ES2277829T3 - Composiciones y metodos para la produccion libre de adyuvante de virus adenoasociados recombinantes. - Google Patents
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Abstract
Un virus híbrido de adenovirus/AAV competente para la replicación, que comprende: (a) elementos cis 5'' de adenovirus necesarios para la replicación y el empaquetamiento; (b) una deleción de secuencias adenovirales en la región E1a y E1b adenoviral natural; (c) un vector viral adenoasociado recombinante (rAAV); (d) una deleción de secuencias adenovirales de la región E3; (e) secuencias de ácido nucleico que codifican E1a de adenovirus y E1b de adenovirus bajo el control de secuencias reguladoras que dirigen la expresión de los productos génicos E1a y E1b, en donde dichas secuencias de ácido nucleico de E1a y E1b están situadas en el sitio de la región E3, y (f) elementos cis 3'' de adenovirus necesarias para la replicación y el empaquetamiento.
Description
Composiciones y métodos para la producción libre
de adyuvante de virus adenoasociados recombinantes.
El virus adenoasociado (AAV) es un parvovirus
deficiente en la replicación, cuyo genoma tiene aproximadamente 4,6
kb de longitud, que incluye repeticiones terminales invertidas
(ITRs) de 145 nucleótidos. Dos marcos de lectura abiertos codifican
una serie de polipéptidos rep y cap. Los polipéptidos
rep (rep78, rep68, rep62 y rep40) están implicados en la
replicación, el rescate y la integración del genoma del AAV. Las
proteínas cap (VP1, VP2 y VP3) forman la cápsida del virión.
Flanqueando los marcos de lectura abiertos de rep y
cap en los extremos 5' y 3' hay repeticiones terminales
invertidas (ITRs) de 145 pb, cuyas primeras 125 pb son capaces de
formar estructuras de dúplex con conformación de Y o T. De
importancia para el desarrollo de vectores de AAV, todos los
dominios rep y cap pueden cortarse y reemplazarse por
un transgén terapéutico o informador [B.J. Carter, en "Handbook
of Parvoviruses", ed., P. Tijsser, CRC Press, pp.
155-168 (1990)]. Se ha observado que las ITRs
representan la secuencia mínima requerida para la replicación, el
rescate, el empaquetamiento y la integración del genoma del
AAV.
Cuando este virus humano no patógeno infecta una
célula humana, el genoma viral se integra en el cromosoma 19 dando
como resultado una infección latente de la célula. La producción de
virus infeccioso y la replicación del virus no se producen a no ser
que la célula se coinfecte con un virus adyuvante lítico, tal como
adenovirus (Ad) o herpesvirus. Al infectarse con un virus
adyuvante, el provirus de AAV se rescata y amplifica y se producen
tanto AAV como virus adyuvante. El ssDNA parental infectivo se
expande a DNAs en forma replicante (RF) dúplex de una manera
dependiente de rep. Los genomas de AAV rescatados se
empaquetan en cápsidas proteínicas preformadas (simetría
icosaédrica de aproximadamente 20 nm de diámetro) y se liberan como
viriones infecciosos que han empaquetado genomas de ss DNA bien + o
bien - después de la lisis celular.
El AAV posee características únicas que le hacen
atractivo como un vector para aportar DNA extraño (es decir, un
transgén) a células, y diversos grupos han estudiado el uso
potencial de AAV en el tratamiento de estados patológicos. Según se
usa en esta solicitud, el término "transgén" significa el DNA
que se desea aportar a un animal, no siendo el DNA un DNA de AAV.
Sin embargo, el avance hacia el establecimiento del AAV como un
vector transductor para el aporte de DNA en la forma de un transgén
deseado ha sido lento por una variedad de razones.
Un obstáculo para el uso de AAV para el aporte
de DNA ha sido la falta de esquemas altamente eficaces para la
encapsidación de genomas recombinantes y la producción de viriones
infecciosos. Véase, R. Kotin, Hum. Gene Ther., 5:
793-801 (1994). Un método que se dirige a este
problema implica transfectar un AAV recombinante (rAAV) (que tiene
el DNA que ha de aportarse pero carece de genes rep y
cap) a células huésped seguido por coinfección con AAV
silvestre (wt) (que suministra los genes rep y cap) y
adenovirus (que suministra al menos los cuatro genes de adenovirus:
E1, E2, E4 y VAI, que se ha indicado que son necesarios para la
producción de rAAV) [véase, por ejemplo, Carter, citado
anteriormente]. Otro método, descrito en WO 95/06743, implica la
coinfección de una célula huésped con un virus híbrido de
adenovirus/MV que contiene secuencias E1a y E1b de adenovirus
funcionales y E1 de Adre de adenovirus. Sin embargo, en estos
métodos, la coinfección es obligatoria y conduce a niveles
inaceptablemente altos de wt AAV resultantes de la recombinación no
homóloga y la contaminación del rAAV producido con wt AAV. La
contaminación con otros virus o plásmidos demanda la purificación
del rAAV. La incubación de células con rAAV en ausencia de wt AAV
contaminante o adenovirus adyuvante da poca expresión del gen
recombinante.
Un medio ampliamente reconocido para fabricar
viriones de AAV transductores para la terapia génica implica la
cotransfección con dos plásmidos complementarios diferentes. Uno de
estos plásmidos contiene un transgén terapéutico o informador
intercalado entre las dos ITRs de AAV de acción cis. Los componentes
del AAV que son necesarios para el rescate y el empaquetamiento
subsiguiente del genoma recombinante de la progenie son
proporcionados en trans por un segundo plásmido que codifica los
marcos de lectura abiertos virales para proteínas rep y
cap. En este sistema, las funciones adyuvantes del Ad son
proporcionadas por un adenovirus silvestre o por adenovirus
defectuoso en la replicación con el gen E1 perdido suministrado por
células HBKL 293. Se han descrito otras variantes de este método.
Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 5.658.785, que se
refiere a una célula huésped de mamífero transfectada establemente
con un genoma de rAAV y con genes rep y cap de AAV, y
un método para producir rAAV infectando esta célula huésped con un
virus adyuvante.
La Patente de EE.UU. Nº 5.658.776 se refiere a
sistemas de empaquetado y a procedimientos para empaquetar vectores
de AAV en los que el promotor p5 de AAV se reemplaza por un promotor
heterólogo. Alternativamente, la Patente de EE.UU. Nº 5.622.856 se
refiere a constructos y métodos para la producción de vectores de
AAV en los que el promotor p5 homólogo se mueve hasta una posición
3' de los genes rep, flanqueando opcionalmente los genes
rep/cap, y recolocando el promotor p5 con las secuencias
FRT.
Sigue habiendo una necesidad en la técnica de
composiciones y métodos adicionales que permitan la producción
eficaz de virus AAV y AAV recombinantes para el uso como vectores
para terapia génica somática sin los problemas de ineficacia,
contaminación y purificación presentes en los métodos descritos
previamente.
La Solicitud de Patente Internacional PCT/US
99/05870 (publicada el 23 de septiembre de 1999 como WO 99/47691),
de la que la presente solicitud reivindica la prioridad de
Convención, se refiere a métodos para cultivar una célula huésped
de mamífero que contiene un transgén flanqueado por repeticiones
terminales invertidas de AAV, una secuencia rep de AAV y una
secuencia cap de AAV, y el DNA de adenovirus mínimo requerido
para expresar un producto génico E1a, un producto génico E1b y un
producto génico E2a. Solo los Ejemplos 8 y 9 de la solicitud
describen vectores de Ad/AAV híbridos competentes para la
replicación, y su uso.
La presente invención permite la producción
eficaz de rAAV que contiene un DNA trasngénico deseado.
Particularmente, la presente invención proporciona tanto
composiciones como métodos que permiten la producción de un rAAV sin
producir wt AAV reensamblado contaminante durante la producción de
rAAV.
De acuerdo con la invención se proporciona un
virus híbrido de adenovirus/AAV competente para la replicación que
comprende (a) elementos cis 5' de adenovirus necesarios para la
replicación y el empaquetamiento; (b) una deleción de secuencias
adenovirales en la región E1a y E1b adenoviral natural; (c) un
vector viral adenoasociado recombinante (rAAV), (d) una deleción de
secuencias adenovirales de la región E3; (e) secuencias de ácido
nucleico que codifican el adenovirus E1a y el adenovirus E1b bajo el
control de secuencias reguladoras que dirigen la expresión de los
productos génicos E1a y E1b, en donde dichas secuencias de ácido
nucleico de E1a y E1b están situadas en el sitio de la región E3; y
(f) elementos cis 3' de adenovirus necesarios para la replicación y
el empaquetamiento.
En otro aspecto, la invención proporciona un
método para producir virus adenoasociado recombinante (rAAV) en
ausencia de virus adyuvante o virus silvestre contaminante, que
comprende la etapa de cultivar una célula huésped que comprende (a)
una secuencia rep de AAV y una secuencia cap de AAV
bajo el control de secuencias reguladoras que dirigen su expresión;
y (b) un virus híbrido de adenovirus/AAV que comprende: elementos
cis 5' de adenovirus necesarios para la replicación y el
empaquetamiento; una deleción de secuencias adenovirales en la
región E1a y E1b adenoviral natural; un vector de virus
adenoasociado recombinante (rAAV); una deleción de secuencias
adenovirales de la región E3; secuencias de ácido nucleico que
codifican E1a de adenovirus y E1b de adenovirus bajo el control de
secuencias reguladoras que dirigen la expresión de los productos
génicos E1a y E1b, en donde dichas secuencias de ácido nucleico de
E1a y E1b están situadas en el sitio de la región E3; y elementos
cis 3' de adenovirus necesarios para la replicación y el
empaquetamiento; cultivándose dicha célula huésped bajo condiciones
que inhiben la replicación de virus híbrido, dando como resultado la
producción de rAAV potenciada.
En una modalidad preferida, el método de la
invención simplifica las etapas de purificación debido a que el
rAd/AAV competente para la replicación proporciona el constructo de
rAAV que ha de empaquetarse y todas las secuencias adenovirales
necesarias, no se usa virus adyuvante y existe una secuencia de
adenovirus insuficiente en la célula huésped para permitir la
recombinación homóloga a un virus silvestre contaminante.
Otros aspectos y ventajas de la presente
invención se describen adicionalmente en la siguiente descripción
detallada de sus modalidades preferidas.
La Fig 1A es una producción ilustrativa
esquemática del plásmido lanzadera
pABrAAV-CMV-EGFP según se describe
en el Ejemplo 2.
La Fig 1B es una producción ilustrativa
esquemática de híbrido de rAd/AAV competente para la replicación
mediante recombinación homóloga entre el plásmido lanzadera de la
Fig. 1A y el adenovirus sub 100r, según se describe en el Ejemplo
2.
La presente invención proporciona un virus
híbrido de adenovirus recombinante/AAV (rAd/AAV), en el que un
adenovirus se trata mediante ingeniería para contener un constructo
de rAAV que ha de empaquetarse en un virión de rAAV y suficientes
secuencias adenovirales para permitir la replicación del virus
híbrido en una célula huésped seleccionada. En una modalidad
preferida, todos los genes adenovirales necesarios son
proporcionados por el virus híbrido de rAd/AAV, que carece de las
secuencias adenovirales de la E3 silvestre y puede contener
deleciones no funcionales de secuencias adenovirales, por ejemplo el
virus híbrido puede carecer de todas las secuencias de codificación
de E4 adenovirales con la excepción de las secuencias necesarias
para expresar la función del ORF6 de E4. El constructo de rAAV se
inserta en la región E3 o E1 del adenovirus. Opcionalmente, las
secuencias que codifican los productos génicos E1 se insertan en y
se expresan a partir de la región E3 silvestre. En otra modalidad,
la invención proporciona un rAd/AAV que expresa los productos
génicos E1, pero que carece de una o más de las otras secuencias
adenovirales necesarias (por ejemplo, E2a y/o ORF6 de E4), que es
suministrado por la célula huésped. El virus híbrido de la
invención, descrito con detalle posteriormente, es útil para la
producción de rAAV en una célula huésped que contiene una secuencia
rep de AAV y una secuencia cap de AAV bajo el control
de secuencias reguladoras que dirigen su expresión.
