EA018723B1 - Полипептиды, вариабельные домены антител и антагонисты - Google Patents

Полипептиды, вариабельные домены антител и антагонисты Download PDF

Info

Publication number
EA018723B1
EA018723B1 EA200901495A EA200901495A EA018723B1 EA 018723 B1 EA018723 B1 EA 018723B1 EA 200901495 A EA200901495 A EA 200901495A EA 200901495 A EA200901495 A EA 200901495A EA 018723 B1 EA018723 B1 EA 018723B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
protease
variable domain
polypeptide
antagonist
sequence
Prior art date
Application number
EA200901495A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200901495A1 (ru
Inventor
Лорен Йесперс
Малгорзата Пупека
Айан Томлинсон
Кэролин Эневер
Original Assignee
Домантис Лимитед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB0724331.4A external-priority patent/GB0724331D0/en
Application filed by Домантис Лимитед filed Critical Домантис Лимитед
Publication of EA200901495A1 publication Critical patent/EA200901495A1/ru
Publication of EA018723B1 publication Critical patent/EA018723B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/005—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies constructed by phage libraries
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/007—Pulmonary tract; Aromatherapy
    • A61K9/0073—Sprays or powders for inhalation; Aerolised or nebulised preparations generated by other means than thermal energy
    • A61K9/0078—Sprays or powders for inhalation; Aerolised or nebulised preparations generated by other means than thermal energy for inhalation via a nebulizer such as a jet nebulizer, ultrasonic nebulizer, e.g. in the form of aqueous drug solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/06—Anti-spasmodics, e.g. drugs for colics, esophagic dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/04—Artificial tears; Irrigation solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/543—Mucosal route intranasal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/544—Mucosal route to the airways
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Hematology (AREA)

Abstract

Изобретение относится к полипептидам и единичным вариабельным доменам (dAb) антител против TNFR1, устойчивым к деградации протеазой, а также к содержащим их антагонистам. Полипептиды, dAb и антагонисты полезны в качестве терапевтических и/или профилактических средств, которые вероятно сталкиваются с протеазами при введении пациенту, например для внутрилегочного введения, перорального введения, доставки в легкое и доставки в ЖК тракт пациента, а также для лечения воспалительного заболевания, такого как артрит или COPD (хроническое обструктивное заболевание легких).

