ES2389532T3 - Profármacos alquilantes de fosforamidato - Google Patents

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Mark Matteucci
Jian-Xin Duan
Hailong Jiao
Jacob Kaizerman
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Abstract

Un compuesto de fórmula: **Fórmula**donde ambos grupos X4 son Cl o ambos grupos X4 son Br.

Description

Profarmacos Alquilantes de Fosforamidato
Antecedentes de la Invención
Campo de la Invención
La presente invencion proporciona composiciones para el tratamiento del cancer y otras condiciones de enfermedad hiperproliferativas con profarmacos alquilantes de fosforamidato. La presente invencion se refiere generalmente a los campos de la quimica, la biologia, la biologia molecular, la farmacologia, y la medicina.
Descripción de la Técnica Relacionada
Los agentes alquilantes (UalquilantesU o UmostazasU) utilizados en la quimioterapia contra el cancer abarcan un grupo diverso de agentes quimicos que tienen la capacidad de alquilar macromoleculas biologicamente vitales tales como ADN en condiciones fisiologicas (vease Hardman et al., The Pharmacological Basis of Therapeutics, 2001, 13891399, McGraw-Hill, New York, USA). Se postula que la alquilacion de ADN es un mecanismo importante en la actividad antitumoral de los alquilantes. Los alquilantes quimioterapeuticos actuan como electrofilos fuertes, por ejemplo, a traves de la formacion de intermedios de onio estabilizados por heteroatomos contiguos tales como una aziridina o un cation aziridinio. Los alquilantes basados en fosforamidato utilizados en la terapia contra el cancer, tales como la Ciclofosfamida y la Ifosfamida, son una subclase importante de alquilantes quimioterapeuticos. La Ciclofosfamida y la Ifosfamida son activados cada uno en el higado y el alquilante activo liberado alquila radicales nucleofilicos tales como ADN en el interior de celulas tumorales para actuar como un agente quimioterapeutico. Si los alquilantes activos se liberan fuera del tumor, el ADN y otros radicales nucleofilicos tales como los grupos fosfato, amino, sulfhidrilo, hidroxilo, carboxilo e imidazol de biomoleculas de celulas no cancerosas sanas, se pueden alquilar. Tal alquilacion de celulas sanas puede dar como resultado eventos toxicos no deseados en los pacientes (vease Hardman et al., supra).
Ciclofosfamida Ifosfamida Permanece la necesidad de nuevos alquilantes basados en fosforamidato que se puedan utilizar para tratar el cancer u otras condiciones de enfermedad hiperproliferativas, preferiblemente compuestos menos toxicos para las celulas normales. La presente invencion satisface estas necesidades y proporciona profarmacos alquilantes de fosforamidato novedosos utiles en terapia, como se resume en la siguiente seccion.
Breve Resumen de la Invención
La presente invencion proporciona un compuesto de formula:
donde ambos grupos N4 son Cl o ambos grupos N4 son Br. En particular, la invencion proporciona los compuestos 25 y 36 que tienen las siguientes formulas:
En un aspecto, la presente invencion proporciona los alquilantes de fosforamidato novedosos anteriores para su uso en el tratamiento del cancer.
En un aspecto, la presente invencion proporciona una formulacion farmaceutica que comprende los profarmacos alquilantes de fosforamidato de la invencion y un excipiente, portador, o diluyente farmaceuticamente aceptable.
Los profarmacos se pu eden ut ilizar en e l t ratamiento del ca ncer mediante l a administracion d e una c antidad terapeuticamente eficaz a un paciente que necesite tal terapia. En una realizacion, el cancer tratado es resistente a terapia de primera linea, segunda linea, o tercera linea, o es un cancer recurrente. En otra realizacion, el cancer tratado es un cancer metastasico. En otra realizacion, el profarmaco alquilante de fosforamidato de la invencion se administra combinado con al menos otro agente anticanceroso.
Breve Descripción de los Dibujos
La Figura 1 demuestra el efecto del Compuesto 25 (50 mg/kg) sobre el crecimiento tumoral en el modelo de raton con xenoinjerto H460.
La Figura 2 demuestra el efecto del Compuesto 25 (100 mg/kg) sobre el crecimiento tumoral en el modelo de raton con xenoinjerto H460.
La Figura 3 dem uestra el ef ecto del Compuesto 25 (150 mg/kg) dosificado combinado con CDDP sobre el crecimiento tumoral en el modelo de raton con xenoinjerto H460.
La Figura 4 demuestra el efecto del Compuesto 25 dosificado combinado con CDDP sobre el crecimiento tumoral en el modelo de raton con xenoinjerto H460.
Las Figuras 5, 6 y 7 demuestran el efecto del Compuesto 25 combinado con Gemcitabina sobre el crecimiento tumoral en ratones atimicos que portaban tumores derivados de celulas de cancer pancreatico humano de tipo MiaPaca2 (vease el Ejemplo 34).
Descripción Detallada de la Invención
La descripciondetallada de los diferentes aspectosylas realizaciones de lapresente invencion se organiza como sigue: la Seccion I proporciona definicionesutiles; la Seccion IIdescribe los compuestos de la invencion y los metodos para el aborarlos; la Seccion III describe metodos de t ratamiento, terapias, a dministraciones, y formulaciones, que empleanlos compuestos de la invencion solos o combinados; y la Seccion IV proporciona ejemplos de metodos sinteticos y analisis biologicos para los compuestos de la invencion. Esta descripcion detallada se organiza en secciones solo para conveniencia del lector, y la descripcion encontrada en cualquier seccion es aplicable a cualquier aspecto de la invencion.
I. Definiciones
Las siguientes definiciones se proporcionan para ayudar al lector. A no ser que se defina de otro modo, se pretende que todos los terminos de la tecnica, notaciones y otros terminos o terminologia cientificos o medicos utilizados en la presente memoria tengan los significados interpretados habitualmente por los expertos en las tecnicas quimicas y medicas. En algunos casos, los terminos con los significados interpretados habitualmente se definen en la presente memoria como aclaracion y/o como referencia inmediata, y no se debe considerar necesariamente que la inclusion de tales definiciones en la presente memoria represente una diferenciasustancial con la definicion del termino interpretada generalmente en la tecnica.
Segun se utiliza en la presente memoria, UunU o UunaU significa Ual menos uno o unaU o Uuno o una o masU.
UAlquilanteU significa un radical reactivo susceptible de formar un enlace alquilico covalente con macromoleculas a traves de una reaccion electrofilica con un nucleofilo en la macromolecula. UAlquilante de fosforamidatoU significa un alquilante para el que esta pr esente un el ectrofilo de azi ridina o azi ridinio o generado mediante ci clacion intramolecular.
Los compuestos de la presente invencion pueden contener tambien proporciones no naturales de isotopos atomicos en uno mas de los atomos que constituyen tales compuestos. Por ejemplo, los compuestos se pueden radiomarcar con isotopos radiactivos, tales como por ejemplo tritio (H3) o carbono 14 (C14). Se pretende que todas las variaciones isotopicas de los compuestos de la presente invencion, sean radioactivas o no, esten incluidas dentro del alcance de la presente invencion.
Se pretende que el termino Usalesfarmaceuticamente aceptablesU incluya sales de compuestos activos que se preparan con acidos o bases relativamente no toxicos, dependiendo de los sustituyentes concretos encontrados en los compuestos descritos en la presente memoria. Cuando los compuestos contienen funcionalidades relativamente acidas, se pueden obtener sales de adicion de bases poniendo en contacto la forma neutra de tales compuestos con una cantidad suficiente dela base deseada,pura o en un disolventeinerte adecuado. Los ejemplos de las sales derivadas de bases inorganicas farmaceuticamente aceptables incluyen aluminio, amonio, calcio, cobre, ferricas, ferrosas, litio, magnesio, manganicas, manganosas, potasio, sodio, cinc y similares. Las sales derivadas de bases organicas farmaceuticamente aceptables incluyen sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, incluyendo aminas sustituidas, aminas ciclicas, aminas de origen natural y similares,tales como arginina, betaina, cafeina, colina, N,N'-dibenciletilendiamina, dietilamina, 2-dietilaminoetanol, 2-dimetilaminoetanol, etanolamina, etilendiamina, N-etilmorfolina, N -etilpiperidina, g lucamina, gl ucosamina, h istidina, hidrabamina, i sopropilamina, l isina, metilglucamina, morfolina, piperazina, piperadina, resinas poliaminicas, procaina, purinas,teobromina, trietilamina, trimetilamina, t ripropilamina, tr ometamina y s imilares. Cuando l os compuestos co ntienen funcionalidades relativamente alcalinas, se pueden obtener sales de adicion de acido poniendo en contacto la forma neutra de tales compuestos con una cantidad suficiente del acido deseado, pura o en un disolvente inerte adecuado. Los ejemplos de las sales de adicion de acido farmaceuticamente aceptables incluyen aquellas derivadas de acidos inorganicos como l os acidos clorhidrico, bromhidrico, n itrico, ca rbonico, m onohidrogenocarbonico, fo sforico, monohidrogenofosforico, dihidrogenofosforico, sulfurico, monohidrogenosulfurico, yodhidrico, o fosforoso y similares, asi como las sales derivadas acidos organicos relativamente no toxicos como acetico, propionico, isobutirico, malonico, b enzoico, su ccinico, su berico, fu marico, m andelico, ftalico, bencenosulfonico, p -tolilsulfonico, ci trico, tartarico, m etanosulfonico, y si milares. Tambien se i ncluyen l as sa les de am inoacidos tales como ar ginato y similares, y sales de acidos organicos como los acidos glucuronico o galacturorico y similares (vease, p. ej., Berge, S.M., et al , U Pharmaceutical S altsU, Jo urnal of Pharmaceutical S cience, 19 77, 6 6, 1 -19). A lgunos compuestos contienen funcionalidades tanto alcalinas como acidas que permiten que los compuestos sean convertidos en sus sales de adicion de acido o de base.
Las formas neutras de los compuestos se pueden regenerar poniendo en contacto la sal con una base o un acido y aislando el compuesto parental de la manera convencional. La forma parental del compuesto difiere de las diversas formas de sal en ciertas propiedades fisicas, tales como la solubilidad en disolventes polares, pero por otra parte las sales son equivalentes a la forma parental del compuesto para los fines de la presente invencion.
Ciertos compuestos de la p resente i nvencion pueden existir en f ormas no s olvatadas asi co mo en f ormas solvatadas, incluyendo las formas hidratadas. En general, las formas solvatadas son equivalentes a las formas no solvatadas y se pretende que esten incluidas dentro del alcance de la presente invencion. Ciertos compuestos de la presente invencion pueden existir en multiples formas cristalinas o amorfas. En general, todas las formas fisicas son equivalentes para los usos contemplados por la presente invencion y se pretende que esten dentro del alcance de la presente invencion.
UOpcionalU u UopcionalmenteU significa que el evento o circunstancia descritos a continuacion pueden ocurrir, pero no es necesario que ocurran, y que la descripcion incluye casos en los que el evento o circunstancia ocurren y casos en los que no.
Segun se ut iliza e n l a presente m emoria, un U profarmacoU s ignifica u n co mpuesto que, despues de s u administracion, es metabolizado o convertido de otro modo en una forma activa o mas activa con respecto a al menos una propiedad biologica, con re specto a si mismo. P ara pr oducir u n pr ofarmaco, un co mpuesto farmaceuticamente activo (o un precursor adecuado del mismo) se modifica quimicamente de manera que la forma modificada se a m enos act iva o i nactiva, pero l a modificacion quimica es ef icazmente reversible en ci ertas condiciones biologicas de manera que la forma farmaceuticamente activa del compuesto sea generada mediante procedimientos metabolicos u otros procedimientos biologicos. Un profarmaco puede tener, con respecto al farmaco, caracteristicas alteradas de estabilidad metabolica o transporte, menos efectos secundarios o inferior toxicidad, o sabor mejorado, por ejemplo(vease la referencia Nogrady, 1985, Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, NewYork, paginas 388-392). Los profarmacos se pueden preparar tambien utilizando compuestos que no son farmacos pero que despues de la activacion en ciertas condiciones biologicas generan un compuesto farmaceuticamente activo. Segun se utiliza en la presente memoria un profarmaco alquilante de fosforamidato es un profarmaco que despues de su activacion libera el alquilante de fosforamidato activo.
Segun se utiliza en la presente memoria, un Uagente citotoxicoU es un agente o compuesto que produce un efecto toxico sobre las celulas. Segun se utiliza en la presente memoria, un Uagente citostaticoU es un agente que inhibe o suprime el crecimiento y la multiplicacion celulares.
Segun se utiliza en la presente memoria Ucelulas hipoxicasU son celulas que residen en un entorno hipoxico in vivo tal como, por ejemplo, en una zona tumoral hipoxica, o in vitro. Segun se utiliza en la presente memoria Ucelulas normoxicasU son celulas que residen en un entorno normoxico in vivo o in vitro. Segun se utiliza en la presente memoria Ucitotoxicidad hipoxicaU de un compuesto o agente es su citotoxicidad sobre celulas hipoxicas. Segun se utiliza en la presente memoria Ucitotoxicidad normoxicaU de un compuesto o agente es su citotoxicidad sobre celulas normoxicas.
Segun se utiliza en la presente memoria, un Ugrupo biorreductorU hace referencia a un grupo que acepta electrones en una reaccion de oxidacion-reduccion. El grupo biorreductor es un grupo (1) que puede ser reducido, es decir, un grupo que puede aceptar electrones, hidrogeno, y/o un ion hidruro; (2) que puede ser reducido in vivo y/o in vitro; (3) que puede ser reducido in vivo y/o in vitro bajo hipoxia; (4) que puede ser reducido in vivo y/o in vitro mediante DTdiaforasa, tioles, o por medios fotoquimicos o electroquimicos; o (5) que puede ser eliminado y/o escindido mediante un procedimiento biologico, tal como mediante hidrolisis enzimatica, metabolismo etc.
Por ejemplo, y como se describe con mas detalle mas adelante, un grupo biorreductor es un nitroimidazol que puede estar sustituido con una variedad de grupos. Otros ejemplos de grupos biorreductores incluyen, pero no estan limitados a, grupos basados en ni trobencenos con deficiencia de el ectrones, amiduros de ac ido nitrobenzoico deficientes en electrones, ni troazoles, ni troimidazoles, n itrotiofenos, n itrotiazoles, ni trooxazoles, ni trofuranos, y nitropirroles, donde cada una de estas clases de radicales puede estar sustituida opcionalmente, de manera que el potencial redox del grupo biorreductor reside en el intervalo en el que el grupo puede experimentar reduccion en las condiciones hipoxicas de un tumor, mediante DT-diaforasa, y/o mediante un tiol. Un experto en la tecnica entendera, en vista de la descripcion de la presente memoria, como sustituir estos y otros grupos biorreductores para proporcionar un grupo biorreductor que tenga un potencial redox que se encuentre dentro de dicho intervalo.
Generalmente, un experto en la tecnica puede UajustarU el potencial redox de un grupo biorreductor modificando el grupo que contiene los grupos captadores de electrones, los grupos donadores de electrones, o alguna combinacion de tales grupos. Por ejemplo, los grupos nitrotiofeno, nitrofurano, y nitrotiazol pueden estar sustituidos conuno o mas grupos donadores de electrones, incluyendo pero no limitados a grupos metilo, metoxi, o amina, para lograr el potencial redox deseado. En otro ejemplo, el radical nitropirrol puede estar sustituido con un grupo captador de electrones, incluyendo pero no limitado a grupos ciano, carboxamida, -CF3, y sulfonamida, para lograr el potencial redox deseado. Para este fin, se pueden utilizar grupos captadores de electrones fuertes tales como ciano, sulfona, sulfonamida, carboxamida, o -CF3, y grupos captadores de electrones mas suaves tales como -CH2-halogeno en los que el halogeno es -F, -Cl, o -Br.
Segun se utiliza en la presente memoria, un Uagente antineoplasicoU, Uagente antitumoralU, o Uagente anticancerosoU, hace referencia a cualquier agente utilizado en el tratamiento del cancer. Tales agentes se pueden utilizar solos o combinados con otros compuestos y pueden aliviar, reducir, mejorar, prevenir, o situar o mantener en un estado de remision de los sintomas clinicos o marcadores diagnosticos asociados con neoplasmas, tumores o canceres. Los agentes antineoplasicos incluyen, pero no estan limitados a, agentes anti-angiogenicos, agentes al quilantes o alquilantes, antimetabolitos, ciertos productos naturales, complejos de coordinacion de platino, antracenodionas, ureas sustituidas, der ivados de metilhidrazina, supresores adrenocorticales, c iertas hormonas y a ntagonistas, polisacaridos anti-cancerosos, quimioprotectores, y ciertas hierbas u otros extractos vegetales.
Segun se utiliza en la presente memoria, UcancerU hace referencia a una de un grupo de mas de 100 enfermedades causadas por el crecimientoincontrolado y diseminado de celulas anormales que pueden adoptar la forma de tumores solidos, linfomas, y canceres no solidos tales como la leucemia.
Segun se utiliza en la presente memoria, Ucancer malignoU hace referencia a celulas cancerosas o canceres que tienen la capacidad de metastasis, con perdida tanto de crecimiento como de control posicional.
Segun se utiliza en la presente memoria, UneoplasmaU (neoplasia) o UtumorU hace referencia a un nuevo crecimiento celular o tisular anormal, que puede ser benigno o maligno.
Segun se utiliza en la presente memoria, UtratarU una afeccion o a un paciente hace referencia a tomar medidas para obtener resultados beneficiosos o deseados, incluyendo resultados clinicos. Para los fines de esta invencion, los resultados clinicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no estan limitados a, alivio o mejora de uno o m as sintomas del cancer u otras condiciones de enfermedad hiperproliferativas, disminucion del grado de enfermedad, retraso o ralentizacion del progreso de la enfermedad, mejora, paliacion o estabilizacion del estado de enfermedad, y otros resultados beneficiosos descritos mas abajo.
Segun se utiliza en la presente memoria, UreduccionU de un sintoma o sintomas (y equivalentes gramaticales de esta frase) significa disminucion de la gravedad o frecuencia del sintoma o los sintomas, o eliminacion del sintoma o los sintomas.
Segun se utiliza en la presente memoria, UadministrarU o Uadministracion deU un farmaco a un sujeto (y equivalentes gramaticales de esta f rase) incluye tanto l a administracion directa, i ncluyendo auto-administracion, como administracion indirecta, incluyendoel hecho de prescribirun farmaco. Por ejemplo, segun se utiliza en la presente memoria, un medico que instruye a un paciente para auto-administrarse un farmaco y/o proporciona a un paciente una prescripcion para que se administre el farmaco al paciente.
Segun se utiliza en la presente memoria, una Ucantidad terapeuticamente eficazU de un farmaco es una cantidad de un farmaco que, cuando se administra a un sujeto con cancer, tendra el efecto terapeutico deseado, p. ej., alivio, mejora, paliacion o eliminacion de una o mas manifestaciones de cancer en el sujeto. El efecto terapeutico completo no se pr oduce necesariamente mediante l a adm inistracion de una d osis, y puede ocu rrir so lo desp ues de l a administracion de una serie de dosis. De este modo, se puede administrar una cantidad terapeuticamente eficaz en una o mas administraciones.
Segun se utiliza en la presente memoria, una Ucantidad profilacticamente eficazU de un farmaco es una cantidadde un farmaco que, cuando se administra a un sujeto, tendra el efecto profilactico deseado, p. ej., prevenir o retrasar el comienzo (o recurrencia) de la enfermedad o los sintomas, o reducir la probabilidad del comienzo (o recurrencia) de la enfermedad o los sintomas. El efecto profilactico completo no se produce necesariamente mediante l a administracion de una dosis, y se puede producir solo despues de la administracion de una serie de dosis. De este modo, una cantidad profilacticamente eficaz se puede administrar en una o mas administraciones.
Segun se ut iliza en l a pr esente m emoria, una terapia de Usegunda l ineaU h ace r eferencia una t erapia que se proporciona para e l tratamiento d e un c ancer que ha f racasado e n l a r espuesta a un primer r egimen d e quimioterapia o quimioterapia de Uprimera lineaU. Terapia de Utercera lineaU hace referencia a la terapia que se proporciona para el tratamiento de un cancer cuando tanto el tratamiento inicial, la terapia de primera linea, como el tratamiento subsiguiente, la terapia de segunda linea, no funciona, o deja de funcionar.
Segun se utiliza en l a presente m emoria U LogPU si gnifica un a m edida de l ca racter lip ofilo de una sustancia determinada basandose en el reparto de la sustancia entre octanol y agua.
II. Compuestos
La mayoria de las terapias contra el cancer mediadas por farmacos, incluyendo las terapias alquilantes basadas en fosforamidato, estan basadas en venenos, denominados agentes citotoxicos, selectivos para elegir como diana celulas en division, por ejemplo, su ADN replicante, microtubulos, y diversos factores de crecimiento y receptores de factores de crecimiento. Estos farmacos son eficaces, debido a que las celulas cancerosas generalmente se dividen mas frecuentemente que las celulas normales. Sin embargo, tales farmacos casi inevitablemente no destruyen todas las celulas cancerosas en el paciente. Una razon es que las celulas cancerosas pueden mutar y desarrollar resistencia a farmacos. Otra es que no todas las celulas cancerosas se dividen mas frecuentemente que las celulas normales y las celulas cancerosas que se dividen lentamente pueden ser tan insensibles a tales agentes citotoxicos,
o incluso mas, que las celulas normales. Algunas celulas cancerosas residen en un tumor solido escasamente vascularizado, son incapaces de generar la energia requerida para la division celular y se dividen lentamente. A medida que el tumor crece, este requiere un suministro de sangre y,por consiguiente, crecimiento de nueva vasculatura. La nueva vasculatura que soporta el crecimiento tumoral a menudo es desordenada; dejando regiones significativas del tumor infra-vascularizadas e incluso las regiones vascularizadas sujetas a bloqueo intermitente. Estas regiones infra-vascularizadas y bloqueadas del tumor se vuelven hipoxicas - tienen una concentracion de oxigeno inferior o una presion parcial de oxigeno inferior que la correspondiente al tejido normal, y las celulas en las mismas exhiben velocidades de divisionmas
lentas. De este modo, la concentracion media de o xigeno de s olo el diez por ciento de los tumores solidos se encuentra en el intervalo normal de 5333 a 8000 Pa (40 a 60 mmHg), y el cincuenta por ciento de los tumores solidos exhiben concentraciones medias de oxigeno de menos de 1333 Pa (10 mm Hg).
5 Las zonas hipoxicas del tumor representan una fuente significativa de metastasis y celulas cancerosas resistentes a terapia (veanse por ejemplo, De Jaeger et al., Br J Cancer.2001, 84(9):1280-5 y Rofstadet al., Br J Cancer. 1999, 80(11):1697-707). Como es logico, ademas, los bajos niveles de oxigeno en los tumores estan asociados con una escasa respuesta a la terapia, aumento de metastasis, y escasa supervivencia. Los mecanismos de activaciony accion de la Ciclofosfamida y la Ifosfamida ilustran agentes que no pueden elegir como diana la zona hipoxica dificil de destruir de un tumor.
Tanto la Ciclofosfamida como la Ifosfamidason profarmacos y se pueden activar oxidativamente enel higado a traves de intermedios para producir alquilantes de f osforamidato activos, los Alquilantes 1 (mostaza de ciclofosfamida) y 2 (mostaza de ifosfamida), respectivamente (vease mas abajo). Los Hemiacetales de carga neutra
15 1 y 2 pueden tener una vida media de muchos minutos y pueden penetrar hacia el interior y el exterior de la celula. En contraste, los Alquilantes anionicos 1 y 2 son mucho menos permeables a traves de la membrana celular y una vez formados extracelularmente destruyen ineficazmente la celula por medio de la alquilacion del ADN celular.
Cuando los alquilantes de f osforamidato alcanzan el tumor, estos destruyen generalmente ce lulas en la z ona externa, n ormoxica, b ien v ascularizada, d e cr ecimiento r apido d el t umor. S in em bargo, est os alquilantes de fosforamidato no son tan eficaces para penetrar en las zonas internas progresivamente hipoxicas, de crecimiento lento, menos vascularizadas del tumor y para destruir alli las celulas tumorales.Antes de quecualquiera de estos alquilantes activos alcancen el tumor, estos puede reaccionar con celulas sanas y dar como resultado toxicidad y/o muerte celular.
Oxidación en el hígado Ciclofosfamida Hemiacetal 1 Alquilante 1
Oxidación en el hígado
Ifosfamida Hemiacetal 2 Alquilante 2
35 Si bien el tumor hipoxico es dificil de tratar, la zona hipoxica del tumor puede generar derivados reducidos deuna variedad de grupos quimicos (vease la referencia Workman et al., 1993, Cancer y Metast. Rev. 12: 73-82), y se pueden des arrollar profarmacos de ci totoxinas para e xplotar t ales entornos biorreductores (documento WO 2006/065448 y documento WO 2006/057946, ambos de Matteucci et al.). Tal farmaco reducible por hipoxia (o activado por hipoxia) se puede construir empleando un grupo biorreductor (Z3) junto con un alquilante. El grupo biorreductor se emplea como parte de un radical Disparador unido covalentemente o anclado al alquilante de fosforamidato.
Los compuestos de la invencion se pueden describir generalmente como profarmacos alquilantes de fosforamidato. 45 En general, los profarmacos alquilantes de fosforamidato de la invencion tienen la siguiente estructura
Alq-Disparador
donde Alq es un alquilante de fosforamidato y el Disparador T tiene una estructura L-Z3, donde el conector L esta unido a un grupo biorreductor Z3. En los compuestos de la invencion, el Disparador T es un disparador activado por hipoxia.
Los alquilantesdefosforamidato son referidos en lasreferencias, Borch et al., J. Med. Chem. 2000, 43: 225865; 2001, 44: 69-73; 2001, 44: 74-7; Hernick et al. J. Med. Chem. 2002, 45: 3540-8; Hernick et al., J. Med. Chem.