Las secuencias de adenovirus mínimas empleadas
en el virus híbrido de rAd/AAV de la invención son las secuencias
de repeticiones terminales invertidas (ITR) de acción cis de un
adenovirus (que funcionan como orígenes de replicación).
Preferiblemente, estas secuencias de ITR incluyen las ITRs 5' y 3'
naturales de un adenovirus. Sin embargo, cuando se desea, pueden
tratarse mediante ingeniería modificaciones de estas secuencias
naturales. Alternativamente, el virus híbrido puede manipularse
para contener ITRs derivadas de diferentes serotipos de adenovirus,
o para contener dos ITRs idénticas. El virus híbrido de rAd/AAV
también contiene secuencias necesarias para empaquetar genomas de
Ad lineales y elementos potenciadores para el promotor de E1.
Convenientemente, estas secuencias pueden ser proporcionadas por un
dominio de empaquetamiento/potenciador 5' adenoviral natural.
Adicionalmente, el virus híbrido de rAd/AAV contiene el DNA
adenoviral necesario para permitir la replicación del virus híbrido
en una célula huésped seleccionada.
El virus híbrido tiene una deleción de
secuencias adenovirales en la región E1a y E1b adenoviral natural y
una deleción de secuencias adenovirales de la región E3.
Además de estas funciones adenovirales mínimas,
el virus híbrido de rAd/AAV puede contener secuencias adenovirales
adicionales. Lo más preferiblemente, todos los otros productos
génicos de adenovirus necesarios, E2a, E2b, ORF6 de E4, los genes
intermedios adenovirales IX y IXa y los genes tardíos adenovirales
L1, L2, L3, L4 y L5 se expresan a partir del virus híbrido. Las
secuencias de adenovirus pueden derivarse de uno o más adenovirus
silvestres o adenovirus mutantes.
Las secuencias de DNA que codifican los genes
adenovirales útiles en esta invención pueden seleccionarse de entre
uno o más tipos de adenovirus, incluyendo los 46 tipos humanos
actualmente identificados [véase, por ejemplo, Horwitz, citado
anteriormente, y American Type Culture Collection]. De forma
similar, adenovirus que se sabe que infectan a otros animales
pueden suministrar las secuencias génicas. La selección del tipo de
adenovirus para cada secuencia génica de E1 y E2a no limita esta
invención. Las secuencias para un número de serotipos de
adenovirus, incluyendo la del serotipo Ad5, están disponibles de
Genbank. Una variedad de cepas de adenovirus está disponible de the
American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, o está
disponible a petición de una variedad de fuentes comerciales e
institucionales. En la siguiente modalidad ejemplar, las secuencias
génicas de E1 y E2a son las del serotipo de adenovirus 5 (Ad5).
Según se usa aquí, por "DNA que expresa el
producto génico" se entiende cualquier secuencia de ácido
nucleico, su producto génico o cualquiera de sus porciones
funcionales. De forma similar, se incluyen cualesquiera alelos u
otras modificaciones de la secuencia de ácido nucleico (por ejemplo,
un gen) o una de sus porciones funcionales. Según se define aquí,
"porción funcional o fragmento funcional" es aquella región de
la secuencia de codificación o el producto génico que se requiere
para proporcionar la función deseada necesaria. Tales modificaciones
pueden introducirse deliberadamente recurriendo a técnicas de
ingeniería genética o mutagénicas convencionales para potenciar la
función del producto o los productos génicos de alguna manera, así
como sus variantes alélicas presentes en la naturaleza. Una
"deleción funcional" se refiere a una región de la secuencia de
codificación o el producto génico que carece de las secuencias
requeridas para proporcionar la función de la región. El término
"deleción funcional" no limita los medios por los que se
elimina la función de la región. No se requiere la escisión de la
región o uno de sus fragmentos.
El virus híbrido de rAd/AAV de la invención
carece de las secuencias que codifican el producto génico E3
adenoviral, permitiéndose así que una secuencia heteróloga se
inserte en la región E3 natural, lo que no es esencial para la
replicación y la infección. Tal secuencia heteróloga puede ser
cualquier secuencia de ácido nucleico que sea no natural para el
adenovirus o cualquier secuencia de ácido nucleico procedente de una
región no contigua del mismo adenovirus. De forma similar, el virus
híbrido de rAd/AAV puede carecer de secuencias de codificación de
E4 adenovirales con la excepción de ORF6 de E4 que es esencial.
Adecuadamente, el virus híbrido de rAd/AAV se trata mediante
ingeniería de modo que no supere 105% del tamaño del genoma
adenoviral natural (por ejemplo, 105% de 36 kb). Así, cuando se
desee, por ejemplo, para permitir la inserción de una secuencia
heteróloga deseada, el rAd/AAV puede tratarse mediante ingeniería
para contener otras deleciones no funcionales de secuencias
silvestres para el adenovirus o los adenovirus a partir de los
cuales se trata mediante ingeniería el híbrido. Tales deleciones no
funcionales incluyen las que no extinguen la capacidad del virus
híbrido para expresar un producto génico funcional requerido para
la replicación del virus híbrido. La deleción de todas las
secuencias de codificación de E4 adenovirales con la excepción de
las secuencias de ORF6 de E4 es un ejemplo de una deleción no
funcional. Otras deleciones no funcionales adecuadas pueden
diseñarse fácilmente.
Así, en una modalidad particularmente deseable,
todos los genes adenovirales necesarios para la replicación del
virus híbrido de rAd/AAV son proporcionados por el propio virus
híbrido. Tal virus híbrido contiene un constructo de rAAV que ha de
empaquetarse en un virión, carece de secuencias adenovirales que
codifican E3 de adenovirus y carece de las secuencias de
codificación de E4 adenovirales con la excepción de la función de
ORF6 de E4. Adicionalmente, los productos génicos E1a y E1b
adenovirales se expresan a partir de una región distinta a la
región E1 silvestre, por ejemplo estos productos génicos se insertan
en y se expresan a partir de la región E3 silvestre.
En otra modalidad, el rAd/AAV de la invención
carece de uno o más de los otros genes adenovirales requeridos para
la replicación. Cualesquiera productos génicos adenovirales
requeridos que se han sometido a deleción desde el virus híbrido
pueden suministrarse al procedimiento de producción mediante una
célula de empaquetamiento seleccionada o en trans mediante una
secuencia de ácido nucleico que dirige la expresión del producto
génico deseado. En un ejemplo, el virus híbrido de rAd/AAV contiene
funciones de E1 silvestre, pero carece de las secuencias necesarias
para la expresión de ORF6 de E4. En esta situación, el híbrido de
rAd/AAV se introduce en una célula huésped que contiene las
secuencias necesarias para expresar ORF6 de E4. En otro ejemplo, el
virus híbrido de rAd/AAV carece de las secuencias necesarias para la
expresión de E2a, cuya función se expresa en la célula huésped
usada para la producción del rAAV. Tales células huésped se analizan
con más detalle posteriormente.
El diseño de estos y otros virus híbridos de
rAd/AAV dentro del alcance de esta invención incluye secuencias
apropiadas que están conectadas operablemente al gen de interés para
promover su expresión. Secuencias "conectadas operablemente"
incluyen tanto secuencias de control de la expresión que son
contiguas al gen de interés como secuencias de control de la
expresión que actúan in trans o a distancia para controlar el
gen de interés. Tales secuencias de control de la expresión se
analizan con más detalle en relación con el transgén.
Los promotores para cada uno de los genes
adenovirales pueden seleccionarse independientemente de un promotor
constitutivo, un promotor inducible o un promotor adenoviral natural
(es decir, un promotor puede ser uno que esté naturalmente asociado
con la región de flanqueo 5' de un gen de adenovirus). Los
promotores pueden regularse mediante un estado fisiológico
específico del organismo o la célula (es decir, mediante el estado
de diferenciación o en células que se replican o quiescentes) o
mediante factores añadidos exógenamente, por ejemplo. Los
promotores seleccionados pueden ser idénticos o pueden ser
diferentes.
En una modalidad, el gen E1a (y
subsiguientemente el gen E1b) se expresa bajo el control de un
promotor constitutivo, incluyendo, sin limitación, el
promotor/potenciador de LTR de RSV, el promotor/potenciador temprano
inmediato de CMV, el promotor de SV40, el promotor de dihidrofolato
reductasa, el promotor de \beta-actina
citoplásmica y el promotor de fosfoglicerol quinasa (PGK).
En otra modalidad, se emplea un promotor
inducible para expresar los productos génicos E1, a fin de controlar
la cantidad y la cronología de la producción por las células de los
productos génicos E1a y E1b, que pueden ser tóxicos para las
células al acumularse excesivamente [véanse, por ejemplo, William,
S.M. Wood, J. Cell. Biochem.,
53:329-335 (1993); J. Nevins, Current
Opinion in Genetics and Development,
4:130-134 (1994); E. Harrington y otros,
Current Opinion in Genetics and Development,
4:120-129 (1994); G. Evan y otros, Current
Opinion in Cell Biology, 7:825-834
(1995); J. Nevins, Science, 258:424 (1992)]. Promotores inducibles
incluyen los conocidos en la técnica y los analizados
anteriormente, incluyendo, sin limitación, el promotor de
metalotionina (MT) de oveja inducible por zinc; el promotor de
virus de tumor mamario de ratón (MMTV) inducible por dexametasona
(Dex); el promotor de T7; el promotor de ecdisona de insectos; el
sistema reprimible por tetraciclina; el sistema inducible por
tetraciclina; el sistema inducible por RU486 y el sistema inducible
por rapamicina. Puede usarse cualquier tipo de promotor inducible
que esté estrechamente regulado y que proporcione una expresión de
alto nivel de E1. Otros tipos de promotores inducibles que pueden
ser útiles en este contexto son aquellos que están regulados por un
estado fisiológico específico, por ejemplo, la temperatura, una fase
aguda, un estado de diferenciación particular de la célula o
solamente en células que se replican.
En el virus de rAd/AAV, las secuencias de AAV se
insertan en la cadena principal adenoviral en una región sometida a
deleción de la secuencia adenoviral natural, y así están flanqueadas
por las secuencias adenovirales seleccionadas. Las secuencias del
AAV están típicamente en la forma de un constructo (por ejemplo, un
casete) de rAAV que está empaquetado en un virión de rAAV de
acuerdo con el método de la invención. El constructo de rAAV
contiene, como mínimo (desde 5' hasta 3'), secuencias de ITR de AAV
5', un transgén seleccionado bajo el control de un promotor
seleccionado y otros componentes reguladores vectoriales
convencionales, y secuencias de ITR de AAV 3'. Cada uno de estos
componentes del constructo de rAAV se analiza posteriormente.
Véanse, además, las Patentes de EE.UU. Nº 5.856.152 y 5.871.982. Un
experto en la técnica puede tratar mediante ingeniería fácilmente
el virus híbrido de rAd/AAV a fin de insertar el constructo de rAAV
en la región adenoviral deseada. En una modalidad, el constructo de
rAAV se sitúa en la región E3 adenoviral del virus híbrido de
rAd/AAV. En otra modalidad adecuada, el constructo de rAAV se sitúa
en la región E1 adenoviral del virus híbrido de rAd/AAV. Sin
embargo, la presente invención no se limita a estas modalidades
ejemplares.