Description

Изобретение относится к протеазоустойчивым полипептидам, иммуноглобулиновым единичным вариабельным доменам (антитела) и содержащим их антагонистам фактора некроза опухоли 1 (ΤΝΕΚ.1, р55, СЭ120а, Р60, член суперсемейства рецепторов ΤΝΕ 1А, ΤΝΕΚ8Ε1 А). Изобретение дополнительно относится к применению, препаратам, композициям и устройствам, содержащим такие лиганды против ΤΝΕΚ1.
Предшествующий уровень техники
Полипептиды и пептиды становятся все более важными агентами в различных приложениях, включая промышленные приложения и применение в качестве медицинских, терапевтических и диагностических агентов. Однако при некоторых физиологических состояниях, таких как воспалительные состояния (например, СОРЭ (хроническое обструктивное заболевание легких)) и рак, количество протеаз, присутствующих в ткани, органе или животном (например, в легком, в опухоли или рядом с опухолью), может увеличиваться. Это увеличение протеаз может приводить в результате к усиленной деградации и инактивации эндогенных белков и терапевтических пептидов, полипептидов и белков, вводимых для лечения заболевания. Соответственно, некоторые агенты, обладающие потенциалом применения ίη νίνο (например, применение в лечении, диагностике или профилактике заболевания), обладают лишь ограниченной эффективностью, поскольку они быстро деградируют и инактивируются протеазами.
Протеазоустойчивые полипептиды обладают некоторыми преимуществами. Например, протеазоустойчивые полипептиды остаются активными ίη νίνο дольше, чем агенты, чувствительные к протеазам, и соответственно остаются функциональными в течение периода времени, достаточного для обеспечения биологических эффектов. Существует потребность в улучшенных способах селекции полипептидов, устойчивых к деградации протеазами, а также обладающих желаемой биологической активностью.
ΤΝΕΚ1.
ΤΝΕΚ1 представляет собой трансмембранный рецептор, содержащий внеклеточную область, связывающуюся с лигандом, и внутриклеточный домен, лишенный собственной активностью передачи сигнала, но который может ассоциироваться с молекулами, передающими сигнал. Комплекс ΤΝΕΚ1 со связанным ΤΝΕ содержит три цепи ΤΝΕΚ1 и три цепи ΤΝΕ (Ваппег е1 а1., Се11, 73(3) 431-445 (1993)). Лиганд ΤΝΕ представлен в виде тримера, связанного с тремя цепями ΤΝΕΚ1 (И.). Три цепи ΤΝΕΚ1 сконцентрированы близко друг к другу в комплексе рецептор-лиганд, и это близкое расположение является предпосылкой для опосредованной ΤΝΕΚ1 передачи сигнала. Фактически мультивалентные агенты, которые связываются с ΤΝΕΚ.1, такие как антитела против ΤΝΕΚ1, могут вызывать кластеризацию ΤΝΕΚΤ и передачу сигнала в отсутствие ΤΝΕ и обычно используются в качестве агонистов ΤΝΕΚ1 (см., например, Ве1ка е1 а1., ЕМВО, 14(6): 1156-1165 (1995); МапФк-Ыауак е1 а1., 1. 1ттипо1, 167:1920-1928 (2001)). Соответственно, мультивалентные агенты, которые связываются с ΤΝΕΚ1, как правило, представляют собой неэффективные антагонисты ΤΝΕΚ1, даже если они блокируют связывание ΤΝΕα с ΤΝΕΚ1.
Внеклеточная область ΤΝΕΚ1 содержит амино-концевой сегмент, состоящий из тринадцати аминокислот (аминокислоты 1-13 в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:603 (человек); аминокислоты 1-13 в 8ЕО ГО ΝΟ:604 (мышь)), домен 1 (аминокислоты 14-53 в 8ЕО ГО ΝΟ:603 (человек); аминокислоты 14-53 в 8ЕО ГО ΝΟ:604 (мышь)), домен 2 (аминокислоты 54-97 в 8ЕО ГО ΝΟ:603 (человек); аминокислоты 54-97 в 8ЕО ГО ΝΟ:604 (мышь)), домен 3 (аминокислоты 98-138 в 8ЕО ГО ΝΟ:603 (человек); аминокислоты 98-138 в 5>ЕО ГО ΝΟ:604 (мышь)) и домен 4 (аминокислоты 139-167 в 8ЕО ГО ΝΟ:603 (человек); аминокислоты 139-167 в 8ЕО ГО ΝΟ:604 (мышь)), за которым следует лежащая ближе к мембране область (аминокислоты 168-182 в 8ЕО ГО ΝΟ:603 (человек); аминокислоты 168-183 8ЕО ГО ΝΟ:604 (мышь)) (см. Ваппег е1 а1., Се11 73(3) 431-445 (1993), и Ьое1:8сйег е1 а1., Се11 61(2) 351-359 (1990)). Домены 2 и 3 формируют контакт со связанным лигандом (ΤΝΕβ, ΤΝΕα) (Ваппег е1 а1., Се11, 73(3) 431-445 (1993)). Внеклеточная область ΤΝΕΚ1 также содержит область, названную как домен сборки предшественника лиганда или РЬАО домен (аминокислоты 1-53 в 8ЕО ГО ΝΟ:603 (человек); аминокислоты 1-53 в 8ЕО ГО ΝΟ:604 (мышь)) (правительство США, \УО 01/58953; Эепд е1 а1., №1Шге МеФсФе, άοί: 10.1038/пт1304 (2005)).
ΤΝΕΚ1 выбрасывается с поверхности клеток Ф νίνο при помощи способа, который включает протеолиз ΤΝΕΚ1 в домене 4 или в находящейся ближе к мембране области (аминокислоты 168-182 в 8ЕО ГО ΝΟ:603; аминокислоты 168-183 в 8ЕО ГО ΝΟ:604), с образованием растворимой формы ΤΝΕΚ1. Растворимый ΤΝΕΚ1 сохраняет способность связываться с ΤΝΕα и, таким образом, действует в качестве эндогенного ингибитора активности ΤΝΕα.
Краткое изложение сущности изобретения
В одном из аспектов в изобретении предложен полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 93% идентична аминокислотной последовательности ЭОМ111131-206 (представленной на фиг. 3). В одном из воплощений процент идентичности составляет по меньшей мере 94, 95, 96, 97, 98 или 99%. В одном из воплощений полипептид представляет собой ЭОМ111131-206. В изобретении дополнительно предложен (по существу) чистый мономер ЭОМ111-131-206. В одном из воплощений ЭОМ111-131-206 представляет собой по меньшей мере на 98, 99, 99,5% чистый или на 100% чистый мономер.
В одном из аспектов в изобретении предложен полипептид, кодируемый аминокислотной последо
- 1 018723 вательностью, которая по меньшей мере на 80% идентична нуклеотидной последовательности ΌΘΜ1Η131-206 (представленной на фиг. 19). В одном из воплощений процент идентичности составляет по меньшей мере 70, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%.
В одном из аспектов в изобретении предложен полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере на 57% идентична нуклеотидной последовательности ΌΘΜ1Η-131206 (представленной на фиг. 19), и где полипептид содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 93% идентична аминокислотной последовательности ΌΘΜ1Η-131-206 (представленной на фиг. 3). В одном из воплощений процент идентичности нуклеотидной последовательности составляет по меньшей мере 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%. В одном из воплощений процент идентичности аминокислотной последовательности составляет по меньшей мере 94, 95, 96, 97, 98, или 99, или 100%. Например, нуклеотидная последовательность может представлять собой кодон-оптимизированный вариант нуклеотидной последовательности ΌΘΜ1Η-131-206 (представленной на фиг. 19). Оптимизация кодонов последовательности известна в области техники. В одном из воплощений нуклеотидная последовательность оптимизирована для экспрессии в бактериальной клеткехозяине (например, Е.соН или Рзеиботоиаз, например Р. Диотезсеиз), клетке-хозяине млекопитающего (например, СНО) или дрожжевой клетке-хозяине (например, РюсЫа или 8ассНаготусез, например Р. раз1опз или 8. сетеу181ае).
В одном из аспектов в изобретении предложен слитый белок, содержащий полипептид по изобретению.
В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора ΤΝΕα 1 типа (ΤΝΕΒ1; р55), содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 93% идентична аминокислотной последовательности ΌΘΜ1Η-131-206 (представленной на фиг. 3). В одном из воплощений процент идентичности составляет по меньшей мере
94, 95, 96, 97, 98 или 99%.
В одном из аспектов в изобретении предложен протеазоустойчивый иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора ΤΝΕα 1 типа (ΤΝΕΒ1; р55), содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности ΌΘΜ1Η-131-206. В одном из воплощений этих аспектов процент идентичности составляет по меньшей мере 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%.
В одном из воплощений иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен содержит аспарагиновую кислоту в положении 53, где нумерация соответствует нумерации по Кабату (КаЬа!) (8ес.|иепсе8 оГ Рго1е1И8 оГ 1ттиио1од1са1 1и1еге81, И8 Оерайтеи! оГ Неа1!Н аиб Нитап 8егу1сез 1991).
В одном из воплощений иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен содержит гистидин в положении 91, где нумерация соответствует нумерации по Кабату.
В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора ΤΝΕα 1 типа (ΤΝΕΒ1; р55), содержащий аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотной последовательности ΌΘΜ1Η-131-206.
В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора ΤΝΕα 1 типа (ΤΝΕΒ1; р55), кодируемый нуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере на 80% идентична нуклеотидной последовательности ΌΘΜ1Η-131-206 (представленной на фиг. 19). В одном из воплощений процент идентичности составляет по меньшей мере 70, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%.
В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора ΤΝΕα 1 типа (ΤΝΕΒ1; р55), кодируемый нуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере на 57% идентична нуклеотидной последовательности ΌΘΜ1Η-131-206 (представленной на фиг. 19), и где вариабельный домен содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 93% идентична аминокислотной последовательности ΌΘΜ1Η-131-206 (представленной на фиг. 3). В одном из воплощений процент идентичности нуклеотидной последовательности составляет по меньшей мере 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%. В одном из воплощений процент идентичности аминокислотной последовательности составляет по меньшей мере 94,
95, 96, 97, 98, или 99%, или 100%. Например, нуклеотидная последовательность может представлять собой кодон-оптимизированный вариант нуклеотидной последовательности ΌΘΜ1Η-131-206 (представленной на фиг. 19). Оптимизация кодонов последовательности известна в области техники. В одном из воплощений нуклеотидная последовательность оптимизирована для экспрессии в бактериальной клеткехозяине (например, Е.соН или Рзеиботоиаз, например Р. Диотезсеиз), клетке-хозяине млекопитающего (например, СНО) или дрожжевой клетке-хозяине (например, РюсЫа или 8ассНаготусез, например Р. раз1оп8 или 8. сетеу181ае).
В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора ΤΝΕα 1 типа (ΤΝΕΒ1; р55), кодируемый последовательностью, которая идентична нуклеотидной последовательности ΌΘΜ1Η-131-206 (представленной на фиг. 19).
В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист рецептора ΤΝΕα 1 типа (ΤΝΕΚ1; р55),
- 2 018723 содержащий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против ΤΝΡΚ1 по изобретению. В одном из воплощений антагонист содержит первый и второй иммуноглобулиновый единичный вариабельный домены, где каждый вариабельный домен представляет собой вариабельный домен по изобретению. Например, когда антагонист содержит мономер указанного иммуноглобулинового единичного вариабельного домена или гомодимер указанного единичного вариабельного домена. В одном из воплощений аминокислотная последовательность единичного вариабельного домена или каждого единичного вариабельного домена идентична аминокислотной последовательности ΩΟΜ1Η-131-206 (представленной на фиг. 3).
В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора ΤΝΕα 1 типа (ΤΝΕΚ.1; р55), содержащий аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотной последовательности ΩΟΜ1Η-131-206 (представленной на фиг. 3) или отличается от аминокислотной последовательности ΩΟΜ1Η-131-206 не более чем по 25 аминокислотным положениям, и имеет последовательность СЭШ. которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности СЭШ из ΌΟΜ1Η-131-206. В одном из воплощений различие имеется не более чем по 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотному положению. В одном из воплощений идентичность последовательности СОЯ составляет по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%.
В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора ΤΝΕα 1 типа (ΤΝΕΚ.1; р55), содержащий аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотной последовательности ΩΟΜ111-131-206 (представленной на фиг. 3) или отличается от аминокислотной последовательности ΩΟΜ111-131-206 не более чем по 25 аминокислотным положениям, и имеет последовательность СОЯ2, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности СОЯ2 из ΌΟΜ1Η-131-206. В одном из воплощений различие имеется не более чем по 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотному положению. В одном из воплощений идентичность последовательности СОЯ составляет по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%.
В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора ΤΝΕα 1 типа (ΤΝΕΚ1; р55), содержащий аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотной последовательности ΩΟΜ111-131-206 (представленной на фиг. 3) или отличается от аминокислотной последовательности ΩΟΜ111-131-206 не более чем по 25 аминокислотным положениям, и имеет последовательность СОЯ3, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности СЭЯ/ из ΩΟΜ111-131-206. В одном из воплощений различие имеется не более чем по 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотному положению. В одном из воплощений идентичность последовательности СОЯ составляет по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%.
В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора ΤΝΕα 1 типа (ΤΝΕΚ1; р55), содержащий аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотной последовательности ΩΟΜ111-131-206 (представленной на фиг. 3) или отличается от аминокислотной последовательности ΩΟΜ111-131-206 не более чем по 25 аминокислотным положениям, и имеет последовательность СЭКЕ которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности СЭШ из ΌΟΜ1Η-131-206, и имеет последовательность СОЯ2, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности СЭР2 из ΩΟΜ111-131-206. В одном из воплощений различие имеется не более чем по 24, 23, 22, 21, 20, 19,18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотному положению. В одном из воплощений идентичности одной или обеих последовательностей СОЯ составляют соответственно по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%.
В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора ΤΝΕα 1 типа (!КЕЯ1; р55), содержащий аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотной последовательности ΩΟΜ111-131-206 (представленной на фиг. 3) или отличается от аминокислотной последовательности ΩΟΜ111-131-206 не более чем по 25 аминокислотным положениям, и имеет последовательность СОЯ1, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности СЭР1 из ΌΟΜ1Η-131-206, и имеет последовательность СОЯ3, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности СЭЯ3 из ΩΟΜ111-131-206. В одном из воплощений различие имеется не более чем по 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотному положению. В одном из воплощений идентичности одной или обеих последовательностей СОЯ составляют соответственно по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%.
В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора ΤΝΕα 1 типа (!КЕЯ1; р55), содержащий аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотной последовательности ΩΟΜ111-131-206 (представленной на фиг. 3) или отличается от аминокислотной последовательности ΩΟΜ111-131-206 не более чем по 25 аминокислотным положениям, и имеет последовательность СОЯ2, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности СЭР2 из ΌΟΜ1Η-131-206, и имеет последовательность СОЯ3, которая по меньшей мере на
- 3 018723
50% идентична последовательности ΟΌΚ3 из ΌΘΜ1Η-131-206. В одном из воплощений различие имеется не более чем по 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотному положению. В одном из воплощений идентичности одной или обеих последовательностей СЭЕ составляют соответственно по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%.
В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора ΤΝΕα 1 типа (ΤΝΕΕ1; р55), содержащий аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотной последовательности ΌΘΜ1Η-131-206 (представленной на фиг. 3) или отличается от аминокислотной последовательности ΌΘΜ1Η-131-206 не более чем по 25 аминокислотным положениям, и имеет последовательность СЭК1, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности СОК! из ΌΘΜ1Η-131-206, и имеет последовательность СЭЯ2. которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности ί.ΌΚ2 из ΌΘΜ1Η-131-206, и имеет последовательность ί.ΌΚ3, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности СОКЗ из ΌΘΜ1Η-131-206. В одном из воплощений различие имеется не более чем по 24, 23, 22, 21, 20, 19,18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11,10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотному положению. В одном из воплощений идентичности одной или обеих, или каждой последовательности СОК составляют по меньшей мере соответственно 55, 60, 65, 70,75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%.
В одном из аспектов изобретения предложен антагонист рецептора ΤΝΕα 1 типа (ΤΝΕΗ1; р55), имеющий последовательность СЭК1, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности СОК! из ΌΘΜ1Η-131-206 (представленной на фиг. 3). В одном из воплощений идентичность последовательности СОВ составляет по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%. Антагонист может быть протеазоустойчивым, например устойчивым к одной или более чем одной из описанных здесь протеаз, например при описанном здесь наборе условий.
В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист рецептора ΤΝΕα 1 типа (ΤΝΕΕ1; р55), имеющий последовательность ί.ΌΒ2, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности ί.ΌΕ1 из ΌΘΜ1Η-131-206 (представленной на фиг. 3). В одном из воплощений идентичность последовательности СОВ составляет по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%. Антагонист может быть протеазоустойчивым, например устойчивым к одной или более чем одной из описанных здесь протеаз, например при описанном здесь наборе условий.
В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист рецептора ΤΝΕα 1 типа (ΤΝΕΒ1; р55), имеющий последовательность ί.ΌΒ3, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности СЭЕ1 из ΌΘΜ1Η-131-206 (представленной на фиг. 3). В одном из воплощений идентичность последовательности СОВ составляет по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%. Антагонист может быть протеазоустойчивым, например устойчивым к одной или более чем одной из описанных здесь протеаз, например при описанном здесь наборе условий.
В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист рецептора ΤΝΕα 1 типа (ΤΝΕΒ1; р55), имеющий последовательность СЭКЕ которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности СЭЕ1 из ΌΘΜ1Η-131-206 (представленной на фиг. 3), и последовательность СОЕ2, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности ί.ΌΕ2 из ΌΘΜ1Η-131-206. В одном из воплощений идентичность последовательности СОК одной или обеих СОК составляет по меньшей мере соответственно 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%. Антагонист может быть протеазоустойчивым, например устойчивым к одной или более чем одной из описанных здесь протеаз, например при описанном здесь наборе условий.
В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист рецептора ΤΝΕα 1 типа (ΤΝΕΗ1; р55), имеющий последовательность СЭКЕ которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности ί.ΌΕ1 из ΌΘΜ1Η-131-206 (представленной на фиг. 3), и последовательность СОЕ3, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности СОКЗ из ΌΘΜ1Η-131-206. В одном из воплощений идентичность последовательности СОК одной или обеих СОК составляет по меньшей мере соответственно 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%. Антагонист может быть протеазоустойчивым, например устойчивым к одной или более чем одной из описанных здесь протеаз, например при описанном здесь наборе условий.
В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист рецептора ΤΝΕα 1 типа (ΤΝΕΗ1; р55), имеющий последовательность СОЕ2, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности ί.ΌΕ2 из ΌΘΜ1Η-131-206 (представленной на фиг. 3), и последовательность СОЕ3, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности СОКЗ из ΌΘΜ1Η-131-206. В одном из воплощений идентичность последовательности СОК одной или обеих СОК составляет по меньшей мере соответственно 55, 60, 65, 70,75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%. Антагонист может быть протеазоустойчивым, например устойчивым к одной или более чем одной из описанных здесь протеаз, например при описанном здесь наборе условий.
В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист рецептора ΤΝΕα 1 типа (ΤΝΕΗ1; р55), имеющий последовательность СЭКЕ которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности ί.ΌΕ1 из ΌΘΜ1Η-131-206 (представленной на фиг. 3), последовательность СОЕ2, которая по меньшей
- 4 018723 мере на 50% идентична последовательности СЭВ2 из ΌΟΜ1Ε-131-206, и последовательность СЭВ3, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности СЭВ3 из ΌΘΜ1Η-131-206. В одном из воплощений идентичность последовательности СОВ одной или обеих, или каждой СОВ составляет по меньшей мере соответственно 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%. Антагонист может быть протеазоустойчивым, например устойчивым к одной или более чем одной из описанных здесь протеаз, например при описанном здесь наборе условий.
В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист рецептора ΤΝΕα 1 типа (ΤΝΒΒ1; р55), содержащий единичный вариабельный домен иммуноглобулина, содержащий последовательность СЭВЕ СЭВ2 и/или СОВ3 (например, СЭВ1, СЭВ2, СОВ3, СЭВ1 и 2, СЭВ1 и 3, СЭВ2 и 3 или СОВ1, 2 и 3) из ΌΟΜ1Ε-131-206 (представленной на фиг. 3). Антагонист может быть протеазоустойчивым, например устойчивым к одной или более чем одной из описанных здесь протеаз, например при описанном здесь наборе условий.
В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист рецептора ΤΝΕα 1 типа (Т№В1; р55), который конкурирует с ΌΘΜ1Η-131-511-206 за связывание с ΤNΕΒ1. Таким образом, антагонист может связываться с тем же самым эпитопом, что и ΌΟΜ1Ε-131-206, или перекрывающимся эпитопом. В одном из воплощений антагонист содержит иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 93% идентична аминокислотной последовательности ΌΟΜ1Ε-131-206 (представленной на фиг. 3). В одном из воплощений процент идентичности составляет по меньшей мере 94, 95, 96, 97, 98 или 99%. Антагонист может быть протеазоустойчивым, например устойчивым к одной или более чем одной из описанных здесь протеаз, например при описанном здесь наборе условий. В одном из воплощений антагонист представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, такой как моновалентный антигенсвязывающий фрагмент (например, βοΕν, ЕаЬ, ЕаЬ', бАЬ), обладающий специфичностью связывания в отношении Т№В1. Другие примеры антагонистов представляют собой описанные здесь лиганды, которые связываются с ТЫЕВ1. Лиганды могут содержать иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен или однодоменное антитело (бАЬ), обладающее специфичностью связывания в отношении Т№В1, или области, определяющие комплементарность, такого ЙАЬ в подходящем формате. В некоторых воплощениях лиганд представляет собой мономер бАЬ, который состоит по существу из или состоит из иммуноглобулинового единичного вариабельного домена или бАЬ, обладающего специфичностью связывания в отношении Т№В1. В других воплощениях лиганд представляет собой полипептид, который содержит ЙАЬ (или СОВ из бАЬ) в подходящем формате, таком как формат антитела.
Один из антагонистов Т№В1 по изобретению не ингибирует связывание ТК’Еа с ΤNΕΒ1, но ингибирует передачу сигнала, опосредованную через Т№В1. Например, антагонист Т№В1 может ингибировать индуцированную ТК’Еа кластеризацию ΤNΕΒ1, предшествующую передаче сигнала через Т№В1. Такие антагонисты обладают несколькими преимуществами. Например, в присутствии такого антагониста Т№а может связываться с ТЫЕВ1, экспрессирующимся на поверхности клеток, и удаляться из клеточного окружения, но опосредованная Т№В1 передача сигнала не будет активироваться. Таким образом, будет ингибироваться индуцированная Т№В1 сигналом продукция дополнительного ΊΝΕα и других медиаторов воспаления. Аналогично, антагонисты Т№В1, связывающиеся с Т№В1 и ингибирующие передачу сигнала, опосредованную через ТЫЕВ1, но не ингибирующие связывание ТК’Еа с Т№В1, не будут ингибировать связывание с ТК’Еа и ингибирующую активность эндогенно продуцируемого растворимого Т№В1. Соответственно, введение такого антагониста млекопитающему, нуждающемуся в таком введении, может дополнить эндогенные регуляторные пути, которые ингибируют активность ТК’Еа и активность Т№В1 ίη νίνο. Изобретение также относится к лигандам, которые (1) связываются с Т№В1 (например, в домене 1), (2) оказывают антагонистическое действие в отношении активации опосредованной Т№В1 передачи сигнала и (3) не ингибируют связывание ТК’Еа с Т№В1. Такой лиганд связывается с растворимым ТЫЕВ1, но не предотвращает связывание растворимого рецептора с Т№а, и, таким образом, введение такого антагониста млекопитающему, нуждающемуся в таком введении, может дополнить эндогенные регуляторные пути, которые ингибируют активность ТК’Еа ίη νίνο путем увеличения периода полувыведения растворимого рецептора из сыворотки крови. Эти преимущества особенно актуальны для лигандов, которые форматированы таким образом, что обладают большим гидродинамическим размером, например путем присоединения группы РЕО (полиэтиленгликоль), альбумина сыворотки крови, трансферрина, рецептора трансферрина или, по меньшей мере, его трансферринсвязывающего фрагмента, области Ес антитела, или путем конъюгации с доменом антитела. Например, агент (например, полипептид, вариабельный домен или антагонист), который 1) связывается с Т№В1 (например, в домене 1), (2) оказывает антагонистическое действие в отношении активации опосредованной Т№В1 передачи сигнала, и (3) не ингибирует связывание ТК’Еа с Т№В1, такой как мономер бАЬ, может быть форматирован в виде более крупного антигенсвязывающего фрагмента антитела или в виде антитела (например, форматирован как ЕаЬ, ЕаЬ', Е(аЬ)2, Е(аЬ')2, 1дО, 5сΕν). Гидродинамический размер лиганда и его период полувыведения из сыворотки крови также может быть увеличен путем конъюгации или связывания агента, связывающего Т№В1 (антагонист; вариабельный домен) со связывающим доме
- 5 018723 ном (например, антителом или фрагментом антитела), связывающим антиген или эпитоп, который увеличивает период полувыведения ίη νίνο, как здесь описано (см. приложение 1 в νθ 2006038027, включенной здесь путем ссылки). Например, связывающийся с ΤΝΤΚ.1 агент (например, полипептид) может быть сконъюгирован или связан с антителом против альбумина сыворотки крови или его фрагментом или с антителом или фрагментом антитела против неонатального Ес рецептора, например бЛЬ. ЕаЬ, ЕаЬ' или 5сЕг против 8А или против неонатального Ес рецептора, или с аффителом против 8А или аффителом против неонатального Ес рецептора.
Примеры подходящего альбумина, фрагментов альбумина или вариантов альбумина для применения в ΤΝΕΒΙ-связывающем лиганде по изобретению описаны в νθ 2005/077042А2 и νθ 2006038027, которые включены здесь путем ссылки.
В других воплощениях по изобретению, описанных в этом описании, вместо применения бАЬ в антагонисте или лиганде по изобретению предполагается, что специалист в данной области техники может использовать домен, который содержит СЭВ из бАЬ, который связывает ΤΝΕΒ1 (например, СЭВ привитые на подходящий белковый остов или скелет, например аффитело, 8рА остов, домен рецептора ЬВЬ (липопротеинов низкой плотности) класса А или домен ЕСЕ (фактор роста эпителия)), или может представлять собой белковый домен, содержащий сайт связывания с ΤΝΤΒ1, например когда домен выбран из аффитела, домена 8рА, домена ЬВЬ рецептора класса А или домена ЕСЕ. Полное описание следует рассматривать таким образом, что оно раскрывает антагонисты, лиганды и способы использования таких доменов вместо бАЬ.
Полипептиды, единичные вариабельные домены иммуноглобулина и антагонисты по изобретению могут быть устойчивыми к одной или более чем одной из следующих протеаз: сериновая протеаза, цистеиновая протеаза, аспартатпротеазы, тиоловые протеазы, матриксная металлопротеиназа, карбоксипептидаза (например, карбоксипептидаза А, карбоксипептидаза В), трипсин, химотрипсин, пепсин, папаин, эластаза, лейкозим, панкреатин, тромбин, плазмин, катепсины (например, катепсин С), протеиназа (например, протеиназа 1, протеиназа 2, протеиназа 3), термолизин, химозин, энтеропептидаза, каспаза (например, каспаза 1, каспаза 2, каспаза 4, каспаза 5, каспаза 9, каспаза 12, каспаза 13), кальпаин, фикаин, клострипаин, актинидаин, бромелаин и сепараза. В конкретных воплощениях протеаза представляет собой трипсин, эластазу или лейкозим. Протеаза также может обеспечиваться биологическим экстрактом, биологическим гомогенатом или биологическим препаратом. В одном из воплощений протеаза представляет собой протеазу, обнаруженную в мокроте, слизи (например, желудочной слизи, носовой слизи, бронхиальной слизи), бронхоальвеолярном смыве, легочном гомогенате, легочном экстракте, экстракте поджелудочной железы, желудочной жидкости, слюне или слезах. В одном из воплощений протеаза представляет собой протеазу, обнаруженную в глазу и/или слезах. В одном из воплощений протеаза представляет собой небактериальную протеазу. В одном воплощении протеаза представляет собой протеазу животного, например протеазу млекопитающего, например человека. В одном воплощении протеаза представляет собой протеазу ЖК (желудочно-кишечного) тракта или протеазу легочной ткани, например протеазу ЖК тракта или протеазу легочной ткани, обнаруженную у людей. Такая приведенная здесь протеаза также может быть использована в описанных здесь способах, включающих воздействие протеазой на репертуар библиотеки.
В одном из аспектов в изобретении предложен протеазоустойчивый иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, содержащий сайт связывания рецептора ΤΝΤα 1 типа (ΤΝΤΒ1; р55), где вариабельный домен устойчив к протеазе, например трипсину, при инкубировании с (1) концентрацией (с) протеазы по меньшей мере 10 мкг/мл при 37°С в течение промежутка времени (1) по меньшей мере 1 ч; или (2) концентрацией (с') протеазы по меньшей мере 40 мкг/мл при 30°С в течение промежутка времени (1) по меньшей мере 1 ч, где вариабельный домен содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности ΌΘΜ111-131-206 (представленной на фиг. 3). В одном из воплощений отношение (на основе моль/моль) протеазы, например трипсина, к вариабельному домену составляет 8000 к 80000 протеаза:вариабельный домен, например когда С составляет 10 мкг/мл, тогда отношение составляет 800 к 80000 протеаза:вариабельный домен; или когда С или С составляет 100 мкг/мл, тогда отношение составляет 8000 к 80000 протеаза:вариабельный домен. В одном из воплощений отношение (на основе масса/масса, например на основе микрограмм/микрограмм) протеазы (например, трипсина) к вариабельному домену составляет 16000 к 160000 протеаза:вариабельный домен, например когда С составляет 10 мкг/мл, тогда отношение составляет 1600 к 160000 протеаза:вариабельный домен; или когда С или С' составляет 100 мкг/мл, тогда отношение составляет 16000 к 160000 протеаза:вариабельный домен. В одном из воплощений концентрация протеазы (с или с') составляет по меньшей мере 100 или 1000 мкг/мл. Здесь сделана ссылка на описание условий, подходящих для протеолитической активности протеазы для применения при работе с репертуарами или библиотеками пептидов или полипептидов (например, параметры мас./мас.). Эти условия могут быть использованы для определения устойчивости к протеазе конкретного иммуноглобулинового единичного вариабельного домена. В одном из воплощений время (1) составляет приблизительно 1, 3 или 24 ч или в течение ночи (например, приблизительно 12-16 ч). В одном из воплощений вариабельный домен устойчив в условиях (1) концентрация протеазы (с) составляет или приблизительно составляет 10
- 6 018723 или 100 мкг/мл, время (!) составляет 1 ч. В одном из воплощений вариабельный домен устойчив в условиях (2) концентрация протеазы (с') составляет или приблизительно составляет 40 мкг/мл, время (!) составляет или приблизительно составляет 3 ч. В одном из воплощений протеаза выбрана из трипсина, эластазы, лейкозима и панкреатина. В одном из воплощений протеаза представляет собой трипсин. В одном из воплощений протеаза представляет собой протеазу, обнаруженную в мокроте, слизи (например, желудочной слизи, носовой слизи, бронхиальной слизи), бронхоальвеолярном лаваже, гомогенате легких, экстракте легких, экстракте поджелудочной железы, желудочной жидкости, слюне или слезах. В одном из воплощений протеаза представляет собой протеазу, обнаруженную в глазу и/или слезах. В одном из воплощений протеаза представляет собой небактериальную протеазу. В этом воплощении протеаза представляет собой протеазу животного, например протеазу млекопитающего, например человека. В этом воплощении протеаза представляет собой протеазу ЖК тракта или протеазу легочной ткани, например протеазу ЖК тракта или протеазу легочной ткани, обнаруженные у людей. Такая приведенная здесь протеаза также может быть использована в описанных здесь способах, включающих воздействие протеазой на репертуар библиотеки.
В одном из воплощений вариабельный домен устойчив к трипсину и/или по меньшей мере одной другой протеазе, выбранной из эластазы, лейкозима и панкреатина. Например, устойчивость представляет собой устойчивость к трипсину и эластазе; трипсину и лейкозиму; трипсину и панкреатину; трипсину, эластазе и лейкозиму; трипсину, эластазе и панкреатину; трипсину, эластазе, панкреатину и лейкозиму или трипсину, панкреатину и лейкозиму.
В одном из воплощений вариабельный домен представлен на бактериофаге при инкубации в условиях (1) или (2), например в фаговой библиотеке, имеющей размер от 106 до 1013, например от 108 до 1012 репликативных единиц (инфекционных вирионов).
В одном из воплощений вариабельный домен специфически связывается с ΤΝΤΚΤ после инкубации в условиях (1) или (2), например при оценке с использованием В1аСоге™ или ЕБ18А (твердофазного иммуноферментного анализа), например фагового ЕБ18А или моноклонального фагового ЕБ18А.
В одном из воплощений вариабельные домены по изобретению специфически связываются с белком А или белком Ь. В одном из воплощений специфическое связывание с белком А или Ь происходит после инкубации в условиях (1) или (2).
В одном из воплощений вариабельные домены по изобретению могут иметь величину ΟΌ450 в ЕБ18А, например фаговом ЕБ18А или моноклональном фаговом ЕЬ18А, по меньшей мере 0,404, например после инкубации в условиях (1) или (2).
В одном из воплощений вариабельные домены по изобретению демонстрируют (по существу) единственную полосу при электрофорезе в геле, например после инкубации в условиях (1) или (2).
В некоторых воплощениях в изобретении предложен антагонист ΤΝΕΚΤ, который представляет собой биспецифический лиганд, содержащий первое бАЬ по изобретению, связывающее ΤΝΤΚ1, и второе бАЬ. которое обладает той же самой или отличающейся от первого бАЬ специфичностью связывания. Второе бАЬ может связываться с мишенью, выбранной из следующего: АроЕ (аполипопротеин Е), АроЗАА (Аро-сывороточный амилоид А-1), ΒΌΝΕ (нейротрофический фактор головного мозга), кардиотрофин-1, СЕА (карциноэмбриональный антиген), СЭ40 (кластер дифференцировки 40), лиганд СЭ40, ί.Ό56, СЭ38, СЭ138, ЕСЕ (эпидермальный фактор роста), рецептор ЕСЕ, ЕNА-78 (эпителиальный нейтрофил-активирующий пептид-78), эотаксин, эотаксин-2, экзодус-2 (ехоби§-2), ЕАРа (белок активации фибробластов α), кислый ЕСЕ (фактор роста фибробластов), основный ЕСЕ, фактор роста фибробластов10, лиганд ЕЬТЗ (Етк-подобной тирозинкиназы-3), фракталкин (СХЗС), СО№ (глиальный нейротрофический фактор), С-СЗЕ (колониестимулирующий фактор гранулоцитов), СМ-С8Е (колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов), СЕ-в1 (фактор роста β1), человеческий сывороточный альбумин, инсулин, ΙΡΝ-γ (интерферон-γ), 1СЕ-1 (инсулиноподобный фактор роста I), 1СЕ-11, 1Ь-1а (интерлейкин-1а), ΙΠ-1β, рецептор 1Ь-1, рецептор 1Ь-1 типа 1, 1Ь-2, 1Ь-3, 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-6, 1Ь-7, 1Ь-8 (72 а.к.), 1Ь-8 (77 а.к.), 1Ь-9, 1Б-10, 1Б-11, 1Б-12, 1Б-13, 1Б-15, 1Б-16, 1Б-17, 1Б-18 (1С1Е (интерферону-индуцирующий фактор)), ингибин α, ингибин β, 1Р-10 (интерферон-индуцибельный белок 10), фактор роста кератиноцитов-2 (КСЕ-2), КСЕ, лептин, Ь1Е (лейкоз-ингибирующий фактор), лимфотактин, вещество, ингибирующее мюллеровы протоки, фактор, ингибирующий колониеобразование моноцитов, белок-аттрактант моноцитов, М-С8Е (колониестимулирующий фактор макрофагов), МЭС (макрофагальный хемокин) (67 а.к.), МЭС (69 а.к.), МСР-1 (моноцитарный хемотаксический фактор-1) (МСАЕ (моноцитарный хемотаксический и активирующий фактор)), МСР-2, МСР-3, МСР-4, МЭС (67 а.к.), МЭС (69 а.к.), М1С (монокин, индуцируемый ΙΤΝ-γ), М1Р-1а (макрофагальный белок воспаления 1α), М1Р-1в, М1Р-3а, М1Р-3в, М1Р-4, фактор-1, ингибирующий миелоидные предшественники (МР1Е-1), NАР-2 (нейтрофилактивирующий белок-2), нейртурин, фактор роста нервов ХСЕ), β-Ν6Ε, ΝΤ-3 (нейротрофин-3), ΝΤ-4, онкостатин М, РЭСЕ-АА (тромбоцитарный фактор роста-АА), РЭСЕ-АВ, РЭСЕ-ВВ, РЕ-4 (тромбоцитарный фактор 4), ВА^ЕЗ (цитокин, экспрессируемый и секретируемый нормальными Т-клетками при активации), 8ΌΤ1α (фактор-1а стромальных клеток), 8ОЕ1 β, 8СЕ, 8ССЕ (фактор роста стволовых клеток), фактор стволовых клеток (8СЕ), ΤАΚС (хемокин, регулируемый тимусом и при активации), ΤСЕ-α
- 7 018723 (трансформирующий фактор роста α), ТСЕ-β, ΤΟΕ-β2, ΤΟΕ-β3, фактор некроза опухолей (ΤΝΕ), ΤΝΡ-α, ΤΝΡ-β, рецептор I ΤΝΡ, рецептор II ΤΝΡ, ΤΝΙΕ-1, ТРО (тромбопоэтин), УЕСЕ (фактор роста сосудистого эндотелия), УЕСЕ А, УЕСЕ В, УЕСЕ С, УЕСЕ Ό, рецептор 1 УЕСЕ, рецептор 2 УЕСЕ, рецептор 3 УЕСЕ, ОСР-2 (гранулоцитарный хемотаксический фактор-2), СКО/МС8А (регулирующий рост онкоген/фактор, стимулирующий рост меланомы), ОКО-β, СКО-у, НСС1 (гемофильтратный СС-хемокин 1), 1-309, НЕК 1, НЕК 2, НЕК 3, НЕК 4, сывороточный альбумин, ν^Ε (фактор (фон) Виллебранда), амилоидные белки (например, альфа-амилоид), ММР12 (матриксная металлопротеаза 12), ΡΌΚ1 (Р13К (фосфатидилинозит3-киназа)-зависимая киназа 1), 1дЕ (иммуноглобулин Е), 1Ь-13Ка1, 1Ь-13Ка2, 1Ь-15, 1Ь-15К, 1Ь-16, 1Ь17К, Ш-17, Ш-18, 1Ь-18К, 1Ь-23, 1Б-23К, 1Ь-25, СЭ2, СЭ4, СП11а, СП23, СП25, СП27, СП28, СП30, ί.Ό40, СП40Ь, СЭ56, СЭ138, АЬК5 (активиновый рецептор-подобная киназа 5), ЕСЕК (рецептор эпидермального фактора роста), ЕсЕК1 (высокоаффинный рецептор для 1дЕ), ТСЕЬ, ССЬ2 (хемокиновый лиганд-2 с СС-мотивом), ССЬ18, СЕА, СК8 (цитокин-отвечающие (СК) гены), СТСЕ (фактор роста соединительной ткани), СХСЬ12 (хемокиновый лиганд-12 с СХС-мотивом) (8ΌΕ-1), химазу, ЕСЕ, фурин, эндотелин-1, эотаксины (например, эотаксин, эотаксин-2, эотаксин-3), СМ-С8Е, 1САМ-1 (фактор межклеточной адгезии 1), 1СО8 (индуцибельный Т-клеточный костимулятор), 1дЕ, ΙΕΝα, 1-309, интегрины, Ь-селектин, ΜΙΕ (фактор, ингибирующий миграцию макрофагов), ΜΙΡ4, МОС, МСР-1, ММР, эластазу нейтрофилов, остеопонтин, ОХ-40, РАКС (легочный хемокин, регулируемый активацией), ΡΌ-1 (рецептор апоптоза 1), КАΝΤЕ8, 8СЕ, 8ΌΕ-1, 5щ1ес8 (связывающий сиаловую кислоту иммуноглобулиноподобный лектин 8), ΤАКС, ΤΟΕΒ, тромбин, Τίιη-1 (семейство 1д и муциновых доменов, член 1), ΤΝΕ, ΤКАΝСЕ (индуцирующий ΤΝΕ-ассоциированную активацию цитокин), триптаза, УЕСЕ, УЪА-4 (очень поздний антиген-4), УСАМ (молекула адгезии сосудистых клеток), α4β7, ССК2 (хемокиновый рецептор2 с СС-мотивом), ССК3, ССК4, сСк5, ССК7, ССК8, а1р11атЬс1а6, а1р11атЬе1а8, сМЕТ, СЭ8, т\УЕ, амилоидные белки (например, альфа-амилоид), ММР12, ΡΌΚ1 и 1дЕ.
В одном из примеров обладающий двойной специфичностью лиганд содержит первое бАЬ, связывающееся с первым эпитопом на ΤΝΕΡΤ, и второе бАЬ, связывающееся с эпитопом на другой мишени. В еще одном примере второе бАЬ связывается с эпитопом на альбумине сыворотки крови.
В других воплощениях лиганд представляет собой мультиспецифический лиганд, который содержит первый эпитопсвязывающий домен, обладающий специфичностью связывания в отношении ΤΝΕΡΤ, и по меньшей мере один другой эпитопсвязывающий домен, обладающий специфичностью связывания, отличающейся от первого эпитопсвязывающего домена. Например, первый эпитопсвязывающий домен может представлять собой бАЬ, связывающее ΤΝΈ!, или может представлять собой домен, который содержит СОК из бАЬ, которое связывает ΤΝΕΡΤ (например, СОК, привитые на подходящем белковом остове или скелете, например аффитело, остов 8рА, домен ЬВЬ рецептора класса А или домен ЕСЕ), или может представлять собой домен, связывающий ΤΝΕК1, где домен выбран из аффитела, домена 8рА, домена ЬВЬ рецептора класса А или домена ЕСЕ.
В некоторых воплощениях полипептид, антагонист, лиганд или мономер бАЬ против ΤΝΡΡΤ характеризуется одним или более чем одним из следующего: 1) диссоциирует из человеческого ΤΝΡΡΤ с константой диссоциации (Кб) от 50 нМ до 20 пМ и константой скорости Κ^ от 5х10-1 с-1 до 1х 10-7 с-1, как определено при помощи поверхностного плазмонного резонанса; 2) ингибирует связывание фактора некроза опухоли альфа (ΤΝΙα) с ΤΝΙΒΙ с 1С50 (средней ингибирующей концентрацией) от 500 нМ до 50 пМ; 3) нейтрализует человеческий ΤΝΕК1 в стандартном анализе на клетках Ь929 с ΝΏ50 (средней нейтрализующей дозой) от 500 нМ до 50 пМ; 4) оказывает антагонистическое действие в отношении активности ΤΝΡΡΤ в стандартном клеточном анализе с ΝΏ50 не более 100 нМ, и в концентрации не более 10 мкМ бАЬ оказывает агонистическое действие в отношении активности ΤΝΡΡΤ не более 5% в анализе; 5) ингибирует летальность в модели септического шока у мышей, вызванного ЬР8 (липополисахарид)Югалактозамином; 6) устойчив к агрегации; 7) секретируется в количестве, составляющем по меньшей мере приблизительно 0,5 мг/л при экспрессии в Е.со11 или в видах РюЫа (например, Р. раЧогй); 8) подвергается обратимому рефолдингу; 9) обладает эффективностью в модели хронического воспалительного заболевания, выбранного из группы, состоящей из модели индуцированного коллагеном артрита у мышей, модели ДАКЕ артрита у мышей, модели ДАКЕ воспалительного заболевания кишечника у мышей, модели воспалительного заболевания кишечника, индуцированного натрия декстрансульфатом, модели вызванного табачным дымом хронического обструктивного заболевания легких у мышей и подходящих моделей у приматов (например, модели индуцированного коллагеном артрита у приматов); и/или 10) обладает эффективностью в лечении, подавлении или профилактике хронического воспалительного заболевания. Ссылка на \¥О 2006038027 в отношении подробной информации относительно анализов и тестов, и параметров, применяемых для условий (1)-(10), и она включена здесь путем ссылки.
В конкретных воплощениях полипептид, антагонист, лиганд или мономер бАЬ диссоциирует из человеческого ΤΝΙΒ1 с константой диссоциации (Кб) от 50 нМ до 20 пМ и константой скорости 1<оп от 5х10-1 до 1х10-7 с-1, как определено при помощи поверхностного плазмонного резонанса; ингибирует связывание фактора некроза опухоли альфа (ΤΝΡα) с ΤΝΕК1 с 1С50 от 500 нМ до 50 пМ и нейтрализует человеческий ΤΝΙΒ1 в стандартном анализе на клетках Ь929 с ΝΏ50 от 500 нМ до 50 пМ. В других кон
- 8 018723 кретных воплощениях полипептид, антагонист, лиганд или мономер бЛЬ диссоциирует из человеческого ΤΝΕΚ1 с константой диссоциации (Κ,ι) от 50 нМ до 20 пМ и константой скорости Κοίϊ от 5х10-1 до 1х10-7 с-1; ингибирует связывание фактора некроза опухоли альфа (ΤΝΕα) с ΤΝΕΚ1 с 1С50 от 500 нМ до 50 пМ и обладает эффективностью в модели хронического воспалительного заболевания, выбранного из группы, состоящей из модели индуцированного коллагеном артрита у мышей, ΔΑΚΕ модели артрита у мышей, ΔΑΚΕ модели воспалительного заболевания кишечника у мышей, модели воспалительного заболевания кишечника, индуцированного натрия декстрансульфатом, модели вызванного табачным дымом хронического обструктивного заболевания легких у мышей и подходящих моделей у приматов (например, модели индуцированного коллагеном артрита у приматов). В других конкретных воплощениях полипептид, антагонист, лиганд или мономер бАЬ диссоциирует из человеческого ΤΝΕΚ1 с константой диссоциации (Κ,ι) от 50 нМ до 20 пМ и константой скорости Κ,ίϊ от 5х10-1 до 1х10-7 с-1, как определено при помощи поверхностного плазмонного резонанса; нейтрализует человеческий ΤΝΕΚ1 в стандартном анализе на клетках Ь929 с ΝΏ50 от 500 нМ до 50 пМ и оказывает антагонистическое действие в отношении активности ΤΝΕΚ1 в стандартном клеточном анализе с ΝΏ50 не более 100 нМ, и в концентрации не более 10 мкМ бАЬ оказывает агонистическое действие в отношении активности ΤΝΕΚ1 не более 5% в анализе.
Протеазоустойчивые полипептиды, иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены и антагонисты по изобретению обладают полезностью в терапии, профилактике и диагностике заболевания или состояний у млекопитающих, например людей. В частности, они обладают полезностью в качестве основы лекарств, которые вероятно сталкиваются с протеазами при введении пациенту, такому как человек. Например, при введении в ЖК тракт (например, при пероральном, сублингвальном, ректальном введении), в этом случае полипептиды, единичные вариабельные домены иммуноглобулина и антагонисты могут быть подвергнуты воздействию протеазы в одном или более чем одном из следующего: верхний отдел ЖК тракта, нижний отдел ЖК тракта, рот, желудок, тонкий кишечник и толстая кишка. Таким образом, в одном из воплощений предложен протеазоустойчивый полипептид, единичный вариабельный домен иммуноглобулина или антагонист, вводимый перорально, сублингвально или ректально в ЖК тракт пациента для лечения и/или профилактики заболевания или состояния у пациента. Например, пероральное введение пациенту (например, пациенту человеку) для лечения и/или профилактики опосредованного ΤΝΕα состояния или заболевания, такого как артрит (например, ревматоидный артрит), ΙΒΌ, псориаз или болезнь Крона. В еще одном примере полипептид, вариабельный домен или антагонист вероятно сталкивается с протеазой при введении (например, путем ингаляции или интраназально) в легочную ткань (например, легкое или дыхательные пути). Таким образом, в одном из воплощений предложено введение пациенту (например, человеку) протеазоустойчивого полипептида, единичного вариабельного домена иммуноглобулина или антагониста путем ингаляции или интраназально в легочную ткань пациента для лечения и/или профилактики заболевания или состояния у пациента. Такое состояние может представлять собой астму (например, аллергическую астму), СОРЭ (хроническое обструктивное заболевание легких), грипп или любое другое легочное заболевание или состояние, раскрытое в \УО 2006038027, включенной здесь путем ссылки. В еще одном примере полипептид, вариабельный домен или антагонист вероятно сталкивается с протеазой при введении (например, при помощи внутриглазной инъекции или в виде глазных капель) в глаз пациента. Таким образом, в одном из воплощений предложено глазное введение пациенту (например, человеку) протеазоустойчивого полипептида, единичного вариабельного домена иммуноглобулина или антагониста для лечения у пациента и/или профилактики заболевания или состояния (например, заболевания или состояния глаз). Введение может представлять собой местное введение в глаз, в форме глазных капель или путем инъекции в глаз, например в стекловидное тело глаза.
Антагонисты, полипептиды и иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены по изобретению могут демонстрировать улучшенные или относительно высокие температуры плавления (Το), обеспечивая улучшенную стабильность. Высокоаффинное связывание с мишенью может также или альтернативно представлять собой свойство антагонистов, полипептидов и вариабельных доменов. Одно или более чем одно из этих свойств, комбинированное с устойчивостью к протеазе, делает антагонисты, вариабельные домены и полипептиды пригодными для применения в качестве лекарственных средств у млекопитающих, таких как люди, где, вероятно, сталкиваются с протеазами, например для введения в ЖК тракт или легочную ткань.
Таким образом, в одном из аспектов в изобретении предложен антагонист ΤΝΕΚ1 для пероральной доставки. В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист ΤΝΕΚ1 для доставки в ЖК тракт пациента. В одном из аспектов в изобретении предложено применение антагониста ΤΝΕΚ1 в изготовлении лекарственного средства для пероральной доставки. В одном из аспектов в изобретении предложено применение антагониста ΤΝΕΚ1 в изготовлении лекарственного средства для доставки в ЖК тракт пациента. В одном из воплощений вариабельный домен устойчив к трипсину и/или по меньшей мере одной другой протеазе, выбранной из эластазы, лейкозима и панкреатина. Например, устойчивость представляет собой устойчивость к трипсину и эластазе; трипсину и лейкозиму; трипсину и панкреатину; трипсину,
- 9 018723 эластазе и лейкозиму; трипсину, эластазе и панкреатину; трипсину, эластазе, панкреатину и лейкозиму; или трипсину, панкреатину и лейкозиму.
В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист ΤΝΡΡ1 для легочной доставки. В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист ΤΝΡΚ1 для доставки в легкое пациента. В одном из аспектов в изобретении предложено применение антагониста ΤΝΡΚ1 в изготовлении лекарственного средства для легочной доставки. В одном из аспектов в изобретении предложено применение антагониста ΤΝΡΡ1 в изготовлении лекарственного средства для доставки в легкое пациента. В одном из воплощений вариабельный домен устойчив к лейкозиму.
В одном из аспектов в изобретении предложен способ пероральной доставки или доставки лекарственного средства в ЖК тракт пациента или в легкое или легочную ткань пациента, который включает введение пациенту фармацевтически эффективного количества антагониста ΤΝΡΡ1 по изобретению.
В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист ΤΝΡΚ1 по изобретению для лечения и/или профилактики воспалительного состояния. В одном из аспектов в изобретении предложено применение антагониста ΤΝΡΡ1 в изготовлении лекарственного средства для лечения и/или профилактики воспалительного состояния. В одном из воплощений состояние выбрано из группы, состоящей из артрита, рассеянного склероза, воспалительного заболевания кишечника и хронического обструктивного заболевания легких. Например, указанный артрит представляет собой ревматоидный артрит или юношеский ревматоидный артрит. Например, указанное воспалительное заболевание кишечника выбрано из группы, состоящей из болезни Крона и неспецифического язвенного колита. Например, указанное хроническое обструктивное заболевание легких выбрано из группы, состоящей из хронического бронхита, хронического обструктивного бронхита и эмфиземы. Например, указанная пневмония представляет собой бактериальную пневмонию. Например, указанная бактериальная пневмония представляет собой стафилококковую пневмонию.
В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист ΤΝΡΡ1 для лечения и/или профилактики респираторного заболевания. В одном из аспектов в изобретении предложено применение антагониста ΤΝΡΡ1 в изготовлении лекарственного средства для лечения и/или профилактики респираторного заболевания. Например, указанное респираторное заболевание выбрано из группы, состоящей из воспаления легких, хронического обструктивного заболевания легких, астмы, пневмонии, гиперчувствительного пневмонита, легочного инфильтрата с эозинофилией, легочного заболевания вследствие факторов окружающей среды, пневмонии, бронхоэктаза, муковисцидоза, интерстициального легочного заболевания, первичной легочной гипертензии, легочной тромбоэмболии, расстройств плевры, расстройств средостения, расстройств диафрагмы, гиповентиляции, гипервентиляции, приступов апноэ во сне, острого респираторного дистресс-синдрома, мезотелиомы, саркомы, отторжения трансплантата, заболевания трансплантат против хозяина, рака легкого, аллергического ринита, аллергии, асбестоза, аспергилломы, аспергиллоза, бронхоэктаза, хронического бронхита, эмфиземы, эозинофильной пневмонии, идиопатического легочного фиброза, инвазивного пневмококкового заболевания, гриппа, нетуберкулезных микобактерий, плеврального выпота, пневмокониоза, пневмоцитоза, пневмонии, легочного актиномикоза, легочного альвеолярного протеиноза, легочной формы сибирской язвы, отека легких, легочной эмболии, воспаления легких, легочного гистиоцитоза X, легочной гипертензии, легочного нокардиоза, легочного туберкулеза, легочного венозно-окклюзионного заболевания, ревматоидного легочного заболевания, саркоидоза и гранулематоза Вегенера. Например, заболевание представляет собой хроническое обструктивное заболевание легких (СОРЭ). Например, заболевание представляет собой астму.
Антагонист по изобретению, содержащий агент, который ингибирует ΤΝΡΡ1 (например, когда агент выбран из группы, состоящей из фрагментов антитела (например, РаЬ фрагмент, РаЬ' фрагмент, Ρν фрагмент (например, 5θΡν. связанный дисульфидными связями Ρν), Р(аЬ')2 фрагмент, ЙАЬ). лигандов и мономеров и мультимеров (например, гомо- или гетеродимеров) ЙАЬ, может быть введен локально в легочную ткань (например, легкое) субъекта с использованием любого подходящего способа. Например, агент может быть введен локально в легочную ткань путем ингаляции или интраназального введения. Для ингаляции или интраназального введения антагонист ΤΝΡΡ1 может быть введен с использованием распылителя, ингалятора, пульверизатора, аэрозоля, атомайзера, сухого порошкового ингалятора, ингалятора отмеренной дозы, распылителя отмеренной дозы, атомайзера отмеренной дозы, пульверизатора отмеренной дозы или другого подходящего ингалятора или устройства для интраназальной доставки. Таким образом, в одном из воплощений изобретения предложено устройство для легочной доставки, содержащее антагонист ΤΝΡΚ.1. В одном из воплощений устройство представляет собой ингалятор или устройство для интраназальной доставки.
В одном из аспектов в изобретении предложена композиция для перорального введения, содержащая антагонист ΤΝΡΚ1. Композиция может представлять собой таблетку, пилюлю, капсулу, жидкость или сироп.
В одном из воплощений в изобретении предложена легочная композиция для доставки в легкое, которая содержат антагонист, полипептид или вариабельный домен по изобретению с частицами, размер которых составляет меньше 5 мкм, например меньше 4,5, 4, 3,5 или 3 мкм (например, в буфере БриттонаРобинсона, например при рН 6,5-8,0, например при рН 7-7,5, например при рН 7 или 7,5).
- 10 018723
В одном из воплощений предложены препараты и композиции по изобретению при рН от 6,5 до 8,0, например от 7 до 7,5, например 7, например 7,5.
Вариабельные домены в соответствии с любым из аспектов изобретения могут иметь Тт по меньшей мере 50°С, или по меньшей мере 55°С, или по меньшей мере 60°С, или по меньшей мере 65°С, или по меньшей мере 70°С. Антагонист, применение, способ, устройство или композиция по изобретению может содержать такой вариабельный домен.
В одном из аспектов изобретения полипептиды, вариабельные домены, антагонисты, композиции или препараты по изобретению, по существу, стабильны после инкубации (в концентрации полипептида или вариабельного домена 1 мг/мл) при 37-50°С в течение 14 суток в буфере Бриттона-Робинсона. В одном из воплощений по меньшей мере 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% полипептида, антагониста или вариабельного домена остаются неагрегированными после такой инкубации при 37°С. В одном из воплощений по меньшей мере 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95,
96, 97, 98, 99% полипептида или вариабельного домена остаются мономерными после такой инкубации при 37°С. В одном из воплощений по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% полипептида, антагониста или вариабельного домена остаются неагрегированными после такой инкубации при 50°С. В одном из воплощений по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96,
97, 98, 99% полипептида или вариабельного домена остаются мономерными после такой инкубации при 50°С. В одном из воплощений после любой из таких инкубаций не обнаружена агрегация полипептидов, вариабельных доменов, антагонистов. В одном из воплощений р1 полипептида или вариабельного домена остается не измененной или по существу неизменной после инкубации при 37°С при концентрации полипептида или вариабельного домена 1 мг/мл в буфере Бриттона-Робинсона.
В одном из аспектов изобретения полипептиды, вариабельные домены, антагонисты, композиции или препараты по изобретению, по существу, стабильны после инкубации (при концентрации полипептида или вариабельного домена 100 мг/мл) при 4°С в течение 7 суток в буфере Бриттона-Робинсона при рН 7-7,5 (например, при рН 7 или 7,5). В одном из воплощений по меньшей мере 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99 или 99,5% полипептида, антагониста или вариабельного домена остаются неагрегированными после такой инкубации.
В одном из воплощений по меньшей мере 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99 или 99,5% полипептида или вариабельного домена остаются мономерными после такой инкубации. В одном из воплощений после любой из таких инкубаций не обнаружена агрегация полипептидов, вариабельных доменов, антагонистов.
В одном из аспектов изобретения полипептиды, вариабельные домены, антагонисты, композиции или препараты по изобретению, по существу, стабильны после распыления (при концентрации полипептида или вариабельного домена 40 мг/мл), например, при комнатной температуре, 20 или 37°С, в течение 1 ч, например в струйном распылителе, например Рап ЬС+ сир. В одном из воплощений по меньшей мере 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99 или 99,5% полипептида, антагониста или вариабельного домена остаются неагрегированными после такого распыления. В одном из воплощений по меньшей мере 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99 или 99,5% полипептида или вариабельного домена остаются мономерными после такого распыления. В одном из воплощений после любого из таких распылений не обнаружена агрегация полипептидов, вариабельных доменов, антагонистов.
Вариабельные домены по любому из аспектов изобретения могут нейтрализовать стимулируемое ΤΝΡα высвобождение 1Ь-8 в анализе на клетках МК.С-5 с ΝΏ50 от 2 нМ до 50 пМ. Антагонист, применение, способ, устройство или препарат по изобретению может содержать такой вариабельный домен.
В одном из аспектов в изобретении предложена выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен по любому из аспектов изобретения, или кодирующая полипептид, антагонист или вариабельный домен по любому из аспектов изобретения. В одном из аспектов в изобретении предложен вектор, содержащий эту нуклеиновую кислоту. В одном из аспектов в изобретении предложена клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту или вектор. В одном из аспектов в изобретении предложен способ продуцирования полипептида, содержащего иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, который включает поддержание клетки-хозяина в условиях, подходящих для экспрессии указанной нуклеиновой кислоты или вектора, посредством чего продуцируется полипептид, содержащий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен. Способ может дополнительно включать выделение полипептида, вариабельного домена или антагониста и возможно продуцирование варианта, например мутантного варианта, обладающего улучшенной аффинностью и/или ΝΏ50 по сравнению с выделенным полипептидом, вариабельным доменом или антагонистом. В области техники известны способы улучшения аффинности связывания иммуноглобулинового единичного вариабельного домена, например способы созревания аффинности.
В одном из аспектов в изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, полипептид или антагонист по любому из аспектов
- 11 018723 изобретения, и фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель.
В одном из воплощений иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен или антагонист по любому из аспектов изобретения содержит константный домен антитела, например Ре антитела, возможно, где Ν-конец Рс связан (возможно непосредственно связан) с С-концом вариабельного домена.
Полипептид или вариабельный домен по изобретению может быть выделенным и/или рекомбинантным.
Здесь описан способ селекции протеазоустойчивого пептида или полипептида. Способ включает получение репертуара пептидов или полипептидов, объединение репертуара и протеазы в условиях, подходящих для протеазной активности, и выделение пептида или полипептида, обладающего желаемой биологической активностью (например, специфическим связыванием с ΤΝΡΚ.1), посредством чего выбирают протеазоустойчивый пептид или полипептид.
Репертуар и протеазу, как правило, инкубируют в течение периода времени, составляющего по меньшей мере приблизительно 30 мин. В способе может быть использована любая желаемая протеаза, такая как одна или более чем одна из следующих: сериновая протеаза, цистеиновая протеаза, аспартатпротеазы, тиоловые протеазы, матриксная металлопротеиназа, карбоксипептидаза (например, карбоксипептидаза А, карбоксипептидаза В), трипсин, химотрипсин, пепсин, папаин, эластаза, лейкозим, панкреатин, тромбин, плазмин, катепсины (например, катепсин С), протеиназа (например, протеиназа 1, протеиназа 2, протеиназа 3), термолизин, химозин, энтеропептидаза, каспаза (например, каспаза 1, каспаза 2, каспаза 4, каспаза 5, каспаза 9, каспаза 12, каспаза 13), калпаин, фикаин, клострипаин, актинидаин, бромелаин и сепараза. В конкретных воплощениях протеаза представляет собой трипсин, эластазу или лейкозим. Протеаза также может также содержаться в биологическом экстракте, биологическом гомогенате или биологическом препарате. Если желательно, способ дополнительно включает добавление ингибитора протеазы к комбинации репертуара и протеазы после завершения инкубирования.
В некоторых воплощениях пептид или полипептид, обладающий желаемой биологической активностью, выделяют на основе связывающей активностью. Например, пептид или полипептид может быть выделен на основе связывания общего лиганда, такого как белок А, белок С или белок Ь. Связывающая активность может также представлять собой специфическое связывание с целевым лигандом. Примеры целевых лигандов включают АроЕ, Аро-ЗАА, ΒΌΝΡ, кардиотрофин-1, СЕА, СЭ40. лиганд СЭ40. СЭ56. СЭ38, СО138, ЕСР, ЕСЕ рецептор, ΕΝΑ-78, эотаксин, эотаксин-2, Ехоби§-2, РАРа, кислый РСР, основной РСР, фактор роста фибробластов-10, лиганд РЬТ3, фракталкин (СХЗС), СОБЕ, С-С8Р, СМ-С8Р, СРβ1, человеческий альбумин сыворотки крови, инсулин, ΙΕΝ-γ, 1СР-1, 1СР-11, 1Ь-1а, ΙΕ-1β, рецептор 1Ь-1, рецептор 1Ь-1 тип 1, 1Ь-2, 1Ь-3, 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-6, 1Ь-7, 1Ь-8 (72 а.к.), 1Ь-8 (77 а.к.), 1Ь-9, 1Б-10, 1Б-11, 1Б-12, Ш-13, Ш-15, Ш-16, 1Б-17, 1Б-18 (1СКР), ингибин а, ингибин β, ΙΡ-10, фактор роста кератиноцитов-2 (КСР-2), КСР, лептин, ЫЕ, лимфотацин, ингибирующее вещество Ми11епап, моноцитарный колониеингибирующий фактор, белок-аттрактант моноцитов, М-С8Р, МОС (67 а.к.), МОС (69 а.к.), МСР-1 (МСАР), МСР-2, МСР-3, МСР-4, МОС (67 а.к.), МОС (69 а.к.), М1С, М1Р-1а, М1Р-1в, М1Р-3а, М1Р-3в, М1Р-4, миелоидный предшественник ингибирующего фактора-1 (МР1Р-1), БАР-2, неуртурин, фактор роста нервов, β-БСР, ΝΤ-3, ΝΤ-4, онкостатин М, РОСР-АА, РОСР-АВ, РОСР-ВВ, РР-4, ВАБТЕ8, 8ОР1а, +ОР1 β, 8СР, 8ССР, фактор стволовых клеток (8СР), ТАКС, ТСР-а, ТСР-β, Τ6Ε-β2, Τ6Ε-β3, фактор некроза опухоли (ТХР), ТХР-α, ΊΝΕ-β, ТХР рецептор I, ТХР рецептор II, ТМЬ-1, ТРО, УЕСР, УЕСР А, УЕСР В, УЕСР С, УЕСР Ό, УЕСР рецептор 1, УЕСР рецептор 2, УЕСР рецептор 3, ССР-2, СКО/МСЗА, СКО-β, СКО-γ, НСС1, 1-309, НЕК 1, НЕК 2, НЕК 3, НЕК 4, альбумин сыворотки крови, у^Р, амилоидные белки (например, амилоид альфа), ММР12, РОК1, 1дЕ, 1Ь-13Ка1, 1Ь-13Ка2, 1Б-15, 1Б-15К, 1Б-16, 1Б-17К, 1Б-17, Ш-18, 1Б-18К, Ш-23 1Б-23К, 1Б-25, СО2, СО4, СО11а, СО23, СО25, СО27, СО28, СО30, СО40, СП40Ь, (4)56, СО138, АЬК5, ЕСРК, РсЕК1, ТСРЬ, ССЬ2, ССБ18, СЕА, СК8, СТСР, СХСБ12 (8ΏΕ-1), химаза, РСР, фурин, эндотелин-1, эотаксины (например, эотаксин, эотаксин-2, эотаксин-3), СМ-С8Р, 1САМ-1, 1СО8, 1дЕ, ШЫа, Ι-309, интегрины, Ь-селектин, М1Р, М1Р4, МОС, МСР-1, ММР, эластазу нейтрофилов, остеопонтин, ОХ-40, РАКС, Р1)-Е КАКГЕЗ, ЗСР, 8ΏΕ-1, Йд1ес8, ТАКС, ТСРЬ, тромбин, Т1Ш-1, ТХБ ТКАЫСЕ, триптазу, УЕСР, УЪА-4, УСАМ, α4β7, ССК2, ССК3, ССК4, ССК5, ССК7, ССК8, а1рйауЬе!а6, а1рйауЬе!а8, сМЕТ, СЭ8, ννΕ, амилоидные белки (например, амилоид альфа), ММР12, РОК1 и 1дЕ.
В конкретных воплощениях пептид или полипептид выделяют путем пэннинга.
В некоторых воплощениях репертуар включает дисплейную систему. Например, дисплейная система может представлять собой бактериофаговый дисплей, рибосомальный дисплей, эмульсионную компартментализацию и дисплей, дрожжевой дисплей, пуромициновый дисплей, бактериальный дисплей, плазмидный дисплей или ковалентный дисплей. Дисплейные системы связывают кодирующую функцию нуклеиновой кислоты и функциональные характеристики пептида или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой. В конкретных воплощениях система дисплея включает реплицируемые генетические комплексы.
В некоторых воплощениях система дисплея включает бактериофаговый дисплей. Например, бактериофаг может представлять собой й, М13, лямбда, МЗ2 или Т7. В конкретных воплощениях система бактериофагового дисплея является мультивалентной. В некоторых воплощениях пептид или полипеп- 12 018723 тид экспонируется в виде слитого белка ρΙΙΙ.
В других воплощениях способ дополнительно включает амплификацию нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид или полипептид, обладающий желаемой биологической активностью. В конкретных воплощениях нуклеиновая кислота амплифицируется путем амплификации фага, роста клеток или полимеразной цепной реакции.
В некоторых воплощениях репертуар представляет собой репертуар иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов. В конкретных воплощениях иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи. В конкретных воплощениях вариабельный домен тяжелой цепи представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина. В других воплощениях иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой вариабельный домен легкой цепи. В конкретных воплощениях вариабельный домен легкой цепи представляет собой вариабельный домен легкой цепи человеческого иммуноглобулина.
В еще одном аспекте предложен способ селекции пептида или полипептида, связывающего целевой лиганд (например, ΤΝΕΚ1) с высокой аффинностью, из репертуара пептидов или полипептидов. Способ включает получение репертуара пептидов или полипептидов, объединение этого репертуара и протеазы в условиях, подходящих для протеазной активности, и выделение пептида или полипептида, связывающих целевой лиганд.
Репертуар и протеазу, как правило, инкубируют в течение периода, составляющего по меньшей мере приблизительно 30 мин. В способе может быть использована любая желаемая протеаза, такая как одна или более чем одна из следующих: сериновая протеаза, цистеиновая протеаза, аспартатпротеазы, тиоловые протеазы, матриксная металлопротеиназа, карбоксипептидаза (например, карбоксипептидаза А, карбоксипептидаза В), трипсин, химотрипсин, пепсин, папаин, эластаза, лейкозим, панкреатин, тромбин, плазмин, катепсины (например, катепсин С), протеиназа (например, протеиназа 1, протеиназа 2, протеиназа 3), термолизин, химозин, энтеропептидаза, каспаза (например, каспаза 1, каспаза 2, каспаза 4, каспаза 5, каспаза 9, каспаза 12, каспаза 13), калпаин, фикаин, клострипаин, актинидаин, бромелаин и сепараза. В конкретных воплощениях протеаза представляет собой трипсин, эластаза или лейкозим. Протеаза может также содержаться в биологическом экстракте, биологическом гомогенате или биологическом препарате. Если желательно, способ дополнительно включает добавление ингибитора протеазы к комбинации репертуара и протеазы после завершения инкубации.
Пептид или полипептид может быть выделен на основе связывания любого желаемого целевого лиганда, такого как раскрытые здесь целевые лиганды (например, ΤΝΡΡ1). В конкретных воплощениях пептид или полипептид выделяют путем пэннинга.
В некоторых воплощениях репертуар содержит дисплейную систему. Например, система дисплея может представлять собой бактериофаговый дисплей, рибосомальный дисплей, эмульсионную компартментализацию и дисплей, дрожжевой дисплей, пуромициновый дисплей, бактериальный дисплей, плазмидный дисплей или ковалентный дисплей. Дисплейные системы связывают кодирующую функцию нуклеиновой кислоты и функциональные характеристики пептида или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой. В конкретных воплощениях дисплейная система содержит реплицируемые генетические комплексы.
В некоторых воплощениях дисплейная система содержит бактериофаговый дисплей. Например, бактериофаг может представлять собой ίά, М13, лямбда, М82 или Т7. В конкретных воплощениях система бактериофагового дисплея является мультивалентной. В некоторых воплощениях пептид или полипептид экспонируется в виде слитого белка ρΙΙΙ.
В других воплощениях способ дополнительно включает амплификацию нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид или полипептид, которые обладают желаемой биологической активностью. В конкретных воплощениях нуклеиновая кислота амплифицируется посредством фаговой амплификации, роста клеток или полимеразной цепной реакции.
В некоторых воплощениях репертуар представляет собой репертуар иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов. В конкретных воплощениях иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи. В конкретных воплощениях вариабельный домен тяжелой цепи представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина. В других воплощениях иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой вариабельный домен легкой цепи. В конкретных воплощениях вариабельный домен легкой цепи представляет собой вариабельный домен легкой цепи человеческого иммуноглобулина.
В еще одном аспекте здесь описан способ продуцирования репертуара протеазоустойчивых пептидов или полипептидов. Способ включает получение репертуара пептидов или полипептидов, объединение репертуара пептидов или полипептидов и протеазы в условиях, подходящих для активности протеазы, и выделение множества пептидов или полипептидов, обладающих желаемой биологической активностью, посредством чего продуцируется репертуар протеазоустойчивых пептидов или полипептидов.
В некоторых воплощениях репертуар и протеазу инкубируют в течение периода времени по меньшей мере приблизительно 30 мин. Например, протеаза, используемая в способе, может представлять собой одну или более чем одну из следующих: сериновая протеаза, цистеиновая протеаза, аспартатпротеа- 13 018723 зы, тиоловые протеазы, матриксная металлопротеиназа, карбоксипептидаза (например, карбоксипептидаза А, карбоксипептидаза В), трипсин, химотрипсин, пепсин, папаин, эластаза, лейкозим, панкреатин, тромбин, плазмин, катепсины (например, катепсин С), протеиназа (например, протеиназа 1, протеиназа 2, протеиназа 3), термолизин, химозин, энтеропептидаза, каспаза (например, каспаза 1, каспаза 2, каспаза 4, каспаза 5, каспаза 9, каспаза 12, каспаза 13), калпаин, фикаин, клострипаин, актинидаин, бромелаин и сепараза. В конкретных воплощениях протеаза представляет собой трипсин, эластазу или лейкозим. Протеаза может также быть представлена в биологическом экстракте, биологическом гомогенате или биологическом препарате. Если желательно, то способ дополнительно включает добавление ингибитора протеазы к комбинации репертуара и протеазы после завершения инкубации.
В некоторых воплощениях множество пептидов или полипептидов, обладающих желаемой биологической активностью, выделяют на основе связывающей активности. Например, множество пептидов или полипептидов может быть выделено на основе связывания типичного лиганда, такого как белок А, белок С или белок Ь. Связывающая активность может также представлять собой специфическое связывание с лигандом-мишенью, таким как описанный здесь лиганд. В конкретных воплощениях множество пептидов или полипептидов, обладающих желаемой биологической активностью, выделяют путем пэннинга.
В некоторых воплощениях репертуар содержит дисплейную систему.
Например, дисплейная система может представлять собой бактериофаговый дисплей, рибосомальный дисплей, эмульсионную компартментализацию и дисплей, дрожжевой дисплей, пуромициновый дисплей, бактериальный дисплей, плазмидный дисплей или ковалентный дисплей. В конкретных воплощениях система дисплея связывает кодирующую функцию нуклеиновой кислоты и функциональные характеристики пептида или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой. В конкретных воплощениях дисплейная система содержит реплицируемые генетические комплексы.
В некоторых воплощениях дисплейная система содержит бактериофаговый дисплей. Например, бактериофаг может представлять собой ίίφ М13, лямбда, М82 или Т7. В конкретных воплощениях система бактериофагового дисплея является многовалентной. В некоторых воплощениях пептид или полипептид экспонируется в виде слитого белка ρΙΙΙ.
В других воплощениях способ дополнительно включает амплификацию нуклеиновых кислот, кодирующих множество пептидов или полипептидов, обладающих желаемой биологической активностью. В конкретных воплощениях нуклеиновые кислоты амплифицируются путем фаговой амплификации, роста клеток или полимеразной цепной реакции.
В некоторых воплощениях репертуар представляет собой репертуар иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов. В конкретных воплощениях иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи. В конкретных воплощениях вариабельный домен тяжелой цепи представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина. В других воплощениях иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой вариабельный домен легкой цепи. В конкретных воплощениях вариабельный домен легкой цепи представляет собой вариабельный домен легкой цепи человеческого иммуноглобулина.
В еще одном аспекте здесь описан способ селекции из репертуара протеазоустойчивого полипептида, содержащего иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен (бЛЬ). который связывает целевой лиганд (например, ΤΝΕΚ1). В одном из воплощений способ включает получение системы фагового дисплея, содержащей репертуар полипептидов, содержащих иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, объединение системы фагового дисплея и протеазы, выбранной из группы, состоящей из эластазы, лейкозима и трипсина, в условиях, подходящих для протеазной активности, и выделение фага, экспонирующего полипептид, содержащий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, который связывает целевой лиганд.
В некоторых воплощениях протеазу используют в концентрации 100 мкг/мл, и объединенные систему фагового дисплея и протеазу инкубируют приблизительно при 37°С в течение ночи.
В некоторых воплощениях фаг, экспонирующий полипептид, содержащий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, который связывает целевой лиганд, выделяют путем связывания с указанной мишенью. В других воплощениях фаг, который экспонирует полипептид, содержащий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, который связывает целевой лиганд, выделяют путем пэннинга.
