TW200907128A - Methods for selecting protease resistant polypeptides - Google Patents

Methods for selecting protease resistant polypeptides Download PDF

Info

Publication number
TW200907128A
TW200907128A TW097121280A TW97121280A TW200907128A TW 200907128 A TW200907128 A TW 200907128A TW 097121280 A TW097121280 A TW 097121280A TW 97121280 A TW97121280 A TW 97121280A TW 200907128 A TW200907128 A TW 200907128A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
protease
polypeptide
peptide
dab
protein
Prior art date
Application number
TW097121280A
Other languages
English (en)
Inventor
Laurent Stephane Anne Therese Jespers
Malgorzata Pupecka
Ian Tomlinson
Carolyn Enever
Original Assignee
Domantis Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB0724331.4A external-priority patent/GB0724331D0/en
Application filed by Domantis Co Ltd filed Critical Domantis Co Ltd
Publication of TW200907128A publication Critical patent/TW200907128A/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/005—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies constructed by phage libraries
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/007—Pulmonary tract; Aromatherapy
    • A61K9/0073—Sprays or powders for inhalation; Aerolised or nebulised preparations generated by other means than thermal energy
    • A61K9/0078—Sprays or powders for inhalation; Aerolised or nebulised preparations generated by other means than thermal energy for inhalation via a nebulizer such as a jet nebulizer, ultrasonic nebulizer, e.g. in the form of aqueous drug solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/06—Anti-spasmodics, e.g. drugs for colics, esophagic dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/04—Artificial tears; Irrigation solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/543—Mucosal route intranasal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/544—Mucosal route to the airways
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Hematology (AREA)

Description

200907128 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 多肽及肽已在多種應用中成為越來越重要之藥劑，包括 工業應用及作為醫藥劑、治療劑及診斷劑之用途。然而， 在諸如發炎狀態（例如，C0PD)及癌症之特定生理狀鵰 中，組織、器官或動物中（例如，肺中、腫瘤中或腫錢 近）所存在之蛋白酶量會増加。該蛋白酶增加會導致内源 性蛋白質及投與以治療疾病之治療狀、多狀及蛋白質加速 降解及純化。因此，一些具有活體内使用（例如，用於治 療、診斷或預防諸如人類之哺乳動物之疾病）之潛力之藥 劑僅，、有有限的功效，因為其由蛋白酶快速降解及失活。 蛋白酶抗性多肽提供數個優點。舉例而言，蛋白酶抗性 多肽在活體内保留活性比蛋白酶敏感劑時間長，且因此保 留功能歷時足以產生生物效應之時間。對選擇抗蛋白酶降 解且亦具有想要之生物活性之多肽的改良方法存在需要。 =將尤其適用於提供抗胃腸道⑹道）及/或肺系統（該系統 已括肺）之流體及組織中可見之蛋白酶的肽及多肽。⑴道 與肺系統為哺乳動物（例如人類）之疾病及不良病狀之部 位；蛋白酶抗性肽及多肽藥物在此情況下將為有利的。 【發明内容】 古本發明係關於選擇蛋白酶抗性肽或多肽之方法及選擇以 问親和力結合乾配位體之肽或多肽之方法。本發明進一步 係關於種產生蛋白酶抗性肽或多肽譜系之方法。 131415.doc 200907128 在-態樣中’本發明為一種選擇蛋白酶抗性肽或多肽之 方法。該方法包含提供肽或多肽譜系，在適於蛋白酶活性 之條件下使譜系與蛋㈣組合，相收具有想要之生物活 性之肽或多肽’藉此選擇蛋白酶抗性肽或多肽。在一實施 例中，蛋白酶與譜系在溶液中組合(亦即，蛋白酶並未固 疋於支掉物上)。在一實施例中，想要之生物活性為結合 活性’例如與配位體、例如乾配位體或一般配位體之結合 活性。
“樣中本發明七供一種自肽或多肽譜系選擇蛋白 酶抗性肽或多肽之方法，該方法包含 提供肽或多肽譜系； 在適於蛋白酶活性之條件下使譜系與蛋白酶組合；及 回收具有想要之生物活性之肽或多肽，藉此選擇蛋白酶抗 性肽或多肽， 1、中蛋白酶係選自痰、黏液（例如，胃黏液、鼻黏液、支 氣管黏液）、支氣管肺泡灌洗液、肺組織勻漿、肺提取 物、騰腺提取物、胃液、唾液或眼淚中可見之蛋白酶，且 該想要之生物活性為結合活性。 因此’蛋白酶可見於一或多種以下各物中：痰、黏液 (例如胃黏液、鼻黏液、支氣管黏液）、支氣管肺泡灌洗 液、肺組織勻漿、肺提取物、胰腺提取物、胃液、唾液或 眼淚。在一實施例中，蛋白酶為眼睛及/或眼淚中可見之 蛋白酶。如以上所討論，所選擇之蛋白酶抗性肽或多肽在 >台療'預防及診斷例如人類之哺乳動物之疾病或病狀中具 131415.doc 200907128 有效用⑻及多肽尤其具有作為向諸如人類之患者投與時 很可能遇到蛋白酶之藥物之基質的效s。舉例而言，當向 GI道技與（例如’經口、舌下、直腸投與）時，在此狀況 了，狀或多肽可能在上胃腸道、下胃腸道、口腔、胃、小 腸及大腸中之—或多處受蛋白酶的侵襲。因此，一個實施 例提供-種待以經口、舌τ或直腸方式向患者之⑴道投與 乂 ’口療及/或預防患者之疾病或病狀的蛋白酶抗性肽或多 肽。舉例而言，經口投與由本發明之方法選擇或可選擇之
TNFa拮抗劑肽或多肽以治療及/或預防τΝρα介導之病症或 疾病’諸如關節炎（例如’類風濕性關節炎）、励、牛皮 癖或克羅恩氏病（Crohn，s disease)。在該實施例中，括抗劑 可為抗TNFIU免疫球蛋白單—可變區域（dAb)。在另—實 例中，當向肺組織（例 >，肺或氣管）投與（例如，藉由吸入 或鼻内方式）肽或多月太時其很可能遇到蛋白酶。因此，一 個實施例提供待以吸人或鼻内方式向患者之肺組織投與以 治療及/或預防患者之疾病或病狀的蛋白酶抗性肽或多 狀。該病狀可為哮喘（例如’過敏性哮喘）、c〇pD、产感 或W0 2G_3讀巾所“之任何其他肺疾病或病狀: W〇 20_38〇27係以引用之方式併入本文中。本發明之狀 及多肽可展現升高或相對較高之熔融溫度(丁爪)，從而提供 增強之穩定性。高親和力減合亦可為肽及多肽之特徵:、 該等特徵以及蛋㈣抗性使得肽及多肽可承擔料諸二人 類之哺乳動物之藥物的用途，其中（例如）對於啦或肺組 織投藥而言很可能會遇到蛋白酶。 、 131415.doc 200907128 注=實例中，“患者之眼睛投與⑼如，以眼球内 抗劑)時'其或二滴眼劑形式)肽或多肽(例如，可變區域或拮 以眼睛方、:了旎會遇到蛋白酶。因此，-個實施例提供 免疫球蛋1單=如::)投與蛋白酶抗性肽、多肽、 了蜓區域或拮抗劑以治療及/或預防患者 眼劑睛之疾病或病狀)。投藥可為以滴 睛投與。 /射至眼睛、例如玻璃體液中而局部向眼
實施例巾，本發明提供—種用於向肺傳遞之肺調配 ，其中該調配物包含粒度範圍小於5微米、例如小於 4广、4、3·5或3微米之本發明之拮抗劑、肽、多肽或可變 區域（例如’當在例如PH 6.5至8.0、例如PH 7至7.5、例如 PH 7或PH 7.5之伯瑞坦-魯賓遜（Briu〇n_R〇bi_n)緩衝 時）。 在一實施例中’提供pH 6.5至8 〇、例如7至7 5、例如 7、例如7.5之本發明之調配物及組合物。 根據本發明之任何態樣之肽或多肽（例如’可變區域）可 具有至少5(TC或至少55t或至少6(rc或至少65。〇或至少 70°C之Tm。本發明之拮抗劑、用途、方法、組合物、裝置 或調配物可包含該肽或多肽。 在本發明之一態樣中’本發明之肽、多肽、可變區域、 拮抗劑、組合物或調配物在37t至5〇t下在伯瑞坦_魯賓遜 緩衝液中培養14天後大體上為穩定的（多肽或可變區域之 濃度為1 mg/ml)。在一實施例中，至少65、7〇、75、、 1314I5.doc 200907128 85、86、87、88、90、91、92、93、Qzl η: 94、95、96、97、 98、99%之肽 '多肽、拮抗劑或可變區域為 甘’ L下進行該 培養後仍不聚集。在一實施例中，至少Μ、 王 ν Μ 、 70 、 75 、 8〇 、 85、86、87、88、90、91、92、93、94、％ 〇乙 、96、97、 98、99%之肽、多肽或可變區域在37。厂下掩> — L下進仃戎培養後仍 為單體。在一實施例中，至少5、1〇 ' 15、2〇、25、％ Ο
35、40、45、50、55、60、65、70、75、8〇、85、％、 87、88、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%之 肽、多肽、拮抗劑或可變區域在5(rc下進行該培養後仍不 聚集。在一實施例中，至少5、1〇、15、π、25、3〇 35、40、45、50、55、60、65、7〇、75、8〇、85、％ 98、99%之 87 、 88 ' 90 、 91 、 92 、 93 、 94 ' 95 ' 96 ' 97 肽、多肽或可變區域在5(TC下進行該培養後仍為單體。在 一實施例中，在任何一個該等培養後未見肽、多肽、可變 區域、拮抗劑之聚集。在一實施例中，肽、多肽或可變區 域之pi在37X：下在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中在j mg/mi之多 肽或可變區域濃度下培養後仍未變化或大體上未變化。 在本發明之一態樣中’本發明之狀 '多狀、可變區域、 拮抗劑、組合物或調配物在4°C下在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液 中在pH 7至7.5(例如pH 7或pH 7.5)下培養（多肽或可變區域 之濃度為1 00 mg/ml)7天後大體上為穩定的。在一實施例 中’至少95、95.5、96、96.5、97、97.5、98、98.5、99或 99.5%之肽、多肽、拮抗劑或可變區域在該培養後仍不聚 集。在一實施例中，至少95、95.5、96、96.5、97、 131415.doc -10- 200907128 97.5、98、98·5、99或99.5%之肽、多肽或可變區域在該培 養後仍為單體。在一實施例中，在任何一個該等培養後未 見肽、多肽、可變區域、拮抗劑之聚集。 在本發明之一態樣中，本發明之肽、多肽、可變區域、 结抗劑、組合物或調配物（例如）在室溫、2 〇。〇或3 7。匚下（例 如）在噴射噴霧器（例如Pari LC +杯）中噴霧（多肽或可變區域 之濃度為40 mg/ml) 1小時後大體上為穩定的。在一實施例 中’至少 65、70、75、80、85、86、87、88、90、91、 92 ' 93、94、95、95.5、96、96.5、97、97.5、98、98 5、 99或99.5%之肽、多肽、拮抗劑或可變區域在該噴霧後仍 不聚集。在一實施例中，至少65、70、75、80、85、80、 87、88 ' 90、91、92、93、94、95、95.5、96、96.5、 97、97.5、98、98.5、99或99.5%之肽、多肽或可變區域在 該喷霧後仍為單體。在一實施例中，在任何一個該喷霧後 未見肽、多肽、可變區域、拮抗劑之聚集。 肽或多肽可為經分離的及/或重组。 在另一態樣中，本發明提供一種自肽或多肽譜系選擇蛋 白酶抗性肽或多肽之方法，該方法包含 提供肽或多肽譜系； 在適於蛋白酶活性之條件下使譜系與蛋白酶組合；及 回收具有想要之生物活性之肽或多肽，藉此選擇蛋白酶抗 性肽或多肽， 其中該想要之生物活性為結合活性，例如與靶配位體或— 般配位體之結合活性。 131415.doc 11 - 200907128 在一實施例中’在本發明之方法中，蛋白酶為非細菌蛋 '在實細例中，蛋白酶為動物、例如哺乳動物、例 如人類蛋白酶。在一眘始你丨办 實把例中’蛋白酶為GI道蛋白酶或肺 組織蛋白酶，例如人類中 八頌甲J見之GI道蛋白酶或肺組織蛋白 酶。 在心樣中本發明提供一種自肽或多肽譜系選擇蛋白 酶抗性肽或多肽之方法，該方法包含 提供肽或多肽譜系； 在適於蛋白酶活性之條件下使譜系與蛋白酶組合；及 回收具有想要之生物活性之肽或多肽，藉此選擇蛋白酶抗 性肽或多肽， 其中該等條件為⑴約1G㈣㈤至約3 mg/ml蛋白酶，⑼約 2〇°C至約4Gt及（iii)歷時至少約％分鐘。纟—實施例中， 該等嚴格條件使得能夠選擇具有高親和力及/或提高之丁爪 的肽或多&。在此狀況下’肽及多肽可以單體形式呈現高 親和力。 在-實施例中’在本發明之方法中，對於該等適於蛋白 酶活性之條件，使用約1〇 #g/mL至約1〇〇叹/mL蛋白酶。 對於该等適於蛋白酶活性之條件，可使用約3〇。匸至約 37°C (例如，在約37°C或約室溫下）之溫度。在一實施例 中，譜系及蛋白酶可組合至少約丨小時（例如，約丨小時、 約兩小時或隔夜）。在本發明之方法中，譜系及蛋白酶在 一實施例中培養至少約3 〇分鐘之時間。在一實施例中，使 用約100 Hg/mL之蛋白酶，且在約37t：下培養所組合之譜 131415.doc 200907128 系及蛋白酶至少約...小時。 …在實施例中，蛋白酶（例如胰蛋白酶）與可變區域之比 率（以莫耳/莫耳計）為8,〇〇〇比8〇 〇〇〇蛋白酶可變區域， 如當c為職克/毫升時，比率為刚比8〇，_蛋白酶可= 區域；或當C或C，為100微克/毫升時，比率.比 80，_蛋白酶：可變區域。在-實施例中，蛋白酶(例如騰 蛋白酶）與可變區域之比率 \爻比早（以重置/重量、例如微 計）為16,000比160,0〇〇蛋白酶 "克 酶·了變區域，例如當〇為10微 克〜升日…匕率為―匕⑽侧蛋白酶:可 可變區域。在一實施例中，使曲 克/其碰疋 /辰度為至〉、wo或1000微 兄/ ¾升蛋白_之蛋白酶。 在：法中可使用任何想要之蛋白酶，諸如一或多 蛋白酶：絲胺酸蛋白酶、+ ㈣帽奴酸蛋白酶、天冬胺酸蛋白 酶、硫醇蛋白酶、基質金屬 货白 基肽酶Λ、羧基肽酶B)、胰蛋白酿^ 羧 ,)職蚩白麵、胰凝乳蛋白酶、胃蛋 白峰、木瓜蛋白酶、彈性蛋白 _月蛋 月夷酶、凝血酶、纖、·容醢έ ^ 球酶deucozyme)、 〇)、蛋白白酶(例如組織蛋白酶 }蛋白酶（例如，蛋白酶1、蛋& #。 菌蛋白酶、凝― ^轉2、蛋白酶3)、嗜熱 贲白酶凝礼酶、腸肽酶、卡斯| ώ 斯蛋_、卡斯蛋白酶2、卡斯：^柳)(例如卡 卡斯笟ώ絡〇上 片蛋白酶4、卡斯蛋白酶5、 蛋白酶9、卡斯蛋白酶12、 白酶、無> 卡斯蛋白酶13)、鈣激活蛋 i| , M ^ ^ _ 後滴蛋白酶、獼猴桃蛋白 姆鳳梨蛋白酶及分離酶。在 、又μ施例中，蛋白酶為胰 13l4l5.doc 200907128 蛋白酶、彈性I & 貪白每或白血球酶。蛋白酶亦可由生物 物、生物組織白埤+ 知取 、、'勺黎或生物製劑（例如活體外全細胞）提 必要時，該太，土、& ’、 去進一步包含在培養完成後向譜系與蛋白 之組合中添加蛋白酶抑制劑。 在本發明之方法之_實施例中’蛋白酶當與譜系組 處於溶液中。 在一些實施例中，基於結合活性回收具有想要之生物活 〖生之肽或多肽。舉例而言，可基於結合諸如蛋白質A、蛋 自質G或蛋白質L之—般配位體回收肽或多肽。結合活性 亦可為與靶配位體之特異性結合。例示性靶配位體包括 ApoE、Apo-SAA、BDNF、心營養素]、CEA、CD4〇、 CD40配位體、CD56、CD38、CD138、EGF、EGF受體、 ENA-78、嗜酸性粒細胞趨化因子、嗜酸性粒細胞趨化因 子-2、次級淋巴組織趨化因子（Ex〇dus)_2、FApa、fGf^ 性、FGF-驗性、纖維母細胞生長因子_丨〇、FLT3配位體、 弗拉塔凱（Fraetalkine)(CX3C)、GDNF、G-CSF、GM- CSF、GF-βΙ、人類血清白蛋白、胰島素、IFN_y、IGF_j、 IGF-II、IL-Ια、. IL-Ιβ、IL-1 受體、il-1 受體 1 型、il-2、 IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8 (72 a.a.)