BG62092B1 - Производни и аналози на2-дезокси-2,3-дидехидро-n-ацетилнеураминовата киселина иизползването им като противовирусни средства - Google Patents

Description

ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА

Изобретението се отнася до нов клас химически съединения и до тяхното използуване в медицината. По-специално, изобретението се отнася до нови 4-заместени-2-дезокси-2,3дидехидро производни на a-D-неураминовата киселина, до методи за получаването им, до лекарствени форми от тях и до използването им като противовирусни средства.

ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

Ензими, способни да отцепват от други захари N-ацетилнеураминова киселина (NANA), известна още като слюнчена киселина, се срещат в много микроорганизми. Към тях се отнасят бактерии като Vibrio cholerae. Clostridium perfringens, Streptococcus pneumoniae, u Arthrobacter sialophilus и вируси като вируса на инфлуенцата (грипния вирус), вируса на параинфлуенцата, вируса на паротита, вируса на Нюкясълската болест, вируса на лъжливата чума по птиците и вируса на Sendai. Повечето от тези вируси са от групите ортомиксовирус или парамиксовирус и притежават неураминидазна активност по повърхността на вирусните частици.

Много от организмите, съдържащи неураминидаза, са основни патогени на човека и/или животните, а някои, като вирусът на инфлуенцата, вирусът на Нюкясълската болест, и вирусът на лъжливата чума, причиняват заболявания с огромна икономическа значимост. Дълго се считаше, че инхибитори на неураминидазната активност могат да предотвратяват инфекция, причинена от носещи неураминидаза вируси. Повечето от известните инхибитори на неураминидазата са аналози на неураминовата киселина, като 2дезокси-2,3-дидехидро-Ь1-ацетилнеураминова киселина (DANA) и нейните производни. Виж напр. Meindl et al., Virology 1974, 58, 457-63. Най-активната от тях е 2-дезокси-2,3-дехидро-К-трифлуорацетилнеураминовата киселина (FANA), която инхибира полицикличната репликация на инфлуенцения и параинфлуенцения вирус in vitro, виж Palese et a., Virology 1974, 59, 490-498.

Ha пракитака са известни голям брой производни на 2-дезокси-

2,3-gugexugpo-N-auemuAHeypaMUHo6ama киселина. Виж например Р. Meindl et al., Virology, 5S, 457-463 (1974), P. Meindl and H. Tuppy, Mh. Chem, 100 (4), 1295-1306 (1969); M. Flashner et al., Carbohydrate Research, 103, 281-285 (1982): E. Zbiral et al., Liebigs Ann Chem, 159-165 (1989); T. Ogawa and Y. Ito, Tetrahedron Letters, 28 (49), 6221-6224 (1987); T. Goto et al., Tetrahedron Letters, 27 (43), 5229-5232 (1986); H. Ogura et al., Chem. Pharm. Bull, 36 (12), 4807-4813 (1988); Немски патент P 1493249. Много от тези съединения са активни in vitro спрямо неураминидазата от V. cholerae или спрямо вируса на Нюкясълската болест, както и спрямо грипния вирус. Съобщава се също, че δ-лактонът на 3-аза-2,3,4-тридезокси-4-оксо-Оарабиноктоновата киселина и О-а-Н-ацетил-О-неурараминозил)2 —>3)-2-ацетамидо-2-дезокси-0-глюкоза инхибират in vitro неураминидазата най-малкото при някои щамове на вируса на инфлуенцата или параинфлуенцата. Виж Zakstel'skaya et al., Vop. Virol. 1972 17 223-28.

Гликалите 2,3-дехидро-4-епи-М-ацетилнеураминова киселина,

2,3-дехидро-2-дезокси-М-ацетилнеураминова киселина и 5-ацетамидо-

2,6-анхидро-2,3,5-тридезокси-0-манонон-2-ен-4-илозонат и техните метилови естери инхибират in vitro неураминидазата от Arthrobacter sialophilus. Виж Kumar et al., Carbohydrate Res., 1981, 94,123-130; Carbohydrate Res., 1982, 103, 281-285. Съобщава се, че тиоаналозите 2α-азидо-б-тионеураминова киселина и 2-дезокси-2,3-дидехидро-6тионеураминова киселина, Mack & Brossmer, Tetrahedron Letters, 1987, 28, 191-194, и флуорираният аналог Ь[-ацетил-2,3-дифлуоро-а-Онеураминова киселина, Nakajima et al., Agric. Biol. Chem., 1988, 52, 1209-1215, инхибират неураминидазата, въпреки че не е се уточнява типа на неураминидазата. Schmid et al., Tetrahedron Letters, 1958, 29, 3643-3646 описват синтезата на 2-ge3okcu-N-auemuA-cc-Dнеураминовата киселина, но не се съобщава за нейната активност или нещо друго по отношение на неураминидазата.

За никой от известните инхибитори на неураминидазната активност in vitro не е показано, че притежава противовирусна активност in vivo, а в действителност за някои от тях, например като FANA, определено е показано, че са неактивни in vivo. Така, общоприето мнение е, че тези съединения, показващи in vitro инхибиране на вирусната неураминидаза няма да предизвикват in vivo блокиране на вирусната инфекция.

Meindl u Tuppy, Hoppe-Seyler's Z. Physiol Chem., 1969, 350, 1088. описват хидрогенирането на олефиновата двойна връзка на 2дезокси-2,3-дехидро-М-ацетилнеураминовата киселина, за да се получи β-аномера на 2-дезокси-И-ацетилнеураминовата киселина. Този β-аномер не инхибира неураминидазата от Vibrio cholerae.

По такъв начин най-мощните инхибитори на вирусната неураминидаза in vitro са идентифицирани като съединения, които са на базата на структурата на неураминовата киселина и някои считат, че те са аналози на преходно състояние, Miller et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 1978, 83, 1479. Ho въпреки че много от цитираните по-горе аналози на неураминовата киселина са конкурентни инхибитори на неураминидазата, до момента за никой от тях не се съобщава, че показва антивирусна активност in vivo. Например, въпреки че е полупланарна, ненаситената 6-членна пръстенна система се счита важна за инхибиращата активност, виж Dernick et al. в ANTIVIRAL CHEMOTHERAPY (K.K. Gauri ed.) Academic Press, 1981, 327-336, някои съединения, характеризиращи се с такава система, особено FANA, не притежават антивирусна активност in vivo. Виж Palese и Schulman в CHEMOPROPHYLAXIS AND VIRUS INFECTION OF THE UPPER RESPIRATORY TRACT, Vol. 1 (J.S. Oxford ed.) CRC Press, 1977, 189-205.

Сега са намерени нови 4-заместени 2-дезокси-2,3-дидехидро производни на ot-D-неураминовата киселина, които са активни in vivo.

Следователно, в първия си аспект изобретението предоставя съединения с формула (lb)

(lb) в която R_3b e (aAk)_xNR_6bR_7b, CN или N₃ където алк е незаместен или заместен метилен, х е 0 или 1

R_6b е водород, С^алкил (например метил, етил), арил (например фенил), аралкил (например фенС₁.₄алкил, като бензил), амидин, NR_7bR_8b или незаместен, или заместен пръстен, съдържащ един или повече хетероатома (например като азот, кислород или сяра),

R_7b е водород, С_ь6аАкил (например метил, етил) или арил,

R_8b е водород или С_ь6алкил и

R_4b е NHCOR_9b, където R_9b е водород, незаместен или заместен С_ь4алкил или арил, и фармацевтично приемливи соли на съединенията с формула (lb) и техните фармацевтично приемливи производни.

В съединенията с формула (lb) заместителите (например групата R_6b в заместителя R_3b) могат от своя страна да притежават заместители, обичайни за фармацевтичната практика.

За предпочитане R_3b е NR_6bR_7b, по-специално NH₂ или гуанидино.

За предпочитане R_4b е NHCOR_9b, където R_9b е метил или заместен с халоген метил (например FCH₂, F₂CH-, F₃C).

С_Ь4алкил, в смисъла, в който се използва тук, включва алкилови групи както с права (например метил, етил), така и с разклонена верига (например изопропил, трет-бутил).

Под фармацевтично приемливи производни се има предвид всеки фармацевтично приемлив естер или сол на такъъв естер на съединението с формула (lb) или всяко друго съединение, което след прилагане върху приемника е в състояние да даде (директно или индиректно) съединение с формула (lb), или метаболит с антивирусна активност, или остатък от същото.

Специалистът в тази област може да прецени, че съединенията с формула I могат да бъдат модифицирани при която и да е от функционалните им групи, така че да се получат техни фармацевтично приемливи производни. Като такива производни от особен интерес са съединенията, модифицирани при (С-2) карбоксилната група, при С-7 или С-9 хидроксилните групи или при аминогрупите. Представляващите интерес съединения включват С]_4алкилови (например като метил-, етил- или пропил-, например изопропил-) или арилови (например като фенил-, бензил-) естери на съединенията с формула (II), С-7 или С-9 естери на съединенията с формула (lb), например като техните ацетилови естери, С-7, или С9 етери, например като фенилови етери, бензилови етери, ртолуилови етери, и ацилирани аминопроизводни, например като формил- и ацетамидопроизводни.

Специалистът в тази област може да прецени, че фармацевтично приемливите производни на съединенията с формула (lb) могат да бъдат модифицирани на повече от една позиция.

фармацевтично приемливите производни на съединенията с формула (lb) включват такива, получени от фармацевтично приемливи киселини и основи. Примерите за подходящи киселини включват хидрохлорна, хидробромна, сярна, азотна, перхлорна, фумарова, малеинова, фосфорна, гликолова, млечна, салицилова, сукцинова, толуенпарасулфонова, винена, оцетна, лимонена, метансулфонова, мравчена, бензоена, малонова, нафтален-2

Ί сулфонова и бензенсулфонова киселина. Други киселини, например като оксаловата, които сами по себе си не са фармацевтично приемливи, могат да бъдат използвани за получаването на соли, приложими като междинни съединения при получаването на съединенията от изобретението и на техните фармацевтично приемливи киселинно присъединителни соли.

Солите, производни на подходящи бази, включват солите на алкалните метали (например натриеви), на алкалоземните метали (например магнезиеви), амониевите и NR₄ ⁺ (където R е С^алкил) соли.

Цитирането на съединенията от изобретението оттук нататък включва съединенията с формула (lb) и техните фармацевтично приемливи соли и производни.

Към особено предпочитаните съединения от изобретението се включват:

5-Аиетамидо-4-амино-2.3.4.5-тетрадезокси-Р-глииеро-Р-галакто нон-2-енопиранозонова киселина (известна също като 5(ацетиламино)-4-амино-2,6-анхидро-3,4,5-тридезокси-Р-глицеро-Ргалакто-нон-2-енова киселина), нейните соли, в това число натриевата сол и 5-ацетамидо-4-гуанидино-2,3,4,5-тетрадезокси-Рглииеро-Р-галакто-нон-2-енопиранозонова киселина (известна също като 5-(ацетиламино)-2,6-анхидро-4-гуанидино-3,4,5-тридезокси-Рглииеро-Р-галакто-нон-2-енова киселина), нейните соли, в това число амониевата сол.

Съединенията с формула (lb) притежават антивирусна активност. По-точно, тези съединения са инхибитори на вирусната неураминидаза от ортомиксовируси и парамиксовируси, например вирусната неураминидаза от вируса на инфлуенца А и В, вируса на параинфлуенцата, вируса на паротита, вируса на Нюкесълската болест, вируса на лъжливата чума по птиците и вируса на Sendai.

По такъв начин, в един друг аспект на изобретението се предоставя съединение с формула (lb) или негова фармацевтично приемлива сол или производно за приложение като активно терапевтично средство, в частност като противовирусно средство, например за лечение на ортомиксовирусни и парамиксовирусни инфекции.

В по-нататъшен или алтернативен аспект се предоставя метод за лечение на вирусна инфекция, например ортомиксовирусна и парамиксовирусна инфекция у бозайници, включително човека, включваш, етап на даване на споменатия бозайник на ефективно количество от съединението с формула I или на фармацевтично приемлива сол или производно на същото.

Предоставя се също като следващ или алтернативен аспект използване на съединение от изобретението като лекарствено средство за лечение на вирусна инфекция.

Специалистът в тази област може да прецени, че цитираното тук лечение се простира както върху профилактика, така и върху лечението на установени болести или симптоми.

Освен това ще стане ясно, че количеството на съединението от изобретението, изисквано за прилагане при лечението, ще варира не само по отношение на отделното избрано съединение, но и според пътя на приемане, от естеството на лекуваното заболяване и от възрастта и състоянието на пациента и в крайна сметка е по преценка на лекуващия хуманен или ветеринарен лекар.

Най-общо обаче, подходящата доза е в интервала от около 0.01 до 750 mg/kg телесно тегло на ден, за предпочитане от порядъка на 0.1 до 100 mg/kg на ден и най-добре в интервала от 0.5 до 25 mg/kg на ден.

На практика е установено, че ефективната доза от изпитваните съединения е във връзка с тяхната сила in vitro. Така,

DANA (която показва 1С_5П редукция на плаките 5 цд/т!) е ефективна при дози между 1 и 10 mg/kg за едно лечение. Съответният метилов естер на DANA (1С₅₀ 50-100 цд/ml) е ефективен при пропорционално по-висока доза.

За предпочитане е лечението да се провежда преди или по време на инфекцията и продължава, докато вирусът не се открива повече в дихателните пътища. Съединенията се ефективни обаче и когато се дават след заразяването, например след появата на установените симптоми.

Подходящото лечение включва даване на съединението 1-4 пъти дневно и продължава 3-7, например 5 дни след заразяването, в зависимост от отделното използвано съединение.

Желаната доза може да бъде предоставена като единична доза или под формата на разделени дози, приемани на подходящи интервали, например като две, три, четири или повече под-дози на ден.

Съединенията се приемат удобно в лекарствени форми с единична дозировка, съдържаща 10 до 1500 mg, обикновено 20 до 1000 mg и още по-добре 50 до 700 mg активна съставка за единично дозирана форма.

Въпреки че е възможно при лечението съединението от изобретението да се прилага във вид на сурово химическо съединение, за предпочитане е активната съставка да се предоставя като фармацевтична форма.

Така изобретението осигурява също и фармацевтична лекарствена форма, включваща съединение с формула (1Ь), но без да е предмет на предварително условие, или фармацевтично приемлива сол или производно на същото, заедно с фармацевтично приемлив носител за него.

Носителят трябва да бъде “приемлив”, в смисъл да бъде съвместим с другите съставки на лекарствената форма и да не е вреден за приемащия я.

Фармацевтичната форма може да бъде във вид на конвенционалните форми за съответния начин на приемане, за който е предназначена.

Инхибиторите на неураминидазата за интраназално приемане съгласно метода на изобретението могат да бъдат прилагани по който и да е от методите и в лекарствените форми, използвани в практиката за интраназално приложение.

Така, съединенията могат да бъдат прилагани най-общо под формата на разтвор, или на суспензия, или на сух прах.

Разтворите и суспензиите са главно водни, например получени само с вода (например стерилна или непирогенна вода), или с вода и физиологично приемлив съразтворител (например етанол, пропиленгликол, и полиетиленгликоли, например като PEG 400).

Такива разтвори или суспензии могат да съдържат допълнително и други ексципиенти, например консерванти (например като бензалкониев хлорид), разтварящи/повърхностно активни вещества, например като полисорбати (например Tween 80, Span 80, бензалкониев хлорид), буфери, средства за настройване на изотоничността (например натриев хлорид), повишаващи абсорбцията и вискозитета вещества. Суспензиите могат допълнително да съдържат суспендиращи средства (например микрокристална целулоза, натриева карбоксиметилцелулоза).

Разтворите и суспензиите се подават директно в носната кухина посредством конвенционалните приспособления, например капкомер, пипета или впръскващо устройство. Лекарствените форми могат да бъдат в единична или многократна доза. В последния случай е желателно да се осигури дозиращо средство. В случай на капкомер или пипета дозирането може да се осъществи от самия пациент, като поема подходящ, предварително определен обем от разтвора или суспензията. В случая с впръскващо устройство това се прави например посредством дозираща впръскваща помпа.

Интраназалното прилагане може да се осъществи също посредством аерозолна форма, при която съединението се предоставя в опаковка под налягане с подходящ пропелент, например като хлорофлуоровъглеводород, например дихлорофлуорометан, трихлорофлуорометан или дихлоротетрафлуороетан, въглероден диоксид или друг подходящ газ. За удобство аерозолът може да съдържа също и повърхностно активно вещество, например като лецитин. Дозата на лекарственото средство може да бъде контролирана чрез осигуряване на дозиращ вентил.

По друг начин съединението може да се предоставя под формата на сух прах, например прахообразна смес от съединението с подходяща прахообразна основа като лактоза, нишесте, нишестени производни като хидроксипропилметилцелулоза и поливинилпиролидон. Подходящо е носителят на праха да образува в носната кухина гел. Прахообразният състав може да бъде предоставен под формата на единична доза, например в капсули или патрони от желатинови или блистерни опаковки, от които прахът може да се приема посредством инхалатор.

В интраназалните лекарствени форми съединението трябва да бъде предимно с малки по размер частички, например от порядъка на 5 цт или по-малко. Такъв размер на частичките може да се постигне по известните в практиката методи, например чрез микронизация.

Когато това е желателно, лекарствените форми могат да бъдат адаптирани така, че да осигуряват забавено отделяне на активната съставка. Съединенията от изобретението могат да бъдат използвани и в комбинация с други терапевтични средства, например други средства против инфекции. В частност, съединенията от изобретението могат да се използват заедно с други противовирусни средства. С това изобретението има и друг аспект - комбинация, която съдържа съединение с формула (lb) или фармацевтично приемлива сол или производно от същото заедно с други терапевтично активни средства, в частност - с противовирусно средство.

За удобство цитираните по-горе комбинации могат да бъдат представени под формата на фармацевтични форми, като такива форми съдържат комбинация, както е дефинирана по-горе, заедно с фармацевтично приемлив носител и това съставлява следващия аспект на изобретението.

Подходящите за използване в такива комбинации терапевтични средства включват други противоинфекционни средства, в частност противобактериални и противовирусни средства, например като тези, използвани за лечение на респираторни инфекции. В такива комбинации могат да бъдат включени например други ефективни срещу грипния вирус средства, например като амантадин, римантадин и рибавирин.

Отделните компоненти от такива комбинации могат да бъдат прилагани или последователно, или едновременно в отделни или в комбинирани фармацевтични форми.

Когато съединенията от изобретението се използват с второ терапевтично средство срещу същия вирус, дозата за всяко от съединенията може да бъде еднаква или да се различава от тази в случая на самостоятелно използване на всяко съединение. Подходящите дози могат лесно да бъдат преценени от специалиста в тази област.

Съединението с формула (lb) и неговите фармацевтично приемливи соли и производни могат да бъдат получени по всеки известен в практиката метод за получаване на съединения с аналогична структура.

При един такъв метод (А) съединение с формула (ШЬ)

(ШЬ) където R_4b е както е дефинирано във формула (lb) и OL е отцепваща се група, например като остатък на сулфонова киселина, например тозил, мезил, трифлуоромезил или нейно защитено производно, взаимодейства с подходящо нуклеофилно съединение, например азид, цианид, подходящ карбанийон или тиоацетат.

Съединенията с формула (ШЬ) могат да бъдат получени от съответните съединения с формула (IVb)

(IVb) чрез инверсия на 4-ОН групата по известни в практиката методи, например чрез реакция с Люисова киселина (например като BF₃етерат), последвано от хидролиза и след това от активация чрез третиране с реактив, служещ за въвеждане на отцепващата се група L, например остатък от сулфонова киселина, например като тозилова, мезилова или трифлуоромезилова група. Съединенията с формула (IVb) са или известни в практиката или могат да бъдат получени пс методи, аналогични на тези за получаването на познатите съединения.

При един втори метод (В) съединенията с формула (lb) могат да бъдат п улучени от други съединения с формула (lb) чрез превръщане едно в друго. Тези съединения с формула (lb), в които R_3b е NH₂ или CH₂NH₂, могат да бъдат получени чрез редукция на съответните азидо- или циано-аналози.

Съединенията, в които R_3b е NH-алкил или гуанидино, могат да бъдат получени чрез получаване на производното на съответното съединение, в което R_3b е NH₂.

За получаване на съединения с формула (lb) с СООН при С(2) съответните естери могат да бъдат хидролизирани или в кисела или в алкална среда, например при pH 11-12 (като се използва основа например като натриев или амониев хидроксид), или при pH 2-3 (като се използва киселина, например като сярна киселина).

Специалистът може да прецени, че за да се предотвратят нежеланите странични реакции, е необходимо или желателно във всеки етап от горния процес да бъдат защитени една или повече от чувствителните групи в молекулата; защитната група може да бъде отстранена във всеки подходящ следващ етап от реакционната последователност.

Защитните групи, използвани за получаване на съединения с формула (lb), могат да бъдат използвани по конвенционален начин. Виж например 'Protective Groups in Organic Chemistry' Ed. J. F. W. McOmie (Plenum Press 1973) или 'Protective Groups in Organic Synthesis' by Theodora W. Greene (John Wiley and Sons 1981).

Конвенционалните аминозащитни групи могат да включват например пралкилови групи, например като бензилова, дифенилметилова или трифенилметилова група; и ацилови групи например като N-бензилоксикарбонил или трет-бутоксикарбонил.

Така, съединенията с обща формула (lb), притежаващи водород при С(3) и С(4), могат да бъдат получени чрез освобождаване от защита на съответното защитено съединение.

Хидроксилните групи могат да бъдат защитени например посредством аралкилови групи, бензилови, дифенилметилови или трифенилметилови групи, с ацилови групи, например като ацетилови; силиконови защитни групи, например като триметилсилилови групи; или под формата на тетрахидропиранови производни.

Отстраняването на всички налични защитни групи може да стане по конвенционалните методи. Така една аралкилова група, например като бензилова, може да бъде отцепена чрез хидрогенолиза в присъствието на катализатор (например паладий върху въглен); ацилова група, например като N-бензилоксикарбонилна, може да бъде отстранена чрез хидролиза, например с хидрогенбромид в кисела среда, или чрез редукция, например каталитично хидрогениране; силиконова защитна група може да бъде отстранена например чрез третиране с флуориден йон; тетрахидропирановите групи могат да бъдат отцепени чрез хидролиза в кисела среда.

Когато е желателно съединение от изобретението да бъде изолирано под формата на сол, например като киселинно присъединителна сол, това може да стане чрез третиране на свободната база с обща формула (lb) с подходяща киселина, за предпочитане в еквивалентно количество, или с креатининсулфат в подходящ разтворител (например воден разтвор на етанол).

Настоящето изобретение се описва по-подробно със следните примери, които имат само илюстративна цел и не трябва да се считат като негово ограничение.

ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Обща методология

За синтеза на съединенията от изобретението са приложими следните общи методи.

Деацетилиране

Третирането на ацетилираното съединение с Amberlite IRA400 (ОН’) при разбъркване, за време най-общо 2-3 часа, при стайна температура води до пълно де-О-ацетилиране. Смолата се филтрува и филтратът се изпарява до сухо, при което се получава желаното ge-Q-ацетилирано съединение.

За специалиста в тази област е разбираемо, че съществуват и други стандартни методи за пълното ge-Q-ацетилиране на същото съединение, например като третиране с натриев метоксид в метанол.

Деестерификация

Напълно де-£)-ацетилираното вещество се разтваря във воден разтвор на натриев хидроксид и се разбърква при стайна температура в продължение най-общо на 2-3 часа. След това сместа се довежда go pH 7,0 -7,5 с помощта на смола Dowex 50w Х8 (Н^Т). филтруването, последвано от сушене чрез замразяване на филтрата дава желаното деестерифицирано съединение.

Специалистът в тази област лесно може да определи няколко алтернативни възможности за деестерифициране на същото съединение като киселинна хидролиза, алтернативна основна хидролиза - например с амониев хидроксид и с калиев хидроксид.

Междинните съединения, цитирани в примери от 1 до 19, са идентифицирани както следва:

Съединение 2

Метилов 5-ацетамидо-7,8,9-три-О-ацетил-2,3,5-тридезокси-Пглицеро-П-тало-нон-2-енопиранозонат (4-епи-Неу5,7,8,9Ац₄2ен1Ме)

Съединение 3

Метилов 5-аи,етамидо-7,8,9-три-0-ацетил-4-азидо-2,3,5-тридезокси0-глицеро-П-галакто-нон-2-енопиранозонат (4-азидоНеу5,7,8,9Ац₄2ен1Ме)

Съединение 5

Метилов 5-аи.етамидо-7,8,9-три-0-ацетил-4-амино-2,3,4,5тетрадезокси-П-глицеро-0-галакто-нон-2-енопиранозонат (4-аминоНеу5 7,8,9Аи,₄2ен1Ме)

Съединение 8

Метилов 5-аи,етамидо-7,8,9-три-О-аи,етил-4-1Ч,Н-диалиламино-2,3,45тетрадезокси-П-глицеро-П-галакто-нон-З-енопиранозонат (4-Ν,Νдиалиламино-Неу5,7,8,9Аи,₄2ен1Ме)

Съединение 9

Натриев 5-ацетамидо-4-?4,К-диалиламино-3,3,4,5-тетрадезокси-0глицеро-О-галакто-нон-З-енопиранозонат

Съединение 10

Метилов 5-ацетамидо-7,8,9-три-О-аи,етил-4-^алиламино-2,3,4,5тетрадезокси-П-глии,еро-О-галакто-нон-2-енопиранозонат (4-Νалиламино-Неу5,7,8,9Ац₄2ен1Ме)

Съединение 12

Метилов 5-ацетамидо-7,8,9-три-О-ацетил-4-амино-3,3,4,5тетрадезокси-П-глицеро-ЕРтало-нон-З-енопиранозонат (4-епи-4амино-Неу5,7,8,9Ац₄Зен1Ме)

Съединение 13

Метилов 7,8,9-три-О-ацетил-3,3,5-тридезокси-4',5'-дихидро-3'метилоксазоло [5,4-с1]0-глии,еро-П-тало-нон-3-енопиранозонат (4епи-4,5-оксазолоНеу7,8,9Аи,₃2ен1Ме)

Съединение 15

Метилов 5-ацетамидо-7,8,9-три-О-аи,етил-4-азидо-2,3,4,5тетрадезокси-П-глицеро-О-тало-нон-З-енопиранозонат (4епиазидоНеу5,7,8,9Ац₄2ен1Ме)

Съединение 16

Метилов 5-ацетамидо-4-азидо-2,3,4,5-тетрадезокси-П-глии,еро-Птало-нон-2-енопиранозонат (4-епи-азидоНеу5Ац2ен1Ме)

Съединение 18

Метилов 5-аи,етамидо-7,8,9-три-О-ацетил-4-Н-метиламино-2,3,4,5тетрадезокси-П-глии,еро-0-галакто-нон-2-енопиранозонат (4-Nметиламино-Неу5,7,8,9Аи,₄2ен1Ме)

Съединение 19

Метилов 5-ацетамидо-4-И-метиламино-2,3,4,5-тетрадезокси-Оглицеро-П-галакто-нон-2-енопиранозонат (4-М-метиламиноНеу5Ац2ен1Ме)

Съединение 21

Метилов 5-ацетамидо-7,8,9-три-0-ацетил-4-К^-диметиламино2Д4,5-тетрадезокси-О-глии,еро-Е)-галакгпо-нон-2енопиранозонат (4N,N-guMemuAaMUHO-Hey5,7,8,9Au,₄2eHlMe)

Съединение 22

Метилов 5-au,emaMugo-4-N,N-guMemuAaMUHO-2,3,4,5-mempage3okcu-Dглицеро-0-галакто-нон-2-енопиранозонат (4-N,N-guMemuAaMUH0Неу5Ац2ен1Ме)

Съединение 24

Метилов 5-аи,етамидо-7,8,9-три-О-ацетил-4-?<-метоксикарбонилметиламино-2,3,4,5-тетрадезокси-О-глии,еро-П-галакто-нон-2енопиранозонато (4-К-метоксикарбонилметиламино

Неу5,7,8.9Ац₄2ен1Ме)

Съединение 25

Метилов 5-аи,етамидо-4-М-метоксикарбонилметиламино-2,3,4,5тетрадезокси-О-глицеро-П-галакто-нон-2-енопиранозонат (4-NметоксикарбонилметиламиноНеу5Ац2ен1Ме)

Съединение 26

Динатриев 5-аи,етамидо-4-Н-оксикарбонилметиламино-2,3,4,5тетрадезокси-Г)-глицеро-П-галакто-нон-2-енопиранозонат.

Съединение 27

Метилов 5-ацетамидо-7,8,9-три-О-ацетил-4-К-2’-хидроксиетиламино-2,3,4,5-тетрадезокси-О-алицеро-П-галакто-нон-2енопиранозонат (4-N-2'- хидроксиетиламиноНеу5,7,8,9-Ац₄2ен1Ме)

Съединение 28

Метилов 5-Ацетамидо-4-Ь1-2'-хидроксиетиламино-2,3,4,5тетрадезокси-П-глии,еро-П-галакто-нон-2-енопиранозонат (4-N-2’хидроксиетиламиноНеу5,7,8,9Ац₄2ен1Ме)

Съединение 29

Метилов 5-аи,етамидо-7,8,9-три-О-аи,етил-4-1Ч-2'-хидроксиетиламино-2,3,4,5-тетрадезокси-0-глицеро-0-галакто-нон-2енопиранозонат (4-№2'-хидроксиетиламиноНеу5Аи,2ен1Ме)

Съединение 30

3-Дезокси-П-глицеро-П-галакто-2-нонилпиразоноВа киселина (KDN)

Съединение 31

Метилов 3-дезокси-0-глии,еро-П-галакто-2-нонилопиранозонат (KDNIMe)

Съединение 32

Метилов (4,5,7,8,9-пента-О-аи,етил-2,3-дидезокси-Е>-глицеро-Огалакто-2-нонилопиранозонилхлорид)онат (KDN4,5,7,8,9Au,₅2pCllMe)

Съединение 33

Метилов 4,5,7,8,9-пента-О-ацетил-2,3-дидезокси-В-глицеро-Огалакто-нон-2-енопиранозонат (KDN4,5,7,8,9Au,₅2eHlMe)

Съединение 34

Метилов 2,3-дидезокси-О-глии,еро-П-галакто-2-енопиранозонат (KDN2eHlMe)

Съединение 35

Натриев 2,3-дидезокси-П-глицеро-О-галакто-нон-2-енопиранозонат

Съединение 36

Хидразинов 4,5-диамино-2,3,4,5-тетрадезокси-Н-глицеро-0-галактонон-2-енопиранозонат (Хидразин4,5-диаминоНеу2ен)

Съединение 37

4,5-диамино-2,3,4,5-тетрадезокси-П-глицеро-О-галакто-нон-2- енопиразонова киселина (4,5-диаминоНеу2ен)

Съединение 38

Натриев 4,5-диамино-2,3,4,5-тетрадезокси-0-глицеро-П-галактонон-2-енопиранозонат

Съединение 39

Метилов 5-аи,етамидо-2,3,5-тридезокси-9-(р-толуенсулфонил)-0глицеро-П-галакто-нон-2-енопиранозонат

Съединение 40

Метилов 5-ацетамидо-9-азидо-2,3,5,9-тетрадезокси-Н-глицеро-Огалакто-нон-2-енопиранозонат

Съединение 42

5,9-диацетамидо-2,3,5,9-тетрадезокси-0-глицеро-Н-галакто-нон-2енопиразонова киселина

Съединение 43

Метилов 5-ацетамидо-9-и,иано-2,3,5,9-тетрадезокси-0-глицеро-Пгалакто-нон-2-енопиранозонат

Съединение 44

5-Ацетамидо-9-и,иано-2,3,5,9-тетрадезокси-П-глии,еро-0-галактонон-2-енопиразонова киселина

Пример 1 Получаване на натриев 5-ацетамидо-4-азидо-2.3.4.5 тетрадезокси-Р-глицеро-Р-галакто-нон-2-енопиразонат (4-азидоНеу5Ац2ен) (4)

Общата реакционна схема е както следва:

1) BF₃.Et_;O

МеОН/С₆Н₆

2) НОАс/Етилацетат/ Н,О

1) Τί,Ο/пиридин

СН_:С1,

2) NaNj/n-Bu.X.H-SO. DMF

Получаване на (2)

Към разбъркван разтвор на метилов 5-ацетамидо-4.7,8.9тетра-0-аиетил-2.3.5-тридезокси-Р-глииеро-Р-галакто-нон-2енопиранозонат (1) (1500 mg, 3.17 mmol) в смес от бензен (50 ml) и метанол (300 mg) за тридесет минути се прибавя на капки BF_?Et_:O (12 ml) в азотна атмосфера при стайна температура. След това общата смес се оставя на разбъркване при стайна температура в продължение на 16 часа. Разтворът се разрежда с етилацетат (250 ml), измива се последователно с наситен разтвор на NaHCO; (30 ml х 3) и с вода (20 ml х 3), след което се изпарява до малък обем (около 10 ml) и към него се прибавя вода (0.5 ml) и оцетна киселина (0.5 ml). След това цялата смес се разбърква при стайна температура в продължение на два дни преди разреждането и с етилацетат (200 ml). Етилацетатният разтвор се измива с 5% разтвор на NaHCO:

(30 ml х 2) и с вода (20 ml x 3), след което се изпарява до сухо. Остатъкът се хроматографира (силикагел, етилацетат като елуиращ разтворител), за да се получи чистото съединение (2) (550 mg, 40%).

Ή ЯМР (CDC1₃) δ (ppm): 1.95, 2.06, 2.08, 2.10, 2.35 (s, 15H, ацетил CH₃ x 5), 3.80 (s, ЗН, COOCH₃), 4.1-4.4 (т, 4Н, Н₄, Н₅, Н₆, Н₉), 4.82 (dd, 1Н, J₉.₈ 1.8Hz, J_y,₉ 12.3Hz, H₉), 5.27 (m, IH, H₈,), 5.45 (dd, IH, J₇.₈ 3.5Hz, H₇)

6.15 (d, 1 H. J3.4 5.4Hz, H₃), 6.47 (d, IH, J_NH5 8.8Hz, -CONH).

Получаване на (3)

Към разбъркван разтвор на съединение (2) (800 mg, 1.67 mmol) в безводен дихлорометан (10 ml) и сух пиридин (316 mg, 4 mmol) за 15 минути при -30° до -40°С се прибавя на капки разтвор на трифлуорометансулфонов анхидрид (Tf₃O) (556 mg, 2 mmol) в дихлорометан (2 ml). Реакционната смес се разбърква 5 часа при -30° и се концентрира до сухо във вакуум. След това остатъкът се разтваря в сух диметилформамид (5 ml), съдържащ смес от натриев азид (650 mg, 10 mmol) и тетрабутиламониев хидрогенсулфат (170 mg, 0.5 mmol). Реакционната смес се разбърква 16 часа при стайна температура, след което се изпарява до сухо под дълбок вакуум. Остатъкът се разделя между етилацетат (200 ml) и вода (50 ml). Органичният слой се отделя и се измива с вода (50 ml х 2), изсушава се над Na_:SO₄, изпарява се до получаване на остатък (780 mg), който се подлага на двойна хроматография (силикагел, първата система от разтворители е етилацетат/ацетон : 8/1; втората система от разтворители е дихлорометан/вода : 10/1) до получаването на безцветно масло (3) (185 mg, 24%).

Масспектър (FAB) 457 (М⁺ + 1), 414 (М⁺ -N3. [a]~°D + 19.1° (Cl, МеОН). Инфрачервен спектър (СНС13) cm'¹ 2100 (N-N3); 1748 (карбонил).

^!Н ЯМР (СРС1₃) δ (ppm): 2.04, 2.05, 2.06, 2.12, (s, 12H, ацетил CH₃x 4). 3.79 (s, ЗН, СООСНз), 3.91 (ddd, 1Н, J_{5 nh} 8.4Hz, J_{5 nh} 8.8Hz, J₅₆ 9.9Hz, H₅), 4.17(dd, 1H, J_y,₈ 6.8Hz, J₉.₉ 12.5Hz, H₈,), 4.42 (dd, 1H, J₄₃ 2.9Hz, J₄₅ 8.8Hz, H₄). 4.48 (dd, 1H, J₆₇2.3Hz, J₆.₅ 9.9Hz, H_fi) 4.46 (dd, 1 H, J₉.₈ 2.7Hz, J₉.₉, 12.5Hz, H₉), 5.31 (m, 1 H₈.₇ 5.2Hz, J₈.₉ 2.7Hz, J₈.₉- 6.8Hz, H₈), 5.45 (dd, 1H, J₇.₆ 2.3Hz, J₇.₈ 5.2Hz, H₇), 5.96 (d, 1H, J₃.₄ 2.9H, H₃), 6.13 (d, IH, J_NH5 8.4Hz, -CONH) ¹³С-ЯМР (CDC1₃, δ (ppm) 20.7 (CH₃-CO-O-), 23.2 (CH₃CO-NH), 48.3 (C₅), 52.6 (COOCH₃), 57.8 (C₄), 62.1 (C₉), 67.7, 70.9 (C,, C₈), 75.9 (C₆), 107.6 (C₃), 145.1 (C₂), 161.5 (Сф, 170.2, 170.3, 170.7, (ацетил-С = 0x4).

Получаване на (4)

Съединение (3) (50 mg, 0.11 mmol) се разтваря в безводен метанол (5 ml), съдържащ натриев метоксид (8 mg, 0.15 mmol). Сместа се разбърква 2 часа при стайна температура и се концентрира до сухо във вакуум. Остатъкът се разтваря във вода (3 ml), разбърква се 1.5 часа при стайна температура, довежда се до pH 6-7 със смола Dowex 50 х 8 (Н⁺) и след това се лиофилизира до получаване на титулното съединение (4) (35 mg, 94%).

Инфрачервен спектър (KBr) cm’¹ 3400 (широка -ОН), 2100 (-N₃), 1714 (карбонил).

*Н ЯМР (D₂O) δ (ррт): 2.06 (5, ЗН, ацетил СН₃), 3.64 (dd, 1 Н, J_{9 S} 6.3Hz, J₉.₉ 11.8Hz, Η₉·), 3.65 (dd, 1 H, J₇.₆ 3.9Hz, J₇₈ 6.8Hz, H₇), 3.88 (dd, 1H, J₉.₈ 2.6Hz, J_y.₉- 11.8Hz, H₉), 3.94 (m, 1H, J₈.₇ 6.8Hz, J_{8 9} 2.6Hz, J₈₉ -6.3Hz, H₈), 4.21 (dd, IH, J₅.₄ 10.4Hz, J_{5 6} 8.9Hz, H₅), 4.31 (dd, 1H, J₄₃ 2.2Hz, J₄₅ 2.2Hz, J₄₅ 10.4Hz, H₄), 4.34 (dd, IH, J₆₅ 8.9Hz, J₆₇ 3.9Hz, H₆) 5.82 (d, IH, J₃.₄ 2.2Hz, H₃).

Пример 2 Получаване на натриев 5-ацетамидо-4-амино-2,3,4,5тетрадезокси-Р-глииеро-Р-галакто-нон-2-енопиранозонат (4-аминоНеу5Ац2ен) (6)

Общата реакционна схема е както следва:

(3)

Н-Ъ/пиридин

HN—-Τ'-'φ

Ac H_:N

1) NaOMe/MeOH

-►

2) OHHO

Ac H-,N (6)

ONa⁺

Получаване на (5)

В разтвор на метилов 5-ацетамидо-7,8,9-три-О-ацетил-4азидо-2,3,4,5-тетрадезокси-Р-глииеро-Р-галакто-нон-2енопиранозонат (3), получен както в Пример 1, (95 mg, 0.208 mmol) в пиридин (6 ml) в продължение на 16 часа при стайна температура се пропуска да барбутира H₂S. След това разтворът се продухва 15 минути с азот и се изпарява под дълбок вакуум за отстраняване на пиридина. Остатъкът се хроматографира (силикагел, етилацетат изопропанол/вода — 5/2/1) до получаване на безцветното съединение (5) (50 mg, 56%).

Масспектър (FAB) 431 (М⁺ + 1), 414 (М⁺ -NH2), [oc]^2OD +34.5° (CI. МеОН). Инфрачервен спектър (СНС1₃) cm’¹ 3400 (широка NH₂), 1740 (карбонил).

^]Н-ЯМР (СРС1₃ + СР₃ОР) δ (ppm) 1.96, 2.06, 2.07, 2.10 (s, 12H ацетил

¹³С-ЯМР (СРС1- + CD3OD) δ (ppm)

20.2, 20.3 (CH3-CO-O-), 22.3 (CH₃-CO-NH), 48.2 (C₅), 50.4 (C₄), 52.0 (COOCH₃), 52.1 (C_y), 67.8, 71.2 (C₇, C_s), 76.5 (C₆), 112.5 (C₃), 143.5 (Cj. 162.0 (CJ, 170.2, 170.4, 170.8, 172.2 (ацетил -C = 0 x 4).

Получаване на (6)

Съединение (5) (50 mg, 0.116 mmol) се разтваря в безводен метанол (5 ml), съдържащ натриев метоксид (12.4 mg, 0.23 mmol). Сместа се разбърква в продължение на 1.5 часа при стайна температура и се изпарява във вакуум при 30°С до сухо. Остатъкът се разбърква във вода (3 ml) при стайна температура, докато тънкослойният анализ (силикагел, етилацетат/метанол/0.1 N HCI = 5/4/1) покаже, че хидролизата е завършила. Разтворът (pH около 10.5) се довежда постепенно до pH 7.5 посредством смола Dowex 50 х 8 (Н⁺). Щом като pH на разтвора достигне стойността 7.5. суспензията се филтрува бързо през прес-филтър.

Разтворът се лиофилизира, при което се получава титулното съединение (6) (30 mg, 83%).

'Η-ЯМР (Р₂О) δ (ppm). 2.07 (S, ЗН, ацетил СН₃), 3.59-3.70 (т, 2Н, Н₇ и Н₉·), 3.89 (dd, 1Н J₉₈ 2.6Hz, J₉₉.11.8Hz, H₉), 3.95 (m, 1H H₈), 3.99 (brd. 1H, J_{4 5} 10.6Hz, H₄), 4.21 (brt, 1H, J_{5 4}u J₅.₆ 10.6Hz, H₅), 4.29 (brd, IH. J₆.₅ 10.6 Hz, H₆), 5.66 (d, 1H J_{3 4}1.9 Hz, H₃).

Пример 3 Получаване на амониев 5-ацетамидо-4-гуанидино-2,3,4,5тетрадезокси-Р-глииеро-Р-галакто-нон-2-енопиранозонат (7)

Общата реакционна схема е както следва:

(7)

В разтвор на S-метилизоуреа (546 mg, 3 mmol) във вода (15 ml) при температурата на ледената баня се прибавя метилов 5,7,8,9три-0-ацетил-4-амино-2.3.4.5-тетрадезокси-Р-глииеро-Р-галактонон-2-енопиранозонат (5), получен както в Пример 2 (40 mg, 0.093 mmol). Реакционната смес се разбърква в продължение на 7 дни при 5°С и се налива в колона със смола Powex 50W X 8 (Н⁺) (35 ml). След това колоната се измива със студена вода (700 ml) и и се елуира с 1.5 М разтвор на NH₄OH. Елуатът (120 ml) се концентрира до сухо под дълбок вакуум. Полученият остатък се хроматографира (силикагел; система от разтворители 1: етилацетат/изопропанол/вода, 1/5/1; система от разтворители 2: 75% изопропанол) до получаване на титулното съединение (7) (8 mg, 24.5%).

Съединение (7) дава силно положителна реакция на Sakaguchi, което показва наличието на гуанидинова група. Данните от ЯМР за съединение (7) са дадени по-долу.

’Н-ЯМР (Р₂О + СР₃ОР) δ (ррт). 2.06 (s, 2Н, ацетил СНз), 3.60 (brd, 1Н, J₇₈ 9.4Hz, Н₇), 3.63 (dd, 1Н, J₉-₈ 6.2Hz, J_9:9 11.8Hz, H₉), 3.76 (brd, 1H, J₄₅ 9.4Hz, H₄), 3.87 (dd, 1 H, J₉.₈ 2.6Hz, J₉₉> 11.8Hz, H₉), 3.93 (ddd, 1H, J₈.₇ 9.4Hz, J₈₉ 2.6Hz, J₈₉. 6.2Hz, H₈), 4.01 (dd, 1H, J₅.₄ 9.4Hz, J₅.₆ 10.6Hz, H₅), 4.20 (br d, 1H₆₅ 10.6Hz, H₆), 5.63 (d, 1H, J₃₄ 2.1Hz, H₃).

Пример 4 Натриев 5-ацетамидо-4-Ь1,Ь1-диалиламино-2,3,4,5тетрадезокси-Р-глииеро-Р-галакто-нон-2-енопиранозонат. (9).

Общата реакционна схема е както следва:

(9)

В разтвор на алилбромид (60 mg, 0.5 mmol) и метилов 5ацегпамидо-7,8,9-три-О-ацетил-4-амино-2,3,4.5-тетрадезокси-Рглииеро-Р-галакто-нон-2-енопиранозонат (5) (90 mg, 0.209 mmol) в ацетонитрил (5 ml) се прибавя сребърен карбонат (116 mg, 0.418 mmol). Защитена от светлина, сместа се разбърква в продължение на 16 часа при стайна температура. Получената суспензия се филтрува и филтратът се изпарява до сухо. Остатъкът се подлага на бърза хроматография върху силикагел, елуиран с етилацетат, съдържащ 10% метанол. при което се получава метилов 5ацетамидо-7,6,9-три-О-ацетил-4-М,М-диалиламино-2,3,4,5тетрадезокси-О-глииеро-Р-галакто-нон-2-енопиранозонат (8) (85 mg. 80% ).

’Η-ЯМР (СОС1з) δ (ppm) 1.94, 2.05, 2.06, 2.11 (s, 12Н, ацетил СН₃ х 4), 2.97 (dd. 2Н, JjOa.lOb ^U JlO’a.IOb 14.3Hz, JiOa.ll и Jio’all’ 7.6Hz, H10a и Н10'а), 3.24 (dd. 2Н, Jiob.ioa ^и Доъ.кга 14.3Hz, Jjob.n u Jio-b.ii’ 4.9Hz, H10b и Н_]0Ъ),

3.58 (dd. 1H, J₄₃ 2.4Hz. J₄₅ 9.3Hz, H₄), 3.79 (s, ЗН, СООСНз), 4.12-4.26 (m, 3H, H₆·, Hy, H₅), 4.70 (dd, 1H, J₉₈ 2.6Hz, J₉₉. 12.3Hz. H₉), 5.09 (dd. —H, Ji2u,ucll 4 JlZ'uucir 10.6Hz, J[_2ieM U JlZ’ecxt 1.5Hz, Н1₂ц_НС U H]_2uuc), 5.14 (dd, —H, Ji2mpaHC.ll 4 JlZ’mpaHC.l 1 ’ 17.7HZ, Fl ~Ί·5Ηζ, Hi2_mp_aHC U

Н_!:транс), 5.27-5.32 (m, 2H, H₈ u -CONH-), 5.55 (dd, 1H, J₇₆ 2.1Hz, J-,₅ 4.7Hz, H₇), 5.72 (m, 2H, Н_и u H_ir), 6.07 (d, 1H, J₃₄2.4Hz, H₃).

Съединение (8) (80 mg, 0.156 mmol) се разтваря в безводен метанол (10 ml), съдържаш, натриев метоксид (16.2 mg, 0.30 mmol). Разтворът се разбърква при стайна температура в продължение на 2 часа, след което се изпарява до сухо. Остатъкът се разтваря във вода (5 ml) и се оставя за 2 часа при стайна температура. Полученият разтвор се неутрализира със смола Dowex 50 х 8 (Н⁺) и се изсушава чрез замразяване, при което се получава титулното съединение (9) (49mg, 80%).

^-ЯМР (D₂O) δ (ppm) 1.94 (s, ЗН, ацетил СН₃), 3.24-3.44 (т, 4Н, Н₁₀ х 2 и Н₁₀> х 2), 3.48-4.33 (т, 7Н, Н₄, Н₅, Н₆ Н₇, Н₈, Н₉ и НЦ, 5.24-5.29 (т. 4Н, Н₁₂ х 2 и Н₁₂- х 2), 5.69 (d, 1 Н, J₃.₄ ~2Hz, Н₃), 5.73-5.76 (т, 2Н, Н_и и Н_П)

Пример 5 Натриев 5-ацетамидо-4-Ь1-алиламино-2,3,4,5-тетрадезокси-Р-глииеро-Р-галакто-нон-2-енопиранозонат (11)

Обидата реакционна схема е както следва:

(Ю)

(И)

Към разтвор на алилбромид (48 mg, 0.40 mmol) и съединение (5) (155 mg, 0.36 mmol) в ацетонитрил (5 ml) се прибавя сребърен карбонат (107 mg, 0.38 mmol). Сместа се разбърква, при стайна температура в продължение на 16 часа, като се защитава от светлината. Получената суспензия се филтрува и филтратът се изпарява до сухо. Остатъкът се хроматографира върху колона със силикагел (етилацетат/изопропанол/вода = 5:2:1). фракциите със стойност за R_f 0.5 се смесват и се изпаряват до сухо, при което се получава съединение (10) (53 mg, 32%). Съответно се възстановяват и изходното вещество (5) със стойност за R_f 0.3 (61 mg, 39%) и Ν,Ν-диалиловото производно (8) със стойност за R_f 0.9 (20 mg, 11%). ^-ЯМР (CDC1₃) на съединение (10) е както следва: δ (ppm) 1.96, 2.05. 2.06, 2.11 (s, 12Н, аи,етилСН₃х 4), 3.25 (dd, 1Н. J_1Oa.iob -14.1Hz. Jio_a.r. 5.8 Hz H_10a), 3.37 (dd, 1H, Jiobioa-14.1Hz, Jiob.n 5-9Hz, H_10b), 3.43 (dd, 1H. R ₃

3.1 Hz, J₄₅ 7.5Hz, H₄), 3.79 (s, 3H, COOCH₃), 4.09 (ddd, 1H, J₅₄ 7.5Hz, J₅._NH9 1Hz J₅.₆ 8.1Hz, H₅), 4.21 (dd, 1H, J₉-₈ 7.1Hz, J_9;9 -12.2Hz, H₉·), 4.30 (dd, 1H, J₆₅ 8.1Hz, J₆₇ 4.1Hz, H₆), 4.63 (dd, 1H, J₉.₈ 3.2Hz, J₉.₉· -12.2Hz, H₉), 5.09(dd, 1H, Ji2nuc.ii 10.2Hz, Jnuuc.nmpaHc -1.3Hz, H^c), 5.18 (dd, 1H, J12mpaHC.ll 17.1Hz, Ji2mpaHc.l2nuc “1.3Hz, Н^транс), 5.2)6 (ddd, 1 H, J₈₇ 4._Hz, J₈.₉ 3.2Hz, J₈₉. 7.1 Hz, H₈), 5.57 (dd, 1 H, J₇₆ 4.1 Hz, J₇₈ 4.2Hz, H₇), 5.65 (d, 1 H, J_nh,₅ 9.1Hz, -CONH-), 5.83 (dddd, 1H, Jn._12mpaHc П.1 Hz, J_H.._2uuc 10.2Hz, Jn.ioa 5.8Hz, J_1110b 5.9Hz, H_n), 6.09(d, 1H, J₃.₄ 3.1Hz, H₃).

Съединение (10) (50 mg, 0.11 mmol) се разбърква в безводен метанол (5 ml), съдържаш, натриев метоксид (12 mg, 0.225 mmol), при стайна температура в продължение на 2 часа, след което се изпарява до сухо. Остатъкът се разтваря отново във вода (5 ml) и се оставя да отстои при стайна температура в продължение на 2 часа, преди неутрализирането му със смола Dowex 50 х 8 (Н⁺). Водният разтвор се изсушава чрез замразяване, при което се получава съединение (11) (31 mg, 78%).

Ή-ЯМР (D₂O) δ (ppm) 2.02 (s, ЗН, CH₃CO), 3.42 (dd, IH, J_10a._10b13.4Hz, Jioa.ii 6.6Hz, HjqJ, 3.52 (dd, IH, Jiob.ioa -13.4Hz, Jiob.n 6-3Hz, _J10b 3.51 -4.27 (m, 7H, H₄ H₅, H₆, H₇, H₈, H₉u H₉·), 5.30 (dd, 1 H, J_Wc._12mpaHC

1.5Hz, Ji₂uuc.ii IO.jHz, Hi_2liuc), 5.j4 (dd,lH, Ji2mpaHC.12u.uc 1.5Hz, Ji2mpaHc.ll 17.7Hz, Н_12транс), 5.72 (d, IH, J₃.₄ 2.4Hz, H₃), 5.89 (dddd, J_luOa 6.6Hz, Jll.lOb 6.3Hz, Jn.i2uuc 10.3Hz, Jn.i2mpaHC 17.7Hz, Нц).

Пример 6 Натриев 5-Ацетамидо-4-амино-2,3,4,5-тетрадезокси-Пглииеро-Р-тало-нон-2-енопиранозонат (14).

Общата реакционна схема е както следва:

(13)

Към разбъркван разтвор на съединение (2) (500 mg, 1.04 mmol) в безводен дихлорометан (8 ml), съдържащ пиридин (205 mg, 2.6 mmol), при -30° за 20 минути се прибавя на капки разтвор на трифлуорометансулфонов анхидрид (Tf₂O) (367 mg, 1.3 mmol) в дихлорометан (2 ml). След това реакционната смес се разбърква при -30° в продължение на 5 часа и накрая се изпарява до сухо при понижено налягане. Полученият остатък се разбърква при стайна температура в продължение на 16 часа в сух диметилформамид, съдържащ Ν,Ν-диизопропилетиламин (194 mg, 1.5 mmol). Реакционната смес се концентрира под дълбок вакуум, за да се отстрани диметилформамида. Остатъкът се разбърква в двуфазна смес от толуен (5 ml) и вода (5 ml), съдържаща тетра-нбутиламониев хидрогенсулфат (950 mg, 2.8 mmol) и натриев азид (137 mg. 2.1 mmol). Сместа се разбърква 16 часа при стайна температура, след което се изпарява до сухо. Остатъкът се разделя между етилацетат (50 ml) и вода (15 ml), като органичният разтвор се измива допълнително с вода (5 ml х 2), след което се изпарява до сухо. Остатъкът се разтваря в пиридин (5 ml), през разтвора се пропуска да барбутира H₂S, след което се изпарява до сухо. Остатъкът се подлага на бърза колонна хроматография (силикагел, първата система разтворители е етилацетат, втората система разтворители е етилацетат/изопропанол/Н₂О:5/2/1). Етилацетатният елуат съдържа съединение (13) (260 mg, 53%).

Фракциите с положителна нинхидринова реакция, изолирани със втората система разтворители, се смесват и се изпаряват до сухо, при което се получава съединение (12) (32 mg, 6.5%).

Масспектър (FAB), 431 (М⁺ + 1), 414 (М⁺ - NH₂).

'Н-ЯМР (CDC1₃ + CD3OD) δ (ppm) 1.96, 2.06, 2.08, 2.09 (s, 12Н, ацетил СН₃ х 4), 3.52 (dd, 1 Н, J₄₃ 5.5Hz, J₄₅ 4.5Hz, H₄), 3.80(s, 3H,COOCH₃), 4.16(dd, 1H, J_{6 5}10.2Hz, J₆₇ 2.3Hz, H₆), 4.17(dd, 1H, J_{9 9} 12.4Hz, J₉-₈ 7.3Hz, H₉·), 4.23 (dd, 1H, J₅.₆ 10.2Hz, J₅.₄ 4.5Hz, H₅), 4.73 (dd, 1H, J₉._9>-12.4Hz. J₉.₈ 2.7Hz, H₉), 5.34 (ddd, 1H, J₈.₇ 4.7Hz, J₈.₉ 2.7Hz, J₈,₉. 7.3Hz, H₈), 5.45 (dd, 1 H, J_{7 6} 2.3Hz, J₇.₈ 4.7Hz, H₇), 6.12 (d, 1 H, J₃.₄ 5.5Hz, H₃).

¹³С-ЯМР (CDC1₃ + CD₃OD) δ (ppm) 20.7 (CH₃C(O)O-), 23.1 (CH₃C(O)N-), 43.8(C₅). 46.2(C₄), 52.4(COOCH₃), 62.3 (C₉), 68.3, 71.8(C₇, C₈), 73.0(C₆), 111.5(C₃), 143.8(C₂), 162.4((20, 170.3 u 170.8(CH₃CO x 4).

Съединение (12) се разбърква в продължение на 3 часа при стайна температура в безводен метанол (5 ml), съдържащ смола Amberlite IRA-400 (OH') (100 mg). След филтруване филтратът се изпарява до сухо. Остатъкът се разтваря във вода (5 ml) и се довежда до pH 13 с 0.1М NaOH. Водният разтвор се разбърква при стайна температура в продължение на 2 часа и след това се неутрализира със смола Dowex 50 х 8 (Н⁺). След филтруване филтратът се лиофилизира, при което се получава съединение (14) (16 rng, 70%), което е с положителна нинхидринова реакция.

^-ЯМР (D₂O) δ (ppm) 2.10 (s, ЗН, CH₃CO), 3.67-3.76 (т, 2Н, Н₄ и Н₉ ), 3.92 (dd, 1Н, J₉₈ 2.8Hz, J₉₉.-11.9Hz, Н₉). 3.90-4.02 (т, 2Н, Н₇ и Н₈), 4.37-

4.44 (т, 2Н, Н₅ и Н₆), 5,81 (d, 1Н, J_{3 4} 5.14Hz, Н₃).

Пример 7 Натриев 5-ацетамидо-4-азидо-2,3,4,5-тетрадезокси-Оглицеро-П-тало-поп-2-енопиранозонат (17)

2) N,N-guu3onponiL\emu\aMUH/DMF

3) NaN₃ /H-Bii₄N.HSO₄/'m0AyeH/H-O

4) 0.1M HC1

NaOMe/MeOH

Към разоъркВан разтвор на съединение (2) (500 mg, 1.04 mmol) в безводен дихлорометан (8 ml), съдържащ пиридин (205 mg, 2.6 mmol), при -30°С на капки за 20 минути се прибавя разтвор на трифлуорометансулфонов анхидрид (Tf₂O) (367 mg, 1.3 mmol) в дихлорометан (2 ml). Реакционната смес се разбърква при 3°С в продължение на 5 часа и накрая се изпарява до сухо при понижено налягане. Полученият остатък се разбърква в продължение на 16 часа при стайна температура в сух диметилформамид, съдържащ Ν,Ν-диизопропилетиламин (194 mg, 1.5 mmol). Реакционната смес се концентрира под вакуум, за да се отстрани диметилформамида. Остатъкът се разбърква в двуфазна смес от толуен (5 ml) и вода (5 ml), съдържаща тетра-н-бутиламониев хидрогенсулфат (950 mg, 2.8 mmol) и натриев азид (137 mg, 2.1 mmol). Сместа се разбърква 16 часа при стайна температура, след което се разрежда с 0.2 М HCI (5 ml). Получената смес се разбърква при стайна температура в продължение на 48 часа. Към тази реакционна смес се прибавя етилацетат (50 ml) и 2 М HCI (1 ml). Органичният слой се отделя и се измива с вода (5 mL X 3), след което се изпарява до сухо. Остатъкът се подлага на бърза колонна хроматография (силикагел, етилацетат/хексан=2/1). Фракциите със стойност за R_t 0.32 (етилацетат/хексан=2/1 като проявител) се смесват и се изпаряват до сухо, при което се получава съединение (15) (40 mg. 8.4%). След това колоната се елуира с етилацетат/метанол=10/1 за възстановяване на изходното съединение (2) (280 mg, 56%).

Съединение (15) се изолира под формата на бяло пенесто вещество. Масспектър (FAB) 457 (М⁺ + 1), 414 (M⁺-N3), Инфрачервен спектър (СНС13) cm'¹ 2108 (-N3), 1748 (карбонил) ¹Н-ЯМР (CDC1₃), δ (ppm) 1.97, 2.04, 2.06, 2.07 (s, 12H, ацетил CH₃x 4), 3.82 (s, ЗН, СООСН₃), 4.12-4.20 (т, ЗН, С₆, С₄и С₉), 4.51 (ddd, 1Н, J₅₄ 4.4Hz, J₅₆ 10.7Hz, J₅, NH, 10.1Hz, H₅), 4.69 (dd, 1H, J₉.₈ 2.6Hz, J₉₉ 12.4Hz, H₉), 5.31 (m, 1H, J₈₇ 4.9Hz, J₈₉ 2.6Hz, J₈._9> 7.0Hz, H₈), 5.45 (dd. 1H, J₇₆ 2.1Hz, J_{7 8} 4.9Hz, H₇), 5.68 (d, 1H, J_NH.₅ 10.1Hz, CONH), 6.15 (d, 1H, J₅₄ 5.7Hz, H₃) ¹³С-ЯМР (CDC1₃) δ (ppm) 20.7, 20.8 (CH₃CO-O x 3), 23.1 (OCH₃CONH), 44.8(C₅), 52.6(COOCH₃), 54.8(C₄), 62.1 (C₉) 6.67.6, 71.3(C₇,C₈), 73.5(C₆), 104.5(C₃), 146.3(C₂), 161.5(^), 169.9, 170.2, 170.5(ацетил, C=Ox4)

Съединение (15) (40 mg, 0.088 mmol) се разтваря в безводен метанол (4 ml), съдържащ натриев метоксид (6.4 mg, 0.12 mmol). Сместа се разбърква при стайна температура в продължение на 2 часа и се концентрира до сухо във вакуум до получаването на (16), което след това се разтваря във вода (3 ml), разбърква се 2 часа при стайна температура, довежда се до pH 6.7 със смола Dowex 50 X 8 (н⁴ ), след което се лиофилизира до получаване на титулното съединение (17) под формата на жълтеникав прах (25 mg, 83%). Инфрачервен спектър (KBr) cm'¹ 3400 (широка, -ОН). 2108 (-N₃), 1714 (карбонил) 'Н-ЯМР (D₂O) δ (ppm) 1.97 (s, ЗН, ацетил), 3.5—4.4 (т, 7Н, Н₄, Н₅, Н₆, Н₇, Н₈, Н₉, и Н₉·), 6.07 (d, J₃.₄ 5.6Hz, Н₃)

Пример 8 Натриев 5-ацетамидо-4-1Ч-метиламино-2,3,4.5тетрадезокси-Р-глииеро-Р-галакто-нон-2-енопиранозонат (20)

ОАс

(18)

NaOMe/MeOH

COONa (20)

NHCH₃

NaOH

H.O

COOMe

NHCH₃ (19)

Към разтвор на метилйодид (15 mg, 0.10 mmol) и съединение (5) (48 mg, 0.11 mmol) в ацетонитрил (6 ml) се прибавя сребърен карбонат (42 mg, 0.15 mmol). Сместа се разбърква 16 часа при стайна температура, като се защитава от светлина. Получената суспензия се филтрува и филтратът се изпарява до сухо. Остатъкът се подлага на хроматография (силикагел, етилацетат/изопропанол/ вода = 5/2/1). Фракциите със стойност за R_f 0.36 се смесват и се концентрират във вакуум до сухо, при което се получава съединение (18) (25 mg, 51%).

Масспектър (FAB) 445 (М⁺ + 1), 414 (М⁺ -NHCH3) ^!Н-ЯМР (СРС13) δ (ppm) 1.95, 2.05, 2.06, 2.12 (s, 12И, ацетил СН₃ х 4).

2.45 (s, ЗИ, N-CH₃), 3.72 (dd, 1Н, J₄₃ 2.3Hz, J₄.₅ 9.2Hz, H₄), 3.89 (s, 3H, COOCH₃), 4.16 (dd, 1H, J₉₈ 7.2Hz, J₉.₉ 12.3Hz, H₉.), 4.26 (ddd, 1H, J₅₄ 9.2Hz, J_{5 NH} 9.1Hz, J_{5 6} 9.0Hz, H₅), 4.36 (dd, 1H, J₆₅ 9.0Hz, J₆₇ 2.7Hz. H₆), 4.64 (dd, 1 H, J₉₈ 2.9Hz, J_99; 12.3Hz, H₉), 5.34 (m, 1H, J₈₇ 4.8Hz. J₈₉

2.9Hz, J_8y· 7.2Hz. H_s). 5.51 (dd, 1H. J₇₆ 2.7Hz, J_7S 4.8Hz). 6.05 (d, 1H, J_v 2.3Hz, H₃)

Съединение (18) (25 mg, 0.056 mmol) се разбърква в безводен метанол (5 ml), съдържащ натриев метоксид (5.4 mg, 0.1 mmol), при стайна температура в продължение на 2 часа, след което се изпарява до сухо до получаване на съединение (19), което се разтваря във вода (5 ml) и се оставя да отстои при стайна температура в продължение на 2 часа преди неутрализирането му със смола Dowex 50 х 8 (Н⁺). филтратът се лиофилизира, при което се получава съединение (20) (15 mg, 82%).

'Н-ЯМР (D,O) δ (ррт) 1.94 (s, ЗН, СН₃СО), 2.43 (s, ЗН, N-CH₃), 3.5-4.3 (т, 7Н, Н₄, Н₅, Н₆, Н_? Н₈, Н, и Н,·), 5.65 (d, 1Н, J_{3 4} 2Hz, Н₃)

Пример 9 Натриев 5-ацетамидо-4-?4,К-диметиламино-2,3,4,5тетрадезокси-0-глицеро-П-галакто-нон-2-енопиранозонат (23).

(21)

Amberlite IRA 400(ОН') МеОН

NaOH

Η-,Ο

Към разтвор на метилйодид (65 mg, 0.46 mmol) и съединение (5) (100 mg, 0.23 mmol) в ацетонитрил (15 ml) се прибавя сребърен карбонат (127 mg, 0.46 mmol). Сместа се разбърква, защитена от светлина от светлина, при стайна температура в продължение на 16 часа. Получената суспензия се филтрува и филтратът се изпарява до сухо. Остатъкът се подлага двукратно на бърза хроматография (силикагел, етилацетат/изопропанол/вода=5/2/1), при което се получава съединение (21) (30 mg, 28%) под формата на безцветна пяна.

Масспектър (FAB) 459 (М⁺ + 1) 414 (M⁺-N(CH₃)₂) ^-ЯМР (CDC1₃) δ (ррт) 1.98, 2.05, 2.06, 2.12 (s, 12Н, ацетил, СН₃ х

4), 2.33 (br s, 6Н, N(CH₃)₂), 3.42 (dd, 1Н, J_{4 3} 32.8Hz, J_{4 5} 8.6Hz, H₄), 3.79 (s, 3H,COOCH₃), 4.17 (dd, 1H, J₉>₈ 7.4Hz, J₉-₉ 12.3Hz, H₉), 4.18 (ddd, 1H, J_{5 4} 8.5Hz, J_{5 NH} 8.9Hz, J₅.₆ 9.0Hz, Hg), 4.31 (dd, 1H, J₆.₅ 9.0Hz, J₆₇ 2.9Hz, H₆), 4.68 (dd, 1H, J₉₈ 3.0Hz, J₉₉· 12.3Hz, H₉), 5.31 (m, 1H, J₈.₇ 4.4Hz, J₈.₉ 3.0Hz, J₈.₉-7,4Hz, H₈), 5.51 (dd, 1H, J₇.₆ 2.9Hz, J₇.₈ 4.4Hz, J₇), 5.79 (d, 1H, J_{NH 5}, 8.9Hz, CONH), 6.09 (d, 1H, J₃.₄ 2.8Hz, H₃)

Съединение (21) (30 mg, 0.066 mmol) се разбърква в безводен метанол (4 ml), съдържащ суха смола Amberlite IRA 400 (OH ) (90 mg), при стайна температура в продължение на 3 h, след което чрез филтруване се отделя смолата, филтратът и промивните води се смесват и се изпаряват до сухо, при което се получава съединение (22) (20 mg), което се разбърква 2 часа при стайна температура във вода (5 ml) при pH 12, след което, преди филтруване, се довежда до pH 7.5 с Dowex 50 X 8 (Н⁺). филтратът се лиофилизира, при което се получава съединение (23) (15 mg, 66%) под формата на бял прах. ’Н-ЯМР (D₂O) δ (ррт) 1.97 (s, ЗН, ацетил), 2.33 (s, 6Н, N(CH₃)₂), 3.50—4.26 (т, 7Н, Н₄, Н₅, Н₆, Н₇ Н₈, Н₉ и Н₉·,), 5.71 (d, J₃.₄ 1.8Hz, Н₃)

Пример 10 Двунатриев 5-ацетамидо-4-М-оксикарбонилметиламино-

2,3,4,5-тетрадезокси-П-глицеро-Е)-галакто-нон-2-енопиранозонат (26).

NaOH

-<---------Н-0 (26)

OH
ho„ 1	__0
	7--^ \_-COOMe
AcHN.-C^
HO	NHCH>cOOMe

(25)

Към разтвор на метил-а-бромоацетат (36 mg, 0.23 mmol) и съединение (5) (100 mg, 0.23 mmol) в ацетонитрил (12 ml) се прибавя сребърен карбонат (64 mg, 0.23 mmol). Сместа се разбърква 16 часа при стайна температура, като се защитава от светлина, след което се филтрува. филтратът се изпарява до сухо. Остатъкът се хроматографира върху колона със силикагел (етилацетат/ изопропанол/вода=5/2/1). Фракциите със стойност за R_f 0.60 се смесват и се изпаряват до сухо, при което се получава съединение (24) (80 mg, 68.5%).

'Н-ЯМР (CDC1₃) δ (ppm) 1.97, 2.044, 2.047, 2.11 (s, 12Н, ацетил СН₃ х

4), 3.49 (AB, 2Н, J_AB 17.6Hz, Н₁₀ х 2), 3.50 (dd, 1Н, J₄₃ 2.9Hz, J₄₅ 8.4Hz, H₄), 3.71 (s, ЗН,С_ИООМе), 3.79 (s, ЗЩфООМе), 4.09 (ddd, 1H, J₅.₄ 8.4Hz, J_5NH8.8Hz, J₅₆ 8.1Hz, H₅), 4.17 (dd, 1H, J₉-₈ 7.4Hz, J_y .₉l 2.3Hz, H₉), 4.32 (dd, 1H, J₆₅ 8.1Hz, J₆.₇ 4.1Hz, H₆), 4.63 (dd, 1H, J₉.₈ 3.1Hz, J₉₉· 12.3Hz, H₉), 5.37 (m, 1H, J_{8 7} 4.1Hz, J₈.₉ 3.1Hz, J₈.₉-7.4Hz, H₈), 5.56 (t, 1H, J_{7 6} 4.1Hz, J_{7 8} 4.1Hz, H₇), 6.03 (d,lH, J_NH5 8.8Hz, CONH), 6.04 (d, 1H, J₃.₄ 2.9Hz, H₃)

Съединение (24) (80 mg. 0.159 mmol) се разбърква в безводен метанол (20 ml), съдържащ натриев метоксид (18 mg, 0.32 mmol) при стайна температура в продължение на 2 часа, след което се изпарява до сухо до получаване на съединение (26), което се разтваря във вода (15 ml). Разтворът се оставя да отстои при стайна температура в продължение на 2 часа преди да се доведе до pH 7 със смола Dowex 50 х 8 (Н⁺). филтратът се изсушава чрез замразяване, при което се получава съединение (25) под формата на бял прах (59 mg, 94.6%).

^-ЯМР (D₂O) δ (ppm) 2.04 (s, ЗН, ацетил), 3.58 (AB, 2Н, J_AB 17.6Hz, H₁₀x 2), 3.50-4.40 (m, 7H, H₄, Н₅, Н₆, Н₇ Н₈, Н₉ и Н₉-,), 5.68 (d, IH, J₃.₄ 2.1Hz, Н₃)

Пример 11 Натриев 5-аи,етамидо-4-М-2'-хидроксиетиламино-

2,3,4,5-тетрадезокси-П-глицеро-0-галакто-нон-2-енопиранозонат (29)

(29) (28)

Към разтвор на бромоетанол (158 mg, 1.26 mmol) и съединение (5) (84 mg, 0.195 mmol) в ацетонитрил (10 ml) се прибавя сребърен карбонат (100 mg. 0.36 mmol). Сместа се защитава от светлина и се разбърква при стайна температура в продължение на 7 дни. След това се филтрува и филтратът се изпарява до сухо. Остатъкът се хроматографира върху колона със силикагел (етилацетат/ изопропанол/вода=5/2/1). фракциите със стойност за R_f 0.4 се смесват и се изпаряват до сухо, при което се получава съединение (27) (40 ml, 40%).

Масспектър (FAB) 475 (М⁺ + 1), 414 (M⁺-NHCH₂CH₂OH) ^-ЯМР (CDC1₃) δ (ppm) 1.96, 2.05, 2.10 (s, 12H, ацетил, CH₃x 4), 2.29 (br s, 2H, NH и OH), 2.76 (ABm, 2H, Н₁₀х 2), 3.47 (dd, 1H,J₄.₃ 2.9Hz, J₄.₅ 7.5Hz, H₄), 3.62 (t, 2H, J₁₁₁₀4.9Hz, H_n x 2), 3.79 (s, 3H, COOCH₃), 4.15 (ddd, 1H, J₅ 4 7.5Hz. J_{5 6} 8.4Hz, J₅._NH 8.3Hz, H₅), 4.19 (dd, 1H, J_9i8 7.5Hz, J_9i9 12.3Hz H₉·), 4.29 (dd, 1H, J₆.₅ 8.4Hz, J₆.₇ 3.8Hz. НД 4.65 (dd, 1H, J₉₈ 2.9Hz, J₉₉·, 12.3Hz. H₉), 5.36 (m, 1H, J₈₇ 4Hz, J₈₉ 2.9Hz, J₈.₉- 7.5Hz, H₈), 5.55 (dd, 1H, J_{7 6} 3.8Hz, J_{7 8} 4Hz, H₇), 6.08 (d, 1H, J_{3 4} 2.9Hz, H₃), 6.09 (d, 1H, J_NH,5 8.3Hz. CONH)' ¹³С-ЯМР (CDC1₃) δ (ppm) 20.6, 20.8, (CH₃-CO-O- x 3), 23.10 (CH₃-CONH), 46.5 (C₅, 47.2 (C₁₀), 52.3 (CH₃COOCH₃), 55.6 (C₄), 61.1 (C_n), 62.1 (C₉), 68.1, 71.1 (C-, C_s), 76.7 (C₆), 111.6 (C₃). 143.7 (C₂), 162.1 (Q), 170.1, 170.3, 170.6, 171.0 (ацетилкарбонил x 4)

Съединение (27) (40 mg, 0.084 mmol) се разбърква в безводен метанол (10 ml), съдържащ суха Amberlite IRA-400 (OH) (120 mg) при стайна температура в продължение на 4 часа, след което се филтрува. филтратът и промивните води се смесват и се изпаряват до сухо до получаване на съединение (28), което се разтваря във вода (10 ml) и се довежда до pH 13 чрез прибавяне на NaOH. Водният разтвор се оставя при стайна температура в продължение на 3 часа, преди да бъде доведен до pH 6.7 със смола

Dowex 50 х 8 (Н⁺). Разтворът след филтруване се лиофилизира. като се получава съединение (29) под формата на бял прах (20 mg, 66%).

’Η-ЯМР (D₂O) δ (ppm) 1.99 (s, ЗН, ацетил), 2.91 (AB, 2Н, Н₁₀ х 2), 3.53-4.25 (т, 9Н, Н₄, H_s, H_ft, Н₇, Н₈, Н₉ и Н₉₇ Н_И Х2), 5.65(d, J₃₄ 2.24Hz, Н₃) Пример 12 Натриев 2.-3-дидезокси-Р-глииеро-Р-галакто-нон-2енопиранозонат (35)

он (30)

НУМеОН

------>

(31)

NaOMe/MeOH τ

AgNOyCH₃CN

(32)

(33) (34)

Съединение (30) (332 mg, 1.24 mmol) се разбърква в безводен метанол (40 ml), съдържащ смола Powex 50 х 8 (Н⁺), (50 mg) при стайна температура в продължение на 16 часа, преди да бъде филтрувано. филтратът се изпарява до сухо до получаване на съединение (31) (320 mg, 1.13 mmol, 91.5%), което се разбърква в ацетилхлорид (5 ml) при стайна температура в продължение на 3 дни, след което се изпарява до сухо, при което се получава съединение (32) (539 mg, 1.057 mmol, 93.6%). Остатъкът се разтваря в ацетонитрил (20 ml), съдържащ сребърен нитрат (500 mg, 2.94 mmol) u калиев карбонат (90 mg, 0.65 mmol), защитава се от светлина и се разбърква при стайна температура в продължение на 16 часа, след което се филтрува. филтратът се изпарява до малък обем и се разделя между етилацетат (75 ml) и вода (15 ml). Органичният слой се измива с вода (10 mL х 3) и се изпарява до сухо. Остатъкът се хроматографира върху колона със силикагел (етилацетат/хексан=2/1), при което се получава чистото съединение (33) (200 mg, 0.423 mmol, 40%).

’Н-ЯМР (CDC1₃) δ (ppm) 2.062, 2.070, 2.073, 2.094, 2.096 (s, 15H, ацетил CH₃ х 5), 3.80 (s, ЗН, СООСН₃), 4.19 (dd, 1 Н, J₉₈ 5.9Hz, J_{9 9} 12.3Hz, H₉), 4.33 (dd, 1 H, J₆.₅ 9.4Hz, J₆.₇ 3.0Hz, H₆), 4.57 (dd, 1 H, J₉.₈ 1.9Hz, J₉.₉> 12.3Hz, H₉), 5.20 (dd, 1 H, J₅.₄ 7.0Hz, J₅₆ 9.4Hz, H₅), 5.38 (m, 1H, J₈₇ 5.1Hz, J_{8 9}1.9Hz, J_{8 9} 5.9Hz H₈), 5.49(dd, 1H, J_{7 6} 3.0Hz, J₇₈ 5.1Hz, H₇), 5.57(dd, 1H, J₄.₃ 3.1Hz, J₄.₅ 7.0Hz, H₄), 5.97 (d, 1H, J_{3 4} 3.1 Hz, H₃)

Съединение (33) (100 mg, 0.211 mmol) се разбърква в безводен метанол (10 ml), съдържащ натриев метоксид (24 mg, 0.423 mmol) при стайна температура в продължение на 3 часа, след което се изпарява до сухо, при което се получава съединение (34) (50 mg, 90%), което се разтваря във вода (5 ml) и се оставя при стайна температура в продължение на 3 часа, преди да се доведе до pH 7 със смола Dowex 50 х 8 (Н⁺). Разтворът се изсушава чрез замразяване до получаване на съединение (35) (47 mg, 91%).

^-ЯМР (D₂O) δ (ppm) 3.69 (dd, 1H, J_9i8 5.6Hz, J₉-₉12.0¾ H₉), 3.76 (dd 1H, J₅₄ 7.8Hz, J_{5 6} 10.5Hz H₅), 3.87-3.99 (m, 3H, H₇ H₈, H₉), 4.13 (d, 1H, J₆₅ 10.5Hz, H₆). 4.40 (dd, 1H, J₄.₃ 2.3Hz, J₄₅ 7.8Hz, H₄), 5.67 (d, 1H, J₃₄ 2.3Hz, H₃)

Пример 13 Натриев 4,5-Диамино-2,3,4,5-тетрадезокси-0-глицероП-галакто-нон-З-енопиранозонат (38)

COO

(38)

1) Amberlite IRA-400(HCOO')

2) 1.5M HCOOH

3) Amberlite IR-4B(OH)

0.40 mmol) в хидразинРазтвор на съединение (6) (125 mg, хидрат (5 ml) се загрява под азот при 85°С в продължение на 3 дни и получената смес се изпарява под вакуум до сухо. Остатъкът се разтваря във вода (15 ml) и се прекарва през колона с Amberlite IRA400 (НСОО), след което се елуира с 1.5 М НСООН. Елуатът (200 ml) се изпарява до сухо. Остатъкът се хроматографира върху силикагел, деактивиран с 10% вода (проявител: изопропанол/вода = 4/1). фракциите със стойност за R_f 0.1 се смесват и се изпаряват до сухо, след което се изсушават чрез замразяване. Остатъкът, съединение (36), се разтваря във вода (10 ml), прекарва се през къса колона с Amberlite IR-4B (OH')(10 ml). Ефлуентът се изпарява до сухо до получаване на съединение (37), чийто масспектър (FAB) е 249 (М⁺ + 1 ). Съединение (37) се разтваря във вода и се довежда до pH 7.5 с 0.1 М NaOH, след което се изсушава чрез замразяване, при което се получава съединение (38) (20 mg, 20%) под формата на бял прах.

Ή-ЯМР (D₂0) δ (ppm) 3.01 (dd, 1H, J₅₄9.7Hz, J₅₆ 10.2Hz, H₅), 3,58 (m, 2H, H₉ u H₇), 3.80—3.89 (m, 3H, H₄ H₈ u H₉), 4.06 (d, 1H, J₆.₅ 10.2Hz, H₆), 5.54 (d, 1H, J₃₄ 2.4Hz, H₃)

Пример 14 Метилов 5-ацетамидо-2,3,5-тридезокси-9-(ртолуенсулфонил)-Р-глицеро-Р-галакто-нон-2-енопиранозонат (39).

Разтвор, получен от метилов 5-ацетамидо-2,3,5-тридезоксиП-глии,еро-Р-галакто-нон-2-енопиранозонат (1000 mg, 3.16 mmol) в сух пиридин (85 ml), се охлажда в ленена баня. Прибавя се ртолуенсулфонилхлорид (660 mg, 3.46 mmol) и бледожълтият хомогенен разтвор се оставя една нощ на разбъркване при 4°С. След това се добавя р-толуенсулфонилхлорид (220 mg, 1.15 mmol) и разтворът се оставя още 4 часа на разбъркване при стайна температура.

Обработката му е първо чрез прибавяне на вода (1 ml), последвано от ротационно изпаряване дава вискозно жълто масло, което се подлага на бърза хроматография (SiO₂, EtOAc/iPrOH/H₂O=6/2/1, обемно съотношение) до получаване на основния продукт 1.19 g (80% добив) от съединение (39).

Инфрачервен спектър (KBr): v_max (cm’¹) 2964 (OH), 1730 (СО₂СН₃), 1656 (NHAc), 1358, 1174 (SO₂) 810, 662, 550 (Ar)

Масспектър (FAB), 460 (M+H⁺)

Ц ЯМР (300 MHz, CD₃OD/TMS); δ (ppm) 2.03 (s, 3H, NHAc), 2.45 (s, 3H, ArCH₃), 3.49 (d, 1H, J₆.₇1.70, H₆), 3.76 (s, 3H, CO₂CH₃), 3.91 (dd, 1H, J₅.₆ 1080, H₅), 3.98-4.13 (m, ЗН, H₈, H₉ и H₉), 4.28 (dd, 1H, J₇.₈ 9.55, H₇), 4.39 (dd, 1H, J₄₅ 8.64, H₄), 5.92 (d, 1H, J₃.₄ 2.49, H₃), 7.74 (d, 2H, ArH), 7.79 (d, 2H, ArH)

Пример 15 Метилов 5-ацетамидо-9-азидо-2,3,5,9-тетрадезокси-Пглицеро-П-галакто-нон-2-енопиранозонат (40)

Метил-5-аи,етамидо-2.3,5-тридезокси-9-(р-толуенсулфонил) -Dглицеро-0-галакто-нон-2-енопиранозонат (39) (600 mg, 1.27 mmol) u литиев азид (186 mg, 3.80 mmol) се разтваря в сух диметилформамид (20 ml) и жълтият хомогенен разтвор се загрява до 80°С. След 2 часа, се добавя още литиев азид (186mg, 3.80 mmol) и разтворът се оставя една нощ при 80°С. Разтворителят се отстранява чрез ротационно изпаряване и оставащото тъмнокафяво масло се разтваря в пиридин (2 ml) и се подлага на бърза хроматография (SiO₂, 5/2/1=EtOAc/i-PrOH/H₂O). Основният продукт е съединение (40) (370 mg, 88% добив), получено под формата на бяха пяна.

Инфрачервен спектър (KBr): v_max (cm⁴) 3428 (s,OH), 2104 (s, N₃), 1730 (s, CO₂CH₃), 1656 (s, NHAc)

Масспектър (FAB) : 331 (M+H⁺)

Ή ЯМР (300 MHz, D₂O); δ (ppm) 1.94 (s, 3H, NHAc), 3.37 (dd, IH, H_9>), 3.48 - 3.57 (m, 2H, J₈.₉- 5.77, H₈ u J₉₉· 13.16, H₉), 3.66 (s, 3H, CO₂CH₃), 3.91 - 3.98 (m, 2H, H₅ u H₆), 4.15 (d, IH, J₇₈ 10.86, H₇ 4.38 (dd, IH, J₄.₅ 8.88, H₄), 5.91 (d, IH, J₃₄ 2.44, H₃)

Пример 16 Метилов 5,9-диацетамидо-2,3,5,9-тетрадезокси-Оглицеро-О-галакто-нон-2-енопиранозонат (41).

Тиолоцетна киселина (130 mL, 1.82 mmol) се прибавя към метилов 5-ацетамидо-9-азидо-2,3,5,9-тетрадезокси-О-глицеро-Пгалакто-нон-2-енопиранозонат (70 mg, 0.21 mmol) до получаване на бледожълт разтвор, който се оставя на разбъркване една нощ при стайна температура.

Излишъкът от тиолоцетна киселина се изпарява при ниско налягане и оставащото твърдо вещество се обработва неколкократно с вода и следващо изпаряване (3x3 ml). Сухият остатък се разтваря в метанол (4 ml), филтрува се и филтратът се нанася върху препаративна плочка за тънкослоен хроматографски анализ (SiO₂, 20 cm х 20 cm х 2 mm, елуирана с 5/2/1 EtOAc iPrOH/HgO). Обработва се ивицата с R_f=0.47 до получаване на 51 mg (70% добив) от съединение (41) под формата на бял прах.

Инфрачервен спектър (KBr) : v_max (cm'¹) 3400 (s, OH), 1728 (s,CO₂CH₃), 1656 (s, NHAc)

Масспектър (FAB) : 347 (M+H⁺) ^-ЯМР (300 MHz, D₂O) δ (ppm) 1.96 (s, 3H, NHAc), 2.00 (s, 3H, NHAc), 3.23 (dd, 1H, H₉-), 3.48 (d, 1H, H₆), 3.56 (dd, 1H, J₉.₉- 14.17, H₉), 3.75 (s, 3H, CO₂CH₃), 3,89 (m, 1H, J_{8 9} 2.90, J₈.₉> 7.40, H₈), 4.02 (dd, 1H, J_{5 6}9.10, H5), 4.22 (d, 1H, J₇.₈ 10.85, H₇), 4.45 (dd, 1H, J₄.₅, 8.94, H₄), 5.61 (d, 1H, J₃.₄ 2.47, H₃);

Пример 17 5.9-диаиетамидо-2.3,5.9-тетрадезокси-Р-глииеро-Ргалакто-нон-2-енопиранозонова киселина (42).

Получаването на съединение (42) от съединение (39) е

CH₃COSH

он •
AcHN		COOMe
AcHN<
НО	OH

Разтвор на метилов 5,9-диацетамидо-2,3,5,9-тетрадезокси-Рглицеро-Р-галакто-нон-2-енопиранозонат (41) (46 mg, 0.13 mmol), разтворен в 0.1М воден разтвор на натриев хидроксид (5 ml) се (41) разбърква 2.5 часа при стайна температура. След това разтворът се довежда go pH 5 с Dowex 50W-X8 (Н⁺), смолата се отделя чрез филтруване и филтратът се лиофилизира, при което се получават 40 mg (91% добив) от съединение (42) под формата на бял прах. Инфрачервен спектър (KBr) : v_max (cm^-1) 3376 (s, OH), 1652 (s, NHAc) Масспектър (FAB) : 333 (M+H⁺) ‘Н-ЯМР (300 MHz D₂O) δ (ppm) 1.89 (s, 3H, NHAc), 1.93 (s, 3H, NHAc), 3.15 (dd. IH, H₉), 3.40 (d, IH, H₆), 3.48 (dd, IH, J₉₉. 14.18, H₉), 3.82(m, IH, J₈.₉ 3.01, J₈.₉· 7.43, H₈), 3.94 (dd, IH, J₅.₆ 10.42, H₅), 4.13 (d, IH, J_{7 8} 10.91, H-), 4.36 (dd, IH, J₄.₅8.80, H₄), 5.81 (d, IH, J₃.₄ 2.41, H₃)

Пример 18 Метилов 5-ацетамидо-9-циано-2,3,5,9-тетрадезокси-Пглицеро-П-галакто-нон-2-енопиранозонат (43)

Разтвор на метилов 5-ацетамидо-2,3,5-тридезокси-9-(ртолуенсулфонил)-0-глицеро-П-галакто-нон-2-енопиранозонат (39) (80 mg, 0.17 mmol), трет-бутиламониев цианид (2 mg) и натриев цианид (12 mg, 0.25 mmol) в сух диметилсулфоксид (1.25 mL) се разбърква 5 дни при стайна температура.

Обработката чрез тънкослойна хроматография (SiO₂, 20 cm х 20 cm х 2 тт, елуиране с EtOAc/u3O-PrOH/HgO, 5/2/1) дава като основно съединение 30 mg (61% добив) от съединение (43) под формата на кремаво оцветен прах. (R_f=0.74).

Инфрачервена cnekmpockomui(KBR) : v_max (cm'¹) 3440 (s, OH), 2256 (w, CN), 1726 (s, CO₂CH₃), 1638 (s, NHAc)

Масспектър (FAB) : 315 (M+H⁺) ^-ЯМР (300 mHz, D₂O) δ (ppm) 1.92 (s, 3H, NHAc), 2.75 (dd, IH, Η₉φ 2.93 (dd, IH, J₉.₉· 17.22, H₉), 3.55 (dd, IH, J₆.₇ 1.17, H₆), 3.67 (s, 3H, CO₂CH₃), 4.02 (dd, IH, J₅.₆ 9.05, H₅), 4.13-4.19 (m, IH, J₈.₉ 3.91, J₈.₉-6.56, H₈), 4.16 (dd, IH. J₇₈ 10.90, JJ, 4.37 (dd, IH, J₄₅ 8.95, H₄, 5.90 (d, IH, J₃.₄ 2.42, H₃)

Пример 19 5-Аи,етамидо-9-и,иано-2,3,5,9-тетрадезокси-13-глии,ероП-галакто-нон-2-енопиранозонова киселина (44).

Методът за получаване на 5-аи,етамидо-9-и,иано-2,3,5,9 тетрадезокси-П-глицеро-О-галакто-нон-З-енопиранозонова киселина (44) е обобщен по-долу :

он

(39) (43)

1) вод. NaOH

2) Н⁺ смола

(44)

Метилов

5-ацетамидо-9-и,иано-2,3,5,9-тетрадезокси-Г) глицеро-П-галакто-нон-2-енопиранозонат (43) (80 mg, 0.25 mmol) се разтваря в 0.1М воден разтвор на натриев хидроксид ( 10 ml) и полученият разтвор се разбърква при стайна температура в продължение на 3 часа.

След това pH се довежда до 4 с Dowex 50W-X8(H⁺), смолата се отделя чрез филтруване и разтворът се лиофилизира, при което се получават 75 mg (98% добив) от съединение (43) под формата на пухкав бял прах.

Инфрачервен спектър (KBr) : v_max (cm^-1) 3370 (s,OH), 2254 (w, CN), 1656 (s, NHAc)

Масспектър (FAB) : 301 (M+H⁺)

Н-ЯМР (300 MHz, D₂O) δ (ppm) 1.98 (s, ЗН, NHAc), 2.70 (dd. 1H, H_y ), 2.88 (dd, 1H, J_yy· 17.27, H₉), 3.48 (d, 1H, H₆), 3.97 (dd, 1H, J₅.₆ 9.84, H₅), 4.09-4.24 (m, 2H, J₇ u H₈, J₈.₉ 3.90, J₈._y· 6.53), 4.41 (dd, 1H, J₄₅ 8.87, HJ. 5.80 (d, 1H, J₃.₄ 2.42, H₃)

Пример 20 Инхибиране на неураминидазаша на вируса на инфлуенцата

Биоанализът in vitro на описаните по-горе съединения срещу неураминидазаша на грипния вирус N2 се провежда, като се следва процедурата, описана от Warner и O'Brien, Biochemistry, 1979 18 27832787. За сравнение, К_; за 2-дезокси-№ацетил-а-О-неураминовата киселина е определен чрез същия анализ на 3 х 10‘⁴ М.

Стойностите за К, се измерват посредством спектрофлуорометрична техника, при която се използва флуорогенен субстрат 4-метилумбелиферил-М-ацетилнеураминова киселина, (MUN), както е описана от Meyers et al., Anal. Biochem. 1980 101 166-174. За двата анализа анализираната смес съдържа тестваното съединение в няколко концентрации между 0 и 2 тМ, и приблизително 1 mU ензим в буфер (32.5 тМ MES, 4 тМ СаС1₂, pH

6.5 - за N2; 32.5 тМ ацетат, 4 тМ CaClg, pH 5.5 - за неураминидаза на V. cholerae).

Реакцията започва с прибавянето на MUN при крайни концентрации 75 или 40 μΜ. След престояване 5 минути при 37°С, 2.4 ml 0.1М глицин-NaOH, pH 10.2 се прибавят към 0.1 ml от реакционната смес за прекъсване на реакцията. Флуоресценцията се отчита при екстинция 365 пт, емисия 450 пт, и стойностите за подходящите празни проби с MUN (несъдържащи ензим) се изваждат от отчетеното. The К; се определя от графиките на Dixon (1/флуоресценция спрямо концентрация на съединението).

Резултатите са обобщени В Таблица 1, и ако не е посочено друго, се отнасят до инхибиране на неураминидаза N2.

Таблица 1

Инхибиране in vitro на неураминидаза от грипния Вирус

Съединение

Ki (М)

2-Дезокси-№ацетил-а-Р-неураминова киселина 3 х 10'⁴

НатриеВ 5-ацетамидо-4-азидо-2,3,4,5тетрадезокси-Р-глииеро-Р-галакто-нон-2енопиранозонат (4) х 10’⁶ g

НатриеВ 5-ацетамидо-4-амино-2,3,4,5- 6 х 10' тетрааезокси-Р-глииеро-Р-галакто-нон-21.9х10‘⁷ енопиранозонат (6) (неураминидаза N9, pH 6.5)

X 10'⁸ (Вирус N2, pH 7.5)

АмониеВ 5-ацетамидо-4-гуанидино-2,3,4,5тетрадезокси-Р-глииеро-Р-галакто-нон-2енопиранозонат (7)

1.7 х'⁸ > 5 х 10’⁸ (неураминидаза N9)

4.5 х 10’⁴ (неураминидаза от

V. cholerae; pH 5.8) > 10‘² (оВча неураминидаза; pH 4.5)

	Натриев 5-аи,етамидо-4-М,М-диалиламино-2.3. 4.5-mempage3okcu-D-2Auuepo-D-2aAakmo-HOH-2- енопиранозонат (9)	4 х 10'6
	Натриев 5-аи,етамидо-4->1-алиламино-2,3,4,5mernpage3okcu-D-2AUuepo-D-2aAakmo-HOH-2енопиранозонат (11)	2.5 х 10’6 (неураминидаза N2 и N9)
с	Метилов 5-ацетамидо-7,8,9-три-О-ацетил-4- aMUHO-2,3,4,5-mempage3okcu-D-2Auu,epo-D-maAO- поп-2-енопиранозонат (12)	прибл. 3 х 1O'J
	Метилов 7,8,9-три-О-ацетил-2,3,5-тридезокси- 4',5'-дихидро-2'-метилоксазоло(5,4-с1] D-глицеро- О-тало-поп-2-енопиранозонат (13)	3 х 10’5
	Натриев 5-аи,етамидо-4-амино-2,3,4,5mempage3okcu-D-2Auuepo-D-maAO-non-2енопиранозонат (14)	1 х ΙΟ'7 (неураминидаза N2 и N9)
е	Натриев 5-аи,етамидо-4-азидо-2,3,4,5тетрадезокси-0-глицеро-Г)-тало-нон-2енопиранозонат (17)	2.8 х 10'5
	Натриев 5-ацетамидо-4 -Ь1-метиламино-2,3,4.5mempage3okcu-D-2AUuepo-D-2aAakmo-HOH-2енопиранозонат(20)	1.15 х 10’6
	Натриев 5-au,emaMugo-4-N,N-guemuAaMUHO- 2,3,4,5-mempage3okcu-D-2Auu,epo-D-2aAakmo-HOH- 2-енопиранозонат (23)	7 х 10’7

Метилов 5-аи,етамидо-4-М-метоксикарбонил-

7 х 10’6

метиламино-2.3.4,5-тетрадезокси-0-глии,ероО-галакггю-нон-2-енопиранозонат (25)

Натриев 5-auema.Mugo-4-N-2 '-хидроксиетиламино-2,3,4,5-тетрадезокси-П-глицеро-Пгалакто-нон-2-енопиранозонат (29)	1.6 х 10’6 (неураминидаза N2 и N9)
Натриев 2,-3-дидезокси-Е>-глицеро-П-галакп1онон-2-енопиранозонат (35)	4.8 х 10’4
Натриев 4,5-диамино-2,3,4,5-тетрадезокси-П- глицеро-П-галакто-нон-2-енопиранозонат (38)	6.5 х 10’7
Метилов 5,9-диацетамидо-2,3,5,9тетрадезокси-П-глицеро-П-галакто-нон-2енопиранозонат (41)	3.6 х 10’5
5,9-диаи,етамидо-2,3,5,9-тетрадезокси-0глии,еро-П-галакто-нон-2-енопиранозонова киселина (42)	1.45 х 10'5
Метилов 5-ацетамидо-9-сиано-2,3,5,9тетрадезокси-П-глицеро-0-галакто-нон-2енопиранозонат (43)	прибл. 3 х 10J
5-Ацетамидо-9-циано-2,3,5,9- тетрадезокси-D- глицеро-П-галакто-нон-2-енопиранозонова киселина (44)	3 х 10’6

Пример 21 Инхибиране на репликацията на грипния вирус in vitro

Инхибирането на репликацията на грип А /Сингапур/1/57 (H2N2) и грип В /Виктория/102/85 in vitro се определя чрез намаляване образуването на вирусни плаки в бъбречни клетки на зайци Madin Darby (MDSK).

Монослоеве от конфлуентни клетки, развиващи се в 6-гнездови плочки за тъканни култури се заразяват с 0.3 ml вирус, разреден така, че да се получат 50 - 100 плаки/гнездо. Вирусът е разреден в свободна от серум минимална есенциална среда (МЕМ), съдържаща 2 ng/ml трипсин, третиран с Ь1-тозил-1-фенилаланинхлорометилкетон (ТРСК), (ензими Worthington) и тестваното съединение.

Вирусът се адсорбира при стайна температура в продължение на един час, и след това клетките се покриват с определена клетъчна култура, версия 1 (DCCM-l)/aeapo8 покривен слой, съдържаща тестваното съединение, 4 ml/гнездо. DCCM-1 е свободна от серум среда за пълно клетъчно развитие (Biological Industries), към която се прибавя трипсин, третиран с М-тозил-1фенилаланинхлорометилкетон и диетиламиноетилдекстран (DEAE-декстран) до крайна концентрация съответно 2 ng/ml и 0.001%. Преди да бъде прибавен към плочките, агарът (5%) (lndubiose) се разрежда 1:10 в покривния слой.

След като се покрият, плочките се инкубират при 37°С, 5% СО₂ в продължение на 3 дни. След това клетките се фиксиран с 5% глутаралдехид, оцветен с карболфуксин и се преброяват вирусните плаки. Резултатите са както следва:

Таблица 2

Съединение

1С₅₀ Редукция на плаки (μΜ)

Грип А

Грип В

Натриев 5-ацетамидо-4-амино-2,3,4,5тетрадезокси-П-глицеро-0-галакто-нон-2енопиранозонат (4-амино-Неу5Ац2ен) (6)

1.6

1.6

Натриев 5-аи,етамидо-4-амино-2,3,4,5mempage3okcu-D-2Auuepo-D-maAO-non-2енопиранозонат (14)

3.0

1.2

Амониев 5-ацетамидо-4-гуанидино-2,3,4,5-

1.6 тетрадезокси-Е)-глицеро-О-галакто-нон-2енопиранозонат (7)

Натриев 5-auemaMugo-4-N-2 '-хидроксиетил- 60 амино-2,3,4,5-тетрадезокси-П-глии,еро-0галакто-нон-2-енопиранозонат (29)

Натриев 5-ацетамидо-4-М-алил-Ь1-хидрокси- 4.7

2,3,4,5-тетрадезокси-О-глицеро-П-галактонон-2- енопиранозонат (45)

Натриев 4,5-диамино-2,3,4,5-тетрадезокси-П- 11 глицеро-П-галакто-нон-2-енопиранозонат (38)

1.6

2.7

6.8

Натриев 5-ацетамидо-4-М-алил-М-хидрокси-2,3,4,5-тетрадезокси-Пглицеро-0-галакто-нон-2-енопиранозонат (45) може да бъде получен лесно от съединение (11), описано в Пример 5, като се използват окислителни методи.

Пример 22 Противовирусна активност in vivo

Съединенията от Примери 2, 3 и 6 (4-амино, 4-гуанидино и 4епи-амино), както и съединението DANA (2-дезокси-2,3-дидехидро-Кацетил-а-О-неураминова киселина), за които в Пример 20 е показано, че притежават противонеураминидазна активност in vitro, се изпитват in vivo по отношение на противовирусната им активност по стандартния анализ. Когато се прилагат интраназално на мишки преди и по време на заразяването им с грипен вирус А, тези съединения понижават титъра на вируса в белодробна тъкан 1 до 3 дни след инфектирането.

Мишките се заразяват интраназално с 50 μΐ 10³ TCID_5n един./мишка от H2N2 грипен вирус A (A/Sing/1/57). Тестваното съединение се подава интраназално в доза или 12.5 или 25 mg/kg телесно тегло (50 μΐ воден разтвор/на мишка) както следва: 24 часа и 3 часа преди заразяването; 3 часа след заразяването и след това два пъти дневно на 1, 2 и 3 ден след заразяването. За сравнение се използват и съединенията рибавирин и амантадин, които не са структурни аналози.

На 1, 2 и 3 ден след заразяването мишките се умъртвяват, отстраняват се белите им дробове и се измерва титъра на вируса в дробовете. Титрите се нанасят графично и се изразяват като процент на площта под кривата (AUC), по отношение на тази с нетретираните мишки. Резултатите са обобщени по-долу.

Таблица 3

Ефикасност при мишки, заразени с грипен вирус

Екс-	Доза
перимент No.	Съединение	(mg/kg телесно тегло)	% AUC
1	Натриев 5-аи,етамидо-4-амино-2,3,4,5тетрадезокси-П-глицеро-П-галакто-нон-2енопиранозонат (4-амино-Неу5Ац2еп) (6)	25	0.06
	Амантадин	25	0.08
	DANA	25	0.18

2 Амониев 5-ацетамидо-4-гуанидино-2,3,4,5-
тетрадезокси-О-глицеро-Е)-галакто-нон-2-
енопиранозонат (7)	12.5	0.03
Рибавирин	25	29.8
Амантадин	25	0.2
	12.5	0.03
DANA	12.5	2.0
3 Натриев 5-ацетамидо-4-амино-2,3,4,5-
тетрадезокси-П-глицеро-П-тало-поп-2-
енопиранозонат(14)	12.5	21.1
Амантидин	12.5	8.8
DANA	12.5	48.0

Пример 23 Следните лекарствени форми са представителни за съставите съгласно изобретението:

Воден разтвор	% тегловни
Съединение с формула (I) Бензалкониев хлорид Фенилетилалкохол Пречистена вода	10.0 0.04 0.40 до 100% тегловни

Разтвор във вода и съразтворител	% тегловни
Съединение с формула (I)	10.0
Бенза.\кониев хлорид	0.04
Полиетиленгликол 400	10.0
Пропиленгликол	30.0
Пречистена вода	до 100% тегловни

Аерозолна форма	% тегловни
Съединение с формула (I)	7.5
Лецитин	0.4
Пропелент 11	25.6
Пропелент 12	66.5

Суха прахообразна форма	%
тегловни
Съединение с формула (I)	40.0
Лактоза	60.0

Тези лекарствени форми се приготвят чрез смесване на активната съставка с ексципиентите по конвенционалните фармацевтични методи.

Claims (17)

1. ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

   1. Съединение с формула (lb) (lb) в която R_3b е (aAk)_xNR_6bR_7b, CN или N₃ където алк е незаместен или заместен метилен, х е 0 или 1

   R_6b е водород, С_ь6алкил, арил, аралкил, амидин, NR_7bR_8b или незаместен, или заместен пръстен, съдържащ един или повече хетероатома, избрани от групата, състояща се от азот, кислород или сяра)

   R_7b е водород, С₁.₆алкил или арил;

   R_8b е водород или С_ь6алкил и

   R_4b е NHCOR_9b, където R_9b е водород, незаместен или заместен С_Ь4а7\кил или арил, или негова фармацевтично приемлива сол или производно.
2. 2. Съединение съгласно претенция 1, където R_3b е NR_6bR_7b.
3. 3. Съединение съгласно претенция 1, където R_3b е NH₂ или NHC(=NH)NH₂.
4. 4. Съединение съгласно претенция 1, избрано от групата, включваща:

   Натриев 5-ацетамидо-4-азидо-2,3,4,5-тетрадезокси-П-глицеро-0галакто-нон-2-енопиранозонат (4-Азидо-Неу5Ац2еп);

   Натриев 5-аи,етамидо-4-М-алиламино-2,3,4,5-тетрадезокси-Цглицеро-П-галакто-нон-2-енопиранозонат;

   Метилов 5-ацетамидо-7,8,9-три-О-ацетил-4-Г4-алиламино-2,3,4,5тетрадезокси-0-глии,еро-Е)-галакто-нон-2-енопиранозонат (4-Nалиламино-Неу5,7,8,9Ац₄2еп1Ме); и

   Натриев 5-au,emaMugo-4-N,N-guMemuAaMUHo-2,3,4,5-mempage3okcu-Dглицеро-0-галакто-нон-2-енопиранозонат.
5. 5. 5-Ацетамидо-4-амино-2,3,4,5-тетрадезокси-О-глицеро-Огалакто-нон-2-енопиразонова киселина и нейни фармацевтично приемливи соли и производни.
6. 6. Натриев 5-ацетамидо-4-амино-2,3,4,5-тетрадезокси-Оглицеро-0-галакто-нон-2-енопиранозонат.
7. 7. 5-Аи,етамидо-4-гуанидино-2,3,4,5-тетрадезокси-Пглицеро-0-галакто-нон-2-енопиразонова киселина и нейни фармацевтично приемливи соли и производни.
8. 8. Амониев 5-ацетамидо-4-гуанидино-2,3,4,5-тетрадезокси0-глицепо-0-галакто-нон-2-енопиранозонат.
9. 9. Лекарствена форма, характеризираща се с това, че се състои от съединение, както е дефинирано във всяка една от претенции от 1 до 8, или негова фармацевтично приемлива сол и производно, заедно с фармацевтично приемлив носител за същото.
10. 10. Лекарствена форма съгласно претенция 9, характеризираща се с това, че е адаптирана за интраназално приложение.
11. 11. Използване на съединение с формула (lb), както е дефинирано в претенция 1, за производството на лекарствено средство за лечение на вирусна инфекция..
12. 12. Използване на съединение съгласно претенция 11, където вирусната инфекция е инфлуенца.
13. 13. Използване на съединение съгласно претенция 11, където инфекцията е причинена от вирус в дихателните пътища.
14. 14. Използване, какпю е заявено във всяка една претенция от 11 до 13. за производството на лекарствено средство за прилагане в дихателния тракт.
15. 15. Използване, както е заявено във всяка една претенция от 11 до 14, за производството на лекарствено средство за интраназално прилагане.
16. 16. Съединение, както е заявено във всяка еднапретенция от 1 до 8, за използване в медицината.
17. 17. Метод за получаване на съединение с формула (lb), както е заявено във всяка една претенция от 1 до 8, характеризиращ се с това, че се състои от етапи на:

    (А) Взаимодействие на съединение с формула (ШЬ), където R_4b е съгласно дефинираното в претенция 1 и OL е отцепваща се група, или на защитено производно на посоченото съединение с подходящо нуклеофилно съединение; или (В) Взаимно превръщане на едно съединение с формула (lb) в друго съединение с формула (lb) и, ако е необходимо, подлагане на полученото съединение на една или две следващи реакции, включващи:

    (i) отстраняване на защитната група;

    (ii) превръщане на съединението с формула (lb) или на неговата сол във фармацевтично приемлива сол на същото.