Также описан выделенный протеазоустойчивый пептид или полипептид, селектируемый или селектированный при помощи описанных здесь способов. В конкретном воплощении предложен выделенный протеазоустойчивый (например, к трипсину, эластазе, лейкозиму) иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен (например, вариабельный домен тяжелой цепи человеческого антитела, вариабельный домен легкой цепи человеческого антитела), селектируемый или селектированный при помощи описанных здесь способов.
Далее здесь описаны выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, которая кодирует протеазоустойчивый пептид или полипептид (например, устойчивый к трипсину, эластазе, или лейкозиму иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен), селектируемый или селектированный при по- 14 018723 мощи описанных здесь способов, и вектора (например, экспрессирующие вектора) и клетки-хозяева, содержащие эти нуклеиновые кислоты.
Здесь далее описан способ получения протеазоустойчивого пептида или полипептида (например, устойчивого к трипсину, эластазе или лейкозиму иммуноглобулинового единичного вариабельного домена), селектируемого или селектированного при помощи описанных здесь способов, включающий поддержание клетки-хозяина, которая содержит рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую протеазоустойчивый пептид или полипептид, в условиях, подходящих для экспрессии, посредством чего продуцируется протеазоустойчивый пептид или полипептид.
Здесь дополнительно описан протеазоустойчивый пептид или полипептид (например, устойчивый к трипсину, эластазе или лейкозиму иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен), селектируемый или селектированный при помощи описанных здесь способов, для применения в медицине (например, для терапии или диагностики). Здесь дополнительно описано применение протеазоустойчивого пептида или полипептида (например, устойчивого к трипсину, эластазе или лейкозиму иммуноглобулинового единичного вариабельного домена), селектируемого или селектированного при помощи описанных здесь способов, для изготовления лекарственного средства для лечения заболевания. Здесь дополнительно описан способ лечения заболевания, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества протеазоустойчивого пептида или полипептида (например, устойчивого к трипсину, эластазе или лейкозиму иммуноглобулинового единичного вариабельного домена), селектируемого или селектированного при помощи описанных здесь способов.
Здесь дополнительно описан диагностический набор для определения того, присутствует ли в образце ΤΝΕΚ.1 или насколько много ΤΝΕΚ.1 присутствует в образце, содержащий полипептид, иммуноглобулиновый вариабельный домен (бАЬ) или антагонист по изобретению и инструкции по применению (например, для определения присутствия и/или количества ΤΝΕΚ.1 в образце). В некоторых воплощениях набор дополнительно содержит один или более чем один вспомогательный реагент, такой как подходящий буфер или подходящий детектирующий реагент (например, детектируемое меченое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывает полипептид или бАЬ по изобретению или группировку, ассоциированную или конъюгированную с ним).
Изобретение также относится к устройству, содержащему твердую поверхность, на которой иммобилизован полипептид, антагонист или бАЬ по изобретению, таким образом, что иммобилизованный полипептид или бАЬ связывается с ΤΝΕΚ.1. Могут быть использованы любые подходящие твердые поверхности, на которых может быть иммобилизовано антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, например стекло, пластики, углеводороды (например, агарозные шарики). Если желательно, подложка может содержать или может быть модифицирована таким образом, чтобы содержать желаемые функциональные группы для облегчения иммобилизации. Устройство и/или подложка могут обладать любой подходящей формой, например формой листа, прута, ленты, пластины, слайда, шарика, гранулы, диска, геля, трубки, сферы, чипа, пластины или чашки и т.п. В некоторых воплощениях устройство представляет собой тест-полоску.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1 представляет собой иллюстрацию сайта множественного клонирования ρΌΘΜ13 (также известного как ρΌΘΜ33), который использовали для получения фаг-дисплейного репертуара.
На фиг. 2 показаны несколько гелей Νονοχ 10-20% Τποίηο с образцами бАЬ, отобранными в разные моменты времени, которые инкубировали с трипсином в концентрации 40 мкг/мл при 30°С. Образцы отбирали непосредственно перед добавлением трипсина и затем через 1, 3 и 24 ч после добавления трипсина. Белки окрашивали с помощью 1х 8итеВ1ие. Гели иллюстрируют, что и ΌΘΜ15-10, и ΌΘΜ15-26501, оба, подвергались значительному перевариванию в течение первых 3 ч инкубации с трипсином. Переваривание ΌΘΜ15-26, ΌΘΜ4-130-54 и ΌΘΜ1Η-131-511 становилось заметным только через 24 ч инкубации с трипсином.
Фиг. 3 представляет собой иллюстрацию аминокислотных последовательностей ΌΘΜ1Η-131-511 и 24 селектированных вариантов. Аминокислоты в селектированных клонах, которые отличаются от родительской последовательности, указаны (идентичные аминокислоты обозначены точками). Петли, соответствующие ΟΌΚ1 (гипервариабельный участок 1), СЭВ2 и ί.ΌΒ3. обведены рамками.
Фиг. 4 представляет собой иллюстрацию аминокислотных последовательностей ΌΘΜ4-130-54 и 27 селектированных вариантов. Аминокислоты в селектированных клонах, которые отличаются от родительской последовательности, указаны (идентичные аминокислоты обозначены точками). Петли, соответствующие СЭВЕ СЭВ2 и СОК.3, обведены рамками.
Фиг. 5 представляет собой иллюстрацию аминокислотной последовательности ΌΘΜ15-26-555 и 21 селектированного варианта. Аминокислоты в селектированных клонах, которые отличаются от родительской последовательности, указаны (идентичные аминокислоты обозначены точками). Петли, соответствующие СЭВЕ СЭВ2 и СОК.3, обведены рамками.
Фиг. 6 представляет собой иллюстрацию аминокислотной последовательности ΌΘΜ15-10 и 16 селектированных вариантов. Аминокислоты в селектированных клонах, которые отличаются от родительской последовательности, указаны (идентичные аминокислоты обозначены точками). Петли, соответст
- 15 018723 вующие СЭРЕ СЭР2 и СЭРЛ, обведены рамками.
Фиг. 7Λ-7Ό представляют собой кривые В1Асоге, показывающие связывание родительского бАЬ, ΌΘΜ1Η-131-511 (фиг. 7А), и трех вариантов бАЬ, ΌΘΜ1Η-131-203 (фиг. 7В), ΌΘΜ1Η-131-204 (фиг. 7С) и ΌΘΜ1Η-131-206 (фиг. 7Ό), с иммобилизованным ΤΝΡΚ.1 после инкубации с различными концентрациями трипсина (варьирующими от 0 до 100 мкг/мл) в течение ночи при 37°С. Результаты демонстрируют, что все три варианта более устойчивы, чем родительское антитело, к протеолизу при высоких концентрациях трипсина (100 мкг/мл).
Фиг. 8А-8С представляют собой кривые В1Асоге, показывающие связывание бАЬ ΌΘΜ1Η-131-511 (фиг. 8А), ΌΘΜ1Η-131-202 (фиг. 8В) и ΌΘΜ1Η-131-206 (фиг. 8С) с иммобилизованным ΤΝΡΚ.1 после инкубации с эластазой и лейкозимом в течение ночи. Эти бАЬ продемонстрировали повышенную устойчивость к протеолизу по сравнению с родительским антителом против эластазы и лейкозима.
На фиг. 9 показаны два геля 4-12% Nονеx Βίδ-Τήδ с образцами бАЬ ΌΘΜ1Η-131-511, ΌΘΜ1Η-131203, ΌΘΜ1Η-131-204, ΌΘΜ1Η-131-206, ΌΘΜ1Η-131-54, ΌΘΜ1Η-131-201 и ΌΘΜ1Η-131-202 перед инкубацией с трипсином, и образцами после инкубации с 100 мкг/мл трипсина в течение 1, 3 и 24 ч.
Фиг. 10А-10С представляют собой кривые В1Асоге, показывающие связывание ΌΘΜ4-130-54 (фиг. 10А), ΌΘΜ4-130-201 (фиг. 10В) и ΌΘΜ4-130-202 (фиг. 10С) с иммобилизованным слитым белком 1Ь1В1 после инкубации с различными концентрациями трипсина (варьирующими от 0 до 100 мкг/мл) в течение ночи при 37°С. Результаты демонстрируют, что оба варианта более устойчивы, чем родительское антитело, к протеолизу при высоких концентрациях трипсина.
Фиг. 11А-11С представляют собой кривые В1Асоге, показывающие связывание ΌΘΜ4-130-54 (фиг. 11А), ΌΘΜ4-130-201 (фиг. 11В) и ΌΘΜ4-130-202 (фиг. 11С) с иммобилизованным слитым белком 1Ь1В1 после инкубации с эластазой и лейкозимом в течение ночи. Эти бАЬ продемонстрировали повышенную устойчивость к протеолизу по сравнению с родительским антителом против обеих тестируемых протеаз.
Фиг. 12 представляет собой иллюстрацию аминокислотной последовательности ΌΘΜ15-26-555 и 6 вариантов. Аминокислоты, которые отличаются от родительской последовательности, в селектированных клонах указаны (идентичные аминокислоты обозначены точками).
Фиг. 13А и 13В представляют собой кривые В1Асоге, показывающие связывание родительского бАЬ, ΌΘΜ15-26-555 (фиг. 13А), и наиболее протеазоустойчивого варианта, ΌΘΜ15-26-593 (фиг. 13В), с иммобилизованным УЕСЕ. Родительское антитело и вариант сравнивали на В1Асоге в отношении связывания с 11УЕСЕ (УЕСЕ человека) при концентрации бАЬ 100 нМ после инкубации с трипсином в концентрации 200 мкг/мл. Реакцию осуществляли в течение 3 ч или 24 ч при 37°С. Результаты демонстрируют, что вариант более устойчив, чем родительское антитело, к протеолизу после 24-часовой обработки трипсином.
Фиг. 14 представляет собой график, показывающий влияние обработки трипсином на связывание вариантов ΌΘΜ15-26-555 с 11УЕСЕ. Результаты ясно демонстрируют, что все варианты более устойчивы, чем родительское антитело (ΌΘΜ15-26-555), к протеолизу после 24-часовой обработки трипсином.
На фиг. 15 показаны два геля Nονеx 10-20% Τπαικ, на которые наносили по 15 мкг обработанных и необработанных образцов ΌΘΜ15-26-555 или ΌΘΜ15-26-593. Образцы отбирали непосредственно перед добавлением трипсина и затем через 1, 3 и 24 ч после добавления трипсина. Белки окрашивали с помощью 1х 8игеВ1ие. Гели иллюстрируют, что профиль устойчивости к трипсину для ΌΘΜ15-26-593 отличается от профиля, продемонстрированного В1Асоге экспериментом.
Фиг. 16 представляет собой иллюстрацию аминокислотной последовательности ΌΘΜ15-10 и варианта, ΌΘΜ15-10-11. Аминокислоты, которые в этом варианте отличаются от родительской последовательности, указаны (идентичные аминокислоты обозначены точками).
Фиг. 17А и 17В представляют собой кривые В1Асоге, показывающие связывание родительского антитела ΌΘΜ15-10 (фиг. 17А), и варианта, ΌΘΜ15-10-11 (фиг. 17В), с иммобилизованным УЕСЕ. Родительское антитело и вариант сравнивали на В1Асоге в отношении связывания с 11УЕСЕ при концентрации бАЬ 100 нМ после инкубации с трипсином в концентрации 200 мкг/мл. Реакцию осуществляли в течение 1, 3 и 24 ч при 37°С. Результаты демонстрируют, что вариант более устойчив, чем родительское антитело, к протеолизу после 24-часовой обработки трипсином.
На фиг. 18 показаны два геля Nονеx 10-20% Τπαικ, на которые наносили по 15 мкг образцов ΌΘΜ15-10 и ΌΘΜ15-10-11. Образцы отбирали непосредственно перед добавлением трипсина и затем через 1, 3 и 24 ч после добавления трипсина. Белки окрашивали с помощью 8игеВ1ие (1х). Результаты демонстрируют, что связывающая активность, обнаруженная в В1Асоге исследовании, непосредственно отражает целостность белка.
Фиг. 19А-19Б иллюстрируют нуклеотидные последовательности нескольких нуклеиновых кислот, кодирующих бАЬ, которые представляют собой варианты ΌΘΜ1Η-131-511 или ΌΘΜ4-130-54. Нуклеотидные последовательности кодируют аминокислотные последовательности, представленные соответственно на фиг. 3 и 4.
Фиг. 20А-20Е иллюстрируют нуклеотидные последовательности нескольких нуклеиновых кислот, кодирующих бАЬ, которые представляют собой варианты ΌΘΜ15-26-555 или ΌΘΜ15-10. Нуклеотидные
- 16 018723 последовательности кодируют аминокислотные последовательности, представленные соответственно на фиг. 5 и 6.
На фиг. 21 показана карта вектора ρΌΘΜ38.
На фиг. 22 показан гель (ЬаЬсНр) с белками ΌΘΜ10-53-474 и ΌΘΜ15-26-593, обработанными трипсином при соотношении бАЬ:трипсин 25:1 при 30°С в различные моменты времени. Стрелки указывают на полноразмерный белок.
На фиг. 23 представлены кривые гель-фильтрации (8ЕС), демонстрирующие высокий уровень чистоты, полученный для каждого образца после очистки посредством ММС-хроматографии, затем анионного обмена. УФ контролировали при 225 нм и через колонку пропускали 1х РВ8 (забуференный фосфатом физиологический раствор) с 10% этанола (об./об.). Процентное содержание мономера рассчитывали посредством интегрирования площади пика с учетом фона.
На фиг. 24 представлены данные по стабильности к протеазам для ΌΘΜ1Η-131-511, ΌΘΜ1Η-131202 и ΌΘΜ1Η-131-206.
На фиг. 25 представлены результаты 8ЕС, которые иллюстрируют данные по стабильности ΌΘΜ1Η-131-202, ΌΘΜ1Η-131-206 и ΌΘΜ1Η-131-511 в течение 14 суток в буфере Бриттона-Робинсона при 37 и 50°С. Концентрация белка для всех бАЬ составляла 1 мг/мл. 8ЕС использовали для определения того, произошли ли какие-либо изменения в белке во время теплового стресса и в количестве мономера, остающегося в растворе, по сравнению с образцом на момент времени 0 (Т0).
На фиг. 26 А-Ι показаны 8ЕС кривые, демонстрирующие влияние теплового стресса (37 и 50°С) на ΌΘΜ1Η-131-511 (А-С), -202 (Ό-Ε) и -206 (С-Ι). Также показан процент мономера, остающегося в растворе, относительно Т=0 в заданный момент времени.
На фиг. 27 показан ΙΕΕ (изоэлектрофокусирование) анализ ΌΘΜ1Η-131-202, ΌΘΜ1Η-131-206 и ΌΘΜ1Η-131-511 на 24, 48 ч и 7-е и 14-е сутки теплового стресса. Образцы инкубировали либо при 37, либо при 50°С в буфере Бриттона-Робинсона.
Фиг. 28: КВА (гесерЮг Ьтбтд аззау, анализ связывания с рецептором) с ΤΝΕΚ-1, демонстрирующий влияние 14-суточной инкубации ΌΘΜ1Η-131-202, ΌΘΜ1Η-131-206 и ΌΘΜ1Η-131-511 при 50°С. Концентрацию белка считали равной 1 мг/мл. Также показано отрицательное контрольное бАЬ (имитация (битту) УН), которое не связывалось с антигеном.
На фиг. 29 проиллюстрированы эффекты хранения А: ΌΘΜ1Η-131-202, В: ΌΘΜ1Η-131-206 и С: ΌΘΜ1Η-131-511 в концентрации примерно 100 мг/мл в течение 7 суток в буфере Бриттона-Робинсона при 4°С. УФ контролировали при 280 нм.
На фиг. 30 показаны данные тестирования ΌΘΜ1Η-131-202, ΌΘΜ1Η-131-206 и ΌΘΜ1Η-131-511 с использованием небулайзеров Рап Е-По\у и ЬС+. Концентрация белка в каждом случае составляла 5 мг/мл в буфере Бриттона-Робинсона.
На фиг. 31 проиллюстрированы относительные процентные изменения концентраций мономера в процессе распыления ΌΘΜ1Η-131-202, ΌΘΜ1Η-131-206 и ΌΘΜ1Η-131-511 в буфере Бриттона-Робинсона при 5 мг/мл.
На фиг. 32 показаны 8ЕС кривые для ΌΘΜ1Η-131-206 и ΌΘΜ1Η-131-511 в буфере БриттонаРобинсона после распыления из Рап ЬС+.
На фиг. 33 показаны 8ЕС кривые для ΌΘΜ1Η-131-206 в процессе распыления в течение 1 ч при 40 мг/мл в РВ8. Белки, находящиеся как в колпачке небулайзера, так и в аэрозоле, обладают высокой устойчивостью к эффектам сдвига и теплового стресса, которым может подвергаться бАЬ при распылении.
На фиг. 34 показаны кривые скорости седиментации для каждого из трех основных белков (ΌΘΜ1Η-131-206, ΌΘΜ1Η-131-511 и ΌΘΜ1Η-131-202). Бимодальный пик, наблюдаемый для образца с более низкой концентрацией, ΌΘΜ1Η-131-206, в этом случае представляет собой артефакт вследствие утечки образца из ячейки.
На фиг. 35 показано влияние буфера и устройства на размер капли при распылении С8К1995056А (ΌΘΜ1Η-131-511).
Фиг. 36: стабильность С8К1995056А (ΌΘΜ1Η-131-511) после распыления в различных устройствах, оцениваемая по образованию димеров, как измерено с использованием 8ЕС.
На фиг. 37 показаны данные тестирования С8К1922567А (202), С8К1995057А (206) и С8К1995056А (511) с использованием небулайзеров Рап Е-По\у и ЬС+. А) тестирование в буфере Бриттона-Робинсона, В) тестирование в ПЭГ1000/сахарозном буфере.
На фиг. 38 изображена кривая зависимости от дозы ΤΝΕ-α, полученная в анализе связывания с рецептором ΤΝΕΚ1 человека. Каждый образец тестировали в четырех повторах.
На фиг. 39 показано ингибирование посредством С8К1922567А (ΌΘΜ1Η-131-202), С8К1995057А (ΌΘΜ1Η-131-206) и С8К1995056А (ΌΘΜ1Η-131-511) в анализе связывания с рецептором ΤΝΕΚ1 человека. Каждый образец тестировали в четырех повторах.
На фиг. 40 проиллюстрирована эффективность бАЬ ΌΘΜ15-26 и ΌΘΜ15-26-593 в КВА с УЕСБ.
На фиг. 41 показаны фармакокинетические данные для ΌΜ81529 (ΌΘΜ15-26-593) и ΌΜ81545 (ΌΘΜ15-26-501) после однократного в/в (внутривенного) введения болюсной дозы крысам в концентра
- 17 018723 ции 5 мг/мг.
На фиг. 42а показан §ЕС-МАЬЬ8 (гель-хроматография/многоугловое лазерное светорассеяние) анализ слитой конструкции ИМ81529Е-С (слитой конструкции ΌΘΜ15-26-593 Ес), подтверждающий мономерные свойства. Показаны две разные партии, которые демонстрируют похожие свойства в отношении показателя преломления (т.е. концентрации; пунктирные линии) и светорассеяния (сплошные линии). Линия, отмеченная стрелкой, показывает расчет молекулярной массы.
На фиг. 42Ь показан АИС (аналитическое ультрацентрифугирование) анализ слитой конструкции ЭМ81529 Ес (слитой конструкции ЭОМ15-26-593 Ес), подтверждающий мономерные свойства. Одну партию вещества тестировали в трех разных концентрациях, приблизительно равных 0,2, 0,5 и 1,0 мг/мл в РВ8-буфере. Анализ скорости седиментации подтвердил, что молекулярная масса составляет приблизительно 80 кДа.
На фиг. 43 показаны И8С (дифференциальная сканирующая калориметрия) кривые для ЭМ81529 (ИОМ15-26-593) и ИОМ15-26-501.
На фиг. 44 представлены данные ЕЬ18А (твердофазного иммуноферментного анализа) связывания с УЕСЕ для ЭМ81529 (ЭОМ15-26-593) до и после 10 циклов замораживания-оттаивания для двух разных партий вещества.
На фиг. 45 показан 8ЕС-профиль устойчивости ЭОМ15-26-593 до и после 10 циклов замораживания-оттаивания.
На фиг. 46 проиллюстрированы результаты ускоренного исследования стабильности для слитой конструкции ЭМ81529 (слитой конструкции ЭОМ15-26-593 Ес); где связывание в ЕЬ18А демонстрирует активность через 7 суток инкубации при показанной температуре.
На фиг. 47А показана стабильность ЭМ81529 (ЭОМ15-26-593) у яванского макака через 14 и 15 суток инкубации при 37°С.
На фиг. 47В показана стабильность ЭМ81529 (ЭОМ15-26-593) в сыворотке человека через 14 и 15 суток инкубации при 37°С.
На фиг. 48 показана эффективность бАЬ ЭОМ15-26 и ЭОМ15-26-593 в виде Ес слияний (ЭМ81564 и 1529 соответственно) в КВА с УЕСЕ.
На фиг. 49 проиллюстрировано ингибирование пролиферации клеток НИУЕС (эндотелиальные клетки пупочной вены человека) слитой конструкцией ЭМ81529 (слитой конструкцией ЭОМ15-26-593 Ес).
Фиг. 50: карта вектора рИот33.
На фиг. 51 изображены последовательности (аминокислотная и нуклеотидная) бАЬ, связывающихся с сывороточным альбумином.
Подробное описание изобретения
Изобретение раскрыто в данном описании со ссылкой на воплощения, что делает возможным составление ясного и четкого описания. Предполагается и должно быть очевидным, что данные воплощения можно различным образом комбинировать или разделять без отклонения от сущности изобретения.
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют такое же значение, что и обычно понимаемое специалистом в данной области техники (например, в клеточной культуре, молекулярной генетике, химии нуклеиновых кислот, способах гибридизации и биохимии). Для молекулярных, генетических и биохимических способов используются стандартные способы (в общем см. 8атЬгоок с1 а1., Мо1еси1аг С1оп1пд: А ЬаЬогайгу Мапиа1, 2б еб. (1989), Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬогайгу Рге88, Со1б 8ргтд НагЬог, Ν.Υ. и Аи8иЬе1 е1 а1., 81юг1 РгоФсоИ ίη Мо1еси1аг Вю1оду (1999), 4‘ь Еб, бо1т ^УИеу & 8оп§, 1пс., включенные здесь путем ссылки) и химические способы.
Используемый здесь антагонист рецептора фактора некроза опухоли 1 (ΤΝΡΚ1) или антагонист ΤΝΡΚ1 и т.п. относится к агенту (например, молекуле, соединению), который связывается с ΤΝΡΚ1 и может ингибировать функцию (одну или более чем одну) ΤΝΡΚ1. Например, антагонист ΤΝΡΚ1 может ингибировать связывание ΤΝΡα с ΤΝΡΚ1 и/или ингибировать передачу сигнала, опосредованную через ΤΝΡΚ1. Соответственно, опосредованные ΤΝΡΚ1 процессы и клеточные ответы (например, индуцированная ΤΝΡα клеточная гибель в стандартном анализе цитотоксичности на клетках Ь929) могут ингибироваться антагонистом ΤΝΒΚ1.
Как использовано в данном изобретении, пептид относится к аминокислотам в количестве от примерно двух до примерно 50, которые соединены вместе посредством пептидных связей.
Как использовано в данном изобретении, полипептид относится к по меньшей мере примерно 50 аминокислотам, которые соединены вместе пептидными связями. В большинстве случаев полипептиды имеют третичную структуру и сворачиваются в функциональные домены.
Как использовано в данном изобретении, пептид или полипептид (например, однодоменное антитело (бАЬ)), который является устойчивым к расщеплению протеазой, по существу, не расщепляется протеазой при инкубации с данной протеазой в условиях, подходящих для протеазной активности. Полипептид (например, бАЬ), по существу, не расщепляется, когда не более чем примерно 25%, не более чем примерно 20%, не более чем примерно 15%, не более чем примерно 14%, не более чем примерно 13%, не
- 18 018723 более чем примерно 12%, не более чем примерно 11%, не более чем примерно 10%, не более чем примерно 9%, не более чем примерно 8%, не более чем примерно 7%, не более чем примерно 6%, не более чем примерно 5%, не более чем примерно 4%, не более чем примерно 3%, не более чем примерно 2%, не более чем примерно 1% белка расщепляется протеазой, или по существу никакое количество белка не расщепляется протеазой при инкубации с протеазой в течение примерно 1 ч при температуре, подходящей для протеазной активности. Например, при 37 или 50°С. Расщепление белка можно оценивать с использованием любого подходящего способа, например с использованием 8Ό8-ΡΆ6Ε (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) или функционального анализа (например, связывания с лигандом), как описано в данном патенте.
Как использовано в данном изобретении, дисплейная система относится к системе, в которой коллекция полипептидов или пептидов доступна для селекции на основании желаемой характеристики, такой как физическая, химическая или функциональная характеристика. Дисплейная система может представлять собой подходящий репертуар полипептидов или пептидов (например, в растворе, иммобилизованном на подходящей подложке). Дисплейная система также может представлять собой систему, которая использует клеточную экспрессирующую систему (например, экспрессию библиотеки нуклеиновых кислот, например, в трансформированных, инфицированных, трансфицированнных или трансдуцированных клетках и экспонирование кодируемых полипептидов на поверхности этих клеток) или бесклеточную экспрессирующую систему (например, эмульсионную компартментализацию и дисплей). Предпочтительные дисплейные системы связывают кодирующую функцию нуклеиновой кислоты и физические, химические и/или функциональные характеристики полипептида или пептида, кодируемого данной нуклеиновой кислотой. Если применяют такую дисплейную систему, то можно осуществлять селекцию полипептидов или пептидов, имеющих желаемую физическую, химическую и/или функциональную характеристику, и можно легко выделить или извлечь нуклеиновую кислоту, кодирующую селектированный полипептид или пептид. В данной области техники известен ряд дисплейных систем, которые связывают кодирующую функцию нуклеиновой кислоты и физические, химические и/или функциональные характеристики полипептида или пептида, например бактериофаговый дисплей (фаговый дисплей, например фагмидный дисплей), рибосомный дисплей, эмульсионная компартментализация и дисплей, дрожжевой дисплей, пуромициновый дисплей, бактериальный дисплей или плазмидный дисплей, ковалентный дисплей и т.п. (см., например, ЕР 0436597 (Оуах), патент США № 6172197 (МсСаГГейу е! а1.), патент США № 6489103 (СпГППъ е! а1.)).
Как использовано в данном изобретении, репертуар относится к коллекции полипептидов или пептидов, которые характеризуются вариабельностью аминокислотной последовательности. Индивидуальные члены репертуара могут иметь общие признаки, такие как общие структурные признаки (например, общую коровую структуру) и/или общие функциональные признаки (например, способность связываться с общим лигандом (например, типичным лигандом или целевым лигандом, ΤΝΡΚ.1)).
Как использовано в данном изобретении, термин функциональный описывает полипептид или пептид, имеющий такую биологическую активность, как специфическая связывающая активность. Например, термин функциональный полипептид включает в себя антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с целевым антигеном посредством своего антигенсвязывающего сайта.
Как использовано в данном изобретении, типичный лиганд относится к лиганду, который связывается со значительной частью функциональных членов (например, по существу всеми функциональнами членами) заданного репертуара. Типичный лиганд (например, общий типичный лиганд) может связываться со многими членами заданного репертуара, даже несмотря на то, что эти члены могут не обладать специфичностью связывания в отношении общего целевого лиганда. В общем случае присутствие функционального сайта связывания с типичным лигандом на полипептиде (на что указывает способность связываться с типичным лигандом) указывает на то, что полипептид надлежащим образом свернут и функционален. Подходящие примеры типичных лигандов включают суперантигены, антитела, которые связываются с эпитопом, экспрессируемым на значительной части функциональных членов репертуара, и т.п.
Суперантиген представляет собой термин данной области техники, который относится к типичным лигандам, взаимодействующим с членами иммуноглобулинового суперсемейства в сайте, отличающемся от сайтов связывания с целевым лигандом, расположенных на этих белках. Примерами суперантигенов являются стафилококковые энтеротоксины, которые взаимодействуют с Т-клеточными рецепторами. Суперантигены, связывающиеся с антителами, включают белок С, который связывается с константной областью 1дС (В_)огск апб КгопуаЛ, 1. 1ттипо1., 133: 969 (1984)); белок А, который связывается с константной областью 1дС и Ун-доменами (Рогкдгеп апб 8)ос.|Ш51. 1. 1ттипо1., 97: 822 (1966)); и белок Ь, который связывается с У|-доменами (В_)огск, 1. 1ттипо1., 140: 1194 (1988)).
Как использовано в данном изобретении, целевой лиганд относится к лиганду, который специфически или селективно связывается полипептидом или пептидом. Например, если полипептид представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, то целевой лиганд может представлять собой любой желаемый антиген или эпитоп. Связывание с целевым антигеном зависит от функциональности данного полипептида или пептида.
- 19 018723
Как оно использовано здесь, антитело относится к 1дО, 1дМ, 1дЛ, Ι§ϋ или 1дЕ или фрагменту (такому как ЕаЬ, Е(аЬ')2, Εν, связанный дисульфидными связями Εν, κοΕν, мультиспецифическое антитело в закрытой конформации, связанный дисульфидными связями κοΕν, диатело), происходящему из любого вида, в природе продуцирующего антитело, или созданному при помощи технологии рекомбинантной
ДНК; выделенное из сыворотки крови, В-клеток, гибридом, трансфектом, дрожжей или бактерий.
Как использовано в данном изобретении, формат антитела относится к любой подходящей полипептидной структуре, в которую может быть инкорпорирован один или более вариабельных доменов антитела с тем, чтобы придать данной структуре специфичность связывания с антигеном. В данной области техники известен ряд подходящих форматов антител, таких как химерные антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела, одноцепочечные антитела, биспецифические антитела, тяжелые цепи антител, легкие цепи антител, гомодимеры и гетеродимеры тяжелых цепей и/или легких цепей антител, антигенсвязывающие фрагменты любого из перечисленного выше (например, Εν-фрагмент (например, одноцепочечный Εν (κοΕν), связанный дисульфидной связью Εν), ЕаЬ-фрагмент, ЕаЬ'-фрагмент, Р(аЬ')2-фрагмент), единичный вариабельный домен антитела (например, бЛЬ, Ун, Унн, Уь) и модифицированные версии любого из перечисленного выше (например, модифицированные посредством ковалентного присоединения полиэтиленгликоля или другого подходящего полимера или гуманизированного У||||).
Фраза иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен относится к вариабельному домену антитела (Ун, Унн, Уь), специфически связывающемуся с антигеном или эпитопом независимо от других У-областей или доменов. Иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен может быть представлен в формате (например, гомо- или гетеромультимера) с другими вариабельными областями или вариабельными доменами, где другие области или домены не требуются для связывания антигена с единичным иммуноглобулиновым вариабельным доменом (т.е. когда иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен связывается с антигеном независимо от дополнительных вариабельных доменов). Однодоменное антитело или бЛЬ представляет собой то же, что и иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, как этот термин используется в данном изобретении. Иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой то же самое, что и единичный иммуноглобулиновый вариабельный домен, как этот термин используется здесь. Иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен в одном воплощении представляет собой вариабельный домен антитела человека, но также включает единичные вариабельные домены антител от других видов, как, например, Унн бЛЬ грызунов (например, как описано в \УО 00/29004, содержание которой включено в данное описание во всей своей полноте посредством ссылки), усатых акул и верблюжьи Унн бЛЬ. Верблюжьи Унн представляют собой полипептиды иммуноглобулинового единичного вариабельного домена, которые происходят из видов, включающих верблюда, ламу, альпаку, дромадера и гуанако, которые продуцируют антитела, состоящие из тяжелых цепей, по своей природе лишенные легких цепей.
Домен представляет собой свернутую белковую структуру, сохраняющую свою третичную структуру независимо от остальной части белка. В большинстве случаев домены ответственны за отдельные функциональные свойства белков и во многих случаях могут быть добавлены, удалены или перенесены в другие белки без потери функции оставшейся части белка и/или домена. Единичный вариабельный домен антитела представляет собой свернутый полипептидный домен, содержащий последовательности, характерные для вариабельных доменов антител. Следовательно, он включает полные вариабельные домены антител и модифицированные вариабельные домены, например в которых одна или более петель заменены на последовательности, не характерные для вариабельных доменов антител, или вариабельные домены антител, которые укорочены или содержат Ν- или С-концевые удлиняющие сегменты, а также свернутые фрагменты вариабельных доменов, которые сохраняют, по меньшей мере, связывающую активность и специфичность полноразмерного домена.
Термин библиотека относится к смеси гетерогенных полипептидов или нуклеиновых кислот. Библиотека состоит из членов, каждый из которых имеет единичную полипептидную или нуклеиновокислотную последовательность. До некоторой степени библиотека является синонимом репертуару. Различия в последовательностях среди членов библиотеки ответственны за разнообразие, представленное в этой библиотеке. Библиотека может принимать форму простой смеси полипептидов или нуклеиновых кислот или может быть в форме микроорганизмов или клеток, например бактерий, вирусов, клеток животных и растений и т.п., трансформированных с использованием библиотеки нуклеиновых кислот. В одном воплощении каждый индивидуальный микроорганизм или клетка содержит только один член библиотеки или ограниченное их количество. В одном воплощении нуклеиновые кислоты инкорпорированы в экспрессирующие векторы для того, чтобы способствовать экспрессии полипептидов, кодируемых данными нуклеиновыми кислотами. Следовательно, в одном аспекте библиотека может принимать форму популяции организмов-хозяев, при этом каждый организм содержит одну или более копий экспрессирующего вектора, содержащего единичный член библиотеки в форме нуклеиновой кислоты, которая может быть экспрессирована с целью получения соответствующего ей полипептидного члена. Таким образом, популяция организмов-хозяев имеет возможность кодировать большой репертуар различающихся полипептидов.
- 20 018723
Универсальный каркас представляет собой последовательность каркаса одиночного антитела, соответствующую областям антитела, консервативным в последовательности, как определено КаЬа! (8едиепсек ο£ РгсИепъ ο£ Iттиηο1οд^са1 1п1егек1, И8 ЭераПтеп! ο£ НеаНЪ апб Нитап 8егу1се§, 1991), или соответствующую репертуару или структуре иммуноглобулинов зародышевой линии человека, как определено в С1ю11на апб Ьекк (1987), 1. Μο1. Вю1. 196: 910-917. В библиотеках и репертуарах могут использоваться одиночный каркас или набор таких каркасов, в отношении которых обнаружено, что они допускают получение производных по сути с любой специфичностью связывания посредством внесения изменений только в гипервариабельные участки.
Используемый здесь термин доза относится к количеству лиганда, вводимому субъекту одновременно (разовая доза), или в течение двух или более чем двух введений в течение определенного промежутка времени.
Например, доза может относиться к количеству лиганда (например, лиганда, содержащего иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, связывающий целевой антиген), вводимому субъекту в течение суток (24 ч) (суточная доза), двух суток, одной недели, двух недель, трех недель или одного или более чем одного месяца (например, путем разового введения, или путем двух или более чем двух введений). Интервал между дозами может представлять собой любое желаемое количество времени.
Фраза период полувыведения представляет собой период времени, в течение которого концентрация лиганда (например, бАЬ, полипептида или антагониста) в сыворотке крови уменьшается на 50% ш νίνο, например вследствие деградации лиганда и/или клиренса или разрушения лиганда при помощи природных механизмов. Лиганды по изобретению могут быть стабилизированы ш νίνο, и период их полувыведения увеличивается путем связывания с молекулами, которые устойчивы к деградации и/или клиренсу, или разрушению. Типично, такие молекулы представляют собой природные белки, которые сами обладают длительным периодом полувыведения ш νίνο. Период полувыведения лиганда увеличивается в том случае, если его функциональная активность сохраняется ш νίνο в течение более длительного периода, чем у похожего лиганда, который не специфичен в отношении молекулы, увеличивающей период полувыведения. Например, лиганд, специфический в отношении НА8 (человеческого сывороточного альбумина), и молекулу-мишень сравнивают с тем же лигандом, у которого специфичность в отношении Н8А отсутствует, то есть он не связывается с НА8, но связывается с другой молекулой. Например, он может связываться с третьей мишенью на клетке. Типично, период полувыведения увеличивается на 10, 20, 30, 40, 50 или более чем 50%. Возможны увеличения периода полувыведения в диапазоне 2х, 3х, 4х, 5х, 10х, 20х, 30х, 40х, 50х или более чем 50х. Альтернативно или дополнительно возможно увеличение периода полувыведения в диапазоне 30х, 40х, 50х, 60х, 70х, 80х, 90х, 100х, 150х.
Используемый здесь термин гидродинамический размер относится к кажущемуся размеру молекулы (например, белковой молекулы, лиганда) на основе диффузии молекулы через водный раствор. Диффузия или движение белка через раствор может быть обработано для выведения кажущегося размера белка, где размер приводится в виде радиуса Стокса или гидродинамического радиуса белковой частицы. Гидродинамический размер белка зависит от массы и формы (конформации) так, что два белка, обладающие одинаковой молекулярной массой, могут обладать отличающимися гидродинамическими размерами на основе общей конформации белка.
Использованный здесь термин конкурирует означает, что связывание первой мишени с ее штатным целевым связывающим доменом ингибируется в присутствии второго связывающего домена, специфического в отношении указанной когнатной мишени. Например, связывание может быть ингибировано стерически, например путем физического блокирования связывающего домена, или путем изменения структуры или окружения связывающего домена таким образом, что его аффинность или авидность в отношении мишени уменьшается (см. \УО 2006038027 в отношении подробной информации относительно того, как осуществлять конкурентные ЕЫ8А и конкурентные эксперименты В|аС'оге для определения конкуренции между первым и вторым связывающими доменами).
Расчеты гомологии или идентичности, или близости между двумя последовательностями (термины здесь используются взаимозаменяемо) осуществляют следующим образом. Последовательности выравнивают в целях оптимального сравнения (например, могут быть введены разрывы в одну или обе первую и вторую аминокислотную или нуклеиново-кислотную последовательности для оптимального выравнивания, а для сравнительных целей негомологичными последовательностями можно пренебречь). В одном воплощении длина референсной последовательности, выравненной для сравнительных целей, составляет по меньшей мере 30%, или по меньшей мере 40%, или по меньшей мере 50%, или по меньшей мере 60%, или по меньшей мере 70, 80, 90, 100% длины референсной последовательности. Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих аминокислотных положениях или нуклеотидных положениях. Если положение в первой последовательности занято тем же аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и соответствующее положение во второй последовательности, тогда молекулы идентичны по этому положению (как использовано в данном описании, аминокислотная гомология или гомология нуклеиновой кислоты эквивалентна аминокислотной идентичности или идентичности нуклеиновой кислоты). Процент идентичности между двумя последовательно
- 21 018723 стями есть функция количества идентичных положений, общих для этих последовательностей, с учетом количества разрывов и длины каждого разрыва, которые необходимы для введения с целью оптимального выравнивания двух последовательностей. Выравнивания аминокислотной и нуклеотидной последовательности и их гомология, сходство или идентичность, как определено в данном описании, могут быть проведены и определены с использованием алгоритма для последовательностей ΒΕΑ8Τ 2 8сс.|испсс5. используя параметры по умолчанию СГаШкоуа, Т.А. с1 а1., ΕΕΜ8 М1сгоЬю1. Ьей, 174: 187-188 (1999)).
Способы селекции
Изобретение в одном из воплощений относится к полипептидам и бАЬ, селектируемым при помощи способа селекции протеазоустойчивых пептидов и полипептидов, обладающих желаемой биологической активностью. Два селективных критерия отбора используют в способе для обеспечения эффективного процесса селекции полипептидов, которые являются высокостабильными и устойчивыми к деградации протеазой и которые обладают желаемой биологической активностью. Как здесь описано, протеазоустойчивые пептиды и полипептиды, как правило, сохраняют биологическую активность. Наоборот, пептиды и полипептиды, чувствительные к протеазе, расщепляются или разрушаются протеазой в описанных здесь способах, и таким образом, утрачивают свою биологическую активность. Соответственно, протеазоустойчивые пептиды или полипептиды, как правило, отбирают на основании их биологической активности, такой как связывающая активность.
Описанные здесь способы обеспечивают несколько преимуществ. Например, как здесь раскрыто и примеры чего здесь приведены, вариабельные домены, антагонисты, пептиды или полипептиды, отобранные по их устойчивости к протеолитической деградации одной из протеаз (например, трипсином), также устойчивы к деградации другими протеазами (например, эластазой, лейкозимом). В одном из воплощений устойчивость к протеазе коррелирует с более высокой температурой плавления (Гт) пептида или полипептида. Более высокие температуры плавления представляют собой показатели более стабильных вариабельных доменов антагонистов, пептидов и полипептидов. Устойчивость к деградации протеазой также коррелирует в одном из воплощений с высокоаффинным связыванием с лигандами-мишенями. Таким образом, описанные здесь способы обеспечивают эффективный путь селекции, выделения и/или извлечения вариабельных доменов, антагонистов, пептидов, полипептидов, обладающих желаемой биологической активностью, и которые хорошо подходят для терапевтического и/или диагностического применения ίη νίνο, поскольку они устойчивы к протеазе и стабильны. В одном из воплощений устойчивость к протеазе коррелирует с улучшенной РК (фармакокинетикой), например улучшением по сравнению с вариабельным доменом, антагонистом, пептидом или полипептидом, который не протеазоустойчивым. Улучшенная РК может представлять собой улучшенную АИС (площадь под кривой) и/или улучшенный период полувыведения. В одном из воплощений устойчивость к протеазе коррелирует с улучшенной стабильностью вариабельного домена, антагониста, пептида или полипептида к сдвигу и/или тепловому стрессу, и/или уменьшенной склонности к агрегации при распылении, например улучшение по сравнению с вариабельным доменом, антагонистом, пептидом или полипептидом, который не является протеазоустойчивым. В одном из воплощений устойчивость к протеазе коррелирует с улучшенной стабильностью при хранении, например улучшением по сравнению с вариабельным доменом, антагонистом, пептидом или полипептидом, который не является протеазоустойчивым. В одном из аспектов предложено одно, два, три, четыре или все преимущества, где преимущества представляют собой устойчивость к деградации протеазой, более высокую 1т и высокоаффинное связывание с целевым лигандом.
В одном из аспектов предложен способ селекции, выделения и/или извлечения из библиотеки или репертуара пептидов и полипептидов (например, дисплейной системы) пептида или полипептида, устойчивого к деградации протеазой (например, одной или более чем одной из протеаз). В одном из воплощений способ представляет собой способ селекции, выделения и/или извлечения из библиотеки или репертуара пептидов и полипептидов (например, дисплейной системы) полипептида, устойчивого к деградации протеазой (например, одной или более чем одной из протеаз). Как правило, способ включает получение библиотеки или репертуара пептидов или полипептидов, объединение этих библиотеки или репертуара с протеазой (например, трипсином, эластазой, лейкозимом, панкреатином, слюной) в условиях, подходящих для активности протеазы, и селекцию, выделение и/или извлечение пептида или полипептида, устойчивого к деградации протеазой и обладающего желаемой биологической активностью. Пептиды или полипептиды, деградирующие под действием протеазы, как правило, обладают уменьшенной биологической активностью или утрачивают свою биологическую активность вследствие активности протеазы. Соответственно, пептиды или полипептиды, устойчивые к деградации протеазой, могут быть селектированы, выделены и/или извлечены с использованием способа на основании их биологической активности, такой как связывающая активность (например, связывание с типичным лигандом, связывание со специфическим лигандом, связывание с субстратом), каталитическая активность или другая биологическая активность.
Библиотеку или репертуар пептидов или полипептидов объединяют с протеазой (например, одной или более чем одной протеазой) в условиях, подходящих для протеолитической активности протеазы. Условия, подходящие для протеолитической активности протеазы, и биологические препараты или смеси, обладающие протеолитической активностью, хорошо известны в области техники или могут быть
- 22 018723 легко определены специалистом в данной области техники. Если желательно, то подходящие условия могут быть идентифицированы или оптимизированы, например путем оценки протеазной активности в диапазоне условий рН, концентраций протеазы, температур и/или путем варьирования времени, в течение которого дают возможность для взаимодействия библиотеки или репертуара и протеазы. Например, в некоторых воплощениях отношение (из расчета моль/моль) протеазы, например трипсина, к пептиду или полипептиду (например, вариабельному домену) составляет от 800 до 8000 (например, от 8000 до 80000) протеаза:пептид или полипептид, например когда используют 10 мкг/мл протеазы, тогда отношение составляет от 800 до 80000 протеаза:пептид или полипептид; или когда используют 100 мкг/мл протеазы, тогда отношение составляет от 8000 до 80000 протеаза:пептид или полипептид. В одном из воплощений отношение (из расчета масса/масса, например из расчета микрограмм/микрограмм) протеазы (например, трипсина) к пептиду или полипептиду (например, вариабельному домену) составляет от 1600 до 160000 (например, от 16000 до 160000) протеаза:пептид или полипептид, например когда используют 10 мкг/мл протеазы, тогда отношение составляет от 1600 до 160000 протеаза:пептид или полипептид; или когда используют 100 мкг/мл протеазы, тогда отношение составляет от 16000 до 160000 протеаза:пептид или полипептид. В одном из воплощений протеазу используют в концентрации, составляющей по меньшей мере 100 или 1000 мкг/мл, и отношение протеаза:пептид (из расчета моль/моль) протеазы, например трипсина, к пептиду или полипептиду (например, вариабельному домену) составляет от 8000 до 80000 протеаза:пептид или полипептид. В одном из воплощений протеазу используют в концентрации, составляющей по меньшей мере 10 мкг/мл, и отношение протеаза:пептид (из расчета моль/моль) протеазы, например трипсина, к пептиду или полипептиду (например, вариабельному домену) составляет от 800 до 80000 протеаза:пептид или полипептид. В одном из воплощений отношение (из расчета масса/масса, например из расчета микрограмм/микрограмм) протеазы (например, трипсина) к пептиду или полипептиду (например, вариабельному домену) составляет от 1600 до 160000 протеаза:пептид или полипептид, например когда С составляет 10 мкг/мл; или когда С или С' составляет 100 мкг/мл, тогда отношение составляет от 16000 до 160000 протеаза:пептид или полипептид. В одном из воплощений концентрация (с или с') составляет по меньшей мере 100 или 1000 мкг/мл протеазы. Для тестирования индивидуального или выделенного пептида или полипептида (например, иммуноглобулинового вариабельного домена), например уже выделенного из репертуара или библиотеки, протеаза может быть добавлена к раствору пептида или полипептида в подходящем буфере (например, РВ8) с получением раствора пептид или полипептид/протеаза, такого как раствор, составляющий по меньшей мере приблизительно 0,01% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, от приблизительно 0,01% до приблизительно 5% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, от приблизительно 0,05% до приблизительно 5% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, от приблизительно 0,1% до приблизительно 5% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, от приблизительно 0,5% до приблизительно 5% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, от приблизительно 1% до приблизительно 5% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, по меньшей мере приблизительно 0,01% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, по меньшей мере приблизительно 0,02% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, по меньшей мере приблизительно 0,03% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, по меньшей мере приблизительно 0,04% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, по меньшей мере приблизительно 0,05% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, по меньшей мере приблизительно 0,06% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, по меньшей мере приблизительно 0,07% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, по меньшей мере приблизительно 0,08% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, по меньшей мере приблизительно 0,09% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, по меньшей мере приблизительно 0,1% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, по меньшей мере приблизительно 0,2% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, по меньшей мере приблизительно 0,3% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, по меньшей мере приблизительно 0,4% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, по меньшей мере приблизительно 0,5% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, по меньшей мере приблизительно 0,6% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, по меньшей мере приблизительно 0,7% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, по меньшей мере приблизительно 0,8% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, по меньшей мере приблизительно 0,9% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, по меньшей мере приблизительно 1% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, по меньшей мере приблизительно 2% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, по меньшей мере приблизительно 3% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, по меньшей мере приблизительно 4% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, или приблизительно 5% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид. Смесь может быть инкубирована при подходящей для протеазной активности температуре (например, комнатной температуре, приблизительно 37°С), и образцы могут быть отобраны с временными интервалами (например, через 1, 2, 3 ч и т.д.). Образцы могут быть проанализированы в отношении деградации белка с использованием любого подходящего способа, такого как анализ путем 8Ό8-ΡΑΟΕ или связывание лиганда, и результаты могут быть использованы для оценки динамики деградации по времени.
В описанных здесь способах может быть использована любая желаемая протеаза или протеазы. Например, может быть использована одна протеаза, любая желаемая комбинация различных протеаз, или любой биологический препарат, биологический экстракт, или биологический гомогенат, который обла- 23 018723 дает протеолитической активностью. Не обязательно, чтобы была известна идентичность используемой протеазы или протеаз. Подходящие примеры протеаз, которые могут быть использованы самостоятельно или в любой желаемой комбинации, включают сериновую протеазу, цистеиновую протеазу, аспартатпротеазы, тиоловые протеазы, матриксную металлопротеиназу, карбоксипептидазу (например, карбоксипептидазу А, карбоксипептидазу В), трипсин, химотрипсин, пепсин, папаин, эластазу, лейкозим, панкреатин, тромбин, плазмин, катепсины (например, катепсин С), протеиназу (например, протеиназу 1, протеиназу 2, протеиназу 3), термолизин, химозин, энтеропептидазу, каспазу (например, каспазу 1, каспазу 2, каспазу 4, каспазу 5, каспазу 9, каспазу 12, каспазу 13), калпаин, фикаин, клострипаин, актинидаин, бромелаин, сепаразу и т.п. Подходящие биологические экстракты, гомогенаты и препараты, обладающие протеолитической активностью, включают слюну, слизь (например, желудочную слизь, носовую слизь, бронхиальную слизь), бронхоальвеолярный лаваж, легочный гомогенат, легочный экстракт, экстракт поджелудочной железы, желудочную жидкость, слюну, слезы и т.п. Протеазу используют в количестве, подходящем для осуществления протеолитической деградации. Например, как здесь описано, протеаза может быть использована в концентрации от приблизительно 0,01 до приблизительно 5% (мас./мас., протеаза/пептид или полипептид). Когда протеазу объединяют с дисплейной системой, которая включает репертуар пептидов или полипептидов (например, система фагового дисплея), протеаза может быть использована в концентрации от приблизительно 10 мкг/мл до приблизительно 3 мг/мл, приблизительно 10 мкг/мл, приблизительно 20 мкг/мл, приблизительно 30 мкг/мл, приблизительно 40 мкг/мл, приблизительно 50 мкг/мл, приблизительно 60 мкг/мл, приблизительно 70 мкг/мл, приблизительно 80 мкг/мл, приблизительно 90 мкг/мл, приблизительно 100 мкг/мл, приблизительно 200 мкг/мл, приблизительно 300 мкг/мл, приблизительно 400 мкг/мл, приблизительно 500 мкг/мл, приблизительно 600 мкг/мл, приблизительно 700 мкг/мл, приблизительно 800 мкг/мл, приблизительно 900 мкг/мл, приблизительно 1000 мкг/мл, приблизительно 1,5 мг/мл, приблизительно 2 мг/мл, приблизительно 2,5 мг/мл или приблизительно 3 мг/мл.
Протеазу инкубируют с коллекцией пептидов или полипептидов (библиотека или репертуар) при температуре, подходящей для активности протеазы. Например, протеазу и коллекцию пептидов или полипептидов можно инкубировать при температуре от приблизительно 20 до приблизительно 40°С (например, при комнатной температуре, приблизительно 20, приблизительно 21, приблизительно 22, приблизительно 23, приблизительно 24, приблизительно 25, приблизительно 26, приблизительно 27, приблизительно 28, приблизительно 29, приблизительно 30, приблизительно 31, приблизительно 32, приблизительно 33, приблизительно 34, приблизительно 35, приблизительно 36, приблизительно 37, приблизительно 38, приблизительно 39, приблизительно 40°С). Протеазу и коллекцию пептидов или полипептидов инкубируют вместе в течение периода времени, достаточного для осуществления протеолитической деградации. Например, коллекцию пептидов или полипептидов можно инкубировать вместе с протеазой в течение от приблизительно 30 мин до приблизительно 24 ч или приблизительно 48 ч. В некоторых примерах коллекцию пептидов или полипептидов инкубируют вместе с протеазой в течение ночи или в течение по меньшей мере приблизительно 30 мин, приблизительно 1 ч, приблизительно 1,5, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14, приблизительно 15, приблизительно 16, приблизительно 17, приблизительно 18, приблизительно 19, приблизительно 20, приблизительно 21, приблизительно 22, приблизительно 23, приблизительно 24, приблизительно 48 ч или больше.
В большинстве случаев желательно, по меньшей мере, на ранних раундах селекции (например, когда используют дисплейную систему), чтобы результатом действия протеазы было уменьшение количества клонов, имеющих желаемую биологическую активность, которая составляет, по меньшей мере, величину одного порядка в сравнении с активностью, полученной в раундах селекции, не включающих инкубацию с протеазой. В конкретных примерах количество протеазы и условия, использованные в таких способах, достаточны для уменьшения количества выделенных клонов по меньшей мере примерно на один логарифм (коэффициент 10), по меньшей мере примерно на 2 логарифма (коэффициент 100), по меньшей мере примерно 3 логарифма (коэффициент 1000) или по меньшей мере примерно 4 логарифма (коэффициент 10000). Подходящие количества протеазы и условия инкубации, которые будут приводить к желаемому уменьшению количества извлеченных клонов, могут быть легко определены с использованием традиционных методов и/или руководства, приведенного в данном изобретении.
Протеаза и коллекция пептидов или полипептидов могут быть объединены и инкубированы с использованием любого подходящего способа (например, ίη νίΐτο, ίη νίνο или ех νίνο). Например, протеаза и коллекция пептидов или полипептидов могут быть объединены в подходящем контейнере и выдержаны в условиях неподвижности, качания, встряхивания, вихревого вращения или т.п., при температуре, подходящей для протеазной активности. Если желательно, протеаза и коллекция пептидов или полипептидов могут быть объединены в системе ίη νίνο или ех νίνο, например, путем введения коллекции полипептидов (например, библиотеки фагового дисплея или репертуара) в подходящего животного (например, мышь) и после прохождения промежутка времени, достаточного для протеазной активности, извлечения коллекции пептидов или полипептидов. В другом примере орган или ткань подвергают перфузии
- 24 018723 коллекцией полипептидов (например, библиотекой фагового дисплея или репертуаром) и после прохождения промежутка времени, достаточного для протеазной активности, извлекают коллекцию полипептидов.
После инкубации протеазоустойчивый пептид или полипептид может быть селектирован на основании желаемой биологической активности, такой как связывающая активность. Если желательно, протеазный ингибитор может быть добавлен перед селекцией. Может быть использован любой подходящий протеазный ингибитор (или комбинация двух или более протеазных ингибиторов), который, по существу, не будет препятствовать такому способу селекции. Примеры подходящих протеазных ингибиторов включают а1-анти-трипсин, а2-макроглобулин, амастатин, антипаин, антитромбин III, апротинин, гидрохлорид 4-(2-аминоэтил)бензолсульфонил-фторида (АЕВ8Е), (4-амидино-фенил)метансульфонилфторид (АΡΜ8Ε), бестатин, бензамидин, химостатин, 3,4-дихлоризокумарин, диизопропилфторфосфат (ОГЕР), Е-64, этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЕЭТА), эластатинал, лейпептин, Νэтилмалеимид, фенилметилсульфонилфторид (ΡΜ^), пепстатин, 1,10-фенантролин, фосфорамидон, ингибиторы сериновых протеаз, Ν-тозил-Ь-лизин-хлорметилкетон (ТЬСК), №-тозил-Рке-хлорметилкетон (ТРСК) и т.п. В дополнение к этому в продаже имеется много препаратов, которые содержат ингибиторы нескольких классов протеаз (например, Воске Сотр1е1е Рго!еаве 1пк1Ьког Соск!ай ТаЬ1е!в™ (полный коктейль протеазных ингибиторов в таблетках от Воске) (Воске П1адпо511С5 Согрогайоп; ГпЛапарокв, ΙΝ, И8А), который ингибирует химотрипсин, термолизин, папаин, проназу, экстракт поджелудочной железы и трипсин).
Селекция протеазоустойчивого пептида или полипептида может быть проведена с использованием желаемого способа селекции по биологической активности, который позволяет отличить пептиды и полипептиды, имеющие желаемую биологическую активность, от пептидов и полипептидов, не имеющих желаемой биологической активности, и провести их селекцию. В большинстве случаев пептиды или полипептиды, подвергнутые перевариванию или расщеплению протеазой, теряют свою биологическую активность, тогда как протеазоустойчивые пептиды или полипептиды сохраняют свою функциональность. Таким образом, для селекции протеазоустойчивых пептидов или полипептидов можно использовать подходящие анализы биологической активности. Например, обычная функция связывания (например, связывание с типичным лигандом, связывание со специфическим лигандом или связывание с субстратом) может быть оценена с использованием подходящего анализа связывания (например, ЕЫ8А, пэннинга). Например, полипептиды, которые связываются с целевым лигандом или типичным лигандом, таким как белок А, белок Ь или антитело, могут быть селектированы, выделены и/или извлечены посредством пэннинга или с использованием подходящей аффинной матрицы. Пэннинг может быть осуществлен путем добавления раствора лиганда (например, типичного лиганда, целевого лиганда) в подходящий сосуд (например, пробирку, чашку Петри) и оставления лиганда для осаждения на стенках или прикрепления к стенкам сосуда. Избыток лиганда можно отмыть, в сосуд можно добавить полипептиды (например, библиотеку фагового дисплея) и сосуд поддерживать в условиях, подходящих для связывания полипептидов с иммобилизованным лигандом. Несвязанный полипептид можно отмыть, а связанные полипептиды можно извлечь с использованием любого подходящего способа, такого как, например, соскабливание или уменьшение рН.
Если используют систему фагового дисплея, то связывание может быть протестировано в фаговом ЕЫ8А. Фаговый ЕЫ8А может быть проведен в соответствии с любой подходящей методикой. В одном из примеров популяции фага, продуцируемые в каждом раунде селекции, могут быть подвергнуты скринингу в отношении связывания в ЕЬ18Л с выбранным целевым лигандом или типичным лигандом с целью идентификации фага, экспонирующего протеазоустойчивые пептиды или полипептиды. Если желательно, растворимые пептиды и полипептиды могут быть протестированы в отношении связывания с целевым лигандом или типичным лигандом, например, посредством ЕЬ18А с использованием реагентов, например, против С- или Ν-концевой метки (см., например, №1п!ег е! а1. (1994), Апп. Βеν. 1ттипо1оду 12, 433-55 и приведенные там ссылки). Вариабельность селектированного фага также может быть оценена посредством гель-электрофореза продуктов ПЦР (полимеразной цепной реакции) (Μπγ1<5 е! а1. 1991, выше; Νίδδίιη е! а1. 1994, выше), путем введения зонда (ТотШъоп е! а1., 1992, I. Μο1. Вю1. 227, 776) или посредством секвенирования векторной ДНК.
Дополнительно к специфичности в отношении Т№В1 антагонист или полипептид (например, обладающий двойной специфичностью лиганд), содержащий протеазоустойчивый полипептид против Т№В1 (например, единичный вариабельный домен антитела), может обладать специфичностью связывания в отношении типичного лиганда или любого желаемого целевого лиганда, такого как человеческие или животные белки, включая цитокины, факторы роста, цитокиновые рецепторы, рецепторы факторов роста, ферменты (например, протеазы), кофакторы ферментов, ДНК-связывающие белки, липиды и углеводороды.
В некоторых воплощениях протеазоустойчивый пептид или полипептид (например, ЙАЬ) или антагонист связывается с 'ТЫЕВ1 в легочной ткани. В одном из воплощений антагонист или полипептид также связывается с дополнительной мишенью в легочной ткани.
- 25 018723
Если в способах, описанных в данном изобретении, используют дисплейную систему (например, дисплейную систему, в которой связаны кодирующая функция нуклеиновой кислоты и функциональные характеристики пептида или полипептида, кодируемого данной нуклеиновой кислотой), то часто бывает предпочтительно амплифицировать или увеличить количество копий нуклеиновых кислот, которые кодируют выбранные пептиды или полипептиды. Благодаря этому имеют эффективный способ получения достаточных количеств нуклеиновых кислот и/или пептидов или полипептидов для дополнительных раундов селекции с использованием способов, описанных в данном изобретении, или других подходящих способов либо для получения дополнительных репертуаров (например, репертуаров с созреванием аффинности). Таким образом, в некоторых воплощениях способ по изобретению включает применение дисплейной системы (например, в которой связаны кодирующая функция нуклеиновой кислоты и функциональные характеристики пептида или полипептида, кодируемого данной нуклеиновой кислотой, такой системы, как фаговый дисплей) и также включает амплификацию или увеличение количества копий нуклеиновой кислоты, которая кодирует селектированный пептид или полипептид. Нуклеиновые кислоты могут быть амплифицированы с использованием любых подходящих способов, например, посредством амплификации фагов, роста клеток или полимеразной цепной реакции.
Способы, описанные в данном изобретении, могут быть использованы в качестве части программы по выделению протеазоустойчивых пептидов или полипептидов, например бЛЬ, которая может включать в себя, если желательно, другие подходящие способы селекции. В этих ситуациях способы, описанные в данном изобретении, могут быть применены в любом желаемом месте данной программы, например, до или после использования других способов селекции. Кроме того, способы, описанные в данном изобретении, могут быть использованы для проведения двух или более раундов селекции, как описано и приведено в качестве примера в данном патенте.
В одном из примеров изобретение относится к способу селекции пептида или полипептида, который устойчив к расщеплению эластазой, включающему получение библиотеки или репертуара пептидов или полипептидов, объединение библиотеки или репертуара с эластазой (или биологическим препаратом, экстрактом или гомогенатом, содержащим эластазу) в условиях, подходящих для протеолитического расщепления эластазой, и селекцию, выделение и/или извлечение пептида или полипептида, который устойчив к расщеплению эластазой и обладает 1№Я1 связывающей активностью.
В конкретных воплощениях предложен способ селекции иммуноглобулинового единичного вариабельного домена (бЛЬ), который устойчив к расщеплению эластазой и связывается с ΤNΕЯ1. В этих воплощениях библиотеку или репертуар, содержащие бЛЬ, получают и объединяют с эластазой (или биологическим препаратом, экстрактом или гомогенатом, содержащим эластазу) в условиях, подходящих для протеолитического расщепления эластазой. Отбирают эластаза-устойчивые бЛЬ, которые связываются с ΤNΕЯ1. Например, эластаза-устойчивое бЛЬ, по существу, не расщепляется, когда его инкубируют при 37°С в 0,04%-ном (мас./мас.) растворе эластазы в течение по меньшей мере примерно 2 ч. В одном воплощении эластаза-устойчивое бЛЬ, по существу, не расщепляется, когда его инкубируют при 37°С в 0,04%-ном (мас./мас.) растворе эластазы в течение по меньшей мере примерно 12 ч. В одном воплощении эластаза-устойчивое бЛЬ, по существу, не расщепляется, когда его инкубируют при 37°С в 0,04%-ном (мас./мас.) растворе эластазы в течение по меньшей мере примерно 24 ч, по меньшей мере примерно 36 ч или по меньшей мере примерно 48 ч.
В воплощении предложен способ отбора единичного вариабельного домена иммуноглобулина (бЛЬ), резистентного к деградации эластазой и связывающегося с ΤNΕЯ1. Этот способ включает обеспечение системы фагового дисплея, содержащей репертуар полипептидов, которые содержат единичный вариабельный домен иммуноглобулина, комбинирование системы фагового дисплея с эластазой (приблизительно 100 мкг/мл) и инкубацию смеси при приблизительно 37°С, например, в течение ночи (например, приблизительно 12-16 ч), и затем отбор фага, которые представляет бЛЬ, специфически связывающееся с ΤNΕЯ1.
В одном из примеров изобретение относится к способу селекции пептида или полипептида (например, бЛЬ), который устойчив к расщеплению лейкозимом, включающему получение библиотеки или репертуара пептидов или полипептидов, объединение библиотеки или репертуара с лейкозимом (или биологическим препаратом, экстрактом или гомогенатом, содержащим лейкозим) в условиях, подходящих для протеолитического расщепления лейкозимом, и селекцию, выделение и/или извлечение пептида или полипептида, который устойчив к расщеплению лейкозимом и обладает специфической ΤNΕЯ1 связывающей активностью.
В конкретных воплощениях предложен способ селекции иммуноглобулинового единичного вариабельного домена (бЛЬ), который устойчив к расщеплению лейкозимом и связывается с ΤNΕЯ1. В этих воплощениях библиотеку или репертуар, содержащие бЛЬ, получают и объединяют с лейкозимом (или биологическим препаратом, экстрактом или гомогенатом, содержащим лейкозим) в условиях, подходящих для протеолитического расщепления лейкозимом. Отбирают устойчивые к лейкозиму бЛЬ, которые специфически связываются с ΤNΕЯ1. Например, устойчивое к лейкозиму бЛЬ, по существу, не расщепляется, когда его инкубируют при 37°С в 0,04%-ном (мас./мас.) растворе лейкозима в течение по меньшей мере примерно 2 ч. В одном воплощении устойчивое к лейкозиму бЛЬ, по существу, не расщепляет- 26 018723 ся, когда его инкубируют при 37°С в 0,04%-ном (мас./мас.) растворе лейкозима в течение по меньшей мере примерно 12 ч. В одном воплощении устойчивое к лейкозиму бАЬ, по существу, не расщепляется, когда его инкубируют при 37°С в 0,04%-ном (мас./мас.) растворе лейкозима в течение по меньшей мере примерно 24 ч, по меньшей мере примерно 36 ч или по меньшей мере примерно 48 ч.
В одном воплощении изобретение относится к способу селекции иммуноглобулинового единичного вариабельного домена (бАЬ), который устойчив к расщеплению лейкозимом и специфически связывается с ΤΝΈΒ.1. Способ включает получение системы фагового дисплея, содержащей репертуар полипептидов, которые содержат иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, объединение данной системы фагового дисплея с лейкозимом (примерно 100 мкг/мл) и инкубирование этой смеси при примерно 37°С, например, в течение ночи (например, примерно 12-16 ч) и затем селекцию фага, экспонирующего бАЬ, которое специфически связывается с ΤNΈВ1.
В другом примере предложен способ селекции пептида или полипептида (например, бАЬ), который устойчив к расщеплению трипсином, включающему получение библиотеки или репертуара пептидов или полипептидов, объединение библиотеки или репертуара с трипсином в условиях, подходящих для протеолитического расщепления трипсином, и селекцию, выделение и/или извлечение пептида или полипептида, который устойчив к расщеплению трипсином и специфически связывается с ΤNΈВ1.
В конкретных воплощениях изобретение относится к способу селекции иммуноглобулинового единичного вариабельного домена (бАЬ), который устойчив к расщеплению трипсином и специфически связывается с ΤNΈВ1. В этих воплощениях библиотеку или репертуар, содержащие бАЬ, получают и объединяют с трипсином (или биологическим препаратом, экстрактом или гомогенатом, содержащим трипсин) в условиях, подходящих для протеолитического расщепления трипсином. Отбирают трипсинустойчивые бАЬ, которые связываются с ΤNΈВ1. Например, устойчивое к трипсину бАЬ, по существу, не расщепляется, когда его инкубируют при 37°С в 0,04%-ном (мас./мас.) растворе трипсина в течение по меньшей мере примерно 2 ч. В одном воплощении устойчивое к трипсину бАЬ, по существу, не расщепляется, когда его инкубируют при 37°С в 0,04%-ном (мас./мас.) растворе трипсина в течение по меньшей мере примерно 3 ч. В одном воплощении устойчивое к трипсину бАЬ, по существу, не расщепляется, когда его инкубируют при 37°С в 0,04%-ном (мас./мас.) растворе трипсина в течение по меньшей мере примерно 4 ч, по меньшей мере примерно 5 ч, по меньшей мере примерно 6 ч, по меньшей мере примерно 7 ч, по меньшей мере примерно 8 ч, по меньшей мере примерно 9 ч, по меньшей мере примерно 10 ч, по меньшей мере примерно 11 ч или по меньшей мере примерно 12 ч.
В типичном воплощении предложен способ селекции иммуноглобулинового единичного вариабельного домена (бАЬ), который устойчив к расщеплению трипсином и специфически связывается с ΤNΈВ1. Способ включает получение системы фагового дисплея, содержащей репертуар полипептидов, которые содержат иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, объединение данной системы фагового дисплея с трипсином (100 мкг/мл) и инкубирование этой смеси при примерно 37°С, например, в течение ночи (например, примерно 12-16 ч), и затем селекцию фага, экспонирующего бАЬ, которое специфически связывается с ΤNΈВ1.
В другом аспекте предложен способ получения репертуара протеазоустойчивых пептидов или полипептидов (бАЬ). Способ включает получение репертуара пептидов или полипептидов; объединение репертуара пептидов или полипептидов и протеазы в условиях, подходящих для протеазной активности; и извлечение множества пептидов или полипептидов, которые специфически связываются с ΤNΈВ1, посредством чего получают репертуар протеазоустойчивых пептидов или полипептидов. Протеазы, дисплейные системы, условия для протеазной активности и способы селекции пептидов или полипептидов, которые подходят для применения в данном способе, описаны в данном изобретении с учетом других способов по изобретению.
В некоторых воплощениях используют дисплейную систему (например, дисплейную систему, в которой связаны кодирующая функция нуклеиновой кислоты и функциональные характеристики пептида или полипептида, кодируемого данной нуклеиновой кислотой), которая содержит репертуар пептидов или полипептидов, и способ также включает амплификацию или увеличение количества копий нуклеиновых кислот, кодирующих это множество селектированных пептидов или полипептидов. Нуклеиновые кислоты могут быть амплифицированы с использованием любого подходящего способа, например, посредством амплификации фагов, роста клеток или полимеразной цепной реакции.
В конкретном воплощении предложен способ получения репертуара протеазоустойчивых полипептидов, содержащих анти-ΤNΈВ1 бАЬ. Способ включает получение репертуара полипептидов, содержащих бАЬ; объединение репертуара пептидов или полипептидов и протеазы (например, трипсина, эластазы, лейкозима) в условиях, подходящих для протеазной активности; и извлечение множества полипептидов, содержащих бАЬ, обладающих специфичностью связывания с ΤNΈВ1. Способ может быть использован для получения наивного репертуара или репертуара, который смещен в сторону желаемой специфичности связывания, такого как репертуар с созреванием аффинности, основанный на родительском бАЬ, обладающем специфичностью связывания с ΤNΈВ1.
- 27 018723
Системы полипептидного дисплея
В одном воплощении репертуар или библиотека пептидов или полипептидов, предложенные для применения в способах по изобретению, содержат подходящую дисплейную систему. Дисплейная система предпочтительно препятствует расщеплению протеазой (например, единичной протеазой или комбинацией протеаз и любым биологическим экстрактом, гомогенатом или препаратом, содержащим протеолитическую активность (например, мокроты, слизи (например, желудочной слизи, носовой слизи, бронхиальной слизи), бронхоальвеолярного лаважа, гомогената легких, экстракта легких, экстракта поджелудочной железы, желудочной жидкости, слюны, слез и т.п.)). Дисплейная система и связь между этой дисплейной системой и экспонируемым полипептидом в одном воплощении, по меньшей мере, настолько же устойчивы к протеазе, насколько устойчивы наиболее стабильные пептиды или полипептиды репертуара. Это дает возможность легко выделить и/или амплифицировать нуклеиновую кислоту, кодирущую селектированный экспонируемый полипептид.
В одном из примеров протеазоустойчивый пептид или полипептид (например, бАЬ) может быть селектирован, выделен и/или извлечен из репертуара пептидов или полипептидов, находящегося в растворе или ковалентно или нековалентно присоединенного к подходящей поверхности, такой как пластик или стекло (например, титрационному микропланшету, полипептидному массиву, такому как микромассив). Например, можно использовать расположение пептидов на поверхности способом, посредством которого каждый индивидуальный член библиотеки (например, уникальная пептидная последовательность) располагается в отдельном, предварительно определенном местоположении в этом массиве. Идентичность каждого члена библиотеки в таком массиве можно определить по его пространственному расположению в данном массиве. Те положения в массиве, где происходят взаимодействия связывания между, например, целевым лигандом и реакционноспособными членами библиотеки, могут быть определены, благодаря этому идентифицируют последовательности реакционноспособных членов на основе пространственного расположения (см., например, патент США № 5143854, \УО 90/15070 и \УО 92/10092).
В одном воплощении в данных способах используют дисплейную систему, в которой связаны кодирующая функция нуклеиновой кислоты и физические, химические и/или функциональные характеристики полипептида, кодируемого данной нуклеиновой кислотой. Такая дисплейная система может содержать множество способных реплицироваться генетических комплексов, таких как бактериофаг или клетки (бактерии). В одном воплощении дисплейная система содержит такую библиотеку, как бактериофаговая дисплейная библиотека.
Описан ряд подходящих бактериофаговых дисплейных систем (например, моновалентные дисплейные и поливалентные дисплейные системы) (см., например, СпГП1115 и др., патент США № 6555313 В1 (включенный в данное описание посредством ссылки); Ιοίιηδοη и др., патент США № 5733743 (включенный в данное описание посредством ссылки); Μ®';·ιΠογΚ и др., патент США № 5969108 (включенный в данное описание посредством ссылки); Μи11^даη-Κейοе, патент США № 5702892 (включенный в данное описание посредством ссылки); \Ут1ег, С. е1 а1., Аппи. Вет. 1ттипо1. 12: 433-455 (1994); δοιιιηίΐΐίοη, Р. е1 а1., Арр1. Вюсйет. Βΐο^οΗηοΙ. 47(2-3): 175-189 (1994); ί’αδίαβηοΐί, Ь. е1 а1., СютЬ. Сйет. Ηί§1ι ΤΙιΐΌΐίβΙιριιΙ 8сгееп., 4(2): 121-133 (2001)). Пептиды или полипептиды, экспонируемые в бактериофаговой дисплейной системе, могут экспонироваться, например, на любом подходящем бактериофаге, таком как нитчатый фаг (например, Гб, М13, Т1), литический фаг (например, Т4, Т7, лямбда) или РНК-содержащий фаг (например, Μ82).