、IL-8 (77 a.a.)、IL-9、IL-10、IL-ll、iL_i2、IL-13、IL-15、IL- 16、IL-17、IL-18 (IGIF)、抑制素 α、抑制素 β、Ip l〇、角 化細胞生長因子-2 (KGF-2)、KGF、痩體素、LIF、淋巴細 胞趨化因子、穆勒氏抑制物質（MuUerian inhibitory substance)、早核細胞集落抑制因子、單核細胞吸附蛋 131415.doc -14- 200907128 白、M-CSF、MDC (67 a.a.)、MDC (69 a.a.)、MCP-l (MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC (67 a，a)、MDC (69 a.a.)、MIG、MIP-la、ΜΙΡ-1β、ΜΙΡ-3α、ΜΙΡ-3β、 MIP-4、骨髓祖細胞抑制劑因子-1 (MPIF-1)、NAP-2、神 經營養因子、神經生長因子、β-NGF、NT-3、NT-4、制瘤 素 Μ、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB 、PF-4、 RANTES、SDFla、SDFlp、SCF、SCGF、幹細胞因子 (SCF)、TARC、TGF-a、TGF-β、TGFJ2、TGF-03、腫瘤 壞死因子（TNF)、TNF-a、TNF-β、TNF 受體 I、TNF 受體 II、TNIL-1、ΤΡΟ、VEGF、VEGF A、VEGF B、VEGF C、VEGF D、VEGF 受體 1、VEGF 受體 2、VEGF 受體 3、 GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β、GRO-γ、HCC1、1-309、 HER 1、HER 2、HER 3、HER 4、血清白蛋白、vWF、澱 粉樣蛋白（例如，澱粉樣a)、MMP12、PDKl、IgE、IL-13Ral、IL-13Ra2、IL-15、IL-15R、IL-16、IL-17R、IL-17、IL-18、IL-18R、IL-23 IL-23R、IL-25、CD2、CD4、 CDlla、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、 CD40L、CD56、CD138、ALK5、EGFR、FcERl、TGFb、 CCL2、CCL18、CEA、CR8、CTGF、CXCL12 (SDF-1)、 凝乳酶、FGF、弗林蛋白酶（Furin)、内皮素-1、嗜酸性粒 細胞趨化因子（例如，嗜酸性粒細胞趨化因子、嗜酸性粒 細胞趨化因子-2、嗜酸性粒細胞趨化因子-3)、GM-CSF、 ICAM-1、ICOS、IgE、IFNa、1-309、整合素、L-選擇 素、MIF、MIP4、MDC、MCP-l、MMPs、嗜中性彈性蛋 131415.doc •15· 200907128 白酶、骨橋蛋白、OX-40、PARC、PD-l、RANTES、 SCF、SDF-1、siglec8、TARC、TGFb、凝血酶、Tim-1、 TNF、TRANCE、類胰蛋白酶、VEGF、VLA-4、VCAM、 α4β7 、 CCR2 、 CCR3 、 CCR4 、 CCR5 、 CCR7 、 CCR8 、 ανβ6、ανβ8、cMET、CD8、vWF、澱粉樣蛋白（例如，殿 粉樣 α)、MMP12、PDK1 及 IgE。 在特定實施例中，藉由淘選回收肽或多肽。 在本發明之方法之一實施例中，當存在蛋白酶時，將譜 系曝露於配位體（靶配位體、一般配位體）中，且基於與配 位體之結合選擇譜系中之一或多個成員。 在一些實施例中，譜系包含呈現系統。舉例而言，呈現 系統可為噬菌體呈現、核糖體呈現、乳液隔室化及呈現、 酵母呈現、嘌呤黴素呈現、細菌呈現、質體上之呈現或共 價呈現。較佳呈現系統使核酸之編碼功能與由核酸所編碼 之肽或多肽之功能特徵相關聯。在特定實施例中，呈現系 統包含可複製之基因組。 在一些實施例中，呈現系統包含噬菌體呈現。舉例而 言，噬菌體可為fd、M13、λ、MS2或T7。在特定實施例 中，噬菌體呈現系統為多價系統。在一些實施例中，肽或 多肽呈現為pill融合蛋白。 在一實施例中，肽或多肽（例如，可變區域）譜系當與蛋 白酶一起培養時，（例如）以106至1013，例如108至1〇12個複 製單位（傳染性病毒體）之噬菌體庫規模呈現於噬菌體上。 在其他實施例中，方法進一步包含擴增編碼具有想要之 131415.doc -16· 200907128 生物活性之肽或多肽的核酸。在特定實施例中，藉由噬菌 體擴增、細胞生長或聚合酶鏈反應擴增核酸。 巫囷 在-些實施例中，言普系為免疫球蛋:單一可變區域皱 系。在特定實施例中，免疫球蛋白單一可變區域為重心 變區域。在更特定實施例中，重鏈可變區域為人類重鏈可 變區域。在其他實施例中，免疫球蛋白單一可變區域 鍵可變區域。在特定實施例中，輕鍵可變區域為二二 可變區域。 貝毕工鏈 在另一態樣中，本發明為-種自肽或多肽譜系選擇以古 親和力結合靶配位體之肽或多肽之方 门 Π. ^ ^ g, ^ ^ 該方法包含提供 ::糸’在適於蛋白酶活性之條件下㈣系與蛋白 鉍、、且〇及回收結合靶配位體之肽或多肽。 通常將譜系及蛋白酶培養至少約3〇分鐘 rt用任何想要之蛋白酶，諸如—或多種以下蛋白Γ 暴胺k蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、天冬胺酸蛋、 蛋白酶、基質金屬蛋白酶、羧基 = «肽鄉騰蛋白酶、騰凝乳蛋白 竣基肽 蛋白酶、彈性蛋白酶、白血球酶、7㈣、木瓜 酶、袓螂IΘ給 酶、凝血酶、纖溶 、-且4蛋白酶（例如組織蛋白 酶1、蛋白酶2、f , 蛋白鉍（例如，蛋白 酶、卡斯：白酶=卡、嗜熱菌蛋白酶、凝乳酶、腸肽 4蛋白酶（例如卡斯蛋白酶〗、 蛋白酶4、卡斯蛋白卡斯 卡斯蛋白二 +斯蛋白酶9、卡斯蛋_、 4耸白刼13)、鈣激活蛋白並 白酶、辆f ώ & …、化果蛋白酶、梭菌蛋 辆猴桃蛋白轉、鳳梨蛋白酶及分離酶。在特定實施 131415.doc 200907128 例中’蛋白酶為胰 酶亦可由生物提取：彈性蛋白酶或白血球酶。蛋白 要時 、生物組織勻漿或生物製劑提供。必 έ人&步包含在培養完成後向譜系與蛋白酶之 組合中添加蛋白酶抑制劑。 、蛋白蜂之 可基於結合任何想 靶配位體回收肽或多 肽或多肽。 要之靶配位體、諸如本文中所揭示之 肽。在特定實施例中，藉由淘選回收
按照本發明之J* Μ 这方法，其中想要之生物活性為結合活 性，所結合之配位體（革巴配位體、一般配位體）不與蛋白酶 相同。 在—些實施例中，譜系包含呈現系统。舉例而言，呈現 系統可為嗟菌體呈現、核糖體呈現、乳液隔室化及呈現、 酵母呈現…票吟黴素呈現、'細菌呈現、質體上之呈現或共 價呈現。較佳呈現系統使核酸之編碼功能與由核酸所編碼 之肽或多肽之功能特徵相關聯。在特定實施例中，呈現系 統包含可複製之基因組。 在一些實施例中’呈現系統包含噬菌體呈現。舉例而 言’噬菌體可為fd'M13、X、MS2或Τ7。在特定實施例 中’嗟囷體呈現糸統為多價系統。在一些實施例中，狀戈 多肽呈現為pill融合蛋白。 在其他實施例中，方法進一步包含擴增編碼具有想要之 生物活性之肽或多肽的核酸。在特定實施例中，藉由嚷菌 體擴增、細胞生長或聚合酶鏈反應擴增核酸。 在一些實施例中’譜系為免疫球蛋白單一可變區域级 131415.doc -18- 200907128 系在特疋實施例中，免疫球蛋白單 變區域。在更特定以⑽}白早可變區域為重鏈可 變區域^ ，重鏈可變區域為人類重鏈可 域在其他實施例中，免疫球蛋白單一 鏈可變區域。在特定實施例中，輕 二為輕 可變區域。 马人類輕鏈 在另一態樣中，本發明為一 譜夺之方、丰& 檀產生蛋白酶抗性肽或多肽 酶tr 包含提供肽或多肽譜系，在適於蛋白 數種之條件下使肽或多肽譜系與蛋白酶組合，及回收複 數種具有想要之生物 次口收複 性肽或多肽譜系、 3夕肽’藉此產生蛋白酶抗 在一些實施例中，通常將譜系及蛋白t s , Μ 鐘之眭Μ I 久龙曰崎培養至少約30分 種。舉例而言，方法中所使用之蛋白酶可為一或多 種以下蛋白酶··絲胺酸蛋白 / S# ^ ^ 干肮妝@夂蛋白酶、天冬胺 蛋白鉍、V醇蛋白酶、基質金 如，跆糞B4· # λ 硬暴狀S# (例 羧基肽駟A、羧基肽酶B)、胰蛋白 酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、- ”白 忠㈡啤评性蛋白軸、白血球酶、牍 蛋白凝血酶、纖溶酶、組織蛋白酶(例如組織蛋 、 ，(例如，蛋白酶】、蛋白酶2、蛋白酶3)、嘻熱菌蛋白 、破乳酶、腸肽酶、卡斯蛋白酶(例 :蛋峰、卡斯蛋白酶4、卡斯蛋白酶5、卡斯蛋白酶9卡 2蛋白卡斯蛋白酶13)、舞激活蛋白酶、無花果 酶杈菌蛋白酶、獼猴桃蛋白酶、鳳梨蛋白酶及分離 白在特疋實細例中，蛋白酶為胰蛋白酶'彈性蛋白酶或 血球_。蛋白酶亦可由生物提取物、生物組織勻漿或生 I3l4l5.d〇c -19· 200907128 該方法進一步包含在培養完成後向 添加蛋白酶抑制劑。 物製劑提供。必要時， 譜系與蛋白酶之組合中 在二實施例中，基於結合活性回收複數種具有想要之 物活I·生之肽或夕肽。舉例而言，可基於結合諸如蛋白質 蛋白貝G或蛋白質L之一般配位體回收複數種狀或多 肽。結合活性亦可為與無配位體、諸如本文中所述之革巴配 位體之特異性結合。在特定實施例中，藉由淘選回收複數 種具有想要之生物活性之肽或多肽。 在—些實施例中，譜系包含呈現系統。舉例而言，呈現 系統可為嗟菌體呈現、核糖體呈現、乳液隔室化及呈現、 酵母呈現、嗓呤黴素呈現、、細菌呈現、質體上之呈現或共 價呈現。在特定實施例中，呈現系統使核酸之編碼功能與 由核酸所編碼之肽或多肽之功能特徵相關聯。在特定實施 例中’呈現系統包含可複製之基因組。
在—些實施例甲，呈現系統包含噬菌體呈現。舉例而 吕，噬菌體可為fd、M13、λ、MS2或丁7。在特定實施例 中，噬菌體呈現系統為多價。在一些實施例中，肽或多肽 呈現為pill融合蛋白。 在其他實施例中，方法進一步包含擴增編碼複數種具有 想要之生物活性之肽或多肽的核酸。在特定實施例中，藉 由i]體擴增、細胞生長或聚合酶鏈反應擴增核酸。 在—些實施例中，譜系為免疫球蛋白單一可變區域譜 系。在特定實施例中’免疫球蛋白單一可變區域為重鍵可 變區域。在更特定實施例中，重鏈可變區域為人類重鏈可 131415.doc -20- 200907128 臭區域在其他實施例中，免疫球蛋白單一 "SJ· ^ p 鏈可變區域。在牲4 T變區域為輕 可變區域。 類輕鏈 在另態'樣中’本發明為一種自譜 位體之免疫球蛋白罝 4 匕3、、、°合靶配 、尤又X蛋白早一可變區域（dAb)之蛋白酶抗性 的方法。在一實祐初丨士 夕肽 霄把例中，該方法包含提供包含多肽 的噬菌體呈現系絲 吩松# 之6曰糸 見糸、'先，多肽包含免疫球蛋白單—可變區 域’在適於蛋白酶活性 ^ 條件下使噬囷體呈現系統與選自 由彈性蛋白酶、白‘ A # „ t π - k目 球酶及胰蛋白酶組成之群之蛋白酶組 乂及回收呈現包含結合㈣立體之免疫 區域之多肽的噬菌體。 平 在一些實施例中，使用100 _L之蛋白酶， ”C:將所組合之嗟菌體呈現系統及蛋白酶培養隔夜。、’、 42=中，藉_配位體結合回收呈現包含結 ::乾之免疫:求蛋白單-可變區域之多狀的嗟菌體。在其 貝％例中，藉由淘選回 抹. 匕3^合靶配位體之免疫 ,白早一可變區域之多肽的噬菌體。 本發明亦係關於—種由本文中所述之方法可選擇或選擇 之經分離蛋白酶抗性肽或多肽。 —、 〆 符疋實施例中，太於 月係關於一種由本文中所述之方法 ^ ^ j、擇或選擇之經分離 =轉（例如，姨蛋白酶、彈性蛋白醇、白也球酶）抗性免 疫球蛋白早一可變區域（例如，人 人類抗體輕鏈可變區域)。 、抗體重鏈可變區域、 本發明亦係關於一種編瑪由本文中所述之方法可選擇或 J3I4I5.doc 21 200907128 選擇之蛋白酶抗性肽或多肽（例如，姨蛋白疏 ,0 贫曰姆、弹性蛋白 酶或白血球酶抗性免疫球蛋白單一可變p· +Jf、^ b域）的經分離或 重組核酸，及係關於包含該等核酸之巷舯r 戰體（例如，表現載 體）及宿主細胞。 本發明亦係關於一種製造由本文中所 叮返之方法可選擇或 選擇之蛋白酶抗性肽或多肽(例如’胰蛋白酶、彈性蛋白 酶或白血球酶抗性免疫球蛋白單一可 、 j夂區域）之方法，該 方法包含將含有編瑪蛋白酶抗性肽或多 I重組核酸之宿 主細胞維持在較表現之條件下，藉此製造蛋自酶抗性狀 之蛋白酶抗性肽或多肽(例如，胰蛋白酶、彈性蛋白2 白血球酶抗性免疫球蛋白單一可 或
(例如，用於治療或診斷)。本發明亦係關於一種由太： 所述之方法可選擇或選擇之蛋、由本文中 胰蛋白酶、彈性蛋白酶戈… 性肽或多肽(例如， 變區域）用於製造m 免疫球蛋白單一可 席佚病用之藥物 係關於-種治療疾病之方法 肖途。本發明亦 投與有效量…文中所述之;法==要之個雜 抗性肽或多肽(例如’姨蛋白酶 蛋:=蛋白酶 抗性免疫球蛋白單—可變區域）。 贫白％或白血球酶 在方之本發明之—實施例中，亨 於第二蛋白酶活性之條件下使第一”方法進-步包含在適 或多肽譜系組合；及 —蛋白酶與蛋白酶抗性肽 13 Ϊ415.doc •22- 200907128 回收至少一種具有想要之生物活性之肽或多肽，藉此選 擇至少一種抗第二蛋白酶之肽或多肽。第一與第二蛋白酶 不同。第二蛋白酶可如以上關於第一蛋白酶之特定實施例 所定義。 本發明進一步提供一種用於向患者投與以治療及/或預 防肺疾病或病狀之經分離肺靶拮抗劑，其包含當在適於本 發明之方法之條件下，例如⑴約10 μ§/πι1至約3 mg/ml蛋白 酶，⑴）約2(TC至約40。〇及（出）歷時至少約3〇分鐘之條件下 (例如，在loo pg/m丨蛋白酶在37t：下歷時至少i小時之條件 下）與或多種以上所提及之蛋白酶（例如一或多種選自胰 蛋白酶、彈性蛋白酶及白血球酶之蛋白酶）一起培養時， 抗該或該等蛋白酶之肽或多肽（例如，免疫球蛋白單一可 變區域）。該拮抗劑可用於以吸入或鼻内方式向患者投 與。
本發明進一步提供-種用於向患者投與以治療及/或預 防GI道疾病或病狀之經分離⑴道靶拮抗 於本發明之方法之條件下，例如⑴約1〇μ二 蛋白酶，⑴）約2(TC至約赋及㈣歷時至少約⑼分鐘之條 件下（例如，在100 μ§/ιη丨蛋白酶在37t下歷時至少i小時之 條件下）與-或多種以上所提及之蛋白酶（例如—或多種選 自士騰蛋㈣、彈性蛋白酶及白血球酶之蛋白酶）-起培養 時’抗該或該等蛋白酶之肽或多肽(例如，免疫球蛋白單 一可變區域）。 該括抗劑可用於以經口、舌下或直腸方式向患者投與。 131415.doc -23· 200907128 肺乾或GI道乾拮抗劑為括抗TNF以。 肽、多肽或可變區域包含TNFR1之結合位點實施例中， 在一實施例中，肺靶或GI道乾 —或一肽、多肽或可二：括抗:·、 TNFIU、VEGF^L-1R1之結合位點。 了为別包含 在本發明之方法之—實施例中，進 戎各妝斟牮-疋人、 f疋所選擇之肽 同”擇方：！ 第一蛋白酶之抗性，不過在-組不
==方法中所使用之條件的條件下。雖然第二蛋白酶 第—蛋白酶’但其可為任何上述蛋白酶。在一實施 例中，在本發明之方法中選擇一種 、 日士杜# 上蛋白酶抗性肽或多 :者下一步為確定該等肽或多肽中何者展示對第二蛋 ::第蛋白酶具有抗性’不過在—組不同於選擇方法 所使用之條件的條件下。雖然第二蛋白酶不同於第一蛋 白酶’但其可為任何上述蛋白酶。以此方式，#出一或多 種肽或多肽中何者對一種以上蛋白酶具有抗性。
，本發明之方法之-實施财，選擇蛋白酶抗性單體狀 或多肽（例如，免疫球蛋白單一可變區域單體 本發明之藥物及括抗劑可包含與該肽或多肽融合之抗體 十亙疋區（例如F c)。 在λ施例中，本發明提供蛋白酶抗性肽或多肽在製造 用於向哺乳動物投與以提供具有？文良ρκ之藥物之藥物中的 途改良之ΡΚ可為改良之AUC(曲線下面積）及/或改良 之半衰期。在一實施例中，由本發明之方法選擇或可選擇 蛋白酶抗性肽或多月太。在一實施例中，肽或多肽為免疫球 1314l5.doc -24· 200907128 蛋=早Y變區域。藥物可包含與該狀或多狀融合之抗體 但疋區’例如抗體Fc。 本發明提供—種包含蛋白酶抗性肽或多肽的藥物，其用 :向哺乳動物(例如’人類)投與以在哺乳動物體内提供具 改良PK之藥物。在—實施例t，由本發明之方法選擇或 :選擇蛋白酶抗性肽或多肽。在一實施例中，肽或多肽為 免疫球蛋白單一可變7 又匚域。该樂物可包含與該肽或多肽融 合之抗體恆定區（例如，Fc)。 【實施方式】 在本說明書内’已參考實施例以使得能夠編寫清楚且簡 明之,兒明書之方式描述本發明。希望且應瞭解，在不脫離 本發明之情況下，實施例可不同地組合或分離。 如本文中所使用，”肽”係指經由肽鍵結合在一起之約2 個至約50個胺基酸。 如本文中所使用，"多肽"係指經由肽鍵結合在一起之至 t. 少約洲胺基酸。多肽通常包含三級結構且摺疊為功能區 域0 如本文中所使用，”抗蛋白酶降解”狀或多肽（例如，區域 抗體（dAb))當在適於蛋白酶活性之條件下與蛋白酶一起培 養時大體上不會被蛋白酶降解。當在適於蛋白酶活性之溫 度，例如在37°C或50。(：下與蛋白酶一起培養約1小時期間 不超過約25%、不超過約20%、不超過約丨5%、不超過約 14%、不超過約13%、不超過約12%、不超過約ΐι%、不超 過約10%、不超過約9%、不超過約8%、不超過約7%、不 131415.doc •25· 200907128 超過約6%、不超過約5%、不超過約4%、不料約3%、不 超過約2%、不超過約1%或大體上無蛋白質被蛋白酶降解 時，多肽（例如，dAb)大體上不降解。可使用任何合適方 法評定蛋白質降解，例如由SDS_pAGE或由如本文中所述 之功能檢定（例如，配位體結合）。 如本文中所使用，"呈現系統”係指其中多狀或狀之集合 易於基於想要之特徵（諸如物理、化學或功能特徵）加以選 擇之系、统。呈現系統可為多肽或肽之合適譜系⑽如，在 溶液中，S1定於合適支撐物上）。1現系統亦可為採用細 胞表現系統（例如，於（例如）經轉型、感染、轉染或轉導細 胞中表現核酸庫及於細胞表面上呈現經編碼多肽）或非細 胞表現系統(例如’乳液隔室化及呈現)之生物化學系統。 較佳呈現系統使核酸之編碼功能與由核酸所編碼之多肽或 肽之物理、化學及/或功能特徵相關聯。