TW200918088A - Polypeptides, antibody variable domains & antagonists - Google Patents

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TW200918088A
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antagonist
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Laurent Stephane Anne Therese Jespers
Malgorzata Pupecka
Ian Tomlinson
Carolyn Enever
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Domantis Ltd
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Description

200918088 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於蛋白酶抗性多肽、免疫球蛋白（抗體）單一 可變區域及包含其之抗介白素_丨受體1型（antidnterkukind Receptor Type 1，IL-1R1)拮抗劑。本發明進一步係關於包 含該等抗IL-1R1配位體之用途、調配物、組合物及裝置。 【先前技術】 多肽及肽已在多種應用中成為越來越重要之藥劑，包括
工業應用及作為醫藥劑、治療劑及診斷劑之用途。然而， 在諸如發炎狀態（例如，COPD)及癌症之特定生理狀態 中，組織、器官或動物中（例如，肺中、腫瘤中或腫瘤附 近）所存在之蛋白酶量會增加。該蛋白酶增加會導致内源 生蛋白質及投與以治療疾病之治療肽、多肽及蛋白質加速 降解及鈍化。因此’ 一些具有活體内使用⑼如，用於治 療θ斷或預防疾病)之潛力之藥劑僅具有有限的功效， 因為其由蛋白酶快速降解及失活。 2白酶抗性多肽提供數個優點。舉例而言，蛋白酶抗性 留多：=内保留活性比蛋白酶敏感劑時間長，且因此保 產生生物效應之時間。對選擇抗蛋白酶降 IL.1R1 、之生物活性之多肽的改良方法存在需要。 已日·2·明某些結合介白夸〗為躺】 之藥劑為草^“ 型(IL-1R1)且中和其活性 為某些發炎性病狀（諸如中等活性至重m 風濕性關節炎)之右分、“ 寻活’生至重度活性之類 有效》。療劑。然而，結合IL_1R1之盆 1314I9.doc 200918088 藥劑（諸如抗IL-1R1抗體AMG 108(Amgen))在臨床研究中未 能達到初級終點（primary endpoint)。將希望提供結合且抄 抗IL- 1R1且有效治療肺發炎或呼吸道疾病（諸如慢性阻塞 性肺疾病（COPD))之藥劑。 對拮抗IL-1R1之改良藥劑及投與該等藥劑治療肺發炎及 肺病之方法存在需要。 【發明内容】 在一態樣中’本發明提供一種多肽’其包含與D〇M4-130-201之胺基酸序列（展示於圖4中）至少98%—致或與 DOM4-1 3 0-202之胺基酸序列（展示於圖4中）至少97%—致 之胺基酸序列。在一實施例中，一致性％為至少9 7.5、 98、98.5或99%。在一實施例中，該多肽為D0M4-130-201 或DOM4-130-202。本發明進一步提供（大體上）純d〇M4-130-201 或 DOM4-130-202 單體。在一實施例中，D0M4-13 0-201或〇€^4-130-202為至少98'99、99.5%純或100% 純之單體。 在一態樣中，本發明提供一種多肽，其包含與D0M4-13 0-201或D0M4-130-202之胺基酸序列至少90%—致之蛋 白酶抗性胺基酸序列。在該等態樣之一實施例中’ 一致性 % 為至少 80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98 或99%。在一實施例中，該多肽為D0M4- 1 30-201或DOM4-130-202 ° 在一態樣中，本發明提供一種多肽，其係由與D0M4· 1 3 0-201或DOM4-1 30-202之核苦酸序列之核普酸序列（展示 131419.doc 200918088 於圖1 9中）至少80% —致之胺基酸序列編碼。在一實施例 中，一致性 ％為至少 70、80、85、90、91、92、93、94、 95、96、97、98 或 99%。 在一態樣中，本發明提供一種多肽，其係由與D〇M4_ 13 0-201或DOM4-13 0-202之核苷酸序列（展示於圖19中）至 少57°/◦—致之核苷酸序列編碼且該多肽包含與d〇m4- 130-201之胺基酸序列至少98%—致或與d〇m4-130-202之胺基 酸序列至少97。/。一致的胺基酸序列。在一實施例中，核苦 酸序列之一致性％為至少60、65、70、75、80、85、90、 91、92、93、94、95、96、97、98 或99%。在一實施例 中’胺基酸序列之一致性％為至少94、95、96、97、98或 99。/。或100%。舉例而言，核苷酸序列可為d〇M4_13〇_2〇1 或DOM4-130-202之核普酸序列（展示於圖19中）之密碼子優 化形式。此項技術中已知序列之密碼子優化。在一實施例 中，核苷酸序列係經優化從而表現於細菌（例如，大腸桿 囷（£"· co/z·)或假單胞滅屬（户_^以0讲0;?(31?)，例如榮光假單胞 菌（八//woreicew))、哺乳動物（例如，CH0)或酵母宿主細 胞（例如，酵母屬或植酵母屬例 如馬斯德畢赤酵母（P. pwio…）或釀酒酵母cereWhae)) 中。 在一悲樣中，本發明提供一種包含本發明之多狀之融合 蛋白。 在一怨樣中，本發明提供一種抗介白素-1受體1型（jl_ iRi)免疫球蛋白單一可變區域，其包含與d〇M4_130_201 131419.doc -8 - 200918088 之胺基酸序列（展示於圖4中）至少98%—致或與DOM4-130-202之胺基酸序列（展示於圖4中）至少97% —致之胺基酸序 列。在一實施例中，一致性％為至少97,5、98、98.5或 99%。 在一實施例中’免疫球蛋白單一可變區域包含至少一個 選自22S、49S、83S及94Y之胺基酸，其中編號係根據 Kabat ( Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services 1991)。 在一實施例中’免疫球蛋白單一可變區域包含22S、 49S、83S及94Y，其中編號係根據Kabat。 在一態樣中，本發明提供一種抗介白素_丨受體1型（IL_ 1R1)免疫球蛋白單一可變區域，其包含與DOM4-130-201 或DOM4_130-202之胺基酸序列一致之胺基酸序列。 在一態樣中，本發明提供一種抗介白素_丨受體1型（IL_ 1R1)免疫球蛋白單一可變區域，其係由與D〇M19-130-201 或D0M4-130-202之核普酸序列（展示於圖ip中）至少80% — 致之核苷酸序列編碼。在一實施例中’一致性。/。為至少 70、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98 或 99%。 在一悲樣中，本發明提供一種抗介白素_丨受體1型（IL· 1R1)免疫球蛋白單一可變區域，其係由與D〇m4-130-201 或DOM4-13 0-202之核苷酸序列（展示於圖19中）至少57%一 致之核苷酸序列編碼且其中該可變區域包含與30-201之胺基酸序列至少98% 一致或與D〇M4_13〇_2〇2之胺基 131419.doc 200918088 酸序列至少97%—致之胺基酸序列。在—實施例中，核苦 酸序列之一致性％為至少60、65、70 ' 75、80、85、90、 、92、93、94、95、96、97、98 或 99%。在一實施例 中，胺基酸序列之一致性％為至少94、95、96、97、％或 99%或100%。舉例而言，核苷酸序列可為^^^肛 或DOM4- i 3 0-202之核苷酸序列(展示於圖! 9中)之密碼子優 化形式。此項技術中已知序列之密碼子優化。在—實施例 中’優化核皆酸序列以表現於細g (例如，大腸桿菌或假 單胞菌屬，例如螢光假單胞菌）、哺乳動物（例如，ch〇)或 酵母宿主細胞（例如’酵母屬㈣酵母屬，例如馬斯德畢 赤酵母或釀酒酵母）中。 在一怨樣中，本發明提供一種抗介白素_丨受體丨型（江_ 1R1)免疫球蛋白單一可變區域’其係由與d〇M4_i3〇_2〇i 或DOM4-13 0-202之核苦酸序列（展示於圖19中）_致之核甘 酸序列編碼。
在一態樣中，本發明提供一種介白素_丨受體丨型彳化-丨…） 拮抗劑’纟包含本發明之抗IL.免疫球蛋白單—可變區 ，。在-實施财，該拮抗劑包含第m疫球蛋白 單可憂區域，其中各可變區域係根據發明。舉例而言， =中。亥抬抗劑包含该單一可變區域之單體或該單一可變區 域之同兀二聚體。在_實施例中，該單一可變區域或各單 一可變區域之胺基酸序列與D〇M4_i3〇_2〇i或D〇M4_13〇_ 202之胺基酸序列（展示於圖4中）一致。 〜樣中本發明提供一種抗介白素_ 1受體丨型（江_ 131419.doc •10· 200918088 1R1)免疫球蛋白單一可變區域，其包含與1)〇]^4_13〇_2〇1 或DOM4-130-202之胺基酸序列（展示於圖4中）一致或在不 超過25個胺基酸位置處與DOM4-13 0-202之胺基酸序列不 同且具有與 DOM4-130-201 或 DOM4-130-202 之 CDR1 序列 至少50%—致之CDR1序列的胺基酸序列。在一實施例中， 不同之處不超過 24、23、22、21、20、19、18、17、16、 15、14、13、12、11、1〇、9、8、7、6、5、4、3、2或 1 個胺基酸位置。在一實施例中，CDR序列一致性為至少 55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98 或 99%。 在一恶樣中，本發明提供一種抗介白素_ 1受體^型（IL_ 1R1)免疫球蛋白單一可變區域，其包含與DOM4-13 0-201 或DOM4-130-202之胺基酸序列（展示於圖4中）一致或在不 超過25個胺基酸位置處與d〇M4-13 0_2〇1或DOM4-13 0-202 之胺基酸序列不同且具有與DOM4-13 0-201或DOM4-13 0-202之CDR2序列至少50%—致之CDR2序列的胺基酸序列。 在一實施例中，不同之處不超過24、23、22、21、20、 19、18、17、16、15、14、13、12、11、1〇、9、8、7、 6、5、4、3、2或1個胺基酸位置。在一實施例中，CDR序 列一致性為至少 55、60、65、70、75、80、85、90、95、 96、97、98或 99%。 在一態樣中，本發明提供一種介白素-1受體1型（IL-1R 1) 免疫球蛋白單一可變區域，其包含與DOM4-130-201或 DOM4-130-202之胺基酸序列（展示於圖4中）一致或在不超 131419.doc -11 - 200918088 過25個胺基酸位置處與DOM4-130-201或DOM4-130-202之 胺基酸序列不同且具有與DOM4-13 0-201或DOM4-130-202 之CDR3序列至少5〇Q/〇 —致之CDR3序列的胺基酸序列。在 一實施例中’不同之處不超過24、23、22、21、20、19、 18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、 5、4、3、2或1個胺基酸位置。在一實施例中，CDR序列 一致性為至少 55、60、65、70、75、80、85、90、95、 96、97、98 或 990/〇 ° 在一態樣中，本發明提供一種抗介白素-1受體1型（IL_ 1R1)免疫球蛋白單一可變區域，其包含與DOM4-130-201 或DOM4-130-202之胺基酸序列（展示於圖4中）一致或在不 超過25個胺基酸位置處與d〇M4-130-201或DOM4-130-202 之胺基酸序列不同且具有與DOM4-130-201或DOM4-130-202之CDR1序列至少50%—致之CDR1序列且具有與DOM4-130-201 或 DOM4-130-202 之 CDR2 序列至少 50% —致之 CDR2序列的胺基酸序列。在一實施例中，不同之處不超 過24 、 23 、 22 、 21 、 20 、 19 、 18 、 17 、 16 、 15 、 14 、 13 、 12、11、1〇、9、8、7、6、5、4、3、2或 1 個胺基酸位 置。在一實施例中，一或兩個CDR序列一致性分別為至少 55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98 或 99%。 在一態樣中’本發明提供一種抗介白素_丨受體1型（IL_ 1R1)免疫球蛋白單一可變區域，其包含與dOM；4-130-201 或DOM4-130-202之胺基酸序列（展示於圖4中）一致或在不 131419.doc -12- 200918088 超過25個胺基酸位置處與D〇M4_13〇_2〇1或d〇M4_13〇 2〇2 之胺基酸序列不同且具有與DOM4-130-201或DOM4-130-202之CDR1序列至少50%—致之CDR1序列且具有與D〇M4_ 130-201 或 DOM4-130-202 之 CDR3 序列至少 50°/。一致之 CDR3序列的胺基酸序列。在一實施例中，不同之處不超 過24、 23 、 22、 21 、 20' 19、 18、 17、 16、 15、 14、 13、 12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或 1 個胺基酸位 置。在一實施例中，一或兩個(：1)11序列一致性分別為至少 55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98 或 99%。 在一悲樣中，本發明提供一種抗介白素_ 1受體1型（化_ 1R1)免疫球蛋白單一可變區域，其包含與DOM4-130-201 或DOM4-1 30-202之胺基酸序列（展示於圖4中）一致或在不 超過25個胺基酸位置處與DOM4-13 0-201或DOM4-130-202 之胺基酸序列不同且具有與DOM4-130-201或DOM^nO-SO〗之 CDR2序 列至少 5〇%—致之 CDR2序列且 具有與 £)〇M4- 130-201 或 DOM4-130-201 或 DOM4-130-202 之 CDR3 序列至 少50°/。一致之CDR3序列的胺基酸序列。在一實施例中，不 同之處不超過 24、23、22、21、20、19、18、17、16、 15、14、13、12、11、1〇、9、8、7、6、5、4、3、2或 1 個胺基酸位置。在一實施例中’—或兩個CDR序列一致性 分別為至少 55、60、65 ' 70、75、80、85、90、95、96、 97、98 或 99% ° 在一態樣中’本發明提供一種抗介白素受體1型（IL_ 131419.doc -13· 200918088 1R1)免疫球蛋白單一可變區域，其包含與D〇M4-130-201 或DOM4-13 0-202之胺基酸序列（展示於圖4中）一致或在不 超過25個胺基酸位置處與d〇M4-130-201或DOM4-130-202 之胺基酸序列不同且具有與DOM4-13 0-201或DOM4-130-202之CDR1序列至少5〇%一致之CDR1序列且具有與DOM4-130-201 或 DOM4-130-202 之 CDR2 序列至少 50% —致之 CDR2 序列且具有與 DOM4-130-201 或 DOM4-130-202 之 CDR3序列至少50% —致之CDR3序列的胺基酸序列。在一 實施例中，不同之處不超過24、23、22、21、20、19、 18、17、16、15、14、13、12、11、1〇、9、8、7、6、 5、4、3、2或1個胺基酸位置。在一實施例中，一或兩個 或各CDR序列一致性分別為至少55、6〇、65、70、75、 80、85、90、95、96、97、98或 99%。 在一態樣中，本發明提供一種介白素_丨受體1型（il_1R1) 拮抗劑，其具有與DOM4-130-201或DOM4-130-202(展示於 圖4中）之CDR1序列至少5〇%一致之CDR1序列。在一實施 例中’ CDR序列一致性為至少55、6〇、65、7〇、75、8〇、 85、90、95、96、97、98或99%。該结抗劑可（例如）在一 組如本文中所述之條件下對蛋白酶（例如一或多種如本文 中所述之蛋白酶）具有抗性。 在一態樣中’本發明提供一種介白素_丨受體i型（IL_丨Ri) 拮抗劑’其具有與DOM4-130-201或DOM4-130-202(展示於 圖4中）之CDR1序列至少5〇% 一致之c〇R2序列。在一實施 例中，CDR序列一致性為至少55、6〇、65、、75、8〇、 131419.doc -14 - 200918088 85、90、95、96、97、98或99%。該拮抗劑可（例如）在一 組如本文中所述之條件下對蛋白酶（例如一或多種如本文 中所述之蛋白酶）具有抗性。 在態樣中’本發明提供一種介白素-1受體1型（IL_ 1 R 1 ) 抬抗劑，其具有與⑽刚-別-训或⑽刚丨3^2^展示於 圖4中）之CDR1序列至少50% —致之CDR3序列。在一實施 例中’ CDR序列一致性為至少55、6〇、65、7〇、75、8〇、 85、90、95、96、97、98或99。/。。該拮抗劑可（例如）在一 組如本文中所述之條件下對蛋白酶（例如一或多種如本文 中所述之蛋白酶）具有抗性。 在一態樣中’本發明提供一種介白素_ 1受體1型（JL_丨R 1 ) 拮抗劑’其具有相應與DOM4-130-201或DOM4-130-202(展 示於圖4中）之CDR1序列至少50% —致之CDR1序列及與 DOM4-13 0-201 或 DOM4_130-202之 CDR2序列至少 50。/。一致 之CDR2序列。在一實施例中，一或兩個€1)11之CDR序列 一致性分別為至少 55、60、65、70、75、80、85、90、 95、96、97、98或99。/。。該拮抗劑可（例如）在一組如本文 中所述之條件下對蛋白酶（例如一或多種如本文中所述之 蛋白酶）具有抗性。 在一態樣中’本發明提供一種介白素_1受體1型（JL-1R1) 才吉抗劑’其具有相應與DOM4-130-201或DOM4-130-202(展 示於圖4中）之CDR1序列至少50%—致之CDR1序列及與 DOM4-13 0-201 或 DOM4-13 0-202之 CDR3序列至少 50%—致 之CDR3序列。在一實施例中’一或兩個cdr之CDR序列 131419.doc •15· 200918088 致 ί1生刀別為至少 55、60、65、70、75、80、85、90、 95、 96、97 ' 98或99%。該拮抗劑可（例如）在一組如本文 中所述之條件下對蛋白酶（例如一或多種如本文中所述之 蛋白酶）具有抗性。 在心樣中，本發明提供一種介白素_ 1受體^型（化_ 1 R 1 ) 拮抗劑，其具有與0〇]^4_13〇 _2〇1或]：)〇]^4_13〇_2〇2(展示於 圖4中）之CDR2序列至少5〇%一致之CDR2序列及與d〇m4_ 130-201 或 D〇M4_13〇_2〇2 之 CDR3 序列至少 5〇% 一致之 CDR3序列。在一實施例中，一或兩個cdr之cdr序列一 致性分別為至少 55、60、65、70、75、80、85、90、95、 96、 97、98或99%。該拮抗劑可（例如）在一組如本文中所 述之條件下對蛋白酶（例如一或多種如本文中所述之蛋白 酶）具有抗性。 在態樣中，本發明提供一種介白素-1受體1型（IL- 1 R 1 ) 拮抗劑，其具有相應與DOM4-130-201或DOM4-130-202(展 不於圖4中）之CDR1序列至少50% —致之CDR1序列及與 DOM4-130-201 或 DOM4-130-202之 CDR2序列至少 50%-致 之 CDR2序列及與 DOM4-130-201 或 DOM4-130-202之 CDR3 序列至少5〇%一致之CDR3序列。在一實施例中，一或兩個 或各CDR之CDR序列一致性分別為至少55、6〇、65、7〇、 75、80、85、90、95、96、97、98 或 99%。該拮抗劑可（例 如）在一組如本文中所述之條件下對蛋白酶（例如一或多種 如本文中所述之蛋白酶）具有抗性。 在一態樣中’本發明提供一種介白素_丨受體1型（IL_1R1) 131419.doc -16· 200918088 拮抗劑，其包含免疫球蛋白單一可變區域，該免疫球蛋白 單一可變區域包含DOM4-130-201或DOM4-130-202(展示於 圖 4 中）之 CDR1、CDR2及 /或 CDR3(例如，CDR1、CDR2、 CDR3、CDR1 及 CDR2、CDR1 及 CDR3、CDR2 及 CDR3 或 CDR1、CDR2及CDR3)序列。該拮抗劑可（例如）在一組如 本文中所述之條件下對蛋白酶（例如一或多種如本文中所 述之蛋白酶）具有抗性。 在一態樣中，本發明提供一種介白素_1受體1型（化_1111) 拮抗劑，其與DOM4-130-201或DOM4-130-202競爭以結合 IL-1R1。因此，拮抗劑可結合與d〇M4-130-201 4DOM4- 1 3 0 - 2 0 2相同之抗原決定基或重疊抗原決定基。在一實施 例中’該拮抗劑包含具有與DOM4-130-201之胺基酸序列 (展示於圖4)至少98%—致或與DOM4-130-202之胺基酸序 列（展示於圖4)至少97%—致之胺基酸序列的免疫球蛋白單 一可變區域。在一實施例中，一致性％為至少97 5、98、 98.5或99%。在一實施例中，該可變區域為如副-丨地加 或DOM4-13 0-202。該拮抗劑可（例如）在一組如本文中所述 之條件下對蛋白酶（例如一或多種如本文中所述之蛋白酶） 具有抗性。在一實施例中，拮抗劑為對IL_ 1R1具有結合特 異性之抗體或其抗原結合片段，諸如單價抗原結合片段 (例如，scFv、Fab、Fab’、dAb)。其他較佳拮抗劑為本文 中所述之結合IL-1R1之配位體。配位體包含合適格式之對 IL-1R1具有結合特異性之免疫球蛋白單一可變區域或區域 抗體（dAb)或該dAb之互補判定區。在一些實施例中，配位 131419.doc . 17- 200918088 體為基本上由對IL-1R1具有結合特異性之免疫球蛋白單一 可變區域或dAb組成或由其組成之dAb單體。在其他實施 例中，配位體為包含合適格式（諸如抗體格式）之dAb(或 dAb之CDR)的多肽。 在一態樣中’本發明提供一種蛋白酶抗性抗IL_丨R〗免疫 球蛋白單一可變區域’其包含與D〇M4-130-201或DOM4-130-202之胺基酸序列至少9〇%一致之胺基酸序列。在該等 態樣之一實施例中’ 一致性％為至少8〇、85、9〇、91、 92、93、94、95、96、97、98 或 99%。 在一實施例中，本發明之配位體（例如，多肽、拮抗 劑、可變區域）係（例如）藉由連接PEG基團、血清白蛋白、 轉鐵蛋白、轉鐵蛋白受體或至少其轉鐵蛋白結合部分、抗 體F c區或藉由接合抗體區域來編排格式以具有較大流體動 力學尺寸。舉例而言，dAb單體可經編排格式為抗體之較 大抗原結合片段或抗體（例如，經編排格式為Fab、Fab，、 t F(ab)2、F(ab’）2、IgG、SCFv)。如本文中所述，亦可藉由使 IL-1R1結合劑（配位體；拮抗劑）與結合增加活體内半衰期 之抗原或抗原決定基的結合區域（例如，抗體或抗體片段） 接合或連接來增加配位體之流體動力學尺寸及其血清半衰 期（參見，W02006038027之附錄1，其整體係以引用之方 式併入本文中）。舉例而言，可使結合劑（例如，多肽）與抗 血清白蛋白或抗新生兒Fc受體抗體或抗體片段（例如，抗 SA或抗新生兒Fc受體dAb、Fab、Fab3scFv)或抗SA親和 體（affibody)或抗新生兒Fc受體親和體接合或連接。 131419.doc • 18- 200918088 用於本發明之IL-1R1結合配位體之合適白蛋白、白蛋白 片段或白蛋白變異體的實例係描述於W〇 2〇〇5/〇77〇42A2 及w〇2006038027中，其整體係以引用之方式併入本文 中。 在貝穿該揭示内容所述之本發明之其他實施例中，代替 在本發明之拮抗劑或配位體中使用"dAb,，，涵蓋熟練的使 用者（addressee)可使用的區域為包含結合之dAb之 CDR(例如，接枝於合適蛋白質骨架或骨幹上之cdr,該 骨架或骨幹例如親和體、SpA骨架、LDL受體A類區域或 EGF區域）或可為包含IL_1R1結合位點之蛋白質區域，例如 其中該區域係選自親和體、SpA區域、跳受體A類區域 或咖區域。因此，揭示内容整體應解釋為提供代替dAb 之拮抗劑、酉Μ立體及使用該等區域之方法之揭示内容。 一本,明之多⑻、免疫球蛋白單一可變區域及拮抗劑可抗 一或多種以下蛋白_ :絲胺酸蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、 ^冬胺酸蛋㈣、硫醇蛋白酶、基質金屬蛋白酶、缓肽酶 二如竣肽酶A、羧肽酶B)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃 ::、木瓜酶、彈性蛋白酶、白血球酶―帅胰 ^血酶、纖溶酶、組織蛋白酶(例如組織蛋白酶G)、 蛋白(例如蛋白酶1、 酶、凝’ π 蛋白酶2、蛋白酶3)、冑熱菌蛋白 酶 蛋白酶（caspase)(例如卡斯蛋白 m 卞斯蛋白酶2、卡斯蛋白絡4上 白酶9 m 蛋白鉍4 '卡斯蛋白酶5、卡斯蛋 m 卡斯蛋白酶12、卡斯卷&結113、 無花杲l a 蛋白酶13)、鈣激活蛋白酶、 …、 蛋白酶（ficain)、梭菌| ώ 蛋白轉、獼餱桃蛋白酶、鳳梨 131419.doc 200918088 酶及分離酶。在特定實施例中， 蛋白酶或白血球酶。蛋白酶亦=胰蛋白酶、彈性 勻漿或生物製劑提供。 _取物、生物組織 文呀’該方法進一步包会力 完成後向譜系與蛋白酶之纟且人 a在心養 實施例中，蛋白酶為可 在一 ' 或多種以下各物中之 軸：痰、黏液（例如胃黏液、g 蛋白 τ黏液、支氣管黏液彳、士 管肺泡灌洗液、肺組織勻漿、 支乳 .._ 肺^取物、胰腺提取物、胃 液、唾液或眼淚。在一實物月 、、“ 冑“列中，蛋白酶為眼睛及/或眼 /戾中可見之蛋白酶。在一眘祐如+ 白酶。在… 實知例中，蛋白酶為非細菌性蛋 白_。在一實施例中，蛋白 贫白酶為動物，例如哺乳動物 如人類蛋白酶。在一實祐彻由 ^ ^ L 貢施例中，蛋白酶為胃腸道蛋白酶或 肺組織蛋白酶，例如人類中可 見之月腸道蛋白酶或肺組織 蛋白此處所列之該蛋白酶亦可用於本文中所述之包括 將庫之谱系暴露於蛋白酶中之方法中。 在一態樣中，本發明提供—種包含介白素^受體㈣叫 1R1)結合位點之蛋白酶抗性免疫球蛋白單一可變區域，盆 中該可變區域在以下情況下對蛋白酶(例如胰蛋白酶)具有 抗性： ⑴在37t下與至少1()微克/毫升之濃度⑷之蛋白酶一起培 養至少1小時之時間（t);或 (Π)在3(TC下與至少40微克/毫升之濃度（c,)之蛋白酶一起培 養至少1小時之時間⑴，*中該可變區域包含與d__ 130-2〇1或DOM4_130-202之胺基酸序列至少9〇%_致之胺 基酸序列。在一實施例中，蛋白酶（例如胰蛋白酶）與可變 131419.doc 20· 200918088 區域之比率（以莫耳/莫耳計）為8,〇〇〇比8〇,〇〇〇蛋白酶可變 區域，例如當C為10微克/毫升時，比率為800比8〇〇〇〇蛋 白酶：可變區域；或當C或C|為100微克/毫升時，比率為 8,000比8G，GGG蛋白酶：可變區域。在—實施例中，蛋白酶 (例如胰蛋白酶）與可變區域之比率（以重量/重量、例如微 克/微克計）為16,000比16〇,000蛋白酶：可變區域，例如當c 為10微克/毫升時，比率為L600比16〇,〇〇〇蛋白酶可變區 域；或當C或c，為100微克/毫升時，比率為uooo比 160,000蛋白酶：可變區域。在一實施例中’濃度。或〇為 至少1〇〇或1〇〇〇微克/毫升蛋白酶。當與肽或多肽之譜系或 庫一起作用時，參考本文中之適於所使用之蛋白酶蛋白水 解活性之條件的描述（例如，w/w參數）。該等條件可供測 定特定免疫球蛋白單一可變區域之蛋白酶抗性之條件使 用。在一實施例中，時間⑴為或約為1、3或24小時或隔夜 (例如，約12-1 6小時）。在一實施例中，該可變區域在條件 ⑴下具抗性且濃度（c)為或約為10或100微克/毫升蛋白酶且 時間⑴為1小時。在一實施例中，該可變區域在條件（ii)下 具抗性且濃度（c’）為或約為40微克/毫升蛋白酶且時間⑴為 或約為3小時。在一實施例中，該蛋白酶係選自胰蛋白 酶、彈性蛋白酶、白血球酶及胰酶。在一實施例中，該蛋 白扭為騰蛋白酶。在一實施例中’蛋白酶為可見於一或多 種以下各物中之蛋白酶：痰、黏液（例如胃黏液、鼻I占 液、支氣管黏液）、支氣管肺泡灌洗液、肺組織勻漿、肺 提取物、胰腺提取物、胃液、唾液或眼淚。在一實施例 131419.doc -21 - 200918088 中’蛋白酶為眼睛及/或眼淚中可 YS 丨 rK -C- 奮白 。在—♦ “ 幻中，蛋白酶為非細菌性蛋白酶。在 實施 為動物，例如哺乳動物，例如人類蛋白酶。在_ =酶 中，蛋^酶為胃腸道蛋白酶或肺組織蛋白酶，例如人^ 可見之胃腸道蛋白酶或肺組織蛋 中 酶亦可用於本文中所述之包括 ：蛋白 之方法中。 糸暴露於蛋白酶中
、登^實施例中，該可變區域對胰蛋白酶及/或至少另— :而蛋白酶、白金球酶及姨酶之蛋白酶具有抗性。舉 H ’抗性係針對胰蛋白酶及彈性蛋白酶；胰蛋白酶及 球酶；月夷蛋白酶及姨酶；騰蛋白酶、彈性蛋白酶及白 血球酶；騰蛋白酶、彈性蛋白酶及胰酶；騰蛋白酶、彈性 蛋白酶、胰酶及白血球酶；或胰蛋白酶、胰酶及白血球 酶。 在實施例+可變區域當在條件⑴或⑼下培養時（例 如）以10至10 、例如1〇8至10丨2個複製單位（傳染性病毒體） 之电fe體庫規模呈現於唆菌體上。 在-實施例中，該可變區域在條件⑴或（ii)下培養後特 異性結合IL-1R1，例如，使用BiaC〇reTM或机似（例如， 噬菌體ELISA或單株噬菌體EUSA)評定。 在-實施例中，本發明之可變區域特異性結合蛋白質A 或蛋白質L。在-實施例中，在條件⑴或⑼下培養後，出 現與蛋白質A或L之特異性結合。 在一實施例中，本發明之可變區域（例如）在條件⑴或（ii) 131419.doc •22- 200918088 下培養後在ELISA(例如噬菌體ELISA或單株噬菌體ELISA) 中可具有至少0.404之OD450讀數。 在一實施例中，本發明之可變區域（例如）在條件⑴或（ii) 下培養後在凝膠電泳中展現（大體上）單一條帶。 在某些實施例中，本發明提供一種為包含結合IL-1R1之 本發明之第一 dAb及具有與第一 dAb相同或不同結合特異 性之第二dAb的雙特異性配位體的IL-1R1拮抗劑。第二 dAb可結合選自以下各之靶：ApoE、Apo-SAA、BDNF、 心營養素-1、CEA、CD40、CD40配位體、CD56、CD38、 CD138、EGF、EGF受體、ENA-78、嗜酸性粒細胞趨化因 子、嗜酸性粒細胞趨化因子-2、次級淋巴組織趨化因子 (Exodus)-2、FAPa、FGF-酸性、FGF-驗性、纖維母細胞生 長因子-10、？1^丁3配位體、弗拉塔凱（？^(^31^1^)(〇乂3(：)、 GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-βΙ、人類血清白蛋白、胰 島素、IFN-γ、IGF-I、IGF-II、IL-la、IL-Ιβ、IL-1 受體、 IL-1 受體 1型、1[-2、1[-3、11^4、11^5、11^6、1[-7、1[-8(72 a.a.)、IL-8(77 a.a.)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、 IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18(IGIF)、抑制素 α、抑 制素β、IP-10、角化細胞生長因子-2(KGF-2)、KGF、瘦體 素、LIF、淋巴細胞趨化因子、穆勒氏抑制物質（Mullerian inhibitory substance)、單核細胞集落抑制因子、單核細胞 引誘蛋白、1^-€8?、]^0(：(67 3.&.)、]\10(：(69珏.&.)、]^〇?-l(MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC(67 a.a)、 MDC(69 a.a.)、MIG、ΜΙΡ.Ια、ΜΙΡ-1β、ΜΙΡ-3α、MIP- 131419.doc •23- 200918088 3β、MIP-4、骨髓祖細胞抑制劑因子- l(MPIF-l)、NAP-2、 神經營養因子、神經生長因子、β-NGF、NT-3、NT-4、制 瘤素 Μ、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、 RANTES、SDFla、SDFip、SCF、SCGF、幹細胞因子 (SCF)、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-P2、TGF-P3、腫瘤 壞死因子（TNF)、TNF-a、TNF-β、TNF 受體 I、TNF 受體 II、TNIL-1、TPO、VEGF、VEGF A、VEGF B、VEGF C、VEGF D、VEGF 受體 1、VEGF 受體 2、VEGF 受體 3、 GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β、GRO-γ、HCC1、1-309、 HER 1、HER 2、HER 3、HER 4、血清白蛋白、vWF、澱 粉樣蛋白（例如，澱粉樣〇〇、河1^?12、？0〖1、1§£、11^ 13Ral、IL-13Ra2、IL-15、IL-15R、IL-16、IL-17R、IL-17、IL-18、IL-18R、IL-23IL-23R、IL-25、CD2、CD4、 CDlla、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、 CD40L、CD56、CD138、ALK5、EGFR、FcERl、TGFb、 CCL2、CCL18、CEA、CR8、CTGF、CXCL12(SDF-1)、凝 乳酶、FGF、弗林蛋白酶（Furin)、内皮素-1、嗜酸性粒細 胞趨化因子（例如，嗜酸性粒細胞趨化因子、嗜酸性粒細 胞趨化因子-2、嗜酸性粒細胞趨化因子-3)、GM-CSF、 ICAM-1、ICOS、IgE、IFNa、1-309、整合素、L-選擇 素、MIF、MIP4、MDC、MCP-1、MMP、嗜中性彈性蛋白 酶、骨橋蛋白、OX-40、PARC、PD-1、RANTES、SCF、 SDF-1、siglec8、TARC、TGFb、凝血酶、Tim-1、TNF、 TRANCE、類胰蛋白酶、VEGF、VLA-4、VCAM、α4β7、 131419.doc -24- 200918088 CCR2 、 CCR3 、 CCR4 、 CCR5 、 CCR7 、 CCR8 、 ανβ6 、 ανβ8、cMET、CD8、vWF、澱粉樣蛋白（例如，澱粉樣 a)、MMP12、PDK1 及 IgE。 在一實例中，雙特異性配位體包含結合IL-1R1上之第一 抗原決定基之第一 dAb及結合不同靶上之抗原決定基之第 二dAb。在另一實例中，第二dAb結合血清白蛋白上之抗 原決定基。 在其他實施例中，該配位體為多特異性配位體，其包含 對IL-1R1具有結合特異性之第一抗原決定基結合區域及具 有不同於第一抗原決定基結合區域之結合特異性之至少另 一抗原決定基結合區域。舉例而言，第一抗原決定基結合 區域可為結合IL-1R1之dAb或可為包含結合IL-1R1之dAb 之CDR(例如，接枝於合適蛋白質骨架或骨幹之CDR，該 骨架或骨幹例如親和體、SpA骨架、LDL受體A類區域或 EGF區域）的區域或可為結合IL-1R1之區域，其中該區域係 選自親和體、SpA區域、LDL受體A類區域或EGF區域。 在一實施例中，IL-1R1之拮抗劑包含對IL-1R1具有結合 特異性之多肽區域，該多肽區域係以如由表面電漿共振所 測定約300 nM至約5 pM之親和力（KD)結合人類IL-1R1。 在一實施例中，本發明之可變區域對IL-1R1具有結合特異 性，其係以如由表面電漿共振所測定約300 nM至約5 pM之 親和力（KD)結合人類IL-1R1。 結合IL-1R1之拮抗劑、多肽及可變區域可以任何想要之 親和力結合IL-1R1且可使用任何合適篩選法容易地鑑別。 131419.doc -25- 200918088 結合IL-1R1(例如，dAb)之本發明之拮抗劑、多肽及可變 區域通常以如由表面電漿共振所測定為約300 nM至5 PM(亦即 ’ 3χ1〇 至 5xl〇-12 M) ’ 較佳 50 nM 至 20 pM，例如 5 nM至200 pM且例如1 nM至100 pM，例如1χ1〇·7 Μ或以 下、例如lxl〇-8 Μ或以下 '例如1χ1〇-9 Μ或以下、例如 1x10 10 Μ或以下、例如1χ1〇-ιι Μ或以下之KD(KD ;如由 表面電漿共振所測定Kd = KofKkdVUka));及/或為5XHT1 s·1至 ΙχΙΟΛ1、例如 lxl0-2 s-i至 1χ1〇·6 s.i、例如5χ1〇_3 / 至卜1〇58-1’例如5\1〇_13-1或以下，例如1><1〇-28-1或以 下’例如lxl〇-3 S·1或以下，例如lxl〇-4 ,或以下，例如 1χ1(Τ5 s·1或以下，例如lxl0-6 s-i或以下2K〇ff速率常數結 合。某些拮抗劑、多肽及可變區域係以如由表面電漿共振 所測定50 nM至20 pM之KD及5X10—1 s·1至lx ΗΓ7 s·丨之Koff速 率常數結合IL- 1R1，特異性結合人類IL- 1R1。 結合IL-1R1之拮抗劑、多肽及可變區域較佳以£1〇 μΜ、 $1 μΜ > <100 nM ' <10 nM ' <1 nM ' <500 pM ' <300 pM、$100 pM 或 $10 pM 之抑制濃度 50(IC50)抑制 IL-Ια 及 / 或IL-Ιβ與IL-1R1之結合。IC50(例如）使用活體外受體結合 檢定（諸如W02006059108中所述之檢定）測定。 亦較佳為結合IL-1R1之拮抗劑、多肽及可變區域在合適 之活體外檢定中以S10 μΜ、μΜ、S100 nM、$1〇 nM、 nM、$500 pM、5300 pM、SI 00 ρΜ或 SI 0 ρΜ之中和劑 量50(ND50)抑制IL-la及/或IL-Ιβ誘導之功能。舉例而言， 結合IL-1R1之拮抗劑、多肽及可變區域可在活體外檢定 131419.doc -26- 200918088 (諸如 W02006059108 (ATCC寄存編號CCL-m)之 _5細胞 1α及/或1誘導之介白 素-8釋放。在另-實例中，結合IL.1R1之多狀及可變區域 在全血檢定（諸如W〇2〇_59⑽中所述之檢定）中制 IL-la及/或IL-Ιβ誘導之介白素_6釋放。 本發明之藥物、可變區域、多肽及拮抗劑可用於全身性 =部投藥。在一些實施例中’藥物係用於腓骨内或皮下 技樂。在其他實施例中，藥物係用於局部向肺組織投盘， 例如藥物可用於吸入或鼻内投藥。 /、 2些實施例中，藥物或抬抗劑進一步包含腫瘤壞死因 X - 1(TNFR1 ’ p55)拮抗劑或用於與腫瘤壞死因子受體 UTNFR1，p55)拮抗劑一起投與。 本=之蛋白酶抗性多肽、免疫球蛋白單一可變區域及 ==療、預防及診斷例如人類之哺乳動物之疾病或 者* 用。肽及多肽尤其具有作為向諸如人類之患 =嫩可能會遇到蛋白酶之藥物之基質的效用 當：胃腸道投與(例如，經口、舌下、直腸投與)多 ”： 早—可變區域及拮抗劑時，在此狀況下， 胃腸H腸道、口腔、胃、小腸及大腸 或夕處受蛋白酶侵襲。因此，一個實施例提供一種 待Μ經口、舌下或直 或預防患者之疾病或：：\之G1道投與以治療及/ 單-可變區域或外劑二知抗性多肽、免疫球蛋白 人類患_與=:例而言’…患者(例如， '、 或預防IL_ 1介導之病症或疾病， J31419.d〇c -27· 200918088 諸如關節炎（例如，類風濕性關節炎）、ibd、牛皮癬或克 羅恩氏病（Cr〇hn，s disease)。在另—實例中，t向肺^織 ⑼如，肺或氣管）投與（例如，藉由吸入或鼻内方式）多 肽、可變區域或拮抗劑時其很可能會遇到蛋白酶。因此 一個實施例提供藉由吸入或鼻内向患者（例如人類）之肺植 織投與之方式向該患者投與蛋白酶抗性多&、免疫球蛋白
單一可變區域或枯抗劑以治療及/或預防患者之疾病或病 狀。該病狀可為哮喘(例如，過敏性哮喘）、COPD、：咸 或則咖侧7中所揭示之任何其他 細_038〇27係以引用之方式併人本Μ 抗劑、多肽及免疫球蛋白罝 發月之枯 夕肽及免紐蛋白可變區域可展現升 較两之㈣溫度（Tm)L供增強之穩定性。 十 =合亦可為或另外為抬抗劑、多肽及可變區域;㈣力 I域特t中之一或多個以及蛋白酶抗性使得括抗劑:可變 s及夕肽可承擔作為諸如人類之哺乳動物二 =如)對於⑴道或肺組織投藥而言很可能會遇到： :的情況而言。在另-實例中，當向患者之眼睛= 二：眼球内注射方式或以滴眼劑形式)多肽、可變:: 或拮抗劑時其很可能會遇到 鲛£域 供以眼睛方式向Φ者n j 。 4 ，一個實施例提
m 人類）投與蛋白酶抗性多肽A 單-可變區域或括抗劑以治療及/ 者免 狀(例如，眼睛之疾病或病狀)。投藥可心 齊j形式或藉由注射至眼睛 為从滴眼 投與。 例如玻璃體液中而局部向眼睛 131419.doc -28- 200918088 因此，在一態樣中，本發明提供—種用於經口傳遞之 IL-1R1拮抗齊卜在一態樣中’本發明提供用於向患者之⑺ 道傳遞之!L-1R1拮抗劑。在一態樣中，本發明提供一種 IL-iRl拮抗劑在製造用於經口傳遞之藥物中的用途。在一 態樣中，本發明提供—種R4士 禋1L 1R1拮抗劑在製造用於向患者 之胃GI道傳遞之藥物中的用途。在一實施例中，該可變區 域對膜蛋白酶及/或至少另一選自彈性蛋白酶、白血球酶 及胰酶之蛋白酶具有抗性。舉例而言，抗性係針對胰蛋白 酶及彈性蛋白酶；胰蛋白酿及 资白酶及白血球酶，·胰蛋白酶及胰 驗’胰蛋白酶、彈性蛋白酶及白血球酶；胰蛋白酶、彈性 蛋白酶及姨酶；胰蛋白酶、彈性蛋白酶、騰酶及白血球 酶，或胰蛋白酶、胰酶及白血球酶。 在-態樣中，本發明提供—種用於肺傳遞找·⑻括抗 劑。在一態樣中’本發明提供一種用於向患者之肺傳遞之 =^抗劑。在—態樣中，本發明提供—種π·枯抗 劑在製&用於肺傳遞之藥物中的用途。在—態樣中，本發 明提供一種IL-1R1拮抗劑在製造 ^ ^ 表化用於向患者之肺傳遞之藥 "的用途。在一實施例中，該可變區域對白血球酶具有 抗性。 田在一態樣中，本發明提供-種經口傳遞藥物或向患者之 月％道或患者之肺或肺組織傳遞藥物的方法，里中士亥方法 :含向該患者投與醫藥學有效量之本發明之w抗 劑。 在一態樣中，本發明提供一種用於治療及/或預防發炎 I31419.doc -29· 200918088 性病狀之本發明之IL_1R1拮抗劑。在一態樣中，本發明提 供-種IL-1R1括抗劑在製造用於治療及/或預防發炎性病 狀之藥物中的用途。在一實施例中，該病狀係選自由關節 炎:多發性硬化症、發炎性腸疾病及慢性阻塞性肺病組成 之群。舉例而f ’該關節炎為類風濕性關節炎或幼年型類 風濕性關節炎。舉例而纟’該發炎性腸疾病係選自由克羅 恩氏病及潰瘍性結腸炎組成之群。舉例而纟，該慢性阻塞 性肺病係選自由慢性支氣管炎、慢性阻塞性支氣管炎及肺 氣腫組成之群。舉例而言，該肺炎為細菌性肺炎。舉例而 言，該細菌性肺炎為葡萄球菌肺炎（Staphyi〇c〇ccai pneumonia) ° 在一態樣中，本發明提供一種用於治療及/或預防呼吸 道疾病之比-lRi拮抗劑。在一態樣中，本發明提供一種 IL-1R1拮杬劑在製造用於治療及/或預防呼吸道疾病之藥 物中的用途。舉例而言，該呼吸道疾病係選自由以下各病 組成之群：肺發炎、慢性阻塞性肺病、哮喘、肺炎、過敏 性肺炎、與嗜伊紅血球增多相關之肺浸潤、環境肺病、肺 炎、支氣管擴張、囊性纖維化、間質肺病、原發性肺動脈 高壓、肺血栓栓塞、胸膜病變、縱隔病變、隔膜病變、換 氣不足、換氣過度、睡眠呼吸暫停、急性呼吸窘迫症候 群、間皮瘤、肉瘤、移植排斥、移植物抗宿主疾病、肺 癌、過敏性鼻炎、過敏症、石棉沈著病、麴菌腫、麴菌 病、支氣管擴張、慢性支氣管炎、肺氣腫、嗜伊紅血球肺 炎、特發性肺纖維化、侵襲性肺炎球菌疾病、流感、非結 131419.doc -30. 200918088 核性分枝桿菌病、胸膜積液、塵肺病、肺孢子蟲病、肺 炎、肺放線菌病、肺泡蛋白沉著症、肺炭疽、肺水腫'肺 栓子、肺發炎、肺組織細胞增多病X、肺動脈高血壓、肺 土壤絲菌病（pulmonary n〇cardi〇sis)、肺結核、肺靜脈閉塞 疾病、類風濕性肺病、肉狀瘤病及韋格納肉牙腫病 (Wegener’s granulomatosis)。舉例而言，該疾病為慢性阻 塞性肺病（COPD)。舉例而言，該疾病為哮喘。 包含抑制IL-1R1之藥劑的本發明之拮抗劑（例如，其中 該藥劑係選自由以下各物組成之群：抗體片段（例如，Fab 片段、Fab，片段、Fv片段（例如，seFv、雙硫鍵鍵結之 Fv)、F(ab’）2片段、dAb)、配位體及dAb單體及多聚體（例 如，同7G或異7L二聚體））可使用任何合適方法局部向個體 之肺組織（例如，肺）投與。舉例而言，藥劑可藉由吸入或 鼻内投與方式局部向肺組織投與。對於吸入或鼻内投藥而 言，IL-1R1之拮抗劑可使用噴霧器、吸入器、霧化器、氣 霧化器（aer〇s〇lizer)、彌霧器（mister)、乾粉吸入器、定劑 量吸入器、計劑量喷霧器、計劑量彌霧器、計劑量霧化器 或其他合適吸入器或鼻内傳遞裝置投與。因此，在一實施 例中，本發明提供一種含有IL_1R1拮抗劑之肺傳遞裝置。 在一實施例中，該裝置為吸入器或鼻内傳遞裝置。 本發明亦係關於藥物傳遞裝置，其包含本發明之醫藥組 合物、拮抗劑、多肽或可變區域。舉例而[該藥物傳遞 裝置可為非經腸傳遞裝置、靜脈内傳遞裝置、肌肉内傳遞 裝置、腹膜内傳遞裝置、經皮傳遞裝置、肺傳遞裝 131419.doc -31 - 200918088 脈内傳遞裝置、鞘内傳遞裝置、關節内傳遞襄 =置、鼻内傳遞裝置、陰道傳遞裝置及直腸傳遞裝置。 在特定實施例中，藥物傳遞裝置係 、 遞裝置、穋囊、錠劑、嗔霧l 射'、經皮傳 片1 ^吸入器、霧化器、氣霧化 器（aer〇solizer)、彌霧器（mister) '、 W叹八器、定濟丨暑吸 入态、定劑量喷霧器、定劑量彌霧器 管組成之群。 疋幻里務化器及導
在一態樣中’本發明提供-種包含IL_1R1拮抗劑之口服 調配物。調配物可為錠劑、丸劑、膠囊、液體或糖梁。 在一實施例中’本發明提供一種用於向肺傳遞之肺調配 物’其中該調配物包含粒度範圍小於5微米、例如小於 4.5、4、3.5或3微米之本發明之拮抗劑、多肽或可變區域 (例如’當在例如pH 6.5至8.〇、例如pH 7至75、例如阳7 或pH 7.5之伯瑞坦_魯f遜（Britt〇n_R〇bin_)緩衝液中 時）。 在—實施例中，提供阳6.5至8.〇、例如7至75、例如 7例如7.5之本發明之調配物及組合物。 根據本發明之任何態樣之可變區域可具有至少5〇。匚或至 =55°C或至少6(rc或至少65^或至少7〇艺之丁爪。本發明之 才口抗齊j、用途、方法、裝置或調配物可包含該可變區域。 在本發明之一態樣中，本發明之多肽、可變區域、拮抗 劑、組合物或調配物在”。(：至⑽它下在伯瑞坦_魯賓遜緩衝 液中培養（多肽或可變區域之濃度為i mg/ml)14天後大體上 為穩疋的。在一實施例中’至少65、7〇、75、、Μ、 131419.doc -32- 200918088 86、 87、88、90、91 92、93、94、95、96、97、98、 99%之多肽 '拮抗劑或可 』域在37 C下進行該培養後仍 不I集。在一實施例中， 至^ 65、70、75、80、85、86、 87、 88、9〇、91、92、93、94、95、96、97、98、99%之 多狀或可變區域在听下進行該培養後仍為單體。在-實 施例中，至少5 ' 10、15、 上〕、20、25、30、35、40、45、 5〇、55、6〇、65、70、75、80、85、86、87、88、9〇、 91 ' 92、93、94、9S、〇( 96、97、98、99%之多肽、结抗劑 或可變區域在賊下進行該培養後仍不聚集。在-實施例 中，至少 5、1〇、15、20、25、3〇、35、4〇、45、5〇、 55 60、65、70、75、80、85、86、87、88、90、91、
92、93、94、95、96、97、98、99%之多肽或可變區域在 5〇 C下進行該培養後仍為單體。在一實施例中，在任何一 個該等培養後未見多肽、可變區域、拮抗劑之聚集。在一 實施例中，多肽或可變區域之？1在37。〇下在伯瑞坦-魯賓遜 緩衝液中在1 mg/ml之多肽或可變區域濃度下培養後仍未 變化或大體上未變化。 在本發明之一態樣中，本發明之多肽、可變區域、拮抗 劑、組合物或調配物在4°C下在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中在 pH 7至7.5(例如pH 7或pH 7.5)下培養（多肽或可變區域之濃 度為1 00 mg/ml)7天後大體上為穩定的。在一實施例中， 至少 95、95.5、96、96_5、97、97.5、98、98,5、99 或 99.5%之多肽、拮抗劑或可變區域在該培養後仍不聚集。 在一實施例中，至少 95、95.5、96、96.5、97、97.5、 131419.doc -33· 200918088 5 99或99.5〇/°之多肽或可變區域在該培養後仍為 單體。在—實施例中’在任何—個該等培養後未見多狀、 可變區域、拮抗劑之聚集。
<在本發明之一態樣中，本發明之多月太、可變區域、拮抗 ^組合物或調配物（例如）在室溫、20T：或37°C下（例如） ，噴射喷霧器(例如Pari LC +杯)中喷霧(多肽或可變區域之 濃度為40 mg/ml)1小時後大體上為穩定的。在一實施例 中至 >、65、70、75、80、85、86、87、88、90、91、 92、93、94、95、95.5、96、96.5、97、97.5、98、98.5、 99或99’5%之多肽、拮抗劑或可變區域在該噴霧後仍不聚 集。在一實施例中，至少65、7〇、75、8〇、85、86、87、 88、90、91、92、93、94、95、％ 5、％、％ 5、97、 97.5、98、98.5、99或99.5%之多肽或可變區域在該喷霧後 仍為單體。在一實施例中’在任一該噴霧後未見多肽、可 變區域、拮抗劑之聚集。 在一實施例中，本發明之可變區域在活體外檢定中以y μΜ之ND50抑制MRC-5細胞（ATCC寄存編號CCL_171)之 1誘導之介白素-8釋放。在一實施例中，另外或其他，可 變區域以$1 μΜ之IC50抑制il-1與IL-1R1之結合。在一實 施例中，另外或其他，可變區域在全血檢定中以U μΜ之 ND50抑制IL-1誘導之介白素·6釋放。本發明之拮抗劑、用 途、方法、裝置或調配物可包含該可變區域。 可用於篩選IL-1R1拮抗劑預防、抑止或治療肺發炎或呼 吸道疾病之效力的動物模型系統係可得到的。舉例而言， 131419.doc -34· 200918088 呼吸道疾病之合適動物模型包括慢性阻塞性呼吸道疾病模 t (參見 ’ Groneberg，DA等人，Respiratory Research 5:18 (2004))，及哮喘模型（參見，c〇ffman等人，jp 201(12):1875-1879 (2001))。較佳地，IL_1R1拮抗劑在慢 性阻塞性呼吸道疾病之小鼠煙草煙霧誘導模型（例如，本 文中所揭示之亞慢性模型）或哮喘或慢性阻塞性呼吸道疾 病之合適之靈長類動物模型中為有效的。更佳地，IL_1R1 拮抗劑在慢性阻塞性呼吸道疾病之小鼠煙草煙霧誘導模型 (例如，本文中所揭示之亞慢性模型）（亦參見，WHght及 Churg，C/ζαί，122:301-306 (2002))中為有效的。舉例而 吕’與合適對照相比’在模型中投與有效量之配位體可減 少、延遲或預防C0PD之症狀之發作。關於用於評定本發 明之拮抗劑及可變區域之檢定及模型的其他詳情，參見 W02006059108，其揭示内容係整體以引用之方式併入本 文中。 IL -1 R1拮抗劑可用作單獨投與之組合物或與其他藥劑組 合使用。該等藥劑可包括多種藥物，諸如磷酸二酯酶抑制 劑（例如，磷酸二酯酶4之抑制劑）；支氣管擴張藥（例如， β2-激動劑、抗膽鹼能藥、茶鹼）；短效β_激動劑（例如，舒 喘寧（albuterol)、沙丁胺醇（salbutam〇i)、班布特羅 (bambuterol)、非諾特羅（fenoter〇i)、新異丙腎上腺素 (isoetherine)、異丙基腎上腺（iSOpr〇teren〇i)、左旋沙丁胺 醇（levalbuterol)、羥異丙腎上腺素（metaproteren〇i)、吼布 特羅（pirbuterol)、特布他林（terbutaline)及托倫萊特 131419.doc •35· 200918088 (tornlate));長效β-激動劑（例如，福莫特羅（f〇rmoter〇i)及 沙美特羅（salmeterol));短效抗膽鹼能藥（例如，異丙托溴 銨（ipratropium bromide)及氧托溴銨（〇xitr〇pium bromide));長效抗膽鹼能藥（例如，噻托銨（ti〇tr〇pium)); 茶鹼（例如，短效調配物、長效調配物）；吸入類固醇（例 如’倍氣米松（beclomethasone)、倍氯米松 (beclometasone)、布地縮松（budes〇nide)、氟尼縮松 (flunisohde)、丙酸氟替卡松（fiuticas〇ne pr〇pi〇nate)及曲 女西龍（triamcinolone)) ; 口服類固醇（例如，甲潑尼龍 (methylprednisolone)、潑尼龍（prednis〇1〇ne)、氫化潑尼松 (prednisolon)及潑尼松（prednisone));與抗膽鹼能藥組合之 短效β-激動劑（例如，舒喘甯/沙丁胺醇/異丙托銨 (ipratopium)及非諾特羅/異丙托銨）；與吸入類固醇組合之 長效β-激動劑（例如，沙美特羅/氟替卡松及福莫特羅/布地 縮松）；及黏液溶解劑（例如，厄多司坦（erd〇steine)、乙醯 半胱胺酸（acetylcysteine)、布漢克辛（br〇mheksin)、羧甲半 胱氨酸（Carb〇Cysteine)、愈創甘油醚（guiafenesin)及碘化甘 油）；環孢素（cyicosporine);抗生素；抗病毒齊^ ;甲胺蝶 呤（methotrexate);阿黴素（adriamycin);順始⑷响如㈣ 及免疫毒素。 含有IL-1R1拮抗劑或其混合物之組合物可出
一些其他可量測參數之量係定義為 131419.doc 可出於預防性及/ ，足以實現 、抑止、調節、殺死 广'治療有效劑量"或 -36- 200918088 醫藥學有效劑量"。舉例而言，對於治療肺發炎及/或呼吸 道疾病而言，如合適問卷（諸如聖喬治呼吸問卷（st. George's Respirat〇ry Questi〇nnaire))(例如，4點改良評分） 中所定量之抑制痰之量、抑制支氣管活檢發炎之量、抑制 呼吸困難之量、增加一秒内用力呼氣量（f〇rced expirat〇ry volume in one second’ FEV⑴）之量、增加健康狀態改良 之量。 達成該等效應所需之量應視疾病之嚴重程度及患者自身 免疫系統之一般狀態而定，但通常在每公斤體重〇 〇〇5 mg 至10.0 mg IL-1R1拮抗劑範圍内，其中更通常使用0.05至 2.0毫克/公斤/劑量之劑量。 對於預防性應用而言，亦可以類似或稍低劑量投與含有 IL-1R1拮抗劑或其混合物之組合物以預防、抑制或延遲疾 病發作（例如，維持症狀緩解或靜止期，或阻止急性期）。 熟練的臨床醫師應能夠確定治療、抑止或預防疾病之適當 給藥間隔。當投與IL_1R1拮抗劑以治療、抑止或預防肺發 炎或呼吸道疾病時，可以（例如至約8〇mg/kg、 約 100 Kg/kg至約 80 mg/kg、約 1 mg/kg至約 8〇 mg/kg、約 1 mg/kg至約 70 mg/kg、約 1 mg/kg至約 60 mg/kg、約 i mg/kg 至約50 mg/kg、約1 mg/kg至約40 mg/kg、約丨mg/kg至約 30 mg/kg、約 1 mg/kg至約 20 mg/kg、約 1 mg/kg至約 1〇 mg/kg、約 1〇 pg/kg 至約 10 mg/kg、約 1〇 pg/kg 至約 5 mg/kg、約 1〇 gg/kg 至約 2.5 mg/kg、約 1 mg/kg、約 2 mg/kg、約 3 mg/kg、約 4 mg/kg、約 5 mg/kg、約 6 mg/kg、 131419.doc -37- 200918088 約 7 mg/kg、約 8 mg/kg、約 9 mg/kg或約 i〇 mg/kgi 劑量投 與每天至多4次、每週兩次、每週一次、每兩週一次、每 月一次或每兩月一次。在特定實施例中，以約1〇 至 約 10 mg/kg(例如，約 1〇 M/kg、約 1〇〇 gg/kg、約 i mg/kg、約 2 mg/kg、約 3 mg/kg、約 4 mg/kg、 約 6 mg/kg、約 7 mg/kg、 約 5 mg/kg、 mg/kg、約 9 mg/kg 或約 1〇 mg/kg)之劑量每天-次、每兩天—次、每週一次、每兩週
—次或每月一次投與IL_1R1拮抗劑來治療、抑止或預防肺 發炎或呼吸道疾病。亦可以約1〇 mg、約9 mg、約8 mg、 約 7mg、約6mg、約5mg、約4mg、約3mg、約2吨或約 mg之每曰劑量或單位劑量投與IL_1Rl拮抗劑來治療、抑 止或預防肺發炎或呼吸道疾病。 右相對於治療之前所存在之一或多個症狀或相對於未經 s亥組合物或其他合適對照物治療之個體（人類或模型動物） 中之該或該等症狀，減少該或該等症狀（例如，減少至少 10%或臨床評定表上之至少一個點），則認為使用本文中所 述之IL-1R1拮抗劑執行之治療或療法"有效"，例如”醫藥學 有效’’。雖然症狀將視靶向之疾病或病症而變化，但其可 由一般熟練的臨床醫師或技師加以量測。該等症狀可（例 如）藉由監測疾病或病症之一或多個身體指標（例如，肺组 織中之細胞浸潤、痰之產生、痰中之細胞浸潤、呼吸困 難、鍛煉耐受性、肺活量（例如，用力肺活量（FVC)、1秒 内用力呼氣量（FEV(l)、FEV⑴/FVC)、疾病惡化速率或嚴 重程度或由公認之臨床評定表（例如，聖喬治呼吸問卷）來 131419.doc -38- 200918088 量測。合適的臨床評定表包括（例如）根據FEV(l)之氣流阻 塞 Ml I 鞋良（Clinical Guideline 12, Chronic Obstructive Respiratory disease, Management of Chronic Obstructive Pulmonary Disease in Adults in Primary and Secondary Care, National Institute for Clinical Excellence, London (2004))、峰值呼氣流量（Peak Expiratory Flow， PEF)(British Guideline on the Management of Asthma, British Thoracic Society, Scottish Intercollegiate Guidelines Network，修訂版（2004》、根據美國胸腔學會 (American Thoracic Society，ATS)標準之 COPD 階段(04 所. J. Cr". Care Mei, 152:S77-S120 (1995)j、根據 ATS標準之哮喘損傷類別.及.及£>&.，i47:i〇56_ 1061 (1993)>或如該領域已知之其他公認之臨床評定表。 疾病或病症症狀之至少1 〇%或給定臨床表上之一或多個點 之維持（例如，一天或一天以上，較佳更長）減少指示”有效 "治療。類似地，若相對於未經組合物治療之類似個體（人 類或動物模型）中之一或多個症狀，延遲、減少或消除該 或該等症狀之發作或嚴重程度，則使用如本文中所述之組 合物所執行之預防”有效，，。 含有本發明之IL-1R1拮抗劑之組合物可在預防性及治療 性情形下使用以幫助改變、滅活、殺死或移除哺乳動物中 所選擇之靶細胞群體。舉例而言，該等組合物可用於減小 肺中之發炎性細胞之含量及/或抑制肺之細胞浸潤。 在一態樣中’本發明提供一種經分離或重組核酸，其編 131419.doc -39- 200918088
碼包含本發明之任何態樣之免疫球蛋白單—可變區域之多 肽或編碼本發明之任何態樣之多R、拮抗劑或可變區域。 在-態樣中，本發明提供一種包含該核酸之載體。在一態 樣中’本發明提供-種包含核酸或載體之宿主細胞。在一 態樣中，本發明提供—種產生包含免疫球蛋白單一可變區 域之夕肽之方法’該方法包含將宿主細胞維持在適於該核 酸或該載體表現之條件下，藉此產生包含免疫球蛋白單一 可變區域之多r。該方法可進一步包含分離多肽、可變區 ^或拮抗劑及視情況產生比經分離多&、可變區域或括抗 劑具有改良之親和力及/或ND5G的變異體（例如，突變變異 體）°此項技術已知改良免疫球蛋白單—可變區域之結合 親和力之技術，例如親和力成熟技術。 在一態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含本發 明之任何態樣之免疫球蛋白單—可變區域、多肽或抬抗劑 及醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。 在一實施例中，本發明之任何態樣之免疫球蛋白單一可 變區域或拮抗劑包含抗體恆定區域’例如抗體Fc，視情況 其中Fc之N-末端連接於（視情況直接連接於）可變區域之c_ 末端。 本發明之多肽或可變區域可為經分離的及/或重組的。 本文中描述一種選擇蛋白酶抗性肽或多肽之方法。該方 法包含提供肽或多肽之譜系，在適於蛋白酶活性之條件下 使該譜系與蛋白酶組合，及回收具有想要生物活性(例 如’特異性結合IL_1R1)之肽或多肽，藉此選擇蛋白酶抗 J314l9.doc •40- 200918088 性肽或多肽。 通常將譜系及蛋白输&甚s , 酶培養至少約30分鐘之時間。在方太 中可使用任何想要之蛋白酶， 在方法 絲胺酸蛋㈣、半胱胺酸蛋 蛋白轉. 蛋白酶、基質金屬蛋白酿Γ 酸蛋白酶 '硫醇 …胰蛋=Γ 酶(例如竣肽酶Α、·酶 Β)胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶 疋a 贫曰姆木瓜酶、彈性 蛋白鉍、白血球酶、胰醢 汗丨土 (例如組織蛋白酶G)、蛋白晦 、蛋白酶 蛋白酶卜蛋白酶2、蛋 白叫、嗜熱菌蛋白酶、凝乳酶、腸㈣
如卡斯蛋白酶1、+浙I 。 ^ θ ^ {iH 卡斯蛋白…、卡斯蛋⑽4、卡斯蛋白 酶、卡斯蛋白酶9、卡斯蛋白酶12、卡斯蛋白酶⑼、每 激活蛋白酶、無花果蛋白酶、梭菌蛋白酶、摘猴桃蛋白 酶、鳳梨酶及分離酶。在特定實施例中，“酶為胰蛋白 酶彈性蛋白酶或白血球酶。蛋白酶亦可由生物提取物、 生物組織勻漿或生物製劑提供。必要時，該方法進一步包
含在培養完成後向譜系與蛋白酶之組合中添加蛋白酶抑Z 劑。 在一些實施例中，基於結合活性回收具有想要之生物活 性之肽或多肽。舉例而言，可基於結合諸如蛋白質A、蛋 白質G或蛋白質L之一般配位體（generic Ugand)回收肽或多 肽。結合活性亦可為與靶配位體之特異性結合。例示性靶 配位體包括ApoE、Apo-SAA、BDNF '心營養素」、 CEA、CD40、CD40 配位體、CD56、CD38、CD138、 EGF、EGF受體、ENA-78、嗜酸性粒細胞趨化因子、嗜酸 131419.doc 41 200918088 性粒細胞趨化因子-2、次級淋巴組織趨化因子-2、FAPa、 FGF-酸性、FGF-鹼性、纖維母細胞生長因子-10、FLT3配 位體、弗拉塔凱（CX3C)、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-βΐ、人類血清白蛋白、胰島素、IFN-γ、IGF-I、IGF-II、 IL-la、IL-Ιβ、IL-1受體、IL-1 受體 1S、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL.7、IL-8(72a.a.)、IL.8(77a.a.)、IL-9 、 IL-10 、 IL-11 、 IL-12 、 IL-13 、 IL-15 、 IL-16 、 IL-17 、 IL-18(IGIF)、抑制素α、抑制素β、IP-10、角化細胞生長 因子-2(KGF-2)、KGF、痩體素、LIF、淋巴細胞趨化因 子、穆勒氏抑制物質、單核細胞集落抑制因子、單核細胞 引誘蛋白、M-CSF、MDC(67 a.a.)、MDC(69 a.a.)、MCP-1 (MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC(67 a.a)、 MDC(69 a.a.)、MIG、ΜΙΡ-Ια、ΜΙΡ-1β、ΜΙΡ-3α、MIP-3β、MIP-4、骨髓祖細胞抑制劑因子- l(MPIF-l)、NAP-2、 神經營養因子、神經生長因子、β-NGF、NT-3、NT-4、制 瘤素 Μ、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、 RANTES、SDFla、SDFip、SCF、SCGF、幹細胞因子 (SCF)、TARC、TGF-a、TGF-β、TGF-P2、TGF-P3、腫瘤 壞死因子（TNF)、TNF-a、TNF-β、TNF 受體 I、TNF 受體 II、TNIL-1、TPO、VEGF、VEGF A、VEGF B、VEGF C、VEGF D、VEGF 受體 1、VEGF 受體 2、VEGF 受體 3、 GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β、GRO-γ、HCC1、1-309、 HER 1、HER 2、HER 3、HER 4、血清白蛋白、vWF、澱 粉樣蛋白（例如，澱粉樣a)、MMP12、PDK1、IgE、IL- 131419.doc •42- 200918088 13Ral、IL-13Ra2、IL-15、IL-15R、IL-16、IL-17R、IL-17、IL-18、IL-18R、IL-23IL-23R、IL-25、CD2、CD4、 CDlla、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、 CD40L、CD56、CD138、ALK5、EGFR、FcERl、TGFb、 CCL2、CCL18、CEA、CR8、CTGF、CXCL12 (SDF-1)、 凝乳酶、FGF、弗林蛋白酶、内皮素-1、嗜酸性粒細胞趨 化因子（例如，嗜酸性粒細胞趨化因子、嗜酸性粒細胞趨 化因子-2、嗜酸性粒細胞趨化因子-3)、GM-CSF、ICAM- ( 1、ICOS、IgE、IFNa、1-309、整合素、L-選擇素、MIF、 MIP4、MDC、MCP-1、MMP、嗜中性彈性蛋白酶、骨橋 蛋白、OX-40、PARC、PD-1、RANTES、SCF、SDF-1、 siglec8、TARC、TGFb、凝血酶、Tim-1、TNF、 TRANCE、類胰蛋白酶、VEGF、VLA-4、VCAM、α4β7、 CCR2 、 CCR3 、 CCR4 、 CCR5 、 CCR7 、 CCR8 、 ανβ6 、 ανβ8、cMET、CD8、vWF、澱粉樣蛋白（例如，殿粉樣 a)、MMP12、PDK1 及 IgE。 I. % 在特定實施例中，藉由淘選回收肽或多肽。 在一些實施例中，譜系包含呈現系統。舉例而言，呈現 系統可為噬菌體呈現、核糖體呈現、乳液隔室化及呈現、 酵母呈現、嘌呤黴素呈現、細菌呈現、質體上之呈現或共 價呈現。例示性呈現系統使核酸之編碼功能與由核酸所編 碼之肽或多肽之功能特徵相關聯。在特定實施例中，呈現 系統包含可複製之基因組。 在一些實施例中，呈現系統包含噬菌體呈現。舉例而 131419.doc -43 - 200918088 言’嗔菌體可為fd、M13、λ、MS2或T7。在特定實施例 中，噬菌體呈現系統為多價系統。在一些實施例中;肽或 多肽呈現為pill融合蛋白。 在其他實施例中，方法進一步包含擴增編碼具有想要之 生物活性之肽或多肽的核酸。在特定實施例中，藉由噬菌 體擴增、細胞生長或聚合酶鏈反應擴增核酸。 f 1 在-些實施例中，譜系為免疫球蛋白單一可變區域譜 $。在特定實施例中，免疫球蛋白單—可變區域為重鍵可 變區域。在更特定實施例中，重鏈可變區域為人類重鍵可 變區域。在其他實施例中，免疫球蛋白單一可變區域為輕 鏈可變區域。在特定實施例中，輕鍵可U 可變區域。 次為人類輕鏈 樣中，提供-種自肽或多肽譜系選擇以高親和 力一乾配位體(例如iL_1R1)之肽或多肽之方 包含提供肽或多肽★並系，/、由狄疋人 以方法 Γ 蛋㈣料之條件下使譜 ' 、·且σ，及回收結合靶配位體之肽或多肽。 通常將譜系及蛋白酶培養至少⑽分鐘 可:用任何想要之蛋白酶，諸如一或多種以下1蛋： (例如羧肽酶A、羧肽酶 蛋白酶、“球白酶、胃蛋白酶、木瓜酶、彈性 (例如組織蛋白酶G)蛋血酶、纖溶酶、組織蛋白酶 / 蛋白酶(例如蛋白酶卜蛋白酶2、蛋 白酶3)、嗜熱®蛋白酶η ^ 贫白酶2蛋 蛋白酶4乳酶、腸肽酶、卡斯蛋白酶（例 131419.doc •44- 200918088 酶:斯蛋白鉍1、卡斯蛋白酶2、卡斯蛋白酶4、卡斯蛋白 激活蛋Π白酶I卡斯蛋白酶12、卡斯蛋白酶13)、舞 ::白花果蛋白酶、梭菌蛋白酶、獼猴桃蛋白 _梨酶及分離酶。在特定實施例H白酶為騰蛋白 4物Γ*1蛋白酶或白血球酶。蛋白酶亦可由生物提取物、 組織勻漿或生物製劑提供。必要時，該方法進一步包 ^在培養完成後向譜系、與蛋白酶之組合中添加蛋白酶抑制
可基於結合任何想要之靶配位體(諸如本文中所揭示之 2配位體（例如’IL.1R1))回收肽或多肽。在特定實施例 中，藉由淘選回收肽或多肽。 在-些實施例中，譜系包含呈現系統。舉例而言，呈現 系統可為噬菌體呈現、核糖體呈現、乳液隔室化及呈現、 酵母呈現…票呤黴素呈現、細菌呈現、質體上之呈現或妓 價呈現。例示性呈現系統使核酸之編碼功能與由核酸所編 碼之肽或多肽之功能特徵相關聯。在特定實施例中，呈現 系統包含可複製之基因組。 在些實施例中，呈現系統包含嗟菌體呈現。舉例而 言，嗟菌體可為1觀小购或丁7。在特定實施例 中，噬菌體呈現系統為多價系統。在一些實施例令，肽或 多肽呈現為pm融合蛋白。 ’ 在其他實施例中，方法進一步包含擴增編碼具有想要之 生物活性之肽或多肽的核酸。在特定實施例中，藉由噬菌 體擴增、細胞生長或聚合酶鏈反應擴增核酸。 131419.doc -45- 200918088 /在一些實施例中，譜系為免疫球蛋白單—可變區域言普 $。在特定實施例中，免疫球蛋白單—可變區域為重^ =區域。在更特^實施例中，重鏈可變區域為人類重鍵可 變區域。在其他實施例中，免疫球蛋白單—可變區域為輕 鏈：變區域。在特定實施例中’輕鏈可變區域為人類輕鏈 可變區域。 態樣中，本文中描述_種產生蛋白酶抗性狀或多 二系之方法。該方法包含提供肽或多肽譜系，在適於蛋 白扭活性之條件下使肽或？肽譜系與蛋白酶組合，及 複:：：有想要之生物活性之肽或多a，藉此產生蛋白酶 抗性肽或多肽譜系。 在-些實施例中，通常將譜系及蛋白酶培養至少約^八 鐘之時間。舉例而t，方法中所使用之蛋白酶可為_或^ 種以下蛋白酶：絲胺酸蛋白酶、半胱胺酸蛋白肖、天 酶、硫醇蛋白酶、基質金屬蛋白酶、羧肽酶(例如 敌肽每A、羧肽酶Β)、騰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、 木瓜酶、彈性蛋白酶、白血球酶、胰酶、凝血酶、纖 '、、植織蛋白酶（例如組織蛋白酶G)、蛋白酶（例如，番 白酶卜蛋白酶2、蛋白酶3)、嗜熱菌蛋白酶 卡斯蛋白酶（例如卡斯蛋白酶^、卡斯蛋白酶2、: 12、^=、卡斯蛋白酶5、卡斯蛋白酶9、卡斯蛋白酶 卡斯蛋白酶U)、鈣蛋白酶、無花果蛋白 :酶蛋蛋白酶、鳳梨酶及分離酶。在特定二施例 蛋白％為騰蛋白酶、彈性蛋㈣或自血球酶。蛋白酶 131419.doc -46- 200918088 亦可由生物提取物、生物組織勻漿或生物製劑提供。必要 > 古少 、隹 . ° 退—步包含在培養完成後向譜系與蛋白酶之組 合中添加蛋白酶抑制劑。 二實把例中，基於結合活性回收複數種具有想要之 生物/舌〖生之肽或多肽。舉例而言，可基於結合諸如蛋白質 Α、蛋白質G或蛋白fL之一般配位體回收複數種肽或多 狀。結合活性亦可為與乾配位體、諸如本文中所述之乾配 位體之特異性結合。在特定實施例中，藉由淘選回收複數 種具有想要之生物活性之肽或多肽。 在—些實施例中，講系包含呈現系統。舉例而言，呈現 糸統^為嗟菌體呈現、核糖體呈現、乳液隔室化及呈現、 酵母王現、嗓吟黴素呈現、細菌呈現、質體上之呈現或丘 價呈現。在特定實施例中，呈現系統使核酸之編碼功能^ 由^酸所編碼之肽或多肽之功能特徵相關聯。在特定實施 例中，呈現系統包含可複製之基因組。 +在:些實施例中，呈現系統包含_體呈現。舉例而 。巫菌體可為fd、M13、λ、咖或仞。在 中，喔菌體呈現系統為多價系統。在 ^ Β, σ ^例中’肽或 多肽呈現為pill融合蛋白。 在其他實施例中，方法進一步包含 想要之生物活性之肽或多肽的核酸。在具= 由噬菌體擴增、細胞生長或聚人酶庵、歹’中，藉 仅飞象α酶鏈反應擴增核酸。 * 實施例中，譜系為免疫球蛋白單-可變… 系。在特定實施例中，免疫球蛋白單 域譜 區域為重鏈可 131419.doc -47- 200918088 $區域。在更特定實施例中’重鏈可變區域為人類重鏈可 =二其他實施例中，免疫球蛋白單-可變區域為輕 可變區^。在特定實施例中’輕鍵可變區域為人類輕鏈 在另-態樣中，本文中描述-種自譜系 ::雜(例如之免疫球蛋白單-可變區域；:
蛋白細抗性客B4* u V 包含多肽之: 例中，該方法包含提供 夕肽之糸的噬菌體呈現系統， 蛋白單 — ^m^ Z寺夕狀包含免疫球 了 k區域，在適於蛋白酶活 呈現李铋盥、$ ώ 注之條件下使噬菌體 系洗與選自由彈性蛋白酶、白血球 之群之蛋白酶組合，及回收呈現包含以=蛋白扭組成 球蛋白單—可、，、。口靶配位體之免疫 文曰早V變區域之多肽的噬菌體。 在-些實施例中’使用100㈣眺之 37°C下將所組合之# 蛋白鉍，且在約 在此音菌體呈現系統及蛋白酶培養隔夜。 在一些實施例中，藉由與㈣ 養田仗 合該起之免疫球蛋白單―可變區收呈現包含結 他實施例中，次之夕肽的噬菌體。在其 r藉由淘選回收呈現包含处人s 球蛋白單-可變區域之多肽的”體配位體之免疫 亦描述_種由本 蛋白酶抗性肽或多狀"’去可選擇或選擇之經分離 文中所述之方法可選禮在一特定實施例中，提供-種由本 蛋白酶、彈性蛋白酶擇：選擇之經分離蛋白酶(例如，騰 變區域（例如，人 血球酶）抗性免疫球蛋白單一可 變區域）。 重鍵可變區域、人類抗體輕鏈可 13I419.doc •48· 200918088 '步“述一種編碼由本文中所述之# 或選擇之蛋白醢浐队斗、* / κ方法可選擇 …㈣酶抗性肽或多肽(例如，胰蛋 白酶或白血球酶抗性免疫球蛋白單一’蛋 或重組核酸，及係 -域)的經分離 载體)及宿主細胞。…〜載軸如，表現 本文中進-步描述一種製造由本文 或選擇之蛋白酶^斤述之方法可選擇 轉幻生肽或多肽(例如，胰蛋 白酶或白血球酶抗性免-彈性蛋 (' ^ ^ A 早可變區域）之方半， 、該方法包含將含有編碼蛋白酶抗性肽法 宿主細胞維持在適於表現之條㈣ ^且核酸之 肽或多肽。 精此製w蛋白酶抗性 擇步描述一種由本文中所述之方法可選㈣選 擇之蛋白_肽或多肽(例如，胰蛋白酶、彈性：= 或白血球酶抗性免疫球蛋白單— 中(例如’用於治療或診斷)。本文：二)，其用於醫學 文中所述之方法可選擇或選擇之蛋白酶—/描述一種由本 如，胰蛋白酶、彈性蛋白酶或白血玫白⑽性狀或多肽⑼ 一 表酶抗性免疫球蛋白單 了 d域)用於製造供治療 中谁一牛扣、+ 仏、 、采物的用途。本文 V田述一種治療疾病之方法， 之個胃f H < θ °亥方法包含向有需要 之個私與有本文巾所述之料 蛋白酶抗性肽或多肽（例如，胰蛋 。^ 血球酶抗性免疫球蛋白單、彈性蛋白酶或白 心在中”:描述一種確定樣品中是否存在1L-1R1或樣 1R1之診斷套組，該套組包含本發明之多 I3I4I9.doc -49- 200918088 肽、dAb或括抗劑及使用說明書（例如，確定樣品中uRi 之存在及/或數量）。在—些實施例中，套組進—步包含一 或夕種辅助e式劑’諸如合適緩衝劑或合適偵測試劑（例 如，結合本發明之多肽或dAb或與其締合或接合之部分的 '·’·！可 <貞性標§己之抗體或其抗原結合片段）。 本發明亦係關於一種包含固體表面的裝置，可在該固體 表面上固定本發明之多肽或dAb以使所固定之多肽或从匕 結合IL-UU。可使用上面可固定抗體或其抗原結合片段之 任何合適固體表面，例如，玻璃、塑膠、碳水化合物（例 如，瓊脂糖珠粒）。必要時，支撐物可含有或經改質以含 有有助於固定之想要官能基。裝置及/或支撐物可具有任 何合適形狀，例如片、桿、帶、板、載玻片、珠粒、小 球、盤狀物、凝膠、試管、球體、晶片、板或器皿及其類 似物。在一些實施例中，該裝置為量桿。 【實施方式】
在本說明書内，已參考實施例以使得能夠編寫清楚且簡 明之s兒明書之方式描述本發明。希望且應瞭解，在不脫離 本發明之情況下’實施例可不同地組合或分離。 除非另有規定，否則本文中所使用之所有技術及科學術 語具有一般熟習此項技術（例如，細胞培養、分子遺傳 學、核酸化學、雜交技術及生物化學）者通常所理解之相 同之含義。關於分子、遺傳及生化法（通常參見， Sambrook 等人，Molecular Cloning: A Laboratory
Manual，第 2版（1989) Cold Spring Harbor Laboratory 131419.doc -50- 200918088
Press，Cold Spring Harbor，Ν.γ.及 Ausubel 等人，Sh〇n Protocols in Molecular Biology (1999)第 4版，J〇hn wuey & Sons, Inc.，其係以引用之方式併入本文中）及化學方 法，使用標準技術。 如本文中所使用，”介白素_丨受體i型"（IL_lRi ; 12la)係指天然存在或内源性哺乳動物il_iri蛋白質且係 指具有與天然存在或内源性相應哺乳動物IL_1R1蛋白質相 同之胺基酸序列之蛋白質（例如，重組蛋白質、合成蛋白 質（亦即，使用合成有機化學方法產生））。因此，如本文中 所定義，該術語包括成熟蛋白質、多形變異體或對偶基因 變異體及IL-1R1之其他同功異型物（例如，藉由替代性拼 接或其他細胞過私產生）及上述者之經修飾或未經修飾形 式（例如經脂質化、、經糖基化形式）。天然存纟或内源性Κ-ΐ R1 l 括野生 型蛋白 質’諸 如成熟 iL_iRi 、多 形或 對偶基 因變異體及哺乳動物(例如，人類、非人類靈長類動物)中 天然存在之其他同功異型物。舉例而言，可自天然產生 IL-1R!之來源回收或分離該等蛋白質。該等具有與天然存 在或内源性相應IL_1R1相同之胺基酸序列之蛋白質及比_ 1R1蛋白質以相應哺乳動物之名稱提及。舉例而言，當相 應哺乳動物為人類時，蛋白質命名為人類IL-1R1。 如本文中所使用，”介白素-1受體1型（IL-1R1)拮抗劑，，係 才曰可向個體投與藉由在個體中與IL-1R1結合且抑制IL_1R1 之功能（例如’抑制IL-1«及/或IL-Ιβ與IL-1R1之結合，抑 制 及7或1L-W與1L_1R1結合後IL-1R1之信號轉導）產 131419.doc •51 - 200918088 生有利治療或診斷效應的任何化合物（例如，多狀） 如本文中所使用，"肽”係指經由肽鍵結合在一起之約2 個至約50個胺基酸。 如本文中所使用’"多肽,,係指經由肽鍵結合在一起之至 =約50個胺基酸。多肽通常包含三級結構且摺疊為功能區 域。
σ文中所使用，”抗蛋白酶降解，，肽或多肽（例如，區域 抗體當在適於蛋白酶活性之條件下與蛋白酶一起培 養時大體上不會被蛋白酶降解。當在適於蛋白酶活性之溫 度，例如在37 C或5(TC下與蛋白酶一起培養約！小時後不 超過約25%、不超過約鳩、不超過約15%、不超過約 14%、不超過約13%、不超過約12%、不超過約"％、不超 過’勺1 0 /〇不超過約9〇/〇、不超過約8%、不超過約7%、不 超過力6 /〇不超過約5°/。、不超過約4%、不超過約3%、不 超過約2%、不超過約1%或大體上無蛋白質被蛋白酶降解 寺多肽（例如，dAb)大體上不降解。可使用任何合適方 法砰定蛋白質降解，例如由SDS_pAGE或由如本文中所述 之功能檢定（例如，配位體結合）。 如本文中所使用，，，呈現系統"係指其中多肽或肽之集合 易於基於想要之特徵（諸如物理、化學或功能特徵）加以選 擇之系統。呈現系統可為多肽或肽之合適譜系（例如，在 /谷液中，固疋於合適支撐物上）。呈現系統亦可為採用細 胞表現系統（例如，於（例如）經轉型、感染、轉染或轉導細 胞中表現核酸庫及於細胞表面上呈現經編碼多肽）或非細 131419.doc -52· 200918088 胞表現系統（例如，乳液隔室化及呈現）之系統。例示性呈 現系統使核酸之編碼功能與由核酸所編碼之多肽或肽之物 理、化學及/或功能特徵相關聯。當採用該呈現系統時， 可選擇具有想要之物理、化學及/或功能特徵之多肽或 肽，且可容易地分離或回收編碼所選擇之多肽或肽之核 酸。此項技術已知許多使核酸之編碼功能與多肽或肽之物 理、化學及/或功能特徵相關聯之呈現系統，例如噬菌體 呈現（bacteriophage display/phage display)(例如，噬質體呈 現）、核糖體呈現、乳液隔室化及呈現、酵母呈現、嘌呤 黴素呈現、細菌呈現、質體上之呈現、共價呈現及其類似 者。（例如參見EP 〇436597(Dyax)、美國專利第6，172，197 號（McCafferty等人）、美國專利第M89，103號（Griffiths等 人）。） 如本文中所使用，”譜系"係指以胺基酸序列多樣性為特 徵之多肽或肽之集合。譜系之個體成員可具有常見特徵， 諸如常見結構特點（例如，常見核心結構）及/或常見功能特 徵（例如，結合常見配位體（例如，—般配位體或靶配位 體’ IL-1R1)之能力）。 如本文中所使用，"功能"描述具有生物活性、諸如特異 性結合活性之多肽或肽。舉例而言，術語"功能多肽||包括 經由抗原結合位點結合靶抗原之抗體或其抗原結合片段。 如本文中所使用，”一般配位體"係指結合給定譜系之相 當一部分（例如，大體上所有）功能成員之配位體。一般配 位體（例如，常見一般配位體）可結合給定譜系之許多成 131419.doc -53· 200918088 員’即使該等成員可能料杳g * 月b對㊉見乾配位體不具有結合特異 性。多肽上存在功能一般配位體結合位點（如結合一般配 4體之月b力所才日不）通常指示多i經適當摺疊且具有功 能。-般配位體之合適實例包括超抗原、結合表現於譜系 之相當-部分功能成員上之抗原決定基之抗體及其類似 者。 。”超抗原”為技術術語，其係指與免疫球蛋白超家族之成 貝在不同於該等蛋白質之靶配位體結合位點之位點處相互 作用之-般配位冑。葡肖球菌腸毒素為與τ'細豸受體相互 作用之超抗原實例。結合抗體之超抗原包括結合lgG恆定 區之蛋白質 G(Bj0rck 及 Kr〇nvall，j 加顧”〇/ , 133:969 (1984))，結合igG恆定區及Vh區域之蛋白質A(F〇rsgren及 Sjoquist，J. /wmw„o/.，97:822 〇966));及結合 & 區域之蛋 白質 L(Bjorck，J_ 140:1 194 (1988)) 〇 如本文中所使用，”靶配位體"係指多肽或肽特異性或選 擇性結合之配位體。舉例而言，當多肽為抗體或其抗原結 合片段時’乾配位體可為任何想要之抗原或抗原決定基。 與輕抗原之結合係視具有功能性之多肽或肽而定。 如本文中所使用，抗體係指源自任何天然產生抗體之物 種或由DNA重組技術產生的自血清、b細胞、融合瘤、轉 染瘤、酵母或細菌分離的IgG、IgM、IgA、IgD或IgE或片 段（諸如Fab、F(ab’）2、Fv、雙硫鍵鍵結之Fv、scFv、封閉 構形多特異性抗體、雙硫鍵鍵結之scFv、雙抗體）。 如本文中所使用，"抗體格式（antibody format)，'係指其中 131419.doc -54- 200918088 可合併一或多個抗體可變區域以在結構上賦予抗原結合特 異性之任何合適多肽結構。此項技術已知多種合適抗體格 式，諸如嵌合抗體、人化抗體、人類抗體、單鏈抗體、雙 特異性抗體、抗體重鏈、抗體輕鏈、抗體重鏈及/或輕鏈 之同兀*一聚體及異元二聚體、任何上述各者之抗原結合片 段（例如，Fv片段（例如單鏈Fv(scFv)、雙硫鍵鍵結之Fv)、
Fab片奴Fab片段、F(ab’）2片段）、單一抗體可變區域（例
如dAb、VH、VHH、VL)及任何上述各者之經修飾形式 (例如經由共價連接聚乙二醇或其他合適聚合物或人化Vhh 來修飾）。 短語"免疫球蛋白單一可變區域”係指獨立於其他、區或 區域特異性結合抗原或抗原決定基之抗體可變區域％、 VHH Vl)。免疫球蛋白單一可變區域可以某一格式（例 士同7L或異凡多聚體）與其他可變區或可變區域一起存 在’其中該等其他區或區域不為單一免疫球蛋白可變區域 之抗原結合所需(亦即，其中免疫球蛋白單一可變區域獨 立於其他可變區域結合抗原）。，，區域抗體"或” Mb"與本文 中所使用之術語"免疫球蛋白單一可變區域，I相同。”單— =球蛋白可變區域”與本文中所使用之術語"免疫球蛋白 一可變區域”相同。”單-抗體可變區域”或”抗體單—可 ^本文中所使用之術語”免疫球蛋白單一可 域”相同。太杳+ y ,丄 笑^ 在一實知例中，免疫球蛋白單—可 類抗體可變區域，且向把步自使从从％ £或為人 红A且包括來自其他物種之單—抗體可 域，者如養齒動物（例如，如W〇 〇〇/29〇〇4中所揭示其内 131419.doc -55- 200918088 容係以引用之方式整體併入本文中）、護士鯊（nurse shark) 及路聪類（〇wehc〇VHH dAb。駱駝類vHH為自產生天然缺 少輕鏈之重鏈抗體之包括駱駝、美洲駝、羊駝、單峰駱駝 及原駝之物種獲得的免疫球蛋白單一可變區域多肽。v抑 可為人化的。
(HE 一” A K (V丁、叩刀 < 二欢箱稱 < 摺璺
蛋白質結構。區域通常會產生蛋白質之離散功能性質，且 在許多狀況下，可在不損失蛋白質之其餘部分及/或區域 之功能之情況下’添加至其他蛋白質中、自其他蛋白質中 移除或轉移至其他蛋白質中。”單一抗體可變區域”為包含 具有抗體可變區域特徵之序列之摺疊多肽區域。因此，I 包括完全抗體可變區域及（例如）其中一或多個環已經被不 具有抗體可變區域之胜外+ e ^, m 又·_ A之特徵之序列置換的經修飾可變區域， 或已經被截斷或包含N_末端或末端延伸之抗體可變區 域，以及保留令y . ^ 至^、結合活性及特異性之可變區 域的摺疊片段。 欠 術語”庫”作苗、広夕 “…原多肽或核酸之混合物。庫包含各具有 早多肽或核酸库夺丨夕 義。庫成員之門…成員。就此而論，，’庫|，與”譜系”同 可採取多狀切 產生庫中所存在之多樣性。庫 之例如細菌=之簡單混合物形式或可呈經核酸庫轉型 或細胞形式。2、動物或植物細胞及其類似者之生物體 個或有限數目=例中’ S個體生物或細胞僅含有一 載體中以允&成員。在'實施例令，將核酸併入表現 表現由核酸所編碼之多肽。因此，在一態樣 131419.doc -56 - 200918088 中，庫可採取宿主生物體群體之形式，各生物體含有一或 多個含有單個呈核酸形式之庫成員的表現載體複本，該庫 成員可經表現以產生相應多肽成員之核酸形式之庫成員。 因此’宿主生物體群體具有編碼多樣性多肽大譜系之潛 能。 通用構架為對應於如 Kabat("Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services)所定義之在序列方面保守之抗體區或對應 於如 Chothia 及 Lesk，（1987) J. Mol. Biol. 196:910-917 所定 義之人類生殖系免疫球蛋白譜系或結構的單一抗體構架序 列。庫及譜系可使用單-構架或—組該等構架，儘管僅高 變區中存在變異但已發現其仍准許實際上任何結合特異性 之起源。 如本文中所使用，術語”劑量”係指一次（單位劑量）或在 規定時間間隔内分兩次或兩次以上投藥向個體投與之配位
T之數量。舉例…劑量可指在叫“小時)(每曰劑 量）、2天、1週、2週、3调式一 +、夕 投_，單次投筚二：月之時程内向個體 干人仅樂或兩次或兩次以卜 J人从上杈樂）之配位體（例 口 ’已^ 4抗原之免疫球蛋白單—可變區域之配位 體)之數量。劑量之間的間隔可為任何想要之時間量。 之：=期”係指配位體(例如，、多肽她 …歸因於自然機制所致之配位體降解及/或 配位體清除或隔離而活體内減小5 解及戈 a* y- ^ 1而之時間。本發明 之配位體在活體内可為穩定的Μ 、牛农期可因結合抗降解 131419.doc •57· 200918088 及/或清除或隔離之分子而增加。該等分子通常為本身具 有長活體内半衰期之天然存在之蛋白質。若配位體之功能 r在活體内比對半衰期增加分子不具有特異性之類似配 體持續更長之時間，則其半衰期增加。舉例而言，對人 類血清白蛋白（HAS)絲分子具有特異性之配位體係可比 於對HSA不存在特異性（即不結合hsa但結合另一分子）之 相同配位體。舉例而言，其可結合細胞上之第三乾。半衰 期通常增加1〇%、桃、鳩、40%、50%或以上。2卜3 倍、4倍、5倍' 1〇倍、20倍、騎、40倍、50倍或以上範 圍内之+衣期之增加為可能的。另外或其他’高達30倍、 4 G 4吾、3 0 4吾、6 0 、7 a /λ· ° 。、80倍、9〇倍、1〇〇倍、15〇倍範 圍内之半衰期之增加為可能的。 :::中所使用’"流體動力學尺寸”係指基於分子擴散 =過之分子（例如，蛋白f分子、配位體）表觀尺 * =使仔蛋白貝擴散或運動通過溶液以獲得蛋白質之表 • 、 Z、_該尺寸係以蛋白質粒子之，，斯托克斯半徑 (Stokes radius)”或"流體 動力學尺寸”視質量▲形狀(構二:二出。蛋白質之”流體 八 θ 一形狀（構形）而定，如此兩個具有相同 刀子貝置之蛋白質基於蛋白 動力學尺寸。 、之㈣構料能具有不同流體 二二：提及’術語"競爭”意謂第-乾與其同源把結 & £域之、、’吉5在存在斜士女 心味 在對5亥同源靶具有特異性之第二結合區 =況下受到抑制。舉例而言，結合可能會(例如)因結 〇區域之物理阻斷或結 飞之、纟。構或環境改變以致其對 13I419.doc •58· 200918088 靶之親和力（affinity或avidity)減小而在空間上受到抑制。 關於如何執行競爭ELISA及競爭BiaC〇re實驗以確定第二與 第二結合區域之間的競爭的詳情，參見w〇2〇〇6〇38()27。/、 如下執行兩個序列之間的”同源性"或，，一致性”或"相似性" 之計算（該等術語在本文中可互換使用）。出於最佳比較目 的比對序列（例如，為最佳比對，可在第一與第二胺基酸 或核酸序列之一個或兩個中引入間隙，且出於比較之目 广的，可忽視非同源序列）。在一實施例中，出於比較之目 (的所比對之參考序列之長度為至少參考序列之長度的至少 30%、或至少40%、或至少5〇%、或至少6〇%、或至少 70%、80%、90。/。、100%。隨後比較相應胺基酸位置或核 普酸位置處之胺基酸殘基或核苷酸。當第一序列中之某一 位置由與第二序列中之相應位置相同之胺基酸殘基或核苷 酉义佔據時，則分子在該位置處一致（如本文中所使用胺 基酸或核酸"同源性"等效於胺基酸或核酸，，一致性"）。兩個 c - 序列之間的一致性％係隨考慮為最佳比對兩個序列所引入 之間隙之數目及各間隙之長度的序列所共享之一致位置之 數目而變化。可使用鼻法BLAST 2 Sequences使用缺省參 數（Tatusova，T. A·等人，？五]\48]^(^〇1^〇11^«，174:187- 188(1999))準備且確定如本文中所定義之胺基酸及核苷酸 序列比對及同源性 '相似性或一致性。 選擇方法 在一實施例中，本發明係關於由選擇具有想要生物活性 之蛋白酶抗性肽及多肽的方法選擇的多肽及dAb。方法中 131419.doc -59- 200918088 使用兩個選擇壓力以產生選擇高度穩定且抗蛋白酶降解且 具有想要生物活性之多肽的高效過程。如本文中所述，蛋 白酶抗性肽及多肽通常保留生物活性。相反，蛋白酶敏感 肽及夕肽在本文中所述之方法中會被蛋白酶裂解或分解， 且因此喪失其生物活性。因此，通常基於諸如結合活性之 生物活性選擇蛋白酶抗性肽或多肽。 ί 在-態樣中’提供—種自肽及多肽之庫或譜系（例如， 呈現系統）選擇、分離及/或回收抗蛋白酶（例如一或多種蛋 白酶清解之肽或多肽之方法。在一實施例中，該方法為 自肽及多肽之庫或譜系（例如’呈現系統）選擇、分離及 回收抗蛋白酶（例如，一或多種蛋白酶）降解之多狀之方 法》亥方去通常包含提供狀或多狀之庫或譜系，在適於 白酶（例如，胰蛋白酶、彈性蛋白酶、白血球酶、騰酶、 疫）活性之條件下使該庫或該譜系與蛋白酶組合，及登 擇、分離及/或回收抗蛋白酶降解且具有想： 多肽、二：： 活性，由蛋白酶降解之肽或 、吊物活性減小或喪失其生物活性。因此， 基於生物活性之古、、土，强埋 、仏 又用 之方法k擇、为離及/或回收抗蛋白 2=多肽，該生物活性諸如結合活性(例如 他生物活,1。口特異性配位體、結合受質）、催化活性或其 ::於蛋白酶(例如’一或多種蛋白酶)之蛋白水 u下使肽或多肽之庫或譜系與蛋白酶組 酶及具有u 口週於蛋白 白水解活性之生物製劑或混合物之蛋白水解活 131419.doc -60- 200918088 / -ί V. 性的條件為此項技術所熟知或可由一般熟習此項技術者容 易地確定。必要時，可（例如）藉由在一定範圍之ΡΗ值條 件、蛋白酶濃度、溫度下評定蛋白酶活性及/或藉由改變 使庫或譜系與蛋白酶反應之時間之量來鑑別或優化合適條 件。舉例而言，在一些實施例中，蛋白酶（例如，胰蛋白 酶）與肽或多肽（例如，可變區域）之比率（以莫耳/莫耳計）為 800比80,00(例如，8,000比80,000)蛋白酶：肽或多肽，例如 當使用10微克/毫升蛋白酶時，比率為8〇〇比8〇,〇〇〇蛋白酶： 肽或多肽；或當使用1〇〇微克/毫升蛋白酶時，比率為8,〇〇〇 比80,000蛋白酶：肽或多肽。在一實施例中，蛋白酶㈠列 如，胰蛋白酶）與肽或多肽（例如’可變區域）之比率（以重 量/重量、例如微克/微克計）為^㈧比丨⑼^⑽（例如， 16,000比160,000)蛋白酶：肽或多肽，例如當使用1〇微克/毫 升蛋白酶時，比率為1，600比16〇,〇〇〇蛋白酶肽或多肽；或 當使用⑽微克/毫升蛋白酶時，比率為16,〇〇〇比16〇,〇〇〇蛋 白酶:肽或多a。在一實施例中’使用濃度為至少1〇〇或 1〇〇〇微克/毫升之蛋白酶，且蛋白酶（例如，騰蛋白酶）與狀 或多肽（例如，可變區域| + 碘）之蛋白肽比率（以莫耳/莫耳計） 為8，_比8G，_蛋白酶：肽或多肽。在—實施例中，使用 濃度為至少1〇微克/毫升之蛋白酶’且蛋白酶(例如，胰蛋 白酶）與肽或多肽（例如，可變區域）之蛋白酶：肽比率（以莫 莫耳計）為謂比8〇,〇〇〇蛋白酶狀或多肽。在—實施例 中，蛋白酶（例如，胰蛋白酶）與狀或多狀（例如，可變區 域）之比率（以重量/番番 里、例如微克/微克計）為16〇〇比 131419.doc 61 200918088 160,000蛋白酶：肽或多 當C或〇，為_微克/毫升時例如當以10微克/毫升時·，或 酶：肽或多狀。在—實/ ’比率為16,〇〇〇比16〇，_蛋白 1 _微克/毫升蛋白酶。\列中/濃度（C或e’）為至少1 〇〇或 如’免疫球蛋白可變區域個體或經分離肽或多肽(例 版或多肽，可向肽或多如早已自譜系或庫分離之 之溶液，添…酶以=合適緩衝液(例一)中 f 至少約。,。1% (★)蛋白酶蛋白酶溶液’諸如 (W/W)蛋白酶/肽或多狀、約〔夕肽、約0.01〇/〇至約5〇/〇 -μ ^ BL ·05 /〇 至約 5% (w/w)| & 絡 /BJ_ 1二、(二.1%至約5% (W/W)蛋白酶/肽或多肽、約。5% 至力5/〇 (w/w)蛋白酶/肽 '，勺〇.5/〇 狀或多狀、至少約_(:^1%至㈣（W/W)蛋白酶/ 〇._ (吟)蛋白酶/肽或多& f㈣/肽或多肽、至少約 肽或多肽、至少約〇 04ΰ/ 至^約0.03% (w/w)蛋白酶/ 〇—)蛋白
肽或多肽、至少約〇〇二狀至少約〇.〇6%(w~)蛋白酶/ 0 08〇/〇 ( . 。（W/W)蛋白酶/肽或多肽、至+ A 肽以、約0.1%(w/w)蛋白酶 白酶/ 二：，白酶/肽或多，、至少 蛋至少： 次夕肽、至少約04% (w/ w)蛋白％/肽 0·5%(，蛋白酶/肽或多狀或多狀、至少約 或多肽、至少約。.7二=6%(W/W)蛋白酶/肽 (叫蛋白酶，肽或多肽」肽、至少約。- 肽、至少約1%—酶= 13I4J9.doc 4夕肽、至少約2%(w/w)蛋 • 62 · 200918088 白酶/肽或多肽、至 約4% (Μ蛋白酿/ 酶/肽或多肽、至少 肽之溶液。可在^狀或多狀或約5% (W/W)蛋白酶/肽或多 叫下培養活性之溫度(例如，室溫，約 時、3小時t)=，且可，間隔(例如，1小時、2小 !>湖分析以 °可使隸何合心法、諸如SDS- : 析或配位體結合就蛋白質降解分析樣品 用結果建立降解時程。 j仗 / 所述之方法中可使用任何想要之蛋白酶 I:，蛋白酶’不同蛋白酶之任何想要之組合， ^有蛋白水解活性之㈣生物製劑、生物提取物或 :水。不需要知道所用蛋白酶之身份。可單獨或以任何相 要之組合使用之蛋白酶之適合實例包括絲胺酸蛋白酶、半 胱胺酸蛋白酶、天冬胺酸蛋白酶、硫醇蛋白酶、基質金屬 蛋白酶、缓肽酶（例如叛肽酶A、緩肽酶B)、姨蛋白酶、胰 凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜酶、彈性蛋白酶、白血球 酶、騰酶、凝血酶、纖溶酶、組織蛋白酶(c — ns)(例 如組織蛋白酶G)、蛋白酶(例如蛋白酶i、蛋白酶2、蛋白 酶3)、嗜熱菌蛋白酶（therm〇lysin)、凝乳酶、腸狀酶、卡 斯蛋白酶（Caspase)(例如卡斯蛋白酶}、卡斯蛋白酶2、卡斯 蛋白酶4、卡斯蛋白酶5、卡斯蛋白酶9、卡斯蛋白酶& 卡斯蛋白酶13)、I弓激活蛋白酶（calpain)、無花果蛋白酶 (Hcain)、梭菌蛋白酶、摘狼桃蛋白酶（acUnidain)、鳳梨 酶、分離酶及其類似物。具有蛋白水解活性之適合生物提 取物、勻漿及製劑包括疫、黏液(例如胃黏液、鼻黏液、 131419.doc -63- 200918088 支氣管黏液）、支氣管肺泡灌洗液、肺組織勻聚、肺提取 物、姨腺提取物、胃液、唾液、眼淚及其類似物。蛋白酶 係以適於發生蛋白水解降解之量使用。舉例而言，如本文 中所述，可使用約0.01%至約5% (w/w，蛋白酶/肽或多肽） 蛋白酶。當蛋白酶與包含肽或多肽譜系之呈現系統（例如 噬菌體呈現系統）組合時，例如，可使用濃度約丨〇 至 約3 mg/m卜約10 pg/m卜約20叩/m卜約3〇 μ§/ηι卜約4〇 pg/ml、約 50 pg/ml、約 60 pg/ml、約 70 pg/ml、約 8〇 pg/ml、約 90 pg/m卜約 1〇〇 μ§/ηι1、約 2〇〇 μ§/ιη1、約 3〇〇 pg/ml、約 400 pg/mi、約 5〇〇 pg/mi、約 6〇〇 gg/mi、約 7〇〇 pg/m 卜約 800 pg/m卜約 9〇〇 pg/nu、約1〇〇〇 μβ/ηι卜約】5 mg/ml、約 2 mg/ml、約 2·5 mg/ml或約 3 mg/mi之蛋白酶。 在適於蛋白酶活性之溫度下，將蛋白酶與肽或多肽之集 合（庫或譜系）一起培養。舉例而言，可在約2〇t至約 40C(例如，室溫、約2〇。〇、約21。〇、約22t、約23。(：、約 24 C、約 25。。、約 26它、約 27。。、約 28。。、約 29。(：、約 30°C、約 3rC、約 32Ϊ：、約 33t、約 34。(：、約 35t、約 36 C約37 C、約38 C、約39°C、約40。〇之溫度下培養蛋 白酶及肽或多肽之集合。將蛋白酶及肽或多肽之集合一起 培養一段足以發生蛋白水解降解之時間。舉例而言，可將 肽或多肽之集合與蛋白酶一起培養約3 〇分鐘至約2 4或約4 8 J時在些貫例，將肽或多肽之集合與蛋白酶一起培養 隔夜或養至少約3〇分鐘、約！小時、約丄.5小時、約2 小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小 131419.doc -64- 200918088 時、約8小時、約9小時、約10小時、約η小時、約12小 時、約13小時、约14小時、約15小時、約16小時、約…、 時、約小時、約19小時、約20小時、約21小時、約、 時、約23小時、約24小時、約48小時或更長。 通常希望，至少在早期各於愛 / 你卞朗谷輪選擇中（例如，當使用呈現 糸統時），與不包括與蛋白醢 ^ 、皮臼柄起培養之選擇相比，蛋白 扭使得所選擇之具有相I夕&札、工 伴要之生物活性之純系數目減少 一個數量級。在料㈣巾，方法巾所使用之蛋白酶 條件足以使所回收到之純夺數 純系S目減少至少約1個對數(10 ^、至少約⑽對數⑽倍卜至少約⑽對數⑽㈤或 :少約4個對數(10,000倍)。產生想要之回收純系減少之合 適蛋白酶量及培養條件可使用 供之指導容易地確定。 方法及/或本文中所提
可使蛋白酶與肽或多肽之隼A細人n A ， ’、σ，，且5且使用任何合適方法 (幻如，活體外、活體内或離體 二卜k ;σ養。舉例而言，可使蛋 白酶與肽或多肽之集合 β以 、σ通4益中且在適於蛋白酶 活性之溫度下保持固定、搖動、 .·〇 震盡、渦旋或其類似情 况。必要時，可使蛋白酶與肽 ^ 次多肽之集合組合於活體内 飞離體糸統中，诸如藉由將 頦；*β夕肱之集合（例如，噬菌體呈 見庫或h系）引入合適動物（例如， ^ L J乳）中，且在足以使蛋 白酶活性起作用之時間過後， ^ . m ^ 口收肽或多肽之集合。在另 只例令，用多肽之集合（例如， 注写含七，桃 里邊體呈現庫或譜系）灌 ^ . 资白與活性起作用之時間過 谩，回收多肽之集合。 1 131419.doc -65- 200918088 培養後，可基於諸如結合活性之想要之生物活性選擇蛋 白酶抗性肽或多狀。必I時，可在選擇之前添加蛋白酶抑 制劑。可使用大體上不會干擾選擇方法之任何合適蛋白酶 抑制劑（或兩種或兩種以上蛋白酶抑制劑之組合）。合適蛋 白S#抑制劑之實例包括α 1 _抗胰蛋白酶、_巨球蛋白、阿 嗎他定（amastatin)、抗痛素（antipain)、抗凝血酶Ιη、抑肽 酶、4-(2-胺基乙基）苯磺醯氟鹽酸鹽（AEBSF)、（4_脒基_ 苯基）-曱烷-磺醯氟（APMSF)、貝他定（bestatin)、笨甲脒、 抑凝乳蛋白酶素、3,4-二氯異香豆素、氟磷酸二異丙酯 (DIFP)、E-64、乙二胺四乙酸（EDTA)、彈性蛋白酶抑制劑 (elastatmal)、亮肽素、N_乙基馬來醯亞胺、苯基甲基磺醯 氟（PMSF)、胃酶抑素、u〇_菲羅啉（phenanthr〇Une)、膦 醯二肽（phosphoramidon)、絲胺酸蛋白酶抑制劑、N_甲苯 磺醯基-L-離胺酸-氯甲基酮（TLCK)、Na_曱苯磺醯基_phe_ 氣甲基酮（TPCK)及其類似物。另外，可在購得許多含有數 類蛋白酶抑制劑之製劑（例如，R〇che C〇rnplete Pmtease Inhibitor Cocktail TabletsTM(Roche Diagnostics Corporation; Indianap〇lis，IN，USA)，其抑制胰凝乳蛋白 酶、嗜熱菌蛋白酶、木瓜酶、鏈黴蛋白酶、胰腺提取物及 膜蛋白酶）。 可使用想要之生物活性選擇方法選擇蛋白酶抗性肽或多 肽’該方法使得具有想要之生物活性之肽及多肽不同於不 具有想要之生物活性之肽及多肽且對其加以選擇。已經被 蛋白酶分解或裂解之肽或多肽通常喪失其生物活性，而蛋 131419.doc -66 - 200918088 白酶抗性肽或多肽仍具功能性。因此，可使用生物活性之 合適檢定選擇蛋白酶抗性肽或多肽。舉例而言，可使用合 適結合檢定（例如，ELISA，淘選）評定常見結合功能（例 如，結合一般配位體、結合特異性配位體或結合受質）。 舉例而言，可藉由淘選或使用合適親和力基質選擇、分離 及/或回收結合靶配位體或諸如蛋白質A、蛋白質1^之或一 般配位體或抗體之多肽。可藉由向合適容器（例如，試 管、皮氏培養皿（petri dish))中添加配位體（例如，一般配 位體、靶配位體）之溶液且使配位體變得沈積或塗佈於容 器壁之上來實現淘選。可洗除過量配位體且可向容器中添 加多肽（例如，噬菌體呈現庫）且將容器維持在適於多肽結 合固定配位體之條件下。可洗除未結合多肽且可使用諸如 刮削或（例如）降低pH值之任何合適方法回收結合多肽。 當使用噬菌體呈現系統時，可在噬菌體EUSA中測試結 合。可根據任何合適程序執行噬菌體Elisa。在一實例 中，可由ELISA就與所選擇之靶配位體或一般配位體之結 合篩選各輪選擇下所產生之噬菌體群體以鑑別呈現蛋白酶 抗性肽或多肽之噬菌體。必要時，可由例如EUSA使用例 如針對C-末端或N-末端標籤之試劑就與靶配位體或一般配 位體之結合測試可溶性肽及多肽（例如參見，Winter等人， (1994)」紙及ev. /咖w⑽/叹少12, 433_55及其中所引用之表 考文獻）。亦可由PCR產物之凝膠電泳（Marks等人，1991， 同上；Nissim等人，1994，同上）、探測（Pr〇bing) (Tomlinson等人，1992，J. Mo/·价〇/· 227, 776)或藉由對载 131419.doc •67· 200918088 體DNA測序評定所選擇之噬菌體之多樣性。 除對IL-1R1具有特異性外，包含抗IL_1R1蛋白酶抗性多 肽（例如，單一抗體可變區域）之拮抗劑或多肽（例如，雙特 異性配位體）可對一般配位體或任何想要之靶配位體具有 I。合特異性，該一般配位體或靶配位體諸如人類或動物蛋 白質，包括細胞激素、生長因子、細胞激素受體、生長因 子欠體、酶（例如，蛋白酶）、酶之辅因子、DNA結合蛋 白、脂質及碳水化合物。
\ 在些實施例中，蛋白酶抗性肽或多肽（例如，dAb)或 拮抗劑結合肺組織中之IL_1R1。在—實施例中，拮抗劑或 多肽亦結合肺組織中之另一纪。 田在本文中所述之方法中使用呈現系統（例如，使核酸 之扁碼力此與由核酸編碼之肽或多肽之功能特徵相關聯的 呈現系統）時，擴增或增加編碼所選擇之肽或多肽之核酸 的複本數通常有利。此提供獲得足夠數量之供使用本文中 所述之方法或其他合適方法之其他輪選擇用或供製備其他 譜系（例如’親和力成熟料)用之核酸及/或肽或多狀的有 效方式θ此’在一些實施例中，該等方法包含使用呈現 系統（例如’使核酸之編碼功能與由核酸 之功能特徵相關聯之呈現系、统，諸如.菌體呈現/I進 步包含擴增或增加編碼所選擇之肽或多肽之核酸的複本 :二：可使用任何合適方法、諸如藉由嗟菌體擴增 '細 胞生長或聚合酶鏈反應擴增。 本文中所述$ 1 _ /可用作必要時可包含其他合適選擇方 131419.doc -68- 200918088 法之分離蛋白酶抗性肽 分。在該飞夕肽（例如，dAb)之程序的部 ^，可在程序之任何想要之點採用本文中 中所描述且例示，本文中所或之後。如本文 -^ 纟文巾所4之方法亦可用於提供兩輪或 兩輪以上選擇。 4 實例中’該方法為選擇抗彈性蛋白酶降解之狀或多 (!如dAb) ’其包含提供肽或多肽之庫或譜系，在適 f、 k 於彈性蛋白酶（或包含彈性蛋白酶之生物製劑、提取物或 組織勻漿）蛋白水解降解之條件下使庫或譜系與彈性蛋白 酶組口’及選擇、分離及/或回收抗彈性蛋白酶降解且具 有IL-1 R1結合活性之肽或多肽。 在特定實施例中，⑹共一種選擇抗彈性蛋白冑降解且結 合IL-1R1的免疫球蛋白單一可變區域（dAb)的方法。在該 等實施例中，提供包含dAb之庫或譜系且在適於彈性蛋白 酶（或包含彈性蛋白酶之生物製劑、提取物或組織勻漿）蛋 白水解降解之條件下使其與彈性蛋白酶組合。選擇特異性 結合IL-1R1之彈性蛋白酶抗性dAb。舉例而言，彈性蛋白 酶抗性dAb當在37。(3下在0.04% (w/w)彈性蛋白酶溶液中培 養至少約2小時之時間時大體上不降解。在一實施例中， 彈性蛋白酶抗性dAb當在3 7°C下在0.04% (w/w)彈性蛋白酶 溶液中培養至少約1 2小時之時間時大體上不降解。在一實 施例中’彈性蛋白酶抗性dAb當在37t：下在0.04%(w/w)彈 性蛋白酶溶液中培養至少約24小時、至少約36小時或至少 約48小時之時間時大體上不降解。 131419.doc -69- 200918088 在一實施例中，提供_ ^ 禮璉擇抗彈性蛋白酶降解且纟士 a IL-1R1的免疫球卷白留 ° 蛋白早一可變區域（dAb)的方法。該方法 包含提供包含多肽银& 电 曰系之噬菌體呈現系統，該等多肽包含 免疫球蛋白單一可^ 0 楚&域，使噬菌體呈現系統與彈性 轉（約100 pg/ml)紐人η u々 山 '，，口且將混合物在約37t：下培養（例如）隔 仪（例如約12 -1 6小拉、„ 4)，及ik後選擇呈現特異性結合IL_1R1 之dAb的噬菌體。 在一實例中，提供—M, . f 、種選擇抗白血球酶降解之肽或多肽
(例如，dAb)之方沐，a— L ^ 去该方法包含提供肽或多肽之庫或譜 糸，在適於白血球酶蛋白（或包含白血球酶之生物製劑、 提取物或組織W)水解降解之條件下使庫或譜系與白企 求酶、·且° ’及選擇、分離及/或回收抗白血球酶降解且具 有特異性IL-1R1結合活性之肽或多肽。 在特定實施例中，提供一種選擇抗白血球酶降解且結合 il]R1的免疫球蛋白單—可變區域（)的方法。在該等 實施例中，提供包含dAb之庫或譜系且在適於白血球酶（或 包含白A球酶之^物製劑、提取物或組織句幻蛋白水解 降解之條件下使其與白血球酶組合。選擇特異性結合几 1R1之白血球酶抗性dAb。舉例而言白血球酶抗性傷當 在37°C下在0.04% (w/w)白血球酶溶液中培養至少約2小時 之時間時大體上不降解。在-實施例中，白血球酶抗性 dAb田在37 C下在0.04%(w/w)白血球酶溶液中培養至少約 12小時之時間時大訂科解。在_實施财，白血球酶 抗性dAb當在37。(：下在〇.〇4% (w/w)白血球酶溶液中培養至 131419.doc 70· 200918088 少約24小時、至少約3 、^ ^ ^ ^ ^ 上不降解。 子或至-賴小時之時間時大體 在-實施例中’提供—種選擇抗白血球酶降解且特里性 結纽-⑻的免疫球蛋白單一可變區域的方法4 ^法包含提供包含多肽譜系之嗟菌體呈現系統，該等多肽 …疫球蛋白單一可變區域，使嗟菌體呈現系統與白血 球酶（約100叫㈣組合且將混合物在約抓下培養（例如） 隔夜（例如約12-1 6小時），及隨接.登裡g 于）及隨後璉擇呈現特異性結合IL_ 1R1之dAb的嗟菌體。 在另-實例中’提供一種選擇抗胰蛋白酶降解之肽或多 肽（例如，dAb)之方法，兮古.土 — A , ^ 去忒方法包含提供肽或多肽之庫或 谱系’在適於胰蛋白酶（或包含 叫、X匕3胰蛋白酶之生物製劑、提 取物或組織勻漿）蛋白水解降經 ^解降解之條件下使庫或譜系與胰 蛋白組合，及選擇、分θ + ^刀離及/或回收抗胰蛋白酶降解且 特異性結合IL -1R1之肽或多肽。 在特定實施例中，提供一種選擇抗胰蛋白酶降解且特異 性結合IL-1R1的免疫球蛋白單一 π w早可變區域（dAb)的方法。 在該等實施例中，提供句合Η Λ Α 1 匕“Ab之庫或譜系且在適於胰蛋 白酶(或包含胰蛋白酶之生物製劑、提取物或組織句幻蛋 白水解降解之條件下使其與騰蛋㈣組合。㈣結合化_ 1R1之騰蛋白酶抗性dAb。舉例而_χ_ 牛例而§ ’胰蛋白酶抗性dAb當 在37°C下在0.04% (w/w)胰蛋白酶，、办 史曰姆溶液中培養至少約2小時 之時間時大體上不降解。在一音# 2丨丄 貫％例中，胰蛋白酶抗性 dAb當在 37 C 下在 0.04% (vv/w^M i a & 、）姨蛋白酶溶液中培養至少約 131419.doc *71 200918088 3小時之時間時大體上不降解。在一實施例中，胰蛋白酶 抗性dAb當在37C下在0.04% (w/w)胰蛋白酶溶液中培養至 少約4小時、至少約5小時、至少約6小時、至少約7小時、 至少約8小時、至少約9小時、至少約1〇小時、至少約"小 時或至少約12小時之時間時大體上不降解。 在-例示性實施例中’提供一種選擇抗胰蛋白酶降解且 特異性結合IL. 1R1的免疫球蛋白單—可變區域（d，的方 法該方法包含提供包含譜系之嗤菌體呈現系統，該等多 肽包含免疫球蛋白單一可變區域，使噬菌體呈現系統盥胰 蛋㈣U00 組合且將混合物在約3rc下培養（例如） 隔夜（例如約12-1 6小日#、，μ 子）及隨後選擇呈現特異性結合il- 1R1之dAb的嗤菌體。 在另一態樣中，提供一種產生蛋白酶抗性肽或多肽（例 dAb) β曰系之方法。該方法包含提供肽或多肽譜系；在 I於蛋白酶活性之條件下使肽或多肽譜系與蛋白酶組合； :收複數種特異性結合il_1Ri之肽或多肽；藉此產生蛋 白酶抗1·生肽或多肽譜系。適用於方法中之蛋白冑、呈現系 蛋白酶活性之條件及選擇肽或多肽之方法係在本文中 相對於其他方法描述。 —實施例中’使用包含肽或多肽譜系之呈現系統 (如]如3，蚀妨_ & " ^ 、、扁石馬功能與由核酸編碼之肽或多肽之功 月匕特徵相關聯的呈 兄糸統）’且該方法進一步包含擴增或 4馬複數種所選擇之肽或多肽之核酸的複本數。核酸 可使用任何合通太、土 ^ ^ 、諸如藉由嗟菌體擴增、細胞生長或 131419.doc -72- 200918088 聚合酶鏈反應加以擴增。 在特定實施例中，提供-種產生包含抗il_iri⑽之蛋 白酶抗性多肽之譜系的方法。該方法包含提供包含楊之 多肽譜系；在適於蛋白酶（例如，胰蛋白酶、彈性蛋白 酶、白血球酶）活性之條件下使肽或多肽譜系與蛋白酶組 合；及回收複數種包含對IL-1R1具有結合特里性之心之 多肽。該方法可用於產生未經處理之躇系或偏向於想要之 ί 結合特異性之譜系，諸如基於對IL_1R1具有結合特異性之 親本dAb的親和力成熟譜系。 多肽呈現系統 在一實施例中，提供用於本文中所述之方法中之狀或多 肽之譜系或庫包含合適呈現系統。呈現系統可抗蛋白酶 ⑼如H㈣或蛋㈣之組合及具有蛋白水解活性 之任何生物提取物、組織勻漿或製劑（例如，痰、黏液（例 如’胃黏液、鼻黏液、支氣管黏液）、支氣管肺泡灌洗 液、肺組織勻衆、肺提取物、胰腺提取物、胃液、唾液、 眼淚及其類似物））降解。在-實施例巾，呈現系統及呈現 系統與所呈現多肽之間的關聯為至少與譜系之大多數穩定 肽或多肽-樣抗蛋白酶。此使得編碼所選擇之呈現多狀之 核酸易於分離及/或擴增。 在-實例中’可自溶液中或共價或非共價連接於合適表 P (諸如塑膠或玻璃（例如，微量滴定板、多肽陣列，諸如 微陣列））之肽或多肽（例如，dAb)譜系選擇、分離及/或回 收蛋白酶抗性肽或多肽。舉例而t，可使用以將各不同庫 1314l9.doc 73- 200918088 ，員（例如，獨特肽序列）置放在陣列離散職位置上之方 =於表面±之肽陣列。可由其在陣列中之空間位 該陣列中之各庫成員之—致性。可衫陣列中發生（例如） 乾配位體與活性庫成員之間的結合相互作用之位置，從而 基於空間位置鑑別活性成員之序列。（例如參見，美國專 利第 5,143,854號、WO 90/1 5070及 WO 92/10092)。 在-實施例中，方法採用使核酸之編碼功能與由核酸編 碼之多肽之物理、化學及/或功能特徵相關聯之呈現系 統。該呈現系統可包含複數種可複製基因組，諸如噬菌體 或細胞（細菌）。在一實施例中，呈現系統包含庫，諸如噬 菌體呈現庫。 已描述許多合適噬菌體呈現系統（例如，單價呈現及多 價呈現系統）。（例如參見，Griffiths等人，美國專利第 6,5 55,3 13 B1號（以引用之方式併入本文中；）；Johns〇n等 人’美國專利第5,733,743號（以引用之方式併入本文中）； McCafferty等人，美國專利第5,969，108號（以引用之方式併 入本文中）；Mulligan-Kehoe，美國專利第5,702,892號（以 引用之方式併入本文中）；Winter, G.等人， /wmwwo/. 12:433-455 (1994) ; Soumillion, Ρ·等人，Jpp/· Biochem. Biotechnol. 47(2-3): 175-189 (1994) ； Castagnoli, k ， Comb. Chem. High Throughput Screen, AO.. 121- 133 (2001)。）呈現於噬菌體呈現系統中之肽或多肽可呈現 於任何合適噬菌體上，諸如絲狀噬菌體（例如’ fd、M13、 FI)、裂解性噬菌體（例如，T4、T7、λ)或RNA嗤菌體（例 131419.doc •74- 200918088 如，MS2)。 通常產生或提供以與合適噬菌體外殼蛋白(例如， 蛋白）形成之融合蛋白形式呈現狀或嗤菌體多狀譜系之嗟 菌體庫。融合蛋白可在噬菌體外殼蛋白之尖端或必要時在 内部位置呈現肽或多肽。舉例而言，戶斤呈現之肽或多肽可 存在於_之區域丨之胺基未端位置。（师之區域丨亦稱為 N1)。所呈現之多肽可與_直接融合（例如师之區域工 之N-末端）或使用連接子與pm融合。必㈣，融合物可進 一步包含標籤（例如，myc抗原決定基、HU標鐵）。可使用 任何合適方法產生包含以與噬菌體外殼蛋白形成之融合蛋 白形式呈現之肽或多肽譜系之庫，該等方法諸如藉由將編 碼所呈現之肽或多肽之噬菌體載體或噬質體(p一載 體庫引人合適宿主細菌巾，且培養所得細_以產生嗟菌體 (例如，必要時使用合適輔助噬菌體或互補質體）。可使用 諸如沈澱及離心之任何合適方法自培養物中回收嗤菌體 庫。 呈現系統可包含含有任何想要之量之多樣性的肽或多肽 譜系。舉例而言’譜系可含有胺基酸序列對應於由生物 體、生物體群（例如，自駱駝類分離之Vhh dAb序列之譜 系）、想要之組織或想要之細胞類型表現之天然存在之多 肽的肽或多肽或可含有具有隨機或隨機化之胺基酸序列之 肽或多肽。必要時，多肽可共享共同核心或骨架。該譜系 或該庫中之多肽可包含具有隨機或隨機化之胺基酸序列之 規定區及常見胺基酸序列區。在某些實施例中，譜系中之 131419.doc -75· 200918088 所有或大體上所有多肽具有想要之類型，諸如想要之酶 (例如，聚合酶)或想要之抗體之抗原結合片段(例如，人類 vH或人類vL)。在眚说a 办 ^ 在實施例中，多肽呈現系統包含多肽譜 系，其中各多肽包含抗體可變區域。舉例而言，譜系中之 各多肽可含有Vh、VL或Fv(例如，單鏈Fv)。 ( 可使用任何σ適方法將胺基酸序列多樣性引人肽或多肽 〆月架之任何想要之區中。舉例而言，可藉由使用任何合 、犬變誘發方法（例如’低保真度PCR、寡核苦酸介導之突 變誘發或疋位犬變誘發，使用NNKS碼子多樣化）或任何 -他σ適方法I備編碼多樣性多肽之核酸庫將胺基酸序列 多樣性引入靶區、諸如抗體可變區域或疏水性區域之互補 判定區巾。必要時，可隨機化待要❹樣化之多肽之區。 構成譜系《多肽之尺寸基本上為一個需要選擇之問題， 且不需要均—的多肽尺寸。在—實施例中，㈣中之多狀 具有至少三級結構（形成至少一個區域）。 選擇/分離/回收 β使用任何σ適方法自譜系或庫（例如，於呈現系统 選擇、分離及/或回收蛋白酶抗性肽或多肽（例如，蛋白酶 抗性多肽群體）。在―竇餘如由^ 在實施例中，基於可選擇之特徵（例 口’理特徵、化學特性、功能特徵)選擇或分離蛋白酶 几性多肽;合紅可選擇之魏特徵包括譜Η之肽或， =之生物活性’例如與—般配位體（例如，超抗原士 :、與乾配位體(例如，抗原、抗原決定基、受質)之： °、與抗體之結合(例如，經由肽或多肽上所表現之抗原: 131419.doc •76· 200918088 疋基）’及催化活性。（例如參見’ Τ 〇 m 1 i n s ο η等人，w 〇 99/20749 ' W0 01/57065、w〇 99/58655)。在一實施例 中，選擇係基於特異性結合IL-1R1。在另一實施例中，選 擇係基於所選擇之功能特徵以產生成員具有蛋白酶抗性之 第二譜系，接著自該第二譜系中選擇特異性結合IL_1R1之 成員。 在一些實施例中，自大體上所有蛋白酶抗性肽或多肽共 享书見之可選擇之特徵的肽或多肽之庫或譜系選擇及/或 分離蛋白酶抗性肽或多肽。舉例而言，蛋白酶抗性肽或多 肽可選自大體上所有蛋白酶抗性肽或多肽結合常見一般配 位體、結合常見靶配位體、結合常見抗體（或由常見抗體 、’Ό a )或具有常見催化活性之庫或譜系。該類型之選擇尤 ,、適用於製備基於具有想要之生物活性的親本肽或多肽蛋 白酶抗性肽或多肽譜系，例如當執行免疫球蛋白單一可變 區域之親和力成熟化作用時。 基於與常見一般配位體之結合選擇可產生含有所有或大 體上所有為原始庫或譜系之组分之蛋白酶抗性肽或多狀之 肽或多肽集合或群體。舉例而言，可藉由淘選或使用合適 親：力基質選擇、分離及/或回收結合乾配位體或諸如蛋 白貝A、蛋白質l之或一般配位體或抗體之肽或多肽。可 藉由向合適容器（例如，試管、皮氏培養皿）中添加配位體 (例如，-般配位體、乾配位體)之溶液且使配位體變得沈 積或塗佈於容器壁上來實現淘選。可洗除過量配位體且可 向容器中添加肽或多肽（例如，已與蛋白酶—起培養之譜 131419.doc •77- 200918088 系）且。將谷态維持在適於肽或多肽結合固定配位體之條件 下。可洗除未結合肽或多肽且可使用諸如刮削或（例如）降 低pH值之任何合適方法回收結合肽或多狀。 °適配位體親和力基質通常含有配位體共價或非共價連 接之固體支擇物或珠粒（例如，瓊脂糖）。可使用分批法、 s柱法或任何其他合適方法在適於使肽或多肽與基質上之 配位體釔合的條件下使親和力基質與肽或多肽⑼如，已 與蛋白酶一起培養之譜系)組合。可洗除未結合親和力基 、 或夕狀且可使用任何合適方法溶離及回收結合肽 或多肽，该合適方法諸如用較低ρΗ值之緩衝液、 用溫和變 性劑（例如’尿素）或用競爭以與配位體結合之肽進行溶 離在f例中，在適於譜系中之肽或多狀結合革巴配位體 (IL 1R1)之條件下使生物素標記乾配位體與譜系、組合。使 用固疋抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素(例如，在珠粒上) 回收結合肽或多肽。 在-些實施例中，一般配位體為抗體或其抗原結合片 段。結合在庫或譜系之肽或多肽中大體上為保守的肽或多 肽之結構特徵之抗體或抗原結合片段尤其適合作為一般配 位體。適合用作分離、選擇及/或回收蛋白酶抗性肽或多 肽之配位體之抗體及抗原結合片段可為單株或多株，且可 使用任何合適方法製備。 庫/譜系 在其他態樣中’提供蛋白酶抗性肽及多肽譜系，編碼蛋 白酶抗性肽及多肽之庫及產生該等庫及譜系之方法。 131419.doc 78- 200918088 可使用任何合適方法製備或獲得編碼及/或含有蛋白酶 抗性肽及多肽之庫。該庫可基於所關注之肽或多肽(例 如，選—狀或多狀)經設計以編碼蛋二 性肽或夕& ’或可使用本文中所述之方法選自另—庫。兴 例而言，可使用合適之多肽呈現系統製備富集蛋白酶錢 多肽之庫。 / 在-實例中’如本文中所述，在適於蛋白酶活性條件下 使包含呈現多肽（包含免疫球蛋白單一可變區域（例如， VH、νκ' νλ))之譜系㈣菌體呈現庫與蛋白酶組合。某於 想要之生物活性，諸如結合活性(例如，結合一般：位 體、結合靶配位體）回收蛋白酶抗性多肽，從而產生富集 蛋白酶抗性多肽之喔菌體呈現庫。在—實施例中，^係 基於結合一般配位體以產生富集庫，接著基於特異性結合 IL-1R1選擇該庫之抗IL-1R1成員。 在另一實例中’首先_選包含呈現多肽（包含免疫球蛋 白單-可變區域(例如，VH、VK、νλ))之譜系的噬菌體呈 現庫以鑑別譜系中對想要之靶抗原（IL_ i R1)具有結合特異 性之成員。回收具有想要之結合特異性之多肽集合，且如 本文中所述’在適於蛋白水解活性之條件下使集合與蛋白 酶組合。回收具有想要之革巴結合特異性之蛋白酶抗性多狀 集合’從而產生富集蛋白酶抗性且高親和力多肽之庫。如 本文在另一實施例中所述’該選擇方法中之蛋白酶抗性與 高親和力結合相關。 可使用任何合適方法谷易地產生編碼想要類型之多狀全並 131419.doc -79- 200918088 系之庫。舉例而言，可獲得編碼想要類型之多肽⑼如， 聚合酶 '免疫球蛋白可變區域）之核酸序歹，且可（例如）藉 由使用易錯（err〇r-prone)聚合酶鍵反應（pcr)系統擴增核 酸、藉由化學突變誘發（Deng等人，丨細/ 脉
9533 (1994))或使用細菌突變菌株（L〇w等人，乂细’咖. 26〇:359 (1996))製備各含有—或多個突變之核酸集合。， 在其他實施例中’可無向核酸之特定區以供多樣化。使 所選位置產生突變之方法亦為此項技術所熟知且包括(例 如）在使用或不使用PCR之情況下使用錯配寡核_酸或簡併 寡核苷酸。舉例而言’已藉由使突變靶向抗原結合環建立 合成抗體庫。已將隨機或半隨機抗體Η3及L3區附加至生 殖系免疫球蛋白V基因片段以產生具有未突變構架區之大 庫（Hoogenboom 及 Winter (1992)同上；Nissim 等人， (1994)同上 ’ Griffiths 等人，（1994)同上；DeKruif 等 人，（1995)同上）。已擴展該多樣化以包括部分或所有其 他抗原結合環（Crameri等人，（1996) 2:1〇();
Riechmann 等人，（1995) 沁以，13:475 ；
Morphosys，WO 97/08320，同上）。在其他實施例中，可例 如由採用弟PCR產物作為"大引子（mega-primer)"之兩步 PCR策略靶向核酸之特定區以供多樣化。（例如參見， 1^11(^,〇.等人，（^加趾.125-128 (1990)。）亦可（例如）由 SOE PCR實現乾向多樣化。（例如參見，H〇rt〇n，R M等 人，77:61-68 (1989)) ° 所選擇位置處之序列多樣性可藉由改變指定多肽序列之 131419.doc -80· 200918088 編碼序列以便可在該位置併入許多可能的胺基酸（例如， 所有20種或其子集）來實現。使用IUPAC命名法，最通用 密碼子為NNK，其可編碼所有胺基酸以及TAG終止密碼 子。可使用NNK密碼子以引入所需之多樣性。亦使用實現 相同終端之其他密碼子，包括NNN密碼子，其使得產生其 他終止密碼子TGA及TAA。該靶向方法可使完全序列空間 處於待探索之乾區域内。 μ寸年Ί匕έ具有已知主鏈構形之蛋白酶抗性抗體多 狀。（例如參見 ’ T〇mlinson等人，w〇 99/2〇749)。 庫可在合適質體或載體中製備。如本文中所使用，載體 係指用於將異源DNA引入細胞中以用於其表現及/或複製 :離散元件。可使用任何合適載體，包括質體(例如，細 #質體）病t或嗟菌體載體、人造染色體及游離型載 體。可使用該等載體進行簡單的選殖及突變誘發，或可使
^表現載體驅動庫表現°载體及質體通常含有-或多個選 殖位點（例如，多接頭 旻I起點及至J —個可選擇標記 物基因。表現載體可進一步 件，諸如辦強+-杜 3有驅動夕肽轉錄及轉譯之元 «強子兀件、啟動子、轉錄終 及其類似物。該# U L唬序列 選殖插入物以致以可操作性連接於編碼多肽之經 ㈤如，：二二：载體維持在適… 列。口^主細胞中）時表現且產生多肽的方式排 選殖及表現裁體通常 曰 所選擇之宿 “載體㉟夠複製於一或多個 评〈佰主細胞中之核 久序列。在選殖載體中# 131419.doc ^81 . 200918088 通常為使得載體能夠獨立於宿主染色體dna複製之序列且 ，括複製起點或自發複製序列。對於多種細菌、酵母及病 母’该等序列為吾人所熟知。質體pBR322之複製起點適 於大夕數革蘭氏陰性菌（Gram_negative bacteria)，2微米質 體起點適於酵母’且多種病毒起點（例如，sv4Q、腺病毒） 適用於在甫礼動物細胞中選殖載體。哺乳動物表現載體通 常不需要複製起點，除非該等表現載體用於能夠複製高級 DNA之哺乳動物細胞（諸如c〇s細胞）中。 選殖或表現載體可含有亦稱為可選擇標記物之選擇基 因。該等標記物基因編碼為在選擇性培養基中生長之轉型 宿主細胞之存活或生長所需的蛋白質。因此，未經含有選 擇基因之载體轉型之宿主細胞在培養基中將不能存活。典 型選擇基因編碼帶有抗生素及其他毒素（例如，胺苄西林 (ampicilhn)、新黴素、甲胺喋呤或四環素）抗性、互補營 養缺陷不足或不可在生長培養基中供應關鍵營養物之蛋白 質。 合適表現載體可含有許多組分，例如複製起點、可選擇 標記物基因、一或多個表現控制元件（諸如轉錄控制元件 (例如，啟動子、強化子、終止子））及/或一或多個轉譯信 號、信號序列或前導序列及其類似物。表現控制元件及信 號或前導序列存在時可由載體或其他來源提供。舉例而 5 ’可使用編碼抗體鍵之選殖核酸之轉錄及/或轉譯控制 序列引導表現。 可提供啟動子以表現於想要之宿主細胞中。啟動子可為 131419.doc -82- 200918088 組成性或可誘導性啟動子。舉例而言，啟動子可可操作性 連接於編碼抗體、抗體鏈或其部分之核酸，如此其引導核 酸轉錄。可利用多種合適啟動子，對於原核宿主（例如，x 對於大腸桿菌（E. c〇li)為β-内醯胺酶及乳糖啟動子系統、 鹼性磷酸酶、色胺酸（trp)啟動子系統、lac、uc、丁3、丁7 啟動子）及對於真核宿主（例如，猿猴病毒4〇早期或晚期啟 動子、勞氏肉瘤病毒（Rous sarc〇ma virus)長末端重複序列 ( 啟動子、細胞巨大病毒啟動子、腺病毒晚期啟動子、EG_ 、 1 a啟動子）。 另外，表現載體通常包含選擇運載載體之宿主細胞之可 選擇標記物，且在可複製表現載體之狀況下，包含複製起 點。編碼帶有抗生素或藥物抗性之產物之基因為常見之可 選擇標記物且可用於原核細胞（例如，β_内醯胺酶基因（胺 苄西林抗性）、Tet基因（四環素抗性））及真核細胞（例如，新 黴素（G418或遺傳黴素）、gpt(麥考酚酸）、胺苄西林或潮黴 ( 素抗性基因）中。二氫葉酸還原酶標記物基因准許在多種 佰主中用甲胺喋呤選擇。編碼宿主之營養缺陷標記物之基 因產物的基因（例如，LEU2、URA3、HIS3)通常用作酵母 中之可選擇標記物。亦涵蓋使用病毒（例如，桿狀病毒）或 噬菌體載體及能夠整合於宿主細胞基因組中之載體，諸如 反轉錄病毒載體。 適於表現於原核細胞（例如，細菌細胞，諸如大腸桿菌） 或哺乳動物細胞中之表現載體包括（例如）pET載體（例如， pET-12a ^ pET-36 ^ pET-37 > pET-39 > pET-40 ^ Novagen 131419.doc -83· 200918088 及其他）、噬菌體載體（例如，pCANTAB 5 E， Pharmacia)、pRIT2T(蛋白質 A 融合載體，Pharmacia)、 pCDM8、pCDNAl.l/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、pEF-l(Invitrogen，Carlsbad，CA)、pCMV-SCRIPT、pFB、 pSG5 ' pXT 1 (Stratagene, La Jolla, CA) ' pCDEF3(Goldman, L.A.等人，Biotechniques， 27:1013-1015 (1996))、 pSVSPORT(GibcoBRL, Rockville, MD) 、 pEF-Bos (Mizushima，S.，等人，Nucleic Acids Res., 18:5322 (1990)) f 1 及其類似物。可利用適於用於多種表現宿主中之表現載 體’該等宿主諸如原核細胞（大腸桿菌）、昆蟲細胞（果蠅史 奈德 S2細胞Schnieder S2 cells)、Sf9)、酵母 (嗜曱醇酵母（P. 、馬斯德畢赤酵母（p p咖orb)、釀酒酵母ππνζϋβ))及哺乳動物細胞（例 如’ COS細胞）。 載體之實例為使得能夠表現對應於多肽庫成員之核苦酸 , 序列之表現載體。因此’可藉由使表現多肽庫成員之單一 純系獨立繁殖及表現執行用一般及/或靶配位體進行之選 擇。如上所述，選擇呈現系統可為噬菌體呈現。因此，可 使用嗟菌體或噬質體載體。例示性載體為具有大腸桿菌複 製起點（用於雙鏈複製）以及噬菌體複製起點（用於產生單鏈 DNA)之噬質體載體。該等載體之操作及表現在此項技術 中為熟知的（Hoogenboom及Winter (1992)同上.Ni .等 人，（1994)同上p簡言之，載體可含有賦予噬質體選擇 性之β-内醯胺酶基因及在表現卡&上游可含有合適前導序 131419.doc * 84 - 200918088 二、:個選殖位點、一或多個肽標籤、_或多個tag終止 體蛋白fpm之1ac啟動子。因此，使用大腸 二二二制因子及非抑制因子菌株且添加葡萄糖、異 Λ V -半乳糖WIPTG)或輔助嗟菌體，諸如VCS M13， 该載體能夠以質<1#报4 4包制 買體形式複製而不表現，來產生大量僅多肽 庫成員或產物噬菌體，其中一此 多肽-P職合物複本。-mu含有至少一個 本文中所述之庫及譜系可含有抗體格式。舉例而言，庫 及譜系中所含之多肽可為整個獨立的^或^區域其任一 係經修飾或未經修飾。可使用任何合適方法容易地產生 scFv片段以及其#於雜少 體工程化方法肽。：項技術中熟知許多合適抗 舉例而吕，ScFv可藉由使編碼兩個可變區 域之核酸與編碼適告〗表垃 ^迥田連接子肽（諸如（Gly_Gly_Gly_Gly_ Μ)3或其他合適連接子肽）之合適寡核苦酸相連接而形
成。連接子橋接第一末端與第二㈣义末端H 用構造諸如Fv、FabD(ab,)2片段之其他抗體格式之類似 技術。為編排格式FabAF(ab，)2片段，可使Μ%多狀與 可自重排基因、生殖系c基因分離或由抗體序列資料合成 之恆定區片段組合。本文中所述之庫或譜系可為 或譜系。 包3蛋白酶抗性可變區域之多狀可包含革巴配位體（比_ 則結合位點及-般配位體結合位點。在某些實施例中， 般配位體結合位點為諸如蛋白質A、蛋白質L或蛋白質〇 之超抗原之結合位點。可變區域可基於任何想要之可變區 131419.doc -85- 200918088 域’例如人類 vH(例如，vH la、vH lb、Vh 2、Vh 3、％ 4、VH 5、VH ό)、人類 νλ(例如，、νλΠ、νλΠι、 VJV、νλν、νχνΐ 或 νκ1)或人類 νκ(例如，νκ2、νκ3、 VK4、VK5、VK6、VK7、VK8、VK9 或 VK10)或視情況經人化 之駱駝類VHH。 產生蛋白酶抗性多肽之核酸、宿主細胞及方法 本發明係關於編碼（例如）由本文中所述之方法可選擇咬 選擇之蛋白酶抗性肽或多肽的經分離及/或重組核酸。 本文中稱為"經分離"之核酸為已其原始環境中（例如，細 胞中或諸如庫之核酸混合物中）之其他物質（例如，其他核 酸，諸如基因組DNA、cDNA及/或RNA)遠遠分離之核酸。 經分離核酸可以載體（例如，質體）之部分形式分離。 本文中稱為”重組”之核酸為已由重組DNA方法產生之核 酉欠，s亥等方法包括依賴於諸如使用（例如）限制酶、同源重 '’且病母' 及其類似物選殖於載體或染色體中之人工重組之 方法’及使用聚合酶鏈反應（PCR)製得之核酸。 本發明亦係關於重組宿主細胞，其包含（一或多個）包含 編碼蛋白_抗性肽或多肽、例如由本文中所述之方法可選 擇或選擇之肽或多肽之核酸的重組核酸或表現構築體。亦 提供製造蛋白酶抗性肽或多肽之方法，其包含將本發明之 重組宿主細胞維持在適於表現蛋白酶抗性肽或多肽之條件 下。該方法必要時可進一步包含分離或回收蛋白酶抗性肽 或多狀之步驟。 舉例而言，可使用任何適合於所選擇之宿主細胞之方法 131419.doc • 86 - 200918088
(例如，轉型、轉染、電穿孔、感染），將編碼蛋白酶抗性 肽或多肽之核酸分子（亦即，一或多個核酸分子）或包含該 (等）核酸分子之表現構築體（亦即，一或多個構築體）引入 合適宿主細胞中以建立重組宿主細胞，如此核酸分子可操 作性連接於一或多個表現控制元件（例如，於載體中、於 由諸多方法在細胞中產生之構築體中、整合於宿主細胞基 因組中）。可將所得重組宿主細胞維持在適於表現（例如， 在誘導物存在下、在合適動物中、在補充有適當鹽、生長 因子、抗生素、營養增補劑等之合適培養基中）之條件 下，藉此產生經編碼之肽或多肽。必要時，可分離或回收 (例如，自動物、宿主細胞、培養基、乳汁中)經編碼之肽 或多肽。該方法涵蓋表現於轉殖基因動物之宿主細胞中 (例如參見，wo 92/03918，GenPharm⑽服如㈣）。 亦可在合適活體外表現系統中由化學合成或任何其他合 適方法產生由本文中所述之方法選擇之蛋白酶抗性肽或； 肽。因此，本發明提供蛋白酶抗性肽及多肽。 多肽、dAb及拮抗劑 如本文中所描述及例示’本發明之蛋白酶抗性_通常 以南親和力結合其㈣己位體，，在另一態樣中，提供 選擇、分離及/或回收以高親和力結合il_iri之本發明之 多肽或dAb的方法。該方法通f包含提供肽或多肽⑼如， 从)之庫或譜系、，在適於蛋白酶(例如，姨蛋白酶、彈性 =酶、白血球酶、騰酶、痰）活性之條件下使該庫或該 與蛋白酶組合，及選擇、分離及/或回收結合配位體 131419.doc -87- 200918088 (例如，靶配位體）之肽或多肽 敏感肽或多肽將會分解之條件 白酶之活性可消除具有弱結合 。因為庫或譜系已在蛋白酶 下暴露於蛋白酶中，所以蛋 親和力之不太穩定的多肽， 且從而產生高親和力結合肽或多肽之集合。舉例而言，本 發明之所選擇之多肽或dAb可以】μΜ或更強或約_碰至 f
約〇·5 ρΜ之親和力（Kd :如由表面電漿共振所測定 KD=Koff(kd)/Kon(ka))結合IL_1R1。舉例*言，本發明之高 親和力多肽或dAb可以約500 nM、約100 nM、約10 nM、 約 1 nM、約 500 PM、約 loo pM、約 1〇 pM、約 1 pM或約 0.5 pM之親和力結合IL_1R1。雖然吾人不受任何特定理論 限制，但咸k，抗蛋白酶之肽及多肽具有較低熵及/或較 高穩定能。因此，蛋白酶抗性與高親和力結合之間的相關 性可能與由本文中所述之方法所選擇之肽及及多肽及dAb 之表面緊密性及穩定性相關。 在實施例中，本發明之多肽、dAb或拮抗劑以約5〇〇 πΜ至 50 pM、或 1〇〇 nM至 50 pM、或 10 nM至 1〇〇 pM、或 1 nM至100 pM，例如50 nM或以下、或5 nM或以下、或500 pM或以下、或2〇〇 pM或以下、或1〇〇 PM或以下之抑制濃 度50(IC50)抑制IL-1與IL-1R1之結合。 在某些實施例中’多肽、dAb或拮抗劑以如由表面電衆 共振所測定300 nM至1 pM、或300 nM至5 pM、或50 nM至 1 pM、或 50 nM至 5 pM、或 50 nM至 20 pM、或約 1〇 pM、 或約15 PM、或約20 pM之解離常數（KD)特異性結合IL-1R1 ’例如人類IL_1R1且與人類IL_1R1解離。在某些實施 131419.doc -88- 200918088 例中，多肽、dAb或拮抗劑以如由表面電聚共振所測定 5x10 s 至 ΐχΐ〇、ι、或 1χΐ〇-3^ 至…〇·7^、或 ΐχΐ〇-4 s 1至 lxlO-7 s-i、或 lxl〇_5 s-丨至 1χΐ〇-7 〆、或 ΐχΐ〇、或 1x10 s之速率常數特異性結合IL_1R1，例如人類几_ 1R1且與人類IL-1R1解離。在某些實施例中，多肽、dAb 或拮抗劑以 lxl〇-3 ΜΛ·1至 lx1〇-7 、或 1χ1〇-3 Μ·!〆 f
至 1x10 6 Μ、·1、或約 1χ1〇_4 Μ、-1、或約 lx1〇_5M-ls-、 κ0η特異性結合IL-1R1，例如人類IL_1R1。在—實施例 中，夕肽、dAb或拮抗劑以如該段落中所詳細說明之解離 吊數（KD)及Kcff特異性結合il-1R1，例如人類且與 人類IL-1R1解離。在一實施例中，多肽、dAb或拮抗劑以 如該段落中所詳細說明之解離常數（Kd)及κ〇η特異性結合 IL-1R1，例如人類几-丨尺丨且與人類^尺丨解離。在一些實 施例中，多肽或dAb以如該段落中所述之Kd&/或〖。打及/或 Kon特異性結合]χ-lRi(例如，人類IL_1R1)，且包含與 DOM4-130-202之胺基酸序列（展示於圖4中）至少或至少約 80〇/〇、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96% 97°/。、98°/〇或99%—致之胺基酸序列。 可將多肽、dAb或拮抗劑表現於大腸桿菌或畢赤酵母物 種（例如，馬斯德畢赤酵母）中。在一實施例中，當表現於 大腸桿菌或畢赤酵母物種（例如，馬斯德畢赤酵母）中時， 分泌至少約0.5 mg/L之量之配位體或dAb單體。雖然當表 現於大腸桿菌或畢赤酵母物種（例如，馬斯德畢赤酵母）中 時’可分泌本文中所述之配位體及dAb單體，但其可使用 131419.doc -89- 200918088 任何合適方法產生，諸如人忐 七思“ 或不採用大腸桿菌 或畢赤酵母物種之生物產生方法。 在-些實施例中，多肽、dAb或拮抗劑不包含_免 疫球蛋白可變區域或—或多個僅為駱騎類生殖系抗體基因 片段所編碼之免疫球蛋白可變區域所特有之構架胺基酸， 例如在位置108、37、44、45及/或47處。 本發明之IL-1R1之拮抗劑可為單價或多價拮抗劑。在一 些實施例中，拮抗劑為單價且含有一個與江-^丨相互作用 之結合位點，該結合位點由本發明之多肽或dAb提供。單 價拮抗劑結合一個IL_1R1且可能不會誘導可引起受體活化 及心號轉導之細胞表面上之IL-1R1的交聯或叢集。 在其他實施例中，IL-1R1之拮抗劑為多價拮抗劑。化_ 1R1之多價拮抗劑可含有兩個或兩個以上特定IL- 1 R1結合 位點複本或含有兩個或兩個以上結合IL- 1R1之不同結合位 點’該等結合位點中之至少一個由本發明之多肽或dAb提 供。舉例而言，如本文中所述，IL- 1 R 1之拮抗劑可為包含 兩個或兩個以上結合IL-1R1之本發明之特定多肽或dAb複 本或兩個或兩個以上結合IL-1R1之本發明之不同多肽或 dAb的二聚體、三聚體或多聚體。在_實施例中，IL_1R1 之多價拮抗劑在標準細胞檢定中大體上不會激動IL-1R1(充當IL-1R1之激動劑）（亦即，當以1 nM、10 nM、100 nM、1 μΜ、10 μΜ、100 μΜ、1000 μΜ或 5,000 μΜ之濃度 存在時，在該檢定中產生不超過5%之由IL-1(100 pg/ml)誘 導的IL-1R1介導之活性）。 131419.doc -90- 200918088 在某些實施例中’ IL-1R1之多價拮抗劑含有兩個或兩個 以上IL-1R1之想要之抗原決定基或區域的結合位點。 在特定實施例中，多肽、dAb或拮抗劑在標準細胞檢定 t大體上不激動IL-1R1 (充當il- 1R1之激動劑）（亦即，當以 1 nM、1〇 nM、100 nM、1 μΜ、10 μΜ、1〇〇 μΜ、1000 μΜ或5,000 μΜ之濃度存在時，在檢定中產生不超過約5% 之由IL-1誘導之IL-1介導活性）。 在某些實施例中，當在慢性發炎性疾病模型中投與有效 量之本發明之多肽、dAb或拮抗劑時為有效的。有效量通 常為約1 mg/kg至約1〇 mg/kg(例如’約1 mg/kg、約2 mg/kg、約 3 mg/kg、約 4 mg/kg、約 5 mg/kg、約 6 mg/kg、 約 7 mg/kg、約 8 mg/kg、約 9 mg/kg或約 1〇 mg/kg)。熟習此 項技術者認為慢性發炎性疾病模型（參見w〇2〇〇6〇59丨〇8中 所述之模型）可預測在人類中之治療功效。 在其他實施例中，多肽、dAb或拮抗劑在小鼠葡聚糖硫 酸鈉（DSS)誘發之IBD模型中為有效的（關於模型詳情，參 見W0200603 8027)。舉例而言，與合適對照相比，投與有 效i之多肽、dAb或拮抗劑可使小鼠IBE) DSS模型中之平 均嚴重程度評分減小（例如）約〇」至約2 5、約〇 5至約2 5、 約1至約2.5、約1.5至約2.5或約2至約25。在另一實例中， 與合適對照相比，投與有效量之多肽、dAb或拮抗劑可使 小鼠IBD DSS模型中IBD症狀之發作延遲（例如）約i天、約2 天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約1〇天、約 14天、約21天或約28天。在另—實例巾，投與有效量之多 131419.doc •91 - 200918088 肽、dAb或拮抗劑可在小鼠IBD DSS模型中產生〇至約0.5、 約0.5至約1、約i至約1.5、約ι .5至約2或約2至約2·5之平均 嚴重程度評分。 在特定實施例中’多肽、dAb或拮抗劑在小鼠慢性阻塞 性肺疾病（COPD)煙草煙霧模型中為有效的（關於模型詳 情’參見 W02006038027 及 W02007049017)。舉例而言， 與合適對照相比’投與有效量之配位體可減小或延遲 COPD症狀之發作。 了利用可用於師選j L - 1R1之括抗劑（例如，配位體、抗 體或其結合蛋白）在預防或治療疾病中之效力的動物模型 系統。此項技術已知關於測試易感小鼠之全身性紅斑狼瘡 (SLE)之方法（Knight 等人，（1978) 乂 Exp. Med.，147: 1653 ; Reinersten等人，（1978) 五叩 j 299: 5 1 5)。藉由用來自另一物種之可溶性AchR蛋白質誘發疾病 在S JL/J雌性小鼠中測試重症肌無力（MG)(Lindstr〇rn等人， (1988) Wv. /爪则„〇/., 42: 233)。在小鼠之易感品系中藉由 注射π型膠原誘發關節炎（Stuart等人，（1984) j /mm_0/·，42: 233)。已描述藉由注射分枝桿菌熱休克蛋白 在易感大鼠中誘發佐劑關節炎之模型（Van Eden等人， (1988) iVa〜re, 331: 171)。如所述在小鼠中藉由投與甲狀 腺球蛋白誘發曱狀腺炎（Maron等人，（1980) J.五 152: 1 1 15)。胰島素依賴性糖尿病qddM)天然發生或可在 小乳之某些品系中誘發，諸如如Kanasawa等人，（1984) 27: 113中所述之胰島素依賴型糖尿病。小鼠 131419.doc -92- 200918088 及大鼠中之EAE充當人類之MS之模型。在該模型中，藉由 投與髓鞘驗性蛋白誘發脫髓鞘疾病（參見Paters〇n (1986) 〇//m卿⑽Mischer等人編，Grune and
Stratton，New York，第 179-213 頁；McFarlin等人，（1973) W繼ι 179: 478 ;及 Satoh等人，（1987) /顧關0/, 138: 179)。 本發明配位體（例如’拮抗劑）通常將以純形式與藥理學 上適當之載劑一起使用。該等載劑通常包括水性或醇性/ 水性溶液、乳液或懸浮液’任何均包括生理食鹽水及/或 緩衝介質。非經腸媒劑包括氯化鈉溶液、林格氏右旋糖 (Ringer's dextrose)、右旋糖及氣化鈉及乳酸化林格氏液 (lactated Ringer's)。必要時保持多肽複合物呈懸浮狀之合 適的生理學上可接受之佐劑可選自增稠劑，諸如羧曱基纖 維素、聚乙烯吡咯啶酮、明膠及海藻酸鹽。 猙脈内媒劑包括流體及營養物補充劑及電解質補充劑， 諸如基於林格氏右旋糖之彼等。亦可存在諸如抗菌劑、抗 氧化劑、螯合劑及惰性氣體之防腐劑及其他添加劑（Mack (1982) Remington s Pharmaceutical Sciences ’ 第 16版）。可 使用多種合適調配物，包括延緩釋放調配物。 本發明之配位體（例如，拮抗劑）可以單獨投與之組合物 形式使用或與其他藥劑結合使用。該等藥劑可包括多種免 疫治療藥物，諸如環孢素、甲胺喋呤、阿黴素或順鉑及免 疫毒素。醫藥組合物可包括多種細胞毒性劑或其他藥劑與 本發明之配位體或甚至不管在投藥之前是否彙集之具有不 131419.doc -93- 200918088 2特I·生的本發明之配位體（諸如使用不同把抗原或抗原決 定基所選擇之配位體）之組合結合的"混合物"。 本：明之醫藥組合物之投藥途徑可為一般熟習此項技術 通常已知之任一投藥途徑。對於治療(包括不限於免疫 m療）而§，可根據標準技術向任何患者投與本發明之所 選擇之配位體。 叙藥可藉由任何適當模式，包括非經腸、靜脈内、肌肉 ( 腹膜内^皮、經由肺途徑或亦適當地，藉由用導管 直接輸注。投藥劑量及頻率應視患者之年齡、性別及病 症、其他藥物之並行投與、禁忌症及臨床醫師要考慮之其 = >數而疋。如所指示，投藥可為局部(例如，藉由肺投 藥方向局部向肺傳遞’例如，鼻内投藥方向）或全身性。 本發明之配位體可料乾以便儲存且在使用之前於合適 載劑中復原。已經由習知免疫球蛋白展示該技術有效，且 可採用技術已知之;東乾及復原技術。熟習此項技術者應瞭 (解凍乾及復原可導致不同程度之抗體活性損失(例如， 對於習知免疫球蛋白而言’ IgM抗體傾向於比邮抗體具有 較大之活性損失）且可能必須上調用量來補償。 。含有本發明配位轉η口，拮抗劑）或其混合物之組合物 可出於預防性及/或治療性治療目的而投與。在某些治療 應用上中’所選擇細胞之群體足以實現至少部分抑制、抑 二調節、殺死或-些其他可量測參數之量係定義為,,治 效劑量”。達成該劑量所需之量應視疾病之嚴重程度 及心者自身免疫系統之—般狀態而定，但通常在每公斤體 1314l9.doc -94- 200918088 重0.005 mg至5_0 mg配位體（例如dAb或拮抗劑）範圍内，其 中更通币使用0.05至2.0毫克/公斤/劑量之劑量。對於預防 性應用而言’亦可以類似或稍低劑量投與含有本發明配位 體或其混合物之組合物以預防、抑制或延遲疾病發作（例 如’維持症狀緩解或靜止期，或阻止急性期）。熟練的臨 床醫師應能夠確定治療、抑止或預防疾病之適當給藥間 隔。當投與IL-1R1配位體（例如’拮抗劑）以治療、抑止或 預防慢性發炎性疾病時’可以（例如）約1〇 pg/kg至約8〇 mg/kg、約 100 pg/kg 至約 80 mg/kg、約 1 mg/kg 至約 80 mg/kg、約 1 mg/kg 至約 70 mg/kg、約 1 mg/kg 至約 60 mg/kg、約 1 mg/kg 至約 50 mg/kg、約 1 mg/kg 至約 40 mg/kg、約 1 mg/kg 至約 30 mg/kg、約 1 mg/kg 至約 20 mg/kg 、約 1 mg/kg 至約 1〇 mg/kg、約 1〇 pg/kg 至約 10 mg/kg、約 10 pg/kg 至約 5 mg/kg、約 1〇 pg/kg 至約 2.5 mg/kg、約 1 mg/kg、約 2 mg/kg、約 3 mg/kg、約 4 mg/kg、 約 5 mg/kg、約 6 mg/kg、約 7 mg/kg、約 8 mg/kg、約 9 mg/kg或約10 mg/kg之劑量每天投與至多4次、每週兩次、 每週一次、每兩週一次、每月一次或每兩月一次。在特定 實施例中’以約10 pg/kg至約1〇 mg/kg(例如，約1〇 pg/kg、約 100 pg/kg、約 1 mg/kg、約 2 mg/kg、約 3 mg/kg、約 4 mg/kg、約 5 mg/kg、約 6 mg/kg、約 7 mg/kg、 約8 mg/kg、約9 mg/kg或約10 mg/kg)之劑量每兩週一次或 母月一 _人彳又與IL -1R1配位體（例如，拮抗劑）來治療、抑土 或預防慢性發炎性疾病。 131419.doc -95- 200918088 若相對於治療之前所存在之—或多個症狀或相對於未經 該組合物或其他合適對照物治療之個體（人類或模型動物） 中之該或該等症狀，減少該或該等症狀（例如，減少至少 10%或臨床料表上之至少—個點），則認為使用本文中所 述之組合物執行之治療或療法"有效”。雖然症狀顯然將視 靶向之疾病或病症而變化，但其可由一般熟練的臨床醫師 或技師加w L該等症狀可（例如）藉由監測疾病或病症 之：或多個生化指標之含量(例如，與疾病、感染細胞數 目等相關之酶或代謝物之含量）、藉由監測物理表現症狀 (例如，發炎、腫瘤尺寸等）或藉由公認之臨床評定表量 、則°亥等°平疋表例如為擴展殘疾狀況評分表（Expanded Disability Status Scale)(對於多發性硬化症）、歐文發炎性 腸疾病里表（Irvine Inflarnmat〇ry Bowel Disease QU__aire)(關於腸功能、全身性症狀、社會職能及感 清狀〜、之32點s平定評估生活品質：評分在32至範圍 内其中較尚#分指示較佳生活品質）、類風濕性關節炎 生活品質表（QuaHty of Life Rheumatoid Arthritis Scale)或 如該領域中已知之其他公認之臨床評定表。至少10〇/〇或給 定"床表上之一或多個點之疾病或病症症狀之維持（例 如 天或一天以上或更長）減少指示”有效”治療。類似 也右相對於未經組合物治療之類似個體（人類或動物模 型）中之一或多個症狀，延遲、減少或消除該或該等症狀 A乍或嚴重釦度，則使用如本文中所述之組合物所執行 之預防"有效”。 131419.doc -96- 200918088 含有本發明之配位體（例如，拮抗劑）或其混合物之組合 物可在預防性及治療性情形下使用以幫助改變、滅活、殺 死或移除哺乳動物中所選擇之靶細胞群體。另外，可離體 或活體外選擇性使用本文中所述之所選擇之多肽譜系以殺 死、排除或自細胞之異源集合有效移除靶細胞群體。可使 哺乳動物之血液與配位體離體組合，藉此根據標準技術殺 死或自血液移除不想要之細胞從而將血液送回至哺乳動物 中。 s有本發明之配位體（例如，拮抗劑）之組合物可在預防 性及治療性情形下使用以幫助改變、滅活、殺死或移除哺 乳動物t所選擇之無細胞群體。 配位體（例如，抗IL_1R1拮抗劑、dAb單體）可與一或多 種其他m療或活性劑一起投與及/或調配。當配位體（例 如，dAb)與其他治療劑一起投與時，配位體可在投與其他 藥劑之前、與其同時或在其之後投與。配位體及其他藥劑 通常以提供疊加治療效應之方式投與。 在實把例中，本發明為治療、抑止或預防慢性發炎性 疾病之方法，該方法包含向有需要之哺乳動物投與治療有 效劑量或量之本發明之多肽、dAb或il_iri之结抗劑。 在實把例中，本發明為治療、抑止或預防關節炎（例 如，類風濕性關Μ、幼年型類風濕性關節炎、強直性脊 椎炎、牛皮癖性關節炎)之方法，該方法包含向有需要之 甫礼動物投與冶療有效劑量或量之本發明之多肽、⑽或 IL-1R1之结抗劑。 131419.doc -97- 200918088 在另一實施例中，本發明為治療、抑止或預防牛皮癬之 方法*亥方法包含向有需要之哺乳動物投與治療有效劑量 或里之本發明之多肽、dAb或IL-1R1之拮抗劑。 在另實施例中’本發明為治療、抑止或預防發炎性腸 疾病（例如，克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎）之方法，該方法 包，向有需要之哺乳動物投與治療有效劑量或量之本發明 之多肽、dAb或IL-1R1之拮抗劑。 在另一實施例中，本發明為治療、抑止或預防慢性阻塞 性肺疾病(例慢性支氣管炎、慢性阻塞性支氣管炎： 肺孔腫）之方法，該方法包含向有需要之哺乳動物投與治 療有效劑量或量之本發明之多肽、dAb或IL-1R1之枯二 在另一實施例中 如，細菌性肺炎 pneumonia))之方法 治療有效劑量或量 劑0 ，本發明為治療、抑止或預防肺炎（例 諸如葡萄球菌肺炎（Staphyiococcal ，該方法包含向有需要之哺乳動物投與 之本發明之多肽、dAb或IL-1R1之拮抗 炎 預 固 療 法 量 、發明提供治療、抑止或預防除慢性阻塞性肺疾病及肺 以外之其他肺疾病之方法。根據本發明可治療、抑止或 =其他肺疾病包括（例如）囊性纖維化及哮喘（例如，類 知抗性哮喘）。因& ’在另一實施例中，本發明為户 、抑止或預防肺疾病(例如，囊性纖維化、哮喘)之： 之向有需要之哺㈣物投與治療有效劑量或 之本么明之多肽、dAb或IL_1R1之拮抗劑。 1314I9.doc •98- 200918088 在特疋實施例中，ττ 1 p】々& > R1之払抗劑係經由肺傳遞、諸如 曰D入（例如’支氣管内、鼻内或經口吸入、鼻内滴 :與或藉由全身傳遞(例如，非經腸、靜脈内、肌肉：、 腹膜内、皮下）投與。 券古法實施例中’本發明為治療、抑止或預防敗血性休 戈曰之含向有需要之哺乳動物投與治療有效 “或1之本發明之多肽、dAb或IL_1R1之拮抗劑。 在本發明之另一離梯 i m^ ^ 〜、樣中k供一種組合物，其包含本發 ' 明之多肽、dAb或IL_]R1夕+士 >矛， -飞比1R丨之拮抗劑及醫藥學上可接 劑 '稀釋劑或賦形劑。 執 此外’本發明提供使用本發明之多肽、dAb或IL_1R1之 劑或組合物治療疾病之方法。在一實施例中，該疾病 ，或發炎性疾病，例如類風濕性關節炎、哮喘或克羅 恩氏病。 格式 半衰期增加可適用於φ、成i i 於免疚球蛋白、尤其抗體且最尤其小 尺寸抗體片段之活體内應 ’、 m 3寺片段（Fv、雙硫鍵鍵結 之卜、^、咖、_)遭遇自身體内之快速清除；因 此’雖然其能夠快速到達身體之大部分且快速產生且易於 處理仁其活體内應用因其僅短暫之活體内持久性而受到 限制。本發明之-igt ±U J \ A*- 貫包例错由提供活體内半衰期增加因此 在身體内具有持續時間較長之配位體功能活性之配位 解決該問題。 &習此項技*者應熟悉藥物動力學分析及配位體半衰期 131419.doc •99· 200918088 之測定之方法。詳情可見於尺d等人，Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists 反 Peters 專尺 ’ Phannacokinetc analysis: A Practical Approach (1996)。亦參考"Pharmacokinetics"，M Gibaldi及 D Perron，由Marcel Dekker出版，第2修訂附加版（Rev· ex edition)(1982)，其描述藥物動力學參數，諸如1〇1及邙半衰 期及曲線下面積（AUC)。 半衰期α及以β)及AUC可由配位體之血清濃度對時 間之曲線確定。可使用WinNonlin軟體套件（自pharsight C〇fp·，Mountain View，CA94040, USA獲得）模擬曲線。在 第一期（α期）中，配位體主要分布於患者中，其中部分消 除。第二期（β期）為末期，此時配位體已分布且血清濃度配 位體隨著自患者中清除配位體而降低。tcc半衰期為第一期 之半衰期且ίβ半衰期為第二期之半衰期。因此，在一實施 例中’本發明提供ta半衰期在丨5分鐘或以上範圍内之配位 體或包含本發明之配位體的組合物。在一實施例中，範圍 之下限為30分鐘、45分鐘、H、時、2小時、3小時、4小 時' 5小時、6小時、7小時、1叫時、11小時或U小時。 卜或/、他本發明之配位體或組合物應具有在至多丨2小 時且包括12小時範圍内之ta半衰期。在一實施例中，範圍 為"，”、"、…终合適範圍之實例 為至6小時、2至5小時或3至4小時。 :-實施例中’本發明提供料衰期在2 圍内之之配位體（多狀、dAb或括抗劑）或包含本發明二 1314l9.doc 200918088 位體的組口物。在一實施例中，範圍之下限為3小時、4小 夺5 J $ 6小時、7小時、1 〇小時、11小時或12小時。 另外或其他，本發明夕^ $月之配位體或組合物具有在至多21天且 包括21天範圍内之〖β束奋& I3牛农期。在一實施例中，範圍之上限 為12小時、24小時、9._ . 町2天、3天、5天、10天、15天或20 天在實知例中，本發明之配位體或組合物應具有1 2至 60小hfc圍内之ίβ半衰期。在另—實施例中，其應在12至 48小時範圍内。在又—實施例中，其應在丨2至％小時範圍 内。 除以上標準以外或其他，本發明提供AUC值（曲線下面 積）在1 mg . min/ml或以上範圍内之配位體或包含本發明之 配位體之組合物在一實施例中’範圍之下限為5、1 〇、 15、20、30、100、200 或 300 mg. min/ml。另外或其他， 本發明之配位體或組合物具有在至多600 mg . min/ml範圍 内之AUC。在一實施例中，範圍之上限為5〇〇、400、 300、200、150、100、75 或 50 mg’min/ml。在一實施例 中’本發明之配位體應具有在選自由以下各範圍組成之群 之範圍内之 AUC : 15 至 150 mg . min/ml、15 至 100 mg . min/ml、15 至 75 mg· min/ml及 1 5 至 50 mg · min/ml。 本發明之多肽及dAb及包含該等多肽及dAb之拮抗劑可 經編排格式以具有較大流體動力學尺寸，例如，藉由連接 PEG基團、血清白蛋白、轉鐵蛋白、轉鐵蛋白受體或至少 其轉鐵蛋白結合部分、抗體Fc區’或藉由接合抗體區域。 舉例而言，多狀、dAb及结抗劑經編排格式為抗體之較大 131419.doc -101 - 200918088 抗原結合片段或抗體（例如，經編排格式為Fab、Fab'、 F〇b)2、F(ab，)2、IgG、scfv)。 可使用此項技術中熟知之方法測定本發明之配位體（例 如’ dAb單體及多聚體）之流體動力學尺寸。舉例而言，可 使用凝膠過濾層析法測定配位體之流體動力學尺寸。諸如 交聯遣脂糖基質之用於測定配位體之流體動力學尺寸之合 適凝膠過濾基質為吾人所熟知且可容易地獲得。 配位體格式之尺寸（例如，連接於dAb單體之PEG部分之 尺寸）可視想要之應用而變化。舉例而言，當配位體意欲 離開循環且進入周邊組織時，希望保持配位體之流體動力 子尺寸較低以有助於自血流外溢。或者，當希望使配位體 保留在體循環中較長時間時，可（例如）藉由編排格式為。 樣蛋白增加配位體尺寸。 藉由乾向增加活趙内半衰期之抗原或抗原蚊基延長半衰期
如本文中所述，亦可藉由使本發明之il_iri結合多肽、 dAb或拮抗劑與結合增加活體内半衰期之抗原或抗原決定 基的結合區域（例如，抗體或抗體片段）接合或締合來增加 配位體之流體動力學尺寸及其血清半衰期。舉例而言，可 使！L.結合劑（例如，多肽）與抗血清白蛋白或抗新生兒 Fc文體抗體或抗體片段(例如’抗sa或抗新生兒pc受體 dAb、Fab、Fab，或scFv)或與抗从親和體或抗新生兒卜受 體親和體或抗SA avi黯或抗SA結合區域接合或連接，咳 抗SA結合區域包含選自（但較佳不限於）由以下各物組成二 群之骨条.CTLA-4、脂質運載蛋白，a、親和體、 131419.doc -102- 200918088 avimer、GroEl及纖維連接蛋白（參見，2〇〇8年2月8日申請 之揭示該等結合區域之PCT/GB2008/000453，該等區域及 其序列以引用之方式併入本文中且構成本發明正文之揭示 内容之一部分）。接合物係指包含鍵結（共價或非共價）於結 合血清白蛋白之結合區域的本發明之多肽、dAb或拮抗劑 之組合物。 增加活體内也清半衰期之合適多肽包括（例如）轉鐵蛋白 受體特異性配位體-神經藥劑融合蛋白（參見美國專利第 5,977,3 07號，其教示内容以引用之方式併入本文中卜腦 毛細血管内皮細胞受體、轉鐵蛋白、轉鐵蛋白受體（例 如，可溶性轉鐵蛋白受體）、胰島素、胰島素樣生長因子 i(igf 1)受體、胰島素樣生長因子2(IGF2)受體、胰島素受 體、血凝因子X、抗胰蛋白酶及HNF u。增加血清半 衰期之合適多肽亦包括〜丨醣蛋白（血清類黏蛋白；aag)、 α-l抗凝乳蛋白酶（ACT)、α]微球蛋白（蛋白質hc ; AIM)、抗凝血酶ΠΙ(ΑΤηυ、脫脂蛋白A_1(Apo Α_υ、脫脂 蛋白Β(Αρο Β)、血漿鋼藍蛋白（Cp)、互補組分、互 補組分C4(C4)、C1酯酶抑制劑（C1 INH)、c_反應蛋白 (CRP)、鐵蛋白（FER)、血液結合素（Ηρχ)、脂蛋白 (a)(Lp(a))、甘露糖結合蛋白（ΜΒρ)、肌血球素（_〇)、前 白蛋白（曱狀腺素運送蛋白；PAL)、視黃醇結合蛋白（RBp) 及類風濕因子（RF)。 來自細胞外基質之合適蛋白質包括（例如）膠原、層黏連 蛋白、整合素及纖維連接蛋自。膠原為細胞外基f之主要 131419.doc •103- 200918088 蛋白質。目前已知約15種類型之膠原分子，可見於身體之 不同部位，例如I型膠原（佔體膠原之9〇%)可見於骨、皮 膚、腱、韌帶、角膜、内臟中或„型膠原可見於軟骨、脊 椎盤、脊索及眼睛玻璃狀液中。 血液之合適蛋白質包括（例如）血漿蛋白（例如，纖維蛋 白、心2巨球蛋白、血清白蛋白、纖維蛋白原(例如，纖維 蛋白原A、纖維蛋白原B)、血清澱粉樣蛋白八、結合珠蛋 , 白、前纖維蛋白（Pr〇⑴出）、泛素、子宮球蛋白及β_2-微球 蛋白）、酶及酶抑制劑（例如，纖溶酶原、溶菌酶、半胱胺 酸蛋白酶抑制劑C(cyStatin C)、α-l-抗胰蛋白酶及胰腺胰 蛋白酶抑制劑）、免疫系統蛋白質，諸如免疫球蛋白蛋白 質（例如、IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、免疫球蛋白輕鏈 (κ/λ))、轉運蛋白（例如，視黃醇結合蛋白、心丨微球蛋 白）、防禦素（defensin)(例如，β-防禦素i、嗜中性白血球 防禦素1、嗜中性白血球防禦素2及嗜中性白血球防禦素3) 及其類似物。 ί \ 血腦屏障或神經組織中可見之合適蛋白質包括（例如）黑 色素皮質素受體、髓磷脂、抗壞血酸轉運體及其類似物。 增加活體内血清半衰期之合適多肽亦包括位於腎中之蛋 白貝（例如’多囊蛋白（P〇lyCystin)、IV型膠原、有機陰離 子轉運體K1、海曼氏抗原（Heymann’s antigen))、位於肝中 之蛋白質（例如’乙醇脫氫酶、G250)、位於肺t之蛋白質 (例如’結合IgA之分泌組分）、位於心臟中之蛋白質（例 如’與擴張性心肌病相關之HSP 27)、位於皮膚之蛋白質 131419.doc •104- 200918088 (例如，角蛋白）、骨特異性蛋白質（諸如促㈣生成之蛋白 質（BMP) ’其為顯示成骨活性之蛋白質之轉化生長因子咏 家族的子集（例如，ΒΜΡ·2、BMp_4、bMP 5、bmP 6 : BMP-7、BMP,、腫瘤特異性蛋白f (例如，滋養母細胞 抗原、賀癌平受體（h⑽eptin reeeptQr)、雌激素受體、組 織蛋白酶（例如，可見於肝及脾中之組織蛋白酶…
合適之疾病特異性蛋白質包括（例如）僅表現於活化Τ'細 胞上之抗原（包括LAG-3(淋巴細胞活化基因））、骨保護素 配位體（OPGL ;參見跑4〇2，3〇4_3〇9 (mg))、 〇X4〇(™M體家族之成員，表現於活化T細胞上且尤其在 I型人類T細胞白企病病毒（町叫）產生細胞中上調；參見 /⑽165 (1):263-7〇 (2〇〇〇))。合適之疾病特異性蛋白 質亦包括（例如）金屬蛋白酶（metaU〇pr〇tease)(與關節炎/癌 症相關）’包括CG0512果蠅、人類截癱蛋白（paraplegin)、 人類FtsH、人類AFG3L2、鼠類ftsH ;及血管生成生長因 子，包括酸性纖維母細胞生長因子（FG^)、驗性纖維母 細胞生長因子（FGF-2)、血管内皮生長因子/血管滲透因子 (VEGF/VPF)、轉化生長因子_a(TGF幻、腫瘤壞死因子_ a(TNF-a)、血管生長素（angi〇genin)、介白素 _3(IL_3)、介 白素-8(IL-8)、血小板源内皮生長因子（pD_ECGF)、胎盤生 長因子（P1GF)、中期因子血小板源生長因子_BB(pDGF)及 弗拉塔凱。 增加活體内灰清半衰期之合適多肽亦包括應力蛋白，諸 如熱休克蛋白（HSP)。HSP通常在細胞内可見。當其細胞 131419.doc -105- 200918088 外可見時，其為細胞已死亡且溢出其内含物之指示。因外 傷、疾病或損傷，發生該未計劃之細胞死亡（壞死），細胞 外HSP引發免疫系統之反應。與細胞外HSP之結合可使得 使本發明之組合物定位於疾病部位。 涉及Fc轉運之合適蛋白質包括（例如）布蘭貝爾受體 (Brambell recept〇r)(亦稱為FcRB)。Fc受體具有兩種功能， 兩者均潛在適用於傳遞。該等功能為（1)自母體穿過胎盤轉 運IgG至小孩’（2)保護lg〇以免降解，從而延長其血清半 衰期。認為受體使IgG自核内體再循環。（參見，Holliger 專尺，Nat Biotechnol \5(7).·63>2-6 (\99Ί)。、 結合血清白蛋白之d Ab 在一實施例中，本發明提供一種包含結合IL_1R1之抗 IL-1R1 dAb(第一 dAb)及結合血清白蛋白（SA)之第二dAb之 多狀或拮抗劑（例如，雙特異性配位體），該第二dAb以如 由表面電漿共振所測定1 nM至1、2、3、4、5、1〇、20、 30、40、50、60、70、1〇〇、2〇〇、300、4〇〇 或 5〇〇 _(亦 即，xlO 9至 5xl〇·4)或 1〇〇 心至 1〇 μΜ、或 μΜ、或 3至 70 nM、或ΙΟηΜ至1、2、3、4或5 μΜ之KD結合SA。舉例 而言，如由表面電漿共振所測定3〇至7〇 。在一實施例 中第dAb(或dAb單體）以如由表面血漿共振所測定約 1、50、70、100、15〇、2〇〇、3〇〇 nM或 i、2 或 3 _之。 結合SA(例如，HSA)。在一實施例中，對於包含第—抗sa dAb及第二抗IL-lRl dAb之雙特異性配位體而言，第二 dAb對其靶之親和力（例如，如由表面電漿共振、例如使用 13I419.doc -106 - 200918088
BiaCore所量測，KD及/或Koff)為第一 dAb對SA之親和力的1 至 100000倍（例如，1〇〇 至 1〇〇〇〇〇、或 1〇〇〇至1〇〇〇〇〇、或 10000至100000倍）。在一實施例中，血清白蛋白為人類血 清白蛋白（HS A)。舉例而言，第一 dAb以約10 μΜ之親和力 結合SA ’而第二dAb以100 ρΜ之親和力結合其靶。在一實 施例中’血清白蛋白為人類血清白蛋白。在一實施 例中’第一 dAb 以約 50 nM，例如 70、100、150 或 200 ιιΜ 之KD結合S A(例如，HSA)。雙特異性配位體之詳情可見於 W003002609、W004003019及 W004058821 中。 在一實施例中，本發明之配位體可包含以如由所表面電 漿共振測定 1 nM 至 1、2、3、4、5、10、20、30、40、 50、60、70、100、200、300、400或 500 μΜ(亦即，χΙΟ·9 至 5χ1(Τ4)或 100 nM 至 10 μΜ、或 1至 5 μΜ、或 3至 70 nM、 或10nM至1、2、3、4或5 μΜ之KD結合血清白蛋白（SA)之 dAb。舉例而言，如由表面電漿共振所測定3〇至70 nM。 在一實施例中，第一dAb(或dAb單體）以如由表面血漿共振 所測定約 1、50、70、100、150、200、300 nM或 1、2 或 3 μΜ之KD結合SA(例如，HSA)。在一實施例中，第一及第 二dAb由連接子連接，例如1至4個胺基酸或1至3個胺基酸 或超過3個胺基酸或超過4、5、6、7、8、9、10、15或20 個胺基酸之連接子。在一實施例中，使用較長連接子（超 過3個胺基酸）增加效價（拮抗劑中之一個或兩個dAb之 KD)。 在配位體及拮抗劑之特定實施例中，dAb結合人類血清 131419.doc •107- 200918088 白蛋白且與選自由以下各物組成之群之dAb競爭以結合白 蛋白： MSA-16、MSA-26(關於該等序列之揭示内容，參見 W004003019，該等序列及其核酸對應物以引用之方式併 入本文中且構成本發明正文之揭示内容的一部分）， DOM7m-16(SEQ ID NO: 473) ' DOM7m-12(SEQ ID NO: 474)、DOM7m-26(SEQ ID NO: 475)、DOM7r-l(SEQ ID NO: 476)、DOM7r-3(SEQ ID NO: 477)、DOM7r-4(SEQ ID NO: 478)、DOM7r-5(SEQ ID NO: 479)、DOM7r-7(SEQ ID NO: 480) ' DOM7r-8(SEQ ID NO: 481) > DOM7h-2(SEQ ID NO: 482)、DOM7h-3(SEQ ID NO: 483)、DOM7h-4(SEQ ID NO: 484)、DOM7h-6(SEQ ID NO: 485)、DOM7h-l(SEQ ID NO: 486)、DOM7h-7(SEQ ID NO: 487)、DOM7h-22(SEQ ID NO: 489)、DOM7h-23(SEQ ID NO: 490)、DOM7h- 24(SEQ ID NO: 491)、DOM7h-25(SEQ ID NO: 492)、 DOM7h-26(SEQ ID NO: 493)、DOM7h-21(SEQ ID NO: 494)、DOM7h-27(SEQ ID NO: 495)、DOM7h-8(SEQ ID NO: 496)、DOM7r-13(SEQ ID NO: 497)、DOM7r-14(SEQ ID NO: 498)、DOM7r-15(SEQ ID NO: 499)、DOM7r- 16(SEQ ID NO: 500)、DOM7r-17(SEQ ID NO: 501)、 DOM7r-18(SEQ ID NO: 502)、DOM7r-19(SEQ ID NO: 503)、DOM7r-20(SEQ ID NO: 504)、DOM7r-21(SEQ ID NO: 505) ' DOM7r-22(SEQ ID NO: 506)、DOM7r-23(SEQ ID NO: 507)、DOM7r-24(SEQ ID NO: 508)、DOM7r- 131419.doc -108- 200918088 25(SEQ ID NO: 509)、DOM7r-26(SEQ ID NO: 510)、 DOM7r-27(SEQ ID NO: 511) > DOM7r-28(SEQ ID NO: 512) ' DOM7r-29(SEQ ID NO: 513)、DOM7r-30(SEQ ID NO: 514)、DOM7r-31(SEQ ID NO: 515)、DOM7r-32(SEQ 10 1^0:516)、00^171*-33(8£(5 10!^0:517)(關於該等序列 之揭示内容，參見W02007080392，該等序列及其核酸對 應物以引用之方式併入本文中且構成本發明正文之揭示内 容的一部分；該段落中之SEQ ID No為W02007080392中所 出現之SEQ ID No)， dAb8(dAb 10)、dAb 10、dAb36、dAb7r20(DOM7r20)、 dAb7r21(DOM7r21) 、 dAb7r22(DOM7r22) 、 dAb7r23(DOM7r23) 、 dAb7r24(DOM7r24) 、 dAb7r25(DOM7r25) 、 dAb7r26(DOM7r26) 、 dAb7r27(DOM7r27) 、 dAb7r28(DOM7r28) 、 dAb7r29(DOM7r29) 、 dAb7r29(DOM7r29) 、 dAb7r31(DOM7r31) 、 dAb7r32(DOM7r32) 、 dAb7r33(DOM7r33) 、 dAb7r3 3(DOM7r33) 、 dAb7h22(DOM7h22) 、 dAb7h23 (DOM7h23) 、 dAb7h24(DOM7h24) 、 dAb7h25(DOM7h25) 、 dAb7h26(DOM7h26) 、 dAb7h27(DOM7h27) 、 dAb7h30(DOM7h30)、dAb7h3 1 (DOM7h3 1)、dAb2(dAb4、 dAb7 、 dAb41) 、 dAb4 、 dAb7 、 dAbl 1 、 dAbl2(dAb7ml2) 、 dAbl3(dAb 15) 、 dAb 15 、 dAbl6(dAb21 、dAb7ml6) 、dAb 17、dAbl8、dAbl9、 131419.doc -109- 200918088 dAb21 、dAb22 、dAb23 、dAb24 、dAb25(dAb26、 dAb7m26)、dAb27、dAb30(dAb35)、dAb31、dAb33、 dAb34 ' dAb35、dAb38(dAb54)、dAb41、dAb46(dAb 47、 dAb 52 及 dAb 56)、dAb47、dAb52、dAb53、dAb54、 dAb5 5 、 dAb56、dAb7m 12、dAb7m 16、dAb7m26、 dAb7rl(DOM7rl)、dAb7r3(DOM7r3)、dAb7r4(DOM7r4)、 dAb7r5(DOM7r5)、dAb7r7(DOM7r7)、dAb7r8(DOM7r8)、 dAb7rl3(DOM7rl3) 、 dAb7r 14(DOM7rl 4) 、 dAb7rl5(DOM7rl5) 、 dAb7r 1 6(DOM7r 1 6) 、 dAb7rl7(DOM7rl7) 、 dAb7r 18(DOM7r 18) 、 dAb7rl9(DOM7rl9) 、 dAb7h 1 (DOM7h 1) 、 dAb7h2(DOM7h2) 、 dAb7h6(DOM7h6) 、 dAb7h7(DOM7h7) 、 dAb7h8(DOM7h8) 、 dAb7h9(DOM7h9) 、 dAb7h 10(DOM7h 10) 、 dAb7hl l(DOM7hl 1) 、 dAb7hl2(DOM7hl2) 、 dAb7hl3(DOM7hl3) 、 dAb7hl 4(DOM7h 14) 、 dAb7pl(DOM7pl)及 dAb7p2(DOM7p2)(關於該等序列之揭 示内容，參見2008年2月8日申請之PCT/GB2008/000453， 該等序列及其核酸對應物以引用之方式併入本文中且構成 本發明正文之揭示内容之一部分）。dAb後之括號中展示替 代名稱，例如dAb8具有替代名稱dAblO，亦即 dAb8(dAbl0)。該等序列亦陳述於圖51a及b中。 在某些實施例中，dAb結合人類血清白蛋白且包含與選 自由以下各物組成之群之dAb的胺基酸序列具有至少約 131419.doc -110- 200918088 80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%、或至 少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少約99%之 胺基酸序列一致性的胺基酸序列： MSA-16、MSA-26、 DOM7m-16(SEQ ID NO: 473) ' DOM7m-12(SEQ ID NO: 474)、DOM7m-26(SEQ ID NO: 475)、DOM7r-l(SEQ ID NO: 476) ' DOM7r-3(SEQ ID NO: 477) > DOM7r-4(SEQ ID NO: 478)、DOM7r-5(SEQ ID NO: 479)、DOM7r-7(SEQ ID NO: 480)、DOM7r-8(SEQ ID NO: 481)、DOM7h-2(SEQ ID NO: 482)、DOM7h-3(SEQ ID NO: 483)、DOM7h-4(SEQ ID NO: 484)、DOM7h-6(SEQ ID NO: 485)、DOM7h-l(SEQ ID NO: 486)、DOM7h-7(SEQ ID NO: 487)、DOM7h-22(SEQ ID NO: 489)、DOM7h-23(SEQ ID NO: 490)、DOM7h-24(SEQ ID NO: 491)、DOM7h-25(SEQ ID NO: 492)、 DOM7h-26(SEQ ID NO: 493) > DOM7h-21(SEQ ID NO: 494)、DOM7h-27(SEQ ID NO: 495)、DOM7h-8(SEQ ID NO: 496)、DOM7r-13(SEQ ID NO: 497)、DOM7r-14(SEQ ID NO: 498)、DOM7r-15(SEQ ID NO: 499)、DOM7r-16(SEQ ID NO: 500)、DOM7r-17(SEQ ID NO: 501)、 DOM7r-18(SEQ ID NO: 502)、DOM7r-19(SEQ ID NO: 503)、DOM7r-20(SEQ ID NO: 504)、DOM7r-21(SEQ ID NO: 505)、DOM7r-22(SEQ ID NO: 506)、DOM7r-23(SEQ ID NO: 507)、DOM7r-24(SEQ ID NO: 508) > DOM7r-25(SEQ ID NO: 509)、DOM7r-26(SEQ ID NO: 510)、 131419.doc -Ill - 200918088 DOM7r-27(SEQ ID NO: 511) ' DOM7r-28(SEQ ID NO: 512)、DOM7r-29(SEQ ID NO: 513)、DOM7r-30(SEQ ID NO: 514)、DOM7r-31(SEQ ID NO: 515)、DOM7r-32(SEQ IDNO:516)、DOM7r_3 3(SEQIDNO:517)(該段落中之 SEQ ID No為 W02007080392 中所出現之SEQ ID No)， dAb8 、dAb 10 、dAb36 、dAb7r20 、dAb7r21 、 dAb7r22、dAb7r23、dAb7r24、dAb7r25、dAb7r26、 dAb7r27、dAb7r28 ' dAb7r29、dAb7r30、dAb7r31、 dAb7r32、dAb7r33、dAb7h21、dAb7h22、dAb7h23、 Ab7h24 、 Ab7h25 、 Ab7h26 、 dAb7h27 、 dAb7h30 、 dAb7h31 、dAb2 、dAb4 、 dAb7、 dAbll 、 dAbl2 > dAb 13、 dAb 15 ' dAbl6 、 dAbl7 、 dAbl8 、 dAbl9 、 dAb21 、 dAb22、 dAb23 、 dAb24 ' dAb25 、 dAb26 、 dAb27 、 dAb30 、 dAb31 、 dAb33、 dAb34、 dAb35、 dAb38 、 dAb41 、 dAb46 、 dAb47 、 dAb52 、 dAb53 、 dAb54 dAb55 dAb56 dAb7m 12 dAb7ml 6 dAb7m26、dAb7rl、dAb7r3、dAb7r4、dAb7r5、dAb7r7、 dAb7r8、dAb7rl3、dAb7rl4、dAb7rl5、dAb7rl6、 dAb7rl7、dAb7rl8、dAb7rl9、dAb7hl 、dAb7h2、 dAb7h6 、dAb7h7 、dAb7h8 、dAb7h9 、dAb7hlO 、 dAb7hl1 、 dAb7hl2 、 dAb7hl3 、 dAb7hl4 、 dAb7pl 及 dAb7p2 ° 舉例而言，結合人類血清白蛋白之dAb可包含與以下各 物具有至少約90%、或至少約95%、或至少約96%、或至 131419.doc -112- 200918088
少約97°/。、或至少約98%、或至少約99%之胺基酸序列一 致性的胺基酸序列：00]\4711-2(8£(5 10 1^0:482)、00]^711-3(SEQ ID NO:483) ' DOM7h-4(SEQ ID NO:484) ' DOM7h-6(SEQIDNO:485)、DOM7h-l(SEQIDNO:486)、DOM7h-7(SEQ ID NO:487) ' DOM7h-8(SEQ ID NO:496) ' DOM7r-13(SEQ ID NO:497)、DOM7r-14(SEQ ID NO:498)、 DOM7h-22(SEQ ID NO:489) 、 DOM7h-23(SEQ ID NO:490)、DOM7h-24(SEQ ID NO:491)、DOM7h-25(SEQ ID NO:492) ' DOM7h-26(SEQ ID NO:493) > DOM7h-21(SEQ ID NO:494)' DOM7h-27(SEQ ID NO:495)(該段落 中之 SEQ ID No為 W02007080392 中所出現之 SEQ ID No)， dAb8 、dAb 10、dAb36、dAb7h21 、 dAb7h22、 dAb7h23 、 Ab7h24 、 Ab7h25 、 Ab7h26 、 dAb7h27 、 dAb7h30、dAb7h31、dAb2、dAb4、dAb7、dAbll、dAb 12、dAb 13、dAb 15 ' dAb 16 ' dAbl7、dAbl8、dAbl9、 dAb21、dAb22、dAb23、dAb24 、 dAb25、dAb26、 dAb27、dAb30、dAb31、dAb33、dAb34、dAb35、 dAb38、dAb41、dAb46、dAb47、dAb52、dAb53、 dAb54、dAb55、dAb56 > dAb7hl、dAb7h2、dAb7h6、 dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、dAb7hlO、dAb7hll 、 dAb7hl2、dAb7hl3及 dAb7hl4 ° 在某些實施例中，dAb結合人類血清白蛋白且包含與選 自由以下各物組成之群之dAb的胺基酸序列具有至少約 80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%、或至 131419.doc -113- 200918088 少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少約99%之 胺基酸序列一致性的胺基酸序列：
DOM7h-2(SEQ ID NO:482) 、 DOM7h-6(SEQ ID NO:485)、DOM7h-l(SEQ ID NO:486)、DOM7h-7(SEQ ID NO:487)、DOM7h-8(SEQ ID NO:496)、DOM7h-22(SEQ ID NO:489)、DOM7h-23(SEQ ID NO:490)、DOM7h-24(SEQ ID NO:491)、DOM7h-25(SEQIDNO:492)、DOM7h-26(SEQ ID NO:493)、DOM7h-21(SEQ ID NO:494)、 DOM7h-27(SEQ ID NO:495)(該段落中之 SEQ ID No 為 W02007080392中所出現之 SEQ ID No)， dAb7h21 、 dAb7h22 、 dAb7h23 、 Ab7h24 、 Ab7h25 、 Ab7h26 ' dAb7h27、dAb7h30、dAb7h31、dAb2 ' dAb4、 dAb7、dAb38、dAb41、dAb7hl、dAb7h2、dAb7h6、 dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、dAb7hlO、dAb7hll 、 dAb7hl2、dAb7hl3及 dAb7hl4。 在更特定實施例中，dAb為結合人類血清白蛋白且具有 選自由以下各物組成之群之胺基酸序列的VK dAb :
DOM7h-2(SEQ ID NO:482) 、 DOM7h-6(SEQ ID NO:485)、DOM7h-l(SEQ ID NO:486)、DOM7h-7(SEQ ID NO:487)、DOM7h-8(SEQ ID NO:496)(該段落中之SEQ ID No為 W020070 803 92 中所出現之SEQ ID No)， dAb2、dAb4、dAb7、dAb38、dAb41 、dAb54、 dAb7hl 、 dAb7h2 、 dAb7h6 、 dAb7h7 、 dAb7h8 、 dAb7h9 、 dAb7hlO、dAb7hll、dAb7hl2、dAb7hl3及 dAb7hl4。 131419.doc -114- 200918088 在更特定實施例中，dAb為結合人類血清白蛋白且具有 選自dAb7h3 0及dAb7h31之胺基酸序列的VH dAb。 在更特定實施例中，dAb為dAb7hl 1或dAb7hl4。 在其他實施例中，dAb、配位體或拮抗劑結合人類血清 白蛋白且包含任何上述胺基酸序列中之一、兩或三個 CDR，例如dAb7hll或dAb7hl4中之一、兩或三個CDR。
結合血清白蛋白之合適駱駝類VHH包括WO 2004/041862(Ablynx N.V.)及 W02007080392 中所揭示之彼 等V Η Η (該等V Η Η序列及其核酸對應物以引用之方式併入本 文中且構成本發明正文之揭示内容之一部分），諸如序列 A(SEQ ID ΝΟ:518)、序列 B(SEQ ID ΝΟ:519)、序列 C(SEQ ID NO:520)、序列 D(SEQ ID NO:521)、序列 E(SEQ ID NO:522)、序列 F(SEQ ID NO:523)、序列 G(SEQ ID
NO:524)、序列 H(SEQ ID NO:525)、序列 I(SEQ ID
NO:526)、序列 J(SEQ ID NO:527)、序列 K(SEQ ID
NO:528)、序歹ij L(SEQ ID NO:529)、序歹ij M(SEQ ID
NO:530)、序列 N(SEQ ID NO:531)、序列 0(SEQ ID
NO:532)、序列 P(SEQ ID NO:533)、序列 Q(SEQ ID NO:534)，該等序列號對應於W02007080392或WO 2004/041862(Ablynx N.V.)中所引用之序列號。在某些實 施例中，駱駝類VHH結合人類血清白蛋白且包含與 W02007080392 中所揭示之 ALB 1 或 SEQ ID NOS:518-534 中之任何一個具有至少約80°/。、或至少約85%、或至少約 90%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97°/。、或至 131419.doc -115- 200918088 少約9 8 %、或至少約9 9 %之胺基酸序列一致性的胺基酸序 列，該等序列號對應於*〇2007080392或％〇 2〇〇4/〇41862 中所引用之序列號。 在一些實施例中，配位體或拮抗劑包含與本文中所揭示 之任何抗血清白蛋白dAb競爭以結合丘清白蛋白（例如人類 血清白蛋白）之抗血清白蛋白dAb。 在替代實施例中，拮抗劑或配位體包含對(例 如，人類IL-1R1)具有特異性之結合部分’其中該部分包 含如2〇08年2月8曰申請之同在申請中之申請案 PCT/GB2〇__53中所述的非免疫球蛋白序n p 合部分、其製造及選擇（例如，自多樣性庫）方法及1㈣ 之揭示内容以引用之方式併入本文中作為本發明正；之揭 不内容之一部分）。 接合半衰期延長部分（例如，白蛋白） 在一實施例中，使（一戎吝侗、坐^ 4 1次夕個)+农期延長部分(例如，白 蛋白、轉鐵蛋白及复片JR B来5 7 w 人々 /、片奴及類似物）與本發明之IL-1RU# 二締合°供^1111結合格式使 ° 、白蛋白片段或白蛋白變異體之實例描述 於WO 2005077042中，苴椙干肉^ 貰例描述 ^ ^ /、揭不内谷以W用之方式併入本文 中且構成本發明正文之揭示 ：本文 ^ ^ 令心口丨5刀。在本發明中 八Μ用以下白蛋白、白蛋白片段或白蛋白變盈體· • ^ ID W: 1 WQ 所揭示，該序列明 土以引用之方式併入本發明揭示内容中）· •包含 WO 2005077(M2t ’ Q 〇Ν〇: 1之胺基酸1387 13I419.doc -Π6· 200918088 或由該等胺基酸1-3 87組成之白蛋白片段或變異體； •包含選自由以下各物組成之群之胺基酸序列的白蛋白 或其片段或變異體：（a)WO 2005077042中之SEQ ID NO: 1 之胺基酸 54 至 61 ; (b)WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1 之胺基酸 76 至 89 ; (c)WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1 之胺基酸 92至 100 ; (d)WO 2005077042 中之 SEQ ID ΝΟ:1 胺基酸 170 至 176 ; (e)WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1 之胺基酸 247 至 252; (f)WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1 之胺基酸 266 至 277 ; (g)WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1之胺基酸 280 至 288 ; (h)WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1 胺基 酸 362 至 368 ; (i)2005077042 中之 SEQ ID NO: 1 之胺基 酸 439至 447 ; (j)WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1 之 胺基酸 462至 475 ; (k)WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1 之胺基酸 478 至 486 ;及（l)WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1之胺基酸560至566。 供IL-1R1結合格式使用之合適白蛋白、片段或類似物之 其他實例描述於WO 03076567中，其揭示内容以引用之方 式併入本文中且構成本發明正文之揭示内容之一部分。在 本發明中尤其可使用以下白蛋白、片段或變異體： •如WO 03076567中之（例如）圖3中所述之人類血清白蛋 白，（該序列資訊係明確地以引用之方式併入本發明 揭示内容中）； •由具有66,500之化學式分子量（formula molecular 131419.doc -117- 200918088 weight)之585個胺基酸的非糖基化多肽單鏈組成的人 類血清白蛋白（HA)(參見，Meloun等人，厂五似leiiers 5δ··/3(5 (1975) ; Behrens 等人，尸以.proc 3U9·/ (1975) ; Lawn等人’^^/泛化3以'心/?61^(^〇/2 9:6102-6114 (1981) ; Minghetti等人，J. J5z-〇/. c/zem. 267..6747 (1986))； •如 Weitkamp等人，//mw. Genei. 37:219 (1973)中 所述之白蛋白之多晶型變異體或類似物或片段； •如EP 322094中所述之白蛋白片段或變異體，例如 ΗΑ(1-373)、ΗΑ(1-388)、ΗΑ(1-389)、ΗΑ(1-369)及 HA( 1-4 19)及1-369與1-4 19之間的片段； •如EP 399666中所述之白蛋白片段或變異體，例如 HA(1-177)及ΗΑ(1-200)及HA(l-X)之間的片段，其中X 為178至199之任何數字。 虽使用（一或多個）半衰期延長部分（例如，白蛋白、轉鐵 蛋白及其片段及類似物）編排本發明之IL_1R1結合多肽、 dAb及拮抗劑格式時，可使用任何合適方法（諸如，直接融 合）例如藉由使用編碼融合蛋白之單一核苷酸構築體使其 與IL-1R1結合部分（例如，抗il]ri接合其中該融 合蛋白係編碼為半衰期延長部分定位於il_iri結合部分之 末端或C末鸠之夕肽單鏈。或者，可藉由在部分之間使 用狀連接子實現接合，肽連接子例如WO G3G76567或WO 2004003019中所述之肽連接子（該等連接子揭示内容以引 用之方式併入本發明親+ & h丄 乃揭不内谷中以提供用於本發明之實 1314I9.doc ，118- 200918088 例)。增加活體内血清半衰期之多肽通常為活體内天缺存 在幻几降解或由自生物體（例如，人類）移除不想要 之内源性機制移除的多肽。例如，增加活體内血清半衰期 之多肽可選自來自細胞外基質之蛋白f、血液中可見之蛋 白質、血腦屏障或神經組織t可見之蛋白f、位於腎、 肝、肺、心臟、皮膚或骨中夕疋人# 用次月宁之蛋白質、應力蛋白、疾病特 異性蛋白質或涉及以轉運之蛋白質。 在貫穿該揭示内容所述之本發明之實施例中，代替在本 發明之拮抗劑或配位體中使用抗IL_1R1 ”dAb"，涵蓋熟練 的使用者（addressee)可使用包含結合il_iri之本發明之 dAb的-或多個或所有三個咖(例如，接枝於合適蛋白質 骨架或骨幹上之CDR ’該骨架或骨幹例如親和體' SpA骨 架、LDL受體A類區域或EGF區域）的多肽或區域。因此， 揭不内容整體應解釋為提供使用該等區域代替心之括抗 劑之揭示内容。在這點上，參見2〇〇8年2月8日申請之 PCT/GB2〇08/_453，其揭示内容以引用之方式併入）。 因此’在-實施例中’本發明之拮抗劑包含合適格式之 對IL-1R1具有結合特性的免疫球蛋白單一可變區域或區域 抗體（dAb)或該dAb之互補判定區。拮抗劑可為由該組 成或大體上由該dAb組成之多肽。拮抗劑可為包含合適格 式、諸如抗體格式（例如，IgG樣格式、scFv、以卜Fab·、 FQb·)2)中之dAb(或dAb之CDR)之多肽，或包含結合il_iri 之dAb及結合另一靶蛋白質、抗原或抗原決定基（例如，血 清白蛋白）之第二dAb的雙特異性配位體。 131419.doc -119- 200918088 可將本發明之多肽' dAb及 P ^ 及扰抗劑可編排格式為此項技 術已知之夕種合適抗體格式 ^ 7 4如1樣格式、嵌合抗 體、人化抗體、人類抗體、單 早鏈抗體、雙特異性抗體、抗 體重鏈、抗體輕鏈、抗體重 體室鏈及/或輕鏈之同元二聚體及 呉7L 一聚體、任何上述者 述有之抗原結合片段（例如，Fv片段 (例如，單鏈FV⑽v)、雙硫鍵鍵結之Fv)、Fab片段、恤 片段、F⑽’)2片段）、單一可變區域（例如，％、D⑽ r
及任何上述者之經修飾形式（例 ^ 如，精由共價連接聚伸烷 二醇（例如，聚乙二醇、聚丙二 畔取丁一醇）或其他合適 聚合物而修飾）。 在一些實施例中，本發明提供為IgG樣格式之配位體（例 如，抗IL-1R1拮抗劑）。該等格式具有習知邮分子之四鍵 結構(兩個重鏈及兩個輕鏈)，其中一或多個可變區Μ及/ 或VL)已經本發明之dAb置換。在—實施例中，各可變區（2 個vH區及2個1區）經dAb或單一可變區域置換，其中之至 少-個為本發明之抗IL_1R1⑽。包括在妙樣格式之㈣ 或單-可變區域可具有相同特異性或不同特異性。在一些 實鼽例中，IgG樣格式為四價且可具有一種（僅抗il_iRi)、 兩種（例如，抗IL-1R1及抗SA)、三種或四種特異性。舉例 而。IgG樣格式可為單特異性且包含四個具有相同特異 性之dAb ;可為雙特異性且包含三個具有相同特異性之 dAb及另一具有不同特異性之⑽τ為雙特異性且包含 兩個具有相同特異性之dAb及兩個具有常見但不同特異性 ，可為一特異性且包含具有相同特異性之第一及第 131419.doc -120- 200918088 二dAb、具有不同特異性之第三dAb及具有不同於第一、 第二及第三dAb之特異性之第四dAb ;或可為四異性且包 含四個各具有不同特異性之dAb。可製備IgG樣格式之抗原 結合片段（例如，Fab、F(ab')2、Fab，、Fv、ScFv)。在一實 施例中，IgG樣格式或其抗原結合片段不會交聯il_iri， 例如該格式對IL-UU而言可為單價。若想要補體活化及/ 或抗體依賴性細胞的細胞毒性（ADCC)功能，則配位體可 , 為1gG1-樣格式。必要時，IgG樣格式可包含突變恆定區 1 ^變異體IgG重鏈恆定區）以最小化與Fc受體之結合及/或固 定補體之能力，（例如參見winter等人，gb
B ； Morrison# Λ > W〇 89/07142 ； Morgan^ A « WO 94/29351，1994年 12 月 22 日）。 可將本發明之配位體(多肽、dAb及拮抗劑)編排格式為 含有與第二免疫球蛋白單一可變區域直接融合之第一免疫 球蛋白單一可變區域的融合蛋白。必要時，該格式可進一 (步包含半衰期延長部分。舉例而言，配位體可包含第二免 疫球蛋白單一可變區域直接融合的第一免疫球蛋白單一可 變區域的融合蛋白’其中該第二免疫球蛋白單一可變區域 直接融合於結合血清白蛋白之免疫球蛋白單一可變區域。 具有對乾具有結合特異性之結合位點之多肽區域的定向 及配位體疋否包含連接子通常為設計所要選擇之問題。然 而’―些定向在有或無連接子之情況下可提供較其他定向 佳之結合特徵。本發明所涵蓋之所有定向（例如，dAbl_連 接子dAb2、dAb2-連接子_dAM)為含有提供可藉由筛選容 13M19.doc • 121 · 200918088 易地鑑別之想要結合特徵的定向的配位體。 可使本發明之多肽及dAb(包括dAb單體、二聚體及三聚 體）與抗體Fc區連接，該抗體！^區包含Ch2及Ch3區域中之 一者或兩者及視情況鉸鏈區。舉例而言，可使用編碼以單 一核苷酸序列形式連接於Fcg之配位體之載體製造該等多 狀。 此外， 本發明提供上述dAb單體之二聚體、 合物。 三聚體及聚
C 密碼子優化序列 如上所述，本發明之實施例提供編碼本發明之多肽及可 k區域之讼碼子優化核苷酸序列。如以下說明中所示，可 產生編碼相同可變區域(在此狀況下，可變區域胺基酸序 列與DOMlh-131-206 一致)之具有約7〇%一致性之密碼子優 化序列。在該情況下’序列經優化從而由馬斯德畢赤酵母 (P/Mk …）（密碼子優化序列^3)或大腸桿菌（密碼子 優化序列4及5)表現。 考慮到遺傳密碼中之及簡併度執行計算 19中所不之DOMlh-131-206之核芽酸序 且最大化由如圖 列及還編碼與 DOMlh-131-206- 致之可變區域之理論核苷酸序 列所編碼 的各簡併密碼子中的核苷酸變化數。訃筲 + 双寸异揭露理論序列將與如圖19中所示之DOMlh-13 1-206之姑#私— ζυο之核苷酸序列具有僅 57%之一致性。 密碼子優化序列1 DNA序列 131419.doc 122- 200918088 gagg-rrqaattgttggaatccggtggtggGttggttcaacctggtggttctttgagattgtcctgtgctg cttccggttttactttcgctcacgagactanggttcgggttagacaggctccaggtaaaggattggaatg ggtttcccacettccaccagatggtcaaga^ccattctacgctgactccgttaagggaagattcactatc tccagagacMctccaagaacactttgtacttgcagatgaactccttgagagctgaggatactgctgttt accactgtgctttgttgccaaagagaggaccttggtttgattaetggggacagggaactttggttactgt ttcttcc 相應AA序列 evq:n.e：5g-gglvqpggs】 r.iscraasgitfahetmvwvrqapg.kgie>rvsttippdg-qdpfyad3vkgrft：l sccinsk'r.tly'iqmnsiraedtavyhcalipkrgpwfdywgqgtivtvss •與WT序列之核苷酸序列一致性為74.1% 密碼子優化Domlh-131-206 Domlh-131-206 WT 一致 密碼子優化Domlh-131-206 Doalh-131-206 WT 一致 密碼子優化Domlh-131-206 D〇ttlh-131>206 W7 —致 密瑪子優化Dom 1 h-131 -206 0〇aXh-i3i-20« wp 一致 密确子優化Domlh-131-206 D〇alh-X3i~206 WT 一致 密碼子優化Domlh-131-206 Donlh-131-206 WT 一致 密碼子優化Domlh-131-206 Domlb-131-206 WT 一致 111 111 ((( 555 (101)uoi) (101) 1 X X 5 5 5 111 (2QX) U〇l) U〇l) 111 5 5 5 2 2 2
STTCAACC 97ACJ10CC 50 密碼子優化Domlh-131-206 D〇aui-i3i*2〇e ws 一致 (301) (301) (301) (351) (351) (351) OAeOTOCAOCTOTTOaAGTCTOOOGeAOOCTTOOVAaiOCCTOdOGOOTC βλΘΟΤ CA TOTTQOA tC ΟΘ GO GK3 ΤΦΟΟΦ CA CCTGQ GK3 TC 51 100 TTTOAGATTOTCCTOTOCTGCTTCCOGTTTTACrrTCQCTCACaAQXCTA CCTOCCWCTCTCCTOTeCAeCCTCCGGATTCACCTTTOCOCATaAGACOA tq q τ tcctotsc ac tccsg tt ac tt oc ca qaoac a 101 150 τοαττΦοοοττλβλα^κιοτοοΜατλλΛοολτνοολλταοοΦττοοολο TOaTGTOGeTCCeCCAdOCACCAaOGlUiOOeTCTAGAOTeoOTCTCACAT TOOT T90GT Θ CAGOG CCAGO λλ ΘΟ T Ολ ΦΟΟΟΤ TC CA 151 200 ATTCCACCAOATOOTCAAOATCCATTCTACaCTCUVCTCCOTTAAOOOAAO ATTCCCCCOeATOOTCAaaATCCCTTCTACOCAa&GTCCeTOMeeOCCO ATTCC CC OATOOTCA OATCC TTCTACGC SACTCCOT ΑλΟΟΘ Q 201 250 ATTCACTATCTCCAQAOftCAACTCCAAOAACACTTTGTACTTOCAeXTaA 0TTCACCATCTCCC0CeACAAT7CCAA0AAC&CQC7ATATCTeCAAATQA TTCAC ATCTCC Ο ΟλΟλλ TCCAAGAACAC T TA TOCA ATQA 251 300 KCTCCTTOAeAQCTQA0eATACTCK：T9TT7ACCACT0V0CT7T07TOCCA ACA9CCTOCOTQCC(3A9QACACAQCOOTATATCACTOT<3C9CT9C7TCCT AC C T9 β OC QAOGA AC GC ΘΤ TA CACTOTOC TG T CC 301 350 AAOILaM<UU；CTTOOTTTailTTACTO〇aaACAOOGAACTTTOQTTACT9T AAaAeoeOOCCTTOOTTTaACTJkCTaOQOTCAQOaHACCCTOliTCACCOT ΛλΟλΟ GQ CCTTOOTTTOA TACTOOOO CAOWSAAC TOOT AC 9T 351 363 TTCTTCCTAATOA CTCOAOC------ TC c 密碼子優化序列2 DNA序列 gaga^aagagaggttcaattgcttgaatctggag^aggtttggtccagccaggagggtcccttcgactaa gttgtg€tgc；cagtgi|gtttacgtttgctcatgaaactai:ggtatgggtccgacaggeacctggt;aaagg tcttgaat:gggtttcaeatatc：ectccagacggtcaagacecdt;tttacgctgattccgtgaaaggcaga tttacaatttcacgagat：aattctaaaaacaccttgtacttacaaatgaactcattdagagctgaggaca ctgcagtttatcactgcgctttactaecaaaacgtggacGttggtttgattattgg^gccaaggtacgtt agtgactgttagttct 相應AA序列 ekrevqllesggglvqpggsl rl^caasqf tfahetir-.vwvrqapgkglewvsh ippdgqdpf y acisvkgr f t i s r dns kn 11 y I qmns 1 r aedt a v yhca 11 pkr gp w £dywgqg1 v tv $s •與WT序列之核苷酸序列一致性為7 1 · 1 °/〇 123· 131419.doc 200918088 1 50
Domlh-131-206 WT (1) 僅畢赤酵母MFa 206 dAb (1) 一致 （1> Domlh-131-206 WT (42) 僅畢赤酵母MFa 206 dAb (51) —致 Domlh-131-206 HT (92) 僅畢赤酵母MFa 206 dAb (101) 一致 uoi， Domlh-131-206 WT (142) 僅畢赤酵母MFa 206 dAb (151) 一致（151> Domlh-131-206 WT <192) 僅畢赤酵母MFa 206 dAb <201) —致（201) Domlh-131-206 WT (242) 僅畢赤酵母MFa 206 dAb (251) —致（251> Domlh-131-206 WT (292) 僅畢赤酵母MFa 206 dAb (301) 一致 <301> Doalh-X31-206 WT (342) 僅畢赤酵母MFa 206 dAb (351) 一致（351) ---------gagotgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcc gagaaaagagaggttcaattgcttgaatctggaggaggtttggtccagcc
GAGGT CA TG T GA TCTGG GGAGG TTGGT CAGCC 51 100
TGGGGGCTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGCGC AGGAGGGTCCCTTCGACTAAGTTGTGCTGCCAGTGGGTTTACGTTTGCTC GG GGGTCCCT CG CT TGTGC GCC GG TT AC TTTGC C 101 150 ATGAG2lCGAXGSTGTGG6TCCGCCA6GCACCAGGGAAGaeTCTAGAGTGG ATGAAACTAXGGTATGGGTCCGACAGGCACCTGGTAAAG^rCTTOAATGG ATGA AC ATGGT TGGGTCCG CAGGCACC GG λλ GGTCT GA TGG 151 200
GTCTCACATATTCCCCCGGATGGTCAGGATCCCTTCTACQCAGACTCCGT GTTTCACATATCCCTCCAGACGGTCAAGACCCATTTTACGCTGATTCCGT GT TCACATAT CC CC GA GGTCA GA CC TT TACGC GA TCCGT 20X 250 GAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTATATC GAA^GOCAGATTTACAATTTCACGAGATAATTCTAAAAAGACCTTGTACT GAA GGC G TT AC AT TC CG GA AATTC AA AACAC T TA 251 300 TGCAMTGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACAGCGGTATATCACTGTGCG TACAAATGAACTCATTGAGAGCTGAGGACACTGCAGTTTATCACTGCGCT T CAAATGAAC TG G GC GAGGACAC GC GT TATCACTG GC 301 350
CTGCTTCCTAAGAGGGGGCCTTGGTTTGACTACTOGGGTCAGGGAACCCT TTACTACCAAAACGTGGACCTTGGTTTGATTATTGGGGCCAAGGTACGTT T CT CC AA G GG CCTTGGTTTGA TA TGGGG CA GG AC T 351 367
GGTCACCGTCTCGAGC-AGTGACTGT-TAGTTCT 6T AC GT T G C 密碼子優化序列3 DNA序列 gaagtgcagctteTtgaaagtggtggagggctagtgcagccagggggatctttdagattaCcatgegetg ccagtggatttacttttgcrcacgagacgatggtctgggtgagacaagctcctggaadaggtttaqagtg ggttcevcaeattccacctgatggtcaagatcctttctacgcagattccgtcaaaggaagatttactatc tccagagataatagtaaaaacactttgtacctacagat.gaactcacttagagccgaa-gat:accgctgtgt accactgcgccttgttgGcaaagagaggtccttggctcgattactggggtGagggtactctggttacagt ctcatct 相應AA序列 evqiiesgggivqpggslrlscaasgftfahemwvrqapgkglewvshippdgqdpfyacisvkgrfti
BrdnskTitlylqmnslraedtsvyhcailpkrgpwfdywgqg^lvtvsa 與WT序列之核苷酸序列一致性為72.6%
Domlh-131-206 WT 僅畢赤酵母Pre206 dAb 一致 Domlh-131-206 WT 僅畢赤酵母Pre 206 dAb 一致 Domlh-131-206 WT 僅畢赤酵母Pre206 dAb 一致 Domlh-131-206 WT 僅畢赤酵母Pre 206 dAb 一致 %/ t/ ), tr \ff ill 111 5 5 5 ο ο o ( ( ( 111 (151) (151) (151) 1 50 GAGGTGCAGCTGTTGGASTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTC GAAGTGCAGCTTCTTGJVAAGTGGTGGAGGGCTAGTGCAGCCAGGGGGATC GA GTGCAGCT T Gk TG6 GGAGG T GT CAGCC GGGGG TC 51 100 CCTGCQTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGCGCATGAGACGA TTTAAGATTATCATGCGCTGCCAGTGGATTTACTTTTGCTCACGAGACGA T G T TC TG GC GCC GGATT AC TTTGC CA GAGACGA 101 150 TGGTGTGGGTCCGCCAGGCACCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACAT TGGTCTOGGTGAGACAilGCTCCTOGAAAAGCTTTAGAGTGGGTTTCTCAC TGGT TGGGT G CA GC CC GG AA GGT TAGA6TGGGT TC CA 151 200 ATTCCCCCGGATGGTCAGGATCCCTTCTACGCAQACTCCGTGMGGGCCG ATTCaiCCTGATGGTCAAGATCCTTTCTACGCAGATTCCGTCAAAGGAAG ATTCC CC GATGGTCA GATCC TTCTACGCAGA. TCCGT AA GG G 201 250 -124- 131419.doc 200918088
Domlh-131-206 WT (201) 僅畢赤酵母Pre 206 dAb (201) 一致（201> Domlh-131-206 WT (251) 僅畢赤酵母Pre 206 dAb (251) 一致(251> Domlh-131-206 WT (301) 僅畢赤酵母Pre 206 dAb <301 > 一致 <301) Domlh-131-206 WT (351) 僅畢赤酵母Pre 206 dAb *351> 一致（351>
GTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTATATCTGCAAATGA ATTTACTATCTCGASAGATAAfAGTAAAAACACTTTGTACCTACAGATGA TT AC ATCTCC G Ολ AAT AA AACAC T TA CT CA ATGA 251 300 ACAGCCTGCGTGCCGAGGACAGAGCGGTATATCACTGTGCGCTGCTTCCT ACTCACTTAGAGCCGAAGATACCGCTQTGTACCACTGCGCCTTGTTGCCA AC CT S GCCGA GA AC GC GT TA CACTG GC TG T CC 301 350 aaojioggggccttggtttgactactggggtcagggaaccctggtcaccgt aaqaqaggtccttggttcgattactggggtcagggtactctggttacagt AAGAG GG CCTTGGTT GA TACTGGGGTCAGGG AC CTGGT AC GT 351 CTCGAGC· CTC-ATCT CTC A C 密碼子優化序列4DNA序列 gaagtacaactgctggagagcggtggcggcctggttcaaccgggtggttccctgcgectgtcctgtgcgg catctggtttcaccttcgcacacgaaaccatggtgtgggttcgccaagctccgggcaaaggcctggaatg ggtdiigCQacattcctccagatggccaggacccattctatgcggat tGcgttaaggctcgctttaccatt tctcgfcgataacitecaaaiiiiea.cectgt^cctrgcagatga.actcectgcgcgc.Ggagq^tsc.t'gc'ggtgt accatt-gtgcgctgctgcctaaacgtggcccgtggttcgattactggggtcagggtac!：etggtcaccgt aagcagc相應AA序列 evqllesgggivqpggsirlscaasgftfahetmvwvrqapgkglewvshippdgqdpfyadsvkgrfti srdnskntlylqmnslraecitavyhcallpkrcpwidywgqgtlvtvss 與WT序列之核苷酸序列一致性為76.5%
Domlh-131-206 WT 僅大腸桿菌Sec 206 dAh 一致 Domlh-131-206 WT 僅大腸桿菌Sec 206 dAb —致 Domlh-131-206 WT 僅大腸桿菌Sec 206 dAb —致 Domlh-131-206 WT 僅大腸桿菌Sec 206 dAb 一致 Domlh-131-206 WT 僅大腸桿菌Sec 206 dAb —致 Domlh-131-206 WT 僅大腸桿菌Sec 206 dAb 一致 Domlh-131-206 WT 僅大腓桿菌Sec 206 dAb 一致 Domlh-131-206 WT 僅大腸桿菌Sec 206 dAb 一致 111 111 ((( 5 5 5 (101)(101) (101) (151) (151) (151) (201) (201) (201) (251) <251) (251) (301) (301) (301) (351) <351) (351)
1 50 GAGGTGCAGCTGTTG6AGTCTGGGG<3AGGCT7GGTACAGCCTGGGGGGTC GAAGTACAACTGCTGGAGAGCGGTGGCGGCCTGGTTCAACCGGGTGGTTC QA GT CA CTG TGGAG GG GG GGC TGGT CA CC GG GG TC 51 100 CCTGCGTCTCTCCTGTSCAGCCTCCGGATTCACCTTTGCGCATGAGACGA CCTGCGCCTGTCCTGTOCGGGATCTGGTTTCACCTTCGCACACGAAACCA CCTGCG CT TCCTGTGC GC TC GG TTCACCTT GC CA GA AC A 101 150 TSGTGTGGGTCCGCCAGGCACCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACAT TGGTGTGGGTTCGCCAAGCTCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGGTAAGCCAC TGGTOTGGGT C6CCA GC CC GG AA GG CT GA TGGGT CA 151 200 ATTCCCCCGGATGGTCAGGATCCCTTCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCG ATTCCTCCAffllTGGCCAGGACGCATTCTATGCGGATTCCGTTAAOGOTCG ATTCC CC GATGG CAGGA. CC TTCTA GC GA TCCGT AJ^GGG CG 201 250 gttcaccatctcccgcoacaattccaagaacacgctatatctgcaaatga CTTTACCATTTCTCGTGATAACTCCAAAAACACCCTGTACCTGCAGATGA TT ACCAT TC CG GA AA TCCAA AACAC CT TA CTGCA ATGA 25X 300 ACAGCCTGCGTGCCGAGGACACAGCGGTATATCACTGTGCGCTGCTTCCT ACTCCCTGGGCGCCGAGGATACTGCGGTGTACCATTGTGCGCTGCTGCCT AC CCTGCG GCCGAGGA AC GCGGT TA CA TGTGCGCTGCT CCT 301 350 aagagggggccttggtttgactactggggtcagggaaccctggtcaccgt AAACGTGGCCCGTGCTTCGATTACTGGGGTCAGGGTACTCTGGTCACCGT AA G GG CC TGGTT GA TACTGGGCTCAGGG AC CTGGTCACCGT 351 CTCGAGC AAGCAGC AGO 密碼子優化序列5 131419.doc 125- 200918088 DNA序列 gaggttcaactgctggaatctggtggtggtctggtacaaccgggtggttccctgcqrctgagctgtgcag cctctggcttcacct-cgctcatgagaccatggtttgggtacCiCcaggctccgggtaaag^cctggagtg ggtaagcciatatccctcctgatggtcagg-acccgttctatgctgattccgtcaaaggcogttzttaccatt cctcgtgacaacagcaaaaacactctgtacctgcaaatgaactccctgcgtgcagaagacacggcggttt atcactgtgcactgctgccaaaacgcggccctt^gttcgactacrggggccsggg^aGtctggtcactgt atcttct 相應AA序列 evqilesggglvqpggslrlscaasgftfahetovwvrqapgkglewvshippdgqdpfyadsvkgrfti srdnskntlylqm^slraedtavyhcallpkrgpwfd^gqgtlvtvss •與wt序 Domlh-131-206 WT 僅大腸桿菌IC206dAb 一致 Domlh-131-206 WT 僅大腸桿菌IC206dAb 一致
Domlh-131-206 WT 僅大腸桿菌IC206dAb 一致
Domlh-131-206 WT 僅大腸桿菌IC206dAb 一致
Domlh-131-206 WT 僅大腸桿菌IC206dAb —致 Domlh-131-206 WT 僅大腸桿菌IC206dAb 一致 Domlh-131-206 WT 僅大腸桿菌IC206dAb 一致 Domlh-131-206 WT 僅大腸桿菌IC206dAb —致 列之核苷酸序列一致性為78.4% 1 50 (1) GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTC (1) GAGGTTCAACTGCTGOAATCTGGTGGTGGTCTGGTACAACCGGGTGGTTC (1) GAGGT CA CTG TGGA TCTGG GG GG TGGTACA CC GG GG TC 51 100 <51) CCTGCGTCTCTCCTQTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGCGCATGAGACGA (51) CCTGCGTCTGAGCTGTGCAGCCTCTGGTTTCACCTTCGCTCATGiyGACCA (51) CCTGCGTCT CTGTGCAGCCTC GG TTCACCTT GC CATGAGAC A 101 150 (101) TGGTGTGGGTCCGCCAGGCACCAGGOAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACAT (101) TGGTTTGGGTACOCCAGGCTCCGGGTAAASGCCTGG^GTGGGTAAGCCAT (101) TGGT 7GGGT CGCCAGGC CC GG AA GG CT GA.6TG6GT CAT 151 200
(151) ilTTCCCCCGGATGGTCAGGATCCCTTCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCQ (151) ATCCCTCCTGATGGTCAGGACCCGTTCTATGCTGATTCCGTCAAAGGCCG (151) AT CC CC GATGGTCAGGA CC TTCTA GC GA TCCGT AA GGCCG 201 250 (201) GTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTATATCTGCAAATGA (2 01) TTTTACCATTTCTCGTGACAACAGCAAAAACACTCTGTACCTGCAAATGA (201) TT ACCAT TC CG GACAA CAA AACAC CT TA CTGCAAATGA 251 300 (251) ACAGCCTGCGTGCCGAGGACACAGCGOTATATCACTGTGCGCTGCTTCCT (2 5 X) ACTCCCTGCOTGCAGAAGACACGGCGGTTTATCACTGTGCACTGCTGCCA (251) AC CCTGCGTGC GA GUICAC GCGGT TATCACTGTGC CTGCT CC 301 350 (301) AAGAGGOGGCCTTGGTTTGACTACTGGGCTCAGGGAACCCTGGTCACCGT (3 01) AAACGCGGCCCTTGGTTCGACTACTGGGGCCAGGOTACTCTGGTCACTGT (301} AA G GG CCTTGGTT GACTACTGGGG CAGGG AC CTGGTCAC GT 351
(351) CTCGAGC (351) ATCTTCT (351> TC 例證 實例A :主要選擇及表徵人類TNFR1之區域抗體 所產生之區域抗體係源自噬菌體庫。根據相關標準方法 執行被動吸收之人類TNFR1之可溶性選擇與淘選。人類 TNFR1係以可溶性重組蛋白質形式自R&D systems(目錄號 636-R1-025/CF)或 Peprotech(目錄號 310-07)購得，且直接 使用（在被動選擇之狀況下）或在生物素標記後，經由一級 -126- 131419.doc 200918088 胺偶合使用，接著在生物檢定中品質控制其活性且由質譜 分析其M W及生物素標記程度。通常執行3輪選擇在每下— 輪中利用遞減含量之抗原。 由嗟菌體ELISA篩選來自選擇物之輸出物的抗tnfri結 合純系之存在。自該等噬菌體選擇分離DNA且亞克隆於表 現載體中以表現可溶性dAb片段。將可溶性dAb片段表現 於96孔板中，且就抗TNFR1結合dAb之存在性使用以抗e_ myc偵測之直接結合ELISA或使用抗生蛋白鏈菌素/經生物 素標記TNFR1 BIAcoreTM晶片之BIAcoreTM使用上清液筛選 抗TNFR1結合dAb之存在，且根據解離速率（〇ff_rate)分等 級。 下文所述之前導分子係源自命名aD0Mlh_131(揭示於 W02006038027中）之親本dAb。該分子在使用6〇 nM經生物 素標記抗原選擇3輪後自噬菌體呈現庫選得。在各輪選擇 中將經抗生蛋白鏈菌素或中性鏈親和素塗佈之Dyna珠粒交 替作為職言式劑以防止選擇針對抗Μ⑽菌素或中性鏈 親和素之結合劑。該階段前導D〇Mlh_131之效價如在 MRC-5纖維母細胞/IL_8釋放細胞檢定中所測定處於低微莫 耳範圍内。如由BIAc〇re™所測定之結合動力學通常呈現 快速締合速率（on rate)/快速解離速率。$D〇Mih_i3i前導 分子之大腸桿菌表現含量以末端mye標記單體計處於8 mg/l之範圍内。 前導分子之親和力成熟作用： 使D〇Mlh-131進行親和力成熟作用以產生具有較高效價及 131419.doc -127- 200918088 改良生物物理學特徵之突變體（關於DOMlh-131來源之前 導分子之胺基酸序列，參見圖3)。使用易錯PCR聚合酶 (Genemorph II，Stratagene)產生易錯庫（平均數為每dAb序 列1個胺基酸變化，庫規模8x107)後，利用該等易錯庫執 行7輪選擇。該策略可引起純系DOMlh-131-8分離，一種 如由MRC-5細胞檢定所量測4個胺基酸變化（一個在構架 1(FR1)中，一個在CDR1中，一個在CDR3中及一個在FR4 中）產生約100倍效價提高（約4 nM)之分子。在該檢定中， 將MRC-5細胞與測試樣品一起培養1小時，隨後添加TNF-a(200 pg/ml)。培養隔夜後，使用IL-8 ABI 8200細胞偵測 檢定（FMAT)測定IL-8釋放。各實驗中包括TNF-α劑量曲 線。在該檢定中，所使用之與dAb競爭結合TNFR1之TNF-a的濃度（200 pg/ml)為最大TNF-a反應之約70%。 為進一步提高效價，由易錯之前導一致資訊提示之關鍵 位置處之募核苷酸引導的突變誘發使單一胺基酸位置多樣 化。該過程期間，經由BIAcore™篩選分離具有單個K94R 胺基酸突變（胺基酸編號根據Kabat)及200-300 pM之RBA效 價之DOMlh-131-8純系的改良形式，〇0河111-131-24(在修 正之前，最初命名為DOMlh-131-8-2)。 產生基於該前導分子及來源之NNS庫之其他易錯（error-prone) 庫 ，且使用熱處理進行 3 輪噬菌 體選擇 （方法請參見 Jespers L 等人，Aggregation-resistant domain antibodies selected on phage by heat denaturation. Nat Biotechnol. 2004年9月；22(9):1161-5)。在此選擇期間，彙集該等庫， 131419.doc -128- 200918088 且自苐2輪選擇所獲付之純糸產生認為更加熱穩定之 dAbs，諸如D〇Mlh-13 1-53。假定該等純系具有較佳生物 物理特徵。使純系DOMlh-131-53中之一些構架突變生殖 糸化’以產生純系DOMlh-13 1-83。該純系形成基礎，供 使用如上所述之噬菌體呈現選擇或使用乳液之活體外隔室 化技術經由寡核苷酸引導的各自CDR突變誘發進一步多樣 化。嗟菌體呈現策略產生前導分子DOMlh_131_117& DOMlh-131-151。活體外隔室化技術產生£)〇^/[111_131_ 在該階段，在生物物理及生物檢定中比較此等三個前導 分子，DOMlh-1 3 1-5 11為具有最佳性質之分子。此外，在 胰蛋白酶或白血球酶存在下測試該等分子的蛋白水解裂解 抗性。白血球酶由患有囊性纖維化之患者彙集的痰組成， 且含有高+量之彈性蛋白酶及其他蛋白冑，用料疾病活 體内條件之替代品。該資料指示所有三個前導分子 DOMlh-131-117、D〇Mlh_131_151&D〇Mihi3i5ii 在騰 蛋白酶或白血球酶存在下均快速降解。該發現引起對 DOMlh-131-511於患者活體内持久性之關&，且研發—種
所呈現之dAb裂解脫離噬菌體。 以允許在胰蛋白酶存在下進行選擇而未使 摔脫離噬菌體。產生基於DOMlh-131-511 131419.doc •129· 200918088 之易錯庫’且選殖於pDOM33載體中（pD〇M33載體圖請參 見圖50)。在37°C用1 mg/ml或100 pg/ml胰蛋白酶預處理該 庫產生之嚷菌體儲備液24小時，接著添加Roche完全蛋白 酶抑制劑（Roche Complete Protease Inhibitor)(2x)之蛋白酶 抑制劑以在選擇相關抗原之前阻斷胰蛋白酶活性。執行4 輪選擇。在37C下在存在或不存在胰蛋白酶（在gg/mi 或1000 Mg/ml最終胰蛋白酶濃度下）之情況下培養1小時或 培養隔仪期間’在存在或不存在蛋白酶之情況下使用 BIAcoreTM評定可溶性表現TNFR1結合dAb的結合TNFR1之 能力。 此引起兩個前導分子DOMlh-131-202及DOMlh-131-206 分離’該兩個前導分子如由BIAcore™抗原結合實驗所示 顯示改良之蛋白酶抗性。令人關注地注意到，與D〇m 1 h- 13 1-511相比，D〇m lh-131-202僅在CDR2中含有一個突變 (V53D)(所有胺基酸編號根據Kabat)，而DOMlh-13 1-206僅 含有兩個突變：第一突變與DOMlh-13 1-202相同（在CDR2 中之V53D突變）及第二突變為FR3中之Y91H突變（參見圖 3)。該FR3中之Y91H突變出現在3-20人類生殖系基因中， 指示該殘基出現在人類抗體中。該三個純系1)〇]^111-131- 511、DOMlh-131-202 及 DOMlh-131-206具有如圖 3中所示 之胺基酸序列。 如下測定分子活性： DOM1H-131-202、DOM1H-131-511 及 DOM1H-131-206 結合 人類TNFR1之BIAcore™結合親和力評定。 131419.doc -130- 200918088 由 BIAcore™ 分析評定 DOM1H-13 1-202、DOM1H-131-51 1及DOM1H-13 1-206結合人類重組大腸桿菌表現人類 TNFR1之結合親和力。使用經生物素標記人類TNFR1進行 分析。將1400 RU經生物素標記TNFR1塗佈於抗生蛋白鏈 菌素（SA)晶片上。使用弱酸溶離條件使表面再生重新回到 基線。在規定濃度下使用50 μΐ/min之流速使DOMlH-131-202、DOM1H-131-511 及 DOM1H-131-206 穿過該表面。在 BIAcore™ 3000機器上進行研究，且分析資料且擬合於1:1 之結合模型。所有測試分子之結合資料充分擬合於1:1模 型。由1^η及kw速率計算所有KD值。在25°C下進行 BIAcoreTM運行。 以下資料由三個獨立的實驗產生。在各個實驗中，藉由 平均大量擬合結果（對kd而言使用最高之dAb濃度及對ka而 言使用較低之濃度）來計算結果。資料以結果之平均值及 標準偏差（在括號中）呈示（表1)。 表 1 :結合人類TNFR1 之 DOM1H-131-202、DOM1H-131-511 及 DOM1H-131-206之 BIAcore™ 資料 κοη k〇ff iTz)(nM) DOM1H-131-511 5.03Ε+05 5.06E-04 1.07 (511) (1.07Ε+05) (1.01E-04) (0.44) DOM1H-131-202 1.02Ε+06 5.42E-04 0.55 (202) (2.69Ε+05) (3.69E-05) (o.ll) DOM1H-131-206 1.55Ε+06 7.25E-04 0.47 (206) (3.57Ε+05) (1.95E-04) (0.06) DOM1H-13 1-202、DOM1H-131-511 及 DOM1H-131-206 類似地且以高親和力結合人類TNFR1。DOM1H-13 1-202及 DOM1H-131-206分別以0.55 nM及0.47 nM之平均親和力結 131419.doc -131 - 200918088 合。與具有1.07 nM之平均親和力之DOM1H-131-511相 比，DOM1H-131-202及DOM1H-131-206具有稍佳之親和 力。 受體結合檢定： 在受體結合檢定中測定dAb對人類TNFR1之效價。該檢定 量測TNF-α與TNFR1之結合及可溶性dAb阻斷該相互作用 之能力。將TNFR1-FC融合物捕獲在預塗佈山羊抗人類 IgG(H&L)之珠粒上。將受體塗佈珠粒與TNF-cx(10 ng/mL)、dAb、生物素接合抗TNF-a及抗生蛋白鏈菌素 alexa fluor 647在黑色側面透明底面之3 84孔板中一起培 養。6小時後，將板在ABI 8200細胞偵測系統中讀數且測 定珠粒相關螢光。若dAb阻斷TNF-α與TNFR1之結合，則 螢光強度將減小。 使用ABI 8200分析軟體分析資料。使用GraphPad Prism 及具有可變斜率之S形劑量反應曲線測定濃度效應曲線及 效價（EC5〇)值。在三種獨立的情形下重複檢定。各實驗中 包括TNF-α劑量曲線（圖38及39)。所使用之與dAb競爭以結 合TNFR1之TNF-a濃度（10 ng/ml)在該檢定中為最大TNF-a 反應之約90%。 圖39中展示代表性曲線圖，其展示dAb抑制TNF-a與 TNFR1之結合之能力。在所有三個實驗中，陰性對照樣品 (HEL4，抗雞蛋白溶菌酶dAb及VH模擬物）在高濃度下微弱 抑制TNF-a與TNFR1之間的相互作用。表2中展示測試樣品 及陽性對照（自R&D Systems獲得之抗TNFR1 mAb， 131419.doc -132- 200918088 mAb225)及 EnbrelTM(依那西普（etanercept);由連接於 IgGl Fc部分之TNFR2組成之二聚融合物；經許可用於治療類風 濕性關節炎）的平均效價（EC5〇)值。 表2 :三個重複實驗之TNFR1受體結合檢定中DOM1H-131-202、DOM1H-131-206 及 DOM1H-131-511 之效價（EC5〇)值 樣品 平均 ECS0(nM) SEM DOM1H-131-202 0.11 0.008 DOM1H-131-206 0.07 0.01 DOM1H-131-511 0.19 0.01 Enbrel™(Etanercept) 0.20 0.07 抗TNFRl mAb # mAb225 0.08 0.003 在該檢定中，DOM 1 h-13 1 -206似乎比正測試之其他兩種 dAb 有效且與市售抗 TNFR1 mAb，MAB225(R and D Systems)具有類似效價。 如下文所述進行來自馬斯德畢赤酵母之前導純系之表 現： 使用三個前導分子之一級胺基酸序列產生分泌表現於馬 斯德畢赤酵母中之密碼子優化基因。密碼子優化DOM1H-1 131-206與非密碼子優化00^1111-131-206之間存在75%之序 列一致性。將三個合成基因選殖於表現載體pPIC-Ζα(來自 Invitrogen)中，且隨後轉型為兩個畢赤酵母菌株X3 3及 KM71H。將轉型細胞濾出置於遞增濃度之芥森 (Zeocin)(100、3 00、600及900 pg/ml)上以選擇具有多個整 合子（integrant)之純系。選擇各個細胞系及構築體的約15 個純系以用於表現篩選。因為馬斯德畢赤酵母中高/低基 因複本數與表現含量之間的相關性尚未完全理解，所以在 131419.doc -133- 200918088 整個芥森濃度範圍内挑選數個純系。使用尚未就高產量進 行廣泛篩選之純系進行5 L醱酵罐運行。此使得產生大量 用於進一步研究之物質。 用於蛋白質表徵之物質產生： 已廣泛使用基於蛋白質A之層析樹脂自微生物培養上清 液中純化VH dAb。雖然此舉使得單步純化方法產生高純度 (在大多數情況下通常>90%)材料，但對於一些分子，低pH 值溶離條件會導致形成聚集體。亦存在用於dAb之親和力 樹脂之容量受到限制之問題，此將意謂使用大量樹脂來加 工來自醱酵罐之物。為產生用於表徵且進一步用於穩定性 及喷霧器研究之高品質物質，使用混合模態電荷感應樹脂 (mixed modal charge induction resin)將下游的純化過程設 計為初級捕獲步驟，接著陰離子交換。未顯著優化，此允 許回收約70%之純度為約95%之表現dAb。 對於混合模態電荷感應樹脂，來自GE Healthcare之 Capto MMC上之捕獲步驟，使用50 mM磷酸鈉（pH 6.0)執 行管柱平衡且在不需要任何稀釋液或pH值調節之情況下加 載上清液。洗滌管柱後，使用為50 mM Tris(pH 9.0)之溶 離緩衝液由pH梯度溶離蛋白質。特定洗滌及梯度條件將略 視正溶離之蛋白質之p I而變化。 隨後使用陰離子交換層析用流經步驟（flow through step) 進一步純化溶離液峰。此舉可移除諸如醇氧化酶之殘餘 HMW污染且減少内毒素。使樹脂與PBS或無鹽之磷酸鹽緩 衝液（pH 7.4)平衡。將來自Capto MMC之溶離液加載於陰 131419.doc -134- 200918088 離子交換樹脂上之後’ dAb不結合且由流經步驟回收。内 毒素及其他污染物與樹脂結合。鹽之存在（若使用pBs緩衝 液）使該步驟之蛋白質回收率提高為91%，而非無鹽情況下 所達成之86%时率。_，鹽之存在會降低内毒素移除 之效力，以致與當不存在鹽時所獲得之<1〇 EU/nU之dAb 之内毒素含量相比，包括鹽之該步驟之後的典型含量經量 測為 58 EU/ml。 蛋白質表徵： 使用電噴霧質譜、胺基末端測序及等電聚焦表徵由几撥 酵罐運行所產生之物質的一致性，且使用SDS_pAGE、 SEC及Gelcode醣蛋白染色套組（pierce)表徵純度。 一致性： 各蛋白質之第一個5殘基之胺基末端序列分析係如所預 期（EVQLL…）。使用C4 zip尖頭（MiUip〇re)對已緩衝液交 換於含有0.1%冰醋酸之50:50 H20:乙腈中之蛋白質樣品執 行質譜分析。三種蛋白質中每一種之量測質量當允許因形 成内部雙硫鍵而產生之_2的質量差時係在基於一級胺基酸 序列之理論質量（使用平均質量計算）之〇·5 Da範圍内。使 用IEF基於對於各蛋白質為不同之pI鑑別蛋白質。 純度· 將三種蛋白質以1盹及10盹之量一式兩份裝載於非還原 SDS-PAGE凝膠上。在所有情況下，觀察到單一條帶。亦 執行尺寸排阻層析以顯示純度級。對於尺寸排阻層析 (SEC) ’將100叫各蛋白質裝載於T〇s〇H g20〇〇請处管 131419.doc •135· 200918088 柱上，在0.5 ml/min下流動。移動相為pBS/1〇%乙醇。 研究dAb穩定性用於候選物選擇： 對於COPD適應症，將有必要（例如）使用喷霧器裝置傳 遞dAb至肺中。此將意謂視所使用之喷霧器類型而定蛋白 質可潛在經歷一定範圍之剪切應力及熱應力且在肺環境下 可經受蛋白酶酶促降解。已確定若蛋白質可使用該類型之 裝置傳遞，則其形成適當粒度分布且在喷霧器傳遞後保留 功月b。因此，研究各分子對一定範圍之物理應力之固有穩 定性以確定指示基線穩定性及最敏感穩定性之檢定。因為 各蛋白質之穩定性將依賴於各蛋白質溶解於其中之緩衝溶 液’所以一些預調配研究為必需的。該諸如緩衝液、pH值 之資sfL亦適用於理解下游純化過程及隨後儲存期間蛋白質 之穩定性。為表徵暴露於一定範圍之物理應力期間分子之 變化，使用大量分析技術’諸如尺寸排阻層析（SEC)、 SDS-PAGE及等電點聚焦（iEF)。 DOM1H-131-202、DOM1H-131-511 及 DOM1H-131-206 之蛋 白酶穩定性之評定： 在過量蛋白酶中預培養規定時間點後由BIAcore™分析 殘餘結合活性評定DOM1H-131-202、DOM1H-131-511及 DOM1H-131-206之蛋白酶穩定性。將約14〇〇 ru經生物素 標記TNTR1塗佈於抗生蛋白鏈菌素（SA)晶片上。在3(rc下 使 250 nM DOM1H-131-202、DOM1H-131-511 及 DOM1H-131-206與僅PBS —起或與1〇〇 yg/mi胰蛋白酶、彈性蛋白 酶或白jk球酶一起培養i、3及24小時。藉由添加蛋白酶抑 131419.doc •136· 200918088 制劑混合物使反應停止。然後使用參考池扣除法（reference cell subtraction)使dAb/蛋白酶混合物越過TNFR1塗佈晶 片。在每次注射循環之間用1〇 μ1 〇」M甘胺酸（pH 2 2)使 晶片表面再生。相對於無蛋白酶之dAb結合，測定結合與 蛋白酶一起預培養之人類TNFR1 (在1〇秒内）之DOM1H- 131-202、DOM1H-131-511 及 DOM1H-13 1-206 的比例。在 25 C下進行BIAcore™運行。由三個獨立的實驗產生資料。 條形圖指示平均值且誤差棒指示結果之標準偏差（關於結 果’參見圖24)。 已發現，與 DOM1H-131-511相比，展示 DOM1H-131-202 及D0M1H-13 1-206具有較高胰蛋白酶、彈性蛋白酶或白血 球酶蛋白水解降解抗性。與DOM1H-131-5U相比， D0M1H-1 3 1-202與D0M1H-13 1-206之間的差異在與胰蛋白 起1小時後及與彈性蛋白酶或白血球酶一起3小時後最 明顯。 如使用DSC所測定之熱穩定性： 為測定在何pH值下分子具有最大穩定性，使用差示掃描 量熱計（DSC)量測各dAb在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中之熔融 溫度（Tm)。當伯瑞坦-魯賓遜係由三組分緩衝液系統（乙酸 鹽、磷酸鹽及硼酸鹽）構成時，在同一溶液中有可能產生3_ 10範圍内之pH值。由蛋白質一級胺基酸序列確定理論y。 由DSC，可見dAb具有最大内在熱穩定性之pH值對 DOM1H-131-202 (202)而言為 PH 7，對 D〇Mih_1312〇6 (206)而言為 pH 7-7.5，且對 DOM1H-131-511 (511)而 + 為 131419.doc •137· 200918088 pH 7.5。關於所有隨後應力及穩定性研究，對於各dAb使 用以下pH值：在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中，對於DOM1H-131-202 (202)及 DOM1H-131-206 (206)，pH 7.0 ;且對於 DOM1H-13 1-5 11 (5 11)，pH 7.5。結果概述於下表 3 中： 表3 :如由DSC所測定於伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中之1 mg/ml DOM1H-131-202 (202)、DOM1H-131-206 (206)及 DOM1H-131-511 (511)之 pH 及 Tm 的概述 dAb 產生最大固有熱穩定性之pH值 在給定pH值下dAb之Tm(°C) DOM1H-131-202(202) 7.0 68.6 DOM1H-131-206 (206) 7.0-7.5 65.8 DOM1H-131-511 (511) 7.5 58.0 固有溶解度測試： 在離心Vivaspin濃縮器（5K截止點）中濃縮所有前導dAb 以確定其农大溶解度及濃縮後之回收含量。在伯瑞坦-魯 賓遜緩衝液中在最穩定pH值下執行實驗。經一定時程量測 樣品體積及濃度，且記錄與預期濃度之偏差以及樣品回收 百分率。 已發現’所有蛋白質均可在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中濃 縮至超過100 mg/ml。雖然與DOM1H-131-511 (511)相比， DOM1H-131-202 (202)與 DOM1H-131-2 06 (206)展示比預期 低之回收率，但仍在可接受之水準内9 前導dAb之噴霧器傳遞： 藉由測試不同噴霧器及調配物緩衝液，已證明dAb可使 用廣泛範圍之噴霧裝置有效傳遞。更重要地，首次展示 dAb於調配物緩衝液中之噴霧產生有效肺傳遞想要之粒度 131419.doc -138- 200918088 (吏用5 μηι之液滴之百分率進比 白質功能性。此進_步描述如下。 Μ 夸蛋 比較多種裝置中之效能： 在六個喷霧器裝置中測試D〇M1H_131_5n (511)，該六 個喷霧益裝置包含三個主要種類之液體調配物噴霧器(亦 P超曰噴霧益、噴射喷霧器及振網噴霧器）之每一類的 各兩個裝置。在各裝置中，在一定範圍之PEG濃度下，測 試5 mg/ml dAb。對於各樣品，使用施卜⑽卟㈣⑽ DeViCe(Malvern Instruments Umhed，υκ)量測 <5 _之液 滴尺寸之百分率且結果展示於圖35中。使用SEC評定各樣 品噴霧後之穩定性以分析已二聚於殘留在杯中及所收集之 氣務冶中之物質中的樣品的量。結果可見於圖3 6中。二聚 體形成程度越小’穩定性越高。 大多數裝置可傳遞40%或更多的適當尺寸範圍内之液體 調配物，但eFl〇w(振網噴霧器裝置）及PARI LC(噴射噴霧 器）裝置表現更佳，其中當緩衝液中包括PEG時，pARI LC (星號）裝置傳遞超過。由eFi〇w亦觀察到因peg該 傳遞之增加，對於PARI LC+，程度較小。 重要地’亦發現，dAb之活性在喷霧後仍保留（參見圖8 中之結果）。 緩衝液添加劑之效應： 由於DOM1H-131-511 (5U)之較低穩定性，5〇 mM礙酸 鹽調配物緩衝液含有PEG 1000與蔗糖（且具有定義為約等 於約2%至約i〇% PEG〗〇〇〇於含有12% w/v蔗糖之5〇 131419.doc •139· 200918088 酸鹽缓衝液中之溶液黏度之範圍内的黏度）以有助於保護 dAb以免受剪切應力與熱應力。當DOM1H-131-202 (202) 及DOM1H-131-206 (206)具有較高L且展示顯著增加之熱 應力穩定性時，在原始調配物缓衝液中及伯瑞坦_魯賓遜 緩衝液（其具有比調配物緩衝液低之黏度）中測試所有分 子。在5 mg/ml之蛋白質濃度下在3.5分鐘之運行時間内在 E-flow 與 Pari LC+裝置中測試dAb且使用 MalVern Spraytek
Device測定粒度分布。作為比較，使用噴霧器裝置傳遞之 用於膀胱纖維化之市售藥物（命名為標準蛋白質χ)在其自 身調配物緩衝液中測試。結果展示於圖37中。為獲得良好 傳遞及於深肺中之分配’理想粒度小於6微米，例如<5 μηι。所有dAb在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液與調配物緩衝液（如 先前所述）中均得到小於5 μιη之可比較級別之粒度。然 而，調配物緩衝液之較高黏度尤其可有利產生適當尺寸範 圍内之粒子，例如<5 μηι之粒子。在喷霧之前及之後由 八28〇量測法測定裝置之杯中dAb之濃度。已發現，蛋白質 濃度並未顯著變化，指示蛋白質與媒劑在傳遞期間均不會 優先喷霧。 結論： 如上所述，已證明諸如dAb之多肽可在大量市售喷霧器 裝置中喷霧，且重要地，其在噴霧後保留穩定性及生物活 性’且喷霧後未觀察到顯著聚集。當向緩衝液調配物中添 加諸如PEG之黏度增強職形劑時粒纟分布及小於5帅之 液滴尺寸百分率得錢良，因此潛在改良dAb至深肺之傳 131419.doc •140- 200918088 遞。 dAb至肺之傳遞亦可藉由增加dAb濃度、例如高達約40 mg/ml之濃度及傳遞時間來改良而無dAb穩定性或活性之 任何降低。 實例1 禮菌趙載體pDOM13 使用絲狀噬菌體（fd)呈現載體pDOM13。該載體與噬菌 體外殼蛋白III產生融合蛋白。圖1中說明pD〇M13之多個 選殖位點。將編碼dAb之基因選殖為心/I/iVoil片段。 實例2 測試蛋白酶對具有一定範圍之姨蛋白酶抗性之嗤菌艘呈 現區域抗體（dAb)的選擇 將編碼結合IL-1R1之dAb DOM4-130-54、結合TNFR1之 DOMlh-131-511 及結合 VEGFAiD〇M15_1〇、D〇M15 26 及 DOM15-26-501的基因選殖於pD〇M13中，且根據標準技術
產生呈現該等dAb之噬菌體。將噬菌體由pEG沈澱純化， 再懸浮於PBS中且測力價。 當以經分離蛋白質形式測試時，上述dAb展示一定範圍 之抗胰蛋白酶降解之能力。如下評定抗降解性：在下 將4〇 gg/ml於PBS中之dAb(1叫/叫與胰蛋白酶一起培養， 產生25:1浙胰蛋白酶之分子比。添加騰蛋白酶之前即 刻，謂後在W小時、3時間及24小時時採集樣品㈤ μΐ)。藉由添加Roche完全蛋白酶抑制劑（2χ)中和蛋白酶活 性，接著浸入液氮中且儲存於乾冰上。隨後藉由在Νο爾 131419.doc • 141 - 200918088 10-20〇/〇 Tricine凝膠上電泳分析15 pg各dAb樣品，且用 SureBlue(lx)染色蛋白質。 第一個3小時期間，DOM15-10與DOM15-26-501顯著分 解。DOM15-26、DOM4-130-54 及 DOMlh-131-511 較穩 定’其中dAb之分解僅在24小時後變得明顯（圖2)。 亦在胰蛋白酶存在下培養嗟菌體呈現dAb以評估嗤菌體 呈現dAb之胰蛋白酶抗性是否與由經分離可溶性dAb所獲 得之結果相關。測試多種濃度之胰蛋白酶及培養時間。在 所有狀況下，用Roche完全蛋白酶抑制劑中和胰蛋白酶 後’測試嗟菌體結合一般配位體：蛋白質A(其結合所有Vh 區域抗體（例如，DOMlh-131、DOM15-26、DOM15-26· 501))或蛋白質L(其結合所有VKg域抗體（例如，〇〇]\44_ 13 0-54、DOM 15-10))之能力。亦測試嗤菌體與乾抗原之結 合。在該兩種狀況下，認為結合與因經抗蛋白水解性保留 dAb結構完整性相關。由ELISA(使用針對噬菌體之接合抗 體）或由溶離所結合之噬菌體及指數生長大腸桿菌TG1細胞 感染後進行力價分析來量測結合活性。 用 DOM15-10、DOM15-26 及 DOM15-26-501 測試嗔菌艘 在室溫下在一定範圍之胰蛋白酶濃度（1〇〇 pg/ml、1〇 pg/ml及0 pg/ml)下，將各dAb處理1小時。用R〇che完全蛋 白酶抑制劑（lx)阻斷胰蛋白酶活性，且隨後將噬菌體稀釋 於PBS中之2〇/〇 Marvell中，在室溫下與50 nM經生物素標記 抗原（重組人類VEGF(R & D systems))—起培養1小時。添 加在室溫下用PBS中之2% Marvell預阻斷1小時之抗生蛋白 131419.doc -142· 200918088 鍵囷素塗佈微珠（Dynabeads M-280(Invitrogen))，且隨後在 室溫下將混合物培養5分鐘。所有與Dynabeads—起培養之 步驟均在轉輪上進行。藉由用1 mlKPBs中之〇.1〇/0 Tween-20洗將:珠粒8次洗除未結合嗤菌體。用〇 5 ml 0· 1 Μ甘胺酸 (pH 2_2)溶離所結合噬菌體且用10〇 μ1 1 μ Tris-HCL(pH 8.0)中和。使用溶離噬菌體感染指數生長之TG1細胞（在 37°C下1小時）且塗鋪於四環素板上。在37〇c下將板培養隔 夜’且進行菌落計數（參見表4)。由與1〇〇 ^^/〇11胰蛋白酶 一起培養之選擇觀察到最佳結果。與D〇M15_10&d〇m15-26-501相比，DOM 15-26之產率增加約1〇倍。 進行第二實驗以在更苛刻培養條件下進一步證實該等結 果。在攪拌（250 rpm)下在37t：下將噬菌體呈處理！小 時或2小時。由與100 μ§/ηιι胰蛋白酶一起培養2小時之選擇 觀察到最佳結果。DOM15-26之產率&D〇M15_26_5〇1之產 率高200倍且&DOM15_1〇之產率高1〇〇〇倍。 在第—貝驗中，開始時將呈現5_26及DOM1 5-26-5〇1之噬菌體1:1混合。隨後在攪拌（25〇 rpm)下在37<t下在 有胰蛋白酶（1000 ^/ml)或無胰蛋白酶之情況下將其培養2 J時且隨後如上所述就抗原結合加以選擇。測序來自各 選擇之10個菌落’對於無胰蛋白酶預處理之選擇，揭露純 系混合群體（D_5-26 : 4/10 ; D〇Mi5 26_5()i : ， 而有胰蛋白酶進行選擇之所有純系如所預期編碼DO·· 2 6 〇 該等實驗指示選擇壓力可藉由向嗟菌體呈現心中添加 1314l9.doc • M3 · 200918088 蛋白酶來獲得，以致優先選擇呈現蛋白水解最穩定之dAb 之噬菌體（在淘選一般配位體或抗原之後）。 表4 〆. 實驗 培養時間 長短 溫度 胰蛋白酶濃度 DOM15-26力價 DOM15-26-501力 價 1 輸入1010 lhr 室溫 100 pg/ml 1.6x10s 6.3χ107 lhr 室溫 10 pg/ml 3x10s 4.4x10s lhr 室溫 0 pg/ml 0.9x10s 2xl08 2 輸入109 lhr， 250 rpm 37〇C 100 pg/ml 2χ10; 1x10° 2 hr， 250 rpm 37〇C 100 pg/ml lxlO7 6xl04 2 hr， 250 rqm 37〇C 0 pg/ml 5.4x107 4.1x10/ 3 輸入1010 2h， 250 rpm 37〇C 100 pg/ml 2.3x10s 8x10' 2h， 250 rpm 37〇C 0 pg/ml 3.9x10s 4.4x10s
用DOM4-130-54測試噬菌艎 以如上所述之類似方案測試DOM4-130-54。變化之參數 為：胰蛋白酶之濃度、溫度及培養時間長短。針對IL-RI-Fc(IL-lRl與Fc之融合物）在1 nM於PBS中之濃度下進行生 物淘選。僅在37°C下使嗔菌體與100 pg/ml騰蛋白酶一起培 養隔夜後才觀察到噬菌體力價之顯著降低（參見表5)。 表5 培養時間長短 溫度 胰蛋白酶濃度 力價 1 hr 室溫 100 pg/ml 1.8χ10ιυ 1 hr 室溫 10 pg/ml 7.2xlOy 1 hr 室温 0 pg/ml 6.6x1 Oy 隔夜 室溫 100 pg/ml 2.16xlOy 隔仪 室溫 10 pg/ml 7.2xlOy 隔仪 室溫 0 pg/ml 7.8xlOy 隔仪 37〇C 100 pg/ml 2.04xl0b 隔夜 37〇C 10 pg/ml 3.84x10s 隔夜 37〇C 0 pg/ml 7.2x1 Oy 131419.doc -144- 200918088 反應用之5-50 pg模板由PCR在基因中引入隨機突變。用 •Sa/I及iVoil分解後，用抗生蛋白鏈菌素塗佈微珠自未分解 產物中純化插入物且使其在相應位點連接於pDOM 1 3中。 用純化連接混合物使大腸桿菌TB 1細胞轉型，從而產生四 環素抗性純系大譜系：8.5xl08(DOM4-130-54)、 1.5xl09(DOMlh-131-511) 、 6χ 1 08(DOM 1 5-1 0)及 3 x 1 Ο9 (DOM15-26-555)。 藉由以PEG雙重沈澱製備噬菌體庫且再懸浮於PBS中。 胺基酸突變率對DOMlh-131-51 1及DOM4-130-54譜系而 言分別為2.3及4.4。藉由在噬菌體ELISA中使用塗佈有蛋 白質A或蛋白質L(1 gg/ml)之孔測試96個純系評定功能性。 在〇〇]^111-131-511及〇(^4-13 0-54譜系中分別有62.5%及 27°/。之純系展示功能性呈現dAb。 胺基酸突變率對DOM1 5-10及DOM15-26-555譜系而言分 別為2.5及4.6。藉由在噬菌體ELISA中使用塗佈有蛋白質A 或蛋白質L(1 Mg/ml)之孔測試96個純系來評定功能性。在 〇€^15-10及〇〇河15-26-555譜系中分別有31.3%及10.4%之 純系展示功能性呈現dAb。 DOM4-130-54及 D〇Mlh_131-511 譜系 對該等庫進行4輪選擇以選擇具有改良蛋白酶抗性之 dAb。 第1輪選擇係抗原結合（1 nM* 1〇 nM抗原）而無蛋白酶處 理從而淨化庫以移除不再以高親和力結合抗原之任何純 系。第1輪之輸出係在1〇8_1〇ι〇範圍内（與1〇11噬菌體之輸入 13I419.doc •146- 200918088 形成對比）’指示庫之大部分以高親和力結合抗原。 在苐2輪中引入1〇〇 gg/mi膜蛋白酶之蛋白酶處理’且輸 出展示於下表7中： 表7 胰蛋白酶培養條件 DOMlh-131-511 庫 DOM4-130-54庫 37°C隔夜 1.86χ106 2.1x10° 37°C，2小時 4.8χ108 5.1χ10δ 室溫，2小時 1.2xlOy 4.62x10" " 無膜资白酶 約1χ109 約 4xl〇y — 無抗原 1·8χ104 <6x1 〇j 當在37C下用胰蛋白酶處理dAb隔夜時，存在顯著選 擇。將該輸出物送至第3輪，其中在37。〇下用i mg/m丨或 100 Mg/ml胰蛋白酶處理噬菌體24小時。來自第3輪之經胰 蛋白酶處理過之噬菌體的力價對D〇Mlh_131_51丨譜系而言 為 1 05-106且對 DOM4-130-154譜系而言為 107-1〇8。 來自第3輪之所有輸出物（DOMlh-131-511 &D〇M4-130- 154，1 mg/ml&10〇吨/1111)在1〇〇 gg/ml胰蛋白酶下經受針 對1 nM抗原之第4輪選擇。類似於第3輪中所見，力價係在 ι〇6-ι〇8範圍内。對於DOMlh_131_511譜系可見一些富集， 而對於DOM4-130-54譜系無富集。 田本 DOM15_10及 DOM15-26·555譜系 第1輪選擇係用2 nM經生物素標記hVEGF(人類血管 生長因子)濃縮物來進行而無蛋白酶處理從而淨化 除不再以高親和力結合抗原之任何純系。第… 約1〇8(與⑽謝⑽之，則體及如應5备555之1〇心 菌體之輸入形成對比)，指示庫之大部分以高 ^ 131419.doc -147- 200918088 抗原。 用2 nM經生物素標記hVEGF執行第2及第3輪選擇。在對 hVEGF淘選之前，在37〇c下在震盪器（25〇 rpm)中在胰蛋白 酶（100 pg/ml)存在下培養噬菌體。培養時間對D〇M15_1〇 譜系而言為1小時且對D〇M15-26-555譜系而言2小時。 輸出如下：DOM15-10譜系之第2及第3輪選擇為1.5χ106 及9xl05 ; DOM15-26-5 55之第2及第3輪選擇為2,2xl08及 3.9χ109。 實例4 分析選擇輸出物：D〇M4-130-54及DOMlh-131-511譜系 將來自第3及第4輪之所有輸出物亞選殖於pD〇M5載體中 且轉型於JM83細胞中。pD〇M5載體為pUCU9基載體。由
PlaC啟動子驅動蛋白質之表現。GAS1前導序列（參見w〇 2005/093074)確保經分離可溶性dAb分泌於大腸桿菌JM83 之周質及培養上清液中。隨機挑選96個及72個來自第3輪 及第4輪之個體菌落來表現。 對第3輪及第4輪輸出物之各12-24個純系進行測序。在 該兩輪選擇中觀察到一致突變且挑選約25個持有一致基序 (consensus motif)之純系來進一步表徵。該等純系之胺基 酸序列展示於圖3(DOMlh_131_511m選擇之變異體）及圖 4(DOM4-130-54所選擇之變異體）中且以DNA序列形式列於 圖1 9A-1 9L中。突出所選擇之純系中不同於親本序列的胺 基酸（彼等一致胺基酸由點標記）。對應於CDR1、CDR2及 CDR3之環用框勾畫。 131419.doc 200918088 §亥等純系係以大量表現，在蛋白質L(就D〇m4-13 0-54變 異體而言）及蛋白質A(就DOMlh-131-51 1變異體而言）上純 化且在存在或不存在胰蛋白酶（最終濃度為1〇〇 pg/ml或 1〇〇〇 Hg/ml)之情況下在下培養i小時或隔夜後就抗原 結合以BIAcore方式測試。 來自DOM4-130-54選擇之輸出物通常較穩定，大多數純 系保留胰蛋白酶抗性〗小時且最佳純系保留隔夜。比較而 言’來自DOMlh_131_511選擇之少量純系抗胰蛋白酶h、 時’而無純系抗胰蛋白酶隔夜。 實例5 分析選擇輸出物：DOM15-10及D〇Ml5_26_SS5譜系 首先以單株噬菌體ELISA方式在存在或不存在胰蛋白酶 分解之情況下測試經胰蛋白酶預處理之選擇有效性。挑選 各庫之來自第2輪選擇之18個菌落及來自第3輪選擇之㈣ 菌落。使用純系 D〇M15-10、D〇M15_26_5()UDc)mi5_26 作為對照。其他對照包括第2及第3輪姨蛋白酶選擇後來自 各庫之擴增且純化的嘆菌體溶液。 將各嗟菌體樣品分為兩部分，第一部分用⑽叫/⑻姨蛋 白酶處理，第二部分不用胰蛋白酶處理。在37。〇下在措拌 ㈣卿）下將該兩個部分培養！小時，且藉由添加以心完 全蛋白酶抑制劑（lx)阻斷。 使用經姨蛋白酶分解及未經分解樣品執行嗟菌體 EUSA。使ELISA孔塗佈有濃度為i叫/如之於〇」μ碳酸氫 鹽緩衝液中之中性鏈親和素。用PBS進行洗滌及在室溫下 131419.doc -149· 200918088 用1%於PBS中之Tween-20阻斷抗原塗佈孔1小時之步驟 後，使孔塗佈有濃度為100 ng/ml之稀釋於1%於PBS中之 Tween-20中的經生物素標記hVEGF。接著，用PBS洗滌各 孔且添加用1% Tween-20/PBS 1:1稀釋之經處理或未經處 理之噬菌體上清液。在37°C下培養30分鐘後，用1% Tween-20/PBS洗滌孔，接著在37°C下與抗M13噬菌體-HRP 接合物（1/5000稀釋於1% Tween-20/PBS中）一起培養30分 鐘。隨後用PBS及過氧化酶洗滌孔。藉由添加SureBlue試 劑啓始反應。約10分鐘後，用等效體積1 M HC1使反應停 止’且在OD45G11M下讀取孔。 經胰蛋白酶處理之不穩定對照DOM15-10及DOM15-26-501之ELISΑ讀數給出低於0.404之OD45()，且認為該值為不 穩定純系之邊界值。產生低於0.404之OD之所有樣品視為 不穩定。超過彼值之所有樣品視為穩定。 表8 庫 胰蛋白酶 無膜蛋白酶 第2輪選擇 第3輪選擇 第2輪選擇 第3輪選擇 DOM15-10 33% 89% 100% 100% DOM15-26-555 94.4% 100% 100% 100% 表8展示各庫之第2及第3輪胰蛋白酶選擇後穩定純系之 百分率。第3輪選擇後，該兩個庫中可見胰蛋白酶抗性純 系之富集。在各狀況下，胰蛋白酶分解後，每次選擇後含 有擴增純化噬菌體混合物之對照ELIS A孔之值大大高於 0.404。此外，當比較來自第3輪選擇之胰蛋白酶處理噬菌 體與來自第2輪選擇之胰蛋白酶處理噬菌體時，觀察到信 號小幅增加。DOM1 5-10噬菌體庫展示該起始值之約14% 131419.doc -150- 200918088 之增加。DOM15-26-555嗤菌體庫展示代表該起始值之約 2%之增加。 所有該等結果展不經胰蛋白酶預處理之選擇係有效自 DOM15-10及DOM15_26_555譜系選擇騰蛋白酶抗性嗟菌體 純系。 將來自第2及第3輪選擇（D〇M15_26-555)及僅來自第3輪 選擇（DOM15-10)之所有輸出物亞選殖於？〇〇1^5載體中且 轉型於HB2151電穿孔法勝任細胞（electr〇c〇mpetent 中。PDOM5載體為pUC119基載體。由piac啟動子驅動蛋 白質表現。GAS 1前導序列確保經分離可溶性dAb分泌於大 腸桿菌HB21 5 1之周貝及培養上清液中。隨機挑選1 84個來 自各輪選擇（3及4)之個體集落來在丨ml培養物體積中表 現。 將細菌上清液稀釋於HBS-EP BIAcore緩衝液（1:1體積比） 中且分成兩份。僅向一個小瓶中添加胰蛋白酶，最終濃度 為20 pg/ml。在攪拌（250 rpm)下在37它下培養4〇分鐘。用 Roche完全蛋白酶抑制劑（lx)阻斷反應後，在BIAc〇re 3〇〇〇 上就抗原結合（SA感應器晶片上之2,〇〇〇 RU經生物素標記 hVEGF)測试經騰蛋白酶處理與未經處理之嗟菌體上清 液。 挑選純系之標準為：相對於未經處理之dAb，<15%之經 胰蛋白酶處理之dAb的抗原結合減小（基於在所選擇之時點 所達到之最大RU)，此通常將反映dAb對蛋白酶處理之穩 定性；及dAb自抗原解離期間，兩個時點之間的解離速率 131419.doc 151 200918088 減小<4〇%。基於該等值，對60個來自DOM15-26-555庫之 第2與第3輪選擇之純系及17個來自d〇m15_10庫之第3輪選 擇之純系進行測序。在該兩個庫之輸出物中觀察到一致突 變’且自各持有一致基序之庫挑選17個純系來進一步表 徵。該等純系之胺基酸序列展示於圖5(d〇m15-26-555所 選擇之變異體）及圖6(d〇M15-10所選擇之變異體）中，且以 DNA序列形式列於圖20A-20E中。突出所選擇之純系中不 同於親本序列之胺基酸（彼等一致胺基酸由點標記）。對應 於CDR1、CDR2及CDR3之環由框勾晝。 將該等純系表現於50 ml表現培養物中，在稀釋於HbS_ EP緩衝液中至100 nM濃度之蛋白質A(就DOM15-26-555變 異體而言）或蛋白質L(就DOM15-10變異體而言）上純化且在 存在或不存在胰蛋白酶（最終濃度為2〇 pg/ml)之情況下在 搜拌（250 rpm)下在37χ：下培養h5小時後就抗原結合以 BIAcore方式測試。 亦使用實例2中所述之方法測試該等純系胰蛋白酶抗 性。將蛋白質緩衝液交換至PBS中且濃縮至1 mg/mi。將25 eg蛋白質與1 pg胰蛋白酶（Promega)混合且在30°C下培養〇 小時及24小時。此後’用R0che完全蛋白酶抑制劑（丨x)阻 斷反應’且添加DTT以及增重劑（loading agent)。使樣品在 1 00°C下變性5分鐘。隨後由電泳在Novex 1 0-20% Triejne 凝膠上分析1 5 pg各樣品，且用SureBlue(l χ)染色蛋白質。 來自DOM1 5-26-555選擇之輸出物通常較穩定，當以 BIAcore方式測試時大多數純系保留胰蛋白酶抗性1 5 131419.doc -152- 200918088 時，且當以SDS-PAGE方式運行時，保留隔夜。相比較而 言，當以SDS-PAGE方式運行時，對於隔夜處理，僅少量 來自DOM1 5-10選擇之純系抗胰蛋白酶。 實例6 鑑別DOMlh-131-511變異趙 更詳細地分析 DOMlh-131-203、DOMlh_131_2〇4 及 DOMlh-131-206。在37。。下與不同濃度之胰蛋白酶(在〇至 1〇〇 Mg/ml範圍内）一起培養隔夜後，以別八⑺代方式在5〇〇 nM之dAb濃度下將其加以比較^ BIAc〇re迹線展示於圖7 中。結果顯然展示在高濃度胰蛋白酶（1〇〇 μ§/ηι1)下該兩個 變異體比其親本對蛋白水解更具抗性。亦在上述條件下就 抗大量包括白血球酶、彈性蛋白酶及胰酶之其他蛋白酶而 言，在100 pg/ml之蛋白酶濃度下，比較兩個dAb ；D〇Mlh_ 131-202及D〇Mlh-131-206與其親本。與親本相比，dAb抗 所有所測s式之蛋白酶之蛋白水解展示增加之抗性。彈性蛋 白酶及白血_球酶之BIAcore迹線展示於圖8中。 用100 pg/ml測序級胰蛋白酶處理5 μΜ各dAb 0、1 ' 3及 24小時。用25X Roche完全蛋白酶抑制劑抑制反應，且使 反應物在4-12% Novex Bis-Tris凝膠上運行。凝膠展示於 圖9中。 實例7 鑑別DOM4-130_54變異體
更詳細地分析 DOM4-130-201 及 DOM4-130-202。在 37°C 下與不同濃度之胰蛋白酶（在0與100 pg/ml範圍内）一起培 131419.doc -153- 200918088 養隔夜後，以BIAcore方式在500 nM之dAb濃度下將其加以 比較。BIAcore迹線展示於圖10中。結果顯然展示在高濃 度胰蛋白酶（100 pg/ml)下所有三個變異體比其親本對蛋白 水解更具抗性。亦在上述條件下就抗大量包括白血球酶、 彈性蛋白酶及胰酶之其他蛋白酶而言，在100 pg/ml之蛋白 酶濃度下，比較DOM4-130-201及DOM4-130-202與親本。 雖然結果與在胰蛋白酶下相比不太明顯，但前導dAb與親 本相比對所有所測試之蛋白酶展示增加之抗蛋白水解性。 彈性蛋白酶及白血·球酶之BIAcore迹線展示於圖11中。 用100 pg/ml測序級胰蛋白酶處理5 μΜ各dAb 0、1、3及 24小時。用25 X Roche完全蛋白酶抑制劑抑制反應，且使 反應物在4-12% Novex Bis-Tris凝膠上運行。凝膠展示於 圖9中。 實例8 進一步表徵DOMlh-131-511 及 DOM4-130-54變異艎 首先使用差示掃描量熱法（DSC)分析dAb以確定胰蛋白 酶抗性之增加是否與熔融溫度（Tm)之增加相關。胰蛋白酶 穩定性之增加確實與Tm之增加相關（參見表9)。 表9 名稱 TmCC) DOMlh-131-511 57.9 DOMlh-131-202 67.5 DOMlh-131-203 65.7 DOMlh-131-204 62.3 DOMlh-131-206 64.9 DOM4-130-54 54.1 DOM4-130-201 64.7 DOM4-130-202 64.5 131419.doc -154- 200918088 亦在MRC-5細胞基檢定（cell-based assay)中比較DOMlh-131-511來源之dAb(參見表10)。在該檢定中，量測dAb中 和TNFa刺激之IL-8釋放之能力以確定胰蛋白酶穩定性之增 加是否已使得功效降低。然而，胰蛋白酶抗性dAb之活性 在該檢定中大體上未受影響。 表10 樣品 ND50 nM DOMlh-131-511 1.98 DOMlh-131-511 1.71 DOMlh-131-511(230307CE) 1.89 DOMlh-131-203(230307CE) 2.28 DOMlh-131-204(230307CE) 1.89 DOMlh-131-511 1.46 DOM1 h-131 -206(230307CE) 0.71 在受體結合檢定中測試DOM4-130-54來源之dAb以瞭解 其是否仍具有相同的抑制IL-1與IL-RI結合之能力（參見表 1 1)。胰蛋白酶抗性dAb之活性在該檢定中未受影響。 表1 1
dAb IC50 (nM) DOM4-130-54 280 pM DOM4-130-201 257 pM DOM4-13 0-202 254 pM 實例9 鑑別DOM15-26-555變異體 更詳細地分析 DOM1 5-26-588、DOM15-26-589、 DOM1 5-26-591及DOM1 5-26-593以及其親本及兩個其他 dAb DOM15-26-594及 DOM1 5-26-595，其係藉由組合將對 效價及穩定性產生最大影響之突變（E6V及F100S/I)之突變 誘發而創建。序列展示於圖12中。與濃度為200 pg/ml之胰 131419.doc -155- 200918088 蛋白酶一起培養後在1〇〇 nM之dAb濃度下就hVEGF結合以 BIAC〇re方式比較純系。在攪拌（250 rpm)下在37°C下使反 應進行3小時及24小時。最佳純系DOM15-26-593及親本之 BIAcore迹線展示於圖13中。其他結果以圖表形式呈示於 圖14中。結果顯然展示在胰蛋白酶處理24小時後，所有變 異體比親本對蛋白水解更具抗性。 亦藉由以SDS-PAGE方式運行經處理及未經處理之樣品 來檢查DOM1 5-26-593及親本之胰蛋白酶抗性。簡言之， 將蛋白質緩衝液交換至PBS中且濃縮至！ mg/ml。將25吨 蛋白貝與1 pg測序級騰蛋白酶（pr〇mega)混合且在下培 養0小時、1小時、3小時及24小時。此後，用Roche完全蛋 白酶抑制劑（1 X)阻斷反應’且添加DTT以及增重劑。使樣 品在100°C下變性5分鐘。將15盹各樣品加載於N〇vex 1〇_ 20% Tricine凝膠上，且用SureBiue(lx)染色蛋白質。結果 展示於圖15中。該實驗tD〇M15_26_593之胰蛋白酶抗性 概況不同於BIAcore實驗所展示之概況，從而提示反應條 件之不同可能會影響胰蛋白酶裂解之最終結果。儘管如 此，如下文所示，DOM15-26-593仍具有較其他所選擇之 純系佳之生物物理性質以及親和力。DOM1 5-26-555變異 體之性質之概述亦展示於下表12中。 表12 屬性 ^----- SEC-M； UXS DSC RBA BIAcore 胰蛋白酶穩s*十峰 dAb 單體 % 估算 mw Tm (°C) nM KD (nM) 昃+24小時時之結合 /0 15-26 0 37-136 64 10 28.2 30 ~---- 131419.doc -156- 200918088 15-26-501 0-40 18-290 51 1.14 9.1 5 " 15-26-555 0 28-78 63 11.7 26.1 10 '— 15-26-588 10 33 70 27 59.1 15 ' 15-26-589 90 17 63 1.94 9.6 65 15-26-591 20 21-234 63 1 16 38 35 ' 15-26-593 80 17 65 0.323 3.2 80 -- 15-26-595 60 17 65 0.828 5 70 一 ~ — - 實例ίο 鑑別DOM15-10變異體 更詳細地分析DOM15-10-11以及其親本DOM15-10。序 列展示於圖16中。與濃度為200 pg/ml之胰蛋白酶一起培養 ( 後在1 〇〇 nM之dAb濃度下就hVEGF結合以BIAc〇re方式比較 dAb。在攪拌（250 rpm)下在37°C下使反應進行1小時、3小 時及24小時。該等dAb之BIAcore迹線展示於圖17中。結果 顯然展示在胰蛋白酶處理24小時後，所選擇之變異體比親 本對蛋白水解更具抗性。 亦藉由運行SDS-PAGE之經處理及未經處理之樣品檢查 鈿‘分子及親本之胰蛋白酶抗性。簡言之，將蛋白質緩衝 液父換至PBS中且濃縮至1 mg/m卜將25叫蛋白質與1叫 I 測序級胰蛋白酶（Promegah^合且在3〇<t下培養〇小時、i小 時、3小時及24小時。此後，用R〇che完全蛋白酶抑制劑 (lx)阻斷反應’且添加DTT以及增重劑。使樣品在⑽。C下 夂！生刀4里將15叫各樣品加载於Novex 10-20% Tricine凝 膠上，且用S则Blue(lx)染色蛋白質。結果呈示於_ 中在此狀況下’騰蛋白酶抗性概況與鳩⑺讀蛋白酶 測試充分相關，從而展+ έ士人、工t, 攸昀展不、纟〇合活性直接反映蛋白質之完整 性。 131419.doc -157· 200918088 實例11 進一步表徵DOMl 5-26-555及DOMl 5-10變異體 首先使用差示掃描量熱法（DSC)分析dAb以確定胰蛋白 酶抗性之增加是否與Tm之增加相關。結果展示於表1 3 中。DOM1 5-26-555變異體之騰蛋白酶抗性與溶融溫度之 間存在相關性。前導DOM15-26-5 88及DOM15-26-593展示 改良之Tm，但其他純系不展示。值得注意的是，雖然起 始時 DOM15-26-555 及 DOM15-10親本分子（63.3-63.7°C)具 有比DOM4-13 0-5 4及DOMlh-131-51 1親本分子（起始時 Tm : 5 7.9-54.1°C)高得多之Tm，但總之，蛋白酶抗性純系 達到類似範圍内之Tm(DOMlh-13 1-51 1/DOM4-130-54變異 體之平均 Tm 為 65.1°C，DOM15-26-55/DOM15-10 變異體之 平均 Tm為 64.9°C)。 表13 名稱 Tm°C D0M 15-26-555 63.3 DOM15-26-588 70.1 DOM15-26-589 63 DOM15-26-591 63 DOM15-26-593 65 DOM15-10 63.7 DOM15-10-11 63.3 在受體結合檢定中比較dAb，且量測BIAcore動力學以確 定胰蛋白酶穩定性之增加是否已使得功效降低。然而， dAb之活性在該檢定中大體上未受影響或甚至得以改良。 結果呈示於表14中。 131419.doc -158- 200918088 表14 純系ID EC5〇 (nM) K〇(nM) DOM15-26-555 11.7 26.1 DOM15-26-588 _ 27 59 1 DOM15-26-589 _ 1.94 96 DOM15-26-591 16 38 DOM15-26-593 0.323 3 2 DOM15-26-594 4.09 15 1 DOM15-26-595 0.828 5 DOM15-10 10.23 23 6 DOM15-10-11 3.58 14.6
Tm增加之優點 大多數蛋白質（包括區域抗體）以兩種狀態存在 態（產生生物學活性分子）及展開狀態（不具有工力能活性） 該兩種狀態在所有溫度下共存且各狀態之相對比例通常由 隨摺疊及展開之動力學常數而變之常數κ確定。熔融溫度 通常定義為K=1之溫度，亦即，指疊蛋白質之比例等於展 開蛋白質之比例時的溫度。常數κ係由蛋白質之穩定及不 穩疋分子内相互作用確定，i因此主要由蛋白質之胺基酸 序列確疋。諸如溫度、pHA、緩衝液組成、壓力之外在參 數影響K，且因此影響熔融溫度。 質為降解機制之容㈣：⑴暴露雙硫鍵視境況 而-會增加氣化或減小之風險，(ii)增加主鏈靈活性可有 ==二解反應，㈣暴露肽片段可提供活體内蛋 留蛋白酶之乾：蛋白酶及下游加工及長期儲存期間遺 聚集及蛋白質沈、殿* 乃奴會導致分子間 蛋白質含量及蛋^所有狀況下，發生蛋白質完整性、 性，⑻確保存放長損失，從而危及⑴確保批次重現 長4穩定性及（ih)活體内功效之努力 I31419.doc -159- 200918088 在自然界中’蛋白質已藉由進化設計以適於在體溫下執 行且經由穩悲機制容易地置換。經由生物技術方法製造出 之冶療蛋白質面對不同環境：其通常由DNA重組技術在外 來侣主中產生，在大容器中以較高量表現，整個下游過程 中經受極重大之pH值或緩衝液組成變化且最後長期以高濃 度儲存在非生理學緩衝液中。新穎傳遞技術（例如吸入、 皮下貼片、緩慢傳遞奈米粒子）亦會增加治療蛋白質所經 受之應力。最後，蛋白質工程化技術之出現使得可產生增 強或完全新穎之治療蛋白質。因為大多數工程化技術為旨 在改變或創造新穎胺基酸序列之基於活體外之技術，不會 發生逐步改良生物蛋白質之進化過程，因而產生在應力抗 性方面具有次最佳效能之蛋白質。 本發明之技術旨在再現整個達爾文進化 ⑽1‘）中蛋白質所面對之條件中之一種。用在組織重 塑及蛋白質穩態中發揮重要作用之蛋白酶灌注肽或多狀 l. (例如免疫球蛋白單-可變區域)。亦測試任何可產生呈有 改良之功能適應之蛋白f的特 震曰貝的特疋犬蜒的適應其表現環境之 能力。在本發明之一實施例中’再現該過程：建立肽或多 肽灸異體4系且暴露於蛋白酶中。在第二 體譜系與特定靶接觸。僅彼 便 變異體能夠與…蛋白酶降解之蛋白質 oo 且因此（例如）由稱為‘淘選，之碎 皁親和力純化過程回收。I ' β 興活體内過程相比，噹系铋袒也 多個優點：蛋白質譜系可 ^糸統ki、 蛋白酶、在較高濃戶下^對車乂見^圍之條件，例如多種 问農度下、歷時較長時間、在不同緩衝液或 131419.doc -160· 200918088 pH值下且在不同溫度下。因此，該活體外技術提供一種設 計可在較所起源、之環境範圍寬之環境中表現且仍穩定的蛋 白質之方式。顯然’此為生物技術工業且尤其治療蛋白質 領域提供多個優點。 實例12 ·蛋白酶抗性前導分子之ρκ相關性資料 進一步在活體内評估四個dAb品系中之每一個品系之親 本dAb及蛋白酶抗性dAb(關於清單及詳情，參見下表15)。 表15 : 品系 dAb ID _ ：—---- 啊货白酶抗性 Tm (°C) 活性 (nM) Fc融合物形 式之ID DOM4-130 DOM4-130-54 良好 54 0.128* DMS1541 DOM4-130-202 64 0.160* DMS1542 DOMlh-131 DOMlh-131-511 良好 57 0.048f DMS1543 DOMlh-131-206 極高 64 0.047f DMS1544 DOM15-10 DOM15-10 低 64 0.913f DMS1546 DOM15-10-11 63 0.577卞 DMS1531 DOM15-26 DOM15-26- 501(*) 低 52 0.330f DMS1545 DOM15-26-593 高 65 0.033f DMS1529 :如由MRC5/IL-a生物檢定所測定；t :如由RBA檢定所測定 註解：DOM15-26-501為本專利申請案申上文所例示之DOM15-26-555 之親本形式。DOM15-26-555在CDR1 (134M)中具有一個生殖系胺基酸突 變。DOM15-26-501具有比DOM15-26-555低之熔融溫度（52V對63.3。〇及 增加之對胰蛋白酶之分解的敏感性。優於DOM15-26-555挑選DOM15-26-501用於PK研究，因為與DOM15-26-593相比，其更充分代表不良穩定 性。 吾人可如下解釋抗性： 1低 131419.doc -161 - 200918088 2中 3良好 4高 5極高 則此意謂親本分子之腌11 〈職蛋白酶抗性為 良好 DOM4-130-54 DOMlh-131-511 良好 DOM15-10 低 DOM15-26-501 低 關於所選擇之前導分子： DOM4-130-202 極高 DOMlh-131-206 極高 DOM15-10-11 黑 DOM15-26-593 高
因為區域抗體之尺寸小（12_15kDa),所以其在靜脈内或 下:主射後自循環中快速清除。實際上，腎絲球過濾截止 Z過50 kDa’且因此諸如抓之小蛋白質當其穿過腎時 曰保留在循環中。以，為評估活體内蛋白酶抗性之長 ::應’吾人用增加全身性滯留之部分標記區域抗體。文 人' 已報導數種旨在延長半衰期之方法(例如PEG、Fc融
Fc部分：白-合等卜在本申請案中，用人類1gG1抗體之 刀不§己區域抗體（或對其編排格式）。該格式提供兩個 所得⑽而之分子尺寸為約75咖，其足夠大以 、、留在循％中，（11)抗體卜部分結合FcRn受體（亦稱 1314l9.doc -162- 200918088 "布蘭貝爾"受體）。該受體定位於上皮細胞、内皮細胞及肝 細胞中且涉及延長抗體及白蛋白之壽命：實際上，在抗體 及其他血清蛋白之胞飲作用後，蛋白質係引導至酸化核内 體，其中FcRn受體在抗體轉運至核内體且使其返回至循環 中之前截取抗體（經由與Fc部分結合）。因此，藉由使Fc部 分標記於dAb，確保dAb將長期暴露於至少兩個隔室：血 清及前核内體隔室（pre-endosomal compartment)中’其各 自含有一組特定蛋白水解酶。另外，FcRn受體介導之穿胞 運輸（transcytosis)，藉此使攜帶Fc之蛋白質遷至及遷出企 管外空間。 藉由經由短介入肽連接子（粗體）使編碼VH及VK dAb之 基因與編碼人類IgGl Fc之基因融合實現用Fc編排格式： 對於VH dAb(加下劃線）： EVQ......GQGTLVTVSSASTHTCPPCPAPELLGGP.. .(hIgGIFc).. .PGK* 對VK dAb(加下劃線）：
DIQ.........GQGTKVEIKRTVAAPSTHTCPPCPAPELLGGP.. (hIgGIFc)...P GK* 根據標準方案使用293-fectin(Invitrogen)藉由瞬時轉染 HEK293/6E細胞產生物質。該等細胞係經設計以當與pTT 系列載體組合使用時高含量瞬時表現（Durocher等人， 2002)。因此，將dAb基因選殖於經修改pTT5載體（pDOM 3 8)中以產生Fc融合物表現載體（參見圖21)。在轉染後5天 收集轉染細胞之上清液，藉由離心澄清且經0.2 μηι過濾器 過濾。藉由捕獲於蛋白質Α流線型樹脂（GE Healthcare)上 純化dAb-Fc融合蛋白。以10 mM擰檬酸鈉（pH 3)自管柱中 131419.doc -163- 200918088 溶離蛋白質，接著添加...及i ]^檸檬酸鈉（pH 6)以達到i〇〇 mM擰檬酸鈉（pH 6)之最終組成。 就活體内半衰期在大鼠中以於雌性SpragUe_Dawiey大鼠 (每組n=3)中5 mg/kg之靶劑量測試dAb_Fc分子。應注意， 靶劑量大大超過大鼠中之靶濃度，所以預期親本dAb與胰 蛋白酶抗性dAb之間的親和力差異（參見實例丨丨）不會影響 活體内分子之最終結果。因此，希望dAb之間的ρκ概況之 差異歸咎於抗原獨立性排除過程。 在才又藥後 0.03、1、4、8、24、48、72、96、120及 168 小時採集jk樣。凝塊形成後’抽出血清且隨後在hIL_ 1R1、TNFR1或VEGF抗原捕獲檢定中測試。 hlL-lRl抗原捕獲檢定： 塗佈有 4 pg/mL抗 hIL- 1R1 阻斷 添加 500 ng/mL shIL-lRl 添加樣品 在1:10,000下用抗人類Fc HRP偵測 TNFR1抗原捕獲檢定： 塗佈有 0.1 gg/mL sTNFRl 阻斷 添加樣品 在l:10,000下用抗人類FcHRP偵測 VEGF抗原捕獲檢定：
塗佈有 0.25 pg/mL VEGF 131419.doc -164- 200918088 阻斷 添加樣品 在1:10,000下用抗人類Fc HRP偵測 使檢定之原始資料轉化為各血清樣品中之藥物之濃度。 隨後在WinNonLin中使用非隔室分析（non-compartmental analysis，NCA)分析各時點之平均pg/mL值。各dAb-Fc對 之PK概況展示於表1 6中，其概述所測出之PK參數。 表16 : ID dAb 半衰期(hr) AUC/D(0-inf) (hr=Vg/inL)/(ing/kg) 外推AUC% DMS1541 4-130-54 93.2 691.5 22.7 DMS1542 4-130-202 176.8 710.1 49 DMS1543 lh-131-511 140.8 1807.5 40 DMS1544 lh-131-206 158.6 2173.0 43.6 DMS1546 15-10 43.2 324.6 3.8 DMS1531 15-10-11 56.6 770.5 n.d. DMS1545 15-26-501 12.9 89 5.1 DMS1529 15-26-593 86.2 804.7 21.0 結果清楚指示，雖然dAb-Fc對4-130-54至lh-13 1-206之 PK概況幾乎可重疊，但該等概況與其他對相差甚遠。當考 慮八11(：/0時，主要可見如下效應：15-10之八1；0/0僅為15-10-11 之 42%。15-26-501 之 AUC/D僅為 15-26-5 93 之 11%。 該等重要差異亦影響（較小程度）半衰期：15-10及15-10-11 分別為43.2 h對56.6 h。對於DOM15-26品系可見更大差 異：15-26-501 及 15-26-593 分別為 12.9 h 對 86.2 h。實際 上，對於使用非隔室分析之良好PK分析，應存在至少4個 用以擬合線性回歸斜率之資料點，且半衰期估算值之時間 應為半衰期計算值之至少3倍。 131419.doc -165 - 200918088 根據本文中之實例中所述之生物物理性質，任何給定 dAb抗胰蛋白酶降解之能力似乎與dAb_Fc融合物在大鼠灰 清中循環較長時間之能力相關。實際上，如實例（諸如實 例10)中所示，DOM15-10及DOM15-26-501為最易降解之 dAb :在1盹胰蛋白酶存在下在3(rc下培養乃吨（^^約3小 時可產生完全降解。該研究中之所有其他dAb(不管其是否 以胰蛋白酶來選擇（亦即，DOM15_1〇_u、D〇M15 26、 593、DOM4-130-202 及 DOMlh-131-206)或其是否已具有部 分如親本分子之胰蛋白酶抗性（D〇M4_13〇_54及D〇Mih_ 13 1 -5 11))當再編排格式於dAb-Fc分子中時在大鼠中具有可 比之pk概況。因此，本發明之卩尺研究提示當彼等dAb具有 極低抗蛋白水解性時，對蛋白水解敏感會對dAb之活體内 系€、疋性產生最大景> 響。亦展示，超過一定程度，胰蛋白酶 降解抗性之進一步增量（例如DOM4-130-206對DOM4-130-54)並不等於說dAb-Fc分子進一步減緩活體内排除之能 力。 在二種狀況下，在胰蛋白酶存在下之選擇產生熱穩定性 (由炫融溫度所定義）增加之新穎分子：D〇m4-130-202、 DOMlh-131-206 及 DOM15-26-593。PK 研究指示，在本發 明資料集中，熔融溫度不足以使所觀察到之ρκ概況合理化 之參數.實際上，DOM15-10具有比DOMKjo-i 1高之 Tm，但比DOM1 5-10-11更快速地自循環中清除。另外， DOM4-130品系之兩個dAb具有顯著不同之丁瓜（相差10。〇， 但當編排格式於dAb-Fc分子中時展示幾乎相同之活體内穩 131419.doc -166- 200918088 疋！·生應、〜本貝上不應排除溶融溫度作為預測活體内 穩定性之I讀參數。對於本發明之資㈣恰好發生的為， 大Tm差異（自541及以上）並不對活體内⑽之走向產生顯 著影響。此並不排除在低於5代之熔融溫度下，⑽之活 體内穩定性可能與熱穩定性相關或也許甚至與熱穩定性及 蛋白酶抗性都相關的可能性。 實例13 /. k'
對DOM10-53-474之胰蛋白酶選擇 經純化DOM1 0-53 -474之胰蛋白酶穩定性 DOM10-53-474為以高效價與江_13結合之區域抗體 評定在胰蛋白酶存在下該dAb之穩定性，用胰蛋白酶分解 純化dAb歷時增加之時點且在凝膠上運行以檢查任何可# 的蛋白質降解。在贼下使25 μ1丨mg/ml之純化〇〇μι(；_ 53-474與i μ1 ! mg/ml之測序級胰蛋白酶一起培養，從而產 生25:1 dAb:騰蛋白酶之分子比。使_與胰蛋白酶—起典 養1 h、4 h及24 h ’且藉由添加4 μ1 R〇ehe完全蛋白酶抑希: 劑中和蛋白酶活性，接著在冰上培養。藉由向⑽中添加 蛋白酶抑制劑而不添加胰蛋白酶製備時間〇之樣品。接著 藉由電泳使用Labchip根據製造商說明書分析2 μΐ樣品。 圖22展示以與胰蛋白酶一起培養歷時增加之時點之 DOMHM3姻運行的凝膠。為了比較，亦如以上所說明 用胰蛋白酶處理一種胰蛋白酶穩定dAb d〇mi5_26_593且 並排運行。如圖中所*，D〇Ml5_26_593即使在與騰蛋白 _一起培養24 h後看起來亦為穩定的。然而，雖妙 131419.doc -167· 200918088 DOM10-53-474在24 h後在一定程度上降解，但在丨hA4 h %點時看起來為穩定的。該等資料表明d〇mi〇-53_474在 一定程度上抗胰蛋白酶降解，但不如最具胰蛋白酶穩定性 之 dAbDOM15-26-593 穩定。 噬菌體呈現DOM10-53-474之胰蛋白酶穩定性： 為評定噬菌體呈現DOM10-53-474之胰蛋白酶穩定性， 將編碼DOM10-53-474之基因選殖於pD〇M33(圖5〇)之 心//7\^/位點中及根據標準技術產生噬菌體。將噬菌體由 PEG沈澱純化，再懸浮於pBS中且測力價。 使。巫菌體呈現dAb與胰蛋白酶一起培養不同時點以評估 胰蛋白酶抗性。與胰蛋白酶一起培養後，在感染指數生長 大腸桿菌TG1細胞後，由力價分析量測穩定性。 在37°C下在震盪培養箱中使1〇〇 μ噬菌體於1〇〇 ^^/…胰 蛋白酶中；1。養1 h、2 h、4 h及隔夜。用Roche完全蛋白酶 抑制劑（X2)阻斷胰蛋白酶活性，且隨後將噬菌體稀釋於2% 於PBS中之marve丨中，在室溫下與1〇 nM經生物素標記化_ 13 —起培養1小時。添加在室溫下用2%kPbs中之 預阻斷1小時的抗生蛋白鏈菌素塗佈珠粒⑴”讣⑶心M_ 280(InVitr〇gen))，且隨後在室溫下將混合物培養$分鐘。 所有與Dynabeads —起進行之培養步驟均在轉輪上進行。 藉由用存於PBS中之〇.1% Tween_2〇洗務珠粒8次洗除未結 合噬菌體。用0.5 ml 〇_丨M甘胺酸（pH 22)溶離結合噬菌體 且用100 μΐ 1 M Tris-HCL(pH 8.0)中和。使用經溶離嗟菌 體感染指數生長之TG1細胞（在37〇c下i小時）且塗鋪於四環 131419.doc 200918088 素板上。在37°C下將各板}立羞坦六 $ 養隔夜，且進行菌落計數。將 胰蛋白酶分解後之噬菌體輪屮 將 歷翰出力價概述於表17中。卷盥肤 蛋白酶一起培養歷時增加時 田/、夷 吁點時，噬菌體力價降低。捭羞 24小時後，所有噬菌體分解。 °奮 表π:對嗟菌體呈現00Μ，·53_474親本執行 酶選擇之輸出力價 史白 —姨蛋白酶培養時間長短 胰蛋白醢澧疮 無胰蛋白酶對照 1 h ' H " 3^107- - — 2h — 一 Ιϋϋμ^/ml ΐχΤη7 4h 隔夜 U-— a v/v/ (Λχ/IIll 100 Mfi/ml 7xl ob 5iT〇^ — 卿 Kg/ml 0 選擇更抗姨蛋白酶之dAb :
為選擇更抗胰蛋白酶降解之dAb，使用Straterg^ Mutazyme 1 1套組、經生物素標記引子及供5〇 ^反應用之 5·50 Pg模板由PCR向編碼DOM1〇_53_474之基因中引入隨 機大k。經心/I及編j分解後，用抗生蛋白鏈菌素塗佈珠 粒自未分解產物巾純化插人物且將其在相應位點處連接於 PDOM33中。用經純化連接混合物轉型大腸桿菌mi細 攸而產生DOM10-53-474之易錯庫。庫之規模為 UxlO且胺基酸突變率為13。 對該庫執行3輪選擇以選擇具有改良蛋白酶抗性之dAb。 在僅有抗原而無胰蛋白酶處理的情況下執行第1輪選擇以 '爭化庫彳之而移除不再以高親和力結合抗原之任何純系。在 IL 13下進行選擇。與6χΐ〇10個輸入嗔菌體相比，第 輪之輸出為2χ1〇9，從而指示庫之大部分以高親和力結合 131419.doc -169- 200918088 抗原。
用1 nM經生物素標記IL TT 執订第2及第3輪選擇。在斟 IL-13淘選之前，在37°c下在 在對 震盈器（250 rpm)中使哼益 與100 pg/ml胰蛋白酶—起谇 P)〒使巫讀體 啼^養。對於第2輪選標， 下或在37t下培養胰蛋白酶工小 — 、 至溫 夺。弟2輪選擇之輸出展一 於表1 8中： 、评心锢®展不 表18:第2輪選擇後輸出之噬菌體力價
使用來自srcn h胰蛋白酶處 f 輸出物作為第3輪選擇之輸入物。對於第3輪選擇，用:〇 咖胰蛋白酶處理嗟菌體且歷時較長時點：在 h，在37C下4 h，在室溫下隔夜或在37。〇下隔夜。第 擇之輸出力價概述於表19中： m選 表19:第3輪選擇後輸出之噬菌體力價
胰蛋白酶處理 無胰蛋白酶 丨丨~ —--- 2 h，37〇C — 4 h > 37〇C 隔夜，室溫 一 ----— 隔夜，37°C 對來自第1 ' 2及3輪之各選擇輸出^^^~~一1 . 之數個純系進行測 序以評定序列多樣性。無胰蛋白酶處 、 处理之第1輪選擇後， 選擇輸出物之50%具有親本DOMl〇-53 — ^474序列。第2輪選 擇後，親本之百分率增加至75%。第3趴、 輪璉擇後，親本之 131419.doc -170- 200918088 百分率增加至800/。。 s亥資料指示D〇Ml 0-53-474已；p·腌及a a攸 ㈣腩Ip 已抗胰蛋白鉍降解，且可自 忒#胰蛋白酶選擇物中選 告 太夕之新穎純系。圖22展示 田用胰蛋白酶分解經純化蛋白質時，d〇mi Ο·”·即使 在胰蛋白酶處理隔夜後亦不會完全分解。然而，為瞭解在 k擇輸出物中是否存在任何比d〇miΟ·”，更具胰蛋白 酶抗性之新穎純系’將在3代下用胰蛋白酶處理嗟菌體隔 / l 伏之第3輪選擇之輸出物亞選殖於PDOM5中。隨後對數百 個純系測序以尋找任何胰蛋白酶抗性純系。在所分析之數 百個’、、屯系中’僅26個純系具有新穎序列，然而該等純系中 沒有一個在胰蛋白酶裂解位點（離胺酸或精胺酸）具有突 變，表明該等純系不比D〇M1〇_53_474更具胰蛋白酶抗 性。 實例14 在騰蛋白酶存在下由噬菌體選擇引入前導d〇M0101(抗 TNFRl)dAb中之儲存及生物物理性改良： 為改良前導分子DOM 1 h-13 1 -5 11之蛋白酶抗性，如先前 所述在胰蛋白酶存在下進行噬菌體選擇。該方法產生大量 與親本DOM 1 h-13 1 -5 11分子相比具有改良胰蛋白酶穩定性 之純系。選擇兩個純系DOMlh-131-202及DOMlh-131-206 以進一步表徵，因為其展示胰蛋白酶作用之最顯著改良。 如下文所概述之進一步研究展示，對於胰蛋白酶作用具有 改良抗性，主要對分子抗剪切應力及熱應力之穩定性存在 其他有利效應。該兩個參數對增加生物醫藥產物之儲存及 131419.doc -171 - 200918088 存放期穩定性至關重要。 馬斯德畢赤酵母中前導DOM0101 dAb之產生： 使用編碼三種前導分子之一級胺基酸序列之基因在馬斯 德畢赤酵母中產生分泌蛋白質。將三種合成基因（D〇Mlh_ 131，511、DOMlh-131-202 及 DOMlh-13 卜 206)選殖於表現 載體pPIC-Zct中，且隨後轉型於兩種畢赤酵母菌株χ33及 KM71H中。將經轉型細胞濾出置於遞增濃度之芥森（1〇〇、 3 00、600及900 Ag/mi)上以選擇具有多個整合子之純系。 隨後在2 L燒瓶中篩選數個純系以鑑別高表現細胞系。隨 後使用最佳表現純系在醱酵罐中以5 L規模產生物質。 蛋白質純化及物質表徵： 為產生高品質物質用於表徵且用於進一步穩定性研究， 使用混合模態電荷感應樹脂（Capt〇 MMC)將下游純化過程 設計為初級捕獲步驟，接著進行陰離子交換⑴ Sepharose)。未顯著優化，此允許回收約7〇%之純度為約 95°/。之表現dAb。使用電噴霧質譜、胺基末端測序及等電 聚焦表徵物質一致性，且使用SDS-PAGE及SEC(尺寸排阻 層析法）表徵純度。 蛋白質一致性： 各蛋白質之第一個5殘基之胺基末端序列分析係如所預 期（EVQLL..·)。使用C4 Zip尖頭（Millipore)對已緩衝液交換 於含有0.10/。冰醋酸之50:50 H2〇:乙腈中之蛋白質樣品執行 質譜分析。對於三種蛋白質中每一種所量測到的質量當允 許因形成内部雙硫鍵而產生之_2質量差時係在基於一級胺 131419.doc -172- 200918088 基酸序列之理論質量(使用平均質量計算)的0.5 Da範圍 内。使用IEF基於對於各蛋白質為不同之pi鑑別蛋白質。 蛋白質純度： 將三種蛋白質以1叫及10吨之量-式兩份褒载於非還原 SDS-PAGE凝膠上。在所有情況下，觀察到單—條帶。
亦執行尺寸排阻層析以顯示純度級。對於尺寸排阻層析 (SEC)，將100叫各蛋白質裝載於TOSOH G2000 SWXL管 柱上，在0.5 ml/min下流動。移動相為pBS/1〇%乙醇。基 於曲線下之面積量測單體百分率（參見圖23)。 比較 DOMlh-131-511、DOMlh-131-202 及 DOMlh-131-206 之穩定性 評定蛋白酶穩定性： 在過量蛋白酶中預培養規定時點後，由BIAc〇reTM分析 殘餘結合活性評定DOMlh-131-511、DOMlh-131-202及 D〇Mlh-131-206之蛋白酶穩定性。將約 1400 RlJ經生物素 標記TNFR1塗佈於抗生蛋白鏈菌素（SA)晶片上。在3〇(3(：下 使 250 nM DOMlh-131-511、DOMlh-131-202 及 DOMlh. 13 1-206與僅PBS—起或與100 pg/ml騰蛋白酶、彈性蛋白酶 或白血球酶一起培養1、3及24小時。藉由添加蛋白酶抑制 劑混合物使反應停止。隨後使用參考池扣除法使dAb/蛋白 酶混合物穿過TNFR1塗佈晶片。在每次注射循環之間用1 〇 μΐ 0· 1 Μ甘胺酸（pH 2.2)使晶片表面再生。相對於無蛋白酶 之dAb結合’測定與蛋白酶一起預培養結合人類TNFR1之 DOMlh-131-511、DOMlh-131-202及 D〇Mlh-131-206(10秒 131419.doc •173· 200918088 時）之比例。在25°C下進行BIAcoreTM運行。以下資料由三 個獨立的實驗產生。條形圖指示平均值，且誤差棒指示結 果之標準偏差（圖24)。 已發現，與 DOMlh-131-511相比，DOMlh-131-202 及 DOMlh-131-206展示具有較大的胰蛋白酶、彈性蛋白酶或 白血球酶蛋白水解降解抗性。與胰蛋白酶一起丨小時後及 與彈性蛋白酶或白企球酶一起3小時後，與D〇M丨h_丨3卜 51 1 相比，DOMlh-131-202 與 DOMlh-1 3 1-206 之間的差異 ' 最明顯。在大部分測試條件下，存在與DOM 1 h-1 3 1 -202相 比，DOMlh-131-206稍更穩定之趨勢。 如使用DSC所測定之dAb之熱穩定性： 為確定在何pH值下前導分子具有最大穩定性，使用差示 掃描量熱計（DSC)量測各dAb在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中之 炫融溫度（Tm)。因為伯瑞坦-魯賓遜由三組分緩衝系統（乙 酸、構酸及棚酸各40 mM)構成，所以有可能在同一溶液中 ( 產生3-10範圍内之pH值。由蛋白質一級胺基酸序列確定理 論pi。由DSC，可見dAb具有最大内在熱穩定性之pH值對 001^111-131-202而言為？117，對〇〇]^111-131-206而言為卩11 7-7.5，且對DOMlh-13 1-511而言為pH 7,5。對於所有隨後 應力及穩定性研究’各dAb在伯瑞坦-魯賓遜缓衝液中使用 以下 pH 值：對 DOMlh-131-202 及 GSK1995057A DOMlh-131-206 而言，pH 7.0 ’ 且對 DOMlh-131-511 而言，pH 7.5。結果概述於表20中。 表20 :如由DSC所測定於伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中1 131419.doc -174- 200918088 mg/ml 之 DOMlh-131-202、DOMlh-131-206 及 DOMlh-131- 51 1之pH值及Tm的概述。溫度以18〇〇c/小時勻變。 dAb — 產生最大固有熱穩定性 之pH值 在給定pH值下dAb之 Tm(°C) DOMlh-131-202 「7.0 Γ 68 6 DOM 1 h-131 -2(J6 7.0-7.5 65.8 DOMlh-131-511 7.5 58.0 兩週熱穩定性測試 f 蛋白質在尚溫下持續長時間之能力通常為其穩定性之良 好指示。在該等條件下，蛋白f可經受數種諸如聚集之物 理過程，或化學改質。在37。〇及5吖下在伯瑞坦_魯賓遜緩 衝液中將dAb(l mg/ml)培養14天。使用SEC測定經14天之 時間溶液中遺留多少單體（圖25)。 由圖 25 可見 DOMlh-131-202 與 DOMlh-13 1-206 顯著比 DOMlh.131.511對熱應力穩定。通常將蛋自f暴露於諸如 37 C及50°C之高溫下來給出藥物長期存放期之指示。使用 該等較高溫度加速與室溫下長期儲存相關之正常過程，諸 如脫醯胺作用、氧化或聚集。亦可使用SEC監測溶液中聚 集形成之程度（圖26A至I)。37。〇下14天後，D〇Mlh_ni_ 5 11自溶液中之損失可歸於沈澱與如由s E c所測定之較高 有序性聚集體之形成（圖26B)。14天後在37它下’關於 〇〇]^111-131-202與〇〇1^111-131-206亦可見顯著較低之蛋白 貝損失，其中聚集體形成極少或無實質性增加，尤其在 DOMlh-131-206之狀況下（圖26H)。在5〇t：下，分子之間的 差異甚至更明顯，DOMlh-131-206在14天後在較高溫度下 展示較DOMlh-131-202佳之穩定性，展示較高分子量聚集 131419.doc -175· 200918088 體之形成顯著降低（圖26)。相對於t=〇，14天後，DOMlh- 1 3 1_206僅展不聚集體形成之小幅增加（圖261)，而DOMlh-131-511幾乎沈澱析出溶液（圖26C)。 此展示由胰蛋白酶選擇引入d A b中之變化（例如改良之熱 穩定性）顯著改良蛋白質在37。(：及5(TC下儲存穩定性。 DOMlh-1 31-202明顯具有且DOMlh_131_2〇6更顯著明顯具 有改良之溶液穩定性及較低的在高溫下形成聚集體之傾 向此可直接解釋為在諸如+4°C及室溫之更多相關溫度下 具有改良之長期儲存穩定性。 隨後由IEF分析熱應力實驗24小時、48小時、7天及14天 日可點之樣品以瞭解蛋白質是否經受任何會影響蛋白質總電 荷之生物物理變化（圖27)。 在 37C 下，DOMlh-131-202 與 DOMlh-131-206 再次展示 與DOM 1 h-13 1 -5 11相比無顯著變化。關於d〇mih-1 3 1 _ 511 ’ 24小時後在37t下出現微弱之第二條帶。咸信，該 額外出現的帶係歸因於蛋白質之二聚作用，從而掩蔽電荷 且產生兩個分子群體。在50°C下，分子之間的差異更明 顯’在局溫下DOM 1 h-13 1 -206明顯展示無顯著變化，而24 小時後，DOMlh-131-202展示一些改質跡象。在伯瑞坦_ 魯賓遜中48小時後，大部分DOMlh-131-511因沈澱而損 失。 由TNFR-1 RBA分析50。〇下之T=0、7及14天時點以確定 暴露於尚溫後蛋白質之功能性（圖28)。雖然目前該檢定在 檢測歸因於應力之分子之微小變化方面不如SEC或ief靈 1314I9.doc -176- 200918088 敏，但可使用其展示dAb仍可結合抗原。 DOMlh-131-511之曲線之向左移動反映大部分dAb已歸 因於沈澱而損失之事實。溶液中遺留之物質仍能夠結合抗 原。如圖25中所示，大部分D〇Mlh_13 ^202與 131-206即使在14天後亦能夠保持在溶液中。RBA展示所 有可〉谷性蛋白質仍具功能性且能夠結合Tnfr 1。 咼蛋白濃度下測試之儲存穩定性： 進行實驗以研究+4°C極高蛋白質濃度下之儲存穩定性以 瞭解在該等條件下各分子如何表現。將所有前導dAb在最 穩定pH值在伯瑞坦·魯賓遜緩衝液中在離心Vivaspin濃縮器 中浪縮（5K戴止點）至約1〇〇 mg/ml。隨後將約1〇〇 mg/ml2 樣品摘置在+4°C下7天，且隨後由SEC分析以瞭解在高濃度 下儲存期間樣品是否會發生任何其他物理變化（圖29)。在 SEC官柱上於ixpBS 1〇%乙醇（v/v)中走柱之前，將樣品稀 釋至約1 rtig/ml。 由 SEC 迹線，可見 DOMlh-131-202 與 DOMlh-131-206 在 7 天後在聚集體形成方面均不展示任何顯著增加，而 DOMlh-131-511單體濃度存在約2%之減小。 前導dAb之喷霧器傳遞： 為進行早期毒理學及臨床研究，將dAb調配為液體形式 且經由噴霧裝置傳遞。視裝置（例如，超音波、噴射或振 網）而定’ dAb當其經噴霧以形成規定粒度之氣霧劑時將經 歷—定程度之剪切應力及熱應力。因為與DOMlh-131-511 相比 ’ DOMlh-13 1-202與 DOMlh-13 1-206具有較高 Tm且展 131419.doc -177- 200918088 7大大改良之熱應力敎性，所以所有dAb均在兩種喷霧 器裝置中測試以瞭解其如何回應喷霧期間所誘發之剪切應 力/熱應力。隨後由SEC分析來自喷霧氣霧劑之蛋白質與裝 置中（亦即杯中）之殘留dAb以確定該過程期間產生聚集 之量。 ' 在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中在最穩定阳值下測試所有分 子。在E-f1〇W Rapid(振網）與PaH LC+(喷射喷霧器）中測試 dAb，其中操作時間為3.5分鐘，蛋白f濃度為$叫㈤且 粒度分布使用Malvern Spraytek確定。結果展示於圖3〇 中。為良好傳遞且分布於深肺中，理想粒度為<5 。所 有dAb在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中產生小於5 μιη之可比粒度 級。在噴務之岫及之後，由Α28〇量測法測定裝置杯中之 dAb之濃度（資料未圖示）。已發現，蛋白質濃度並未顯著 改變，從而指示蛋白質與媒劑在傳遞期間均不會優先霧 化。 在SEC上運行在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中霧化之dAb之樣 品以確定傳遞期間蛋白質是否經受任何物理變化。圖3 1展 示由SEC所測定之杯或氣霧劑中之相對百分率變化。可 見’在單體濃度方面，DOMlh-131-202 與 DOMlh-131-206 相對於DOM 1 h-1 3 1 -5 11經受相對較小之變化。此證明具有 改良丁1„之〇〇1;11]1-131-202與〇〇^4111-131-206在喷霧期間具 有較小的聚集傾向。 圖32展示於伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中之D〇Mlh-13 1-206 及DOMlh-131-511在喷霧後之實際SEC迹線且顯示單體之 131419.doc -178- 200918088 相對損失（圖3 1)係歸因於二聚體形成。此再次提供由 〇〇]^111-131-202及〇〇1^111-131-206所展示之較高熱穩定性 即使在未優化調配物緩衝液中亦可阻止顯著聚集之理論的 其他證據。 關於毒理學及安全評定研究，有必要傳遞比給予患者之 治療劑量顯著高之含量的dAb至動物中。此僅可藉由使用 顯著較高之蛋白質濃度及/或經長時間傳遞dAb來達成。因 f 為已展示〇〇]\4111-131-511在經3.5分鐘在5 111§/1111下嘴霧時 形成聚集體，所以D〇Mlh-131-206係在PBS中在40 mg/ml 下j »式且使用pari LC+ 霧至多1小時。整個運行期間在 各時點採集杯及氣霧劑之樣品以瞭解延長噴霧是否會導致 dAb歸因於剪切應力或熱應力（由SEC測定）及蛋白質濃度 (A280 nm量測法）而聚集。表以展示由A28〇確定之杯與氣 霧劑中之dAb的蛋白質濃度。 表1在使用Pan LC +在約40 mg/ml下喷霧dAb期間， 杯與軋霧劑之由A280吸光度讀數確定之〇〇難_13卜細的 經量測蛋白質濃度。考慮到稀釋誤差及儀器誤差，在經1 小時噴霧dAb後，樣品濃度並未改變。 杯樣品 氣霧劑樣品 (mg/mn (mg/ml) 43.8 1 43.4 __ 44.5 Γ 43.5 44.6 44.1 表、考的歸因於聚集之蛋 _ ^ 時間 iMin) 不存在翻“ w及隹運行期間並未顯著改變，顯示 SEC所測定, 龙日貞損失圖33展不如由 」疋’經1小時之啥裳主 吋之噴務時間，DOMlh_131_206並未形 131419.doc •179· 200918088 成任何較高有序性之聚集體， 由胰蛋白酶選擇向分子中引入 加dAb抗剪切應力及熱應力性 期及噴霧蛋白質以致不形成較 相關。 諸如二聚體。此明顯顯示如 之改良生物物理性質顯著增 ，且此可與改良之儲存存放 高有序性聚集體之能力直接 前導dAb之溶解狀態： 因為所有三種前導dAb之主要降解途徑似乎為最初導致 二聚合接著進-步聚集且最終沈殿之自締合，所以由分析 超速離心（AnalytiCal Ultra_CentrifugatiGn，auc)研究該三 種前導分子以確定自締合之程度。由兩種方法，即沈降平 衡及沈降速度研究蛋白質。 關於沈降平衡方法，在0.5 mg/n^5出⑽範圍内之三 種不同濃度下用離讀應使用三個不同轉子速度運行三個 樣品。由該方法，確定DOMlh_131_5u為穩定二聚體 (26.1-34.4 kDa)，DOMlh_131_2〇2 為單體 / 二聚體平衡 = 2.7-27.8 kDa)，由Kd=1 ·3 μΜ量測在各濃度下具有相對穩 定之二聚物狀態，且主要為單體性（Μ4· 17.9 kDa)，單體締合為二聚體之Κ(^36〇 。
由沈降速度方法，所有樣品在稀釋後展示一定程度之解 離。由展示於圖34中之所獲得之結果，關於D〇Mlh_13K 5Π所觀察到之沈降係數指示較高有序性聚集體，且稀釋 後峰位移為該等聚集體解離之指示。蛋白f聚集及解離互 相抵消，可得出如由沈降平衡所觀察到之穩定二聚體之印 象。關於DQMlh-131_2G2所觀察狀沈降係數指示快速動 131419.doc •180- 200918088 力平衡，且因此可將單體及二聚體峰彼此分開，從而得到 具有比適於樣品質量高之沈降係數之單峰。該結果與沈降 平衡方法所獲得之結果一致，且解離常數經量測為1 μΜ。 DOMlh-131-206係經測定比其他兩個樣品更具單體性，與 其他兩個樣品之2.5 s相比，其具有1.9 s之沈降係數。該資 料與沈降平衡資料極一致。在量測濃度下，360 μΜ之Kd以 下約1 0倍，樣品主要為單體性。 實例1 5 DOM15-26-593 dAb 之效價增強： 圖40中展示VEGFR2受體結合檢定中DOM15-26-593 dAb 比DOM1 5-26親本之效價增加之實例。在該檢定中，在板 基檢定中量測潛在抑制劑阻止VEGF與VEGFR2結合之能 力。在該檢定中，將¥£0?112-?〇嵌合體塗佈於96孔£1^18八 板上，且向其中添加預定量之已與測試dAb稀釋系列一起 預培養之VEGF。洗除未結合蛋白質後，用抗VEGF抗體偵 測與受體結合之VEGF之量，比色測定其含量。以隨測試 物質濃度變化之VEGF結合抑制百分率繪製劑量-反應效 應。因此有效抑制劑為顯示在低濃度下實質性阻斷配位體 結合之抑制劑。 FC融合物之效價及半衰期： VEGF阻斷在治療腫瘤中之治療潛能已實現超過30年。 癌症之慢性性質指示生物醫藥需要長的血清半衰期來介導 其效應，而此與游離dAb因腎濾過而自循環快速清除不相 符。為評定VEGF dAb作為治療癌症之抗血管生成劑之效 131419.doc -181 - 200918088 用，藉由使用FcRn介導抗體補救途徑經由雜交連接子使前 導區域抗體編排格式為與野生型人類IgG1 Fc之融合物以 形成具有延長的血清半衰期之二價分子。 在該Fc融合物格式中，使用先前所述之檢定，可將前導 胰蛋白酶選擇dAb(D〇Ml5_26_593)之效價與最初親本 dAb(DOM15-26)及胰蛋自酶不穩定 dAb(D〇Ml5_26 5〇i)作 比車父。結果展不於下表22中： / 1.,: 表22.呈Fc融合物格式之〇〇]^15_26前導分子之效價 (RBA)及半衰期特徵 ' dAb 效價（nM) 0.506 Tl/2b (hr) ND DOM 15-26 DOM 15-26-501 hlgGl hlgGl DOM 15-26-593 hlgGl 0.323 0.033 12.9 84.6 n ， -々久双 價歸因於親和性㈣㈣效應相_游離_增加。顯 然’由於騰蛋白酶選擇所獲得之的仙冬州之效價辦 加得以維持且在該Fc格式中甚至更明顯。此外，执及蛋: 酶穩定性之改良解釋為分子活體内藥物動力學特性之深度 改變。與_15_26相比，_15·26 593之排除半衰 期之改良（參見圖41)很可能氣a 口 ）很T此為dAb穩定性增加之直接結 果，從而使其變得-4二> & 使八雙仔更抗核内體隔室（end〇s〇mal l〇mpartme，所發生之降解過程。因此，亦預期具有增 敎性之dAb能夠在其中蛋白水解為涉及生物分 子轉換（t_叫之活性過程的其他生物隔室（諸如血清、 黏膜表面及多種組織隔室）中持續較長時間。 131419.doc -182- 200918088 藥物動力學清除概況： 在向3隻大鼠靜脈内投與濃度為5 mg/kg之DOM15-26-593及 DOM15-26-501後，量測 DOM15-26-593及 DOM15-26-501之藥物動力學清除概況。隨後使用直接VEGF結合標準 ELISA檢定及抗人類Fc抗體量測DOM 15-26-593 &DOM15-2 6 - 5 01在jk清中之含量，因此僅债測血清樣品中之完整藥 物。完整藥物動力學概況展示於下表23中： 表23:大鼠中DOM15-26及DOM15-26-593 Fc融合物之 藥物動力學參數概述 dAb 半衰期 Cmax (pg/ml) AUC(O-inf) (hr*pg/ml) 清除率 (ml/hr/kg) DOM15-26-501 12.9 91.4 445.1 11.8 DOM15-26-593 84.6 101.8 3810 1.3 由該等結果可見DOM15-26-593具有顯著改良之藥物動 力學概況，（例如）延長之半衰期及降低之清除率。 DOM1 5-26-5 93之顯著改良之效價及藥物動力學性質產 生對化合物之多種其他生物物理屬性的分析。 ( 溶解狀態性質：由SEC-MALL及AUC分析： 用DOM15-26-593如下進行實驗： DOM1 5-26-593在至多2.5 mg/ml之濃度下以單體形式在 溶液中起作用，其中計算分子質量為78-81 KDa，與約76 kDa之計算完整分子質量（圖42a及42b)—致。 熱熔融性質：由DSC分析 用DOM15-26-593如下進行實驗： 胰蛋白酶選擇dAb(65°C，圖43之中間圖）之增加之熱穩 131419.doc -183 - 200918088 定性在Fc融合物（64.5 °C，圖43之上圖）中得以維持。展示 DOM15-26-501 dAb(52°C，圖43之下圖）之Tm曲線以便比 較。 冷凍-解凍、溫度應力及血清組分之穩定性 用DOM15-26-593如下進行實驗： DOM1 5-26-5 93 dAb之穩定性性質意謂可使DOM 15-26-593 dAb經受物理及生物應力，而對其結合VEGF之能力產 生最小影響（圖44-47(a及b))。舉例而言，可使分子自液氮 (-196°C)至體溫（37°C)重複冷凍解凍10次循環，而如由 ELISA所測定未損失結合活性（圖44)。如由習知尺寸排阻 層析法所評定，該處理亦不會對分子聚集狀態產生明顯改 變（圖45)。其他測試顯示分子可置放於-80°C至55°C範圍之 不同溫度下而僅在最高培養溫度下168小時後，抗原結合 活性略微減小（圖46)。此外，如由VEGF結合ELISA所測 定，在37°C下與人類或獼猴血清一起培養14天不會導致抗 原結合能力損失（圖47a及47b)。 VEGFR2受體結合檢定及HUVEC細胞檢定中之效價： 如下進行上述受體結合檢定： 使用上述受體結合檢定評定Fc融合物之效價（圖48)。已 發現，DOM1 5-26-593 dAb在該檢定中具有增強之效價， 此確立dAb阻斷VEGF與VEGFR2活體外結合之能力。亦在 量測VEGF拮抗劑阻斷HUVE細胞之VEGF刺激增生之能力 的HUVEC(人類臍靜脈内皮細胞）檢定中說明DMS1 529之效 價。在與預定量之VEGF及不同量之測試樣品一起培養固 131419.doc 184- 200918088 定時期結束時，測定細胞數目。拮抗劑越有效’所觀察到 之細胞增生越低（圖4 9)。 該段落中陳列DOM 1 h-13 1 -5 11之核苷酸序列。 DOMlh-131-511之核苷酸序列：
GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC tTGGGGGAGGC TTOQThChQC CTGGGGC50TC CCTOCOTCTC rCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGCG CATOAGACGA TGGTGTGGOT CCGCCAGGCT CCA0GGAAGG GTCTAGAGTC GGTCTCXC^T ATTCCCC€GG TTOGTCAGGA TCCCTTCTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG GTTCACCATC TCCCQCGA<^ ATTCCAAGAA CACGCTATAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACAGCGGXAT ATTACTGTGC GOTGCTTCCT AAGAGGGGGG CTTGCOTTaA CTACTGQOGT CAGGGAACCC TGGTCACCGf CTCGAGC ' 【圖式簡單說明】 圖1說明用於製備噬菌體呈現譜系之pDOM 13(亦稱為 pDOM33)之多個選殖位點。 圖2展示以來自在30°C與40 pg/ml胰蛋白酶一起培養之 dAb之不同時點的樣品運行之數個Novex 1 0-20% Tricene凝 膠。在添加胰蛋白酶之前即刻及隨後在添加胰蛋白酶之後 1小時、3小時及24小時獲取樣品。用1 xSureBlue染色蛋白 ί 質。凝膠說明在與胰蛋白酶一起培養第一個3小時期間， DOM15-10 與 DOM15-26-501 顯著分解。DOM15-26、 DOM4-130-54及DOMlh-131-511之分解僅在與胰蛋白酶一 起培養24小時後才變得明顯。 圖3說明DOMlh-131-511及24個所選擇之變異體之胺基 酸序列。突出所選擇之純系中不同於親本序列之胺基酸 (彼等一致胺基酸由點標記）。對應於CDR1、CDR2及CDR3 之環用框勾晝。 131419.doc -185- 200918088 圖4說明DOM4-130-54及27個所選擇之變異體之胺基酸 序列。突出所選擇之純系中不同於親本序列之胺基酸（彼 荨一致胺基酸由點標記）。對應於CDri、CDR2及CDR3之 環用框勾晝。 圖5說明DOM1 5-2 6-55 5及21個所選擇之變異體之胺基酸 序列。突出所選擇之純系中不同於親本序列之胺基酸（彼 4 一致胺基酸由點標記）。對應於CDR1、CDR2及CDR3之 環用框勾晝。 圖6說明DOM15-10及16個所選擇之變異體之胺基酸序 列。突出所選擇之純系中不同於親本序列之胺基酸（彼等 一致胺基酸由點標記）。對應於CDR1、CDR2及CDR3之環 用框勾晝。 圖7A-7D為展示在37°C下與不同濃度之胰蛋白酶（在〇至 100 pg/ml範圍内）一起培養隔夜後，親本dAb D〇Mlh-131- 5 1 1(圖 7A)及三個變異體 dAb DOMlh-13 1-203(圖 7B)、 DOMlh-131-204(圖 7C)及 DOMlh-131-206(圖 7D)與固定 TNFR1之結合的BIAcore迹線。結果展示在高濃度胰蛋白 酶（100 pg/ml)下，所有三個變異體比親本對蛋白水解更具 抗性。 圖8A-8C為展示在與彈性蛋白酶及白企球酶一起培養隔 夜後 dAb DOMlh-131-511(圖 8A)、DOMlh-13 1-202(圖 8B) 及DOMlh-13 1-206(圖8C)與固定TNFR1之結合的BIAcore迹 線。與親本相比’ dAb對彈性蛋白酶與白血球酶之蛋白水 解展示增加之抗性。 131419.doc -186- 200918088 圖 9 展示以 dAb DOMlh-131-511、DOMlh-13 1-203、 DOMlh-131-204、DOMlh-131-206、DOMlh-131-54、 DOMlh-131-201及DOMlh-13 1-202之與胰蛋白酶一起培養 之前的樣品及以1 〇〇 pg/ml胰蛋白酶一起培養丨小時、3小時 及24小時後的樣品運行的兩個4_i2% Novex Bis-Tris凝 膠。 圖10A-10C為展示在3 7°C下與不同濃度胰蛋白酶（在〇至 100 Mg/ml範圍内）一起培養隔夜後，d〇M4-130-54(圖 f . 4 10A)、D〇M4-130-201(圖 10B)及 DOM4-130-202(圖 10C)與 固定IL-1R1融合蛋白之結合的BIAcore迹線。結果展示在 高濃度胰蛋白酶（100 pg/ml)下，兩個變異體比其親本對蛋 白水解更具抗性。 圖11A-11C為展示與彈性蛋白酶及白血球酶一起培養隔 仪後，DOM4-130-54(圖 11A)、DOM4-130-201(圖 11B)及 DOM4-130-202(圖11C)與固定IL-1R1融合蛋白之結合的 BIAcore迹線。與親本相比，dAb對兩種所測試之蛋白酶之 I: 蛋白水解展示增加之抗性。 圖12說明DOM1 5-26-555及6個變異體之胺基酸序列。突 出所選擇之純系中不同於親本序列之胺基酸（彼等一致胺 基酸由點標記）。 圖13A及13B為展示親本dAb D〇M15-26-555(圖13A)及最 具蛋白酶抗性變異體DOM 15-26-593(圖13B)與固定VEGF 之結合的BIAcore迹線。與濃度為200 jLig/ml之胰蛋白酶一 起培養後在1 00 nM之dAb濃度下就hVEGF結合以BIAcore方 131419.doc •187- 200918088 式比較親本及變異體。在37它下進行反應3小時或24小 時。結果展示在胰蛋白酶處理24小時後，變異體比親本對 蛋白水解更具抗性。 圖14為展示胰蛋白酶處理對d〇m1 5-26-555變異體之 hVEGF結合之影響的圖表。結果顯然展示胰蛋白酶處理24 小時後，所有變異體比親本（DOM15-26-555)對蛋白水解更 具抗性。 圖1 5展示兩個加載1 5 經處理及未經處理之d〇M1 5- 26-555 或 DOM15-26-593 樣品之 Novex 10-20。/。Tricine 凝 膠。在添加胰蛋白酶之前即刻及隨後在添加胰蛋白酶之後 1小時、3小時及24小時獲取樣品。用lxSureBlue染色蛋白 質。凝膠說明DOM15-26-593之胰蛋白酶抗性概況不同於 由BIAcore實驗展示之概況。 圖16說明DOM1 5-10及變異體DOM 15-10-11之胺基酸序 列。突出變異體中不同於親本序列之胺基酸（彼等一致胺 基酸由點標記）。 圖17A及17B為展示親本DOM15-10(圖17A)及變異體 DOM15-10-11(圖17B)與固定VEGF之結合的BIAcore迹線。 與濃度為2〇〇 Mg/ml之胰蛋白酶一起培養後在10〇 nM之dAb 濃度下就hVEGF結合以BIAcore方式比較親本及變異體。 在37°C下進行反應1小時、3小時及24小時。結果展示在胰 蛋白酶處理24小時後’變異體比親本對蛋白水解更具抗 性。 圖18展示兩個加載15吨DOM15-1〇及DOM15-10-11樣品 131419.doc •188- 200918088 之Novex 10·20% Tricene凝膠。在添加胰蛋白酶之前即刻 及隨後在添加胰蛋白酶之後丨小時、3小時及24小時獲取樣 品。用SureBlue(l X)染色蛋白質。結果展示BIAc〇re研究中 可見之結合活性直接反映蛋白質之完整性。 圖19A-19L說明數個編碼為D〇Mlh-131-511或DOM4- 130-54之變異體之dAb的核酸的核苷酸序列。核苷酸序列 分別編碼圖3及圖4中所呈示之胺基酸序列。 圖20八_2犯說明數個編碼為DOM1 5-26-555或DOM15-10 之變異體之dAb的核酸的核苷酸序列。核苷酸序列分別編 碼圖5及圖6中所呈示之胺基酸序列。 圖21展示pDOM38之載體圖。 圖22展示不同時點在3〇。〇下以25:1 dAb:胰蛋白酶比率用 胰蛋白酶處理之DOM10-53-474及DOM15-26-593蛋白質之 在Labchip上運行的凝膠。箭頭展示全長蛋白質。 圖23為展示各樣品由]viMC層析接著陰離子交換純化後 所獲得之高純度級的尺寸排阻層析迹線。在225 nm下監測 uv且用具有ι〇%乙醇（v/v：^lxPBS走柱。藉由經基線校正 之峰面積積分計算單體百分率。 圖 24 展示 DOMlh-131-511、DOMlh-131-202 及 D〇Mlh_ 1 3 1 -206之蛋白酶穩定性資料。 圖 25 為說明 DOMlh-131-202 、D〇Mlh-131-206 及 DOMih-m-sn在3rt及5(rc下在伯瑞坦_魯賓遜緩衝液中 之14天穩定性資料的SEC。所有dAb之蛋白質濃度為1 mg/ml。使用SEC確定熱應力期間蛋白質中是否會發生任 I31419.doc •189· 200918088 何變化及相對於時間=〇(το)樣品溶液中所遺留之單體之 量。 圖26Α至I展示SEC迹線，其展示DOMlh-131-511(A至 C)、DOMlh-131-202(D 至 F)及 DOMlh-131-206(G 至 I)之熱 應力（37°C及50°C)效應。亦展示給定時點下相對於T=0時溶 液中所遺留之單體百分率。 圖27展示熱應力24小時、48小時及7天及14天時DOMlh-13 1-202、DOMlh-13 1-206 及 DOMlh-131-511 之 IEF 分析。 樣品已在37°C或50。〇下在伯瑞坦-魯賓遜缓衝液中培養。 圖 28 為展示在 50°C 下將 DOMlh-131-202、DOMlh-131-206 及 DOMlh-131-511 培養 14 天之效應的 TNFR-1 RBA。假 定蛋白質濃度為1 mg/ml。亦展示不結合抗原之陰性對照 dAb(VH模擬物）。 圖 29說明在 +4°C 下在約 100 mg/mlTWA:DOMlh-131-202 ’ B : DOMlh-13 1-206及 C : DOMlh-131-511在伯瑞坦_ 魯賓遜缓衝液中儲存7天之效應。在280 nm下監測UV。 圖 30 展示 Pari Ε-flow 及 LC+ 中之 DOMlh-131-202、 DOMlh-13 1-206及DOMlh-131-511之噴霧器測試的資料。 蛋白質濃度在任一伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中為5 mg/mh 圖3 1說明在以5 mg/ml存於伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中之 DOMlh-131-202、DOMlh-131-206 及 DOMlh-131-511 喷霧 期間’單體濃度之相對百分率之變化。 圖32展示伯瑞坦-魯賓遜缓衝液中之D〇Mih-l 3 1-206及 DOMlh-131-511 自 Pari LC+喷霧後之SEC迹線。 131419.doc -190- 200918088 圖33展示經1小時喷霧過程期間以40 mg/ml存於PBS中之 DOMlh-13 1-206之SEC迹線。噴霧器杯與氣霧劑中之蛋白 質對喷霧期間dAb可能會經歷之剪切應力及熱應力效應具 有南抗性。 圖34展示三種主要蛋白質（DOMlh-131-206及DOMlh-13 1-511及DOMlh-13 1-202)各自之沈降速度曲線。所觀察 到之較低濃度樣品DOMlh-131-206之雙峰為在此情況下由 來自樣品池之樣品泡漏所致之偽跡。 圖35展示緩衝液及裝置對GSK WPSOSGACDOMlh-lSl-Sll)之喷霧液滴 尺寸之影響。 圖36為如由SEC所量測，在各裝置中喷霧後，由二聚體 形成評定之〇8〖1995 05 6八（〇〇1^111-131-511)之穩定性。 圖 37 展示 Pari E-flow 及 LC+ 中 GSK1922567A(202)、 GSK199505 7A(206)及 GSK1995056A(51 1)之噴霧器測試。 A)伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中之測試，B)PEG 1000/蔗糖緩衝 液中之測試。 圖38描繪人類TNFR1受體結合檢定中之TNF-α劑量曲 線。以四個複本測試各樣品。 圖 39展示人類TNFR1受體結合檢定中 GSK1922567A(DOMlh-131-202) ' GSK1995057A(DOMlh-131-206)及 GSK1995056A(DOMlh-13 卜 511)之抑制。以四 個複本測試各樣品。 圖 40說明 DOM15-26及 DOM15-26-593 dAb在 VEGF RBA 中之效價。 131419.doc -191 - 200918088 圖41展示DMS15 29(DOM15-26-5 93)及DMS1545(DOM15-26-50 1)在以5 mg/mg單次快速靜脈内注射向大鼠投與後之 藥物動力學。 圖42a展示確認單體性質之DMS1529 Fc融合物（DOM15-2-593 Fe融合物）之SEC-MALL(尺寸排阻層析-多角雷射散 射）分析。展示在折射率（亦即，濃度；虛線）及光散射（實 線）方面顯示類似性質之兩個不同批次。用箭頭標記之線 表示分子質量計算值。 圖42b展示確認單體性質之DMS1529 Fc融合物（DOM15-26-593 Fc融合物）之AUC(分析超速離心）分析。在三個不 同濃度，即約0.2、0.5及1.0 mg/ml下在PBS緩衝液中測試 一個批次之材料。沈降速率分析確認分子質量約80 kDa。 圖 43 展示 DMS1529(DOM 15-26-593)及 DOM15-26-501 之 DSC迹線。 圖44為對兩個不同批次之材料進行1 0次冷凍-解凍循環 之前及之後，DMS1529(DOM15-26-593)之 VEGF 結合 ELISA。 圖45展示10次冷凍-解凍循環之前及之後，DOM15-26-593 SEC概況之一致性。 圖46說明DMS1529融合物（DOM15-26-593 Fc融合物）之 加速穩定性研究的結果；結合ELIS A在所示溫度下顯示培 養7天後之活性。 圖47A展示在37°C下培養14及15天後， DMS1529(DOM 15-26-5 93)在人類獼猴中之穩定性。 131419.doc -192- 200918088 圖47B展示在37°C下培養14及15天後， DMS15 29(DOM1 5-26-593)在人類血清中之穩定性。 圖48展示DOM15-26及DOM15-26-593 dAb作為Fc融合物 (相應DMS15 64及1529)在VEGF RBA中之效價。 圖49說明DMS1529融合物（DOM15-26-593 FC融合物）對 HUVEC細胞增生之抑制。 圖50為pDom33載體圖。 圖51a及51b描繪結合血清白蛋白之dAb之序列（胺基酸及 核普酸）。 13U19.doc -193 · 200918088 序列表 <11〇>英商多曼提斯有限公司 <120>多肽、抗體可變區域及拮抗劑 <130>D0051 <140>TW097121301 <141>2008-06-06 <150> US 60/933,632 <151> 2007-06-06 <J50> GB 0724331.4 <151> 2007-12-13 <160> 235 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> I <211> 109 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> pUM\2 <400> 1 60 109 taatgttatt taaatcatta tcaaaattag caaccgcagc agcatttttt gcaggcgtgg caacagcgtc gacacactgc aggaggcggc cgcagaaact gttgaacgt <210〉 2 <211> 119 <212> PRT <2!3>智人 <400> 2
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly I 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala His Glu 20 30
Thr Met Val Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser His lie Pro Pro Val Gty Gin Asp Pro Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys G】y Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Leu Leu Pro Lys Arg Gly Pro Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 no
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <2\0> 3 <211> 108 <212> PRT <213〉智人 <400〉 3
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp lie Tyr Leu Asn 20 25 30
Leu Asp 丁rp Tyr Gin G!n Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He 35 40 45
Asn Phe Gly Ser Glu Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 131419.doc 200918088 G)u Asp Phe A)a Thr 丁yr Tyr Cys Gin Pro Ser Phe 丁yr Phe Pro 丁yr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 4 <211> Π6 <212> PRT <213〉智人 <400> 4
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Ala Tyr 20 25 30
Pro Mel Met Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Va] 35 40 45
Ser Glu lie Ser Pro Ser Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu 丁yr 65 70 75 80
Leu Gin Mel Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Asp Pro Arg Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 100 105 110
Thr Val Ser Ser 115 <210〉 5 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 5
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 】5
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Trp Me Gly Pro Glu 20 25 30
Leu Ser 丁rp Tyr Gin G】n Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 11e 35 40 45
Tyr His Thr Ser lie Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser 0iy Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 丁hr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 丁：/r Cys G!r. G!n Tyr Met Phe Gin Pr。Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Arg Arg 100 105 <210> 6 <211> 358 <212> DNA <213>智人 <400〉 6 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc atggtacagc ctggggggtc cctgcglctc tcctgtgcag cctccggatt cacctilgcg catgagacga tggigtgggt ccgccaggci ccagggaagg gtetagagig ggtctcacat attcccccgg ttggtcagga tcccttctac gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctatai cigcaaatga acagcctgcg tgeegaggae acagcggtat attactgtgc getgettcct aagagggggc cttggtttga ctactggggt cagggaaccc tgglcaccgt ctcgagcg <2]0> 7 <211> 358 <212> DNA <2丨3>智人 <400> 7 gaggtgcagc tgUggagtc igggggaggc nggiacagc cigggg££tc cctgcgicic tcctgtgcag cctccggatt cgcctugcg catgagacga tggigtgggt ccgccaggci ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcccccgg tiggtcagga icccilciac gcagactccg igaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgciaiai 2- 131419.doc 200918088 cigcaaatga acagcclgcg agccgaggac acagcggtat aitactgtgc gctgct tcct 300 aagagggggc ctlggtttga ctactggggt cagggaaccc iggicaccgt ctcgagcg 358 <210> 8 <211> 358 <212> DNA <2丨3>智人 <400> 8 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc tcctgtgcag cctccggatt caactttgcg ccagggaagg gictagagtg ggtctcacal gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac aagagggggc cttggtttga ctactggggt ttggtacagc catgagacga at tcccccgg tcccgcgaca acagcggtat cagggaaccc ciggggggtc tggtgtHggt ttggtcagga attccaagaa at tactgtgc iggicaccgt cctgcgtctc ccgccaggct tccct tctac cacgctatat gctgct tcct ctcgagcg 60 120 180 240 300 358 <210> 9 <211> 358 <212> DNA <213> %人 <400> 9 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc ccigcgtcic 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg catgagacga tggtgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcccccgg ttggtcagga tcccttctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tc'ccgcgacg attccaagaa cacgctatat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acagcgetat attactgtgc gctgcticct 300 aagagggegc cttggtitga ciactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcg 358 <210> 10 <211> 358 <212> DNA <213>智人 <400> 10 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc tcctgtgcag cctccggatt 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agcciaigac gttcggccaa <210> 92 <21i> 22 <2】2> PRT <2丨3>人工序列 <220> <223> Gas前導序列 <400> 92
Met Leu Phe Lys Ser Leu Ser Lys Leu Ala Thr Ala Ala Ala Phe Phe 15 10 15
Ala G)y Val Ala Thr Ala 20 <210> 93 <211> 8 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>基因ΙΠ序列 <400> 93
Ala Ala Ala Glu Thr Val Glu Ser <210> 94 <2)1> 108 17- 131419.doc 200918088 <212> PRT <213>智人 <400> 94
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Va] Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser G3n Ser lie Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr G!n Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Arg Asn Ser Phe Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phc Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 GIu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Tyr Thr Va) Pro Pro 85 90 95
Thr Phe Gly Gin G]y Thr Lys Va) G)u He Lys Gin 100 105 <210> 95 <211> 108 <212> PRT <2]3>智人 <400> 95
Asp (le Gin Met Thr Gin Ser Pro Pro Ser Leu Ser Ala Scr Val Gly 15 10 15 f Asp Arg Va} 丁 hr J !e Thr Cys Arg Ah Ser G!n Ser lie Ser Ser 丁yr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Arg Asn Ser Pro Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 s Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Tyr Ser lie Pro Pro 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val GIu He Lys Arg 100 105 <210〉 96 <2])> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 96
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Va! Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Arg Pro lie Gly Thr Thr 20 25 30
Leu Ser 丁rp 丁yr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45 丁rp Phe Ser Arg Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 i Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 01u Asp Phe Ala Thr Tyr 丁yr Cys Ala Gin Ala Gly Thr His Pro Tin 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <2I0> 97 <211> 108 <2!2> PR丁 <2]3>智人 <400> 97
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly I 5 30 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Lys Tyr He Gly Ser Gin _ 20 25 30
Leu Asn Trp 丁yr Gin Gin Lys Pm Gly Lys AU Pro Lys Leu 18- 131419.doc 200918088 35 40 45
Ala Trp Ala Ser Val Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
SeT Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 G)u Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Arg Gin Gly Ala Ala Ser Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <2I0> 98 <211> 108 <212> PRT <2]3>智人 <400> 98
Asp lie Gin Mel Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 ]5
Asp Arg Vai Thr ile Thr Cys Arg A】a Ser G)n Phe I!e 丁yr Arg 丁yr 20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asn Ala Ser Tyr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin His Ala His Leu Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg 100 105 <210> 99 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 99
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser l.eu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Trp lie Gly Ser Gin 20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro G)y Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Met Trp Arg Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gin Gly Ala Ala Leu Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 100 <211> 108 <212> PRT <2B>智人 <400> 100
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Vai Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Lys He Ala Thr 丁yr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Arg Ser Ser Ser Leu Gin Ser Ala Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Val Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 SO
Glu Asp Phe Aia Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Ty【AU Vai Pro Pro 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 19- 131419.doc 200918088 <21〇> 101 <211> 108 <2I2> PRT <2]3>智人 <400> 101
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Va) Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser GJn Trp lie Asp Thr G]y 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asn Val Ser Arg Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 丁yr Cys Gin Gin Tyr Trp Gly Ser Pro Thr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg 100 105 <210> 102 <211> 108 <2I2> PRT <213>智人 <400> 102
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr Ik Thr Cys Arg Ala Ser Gin Glu lie 丁yr Ser Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asn Ala Ser His Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser G)y Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Jle Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Val lie Gly Asp Pro Val 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg 100 105 <210> 103 <211> 108 <2I2> PRT <213>智人 <400> 103
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Vai Thr iie Thr Cys Arg A!a Ser Gin Ser He Ser Ser 丁yr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Thr Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Arg Leu Ser Val Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser G3y Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Tyr Asn Val Pro Pro 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg ]〇0 105 <210> 104 <211> 108 <212> PRT <2丨3>智人 <400> 104
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Scr Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 20- 131419.doc 200918088 15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu I le 35 40 45
Tyr Arg Asn Ser Gin Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Phe Ala Val Pro Pro 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly 丁hr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 105 <211> 108 <212> PR丁 <213>智人 <400> 105
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg ΑΙςΤ Ser Gin Ser lie Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Giy Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Arg Asn Ser Pro Leu Gin Ser Glv Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Giy Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Tyr Arg Val Pro Pro 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg 100 105 <210> 106 <211> 108 <212> PRT <2]3>智人 <400> 106
Asp lie όΐη Met 丁hr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ηίϋ lie Gly Leu Trp 20 25 30
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Tyr Arg Ser Ser Leu Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Me Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Lys Tyr Asn Leu Pro Tyr 85 90 95
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Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Phe Arg His 20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Me 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ar^ Leu G]n Ser Gi> Val Pro Ser Arg Phe Sei Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 -21 - 131419.doc 200918088
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Val Ala Leu Tyr Pro Lys 85 90 95
Thr Phe Gly Gin G]y Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 100 105 <210> 108 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400〉 108
Asp lie Gin Mel Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Va) Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie lie Lys His 20 25 30
Leu Lys Trp 丁yr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Arg Leu Gin Ser Glv Va! Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Me Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin G】n Gly Ala Arg Trp Pro Gin 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 )05 <210> 109 <211> 108 <212> PRT <2]3>智人 <400> 109
Asp lie Gin Met rrhr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Va] Gly 1 5' 10 15
Asp Arg Va) Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Tyr Tyr His 20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro G】y Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Gin Ser Giy Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Val Arg Lys Val Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg 100 105 <2)0> 110 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> Π0
Asp lie Gin Thr Thr Gin Ser Pro Scr Ser Leu Scr Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Tyr lie Gly Arg Tyr 20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
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Ser 01y Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 乃 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Tyr Arg Met Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin G]y Thr Arg Va) C)u lie Lys Arg 100 105 <210> 111 <211> 108 22- 131419.doc 200918088
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Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin His lie His Arg Glu 20 25 30
Leu Arg Trp 丁yr Gin G】n Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Gin Ala Ser Arg Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser G】y Thr Asp Phe Thr Leu Thr Me Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Gfu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Lys Tyr Leu Pro Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210〉 112 <211> 10S <212> PRT <2]3>智人 <400> 112
Asp ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin His (le His Arg Glu 20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glv Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Gin Ala Ser Arg Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Tyr Arg Val Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 113 <211> 108 <212> PRT <2丨3>智人 <400〉 1]3
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val 丁hr Ile 丁hr Cys Arg Ala Ser Gjn Ser l】e Gly Arg Arg 20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ala Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Arg Thr Ser Trp Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly r 50 55 60 \ Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Ser Gin Trp Pro His 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Me Lys Arg 100 105 <210> 114 <2])> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 114
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly i 5 】0 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys A「g Ala Ser Gin Lys lie 丁yr Lys Αϋη 20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lya Ala Pro Lyy Leu Leu Iie -23 · 131419.doc 200918088 35 40 45
Tyr Asn Ser Ser lie Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr 丁yr Tyr Cys Gin Gin Arg Tyr Leu Ser Pro 丁yr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg 100 105 <210> 115 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 115
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Lys lie Tyr Asn Asn 20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asn Thr Ser lie Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Trp Arg Ala Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 116 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> ]16
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg A!a Ser Gin Trp iie Tyr Lys Ser 20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Gin Ser Ser Leu Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser G)y Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Me Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr His Gin Met Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly G)n Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <2)0> 117 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 117
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Trp lie Tyr Arg His 20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Me 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Arg Leu Gin Ser Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly 丁hr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Giu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr His Asn Pro Pro Lys 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 -24- 131419.doc 200918088 <21ϋ> 118 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 118
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 ]〇 35
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Tyr lie Gly Arg Tyr 20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He 35 40 45
Tyr Asp Ser Ser Val Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 丁hr 丨）e Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Tyr Met Gin Pro Phe 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 119 <211> 108 <212> PRT <213〉智人 <400> 119 f Asp lie On Met Thr On Ser Pro Ser Ser Leu Ser A]a Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Trp lie Gly Arg Tyr 20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Giy Lys Ala Pro Lys Leu Leu He 35 40 45
Tyr Asn Gly Ser Gin Leu Gin Ser Glv Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Scr Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Tyr Leu Gin Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <2】0> 120 <211> 108 <2i2> PRT <2丨3>智人 <400> 120
Asp Me Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Tyr lie Gly Arg Tyr 20 25 30
Leu Arg Trp 丁yr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asp Ser Ser Val Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Asp Phe A!a 丁hr 丁yr 丁yr Cys Gin G)n Arg 丁yr Ser Ser Pro 丁yr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lvs Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 121 <2]]> )08 <212> PRT <213>智人 <400〉 12i
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 25- 131419.doc 200918088 15 】0 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Tyr lie Ser Arg Gin 20 25 30
Leu Arg Trp 丁yr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Giy Ala Ser Val Leu Gin Ser Gly lie Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Tyr lie Thr Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe ⑴y Gin Gly 丁hr Lys Val Glu Val Lys Arg 100 105 <210> 122 <211> 108 <212> PR丁 <213>智人 <400> 122
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Trp lie His Arg Gin 20 25 30
Leu Lys 丁rp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser lie Leu On Ser Gly Va) Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Phe Ser Lys Pro Ser 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> )23 <211> 118 <212> PR丁 <213〉智人 <400> 123 G)u Va) Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Tyr Abp Tyr 20 25 30
Asn Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr lie Thr His Thr Gly Gly Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys 01y Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Gin Asn Pro Ser Tyr Gin Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 124 <231> 120 <212> PRT <213>智人 <400> 124
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Va! Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Leu Tyr 20 25 30
Asp Mel Ser Trp Val A「g Gin Ala Pro (Jly Lys Gly Leu 6lu 丁rp Vai 35 40 45
Ser Ser !!e Va) Asn Ser G】v Val Arg Thr Tyr 丁yr Ala Asp Ser Va) 50 55 60 26- 131419.doc 200918088
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Mel Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 丁hr Ala Va】丁yr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Leu Asn Gin Ser Tyr His 丁rp Asp Phe Asp Tyr Trp 01y Gin 100 105 110 G]y Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210〉 125 <211> 123 <212> PRT <2]3>智人 <400> 125 GIu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 】0 】5
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr 20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pr。Gly Lys Gly Leu Glu 丁rp Val 35 40 45
Ser Ser He Asp Phe Met Gly Pro His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Gly Arg Thr Ser Met Leu Pro Met Lys Gly Lys Phe Asp 丁yr 100 105 110
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 126 <211> 118 <212> PR丁 <213>智人 <400> 126
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly ] 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe His Arg 丁yr 20 25 30
Ser Met Ser 丁rp Val Arg Gin A]a Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr lie Leu Pro Gly Giy Asp Va! Thr Tyr 丁yr A!a Asp Ser Val 50 55 60
Lys 01y Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu 丁yr
65 70 75 SO
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Ala Lys Gin Thr Pro Asp Tyr Met Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
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Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Giy Gly 15 !0 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Lys Tyr 20 25 30
Asn Met Ala Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Giu Trp Val 35 40 45
Ser Tnr lie Leu G!v Glu Gly Asn Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Ly^ Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu G!n Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 131419.doc 27- 200918088 85 90 95
Ala Lys Thr Met Asp 丁yr Lys Phe Asp 丁yr Trp Gly Gin Gly 亍hr Leu 100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115 <210> )28 <211> 118 <212> PRT <213>智人 <400> 128
Glu Va) Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Va) On Pro C]y Cly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp G]u Tyr 20 25 30
Asn Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Cly Lys Gly Leu C)u Trp Va) 35 40 45
Ser Thr He Leu Pro His G)y Asp Arg 丁hr Tyr 丁yr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu 丁yr 65 70 75 80
Leu CHn Met Asn Ser Leu Arg Ala G)u Asp 丁hr Ala Va】 Tyr Tyr tys 85 90 95
Ala Lys Gin Asp Pro Leu 丁yr Arg Phe Asp 丁yr 丁rp G!y Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Va] Thr Val Ser Ser 115 <210> 129 <211> 118 <212> PRT <213>智人 <400> 129
Glu Val CJn Leu Leu Glu Ser Cly Gly Cly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 丁hr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30
Arg Met Ser Trp Va) Arg G)n Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr !le lie Ser Asn Gly Lys Phe Thr 丁yr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
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65 70 75 SO ieu Gin Met Asn Ser Leu Arg A)a G】u Asp 丁hr Ala Vaj Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Gin Asp 亍rp Me! Tyr Mel Phe Asp Tyr Trp Giy Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <2)0> 130 ^ <211> 118 <2!2> PR丁 <213>智人 <400> J30
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser G)y Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly i 5 )0 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr 20 25 30
Thr Met A]a 丁rp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ser lie Thr Ser Ser G】y Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys 0jy Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala 1-vs Val Asn Ser Leu Tyr Lys Phe Asp Tvr Trp Gly G)n Gly Thr 100 105 no 28- 131419.doc 200918088
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Pro Thr 20 25 30
Asn Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 01u 丁rp Val 35 40 45
Ser Thr He Thr G!y Thr Gly Aja A)a 丁hr Tyr 丁yr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 A)a Lys G!n Asn Ser Arg Tyr Arg Phe Asp 丁yr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Xaa ])5 <2]〇> 132 <211> 117 <212> PRT <2丨3>智人 <220> <22)> VARIANT <222> 117 <223> Xaa =任何胺基酸 <400> 132
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Giy Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Aid AU Ser Gly Phe 丁hr Phe Trp Pro Tyr 20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr iie Ser Pro Phe Gly Ser 丁h「丁hr 丁yr 丁yr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys / 85 90 95 、 Ala Lys Giy Gly Lys Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 丁hr Leu Val 100 105 110
Thr Val Ser Ser Xaa Π5 <210> 133 <211> 123 <212> PRT <2丨3>智人 <220> <221〉 VAR丨AN丁 <222> 123 <223> Xaa =任何胺基酸 <4ϋ0> 133
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Giy Gly Leu Val Gin Pro Gly Giy ) 5 10 15 29- 131419.doc 200918088
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Pro Tyr 20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys G)y Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr lie Ser Pro Phe Gly Ser Thr Thr 丁yr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Me Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu On Met Asn Ser Leu Arg A)a Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Ser Asp Val Leu Lys Thr Gly Leu Asp Gly Phe Asp Tyr Trp 100 105 110
Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Va! Ser Ser Xaa 1)5 120 <210> 134 <211> 】21 <212> PRT <213>智人 <220> <221> VARIANT <222> 121 <223> Xaa =任何胺基酸 <400> 134
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Met Ala Tyr 20 25 30
Gin Met Ala Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu G)u Trp Val 35 40 45
Ser Thr lie His Gin Thr Gly Phe Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 SO
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 丁yr Cys 85 90 95
Ala Lys Val Arg 》er Met Arg Pro Tyr Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 Π0
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Xaa 115 120 <210〉 135 <21l> 118 <2I2> PRT <2丨3>智人 <220> <221> VARIANT <222> 118 <223> Xaa =任何胺基酸 / <400> 135
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Pro Tyr 20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr Me Ser Pro Phe G!y Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Mel Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Gly Asn Leu Glu Pro Phe Asp 丁yr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 100 105 Π0
Val Thr Val Ser Ser Xaa 115 <210> 136 •30- 131419.doc 200918088 <2Π> 119 <212> PRT <2】3;>智人 <220> <221〉 VARIANT <222> 119 <223> Xaa =任何胺基酸 <400> 136 G!u Val Gin Leu Leu Glu Ser G!y Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly I 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Pro Tyr 20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr lie Ser Pro Phe Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 丁yr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Lys Thr Gly Pro Ser Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr ]〇0 105 )10
Leu Val Thr Val Ser Ser Xaa 115 <210> 137 <211> 118 <212> PRT <213>智人 <220> <221> VARIANT <222> 118 <223> Xaa =任何胺基酸 <400> 137
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Glv Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 ]〇 】5
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Pro Tyr 20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr lie Ser Pro Phe Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 SO
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Lys Leu Ser Asn Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 100 105 110
Va丨 Thr Val &er Ser Xaa 115 <210> 138 <2I1> 119 <212> PRT <213>智人 <220> <221> VARIANT <222> 119 <223> Xaa =任何胺基酸 <400> 138
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cvs Aia Ala Ser Giy Phe Thr Phe Trp Pro Tyr 20 " 25 30
Thr Met Ser 丁rp Val Arg Gin Ma Pro G】y Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser 丁hr He Ser Pro Phe Gly Ser 丁hr Thr 丁yr 丁yr Aia Asp Ser Va】 -31 - 131419.doc 200918088 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tvr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Val Val Lys Asp Asn Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 no
Leu Val Thr Val Ser Ser Xaa )]5 <210> 139 <211> 119 <2I2> PRT <213>智人 <220> <221> VARIANT <222> 119 <223> Xaa =任何胺基酸 <400> 139
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 ]〇 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala A)a Ser Gly Phe Thr Phe Trp Pro Tyr 20 25 30
Thr Mel Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr !le Ser Pro Phe Gly Ser Thr Thr Tyr 丁yr Aia Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Asn Thr Gly Gly Lys Gin Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Xaa 115 <210> 140 <21!> 】2! <2]2> PRT <2]3>智人 <220> <221> νΛΗίΛιΝΤ <222> 121 <223〉Xaa =任何胺基酸 <400> 140
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Aia Ala Ser Gly Phe 丁hr Phe 丁rp Pro 丁yr 20 25 30
Thr Mel Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr Me Ser Pro Phe Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gh Met Asn Ser Leu Arg AU Glu Asp Tlu Ala Val Tyr 丁yr Cys 85 90 95
Ala Lys Arg Thr Asn Arg Gly Va) Ser Phe Asp 丁yr 丁卬 Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Leu Va) Thr Val Ser Ser Xaa 1)5 120 <210> 141 <211> 121 <212> PRT <2】3>智人 <220> 131419.doc •32- 200918088 <221> VARIANT <222> 121 <223> Xaa =任何胺基酸 <400> 141
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Asp Tyr 20 25 30
Asp Met Thr Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Met lie Ser Ser Ser Gly Leu Trp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Gly Phe Arg Leu Phe Pro Arg Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Xaa 115 120 <210> 142 <2)1> 108 <2I2> PRT <213>智人 f <400> 142
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly I 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Asn 下rp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Pro Leu Gin Ser Giy Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Tyr Ser Val Pro Pro 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg 100 105 <210> 143 <21i> 108 <212> PRT <2丨3>智人 <400> 143
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys A!a Pro Lys Leu Leu lie \ 35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Pro Leu Gin Ser Gly Va] Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Tyr Arg lie Pro Pro 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg 100 105
<210> 144 <21)> 108 <212> PRT <2Π>智人 <400> M4
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Va] Gly 1 5 10 •33· 131419.doc 200918088
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Phe Lys Ser 20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He 35 40 45
Tyr Asn Ala Ser Tyr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
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<210> 210 <211> 355 <2I2> DNA 131419.doc ttggttcgac tacatactac 180 at iccaagaa cacgctgtat 240 altactglgc gaaaagtgat 300 agggaaccct ggtcaccgtc 360 367 ctggggggtc cctgcgtctc 60 tggcttgggt ccgccaggct 120 cggglttttc tacatactac 180 attccaagaa cacgctgtat 240 attactgigc gaaagtgcgt 300 ccctggtcac cgtctcgagc 360 361 ctggggggtc cctgcgtctc 60 tgagttgggt ccgccaggct 120 ttggttcgac tacatactac ISO attccaagaa cacgctgtat 240 atlactgtgc gaaaggtaat 300 ccgtctcgag eg 352 ctggggggtc cctgcgtctc 60 tgagttgggt ccgccaggct 120 ttggttcgac tacatactac 180 attccaagaa cacgctgtai 240 atiactgtgc gaaaaagacg 300 tcaccgtctc gageg 355 ciggggggic ccigcgtctc 60 tgagttgggt ccgccaggct 120 ttggttcgac tacatactac 180 attccaagaa cacgctgtat 240 attactgigc gaaaaagctt 300 ccgictcgag eg 352 ctggggggtc cctgcgtctc 00 tgagttgggt ccgccaggct 120 ttggticgac tacatactac 180 attccaagaa cacgctgtat 240 attactgigc gaaagiggtt 300 tcaccgtctc gageg 355 -47- 200918088 <213>智人 <400> 210 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgictc tcctgtgcag cctccggaU caccltttgg ccgUtacga tgagttgggt ccgccaggct ccagggaagg gtctagaglg ggtctcaacg atitcgccgt Uggitcgac tacaiactac gcagactccg tgaagggccg gttcaccatt tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat ctgcaaaiga acagcctgcg tgccgaggac accgcggiat aitacigtgc gaaaaataci gggggtaagc agtttgacta ctggggtcag ggaacccigg tcaccgtctc gagcg <210> 211 <2Π> 36] <212> DNA <213>智人 <400> 2J] gaggtgcagc tgtlggagtc tgggggaggc tiggtacagc ciggggggtc cctgcgtctc Iccigigcag cctccggait cacctttigg ccgtaiacga tgagngggt ccgccaggci ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaacg atttcgccgt ttggttcgac tacatactac gcagaciccg tgaagggccg gttcaccalc tcccgcgaca aticcaagaa cacgcigtat ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaaggact gagaaiaggg gggutctu tgaciactgg gglcagggaa ccciggicac cgtctcgagc g <210> 212 <2!1> 36] <212> DNA <2]3>智人 <400> 212 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc iccigigcag cctccggati cacctttaag gattatgata tgacttgggt ccgccaggct ccagggaagg gtctagaglg ggtctcaatg atttcttcgt cgggictttg gacatactac gcagactccg 丨gaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca auccaagaa cacgctgtat ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaggttil aggciguic ctcggaciii 丨gactactgg ggtcagggaa ccctggtcac cgtctcgagc g <210〉 213 <2Π> 357 <212> DNA <213>智人 <400> 213 gaggttcaat tgttggaatc cggtggtgga ttggttcaac ctggiggitc tttgagattE iccigtgctg cticcggtit tactttcgci cacgagacta iggtttgggt tagacaggci ccaggtaaa^ gutUgaatg ggutcccac attccaccag atggtcaaga gciganccg itaagggaag attcactatc iccagagaca actccaagaa cactugtac ttgcagatga actccttgag agctgaggat actgctgut accactgtgc rttgttgcca aagagaggac cttggtttga ttacigggga cagggaactt tggttactgt ttcttcc <2J0> 214 <211> 119 <212> PRT <213>智人 <400> 214
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Giy Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala His Glu 20 25 30
Thr Mei Val Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser His ile Pro Pro Asp Gly Gin Asp Pro Phe 丁yr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys 85 90 95
Ala Leu Leu Pro Lys Arg Gly Pro Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val 丁hr Val Ser Ser 115 48- 13l4l9.doc 200918088 <2】0> 215 <211> 357 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> —致序列 <220> <221> misc_feature <222> (6)...(6) <223> n = t 或 g <220> <221> misc_feature <222> (9)...(9) <223〉 n = a 或 g <220> <221> misc一feature <222> (10)...(10) <223〉 n = t 或 c <220> <221> misc.feature <222> (18)...(18) <^23> n = a 或 g <220> <221> misc_feature <222> (21)...(2]) <223> n = c 或 l <220> <221> misc^feature <222> (24)...(24) <223> n = t 或 g <220> <221> misc^fealure <222> (27)...(27) <223> η = 1 或 a <220> <22]> misc_feature <222> (30)...(30) <323> n = a 或 c <220> <22!> misc_feature <222> ¢36)...(36) \ <223> n = t 或 a <220> <221> misc_feature <222> (39),..(39) <223> n = a 或 g <220> <221> misc^feature <222> (45),..(45) <223> n = t 或 g <220> <221> misc_feature <222> (48)...(48) <223> n = t 或 g -49 131419.doc 200918088 <220> <221> misc_feature <222> (51)...(51) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_fealure <222> (52)...(52) <223> n = t 或 c <220> <221> misc.feature <222〉 （55)...(55) <223> η = a 或 c <220〉 <221> misc^feature <222〉 （57)…（57) <223> n = a 或 i <220> <221> misc.feature <222> (58)...(58) <223〉 n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (60)...(60) <223> n = g 或 c <220> <221> misc一feature <222> (69)...(69) <223〉 n = l 或 a <220〉 <221> rmsc_feature <222> (72)...(72) <223〉 n = t 或 c <220> <221> misc.feature <222> (78)...(78) <223> n = l 或 a <220> 4: <221> misc feature \, <222> (81)...(81) <223> π = t 或 c <220> <221> misc.feature <222> (84)...(84) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (87),..(87) <223> n = c 或 t <220〉 -50- 131419.doc 200918088 <221> misc_feature <222> (90)...(90) <223> n = t 或 g <220〉 <221> misc_feature <222> (93)...(93) <223> π = c 或 i <220> <221> misc_feature <222> (99)...(99) <223> n = t 或 g <220> <221> misc_feature <222> (105T...(105) <223> n = t 或 g <220> <221> misc^feature <222> (31lT...(111) <223> n = t 或 c <220> <221> misc^feature <222> (Π2Τ...(112) <223> n = a 或 c <220> <221> misc_fealure <222> (114了...（114) <223> n = a 或 c <220> <221> misc^feature <222> (12〇T...(120) <223> n = t 或 a <220> <221> misc_feature <222> (126T...(126) <223> n = t 或 g <220> <221> misc_feature <222> (1295...(129) <223> n = a 或 g <220> <221> mi sc feature <222> (132T...(132) <223> n = a 或 t <220> <221> mi sc一feature <222> (133T...(133) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feaiure <222> (135T...(135) <223> π = g 或 a -51 · 131419.doc 200918088 <220> <221> misc^feature <222> (138),..(138) <223> n = a 或 g <220> <221> misc_feature <222> (144)...(144) <223> n = t 或 c <220> <221> misc.feature <222> (147T，..(147) <223> n = c 或 a <220> <221> misc一feature <222> (15〇T...(150) <223> n = c 或 i <220> <221> misc^feaiure <222> (156T...(156) <223> η ：= a 或 c <220> <221> misc_feature <222> (159T...0 59) <223〉 n = a 或 g <220> <221> misc^feature <222> (168了…（168) <223> n = a 或 g <220> <221> misc_feature <222> (174)...(174) <223> n = a 或 c <220> <22l> misc_feature <222> (1S3)...(183) <223〉 η = I 或 a <220> <221> misc_feature <222> (192)...(192) <223> n = t 或 g <220> <221> misc_feature <222> …（198) <223> n = a 或 〇 <22ϋ> <22)> misc_feature <222> (199)...(199) <223> η = a 或 c <220> -52- 131419.doc 200918088 <221> misc_feature <222> (20lj...(201) <223> n = a 或 g <220> <221> misc feature <222> (207)...(207) <223> n = t 或 c <220> <221> misc^feature <222> (214T...(214) <223> n = a 或 c <220〉 <221> misc.feature <222> (216)...(216) <223〉 n = a 或 c <220〉 <221> misc feature <222> (222)...(222) <223> n = c 或 t <220> <221〉miscjeature <222> (234)...(234) <223> n = t 或 g <220> <221> misc.feature <222> (235j...(235) <223> n = i 或 c <220〉 <221> misc feature <222> (237j...(237) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> ¢240)...(240) <>23> n = c 或 t <220> <221> misc_feature i <222> ¢241]...(241) \ <223> n =【或 c <220〉 <221> misc^feature <222> (246)...(246) <223〉 n 二 g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (253T...(253) <223> n = t 或 a <220> <221> misc.feature <222> (254)...(254) <223〉 n = c 或 g -53 - 131419.doc 200918088 <220> <221> misc^feature <222> (256T...(256) <223> η = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (259),..(259) <223> n = a 或 c <220> <221> misc_feature <222> (261)...(261) <223> n = a 或 t <220> <22】> mi sc一feature <222> (264)...(264) <223〉 n = t 或 c <220> <221> misc^feature <222> (27〇T...(270) <2〉3> η = t 或 c <220> <221> misc一feature <222> (273)...(273) <223> n = t 或 a <220〉 <221> misc.feature <222> (276T...(276) <223> n = t 或 g <220> <221> misc.feature <222> (279T...(279) <223> n = t 或 a <220> <221> misc.feaiure <222> (282j...(282) <223〉 n = c 或 t <220〉 i <221> misc_feaiure \ <222> (29lT...(291) <223〉 n = t 或 g <220〉 <221> misc_feature <222> (292j...(292) <223> η = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (295)...(295) <223> n = t 或 c <220〉 -54- 131419.doc 200918088 <221> misc_feature <222> (297)...(297) <223〉 n = g 或 t <220〉 <221> misc.feature <222> (300T...(300) <223〉 n = a 或 t <221> misc^feature <222> (306T...(306) <223> n = a 或 g <220> <22!> mi sc一feature <222> (309T...(309) <223〉 n = a 或 g <220> <221> misc^feature <222> (32lT...(321) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (33〇j...(330) <223> n = a 或 t <220> <221> misc_feature <222> (339j...(339) <223> π = t 或 c <220> <221> misc一feature <222> (340)...(340) <223〉 n = i 或 c <220> <221〉mi sc feature <222> (345)...(345) <223> n = l 或 c <220> <221> misc_feature <222> (348j,..(348) <223> n = t 或 c <220> <221> misc.feature <222> (35lT...(351) <223> n = ΐ 或 c <220> <22】> misc-feature <222> (354-).. .(354) <223> n = t 或 g <220> <221> misc.feature <222> (355)...(355) <223〉 n =〖或 a -55- 131419.doc 200918088 <220> <221> misc_feature <222> (356)...(356) <223〉 n = c 或 g <400〉 215 gaggtncann tgttggantc nggnggnggn ttggincanc ctggnggntc nntgngnntn tcctgigcng cniccggntt nacntingcn cangagacna igginigggi nngncaggcn ccaggnaang gnntngantg ggtntcncan attccnccng atgglcanga tccnttctac gcngactccg tnaagggnng nttcacnatc iccngngaca antccaagaa cacnntntan nrgcanatga acnncntgng ngcngaggan acngcngtnt ancactgtgc nntsnlnccn aagagnggnc cttggtltga niactggggn cagggaacnn tggtnacngt ntcnnnc <210> 216 <211> 366 <212> DNA <2Π>智人 <400> 216 gagaaaagag aggitcaatt gcttgaatct ggaggaggtt tggtccagcc aggagggtcc cticgactaa gugtgetgc cagtgggUt acgtttgctc aigaaactat ggialgggtc cgacaggcac ctggtaaagg tcttgaatgg gtttcacata tccctccaga cggtcaagac ccaltttacg ctgattccgt gaaaggcaga tttacaaiit cacgagataa ttctaaaaac accitgtact tacaaatgaa ctcattgaga gctgaggaca ctgcagttta tcactgcgcl ttactaccaa aacgtggacc tlggtitgat tatiggggcc aaggtacgtt agtgactgil agttct <210> 217 <211> 122 <212> PRT <213>智人 <400> 217
Glu Lys Arg Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin 15 10 15
Pro Giy Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 20 25 30
Ala His Glu Thr Met Val Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45
Glu Trp Val Ser His He Pro Pro Asp Gly Gin Asp Pro Phe Tyr Ala 50 55 60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 65 70 75 80
Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95
Tyr His Cys Ala Leu Leu Pro Lys Ai'g G】y Prc 丁卬 Phe Asp 丁yr 丁rp 100 105 110
Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 218 <211> 366 <212> DNA <213>馬斯德畢赤酵母 <400> 2】8 gagaaaagag aggitcaatt gcttgaatct ggaggaggti tggtccagcc aggagggtcc cttcgactaa gtigtgctgc cagtgggm acgtttgctc atgaaactat ggtatgggtc cgacaggcac ctggiaaagg tcttgaatgg gtitcacata tccctccaga cggtcaagac ccanttacg cigattccgt gaaaggcaga ittacaattt cacgagataa ttctaaaaac accttgtact tacaaatgaa ctcattgaga gctgaggaca cigcagtlta tcactgcgct ttactaccaa aacgtggacc uggtttgat tatiggggcc aaggtacgtt agtgactgtt agttct <210> 219 <211> 358 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> —致序列 56- 131419.doc 200918088 <220> <22)> misc_feature <222> (6)...(6) <223> n = g 或 t <220> <221> misc.feature <222> (9)...(9) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (10)...(10) <223> n = c 或 t <220> <221> misc一feature <222> (13)...(13) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feaiure <222> (15)...(15) <223> n = g 或 t <220> <221> mi sc_fealure <222> (18)...(18) <223> n = g 或 a <220> <221> mi sc_feature <222> (24)...(24) <223〉 n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (30)...(30) <223> n = c 或 ί <220> <221> misc_feature <222〉 （36)..,(36) <223> n = a 或 c <220> .% <221> misc_feature ^ <222〉 （42)…（42) <223> n = t 或 a <220> <221> misc_fealure <222> (45)...(45) <22Ϊ> n = g 或 a <220> <22I> mi sc_feature <222> (54)...(54) <223> n = g 或 l <220> <'221> misc_fea[ure -57- 131419.doc 200918088 <222> (57),..(57) <223> η = t 或 a <220> <221> misc_feature <222> (60)...(60) <223> η = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (61)...(61) <223> η = t 或 a <220> <221> misc一feature <222> (62)...(62) <223> n = c 或 g <220> <22]> misc_feature <222> (63)...(63) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (69)...(69) <223> n = a 或 t <220> <221> misc feature <222> (73)...(73) <223> n = t 或 a <220> <221> misc_feature <222> (74)...(74) <223> n = c 或 g <220> <221> misc.feature <222> (75).,.(75) <223〉 n = c 或 t <220> <221> misc.feature <222> (78)...(78) <223〉 n = a 或 g <220> <221> misc.feature <222> (81)...(81) <223> n = c 或 i <220> <221> misc_feature <222> (84)...(84) <223> n = c ^ g <220> <221> misc_feature <222> ¢90)...(90) <223> n = g 或 t -58 131419.doc 200918088 <220> <221> misc^feature <222> (96)...(96) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (99)7..(99) <223〉 n = g 或 ί <220> <221> misc feature <222> (105)...(105) <223〉 n = g 或 a <220> <221> mi sc一feature <222> (114]...(Π4) <223> η = c 或 a <220〉 <221> misc_feature <221> (123)...(123) / <223> n = a 或 t <220> <221> misc.feature <222> (126),..(126) <223> n = g 或 t <220> <221> misc^feature <222> (129"). .,(129) <223〉 n = g 或 a <220> <221> misc feature <222> (1351...(135) n - a 或 t <220> <221> misc feature <222> (138T...(138) <223> n = g 或 a <220> <221> misc feature <222> (144)...(144) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (153T...U53) <223> n = t 或 c <220> <221> miiic_feature <222> (156)...(156) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (159]...(159) -59 131419.doc 200918088 <223> η ; g 或 a <220> <221> mi sc_feature <222> (]62T...(162) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (168j,..(168) <223> n = g 或 a <220> <221> mi sc feature <222> (17lT...(171) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (174)...(174) <223> n = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (177T...(177) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (183^...(183) <223> π = a 或 t <220> <221> misc_feature <222> (186T...(186) <223> n = c 或 i <220> <221> misc_fcalure <222> (195)...(195) <223> n = g 或 a <220> <22)> misc_fealure <222> (199)...(199) <223> n = c 或 a <220〉 <221> misc_feaiure <222> (20Π. ..(201) <223> n = g 或 a <220> <221> misc feature <222> (204)...(204) <223〉n =： c 或 t <220> <221> misc_fea(ure <222> (207T...(207) <223> n = c 或 a -60 131419.doc 200918088 <220> <221> misc^feature <222> (210)...(210) <223> η = c 或 t <220> <221> misc一feature <222> ¢213]...(213) <223> n = c 或 a <220> <221> misc^feaiure <222> C216T，..C216) <223> n = c 或 a <220> <221> misc.feature <222> (219T...(219) <223> n = c 或 t <220> <221> mi sc feature <222> (225j...(225) <223〉 η = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (228T...(228) <223〉 η = g 或 a <220> <221> m sc一feature <222> (234),..(234) <223> n = g 或 c <220> <221> misc.feature <222> (235j...(235) <223> n = c 或 t <220> <22l> misc feature <222> (237)..,(237) <223> n = a 或 g <220> <221> misc feature \ <222〉 （240)...(240) <223〉 n = t 或 c <220> <221> mi sc_feature <222> (24lT...(241) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (243j...(243) <223〉 n = g 或 a <220> <221> misc_feature <2'22> (253). . .( 253) -61 131419.doc 200918088 <223> η = a 或 t <220> <221> misc一feature <222> (254)...(254) <223〉 n = g 或 c <220> <221> mi sc feature <222> (255)...(255) <223〉 n = c 或 a <220> <221> mi sc一feature <222> (256T...(256) <223> n = c 或 t <220> <221> mi sc feature <222> (259了…（259) <223> n = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (26〇.. .(261) <223> π = t 或 a <220> <221> mi sc—feature <222> (264"). ..(264) <223〉 n = c 或 t <220> <221> misc^feature <222〉 （273了...（273) <223> n = a 或 i <220> <221> rrii sc_fcature <222> (276^...(276) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222〉 （279了...（279) <223〉 n = a 或 t <220> <221> misc_feature <222> (288j...(288) <223> n = t 或 c <220> <22l> mi sc—feature <222> (29lT...(291) <223> n = g 或 l <220> <221> misc feature <222> (292)...(292) <223> π = c 或 1 •62 131419.doc 200918088 <220〉 <221> misc.feature <222> (294T...(294) <223> η = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (297T...(297) <223> n = t 或 a <220> <221> misc_feature <222> (30〇T...(300) <223> π = t 或 a <220> <223> mi sc^fealure <222> (3037-..(303) <223> n = g 或 a <220> <221> misc^feaiure <222> (304)...(304) <223〉 n = a 或 c <220> <221> misc.feature <222> (306T...(306) <223> n = g 或 t <220> <22l> misc_feature <222> (309j...(309) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222〉 （32lT…（321) <223> n = c ^ t <220> <221> misc_feature <222> (324T...(324) <223〉 n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> ¢330)...(330) <223> n = t 或 c <220> <221> rr.isc^feature <222> (333)...(333) <223> n = g 或 a <220> <221> m】sc_feature <222> (336T...(336) <223> n = a 或 t <220> <221> mi sc_feature •63- 131419.doc 200918088 <222> (339)...(339) <223> η = c 或 g <220> <221> misc_feature <222> (34〇T...(340) <223> η = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> ¢342).,.(342) <223> n = g 或 a <220> <22)> misc.feature <222> (345)...(345) <223> n = c 或 g <220> <22】> misc_i’ea【ure <222> (348)...(348) <223> n = c ^ t <220> <221> misc.feature <222> (351)...(351) <223> n = c或空白 <220〉 <221> mi sc一feature <222> (353T...(353) <223> n = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (355T.,.(355) <223> n = a 或 t <220> <22)> misc_feature <222> (356j...(356) <223> n = g 或 t <220〉 <221> misc_feature <222> (358^...(358) <223> n = 空白或t cctncgnctn 60 ccgncaggca !20 nccnttniac !80 cacnntntan 240 nntnctnccn 300 ntngnncn 358 <400> 219 gaggtncann nnnlgigcng ccnggnaang gcngantccg ntncaaatga aanngnggnc tgntngantc ccnnnggnt t gtctngantg tgaanggcng iicnnnntgng cttggt t tga tggnggaggn nacnmgcn ggintcacat nltnacnatn ngcngaggac nrantggggn t tggmcagc catganacna atnccnccng icncgngana acngcngtnt canggnacnn cnggngggtc tggtntgggt anggtcanga at tcnaanaa atcactgngc tngtnacngt <210〉 220 <2H> 357 <212> DNA <213>智人 <400> 220 gaagtgcagc ucttgaaag tggtggaggg ctagtgcagc cagggggatc tttaagaita 60 tcatgcgctg ccagtggait iacttitgct cacgagacga tggtctgggt gagacaagci 120 • 64· 131419.doc 200918088 cctggaaaag gtttagagtg ggtttctcac aticcacctg atggtcaaga tcctttctac 180 gcagattccg tcaaaggaag atttactatc tccagagata atagtaaaaa cactttgtac 240 c【acagatga actcact tag agccgaagat accgctgtgt accactgcgc cttgttgcca 300 aagagaggtc cttggttcga ttactggggt cagggtactc tggttacagt ctcatct 357 <210〉 221 <211> 1】9 <2]2> PRT <2丨3>智人 <400〉 221
Glu Val Gin Leu Leu GIu Ser Gly Gly Gly Leu Va! Gin Pro Cly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala His Glu 20 25 30
Thr Met Va) Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser His He Pro Pro Asp Gly Gin Asp Pro Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr I)e Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys 85 90 95
Ala Leu Leu Pro Lys Arg Gly Pro Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 222 <211> 357 <212> DNA <213>馬斯德畢赤酵母 <400> 222 gaagtgcagc ttcttgaaag tggtggaggg tcatgcgctg ccagtggatt tacttttgct cctggaaaag gittagagtg ggmctcac gcagattccg 〖caaaggaag atttactatc ctacagatga actcact tag agccgaagat aagagaggtc cttggucga ttactggggt <210> 223 <211> 358 <212> DNA <2丨3>人工序列 <220〉 <223>—致序列 ctagtgcagc cagggggaic tttaagatta 60 cacgagacga tggtctgggt gagacaagct 120 attccacctg aiggtcaaga tccutctac 180 tccagagata atagtaaaaa cactttgtac 240 accgclgtgi accactgcgc ct tgt tgcca 300 cagggtactc tggttacagt ctcatct 357 <220> <221> misc^feature <222> (3)...(3) <223> n = g ^ a ξ <220> <221> misc_feature <222> (12)...(12) <223> π = g 或 t <220> <221> misc_feature <222> (13)...(13) <223> n = t 或 c <220> <221> misc„feature <222> (!5).. .(15) <223> n = g 或 t 65- 131419.doc 200918088 <220〉 <221〉 misc一feature <222> (18)...(18) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (19).,.(19) <223> n = t 或 a <220〉 <221> misc^feaiure <222> (20).,.(20) <223> π = c 或 g <220> <221> misc一feature <222> (24)...(24) <223> n = g 或 1 <220> <221> misc.feature <222> (30)...(30) <223> n = c ^ g <220> <221> misc_feature <222> (31)...(31) <^23> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (33)7..(33) <223> π = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (36)...(36) <223> n = a 或 g <220> <221> misc_feature <222> (42)...(42) <223> n = t 或 a <220> ， <22]> misc一feature \ <222> ¢48)...(48) <223> n = g ^ a <220> <221> misc.feature <222> ¢51)...(51) <223> n = c 或 t <220> <221> mi sc一feature <222> (52)...(52) <223> n = c 或！ <220> <221> misc_feature <222> (54)'..(54) -66- 131419.doc 200918088 <223> η = £ 或 a <220> <221> misc_feature <222> (55)…（55) <223> n = c ^ a <220> <221> misc—feature <222> (57)...(57) <223> n = t 或 a <220> <22i> misc_feature <222> (58)...(58) <223> n = c 或 t <220> <22i> mi sc一feature <222〉 （60)...(60) <223> n = c 或 a <220> <221> misc_feature 1 <222> (63)...(63) <223> n = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (66)...(66) <223> π = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (69)...(69) <223> n = a 或 t <220> <22】> misc_feature <222> (73)...(73) <223> n = l 或 a <220> <221> misc^feature <222> (74)...(74) <223> n = c ^ g <220> <221> misc_feature <222> (75)...(75) <223> n = c ^ t <220> <221> mi sc.feaiure <222> ¢81)...(81) <223> n = c 或 t <220> <221> mi sc_feature <222> (84)...(84) <223> n = c 或 t -67- 131419.doc 200918088 <220> <221〉mi sc feature <222> (90)..,(90) <223> n = g ^ t <220> <221> mi sc feature <222> (93),.>(93) <223> n = t 或 c <220> <221〉mi sc一feature <222> (105T...(105) <223> π = g 或 c <220> <221> misc.feature <222> (111)...(111) <223> n = c 或 g <220> <221> misc.feature <222> (112Τ...(Π2) <223> n = c 或 a <220> <22)> misc_feature <222> (114T...(114) <223> n = c 或 a <220〉 <221> mi sc_feature <222> (117T...(117) <223〉 n = g 或 a <220> <221> misc_fcature <222> (]2〇T...(120) <223> n = a 或 t <220> <22]> mi sc一feature <222> (123]..,(123) <223> π = a 或 t <220> <22!> misc一feature <222> (126T..,(I26) <223> n = g 或 a <220> <22)> misc.feature <222> (129T...(129) <223> n = g 或a <220〉 <221> misc_feaiure <222> (Π3Τ-. .(133) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feaiure <222> (144j...(]44) <223> n = c 或 t -68- 131419.doc 200918088 <220> <221> misc_feature <222> (147)...(]47) <223〉 n = a 或 t <220> <221> misc_feature <222> (150)..,(150) <223〉 n = t 或 c <220> <22]> mi sc feature <222> (156T…（156) <223> n = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (159)...(159) <223> n = g 或 t <220> <221> misc_feature <222> (168Τ...Π68) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_fea\ure <222> (374)...(174) <223> n = c 或 t <220> <221> misc一feature <222> (186),..(186) <223〉 n = c 或 t <220> <221> mi sc_feature <222> (192)...(192) <223> n = g 或 c <220> <221> misc_feaiure <222> (195j...(195) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> ¢198)...(198) <》23> n = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (I99T...099) <223> n = c 或 a <220> <221> misc—fealure <222> (20lT...(201) <223> η = g 或 a <220> -69- 131419.doc 200918088 <221> misc_feature <m> (204)...(204) <2》3> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (207)...(207) <223> n = c 或 t <220> <221> misc.feature <222> (214^.,.(214) <223> n = c 或 a <220> <221> mi sc—feature <222> ¢2161...(216) <223〉 n = c 或 a <220> <221> misc-feature <222> ¢219)...(219) <223〉 n = c 或 t <220> <22I> misc一feature <222> (223T...(223) <223> n = t 或 a <220> <221> misc_feature <222> (224)..,(224) <223> n = c 或 e <220> <221〉mi sc一feature <222> (225T...(225) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (228T...(228) <223> n = g 或 a <220> <22l> misc.feature <222> (234h . .(234) <223> n = g 或 1 <220> <221> misc_feature <222> (235)...(235) <223> n = c 或 t <220> <221> mi sc_feature <222〉 （2377...(237) π = a 或 g <220> <22l> misc_feature -70 131419.doc 200918088 <222> (240)...(240) <223〉 η = ι 或 c <220> <221> misc.feature <222> (243T-..C243) <223> n = g 或 a <220> <221> misc.feature <222> (246T...C246) <223> n = a 或 g <220> <221> misc一feame <222> (253T...(253) <223> n = a 或 t <220> <221> misc_feature <222> (254T...(254) <223> n = g 或 c <220> 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atggccagga cccattctat 180 tctcgtgata actccaaaaa caccctgtac 240 actgcggtgt accattgtgc gctgctgcct 300 cagggtactc tggtcaccgt aagcagc 357 <400> 223 gangtgcagc tcntgngcng ccnggnaang gcagantccg cmcanaiga aagagnggnc <210> 224 <2U> 357 <212> DNA <213>智人 <400> 224 gaagtacaac tcctgtgcgg ccgggcaaag gcggattccg ctgcagatga aaacgtggcc inn tngannn ccnnnggat t gtniagagig inaanggnng acnnnctnng ct tggtInga tgctggagag catctggttt gcctggaatg ttaagggtcg actccclgcg cgtggttcga tggnggaggn nacnt t tgcn gglnlcncan ntinacnatc r.gccgangan ruactggggt cggtggcggc cacct tcgca ggtaagccac ctttaccatt cgccgaggat ttactggggt <210> 225 <211> 1)9 <212> PRT <213>智人 <400> 225
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly ] 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala His Glu 20 25 30
Thr Met Val Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Hi s lie Pro Pro Asp Giy Gin Asp Pro Phe Tyr Aia Αϋρ Ser Va] 73- 131419.doc 200918088 50 55 60
Lys Cly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys 85 90 95
Ala Leu Leu Pro Lys Arg Gly Pro Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 226 <21】> 357 <212> DNA <213>大腸桿菌 <>226 gaagiacaac tgctggagag cggtggcggc ciggttcaac cgggiggttc cctgcgcctg 60 tcctgtgcgg catctggttt caccttcgca cacgaaacca tggtgtggg丨 tcgccaagct 120 ccgggcaaag gcctggaatg ggtaagccac at tcctccag atggccagga cccat tctat 180 gcggattccg ttaagggtcg ctttaccatl tctcgtgata actccaaaaa caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg cgccgaggat actgcggtgi accauglgc gctgctgcc丨 300 aaacgtggcc cgtggtuga 丨 tactggggt cagggtaclc tggtcaccgt aagcagc 357 <210> 227 <211> 357 <212> DNA <2】3>人工序列 <220> <223> —致序列 <220> <221> misc feature <222> (3)...(3) <223〉 n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (6)...(6) <223> n = g 或 a <220〉 <22l> mi bC_feature <222> (9).:.(9) <223〉 n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> ¢13)...(13) <223〉 n = t 或 c <220> <221> misc feature <222> (19)...(19) <223〉 n = t 或 a <220> <221> misc feature <222> (20)...(20) <223> n = c 或 g <220> <22!> mi sc feature <222> (21),..(2]) <223〉 n = t 或 c 74- 131419.doc 200918088 <220> <22!> misc一feature <222> (24)...(24) <223> η 二 g 或 t <220> <221> misc.feature <222> (27),..(27) <223> n = a 或 c <220> <221> misc一feature <222> (31)...(31) <223> η = I 或 c <220> <221> misc.feature <222> ¢36)...(36) <223> n = a 或 t <220> <221> misc_feaiure <222> (39)7..(39) <223> n = g 或 a <220> <221〉 misc—feature <222> (42)...(42) <223> η = t 或 g <220> <221> misc_feature <222> (45)...(45) <223> n = g 或 1 <220> <22]> rmsc feature <222> (48)...(48) <223〉 n = g 或 t <220> <221> misc feature <222> (57)7..(57) <223> η = t 或 c <220> <221> mi sc^feature <222> (60)...(60) <223> η = c 或 g <220> <221> misc_feature <222〉 （69)...(69) <223〉 η = a 或 g <220> <221> misc.feaiure <222> (72)...(72) <223> n = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (75)‘ ‘ .（75) -75 131419.doc 200918088 <223〉 η = c 或 t <220〉 <221> misc_feature <222> (78)...(78) <223> η = a 或 t <220> <221> misc_feature <222> (87)7..(87) <223〉 n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222〉 （90)...(90) <223〉 π = g 或 a <220> <221〉 misc一feature <222> (93)7..(93) <223> π = t 或 c <220〉 <221> misc_feature <222> (96)...(96) <223〉 n = g 或 a <220> <221> misc一feature <222〉 （99)...(99) <223> n = g 或 c <220> <221> misc.feaiure <222> ¢110...(111) <223> n = c 或 t <220〉 <221> misc feature <222〉（117]…（1Π) <223> η = g 或 a <220> <221> misc_feature - <222> (12〇T...(120) \ <223> n = a 或 t <220> <221> misc-feature <222> (123了…（123) <223> n = a 或 g <220> <22]> misc-feature <222> (\26). ..(126) <223> n = g 或 c <220> <221> mi!ic_feature <222> (129]...(129) <223> n = g 或 a ·Ί6· 131419.doc 200918088 <220> <221> miscj.eature <222> (132T...(132) <223> η = t 或 c <220> <221> mi sc_feature <222> (]35T...(135) <223> η = a 或 g <220> <221〉mi sc一feature <222> (138T..,(138) <223> η = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (144T...(144) <223> n = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (145T...(145) <223> n = t 或 a <220> <221> mi sc一feature <222> (146T...(146) <223> n = c 或 g <220> <221> misc_feature <222> (147T...(147) <223〉 n = a 或 c <220> <221> misc_feature <222> (15〇T...(150) <2?3> n = r 或 c <220> <221> misc_feature <222> (156T...(156) <223〉 n = c 或 t <220> \ <221> misc_feature <222> (159T...(159) <223〉 n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (165T...(165) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (17lT...(171) <223> n = t 或 c <220〉 <221> misc.feature -11 - 131419.doc 200918088 <222> (174)...(174) <223> π = c 或 a <220> <22!> misC-feature <222> (l8〇T...(180) <223> η = c 或 t <220> <221> misc^feature <222> (1S3T-..(183) <223> n = a 或 g <220> <22l> misc^feaiure <222> (186)...(186) <223〉 n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (192)...(192) <223> n = g 或 t . <220> f <221> misc_feature ' <222> (198Τ...Π98) <223> n = c 或 i <220> <221> misc_feature <222> (201)...(201) <223> n = g 或 c <220> <221> misc一feature <222> (204).,.(204) <223> n = c 或 t <220> <221> mj st'_fca l u rc <222> (21〇T...(210) <223> n = c 或 ί <220> <221> misc.feature <222> (213j...(213) <223> n = c 或 l <220> <221> misc一feature <222> (216j...(216) <223〉 n = c 或 l <220> <221> misc_feature <222> (219)...(219) <223〉 n = c 或 t <220> <221> mi sc_feature <222> (222T...(222) <223> n = t 或 c •78· 131419.doc 200918088 <220> <221> misc_feature <222> (228)...(228) <223> η = g 或 a <220〉 <221> misc^feature <222> (234)...(234) <223> η = g 或 c <220〉 <221> misc一feature <222> (237j...(237) <223〉 η = a 或 g <220> <221> misC-feaiure <222> (24〇T...(240) <223> η = ι 或 c <220> <221> misc^feature <222> (246T...(246) <223> n = a 或 g <220> <221> misc一feature <222> (253T...(253) <223> n = a 或 t <220> <221> misc_feature <222〉 （254了.，.（254) <223> n = g 或 c <220> <221> misc一feature <222> ¢260.. .(261) <223> n = t 或 c <220> <221> misc feature <222> ¢270)...(270) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (273)...(273) <223> n = a 或 t <220> <221> misc一feature <222> (279了…（279) <223〉 n = a 或 g <220> <221> misc_feature <222> (282)...(282) <223> n = t 或 c <220> <221> mi sc_feature <222> (2S5T...(285) •79- 131419.doc 200918088 <223> η = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (297)...(297) <223> n = t 或 g <220> <221> misc一feature <222> (303)...(303) <223> n = g 或 a <220> <221> misc.feature <222> (304j...(304) <223> n = a 或 c <220> <221> misc feature <222> (3061...(306) <223> n = g 或 t <220> <22)> misc_feature <222> (309)...(309) <223> n = g 或 c <220> <22i> misc_feature <222> {312^...(312) <223> n = t 或 g <220> <221> misc_feature <222> (318T...(318) <223> n = t 或 c <220> <221> misc feaiure <222> (320...(321) <223> n = c 或 t <220> <221> misc^feature <222> (336-). ..(336) <223〉 n = a 或 t <220> <221> misc_feature <222> ¢3397...(339) <223〉 n = c 或 i <220> <221> misc_feature <222> (351)...(351) <223> n = c 或 a <220> <221〉mi sc一feature <222> (352T...(352) <223> n = t 或 a -80- 131419.doc 200918088 <220> <221> misc.feature <222> (353T...(353) <223> η = c 或 g <220〉 <221> misc feature <222> (354).,,(354) <223〉 n = g 或 c <400> 227 gangtncanc tgraggagnn nggnggnggc ntggtncanc cnggnggntc ccigcgnctn tcctgtgcng cntcnggntt caccttngcn canganacna tggtgtgggt ncgccangcn ccnggnaang gnctngantg ggtnnnncan altccnccng atggncagga nccnttctan gcngantccg tnaagggncg nttnaccatn tcncgngana antccaanaa cacnctntan ctgcanaiga acnncctgcg ngccgaggan acngcggtnt ancantgtgc gctgctncct aanngnggnc cntggttnga ntactggggt cagggnacnc tggtcaccgt nnnnagc <210> 228 <211> 357 <212> DNA <213>智人 <400> 228 gaggttcaac tgctggaatc tggtggtggt ctggtacaac cgggtggttc cctgcgtctg agctgtgcag cctctggm caccttcgct catgagacca tggtttgggi acgccaggct ccgggtaaag gcctggagtg ggtaagccat atccctcclg atggicagga cccguciat gctgattccg tcaaaggccg ttttaccatt tctcgtgaca acagcaaaaa cactctgtac ctgcaaatga actccctgcg tgcagaagac acggcggilt atcactgtgc actgcigcca aaacgcggcc cttggttcga ciactggggc cagggtactc tggtcactgt atcttct
<210> 229 <211> 119 <212> PRT <213>智人 <400> 229
Glu Va] Gin Leu Leu Glu Ser G)y Gly Gly Leu Va) Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Scr Gly Phe Thr Phe Ala His Glu 20 25 30
Thr Met Val Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser His ile Pro Pro As>p Gly Gin A^p Ριυ Phe Tyr Ala A^p Scr Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys 85 90 95
Ala Leu Leu Pro Lys Arg Gly Pro Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Scr 115 <210> 230 <211> 357 <212> DNA <2丨3>大腸桿菌 <400> 230 gaggucaac tgctggaatc tggtggtggt ctggtacaac cggetggttc ccigcgtctg agctgtgcag cctctggm caccttcgct catgagacca tggmgggi acgccaggct ccgggiaaag gcctggagtg ggtaagcca丨 aucciccig aiggtcagga cccguciat gctgattccg tcaaaggccg mtaccau utcgigaca acagcaaaaa cactcigtac ctgcaaatga actccctgcg tgcagaagac acggcggttt atcactgtgc actgctgcca aaacgcggcc cttggticga ctactggggc cagggiacic tggtcactgt atcttct <210> 231 <211> 357 <212> DNA <213>人工序列 -81 - 131419.doc 200918088 <220> <223> —致序列 <220> <221> misc_feature <222> (6)...(6) <223> η =： g 或 t <220> <221> misc_feature <222> (9)...(9) <223> n = g 或 a <220〉 <221> misc_feature <222> (13)…（13) <223〉 n = t 或 c <220〉 <221> misc_feature <222> (18)...(18) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_fealure <222> (24)7,.(24) <223> n = g 或 t <220> <221> misc_feature <222〉 （27)…（27) <223> n = a 或 t <220> <221> mi sc胃feature <222> (30)...(30) <223> n = c 或 t <220〉 <221> mi sc feature <222> (31)...(31) <223> η = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (39)...(39) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> ¢42)...(42) <223> n = t 或 g <220> <221> misc_feature <222> (45)..,(45) <223> n = g 或 t <220> <221> misc.feature <222> (48)...(48) <223> n = g 或 ί -82 131419.doc 200918088 <220> <221> misc feature <222> (60)...(60) <223> η = c 或 g <220> <221> mi sc_feature <222> ¢61)...(61) <223> η = t 或 a <220> <221> misc_feature <222> (62)...(62) <223> η = c 或 g <220> <221> misc^feature <222> (75)...(75) <223〉 n = c 或 t <220> <221〉misc-feature <222> (78)...(78) <223> η = a 或 t <220> <221> misc_feature <222> (87)..,(87) <223> η = t 或 c <220〉 <221> misc_feature <222> (90)...(90) <223〉 n = g 或 t <220> <221> misc_feature <222> (99)...(99) <223〉 n = g 或 c <220> <22)> misc^feature <222> (105T...(105) <223> n = g 或 l <220〉 <22】> misc—feature <222> (11]了…⑴ 1) <223> n = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (}2Q).,.{}20) <223> n = a 或 1 <220> <221> misc feature <222> ()23).. .(123) <223> n = a 或 g <220> -83- 131419.doc 200918088 <221> misc feature <222> (126)...(126) <223〉 n = g 或 t <220> <221> mi sc一feature <222> {129)...(129) <223> n = g 或 a <220> <221> mi sc一feature <222> (132T-.(132) <223〉 n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (135T...(135) <223> n = a 或 g <220> <221> misc_feature <222> (144T...(144) <223〉 n = c 或 a / V <220> <221> mi sc feature <222〉 （1451...(145) <223〉 n = t 或 a <220> <221> misc_feature <222> (146)...(146) <223〉 n = c 或 g <220> <221> misc_feature <222> (]47j...(147) <223〉 n = a 或 c <220> <221> mi sc feature <222> (153"). ..(153) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (1567...(156) <223> n = c 或 t <220> <221> misc.feature <222> (159Τ...Π59) <223> n = g 或 t <220> <22】> misc_feature <222> (171)...(171) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <m> {174T. ..(174) -84- 131419.doc 200918088 <223> η = c 或 g <220> <221> misc_feature <222> (!8〇T...(180) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (183)...(183) <223> n = a 或 t <220> <221> misc_feature <222> (186T...(186) <223> n = c 或 l <220> <221> misc_feature <222> (192T...(192) <223> n = g 或 c <221> misc_feature <222> (195)...(195) <223> n = g 或 a <220> <221> misc.feature <222> (20Π. ..(201) <223> n = g 或 t <220> <221> misc_feature <222> (204T...(204) <223〉 n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (210)...(210) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (213T...(213) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feaiure <222> (216T...(216) <223> n = c 或 l <220> ' <221> misc_feature <222> (222)...(222) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (2231.·-(223) <223> n = t 或 a -85 131419.doc 200918088 <220〉 <221> misc—feature <222> (224T...(224) <223> n = c 或 g <220〉 <221> misc_feature <222> (228)...(228) <223> n = g 或 a <220> <221> misc.feature <222> (234)...(234) <223> n = g 或 t <220> <221> misc_feature <222> (237)...(237) <223〉 n = a 或 g <220> <221> misc_feature <222> (240)...(240) n = i 或 c <220〉 <221> misc^feature <222> (253T...(253) <223> n = a 或 t <220> <221> misc_feature <222〉 （2547...(254) <223> n = g 或 c <220> <221> misc_feature <222> (264j...(264) <223〉 n = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (267T...(267) <223> n = g 或 a <220> <221> misc feature <222> (273],..(273) <223> n = a 或 g <220> <221> misc_feature <222> (279T..,(279) <223> n = a 或 t <220> <22)> mi sc feature <222> (29Π. ..(291) <223> π = g 或 a <220> <22]> misC-feature -86- 131419.doc 200918088 <222〉 （297)_ ..(297) <223> η ：= ι 或 g <220> <22】> mi sc一feature <222> (30〇T...(300) <223> n = t 或 a <220〉 <22]> misc.feature <222> (303)..,(303) <223〉 n = g 或 a <220> <221> misc-feature <222> (304T..,(304) <223〉 n = a 或 c <220> <221> misc_feature <222> (306T...(306) <223> n = g 或 c ， <220〉 <22\> misc_fea\ure <222> (309)...(309) <223〉 n = g 或 c <220> <221> misc_feature <222> (318T...(318) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feaiure <222> (33〇T...(330) <223> n = t 或 c <220> <221> misc.feature <222> (336)...(336) <223〉 n = a 或 1 <220> <221> misc_feature ^ <222> (339T，..(339) \ <223〉 n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (348T...(348) <223〉 n = c 或 l <220〉 <22]> misc^featare <222> (351 了…（351) <223> π = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (354^...(354) <2U> n = g 或 i -87 131419.doc 200918088 <220> <221> misc_feaiure <222> (355T...(355) <223> η = a 或 t <220> <221> misc一feature <222> (356了...（356) <223> n = g 或 c <220> <221> misc^feature <222> (357T...(357) <223> n = c 或 t <400> 231 gaggtncanc tgntggantc tggnggnggn ntggtacanc cnggnggntc cctgcgtcin 60 nnctgtgcag cctcnggntt cacctmgcn catgagacna tggtntgggt ncgccaggcn 120 ccnggnaang gnctngagtg ggtnnnncat atnccnccng atggtcagga nccniictan 180 gcnganiccg tnaanggccg nttnaccaln tcncgngaca annncaanaa cacnciman 240 ctgcaaatga acnncctgcg tgcngangac acngcggtnt atcactgtgc nctgctnccn 300 aanngnggnc cttggttnga ctactggggn cagggnacnc iggtcacngt nicnnnn 357 <210〉 232 f <211> 5 <212> PRT <213>智人 <400> 232
Glu Val Gin Leu Leu <210> 233 <21)> 28 <212> PRT <2丨3>人工序列 <220> <223>肽連接子 <400〉 233
Giy Gin Gly Ήίγ Leu Vai 丁hr Val Ser Ser Ala Ser Thr His 丁’nr Cys 15 10 15
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 20 25 <2】0> 234 <211> 32 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>肽連接子 <400> 234
Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser ] 5 ] Q 1 <
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 20 25 30 <210> 235 <211> 357 <212> DNA <2]3>智人 <400> 235 -88- 131419.doc 200918088 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggegggtc cctgcgtctc 60 iccigigcag cctccggaii cacctttgcg caigagacga tggtgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcccccgg tiggtcagga tcccttctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctatat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acagcggtat attactgtgc gcigcticct 300 aagagggggc cttggtttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt cicgagc 357 -89- 131419.doc

Claims (1)

  1. 200918088 十、申請專利範圍： 1· 一種抗介白素-1受體1型（IL_1R1)免疫球蛋白單一可變區 域’其包含與DOM4-130-202之胺基酸序列（展示於圖4 中）至少97% —致之胺基酸序列。 2 ·如請求項1之免疫球蛋白單一可變區域，其包含至少一 個選自22S、49S、83S及94Y之胺基酸，其中編號係根據 Kabat。 3'如請求項1或2之免疫球蛋白單一可變區域，其包含 22S、49S、83S及94Y，其中編號係根據Kabat。 4. 一種抗介白素」受體！型（IL_1R1)免疫球蛋白單一可變區 域，其包含與DOM4-130-202之胺基酸序列一致的胺基酸 序列。 5. 一種抗介白素-丨受體丨型^^…丨）免疫球蛋白單一可變區 域，其係由與…至少8〇% 一致之核苷酸序列與…至少 80%—致之核苷酸序列編碼。
    6· 一種抗介白素]受體^(IL_1R1)免疫球蛋白單一可變區 域，其係由與DOM4_130_202之核芽酸序列（展示於圖Η 中）一致之序列編碼。 7· 一種介白素]受體1型（IL—1R1)拮抗劑，#包含如請求項 1至6中任一項之抗IL]R1免疫球蛋白單—可變區域。、 -7之括抗劑，其包含第—及第二免疫球蛋白單 …1域，其中各可變區域係如請求項…中任— 項0 9.如請求項7或8之拮抗劑 其中該拮抗劑包含該單一可變 131419.doc 200918088 區域之單體或該單一可變區域之同元二聚體 (homodimer) ° 10·如請求項7或8之拮抗劑，其中該單一可變區域或各單一 可變區域之胺基酸序列係與DOM4-130-202之胺基酸序列 (展示於圖4中）一致。 Π. —種抗介白素_丨受體1型（IL_1R1)免疫球蛋白單一可變區 域，其包含與DOM4-130-202之胺基酸序列（展示於圖4 中）一致或不超過25個胺基酸位置與DOM4-130-202之胺 基酸序列不同且具有與DOM4-13 0-202之CDR1序列至少 50%—致之CDR1序列的胺基酸序列。 12. —種抗介白素·1受體1型（IL-1R1)免疫球蛋白單一可變區 域，其包含與DOM4-130-202之胺基酸序列（展示於圖4 中）一致或不超過25個胺基酸位置與DOM4-130-202之胺 基酸序列不同且具有與DOM4-13 0-202之CDR2序列至少 50%—致之CDR2序列的胺基酸序列。 13· —種抗介白素-1受體1型（IL-1R1)免疫球蛋白單一可變區 域，其包含與DOM4-130-202之胺基酸序列（展示於圖4 中）一致或不超過25個胺基酸位置與D0M4-130-202之胺 基酸序列不同且具有與DOM4-130-202之CDR3序列至少 50% —致之CDR3序列的胺基酸序列。 14. 一種抗介白素-1受體1型（IL-1R1)免疫球蛋白單一可變區 域，其包含與DOM4-130-202之胺基酸序列（展示於圖4 中）一致或不超過25個胺基酸位置與DOM4-130-202之胺 基酸序列不同且具有與DOM4-130-202之CDR1序列至少 131419.doc 200918088 50%—致之CDR1序列且具有與DOM4-130-202之CDR2序 列至少50%—致之CDR2序列的胺基酸序列。 15. —種抗介白素-1受體1型（IL-1R1)免疫球蛋白單一可變區 域，其包含與DOM4-130-202之胺基酸序列（展示於圖4 中）一致或不超過25個胺基酸位置與DOM4-130-202之胺 基酸序列不同且具有與DOM4-130-202之CDR1序列至少 5 0%—致之CDR1序列且具有與DOM4-130-202之CDR3序 列至少50%—致之CDR3序列的胺基酸序列。 16. —種抗介白素-1受體1型（IL-1R1)免疫球蛋白單一可變區 域，其包含與DOM4-130-202之胺基酸序列（展示於圖4 中）一致或不超過25個胺基酸位置與DOM4-13 0-202之胺 基酸序列不同且具有與DOM4-130-202之CDR2序列至少 5 0%—致之CDR2序列且具有與DOM4-130-202之CDR3序 列至少50%—致之CDR3序列的胺基酸序列。 17. —種抗介白素-1受體1型（IL-1R1)免疫球蛋白單一可變區 域’其包含與DOM4-130-202之胺基酸序列（展示於圖4 中）一致或不超過25個胺基酸位置與DOM4-13 0-202之胺 基酸序列不同且具有與DOM4-130-202之CDR1序列至少 5 0%—致之CDR1序列且具有與d〇M4-130-202之CDR2序 列至少50。/。一致之CDR2序列且具有與DOM4-130-202之 CDR3序列至少50%—致之CDR3序列的胺基酸序列。 18· —種介白素-1受體1型（IL_1R1)拮抗劑，其具有與d〇M4-13 0-202(展示於圖4中）之CDR1序列至少50%—致之CDR1 序列。 131419.doc 200918088 19. 一種介白素-1受體1型（IL-1R1)拮抗劑，其具有與DOM4-130-202(展示於圖4中）之CDR1序列至少50%—致之CDR2 序列。 20. —種介白素-1受體1型（IL-1R1)拮抗劑，其具有與DOM4-130-202(展示於圖4中）之CDR1序列至少50%—致之CDR3 序列。 21. —種介白素-1受體1型（IL-1R1)拮抗劑，其具有與DOM4-130-202(展示於圖4中）之CDR1序列至少50%—致之CDR1 序列及與DOM4-130-202之CDR2序列至少50% —致之 CDR2序歹丨J。 22. —種介白素-1受體1型（IL-1R1)拮抗劑，其具有與DOM4-130-202(展示於圖4中）之CDR1序列至少50%—致之CDR1 序列及與DOM4-130-202之CDR3序列至少50% —致之 CDR3序列。 23. —種介白素-1受體1型（IL-1R1)拮抗劑，其具有與DOM4-130-202(展示於圖4中）之CDR2序列至少50%—致之CDR2 序列及與DOM4-130-202之CDR3序列至少50% —致之 CDR3序歹丨J。 24. —種介白素-1受體1型（IL-1R1)拮抗劑，其具有與DOM4-130-202(展示於圖4中）之CDR1序列至少50%—致之CDR1 序列及與DOM4-130-202之CDR2序列至少50% —致之 CDR2序歹ij及與DOM4-13 0-202之CDR3序歹ij至少50%—致 之CDR3序歹丨J。 25. —種介白素-1受體1型（IL-1R1)拮抗劑，其包含免疫球蛋 131419.doc 200918088 白單一可變區域，該可變區域包含DOM4-130-202(展示 於圖4中）之CDR1、CDR2及/或CDR3之序列。 26. —種介白素_丨受體1型（IL_1R1)拮抗劑，其與D〇Mlh-131-5 1 1-206 競爭結合 IL-1R1。 27. —種免疫球蛋白單一可變區域，其包含介白素_丨受體1型 (IL-1R1)結合位點，其中該可變區域在以下情況下對蛋 白酶具有抗性： (1)在37°C與至少1〇微克/毫升之濃度（c)之蛋白酶一起培 養至少1小時之時間（t);或 (ii)在30°C與至少40微克/毫升之濃度（c，）之蛋白酶一起培 養至少1小時之時間（t); 其中該可變區域包含與DOM4_130_202之胺基酸序列（展 示於圖4中）至少9〇% 一致之胺基酸序列。 28. 如請求項27之可變區域，其中該濃度（(；或〇為至少}卯或 1000微克/毫升蛋白酶。 29. 如請求項27或28之可變區域，其中時間⑴為i、3或μ小 時或隔夜。 30. 如請求項27之可變區域，其中該可變區域在條件⑴下呈 抗性且該濃度⑷為10或100微克/毫升蛋白酶且時間⑴: 31. 如請求項2 7之可變區域， 抗性且該濃度（c1)為40微 時。 其1該可變區域在條件⑴）下具 克/毫升蛋白酶且日寺間⑴為3小 32.如請求項27、28、 30及31中任— 項之可變區域 其中該 131419.doc 200918088 白血·球酶 蛋白酶係選自騰蛋自_ 1性蛋白酶 (leucozyme)及胰酶。 33.如請求項27、28、 蛋白酶為胰蛋白酶 30及31中任一項之可變區域 其中該 34.如請求項27、28、30及31中任-項之可變區域，其中該 可變區域對騰蛋白酶及至少另—種選自彈性蛋白酶'白 血球酶及胰酶之蛋白酶具有抗性。 如請求項27、28、3〇及31中任一項之可變區域，其中該 可變區域在條件⑴或（ii)下培養後特異性結合江-⑻。 36·如5月求項35之可變區域，該可變區域在條件⑴或⑴）下培 養後在ELISA中具有至少〇.4〇4之〇〇45〇讀數。 37.如請求項27、28、3()及31中任—項之可變區域，其中該 可變區域在條件⑴或（ii)下培養後特異性結合蛋白質A或 蛋白質L。 38·如^求項27、28、3〇及31中任一項之可變區域，其中該 可k區域在條件⑴或（ii)下培養後在凝膠電泳中大體上展 現單一條帶。 39_ 一種介白素-1受體1型（IL]Ri)拮抗劑，其包含如請求項 27至38中任一項之可變區域。 40.如叫求項39之IL-1R1拮抗劑，其係用於經口傳遞。 41·如請求項39或4〇之IL_1R1拮抗劑，其係用於向患者之 腸（GI)道傳遞。 42.:種如請求項39之IL_1R1拮抗劑在製造用於經口傳遞之 藥物的用途。 131419.doc 200918088 43·:種如請求項39之IL_1R1拮抗劑在製造用於向 道傳遞之藥物的用途。 44. 如請求項39或4〇之拮抗劑，其 _ τ 』支區域對胰蛋白 _、彈性蛋白酶及/或胰酶具有抗性。 45. 如請求項42或43之用途，其中該可變區域對胰蛋白酶、 彈性蛋白酶及/或胰酶具有抗性。 46. 如請求項39iIL_1R1拮抗劑，其係用於肺傳遞。 47. 如請求項39或46iIL_1R1拮抗劑，其係用於向患者之 傳遞。 48. —種如請求項39之IL_1R1拮抗劑在製造用於肺傳遞之藥 物的用途。 μ 49. 一種如請求項39之IL_1R1拮抗劑在製造用於向患者之肺 傳遞之藥物的用途。 50. 如請求項46之拮抗劑，其中該可變區域對白血球酶具有 抗性。 5 1 _如請求項48或49之用途，其中該可變區域對白血球酶具 有抗性。 52. 如請求項39之IL_1R1拮抗劑，其係用於治療及/或預防發 炎性病狀。 53. —種如請求項39之IL_1R1拮抗劑在製造用於治療及/或預 防發炎性病狀之藥物的用途。 54. 如請求項52之拮抗劑’其中該病狀係選自由關節炎、多 發性硬化症、發炎性腸疾病及慢性阻塞性肺疾病組成之 群。 131419.doc 200918088 55.如請求項53之用途，其中該病狀係選自由關節炎、多發 性硬化症、發炎性腸疾病及慢性阻塞性肺疾病^之 群。 56_如請求項54之拮抗劑，其中該關節炎為類風濕性關節炎 或幼年型類風濕性關節炎。 57. 如請求項55之用途’其中該關節炎為類風濕性關節炎或 幼年型類風濕性關節炎。 58. 如請求項54之拮抗劑，其中該發炎性腸疾病係選自由克 羅恩氏病（Crohn's disease)及潰瘍性結腸炎組成之群。 59. 如請求項55之用途，其中該發炎性腸疾病係選自由克羅 恩氏病（Crohn's disease)及潰瘍性結腸炎組成之群。 6〇_如請求項54之拮抗劑，其中該慢性阻塞性肺疾病係選自 由慢性支氣管炎、慢性阻塞性支氣t炎及肺氣腫組成之 群。 61. 如請求項55之用途，其中該慢性阻塞性肺疾耗選自由 慢性支氣管炎、慢性阻塞性支氣管炎及肺氣腫 群。 62. 如請求項54之拮抗劑，其中該肺炎為細菌性肺炎。 63. 如請求項55之用途，其中該肺炎為細菌性肺炎。 64. :明求項62之拮抗劑，其中該細菌性肺炎為葡萄球菌肺 k (Staphyl〇coccai pneumonia) ° 65·:請求項63之用途，其中該細菌性肺炎為葡萄球菌肺 炎。 66.如請求項39之IL_1R1拮抗劑，其係用於治療及/或預防啤 131419.doc 200918088 吸道疾病。 種如"月求項39之IL- 1R1拮抗劑在製造用於治療及/或預 防呼吸道疾病之藥物的用途。 68·^請求項66之拮抗劑，其中該呼吸道疾病係選自由以下 組成之群：肺發炎、慢性阻塞性肺疾病、哮喘、肺炎、 過敏性肺炎、與嗜伊紅血球增多相關之肺浸潤、環境肺 ;； 肺乂支氣管擴張、囊性纖維化、間質肺疾病、 原發丨生肺動脈高壓、肺血栓栓塞、胸膜病變 (disorders)、縱隔病變、隔膜病變、換氣不足、換氣過 度、睡眠呼吸暫停、急性呼吸窘迫症候群、間皮瘤、肉 瘤、移植排斥、移植物抗宿主疾病、肺癌、過敏性鼻 炎、過敏症、石棉沈著病、麴菌腫、麴菌病、支氣管擴 張丨支性支軋管炎、肺氣腫、嗜伊紅血球肺炎、特發性 肺纖維化、侵襲性肺炎球菌疾病、流感、非結核性分枝 才干菌病、胸膜積液、塵肺病 '肺孢子蟲病 (pneum〇cytosis)、肺炎、肺放線菌病、肺泡蛋白沉著 症、肺炭疽、肺水腫、肺栓子、肺發炎、肺組織細胞增 多病（histiocytosis) X、肺動脈高血壓（pulm〇nary hypertension)、肺土壤絲菌病（pUimonary nocardiosis)、 肺結核、肺靜脈閉塞疾病、類風濕性肺病、肉狀瘤病及 早格納肉牙腫病（Wegener's granulomatosis)。 69·如凊求項67之用途，其中該呼吸道疾病係選自由以下組 成之群：肺發炎、慢性阻塞性肺疾病、哮喘、肺炎、過 敏性肺炎、與嗜伊紅血球增多相關之肺浸潤、環境肺疾 131419.doc 200918088 病、肺炎、支氣管擴張、囊性纖維化、間質肺疾病、原 發性肺動脈高壓、肺血Μ塞、胸膜病變、縱隔病變、 隔膜病變、換氣不足、換氣過度、睡眠呼吸暫停、急性 呼吸窘迫症候群、間皮瘤、肉瘤、 " 1 Μ移植排斥、移植物抗 宿主疾病、肺癌、過敏性鼻炎、過敏症、石棉沈著病、 麴菌腫、麵菌病、支氣管擴張、慢性支氣管炎、肺氣 腫、嗜伊紅血球肺炎、特發性肺纖維化、侵襲性肺炎球 菌疾病、流感、非結核性分枝桿菌病、胸膜積液、塵肺 病、肺孢子蟲病、肺炎、肺放線菌病、肺泡蛋白沉著 症、肺炭疽、肺水腫、肺栓子、肺發炎、肺組織細胞增 多病X、肺動脈高血壓、肺土壤絲菌病、肺結核、肺靜 脈閉塞疾病、類風濕性肺病、肉狀瘤病及韋格納肉牙腫 病0 70. —種肺傳遞裝置，立含右主 ’、 百4 5月求項39、46、47或5 0之1L- 1R1拮抗劑。 71. 士。月求項7〇之裝置’其中該裝置為吸入器或鼻内投藥裝 72·種口服调配物，其包含如請求項39或4〇之iLH抬抗 劑。 其中該調配物為鍵劑、丸劑、膠 4〇、46、50、52 至 54、56、58、 73. 如請求項72之調配物 囊、液體或糖漿。 74. 如請求項7、8、39， 勹人62、64、66及68中任一項之拮抗劑，其中該拮抗劑 匕3如明求項1至6、11至17及27至38中任一項之可變區 131419.doc -10- 200918088 域。 75.如清求項 7、8、39、40、46、50、52 至 54、56、58、 60 ' 62、64、66及68中任一項之拮抗劑，其中該拮抗劑 包含具有至少50〇C之Tm之可變區域。 76·如 δ青求項 7、8、39、40、46、50、52 至 54、56、58、 、62、64、66及68中任一項之拮抗劑，其中該拮抗劑 包含在活體外檢定中以μΜ之ND50抑制MRC-5細胞 (ATCC寄存編號CCL-Wl)經il-1誘導之介白素-8釋放的 1 可變區域。 77. 如請求項 7、8、39 ' 4〇、46、5〇、52 至 54、56、58、 60、62、64、66及68中任一項之拮抗劑，其中該拮抗劑 包含以μΜ之IC50抑制IL-1與IL-1R1結合之可變區 域。 78. 如請求項 7、8、39、40、46、50、52 至 54、56、58、 60、62、64、66及68中任一項之拮抗劑，其中該拮抗劑 包含1R1在全血檢定中以g 之ND50抑制IL-1誘導之 i / .,. 介白素-6釋放的可變區域。 79. 如請求項 42、43、48、49、53、55、57、59、61、63、 05、67及69中任一項之用途，其中該拮抗劑包含如請求 項1至6、11至17及27至38中任一項之可變區域。 80. 如請求項 42、43、48、49、53、55、57、59、61、63、 65、67及69中任一項之用途，其中該拮抗劑包含具有至 少50°C之Tm之可變區域。 81. 如請求項 42、43、48、49、53、55、57、59、61、63、 131419.doc -11 · 200918088 65、67及69中任一項之用途，其中該拮抗劑包含在活體 外檢定中以51 μΜ之ND50抑制MRC-5細胞（ATCC寄存編 號CCL-171)經IL-1誘導之介白素_8釋放的可變區域。 82. 如請求項 42、43、48、49、53、55、57、59、61、63、 65、67及69中任一項之用途，其中該拮抗劑包含以g μΜ之IC50抑制IL-1與IL-1R1結合之可變區域。 83. 如請求項42、43、48、49、53、55 ' 57、59、61、63、 65、67及69中任一項之用途，其中該拮抗劑包含iri在 全血檢定中以μΜ2ΝΕ>5〇抑制IL-1誘導之介白素_6釋 放的可變區域。 84. 如請求項70或71之裝置，其中該拮抗劑包含如請求項^ 至6、11至17及27至38中任一項之可變區域。 85. 如請求項70或71之裝置，其中該拮抗劑包含具有至少 50°C之Tm之可變區域。 86_如請求項70或71之裝置，其中該拮抗劑包含在活體外檢 疋中以S1 μΜ之ND50抑制MRC-5細胞（ATCC寄存編號 CCL-171)經IL-1誘導之介白素_8釋放的可變區域。 87. 如請求項70或71之裝置，其中該拮抗劑包含以y μΜ之 IC50抑制IL-1與IL-1R1結合之可變區域。 88. 如請求項70或71之裝置，其中該拮抗劑包含以丨在全血 檢定中以μΜ2 ND50抑制IL_丨誘導之介白素_6釋放的 可變區域。 89·如請求項72或73之調配物，其中該拮抗劑包含如請求項 1至6、11至17及27至38中任一項之可變區域。 131419.doc 12· 200918088 90. 如請求項72或73之調配物’其中該拮抗劑包含具有至少 50°C之Tm之可變區域。 91. 如請求項72或73之調配物，其中該拮抗劑包含在活體外 檢定中以$1 μΜ之ND50抑制MRC-5細胞（ATCC寄存編號 CCL-171)經IL-1誘導之介白素-8釋放的可變區域。 92. 如請求項72或73之調配物，其中該拮抗劑包含以μΜ 之IC50抑制IL-1與IL-1R1結合之可變區域。 93. 如請求項72或73之調配物，其中該拮抗劑包含1R1在全 血檢定中以μΜ之ND50抑制IL_1誘導之介白素_6釋放 的可變區域。 94. 如請求項1、2、4至6、11至17、27、28、3 0及31中任一 項之可變區域，其中該可變區域具有至少5(rc之丁爪。 95. 如請求項丄、2、4至6、11至17、27、28、30及31中任一 項之可變區域’其中該可變區域在活體外檢定中以^ μΜ之ND50抑制MRC-5細胞（ATCC寄存編號CCL_171)g IL-1誘導之介白素_8釋放。 96. 如請求項1、2、4至6、"至^、27、28、3〇及31中任一 項之可變區域，其中該可變區域5以q μΜ之IC5〇抑制 IL-1與IL-1R1之結合。 97. 如請求項i、2、4至6、"至17、27、28、3〇及31中任一 項之可變區域，其中該可變區域1R1在全血檢定中以U μΜ之ND5〇抑制IL-1誘導之介白素4釋放。 98. —種雙特異性配位體，其包含如請求項1至6、丨丨至π、 27至38及94至97中任一項之可變區域。 131419.doc -13· 200918088 99. 一種分離或重組核酸，其編碼包含如請求項丨至^ 1 17、W至97中任—項之免疫球蛋白單 ^ 域之多肽。 之核酸或如請求 項 100. —種載體，其包含如請求項99之核酸 ιοί. —種宿主細胞，其包含如請求項99 100之載體。 102. -種產生包含免疫ί東蛋白單—彳變區域之多月太之方法， 該方法包含將如請求項101之宿主細胞維持在適於該核 酸或該載録現之條件下，藉此產生包含免疫球蛋白單 —可變區域之多肽。 103·如請求項102之方4，其進—纟包含分離該多肽，及視 情況產生比該分離之多肽具有改良親和力及/或之 變異體’例如突變變異體。 104. —種醫藥組合物，其包含如請求項丨至6、^至口、27至 38及94至97中任-項之免疫球蛋白單—可變區域或如請 求項 7 至 1〇、18 至 26、39 至 41、44、46、47、50、52、 54 56、58、60、62、64、66、68及 74至 78 中任一項之 杧抗η]及w藥學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。 105. 種夕肽，其包含與⑽刚-⑽―搬之胺基酸序列（展示 於圖4中）至少97%—致之序列。 106. 一種多肽，其由與加刚七。，〗之核苷酸序列之核苷酸 序列(展示於圖19中)至少8〇%—致之序列編碼。 1〇7.種融合蛋白，其包含如請求項105或106之多肽。 108·種刀離或重組核酸’其編碼如請求項1 〇5或1 %之多狀 131419.doc 200918088 或如請求項107之融合蛋白。 109.如請求項卜 項之务广 4至6、U至17、27、28、30及31中任一 μ如請求：單一可變區域，其包含抗體恆定區域。 109之可變區域’其包含抗體FC’視情況其中 ""端連接於（視情況直接連接於）該可變區域之€ 端0 f 111.如請求項7、 6〇 、 62 、 64 、定區域。 ;、39、40、46、50、52 至 54、56、58、 66及68中任一項之拮抗劑，其包含抗體恆 月求項111之拮抗劑，其包含抗體F c，視情況其中該 Fc之N端連接於（視情況直接連接於）該可變區域之匸端。 113.如4求項1〇5或1〇6之多肽，其包含抗體恆定區域。 114·如請求項i 13之多肽，其包含抗體Fc，視情況其中該 之N端連接於（視情況直接連接於）該可變區域之C端。 131419.doc 15·
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