Las secuencias de AAV empleadas son
preferiblemente las secuencias de repeticiones terminales invertidas
5' y 3' de acción cis [Véase, por ejemplo, B.J. Carter, en
"Handbook of Parvoviruses", ed., P. Tijsser, CRC Press, pp.
155-168 (1990)]. Las secuencias de ITR tienen
aproximadamente 145 pb de longitud. Preferiblemente,
substancialmente todas las secuencias que codifican las ITRs se
usan en la molécula, aunque es permisible algún grado de
modificación menor de estas secuencias. La capacidad para modificar
estas secuencias de ITR está dentro de la experiencia de la técnica
[Véanse, por ejemplo, textos tales como Sambrook y otros,
"Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2ª ed., Cold Spring
Harbor Laboratory, Nueva York (1989); Carter y otros, citado
anteriormente y K. Fisher y otros, J. Virol.,
70:520-532 (1996)]. Un ejemplo de tal
molécula empleada en la presente invención es un plásmido de
"acción cis" que contiene el transgén, en el que la secuencia
transgénica seleccionada y los elementos reguladores asociados
están flanqueados por las secuencias de ITR del AAV 5' y 3'.
Las secuencias de ITR del AAV pueden obtenerse a
partir de cualquier AAV conocido, incluyendo tipos de AAV humanos
actualmente identificados. De forma similar, AAVs que se sabe que
infectan a otros animales también pueden proporcionar estas ITRs
empleadas en las moléculas o los constructos de esta invención. Por
ejemplo, las ITRs pueden ser proporcionadas por AAV tipo 1, AAV
tipo 2, AAV tipo 3, AAV tipo 4, AAV tipo 5, AAV 6, otros serotipos
de AAV o densovirus. Una variedad de cepas de AAV está disponible de
the American Type Culture Collection o está disponible a petición
de una variedad de fuentes comerciales e institucionales. En las
siguientes modalidades ejemplares se usa un AAV-2
por comodidad. Sin embargo, la selección de la especie y el serotipo
de AAV que proporciona estas secuencias está dentro de la
experiencia del experto de acuerdo con las enseñanzas de esta
solicitud y no limita la siguiente invención.
De acuerdo con la presente invención, el
constructo de rAAV contiene una molécula de ácido nucleico que
comprende un transgén deseado, un promotor y otros elementos
reguladores que controlan y dirigen la expresión del transgén en
una célula huésped, flanqueados por secuencias de AAV. La secuencia
transgénica es una secuencia de ácido nucleico, heteróloga para la
secuencia de AAV, que codifica un polipéptido o una proteína de
interés. La composición de la secuencia transgénica depende del uso
pretendido para el rAAV resultante. Por ejemplo, un tipo de
secuencia transgénica comprende una secuencia informadora o
marcadora, que durante la expresión produce una señal detectable.
Tales secuencias informadoras o marcadoras incluyen, sin limitación,
secuencias de DNA que codifican \beta-lactamasa,
\beta-galactosidasa (LacZ), fosfatasa
alcalina, timidina quinasa, proteína fluorescente verde (GFP),
cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), luciferasa, proteínas unidas
a la membrana incluyendo, por ejemplo, CD2, CD4, CD8, la proteína
de hemaglutinina de influenza y otras bien conocidas en la técnica,
para las que existen o pueden elaborarse habitualmente anticuerpos
de alta afinidad dirigidos a ellas, y proteínas de fusión que
comprenden una proteína unida a la membrana fusionada
apropiadamente a un dominio de etiqueta de antígeno de, entre otras,
hemaglutinina o Myc.
Estas secuencias, cuando están asociadas con
elementos reguladoras que conducen su expresión, proporcionan
señales detectables por medios convencionales, incluyendo ensayos
enzimáticos, radiográficos, colorimétricos, fluorescentes u otros
espectrográficos, un ensayo de clasificación de células activado
fluorescentemente y ensayos inmunológicos, incluyendo ELISA, RIA e
inmunohistoquímica. Por ejemplo, cuando el transgén es el gen LacZ,
la presencia de rAAV se detecta mediante ensayos para la actividad
de \beta-galactosidasa. De forma similar, cuando
el transgén es luciferasa, el rAAV puede medirse mediante producción
de luz en un luminómetro.
Sin embargo, deseablemente, el transgén es un
gen no marcador que puede aportarse a una célula o un animal a
través del rAAV producido mediante este método. El transgén puede
seleccionarse de una amplia variedad de productos génicos útiles en
biología y medicina, tales como proteínas, ácidos nucleicos
antisentido (por ejemplo, RNAs) o RNAs catalíticos. La invención
puede usarse para corregir o mitigar deficiencias génicas, en donde
los genes normales se expresan pero a niveles menores que los
normales, y también pueden usarse para corregir o mitigar defectos
genéticos en los que no se expresa un producto génico funcional. Un
tipo preferido de secuencia transgénica es un gen terapéutico que
expresa un producto génico deseado en una célula huésped. Estas
secuencias de ácido nucleico terapéuticas típicamente codifican
productos que, durante la expresión, son capaces de corregir o
complementar un defecto genético heredado o no heredado, o tratar un
trastorno o enfermedad epigenéticos. Sin embargo, el transgén
seleccionado puede codificar cualquier producto deseable para el
estudio. La selección de la secuencia transgénica no es una
limitación de esta invención. La elección de una secuencia
transgénica está dentro de los conocimientos del experto de acuerdo
con las enseñanzas de esta solicitud.
La invención también incluye métodos para
producir rAAV que puede usarse para corregir o mitigar un defecto
génico provocado por una proteína multisubunitaria. En ciertas
situaciones, un transgén diferente puede usarse para codificar cada
subunidad de la proteína. Esto es deseable cuando el tamaño del DNA
que codifica la subunidad proteínica es grande, por ejemplo, para
una inmunoglobulina o el receptor de factor de crecimiento derivado
de plaquetas. Para que la célula produzca la proteína
multisubunitaria, una célula se infectaría con rAAV que contuviera
cada una de las diferentes subunidades. Alternativamente, diferentes
subunidades de una proteína pueden ser codificadas por el mismo
transgén. En este caso, un solo transgén incluiría el DNA que
codifica cada una de las subunidades, con el DNA para cada
subunidad separado por un sitio interno de entrada al ribosoma
(IRES). Esto es deseable cuando el tamaño del DNA que codifica cada
una de las subunidades es pequeño, de modo que el total del DNA que
codifica las subunidades y el IRES es menor que cinco kilobases.
Productos génicos útiles incluyen hormonas y
factores de crecimiento y diferenciación, incluyendo, sin
limitación, insulina, glucagón, hormona del crecimiento (GH),
hormona paratiroidea (PTH), factor liberador de hormona del
crecimiento (GRF), hormona estimulante de los folículos (FSH),
hormona luteinizante (LH), gonadotropina coriónica humana (hCG),
factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), angiopoyetinas,
angioestatina, factor estimulante de colonias de granulocitos
(GCSF), eritropoyetina (EPO), factores de crecimiento del tejido
conectivo (CTGF), factor de crecimiento de fibroblastos básico
(bFGF), factor de crecimiento de fibroblastos ácido (aFGF), factor
de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento transformante
\alpha (TGF\alpha), factor de crecimiento derivado de plaquetas
(PDGF), factores de crecimiento similares a insulina I y II
(IGF-I e IGF-II), uno cualquiera de
la superfamilia de factores de crecimiento transformantes \beta
(TGF\beta) que comprende TGF\beta, activinas, inhibinas, o
cualquiera de las proteínas morfogénicas óseas (BMP) BMPs
1-15, uno cualquiera de la familia de factores de
crecimiento de heregulinas/neuregulinas/ARIA/factor de
diferenciación de neu (NDF), factor de crecimiento nervioso (NGF),
factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), neurotrofinas
NT-3 y NT-4/5, factor neurotrófico
ciliar (CNTF), factor neurotrófico derivado de líneas celulares
gliales (GDNF), neurturina, agrina, una cualquiera de la familia de
semaforinas/colapsinas, netrina-1 y
netrina-2, factor de crecimiento de hepatocitos
(HGF), efrinas, nogina, "sonic hedgehog" y tirosina
hidroxilasa.
Otros productos génicos útiles incluyen
proteínas que regulan el sistema inmunitario incluyendo, sin
limitación, citoquinas y linfoquinas tales como trombopoyetina
(TPO), interleuquinas (IL) IL-1\alpha,
IL-1\beta, IL-2,
IL-3, IL-4, IL-5,
IL-6, IL-7, IL-8,
IL-9, IL-10, IL-11,
IL-12, IL-13, IL-14,
IL-15, IL-16 e
IL-17, proteína quimioatrayente de monocitos
(MCP-1), factor inhibidor de leucemia (LIF), factor
estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos
(GM-CSF), ligando Fas, factores de necrosis tumoral
\alpha y \beta (TNF\alpha y TNF\beta), interferones (IFN)
IFN-\alpha, IFN-\beta e
IFN-\gamma, factor de células pluripotenciales,
ligando flk-2/flt3. Productos génicos producidos por
el sistema inmunitario también son abarcados por esta invención.
Estos incluyen, sin limitaciones, inmunoglobulinas IgG, IgM, IgA,
IgD e IgE, inmunoglobulinas quiméricas, anticuerpos humanizados,
anticuerpos monocatenarios, receptores de células T, receptores de
células T quiméricos, receptores de células T monocatenarios,
moléculas del MHC clase I y clase II, así como moléculas del MHC
tratadas mediante ingeniería, incluyendo moléculas del MHC
monocatenarias. Productos génicos de uso también incluyen proteínas
reguladoras del complemento tales como proteína reguladora del
complemento, proteína de cofactor de membrana (MCP), factor
acelerador de la degradación (DAF), CR1, CR2 y CD59.
Otros productos génicos adicionales incluyen uno
cualquiera de los receptores para las hormonas, los factores de
crecimiento, las citoquinas, las linfoquinas, las proteínas
reguladoras y las proteínas del sistema inmunitario. La invención
abarca receptores para la regulación de colesterol, incluyendo el
receptor de LDL, el receptor de HDL, el receptor de VLDL y el
receptor eliminador. La invención también abarca productos génicos
tales como la superfamilia de receptores de hormonas esteroideas,
incluyendo receptores de glucocorticoides y receptores de
estrógenos, receptores de vitamina D y otros receptores nucleares.
Además, productos génicos útiles incluyen factores de transición
tales como jun, fos, max, mad, factor de respuesta sérico
(SRF), AP-1, AP-2, myb, MRG1,
CREM, Alx4, FREAC1, NF-xB, miembros de la familia
de la cremallera de leucina, proteínas dedo de zinc C2H4,
incluyendo Zif268, EGR1, EGR2, proteínas dedo de zinc C6, incluyendo
los receptores de glucocorticoides y estrógenos, proteínas del
dominio POU, ejemplificadas por Pitl, proteínas de homeodominios,
incluyendo HOX-1, proteínas de
hélice-bucle-hélice básicas,
incluyendo myc, MyoD y miogenina, proteínas que contienen la
caja ETS, TFE3, E2F, ATF1, ATF2, ATF3, ATF4, ZF5, NFAT, CREB,
HNF-4, C/EBP, SP1, proteínas que se unen a la caja
CCAAT, factor de regulación de interferón 1 (IRF-1),
proteína tumoral de Wilms, proteína que se une a ETS, STAT,
proteínas que se unen a la caja GATA, por ejemplo,
GATA-3, y la familia de cabeza ahorquillada de
proteínas de hélice con alas.
