JP2006517598A - ヒドロキシフェニル架橋高分子ネットワークおよびその用途 - Google Patents

Abstract

人工組織および組織工学用途，例えば，人工または合成の軟骨において有用なジヒドロキシフェニル架橋高分子ネットワークが提供される。このネットワークは，まずポリアミンまたはポリカルボキシレート高分子（分子の長さ方向に沿って結合しているそれぞれ複数のアミンまたはカルボン酸基を有する）を用意し，この高分子を，ポリアミンの場合には遊離カルボン酸基を，またはポリカルボキシレートの場合には遊離第１アミン基を有するヒドロキシフェニル化合物と反応させ，そしてカルボジイミド媒介性反応経路により高分子上にヒドロキシフェニル化合物を置換して，ヒドロキシフェニルで置換された高分子を得ることにより製造される。次にこの高分子を，代謝条件の温度およびｐＨの下で，酵素により触媒される，それぞれ異なる高分子に結合している２つのヒドロキシフェニル基の間の二量体化反応により，他のそのような高分子と連結させる。好ましい態様においては，ジチラミン結合により連結されているチラミン置換ヒアルロナン分子から高分子ネットワークを作成して，所望の物理学的特性を有する安定な凝集したハイドロゲルを得る。そのようなネットワークを製造する方法も提供される。

Description

発明の背景
関節軟骨は，健康な関節において必須の機能を果たす。これは，負荷を骨からそらして骨を損傷から保護するために，衝撃および摩擦負荷を吸収し放散させることを担う。軟骨は，負荷力をアグリカン分子の三次元ネットワーク中の液相に移動させ，それ自身が関節空間中に拘束されることにより（次節で説明する），その機能を行う。アグリカン分子は，コア蛋白質に結合した１００個程度の硫酸コンドロイチン鎖を有し，各硫酸コンドロイチン鎖はその長さ方向に沿って多数の負に荷電した硫酸基を有する。これらのすべての硫酸基の効果は，１つのアグリカン分子中の硫酸コンドロイチン鎖のそれぞれが互いに反発するようにすること（このためアグリカン分子は静止時に最大可能な体積を有する），および軟骨凝集体中の隣接するアグリカン分子が互いに反発するようにすることである。

健康な軟骨においては，アグリカン分子は長いヒアルロナン鎖に結合しており，一方これは，細胞外コラーゲン原線維マトリクスにより大きい軟骨凝集体中の関節空間中に拘束されている。すなわち，各アグリカン分子中の隣接する硫酸コンドロイチン鎖（および同じまたは異なるヒアルロナン鎖に結合している隣接するアグリカン分子）は互いに反発するが，これらはそれでもなおコラーゲンマトリクス中に拘束されている。正常な健康な軟骨を示す図１を参照。硫酸コンドロイチン鎖は非常に反発性であるため，休息時ではヒアルロナン−アグリカンネットワーク（または高分子ネットワーク）はコラーゲンマトリクスの拘束の中で可能な限り大きく拡張して，可能な限り低いエネルギー状態を達成する。すなわち，隣接する負に荷電した硫酸基の間には可能な最大の空間がある。その結果，ネットワーク分子は，隣接するネットワーク分子に近づくことを回避するために，転位または転置させることに非常に抵抗性である。これらの大きい軟骨凝集体は，その自由溶液体積の５分の１でコラーゲン線維の網の中にトラップされており，これはさらに膨潤することに抵抗する。高い負の電荷密度を有する軟骨凝集体は，大きい溶媒ドメインを結合し，軟骨が負荷を吸収し変形に抵抗する能力に寄与する。圧縮されると，プロテオグリカン上の固定された負電荷基の間の距離が減少し，これは電荷対電荷反発力ならびに自由に浮遊する正のカウンターイオン（例えばＣａ²⁺およびＮａ⁺）の濃度を増加させる。両方の効果が軟骨の粘弾性的性質および変形に抵抗し圧縮負荷を吸収する能力に寄与する。このことは以下にさらに説明する。

高分子ネットワーク中には，実質的に連続する液相を提供する水分子が存在する。高分子ネットワークは，以下のようにして，衝撃および摩擦負荷を連続液体（水）相に伝達することにより，骨から衝撃および摩擦負荷をそらす。関節に負荷がかかると，力はまず高分子ネットワークにより吸収され，ここで力はネットワークに作用してこれを変形させるか圧縮する傾向を示す。力は，負荷によるネットワークの変形または圧縮に適応するために液体流れを誘導するため，液相中で圧力勾配を形成する。しかし，液体は，ネットワーク分子を転位または転置することなしには，反発性の硫酸コンドロイチン鎖で充填された密な高分子ネットワークを大量の水の流れに適応するよう十分に通り抜けることができない。したがって，個々の水分子はネットワーク中で拡散しうるが，大量の液体相がネットワークを通って流れることは実質的に抑えられており，ネットワーク分子の転置に対する耐性のため，はるかに遅い速度で流れる。水分子は圧力勾配に逆らって容易に流れることができないため，衝撃または摩擦負荷からのエネルギーは液相に伝達されてここで吸収され，液相は水がネットワークコンフォメーションに適応して圧力勾配が減退するのに十分に転置されることができるまで，液体の水を圧縮することに寄与する。全体的な結果は，有害である可能性のある負荷を軟骨が吸収し，このことによりこれを骨からそらすことである。

この優雅なメカニズムにより，正常な軟骨は，高分子ネットワーク中に拘束されている液相に大部分の負荷力を伝達することにより，大きな負荷を吸収することができる。これまでこの組み合わせは，従来技術の人工または合成手段によっては適切に複製されていない。したがって，関節炎等の軟骨変性性疾患については，アグリカン分子がそのヒアルロナン鎖から分離され，消化されるかまたは軟骨凝集体から運び出されるような，適切な治療法は存在しない。

変形性関節症および慢性関節リウマチは，それぞれ２０７０万人および２１０万人のアメリカ人に影響していると見積もられる。変形性関節症だけでも１年間におよそ７００万人が医師を訪れている。重症の身体障害関節炎に対しては，現在の治療は総関節置換を含み，米国だけで平均で１年間に１６８，０００件の総股置換および２６７，０００件の総膝置換が行われている。関節軟骨の欠陥は，軟骨細胞が軟骨を修復する能力が限定されているため，複雑な治療問題を示す。これまでの治療戦略は，培養で増殖させた自己軟骨細胞の使用，または走化性または有糸分裂の促進剤によるインビボでの間葉性幹細胞のリクルートに焦点をあててきた。これらの戦略の意図は，正常な健康な関節軟骨表面を再合成するために，軟骨細胞集団を増加および／または活性化させることである。これらの戦略に伴う１つの主要な困難性は，これらの薬剤を欠陥の部分に維持することができないことである。ヒアルロナンは，その独特の特性，例えば，優れた生体適合性，分解性，およびレオロジー特性および物理化学的特性のため，軟骨細胞または生物学的に活性な薬剤の局所デリバリー用の生体材料の開発の候補として提唱されてきた。しかし，組織培養ヒアルロナンマトリクス中に懸濁させた軟骨細胞が，正常な健康な関節軟骨に匹敵する機械的特性を有する新たな軟骨マトリクスを合成することができるか否かは不明である。これは，ヒアルロナンから作成された慣用の生物材料が，細胞の生存性の維持と適合しない化学により形成されるためである。マトリクス形成の後にマトリクス中に軟骨細胞を導入しなければならないが，その結果は様々であり，通常はあまりよくない。

したがって，当該技術分野においては，効果的な様式で骨から負荷力を有効にそらすことができる人工または合成のマトリクスが求められている。好ましくは，そのようなマトリクスをインシトゥーまたはインビボで提供して，整形外科手術の間に関節軟骨を修復または置換することができる。最も好ましくは，人工または合成のマトリクスを液体または複数の液体としてインシトゥーまたはインビボで標的部位に提供して，その場で患者の現存する軟骨組織および／または身体組織と実質的に継ぎ目のない一体化を構築することができる。

発明の概要
以下の構造：

［式中，Ｒ₁およびＲ₂は，それぞれ，ポリカルボキシレート，ポリアミン，ポリヒドロキシフェニル分子，およびこれらのコポリマーからなる群より選択される構造であるかこの構造を含み，Ｒ₁およびＲ₂は，同じ構造であっても異なる構造であってもよい］
を含む高分子ネットワークが提供される。

また，複数のチラミン置換ヒアルロナン分子を有し，少なくとも２つの隣接するヒアルロナン分子はジチラミン結合により連結されていることを特徴とする高分子ネットワークが提供される。

また，ヒアルロナン分子間のジチラミン結合により架橋されたチラミン置換ヒアルロナン分子の高分子ネットワークを含むハイドロゲルが提供される。

また，高分子ネットワークを製造する方法が提供され，この方法は，ヒドロキシフェニル置換ポリカルボキシレート，ヒドロキシフェニル置換ポリアミン，他のポリヒドロキシフェニル分子，およびこれらのコポリマーからなる群より選択される第１の高分子種を用意し，そしてそれぞれ第１の高分子種の隣接する基種に結合した２つのヒドロキシフェニル基の間に少なくとも１つのジヒドロキシフェニル結合を形成する，の各工程を含む。

また，ハイドロゲルを製造する方法が提供され，この方法は，
ａ）ペルオキシダーゼ酵素または過酸化物のいずれかを有するが両方は有しない第１の溶液，ならびにヒドロキシフェニル置換ポリカルボキシレート，ヒドロキシフェニル置換ポリアミン，他のポリヒドロキシフェニル分子，およびこれらのコポリマーからなる群より選択される高分子種を用意し；
ｂ）ペルオキシダーゼ酵素または過酸化物のうち第１の溶液中で提供されていない方を有する第２の溶液を用意し；そして
ｃ）第１の溶液および第２の溶液を混合して，ジヒドロキシフェニル架橋を開始させて，ハイドロゲルを形成する，
の各工程を含む。

図面の簡単な説明
図１は，正常な健康なヒト軟骨の概略図である。

図２は，本発明にしたがう，ジヒドロキシフェニルで架橋された高分子ネットワークの概略図である。

図３は，ヒアルロナン分子の構造式である。

図４は，本発明にしたがうＴ−ＨＡハイドロゲルと，関節軟骨プラグについての公表されている結果との，制限圧縮試験における機械的試験の比較の結果を示すグラフである（平衡応力対適用された歪）（実施例３）。

図５は，Ｔ−ＨＡハイドロゲル（１．７％および４．７％Ｔ−ＨＡ）中に包埋された軟骨細胞のグルコース利用を，組織培養プラスチック（対照）上で培養したものと比較した比較データを示すグラフである。

発明の好ましい態様の詳細な説明
本明細書において用いる場合，ポリカルボキシレートとの用語は，少なくとも２つの官能基または単位の鎖長を有する分子，構造または種を意味し，ここで，鎖の少なくとも２つのそのような基または単位は，本明細書に記載されるように求核置換反応に立体的にアクセス可能であるカルボン酸基であるかまたはこれを含む。また，本明細書において用いる場合，ポリアミンとの用語は，少なくとも２つの官能基またはユニットの鎖長を有する分子，構造または種を意味し，ここで，鎖の少なくとも２つのそのような基またはユニットは，求核置換反応に利用可能な第１アミン基であるかまたはこれを含む。また，本明細書において用いる場合，ポリヒドロキシフェニル分子とは，少なくとも２つの官能基またはユニットの鎖長を有する分子を意味し，ここで，鎖の少なくとも２つのそのような基またはユニットは，別のヒドロキシフェニル基とＣ−Ｃ結合により連結することができるヒドロキシフェニル基であるかまたはこれを含む。また，本明細書において用いる場合，ハイドロゲルとは，組織置換または工学用途において，例えば，人工関節として，手術機械をコーティングして組織の刺激を防止する材料として，または人工腎臓等で用いるための半透膜を提供するために用いられるかまたは有用である高分子ネットワークを含むよう製造される材料である。