В большинстве случаев получена или предложена библиотека фага, экспонирующего репертуар пептидов или полипептидов в виде белков, слитых с подходящим белком оболочки фага (например, с ρΙΙΙ-белком Гб). Слитый белок может эксонировать пептиды или полипептиды на конце белка оболочки фага, или, если будет желательно, во внутреннем положении. Например, экспонируемый пептид или полипептид может быть аминоконцевым относительно домена 1 в ρΙΙΙ (домен 1 в ρΙΙΙ также обозначают как N1). Экспонируемый полипептид может быть непосредственно слит с ρΙΙΙ (например, с Ν-концом домена 1 в ρΙΙΙ) или слит с ρΙΙΙ с использованием линкера. Если желательно, такая слитая конструкция может дополнительно содержать метку (например, эпитоп тус, Ηίδ-метку). Библиотеки, содержащие репертуар пептидов или полипептидов, которые экспонируются в виде белков, слитых с белком оболочки фага, могут быть получены с использованием любых подходящих способов, таких как введение библиотеки фаговых векторов или фагмидных векторов, кодирующих экспонируемые пептиды или полипептиды, в подходящих бактерий-хозяев и культивирование полученных бактерий с целью продуцирования фага (например, с использованием подходящего хелперного фага или комплементирующей плазмиды, если желательно). Библиотека фага может быть извлечена из культуры с использованием любого подходящего метода, такого как осаждение и центрифугирование.
Дисплейная система может содержать репертуар пептидов или полипептидов, который содержит любое желаемое количество разнообразных вариантов. Например, репертуар может содержать пептиды или полипептиды, которые имеют аминокислотные последовательности, соответствующие полипептидам природного происхождения, экспрессируемым организмом, группой организмов (например, репертуар последовательностей νΗΗ бАЬ, выделенных из верблюжьих), желаемой тканью или желаемым типом клеток, или может содержать пептиды или полипептиды, которые имеют случайные или рандомизи
- 28 018723 рованные аминокислотные последовательности. Если желательно, полипептиды могут иметь общее ядро или общий остов. Полипептиды в таком репертуаре или такой библиотеке могут содержать определенные области случайной или рандомизированной аминокислотной последовательности и области общей аминокислотной последовательности. В некоторых воплощениях все или по существу все полипептиды в репертуаре являются полипептидами желаемого типа, такими как желаемый фермент (например, полимераза) или желаемый антигенсвязывающий фрагмент антитела (например, УН человека или Уъ человека). В некоторых воплощениях полипептидная дисплейная система содержит репертуар полипептидов, где каждый полипептид представляет собой вариабельный домен антитела. Например, каждый полипептид в репертуаре может содержать УН, Уь или Εν (например, одноцепочечный Е^.
Вариабельность аминокислотной последовательности может быть внесена в любую желаемую область пептида или полипептида либо остова с использованием любого подходящего способа. Например, вариабельность аминокислотной последовательности может быть внесена в целевую область, такую как определяющий комплементарность участок вариабельного домена антитела или гидрофобный домен, посредством получения библиотеки нуклеиновых кислот, кодирующих разнообразные полипептиды, с использованием любых подходящих методов мутагенеза (например, ПЦР пониженной точности, олигонуклеотид-опосредованного или сайт-специфического мутагенеза, диверсификации с использованием кодонов ΝΝΚ) или любого другого подходящего метода. Если желательно, область полипептида, в которую должно быть внесено разнообразие, может быть выбрана случайным образом.
Размер полипептидов, которые входят в состав репертуара, во многом является предметом выбора, и единообразный размер полипептида не обязателен. В одном воплощении полипептиды в репертуаре имеют, по меньшей мере, третичную структуру (образовывали по меньшей мере один домен).
Селекция/выделение/извлечение
Протеазоустойчивый пептид или полипептид (например, популяция протеазоустойчивых полипептидов) может быть селектирован, выделен и/или извлечен из репертуара или библиотеки (например, в дисплейной системе) с использованием любого подходящего способа. Предпочтительно протеазоустойчивый полипептид селектируют или выделяют на основании селектируемой характеристики (например, физической характеристики, химической характеристики, функциональной характеристики). Подходящие селектируемые функциональные характеристики включают биологические активности пептидов или полипептидов в репертуаре, например, связывание с типичным лигандом (например, суперантигеном), связывание с целевым лигандом (например, антигеном, эпитопом, субстратом), связывание с антителом (например, через эпитоп, экспрессируемый на пептиде или полипептиде) и каталитическую активность (см., например, Τοιηΐίηδοη е1 а1., \¥О 99/20749; \¥О 01/57065; \¥О 99/58655). В одном из воплощений селекция основана на специфическом связывании с ΤΝΕ^. В еще одном воплощении селекция основана на выбранной функциональной характеристике с получением второго репертуара, в котором члены устойчивы к протеазе, а затем путем селекции члена из второго репертуара, специфически связывающегося с ΤΝΕ^.
В некоторых воплощениях протеазоустойчивый пептид или полипептид отбирают и/или селектируют из библиотеки или репертуара пептидов или полипептидов, в которой по существу все протеазоустойчивые пептиды или полипептиды обладают общим селектируемым свойством. Например, протеазоустойчивый пептид или полипептид может быть выбран из библиотеки или репертуара, в которых по существу все протеазоустойчивые пептиды или полипептиды связываются с общим родовым лигандом, связываются с общим целевым лигандом, связываются (или связаны) с общим антителом, или обладают общей каталитической активностью. Этот тип селекции в особенности полезен для получения репертуара протеазоустойчивых пептидов или полипептидов, основанного на родительском пептиде или полипептиде, обладающем желаемой биологической активностью, например, когда осуществляют созревание аффинности иммуноглобулинового единичного вариабельного домена.
Селекция на основании связывания с общим родовым лигандом может дать начало коллекции или популяции пептидов или полипептидов, содержащей все или по существу все из протеазоустойчивых пептидов или полипептидов, представляющих собой компоненты исходной библиотеки или репертуара. Например, пептиды или полипептиды, связывающие целевую лиганд или общий лиганд, такой как белок А, белок Ь или антитело, могут быть селектированы, выделены и/или извлечены посредством пэннинга или с использованием подходящей матрицы аффинности. Пэннинг может быть осуществлен путем добавления раствора лиганда (например, общего лиганда, целевого лиганда) в подходящий сосуд (например, пробирку, чашку Петри) и предоставления лиганду возможности осаждаться или образовывать слой на стенках сосуда. Избыток лиганда может быть отмыт, и пептиды или полипептиды (например, репертуар, который инкубируют с протеазой) могут быть добавлены в сосуд, и сосуд поддерживают в условиях, подходящих для связывания пептидов или полипептидов с иммобилизованным лигандом. Несвязавшиеся пептиды или полипептиды могут быть отмыты, а связанные пептиды или полипептиды могут быть выделены с использованием любого подходящего способа, такого как, например, соскребание или уменьшение рН.
Подходящие аффинные матрицы для лиганда, как правило, содержат твердый носитель или шарики (например, агарозу), к которым лиганд прикреплен ковалентно или нековалентно. Аффинная матрица
- 29 018723 может быть объединена с пептидами или полипептидами (например, репертуаром, который инкубировали с протеазой) с использованием способа в партии, колоночного способа или любого другого подходящего способа в условиях, подходящих для связывания пептидов или полипептидов с лигандом на матрице. Пептиды или полипептиды, которые не связываются с аффинной матрицей, могут быть отмыты, а связавшиеся пептиды или полипептиды могут быть элюированы и выделены с использованием любого подходящего способа, такого как элюция буфером с меньшим значением рН, мягким денатурирующим агентом (например, мочевиной), или пептидом, который конкурирует за связывание с лигандом. В одном из примеров биотинилированный целевой лиганд объединяют с репертуаром в условиях, подходящих для связывания пептидов или полипептидов в репертуаре с целевым лигандом (ΤΝΕΗ1). Связанные пептиды или полипептиды выделяют с использованием иммобилизованного авидина или стрептавидина (например, на шариках).
В некоторых воплощениях общий лиганд представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Антитела или антигенсвязывающие фрагменты, связывающиеся со структурными особенностями пептидов или полипептидов, которые являются, по существу, консервативными в пептидах или полипептиах библиотеки или репертуара, особенно полезны в качестве общих лигандов. Антитела и антигенсвязывающие фрагменты, подходящие для применения в качестве лигандов для выделения, селекции и/или извлечения протеазоустойчивых пептидов или полипептидов, могут быть моноклональными или поликлональными и могут быть получены с использованием любого подходящего способа.
Библиотеки/репертуары
В других аспектах предложены репертуары протеазоустойчивых пептидов и полипептидов для библиотек, кодирующих протеазоустойчивые пептиды и полипептиды, и способы продуцирования таких библиотек и репертуаров.
Библиотеки, которые кодируют и/или содержат протеазоустойчивые пептиды и полипептиды, могут быть изготовлены или получены с использованием любого подходящего способа. Библиотека может быть разработана для кодирования протеазоустойчивых пептидов или полипептидов на основе интересующего пептида или полипептида (например, пептида или полипептида против ΤΝΕΗ1, выбранного из библиотеки), или может быть выбрана из другой библиотеки с использованием описанных здесь способов. Например, библиотека, обогащенная протеазоустойчивыми полипептидами, может быть изготовлена с использованием подходящей системы дисплея полипептидов.
В одном из примеров библиотеку фагового дисплея, содержащую репертуар экспонированных полипептидов, содержащих иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены (например, Ун, Ук, νλ), объединяют с протеазой в условиях, подходящих для протеазной активности, как здесь описано. Протеазоустойчивые полипептиды выделяют на основе желаемой биологической активности, такой как связывающая активность (например, связывание общего лиганда, связывание целевого лиганда), тем самым с получением библиотеки фагового дисплея, обогащенной протеазоустойчивыми полипептидами. В одном из воплощений выделение основано на связывании общего лиганда с получением обогащенной библиотеки, а затем селекции анти-ΤNК.Ε1 члена этой библиотеки на основе специфического связывания с ΤΝΕΗ1.
В еще одном примере библиотеку фагового дисплея, содержащую репертуар экспонированных полипептидов, содержащих иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены (например, Ун, Ук, νλ), сначала отбирают для идентификации членов репертуара, которые обладают специфичностью связывания в отношении желаемого целевого антигена (ΤΝΕΗ1). Коллекцию полипептидов, обладающих желаемой специфичностью связывания, выделяют, и коллекцию объединяют с протеазой в условиях, подходящих для протеолитической активности, как здесь описано. Коллекцию протеазоустойчивых полипептидов, которые обладают желаемой специфичностью связывания с мишенью, выделяют с получением библиотеки, обогащенной протеазоустойчивыми и высокоаффинными полипептидами. Как здесь описано в одном воплощении, устойчивость к протеазе в этом способе селекции коррелирует с высокой аффинностью связывания.
Библиотеки, кодирующие репертуар полипептидов желаемого типа, легко могут быть получены с использованием любого подходящего способа. Например, может быть получена последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид желаемого типа (например, полимеразу, вариабельный домен иммуноглобулина), и может быть приготовлена коллекция нуклеиновых кислот, каждая из которых содержит одну или более чем одну мутацию, например путем амплификации нуклеиновой кислоты с использованием системы допускающей ошибки полимеразной цепной реакции (ПЦР), путем химического мутагенеза (Эепд е! а1., 1. ΒίοΙ. СНет., 269:9533 (1994)) или с использованием бактериальных мутаторных штаммов (Βο\ν е! а1., 1. Μο1. Βίο1., 260:359 (1996)).
В некоторых воплощениях конкретные области нуклеиновой кислоты могут быть помечены для диверсификации. Способы мутирования выбранных положений хорошо известны в данной области и включают, например, применение ошибочно спаренных олигонуклеотидов или вырожденных олигонуклеотидов как с использованием ПЦР, так и без нее. Например, созданы библиотеки синтетических антител посредством направленного введения мутаций в антигенсвязывающие петли. Случайным или полу- 30 018723 случайным образом Н3- и Ь3-области антител присоединяли к генным У-сегментам иммуноглобулинов зародышевой линии с целью создания больших библиотек с не затронутыми мутациями каркасными областями (НоодепЬоот и \Ута1ег (1992), выше; Νίδδίιη е1 а1. (1994), выше; ΟπΓΓίΙΙικ е1 а1. (1994), выше; ЭеКгш£ е1 а1. (1995), выше). В этом случае внесение разнообразия затрагивает некоторые или все другие антигенсвязывающие петли (Статей е1 а1. (1996), Меб., 2: 100; ШесНтапп е1 а1. (1995),
Вю/Тес11по1о§у, 13: 475; МогрНокук, \¥О 97/08320, выше). В других воплощениях конкретные области нуклеиновой кислоты могут быть выбраны в качестве мишеней для внесения разнообразия, например, посредством стратегии двухстадийной ПЦР, в которой продукт первой ПЦР используется в качестве мегапраймера (см., например, ЬапбГ, О. е1 а1., Сепе 96: 125-128 (1990)). Целенаправленное внесение разнообразия также может быть осуществлено, например, посредством ЗОЕ РСК (ПЦР со сплайсингом посредством перекрывающегося удлинения) (см., например, Нойоп, К.М. е1 а1., Сепе 77: 61-68 (1989)).
Вариабельность последовательности в выбранных положениях может быть достигнута путем изменения кодирующей последовательности, определяющей последовательность полипептида, таким образом, чтобы в данное положение можно было встроить ряд возможных аминокислот (например, все 20 или часть из них). В соответствии с номенклатурой ГОРАС (Международный союз теоретической и прикладной химии) наиболее многофункциональным кодоном является ΝΝΙΧ, который кодирует все аминокислоты, а также стоп-кодон ТАС. Кодон ΝΝΒ предпочтительно используют для того, чтобы внести необходимую вариабельность. Также используют другие кодоны, с помощью которых добиваются той же цели, включая кодон ΝΝΝ, что приводит к созданию дополнительных стоп-кодонов ТСА и ТАА. Такой целенаправленный подход может способствовать зондированию всей последовательности в целевой области.
Библиотеки могут содержать протеазоустойчивые полипептиды антител, которые имеют известную конформацию основной цепи (см., например, Тотйпкоп и др., \УО 99/20749).
Библиотеки могут быть получены в подходящей(ем) плазмиде или векторе. Как использовано в данном изобретении, термин вектор относится к дискретному элементу, который используют для введения гетерологической ДНК в клетки для ее экспрессии и/или репликации. Можно использовать любой подходящий вектор, включая плазмиды (например, бактериальные плазмиды), векторы на основе вирусов или бактериофагов, искусственные хромосомы и эписомальные векторы. Такие векторы могут быть использованы для простого клонирования и мутагенеза, или экспрессирующий вектор может быть использован для управления экспрессией библиотеки. Векторы и плазмиды обычно содержат один или более клонирующих сайтов (например, полилинкер), ориджин репликации и по меньшей мере один селектируемый маркерный ген. Экспрессирующие векторы могут дополнительно содержать элементы для управления транскрипцией и трансляцией полипептида, такие как энхансерный элемент, промотор, сигнал терминации транскрипции, сигнальные последовательности и т.п. Эти элементы могут быть организованы таким образом, чтобы быть оперативным образом связанными с клонированной вставкой, кодирующей полипептид, так чтобы полипептид экспрессировался и продуцировался, когда такой экспрессирующий вектор поддерживают в условиях, подходящих для экспрессии (например, в подходящей клеткехозяине).
Клонирующие и экспрессирующие вектора, как правило, содержат нуклеиново-кислотные последовательности, позволяющие вектору реплицироваться в одном или более выбранных типах клеток-хозяев. Обычно в клонирующих векторах эта последовательность представляет собой последовательность, позволяющую вектору реплицироваться независимо от хромосомной ДНК хозяина, и включает ориджины репликации или автономно реплицирующиеся последовательности. Хорошо известны такие последовательности для ряда бактерий, дрожжей и вирусов. Ориджин репликации из плазмиды рВК322 подходит для большинства грамотрицательных бактерий, 2-микрометровый плазмидный ориджин подходит для дрожжей, а различные вирусные ориджины (например, ЗУ40 (обезьяньего вируса 40), аденовируса) полезны для клонирования векторов в клетках млекопитающих. Как правило, ориджин репликации не являются необходимыми для экспрессирующих векторов млекопитающих за исключением случаев, когда их используют в клетках млекопитающих, способных реплицировать высокие уровни ДНК, таких как СОЗ-клетки (фибробласты африканской зеленой мартышки).
Клонирующие или экспрессирующие векторы могут содержать ген селекции, также называемый селектируемым маркером. Такие маркерные гены кодируют белок, необходимый для выживания или роста трансформированных клеток-хозяев, растущих на селективной культуральной среде. Клеткихозяева, не трансформированные вектором, содержащим ген селекции, не будут поэтому выживать в данной культуральной среде. Типичные гены селекции кодируют белки, которые придают устойчивость к антибиотикам и другим токсинам, например ампициллину, неомицину, метотрексату или тетрациклину, дополняют ауксотрофные дефициты или восполняют критические питательные вещества, которых нет в ростовых средах.
Подходящие экспрессирующие векторы могут содержать ряд компонентов, например ориджин репликации, селектируемый маркерный ген, один или более элементов контроля экспрессии, таких как элемент контроля транскрипции (например, промотор, энхансер, терминирующий элемент) и/или один или более сигналов трансляции, сигнальную или лидерную последовательность и т.п. Элементы контроля
- 31 018723 экспрессии и сигнальная или лидерная последовательность, если они присутствуют, могут быть предусмотрены в векторе или за счет другого источника. Например, для непосредственной экспрессии могут быть использованы последовательности транскрипционного и/или трансляционного контроля клонированной нуклеиновой кислоты, кодирующей цепь антитела.
Для экспрессии в желаемой клетке-хозяине может быть предусмотрен промотор. Промоторы могут быть конститутивными или индуцибельными. Например, промотор может быть оперативным образом связан с нуклеиновой кислотой, кодирующей антитело, цепь антитела или его часть, с тем чтобы он направлял транскрипцию нуклеиновой кислоты. Доступны разнообразные промоторы, подходящие для прокариотических (например, β-лактамазные и лактозные промоторные системы, промотор гена щелочной фосфатазы, триптофановая (ΐτρ) промоторная система, промоторы 1ас, (ас, Т3, Т7 для Е.сой) и эукариотических (например, ранний и поздний промотор обезьянего вируса 40, промотор длинных концевых повторов вируса саркомы Рауса, цитомегаловирусный промотор, поздний аденовирусный промотор, промотор ЕС-1а) хозяев.
В дополнение к этому, экспрессирующие векторы обычно содержат селектируемый маркер для селекции клеток-хозяев, несущих этот вектор, и, в случае способного реплицироваться экспрессирующего вектора, ориджин репликации. Гены, кодирующие продукты, которые придают устойчивость к антибиотикам или лекарственным средствам, представляют собой общеизвестные селектируемые маркеры и могут быть использованы в прокариотических (например, ген β-лактамазы (устойчивость к ампициллину), ген Те! для устойчивости к тетрациклину) и эукариотических клетках (например, гены устойчивости к неомицину (С418 или генетицину), §ρΐ (микофенольной кислоте), ампициллину или гигромицину). Дегидрофолатредуктазные маркерные гены позволяют проводить селекцию с метотрексатом в разнообразных хозяевах.
Гены, кодирующие генный продукт ауксотрофных маркеров хозяина (например, ЬЕИ2, ИВА3, Ш83), часто используют в качестве селектируемых маркеров в дрожжах. Также рассматривается применение вирусных (например, бакуловирусных) или фаговых векторов и векторов, способных интегрироваться в геном клетки-хозяина, таких как ретровирусные векторы.
Подходящие экспрессирующие векторы для экспрессии в клетках прокариот (например, бактериальных клетах, таких как Е.сой) или млекопитающих включают, например, вектор рЕТ (например, рЕТ12а, рЕТ-36, рЕТ-37, рЕТ-39, рЕТ-40; Nоνадеη и других фирм), фаговый вектор (например, ρί’ΑΝΤΑΒ 5 Е; Рйагтааа), ρΒΙΤ2Τ (вектор, представляющий собой слитую конструкцию с геном белка А, Рйагтас1а), ρΟΌΜ8, ρϋϋΝΑ1.1/^, ρςϋΝΑ3.1, рВс/В8У, ρΕΕ-1 (Iη\ιιго^еη. Саг1кЬаб, СА), рСМУ-8СВ1РТ, ρΕΒ, ρ865, ρΧΤ1 (8йа1адепе, Ьа Эо11а, СА), ρί.ΌΕΕ3 (Со1бтаи, Ь.А., е! а1., Вю1есйтдцек, 21: 1013-1015 (1996)), ρ8У8РОВΤ (61ЬсоВВЬ, ВоскуШе, МО), ρΕΕ-Вок (М|/нкЫта, 8., е! а1., №с1ею Ас1бк Век., 18: 5322 (1990)) и т.п. Доступны экспрессирующие векторы, которые подходят для применения в различных экспрессирующих хозяевах, таких как прокариотические клетки (Е.сой), клетки насекомых (82-клетки ^^окоρй^1а 8с11шебег, 8Г9), дрожжи (Р. теШаиойса, Р. ρакΐо^^к, 8. се^еν^к^ае) и клетки млекопитающих (например, СО8-клетки).
Предпочтительными векторами являются экспрессирующие векторы, которые позволяют экспрессироваться нуклеотидной последовательности, соответствующей члену библиотеки полипептидов. Так, селекция с использованием типичных и/или целевых лигандов может быть проведена в результате раздельных этапов культивирования и экспрессии единичного клона, экспрессирующего член библиотеки полипептидов. Как описано выше, предпочтительной дисплейной системой селекции является бактериофаговый дисплей. Так, могут быть использованы фаговые или фагмидные векторы. Примерами векторов являются фагмидные векторы, имеющие ориджин репликации Е.сой (для двухнитевой репликации), а также фаговый ориджин репликации (для продуцирования однонитевой ДНК). Особенности манипулирования с такими векторами и их экспрессии общеизвестны в данной области техники (ноодеиЬоот апб \Ут1ег (1992), выше; Νίκκίιη е! а1. (1994), выше). Кратко, вектор может содержать ген р-лактамазы на фагмиде для придания селективности и 1ас-промотор, расположенный вверх по течению по отношению к экспрессирующей кассете, которая может содержать подходящую лидерную последовательность, сайт множественного клонирования, одну или более пептидных меток, один или более стоп-кодонов ΤΛ6 и ρΙΙΙ-белок фага. Таким образом, с использованием различных супрессорных и несупрессорных штаммов Е.сой и с добавлением глюкозы, изопропилтио-в-О-галактозида (ΙΓΤΟ) или хелперного фага, такого как УС8 М13, вектор способен реплицироваться в виде плазмиды без какой-либо экспрессии, продуцировать большие количества только данного члена библиотеки полипептидов либо продуктивные фаги, некоторые из которых содержат по меньшей мере одну копию слитой конструкции полипептид-ρΙΙΙ на своей поверхности.
Библиотеки и репертуары по изобретению могут быть представлены в форматах антител. Например, полипептид, содержащийся в библиотеках и репертуарах, может представлять собой отдельные Унили Уь-домены, каждый из которых или модифицирован, или не модифицирован. Фрагменты ксЕх, а также другие полипептиды антител, могут быть легко получены с использованием любого подходящего метода. В данной области техники хорошо известен ряд подходящих методов конструирования антител.
- 32 018723
Например, 5сРг может быть образован путем соединения нуклеиновых кислот, кодирующих два вариабельных домена, с использованием подходящего олигонуклеотида, который кодирует соответствующий линкерный пептид, такой как (С1у-С1у-С1у-С1у-8ег)3, или другие подходящие линкерные пептиды. Линкер связывает С-терминальный конец первой У-области и Ν-терминальный конец второй У-области. Для конструирования других форматов антител, таких как фрагменты Εν, ЕаЬ и Е(аЬ')2, могут быть использованы похожие методики. Для образования фрагментов ЕаЬ и Е(аЬ')2 полипептиды Ун и Уъ могут быть объединены с сегментами константной области, которые могут быть получены из реаранжированных генов, С-генов (иммуноглобулинов) зародышевой линии или синтезированы на основании данных последовательности антител. Библиотека или репертуар по изобретению могут представлять собой библиотеку или репертуар Ун или Уь.
Полипептиды, содержащие протеазоустойчивый вариабельный домен, предпочтительно содержат сайт связывания с целевым лигандом (ΤΝΕΚ1) и сайт связывания с типичным лигандом. В некоторых воплощениях сайтом связывания с типичным лигандом является сайт связывания для суперантигена, такого как белок А, белок Ь или белок С. Основой для вариабельных доменов может служить любой желаемый вариабельный домен, например Ун человека (например, Ун 1а, Ун 1Ь, Ун 2, Ун 3, Ун 4, Ун 5, Ун 6), УХ человека (например, УХ1, УХ11, УХШ, УХ1У, УХУ, УХУ1 или Ук1) или Ук человека (например, Ук2, Ук3, Ук4, Ук5, Ук6, Ук7, Ук8, Ук9 или Ук10) или Унн верблюжьих, которые, возможно, были гуманизированы.
Нуклеиновые кислоты, клетки-хозяева и способы продуцирования протеазоустойчивых полипептидов
Данное изобретение также относится к выделенным и/или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, кодирующим протеазоустойчивые пептиды или полипептиды, например, селектируемые или селектированные способами, описанными в данном изобретении.
Нуклеиновыми кислотами, обозначенными в данном изобретении как выделенные, являются нуклеиновые кислоты, которые отделены от другого вещества (например, других нуклеиновых кислот, таких как геномная ДНК, кДНК и/или РНК) в своем первоначальном окружении (например, в клетках или в смеси нуклеиновых кислот, такой как библиотека). Выделенная нуклеиновая кислота может быть выделена в виде части вектора (например, плазмиды).
Нуклеиновыми кислотами, обозначенными в данном изобретении как рекомбинантные, являются нуклеиновые кислоты, которые получены с использованием методологии рекомбинантной ДНК, включая способы, в основе которых лежит искусственная рекомбинация, такая как клонирование в вектор или хромосому с использованием, например, рестрикционных ферментов, гомологичная рекомбинация, использование вирусов и т.п., и нуклеиновые кислоты, полученные с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Изобретение также относится к рекомбинантной клетке-хозяине, которая содержит (одну или более) рекомбинантную нуклеиновую кислоту или экспрессирующую конструкцию, содержащую нуклеиновую кислоту, кодирующую протеазоустойчивый пептид или полипептид, например, пептид или полипептид, селектируемый или селектированный способами, описанными в данном изобретении. Также предложен способ получения протеазоустойчивого пептида или полипептида, включающий поддержание рекомбинантной клетки-хозяина по изобретению в условиях, подходящих для экспрессии данного протеазоустойчивого пептида или полипептида. Способ может дополнительно включать стадию выделения или извлечения протеазоустойчивого пептида или полипептида, если желательно.
Например, нуклеиново-кислотную молекулу (т.е. одну или более из нуклеиново-кислотных молекул), кодирующую протеазоустойчивый пептид или полипептид, или экспрессирующую конструкцию (т.е. одну или более конструкций), содержащую такую нуклеиново-кислотную молекулу(ы), можно ввести в подходящую клетку-хозяина для создания рекомбинантной клетки-хозяина, используя любой способ, соответствующий выбранной клетке-хозяину (например, трансформацию, трансфекцию, электропорацию, инфекцию), с тем чтобы нуклеиново-кислотная молекула(ы) была оперативным образом связана с одним или более элементами контроля экспрессии (например, в векторе, в конструкции, созданной в результате процессов, протекающих в данной клетке, интегрированной в геном клетки-хозяина). Полученную рекомбинантную клетку-хозяина можно поддерживать в условиях, подходящих для экспрессии (например, в присутствии индуктора, в подходящем животном, в подходящих культуральных средах, дополненных соответствующими солями, ростовыми факторами, антибиотиками, пищевыми добавками и т.д.), в результате чего продуцируется кодируемый пептид или полипептид. Если желательно, кодируемый пептид или полипептид может быть выделен или извлечен (например, из животного, клеткихозяина, среды, молока). Этот способ охватывает экспрессию в клетке-хозяине трансгенного животного (см., например, \¥О 92/03918, СепРйагт 1п!егпайопа1).
Кроме того, протеазоустойчивый пептид или полипептид, селектированный способом, описанным в данном изобретении, может быть получен в подходящей экспрессирующей системе ίη νίίτο посредством химического синтеза или посредством любого другого подходящего метода. Таким образом, в настоящем изобретении предложены протеазоустойчивые пептиды и полипептиды.
- 33 018723
Полипептиды, бАЬ и антагонисты
Как здесь описано и примеры чего здесь приведены, протеазоустойчивые бАЬ по изобретению, как правило, связываются с их целевым лигандом с высокой аффинностью. Таким образом, в еще одном аспекте предложен способ селекции, выделения и/или извлечения полипептида или бАЬ по изобретению, связывающегося ΤΝΡΚ.1 с высокой аффинностью. Как правило, способ включает получение библиотеки или репертуара пептидов или полипептидов (например, бАЬ), объединение библиотеки или репертуара с протеазой (например, трипсином, эластазой, лейкозимом, панкреатином, слюной) в условиях, подходящих для протеазной активности, и селекцию, выделение и/или извлечение пептида или полипептида, связывающегося с лигандом (например, целевым лигандом). Поскольку библиотека или репертуар подвергается воздействию протеазы в условиях, в которых чувствительные к протеазе пептиды или полипептиды расщепляются, то активность протеазы может элиминировать менее стабильные полипептиды, обладающие низкой аффинностью связывания, и таким образом продуцировать коллекцию пептидов или полипептидов, обладающих высокой аффинностью связывания. Например, полипептид или бАЬ по изобретению может связываться с ΤΝΡΚ1 с аффинностью (Кс; Кс=КоГГ(кб)/Коп(ка), что определяют при помощи поверхностного плазмонного резонанса), составляющей 1 мкМ или более, или от приблизительно 500 нМ до приблизительно 0,5 пМ. Например, полипептид или бАЬ по изобретению может связываться с ΤΝΡΚ.1 с аффинностью, составляющей приблизительно 500 нМ, приблизительно 100 нМ, приблизительно 10 нМ, приблизительно 1 нМ, приблизительно, 500 пМ, приблизительно 100 пМ, приблизительно 10 пМ, приблизительно 1 пМ или приблизительно 0,5 пМ. Хотя авторы изобретения не желают быть связанными какой-либо конкретной теорией, пептиды и полипептиды, устойчивые к протеазам, как полагают, обладают меньшей энтропией и/или более высокой стабилизационной энергией. Таким образом, корреляция между устойчивостью к протеазе и высокой аффинностью связывания может быть связана с компактностью и стабильностью поверхностей пептидов и полипептидов и бАЬ, селектированных при помощи описанного здесь способа.
В одном из воплощений полипептид, бАЬ или антагонист по изобретению ингибирует связывание ΤΝΡα с рецептором ΤΝΡα I (рецептор р55) с ингибирующей концентрацией (1С50), составляющей приблизительно от 500 нМ до 50 пМ, или от 100 нМ до 50 пМ, или от 10 нМ до 100 пМ, или от 1 нМ до 100 пМ; например 50 нМ или меньше, или 5 нМ или меньше, или 500 пМ или меньше, или 200 пМ или меньше, или 100 пМ или меньше.
В некоторых воплощениях полипептид, бАЬ или антагонист специфически связывается с ΤΝΡΚ.1, например человеческим ΤΝΡΚ.1, и диссоциирует от человеческого ΤΝΡΒ1 с константой диссоциации (Кс) от 300 нМ до 1 пМ, или от 300 нМ до 5 пМ, или от 50 нМ до 1 пМ, или от 50 нМ до 5 пМ, или от 50 нМ до 20 пМ, или приблизительно 10 пМ, или приблизительно 15 пМ, или приблизительно 20 пМ, что определяют при помощи поверхностного плазмонного резонанса. В некоторых воплощениях полипептид, бАЬ или антагонист специфически связывается с ΤΝΡΚ.1, например человеческим ΤΝΡΚ.1, и диссоциирует от человеческого ΤΝΡΚ.1 с константой скорости КоГГ от 5х 10-1 с-1 до 1х 10-7 с-1, или от 1х 10-3 с-1 до 1х10-7 с-1, или от 1х10-4 с-1 до 1х10-7 с-1, или от 1х10-5 с-1 до 1х10-7 с-1, или 1х10-4 с-1, или 1х10-5 с-1, что определяют при помощи поверхностного плазмонного резонанса. В некоторых воплощениях полипептид, бАЬ или антагонист специфически связывается с ΤΝΡΚ.1, например человеческим ΤΝΡΚ.1, с Ко|| от 1х 10-3 М-1с-1 до 1х 10-7 М-1с-1, или от 1х 10-3 М-1с-1 до 1х 10-6 М-1с-1, или приблизительно 1х 10-4 М-1с-1, или приблизительно 1х10-5 М-1с-1. В одном из воплощений полипептид, бАЬ или антагонист специфически связывается с ΤΝΡΚ.1, например человеческим ΤΝΡΚ.1, и диссоциирует от человеческого ΤΝΡΚ1 с константой диссоциации (Кс) и КоГГ, определенными в этом абзаце. В одном из воплощений полипептид, бАЬ или антагонист специфически связывается с ΤΝΡΚ.1, например человеческим ΤΝΡΚ.1, и диссоциирует от человеческого ΤΝΡΚ.1 с константой диссоциации (Кс) и Коп, определенными в абзаце. В некоторых воплощениях полипептид или бАЬ специфически связывается ΧΝΡΒ1 (например, человеческим ΤΝΡΚ1) с Ии и/или КоГГ, и/или Коп, приведенными в этом абзаце, и содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно на 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности ΌΘΜ1Η-131-206 (представленной на фиг. 3).
Полипептид, бАЬ или антагонист может экспрессироваться в Е.сой или в видах РюЫа (например, Р. райопк). В одном из воплощений лиганд или мономер бАЬ секретируется в количестве, составляющем по меньшей мере приблизительно 0,5 мг/л при экспрессии в Е.сой или видах РюЫа (например, Р. райопк). Хотя описанные здесь лиганды и мономеры бАЬ могут быть секретируемыми при экспрессии в Е.сой или видах РюЫа (например, Р. району, они могут продуцироваться с использованием любого подходящего способа, такого как способы химического синтеза или способы биологической продукции, в которых не используется Е.сой или виды РюЫа.
В некоторых воплощениях полипептид, бАЬ или антагонист не содержат верблюжий (Сатейб) иммуноглобулиновый вариабельный домен или одну или более каркасных аминокислот, которые являются уникальными для иммуноглобулиновых вариабельных доменов, кодируемых генными сегментами антитела зародышевой линии верблюда, например, в положении 108, 37, 44, 45 и/или 47.
- 34 018723
Антагонисты ΤΝΕΚ1 могут быть моновалентными или поливалентными. В некоторых воплощениях антагонист является моновалентным и содержит один сайт связывания, который взаимодействует ΤΝΕΚ1, где сайт связывания обеспечивается полипептидом или бАЬ по изобретению. Моновалентные антагонисты связываются с одним ΤΝΕΚ1 и могут не индуцировать перекрестное связывание или кластеризацию ΤΝΕΚ1 на поверхности клеток, что может привести к активации этого рецептора и трансдукции сигнала.
В других воплощениях антагонист ΤΝΕΚ1 является мультивалентным. Мультивалентные антагонисты ΤΝΕΚ1 могут содержать две или более чем две копии конкретного сайта связывания ΤΝΕΚ1 или содержать два или более чем два различных сайта, связывающих ΤΝΕΚ1, причем по меньшей мере один из связывающих сайтов обеспечивается полипептидом или бАЬ по изобретению. Например, как здесь описано, антагонист ΤΝΕΚ1 может представлять собой димер, тример или мультимер, содержащий две или более чем две копии конкретного полипептида или бАЬ по изобретению, связывающие ΤΝΕΚ1, или два или более чем два различных полипептида или бАЬ по изобретению, связывающие ΤΝΕΚ1. В одном из воплощений мультивалентный антагонист ΤΝΕΚ1, по существу, не оказывает антагонистическое действие в отношении ΤΝΕΚ1 (действует в качестве агониста ΤΝΕΚ1) в стандартном клеточном анализе (т.е. когда он представлен в концентрации 1, 10, 100 нМ, 1 мкМ, 10, 100, 1000 или 5000 мкМ, тогда он приводит в результате к не более чем приблизительно 5% опосредованной ΤΝΕΚ1 активности, индуцированной ΤΝΕα (100 пг/мл) в анализе).
В некоторых воплощениях мультивалентный антагонист ΤΝΕΚ1 содержит два или более чем два сайта связывания желаемого эпитопа или домена ΤΝΕΚ1. Например, мультивалентный антагонист ΤΝΕΚ1 может содержать два или более чем два сайта связывания, которые связываются одним и тем же эпитопом в домене 1 в ΤΝΕΚ1.
В других воплощениях мультивалентный антагонист ΤΝΕΚ1 содержит два или более чем два сайта связывания, обеспечиваемые полипептидами или бАЬ по изобретению, которые связываются с различными эпитопами или доменами в ΤΝΕΚ1. В одном из воплощений такие мультивалентные антагонисты не оказывают агонистического действия в отношении ΤΝΕΚ1, когда представлены в концентрации приблизительно 1 нМ, или приблизительно 10 нМ, или приблизительно 100 нМ, или приблизительно 1 мкМ, или приблизительно 10 мкМ, в стандартном анализе цитотоксичности Ь929 или стандартном анализе НеЬа 1Ь-8, как описано в \УО 2006038027.
Другие антагонисты ΤΝΕΚ1 не ингибируют связывание ΤΝΕα с ΤΝΕΚ1. Такие лиганды (и антагонисты) могут обладать полезностью в качестве диагностических агентов, поскольку они могут быть использованы для связывания и обнаружения, количественного определения или измерения ΤΝΕΚ1 в образце, и не конкурируют с ΤΝΕ в образце за связывание с ΤΝΕΚ1. Соответственно, может быть осуществлено точное определение того, присутствует ли или сколько присутствует ΤΝΕΚ1 в образце.
В других воплощениях полипептид, бАЬ или антагонист специфически связывается с ΤΝΕΚ1 с описанной здесь Ии и ингибирует летальность в стандартной модели септического шока у мышей, вызванной ЬР8 (липополисахарид)/б-галактозамином (т.е. предотвращает летальность или уменьшает летальность по меньшей мере приблизительно на 10% по сравнению с подходящим контролем). В одном из воплощений полипептид, бАЬ или антагонист ингибирует летальность по меньшей мере приблизительно на 25% или по меньшей мере приблизительно на 50% по сравнению с подходящим контролем в стандартной модели септического шока у мышей, вызванной ЬР8/П-галактозамином, при введении в концентрации приблизительно 5 мг/кг или больше, например приблизительно 1 мг/кг.
В других воплощениях полипептид, бАЬ или антагонист связывается с ΤΝΕΚ1 и оказывает антагонистическое действие в отношении активности ΤΝΕΚ1 в стандартном клеточном анализе с ΝΌ50 не более 100 нМ, и в концентрации не более 10 мкМ бАЬ оказывает агонистическое действие в отношении активности ΤΝΕΚ1 не более чем на 5% в анализе.
В конкретных воплощениях полипептид, бАЬ или антагонист, по существу, не оказывает антагонистического действия в отношении ΤΝΕΚ1 (действует в качестве агониста ΤΝΕΚ1) в стандартном клеточном анализе (т.е. когда представлен в концентрации 1, 10, 100 нМ, 1 мкМ, 10, 100, 1000 или 5000 мкМ, приводя в результате к не более чем приблизительно 5% опосредованной ΤΝΕΚ1 активности, индуцированной ΤΝΕα (100 пг/мл) в анализе).
В некоторых воплощениях полипептид, бАЬ или антагонист по изобретению являются эффективными в модели хронических воспалительных заболеваний, когда вводят эффективное количество. Как правило, эффективное количество составляет от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг (например, приблизительно 1 мг/кг, приблизительно 2 мг/кг, приблизительно 3 мг/кг, приблизительно 4 мг/кг, приблизительно 5 мг/кг, приблизительно 6 мг/кг, приблизительно 7 мг/кг, приблизительно 8 мг/кг, приблизительно 9 мг/кг или приблизительно 10 мг/кг). Модели хронического воспалительного заболевания (см. описанные в \УО 2006038027) признаны специалистами в данной области техники в качестве моделей, прогнозирующих терапевтическую эффективность у людей.
В конкретных воплощениях полипептид, бАЬ или антагонист эффективен в стандартной модели индуцированного коллагеном артрита у мышей (подробную информацию о модели см. в
- 35 018723 \УО 2006038027). Например, введение эффективного количества полипептида, ЙАЬ или антагониста может уменьшить среднюю оценку артрита после суммирования для четырех конечностей в стандартной модели индуцированного коллагеном артрита у мышей на величину, составляющую, например, от приблизительно 1 до приблизительно 16, от приблизительно 3 до приблизительно 16, от приблизительно 6 до приблизительно 16, от приблизительно 9 до приблизительно 16 или от приблизительно 12 до приблизительно 16 по сравнению с подходящим контролем. В еще одном примере введение эффективного количества полипептида, ЙАЬ или антагониста может замедлить появление симптомов артрита в стандартной модели индуцированного коллагеном артрита у мышей на величину, составляющую, например, приблизительно 1 сутки, приблизительно 2 суток, приблизительно 3 суток, приблизительно 4 суток, приблизительно 5 суток, приблизительно 6 суток, приблизительно 7 суток, приблизительно 10 суток, приблизительно 14 суток, приблизительно 21 сутки или приблизительно 28 суток по сравнению с подходящим контролем. В еще одном примере введение эффективного количества полипептида, ЙАЬ или антагониста может привести в результате к средней оценке артрита в результате суммирования для четырех конечностей в стандартной модели индуцированного коллагеном артрита у мышей, составляющей от 0 до приблизительно 3, от приблизительно 3 до приблизительно 5, от приблизительно 5 до приблизительно 7, от приблизительно 7 до приблизительно 15, от приблизительно 9 до приблизительно 15, от приблизительно 10 до приблизительно 15, от приблизительно 12 до приблизительно 15 или от приблизительно 14 до приблизительно 15.
В других воплощениях полипептид, ЙАЬ или антагонист эффективен в ΔΑΚΕ модели артрита у мышей (подробную информацию о модели см. в \УО 2006038027). Например, введение эффективного количества полипептида, ЙАЬ или антагониста может уменьшить среднюю оценку артрита в ΔΑΚΕ модели артрита у мышей на величину, составляющую, например, от приблизительно 0,1 до приблизительно 2,5, от приблизительно 0,5 до приблизительно 2,5, от приблизительно 1 до приблизительно 2,5, от приблизительно 1,5 до приблизительно 2,5 или от приблизительно 2 до приблизительно 2,5 по сравнению с подходящим контролем. В еще одном примере введение эффективного количества полипептида, ЙАЬ или антагониста может замедлить появление симптомов артрита в ΔΑΚΕ модели артрита у мышей на величину, составляющую, например, приблизительно 1 сутки, приблизительно 2 суток, приблизительно 3 суток, приблизительно 4 суток, приблизительно 5 суток, приблизительно 6 суток, приблизительно 7 суток, приблизительно 10 суток, приблизительно 14 суток, приблизительно 21 сутки или приблизительно 28 суток по сравнению с подходящим контролем. В еще одном примере введение эффективного количества полипептида, ЙАЬ или антагониста может привести в результате к средней оценке артрита в ΔΑΚΕ модели артрита у мышей, составляющей от 0 до приблизительно 0,5, от приблизительно 0,5 до приблизительно 1, от приблизительно 1 до приблизительно 1,5, от приблизительно 1,5 до приблизительно 2, или от приблизительно 2 до приблизительно 2,5.
В других воплощениях полипептид, ЙАЬ или антагонист эффективен в ΔΑΚΕ модели воспалительного заболевания кишечника (ΙΒΌ) у мышей (подробную информацию о модели см. в \УО 2006038027). Например, введение эффективного количества полипептида, άΑЬ или антагониста может уменьшить среднюю оценку острого и/или хронического воспаления в ΔΑΚΕ модели ΙΒΌ у мышей на величину, составляющую, например, от приблизительно 0,1 до приблизительно 2,5, от приблизительно 0,5 до приблизительно 2,5, от приблизительно 1 до приблизительно 2,5, от приблизительно 1,5 до приблизительно 2,5, или от приблизительно 2 до приблизительно 2,5 по сравнению с подходящим контролем. В еще одном примере введение эффективного количества полипептида, άΑЬ или антагониста может замедлить появление симптомов ΙΒΌ в ΔΑΚΕ модели ΙΒΌ на величину, составляющую, например, приблизительно 1 сутки, приблизительно 2 суток, приблизительно 3 суток, приблизительно 4 суток, приблизительно 5 суток, приблизительно 6 суток, приблизительно 7 суток, приблизительно 10 суток, приблизительно 14 суток, приблизительно 21 сутки или приблизительно 28 суток по сравнению с подходящим контролем. В еще одном примере введение эффективного количества полипептида, άΑЬ или антагониста может привести в результате к средней оценке острого и/или хронического воспаления в ΔΑΚΕ модели ΙΒΌ, составляющей от 0 до приблизительно 0,5, от приблизительно 0,5 до приблизительно 1, от приблизительно 1 до приблизительно 1,5, от приблизительно 1,5, до приблизительно 2 или от приблизительно 2 до приблизительно 2,5.
В других воплощениях полипептид, άΑЬ или антагонист эффективен в модели ΙΒΌ (воспалительного заболевания кишечника) у мышей, вызванной натрия декстрансульфатом (Ό88) (подробную информацию о модели см. в \УО 2006038027). Например, введение эффективного количества полипептида, άΑЬ или антагониста может уменьшать среднюю оценку тяжести в вызванной Ό88 модели ΙΒΌ у мышей, например, на величину, составляющую от приблизительно 0,1 до приблизительно 2,5, от приблизительно 0,5 до приблизительно 2,5, от приблизительно 1 до приблизительно 2,5, от приблизительно 1,5 до приблизительно 2,5, или от приблизительно 2 до приблизительно 2,5 по сравнению с подходящим контролем. В еще одном примере введение эффективного количества полипептида, άΑЬ или антагониста может замедлять возникновение симптомов ΙΒΌ в вызванной Ό88 модели ΙΒΌ у мышей, например, приблизительно на 1 сутки, приблизительно 2 суток, приблизительно 3 суток, приблизительно 4 суток, приблизи- 36 018723 тельно 5 суток, приблизительно 6 суток, приблизительно 7 суток, приблизительно 10 суток, приблизительно 14 суток, приблизительно 21 сутки или приблизительно 28 суток по сравнению с подходящим контролем. В еще одном примере введение эффективного количества полипептида, бАЬ или антагониста может приводить в результате к средней оценке тяжести в вызванной Ό88 модели ΙβΌ у мышей, составляющей от 0 до приблизительно 0,5, от приблизительно 0,5 до приблизительно 1, от приблизительно 1 до приблизительно 1,5, от приблизительно 1,5 до приблизительно 2 или от приблизительно 2 до приблизительно 2,5.
В конкретных воплощениях полипептид, бАЬ или антагонист эффективен в вызванной табачным дымом модели хронического обструктивного заболевания легких (СОРЭ) (подробную информацию о модели см. в \УО 2006038027 и \УО 2007049017). Например, введение эффективного количества лиганда может уменьшать или замедлять возникновение симптомов СОРЭ по сравнению с подходящим контролем.
Имеются модельные системы на животных, которые можно использовать для скрининга эффективности антагонистов ΤΝΕΚ1 (например, лигандов, антител или связывающихся с ними белков) в предотвращении или лечении заболеваний. В области техники известны методы тестирования системной красной волчанки (8ЬЕ) на восприимчивых мышах (Кшдй! е! а1. (1978), 1. Ехр. Меб., 147: 1653; Кетегк!еп е! а1. (1978), №\ν Епд. 1. Меб., 299: 515). Злокачественную миастению (МО) тестируют на самках мышей 81Ь/1, индуцируя заболевание растворимым белком АсйК из другого вида (Ьтбйгот е! а1. (1988), Абν. Iттиηο1., 42: 233). Артрит у восприимчивой линии мышей вызывают введением коллагена II типа (8!иат1 е! а1. (1984), Апп. Кем. Iттиηο1., 42: 233). Описана модель, в которой адъювантный артрит у восприимчивых крыс вызывают введением белка теплового шока микобактерий (Уап Ебеп е! а1. (1988), №11иге. 331: 171). Тиреоидит у мышей вызывают введением тироглобулина, как описано (Маган е! а1. (1980), 1. Ехр. Меб., 152: 1115). Инсулинозависимый сахарный диабет (ГОЭМ) возникает естественным образом или может быть вызван у определенных линий мышей типа тех, что описаны в Капака^а е! а1. (1984), ПхаЬеФкдха, 27: 113. ЕАЕ у мышей и крыс служит моделью рассеянного склероза (М8) у человека. В этой модели демиелинизирующее заболевание вызывается введением основного белка миелина (см. Раΐе^8οη (1986), ΤеxΐЬοοк ο£ IттиηοраΐЬο1οду, М18сбег е! а1., ебк., Сгипе апб 81га1Юп, №\ν ΥογΚ, р. 179213; МсРагИпе!а1. (1973), 8с1епсе, 179: 478; 8аЮЬе!а1. (1987), 1. Iттиηο1., 138: 179).
Как правило, лиганды по настоящему изобретению (например, антагонисты) будут использоваться в очищенной форме вместе с фармакологически приемлемыми носителями. Обычно эти носители включают водные или спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, любые среды, включающие физиологический раствор, и/или буферные среды. Парентеральные разбавители включают раствор хлорида натрия, декстрозный раствор Рингера, декстрозу и хлорид натрия и раствор Рингера с лактатом. Подходящие физиологически приемлемые адъюванты, при необходимости хранения полипептидного комплекса в суспензии, могут быть выбраны из таких загустителей, как карбоксиметилцеллюлоза, поливинилпирролидон, желатин и альгинаты.
Внутривенные разбавители включают жидкость, питательные добавки и электролитные добавки, такие как разбавители на основе декстрозного раствора Рингера. Также могут присутствовать консерванты и другие добавки, такие как антимикробные средства, антиоксиданты, хелатирующие агенты и инертные газы (Маск (1982), КеттдФп'к Рйагтасеибса1 8с1епсек, 16-е издание). Можно использовать различные подходящие композиции, включая композиции с длительным высвобождением.
Лиганды (например, антагонисты) по настоящему изобретению могут быть использованы в виде вводимых по отдельности композиций или вместе с другими агентами. Они могут включать различные иммунотерапевтические лекарственные средства, такие как циклоспорин, метотрексат, адриамицин или цисплатин, и иммунотоксины. Фармацевтические композиции могут включать коктейли различных цитотоксических или других агентов вместе с лигандами по настоящему изобретению или даже комбинациями лигандов по настоящему изобретению, имеющих различные специфичности, таких как лиганды, селектированные с использованием различных целевых антигенов или эпитопов, независимо от того, объединены они перед введением или нет.
Путь введения фармацевтических композиций по изобретению может представлять собой любой из путей, хорошо известных средним специалистам в данной области техники. Что касается терапии, включая, но не ограничиваясь этим, иммунотерапию, то селектированные лиганды по изобретению могут быть введены любому пациенту в соответствии со стандартными методиками.
Введение может быть осуществлено любым подходящим способом, в том числе парентерально, внутривенно, внутримышечно, интраперитонеально, трансдермально, через легочный путь или соответственно также посредством прямой инфузии с использованием катетера. Дозировка и частота введения будут зависеть от возраста, пола и состояния пациента, совместного введения других лекарственных средств, противопоказаний и других параметров, которые должны быть учтены практикующим врачом. Введение может быть локальным (например, локальная доставка в легкое путем внутрилегочного введения, например интраназального введения) или системным, по показаниям.
Лиганды по данному изобретению могут быть лиофилизированы для хранения и повторного разведения в подходящем носителе перед применением. Показано, что эта методика эффективна для традиционных иммуноглобулинов и что могут быть использованы известные в данной области методики лиофи- 37 018723 лизации и разведения. Специалистам в данной области техники будет понятно, что лиофилизация и разведение могут приводить к потере антителами активности в различной степени (например, что касается традиционных иммуноглобулинов, то ΙβΜ антитела имеют тенденцию к большей потере активности, чем
1дС антитела) и что используемые уровни, возможно, следует коррелировать с целью компенсации.
Композиции, содержащие лиганды по настоящему изобретению (например, антагонисты), или их коктейль, можно вводить для профилактического и/или терапевтического лечения. В некоторых терапевтических применениях адекватное количество, необходимое для достижения, по меньшей мере, частичного ингибирования, подавления, модуляции, киллинга или какого-либо другого измеряемого параметра популяции выбранных клеток, определяют как терапевтически эффективную дозу. Количества, необходимые для достижения этой дозировки, будут зависеть от тяжести заболевания и общего состояния иммунной системы пациента, но обычно варьируют от 0,005 до 5,0 мг лиганда, например бАЬ или антагониста, на 1 кг массы тела, где чаще всего используют дозы от 0,05 до 2,0 мг/кг/доза. В случае профилактических применений композиции, содержащие лиганды по настоящему изобретению или их коктейли, также можно вводить в похожих или несколько меньших дозировках для предупреждения, ингибирования или задержки начала заболевания (например, для поддержания ремиссии или бессимптомного состояния, либо для предупреждения острой фазы). Практикующий врач сможет определить подходящий интервал дозирования для лечения, подавления или предупреждения заболевания. Когда лиганд ΤΝΕΡ1 (например, антагонист) вводят для лечения, подавления или предупреждения хронического воспалительного заболевания, тогда его можно вводить вплоть до четырех раз в сутки, два раза в неделю, один раз в неделю, один раз каждые две недели, один раз в месяц или один раз каждые два месяца в дозе, например, от примерно 10 мкг/кг до примерно 80 мг/кг, от примерно 100 мкг/кг до примерно 80 мг/кг, от примерно 1 до примерно 80 мг/кг, от примерно 1 до примерно 70 мг/кг, от примерно 1 до примерно 60 мг/кг, от примерно 1 до примерно 50 мг/кг, от примерно 1 до примерно 40 мг/кг, от примерно 1 до примерно 30 мг/кг, от примерно 1 до примерно 20 мг/кг, от примерно 1 до примерно 10 мг/кг, от примерно 10 до примерно 10 мг/кг, от примерно 10 мкг/кг до примерно 5 мг/кг, от примерно 10 мкг/кг до примерно 2,5 мг/кг, примерно 1 мг/кг, примерно 2, примерно 3, примерно 4, примерно 5, примерно 6, примерно 7, примерно 8, примерно 9 или примерно 10 мг/кг. В конкретных воплощениях лиганд ΤΝΕΡ1 (например, антагонист) вводят для лечения, подавления или предупреждения хронического воспалительного заболевания один раз в неделю или один раз в месяц в дозе от примерно 10 мкг/кг до примерно 10 мг/кг (например, примерно 10, примерно 100 мкг/кг, примерно 1 мг/кг, примерно 2, примерно 3, примерно 4, примерно 5, примерно 6, примерно 7, примерно 8, примерно 9 или примерно 10 мг/кг).
Лечение или терапия, проведенные с использованием композиций, описанных в данном изобретении, считаются эффективными, если один или более симптомов ослабляются (например, по меньшей мере на 10% или по меньшей мере на один пункт по шкале клинической оценки) относительно таких симптомов, присутствующих до лечения, или относительно таких симптомов у индивидуума (человека или модельного животного), не подвергнутого лечению такой композицией или другим подходящим контролем. Конечно, симптомы будут варьировать в зависимости от целевого заболевания или расстройства, но могут быть оценены практикующим врачом или специалистом средней квалификации. Такие симптомы могут быть оценены, например, посредством мониторинга уровня одного или более биохимических индикаторов заболевания или расстройства (например, уровней фермента или метаболита, которые коррелируют с данным заболеванием, количеств пораженных клеток и т.д.), посредством мониторинга физических проявлений (например, воспаления, размера опухоли и т.д.) или согласно принятой шкале клинической оценки, например, расширенной шкале инвалидизации (Ехрапбеб Э/пЬИНу 81а1и§ 8са1е (ЕИ88)) (для множественного склероза), опроснику Ирвина больных воспалительным заболеванием кишечника (Чгипе 1пГ1атта1огу Во\\е1 И^еаке Риейюппане) (32 вопроса позволяют оценить качество жизни в отношении кишечной функции, системных симптомов, социальной функции и эмоционального статуса - оценка варьирует от 32 до 224 баллов, при этом более высокие баллы указывают на лучшее качество жизни), шкале оценки качества жизни больных ревматоидным артритом (ОнаШу оГ Ь1Ге РНента1оИ АгЙпЩ 8са1е) или другой приемлемой шкале клинической оценки, известной в данной области.
Длительное (например, в течение одних суток или более, или еще дольше) ослабление симптомов заболевания или расстройства по меньшей мере на 10% или по меньшей мере на один или более пунктов по данной клинической шкале является показателем эффективного лечения. Аналогично, профилактика, осуществляемая с использованием композиции, описанной в данном изобретении, является эффективной, если начало или тяжесть одного или более чем одного симптома замедляется, уменьшается или исчезает по сравнению с такими симптомами у аналогичного индивидуума (человека или животной модели), не подвергнутого лечению данной композицией.
Композиция, содержащая лиганд (например, антагонист) или его коктейль по настоящему изобретению, может быть использована в профилактических и терапевтических целях для изменения, инактивации, киллинга или удаления выбранной популяции целевых клеток у млекопитающего. В дополнение к этому, выбранные репертуары полипептидов, описанных в данном изобретении, могут быть использованы экстракорпорально или селективно ίη νίΙΐΌ для киллинга, истощения или иного эффективного удаления популяции целевых клеток из гетерогенной коллекции клеток. Кровь млекопитающего можно объе
- 38 018723 динить экстракорпорально с лигандами, посредством чего нежелательные клетки подвергаются уничтожению или иным образом удаляются из крови для возврата млекопитающему в соответствии со стандартными методиками.
Композиция, содержащая лиганд (например, антагонист) по настоящему изобретению, может быть использована в профилактических и терапевтических целях для изменения, инактивации, уничтожения или удаления выбранной популяции целевых клеток у млекопитающего.
Лиганды (например, антагонисты ΤΝΡΡ1, мономеры бАЬ) могут быть введены и/или приготовлены вместе с одним или более чем одним дополнительным терапевтическим или активным агентом. Когда лиганд (например, бАЬ) вводят с дополнительным терапевтическим агентом, тогда указанный лиганд может быть введен до, одновременно или после введения дополнительного агента. Как правило, лиганд и дополнительный агент вводят способом, обеспечивающим перекрывание терапевтического эффекта.
В одном из воплощений изобретение относится к способу лечения, подавления или предупреждения хронического воспалительного заболевания, включающему введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективной(го) дозы или количества полипептида, бАЬ или антагониста ΤΝΡΡ1 по изобретению.
В одном из воплощений изобретение относится к способу лечения, подавления или предупреждения артрита (например, ревматоидного артрита, ювенильного ревматоидного артрита, анкилозирующего спондилита, псориатического артрита), включающему введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективной(го) дозы или количества полипептида, бАЬ или антагониста ΤΝΡΡ1 по изобретению.
В другом воплощении изобретение относится к способу лечения, подавления или предупреждения псориаза, включающему введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективной(го) дозы или количества полипептида, бАЬ или антагониста ΤΝΡΡ1 по изобретению.
В другом воплощении изобретение относится к способу лечения, подавления или предупреждения воспалительного заболевания кишечника (например, болезни Крона, язвенного колита), включающему введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективной(го) дозы или количества полипептида, бАЬ или антагониста ΤΝΡΡ1 по изобретению.
В другом воплощении изобретение относится к способу лечения, подавления или предупреждения хронического обструктивного заболевания легких (например, хронического бронхита, хронического обструктивного бронхита, эмфиземы), включающему введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективной(го) дозы или количества полипептида, бАЬ или антагониста ΤΝΡΡ1 по изобретению.
В другом воплощении изобретение относится к способу лечения, подавления или предупреждения пневмонии (например, бактериальной пневмонии, такой как стафилококковая пневмония), включающему введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективной(го) дозы или количества полипептида, бАЬ или антагониста ΤΝΡΡ1 по изобретению.
В изобретении предложен способ лечения, подавления или предупреждения других заболеваний легких в дополнение к хроническому обструктивному заболеванию легких и пневмонии. Другие заболевания легких, которые можно лечить, подавлять или предупреждать в соответствии с изобретением, включают, например, муковисцидоз и астму (например, стероид-резистентную астму). Таким образом, в другом воплощении изобретение относится к способу лечения, подавления или предупреждения заболевания легких (например, муковисцидоза, астмы), включающему введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективной(го) дозы или количества полипептида, бАЬ или антагониста ΤΝΡΡ1 по изобретению.
В конкретных воплощениях антагонист ΤΝΡΡ1 вводят посредством внутрилегочной доставки, такой как ингаляция (например, внутрибронхиальная, интраназальная или пероральная ингаляция, интраназальные капли), или посредством системной доставки (например, парентеральной, внутривенной, внутримышечной, интраперитонеальной, подкожной).
В другом воплощении изобретение относится к способу лечения, подавления или предупреждения септического шока, включающему введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективной(го) дозы или количества полипептида, бАЬ или антагониста ΤΝΡΡ1 по изобретению.
В другом аспекте изобретения предложена композиция, содержащая полипептид, бАЬ или антагонист ΤΝΡΡ1 по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент.
Кроме того, согласно настоящему изобретению предложен способ лечения заболевания с использованием полипептида, бАЬ или антагониста ΤΝΡΡ1 либо композиции по настоящему изобретению. В одном из воплощений заболевание представляет собой рак или воспалительное заболевание, например ревматоидный артрит, астму или болезнь Крона.
- 39 018723
Форматы
Увеличенный период полувыведения полезен для применений ίη νίνο иммуноглобулинов, особенно антител и в особенности фрагментов антител небольшого размера. Такие фрагменты (Εν, связанные дисульфидной связью Εν, Εαό, ^Εν, бЛЬ) подвергаются быстрому клиренсу из организма; таким образом, несмотря на то, что они способны быстро достигать большинства частей организма, их можно быстро получить и с ними легче работать, их применения ίη νίνο были ограничены только их непродолжительной персистенцией ίη νίνο. Одно из воплощений изобретения решает эту проблему путем обеспечения увеличенного периода полувыведения лигандов ίη νίνο и, следовательно, более длительного сохранения в организме функциональной активности лиганда.
Методы фармакокинетического анализа и определения периода полувыведения лиганда хорошо известны специалистам в данной области техники. Подробности можно найти в ΚβηηβΐΗ, А. с1 а1.: Сйеш1са1 81аЬ1111у οί РкагтасеибсаК А Ηαηάόοοί £ογ РНагтасБг, и в Ре1ег8 е1 а1., Ρ1ι;·ιπη;κο1<ίικΙχ аш-булх А Ргас11са1 ЛрргоасН (1996). Также дана ссылка на ΡΗαι^α^Γί^ίκδ, Μ. Οίόαίάί & Ό. Регтом, опубликованную Μа^се1 Эеккег, 2'1 Яеν. ех ебНю!! (1982), где описаны такие фармакокинетические параметры, как периоды полувыведения ΐ-альфа и 1-бета и площадь под кривой (АИС).
Периоды полувыведения (ΐ'/2 альфа и ΐ'/2 бета) и АИС можно определить из кривой зависимости концентрации лиганда в сыворотке от времени. Для моделирования кривой можно использовать пакет программ \νίηΝοη1ίη (фирмы РНаглДи Согр., ΜοιιηΙηίη У1ете, СА94040, И8А). В первой фазе (альфа-фазе) лиганд в основном подвергается распределению в организме пациента с некоторой элиминацией. Вторая фаза (бета-фаза) представляет собой конечную фазу, когда лиганд уже распределен и концентрация в сыворотке уменьшается по мере того, как лиганд выводится из организма пациента. Период полувыведения ΐ-альфа представляет собой период полувыведения в первой фазе, а период полувыведения ΐ-бета представляет собой период полувыведения во второй фазе. Таким образом, в одном из воплощений согласно настоящему изобретению предложены лиганд или композиция, содержащая лиганд по изобретению, с периодом полувыведения ΐ-альфа в диапазоне 15 мин или больше. В одном из воплощений нижняя граница диапазона составляет 30, 45 мин, 1 ч, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 11 или 12 ч. В дополнение к этому, или альтернативно, лиганд или композиция по изобретению будут иметь период полувыведения ΐ-альфа в диапазоне до 12 ч включительно. В одном из воплощений верхняя граница диапазона составляет 11, 10,
9, 8, 7, 6 или 5 ч. Примером подходящего диапазона является диапазон от 1 до 6 ч, от 2 до 5 ч или от 3 до 4 ч.
В одном из воплощений согласно настоящему изобретению предложены лиганд (полипептид, бАЬ или антагонист) или композиция, содержащая лиганд по изобретению, с периодом полувыведения ΐ-бета в диапазоне 2,5 ч или больше. В одном из воплощений нижняя граница диапазона составляет 3, 4, 5, 6, 7,
10, 11 или 12 ч. В дополнение к этому, или альтернативно, лиганд или композиция по изобретению имеют период полувыведения ΐ-бета в диапазоне до 21 суток включительно. В одном из воплощений верхняя граница диапазона составляет 12, 24 ч, 2 суток, 3, 5, 10, 15 или 20 суток. В одном из воплощений лиганд или композиция по изобретению будут иметь период полувыведения ΐ-бета в диапазоне от 12 до 60 ч. В другом воплощении он будет лежать в диапазоне от 12 до 48 ч. В еще одном воплощении он будет лежать в диапазоне от 12 до 26 ч.
В дополнение к этому или в противоположность приведенным выше критериям, согласно настоящему изобретению предложены лиганд или композиция, содержащая лиганд по изобретению, имеющие величину АИС (площадь под кривой) в диапазоне 1 мг-мин/мл или больше. В одном из воплощений нижняя граница диапазона составляет 5, 10, 15, 20, 30, 100, 200 или 300 мг-мин/мл. В дополнение к этому, или альтернативно, лиганд или композиция по изобретению имеют АИС в диапазоне до 600 мг-мин/мл. В одном из воплощений верхняя граница диапазона составляет 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 или 50 мг-мин/мл. В одном из воплощений лиганд по изобретению будет иметь АИС в диапазоне, выбранном из группы, состоящей из следующего: 15-150, 15-100, 15-75 и 15-50 мг-мин/мл.
Полипептиды и бАЬ по изобретению и антагонисты, содержащие их, могут быть представлены в формате с большим гидродинамическим размером, например, посредством присоединения ПЭГ (полиэтиленгликоль) группы, сывороточного альбумина, трансферрина, рецептора трансферрина или, по меньшей мере, его трансферрин-связывающей части, Гс-области антитела, или посредством конъюгирования с доменом антитела. Например, полипептиды, бАЬ и антагонисты были форматированы в виде более крупного антигенсвязывающего фрагмента антитела или в виде антитела (например, форматированы в виде Επό, Επό', ЦаЬ)2, ЦаЬ'Г, ΙβΟ, ^Εν).
Гидродинамический размер лигандов (например, мономеров и мультимеров бАЬ) по изобретению может быть определен с использованием способов, которые хорошо известны в данной области техники. Например, для определения гидродинамического размера лиганда может быть использована гельфильтрационная хроматография. Матрицы, подходящие для гель-фильтрационного определения гидродинамических размеров лигандов, такие как поперечносшитые агарозные матрицы, хорошо известны и легко доступны.
Размер формата лиганда (например, размер ПЭГ группировки, присоединенной к мономеру бАЬ),
- 40 018723 можно варьировать в зависимости от желаемого применения. Например, когда лиганд, как предполагают, удаляется из кровообращения и проникает в периферические ткани, то желательно поддерживать гидродинамический размер лиганда достаточно низким для того, чтобы облегчить выход из кровотока. Альтернативно, когда желательно, чтобы лиганд оставался в системном кровообращении в течение более продолжительного периода времени, тогда размер лиганда можно увеличить, например, путем форматирования в виде Ιβ-подобного белка.
Увеличение периода полувыведения путем конъюгирования с антигеном или эпитопом, который увеличивает период полувыведения ш νί\Ό
Гидродинамический размер лиганда и период его полувыведения из сыворотки также могут быть увеличены путем конъюгирования или присоединения ΤNΕΒ1-связывающего полипептида, ЙАЬ или антагониста по изобретению к связывающему домену (например, антителу или фрагменту антитела), который связывается с антигеном или эпитопом, который увеличивает период полувыведения ш νίνΌ, как описано в данном изобретении. Например, Т№В1-связывающий агент (например, полипептид) может быть конъюгирован или связан с антителом или фрагментом антитела против сывороточного альбумина или против неонатального Ес-рецептора, например ЙАЬ, ЕаЬ, ЕаЬ' или 5сΕν против 8А или против неонатального Ес-рецептора, или с аффителом против 8А или аффителом против неонатального Ес-рецептора, или авимером против 8А, или связывающим доменом против 8А, который содержит каркас, выбранный, но предпочтительно не ограниченный этим, из группы, состоящей из СТБА-4, липокалина, 8рА, аффитела, авимера, 6гоЕ1 и фибронектина (см. РСТ/СВ2008/000453, поданную 8 февраля 2008 г., в которой описаны эти связывающие домены, при этом указанные домены и их последовательности включены в данную заявку посредством ссылки и образуют часть описания настоящего изобретения). Конъюгирование относится к композиции, содержащей полипептид, ЙАЬ или антагонист по изобретению, которые связываются (ковалентно или нековалентно) со связывающим доменом, который связывается с сывороточным альбумином.
Подходящие полипептиды, которые увеличивают период полувыведения из сыворотки ш гБо, включают, например, белки слияния лиганда, специфичного к рецептору трансферрина, и нейрофармацевтического агента (см. патент США № 5977307, содержание которого включено в данное описание посредством ссылки), рецептор эндотелиальных клеток капилляров головного мозга, трансферрин, рецептор трансферрина (например, растворимый рецептор трансферрина), инсулин, рецептор инсулиноподобного ростового фактора 1 (1ОЕ 1), рецептор инсулиноподобного ростового фактора 2 (ЮЕ 2), рецептор инсулина, фактор свертывания крови X, а1-антитрипсин и НПЕ 1α (ядерный фактор гепатоцитов 1α). Подходящие полипептиды, которые увеличивают период полувыведения из сыворотки, также включают альфа-1-гликопротеин (орозомукоид; ААС), альфа-1-антихимотрипсин (АСТ), альфа-1микроглобулин (белок НС; АЫ), антитромбин III (АТ III), аполипопротеин А-1 (Аро А-1), аполипопротеин В (Аро В), церулоплазмин (Ср), компонент комплемента С3 (С3), компонент комплемента С4 (С4), ингибитор эстеразы С1 (С1 £ΝΗ), С-реактивный белок (СВР), ферритин (ЕЕВ), гемопексин (НРХ), липопротеин^) (Бр(а)), маннозасвязывающий белок (МВР), миоглобин (Муо), преальбумин (транстиретин; РАБ), ретинолсвязывающий белок (ВВР) и ревматоидный фактор (ВЕ).
Подходящие белки внеклеточного матрикса включают, например, коллагены, ламинины, интегрины и фибронектин. Коллагены являются основными белками внеклеточного матрикса. В настоящее время известно около 15 типов коллагеновых молекул, обнаруженных в различных частях организма, например коллаген I типа (составляющий 90% коллагена организма), обнаруженный в костях, коже, сухожилиях, связках, роговице, внутренних органах, или коллаген II типа, обнаруженный в хряще, позвоночном диске, хорде и стекловидном теле глаза.
Подходящие белки крови включают, например, белки плазмы (например, фибрин, α-2макроглобулин, сывороточный альбумин, фибриноген (например, фибриноген А, фибриноген В), сывороточный амилоидный белок А, гаптоглобин, профилин, убиквитин, утероглобулин и β-2микроглобулин), ферменты и ингибиторы ферментов (например, плазминоген, лизоцим, цистатин С, альфа-1-антитрипсин и панкреатический ингибитор трипсина), белки иммунной системы, такие как иммуноглобулиновые белки (например, ЦА, Iд^, IдЕ, ЦО, IдΜ, легкие цепи (каппа/лямбда) иммуноглобулинов), транспортные белки (например, ретинолсвязывающий белок, α-1-микроглобулин), дефензины (например, бета-дефензин 1, дефензин нейтрофилов 1, дефензин нейтрофилов 2 и дефензин нейтрофилов 3) и т.п.
Подходящие белки, обнаруженные в гематоэнцефалическом барьере или в нервной ткани, включают, например, рецептор меланокортина, миелин, переносчик аскорбата и т.п.
Подходящие полипептиды, которые увеличивают период полувыведения из сыворотки ш гБо, также включают белки, локализованные в почке (например, полицистин, коллаген IV типа, переносчик органических анионов Кф антиген Хейманна), белки, локализованные в печени (например, алкогольдегидрогеназу, С250), белки, локализованные в легком (например, секреторный компонент, который связывается с ^А), белки, локализованные в сердце (например, Н8Р (белок теплового шока) 27, который ассоциируется с дилатационной кардиомиопатией), белки, локализованные в коже (например, кератин), ос- 41 018723 теоспецифические белки, такие как (костные) морфогенные белки (ВМР), которые представляют собой подгруппу суперсемейства белков трансформирующего ростового фактора β, демонстрирующих остеогенную активность (например, ВМР-2, ВМР-4, ВМР-5, ВМР-6, ВМР-7, ВМР-8), опухолеспецифические белки (например, трофобластный антиген, герцептиновый рецептор, эстрогеновый рецептор, катепсины (например, катепсин В, который можно обнаружить в печени и селезенке)).
Подходящие белки, специфические для заболевания, включают, например, антигены, экспрессируемые только на активированных Т-клетках, включая ЬАС-3 (ген активации лимфоцитов), лиганд остеопротегерина (ОРСЬ; см. №11иге 402, 304-309 (1999)), ОХ40 (член семейства рецепторов ЮТ, экспрессирующийся на активированных Т-клетках и специфически активируемый в Т-клетках человека, продуцирующих вирус лейкоза типа I (ΗΤΕΥ-Ι); см. 1ттипо1. 165 (1): 263-70 (2000)). Подходящие белки, специфические для заболевания, также включают, например, металлопротеазы (ассоциированные с артритом/видами рака), включая СС6512 дрозофилы (ЭгокорШа), параплегии человека, ЕйН человека, АЕС3Ь2 человека, й&Н мыши; и ангиогенные ростовые факторы, включая кислотный фактор роста фибробластов (ЕСЕ-1), основный фактор роста фибробластов (ЕСЕ-2), фактор роста сосудистого эндотелия/фактор проницаемости сосудов (УЕСЕ/УРЕ), трансформирующий фактор роста-α (ТСЕа), фактор некроза опухолей-альфа (ΤNЕ-α), ангиогенин, интерлейкин-3 (1Ь-3), интерлейкин-8 (1Ь-8), тромбоцитарный эндотелиальный фактор роста (РЭ-ЕССЕ), плацентарный ростовой фактор (Р1СЕ), фактор роста тромбоцитов(РОСЕ)-ВВ мидкин (т1бк1пе) и фракталкин (Егас!а1к1пе).
Подходящие полипептиды, увеличивающие период полувыведения из сыворотки ίη у1уо, также включают стресс-белки, такие как белки теплового шока (НЗР). В норме НЗР являются внутриклеточными. Когда они обнаруживаются вне клеток, это является индикатором того, что клетка погибла и из нее вылилось содержимое. Эта непрограммируемая гибель клеток (некроз) случается как результат травмы, заболевания или повреждения, при этом внеклеточные НЗР запускают ответ иммунной системы. Связывание с внеклеточным НЗР может приводить к локализации композиции по изобретению в месте заболевания.
Подходящие белки, вовлеченные в Ес-транспорт, включают, например, рецептор Брамбелла (также известный как ЕсВВ). Этот Ес-рецептор имеет две функции, обе из которых потенциально полезны для доставки. Функции представляют собой (1) транспорт 1дС от матери к ребенку через плаценту; (2) защиту 1дС от расщепления с пролонгированием тем самым периода его полувыведения из сыворотки. Полагают, что данный рецептор осуществляет рециркуляцию 1дС из эндосом (см. НоШдег е! а1., Να!. Вю!есйпо1. 15(7): 632-6 (1997)).