當採用該呈現系 統時，可選擇具有想要之物理、化學及/或功能特徵之多 肽或肽，且可容易地分離或回收編碼所選擇之多肽或肽之 核酸。此項技術已知許多使核酸之編碼功能與多肽或肽之 物理、化學及/或功能特徵相關聯之呈現系統，例如噬菌 體呈現（bacteriophage disPlay/phage display)、核糖體呈 現、乳液隔室化及呈現、酵母呈現、嘌呤黴素呈現、細菌 呈現、質體上之呈現、共價呈現及其類似者。（例如來見 EP 0436597 (Dyax)、美國專利第 6,172，197 號（McCaffe巧等 人）、美國專利第6,489，1〇3號（Griffiths等人）。） 如本文中所使用，，，譜系"係指以胺基酸序列多樣性為特 131415.doc -26· 200907128 谜之多肽或肽之集合。譜系之個體成員可具有常見特徵， 諸如㊉見結構特點(例如，常見核心結構)及/或常見功能特 徵（例如，結合常見配位體（例如，一般配位體或靶配位體 之能力）。 汝本文中所使用，"功能"描述具有生物活性、諸如特異 性結合活性之多肽或肽。舉例而言，術語，，功能多肽"包括 經由抗原結合位點結合靶抗原之抗體或其抗原結合片段及 結合受質之酶。 如本文申所使用，"一般配位體，，係指結合給定譜系之相 當一部分（例如，大體上所有）功能成員之配位體。—般配 位體（例如，常見一般配位體）可結合給定譜系之許多成 員，即使該等成員可能對常見靶配位體不具有結合特異 性。多肽上存在功能一般配位體結合位點（如結合一般配 位體之能力所指示）通常指示多肽經適當摺疊且具有功 月匕 般配位體之合適實例包括超抗原、結合表現於譜系 之相當一部分功能成員上之抗原決定基之抗體及其類似 者。 ”超抗原”為技術術語，其係指與免疫球蛋白超家族之成 員在不同於該等蛋白質之靶配位體結合位點之位點處相互 作用之一般配位體。葡萄球菌腸毒素為與丁_細胞受體相互 作用之超抗原實例。結合抗體之超抗原包括結合IgG恆定 區之蛋白質 G (Bjorck 及 Kronvall，J. /www„〇/ , n3:969 (1984));結合IgG恆定區及乂„區域之蛋白質a (F〇rsgren及 Sjoquist，J. /wmw ⑽/.，97:822 (1966));及結合 乂[區域之蛋 131415.doc -27- 200907128 白質 L (Bjorck，《/. /mmwzto/·，140:1194 (1988))。 如本文中所使用，”靶配位體"係指多肽或肽特異性或選 擇性結合之配位體。舉例而言，當多肽為抗體或其抗原結 合片段時，靶配位體可為任何想要之抗原或抗原決定基， 且當多肽為酶時，靶配位體可為任何想要之受質。與靶抗 原之結合係視具有功能性之多肽或肽而定。 如本文中所使用，抗體格式（antib〇dy format)"係指其中 可合併抗體可變區域以在結構上賦予抗原結合特異性之任 何合適多肽結構。此項技術已知多種合適抗體格式，諸如 嵌合抗體、人化抗體、人類抗體、單鏈抗體、雙特異性抗 體、抗體重鏈、抗體輕鏈、抗體重鏈及/或輕鏈之同源二 聚體及異源二聚體、任何上述各者之抗原結合片段（例 如，Fv片段（例如單鏈Fv (scFv)、雙硫鍵鍵結之Fv)、 片段、Fab'片段
中所使用之術語π免疫球蛋白單一 【域抗體”或”dAb"與本文 可變區域"相同。免疫球 131415.doc -28- 200907128 蛋白單一可變區域較佳為人類抗體可變區域，且包括來自 其他物種之單一抗體可變區域，諸如齧齒動物（例如，如 WO 00/29004中所揭示，其内容係以引用之方式整體併入 本文中）、邊士鯊（nurse shark)及駱聪類（c謂e/z.c/) vHH dAb。駱駝類Vhh為自產生天然缺少輕鏈之重鏈抗體之包 括駱馱、美洲駝、羊駝、單峰駱駝及原駝之物種獲得的免 疫球蛋白單一可變區域多肽。 區域"為具有獨立於蛋白質其餘部分之三級結構之摺疊 蛋白質結構。區域通常會產生蛋白質之離散功能性質，且 在許多狀況下，可在不損失蛋白質之其餘部分及/或區域 之力月b之丨月況下，添加至其他蛋白質中、自其他蛋白質中 移除或轉移至其他蛋白質中。”單一抗體可變區域"為包含 具有抗體可變區域特徵之序列之摺疊多肽區域。因此，其 包括完全抗體可變區域及（例如）其中一或多個環已經被不 具有抗體可變區域之特徵之序列置換的經修飾可變區域， 或已經被截斷或包含N-末端或C_末端延伸之抗體可變區 域，以及保留全長區域之至少結合活性及特異性之可變區 域的摺疊片段。 術語"庫"係指異源多肽或核酸之混合物。庫包含各具有 單一多肽或核酸序列之成員。就此而論，”庫，，與”譜系'"同 義。庫成員之間的序列差異產生庫中所存在之多樣性。庫 可採取多肽或核酸之簡單混合物形式或可呈經核酸庫轉型 之例如細菌、病毒、動物或植物細胞及其類似者之生物體 或細胞形式。各個體生物或細胞較佳僅含有—個或有限數 131415.doc -29- 200907128 目之庫成員。有利地將核酸併人表現載體中以允許表現由 核酸所編碼之多肽。因Λ，在—較佳態樣中，庫可採取宿 主生物體群體之形式，各生物體含有一或多個含有單個呈 核酸形式之庫成員的表現載體複本，該庫成員可經表現以 產生相應多肽成員。因&，宿主生物體群體具有編碼多樣 性多肽大譜系之潛能。 ，通用構架”為對應於如Kabat (”Sequences 〇f pr〇teins 〇f Immunological Interest", US Department of Health and Human Services，i991)所定義之在序列方面保守之抗體區 或對應於如 Chothia 及 Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196:91〇_ 9 1 7所定義之人類生殖系免疫球蛋白譜系或結構的單一抗 體構架序列。本發明提供單一構架或一組該等構架之用 途，儘管僅高變區中存在變異但已發現其仍准許實際上任 何結合特異性之起源。 較佳使用算法BLAST 2 Sequences使用缺省參數 (TatUsova，Τ, A.等人，尸五奶 Mz.cr〇0z.〇/ £ 扣， 1 88(1999))準備且確定如本文中所定義之胺基酸及核苷酸 序列比對及同源性、相似性或一致性。 本發明係關於一種選擇具有想要之生物活性之蛋白酶抗 性肽及多肽的方法。方法中使用兩個選擇壓力以產生選擇 高度穩定且抗蛋白酶降解且具有想要之生物活性之多狀的 高效過程。如本文中所述，蛋白酶抗性肽及多肽通常保留 生物活性。相反，蛋白酶敏感肽及多肽在本文中所述之方 法中會被蛋白酶裂解或分解，且因此喪失其生物活性。因 131415.doc -30- 200907128 此’通常基於諸如社八、々丄w 兩戈，，σ n活性之生物活性選擇蛋白酶抗 或多肽。 本文中所述之方法提供數個優點。舉例而言，如本文中 所揭示及例示’選擇抗-種蛋白酶(例如，膜蛋白酶)之蛋 白水解降解的肽或多肽亦對其他蛋白酶（例如，彈性蛋白 Γ白血f酶）降解具有抗性。另外，蛋白酶抗性與肽或 夕肽之較向熔融溫度 又U m)相關。較尚熔融溫度指 之肽及多肽。抗蛋白酶降 德疋 姆降解亦與結合靶配位體之高親和力 相關。因此，本文中餅'+、 中所述之方法提供一種選擇、分離及/ 或回收具有想要之生物 ^ ^ ^ /，丨且因其具蛋白酶抗性且穩定而 極適於活體内治療及/或味 、次0斷使用之多肽的有效方式。 選擇方法 在一態樣中，本菸明炎ώ。， a , 月為自肽及多肽庫或譜系（例如，呈 現糸統）選擇、分離月/斗、 呈 S回收抗蛋白酶（例如一或多種蛋白 知）降解之肽或多肽之方 ,_ , ' °亥方法較佳為自肽及多肽庫 或以糸（例如，呈現系統 , 二、* 伴刀離及/或回收抗蛋白酶 (|丨如，一或夕種蛋白酶 ,A 』降解之夕肽之方法。該方法诵赍 匕3提供肽或多肽庫或兮並系 D曰系，在適於蛋白酶活性之條件ητ 使該庫或該譜系與蛋白 之怿件下 ^ 駟（例如，胰蛋白酶、彈性蛋白 _、白血球酶、胰酶、瘦 /又）組合，及選擇、分雜 抗蛋白酶降解且具有想 5 D收 及ώ # 之生物活性之肽或多肽。歸因於 蛋白酶之活性，由蛋白酶 、 小或喪失其生物活性。^ 、吊生物活性減 、e& 因此’可使用基於生物活性之方、本 k擇、分離及/或回/ 收抗蛋白酶降解之肽或多肽，該生物 1314l5.doc 200907128 活性諸如結合活性（例如，結合一般配位體、結合特異性 配位體、結合受質）、催化活性或其他生物活性。 如本文中所描述及例示，蛋白酶抗性dAb通常以高親和 力結合其靶配位體。因此，在另一態樣中，本發明為選 擇、分離及/或回收以高親和力結合配位體、較佳靶配位 體之肽或多肽之方法。該方法較佳為選擇、分離及/或回 收以鬲親和力結合配位體、較佳乾配位體之多肽之方法。 6玄方法通常包含提供肽或多肽庫或譜系，在適於蛋白酶活 性之條件下使s亥庫或該譜系與蛋白酶（例如，騰蛋白酶、 彈性蛋白轉、白血球酶、姨酶、痰）組合，及選擇、分離 及/或回收結合配位體（例如，靶配位體）之肽或多肽。因為 庫或譜系已在蛋白酶敏感肽或多肽會分解之條件下曝露於 蛋白酶中，所以蛋白酶之活性可消除具有弱結合親和力之 不太穩定的多肽，且從而產生高親和力結合肽或多肽之集 合。舉例而言，所選擇之肽或多肽可以1 μΜ或更強、較佳 約福至約0.5 ρΜ之親和力（KD;如由表面電敷共振所 測定KD=K〇ff(kd)/K〇n(ka))結合其靶配位體。舉例而言，高 親和力肽或多肽可以約500 nM、約1〇〇 nM、約ι〇罐、約 1福、約5〇〇_、約100_、約1〇_、約i pM或約〇5 之親和力結合乾配位體。咸信’抗蛋白酶之肽及多肽 =較低網及/或較高穩定能。因此’蛋白酶抗性與高親 =合之間的相關性可能與本發明之方法所選擇之狀及 =表面的緊密性及穩定性相關。在適於蛋白酶之蛋白水 活f生之條件下使肽或多肽之庫或譜系與蛋白酶（例如， 131415.doc -32- 200907128 一或多種蛋白酶）組合。適於蛋白酶及具有蛋白水解活性 之生物製劑或混合物之蛋白水解活性的條件為此項技術所 熟知或可由一般熟習此項技術者容易地確定。必要時，可 (例如)藉由在-定範圍之pH值條件、蛋白酶濃度、溫度下 評定蛋白酶活性及/或藉由改變使庫或譜系與蛋白酶反應 之時間之量來鑑別或優化合適條件。舉例而言，在一些實 施例中’蛋白酶(例如，胰蛋白酶)與肽或多肽(例如，可變 區域）之比率（以莫耳/莫耳計）為8〇〇比8〇,〇〇(例如，8,剛比 队綱）蛋白酶：肽或多肽，例如當使用職克/毫升蛋白 酶時，比率為_比80，_蛋白酶：肽或多肽；或當使用 100微克/毫升蛋白酶時，比率為8，_比8〇,_蛋白酶：肽 或多肽。在-實施例中，蛋白酶（例如，騰蛋白酶）與狀或 多肽（例如，可變區域）之比率（以重量/重量、例如微克/微 克計）為1，600比160，_(例如，16，_比16〇〇〇〇)蛋白酶· 肽或多肽，例如當使用10微克/毫升蛋白酶時，比率為 1，6〇〇比16〇,〇〇〇蛋白酶：肽或多肤；或當使用⑽微克/毫 升蛋白酶時’比率為16，_比16〇，_蛋白酶：肽或多肽。 在實施例中，使用遭度為至少1〇〇或1〇〇〇微克/毫升之蛋 白酶’且蛋白酶（例如’胰蛋白酶）與肽或多肽（例如，可變 區域）之蛋白酶：肽比率（以莫耳/莫耳計⑽比8〇，嶋 蛋白酶：肽或多肽。在一實施例中，使用濃度為至少1()微 克/毫升之蛋白酶’且蛋白酶（例如’胰蛋白酶）與肽或多肽 (例如，可變區域）之蛋白酶：肽比率（以莫耳/莫耳計）為 800比8〇，_蛋白酶：肽或多肽。在一實施例中蛋白酶 I31415.doc -33- 200907128 蛋白酶)與狀或多狀(例如，可變區域)之比率(以 肽或多肽例如微克/微克計）為16〇〇比160,000蛋白酶： 克^升時例如當C為10微克/毫升時；或當eg，為1〇〇微 在一實施例中比率為16,000比16_蛋白酶：肽或多肽。 白酶。為^ ’遭度（咖，）為至少100或義微克/毫升蛋 可變區域體或經分離狀或多狀（例如，免疫球蛋白 肤或多狀存自譜系或庫分離之狀或多狀，可向
白酶以製衝液（例如，PBS)中之溶液中添加蛋 t狀或多肽/蛋白酶 (w/w)蛋白酶/狀或多肽、約0至：至二約0·。1% 或多肽，，至心 至約5%(，蛋白酶/肽或多狀、狀或多狀、約㈣ 白酶/肽或多肽，至約5% (二 少約。〜，白酶/肽或多肽^ 白酶/狀或多狀、至少約0.03%(W/W)==0w)蛋 少約。〜啊/肽或多(/)至蛋白叫^ 白酶/肽或多肽、至少約0.06% 7約0她―蛋 少約〇亀⑻w)蛋白酶/肽:）蛋白酶/狀或多肽、至 白酶/肽或多肽、至少約〇 〇9 至少約〇·嶋（w/w)蛋 少約蛋白酶/肽或多、，蛋白酶/肽或多肽、至 酶/狀或多狀、至少約0.3% ( I至少約〇篇（W/W)蛋白 約〇·作。（WAV)蛋白酶/肽或多肽、）蛋白酶/肽或多狀、至少 肽或多肽、至少約〇6% 至少约〇.W(w/w)蛋白酶/ 0.7%⑽w)蛋白酶/肽或多肽蛋白酶/肽或多肽、至少約 J31415.doc 少約〇篇（~蛋白酶/肽 •34- 200907128 或夕肽、至少約0.9% (w )蛋白軸/肽或多肽、至少約1 % (w/w)蛋白酶/肽或多肽、 至V約2〇/〇 (w/w)蛋白酶/肽或多 狀、至少約3% (w/w)蛋白碰/ηι a 喊/肽或多肽、至少約4% (w/w) 蛋白/肽或多肽或約5 〇/〇 f / ( /w)蛋白酶/肽或多肽之溶液。 叮在適於蛋白酶活性之 ,θ .又（例如，室溫，約37。〇下培養 /吧δ物，且可以時間間
Uj如，1小時、2小時、3小時等） 抹集樣品。可使用任何合 、方法、啫如SDS-PAGE分析或 -己位體結合就蛋白質降解分 〇 站故土 析樣°口，且可使用結果建立降 解呀程。 在本文中所述之方法中可使 ^ 』使用任何想要之蛋白酶。舉例 而吕，可使用單一蛋白酶、 不冋蛋白酶之任何想要之組合 现，、有蛋白水解活性之任付+ 组舛刍將 製劑、生物提取物或生物 :-焚。不必要知道所使用之蛋白酶之—致性。可單獨 =何想要之組合使用之蛋白酶之合適實例包括絲胺酸 _ ^ 穴冬胺酸蛋白酶、硫醇蛋白 土貝金屬蛋白酶、缓基肽酿（备丨4 沒土狀_ (例如’羧基肽酶A、羧基 Π)性姨蛋白酶、膜凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋： 蛋白酶、白血球酶、胰酶、凝血酶、纖溶酶、組 广蛋白酶⑼如’組織蛋白酶⑺、蛋白酶(例如，蛋白酶 蛋白酶2、蛋白酶3)、嗜熱菌 姆凝礼酶、腸肽 斤蛋白酶（例如，卡斯蛋白酶】、卡斯蛋白酶2、 ^=1、卡斯蛋白酶卜卡斯蛋白酶9、卡斯蛋白酶 :斯蛋白酶13)、約激活蛋白酶、無花果蛋白酶、梭 酶、獼猴桃蛋白酶、鳳梨蛋白酶、分離酶及置類似 131415.doc -35- 200907128 物。具有蛋白水解活性之合適生物提取物、組織勻漿及製 劑包：痰、黏液(例如，_、鼻黏液、支氣管黏液)、 支氣管肺泡灌洗液、肺組織句漿、肺提取物、姨腺提取 物、胃液、唾液、眼淚及其類似物一實施例中，蛋白 酶為眼睛及/或眼淚中可見之蛋白酶。蛋白酶係以適於發 生蛋白水解降解之量使用 舉例而言，如本文中所述，可
使用約〇·(Η%至約5% (w/w，蛋白酶/肽或多肽）蛋白酶。當 使蛋白酶與包含肽或多肽譜系之呈現系統（例如，嗟菌體 呈現系統）組合時，例如，可使用濃度為約1〇 μ§/ηι1至約3 mg/ml、約 10 μ§/ηι1 '約 2〇 gg/ml、約 3〇 ^/mi、約 4〇 pg/ml、約 50 pg/ml、約 60 pg/ml、約 7〇 yg/m!、約 8〇 gg/ml、約 90 pg/ml、約 100 pg/ml、約 200 pg/mi、約 3〇〇 gg/m 卜約 400 pg/m 卜約 500 pg/nU、約 600 pg/m 卜約 7〇〇 pg/ml、約 800 pg/m卜約 900 pg/ml、約 1〇〇〇 pg/m卜約 j 5 mg/ml、約 2 mg/ml、約 2.5 mg/ml或約 3 mg/ml之蛋白酶。 合適濃度為約 10 pg/ml至 1 mg/nil、1〇 pg/mi 至 1〇〇、9〇、 80、70、60、50 或 40 pg/ml，或 1 〇、20、30、40 或 50 pg/ml至 1〇〇、90、80、70、60 pg/ml。 在適於蛋白酶活性之溫度下，將蛋白酶與肽或多肽之集 合（庫或譜系）一起培養。舉例而言，可在約2(TC至約 40°C (例如，室溫、約20°C、約21°C、約22°C、約23T：、約 24°C、約 25°C、約 26°C、約 27°C、約 28°C、約 29°C、約 30°C、約 31°C、約 32°C、約 33°C、約 34°C、約 35°C、約 36。(：、約37T：、約38°C、約39°C、約40°C)之溫度下培養蛋 131415.doc • 36 - 200907128 白酶及肽或多肽之集合。將蛋白酶及肽或多肽之集合一起 培養-段足以發生蛋白水解降解之時間。舉例^言，可將 肽或夕肽之集口與蛋白酶一起培養約3〇分鐘至約％或約“ 小時。在-些實例’將肽或多肽之集合與蛋白酶一起培養 隔夜，或培養至少約30分鐘、約i小時、約15小時、約2 小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約了小 時、約M、日夺、約9小時、約1〇小時、約u 約1 7 約22> 時、㈣小時、約14小時、約15小時、約16小時 時 '約18小時、約19小時、約2〇小時、約21小時 時、約23小時、約24小時、約48小時或更長。 通常希望，至少在早期各輪選擇中（例如，當使用呈 糸統時），與不包括與蛋白 σ養之選擇相比’蛋 料得所騎之具有想要之生物活性之純系數目減少至 -個數量級。在特定實例中，方法中所使用之 件足以使所时到之㈣數目減少至少約1個對數（: :、至少約2個對數⑽倍)、至少約3個 if 4二對數〇_倍)。產生想要之回收純系減少之 適蛋白酶量及培養條件可使用 供之指導容易地確定。 方法及/或本文中所彳 ^使蛋_與肽或多肽之集合組合且使用任何合 歹1如’活體外、活體内或離體 " 白峰與肽或多肽之集合紐合於人適1。=例“，可们 活性之溫度下保持固定':動。適:；中且在適於蛋白8 徭動震盪、渦旋或其 -要時’可使蛋白酶與肽或多肽之集合組合於活體； I314l5.d〇c -37- 200907128 或離體系統中’諸如藉由將多肽之集合 現庫或譜系)引入合適動物⑼如，小鼠)中，：二嗟菌體呈 白；活性起作用之時間過後，回收肽或多肽之隼：以= 注器官或組織，且在足以使蛋白酶活性起== 後，回收多肽之集合。 邛用之％間過 培養後，可基於諸如 ^ ^ 、，σ σ，舌性之想要之生物活性選擇蛋
白酶抗性肽或多肽。必要時， 予τ在選擇之前添加蛋白酶抑 ϋ使用大體上不會干擾選擇方法之任何合適蛋白酶 抑制劑（或兩種或兩種以上蛋白酶抑制劑之組合人適蛋 白酶抑制劑之實例包括心·抗姨蛋白酶、α2•巨球蛋白、阿 嗎他定（amastatin)、抗痛素（amipain)、抗凝血酶出、抑肽 酶、4-(2-胺基乙基）苯磺醯氟鹽酸鹽（aebsf)、〇_脒基_ 苯基）-甲烷-磺醯氟（APMSF)、貝他定（bestatin)、苯甲脒、 抑凝乳蛋白酶素、3,4-二氯異香豆素、氟磷酸二異丙酯 (DIFP)、E-64、乙二胺四乙酸（EDTA)、彈性蛋白酶抑制劑 (elastatinal)、亮肽素、N-乙基馬來醯亞胺、苯基，基磺醯 氟（PMSF)、胃酶抑素、ι，ι〇_ 菲羅啉（Phenanthr〇Hne)、膦 醯二肽（phosphoramidon)、絲胺酸蛋白酶抑制劑、N_甲苯 磺醯基-L-離胺酸-氣甲基酮（TLCK)、Na-甲苯磺醯基_Phe_ 氣甲基酮（TPCK)及其類似物。另外，可購得許多含有數類 蛋白酶抑制劑之製劑（例如，Roche Complete Protease
Inhibitor Cocktail Tablets™ (Roche Diagnostics Corporation; Indianapolis，IN, USA)，其抑制胰凝乳蛋白酶、嗜熱菌蛋 I31415.doc -38- 200907128 白酶、木瓜蛋白酶、鏈黴蛋白酶、胰腺提取物及胰蛋白 酶）。 可使用想要之生物活性選擇方法選擇蛋白酶抗性肽或多 肽，該方法使得具有想要之生物活性之肽及多肽不同於不 具有想要之生物活性之肽及多肽且對其加以選擇。已經被 蛋白酶分解或裂解之肽或多肽通常喪失其生物活性，而蛋 白酶抗性肽或多肽仍具功能性。因此，可使用生物活性之 合適檢定選擇蛋白酶抗性肽或多肽。舉例而言，可使用合 適結合檢定（例如，ELISA，淘選）評定常見結合功能（例 如，結合一般配位體、結合特異性配位體或結合受質）。 舉例而言，可藉由淘選或使用合適親和力基質選擇、分離 及/或回收結合靶配位體或諸如蛋白質A、 配位體或抗體之多狀。可藉由向合適容器(例二 皮氏培養皿（petri dish))中添加配位體（例如，一般配位 體、革巴配位體）之溶液且使配位體變得沈積或塗佈於容器 壁之上來實現淘選。可洗除過量配位體且可向容器中添加 多肽’ Μ體呈現庫）且將容器維持在適於多狀結合 固定配位體之條件下。可洗除未結合多肽且可使用諸如到 削或（例如）降低ρΗ值之任何合適方法回收結合多肽。 當使用嗔®體呈現系統時，可㈣菌體eusa中測試結 合。可根據任何合適程序執行嗟菌體eusa。在一實例 中丄可由ELISA就與所選擇之乾配位體或—般配位體之結 5師選各輪選擇下所產生之 < 結# 、评Γ尸；r座生之巫痛體群體以鑑別呈現蛋白酶 抗性肽或多肽之嗟菌體。必要時，可由例如eusa使用例 131415.doc •39- 200907128 如針對c-末端或^末端標籤之試劑就與靶配位體或一般配 位體之結合測試可溶性肽及多肽（例如參見，winter等人， (1994) J眺/卿M㈣/^以12, 433-55及其中所引用之參 考文獻）。亦可由PCR產物之凝膠電泳（Marks等人，1991， 同上；Nissim等人，1994,同上）、探測（Pr〇bing)(T〇mlins〇n 等人，1992, 乂 Mo/·价〇/· 227, 776)或藉由對載體DNA測序 評定所選擇之噬菌體之多樣性。 亦可例如基於可使用催化活性檢定（例如，蛋白水解活 性檢定、磷酸轉移酶檢定、磷酸水解酶檢定、聚合酶活性 檢定）量測之催化活性選擇蛋白酶抗性肽及多肽。 蛋白酶抗性肽或多肽（例如，單一抗體可變區域）可對一 般配位體或任何想要之靶配位體具有結合特異性，該一般 配位體或革巴配位體諸如人類或動物蛋白質，包括細胞激 素、生長因子、細胞激素受體、生長因子受體、酶（例 如’蛋白酶）、酶之輔因子、DNA結合蛋白、脂質及碳水 化合物。合適靶抗原（包括細胞激素、生長因子、細胞激 素焚體、生長因子受體及其他蛋白質）包括（但不限 於）ApoE、Apo-SAA、BDNF、心營養素_i、CEA、CD40、 CD40 配位體、CD56、CD38、CD138、EGF、EGF 受體、 ENA-78、嗜酸性粒細胞趨化因子、嗜酸性粒細胞趨化因 子-2、次級淋巴組織趨化因子_2、FAPa、FGF-酸性、FGF-鹼性、纖維母細胞生長因子-1 0、FLT3配位體、弗拉塔訊 (CX3C)、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-βΙ、人類血清白 蛋白、胰島素、IFN-γ、IGF-I、IGF-II、IL-la、IL-Ιβ、 1314i5.doc -40- 200907128 IL-1受體、IL-1 受體 1型、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、 IL-7、IL-8(72a.a.)、IL-8(77a.a.)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18 (IGIF)、 抑制素a、抑制素β、IP-10、角化細胞生長因子-2 (KGF-2)、KGF、瘦體素、LIF、淋巴細胞趨化因子、穆勒氏抑 制物質、單核細胞集落抑制因子、單核細胞吸附蛋白、M-CSF ' c-fms ' v-fmsMDC (67 a.a.) ' MDC (69 a.a.) ' MCP-1 (MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC (67 a.a.)、MDC (69 a.a.)、MIG、MIP-la、MIP-Ιβ、MIP-3ct、ΜΙΡ-3β、 MIP-4、骨髓祖細胞抑制劑因子-1 (MPIF-1)、NAP-2、神 經營養因子、神經生長因子、β-NGF、NT-3、NT-4、制瘤 素 Μ、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、 RANTES、SDFla、SDFip、SCF、SCGF、幹細胞因子 (SCF)、TARC、TGF-a、TGF-β、TGF-02、TGF-03、腫瘤 壞死因子（TNF)、TNF-a、TNF-β、TNF 受體 I、TNF 受體 II、TNIL-1、ΤΡΟ、VEGF、VEGF A、VBGF B、VEGF C、VEGF D、VEGF 受體 1、VEGF 受體 2、VEGF 受體 3、 GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β、GRO-γ、HCC1、1-309、 HER 1、HER 2、HER 3、HER 4、灰清白蛋白、vWF、殿 粉樣蛋白（例如’澱粉樣a)、MMP12、PDKl、IgE及其他 本文中所揭示之靶。應瞭解，該清單無論如何不為詳盡 的。 在一些實施例中’蛋白酶抗性肽或多肽結合肺組織中之 乾，諸如選自由以下各物組成之群之托：TNFR1、IL-1、 131415.doc -41 - 200907128 IL-1R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-8R、 IL-9、IL-9R、IL-10、IL-12、IL-12R、IL-13、IL-13Ral、 IL-13Ra2、IL-15、IL-15R、IL-16、IL-17R、IL-17、IL-18、IL-18R、IL-23IL-23R、IL-25、CD2、CD4、CDlla、 CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、CD40L、 CD56、CD138、ALK5、EGFR、FcERl、TGFb、CCL2、 CCL18、CEA、CR8、CTGF、CXCL12 (SDF-1)、凝乳酶、 FGF、弗林蛋白酶、内皮素-1、嗜酸性粒細胞趨化因子（例 如，嗜酸性粒細胞趨化因子、嗜酸性粒細胞趨化因子-2、 嗜酸性粒細胞趨化因子-3)、GM-CSF、ICAM-1、ICOS、 IgE、IFNa、1-309、整合素、L-選擇素、MIF、MIP4、 MDC、MCP-1、MMP、嗜中性彈性蛋白酶、骨橋蛋白、 OX-40、PARC、PD-1、RANTES、SCF、SDF-1、siglec 8、TARC、TGFb、凝血酶、Tim-1、TNF、TRANCE、類 胰蛋白酶、VEGF 、 VLA-4 、 VCAM 、 α4β7 、 CCR2 、 CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8、ανβ6、ανβ8、 cMET、CD8、vWF、澱粉樣蛋白（例如，澱粉樣c〇、 MMP12、PDK1 及 IgE。 當在本文中所述之方法中使用呈現系統（例如，使核酸 之編碼功能與由核酸編碼之肽或多肽之功能特徵相關聯的 呈現系統）時，擴增或增加編碼所選擇之肽或多肽之核酸 的複本數通常有利。此提供獲得足夠數量之供使用本文中 所述之方法或其他合適方法之其他輪選擇用或供製備其他 譜系（例如，親和力成熟譜系）用之核酸及/或肽或多肽的有 131415.doc -42- 200907128 效方式。因此’在一些實施例中，本發 呈現系統(例如’使核酸之編碼功能與：包含使用 多肽之功能特徵相關聯之呈現 —扁碼之肽或 且進一步包含擴增戋辦加 、諸如嗑菌體呈現）， 複本數。核酸可使用任何合或夕狀之核酸的 增、細胞生長或聚合酶鍵反應擴增。 士巫囷體擴 r 本文中所述之方法可用作必要時可 =之分離蛋白酶抗性肽或多肽之程序二他=方 中’可在程序之任何想要之點採用本文中所述 如使用其他選擇方法之前或之後。 =且, 擇。 、楗供兩輪或兩輪以上選 2 =例中，本發明為選擇抗彈性蛋白酶降解之狀 該方法包含提供肽或多狀庫或譜系，在適於彈 X酶白(或包含彈性蛋白酶之生物製劑、提取物或組織 句水)蛋白水解分解之條件下使庫或譜系與彈性蛋白酶组 合’及選擇、分離及/或回收抗彈性蛋白酶降解且具有想 要之生物活性（例如，結合活性）之肽或多肽。 特疋實％例中，本發明為選擇抗彈性蛋白酶降解且結 合諸如肺組織中之靶之靶配位冑的免疫球蛋白單一可變 域（dAb)的方法。在該等實施例中，提供包含dAb之庫或譜 2且在適於彈性蛋白酶（或包含彈性蛋白酶之生物製劑、 提取物或組織勻漿）蛋白水解分解之條件下使其與彈性蛋 白酶組合。選擇結合靶配位體之彈性蛋白酶抗性dAb。舉 131415.doc -43- 200907128 例而言，彈性蛋白酶抗性dAb當在3rc下在〇〇4% (w/w)彈 蛋酶'奋液令培養至少約2小時之時間時大體上不降 解車乂佳地’彈性蛋白酶抗性dAb當在37t：下在0.04% (w/w)彈(4蛋白酶溶液中培養至少約u小時之時間時大體 上不降解。更佳地’彈性蛋白酶抗性dAb當在37。(：下在 0.04% (w/w)彈性蛋白酶溶液十培養至少約24小時、至少 約36小時或至少約48小時之時間時大體上不降解。 在例不性實施例中，本發明為選擇抗彈性蛋白酶降解 且、、° 口諸如肺組織中之把之乾配位體的免疫球蛋白單-可 ，區或(dAb)的方法。該方法包含提供包含多肽譜系之噬 菌體呈現系統，該等多肽包括免疫球蛋白單一可變區域， 使噬菌體呈現系統與彈性蛋白酶(約1〇〇 gg/ml)組合且將混 合物在約抓下培#(例如）隔夜（例如約12_16小時），及隨 後基於與靶抗原之結合選擇呈現結合想要之靶抗原的_ 的噬菌體。 實例中本發明為選擇抗白血球酶降解之肽或多肽 之方：’該方法包含提供肽或多肽之庫或譜系，在適於白 血球酶(或包含白血球酶之生物製劑、提取物或組織勾漿） 蛋白尺解刀解之條件下使庫或譜系與白血球酶組合，及選 擇/刀離及/或回收抗白血球酶降解且具有想要之生物活 性（例如，結合活性）之肽或多肽。 在特定實施例中，本發明為選擇抗白血球酶降解且結合 諸如肺組織中之之革巴配位體的免疫球蛋白單一可變區域 (dAb)的方法。在該等實施例中，提供包含之庫或譜系 131415.doc -44· 200907128 且在適於白血球酶（或包含白血球酶之生物製劑、提取物 或組織勻漿）蛋白水解分解之條件下使其與白血球酶組 合。選擇結合靶配位體之白血球酶抗性dAb。舉例而言， 白血球酶抗性dAb當在37。〇下在0.04% (w/w)白血球酶溶液 中培養至少約2小時之時間時大體上不降解。較佳地，白 血球酶抗It dAb虽在37 C下在0.04% (w/w)白jk球酶溶液中 培養至少約U小時之時間時大體上不降解。更佳地，白血 球酶抗性dAb當在3rc下在0.04% (w/w)白血球酶溶液中培 養至少約24小時、至少約36小時或至少約48小時之時間時 大體上不降解。 在一例示性實施例中，本發明為選擇抗白企球酶降解且 結合諸如肺組織中之靶之靶配位體的免疫球蛋白單一可變 區域（dAb)的方法。該方法包含提供包含多肽譜系之噬菌 體呈現系統，該等多肽包括免疫球蛋白單一可變區域，使 噬菌體呈現系統與白血球酶（約丨〇 〇 μ g / m丨）組合且將混合物 在約37°C下培養（例如）隔夜（例如約12_16小時），及隨後基 於與靶抗原之結合選擇呈現結合想要之靶抗原的dAb的噬 菌體。 在另一實例中，本發明為選擇抗胰蛋白酶降解之肽或多 肽之方法，該方法包含提供肽或多肽之庫或譜系，在適於 胰蛋白酶（或包含胰蛋白酶之生物製劑、提取物或組織勻 漿）蛋白水解分解之條件下使庫或譜系與胰蛋白酶組合， 及選擇、分離及/或回收抗胰蛋白酶降解且具有想要之生 物活性之肽或多肽。 131415. doc -45- 200907128 在特定實施例中，本發明為選擇抗胰蛋白酶降解且結合 諸如肺組織中之靶之靶配位體的免疫球蛋白單一可變區域 (dAb)的方法。在該等實施例中，提供包含dAbi庫或說 且在適於胰蛋白酶（或包含胰蛋白酶之生物製劑、提取物 或組織勻漿）蛋白水解分解之條件下使其與胰蛋白酶組 合。選擇結合靶配位體之胰蛋白酶抗性dAb。舉例而言 胰蛋白酶抗性dAb當在37°C下在0.04% (w/w)胰蛋白酶溶
中培養至少約2小時之時間時大體上不降解。較佳地，胰 蛋白酶抗性dAb當在37。(：下在〇 .04% (w/w)胰蛋白酶溶液中 培養至少約3小時之時間時大體上不降解。更佳地，胰蛋 白酶抗性dAb當在37t;下在〇.〇4% (w/w)胰蛋白酶溶液中培 養至少約4小時、至少約5小時、至少約6小時、至少約7小 時、至少約8小時、至少約9小時、至少約1〇小時、至少約 11小時或至少約12小時之時間時大體上不降解。 在-例示性實施例中’本發明為選擇抗騰蛋白酶降解且 結合諸如肺組織中U之減位體的免疫球蛋白單一可變 區鄉)的方法。該方法包含提供包含多肽譜系之嗤菌 體主現糸統’該等多肽包括免疫球蛋白單一可變區域，使 嗟菌體呈現系統與胰蛋白酶(〜峰合且將混合物在 約37C下培養(例如)隔夜(例如㈣，小時)，及隨後基於 與乾抗原之結合選擇呈現結合想要之起抗原之⑽的嗟菌 體。 〜樣中’本發明為產生蛋白酶抗性肽或多肽譜系 之方法。該方法包含提供肽或多肽譜系；在適於蛋白酶活 131415.doc -46- 200907128 之條件下使肽或多肽譜系與蛋白酶組合；及回收複數種 二，心要之生物活性之肽或多肽；藉此產生蛋白酶抗性肽 5肽'曰系較佳基於結合活性、諸如與一般配位體或靶 配位體之結合回收複數種具有想要之生物活性之肽或多 月太適用於方法中之蛋白酶、呈現系統、蛋白酶活性之條 及選擇肽或多肽之方法係在本文中相對於本發明之其他 方法描述。 在些實施例中，使用包含肽或多肽譜系之呈現系統 (例如吏核酸之編碼功能與由核酸編碼之肽或多肽之功 能特徵相關聯的呈現系統），且該方法進-步包含擴增或 增加編碼複數種所選擇之肽或多肽之核酸的複本數。核酸 y吏用任何合適方法、諸如藉由噬菌體擴增、細胞生長或 聚合酶鏈反應加以擴增。 在特定實她例中’本發明為產生包含dAb之蛋白酶抗性 多肽之譜系的方法。1亥方法包含提供包含dAb之多肽譜 系在適於蛋白酶（例如，騰蛋白酶、彈性蛋白酶、& & 球酶)活性之條件下使肽或多肽譜系與蛋白酶組合；及回 收複數種包含對一般配位體(例如，蛋白質A、蛋白質〇、 蛋白質L)或靶配位體具有結合特異性之⑽之多肽。該方 法可用於產生未經處理之譜系或偏向於想要之結合特異性 U肖如基於對想要之託配位體具有結合特異性之親 本dAb的親和力成熟譜系。 多肽呈現系統 提供用於本發明之方法中之肽或多肽之譜系或庫較佳包 131415.doc •47- 200907128 3合適呈現系、统。呈現系統較佳抗蛋白酶（例如’單—蛋 白酶或蛋白酶之組合及具有蛋白水解活性之任何生物提取 物：組織勾漿或製劑(例如，痰、黏液(例如，胃黏液、鼻 4液支氣官黏液）、支氣管肺泡灌洗液、肺組織勻漿、 肺提取物、胰腺提取物、胃⑨、唾液、眼淚及其類似物）） 降解。呈現系統及呈現系統與所呈現多狀之間的關聯較佳 1至少與譜系之大多數穩定肽或多肽—樣抗蛋白酶。此使 付、扁碼所選擇之呈現多狀之核酸易於分離及/或擴增。 在實例中，可自溶液中或共價或非共價連接於合適表 :(諸如塑膠或玻璃（例如，微量滴^板、多肽陣列，諸如 微陣列））之肽或多肽譜系選擇、分離及/或回收蛋白酶抗性 肽或多肽。舉例而言，可使用以將各不同庫成員（例如， 獨特肽序列)置放在陣列離散預定位置上之方式位於表面 上之肽，列。可由其在陣列中之空間位置讀定該陣列中之 員之—致性。可確定陣列中發生（例如）乾配位體斑 =庫成員之間的結合相互作用之位置，從而基： 〇成貝之序列。（例如參見，美國專利第 ，43,854唬、w〇 90/15070及 WO 92/10092。） 方法較佳採用使㈣之編碼功能與由核酸編碼之 物理、化學及/或功能特徵相關聯之呈現系統 統可包含葙軏级 〜王兄糸 菌） 可複製基因‘组，諸如嗟菌體或細胞（細 呈現為Λ系：較佳包含庫，諸如嗟菌體呈現庫。嗟菌體 、較佳之呈現系統。 已私述許多合適噬菌體呈現系統（例如，單價呈現及多 1314J5.doc •48- 200907128 價呈現系統）。（例如參見，Griffiths等人，美國專利第 6,555,3 13 B1號（以引用之方式併入本文中johnson等 人，美國專利第5,733,743號（以引用之方式併入本文中 McCafferty等人，美國專利第5,969，1〇8號（以引用之方式併 入本文中）；Mulligan-Kehoe，美國專利第5,702,892號（以 引用之方式併入本文中）；Winter，G.等人，d⑽w•心v.
/麵⑽扑 12:433-455 (1994) ; Soumillion，P.等人，却〆 Biochem. Biotechnol 47(2-3): 175-189 (1994) ； Castagnoli, L.專尺，Comb. Chem. High Throughput Screen, 4(2),. \2\- 133 (2001)。）呈現於噬菌體呈現系統中之肽或多肽可呈現 於任何合適噬菌體上，諸如絲狀噬菌體（例如，&、M 1 3、 F1)、裂解性噬菌體（例如，T4、T7、λ)或RNA噬菌體（例 如，MS2)。 通常產生或提供以與合適噬菌體外殼蛋白（例 蛋白）形成之融合蛋白形式呈現肽或噬菌體多肽譜系之噬 菌體庫。融合蛋白可在嗟菌體外殼蛋白之尖端或必要時在 内部位置呈現肽或多肽。舉例而t，所呈現之肽或多肽可 存在於pm之區域i之胺基未端位置。（ρΙΠ之區域i亦稱為 w。）所呈現之多料與师直接融合（例如，pm之區域j 之N-末端)或使用連接子與pm融合，時，齡物可進 -步包含標籤（例如，myc抗原決定基、叫標籤可使用 任何合適方法產生包含以與嗟菌體外殼蛋白形成之融合蛋 白形式呈現之肽或多肽譜系之庫，該等方法諸如藉由將編 碼所呈現之肽或多肽之噬菌體載體或噬質體載 1314l5.doc -49- 200907128 體庫引入合適宿主細菌+’且培養所得細菌以產生嗟菌體 (例如，必要時使用合適輔助嗤菌體或互補質體)。可使： 諸如沈澱及離心之任何合適方法自培養物中回收嗟菌體 庫。 呈現糸統可包含含有任何相、要夕吾#少4l IJ心罟之Ϊ之多樣性的肽或多肽 譜系。舉例而言’譜系可含有胺基酸序列對應於由生物 體、生物體群、想要之組織或想要之細胞類型表現之天然 存在之多肽的肽或多肽或可含有具有隨機或隨機化之胺基 酸序列之肽或多肽。必要時，多肽可共享共同核心或^ 架。舉例而言，譜系或庫中之所有多肽可基於選自蛋白質 A、蛋白質L、蛋白質G、纖維連接蛋白區域、抗運載蛋白 (anticalin)、CTLA4、想要之酶（例如，聚合酶、纖維素酶） 或免疫球蛋白超家族之多肽（諸如抗體或抗體片段（例如， 抗體可變區域））之骨架。該譜系或該庫中之多肽可包含具 有隨機或隨機化之胺基酸序列之規定區及常見胺基酸序列 區。在某些實施例中，譜系中之所有或大體上所有多肽具 有想要之類型，諸如想要之酶（例如，聚合酶）或想要之抗 體之抗原結合片段（例如’人類vH或人類vL)。在較佳實施 例中’夕肽呈現系統包含多肽譜系，其中各多肽包含抗體 可變區域。舉例而言，譜系中之各多肽可含有、vL或 Fv(例如，單鏈Fv)。 可使用任何合適方法將胺基酸序列多樣性引入肽或多肽 或骨架之任何想要之區中。舉例而言，可藉由使用任何合 適突變誘發方法（例如，低保真度PCR、寡核苷酸介導之突 131415.doc • 50- 200907128 變誘發或定位突變誘發，使用ΝΝκ密碼子多樣化）或任何 其他合適方法製備編碼多樣性多肽之核酸庫將胺基酸序列 多樣性引入靶區、諸如抗體可變區域或疏水性區域之互補 判定區中。必要時，可隨機化待要使多樣化之多肽之區。 構成譜系之多肽之尺寸基本上為一個所要選擇之問題， 且不需要均一的多肽尺寸。譜系中之多肽較佳具有至少三 級結構（形成至少一個區域）。 選擇/分離/回收 可使用任何合適方法自譜系或庫（例如，於呈現系統中） 選擇、分離及/或回收蛋白酶抗性肽或多肽（例如，蛋白酶 抗性多肽群體）。較佳基於可選擇之特徵（例如，物理特 徵、化學特性、功能特徵）選擇或分離蛋白酶抗性多肽。 合適之可選擇之功能特徵包括譜系中之肽或多肽之生物活 )·生例如與一般配位體（例如，超抗原）之結合、與把配位 體（例如，抗原、抗原決定基、受質）之結合、與抗體之結 合（例如，經由肽或多肽上所表現之抗原決定基），及催化 活1'生（例如參見，Tomlinson等人，w〇 99/20749、W〇 01/57065、WO 99/58655。） 在一些實施例中，自大體上所有蛋白酶抗性肽或多肽共 享⑦見之可選擇之特徵的肽或多肽庫或譜系選擇及/或分 離蛋白酶抗性肽或多肽。舉例而言，蛋白酶抗性肽或多肽 可選自大體上所有蛋白酶抗性肽或多肽結合常見一般配位 體、結合常見靶配位體、結合常見抗體（或由常見抗體結 合）或具有常見催化活性之庫或譜系。該類型之選擇尤其 131415.doc -51 - 200907128 適用於製備基於具有想要之生物活性的親本狀或多狀 =抗性肽或多肽譜系’例如當執行免疫球蛋白單-可變 區域之親和力成熟化作用時。 基於與常見-般配位體之結合選擇可產生含有所有或大 體上所有為原始庫或譜系之組分的蛋白酶抗性狀或 肽或多狀集合或群體。舉例而言，可藉由淘選或使用合適 '、晰力基貝選擇、分離及’或回收結合靶配位體或諸如蛋 白質A、蛋白質l之—般配位體或抗體之肽或多肽 由向合適容器（例如，試管、皮氏培養皿）中添加配位體（; 如’—般配位體、靶仿駚、— 靶配位體）之洛液且使配位體變得沈積 或塗佈於容器壁上來實現淘選。可洗除過量配位體且可向 谷益中添加肽或多肽（例如，已與蛋白酶一起培養 且將容器維持在適於肽或多肽結合以配位體之條件P 可洗除未結合肽或多肽且可使用諸如刮
值之任何合適方法回收結合肽或多肽。 ）降低PH 合適配位體親和力基質通常含有配位體共價或非並價連 接之固體支撑物或珠粒（例如，€脂糖）。可使用分批法、 官柱法或任何其他合適方法在適於使肽或多肽與基質 配位體結合的條件下使親和力基質與肽或多肽（例如，已 與蛋白酶一起培養之譜系）組合。可洗除未結合親和力基 負=肽或夕肽，且可使用任何合適方法溶離及回收結合肽 或夕肽該合適方法諸如用較低pH值之緩衝液、用溫和變 性训（例如，尿素）或用競爭以與配位體結合之肽進行溶 離在f例中，在適於請系中之狀或多狀結合革巴配位體 131415.doc -52- 200907128 條件下使生物素標記靶配位體與譜系組合。使用固定抗 生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素（例如，在珠粒上）回收結合 肽或多肽。 σ σ
在些實施例中，一般或靶配位體為抗體或其抗原結合 ^奴。結合在庫或譜系之肽或多肽中大體上為保守的肽或 多肽之結構特徵之抗體或抗原結合片段尤其適合作為—般 -位體適合用作分離、選擇及/或回收蛋白酶抗性肽或 多肽之配位體之抗體及抗原結合片段可為單株或多株，且 可使用任何合適方法製備。 庫/譜系 在其他態樣中，本發明係關於蛋白酶抗性肽及多肽譜 系，編碼蛋白酶抗性肽及多肽之庫及產生該等庫及譜系之 方法。 μ 可使用任何合適方法製備或獲得編碼及/或含有蛋白酶 抗性狀及多狀之庫。本發明之庫可基於所關注之肽或多狀 (例如’選自庫之肽或多肽)經設計以編碼蛋白酶抗性肽或 多肽，或可使用本文中所述之方法選自另—庫。舉例而 言’可使用合適之多肽呈現系統製備富集蛋白酶抗性多肽 之庫。 在-實例中，如本文中所述，在適於蛋白酶活性條件下 使包含呈現多肽（包含免疫球蛋白單—可變區域（例如， νΗ、νκ、νλ))之譜系的噬菌體里現庫與蛋白酶組合。基於 結合一般配位 從而產生富集 想要之生物活性，諸如結合活性（例如 體、結合靶配位體）回收蛋白酶抗性多肽 131415.doc •53- 200907128 蛋白酶抗性多肽之噬菌體呈現庫。 在另一實例中，昔生e η… 百先師選包含呈現多肽(包含免疫球蛋 白单一可變區域（例如 , κ νλ))之譜系的噬菌體呈 現庫以L別s普系中對相 要之靶杬原具有結合特異性之成 員。回收具有想要之处a蛀s w々夕 您、，°合特異性之多肽集合，且如本文中 所述，在適於蛋白八4 刀解活性之條件下使集合與蛋白酶組 合。时具有想要之乾結合特異性之蛋白酶抗性多狀集 Γ 合’從而產生富集蛋白酶抗性高親和力多肽之庫。如本文 中所述，該選擇方法Φ夕i t 评乃忐中之蛋白酶抗性與高親和力結合相 關。 可使用任何合適方法容易地產生編碼想要類型之多狀譜 系之庫。舉例而言’可獲得編碼想要類型之多肽（例如， 聚合酶、免疫球蛋白可變區域）之核酸序列，且可（例如）藉 由使用易於出錯之聚合酶鏈反應(pCR)系統擴增核酸、藉 由化學突變誘發（Deng等人，j出〇/ Ο㈣，269:9533 (1994))或使用細菌突變菌株（Low等人，乂 识〇/.， 260:3 59 (1996))製備各含有—或多個突變之核酸集合。 在其他實施例中，可靶向核酸之特定區以供多樣化。使 所選位置產生突變之方法亦為此項技術所熟知且包括（例 如）在使用或不使用PCR之情況下使用錯配寡核苷酸或簡併 募核苷酸。舉例而言，已藉由使突變靶向抗原結合環建立 合成抗體庫。已將隨機或半隨機抗體Η3及L3區附加至生 殖系免疫球蛋白V基因片段以產生具有未突變構架區之大 庫（Hoogenboom及 Winter (1992)同上；Nissim 等人，（1994) 131415.doc •54· 200907128 同上；Griffiths等人，（1994)同上；DeKruif等人，（1995) 同上）。已擴展該多樣化以包括部分或所有其他抗原結合 ^•(Crameri等人，（1996) TVa/Mre Met/·，2:100 ; Riechmann 等 k，[\995、Bio/Technology, 13:475 ; Morphosys, WO 97/08320，同上）。在其他實施例中，可例如由採用第一 PCR產物作為”大引子（mega-primer)”之兩步PCR策略輕向 核酸之特定區以供多樣化。（例如參見，Landt，0,等人， Gwe PA 125-128 (1990))。亦可（例如）由 SOE PCR實現靶向 多樣化。（例如參見，Horton, R.M,等人，77:61-68 (1989)) 〇 所選擇位置處之序列多樣性可藉由改變指定多肽序列之 編碼序列以便可在該位置併入許多可能的胺基酸（例如， 所有20種或其子集）來實現。使用IupAC命名法，最通用密 碼子為NNK ’其可編碼所有胺基酸以及tag終止密碼子。 車乂佳係使用NNK密碼子以引入所需之多樣性。可實現相同 終端之其他密碼子亦可使用，包括NNN密碼子，其導致產 生其他終止密碼子TGA及TAA。該把向方法可使完全序列 空間處於待探索之靶區域内。 較佳的庫包含作為免疫球蛋白超家族之成員（例如，抗 體或其部分）之蛋白酶抗性多肽。舉例而言，庫可包含具 有已知主鏈構形之蛋白酶抗性抗體多肽。（例如參見， Tomlinson等人，w〇 "/π?49。）庫可在合適質體或載體 中製備。如本文中所使用，載體係指用於將異源dna引入 細胞中以用於其表現及/或複製之不連續序列元件。可使 131415.doc -55- 200907128 用任何合適载體’包括質體(例如 菌體載體、人、& % 、卤只體）、病毒或噬 囷菔戰體、人造染色體及游離 行簡單的凓猪s办 體破專載體可用以進 叮間早的選殖及突變誘發， 疋 表if作用# ^ <者表現載體可用以驅動庫的 表現作用。载體及質體通常含 早的 如，多接萠）、f制 或夕個選殖位點（例 戈夕接頭）、複製起點及至 表現載體可進一步含有骚動m k擇標記物基因。 諸如w杜 肽轉錄及轉譯之序列元件， 堵如&強子兀件、啟動子、轉錄終 類似物。今莖-从 J 4號序列及其 s貝似物忒4兀件可以可操作性 溪碚扞人私 式連接於編碼多肽之經 選殖插入物以致當該表現载 *人ώ 維持在適於表現之條件下 (例如，在合適宿主細胞中） 列。 所录現且產生多肽的方式排 選殖及表現載體通常含有 , 付戰體此夠複製於一或多個 所込擇之佰主細胞中之核酸序列。在 二 B ^ ^ mb ^ ^ 込殖載體中，S亥序列 通*為使仔载體能夠獨立於宿主 包括複製起點m㈣ -色體⑽八複製之序列且 a祜複袈起點或自發複製序 對於多種細菌、酵母及病 毋，该專序列為吾人所熟知。 ^ 貞遐pBR322之稷製起點適 於大多數革蘭氏陰性菌（Gram_ gative bacteria) ’ 2微米質 體起點適於酵母，且客铺，生主& , 、 、 且夕種病毒起點(例如，SV40,腺病毒） 適用於在哺乳動物細胞中選裙恭辦 ^ 甲璉殖載體。哺乳動物表現載體通 常不需要複製起點，除非該笨矣 于、非忒寺表現載體用於能夠複製高級 DNA之哺乳動物細胞（諸如c〇s細胞）中。 選殖或表現载體可含有亦稱為可選擇標記物之選擇基 因。該等標記物基因編碼為在選擇性培養基中生長之㈣ 宿主細胞之存活或生長所需的蛋白質。因此，未經含有選 131415.doc -56- 200907128 擇基因之载體轉型之宿主細胞在培養基中將不能存活。典 型選擇基因編碼帶有抗生素及其他毒素（例如，胺节西林 (ampiciUin)、新黴素、甲胺#吟或四環幻抗性、互補營 養缺陷不；I或不可在生長培養基中供_鍵#養物 二 質。 通合適表現载體可含有許多組分，例如複製起點、可選擇 丁己物基因 或多個表現控制元件（諸如轉錄控制元件 (例如’啟動子、強化子、終止子))及/或-或多個轉譯信 號、信號序列或前導序列及其類似物。表現控制元件及信 號或前導序列存在時可由載體或其他來源提供。舉例而 5，可使用編碼抗體鏈之選殖核酸之轉錄及/或轉譯控制 序列引導表現。 可提供啟動子以表現於想要之宿主細胞中。啟動子可為 組成性或誘導性啟動子。舉例而言，啟動子可以可操作性 方式連接於編碼抗體、抗體鏈或其部分之核酸，如此其弓丨 導核酸轉錄。可利用多種合適啟動子，對於原核宿主（例 如對於大腸杯菌（E· coli)為β -内醢胺酶及乳糖啟動子系 統、鹼性磷酸酶、色胺酸（trp)啟動子系統、Uc、⑽、 T3、T7啟動子）及對於真核宿主（例如，辕猴病毒早期戋 晚期啟動子、勞氏肉瘤病毒（R0Us sarcoma virus)長末端重 複序列啟動子、細胞巨大病毒啟動子、腺病毒晚期啟動 子、EG-la啟動子）。 另外，表現载體通常包含選擇運載載體之宿主細胞之可 選擇標記物’且在可複製表現載體之狀況下，包含複製起 131415.doc -57- 200907128 點。編碼帶有抗生素或藥物抗性之產物之基因為常見之可 選擇標記物且可用於原核細胞（例如’ β_内醯胺酶基因（胺 节西林抗性）、Tet基因（四環素抗性））及真核細胞（例如，新 黴素（G418或遺傳黴素）、gpt(麥考酚酸）、胺苄西林或潮黴 素抗性基因）中。二氫葉酸還原酶標記物基因准許在多種 宿主中用甲胺喋呤選擇。編碼宿主之營養缺陷標記物之基 因產物的基因（例如，/^[/2、、///S3)通常用作酵母 中之可選擇標記物。亦涵蓋使用病毒（例如，桿狀病毒）或 嗤菌體載體及能夠整合於宿主細胞基因組中之載體，諸如 反轉錄病毒載體。 適於表現於原核細胞（例如，細菌細胞，諸如大腸桿菌） 或哺乳動物細胞中之表現載體包括（例如）PET載體（例如， pET-1 2a、ρΕΤ-36、ρΕΤ·37、pET-39、pET-40、Novagen及 其他）、噬菌體載體（例如，pCANTAB 5 E，Pharmacia)、 pRIT2T(蛋白質 A 融合載體，Pharmacia)、pCDM8、 pCDNAl.l/amp ' pcDNA3,l ' pRc/RSV ' pEF-1 (Invitrogen, Carlsbad, CA)、pCMV-SCRIPT、pFB、pSG5、pXTl (Stratagene，La Jolla, CA)、pCDEF3 (Goldman, L.A.等人，
Biotechniques, 27:1013-1015 (1996)) > Psvsport (GibcoBRL,
Rockville, MD)、pEF-Bos (Mizushima，S.等人， jcfc/s ees·，18:5322 (1990))及其類似物。可利用適於用於多 種表現宿主中之表現載體，該等宿主諸如原核細胞（大腸 桿菌）、昆蟲細胞（果繩史奈德S2細胞（Drosop/n'/a Schnieder S2 cells)、Sf9)、酵母（嗜甲醇酵母（户· 、馬斯 131415.doc -58- 200907128 德畢赤酵母（户.PimoWs)、釀酒酵母（s. cereWiW.ae))及哺乳 動物細胞（例如，COS細胞）。 較佳載體為使得能夠表現對應於多肽庫成員之核普酸序 列之表現載體。因此’可藉由使表現多肽庫成員之單一純 系獨立繁殖及表現執行用一般及/或乾配位體進行之選 擇。如上所述，較佳選擇呈現系統為噬菌體呈現。因此， 可使用电菌體或嗔質體載體。較佳載體為具有大腸桿菌複 製起點（用於雙鏈複製）以及噬菌體複製起點（用於產生單鏈 DNA)之噬質體載體。該等載體之操作及表現在此項技術 中為熟知的（Hoogenboom 及 Winter (1992)同上；Nissim 等 人（1994)同上）。簡&之，載體可含有賦予嗟質體選擇性 之β-内醯胺酶基因及在表現卡匣上游可含有合適前導序 列、多個選殖位點、一或多個肽標籤、一或多個TAC}終止 密碼子及噬菌體蛋白質ρΙΠ之lac啟動子。因此，使用大腸 桿菌之多種抑制因子及非抑制因子菌株且添加葡萄糖、異 丙基硫基-β-D-半乳糖苷（IPTG)或輔助噬菌體，諸如vcs M13，該載體能夠以質體形式複製而不表現，來產生大量 僅多肽庫成員或產物噬菌體’其中一些在其表面上含有至 少一個多肽-pill融合物複本。 本發明之庫及譜系可含有抗體格式。舉例而言，庫及譜 系中所含之多肽可為全抗體或其片段，諸如Fab、 F(ab’）2、FV4SCFV片段、獨立的、或火區域，其任一係經 修飾或未經修飾。可使用任何合適方法容易地產生心片 段以及其他抗體多肽。此項技術中熟知許多合適抗體工程 I31415.doc •59- 200907128 化方法。舉例而s，scFv可籍由使編碼兩個可變區域之核 酸與編碼適當連接子肽（諸如⑹y_Gly_Gly_Gly_㈣或其 他合適連接子肽）之合適募核㈣相連接㈣成。連接子 橋接第一區C-末端與第二MN_末端。可使用構造諸如 Fv'Fab及F(ab’)2片段之其他抗體格式之類似技術。為編 排格式Fab及F(ab，)2片段，可使^及％多狀與可自重排基 因、生殖系C基因分離或由抗體序列資料合成之怪定區片 段組合。本發明之庫或譜系可為^或火庫或譜系。 包含蛋白酶抗性可變區域之多肽較佳包含乾配位體結合 位點及/或一般配位體結合位點。在某些實施例中，一般 配位體結合位點為諸如$白質A、$白質[或蛋白質G之超 抗原之結合位點。可變區域可基於任何想要之可變區域， 例如人類vH(例如，Vh la、Vh lb、％ 2、％ 3、％ 〇 VH 5、VH 6)、人類 ％(例如，V)J、νλη、νλΐπ、、 νλν、νλνΐ 或 νκ υ 或人類 νκ(例如，、 VK5、VK6、VK7、VK8、VK9或 VK10)。 產生蛋白酶抗性多肽之核酸、宿主細胞及方法 本發明亦係關於編碼（例如）由本文中所述之方法可選擇 或選擇之蛋白酶抗性肽或多肽的經分離及/或重組核酸。 本文中稱為”經分離"之核酸為已其原始環境中（例如，細 胞中或諸如庫之核酸混合物中）之其他物質（例如，其他核 酸，諸如基因組DNA、cDNA及/或RNA)遠遠分離之核酸。 經分離核酸可以載體（例如，質體）之部分形式分離。 本文中稱為”重組”之核酸為已由重組DNA方法產生之核 131415.doc -60- 200907128 酸’該等方法包括依賴於諸如使用（例如）限制酶、同源重 組、病毒及其類似物選殖於載體或染色體中之人工重組之 方法’及使用聚合酶鏈反應（PCR)製得之核酸。 本發明亦係關於重組宿主細胞，其包含（一或多個）包含 編碼蛋白酶抗性肽或多肽、例如由本文中所述之方法可選 擇或選擇之肽或多肽之核酸的重組核酸或表現構築體。本 發明亦包括製造蛋白酶抗性肽或多肽之方法，其包含將本 發明之重組宿主細胞維持在適於表現蛋白酶抗性肽或多肽 之條件下。該方法必要時可進一步包含分離或回收蛋白酶 抗性肽或多肽之步驟。 舉例而s ’可使用任何適合於所選擇之宿主細胞之方法 (例如’轉型、轉染、電穿孔、感染），將編碼蛋白酶抗性 肽或多肽之核酸分子（亦即，一或多個核酸分子）或包含該 (等）核酸分子之表現構築體（亦即，一或多個構築體）引入 5適伯主細胞中以建立重組宿主細胞，如此核酸分子可操 作性連接於一或多個表現控制元件（例如，於載體中、於 由諸多方法在細胞中產生之構築體中、整合於宿主細胞基 因組中）。可將所得重組宿主細胞維持在適於表現（例如， 在誘導物存在下、在合適動物中、在補充有適當鹽、生長 因子、抗生素、營養增補劑等之合適培養基中）之條件 下，藉此產生經編碼之肽或多肽。必要時，可分離或回收 (例如，自動物、宿主細胞、培養基、乳汁中）經編碼之肽 或多肽。該方法涵蓋表現於轉殖基因動物之宿主細胞中 (例如參見 ’ WO 92/03918, GenPharm lnternational)。 1314l5.doc -61 _ 200907128 亦可在合適活體外表現系統中由化學合成或任何其他合 適方法產生由本文中所述之方法選擇之蛋白酶抗性狀或多 肽。 多肽、dAb及拮抗劑 如本文中所描述及例示，本發明之蛋白酶抗性⑽通常 以高親和力結合其革巴配位體。因此，在另一態樣令，提供 ，、分離及/或回收以高親和力結合乾抗原之本發明之 多肽或dAb的方法。該方法通常包含提供狀或多狀（例如， 之庫或譜系’在適於蛋白酶活性之條件下使該庫或該 2系與蛋白酶（例如，姨蛋白酶、彈性蛋白酶、白血球 每、姨5#、瘦）组人，；^、强埋 ' ^擇、/刀離及/或回收結合配位體 (例如，靶配位體）之肽或多肽。因 敏感肽或多肽將會分解之條件 :5〜 蛋白酶 一 解之條件下曝露於蛋白酶中，所以蛋 白酶之活性可消降 ^ 〜、有弱“親和力之不太穩定的多肽， 而產生南親和力結合肽或多肽之集合 發明之容Η去-V、d Λ +例而έ ’本 之親=/1 μΜ或更強或約500 —.5 ΡΜ ’、力D，如由表面電漿共振所測定Κ 結合靶抗原。兴如 KD~K〇^kd)/Kon(ka)) 扣仇原。舉例而言，本發 ηΜ、約100 之多肽或dAb可以約5〇〇 約100 _、約1〇碰、約^ PM、約 1〇 · n 500 PM、約 1〇〇 PM、約1 pM或約〇·5 pM之 (例如，TNFRn。π 規#力結合靶抗原 。雖然吾人不受任何特定理认卩Ρ ϋ 信，抗蛋白酶之Β+ 弋里，限制，但咸 因此，蛋白at t h t 次較向穩定能。 龙白酶抗性與高親和力結合 本文中所述之大、i 1的相關性可能與由 方法所選擇之肽及及多狀及dAb之表面緊密 131415.doc -62- 200907128 性及穩定性相關。 在一實施例中，本發明之多肽、dAb或拮抗劑以約5〇〇 nM至 50 pM、或 1 00 nM至 50 pM、或 10 nM至 1 〇〇 pM、咬 1 nM至1 〇〇 pM ’例如50 nM或以下、或5 nM或以下、或5〇〇 pM或以下、或200 pM或以下、或100 pM或以下之抑制濃 度50 (IC50)抑制抗原配位體（例如，TNF α)與其同源受體 (例如’ TNF α受體I (ρ55受體））之結合。 在某些實施例中’多肽、dAb或拮抗劑以如由表面電聚 ' 共振所測定300 nM至1 pM、或300 nM至5 pM、或50 niy[至 1 pM、或 50 nM至 5 pM、或 50 nM至 20 pM、或約 1〇 pM、 或約15 pM、或約20 pM之解離常數（KD)特異性結合靶抗原 且與人類靶抗原解離。在某些實施例中，多肽、dAb或拮 抗劑以如由表面電漿共振所測定5X10·1 s·1至ixi〇-7 s-i、或 lxl〇-3 s-]至 lxl〇·7 S-1、或 lxl〇-4 3-1至 1χ1〇·7 s.!、或 5 s 1至lxl〇-7 s’丨、或lxl〇-4 s-丨、或lxl0-5 s-丨之〖。"速率常數 (特異性結合靶抗原（例如，TNFR1，例如人類TNFR1)且與 抗原解離。在某些實施例中’多肽、dAb或拮抗劑以 1 X 10 3 Μ、1至 1 X 1〇·7 丨s·1、或 1 X 1〇·3 Μ-V丨至 1 χΙΟ·6 ΜΓV1、 或約ΐχΐο_4 μ·1’、或約1x10-5m-is-i之κ〇η特異性結合靶抗 原（TNFR1，例如人類TNFR1)。在—實施例中，多肽、 dAb或拮抗劑以如該段落中所詳細說明之解離常數（κ〇) 及KQff特異性結合靶抗原（例如，TNFR1，例如人類 TNFR1)且與乾抗原解離。在一實施例中，多肽、dAb或拮 抗劑以如該段落中所詳細說明之解離常數$〇)及Km特異 131415.doc -63· 200907128 性結合靶抗原（例如，TNFRl，例如人類TNFR1)且與起广 原解離。在一些實施例中’多肽或dAb以該段落中所述之 KD及/或〖。”及/或Kon特異性結合乾抗原（例如，TNJ7R 1 (例 如，人類TNFR1))，且包含與圖中所示之免疫球蛋白單_ 可變區域之胺基酸序列至少或至少約80%、85%、9q%、 910/。、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99。/〇 — 致之胺基酸序列。 可將多肽、dAb或拮抗劑表現於大腸桿菌或畢赤酵母物 種（例如，馬斯德畢赤酵母）中。在一實施例中，當表現於 大腸桿菌或畢赤酵母物種（例如，馬斯德畢赤酵母）中時， 分泌至少約〇·5 mg/L之量之配位體或dAb單體。雖然當表 現於大腸桿菌或畢赤酵母物種（例如，馬斯德畢赤酵母） 時，可分泌本文中所述之配位體及dAb單體，但其可使用 任何合適方法產生，諸如合成化學方法或不採用大腸桿菌 或畢赤酵母物種之生物產生方法。 在一些實施例中，多肽、dAb或拮抗劑不包含駱駝類免 疫球蛋白可變區域或一或多個僅為駱駝類生殖系抗體基因 片段所編碼之免疫球蛋白可變區域所特有之構架胺基酸， 例如在位置108、37、44、45及/或47處。 本發明之拮抗劑可為單價或多價。在一些實施例中，拮 抗劑為單價且含有一個與靶抗原相互作用之結合位點，該 。口位點由本發明之多肽或dAb提供。單價拮抗劑結合一 個靶抗原且可能不會誘導可引起受體活化及信號轉導之細 胞表面上之靶抗原（例如，受體抗原）的交聯或叢集。 131415.doc -64 - 200907128 在其他實施例中，拮抗齊 個或兩個以上特定_結合位點複㈣ 以上結合乾抗原之不同結合位點二有兩個或兩個 -個由本發明之多肽或dAb提供二“立:中了 之特定多肽Γ 個或兩個以上結合乾抗原之本發明 複本或兩個或兩個以上結合靶抗原之本
或dAb的二聚體、三聚體或多聚體。在-’多價结抗劑結合細胞表面受體抗原且在標準細 胞才欢疋_大體上不會激動抗原（充當抗原激動劑）。 在某二實施例令’多價拮抗劑含有兩個或兩個以上結合 靶抗原之想要之抗原決定基或區域的結合位點。 在’、他實轭例中，多價拮抗劑含有兩個或兩個以上結合 乾抗原之不同抗原決定基或區域的由本發明之多肽或· 提供的結合位點。 在某些實施例中，當在慢性發炎性疾病模型中投與有效 量之本發明之多肽、dAb或拮抗劑時為有效的。有效量通 常為約1 mg/kg至約10 mg/kg(例如’約i mg/kg、約2 mg/kg ' 約 3 mg/kg、約 4 mg/kg、約 5 mg/kg、約 ό mg/kg、 約 7 mg/kg、約 8 mg/kg、約 9 mg/kg或約 10 mg/kg)。熟習此 項技術者認為慢性發炎性疾病模型（參見WO 2006038027中 所述之模型）可預測在人類中之治療功效。 本發明配位體（例如，拮抗劑）通常將以純形式與藥理學 上適當之載劑一起使用。該等載劑通常包括水性或醇性/ 水性溶液、乳液或懸浮液，任何均包括生理食鹽水及/或 131415.doc 65· 200907128 緩衝介質。非經腸媒劑包括氣化納溶液、林格氏右旋糖 (Ringer’s dextrose)、右旋糖及氣化鈉及乳酸化林格氏液 (lactated Ringer’s)。必要時保持多肽複合物呈懸浮狀之合 適的生理學上可接受之佐劑可選自增稠劑，諸如羧曱基纖 維素、聚乙烯吡咯啶酮、明膠及海藻酸鹽。
靜脈内媒劑包括流體及營養物補充劑及電解質補充劑， 諸如基於林格氏右旋糖之彼等。亦可存在諸如抗菌劑、抗 氧化劑、螯合劑及惰性氣體之防腐劑及其他添加劑（Mack (1982) 圓.邮⑽〜户/^則咖"£^/以隱以，第16版）。可 使用多種合適調配物，包括延緩釋放調配物。 本發明之配位體（例如，拮抗劑）可以單獨投與之組合物 形式使用或與其他藥劑結合使用。該等藥劑可包括多種免 疫療藥物’諸如環孢素、甲胺喋呤、阿黴素或順鉑及免 疫毒素。醫藥組合物可包括多種細胞毒性劑或其他藥劑盥 本發明之配位體或甚至不管在投藥之前是否彙集之具有不 =性的本發明之配位體（諸如使用不同乾抗原或抗原決 疋基所選擇之配位體）之組合結合的”混合物”。 本發明之醫藥組合物之投藥 者通常已知之任―"途了為一般熟習此項技術 治療)而+，丄 f於治療(包括不限於免疫 選摆之° 據標準技術向任何患者投與本發明之所 述擇之配位體。 胺可精由任何適當模式，包括非經腸、靜脈内、肌 心、經皮、、經由肺途徑或亦適當地，藉由用導 …投樂劑量及頻率應視患者之年齡、性別及 131415.doc -66 - 200907128 症、其他藥物之並行投與、禁忌症及臨床醫師要考慮之其 ，參數而定。如所指示，投藥可為局部(例如，藉由肺投 樂方式局部向肺傳遞，例如，鼻内投藥方式）或全身性。 本發月之配位體可經;東乾以便儲存且在使用之前於合適 載劑中復原。已經由習知免疫球蛋白展示該技術有效，且 可採用技術已知之凌乾及復原技術。熟習此項技術者應瞭 解，凌乾及復原可導致不同程度之抗體活性損失（例如， =於習知免疫球蛋白而言，IgM抗體傾向於比邮抗體具有 奴大之活性損失）且可能必須上調用量來補償。 含有本發明配位體(例如，拮抗劑)或其混合物之組合物 可出於預防性及/或治療性治療目的而投與。在某些治療 應用中’所選擇細胞之群體足以實現至少部分抑制、抑 止、調節、殺死或-些其他可量測參數之量係定義為"治 療有效劑量”。達成該劑量所需之量應視疾病之嚴重程度 及心、者自身免疫系統之一般狀態而定，但通常在每公斤體 重0.005 mg至5.0 mg配位體（例如dAb或抬抗劑）範圍内，其 中更通吊使用0.05至2,0毫克/公斤/劑量之劑量。對於預防 應用而„亦可以類似或稍低劑量投與含有本發明配位 體或其混合物之組合物以預防、抑制或延遲疾病發作（例 々、准持症狀緩解或靜止期，或阻止急性期）。熟練的臨 床醫師應能夠確定治療、抑止或預防疾病之適當給藥間 。當投與TNFR1配位體（例如，结抗劑）以治療、抑止或 預防慢性發炎性疾病時，可以(例如)約1〇 _至約8〇 mg/kg、約 100 至約 8〇 mg/kg、約丨 mg/kg 至約 8〇 131415.doc -67- 200907128 mg/kg、約 1 mg/kg 至約 70 mg/kg、約 1 mg/kg 至約 60 mg/kg、約 1 mg/kg 至約 50 mg/kg、約 1 mg/kg 至約 40 mg/kg、約 1 mg/kg 至約 30 mg/kg、約 1 mg/kg 至約 20 mg/kg 、約 1 mg/kg 至約 10 mg/kg、約 10 Mg/kg 至約 10 mg/kg、約 10 pg/kg至約 5 mg/kg、約 i〇 pg/kg至約 2.5 mg/kg、約 1 mg/kg、約 2 mg/kg、約 3 mg/kg、約 4 mg/kg、 約 5 mg/kg、約 6 mg/kg、約 7 mg/kg、約 8 mg/kg、約 9 mg/kg或約1 0 mg/kg之劑量每天投與至多4次、每週兩次、 每週一次、每兩週一次、每月一次或每兩月一次。在特定 實施例中，以約10 pg/kg至約10 mg/kg(例如，約1〇 pg/kg、約 100 pg/kg、約 1 mg/kg、約 2 mg/kg、約 3 mg/kg、約 4 mg/kg、約 5 mg/kg、約 6 mg/kg、約 7 mg/kg、 約8 mg/kg、約9 mg/kg或約10 mg/kg)之劑量每兩週一次或 每月一次投與TNFR1配位體（例如，拮抗劑）來治療、抑止 或預防慢性發炎性疾病。 若相對於治療之前所存在之—❹個症狀或相對於未經
之含量）、 131415.doc ’與疾病、感染細胞數 藉由監測物理表現症狀 -68- 200907128 (例如，發炎、腫瘤尺寸等）或藉由公認之臨床評定表量 測，該等砰疋表例如為擴展殘疾狀況評分表（Expanded DisabUity Status Scale)(對於多發性硬化症）、歐文發炎性 腸疾病量表（Irvine Inflammatory B〇wd此嶋加―）（關 於腸功能、全身性症狀、社會職能及感情狀態之32點評定 評估生活品質1分在32至224範圍内，#中較高評分指 示較佳生活品質）、類風濕性關節炎生活品質表（如卿〇f Life RheUmatoid Arthritis ScaU)或如該領域中已知之其他 公認之臨床評定表。至少1〇%或給定臨床表上之一或多個 點之疾病或病症症狀之維持（例如，一天或—天以上或更 長）減少指示'丨有效”治瘅。_ v ^類似地，若相對於未經組合物治 類似個體（人類或動物模型）中之一或多個症狀，延 遲、減少或消除該或該等症妝夕疏〜4、四 寻症狀之發作或嚴重程度，則使用 如本文中所述之組合物所執行之預防”有效"。 含有本發明之配位體（例如，拮抗劑）或其混合物之以 V... 物可在預防性及治療性情形下使用以幫助改變、滅活，、^ 死或移除哺乳動物中所選禮夕s彡 ” 々、碰 遠擇之乾細胞群體。另外，可㈣ 或活體外選擇性使用本文中所述之 死、砒r i 6k擇之夕肽譜系以殺 死☆排除或自細胞之異源集合有效移除乾細胞 哺乳動物之血液與配位體離 可使 死或自血液移除不想要之 技打权 中。 、、，攸而將企液送回至哺乳動物 含有本發明之配位體(例如，拮抗劑)之 性及治療性情形下使用以幫 可在預防 幫助改變、滅活、殺死或移除哺 131415.doc -69 - 200907128 乳動物中所選擇之革巴細胞群體。 配位體（例如，抗靶抗原拮抗劑、dAb單體）可與一或多 種/、他療或活性劑一起投與及/或調配。當配位體（例 如dAb)與其他治療劑一起投與時，配位體可在投與其他 藥之月卜與其同時或在其之後投與。配位體及其他藥劑 通常以提供疊加治療效應之方式投與。 在只知例中’本發明為治療、抑止或預防慢性發炎性 疾病之方法，兮古·、、土 A, A » j, Λ /匕3向有需要之哺乳動物投與治療有 效劑：：量之本發明之多肽、_或拮抗劑。 、· 例中’本發明為治療、抑止或預防關節炎(例 如，類風濕性關韵$ u V ^ 、、年型類風濕性關節炎、強直性脊 椎炎、牛皮癬性關節炎 、 方法，該方法包含向有需要之 哺乳動物投與治療有 拮抗劑。 里之本發明之多肽、dAb或 在另一實施例中，本發 方法，該方人^ 抑止或預防牛皮癖之 ,θ 含向有需要之哺乳動物投盥产療有θ 或量之本發明j 仅/、，口療有效劑量 之多肽、dAb或拮抗劑。 在另—實施例中，本發 疾病（例如，克羅因 ’'、/〇 、、抑止或預防發炎性腸 兄維恩氏病、潰癦枓έ士 包含向有需I£、 易性、.°腸九）之方法，該方法 J啕而要之哺乳動物投盥 衣 之多肽、dAb或拮抗劑。…、有相量或量之本發明 在另—實施例中，本發明 性肺疾病(例如，慢性支氣管炎？、：止或預防慢性阻塞 肺氣腫）之方法， &性阻塞性支氣管炎、 ",匕含向有需要之哺乳動物投與户 131415.doc -70. 200907128 療有效劑量或量之本發明之多狀、dAb或抬抗劑。 在另-實施例中，本發明為治療、抑止或預防肺炎（例 如，細菌性肺炎，諸如葡萄球菌肺炎（staPhylococcal _侧叫）之方法，該方法包含向有需要之哺乳動物投盘 治療有效劑量或量之本發明之多肽、dAb或括抗劑。 本發明提供治療、抑止或預防除慢性阻塞性肺疾病及肺 炎以外之其他肺疾病之方法。根據本發明可治療、抑止或 預防之其他肺疾病包括(例如)囊性纖維化及哮喘(例 固醇抗性哮喘）。因此，在另—實施射，本發明為治 療、抑止或預防肺疾病（例如，囊性纖維化、哮喘）之方 2 ’該方法包含向有需要之哺乳動物投與治療有效劑量或 1之本發明之多肽、dAb或拮抗劑。 在特定實㈣中’拮抗劑係經由肺傳遞投與，諸如藉由 吸入(例如，支氣管内、鼻内或經口吸入、鼻内滴劑则 由全身傳遞（例如，非經腸、靜脈内、肌肉内、腹 皮下）。 、 在另一實施例中，本發明為治療、抑止或預防敗血性休 克：方法，該方法包含向有需要之哺乳動物投與治療有效 劑量或量之本發明之多肽、dAb或拮抗劑。 在本發明之另—態樣中，提供—種組合物，其包含本發 明之多肽、dAb或拮抗劑及醫藥學上可接受 劑或賦形劑。 稀釋 此外，本發明提供使用本發明之多肽、咖或拮抗劑或 組合物治療疾病之方法。在一實施例中，該疾病為癌症或 131415.doc 200907128 發炎性疾病，例如類風濕性關節炎、哮喘或克羅取氏病。 格式 " 半衰期增加可適用於免疫球蛋白、尤其抗體且最尤其小 尺寸抗體片段之活體内應用。該等片段（Fv、雙硫鍵鍵結