本発明は，隣接する長鎖高分子に結合したヒドロキシフェニル基を連結させ，その結果，高分子を効率的に架橋させて大きなネットワークを得ることにより形成される高分子ネットワークの新規な構造を含む。ネットワークの基本的な架橋構造は以下に示される：

［式中，Ｒ₁およびＲ₂はそれぞれ長鎖高分子である］。Ｒ₁およびＲ₂は同じ分子であってもよく，異なる分子であってもよいが，適当なネットワークを提供するためには，本発明にしたがうネットワーク中のジヒドロキシフェニル結合の少なくとも一部については，Ｒ₁およびＲ₂が異なる分子であることが理解されるであろう。Ｒ₁およびＲ₂は同じ種の分子であることが好ましいが，必要ではない。

隣接する高分子間に複数のこれらのジヒドロキシフェニル結合を提供することにより，図２にその概略図が示されるように，ジヒドロキシフェニル架橋高分子のネットワークが得られる。図面においては，高分子は，その長さ方向に沿って少なくとも２つのヒドロキシフェニル基が結合している円柱状の鎖により図解的に示されている。すべてのヒドロキシフェニル基が別のヒドロキシフェニル基と連結していなければならないわけではないことに注意すべきである。

簡単には，ここに開示される発明は，カルボジイミドにより媒介される反応により，ヒドロキシフェニル含有化合物（例えば，限定されないが，チラミン）を，その第１アミン（またはカルボキシル）基を介して，種々の高分子足場材料，例えば，限定されないが，ヒアルロナンまたは硫酸コンドロイチン（例えば，アグリカンの形態で）のカルボキシル（または第１アミン）基と共有結合させることを含む。ヒドロキシフェニルで置換された高分子の足場を単離し精製した後，非常に希薄な過酸化水素の存在下で西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）によりヒドロキシフェニル残基を選択的に架橋して，ハイドロゲルを形成する。

高分子ネットワークを提供する第１の工程は，ヒドロキシフェニル基が周期的に結合した長鎖高分子を製造または用意することである。１つの態様においては，高分子は，多数のまたは周期的なヒドロキシフェニル基を既に有するポリヒドロキシフェニル分子，例えばポリフェノールである。適当なポリフェノールには，ポリアミノ酸（例えば，ポリチロシン），エピガロカテキン（ＥＧＣ），および緑茶から単離される没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ），およびあまり好ましくないが他のポリフェノールが含まれる。

さらに別の態様においては，化学反応により，高分子にヒドロキシフェニル基をその長さに沿って周期的にまたはランダムに付加することができる。高分子にヒドロキシフェニル基を付加する好ましい方法は，カルボジイミドにより媒介される置換反応経路を利用して，ヒドロキシフェニル基を有する第１アミンと高分子に結合したカルボン酸基との間にアミド結合を形成させることである。この方法においては，長鎖高分子は，好ましくはその長さに沿って周期的なカルボン酸基を有するポリカルボキシレート分子である。ヒドロキシフェニル基は，カルボジイミド経路を介して長鎖高分子上のカルボン酸基のカルボキシル炭素原子に結合させることができる第１アミン基を有するより小さい分子の一部として与えられる。反応は以下のように進行する：

式中，
構造Ａはカルボジイミドであり；
構造Ｂはポリカルボキシレートであり（ただし１つのＣＯ₂Ｈ基のみが示されている）；
構造Ｃは反応Ａの生成物である，活性化Ｏ−アシルイソウレアであり；
構造Ｄは，ヒドロキシフェニル基を有する第１アミンであり；
構造Ｅは，ヒドロキシフェニル置換ポリカルボキシレートであり；および
構造Ｆは，アシルウレア副生成物であり；
ここで，それぞれのＲは，独立して，直鎖または分枝鎖のアルカンまたはアシル基，または上述の構造Ｅで示される，ＮＨ₂とＣＯ₂Ｈ基との間のアミド結合を与えるカルボジイミド反応経路を妨害しない他の任意の構造であるように選択することができ，互いに同じでも異なっていてもよい。

上で図解した経路においては，反応Ａは，カルボキシル基をカルボジイミドで活性化して活性化Ｏ−アシルイソウレア中間体を与える反応を示す。この中間体の電気的に陽性の炭素原子は，ヒドロキシフェニル基が結合した隣接する第１アミン分子の窒素原子上の孤立電子対による求核攻撃を受けることができる。この求核置換反応（反応Ｂ）の生成物はヒドロキシフェニル置換ポリカルボキシレートおよびアシルウレア副生成物であり，これを透析により除いて，実質的に純粋なヒドロキシフェニル置換ポリカルボキシレート生成物を得ることができる。

上述のカルボジイミド反応経路の化学においてある種の副反応が可能であり，当業者はこれを考慮しなければならない。第１に，カルボジイミドは，所望のＯ−アシルイソウレア（反応Ａ）を形成するために必要なポリカルボキシレート分子のカルボキシレート酸素原子以外の求核基と反応することができる。そのような求核基には，上で図解した構造Ｄのアミンおよび／またはヒドロキシフェニル基が含まれる。特に，反応Ａについては，カルボジイミドおよびヒドロキシフェニル基を有する第１アミン（構造ＡおよびＤ）の有効濃度を低下させ，ポリカルボキシレート（構造Ｂ）上に望ましくない負荷物を形成することにつながる可能性のある３つの可能な副反応がある：

カルボジイミドとのアミン反応（反応Ｃ）の生成物は，Ｏ−アシルイソウレアとの反応に利用可能なチラミンの量を有効に低下させる遊離アミン基を有しないであろう。この反応はまた，所望のＯ−アシルイソウレアを形成するために利用可能なカルボジイミドの量を低下させる。ヒドロキシフェニル反応（反応Ｄ）の生成物はＵＶ吸収剤ではなく，最終的なヒドロキシフェニル置換ポリカルボキシレート生成物中でＵＶ分光分析により検出することがより困難である（以下に説明する）。しかし，これらの生成物はなお遊離のアミン基を含むため，反応Ｂによりポリカルボキシレート分子とアミド結合を形成することができる。このことから，２つの非生産的なヒアルロナン置換構造が生じ，これらはいずれも本発明にしたがう架橋ネットワークの製造の第２工程においてペルオキシダーゼ架橋反応に関与することができない（以下に説明する）。フリーラジカルを生成するのに必要な引き抜き可能なフェノール性ヒドロキシル水素原子がないためである（これも以下に説明する）。最後に，カルボジイミドは水と非生産的に反応して（反応Ｅ），反応Ｂの副生成物として上に示したものと同じアシルウレアを生成するが，所望の生成物である構造Ｅは生じない。

反応Ａにおいて一旦所望のＯ−アシルイソウレア生成物が形成されると，再び，ある種の追加の副反応の可能性がある：

Ｏ−アシルイソウレア（構造Ｃ）は，反応Ｆに示されるように加水分解して，元の修飾されていないポリカルボキシレート（構造Ｂ）およびカルボジイミドのアシルウレア（構造Ｆ）を放出する。これは反応Ｅと同様の非生産的な反応であり，カルボジイミドの有効濃度を低下させる。Ｏ−アシルイソウレアはまた，分子内再配置（反応Ｇ）を起こして，２つの非反応性Ｎ−アシルウレアを生成する。これらの構造は，カルボキシレート分子上に非生産的な付加物を形成し，これは本発明にしたがうネットワークを製造するためのペルオキシダーゼ触媒架橋反応に寄与しない（上述した工程２）。Ｏ−アシルイソウレアはまた，同じまたは別のポリカルボキシレート分子上の第２のカルボキシル基と反応して，酸無水物を形成しうる（反応Ｈ）。次にこの分子は構造Ｄと反応して，所望のアミドを形成し，第２のカルボキシル基を再生することができる。すなわち，Ｏ−アシルイソウレアについては２つの可能な副反応があり，これらはカルボジイミドの有効濃度を低下させることができ（反応ＦおよびＧ），およびポリカルボキシレート分子上に望ましくない付加物を形成することにつながる可能性がある。

これらの副反応の負の効果は，過度の実験をすることなく慣用の手法により解決可能である。

高分子（構造Ｂ）がポリカルボキシレートである上述した経路とは別に，高分子はその長さ方向に沿って多数のまたは周期的なアミン基を有するポリアミンであってもよい。この場合には，ヒドロキシフェニル基をより小さいカルボン酸分子の一部として提供する。適当なポリアミンとしては，ポリヘキソースアミン，例えば，キトサン（ポリグルコサミン）；ポリアミノ酸，例えばポリリジン；ポリデオキシリボヌクレオチド，例えば，ポリ（ｄＡ）（ポリデオキシアデニル酸），ポリ（ｄＣ）（ポリデオキシシチジル酸），およびポリ（ｄＧ）（ポリデオキシグアニル酸）；およびポリリボヌクレオチド，例えば，ポリ（Ａ）（ポリアデニル酸），ポリ（Ｃ）（ポリシチジル酸），およびポリ（Ｇ）（ポリグアニル酸）が挙げられる。カルボジイミドにより媒介される反応経路は，上で説明したものと全く同じく進行して，アミン基とカルボン酸基との間にアミド結合が形成されるが，ただし，当業者には理解されるように，得られる生成物は，ポリカルボキシレートではなく，ヒドロキシフェニル置換ポリアミンである。その長さに沿って配置されたヒドロキシフェニル基を有するか，または，本明細書に記載される置換反応によりその上にヒドロキシフェニル基を提供することができる他のペプチドおよび／または蛋白質も，本発明において高分子として用いることができる。例えば，既に本明細書に開示されているペプチドに加えて，ポリアルギニンを高分子として用いることができる。

ポリカルボキシレート分子上で置換する場合には，本発明において用いるのに適当なヒドロキシフェニル含有化合物としては，多数のまたは周期的なＣＯ₂Ｈ基を有する足場材料を修飾するために用いることができる遊離第１アミンを有するもの，例えば，チロシン（２−アミノ−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸）およびチラミン（チロサミンまたは２−（４−ヒドロキシフェニル）エチルアミン）が挙げられる。ポリアミン上で置換する場合には，適当なヒドロキシフェニル含有化合物としては，多数のまたは周期的な１級ＮＨ₂基を有する足場材料を修飾するために用いることができる遊離ＣＯ₂Ｈ基を有するもの，例えば，チロシン，３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸および４−ヒドロキシフェニル酢酸が挙げられる。

本発明にしたがう架橋された高分子ネットワークを製造する第２工程は，得られた高分子，すなわち１またはそれ以上のヒドロキシフェニル基が結合している高分子をジヒドロキシフェニル結合構造を介して連結させることである。この工程においては，異なる高分子に結合しているヒドロキシフェニル基を，ペルオキシダーゼの存在下で過酸化物試薬を用いて，以下に示される反応メカニズムにより連結させる：

（同じ分子上の異なるヒドロキシフェニル基の間にも，ある程度のジヒドロキシフェニル結合が生じうることに注意すべきである）。ペルオキシダーゼは，希薄な過酸化物（好ましくはＨ₂Ｏ₂）の存在下で，ヒドロキシフェニル含有化合物（例えばチラミン）からフェノール性ヒドロキシル水素原子を引き抜いて，１つの非共有電子を有するフェノール性ヒドロキシル酸素，すなわち非常に反応性の高いフリーラジカルを離脱することができる。フリーラジカルは，オルト位置の２つの同等の炭素の一方に異性化し，次に２つのそのような構造が二量体して，構造を効果的に架橋する共有結合を形成し，これはエノール化の後，ジヒドロキシフェニル二量体を生成する（ジヒドロキシフェニル結合，例えば以下に説明されるジチラミン結合）。

上では，明確化のため１つのジヒドロキシフェニル結合反応のみが示されているが，ヒドロキシフェニル基が結合している高分子をこの反応条件（過酸化物およびペルオキシダーゼ）に供したときには，いくつかのまたは多数のそのような結合が生成することが理解されるであろう。上述のメカニズムでは過酸化水素が示されているが，他の適当な過酸化物を用いることができる。また，ペルオキシダーゼは，好ましくは西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である。あるいは，ヒドロキシフェニル基を含む足場材料を架橋するために，フリーラジカルを生成しうる他の任意の適当な酵素（または他の試薬）を，好ましくは以下に記載される通常の代謝条件下で，用いることができる。

ジヒドロキシフェニル架橋高分子ネットワークは，架橋反応が酵素（ペルオキシダーゼ）により推進されるため，慣用の軟骨または他の組織の補充または置換の方法および製品より優れている。これは，架橋反応が通常のインビボまたは代謝条件の温度，例えば３５−３９℃（例えば約３７℃），ｐＨ６−７の範囲（例えば約６．５），試薬（架橋反応に必要な試薬は過酸化水素等の過酸化物のみである）で行われることを意味する。すなわち，架橋反応をインビボで行って，架橋されたハイドロゲルを手術の現場，例えば，整形外科の手術の現場で提供して，ハイドロゲルと天然の組織，例えば骨および軟骨の組織との間に継ぎ目のない最大限の一体化を促進することができる。ヒドロキシフェニル置換高分子足場は，架橋の前に現存する軟骨マトリクス中に急速に浸透し，他のヒドロキシフェニル置換高分子足場材料とのみならず，現存する軟骨マトリクス中に存在する蛋白質のチロシン残基とも架橋しうるため，新たなハイドロゲル足場と天然の軟骨マトリクスとの一体化はただちに起こるであろう。このことにより，予め形成されたマトリクスのプラグにおいて見いだされる，天然の軟骨組織とよく一体化しないという典型的な問題を排除することができる。関節表面上で直接ハイドロゲルを架橋することができることは，その化学が毒性を有するかまたは患者の内部でこれを形成することができないようなハイドロゲルの場合に必要とされる，予め成形されたプラグを適合させるために欠陥を外科的に広げるという必要性を排除する。関節炎の結果として生ずるほとんどの軟骨の障害は，関節表面の様々な菲薄化として存在し，輪郭をもつ形状の穴として存在するのではないことに注意すべきである。

架橋反応は過酸化物とペルオキシダーゼ（好ましくは西洋ワサビペルオキシダーゼ）との両方を必要とするため，手術部位に適用するのに便利なように，これらの成分の１つを除き全てを含む溶液を調製することができる。例えば，チラミン（または他のヒドロキシフェニル含有種）で置換されたポリカルボキシレート（例えば，チラミン置換ヒアルロナン等）およびペルオキシダーゼを含む溶液を調製し，過酸化物を含む第２の溶液を調製することができる。あるいは，過酸化物およびペルオキシダーゼを第１の溶液および第２の溶液で入れ替えてもよく，ここで重要なことは，架橋反応を行うまで過酸化物とペルオキシダーゼとを別々にしておくことである（すなわち別々の溶液中で）。次に，第１の溶液を適用し（例えば，インビボの手術現場に），第２の溶液を第１の溶液にインビボで適用するかまたはスプレーして，チラミン残基のインシトゥー架橋を引き起こす。架橋反応はインビボで生ずる。本発明の開示から明らかな他の組み合わせも当業者の通常の能力の範囲内であろう。

さらに，架橋反応は通常の代謝条件下で生ずるため，追加の生きた細胞，例えば軟骨細胞，先祖細胞，幹細胞等を，架橋されていないヒドロキシフェニル置換ポリカルボキシレートまたはポリアミン（またはポリフェノール）を含む培地，すなわち上の段落に記載される第１の溶液または第２の溶液に直接入れることができ，ここで，細胞を含有する培地を高分子とともにインビボの部位に適用し，次にペルオキシダーゼおよび過酸化物を加えることにより分子を架橋させることができる。その結果得られるものは，その中に所望の細胞が分散している架橋高分子ネットワークである。そのような細胞含有ネットワークは，慣用の組織置換マトリクスではこれらを製造する温度およびｐＨの条件が過酷であるために不可能である。さらに，以下の実施例５に記載されるように，上述のようにして本発明のマトリクス中に入れた細胞は，チラミン置換ヒアルロナンを架橋して本発明にしたがうネットワークを製造した後でも生存可能なままであることが示された（これも以下に説明する）。

合成軟骨ならびに他の合成もしくは人工組織を製造するのに特に適した好ましい態様においては，本発明にしたがうネットワークを製造するために用いられる高分子はヒアルロナンまたはヒアルロン酸（ＨＡ）であり，ヒドロキシフェニル基はチラミンの形で供給される。

ＨＡは，図３に示されるように，β１，３グリコシド結合により連結したグルクロン酸残基（ｇｌｃＡ）とＮ−アセチルグルコサミン残基（ｇｌｃＮＡｃ）との反復する対から構成される。各ヒアルロナン鎖について，この単純な二糖が１０，０００回も反復され，各反復二糖はβ１，４グリコシド結合により連結されている。各ｇｌｃＡ残基はグルコース環の５位の炭素原子に結合したカルボン酸基（ＣＯ₂Ｈ）を有する。チラミンはベンゼン環のＯＨ基のパラ位に結合したエチルアミン基を有するフェノール性分子である。これらの分子種を用いると，ＨＡ上のＣＯ₂Ｈ基の単結合酸素原子へのチラミン置換のメカニズムは，上述のカルボジイミド媒介性反応メカニズムにより進行し，これは以下に説明する。好ましいカルボジイミド種は，以下に示される１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）である：

［式中，
構造ＡはＥＤＣであり；
構造Ｂはヒアルロナン（ただし１つのＣＯ₂Ｈ基しか示していない）であり；
構造Ｃは反応Ａの生成物である１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）イソウレアであり；
構造Ｄはチラミンであり；
構造Ｅはチラミン置換ヒアルロナンであり；および
構造Ｆは１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）ウレア（ＥＤＵ）である］。

上述の経路において，ヒアルロナン分子のカルボキシル基の負に荷電した酸素原子は，求核反応メカニズムにより，カルボジイミド分子（ＥＤＣ）上の電子不足ジイミド炭素原子を攻撃して，活性化されたＯ−アシルイソウレアを形成する（反応Ａ）。その結果，ＨＡカルボキシレート基の炭素原子は十分に電子不足となり，チラミン分子のアミン基上の非共有電子対による求核攻撃を受けやすくなる（反応Ｂ）。反応Ａは，好ましくは，反応Ａの間に活性エステルを形成し，したがって，反応を実質的に中性のｐＨ（例えばｐＨ＝６．５）で行うことができる適当な触媒により触媒される。適当な触媒としては，より高いｐＨにおけるカルボジイミドの非生産的な加水分解を最小にするために，Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）が挙げられ，より劣るが好ましくは１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）またはＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＮＨＳＳ），より劣るが好ましくは活性エステルの形成によりカルボジイミド反応を促進するのに有効な別の適当な触媒またはこれらの組み合わせが挙げられる。より劣るが好ましくはＥＤＣ以外の他のカルボジイミド，例えば，１−シクロへキシル−３−［２−（４−メチルモルホリノ）エチル］カルボジイミド（ＣＭＣ），およびジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を用いることができる。

上述の反応Ａの結果得られるものはＯ−アシルイソウレアで置換されたヒアルロナンである。本質的に，ＥＤＣ分子はＨＡ分子からのｇｌｃＡ残基のカルボン酸基上に一時的に置換され，カルボン酸基の炭素原子をわずかに正に荷電させる。次に，チラミン分子の末端アミン基からの電子対が，上の節で説明したように求核置換反応により炭素原子上に置換される（反応Ｂ）。反応Ｂの結果得られるものはチラミン置換ＨＡ分子（Ｔ−ＨＡ）および副生成物であるアシルウレアである。ここでは，簡潔さと明瞭さのために１つの置換が示されているが，反応ＡおよびＢによりＨＡ分子の周期的なｇｌｃＡ残基上で複数のチラミン置換が生ずることが理解されるであろう。

Ｔ−ＨＡを形成した後，上で説明し図解したように，複数のＴ−ＨＡ分子を過酸化物およびペルオキシダーゼ酵素により反応させて，Ｔ−ＨＡ分子を架橋させる。すなわち，ＨＡ分子に結合しているチラミン残基上のヒドロキシフェニル基を，ペルオキシダーゼの存在下で過酸化物（好ましくはＨ₂Ｏ₂）と反応させて，フェノール性水素原子を除去して，フェノール性酸素原子に附随した不対電子を有するチラミンフリーラジカルを得る。このフリーラジカル種は異性体化または共鳴して，フェノール環上のオルト炭素原子に附随している不対電子との共鳴構造（またはフリーラジカル異性体）が得られる。この位置においては，不対電子は別のチラミンフリーラジカル上の同様な状況の不対電子と速やかに反応して，これらの間に共有結合が形成される。その結果，同じまたは異なるＨＡ分子の異なるｇｌｃＡｓに結合している別々のチラミンフリーラジカル残基の間にフリーラジカル推進性の二量体化反応が生ずる。この二量体化された種は，さらにエノール化して，現在結合しているチラミン残基をもとに戻し，ジチラミン結合構造が生成する。本明細書に記載されているような複数の反応が隣接するチラミン残基の間に生じて，以下の架橋構造：

を有する本発明にしたがうＴ−ＨＡ分子の架橋された高分子ネットワークが得られることが理解されるであろう。

架橋されたＴ−ＨＡネットワークは，慣用の方法で，例えば結合蛋白質を介してアグリカン分子とともに提供して，ＨＡ鎖に結合したアグリカン分子を有する架橋Ｔ−ＨＡネットワークを得ることができる。すなわち，本発明にしたがって，正常な軟骨凝集体に見いだされるものと類似したネットワークを提供し，ジチラミン結合がネットワークを一緒に保持して，このことにより正常な軟骨におけるコラーゲン原線維ではなく，含有されるアグリカンネットワークを拘束することができる。

本発明から，本明細書に記載される架橋されたネットワークを生成するための高分子として他のグルコサミノグリカン，多糖類およびポリカルボン酸を用いることができることが理解されるであろう。例えば，ＨＡの他に適当なグルコサミノグリカンとしては，コンドロイチン，硫酸コンドロイチン，デルマタン硫酸，ヘパラン硫酸およびヘパリンが挙げられる。他の適当なポリカルボキシレートとしては，ベルシカン，アグリカン等のプロテオグリカン，およびアグリカン，ヒアルロナンおよび連結蛋白質から構成される軟骨凝集体；ポリウロン酸，例えば，ポリペクチン酸（ポリガラクツロン酸），ポリグルクロン酸，ペクチン（ポリガラクツロン酸メチルエステル），コロミン酸（ポリ［２，８−（Ｎ−アセチルノイラミン酸）］），およびアルギン酸塩（ポリ［アルギン酸−ｃｏ−グルクロン酸］）；および上述のポリカルボキシレートの定義に合致するアミノ酸（少なくとも２アミノ酸ユニットを有する），例えば，ポリアスパラギン酸およびポリグルタミン酸が挙げられる。これらはすべて，当業者であれば，本明細書に開示されるカルボジイミド媒介性反応経路を用いて過度の実験なしに１または複数のヒドロキシフェニル基で置換することができる。

上述したように，本明細書に記載される酵素触媒化学を用いて架橋することができる２またはそれ以上のヒドロキシフェニル基を既に有する天然のポリフェノール化合物を，化学反応により付加されたヒドロキシフェニル基を有していなければならない上述のポリカルボキシレートおよびポリアミンの代わりに用いることができることも理解されるであろう。

別の好ましい態様においては，正常な軟骨を模倣または置き換えるための，チラミンで架橋された硫酸コンドロイチン分子（単独でまたはアグリカンの一部として与えられる）のネットワークが提供される。硫酸コンドロイチンは以下の点を除いてヒアルロナンと同一である：１）反復二糖構造はｇｌｃＮＡｃではなくＮ−アセチルガラクトサミン（ｇａｌＮＡｃ）を含み，これは４位の炭素（図３で丸で囲まれる）に結合したヒドロキシル基の位置のみが異なる；２）ｇａｌＮＡｃ残基の４位および／または６位および／またはｇｌｃＡ残基の２位のヒドロキシル基上のＯ−硫酸化の存在（図３）；および３）硫酸コンドロイチン鎖のサイズはヒアルロナンより小さく，２０−１００個の反復二糖類単位を含む。（アグリカン分子は，各鎖の還元末端に位置する連結糖を介してコア蛋白質に結合している多数の（およそ１００個の）硫酸コンドロイチン鎖から構成される）。この態様においては，隣接する（架橋した）硫酸コンドロイチン分子の負に荷電したＳＯ₄ ^2-基が，ネットワーク凝集体の圧縮耐性に寄与する主要な反発力を提供し，一方，チラミン架橋は硫酸コンドロイチンネットワークが破壊または崩壊することを抑える。その結果得られるものは，正常な軟骨と同様に非転置性である（同時に水不浸透性である）が，正常な軟骨に見いだされる細胞外コラーゲン原線維マトリクスまたはＨＡ鎖を有しない硫酸コンドロイチンネットワークである。実際，硫酸コンドロイチン分子を直接架橋させることにより（上述した態様におけるようなそのコアＨＡ分子ではなく），隣接する硫酸コンドロイチン分子間の反発力を強くすることができ，正常な軟骨と比較してさらに強い液体流動耐性を得ることができる。このことにより，間質の液相が流動からさらに拘束されるため，正常な軟骨より強い負荷力吸収および放散能力を得ることができる。硫酸コンドロイチン分子が直接架橋しているこの態様においては，ある種の軟骨変形条件，例えば，正常な軟骨において硫酸コンドロイチン分子が通常結合しているコア蛋白質がＨＡ結合ドメイン（Ｇ１）と第２の球状のドメイン（Ｇ２）との間で切断され，したがって硫酸コンドロイチンに富む領域が軟骨凝集体から拡散して外に出ることが可能となる条件を完全に回避することができる。この態様においては，硫酸コンドロイチン分子はアグリカンまたは他のプロテオグリカン分子と結合せずに互いに直接架橋しているため，これらは正常な軟骨におけるように切断されるかまたは外に運ばれることができない。

いずれにしても，チラミン架橋Ｔ−ＨＡネットワーク（結合したアグリカン分子を有するＨＡ主鎖を有し，この分子は硫酸コンドロイチン鎖を含む）はＨＡの利用可能性が高いため好ましい。これは，移植されたチラミン架橋Ｔ−ＨＡネットワーク上に軟骨を生成する身体の正常な代謝経路を直接構築することができるため，本発明を用いる軟骨置換または修復の場合に有益であろう。これは以下に説明される。

上述したジチラミン架橋Ｔ−ＨＡネットワークは，人工もしくは合成の軟骨を製造するのに特に有用である。軟骨の移植は，外傷後のまたは先天性異常において頭頚部を再構成して軟骨または骨の欠陥を修復する方法においてしばしば用いられる。耳に特異的な用途には，耳形成術および耳介再構成が含まれ，これらは，外傷，新生物（すなわち，扁平上皮癌，基底細胞癌，および黒色腫），および先天性欠陥，例えば小耳症による軟骨の欠陥を修復するためにしばしば行われる。鼻に特異的な用途には，鼻および鼻中隔の美容外科および再構成方法が含まれる。背側こぶ増大，先端，シールドおよびスプレッダー移植はしばしば美容鼻形成術において用いられる。外傷，新生物，自己免疫疾患，例えば，ヴェーゲナー肉芽腫症の後，または先天性欠陥の鼻再構成においては，修復のための軟骨が必要である。中隔穿孔は管理が困難であり，しばしば治療に失敗する。これらの用途には軟骨移植が理想的であるが，自己移植またはドナーの軟骨はしばしば利用できない。咽喉に特異的な用途には，喉頭気管再構成が含まれ，これは小児では通常肋軟骨を回収することを必要とするが，これは病原性でないわけではない。耳介軟骨および鼻中隔軟骨はしばしばこの目的には不適当である。したがって，本明細書に記載される架橋ＨＡネットワークから加工された軟骨は，これらの問題の管理に大きな影響を有しうる。喉頭気管の再構成は，通常は声門下または気管の狭窄による気道狭化について行われる。病因は，外傷（すなわち，気管チューブ挿入外傷または気管切開術）または突発性でありうる。

他の可能性としては，多くの脳顔面頭蓋用途に加えて，おとがいおよび頬の拡大，および低い眼瞼の外反修復における使用が含まれる。これらの用途は関節軟骨の厳密な機械的特性を有する軟骨を必要としないことに注意すべきである。細胞集団または生物学的に活性な薬剤を含ませることも望ましい。

本発明にしたがう架橋ネットワークが実質的な有用性を有するであろう１つの特別の用途は，人工腎臓の製造におけるものである。腎臓は２つのメカニズムにより血液を濾過する：一方はサイズ排除であり，他方は電荷排除によるものである。ＭＥＭＳデバイスは，人工腎臓デバイスにおいて用いるために設計されており，これは腎臓に特徴的なサイズ排除のみを有効に模倣することができる，精密に規定されたミクロ多孔を含む。健康な腎臓においては，電荷排除に関連する濾過は，基底膜に存在するヘパラン硫酸プロテオグリカンの結果であり，これは，他の腎臓関連機能に重要な２つの異なるタイプの細胞を分離する。ＭＥＭＳ工学による人工腎臓においてこの荷電バリアを模倣するためには，ハイドロゲルを，本明細書に記載されるジヒドロキシフェニル（ジチラミン）結合により架橋されているヘパラン硫酸またはヘパリンから構成されるように製造し，これをＭＥＭＳデバイスの孔の中に入れることができる。次に，このヘパリン／ヘパラン硫酸ハイドロゲルを，本明細書に記載される２つのヒアルロナン誘導ハイドロゲル（例えば，上述したＴ−ＨＡ）の間にサンドイッチし，正常に機能している腎臓に通常見いだされるそれぞれの細胞タイプの１つを含ませることができる。中心のヘパリン／ヘパラン硫酸ハイドロゲルはデバイスの荷電排除特性を与える。外側の２つのヒアルロナンハイドロゲル層は，免疫系および通常の細胞および分子の残骸による付着物からの保護を与える。濾過バリアの反対側に２つの細胞タイプを含めることにより，正常な生理学的な方向で細胞成分を提供することができる。

別の有望な用途においては，本発明にしたがうハイドロゲルは，人工膵臓の開発に応用することができる。人工膵臓の開発における問題点は，検出器電極のインビボでの付着物のため，ＭＥＭＳ工学によるグルコースセンサーの半減期が短いことである。これらの検出器の表面を本明細書に記載されるヒアルロナンハイドロゲル（例えばＴ−ＨＡ）でコーティングすると，センサーがこれを検出するよう設計されている低分子量のグルコース分子の拡散を許容し，一方，免疫系および通常の細胞および分子の残骸による付着物からの保護を与えることができる。

まとめると，上の記載から，ハイドロゲルを形成するための足場材料として有用な高分子には，限定されないが，ポリカルボキシレート（遊離カルボキシレート基を含む），ポリアミン（遊離第１アミン基を含む），ポリフェノール（遊離ヒドロキシフェニル基を含む）およびこれらのコポリマーが含まれることが明らかであろう。これらの例は上に記載されている。ポリフェノールを用いる場合には，ポリフェノールは多数のまたは周期的なヒドロキシフェニル基をすでに含むため，上述の本発明にしたがうネットワークを製造する第１工程を省略することができる。それ以外の場合には，ポリカルボキシレートおよびポリアミンの両方とも，好ましくは上述したカルボジイミド反応経路により，その長さ方向に沿って付加または置換されたヒドロキシフェニル基を有しなくてはならない。ネットワークを製造する第２工程は，架橋された構造を提供するために，隣接する高分子（ポリカルボキシレート，ポリアミンまたはポリフェノールのいずれか）に結合している２つのヒドロキシフェニル基の間で酵素により推進される二量体化反応を行うことである。この工程は，過酸化物試薬（好ましくは過酸化水素）を用いて，適当な酵素（好ましくはＨＲＰ）の存在下で，代謝条件の温度およびｐＨで行う。

好ましいジチラミン架橋Ｔ−ＨＡネットワークの場合には，第１工程において高分子ヒアルロナン（ＨＡ）上のカルボキシル基をチラミンで置換して，反応性ヒドロキシフェニル基をＨＡ分子中に導入する。このチラミン置換反応は，好ましくはカルボジイミド，１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）により媒介され，ＨＡ上のチラミン置換の程度は，反応混合物中で用いられるチラミン，ＥＤＣおよびＨＡのモル比および絶対濃度により制御する。次に，過剰な試薬，例えば，利用されなかったチラミンおよびＥＤＣを透析により除去することにより，高分子量のチラミン置換ＨＡ（Ｔ−ＨＡ）を単離し回収する。各Ｔ−ＨＡ調製物中のチラミン置換のパーセントは，以下を測定することにより容易に計算することができる：１）調製物中に存在するチラミンの濃度，これはチラミンの２７５ｎｍにおける独特のＵＶ吸収特性に基づいて分光光学的に定量する（以下の実施例２を参照）；および２）ＨＡ調製物中の総カルボキシル基の濃度，これは標準的なヘキスロン酸アッセイにより分光光学的に定量することができる。この手法により，わずか４−６％のチラミン置換パーセントを含むＴ−ＨＡ調製物を実験室で日常的に合成した。このレベルのチラミン置換では，ＨＡ分子のほとんど（好ましくは少なくとも６０，７０，８０，９０，または９５パーセント）は化学的に変更されないまま残り，したがって生物学的に機能性である。このプロセスの第２工程において用いられるＴ−ＨＡの濃度を単に変化させることにより，Ｔ−ＨＡのこの処方（すなわち４−６％チラミン置換）から，種々の物理学的特性を有する多様な生体材料を製造することができる。

架橋反応においては，隣接するＨＡ分子上の２つのチラミン付加物の間に共有結合を形成して単一のジチラミン架橋を生成させることを触媒する酵素（ペルオキシダーゼ）により推進される反応により，Ｔ−ＨＡの溶液を架橋させてハイドロゲルを形成する。これらのジチラミン架橋がＨＡ分子１つあたり数百個形成されるため，安定な３次元の足場もしくはハイドロゲルが形成される。ペルオキシダーゼ酵素の実際の基質は−ＨＡではなく過酸化物であるため，架橋反応を開始させるためには，非常に希薄な過酸化物（好ましくはＨ₂Ｏ₂）を加えることが必要である。ペルオキシダーゼ酵素の過酸化物に対する反応の生成物はフリーラジカルであり，これはチラミンのヒドロキシフェニル環により優先的に捕獲されて，その結果ジチラミン架橋が形成される。ジチラミンにより連結された構造は，青色蛍光を生じ（実施例２を参照），その特性をハイドロゲルのイメージングおよびハイドロゲル中の架橋の程度の定量の両方に用いる。架橋反応は酵素により推進されるため，ハイドロゲルは生理学的条件下で形成することができ，したがって，ハイドロゲルは含まれる細胞または生物学的に活性な薬剤の存在下で形成することができ，または細胞および組織の生存性を維持しながら生きている組織に直接隣接させて形成することができる。

得られるハイドロゲルは，任意に透明であってもよく，初期Ｔ−ＨＡ濃度に依存して広範な範囲の物理学的特性を有する。例えば，６．２５，１２．５，２５，５０および１００ｍｇ／ｍｌのＴ−ＨＡのＴ−ＨＡ溶液から形成されるハイドロゲルは，それぞれ，ゼリー，ゼラチン，パン生地，弾力性ゴム様の組成物（ゴムボールと類似），および関節と同様の材料の物理学的特性（剛性，レオロジーおよびテクスチャー）を有することが実験的に示されている（実施例３を参照）。これらの材料は，広範な範囲の臨床設定，例えば，整形外科的組織（すなわち，軟骨，骨，腱，半月，椎間円板等）および非整形外科的組織（腎臓，肝臓，膵臓等）の両方の組織工学，遺伝子および薬剤のデリバリー，非生物学的デバイスのインビボ移植用のコーティング（すなわち，グルコースセンサー，人工心臓等），創傷修復，バイオセンサー設計，および声帯再構築において潜在的な用途を有する。

本明細書に記載されるハイドロゲルの有利な特徴には以下のものが含まれる：１）特性決定と質の管理が容易である；２）現存する組織マトリクスと一体化することができる；３）新たに形成されるマトリクスに直接取り込まれることができる；４）細胞および生物活性因子を直接含むことができる；５）生体適合性を維持することができる；６）生体吸収を制御することができる；７）複雑な解剖学的形状に容易に成形することができる（以下の実施例６を参照）；および８）天然の組織，例えば関節軟骨の機械的特性を示すことができる。

例示のために提供される以下の実施例の１またはそれ以上に関連して，本発明のさらに別の観点が理解されるであろう。

実施例１：
実験に用いる量の，本発明にしたがうジチラミン架橋を有するチラミン置換ヒアルロナンハイドロゲルは，以下のようにして製造した。ＨＡを，ＨＡのカルボキシル基のモル濃度に対して１０倍モル過剰のチラミンを含む，２５０ｍＭ ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ），１５０ｍＭ ＮａＣｌ，７５ｍＭ ＮａＯＨ，ｐＨ６．５中に，ヘキスロン酸に基づいて１ｍｇ／ｍｌで溶解した。次に，ＨＡのカルボキシル基のモル濃度に対して１０倍モル過剰のＥＤＣを加えることにより，カルボキシル基のチラミン置換を開始する。ＥＤＣのモル量に対して１／１０のモル比のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を反応液に加えて，活性エステルの形成により，ＥＤＣにより触媒されるアミド化反応を助ける。反応は，室温で２４時間行い，その後，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，続いて超純水に対して徹底的に透析し，次に凍結乾燥することにより，未反応低分子量反応物，例えば，チラミン，ＥＤＣ，ＮＨＳ，およびＭＥＳから高分子画分を回収する。凍結乾燥の後，チラミン置換ＨＡ（Ｔ−ＨＡ）生成物を５−１００ｍｇ／ｍｌの作業濃度でＰＢＳ（細胞懸濁液，インビボ組織接触および架橋反応に適合性の緩衝液）に溶解して，最終的なハイドロゲルの所望の剛性によって種々の濃度の調製物を得る。あるいは，溶媒は，実質的に酵素活性に負に影響せず，酵素により生成したフリーラジカルの選択的取り込みにより架橋反応を妨害しないであろう，ＰＢＳ以外の他の任意の適当な溶媒であってもよい。別の適当な溶媒には，水，慣用の生物学的組織培養用培地，および細胞凍結溶液（一般に約９０％の血清および約１０％のジメチルスルホキシドから構成される）が含まれる。細胞を懸濁するか（実施例５を参照），またはインビボで組織と接触させる前に，Ｔ−ＨＡを０．２μｍのフィルターを通して濾過すべきである。次に，１０Ｕ／ｍｌのタイプＩＩ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を各Ｔ−ＨＡ調製物に加えることにより，チラミン−チラミン架橋を行う。架橋は，少量の（１−５μｌ）希釈過酸化水素溶液（０．０１２％−０．０００１２％最終濃度）を加えることにより開始させ，所望の剛性を有する最終的なハイドロゲルを得る。より大量のまたは大きな体積の所望のハイドロゲルを調製するためには，当業者はこの節で提供される試薬の量を適宜スケールアップすることができる。

実施例２：
本発明にしたがうＴ−ＨＡ高分子ネットワークのチラミン置換（およびその結果としてのジチラミン架橋）の程度を決定するために実験を行った。最初に，（未架橋）チラミン置換ヒアルロナン（Ｔ−ＨＡ）の，０Ｘ，１Ｘまたは１０Ｘと称される３つの処方を上述のようにして調製した。０Ｘ処方は，ＥＤＣなしで調製した（すなわち，カルボジイミドを含まない）。これは，チラミン上のＮＨ₂基とＨＡ分子上のＣＯ₂Ｈ基との間にアミド結合を形成するための反応を媒介するカルボジイミドが存在しないことを意味する。すなわち，０Ｘ処方は，対照と考えることができる。１Ｘ処方は，反応混合物中のＨＡ分子上に存在するＣＯ₂Ｈ基の量に基づいて１：１の化学量論比のＥＤＣを含むものであった。１０Ｘ処方は，反応混合物中のＨＡ分子上に存在するＣＯ₂Ｈ基の量に基づいて，１０：１の化学量論比（または１０倍過剰）のＥＤＣを含む。３つすべての処方において，ＨＡ上のＣＯ₂Ｈ基の量に対して化学量論的過剰量のチラミンを用いた。３つすべての処方（０Ｘ，１Ｘおよび１０Ｘ）において，処方用の反応物と適量のＥＤＣをバイアル中で混合し，撹拌してチラミン置換反応を促進させた。３つすべての処方は，室温で２４時間反応させ，その後に，バイアルの内容物を透析して，未反応チラミン分子，ＥＤＣおよび反応の副生成物であるアシルウレア（ＥＤＵ）を除去した。チラミン，ＥＤＣおよびＥＤＵのサイズが高分子ＨＡより比較的小さいため，これらの分子は，透析によりＨＡおよび形成されたＴ−ＨＡ分子から容易に分離された。未反応チラミンおよびＥＤＣを除去した後，各処方についての残りの内容物を分析して，ＨＡ分子上に存在する利用可能なＣＯ₂Ｈ部位の総数に対するチラミン置換の比率を決定した。

チラミンは，２７５ｎｍにＵＶ吸収ピークを示すため，チラミンの滴定曲線を用いてチラミン置換の程度を容易に検出することができる。上述の３つのＴ−ＨＡ処方のＵＶ分光光度分析に基づいて，ＥＤＣの非存在下（処方０Ｘ）で行ったＨＡ−チラミン置換反応では，ＨＡ分子上へのチラミン置換は実質的にゼロであったことが見いだされた。このことから，チラミン置換反応においてカルボジイミド反応経路を用いることの重要性が確認される。しかし，チラミン置換反応において１：１のＥＤＣ：ＣＯ₂Ｈ化学量論比を用いて調製したＴ−ＨＡ処方（処方１Ｘ）のチラミン吸収は，ＨＡ鎖上のすべての利用可能なＣＯ₂Ｈ基に対して約１．７％のチラミン置換率を示した。１０Ｘ処方（１０：１ＥＤＣ：ＣＯ₂Ｈ比）では，約４．７％の置換率が得られた。

次に，３つの透析したＨＡ／Ｔ−ＨＡ処方（０Ｘ，１Ｘおよび１０Ｘ）のそれぞれに過酸化水素および西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を５ｍｇ／ｍＬで加え，得られた処方の反応を完了させた。過酸化物およびＨＲＰの存在下で反応させた後，０Ｘ処方は完全に液体のままであり，強いメニスカスを有し，ゲル形成は認められなかった。このことから，チラミン置換反応においてＥＤＣを用いなかった場合には，チラミン置換が全くまたは実質的に全く起こらなかったことが確認された。１Ｘ処方については，非常に弱いメニスカスのみが認められ，バイアルの内容物はゲル化し，チラミン置換および架橋の両方が起こったことが確認された。１０Ｘ処方については，比較的堅いゲルが形成し，実際には容器中の液体の最初の体積と比較して収縮し，若干の液体（メニスカスを有する）が上部に残った。１０Ｘ処方（４．７％チラミン置換率を有する）から製造したゲルは，１．７％チラミン置換率を有する１Ｘ処方から製造したゲルよりも堅く，より剛性が高かった。

ジチラミン構造は，ＵＶ光に曝露すると青色蛍光を示す。上述の処方のそれぞれの生成物をＵＶ光に曝露して，ジチラミン架橋の存在を検出した。予測されたように，１Ｘおよび１０Ｘハイドロゲルは両方とも青色蛍光を示したが（１０Ｘハイドロゲルの蛍光は１Ｘハイドロゲルの蛍光より強かった），０Ｘ処方は青色蛍光を全く示さなかった。このことから，両方のハイドロゲルにおいてジチラミン架橋が存在すること，およびより剛性の高いハイドロゲル（１０Ｘ）におけるジチラミンの出現率はより剛性の低いハイドロゲル（１Ｘ）におけるより高いことが確認された。

全体的な結果は，カルボジイミド媒介性反応経路の重要性が示されたこと，および本発明にしたがう架橋されたＴ−ＨＡネットワークから形成されたハイドロゲルの相対的剛性はジチラミン架橋の程度に比例すること，さらにこれはＨＡ上へのチラミン置換の程度に比例することが確認されたことである。本発明にしたがって，１．７％のチラミン置換率（および続いてジチラミン結合を形成する架橋比）でさえ，適切に堅いＴ−ＨＡゲル（またはハイドロゲル）を与えたことは，非常に驚くべきかつ予測されなかったことである。４．７％置換（および架橋）比率からはさらに堅いＴ−ＨＡゲルが得られた。さらに驚くべきことには，反応混合物中に存在するカルボン酸基の量に対して１０倍の化学量論的過剰量のカルボジイミド（ＥＤＣ）（処方１０Ｘ）から，わずか約４．５−４．７％のチラミン置換率しか得られなかったが，それでもなお，安定かつ凝集性のチラミン架橋Ｔ−ＨＡネットワークが達成された。

このことは，ＨＡ分子上のカルボン酸基の大部分は置換されず，チラミン架橋されず，本質的に天然のＨＡ分子におけるものと同じままであるが，得られるネットワークは凝集性かつ安定なハイドロゲルであることを意味する。したがって，本発明のＴ−ＨＡネットワークまたはゲル中のＨＡ分子の大部分は正常な軟骨中のＨＡと比較して本質的に変更されていないため，インビボで軟骨代替物として用いる場合，身体の天然の代謝経路（Ｔ−ＨＡネットワーク中で提供される細胞により助けられるかまたは助けられずに）は本発明のネットワークを天然の生物学的材料として認識して，これに対して通常の合成および代謝機能を行うことができるであろうと考えられる。さらに，ＨＡは身体中に非常に普遍的に存在する材料であり，ヒトにおいて免疫原性がないことに注目すべきである。その結果，変更されていない天然のＨＡの大部分を含む本発明の架橋高分子ネットワークは，ヒト身体において合成組織を提供するのに望ましいかまたはこれが必要である広範な範囲の組織工学用途において実質的な用途を有するであろうと考えられる。この点は，従来技術と比較して顕著な利点である。したがって，非常に驚くべきことに，高い程度の，例えば，約１０−２０％より高いチラミン置換は望ましくないかもしれない。上述の実験は，適切なＴ−ＨＡネットワークを提供するためには，そのような高い程度の置換は必要ではないことを示した。好ましくは，本発明にしたがう，ジヒドロキシフェニル（例えば，ジチラミン）で架橋されたポリカルボキシレート（例えば，ＨＡ）ネットワークは，ポリカルボキシレート（ＨＡ）分子上に存在するＣＯ₂Ｈ基の総量に基づくパーセントとして，５０未満，好ましくは４０未満，好ましくは３０未満，好ましくは２０未満，好ましくは１５未満，好ましくは１０未満，好ましくは９未満，好ましくは８未満，好ましくは７未満，好ましくは６未満，好ましくは５未満のヒドロキシフェニル（チラミン）置換率を有する。

実施例３：
伝統的には，天然の軟骨は，主としてアグリカンマトリクス中に存在する隣接する硫酸コンドロイチン鎖上の負に荷電したＳＯ₄ ^2-基の間の反発力の結果として，その粘弾性的特性および変形に抵抗しかつ圧縮負荷を吸収するその能力を示すと考えられてきた。本発明にしたがう，ジチラミン架橋ヒアルロナン分子のみから構成される（すなわち，アグリカンまたは硫酸コンドロイチンを含まない）高分子ネットワークが，ＳＯ₄ ^2-基がないにもかかわらず天然の軟骨と比較して変形に抵抗し圧力を吸収する効力を有するかを判定するために実験を行った。約５％のチラミン置換率を有する架橋していないＴ−ＨＡの処方を調製し，実施例１に記載されるように精製した。このＴ−ＨＡ処方から５つの異なるＴ−ＨＡ濃度を調製した：
濃度１：６．２５ｍｇＴ−ＨＡ／ｍＬＰＢＳ
濃度２：１２．５ｍｇＴ−ＨＡ／ｍＬＰＢＳ
濃度３：２５ｍｇＴ−ＨＡ／ｍＬＰＢＳ
濃度４：５０ｍｇＴ−ＨＡ／ｍＬＰＢＳ
濃度５：１００ｍｇＴ−ＨＡ／ｍＬＰＢＳ

次に上述の調製物のそれぞれを，過酸化水素および西洋ワサビペルオキシダーゼの存在下で，これも実施例１と同様にして反応させて，Ｔ−ＨＡ分子の間にジチラミン架橋を形成させて，それぞれハイドロゲル１，２，３，４および５を得た。これらの５種類のハイドロゲルのそれぞれは，驚くべきことにかつ予測されなかったことに，作製した調製物中のＴ−ＨＡの濃度と相関して様々に異なる各ハイドロゲルの物理学的特性を有する，安定な実質的に凝集性の材料であることが見いだされた。例えば，定性的には，濃度１からは，ワセリンまたはゼリーの特性と匹敵する剛性およびレオロジー特性を有するハイドロゲル１が得られた。このハイドロゲルは安定であり凝集性であるが，例えばスパチュラまたは他の慣用の道具からの外力を適用したときになお流れまたは広がりを引き起こすことができた。ハイドロゲル１は非常に優れた接着特性を示し，このため，眼科手術などの手術の間の手術装置のアレルゲン性のないコーティング材料として理想的な候補である。ハイドロゲル２は，これを製造した調製物中のＴ−ＨＡの濃度がより高かったため，ハイドロゲル１より剛性が高かった。この結果は，Ｔ−ＨＡ濃度の増加に伴う分子内架橋の減少および分子間架橋の増加の結果であると予測される。ハイドロゲル２は，ゼラチンの特性を有するレオロジーおよび剛性特性を示し，外部負荷に対してある程度の粘弾性的反発性を有していた。負荷を高くすると，ハイドロゲル２は流れるのではなく破断してより小さい片になることが認められ，これもゼラチン性材料の特性である。ハイドロゲル３は，パン生地または延ばすことができるパスタの特性および粘稠度を有しており，これもまた，外部負荷力を適用しても流動しなかった。この材料はまた，ハイドロゲル１および２と比較して実質的により高い粘弾性的特性を示した。ハイドロゲル４は非常に剛性が高く，凝集性のゲルであり，外部負荷力を適用したときに，破断に対して強く抵抗した。ハイドロゲル４は非常に弾力性のゴム様の組成物であり，実際に突然の圧縮（例えば床に落下）に対して実質的なバネ力を生じた。ハイドロゲル４は，突然の圧縮に応答してそのようなバネ力を生ずる能力のため，この材料は関節に繰り返しの周期的な圧縮負荷がかかるある種の関節置換／修復用途（例えばくるぶしの関節）に理想的である。ハイドロゲル５は，ハイドロゲル４について記載した特性に加えて，関節と同様の特性を有しており，関節軟骨の外観および手術用ナイフで切断したときに軟骨の感覚を有していた。

制限圧縮試験を実施して，上述の５つの異なるハイドロゲルについて，圧縮の機械的特性を定量的に決定した。特注のポリカーボネート制限チャンバおよび多孔質ポリプロピレンフィルター板（孔径２０μｍ，多孔度２０％）を用いて，制限圧縮試験を行った。制限チャンバおよび以下の実施例４に記載される凍結融解手法を用いて，各ハイドロゲル濃度の５つの円筒形のプラグ（直径７．１ｍｍ，厚さ約３ｍｍ）を作成した。制限圧縮における一連の応力緩和試験のために以下の試験プロトコルを実施した。すべての試験はＩｎｓｔｒｏｎ５５４３装置を用いてコンピュータ制御下で行い，１０Ｈｚの周波数で時間−変位−負荷データを記録した。±５Ｎまたは±５０Ｎ負荷セル（Ｓｅｎｓｏｔｅｃ）を用いて，各試験全体の負荷をモニターした。１％の歪を示す３０μｍ（３０μｍ／ｓｅｃ）のステップをサンプルが平衡に達するまで与えた。これは，１０ｍＮｍｉｎ^-1より低い値まで示した緩和速度として定義し，このとき，自動的に次のステップを開始し，これを２０サイクル（約２０％の歪）が完了するまで行った。制限圧縮において試験した各サンプルの厚さは，圧縮応答を開始したときのチャンバの底に対する転位をＩｎｓｔｒｏｎ５５４３装置で測定することにより機械的に決定した。測定した厚さを用いて，各ステップについての歪パーセンテージを計算した。

５種類のハイドロゲルの圧縮機械的特性を先の節に記載されるようにして判定した。負荷データはサンプル断面積（３９．６ｍｍ²）により標準化して，応力を計算した。各材料処方について，平衡応力を適用した歪に対してプロットした。各工程における凝集係数は，平衡応力を適用した歪で割った値として定義した。各材料について，凝縮係数は，最も直線的な範囲における平衡応力−歪データの傾きとして定義した。制限圧縮試験の結果は図４に示される。５つすべてのハイドロゲルは制限圧縮において試験することが可能であり，二相性材料（例えば軟骨）に典型的な特徴的な応力緩和応答を示した。６．２５ｍｇ／ｍｌおよび１２．５ｍｇ／ｍｌのＴ−ＨＡハイドロゲルの凝集係数は関節軟骨より１−２桁低かった。２５ｍｇ／ｍｌのＴ−ＨＡハイドロゲルは，関節軟骨について報告されている値の約半分の凝集係数を示した。５０および１００ｍｇ／ｍｌのＴ−ＨＡハイドロゲルは，直線範囲全体にわたって関節軟骨について報告されている値より低い凝集係数を示したが，１５−２０％の歪では関節軟骨より高い係数を有していた。これらのデータは，標準的な機械的アッセイを用いてハイドロゲルを特徴づけることができること，および関節軟骨と類似する機械的特性を有するハイドロゲルを生成しうることを示す。

上述の実験に基づいて，驚くべきことにかつ予測されなかったことに，ジチラミン架橋ヒアルロナンネットワークを用いて，チラミン基を架橋させる前にＴ−ＨＡ濃度を様々にして特定の用途に適合させることにより，その剛性および他の物理学的（レオロジー）特性を調節することができる凝集性のハイドロゲル材料を製造しうることが発見された。これらのハイドロゲルの凝集性および弾力性の特性は，電荷対電荷の反発力を供給して材料の圧縮耐性および弾力性を生成するＳＯ₄ ^2-基をネットワーク中に全く（または実質的に全く）供給しない場合であっても認められた。これは，組織工学用途において実質的に正の結論を有する，非常に驚くべきことであり予測できない結果であった。ヒアルロナンはヒトにおいて見いだされる非常に普遍的な，非免疫原分子である。したがって，ジチラミン架橋ヒアルロナンネットワークから構成されるハイドロゲルは，用途に応じてその剛性を調節することができる，ヒトの身体中に移植しうる非常に適切な組織置換材料を提供することができる。これらの材料は非免疫原性である変更していないヒアルロナンから主として構成され，このため免疫応答がゼロまたは実質的にゼロとなると考えられる。このことは，多くの慣用の組織工学材料は，これを形成する化学の苛酷な反応条件または試薬のためにインビボでの適用ができないため，およびその最終的な化学構造が免疫応答を誘導しそうであるため，これらと比べて重要な利点である。

実施例４：
実施例３に記載されるもの等のハイドロゲルを製造して，ハイドロゲルを予め決定された三次元形状に成形または形成するための多くの方法が開発されている。このことは，患者の天然の組織の欠陥または空隙に充填するための人工組織材料を提供することが必要である，多くの組織工学用途において重要である。

第１の方法は，ハイドロゲルをその場で，すなわち，その最終的な適用および構造の位置および形状で形成するインシトゥー形成手法を用いる。以下のようにしてインシトゥー形成方法を実験的に行った。本明細書に記載されるカルボジイミド媒介性経路によりチラミン置換ヒアルロナン（Ｔ−ＨＡ）を調製した。透析して未反応チラミン，ＥＤＣ，ＮＨＳ等を除去し，所望の濃度でＰＢＳに溶解した後（上記実施例１を参照），Ｔ−ＨＡ液体調製物に少量の西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素を加えて，第１の溶液を形成した。この第１の溶液を特定の内部幾何学を有する実験室容器（インビボの現場を模倣するために）に入れた。次に，非常に希薄な過酸化水素（０．０１２％−０．０００１２％の最終濃度）を含有する第２の溶液を調製した。次に，第１の溶液に対して少量のこの第２の溶液を，既に第１の溶液を含む容器に注入して，ジチラミン架橋反応を開始させ，ハイドロゲルを得た。この手法により調製されたハイドロゲルを，実施例３で上述したように，種々の剛性およびレオロジー特性を有するように，これらを形成する容器の内部表面輪郭とよく適合するように製造した。主な試薬（Ｈ₂Ｏ₂，ヒアルロナンおよびペルオキシダーゼ）はアレルゲン性がないか拡散可能な分子であるため，および架橋反応は代謝条件の温度およびｐＨで進行するため，この手法は，手術の手順としてインビボで患者の手術場所で実施して，欠陥に適合した形のハイドロゲルを製造することができる。この方法は，架橋されていないＴ−ＨＡ調製物（ペルオキシダーゼを含む）を注入し，外科医が皮下で操作して所望の顔輪郭を生成し，次に少量の過酸化水素溶液を注入することによりハイドロゲルを架橋させる，顔の再建手術に特に魅力的である。

第２の方法は，多孔質金型手法であり，ハイドロゲルをより複雑な三次元構造に形成するのに適している。この手法においては，最初に多孔質の中空の金型を，意図する最終的な構造の形状および輪郭に適合するように成形する。例として，立方形の形状のハイドロゲルが望まれる場合には，立方形の形状の内部表面を有する金型を用意することができる。金型は，例えば，パリプラスター，多孔質または焼結したプラスチックまたは金属等の慣用の多孔質材料から慣用の手法により製造または成形することができる。特に好ましい態様においては，金型は，セルロースの透析膜を用いて製造する。第１の溶液および第２の溶液を上述のようにして調製し，第１の溶液を多孔質金型の中空の金型キャビティー中に入れる。次に，充填された金型を非常に希薄な過酸化物の浴に浸漬する。高分子Ｔ−ＨＡおよびペルオキシダーゼ分子はそのサイズのため多孔質金型から外に拡散することができないが，非常に小さい過酸化物分子（Ｈ₂Ｏ₂）は内部に拡散することができ，ペルオキシダーゼ酵素の存在下で反応して，ジチラミン架橋が得られる。この方法に特有のことは，架橋が外側から内側に向かって起こって，完成したハイドロゲル形状が生成すること，および過酸化物浴への最適なまたは十分な浸漬時間を決定するためにはある程度の試行錯誤が必要であることである。これらの時間の決定は当業者の通常の能力の範囲内である。この多孔質金型手法により実験台上で首尾よく完成した三次元ハイドロゲル形状を製造した。

第３の方法は，凍結乾燥手法であり，これは本発明にしたがうハイドロゲルを非常に複雑な三次元形状，例えばヒトの耳などの内部のひだを有するものに成形するのに適している。この手法においては，金型を柔軟な柔らかい材料，例えば，低いガラス転移温度，例えば−８０℃より低い温度を有する高分子材料から製造する。好ましい金型材料は，低いガラス転移温度を有するシリコーン，例えば，−１２７℃のガラス転移温度を有するポリジメチルシロキサンであるが，他の適当に低いガラス転移温度（例えば−８０℃より低い）のシリコーン，ならびに他のポリマーを用いることができる。まず，任意の慣用のまたは適当な手法（すなわち，プレス成形，彫刻等）により，シリコーン（好ましい材料）を，所望のハイドロゲルの部分の表面形状，輪郭および体積に適合する内部金型キャビティーを有するように製造する。第１の溶液および第２の溶液を上述のようにして調製し，第１の溶液をシリコーン金型の内部金型キャビティーの中に入れる。次に，充填されたシリコーン金型を固体ＣＯ₂（ドライアイス）と接触させることにより約−８０℃に冷却する。第１の溶液は主として水であるため，これは凍結して，内部金型表面の形状および輪郭に適合した形の固形状の氷となる。しかし，−８０℃より低いガラス転移温度を有するシリコーン金型は柔らかく柔軟なままであり，第１の溶液の固形状の氷を容易に取り出すことができる。第１の溶液は凍結するにつれて膨張するため，適当な機械的ハードウエアを用いて，溶液が凍結するにつれてシリコーン金型が変形または膨張しないことを確実にしなければならない。好ましくは，金型に蒸気口を設けて，凍結プロセスの間に第１の溶液が膨張するにつれてこれが膨張し排出されるようにする。

第１の溶液の固形状氷を取り出した後，適当な道具で彫刻することにより三次元構造中の微細な欠陥またはきずを修復し，さらに液体の第１の溶液を加えて表面の空隙を充填する。この液体は接触している固形状氷上で直ちに凍結する。また，所望の場合には加えられた第１の溶液材料について均一な温度および凍結を確実にするために，氷形をドライアイス表面に戻すことができる。氷形の三次元形状がいったん完成したら，これを液体過酸化物溶液中に浸漬して，外側から内側に凍結した水の融解およびジチラミン架橋を開始させる。架橋反応の早い速度論のため，これが可能である。形成されつつあるハイドロゲル形の中心で最後の残存した凍結水が融解したとき，架橋が完了したと判定する。形成されつつあるハイドロゲルは実質的に透明であるため，これは容易に観察することができる。

実験はこの凍結乾燥手法にしたがって非常に首尾良く行うことができ，本発明にしたがう固体のハイドロゲルをヒトの耳の形状で製造することができた。当業者には他の構造，例えば，椎間円板，半月等をこの方法により形成することができることが明らかであろう。この凍結乾燥手法においては，第１の溶液が凍結して固形状の氷が生成するときに金型材料がもろくならないことを確実にするために，金型材料について，ほぼ固体ＣＯ₂（ドライアイス）の表面温度に対応するよう，−８０℃の閾値ガラス転移温度を選択することに注意すべきである。しかし，ＣＯ₂以外の別の冷却材料を用いる場合には，適当な金型材料についての閾値ガラス転移温度はそれにしたがって調節することができる。

上述したハイドロゲル形成の３つの方法について，第１の溶液はペルオキシダーゼおよびＴ−ＨＡの両方を含み，一方，第２の溶液は過酸化物を含むものであった。それぞれ第１の溶液と第２の溶液中のペルオキシダーゼと過酸化物を交換することは可能であるが，過酸化物を第１の溶液中でＴ−ＨＡとともに提供することはあまり好ましくない。これは，過酸化物，ペルオキシダーゼおよびＴ−ＨＡが一旦混合されると，Ｔ−ＨＡは急速に架橋された高分子ネットワークを形成し始めるためである。ペルオキシダーゼ（これは高分子である）がＴ−ＨＡとともに既に均一に分布していなければ，これは形成されつつあるハイドロゲルの孔構造を通って拡散して，Ｔ−ＨＡ／過酸化物溶液全体にわたって均一な架橋を形成することができないか実質的に妨げられる。その結果得られるものは，均一でないか，および／またはＴ−ＨＡの不完全な架橋および不均一なハイドロゲルであろう。逆に，比較的小さい過酸化物分子（過酸化水素は水より１つの酸素原子が多いだけである）は，比較的容易にハイドロゲルの構造を通って拡散することができ，均一なハイドロゲル構造が得られる。

さらに，高分子サイズのペルオキシダーゼは，Ｔ−ＨＡと同様に，多孔質金型中に残留するであろう。この金型は，金型および新たに形成されつつある高分子ネットワーク（すなわちハイドロゲル）の両方を通って容易にかつ均一に拡散する低分子量の過酸化物に対してのみ多孔質である。これらの理由のため，第１の溶液中にＴ−ＨＡとともに均一に分布したペルオキシダーゼを用いて出発し，別に過酸化物を第２の溶液で提供することが好ましい。

第４の方法は，交互のスプレーまたはブラシ重層手法である。第１の溶液は上述したように用意し，ペルオキシダーゼおよびＴ−ＨＡの両方を含む。しかし，第２の溶液は，上述したように過酸化物を含むのみならず，Ｔ−ＨＡを第１の溶液と同じ濃度で含む。次に，第１の溶液の薄膜を所望の位置に塗布し（インシトゥー），次に第２の溶液の薄膜を重層する。欠陥または適用場所が完成するまで第１の溶液と第２の溶液の交互の層が連続的に塗布されるように，この手順を繰り返す。第１の溶液と第２の溶液の非常に薄い交互の層は，事実上完全なジチラミン架橋を促進して，高度に凝集性の最終的なハイドロゲルが２つの溶液の最初のＴ−ＨＡ濃度に基づいて所望のレオロジー特性を有することを確実にする。層が薄いという特性は，第１の溶液層中のペルオキシダーゼにより生成されるフリーラジカルが隣接する第２の溶液層に完全に浸透しうること，および第２の溶液層へのペルオキシダーゼの拡散とは無関係に完全な架橋が形成されることを確実にするために望ましい（上を参照）。Ｔ−ＨＡを両方の溶液中に含ませることにより，最終的なハイドロゲル全体で均一なＴ−ＨＡ濃度を確実にする。この手法を実験室の実験台で実施して，輪郭に従いかつ体積の充填した凝集性のハイドロゲルを得た。この手法は，患者の移植部位に天然の健康な軟骨があったとしてもわずかに残っている変形性関節症の露出した関節の表面などの，薄いチラミン架橋ＨＡの可変の層を提供することが望まれる場合に非常に適用可能である。

上述の４つの手法はすべてジチラミン架橋ヒアルロナンに関して記述してきたが，本発明の範囲内の他の組み合わせ（他のジヒドロキシフェニル架橋高分子，例えば，ポリカルボキシレート，ポリアミン，ポリヒドロキシフェニル分子およびこれらのコポリマー）を上述の手法により成形することができることが理解されるであろう。

実施例５：
ラット軟骨細胞を（架橋）Ｔ−ＨＡハイドロゲル中に包埋して，これらが架橋反応に耐える能力を測定した。これらの生きた細胞を第１の溶液に入れてＴ−ＨＡおよびペルオキシダーゼとともに分散させ，次に過酸化物を含有する第２の溶液を導入してジチラミン架橋を開始させることにより，実施例２に記載される１．７％および４．７％Ｔ−ＨＡハイドロゲル中に単離された軟骨細胞を懸濁した。軟骨細胞を包埋した１．７％および４．７％のＴ−ＨＡハイドロゲルは，均一に分布した軟骨細胞を示し，ゲルは光学的に透明であって，ゲル全体を見ることができた。軟骨細胞はグルコース消費が旺盛であり，２４時間以内に培地のグルコースを涸渇させるため，架橋してハイドロゲルを形成した後に細胞生存性を指示するものとしてグルコース利用を用いた。結果は，Ｔ−ＨＡハイドロゲル中に包埋された軟骨細胞が２４時間にわたり単層で培養した同じ軟骨細胞と本質的に同じグルコース消費プロファイルを示すことを示した（図５）。これは７日間まで続き，これは細胞が生きており代謝的に活性であることを示す。培地のグルコースは標準的なヘキソキナーゼアッセイにより測定した。

軟骨細胞および軟骨組織の両方を含むＴ−ＨＡハイドロゲルの凍結切片の蛍光画像も作成した。ハイドロゲル足場および軟骨マトリクスの両方からのＨＡサンプルをビオチン化ＨＡ結合蛋白質（ｂ−ＨＡＢＰ）試薬で蛍光染色することにより可視化し，細胞の核は標準的なＤＡＰＩ染色により可視化した。ｂ−ＨＡＢＰ試薬は，精製した軟骨アグリカン（Ｇ１ドメインのみ）および結合蛋白質から調製し，これは，通常は軟骨においてアグリカンおよび結合蛋白質により結合しているストレッチと同等の天然のＨＡのストレッチを認識しこれに不可逆的に結合する。結果は，軟骨よりＴ−ＨＡハイドロゲルでｂ−ＨＡＢＰによるより強い染色を示した。これは，組織中のヒアルロナンが既に天然のアグリカンおよび結合蛋白質により占められているためである。ハイドロゲルのＴ−ＨＡ足場と懸濁した軟骨組織のマトリクスとの間に目に見える区別はなく，このことは継ぎ目のない一体化を示唆する。これらの結果は，ハイドロゲル架橋反応の間に軟骨細胞の生存性を維持することの実用可能性，およびハイドロゲルが現存する軟骨マトリクス中に継ぎ目なく一体化しうることを示した。これらはいずれも，軟骨修復への適用に有利である。この結果はまた，Ｔ−ＨＡの十分なストレッチが化学的に変化しないまま残っており，インシトゥーで新たに合成されたアグリカンおよび結合蛋白質との結合に利用可能であることを示す。この結果はまた，酸素，二酸化炭素，グルコースおよびインスリンが軟骨細胞の代謝を制限しない速度で本発明にしたがうＴ−ＨＡハイドロゲルを通って拡散可能であることを示す。このことは，軟骨代替物の開発のみならず，他の用途，例えば，グルコースセンサーの設計および人工腎臓の開発においても重要である。

実施例４に記載される凍結乾燥手法を用いて軟骨細胞等の細胞を複雑な解剖学的形状に成形されたハイドロゲル中に含有させるためには，酵素により推進される架橋反応が，標準的な細胞凍結溶液，例えば，１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／９０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む溶液の存在下で進行することが望ましい。実施例３に記載されるすべてのＴ−ＨＡハイドロゲル処方について，実験室でこのことが示された。９０％ＦＢＳを含む溶液を直接取り込むことができることはまた，生物活性因子，例えば成長因子，ホルモンおよび細胞分化を制御する因子を取り込むことができることを示す。これらはＦＢＳの通常の成分であるためである。

上述の態様は好ましい態様を構成するが，特許請求の範囲に記載される本発明の精神および範囲から逸脱することなく，これに種々の変更または改変をなすことができることが理解されるであろう。

図１は，正常な健康なヒト軟骨の概略図である。 図２は，本発明にしたがう，ジヒドロキシフェニルで架橋された高分子ネットワークの概略図である。 図３は，ヒアルロナン分子の構造式である。 図４は，本発明にしたがうＴ−ＨＡハイドロゲルと，関節軟骨プラグについての公表されている結果との，制限圧縮試験における機械的試験の比較の結果を示すグラフである。 図５は，Ｔ−ＨＡハイドロゲル中に包埋された軟骨細胞のグルコース利用を示すグラフである。

Claims (65)

1. 次式：
   

   

   ［式中，Ｒ₁およびＲ₂は，それぞれ，ポリカルボキシレート，ポリアミン，ポリヒドロキシフェニル分子，およびこれらのコポリマーからなる群より選択される構造を含み，ここで，Ｒ₁およびＲ₂は同じ構造であっても異なる構造であってもよい］
   を含む高分子ネットワーク。
2. Ｒ₁がポリカルボキシレートである，請求項１記載の高分子ネットワーク。
3. Ｒ₁がポリアミンである，請求項１記載の高分子ネットワーク。
4. Ｒ₁がポリフェノールである，請求項１記載の高分子ネットワーク。
5. Ｒ₁がペプチドおよび蛋白質からなる群より選択される構造を含む，請求項１記載の高分子ネットワーク。
6. Ｒ₁がグルコサミノグリカンからなる群より選択される構造を含む，請求項１記載の高分子ネットワーク。
7. Ｒ₁がヒアルロナンを含む，請求項１記載の高分子ネットワーク。
8. Ｒ₁が硫酸コンドロイチンおよびデルマタン硫酸からなる群より選択される構造を含む，請求項１記載の高分子ネットワーク。
9. Ｒ₁がヘパラン硫酸およびヘパリンからなる群より選択される構造を含む，請求項１記載の高分子ネットワーク。
10. Ｒ₁がアルギン酸塩，ポリグルクロン酸，ポリガラクツロン酸，ペクチンおよびコロミン酸からなる群より選択される構造を含む，請求項１記載の高分子ネットワーク。
11. Ｒ₁がポリアスパラギン酸およびポリグルタミン酸からなる群より選択される構造を含む，請求項１記載の高分子ネットワーク。
12. Ｒ₁がポリチロシンを含む，請求項１記載の高分子ネットワーク。
13. Ｒ₁がポリリジンおよびポリアルギニンからなる群より選択される構造を含む，請求項１記載の高分子ネットワーク。
14. Ｒ₁がプロテオグリカンを含む，請求項１記載の高分子ネットワーク。
15. Ｒ₁がアグリカンを含む，請求項１記載の高分子ネットワーク。
16. さらに高分子ネットワーク中に生きた細胞の集団を含む，請求項１記載の高分子ネットワーク。
17. さらに高分子ネットワーク中に生物活性因子を含む，請求項１記載の高分子ネットワーク。
18. 前記ネットワークが，ヒドロキシフェニル化合物で置換されているポリカルボキシレート分子を含み，ここで，隣接するポリカルボキシレート分子にそれぞれ結合している２つのヒドロキシフェニル基の間に少なくとも１つのジヒドロキシフェニル結合が形成されている，請求項１記載の高分子ネットワーク。
19. 前記ネットワークが，ヒドロキシフェニル化合物で置換されているポリアミン分子を含み，ここで，隣接するポリアミン分子にそれぞれ結合している２つのヒドロキシフェニル基の間に少なくとも１つのジヒドロキシフェニル結合が形成されている，請求項１記載の高分子ネットワーク。
20. 前記ネットワークが，ヒドロキシフェニル化合物で置換されているペプチドおよび／または蛋白質を含み，ここで，隣接するペプチドおよび／または蛋白質にそれぞれ結合している２つのヒドロキシフェニル基の間に少なくとも１つのジヒドロキシフェニル結合が形成されている，請求項１記載の高分子ネットワーク。
21. 前記ヒドロキシフェニル化合物がチラミンまたはチロシンである，請求項１８記載の高分子ネットワーク。
22. 前記ヒドロキシフェニル化合物が，チロシン，４−ヒドロキシフェニル酢酸，または３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸である，請求項１９記載の高分子ネットワーク。
23. 前記ポリカルボキシレート分子が，前記ポリカルボキシレート分子上に存在するＣＯ₂Ｈ部位のモル量に基づいて５０パーセント未満のヒドロキシフェニル化合物置換率を有する，請求項１８記載の高分子ネットワーク。
24. 前記ポリアミン分子が，前記ポリアミン分子上に存在する１級ＮＨ₂部位のモル量に基づいて５０パーセント未満のヒドロキシフェニル化合物置換率を有する，請求項１９記載の高分子ネットワーク。
25. 複数のチラミン置換ヒアルロナン分子を含み，少なくとも２つの隣接するヒアルロナン分子がジチラミン結合により結合している高分子ネットワーク。
26. 前記ヒアルロナン分子上のチラミン置換比率が，前記ヒアルロナン分子上に存在するＣＯ₂Ｈ部位のモル量に基づいて５０％未満である，請求項２５記載の高分子ネットワーク。
27. 前記ヒアルロナン分子上のチラミン置換比率が，前記ヒアルロナン分子上に存在するＣＯ₂Ｈ部位のモル量に基づいて１０％未満である，請求項２５記載の高分子ネットワーク。
28. さらに高分子ネットワーク中に生きた細胞の集団を含む，請求項２５記載の高分子ネットワーク。
29. さらに高分子ネットワーク中に生物活性因子を含む，請求項２５記載の高分子ネットワーク。
30. ヒアルロナン分子間のジチラミン結合により架橋されているチラミン置換ヒアルロナン分子の高分子ネットワークを含むハイドロゲル。
31. ゼリーの剛性およびレオロジー特性を有する，請求項３０記載のハイドロゲル。
32. ゼラチンの剛性およびレオロジー特性を有する，請求項３０記載のハイドロゲル。
33. パン生地の剛性およびレオロジー特性を有する，請求項３０記載のハイドロゲル。
34. 弾力性ゴム様組成物の剛性およびレオロジー特性を有する，請求項３０記載のハイドロゲル。
35. 関節と同様の剛性およびレオロジー特性を有する，請求項３０記載のハイドロゲル。
36. さらに高分子ネットワーク中に生きた細胞の集団を含む，請求項３０記載のハイドロゲル。
37. 合成もしくは人工の関節として提供される，請求項３０記載のハイドロゲル。
38. さらに高分子ネットワーク中に生物活性因子を含む，請求項３０記載のハイドロゲル。
39. 高分子ネットワークを作成する方法であって，
    ヒドロキシフェニル置換ポリカルボキシレート，ヒドロキシフェニル置換ポリアミン，他のポリヒドロキシフェニル分子，およびこれらのコポリマーからなる群より選択される第１の高分子種を用意し，そして隣接する前記第１の高分子種にそれぞれ結合している２つのヒドロキシフェニル基の間に少なくとも１つのジヒドロキシフェニル結合を形成する，
    の各工程を含む方法。
40. ポリカルボキシレートと，第１アミン基およびヒドロキシフェニル官能基を含む第２の分子種との間の化学反応を実施することにより前記ヒドロキシフェニル置換ポリカルボキシレートを製造することをさらに含む，請求項３９記載の方法。
41. ポリアミンと，ＣＯ₂Ｈ基およびヒドロキシフェニル官能基を含む第２の分子種との間の化学反応を実施することにより前記ヒドロキシフェニル置換ポリアミンを製造することをさらに含む，請求項３９記載の方法。
42. 前記第２の分子種がチラミンまたはチロシンである，請求項４０記載の方法。
43. 前記第２の分子種が，チロシン，４−ヒドロキシフェニル酢酸，または３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸である，請求項４１記載の方法。
44. 前記ポリカルボキシレートがヒアルロナンである，請求項４０記載の方法。
45. 前記ポリカルボキシレートが硫酸コンドロイチンである，請求項４０記載の方法。
46. 前記第２の分子種がチラミンであり，および前記ポリカルボキシレートがヒアルロナンであり，得られる高分子ネットワークがチラミン置換ヒアルロナン分子のジチラミン架橋ネットワークである，請求項４０記載の方法。
47. 前記化学反応がｐＨ６−７の範囲で実施される，請求項４０記載の方法。
48. 前記化学反応が，以下の経路：
    ａ）前記ポリカルボキシレートのカルボン酸基をカルボジイミドと反応させて，Ｏ−アシルイソウレアで置換されたポリカルボキシレートを形成し，そして
    ｂ）前記Ｏ−アシルイソウレアで置換されたポリカルボキシレートを前記第２の分子種の第１アミン基と反応させて前記ヒドロキシフェニル置換ポリカルボキシレートを形成する，
    により実施される，請求項４０記載の方法。
49. 前記化学反応が，以下の経路：
    ａ）前記第２の分子種の前記ＣＯ₂Ｈ基をカルボジイミドと反応させて，Ｏ−アシルイソウレアで置換された第２の分子種を形成し，そして
    ｂ）前記Ｏ−アシルイソウレアで置換された第２の分子種を前記ポリアミンの第１アミン基と反応させて，前記ヒドロキシフェニル置換ポリアミンを形成する，
    により実施される，請求項４１記載の方法。
50. 前記カルボジイミドが１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドである，請求項４８記載の方法。
51. 工程（ａ）が活性エステル形成触媒の存在下で実施される，請求項４８記載の方法。
52. 前記触媒がＮ−ヒドロキシスクシンイミドである，請求項５１記載の方法。
53. さらに，前記ヒドロキシフェニル基を酵素の存在下で過酸化物と反応させて，隣接するヒドロキシフェニルフリーラジカル種を得，前記フリーラジカル種を二量体化反応により二量体化させて前記ジヒドロキシフェニル結合を得ることにより前記ジヒドロキシフェニル結合を形成することを含む，請求項３９記載の方法。
54. 前記過酸化物が過酸化水素であり，前記酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼである，請求項５３記載の方法。
55. ハイドロゲルを製造する方法であって，
    ａ）ペルオキシダーゼ酵素または過酸化物のいずれかを含むが両方は含まず，かつ，ヒドロキシフェニル置換ポリカルボキシレート，ヒドロキシフェニル置換ポリアミン，他のポリヒドロキシフェニル分子，およびこれらのコポリマーからなる群より選択される高分子種を含む第１の溶液を用意し；
    ｂ）前記ペルオキシダーゼ酵素または過酸化物のうち前記第１の溶液中で提供されていない方を含む第２の溶液を用意し；そして
    ｃ）前記第１の溶液および第２の溶液を混合してジヒドロキシフェニル架橋を開始させて，前記ハイドロゲルを形成する，
    の各工程を含む方法。
56. さらに，所望のハイドロゲル部分の形状，輪郭および体積に適合した形の内部金型キャビティーを有する非孔質の金型を用意し，そして，前記第１の溶液および第２の溶液を前記内部金型キャビティー中で混合して，その形状の前記ハイドロゲルを形成することを含む，請求項５５記載の方法。
57. さらに，
    ｄ）多孔質材料から製造され，所望のハイドロゲル部分の形状，輪郭および体積に適合した形の内部金型キャビティーを有する金型を用意し；
    ｅ）前記第１の溶液を前記金型の前記内部金型キャビティーに入れ；そして
    ｆ）前記第１の溶液をその中に有する前記多孔質金型を前記第２の溶液の浴に浸漬し，このことにより前記ジヒドロキシフェニルの架橋および前記ハイドロゲルの形成を開始させる，
    の各工程を含む，請求項５５記載の方法。
58. さらに，
    ｄ）柔軟な材料から製造され，所望のハイドロゲル部分の形状，輪郭および体積に適合した形の内部金型キャビティーを有する金型を用意し；
    ｅ）前記第１の溶液を前記金型の前記内部金型キャビティーに入れ；
    ｆ）前記金型を冷却して前記第１の溶液をその内部金型キャビティー中で凍結させて，前記内部金型キャビティーの形状の固形状氷を形成し；そして
    ｇ）前記固形状氷を前記第２の溶液の浴に浸漬して，このことにより，凍結した水の融解およびジヒドロキシフェニルの架橋を開始して，前記ハイドロゲルを形成する，
    の各工程を含む，請求項５５記載の方法。
59. 前記柔軟な材料が約−８０℃より低いガラス転移温度を有する高分子材料である，請求項５８記載の方法。
60. 前記冷却工程が，前記金型およびその内容物をドライアイスと接触させることにより実施される，請求項５８記載の方法。
61. さらに，前記固形状氷を浸漬する前に前記固形状氷を前記成形から取り出すことを含む，請求項５８記載の方法。
62. 前記柔軟な材料が，前記冷却工程において前記第１の溶液が凍結する温度より低いガラス転移温度を有する，請求項５８記載の方法。
63. 前記第２の溶液が前記高分子種をさらに含み，方法が，第１の溶液および第２の溶液の層を現場に交互に適用することにより前記ジヒドロキシフェニルの架橋および前記ハイドロゲルの形成を開始させることをさらに含む，請求項５５記載の方法。
64. 前記第１の溶液がペルオキシダーゼを含む，請求項５５記載の方法。
65. 前記高分子がチラミン置換ヒアルロナンである，請求項５５記載の方法。
    

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