бАЬ, связывающиеся с сывороточным альбумином
Согласно изобретению в одном из воплощений предложен полипептид или антагонист (например, лиганд с двойной специфичностью, содержащий бАЬ против ЮТИТ (первое бАЬ)), который связывается с ЮТК!, и второе бАЬ, которое связывается с сывороточным альбумином (ЗА), причем второе бАЬ связывается с ЗА с Кс, как определено с помощью поверхностного плазмонного резонанса, составляющей от 1 нМ до 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 100, 200, 300,400 или 500 мкМ (т.е. от х10-9 до 5х10-4), или от 100 нМ до 10 мкМ, или от 1 до 5 мкМ или от 3 до 70 нМ или от 10 нМ до 1, 2, 3,4 или 5 мкМ. Например, от 30 до 70 нМ, как определено с помощью поверхностного плазмонного резонанса. В одном из воплощений первое бАЬ (или мономер бАЬ) связывается с ЗА (например, НЗА) с Кс, как определено с помощью поверхностного плазмонного резонанса, составляющей приблизительно 1, 50, 70, 100, 150, 200, 300 нМ или 1, 2 или 3 мкМ. В одном из воплощений, относящихся к лиганду с двойной специфичностью, содержащему первое анти-ЗА бАЬ и второе бАЬ к Τ^ΡΕ аффинность (например, Кс и/или Кой как измерено с помощью поверхностного плазмонного резонанса, например, с использованием В1аСоге) второго бАЬ в отношении своей мишени от 1 до 100000 раз (например, от 100 до 100000, или от 1000 до 100000, или от 10000 до 100000 раз) выше аффинности первого бАЬ в отношении ЗА. В одном из воплощений сывороточным альбумином является сывороточный альбумин человека (НЗА). Например, первое бАЬ связывается с ЗА с аффинностью приблизительно 10 мкМ, тогда как второе бАЬ связывается со своей мишенью с аффинностью 100 пМ. В одном из воплощений сывороточным альбумином является сывороточный альбумин человека (НЗА). В одном из воплощений первое бАЬ связывается с ЗА (например, НЗА) с Ки приблизительно 50, например 70, 100, 150 или 200 нМ. Подробности относительно лигандов с двойной специфичностью можно найти в \УО 03002609, \УО 04003019 и \УО 04058821.
Лиганды по изобретению в одном из воплощений могут содержать бАЬ, которое связывается с сывороточным альбумином (ЗА) с Кс, как определено с помощью поверхностного плазмонного резонанса, составляющей от 1 нМ до 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 100, 200, 300, 400 или 500 мкМ (т.е. от х 10-9 до 5х 10-4), или от 100 нМ до 10 мкМ, или от 1 до 5 мкМ, или от 3 до 70 нМ, или от 10 нМ до 1, 2, 3, 4 или 5 мкМ. Например, от 30 до 70 нМ, как определено с помощью поверхностного плазмонного резонанса. В одном из воплощений первое бАЬ (или мономер бАЬ) связывается с ЗА (например, НЗА) с Кс, как определено с помощью поверхностного плазмонного резонанса, приблизительно 1, 50, 70,100, 150, 200, 300 нМ или 1, 2 или 3 мкМ. В одном из воплощений первое и второе бАЬ соединены линкером, например линкером, состоящим из 1-4 аминокислот, или из 1-3 аминокислот, или более 3 аминокислот, или
- 42 018723 более 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 15 или 20 аминокислот. В одном из воплощений более длинный линкер (более 3 аминокислот) используют для повышения эффективности (Кс одного или обоих бАЬ в данном антагонисте).
В конкретных воплощениях лигандов и антагонистов бАЬ связывается с сывороточным альбумином человека и конкурирует за связывание с альбумином с бАЬ, выбранным из группы, состоящей из:
М8А-16, М8А-26 (для описания этих последовательностей см. \¥О 04003019, причем данные последовательности и их нуклеиново-кислотные аналоги включены в данное описание посредством ссылки и образуют часть описания настоящего текста);
ООМ7т-16 (ЗЕО Ю N0: 473), ООМ7т-12 (ЗЕО Ю N0: 474), 0ОМ7т-26 (ЗЕО Ю N0: 475), Ц0М7Г-1 (ЗЕО Ю N0: 476), ЦОМ7Г-3 (ЗЕО Ю N0: 477), ЦОМ7Г-4 (ЗЕО Ю N0: 478), ООМ7г-5 (ЗЕО Ю ΝΟ: 479), ООМ7г-7 (ЗЕО Ю ΝΟ: 480), ООМ7Г-8 (ЗЕО Ю ΝΟ: 481), ООМ7Н-2 (ЗЕО Ю ΝΟ: 482), ϋΟΜ7ή-3 (ЗЕО Ю N0: 483), ООМ7Н-4 (ЗЕО Ю N0: 484), ϋΟΜ7ή-6 (ЗЕО Ю ΝΟ: 485), 00Μ7Ι1-1 (ЗЕ(2 Ю ΝΟ: 486), ϋΟΜ7Ιι-7 (ЗЕО Ю ΝΟ: 487), ООМ7Н-22 (ЗЕО Ю ΝΟ: 489), ООМ7И-23 (ЗЕО Ю ΝΟ: 490), ϋΟΜ7Κ-24 (ЗЕО Ю ΝΟ: 491), ООМ76-25 (ЗЕО Ю N0: 492), ООМ7Н-26 (ЗЕО Ю N0: 493), ϋΟΜ7ή-21 (ЗЕО Ю ΝΟ: 494), ϋΟΜ7ή-27 (ЗЕО Ю N0: 495), ООМ7Й-8 (ЗЕО Ю N0: 496), ЭОМ7г-13 (ЗЕО Ю ΝΟ: 497), ООМ7г-14 (ЗЕО Ι0 N0: 498), ООМ7Г-15 (ЗЕО Ю N0: 499), ООМ7Г-16 (ЗЕО Ю N0: 500), ООМ7М7 (ЗЕО Ю ΝΟ: 501), ООМ7Г-18 (ЗЕО Ю ΝΟ: 502), ООМ7Г-19 (ЗЕО Ю N0: 503), ООМ7Г-20 (ЗЕО Ю ΝΟ: 504), ООМ7г-21 (ЗЕО Ю N0: 505), ООМ7г-22 (ЗЕО Ю ΝΟ: 506), ООМ7Г-23 (ЗЕО Ю N0: 507), ООМ7Г-24 (ЗЕО Ю N0: 508), ООМ7Г-25 (ЗЕО Ю N0: 509), ΩΟΜ7Γ-26 (ЗЕО Ю N0: 510), ООМ7Г-27 (ЗЕО Ю ΝΟ: 511), ООМ7Г-28 (ЗЕО Ю ΝΟ: 512), ООМ7г-29 (ЗЕО Ю N0: 513), ООМ7г-30 (ЗЕО Ю ΝΟ: 514), ООМ7Г-31 (ЗЕО Ю ΝΟ: 515), ООМ7Г-32 (ЗЕО Ю N0: 516), ООМ7Г-33 (ЗЕО Ю ΝΟ: 517) (для описания этих последовательностей см. \¥О 2007080392, причем данные последовательности и их нуклеиново-кислотные аналоги включены в данное описание посредством ссылки и образуют часть описания настоящего текста; 8Е0 ΙΌ ΝΟ в этом абзаце аналогичны приведенным в \¥О 2007080392);
6АЬ8 (6АЫ0), 6АЫ0, бАЬЗб, бАЬ7г20 (ООМ7г20), <1АЬ7г21 (ООМ7г21), бАЬ7г22 (ООМ7г22), бАЬ7г23 (ООМ7г23), бАЬ7г24 (ООМ7г24), бАЬ7г25 (ООМ7Г25), бАЬ7г26 (ООМ7г26), бАЬ7г27 (ООМ7г27), бАЬ7г28 (ООМ7г28), с!АЬ7г29 (ООМ7г29), бАЬ7г29 (ООМ7Г29), бАЬ7г31 (ООМ7г31), бАЬ7г32 (ООМ7г32), бАЬ7гЗЗ (ООМ7гЗЗ), бАЬ7гЗЗ (ООМ7гЗЗ), 6АЬ7Ь22 (ϋΟΜ7Ιι22), 6АЬ7Ь23 (ООМ7И23), с1АЬ7Ь24 (ООМ7Н24), 6АЬ7Г125 (ООМ7Н25), 6АЬ7Ь26 (ϋΟΜ7)126), 6АЬ7Ь27 (ООМ7Н27), 6АЬ7КЗО (ООМ7КЗО), 6АЬ7Н31 (ООМ7И31), 6АЬ2 (бАЬ 4,7,41), 6АЬ4, 6АЬ7, 6АЫ1, 6АЫ2 (с1АЬ7т12), 6АЫЗ (бАЬ 15), с!АЫ5, 6АЫ6 (6АЬ21, с!АЬ7т16), 6АЫ7,6АЫ8, 6АЫ9, дАЬ21, 6АЬ22, 6АЬ23, 6АЬ24, 6АЬ25 ( 6АЬ26, бАЬ7т26), 6АЬ27, бАЬЗО (6АЬ35), 6АЬ31, бАЬЗЗ, 6АЬ34, с!АЬ35, 6АЬ38 (с1АЬ54), 6АЬ41,6АЬ46 (ОАЬ 47, 52 и 56), с!АЬ47, 6АЬ52, 6АЬ53, 6АЬ54, 6АЬ55, άΑ&56, бАЬ7т12, бАЬ7т16, бАЬ7т26, бАЬ7г1 (ϋΟΜ 7г1), бАЬ7гЗ (ООМ7гЗ), бАЬ7г4 (ООМ7г4), с)АЬ7г5 (ООМ7г5), бАЬ7г7 (ООМ7г7), бАЬ7г8 (ООМ7г8), бАЬ7г13 (ϋΟΜ7ιΊ3), бАЬ7г14 (ϋΟΜ7ιΊ4), с1АЬ7г15 (ϋΟΜ7Γΐ5), бАЬ7г16 (ООМ7г16), бАЬ7г17 (ООМ7г17), бАЬ7г18 (ООМ7г18), с1АЬ7г19 (ООМ7Н9), 6АЬ7М (ΟΟΜ7Ϊ11), 6Α57Ι12 (ООМ7Н2), 6АЬ7К6 (ϋΟΜ7)ι6), 6АЬ7Н7 (ϋΟΜ7ή7), 6АЬ7М8 (ϋΟΜ7ήθ), 6Α57ή9 (ΟΟΜ7Ι19), 6АЬ7МО (ϋΟΜ7ή10), бАЬ7п11 (0ОМ7М1), 6АЬ7Н12 (ООМ7Ы2), 6АЬ7МЗ (ООМ7МЗ), 6АЬ7Н14 (ООМ7Ы4), бАЬ7р1 (ϋΟΜ7ρ1) и бАЬ7р2 (ООМ7р2) (для описания этих последовательностей см. РСТ/СВ2008/000453, поданную 8 февраля 2008 г., причем данные последовательности и их нуклеиново-кислотные аналоги включены в данное описание посредством ссылки и образуют часть описания настоящего текста). Альтернативные названия показаны в круглых скобках после бАЬ, например 6АЬ8 имеет альтернативное название 6АЬ10, т.е. 6АЬ8 (6АЫ0). Эти последовательности также приведены на фиг. 51а и Ь.
В некоторых воплощениях бАЬ связывается с сывороточным альбумином человека и содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 80%, или по меньшей мере
- 43 018723 примерно 85%, или по меньшей мере примерно 90%, или по меньшей мере примерно 95%, или по меньшей мере примерно 96%, или по меньшей мере примерно 97%, или по меньшей мере примерно 98%, или по меньшей мере примерно 99% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью бАЬ, выбранного из группы, состоящей из
М8А-16, МЗА-26, ϋΟΜ7πι-16 (ЗЕО ГО N0: 473), ДОМ7т-12 (ЗЕО ГО ΝΟ: 474), ООМ7т-26 (ЗЕО ГО ΝΟ: 475), Ь0М7г-1 (ЗЕО ГО N0: 476), ООМ7Г-3 (ЗЕО ГО N0: 477), ООМ7Г-4 (ЗЕО ГО ΝΟ: 478), ООМ7Г-5 (ЗЕО ГО N0:479), ООМ7Г-7 (ЗЕО ГО N0:480), ООМ7Г-8 (ЗЕО Ю ΝΟ: 481), ООМ7Н-2 (ЗЕО Ю N0: 482), ϋΟΜ7ή-3 (ЗЕО Ю N0: 483), ϋΟΜ7ή-4 (ЗЕО Ю N0: 484), ООМ7И-6 (ЗЕО Ю ΝΟ: 485), 00Μ7Ι1-1 (ЗЕО Ю N0: 486), ООМ7П-7 (ЗЕО Ю N0: 487), ООМ7Г1-22 (ЗЕО Ю N0: 489), ООМ7К-23 (ЗЕО Ю N0: 490), ΟΟΜ7ίι-24 (ЗЕО ГО N0: 491), ООМ7Г1-25 (ЗЕО ГО N0: 492), ΟΟΜ7Ϊ1-26 (ЗЕО Ю ΝΟ: 493), ϋΟΜ7ή-21 (ЗЕО ГО ΝΟ: 494), ϋΟΜ7ή-27 (ЗЕО Ю N0: 495), ϋΟΜ7ή-8 (ЗЕО ГО ΝΟ: 496), ΟΟΜ7Μ3 (ЗЕО ГО ΝΟ: 497), ЭОМ7Г-14 (ЗЕО Ю N0: 498), ООМ7Г-15 (ЗЕО Ю N0: 499), ООМ7Г-16 (ЗЕО Ю N0: 500), ООМ7г-17 (ЗЕО Ю ΝΟ: 501), ООМ7М8 (ЗЕО Ю ΝΟ: 502), БОМ7г-19 (ЗЕО ГО N0: 503), ООМ7Г-20 (ЗЕО ГО N0: 504), ООМ7Г-21 (ЗЕО ГО N0: 505), ООМ7Г-22 (ЗЕО ГО ΝΟ: 506), ООМ7г-23 (ЗЕО ГО N0: 507), ООМ7г-24 (ЗЕО ГО N0: 508), ООМ7г-25 (ЗЕО ГО N0: 509), ООМ7Г-26 (ЗЕО ГО N0: 510), ЭОМ7г-27 (ЗЕО ГО N0: 511), ООМ7г-28 (ЗЕО ГО ΝΟ: 512), ООМ7г-29 (ЗЕО ГО N0: 513), ООМ7г-30 (ЗЕО ГО N0: 514), ООМ7Г-31 (ЗЕО ГО N0: 515), ООМ7г-32 (ЗЕО ГО ΝΟ: 516), ООМ7г-33 (ЗЕО Ю ΝΟ: 517) (ЗЕО Ю N0 в этом абзаце аналогичны приведенным в №02007080392),
6АЬ8, бАЬ 10, бАЬЗб, бАЬ7г20, бАЬ7г21, бАЬ7г22, бАЬ7г23, бАЬ7г24, бАЬ7г25, бАЬ7г26, бАЬ7г27, бАЬ7г28, бАЬ7г29, бАЬ7г30, бАЬ7г31, бАЬ7г32, бАЬ7гЗЗ, 6АЬ7Ь21, 6АЬ7Ь22, 6АЬ7Ь23, АЬ7Ь24, АЬ7Ь25, АЬ7Ь26, 6АЬ7Ь27, 6АЬ7ЬЗО,6АЬ7Й31,6АЬ2,6АЬ4,6АЬ7, 6АЫ1,6АЫ2, 6АЫЗ, 6АЫ5, 6АЫ6,6АМ7, 6АЫ8, 6АЫ9, 6АЬ21, 6АЬ22, 6АЬ23, 6АЬ24, 6АЬ25, 6АЬ26, 6АЬ27, бАЬЗО, 6АЬ31, бАЬЗЗ, 6АЬ34, 6АЬ35, 6АЬ38, 6АЬ41, 6АЬ46, 6АЬ47, 6АЬ52, 6АЬ53, 6АЬ54, 6АЬ55, 6АЬ56, бАЬ7т12, бАЬ7т16, бАЬ7т26, 6АЬ7г1, бАЬ7гЗ, бАЬ7г4, бАЬ7г5, бАЬ7г7, бАЬ7г8, ЬАЬ7г13, бАЬ7г14, бАЬ7г15, бАЬ7г16, бАЬ7г17, бАЬ7г18, бАЬ7г19, 6АЬ7М, 6АЬ7Ь2,6АЬ7Ь6, 6АЬ7Ь7, 6АЬ7Ь8,6АЬ7Ь9, 6АЬ7МО, 6АЬ7Ь11, 6АЬ7Ь12,6АЬ7Ь13, 6АЬ7Ь14, бАЬ7р1 и бАЬ7р2.
Например, бАЬ, которое связывается с сывороточным альбумином человека, может содержать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 90%, или по меньшей мере примерно 95%, или по меньшей мере примерно 96%, или по меньшей мере примерно 97%, или по меньшей мере примерно 98%, или по меньшей мере примерно 99% идентичности аминокислотной последовательности с ϋΟΜ7ίι-2 (ЗЕО ГО N0:482),
ООМ7П-3 (ЗЕО ГО N0:483), ООМ7Н-4 (ЗЕО ГО N0:484), ООМ76-6 (ЗЕО ГО N0:485), 00М7И-1 (ЗЕО ГО N0:486), ООМ7И-7 (ЗЕО ГО N0:487), ООМ7Я-8 (ЗЕО ГО N0:496), ООМ7Г-13 (ЗЕО ГО N0:497), ΟΟΜ7Μ4 (ЗЕО ГО N0:498), ϋΟΜ7ή-22 (ЗЕО ГО N0:489), ООМ7Й-23 (ЗЕО ГО N0:490), ϋΟΜ7ή-24 (ЗЕО ГО N0:491), ООМ7Ь-25 (ЗЕО ГО N0:492), ООМ7К-26 (ЗЕО ГО N0:493), ООМ7И-21 (ЗЕО ГО N0:494), ООМ7Н-27 (ЗЕО ГО N0:495) (ЗЕО ГО ΝΟ в этом абзаце аналогичны приведенным в №02007080392),
6АЬ8, бАЬ 10, бАЬЗб, 6АЬ7Ь21, 6АЬ7Ь22,6АЬ7Ь23, АЬ7Ь24, АЬ7Ь25, АЬ7Ь26,
6АЬ7Ь27, 6АЬ7ЬЗО, 6АЬ7Ь31, 6АЬ2, 6АЬ4, 6АЬ7, 6АЫ1, 6АЫ2, 6АЫЗ, 6АЫ5,
6АЫ6, 6АЫ7, 6АЫ8, 6АЫ9, 6АЬ21,6АЬ22, 6АЬ23, 6АЬ24, 6АЬ25, 6АЬ26, 6АЬ27, бАЬЗО, 6АЬ31, бАЬЗЗ, 6АЬ34, 6АЬ35, 6АЬ38, 6АЬ41, 6АЬ46, 6АЬ47, 6АЬ52, 6АЬ53, 6АЬ54, 6АЬ55, 6АЬ56, 6АЬ7Ь1, 6АЬ7Ь2, 6АЬ7Ь6, 6АЬ7Ь7, 6АЬ7И8, 6АЬ7И9, 6АЬ7Ь1О, 6АЬ7Ь11, 6АЬ7М2, 6АЬ7МЗ и 6АЬ7П14.
В некоторых воплощениях бАЬ связывается с сывороточным альбумином человека и содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 80%, или по меньшей мере
- 44 018723 примерно 85%, или по меньшей мере примерно 90%, или по меньшей мере примерно 95%, или по меньшей мере примерно 96%, или по меньшей мере примерно 97%, или по меньшей мере примерно 98%, или по меньшей мере примерно 99% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью бАЬ, выбранного из группы, состоящей из
ООМ7К-2 (δΕΟ ГО N0:482), ϋΟΜ7Κ-6 (δΕΟ ГО N0:485), ϋΟΜ7ή-1 (8Е0 ГО
N0:486), ϋΟΜ7ή-7 (δΕΟ ГО N0:487), ϋ0Μ7Ιι-8 (5Е0 ГО N0:496), ϋΟΜ7ή-22 (δΕΟ
ГО N0:489), ООМ7Н-23 (δΕΟ ГО N0:490), ООМ7И-24 (δΕΟ ГО N0:491), ΟΟΜ7Ιι-25 (δΕΟ 10 N0:492), ООМ7П-26 (δΕΟ ГО N0:493), ϋΟΜ7ή-21 (δΕΟ ГО N0:494),
ΟΟΜ7Κ-27 (δΕΟ ГО N0:495) (δΕΟ ΙΟ N0 в этом абзаце аналогичны приведенным в 7702007080392), бАЬ7п21, с1АЬ7(|22, с!АЬ7п23, АЬ7М24, АЬ7к25, АЬ7к26, бАЬ7к27, с!АЬ7пЗО,
4АЬ7Г131, 6АЬ2, <1АЬ4, 6АЬ7, с!АЬ38, 6АЬ41, <ЗАЬ7Н1, 8АЬ7Ь2, 6АЬ7К6, бАЬ7к7,
6АЬ7Ь8, 6АЬ7(19, 6АЬ7М0, с1АЬ7Ь11, с1АЬ7Ы2, <1АЬ7ЫЗ и дАЬ7М4.
В более конкретных воплощениях бАЬ представляет собой Ук-область бАЬ, которая связывается с сывороточным альбумином человека и имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из
001717)1-2 (δΕΟ ГО N0:482), 00Μ7Ϊ1-6 (δΕΟ ГО N0:485), ϋΟΜ7ή-1 (δΕΟ ГО
N0:486), ООМ7Н-7 (ЗЕО ГО N0:487), ООМ7Н-8 (δΕΟ ГО N0:496) (ЗЕО ГО ΝΟ в этом абзаце аналогичны приведенным в 7702007080392),
6АЬ2, с!АЬ4, 6АЬ7, 6АЬ38, 6АЬ41, 6АР54, с1АЬ7П1,6АЬ7И2, 6АЬ7Н6, бАЬ7п7,
6АЬ7К8,6АЬ7К9, бАЬ7пЮ, 6АЬ7Ь11, 6АЬ7П12, 6АЬ7ЫЗ и 0АЬ7М4.
В более конкретных воплощениях бАЬ представляет собой УН-область бАЬ, которая связывается с сывороточным альбумином человека и имеет аминокислотную последовательность, выбранную из бАЬ7й30 и 6АЬ7Ь31.
В более конкретных воплощениях бАЬ представляет собой бАЬ71т11 или бАЬ71114.
В других воплощениях бАЬ, лиганд или антагонист связывается с сывороточным альбумином человека и содержит один, два или три СОК (гипервариабельных участка) любой из перечисленных выше аминокислотных последовательностей, например один, два или три СОК из бАЬ71111 или бАЬ71114.
Подходящие верблюжьи (Сатейб) УНН, которые связываются с сывороточным альбумином, включают таковые, описанные в \7О 2004/041862 (АЬ1упх Ν.ν.) и в \7О 2007080392 (причем последовательности УНН и их нуклеиново-кислотные аналоги включены в данное описание посредством ссылки и образуют часть описания настоящего текста), такие как последовательность А (8Е0 ΙΌ ΝΌ:518), последовательность В (8Е0 ΙΌ ЫО:519), последовательность С (ЗЕЦ ΙΌ ЫО:520), последовательность Ό (8ЕЦ ΙΌ ЫО:521), последовательность Е (8ЕЦ ΙΌ ЫО:522), последовательность Е (8ЕЦ ΙΌ ЫО:523), последовательность С (8Е0 ΙΌ ЫО:524), последовательность Н (8ЕЦ ΙΌ ЫО:525), последовательность Ι (8ЕЦ ΙΌ ЫО:526), последовательность 1 (8ЕЦ ΙΌ ЫО:527), последовательность К (8ЕЦ ΙΌ ЫО:528), последовательность Ь (8ЕЦ ΙΌ ЫО:529), последовательность М (8ЕЦ ΙΌ ЫО:530), последовательность Ν (8ЕЦ ΙΌ ЫО:531), последовательность О (ЗЕЦ ΙΌ ЫО:532), последовательность Р (8ЕЦ ΙΌ ЫО:533), последовательность О (8Е0 ΙΌ ЫО:534), причем номера этих последовательностей соответствуют номерам, приведенным в \7О 2007080392 или \7О 2004/041862 (АЬ1упх Ы.У.). В некоторых воплощениях верблюжий (Сатейб) УНН связывается с сывороточным альбумином человека и содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 80%, или по меньшей мере примерно 85%, или по меньшей мере примерно 90%, или по меньшей мере примерно 95%, или по меньшей мере примерно 96%, или по меньшей мере примерно 97%, или по меньшей мере примерно 98%, или по меньшей мере примерно 99% идентичности аминокислотной последовательности с последовательностью АЬВ1, описанной в \7О 2007080392 или любой из 8Е0 ΙΌ ЫО:518-534, причем номера этих последовательностей соответствуют номерам, приведенным в \7О 2007080392 или \7О 2004/041862.
В некоторых воплощениях лиганд или антагонист содержит бАЬ против сывороточного альбумина, которое конкурирует с любым бАЬ против сывороточного альбумина, приведенным в данном изобретении, за связывание с сывороточным альбумином (например, сывороточным альбумином человека).
В альтернативном воплощении антагонист или лиганд содержит связывающую группировку, специфичную к целевому антигену (например, ΤΝΤΚ1 человека), которая содержит неиммуноглобулиновые последовательности, как описано в родственной заявке РСТ/СВ2008/000453, поданной 8 февраля 2008 г.; описание этих связывающих группировок, способы их получения и селекции (например, из разнообразных библиотек) и их последовательности включены в данное описание посредством ссылки как часть описания настоящего текста).
- 45 018723
Конъюгирование с группировкой, удлиняющей период полувыведения (например, альбумином)
В одном из воплощений (одна или более чем одна) группировку, удлиняющую период полувыведения (например, альбумин, трансферрин и их фрагменты и аналоги), конъюгируют или объединяют со связывающимся с ΤΝΕΗ1 полипептидом, кАЬ или антагонистом по изобретению. Примеры альбумина, фрагментов альбумина или вариантов альбумина, подходящих для применения в связывающемся с ΤΝΕΡ1 формате, описаны в МО 2005077042, описание которой включено в данное описание посредством ссылки и образует часть описания настоящего текста. В частности, в настоящем изобретении могут быть использованы следующие далее альбумин, фрагменты альбумина или варианты альбумина:
8ЕО ΙΌ ΝΟ:1 (как описано в МО 2005077042, при этом данная последовательность непосредственно включена в настоящее описание посредством ссылки);
фрагмент или вариант альбумина, содержащий аминокислоты 1-387 из 8ЕО ГО ΝΟ:1 в МО 2005077042 или состоящий из них;
альбумин или его фрагмент или вариант, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (а) аминокислот 54-61 из 8ЕО ГО ΝΟ:1 в МО 2005077042; (Ь) аминокислоты 76-89 из 8ЕО ГО ЫО:1 в МО 2005077042; (с) аминокислоты 92-100 из 8ЕО ГО ЫО:1 в МО 2005077042; (ά) аминокислоты 170-176 из 8ЕО ГО ЫО:1 в МО 2005077042; (е) аминокислоты 247-252 из 8ЕО ГО ΝΌ:1 в МО 2005077042; (£) аминокислоты 266-277 из 8ЕО ГО ЫО:1 в МО 2005077042; (д) аминокислоты 280-288 из 8ЕО ГО ЫО:1 в МО 2005077042; (к) аминокислоты 362-368 из 8ЕО ГО ЫО:1 в МО 2005077042; (ί) аминокислоты 439-447 из 8ЕО ГО ЫО:1 в МО 2005077042 (|) аминокислоты 462-475 из 8ЕО ГО ΝΌ:1 в МО 2005077042; (к) аминокислоты 478-486 из 8ЕО ГО ЫО:1 в МО 2005077042 и (1) аминокислоты 560-566 из 8ЕО ГО ΝΌ:1 в МО 2005077042.
Следующие примеры альбумина, фрагментов и аналогов, подходящих для применения в связывающемся с целевым антигеном формате, описаны в МО 03076567, описание которой включено в данное описание посредством ссылки и которое образует часть описания настоящего текста. В частности, в настоящем изобретении могут быть использованы следующие далее альбумин, фрагменты или варианты:
сывороточный альбумин человека, как описано в МО 03076567, например, на фиг. 3 (причем информация об этой последовательности непосредственно включена в настоящее описание посредством ссылки);
сывороточный альбумин человека (НА), состоящий из единичной негликозилированной полипептидной цепи из 585 аминокислот с молекулярной массой 66500 (см. Μе1οиη, е! а1., ΕЕΒ8 Бе!!егк 58: 136 (1975); Векгепк, е! а1., Гек. Ргос. 34: 591 (1975); Ба^п, е! а1., Ыис1е1с Άοίάκ Кекеагск 9: 6102-6114 (1981); Μ^ηдке!ί^, е! а1., 1. Βΐο1. Скет. 261: 6747 (1986));
полиморфный вариант или аналог либо фрагмент альбумина, как описано в Меккатр, е! а1., Апп. Нит. Сепе!. 37: 219 (1973);
фрагмент или вариант альбумина, как описано в ЕР 322094, например НА(1-373), НА(1-388), НА(1389), НА(1-369) и НА(1-419) и фрагменты среди 1-369 и 1-419;
фрагмент или вариант альбумина, как описано в ЕР 399666, например, НА(1-177) и НА(1-200) и фрагменты среди НА(1-Х), где X равно любому числу от 178 до 199.
Когда (одну или более чем одну) удлиняющую период полувыведения группировку (например, альбумин, трансферрин и их фрагменты и аналоги) используют для представления в формате связывающихся с ΤΝΕΡ1 полипептидов, кАЬ и антагонистов по изобретению, они могут быть конъюгированы с использованием любого подходящего способа, такого как непосредственное слияние со связывающейся с ΤΝΕΡ1 группировкой (например, кАЬ), например с использованием единой нуклеотидной конструкции, кодирующей слитый белок, при этом данный слитый белок кодируется как единая полипептидная цепь с удлиняющей период полувыведения группировкой, расположенной на Ν- или С-конце по отношению к связывающейся с ΤΝΕΡ1 группировке. Альтернативно, конъюгирование может быть осуществлено с использованием пептидного линкера между группировками, например пептидного линкера, который описан в МО 03076567 или МО 2004003019 (при этом описания линкера включены посредством ссылки в настоящее описание для представления примеров применения в настоящем изобретении). Обычно полипептид, увеличивающий период полувыведения из сыворотки ш νίνο, представляет собой полипептид, существующий в природе ш νίνο и который устойчив к расщеплению либо удалению посредством эндогенных механизмов, посредством которых нежелательное вещество выводится из организма (например, человека). Например, полипептид, увеличивающий период полувыведения из сыворотки 1п νίνο, может быть выбран из белков внеклеточного матрикса, белков, обнаруживаемых в крови, белков, обнаруживаемых в гематоэнцефалическом барьере или в нервной ткани, белков, локализованных в почках, печени, легких, сердце, коже или костях, стресс-белков, белков, характерных для конкретного заболевания, или белков, вовлеченных в Рс-транспорт.
В воплощениях изобретения, описанных по всему этому описанию, вместо использования антиΤΝΕΡ1 кАЬ в антагонисте или лиганде по изобретению, предполагается, что специалист средней квалификации может использовать полипептид или домен, содержащий один или более либо все 3 СОК из кАЬ по изобретению, которое связывается с ΤΝΕΡ1 (например, СОК, привитые на подходящий белковый остов или каркас, например аффитело, остов 8рА, домен рецепторов БОБ (липопротеины низкой плотно
- 46 018723 сти), класс А, или домен ЕСЕ). Соответственно, данное описание в целом следует истолковывать в смысле предложения антагонистов, в которых такие домены используются вместо бАЬ. В этой связи см. РСГ/6В2008/000453, поданную 8 февраля 2008 г., описание которой включено посредством ссылки.
Таким образом, в одном из воплощений антагонист по изобретению содержит иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен или доменное антитело (бАЬ), обладающий(ее) специфичностью связывания с ΤΝΕΚ1, или определяющие комплементарность участки такого бАЬ в подходящем формате. Антагонистом может быть полипептид, состоящий из такого бАЬ или состоящий по существу из такого бАЬ. Антагонистом может быть полипептид, содержащий бАЬ (или СЭК из бАЬ) в подходящем формате, таком как формат на основе антитела (например, 1дС-подобный формат, 5сЕу, ЕаЬ, ЕаЬ', Е(аЬ')2), или лиганд с двойной специфичностью, содержащий бАЬ, которое связывается с ΤΝΕΚ1, и второе бАЬ, которое связывается с другим целевым белком, антигеном или эпитопом (например, сывороточным альбумином).
Полипептиды, бАЬ и антагонисты по изобретению могут быть представлены в различных подходящих форматах на основе антител, которые известны в данной области техники, таких как 1дС-подобные форматы, химерные антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела, одноцепочечные антитела, биспецифические антитела, тяжелые цепи антител, легкие цепи антител, гомодимеры и гетеродимеры тяжелых цепей и/или легких цепей антител, антигенсвязывающие фрагменты любого из перечисленного выше (например, Εν-фрагмент (например, одноцепочечный Εν (^Εν), связанный дисульфидной связью Εν), ΕаЬ-фрагмент, ΕаЬ'-фрагмент, Ε(аЬ')2-фрагмент), единичный вариабельный домен (например, Ун, Уъ), бАЬ и модифицированные версии любого из перечисленного выше (например, модифицированные посредством ковалентного присоединения полиалкиленгликоля (например, полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, полибутиленгликоля) или другого подходящего полимера).
В некоторых воплощениях изобретения предложен лиганд (например, анти-ΤNΕΚ1 антагонист), представленный в 1дС-подобном формате. Такие форматы имеют традиционную четырехцепочечную структуру молекулы 1дС (две тяжелые цепи и две легкие цепи), в которых одна или более чем одна из вариабельных областей (Ун и/или Уъ) заменена на бАЬ по изобретению. В одном из воплощений каждая из вариабельных областей (2 Ун-области и 2 Уъ-области) заменена на бАЬ или единичный вариабельный домен, по меньшей мере один из которых представляет собой анти-ΤΝΕΚΙ бАЬ по изобретению. бАЬ или единичный(е) вариабельный домен(ы), которые включены в 1дС-подобный формат, могут иметь одну и ту же специфичность или разные специфичности. В некоторых воплощениях 1дС-подобный формат является тетравалентным и может иметь одну (только против ΤΝΕΚ1), две (например, против ΤΝΕΚ1 и против 8А), три или четыре специфичности. Например, 1дС-подобный формат может быть моноспецифическим и содержать 4 бАЬ, которые имеют одинаковую специфичность; биспецифическим и содержать 3 бАЬ, которые имеют одинаковую специфичность, и другое бАЬ, имеющее иную специфичность; биспецифическим и содержать два бАЬ, которые имеют одинаковую специфичность, и два бАЬ, которые имеют общую, но другую специфичность триспецифическим и содержать первое и второе бАЬ, которые имеют одинаковую специфичность, третье бАЬ с другой специфичностью, а четвертое бАЬ со специфичностью, отличающейся от первого, второго и третьего бАЬ; или тетраспецифическим и содержать четыре бАЬ, каждое из которых имеет разную специфичность. Можно получить антигенсвязывающие фрагменты 1дС-подобных форматов (например, ΕаЬ, Е(аЬ');, ΕаЬ', Εν, 5сЕу). В одном из воплощений 1дСподобные форматы или их антигенсвязывающие фрагменты не связываются перекрестно с ΤΝΕΚ1, например, данный формат может быть моновалентным в отношении ΤΝΕΚ1. Если желательно иметь функцию активации системы комплемента и/или функцию антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЭСС), то лиганд может быть представлен в 1дС1-подобном формате. При желании, 1дС-подобный формат может содержать мутированную константную область (вариант константной области тяжелой цепи 1дС) с целью минимизации связывания с Εс-рецепторами и/или способности фиксировать комплемент (см., например, ХУйНег и др., СВ 2209757 В; Μοττίκοη и др., νθ 89/07142; Могдап и др., νθ 94/29351, 22 декабря 1994 г.).
Лиганды по изобретению (полипептиды, бАЬ и антагонисты) могут быть представлены в формате в виде слитого белка, содержащего первый иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, который слит непосредственно со вторым иммуноглобулиновым единичным вариабельным доменом. При желании, то такой формат дополнительно может содержать группировку, удлиняющую период полувыведения. Например, лиганд может содержать первый иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, который слит непосредственно со вторым иммуноглобулиновым единичным вариабельным доменом, слитым непосредственно с иммуноглобулиновым единичным вариабельным доменом, который связывается с сывороточным альбумином.
Как правило, ориентация полипептидных доменов, имеющих сайт связывания со специфичностью связывания с мишенью, и то, содержит ли данный лиганд линкер, является предметом выбора при конструировании. Однако некоторые ориентации, с линкерами или без них, могут обеспечивать более удовлетворительные характеристики связывания по сравнению с другими ориентациями. Все ориентации (например, бАЬ1-линкер-бАЬ2; бАЬ2-линкер-бАЬ1) охватываются данным изобретением и лиганды, которые содержат ориентацию, обеспечивающую желаемые характеристики связывания, могут быть легко идентифицированы посредством скрининга.
- 47 018723
Полипептиды и άΑЬ по изобретению, включая мономеры, димеры и тримеры άΑό, могут быть присоединены к Рс-области антитела, содержащей один или оба домена Сн2 и Сн3 и возможно шарнирную область. Например, для получения таких полипептидов могут быть использованы векторы, кодирующие лиганды, соединенные в виде единой нуклеотидной последовательности Рс-областью.
В изобретении также предложены димеры, тримеры и полимеры вышеупомянутых мономеров άΑό.
Кодон-оптимизированные последовательности
Как описано выше, согласно воплощениям изобретения предложены кодон-оптимизированные нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептиды и вариабельные домены по изобретению. Как показано в следующей иллюстрации, могут быть получены кодон-оптимизированные последовательности с примерно 70%-ной идентичностью, которые кодируют один и тот же вариабельный домен (в этом случае аминокислотная последовательность вариабельного домена идентична ЭОМ111-131-206). В этом случае последовательности были оптимизированы для экспрессии в Р1сЫа райопк (кодоноптимизированные последовательности 1-3) или Е.сой (кодон-оптимизированные последовательности 4 и 5).
Авторы изобретения осуществили расчеты с учетом вырожденности генетического кода и максимизировали количество нуклеотидных изменений в каждом вырожденном кодоне, кодируемом нуклеотидной последовательностью ООМ111-131-206, как показано на фиг. 19, и рассчитали теоретическую нуклеотидную последовательность, которая все еще будет кодировать вариабельный домен, идентичный ЭОМ111-131-206. Этот расчет показал, что теоретическая последовательность будет иметь только 57%ную идентичность с нуклеотидной последовательностью ЭОМ111-131-206, как показано на фиг. 19.
Кодон-оптимизированная последовательность 1.
Последовательность ДНК даддЫгсааШдЮддааСссддСддДдда-Ызддг Ссаасс£дд1дд11Дс1:’Ы:дада(:11д1:сс{1дСдс1:дсСт сс ддеАЫасИТсдсТсасдадасДаСддДДТдддДСадасаддсДссаддОаааддаДкддааСдддГ-ССсссас а'Ыссассада'ЬддЕсаадаЬссаС'СсЁасдсЕдас^ссдЕЕаадддаада'ЬЪсасЁа^сЬссададасаас'Есс аадаасасЕ^^дЪасЁ^дсадаЁдаас£ссЬ^дададс£даддаВас^дс£д1:Ы:ассасЕд£дс£1:Ьд£,Ьдсса аадададдасс'ЫгддОД-ЕдаССасДддддасадддаастДАддг.ДасАдШсССсс
Соответствующая а.к. (аминокислотная) последовательность е ггд11езддд1удрдд51г1зсаа5д£5£аНе'0ту>^гдардкд1еиузЫррс1ддс1р£уас1зукдг £Д.1зг5пз ^Α1γ1ς[ηη51’;Ηθί1·1;8νγί·ια311ρ^3ρν;£·;1γΗ599ΐ;1νίιν3 3
74,1% идентичности нуклеотидной последовательности с последовательностью ΧΥΤ (дикого типа).
I 50
0опЛЬ-131-М6; ; 1 , Τ·-, АЛТ-Л,':.· 1 чГ..Л-Α 1 ч. /Χΐ ,-ч.л ί .7' --ί-. - 2 ί.Α: 4 ΐ Э/А .к · чАз _ . -
кодон-оптимизированная
ΒοΛΐΙι-131-206 НТ П) ι гт:с еду: д :йх.?уу ттсуЗаслссс·; ссзззс :г
Консенсусная П) ёйзёт сё ТЗТ1С-ЗА ТС ЗУ у: ус -ГААЗТ АД ССТСС ДА ТС
ТА
Вот1к~131-206; (.51)
ко лон - опвшиэиоев анн а я
Вот1Ь-131:-206 »Т (51) ~'С : _ ~ х о СТССТЗС'-СА·;-·.!·:!!. Ая: НАС? “ТАСС УДуй АЙД: ;дд
Консенсусная (51) 73 1 7 ТСС7~СС СС ТССТО 7Т АС ГС 5С СА САСАС А
101 1: ?
Вот1П-131-20б; :: б: :· с газа г т тссс ас
кодон-оитимизированная
СотХЬ-131-206: ИТ (152: ТС0СС2АСССАССД ТТАДСАССССАААеТСТАССТ'ААСАТ
Консенсусная :101? ТЗ-ЗТ ТЮТ ь ОАСС-: ТАХ ЗА СТ - ЙА ТЯАЙС ТС С А
151 200
Вот1й-131-20:6; (151): у.·: удАСУА-ДУХА — а: л ууа'у /ГдТЗССАуАГ’Сак-ТДЛЙййААЙ
кодон-оптимизированная
0ои1Ь-131-206 НТ 1151): ’:‘7 : ~ .··-· '2/' :””Ί .'.С ССС'-*С
Консенсусная (151) ат:: с: САТаууд АЛТАС ТССТЛС5С ААСТССет ААййА А
201 250
- 48 018723
Оот1Ь-131-20б;
кодон-оптимизированная 0от1П-131-206 ИТ
Консенсусная □οπύΗ-Ι31-206;
кодон-оптимизированная
0ОМ11Й-131 -206 нт
Консенсусная
Оот1Ь-131-206;
кодон-оптимизированная
Оои11Ъ-131-206 ИТ
Консенсусная
Оот1Ь-131-206;
кодон-оптимизированная
0ОШ1Й-131-206 ИТ
Консенсусная (201) АТТСАСТАТСТССАЗАСАСААСТССДАСААСАСТТТСТАСТТССАСАТСА (201) 6ТСАССАТСТССССС0АСААТТССААСААСАССС7АТАТСТ6САААТ6А (201} ТТСАС АТСТСС С 6АСАА ТССААСААСАС Т ТА ТССА АТСА
251300 (251) .кСтсот-'ЗАБАсстеАеаАТАСтпс'татттАссАстетсстттстгсссА (251) А!;АСССТССг4ТССССА^кАСАСА«СС-ЗТА2АТСАСТетССССТ5СТТССТ (251) АС С ТС С СС САССА АС СС СТ ТА САСТСТ6С ТС Т СС
301350 (301) АДСАСАССАССТТССТТТСАТТАСТСЗСеАСАССбААСТТТССТТАСТСЖ (301) ГиА^бббССССТТССТТТ&АСТ/ЛСТбСбСТС/АСбСАА.СССТССТСАСССТ (301) аасас ее ссттсстттса тастсссс сасссаас тест ас ст
351363 (351) ТТСТТССТААТСА (351) СТССАСС- — ---(351) ТС С
Кодон-оптимизированная последовательность 2.
Последовательность ДНК
СадаааадададдРРсааЕ'ЬдсБкдааОскддаддадд'ЬкЬддкссадссаддадддксссЕЕсдаскаадРЕдЕ дсЕдссадРдддЪР'Еасд'ЬЕГдсРсаГ дааасР аГддГаЬдддГссдасаддсассЕддЕаааддЕсГ ЕдааРдд дЕОксасаЕакссскссадасдд'ЬсаадасссакЕСЕасдс'ЬдакРссдРдаааддсадаРОРасааСОксасда дакааЬЕсЕааааасассГЕдРаскГасаааЬдаасЬсаОСдададсЬдаддасасЬдсадЕЬЬаЬсасЬдсдск ЬЕасЬассаааасдЬддассСЬдд'ЕЬЬда'ЬЕаЬЬддддссааддЬасд'ЕЕадЬдасЬд'ЕЬадЬЕсЬ
Соответствующая а.к. последовательность скгсг’д11езддд1удрддз1г1зсаазд£±£аПе1:л1Унугдардкд1енУзП1рр0дддр±'уаП5Укдгг5й аг дпзкпЫу1дтп51гае<11: аууЬсаИркгдриГбундддЫукУзз
71,1% идентичности нуклеотидной последовательности с последовательностью ^Τ.
ΡόΛΐη-131-206 ИТ
Только ₽1сЫа 206 МРа ОАЬ
Консенсусная
0от1Ъ-131-206 НТ
Тольке Р1сЫа 206 МРа ЙАЬ
Консенсусная
0от1Ь-131-20б ИТ
Только РЗсНха 206 МЕа <ЗАЬ
Консенсусная
Оот1Ь-131-206 ИТ
Только РисНга 206 МРа ОАЬ консенсусная
Рот1Ь-131-20б ИТ
Только ₽1сЫа 206 МРа ОАЬ
Консенсусная
ΟοπιΙϊι-131-206 ИТ
Только ₽1сЫа 206 МРа ОАЬ
Консенсусная
ПОИ1Н-131-206 ИТ
Только РЗсЫа МРа 206 <1АЬ
Консенсусная
Оот1Ь-131-206 ИТ
Только РйсЫа МРа 206 ОАЬ
Консенсусная (1) (1) (11 (42) <511 (51) (92) (101) (101) (142) (151) (151) (192) (201) (201) (242) (251) (251) (292) (301 >
(301) (342) (351) (351)
150 —-------ОАССТ'ЗСАбСТ&ТТССЛСТСТССССбАСССТГСОТАСА&ОО
САеАА7АСАОА5СТТСААТТССТТСААТСТО6АС6АС2Т'ГГОСТССАССС слест ок те т ел тстес сзлес ттеёт сассс 51100
ТОССС-ОеТСССТСССТСТСТССТЗТССАСССТССССАТТСАССТТТСССС АС-С-АСССТСтеТТГСАСТААСТТСТЯСТСССАСТСЗСТТТАССТТТССТС сс сестссст сс ст тстсс ссс ее тт ас тттсс с
101150 атс.ас; ссАтсстетесУА г/χ^κχ лссАс-тедАССстелАстетте АК Л?1АСТАГг-'У'АК/,С'.''у/,А..АкаОСАССТО&ТААА^ ,ΙΟΓΤ' ААГл~, АТСА АС АТССТ ТСССТССС САСССАСС СС АА ССТСТ СА ТСС 151 200
СТСТСАСАТАТТСССССССАТОСТСАССАТСССТТСТАСССАС-АСТСССТ ОТТТСАСАТАТСССТС-АбАС&СТСААСАСССАТТТТАСССТСАТТСССТ СТ ТСАСАТАТ СС СС СА ССТСА 6А СС ТТ ТАС6С СА ТСССТ 201 250
С?ДСетеСОС-7СА'САТСТ1;С13СОАС1АТТ-слдСЛ?з71сССТА'-АТС САДА-0<-А<?А1'1Т?»САА1Т 1'-АСЗАОАТАА1ТСТАААААСА/СТ1СГАСТ САА ССС С ТТ АС АТ ТС СС СА ААТТС АА ААСАС Т ТА
251300
ТССЛААТСААСАСССТСССТСССОАСЗАСАСАССЗСТАТАТСАСГСТССС ТАСАААТСААСТСАТТСАСАС-СТСАССАСАСТССАСТТТАТСАСТССССТ Т САААТСААС ТС С СС 6А6САСАС СС СТ ТАТСАСТ6 СС
301350
СТССТТССТААСАСбСбСССТТБбТТТеАСТЛСТССбеТСАЕСеААСССЩ ТТАСТАССАЛААСеТССАССТТебТТТСАТтаТТССССССААССТАСЗТТ
Т СТ СС АА С ее ССТТССТТТСА та тсссс СА сс ас т 351367
ССТСАСССТС ТССАССАСТСАСТСТ-ТАЗТТСТ
СТ АС СТ Т С С
Кодон-оптимизированная последовательность 3.
Последовательность ДНК даадРдсадсЕРсЪЪдааадРддЪддадддсРадРдсадссадддддаЕсккЪаадаРРаЪсаЕдсдсЕдссадС ддаОЕЕасЕЪЕЕдсксасдадасдаиддЬсЪдддЕдадасаадскссГддааааддЬ-ЬБададЪдддЕЪЕскаас аБкссассЕдаЕддЕсаадаЪссЕЪЕсрасдсадаСЕссдксаааддаадаЕкЪасЪаЪсЕссададаЪаакад!: ааааасасЕЬГдЪассЕасадаРдаас'ЬсасРЪададссдаадаЪассдсЕдБдЕассасрдсдсс'Ь'Ед'С'Едсса аадададдРссГЪддрРсдар-ЬаскддддЪсадддкасйсЕддР'ЬасадЕс'ксаЬсЪ
Соответствующая а.к. последовательность е1;д11езддд1’/дрддз1г1зсаазд£££аЬе(:т1/м’7гдардкд1е*^зк1ррс1ддс1р£уаб5Укдг (Шзгйпз кгй 1у1дтпз1гаедЕаууНса11ркгдрн£с1ундддЕ1урузз
- 49 018723
0от1И-131-206 НТ Только РхсМа Рге 206 0АЬ Консенсусная Ш ш ш
Пот1Ь-131-206 ИТ (51)
Только РтсМа Рге 206 ЙАЬ (51)
Консенсусная (51)
ϋοπιΙΙι-131-206 ИТ (101)
Только ₽1сЫа: Рге 206 ЙАЬ (101)
Консенсусная (101)
Вот1Ь-131-206 НТ (151)
Только Р1сЫа Рее 206 аАЬ (151)
консенсусная (151)
0отИ1-131-206 ИТ (201)
Только ₽1сЫа Рге 206 с1АЬ (201)
консенсусная (201)
Οόΐπΐη-131-206 ИТ (251)
Только ₽1сл1а Рге 206 йДр (231)
Консенсусная (251)
Οοιαΐη-131-206 ИТ (301)
Только ₽1сЫа Рге 206 САЬ (301)
Консенсусная (301)
РОШ1П-131-206 ИТ (351)
Только Р1сЫа Рге 2С6 с!АЬ (351)
Консенсусная (351)
72,6% идентичности нуклеотидной последовательности с последовательностью ЛТ.
50
С-ЛАС-7 1С;.-.-/”ТС716?.АА57СйТ-35;<-ЗССТЙΊΐΟί'.Λ ИСАЗС66СА2С ЗА СТ6САССТ Т СА ТСС 66АЙ6 Т СТ САБСС 66666 ТС 51 100
ССТСССТСТС1ССТСТСТА1СТТССС-СаСТ_СА1С’1 170С6САТ6А 1АСЗА ТТТААСАТТАТСАТСТ. СТС СТАБТССАТТТА .СТТ ГОСТ ^АССАСАСОА ТСТ ТС Тб ОС 6СС 6ΘΑΤΤ АС ТТТСС СА 6А6АС6А 101 150
-СПТС--.-.ХРТСССТ-АСТСАСАчСТ-бАЛСССТСТАС-АСТ -ТСТТАСТТ
ТББТСТбЗСТСЛСАСАРССТ:' .'ТССААЛАБЗСТ'-ДБАСТ, ртТ-. 7 Т667 Т36СТ Б СА -ЗС ОС СБ АА СТ. 7А6А6ТБ6ОТ ТС 21, 151200
н. СТСТСТ-ССТСТСТБСТ·’ ССТС:ст:СТА6АСГСТСТССТССТССТ А . : : 6АТСТ1-АТ ОТ1 СГ.ЛСЛ1 ССТ'П’СТАСССА С-АТТСТС ГСАААбСАД О АТТСС СС 6АТСТТСА 6АТСС ТТСТАС6СА6А ТСС6Т АА 666
201250
ЗТТСаССЛТСТЮССССАСйАТТОТААС.ААСАСБСТАТАТСТСЗЮТАТСА АТТ.-.. ·Τ<·. '..1ССАЗА5ЛТЛАтабТЛЛАГ6'/-АСТТ'СТЛССТА0/.6АТБА ТТ АС АТСТСС 6 СА ААТ ДА ААСАС Т ТА СТ С А АТ6А 251 300
V -АСТ- 16С6ТСТ НАС >С АСДССТС1А1 АТСАСТС-ТБСТСТбССТ-'С” а; ТСАСТТА ;А6ОТСТАСТ7СТ:ОТТСТСТАССТОТ6ОТССТТ',Т 5'=А АС СТ 6 6СС6А СА АС ОС СТ ТА САСТ6 6С ТС Т СС 301 350 .АС-АБС-С-66С.:ТГО-,Т' СТАСТАСТЗй63ТСАССТСТСТССТС.СТСТСС5Т ААСАБАбеТССТТБбТСССАТТАС'-ббЗбТ'САЗСТТАСТС’С-СТТАСЛСТ АА6АС 66 ССТТ66ТТ 5А ТАСТбЕСеТСАССб АС СТ65Т АС ОТ 351 СТС6АС?.. . , _ ·. СТС А С
Кодон-оптимизированная последовательность 4. Последовательность ДНК даадСасаасСдсЪддададсддСддсддсскддСТсаассддд'ЕддСТсосАдсдсс+дТссЪдЪдсддсаСсУ дд£Е£сасс£Есдсасасдааасса£дд£.дЕддд£.£:сдссаадсЪссдддсаааддсс1:ддаа£ддд£аадссас аистсСстадаСддссаддасссаС1с1аСдсддаС1:ссдЬТаадддСсдс1:СТасса1С1сСсдСдаСаасСсс ааааасасссЪд£асс£дсада^даас£ссс1:дсдсдссдадда£ас£дсдд£д£асса£ЕдЕдсда1:дсЕдсс£ ааасдЕддсссдЕддЕЕсдаЕЕасЕддддксадддЕасЬсЕддЪсассд^аадсадс
Соответствующая а.к. последовательность еуд11е5ддд1удрдд51г1зсааад£Е£айеЕтуиугдардкд1еиУ5п1рр0дд0р£уас15Укдг£1:15ГС1П5 кп£1у1дп1П31гаес11:ауу11са11ркгдри£с1уидддЪ1у1;У55
76,5% идентичности нуклеотидной последовательности с последовательностью ЛТ.
СА66Т6СА6СТ5ТТ6САСТСТ3666СА6ССТТССТАСАСССТ666СССТС 6ААСТАСААСТБСТ55А6А6С66ТбеС6СССТ&ЗТТСААССС66ТСеТТС СА СТ СА СТС Т6СА6 СС 66 ССС ТОСТ СА СС 66 66 ТС 51 ЮО
ССТ6СЭТСТСТССТ6Т6САСССТСС65АТТСАССТТТ6С6САТ6А6АС6А ССТеСбССТСТССТЗТбСбеСАТСТСОТТТСЛССТТС.ЗСАСАСбАААССА ССТСС6 СТ ТССТ6Т6С СС ТС СС ТТСАССТТ ОС СА СА АС А 101 150
ТебТСТСССТССССОАбОСАССАббСААОбСТСТАСАСТСССТСТСАСАТ ТСЗТ6Т6С-6ТТСС-ССААССТСС666САААССССТ6СААТ66СТАА6ССАС ТССТ6ТС66Т ССССА СС СС СС АА 66 СТ СА ТС6СТ СА 151 200 ДТТСССССССАТССТСА36АТСССТТСТАС6СА6АСТССОТ6ААСС6ССС АТТССТССА6АТ5СССА66АСССАТТСТАТ5СССАТТСС6ТТАА656ТС6 АТТСС СС САТ6С САССА СС ТТСТА СС СА ТСССТ АА666 СС η0250 ОТТСАССАТСТСССбСбАСААТТССААСААСАСССТАТАТСТБСАААТСА СТТТАССАТТТСТС6ТС-АТААСТССАААААСАСССТ6ТАССТССА6АТСА ТТ АССАТ ТС СС 6А АА ТССАА ААСАС СТ ТА СТССА АТСА 251 300
АСАСССТбССТСССЗАСбАСАСАЗСвБТАТАТСАСТбТ'ЗСССТССТТССТ АСТСССТ-СТССЙСС5А66АТЛСТ6С66ТСТАССЙТТСТ6С5СТ6СТ6ССТ АС ССТ6СС ССС6А66А АС ССССТ ТА СА Т6ТСС6СТССТ ССТ 301 350
АА 3 55 СС ТБСТТ СА ТАСТ6666ТСА666 АС СТССТСАССбТ 351
СТССАСС ААССАСС
АСС
Вот1Ь-131-206 ИТ (1)
Только Е.соИ Зес 206 ЛАЬ (1)
Консенсусная (1)
Вот1Н-131-206 ИТ (51)
Только Е.соИ Зес 206 ЙАЬ (51)
Консенсусная (51)
Вот1Ь-131-206 ИТ (101)
Только Е.соИ Зес 206 с!АЬ (101)
Консенсусная (101)
Оот1Н-131-206 НТ (151)
Только Е.соИ Зес 206 <1АЬ (151)
Консенсусная (151)
Сот1Ь-131-206 ИТ (201)
Только Е.соИ Зес 206 ЙАЬ (201)
Консенсусная (201)
Сот1Ь-131-206 ИТ (251)
Толь ко Е.соИ Зес 20 6 ДАЬ (251)
Консенсусная (251)
ОотХП-131-206 ИТ (301)
Только Е.соИ Зес 206 <1АЬ (301)
Консенсусная (Зои
Оот1й-131-206 ИТ (351)
Только Е.соИ Зес 206 ёАЬ (351)
Консенсусная (351)
- 50 018723
Кодон-оптимизированная последовательность 5.
Последовательность ДНК даддГСсаасЕдсЪддааксСддГддСддЕсИддСасаассдддЕддИсссИдсдкскдадсЕдкдсадссЪсЪ дд£Е£сассЬЕсдс£са'Ьдадасса£.ддЕС£дддЕасдссаддс£ссдддЕаааддсс£ддад£ддд£аадсса1 аГсссЕссАдаЬддЕсаддасссд+Ж.с+аЕдсЕдабЛссдЬ. саааддссдМ.ГЕассаЕГЛсг.сдЕдасаасадс ааааасас£с£д£асс£дсаааЕдаас£.ссс£дсд£дсадаадасасддсдд1:££а£сас£д'Ьдсас£дс£дсса ааасдсддссс^ддМ^сдасЕасьддддссадддЬасЕсЕдддсасЬдБагсСгсд
Соответствующая а.к. последовательность еν^11езддд1ν^ρддз^^1зсаазд£ϊ£а^1е1:тνмν^^аρдкд1еиνз^1^ρράд^бρ£уаάзνкд^£С^з^с^ηз кпР 1у1дтпз1 гаесГС аууЬса! 1ркгдрн£ сЕундддЪ! ν£ узз
78,4% идентичности нуклеотидной последовательности с последовательностью νΤ.
Оош1Ь-131-206 НТ (1)
Только Е.СО11 1С 206 ЙАЬ (1)
Консенсусная ш
0от1Ь-131-206 ИТ (51)
Только Е.СО11 1С 206 ЗАЬ (51)
консенсусная (51)
0от1Ь-131-206 ИТ (101)
Только : Е. со1х 1С 206 ЙАЬ (101)
Консенсусная (101)
ООШ1Н-131-206 ИТ (151)
Только е.соИ 1с 206 здь (151)
Консенсусная (151)
ϋοπι1Η-131-206 ИТ (201)
Только Е.соИ ТС 206 адь (201*
Консенсусная (201)
ПО1В1Т1-131-206 ИТ (2 51)
Только Е.соИ 1С 206 адь (251)
Консенсусная (251)
ΒοπιΙΚ-131-2 06 ИТ (301)
Только Е.соИ 1С 206 адь (301)
Консенсусная (301)
Вош1Ь-131-206 НТ (351)
Только Е.соИ 1С 206 адь (351)
Консенсусная (351)
50 САССТ6€АвСТСТТССА6ТСТ6ССС6АСССТТС6ТАСАС-ССТС66666ТС 6А66ТТСАЛСТ6СТ66ААТСТ66Т66ТС6ТСТ66ТАСААСС666Т66ТТС САС6Т СА СТ6 ТЕСА ТСТ66 66 СС Т66ТАСА СС 66 66 ТС 51 100 ССТСС6ТС.ТСТССТ6Т0САСССТСС66А7ТСАССТТТ6С6САТОА6АССА ССТ0СетСТ6А6С-Г6Т6САбС!СТСТ66ТТТСАССТТС6СТСАТ6А6АССА ССТ6С6ТСТ СТ6Т6САБССТС 66 ТТСАССТТ 6С САТ6А6АС А 101 150 Т6СТ6Т666ТСС6ССАСССАССАС66АА6ССТСТАСА6Т6С6ТСТСАСАТ Т6СТТТСС6ТАССССАСССТСС6ССТААА6СССТ66А6Т6С6ТАА6ССАТ ТС6Т ТС66Т С6ССА66С СС 66 АА 66 СТ 6А6Т666Т САТ 151 200 АТТССССС66АТССТСА66АТСССТТСТЛС6СА6АСТСС6Т6АА6С6СС6 ,АТСССТССТ6АТСеТСА66АССС6ТТСТАТ6СТ5АТТСС6ТСАААС6СС6 АТ СС СС 6АТ66ТСА66А СС ТТСТА 6С СА ТСС6Т АА 66СС6 201 250 СТТСАССАТСТССС6ССАСААТТССАА6ААСАС6СТАТАТСТССАААТСА
ТТТТА : АТТТС Г СС-Т ЗА 1ААСАССААААА АСТСI 62 ДСсТ6€АААТ< ТА ТТ АССАТ ТС С-3 САСАА САД ААСЛС СТ ТА СТЗСАААТ6А 251 Ι00 .<.СА6сст+>'™сс ·,σ с?· :А'А?С6Татл'г'ч1ст6т ;сс гзсттз.'т л,<-ТСС<’д| 6, ЗСАСААСг···' АСЗССЗбТТ’А.АСТ6ТЗА1 СьСТСССА АС СС13С6Т6С ЗА 6АСАС 6С66Т ТАТСАСТС'ТбС СТССТ СС 301 350 .АА6АС,6006161-:ЗЕТ': Τ'ΙΛΕΤΑΤΤΡβαΰΤΰΑΟ&ΪΑΑΕΟΠΙ-εΟΤΤΑΊΟ&Τ АААСС-С'ЗССССИССТСССАСТАСТСаССССАбСбТАСТСТбСТСАПТбТ АА С 36 ССТТСОТТ САСТАСТ663С САС66 АС СТ66ТСАС ЗТ 351
СТС6А6С А’СТТСТ ТС
Пояснение на примерах
Пример А.
Основная селекция и характеристика доменных антител к ΤΝΓΚ1 человека.
Доменные антитела получали из фаговых библиотек. И селекцию в растворе, и пэннинг в отношении пассивно адсорбированного ΤΝΓΚ1 человека осуществляли в соответствии с релевантными стандартными способами. ΤΝΓΚ1 человека приобретали в виде растворимого рекомбинантного белка либо в Β&Ό 8у81етз (№ по каталогу 636-В1-025/СГ), либо в Рерго1есН (№ по каталогу 310-07) и использовали либо непосредственно (в случае пассивной селекции), либо после биотинилирования, используя реакцию сочетания через первичные амины с последующим качественным контролем его активности в биологическом анализе и анализе его Μν (молекулярная масса) и степени биотинилирования посредством массспектрометрии. Обычно осуществляли 3 раунда селекции, используя уменьшающиеся уровни антигена в каждом последующем раунде.
Продукты селекции подвергали скринингу с использованием фагового ЕЫ8А на присутствие анти'ТОГК1-связывающих клонов. ДНК из этих селектированных фагов выделяли и субклонировали в экспрессирующий вектор для экспрессии растворимых фрагментов бАЬ. Растворимые фрагменты бАЬ экспрессировали в 96-луночных планшетах и супернатанты использовали для скрининга на присутствие анти-'ГОРМ-связывающих бАЬ, используя либо непосредственное связывание в ЕЫ8А с детекцией антис-тус, либо В1Асоге™ с использованием чипа В1Асоге™ со стрептавидин/биотинилированным ΤΝΡΒ1, и ранжировали в соответствии со скоростями диссоциации.
Основные молекулы, описанные ниже, происходили из родительского бАЬ, названного ΌΟΜ1Φ-131 (описанного в νΟ 2006038027). Эту молекулу селектировали из фаг-дисплейной библиотеки после 3 раундов селекции с использованием 60 нМ биотинилированного антигена. Покрытые стрептавидином или нейтравидином гранулы ЭупаЬсабз чередовали в качестве захватывающих реагентов в каждом раунде селекции для предупреждения селекции структур, связывающихся либо со стрептавидином, либо с нейтравидином. Эффективность основной молекулы ΌΟΜ1Η-131 на этой стадии находилась в низком микромолярном диапазоне, как определено в клеточном анализе на фибробластах ЫКС-5 с высвобождением 1Ь-8. Кинетика связывания, определенная при помощи В1Асогс™, обычно представляла скорости
- 51 018723 быстрой ассоциации и быстрой диссоциации (Гакΐ-οη/Гакΐ-οГГ га!ек). Уровни экспрессии в Εχο1ί этой основной молекулы ЭОМ111-131 в виде мономера с присоединенной к С-концу тус-меткой находились в диапазоне 8 мг/л.
Созревание аффинности основных молекул
ЭОМ111-131 подвергали созреванию аффинности с получением мутантов с более высокой эффективностью и улучшенными биофизическими характеристиками (см. фиг. 3 в отношении аминокислотных последовательностей основных молекул, происходящих из ЭОМ111-131). После создания допускающей ошибки библиотеки (в среднем 1 аминокислотная замена на последовательность бАЬ, размер библиотеки 8х107) с использованием ПЦР-полимеразы низкой точности (Сеηетο^рб II, 8!га!адепе) осуществляли семь раундов селекции, используя эти допускающие ошибки библиотеки. Такая стратегия привела к выделению клона ЭОМ111-131-8, молекулы, в которой 4 аминокислотные замены (одна в каркасной области 1 (РК1), одна в СГОК1, одна в СЭК3 и одна в РК4) дали приблизительно 100-кратное улучшение эффективности, как измерено в анализе с использованием клеток МКС-5 (приблизительно 4 нМ). В этом анализе клетки МКС-5 инкубировали с тестируемыми образцами в течение 1 ч, затем добавляли ΤΝΕ-α (200 пг/мл). После инкубации в течение ночи определяли высвобождение ГО-8 с использованием клеточного анализа, обнаруживающего ГО-8 при помощи АВI 8200 (РМА^ (ГйюготеЩс ιηκΐΌνο1ιιπκ аккау {есбтоФду; технология флуориметрического анализа в микрообъеме). В каждый эксперимент включали кривую зависимости от дозы ΤΝΕ-α. Концентрация ΤΝΕ-α, используемая для конкуренции с бАЬ за связывание с ΤΝΕΚ1 (200 пг/мл), составляла приблизительно 70% от максимального ответа на ΤΝΕ-α в этом анализе.
Для дальнейшего улучшения эффективности отдельные аминокислотные положения диверсифицировали посредством олиго-направленного мутагенеза по ключевым положениям, предсказанным на основании информации о допускающей ошибки консенсусной последовательности основной молекулы. Во время этого процесса посредством скрининга с использованием В^тоге™ выделили улучшенный вариант клона ЭОМ11-131-8, ЭОМ111-131-24 (первоначально названный ЭОМ111-131-8-2 до коррекции), который имел единственную аминокислотную мутацию К94К (нумерация аминокислот согласно КаЬа!) и эффективность в КВА 200-300 пМ.
Далее на основе этой основной молекулы и ΝΝδ-библиотеки, из которой она происходила, создавали допускающие ошибки библиотеки и подвергали их трем раундам фаговой селекции, используя тепловую обработку (описание способа см. в 1екрегк Ь., е! а1., Лдгеда!юп-гек1к!ап! бοта^η аη!^Ьοб^ек ке1ес!еб οη рбаде Ьу беа! бепа!ига!юп. №1!. Вю!ес1ию1. 2004 8ер; 22(9): 1161-5). В процессе селекции библиотеки объединяли и из клонов, полученных во втором раунде селекции, получали бАЬ, такие как ООМ1Н-131-53, которое, как полагали, было более термостабильным. Предположили, что эти клоны будут обладать улучшенными биофизическими характеристиками. Некоторые мутации в каркасной области в клоне ЭОМ111-131-53 были эмбрионального типа для создания клона ЭОМ111-131-83. Этот клон стал основой для дальнейшей диверсификации посредством олиго-направленного мутагенеза индивидуальных СОК либо с применением фаг-дисплейной селекции, как описано выше, либо с применением технологии компартментализации ш νίΐτο с использованием эмульсий. С применением фаг-дисплейной стратегии были созданы основные молекулы ООМ16-131-117 и ООМ16-131-151. ООМ16-131-511 создавали с применением технологии компартментализации ш νίίτο.
На этой стадии сравнивали эти три основные молекулы в биофизических и биологических анализах, и наилучшими свойствами обладала молекула ЭОМ111-131-511. Кроме того, эти молекулы тестировали на их устойчивость к протеолитическому расщеплению в присутствии трипсина или лейкозима. Лейкозим состоит из объединенной слюны, полученной от пациентов с муковисцидозом, и содержит высокие уровни эластазы и других протеаз, и его использовали в качестве имитатора условий ш νίνο при легочных заболеваниях. Эти результаты показали, что все три основные молекулы ООМ1Н-131-117, ЭОМ111-131-151 и ООМ1Н-131-511 быстро расщеплялись в присутствии трипсина или лейкозима. Эти данные поставили вопрос о персистенции ООМ1Н-131-511 ш νίνο, в организме пациента, и была разработана стратегия селекции в отношении улучшенной устойчивости к трипсину. Предположили, что такая улучшенная устойчивость к трипсину может оказывать благоприятный эффект на другие биофизические свойства данной молекулы. По существу модифицировали стандартный способ селекции фагов, чтобы обеспечить возможность селекции в присутствии протеаз перед селекцией по антигену. Для этого конструировали новый фаговый вектор, в котором делетировали концевую последовательность с-тус, чтобы обеспечить возможность селекции в присутствии трипсина без отщепления экспонируемого бАЬ от фага. На основе ЭОМ111-131-511 создали допускающие ошибки библиотеки и клонировали их в вектор рЭОМ33 (см. фиг. 50 в отношении карты вектора рЭОМ33). Фаговые концентраты, полученные из этой библиотеки, предварительно обрабатывали трипсином в концентрации либо 1 мг/мл, либо 100 мкг/мл при 37°С в течение 24 ч, затем добавляли ингибитор протеазы, который представлял собой полный набор ингибиторов протеаз от ^сбе (2х), для блокирования активности трипсина перед селекцией по релевантному антигену. Осуществляли четыре раунда селекции. Экспрессируемые растворимые ΤΝΕ^связывающие бАЬ оценивали, используя В^тоте™, в отношении их способности связываться с ΤΝΕ^ в
- 52 018723 присутствии или в отсутствие протеаз при инкубациях в течение 1 ч или в течение ночи при 37°С в присутствии или в отсутствие трипсина (в конечной концентрации трипсина 100 или 1000 мкг/мл).
Это привело к выделению двух основных молекул ЭОМ111-131-202 и ПОМ1Н-131-206, которые демонстрировали улучшенную устойчивость к протеазам, как показано в В1Асоге™-экспериментах по связыванию с антигеном. Интересно отметить, что ЭОМ111-131-202 содержала только одну мутацию в ί.ΌΒ2 (У53Э) (нумерация всех аминокислот согласно КаЬа!) по сравнению с ООМ111-131-511, в то время как ЭОМ111-131-206 содержала только две мутации: первая мутация является такой же, как в ООМ111131-202 (мутация У53Э в СЭВ2), а вторая мутация представляет собой мутацию У9Ш в ΕΒ3 (см. фиг. 3). Эта мутация У9Ш в ΕΒ3 встречается в гене 3-20 зародышевой линии человека, что указывает на то, что этот остаток присутствует в антителах человека. Три клона ООМ111-131-511, ЭОМ111-131-202 и ООМ111131-206 имеют аминокислотные последовательности, показанные на фиг. 3.
Активность молекул определяли, как показано ниже.
Оценка аффинности связывания ПОМШ-131-202, ПОМШ-131-511 и ООМШ-131-206 в отношении связывания с человеческим ΤΝΕΒ1 с использованием В1Асоге™
Аффинности связывания ПОМШ-131-202, ПОМШ-131-511 и ООМШ-131-206 в отношении связывания с человеческим рекомбинантным ΤΝΕΒ1, экспрессируемым в Е.сой, оценивали посредством В1Асоге™-анализа. Анализ осуществляли с использованием биотинилированного человеческого ΤΝΕΒ1. 1400 ВИ (резонансных единиц) биотинилированного ΤΝΕΒ1 использовали для нанесения на чип со стрептавидином (8А). Поверхность регенерировали до исходного состояния, используя элюцию в условиях слабой кислотности. ПОМШ-131-202, ПОМШ-131-511 и ООМШ-131-206 пропускали через эту поверхность при определенных концентрациях, используя скорость потока 50 мкл/мин. Для работы использовали устройство В1Асоге™ 3000, и данные анализировали и подгоняли к модели связывания 1:1. Данные по связыванию хорошо соответствовали модели 1:1 для всех тестируемых молекул. Все значения Кс рассчитывали, исходя из констант кои и коГГ. В1Асоге™-анализы осуществляли при 25°С.
Приведенные ниже данные получены их трех независимых экспериментов. В каждом эксперименте результаты вычисляли путем усреднения числа подгонок с использованием наибольших концентраций бАЬ для кб и меньших концентраций для ка. Данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения (в скобках) результатов (табл. 1).
Таблица 1
Данные В1Асоге™ для связывания ЭОМ1н-131-202, ПОМ1н-131-511 и ООМШ-131-206 с ΤΝΕΒ1 человека
кап Ко (нМ)
ООМ1Н-131-511 5.03Е+05 5.06Е-04 1,07
(511) (1.07Е+05) (1.01Е-04) (0,44)
ϋΟΜ1Η-131202 1.02Е+06 5.42Е-04 0,55
(202) (2.69Е+05) (3.69Е-05) (0,11)
РОМ1Н-131-206 1.55Е+06 7.25Е-04 0,47
(206) (3.57Е+05) (1.95Е-04) (0,06)
ПОМШ-131-202, ПОМШ-131-511 и ООМШ-131-206 связывались с ΤΝΕΒ1 человека сходным образом и с высокой аффинностью. ООМШ-131-202 и ЭОМ1н-131-206 связываются со средними аффинностями 0,55 и 0,47 нМ соответственно. И ПОМШ-131-202, и ООМШ-131-206 имеют несколько лучшую аффинность по сравнению с ПОМШ-131-511, который имеет среднюю аффинность 1,07 нМ.
Анализ связывания с рецептором
Эффективность бАЬ определяли в отношении ΤΝΕΒ1 человека в анализе связывания с рецептором. В этом анализе измеряют связывание ΤΝΕ-альфа с ΤΝΕΒ1 и определяют способность растворимого бАЬ блокировать это взаимодействие. Слияние ΤΝΕΒ1-ΕΌ улавливают на шариках, предварительно покрытых козьими антителами против 1§С человека (н&Ь). Покрытые рецептором гранулы инкубируют с ΤΝΕ-альфа (10 нг/мл), бАЬ, биотин-конъюгированным анти-ΤNΕ-альфа и стрептавидин-(а1еха йиог 647) в 384-луночном планшете с прозрачным дном и черными стенками. Через 6 ч планшет считывают в системе АВ1 8200 Се11и1аг Ое1есйои и определяют ассоциированную с гранулами флуоресценцию. Если бАЬ блокирует связывание ΤΝΕ-альфа с ΤΝΕΒ1, то интенсивность флуоресценции будет уменьшаться.
Данные анализировали с использованием программного обеспечения для анализа АВ1 8200. Кривые зависимости эффекта от концентрации и значения эффективности (ЕС50, средняя эффективная концентрация) определяли с использованием Οηρί^-^ Рпкт и сигмоидальной кривой зависимости ответа от дозы с вариабельным наклоном. Анализ повторяли в трех отдельных параллелях. Кривую зависимости от дозы ΤΝΕ-альфа включали в каждый эксперимент (фиг. 38 и 39). Концентрация ΤΝΕ-альфа, используемая для конкуренции с бАЬ за связывание с ΤΝΕΒ1 (10 нг/мл), составляет приблизительно 90% от максимального ответа на ΤΝΕ-альфа в этом анализе.
Репрезентативный график, представленный на фиг. 39, демонстрирует способность бАЬ ингибировать связывание ΤΝΕ-альфа с ΤΝΕΒ1. Во всех трех экспериментах отрицательные контрольные образцы
- 53 018723 (НЕЬ4, ЙАЬ против лизоцима белка куриного яйца и имитация νΗ) слабо ингибируют взаимодействие между ТБЕ-альфа и ТБЕВ1 при высоких концентрациях. Средние значения эффективности (ЕС50) для тестируемых образцов и положительных контролей (анти-ТОТВ! тАЬ (моноклональное антитело), полученное от В&Э Будете, тАЬ225) и ЕпЬге1™ (этанерцепт; димерная слитая конструкция, состоящая из 'ТЫЕВ2, связанного с Ес-областью ^01; разрешен для лечения ревматоидного артрита) представлены в табл. 2.
Таблица 2
Значения эффективности (ЕС50) для ΌΘΜ1Η-131-202, ΌΘΜ1Η-131-206 и ΌΘΜ1Η-131-511 в анализе связывания с рецептором ТБЕВ1 для трех повторных экспериментов.
Образец Средняя ЕС50 (нМ) 8ЕМ (стандартная ошибка среднего)
ΡΟΜ1Η-131-202 0,11 0,008
ООМ1Н-131-206 0,07 0,01
ООМ1Н-131-511 0,19 0,01
ЕпЬге1™ (этанерцепт) 0,20 0,07
Анти-ΤΝΡΕΠ тАЬ № тАЬ225 0,08 0,003
В этом анализе ΌΘΜ1Η-131-206 кажется более эффективным, чем два других тестируемых ЙАЬ, и имеет похожую эффективность с имеющимся в продаже анти-ТЫЕВ тАЬ, ΜЛВ225 (В&Э 8у5!етв).
Экспрессию основных клонов в Р1сЫа рав!ог15 осуществляли, как описано ниже.
Первичную аминокислотную последовательность трех основных молекул использовали для получения кодон-оптимизированных генов для секретируемой экспрессии в Р1сЫа рав!ог15. Имеется 75%-ная идентичность последовательностей между кодон-оптимизированной и кодон-неоптимизированной последовательностью ΌΘΜ1Η-131-206. Три синтетических гена клонировали в экспрессирующий вектор рРЮ-Ζα (от БтеЦгодеп) и затем осуществляли трансформацию двух штаммов РюЫа, Х33 и ΚΜ71Η. Трансформированные клетки высевали на чашки с увеличивающимися концентрациями зеоцина (100, 300, 600 и 900 мкг/мл) для селекции клонов с множественными интегратами. Для скрининга экспрессии было отобрано приблизительно 15 клонов для каждой клеточной линии и конструкции.
Поскольку корреляция между высокой/низкой копийностью гена и уровнем экспрессии в Р1сЫа рав!ог1в до конца не понятна, несколько клонов отбирали во всем диапазоне концентраций зеоцина. Циклы ферментации в 5-литровом ферментаторе осуществляли с использованием клонов, которые не были подвергнуты расширенному скринингу в отношении высокой продуктивности. Это позволило получить значительные количества материала для дальнейших исследований.
Получение материала для характеристики белка
Для очистки νΗ ЙАЬ из супернатантов микробных культур широко используются хроматографические смолы на основе белка А. Хотя это позволяет использовать одностадийный способ очистки для получения высоко очищенного материала, обычно в более чем 90% случаев условия элюции при низких рН для некоторых молекул могут приводить к образованию агрегатов. Также существует проблема ограниченной емкости аффинных смол для ЙАЬ; это означает необходимость использования значительных количеств смолы для обработки материала из ферментаторов. Для получения высококачественного материала с целью его характеристики и дальнейших исследований стабильности и исследований с применением небулайзеров разработали следующий способ очистки с использованием смолы с индукцией заряда смешанной модальности в качестве первичной стадии захвата с последующей анионообменной хроматографией. Без какой-либо значительной оптимизации это позволяет достичь приблизительно 70%-ного извлечения экспрессированного ЙАЬ с чистотой приблизительно 95%.
Для проведения стадии захвата на смоле с индукцией заряда смешанной модальности (Сар!о ΜΜС от СЕ ИеаНксаге) колонку уравновешивают, используя 50 мМ фосфат натрия рН 6,0, и супернатант наносят без разведения или корректировки рН. После промывки колонки белок элюируют градиентом рН, используя буфер для элюции, представляющий собой 50 мМ Трис рН 9,0. Конкретные условия промывки и градиента слегка варьируют в зависимости от рI элюируемого белка.
Пик элюата затем дополнительно очищают посредством стадии анионообменной хроматографии. Это позволяет удалить остаточную ΗΜ№ (высокомолекулярную) примесь, такую как алкогольоксидаза, и уменьшает содержание эндотоксина. Смолу уравновешивают либо РВ8, либо фосфатным буфером рН 7,4 без соли. При нанесении элюата с Сар!о ΜΜС на анионообменную смолу ЙАЬ не связывается, и его извлекают из проскока (Доте 111гоиц11). Эндотоксин и другие примеси связываются со смолой. Присутствие соли, в случае использования РВ8-буфера, улучшает выход белка до 91% для этой стадии вместо выхода 86%, достигаемого в отсутствие соли. Однако присутствие соли снижает эффективность удаления эндотоксина, так что типичный уровень эндотоксина в ЙАЬ после этой стадии с включением соли составлял 58 ЕИ/мл по сравнению с уровнем менее 1,0 ЕИ/мл, полученным в отсутствие соли.
- 54 018723
Характеристика белка
Материал, полученный из циклов ферментации в 5-литровом ферментаторе, характеризовали в отношении идентичности, используя масс-спектрометрию с электрораспылением, амино-концевое секвенирование и изоэлектрическое фокусирование, а также в отношении чистоты, используя БОЗ-РАСЕ, ЗЕС и набор для окрашивания гликопротеинов Се1собе (Р1егсе).
Идентичность
Анализ аминоконцевой последовательности первых пяти остатков каждого белка дал ожидаемый результат (ЕУОЬЬ..). Масс-спектрометрию осуществляли на образцах белков, в которых произвели замену буфера на Н2О:ацетонитрил 50:50, содержащий 0,1% ледяной уксусной кислоты, с использованием С4 21р-йр8 (М1Шроге). Измеренная масса каждого из трех белков находилась в пределах 0,5 Да от теоретической массы на основании первичной аминокислотной последовательности (рассчитанной с использованием средних масс) с учетом разницы масс -2, получаемой в результате образования внутренней дисульфидной связи. ΙΕΡ использовали для идентификации белков на основании их р1, которые различались для каждого белка.
Чистота
Эти три белка наносили на невосстанавливающие БОЗ-РАСЕ гели в количествах 1 мкг и 10 мкг в двух повторностях. Во всех случаях наблюдали одну полосу. Для демонстрации уровней чистоты также осуществляли гель-фильтрацию. При проведении гель-фильтрации (ЗЕС) на колонку С2000 ЗХХЬ ΤΟЗОН наносили по 100 мкг каждого белка при скорости потока 0,5 мл/мин. Использовали подвижную фазу РВЗ/10% этанол.
Исследование стабильности бАЬ в отношении селекции кандидатов
При показании СОРО необходимо доставлять АЬ в легкое, например, с использованием распылительного устройства. Это означает, что белок может испытывать сдвиговую деформацию и тепловой стресс в некотором диапазоне в зависимости от типа используемого небулайзера и может подвергаться ферментативному расщеплению протеазами во внутрилегочной среде. Определяли, может ли белок доставляться с использованием этого типа устройства, происходит ли правильное распределение по размеру частиц и остается ли он функциональным после доставки небулайзером. Поэтому исследовали внутреннюю стабильность молекулы в диапазоне физических нагрузок для того, чтобы определить исходную стабильность и наиболее чувствительные анализы для измерения стабильности. Поскольку стабильность каждого белка будет зависеть от буферного раствора, в котором он растворен, необходимо было провести некоторую подготовительную работу. Такая информация, как буфер, рН, также может быть полезна для представления о стабильности белка во время последующего процесса очистки и дальнейшего хранения. Для того чтобы охарактеризовать изменения в молекулах во время воздействия на них различных физических нагрузок, использовали ряд аналитических методик, таких как гель-фильтрация (ЗЕС), ЗОЗРАСЕ и изоэлектрическое фокусирование (ΕΡ).
Оценка стабильности ООМ1Н-131-202, ООМ1Н-131-511 и ООМ1Н-131-206 при действии протеаз
Стабильность ООМ1Н-131-202, ООМ1Н-131-511 и ООМ1Н-131-206 при действии протеаз оценивали в В1Асоге™-анализе остаточной связывающей активности после предварительной инкубации в течение определенных периодов времени с избытком протеаз. Приблизительно 1400 Ки биотинилированного ΤΝΡΚ1 использовали для нанесения на чип со стрептавидином (ЗА). 250 нМ ООМ1Н-131-202, ООМ1Н131-511 и ООМ1Н-131-206 инкубировали только с РВЗ или с 100 мкг/мл трипсина, эластазы или лейкозима в течение 1, 3 и 24 ч при 30°С. Реакцию останавливали путем добавления коктейля ингибиторов протеаз. Затем смеси бАЬ/протеазы пропускали через чип, покрытый ΤΝΡΚ1, вычитая сигнал ячейки сравнения.
Поверхность чипа регенерировали перед каждым циклом инжекции, используя 10 мкл 0,1 М глицина, рН 2,2. Фракцию ООМ1Н-131-202, ООМ1Н-131-511 и ООМ1Н-131-206, связавшихся с ΤΝΡΚ1 человека (за 10 с), предварительно инкубированных с протеазами, определяли относительно бАЬ, связавшегося в отсутствие протеаз. В1Асоге™-анализы осуществляли при 25°С.
Данные получали из трех независимых экспериментов. Гистограмма показывает средние значения, а планки погрешностей указывают на стандартное отклонение результатов (результаты см. на фиг. 24).
Обнаружили, что ООМ1Н-131-202 и ООМ1Н-131-206 показали более высокую устойчивость к протеолитическому расщеплению трипсином, эластазой или лейкозимом по сравнению с ООМ1Н-131-511. Различие между ООМ1Н-131-202 и ООМ1Н-131-206 по сравнению с ООМ1Н-131-511 наиболее ярко выражено после инкубации в течение 1 ч с трипсином и 3 ч с эластазой или лейкозимом.
Термостабильность, определенная с использованием ОЗС
Для того чтобы определить, при каких значениях рН молекулы имели наибольшую стабильность, использовали дифференциальную сканирующую калориметрию (ОЗС) для измерения температур плавления (Τφ каждого бАЬ в буфере Бриттона-Робинсона. Поскольку буфер Бриттона-Робинсона изготовлен из трех буферных систем (ацетата, фосфата и бората), то в одном и том же растворе можно получать рН в диапазоне от 3 до 10. Теоретическую величину р1 определяли из первичной аминокислотной последовательности белков. На основании данных ОЗС обнаружили, что рН, при котором бАЬ имеют самую
- 55 018723 высокую внутреннюю термостабильность, составляет: рН 7 для ΌΟΜ1Η-131-202 (202), рН 7-7,5 для ΌΟΜ1Η-131-206 (206) и рН 7,5 для ΌΟΜ1Η-131-511 (511). Во всех последующих исследованиях нагрузок и стабильности для каждого бАЬ использовали следующие значения рН: для ΌΟΜ1Η-131-202 (202) и ΌΟΜ1Η-131-206 (206) рН 7,0, а для ΌΟΜ1Η-131-511 (511) рН 7,5 в буфере Бриттона-Робинсона. Результаты суммированы ниже в табл. 3.
Таблица 3
Краткий обзор значений рН и У для ΌΟΜ1Η-131-202 (202), ΌΟΜ1Η-131-206 (206) и ΌΟΜ1Η-131-511 (511), как определено посредством ЭБС в буфере Бриттона-Робинсона при концентрации 1 мг/мл
бАЬ рН, который дает наибольшую внутреннюю термостабильность Тт (°С) бАЬ при данном рН
ООМ1Н-131-202 (202) 7,0 68,6
ϋΟΜ1Η-131-206 (206) 7,0-7,5 65,8
ООМ1Н-131-511 (511) 7,5 58,0
Тестирование собственной растворимости
Все основные молекулы бАЬ концентрировали в центрифужных концентраторах νίνηδρίη (отсечение 5 кДа) для определения их максимальной растворимости и выходов после концентрирования. Эксперименты осуществляли в буфере Бриттона-Робинсона при наиболее стабильном рН. Объемы образцов и концентрации измеряли во времени и регистрировали отклонение от ожидаемой концентрации, а также процентный выход образца.
Обнаружили, что все белки могут быть сконцентрированы до концентрации более 100 мг/мл в буфере Бриттона-Робинсона. И ΌΟΜ1Η-131-202 (202), и ΌΟΜ1Η-131-206 (206) демонстрировали более низкие выходы, чем ожидалось, по сравнению с ΌΟΜ1Η-131-511 (511), но остающиеся все еще на приемлемых уровнях.
Доставка основных бАЬ с использованием небулайзеров
В результате тестирования различных небулайзеров и препаративных буферов было продемонстрировано, что бАЬ могут эффективно доставляться с использованием широкого набора распылительных устройств. Важнее то, что впервые было показано, что распыление бАЬ в препаративном буфере приводило к получению желаемого распределения частиц по размерам (сравнимое с использованием процента капель менее 5 мкм) для эффективной доставки в легкое при сохранении функциональности белка. Это дополнительно описано ниже.
Сравнение производительности различных устройств
ΌΟΜ1Η-131-511 (511) тестировали в шести распылительных устройствах, включающих по два устройства из каждой из трех основных групп небулайзеров, используемых для жидких композиций, т.е. ультразвуковых небулайзерах, струйных небулайзерах и небулайзерах на основе технологии вибрирующего сита. В каждом устройстве бАЬ тестировали в концентрации 5 мг/мл с диапазоном концентраций ПЭГ. Для каждого образца измеряли процент капель размером менее 5 мкм, используя устройство Μηίуегп 8ргау1ек (ΜηΙνΌΓη ΙηΛπιιικηΙδ ЫтНеб, иК), и результаты представлены на фиг. 35. Стабильность каждого образца после его распыления оценивали, используя 8ЕС для анализа количества образца, который димеризовался как в веществе, оставшемся в колпачке, так и в собранном аэрозоле. Результаты можно видеть на фиг. 36. Чем меньше степень образования димеров, тем выше стабильность.
Большая часть устройств может доставлять 40% или более жидкой композиции в подходящем диапазоне размеров, но устройства еΕ1ο\ν (распылительное устройство на основе технологии вибрирующего сита) и РАЯ1 ЬС (струйный небулайзер) работают лучше, причем устройство РАЯ1 ЬС* (Б1аг) доставляет более 80%, когда в состав буфера включен ПЭГ. Это увеличение доставки при использовании ПЭГ также наблюдается для еΕ1ο\ν и в меньшей степени для РАЯ1 ЬС+.
Важно, что также обнаружили, что после распыления сохраняется активность бАЬ (см. результаты на фиг. 8).
Влияние буферных добавок
Вследствие меньшей стабильности ΌΟΜ1Η-131-511 (511), 50 мМ фосфатный препаративный буфер, содержащий как ПЭГ 1000, так и сахарозу (и имеющий вязкость, которая находится в диапазоне, который определен как примерно равный вязкости раствора от примерно 2 до примерно 10% ПЭГ 1000 в 50 мМ фосфатном буфере, содержащем 1,2% сахарозы (мас./об.)), способствует защите бАЬ как от сдвиговой деформации, так и от теплового стресса. Поскольку и ΌΟΜ1Η-131-202 (202), и ΌΟΜ1Η-131-206 (206) имеют более высокие У и демонстрируют значительно улучшенную стабильность к тепловому стрессу, все молекулы тестировали как в исходном препаративном буфере, так и в буфере БриттонаРобинсона (который имеет меньшую вязкость, чем препаративный буфер). бАЬ тестировали в обоих устройствах Ε-Πο\ν и Рап ЬС+ со временем работы 3,5 мин при концентрации белка 5 мг/мл и распределение частиц по размерам определяли с использованием устройства ΜηΙνΌΓη 8ргау1ек. Для сравнения имеющееся в продаже лекарственное средство для лечения муковисцидоза (обозначенное как стандартный белок X), которое доставляют с использованием распылительного устройства, тестировали в его
- 56 018723 собственном препаративном буфере. Результаты представлены на фиг. 37. Для хорошей доставки и распределения в глубоких отделах легких идеальный размер частиц составляет менее 6 мкм, например менее 5 мкм. Все бАЬ обеспечивают сравнимые уровни размеров частиц, которые были меньше 5 мкм как в буфере Бриттона-Робинсона, так и в препаративном буфере (как описано ранее). Однако более высокая вязкость препаративного буфера может быть особенно полезной для продуцирования частиц в подходящем диапазоне размеров, например частиц менее 5 мкм. Концентрацию бАЬ в колпачке устройства определяли, измеряя А280 до и после распыления. Обнаружили, что концентрация белка не изменялась существенно, что указывает на то, что ни белок, ни разбавитель не распылялись предпочтительно во время доставки.
Заключение
Продемонстрировано, как описано выше, что полипептиды, такие как бАЬ, можно распылять с использованием различных, имеющихся в продаже распылительных устройств, и важно, что они сохраняют стабильность и биологическую активность после распыления и что после распыления не наблюдается никакой значительной агрегации. Когда в состав буфера добавляют эксципиенты, увеличивающие вязкость, такие как ПЭГ, распределение частиц по размеру и процент капель с размером менее 5 мкм могут быть улучшены, что потенциально улучшает доставку бАЬ в глубокие отделы легких.
Доставка бАЬ в легкое также может быть улучшена посредством увеличения концентрации бАЬ, например, вплоть до концентрации примерно 40 мг/мл, и времени доставки без какого-либо уменьшения стабильности или активности бАЬ.
Пример 1.
Фаговый вектор РЭОМ13
Использовали вектор рИОМ13 для фагового дисплея на основе нитчатого фага (Гб). Этот вектор продуцирует белки, слитые с оболочечным фаговым белком III. Сайт множественного клонирования рИОМ13 проиллюстрирован на фиг. 1. Гены, кодирующие бАЬ, клонировали в виде ЗаП^обфрагментов.
Пример 2.
Протеазные селекции экспонируемых на фагах доменных антител (бАЬ) с различной устойчивостью к трипсину
Гены, кодирующие бАЬ: ИОМ4-130-54, которое связывается с ШИКб, ИОМ11-131-511, которое связывается с ЮТКб, и ИОМ15-10, ИОМ15-26 и ИОМ15-26-501, которые связываются с УЕСЕА, клонировали в рИОМ13, и фаги, экспонирующие эти бАЬ, получали в соответствии со стандартными методиками. Фаги очищали посредством ПЭГ-преципитации, ресуспендировали в РВЗ и титровали.
Указанные выше бАЬ демонстрировали разную способность противостоять расщеплению трипсином при тестировании их в виде выделенных белков. Устойчивость к расщеплению оценивали следующим образом: бАЬ (1 мг/мл) в РВЗ инкубировали с трипсином в концентрации 40 мкг/мл при 30°С, что приводит к молекулярному соотношению бАЬ:трипсин 25:1. Образцы (30 мкл) отбирали непосредственно перед добавлением трипсина и затем через 1, 3 и 24 ч. Протеазную активность нейтрализовали путем добавления полного набора ингибиторов протеаз от Восйе (2х) с последующим погружением в жидкий азот и хранением на сухом льду. По 15 мкг каждого образца бАЬ далее анализировали посредством электрофореза на геле №гех (10-20%) Исше и белки окрашивали с помощью ЗигеВ1ие (1х).
И ИОМ15-10, и ИОМ15-26-501, оба, в значительной степени переваривались в течение первых трех часов. ИОМ15-26, ИОМ4-130-54 и ИОМ11-131-511 оказались более стабильными, причем переваривание этих бАЬ становилось заметным только через 24 ч (фиг. 2).
Экспонируемые на фагах бАЬ инкубировали также в присутствии трипсина для оценки того, коррелирует ли устойчивость к трипсину экспонируемых на фагах АЬ с результатами, полученными с выделенными растворимыми бАЬ. Тестировали различные концентрации трипсина и времена инкубации. Во всех случаях после нейтрализации трипсина полным набором ингибиторов протеаз от ИосЬе фаги тестировали в отношении их способности связываться с типичным лигандом: белком А, который связывается со всеми УН-доменными антителами (например, ИОМ11-131, ИОМ15-26, ИОМ15-26-501), или белком Ь, который связывается со всеми ^-доменными антителами (например, ИОМ4-130-54, ИОМ15-10). Фаги также тестировали в отношении связывания с целевыми антигенами. В обоих случаях предполагалось, что связывание коррелирует с сохранением структурной целостности бАЬ благодаря устойчивости к протеолизу. Связывающую активность измеряли либо посредством ЕЫЗА (с использованием конъюгированных антител против фага), либо посредством элюции связавшихся фагов и анализа титрованием после инфицирования клеток Е.со11 Τ^, находящихся в экспоненциальной фазе роста.
Тестирования ИОМ15-10, ИОМ15-26 и ИОМ15-26-501 на фаге
Каждое бАЬ обрабатывали в течение 1 ч при комнатной температуре трипсином в диапазоне концентраций (100, 10 и 0 мкг/мл). Активность трипсина блокировали полным набором ингибиторов протеаз от Восйе (1Х) и затем фаги разбавляли в 2% Магуе11 в РВЗ, инкубировали с 50 нМ биотинилированного антигена (рекомбинантного УЕСЕ человека (В&И Зуйетк)) в течение 1 ч при комнатной температуре. Добавляли покрытые стрептавидином гранулы (ИупаЬебк М-280 Дпуйгодеп)), которые предварительно блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре 2% Магуе11 в РВЗ, и смесь затем инкубировали в
- 57 018723 течение 5 мин при комнатной температуре. Все стадии инкубации с ЭупаЬекк осуществляли на вращающемся диске. Несвязавшийся фаг отмывали путем промывки гранул восемь раз 1 мл 0,1% Бетееп-20 в РВ8. Связавшийся фаг элюировали, используя 0,5 мл 0,1 М глицина, рН 2,2, и нейтрализовали 100 мкл 1 М трис-НС1, рН 8,0. Элюированный фаг использовали для инфицирования клеток Τ^, находящихся в экспоненциальной фазе роста (1 ч при 37°С), и высевали на чашки с тетрациклином. Чашки инкубировали в течение ночи при 37°С и осуществляли подсчет колоний (см. табл. 4). Наилучшие результаты наблюдали для селекции с инкубацией при 100 мкг/мл трипсина. Наблюдали примерно 10-кратное увеличение выхода ОО1Ш5-26 по сравнению с ^ΟΜ15-10 и ^ΟΜ15-26-501.
Второй эксперимент осуществляли для дополнительного подтверждения этих результатов в более жестких условиях инкубации. Экспонируемые на фагах кАЬ обрабатывали в течение 1 или 2 ч при 37°С с перемешиванием (250 об/мин). Наилучшие результаты наблюдали для селекции с инкубацией в течение 2 ч при 100 мкг/мл трипсина. Выход ^ΟΜ15-26 был в 200 раз выше, чем выход ^ΟΜ15-26-501, и в 1000 раз выше, чем выход ^ΟΜ15-10.
В третьем эксперименте фаги, экспонирующие ^ΟΜ15-26 и ^ΟΜ15-26-501, вначале смешивали 1:1. Затем их инкубировали либо с трипсином (1000 мкг/мл), либо без трипсина в течение 2 ч при 37°С с перемешиванием (250 об/мин) и затем селектировали в отношении связывания с антигеном, как описано выше. Секвенирование десяти колоний для каждой селекции обнаружило смешанную популяцию клонов для селекции без предварительной обработки трипсином (^ΟΜ15-26: 4/10; ^ΟΜ15-26-501: 6/10), в то время как все клоны для селекции с трипсином кодировали ^ΟΜ15-26, как и ожидалось.
Эти эксперименты показывают, что селекционное давление может быть получено путем добавления протеазы к фагам, экспонирующим кАЬ, так что предпочтительно селектируются фаги, экспонирующие наиболее стабильные к протеолизу кАЬ (после пэннинга на типичным лиганде или антигене).
Таблица 4
Тесты с ^ΟΜ4-130-54 на фаге ^ΟΜ4-130-54 тестировали согласно аналогичному протоколу, как описано выше. Варьировали следующие параметры: концентрацию трипсина, температуру и длительность инкубации. Биопэннинг осуществляли против ΙΤ-ΙΗΙ-Ес (слияние 1Б-1К1 и Ес) при 1 нМ концентрации в РВ8. Значительное уменьшение фагового титра наблюдали только после инкубации фага с трипсином в концентрации 100 мкг/мл в течение ночи при 37°С (см. табл. 5).
Таблица 5
Длительность инкубации Температура Концентрация трипсина Титр
1 ч Комнатная темп. 100 мкг/мл 1,Зх1О10
1 ч Комнатная темп. 10 мкг/мл 7,2 х 10а
1 ч Комнатная темп. 0 мкг/мл 6,6x10’
В течение ночи Комнатная темп. 100 мкг/мл 2,16x10°
В течение ночи Комнатная темп. 10 мкг/мл 7,2 х 10’
В течение ночи Комнатная темп. 0 мкг/мл 7,8 х 10’
В течение ночи 37’С 100 мкг/мл 2,04x10°
В течение ночи 37°С 10 мкг/мл 3,84 х 10°
В течение ночи 37°С 0 мкг/мл 7,2x10’
Тесты с фагом, экспонирующим ^ΟΜ1к-131