Otros productos génicos útiles incluyen
carbamoilsintetasa I, ornitina transcarbamilasa, arginosuccinato
sintetasa, arginosuccinato liasa, arginasa, fumarilacetoacetato
hidrolasa, fenilalanina hidroxilasa, antritripsina
alfa-1,
glucosa-6-fosfatasa, receptor de
lipoproteína de baja densidad, porfobilinógeno desaminasa, factor
VIII, factor IX, cistationa beta-sintasa, cetoácido
de cadena ramificada descarboxilasa, albúmina,
isovaleril-CoA-deshidrogenasa,
propionil-CoA-carboxilasa,
metil-malonil-CoA mutasa,
glutaril-CoA-deshidrogenasa,
insulina, beta-glucosidasa, piruvato carboxilasa,
fosforilasa hepática, fosforilasa quinasa, glicina descarboxilasa
(también denominada proteína P), proteína H, proteína T, proteína
de la enfermedad de Menkes, supresores tumorales (por ejemplo,
p53), regulador de transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) y el
producto del gen de la enfermedad de Wilson PWD.
Otros transgenes útiles incluyen polipéptidos no
presentes en la naturaleza, tales como polipéptidos quiméricos o
híbridos o polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos no
presente en la naturaleza que contiene inserciones, deleciones o
substituciones de aminoácidos. Por ejemplo, inmunoglobulinas
tratadas mediante ingeniería monocatenarias podrían ser útiles en
ciertos pacientes inmunocomprometidos. Otros tipos de secuencias
génicas no presentes en la naturaleza incluyen moléculas
antisentido y ácidos nucleicos catalíticos, tales como ribozimas,
que podrían usarse para reducir la sobreexpresión de un gen.
El diseño del transgén para la expresión en
células y huéspedes mamíferos incluiría secuencias apropiadas que
están conectadas operablemente al gen de interés para promover su
expresión. Secuencias de control de la expresión incluyen
secuencias de iniciación, terminación, promotoras y potenciadoras de
la transcripción apropiadas; señales de procesamiento de RNA
eficaces tales como señales de reparación y poliadenilación;
secuencias que estabilizan mRNA citoplásmico; secuencias que
potencian la eficacia de traducción (es decir, secuencia de
consenso de Kozak); secuencias que potencian la estabilidad de
proteínas; y, cuando se desee, secuencias que potencian la
secreción de proteínas. Se conoce en la técnica un gran número de
secuencias de control de la expresión - naturales, constitutivas,
inducibles y/o específicas para tejido - y pueden utilizarse para
conducir la expresión del transgén, dependiendo del tipo de
expresión deseada. Para células eucarióticas, secuencias de control
de la expresión incluyen típicamente un promotor, un potenciador,
tal como uno derivado de un gen de inmunoglobulina, SV40,
citomegalovirus, etc., y una secuencia de poliadenilación que puede
incluir sitios donantes y aceptores de reparación. La secuencia de
poliadenilación generalmente se inserta después de las secuencias
transgénicas y antes de la secuencia de ITR de AAV 3'. Un constructo
de rAAV útil en la presente invención también puede contener un
intrón, situado deseablemente entre la secuencia
promotora/potenciadora y el transgén. Una posible secuencia
intrónica también se deriva de SV-40 y se denomina
la secuencia intrónica T de SV-40. Otro elemento
vectorial que puede usarse es un sitio interno de entrada al
ribosoma (IRES). Una secuencia de IRES se usa para producir más de
un polipéptido a partir de un solo transcrito génico. Una secuencia
de IRES se usaría para producir una proteína que contuviera más de
una cadena polipeptídica. La selección de estos y otros elementos
vectoriales comunes es convencional y muchas de tales secuencias
están disponibles [véanse, por ejemplo, Sambrook y otros y las
referencias citadas allí en, por ejemplo, las páginas
3.18-3.26 y 16.17-16.27 y Ausubel y
otros, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley
& Sons, Nueva York, 1989].
En una modalidad, se deseará una expresión
constitutiva de alto nivel. Ejemplos de tales promotores incluyen,
sin limitación, el promotor/potenciador de LTR del virus del sarcoma
de Rous (RSV) retroviral, el promotor/potenciador temprano
inmediato de citomegalovirus (CMV) [véase, por ejemplo, Boshart y
otros, Cell, 41:521-530 (1985)], el
promotor de SV40, el promotor de dihidrofolato reductasa, el
promotor de \beta-actina citoplásmico y el
promotor de fosfoglicerol quinasa (PGK).
En otra modalidad, pueden desearse promotores
inducibles. Los promotores inducibles son aquellos que son regulados
por compuestos suministrados exógenamente, incluyendo, sin
limitación, el promotor de metalotionina (MT) de oveja inducible
por zinc; el promotor de virus del tumor mamario de ratón (MMTV)
inducible por dexametasona (Dex); el sistema promotor de polimerasa
de T7 [WO 98/10088]; el promotor de ecdisona de insecto [No y otros,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
93:3346-3351 (1996)]; el sistema reprimibile
por tetraciclina [Gossen y otros, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 89:5547-551 (1992)]; el sistema
inducible por tetraciclina [Gossen y otros, Science,
268:1766-1769 (1995); véase también Harvey y
otros, Curr. Opin. Chem. Biol.,
2:512-518 (1998)]; el sistema inducible por
RU486 [Wang y otros, Nat. Biotech.,
15:239-243 (1997) y Wang y otros, Gene
Ther., 4:432-441 (1997)] y el sistema
inducible por rapamicina [Magari y otros, J. Clin. Invest.,
100: 2865-2872 (1997)]. Otros tipos de
promotores inducibles que pueden ser útiles en este contexto son
aquellos que son regulados por un estado fisiológico específico,
por ejemplo, la temperatura, una fase aguda o solamente en células
que se replican. En una modalidad preferida, el transgén está bajo
el control del promotor de AAV natural P5.
En otra modalidad, se usará el promotor natural
para el transgén. El promotor natural puede preferirse cuando se
desea que la expresión del transgén imite la expresión natural. El
promotor natural puede usarse cuando la expresión del transgén debe
regularse temporalmente o con relación al desarrollo, o de una
manera específica para un tejido, o en respuesta a estímulos
transcripcionales específicos. En una modalidad adicional, otros
elementos de control de la expresión naturales, tales como elementos
potenciadores, sitios de poliadenilación o secuencias de consenso
de Kozak, también pueden usarse para imitar la expresión
natural.
Otra modalidad del transgén incluye un transgén
conectado operablemente a un promotor específico para un tejido.
Por ejemplo, si se desea la expresión en músculo esquelético, debe
usarse un promotor activo en el músculo. Estos incluyen los
promotores de genes que codifican \alpha-actina
esquelética, cadena ligera 2A de miosina, distrofina, creatina
quinasa muscular, así como promotores musculares sintéticos con
actividades superiores que los promotores presentes en la
naturaleza [véase, Li y otros, Nat. Biotech.,
17:241-245 (1999)]. Ejemplos de promotores
que son específicos para un tejido son conocidos para el hígado
[albúmina, Miyatake, S. y otros, J. Virol.,
71:5124-32 (1997); promotor nuclear del virus de la
hepatitis B, Sandig y otros, Gene Ther.,
3:1002-9 (1996); fetoproteína alfa (AFP)
Arbuthnot y otros, Hum. Gene Ther.,
7:1503-14 (1996)], el hueso [osteocalcina,
Stein y otros, Mol. Biol. Rapl.,
24:185-96 (1997); sialoproteína ósea, Chen y
otros, J. Bone Miner. Res., 11:654-64
(1996)], los linfocitos [CD2, Hansal y otros, J. Immunol.,
161:11063-8 (1998); cadena pesada de
inmunoglobulina; cadena \alpha de receptor de células T], neuronal
[promotor de enolasa específica de neuronas (NSE), Andersen y
otros, Cell. Mol. Neurobiol.,
13:503-15 (1993); gen de la cadena ligera de
neurofilamentos, Piccioli y otros, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 88:561-6 (1991); el gen vgf
específico de neuronas, Piccioli y otros, Neuron,
15:373-84 (1995)]; entre otros.
Por supuesto, no todos los vectores y las
secuencias de control de la expresión funcionarán igualmente bien
para expresar todos los transgenes de esta invención. Sin embargo,
un experto en la técnica puede hacer una selección entre estas
secuencias de control de la expresión sin apartarse del alcance de
esta invención. Secuencias promotoras/potenciadoras adecuadas
pueden seleccionarse por un experto en la técnica usando las pautas
proporcionadas por esta solicitud. Tal selección es un asunto
habitual y no es una limitación de la molécula o el constructo. Por
ejemplo, pueden seleccionarse una o más secuencias de control de la
expresión, conectar operablemente la secuencia a un transgén de
interés e insertar el "minigén" que comprende la secuencia de
control de la expresión y el transgén en un vector de AAV. Después
de seguir uno de los métodos para empaquetar el rAAV mostrados en
esta memoria descriptiva, o según se muestra en la técnica, pueden
infectarse células adecuadas in vitro o in vivo. El número de
copias del transgén en la célula puede verificarse mediante
transferencia Southern o reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
cuantitativa; el nivel de expresión de RNA puede verificarse
mediante transferencia Northern o PCR con transcriptasa inversa
(RT)-PCR cuantitativa; y el nivel de expresión de
proteína puede verificarse mediante transferencia Western,
inmunohistoquímica, ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas
(ELISA), radioinmunoensayo (RIA) o pruebas de la actividad biológica
del producto génico del transgén. Así, puede ensayarse fácilmente
si una secuencia de control de la expresión particular es adecuada
para un transgén específico y elegir la secuencia de control de la
expresión más apropiada para la expresión del transgén deseado.
El virus híbrido de rAd/AAV de la invención
puede construirse y producirse usando los materiales y métodos
descritos aquí, así como los conocidos por los expertos en la
técnica. Tales métodos de ingeniería usados para construir
cualquier modalidad de esta invención son conocidos por los expertos
en la manipulación de ácidos nucleicos e incluyen técnicas de
ingeniería genética, ingeniería recombinante y sintéticas. Véanse,
por ejemplo, Sambrook y otros y Ausubel y otros, citados
anteriormente, y la Solicitud de Patente Internacional Nº
WO95/13598. Además, métodos adecuados para producir un casete de
rAAV en una cápsida adenoviral se han descrito en las Patentes de
EE.UU. Nº 5.856.152 y 5.871.982.
\newpage
Debido a que el virus híbrido de rAd/AAV de la
invención es competente para la replicación, puede producirse
mediante infección y replicación en una célula huésped seleccionada,
usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica y según se
describe aquí. Véanse las Patentes de EE.UU. Nº 5.856.152 y
5.871.982 y el análisis de métodos para infectar y cultivar una
célula huésped con el rAd/AAV descrito en la Parte II
posteriormente.
El método de la invención proporciona la
producción de rAAV utilizando un rAd/AAV competente para la
replicación. En una modalidad particularmente preferida el rAd/AAV
usado en el método de la invención proporciona el casete de rAAV y
todas las secuencias adenovirales necesarias a la célula huésped,
evitando así la necesidad de una segunda infección o transfección
con un virus adyuvante. Lo más adecuadamente, el virus híbrido de
rAd/AAV se trata mediante ingeniería según se describe aquí de modo
que todos los productos génicos adenovirales requeridos para la
replicación del virus sean expresados por el virus híbrido de
rAd/AAV.
Brevemente, la célula huésped seleccionada se
infecta con virus híbrido de rAd/AAV. Una vez que el virus híbrido
de rad/AAV es recogido por la célula, el transgén flanqueado por ITR
de AAV debe rescatarse de la cadena principal de adenovirus
suministrando a la célula infectada un gen rep de AAV, que
preferiblemente está presente en la célula de empaquetamiento del
huésped. El genoma de AAV recombinante se empaqueta suministrando a
la célula infectada un gen cap de AAV, que preferiblemente
está presente en la célula de empaquetamiento del huésped.