55 2003, 46: 148-54; Patentes de los Estados Unidos Nums. 4.908.356; 5.306.727; 5.403.932; 5.190.929; 5.472.956; y
6.656.926; Publicacion de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Num. 2003/0008850; y Papot et al., Curr. Med. Chem., 2002, 2, 155-85. Los profarmacos alquilantes de fosforamidato de la presente invencion tienen uno o mas de las siguientes caracteristicas: (i) una toxicidad hipoxica superior o valor de CI50 o CI90 inferior, en tejido hipoxico, (ii) citoxicidad normoxica inferior, y (iii) un perfil de efectos secundarios menos toxicos o alguna combinacion de estos atributos. Los profarmacos alquilantes de fosforamidato de la presente invencion difieren de los derivados alquilantes de fosforamidato conocidos en: (i) la naturaleza del alquilante de fosforamidato liberado, (ii) la naturaleza del conector (L) y/o el grupo biorreductor Z3, (iii) la presencia de mas de un grupo radical biorreductor,
o alguna combinacion de estos atributos, (iv) el aumento de la citoxicidad selectiva por hipoxia medida por valores de la razon de citotoxicidad por hipoxia (HCR) mas altos, (v) aumento de la solubilidad en agua, (vi) aumento de la estabilidad a la degradacion microsomal en el higado, y/o (vii) el suministro de profarmacos alquilantes de fosforamida eficaces que son aquirales y evitan la especificidad enantiomerica en el metabolismo in vivo. La HCR es la razon de citotoxicidades normoxicas e hipoxicas y se define como mayor detalle mas abajo.
Para entender por que los compuestos profarmaco de la presente invencion representan un avancesignificativo sobre los derivados alquilantes de fosforamidato anticancerosos conocidos, es util una comprension de la biologia del tumor particularmente bajo hipoxia y farmacocinetica, y farmacodinamica de los profarmacos propocionados en la presente memoria en particular.
Para la terapia contra tumores eficaz, un profarmaco activado por hipoxia debe ser mucho menos toxico para celulas normoxicas sanas en comparacion con las celulas tumorales hipoxicas. En algunas realizaciones, los profarmacos activados por hipoxia de la invencion son menos activos y menos toxicos para las celulas normoxicas que para las celulas hipoxicas. Cuando tal profarmaco de la invencion encuentra el entorno reductor hipoxico, en el interior de un tejido tumoral solido, la reduccion del grupo biorreductor ocasiona la disociacion del alquilante de fosforamidato o de la citotoxina activa. El alquilante de fosforamidato es liberado en la zona interna del tumor y puede penetrar mas facilmente en la region hipoxica del tumor solido. Estos alquilantes de fosforamidato pueden destruir celulas en la region hipoxica del tumor solidodificil de alcanzar a la vez que se minimizan lamuerte de las celulas sanas no cancerosas y los efectos secundarios toxicos para el paciente. De estemodo la presente invencion proporciona profarmacos activados por hipoxia que s on m ucho m enos toxicos para las celulas normoxicas, sanas en comparacion con las celulas tumorales, hipoxicas.
Los profarmacos alquilantes de fosforamidato de la presente invencion emplean radicales aromaticos que contienen nitro como grupos biorreductores en el Disparador T. Enel tumor hipoxico, el grupo nitro se reduce a un grupo hidroxilamino o un grupo amino y el flujo de un par deelectrones del grupo amino o hidroxilamino a travesdel sistema de electrones I conjugados del Disparador T libera el alquilante de fosforamidato. El alquilante de fosforamidato liberado destruye celulas en y/o cerca del tumor hipoxico.
Varias enzimaspueden ser responsablesde la reduccion del grupobiorreductor Z3enel Disparador. Por ejemplo, las enzimas citocromo P450 reductasa pueden reducir el radical nitro en un grupo biorreductor en una primera etapa respectivamente a un anion radical NO2(.-). La zona del tumor hipoxico puede tener una concentracion mas alta de la enzima reductasa en comparacion con el tejido normoxico. Bajo normoxia, como en tejido sano bien vascularizado, en presencia de oxigeno, el anion radical NO2(.-) formado puede reaccionar con oxigeno para devolverlo al grupo biorreductor y no generar o liberar f inalmente el al quilante de fosforamidato. El r adical he teroarilo u nido covalentemente al anion radical NO2(.-) modula la sensibilidad al oxigeno del anion radical.
La sensibilidad al oxigeno del grupo biorreductor varia dependiendo parcialmente del potencial de reduccion del grupo biorreductor. De este modo, por ejemplo, un grupo biorreductor se puede reducir en una zona hipoxica del tumor que tenga 1% de oxigeno, otro en una zona que tenga 0,1% de oxigeno, y otro mas en una zona que tenga 0,01% de oxigeno.
Un grupo biorreductor pierde algo o toda la especificidad hipoxica cuando es tan facil de reducir que la enzima citocromo P450 reductasa u otros agentes reductores (Uagentes reductoresU) en tejido normoxico sano pueden reducirloen presencia de oxigeno. Si un anion radical NO2(.-) en un grupo biorreductorno reacciona o reacciona lentamente con oxigeno, el propio anion radical puede liberar el alquilante de fosforamidato, o puede reducir y liberar adicionalmente el alquilante de fosforamidato, causando toxicidad para las celulas y tejidos normoxicos sanos. Los profarmacos alquilantes de fosforamidato novedosos de la presente invencion son mas toxicos para las celulas y tejidos cancerosos hipoxicos en comparacion con las celulas y tejidos normoxicos sanos. La facilidad o dificultad para reducir el grupo biorreductor Z3 se puede medir por medio del potencial de reduccion del grupo biorreductor y esta influida por el conector (L), y el alquilante de fosforamidato (Alq-H). Por ejemplo, el anclaje del grupo biorreductor a un conector captador de electrones o un alquilante de fosforamidato captador de electrones puede hacer mas facil de reducir el grupo biorreductor en comparacion con cuando esta unido covalentemente a un conector rico en electrones o a un alquilante de fosforamidato rico en electrones.
El Disparador T se puede oxidar, hidrolizar, o tiolizar y puede liberar el alquilante de fosforamidato de una manera no selectiva de hipoxia. La Telcita', un profarmaco alquilante de fosforamidato que esta en uso clinico, puede liberar
una toxina activa en ausencia de hipoxia por medio de la accion de laglutationa transferasa (vease, p. ej., el alquilante defoforamidato If en la seccion UMetodos de TratamientoU). La naturaleza quimica del conector y/o el alquilante de f osforamidato pueden i nfluir en l a est abilidad o xidativa, hidrolitica, o t iolitica del profarmaco c on respecto a la liberacion del alquilante de fosforamidato. En una realizacion de la presente invencion un profarmaco 5 alquilante de fosforamidato activado por hipoxia no libera el alquilante de fosforamidato en, una oxidacion, hidrolisis,
o tiolisis no especifica de hipoxia.
De acuerdo con la presente invencion, se puede utilizar un Disparador empleado apropiadamente en un profarmaco alquilante de fosforamidato para UajustarU la propiedad farmacocinetica del profarmaco sin alterar sus propiedades 10 citotoxicas. Por ejemplo, un alto volumen de distribucion de un agente anticanceroso asegura que el profarmaco sea absorbido en el tejido rapidamente. De acuerdo con la presente invencion, en unarealizacion, el volumen de distribucion d e un pr ofarmaco alquilante de f osforamidato se pu ede modular empleando un Disparador T que contenga un grupo amino capaz de formar un cation amonio en condiciones fisiologicas. En una realizacion, un Disparador T que contiene un grupo amonio cuaternario puede producir un compuesto profarmaco de la invencion
15 que tiene un alto volumen de distribucion a la vez que se evitan posibles capturas endosomicas.
Un alquilante de fosforamidato que contiene un grupo hidroxilo se puede transformar en un profarmaco anclando covalentemente un Disparador T a este grupo funcional. Durante la transformacion de un alquilante de fosforamidato en un profarmaco, un grupo hidroxilo en el alquilante de fosforamidato se puede transformar en un ester, como se 20 describe conmas detalle enlas seccionesMetodo de Sintesis y Experimentaldemas abajo. Esta transformacion puede producir un profarmaco que es menos polar o mas lipofilo que el alquilante de fosforamidato correspondiente. Los profarmacos alquilantes de f osforamidato n o p olares pueden no se r f acilmente so lubles en por tadores o diluyentes farmaceuticos acuosos. Los grupos potenciadores de la solubilidad como alquilamino, se pueden emplear en el Disparador T para modular la solubilidad del profarmaco y superar cualquiera de los problemas encontrados en
25 la preparacion de formulaciones acuosas de los profarmacos alquilantes de fosforamidato.
Los alquilantes de fosforamidato pueden tener radicales N-(2-haloetilo) unidos covalentemente a un radical P=O como se muestra mas abajo. Despues de la liberacion del radical alquilante de fosforamidato anionico se forma una especie de aziridina o aziridinio que puede alquilar ADN. Dependiendo de la naturaleza captadora de electrones de
30 los sustituyentes R2y R3, la cinetica de formacionde aziridiniopuede variar. Por ejemplo, como se muestra en la secuencia de reaccion de mas abajo, la velocidad de alquilacion puede aumentar cuando el radical NR2R3 se cambia de NH2 a
35 (vease Engle et al., J. Med. Chem., 1987, 25:1347-57). Los sustituyentes en los atomos de nitrogeno pueden alterar la geometria del alquilante de fosforamidato, la deslocalizacion del par de electrones solitario en este atomo de nitrogeno en el radical P=O, la disponibilidad de los pares de electrones solitarios en el nitrogeno para el aziridinio o la posterior formacion de aziridina, y la solubilidad en agua del profarmaco alquilante de fosforamidato y el alquilante de fosforamidato.
Profármaco alquilante de Alquilante de Aziridinio fosforamidato de la presente invención fosforamidato
45 La presente invencion surge en parte del descubrimiento de que profarmacos alquilantes de fosforamidato que emplean un grupo biorreductor 2-nitroimidazol muestran una citotoxicidad hipoxica inesperadamente alta, baja toxicidad normoxica y alta HCR y solubilidad mejorada. Por ejemplo, los Compuestos 24 (véase el Ejemplo 34) y 25 fueron respectivamente, de 400 a 1000 veces mas toxicos en celulas hipoxicas que en celulas normoxicas en un analisis de citotoxicidad anti-proliferacion c on una CI50 0,05 !M e n ce lulas bajo hi poxia (vease l a seccion d e
50 EJEMPLOS). Los profarmacos alquilantes de fosforamidato que contienen mostaza deifosfamida oanalogos de mostaza de ifosfamida y que tienen las formulas:
Z3-CH2-O-P(=O)NHCH2CH2N4)2,
55 Z3-CH2-O-P(=O)NHCH(R9)CH2N4)2, y
Z3-CH(Z2)-O-P(=O)(NHCH(R9)CH2N4)2;
donde Z2 es metilo; R9 es hidrogeno, metilo, o isopropilo; Z3 es 1-N-metil-2-nitroimidazol-5-ilo), 2-nitrotiofen-5-ilo, o 2
5 nitrofurano-5-ilo; y cada N4 es Cl o Br fueron inesperadamente mas toxicos en celulas hipoxicas en comparacion con celulas normoxicas, y/o poseian v alores de HCR inesperadamente al tos, e n analisis d e ci totoxicidad antiproliferacion celular, en contraste con los valores de HCR de derivados alquilantes de fosforamidato conocidos que tienen gr upos bi orreductores (Z3) de 2-nitrotiofen-5-ilo, 2-nitrofuran-5-ilo, o 5-nitroimidazolilo, y m ostaza de N,N'(tetrakis-2-cloroetil)fosforamidato o mostaza de ciclofosfamida; o un grupo indoloquinonilo como Z3 y mostaza de
10 ifosfamida (veanse p. ej., los compuestos P4, P14-17, P19, y P21-22, en Borch et al., J. Med. Chem., y Patente de los Estados Unidos Num. 6.656.926 ambas mas arriba).
Método de síntesis
15 La presente invencion surge en parte del descubrimiento de que el compuesto 36, que podria no ser aislado haciendo reaccionar
20 1-N-metil-2-nitroimidazol-5-metanol, y n-butil litio en un disolvente adecuado, se sintetizo facilmente empleando una reaccion d e t ipo Mitsunobu don de el 1-N-metil-2-nitroimidazol-5-metanol era activado m ediante l a adicion d e trifenilfosfina y azodicarboxilato de diisopropilo, y se hacia reaccionar con
25 para producir el compuesto 36.
De este modo, en un aspecto la presente descripcion proporciona un metodo para sintetizarun compuestode fosforamidato que comprende hacer reaccionar un acido fosforamidico o fosfordiamidico y un alcohol para producir
30 un fosforamidato. En otro aspecto,la presente descripcion proporciona metodos para sintetizarlos compuestos profarmaco al quilantes de f osforamidato novedosos de l a i nvencion. E n un aspecto, la pr esente descr ipcion proporciona un metodo para sintetizar un profarmaco alquilante de fosforamidato que comprende hacer reaccionar, un alquilante de fosforamidato novedoso o conocido, un Disparador-OH, una fosfina trisustituida, y un azodicarboxilato de dialquilo para producir un profarmaco alquilante de fosforamidato. En un aspecto del metodo, en
35 una primera etapa el Disparador-OH se hace reaccionar con la fosfina trisustituida y el azodicarboxilato de dialquilo para producir un intermedio, y en una segunda etapa, el alquilante de fosforamidato se anade al intermedio obtenido a partir de la primera etapa para formar el producto.
La sintesis degrupos biorreductores y profarmacos alquilantes de fosforamidato, y los metodos de la presente
40 descripcionse pueden adaptar de las referencias Matteucci et al., Publicacion de la Solicitud PCTNums. WO 04/009667 y WO 2005/086951; deGroot et al., 2001, Current Med. Chem. 8:1093-1122; Denny et al., Patentes de los Estados Unidos Nums. 5.750.782; 5.780.585; 5.872.129; y 6.251.933; Davis et al., Publicacion de la Solicitud PCT Nums.WO 04/85421 y WO 04/85361; y Lin et al., Publicacion de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Nums. 2004/254103 y 2005/043244, y Borch et al. (supra).
45 Los ejemplos de los metodospara sintetizar losprofarmacos alquilantesdefosforamidato de lapresente invencion se proporcionan con mas detalle en la seccion UEJEMPLOSU de mas abajo.
III Tratamientos
En una realizacion, la presente descripcion proporciona un metodo para el tratamiento del cancer en un paciente que necesite su terapia mediante la administracion al paciente de un profarmaco alquilante de fosforamidato de la presente invencion.
La terapia contra el cancer con agentes alquilantes puede conducir al desarrollo de canceres que sean resistentes a estos agentes alquilantes. Los agentes alquilantes pueden destruir celulas cancerosas en la region cancerosa que se divide mas rapidamente o que contiene la concentracion mas alta de oxigeno en comparacion con las celulas cancerosas de la region cancerosa hipoxica de crecimiento mas lento. Las ultimas celulas sobreviven al tratamiento con agentes alquilantes y pueden producir celulas resistentes a tales alquilantes. Se postula que el aumento de actividad de la guanina-O6-alquiltransferasa, glutationa, glutationa transferasas, la ruta de reparacion de la escision de nucleotidos, y/o las proteinas de reparacion de emparejamientos erroneos, y la disminucion de la penetracion de farmacos transportados activamente tales como mecloretamina y melfalan, son responsables de la resistencia del cancer a los alquilantes (por ejemplo, véase, Hardman et al., paginas 1393 y 1433, supra).
Los profarmacos de la presente invencion son eficaces en el tratamiento de canceres resistentes a otras terapias. Las celulas cancerosas que se dividen lentamente en la zona cancerosa hipoxica actuan como fuente de celulas y cepas cancerosas resistentes y son destruidas por los profarmacos de la presente invencion. Enun aspecto, la presente descripcion proporciona un metodo para el tratamiento de un cancer resistente al tratamiento por uno o mas alquilantes mediante la administracion de los compuestos de la presente invencion solos o combinados con otro agente anticanceroso. En unaspecto,un profarmacoalquilante de fosforamidato dela invencion se administra combinado con un farmaco que no tiene sustancialmente nefrotoxicidad. En un aspecto el profarmaco alquilante de fosforamidato se administra con carboplatino.
En un aspecto, la presente descripcion proporciona profarmacos alquilantes de fosforamidato que no presentan resistencia cruzada con alquilantes conocidos. En otro aspecto, la presente descripcion proporciona profarmacos alquilantes de fosforamidato que no presentan resistencia cruzada con los alquilantes ciclofosfamida, ifosfamida, glufosfamida, m ecloretamina, melfalan, clorambucilo, d acarbazina, t emozolomida, carmustina, estreptozocina, bendamustina, busulfan, tiotepa, cisplatino, carboplatino, y oxaliplatino.
En un aspecto, la pr esente descr ipcion proporciona un m etodo par a el t ratamiento del ca ncer m ediante la administracion como terapia de primera linea de los compuestos de la presente invencion solos o combinados con otros agentes anticancerosos. En otro aspecto, la presente descripcion proporciona un metodo para el tratamiento de un cancer metastasico mediante la administracion como terapia de primera linea de los compuestos de l a presente invencion solos o combinados con otros agentes anticancerosos. En un aspecto, la presente descripcion proporciona un metodo para el tratamiento del cancer mediante la administracion como terapia de segunda linea de los compuestos de la presente invencion solos o combinados con otros agentes anticancerosos. En un aspecto, la presente descripcion proporciona un metodo para el tratamiento del cancer mediante la administracion como terapia de tercera linea de los compuestos de la presente invencion solos o combinados con otros agentes anticancerosos. En un aspecto, la pr esente descr ipcion proporciona un m etodo par a el t ratamiento del ca ncer m ediante la administracion despues de un tratamiento previo con cirugia y/o terapia de radiacion de los compuestos de la presente invencion solos o combinados con otros agentes anticancerosos. En un aspecto, la presente descripcion proporciona un m etodo par a el t ratamiento del ca ncer, habiendo vu elto a a parecer el ca ncer despues de quimioterapia, cirugia, radiacion previas o cualquier combinacion de ellas, mediante la administracion de los compuestos de la presente invencion solos o combinados con otros agentes anticancerosos.
En los metodos para el tratamiento del cancer proporcionados por la presente descripcion, se administra al sujeto una cantidad eficaz de profarmaco alquilante de fosforamidato. Generalmente, el sujeto puede ser cualquier mamifero humano o no humano. El sujeto preferido es un sujeto humano. Otros sujetos concretos incluyen pero no estan limitados a primates no humanos, perros, gatos, animales de granja y caballos. En una version, el profarmaco alquilante de fosforamidato se administra solo. En una version el profarmaco alquilante de fosforamidato se administra combinado con uno o mas agentes anticancerosos adicionales. En una version el profarmaco alquilante de fosforamidato se administra junto con un tratamiento terapeutico del cancer, incluyendo pero no limitado a cirugia y radiacion. El profarmaco alquilante de fosforamidato se administrara tipicamente en una composicion farmaceutica. Diversas composiciones farmaceuticas que se pueden utilizar se describen en la seccion Formulaciones mas abajo.
Los profarmacos alquilantes de fosforamidato y sus composiciones farmaceuticas se pueden utilizar para tratar cualquier tipo de cancer en un sujeto, particularmente en un sujeto humano. Los canceres que se pueden tratar incluyenpero no estan limitados a leucemia, cancer de mama, cancer de piel, cancer oseo, cancer de higado, cancer de cerebro, cancer de laringe, cancer de vesicula biliar, pancreas, recto, paratiroides, tiroides, suprarrenal, tejido neural, cabeza y cuello, estomago, bronquios, rinones, carcinoma de celulas basales, carcinoma de celulas escuamosas de tipo ulceroso y papilar, carcinoma de piel metastasico, osteosarcoma, sarcoma de Ewing, sarcoma de celulas del reticulo, mieloma, tumor de celulas gigantes, tumor de pulmon de celulas pequenas, calculos biliares, tumores celulares de los islotes, tumor cerebral primario, tumores linfociticos y granulociticos agudos y cronicos, tumor d e ce lulas pilosas, ad enoma, hiperplasia, ca rcinoma medular, feocromocitoma, n euroma mucoso,
ganglioneuromas intestinales, tumor hiperplasico del nervio de la cornea, tumor habitus marfanoide, tumor de Wilm, seminoma, tumor leiomiomatoso, displasia cervical y carcinoma in situ, neuroblastoma, retinoblastoma, sarcoma de tejido blando, carcinoide maligno, lesion cutanea topica, micosis fungoide, rabdomiosarcoma, sarcoma de Kaposi, sarcoma ost eogenico y o tros sarcomas, hipercalcemia maligna, t umor de c elulas renales, policitemia ve ra, adenocarcinoma, glioblastoma multiforme, leucemias, linfomas, melanomas malignos, y carcinomas epidermoides.
El profarmaco alquilante de fosforamidato se puede utilizar particularmente en el tratamiento del canceres que contienen zonas significativas de tejido hipoxico. Tales canceres incluyen pero no estan limitados a cancer de pulmon, especialmente cancer de pulmon de celulas no pequenas, cancer de mama, cancer de colon, cancer de cabeza y cuello, cancer de ovario, cancer pancreatico, y cancer de prostata. Los ejemplos de los tipos del canceres que se pueden tratar con los profarmacos alquilantes de fosforamidato de la invencion se proporcionan en las siguientes referencias: T idmarsh et al., Solicitud de patente PCTNum. PCT/US2005/047314 (WO 2006/071955) presentada el 22 de Diciembre d e 2 005; Solicitud de P atente PCT titulada UGlufosfamide combination therapyU, documento WO 2006/122227; y Publicacion dePatente PCT Num. WO 2005/076888. Algunos de estos canceres se comentan con fines ilustrativos mas abajo. Los expertos en la tecnica apreciaran que la quimioterapia del cancer implica a menudo la administracion simultanea o sucesiva de una variedad de agentes anticancerosos, y como se comenta adicionalmente mas abajo, se puede utilizar un profarmaco alquilante de fosforamidato en terapias combinadas proporcionadas por medio de los metodos descritos en la presente memoria. De este modo, en la descripcion de los canceres ilustrativos que contienen regiones hipoxicas susceptibles al tratamiento con un profarmaco alquilante de fosforamidato, tambien se describen los ejemplos de las terapias combinadas.
El cancer de pulmon afecta a mas de 100.000 varones y 50.000 mujeres en los Estados Unidos, la mayoria de los cuales fallece en el plazo de1 ano desde el diagnostico,haciendolo la causa principal de muerte por cancer.Los protocolos actuales para el tratamiento del cancer de pulmon implican la integracion de quimioterapia con o sin radioterapia o cirugia. Se puede utilizar un profarmaco alquilante de fosforamidato como agente unico o combinado con las terapias combinadas existentes. Se ha i nformado so bre una va riedad de regimenes de qui mioterapia combinados para el cancer de pulmon de celulas pequenas, incluyendo las combinaciones que consisten en ciclofosfamida, doxorrubicina y vincristina (CAV); etoposido ycisplatino (VP-16); yciclofosfamida, doxorrubicina y VP-16 (C AVP-16). Se ha i nformado d e b eneficios de su pervivencia modestos a partir de l a combinacion de tratamiento con quimioterapia (etoposido mas cisplatino) para el cancer de pulmon de celulas no pequenas.
Asimismo, varios farmacos citotoxicos diferentes han producido al menos la regresion temporal del cancer de ovario. Los farmacos mas activos en el tratamiento del cancer de ovario han sido los agentes alquilantes, incluyendo ciclofosfamida, i fosfamida, melfalan, clorambucil, t iotepa, ci splatino, y c arboplatino. Las terapias combinadas actuales para el cancer de ovario incluyen cisplatino o carboplatino combinados con ciclofosfamida a intervalos de 3 a 4 semanas durante se is a och o ci clos. Los compuestos y l os metodos d escritos en l a pr esente m emoria proporcionan formas de profarmacos y metodos para el tratamiento del cancer de ovario en el que un profarmaco alquilante de fosforamidato como el descrito en la presente memoria se utiliza como un solo agente o en tal terapia combinada existente, o bien para remplazar a un agente o ademas del agente o los agentes utilizados actualmente.
El cancer de prostata es la malignidad mas comun en hombres en los Estados Unidos y es la segunda causa mas comun de muerte por cancer en hombres por encima de55 anos de edad, y se ha informado que este cancer consiste principalmente en tejido hipoxico. Se ha informado sobre diversos protocolos de quimioterapia para su uso en la fase de enfermedad tardia despues de la recaida tras el tratamiento hormonal. Los agentes para el tratamiento del cancer de prostata incluyen los alquilantes fosfato de estramustina, prednimustina, y cisplatino. La quimioterapia combinada tambien se utiliza para tratar el cancer de prostata, incluyendo el tratamiento con fosfato de estramustina mas prednimustina y ci splatino, y 5-fluorouracilo, melfalan, e hidroxiurea. La presente descr ipcion proporciona metodos para el tratamiento del cancer de prostata en los que se utiliza un profarmaco alquilante de fosforamidato de la presenteinvencion en tales combinaciones,o bien para remplazar un agente oademas del agente o los agentes utilizados actualmente.
El cancer de intestino grueso es la segunda causa de muerte por cancer mas comun en los Estados Unidos y es asimismo u n cancer c aracterizado p or regiones hipoxicas. Si bi en se ha d emostrado qu e l a quimioterapia e n pacientes con cancer colorrectal avanzado tiene solo un beneficio marginal, el 5-fluorouracilo es el tratamiento mas eficaz para esta enfermedad. El 5-fluorouracilo es util solo o combinado con otros farmacos, pero esta asociado solo con un 15 a 20 por ciento de probabilidad de reducir las masas de tumor medibles en 50 por ciento o mas. Utilizando 5-FU combinado con los compuestos y los metodos descritos en la presente memoria, y los metodos para el tratamiento del cancer de colon utilizando un profarmaco, se puede ofrecer un beneficio terapeutico significativo y el potencial para atender la necesidad no satisfecha de mejores metodos del tratamiento para esta enfermedad.
En unaversion de los metodos detratamiento,se puede utilizar un profarmacoalquilante de fosforamidato en diversos enfoques conocidos para l a terapia co ntra el c ancer i ncluyendo pero no limitados a Uterapia con profarmacos enzimaticos dirigidos por anticuerposU (ADEPT), Uterapia con profarmacos enzimaticos dirigidos por virus (VDEPT), Uterapia con profarmacos enzimaticos dirigidos por genesU (GDEPT), y Uterapia con profarmacos
enzimaticos dirigidos por bacteriasU (BDEPT). Los usos generales de un profarmaco alquilante de fosforamidato no estan limitados a los metodos de tratamiento anteriores.
En otro aspecto, la presente descripcion proporciona un metodo de tratamiento de enfermedades hiperproliferativas no cancerosas caracterizado por hiperproliferacion celular (p. ej., un aumento anormal de velocidad o cantidad de proliferacion celular). En un aspecto, la enfermedad hiperproliferativa tratada de acuerdo con el presente metodo se selecciona del grupo que consiste en angiitis alergica y granulomatosis (enfermedad de Churg-Strauss), asbestosis, asma, gastritis atrofica, hiperplasia prostatica benigna, penfigoide bulloso, enfermedad celiaca, bronquitis cronica y enfermedad respiratoria obstructiva cronica, sinusitis cronica, enfermedad de Crohn, neuropatias desmielinizantes, dermatomiositis, eczema incluyendo dermatitis atopica, enfermedades de la trompa de eustaquio, arteritis de celulas gigantes, rechado de injertos, neumonitis por hipersensibilidad, vasculitis por hipersensibilidad (purpura de Henoch-Schonlein), dermatitisirritante, anemia hemolitica inflamatoria, neutropenia inflamatoria, enfermedadinflamatoria intestinal, enfermedad de Kawasaki, esclerosis multiple, miocarditis, miositis, polipos nasales, enfermedades del conducto nasolacrimal, v asculitis neoplasica, p ancreatitis, penfigo vulgar, g lomerulonefritis primaria, pso riasis, enfermedad periodontal, enf ermedad renal pol iquistica, poliarteritis nodosa, sindrome de so lapamiento de la poliangitis, colangitis esclerosante primaria, a rtritis reumatoide, enfermedad de l suero, adherencias quirurgicas, estenosis o r estenosis, escleritis, esclerodermia, estenosis de l os conductos biliares, estenosis (de duodeno, intestino delgado, y colon), silicosis y otras formas de neumoconiosis,diabetes detipo I, colitis ulcerosa, proctitis ulcerosa, vasculitis asociada con trastornos del tejido conectivo, vasculitis asociada con deficiencias congenitas del sistema del complemento, vasculitis del sistema nervioso central, y granulomatosis de Wegener.
En algunos aspectos de ladescripcion, un compuesto de la presente invencion se administra para tratar una enfermedad h iperproliferativa se leccionada d el grupo que co nsiste en psoriasis, esclerosis multiple, artritis reumatoide, restenosis, e hiperplasia prostatica benigna. En un aspecto, la enfermedad hiperproliferativa tratada es la psoriasis, una enfermedad caracterizada por la hiperproliferacion celular de queratinocitos que crecen sobre la piel para formar lesiones escamosas, elevadas. En otro aspecto, la enfermedad hiperproliferativa tratada es la esclerosis multiple, una enfermedad caracterizada por desmielinizacion progresiva en el cerebro. En otro aspecto, la enfermedad hiperproliferativa t ratada es la artritis reumatoide, una e nfermedad inflamatoria r ecurrente, cr onica, multisistemica que puede conducir a la destruccion y anquilosis de las articulaciones afectadas. En otro aspecto, los compuestos de la presente invencion se administran para prevenir una enfermedad hiperproliferativa resultante de la proliferacion celular en una protesis implantada en un sujeto recubriendo la protesis con una composicion que contiene un compuesto de la presenteinvencion. En otro aspecto, la enfermedad hiperproliferativatratada es la hiperplasia prostatica benigna, una enfermedad en la que las celulas epiteliales de la prostata crecen anormalmente y de ese modo bloquean el flujo urinario.
Formulaciones, modos de administración, dosificaciones
Un profarmaco alquilante de fosforamidato se formulara tipicamente en forma de formulaciones farmaceuticas para su a dministracion a un su jeto. En est a seccion se d escriben l os modos de administracion, formulaciones, y dosificaciones que se pueden utilizar cuando se tratan canceres utilizando un profarmaco alquilante de fosforamidato descrito en la presente memoria.
La administracion de un profarmaco alquilante de fosforamidato para el tratamiento del cancer se puede efectuar por medio de cualquier metodo que posibilite la liberacion de los profarmacos en el sitio de accion, la region hipoxica de un tumor. Muchos farmacos contra el cancer se administran mediante inyeccion intravenosa, y un profarmaco alquilante de fosforamidato se puede formular para tal administracion, incluyendo no solo formulaciones listas para su i nyeccion s ino tambien formulaciones liofilizadas o co ncentradas que se debe n rehidratar o di luir, respectivamente, antes de su inyeccion. Ademas de estas formulaciones, un profarmaco alquilante de fosforamidato se puede formular para su administracion por medio de las rutas orales, rutas intraduodenales, inyeccion parenteral (incluyendo intravenosa, subcutanea, intramuscular, intravascular o infusion), topicas, y rutas rectales. Los expertos en la tecnica advertiran que un profarmaco alquilante de fosforamidato puede ser activado por bacterias en el intestino. Si no se desea tal activacion, el medico puede emplear una ruta de administracion o una formulacion que de como resultado la absorcion de un profarmaco alquilante de fosforamidato antes de que entre en el intestino grueso o el colon. La ruta de administracion efectiva y la formulacion correspondiente del profarmaco alquilante de fosforamidato dependera del tipo de cancer que este siendo tratado, el profarmaco alquilante de fosforamidato seleccionado para su administracion, la gravedad del cancer, y la edad, el peso, y el estado del paciente, entre otros factores.
La cantidad administrada de un profarmaco alquilante de fosforamidato, y por tanto la cantidad del profarmaco alquilante de fosforamidato contenido en la dosis administrada y el producto que comprende esa dosis, dependera del sujeto que este siendo tratado, la gravedad del cancer, localizacion del cancer, la tasa de administracion, la disposicion del profarmaco (p. ej., peso molecular, solubilidad y citotoxicidad hipoxica y normoxica), el agente citotoxico liberado por un profarmaco alquilante de fosforamidato, y la consideracion del medico a cargo.
En un aspecto, la presente descripcion proporciona un metodo de tratamiento del cancer en un paciente donde una dosificacion eficaz se encuentra tipicamente en el intervalo de alrededor de 0,001 a alrededor de 0,1 g por kg de peso corporal, o de alrededor de 0,1 a alrededor de 35 mg/kg/dia en una sola dosis o en dosis divididas. Para un ser humano de 70 kg, esta ascenderia de alrededor de 0,05 a alrededor de 7 g/dia, de alrededor de 0,2 a alrededor de
5 2,5 g/dia. En algunoscasos,pueden sermas adecuados niveles de dosificacion por debajo del limite inferior del intervalo anteriormente mencionado, mientras que en otros casos se pueden emplear dosis aun mayores sin causar ningun efecto secundario nocivo; las dosis mayores se pueden dividir tambien en varias dosis mas pequenas para su adm inistracion a l o l argo del dia mediante infusion durante u na hora o c ontinuamente utilizando c ateteres centrales de insercion periferica (linea PICC) y bolsas y bombas intravenosas portatiles.
10 En un aspecto, la dosis eficaz de un compuesto de la presenteinvencion para el tratamiento del cancer y otras enfermedades hiperproliferativas se encuentra en el intervalo de alrededor de 0,1 a alrededor de 35 mg/kg/dia; de alrededor de 0,5 a alrededor de 20 mg/kg/dia; de alrededor de 0,5 a alrededor de 15 mg/kg/dia; de alrededor de 0,5 a alrededor de 10 mg/kg/dia; de alrededor de 0,5 a alrededor de 8 mg/kg/dia; y de alrededor de 1 a alrededor de 5
15 mg/kg/dia en una sola dosis o en d osis divididas. En un aspecto, la dosis eficaz de un compuesto de la presente invencion para el tratamiento del cancer y otras enfermedades hiperproliferativas seencuentra en el intervalo de alrededor de 2a alrededor de 8 mg/kg/dia; de alrededor de 2 a alrededor de 4 mg/kg/dia; y de alrededor de 2 mg/kg/dia en una sola dosis o en d osis divididas. En un aspecto, la dosis eficaz de un compuesto de la presente invencion para el tratamiento del cancer y otras enfermedades hiperproliferativas seencuentra en el intervalo de
20 alrededor de 0,25 a alrededor de 2,5 mg/kg/dia; de alrededor de 0,25 a alrededor de 1 mg/kg/dia; y de alrededor de 0,25 a alrededor de 0,5 mg/kg/dia en una sola dosis o en dosis divididas. En un aspecto, la dosis se administra i.v. diariamente, o bien como monoterapia (compuesto de la presente invencion solo) o junto (combinada) con terapias asistenciales convencionales.En un aspecto, la dosis eficazpara el tratamiento del cancery otras enfermedades hiperproliferativas se encuentra en el intervalo descrito antes administrada una vez a la semana.
25 En un aspecto, se administra una dosis mayor intermitentemente (menos frecuentemente); una dosis en el intervalo de alrededor de 3 a alrededor de 20 mg/kg; de alrededor de 6 a alrededor de 10 mg/kg; o 8 mg/kg una vez cada tres dias durante dos semanas. En otro aspecto, se administra una dosis en el intervalo de alrededor de 5 a alrededor de 30 mg/kg; de alrededor de 10 a alrededor de 15 mg/kg; o 12,5 mg/kg del profarmaco alquilante de fosforamidato una
30 vez a la semana durante cuatro semanas. En un aspecto, se administra una dosis en el intervalo de alrededor de 0,5 a alrededor de 8 mg/kg/dia durante 5 dias a lo largo de ciclos de dos semanas.
En otro aspecto, para el tratamiento de pacientes humanos, la dosis diaria maxima de un profarmaco alquilante de fosforamidato no es superior a 500 m g/kg de peso de l paci ente y, por l o t anto, un pr ofarmaco alquilante de
35 fosforamidato se administra a una dosis diaria en el intervalo de alrededor de 1 mg de un profarmaco alquilante de fosforamidato/kg de peso del paciente a alrededor de 500 mg de un profarmaco alquilante de fosforamidato/kg de peso del paciente. En un aspecto,un profarmacoalquilante de fosforamidato se administra a una dosisdiaria en el intervalo de alrededor de 5 mg/kg a alrededor de 500 mg/kg de peso corporal del paciente que se vaya a tratar. En otro aspecto, la dosis terapeuticamente eficaz de un profarmaco alquilante de fosforamidato es de alrededor de 10
40 mg/kg a alrededor de 250 mg/kg de peso corporal del paciente que se vaya a tratar. En otro aspecto, la dosis terapeuticamente eficaz de un profarmaco alquilante de fosforamidato es de alrededor de 25 mg/kg a alrededor de 150 mg/kg de peso corporal del paciente que se vaya a tratar. En otro aspecto, la dosis terapeuticamente eficaz de un profarmaco alquilante de fosforamidato es de alrededor de 25 mg/kg a alrededor de 50 mg/kg de peso corporal del paciente que se vaya a tratar. En otro aspecto, la dosis terapeuticamente eficaz de un profarmaco alquilante de
45 fosforamidato es de alrededor de 1,25 mg/kg a alrededor de 12,5 mg/kg de peso corporal del paciente que se vaya a tratar.
Tambien se pueden proporcionar las pautas concernientes a la administracion por medio y a partir de estudios en seres humanos y otros animales mamiferos. La dosis terapeuticamente eficaz determinada para un animal se puede
50 convertir en la dosis correspondiente en seres humanos (HED) como se describe en la tabla de mas abajo:
Animal
Factor de conversion de la Dosis Equivalente en Seres Humanos (HED)a
Raton
12,3
Hamster
7,4
Rata
6,2
Huron
5,3
Cobaya
4,6
Microcerdo
1,4
Animal
Factor de conversion de la Dosis Equivalente en Seres Humanos (HED)a
Minicerdo
1,1
Conejo
3,1
Perro
1,8
Monosb
3,1
Titi
6,2
Mono ardilla
5,3
Babuino
1,8
aPara convertir la dosis para animal en mg/kg en HED (se supone un ser humano de 60 kg) en mg/kg, dividir la dosis para animal por el factor de conversion de HED. Para especies no enumeradas o para p esos fuera d e l os intervalos convencionales, la dosi s equivalente en humanos (HED) se puede calcular a par tir de l a formula: HED = dosis para animal en mg/kg x (peso del animal en kg/peso del ser humano en kg)0,33. b Por ejemplo, cinomolgus, rhesus, o cola de munon.
Para l ograr la ef icacia terapeutica, la dosis diaria terapeuticamente eficaz de u n pr ofarmaco alquilante de fosforamidato se administra usualmente multiples veces al paciente. En una realizacion, se administra diariamente un pr ofarmaco alquilante de f osforamidato durante u n p eriodo d e t iempo. Tipicamente, s e empleara un a 5 administracion diaria durante al menos 3 dias consecutivos. En realizaciones relacionadas, la administracion es durante al m enos 5 dias consecutivos, al m enos 7 dias consecutivos, o al m enos 10 dias consecutivos. Dependiendo de la dosis, la formulacion, y la ruta de administracion seleccionada por el medico y la conveniencia del paciente, la dosis diaria completa se puede administrar una vez al dia, o la dosis diaria se puede administrar en dosis mas pequenas multiples en el curso de un dia (incluyendo mediante infusion con una bomba o administracion
10 intravenosa). Por ejemplo, la dosis se puede dividir en dosis mas pequenas y administrarla dos veces al dia, o dividir en tres dosis mas pequenas y administrarla tres veces al dia. Resultara evidente para un experto en la tecnica del tratamiento delcancer que, segun se utiliza en la presente memoria, administracion UdiariaU no estalimitada a una administracion por dia sino que puede incluir administraciones multiples.
15 Tambien se pueden utilizar programas de administraciondistintos de la administracion en dias consecutivos. Es particularmente conveniente la administracion en dias alternos (qod), y puede ser apropiada en algunos casos la administracion una vez cada tres dias, o una vez a la semana, pero en cualquier caso, un profarmaco alquilante de fosforamidato se administra repetidamente a lo largo de un periodo de tiempo. Por ejemplo, ya sea administracion diaria (incluyendo, segun se observe, una dosis diaria dividida), en dias alternos, o menos frecuentemente, en una
20 realizacion un profarmaco alquilante de fosforamidato se administra al menos 2 dias por semana durante al menos dos, tres, cuatro, cinco o al menos seis semanas consecutivas, o, alternativamente, durante al menos dos, tres, cuatro, cinco o al menos seis semanas en un per iodo de se is meses, o, alternativamente, durante al menos dos, tres, cuatro, cinco o al menos seis semanas en un periodo de doce meses. En un aspecto, un profarmaco alquilante de fosforamidato se administra al menos 3 dias por semana durante al menos dos, tres, cuatro, cinco o al menos
25 seis semanas consecutivas, o, alternativamente, durante al menos dos, tres, cuatro, cinco o al menos seis semanas en un periodo de seis meses, o, alternativamente, durante al menos dos, tres, cuatro, cinco o al menos seis semanas en un periodo de doce meses. En un aspecto un profarmaco alquilante de fosforamidato se administra al menos 10 dias al mes, opcionalmente al menos 20 dias al mes, durante al menos un mes o al menos dos, tres, cuatro, cinco o al menos seis meses consecutivos, o, alternativamente, al menos un, dos, tres, cuatro, cinco o al
30 menos seis meses en un periodo de seis meses.
En un aspecto,la administracion de la dosis terapeuticamente eficazcontinua durantemultiplesdias, tipicamente durante al menos tres dias consecutivos, y con frecuencia durante al menos cinco a diez dias consecutivos, o durante una semana, o varias semanas o mas. De este modo, se puede administrar a un paciente un profarmaco
35 alquilante de fosforamidato de acuerdo con los presentes metodos durante varios dias, una semana, un mes, dos meses, tres meses, seis meses, o un ano o mas.
Coincidiendo con los regimenes de administracion de otros agentes anticancerosos, un profarmaco alquilante de fosforamidato se puede administrar en multiple UtandasU de administracion. Por ejemplo, en algunas realizaciones, 40 un profarmaco alquilante de fosforamidato se puede administrar una vez al dia durante al menos tres a diez, o al menos cinco a diez dias consecutivos, y tales tres a diez o cinco a diez dias de tratamiento se pueden repetir una
vez, dos veces, o tres o mas veces, a veces con un periodo sin tratamiento (con un profarmaco alquilante de fosforamidato) que oscila de una a varias semanas entre cada tratamiento de varios dias. De un modo similar, en algunos aspectos, un profarmaco alquilante de fosforamidato se administra en dias alternos durante dos a diez administraciones, mas a menudo de tres a diez administraciones, o cinco a diez administraciones, y tales dos, tres o cinco adiezadministracionesqodse pueden repetir una vez,dos veces, o tres o mas veces con un periodosin tratamiento (con un profarmaco alquilante de fosforamidato) que oscila de una a varias semanas entre cada tratamiento de varios dias. Otros programas de tandas multiples de administracion resultaran evidentes para el medico experto guiado por esta descripcion.
En u n as pecto, U administrar una dosis o regimen terapeuticamente eficaz de un pr ofarmaco alquilante d e fosforamidatoU hace referencia a (i) administrar un profarmaco alquilante de fosforamidato en los intervalos establecidos (p. ej ., 1 m g a 1 g de un profarmaco alquilante de f osforamidato p or kg de pes o de l pac iente, tipicamente de 25 a 150 mg de un profarmaco alquilante de fosforamidato por kg de peso del paciente) durante un numero de dias minimo especificado en un periodo de tiempo especificado, donde la administracion de un profarmaco alquilante de fosforamidato tiene un efecto terapeutico sobre el cancer en el paciente. Los regimenes de dosificacion eficaces terapeuticamente ilustrativos para un profarmaco alquilante de fosforamidato incluyen los descritos en la presente memoria, tal como la administracion de un profarmaco alquilante de fosforamidato durante 3 dias consecutivos, 5 dias consecutivos, 7 dias consecutivos, 10 dias consecutivos, al menos 3 dias por semana, al menos 3 dias por semana durante un mes, al menos 10 dias al mes, y al menos 20 dias al mes.
Al optimizar un regimen tratamiento con un profarmaco alquilante de fosforamidato de acuerdo con la presente invencion, la dosis y frecuencia de administracion de un profarmaco alquilante de fosforamidato se puede seleccionar para lograr un area sostenida maxima bajo la curva de concentracion de plasma (AUC) en el curso del tratamiento. Elregimen de dosificacion teoricamente optimo dara como resultado una exposicion maxima de las celulas tumorales a un profarmaco alquilante de fosforamidato, segun se mide por medio de la AUC, a la vez que se minimiza la concentracion m axima en plasma ( Cmax) para cu alquier administracion i ndividual. Una C max mayor contribuira a la toxicidad mientras que la AUC determinara la eficacia. Segun se entiende en la tecnica para otros farmacos terapeuticos para el cancer, el tratamiento co n u n pr ofarmaco a lquilante de f osforamidato se p uede suspender temporalmente si se observa toxicidad, o por conveniencia para el paciente, sin apartarse del alcance de la invencion, y se reanuda a continuacion.
En un aspecto, la farmacocinetica del profarmaco alquilante de fosforamidato de la presente invencion empleado para el tratamiento del cancer puede determinar la dosis, el metodo de administracion, y la clase de cancer que se trata con el profarmaco alquilante de fosforamidato. En un aspecto, el profarmaco alquilante de fosforamidato de la presente invencion puede tener una vida media in vivo de entre 1 y 300 minutos. En un aspecto, los compuestos de la presente invencion puede tener una vida media in vivo de entre 3 y 10 minutos. En un aspecto, los compuestos de la presente invencion puedetener una vida media in vivo de entre 10 y 30 minutos. Una vida media corta del profarmaco alquilante de fosforamidato puede requerir un tiempo de infusion en tratamiento que es mayor que el requerido para un profarmaco alquilante de fosforamidato que tiene una vida media mas larga. Una vida media corta del profarmaco alquilante de fosforamidato puede aumentar la dosis tolerada maxima (DTM) para ese profarmaco.
En otro aspecto, la presente descripcion proporciona profarmacos alquilantes de fosforamidato que permanecen sin cambios en 20% cuando se incuban con proteina microsomal de higado de r aton durante 30 minutos. En otro aspecto, la presente invencion proporciona profarmacos alquilantes de fosforamidato que permanecen sin cambios en 20-80% cuando se incuban con proteina microsomal de higado de raton durante 30 minutos. En otro aspecto, la presente invencion proporciona profarmacos alquilantes de fosforamidato que permanecen sin cambios en mas de 80% cuando se incuban con proteina microsomal de higado de raton (MLM) durante 30 minutos. En otro aspecto, los ejemplos de los profarmacos alquilantes de fosforamidato de la presente invencion que cuando se incuban con proteina microsomal de higado de raton 30 minutos permanecen sin cambios en mas de 80% incluyen 1, 25, y 36. A mayor estabilidad en MLM de un profarmaco de la invencion, menores seran su dosis terapeuticamente eficaz y los efectos secundarios no deseados para el paciente.
En un aspectorelacionado, el grupo biorreductor de los profarmacos alquilantes de fosforamidato de la presente invenciondespues de la reduccion/activacion en una zona hipoxica del tumor forma un producto conjugado de alquilante de fosforamidato-TM. El producto conjugado de alquilante de fosforamidato-TM puede difundirse y alcanzar otras partes del tumor o de otros tumores en el caso de una enfermedad metastasica. Diversos parametros farmacocineticos tales como el volumen de distribucion en estado estacionario (Vss), el aclaramiento (CL), el area bajo la curva (AUC), la estabilidad microsomal en higado de raton (estabilidad MLM), la estabilidad en plasma, y la Cmax de los profarmacos alquilantes de fosforamidato de l a presente invencion se midieron y enumeraron en la seccion EJEMPLOS (vease tambien Hardman et al., supra).
En los regimenes de re-tratamiento, la dosis se puede ajustar para reflejar la tolerancia del paciente al tratamiento anterior. En cualquier caso, puesto que se observa toxicidad durante la administracion repetida, la dosificacion se puede detener temporalmente a medida que se observen sintomas graves. El periodo de interrupcion temporal de la
administracion (vacaciones del medicamento) puede finalizar en el momento en el que el primer organo de toxicidad ya no c ontiene concentraciones significativas de un pr ofarmaco alquilante de f osforamidato o un alquilante d e fosforamidato liberado alli (que se puede medir o determinar indirectamente mediante el cese de los sintomas). Por lo tanto, se puede definir un periodo de dosificacion intermitente no solo por los dias especificos sino individualizado por las vacaciones de medicamento que estan basados en los sintomas y el aclaramiento normal en el organo de un profarmaco alquilante de fosforamidato o un alquilante de fosforamidato liberado alli.
Una formulacion de un profarmaco alquilante de fosforamidato puede estar, por ejemplo, en una formaadecuada para su administracionoral en forma decomprimido, capsula, pildora,polvo, formulacion de liberacion sostenida, solucion, y suspension; para su inyeccion parenteral en forma de una solucion, suspension o emulsion esteril; para su administracion topica en forma de un a pom ada o cre ma; y para su administracion r ectal en f orma de un supositorio. Una formulacion de un profarmaco alquilante de fosforamidato puede estar en formas de dosificacion unitaria adecuadas para la administracion individual de dosificaciones precisas e incluira tipicamente un portador o excipiente farmaceutico convencional.
Los portadores farmaceuticos adecuados incluyen diluyentes o cargas inertes, ag ua y diversos di solventes organicos. Las composiciones farmaceuticas pueden contener, si se desea, ingredientes adicionales tales como aromas, aglutinantes, e xcipientes, y si milares. D e este m odo para s u administracion oral, se p ueden emplear comprimidos que contienen diversos excipientes, tales como acido citrico junto con diversos disgregantes, tales como almidon, acido alginico, y ciertos silicatos complejos, y con agentes aglutinantes tales como sacarosa, gelatina y acacia. Adicionalmente, se pueden utilizar agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, laurilsulfato de sodio, y t alco para pr eparar l as f ormas en c omprimido de las formulaciones de un pr ofarmaco alquilante d e fosforamidato descritas en la presente memoria. Se pueden emplear composiciones solidas de un tipo similar en capsulas de gelatina dura y blanda cargadas. Las sustancias preferidas, por lo tanto, incluyen lactosa o galactosa y polietilenglicoles de alto peso molecular. Cuando se desean suspensiones acuosas o elixires para su administracion oral, el profarmaco se puede combinar con diversos agentes edulcorantes o aromatizantes, materias colorantes o tintes y, si se desea, agentes emulsionantes o agentes suspensores, junto con diluyentes tales como agua, etanol, propilenglicol, glicerina, o combinaciones de los mismos.
Las formas de administracion parenteral ilustrativas incluyen soluciones o suspensiones de un profarmaco alquilante de fosforamidato en soluciones acuosas esteriles, por ejemplo, polietilenglicoles acuosos, propilenglicol o soluciones de dextrosa. Tales formas de dosificacion se pueden tamponar adecuadamente, si se desea.
Los metodos para preparar diversas composiciones farmaceuticas con una cantidad especifica de farmaco activo son conocidos, o resultaran evidentes, para los expertos en esta tecnica a la vista de esta descripcion. Por ejemplo, vease Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17a Edicion (1984).
Los metodos de tratamiento del cancer que emplean un profarmaco alquilante de fosforamidato de la presente descripcion son eficaces para destruir las celulas cancerosas mas dificiles de eliminar que crecen en la region hipoxica de un tumor. Una vez liberado en la region hipoxica un profarmaco de fosforamidato puede difundirse desde las celulas hipoxicas y destruir las celulas cancerosas en regiones adyacentes que contienen poblaciones crecientes de celulas que se dividen rapidamente. La region hipoxica actua como una fabrica de farmaco para producir en el interior de un tumor un alquilante para destruir las celulas cancerosas normoxicas adyacentes conduciendo a una mayor concentracion del alquilante de fosforamidato dentro del tumor, con respecto a los tejidos normales. El uso del profarmaco para generar el alquilante de fosforamidato dentro del tumor puede reducir los efectos secundarios toxicos que aparecen debido a la toxicidad celular normal. Despues de destruir las celulas cancerosas en la region normoxica del tumor, una region hipoxica se puede volver normoxica y comenzar a dividirse. En este momento, tales celulas pueden ser destruidas por los alquilantes de fosforamidato generados a partir de un profarmaco alquilante de fosforamidato de esta invencion o los conocidos, o por otros agentes anticancerosos o citotoxinas administrados combinados con el profarmaco alquilante de fosforamidato, como se describe en la seccion siguiente.
Terapias combinadas
De acuerdo con los metodos de la descripcion, un profarmaco alquilante de fosforamidato se puede administrar simultaneamente combinado con otros agentes anticancerosos. Sin pretender estar ligado a ningun mecanismo o efecto concreto, tal administracion simultanea puede proporcionar en algunos casos una o mas de varias ventajas sobre otras terapias contra el cancer conocidas, tal como, por ejemplo que la administracion simultanea deun profarmacoalquilante de fosforamidato yelagente anticanceroso tiene un efecto sinergico sobre la induccion de la muerte de las celulas cancerosas. La administracion simultanea proporciona un mejor resultado terapeutico que la administracion del agente anticanceroso solo, p. ej., mayor alivio o mejora de uno o mas sintomas del cancer, disminucion del grado de enfermedad, retraso o ralentizacion del progreso de la enfermedad, mejora, paliacion o estabilizaciondel estado deenfermedad, remision parcial o completa, supervivencia prolongada u otros resultados terapeuticos beneficiosos.
La administracion simultanea de un profarmaco alquilante de fosforamidato aumentala sensibilidad de celulas cancerosas al agente anticanceroso, permitiendo dosis menores del agente anticanceroso que se vaya a administrar al paciente o permitiendo el uso de un agente anticanceroso para el tratamiento de celulas resistentes por lo demas al agente anticanceroso o refractarias por lo demas al tratamiento. Mientras que los agentes anticancerosos
5 conocidos en general se dirigen a las celulas que se dividen rapidamente en la region normoxica, los profarmacos alquilantes de fosforamidato de la invencion se dirigen a las celulas hipoxicas en las regiones de tumores que no son destruidas eficazmente por el agente anticanceroso solo.
Segun se utiliza en la presente memoria, un profarmaco alquilante de fosforamidato se Uadministra simultaneamenteU
10 con otro agente anticanceroso(tambienreferidoen lapresentememoria como, UAgenteU) cuando un profarmaco alquilante de fosforamidato y el Agente se administran como parte del mismo curso de terapia. En un aspecto, se administra en primer lugar un profarmaco alquilante de fosforamidato antes de la administracion del Agente, (es decir, el comienzo de la otra terapia contra el cancer), y se continua el tratamiento con un profarmaco alquilante de fosforamidato a lo largo del curso de administracion delAgente (es decir, el cursode la otraterapia). En otro
15 aspecto,se administra un profarmacoalquilante de fosforamidato despues del comienzo o finalizacion de la otra terapia contra el cancer. En otros aspectos, un profarmaco alquilante de fosforamidato se administra en primer lugar simultaneamente al inicio de la otra terapia contra el cancer. Veanse por ejemplo las terapias combinadas descritas en la seccion EJEMPLOS.
20 En un aspecto, se administra en primer lugar un profarmaco alquilante de fosforamidato antes de la administracion del Agente, y se continua el tratamiento con un profarmaco alquilante de fosforamidato despues del cese de l a administracion del Agente. En un aspecto, se administra en primer lugar un profarmaco alquilante de fosforamidato antes de la administracion del Agente, y se continua el tratamiento con un profarmaco alquilante de fosforamidato durante parte del periodo de administracion del Agente. Para ciertos farmacos, tales como ciertos inhibidores de
25 topoisomerasa, se puede iniciar la administracion de un profarmaco alquilante de fosforamidato y completar antes de la administracion del segundo farmaco.
En presencia de oxigeno, el anion radicalformado despues de la reduccion de Z 3 reacciona con oxigeno para producir superoxido y Z3. Superoxido es una citotoxina y la produccion de superoxido en tejidos normoxicos puede 30 conducir a efectos secundarios no deseados.En un aspecto,la presente descripcionproporciona un profarmaco alquilante de fosforamidato administrado combinado con un agente quimioprotector o protector quimico. Los agentes quimioprotectores protegen el tejido sano de los efectos toxicos de los farmacos anticancerosos. En un aspecto, el agente quimioprotector es un tiol o un disulfuro. En un aspecto, el protector quimico puede reducir superoxidos. En otro aspecto, el protector quimico puede reaccionar con el Ureceptor de MichaelU generado a partir de un profarmaco
35 alquilante de fosforamidato y evitar que el Ureceptor de MichaelU reaccione con proteinas y acidos nucleicos (vease mas abajo).
40 La terapia con f armacos anticancerosos implica en l a act ualidad t ipicamente rondas, o U ciclosU multiples de administracion delagente o los agentes anticancerosos.En elcontexto delaadministracion de un profarmaco alquilante de f osforamidato, cada ci clo de a dministracion ( asi c omo una se rie completa de ciclos) se p uede considerar como la administracion de un segundo farmaco. Un profarmaco alquilante de fosforamidato se puede administrar en cualquiera o en t odos los multiples ciclos de t ratamiento co n el o tro Agente; en g eneral, un
45 profarmaco alquilante de fosforamidato se administra en una base diaria durante al menos dos o mas dias durante cada ci clo. En un asp ecto de la descr ipcion, un pr ofarmaco a lquilante d e f osforamidato se adm inistra simultaneamente con el Agente de acuerdo con un programa repetido en cada ronda.
En una version del metodo para el tratamiento del cancer utilizando el profarmaco alquilante de fosforamidato, un
50 profarmacoalquilante de fosforamidato se administra combinado con una cantidadeficaz deunoomasagentes quimioterapeuticos, una ca ntidad ef icaz de r adioterapia, un procedimiento de ci rugia apropiado, o cualquier combinacion de tales terapias adicionales.
Cuando un profarmaco alquilante de fosforamidato se utiliza combinado con una o mas de las terapias adicionales, 55 un profarmaco alquilante de fosforamidato y la terapia adicional se pueden administrar al mismo tiempo o se pueden
administrar separadamente. Por ejemplo, si un profarmaco alquilante de fosforamidato se administra con un agente quimioterapeutico adicional, los dos agentes se pu eden administrar simultaneamente o se p ueden adm inistrar sucesivamente con algun t iempo ent re administraciones. Un experto en l a t ecnica concebira metodos d e administracion de los agentes simultaneamente y sucesivamente y los posibles periodos de t iempo entre administraciones. Veanse por ejemplo las terapias combinadas descritas en la seccion EJEMPLOS.
Los Agentes se pueden administrar en forma de la misma formulacion o de formulaciones diferentes y se pueden administrar a traves de la misma ruta o de diferentes rutas.
Los agentes quimioterapeuticos que se pueden utilizar combinados con el profarmaco alquilante de fosforamidato de la invencion incluyen, pero no estan limitados a, busulfan, improsulfan, piposulfan, benzodepa, carbocuona, 2 desoxi-D-glucosa, lonidamina y analogos de los mismos, glufosfamida, gemcitibina, erlotinib, meturedepa, uredepa, altretamina, imatinib, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida, trimetilolomelamina, clorambucil, clomafazina, estramustina, ifosfamida, gefitinib, mecloretamina, hidrocloruro de oxido de mecloretamina, melfalan, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo, carmustina, clorozotocina, fotemustina, nimustina, ranimustina, dacarbazina, m anomustina, mitobronitol, m itolactol, pi pobroman, a clacinomicinas, actinomicina F(1), antramicina, azaserina, bleomicina, cactinomicina, carrubicina, carzinofilina, cromomicina, dactinomicina, daun orrubicina, da unomicina, 6 -diazo-5-oxo-1-norleucina, acido micofenolico, n ogalamicina, olivomicina, p eplomicina, p licamicina, por firomicina, pur omicina, estreptonigrina, estreptozocina, t ubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina, denopterina, pteropterina, trimetrexato, fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina, an citabina, aza citidina, 6-azauridina, carmofur, ci tarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-fluorouracilo, t egafur, L -asparraginasa, p ulmozima, ace glatona, g licosido de aldofosfamida, acido aminolevulinico, amsacrina, bestrabucilo, bisantreno, carboplatino, defofamida, demecolcina, diazicuona, elfornitina, acetato de eliptinio, etoglucido, flutamida, nitrato de galio, hidroxiurea, interferon-alfa, interferon-beta, interferongamma, i nterleuquina-2, l entinano, mitoguazona, mitoxantrona, mopidamol, nitracrina, pentostatina, fenamet, pirarrubicina, acido podofilinico, 2 -etilhidrazida, pr ocarbazina, r azoxano, si zofirano, espirogermanio, pac litaxel, tamoxifeno, er lotonib, t eniposido, acido tenuazonico, t riazicuona, 2, 2',2U-triclorotrietilamina, uretano, vi nblastina, ciclofosfamida, y vincristina. Otros agentes quimioterapeuticos que se pueden utilizar incluyen derivados de platino, incluyendo pero no limitado a cisplatino, carboplatino, y oxoplatino.
En una version, un pr ofarmaco al quilante de f osforamidato descr ito en l a pr esente m emoria se pued e ut ilizar combinado con un inhibidor de la antiangiogenesis incluyendo pero no limitado a Avastina y agentes terapeuticos similares. En una version de los metodos de t ratamiento co mbinados, un su jeto se t rata con un inhibidor antiangiogenesis y con posterioridad se trata con un profarmaco alquilante de fosforamidato. En una version de los metodos de tratamiento combinados, un sujeto se trata con un inhibidor antiangiogenesis y con posterioridad se trata con un profarmaco alquilante de fosforamidato con otro agente quimioterapeutico, incluyendo pero no limitado a Cisplatino, y carboplatino. En una version de estos metodos de tratamiento combinados que utilizan uninhibidor antiangiogenesis, el metodo se utiliza para tratar el cancer de mama.
En otro aspecto, un profarmaco alquilante de fosforamidato se administra con un agente anticanceroso que actua, directamente o indirectamente, para inhibir el factor de crecimiento epidermico o receptor EGFR. Los inhibidores de EGFR adecuados para su administracion simultanea con un profarmaco alquilante de fosforamidato de la invencion incluyen gefitinib y erlotonib.
En otra version, un profarmaco alquilante de fosforamidato se administra con un agente anticanceroso que actua, directamente o indirectamente, para inhibir el factor 1 alfa inducible por hipoxia (HIF1a) o para inhibir una proteina o enzima, tal como el transportador de glucosa o VEGF, cuya expresion o actividad aumenta despues de aumentar los niveles de HIP1a. Los inhibidores de HIF1a adecuados para su uso en esta version de los metodos y composiciones descritos en la presente memoria incluyen inhibidores de la quinasa P13; LY294002; rapamicina; inhibidores de la histona desacetilasa tales como [(E)-(1S,4S,10S,21R)-7-[(Z)-etiliden]-4,21-diisopropil-2-oxa-12,13-ditia-5,8,20,23tetraazabiciclo-[8,7,6]-tricos-16-eno-3,6,9,19,22-pentanona (FR901228, depsipeptido); inhibidores de la proteina de choque termico 90(Hsp90) tales como geldanamicina, 17-alilamino-geldanamicina (17-AAG), y otros analogos de geldanamicina, y radicicol y derivados de radicicol t ales co mo K F58333; ge nisteina; i ndanona; estaurosporina; inhibidores de proteina quinasa-1 (MEK-1) tales como PD98059 (2'-amino-3'-metoxiflavona); PN-12 (disulfuro de 1metilpropil-2-imidazolilo); pleurotina PN-478; 1,4-dioxidos de quinoxalina; butiratode sodio (NaB); nitroprusiato de sodio (SNP) y otros donadores de NO; inhibidores de microtubulos tales como novobiocina, panzem (2metoxiestradiol o 2-ME2), vincristinas, taxanos, epotilones, discodermolido, y derivados de cualquiera de los anteriores; cumarinas; barbituricos y analogos de acido tiobarbiturico; camptotecinas; e YC-1, un compuesto descrito en Biochem. Pharmacol., 15 de Abril de 2001, 61(8):947-954, y sus derivados.
En otra version, un profarmaco alquilante de fosforamidato se administra con un agente anti-angiogenico, incluyendo pero no limitado a agentes anti-angiogenicos seleccionados del grupo que consiste en angiostatina, un agente que inhibe o suscita antagonismo de otro modo sobre la accion de VEGF, batimastat, captopril, inhibidor derivado de cartilago, ge nisteina, end ostatina, i nterleuquina, l avendustina A, acetato de medroxiprogesterona, factor 4
plaquetario humano recombinante, Taxol, tecogalano, talidomida, trombospondina, TNP-470, y Avastina. Otros inhibidores de la angiogenesis utiles para los fines de las terapias combinadas proporcionadas por los presentes metodos y c omposiciones descritos en l a p resente m emoria i ncluyen inhibidores de Cox-2 como celecoxib (Celebrex), diclofenaco (Voltaren), etodolaco (Lodina), fenoprofeno (Nalfon), indometacina (Indocina), cetoprofeno (Orudis, Oruvail), cetoralac (Toradol), oxaprozina (Daypro), nabumetona (Relafeno), sulindac (Clinoril), tolmetina (Tolectin), rofecoxib (Vioxx), ibuprofeno (Advil), naproxeno (Aleve, Naprosina), aspirina, y acetaminofeno (Tilenol).
Ademas, puesto que el acido piruvico juega un importante papel en la angiogenesis, se pueden utilizar mimeticos de piruvato e inhibidores glicoliticos como los halopiruvatos, incluyendo bromopiruvato, combinados con un compuesto anti-angiogenico y un profarmaco alquilante de fosforamidato para tratar el cancer. En otra version, se administra un profarmaco alquilante de fosforamidato con un agente anti-angiogenico y otros agentes anticancerosos, incluyendo pero no l imitados a un agente ci totoxico se leccionado del gr upo qu e co nsiste en alquilantes, C isplatino, Carboplatino, e inhibidores del ensamblaje de microtubulos, para tratar el cancer.
Ademas de la combinacion de un profarmaco alquilante de fosforamidato con los Agentes descritos anteriormente, los presentes m etodos y co mposiciones descr itos en l a pr esente memoria proporcionan una variedad de combinaciones sinergicas de un profarmaco alquilante de fosforamidato y otros farmacos anticancerosos. Los expertos en la tecnica pueden determinar facilmente los farmacos anticancerosos que actuan UsinergicamenteU con un profarmaco alquilante de fosforamidato como se ha descrito en la presente memoria. Por ejemplo, las referencias Vendetti, URelevance of Transplantable Animal-Tumor Systems to the Selection de New Agents for Clinical TrialU, Pharmacological Basis of Cancer Chemotherapy, Williams y Wilkins, Baltimore, 1975, y Simpson Herren et al., 1985, UEvaluation of In Vivo Tumor Models for Predicting Clinical Activity for Anticancer DrugsU, Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 26: 330 describen metodos para ayudar en la determinacion de si dos farmacos actuan sinergicamente.
Si bien no se requiere sinergia para el beneficio terapeutico de acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria, en un aspecto, la presente descripcion proporciona un metodo detratamiento delcancer, donde existe sinergiaentre un profarmaco alquilantede fosforamidatoy otro agente anticanceroso. Se puede decir que dos farmacos poseen sinergia terapeutica si un regimen de dosificacion combinado delosdos farmacos produce una destruccion de celulas tumorales significativamente mejor que la suma de los Agentes individuales a las dosis toleradas optimas o maximas. El Ugrado de sinergiaU se puede definir como el log neto de la destruccion de celulas tumorales por el regimen combinado optimo menos el log neto de la destruccion de celulas tumorales por la dosis optima de Agente individual mas activo. Diferencias de destruccion celular mayores de diez veces (un log) se consideran indicativas de forma concluyente de sinergia terapeutica.
Cuando un pr ofarmaco alquilante d e f osforamidato se utiliza con otro ag ente anticanceroso, un profarmaco alquilante de fosforamidato se administrara, al menos en algunas realizaciones, antes del comienzo de la terapia con el otro farmaco o farmacos y administracion continuara tipicamente a lo largo del curso de tratamiento con el otro farmaco o f armacos. En algunas realizaciones, el f armaco administrado si multaneamente con un pr ofarmaco alquilante de f osforamidato se l iberara a una d osis inferior, y opci onalmente durante per iodo d e t iempo m as prolongados, de lo que seria el caso en ausencia de administracion de un profarmaco alquilante de fosforamidato. Tales terapias de Udosis bajasU pueden implicar, por ejemplo, la administracion de un farmaco anti-canceroso, incluyendo pero no limitado a paclitaxel, docetaxel, doxorrubicina, cisplatino, o carboplatino, a una dosis inferior a la aprobada y durante un periodo de tiempo mas prolongado junto con un profarmacoalquilante de fosforamidato administrado de acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria.
Estos metodos se pueden utilizar para mejorar el resultado en el paciente durante las terapias llevadas a la practica en la actualidad destruyendo mas eficazmente las celulas cancerosas o deteniendo el crecimiento de la celulas cancerosas asi como disminuyendo los efectos secundarios no deseados de la otra terapia. Cuando se emplean combinados con un profarmaco alquilante de fosforamidato, el agente o los agentes anticancerosos adicionales se dosifican utilizando cualquiera de las dosificaciones convencionales empleadas para esos Agentes (es decir, cuando se utilizan sin un profarmaco alquilante de fosforamidato) o son menores que esas dosificaciones convencionales.
La administracion de un profarmaco alquilante de fosforamidato de acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria puede permitir al medico por lo tanto tratar el cancer con farmacos existentes (o aprobados mas tarde) a dosis menores (que las utilizadas en la actualidad), mejorando de este modo algunos o todos los efectos secundarios toxicos de tales farmacos.La dosificacion exacta para un paciente dado varia de pacientea paciente, dependiendo de numerosos factores incluyendo la combinacion de farmacos empleada, la enfermedad concreta que este siendo tratada, y el estado e historial medico previo del paciente, pero se puede determinar utilizando solo el conocimiento practico del experto normal en la tecnica en vista de las ensenanzas de la presente memoria.
Los regimenes de dosificacion especificos para los agentes quimioterapeuticos o antineoplasicos conocidos y aprobados (es decir, la dosis eficaz recomendada) son conocidos por los metodos y se proporcionan, por ejemplo, en l as descripciones de productos encontradas en The Physician's Desk Reference 2003, (Physicians' Desk Reference, 5 7a Ed) Me dical Eco nomics Company, I nc., O radell, N .J y/o son asequibles de la Federal D rug
Administration. Los regimenes de dosificacion i lustrativos para ci ertos farmacos anticancerosos tambien s e proporciona mas abajo.
Los farmacos contra el cancer se pueden clasificar generalmente como alquilantes, antraciclinas, antibioticos, inhibidores de aromatasa, bisfosfonatos, inhibidores de ciclo-oxigenasa, moduladores de receptores de estrogeno, antagonistas de folato, arseniatos inorganicos, inhibidores de microtubulos, modificadores, nitrosoureas, analogos de nucleosidos, i nhibidores de osteoclastos, co mpuestos que co ntienen platino, r etinoides, i nhibidores de topoisomerasa 1, inhibidores de topoisomerasa 2, e inhibidores tirosina quinasas. De acuerdo conlos metodos descritos en la presente memoria, un profarmaco alquilante de fosforamidato se puede administrar simultaneamente con cualquier farmaco anticanceroso de cualquiera de estas clases o se puede administrar antes o despues del tratamiento c on cualquiera de t ales farmacos o una combinacion d e tales farmacos. Ademas, un pr ofarmaco alquilante d e f osforamidato se pue de a dministrar combinado co n una t erapia biologica (p. ej ., t ratamiento co n interferones, i nterleuquinas, fa ctores esetimuladores de co lonias y anticuerpos monoclonales). Los agentes biologicos utilizados para el tratamiento del cancer son conocidos en la tecnica e incluyen, por ejemplo, trastuzumab (Herceptina), tositumomab e 131I-Tositumomab (Bexxar), rituximab (Rituxan).
Los alquilantes utiles en la practica de los metodos descritos en la presente memoria incluyen pero no estan limitados a busulfan (Mileran, Busulfex), clorambucilo (Leukeran), ifosfamida (con o sin MESNA), ciclofosfamida (Cytoxan, Neosar), glufosfamida, melfalan, L-PAM (Alkeran), dacarbazina (DTIC-Dome), y temozolamida (Temodar). De ac uerdo con los me todos d escritos en l a pr esente memoria un p rofarmaco alquilante d e f osforamidato se administra simultaneamente con un alquilante para tratar el cancer. En una version, el cancer es la leucemia mielogena cronica, el mieloma multiple, o el astrocitoma anaplasico.
En un aspecto, la presente descripcion proporciona un metodo para el tratamiento del cancer tratable mediante la administracion de un alquilante administrando los profarmacos alquilantes de fosforamidato de la presente invencion solos o combinados con al menos otro alquilante o un profarmaco del mismo. Alquilantes, tales como, por ejemplo, ciclofosfamida, ifosfamida, gl ufosfamida, m ecloretamina, melfalan, clorambucilo, dacarbazina, temozolomida, carmustina, estreptozocina, bendamustina, busulfan, tiotepa, cisplatino, carboplatino, y oxaliplatino, y los tipos del canceres tratados utilizando uno cu alquiera d e t ales alquilantes solos o combinados con otros agentes anticancerosos o quimioprotectores se describen por ejemplo en la referencia Hardman et al. (supra).
En un aspecto, la p resente descr ipcion proporciona un m etodo par a el t ratamiento del ca ncer mediante la administracion simultanea de un profarmaco alquilante de fosforamidato con al menos el alquilante Ciclofosfamida, en el tratamiento de linfomas malignos en Fases III y IV, mieloma multiple, leucemia, micosis fungoides, neuroblastoma, adenocarcinoma ovarico, retinoblastoma, y carcinomade mama. La Ciclofosfamidase administra para terapia de induccion a dosis de 1500-1800 mg/m2 que se administran intravenosamente en dosis divididas a lo largo de un periodo de tres a cinco dias; para la terapia de mantenimiento, se administran 350-550 mg/m2 cada 7-10 dias, o se administran intravenosamente 110-185 mg/m2 dos veces a la semana. De acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria, un profarmaco alquilante de fosforamidato se administra simultaneamente con ciclosfosfamida administrada a tal dosis o a una dosis inferior y/o durante mas tiempo que el normal para la administracion de Ciclofosfamida sola.
En un aspecto, la p resente descr ipcion proporciona un m etodo par a el t ratamiento del ca ncer mediante la administracion de un profarmaco alquilante de fosforamidato de la invencion junto con un regimen de tratamiento del cancer utilizando al menos el alquilante Mecloretamina. Por ejemplo, la Mecloretamina se utiliza en el regimen de quimioterapia combinada MOPP (mecloretamina, Oncovin (vincristina), procarbazina, y prednisona) en pacientes con enfermedad de Hodgkin y se administra por medio de administracion de embolada intravenosa en dosis de 6 mg/m2 los dias 1 y 8 de ciclos de 28 dias de cada curso de tratamiento.
En un aspecto, la pr esente descr ipcion proporciona un m etodo par a el t ratamiento del ca ncer mediante la administracion de un profarmacoalquilante de fosforamidato de la invencion con un regimen de tratamiento del cancer utilizando al menos el alquilante Ifosfamida. La Ifosfamida se utiliza para tratar sarcomas pediatricos y adultos, carcinomas de cervix y pulmon, y combinado con otros farmacos para el cancer testicular de celulas germinales. La Ifosfamida se utiliza como parte de los regimenes CIE (Ifosfamida, Carboplatino, y Etoposido) y RICE (Rituxan y CIE) para el tratamiento del linfomas (vease Hardman et al., supra).
En un aspecto, la pr esente descr ipcion proporciona un m etodo par a el t ratamiento del ca ncer mediante la administracion de un profarmacoalquilante de fosforamidato de la invencion con un regimen de tratamiento del cancer utilizando al menos el alquilante Glufosfamida. La Glufosfamida esta en uso clinico para el tratamiento del o del cancer de pancreas resistente a Gemzar. La Glufosfamida se puede utilizar para el tratamiento del cancer de mama, H odgkin Morbus, cancer de t racto gastrointestinal, o como par te del r egimen GCE ( Glufosfamida, Carboplatino, y Etoposido) o RGCE (Rituxan y GCE), para el tratamiento del linfomas. (Véase Tidmarsh et al., Solicitud de Patente PCTNum. PCT/US2005/047314 (WO 2006/071955) presentada el 22 de Diciembre de
2005; Solicitud de P at. PCT t itulada UGlufosfamide co mbination therapyU, documento WO 2006/ 122227; y Publicacion de Pat. PCT Num. WO 2005/076888).
En un aspecto, la pr esente descr ipcion proporciona un m etodo par a el t ratamiento del cancer m ediante la administracion de un profarmacoalquilante de fosforamidato de la invencion con un regimen de tratamiento del cancer utilizando al menos un alquilante seleccionado del grupo que consiste en etileniminas y metilmelaminas. En otro aspecto, la etilenimina es Trietilenmelamina o Tiotepa.
La Tiotepa se puede utilizar para tratar adenocarcinomas de mama, ovario, y vejiga, linfomas malignos, carcinomas broncogenicos, y tumor de Wilms. La Tiotepa se ut ilizo a una dosi s alta en la quimioterapia combinada con ciclofosfamida en pacientes con malignidades refractarias tratadas mediante trasplante de hueso autologo y para tratar a variedad del canceres incluyendo vejiga, ovario, mama, pulmon, cerebro, y linfomas (vease, International Agency for Research on Cancer Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risk of Chemicals to Humans, 1975,
9 : 286, Lyon, France; International Agency for Research on Cancer Monographs on the Evaluacion of Carcinogenic Risk of Chemicals to Humans,1990, 50 : 415, Lyon, France; y MEDLINE plus, 2003, DrugInformation: Thiotepa, National Library of Medicine). La metilmelamina Altretamina se utiliza para tratar el cancer de ovario avanzado despues del fracaso de las terapias de primera ronda.
En un aspecto, la pr esente descr ipcion proporciona un m etodo par a el t ratamiento del ca ncer mediante la administracion de un profarmacoalquilante de fosforamidato de la invencion con un regimen de tratamiento del cancer utilizando al menos el alquilante Melfalan, Clorambucilo, o Bendamustina. El Melfalan se utiliza para tratar el mieloma multiple y se puede administrar oralmente. El Clorambucilo se utiliza para tratar la leucemia linfocitica cronica y la macroglobulinemia primaria. La Bendamustina, desarrollada por Salmedix Inc. se puede utilizar para tratar malignidades hematologicas, tales como, por ejemplo, linfoma no Hodgkin, leucemia linfocitica cronica, y mieloma multiple.
En un aspecto, la pr esente descr ipcion proporciona un m etodo par a el t ratamiento del ca ncer mediante la administracion de un profarmacoalquilante de fosforamidato de la invencion con un regimen de tratamiento del cancer utilizando al menos el alquilante Busulfan. El Busulfan se utiliza para tratar la leucemia granulocitica cronica y la leucemia mielogena cronica. Se pueden utilizar altas dosis de busulfan combinadas con Ciclofosfamida para tratar pacientes con leucemia mielogena aguda antes del trasplante de medula osea.
En un aspecto, la pr esente descr ipcion proporciona un m etodo par a el t ratamiento del ca ncer mediante la administracion de un profarmacoalquilante de fosforamidato de la invencion con un regimen de tratamiento del cancer utilizando al menos un alquilante de nitrosourea. En otro aspecto, el alquilante de nitrosourea es la Carmustina. La Carmustina se puede utilizar para tratar la enfermedad de Hodgkin, linfomas, mielomas, astrocitomas malignos, tumores metastasicos del cerebro, melanomas, y tumores gastrointestinal. En otro aspecto, la nitrosourea es la Estreptozocina que se utiliza para tratar el carcinoma de celulas de los islotes pancreaticos.
En un aspecto, la pr esente descr ipcion proporciona un m etodo par a el t ratamiento del ca ncer mediante la administracion de un profarmacoalquilante de fosforamidato de la invencion con un regimen de tratamiento del cancer utilizando al menos un alquilante de triazeno. En un aspecto, el alquilante de triazeno es la Dacarbazina. La Dacarbazina se utiliza para tratar melanomas malignos, la enfermedad de Hodgkin, y sarcomas en adultos. En otro aspecto, el alquilante de triazeno es la Temozolomida. La Temozolomida se puede utilizar paratratar gliomas malignos.
En un aspecto, la pr esente descr ipcion proporciona un m etodo par a el t ratamiento del ca ncer mediante la administracion de un profarmacoalquilante de fosforamidato de la invencion con un regimen de tratamiento del cancer utilizando al menos un alquilante de complejo de coordinacion de platino. En una realizacion, el alquilante de complejo de coordinacion de platino es el Cisplatino. El Cisplatino se puede utilizar para tratar el cancer de vejiga, cabeza y cu ello, en dometrio, ca rcinoma d e pulmon de celulas pequenas, y algunos neoplasmas de ninos. El Cisplatino solo o con ciclofosfamida se utiliza para tratar el cancer de ovario avanzado. La quimioterapia combinada de Cisplatino con Bleomicina, Etoposido, y Vinblastina se utiliza para tratar el cancer testicular avanzado; y con uno de Paclitaxel, Ciclofosfamida, o Doxorrubicina para tratar el carcinoma ovarico.
Las Antraciclinas utiles en la practica de los metodos descritos en la presente memoria incluyen pero no estan limitadas a, do xorrubicina (Adriamicina, D oxil, R ubex), m itoxantrona (Novantrone), i darrubicina (Idamicina), valrrubicina (Valstar), y epirrubicina (Ellence). De acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria un profarmaco alquilante de fosforamidato se administra simultaneamente con una antraciclina para tratar el cancer. En una version, el cancer es la leucemia no linfocitica aguda, el sarcoma de Kaposi, el cancer de prostata, el cancer de vejiga, el carcinoma de ovario metastasico, y el cancer de mama.
Como ejemplo el compuesto (8S,10S)-10-[(3-Amino-2,3,6-tridesoxi-alfa-L-lixo-hexopiranosil)oxi]-8-glicoloil-7,8,9,10tetrahidro-6,8,11-trihidroxi-1-metoxi-5,12-naftacenodiona, conocido mas comunmente co mo doxorrubicina, es un
antibiotico de antraciclina citotoxico aislado de cultivos de Streptomyces peucetius var. caesius. La Doxorrubicina se ha utilizado eficazmente para producir la regresion de afecciones neoplasicas diseminadas tales como leucemia linfoblastica aguda, leucemia mieloblastica aguda, el tumor de Wilm, el neuroblastoma, sarcomas de tejido blando y de hueso, carcinoma de mama, carcinoma ovarico, carcinoma de vejiga de celulas transicionales, carcinoma de tiroides, linfomas de tipo tanto Hodgkin como no Hodgkin, carcinoma broncogenico, y carcinoma gastrico. La Doxorrubicina se administra tipicamente a una dosis en el intervalo de 30-75 mg/m2 en forma de una sola inyeccion intravenosa administrada a intervalos de 21 dias; inyeccion intravenosa semanal a dosis de 20 mg/m2; o dosis de 30 mg/m2 en cada uno de tres dias sucesivos repetidas cada cuatro semanas. De acuerdo con los metodos descritos en la presentememoria, un profarmaco alquilantede fosforamidato se administra simultaneamente comenzando antes y co ntinuando despues de la administracion de do xorrubicina a tales dosis (o a dosis inferiores). Los profarmacos de la citotoxina Antraciclina ciclica utiles en la practica de los metodos descritos en la presente memoria se proporcionan mediante la referencia Matteucci et al., Solicitud de Patente PCT Num. US05/008161 (WO 2005/086951).
Los antibioticosutiles en la practica de los metodosdescritos en la presente memoria incluyen pero no estan limitados a dactinomicina, actinomicina D (Cosmegen), bleomicina (Blenoxano), daunorrubicina, y daunomicina (Cerubidina, DanuoNome). De acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria un profarmaco alquilante de fosforamidato se administra simultaneamente con un antibiotico para tratar el cancer. En una version, el cancer es un cancer seleccionado del grupo que consiste en leucemia linfocitica aguda, otras leucemias, y sarcoma de Kaposi.
Los inhibidores de aromatasa utiles en la practica de los metodos descritos en la presente memoria incluyen pero no estan limitados a anastrozol (Arimidex) y letroazol (Femara). De acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria un profarmaco alquilante de fosforamidato se administra simultaneamente con un inhibidor de aromatasa para tratar el cancer. En una version, el cancer es cancer de mama.
Los inhibidores de bisfosfonato utiles en la practica de los metodos descritos en la presente memoria incluyen pero no estan limitados a zoledronato (Zometa). De acuerdo con los metodos descritos en la presentememoria un profarmaco alquilante de fosforamidato se administra simultaneamente con inhibidor de bisfosfonato para tratar el cancer. En una version, el cancer es un cancer seleccionado del grupo que consiste en el mieloma multiple, metastasis osea de tumores solidos, o cancer de prostata.
Los inhibidores de ciclo-oxigenasa utiles en la practica de los metodos descritos en la presente memoria incluyen pero no estan limitados a celecoxib (Celebrex). De acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria un profarmaco alquilante de fosforamidato se administra simultaneamente con un inhibidor de ciclo-oxigenasa para tratar el cancer. En una version, el cancer es cancer de colon o una afeccion pre-cancerosa conocida como poliposis adenomatosa familiar.
Los moduladores de receptores de estrogenos utiles en la practica de los metodos descritos en la presente memoria incluyen pero no estan limitados a tamoxifeno (Nolvadex) y fulvestrant (Faslodex). De acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria un profarmaco alquilante de fosforamidato se administra simultaneamente con un modulador de receptores de estrogenos para tratar el cancer. En una version, el cancer es cancer de mama o el tratamiento se administra para prevenir la aparicion o reaparicion del cancer de mama.
Los antagonistas de folato utiles en la practica de los metodos descritos en la presente memoria incluyen pero no estan limitados a metotrexato y tremetrexato. De acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria un profarmaco alquilante de fosforamidato se administra simultaneamente con un antagonista de folato para tratar el cancer. En una version, el cancer es un osteosarcoma.
Como ejemplo, el compuesto acido N-[4-[[(2,4-diamino-6-pteridinil)metil-metilamino]benzoil]-L-glutamico, conocido comunmente como metotrexato, es un farmaco antifolato que ha sido utilizado en el tratamiento del coriocarcinoma gestacional y en el tratamiento de pacientes con corioadenoma destruens y mola hidatiforme. Tambien es util en el tratamiento de fases avanzadas de linfoma maligno y en el tratamiento de casos avanzados de micosis fungoides. El Metotrexato s e adm inistra co mo si gue. P ara el co riocarcinoma, se adm inistran d iariamente i nyecciones intramusculares de dosis de 15 a 30 mg durante un curso de cinco dias, repitiendose tales cursos segun se necesite con periodos de descanso de una o mas semanas intercalados entre los cursos de terapia. Para las leucemias, se administran dos veces a la semana inyecciones intramusculares en dosis de 30 mg/m2. Para la micosis fungoides, se administran semanalmente inyecciones intramusculares de dosis de 50 mg o, alternativamente, de 25 mg dos veces a la semana. De acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria, un profarmaco alquilante de fosforamidato se administra simultaneamente con metotrexato administrado a tal dosis (o a una dosis inferior). La 5metil-6-[[(3,4,5-trimetoxifenil)-amino]metil]-2,4-quinazolindiamina (conocida comunmente como trimetrexato) es otro farmaco antifolato que se puede administrar simultaneamente con un profarmaco alquilante de fosforamidato.
Los arsenatos inoganicos utiles en la practica de los metodos descritos en la presente memoria incluyen pero no estan limitados a trioxido de arsenico (Trisenox). De acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria un profarmaco alquilantede fosforamidato se administra simultaneamente con un arsenato inorganico para tratarel cancer. En una version, el cancer es leucemia promielocitica aguda refractaria (APL).
Los inhibidores de microtubulos (segun se utiliza en la presente memoria, un Uinhibidor de microtubulosU es cualquier agente que interfiere en el ensamblaje o desensamblaje de microtubulos) utiles en la practica de los metodos descritos en la presente memoria incluyen pero no estan limitados a vincristina (Oncovina), vinblastina (Velban), paclitaxel ( Taxol, P axeno), v inorelbina (Navelbina), docetaxel ( Taxotero), ep otilona B o D o un derivado d e cualquiera, y di scodermolido o s us derivados. Los farmacos anticancerosos que s e une n a Tubulina y sus profarmacos que se pueden utilizar en la practica de los metodos de la presente invencion se proporcionan en la referencia Matteucci et al., Solicitud de Patente PCT Num.PCT/US2005/042095; (WO 2006/057946). De acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria un profarmaco alquilante de fosforamidato se administra simultaneamente con un inhibidor de microtubulos para tratar el cancer. En una version, el cancer es cancer de ovario, cancer de mama, cancer de pulmon de celulas no pequenas, sarcoma de Kaposi, y cancer metastasico de mama o de origen ovarico. Como ejemplo, el compuesto 22-oxo-vincaleucoblastina, tambien conocido comunmente como vincristina, es un alcaloide obtenido de la planta vincapervinca (Vinca rosea, Linn.) y es util en el tratamiento de la leucemia aguda. Tambien se ha demostrado que es util combinado con otros agentes oncoliticos en el tratamiento de la enfermedad de Hodgkin, el linfosarcoma, el sarcoma de celulas del reticulo, el rabdomiosarcoma, el neuroblastoma, y el tumor de Wilm. La Vincristina se administra en dosis intravenosas semanales de 2 mg/m2 para ninos y de 1,4 mg/m2 para adultos. De acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria, un profarmaco alquilante de fosforamidato se administra simultaneamente con vincristina administrada a tales dosis. En una version, un profarmaco alquilante de fosforamidato no se administra antes del tratamiento con un inhibidor de microtubulos, tal como un taxano, pero en lugar de eso, se administra simultaneamente un profarmaco alquilante de fosforamidato de u nos pocos dias a un a s emana despues del comienzo del tratamiento co n un inhibidor de microtubulos.
Los modificadores utiles en la practica de los metodos descritos en la presente memoria incluyen pero no estan limitados a Leucovorina (Wellcovorin), que se utiliza con otros farmacos tales como 5-fluorouracilo para tratar el cancer colorrectal. De acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria un profarmaco alquilante de fosforamidato se administra simultaneamente con un modificador y otro agente anticanceroso para tratar el cancer. En una version, el cancer es cancer de colon. En una version, el modificador es un compuesto que aumenta la capacidad de una celula para absorber glucosa, incluyendo pero no limitado al compuesto N-hidroxiurea. Se ha informado que l a N-hidroxiurea aumenta la ca pacidad d e u na c elula para abs orber 2-desoxiglucosa ( vease la referencia Smith et al., 1999, Cancer Letters141: 85), yla administracion de N-hidroxiurea a los niveles referidos para aumentar l a a bsorcion de 2-desoxiglucosa o para t ratar la leucemia junto co n l a administracion d e 2 desoxiglucosa y un profarmaco alquilante de fosforamidato como se ha descrito en la presente memoria es una version de los metodos terapeuticos proporcionados en la presente memoria. En otra de tal version, un profarmaco alquilante de fosforamidato se administra simultaneamente con oxido nitrico o un precursor de oxido nitrico, tal como un nitrito organico o un NONOato de espermina, para tratar el cancer, como ultimos compuestos que estimulan la absorcion de glucosa.
Las nitrosoureas utiles en la practica de los metodos descritos en la presente memoria incluyen pero no estan limitadas a pr ocarbazina (Matulano), lo mustina, CCNU ( CeeBU), carmustina (BCNU, B iCNU, Oblea Gliadel), y estramustina (Emcit). De acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria un profarmaco alquilante de fosforamidato se administra simultaneamente con una nitrosourea para tratar el cancer. En una version, el cancer es cancer de prostata o glioblastoma, incluyendo glioblastoma multiforme recurrente.
Los analogos de nucleosidos utiles en la practica de los metodos descritos en la presente memoria incluyen pero no estan limitadosa mercaptopurina, 6-MP (Purinetol), fluorouracilo, 5-FU (Adrucil), tioguanina, 6-TG (Tioguanina), hidroxiurea (Hydrea), citarabina (Cytosar-U, DepoCyt), floxuridina (FUDR), fludarabina (Fludara), azacitidina (Vidaza), pentostatina (Nipent), cladribina (Leustatina, 2-CdA), gemcitabina (Gemzar), y capecitabina (Neloda). De acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria un profarmaco alquilante de fosforamidato se administra simultaneamente con un analogo de nucleosido para tratar el cancer. En una version, el cancer leucemia linfocitica de celulas B (LLB), leucemia de celulas pilosas, adenocarcinoma de pancreas, cancer de mama metastasico, cancer de pulmon de celulas no pequenas, o carcinoma colorrectal metastasico. Como ejemplo, el compuesto 5-fluoro2,4(1H,3H)-pirimidinodiona, conocido comunmente tambien como 5-fluorouracilo, es un analogo de nucleosido antimetabolito eficaz en el m anejo paliativo del carcinoma de colon, recto, mama, estomago, y pancreas en pacientes que se consideran incurables por medios quirurgicos u otros medios. El 5-Fluorouracilo se administra en una terapia inicial a dosis de 12 mg/m2 administrada intravenosamente una vez al dia durante 4 dias sucesivos no excediendo la dosis diaria de 800 mg. Si no se observa toxicidad en ningun momento en el curso de la terapia, se administran intravenosamente 6 mg/kglos dias 6o, 8o, 10o,y 12o. No se administra terapia los dias 5o, 7o, 9o, o 11o. En pacientes con bajo riesgo o aquellos que no estan en un estado nutricional adecuado, se administra una dosis diaria de 6 mg/kg durante tres dias, no excediendo la dosis diaria de 400 mg. Si no se observa toxicidad en ningun
momento durante el tratamiento, se pueden administrar 3 mg/kg los dias 5o, 7o, y 9o dias. No se administra terapia los dias 4o, 6o, u 8o. Una secuencia de inyecciones en cualquier programa constituye un curso de terapia. De acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria, un profarmaco alquilante de fosforamidato se administra simultaneamente con 5-FU administrado a tales dosis o con la forma de profarmaco Neloda con dosis ajustadas correspondientemente. Como otro ejemplo, el compuesto 2-amino-1,7-dihidro-6H-purino-6-tiona, tambien conocido comunmente como 6-tioguanina, es un analogo de nucleosido eficaz en la terapia de leucemias no linfociticas agudas. La 6-tioguanina se administra oralmente a dosis de alrededor de 2 mg/kg de peso corporal por dia. La dosis diaria total se puede proporcionar de una vez. Si al cabo de cuatro semanas de dosificacion a este nivel no hay mejora, la dosificacion se puede aumentar cautelosamente prudentemente a 3 mg/kg/dia. De acu erdo con los metodos descritos en l a pr esente m emoria, un profarmaco alquilante de f osforamidato se adm inistra simultaneamente con 6-TG administrada a tales dosis (o a dosis inferiores).
Los inhibidores de osteoclastos utiles en la practica de los metodos descritos en la presente memoria incluyen pero no estan limitados a pamidronato (Aredia). De acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria un profarmaco alquilante de fosforamidato se administra simultaneamente con un inhibidor de osteoclastos para tratar el cancer. En una version, el cancer es la metastasis osea osteolitica de cancer de mama, y tambien se administran simultaneamente uno o mas agentes anticancerosos adicionales con un profarmaco alquilante de fosforamidato.
Los compuestos de platino utiles en la practica de los metodos descritos en la presente memoria incluyen pero no estan limitadosacisplatino (Platinol) y carboplatino(Paraplatino). De acuerdo conlos metodos descritos enla presente memoria un profarmaco alquilante de fosforamidato se administra simultaneamente con un compuesto de platino para t ratar el ca ncer. En una v ersion, el c ancer es cancer testicular metastasico, ca ncer de ovario metastasico, carcinoma ovarico, ycancer de vejiga de celulas transicionales. Como ejemplo, el compuesto cis-Diaminodicloroplatino (II), conocido comunmente como cisplatino, es util enel tratamiento paliativo de tumores testiculares y ovaricos metastasicos, y para el tratamiento del cancer de vejiga de celulas transicionales que no es susceptible d e ci rugia o r adioterapia. El Cisplatino, cu ando se ut iliza p ara el ca ncer d e ve jiga avanzado, s e administra inyecciones intravenosas a dosis de 50-70 mg/m2 una vez cada tres a cuatro semanas. De acuerdo con los metodos descritos en l a pr esente m emoria, un pr ofarmaco alquilante de f osforamidato se a dministra simultaneamente con cisplatino administrado a estas dosis (o a dosis inferiores). Se pue den adm inistrar simultaneamente uno omasagentes anticancerosos adicionales con el compuesto de platino y unprofarmaco alquilante de fosforamidato. Como ejemplo, se pueden administrar simultaneamente Platinol, Blenoxano, y Velbam con un profarmaco alquilante de fosforamidato. Como otro ejemplo, se pueden administrar simultaneamente Platinol y Adriamicina con un profarmaco alquilante de fosforamidato.
Los retinoides utiles en la practica de los metodos descritos en la presente memoria incluyen pero no estan limitados a tretinoina, ATRA (Vesanoide), alitretinoina (Panretina), y bexaroteno (Targretina). De acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria un profarmaco alquilante de fosforamidato se administra simultaneamente con un retinoide para tratar el cancer. En una version, el cancer es un cancer seleccionado del grupo que consiste en APL, sarcoma de Kaposi, y linfoma de celulas T.
Los inhibidores de topoisomerasa 1 utiles en la practica de los metodos descritos en la presente memoria incluyen pero no estan limitados a topotecan (Hicamtina) e irinotecan (Camptostar). De acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria un profarmaco alquilante de fosforamidato se administra simultaneamente con un inhibidor de topoisomerasa 1 para tratar el cancer. Los inhibidores de topoisomerasa y sus profarmacos utiles en la practica de los metodos de la presenteinvencion se proporcionan en la referencia Matteucci et al., Solicitud de Patente PCT Num. PCT/US2005/041959 (WO 2006/ 065448). En una ve rsion, el ca ncer es carcinoma metastasico de ova rio, colon, o recto, o cancer de pulmon de celulas pequenas. Como se ha observado anteriormente, no obstante, en una version de los m etodos descritos en l a p resente m emoria, la administracion d e un pr ofarmaco a lquilante d e fosforamidato precede o sigue, o ambos, a l a administracion de un inhibidor de topoisomerasa 1 pero n o s e administra concurrentemente con el mismo.
Los inhibidores de topoisomerasa 2 utiles en la practica de los metodos descritos en la presente memoria incluyen pero no estan limitados a etoposido, VP-16 (Vepesid), teniposido, VM-26 (Vumon), y fosfato de etoposido (Etopofos). De ac uerdo con los me todos d escritos en l a pr esente memoria un p rofarmaco alquilante d e f osforamidato se administra simultaneamente con un inhibidor de topoisomerasa 2 para tratar el cancer. En una version, el cancer es un cancer seleccionado del grupo que consiste en tumores testiculares refractarios, leucemia linfoblastica aguda refractaria (LLA), y cancer de pulmon de celulas pequenas. Como se ha observado anteriormente, no obstante, en una version de los metodos descritos en la presente memoria, la administracion de un profarmaco alquilante de fosforamidato pr ecede o sigue, o ambos, a l a administracion de un inhibidor de topoisomerasa 2 pero n o s e administra concurrentemente con el mismo.
Los inhibidores de tirosina quinasas utiles en la practica de los metodos descritos en la presente memoria incluyen pero no estan limitados a imatinib (Gleevec). De acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria un
profarmaco alquilante de fosforamidato se administra simultaneamente con un inhibidor de tirosina quinasas para tratar el cancer. En una version, el cancer es CML o un tumor estromatico gastrointestinal maligno no extirpable.
De este modo, en l a presente memoria se describen los metodos para el tratamiento del cancer en el que se
5 administran a un paciente un profarmacoalquilante defosforamidato ouna sal farmaceuticamente aceptabledel mismo y uno o mas agentes anticancerosos adicionales. Las versiones especificas de tales otros agentes anticancerosos incluyen sin limitacion 5-metil-6-[[(3,4,5-trimetoxifenil)amino]-metil]-2,4-quinazolindiamina o una de sus sa les farmaceuticamente ace ptables, ( 8S,10S)-10-(3-amino-2,3,6-tridesoxi-alfa-L-lixo-hexopiranosil)oxi]-8glicoloil-7,8,9,10-tetrahidro-6,8,11-trihidroxi-1-metoxi-5,12-naftacenodiona o una de s us sales farmaceuticamente
10 aceptables; 5-fluoro-2,4(1H,3H)-pirimidinodiona o una de sus sales farmaceuticamente aceptables; 2-amino-1,7dihidro-6H-purino-6-tiona o una de sus sales farmaceuticamente aceptables; 22-oxo-vincaleucoblastina o una de sus sales farmaceuticamente aceptables; 2-bis[(2-cloroetil)amino]tetrahidro-2H-1,3,2-oxazafosforina, 2-oxido, o una de sus sales farmaceuticamente aceptables; acido N-[4-[[(2,4-diamino-6-pteridinil)metil]-metilamino]benzoil]-L-glutamico,
o una de sus sales farmaceuticamente aceptables; o cisdiaminodicloro-platino (II). 15
IV. EJEMPLOS
En los siguientes ejemplos, cualquier referencia a un compuesto designado por una letra es una referencia a la estructura mostrada a continuacion o antes de la letra en los esquemas de reaccion correspondientes. �nicamente
20 se reivindican los compuestos 25 y 36.
Síntesis
Los metodos para sintetizar los profarmacos alquilantes de fosforamidato de la presente invencion se proporcionan
25 en la seccion II. Las sustancias de partida utilizadas en la sintesis de los profarmacos alquilantes de fosforamidato de la presente invencion se adquirieron, cuando estuvieron disponibles, de fabricantes comerciales, tales como, por ejemplo, Sigma-Aldrich Co. El 1-N-metil-2-nitroimidazol-5-metanol se adquirio de Syngene, India. Las sustancias de partida no a sequibles comercialmente se pueden sintetizar a traves de procedimientos de la literatura convencionales. Tales procedimientos es pueden identificar a traves de herramientas de busqueda de literatura tales
30 como SciFinder asequible de The American Chemical Society o Beilstein, asequible de MDL Software.
Las reacciones con compuestos sensibles a la humedad, tales como, por ejemplo, POCl3 y PCl3, y sus derivados mono- y diclorados se realizaron empleando disolventes anhidros y en nitrogeno o argon. La separacion de un producto de l a mezcla de r eaccion se r ealizo empleando u na elaboracion c uando f ue n ecesario, seguido de 35 destilacion a vacio, cristalizacion, cromatografia en columna, o cromatografia en capa fina preparativa. Se puede determinar un eluyente adecuado para la cromatografia en columna de un compuesto leyendo esta descripcion y/o determinando el Rf del compuesto por medio de cromatografia en capa fina y eligiendo un disolvente que permita la separacion del compuesto deseado de los compuestos no deseados. La eleccion del eluyente concreto puede depender, entre otros factores, de la naturaleza polar del compuesto, la existencia de otros compuestos que eluyen
40 cerca, eltipo defaseestacionariautilizadatal como gel desiliceoalumina, y lacantidad de presionutilizadapara eluir el disolvente a traves de la fase estacionaria. En la practica, se pueden utilizar diferentes composiciones de disolventes para separar el mismo compuesto.
Los compuestos separados se analizaron para determinar su pureza por medio de tecnicas analiticas
45 convencionales, tales como, CCF, espectroscopia RMN, yCL-EM, yse almacenaron en un congelador oen un frigorifico, evitando la humedad, la luz, o el aire. Se prepararon soluciones de partida de los compuestos profarmaco alquilantes de fosforamidato en DMSO y se almacenaron en un congelador.
Ejemplo 1
Síntesis del Compuesto 36
55 A una solucion de N-metil-2-nitroimidazol-5-metanol (180 mg, 1,14 mmoles), trifenilfosfina (300 mg, 1,14 mmoles), y mostaza de isofosforamida (1c, 127 mg, 0,57 mmoles) en THF (10 ml) se le anadio gota a gota azodicarboxilato de diisopropilo (DIAD, 0,22 ml, 1,14 mmoles) a temperatura ambiente. Al cabo de dos horas la mezcla de reaccion se
concentro y el residuo se separo mediante cromatografia instantanea con acetona al 30-100% en tolueno produciendo el compuesto 36.
Ejemplo 2 Síntesis del Compuesto 25
A una solucion de bromuro de 2-bromoetilamonio (19,4 g) en DCM (90 mL) a -10�C se le anadio una solucion de POCl3 (2,3 mL) en DCM (4 mL) seguido de la adicion de una solucion de TEA (14,1 mL) en DCM (25 mL). La mezcla 10 de reaccion se filtro, el producto filtrado se concentro a aprox. 30% del volumen original y se filtro. El residuo se lavo con DCM (3x25 mL) y las porciones en DCM combinadas se concentraron para producir un solido al que se anadio una mezcla de THF (6 mL) y agua (8 mL). El THF se elimino en un evaporador rotativo, la solucion resultante se enfrio durante la noche en un frigorifico. El precipitado obtenido se filtro, se lavo con agua (10 mL) y eter (30 mL), y
se seco a vacio para producir 2,1 g de:
La mostaza de isofosforamida
20 se puede sintetizar empleando el metodo proporcionado anteriormente, sustituyendo bromuro de 2-bromoetilamonio por cloruro de 2-cloroetilamonio. Se ha descrito la sintesis de la mostaza isofosforamida (vease por ejemplo Wiessler et al., supra).
La toxina alquilante de fosforamidato:
se transformo en el compuesto 2 5, empleando el metodo proporcionado e n e l E jemplo 1 y el Disparador-OH apropiado. 30 Ejemplo 3 Síntesis de éster etílico de ácido 1-N-metil-2-aminoimidazol-5-carboxílico
Se anadio formiato de etilo (500 mL) a hidrocloruro de eter metilico de sarcosina (82 g, 585,7 mmoles, molido en polvo antes de la reaccion) contenido en un matraz de fondo redondo de 1 L. La mezcla de reaccion se enfrio en un bano de agua con hielo, se agito, se conecto una salida de gas al matraz, se anadio lentamente NaH (suspension en 40 aceite al 60%, 54 g, 1,35 moles) durante un periodo de 2 h, y se agito a temperatura ambiente durante al rededor de 14 h. Las sustancias volatiles se eliminaron utilizando un evaporador rotativo para producir un residuo que se trituro dos veces con hexano (500 mL) para producir una pasta pegajosa de color pardo claro que se disolvio en etanol
(400 mL) yHCl conc.(50 mL) y se agitoa 110�C durante 1,5 h. Despues de enfriar la mezcla de reaccion, el precipitado de color blanco se separo mediante filtracion y el residuo se lavo con 2 x 25 mL de etanol. El producto filtrado se evaporo para producir un aceite de color pardo claro al que se anadio HOAc acuoso al 10%, H2NCN (45 g, 1,07 moles), y acetato de sodio (88 g, 1,07 moles). La mezcla de reaccion se agito a 90-100�C durante 1,5 h para 5 producir una solucion transparente que se enfrio, su pHse ajusto a 1 utilizandoHCl concentradoy la solucion resultante se concentro a 1/5 de su volumen original utilizando un evaporador rotativo a una temperatura no mayor de 45�C. La mezcla de reaccion concentrada se neutralizo cuidadosamente por medio de la adicion de K2CO3 a un pH de 8-9 y se extrajo con AE (5 x 200 mL seguido de 3 x 50 mL). Las capas de acetato de etilo combinadas se secaron sobreMgSO4, se filtraron, y las sustancias volatiles se eliminaron para producir 48 g de ester etilico de
10 acido 1-N-metil-2-aminoimidazol-5-carboxilico.
Ejemplo 4
Síntesis de éster etílico de ácido 1-N-metil-2-aminoimidazol-5-carboxílico
Se anadio formiato de etilo (850 mL) a sal HCl de ester metilico de sarcosina (205 g, 1,46 mol, molida en polvo antes
20 de su uso), carbonato de potasio (205 g, 1,48 moles), y EtOH (800 mL), se agito durante la noche a temperatura ambiente, y se filtro. El producto filtrado se concentro en un evaporador rotativo durante lo cual el residuo se separo en dos capas. La capa superior se separo y la capa inferior se extrajo con AE. Las capas de AE combinadas y la capa superior se seco sobreMgSO4, se filtro, y seconcentro para producir 185 g (81%) de ester metilico deNformilsarcosina que se utilizo para la reaccion siguiente. Se anadio cuidadosamente NaH (suspension en aceite al
25 60%, 16,0 g, 0,4 moles) en varias porciones en 1 h a una mezcla de ester metilico de N-formilsarcosina (50 g, 0,34 moles) yformiato de etilo (160 mL)enfriada en un bano de agua con hielo. La mezcla de reaccion se agito, la temperatura se subio a temperatura ambiente, y se continuo agitando durante la noche. La mezcla de reaccion se trituro dos veces con hexano (100 mL cada vez), el residuo se disolvio en EtOH (100 mL) y HCl concentrado (60 mL), y la mezcla de reaccion se agito a 110�C. Al cabo de 1 h, la mezcla de reaccion se enfrio, se filtro, el residuo
30 se lavo con EtOH y el producto filtrado se concentro para producir un aceite de color pardo claro. El aceite se anadio a HOAc al 10% en agua (200 mL), NH2CN (35 g) y acetato de sodio (90 g), se agito a 95�C. Al cabo de 1h la mezcla de reaccion se concentro a 1/3 de su volumen original en un evaporador rotativo y su pH se ajusto a alrededor de 9 por medio de la adicion de carbonato de sodio. La mezcla de reaccion se extrajo a continuacion conAE (8 x 100 mL), las capas de AE combinadas se secaron, se filtraron, y se concentraron para producir un residuo que se purifico
35 mediante recristalizacion para producir ester etilico de acido 1-N-metil-2-amino-imidazol-5-carboxilico (UaminoesterU).
Ejemplo 5
Síntesis de éster etílico de ácido 1-N-metil-2-nitroimidazol-5-carboxílico
Una solucion del aminoester (36,94 g, 0,218 moles) en 200 ml de acido acetico se anadio gota a gota a una solucion de nitrito de sodio (100 g, 1,449 moles) y agua (300 ml) enfriada en un bano de agua con hielo, y se agito. La
45 temperatura de l a m ezcla d e r eaccion, que se habia medido que era de alrededor de -5 -10�C se su bio a temperatura ambiente y la mezcla de reaccion se agito durante la noche. La mezcla de reaccion se extrajo con DCM (3 x 150 mL). Las capas de DCM combinadas se secaron y se evaporaron para producir un residuo rojizo que se
separo mediante cromatografia en columna sobre gel de silice empleando como eluyente AE/hexano (30%) para producir ester metilico de acido 1-N-metil-2-nitroimidazol-5-carboxilico (UnitroesterU) en forma de un solido de color pardo claro (27 g, rendimiento 62%).
5 Este metodo descrito en el Ejemplo 5 y que emplea acido acetico acuoso es una mejora del metodo en el que se utiliza acido sulfurico a alrededor de 7% (v/v) para la formacion del ion diazonio a partir del aminoester. Utilizando acido sulfurico acuoso, el volumen de reaccion se vuelve mayor causando dificultad para agitar la mezcla de reaccion eficazmente. Por ejemplo, una reaccion que implica 150 g del aminoester requiere un volumen de mezcla de reaccion de alrededor de 12 L. El nitroester pegajoso se forma como producto enacido sulfurico acuoso e interrumpe la agitacion de la mezcla de reaccion.
Ejemplo 6
Síntesis de ácido 1-N-metil-2-nitroimidazol-5-carboxílico
Una suspension del nitroester (39,2 g, 196,9 mmoles) en NaOH 1N (600 mL) y agua (200 mL) se agito a temperatura ambiente durante al rededor de 20 h para producir un solucion transparente de color pardo claro. El pH de la mezcla de reaccion se ajusto a a alrededor de 1 mediante la adicion de HCl conc. y la mezcla de reaccion se extrajo con AE (5 x 150 mL). Las capas de acetato de etilo combinadas se secaron sobre MgSO4 y se concentraron para producir acido 1-N-metil-2-nitroimidazol-5-carboxilico (UnitroacidoU) en forma de un solido de color pardo claro (32,2 g, 95%).
25 Ejemplo 7
Síntesis de 1-N-metil-2-nitroimidazol-5-metanol
Una mezcla del nitroacido (30,82 g, 180,23 mmoles) y trietilamina (140 mL, 285 mmoles) en THF anhidro (360 mL) se agito mientras la mezcla de reaccion se enfriaba en un bano de hielo seco-acetonitrilo (temperatura � -20�C). Se anadio gota a gota cloroformiato de isobutilo (37,8 mL, 288 mmoles)a esta mezcla de reaccion refrigerada durante un periodo de 10 min y se agito durante 1 h seguido de laadicion de borohidruro de sodio (36 g, 947 mmoles)y
35 adicion gota a gota de agua durante un periodo de 1 h mientras se mantenia a una temperatura en torno o menor de 0�C. La mezcla de reaccionse calento a 0�C. El solido se separomediante filtracion y se lavo con THF. Las porciones en THF combinadas se evaporaron para producir 1-N-metil-2-nitroimidazol-5-metanol en forma de un solido de color naranja (25 g) que se recristalizo en acetato de etilo.
Ejemplo 8
La solubilidad del siguiente compuesto se enumera mas abajo:
Compuesto
Solubilidad ( en s olucion sa lina a t emperatura ambiente)
25
15 mg/mL
45 Ejemplo 9
Análisis Antiproliferación
Para determinar el efecto de los profarmacos alquilantes de fosforamidato sobre la proliferacion celular, se sometio a ensayo la actividad antiproliferativa de estos compuestos en un analisis basado en Alamar Blue de multiples pocillos. Se comparo el crecimiento celular en presencia y ausencia del compuesto de ensayo, medido mediante un lector de placa de fluorescencia a una excitacion de 550 nm y una emision de 590 nm (vease Biosource International Inc., Tech Application Notes, Use of Alamar Blue in the measurement of Cell Viability and Toxicity, Determinacion de la
CI50). Se sometieron a ensayo las siguientes lineas celulares con 20.000 celulas/pocillo/500 !L de medio: celulas NCI-H460 (ATCC HTB-177, medio RPMI (Gibco Products, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)), celulas HT29 (ATCC HTB-38, medio RPMI (Gibco)), celulas MES-SA (ATCC CRL-1976, medio de McCoy 5a (ATCC)), celulas MES-SA/Dx5((ATCC CRL-1977), medio de McCoy 5a (ATCC)), celulas ACHN (ATCC CRL-1611,Medio esencial 5 minimo, Eagle (ATCC)), celulas PC3 (ATCC CRL-1435, medio F12K de Ham (ATCC)). Las celulas se sembraron en insertos de vidrio colocados en cada uno de los pocillos de una placa de 24 pocillos a la densidad y en el medio especificados mas arriba un di a antes de l ens ayo c on el c ompuesto. Despues d e 24 hor as, estas placas se dividieron en dos grupos -grupo conanoxia y grupocon aire. Se anadioun compuesto de ensayoacadapocillo (volumen 200 !L) en los grupos de tratamiento a concentraciones que variaban de 100, 30, 10, 3, 1, 0,3, 0,1, 0,03, a 10 0,01 !M. Todos los compuestos de ensayo fueron diluidos seriadamente en medio completo con concentraciones finales de DMSO menores o iguales a 1% en cada pocillo. Las celulas del grupo de tratamiento con anoxia se incubaron durante 2 horas en una camara anaerobica Bactron II. Las celulas del grupo de tratamiento con aire se incubaron durante 2 horas en incubadoras para el cultivo de tejidos convencionales. Despues del tratamiento de 2 horas con un compuesto de ensayo, el compuesto de ensayo se retiro de cada pocillo, las celulas se lavaron con
15 500 !L de medio, y se incubaron durante 3 dias en 500 !L de medio de nueva aportacion. Despues de 3 dias, las celulas se tineron con Alamar Blue al 10% durante 2 horas despues de lo cual se midio la capacidad de las celulas para proliferar (como se ha mencionado antes), y la concentracion inhibidora del crecimiento del 50% (IG50 (tambien referido como CI50 en la presente memoria)) de los compuestos de ensayo y se tabularon en la Tabla N de mas abajo.
20 Tabla N: Valores de CI50 (!M)
Compuesto
H460 Anoxia/Aire HT29 Anoxia/Aire MES-SA Anoxia/ Aire MESSA/Dx5 Anoxia/Aire ACHN Anoxia/ Aire PC3 Anoxia/Aire
36
0,88/ �100 55/�100 5/�100 7,5/�100
25
0,15/86 16/�100 0,9/ �100 0,3/�100 0,2/62 0,6/�100
Ejemplo 10
Análisis Antiproliferación – Dependencia de Oxígeno
Para determinar la dependencia del oxigeno de los profarmacos alquilantes de fosforamidato, se sometio a ensayo la actividad antiproliferativa de estos compuestos en un analisis basado en Alamar Blue de multiples pocillos como 30 se ha descrito previamente (vease el Ejemplo 9). Se sembraron celulas NCI-H460 (ATCC HTB-177, medio RPMI (Gibco)) o HT29 (ATCC HTB-38, medio RPMI (Gibco)) a 20.000 celulas/pocillo/500 !L de medio en insertos de vidrio en placas de 24 pocillos un di a ant es del ensa yo. Las celulas se i ncubaron dur ante 2 h oras en una c amara anaerobica Bactron II purgada con gases con las concentraciones de oxigeno deseadasque variaban desde la anoxia, oxigeno al 0,1%, 0,3%, 0,6%, 1%, 10%, y aire. Los valores de CI50 calculados (!M) se tabulan en la Tabla Y1
35 (celulas H460) o en la Tabla Y2 (celulas HT29) de mas abajo.
Tabla Y1: Valores de CI50 (!M) en celulas H460
Compuesto
N2 0,1% O2 0,3% O2 0,6% O2 1% O2 10% O2 Aire
36
1 30 60 60 �100 �100
25
0,1 1 3 5 1 0 25 55
Tabla Y2: Valores de CI50 (!M) en celulas HT29
Compuesto
N2 0,1% O2 0,3% O2 0,6% O2 1% O2 10% O2 Aire
25
2 25 �1 00
Ejemplo 11 Análisis Clonogénico – Dependencia de Oxígeno
Para determinar la dependencia de oxigeno de los profarmacos alquilantes de fosforamidato, se llevo a cabo un analisis de supervivencia clonogenica. Se cultivaron en placa las celulas en bandejas de vidrio de 60 mm
(5x105 celulas por bandeja en 5 mL de medio) 2 dias antes de someter a ensayo el compuesto. Se sometieron a ensayolas siguientes lineas celulares: celulas NCI-H460 (ATCC HTB-177, medio RPMI (Gibco)), celulas HT29 (ATCC HTB-38, medio RPMI (Gibco)), celulas PC3 (ATCC CRL-1435, medio F12K de Ham (ATCC)). Se elaboro una solucion del compuesto de ensayo en medio completo inmediatamente antes del ensayo y se anadio directamente a 5 las celulas (volumen 2 mL). Se lograron la anoxia o la hipoxia (menos de 200 ppm de O2) exponiendo las bandejas de vidrio a una camara anaerobica Bactron II o en recipientes de aluminio (vease el Ejemplo 13) durante 2 horas. Para la camara anaerobica, se lograron los niveles deseados de oxigenacion entre 200 ppm y aire purgando la camara anaerobica con gases pre-calibrados antes de la experimentacion. Para los recipientes de aluminio, se lograron la anoxia o la hipoxia exponiendo las bandejas de vidrio en guias de aluminio hermeticas, pre-calentadas a 10 una serie de cinco evacuaciones rapidas y purgados con 95% de nitrogeno mas 5% de dioxido de carbono en un bano de agua a 37�C sobre una plataforma de sacudimiento (los controles tambien se purgan). Despues de la quinta evacuacion y purgado, la plataforma (con bano de agua y guias) se sacudieron durante 5 minutos, despues de lo cual se llevaron a cabo una evacuacion y purgado mas, y las guias se transfirieron a un aparato de sacudimiento en una i ncubadora a 37 grados C durante l as 1 a 2 h oras restantes de e xposicion al f armaco. Los niveles de 15 oxigenacion entre 200 ppm y aire se lograron variando el grado y el numero de las evacuaciones. Se verificaron las concentraciones de oxigeno en el medio y las fases gaseosas utilizando un electrodo d e oxigeno ( Anima, Phoenixville, PA) en una guia de aluminio especialmente modificadaque permitia el control de lasfases tanto gaseosas como liquidas. Despues de la exposicion al farmaco, las bandejas de vidrio de retiraron de la camara o de los recipientes de aluminio y el farmaco se separo de las celulas por lavado, enjuagando con el medio. Despues las
20 celulas se tripsinizaron y se cultivaron en placa para determinar la supervivencia clonogenica en placas de Petri de plastico. De 10 a 14 dias mas tarde, las bandejas se tineron con cristal violeta(0,25%en etanol del 95%), y se contaron las colonias que contenian mas de 50 celulas (vease el Ejemplo 13). Se calculo la concentracion inhibidora del 90% del crecimiento (CI90, eliminacion 90%, supervivencia 10%) de los compuestos de ensayo y se tabulo en la Tabla Y3 de mas abajo.
25 Tabla Y3: Valores de CI90 (!M)
Compuesto (Linea Celular)
N2 0,1% O2 0,6% O2 Aire
25 (H460)
0,1 0,4 5 30
25 (HT29)
0,2 3 40
25 (PC3)
0,3 50
Ejemplo 12
30 Electroquímica
Para determinar las propiedades electroquimicas y los potenciales de reduccion de los profarmacos alquilantes de fosforamidato, se generaron voltamogramas ciclicos de estos compuestos por medio de Bioanalytical Systems, Inc. Todos los experimentos se llevaron a cabo sobre electrodos de trabajo de carbono vitreo (3,0 mm de diametro), 35 electrodos de referencia de Ag/AgCl, y electrodos auxiliares de alambre de platino. Los compuestos se disolvieron en 1 mL de metanol para obtener concentraciones finales de farmaco entre 0,5 y 1,5 mM despues de la adicion de 9 mL de Solucion Salina Tamponada con Fosfato (PBS). La solucion se anadio a un vial con una pila electroquimica y se purgo con Argon durante 5 minutos para eliminar la mayor parte del oxigeno. Se realizo una voltametria ciclica a velocidades de barrido de 100 mV/seg y 10.000 mV/seg en un electrodo de trabajo de carbono vitreo. Se realizo una
40 ronda de ensayo en un electrodo de mercurio CGME (CGME en modo SMDE, 150 !m de diametro capilar, tamano de gota 8), pero se observo poca diferencia entre los voltamogramas de mercurio y carbono vitreo, de manera que el electrodo de mercurio no se utilizo mas. Se generaron los potencialesde reduccion de un solo electron o de multiples electrones de los compuestos a cada velocidad de barrido y se tabulan en la tabla de mas abajo.
45 Tabla: Potenciales de Reduccion (mV)
Compuesto
100 mV/seg 10,000 mV/seg
36
-609 -634
25
-594 -626
2-NO2-Imidazol
-634 -693
5-NO2-Furano
-487 -638
4-NO2-Benceno
-712, -1106 -735,-1268
Ejemplo 13
Análisis de Supervivencia Clonogénica
5 Se sometieron a ensayo los profarmacosalquilantes de fosforamidato de la invencion en el siguiente analisis. Se sembraron celulas H460 humanas en crecimiento exponencial (obtenidas de la ATCC) en placas de vi drio con muescas de 60 mm a una densidad de entre 2,5 y 5 x 105 celulas por placa y se hicieron crecer en medio RPMI con un suplemento de suero bovino fetal al 10% durante 2 dias antes de iniciar el tratamiento con el farmaco. El dia del ensayo, se prepararon soluciones de partida de farmaco de concentraciones conocidas en medio completo, y se
10 anadieron2ml dela solucion de partidadeseada a cada placa.Paralograr un equilibriocompletoentre lafase gaseosa circundante y la fase liquida, se retiro la tapa de la placa de vidrio y la placa se sacudio durante 5 minutos sobre un aparato de sacudimiento orbital. Las placas se recuperaron y se almacenaron en el interior de una caja de manipulacioncon guantes. La caja de manipulacion con guantes se evacuo y se gaseo o bien con una mezcla gaseosa anoxica certificada (95% de nitrogeno y 5% de dioxido de carbono) o bien con una mezcla gaseosa aerobia
15 (normoxica) (95% de aire y 5% de dioxido de carbono). Despues las celulas se incubaron con el farmaco durante 2 horas a 37�C.
Al final del tratamiento con el profarmaco, se retiraron las placas de cada recipiente, y el profarmaco fue rapidamente retirado de las celulas. Las placas se lavaron con solucion salina tamponada con fosfato y una solucion de tripsina20 EDTA y despues se trataron con tripsina durante 5 minutos a 37�C. Las celulas separadas se neutralizaron con medio mas suero y se recogieron por centrifugacion durante 5 min a 100 xg. Las celulas se resuspendieron a aproximadamente 1x106 celulas/ml y se diluyeron 1:10 para producir concentraciones de partida para el cultivo en placa. La concentracion de cada solucion de partida se determino mediante recuento con un contador de particulas Coulter Z2. Se cultivaron en placa numeros conocidos de celulas, y las placas se colocaron en una incubadora entre
25 7 y 10 dias. Las colonias se fijaron y se tineron con una solucion de etanol del 95% y cristal violeta al 0,25%. Se contaron las colonias de mas de 50 celulas, y se determino la fraccion superviviente.
Se llevaron a cabo analisis clonogenicos basados en celulas HT29 de la misma manera que se ha descrito mas arriba y en el Ejemplo 11.
30 Se determinola citotoxicidad de los compuestos (Tablas1A y 1B) en hipoxia y en normoxiamediante analisis clonogenico empleando las lineas celulares H460 y HT29 proporcionadas en el Ejemplo 11 y se expreso como la CI90 en !M, y mediante analisis anti-proliferacion realizado modificando un analisis de multiples pocillos descrito por Hay et al., J. Med. Chem., 2003, 46:169-82 empleandolas lineas celulares H460, HT29, HCT116, y DN-5 y se
35 expreso como la CI50 en !M (vease el Ejemplo 9). La razon de CI50 o CI90 determinada en normoxia e hipoxia se denomina razon de citotoxicidad en hipoxia (HCR) y puede ser una medida de la citotoxicidad selectiva en hipoxia de los profarmacos de la presente invencion.
Tabla 1A (H460)
Comp. Num.
logP Hipoxia Normoxia HCR
P
C P C P C
36
-0,1 0,88 0,2 �100 �100 �110 �500
25
0,05 50 1000
40 Tabla 1B
Comp Num.
HT29 DN-5 HCT116
P
C HCR P HCR P HCR
H
N H N P C H N H N
36
55(35) �100 3 �2 7,5 �100 �13 5 �100 �20
25
16 �100 �6 1 �100 �100 0,9 �100 �100
P = Proliferacion; C = Clonogenico; H = Hipoxia; N = Normoxico

Ejemplo 14 Efecto del Compuesto 25 sobre la Distribución del Ciclo Celular
Se sembraron las celulas (H60, PC3 y HT29) a una densidad de 1,0 x 106 celulas/3 ml de medio por placa de 60 mm. Despues de 24 h de anclaje, las celulas se expusieron al Compuesto 25 a las concentraciones indicadas durante 2 h o bien en normoxia (aire) o bien en anoxia (nitrogeno). Las celulas se lavaron dos veces, y se incubaron durante 22 h mas en medio de nueva aportacion. Las celulas se trataron con tripsina, se centrifugaron, y se fijaron en etanol del 75% al menos durante 24 h a -20�C. Se determino la distribucion del ciclo celular utilizando el reactivo para el Ciclo celular Guava (Guava, Hayward, CA) mediante citometria de flujo (Guava, Hayward, CA). Los datos demuestran que el Compuesto 25 induce la detencion del ciclo celular de una manera dependiente del oxigeno y de la concentracion en multiples lineas celulares cancerosas humanas.
Celulas H460
!M
G0/G1 S G2/M
0
Aire 56 12 30
Nitrogeno
59 11 26
0,005
Aire 38 18 42
Nitrogeno
50 12 38
0,05
Aire 58 11 28
Nitrogeno
30 7 59
0,5
Aire 58 11 28
Nitrogeno
23 31 40
5
Aire 42 6 59
Nitrogeno
47 15 17
50
Aire 14 19 65
Nitrogeno
33 14 11
celulas PC3
!M
G0/G1 S G2/M
0
Aire 54 13 33
Nitrogeno
60 12 28
0,0005
Aire 55 12 32
Nitrogeno
59 10 31
0,005
Aire 52 13 34
Nitrogeno
56 11 32
0,05
Aire 55 12 33
Nitrogeno
43 12 44
0,5
Aire 55 13 32
Nitrogeno
21 33 46
5
Aire 55 12 32
Nitrogeno
35 38 26
celulas HT29
!M
G0/G1 S G2/M
0
Aire 50 14 36
Nitrogeno
47 13 39
0,005
Aire 52 12 35
Nitrogeno
46 14 40
celulas HT29
!M
G0/G1 S G2/M
0,05
Aire 50 15 35
Nitrogeno
37 11 52
0,5
Aire 48 14 37
Nitrogeno
8 8 84
5
Aire 47 13 39
Nitrogeno
14 50 36
5
Aire
Nitrogeno
Ejemplo 15
Modelo Esferoide
5 Se utilizaron dos lineas celulares cancerosas humanas en estos estudios de esferoides para determinar la eficacia de los profarmacos alquilantes de fosforamidato activados hipoxicos. Se sembraron celulas de adenocarcinoma colorrectal HT29 (carcinoma de colon) directamente en un matraz de agitacion de 125 ml a 10.000 celulas/mL y se hicieron crecer en medio RPMI con un suplemento de FBS al 10% yantibioticos. A medida que estascelulas se
10 dividian, se adherian entre si y formaban esferoides. Se sembraron celulas de carcinoma de pulmon H460 en un matraz recubierto con una superficie no adherente para formar pequenas bolas de celulas que se pueden sembrar en un matraz de agitacion. Para iniciar las siembras de celulas H460, se recubrieron matraces para el cultivo de tejidos de 150 cm2 con agarosa al 1% y despues se anadieron 10.000 celulas por matraz y se dejo que crecieran en medio RPMI con un suplemento deFBS al 10% y antibioticos durante 3 a 5 dias antes de sembrarlas en cultivos
15 celulares con agitacion c entrifuga. P ara ambas lineas celulares, e l m edio de cr ecimiento s e ca mbio c ada dia despues de que los esferoides se hicieran visibles a simple vista.
Con el fin de determinar la morfologia y la localizacion de las regiones hipoxicas dentro de un esferoide intacto, se prepararon los esferoides completos para la histologia. Para las secciones congeladas, se lavaron los esferoides
20 intactos en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) y se embebieron en OCT y se congelaron rapidamente en una solucionde hielo seco/2-metilbutano antes de ser almacenado a -80�C. Para las secciones embebidas en parafina, los esferoides intactos se fijaron en una solucion recien preparada de paraformaldehido al 4% en PBS y con posterioridad se embebieron y se seccionaron.
25 Para evaluar la capacidad de un profarmaco alquilante de fosforamidato para penetrar en las celulas cancerosas hipoxicas internas, activadas, liberar el alquilante de fosforamidato, y eliminar aquellas celulas cancerosas internas, se midio la supervivencia clonogenica de los esferoides expuestos al farmaco durante 2 h.
Los esferoides se colocaron en un nuevo medio de crecimiento y se incubaron durante al menos 1 h antes de
30 comenzar l os experimentos. Los esferoides ent re 500 y 600 !m se ai slaron m ediante f iltracion del cu ltivo de esferoides a traves de una serie de filtros de malla esteril de tamano definido. Se colocaron entre 10 y 20 esferoides sobre una placas Pyrex de 60 mm con muescas siliconizada en 3 mL de medio con la concentracion deseada de compuesto de ensayo. Las bandejas se colocaron en recipientes de aluminio sellados y se expusieron a una serie de evacuaciones y gaseados con gases certificados que contenian 5% de CO2 y una cantidad definida de O2 (0% de
35 O2, 3% de O2, 10% de O2 o aire). Se incubaron los esferoides en un bano de agua con sacudimiento para asegurar tanto el equilibrio del O2 disuelto en la solucion como la integridad de los esferoides en la solucion durante 2 h. El compuesto de ensayo se retiro y los esferoides se lavaron antes de ser completamente digeridos con tripsina. Puesto que el nucleo necrotico contiene desechos celulares se requirio un tratamiento con ADNasa I para producir una sola suspension celular uniforme. Las celulas se resuspendieron a 106/mL y se cultivaron para la supervivencia
40 clonogenica.
Los experimentos de respuesta a la dosis inicial se llevaron a cabo en celulas en monocapa en nitrogeno, 0,6% de O2, o aire para establecer el intervalo de dosis apropiado y la dependencia del oxigeno de la liberacion del alquilante de fosforamidato a partir de un profarmaco alquilante de fosforamidato. La supervivencia clonogenica fue el criterio 45 de valoracionylos datos se resumen por los valores de laCI90o C90(laconcentracioninhibidora requerida para eliminar el 90% de las celulas y producir un 10% de supervivencia). Se emplearon daunorrubicina y cisplatino, cada uno de los cuales penetra en los esferoides en un grado diferente, para eliminar las celulas cancerosas aerobicas externas del esferoide. Se utilizo daunorrubicina para penetrar las capas externas de un esferoidemulticelular
debido a su elevada afinidad hacia las celulas y se utilizo cisplatino a una dosis apropiada para eliminar solamente las celulas cancerosas aerobicas externas. Como control para un farmaco biorreductor que eliminaba las celulas en hipoxia en cultivos monocapa, pero no en cultivos celulares multicelulares debido a su elevada reactividad y escasa penetracion, se utilizo Tirapazamina tantoen experimentos basados en monocapas como en esferoides como se tabula mas abajo para las celulas H460 expuestas durante 2 h.
Valores de CI90 para las celulas H460 expuestas en forma de monocapas o esferoides
Farmaco
Monocapa Esferoide 10% de O2
N2
0,6% de O2 Aire
Cisplatino
4,2 !M 7,7 !M 7,3 !M 8,0 !M
Daunorrubicina
0,16 !M 19 !M
Tirapazamina
14 !M 27 !M �100 !M �200 !M
Se sometieron a ensayo los profarmacos alquilantes de fosforamidato en esferoides para determinar su capacidad 10 para penetrar en las celulas cancerosas hipoxicas que yacen en el interior, activarse, y eliminar las celulas hipoxicas. Los resultados se tabulan mas abajo.
CI90 para las celulas H460 expuestas en forma de monocapas o esferoides a profarmacos de fosforamidato durante 2 h.
Compuesto
Monocapa Esferoide 10% de O2
N2
0,6% de O2 Aire
25
0,1 !M 0,6 !M 20 !M 15 !M
36
1 !M 100 !M ��100 !M
Se demostraron resultados similares para la eficacia del Compuesto 25 en los esferoides de HT29 como se tabula mas abajo:
Compuesto
Monocapa Esferoide 10% de O2
N2
10,6% O2 Aire
25
0,2 !M 3 !M 40 !M 29 !M
20 El pr ofarmaco al quilante d e f osforamidato se co mbino simultaneamente co n c isplatino o d aunorrubicina y los esferoides se expusieron durante 2 h a la combinacion, seguido de la medicion de la supervivencia clonogenica. Los resultados se tabulan mas abajo:
Compuesto
CI50 (!M)
Daunorrubicina
17
Compuesto 25
9
Daunorrubicina � Compuesto 25
2,3
Compuesto
CI50 (!M) CI99 (!M)
Cisplatino
14
Compuesto 25
12
Cisplatino � Compuesto 25
2,3 5,4
25 Los profarmacos alquilantes de fosforamidato demuestran una capacidad para penetrar en las celulas subyacentes internas en el esferoide y eliminar las celulas cancerosas hipoxicas solos y combinados con otros agentes que eligen como diana las celulas cancerosas aerobicas.
Ejemplo 16
Análisis Antiproliferación – Células Mutantes para la Reparación de ADN
Se obtuvieron celulas de ovario de hamster Chino mutantes para rutas de reparacion de ADN especificas de la ATCC. Se sometieron a ensayo las siguientes lineas celulares con 2.500 o 3.000 celulas/pocillo/500 !L de Medio de Eagle Modificado porDulbecco (Gibco)con un suplemento de suero bovino fetal al 10% y antibioticos:celulas AA8 (ATCC CRL-1859), celulas EM9 (ATCC CRL-1861), celulas UV41 (ATCC CRL-1860), celulas UV135 (ATCC CRL5 1867), celulasIRS1SF. Todas las lineas celulares se escrutaron inicialmente con un analisis anti-proliferaciony aquellas que demostraron sensibilidad se volvieron a someter a ensayocon el analisis clonogenico(como se ha descrito previamente) para confirmar los resultados de la proliferacion. Las celulas se expusieron a dosis seleccionadas de profarmacos alquilantes de fosforamidato de la presente invencion durante 2 h en condiciones hipoxicas o aerobicas, el compuesto de ensayo se retiro, y las celulas se analizaron. La siguiente tabla enumera las
10 lineas celulares, la ruta mutada, y el defecto en el gen especifico:
Linea celular
Ruta mutante Defecto en el gen
AA8
Ninguna (Tipo salvaje) (Ninguno)
EM9
Reparacion de la escision de bases NRCC1
UV135
Reparacion de la escision de nucleotidos NPG
UV41
Reparacion de la escision de nucleotidos y Recombinacion homologa NPF
Irs1SF
Recombinacion homologa NRCC3
La siguiente tabla enumera el efecto de la exposicion de diferentes lineas celulares a losCompuestos 25 y 36 en condiciones anoxicas o aerobicas y analizadas mediante la proliferacion medida por la CI50.
Compuesto
AA8 (Anoxia / Aire) EM9 (Anoxia / Aire) UV41 (Anoxia / Aire) UV135 (Anoxia / Aire) IRS1SF (Anoxia / Aire)
36
2/�100 4/�100 0,03 / 20 2/�100 0,3/59
25
8/�100 7/�100 0,2/95 6/�100 2/�100
La s iguiente t abla e numera l os va lores de CI90 para l a su pervivencia cl onogenica para c elula seleccionadas expuestas al Compuesto 25 en condiciones anoxicas o anaerobicas.
Linea Celular
CI90 (!M)
N2
Aire
AA8
0,85 �300
UV41
0,02 17
Irs1SF
0,02 20
Solamente las lineas celulares con una recombinacion homologa defectuosa fueron sensibles al Compuesto 25 en
hipoxia. Puesto que UV41 participa tanto en la ruta de reparacion de la escision de nucleotidos como en la ruta de
reparacion de la recombinacion homologa, el Compuesto 25 posiblemente tambien produjo una cantidad significativa 25 de monoaductos. Sin embargo, UV135 que tambien esta implicado en la reparacion de la escision de nucleotidos no
fue sensible al Compuesto 25. Las lesiones predominantes producidas por el C ompuesto 2 5 fueron los
entrecruzamientos intercatenarios en el ADN. Estos resultados fueron confirmados en celulas UV41 e irs1SF con el
analisis clonogenico. La exposicion en condiciones aerobicas produjo el mismo espectro de sensibilidades que se
habia observado en hipoxia, indicando que la toxicidad aerobica tambien estaba causada por la formacion de 30 entrecruzamientos intercatenarios en el ADN. El Compuesto 36 mostro un patron de sensibilidad similar en las lineas
celulares mutantes, indicando que el Compuesto 36 tambien producia entrecruzamientos intercatenarios en el ADN.
Ejemplo 17
35 Análisis de Cultivos Celulares de Múltiples capas
Este ejemplo demuestra el efecto del Compuesto 25 sobre la penetracion en el tejido utilizando cultivos celulares de multiples capas (MCC) y evalua cualquier efecto presencial. Los MCC se incubaron con medio oxigenado (20% de O2 y 5% de O2) o medio hipoxico (aproximadamente 0% de O2) y se expusieron al compuesto de ensayo desde un lado (superficie expuesta, lado normoxico) mientras el otro lado fue temporalmente cerrado (lado mas alejado, lado
5 hipoxico). Cuando se incuban los MCC en un medio con20% de O2o 5%de O2 se desarrolla un gradiente de oxigeno desde la superficie expuesta al medio hacia la superficie mas lejana del cultivo. Los 50 !m de tejido mas lejano agotan el oxigeno. El grado de agotamiento de O2 es mayor en el medio gaseado con 5% de O2 que en el gaseado con 20% de O2; la incubacion con 5% de O2 refleja la situacion in vivo mas exactamente. La incubacion de los MCC con medio a 0% de O2 modela la hipoxia limitada por perfusion, donde los vasos sanguineos tumorales se quedan completamente sin oxigeno y el compuesto de ensayo penetra considerables distancias para alcanzar todas las celulas. Esta situacion por lo tanto supone una barrera mayor para la penetracion del farmaco, si la union del farmaco activado actua limitando su penetracion.
Se llevaron a cabo experimentos basados en MCC con medios gaseados con 0, 5 o 20% de O2 durante 45 minutos
15 antes y durante la incubacion con el compuesto de ensayo. Se hicieron crecer celulas HCT116 hasta un grosor de 150 !m sobre un soporte solido y un lado del cultivo se pinzo para desarrollar una hipoxia por difusion limitada. Los cultivos se expusieron al compuesto de ensayo durante 1 hr bajo 0% de O2, 5% de O2 o 20% de O2 y se evaluo la eficacia midiendo la inhibicion de la incorporacion de BrdU. Los cultivos se incubaron durante una segunda hora en medio de nueva aportacion a 20% de O2 yse retiraron del aparato y se devolvieron a una camara de crecimiento normal, donde el medio fluye a ambos lados del MCC. Los cultivos se incubaron durante 24 horas antes del marcaje con BrdUrd y el posterior crioseccionamiento. Se analizaron el marcaje con BrdUrd en los lados expuesto y alejado del MCC utilizando la tincion inmunohistoquimica, imagenes microscopicas y analisis de imagenes por ordenador para evaluar el efecto del Compuesto 25 sobre la proliferacion celular.
25 Cuando los cultivos se expusieron a dosis graduales del Compuesto 25 en 20% de O2, se requirieron 5 veces menos de compuesto en el lado lejano (hipoxico) en comparacion con el lado expuesto (normoxico) para producir resultados comparables, demostrando l a penetracion y la act ivacion h ipoxica del C ompuesto 2 5. Cuando los MCC s e expusieron al compuesto de ensayo en una condicion mas fisiologicamente relevante de 5% de O2, el Compuesto 25 fue 10 veces mas eficaz en la inhibicion de la incorporacion de BrdU en el lado hipoxico en comparacion con el lado normoxico. L os lados normoxicos de los cu ltivos a 5% y 20% de O2 resultaron i gualmente afectados por l a exposicion al Compuesto 25.
El Compuesto 25 es mas eficaz en el lado hipoxico de los cultivos con 5% de O2 que con 0% de O2. La comparacion de los lados normoxicos versus los lados hipoxicos de los cultivos en 5% de O2 demostro que el Compuesto 25 35 penetra eficazmente a traves de tejidos relativamente bien oxigenados. ElCompuesto 25 es capazdeeliminar las celulas hipoxicas localizadas a alrededor de 150 !m de los vasos sanguineos funcionales. Se observo una reduccion de aproximadamente 3 veces en la exposicion al Compuesto 25 para el lado hipoxico en 0% de O2 con respecto a la exposicion en condiciones de 5% de O2. Se observo un efecto presencial solamente a la concentracion mas elevada.
La siguiente tabla enumera el efecto de e expuesto a dosis graduales del Compuesto 25 medidomediante la CI50 (concentracion para inhibir la incorporacion de BrdU en 50%).
Lado
0% de O2 (!M) 5% de O2 (!M) 20% de O2 (!M)
Hipoxico
ѝ1,1 0,7 2,6
Normoxico
ѝ1,7 8,0 �10
Ejemplo 18
Metabolismo del Compuesto 25
Por Proteína Microsomal Humana y de Ratón
Se llevo a cabo una evaluacion in vitro de la estabilidad metabolica de un profarmaco alquilante de fosforamidato (Compuesto 25) utilizando proteinas microsomales de higado humano (HLM), de rata (RLM) y de raton (MLM) que contenian enzimas citocromo P450. Se preparo una solucion del Compuesto 25 (500 !L, 5!M) diluyendo una solucion de partida de DMSO 100 veces en una solucion puente de agua:metanol, anadiendo proteina microsomal (1 mg/mL) en PBS/MgCl2, y se iniciaron las reacciones enzimaticas anadiendo una solucion de NADPH. Se retiraron
55 50 !l de la mezcla dereaccion a los 0, 10,20, y 30 minutos de la adicion de la solucion de NADPH,se hicieron precipitar las proteinas con acetonitrilo y se analizo el sobrenadante claro para determinar la cantidad del Compuesto 25 mediante CL-EM/EM de fase inversa. Se utilizaron nifedipina y testosterona como controles positivos. El primer estudio comparo RLM con MLM (Tabla 1) y el segundo estudio comparo HLM con RLM (Tablas 2A y 2B)
Tabla 1
Compuesto
Estabilidad metabolica (% a los 30 min)
RLM
MLM
25
84% 89%
Nifedipina
6% 4%
Testosterona
0% 6%
Tabla 2A
Compuesto
Estabilidad metabolica (% a los 30 min)
HLM
RLM
25
127% 137%
Nifedipina
22% 2%
Testosterona
65% 33%
Tabla 2B
Comp. Num.
Estabilidad metabolica (MLM) Estabilidad en plasma (% a los 30 min) MTD (mg/ ml) Administracion intravenosa en ratones Administracion intraperitoneal en ratones
(% a los 30 min)
t 1/2 (hr) Cmax (!g/ml ) AUC (!g/ml x hr) Vss(l/kg) CL (ml/min /kg) t 1/2 (hr) Cmax (!g/ml) AUC (!g/ml x hr)
25
92 102 (at 20 min) 0,11 (6,7 min) 27,5 0,18 (11 min) 22,9
36
90 60 400 0,24 27,7 10,8 1,27 77,4 0,18 44 26,1

Ejemplo 19 Farmacocinética In Vivo de los Profármacos Alquilantes de Fosforamidato
Se determinaron diferentes parametros farmacocineticos en plasma de los profarmacos alquilantes de fosforamidato en ratones CD-1 excepto cuando se indica como se enumera mas abajo en la Tabla 3.
Tabla 3
Farmaco (mg/kg)
Dosis (mg/kg) Ruta Formulacion Tmax(min) Cmax(!g/mL) AUC (!g-h/mL) Vida media (min)
36
50 i.p. PEG 25%/ Solucion salina 75% 15,0 44,0 1439 11,0
36
50 i.v. PEG 25%/ Solucion salina 75% 5,00 27,7 646 14,1
aRatones Balb/c
Ejemplo 20
Farmacocinética In Vivo del Compuesto 25
20 Se determinaron diferentes parametros farmacocineticos en plasma o tumor del Compuesto 25 en ratones CD-1 excepto cuando se indica como se enumera mas abajo en la Tabla 4.
Tabla 4
Dosis (mg/kg)
Ruta Formulacion Tmax (min) Cmax(!g/mL) AUC (!g-h/mL) Vida media (min) Fc(%)
150a
i.p. Solucion salina 5,00 90,1 1239 58,7 -
150a,b
i.p. Solucion salina 15,0 3,38 307 ND -
100
p.o. Solucion salina 15,0 15,8 784 95,2 -
50
i.p. PEG 30%/ Solucion salina 70% 5,00 22,9 438 11,0 -
50
i.v. PEG 30%/ Solucion salina 70% 2,0 27,5 325 6,7 -
50
i.p. PEG 30%/ Solucion salina 70% 15,0 9,2 - - -
50
i.v. PEG 30%/ Solucion salina 70% 2,0 27,5 177 10,1 -
50
i.p. Solucion salina 5,00 38,5 635 7,91 -
50
p.o. Solucion salina 15,0 0,93 40,4 25,7 13,6
25
i.p. PEG 10% 45,0 6,33 247 4,43
aRatones atimicos con tumor H460 bPK tumor cBiodisponibilidad
Ejemplo 21
5 Inhibición por Citocromo P450 del Metabolismo del Compuesto 25
Se prepararon 8 pocillos de reaccion con 100 !L de unasolucion que conteniafosfatode potasio 50mM, pH 7,4, NADP� 2,6 mM, glucosa-6-fosfato 6,6 mM, 0,8 U/mL de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, y diluciones seriadas 1:3 del compuestode ensayo (tal como el Compuesto 25) junto con ocho pocillos de diluciones seriadas 1:3 de un
10 inhibidor de control positivo adecuado (tal como furafilina para CYP1A2, sulfafenazol para CYP2C9, N-bencilnirvanol para CYPC219, qu inidina para CYP2D6 y cetoconazol par a CYP3A4). Las concentraciones de co mpuesto de ensayo oscilan entre 0,0229 !M y200 !M. Las reacciones se iniciaron anadiendo100 !L de una solucion de enzima/sustrato previamente calentada. Se preparo una reaccion de control a tiempo cero anadiendo 50 mL de acido formico al 10% (400 mL de acetonitrilo para 2C 19) en agua a 100 mL de solucion de cofactor para inactivar
15 las enzimas, anadiendo despues 100 mL desolucion de enzima/sustrato. Tambien se preparo una reaccion de control sin inhibidor. Despues de una incubacion adecuada a 37�C, las reacciones se terminaron por medio de la adicion de 50 mL de acido formico al 10% en agua (400 mL de acetonitrilo para 2C 19). Las reacciones se prepararon y se analizaron para determinar las formas de metabolito del sustrato de la sonda (fenacetina parar CYP1A2, diclofenaco para CYP2C9, (S)-mefenitoina para CYPC219, dextrometorfano para CYP2D6 y midazolam,
20 testosterona y nifedipina para CYP3A4) utilizando CLAR-EM/EM. Cada analisis se llevo a cabo por duplicado. Mas abajo se enumera un resumen de los valores de la CI50.
Tabla 5
CI50 (mM)
Isoforma
Control Compuesto 25
1A2
8,6 NI
CI50 (mM)
Isoforma
Control Compuesto 25
2C9
0,20 ѝ10
2C19
6,0 NI
2D6
0,21 �50
3A4 Midazolam
0,049 �50
3A4 Nifedipina
0,03 NI
3A4 Testosterona
0,10 �50
NI = Sin inhibicion significativa detectada
Ejemplo 22
Determinación de los Metabolitos Potenciales del Compuesto 25 Formados en Hepatocitos de Ratón, Rata, 5 Perro y Ser Humano
Se incuba el Compuesto 25 con hepatocitos crioconservados de raton, rata, perro,mono y ser humanoauna concentracionde 10 !M. Lasreacciones se detienen a los0 (pre-incubacion), 30, 60 y 120 minutos sofocando con acetonitrilo antes de la centrifugacion y el analisis mediante cromatografia de liquidos de alta resolucion (CLAR) 10 junto con espectrometria de masas en tandem (CL-EM/EM). Los metabolitos potenciales se identifican llevando a cabo barridos completos de100a520amu. Los espectros ionicos producto de los metabolitos potenciales se recogen con posterioridad y se comparan con el espectro ionico producto del compuesto parental para determinar si cada metabolito potencial esta r elacionado co n e l Compuesto 2 5. La desaparicion del co mpuesto p arental (Compuesto 25) y la aparicion de metabolitos potenciales a lo largo del tiempo se controlan comparando las alturas
15 de los picos en cada momento puntual adquirido.
Ejemplo 23
Determinación de la Farmacocinética In Vivo del Compuesto 25 y sus Metabolitos en Rata, Perro y Mono
20 Se determinanlos parametros farmacocineticos del Compuesto 25 y sus metabolitos en ratas Sprague Dawley despues de la administracion intravenosa de 5, 20, 50 y 100 mg/kg de Compuesto 25. Tambien se determinara la farmacocinetica del Compuesto 25 y sus metabolitos en perros beagle y monos cinomologus despues de una unica administracion intravenosa de 20 mg/kg de Compuesto 25. Se determinan las concentraciones del Compuesto 25 y
25 sus metabolitos en plasma mediante el metodo CL-EM/EM y se computan los parametros farmacocineticos medios.
Ejemplo 24
Estudio del Equilibrio de Masas en Ratas
30 Se administra Compuesto 25-C14 a ratas Sprague-Dawley con una canula en el conducto biliar y normales en una unica dosis intravenosa. Se recogen el plasma sanguineo, la orina, y las heces en momentos especificados y se determinan las concentraciones de radiactividad total mediante recuento de centelleo en liquido (RCL).
35 Ejemplo 25
Autorradiografía Cuantitativa del Organismo Completo
Se administra a r atas Sprague-Dawley u na un ica d osis intravenosa de C ompuesto 25 -C14. En l os momentos
40 especificados, se somete a eutanasia una rata por momento puntual. Se centrifuga la sangre para obtener el plasma, y se analizan las sangre y el plasma para determinar la concentracion de la radiactividad. Los cadaveres congelados de las ratas se embeben en CMC al 2%, se congelan en un bloque, y se hacen secciones de 40 !m en un criomicrotomo Leica CM 3600. Las secciones recogidas se liofilizan, se montan y se exponen sobre placas de fosforo para el diagnostico de imagenes junto con patrones autorradiograficos C14 para el posterior calibrado con un
45 soporte logico de analisis de imagenes. Las pantallas expuestas se escanean utilizando Molecular Dynamics Storm 820 o 860. Se mide la concentracion de radiactividad en tejidos incluyendo tejido adiposo (pardo y blanco), glandula suprarrenal, sangre, cerebro (cerebro, c erebelo, m edula), hueso, m edula osea, c iego y c ontenidos, epi didimo, esofago, globo ocular (tracto uveal, humor acuoso, cristalino), glandula Harderiana, corazon, rinon (cortex, medula, papila y seccion completa), intestino grueso y contenidos, higado, pulmon, ganglio linfatico submaxilar), pancreas,
glandula pituitaria, glandula prostatica, glandula salivar, vesiculas seminales, musculo esqueletico, piel, estomago (y contenidos), intestino delgado (y contenidos), bazo, medula espinal, traquea, tiroides y vejiga urinaria (y contenidos) mediante analisis de imagenes. Se producen autorradioluminografias e imagenes digitales para cada animal.
5 Ejemplo 26
Unión a Proteínas del Plasma del Compuesto 25
Se determina la union a proteinas del plasma de raton, rata, perro, mono y ser humano del Compuesto 25 utilizando
10 ultrafiltracion. La ultrafiltracion se lleva a cabo tomando alicuotas del plasma preparadas a tres concentraciones con Compuesto 25 en un dispositivo Centrifree� por triplicado. Despues todas las muestras de plasma se equilibran a 37�C. El aparato Centrifree�se centrifuga a 37�C durante 30 minutos a2500 x g. Una alicuota de 75 !L del producto ultrafiltrado se prepara con el I.S. (Compuesto 25 deuterado) yse analiza utilizandoCL-EM/EM. Los productos ultrafiltrados se analizan y se cuantifican utilizando patrones de productos ultrafiltrados humanos para la
15 curva de calibracion.
Ejemplo 27
Este Ejemplo demuestra la utilidad de un compuesto de esta invencion en el tratamiento del cancer empleando un 20 modelo de raton con xenoinjerto de carcinoma de colon humano HT-29.
Se dejo que ratones CB17/SCID hembra (adquiridos de Charles River, Cambridge, MA), 7-8 semanas de edad, se aclimataran durante al menos tres dias, y se manipularon en condiciones libres de patogenos. Se obtuvo la linea celular de carcinoma de colon humano HT-29 de la Coleccion de Cultivos Tipo Americana. Las lineas celulares se 25 cultivaron en medio RPMI 1640 con un suplemento de suero bovino fetal al 10%. Las celulas se mantuvieron en una incubadora a 37�C con 5% de CO2. Se cosecharon las celulas HT-29 del cultivo y se inocularon a 3 x 106 celulas/animal en el espacio subcutaneoperitoneal. Cuando los tumores crecieron hasta un volumen medio de 100 mm3 (dia 8), se administro a cada grupo de 10 ratones durante tres semanas, vehiculo solo (solucion salina y PEG (10 mL/kg cada uno), Grupo 1), Compuesto 36 solo (disuelto en ciclodextrina al 30% en PBS) a una dosis
30 diaria de 20, 60, o 200 mg/kg (Grupos 2, 3y4, respectivamente), yCompuesto 36 a una dosis diariade 20,60, y 200 mg/kg suministrados 2-3 horas despues de una dosis de 10 mg/kg de 5FU (en solucion salina) (Grupos 5, 6 y 7, respectivamente) y en comparacion con un grupo que recibio solamente 5FU a 10 mg/kg (Grupo 8) como se tabula mas abajo.
35 Se registro el peso corporal de cada ratondos veces por semana. Se controlo el crecimiento de cada xenoinjerto midiendoexternamente los tumores en dosdimensiones utilizandoun calibredigitaldos vecespor semana. Se determino el volumen del tumor (V) por medio de la siguiente ecuacion: V = (L x W2)/2, donde L es la longitud y W es la anchura de un xenoinjerto. Los volumenes de los tumores se midieron dos veces por semana.
40 La a dministracion del C ompuesto 36 a 20, 60, y 20 0 m g/kg/dia cada uno redujo el crecimiento de l tumor e n comparacion con la administracion de vehiculo solo. La administracion de una combinacion del Compuesto 36 y 5FU dio como resultado una inhibicion mayor y dependiente de la dosis del crecimiento del tumor en comparacion con el vehiculo. Ademas las combinaciones de 60 y 200 mg/kg del Compuesto 36 redujeron el crecimiento del tumor en un grado mayor que el 5FU solo.
Grupo
Tratamiento (mg/kg) % Inhibicion vs
Grupo 1
Grupo 8
2
20 34,6 -
3
60 16,1 -
4
200 20,2 -
5
20 � 5FU 35,7 3,3
6
60 � 5FU 46,9 13,3
7
200 � 5FU 58,2 23
8
5FU 38,7 -
Hubo una cierta perdida de peso asociada con estos efectos anti-tumorales y una mortalidad ocasional, particularmente en el grupo tratado con la dosis elevada del Compuesto 36 pero tambien en los otros grupos. En 50 conjunto, el Compuesto 36 mostro tasas variables de inhibicion del crecimiento del tumor. 41
Ejemplo 28
Este Ejemplo demuestra la utilidad de un compuesto de esta invencion en el tratamiento del cancer empleando un modelo de raton con xenoinjerto de carcinoma de pulmon de celulas no pequenas humano NCI H460.
5 Se permitio que ratones CB 17/SCID hembra (adquiridos de Charles River, Cambridge, MA), de 7-8 semanas de edad, se aclimataran durante al menos tres dias, y se manipularon en condiciones libres de patogenos. Se obtuvo la linea c elular NCI H 460 de la C oleccion de C ultivos Tipo A mericana. Las lineas celulares se cu ltivaron y s e cosecharon de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 27 y se inocularon a 1 x 106 celulas/animal en el
10 espacio subcutaneo peritoneal. Cuando los tumores crecieron hasta un volumen medio de 100 mm3 (dia 8), se administraron a cada grupo de ratones durante tres semanas, como se tabula en la tabla de mas abajo: Compuesto 25 (2,5 mg/ml en PEG al 10%; ruta de administracion -i.p.) y Taxol (1 mg/ml en EtOH del 5%, Cremofor al 5% y solucion salina al 90%; administracion - i.v. 2 h despues de la administracion del Compuesto 25). Se midieron el peso corporal y los volumenes de los tumores como se describe en el Ejemplo 27 de mas arriba.
Protocolo de Tratamiento
Grupo (n= 10)
Tratamiento Dosis (mg/kg) Regimen
1a�
No Aplicable (NA) NA NA
1b�
Solucion salina NA (q1d x 5) / semana x 2 semanas
2
Vehiculo NA (q1d x 5) / semana x 2 semanas
3
Compuesto 25 25 (q1d x 5) / semana x 2 semanas
4
Compuesto 25 50 (q2d x 3) / semana x 2 semanas
5
Compuesto 25 100 (q7d x 1) / semana x 2 semanas
6
Taxol NA (q2d x 3) / semana x 2 semanas
7
Compuesto 25 25 (q1d x 5) / semana x 2 semanas
Taxol
10 (q2d x 3) / semana x 2 semanas
8
Compuesto 25 50 (q2d x 3) / semana x 2 semanas
Taxol
10 (q2d x 3) / semana x 2 semanas
9
Compuesto 25 100 (q7d x 1) / semana x 2 semanas
Taxol
10 (q2d x 3) / semana x 2 semanas
Grupos 1a y 1b, n = 5; q1d/qd = cada dia; q2d = en dias alternos; q7d = cada siete dias.
20 Los resultados se presentan en la Tabla N2 basandose enla medicion del volumen tumoral el dia 29 cuando los ratones tratados con vehiculo han alcanzado un volumen de 946 mm3,Se anadieron grupos de 5 ratones que recibian solucion salina o sin tratamiento con el fin de indicar cualquier efecto del vehiculo pero no se utilizaron para comparaciones en este analisis.
Grupo
% Inhibicion vs
Grupo 2
Grupo 6
3
50,1 -
4
52 -
5
46,7 -
7
65,9 38,8
8
63,1 31,7
9
52,6 12,5
6
46 -
Los resultados demuestran que los tres regimenes de dosificacion del Compuesto 25 proporcionaban gr ados similares de inhibicion del crecimiento tumoral y que la terapia combinada, particularmente con la dosificacion de
5 todos los dias proporcionaba un beneficio adicional. Cada terapia combinada estaba asociada con cierto grado de perdida de peso, pero no lo suficiente como para causar mortalidad. En conjunto los resultados indican que el Compuesto 25 es eficaz en este modelo de cancer de pulmon y proporciona un beneficio adicional al proporcionado por el agente quimioterapeutico convencional taxol.
10 Utilizando el raton para la conversionHED, se puede administrarel Compuesto 25 a una dosis terapeuticamente eficaz de alrededor de 2 a alrededor de 8 mg/kg/dia, para el tratamiento del cancer, particularmente del cancer de pulmon, solo o combinado con Taxol', donde la dosis diaria se puede administrar con una frecuencia decreciente de dosificacion para dosis mas elevadas en comparacion con dosis inferiores.
15 Ejemplo 29
Este Ejemplo descr ibe la ut ilidad de un c ompuesto d e esta i nvencion en el t ratamiento del ca ncer como se demuestra empleando un modelo de raton con xenoinjerto de carcinoma de pulmon de celulas no pequenas humano H460. Se permitio que ratones CB 17/SCID hembra (adquiridos de Charles River, Cambridge, MA), de 7-8 semanas 20 de edad, se aclimataran durante al menos tres dias, y se manipularon en condiciones libres de patogenos. Se obtuvo la linea de carcinoma de pulmon de celulas no pequenas humano NCI H460 de la Coleccion de Cultivos Tipo Americana. Las lineas celulares se cultivaron y se cosecharon como se describe en el Ejemplo 27 de mas arriba, y se inocularon a 3 x106 celulas/animal en el espacio subcutaneo peritoneal. Cuando los tumores crecieron hasta un volumen m edio de 100 m m3 (dia 8) , se a dministraron a ca da grupo de ratones (diez por grupo) durante t res
25 semanas, como se t abula en l a t abla de m as abajo: C ompuesto 25 ( 2,5 mg/ml e n PEG al 10%; ruta de administracion -i.p.); Compuesto 24 (vease el Ejemplo 34; 0,3, 0,1 mg/ml en PEG al 10%, ruta de administracion i.p.) y Taxol (1 mg/ml en EtOH del 5%, Cremofor al 5% y solucion salina al 90%; administracion -i. v. 2 h despues de la administracion del compuesto de ensayo).
30 Protocolo de tratamiento
Grupo
Num. de Ratones Tratamiento Dosis (mg/kg) Regimen
1
10 Vehiculo� NA (q1d x 5d) / semana x 3 semanas
2
8 Taxol 10 (q2d x3) / semana x 2 semanas
3
8 Compuesto 24 3 (q1d x 5d) / semana x 3 semanas
4
9 Compuesto 24 Taxol 1 (q1d x 5d) / semana x 3 semanas
10
(q2d x3) / semana x 2 semanas
5
8 Compuesto 24 Taxol 3 (q1d x 5d) / semana x 3 semanas
Grupo
Num. de Ratones Tratamiento Dosis (mg/kg) Regimen
10
(q2d x3) / semana x 2 semanas
6
8 Compuesto 25 Taxol 25 (q1d x 5d) / semana x 3 semanas
10
(q2d x3) / semana x 2 semanas
� - 50% PEG
Se determinaron el peso corporalyel volumen de los tumores como se describe en el Ejemplo 32 anterior. Los resultados para la inhibicion del crecimiento tumoral medida el dia 27 se tabulan mas abajo. Las comparaciones se realizaron el dia 27 porque ese era el ultimo dia de mediciones para el grupo con vehiculo y esos animales fueron sacrificados.
Grupo
% Inhibicion vs
Grupo 1
Grupo 2
3
39,9 -
4
16 -32,7
5
51,5 23,3
6
56,8 31,7
2
36,7 -
10 Estos resultados demuestran que la dosis diaria de 3 mg/kg del Compuesto 24 y 25 mg/kg del Compuesto 25 inhibian el crecimiento del tumor y que el Compuesto 25 tenia un beneficio ligeramente mayor como monoterapia y combinado con taxol. Estos efectos estuvieron acompanados por leves reducciones de peso, particularmente en el grupo con Compuesto 25 � taxol.
15 Utilizando elraton para la conversionHED, se puedeadministrar el Compuesto 25 a una dosis terapeuticamente eficaz de 2 mg/kg/dia, para el tratamiento del cancer, particularmente del cancer de pulmon, solo o combinado con Taxol ', y se puede administrar el Compuesto 24 a una dosis terapeuticamente eficaz de 0,25 mg/kg/dia, para el tratamiento del cancer, particularmente del cancer de pulmon, solo o combinado con Taxol '.
20 Ejemplo 30
Este Ejemplo descr ibe la ut ilidad de un c ompuesto d e esta i nvencion en el t ratamiento del ca ncer como se demuestra empleando un modelo de raton con xenoinjerto de carcinoma de pulmon de celulas no pequenas H460. Se permitio que ratones CB17/SCID hembra (adquiridos de Charles River, Cambridge, MA), de 7-8 semanas de
25 edad, se aclimataranduranteal menostresdias,ysemanipularon en condiciones libres depatogenos. La linea celular de carcinoma de pulmon de celulas no pequenas humano NCI H460 se obtuvo de la Coleccion de Cultivos Tipo Americana. Las lineas celulares se cultivaron y se cosecharon como se describe en el Ejemplo 27 anterior, y se inocularon a 3 x106 celulas/animal en el espacio subcutaneo peritoneal. Cuando los tumores crecieron hasta un volumen medio de 100 mm3, se inicio un tratamiento en el que grupos de 10 ratones recibieron vehiculo (Grupo 1),
30 CDDP a 3 o 6 mg/kg (Grupos 2 y 3, respectivamente, IV una vez), Compuesto 25 a 50 mg/kg en solucion salina 5 veces por semana durante dos semanas (Grupo 4), Compuesto 25 a 100 mg/kg cada tres dias 5 veces (Grupo 5) o la combinacion de cada dosis del Compuesto 25 con 3 o 6 mg/kg de CDDP (Grupos 6 y 7, respectivamente). Los resultados para los grupos que recibieron 50 mg/kg del Compuesto 25 se ilustran en la Figura 1. La Figura 2 muestra resultados similares para 100 mg/kg del Compuesto 25.
35 Estos re sultados realizados con un a v ersion de l Compuesto 25 formulado en so lucion sa lina demuestran una disminucion s ignificativa del vo lumen del t umor r elacionada co n l a dosis y un i ncremento en el r etraso d el crecimiento del tumor con una dosis diaria de 50 m g/kg,y100 mg/kg con una dosificacion menos frecuente en comparacion con la empleada para la dosis diaria de 50 mg/kg. Estos datos tambien demuestran que ambos
40 regimenes de dosificacion se suman al efecto de CDDP en este modelo.
Utilizandoel raton para la conversionHED, se puede administrar el Compuesto 25 a unadosis terapeuticamente eficaz de alrededor de 4 a alrededor de 8 mg/kg/dia, para el tratamiento del cancer, particularmente del cancer de pulmon, solo o combinado con 5FU o CDDP, donde la dosis diaria se puede administrar con una frecuencia de dosificacion decreciente para dosis mas elevadas en comparacion con dosis inferiores.
Ejemplo 31
Este Ejemplo descr ibe la ut ilidad de un c ompuesto d e esta i nvencion en el t ratamiento del ca ncer como se demuestra empleando un modelo de raton con xenoinjerto de carcinoma de colon humano HT-29. Se permitio que
10 ratones CB17/SCID hembra (adquiridos de Charles River, Cambridge, MA), de 7-8 semanas de edad, se aclimataran durante al menos tres dias, y se manipularon en condiciones libres de patogenos. Se obtuvo la linea celular de carcinoma de colon humano HT29 de la Coleccion de Cultivos Tipo Americana. Las lineas celulares se cultivaron y se cosecharon como se describe en el Ejemplo 27 y se inocularon a 3 x106 celulas/animal en el espacio subcutaneo peritoneal. Cuando los tumores crecieron hasta un volumen medio de 100 mm3 (dia 8), se administraron a cada
15 grupo de ratones (diez por grupo) durante tres semanas, como se tabula en la tabla de mas abajo: Compuesto 25 en solucion salina, ruta de administracion -i.p., administrado 2 h antes de CDDP los dias en los que estaba programada la terapia combinada y CDDP (en solucion salina, IV).
Protocolo de tratamiento
Grupo (n = 9)
Articulo de Ensayo Dosis (mg/kg) Regimenes de Administracion
1
Solucion salina 10 ml/kg (qd x 5) / semana x 2 semanas
2
CDDP 5 Una vez
3
Compuesto 25 50 (qd x 5) / semana x 2 semanas
4
Compuesto 25 100 (q2d x 3) / semana x 2 semanas
5
Compuesto 25 100 �3d x 5
6
Compuesto 25 100 �7d x 2
7
Compuesto 25 50 (qd x 5) / semana x 2 semanas
CDDP
5 Una vez
8
Compuesto 25 100 (q2d x 3) / semana x 2 semanas
CDDP
5 Una vez
9
Compuesto 25 100 q3d x 5
CDDP
5 Una vez
10
Compuesto 25 100 q7d x 2
CDDP
5 Una vez
Se determinaron el peso corporal y el volumen del tumor como se describe en el Ejemplo 27. Los datos se basan en los volumenes de los tumores el dia 25 cuando los tumores del grupo con vehiculo habian alcanzado un tamano 25 suficiente como para requerir que los ratones fueran sacrificados. Los resultados de la inhibicion del crecimiento del tumor se tabulan mas abajo.
Grupo
% Inhibicion vs
Grupo 1
Grupo 2
3
28,2 -
4
30,1 -
Grupo
% Inhibicion vs
Grupo 1
Grupo 2
5
31,3 -
6
48,1 -
7
50,7 30,8
8
44,2 27,5
9
36,2 21,5
10
51,8 33,2
2
24,2 -
Los resultados demuestran que el Compuesto 25 administrado en monoterapia, formulado en solucion salina, a 50 mg/kg/dia y 100 mg/kg/dia con una variedad de regimenes de dosificacion da c omo resultado la inhibicion del
5 crecimiento tumoral en este modelo de cancer de colon, y que el tratamiento combinado del Compuesto 25 y CDDP intensificaba la eficacia del Compuesto 25 para el tratamiento del cancer de colon en este modelo. Estos efectos estuvieron acompanados de una perdida de peso corporal modesta, mas si cabe en los grupos combinados; los ratones recuperaron las perdidas de peso corporales una vez finalizado el tratamiento.
10 Utilizando el raton para la conversionHED, se puede administrarel Compuesto 25 a unadosis terapeuticamente eficaz de alrededor de 4 a alrededor de 8 mg/kg/dia, para el tratamiento del cancer, particularmente del cancer de pulmon de celulas no pequenas, solo o combinado con CDDP, donde la dosis diaria se puede administrar con una frecuencia de dosificacion decreciente para dosis mas elevadas en comparacion con las dosis mas bajas.
15 Ejemplo 32
Este ejemplo describe la utilidad de un c ompuesto d e esta i nvencion en el t ratamiento del ca ncer como se demuestra empleando un modelo de raton con xenoinjerto de carcinoma de pulmon de celulas no pequenas H460. Se permitio que ratones CB17/SCID hembra (adquiridos de Charles River, Cambridge, MA), de 7-8 semanas de
20 edad, se aclimataranduranteal menostresdias,ysemanipularon en condiciones libres depatogenos. La linea celular de carcinoma de colon humano NCI H460 se obtuvo de la Coleccion de Cultivos Tipo Americana. Las lineas celulares se cultivaron y se cosecharon como se describe en el Ejemplo 27 y se inocularon a 3 x106 celulas/animal en el espacio subcutaneo peritoneal. Cuando los tumores crecieron hasta un volumen medio de 100 mm3, se inicio el tratamiento en el que grupos de 10 ratones recibieron vehiculo (Grupo 1), CDDP a 6 mg/kg (IV una vez, Grupo 2),
25 Compuesto 25 a 150 mg/kg en solucion salina, una vez por semana durante dos semanas (i.p., Grupo 3), o la combinacion de los dos agentes (Grupo 4).
Los resultados mostrados en la Figura 3 demuestran que 150 mg/kg por semana del Compuesto 25 proporcionaban una mayor reduccion en el crecimiento del tumor que CDDP solo y quela combinacion de los dos agentes daba
30 como resultado un beneficio adicional. Estos resultados tambien indican que durante el periodo de dos semanas de dosificacion el volumenmedio del tumor no cambio indicando una inhibicion completa del crecimiento del tumor. Esos datos indican que el Compuesto 25 administrado a 150 mg/kg/dia como monoterapia, una vez a la semana, es el mas eficaz de todos los regimenes de dosificacion descritos en los ejemplos precedentes (Ejemplos 27-31). Se observo un pequeno cambio en el peso corporal que sugeria la toxicidad reducida con este regimen de dosificacion.
35 Utilizando el raton para la conversion HED, se puede administrar el Compuesto 25 a una dosis terapeuticamente eficaz de alrededor de 12 mg/kg/dia, para el tratamiento del cancer, opcionalmente administrada a una frecuencia de una vez cada semana, particularmente del cancer de pulmon de celulas no pequenas, solo o combinado con CDDP.
40 Ejemplo 33
Este Ejemplo describe la eficacia del Compuesto 25 por medio de una inyeccion en embolada ip o infusion ip solo o combinado co n Cisplatino en modelo de r aton co n xenoinjertos de H460. Se per mitio que r atones nu/nu homozigoticos Nu-Foxnlnu hembra (adquiridos de Charles R iver, C ambridge, M A), de 6 se manas de edad se 45 aclimataran durante al menos tres dias,yse manipularon en condiciones libres de patogenos.La linea celular de carcinoma de colon humano HT29 se obtuvo de la Coleccion de Cultivos Tipo Americana. Las lineas celulares se cultivaron y se cosecharon como se describe en el Ejemplo 27 y se inocularon a 3 x 106 celulas/animal en el espacio subcutaneo peritoneal. Cuando los tumores crecieron hasta un volumen medio de 100 mm3 (dia 8), se administro a cada grupo de ratones (diez por grupo) durante tres semanas, como se tabula en la tabla de mas abajo: Compuesto
25 (formulado en forma de una solucion de 15 mg/ml en solucion salina, ruta de administracion -i.p., administrado 2 h antes de CDDP los dias que estaba programada la terapia combinada y CDDP en solucion salina, IV.
Protocolo de Tratamiento
Grupo
Articulo de Ensayo Dosis (mg/kg) Regimenes Concentracion de la dosis: Volumen de la Dosis
1
Solucion salina 10 �7dx2 0 mg/mL : 10 mL/kg
2
CDDP 6 �7d x 2 0,6 mg/mL : 10 mL/kg
3
Compuesto 25 150 �7d x 2 15 mg/mL : 10 mL/kg
4
Compuesto 25 150 q7dx2 15 mg/mL : 10 mL/kg
CDDP
6 q7dx2 0,6 mg/mL : 10 mL/kg
5
Compuesto 25 150 �7d x 2 10 mg/mL: 15 mL/kg
6
Solucion salina 0,2 ml 200 !L - 1 semana x2� 0 mg/mL :1 !L/hr
7
Compuesto 25 15 mg/ml 200 !L - 1 semana x2� 15 mg/mL : 1 !L/hr
� -Bomba Alzet, 200 !L durante 1 semana x 2 (re-implantar nueva bomba al final de una semana).
Se determinaron el pesocorporalyel volumen deltumorcomo se describe enelEjemplo 32.Los resultados se indican en la Figura 4. Los datos indican que, si bien la aplicacion continua del Compuesto 25 solo o combinado con 10 CDDP es eficaz, la dosificacion intermitente, por ejemplo una vez a la semana pueden proporcionar un mayor beneficio terapeutico en el tratamiento de ciertos canceres tales como el cancer de pulmon de celulas no pequenas.
Ejemplo 34
15 Terapia Combinada con Compuesto 25 y Gemcitabina
Se administro una combinacion del Compuesto 25 y gemcitabina a ratones atimicos que tenian tumores derivados de celulas de cancer pancreatico humano de tipo MiaPaca2. El tumor MiaPaca-2 es un tumor altamente invasivo, de crecimiento rapido que produce la muerte en 20-30 dias en animales no tratados. Las celulas tumorales habian sido 20 transfectadas con el gen para la proteina fluorescente roja. Se administraron i.p. a los ratones dosis de control con vehiculo, gemcitabina, Compuesto 25, Compuesto 24, o combinaciones de gemcitabina/Compuesto 25 o gemcitabina/Compuesto 24 i.p., como se tabula mas abajo (8 ratones/grupo). Los Compuestos 24 y 25 se formularon en solucion salina y fueron proporcionados por Threshold Pharmaceuticals, Inc. en forma de polvo seco. La Gemcitabina se obtuvo comercialmente y se preparo de nuevo de acuerdo con instrucciones del fabricante. El
25 Compuesto 24 tiene la siguiente estructura:
Protocolo de Tratamiento
Grupo
Compuesto Dosis (mg/kg) Programa
1
Vehiculo 10ml/kg (qd� x 5) / semana durante 2 semanas
2
Gemcitabina 200 qw� x 3 semanas
3
Compuesto 25 30 (qd x 5) / semana durante 2 semanas
4
Compuesto 24 6 (qd x 5) / semana durante 2 semanas
5
Gemcitabina 200 qw x 3 semanas
Compuesto 25
30 (qd x 5) / semana durante 2 semanas
6
Gemcitabina 200 qw x 3 semanas
Compuesto 24
6 (qd x 5) / semana durante 2 semanas
� qd = cada dia; qw = cada semana.
Se tomaron imagenes de los tumores una vez a la semana hasta el final del estudio en cuyo momento se obtuvieron 5 imagenes del cuerpo abierto para confirmar los efectos. En el Grupo 1, los tumores crecieron rapidamente (Figura 5) y produjeron una letalidad del 100% el dia 30 (Figura 6).
Los Grupos 3 y 4 pr odujeron ef ectos menores sobre el vo lumen d el t umor y tuvieron poco e fecto so bre l a supervivencia. El Grupo 2 redujo significativamente el volumen del tumor y prolongo la supervivencia. El Grupo 6
10 proporciono una modesta reduccion en el tamano del tumor pero sin efectos adicionales sobre la supervivencia. En contraste, el Grupo 5 demostro un cr ecimiento t umoral significativamente r educido y una supervivencia significativamente prolongada en comparacion con el Grupo 2. Cinco de los 8tumores del Grupo 5 disminuyeron rapidamente despues del tratamiento y en un corto periodo de tiempo dejaron de emitir fluorescencia (Figura 7).
15 Cuatro de estos tumores permanecieron con fluorescencia cero hasta el final del experimento y se considero que los tumores se habian curado. Ningun tumor del Grupo 2 se considero curado. Estos resultados demuestran que el tratamiento combinado con Compuesto 25 y gemcitabina tiene mayores ventajas en este modelo de cancer en comparacion con la monoterapia con gemcitabina convencional. Estos resultados demuestran que la reduccion de tumores en los animales a los que se habia administrado una combinacion del Compuesto 25 a 30 mg/mg/dia y
20 gemcitabina era significativamente mayor que en los animales tratados con gemcitabina como unico agente.
Utilizando el raton para la conversion HED, se puede administrar el Compuesto 25 a una dosis terapeuticamente eficaz de alrededor de 2,5 m g/kg/dia, para el tratamiento del cancer, particularmente del cancer pancreatico, combinado con gemcitabina.
Ejemplo 35
Se reconoce que las moleculas eficaces para el tratamiento de enfermedades humanas incluyendo el cancer pueden ser toxicas a dosis proximas o a veces muchos mayores que las dosis necesarias para lograr efectos beneficiosos. 30 Para determinar las dosis y laruta de administracion apropiadas de dichocompuesto, es necesario comprender su toxicidad. Rutinariamente, losenfoques iniciales para determinar la dosis toxica implican el uso de roedorestales como ratones para proporcionar datos preliminares que podrian apoyar el diseno de estudios similares en animales mas grandes y en seres humanos. Los compuestos de ensayo (Compuestos 24, 25 y 36) se sometieron a ensayo en ratones como experimentos preliminares para determinar las dosis a utilizar en animales mas grandes. El 35 Compuesto 25 se sometio a ensayo a dosis tan elevadas como 300 mg/kg en una sola dosis y se encontro que ocasionaba t oxicidades r enales tales como necrosis tubular y perdida de pr oteinas por l a or ina. Tambien s e observaron reducciones transitorias en los globulos blancos. Sin embargo, se observo poca toxicidad a dosis mas bajas (100 y 200 mg/kg). Estas dosis seleccionadas representan una aproximacion a la dosis que se deberia utilizar en animales mas grandes tales como ratas y perros con el fin de confirmar que dichas toxicidades existen y de
40 pronosticar si la funcion renal debe ser medida en seres humanos.

Claims (10)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un compuesto de formula:
    donde ambos grupos N4 son Cl o ambos grupos N4 son Br.
  2. 2.
    Un compuesto de la reivindicacion 1 que tiene la formula:
  3. 3.
    Un compuesto de la reivindicacion 1 que tiene la formula:
  4. 4. Una formulacion farmaceutica que comprende el compuesto de la reivindicacion 1 y un excipiente, portador, o 20 diluyente farmaceuticamente aceptable.
  5. 5. Una formulacion farmaceutica que comprende el compuesto de la reivindicacion 2 y un excipiente, portador, o diluyente farmaceuticamente aceptable.
    25 6. Una formulacion farmaceutica que comprende el compuesto de la reivindicacion 3 y un excipiente, portador, o diluyente farmaceuticamente aceptable.
  6. 7. El uso de un compuesto de la reivindicacion 1 en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento del cancer.
    30 8. El uso de un compuesto de la reivindicacion 2 en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento del cancer.
  7. 9. El uso de un compuesto de la reivindicacion 3 en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento del cancer.
  8. 10. El compuesto de la reivindicacion 1 para su uso en el tratamiento del cancer. 35
  9. 11. El compuesto de la reivindicacion 2 para su uso en el tratamiento del cancer.
  10. 12. El compuesto de la reivindicacion 3 para su uso en el tratamiento del cancer.
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