Фаг ^ΟΜ1к-131 (близкородственный ^ΟΜ1к-131-511 по аминокислотной последовательности), обрабатывали трипсином в концентрации 0, 10, 100 и 1000 мкг/мл в течение 1 ч при комнатной температуре. Переваривание ингибировали путем добавления 25х полного набора ингибиторов протеаз (Вοске). Последовательные 2-кратные разведения фага осуществляли в планшете для ЕЫ8А, покрытом 1 нМ
- 58 018723
ΤΝΕΚΙ, и связывание фага определяли с помощью анти-М13-НРР (пероксидаза хрена). Результаты представлены ниже в табл. 6.
Таблица 6
ΟΟΜ1ΙΊ-131
Концентрация трипсина
100 Исходное количество
1 мг/мл мкг/мл 10 мкг/мл 0 мкг/мл фага
0,284 0.418 0,734 0,916 4.51Е+10
0,229 0.377 0 802 7 0,944 ’ 2.26Е+10
0,183 0.284 • 0,949 1.13Е+10
0,133 0.196 . 0,695. . - . 0,962 5.64Е+09
0,114 0,141 .= 0,946 2.82Е+09
.ν :.
0,089 0,115 Γ'ΟέΙθθ '7 0.850 1,41 Е+09
0,084 0,084 ... 0,705 7.05Е+08
0,080 0,084 0,213 0,577 3.52Е+08
Эти тест-эксперименты ясно демонстрируют, что 100 мкг/мл трипсина и температура 37°С подходят для создания селекционного давления на фаги, экспонирующие бАЬ с разной степенью устойчивости к протеолизу трипсином. Продолжительность инкубации с протеазой может быть оптимизирована для каждого экспонируемого на фаге бАЬ, если это желательно.
Пример 3.
Протеазная селекция экспонируемых на фагах репертуаров доменных антител
Были созданы четыре репертуара с использованием следующих бАЬ в качестве родительских молекул: ΌΟΜ4-130-54, ΌΟΜ1Η-131-511, ΌΟΜ15-10 и ΌΟΜ15-26-555. Случайные мутации вводили в гены посредством ПЦР, используя набор 81га1адепе Μиΐаζуте II, биотинилированные праймеры и 5-50 пг матрицы для 50 мкл реакционной смеси. После переваривания с использованием 8а11 и ΝοΐΙ вставки очищали от непереваренных продуктов с помощью покрытых стрептавидином гранул и лигировали в ρΌΟΜ13 по соответствующим сайтам. Клетки Εχοΐΐ ΤΒ1 трансформировали очищенной смесью для лигирования, получая в результате большие репертуары устойчивых к тетрациклину клонов: 8,5х108 (ΌΟΜ4-130-54), 1,5х109 (ΌΟΜ1Η-131-511), 6х108 (ΏΟΜ15-10) и 3х109 (ΌΟΜ15-26-555).
Фаговые библиотеки получали двойной преципитацией с ПЭГ и ресуспендировали в РВ8.
Частоты аминокислотных мутаций составляли 2,3 и 4,4 для репертуаров ΌΟΜ1Η-131-511 и ΌΟΜ4130-54 соответственно. Функциональность оценивали путем тестирования 96 клонов в фаговом ЕЫ8А, используя лунки, покрытые белком А или белком Г (в концентрации 1 мкг/мл). 62,5 и 27% клонов демонстрировали функциональный дисплей бАЬ в репертуарах ΌΟΜ1Η-131-511 и ΌΟΜ4-130-54 соответственно.
Частоты аминокислотных мутаций составляли 2,5 и 4,6 для репертуаров ΌΟΜ15-10 и ΌΟΜ15-26555 соответственно. Функциональность оценивали путем тестирования 96 клонов в фаговом ЕЫ8А, используя лунки, покрытые белком А или белком Г (в концентрации 1 мкг/мл). 31,3 и 10,4% клонов демонстрировали функциональный дисплей бАЬ в репертуарах ΌΟΜ15-10 и ΌΟΜ15-26-555 соответственно.
Репертуары ΌΟΜ4-130-54 и ΌΟΜ1Η-131-511
Для селекции бАЬ с улучшенной устойчивостью к протеазам осуществляли четыре раунда селекции, используя эти библиотеки.
Первый раунд селекции был основан на связывании с антигеном (1 нМ или 10 нМ антигена) без обработки протеазами для очистки библиотеки с целью удаления клонов, которые больше не связывались с антигеном с высокой аффинностью. Выходы после 1-го раунда составляли 108-1010 (по сравнению с исходным количеством 1011 фагов), что указывает на то, что большая часть библиотеки связывалась с антигеном с высокой аффинностью.
Во 2-м раунде вводили обработку протеазой (100 мкг/мл трипсина) и выходы представлены в табл. 7.
Таблица 7
Условия инкубации с Библиотека Библиотека
трипсином □ОМ1Н-131-511 ЦОМ4-130-54
37’С, в течение ночи 1,86 x10й 21 х 10®
37вС, 2 ч 4,8x10° 5,1 х 10°
Комнатная температура, 2 ч 1,2 x10й 4,62 х 17
Без трипсина приблизит, 1 х 10й приблизит. 4x10°
Без антигена 1.8 х 104 менее 6 х 10°
Наблюдали значительную селекцию, когда бАЬ обрабатывали трипсином при 37°С в течение ночи.
Этот выход использовали для 3-го раунда, где фаг обрабатывали либо 1 мг/мл, либо 100 мкг/мл трипсина
- 59 018723 при 37°С в течение 24 ч. Титры фагов, обработанных трипсином, из 3-го раунда составляли 105-106 для репертуара ООМ1Й-131-511 и 107-108 для репертуара ООМ4-130-154.
Все выходы после 3-го раунда (ЫОМ1Й-131-511 и ЭОМ4-130-154 с 1 мг/мл и 100 мкг/мл) подвергали четвертому раунду селекции против 1 нМ антигена с 100 мкг/мл трипсина. Титры находились в диапазоне 106-108 аналогично тому, что наблюдали в 3-м раунде. Некоторое обогащение наблюдали для репертуара ЭОМ111-131-511, но никакого обогащения не наблюдали для репертуара ЭОМ4-130-54.
Репертуары ООМ15-10 и ООМ15-26-555
Первый раунд селекции осуществляли с 2 нМ концентрацией биотинилированного ΙΑΈΟΡ (человеческого фактора роста сосудистого эндотелия) и без протеазной обработки для очистки библиотеки с целью удаления клонов, которые больше не связывались с антигеном с высокой аффинностью. Выходы после 1-го раунда составляли примерно 108 (по сравнению с исходным количеством 1010 фагов для ЭОМ15-10 и 1011 фагов для ЭОМ15-26-555), что указывает на то, что большая часть библиотеки связывалась с антигеном с высокой аффинностью.
Второй и третий раунды селекции осуществляли с 2 нМ биотинилированного ΙΫΈΟΡ. Перед пэннингом на ΙΑΈΟΡ фаги инкубировали в присутствии трипсина (100 мкг/мл) при 37°С в шейкере (250 об/мин). Продолжительность инкубации составляла 1 ч для репертуара ЭОМ15-10 и 2 ч для репертуара ООМ15-26-555.
Выходы были следующими: 1,5х106 и 9х105 для второго и третьего раундов селекции с репертуаром ООМ15-10; 2,2х108 и 3,9х109 для второго и третьего раундов селекции с ООМ15-26-555.
Пример 4.
Анализ продуктов селекции: репертуары ЭОМ4-130-54 и ЭОМ1Й-131-511
Все продукты 3-го раунда и 4-го раунда субклонировали в вектор рЭОМ5 и использовали для трансформации клеток 1М83. Вектор рЭОМ5 представляет собой вектор на основе рИС119. Экспрессия белков находится под контролем Р1ас-промотора. Лидерная последовательность САЗ1 (уго\\1й аггейкресШс рго!еш 1; белок 1, специфический для остановки роста) (см. ХО 2005/093074) обеспечивает секрецию выделенных растворимых бАЬ в периплазму и культуральный супернатант Е.сой 1М83. 96 и 72 индивидуальных колоний после 3-го раунда и 4-го раунда перекалывали случайным образом для экспрессии.
12-24 клона секвенировали из каждого выхода после 3-го раунда и 4-го раунда. Консенсусные мутации наблюдали для обоих раундов селекции и приблизительно 25 клонов, содержащих консенсусные мотивы, выбирали для дальнейшей характеристики. Аминокислотные последовательности этих клонов представлены на фиг. 3 (селектированные варианты ЫОМ1Й-131-511) и фиг. 4 (селектированные варианты ООМ4-130-54), а последовательности ДНК представлены на фиг. 19А-19Й. Аминокислоты, которые отличаются от родительской последовательности в селектированных клонах, указаны (идентичные аминокислоты обозначены точками). Петли, соответствующие СЭКЕ СЭК2 и ί.ΌΒ3, обведены рамками.
Эти клоны экспрессировали в большем количестве, очищали на белке Ь (для вариантов ЭОМ4-13054) и белке А (для вариантов ЫОМ1Й-131-511) и тестировали в отношении связывания с антигеном на В1Асоге после 1 ч инкубации или после инкубации в течение ночи при 37°С в присутствии или в отсутствие трипсина (конечная концентрация 100 или 1000 мкг/мл).
Как правило, продукты селекции ЭОМ4-130-54 были более стабильными, причем большая часть клонов сохраняла устойчивость к трипсину в течение 1 ч, а самые лучшие клоны - в течение ночи. По сравнению с этим небольшое количество клонов после селекции ЫОМ1Й-131-511 было устойчивым к трипсину в течение 1 ч и в то же время ни один клон не был устойчив в течение ночи.
Пример 5.
Анализ продуктов селекции: репертуары ЭОМ15-10 и ЭОМ15-26-555
Эффективность селекции с предварительной обработкой трипсином сначала тестировали посредством фагового ЕЫЗА с использованием моноклональных антител с перевариванием и без переваривания трипсином. Перекалывали восемнадцать колоний со второго раунда селекции и 24 колонии с третьего раунда селекции каждой библиотеки. Клоны ООМ15-10, ООМ15-26-501 и ООМ15-26 использовали в качестве контролей. Дополнительные контроли включали раствор амплифицированных и очищенных фагов из каждой библиотеки после второго и третьего раундов селекции с использованием трипсина.
Каждый образец фага делили на две фракции, первую обрабатывали 100 мкг/мл трипсина, вторую не обрабатывали трипсином. Инкубацию обеих фракций осуществляли в течение 1 ч при 37°С с перемешиванием (250 об/мин) и блокировали путем добавления полного набора ингибиторов протеаз от Косйе (1х).
Фаговый ЕЫЗА осуществляли, используя переваренные и непереваренные трипсином образцы. Лунки в ЕЫЗА покрывали нейтравидином в концентрации 1 мкг/мл в 0,1 М бикарбонатном буфере. После стадий промывки РВЗ и блокирования покрытых антигеном лунок 1% Τ^ееη-20 в РВЗ в течение 1 ч при комнатной температуре лунки покрывали биотинилированным ΙΑΈΟΡ, разбавленным в 1% Τ^ееη20 в РВЗ в концентрации 100 нг/мл. Затем лунки промывали РВЗ и добавляли обработанные или необработанные фаговые супернатанты, разбавленные 1:1 1% Τ\νееη-20/ΡВЗ. После 30 мин инкубации при 37°С
- 60 018723 лунки промывали 1% Τνееη-20/ΡΒ8 с последующей 30-минутной инкубацией при 37°С с конъюгатом анти-(фаг ΜΠί-Η^ (разбавленным 1/5000 в 1% ^^11-20^68). Затем лунки промывали РВ8 и пероксидазой. Реакцию инициировали путем добавления реагента 8игеВ1ие. Примерно через 10 мин реакцию останавливали эквивалентным объемом 1 М ΗΟ и лунки считывали при ΟΌ450 нм.
Считывание результатов ЕЫ8А для нестабильных контролей ΌΟΜ15-10 и ΌΟΜ15-26-501, обработанных трипсином, давало ΟΌ450 ниже 0,404, и это значение принимали в качестве предельного значения для нестабильного клона. Все образцы, которые давали ΟΌ ниже 0,404, считались нестабильными. Все образцы, которые давали большее значение, считались стабильными.
Таблица 8
Библиотека Трипсин Без трипсина
2-я селекция 3-я селекция 2-я селекция 3-я селекция
ООМ15-Ю 33% 89% 100% 100%
ΩΟΜ15-26-555 94,4% 100% 100% 100%
В табл. 8 показано процентное содержание стабильных клонов после второго и третьего раундов трипсиновой селекции каждой библиотеки. Обогащение устойчивых к трипсину клонов является заметным в обеих библиотеках после третьего раунда селекции. Полученные в ЕЫ8А значения для контрольных лунок, содержащих амплифицированную очищенную фаговую смесь, после каждого раунда селекции были намного выше 0,404 в каждом случае после переваривания трипсином. Кроме того, небольшое увеличение сигнала наблюдали при сравнении обработанных трипсином фагов после третьего раунда селекции с обработанными трипсином фагами после второго раунда селекции. Фаговая библиотека ΌΟΜ15-10 демонстрировала увеличение примерно на 14% от исходного значения. Фаговая библиотека ΌΟΜ15-26-555 демонстрировала увеличение, которое представляет собой примерно 2% от исходного значения.
В целом эти результаты демонстрируют, что селекция с предварительной обработкой трипсином была эффективной для отбора устойчивых к трипсину фаговых клонов из репертуаров ΌΟΜ15-10 и ΌΟΜ15-26-555.
Все продукты второго и третьего раундов селекции (ΌΟΜ15-26-555) и только после третьего раунда селекции (ΌΟΜ15-10) субклонировали в вектор ρΌΟΜ5 и трансформировали в электрокомпетентные клетки НВ2151. Вектор ρΌΟΜ5 представляет собой вектор на основе рИС119. Экспрессия белков находится под контролем Р1ас-промотора. Лидерная последовательность СА81 обеспечивает секрецию выделенных растворимых бАЬ в периплазму и культуральный супернатант Εχοίί ΗΒ2151. 184 индивидуальные колонии после каждого раунда селекции (3 и 4) случайным образом перекалывали для экспрессии в 1 мл среды для культивирования.
Бактериальные супернатанты разбавляли в буфере ИВ8-ЕР ВТАотге (соотношение объемов 1:1) и разделяли на две равные части. Трипсин добавляли только в один флакон до конечной концентрации 20 мкг/мл. Инкубацию осуществляли в течение 40 мин при 37°С с перемешиванием (250 об/мин). После блокирования реакции полным набором ингибиторов протеаз от ΕοΟκ (1Х) как обработанные трипсином, так и необработанные трипсином фаговые супернатанты тестировали на ВТАтоге 3000 в отношении связывания с антигеном (2000 ЯИ биотинилированного ΙινΕΟΕ на сенсорном чипе 8А).
Критериями для перенесенных перекалыванием клонов были: уменьшение связывания с антигеном менее чем на 15% для бАЬ, обработанных трипсином, относительно необработанных бАЬ (на основании максимальных ЯИ, достигаемых для выбранной временной точки), которое отражает стабильность бАЬ к протеазной обработке в целом; и уменьшение скорости диссоциации менее чем на 40% между двумя временными точками в процессе диссоциации бАЬ от антигена. На основании этих величин осуществляли секвенирование 60 клонов после второго и третьего раундов селекции библиотеки ΌΟΜ15-26-555 и 17 клонов после третьего раунда селекции библиотеки ΌΟΜ15-10. Консенсусные мутации наблюдались в продуктах обеих библиотек и 17 клонов из каждой библиотеки, содержащих консенсусные мотивы, выбрали для дальнейшей характеристики. Аминокислотные последовательности этих клонов представлены на фиг. 5 (селектированные варианты ΌΟΜ15-26-555) и фиг. 6 (селектированные варианты ΌΟΜ15-10), а последовательности ДНК представлены на фиг. 20А-20Е. Аминокислоты, которые отличаются от родительской последовательности в селектированных клонах, указаны (идентичные аминокислоты обозначены точками). Петли, соответствующие СОЯ1, СЭР2 и СОЯ3, обведены рамками.
Эти клоны экспрессировали в 50 мл культуральной среды для экспрессии, очищали на белке А (для вариантов ΌΟΜ15-26-555) или белке Ь (для вариантов ΌΟΜ15-10), разбавленных до концентрации 100 нМ в буфере ΗΒ8-ЕΡ, и тестировали в отношении связывания с антигеном на ВТАтоге после 1,5 ч инкубации при 37°С с перемешиванием (250 об/мин) в присутствии или в отсутствие трипсина (конечная концентрация 20 мкг/мл).
Эти клоны тестировали также в отношении устойчивости к трипсину, используя способ, описанный в примере 2. Белки подвергали замене буфера на РВ8 и концентрировали до 1 мг/мл. 25 мкг белка смешивали с 1 мкг трипсина (Рготеда) и инкубировали в течение 0 ч и 24 ч при 30°С. После этого реакцию блокировали полным набором ингибиторов протеаз от ΕοΟκ (1Х) и ΌΤΤ (дитиотреитол), а также добав- 61 018723 ляли агент для нанесения образцов. Образцы денатурировали в течение 5 мин при 100°С. Затем 15 мкг каждого образца анализировали посредством электрофореза на гелях Nονеx 10-20% Тисте и белки окрашивали с помощью 8игеВ1ие (1х).
Как правило, продукты селекции ΌΘΜ15-26-555 были более стабильными, причем большая часть клонов сохраняла устойчивость к трипсину в течение 1,5 ч при тестирования на В^сою и в течение ночи при тестировании на 8О8-РАСЕ. По сравнению с этим, только небольшое количество клонов после селекции ΌΘΜ15-10 было устойчивым к трипсину в течение ночной обработки при тестировании на 8Ό8РАСЕ.
Пример 6.
Идентификация вариантов ΌΘΜ1Η-131-511
ΌΘΜ1Η-131-203, ΌΘΜ1Η-131-204 и ΌΘΜ1Η-131-206 анализировали более подробно. Их сравнивали на ВМсою при концентрации ЙАЬ 500 нМ после инкубации с различными концентрациями трипсина (варьирующими от 0 до 100 мкг/мл) в течение ночи при 37°С. Кривые ВМсою представлены на фиг. 7. Результаты ясно показывают, что оба варианта более устойчивы, чем родительское антитело, к протеолизу при высоких концентрациях трипсина (100 мкг/мл). Два ЙАЬ, ΌΘΜ1Η-131-202 и ΌΘΜ1Η-131-206, также сравнивали вместе с их родительским антителом в отношении устойчивости к различным другим протеазам, включая лейкозим, эластазу и панкреатин, в условиях, описанных выше, при концентрации протеазы 100 мкг/мл. ЙАЬ продемонстрировали повышенную устойчивость к протеолизу по сравнению с родительским антителом в отношении всех протестированных протеаз. Кривые В^сою для эластазы и лейкозима представлены на фиг. 8.
Каждое ЙАЬ (5 мкМ) обрабатывали 100 мкг/мл трипсина с чистотой для секвенирования в течение 0, 1, 3 и 24 ч. Реакцию ингибировали полным набором ингибиторов протеаз от Воске (25Х) и продукты реакции анализировали на геле 4-12% Nονеx В1в-Тг15. Гели представлены на фиг. 9.
Пример 7.
Идентификация вариантов ΌΘΜ4-130-54
ΌΘΜ4-130-201 и ΌΘΜ4-130-202 анализировали более подробно. Их сравнивали на ВМсою при концентрации ЙАЬ 500 нМ после инкубации с различными концентрациями трипсина (варьирующими от 0 до 100 мкг/мл) в течение ночи при 37°С. Кривые ВМсою представлены на фиг. 10. Результаты ясно показывают, что все три варианта более устойчивы, чем родительское антитело, к протеолизу при высоких концентрациях трипсина (100 мкг/мл). ΌΘΜ4-130-201 и ΌΘΜ4-130-202 также сравнивали с родительским антителом в отношении устойчивости к различным другим протеазам, включая лейкозим, эластазу и панкреатин, в условиях, описанных выше, с концентрацией протеазы 100 мкг/мл. Хотя результаты были менее наглядными, чем с трипсином, основные ЙАЬ продемонстрировали повышенную устойчивость к протеолизу по сравнению с родительским антителом в отношении всех тестируемых протеаз. Кривые В Осою для эластазы и лейкозима представлены на фиг. 11.
Каждое ЙАЬ (5 мкМ) обрабатывали 100 мкг/мл трипсина с чистотой для секвенирования в течение 0, 1, 3 и 24 ч. Реакцию ингибировали полным набором ингибиторов протеаз от Воске (25Х) и продукты реакции анализировали на геле 4-12% Nονеx В1в-Тг15. Гели представлены на фиг. 9.
Пример 8.
Дополнительная характеристика вариантов ΟΘΜ111-131-511 и ΌΘΜ4-130-54
Сначала ЙАЬ анализировали с использованием дифференциальной сканирующей калориметрии (Ό8ί.') для того, чтобы определить, коррелирует ли увеличение устойчивости к трипсину с увеличением температуры плавления (Тт). Увеличение стабильности в присутствии трипсина коррелирует с увеличением Тт (см. табл. 9).
Таблица 9
Название Тт. °С
ЦОМ111-131-511 57,9
ЦОМ1И-131-202 67,5
ϋΟΜ 111-131-203 65,7
ЦОМ1Г1-131-204 62,3
ϋΟΜ1ή-131-206 64,9
ЦОМ4-130-54 54,1
ЦОМ4-130-201 64,7
ЦОМ4-130-202 64,5
ЙАЬ, происходящие из ΟΘΜ1Η-131-511, также сравнивали в анализе с использованием клеток ΜΒС5 (см. табл. 10). В этом анализе измеряли способность ЙАЬ нейтрализовать ТБЕа-стимулированное высвобождение ^-8 для того, чтобы определить, приводит ли увеличение стабильности в присутствии трипсина к уменьшению эффективности. Однако активность устойчивых к трипсину ЙАЬ в этом анализа была по существу неизменной.
- 62 018723
Таблица 10
Образец N050 (средняя нейтрализующая доза), нМ
ϋΟΜΙή-131-511 1,98
ΟΟΜ1ή-131-511 1,71
ϋΟΜ1 ή-131-511 (230307СЕ) 1,89
ϋΟΜ1ή-131-203 (230307СЕ) 2,28
ϋΟΜ1ή-131-204 (230307СЕ) 1,89
ϋΟΜ1 ή-131-511 1,46
ΟΟΜ1ή-131-206 (230307СЕ) 0,71
бАЬ, происходящие из ЭОМ4-130-54, тестировали в анализе связывания с рецептором для того, чтобы посмотреть, обладают ли они все той же способностью ингибировать связывание ГС-1 с ГО-К! (см. табл. 11). В этом анализе активность устойчивых к трипсину бАЬ была неизменной.
Таблица 11
ЭАЬ 1С50 (нМ)
ООМ4-130-54 280 пМ
ООМ4-130-201 257 пМ
ЭОМ4-130-202 254 пМ
Пример 9.
Идентификация вариантов ЭОМ15-26-555
ООМ15-26-588, ООМ15-26-589, ООМ15-26-591 и ООМ15-26-593 анализировали более подробно вместе с их родительским антителом и двумя дополнительными бАЬ, ЭОМ15-26-594 и ЭОМ15-26-595, которые были созданы посредством мутагенеза с целью объединения мутаций, которые могли бы оказывать наибольшее влияние на эффективность и стабильность (Е6У и Ε1008/!). Последовательности представлены на фиг. 12. Клоны сравнивали на В^тоте в отношении связывания с йУЕСР при концентрации бАЬ 100 нМ после инкубации с трипсином в концентрации 200 мкг/мл. Реакцию осуществляли в течение 3 и 24 ч при 37°С с перемешиванием (250 об/мин). Кривые В^отте для самого лучшего клона ЭОМ1526-593 и родительского антитела представлены на фиг. 13. Другие результаты представлены в виде диаграммы на фиг. 14. Эти результаты ясно показывают, что все варианты более устойчивы, чем родительское антитело, к протеолизу после 24-часовой обработки трипсином.
Устойчивость к трипсину ЭОМ15-26-593 и родительского антитела также исследовали, анализируя обработанные и необработанные образцы на 8Э8-РАСЕ. Кратко, белки подвергали замене буфера на РВ8 и концентрировали до 1 мг/мл. 25 мкг белка смешивали с 1 мкг трипсина со степенью чистоты для секвенирования (Рготеда) и инкубировали в течение 0, 1, 3 и 24 ч при 30°С. После этого реакцию блокировали полным набором ингибиторов протеаз от ^сбе (1Х) и ΌΤΤ, а также добавляли агент для нанесения образцов. Образцы денатурировали в течение 5 мин при 100°С. 15 мкг каждого образца наносили на гели Nονеx 10-20% Τπαικ и белки окрашивали с помощью 8игеВ1ие (1х). Результаты представлены на фиг. 15. Профиль устойчивости к трипсину для ООМ15-26-593 в этом эксперименте отличался от профиля, продемонстрированного В^тоте экспериментом, подтверждая тот факт, что различия в условиях реакции могут оказывать влияние на конечный результат расщепления трипсином. Тем не менее, ООМ1526-593 имеет лучшие биофизические свойства, а также аффинность, чем другие селектированные клоны, как показано ниже. Краткий обзор свойств вариантов ООМ15-26-555 также представлен ниже в табл. 12.
Таблица 12
Свойство
ЗЕС-МАИЗ О8С КВА В1Асоге Стабильность в присутствии трипсина
0АЬ % мономера Рассчит. МУ7 Тт, °С нМ Ко, нМ % связывания при +24 ч
15-26 0 37-136 64 10 28,2 30
15-26-501 0-40 18-290 51 1,14 9,1 5
15-26-555 0 28-78 63 11,7 26,1 10
15-26-588 10 33 70 27 59,1 15
15-26-589 90 17 63 1,94 9.6 65
15-26-591 20 21-234 63 16 38 35
15-26-593 80 17 65 0,323 3,2 80
15-26-595 60 17 65 0,828 5 70
Пример 10.
Идентификация вариантов ООМ15-10
ООМ15-10-11 анализировали более подробно вместе с его родительским вариантом ООМ15-10. Последовательности представлены на фиг. 16. бАЬ сравнивали на В^отте в отношении связывания с
- 63 018723 кУЕСЕ при концентрации кАЬ 100 нМ после инкубации с трипсином в концентрации 200 мкг/мл. Реакцию осуществляли в течение 1, 3 и 24 ч при 37°С с перемешиванием (250 об/мин). Кривые ΒΙΛ^ιό для этих кЛЬ представлены на фиг. 17. Результаты ясно показывают, что селектированный вариант более устойчив к протеолизу, чем родительское антитело, после 24-часовой обработки трипсином.
Устойчивость к трипсину основной молекулы и родительского антитела также проверяли посредством анализа обработанных и необработанных образцов на 8Э8-РЛСЕ. Кратко, белки подвергали замене буфера на РВ8 и концентрировали до 1 мг/мл. 25 мкг белка смешивали с 1 мкг трипсина со степенью чистоты для секвенирования (Рготеда) и инкубировали в течение 0, 1, 3 и 24 ч при 30°С. После этого реакцию блокировали полным набором ингибиторов протеаз от Киске (1Х) и ΌΤΤ, а также добавляли агент для нанесения образцов. Образцы денатурировали в течение 5 мин при 100°С. 15 мкг каждого образца наносили на гели Νο\όχ 10-20% Τπαικ и белки окрашивали с помощью 8игеВ1ие (1х). Результаты представлены на фиг. 185. В этом случае профиль устойчивости к трипсину хорошо коррелирует с результатами ВМ^ге теста с использованием трипсина, показывая, что связывающая активность непосредственно отражает целостность белка.
Пример 11.
Дополнительная характеристика вариантов ^ΟΜ15-26-555 и ^ΟΜ15-10 кАЬ анализировали с использованием дифференциальной сканирующей калориметрии (Э8С) для того, чтобы определить, коррелирует ли увеличение устойчивости к трипсину с увеличением Бт. Результаты представлены в табл. 13. Имеется корреляция между устойчивостью к трипсину вариантов ^ΟΜ1526-555 и температурой плавления. Основные молекулы ^ΟΜ15-26-588 и ^ΟΜ15-26-593 демонстрируют улучшенные Бт, а другие клоны нет. Важно отметить, что обе родительские молекулы ^ΟΜ15-26-555 и ^ΟΜ15-10 имеют гораздо более высокие (63,3-63,7°С) на старте, чем родительские молекулы ОО1И4130-54 и ^ΟΜ1к-131-511 (Гт на старте: 57,9-54,1°С), но в целом протеазоустойчивые клоны достигают значений в аналогичном диапазоне (средняя 65,1°С для вариантов ^ΟΜ1к-131-511/^ΟΜ4-130-54 и средняя 64,9°С для вариантов ^ΟΜ15-26-55/^ΟΜ15-10).
Таблица 13
Название Тпъ ’С
ϋΟΜ15-26-555 63,3
йОМ 15-26-588 70,1
ϋΟΜ 15-26-589 63
ООМ15-26-591 63
ΰΟΜ 15-26-593 65
ϋΟΜ 15-10 63,7
РОМ15-Ю-11 63,3
Эти кЛЬ также сравнивали в анализе связывания с рецептором и осуществляли измерения кинетики на В^отте для того, чтобы определить, приводит ли увеличение стабильности в присутствии трипсина к уменьшению эффективности. Однако активность кЛЬ в данном анализе оказалась по существу незатронутой или даже улучшенной. Результаты представлены в табл. 14.
Таблица 14
Клон (Ю) ЕСвд (нМ) Ко (нМ)
ϋΟΜ 15-26-555 11,7 26,1
ООМ15-26-588 27 59,1
ϋΟΜ15-26-589 1,94 9,6
ϋΟΜ15-26-591 16 38
ϋΟΜ 15-26-593 0,323 3,2
ϋΟΜ15-26-594 4,09 15,1
ϋΟΜ15-26-595 0,828 5
ϋΟΜ15-10 10,23 23,6
ϋΟΜ15-10-11 3,58 14,6
Преимущества увеличенной
Большинство белков, включая доменные антитела, существуют в двух состояниях: свернутом состоянии (результатом которого является биологически активная молекула) и развернутом состоянии (которое не связано с функциональной активностью). Эти два состояния сосуществуют при всех температурах, и относительная доля каждого состояния обычно определяется константой К, которая является функцией кинетических констант сворачивания и разворачивания. Температуру плавления обычно определяют как температуру, при которой К=1, т.е. температуру, при которой доля свернутого белка равна доле развернутого белка. Константа К определяется стабилизирующими и дестабилизирующими внутримолекулярными взаимодействиями в белке и поэтому в первую очередь определяется аминокислотной последовательностью белка. Внешние параметры, такие как температура, рН, состав буфера, давление,
- 64 018723 влияют на К и таким образом на температуру плавления.
Развернутые белки являются удобными мишенями для механизмов деградации: (1) экспонирование дисульфидных связей увеличивает риск окисления или восстановления в зависимости от обстоятельств, (2) повышенная гибкость скелета благоприятствует реакциям аутопротеолиза, (3) экспонирование пептидных сегментов делает их мишенями для протеаз ίη νί\Ό, для протеаз во время способов получения и для переноса протеаз на следующие стадии обработки и длительного хранения и (4) экспонирование склонных к агрегации сегментов приводит к внутримолекулярной агрегации и осаждению белка. Во всех случаях происходит потеря целостности белка, содержания белка и активности белка, ставя под сомнение попытки, направленные на (1) обеспечение воспроизводимости партий, (2) обеспечение стабильности при хранении в течение длительного времени и (3) обеспечение эффективности ίη νί\Ό.
В природе белки под действием эволюции были сконструированы таким образом, чтобы адекватно функционировать при температуре тела и чтобы без труда замещаться посредством механизмов гомеостаза. Терапевтические белки, полученные в биотехнологическом процессе, сталкиваются с другим окружением: их часто продуцируют с использованием технологии рекомбинантной ДНК в чужеродном хозяине и экспрессируют в большем количестве в больших сосудах, подвергают очень важным изменениям рН или состава буфера в последующих процессах и, наконец, хранят в высоких концентрациях в нефизиологических буферах в течение длительного периода времени. Новые способы доставки (например, ингаляция, пластырь для подкожного введения, наночастицы для замедленной доставки) также оказывают дополнительное стрессовое воздействие на терапевтические белки. В конце концов, введение методов белковой инженерии привело к получению улучшенных или полностью новых терапевтических белков. Поскольку большая часть методов инженерии представляет собой методы ίη νίίΐΌ, направленные на изменение или создание новых аминокислотных последовательностей, то эволюционные процессы, которые постепенно улучшали биологические белки, не происходят, что приводит к получению белков с субоптимальными характеристиками в отношении устойчивости к стрессу.
Способ по настоящему изобретению направлен на воспроизведение одного из условий, с которыми сталкиваются белки в ходе дарвиновской эволюции. Пептиды или полипептиды, например иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, заселены протеазами, которые играют главную роль в ремоделировании ткани и белковом гомеостазе. Любую конкретную мутацию, которая может приводить к образованию белка с улучшенным соответствием его функции, также тестируют на ее способность соответствовать окружению, в котором белок функционирует. Этот процесс воспроизводят в одном из воплощений настоящего изобретения: создают репертуар пептидных или полипептидных вариантов и подвергают воздействию протеазы. На второй стадии репертуар вариантов приводят в контакт со специфической мишенью. Только те варианты белка, которые оказались устойчивыми к деградации протеазой, способны взаимодействовать с мишенью и поэтому извлекаются, например, в простом процессе аффинной очистки, названном биопэннингом. Данная система предлагает ряд преимуществ по сравнению с процессами ίη νίνυ: репертуар белков может столкнуться с более широким диапазоном условий, например, с набором протеаз в более высоких концентрациях, в течение более длительных периодов времени, в различных буферах или рН и при различных температурах. Таким образом, такая технология ίη νίΐΐΌ предлагает средства для конструирования белков, которые могут функционировать и оставаться стабильными в более широком диапазоне условий окружающей среды, чем те условия, из которых они происходят. Ясно, что это дает значительные преимущества для биотехнологической промышленности и для области терапевтических белков, в частности.
Пример 12.
РК корреляционные данные для протеазоустойчивых основных молекул
Родительское бАЬ и протеазоустойчивое бАЬ в каждой из четырех линий бАЬ затем оценивали ίη νί\Ό (перечень и подробности см. в табл. 15).
Таблица 15
Линия бАЬ (Ю) Устойчивость к трипсину Тт (°С) Активность (нМ) Ю Рс слияния
РОМ4-130 00 М4-130-54 Хорошая 54 0,128* ОМ81541
Э0М4-130-202 Очень высокая 64 0,160* РМ31542
ООМ1П-131 ООМ1Й-131-511 Хорошая 57 0,0481 РМ31543
ООМ1И-131-206 Очень высокая 64 0,0471 ОМ81544
ООМ15-10 ООМ15-Ю Низкая 64 0,9131 РМ81546
ϋΟΜ15-10-11 Высокая 63 0,5771 ОМ31531
РОМ 15-26 ϋΟΜ 15-26-501(‘) Низкая 52 0,3301 ОМ81545
ϋΟΜ15-26-593 Высокая 65 0,0331 ОМ31529
*: по данным биоанализа с использованием МВС5/1Ь-а; Т по данным ВВА-анализа.
Примечание: ЭОМ15-26-501 является родительским вариантом ЭОМ15-26-555, приведенным в качестве примера в настоящем патенте. ЭОМ15-26-555 имеет одну герминальную аминокислотную мутацию в ΓΌΒ1 (134М). ЭОМ15-26-501 характеризуется более низкой температурой плавления, чем ЭОМ15-26-555 (52°С по сравнению с 63,3°С), и повышенной чувствительностью к перевариванию трип
- 65 018723 сином. ЭОМ15-26-501 выбрали относительно ЭОМ15-26-555 для РК исследования, поскольку оно является более типичным в отношении плохой стабильности по сравнению с ЭОМ15-26-593.
Авторы изобретения истолковывают устойчивость следующим образом:
низкая, средняя, хорошая, высокая, очень высокая.
Тогда это означает, что устойчивость к трипсину родительских молекул является следующей: ООМ4-130-54 хорошая,
ΟΟΜΙή-131-511 хорошая,
00М15-Ю низкая, ϋΟΜ15-26-501 низкая.
Для селектированных основных молекул:
ООМ4-130-202 очень высокая, ϋΟΜΙΠ-131-206 ϋΟΜ15-10-11 ϋΟΜ15-26-593 очень высокая, высокая, высокая.
Поскольку доменные антитела характеризуются небольшим размером (12-15 кДа), они быстро выводятся из кровообращения после в/в (внутривенной) или п/к инъекции. Действительно, предел отсечения при почечной клубочковой фильтрации составляет более чем 50 кДа, и поэтому небольшие белки, такие как бАЬ, не задерживаются в кровотоке, поскольку они проходят через почки. Поэтому для того, чтобы оценить долговременные эффекты устойчивости к протеазам ίη у1уо, авторы изобретения метили доменные антитела группировкой, которая увеличивает пребывание в системе кровообращения. Некоторые подходы (например, ПЭГ, слияния с Ес, слияния с альбумином и т.д.), направленные на увеличение периода полувыведения, известны из литературы. В настоящем изобретении доменные антитела были помечены (или форматированы) Ес-областью !дС1 антитела человека. Этот формат обеспечивает два преимущества: (1) молекулярный размер полученных бАЬ-Ес составляет приблизительно 75 кДа, что является достаточным для обеспечения удержания в кровотоке, (2) Ес-группировка антитела связывается с ЕсКп рецептором (также известным как рецептор Брамбелла). Этот рецептор локализуется на эпители альных клетках, эндотелиальных клетках и гепатоцитах и вовлечен в пролонгирование продолжительности жизни антител и альбумина: действительно, после пиноцитоза антител и других сывороточных белков, белки направляются в подкисленную эндосому, где ЕсКп рецептор перехватывает антитела (посредством связывания с Ес-областью) перед переносом в эндосому и возвращает их в кровоток. Таким образом, посредством мечения бАЬ Ес-областью обеспечивается присутствие бАЬ в течение более длительного периода времени по меньшей мере в двух компартментах - сыворотке и преэндосомальных компартментах, каждый из которых содержит специфический набор протеолитических ферментов. В дополнение к этому, ЕсК рецептор опосредует трансцитоз, посредством чего Ес-несущие белки мигрируют во внесосудистое пространство и из внесосудистого пространства.
Форматирование с использованием Ес осуществляли посредством слияния гена, кодирующего УН и УК бАЬ, с геном, кодирующим Ес !дС1 человека, через короткий промежуточный пептидный линкер (выделенный жирным шрифтом):
Для νΗ с1АЬ (подчеркнуто):
ЕУО <30еТЬУТУ35А5ТНТСРРСРАРЕЫССР... (П1дО1 Ес)... ΡΘΚ”
Для УК бАЬ (подчеркнуто):
ЭЮ......60СТКУЕ1КЕ!П/ААР8ТНТСРРСРАРЕЕЬ6СР...(И1дС1Рс).РеК*
Материал получали путем временной трансфекции клеток НЕК293/6Е, используя 293-фектин (Ιηνί1годеп) в соответствии со стандартными протоколами. Эти клетки разработаны для высоких уровней временной экспрессии при их использовании вместе с векторами серий рТТ (Эигосйег е1 а1., 2002). Таким образом, гены бАЬ клонировали в модифицированный вектор рТТ5 (рЭОМ38) с целью создания вектора, экспрессирующего слияние с Ес (см. фиг. 21).
Супернатант от трансфицированных клеток собирали на 5-е сутки после трансфекции, осветляли центрифугированием и фильтровали через 0,2 мкм фильтр. Слитые белки бАЬ-Ес очищали путем захвата на смоле Рго1ет-А йгеатЛпе (СЕ НеаНйсаге). Белок элюировали с колонки в 10 мМ цитрате натрия, рН 3, с последующим добавлением 1 М цитрата натрия, рН 6, для достижения конечного содержания цитрата натрия 100 мМ (рН 6).
Молекулы бАЬ-Ес тестировали в отношении периода полувыведения т νί\Ό на крысах в целевой дозе 5 мг/кг для самок крыс 8ргадие-Оате1еу (п=3 на одну группу). Необходимо отметить, что целевая доза значительно превышает целевую концентрацию у крыс, поэтому ожидают, что различия в аффинностях между родительскими бАЬ и устойчивыми к трипсину бАЬ (см. пример 11) не будут влиять на судь- 66 018723 бу молекул 1п у1уо. Следовательно, ожидают, что различия в РК профилях между бАЬ будут отражать независимый от антигена процесс элиминации.
Образцы крови отбирали через 0,03, 1, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120 и 168 ч после ввведения. После образования сгустка сыворотку извлекали и затем тестировали в анализах захвата антигена ЫЬ-1К1, ЮТРТ или УЕСЕ.
Анализы захвата антигена ЫЬ-1К1:
покрывают с использованием 4 мкг/мл анти-ЫЬ-1К1;
блокируют;
добавляют 500 нг/мл 8ЫЬ-1К1;
добавляют образцы;
определяют с использованием анти-(Ес человека)-НРР в разведении 1:10000.
Анализы захвата антигена ЮТРТ:
покрывают с использованием 0,1 мкг/мл МНЕИЕ блокируют;
добавляют образцы;
определяют с использованием анти-(Ес человека)-НИР в разведении 1:10000.
Анализы захвата антигена УЕСЕ:
покрывают с использованием 0,25 мкг/мл УЕСЕ;
блокируют;
добавляют образцы;
определяют с использованием анти-(Ес человека)-НИР в разведении 1:10000.
Необработанные данные этих анализов преобразовывали в концентрации лекарственного средства в каждом образце сыворотки. Средние значения в мкг/мл для каждой временной точки затем анализировали в УюЫопЬт с использованием некомпартментного анализа (ΝΟΆ). РК профили для каждой пары бАЬ-Ес представлены в табл. 16, в которой суммированы определенные РК параметры.
Таблица 16
ю бАЬ Период полувыведения (ч) дисю (ОчпГ) (ч-мкг/мл)/(мг/кг) % лис экстраполир.
ОМ31541 4-130-54 93,2 691,5 22,7
ОМ81542 4-130-202 176,8 710,1 49
РМ81543 10-131-511 140,8 1807,5 40
РМ31544 10-131-206 158,6 2173,0 43,6
ОМ81546 15-10 43,2 324,6 3,8
0М81531 15-10-11 56,6 770,5 не опред.
РМ81545 15-26-501 12,9 89 5,1
0М31529 15-26-593 86,2 804,7 21,0
Данные результаты ясно показывают, что, хотя РК профили для бАЬ-Ес пар с 4-130-54 по 11-131206 почти совпадают при наложении, профили для других пар широко варьируют. Данные эффекты обычно видны, когда рассматривают АИС/Э: АИС/Э для 15-10 составляет только 42% от АИС/Э для 1510-11. АИС/И для 15-26-501 составляет только 11% от АИС/И для 15-26-593. Эти важные раличия также влияют (в меньшей степени) на периоды полувыведения: 43,2 ч против 56,6 ч соответственно для 15-10 и 15-10-11. Большее различие наблюдается для линии ИОМ15-26: 12,9 ч против 86,2 ч соответственно для 15-26-501 и 15-26-593. Действительно, для проведения хорошего РК анализа с использованием некомпартментного анализа необходимо использовать по меньшей мере 4 точки на графике для подгонки угла наклона линейной регрессии, и период времени, в течение которого оценивают период полувыведения, должен быть по меньшей мере в 3 раза больше, чем рассчитанный период полувыведения.
В свете биофизических свойств, описанных в разделе Примеры в данном изобретении, видно, что способность любого заданного бАЬ противостоять расщеплению трипсином коррелирует со способностью продукта слияния бАЬ-Ес циркулировать в течение более продолжительного периода времени в сыворотке крыс. Действительно, как показано в примерах, например, в примере 10, ЭОМ15-10 и ЭОМ15-26-501 представляют собой наиболее расщепляемые бАЬ: инкубация 25 мкг бАЬ в присутствии 1 мкг трипсина при 30°С в течение приблизительно 3 ч приводит к полному расщеплению. Все другие бАЬ в этом исследовании (независимо от того, были ли они селектированы с использованием трипсина (т.е. ИОМ15-10-11, ИОМ15-26-593, ИОМ4-130-202 и ПОМ11-131-206) или уже обладали некоторой устойчивостью к трипсину как родительские молекулы (ИОМ4-130-54 и ООМ1Н-131-511)) имели сопоставимый РК профиль у крыс при реформатировании в молекулы бАЬ-Ес. Таким образом, настоящее РК исследование позволяет предположить, что чувствительность к протеолизу оказывает наибольшее влияние на стабильность бАЬ ш у1уо в случае, когда такие бАЬ обладают очень низкой устойчивостью к протеолизу. Оно также показывает, что, при достижении определенного уровня, дальнейшее возрастание устойчивости к расщеплению трипсином (например, ЭОМ4-130-206 по сравнению с ИОМ4-130-54) существенно
- 67 018723 не увеличивает способность молекулы бАЬ-Ес дополнительно снижать скорость элиминации ш νίνο.
В трех случаях селекция в присутствии трипсина приводила к получению новых молекул с повышенной термостабильностью (определенной по температуре плавления): ΌΟΜ4-130-202, ΌΟΜ11-131206 и ΌΟΜ15-26-593. РК исследования показывают, что - в соответствии с представленным набором данных - температура плавления не является адекватным параметром для объяснения наблюдаемых РК профилей: действительно, ΌΟΜ15-10 имеет более высокую Τ^ чем ΌΟΜ15-10-11, однако быстрее выводится из кровотока, чем ΌΟΜ15-10-11. В другом случае, два бАЬ из линии ΌΟΜ4-130 имеют заметно различающиеся (на 10°С), однако демонстрируют почти идентичную стабильность ш νίνο при форматировании в молекулы бАЬ-Ес. Следует отметить, что температуру плавления саму по себе не исключают в качестве ключевого параметра для предсказания стабильности ш νίνο. Так получилось, что в соответствии с представленным набором данных большие различия в Τηι (от 54°С и выше) не оказывают значительного влияния на судьбу бАЬ ш νίνο. Это не исключает возможности того, что при температуре плавления ниже 54°С стабильность бАЬ ш νίνο будет коррелировать с термостабильностью или, возможно, и с термостабильностью, и с устойчивостью к протеазам.
Пример 13.
Селекции ΌΟΜ10-53-474 в присутствии трипсина
Стабильность очищенного ΌΟΜ10-53-474 в присутствии трипсина
ΌΟΜ10-53-474 представляет собой доменное антитело, которое связывается с ГЬ-13 с высокой эффективностью. Для оценки стабильности этого бАЬ в присутствии трипсина очищенное бАЬ переваривали трипсином в течение увеличивающихся периодов времени и наносили на гель для исследования любой возможной деградации белка. 25 мкл очищенного ΌΟΜ10-53-474 в концентрации 1 мг/мл инкубировали с 1 мкл трипсина с чистотой для секвенирования в концентрации 1 мг/мл при 30°С, что соответствовало молекулярному соотношению бАЬ:трипсин 25:1. бАЬ инкубировали с трипсином в течение 1, 4 и 24 ч, и протеазную активность нейтрализовали путем добавления 4 мкл полного набора ингибиторов протеаз от Βο^ι; с последующей инкубацией на льду. Образец, соответствующий моменту времени 0, готовили путем добавления ингибиторов протеаз к бАЬ без добавления трипсина. 2 мкл образца затем анализировали посредством электрофореза с использованием ЕаЬс1н]э в соответствии с инструкциями производителя.
На фиг. 22 показаны результаты гель-электрофореза ΌΟΜ10-53-474, инкубированного с трипсином в течение увеличивающихся периодов времени. Для сравнения, одно из стабильных в присутствии трипсина бАЬ, ΌΟΜ15-26-593, также обрабатывали трипсином, как описано выше, и анализировали параллельно. Как видно на фигуре, ΌΟΜ15-26-593 выглядит стабильным даже через 24 ч инкубации с трипсином. Однако ΌΟΜ10-53-474 расщепляется в некоторой степени через 24 ч, но выглядит стабильным во временные точки 1 ч и 4 ч. Эти данные позволяют предположить, что ΌΟΜ10-53-474 устойчив к расщеплению трипсином в некоторой степени, но не настолько стабилен, как наиболее стабильные в присутствии трипсина бАЬ ΌΟΜ15-26-593.
Стабильность экспонируемого на фаге ΌΟΜ10-53-474 в присутствии трипсина
Для оценки стабильности экспонируемого на фаге ΌΟΜ10-53-474 в присутствии трипсина, ген, кодирующий ΌΟΜ10-53-474, клонировали в ρΌΟΜ33 по сайтам &11/Νο1 (фиг. 50) и фаг получали в соответствии со стандартными методиками. Фаг очищали посредством ПЭГ-преципитации, ресуспендировали в РВ8 и титровали.
Для оценки устойчивости к трипсину экспонируемые на фагах бАЬ инкубировали с трипсином в течение различных периодов времени. После инкубации с трипсином определяли стабильность посредством анализа титрованием после инфицирования клеток Εχοΐί Τ®, находящихся в экспоненциальной фазе роста.
100 мкл фага инкубировали в присутствии 100 мкг/мл трипсина в течение 1, 2, 4 ч и в течение ночи при 37°С в инкубаторе при встряхивании. Активность трипсина блокировали полным набором ингибиторов протеаз от Клсйе (х2), затем фаг разбавляли в 2% Μ;·ιγ\ό11 в РВ8, инкубировали с 10 нМ биотинилированного ЕС-13 в течение 1 ч при комнатной температуре. Добавляли покрытые стрептавидином гранулы (ЭупаЬебх Μ-280 (Iην^ί^οдеη)), предварительно блокированные в течение 1 ч при комнатной температуре с использованием 2% Μ;·ιγλό11 в РВ8, и смесь затем инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. Все стадии инкубации с ЭупаЬебх осуществляли на вращающемся диске. Несвязавшийся фаг отмывали путем промывки гранул восемь раз 1 мл 0,1% Τ^ееη-20 в РВ8. Связавшийся фаг элюировали, используя 0,5 мл 0,1 М глицина, рН 2,2, и нейтрализовали 100 мкл 1 М трис-НС1, рН 8,0. Элюированный фаг использовали для инфицирования клеток Τ®, находящихся в экспоненциальной фазе роста (1 ч при 37°С), и высевали на чашки с тетрациклином. Чашки инкубировали в течение ночи при 37°С и осуществляли подсчет колоний. Титры выхода фага после переваривания трипсином суммированы в табл. 17. Титры фага уменьшались при инкубации с трипсином в течение увеличивающихся периодов времени. Через 24 ч инкубации все фаги переваривались.
- 68 018723
Селекция бАЬ, более устойчивых к трипсину
Для селекции бАЬ, которые более устойчивы к расщеплению трипсином, в ген, кодирующий ООМ10-53-474, вводили случайные мутации посредством ПЦР с использованием набора З1га!адепе Ми1ахуте II, биотинилированных праймеров и 5-50 пг матрицы для 50 мкл реакционной смеси. После переваривания с использованием За11 и ЫоЙ вставки очищали от непереваренных продуктов, используя покрытые стрептавидином гранулы, и лигировали в рЭОМ33 по соответствующим сайтам. Клетки Е.сой ТВ1 трансформировали очищенной смесью для лигирования, получая в результате допускающую ошибки библиотеку ЭОМ10-53-474. Размер библиотеки составлял 1,9х 109, а частота аминокислотных мутаций составляла 1,3.
Три раунда селекции осуществляли с использованием этой библиотеки для селекции бАЬ с улучшенной устойчивостью к протеазам. Первый раунд селекции осуществляли только с антигеном без обработки трипсином для очистки библиотеки с целью удаления клонов, которые больше не связывались с антигеном с высокой аффинностью. Селекцию осуществляли в присутствии 10 нМ Ю-13. Выходы после первого раунда составляли 2х109 по сравнению с исходным количеством фага 6х1010, что указывает на то, что большая часть библиотеки связывается с антигеном с высокой аффинностью.
Второй и третий раунды селекции осуществляли в присутствии 1 нМ биотинилированного Ю-13. Перед пэннингом на Ю-13 фаг инкубировали с 100 мкг/мл трипсина при 37°С в шейкере (250 об/мин). Во втором раунде селекции инкубацию с трипсином осуществляли в течение 1 ч или при комнатной температуре, или при 37°С. Выходы после 2-го раунда селекции представлены в табл. 18.
Таблица 18
Титры выхода фага после второго раунда селекции
Обработка трипсином Титр
Без обработки 1 X 10й
1 ч, комнатная температура δχΐό7
1 ч, 37°С 2 х 10'
Выходы фага, полученные во 2-ом раунде селекции с обработкой трипсином в течение 1 ч при 37°С, использовали в качестве исходного количества для 3-го раунда селекции. В 3-ем раунде селекции фаг обрабатывали 100 мкг/мл трипсина, но в течение более длительных периодов времени: 2 ч при 37°С, 4 ч при 37°С, в течение ночи при комнатной температуре или в течение ночи при 37°С. Титры выхода после 3-го раунда селекции суммированы в табл. 19.
Таблица 19
Титры выхода фага после третьего раунда селекции
Обработка трипсином Титр
Без трипсина 1,3 х 10“
2 ч при 37’С 1,9x10'
4 ч при 37°С 2x10“
В течение ночи при комнатной температуре 4ΧΪ07
В течение ночи при 37°С 2,1 х 10“
Для оценки разнообразия последовательностей осуществляли секвенирование некоторых клонов из каждого выхода селекции после раундов 1, 2 и 3. После первого раунда селекции без обработки трипсином 50% продуктов селекции имели последовательность родительского ЭОМ10-53-474. После 2-го раунда селекции процент родительской последовательности увеличивался до 75%. После 3-го раунда селекции процент родительской последовательности увеличивался до 80%.
Эти данные показывают, что ЭОМ10-53-474 уже устойчив к расщеплению трипсином, и из этих селекций с использованием трипсина может быть отобрано не так много новых клонов. На фиг. 22 показано, что когда трипсином переваривали очищенный белок, тогда ЭОМ10-53-474 не переваривался полностью даже после обработки трипсином в течение ночи. Однако для того чтобы определить, имеются ли в продуктах селекции какие-либо новые клоны, которые более устойчивы к трипсину, чем ЭОМ10-53-474,
- 69 018723 продукт 3-й селекции, где фаг обрабатывали трипсином в течение ночи при 37°С, субклонировали в ρΌΟΜ5. Затем секвенировали сто клонов для поиска устойчивых к трипсину клонов. Среди ста проанализированных клонов только 26 клонов имели новые последовательности, однако ни один из этих клонов не имел мутаций в сайтах расщепления трипсином (лизин или аргинин), что позволяет предположить, что эти клоны не являются более устойчивыми к трипсину, чем ΌΟΜ10-53-474.
Пример 14.
Улучшения хранения и биофизических свойств, вводимые в основные бАЬ ΌΟΜ0101 (анти-ΤNΕЯ1), посредством селекции фагов в присутствии трипсина
Для улучшения устойчивости к протеазам основной молекулы ΌΟΜ1Η-131-511 осуществляли селекции фагов в присутствии трипсина, как описано ранее. В соответствии с данным способом получали несколько клонов с улучшенной стабильностью в присутствии трипсина по сравнению с родительской молекулой ΌΟΜ1Η-131-511. Два клона, ΌΟΜ1Η-131-202 и ΌΟΜ1Η-131-206, отобрали для дальнейшей характеристики, поскольку они продемонстрировали наиболее значительное улучшение к действию трипсина. Дальнейшие исследования, которые изложены ниже, показали, что вместе с улучшенной устойчивостью к действию трипсина имеются и другие благоприятные эффекты, главным образом в отношении стабильности молекул к сдвиговой деформации и тепловому стрессу. Эти два параметра являются главными в увеличении стабильности при хранении и длительности хранения биофармацевтических продуктов.
Продуцирование основных бАЬ ΌΟΜ0101 в Р1сЫа ра^ЮгБ
Гены, кодирующие первичную аминокислотную последовательность трех основных молекул, использовали для продуцирования секретируемого белка в Р1сЫа ра^Юпх Три синтетических гена (ΌΟΜ1Η-131-511, ΌΟΜ1Η-131-202 и ΌΟΜ1Η-131-206) клонировали в экспрессирующий вектор рРЮ-Ζα и затем использовали для трансформации двух штаммов Р1сЫа, Х33 и ΚΜ71Н. Трансформированные клетки высевали на чашки с возрастающей концентрацией зеоцина (100, 300, 600 и 900 мкг/мл) для селекции клонов с множественными интегратами. Некоторые клоны затем подвергали скринингу в 2-л колбах для идентификации клеточных линий с высоким уровнем экспрессии. Клоны с наилучшим уровнем экспрессии затем использовали для получения материала в 5-л ферментаторах.
Очистка белка и характеристика материала
Для получения материала высокого качества с целью его характеристики и дальнейших исследований стабильности был разработан следующий способ очистки с использованием смолы с индукцией заряда смешанной модальности (СарЮ ΜΜΟ) в качестве первичной стадии захвата с последующей анионообменной хроматографией (О 8ерйаго5е). Без какой-либо значительной оптимизации это позволило осуществить извлечение приблизительно 70% экспрессированного бАЬ с чистотой приблизительно 95%. Данный материал характеризовали в отношении идентичности, используя масс-спектрометрию с электрораспылением, амино-концевое секвенирование и изоэлектрическое фокусирование, а также анализировали чистоту, используя 808-РАСЕ и 8ЕС (гель-фильтрацию).
Идентичность белков
Анализ аминоконцевой последовательности первых пяти остатков каждого белка дал ожидаемый результат (Е^РЬЬ..). Масс-спектрометрию осуществляли на образцах белков, в которых была произведена замена буфера на 50:50 Н2О:ацетонитрил, содержащий 0,1% ледяной уксусной кислоты, с использованием С4 Ζΐρ-ΐΐρκ (Μίίίίροκ). Измеренная масса каждого из трех белков находилась в пределах 0,5 Да от теоретической массы на основании первичной аминокислотной последовательности (рассчитанной с использованием средних масс) с учетом разницы масс -2, получаемой в результате образования внутренней дисульфидной связи. ΙΞΕ использовали для идентификации белков на основании их р1, которые различались для каждого белка.
Чистота белков
Эти три белка наносили на невосстанавливающие 8О8-РАСЕ гели в количествах 1 мкг и 10 мкг в двух повторностях. Во всех случаях наблюдали одну полосу.
Для демонстрации уровней чистоты также осуществляли гель-фильтрацию. При проведении гельфильтрации (8ЕС) на колонку С2000 8νΧΕ ΤΟ8ΟΗ наносили по 100 мкг каждого белка при скорости потока 0,5 мл/мин. Использовали подвижную фазу РВ8/10% этанола. Процентное содержание мономеров измеряли по площади под кривой (см. фиг. 23).
Сравнение стабильности ΟΟΜ111-131-511, -202 и -206
Оценка стабильности в присутствии протеаз
Стабильность ΟΟΜ111-131-511, ΌΟΜ1Η-131-202 и ΌΟΜ1Η-131-206 в присутствии протеаз оценивали посредством ΒIАсο^е™-анализа остаточной связывающей активности после предварительной инкубации в течение определенных периодов времени с избытком протеаз. Приблизительно 1400 ЯИ биотинилированного ΤNΕЯ1 наносили на чип со стрептавидином (8А). 250 нМ ΌΟΜ1Η-131-511, ΌΟΜ1Η-131-202 и ΌΟΜ1Η-131-206 инкубировали либо только с РВ8, либо с 100 мкг/мл трипсина, эластазы или лейкозима в течение 1, 3 и 24 ч при 30°С. Реакцию останавливали путем добавления коктейля ингибиторов протеаз. Затем бАЬ/протеазные смеси пропускали через чип, покрытый ΤNΕЯ1, вычитая сигнал ячейки срав- 70 018723 нения. Поверхность чипа регенерировали перед каждым циклом инжекции, используя 10 мкл 0,1 М глицина, рН 2,2. Фракцию ΌΘΜ1^131-511, ΌΘΜ1^131-202 и ΌΘΜ1^131-206, связавшихся с ТБЕВ1 человека (за 10 с), предварительно инкубированных с протеазами, определяли относительно бАЬ, связавшегося в отсутствие протеаз. В^сокм-анализы осуществляли при 25°С. Данные ниже получали из трех независимых экспериментов. Гистограмма показывает средние значения, а планки погрешностей указывают на стандартное отклонение результатов (фиг. 24).
Обнаружили, что ΩΟΜ111-131-202 и ΩΟΜ111-131-206 показали более высокую устойчивость к протеолитическому расщеплению трипсином, эластазой или лейкозимом по сравнению с ΩΟΜ111-131-511. Различие между ΌΘΜ1Μ31-202 и ΌΘΜ1^131-206 по сравнению с ΌΘΜ1^131-511 наиболее ярко выражено после инкубации в течение 1 ч с трипсином и 3 ч с эластазой или лейкозимом. Имеется тенденция к тому, что ΌΘΜ1 к-131-206 будет обладать несколько большей стабильностью по сравнению с ΩΟΜ111131-202 в большинстве тестируемых условий.
Термостабильность бАВ, определенная посредством Э8С
Для определения того, при каком рН основные молекулы обладали наибольшей стабильностью, использовали дифференциальный сканирующий калориметр (Ό80) для измерения температур плавления (Тт) каждого бАЬ в буфере Бриттона-Робинсона. Поскольку буфер Бриттона-Робинсона изготовлен из трех буферных систем (40 мМ каждой из кислот: уксусной, фосфорной и борной), то в одном и том же растворе можно получать рН в диапазоне от 3 до 10. Теоретическую величину рI определяли из первичной аминокислотной последовательности белков. На основании данных Э8С обнаружили, что рН, при котором бАЬ имеют самую высокую внутреннюю термостабильность, составляет: рН 7 для ΌΟΜ1^131202, рН 7-7,5 для ΌΟΜ1^131-206 и рН 7,5 для ΌΟΜ1^131-511. Во всех последующих исследованиях нагрузок и стабильности для каждого бАЬ использовали следующие значения рН: для ΩΟΜ111-131-202 и ΌΟΜ1^131-206 (68К1995057А) рН 7,0, а для ΌΟΜ1Μ31-511 рН 7,5 в буфере Бриттона-Робинсона. Результаты суммированы в табл. 20.
Таблица 20 Краткий обзор значений рН и Тт для ΌΟΜ1-131-202, ΌΟΜ1^131-206 и ΌΟΜ1^131-511, как определено посредством Э8С в буфере Бриттона-Робинсона при концентрации 1 мг/мл. Температура изменялась со скоростью 180°С/ч
с1АЬ рН, который дает наибольшую внутреннюю термостабильность Т„, (°С) РАЬ при данном рН
ЦОМ1Н-131-202 7,0 68,6
ЦОМ1Н-131-206 7,0-7,5 65,8
ЦОМ1Н-131-511 7,5 58,0
Тестирование термостабильности в течение двух недель
Способность белка выдерживать повышенные температуры в течение длительных периодов времени обычно является хорошим показателем его стабильности. В этих условиях белок может подвергаться различным физическим процессам, таким как агрегация или химическая модификация. бАЬ (в концентрации 1 мг/мл) инкубировали при 37 и 50°С в течение 14 суток в буфере Бриттона-Робинсона. Для того чтобы определить, сколько мономера осталось в растворе после 14 суток, использовали 8ЕС (фиг. 25).
Из фиг. 25 можно видеть, что и ΌΟΜ1^131-202, и ΩΟΜ111-131-206 значительно более стабильны, чем ΌΟΜ1^131-511, к тепловому стрессу. Воздействие на белки повышенных температур, таких как 37 и 50°С, обычно используют для получения указания относительно продолжительности срока хранения лекарственных средств. Эти повышенные температуры используют для ускорения обычных процессов, связанных с длительным хранением при комнатной температуре, таких как дезамидирование, окисление или агрегация. Уровень образования агрегатов в растворе также можно контролировать с использованием 8ЕС (фиг. 26Л-I). После 14 суток при 37°С потеря ΩΟΜ111-131-511 из раствора может происходить вследствие как осаждения, так и образования агрегатов более высокого порядка, как определено посредством 8ЕС (фиг. 26В). Значительно меньшая потеря белка также наблюдалась для ΩΟΜ111-131-202 и ΩΟΜ111-131-206 при 37°С после 14 суток с очень незначительным, или по существу без него, увеличением образования агрегатов, особенно в случае ΩΟΜ111-131-206 (фиг. 26Н). При 50°С различие между молекулами становится еще более выраженным, причем ΩΟΜ111-131-206 демонстрирует лучшую стабильность при повышенной температуре, чем ΩΟΜ111-131-202 через 14 суток, что свидетельствует о значительно сниженном образовании агрегатов с более высокой молекулярной массой (фиг. 26). Относительно !=0, ΩΟΜ111-131-206 демонстрирует лишь небольшое увеличение образования агрегатов через 14 суток (фиг. 26Ц, в то время как ΩΟΜ111-131-511 почти полностью выпадает в осадок из раствора (фиг. 26С).
Это показывает, что изменения, вводимые в бАЬ посредством селекции с использованием трипсина, например улучшенная термостабильность, значительно улучшили стабильность белка при хранении при 37 и 50°С. Очевидно, что и ΌΟΜ1^131-202, и в большей степени ΌΟΜ1^131-206 обладают улучшенной стабильностью в растворе и меньшей тенденцией к образованию агрегатов при повышенных температурах, которые могут непосредственно объяснить улучшенную стабильность при длительном хранении при более релевантных температурах, таких как 4°С и комнатная температура.
- 71 018723
Образцы, соответствующие временным точкам 24 ч, 48 ч, 7 суток и 14 суток эксперимента с тепловым стрессом, затем анализировали посредством ΙΕΕ для того, чтобы посмотреть, подвергались ли белки каким-либо биофизическим изменениям, которые могли бы повлиять на общий заряд белка (фиг. 27).
Кроме того, и ΌΟΜ1Η-131-202, и ΌΟΜ1Η-131-206 не показывают никаких существенных изменений при 37°С по сравнению с ΩΟΜ111-131-511. Для ΩΟΜ111-131-511 слабая вторая полоса появляется через 24 ч при 37°С. Полагают, что образование этой дополнительной полосы происходит вследствие димеризации данного белка, экранирующей таким образом заряд и дающей две популяции молекул. При 50°С различие между молекулами становится более выраженным, ΩΟΜ111-131-206 явно не демонстрирует никаких существенных изменений при повышенной температуре, тогда как ΩΟΜ111-131-202 демонстрирует некоторые признаки модификации через 24 ч. Большая часть ΩΟΜ111-131-511 теряется в результате осаждения через 48 ч в буфере Бриттона-Робинсона.
Временные точки Т=0, 7 и 14 сутки при 50°С анализировали в КВА с ΤΝΕΚ-1 для определения функциональности белка после воздействия высоких температур (фиг. 28). В настоящее время этот анализ не является таким чувствительным, как 8ЕС или ΙΕΕ, при обнаружении едва заметных изменений в молекуле под действием стресса, но он может быть использован для того, чтобы показать, что 4АЬ все же может связываться с антигеном.
Смещение кривой влево для ΩΟΜ111-131-511 отражает тот факт, что большая часть ЙАЬ потеряна вследствие осаждения. Материал, который остается в растворе, все еще способен связываться с антигеном. Как показано на фиг. 25, большая часть как ΌΟΜ1Η-131-202, так и ΩΟΜ111-131-206 способна оставаться в растворе даже после 14 суток. Данные КВА показывают, что весь растворимый белок является все еще функциональным и способен связываться СТИРКЕ
Тестирование стабильности при хранении высоких концентраций белков
Осуществляли эксперименты с целью исследования стабильности при хранении при 4°С при очень высоких концентрациях белков, чтобы посмотреть, как каждая молекула функционировала в этих условиях. Все основные 4АЬ концентрировали в центрифужных концентраторах УИакрт (отсечение 5 кДа) в буфере Бриттона-Робинсона при их наиболее стабильном рН, до концентрации приблизительно 100 мг/мл. Затем образцы в концентрации приблизительно 100 мг/мл оставляли при 4°С на 7 суток и после этого анализировали посредством 8ЕС, чтобы посмотреть, появились ли какие-либо другие физические изменения в образцах в процессе хранения при высоких концентрациях (фиг. 29). Образцы разбавляли до приблизительно 1 мг/мл, после чего анализировали на 8ЕС колонке в 1хРВ8/10% этанола (об./об.).
Из 8ЕС кривых можно видеть, что ни ΌΟΜ1Η-131-202, ни ΩΟΜ111-131-206 не демонстрируют какого-либо существенного увеличения образования агрегатов через 7 суток, в то время как для ΩΟΜ111-131511 наблюдается уменьшение концентрации мономера приблизительно на 2%.
Доставка основных ЙАЬ с помощью небулайзеров
Для токсикологических и клинических исследований на ранних стадиях ЙАЬ будут приготавливаться в виде жидкости и доставляться посредством распылительного устройства. В зависимости от устройства (например, ультразвукового, струйного или на основе технологии вибрирующего сита) 4АЬ будет испытывать некоторый сдвиг и тепловой стресс по мере его распыления с образованием аэрозоля с частицами определенного размера. Поскольку и ΩΟΜ111-131-202 и -206 имеют более высокую и демонстрируют значительно улучшенную стабильность к тепловому стрессу по сравнению с ΌΟΜ1Η-131-511, все 4АЬ тестировали в двух распылительных устройствах, чтобы понять, как они реагируют на сдвиг/тепловой стресс, индуцируемые в процессе распыления. Как белок из распыляемого аэрозоля, так и оставшееся ЙАЬ в устройстве (т.е. в колпачке) затем анализировали посредством 8ЕС для определения степени агрегации, происходящей во время этого процесса.
Все молекулы тестировали в буфере Бриттона-Робинсона при их наиболее стабильном рН. ЙАЬ тестировали как в устройстве Ε-Γ1ο\ν КарИ (на основе технологии вибрирующего сита), так и в Рап ЬС+ (струйный небулайзер) со временем работы 3,5 мин при концентрации белка 5 мг/мл и распределением частиц по размеру, определенному с использованием Μη1\όγπ 8ргау!ек. Результаты представлены на фиг. 30. Для хорошей доставки и распределения в глубоких отделах легких идеальный размер частиц составляет менее 5 мкм. Все 4АЬ дают сравнимые уровни размеров частиц, которые составляли менее 5 мкм в буфере Бриттона-Робинсона. Концентрацию 4АЬ в колпачке устройства определяли с помощью измерений А280 до и после распыления (данные не показаны). Обнаружили, что концентрация белка не изменялась существенно, что указывает на то, что ни белок, ни разбавитель не распыляются предпочтительно в процессе доставки.
Образцы ЙАЬ, распыленные в буфере Бриттона-Робинсона, анализировали посредством 8ЕС для определения того, подвергался ли белок каким-либо физическим изменениям в процессе доставки. На фиг. 31 показано относительное процентное изменение как в колпачке, так и в аэрозоле, как определено посредством 8ЕС. Можно видеть, что и ΌΟΜ1Η-131-202, и ΌΟΜ1Η-131-206 претерпевают относительно небольшие изменения в концентрации мономера относительно ΩΟΜ111-131-511. Это демонстрирует, что как ΌΟΜ1Η-131-202, так и ΌΟΜ1Η-131-206, обладающие улучшенными 1т, имеют меньшую предрасположенность к образованию агрегатов в процессе распыления.
На фиг. 32 показаны фактические 8ЕС кривые для ΌΟΜ1Η-131-206 и ΌΟΜ1Η-131-511 в буфере
- 72 018723
Бриттона-Робинсона после распыления и продемонстрировано, что относительная потеря мономера (фиг. 31) происходит вследствие образования димеров. Это снова дает дополнительное подтверждающее доказательство для теории, согласно которой более высокая термостабильность, демонстрируемая
ЭОМ111-131-202 и ООМ111-131-206, может предотвращать существенную агрегацию даже в неоптимизированном препаративном буфере.
Для токсикологических исследований и оценки безвредности необходимо обеспечить доставку бАЬ животному при значительно более высоких уровнях уровней, чем терапевтические дозы, даваемые пациентам. Этого можно достичь только путем использования значительно более высоких концентраций белка и/или посредством доставки бАЬ в течение пролонгированного периода времени. Поскольку уже было показано, что ООМ1Н-131-511 образует агрегаты при распылении в концентрации 5 мг/мл в течение 3,5 мин, то ЭОМ111-131-206 тестировали в концентрации 40 мг/мл в РВЗ и распыляли, используя Рап ЬС+ в течение до 1 ч включительно. Образцы из колпачка и аэрозоля отбирали в моменты времени на протяжении всего исследования, чтобы посмотреть, вызывает ли пролонгированное распыление агрегацию бАЬ вследствие сдвига или теплового стресса, как определяли с помощью ЗЕС и концентрации белка (измерения А280 нм). В табл. 21 показана концентрация белка бАЬ как в колпачке, так и в аэрозоле, определенная по А280.
Таблица 21 Измеренная концентрация белка ООМ111-131-206, определенная по величинам поглощения при А280 для колпачка и аэрозоля во время распыления бАЬ в концентрации приблизительно 40 мг/мл с использованием Рап ЬС+. С учетом ошибок при разведении и погрешности прибора концентрация образца не изменяется после распыления бАЬ в течение 1 ч
Время (мин) Образец из колпачка (мг/мл) Образец из аэрозоля (мг/мл)
1 43,8 43,4
29 44,5 43,5
59 44,6 44,1
Из табл. 21 можно видеть, что концентрация белка существенно не изменялась во время анализа, демонстрируя отсутствие значительной потери белка вследствие агрегации. На фиг. 33 показано, что в течение 1 ч распыления ЭОМ111-131-206 не образует каких-либо агрегатов более высокого порядка, таких как димеры, как определено посредством ЗЕС. Это ясно демонстрирует, что улучшенные биофизические свойства, которые введены в молекулу посредством селекции с использованием трипсина, существенно увеличивают устойчивость бАЬ к сдвигу и тепловому стрессу и что это может непосредственно коррелировать с увеличением срока годности при хранении и со способностью распылять белок таким образом, чтобы не образовывались агрегаты более высокого порядка.
Состояние основных бАЬ в растворе
Поскольку основным путем деградации для всех трех основных бАЬ, по-видимому, является самоассоциация, приводящая сначала к димеризации, затем к дальнейшей агрегации и в конечном счете к осаждению, эти три основные молекулы исследовали посредством аналитического ультрацентрифугирования (АИС) для определения степени самоассоциации. Белки исследовали с помощью двух способов: седиментационного равновесия и скорости седиментации.
Для способа седиментационного равновесия эти три образца анализировали в трех различных концентрациях, варьирующих от 0,5 до 5 мг/мл, исследуя эффекты центрифугирования при трех различных скоростях вращения ротора. Этим способом определили, что ЭОМ111-131-511 является стабильным димером (26,1-34,4 кДа), ЭОМ111-131-202 представляет собой равновесие мономер/димер (22,7-27,8 кДа) с относительно стабильным димерным состоянием в измеренных концентрациях с Кб=1,3 мкМ, а ЭОМ111131-206 предпочтительно является мономерным (15,4-17,9 кДа) с Кб для ассоциации мономера в димер, равной 360 мкМ.
В способе седиментационного равновесия все образцы продемонстрировали некоторую степень диссоциации при разбавлении. Согласно полученным результатам, представленным на фиг. 34, коэффициент седиментации, измеренный для ООМ111-131-511, является показателем агрегатов более высокого порядка, а смещение пика при разведении указывает на диссоциацию этих агрегатов. Агрегация и диссоциация белка компенсируют друг друга, что может создавать впечатление присутствия стабильного димера, как наблюдали при седиментационном равновесии. Коэффициенты седиментации, измеренные для ООМ111-131-202, являются показателем быстрого динамического равновесия, и поэтому пики мономера и димера не могут быть отделены друг от друга, давая единственный пик с более высоким коэффициентом седиментации, чем соответствующий массе образца. Этот результат согласуется с результатом, полученным способом седиментационного равновесия, а измеренная константа диссоциации равна 1 мкМ. Было установлено, что ООМ111-131-206, имея значение коэффициента седиментации 1,9 5 (единиц Сведберга), в большей степени представляет собой мономер, чем другие два образца (2,5 5). Эти данные хорошо согласуются с данными способа седиментационного равновесия. При тех концентрациях, при ко- 73 018723 торых производили измерения, т.е. при концентрациях приблизительно в 10 раз меньше Κά, равной 360 мкМ, образец предпочтительно является мономером.
Пример 15.
Повышение эффективности кАЬ ^ΟΜ15-26-593
Пример повышения эффективности кЛЬ ^ΟΜ15-26-593 в анализе связывания с рецептором УЕСЕК2 по сравнению с родительским ^ΟΜ15-26 представлен на фиг. 40. В этом анализе способность потенциального ингибитора предупреждать связывание УЕСЕ с УЕСΕВ2 измеряют в планшетном анализе. В этом анализе химерную конструкцию УЕСΕВ2-ΕС наносят на 96-луночный планшет для ЕБ18Л и к ней добавляют заданное количество УЕСΕ, который предварительно инкубировали с серией разведений тестируемого кАЬ. После отмывки несвязавшегося белка определяют количество УЕСΕ, связавшегося с рецептором, используя антитело против УЕСΕ, уровень которого определяют колориметрически. График зависимости доза-ответ строят в виде процента ингибирования связывания УЕСГ в зависимости от концентрации тестируемого вещества. Таким образом, эффективный ингибитор представляет собой такой ингибитор, который в низких концентрациях демонстрирует существенное блокирование связывания лиганда.
Эффективность и период полувыведения слияний с Гс
Терапевтический потенциал УЕСΕ-блокады в лечении опухолей реализуется уже в течение более 30 лет. Хроническая природа рака диктует, что биофармацевтические продукты должны иметь длительный период полувыведения из сыворотки для опосредования их эффектов, и это не согласуется с быстрым клиренсом свободных кЛЬ из кровотока посредством почечной фильтрации. Для оценки применимости кЛЬ к УЕСВ в качестве антиангиогенных средств для лечения рака основные доменные антитела форматировали в виде слияний с человеческим Вс 1дС1 дикого типа через гибридный линкер с тем, чтобы создать бивалентную молекулу с периодом полувыведения из сыворотки, увеличенным благодаря использованию ΕсВη-опосредованных путей утилизации антител.
В этом формате Бс-слияния эффективность основного, селектированного с использованием трипсина кАЬ, ^ΟΜ15-26-593, сравнивали с исходным родительским кЛЬ (^ΟΜ15-26) и чувствительным к трипсину кЛЬ (^ΟΜ15-26-501), используя анализ, описанный выше. Результаты представлены ниже в табл. 22.
Таблица 22 Характеристики эффективности (КВА) и периода полувыведения основных молекул на основе ^ΟΜ1526 в формате Нс-слияния
С1АЬ ЕС Эффективность (НМ) Т1/2Ь (ч)
РОМ 15-26 К1д<31 0,506 Не опред.
РОМ 15-26-501 Ыд<Э1 0,323 12,9
РОМ 15-26-593 Ыд61 0,033 84,6
Из этих результатов можно видеть, что в формате димерного слияния с Кс аффинность и эффективность повышены относительно свободных кЛЬ благодаря эффекту авидности. Очевидно, что увеличение эффективности, полученное для ^ΟΜ15-26-593 благодаря селекции с использованием трипсина, поддерживается и даже еще более выражено в этом ?с-формате. Кроме того, улучшения термостабильности и стабильности к протеазам объясняют глубокие изменения фармакокинетического поведения данных молекул 1п νίνο. Увеличение периода полувыведения (см. фиг. 41) для ^ΟΜ15-26-593 по сравнению с ^ΟΜ15-26-501, вероятно, является прямым следствием повышенной стабильности кАЬ, делающей его более устойчивым к процессам расщепления, которые протекают в эндосомальном компартменте. Поэтому также следует ожидать, что кЛЬ с повышенной стабильностью к протеазам, способны сохраняться в течение более длительного времени и в других биологических компартментах, таких как сыворотка, поверхности слизистых оболочек и компартменты различных тканей, где протеолиз представляет собой активный процесс, вовлеченный в метаболизм биологических молекул.
Фармакокинетические профили клиренса
Фармакокинетические профили клиренса ^ΟΜ15-26-593 и ^ΟΜ15-26-501 измеряли после в/в введения ^ΟΜ15-26-593 и ^ΟΜ15-26-501 3 крысам в концентрациях 5 мг/кг. Затем измеряли уровни ^ΟΜ15-26-593 и ^ΟΜ15-26-501 в сыворотке, используя стандартный ЕЫ8Л-анализ прямого связывания с УЕС? и антитело против ?с человека, поэтому определяли только интактное лекарственное средство в образцах сыворотки. Полный фармакокинетический профиль показан ниже в табл. 23.
Таблица 23
Краткий обзор фармакокинетических параметров слияний _______РОХ115-26 и ^ΟΜ15-26-593 с Εс у крыс___________
ЙАЬ Период полувыведения (ч) Стах (кг/мл) дис (0-ίηί) (ч*мкг/мл) Выведение (мл/ч/кг)
РОМ15-26-501 12,9 91,4 445,1 11,8
ЦОМ15-26-593 84,6 101,8 3810 1,3
Из этих результатов видно, что ^ΟΜ15-26-593 имеет значительно улучшенный фармакокинетиче- 74 018723 ский профиль, например, с увеличенным периодом полувыведения и сниженной скоростью клиренса.
Значительно улучшенные эффективность и фармакокинетические свойства ЭОМ15-26-593 привели к анализу различных других биофизических свойств данного соединения.
Свойства в растворе: анализ посредством ЗЕС-МАИЬЗ и АИС
Эксперименты с ЭОМ15-26-593 осуществляли следующим образом.
ЭОМ15-26-593 ведет себя как мономер в растворе при концентрациях до 2,5 мг/мл включительно с рассчитанной молекулярной массой 78-81 кДа, согласующейся с рассчитанной массой интактной молекулы приблизительно 76 кДа (фиг. 42а и 42Ь).
Свойства, связанные с температурой плавления: анализ посредством ОЗС
Эксперименты с ЭОМ15-26-593 осуществляли следующим образом.
Повышенная термостабильность бАЬ, селектированного с использованием трипсина (65°С; фиг. 43, средняя панель), сохраняется в Ρс-слиянии (64,5°С; фиг. 43, верхняя панель). Для сравнения показана Τ^ кривая для бАЬ ИОМ15-26-501 (52°С, фиг. 43, нижняя панель).
Стабильность к замораживанию-оттаиванию, тепловому стрессу и компонентам сыворотки
Эксперименты с ЭОМ15-26-593 осуществляли следующим образом.
Свойства стабильности бАЬ ЭОМ15-26-593 означают, что данное бАЬ ЭОМ15-26-593 может быть подвергнуто физическому и биологическому стрессу с минимальным влиянием на его способность связываться с VΕСΡ (фиг. 44-47 (А и В)). Например, данную молекулу можно неоднократно размораживать из замороженного состояния в жидком азоте (-196°С) до температуры тела (37°С) (10 циклов) без потери связывающей активности, как определено посредством ЕЫЗА (фиг. 44). Эта обработка также не приводила к каким-либо заметным изменениям в агрегированном состоянии молекул, как оценивали посредством традиционной гель-фильтрации (фиг. 45). Другие тесты продемонстрировали, что молекула может быть помещена в диапазон различных температур от -80 до 55°С лишь с незначительным падением антигенсвязывающей активности через 168 ч и только при самой высокой температуре инкубации (фиг. 46). Кроме того, инкубация с сывороткой человека или яванского макака при 37°С в течение 14 суток не вызывала никакой потери антигенсвязывающей способности (фиг. 47А и 47В), как определено посредством связывания VΕСΡ в ЕЫЗА.
Эффективность в анализе связывания с рецептором УΕСΡК2 и в анализе с использованием клеток НИУЕС
Описанные выше анализы связывания с рецептором осуществляли следующим образом.
Описанный выше анализ связывания с рецептором использовали для оценки эффективности Ρ^ слияний (фиг. 48). Обнаружили, что бАЬ ИОМ15-26-593 обладает повышенной эффективностью в этом анализе, в котором устанавливают способность бАЬ блокировать связывание УΕСΡ с УΕСΡК2 ш уйго. Кроме того, эффективность ИМЗ1529 была продемонстрирована в анализе с НИУЕС (эндотелиальные клетки пупочной вены человека), в котором измеряют способность антагонистов УΕСΡ блокировать УΕСΡ-стимулированную пролиферацию клеток НИУЕС. Количества клеток определяют в конце фиксированного периода инкубации с заданным количеством УΕСΡ и варьирующим количеством тестируемого продукта. Чем больше эффективность антагониста, тем меньше наблюдаемая клеточная пролиферация (фиг. 49).
В этом абзаце приведена нуклеотидная последовательность ИОМ1Й-131-511.
Нуклеотидная последовательность ИОМ1Й-131-511:

Claims (24)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора ΤΝΡα 1 типа (ΤΝΡΚ1; р55), содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 99% идентична аминокислотной последовательности ИОМ1Й-131-206 (представленной на фиг. 3).
  2. 2. Иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен по п.1, содержащий аспарагиновую кислоту в положении 53, где нумерация соответствует нумерации по Кабату.
  3. 3. Иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен по п.1 или 2, содержащий гистидин в положении 91, где нумерация соответствует нумерации по Кабату.
  4. 4. Иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора ΤΝΡα 1 типа (ΤΝΡΚ1; р55) по п.1, содержащий аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотной последовательности ИОМ1Й-131-206 (представленной на фиг. 3).
  5. 5. Иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора ΤΝΡα 1 типа (ΤΝΡΚ1; р55) по п.4, кодируемый последовательностью, которая идентична нуклеотидной последовательности ИОМ1Й-131-206 (представленной на фиг. 19).
    - 75 018723
  6. 6. Иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен по п.1, устойчивый к протеазе, содержащий сайт связывания рецептора ΤΝΕα 1 типа (ΤΝΕ^; р55), где вариабельный домен устойчив к протеазе при инкубации с:
    (1) концентрацией протеазы (с) по меньшей мере 10 мкг/мл при 37°С в течение промежутка времени (!) по меньшей мере 1 ч или (2) концентрацией протеазы (с') по меньшей мере 40 мкг/мл при 30°С в течение промежутка времени (!) по меньшей мере 1 ч;
    где вариабельный домен содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 99% идентична аминокислотной последовательности ООМ111-131-206 (представленной на фиг. 3).
  7. 7. Вариабельный домен по п.6, где протеаза выбрана из трипсина, эластазы, лейкозима и панкреатина.
  8. 8. Антагонист рецептора ΤΝΕα 1 типа (ΤΝΕ^; р55), содержащий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против ΤΝΕ^ по любому из пп.1-7.
  9. 9. Антагонист по п.8, содержащий первый и второй иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, где каждый вариабельный домен представляет собой домен по любому из пп.1-5.
  10. 10. Антагонист по п.8 или 9, где антагонист содержит мономер указанного единичного вариабельного домена или гомодимер указанного единичного вариабельного домена, где указанный вариабельный домен идентичен аминокислотной последовательности ООМ111-131-206 (представленной на фиг. 3).
  11. 11. Антагонист рецептора ΤΝΕα 1 типа (ΤΝΕ^; р55), имеющий последовательность СЭКЕ которая по меньшей мере на 99% идентична последовательности СОК1 из ЭОМ1Н-131-206 (представленной на фиг. 3), последовательность СОК2, которая по меньшей мере на 99% идентична последовательности СОК2 из ООМ111-131-206, и последовательность СЭК3, которая по меньшей мере на 99% идентична последовательности СОК3 из ЭОМ1Н-131-206.
  12. 12. Антагонист рецептора ΤΝΕα 1 типа (ΤΝΕ^; р55) по п.11, содержащий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, содержащий последовательность СЭКЕ СЭК2 и СЭК3 из ЭОМ1Н-131206 (представленную на фиг. 3).
  13. 13. Антагонист ΤΝΕΜ по любому из пп.8-12 для пероральной доставки, доставки в желудочнокишечный тракт или легочной доставки.
  14. 14. Антагонист ΤΝΕΜ по любому из пп.8-12 для лечения и/или профилактики воспалительного состояния.
  15. 15. Антагонист ΤΝΕΜ по п.14, где указанное воспалительное состояние выбрано из легочного заболевания, псориаза, артрита и воспалительного заболевания кишечника.
  16. 16. Антагонист ΤΝΕ^ по любому из пп.8-12 для лечения и/или профилактики респираторного заболевания.
  17. 17. Антагонист ΤΝΕ^ по п.16, где указанное респираторное заболевание выбрано из воспаления легких, хронического обструктивного заболевания легких (ХОЗЛ), астмы, пневмонии, муковисцидоза, интерстициального легочного заболевания, аллергии и легочного воспаления.
  18. 18. Обладающий двойной специфичностью лиганд, содержащий вариабельный домен по любому из пп.1-7.
  19. 19. Выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен по любому из пп.1-7.
  20. 20. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.19.
  21. 21. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.19 или вектор по п.20.
  22. 22. Фармацевтическая композиция, содержащая иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен по любому из пп.1-7 или антагонист по любому из пп.8-12 и фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель.
  23. 23. Иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен по любому из пп.1-7, содержащий константный домен антитела.
  24. 24. Антагонист по любому из пп.8-12, содержащий константный домен антитела.
EA200901495A 2007-06-06 2008-06-04 Полипептиды, вариабельные домены антител и антагонисты EA018723B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US93363207P 2007-06-06 2007-06-06
GBGB0724331.4A GB0724331D0 (en) 2007-12-13 2007-12-13 Compositions for pulmonary delivery
PCT/GB2008/050405 WO2008149148A2 (en) 2007-06-06 2008-06-04 Polypeptides, antibody variable domains and antagonists