Independientemente del rAd/AAV usado en la
producción de rAAV, crítico para la producción óptima de rAAV, el
método de la invención incluye una etapa que controla (es decir,
inhibe o extingue) la capacidad del rAd/AAV para replicarse en un
momento seleccionado después de la infección de las células huésped.
Esta etapa potencia la capacidad del constructo de rAAV soportado
por el rAd/AAV para ser rescatado y empaquetado en un virión de
rAAV. Esto puede alcanzarse mediante una variedad de medios, que se
describen con más detalle aquí.
Para empaquetar el constructo de rAAV
proporcionado por el híbrido de rAd/AAV en un virión de rAAV, una
célula huésped debe contener secuencias necesarias para expresar
rep de AAV y cap de AAV o fragmentos funcionales de
los mismos. Por ejemplo, las proteínas rep78/52 pueden ser
suficientes para proporcionar las funciones de rep necesarias. Las
secuencias rep y cap de AAV se obtienen a partir de
una fuente de AAV según se identifica anteriormente. Las secuencias
rep y cap de AAV pueden introducirse en la célula
huésped de cualquier manera conocida para un experto en la técnica
según se describe anteriormente, incluyendo, sin limitación,
transfección, electroporación, aporte de liposomas, técnicas de
fusión de membranas, nódulos revestidos con DNA de alta velocidad,
infección viral y fusión de protoplastos. En una modalidad, las
secuencias rep y cap pueden transfectarse a la célula
huésped mediante una o más moléculas de ácido nucleico y existir
establemente en la célula como un episoma. En otra modalidad, las
secuencias rep y cap se integran establemente en el
genoma de la célula. Una línea de células huésped estable que
contiene rep y cap es B-50, descrita
en PCT/US98/19463. Otra modalidad tiene las secuencias rep y
cap expresadas transitoriamente en la célula huésped. Por
ejemplo, una molécula de ácido nucleico útil para tal transfección
comprende, de 5' a 3', un promotor, un espaciador opcional
interpuesto entre el promotor y el sitio de inicio de la secuencia
del gen rep, una secuencia del gen rep de AAV y una
secuencia del gen cap de AAV.
Las secuencias rep y cap, junto
con sus secuencias de control de la expresión, pueden suministrarse
en un solo vector, o cada secuencia puede suministrarse en su
propio vector. Preferiblemente, las secuencias rep y
cap se suministran en el mismo vector. Alternativamente, las
secuencias rep y cap pueden suministrarse en un
vector que contiene otras secuencias de DNA que han de introducirse
en las células huésped.
Preferiblemente, el promotor usado en este
constructo puede ser cualquiera de los promotores constitutivos,
inducibles o naturales conocidos para un experto en la técnica o
como los analizados previamente. En una modalidad preferida, se
emplea una secuencia promotora P5 de AAV. Aunque puede obtenerse de
cualquiera de las fuentes de AAV mencionadas anteriormente, el
promotor P5 de parvovirus es preferiblemente homólogo al serotipo de
AAV que proporciona las secuencias génicas rep y cap.
Alternativamente, el promotor puede ser un promotor P5 procedente
de otro tipo de AAV diferente al que proporciona las secuencias
rep y cap. AAVs que se sabe que infectan a otros
seres humanos u otros animales también pueden proporcionar el
promotor P5. La selección del AAV para proporcionar cualquiera de
estas secuencias no limita la invención.
En otra modalidad preferida, el promotor para
rep es un promotor inducible. Según se analiza anteriormente,
promotores inducibles incluyen, sin limitación, el promotor de
metalotionina (MT); el promotor de virus de tumor mamario de ratón
(MMTV) inducible por dexametasona (Dex); el sistema promotor de
polimerasa de T7; el promotor de ecdisona de insecto; el sistema
reprimible por tetraciclina; el sistema inducible por tetraciclina;
el sistema inducible por RU486 y el sistema inducible por
rapamicina. Un promotor preferido para la expresión de rep
es el promotor T7. El vector que comprende el gen rep
regulado por el promotor T7 y el gen cap se transfiere o se
transforma en una célula que expresa bien constitutivamente o bien
induciblemente la polimerasa de T7. Véase WO 98/10088, publicada el
12 de marzo de 1998.
El espaciador es un elemento opcional en el
diseño del vector. El espaciador es una secuencia de DNA interpuesta
entre el promotor y el sitio de inicio ATG del gen rep. El
espaciador puede tener cualquier diseño deseado; esto es, puede ser
una secuencia aleatoria de nucleótidos o, alternativamente, puede
codificar un producto génico, tal como un gen marcador. El
espaciador puede contener genes que incorporan típicamente sitios de
inicio/parada y poliA. El espaciador puede ser una secuencia de DNA
no codificante procedente de un procariota o eucariota, una
secuencia no codificante repetitiva, una secuencia codificante sin
controles transcripcionales o secuencias codificantes con controles
transcripcionales. Dos fuentes ejemplares de secuencias espaciadoras
son las secuencias escalera del fago \lambda o secuencias
escalera de levadura, que están disponibles comercialmente, por
ejemplo de Gibco o Invitrogen, entre otros. El espaciador puede ser
de cualquier tamaño suficiente para reducir la expresión de los
productos génicos rep78 y rep68, dejando los productos
génicos rep52, rep40 y cap expresados a
niveles normales. La longitud del espaciador puede variar por lo
tanto de aproximadamente 10 pb a aproximadamente 10,0 kpb,
preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 100 pb a
aproximadamente 8,0 kpb. Para reducir la posibilidad de
recombinación, el espaciador es preferiblemente menor que 2 kpb de
longitud; sin embargo, la invención no está así limitada.
Moléculas ejemplares que proporcionan las
proteínas rep y cap de AAV son plásmidos, por ejemplo,
pMT-Rep/Cap, pP5-Rep/Cap y
pMMTV-Rep/Cap. Estos plásmidos contienen cada uno un
gen marcador selectivo para neomicina y expresan los genes rep/cap
de AAV conducidos bien por su promotor P5 natural
(pP5-Rep/Cap), el promotor de metalotionina de
oveja inducible por zinc (pMTRep/Cap) o bien el promotor de virus de
tumor mamario de ratón (MMTV) inducible por dexametasona (Dex)
(pMMTV-Rep/Cap). Aunque estas proteínas pueden
proporcionarse a la célula por diversos medios, métodos ejemplares
de la invención incluyen el uso de diversos plásmidos. Para la
construcción del plásmido pMT-Rep/Cap, la secuencia
de ORF6 se retiró de un plásmido pMTE4ORF6 [G. P. Gao y otros,
J. Virol., 70:8934-8943 (1996)]
mediante digestión con BamHI y se reemplazó por un fragmento de
rep/cap de 4,1 kb que se preparó mediante amplificación por PCR
usando el plásmido pSub201 [Samulski, R.J. y otros, J.
Virol., 63:3822-3828 (1989)] como una
plantilla. El plásmido pMMTV-Rep/Cap se construyó
del mismo modo que pMT-Rep/Cap, excepto que se usó
un plásmido pMMTVE4ORF6 [Gao y otros, citado anteriormente] como la
cadena principal vectorial. Para la construcción de
P5-Rep/Cap, las secuencias promotora de MT y de ORF6
se retiraron de un plásmido pMTE4ORF6 [G.P. Gao y otros, J.
Virol., 70:8934-8943 (1996)] mediante
digestión con EcoRI/BamHI y se reemplazaron por un fragmento de
P5-Rep/Cap de 4,3 kb que se aisló de un plásmido
pSub201 [Samuiski R.J. y otros, J. Virol.,
63:3822-3828 (1989)] mediante digestión con
XbaI. La construcción del plásmido implicaba métodos de ingeniería
genética convencionales, tales como los citados en Sambrook y otros,
citado anteriormente. Todas las referencias citadas anteriormente
se incorporan aquí mediante referencia.
Una variedad de otros constructos plasmídicos
que proporcionan las proteínas rep y cap es conocida
en la técnica y puede emplearse en la célula huésped de la
invención. Por ejemplo, los constructos de rep/cap pueden
omitir el espaciador entre el promotor y los genes rep/cap
mencionado en el constructo descrito anteriormente. Otros
constructos de la técnica, tales como los descritos en la Patente de
EE.UU. Nº 5.622.856, que sitúa el promotor P5 3' con respecto a los
genes rep/cap, también pueden emplearse en este contexto.
La molécula que proporciona las proteínas
rep y cap puede estar en cualquier forma que
transfiera estos componentes a la célula huésped. Según se
ejemplifica aquí, esta molécula está preferiblemente en la forma de
un plásmido, que puede contener otras secuencias no virales, tales
como aquellas para genes marcadores. Esta molécula no contiene las
ITRs de AAV y generalmente no contiene las secuencias de
empaquetamiento de AAV. Para evitar la presencia de recombinación
homóloga, otras secuencias de virus, particularmente las de
adenovirus, se evitan en este plásmido. Este plásmido se construye
deseablemente de modo que pueda transfectarse establemente a una
célula.
Aunque la molécula que proporciona rep y
cap puede transfectarse transitoriamente a la célula huésped,
se prefiere que la célula huésped se transforme establemente con
secuencias necesarias para expresar proteínas rep/cap
funcionales en la célula huésped, por ejemplo, como un episoma o
mediante integración en el cromosoma de la célula huésped.
Dependiendo del promotor que controla la expresión de tal célula
huésped transfectada establemente, las proteínas rep/cap
pueden expresarse transitoriamente (por ejemplo, a través del uso de
un promotor inducible).
Los métodos empleados para construir modalidades
de esta invención son técnicas de ingeniería genética o ingeniería
recombinante convencionales tales como las descritas en las
referencias anteriores. Aunque esta memoria descriptiva proporciona
ejemplos ilustrativos de constructos específicos, usando la
información proporcionada aquí, un experto en la técnica puede
seleccionar y diseñar otros constructos adecuados, usando una
elección de espaciadores, promotores P5 y otros elementos,
incluyendo al menos una señal de inicio y parada la traducción, y la
adición opcional de sitios de poliadenilación.
La propia célula huésped de mamífero puede
seleccionarse de cualquier especie de mamífero, tal como tipos de
células humanas, incluyendo, sin limitación, células tales como
A549, WEHI, 3T3, 10T1/2, BHK, MDCK, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40,
BMT 10, VERO, WI38, HeLa, células 293 (que expresan E1 adenoviral
funcional), Saos, C2C12, células L, HT1080, HepG2 y células
fibroblásticas, hepatocíticas y mioblásticas primarias derivadas de
mamíferos, incluyendo ser humano, mono, ratón, rata, conejo y
hámster. La selección de la especie de mamífero que proporciona las
células no es una limitación de esta invención; ni lo es el tipo de
célula de mamífero, es decir, fibroblasto, hepatocito, célula
tumoral, etc. Los requisitos para la célula usada es que no pueda
aportar gen de un virus, lo que podría dar como resultado una
recombinación homóloga de un virus contaminante durante la
producción de rAAV; y debe ser capaz de transfección de DNA y
expresión del DNA transfectado.
En una modalidad preferida, la célula huésped es
una que tiene rep y cap establemente transfectados en
la célula, tal como la línea de células B50. También pueden
emplearse de forma similar otras líneas celulares que expresan
rep/cap estables, tales como las descritas en la Patente de
EE.UU. Nº 5.658.785. En otra modalidad adecuada, la célula huésped
se transfecta establemente con las secuencias necesarias para
expresar cualesquiera productos génicos adenovirales necesarios
para la replicación de virus híbrido de rAd/AAV que carecen del
virus híbrido.
