ES2320412T3 - Preparacion de anticuerpos que tienen una adcc a traves del cd16, en particular de los anticuerpos monoclonales anti-rhesus d. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de preparación de un anticuerpo monoclonal capaz de activar las células efectoras que expresan el FcgammaRIII, caracterizado porque comprende las etapas siguientes: a) purificar anticuerpos monoclonales obtenidos a partir de diferentes clones que proceden de líneas celulares seleccionadas de entre los hibridomas, en particular los heterohibridomas y las líneas celulares animales o humanas transfectadas con la ayuda de un vector que comprende el gen que codifica para dicho anticuerpo; b) añadir cada anticuerpo obtenido en la etapa a) en una mezcla de reacción distinta que comprende las células diana de dichos anticuerpos, unas células efectoras que comprenden unas células que expresan el FcgammaRIII, y unas IgG polivalentes, c) determinar el porcentaje de lisis de las células diana y seleccionar los anticuerpos monoclonales que activan las células efectoras que provocan una lisis significativa de las células diana (actividad ADCC de tipo FcgammaRIII).
Description
\global\parskip0.960000\baselineskip
Preparación de anticuerpos que tienen una ADCC a
través del CD16, en particular de los anticuerpos monoclonales
anti-Rhesus D.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de obtención y de selección de anticuerpos
monoclonales mediante un ensayo de tipo ADCC, pudiendo dichos
anticuerpos activar los receptores Fc\gamma de tipo III. La
invención se refiere asimismo a unos anticuerpos monoclonales que
presentan una estructura glicánica particular, a las células que
producen dichos anticuerpos, a los procedimientos de preparación de
las células productoras, así como a las composiciones farmacéuticas
o a los ensayos de diagnóstico que comprenden dichos anticuerpos.
Los anticuerpos anti-D según la invención se pueden
usar para la prevención de la isoinmunización Rhesus de individuos
Rh negativos, en particular de la enfermedad hemolítica del recién
nacido (MHNN) o en unas aplicaciones tal como la púrpura
trombocitopénica idiopática (PTI).
La inmunoterapia pasiva con la ayuda de
anticuerpos policlonales se realiza desde los años 70. Sin embargo,
la fabricación de las inmunoglobulinas policlonales plantea varios
problemas:
- \quad
- La inmunización de sujetos voluntarios se interrumpió en Francia en 1997, debido a los problemas éticos que presentan dichos actos. En Francia, tal como en Europa, el número de donantes inmunizados es tan bajo para asegurar un abastecimiento suficiente en ciertos anticuerpos, que es necesario importar plasma hiperinmunizado de los Estados Unidos por ejemplo.
- \quad
- Así, esta escasez de inmunoglobulina no permite prever una administración antenatal para la prevención de la MHNN.
Diversos estudios han conducido a la producción
de anticuerpos monoclonales humanos con el objetivo de sustituir
los anticuerpos policlonales obtenidos a partir del fraccionamiento
de plasmas de donantes voluntarios.
Los anticuerpos monoclonales presentan varias
ventajas: se pueden obtener en grandes cantidades a precios
razonables, cada lote de anticuerpos es homogéneo y la calidad de
los diferentes lotes es reproducible puesto que están producidos
por la misma línea celular que es criopreservada en nitrógeno
líquido. La seguridad del producto se puede asegurar en cuanto a la
ausencia de contaminación vírica.
Varias publicaciones describen la obtención de
líneas celulares productoras de anticuerpos monoclonales humanos
anti-Rh D de clase IgG, a partir de células B de
donantes inmunizados. Boylston et al. 1980; Koskimies 1980;
Crawford et al. 1983; Doyle et al. 1985; Goossens
et al. 1987; Kumpel et al. 1989(a) y Mc
Cann-Carter et al. 1993 describen la
obtención de líneas de linfocitos B transformados por el virus EBV.
Melamed et al. 1985; Thompson et al. 1986 y Mc
Cann-Carter et al. 1993 se refieren a unos
heterohíbridos que resultan de la fusión de linfocitos B
(transformados por EBV) con mieloma murino. Goossens et al.
1987 se refiere a unos heterohíbridos que resultan de la fusión de
linfocitos B (transformados por EBV) con mieloma humano. Bron et
al. 1984 y Foung et al. 1987 describen unos
heterohíbridos que resultan de la fusión de linfocitos B
(transformados por EBV) con heteromieloma
humano-ratón y, por último, Edelman et al.
1997 se refiere a unas células de insectos transfectadas con el gen
que codifica para un anti-Rh(D) con la ayuda
del sistema baculovirus. Klein P. et al., Human antibodies,
1997, 8(1), 17-25 y Hadley A. et al.
Immunology, 1992,
\hbox{76(5), 446-51 describen el efecto de un cambio de sub-clase IgG1/3 sobre la actividad de un anti-D.}
Entre las patentes y solicitudes de patente que
se refieren a dichos anticuerpos monoclonales y sus líneas
secretoras, se pueden citar:
- \quad
- El documento EP 576 093 (AETS (FR), Biotest Pharma GmbH (Alemania); Composition for prophylaxis of the haemolytic disease of the new-born comprises two human monoclonal antibodies of sub-class IgG1 and IgG3, which are active against the Rhesus D antigen), el documento RU 2094462, WO 85/02413 (Board of Trustees of the Leland Stanford Jr. University, Human Monoclonal Antibody against Rh (D) Antigen and its Uses), el documento GB 86-10106 (Central Blood Laboratories Authority, Production of heterohybridomas for manufacture of human monoclonal antibodies to Rhesus D antigen), el documento EP 0 251 440 (Central Blood Laboratories Authority, Human Anti-Rhesus D Producing Heterohybridomas), los documentos WO 89/02442, WO 89/02600 y WO 89/024443 (Central Blood Laboratories Authority, Human Anti-Rh (D) Monoclonal Antibodies), el documento WO 8607740 (Institut Pasteur, Protein Performance SA, Paris, FR, Obtention d'un anticorps monoclonal recombinant à partir d'un anticorps monoclonal human anti-rhésus D, sa production en cellules d'insecte et ses utilisations), el documento JP 88-50710 (International Reagents Corp., Japan, Reagents for Determination of Blood Group Substance Rh (D) Factor), el documento JP 83-248865 (Mitsubishi Chemical Industries Co., Ltd., Japan, Preparation of Monoclonal Antibody to Rh (D) positive Antigen), el documento CA 82-406033 (Queens University at Kingston, Human Monoclonal Antibodies) y el documento GB 8226513 (University College London, Human Monoclonal Antibody against Rhesus D Antigen).
Si el uso de anticuerpos monoclonales presenta
numerosas ventajas con relación al uso de pools de anticuerpos
policlonales, puede en cambio resultar difícil obtener un anticuerpo
monoclonal eficaz. En efecto, en el marco de la invención, se ha
descubierto que el fragmento Fc\gamma de la inmunoglobulina
obtenida debe poseer unas propiedades bien particulares con el fin
de poder interactuar y activar los receptores de las células
efectoras (macrófago, linfocito T, H y NK).
\global\parskip1.000000\baselineskip
La actividad biológica de ciertas
inmunoglobulinas G es dependiente de la estructura de los
oligosacáridos presentes en la molécula, y en particular en su
parte Fc. Las moléculas IgG de todas las sub-clases
humanas y murinas poseen un N-oligosacárido fijado
al dominio CH_{2} de cada cadena pesada (en el residuo Asn 297
para las IgG humanas). Se ha demostrado la influencia de este
residuo glicánico sobre la capacidad del anticuerpo para
interactuar con unas moléculas efectoras (Fc receptores y
complemento). La inhibición de glicosilación de una IgG1 humana,
mediante el cultivo en presencia de Tunicamicina, provoca por
ejemplo una disminución de 50 veces de la afinidad de este
anticuerpo para el receptor Fc\gammaRI presente sobre los
monocitos y macrófagos (Leatherbarrow et al., 1985). La
fijación al receptor Fc\gammaRIII está afectada asimismo por la
pérdida de carbohidratos sobre la IgG, puesto que se ha descrito que
una IgG3 no glicosilada es capaz de inducir una lisis de tipo ADCC
por medio del receptor Fc\gammaRIII de las células NK (Lund et
al., 1990).
Sin embargo, más allá de la presencia necesaria
de estos residuos glicánicos, es más precisamente la heterogeneidad
de su estructura lo que puede ocasionar unas diferencias en la
capacidad para activar unas funciones efectoras. Se han observado
unos perfiles de galactosilación variables en función de los
individuos (IgG1 humanas séricas). Estas diferencias reflejan
probablemente unas disparidades en la actividad de las
galactosiltransferasas y otras enzimas entre los clones celulares
de estos individuos (Jefferis et al., 1990). Mientras que
esta heterogeneidad normal de los procesos
post-traduccionales genera diferentes glicoformas
(incluso en el caso de anticuerpos monoclonales), puede conducir a
unas estructuras atípicas asociadas a ciertos estados patológicos
tales como la artritis reumatoide, la enfermedad de Crohn, para los
cuales se ha demostrado una proporción importante de los residuos
agalactosilados (Parekh et al., 1985).
El perfil de glicosilación de la molécula
purificada es la consecuencia de efectos múltiples de los que ya se
han estudiado ciertos parámetros. El esqueleto proteico de las IgG y
en particular los aminoácidos en contacto con los residuos
N-acetilglucosamina (GlcNAc) y galactosa terminales
del brazo manosa \alpha 1-6 (aa 246 y 258 de las
IgG) pueden explicar la existencia de estructuras preferenciales
(galactosilación), tal como lo muestra el estudio realizado sobre
las IgG murinas y quiméricas de diferentes isotipos (Lund et
al., 1993).
Las diferencias observadas demuestran asimismo
unas especificidades relacionadas con la especie y con el tipo
celular usado para la producción de la molécula. Así, la estructura
habitual de los N-glicanos de las IgG humanas
revela una proporción significativa de tipos biantenados con un
residuo GlcNAc en posición bisectriz, estructura ausente a nivel de
los anticuerpos producidos por unas células murinas. Asimismo, los
residuos de ácidos siálicos sintetizados por la línea CHO (Chinese
Hamster Ovary) son exclusivamente de tipo \alpha
2-3 mientras que son de tipo \alpha
2-3 y \alpha 2-6 con las células
murinas y humanas (Yu Ip et al., 1994). La producción de
inmunoglobulinas en unos sistemas de expresión diferentes de los que
proceden de mamíferos puede introducir unas modificaciones mucho
más importantes tales como la presencia de residuos xilosa
fabricados por las células de insectos o por las plantas (Ma et
al., 1995).
Otros factores, tales como las condiciones de
cultivo celular (incluyendo la composición del medio de cultivo, la
densidad celular, el pH, la oxigenación), parecen intervenir sobre
la actividad de las glicosiltransferasas de la célula y por
consiguiente sobre la estructura glicánica de la molécula (Monica
et al., 1993; Kumpel et al., 1994 b).
Ahora bien, se ha descubierto en el campo de la
presente invención que una estructura de tipo biantenada, con unas
cadenas cortas, una baja sialilación, unas manosas terminales y/o
GlcNAc terminales no intermedios es el denominador común de las
estructuras glicánicas que confieren una fuerte actividad ADCC a los
anticuerpos monoclonales. Se ha llevado a cabo asimismo un
procedimiento de preparación de dichos anticuerpos capaces de
activar las células efectoras por medio del Fc\gammaRIII, en
particular de anticuerpos anti-Rh(D).
Los antígenos de grupos sanguíneos se clasifican
en varios sistemas en función de la naturaleza de las moléculas
membranarias expresadas en la superficie de los hematíes. El sistema
Rhesus (Rh) comprende 5 moléculas o antígenos: D, C, c, E y e
(ISSITT, 1988). El antígeno D es la más importante de estas
moléculas porque es la más inmunógena, es decir, que puede inducir
la producción de anticuerpos anti-D si unos glóbulos
rojos Rh D positivo son transfundidos a unos sujetos Rh
negativo.
El antígeno D se expresa normalmente en 85% de
los sujetos caucásicos, siendo estas personas denominadas Rh
positivo; 25% de estos sujetos son por lo tanto Rh negativo, es
decir, que sus hematíes no presentan el antígeno D. La expresión de
los antígenos D presenta ciertas variantes que se pueden asociar, o
bien a una baja densidad antigénica, y se hablará entonces de
antígenos D débiles, o bien a una antigenicidad diferente o parcial,
y se hablará entonces de antígenos D parciales. El carácter D débil
se caracteriza porque se trata de un antígeno normal pero cuyo
número de sitios por hematíe está disminuido de manera más o menos
importante; este carácter es transmisible según las leyes
mendelianas. Los fenotipos D parciales han sido descubiertos en unos
sujetos Rh D positivo que poseían unos anticuerpos
anti-D séricos; estos antígenos D parciales se
pueden por lo tanto caracterizar como que poseen sólo una parte del
mosaico. Unos estudios realizados con unos anticuerpos policlonales
y monoclonales han permitido definir 7 categorías de antígenos D
parciales con la descripción de por lo menos 8 epítopos
constitutivos del antígeno D (LOMAS et al., 1989; TIPETT
1988).
La importancia de los anticuerpos
anti-Rh D apareció con el descubrimiento de los
mecanismos que conducen a la enfermedad hemolítica del recién
nacido (MHNN). Ésta corresponde a los diferentes estados patológicos
observados en ciertos fetos o en ciertos recién nacidos cuando
existe una incompatibilidad feto-maternal de grupo
sanguíneo que es responsable de la formación de anticuerpos
maternales anti-Rh D capaces de atravesar la
barrera placentaria. En efecto, el paso de hematíes fetales Rh
positivo a una madre Rh negativo puede provocar la formación de
anticuerpos anti-D.
Después de la inmunización de la madre Rh
negativo, los anticuerpos anti-D de clase IgG son
capaces de atravesar la barrera placentaria y fijarse sobre los
hematíes fetales Rh positivo. Esta fijación provoca la activación
de células inmunocompetentes a través de sus receptores Fc de
superficie que induce así una hemólisis de los hematíes fetales
sensibilizados. En función de la intensidad de la reacción, se
pueden observar varios grados de gravedad de la MHNN.
Un diagnóstico de la MHNN se puede realizar
antes y después del nacimiento. El diagnóstico prenatal se basa en
la evolución del índice de los anticuerpos anti-D en
la madre usando varias técnicas inmunohematológicas. El diagnóstico
post-parto se puede llevar a cabo a partir de una
extracción de sangre del cordón umbilical analizando los siguientes
parámetros: determinación de los grupos sanguíneos del feto y del
padre; búsqueda de anticuerpos anti-D; dosificación
de la hemoglobina y de la bilirrubina.
Una profilaxis de la MHNN se realiza actualmente
de forma sistemática en todas las mujeres de grupo sanguíneo Rh
negativo que haya traído al mundo un niño Rh positivo con unas
inyecciones de inmunoglobulinas humanas anti-D. Los
primeros ensayos reales de inmunoprofilaxia han empezado en 1964.
Para que la prevención sea eficaz, se necesita que las
inmunoglobulinas sean inyectadas antes de la inmunización, es decir,
en las 72 horas siguientes al parto, y que las dosis de anticuerpos
sean suficientes (10 \mug de anticuerpo anti-D
para 0,5 ml de hematíes Rh+).
Varios anticuerpos monoclonales
anti-D han sido objeto de una evaluación
terapéutica: BROSSARD/FNTS 1990 (no publicado); THOMSON/IBGRL 1990;
KUMPEL/IBGRL 1994; BELKINA/Instituto de hematología de Moscú 1996;
BIOTEST/LFB 1997 (no publicado). La eficacia clínica de los
anticuerpos para inducir el aclaramiento de los glóbulos rojos
Rh(D) positivo ha sido evaluado en unos voluntarios
Rh(D) negativo. Sólo un anticuerpo de tipo IgG1 ha mostrado
una eficacia equivalente a la de las inmunoglobulinas policlonales
anti-D pero sólo en algunos pacientes (KUMPEL et
al., 1995).
La invención propone suministrar unos
anticuerpos monoclonales que responden a los problemas mencionados
anteriormente, es decir, unos anticuerpos seleccionados mediante un
ensayo de tipo ADCC específico del anticuerpo y/o de los
anticuerpos que poseen una estructura glicánica necesaria para la
obtención de una buena eficacia.
Así, la presente invención se refiere a un
procedimiento de preparación de un anticuerpo monoclonal capaz de
activar las células efectoras que expresan el Fc\gammaRIII,
caracterizado porque comprende las siguientes etapas:
- a)
- purificar anticuerpos monoclonales obtenidos a partir de diferentes clones que proceden de líneas celulares seleccionadas de entre los hibridomas, en particular los heterohibridomas, y las líneas celulares animales o humanas transfectadas con la ayuda de un vector que comprende el gen que codifica para dicho anticuerpo;
- b)
- añadir cada anticuerpo obtenido en la etapa a) a una mezcla de reacción distinta que comprende:
- -
- las células diana de dichos anticuerpos,
- -
- unas células efectoras que comprenden unas células que expresan el Fc\gammaRIII,
- -
- unas IgG polivalentes,
- c)
- determinar el porcentaje de lisis de las células diana y seleccionar los anticuerpos monoclonales que activan las células efectoras que provocan una lisis significativa de las células diana (actividad ADCC de tipo Fc\gammaRIII).
Los clones pueden proceder de líneas celulares
heterohíbridas obtenidas mediante la fusión de linfocitos B humanos
(que proceden de sujetos inmunizados) con unas células de mieloma
murino, humano o heterohíbrido, en particular el mieloma
K6H6-B5 (ATCC nº CRL 1823); o también de líneas
celulares animales o humanas transfectadas con la ayuda de un
vector que contiene el gen que codifica para una inmunoglobulina
humana de tipo IgG, pudiendo ser dichas líneas seleccionadas de
entre las líneas CHO-K, CHO-Lec10,
CHO Lec-1, CHO Pro-5, CHO dhfr-,
Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4,
COS-7, 293-HEK, YB2/0, BHK, K6H6,
NSO, SP2/0-Ag 14 y P3X63Ag8.653.
Las IgG polivalentes se usan para inhibir el
mecanismo de lisis de las células efectoras a través del
Fc\gammaRIII. En este procedimiento, se seleccionan los
anticuerpos que presentan un porcentaje ADCC de tipo Fc\gammaRIII
superior a 60%, 70%, 80% o preferentemente superior a 90%.
Las células diana pueden ser unos hematíes
tratados con papaína. En este caso, se depositan por pocillo:
- -
- 100 \mul de anticuerpos monoclonales purificados a aproximadamente 200 ng/ml,
- -
- 25 \mul de hematíes papainados, es decir, aproximadamente 1x10^{6} células,
- -
- 25 \mul de células efectoras, es decir, aproximadamente 2 x 10^{6} células, y
- -
- 50 \mul de IgG polivalentes, en particular de TEGELINE^{TM} (LFB, Francia), con una concentración comprendida entre 1 y 20 mg/ml.
Así, se puede comparar la calidad de lisis de
las células diana con dos controles positivos que consisten en un
compuesto químico tal como NH_{4}Cl y un anticuerpo de referencia
activo in vivo y con un control negativo que consiste en un
anticuerpo inactivo in vivo.
Se pueden usar asimismo los anticuerpos
policlonales de origen comercial como controles positivos y un
anticuerpo monoclonal no apropiado para inducir un aclaramiento
in vivo como control negativo.
Ventajosamente, este procedimiento permite
preparar unos anticuerpos monoclonales
anti-Rh(D), tal como se ha indicado
anteriormente. Se usan entonces como células diana unos hematíes
rhesus D.
La invención se basa por lo tanto en la puesta a
punto de un ensayo de actividad biológica in vitro en el que
las actividades medidas están en correlación con la actividad
biológica in vivo de los anticuerpos monoclonales o
policlonales ya evaluados desde el punto de vista clínico en cuanto
a su potencialidad para inducir el aclaramiento de hematíes Rh (D)
positivos en unos sujetos voluntarios Rh (D) negativo. Este ensayo
permite evaluar la actividad lítica dependiente del anticuerpo =
ADCC (Antibody Dependent Cellular Cytotoxiticy) inducida
esencialmente por los receptores Fc\gamma de tipo III (CD 16),
siendo los receptores Fc\gamma de tipo I (CD 64) saturados por la
adición de inmunoglobulinas humanas de tipo IgG (en forma de IgG
polivalentes terapéuticas). La especificidad Fc\gammaRIII de este
ensayo ADCC ha sido confirmada por la inhibición en presencia de
anticuerpos monoclonales anti-Fc\gammaRIII (véase
la figura 6). Se usan unas células mononucleadas de sujetos sanos
como células efectoras en una proporción efector/diana (E/C) cercana
a las condiciones fisiológicas in vivo. En estas
condiciones, las actividades líticas de las inmunoglobulinas
policlonales y de los anticuerpos monoclonales
anti-D ineficaces in vivo (anticuerpo DF5
Goossens et al., 1987 y los anticuerpos AD1 + AD3, FR
9207893 LFB/Biotest y FOG-1, GB 2189506) son
respectivamente fuertes y débiles.
La selección de los anticuerpos descritos en la
presente invención se ha realizado por lo tanto mediante la
evaluación de su actividad biológica en este ensayo de tipo ADCC
(véase el ejemplo 1).
En otro aspecto, la invención se refiere a los
anticuerpos susceptibles de ser obtenidos a partir del procedimiento
descrito anteriormente, presentando dichos anticuerpos unos
porcentajes ADCC de tipo Fc\gammaRIII superiores a 60%, 70%, 80%
o preferentemente superiores a 90% con relación al policlonal de
referencia. Los anticuerpos monoclonales de la invención, dirigidos
contra un antígeno determinado, activan las células efectoras que
expresan el Fc\gammaRIII provocando una lisis superior a 60%, 70%,
80%, preferentemente superior a 90% de la lisis provocada por unos
anticuerpos policlonales dirigidos contra dicho antígeno.
Ventajosamente, dichos anticuerpos monoclonales son dirigidos
contra el rhesus D.
Preferentemente, se pueden producir mediante
unos clones derivados de las líneas Vero (ATCC nº CCL 81), YB2/0
(ATCC nº CRL 1662) o CHO Lec-1 (ATCC nº CRL 1735), y
pueden pertenecer a la clase IgG1 o IgG3.
La invención se refiere asimismo a unos
anticuerpos que presentan una estructura glicánica particular que
confiere una actividad efectora dependiente del Fc\gammaRIII.
Dichos anticuerpos se pueden obtener a partir de
un procedimiento expuesto anteriormente y poseen en su sitio de
glicosilación (Asn 297) del Fc\gamma unas estructuras glicánicas
de tipo biantenadas, con unas cadenas cortas y una baja
sialilación.
Preferentemente, su estructura glicánica
presenta unas manosas terminales y/o GlcNAc terminales no
intermedios.
Dichos anticuerpos se seleccionan más
particularmente de entre las formas:
De esta forma, la invención prevé un anticuerpo
monoclonal caracterizado porque posee en su sitio de glicosilación
(Asn 297) del Fc\gamma unas estructuras glicánicas de tipo
biantenadas, con unas cadenas cortas, una baja sialilación, unas
manosas y GlcNAc del punto de unión terminales no intermedios.
Dichos anticuerpos, dirigidos contra un antígeno determinado,
activan las células efectoras que expresan el Fc\gammaRIII
provocando una lisis superior a 60%, 70%, 80%, preferentemente
superior a 90% de la lisis provocada por unos anticuerpos
policlonales dirigidos contra dicho antígeno.
Más particularmente, la invención se refiere a
unos anticuerpos y a unas composiciones que comprenden dichos
anticuerpos tal como se han definido anteriormente, en los que el
contenido en ácido siálico es inferior a 25%, 20%, 15% o 10%,
preferentemente 5%, 4%, 3% o 2%.
Asimismo, la invención se refiere a unos
anticuerpos y a unas composiciones que comprenden dichos anticuerpos
tal como se han definido anteriormente, en los que el contenido en
fucosa es inferior a 65%, 60%, 50%, 40%, o 30%. Preferentemente, el
contenido en fucosa está comprendido entre 20% y 45% o también entre
25% y 40%.
Una composición según la invención
particularmente eficaz comprende, por ejemplo, un contenido superior
a 60%, preferentemente superior a 80%, para las formas G0 + G1 +
G0F + G1F, entendiéndose que las formas G0F + G1F son inferiores a
50%, preferentemente inferiores a 30%.
Una alternativa para seleccionar específicamente
el Fc\gammaRIII consiste en la preparación de anticuerpos de tipo
"high mannose".
En otro aspecto, la invención se refiere a una
célula que produce un anticuerpo mencionado anteriormente. Puede
tratarse de un hibridoma, en particular de un heterohibridoma
obtenido con la pareja de fusión K6H6-B5 (ATCC nº
CRL 1823); o de una célula animal o humana transfectada con la ayuda
de un vector que comprende el gen que codifica para dicho
anticuerpo, en particular una célula derivada de las líneas Vero
(ATCC nº CCL 81), YB2/0 (ATCC nº CRL 1662) o CHO
Lec-1 (ATCC nº CRL 1735). Estas células corresponden
a las líneas celulares seleccionadas por medio del procedimiento
según la invención, produciendo dichas células unos anticuerpos que
poseen las características evocadas anteriormente.
Un anticuerpo preferido según la invención
muestra una actividad biológica importante (superior o igual a la
del anticuerpo policlonal anti-Rh(D) de
referencia) en el ensayo ADCC que usa unas células efectoras
Fc\gammaRIII positivas. Su aptitud para la activación de los
receptores Fc\gammaRIII (después de la fijación) se confirma
sobre unos modelos in vitro que ponen en evidencia la
modificación del flujo cálcico intracelular, la fosforilación de
moléculas de transducción de la señal de activación o la liberación
de mediadores químicos.
Estas propiedades se asocian a una estructura
particular de los oligosacáridos del sitio de
N-glicosilación de la parte Fc del anticuerpo:
presencia de cadenas cortas, débilmente galactosiladas, poco
sialiladas, que poseen unas manosas terminales y/o GlcNAc
terminales no intermedios por ejemplo.
Este anticuerpo presenta unas aplicaciones
terapéuticas: prevención de la MHNN, tratamiento de la PTI en los
individuos Rh(D) positivo, y cualquier otra aplicación
referida a la utilización de unas inmunoglobulinas policlonales
anti-D.
Un anticuerpo preferido según la invención puede
tener asimismo una especificidad distinta de
anti-Rh(D) (anti-célula
cancerígena, por ejemplo). Puede poseer las propiedades descritas
anteriormente (actividad funcional dependiente de un mecanismo de
fijación/activación a nivel de los receptores Fc\gammaRIII,
estructura particular de los oligosacáridos) y ser usado en la
inmunoterapia de cánceres o de cualquier otra patología para la cual
se puede efectuar un tratamiento curativo o preventivo con la ayuda
de un anticuerpo monoclonal cuyo mecanismo de acción corresponde a
una actividad funcional por medio del receptor Fc\gammaRIII.
Otro aspecto se refiere a una composición
farmacéutica que comprende un anticuerpo según la invención y al
uso de dicho anticuerpo para la preparación de un medicamento.
Preferentemente, la invención se refiere al uso
de un anticuerpo anti-Rh(D) descrito
anteriormente para la preparación de un medicamento destinado a la
prevención de la aloinmunización Rhesus de individuos Rh negativo.
El modo de acción de las inmunoglobulinas anti-D
in vivo es una fijación específica de los anticuerpos sobre
el antígeno D de los glóbulos rojos Rh(D) positivo, seguida
de una eliminación de estos glóbulos rojos de la circulación
esencialmente a nivel del bazo. Este aclaramiento se asocia a un
mecanismo dinámico de supresión de la respuesta inmune primaria en
los individuos y previene por lo tanto la inmunización.
De esta manera, se puede usar un anticuerpo de
la invención de manera profiláctica para la prevención de la
aloinmunización de mujer Rhesus negativo, inmediatamente después del
nacimiento de un niño Rhesus positivo, y para prevenir, durante los
embarazos posteriores, la enfermedad hemolítica del recién nacido
(MHNN); durante abortos, embarazos extra-uterinos
en situación de incompatibilidad Rhesus D o también durante
hemorragias transplacentarias que resultan de amniocentesis, de
biopsias coriónicas, o de manipulaciones obstétricas traumatizantes
en situación de incompatibilidad Rhesus D.
Además, se puede usar un anticuerpo de la
invención en el caso de transfusiones Rh incompatibles con sangre o
con derivados sanguíneos lábiles.
La invención se refiere asimismo al uso de un
anticuerpo de la invención para la preparación de un medicamento
destinado a un uso terapéutico en la Púrpura Trombocitopénica
Idiopática (PTI).
Los anticuerpos de la invención son asimismo
útiles para la preparación de un medicamento destinado al
tratamiento de cánceres por inmunoterapia o para el tratamiento de
infecciones causadas por unos agentes patógenos víricos o
bacterianos.
Un aspecto complementario de la invención se
refiere al uso de dichos anticuerpos en particular para el
diagnóstico. La invención prevé por lo tanto un kit que comprende
un anticuerpo descrito anteriormente.
En la continuación de la descripción, se hará
referencia a las leyendas de las figuras presentadas a
continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1: evaluación ADCC de F60 y T125 YB2/0
(R270)
Esta figura representa el porcentaje de lisis
obtenido en función de la concentración en anticuerpos en presencia
de 100 y 500 \mug/pocillo de TEGELINE^{TM} (LFB, Francia). Se
obtiene un porcentaje de lisis elevado para los anticuerpos según
la invención F60 y T125.
Figura 2: fijación de los anti-D
al receptor (Fc\gammaRIII)
Se obtiene un fuerte índice de fijación para los
anticuerpos según la invención F60 y T125.
Figura 3: construcción del vector de expresión
T125-H26 para la expresión de la cadena H de
T125.
Figura 4: construcción del vector de expresión
T125-K47 para la expresión de la cadena L de
T125.
Figura 5: construcción del vector de expresión
T125-IG24 para la expresión del anticuerpo completo
T125.
Figura 6: inhibición ADCC en presencia de anti
Fc RIII (CD 16).
Se establece el ensayo ADCC según el modo de
funcionamiento descrito en el apartado 3.3 en presencia del
anti-CD16 comercial 3G8 (TEBU) cuya acción es
bloquear los receptores FcRIII presentes sobre las células
efectoras. La concentración final de 3G8 es de 5 \mug/pocillo (25
\mug/ml). Se realiza un control en paralelo en ausencia de
3G8.
Los tres anticuerpos ensayados son el
Poli-D WinRho, el anticuerpo F60 (Pf 155 99/47)
obtenido según el procedimiento descrito en el ejemplo 1 y el R297
(Pf 210 01/76) obtenido según el procedimiento descrito en el
ejemplo 2.
Resultados: se observa una inhibición en
presencia del 3G8, lo que demuestra que la ADCC inducida por los
tres anticuerpos ensayados es mayoritariamente dependiente del
FcRIII.
Una inhibición ligeramente más fuerte se observa
en presencia del Poli-D WinRho (83% frente a 68% y
61% de inhibición para el F60 y R297 respectivamente). Esta
diferencia puede deberse a la presencia en el Poli-D
de IgG humanas no anti-D que inhibirán los
receptores de tipo 1 (FCRI o CD64) y por lo tanto actuar en sinergia
con el anti-CD16.
Figura 7: caracterización de los glicanos de los
anti-D mediante espectrometría de masa (MS).
Figura 8: comparación de los espectros MS de R
290 y DF5.
Figura 9: estudio de la glicosilación del
anti-D D31DMM mediante MS.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
El donante de linfocitos B se selecciona de
entre los donantes de anti-Rh(D) en
plasmaféresis, sobre la actividad de sus anticuerpos
anti-Rh(D) séricos en el ensayo de actividad
ADCC descrito en al apartado 3.3. Después de una donación de sangre
total en 1998, se recupera la fracción "buffy coat"
(concentrado de leucocitos).
\vskip1.000000\baselineskip
Se separan las células mononucleadas de la
sangre periférica de los demás elementos por centrifugación sobre
Ficoll Plus (Pharmacia). Después, se diluyen a 10^{6} células/ml
en IMDM que contiene 20% (v/v) de suero de ternera fetal (SVF), al
cual se añaden 20% de sobrenadante de cultivo de la línea
B95-8 (ATCC-CRL 1612), 0,1
\mug/ml de ciclosporina A (Sandoz), 50 \mug/ml de sulfato de
gentamicina (Life Technologies), y se reparten en placas de 24
pocillos (P24 Greiner) o en placas de 96 pocillos de fondo redondo.
Después, se disponen en una incubadora a 37ºC, 7% CO_{2}. Después
de 3 semanas, se busca mediante ADCC la presencia de anticuerpos
anti-Rh(D).
- ^
- Cada uno de los 16 micropocillos de un pocillo de placa P24 positivo se transfiere a un nuevo pocillo de P24. Este enriquecimiento se repite después de 10 a 15 días de cultivo y cada micropocillo se amplifica en P96 y después en P24.
- ^
- Los pocillos de P96 positivos se recogen y se amplifican en P24 de fondo plano (Nunc). Después de algunos días de cultivo, se busca la presencia de anticuerpos anti-Rh(D) mediante ADCC.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células procedentes de uno o varios pocillos
de P24 se enriquecen con células específicas mediante la formación
y separación de rosetas con unos hematíes Rh(D) positivos
papainados: se incuba 1 volumen de hematíes lavados en NaCl 0,9%
durante 10 minutos a 37ºC con 1 volumen de disolución de papaína
(Merck) al 1/1000ª (m/v), y después se lava 3 veces en NaCl al
0,9%. A continuación, las células se lavan una vez en disolución de
Hanks, se suspenden en SVF y se mezclan con los hematíes papainados
en la relación 1 célula por 33 hematíes. La mezcla se dispone en un
tubo de centrifugar de fondo cónico, se centrifuga durante 5 minutos
a 80 g y se incuba durante una hora en hielo fundente. La mezcla se
agita suavemente a continuación y se deposita el Ficoll en el fondo
del tubo para separación durante 20 minutos a 900 g. El residuo que
contiene las rosetas se hemoliza en disolución de NH_{4}Cl
durante 5 minutos y las células se re-cultivan en
P24 que contiene unas células mononucleadas humanas irradiadas.
Después de aproximadamente 1 semana, los sobrenadantes se evalúan
mediante ensayos CELA (apartado 3.2) y ADCC para la presencia de
anticuerpos anti-Rh(D) que tienen una buena
actividad. Se realiza un nuevo ciclo de enriquecimiento si el
porcentaje de las células que forman rosetas aumenta
significativamente con relación al ciclo
anterior.
anterior.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células enriquecidas por RI se reparten en 5
y 0,5 células por pocillo en unas placas de 96 pocillos de fondo
redondo que contienen unas células mononucleadas humanas
irradiadas.
\newpage
Después de aproximadamente 4 semanas de cultivo,
se evalúan los sobrenadantes de los pocillos que contienen unos
cúmulos celulares mediante un ensayo ADCC.
\vskip1.000000\baselineskip
Los pocillos de clonación de las células
transformadas por EBV que presentan una actividad ADCC interesante
se amplifican en cultivo y después se fusionan con el heteromieloma
K6H6-B5 (ATCC CRL 1823) según la técnica estándar
con PEG. Después de la fusión, las células se reparten a razón de
2\cdot10^{4} células/pocillo en P96 de fondo plano que contiene
unos macrófagos intraperitoneales murinos y en un medio selectivo
que contiene aminopterina y ouabaína (Sigma).
Después de 3 a 4 semanas de cultivo, se evalúan
los sobrenadantes de los pocillos que contienen unos cúmulos
celulares mediante el ensayo ADCC.
\vskip1.000000\baselineskip
La clonación por dilución límite se efectúa en
4, 2 y 1 células/pocillo en unos P96 de fondo plano. Después de 2
semanas se examina el aspecto microscópico de los pocillos para
identificar los clones únicos, y después se renueva el medio. Al
cabo de aproximadamente 2 semanas, se evalúan los sobrenadantes de
los pocillos que contienen unos cúmulos celulares mediante el
ensayo ADCC.
\vskip1.000000\baselineskip
La transformación mediante EBV de las células
del donante d13 ha permitido la selección de un pocillo, denominado
T125 2A2 sobre el cual se han realizado sucesivamente: 2
enriquecimientos, 3 ciclos de Rl, y una clonación en 5
células/pocillo para dar 2 clones:
- 1)
- T125 2A2 (5/1) A2 a partir del cual se ha extraído el ADN para la preparación del vector recombinan- te;
- 2)
- T125 (5/1) A2 que ha sido fusionado con K6H6-B5 para dar F60 2F6 y después 5 clonaciones F60 2F6 (5) 4C4, clon considerado para la constitución de un stock celular previo a la preparación de bancos.
Se trata de una IgG1 que posee una cadena ligera
Kappa.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Según el mismo procedimiento que el usado para
la preparación del anticuerpo de isotipo IgG1, se ha preparado una
línea productora de una IgG3. Las células de origen proceden de una
donación de sangre total, de otro donante designado, cuya fracción
"buffy coat" (concentrado de leucocitos) ha sido recuperada. Se
trata de una IgG3 que posee una cadena ligera Kappa.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de la purificación por cromatografía de
afinidad sobre la proteína A sefarosa (Pharmacia) y diálisis en
tampón Tris 25 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4, se determina la
concentración del anticuerpo T125 mediante la técnica de ELISA.
Después, se mide la actividad biológica in vitro mediante la
técnica ADCC.
\vskip1.000000\baselineskip
- Coating: anti-IgG (Calbiochem) a 2 \mug/ml en tampón carbonato 0,05M pH 9,5, 1 noche a 4ºC. Saturación: tampón de dilución (PBS + 1% de BSA + 0,05% de Tween 20, pH 7,2) 1 h a temperatura ambiente. Lavado (renovar en cada etapa): H_{2}O + NaCl 150 mM + 0,05% de Tween 20. Dilución de las muestras en tampón de dilución a aproximadamente 100 ng/ml y del intervalo de control constituido a partir de IgG humanas polivalentes LFB prediluidas a 100 ng/ml. Incubación durante 2 h a temperatura ambiente. Conjugado: anti-IgG (Diagnostic Pasteur) diluido al 1/5000, durante 2 horas a temperatura ambiente. Sustrato: OPD a 0,5 mg/ml (Sigma) en tampón de fosfato citrato, perborato de Na (Sigma), durante 10 minutos en oscuridad. Parada de la reacción mediante HCL 1N, y lectura a 492 nm.
- Coating: anti-Kappa (Caltag Lab) a 5 \mug/ml en tampón carbonato 0,05M pH 9,5, 1 noche a 4ºC. Saturación: tampón de dilución (PBS + 1% de BSA + 0,05% de Tween 20, pH 7,2) durante 1 h a temperatura ambiente. Lavado (renovar en cada etapa): H_{2}O + NaCl 150 mM + 0,05% de Tween 20. Dilución de las muestras en tampón de dilución a aproximadamente 100 ng/ml y del intervalo de control constituido a partir del anticuerpo monoclonal AD3T1 LFB (Kappa/gamma 3) prediluido a 100 ng/ml. Incubación durante 2 h a temperatura ambiente. Conjugado: anti-Kappa biotinilado (Pierce) diluido al 1/1000 en presencia de estreptavidina-peroxidasa (Pierce) diluido al 1/1500, durante 2 horas a temperatura ambiente. Sustrato: OPD a 0,5 mg/ml (Sigma) en tampón de fosfato citrato, perborato de Na (Sigma), durante 10 minutos en oscuridad. Parada de la reacción mediante HCL 1N, y lectura a 492 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Este método se usa para la determinación
específica de los anticuerpos anti-D en particular
cuando se trata de sobrenadante de cultivo en unas etapas de
cultivo en las que otras inmunoglobulinas no anti-D
están presentes en la disolución (etapas precoces después de la
transformación EBV).
Principio: el anticuerpo
anti-D se incuba con unos hematíes Rhesus positivo y
después se revela mediante una anti-Ig humana
marcada con fosfatasa alcalina.
100 \mul de hematíes Rh+ a 10% diluidos en
tampón de dilución Liss-BSA 1%. Dilución de las
muestras en tampón de dilución a aproximadamente 500 ng/ml y del
intervalo de control constituido a partir de una IgG
anti-D humana monoclonal purificada (DF5, LFB)
prediluida a 500 ng/ml. Incubación durante 45 min a temperatura
ambiente. Lavado (renovar en cada etapa): H_{2}O + NaCl 150 mM.
Conjugado: anti-IgG fosfatasa alcalina (Jackson)
diluido al 1/4000 en PBS + 1% de BSA, durante 1 h 30 a temperatura
ambiente. Sustrato: PNPP a 1 mg/ml (Sigma) en dietanolamina 1M,
MgCl2 0,5 mM; pH 9,8. Parada de la reacción mediante NaOH 1N y
lectura a 405 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
La técnica ADCC
(Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity) permite
evaluar la capacidad de los anticuerpos (anti-D)
para inducir la lisis de los hematíes Rh positivo, en presencia de
células efectoras (células mononucleadas o linfocitos).
Brevemente, los hematíes de un concentrado
globular Rh positivo se tratan con papaína (1 mg/ml, durante 10 min
a 37ºC) y después se lavan en NaCl al 0,9%. Las células efectoras se
aíslan a partir de un pool de por lo menos 3
buffy-coat, mediante centrifugación sobre Ficoll
(Pharmacia), seguida de una etapa de adherencia en presencia de 25%
de SVF, de manera que se obtiene una proporción linfocitos/monocitos
del orden de 9. En una placa de microtitulación (96 pocillos) se
depositan por pocillo: 100 \mul de anticuerpos
anti-D purificados a 200 ng/ml, 25 \mul de
hematíes papainados Rh+ (es decir 1 x 10^{6}), 25 \mul de
células efectoras (es decir 2 x 10^{6}) y 50 \mul de IgG
polivalentes (Tegelina LFB por ejemplo) con las concentraciones
habituales de 10 y 2 mg/ml. Las diluciones se realizan en IMDM que
contiene SVF al 0,25%. Después de la incubación durante una noche a
37ºC, se centrifugan las placas, y después se mide la hemoglobina
liberada en el sobrenadante en presencia de un sustrato específico
de la actividad peroxidásica (2,7-diaminofluoreno,
DAF). Los resultados se expresan en porcentaje de lisis,
correspondiendo el 100% a la lisis total de los hematíes en
NH_{4}Cl (control 100%), y el 0% a la mezcla de reacción sin
ningún anticuerpo (control 0%).
La lisis específica se calcula en porcentaje
según la siguiente fórmula:
\frac{(DO\
muestra - DO\ control\ 0%)\ x\ 100}{DO\ control\ 100% - DO\ control\
0%} = %\
ADCC
Los resultados presentados en la figura 1
muestran la actividad del anticuerpo producido por el heterohíbrido
F60 comparada con la de los anticuerpos de referencia:
- -
- los anticuerpos policlonales anti-Rh(D) POLI-D LFB 51 y WinRhO W03 (Cangene) = controles positivos
- -
- el anticuerpo monoclonal DF5 (inactivo in vivo sobre el aclaramiento de hematíes Rh(D) positivos (BROSSARD/FNTS, 1990, no publicado)) = control negativo
- -
- las IgG1 purificadas (separadas de las IgG3) a partir del policlonal WinRhO W03.
Dos concentraciones de IgG humanas (Tegelina
LFB) se usan para demostrar que la inhibición de actividad del
control negativo está relacionada con la fijación de las IgG
competidoras sobre los receptores Fc\gamma de tipo I.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ensayo permite apreciar la fijación de los
anticuerpos anti-Rh(D) de isotipo IgG1 sobre
el Fc\gammaRIII y en particular diferenciar unos anticuerpos
IgG3. Teniendo en cuenta la baja afinidad de este receptor para las
IgG monoméricas, es necesaria la fijación previa de los anticuerpos
sobre el antígeno D.
Principio: sobre unas membranas de
hematíes Rh+ recubiertas en placas de microtitulación, se añade el
anticuerpo a ensayar (anti-D) y después unas
células Jurkat transfectadas que expresan en su superficie el
receptor Fc\gammaRIII. Después de la centrifugación, se visualiza
la interacción "membrana Rh+/anti-D/Jurkat
CD16" mediante un esparcimiento homogéneo de las Jurkat CD16 en
el pocillo. Al contrario, las células se agrupan en el centro del
pocillo en ausencia de interacción. La intensidad de la reacción se
expresa en cantidad de +.
\vskip1.000000\baselineskip
1) Incubación durante 1 h a 37ºC del anticuerpo
anti-D (50 \mul a 1 \mug/ml en IMDM) sobre una
placa de Capture R (Immunochim), y después se lavan con agua + NaCl
al 0,9%. Se añade Jurkat CD16 (2\cdot10^{6} células/ml) en IMDM
+ 10% de SVF. Se incuba durante 20 min a 37ºC y después se
centrifuga y se evalúa la adherencia de las células (frente a un
intervalo de control).
2) Revelación del anti-D fijado
sobre las placas de Capture R mediante la técnica de tipo ELISA con
la ayuda de anti IgG humanas-peroxidasa al 1/5000
(Sanofi Diagnostics Pasteur) después de haber lisado las células
Jurkat CD16 con Tris-HCl 0,2M, urea 6M, pH
5,3-5,5. Revelación OPD y después lectura de la
densidad óptica (D.O.) a 492 nm.
Expresión de los resultados: se asigna un valor
arbitrario de 0 a 3 en función de la fijación y del esparcimiento
de las células Jurkat CD16. Estos valores se asignan a cada
intervalo de DO definido (de 0,1 en 0,1). Se traza:
- \text{*}
- o bien una curva: adherencia de las células Jurkat (Y) en función de la cantidad de anti-D fijada sobre las membranas de hematíes (X).
- \text{*}
- o bien un histograma de los "índices de fijación" que corresponde para cada anticuerpo a la suma de cada valor de fijación de las células Jurkat (0 a 3) asignada por intervalo de DO (sobre una porción común al conjunto de los anticuerpos ensayados).
Se presenta en la figura 2 un ejemplo de
histograma.
Los anticuerpos
anti-Rh(D) de isotipo IgG1 (F60 y T125 YB2/0)
muestran un índice de fijación próximo al de las IgG1 policlonales
(WinRho), mientras que los anticuerpos de control negativos DF5 y
AD1 no se fijan. De la misma manera, el anticuerpo de isotipo IgG3
(F41) presenta un buen índice de fijación, ligeramente inferior al
de las IgG3 purificadas a partir del policlonal WinRho y superior al
del anticuerpo AD3 (otra IgG3 ensayada e ineficaz en ensayo
clínico, en mezcla con AD1 (Biotest/LFB, 1997, no publicado).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se han extraído los ARN totales de un clon
productor de Ac anti-D (IgG G1/Kappa) obtenido por
transformación EBV: T125 A2 (5/1) A2 (véase apartado 2, ejemplo
1).
Los ADNc correspondientes han sido sintetizados
por transcripción inversa de los ARN totales con la ayuda de
cebadores oligo dT.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia VH/T125-A2 se
obtiene mediante la amplificación de los ADNc de
T125-A2 con la ayuda de los siguientes
cebadores:
- -
- el cebador A2VH5 localizado en la dirección 5' de la región líder del gen VH de T125-A2, introduce una secuencia líder de consenso (en negrita) deducida de secuencias líder ya publicadas y asociadas a unos genes VH que pertenecen a la misma familia VH3-30 que el gen VH de T125-A2; esta secuencia comprende asimismo un sitio de restricción Eco RI (en cursiva) y una secuencia de Kozak (subrayada):
- A2VH5 (SEC ID nº1):
- 5'-CTCTCCGAATTC GCCGCCACC ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGT-3'
- -
- el cebador antisentido GSP2ANP situado en la dirección 5' de la región constante (CH) de T125-A2: GSP2ANP (SEC ID nº 2):
- 5'-GGAAGTAGTCCTTGACCAGGCAG-3'.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia CH/T125-A2 se
obtiene mediante la amplificación de los ADNc de
T125-A2 con la ayuda de los siguientes
cebadores:
- -
- cebador G1 localizado en 5' de la región CH de T125-A2:
- G1 (SEC ID nº3): 5'-CCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC-3'
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
- La primera base G de la secuencia CH se sustituye en este caso por un C (subrayado) a fin de recrear después de la clonación un sitio Eco RI (véase el apartado 2.1.1).
- -
- el cebador antisentido H3'Xba situado en 3' del CH de T125-A2, introduce un sitio Xba I (subrayado) en 3' de la secuencia amplificada:
- H3'Xba (SEC ID nº4):
- 5'-GAGAGGTCTAGACTATTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3'
\vskip1.000000\baselineskip
La cadena Kappa completa de
T125-A2 (secuencia K/T125-A2) se
amplifica a partir de los ADNc de T125-A2 usando
los siguientes cebadores:
- -
- el cebador A2VK3 situado en dirección 5' de la región líder del gen VK de T125-A2, introduce una secuencia de consenso (en negrita) deducida de la secuencia de varias regiones líder de genes VK VH que pertenecen al mismo sub-grupo VK1 que el gen VK de T125-A2; esta secuencia comprende asimismo un sitio de restricción Eco RI (en cursiva) y una secuencia de Kozak (subrayado):
- A2VK3 (SEC ID nº5):
- 5'-CCTACCGAATTC GCCGCCACC ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCA-3'
- -
- cebador antisentido KSE1 localizado en dirección 3' de Kappa, introduce un sitio Eco RI (subrayado):
- KSE1 (SEC ID nº6):
- 5'-GGTGGTGAATTCCTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT-3'.
La Fig. 1 esquematiza las estrategias de
amplificación de las cadenas pesada y ligera de
T125-A2.
\vskip1.000000\baselineskip
La construcción de T125-H26 se
resume en la Fig. 2. Se efectúa en dos tiempos: en primer lugar la
construcción del vector intermedio
V51-CH/T125-A2 por inserción de la
región constante de T125-A2 en el vector de
expresión V51 derivado de pCl-neo (Fig. 3) y
después clonación de la región variable en
V51-CH/T125-A2.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia CH/T125-A2
amplificada se inserta después de la fosforilación a nivel del sitio
Eco RI del vector V51 (Fig. 3). La unión se efectúa después del
tratamiento previo con polimerasa Klenow de los extremos cohesivos
Eco RI de V51 a fin de hacerlos "extremos romos".
El cebador G1 usado para la amplificación de
CH/T125-A2 permite recrear después de su inserción
en V51 un sitio Eco RI en dirección 5' de
CH/T125-A2.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia VH/T125-A2 obtenida
por amplificación es digerida por Eco RI y Apa I y después se
inserta a nivel de los sitios Eco RI y Apa I del vector
V51-G1/T125-A2.
\vskip1.000000\baselineskip
La construcción de T125-K47 se
representa en la Fig. 4. La secuencia K/T125-A2
obtenida mediante PCR es digerida por Eco RI y se inserta a nivel
del sitio Eco RI del vector de expresión V47 derivado de
pCl-neo (Fig. 5).
\vskip1.000000\baselineskip
La construcción de T125-IG24 se
esquematiza en la Fig. 6. Este vector que contiene las dos unidades
de transcripción de las cadenas pesada y Kappa de
T125-A2 se obtiene mediante la inserción del
fragmento Sal I - Xho I de T125-K47 que contiene la
unidad de transcripción de K/T125-A2 a nivel de los
sitios Xho I y Sal I de T125-H26.
De esta forma, las cadenas pesadas y ligeras de
T125-A2 se expresan bajo la dependencia del promotor
CMV; se pueden usar otros promotores: RSV, promotor de cadena
pesada IgG, LTR, MMLV, HIV, \beta actina, etc.
\vskip1.000000\baselineskip
Se construye asimismo un segundo vector de
expresión de T125-A2 en el que la secuencia líder de
consenso de la cadena Kappa se sustituye por la secuencia real de
la región líder de T125-A2 previamente determinada
por secuenciación de productos de "PCR
5'-RACE" (Rapid Amplification of cDNA 5'
Ends).
La construcción de este vector
T125-LS4 se describe en la Fig. 7. Se lleva a cabo
en dos etapas: en primer lugar la construcción de un nuevo vector
de expresión de la cadena Kappa de T125-A2,
T125-KLS18, y después el ensamblaje del vector de
expresión final, T125-LS4, que contiene las dos
unidades de transcripción de cadena ligera modificada y de cadena
pesada.
\vskip1.000000\baselineskip
La parte 5' de la secuencia líder de consenso
Kappa del vector T125-K47 se sustituye por la
secuencia líder específica de T125 (KLS/T125-A2)
durante una etapa de amplificación de la secuencia
K/T125-A2 realizada con la ayuda de los siguientes
cebadores:
- -
- el cebador A2VK9 modifica la parte 5' de la región líder (en negrita) e introduce un sitio Eco RI (subrayado) así como una secuencia de Kozak (en cursiva):
- A2VK9: 5'-CCTACCGAATTC GCCGCCACC ATGAGGGTCCCCGCTCAGCTC-3'
- -
- cebador KSE1 (descrito en el apartado 1.4)
El vector T125-KLS18 se obtiene
a continuación sustituyendo el fragmento Eco RI de
T125-K47 que contiene la secuencia
K/T125-A2 de origen por la nueva secuencia
KLS/T125-A2 digerida por Eco RI.
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento Sal I - Xho I de
T125-KLS18 que contiene la secuencia modificada
KLS/T125-A2 se inserta en T125-H26
a nivel de los sitios Xho I y Sal I.
\vskip1.000000\baselineskip
Los dos vectores de expresión
T125-IG24 y T125-LS4 se han usado
para la transfección de células de la línea YB2/0 (mieloma de rata,
línea ATCC nº 1662).
Después de la transfección por electroporación y
la selección de los transformantes en presencia de G418 (selección
neo), se han aislado varios clones. La producción de Ac
anti-D recombinantes es de aproximadamente 0,2
\mug/10^{6} células/24 h (valor obtenido para el clon 3B2 de
R270). La actividad ADCC de este Ac recombinante es superior o
igual a la de los controles poli-D (figura 1). Los
Ac producidos con la ayuda de dos vectores de expresión no son
significativamente diferentes en términos de nivel de producción o
de actividad ADCC.
\vskip1.000000\baselineskip
El sistema de amplificación génica usado se basa
en la selección de los transformantes que resisten al metotrexato
(MTX). Necesita la introducción previa de una unidad de
transcripción que codifica para la enzima DHFR (dihidrofolato
reductasa) en el vector de expresión del Ac recombinante (SHITARI
et al., 1994).
\vskip1.000000\baselineskip
El esquema presentado en la Fig. 8 describe la
construcción del vector de expresión de T125-A2 que
contiene el gen dhfr murino.
Se ha construido un primer vector (V64) a partir
de un vector de pCl-neo, V43 (Fig. 9), sustituyendo
en dirección 3' del promotor SV40 y en dirección 5' de una
secuencia de poliadenilación sintética, el gen neo (fragmento Hind
III- Csp 45 I) por el ADNc del gen dhfr murino (obtenido por
amplificación a partir del plásmido pMT2). Después, este vector se
modifica de manera que se crea un sitio Cla I en dirección 5' de la
unidad de transcripción dhfr. El fragmento Cla I que contiene la
unidad de transcripción dhfr se inserta después a nivel del sitio
Cla I de T125-LS4.
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
Las células YB2/0 transfectadas por
electroporación con el vector T125-dhfr13 se
seleccionan en presencia de G418. Los transformantes productores de
Ac recombinante se someten a continuación a una selección en
presencia de dosis crecientes de MTX (de 25 nM a 25 \muM). La
evolución de la producción de Ac recombinantes, control del proceso
de amplificación génica, se monitoriza a lo largo de las etapas de
selección en MTX. Los transformantes que resisten al MTX se clonan
después por dilución límite. Se evalúa el nivel y la estabilidad de
la producción de Ac recombinantes para cada clon obtenido. La
productividad de anticuerpos anti-D después de la
amplificación génica es de aproximadamente 13 (+/- 7)
\mug/10^{6} células/24 h.
Las células YB2/0 transfectadas por
electroporación con el vector T125-dhfr13 se
seleccionan en presencia de G418. Los mejores transformantes
productores de Ac recombinante se clonan por dilución límite antes
de la selección en presencia de dosis crecientes de MTX. La
evolución de la producción de cada clon, control del proceso de
amplificación génica, se monitoriza a lo largo de las etapas de
selección en MTX. Se evalúa el nivel y la estabilidad de la
producción de Ac recombinantes para cada clon resistente al MTX
obtenido.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de la purificación por cromatografía de
afinidad sobre proteína A sefarosa (Pharmacia) y diálisis en tampón
Tris 25 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4, se determina la concentración del
anticuerpo T125 mediante la técnica ELISA. La actividad biológica
in vitro se mide a continuación mediante el ensayo ADCC
descrito anteriormente. Los resultados se presentan en la figura
1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Varios estudios describen el efecto de
inhibidores enzimáticos sobre la glicosilación de las
inmunoglobulinas y sobre su actividad biológica. Un aumento de la
actividad ADCC se relaciona en ROTHMAN et al., 1989, aumento
no atribuible a una mejora de la afinidad del anticuerpo para su
diana. La modificación de glicosilación provocada por la adición de
DMM consiste en una inhibición de la
\alpha1,2-manosidasa I presente en el Golgi.
Conduce a la producción de una proporción más importante de
estructuras polimanosiladas, no fucosiladas.
Diferentes líneas productoras de anticuerpos
anti-Rh(D) han sido puestas en presencia de
DMM, y la actividad funcional de los anticuerpos monoclonales
producidos ha sido evaluada en forma de sobrenadantes de cultivo o
después de la purificación.
Las células (heterohíbridas o linfoblastoides)
se inoculan entre 1 y 3 x 10^{5} células/ml, y se cultivan en un
medio de cultivo IMDM (Life Technologies) con 10% de SVF y en
presencia de 20 \mug/ml de DMM (Sigma, Boehringer). Después de 3
renovaciones de medio, se ensayan los sobrenadantes de cultivo
mediante ELISA IgG humanas y después mediante ADCC.
- \bullet
- El cultivo en presencia de desoximanojirimicina (DMM) aporta una mejora significativa de los resultados ADCC para los anticuerpos débilmente activos antes producidos por:
- Un hibridoma hombre-ratón
- D31
- Una línea linfoblastoide humana
- DF5
- Una línea murina transfectada
- T125 en CHO
- \bullet
- La adición de DMM puede permitir restaurar la actividad ADCC de un anticuerpo que procede del cloide T 125 = T125 RI(3) (descrito en el ejemplo 1) y que ha perdido esta actividad por un cultivo prolongado.
- \bullet
- La actividad fuerte del anticuerpo producido por el heterohibridoma F60 (cuya obtención se describe en el ejemplo 1) no se modifica por el cultivo en presencia de DMM.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usa la secuencia nucleotídica del anticuerpo
DF5, control negativo en el ensayo ADCC, para estudiar la
transfección de este anticuerpo en algunas líneas, paralelamente a
la transfección del anticuerpo T125.
Las secuencias que codifican para el Ac DF5 se
aíslan y se amplifican según las mismas técnicas usadas para el Ac
recombinante T125-A2.
- \bullet
- Los ADNc correspondientes se sintetizan en primer lugar a partir de ARN totales extraídos del clon productor de Ac anti-D (IgG G1/Lambda) 2MDF5 obtenido por transformación EBV.
- \bullet
- La amplificación de las cadenas pesada y ligera se realiza a continuación a partir de estos ADNc usando los cebadores presentados a continuación.
- \bullet
- Amplificación de la región variable de la cadena pesada de DF5 (secuencia VH/DF5):
- -
- cebador DF5VH1 localizado en dirección 5' de la región líder (en negrita) del gen VH de DF5 (secuencia publicada: Chouchane L et al.); este cebador comprende asimismo un sitio de restricción Eco RI (en cursiva) y una secuencia de Kozak (subrayada): DF5VH1 (SEC ID nº 8):
- 5'CTCTCCGAATTC GCCGCCACC ATGGACTGGACCTGGAGGATCCTCTTTTTGGTGG-3'
- -
- El cebador antisentido GSP2ANP situado en dirección 5' de la región constante (CH) ya descrito en el apartado 1.2 (ejemplo 2).
- \bullet
- Amplificación de la región constante CH de DF5 (secuencia CH/DF5): cebadores G1 y H3'Xba ya descritos en el apartado 1.3 (ejemplo 2).
- \bullet
- Amplificación de la cadena ligera Lambda de DF5 (secuencia LBD/DF5):
- -
- El cebador DF5VLBD1 situado en dirección 5' de la región líder del gen VL de DF5, introduce una secuencia de consenso (en negrita) deducida de la secuencia de varias regiones líder de genes VL que pertenecen al mismo sub-grupo VL1 que el gen VL de 2MDF5; esta secuencia comprende asimismo un sitio de restricción Eco RI (en cursiva) y una secuencia de Kozak (subrayada):
- DF5VLBD1 (SEC ID nº9):
- 5' CCTACCGAATTC GCCGCCACC ATGGCCTGGTCTCCTCTCCTCCTCAC-3'
- -
- El cebador antisentido LSE1 localizado en dirección 3' de Lambda, introduce un sitio Eco RI (subrayado):
- LSE1 (SEC ID nº 10):
- 5'-GAGGAGGAATTCACTATGAACATTCTGTAGGGGCCACTGTCTT-3'.
- \bullet
- La construcción de los vectores de expresión de cadena pesada (DF5-H31), de cadena ligera (DF5-L10) y de cadenas pesada y ligera (DF5-IG1) del Ac DF5 se efectúa según un esquema de construcción similar a los vectores que expresan el Ac T125-A2. Todas las secuencias líder de origen (introducidas a nivel de los cebadores de amplificación) se conservan en estos diferentes vectores.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usan los tres vectores de expresión
T125-IG24, T125-LS4 y
DF5-IgG1 para la transfección de células de
diferentes líneas:
Se realizan unas transfecciones estables o
transitorias mediante electroporación o con la ayuda de un agente
reactivo de transfección.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Después de la selección de los transformantes en
presencia de G418 (selección neo) se han aislado varios clones.
La modificación de actividad efectora de un
anticuerpo monoclonal humanizado en función de la célula de
expresión ha sido descrita por CROWE et al. (1992), con las
líneas celulares CHO, NSO, YB2/0.
Los resultados obtenidos en este caso confirman
la importancia de la línea celular de expresión frente a las
características funcionales del anticuerpo a producir. Entre las
células ensayadas, sólo las líneas Vero, YB2/0 y CHO
Lec-1 permiten expresar unos anticuerpos
monoclonales anti-Rh(D) recombinantes con una
actividad lítica fuerte en el ensayo ADCC (véase el ejemplo 1 y la
tabla 3).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La caracterización de las estructuras glicánicas
del anticuerpo anti Rh-D ha sido realizada sobre
cuatro productos purificados que tienen una actividad ADCC (F 60, y
tres proteínas recombinantes procedentes de T125) en comparación
con dos productos purificados inactivos o muy débilmente activos en
el ensayo ADCC según la invención (D31 y DF5).
En la práctica, los oligosacáridos se separan de
la proteína mediante una desglicosilación enzimática específica por
la PNGasa F a nivel del Asn 297. Los oligosacáridos así liberados se
marcan mediante un fluoróforo, se separan y se identifican mediante
diferentes técnicas complementarias que permiten:
- -
- Una caracterización fina de las estructuras glicánicas mediante espectrometría de masas con desorción láser asistida por matriz (MALDI) por comparación de las masas experimentales con las masas teóricas.
- -
- La determinación del porcentaje de sialilación por HPLC de intercambios de iones (GlycoSep C).
- -
- La separación y la cuantificación de las formas oligosacarídicas según unos criterios de hidrofilicidad por HPLC en fase normal (GlycoSep N).
- -
- La separación y la cuantificación de los oligosacáridos mediante electroforesis capilar con detección de fluorescencia inducida por láser (HPCE-LIF).
\vskip1.000000\baselineskip
Las diferentes formas activas estudiadas son F
60 y tres anticuerpos recombinantes, R 290, R 297 y R 270,
procedentes de T125 y producidos en YB2/0. La caracterización fina
de las estructuras glicánicas por espectrometría de masas (figura
7) muestra que todas estas formas son de tipo biantenadas. En el
caso de R 270 la forma mayoritaria es de tipo agalactosilada no
fucosilada (G0, masa exp. 1459,37 Da, fig. 1). Se han identificado
otras tres estructuras: agalactosilada fucosilada (G0F a 1605,41
Da), monogalactosilada no fucosilada (G1 a 1621,26 Da) y
monogalactosilada fucosilada (G1F a 1767,43 Da) minoritaria. Estas
cuatro mismas estructuras son características de R 290, F 60 y R
297 (Figura 1).
Estos cuatro anticuerpos activos en ADCC se
caracterizan asimismo por la ausencia de oligosacáridos que poseen
un residuo N-acetilglucosamina en bisectriz.
La cuantificación de las estructuras glicánicas
mediante las diferentes técnicas de HPLC y de
HPCE-LIF (Tabla 1) confirma la presencia de las
cuatro formas identificadas en masa: G0, G0F, G1 y G1F. El
porcentaje de sialilación es muy bajo, en particular para los
productos recombinantes, de 1 a 9,4%, lo que se confirma mediante la
similitud de los espectros de masa obtenidos antes y después de la
desialilación enzimática. El porcentaje de fucosilación varía entre
34 y 59%.
\vskip1.000000\baselineskip
Las diferentes formas inactivas estudiadas son
D31 y DF5. La cuantificación de las estructuras glicánicas mediante
las diferentes técnicas cromatográficas y de electroforesis capilar
(Tabla 1) revela, para estos dos anticuerpos, un porcentaje de
sialilación próximo a 50%, y un porcentaje de fucosilación de 88 y
100% para D31 y DF5, respectivamente. Estos porcentajes de
sialilación y de fucosilación son muy superiores a los obtenidos a
partir de las formas
activas.
activas.
La caracterización de las estructuras glicánicas
muestra que la forma mayoritaria es, para los dos anticuerpos, de
tipo biantenada monosialilada bigalactosilada fucosilada (G2S1F,
tabla 1). La caracterización mediante espectrometría de masas de
D31 (figura 7) revela que las formas neutras son mayoritariamente de
tipo monogalactosilada fucosilada (G1F a 1767,43 Da) y
bigalactosilada fucosilada (G2F a 1929,66 Da).
El anticuerpo inactivo DF5 se caracteriza por la
presencia de oligosacáridos que poseen un residuo GlcNAc
intermedio. En particular, el análisis en masas (figura 8) revela la
presencia de una forma neutra mayoritaria de tipo monogalactosilada
fucosilada Bisec-GlcNAc intermedia (G1FB a 1851,03
Da). Por el contrario, estas formas estructurales no son
detectables o están presentes en el estado de traza en los
anticuerpos activos estudiados.
La actividad ADCC del D31 después de la acción
del DMM pasa de 10% a 60%. Las estructuras glicánicas del D31 DMM
difieren de las de D31 por la presencia de formas oligomanosas (Man
5, Man 6 y Man 7) (véase la figura 9).
\vskip1.000000\baselineskip
Los diferentes anticuerpos activos son
modificados sobre el Asn 297 por unas
N-glicosilaciones de tipo biantenadas y/o
oligomanosídicas. Para las formas biantenadas, se trata de
estructuras cortas muy débilmente sialiladas, débilmente
fucosiladas, débilmente galactosiladas y sin ningún GlcNAc
intermedio.
\vskip1.000000\baselineskip
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Claims (32)
1. Procedimiento de preparación de un anticuerpo
monoclonal capaz de activar las células efectoras que expresan el
Fc\gammaRIII, caracterizado porque comprende las etapas
siguientes:
- a)
- purificar anticuerpos monoclonales obtenidos a partir de diferentes clones que proceden de líneas celulares seleccionadas de entre los hibridomas, en particular los heterohibridomas y las líneas celulares animales o humanas transfectadas con la ayuda de un vector que comprende el gen que codifica para dicho anticuerpo;
- b)
- añadir cada anticuerpo obtenido en la etapa a) en una mezcla de reacción distinta que comprende las células diana de dichos anticuerpos, unas células efectoras que comprenden unas células que expresan el Fc\gammaRIII, y unas IgG polivalentes,
- c)
- determinar el porcentaje de lisis de las células diana y seleccionar los anticuerpos monoclonales que activan las células efectoras que provocan una lisis significativa de las células diana (actividad ADCC de tipo Fc\gammaRIII).
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque los clones proceden de líneas celulares
heterohíbridas obtenidas por fusión de linfocitos B humanos que
proceden de sujetos inmunizados con unas células de mieloma murino,
humano o heterohíbrido, en particular el mieloma
K6H6-B5 (ATCC nº CRL 1823).
3. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque los clones proceden de líneas celulares
animales o humanas transfectadas con la ayuda de un vector que
contiene el gen que codifica para una inmunoglobulina humana de
tipo IgG, pudiendo dichas líneas ser seleccionadas en particular de
entre las líneas CHO-K, CHO-Lec10,
CHO Lec-1, CHO Pro-5, CHO dhfr-,
Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4,
COS-7, 293-HEK, YB2/0, BHK, K6H6,
NSO, SP2/0-Ag 14 y P3X63Ag8.653.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las IgG
polivalentes inhiben el mecanismo de lisis de las células efectoras
a través del receptor Fc\gammaRIII.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se
seleccionan los anticuerpos que presentan un porcentaje ADCC de
tipo Fc\gammaRIII superior a 60%, 70%, 80% o preferentemente
superior a 90%.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las células
diana son unos hematíes tratados con papaína.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se deposita
por pocillo:
- -
- 100 \mul de anticuerpos monoclonales purificados con unas concentraciones de 20 a 200 ng/ml,
- -
- 25 \mul de hematíes papainados, es decir, aproximadamente 1x10^{6} células,
- -
- 25 \mul de células efectoras, es decir, aproximadamente 2 x 10^{6} células, y
- -
- 50 \mul de IgG polivalentes, en particular de TEGELINE^{TM}, con una concentración comprendida entre 1 y 20 mg/ml.
8. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se compara
la cantidad de lisis de las células diana con dos controles
positivos que consisten en un compuesto químico tal como NH_{4}Cl
y un anticuerpo de referencia activo in vivo, y con un
control negativo que consiste en un anticuerpo inactivo in
vivo.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los
anticuerpos monoclonales son unos
anti-Rh(D), y las células diana son unos
hematíes rhesus D.
10. Procedimiento según la reivindicación 9,
caracterizado porque se usan los anticuerpos policlonales de
origen comercial como controles positivos, y un anticuerpo
monoclonal no apropiado para inducir un aclaramiento in vivo
como control negativo.
11. Anticuerpos susceptibles de ser obtenidos a
partir de un procedimiento según una de las reivindicaciones
anteriores, caracterizados porque presentan unos porcentajes
ADCC de tipo Fc\gammaRIII superiores a 60%, 70%, 80% o
preferentemente superiores a 90% con relación al policlonal de
referencia, y porque poseen sobre su sitio de glicosilación (Asn
297) Fc\gamma de las estructuras glicánicas de tipo biantenadas,
con unas cadenas cortas, una baja sialilación, y un contenido
superior al 60% para las formas G0 + G1 + G0F + G1F, siendo las
formas G0F + G1F superiores a 50%.
12. Anticuerpo monoclonal dirigido contra un
antígeno determinado, caracterizado porque activa las células
efectoras que expresan el Fc\gammaRIII que provoca una lisis
superior a 60%, 70%, 80%, preferentemente superior a 90% de la
lisis provocada por unos anticuerpos policlonales dirigidos contra
dicho antígeno, y porque posee sobre su sitio de glicosilación (Asn
297) Fc\gamma de las estructuras glicánicas de tipo biantenadas,
con unas cadenas cortas, una baja sialilación, y un contenido
superior al 60% para las formas G0 + G1 + G0F + G1F, siendo las
formas G0F + G1F inferiores a 50%.
13. Anticuerpo monoclonal según una de las
reivindicaciones 11 y 12, caracterizado porque está dirigido
contra el antígeno rhesus D.
14. Anticuerpo monoclonal según la
reivindicación 13, caracterizado porque está producido por
unos clones derivados de las líneas Vero (ATCC nº CCL 81), YB2/0
(ATCC nº CRL 20 1662) o CHO Lec-1 (ATCC nº CRL
1735).
15. Anticuerpo según una de las reivindicaciones
12 a 14, caracterizado porque se trata de una IgG1 o de una
IgG3.
16. Anticuerpos susceptibles de ser obtenidos a
partir de un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a
10, caracterizados porque poseen sobre su sitio de
glicosilación (Asn 297) Fc\gamma de las estructuras glicánicas de
tipo biantenadas, con unas cadenas cortas, una baja sialilación, y
un contenido superior a 60% para las formas G0 + G1 + G0F + F1F,
siendo las formas G0F + G1F inferiores a 50%.
17. Anticuerpo según la reivindicación 16,
caracterizado porque su estructura glicánica presenta unas
manosas terminales y/o unas N-acetilglucosaminas
terminales no intermedias.
18. Anticuerpo monoclonal, caracterizado
porque posee en su sitio de glicosilación (Asn 297) Fc\gamma de
las estructuras glicánicas de tipo biantenadas, con unas cadenas
cortas, una baja sialilación, unas manosas terminales y/o unos
GlcNAc terminales no intermedios.
19. Anticuerpo monoclonal según la
reivindicación 18, dirigido contra un antígeno determinado,
caracterizado porque activa las células efectoras
Fc\gammaRIII+ provocando una lisis superior a 60%, 70%, 80%,
preferentemente superior a 90% de la lisis provocada por unos
anticuerpos policlonales dirigidos contra dicho antígeno.
20. Células que producen un anticuerpo según una
de las reivindicaciones 11 a 19.
21. Células según la reivindicación 20,
caracterizadas porque se trata de un hibridoma, en particular
de un heterohibridoma obtenido por fusión con mieloma
K6H6-B5 (ATCC nº CRL 1823) o de una célula animal o
humana transfectada con la ayuda de un vector que comprende el gen
que codifica para dicho anticuerpo, en particular una célula
derivada de las líneas Vero (ATCC nº CCL 81), YB2/0 (ATCC nº CRL
1662) o CHO Lec-1 (ATCC nº CRL 1735).
22. Composición farmacéutica que comprende un
anticuerpo según una de las reivindicaciones 11 a 19.
23. Uso de un anticuerpo según cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 19, para la preparación de un medicamento.
24. Uso de un anticuerpo
anti-Rh(D) según una de las reivindicaciones
11 a 19, para la preparación de un medicamento destinado a la
prevención de la aloinmunización Rhesus de individuos Rh
negativo.
25. Uso según la reivindicación 24 de manera
profiláctica para la protección de mujeres Rhesus negativo,
inmediatamente después del nacimiento de un hijo Rhesus positivo,
para prevenir, durante los embarazos ulteriores, la enfermedad
hemolítica del recién nacido (MHNN).
26. Uso según la reivindicación 23 durante
abortos, embarazos extra uterinos en situación de incompatibilidad
Rhesus D.
27. Uso según la reivindicación 23 durante
hemorragias transplacentarias que resultan de amniocentesis, de
biopsias coriónicas, o de manipulaciones obstétricas traumatizantes
en situación de incompatibilidad Rhesus D.
28. Uso según la reivindicación 23, en el caso
de transfusiones Rh incompatibles con sangre o derivados sanguíneos
lábiles.
29. Uso según la reivindicación 23, para la
preparación de un medicamento destinado a un uso terapéutico en la
Púrpura Trombocitopénica Idiopática (PTI).
30. Uso según la reivindicación 23, para la
preparación de un medicamento destinado al tratamiento de cánceres
por inmunoterapia.
31. Uso según la reivindicación 23, para la
preparación de un medicamento destinado al tratamiento de
infecciones causadas por unos agentes patógenos víricos o
bacterianos.
32. Kit de diagnóstico que comprende un
anticuerpo según una de las reivindicaciones 11 a 19.
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