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200901495A1 EA200901495A1 (ru) 2010-10-29
EA018723B1 true EA018723B1 (ru) 2013-10-30

Family

ID=39791116

Family Applications (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200901494A EA200901494A1 (ru) 2007-06-06 2008-06-03 Способы селекции протеазоустойчивых полипептидов
EA200901300A EA200901300A1 (ru) 2007-06-06 2008-06-04 Полипептиды, вариабельные домены антител и антагонисты
EA200901491A EA018129B1 (ru) 2007-06-06 2008-06-04 Полипептиды, вариабельные домены антитела и антагонисты
EA200901495A EA018723B1 (ru) 2007-06-06 2008-06-04 Полипептиды, вариабельные домены антител и антагонисты
EA201100546A EA201100546A1 (ru) 2007-06-06 2009-11-04 Полипептиды, вариабельные домены антител и антагонисты

Family Applications Before (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200901494A EA200901494A1 (ru) 2007-06-06 2008-06-03 Способы селекции протеазоустойчивых полипептидов
EA200901300A EA200901300A1 (ru) 2007-06-06 2008-06-04 Полипептиды, вариабельные домены антител и антагонисты
EA200901491A EA018129B1 (ru) 2007-06-06 2008-06-04 Полипептиды, вариабельные домены антитела и антагонисты

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201100546A EA201100546A1 (ru) 2007-06-06 2009-11-04 Полипептиды, вариабельные домены антител и антагонисты

Country Status (32)

Country Link
US (5) US20100247515A1 (ru)
EP (5) EP2164867A2 (ru)
JP (3) JP2010530364A (ru)
KR (4) KR20100018040A (ru)
CN (4) CN101778865B (ru)
AR (3) AR066847A1 (ru)
AU (4) AU2008259590A1 (ru)
BR (3) BRPI0812795C1 (ru)
CA (6) CA2688433A1 (ru)
CL (3) CL2008001676A1 (ru)
CO (2) CO6251321A2 (ru)
CR (2) CR11195A (ru)
CY (1) CY1116762T1 (ru)
DK (1) DK2162467T3 (ru)
DO (1) DOP2009000268A (ru)
EA (5) EA200901494A1 (ru)
ES (1) ES2546943T3 (ru)
HK (1) HK1138022A1 (ru)
HR (1) HRP20151024T1 (ru)
HU (1) HUE025899T2 (ru)
IL (2) IL201398A0 (ru)
MA (2) MA31403B1 (ru)
MX (4) MX2009013137A (ru)
NZ (1) NZ581372A (ru)
PE (3) PE20090322A1 (ru)
PL (1) PL2162467T3 (ru)
PT (1) PT2162467E (ru)
SG (2) SG182151A1 (ru)
SI (1) SI2162467T1 (ru)
TW (6) TW200918088A (ru)
WO (3) WO2008149148A2 (ru)
ZA (1) ZA200908470B (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2625010C1 (ru) * 2016-11-10 2017-07-11 Илья Петрович Приколаб Экспрессионный плазмидный вектор для экспрессии активной формы TNFR1-Fc и способ получения рекомбинантного белка

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005289809A (ja) 2001-10-24 2005-10-20 Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) 突然変異重鎖抗体
CN103254309B (zh) 2005-05-18 2017-09-26 埃博灵克斯股份有限公司 针对肿瘤坏死因子α的改进的纳米体TM
DE102005023617A1 (de) 2005-05-21 2006-11-23 Aspre Ag Verfahren zum Mischen von Farben in einem Display
KR20100018040A (ko) 2007-06-06 2010-02-16 도만티스 리미티드 프로테아제 내성 폴리펩티드를 선택하는 방법
GB0724331D0 (en) 2007-12-13 2008-01-23 Domantis Ltd Compositions for pulmonary delivery
JP2010528647A (ja) * 2007-06-06 2010-08-26 ドマンティス リミテッド ポリペプチド、抗体可変ドメインおよびアンタゴニスト
EP2220115A2 (en) * 2007-12-13 2010-08-25 Glaxo Group Limited Polypeptides, antibody variable domains & antagonists
WO2009127691A1 (en) 2008-04-17 2009-10-22 Ablynx N.V. Peptides capable of binding to serum proteins and compounds, constructs and polypeptides comprising the same
PL3216803T3 (pl) 2008-06-25 2020-10-19 Novartis Ag Stabilne i rozpuszczalne przeciwciała hamujące vegf
US8268314B2 (en) 2008-10-08 2012-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
KR20110091777A (ko) * 2008-11-26 2011-08-12 글락소 그룹 리미티드 폴리펩티드, 항체 가변 도메인 및 길항제
WO2010081787A1 (en) 2009-01-14 2010-07-22 Domantis Limited IMPROVED TNFα ANTAGONISM, PROPHYLAXIS & THERAPY WITH REDUCED ORGAN NECROSIS
JP2012517818A (ja) 2009-02-19 2012-08-09 グラクソ グループ リミテッド 改善された抗ｔｎｆｒ１ポリペプチド、抗体可変ドメインおよびアンタゴニスト
BRPI1008705B1 (pt) * 2009-02-19 2021-05-25 Glaxo Group Limited Domínio variável único da imunoglobulina anti-soro albumina, ligante multiespecífico compreendendo o dito domínio, proteína de fusão fundida ao dito domínio, composição, ácido nucleico e vetor compreendendo o dito ácido nucleico
EP3656788A3 (en) * 2009-02-19 2020-07-29 Glaxo Group Limited Improved anti-serum albumin binding variants
CA2753287A1 (en) 2009-02-24 2010-09-02 Glaxo Group Limited Antigen-binding constructs
CA2768460A1 (en) * 2009-07-16 2011-01-20 Glaxo Group Limited Antagonists, uses & methods for partially inhibiting tnfr1
EA201270174A1 (ru) 2009-07-16 2012-07-30 Глэксо Груп Лимитед Отдельные связывающиеся вариабельные домены с улучшенными свойствами, направленные против сывороточного альбумина
CN102655875A (zh) * 2009-10-14 2012-09-05 爱勒让治疗公司 改善的拟肽大环化合物
TW201125877A (en) 2009-10-27 2011-08-01 Glaxo Group Ltd Stable anti-TNFR1 polypeptides, antibody variable domains & and antagonists
JP2013518853A (ja) 2010-02-05 2013-05-23 アブリンクス エン．ヴェー． 血清アルブミンと結合することが可能なペプチド並びにこれを含む化合物、構築物及びポリペプチド
BR112012029280A2 (pt) 2010-05-20 2016-11-29 Glaxo Group Ltd variante de domínio variável único de imunoglobulina antialbumina sérica, imunoglobulina anti-sa, ligando multiespecífico, proteína de fusão, composição, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira isolada, e, uso de uma variante, ligando multiespecífico ou proteína de fusão
JP2013538566A (ja) 2010-08-13 2013-10-17 グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッド 改良された抗血清アルブミン結合変異体
JP2013537421A (ja) 2010-08-20 2013-10-03 グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッド 改良された抗血清アルブミン結合変異体
US8859739B2 (en) 2010-09-16 2014-10-14 Baliopharm Ag Anti-huTNFR1 antibody and methods of use thereof for treatment
JP2014501515A (ja) 2010-12-01 2014-01-23 グラクソ グループ リミテッド 改良された抗血清アルブミン結合単一可変ドメイン
JP2014505698A (ja) * 2011-02-02 2014-03-06 グラクソ グループ リミテッド 新規抗原結合タンパク質
US9527925B2 (en) 2011-04-01 2016-12-27 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bispecific binding molecules binding to VEGF and ANG2
US10400029B2 (en) 2011-06-28 2019-09-03 Inhibrx, Lp Serpin fusion polypeptides and methods of use thereof
EP2726092B1 (en) * 2011-06-28 2019-06-19 Inhibrx, LP Serpin fusion polypeptides and methods of use thereof
EP2736925A2 (en) 2011-07-27 2014-06-04 Glaxo Group Limited Anti-vegf single variable domains fused to fc domains
EA027160B1 (ru) 2011-08-17 2017-06-30 Глаксо Груп Лимитед Модифицированные белки и пептиды
GB2497138A (en) * 2011-12-02 2013-06-05 Randox Lab Ltd Biomarkers for stroke and stroke subtype diagnosis.
HUE056217T2 (hu) 2012-07-13 2022-02-28 Roche Glycart Ag Bispecifikus anti-VEGF/anti-ANG-2 antitestek és ezek alkalmazása szemészeti érbetegségek kezelésében
WO2014111550A1 (en) 2013-01-17 2014-07-24 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Modified anti-serum albumin binding proteins
WO2014118220A1 (en) 2013-01-31 2014-08-07 Glaxo Group Limited Method of producing a protein
US9840553B2 (en) 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
MA41374A (fr) * 2015-01-20 2017-11-28 Cytomx Therapeutics Inc Substrats clivables par métalloprotéase matricielle et clivables par sérine protéase et procédés d'utilisation de ceux-ci
CN108712911A (zh) 2015-12-30 2018-10-26 科达制药股份有限公司 抗体及其缀合物
GB201617622D0 (en) * 2016-10-18 2016-11-30 VIB VZW and Universiteit Gent Means and methods to treat inflammation
CN110177875B (zh) 2016-11-28 2023-11-28 中外制药株式会社 包含抗原结合结构域和运送部分的多肽
UY37651A (es) * 2017-03-31 2018-10-31 Swedish Orphan Biovitrum Ab Publ Polipéptido de unión al il-1r-i
US11326156B2 (en) * 2017-11-01 2022-05-10 Allogene Therapeutics, Inc. Modified caspase-9 polypeptides and methods of use thereof
WO2019230866A1 (en) * 2018-05-30 2019-12-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Polypeptide comprising il-1r1 binding domain and carrying moiety
ES2903440T3 (es) * 2018-09-13 2022-04-01 Euroimmun Medizinische Labordiagnostika Ag Procedimiento y dispositivo para registrar y visualizar una imagen de inmunofluorescencia de una muestra biológica
WO2020084032A1 (en) * 2018-10-25 2020-04-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Modification of antibody fcrn binding
CN111454366B (zh) * 2019-01-21 2023-06-16 中国科学院深圳先进技术研究院 一种融合蛋白及其应用
WO2020158857A1 (ja) * 2019-01-31 2020-08-06 積水メディカル株式会社 生物学的試料中の遊離ａｉｍの免疫学的分析方法及び測定キット
US11912784B2 (en) 2019-10-10 2024-02-27 Kodiak Sciences Inc. Methods of treating an eye disorder
CA3193273A1 (en) 2020-08-27 2022-03-03 Enosi Therapeutics Corporation Methods and compositions to treat autoimmune diseases and cancer
WO2022117569A1 (en) 2020-12-02 2022-06-09 Oncurious Nv A ccr8 antagonist antibody in combination with a lymphotoxin beta receptor agonist antibody in therapy against cancer
CN115181751A (zh) * 2021-04-02 2022-10-14 苏州博腾生物制药有限公司 靶向白蛋白的嵌合抗原受体及其使用方法
CN114657162B (zh) * 2022-03-04 2023-06-16 华南理工大学 一种具有血管内皮细胞保护功能的抗氧化五肽及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004058820A2 (en) * 2002-12-27 2004-07-15 Domantis Limited Single-domain-effector group and its uses
WO2007049017A2 (en) * 2005-10-24 2007-05-03 Domantis Limited Agents that bind a target in pulmonary tissue for treating respiratory diseases

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2148299B (en) * 1983-09-01 1988-01-06 Hybritech Inc Antibody compositions of therapeutic agents having an extended serum half-life
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
GB8725529D0 (en) 1987-10-30 1987-12-02 Delta Biotechnology Ltd Polypeptides
JP3095168B2 (ja) 1988-02-05 2000-10-03 エル． モリソン，シェリー ドメイン‐変性不変部を有する抗体
ATE151110T1 (de) 1988-09-02 1997-04-15 Protein Eng Corp Herstellung und auswahl von rekombinantproteinen mit verschiedenen bindestellen
ES2052027T5 (es) 1988-11-11 2005-04-16 Medical Research Council Clonacion de secuencias de dominio variable de inmunoglobulina.
ATE92107T1 (de) 1989-04-29 1993-08-15 Delta Biotechnology Ltd N-terminale fragmente von menschliches serumalbumin enthaltenden fusionsproteinen.
CA2016842A1 (en) 1989-05-16 1990-11-16 Richard A. Lerner Method for tapping the immunological repertoire
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5977307A (en) 1989-09-07 1999-11-02 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific ligand-neuropharmaceutical agent fusion proteins
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
WO1992020791A1 (en) 1990-07-10 1992-11-26 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
WO1992003918A1 (en) 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ES2155822T3 (es) 1990-12-06 2001-06-01 Affymetrix Inc Compuestos y su utilizacion en una estrategia de sintesis binaria.
ATE275198T1 (de) 1991-12-02 2004-09-15 Medical Res Council Herstellung von antikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken.
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
JPH08511420A (ja) 1993-06-16 1996-12-03 セルテック・セラピューテイクス・リミテッド 抗 体
US5702892A (en) 1995-05-09 1997-12-30 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Phage-display of immunoglobulin heavy chain libraries
CA2229043C (en) 1995-08-18 2016-06-07 Morphosys Gesellschaft Fur Proteinoptimierung Mbh Protein/(poly)peptide libraries
DK0929578T3 (da) * 1996-02-09 2003-08-25 Abbott Lab Bermuda Ltd Humane antistoffer, der binder human TNFalfa
DE69838521T2 (de) 1997-07-07 2008-05-21 Medical Research Council Methode zur Erhöhung der Konzentration von Nucleinsäuremolekülen
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
EP1078051B1 (en) 1998-05-13 2007-12-12 Domantis Limited Phage-display system for the selection of correctly folded proteins
IL127127A0 (en) 1998-11-18 1999-09-22 Peptor Ltd Small functional units of antibody heavy chain variable regions
GB2375112A (en) 2000-02-03 2002-11-06 Domantis Ltd Combinatorial protein domains
WO2001058953A2 (en) 2000-02-11 2001-08-16 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Identification of a domain in the tumor necrosis factor receptor family that mediates pre-ligand receptor assembly and function
US7164009B2 (en) * 2000-09-15 2007-01-16 Genentech, Inc. Pro9821 polypeptides
EP2027874B1 (en) 2000-11-28 2013-10-16 Medimmune, Inc. Methods of administering/dosing anti-rsv antibodies for prophylaxis and treatment
US20060073141A1 (en) * 2001-06-28 2006-04-06 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
EP1399484B1 (en) 2001-06-28 2010-08-11 Domantis Limited Dual-specific ligand and its use
GB0118689D0 (en) * 2001-08-01 2001-09-19 Psimedica Ltd Pharmaceutical formulation
AU2003210806A1 (en) 2002-03-05 2003-09-22 Eli Lilly And Company Heterologous g-csf fusion proteins
US7696320B2 (en) 2004-08-24 2010-04-13 Domantis Limited Ligands that have binding specificity for VEGF and/or EGFR and methods of use therefor
US20060002935A1 (en) * 2002-06-28 2006-01-05 Domantis Limited Tumor Necrosis Factor Receptor 1 antagonists and methods of use therefor
ATE328906T1 (de) * 2002-06-28 2006-06-15 Domantis Ltd Dual-specifische liganden mit erhöhter halbwertszeit
US20040115194A1 (en) 2002-09-06 2004-06-17 Yi Wang Method of treatment of asthma using antibodies to complement component C5
MXPA05002514A (es) 2002-09-06 2005-05-27 Amgen Inc Anticuerpo monoclonal anti-il-1r1 humano terapeutico.
WO2004041865A2 (en) 2002-11-08 2004-05-21 Ablynx N.V. Stabilized single domain antibodies
EP1578801A2 (en) 2002-12-27 2005-09-28 Domantis Limited Dual specific single domain antibodies specific for a ligand and for the receptor of the ligand
US20060104968A1 (en) * 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
CA2529819A1 (en) * 2003-06-30 2004-09-23 Domantis Limited Pegylated single domain antibodies
PL1729795T3 (pl) 2004-02-09 2016-08-31 Human Genome Sciences Inc Białka fuzyjne albuminy
PT1737962E (pt) 2004-03-24 2010-12-03 Domantis Ltd Sequência líder universal gas1
EP2311433A3 (en) * 2004-10-21 2011-08-10 Genentech, Inc. Method for treating intraocular neovascular diseases
AU2005311101B8 (en) * 2004-12-02 2011-03-03 Domantis Limited Anti-IL-IRI single domain antibodies and therapeutic uses
AU2006321364B2 (en) * 2005-12-01 2011-11-10 Domantis Limited Noncompetitive domain antibody formats that bind Interleukin 1 Receptor type 1
EP1957537A2 (en) * 2005-12-01 2008-08-20 Domantis Limited Competitive domain antibody formats that bind interleukin 1 receptor type 1
HUE048024T2 (hu) 2006-08-10 2020-05-28 Roy C Levitt Anakinra bronchiolitis obliterans szindróma kezelésében való alkalmazásra
US20100129354A1 (en) * 2006-10-27 2010-05-27 Ablynx N.V. Intranasal delivery of polypeptides and proteins
JP2010528647A (ja) 2007-06-06 2010-08-26 ドマンティス リミテッド ポリペプチド、抗体可変ドメインおよびアンタゴニスト
KR20100018040A (ko) 2007-06-06 2010-02-16 도만티스 리미티드 프로테아제 내성 폴리펩티드를 선택하는 방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004058820A2 (en) * 2002-12-27 2004-07-15 Domantis Limited Single-domain-effector group and its uses
WO2007049017A2 (en) * 2005-10-24 2007-05-03 Domantis Limited Agents that bind a target in pulmonary tissue for treating respiratory diseases

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HARMSEN M.M. ET AL.: "Selection and optimization of proteolytically stable llama single-domain antibody fragments for oral immunotherapy". APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY SEP 2006, vol. 72, no. 3, September 2006 (2006-09), pages 544-551, XP002510773, ISSN: 0175-7598, abstract *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2625010C1 (ru) * 2016-11-10 2017-07-11 Илья Петрович Приколаб Экспрессионный плазмидный вектор для экспрессии активной формы TNFR1-Fc и способ получения рекомбинантного белка

Also Published As

Publication number Publication date
AR066847A1 (es) 2009-09-16
EA200901495A1 (ru) 2010-10-29
AR066848A1 (es) 2009-09-16
US8398979B2 (en) 2013-03-19
CL2008001674A1 (es) 2008-11-21
SI2162467T1 (sl) 2015-11-30
ZA200908470B (en) 2011-02-23
EA200901300A1 (ru) 2010-06-30
US20090148437A1 (en) 2009-06-11
EP2746290A2 (en) 2014-06-25
JP2010529841A (ja) 2010-09-02
US20120134982A1 (en) 2012-05-31
MA31403B1 (fr) 2010-05-03
EP2746291A2 (en) 2014-06-25
MX2009013138A (es) 2010-04-30
CR11194A (es) 2010-06-28
EA018129B1 (ru) 2013-05-30
EP2162467A2 (en) 2010-03-17
EP2162467B1 (en) 2015-07-22
CO6251322A2 (es) 2011-02-21
MX2009012967A (es) 2010-04-01
MX2009013137A (es) 2010-04-30
CL2008001676A1 (es) 2008-11-21
BRPI0812795A2 (pt) 2014-12-02
AU2008259590A1 (en) 2008-12-11
WO2008149148A2 (en) 2008-12-11
BRPI0813899A2 (pt) 2019-09-24
CN101802004A (zh) 2010-08-11
TW200918088A (en) 2009-05-01
HK1138022A1 (en) 2010-08-13
US20100266616A1 (en) 2010-10-21
JP2010530220A (ja) 2010-09-09
CA2688433A1 (en) 2008-12-11
ES2546943T3 (es) 2015-09-30
PL2162467T3 (pl) 2015-12-31
WO2008149149A2 (en) 2008-12-11
KR20100040841A (ko) 2010-04-21
EA200901491A1 (ru) 2010-08-30
BRPI0812795B1 (pt) 2019-12-03
CA2688434A1 (en) 2008-12-11
CA2683823A1 (en) 2008-12-11
CA2688456A1 (en) 2008-12-11
JP2010530364A (ja) 2010-09-09
SG182151A1 (en) 2012-07-30
PE20090322A1 (es) 2009-04-20
WO2008149150A3 (en) 2009-06-25
CN101883788A (zh) 2010-11-10
AU2008259514B2 (en) 2014-05-15
AR066850A1 (es) 2009-09-16
EP2746290B1 (en) 2019-08-14
WO2008149150A2 (en) 2008-12-11
NZ581372A (en) 2012-02-24
TW200911834A (en) 2009-03-16
CN104311663A (zh) 2015-01-28
CN101778865B (zh) 2016-11-09
CA2683791A1 (en) 2008-12-11
AU2008259515A1 (en) 2008-12-11
BRPI0812795C1 (pt) 2021-05-25
CN101778865A (zh) 2010-07-14
KR101604274B1 (ko) 2016-03-17
US20100247515A1 (en) 2010-09-30
KR20100021642A (ko) 2010-02-25
EA201100546A1 (ru) 2011-12-30
CO6251321A2 (es) 2011-02-21
CR11195A (es) 2010-05-24
EP2164867A2 (en) 2010-03-24
HRP20151024T1 (hr) 2015-11-06
CL2008001673A1 (es) 2008-11-21
IL201398A0 (en) 2010-05-31
CY1116762T1 (el) 2017-03-15
IL202204A0 (en) 2010-06-16
EP2162468A2 (en) 2010-03-17
CN104311663B (zh) 2018-11-02
EP2746291B1 (en) 2019-08-14
DK2162467T3 (en) 2015-08-24
MA31668B1 (fr) 2010-09-01
TW200911831A (en) 2009-03-16
DOP2009000268A (es) 2010-02-28
JP5325211B2 (ja) 2013-10-23
SG182141A1 (en) 2012-07-30
CA2688447C (en) 2016-11-08
PE20090323A1 (es) 2009-04-20
PT2162467E (pt) 2015-10-29
EP2746290A3 (en) 2014-09-10
MX2009013211A (es) 2010-04-09
PE20090763A1 (es) 2009-07-10
TW200911832A (en) 2009-03-16
US20110256122A1 (en) 2011-10-20
WO2008149149A3 (en) 2009-04-02
KR20100018040A (ko) 2010-02-16
BRPI0812268A2 (pt) 2019-09-10
TW200902551A (en) 2009-01-16
BRPI0812795B8 (pt) 2020-01-28
WO2008149148A3 (en) 2009-04-02
AU2008259514A1 (en) 2008-12-11
JP5444215B2 (ja) 2014-03-19
EP2746291A3 (en) 2014-09-03
KR20100041746A (ko) 2010-04-22
AU2008259516A1 (en) 2008-12-11
HUE025899T2 (en) 2016-05-30
CA2688447A1 (en) 2008-12-11
TW200907128A (en) 2009-02-16
EA200901494A1 (ru) 2010-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA018723B1 (ru) Полипептиды, вариабельные домены антител и антагонисты
EP4159757A1 (en) Sars-cov-2 spike protein binding molecule and application thereof
CN106573966B (zh) 用于治疗代谢异常的组合物和方法
EP1948694B1 (en) Tumor necrosis factor receptor 1 antagonists for treating respiratory diseases
CN101848935A (zh) 选择蛋白酶抗性多肽的方法
CN102131827A (zh) 用于肺部传递给药的组合物
CN101679511A (zh) 多肽、抗体可变域和拮抗剂
JP2017520253A (ja) 多重特異性抗体コンストラクト
AU2018256392B2 (en) Anti-PD-L1 antibody and use thereof
JP2021105060A (ja) 転移を低減するための方法および組成物
MX2007006593A (es) Anticuerpos de dominio simple anti-il 1r1 y sus usos terapeuticos.
EP2364326B1 (en) Methods for selecting protease resistant polypeptides
EA022898B1 (ru) Стабильные полипептиды, вариабельные домены антитела и антагонисты против tnfr1
JP2020501518A (ja) キメラタンパク質を用いたアレルギー疾患の治療
US20220241374A1 (en) Treatment of non-alcoholic steatohepatitis
TWI816164B (zh) 分離的抗體或抗原結合片段、其製備方法、編碼其的核酸分子、包含其的載體、宿主細胞和藥用組合物及其用途
US9546219B2 (en) Treatment of allergic diseases with recombinant antibodies
JP2023532316A (ja) Ｃ５ａを特異的に認識する抗体およびその使用
CN117241826A (zh) 用于治疗性递送的组合物和方法

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU