ES2600160T3 - Método de preparación de enantiómeros de compuestos de espiro-oxindol - Google Patents

Abstract

Un método para preparar el enantiómero (S) de 1'-{[5-(trifluorometil)furan-2-il]metil}espiro[furo[2,3- f][1,3]benzodioxol-7,3'-indol]-2'(1'H)-ona que tiene la siguiente fórmula (I-S):**Fórmula** en donde el método comprende: aislar el enantiómero (S) de 1'-{[5-(trifluorometil)furan-2-il]metil}espiro[furo[2,3-f][1,3]benzodioxol-7,3'-indol]-2'(1'H)- ona del compuesto de fórmula (I):**Fórmula** en condiciones de cromatografía de líquidos de alta eficacia en fase quiral o en condiciones de cromatografía en lecho móvil simulado.

Description

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Ejemplo sintético 1

Síntesis de 1’-{[5-(trifluorometil)furan-2-il]metil}espiro[furo[2,3-f][1,3]benzodioxol-7,3’-indol]-2’(1’H)-ona (compuesto de fórmula (I))

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A una suspensión de espiro[furo[2,3-f][1,3]benzodioxol-7,3’-indol]-2’(1’H)-ona (1,0 g, 3,6 mmol), que se puede preparar según los métodos descritos en la solicitud de patente publicada PCT nº WO 2006/110917, y carbonato de cesio (3,52 g, 11 mmol) en acetona (50 ml) se añadió 2-bromometil-5-trifluorometilfurano (1,13 g, 3,9 mmol) en una porción y la mezcla de reacción se agitó a 55-60°C durante 16 horas. Tras enfriar a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se filtró y el filtrado se evaporó a presión reducida. El residuo se sometió a cromatografía en columna, eluyendo con acetato de etilo/hexano (1/9 -1/1) para dar la 1’-{[5-(trifluorometil)furan-2-il]metil} espiro[furo[2,3f][1,3]benzodioxol-7;3’-indol]-2’(1’H)-ona, es decir, el compuesto de fórmula (I), (1,17 g, 76%) en forma de un sólido blanco: p.f. 139-141°C; RMN 1H (300 MHz, CDCl3)  7,32-6,97 (m, 5H), 6,72 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 6,66 (s, 1H), 6,07 (s, 1H), 5,90-5,88 (m, 2H), 5,05, 4,86 (ABq, JAB = 16,1 Hz, 2H), 4,91 (d, J = 9,0 Hz; 1 H), 4,66 (d, J = 9,0 Hz, 1H); RMN 13C (75 MHz, CDCl3)  176,9, 155,7, 153,5, 148,8, 142,2, 141,9, 140,8, 140,2, 139,7, 139,1, 132,1, 129,2, 124,7, 124,1, 123,7, 121,1, 120,1, 117,6, 114,5, 114,4, 110:3, 109,7, 103,0, 101,9, 93,8, 80,0, 57,8, 36,9; MS (ES+) m/z 430,2 (M + 1), 452,2 (M + 23); Calculado para C22H14F3NO6: C, 61,54%; H, 3,29%; N, 3,26%; Encontrado: C, 61,51%; H, 3,29%; N, 3,26%.

Ejemplo sintético 2

Resolución del compuesto de fórmula (I) por HPLC quiral

El compuesto de fórmula (I) se resolvió en el enantiómero (S) de la invención y el correspondiente enantiómero (R) por HPLC quiral en las siguientes condiciones:

Columna:

Chiralcel ® OJ-RH; 20 mm D.I. x 250 mm, 5 µm; Lote: OJRH CJ-EH001 (Daicel Chemical Industries, Ltd)

Eluyente:

acetonitrilo/agua (60/40, v/v, isocrático)

Caudal:

10 ml/min

Tiempo de ejecución:

60 min

Carga:

100 mg del compuesto de fórmula (I) en 1 ml de acetonitrilo

Temperatura:

Ambiente

En las condiciones de HPLC quiral anteriores, el enantiómero (R) del compuesto de fórmula (I), es decir, la (R)-1’{[5-(trifluorometil)furan-2-il]metil}espiro[furo[2,3-f][1,3]benzodioxol-7,3’-indol]-2’(1’H)-ona, se aisló como la primera fracción como un sólido blanco; ee (exceso enantiomérico) >99% (OJ-RH analítico, acetonitrilo en agua al 55%); p.f. 103-105.°C; RMN 1H (300 MHz, DMSO-d6)  7,32-6,99 (m, 5H), 6,71 (d, J = 3,4 Hz, 1H), 6,67 (s, 1H); 6,05 (s, 1H), 5,89 (d, J = 6,2 Hz, 2H), 5,13, 5,02 (ABq, JAB = 16,4 Hz, 2H), 4,82, 4,72 (ABq, JAB = 9,4 Hz, 2H); RMN 13C (75 MHz, CDCl3)  177,2, 155,9, 152,0, 149,0, 142,4, 142,0, 141,3, 132,0, 129,1, 123,9, 120,6, 119,2, 117,0, 112,6, 109,3, 108,9, 103,0, 101,6, 93,5, 80,3, 58,2, 36,9; MS (ES+) m/z 430,2 (M + 1), [α]D -17,46° (c 0,99, DMSO). El enantiómero

(S) del compuesto de fórmula (I), es decir, la (S)-1’-{[5-(trifluorometil)furan-2-il]metil)espiro-[furo[2,3f][1,3]benzodioxol-7,3’-indol]-2’(1’H)-ona se aisló como la segunda fracción en forma de un sólido blanco; ee > 99% (OJ-RH analítico, acetonitrilo en agua al 55%); p.f. 100-102 °C; RMN 1H (300 MHz, DMSO-d6)  7,32-6,99 (m, 5H), 6,71 (d, J = 3,4 Hz, 1H), 6,67 (s, 1 H), 6,05 (s, 1H), 5,89 (d, J = 6,3 Hz, 2H), 5,12, 5,02 (ABq, JAB = 16,4 Hz, 2H), 4,82, 4,72 (ABq, JAB = 9,4 Hz, 2H); RMN 13C (75 MHz, CDCl3)  177,2, 155,9, 152,0, 149,0, 142,4, 142,0, 141,3, 132,0, 129,1, 123,9, 120,6, 119,2, 117,0, 112,6, 109,3, 108,9, 103,0, 101,6, 93,5, 80,3, 58,2, 36,9; MS (ES+) mlz 430,2(M + 1), [α]D +14,04° (c 0,99, DMSO).

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Cada uno de los agentes ensayados se ensaya contra células que expresan los canales de sodio regulados por voltaje de interés. Los canales de sodio regulados por voltaje se caracterizan como sensibles o insensibles a TTX. Esta propiedad es útil cuando se evalúan las actividades de un canal de sodio regulado por voltaje de interés cuando reside en una población mezclado con otros canales de sodio regulados por voltaje. La siguiente tabla 1 resume las líneas celulares útiles en el cribado para una determinada actividad de canal de sodio regulado por voltaje en presencia o ausencia de TTX.

Tabla 1

Línea celular

Expresión de ARNm Caracterización funcional

CHO-K1 (Ovario de hámster chino; línea celular hospedante recomendada) Número de acceso en ATTC CCL-61

• La expresión de Nav1.4 se ha mostrado por RT-PCR • No se ha detectado expresión de otros Nav • El aumento de 18 a 20 veces en la entrada de flujo de [14C]-guanidina se bloqueó completamente usando TTX (Nav1.4 es un canal sensible a TTX)

L6 (células de mioblasto de rata)

• Expresión de Nav1.4 y 1.5 • El aumento de 10 a 15 veces en la entrada

Número en ATCC CRL-1458

de flujo de [14C]-guanidina era bloqueada solo parcialmente por TTX 100 nM (Nav1.5 es resistente a TTX)

SH-SY5Y (neuroblastoma humano) número en ATCC CRL-2266

• Expresión publicada de NaV1.9 y NaV1.7 (Blum et al.) • El aumento de 10 a 16 veces en la entrada de flujo de [14C]-guanidina por encima de la base era bloqueada parcialmente por TTX (Nav1.9 es resistente a TTX)

SK-N-BE2C (una línea celular de neuroblastoma humano, número en ATCC CRL-2268)

• Expresión de NaV1.8 • La estimulación de células BE2C con piretroides produjo un aumento de 6 veces de la entrada de flujo de [14C]-guanidina por encima de la base. • La TTX bloqueó parcialmente la entrada de flujo (Nav1.8 es resistente a TTX)

PC12 (feocromocitoma a de rata)

• Expresión de NaV1-2 y • El aumento de 8 a 12 veces en la entrada de

Número en ATCC CRL-1721

Nav1.7 flujo de [14C]-guanidina se bloqueó completamente usando TTX. (Nav1.2 y Nav1.7 son canales sensibles a TTX)

HEK293 (riñón embrionario humano) Número en ATCC CRL-1573

• Expresión de hNaV1.7 • Nav1.7 es un canal sensible a TTX. La CI50 de TTX en el ensayo funcional de guanidina es 8 nM

También se pueden usar líneas celulares inmortalizadas que expresan de forma heterogénea canales de sodio

10 regulados por voltaje. La clonación, transfección estable y propagación de dichas líneas celulares son conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Klugbauer, N, et al., EMBO J. (1995), 14(6):1084-90; y Lossin, C., et al., Neuron (2002), 34, pág. 877-884).

Las células que expresan el canal de sodio regulado por voltaje de interés se desarrollan de acuerdo con el proveedor o en el caso de una célula recombinante en presencia de medio de crecimiento selectivo tal como G418 15 (Gibco/Invitrogen). Las células se disocian de las placas de cultivo con una solución enzimática (1X) Tripsina/EDTA (Gibco/Invitrogen) y se analizó la densidad y viabilidad usando hemocitómetro (Neubauer). Las células disociadas se lavan y se vuelven a suspender en su medio de cultivo y después se cultivan en placas de centelleo recubiertas con Poli-D-Lisina (Perkin Elmer) (aproximadamente 100.000 células/pocillo) y se incuban a 37°C/5% de CO2, durante 2024 horas. Después de un lavado exhaustivo con solución salina tamponada -HEPES bajo en sodio (LNHBSS) 20 (cloruro de colina 150 mM, HEPES 20 nM (Sigma), cloruro cálcico 1 mM, cloruro potásico 5 mM, cloruro magnésico 1 mM, glucosa 10 mM) los agentes de ensayo se diluyen con LNHBSS y después se añaden a cada pocillo a la concentración deseada. (Se pueden usar diferentes concentraciones del agente de ensayo). La mezcla de activación/radiomarcaje contiene un alcaloide tal como veratridina o aconitina (Sigma) o un piretroide tal como deltametrina, veneno de escorpión Leiurus quinquestriatus hebraeus (Sigma) e hidrocloruro de 14C-guanidina (ARC)

25 para medir el flujo a través de los canales de sodio regulados por voltaje.

Después de cargar las células con agente de ensayo y mezcla de activación/radiomarcaje, las placas de centello recubiertas con poli-L-lisina se incuban a temperatura ambiente. Después de incubación, las placas de centello

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recubiertas con poli-D-lisina se lavan extensamente con LNHBSS complementado con guanidina (Sigma). Las placas de centello recubiertas con poli-D-lisina se secan y a continuación se realiza el recuento usando un aparato Wallac MicroBeta TriLux (Perkin-Elmer Life Sciences). La capacidad del agente de ensayo para bloquear la actividad del canal del sodio regulado por voltaje se determina comparando la cantidad de 14C-guanidina presente dentro de las células que expresan los diferentes canales del sodio regulados por voltaje. Basándose en estos datos se puede usar una variedad de cálculos, como se expone en otro lugar de esta memoria descriptiva, para determinar si un agente de ensayo es selectivo para un canal de sodio regulado por voltaje particular.

El valor de CI50 de un agente de ensayo para un canal de sodio regulado por voltaje específico se puede determinar usando el método general anterior. La CI50 se puede determinar usando una curva de 3, 8, 10, 12 o 16 puntos por duplicado o triplicado con una concentración inicial de 1, 5 o 10 µM con dilución seriada con una concentración final que alcanza los intervalos subnanomolar, nanomolar y micromolar bajo. Típicamente, la concentración del punto medio del agente de ensayo se establece en 1 µM, y se aplican concentraciones secuenciales de diluciones a la mitad o mayores o menores (p. ej. 0,5 µM; 5 µM y 0,25 µM; 10 µM y 0,125 µM; 20 µM etc.). La curva de CI50 se calcula usando el modelo logístico de 4 parámetros o fórmula de modelo de dosis-respuesta sigmoidea (ajuste = (A+((BA)/(1+((C/x)^D)))).

El número de veces de selectividad, factor de selectividad o múltiplo de selectividad, se calcula dividiendo el valor de CI50 del canal de sodio regulado por voltaje de ensayo entre el canal de sodio regulado por voltaje de referencia, por ejemplo Nav1.5.

Por consiguiente, el compuesto de fórmula (I), el enantiómero (S) del compuesto de fórmula (I), es decir el enantiómero (S) de la invención, y el enantiómero (R) del compuesto de fórmula (I), cuando se ensayaron en este ensayo, demostraron actividad de bloqueo de canal de sodio regulado por voltaje contra hNav1.7 como se expone en la tabla 2:

Tabla 2

Compuesto

Nombre químico CI50 (µM)

(I)

1’-{[5-(trifluorometil)furan-2-il]metil}espiro[furo[2,3-f][1,3]benzodioxol-7,3’-indol]-2’(1’H)ona 0,007

(I-R)

(R)-1’-{[5-(trifluorometil)furan-2-il]metil}espiro[furo[2,3-f][1,3]benzodioxol-7,3’-indol]2’(1’H)-ona 4,200

(I-S)

(S)-1’-{[5-(trifluorometil)furan-2-il]metil}espiro[furo[2,3-f][1,3]benzodioxol-7,3’-indol]2’(1’H)-ona 0,003

La relación concentración-respuesta para el enantiómero (S) de la invención y el enantiómero (R) se muestra en la figura 1. Las curvas negras indican el mejor ajuste por mínimos cuadrados a una isoterma de unión 1:1; la CI50 que describe estas curvas se dan en la tabla 2. El enantiómero (S) de la invención demostraba una potencia de inhibición significativamente mayor (es decir, > 1000 veces) contra hNav1.7 en este modelo cuando se comparó con la potencia de inhibición del correspondiente enantiómero (R).

Estos resultados favorecen el uso del enantiómero (S) preparado por el método de la invención frente al enantiómero (R) o el compuesto de fórmula (I) (el racemato) para las utilidades descritas en la presente memoria, en cuanto que se puede lograr una mayor actividad farmacológica con menores niveles de dosis, posiblemente con menores efectos secundarios. Además, el enantiómero (R) es una herramienta muy importante para los estudios de seguridad porque permite distinguir entre los efectos basados en mecanismo (los mediados por bloqueo de canales de sodio) y actividades fuera del objetivo que se pueden eliminar en análogos sin comprometer la eficacia. Si un efecto adverso se basa en mecanismo, entonces el enantiómero (S) será mucho más potente que el enantiómero (R), ya que es improbable que los sitios secundarios de acción tengan estereoselectividad idéntica y es probable que los dos enantiómeros tengan efectos similares, incluyendo la potencia en sitios de acción secundarios.

Ejemplo biológico 2

Ensayo electrofisiológico (ensayo in vitro)

Células HEK293 que expresaban hNav1.7 se cultivaron en medio de crecimiento DMEM (Gibco) con G418 0,5 mg/ml, PSG ± 1%, y suero bovino fetal inactivado térmicamente al 10% a 37ºC y CO2 al 5%. Para los registros electrofisiológicos las células se pusieron en placas de 10 mm.

Se examinaron los registros de células enteras mediante métodos establecidos de pinzamiento de voltaje en configuración de célula entera (Bean et al., citado antes) usando un amplificador Axopatch 200B y el programa informático Clampex (Axon Instruments, Union City, CA). Todos los experimentos se realizaron a temperatura

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ambiente. Los electrodos se pulieron con fuego hasta resistencias de 2-4 Mohms. Los errores del voltaje y artefactos de capacitancia se minimizaron mediante compensación de resistencia en serie y compensación de capacitancia, respectivamente. Los datos se adquirieron a 40 kHz y se filtraron a 5 kHz. La disolución externa (baño) consistía en: NaCl (140 mM), KCI (5 mM), CaCl2 (2 mM), MgCl2 (1 mM), HEPES (10 mM) a pH 7,4. La disolución interna (pipeta) consistía en (en mM): NaCl (5), CaCl2 (0,1), MgCl2 (2), CsCl (10), CsF (120), HEPES (10), EGTA (10), a pH 7,2.

Para estimar la afinidad de los compuestos en estado estacionario por el estado de reposo e inactivado del canal (Kr y Ki, respectivamente), se usaron pulsos de ensayo de 12,5 ms para voltajes despolarizantes de -60 a +90 mV desde un potencial de mantenimiento de -120 mV, para construir las relaciones corriente-voltaje (curvas I-V). Se usó un voltaje cercano al máximo de la curva I-V (-30 a 0 mV) como el pulso de ensayo a lo largo del resto del experimento. Después se construyeron las curvas de inactivación en estado estacionario (disponibilidad) midiendo la corriente activada durante un pulso de ensayo de 8,75 ms después de pulsos de acondicionamiento de 1 segundo para potenciales en el intervalo de -120 a -10 mV.

La dependencia del voltaje en estado estacionario de la unión de un compuesto a un canal de sodio regulado por voltaje se demostró midiendo el bloqueo de la corriente iónica a dos potenciales de mantenimiento. La unión a canales en estado de reposo se determinó usando el potencial de mantenimiento de -120 mV, de modo que se logró la máxima disponibilidad. Se evaluó la unión a canales en estado inactivado a un potencial de mantenimiento tal que solo aproximadamente 10% de los canales estaban disponibles para abrirse. El potencial de membrana se mantuvo a este voltaje durante al menos 10 segundos de modo que podía equilibrarse la unión al fármaco.

La constante de disociación aparente a cada voltaje se calculó con la ecuación:

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donde Kd es la constante de disociación (sea Kr o Ki), y [fármaco] es la concentración del compuesto de ensayo.

Por consiguiente, el compuesto de fórmula (I), el enantiómero (S) del compuesto de fórmula (I), es decir, el enantiómero (S) de la invención, y el enantiómero (R) del compuesto de fórmula (I), cuando se ensayó en este modelo, demostró afinidades para el estado de reposo/cerrado y el estado inactivado de hNav1.7 como se expone en la tabla 3:

Tabla 3

Compuesto

Nombre químico Ki (µM) Kr (µM)

(I)

1’-{[5-(trifluorometil)furan-2-il]metil}espiro[furo[2,3-f][1,3]benzodioxol-7,3’indol]-2’(1’H)-ona 0,142 >10 µM

(I-R)

(R)-1’-{[5-(trifluorometil)furan-2-il]metil}espiro[furo[2,3-f][1,3]benzodioxol-7,3’indol]-2’(1’H)-ona 0,869 >10 µM

(I-S)

(S)-1’-{[5-(trifluorometil)furan-2-il]metil}espiro[furo[2,3-f][1,3]benzodioxol-7,3’indol]-2’(1’H)-ona 0,161 >10 µM

Como se demostraba con estos resultados, el enantiómero (S) preparado por el método de la invención es un modificador dependiente del estado o voltaje de hNav1.7, que tiene una afinidad baja por el estado de reposo/cerrado y una afinidad alta por el estado inactivado. Los resultados demostraban que el enantiómero (S) era aproximadamente 5 veces más potente en la unión al estado inactivado de hNav1.7 que el enantiómero (R). Además, los resultados demostraban que el enantiómero (S) es principalmente responsable de la potencia del racemato, es decir, el compuesto de fórmula (I).

Ejemplo biológico 3

Ensayos in vivo

Dolor agudo (ensayo de formalina)

Se usa el ensayo de formalina como un modelo animal de dolor agudo. En el ensayo de formalina, los animales se habitúan brevemente a la cámara de ensayo de plexiglás el día antes del experimento durante 20 minutos. El día del ensayo se inyecta a los animales aleatoriamente los artículos de ensayo. Después de 30 minutos después de la administración de fármaco, se inyectan 50 µl de formalina al 10% por vía subcutánea en la superficie de la planta de la pata trasera izquierda de las ratas. La adquisición de datos por vídeo empieza inmediatamente después de la administración de formalina, durante 90 minutos.

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Se evaluaron los umbrales nociceptivos térmicos de los animales usando la prueba de Hargreaves. Después de medir los umbrales táctiles, los animales se pusieron en un recinto cerrado de plexiglás en la parte superior de una plataforma de vidrio elevada con unidades de calentamiento. La plataforma de vidrio se controló por termostato a una temperatura de aproximadamente 24 a 26ºC durante todos los ensayos. Se dejó que los animales se acomodaran durante 10 minutos después de ponerlos en el recinto hasta que cesan todos los comportamientos de exploración. Se usó el medidor de analgesia estimulador de planta/cola modelo 226 (IITC, Woodland Hills, CA) para aplicar un haz de calor radiante desde debajo de la plataforma de vidrio a la superficie de la planta de las patas traseras. Durante todos los ensayos, la intensidad inactiva y la intensidad activa de la fuente se calor se fijaron en 1 y 55 respectivamente, y se usó un tiempo de exclusión de 20 segundos para prevenir el daño del tejido.

El enantiómero (S) se comparó con el correspondiente enantiómero (R) y el racemato (compuesto de fórmula (I)) en este modelo de lesión por constricción crónica (CCI) usando aplicación tópica del fármaco, como se describe para el modelo de CFA (véase la figura 3). Cada compuesto de ensayo se administró como una pomada que contenía 2% (p/v). De acuerdo con las diferentes actividades de estos dos enantiómeros como inhibidores de canales de sodio regulados por voltaje, solo el enantiómero (S) anulaba las respuestas de dolor, mientras que el enantiómero (R) no tenía un aumento significativo desde el valor base. Tanto el enantiómero (S) como el racemato mostraron porcentaje similar de aumento desde el valor base, lo que tiende a sugerir que el enantiómero (S) es responsable del efecto analgésico.

Ejemplo biológico 4

Ensayo de arritmia inducido por aconitina

La actividad antiarrítmica de los compuestos de la invención se demuestra mediante el siguiente ensayo. La arritmia se provoca por administración intravenosa de aconitina (2,0 µg/Kg) disuelta en solución salina fisiológica. Los compuestos de ensayo de la invención se administran por vía intravenosa 5 minutos después de la administración de la aconitina. La evaluación de la actividad antiarrítmica se lleva a cabo midiendo el tiempo desde la administración de la aconitina hasta la aparición de extrasístole (ES) y el tiempo desde la administración de la aconitina hasta la aparición de taquicardia ventricular (VT).

En ratas bajo anestesia con isoflurano (1/4 a 1/3 de 2%), se llevó a cabo una traqueotomía creando primero una incisión en la zona del cuello, después aislando la tráquea y haciendo una incisión de 2 mm para insertar un tubo traqueal de 2 cm en la tráquea de modo que la abertura del tubo está colocada justo en la parte superior de la boca. El tubo se sujeta con suturas y se une a un respirador durante la duración del experimento.

Después se hacen incisiones (2,5 cm) en las zonas femorales y usando una sonda de disección roma, se aíslan los vasos femorales. Se lleva a cabo la canulación de ambas venas femorales, una para el mantenimiento de anestesia con pentobarbital (0,02-0,05 ml) y una para la infusión e inyección de fármaco y vehículo. Se pone la cánula en la arteria femoral con el catéter con gel de presión sanguínea del transmisor.

Los electrodos del ECG se fijan al músculo torácico en la posición de Electrodo II (derecha superior/arriba del corazón -electrodo blanco e izquierda inferior/debajo del corazón -electrodo rojo). Los electrodos se fijan con suturas.

Todas las zonas quirúrgicas se cubren con gasa humedecida con solución salina al 0,9%. Se suministra solución salina (1-1,5 ml de una solución al 0,9%) para humedecer las zonas después de cirugía. El ECG y respirador de los animales se dejan equilibrar durante al menos 30 minutos.

La arritmia se induce con infusión de aconitina de 2 µg/Kg/min durante 5 minutos. Durante este tiempo se registra el ECG y se vigila continuamente.

Ejemplo biológico 5

Ensayo de arritmia inducida por isquemia

Se han usado modelos de roedores de arritmias ventriculares, tanto en la cardioversión aguda como en los modelos de prevención en el ensayo de potenciales productos terapéuticos para las arritmias tanto auriculares como ventriculares en seres humanos. La isquemia cardiaca que conduce a infarto de miocardio es una causa común de morbosidad y mortalidad. La capacidad de un compuesto para prevenir la taquicardia ventricular inducida por isquemia y fibrilación es un modelo aceptado para determinar la eficacia de un compuesto en un marco clínico tanto para taquicardia auricular y ventricular como fibrilación.

La anestesia se induce primero con pentobarbital (i.p.) y se mantiene por una infusión de bolo i.v. Se lleva a cabo la canulación de la tráquea de ratas SD macho para la respiración artificial con aire ambiente con un volumen sistólico de 10 ml/kg, 60 latidos/min. Se ponen cánulas en la arteria y vena femoral derecha con tubo de PE50 para el registro de la presión arterial media (PAM) y la administración intravenosa de compuestos, respectivamente.

Se abre el pecho entre la 4ª y 5ª costillas para crear una abertura de 1,5 cm de modo que el corazón fuera visible.

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Cada rata se pone en una plataforma con muescas y se enganchan sujeciones metálicas en la caja torácica abriendo la cavidad torácica. Se usa una aguja de sutura para penetrar el ventrículo justo bajo la aurícula levantada y sacar el ventrículo en una dirección diagonal descendente de modo que se obtendría de >30% a <50% de zona de oclusión (ZO). La posición de salida está ~0,5 cm debajo de donde la aorta conecta con el ventrículo izquierdo. La sutura se tensa de modo que se forma un bucle flojo (oclusor) alrededor de una rama de la arteria. Después se cierra el pecho con el extremo del oclusor accesible fuera del pecho.

Los electrodos se ponen en la posición de Electrodo II (aurícula derecha a apéndice) para la medición del ECG como sigue: se inserta un electrodo en la pata delantera derecha y el otro electrodo se inserta en la pata trasera izquierda.

Se registran constantemente la temperatura corporal, presión arterial media (PAM), ECG y frecuencia cardiaca a lo largo del experimento. Una vez que se han estabilizado los parámetros críticos, se toma un registro de 1-2 min para establecer los valores base. Se inicia la infusión de un compuesto preparado por el método de la invención o sustancia de control una vez que se han establecido los valore base. Después de 5 min de infusión del compuesto o control, se tensa la sutura para ligar la LCA y crear isquemia en el ventrículo izquierdo. Los parámetros críticos se registran continuamente durante 20 minutos después de ligado, salvo que la PAM alcance el nivel crítico de 20-30 mm de Hg (0,0266-0,0399 bar) durante al menos 3 minutos, en cuyo caso se detienen los registros porque el animal se declararía muerto y se sacrificaría. La capacidad de los compuestos de la invención para prevenir arritmias y mantener la PAM y FC cerca de la normalidad se puntúa y se compara con el control.

Ejemplo biológico 6

Comparado con el racemato, es decir, el compuesto de fórmula (I), el enantiómero (S), sustancialmente exento del enantiómero (R), tiene un mejor perfil de solubilidad en una variedad de excipientes farmacéuticamente aceptables. Por lo tanto, el enantiómero (S) se puede formular en un número menor de unidades de dosificación que el racemato. Esta propiedad facilita la administración a los pacientes en un nivel mayor si se necesita para lograr la eficacia. A continuación en la tabla 5 se muestran ejemplos de la diferencia de solubilidad:

Tabla 5

Excipiente

Compuesto de fórmula (I) (racemato) Enantiómero (S)

Labrasol®

72,5 mg/ml 231 mg/ml

Propilenglicol

2,7 mg/ml 9,8 mg/ml

PEG 400

< 50 mg/ml > 55 mg/ml

Capryol® 90

18,1 mg/ml 96 mg/ml

Tween® 80

64 mg/ml > 123 mg/ml

Etanol

10,0 mg/ml 36,4 mg/ml

Labrasol®/PEG 400 60/40

70,4 mg/ml 182 mg/ml

Labrasol®/Capryol®90 60/40

44,4 mg/ml 191 mg/ml

Labrasol®/Transcutol® 60/40

74,2 mg/ml 186 mg/ml

Ejemplo biológico 7

Ensayo in vivo para el tratamiento del prurito

La histamina produce prurito (picor) en seres humanos. Por consiguiente, este ensayo evalúa la eficacia del enantiómero (S) de la invención administrado por vía tópica y por vía oral en prurito inducido por histamina en ratones ICR macho.

Los animales se dividieron aleatoriamente en grupos de ensayo que incluían un grupo no tratado, un grupo tratado con una composición farmacéutica tópica con 8% (p/v) de enantiómero (S), y un grupo tratado con una composición farmacéutica oral de 50 mg/Kg de enantiómero (S). Un día antes del ensayo, se afeitaron las regiones escapulares de los animales con maquinillas de cortar el pelo. El día del ensayo, los animales se habituaron durante 60 min en la cámara de ensayo compuesta de un tubo de plástico transparente puesto en vertical sobre una superficie plana. Después del periodo de habituación, los animales se sacaron del tubo de plástico y se pusieron en un recinto, y se les inyectó histamina en la región escapular afeitada. Las inyecciones se hicieron por vía intradérmica en la piel en pequeños volúmenes de inyección (10 µl) usando una jeringa de Hamilton. Las soluciones de inyección consistían

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en histamina disuelta en solución salina en una concentración 100 µg/10 µl (o 10 mg/ml). Se inyectaron 10 µg de la solución a cada ratón. Inmediatamente después de las inyecciones, los animales se devolvieron a las cámaras de ensayo y se observaron mediante cámaras puestas encima de las cámaras de ensayo durante un total de 50 minutos. Las cámaras se conectaron a un ordenador donde se crearon, grabaron y analizaron ficheros de vídeo digital.

Se puntuó el número de ataques de picor a lo largo de 40 minutos. Un “ataque de picor” se definió como la elevación de una pata trasera usándola para rascar la región escapular, y después volviéndola a poner en el suelo. Alternativamente, si en lugar de poner la pata trasera de nuevo en el suelo se observaba que el ratón se lamía la pata, entonces esto también se contaba como un ataque de picor.

Para el grupo no tratado, los animales (n=7) se habituaron a la cámara de ensayo durante 60 minutos antes de la inyección de histamina. Para evaluar el enantiómero (S) por vía tópica en el prurito inducido por histamina, los animales (n=16/grupo) se habituaron a la cámara de ensayo durante 30 minutos, seguido de la aplicación de 50 mg del enantiómero (S) al 8% (p/v) por vía tópica o vehículo en la región afeitada de la espalda. Los animales se devolvieron a la cámara de ensayo durante otros 30 minutos para habituarse antes de la inyección de histamina. Para evaluar el enantiómero (S) oral, se administró a los animales (n=8/grupo) por alimentación oral con sonda 50 mg/kg del enantiómero (S) o vehículo seguido de habituación en la cámara de ensayo durante 60 minutos antes de la inyección de histamina.

Los datos se analizaron usando el programa de análisis estadístico GraphPad Prism 5 y una prueba t para datos no pareados para el análisis unifactorial. Los resultados se expresan como media ± EEM. Los valores que alcanzaban un nivel de p<0,05 de significancia se consideró que eran estadísticamente significativos.

Resultados

La inyección de histamina en la piel produjo a los animales picor esporádicamente en ataques que duraban 1-2 segundos. En el grupo no tratado, los ataques de picor empezaron inmediatamente después de la inyección y después duraron unos 40 min (véase la figura 4). El grupo tratado con enantiómero (S) al 8% (p/v) por vía tópica mostró prurito significativamente reducido (véase la figura 5). Los animales tratados solo con vehículo tenían un número total de ataques de picor de 134,3 ± 13,31 (n=16) mientras que los ratones tratados con el enantiómero (S) por vía tópica tuvieron 89,00 ± 10,51 (n=16) ataques de picor. La diferencia entre estos grupos era estadísticamente significativa con un p valor de 0,0122. El grupo tratado con 50 mg/Kg de enantiómero (S) por vía oral mostró igualmente prurito significativamente menor (véase la figura 6). Los animales tratados solo con vehículo tuvieron un número total de ataques de picor de 42,88 ± 6,667 (n=8) mientras que los ratones tratados con el enantiómero (S) tuvieron 17,25 ± 6,310 (n=8) ataques de picor. La diferencia entre los grupos tratados por vía oral también es estadísticamente significativa con un p valor de 0,0144. Los resultados demostraron que el enantiómero (S) administrado por vía oral y tópica reducía el prurito. Además, es evidente que se pueden usar los dos modos comunes de suministro de fármaco, oral y tópico, para suministrar el enantiómero (S) para lograr este efecto terapéutico.

Ejemplo biológico 8

Ensayo clínico en seres humanos para el tratamiento de la eritromelalgia primaria/hereditaria (IEM)

La eritromelalgia primaria/hereditaria (IEM) es una afección de dolor hereditaria rara. La causa subyacente puede ser una o más mutaciones de ganancia de función en el canal de sodio regulado por voltaje NaV1.7, que se ha mostrado que inhibe el enantiómero (S) de la invención.

Los pacientes humanos con IEM tienen episodios recurrentes de dolor ardiente intenso asociado con enrojecimiento y calor en las manos y pies, pero finalmente el dolor se vuelve constante. El dolor se alivia por enfriamiento, pero ha sido en gran medida resistente a la intervención farmacológica. Sin embargo, hay descripciones de bloqueantes de canales de sodio regulados por voltaje que muestran un alivio de dolor de moderado a excelente para esta afección.

Se puede diseñar un ensayo clínico para determinar la eficacia del enantiómero (S) de la invención en la mejora o alivio de la IEM para que sea un estudio cruzado, de múltiples dosis, con doble ocultación, de tres periodos, para minimizar la tasa de abandono de los participantes, y tendrá en cuenta que los pacientes reclutados solo estarán disponibles para un estudio de 10 días. Cada paciente reclutado en el estudio servirá como su propio control, recibiendo tanto placebo como 400 mg del enantiómero (S) de la invención dos veces al día en un modo cruzado.

Ejemplo biológico 9

Ensayo clínico en seres humanos para el tratamiento del dolor dental

El propósito de este ensayo clínico era comparar la seguridad y eficacia (inicio, duración del alivio y eficacia general) de una sola dosis de 500 mg del enantiómero (S) preparado por el método de la invención frente a dosis de placebo para aliviar el dolor después de extracción de terceros molares retenidos.

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Se reclutaron 61 sujetos en este estudio. La edad media de los sujetos era 20,4 años, y todos los sujetos eran varones. La mayoría de los sujetos eran caucasianos (95,1%).

La gravedad y el alivio del dolor se midieron usando una escala de valoración numérica de la intensidad del dolor de 11 puntos (clasificada de 0 = sin dolor en absoluto a 10 = el peor dolor imaginable) (PINRS) y una escala categórica de alivio del dolor de 5 puntos (REL). Los sujetos completaron la escala PINRS después de cirugía, pero antes de la administración del enantiómero (S) de la invención. Las variables de eficacia se obtuvieron de las puntuaciones de REL y PINRS e incluían al alivio del dolor total (TOTPAR), diferencia de intensidad de dolor (PID) y suma de las diferencias de intensidad del dolor (SPID) y se evaluaron en los tiempos de medición de 4, 6, 8 y 12 horas después de la administración del enantiómero (S) preparado por el método de la invención.

Sin embargo, los criterios de valoración primarios y todos los secundarios mostraron una tendencia analgésica consistente con separación clara del enantiómero (S) del placebo. Estos resultados sugieren que el enantiómero (S) tiene propiedades analgésicas, pero no se logró la significancia estadística respecto del placebo debido a dos razones principales: (1) tasa de respuesta del placebo relativamente alta y (2) el inicio lento de la acción del enantiómero (S). El modelo dental usado se diseña y está bien adecuado para la evaluación de fármacos con inicio rápido tales como la clase de fármacos antiinflamatorios AINE. A partir de este estudio era evidente que el enantiómero (S) de la invención no tenía dicho inicio rápido de la acción de tipo AINE. Sin embargo, el alivio del dolor demostrado por los sujetos que recibían el enantiómero (S) era mayor comparado con los sujetos que solo recibían el placebo, suficientemente de modo que la población de eficacia mostró una señal analgésica consistente par todos los criterios de valoración evaluados.

Ejemplo biológico 10

Ensayo clínico en seres humanos para la seguridad del enantiómero (S) de la invención

Este ensayo clínico era un estudio controlado con placebo, con doble ocultación, aleatorizado, en fase 1, en sujetos sanos para evaluar la seguridad y farmacocinética de pomada aplicada por vía tópica que contiene el enantiómero

(S) preparado por el método de la invención.

La pomada con enantiómero (S) se aplicó diariamente durante 21 días consecutivos para determinar la toxicidad/capacidad irritante local de la piel del enantiómero (S). También se evaluaron la farmacocinética sistémica y los niveles de fármaco local en la piel. Se evaluó la exposición sistémica del enantiómero (S) después de aplicaciones tópicas e irritación local de la piel después de múltiples dosis de pomada con enantiómero (S). Cada sujeto recibió 5 tratamientos durante 21 días consecutivos: el enantiómero (S) como pomada con 4% y 8% (p/p) (1 x 100 µl; tratamientos A y B, respectivamente), placebo como pomada (tratamiento C), solución salina (0,9%) (1 x 100 µl; control negativo; tratamiento D), y solución de laurilsulfato sódico (SLS) al 0,1% (1 x 100 µl; control positivo; tratamiento E). Los tratamientos se aplicaron en dos sitios diferentes de la parte superior de la espalda de cada sujeto de una forma ocluida (5 tratamientos) y de forma parcialmente ocluida (los primeros 3 tratamientos). La localización para cada tratamiento en cada sitio (tratamientos A, B, C, D y E en sitio ocluido y tratamientos A, B y C en sitio parcialmente ocluido) se hicieron aleatoriamente. Los sujetos se confinaron en el centro de investigación clínica desde aproximadamente 18 horas antes de la primera dosis el día 1 hasta aproximadamente 8 horas después de la 2ª dosis (día 2). Los sujetos volvieron cada día durante 19 días consecutivos (días 3 a 21) para la administración de dosis y procedimientos del estudio.

No se notificaron acontecimientos adversos graves (AAG) o muertes. Todos los acontecimientos adversos (AA) eran de gravedad leve o moderada, con la mayoría de los AA relacionados con reacciones locales de la piel de la cinta quirúrgica usada para adherir los apósitos oclusivos. Todos los sujetos reaccionaron al control positivo. El control positivo se detuvo en todos los sujetos el día 4 después de quejas de excesiva incomodidad de los sujetos. Las puntuaciones de irritación de la piel eran bajas para todos los tratamientos administrados (puntuación máxima de 3 medida en una escala de 0-7) indicando que la pomada con enantiómero (S) era bien tolerada localmente. No se observaron diferencias entre las puntuaciones de irritación acumulada para el enantiómero (S) al 4% (p/p), el enantiómero (S) al 8% (p/p), pomadas con placebo y el control negativo (solución salina al 0,9%). Los signos de irritación se habían resuelto completamente el día 28 (7 días después de la dosis final) para la mayoría de los sujetos.

Los trazados electrocardiográficos no demostraron cambios clínicamente significativos en la frecuencia del puso, estado de reposo quiescente o intervalos QTC de los sujetos y no se observaron cambios clínicamente significativos desde los valores base en los signos vitales de los sujetos, reconocimientos médicos o evaluaciones de laboratorio. La exposición sistémica al enantiómero (S) era despreciable, ya que las concentraciones del enantiómero (S) en el plasma estaban por debajo del límite inferior de cuantificación (LLOQ) (0,1 ng/ml o 100 pg/ml) en la mayoría de las muestras (489 de 546 = ~90%). El nivel más alto del enantiómero (S) observado en un sujeto durante el periodo de administración (día 22) era 994 pg/ml. Basado en la irritación local mínima y perfil de seguridad favorable, junto con la baja exposición sistémica del enantiómero (S), se concluyó que el enantiómero (S) de la invención era bien tolerado y seguro como analgésico tópico.

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Claims (1)

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