Por ejemplo, cuando el virus híbrido de rAd/AAV
carece de la secuencia de ORF6 de E4 adenoviral, la línea celular
seleccionada se trata mediante ingeniería para transfectarse
establemente con las secuencias necesarias para la expresión de la
proteína de ORF6 de E4. En tal caso, la línea celular es
preferiblemente una que contiene las secuencias para la expresión
de rep/cap. Después de la infección de la célula por el rAd/AAV, las
funciones de E1a y E1b expresadas por el virus híbrido ponen en
marcha la expresión de las funciones de rep/cap por la célula
huésped. Posteriormente, la expresión de ORF6 de E4 se pone en
marcha deseablemente suministrando el agente necesario para inducir
la función de ORF6 de E4 controladora del promotor para expresar el
producto génico de ORF6 de E4.
Según se analiza aquí, esta invención puede
utilizar células de las siguientes modalidades ilustrativas:
- (a)
- una célula establemente transfectada con los genes rep y cap de AAV (o fragmentos funcionales de los mismos) y el producto génico de ORF6 de E4 de adenovirus;
- (b)
- una célula establemente transfectada con los genes rep y cap de AAV (o fragmentos funcionales de los mismos), el producto génico E2a de adenovirus y la ORF6 de E4 de adenovirus;
- (c)
- una célula establemente transfectada con los genes rep y cap de AAV (o fragmentos funcionales de los mismos) soportados sobre un episoma o integrados en los cromosomas de la célula y que expresa transitoriamente los productos génicos E2a de adenovirus;
- (d)
- una célula establemente transfectada con al menos uno de los genes rep y cap de AAV y los productos génicos E2a de adenovirus (o fragmentos funcionales de los mismos); y
- (e)
- una célula establemente transfectada con el gen rep de AAV, el gen cap de AAV, el gen E2a (o fragmentos funcionales de los mismos) establemente como uno o más episomas o como DNA integrado, y que expresa transitoriamente la molécula de ácido nucleico que contiene el transgén.
Cuando ni la célula huésped ni el virus híbrido
de rAd/AAV suministran las secuencias rep y/o cap
necesarias y cualesquiera secuencias adenovirales requeridas, estas
secuencias pueden introducirse en la célula huésped mediante
cualquier método adecuado, incluyendo, por ejemplo, transfección,
electroporación, aporte de liposomas, técnicas de fusión de
membranas, nódulos revestidos con DNA de alta velocidad, infección
viral y fusión de protoplastos.
Por ejemplo, si ni la línea de células huésped
ni el virus híbrido de rAd/AAV de la invención expresan el producto
génico E2a, el DNA del adenovirus que expresa el producto génico E2a
puede proporcionarse a la célula huésped en la forma de una
secuencia de ácido nucleico que también incluye un promotor que
dirige la expresión del producto génico E2a y otros componentes
reguladores opcionales. El promotor para E2a puede ser un promotor
constitutivo, inducible o natural, según se analiza anteriormente.
Aunque el promotor en el control de la expresión del producto
génico E2a puede ser un promotor constitutivo en ciertas
modalidades, en una modalidad preferida, el promotor es un promotor
inducible a fin de controlar la cantidad y la cronología de la
generación de producto génico E2a (que es tóxico para la célula al
sobreacumularse [D. Brough y otros, Virology,
190:624-634 (1992) y D. Klessig y otros,
Virus Res., 1:169-188 (1984)] con
relación a la producción de los productos génicos E1. Una modalidad
preferida proporciona que el promotor que dirige la producción de
E2a sea un promotor inducible diferente del que dirige la expresión
de E1a y E1b, y sea inducible mediante exposición a un agente
inductor diferente al usado para el promotor inducible de E1.
La introducción de una molécula de ácido
nucleico (un plásmido o virus) en la célula huésped y la preparación
de una célula huésped útil en esta invención también pueden
efectuarse usando técnicas conocidas para el experto y según se
analizan a lo largo de la memoria descriptiva. Técnicas para la
construcción de moléculas de ácido nucleico incluyen clonación de
cDNA y genómica, que es bien conocida y se describe en Sambrook y
otros y Ausubel y otros, citados anteriormente, el uso de
secuencias oligonucleotídicas solapadas de los genomas de adenovirus
y AAV, combinado con reacción en cadena de la polimerasa, métodos
sintéticos y cualesquiera otros métodos adecuados que proporcionen
la secuencia de nucleótidos deseada. En una modalidad preferida, se
usan técnicas de transfección estándar, por ejemplo transfección
con CaPO_{4} o electroporación, y/o infección mediante vectores
de adenovirus/AAV híbridos en líneas celulares tales como la línea
celular renal embrionaria humana HEK 293 (una línea celular renal
humana que contiene genes E1 de adenovirus funcionales que
proporcionan proteínas E1 de acción trans) y las líneas celulares
B50 (una línea celular HeLa que contiene genes rep y
cap integrados establemente).
Según se describe anteriormente, la invención
proporciona un método para producir virus adenoasociado recombinante
(rAAV) en ausencia de virus adyuvante o virus silvestre
contaminante. Adecuadamente, la célula huésped se infecta con el
virus híbrido de rAd/AAV con una multiplicidad de infección en el
intervalo de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 1000 o
intermedia, por ejemplo de aproximadamente 1 a aproximadamente 500,
de aproximadamente 10 a aproximadamente 250 y de aproximadamente 50
a aproximadamente 200.
El método para producir viriones de rAAV implica
cultivar una célula huésped de mamífero que contiene un virus
híbrido de rAd/AAV como el descrito aquí que contiene un constructo
de rAAV que ha de empaquetarse en un virión de rAAV, una secuencia
rep de AAV y una secuencia cap de AAV bajo el control
de secuencias reguladoras que dirigen su expresión. Posteriormente,
el virión de AAV recombinante que dirige la expresión del transgén
se aísla de la célula o el cultivo celular en ausencia de virus
adyuvante o AAV silvestre contaminantes.
Técnicas convencionales empleadas en este método
incluyen la clonación de los genomas virales de rAAV y métodos para
medir la generación de señales, y similares. No se necesita una
etapa de purificación para detectar el mensaje o la señal o para
separar el rAAV de otros virus. Generalmente, en la producción, se
usan técnicas de purificación convencionales, tales como
centrifugación en gradiente de cloruro o cromatografía en columna,
para concentrar el rAAV de las proteínas celulares del lisado. Por
ejemplo, las células junto con el medio de transfección se recogen
mediante rascadores y se someten a tres rondas de
congelación-descongelación en
etanol-hielo seco y un baño de agua a 37ºC. Las
células pueden centrifugarse, por ejemplo, durante de 15 minutos a 4
horas.
Debido a que el virus de Ad/AAV híbrido de la
invención es competente para la replicación, después de la infección
de las células huésped seleccionadas, para optimizar la producción
de viriones de rAAV, puede ser deseable controlar la capacidad del
virus híbrido de rAd/AAV para replicarse, potenciando de ese modo la
capacidad del constructo de AAV para ser rescatado y empaquetado en
un virión de rAAV. La capacidad del virus híbrido de rAd/AAV para
replicarse después de la infección puede inhibirse mediante una
variedad de sistemas que serán totalmente evidentes para los
expertos en la técnica.
Por ejemplo, en una modalidad particularmente
adecuada, la célula huésped se infecta con el virus híbrido de
rAd/AAV que contiene una mutación sensible a la temperatura en un
gen adenoviral necesario para la replicación y/o el empaquetamiento
adenovirales (por ejemplo, el gen adenoviral E2b) con una MOI de
aproximadamente 100 a aproximadamente 200. Posteriormente, la
célula huésped se cultiva a una temperatura de aproximadamente 32ºC
a aproximadamente 37ºC y el rAAV se aísla como se describe aquí.
Según se ilustra en los ejemplos posteriores, se ha encontrado que
este método proporciona rendimientos superiores de rAAV. Un ejemplo
de un rAd adecuado que contiene una mutación sensible a la
temperatura es sub 100r, que ha sido descrito [Schaack, J. y otros,
J. Virol., 69:4079-4085 (1995)].
Adicionalmente, o alternativamente, puede
controlarse la expresión de uno o más de los genes adenovirales
necesarios para la replicación del rAd/AAV. Por ejemplo, el E4 (u
ORF6 de E4) adenoviral se expresa bajo el control de un promotor
inducible, mediante el rAd/AAV o mediante la célula huésped en la
que el virus híbrido de rAd/AAV no expresa este producto génico. En
otro ejemplo, los productos génicos E1 y E2a adenovirales se
expresan bajo el control de al menos un promotor inducible. Así,
este método incluye además la etapa de poner en contacto las
células huésped cultivadas con al menos un agente inductor, que
controla la expresión de al menos uno de los productos génicos de
adenovirus requeridos. Cuando cada uno de los productos génicos de
adenovirus requeridos está bajo el control de un promotor inducible
diferente, el método implica además las etapas de añadir al cultivo
de células huésped un primer agente inductor para el primer promotor
inducible y un segundo agente inductor para el segundo promotor
inducible. Esta modalidad del método permite así la expresión
controlada de los productos génicos adenovirales, por ejemplo los
genes adenovirales E1a, E1b, E2a y/o ORF6 de E4. Además, esta
invención permite la expresión de los productos génicos adenovirales
(por ejemplo, E1a y E1b) en una relación deseada con respecto a la
expresión de otro producto o productos génicos adenovirales (por
ejemplo, E2a), que es óptima para la producción de rAAV en la
célula huésped particular bajo condiciones de cultivo adecuadas para
esa célula.
La determinación de una relación adecuada de
productos génicos E1 a productos génicos E2a y los productos de
rep/cap de AAV puede efectuarse por un experto en la técnica,
teniendo en cuenta el tipo de célula, la fuerza de los promotores
constitutivos y/o inducibles usados, las cantidades de inductor o
inductores usadas y el orden o la cronología de inducción de
productos génicos preferidos. La relación óptima que permite la
mayor producción de rAAV puede diferir según difieran estos
factores. Por ejemplo, cuando el gen E1a está controlado por un
promotor constitutivo de fuerza débil o media, el gen E2a debe estar
controlado por un promotor inducible fuerte y el agente inductor
añadirse inicialmente en el cultivo para obtener una relación
adecuada. Cuando el gen E1a está controlado por un promotor
inducible así como el gen E2a, los dos agentes inductores pueden
añadirse en cantidades variables y en órdenes de inducción variables
para proporcionar el sistema de producción óptimo para rAAV. Sin
embargo, tal experimentación de optimización empleada para
determinar cantidades y órdenes preferidos está totalmente dentro
de la experiencia de la técnica y es meramente habitual a la luz de
las presentes descripciones.
En otra modalidad preferida del método, el
producto génico E1a se expresa bajo el control de un promotor
inducible y los genes E1b y E2a, así como cualesquiera otros genes
adenovirales (por ejemplo, ORF6 de E4 y/o RNA de VAI) que están
presentes se expresan bajo el control de su promotor natural. Según
se analiza anteriormente, el producto génico E1a activa los
promotores naturales de E1b, E2a y cualesquiera otros genes
adenovirales. Cualquier promotor inducible puede usarse con tal de
que exprese bajos niveles basales de E1a cuando la célula no está
inducida y altos niveles de E1a cuando la célula se pone en contacto
con un agente inductor. Un número de promotores inducibles es
conocido en la técnica y se ha analizado a lo largo de la memoria
descriptiva. Promotores inducibles específicos incluyen, sin
limitación, el promotor de metalotionina (MT) de oveja inducible
por zinc; el promotor de virus de tumor mamario de ratón (MMTV)
inducible por dexametasona (Dex); el promotor de ecdisona de
insecto; el sistema reprimible por tetraciclina; el sistema
inducible por tetraciclina; el sistema inducible por RU486 y el
sistema inducible por rapamicina.