Fab、scpv、dAb)遭遇自身體内之快速清除；因 此’雖然其能夠快速到達身體之大部分且快速產生且易於 處理，但其活體内應用因其僅短暫之活體内持久性而受到 限制。本發明之—實施例藉由提供活體内半衰期增加且因 此在身體内具有持續時間較長之配位體功能活性之配位體 來解決該問題。 熟習此項技術者應熟悉藥物動力學分析及配位體半衰期 之測定之方法。詳情可見於尺d等人，Chemicai
Stability 〇f Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists^
Peka等人，Phannac〇kinetc analysis: A (1996)。亦參考，，Pharmac〇kinetics,，，M 及 d p咖〜 由Marcel歸ker出版，第2修訂附加版（Rev.㈣伽⑽⑽2) 其描述藥物動力學參數，諸如ta及邙半衰期及曲線下面積 (AUC)。 、 半衰期0½ «及以β)及Auc可由配位體之血清濃度對時 間之曲線確定。可使用WinNonlin分析軟體套件（自
Pharsight Corp.，Mountain View，CA94〇4〇，USA獲得）模擬 曲線在第一期（α期）中，配位體主要分布於患者中，其 中部/刀/肖除。第二期⑽）為末期，此時配位體已分布且血 /月/農度配位體奴著自患者中清除配位體而降低。h半衰期 131415.doc 72 200907128 為第一期之半衰期且邙半衰期為第二期之半衰期。因此， 在一實施例中，本發明提供ta半衰期在丨5分鐘或以上範圍 内之配位體或包含本發明之配位體的組合物。在一實施例 中，範圍之下限為3 〇分鐘、45分鐘、1小時、2小時、3小 Βτ、4小a夺' 5小時、6小時、7小時、1 〇小時、i!小時或i 2 小時。另外或其他，本發明之配位體或組合物應具有在至 夕12小時且包括1 2小時範圍内之ta半衰期。在一實施例 中，範圍之上限為11、i 〇、9、8、7、6或5小時。合適範 圍之實例為1至6小時、2至5小時或3至4小時。 在一實施例中，本發明提供邙半衰期在2·5小時或以上範 圍内之配位體（多肽、dAb或拮抗劑）或包含本發明之配位 體的組合物。在一實施例中’範圍之下限為3小時、4小 時、5小時、6小時、7小時、1〇小時、u小時或12小時。 另外或其他，本發明之配位體或組合物具有在至多21天且 包括21天範圍内之邙半衰期。在一實施例中，範圍之上限 為12小時、24小時、2天、3天、5天、1〇天、15天或2〇 天。在一實施例中，本發明之配位體或組合物應具有以至 60小時範圍内之邙半衰期。在另一實施例中，其應在丨2至 48小時範圍内。在又—實施例巾，其應在以叫、時範圍 内。 除以上標準以外或其他，本發明提供AUC值（曲線下面 積）在1 mg’min/ml或以上範圍内之配位體或包含本發明之 配位體之組合物在一實施例中，範圍之下限為5、、 15、20、30、1〇〇、2〇〇或 300 mg.min/ml。另外或其他，本 131415.doc -73· 200907128 發明之配位體或組合物具有在至多600 mg.min/ml範圍内之 AUC。在一實施例中，範圍之上限為500、4〇〇、3〇〇、 200、150、100、75 或 50 mg.min/nd。在一實施例中，本發 明之配位體應具有在選自由以下各範圍組成之群之範圍内 之 AUC: 15 至 150 mg.min/ml、15 至 1〇〇 mg.min/mI、15至 75〇1§.1]1111/1111及15至5〇111吕.〇11:〇/1111。
本發明之多肽及dAb及包含該等多肽及dAb之拮抗劑可 經編排格式以具有較大流體動力學尺寸，例如，藉由連接 PEG基團、血清白蛋白、轉鐵蛋白、轉鐵蛋白受體或至少 其轉鐵蛋白結合部分、抗體以區，或藉由接合抗體區域。 舉例而言，多肽dAb及拮抗劑經編排格式為抗體之較大抗 原結合片段或抗體（例如，經編排格式為Fab、Fab,、 F(ab)2、F(ab丨)2、IgG、scFv) 〇 可使用此項技術中熟知之方法測定本發明之配位體（例 如，dAb單體及多聚體）之流體動力學尺寸。舉例而言，可 使用凝膠過濾層析法測定配位體之流體動力學尺寸。諸如 交聯璦脂糖基質之詩測定配位體流體動力學&寸之合適 凝膠過濾基質為吾人所熟知且可容易地獲得。
配位體格式之尺寸（例如，連接sdA 尺伽見想要之應用而變化。舉例而言，當配位二: 離開循環且進入周邊組織時，希望保持配位體之流體動力 學尺寸較低以有助於自血流外溢。或者，當希望使配位體 保留在體循環中較長時間時，可(例如)藉由編排格式為1§ 樣蛋白增加配位體尺寸。 131415.doc -74· 200907128 藉由靶向增加活體内半衰期之抗原或抗原決定基延長半衰期 如本文中所述，亦可藉由使本發明之靶抗原結合多肽、 dAb或拮抗劑與結合增加活體内半衰期之抗原或抗原決定 基的結合區域（例如，抗體或抗體片段）接合或締合來增加 配位體之流體動力學尺寸及其血清半衰期。舉例而言，可 使靶抗原結合劑（例如，多肽;)與抗血清白蛋白或抗新生兒
Fc受體抗體或抗體片段（例如，抗s A或抗新生兒&受體 f
dAb、Fab、Fab，或scFv)或與抗sA親和體⑽化吻）或抗新 生兒Fc受體親和體或抗SA avimer或抗s八結合區域接合或 連接，該抗SA結合區域包含選自（但較佳不限於）由以下各 物組成之群之骨架：CTLA_4、脂f運載蛋白、sm、親和 體、avimer、Gr〇El&纖維連接蛋白（參見，2〇〇8年2月8曰 申請之揭示該等結合區域之PCT/GB 2〇〇8/〇〇〇453，該等區 域及其序列以引用之方式併入本文中且構成本發明正文之 揭丁内谷之彳分）。接合物係指包含鍵結（共價或非共價）
於結合血清白蛋白之結合區域的本發明之多肽、dAb或拮 抗劑之組合物。 P 典增加活體内血清半衰期之合適多肽包括(例如)轉鐵蛋白 受體特異性配位體，經藥劑融合蛋白(參見美國專利第 5’977,3〇J號，纟教示内容以引用之方式併入本文幻、腦 毛’'田血/内皮細胞受體、轉鐵蛋白、轉鐵蛋白受體(例 如’可:性轉鐵蛋白受體）、騰島素、膜島素樣生長因子1 =GF 體、姨島素樣生長因子2 (IGF 2)受體、 體、血凝因早γ , 尔又 Λ、《1-抗胰蛋白酶及HNF lot。增加血清半 131415.doc -75- 200907128 衰期之合適多肽亦包括α-l醣蛋白（血清類黏蛋白；AAG)、 α-l抗凝乳蛋白酶（ACT)、α-l微球蛋白（蛋白質HC ; AIM)、抗凝血酶ΙΠ (ΑΤΙΙΙ)、脫脂蛋白Α-1 (Αρο Α-l)、脫 脂蛋白Β (Αρο Β)、血漿銅藍蛋白（Cp)、互補組分C3 (C3)、互補組分C4 (C4)、C1酯酶抑制劑（Cl INH)、C-反應 蛋白（CRP)、鐵蛋白（FER)、血液結合素（HPX)、脂蛋白⑷ (Lp(a))、甘露糖結合蛋白（MBP)、肌血球素（Myo)、前白
蛋白（曱狀腺素運送蛋白；PAL)、視黃醇結合蛋白（rbp)及 類風濕因子（RF)。 來自細胞外基質之合適蛋白質包括（例如）膠原、層黏連 蛋白、整合素及纖維連接蛋白。膠原為細胞外基質之主要 蛋白質。目前已知約1 5種類型之膠原分子，可見於身體之 不同部位，例如I型膠原（佔體膠原之9〇%)可見於骨、皮 膚、腱、韌帶、角膜、内臟中或n型膠原可見於軟骨、脊 椎盤、脊索及眼睛玻璃狀液中。 來自血液之合適蛋白質包括（例如）血漿蛋白（例如，纖維 蛋白、α-2巨球蛋白、*清白蛋白、纖維蛋白原（例如，纖 維蛋白原A、纖維蛋白原B)、血清澱粉樣蛋白A、結合珠 蛋白、前纖維蛋白（profilin)、泛素、子宮球蛋白及卜2微 球蛋白）、酶及酶抑制劑（例如，纖溶酶原、溶菌酶、半胱 胺酸蛋白酶抑制劑C (eystatin C)、α小抗騰蛋白酶及騰腺 胰蛋白酶抑制劑)、免疫系統蛋白質，諸如免疫球蛋白蛋 =例如、IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、^ K 、轉運蛋白(例如’視黃醇結合蛋白、q微球蛋 131415.doc -76- 200907128 白）、防禦素（defensin)(例如，β-防禦素1、嗜中性白血球 防禦素1、嗜中性白血球防禦素2及嗜中性白企球防紫素3) 及其類似物。 金腦屏障或神經組織中可見之合適蛋白質包括（例如）累 色素皮質素受體、髓磷脂、抗壞血酸轉運體及其類似物。
增加活體内血清半衰期之合適多肽亦包括位於腎中之蛋 白質（例如，多囊蛋白（p〇lyCystin)、IV型膠原、有機陰離 子轉運體Κ1、海曼氏抗原（Heymann，s antigen))、位於肝中 之蛋白質（例如，乙醇脫氫酶、G250)、位於肺中之蛋白質 (例如，結合IgA之分泌組分）、位於心臟中之蛋白質（例 如，與擴張性心肌病相關之HSP 27)、位於皮膚之蛋白質 (例如，角蛋白）、骨特異性蛋白質（諸如促進骨生成之蛋白 質（BMP) ’其為顯示成骨活性之蛋白質之轉化生長因子β超 家族的子集（例如，BMP-2、BMP-4、BMP-5、ΒΜΡ-6、 ΒΜΡ-7、ΒΜΡ·8))、腫瘤特異性蛋白質（例如，滋養母細胞 抗原賀癌平文體（herceptin receptor)、雌激素受體、组 織蛋白酶（例如’可見於肝及脾中之組織蛋白酶B))。 合適之疾病特異性蛋白質包括（例如）僅表現於活化Τ_細 胞上之抗原(包括LAG_3(淋巴細胞活化基因))、骨保護素 ®M4M(0PGL； ^ ^Nature 402, 304-309 (1999)) > 〇χ4〇 (™F受體家族之成Μ，表現於活化τ細胞上且尤其在！型人 類Τ細胞白血病病毒(Η，」)產生細胞中上調；來見 /~从165⑴:263_7G(2_))。合適之疾病特異性蛋白 、亦。括（例如）金屬蛋白酶（metaU〇㈣k咖）（與_節炎八癌 131415.doc -77- 200907128 症相關）’包括CG6512果蠅、人類截癱蛋白（parapiegin)、 人類FtsH、人類AFG3L2、氣類ftsH ;及血管生成生長因 子，包括酸性纖維母細胞生長因子（FGF4)、鹼性纖維母 細胞生長因子（FGF-2)、血管内皮生長因子/血管滲透因子 (VEGF/VPF)、轉化生長因子_a (TGF α)、腫瘤壞死因子_α (TNF α)血 S 生長素（angiogenin)、介白素 _3 (IL-3)、介 白素-8 (IL-8)、血小板源内皮生長因子（pd_EcgF)、胎盤 生長因子（P1GF)、中期因子血小板源生長因子_BB (pDGF) 及弗拉塔軌。 增加活體内血清半衰期之合適多肽亦包括應力蛋白，諸 如熱休克蛋白（HSP)。HSP通常在細胞内可見。當其細胞 外可見時，其為細胞已死亡且溢出其内含物之指示。因外 傷、疾病或損傷，發生該未計劃之細胞死亡（壞死），細胞 外HSP引發免疫系統之反應。與細胞外HSp之結合可使得 使本發明之組合物定位於疾病部位。 涉及Fc轉運之合適蛋白質包括（例如）布蘭貝爾受體 (Brambell receptor)(亦稱為FcRB)。Fc受體具有兩種功能， 兩者均潛在適用於傳遞。該等功能為（丨）自母體穿過胎盤轉 運IgG至小孩，（2)保護IgG以免降解，從而延長其血清半 衰期。認為受體使IgG自核内體再循環。（參見，H〇Uiger 專 k，Nat Biotechnol 、\99Ί、。、 結合血清白蛋白之dAb 在一實施例中，本發明提供一種包含結合靶抗原之抗靶 抗原dAb(第一 dAb)及結合血清白蛋白（sa)之第二dAb之多 131415.doc -78- 200907128 狀或枯抗劑（例如，雙特異性配位體），該第二dAb以如由 表面電漿共振所測定！ nM至1、2、3、4、5、1〇、20、 30、40、50、6〇、7〇、1〇〇、2〇〇、3〇〇、4〇〇 或 5〇〇 _(亦 即 ’ Xl〇 至 5xl0-4)或 100 nM至 10 μΜ、或 1 至 5 μΜ、或 3至 70 ηΜ、或1〇咖至！、2、3、4或5 μΜ之結合SA。舉例 而言’如由表面電漿共振所測定3〇至7〇 nM。在一實施例 中，第一 dAb(或dAb單體）以如由表面血漿共振所測定約 1、50、70、1〇〇、150、2〇〇、3〇〇 nM或 i、2 或 3 _之 κ〇 結合SA(例如，HSA)。在一實施例中’對於包含第一抗sa dAb及第二抗革巴抗原之dAb之雙特異性配位體而言，第二 dAb對其乾之親和力（例如’如由表面電漿共振、例如使用 BiaCore所量測，kd及/或Koff)為第一 dAb對SA之親和力的1 至 100000倍（例如，100至 100000、或 1〇〇〇至1〇〇〇〇〇、或 10000至100000倍）。在一實施例中’血清白蛋白為人類血 清白蛋白（HSA)。舉例而言，第一dAb以約10 μΜ之親和力 結合SA ’而第二dAb以100 ρΜ之親和力結合其靶。在一實 施例中’血清白蛋白為人類血清白蛋白（HSA)。在一實施 例中’第一 dAb 以約 50 nM，例如 70、1〇〇、150 或 200 ηΜ 之KD結合SA(例如，HSA)。雙特異性配位體之詳情可見於 WO 03002609、WO 04003019及 WO 04058821 中。 在一實施例中，本發明之配位體可包含以如由所表面電 漿共振測定 1 nM 至 1、2、3、4、5、10、20、30、40、 50、60、70、100 ' 200、300、400 或 500 μΜ(亦即，xi〇-9 至 5χ1(Γ4)或 100 nM 至 10 μΜ、或 1至 5 μΜ、或 3至 70 nM、 131415.doc -79- 200907128 或ΙΟηΜ至1、2、3、4或5 μΜ之KD結合血清白蛋白（SA)之 dAb。舉例而言，如由表面電漿共振所測定30至70 nM。 在一實施例中’第一dAb(或dAb單體）以如由表面血漿共振 所測定約 1、50、70、100、150、200、300 nM或 1、2或 3 μΜ之KD結合SA(例如，HSA)。在一實施例中，第一及第 二dAb由連接子連接，例如1至4個胺基酸或1至3個胺基酸 或超過3個胺基酸或超過4、5、6、7、8、9、10、15或20 個胺基酸之連接子。在一實施例中，使用較長連接子（超 過3個胺基酸）增加效價（拮抗劑中之一個或兩個dAb之 KD)。 在配位體及拮抗劑之特定實施例中，dAb結合人類血清 白蛋白且與選自由以下各物組成之群之dAb競爭以結合白 蛋白： MSA-16、MSA-26(關於該等序列之揭示内容，參見WO 04003019，該等序列及其核酸對應物以引用之方式併入本 文中且構成本發明正文之揭示内容的一部分），
DOM7m-16 (SEQ ID NO: 473) ' DOM7m-12 (SEQ ID NO: 474)、DOM7m-26 (SEQ ID NO: 475)、DOM7r-l (SEQ ID NO: 476)、DOM7r-3 (SEQ ID NO: 477)、DOM7r-4 (SEQ ID NO: 478)、DOM7r-5 (SEQ ID NO: 479)、DOM7r-7 (SEQ ID NO: 480)、DOM7r-8 (SEQ ID NO: 481)、 DOM7h-2 (SEQ ID NO: 482)、DOM7h-3 (SEQ ID NO: 483)、DOM7h-4 (SEQ ID NO: 484)、DOM7h-6 (SEQ ID NO: 485)、DOM7h-l (SEQ ID NO: 486) > DOM7h-7 (SEQ 131415.doc -80- 200907128 ID NO: 487)、DOM7h-22 (SEQ ID NO: 489)、DOM7h-23 (SEQ ID NO: 490)、DOM7h-24 (SEQ ID NO: 491)、 DOM7h-25 (SEQ ID NO: 492) > DOM7h-26 (SEQ ID NO: 493)、DOM7h-21 (SEQ ID NO: 494) ' DOM7h-27 (SEQ ID NO: 495)、DOM7h-8 (SEQ ID NO: 496)、DOM7r-13 (SEQ ID NO: 497)、DOM7r-14 (SEQ ID NO: 498)、DOM7r-15 (SEQ ID NO: 499)、DOM7r-16 (SEQ ID NO: 500)、 DOM7r-17 (SEQ ID NO: 501) > DOM7r-18 (SEQ ID NO: 502)、DOM7r-19 (SEQ ID NO: 503)、DOM7r-20 (SEQ ID NO: 504)、DOM7r-21 (SEQ ID NO: 505)、DOM7r-22 (SEQ ID NO: 506)、DOM7r-23 (SEQ ID NO: 507)、DOM7r-24 (SEQ ID NO: 508)、DOM7r-25 (SEQ ID NO: 509)、 DOM7r-26 (SEQ ID NO: 510)、DOM7r-27 (SEQ ID NO: 511)、DOM7r-28 (SEQ ID NO: 512)、DOM7r-29 (SEQ ID NO: 513)、DOM7r-30 (SEQ ID NO: 514)、DOM7r-31 (SEQ ID NO: 515) ' DOM7r-32 (SEQ ID NO: 516) > DOM7r-33 (SEQ ID NO: 5 17)(關於該等序列之揭示内容，參見WO 2007080392，該等序列及其核酸對應物以引用之方式併入 本文中且構成本發明正文之揭示内容的一部分；該段落中 之SEQIDNO為WO 2007080392 中所出現之SEQIDNO)， dAb8 (dAb 10)、dAb 10、dAb36、dAb7r20 (DOM7r20)、 dAb7r21 (DOM7r21) 、dAb7r22 (DOM7r22) 、dAb7r23 (DOM7r23)、dAb7r24 (DOM7r24)、dAb7r25 (DOM7r25)、 dAb7r26 (DOM7r26) 、 dAb7r27 (DOM7r27) 、 dAb7r28 131415.doc -81 - 200907128 (DOM7r28)、dAb7r29 (DOM7r29)、dAb7r29 (DOM7r29)、 dAb7r31 (DOM7r31) 、dAb7r32 (DOM7r32) 、dAb7r33 (DOM7r33)、dAb7r33 (DOM7r33)、dAb7h22 (DOM7h22)、 dAb7h23 (DOM7h23)、dAb7h24 (DOM7h24)、dAb7h25 (DOM7h25)、dAb7h26 (DOM7h26)、dAb7h27 (DOM7h27)、 dAb7h30 (DOM7h30)、dAb7h31 (DOM7h31)、dAb2 (dAb4、
