FI105478B

FI105478B - Menetelmä valmistaa terapeuttisesti vaikuttavaa 2-deoksi-2,3-didehydro-N-asetyylineuramiinihapon johdannaisia ja niiden analogeja

Info

Publication number: FI105478B
Application number: FI924790A
Authority: FI
Inventors: Betty Jin; Wen Yang Wu; Basil Danylec; Itzstein Laurence Mark Von; Phan Tho Van
Original assignee: Biota Scient Management
Priority date: 1990-04-24
Filing date: 1992-10-22
Publication date: 2000-08-31
Also published as: FI924790A; AU7533891A; NO302751B1; NO974670L; CZ288492B6; NL990030I1; CN1036849C; MY107843A; SI9110745A; CA2081356C; BG62092B1; PL167630B1; DE69128469T2; RU2119487C1; AU654815B2; GR3026225T3; IE911372A1; PL166918B1; CY2186B1; CA2291994C

Description

105478

Menetelmä valmistaa terapeuttisesti vaikuttavaa 2-deoksi-2,3-didehydro-N-asetyylineuramiinihapon johdannaisia ja niiden analogeja - Förafarande för framställning av terapeutiskt verksamma 2-deoxi-2,3-didehydro-N-acetylneura-minsyrans derivat och analoger 5 Tämä keksintö koskee menetelmää valmistaa terapeuttisesti vaikuttavaa yhdistettä, jolla on kaava (I)

OH

HO—v/''--..^0sVCOiH

10 I XJL

R« = H

R3 jossa 15 R3 on N3, tai NR6R7, jossa R6 on vety, C^alkyyli, aryyli, aralkyyli. amidiini, NR7Re, tai tyydyttämätön tai tyydyttynyt rengas, jossa on yksi tai useampi heteroatomi joukosta typpi, happi tai rikki, 20 R7 on vety, C^alkyyli tai allyyli, R8 on vety tai C^alkyyli, ja • I t ‘ R4 on NHCOR9, jossa R9 on vety, substituoitu tai substituoitumaton C^alkyyli tai ’’ aryyli, *«· tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävää suolaa tai johdannaista.

• «· 25 • · · * · ·

Entsyymejä, joilla on kyky lohkaista N-asetyylineuramiinihappoa (NANA), myös ,···, tunnettu sialihappona, muista sokereista ovat läsnä monessa mikro-organismis- • ♦ sa. Näihin kuuluu bakteerit, kuten Vibrio cholerae. Clostridium perfrinaens.

* · .. · * Streptococcus pneumoniae, ja Arthrobacter sialofilus. ja virukset, kuten influens- • · « 30 savirus, parainfluenssavirus, sikotautivirus, Newcastletaudin virus, linturuttovirus ;*' (fowl plague virus), ja Sendaivirus. Useammat näistä viruksista kuuluvat orto- • ·i ’ myksovirus- tai paramyksovirusryhmään, ja kantavat neuraminidaasiaktiivisuutta ’· *·* virushiukkasten pinnalla.

2 105478

Monet neuraminidaasia omaavista organismeista ovat ihmisen ja/tai eläinten huomattavia taudinsynnyttäjiä, ja muutama, kuten influenssavirus, Newcastle-taudin virus, ja linturuttovirus, aiheuttavat tauteja, joilla on valtava taloudellinen vaikutus.

5

Pitkään on ollut se käsitys, että neuraminidaasiaktiivisuuden inhibiittorit voisivat estää neuraminidaasi-kantavien virusten infektiot. Useimmat tunnetut neuramini-daasi-inhibiittorit ovat neuramiinihapon analogeja, kuten 2-deoksi-2,3-didehydro-N-asetyylineuramiinihappo (DANA) ja sen johdannaiset. Katso, esim., Meindl 10 et ai., Virology 1974 58 457-63. Näistä aktiivisin on 2-deoksi-2,3-dehydro-N-tri-fluoriasetyyli-neuramiinihappo (FANA), joka inhiboi influenssa-ja parainfluens-saviruksen moninkertaisen toiston in vitro. Katso Palese et ai., Virology 1974 59 490-498.

15 T unnetaan joukko 2-deoksi-2,3-didehydro-N-asetyylineuramiinihappojohdannai-sia. Katso esimerkiksi P. Meindl et at. Virology, 58, 457 463 (1974); P. Meindl ja H. Tuppy, Mh. Chem, 100 (4), 1295-1306 (1969); M. Flashner et at.. Carbohydrate Research, 103. 281-285 (1982); E. Zbiral et ai.. Liebigs Ann Chem, 159-165 (1989); T Ogawa ja Y. ito, Tetrahedron Letters, 28 (49), 6221 6224 (1987); T.

20 Goto et ai.. Tetrahedron letters, 27 (43), 5229 5232 (1986); H. Ogura et ai., *«· Chem. Farm. Bull, 36 (12), 4807 4813 (1988); Saksalainen hakemusjulkaisu t P 1439249. Monet näistä yhdisteistä ovat aktiivisia jn vitro V. cholerae tai New- • « •V\: castletaudin viruksesta sekä influenssaviruksesta. Neuraminidaasi ainakin jois- v ·* takin influenssa- tai parainfluenssavirusten kannoista on myös raportoitu inhiboi- 25 tuvan in vitro σ-laktoonista ja O-a -N-asetyyli-D-neuraminosyyli)2—>3)-2-aset-

• II

: amido-2-deoksi-D-glukoosista. Katso Zakstel'skaya et ai., Vop. Virol. 1972 17 • · · V : 223-28.

• ♦ • · · • ·· • ·

Arthrobacter sialofilus-peräistä neuramidaasia inhiboi in vitro glykaalit 2,3-de-30 hydro-4-epi-N-asetyylineuramiinihappo, 2,3-dehydro-2-deoksi-N-asetyylineur- • ·« ·: ··· amiinihappo ja 5-asetamido-2,6-anhydro-2,3,5-trideoksi-D-manno-non-2-eeni- 4-ulosonaatti, ja niiden metyyliesterit. Katso Kumar et ai., Carbohydrate Res. 1981 94 123-130; Carbohydrate Res. 1982 103 281-285. Tioanalogit 2-a-atsido- 3 105478 6-tioneuramiinihappo ja 2-deoksi-2,3-didehydro-6-tioniuramiinihappo, Mack & Brossmer, Tetrahedron Letters 1987 28 1 91-194, ja fluorinoidut analogit N-asetyyli-2,3-difluori-a-D-neuramiinihappo, Nakajima et al., Agric. Biol. Chem. 1988 52 1209-1215, on raportoitu inhiboivan neuraminidaasia, vaikkakin neura-5 minidaasityyppiä ei ole identifioitu. Schmid et ai., Tetrahedron Letters 1958 29 3643-3646, kuvaa 2-deoksi-N-asetyyIi-a-D-neuramiinihapon synteesiä, mutta ei ole raportoinut sen aktiivisuutta tai muuta vaikutusta neuraminidaasia vastaan.

Mikään tunnetun inhibiittorin neuraminidaasi aktiivisuus in vitro ei ole osoittautu-10 nut omaavan antiviraalista aktiivisuutta in vivo, ja nimenomaan jotkut, kuten FANA, ovat erityisesti osoittautuneet inaktiivisiksi jn vivo. Siten yleinen käsitys on ollut se, että yhdisteet, jotka in vitro inhiboivat viraalista neuraminidaasia eivät jn vivo estä virusinfektioita.

15 Meindl ja Tuppy, Hoppe Seyler's 2. Physiol Chem 1969 350 1088, kuvaavat 2-deoksi-2,3-dehydro-N-asetyylineuramiinihapon olefiinisen kaksoissidoksen hydrogenointia 2-deoksi-N-asetyylineuramiinihapon β-anomeerin tuottamiseksi. Tämä β-anomeeri ei inhiboi vibrio cholerae-neuraminidaasi.

•,;' < 20 Tehokkaimmat viraalisen neuramiinidaasin in vitro inhibiittorit ovat näin identifi- I t • ' < oitu yhdisteiksi, jotka perustuvat neuramiinihapporunkoon, ja näitä jotkut pitävät ( transitio-tilassa olevina analogeina. Miller et ai., Biochem. Biofys. Res. Comm. 1978 83 1479. Mutta vaikkakin monet edellä mainituista neuramiinihappoanalo- • · geista kilpailukykyisiä neuraminidaasin inhibiittoreita, tähän päivään saakka, 25 mikään niistä ei ole raportoitu omaavan anti-viraalista aktiivisuutta in vivo. Esi- • · · : merkiksi, vaikkakin puolitasoinen, tyydyttämätön 6 jäseninen rengasjärjestelmä ·*** ** : on oletettu olevan tärkeä inhibointiaktiivisuudelle, katso Dernick et ai. in ANTIVI- :/.: RAL CHEMOTHERAPY (K. K. Gauri ed.: Academic Press, 1981, sivut 327 - 336,

joistakin yhdisteistä, joille on tunnusomaista tällainen järjestelmä, erityisesti 30 FANA, on raportoitu, että ne eivät omaa in vivo antiviraalista aktiivisuutta. Katso ·:··; Palese ja Schulman CHEMOPROPHYLAXIS AND VIRUS INFECTION OF THE

UPPER RESPIRATORY TRACT, Voi. 1 (J. S. Oxford ed.) CRC Press, 1977, sivut 189-205.

105478 4

Olemme nyt löytäneet uusia 4-substituoituja a-D-neuramiinihapon 2-deoksi-2,3-didehydrojohdannaisia (edellä esitetty kaava I), jotka ovat aktiivisia in vivo.

Kaavan (I) mukaisissa yhdisteissä substituentit (esimerkiksi ryhmä R6 substi-5 tuentissa R3) voi itse sisältää substituentteja, joita tavanomaisesti farmaseuttisen kemian alalla katsotaan liittyviksi tällaisiin substituentteihin.

Edullisesti R3 on NR6R7, erityisesti NH2 tai guanidiino.

10 Edullisesti R4 on NHCOR9 jossa R9 on metyyli tai halogeenisubstituoitu metyyli (esim. FCH2-, F2CH-, F3C-).

C^alkyyli tässä yhteydessä käytettynä käsittää sekä suorat (esim. metyyli, etyyli) että haarautuneet (esim. isopropyyli, t-butyyli) alkyyliryhmät.

15

Farmaseuttisesti hyväksyttävillä johdannaisilla tarkoitetaan mitä tahansa kaavan (I) mukaisten yhdisteiden farmaseuttisesti hyväksyttävää esteriä tai suolaa tai mitä tahansa yhdistettä, joka annostuksen jälkeen ottajassa kykenee muodostamaan (suoraan tai epäsuoraan) kaavan (I) mukaisen yhdisteen tai sen anti-vi-20 raalisesti aktiivisen metaboliitin tai jäännöksen.

« • I · lii « « ' Alan ammattimiehelle on selvää, että kaavan (I) mukaisia yhdisteitä voidaan • a ‘ ]’ modifioida farmaseuttisesti hyväksyttävien johdannaisten aikaansaamiseksi • · · mihin tahansa funktionaaliseen ryhmään yhdisteissä. Erityisen mielenkiintoisina • · # • · · 25 tällaisina johdannaisina ovat yhdisteet, jotka on modifioitu C-1-karboksyylifunk- • · · tion, C-7- tai C-9-hydroksyylifunktioiden tai aminoryhmien kohdalla. Näin mielen- .···. kiintoisiin yhdisteisiin kuuluu kaavan (I) mukaisten yhdisteiden C^-alkyyli- (ku- • · ten metyyli, etyyli tai propyyli, esim. isopropyyli) tai aryyli- (esim. fenyyli, bentso- • · yyli) esterit, kaavan (I) mukaisten yhdisteiden C-7- tai C-9-esterit, kuten sen • · · 30 asetyyliesterit, C-7- tai C-9- eetterit, kuten fenyylieetterit, bentsyylieetterit, p- • · tolyylieetterit, ja asyloidut aminojohdannaiset, kuten formyyli, asetamido.

• · · • · · · · · • «· • · 5 105478

Alan ammattimiehille on selvää, että kaavan (I) mukaisten yhdisteiden farmaseuttisesti hyväksyttävät johdannaiset voidaan derivatisoida enemmän kuin yhdessä kohdassa.

5 Kaavan (I) mukaisten yhdisteiden farmaseuttisesti hyväksyttäviin suoloihin kuuluu farmaseuttisesti hyväksyttävistä, epäorgaanisista ja orgaanisista hapoista ja emäksistä johdetut. Esimerkkejä sopivista hapoista ovat kloorivety-, bromivety-, rikki-, typpi-, perkloori-, fumaari-, maleiini-, fosfori-, glykoli-, maito-, salisyyli-, meripihka-, tolueeni-p-sulfoni-, tartaari-, etikka-, sitruuna-, metaanisulfoni-, 10 muurahais-, bentseeni-, maloni-, naftaleeni-2-sulfoni- ja bentseenisulfonhappo. Muut hapot, kuten oksaalihappo, vaikka eivät itsestään farmaseuttisesti hyväksyttäviä, voivat olla hyödyllisiä valmistettaessa suoloja, jotka ovat hyödyllisiä välituotteina valmistettaessa keksinnön mukaisia yhdisteitä ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttäviä happoadditiosuoloja.

15

Sopivista emäksistä johdettuihin suoloihin kuuluvat alkalimetalli- (esim. natrium), maa-alkalimetalli- (esim. magnesium), ammonium-ja NR4+ (jossa R on C^alkyy-li) suolat.

• « I

':': 20 Viittaukset seuraavassa keksinnön mukaiseen yhdisteeseen sisältävät myös kaavan (I) mukaiset yhdisteet niiden farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat.

« • * · :.\i Erityisen edullisia keksinnön mukaisia yhdisteitä ovat: • · · • · · • · · 25 5-Asetamido-4-amino-2.3.4.5-tetradeoksi-D-alvsero-D-aalakto-non-2-enopvra- ·«· v : nosonihappo (myös tunnettu 5-(asetyyliamino)-4-amino-2,6-anhydro-3,4,5- • · · v ; trideoksi-D-alvsero-aalakto-non-2-enoiinihappona). sen suolat mukaan lukien natriumsuola ja 5-asetamido-4-auanidiino-2.3.4.5-tetradeoksi-D-qalakto-non-2-·’··: enopyranosonihappo (myös tunnettu 5-(asetyyliamino)-2,6-anhydro-4-guani- 30 diino-3.4.5-trideoksi-D-glvsero-D-aalakto-non-2-enoiinihappona) ja sen suolat * · · . ·.: mukaan lukien ammoniumsuola.

• ♦ 105478 6

Kaavan (I) mukaista yhdistettä ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävää suolaa ja johdannaisia voidaan keksinnön mukaisesti valmistaa siten, että (A) saatetaan kaavan (III) mukainen yhdiste 5

OH

ΗΟ-γ^γ°γ^Η T 1 11 (m)

OH /\Au R4 Ξ H OL

10 jossa R4 tarkoittaa samaa kuin edellä ja OL on poistuva ryhmä, (esimerkiksi sulfonihapporyhmä, kuten tosyyli, mesyyli, trifluorimesyyli), tai mainitun yhdisteen suojattu johdos reagoimaan nukleofiilin, esimerkiksi atsidin, syanidin, sopivan karbanionin tai tioasetaatin, kanssa; tai 15 (B) interkonversoidaan kaavan (I) mukainen yhdiste toiseksi kaavan (I) mukaiseksi yhdisteeksi, ja tarvittaessa saatetaan saatu yhdiste yhteen tai kahteen lisäreaktioon, joita ovat: (i) minkä tahansa suojaavan ryhmän poistaminen; 20 (ii) kaavan (I) mukaisen yhdisteen tai sen suolan muuntaminen sen farmaseutti- j'\. sesti hyväksyttäväksi suolakseen.

«

Ml « • * * «

Toisessa menetelmässä (B) kaavan (I) mukaiset yhdisteet voidaan valmistaa • · · ·’ muista kaavan (b) mukaisista yhdisteistä interkonversiolla. Näin kaavan (I) mu- 25 kaisia yhdisteitä, jossa R3 on NH2 tai CH2NH2, voidaan valmistaa pelkistämällä • · · ; vastaava atsido- tai syanoanalogi.

• · ·

• t I

• » · t

Alan ammattimiehelle on selvää, että voi olla välttämätön tai toivottava missä *.··*: tahansa edellä kuvatun menetelmän vaiheessa suojata yksi tai useampi herkkä ;···. 30 ryhmä molekyylissä ei-toivottujen sivureaktioiden välttämiseksi; suojaava ryhmä • · · •:. j voidaan poistaa missä tahansa sopivassa reaktiokulun seuraavassa vaiheessa.

7 105478

Suojaavia ryhmiä, joita käytetään kaavan (I) mukaisten yhdisteiden valmistuksessa, voidaan käyttää tavanomaisella tavalla. Katso esimerkiksi 'Protecting Groups in Organic Chemistry' Ed. J. F. W. McOmie (Plenum Press 1973) tai 'Protecting Groups in Organic Synthesis', Theodora W Greene (John Wiley and 5 Sons 1981).

Tavanomainen aminoa suojaava ryhmä voi olla esimerkiksi aralkyyliryhmät, kuten bentsyyli-, difenyylimetyyli- tai trifenyylimetyyliryhmät; ja asyyliryhmät, kuten N-bentsyylioksikarbonyyli tai t-butoksikarbonyyli. Siten, yleiskaavan (I) 10 mukaisia yhdisteitä, jossa yksi tai molemmat ryhmistä R2 ja R3 on vety, voidaan valmistaa poistamalla vastaavan suojatun yhdisteen suojaus.

Hydroksiryhmät voivat olla suojattuja, esimerkiksi aralkyyliryhmällä, kuten bentsyyli-, difenyylimetyyli- tai trifenyylimetyyli-ryhmillä, asyyliryhmillä, kuten 15 asetyylillä; piitä suojaavilla ryhmillä, kuten trimetyylisilyyliryhmillä; tai tetrahydro-pyraanijohdiksina.

Minkä tahansa suojaavan ryhmän poisto voidaan suorittaa tavanomaisilla mene- telmillä. Näin aralkyyliryhmä, kuten bentsyyli, voidaan poistaa hydrogenolyysilla 20 katalyytin (esim. palladiumin hiilillä) läsnäollessa; asyyliryhmä, kuten N-bents- j ·.. yylioksikarbonyyli, voidaan poistaa hydrolyysilla, esimerkiksi bromivedyllä etik- .,;j’ kahapossa tai pelkistämällä, esimerkiksi katalyyttisella hydrauksella; piitä suo- jaavat ryhmät voidaan poistaa, esimerkiksi käsittelemällä fluoridi-ionilla; ·♦· __ : tetrahydropyraaniryhmät voidaan poistaa hydrolyysilla happamissa olosuhteis- 25 sa.

··· • · · .

• · ♦ • · ·

Jossa se on tarpeellista eristää keksinnön mukainen yhdiste suolana, esimerkik- • ..............- si happoadditiosuolana, tämä saavuttaa käsittelemällä yleiskaavan (I). mukainen '···*: vapaa emäs sopivalla hapolla, mieluummin ekvivalenttimäärän kanssa, tai .···. 30 kreatiniinisulfaatilla sopivassa liuottimessa (esim. vesipitoisessa etanolissa).

«· · I · 8 105478

Esillä olevaa keksintöä selostetaan edelleen seuraavissa esimerkeissä, jotka ainoastaan havainnollistava sitä, eivätkä niitä pidä käsittää keksinnön rajoittamisena.

5 Yleismetodiikka

Seuraavia yleismenetelmiä käytetään keksinnön mukaisten yhdisteiden synteeseissä.

10 Deasetylointi

Asetyloidun aineksen käsittely Amberlite IRA 400:Ha (OH-) sekoittaen, ajanjakson, yleensä 2-3 h, huoneenlämpötilassa johtaa täudelliseen de-O-asetyloi-tumiseen. Hartsi suodatetaan pois ja suodos väkevöidään kuiviin, jolloin saa-15 daan toivottu de-O-asetyloitu aines.

Alan ammattimiehille on selvää, että muitakin tavanomaisia menetelmiä on käytettävissä saman aineksen täydellistä de-O-asetylointia varten, kuten käsitte-ly natriummetoksidilla metanolissa.

: 20 j De-esteröinti • · · •»*« ;.‘.j Täydellisesti de-O-asetyloitu aines liuotetaan vesipitoiseen natriumhydroksidiin • · · : : · ja sekoitetaan huoneenlämpötilassa ajanjakson, yleensä 2-3 h. Seos säädetään 25 sitten pH-arvoon 7,0-7,5 Dowex 50w X 8 (H+)-hartsilla. Suodatus ja sen jälkeinen ·»· v : pakaste-kuivaus antaa toivotun de-esteröidyn aineen.

··· • ♦ · » ♦ ·

Alan ammattimiehet pystyvät helposti selvittämään useita vaihtoehtoisia mene-·:**: telmiä saman aineen de-esteröinnille, kuten happohydrolyysi, vaihtoehtoinen 30 emäshydrolyysi, esim. ammoniumhydroksidi, kaliumhydroksidi.

• · 4

Mm!

Kaavan (I) mukaisilla yhdisteillä on anti-viraalinen aktiivisuus. Erityisesti nämä yhdisteitä ovat ortomyksovirusten ja paramyksovirusten viraalisten neuramiini- - i 9 105478 daasin, esimerkiksi influenssa A:n ja B:nr parainfluenssan, sikotaudin ja Newcastletaudin, linturuton ja Sendaiviruksen viraalisen neuramiinidaasin, inhi-biittoreita.

5 Edelleen on selvää, että hoitoon vaadittava keksinnön mukaan saatu yhdisteen määrä vaihtelee ei ainoastaan riippuen valitusta yhdisteestä vaan myös antamistavasta, hoidon kohteen tilasta ja potilaan iästä ja kunnosta, ja riippuu loppukädessä hoitavan lääkärin tai eläinlääkärin harkinnasta. Yleensä kuitenkin sopiva annos voi olla välillä noin 0,01 - 750 mg/kg ruumiinpaino päivä 10 kohti, mieluummin välillä 0,1 -100 mg/kg/päivä, kaikkein mieluiten välillä 0,5-25 mg/kg/päivä.

Erityisesti olemme havainneet, että kokeiltujen yhdisteiden tehokas määrä riippuu niiden in vitro tehosta. Näin DANA (jonka IC50 täplän pienenemisessä on 15 5pg/ml) on osoittautunut tehokkaaksi annoksella välillä 1 ja 10 mg/kg per käsittely. Vastaava DANA: n metyyliesteri (10^ 50-100 pg/ml) on tehokas suhteellisesti korkeammilla annoksilla.

:'": Käsittely aloitetaan mieluummin ennen tai infektion aikana ja jatketaan kunnes «· * 20 virusta ei enää ole läsnä hengitystiehyissä. Kuitenkin yhdisteet ovat myös tehoksi ' ·.. kaita annettu infektion jälkeen, esimerkiksi todettujen oireiden ilmenemisen >#;j· jälkeen.

« · « · » • · · • · • · i Tarkoituksenmukaisesti käsittelyä annetaan 1 -4 kertaa päivässä ja jatketaan 25 3-7, esim. 5 päivää infektion jälkeen riippuen kyseessä olevasta käytetystä • · * : yhdisteestä.

• · · • · · • · · · · - - __

Sopiva annos voi olla yksittäisannos tai jaettuja annoksia, joita otetaan sopivin ·:··: välein, esimerkiksi kahtena, kolmena, neljänä tai useampana osa-annoksena .··. 30 päivässä.

• · • · · » * · 10 105478

Yhdistettä annostellaan tarkoituksenmukaisesti yksikköannoksena, esimerkiksi 10 -1500 mg, tarkoituksenmukaisesti 20 -1000 mg, tarkoituksenmukaisimmin 50 - 700 mg aktiivista ainesosa yksikköannosta kohden.

5 Vaikka on mahdollista että, terapiakäyttöön, keksinnön mukaan saatu yhdiste voidaan antaa raakana kemikaalina, sitä käytetään edullisesti farmaseuttisena valmisteena.

Edelleen voidaan valmistaa farmaseuttinen formulaatio, johon kuuluu kaava (I) 10 mukainen yhdiste, mutta ei siihen kuuluvien ehtoineen, tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola tai johdos yhdessä farmaseuttisesti hyväksyttävän kantoai-neen kanssa.

Kantoaine on oltava "hyväksyttävä" siinä mielessä, että se on yhteensopiva 15 muiden formulaation ainesosien kanssa ja ei ole haitallinen sen vastaanottajalle.

Farmaseuttiset formulaatiot voivat olla tarkoitetun antamistavan mukaisten tavanomaisten formulaatioiden muodossa.

f I i < I

r i i r i :' ·'; 20 Intranasaalista antamista varten keksinnön mukaisella menetelmällä neuramini- j' ·.. daasi-inhibiittoreita voidaan antaa millä tahansa menetelmällä ja formulaatiolla, ; i · joita on kehitetty intranasaalisen antamisen alalla.

• · · • ·

Siten yleensä yhdisteitä voidaan antaa liuoksen tai suspension tai kuivan jau-25 heen muodossa.

• · · • · · • · · • · · v : Liuokset ja suspensiot voivat yleensä olla vesipitoisia, esimerkiksi tehty pelkäs- tään vedestä (esimerkiksi steriilistä tai pyrogeeni-vapaasta vedestä), tai vedestä • « ·:··: ja fysiologisesti hyväksyttävästä lisäliuottimesta (esimerkiksi etanoli, propyleeni- .···. 30 glykoli, ja polyetyleeniglykolit, kuten PEG 400).

• · * « · « Tällaiset liuokset tai suspensiot voivat lisäksi sisältää muita lisäaineita, esimerkiksi säilöntäainetta (kuten bentsalkoniumkloridia), liukenemista edistävää ,, 105478 ainetta/pinta-aktiivista ainetta, kuten polysorbaattia (esim. Tween 80, Span 80, bentsalkoniumkloridi), puskuria, isotonisuutta säätävää ainetta, (esimerkiksi natrium kloridi), absorptiota tehostavaa ainetta ja viskositeettia tehostavaa ainetta. Suspensiot voivat lisäksi sisältää suspendointiainetta (esimerkiksi mikroki-5 teistä selluloosa, natriumkarboksimetyyliselluloosaa).

Liuoksia tai suspensioita annetaan suoraan nenäonteloon tavanomaisella tavalla, esimerkiksi tippalaiteella, pipetillä tai suihkeella. Formulaatiot voivat olla yksittäis- tai moniannoksen muodossa. Jälkimmäisessä tapauksessa edullista 10 järjestää mukaan annosmittari. Jos on kyse tippalaitteesta tai pipetistä voi potilas käyttää sopivaa, edeltä päin määrättyä liuoksen tai suspension tilavuutta. Suihke voidaan toteuttaa mittaavalla hajottavalla spraypumpulla.

Intranasaalinen antaminen voidaan myös aikaansaada aerosoliformulaatiolla, 15 jossa yhdiste on paineistetussa pakkauksessa sopivan ponneaineen, kuten kloorifluorihiilen (CFC), esimerkiksi diklooridifluorimetaanin, trikloorifluorimetaa-nin tai diklooritetrafluorietaanin, hiilidioksidin tai muun sopivan kaasun, kanssa. Aerosoli voi tarkoituksenmukaisesti myös sisältää pinta-aktiivista ainetta, kuten lesitiiniä. Lääkkeen annosta voidaan kontrolloida käyttämällä mittaventtiiliä.

Ml 20 : * .. Vaihtoehtoisesti yhdisteitä voidaan käyttää kuivan jauheen muodossa, esimer- ;:· kiksi yhdisteen jauheseoksena sopivassa jauhepohjassa, kuten laktoosissa, :/·{ tärkkelyksessä, tärkkelysjohdannaisissa, kuten hydroksipropyylimetyyliselluloo- ·* sassa ja polyvinyylipyrrolidiinissä (PVP). Tarkoituksenmukaisesti jauhekantoaine 25 muodostaa geelin nenäontelossa. Jauheseosta voidaan käyttää yksikköannok- • · · •V : sen muodossa, esimerkiksi kapseleina tai patruunoina, esim. kelaattina tai kup- ··· : lapakkauksena, joista jauhe voidaan antaa inhalointilaiteeen avulla.

• · • ♦ » • · ♦ • · ·:··: Intranasaaliformulaatioissa yhdiste on yleensä pieni hiukkaskoko, esimerkiksi . · · ·. 30 suuruusluokkaa 5 mikronia tai vähemmän. Tällainen hiukkaskoko voidaan saada • · « · · ....: tunnetuilla tavoilla, esimerkiksi mikronisoimalla.

• · 12 105478

Haluttaessa formulaatiot voidaan muokata aktiiviaineen hidastettua vapauttamista varten. Keksinnön mukaisia yhdisteitä voidaan myös käyttää yhdistelmänä muiden terapeuttisten aineiden, esimerkiksi muiden tulehdusta estävien aineiden, kanssa. Erityisesti keksinnön mukaisia yhdisteitä voidaan käyttää yhdessä 5 muiden anti-viraalisten aineiden kanssa. Keksinnön mukaan saadaan siis vielä seos, joka sisältää kaavan (I) mukaista yhdistettä tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävää suolaa tai johdannaista yhdessä toisen terapeuttisesti aktiivisen aineen, erityisesti anti-viraalinen aineen, kanssa.

10 Edellä mainitut yhdistelmät, joita tarkoituksenmukaisesti voidaan käyttää farmaseuttisen formulaation muodossa ja näin tällaiset formulaatiot sisältävät yhdistelmä kuten edellä on määritelty yhdessä farmaseuttisesti hyväksyttävän kantoai-neen, muodostavat keksinnön lisäaspektin.

15 Sopivia terapeuttisia aineita käytettäväksi tällaisissa yhdistelmissä käsittävät muita infektionvastaisia aineita, erityisesti antibakteeriset ja anti-viraalista aineet, kuten ilmatiehyttulehduksien hoitoon käytetyt. Esimerkiksi, muita influenssan viruksia vastaan tehokkaita yhdisteitä, kuten amantadiinia, rimantadiinia ja ribaviriinia, voidaan sisällyttää tällaisiin yhdistelmiin.

:T: 20 Tällaisten yhdistelmien yksittäisiä komponentteja voidaan antaa joko peräkkäin *: · tai samanaikaisesti erillisissä tai yhdistetyissä farmaseuttisissa formulaatioissa.

«M« • · • · · • · · • · :T: Kun keksinnön mukaisia yhdisteitä käytetään yhdessä toisen terapeuttisen 25 aineen kanssa, joka on aktiivinen samaa virusta vastaan, kunkin yhdisteen annos voi joko olla sama tai erilainen kuin jos kukin yhdiste käytetään yksitellen.

· Alan ammattimies pystyy helposti arvioimaan sopivat annokset.

• · • · · • · · • · ·:··· Välituoteyhdisteitä, jotka on mainittu esimerkeissä 1-15 ovat identifioitu seuraa- 30 vassa: • · • · · « · 13 105478

Yhdiste 2

Metyyli-S-asetamido-T.e.S-tri-O-asetyyli^.S.S-trideoksi-D-glysero-D-talo-non^-enopyranosonaatti (4-epi-Neu5,7,8r9Ac42enlMe) 5

Yhdiste 3

Metyyli-5-asetamido-7,8,9-tri-0-asetyyli-4-atsido-2,3,5-trideoksi-D-glysero-D-galakto-non-2-enopyranosonaatti (4-atsidoNeu5,7,8,9Ac42enlMe) 10

Yhdiste 5

Metyyli-5-asetamido-7,8,9-tri-0-asetyyli-4-amino-2,3,4,5-tetradeoksi-D-glysero-D-galakto-non-2-enopyranosonaatti (4-amino-Neu5,7l8,9Ac42enlMe) 15

Yhdiste 8

Metyyri-S-asetamido^.B.Ö-tri-O-asetyylM-N.N-diallyyliamino^.S^.S-tetra-deoksi-D-glysero-D-galakto-non-2-enopyranosonaatti 20 (4-NIN-diallyyliamino-Neu5,7l8,9Ac42enlMe) « · < ·:· Yhdiste 10 f * 4 < — l « • · · • · · • · :]:'·* Metyyli-S-asetamido^.e.ä-tri-Ö-asetyylM-N-allyyliamino^.S^.S-tetradeoksi- 25 D-glysero-D-galakto-non-2-enopyranosonaatti (4-N-allyyliamino- v': NeuSJAÖAc^enlMe) • · · • · * • · · :*·.· Yhdiste 12 • ♦ « « .···. 30 Metyyli-5-asetamido-7,8,9-tri-0-asetyyli-4-amino-2,3,4,5-tetradeoksi-D-glysero- a · D-talo-non-2-enopyranosonaatti (4-epi-4-aminoNeu5I7,8,9Ac42enlMe)

Yhdiste 13 14 105478

Metyyli^Aö-tn-O-asetyyli^.S.S-trideoksi-^.S-dihydro-Zmetyylioksatsolo-[5,4-d]-D-glysero-D-talo-non-2-enopyranosonaatti 5 (4-epi-4,5-oksatsaloNeu7,8I9Ac32enlMe)

Yhdiste 15

Metyyli-S-asetamido-Z.e.tMri-O-asetyylM-atsido^.S^.S- tetradeoksi-D-glysero-10 D-talo-non-2-enopyranosonaatti (4-epi-atsidoNeu5,7,8I9Ac42enlMe)

Yhdiste 16

Metyyli-5-asetamido-4-atsido-2,3,4,5-tetradeoksi-D-glysero-D-talo-non-2-enopy-15 ranosonaatti (4-epi-atsidoNeu5Ac2enlMe)

Yhdiste 18

Metyyli-S-asetamido^.e.g-tri-O-asetyyli^-N-metyyliamino^.S^.S-tetradeoksi-D-; 20 glysero-D-galakto-non-2-enopyranosonaatti ;''.. (4-N-metyyliamino-Neu5,7,8,9Ac42enlMe) ( I { (

I « ( I

Yhdiste 19 • · « « · • · t 25 Metyyii-S-asetamido^-N-metyyliamino^.S^.ö-tetradeoksi-D-glysero-D-galakto- • · · : non-2-enopyranosonaatti (4-N-metyy!iaminoNeu5Ac2enlMe) «t · • · · • · · *

Yhdiste 21 • · .···. 30 Metyyli-S-asetamido^.e^-tri-O-asetyyli^-N.N-dimetyyliamino^.S^.S-tetra- • 4 · ....: deoksi-D-glysero-D-galakto-non-2-enopyranosonaatti (4-N,N-dimetyyliamino-Neu5,7,8,9Ac42enlMe) is 105478

Yhdiste 22

Metyyli-5-asetamido^-N,N<iimetyyliamino-2,3,4,5-tetradeoksi-D-glysero-D-galakto-non-2-enopyranosonaatti (4-N,N-dimetyy!iaminoNeu5Ac2enlMe) 5

Yhdiste 24 3-Deoksi-D-glysero-D-galakto-2-nonulopyranosonihappo (KDN) 10 Yhdiste 25

Metyyli-3-deoksi-D-glysero-D-galakto-2-nonulopyranosonaatti (KDNIMe)

Yhdiste 26 15

Metyl-(4,5,7,8,9-penta-0-asetyyli-2,3-dideoksi-D-glysero-B-D-galakto-2-nonulo-pyranosyylikloridi)-onaatti (KDN4,5,7,8,9Ac52BCIIMe)

Yhdiste 27 • I I — — I — 20

Metyyli-4,5,7,8,9-penta-0-asetyyli-2,3-dideoksi-D-glysero-D-galakto-non-2-enopyranosonaatti (KDN4,5,7,8,9Ac52enlMe) • « • * * • · · • · : Yhdiste 28 25

Ml _____________ v : Metyyli-2,3-dideoksi-D-glysero-D-galakto-non-2-enopyranosonaatti (KDN2enl- • « · v 1 Me) • « • t · » · • · *!"·* Yhdiste 29 30 c i * · % •;· j Hydratsinium-4,5-diamino-2l3,4,5-tetradeoksi-D-glysero-D-galakto-non-2-enopy- ranosonaatti (hydratsinium-4,5-diaminoNeu2en)

Yhdiste 30 ie 105478 4,5-Diamino-2,3,4,5-tetradeoksi-D-glysero-D-galakto-non-2-enopyranosonihap-po (4,5-diaminoNeu2en) 5

Esimerkki 1

Natrium-5-Asetamido-4-atsido-2.3,4.5-tetradeoksi-D-alvsero-D-aalakto-non-2-enopyranosonaatin (4-atsido Neu5Ac2en) (4) valmistus 10

Kokonaisreaktiokaavio on seuraavanlainen: /c /' ^Ac H,CX AcQ OH H*% O 9 P _/ 1)BF3.Et20 - >—Sj MeOH/C-H4 °

15 H3C^hN-^^ -i-U- H3C HN

I AcO 2) HOAc/etyyli- Y

O asetaatti/HjO O

(1) (2) 1) TY20/pyrldiini/ ... ch2ci2 : : 2) NaN3/m-Bu4N.HS04/

.:i:. 20 „ DMP

• · # : HO 9H OH O P'Na+ Ac AC H3C\ •i ΓοΓ ou£vf Γ n3 2) oh-

Ac VN n3 (4) Ac 25 (3) • · · m • · · • · · • · · : (2Vn valmistusmenetelmä • · · • · 30 Sekoitettuun liuokseen, jossa oli metyyli-5-asetamido-4,7,8,9-tetra-0-asetyyli- #” \ 2.3.5-trideoksi-D-alvsero-D-aalakto-non-2-enopvranosonaattia (1) (1500 mg, • · 3,17 mmol) bentseenin (50 ml) ja metanolin (300 mg) seoksessa lisättiin tipoit-tain BF3Et20:a (12 ml) yli 30 minuutin ajan typpikehässä huoneenlämpötilassa.

17 105478

Sitten koko seoksen annettiin sekoittua huoneenlämpötilassa 16 tuntia. Liuos laimennettiin etyyliasetaatilla (250 ml), pestiin peräkkäin kyllästetyllä NaHC03-liuoksella (30 ml x 3) ja vedellä (20 ml x 3), sitten haihdutettiin pieneen tilavuuteen (noin 10 ml), johon lisättiin vettä (0,5 ml) ja etikkahappoa (0,5 ml). Sitten 5 koko seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa kaksi päivää ennen etyyliasetaatilla (200 ml) laimentamista. Etyyliasetaattiliuos pestiin 5 % NaHC03-liuoksella (30 ml x 2) ja vedellä (20 ml x 3), sitten haihdutettiin kuiviin. Jäännös kromato-grafoitiin (eluointiliuottimena silikageeli, etyyliasetaatti), jolloin saatiin puhdasta yhdistettä (2) (550 mg, 40 %).

10 1H nmr (CDCI3) δ (ppm); 1,95, 2,06, 2,08, 2,10, 2,35 (s, 15H, asetyyli CH3 x 5), 3,80 (s, 3H, COOCH3), 4,1-4,4 (m, 4H, H4, Hs, H6, H9), 4,82 (dd, 1H, J9,e 1,8Hz, J9iff 12,3Hz, H9), 5,27 (m, 1H, H8), 5,45 (dd, 1H, J78 3,5Hz, H7), 6,15 (d, 1H, J3<4 5,4Hz, H3), 6,47 (d, 1H, Jnh,58,8Hz, -CONH).

15 (31:n valmistusmenetelmä

Sekoitettuun liuokseen, jossa oli yhdistettä (2) (800 mg, 1,67 mmol) vedettömässä dikloorimetaanissa (10 ml) ja kuivassa pyridiinissä (316 mg, 4 mmol) ,... t -30°C - -40°C:ssa lisättiin tipoittain liuos, jossa oli trifluorimetaanisulfonianhydri- • « 20 diä (Tf20) (556 mg, 2 mmol) dikloorimetaanissa (2 ml) yli 15 minuutin ajan. Sit- • · · :·. ten reaktioseosta sekoitettiin -30°C:ssa 5 tuntia ja väkevöitiin kuiviin tyhjössä.

Sitten jäännös liuotettiin kuivaan DMF:iin (5 ml), joka sisälsi natriumatsidin a (650 mg, 10 mmol) ja tetrabutyyliammoniumvetysulfaatin (170 mg, 0,5 mmol) • «· t seosta. Reaktioseosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 16 tuntia ja sitten haih- • * .........

25 dutettiiin kuiviin suurtyhjössä. Jäännös jaettiin etyyliasetaatin (200 ml) ja veden (50 ml) kesken. Orgaaninen kerros erotettiin ja pestiin vedellä (50 ml x 2), kui- vattiin Na2S04:lla, haihdutettiin, jolloin saatiin jäännös (780 mg), joka kaksois- . kromatografoitiin (silikageeli, ensimmäinen liuotinjärjestelmä oli etyyliasetaat- * · , *., | ti/asetoni: 8/1; toinen liuotinjärjestelmä oli dikloorimetaani/vesi: 10/1), jolloin • t 30 saatiin väritöntä öljyä (3) (185 mg, 24 %).

:···; MS (FAB) 457 (M+ + 1), 414 (M+ -N3. [a]2D° + 19.1° (Cl, MeOH).ir.(CHCI3) cm*1 2100 (N-N3). 1748 (karbonyyli).

18 105478 1H-nmr (CDCI3) δ (ppm) 2,04, 2,05, 2,06, 2,12, (s, 12H, asetyyli CH3 x 4), 3,79 (s, 3H, C00CH3), 3,91 (ddd, 1H, J5,NH 8,4Hz, J5.4 8,8 Hz, J5.6 9,9Hz, H5), 4,17 (dd, 1H, Jff8 6,8Hz, J9.9, 12,5Hz, H8i), 4,42 (dd, 1H, J4,3 2,9Hz, J4>5 8,8Hz, H4), 4,48 (dd, 1H, J6t7 2,3Hz, J6i59,9Hz, H64,46 (dd, 1H, J9i82,7Hz, J9.9, 12,5Hz, H9), 5 5,31 (m, 1H, J87 5,2Hz, J8,9 2,7Hz, J8.9, 6,8Hz, H8), 5,45 (dd, 1H, J7i6 2,3Hz, J7>8 5,2Hz, H7), 5,96 (d, 1H, J3i4 2,9H, H3), 6,13 (d, 1H, JNH(5 8,4Hz, CONH) 13C-nmr (CDCI3) δ (ppm) 20,7 (CH3-C0-0-), 23,2 (CH3CO-NH), 48,3 (C5), 52,6 (COOCH3), 57,8 (C4), 62,1 (C9), 67,7, 70,9 (C7, C8), 75,9 (C6), 107,6 (C3), 145,1 (C2), 161,5 (CJ, 170,2, 10 170,3, 170,7, (asetyyli -C = 0 x 4).

(4Vn valmistusmenetelmä

Yhdiste (3) (50 mg, 0,11 mmol) liuotettiin vedettömään metanoliin (5 ml), joka 15 sisälsi natriummetoksidia (8 mg, 0,15 mmol). Seosta sekoitettiin huoneenlämpö-tilassa 2 tuntia ja väkevöitiin kuiviin tyhjössä. Jäännös liuotettiin veteen (3 ml), sekoitettiin huoneenlämpötilassa 1,5 tuntia, pH säädettiin arvoon 6-7 Dowex 50 x 8 (H+)-hartsilla, ja sitten lyofilisoitiin, jolloin saatiin otsikkoyhdistettä (4) .·**. (35 mg, 94 %).

20 i.r. (KBr)cnr1 3400 (lev. -OH), 2100 (-N3), 1714 (karbonyyli).

1H-nmr (D20) δ (ppm) 2,06 (5, 3H, asetyyli CH3), 3,64 (dd, 1H, J9.8 6,3Hz, Jg.9 ’ 11,8Hz, Hg,), 3,65 (dd, 1H, J7i63,9Hz, J7i86,8Hz, H7), 3,88 (dd, 1H, J9>82,6Hz, i\: J9.9. 11.8Hz, H9), 3,94 (m, 1 H, J8.7 6,8Hz, J8.9 2,6Hz, J8>9, 6,3Hz, H8), 4,21 (dd, 1 H, :T; J5410,4Hz, J56 8,9Hz, H5), 4,31 (dd, 1H, J4,3 2,2Hz, J45 2,2Hz, J4,510,4Hz, H4), 25 4,34 (dd, 1 H, J6t5 8,9Hz, J6.7 3,9Hz, H8) 5,82 (d, 1 H, J3,4 2,2Hz, H3).

«·· • · « • · ·

Esimerkki 2 • - • · • · · • · · • ·

Natrium-5-Asetamido-4-amino-2.3.4.5-tetradeoksi-D-alvsero-D-aalakto-non-2-30 enopyranosonaatin (4-amino-Neu5Ac2en) (6) valmistusmenetelmä « « ·

Kokonaisreaktiokaavio on seuraavanlainen: • · 19 105478 A oAoac aLJsXr^°'^^-40

™fi mcl^T

g Ac Ac (¾ © OH 01Ma+ . £===* (6) 15 (5Vn valmistusmenetelmä

Liuokseen, jossa oli esimerkissä 1 valmistettua metyyli-5-asetamido-7,8,9-tri-0-asetvvli-4-atsido-2.3.4.5-tetradeoksi-D-alvsero-D-aalakto-non-2-enopvranoso-,···. naattia (3) (95 mg, 0,208 mmol) pyridiinissä (6 ml) kuplitettiin H2S:lla 16 tuntia 20 huoneenlämpötilassa. Sitten liuosta suihkutettiin typellä 15 minuuttia ja haihdu- · · :·. tettiin pyridiinin poistamiseksi suurtyhjössä. Jäännös kromatografoitiin (silika- «· geeli, etyyliasetaatti/isopropanoli/vesi = 5/2/1), jolloin saatiin väritöntä yhdistettä j:‘/: (5) (50 mg, 56 %).

.·*:·! MS (FAB) 431 (M+ + 1), 414 (M+ -NH2), [a]2D° +34,5° (Cl, MeOH) i.r. (CHCI3) cm'1 25 3400 (lev. NH2), 1740 (karbonyyli).

1H-nmr (CDCI3 + CD3OD) δ (ppm) 1,96, 2,06, 2,07, 2,10 (s, 12H asetyyli CH3 x 4), 3,81 (S, 3H, -COOCH3), 3,92 (lev. t, 1H, J5,4 & J5,e 10Hz, H5), 4,17 (dd, 1H, j 7,2Hz, Jg>i9 12,3Hz, Hg,), 4,22 (lev. dd, 2H, J48 & J8i5 10Hz, J43 & Jg7 2,1 Hz, H4 & H6), 4,71 (dd, 1H, J9e 2,6Hz, J9>g, 12,3Hz, H9), 5,31 (m, 1H, J87 4,9Hz, J8i9 • · * .30 2,6Hz, Je>9, 7,2Hz, H8), 5,45 (d, 1 H, J7.6 2,1 Hz, J7.8 4,9Hz, H7), 5,97 (d, 1 H, J3.4 2,ihz,h3).

13C-nmr (CDCI3 + CD3OD) δ (ppm) 105478 20 20,2, 20,3 (CH3-C0-0-), 22,3 (CH3-CO-NH), 48,2 (C5), 50,4 (C4), 52,0 (COOCH3), 52,1 (C9), 67,8, 71,2 (C7l C8), 76,5 (C6), 112,5 (C3), 143,5 (C2), 162,0 (C,), 170,2,170,4,170,8,172,2 (asetyyli C = 0 x 4).

5 (6):n valmistusmenetelmä

Yhdiste (5) (50 mg, 0,116 mmol) liuotettiin vedettömään metanoliin (5 ml), joka sisälsi natriummetoksidia (12,4 mg, 0,23 mmol). Seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 1,5 tuntia ja haihdutettiin kuiviin tyhjössä 30°C:ssa. Jäännöstä 10 sekoitettiin vedessä (3 ml) huoneenlämpötilassa kunnes TLC (silikageeli, etyyli asetaatti/metanoli/0,1 N HCI = 5/4/1) osoitti, että hydrolyysi on päättynyt. Sitten liuoksen (pH noin 10,5) pH säädettiin asteittain arvoon noin 7,5 Dowex 50 x 8 (H+)-hartsilla. Kun liuoksen pH saavutti arvon 7,5, suspensio suodatettiin nopeasti puristussuodattimella. Suodos lyofilisoitiin, jolloin saatiin otsikkoyhdistettä 15 (6) (30 mg, 83 %).

1H-nmr (D20) δ (ppm) 2,07 (S, 3H, asetyyli CH3), 3,59-3,70 (m, 2H, H7 & H9l), 3,89 (dd, 1H J9>8 2,6Hz, -J99. 11,8Hz, Hg), 3,95 (m, 1H, H8), 3,99 (tev. d, 1H, J4.510,6Hz, H4), 4,21 (lev. t, 1H, J5>4 & J5610,6Hz, H5), 4,29 (lev. d, 1 H, J6>5 10,6Hz, H6), 5,66 (d, 1H J3>4 1,9Hz, H3).

20 • · · :·. Esimerkki 3 • t 1 - « • · · « «

Ammonium-5-asetamido-4-auanidiino-2.3.4.5-tetradeoksi-D-alvsero-D-aalakto- • · non-2-enopyranosonaatin (7) valmistusmenetelmä.

25

Kokonaisreaktiokaavio on seuraavanlainen: 9 :T: OAc ho \ s-ch3 \ Ä / Λ 1) H,N-C=NH /

, AcO-Y OAc O H0—( OH O

·...· Ac wn2 2) Dowex 50Wx8 Ac HN

·:·: NH40H \=nh (5) Hz" (7) i 21 105478

Liuokseen, jossa oli S-metyyli-isoureaa (546 mg, 3 mmol) vedessä (15 ml) jää-haudelämpötilassa lisättiin esimerkissä 2 valmistettua metyyli-5,7,8,9-tri-0-ase-tyyli-4-amino-2.3.4.5-tetradeoksi-D-alvsero-D-aalakto-non-2-enopvranosonaattia (5) 40 mg, 0,093 mmol). Reaktioseosta sekoitettiin 5°C:ssa seitsemän päivää ja 5 kaadettiin pylvääseen, jossa oli Dowex 50W X 8 (H+)-hartsia (35 ml). Sitten pylväs pestiin kylmällä vedellä (700 ml) ja eluoitiin 1,5 M NH4OH-liuoksella. Eluaatti (120 ml) väkevöitiin kuiviin suurtyhjössä. Saatu jäännös kromatografoitiin (silika-geeli; liuotinjärjestelmä 1: etyyliasetaatti/isopropanoli/vesi, 1/5/1; liuotinjärjestel-mä 2: 75 % isopropanoli), jolloin saatiin otsikkoyhdistettä (7) (8 mg, 24,5 %).

10

Yhdiste (7) sai aikaan voimakkaan, positiivisen Sakaguchi-reaktion, joka osoitti guanidiiniryhmän läsnäolon. Yhdisteen (7) NMR-tiedot on annettu alla.

1H-nmr (D20 + CD3OD) δ (ppm) 2,06 (s, 2H, asetyyli CH3), 3,60 (lev. d., 1H, J78 9,4Hz, H7), 3,63 (dd, 1H, J9.8 15 6,2Hz, Jg.9 11,8Hz, H9), 3,76 (lev. d, 1H, J45 9,4Hz, H4), 3,87 (dd, 1H, J98 2,6Hz, J9>9, 11,8Hz, H9), 3,93 (ddd, 1H, J8.7 9,4Hz, J8.9 2,6Hz, J89, 6,2Hz, H8), 4,01 (dd, 1 H, J5>4 9,4Hz, J5,610,6Hz, H5), 4,20 (lev. d., 1H J6>5 10,6Hz, H6), 5,63 (d, 1H, J3.4 2,1 Hz, H3).

I « I

20 Esimerkki 4

« « I

« « · « t t .:, Natrium-5-asetamido-4-N,N-diallwliamino-2,3.4,5-tetradeoksi-D-glvsero-D- * f I ( : galakto-non-2-enopvranosonaatti (9).

• · ··· • · · • · · 25 Kokonaisreaktiokaavio on seuraavanlainen: t · t « · « • · ««t • · · • · · • · I I I • · · • · « • · • « « · « « • · 105478 22 OAc

Ac°_/ 0Ac ° AfeCO^CN Ac0“V.,°*c 2 1 - * 7^^^rJT'°'CH> m -f7>i 1 5 ^ Ίψ ΑιΓ /Νχ j ^ (=) H,cT 11 ^CH, 12 ho " 10 ho—/oh 9

1) NaOMe/MeOH

-► bIH— 2) OH- Ac N'

/V

h2c ch2 15

Liuokseen, jossa oli allyylibromidia (60 mg, 0,5 mmol) ja metyyli-5-asetamido- 7.8.9- tri-0-asetyyli-4-amino-2,3,4,5-tetradeoksi-D-glyserg-D-galaktg-non-2-enopyranosonaattia (5) (90 mg, 0,209 mmol) asetonitriilissä (5 ml) lisättiin 20 hopeakarbonaattia (116 mg, 0,418 mmol). Seosta sekoitettiin ja suojattiin valolta :huoneenlämpötilassa 16 tuntia. Saatu suspensio suodatettiin, ja suodos haihdu-

t t I

,:. tettiin kuiviin. Jäännös saatettiin flash-pylväskromatografiaan (silikageeli, ( etyyliasetaatti, joka sisälsi 10 % metanolia), jolloin saatiin metyyli-5-asetamido- 7.8.9- tri-Q-asetvvli-4-NI.N-diallvvliamino-2.3.4.5-tetradeoksi-D-qlvsero-D-25 aalakto-non-2-enopvranosonaattia (8) (85 mg, 80 %).

’H-nmr (CDCI3) δ (ppm) 1,94, 2,05, 2,06, 2,11 (s, 12H, asetyyli CH3 x 4), 2,97 : :: (dd, 2H, Jioa,iob & ^10¾.iab 14,3Hz, Jioa.n & Jiaa.ii’ 7,6Hz, H10a & H10.a), 3,24 (dd, 2H, .·. : Jiob.ioa & Jiffb.iffa 14,3Hz, J10b,n & Jurb.11' 4,9Hz, H10b & H1ffb), 3,58 (dd, 1H, J43 !;.!! 2,4Hz, J4i5 9,3Hz, H4), 3,79 (s, 3H, COOCH3), 4,12-4,26 (m, 3H, H6, H9, H5), 4,70 30 (dd, 1H, J982,6Hz, J99, 12,3Hz, H9), 5,09 (dd, 2H, J^cis.n & Ji2'cis,ii. 10,6Hz, Jj2gem * · & Jl2'gem 1 i^HZ, H12cis & H12.cis), 5,14 (dd, 2H, Ji2trans,11 & Jl^trans.H' 17,7HZ, J12gem & ’’ " Ji2-gem ~ 1,5Hz, H12tfans & Η12ΐΓ3η8), 5,27-5,32 (m, 2H, He & -CONH-), 5,55 (dd, 1H, J762,1Hz, J78 4,7Hz, H7), 5,72 (m, 2H, H„ & H1V), 6,07 (d, 1H, J342,4Hz, H3).

23 105478

Yhdiste (8) (80 mg, 0,156 mmol) liuotettiin vedettömään metanoliin (10 ml), joka sisälsi natriummetoksidia (16,2 mg, 0,30 mmol).

Liuosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 2 tuntia, sitten haihdutettiin kuiviin.

5 Jäännös liuotettiin veteen (5 ml) ja jätettiin huoneenlämpötilaan kahdeksi tunniksi. Saatu liuos neutraloitiin Dowex 50 x 8 (H+):lla ja pakastekuivattiin, jolloin saatiin otsikkoyhdistettä (9) (49 mg, 80 %).

1H-nmr (D20) δ (ppm) 1,94 (s, 3H, asetyyli CH3), 3,24-3,44 (m, 4H, H10 x 2 & H10, x 2), 3,48-4,33 (m, 7H, H* H5, H6f H7, He, H9 & H9), 5,24-5,29 (m, 4H, H12 x 2 & 10 H12. x 2), 5,69 (d, 1 H, J3,4 2Hz, H3), 5,73-5,76 (m, 2H, H„ & Hir)

Esimerkki 5

Natrium-5-Asetamido-4-N-allvyliamino-2.3.4.5-tetra-deoksi-D-alvsero-D-aalakto-15 non-2-enopyranosonaatti (11)

Kokonaisreaktiokaavio on seuraavanlainen: a °fc ·...· nn . - f n allyylibromidi AcO·-/ OAc ® 20 AcO-K OAc O _V 6 λ 2 : : : V .o. Il ... AfcC03W» I:·:· a/ ^ *1 ; ·.: n ^ch, (5) 2 ::: m i2 25 :.T; ho J oh °

:Τϊ !) NaOM&MeOH Yl^O^___[I

• -► Ό 2) oh· ·.*·· Ac Nti 30 k.

.···. ^CH, (U) * • · 105478 24

Liuokseen, jossa oli allyylibromidia (48 mg, 0,40 mmol) ja yhdistettä (5) (155 mg, 0,36 mmol) asetonitriilissä (5 ml) lisättiin hopeakarbonaattia (107 mg, 0,38 mmol). Seosta sekoitettiin, samalla suojattiin valolta, huoneenlämpötilassa 16 tuntia. Saatu suspensio erotettiin suodattamalla, ja suodos haihdutettiin kuiviin.

5 Jäännös kromatografoitiin silikageelipylväässä (etyyliasetaatti/isopropanoli/vesi = 5:2:1). Jakeet, joiden FVarvo oli 0,5 yhdistettiin ja haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin yhdistettä (10) (53 mg, 32 %). Lähtöaine (5), jonka FVarvo oli 0,3 (61 mg, 39 %) ja Ν,Ν-diallyylijohdos (8), jonka Rrarvo oli 0,9 (20 mg, 11 %) poistettiin vastaavasti.

10 Yhdisteen (10) ’H-nmr (CDCI3) osoittaa seuraavaa.

δ (ppm) 1,96, 2,05, 2,06, 2,11 (s, 12H, asetyyli CH3x4), 3,25 (dd, 1H, *Jioa,iob-"l4>"lhtei Jioa,n 5,8Hz, H10a), 3,37 (dd, 1H, Jiob,ioa"”l4,1Hz, Jiob.ii 5,9Hz, H10b), 3,43 (dd, 1 H, J4.3 3,1 Hz, J4.5 7,5Hz, H4), 3,79 (s, 3H, COOCH3), 4,09 (ddd, 1H, J54 7,5Hz, J5,nh9· 1 Hz, J5,68,1Hz, H5), 4,21 (dd, 1H, J„7,1Hz, J^-l 2,2Hz, 15 H9.), 4,30 (dd, 1H, J65 8,1 Hz, J6.74,1Hz, H6), 4,63 (dd, 1H, J9i83,2Hz, J99.-12,2Hz, H9), 5,09 (dd, 1H, J12ciSi11 10,2HZ, Ji2cis,12trans“ 1.3Hz, H12*), 5,18 (dd, 1H, J12trans>11 17,1 Hz, Ji2trans,i2cis"^ i0Hz, Hi^ns), 5,36 (ddd, 1H, J8 7 4,2Hz, J893,2Hz, Jeg· 7,1 Hz, He), 5,57 (dd, 1H, J76 4,1 Hz, J7.84,2Hz, H7), 5,65 (d, 1H, Jnh.59,1Hz, -CONH-), ... 5,83 (dddd, 1H, Jn i2trans 17,1 Hz, Jh^ci» 10,2Hz, Jii10a5,8Hz, Jn 10b 5,9Hz, Hu), 20 6,09(d, ih,j343,ihz,h3).

I * I

• · I • f · • 4 ’ Yhdistettä (10) (50 mg, 0,11 mmol) sekoitettiin vedettömässä metanolissa (5 ml), joka sisälsi natriummetoksidia (12 mg, 0,225 mmol) huoneenlämpötilassa 2 • · · tuntia, sitten haihdutettiin kuiviin. Jäännös uudelleenliuotettiin veteen (5 ml) ja • I · 25 sen annettiin seisoa huoneenlämpötilassa 2 tuntia ennen neutraloimista Dowex 50 x 8 (H+)-hartsilla. Vesiliuos pakastekuivattiin, jolloin saatiin yhdistettä (11) • · · (31 mg, 78 %).

• · · . ’H-nmr (D20) δ (ppm) 2,02 (s, 3H, CH3CO), 3,42 (dd, 1H, J10,.10t-13,4Hz, V,i ;,1 6,6Hz, H,„.), 3,52 (dd, 1H, JlM,il0,-13,4Hz, J10b.„ 6,3Hz, J10b>, 3,51-4,27 (m, 7H, \ ' 30 H., H5, H„, H7, Hs, Hs & Hgr), 5,30 (dd, 1H, J,M,.,*,»» 1,5Hz, J,;Ä„ 10,3Hz, Η,!Λ), :···: 5,34 (dd, 1H, 1,5Hz, J,17,7Hz, H1Mra„), 5,72 (d, 1H, J3,4 2,4Hz, H3), 5,89 (dddd, J„ ,6,6Hz, J11l0b 6,3Hz, 10,3Hz, 17,7Hz, H„).

25 105478

Esimerkki 6

Natrium-5-Asetamido-4-amino-2.3.4.5-tetra-deoksi-D-qlvsero-D-talo-non-7-enopyranosonaatti (14).

5

Kokonaisreaktiokaavio on seuraavanlainen:

oac °AC

) « „ ./9 m,

10 X.-CH1>WT

Ac 2) KN-di-isopropyylietyylianiini Ac 3) NaN^u/lHSO/tolueenif^O Q2> ^H^yridDni +

15 "L

y 0 S

OAc N OAc % * 05 •T: 20 H°’Voh Γ ?

« AirterilteRAAOO

M --► J* 3<** O* • · • * · • · · • · • «% • · · • · ♦ 25 Sekoitettuun liuokseen, jossa oli yhdistettä (2) (500 mg, 1,04 mmol) vedettömäs- sä dikloorimetaanissa (8 ml), joka sisälsi pyridiiniä (205 mg, 2,6 mmol) -30°C:ssa ••s*. lisättiin tipoittain liuos, jossa oli trifluorimetaanisulfonianhydridiä (Tf20) (367 mg, y . 1,3 mmol) dikloorimetaanissa (2 ml) yli 20 minuutin ajan. Sitten reaktioseosta • · · ] sekoitettiin -30°C:ssa 5 tuntia ja lopuksi haihdutettiin kuiviin alipaineessa. Saa- • · 30 tua jäännöstä sekoitettiin kuivassa DMF.ssä, joka sisälsi N,N-di-isopropyylietyy-'··] tiamiinia (194 mg, 1,5 mmol) huoneenlämpötilassa 16 tuntia. Reaktioseos väke- «»«n voitiin suurtyhjössä DMF:n poistamiseksi. Sitten jäännöstä sekoitettiin tolueenin (5 ml) ja veden (5 ml) kaksifaasissa seoksessa, joka sisälsi tetra-n-butyyliammo- 26 105478 niumvetysulfaattia (950 mg, 2,8 mmol) ja natriumatsidia (137 mg, 2,1 mmol). Seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 16 tuntia ja sitten haihdutettiin kuiviin. Jäännös jaettiin etyyliasetaatin (50 ml) ja veden (15 ml) kesken, jolloin orgaaninen kerros pestiin peräkkäin vedellä (5 ml x 2), ja sitten haihdutettiin kuiviin.

5 Jäännös liuotettiin pyridiiniin (5 ml), kuplitettiin H2S:lla ja sitten haihdutettiin kuiviin. Jäännös saatettiin flash-pylväskromatografiaan (silikageeli, ensimmäinen liuotinjärjestelmä oli etyyliasetaatti, toinen liuotinjärjestelmä oli etyyliasetaat-ti/isopropanoli/H20: 5/2/1). Etyyliasetaattieluaatti sisälsi yhdistettä (13) (260 mg, 53 %). Positiivisen ninhydriinireaktion jakeet otettiin talteen toisesta liuotinjärjes-10 telmästä, yhdistettiin ja haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin yhdistettä (12) (32 mg, 6,5 %).

MS (FAB), 431 (M+ + 1), 414 (M+ - NH2).

1H-nmr (CDCI3 + CD3OD) δ (ppm) 1,96, 2,06, 2,08, 2,09 (s, 12H, asetyyli CH3x4), 3,52 (dd, 1H, J4t35,5Hz, J4.54,5Hz, H4), 3,80 (s, 3H, 15 COOCH3), 4,16 (dd, 1H, J6>510,2Hz, J67 2,3Hz, He), 4,17 (dd, 1H, Jffi9-12,4Hz, J»* 7,3Hz, H*), 4,23 (dd, 1H, J5i6 10,2Hz, J5,4 4,5Hz, H6), 4,73 (dd, 1H, J9>sr 12,4Hz, J98 2,7Hz, H9), 5,34 (ddd, 1H, J8.74,7Hz, J8i92,7Hz, J8 «,7,3Hz, He), 5,45 (dd, 1H, J76 2,3Hz, J78 4,7Hz, H7), 6,12 (d, 1H, J3.45,5Hz, H3).

13C-nmr (CDCI3 + CD30D) ϋ (ppm) 20,7 (CH3C(0)0-), 23,1 (CH3C(0)N-), 43,8 20 (C5), 46,2 (C4), 52,4 (COOCH3), 62,3 (C9), 68,3, 71,8 (C7, C8), 73,0 (C6), 111,5 !:* ' (C3), 143,8 (C2), 162,4 (C,), 170,3 & 170,8 (CH3CO x 4).

· V

Yhdistettä (12) sekoitettiin vedettömässä metanolissa (5 ml), joka sisälsi Amber- • · · lite IRA-400 (OHMiartsia (100 mg), huoneenlämpötilassa 3 tuntia. Seuraavaksi • · · 25 suodatettiin, suodos haihdutettiin kuiviin. Jäännös liuotettiin veteen (5 ml) ja pH säädettiin arvoon 13 0,1M NaOH:lla. Vesiliuosta sekoitettiin huoneenlämpötilas- • · · sa 2 tuntia ja sitten neutraloitiin Dowex 50 x 8 (H+)-hartsilla. Suodatettiin, minkä .· . jälkeen suodos lyofilisoitiin, jolloin saatiin yhdistettä (14) (16 mg, 70 %), joka oli • · · • · · positiivinen ninhydriinireaktiossa.

30 1H-nmr (D20) δ (ppm) 2,10 (s, 3H, CH3CO), 3,67-3,76 (m, 2H, H4 & H9.), 3,92 (dd, 1H, J9i8 2,8Hz, J9.9.-11,9Hz, H9), 3,90-4,02 (m, 2H, H7 & H8), 4,37-4,44 (m, 2H, H5 & H6), 5,81 (d, 1H, J3.4 5,14Hz, H3).

• 1 * * 27 105478

Esimerkki 7

Natrium-5-asetamido-4-atsido-2,3,4,5-tetradeoksi-.D-glysero-D-talo-non-2-eno-pyranosonaatti (17).

5 N3 HO OAc *

Acc^y^C00Me

AcH1) Rf20/pyridiini/DCM achn^-^ ^

A O -^ AcO

C 2) Ν,Ν-di-isopropyyli-

j« etyyliamiini/DMF

10 3) NaN3/n-Bu4NHS04/ (15)

tolueeni/HjO

4) 0,1 M HCi

NaOMe/MeOH

N3 15 HO JP .O^coONa 1) NaOH nu N« PYYY - HO f O COOMe HO^ 2)H’° (17) H° (16) • « · :::: 20 • · ·

Sekoitettuun liuokseen, jossa oli yhdistettä (2) (500 mg, 1,04 mmol) vedettömäs- * ! sä dikloorimetaanissa (8 ml), joka sisälsi pyridiiniä (205 mg, 2,6 mmol) -30°C:ssa « · » . lisättiin tipottain yli 20 minuutin ajan liuos, jossa oli trifluorimetaanisulfonianhyd- • · · .’♦/ ridiä (Tf20) (367 mg, 1,3 mmol) dikloorimetaanissa (2 ml). Sitten reaktioseosta • ♦ · 25 sekoitettiin 3°C:ssa 5 tuntia ja lopuksi haihdutettiin kuiviin alipaineessa. Saatua jäännöstä sekoitettiin kuivassa DMFissa, joka sisälsi N,N-di-isopropyylietyyli- • · · amiinia (194 mg, 1,5 mmol) huoneenlämpötilassa 16 tuntia. Reaktioseos väke- • » · vöitiin suurtyhjössä DMF:n poistamiseksi. Sitten jäännöstä sekoitettiin tolueenin • * · ’· (5 ml) ja veden (5 ml) kaksifaasisessa seoksessa, joka sisälsi tetra-n-butyyliam- . * 30 moniumvetysulfaattia (950 mg, 2,8 mmol) ja natriumatsidia (137 mg, 2,1 mmol).

• · ·

Seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 16 tuntia ja sitten laimennettiin 0,2 M HCI:lla (5 ml). Seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 48 tuntia. Tähän reak-tioseokseen lisättiin etyyliasetaattia (50 ml) ja 2 M HCI:a (1 ml). Orgaaninen 28 105478 kerros erotettiin ja pestiin vedellä (5 ml x 3), sitten haihdutettiin kuiviin. Jäännös saatettiin flash-pylväskromatografiaan (silikageeli, etyyliasetaatti/heksaani=2/1). Jakeet, joiden Rf-arvo oli 0,32 (etyyliasetaatti/heksaani=2/1 kehitysliuottimena) yhdistettiin ja haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin yhdistettä (15) (40 mg, 8,4 %).

5 Sitten pylväs eluoitiin etyyliasetaatti/metanolilla = 10/1 lähtöaineen (2) (280 mg, 56 %) saamiseksi. Yhdiste (15) eristettiin valkoisena vaahtoaineena.

MS (FAB) 457 (M++1 ),414 (M*-N3), i.r. (CHCI3) cm-1 2108 (-N3), 1748 (karbonyyli) ^-nmr (CDCI3), δ (ppm) 1,97, 2,04, 2,06, 2,07 (s, 12H, asetyyli CH3 x 4), 3,82 10 (s, 3H, COOCH3), 4,12-4,20 (m, 3H, C6, C4 & C9), 4,51 (ddd, 1H, J54 4,4Hz, J56 10,7Hz, Js-NH, 10,1 Hz, H5), 4.69 (dd, 1H, J9.82,6Hz, J9,9 12,4Hz, H9), 5,31 (m, 1H, J8,7 4,9Hz, J8.9 2,6Hz, J8.9.7,0Hz, He), 5,45 (dd, 1H, J7.6 2,1 Hz, J7>8 4,9Hz, H7), 5,68 (d, 1H, JNH510,1Hz,CONH), 6,15 (d, 1H, J3,45,7Hz, H3) 13C-nmr (CDCI3) δ (ppm) 20,7, 20,8, (CH3CO-0 x 3), 23,1 (O CH3 CO-NH), 44,8 (C5), 52,6 15 (COOCH3), 54,8 (C4), 62,1 (C9), 67,6, 71,3 (C7, C8), 73,5 (C6), 104,5 (C3), 146,3 (C2), 161,5 (C^, 169,9, 170,2, 170,5 (asetyyli, -C=OX4)

Yhdiste (15) (40 mg, 0,088 mmol) liuotettiin vedettömään metanoliin (4 ml), joka sisälsi natriummetoksidia (6,4 mg, 0,12 mmol). Seosta sekoitettiin huoneenläm-20 pötilassa 2 tuntia ja väkevöitiin kuiviin tyhjössä, jolloin saatiin yhdistettä (16),

* « I

;' t joka sitten liuotettiin veteen (3 ml), sekoitettiin huoneenlämpötilassa 2 tuntia, pH

' « * ,;, säädettiin arvoon 6™7 Dowex 50 X 8 (H+) hartsilla ja sitten lyofilisoitiin, jolloin saatiin otsikkoyhdistettä (17) kellertävänä jauheena (25 mg, 83 %).

• · · .·:·! i.r. (KBr) cm.1 3400 (lev., OH), 2108 (-N3), 1714 (karbonyyli) 25 ’H-nmr (D20) δ (ppm) 1,97 (s, 3H, asetyyli), 3,5-4,4 (m, 7H, H4, Hs, H6, H7, H8, H9, & H*), 6,07 (d, J34 5,6Hz, H3) « • · ' Esimerkki 8 M«|« ----- 1 30 »·» • « ’ · · ·) Natrium-5-asetamido-4-N-metyyliamino-2,3,4,5-tetradeoksi-D-glysero-D-galakto- non-2-enopyranosonaatti (20) 29 105478 OAc OAc _

AcO f /O^^COOMe cOOMe

Met/Αα CO,CHCN

AcO NH2 Met/Ag2CQ3/CH3CN Ac0 NHCn3 (5) <«>

NaOMe/MeOH

HO .0 cOONa nH

-«-Na0H- Ho5f/°\^COOMe HO NHCH3 H20 AdHN-5 HO NHCH3 <20> (19)

Liuokseen, jossa oli metyylijodidia (15 mg, 0,10 mmol) ja yhdistettä (5) (48 mg, 0,11 mmol) asetonitriilissä (6 ml) lisättiin hopeakarbonaattia (42 mg, 0,15 mmol). Seosta sekoitettiin, samalla suojattiin valolta, huoneenlämpötilassa 5 16 tuntia. Saatu suspensio erotettiin suodattamalla, ja suodos haihdutettiin • · « * kuiviin. Jäännös saatettiin kromatografiaan (silikageeli, etyyliasetaatti/isopropa- • « : j * noli/vesi=5/2/1). Jakeet, joiden Rf-arvo oli 0,36 yhdistettiin ja väkevöitiin tyhjössä « · » kuiviin, jolloin saatiin yhdistettä (18) (25 mg, 51 %).

’λ/ MS (FAB) 445 (M++1), 414 (M+ - NHCH3) 10 1H - nmr (CDCy δ (ppm) 1,95, 2,05, 2,06, 2,12 (s, 12H, asetyyli CH3X4), 2,45 (s, 3H, N-CH3), 3,72 (dd, !:i\ 1 H, J4,3 2,3Hz, J4i5 9,2Hz, H4), 3,89 (s, 3H, COOCH3), 4,16 (dd, 1H, J9.8 7,2Hz, * J9,9 12,3Hz, H*), 4,26 (ddd, 1H, J5,4 9,2Hz, J5NH 9,1Hz, J5.6 9,0Hz, H5), 4,36 (dd, I;’’; 1H, J6i5 9,0Hz, J6.7 2,7Hz, H6), 4,64 (dd, 1H, J9.8 2,9Hz, J9,9.12,3Hz, H9), 5,34 (m, V 15 1 H, J8i7 4,8Hz, J8,9 2,9Hz, J8ff 7,2Hz, H8), 5,51 (dd, 1 H, J7.6 2,7Hz, J7>8 4,8Hz), 6,05 (d, 1H, J342,3Hz, H3)

• I

30 105478

Yhdistettä (18) (25 mg, 0,056 mmol) sekoitettiin vedettömässä metanolissa (5 ml), joka sisälsi natriummetoksidia (5,4 mg, 0,1 mmol) huoneenlämpötilassa 2 tuntia, sitten haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin yhdistettä (19), joka uudelleen-liuotettiin veteen (5 ml) ja annettiin seistä huoneenlämpötilassa 2 tuntia ennen 5 neutraloimista Dowex 50 x 8 (H+)-hartsilla. Suodos lyofilisoitiin, jolloin saatiin yhdistettä (20) (15 mg, 82 %).

1H-nmr(D20) δ (ppm) 1,94 (s, 3H, CH3CO), 2,43 (s, 3H, N-CH3), 3,5-4,3 (m, 7H, H4, H5, H6, H7, H8, H9 & H9.), 5,65 (d, 1H, J34 2Hz, H3) 10

Esimerkki 9

Natrium-5-asetamido-4-N,N-dimetyyliamino-2,3,4,5-tetradeoksi-D-glysero-D-galakto-non-2-enopyranosonaatti (23).

15 OAc OAc _

AcO i 0N COOMe AcQ^J^^°\-COOMe co (CH «. achn^^T-/

AcO NH! Met/Ag,COa/CH,CN AcO NMe, ;:j:; 20 (5) (21) • • · * · ·

Amberlite [RA 400(OH) MeOH

• · • · · • ·· .

• · • ·· • · · • · ·

25 HQ ?H /Ov COONa nH

:;r: a« NaOH H(Ofl/ovC00Me HO NMe^ H20 '· * HO NMea V-l (23) m • · 30 • « · *···; Liuokseen, jossa oli metyylijodidia (65 mg, 0,46 mmol) ja yhdistettä (5) (100 mg, * ’ 0,23 mmol) asetonitriilissä (15 ml) lisättiin hopeakarbonaattia (127 mg, 0,46 mmol). Seosta sekoitettiin ja suojattiin valolta huoneenlämpötilassa 16 tuntia.

105478 31

Saatu suspensio erotettiin suodattamalla ja suodos haihdutettiin kuiviin. Jäännös saatettiin kahdesti flash-pylväskromatografiaan (silikageeli, etyyli-asetaatti/isopropanoli/vesi=5/2/1), jolloin saatiin yhdistettä (21) (30 mg, 28 %) värittömänä vaahtona.

5 MS (FAB) 459 (M++1) 414 (M+-N(CH3)2) ^-nmr (CDCI3) δ (ppm) 1,98, 2,05, 2,06, 2,12 (s, 12H, asetyyli, CH3 X 4), 2,33 (lev. s, 6H, N(CH3)2), 3,42 (dd, 1H, J43 2,8 Hz, J4-5 8,6Hz, H4), 3,79 (s, 3H, COOCH3), 4,17 (dd, 1H, J9.8 7,4Hz, Jff 9 12,3Hz, H*), 4,18 (ddd, 1H, J5.4 8,5Hz, J5.NH 8,9Hz, J5.6 9,0Hz, H5), 10 4,31 (dd, 1H, J6>5 9,0Hz, J6.7 2,9Hz, H6), 4,68 (dd, 1H, J9.8 3,0Hz, J9i9r 12,3Hz, H9), 5,31 (m, 1H, J8 7 4,4Hz, Je.93,0Hz, J8.ff 7,4Hz, H8), 5,51 (dd, 1H, J7.62,9Hz, J7.8 4,4Hz, H7), 5,79 (d, 1H, JNHi5 8,9Hz, CONH), 6,09 (d, 1H, J3.4 2,8Hz, H3)

Yhdistettä (21) (30 mg, 0,066 mmol) sekoitettiin vedettömässä metanolissa 15 (4 ml), joka sisälsi kuivaa Amberlite IRA 400 (OH* hartsia (90 mg) huoneenläm pötilassa 3 tuntia, sitten hartsi erotettiin suodattamalla. Suodos ja pesunesteet yhdistettiin ja haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin yhdistettä (22) (20 mg), jota sekoitettiin vedessä (5 ml) pH:n arvossa 12 huoneenlämpötilassa 2 tuntia, sitten pH säädettiin arvoon 7,5 Dowex 50 X 8 (H+):lla ennen suodattamista. Suodos ;;; 20 lyofilisoitiin, jolloin saatiin yhdistettä (23) (15 mg, 66 %) valkoisena jauheena.

( « .’H-nmr (D20) δ (ppm) ; !' 1,97 (s, 3H, asetyyli), 2,33 (s, 6H, N(CH3)2), 3,50-4,26 (m, 7H, H4, H5, H6, H7l H8, H9&Hff),5,71 (d, J341,8Hz, H3) • ·· • * ·«· • « f • » · 25 Esimerkki 14 ··· • · · • · · .·*:·. Influensaviruksen neuraminidaasin inhibointi • · · • · • · · ' *! Ylläkuvatun yhdisteen jn vitro biokoe N2 influensaviruksen neuramiinidaasia 30 vastaa suoritettiin Warner ja O.Brien, Biochemistry, 1979 18 2783-2787, mu- • · · ’ ·: kaan. Vertailuna, samalla määritysmenetelmällä, määrättiin 2-deoksi-N-asety-a- ' ’ D-neuramiinihapon Κ,-arvoksi 3 x ΙΟ"4 M.

32 105478

Κ,-arvot mitattiin spektrofluorimetriseiiä menetelmällä, joka käyttää fluorigeenistä substraatti-4-metyyliumbelliferyyliasetyylineuramiinihappoa (MUN), jonka on kuvannut Meyers et ai-, Anal. Biochem. 1980 101166 174. Molempien entsyymien kohdalla, määritysseos sisälsi koeyhdistettä useampina pitoisuuksina välillä 5 0 ja 2 mM, ja noin 1 mU entsyymiä puskurissa (32,5 mM MES, 4 mM CaCI2, pH

6,5 N2:lle; 32,5 mM asetaatti, 4 mM CaCI2, pH 5,5 V. cholerae neuramiinidaasil-le).

Reaktio käynnistettiin lisäämällä MUN lopullisiin pitoisuuksiin 75 tai 40 μΜ.

10 5 minuutin jälkeen 37°C, 2,4 ml 0,1 M glysiini-NaOH, pH = 10,2 lisättiin 0,1 ml:n reaktioseokseen reaktion lopettamiseksi. Fluoresenssi luettiin herätteellä 365 nm, emissiolla 450 nm, ja vastaava MUN-sokko Qoka ei sisällä entsyymiä) vähennettiin lukemasta. Kj-arvo arvioitiin Dixon- plotterilla (l/fluoresenssi vastaan yhdisteen pitoisuus). Tulokset on esitetty taulukossa 1, ja ellei toisin ole mai-15 nittu, tarkoittaa N2-neuramiinidaasin inhibointia.

Taulukko I

Yhdiste Ki (M) 20 2-deoksi-N-asetyyli-a-D-neuramminihappo 3 xlO-4 : 1 2., natrium-5-asetamido-4-atsido-2,3,4,5-tetradeoksi- · D-alvsero-D-aalakto-non-2-enopvranosonaatti (4) 2 x 10-6 i < I | - — ... — natrium-5-asetamido-4-amino-2,3,4,5-tetradeoksi-:T: D-alvsero-D-aalakto-non-2-enoDvranosonaatti (6) 6 x 10-8 1,9 x 10'9 (N9-neuraminidaasi, pH 6,5) 1 x 10* • « « , (N2-virus, pH 7,5)

• * · I ' I ' —Il ' ' — " 11 J

• · · • · * · • · ' « • · · · « · « 2 1 « 105478 33

Yhdiste Ki (M) ammonium-5-asetamido-4-qunidiino-2,3,4,5-tetra- deoksi-D-qlvsero-D-galakto-non-2-enopvranoso- naatti (7) 1,7 xlO* >3 x 10-8 (N9-neuraminidaasi) 4,5 xlO-4 (V. cholerae neuraminidaasi; pH 5,8) > 10-2 (lampaan neuraminidaasi; _ pH 4,5)_ natrium-5-asetamido-4-N,N-diallyyliamino-2,3,4,5-5 tetradeoksi-D-Qlvsero-D-aalakto-non-2-enoDvrano- sonaatti (9) 4 x 10-6 natrium-5-asetamido-4-N-allyyliamino-2,3,4,5-tetra- deoksi-D-glvsero-D-galakto-non-2-enopvranoso- naatti (11) 2,5 x 10-6 (N2-ja N9-neuraminidaasi) 10 metyyli-5-asetamido-7,8,9-tri-0-asetyyli-4-amino- . ·: · 4 2,3,4,5-tetradeoksi-D-glysero-D-talo-non'2-enopy- • * :·. ranosonaatti (12) noin 3 x1ο-3 * * · — ... Il imu·· —----- . |. natrium-5-asetamido-4-amino-2,3,4,5-tetradeoksi-D- glvsero-D-talo-non-2-enopvranosonaatti (141 1 x10’7 *· " (N2-ja N9-neuraminidaasi) • · · — - - - — — 15 natrium-5-asetamido-4-atsido-2,3,4,5-tetradeoksi- D-glysero-D-talo-non-2-enopyranosonaatti(17) 2,8 xlO-5 · · — - - _ natrium-5-asetamido-4-N-metyyliamino-2,3,4,5- .· , tetradeoksi-D-glysero-D-galakto-non-2-enopyrano- • · · *· *| sonaatti (20) 1,15 x 10-6 - · · t » I ————— I ———1^— II. I — • Ψ . 20 natrium-5-asetamido-4-N,N-dimetyyliamino-2,3,4,5- • · · :; tetradeoksi-D-glysero-D-galakto-non-2-enopyrano- sonaatti (23) 7x10’7 34 105478

Yhdiste_ Ki (M) natrium-2,3-dideoksi-D-glysero-D-galakto-non-2-enopyranosonaatti (35 4,8 x1ο·4 natrium-4,5-diamino-2,3,4,5-tetradeoksi-D-glysero-D-galakto-non-2-enopyranosonaatti (38) 6,5 x 10'7 5 5.9-diasetamido-2.3.4.9-tetradeoksi-D-alvsero-D- galakto-non-2-enopyranosoihappo (42) 1,45 x10'5

Esimerkki 11 10 Influenssa-viruksen replikaation In Vitro inhibointi

Influenssa A/Singapore/1/57 (H2N2) ja influenssan B/Victoria/102/85 replikaation in vitro inhibointi mitattiin viraalisen täplän pienenemisellä Mädin Darby-kanien munuaissoluissa (MDCK).

15

Kerros huudeltuja MDCK-soluja, kasvatettu kuudella kudosviljelylevyllä, inokuloi- tiin 0,3 ml:lla laimennetulla viruksella, jolloin saadaan noin 50-100 täplää/astia.

,., Virus laimennettiin seerumi-vapaassa minimaalisessa oleellisessa väliaineessa » « *;;;' (MEM) jossa oli 2 pg/ml N-tosyyli-1 -fenyylialaniinikloorimetyyliketonilla (TPCK) 1 1 1 20 käsiteltyä trypsiiniä (Worthington Enzymes), ja koeyhdistettä.

• * Λ · «

«M

'l'\ Virus adsorboitiin huoneenlämpötilassa tunnin, ja solut päällystettiin sitten so- • · · lunkasvuväliaineella, version 1 (DCCM-1)/agarpinnoite, jossa on koeyhdistettä, • · · 4 ml/astia. DCCM-1 on seerumi-vapaa täydellinen solunkasvuväliaine (Biologi-25 cal Industries), johon lisättiin TPCK-käsiteltyä trypsiiniä ja DEAE-dekstraania • · · lopulliseen pitoisuuteen 2 pg/ml ja 0,001 % vastaavasti. Agar (5%) (Indubiose) « * .*. laimennettiin 1:10 pinnoitteessa ennen lisäystä levylle, i • · • ••Il « · . Kerran päällystetyt levyt inkuboitiin 37°C, 5% C02 3 päivää. Sitten solut kiinnitet- «i · 30 tiin 5% glutaarialdehydilla, värjättiin karbolifuksiinilla ja viraaliset täplät lasket-' ' tiin. Tulokset ovat seuraavat: 35 105478

Taulukko 2

Yhdiste ΙΟ,1, täplän pieneneminen (pm)

influenssa A influenssa B

natrium-5-asetamido-4-amino-2,3,4,5-5 tetradeoksi-D-alvsero-D-aalakto-non-2- 1,6 1,6 enopyranosonaatti (4-amino-Neu5Ac2en) (6) natrium-5-asetamido-4-amino-2,3,4,5- tetradeoksi-D-glvsero-D-talo-non-2- 3 1,2 10 enopyranosonaatti (14) ammonium-5-asetamido-4-quanidiino- 2.3.4.5-tetradeoksi-D-alvsero-D-aalakto- 1,6 1,6 non-2-enopyranosonaatti (17) natrium-5-asetamido-4-N-allyyli-N-hydr- 15 oksi-2.3.4.5-tetradeoksi-P-alvsero-D- 4,7 2,7 oalakto-non-2-enoDvranosonaatti (45) .···. natrium-4,5-diamino-2,3,4,5-tetradeoksi- • · D-glysero-D-galakto-non-2-enopyrano- 11 6,8 sonaatti (38) 20 • · « ]·!1: Natrium-5-asetamido-4-N-allvvli-N-hvdroksi-2.3.4.5-tetradeoksi-D-olvcero-D- ' n galakto-non-2-enoDvranosonaattia (45) voidaan helposti valmistaa yhdisteestä

• « I

(11) kuvattu esimerkissä 5, käyttämällä hapetusmenetelmää.

··· • · · • · « 25 Esimerkki 12 ♦ ♦ · ”" 1 « • · • · · • ·· , t j ]n Vivo-anti-viraalinen vaikutus • a · · · '" · t' Esimerkkien 2, 3 ja 6 (4-amino, 4-guanidiino ja 4-epi-amino), yhdisteitä sekä 30 yhdistettä DANA (2-deoksi-N-asetyyli-a-D-neuramiinihappo), joka esimerkissä 20 on osoitettu omaavan anti-neuraminidaasiaktiivisuutta jn vitro, käytettiin 36 105478 kokeissa niiden anti-viraalisen aktiivisuuden selvittämiseksi standardi-in vivo-määritysmeneteimällä. Kun näitä yhdisteitä annettiin intranasaalisesti hiirille ennen influenssa-A-viruksen altistumista ja sen aikana, ne alensivat virustiitteriä keuhkokudoksissa 1 - 3 päivää infektion jälkeen.

5

Hiiriä infektoitiin intranasaalisesti 50 piillä 103 TCID^ yksikköä/hiiri H2N2-influenssa-A-virusta (A/Sing/1/57). Koeyhdistettä annettiin intranasaalisesti annosnopeudella joko 12,5 tai 25 mg/kg ruumiinpaino (50 μΙ vesiliuosta/hiiri) seuraavasti: 24 tuntia ja 3 tuntia ennen infektiota; 3 tuntia jälkeen infektion, 10 sitten kahdesti päivässä 12. ja 3. päivänä infektion jälkeen. Rakenteellisesti poikkeavia yhdisteitä ribaviriiniä ja amantadiiniä käytettiin myös vertailuun.

Hiiret lopetettiin 1., 2. ja 3. päivänä infektion jälkeen, niiden keuhkot poistettiin ja keuhkojen virustiitterit mitattiin. Tiitterit merkittiin graafisesti ja ilmaistiin käyrän 15 alla olevana prosenttialana (AUC) verrattuna käsittelemättömien hiirien arvoihin. Tulokset on annettu seuraavassa: ·»· • · • « ·«» • 1 · • ♦ » • · • · • · · « I I t « « · · • 1 • · · • ·· * · • ♦· • · · • · · • « · • · · • · · • · « • · · • · « • · • · ♦ • ·· • · < · • 99 9 « • · · | 37 105478

Taulukko 3

Tehokkuus influenssaviruksella infektoiduissa hiirissä 5 Kokeen Annos (mg/kg

numero Yhdiste kehon painoa) % AUC

1 natrium-5-asetamido-4-amino-2,3,4,5-tetra-deoksi-D-qlvsero-D-galakto-non-2-enopvra- nosonaatti (4-amino-Neu5Ac2en) (16) 252525 0,06 amantadiini 0,08 DANA __0,18 2 ammonium-5-asetamido-4-quanidiino- 2,3,4,5-tetradeoksi-D-qlysero-D-qalakto-non- 2-enopyranosonaatti (7) 12,5 0,03 ribariviini 25 29,8 amantadiini 25 0,2 12,5 0,03 DANA__12^5__2,0 3 natrium-5-asetamido-4-amino-2,3,4,5-tetra- • · ..; deoksi-D-glvsero-D-talo-non-2-anopvrano- sonaatti (14) 12,5 21,1 • ’.· amantadiini 12,5 g g DANA 12,5 480 • · · 1 ”,M ' " 1 1 ~ ' 10 • I*

Kaikilla kolmella koeyhdisteellä oli suurempi teho kuin DANA:lla.

··♦ • · · • ♦ · • · · • · « • · · • · * · · • »· • · »

Mm < « » ' < < I < I I * € 3β 105478

Esimerkki 13

Seuraavat valmisteet edustavat keksinnön mukaisia seoksia: 5 Vesiliuos % w/w

Kaavan mukainen yhdiste (I) 10,0

Bentsalkoniumkloridi 0,04

Fenyylietyylialkoholi 0,40

Puhdistettu vesi 100 %w/w saakka 10

Vesipitoinen lisäliuotinliuos % w/w

Kaavan mukainen yhdiste (I) 10,0

Bentsalkoniumkloridi 0,04

Polyetyleeniglykoli 400 10,0 15 Propyylieeniglykoli 30,0

Puhdistettu vesi 100 % w/w saakka

Aerosolivalmiste % w/w

Kaavan mukainen yhdiste (I) 7,5 « * « 20 Lesitiini 0,4

Ponneaine 11 25,6 ··· Ponneaine 12 66,5 • ♦ • · · • ·· • · :T: Kuivaiauhevalmiste % w.w 25 Kaavan mukainen yhdiste (I) 40,0 •V*: Laktoosi 60,0 • · · • · · • * « m Näitä valmisteita valmistetaan sekoittamalla aktiivinen ainesosa ja lisäaineet • · •: · ·: tavanomaisilla farmaseuttisilla menetelmillä.

30 ....: On selvää, että keksintö yleisesti ei rajoitu edellä esitettyihin yksityiskohtiin.

Claims

105478

1. Menetelmä valmistaa terapeuttisesti vaikuttavaa yhdistettä, jolla on kaava (I), 5 OH Ho-nJy°yco2h OH (l> R* Ξ H R3 10 jossa R3 on N3, tai NR6R7, jossa R6 on vety, C^alkyyli, aryyli, aralkyyli amidiini, NR7R8, tai tyydyttä-15 mätön tai tyydyttynyt rengas, jossa on yksi tai useampi heteroatomi joukosta typpi, happi tai rikki, R7 on vety, C^alkyyli tai allyyli, R8 on vety tai C^alkyyli, ja R4 on NHCOR9, jossa

20 R9 on vety, substituoitu tai substituoitumaton C^alkyyli tai aryyli, ;; ’ tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävää suolaa, esteriä tai tällaisen esterin suo- * laa’ : ” tunnettu siitä, että • · « • · · · • · • · · • «· 25 (A) saatetaan kaavan (III) mukainen yhdiste • · · OH *···: HO—X^''..^0\/CC>2H l 11 (»o :v OH : ·: 30 R4 = OL • * · V • · ♦ i ’ jossa R4 tarkoittaa samaa kuin edellä ja OL on poistuva ryhmä, tai mainitun • « '· '** yhdisteen suojattu johdos reagoimaan nukleofiilin kanssa; tai 105478 (B) interkonversoidaan kaavan (I) mukainen yhdiste toiseksi kaavan (I) mukaiseksi yhdisteeksi, ja tarvittaessa saatetaan saatu yhdiste yhteen tai kahteen lisäreaktioon, joita ovat: (i) minkä tahansa suojaavan ryhmän poistaminen; 5 (ii) kaavan (I) mukaisen yhdisteen tai sen suolan muuntaminen sen farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolakseen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R3 on NReR7. 10

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R3 on NH2 tai NHC(=NH)NH2.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä valmistaa kaavan I mukainen 15 yhdiste, joka on natrium-5-asetamido-4-atsido-2,3,4,5-tetradeoksi-D-glysero-D-galakto-non-2- enopyranosonaatti; natrium-5-asetamido-4-N-allyyliamino-2,3,4,5-tetradeoksi-D-glysero-D-galakto-:' ‘; non-2-enopyranosonaatti; • 4 I : T: 20 metyyri-S-asetamido-y.e.O-tri-O-asetyylM-N-allyyliamino^.SAS-tetradeoksi-D- « :' .. glysero-D-galakto-non-2-enopyranosonaatti; ja t ;i· natrium-5-asetamido-4-N,N-dimetyyliamino-2,3,4,5-tetradeoksi-D-glysero-D- : ’ ·.: g alakto-non-2-enopyranosonaatti, tunnettu siltä, että käytetään vastaavia lähtöaineita. 25 • · « v

: 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä valmistaa kaavan I mukaista 5- • · v ; asetamido-4-amino-2,3,4,5-tetradeoksi-D-glysero-D-galakto-non-2-enopyra- nosonihappoa ja sen farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja ja johdannaisia, • · ': ”: tunnettu siitä, että käytetään vastaavia lähtöaineita. < | 30 41 105478

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä valmistaa kaavan I mukaista natrium-5-asetamido-4-amino-2,3,4,5-tetradeoksi-D-glysero-D-galakto-non-2-enopyranosonaattia, tunnettu siitä, että käytetään vastaavia lähtöaineita.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä valmistaa kaavan I mukaista 5- asetamido-4-quanidiino-2,3,4p5-tetradeoksi-D-glysero-D-galakto-non-2-enopy-ranosonihappoa ja sen farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja ja johdannaisia, tunnettu siitä, että käytetään vastaavia lähtöaineita.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä valmistaa kaavan I mukaista ammonium-5-asetamido-4-guanidiino-2,3,4,5-tetradeoksi-D-glysero-D-galakto-non-2-enopyranosonaattia, tunnettu siitä, että käytetään vastaavia lähtöaineita.

< ( ' ! « 9 • 99 • • · · · « 9 • · · • ·· • · • ·· 9 9 · * 1 · • · · • · « · • · · • · · • · • i • · · I > · J 9 · Ψ · « • « « · • # • · » • · · • · · · « · 42 105478