Los siguientes ejemplos ilustran varios métodos
preferidos de la invención. Estos ejemplos son solamente
ilustrativos y no están destinados a limitar el alcance de la
invención.
Se construye un vector híbrido de Ad/AAV
recombinante usando los métodos descritos en la Patente de EE.UU.
Nº 5.856.152, excepto que el gen E3 se somete a deleción y el gen E1
conectado operablemente a y bajo el control del promotor de RSV o
PGK se clona en la región E3 del genoma de adenovirus. El vector
híbrido de Ad/AAV se empaqueta como se describe en la Patente de
EE.UU. Nº 5.856.152.
Descrita brevemente, B-50 es una
célula que expresa establemente genes rep y cap tipo 2
de AAV bajo el control del promotor p5 homólogo. Esta línea celular
se caracteriza por la integración de múltiples copias (al menos 5
copias) de casetes génicos P5-rep-cap en una
forma concatámera en el cromosoma del huésped. Esta línea celular
B-50 se depositó en the American Type Culture
Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA
20110-2209 el 18 de septiembre de 1997 bajo el Nº
de Registro CRL-12401 de acuerdo con los requisitos
del Tratado de Budapest con el reconocimiento internacional del
Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure.
Células B-50 se siembran con una
densidad de 2 x 10^{5} células por placa de 60 mm durante 24
horas. Veinticuatro horas más tarde, el medio de siembra (DMEM/FBS
al 10% complementado con antibióticos) se reemplaza por DMEM/FBS al
2%. Las células se infectan con clon de Ad/AAV recombinante que
contiene E1 y el minigén de rAAV con una MOI apropiada. Esta
infección en una etapa de células B-50 proporciona
todos los genes adyuvantes requeridos para la producción de rAAV.
Así, no existe necesidad de otros virus adyuvantes tales como sub
100r.
De veinticuatro a noventa y seis horas después
de la infección, los lisados celulares se preparan y el lisado se
valora con respecto a la producción de rAAV mediante cualquier
procedimiento conocido en la técnica. Si el rAAV es rAAVLacZ, el
lisado puede valorarse como sigue. Las células junto con el medio de
transfección se recogen mediante rascadores y se someten a tres
rondas de congelación-descongelación en
etanol-hielo seco y un baño de agua a 37ºC. Las
células se centrifugan a 3000 rpm en una centrífuga de sobremesa
durante 15 minutos a 4ºC. Un décimo de cada lisado se usa para
infectar células 84-31, una línea celular de
complementación doble de E1/E4 que es transducibile por rAAV,
durante 24 horas. Las células 84-31 se tiñen a
continuación histoquímicamente con X-Gal. Los
números de células azules en cada infección se evalúan y se
presentan en Unidades Infecciosas (IU, 1 IU se definió como una
célula azul contada) de rAAVLacZ producido en cada transfección.
Un genoma rAAV CMVGFP en el que un gen
informador de proteína fluorescente verde (GFP) es conducido por
promotor de CMV y flanqueado por ITRs de AAV2 se clonó en la región
E3 de un mutante de Ad5, virus sub 100r. El gen proteínico terminal
E2b de sub 100r se rompió mediante una inserción de 3 bp, dando un
fenotipo sensible a la temperatura. El híbrido de
Ad-AAV recombinante resultante es un tipo
genotípicamente silvestre para genes E1, E2a, E4 y VARNA, pero sus
genes E3 son reemplazados ahora por un genoma rAAVCMVGFP. Así, este
híbrido Ad-AAV de segunda generación posee todos
los genes adyuvantes esenciales y un genoma de rAAV y, teóricamente,
una sola infección de células B50 con el virus debe conducir a
rescate, replicación y empaquetamiento de genomas de rAAV.
Un constructo plasmídico pAB27 disponible
comercialmente se adquirió de Microbix Biosystems (Ontario, Canadá).
Tiene los siguientes segmentos del genoma de Ad5: m.u.
0-1, 10,6-16,1 y
60-100 con una deleción de E3 de 2,7 kb que abarca
m.u. 78,3 n 85,8. Un genoma AAVCMVGFP recombinante se aisló del
constructo prAAVCMVGFP [un producto de Clontech que contiene GFP
potenciada, EGFP] como un fragmento Pvu II y se clonó en el
sitio ScaI del plásmido pAB27. El plásmido lanzadera
resultante se denominó pABrAAVCMVEGFP [Fig. 1A]. Un mutante
proteínico terminal de E2B de Ad, sub 100r, se eligió como cadena
principal viral para montar el nuevo híbrido de
Ad-AAV que es condicionalmente competente para la
replicación a sus 32ºC permisivos. Para introducir el rAAVCMVEGFP
en el genoma de sub 100r, DNA viral de sub 100r se digirió con
endonucleasa de restricción Spe I y se contransfectó con
pABrAAVCMVEGFP en células 293 mediante el método del fosfato
cálcico. Las células transfectadas se cubrieron con agar superior y
se cultivaron a 32ºC durante 14 días. Las calvas virales verdes de
sub 100r-rAAVCMVGFP se aislaron para la
purificación de calvas adicional y la expansión a un preparado viral
a gran escala. Véase la Fig. 1B para la ilustración del
procedimiento de recombinación homóloga para generar virus híbrido
de sub 100rAAVCMVGFP.
Células B50 se sembraron en placas de 12
pocillos con una densidad de 1 x 10^{5} células por pocillo.
Veinticuatro horas más tarde, las células se infectaron con el
híbrido de sub 100rAAVCMVGFP con 100, 1000, 2000 y 4000 partículas
virales por célula. Para cada infección, se establecieron
triplicados de placas de 12 pocillos para la incubación a
diferentes temperaturas, 32, 37 y 39,5ºC. Como controles positivos,
células B50 en 12 pocillos se infectaron con adyuvante Ad5
silvestre y sub100rAAVCMVGFP a las MOIs descritas anteriormente,
bien simultáneamente o bien con un intervalo de 24 h. A las 72, 96 y
120 h después de la infección, el lisado celular total de cada
infección se recogió. Después de haber pasado a través de tres
ciclos de congelación/descongelación, el lisado se centrifugó a
3000 rpm y 4ºC durante 15 min. El sobrenadante resultante de cada
muestra se recogió y se almacenó a -80ºC. Para cuantificar
rAAVCMVGFP producido en cada infección, una porción de cada muestra
se calentó a 56ºC durante 1 h para inactivar híbrido de
Ad-AAV infeccioso inactivo sub
100r-AAVCMVGFP y se puso sobre células
84-31, un clon celular que complementa E1/E4, en
dilución en serie. Unidades formadoras de fluorescencia verde
(GFFU) de cada muestra se evaluaron bajo un microscopio UV a las
24-48 h después de la infección y se computaron
como GFFU por célula B50 usadas en la infección con sub 100rAAVCWGFP
inicial. Una GFFU se definió aquí por los focos de transducción de
GFP por virus rAAVCMVGFP en una infección de dilución limitativa.
Así, las GFFUs por célula representan rAAVCMVGFP producido por cada
célula B50 bajo el entorno experimental correspondiente.
Se estableció una serie de experimentos para
optimizar condiciones para el rendimiento máximo de rAAV producido
por este nuevo sistema de B50/híbrido y comparar con el sistema
B50/híbrido original.
El sistema de infección B50/híbrido competente
para la replicación puede producir aproximadamente
1/3-1/6 del rAAVCMVGFP producido en presencia de
virus adyuvante Ad en el experimento inicial. Los datos resumidos
en la Tabla 1 demuestran la viabilidad de usar el sistema de
infección de B50/híbrido de Ad-AAV competente para
la replicación para la producción de rAAV.
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos presentados aquí sugieren que, bajo
las condiciones experimentales probadas, el sistema B50/híbrido de
Ad-AAV competente para la replicación puede producir
rAAV. Pero el rendimiento máximo cae 3-6 veces en
comparación con el positivo, donde las células B50 se infectaron con
una adyuvante Ad5Wt y el híbrido con un intervalo de 24 h. El
sistema de infección simple se comportaba mucho mejor a 32 y 37ºC en
comparación con 39,5ºC.
Se ha establecido como hipótesis que, una vez
introducido en las células B50, el híbrido de Ad-AAV
competente para la replicación afronta dos posibles destinos: bien
ser replicado o bien ser inutilizado por proteínas Rep para el
rescate, la replicación y el empaquetamiento de AAV. Una infección
productiva para rAAV usando este sistema será un equilibrio
delicado de ambas direcciones. Se ha demostrado previamente que,
para la producción de AAV con alto rendimiento mediante el
B50/adyuvante de Ad/híbrido Ad-AAV sometido a
deleción de E1, hay una relación temporal crítica entre la
expresión de los genes Rep/cap activada por proteínas E1 de Ad5, la
amplificación transitoria de híbridos de Ad-AAV
entrantes, la resolución de genomas de rAAV a partir de la cadena
principal del híbrido y la replicación adicional de genomas de AAV.
Aunque la temperatura permisiva para el mutante sub 100r es 32ºC,
se sabe que tal sensibilidad a la temperatura es algo defectuosa a
37ºC pero bastante restrictiva a 39,5ºC. Se espera que, a 37ºC, la
replicación de sub 100rAAVCMVGFP se frene, pero la expresión de
Rep/cap, el rescate, la replicación y el empaquetamiento de AAV sean
óptimos. Los datos demuestran que el sistema era en efecto más
productivo a 37ºC en comparación con 32ºC. Pero la productividad de
AAV a 39,5ºC se disminuía bruscamente. En este caso, probablemente
no había replicación de híbrido en absoluto. Adicionalmente, toda
la maquinaria celular estaba bajo estrés por alta temperatura, dando
como resultado una deficiencia en la expresión de rep/cap, el
rescate, la replicación y el empaquetamiento de AAV.
Basándose en los datos del Ejemplo 2B, la
infección de células B50 a MOIs inferiores parece ser beneficiosa
para la producción de AAV. De acuerdo con los datos del experimento
inicial, parece que, a temperaturas productivas, 32 y 37ºC, el
rendimiento de rAAV cae bruscamente a medida que se incrementa la
MOI de la infección con sub 100rAAVCMVGFP. Existe una diferencia
drástica en la productividad de AAV entre 100 pts/célula y 100
pts/célula, sugiriendo que la MOI óptima para la productividad
máxima está en ese intervalo. Para definir la MOI óptima, el
segundo experimento llevado a cabo era examinar el impacto de la MOI
entre 20 y 1000 partículas (pt)/célula tanto a 32 como a 37ºC
(Tabla 2). De acuerdo con esto, las células B50 se sembraron en
placas de 12 pocillos como se describe anteriormente y se
infectaron con 20, 40, 100, 200, 400 y 1000 partículas de sub
100rAAVGFP. Las muestras de lisados celulares en bruto se
prepararon y ensayaron con respecto a la productividad de rAAVCMVGFP
por célula del mismo modo que anteriormente.
Los resultados revelaban que bien 100 o bien 200
pts/célula era óptimo para la infección a 32ºC. Pero la situación a
37ºC era bastante diferente, donde la MOI óptima estaba limitada
restrictivamente a 200 pts/célula. Dos veces de incremento o
disminución de la MOI daban como resultado una reducción de 60% en
la productividad de AAV. El impacto de la MOI sobre la producción
de AAV observado aquí y en un estudio previo demostraba la
importancia de alcanzar un equilibrio delicado entre la replicación
del híbrido y el empaquetamiento de rAAV al usar el sistema
B50/híbrido para la producción de AAV. Se sabe que el proceso de
replicación del adenovirus es altamente dependiente de la MOI,
particularmente bajo condiciones permisivas y semipermisivas. Es
plausible que, con altas MOIs, la replicación del virus híbrido se
haga dominante, pero el rescate, la replicación y el
empaquetamiento de rAAV disminuyen significativamente. Por otra
parte, es deseable una amplificación del virus híbrido limitada
para incrementar el número de genomas de rAAV para el rescate y el
empaquetamiento. Esto se demuestra claramente en los resultados
presentados en la Tabla 2. Puesto que 32ºC es permisivo para sub
100rAAVCMVGFP, no existe una diferencia obvia en el rendimiento de
AAV observado entre 100 y 200 pts/célula. Solo cuando la MOI supera
400 pts/célula, entonces el rendimiento de AAV cae drásticamente.
Sin embargo, cuando las infecciones se llevaban a cabo a una
temperatura semipermisiva, a 37ºC, la MOI óptima estaba restringida
a 200 pts/célula solamente. Aquí, una replicación de virus híbrido
limitada y dependiente de MOI se hacía crítica para un
empaquetamiento de AAV máximo.
A partir del experimento inicial, se encontró
que había muy poco AAV producido a 39,5ºC, pero la productividad de
AAV a 32 y 37ºC era comparable. Para investigar el impacto potencial
de las temperaturas de infección sobre la productividad de AAV, el
experimento de MOI descrito anteriormente se efectuó por duplicado
tanto a 32 como a 37ºC.
Los datos presentados en las Tablas 1 y 2
también indicaban que, a MOIs óptimas, la producción de AAV era
mejor a 37ºC que a 32ºC. Esto también podía explicarse por la
necesidad de equilibrar entre la replicación de virus híbrido
limitada y el rescate, la replicación y el empaquetamiento de AAV.
Aparentemente, a la temperatura semipermisiva, a 37ºC, el
equilibrio de dos episodios diferentes se movía a favor del
empaquetamiento de AAV, conduciendo a una productividad
superior.
Células B50 en placas de 12 pocillos se
infectaron con sub 100rAAVCMVGFP a 100 partículas por célula y 37ºC
durante 36 y 60 h. A continuación, las placas se movieron a otra
incubadora fijada a 32ºC. El lisado celular en bruto se preparó a
las 72, 96, 120, 144 y 168 h después de la infección para la
valoración de la productividad de AAV sobre células
84-31.
La lógica tras este diseño experimental era que
el virus sub 100rAAVCMVGFP debe tener una replicación limitada a
37ºC, pero la activación del promotor P5 para proteína Rep/cap debe
ser óptima. Una incubación de 24 h a 37ºC permitiría la expresión
de Rep/cap iniciada con un nivel limitado de replicación de virus
híbrido y así obtener células B50 acondicionadas para el rescate,
la replicación y el empaquetamiento de AAV. Una vez que la
infección se cambiaba a 32ºC, la replicación del virus híbrido
también debía frenarse algo por los efectos de inhibición de
proteínas Rep acumuladas en las células. Los resultados del
experimento de cambio de temperatura (Tabla 3) no cumplían la
probabilidad esperada debido al fallo en alcanzar un equilibrio
óptimo entre la replicación de híbrido y el rescate y la
replicación de AAV. Pero los datos indicaban que un cambio anterior
en la temperatura daba lugar a un mejor rendimiento que uno
posterior, sugiriendo que la cronología del cambio representa un
papel crucial en la producción de AAV.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Células B50 en placas de 12 pocillos se
infectaron con sub 100rAAVCMVGFP a 50 partículas por célula y 37ºC
durante 24 h. Una segunda partida de sub 100rAAVCMVGFP a 100
partículas por célula se añadió a 37ºC y el otro grupo se movió a
una incubadora a 32ºC. La producción de AAV bajo cada condición se
examinó a las 72, 96, 120, 144 y 168 h después de la infección
inicial.
En el sistema B50/adyuvante de Ad5/híbrido de
Ad-AAV sometido a deleción en E1 clásico, era
esencial tener un intervalo de 24 h entre la primera infección con
virus adyuvante de Ad y la segunda infección con híbrido de
Ad-AAV. Esta relación temporal delicada de dos
infecciones permite la creación de condiciones celulares óptimas,
tales como un nivel apropiado de proteínas Rep para regular la
velocidad apropiada de replicación de virus híbrido y el rescate de
AAV, para un alto rendimiento de producción de AAV. En ese caso, la
diferencia entre las infecciones con virus adyuvante de Ad e
híbrido sometido a deleción en E1 es la presencia y ausencia de
proteínas E1. Sin embargo, cuando se usa el híbrido de
Ad-AAV competente para la replicación para la
producción de AAV en células B50, no existe diferencia entre el
virus adyuvante de Ad y el híbrido en términos de su capacidad para
proporcionar todas las funciones adyuvantes necesarias. Si se
infectan las células con dos partidas del híbrido con 24 h de
intervalo, la primera partida debe servir como un adyuvante justo
como la infección con Ad Wt y la segunda partida debe ser
exactamente como el híbrido sometido a deleción en E1 para aportar
genoma de rAAV para la amplificación, el rescate y el
empaquetamiento. Se espera que la productividad de AAV del método
de B50/híbrido de Ad-AAV competente para la
replicación sea tan alta como la del sistema B50/híbrido clásico.
Los datos generados a partir del experimento apoyaban en efecto la
presente teoría (Tabla 4). Puesto que solo se usaba un tipo de
adenovirus en este nuevo método de producción, se simplifica algo
el procedimiento de purificación y se facilita el procedimiento a
escala aumentada. Por otra parte, podrían introducirse algunas
mutaciones más intensas tales como la deleción de E4 en la cadena
principal del híbrido y los genes de Ad correspondientes en células
B50 establemente. Así, se incapacita el propio virus de modo que
incluso si los preparados de AAV se contaminaban con algunos
híbridos defectuosos, los efectos secundarios de tales híbridos
defectuosos in vivo se minimizarían adicionalmente.
Claims (23)
1. Un virus híbrido de adenovirus/AAV competente
para la replicación, que comprende:
- (a)
- elementos cis 5' de adenovirus necesarios para la replicación y el empaquetamiento;
- (b)
- una deleción de secuencias adenovirales en la región E1a y E1b adenoviral natural;
- (c)
- un vector viral adenoasociado recombinante (rAAV);
- (d)
- una deleción de secuencias adenovirales de la región E3;
- (e)
- secuencias de ácido nucleico que codifican E1a de adenovirus y E1b de adenovirus bajo el control de secuencias reguladoras que dirigen la expresión de los productos génicos E1a y E1b, en donde dichas secuencias de ácido nucleico de E1a y E1b están situadas en el sitio de la región E3, y
- (f)
- elementos cis 3' de adenovirus necesarias para la replicación y el empaquetamiento.
2. Un virus híbrido de adenovirus/AAV de acuerdo
con la reivindicación 1, en donde dicho virus de adenovirus/AAV
híbrido comprende además secuencias de ácido nucleico que codifican
producto génico E2a adenoviral bajo el control de secuencias
reguladoras que dirigen su expresión en una célula huésped.
3. Un virus híbrido de adenovirus/AAV de acuerdo
con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde dicho virus
de adenovirus/AAV híbrido comprende además secuencias de ácido
nucleico que codifican producto génico E4 adenoviral o uno de sus
fragmentos funcionales bajo el control de secuencias reguladoras que
dirigen su expresión en una célula huésped.
4. Un virus híbrido de adenovirus/AAV de acuerdo
con la reivindicación 3, en el que dicho fragmento funcional del
producto génico E4 es ORF6 de E4.
5. Un virus híbrido de adenovirus/AAV de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además
secuencias adenovirales que codifican RNA de VAT.
6. Un virus híbrido de adenovirus/AAV de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho rAAV
comprende secuencias seleccionadas de AAV tipo 1 o AAV tipo 5.
7. Un virus híbrido de adenovirus/AAV de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho vector
de rAAV está situado en la región E1a y E1b adenoviral
silvestre.
8. Un virus híbrido de adenovirus/AAV de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el vector de
AAV comprende repeticiones terminales invertidas (ITRs) 5' y 3' de
AAV y un transgén bajo el control de secuencias reguladoras que
dirigen su expresión.
9. Un virus híbrido de adenovirus/AAV de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que las
secuencias reguladoras de (e) comprenden un primer promotor que
dirige la expresión del producto génico E1a.
10. Un virus híbrido de adenovirus/AAV de
acuerdo con la reivindicación 9, en el que el primer promotor se
selecciona del grupo que consiste en un promotor natural de E1a, un
promotor inducible, un promotor específico para tejidos y un
promotor constitutivo.
11. Un virus híbrido de adenovirus/AAV de
acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en el que
las secuencias reguladoras comprenden un segundo promotor que dirige
la expresión del producto génico E1b adenoviral.
12. Un virus híbrido de adenovirus/AAV de
acuerdo con la reivindicación 11, en el que el segundo promotor es
idéntico al primer promotor.
13. Un virus híbrido de adenovirus/AAV de
acuerdo con la reivindicación 11, en el que el segundo promotor y el
primer promotor son diferentes.
14. Un virus híbrido de adenovirus/AAV de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde
dicho virus comprende además una mutación sensible a la temperatura
en el gen E2b adenoviral.
15. Una célula huésped de mamífero que contiene
un virus híbrido de adenovirus/AAV de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14.
\newpage
16. Un método para producir virus adenoasociado
recombinante (rAAV), que comprende las etapas de:
cultivar una célula huésped que contiene:
- (a)
- una secuencia rep de AAV y una secuencia cap de AAV bajo el control de secuencias reguladoras que dirigen su expresión; y
- (b)
- un virus híbrido de adenovirus/AAV que comprende:
- elementos cis 5' de adenovirus necesarios para la replicación y el empaquetamiento;
- una deleción de secuencias adenovirales en la región E1a y E1b adenoviral natural;
- un vector de virus adenoasociado recombinante (rAAV);
- una deleción de secuencias adenovirales de la región E3;
- secuencias de ácido nucleico que codifican E1a de adenovirus y E1b de adenovirus bajo el control de secuencias reguladoras que dirigen la expresión de los productos génicos E1a y E1b, en donde dichas secuencias de ácido nucleico de E1a y E1b están situadas en el sitio de la región E3, y
- elementos cis 3' de adenovirus necesarios para la replicación y el empaquetamiento;
- cultivándose dicha célula huésped bajo condiciones que inhiben la replicación del virus híbrido, dando como resultado una producción de rAAV potenciada.
17. Un método de acuerdo con la reivindicación
16, que comprende además la etapa de aislar el rAAV de dicha célula
huésped o cultivo de células huésped.
18. Un método de acuerdo con la reivindicación
16 o la reivindicación 17, en el que la célula huésped se transforma
establemente con la secuencia rep de AAV.
19. Un método de acuerdo con la reivindicación
16 o la reivindicación 17, en el que la célula huésped se transforma
establemente con la secuencia cap de AAV.
20. Un método de acuerdo con la reivindicación
16 o la reivindicación 17, en el que la secuencia rep se
expresa transitoriamente en la célula huésped.
21. Un método de acuerdo con la reivindicación
16 o la reivindicación 17, en el que la secuencia cap se
expresa transitoriamente en la célula huésped.
22. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 21, que comprende además la etapa de, antes
del cultivo, infectar la célula huésped con el adenovirus/AAV
híbrido con una multiplicidad de infección de aproximadamente 0,5 a
aproximadamente 1000.
23. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 22, en el que el adenovirus/AAV híbrido se
cultiva a una temperatura de aproximadamente 32ºC a aproximadamente
37ºC.
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