障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）、脳卒中、認知症、筋ジストロフィー（ＭＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、嚢胞性線維症、アンジェルマン症候群、リドル症候群、パーキンソン病、ピック病、パジェット病、ガン及び外傷性脳損傷からなる群より選択される。

血液脳関門シャトルとしての非共有結合複合体
非共有結合複合体の１つの部分は、ハプテンに対する第１の結合特異性と、血液脳関門レセプター（ＢＢＢＲ）に対する第２の結合特異性とを有する二重特異性抗体である血液脳関門シャトルモジュール（ＢＢＢシャトルモジュール）である。このようなＢＢＢシャトルモジュールは、血液脳関門上のトランスサイトーシス可能な細胞表面ターゲット（例えば、ＴｆＲ、ＬＲＰ又は他のターゲット、ＢＢＢ−Ｒ）を認識し、それと同時に、ハプテン化抗ヒトＣＤ１９抗体に結合する。

より具体的には、ヒトＣＤ１９に特異的に結合する抗体はハプテンとコンジュゲートされ、血液脳関門シャトルのハプテン結合部位と複合体形成する。この複合体は定義されており、安定であり、ヒトＣＤ１９に特異的に結合するハプテン化抗体を、血液脳関門を越えて特異的に送達する。ヒトＣＤ１９に特異的に結合するハプテン化抗体は、血液脳関門シャトルと非共有結合的に複合体形成するので、ヒトＣＤ１９に特異的に結合するハプテン化抗体は、一方では、その循環中にその送達ビヒクル（＝血液脳関門シャトル＝二重特異性抗体）に結合しているが、他方ではトランスサイトーシス後に効率的に放出され得る。ハプテンとのコンジュゲーションは、ヒトＣＤ１９に特異的に結合する抗体の活性を妨げずに行われ得る。血液脳関門シャトルは、異常な共有結合的付加を含有しないので、免疫原性のあらゆるリスクを回避する。ヒトＣＤ１９に特異的に結合するハプテン化抗体と、ハプテン特異的結合部位を含有する二重特異性抗体との複合体は、ヒトＣＤ１９に特異的に結合する抗体に無害な生物物理学的挙動を付与する。さらに、このような複合体は、二重特異性抗体の第２の結合特異性によって認識される抗原を提示する細胞又は組織への負荷をターゲティングすることができる。

ヒトＣＤ１９に特異的に結合する抗体は、血液脳関門シャトル（＝二重特異性抗体）と複合体形成する一方で、ハプテン化されているにもかかわらずその機能性を保持する。加えて、二重特異性抗体の血液脳関門レセプター結合部位は、ヒトＣＤ１９に特異的に結合する複合体化ハプテン化抗体の存在下で、その結合特異性及び親和性を保持する。ヒトＣＤ１９に特異的に結合するハプテン化抗体と本明細書で報告される、二重特異性抗体との複合体は、血液脳関門レセプターを発現する細胞に、ヒトＣＤ１９に特異的に結合する抗体を特異的にターゲティングするために使用され得る。ヒトＣＤ１９に特異的に結合するハプテン化抗体は、二重特異性抗体に非共有結合的にカップリングされるので、ヒトＣＤ１９に特異的に結合する抗体は、インターナリゼーション又はトランスサイトーシス後に放出され得る。

さらなる態様では、上記実施態様のいずれかの抗ヒトＣＤ１９抗体は、以下のセクション１〜５に記載されているような、特徴のいずれかを単独で又は組み合わせて取り込み得る：

１．抗体親和性
特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、≦１μM、≦１００nM又は≦１０nM（例えば、１０^−８Ｍ以下、例えば１０^−７Ｍ〜１０^−８Ｍ）のＫＤ値を有する。

例えば、BIACORE（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイを使用して、Ｋ_Ｄを測定し得る。BIACORE（登録商標）-2000又はBIACORE（登録商標）-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を使用したアッセイを、約１０応答単位（ＲＵ）で固定化抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃で実施する。供給業者の指示にしたがって、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIACORE, Inc.)を活性化する。抗原を１０mM酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μg/ml（約０．２μM）に希釈してから、５μl／分の流速で注入して、約１０応答単位（ＲＵ）の共役タンパク質を達成する。抗原の注入後、１Ｍエタノールアミンを注入して、未反応基をブロッキングする。動態測定のために、Ｆａｂの２倍連続希釈物（０．７８nM〜５００nM）を、０．０５％ポリソルベート２０（TWEEN-20（商標））界面活性剤（ＰＢＳＴ）と共にＰＢＳ中、２５℃、約２５μl／分の流速で注射する。単純な１対１ラングミュア結合モデル（BIACORE（登録商標）Evaluation Software version 3.2）を使用して、会合及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることによって、会合速度（ｋ_ｏｎ）及び解離速度（ｋ_ｏｆｆ）を計算する。平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）をｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎの比として計算する（例えば、Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881を参照のこと）。

２．抗体フラグメント
特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、抗体フラグメントである。抗体フラグメントとしては、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ及びｓｃＦｖフラグメント並びに以下に記載される他のフラグメントが挙げられる。特定の抗体フラグメントの概説については、Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134を参照のこと。ｓｃＦｖフラグメントの概説については、例えば、Plueckthun, A., In; The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315を参照のこと。国際公開公報第９３／１６１８５号；米国特許第５，５７１，８９４号及び米国特許第５，５８７，４５８号も参照のこと。サルベージレセプター結合エピトープ残基を含み、増加したin vivo半減期を有するＦａｂ及びＦ（ａｂ’）_２フラグメントの考察については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照のこと。

ダイアボディは、二価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体フラグメントである。例えば、欧州特許出願公開第０４０４０９７号；国際公開公報第１９９３／０１１６１号；Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134;及びHolliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448を参照のこと。トリボディ及びテトラボディもまた、Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (20039 129-134)に記載されている。

単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部若しくは一部又は軽鎖可変ドメインの全部若しくは一部を含む抗体フラグメントである。特定の実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば、米国特許第６，２４８，５１６号を参照のこと）。

抗体フラグメントは、限定されないが、本明細書に記載されるように、インタクトな抗体のタンパク質分解消化及びリコンビナント宿主細胞（例えば、E. coli又はファージ）による産生を含む様々な技術によって作製され得る。

３．キメラ抗体及びヒト化抗体
本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；及びMorrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ又は非ヒト霊長類、例えばサルに由来する可変領域）及びヒト定常領域を含む。さらなる例では、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のものから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合フラグメントを含む。

ヒト化抗体は、キメラ抗体である。典型的には、非ヒト抗体をヒト化して、非ヒト親抗体の特異性及び親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を減少させる。一般的に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えばＣＤＲ（又はその部分）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（又はその部分）がヒト抗体配列に由来する１つ以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、ヒト定常領域の少なくとも一部を場合により含むであろう。いくつかの実施態様では、ヒト化抗体中のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体の特異性又は親和性を回復又は改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）に由来する対応する残基で置換されている。

ヒト化抗体及びそれらの作製方法は、例えば、Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633に概説されており、例えば、Riechmann, I. et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033；米国特許第５，８２１，３３７号、米国特許第７，５２７，７９１号、米国特許第６，９８２，３２１号及び米国特許第７，０８７，４０９号；Kashmiri, S.V. et al., Methods 36 (2005) 25-34（特異性決定領域（ＳＤＲ）グラフティングを記載している）；Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498（「リサーフェシング」を記載している）；Dall’Acqua, W.F. et al., Methods 36 (2005) 43-60（「ＦＲシャッフリング」を記載している）；並びにOsbourn, J. et al., Methods 36 (2005) 61-68及びKlimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260（「ＦＲシャッフリング」への「誘導選択」アプローチを記載している）にさらに記載されている。

ヒト化に使用され得るヒトフレームワーク領域としては、限定されないが、「ベストフィット」法（例えば、Sims, M.J. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308を参照のこと）を使用して選択されたフレームワーク領域；特定のサブグループの軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289;及びPresta, L.G. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632を参照のこと）；ヒト成熟（体細胞突然変異）フレームワーク領域又はヒト生殖系列フレームワーク領域（例えば、Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633を参照のこと）；及びＦＲライブラリーのスクリーニングから得られたフレームワーク領域（例えば、Baca, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684及びRosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618を参照のこと）が挙げられる。

４．多重特異性抗体
特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施態様では、結合特異性の一方はヒトＣＤ１９に対するものであり、他方は任意の他の抗原に対するものである。特定の実施態様では、二重特異性抗体は、ヒトＣＤ１９の２つの異なるエピトープに結合し得る。二重特異性抗体はまた、ヒトＣＤ１９を発現する細胞に細胞傷害剤を局限するために使用され得る。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体フラグメントとして調製され得る。

多重特異性抗体を作製するための技術としては、限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペアのリコンビナント同時発現（Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540、国際公開公報第９３／０８８２９号及びTraunecker, A. et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659を参照のこと）及び「ノブ・イン・ホール」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照のこと）が挙げられる。多重特異性抗体はまた、抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための静電気的ステアリング効果を操作すること（国際公開公報第２００９／０８９００４号）；２つ以上の抗体又はフラグメントを架橋すること（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号及びBrennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83を参照のこと）；二重特異性抗体を生産するためのロイシンジッパーを使用すること（例えば、Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553を参照のこと）；二重特異性抗体フラグメントを作製するための「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448を参照のこと）；及び１本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること（例えば、Gruber, M et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374を参照のこと）；並びに例えばTutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって作製され得る。

「オクトパス抗体」を含む３つ以上の機能的抗原結合部位を有する操作抗体もまた、本明細書に含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６号を参照のこと）。

本明細書における抗体又はフラグメントはまた、ヒトＣＤ１９及び別の異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用性Ｆａｂ」又は「ＤＡＦ」を含む（例えば、米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号を参照のこと）。

本明細書における抗体又はフラグメントはまた、国際公開公報第２００９／０８０２５１号、国際公開公報第２００９／０８０２５２号、国際公開公報第２００９／０８０２５３号、国際公開公報第２００９／０８０２５４号、国際公開公報第２０１０／１１２１９３号、国際公開公報第２０１０／１１５５８９号、国際公開公報第２０１０／１３６１７２号、国際公開公報第２０１０／１４５７９２号及び国際公開公報第２０１０／１４５７９３号に記載されている多重特異性抗体を含む。

５．抗体変異体
特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することによって、又はペプチド合成によって調製され得る。このような改変としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又は該残基中への挿入及び／又は該残基の置換が挙げられる。最終構築物が所望の特徴、例えば、抗原結合を示すことを条件として、最終構築物を得るために欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせを行い得る。

ａ）置換変異体、挿入変異体及び欠失変異体
特定の実施態様では、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。目的の置換突然変異誘発部位としては、ＨＶＲ及びＦＲが挙げられる。保存的置換は、以下の表の「好ましい置換」という項目に示されている。アミノ酸側鎖クラスについて以下にさらに記載されているように、より実質的な変更は、表１の「例示的な置換」という項目に提供されている。アミノ酸置換を目的の抗体に導入し、所望の活性、例えば、保持／改善された抗原結合、減少した免疫原性、又は改善されたＡＤＣＣ若しくはＣＤＣについて生成物をスクリーニングし得る。

アミノ酸は、共通の側鎖特性に基づいて分類され得る：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性で親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴うであろう。

置換変異体の一種は、親抗体（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基の置換を含む。一般的に、さらなる研究のために選択される得られた変異体は、親抗体を基準として特定の生物学的特性の改変（例えば、改善）（例えば、増加した親和性、減少した免疫原性）を有し、及び／又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持するであろう。例示的な置換変異体は、例えば、ファージディスプレイに基づく親和性成熟技術、例えば本明細書に記載されるものを使用して簡便に作製され得る親和性成熟抗体である。簡潔に言えば、１つ以上のＨＶＲ残基を突然変異させ、変異体抗体をファージ上に提示させ、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。

例えば、抗体親和性を改善するために、ＨＶＲ中に変化（例えば、置換）を行い得る。ＨＶＲ「ホットスポット」（すなわち、体細胞成熟プロセスの間に高頻度で突然変異を受けるコドンによってコードされる残基（例えば、Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196を参照のこと）及び／又は抗原と接触する残基）において、このような変化を行い得、得られた変異体ＶＨ又は変異体ＶＬを結合親和性について試験する。二次ライブラリーを構築し、それから再選択することによる親和性成熟は、例えば、Hoogenboom, H.R. et al. in Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施態様では、様々な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、チェーンシャッフリング又はオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発）のいずれかによって、成熟のために選択された可変遺伝子に多様性を導入する。次いで、二次ライブラリーを作製する。次いで、ライブラリーをスクリーニングして、所望の親和性を有する任意の抗体変異体を同定する。多様性を導入するための別の方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、同時に４〜６個の残基）をランダム化するＨＶＲ特異的アプローチを含む。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発又はモデリングを使用して、特異的に同定され得る。特に、ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３がターゲティングされることが多い。

特定の実施態様では、置換、挿入又は欠失は、このような変化によって、抗体が抗原に結合する能力が実質的に減少しない限り、１つ以上のＨＶＲ内に存在し得る。例えば、結合親和性を実質的に減少させない保存的変化（例えば、本明細書で提供される保存的置換）が、ＨＶＲにおいて行われ得る。このような変化は、例えば、ＨＶＲ中の抗原接触残基の外側にあり得る。上記で提供される変異体ＶＨ配列及び変異体ＶＬ配列の特定の実施態様では、各ＨＶＲは変化されないか、又は１個、２個、若しくは３個以下のアミノ酸置換を含有する。

突然変異誘発のためにターゲティングされ得る抗体の残基又は領域を同定するために有用な方法は、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と称され、Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085に記載されている。この方法では、ターゲット残基の一残基又は一群（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの電荷残基）を同定し、中性又は負電荷アミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）で置換して、抗体と抗原の相互作用が影響を受けるかを決定する。さらなる置換が、最初の置換に対して機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入され得る。あるいは又は加えて、抗体と抗原の接触点を特定するための抗原−抗体複合体の結晶構造。このような接触残基及び隣接残基は、置換の候補としてターゲティング又は排除され得る。変異体をスクリーニングして、それらが所望の特性を含有するかを決定し得る。

アミノ酸配列挿入としては、長さが１残基から１００残基以上を含有するポリペプチドに及ぶアミノ末端融合及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入変異体としては、（例えば、ＡＤＥＰＴの）酵素又は抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへの抗体のＮ末端又はＣ末端の融合が挙げられる。

ｂ）グリコシル化変異体
特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させるように変化される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が作製又は排除されるようにアミノ酸配列を変化させることによって、簡便に達成され得る。

抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合している炭水化物が変化され得る。典型的には、哺乳動物細胞によって産生されるネイティブな抗体は、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７へのＮ結合によって一般的に結合している分岐状の二分岐オリゴ糖を含む（例えば、Wright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32を参照のこと）。オリゴ糖としては、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース及びシアル酸、並びに二分岐オリゴ糖構造の「ステム」中のＧｌｃＮＡｃに結合しているフコースが挙げられ得る。いくつかの実施態様では、特定の改善された特性を有する抗体変異体を作製するために、本明細書で報告される抗体中のオリゴ糖の改変が行われ得る。

一実施態様では、Ｆｃ領域に（直接的に又は間接的に）結合しているフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体変異体が提供される。例えば、このような抗体中のフコースの量は、１％〜８０％、１％〜６５％、５％〜６５％又は２０％〜４０％であり得る。フコースの量は、例えば国際公開公報第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって測定した場合に、Ａｓｎ２９７に結合している全ての糖構造（例えば、複合体構造、ハイブリッド構造及び高マンノース構造）の合計に対するＡｓｎ２９７の糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域における約２９７位（Ｆｃ領域残基のＥＵナンバリングはKabatに従う）に位置するアスパラギン残基を指す；しかしながら、Ａｓｎ２９７はまた、抗体のわずかな配列変異により、２９７位からアミノ酸±約３個上流又は下流に（すなわち、２９４位〜３００に）位置し得る。このようなフコシル化変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号を参照のこと。「脱フコシル化」又は「フコース欠損」抗体変異体に関する刊行物の例としては、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；国際公開公報第２０００／６１７３９号；国際公開公報第２００１／２９２４６号；米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号；米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号；米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号；米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号；米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号；米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号；国際公開公報第２００３／０８５１１９号；国際公開公報第２００３／０８４５７０号；国際公開公報第２００５／０３５５８６号；国際公開公報第２００５／０３５７７８号；国際公開公報第２００５／０５３７４２号；国際公開公報第２００２／０３１１４０号；Okazaki, A. et al., J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249; Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622が挙げられる。脱フコシル化抗体を産生することができる細胞株の例としては、タンパク質フコシル化に欠陥があるＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ripka, J. et al., Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；及び国際公開公報第２００４／０５６３１２号、特に実施例１１）及びノックアウト細胞株、例えば、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622; Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688；及び国際公開公報第２００３／０８５１０７号を参照のこと）が挙げられる。

分岐オリゴ糖を有する抗体変異体であって、例えば、抗体のＦｃ領域に結合している二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって分岐されている抗体変異体がさらに提供される。このような抗体変異体は、減少したフコシル化及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。このような抗体変異体の例は、例えば、国際公開公報第２００３／０１１８７８号；米国特許第６，６０２，６８４；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号に記載されている。Ｆｃ領域に結合しているオリゴ糖において少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。このような抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。このような抗体変異体は、例えば、国際公開公報第１９９７／３００８７号；国際公開公報第１９９８／５８９６４；及び国際公開公報第１９９９／２２７６４号に記載されている。

ｃ）Ｆｃ領域変異体
特定の実施態様では、１つ以上のアミノ酸改変を本明細書で提供される抗体のＦｃ領域中に導入し、それによりＦｃ領域変異体を作製し得る。Ｆｃ領域変異体は、１つ以上のアミノ酸位置においてアミノ酸改変（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含み得る。

特定の実施態様では、全てではないが一部のエフェクター機能を有する（このことは、抗体のin vivo半減期が重要だが、特定のエフェクター機能（例えば、補体及びＡＤＣＣ）が不要又は有害な用途の望ましい候補にする）抗体変異体が本明細書で提供される。ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／消失を確認するために、in vitro及び／又はin vivo細胞傷害性アッセイが行われ得る。例えば、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（したがって、ＡＤＣＣ活性を欠く可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能を保持することを保証するために、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）結合アッセイが行われ得る。ＡＤＣＣを媒介する主な細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対して、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲ発現は、Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492の４６４頁の表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのin vitroアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063;及びHellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502を参照のこと）；米国特許第５，８２１，３３７号（Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361を参照のこと）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ方法が用いられ得る（例えば、フローサイトメトリーのためのACTI（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（CellTechnology, Inc. Mountain View, CA；及びCytoTox 96（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Promega, Madison, WI）を参照のこと）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは又は加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、in vivoで、例えば、Clynes, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656に開示されているような動物モデルにおいて評価され得る。抗体がＣ１ｑに結合することができないので、ＣＤＣ活性を欠くことを確認するために、Ｃ１ｑ結合アッセイも行われ得る（例えば、国際公開公報第２００６／０２９８７９号及び国際公開公報第２００５／１００４０２号におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照のこと）。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイが実施され得る（例えば、Gazzano-Santoro, H. et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171; Cragg, M.S. et al., Blood 101 (2003) 1045-1052;及びCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743を参照のこと）。ＦｃＲｎ結合及びin vivoクリアランス／半減期の決定がまた、当技術分野で公知の方法を使用して実施され得る（例えば、Petkova, S.B. et al., Int. Immunol. 18 (2006: 1759-1769を参照のこと）。

減少したエフェクター機能を有する抗体としては、Ｆｃ領域残基２３８位、２６５位、２６９位、２７０位、２９７位、３２７位及び３２９位の１つ以上の置換を有するものが挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号）。このようなＦｃ突然変異体としては、アミノ酸２６５位、２６９位、２７０位、２９７位及び３２７位の２つ以上において置換を有するＦｃ突然変異体（アラニンへの残基２６５位及び２９７位の置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体を含む）が挙げられる（米国特許第７，３３２，５８１号）。

改善又は減弱したＦｃＲ結合性を有する特定の抗体変異体が記載されている（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；国際公開公報第２００４／０５６３１２号及びShields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604を参照のこと）。

特定の実施態様では、抗体変異体は、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換（例えば、Ｆｃ領域の２９８位、３３３位及び／又は３３４位（残基のＥＵナンバリング）における置換）を有するＦｃ領域を含む。

いくつかの実施態様では、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、国際公開公報第９９／５１６４２号及びIdusogie, E.E. et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184に記載されているように、変化（すなわち、改善又は減弱のいずれか）したＣ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をもたらす変化が、Ｆｃ領域において行われる。

増加した半減期及び改善された新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）結合性（これは、胎児への母親のＩｇＧの移行に関与する）を有する抗体（Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593及びKim, J.K. et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434）は、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎに対するＦｃ領域の結合を改善する１つ以上の置換をその中に有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体としては、Ｆｃ領域残基：２３８位、２５６位、２６５位、２７２位、２８６位、３０３位、３０５位、３０７位、３１１位、３１２位、３１７位、３４０位、３５６位、３６０位、３６２位、３７６位、３７８位、３８０位、３８２位、４１３位、４２４位又は４３４位の１つ以上において置換（例えば、Ｆｃ領域残基４３４位の置換）を有するものが挙げられる（米国特許第７，３７１，８２６号）。

Ｆｃ領域変異体の他の例については、Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１；及び国際公開公報第９４／２９３５１号も参照のこと。

ｄ）システイン操作抗体変異体
特定の実施態様では、システイン操作抗体、例えば、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている「チオＭＡｂ」を作製することが望ましい場合がある。特定の実施態様では、置換残基は、抗体のアクセス可能な部位に存在する。前記残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基が、抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書にさらに記載されるように、薬物部分又はリンカー−薬物部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートしてイムノコンジュゲートを作製するために使用され得る。特定の実施態様では、以下の残基の任意の１つ以上がシステインで置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Kabatのナンバリング）；重鎖のＡ１１８（ＥＵナンバリング）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵナンバリング）。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されているように作製され得る。

ｅ）抗体誘導体
特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で公知であり、容易に入手可能なさらなる非タンパク性部分を含有するようにさらに改変され得る。抗体の誘導体化に適切な部分としては、限定されないが、水溶性ポリマーが挙げられる。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダム共重合体のいずれか）及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレン（prolypropylene）オキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、並びにそれらの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、その水中安定性により、製造に有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量のものであり得、分岐状又は非分岐状であり得る。抗体に結合しているポリマーの数は変動し得、複数のポリマーが結合している場合、それらは、同じ分子又は異なる分子であり得る。一般的に、誘導体化のために使用されるポリマーの数及び／又は種類は、限定されないが、改善すべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が所定条件下の治療法で使用されるかなどを含む検討事項に基づいて決定され得る。

別の実施態様では、抗体と、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る非タンパク性部分とのコンジュゲートが提供される。一実施態様では、非タンパク性部分は、カーボンナノチューブである（Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605）。放射線は、任意の波長のものであり得、限定されないが、正常の細胞を害しないが、抗体−非タンパク性部分の近くの細胞が殺傷される温度に非タンパク性部分を加熱する波長を含む。

Ｂ．リコンビナント法及び組成物
抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているリコンビナント法及び組成物を使用して生産され得る。一実施態様では、本明細書に記載される抗ヒトＣＤ１９抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び／又はＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードし得る。さらなる実施態様では、このような核酸を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。さらなる実施態様では、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。このような一実施態様では、宿主細胞は、（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクターを含む（例えば、それらでトランスフォーメーションされている）。一実施態様では、宿主細胞は、真核生物性、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様では、抗ヒトＣＤ１９抗体を作製する方法であって、抗体の発現に適切な条件下で、上記で提供される抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養すること、及び場合により、宿主細胞培養（又は宿主細胞培地）から抗体を回収することを含む方法が提供される。

抗ヒトＣＤ１９抗体のリコンビナント生産では、例えば上記抗体をコードする核酸を単離し、宿主細胞におけるさらなるクローニング及び／又は発現のために、１つ以上のベクターに挿入する。このような核酸は、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離及び配列決定され得る。

抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適切な宿主細胞としては、本明細書に記載される原核細胞又は真核細胞が挙げられる。例えば、抗体は、特に、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が不要な場合には、細菌において生産され得る。細菌における抗体フラグメント及び抗体ポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、米国特許第５，７８９，１９９号及び米国特許第５，８４０，５２３号を参照のこと。（E. coliにおける抗体フラグメントの発現が記載されているCharlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254も参照のこと）。発現後、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから抗体を単離し得、さらに精製し得る。

原核生物に加えて、糸状菌又は酵母などの真核微生物（そのグリコシル化経路が「ヒト化」されており、その結果、部分的又は完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体を産生する真菌株及び酵母株を含む）が、抗体コードベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414;及びLi, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215を参照のこと。

グリコシル化抗体の発現のための適切な宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。特にSpodoptera frugiperda細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と併せて使用され得る多数のバキュロウイルス株が同定されている。

植物細胞培養物もまた、宿主として利用され得る。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、米国特許第６，０４０，４９８号、米国特許第６，４２０，５４８号、米国特許第７，１２５，９７８号及び米国特許第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物において抗体を生産するためのPLANTIBODIES（商標）技術が記載されている）を参照のこと。

脊椎動物細胞もまた、宿主として使用され得る。例えば、懸濁液中で成長するように適合させた哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０でトランスフォーメーションされたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７）；ヒト胎児腎臓株（例えば、Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74に記載されているＨＥＫ２９３又は２９３細胞）；仔ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252に記載されているＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頸部ガン細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；例えば、Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68に記載されているＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ＤＨＦＲ⁻ＣＨＯ細胞（Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、並びにＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が挙げられる。抗体生産に適切な特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268を参照のこと。

Ｃ．アッセイ
本明細書で提供される抗ヒトＣＤ１９抗体は、当技術分野で公知の様々なアッセイにより、その物理的／化学的特定及び／又は生物学的活性について同定、スクリーニング又は特性評価され得る。

１．結合アッセイ及び他のアッセイ
一態様では、本明細書で報告される抗体は、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットなどの公知の方法によって、その抗原結合活性について試験される。

２．活性アッセイ
一態様では、生物学的活性を有するその抗ヒトＣＤ１９抗体を同定するためのアッセイが提供される。生物学的活性は、例えば、Ｂ細胞増殖の阻害又はＢ細胞の殺傷を含み得る。in vivo及び／又はin vitroでこのような生物学的活性を有する抗体も提供される。

特定の実施形態では、本明細書で報告される抗体は、このような生物学的活性について試験される。

Ｄ．イムノコンジュゲート
また、１つ以上の細胞傷害剤、例えば化学療法剤又は薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物若しくは動物起源の酵素活性毒素又はそのフラグメント）又は放射性同位体にコンジュゲートされている本明細書で報告される抗ヒトＣＤ１９抗体を含むイムノコンジュゲートが本明細書で提供される。

一実施態様では、イムノコンジュゲートは、抗体が、限定されないが、マイタンシノイド（米国特許第５，２０８，０２０号、米国特許第５，４１６，０６４号及び欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号を参照のこと）；アウリスタチン、例えばモノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）（米国特許第５，６３５，４８３号、米国特許第５，７８０，５８８号及び米国特許第７，４９８，２９８号を参照のこと）；ドラスタチン；カリチアマイシン又はその誘導体（米国特許第５，７１２，３７４号、米国特許第５，７１４，５８６号、米国特許第５，７３９，１１６号、米国特許第５，７６７，２８５号、米国特許第５，７７０，７０１号、米国特許第５，７７０，７１０号、米国特許第５，７７３，００１号及び米国特許第５，８７７，２９６号；Hinman, L.M. et al., Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342;並びにLode, H.N. et al., Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928を参照のこと）；アントラサイクリン、例えばダウノマイシン又はドキソルビシン（Kratz, F. et al., Curr. Med. Chem. 13 (2006) 477-523; Jeffrey, S.C. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (2006) 358-362; Torgov, M.Y. et al., Bioconjug. Chem. 16 (2005) 717-721; Nagy, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 829-834; Dubowchik, G.M. et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532; King, H.D. et al., J. Med. Chem. 45 (20029 4336-4343；及び米国特許第６，６３０，５７９号を参照のこと）；メトトレキサート；ビンデシン；タキサン、例えばドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル及びオルタタキセル；トリコテシン；並びにＣＣ１０６５を含む１つ以上の薬物にコンジュゲートされている抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。

別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、限定されないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、（Pseudomonas aeruginosa由来の）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、αサルシン、Aleurites fordiiタンパク質、dianthinタンパク質、Phytolaca americanaタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ）、momordica charantia阻害剤、クルシン、クロチン、sapaonaria officinalis阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテシンを含む酵素活性毒素又はそのフラグメントにコンジュゲートされている本明細書に記載される抗体を含む。

別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートされてラジオコンジュゲートを形成する本明細書に記載される抗体を含む。様々な放射性同位体が、ラジオコンジュゲートの生産に利用可能である。例としては、Ａｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８、Ｓｍ^１５３、Ｂｉ^２１２、Ｐ^３２、Ｐｂ^２１２及びＬｕの放射性同位体が挙げられる。ラジオコンジュゲートが検出に使用される場合、それは、シンチグラフィ試験のための放射性原子、例えばＴＣ^９９ｍ若しくはＩ^１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法（磁気共鳴画像法、ＭＲＩとしても公知である）のためのスピン標識、例えば再びヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン若しくは鉄を含み得る。

抗体及び細胞傷害剤のコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル−）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン），ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６−ジイソシアネート）及びビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン））を使用して作製され得る。例えば、リシンイムノトキシンは、Vitetta, E.S. et al., Science 238 (1987) 1098-1104に記載されるように調製され得る。炭素−１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体にコンジュゲートするための例示的なキレート剤である。国際公開公報第９４／１１０２６号を参照のこと。リンカーは、細胞における細胞傷害薬の放出を容易にする「切断可能リンカー」であり得る。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る（Chari, R.V. et al., Cancer Res. 52 (1992) 127-131；米国特許第５，２０８，０２０号）。

本明細書におけるイムノコンジュゲート又はＡＤＣは、限定されないが、（例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aから）市販のＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ及びスルホ−ＳＭＰＢ及びＳＶＳＢ（スクシンイミジル−−（４−ビニルスルホン）ベンゾアート）を含む架橋リンカー試薬を用いて調製されるコンジュゲートを明確に企図する。

Ｅ．診断及び検出のための方法及び組成物
特定の実施態様では、本明細書で提供される抗ヒトＣＤ１９抗体はいずれも、生物学的サンプル中のヒトＣＤ１９提示細胞の存在を検出するために有用である。本明細書で使用される「検出」という用語は、定量的又は定性的検出を包含する。特定の実施態様では、生物学的サンプルは、細胞又は組織、例えば血液、血清又は血漿などを含む。

一実施態様では、診断又は検出の方法に使用するための抗ヒトＣＤ１９抗体が提供される。さらなる態様では、生物学的サンプル中のヒトＣＤ１９提示細胞の存在を検出する方法が提供される。特定の実施態様では、該方法は、ヒトＣＤ１９に対するヒトＣＤ１９抗体の結合を可能にする条件下で、生物学的サンプルと本明細書に記載される抗ヒトＣＤ１９抗体とを接触させること、及び抗ヒトＣＤ１９抗体とヒトＣＤ１９との間で複合体が形成されるかを検出することを含む。このような方法は、in vitro又はin vivo方法であり得る。一実施態様では、例えば、ヒトＣＤ１９が、患者を選択するためのバイオマーカーである場合、抗ヒトＣＤ１９抗体は、抗ヒトＣＤ１９抗体による治療に適格な被験体を選択するために使用される。

本明細書で報告される抗体を使用して診断され得る例示的な障害としては、多発性骨髄腫以外のＢ細胞ガン、例えばＢ細胞リンパ腫及びＢ細胞白血病、例えば非ホジキンリンパ腫及び急性リンパ芽球性白血病が挙げられる。

特定の実施態様では、標識抗ヒトＣＤ１９抗体が提供される。標識としては、限定されないが、直接的に検出される標識又は部分（例えば、蛍光、発色団、高電子密度、化学発光及び放射性標識）、並びに例えば酵素反応又は分子相互作用により間接的に検出される酵素又はリガンドなどの部分が挙げられる。例示的な標識としては、限定されないが、放射性同位体^３２Ｐ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ、^３Ｈ及び^１３１Ｉ、蛍光体、例えば希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えばホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リソザイム、糖オキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びグルコース−６−ホスファートデヒドロゲナーゼ、複素環オキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ（過酸化水素を用いて色素前駆体を酸化する酵素、例えばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ又はマイクロペルオキシダーゼとカップリングされている）、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定フリーラジカルなどが挙げられる。

Ｆ．医薬製剤
本明細書で報告される抗ヒトＣＤ１９抗体の医薬製剤は、所望の純度を有するこのような抗体を１つ以上の任意選択の薬学的に許容し得る担体（Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16^thedition, Osol, A. (ed.) (1980)）と混合することによって、凍結乾燥製剤又は水性液剤の形態で調製される。一般的に、薬学的に許容し得る担体は、用いられる投与量及び濃度においてレシピエントに非毒性であり、限定されないが、バッファー、例えばリン酸、クエン酸及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコール若しくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルパラベン若しくはプロピルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン若しくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリ（ビニルピロリドン）；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン若しくはリシン；グルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む単糖、二糖及び他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース、若しくはソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；並びに／又は非イオン系界面活性剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。本明細書における例示的な薬学的に許容し得る担体としてはさらに、侵入型薬物分散剤、例えば可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えばヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばｒｈｕＰＨ２０（HYLENEX（登録商標）、Baxter International, Inc.）が挙げられる。ｒｈｕＰＨ２０を含む特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び米国特許出願公開第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、１つ以上のさらなるグリコサミノグリカナーゼ、例えばコンドロイチナーゼと組み合わせられる。

例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。水性抗体製剤としては、米国特許第６，１７１，５８６号及び国際公開公報第２００６／０４４９０８号に記載されているものが挙げられ、後者の製剤は、ヒスチジン−酢酸バッファーを含む。

本明細書における製剤はまた、処置される特定の適応症に必要な複数の有効成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含有し得る。このような有効成分は、意図される目的のために有効な量で組み合わせて適切に存在する。

有効成分は、例えば、コアセルベーション技術によって又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル中に、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリラート）マイクロカプセル中に、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）中に、又はマクロエマルジョン中に封入され得る。このような技術は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16^thedition, Osol, A. (ed.) (1980)に開示されている。

徐放調製物が調製され得る。徐放調製物の適切な例としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスであって、造形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態の半透性マトリックスが挙げられる。

一般的に、in vivo投与に使用すべき製剤は、滅菌されている。滅菌は、例えば、滅菌ろ過膜によるろ過によって容易に達成され得る。

Ｇ．治療方法及び組成物
本明細書で提供される抗ヒトＣＤ１９抗体はいずれも、単一特異性抗体又は多重特異性抗体のいずれかとして、単独で又は組み合わせて治療方法において使用され得る。

ＣＤ１９は、幹細胞及び形質細胞を除くほとんどのＢ細胞（パンＢ細胞マーカー）上で発現され、多発性骨髄腫を除くリンパ腫及び白血病などのほとんどのヒトＢ細胞悪性腫瘍（腫瘍関連抗原）、例えば非ホジキンリンパ腫及び急性リンパ芽球性白血病で頻繁に発現される。

異なる細胞集団上の２つの細胞表面タンパク質を認識する二重特異性抗体は、病原性ターゲット細胞の破壊のために、細胞傷害性免疫細胞を再指向する可能性がある。

一態様では、医薬として使用するための抗ヒトＣＤ１９抗体が提供される。さらなる態様では、Ｂ細胞ガンの処置において使用するための抗ヒトＣＤ１９抗体が提供される。特定の実施態様では、処置方法において使用するための抗ヒトＣＤ１９抗体が提供される。特定の実施態様では、Ｂ細胞ガンを有する個体を処置する方法であって、有効量の抗ヒトＣＤ１９抗体を該個体に投与することを含む方法において使用するための抗ヒトＣＤ１９抗体が本明細書で提供される。このような一実施態様では、該方法は、有効量の少なくとも１つのさらなる治療剤を個体に投与することをさらに含む。さらなる実施態様では、Ｂ細胞の枯渇において使用するための抗ヒトＣＤ１９抗体が本明細書で提供される。特定の実施態様では、個体におけるＢ細胞を枯渇させる方法であって、有効の抗ヒトＣＤ１９抗体を該個体に投与して、Ｂ細胞を枯渇させることを含む方法において使用するための抗ヒトＣＤ１９抗体が本明細書で提供される。上記実施態様のいずれかの「個体」は、好ましくは、ヒトである。一実施態様では、Ｂ細胞ガンは、Ｂ細胞リンパ腫又はＢ細胞白血病である。一実施態様では、Ｂ細胞ガンは、非ホジキンリンパ腫又は急性リンパ芽球性白血病である。

さらなる態様では、ガン免疫療法において使用するための抗ヒトＣＤ１９抗体が提供される。特定の実施態様では、ガン免疫療法の方法において使用するための抗ヒトＣＤ１９抗体が提供される。上記実施態様のいずれかの「個体」は、好ましくは、ヒトである。

さらなる態様では、医薬の製造又は調製における抗ヒトＣＤ１９抗体の使用が本明細書で提供される。一実施態様では、医薬は、Ｂ細胞ガンを処置するためのものである。さらなる実施態様では、医薬は、Ｂ細胞ガンを処置する方法であって、有効量の医薬を、Ｂ細胞ガンを有する個体に投与することを含む方法において使用するためのものである。このような一実施態様では、該方法は、有効量の少なくとも１つのさらなる治療剤（例えば、下記）を個体に投与することをさらに含む。さらなる実施態様では、医薬は、Ｂ細胞を枯渇させるためのものである。さらなる実施態様では、医薬は、個体におけるＢ細胞を枯渇させる方法であって、有効量の医薬を個体に投与して、Ｂ細胞を枯渇させることを含む方法において使用するためのものである。上記実施態様のいずれかの「個体」は、ヒトであり得る。一実施態様では、Ｂ細胞ガンは、Ｂ細胞リンパ腫又はＢ細胞白血病である。一実施態様では、Ｂ細胞ガンは、非ホジキンリンパ腫又は急性リンパ芽球性白血病である。

さらなる態様では、Ｂ細胞ガンを処置するための方法が本明細書で提供される。一実施態様では、該方法は、有効量の抗ヒトＣＤ１９抗体を、このようなＢ細胞ガンを有する個体に投与することを含む。このような一実施態様では、該方法は、有効量の少なくとも１つのさらなる治療剤（例えば、下記）を個体に投与することをさらに含む。上記実施態様のいずれかの「個体」は、ヒトであり得る。一実施態様では、Ｂ細胞ガンは、Ｂ細胞リンパ腫又はＢ細胞白血病である。一実施態様では、Ｂ細胞ガンは、非ホジキンリンパ腫又は急性リンパ芽球性白血病である。

さらなる態様では、個体におけるＢ細胞を枯渇させるための方法が本明細書で提供される。一実施態様では、該方法は、有効量の抗ヒトＣＤ１９抗体を個体に投与して、Ｂ細胞を枯渇させることを含む。一実施態様では、「個体」は、ヒトである。一実施態様では、Ｂ細胞ガンは、Ｂ細胞リンパ腫又はＢ細胞白血病である。一実施態様では、Ｂ細胞ガンは、非ホジキンリンパ腫又は急性リンパ芽球性白血病である。

さらなる態様では、例えば上記治療方法のいずれかに使用するための医薬製剤であって、本明細書で報告される抗ヒトＣＤ１９抗体のいずれかを含む医薬製剤が本明細書で提供される。一実施態様では、医薬製剤は、本明細書で報告される抗ヒトＣＤ１９抗体のいずれか、及び薬学的に許容し得る担体を含む。別の実施態様では、医薬製剤は、本明細書で報告される抗ヒトＣＤ１９抗体のいずれか、及び少なくとも１つのさらなる治療剤を含む。

治療では、本明細書で報告される抗体は単独で、又は他の薬剤と組み合わせて使用され得る。例えば、本明細書で報告される抗体は、少なくとも１つのさらなる治療剤と同時投与され得る。

このような上記併用療法は、併用投与（この場合、２つ以上の治療剤が同じ製剤又は別個の製剤に含まれる）及び個別投与（この場合、１つ又は複数のさらなる治療剤の投与の前に、同時に及び／又は後に、本明細書で報告される抗体の投与を行い得る）を包含する。一実施態様では、抗ヒトＣＤ１９抗体の投与及びさらなる治療剤の投与は、互いに約１カ月以内、又は約１、２若しくは３週間以内、又は約１、２、３、４、５、若しくは６日以内に行なわれる。

本明細書で報告される抗体（及び任意のさらなる治療剤）は、非経口、肺内及び鼻腔内、並びに局所処置の場合には所望により病変内投与を含む任意の適切な手段によって投与され得る。非経口注入としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与が挙げられる。投薬は、任意の適切な経路による、例えば、投与が短時間又は慢性的であるかに部分的に応じて、静脈内又は皮下注射などの注射によるものであり得る。限定されないが、単回投与又は様々な時点の複数回投与、ボーラス投与及びパルス注入を含む様々な投薬スケジュールが本明細書で企図される。

本明細書で報告される抗体は、優れた医療行為と一致した様式で、製剤化、投薬及び投与されるであろう。これとの関連での検討要因としては、処置される特定の障害、処置される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床症状、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与のスケジュール管理及び医療従事者に公知の他の要因が挙げられる。抗体は、必須ではないが場合により、問題の障害を予防又は治療するために現在使用される１つ以上の薬剤と共に製剤化される。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害又は処置の種類及び上記で考察されている他の要因に依存する。これらは、一般的に、本明細書に記載されるのと同じ投与量及び投与経路で、又は本明細書に記載される投与量の約１〜９９％、若しくは適切であると経験的／臨床的に決定される任意の投与量で及び任意の経路で使用される。

疾患の予防又は治療のために、（単独で又は１つ以上の他のさらなる治療剤と組み合わせて使用される場合の）本明細書で報告される抗体の適切な投与量は、処置すべき疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体が予防目的で投与されるか治療目的で投与されるか、以前の治療法、患者の病歴及び抗体への反応、並びに主治医の裁量に依存するであろう。抗体は、１回で又は一連の処置で患者に適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば、１回以上の別個投与又は連続注入にかかわらず、約１μg/kg〜１５mg/kg（例えば、５mg/kg〜１０mg/kg）の抗体が、患者への投与のための初回候補投与量であり得る。１つの典型的な１日投与量は、上記要因に応じて、約１μg/kg〜１００mg/kg以上の範囲であり得る。症状に応じて数日間以上の反復投与では、処置は、一般的に、疾患症候の所望の抑制が起こるまで持続されるであろう。抗体の１つの例示的な投与量は、約０．０５mg/kg〜約１０mg/kgの範囲であろう。したがって、約０．５mg/kg、２．０mg/kg、４．０mg/kg又は１０mg/kg（又はそれらの任意の組み合わせ）の１つ以上の用量が患者に投与され得る。このような用量は、断続的に、例えば、毎週又は３週間毎に（例えば、患者が抗体の約２〜約２０、又は例えば、約６つの用量を受けるように）投与され得る。初回高負荷用量とそれに続く１つ以上の低用量が投与され得る。しかしながら、他の投与量レジメンが有用であり得る。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニタリングされる。

炎症性疾患、自己免疫疾患、関節リウマチ、狼瘡、乾癬及び骨疾患を処置するための方法であって、本明細書で報告されるヒトＣＤ１９に特異的に結合する抗体を、このような疾患を有すると診断された（したがって、このような治療を必要とする）患者に投与することを含む方法が本明細書でさらに提供される。抗体は、医薬組成物中で単独で、又は炎症性疾患、自己免疫疾患、関節リウマチ、狼瘡、乾癬若しくは骨疾患を処置するための他の医薬と組み合わせて投与され得る。抗体は、医薬有効量で投与される。

炎症性疾患、自己免疫疾患、関節リウマチ、狼瘡、乾癬又は骨疾患を処置するための、及び本明細書で報告される抗体を含む医薬組成物を製造するための、本明細書で報告される抗体の使用が本明細書でさらに提供される。加えて、本明細書で報告される抗体を含む医薬組成物を製造するための方法が本明細書で提供される。

炎症性疾患、自己免疫疾患、関節リウマチ、狼瘡、乾癬又は骨疾患を処置するための、本明細書で報告される抗体が本明細書でさらに提供される。

炎症性疾患、自己免疫疾患、関節リウマチ、狼瘡、乾癬又は骨疾患を処置するための医薬組成物を製造するための、本明細書で報告される抗体の使用が本明細書でさらに提供される。抗体は、医薬有効量で使用される。

炎症性疾患、自己免疫疾患、関節リウマチ、狼瘡、乾癬又は骨疾患を処置するための医薬組成物を製造するための、本明細書で報告される抗体の使用が本明細書でさらに提供される。抗体は、医薬有効量で使用される。

上記の製剤又は治療方法はいずれも、抗ヒトＣＤ１９抗体に代えて又はそれに加えて、本明細書で報告されるイムノコンジュゲートを使用して行われ得ると理解される。

ＩＩＩ．製品
別の態様では、上記障害の治療、予防及び／又は診断に有用な材料を含む製品が提供される。製品は、容器と、該容器上の又は該容器に付着しているラベル又は添付文書とを含む。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなど様々な材料から形成され得る。容器は、組成物（これは、それ自体であるか、又は症状を治療、予防及び／若しくは診断するために有効な別の組成物と組み合わされている）を収容し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静注液バッグ又はバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、本明細書で報告される抗体である。ラベル又は添付文書は、組成物が、選択された症状を処置するために使用されることを示す。また、製品は、（ａ）本明細書で報告される抗体を含む組成物がその中に含まれる第１の容器；及び（ｂ）さらなる細胞傷害剤又は別の治療剤を含む組成物がその中に含まれる第２の容器を含み得る。この実施態様の製品は、組成物が、特定の症状を処置するために使用され得ることを示す添付文書をさらに含み得る。あるいは又は加えて、製品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液などの薬学的に許容し得るバッファーを含む第２の（又は第３の）容器をさらに含み得る。それは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む商業的観点及び使用者観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。

上記製品はいずれも、抗ヒトＣＤ１９抗体の代わりに、又は抗ヒトＣＤ１９抗体に加えて、本明細書で報告されるイムノコンジュゲートを含み得ると理解される。

ＩＶ．配列表の説明
配列番号：１ マウス抗ヒトＣＤ１９抗体８Ｂ８重鎖可変ドメイン
配列番号：２ マウス抗ヒトＣＤ１９抗体８Ｂ８軽鎖可変ドメイン
配列番号：３ マウス抗ヒトＣＤ１９抗体８Ｂ８ ＨＶＲ−Ｈ１
配列番号：４ マウス抗ヒトＣＤ１９抗体８Ｂ８ ＨＶＲ−Ｈ２
配列番号：５ マウス抗ヒトＣＤ１９抗体８Ｂ８ ＨＶＲ−Ｈ３
配列番号：６ マウス抗ヒトＣＤ１９抗体８Ｂ８ ＨＶＲ−Ｌ１
配列番号：７ マウス抗ヒトＣＤ１９抗体８Ｂ８ ＨＶＲ−Ｌ２
配列番号：８ マウス抗ヒトＣＤ１９抗体８Ｂ８ ＨＶＲ−Ｌ３
配列番号：９ ヒト化重鎖可変ドメイン
配列番号：１０〜２８ ヒト化軽鎖可変ドメイン変異体及びヒト化ＨＶＲ−Ｌ１変異体の配列を交互に記載
Ｖ．抗体命名法

ＶＩ．実施例
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上記一般的な説明を考慮して、様々な他の実施態様が実施され得ると理解される。

理解を明確にするために、例示及び実施例によって、上記本発明が幾分詳細に説明されているが、説明及び実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書で引用される全ての特許及び科学文献の開示は、その全体が参照により明示的に組み入れられる。

実施例１
免疫化及びマウス抗ヒトＣＤ１９抗体（ハイブリドーマ）の作製
Ｂａｌｂ／ｃマウスを６回免疫し、ＣＤ１９トランスフェクションＨＥＫ２９３細胞（平均レセプター密度３５，０００／細胞）で追加免疫した。ヒトＣＤ１９トランスフェクションＮＩＨ−３Ｔ３細胞に対するＣＤ１９細胞ＥＬＩＳＡを用いて血清サンプルを試験することによって、免疫応答をモニタリングした。十分な力価の抗ヒトＣＤ１９抗体を有するマウス由来の脾臓細胞を、マウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３ Ａｇ８．６５３との融合による不死化に使用した。３回の融合を行い、ヒトＣＤ１９トランスフェクションＮＩＨ−３Ｔ３細胞に対する細胞ＥＬＩＳＡと、抗ヒトＣＤ１９特異的抗体について、Ｄａｕｄｉ（ＣＤ１９^＋）及びＣＤ１９⁻細胞を使用したＦＡＣＳ結合アッセイとによって、ハイブリドーマ上清をスクリーニングした。

実施例２
ハイブリドーマスクリーニング及び抗ＣＤ１９抗体の細胞生物学的機能評価
ｈＣＤ１９に対する抗体をスクリーニングするための細胞ＥＬＩＳＡ
ハイブリドーマをスクリーニングするために、及びヒトＣＤ１９に対する抗体を分泌するハイブリドーマを同定するために、細胞ＥＬＩＳＡを適用した。ヒトＣＤ１９をトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞を陽性細胞として使用した；非トランスフェクションＮＩＨ３Ｔ３細胞をネガティブコントロール細胞として使用した。陽性ハイブリドーマの評価のために、トランスフェクションＮＩＨ３Ｔ３細胞と非トランスフェクションＮＩＨ３Ｔ３細胞とのＯＤ比を定量した。

−培養培地：ＤＭＥＭ高グルコース（４．５mg/ml）、１０％ＦＣＳ、ピルビン酸Ｎａ、ＮＥＡＡ、グルタミン
−抗体ポジティブコントロール：抗ＣＤ１９モノクローナル抗体（ＩｇＧ１）Pharmingen Cat# 555409 c＝１mg/ml
−検出抗体：ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨＲＰコンジュゲートBio-Rad Cat# 170-06516
−１×ＥＬＩＳＡブロッキング試薬で１：２０００希釈
−他の試薬：Fibronectin Roche Cat# 838039 c＝１mg/ml
−グルタルジアルデヒド：２５％原液／／Grade Agar Scientific #R102最終濃度：ＰＢＳ中０．０５％
−ＥＬＩＳＡブロッキング試薬：１０×原液／／Roche Cat# 1112589
−ＴＭＢ基質：Roche Cat# 11432559
−停止溶液：１M Ｈ_２ＳＯ_４
−ＢｉｏＲａｄ Ｃａｔ＃ １７０−６５１６ １×ＥＬＩＳＡブロッキング試薬で１：２０００希釈

１日目：
−フィブロネクチンコーティング：ＰＢＳ中５μg/cm²；９６ウェルプレート＝３２cm²；６ml中１６０μg／プレート
−ＰＢＳ、５０μl／ウェル
−室温で４５分間インキュベーションし、コーティング溶液を吸引する
−９６ウェルプレートにおいて、培養培地 ５０μl中で１ウェル当たり細胞 １．２５×１０^４個を播種する
−３７℃で４０時間インキュベーションする
−ＣＤ１９を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞をプレートの上半分に追加する
−非トランスフェクションＮＩＨ３Ｔ３細胞をプレートの下半分に追加する

３日目：
−ポジティブコントロール抗体又はサンプル（上清又はマウス血清）を培養培地 ５０μlに追加する
−４℃で２時間インキュベーションする
−培地を除去し、グルタルジアルデヒド（ＰＢＳ中０．０５％）１００μlで細胞を固定する
−ＰＢＳ ２００μlで２回洗浄する
−１ウェル当たり検出抗体１：２０００ ５０μlを追加する
−室温で２時間インキュベーションする
−ＰＢＳ ２００μlで３回洗浄する
−ＴＭＢ ５０μlを追加し、室温で３０分間インキュベーションする
−１M Ｈ_２ＳＯ_４２５μlを追加することによって停止し、４５０nm／６２０nmで吸光度を読み取る
−結果の計算：ＯＤ ＮＩＨ３Ｔ３ ＣＤ１９のＯＤ：ＯＤ非トランスフェクションＮＩＨ３Ｔ３のＯＤの比

実施例３
抗ＣＤ１９抗体のヒト化
マウス抗体のＣＤ１９結合特異性をヒトアクセプターフレームワークに移植し、ヒトの体が異物と認識する配列ストレッチから生じる潜在的な免疫原性問題を排除した。マウス（ドナー）抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）全体をヒト（アクセプター）抗体フレームワークにグラフトすることによって、これを行った（これは、ＣＤＲグラフティング又は抗体ヒト化と称される）。

マウスアミノ酸配列をヒト生殖系列抗体Ｖ遺伝子のコレクションとアライメントし、配列同一性及び相同性に従って選別した。１つの特定のアクセプター配列を選択する前に、ドナー抗体のいわゆるカノニカルループ構造を決定しなければならない（Morea, V., et al., Methods, Vol 20, Issue 3 (2000) 267-279）。これらのカノニカルループ構造は、いわゆるカノニカル位置に存在する残基の種類によって決定される。これらの位置はＣＤＲ領域の（部分的に）外側にあり、親（ドナー）抗体のＣＤＲコンフォメーションを保持するためには、最終構築物において機能的に同等に維持されなければならない。ヒト生殖系列配列ＶＢＡＳＥ＿ＶＨ１＿１を重鎖のアクセプターとして選択し、配列ＶＢＡＳＥ＿ＶＫ２＿５を軽鎖のために選択した。この結果、野生型ヒト化抗体が得られた。

実施例４
ＣＤ１９結合抗体の発現
遺伝子合成によって、抗体可変ドメインをコードする配列を作製した。

各点突然変異の導入のために、３３ｍｅｒプライマーベースのクイックチェンジ反応を実施した。配列決定（SequiServe, Vaterstetten, Germany）によって、全ての配列を検証した。E. coliにおける選択及び繁殖を可能にするベクターに全ての配列をクローニングした（ベクターｐＵＣ１８由来の複製起点、アンピシリン耐性のためのβ−ラクタマーゼ）。これらのベクターは、哺乳動物細胞における発現を可能にするカセットをさらに含有する（エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）の複製起点ｏｒｉＰ、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）由来の前初期エンハンサー及びプロモーター、並びにポリアデニル化配列）。

抗体軽鎖及び重鎖をコードする全ての遺伝子セグメントの前に、シグナルペプチド（ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ；配列番号：２９）をコードするＤＮＡ配列がある。懸濁液中、ヒト胎児腎臓ＨＥＫ２９３細胞への一過性トランスフェクションによって、タンパク質を発現させた。これらの細胞を３７℃及び８％ＣＯ_２で培養した。トランスフェクションの日に、細胞を生細胞１〜２×１０^６個／mLの密度で新鮮培地に播種した。等モル量の重鎖及び軽鎖両方のプラスミドＤＮＡをコトランスフェクションした。トランスフェクションの７日後に細胞培養上清を採取し、遠心分離し（１４，０００×ｇ、４℃で４５分間）し、続いて、０．２２μmフィルターでろ過した。精製前に、これらの上清を−２０℃で凍結及び保存することができた。

実施例５
ＣＤ１９結合抗体の精製
一般的な方法：
５分間の接触時間で、無細胞発酵上清（ＨＥＫ２９３Ｆ）を、予め平衡化した（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ）プロテインＡアフィニティーカラム（MabSelect（商標）SuRe, GE Healthcare、８×１００mm）にロードする。洗浄後（ＰＢＳ、５カラム容量）、２５mMクエン酸／ＮａＯＨ（ｐＨ３．０）で抗体を溶出する。１M Ｔｒｉｓで溶出液をｐＨ５．５に調整し、４℃で一晩インキュベーションする。その後、最終ろ過（０．４５μm）を実施する。

抗ヒトＣＤ１９抗体変異体５（Ｓ２７ｅＰ）の精製：
５分間の接触時間で、無細胞発酵上清（２４４ml、ＨＥＫ ２９３Ｆ）を、予め平衡化した（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ）プロテインＡアフィニティーカラム（MabSelect（商標）SuRe, GE Healthcare、８×１００mm）にロードした。洗浄後（ＰＢＳ、５カラム容量）、２５mMクエン酸／ＮａＯＨ（ｐＨ３．０）で抗体を溶出した。１M Ｔｒｉｓで溶出液をｐＨ５．５に調整し、４℃で一晩インキュベーションした。最終ろ過（０．４５μm）により、９９．０％（ＳＥＣ）純粋な生成物 ３１．１mg（５．７ml、５．４５mg/ml）を回収した。

抗ヒトＣＤ１９抗体変異体９（Ｓ２７ｅＰ／Ｎ２８Ｓ）の精製：
５分間の接触時間で、無細胞発酵上清（２６０ml、ＨＥＫ ２９３Ｆ）を、予め平衡化した（ＰＢＳ）プロテインＡアフィニティーカラム（MabSelect（商標）SuRe, GE Healthcare、８×１００mm）にロードした。洗浄後（ＰＢＳ、５カラム容量）、２５mMクエン酸／ＮａＯＨ（ｐＨ３．０）でターゲットタンパク質を溶出した。１M Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）で溶出液をｐＨ５．５に調整し、４℃で一晩インキュベーションした。最終ろ過（０．２μm）により、９８．０％（ＳＥＣ）純粋な生成物 ９．１mg（５．２ml、１．７５mg/ml）を回収した。

実施例６
ＣＤ１９ ＥＣＤ発現細胞の提供及びそれに対する抗体の結合
LipofectAmine 2000を使用して、細胞 １．５×１０^６個当たりプラスミドＤＮＡ １μgをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションし、その後、３７℃で４８時間インキュベーションした。プラスミドは、細胞外提示のためのヒトＰＳＣＡ ＧＰＩアンカー配列（ＤＴＤＬＣＮＡＳＧＡ ＨＡＬＱＰＡＡＡＩＬ ＡＬＬＰＡＬＧＬＬＬ ＷＧＰＧＱＬ；配列番号：３２）に融合されたヒトＣＤ１９

又はカニクイザルＣＤ１９

細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のいずれかをコードしていた。各トランスフェクション細胞をＦＡＣＳバッファー（５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＰＢＳ）で２回洗浄し、ＦＡＣＳバッファーに再懸濁して、最終濃度を細胞２＊１０^６個／mL（これは、細胞５．０＊１０^４個／２５μL／ウェルに対応する）とした。抗体の開始濃度を６０μg/mL（最終濃度の２倍）に設定し、次いで、１：３（v/v）滴定系列で希釈した。細胞上で、一次抗体を室温で１時間インキュベーションし、続いて、２回の洗浄工程を行った。二次検出のために、Alexa488にコンジュゲートされた抗ｈｕＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を３０μg/mLの濃度で使用した。二次抗体を室温で１時間インキュベーションした。続いて、細胞を２回洗浄し、１ウェル当たりＦＡＣＳバッファー ７０μLに再懸濁し、BD FACS Cantoを使用して分析した。

ヒト化野生型抗体並びに変異体５（Ｓ２７ｅＰ）及び９（Ｓ２７ｅＰ／Ｍ２８Ｓ）の各ＥＣ_５０値は、以下の表に示されている。

実施例７
質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）
約７Ｍグアニジニウム−ＨＣｌを含む２００mMヒスチジン−ＨＣｌバッファー（ｐＨ６．０）中で抗体材料（約８０μg）を変性させ、１０mM ＴＣＥＰを使用して還元し、Zeba Spin Columns 7K MWCO (Thermo Scientific)を使用して２００mMヒスチジン−ＨＣｌ（ｐＨ６．０）にバッファー交換した。最後に、トリプシン又はサーモリシン（Promega）２．５μgを用いて、材料を３７℃で１６時間消化した。NanoAcquity UPLCシステム(Waters)を使用したACQUITY BEH300 C18カラム(Waters)でのＲＰ−ＵＰＬＣ勾配、続いて、ナノエレクトロスプレーイオン源としてTriVersa NanoMate (Advion)を備えるOrbitrap Fusion Tribrid質量分析計(Thermo Scientific)でのＣＩＤベースのＭＳ／ＭＳによって、データ収集を実施した。Mascot MS/MS Ion Searches (Matrix Science)及びペプチドアナライザー（Roche Diagnostics GmbH）（自社のＭＳデータ評価ソフトウェア）を使用して、データを評価した。対応するペプチドの抽出イオン電流クロマトグラムの統合によって、定量を実施した。

結果：
ＰＢＳバッファー中、ｐＨ７．４で、野生型ヒト化抗ＣＤ１９抗体（変異体０：ｗｔ）を３７℃で２週間インキュベーションした際の脱アミド化及びスクシンイミド形成のレベルは、以下の表に示されている（使用したフラグメント：ＳＳＱＳＬＥＮＳＮＧＮＴＹＬＮＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＲ；配列番号：３５）。

ヒト化抗ＣＤ１９抗体変異体５（Ｓ２７ｅＰ）をインキュベーションした際の脱アミド化及びスクシンイミド形成のレベルは、以下の表に示されている（使用したフラグメント：ＳＳＱＳＬＥＮＰＮＧＮＴＹＬＮＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＲ；配列番号：３５）。

ヒト化抗ＣＤ１９抗体変異体３（Ｓ２７ｅＡ）をインキュベーションした際の脱アミド化及びスクシンイミド形成のレベルは、以下の表に示されている（使用したフラグメント：ＳＳＱＳＬＥＮＡＮＧＮＴＹＬＮＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＲ；配列番号：３５）。

ヒト化抗ＣＤ１９抗体変異体７（Ｇ２９Ａ）をインキュベーションした際の脱アミド化及びスクシンイミド形成のレベルは、以下の表に示されている（使用したフラグメント：ＳＳＱＳＬＥＮＳＮＡＮＴＹＬＮＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＲ；配列番号：３５）。

実施例８
ＣＤ１９親和性の決定
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）ベースのアッセイを使用して、抗ヒトＣＤ１９抗体とリコンビナントヒトＣＤ１９レセプターの細胞外ドメインとの間の結合の動態パラメータを決定した。

プロトコール１：
抗ヒトＣＤ１９抗体を捕捉するために、捕捉抗体として抗ヒトＦ（ａｂ）’２抗体フラグメントを使用した（Jackson Immuno Research; order code: 109-006-006）。製造業者の説明書（GE Healthcare）に従ってアミンカップリングキットを使用することによって、捕捉抗体２０μg/mLをCM5チップ(GE Healthcare; BR-1005-30)上にｐＨ４．５で固定化した。サンプル及びランニングバッファーは、ＨＢＳ−ＥＰ＋（GE Healthcare; BR-1006-69）であった。フローセルを２５℃に設定した。サンプルブロックを１２℃に設定した。ランニングバッファーで両方ともプライミングした。３５nM溶液を２０μL／分の流量で６０秒間注入することによって、抗ヒトＣＤ１９抗体を捕捉した。９００nMから開始して１：３希釈で合計５つの濃度で、様々な濃度のリコンビナントヒトＣＤ１９ ＥＣＤ溶液を５０μL／分の流量で１２０秒間注入することによって、会合を測定した。解離相を最大６００秒間モニタリングし、サンプル溶液からランニングバッファーに切り替えることによってトリガーした。１０mMグリシン溶液（ｐＨ１．５）によって３０μL／分の流速で６０秒間及び３０秒間洗浄することによって、表面を２回再生した。ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ）’２表面から得られた応答を減算することによって、バルク屈折率の差を補正した。ブランク注入も減算する（＝二重参照）。見掛けのＫＤ及び他の動態パラメータの計算のために、ラングミュア１：１モデルを使用した。

プロトコール２：
抗ヒトＣＤ１９抗体を捕捉するために、抗ヒトＦａｂ捕捉抗体を使用した。最初に、製造業者の説明書に従ってアミンカップリングキット（GE Healthcare）を使用することによって、３０μg/mLヤギ抗ヒトＦａｂ抗体（Order Code: 28958325; GE Healthcare Bio-Sciences AB）をCM5チップ(GE Healthcare; BR-1005-30)上にｐＨ５．０で固定化した。サンプル及びランニングバッファーは、ＨＢＳ−ＥＰ＋（GE Healthcare; BR-1006-69）であった。フローセルを２５℃に設定した。サンプルブロックを１２℃に設定した。ランニングバッファーで両方ともプライミングした。１０nM溶液を１０μL／分の流量で６０秒間注入することによって、抗ヒトＣＤ１９抗体を捕捉した。２５０nMの濃度でリコンビナントヒトＣＤ１９ ＥＣＤを１０μL／分の流速で９０秒間注入することによって、会合を測定した。解離相を最大６０秒間モニタリングし、サンプル溶液からランニングバッファーに切り替えることによってトリガーした。１０mMグリシン溶液（ｐＨ２．１）によって１０μL／分の流速で６０秒間洗浄することによって、表面を再生した。ブランク表面からの応答を減算することによって、バルク屈折率の差を補正した。

計算：
サンプルの相対的結合は、捕捉レベル及び結合レベルから計算される比（RU結合をRU捕捉で割ったもの）である：

サンプルの相対活性濃度は、参照サンプルと比較したサンプルの比である：

Claims (14)

1. ヒトＣＤ１９に特異的に結合する抗体であって、
   （ａ）配列番号：０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
   （ｂ）配列番号：１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
   （ｃ）配列番号：０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
   （ｄ）配列番号：２０又は２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
   （ｅ）配列番号：０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
   （ｆ）配列番号：０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
   を含む、抗体。
2. モノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
3. ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体である、請求項１〜２のいずれか一項に記載の抗体。
4. ヒトＣＤ１９に特異的に結合する抗体フラグメントである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体。
5. （ａ）配列番号：０９のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列、及び配列番号：１９のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、又は
   （ｂ）配列番号：０９のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列、及び配列番号：２７のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、又は
   （ｃ）（ａ）若しくは（ｂ）の通りのＶＨ配列及びＶＬ配列
   を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体。
6. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体、及び薬学的に許容し得る担体を含む、医薬製剤。
7. 医薬として使用するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体。
8. Ｂ細胞ガンを処置するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体。
9. Ｂ細胞の枯渇において使用するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体。
10. 医薬の製造における、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体の使用。
11. 医薬が、Ｂ細胞ガンを処置するためのものである、請求項１０に記載の使用。
12. 医薬が、Ｂ細胞を枯渇させるためのものである、請求項１０に記載の使用。
13. Ｂ細胞ガンを有する個体を処置する方法であって、有効量の請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体を該個体に投与することを含む、方法。
14. 個体におけるＢ細胞を枯渇させる方法であって、有効量の請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体を該個体に投与して、Ｂ細胞を枯渇させることを含む、方法。