dAb7、dAb41)、dAb4、dAb7、dAbll、dAbl2 (dAb7ml2)、 dAbl3 (dAb 15)、dAbl5、dAbl6 (dAb21、dAb7ml6)、 dAbl7、dAbl8、dAbl9、dAb21、dAb22、dAb23、dAb24、 dAb25 (dAb26、dAb7m26)、dAb27、dAb30 (dAb35)、 dAb31、dAb33、dAb34、dAb35、dAb38 (dAb54)、dAb41、 dAb46 (dAb 47、dAb 52 及 dAb 56)、dAb47、dAb52、 dAb53、dAb54、dAb55、dAb56、dAb7ml2、dAb7ml6、 dAb7m26、dAb7rl (DOM7rl)、dAb7r3 (DOM7r3)、dAb7r4 (DOM7r4)、dAb7r5 (DOM7r5)、dAb7r7 (DOM7r7)、dAb7r8 (DOM7r8)、dAb7rl3 (DOM7rl3)、dAb7rl4 (DOM7rl4)、 dAb7rl5 (DOM7rl5) 、dAb7rl6 (DOM7rl6) 、dAb7rl7 (DOM7rl7)、dAb7rl8 (DOM7rl8)、dAb7rl9 (DOM7rl9)、 dAb7hl (DOM7hl) 、 dAb7h2 (DOM7h2) 、 dAb7h6 (DOM7h6)、dAb7h7 (DOM7h7)、dAb7h8 (DOM7h8)、 dAb7h9 (DOM7h9)、dAb7hlO (DOM7hlO)、dAb7hll (DOM7hll)、dAb7hl2 (DOM7hl2)、dAb7hl3 (DOM7hl3)、 dAb7hl4 (DOM7hl4) 、 dAb7pl (DOM7pl)及 dAb7p2 (DOM7p2)(關於該等序列之揭示内容，參見2008年2月8曰 131415.doc -82- 200907128 申請之PCT/GB 2008/000453，該等序列及其核酸對應物以 引用之方式併入本文中且構成本發明正文之揭示内容之一 部分）。dAb後之括號中展示替代名稱，例如dAb8具有替代 名稱dAblO，亦即dAb8 (dAblO)。該等序列亦陳述於圖51a 及b中。 在某些實施例中，dAb結合人類血清白蛋白且包含與選 自由以下各物組成之群之dAb的胺基酸序列具有至少約 80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%、或至 少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少約99%之 胺基酸序列一致性的胺基酸序列： MSA-16、MSA-26、
DOM7m-16 (SEQ ID NO: 473) > DOM7m-12 (SEQ ID NO: 474)、DOM7m-26 (SEQ ID NO: 475)、DOM7r-l (SEQ ID NO: 476)、DOM7r-3 (SEQ ID NO: 477)、DOM7r-4 (SEQ ID NO: 478)、DOM7r-5 (SEQ ID NO: 479)、DOM7r-7 (SEQ ID NO: 480)、DOM7r-8 (SEQ ID NO: 481)、 DOM7h-2 (SEQ ID NO: 482)、DOM7h-3 (SEQ ID NO: 483)、DOM7h-4 (SEQ ID NO: 484)、DOM7h-6 (SEQ ID NO: 485)、DOM7h-l (SEQ ID NO: 486)、DOM7h-7 (SEQ ID NO: 487)、DOM7h-22 (SEQ ID NO: 489)、DOM7h-23 (SEQ ID NO: 490) ' DOM7h-24 (SEQ ID NO: 491)、 DOM7h-25 (SEQ ID NO: 492) ' DOM7h-26 (SEQ ID NO: 493)、DOM7h-21 (SEQ ID NO: 494)、DOM7h-27 (SEQ ID NO: 495)、DOM7h-8 (SEQ ID NO: 496)、DOM7r-13 (SEQ 131415.doc •83- 200907128 ID NO: 497)、DOM7r-14 (SEQ ID NO: 498)、DOM7r-15 (SEQ ID NO: 499)、DOM7r-16 (SEQ ID NO: 500)、 DOM7r-17 (SEQ ID NO: 501) ' DOM7r-18 (SEQ ID NO: 502)、D〇M7r-19 (SEQ ID NO: 503)、DOM7r-20 (SEQ ID NO: 504)、DOM7r-21 (SEQ ID NO: 505)、D〇M7r-22 (SEQ ID NO: 506)、DOM7r-23 (SEQ ID NO: 507)、DOM7r-24 (SEQ ID NO: 508)、DOM7r-25 (SEQ ID NO: 509)、 DOM7r-26 (SEQ ID NO: 510)、DOM7r-27 (SEQ ID NO: 511)、D〇M7r-28 (SEQ ID NO: 512)、DOM7r-29 (SEQ ID NO: 513)、DOM7r-30 (SEQ ID NO: 514)、DOM7r-31 (SEQ ID NO: 515) ' DOM7r-32 (SEQ ID NO: 516) > DOM7r-33 (SEQ ID NO: 517)(該段落中之 SEQ ID NO 為 WO 2007080392 中所出現之SEQ ID NO)， dAb8 、dAb 10、dAb36 、dAb7r20、dAb7r21 、 dAb7r22 、 dAb7r23 、 dAb7r24 、 dAb7r25 、 dAb7r26 、 dAb7r27、dAb7r28、dAb7r29、dAb7r30、dAb7r31、 dAb7r32、dAb7r33、dAb7h21、dAb7h22、dAb7h23、 Ab7h24 、 Ab7h25 、 Ab7h26 、 dAb7h27 、 dAb7h30 、 dAb7h31、dAb2、dAb4、dAb7、dAbll、dAbl2、dAbl3、 dAbl5 、 dAb 16、 dAbl7 、 dAbl8 、 dAbl9 、dAb21、 dAb22 、 dAb23 、 dAb24 、 dAb25 、 dAb26 、dAb27、 dAb30 、 dAb31、 dAb33、 dAb34 、 dAb35 、dAb38、 dAb41 、 dAb46 、 dAb47 、 dAb52 ' dAb53 ' dAb54 ' dAb55 、 dAb56 、 dAb7ml2 、dAb7m16 、 dAb7m26 、 131415.doc -84- 200907128 dAb7rl、dAb7r3、dAb7r4、dAb7r5、dAb7r7、dAb7r8、 dAb7rl3、dAb7rl4、dAb7rl5、dAb7rl6、dAb7rl7、 dAb7rl8 、dAb7rl9 、dAb7hl 、dAb7h2 、dAb7h6 、 dAb7h7、dAb7h8 、dAb7h9、dAb7hlO、dAb7hll 、 dAb7hl2、dAb7hl3、dAb7hl4、dAb7pl及 dAb7p2 ° 舉例而言，結合人類血清白蛋白之dAb可包含與以下各 物具有至少約90%、或至少約95%、或至少約96%、或至 少約97°/。、或至少約98%、或至少約99%之胺基酸序列一 致性的胺基酸序歹|J ： DOM7h-2 (SEQ ID NO: 482)、 DOM7h-3 (SEQ ID NO: 483) ' DOM7h-4 (SEQ ID NO: 484)、DOM7h-6 (SEQ ID NO: 485)、DOM7h-l (SEQ ID NO: 486) > DOM7h-7 (SEQ ID NO: 487) ' DOM7h-8 (SEQ ID NO: 496)、DOM7r-13 (SEQ ID NO: 497)、DOM7r-14 (SEQ ID NO: 498)、DOM7h-22 (SEQ ID NO: 489)、 DOM7h-23 (SEQ ID NO: 490) ' DOM7h-24 (SEQ ID NO: 491)、DOM7h_25 (SEQ ID NO: 492)、DOM7h-26 (SEQ ID NO: 493) ' DOM7h-21 (SEQ ID NO: 494)、DOM7h-27 (SEQ ID NO: 495)(該段落中之 SEQ ID NO 為 WO 2007080392 中所出現之SEQ ID NO)， dAb8 、dAb 10 、dAb36、dAb7h21 、dAb7h22 、 dAb7h23 、 Ab7h24 、 Ab7h25 、 Ab7h26 、 dAb7h27 、 dAb7h30、dAb7h31、dAb2、dAb4、dAb7、dAbll、dAb 12 ' dAb 13、dAbl5、dAbl6、dAbl7、dAbl8、dAbl9、 dAb21 、 dAb22 、 dAb23 、dAb24 、 dAb25 、 dAb26 、 131415.doc -85- 200907128 dAb27、dAb30、dAb31、dAb33、dAb34、dAb35、 dAb38、dAb41、dAb46、dAb47、dAb52、dAb53、 dAb54、dAb55、dAb56、dAb7hl、dAb7h2、dAb7h6、 dAb7h7 、 dAb7h8 、 dAb7h9 、 dAb7hlO 、 dAb7hll 、 dAb7hl2 、 dAb7hl3及dAb7hl4 ° 在某些實施例中，dAb結合人類血清白蛋白且包含與選 自由以下各物組成之群之dAb的胺基酸序列具有至少約 80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%、或至 少約96%、或至少約97°/。、或至少約98%、或至少約99%之 胺基酸序列一致性的胺基酸序列： DOM7h-2 (SEQ ID NO: 482) ' DOM7h-6 (SEQ ID NO: 485) ' DOM7h-l (SEQ ID NO: 486) > DOM7h-7 (SEQ ID NO: 487)、DOM7h-8 (SEQ ID NO: 496)、DOM7h-22 (SEQ ID NO: 489)、DOM7h-23 (SEQ ID NO: 490)、DOM7h-24 (SEQ ID NO: 491)、DOM7h-25 (SEQ ID NO: 492)、 DOM7h-26 (SEQ ID NO: 493) > DOM7h-21 (SEQ ID NO: 494)、DOM7h-27 (SEQ ID NO: 495)(該段落中之 SEQ ID NO為 WO 2007080392 中所出現之SEQ ID NO)， dAb7h21 ' dAb7h22、dAb7h23、Ab7h24、Ab7h25、 Ab7h26、dAb7h27、dAb7h30 > dAb7h31、dAb2、dAb4、 dAb7、dAb38、dAb41、dAb7hl、dAb7h2、dAb7h6、 dAb7h7 、dAb7h8 、dAb7h9 、dAb7hlO 、dAb7hl 1 、 dAb7hl2、dAb7hl3及 dAb7hl4 ° 在更特定實施例中，dAb為結合人類血清白蛋白且具有 131415.doc -86- 200907128 選自由以下各物組成之群之胺基酸序列的VK dAb : DOM7h-2 (SEQ ID NO: 482) ' DOM7h-6 (SEQ ID NO: 485)、DOM7h-l (SEQ ID NO: 486)、DOM7h-7 (SEQ ID NO: 487)、DOM7h-8 (SEQ ID NO: 496)(該段落中之SEQ ID NO為 WO 2007080392 中所出現之SEQ ID NO)， dAb2、dAb4、dAb7、dAb38、dAb41 、dAb54、 dAb7hl、dAb7h2、dAb7h6、dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、 dAb7hlO、dAb7hll、dAb7hl2、dAb7hl3 及 dAb7hl4。 在更特定實施例中，dAb為結合人類血清白蛋白且具有 選自dAb7h3 0及dAb7h31之胺基酸序列的VH dAb。 在更特定實施例中，dAb為dAb7hll或dAb7hl4。 在其他實施例中，dAb、配位體或结抗劑結合人類血清 白蛋白且包含任何上述胺基酸序列中之一、兩或三個 CDR，例如dAb7h 11或dAb7h 14中之一、兩或三個CDR。 結合血清白蛋白之合適駱駝類VHH包括WO 2004/041862 (Ablynx N.V.)及WO 2007080392中所揭示之彼等VHH(該等 Vhh序列及其核酸對應物以引用之方式併入本文中且構成 本發明正文之揭示内容之一部分），諸如序列A (SEQ ID NO: 518)、序列 B (SEQ ID NO: 519)、序列 C (SEQ ID NO: 520)、序列 D (SEQ ID NO: 521)、序列 E (SEQ ID NO: 522)、序列 F (SEQ ID NO: 523)、序列 G (SEQ ID NO: 524)、序列 H (SEQ ID NO: 525)、序列 I (SEQ ID NO: 526)、序列 J (SEQ ID NO: 527)、序列 K (SEQ ID NO: 528)、序列 L (SEQ ID NO: 529)、序列 M (SEQ ID NO: 1314l5.doc -87- 200907128 5 3 0)、序歹ij N (SEQ ID NO: 531)、序列 O (SEQ ID NO: 532)、序列 P (SEQ ID NO: 533)、序列 Q (SEQ ID NO: 534)，該等序列號對應於 WO 2007080392 或 WO 2004/041862 (Ablynx N.V.)中所引用之序列號。在某些實施例中，駱,IS 類Vhh結合人類血清白蛋白且包含與WO 2007080392中所 揭示之ALB 1或SEQ ID NOS: 5 1 8-534中之任何一個具有至 少約80%、或至少約85°/。、或至少約90%、或至少約95%、 或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少約 99%之胺基酸序列一致性的胺基酸序列，該等序列號對應 於WO 20070803 92或WO 2004/041862中所引用之序列號。 在一些實施例中，配位體或拮抗劑包含與本文中所揭示 之任何抗血清白蛋白dAb競爭以結合血清白蛋白（例如人類 血清白蛋白）之抗血清白蛋白dAb。 在一替代實施例中，拮抗劑或配位體包含對靶抗原（例 如，人類TNFR1)具有特異性之結合部分，其中該部分包 含如2008年2月8曰申請之同在申請中之申請案PCT/GB 2008/000453中所述的非免疫球蛋白序列，該等結合部 分、其製造及選擇（例如，自多樣性庫）方法及其序列之揭 示内容以引用之方式併入本文中作為本發明正文之揭示内 容之一部分）。 接合半衰期延長部分（例如，白蛋白） 在一實施例中，使（一或多個）半衰期延長部分（例如，白 蛋白、轉鐵蛋白及其片段及類似物）與本發明之靶抗原結 合多肽' dAb或拮抗劑接合或締合。供把抗原結合格式使 13H15.doc -88 - 200907128 用之合適白蛋白、白蛋白片段或白蛋白變異體之實例描述 於WO 2005 077042中，其揭示内容以引用之方式併入本文 中且構成本發明正文之揭示内容之一部分。在本發明中 尤其可使用以下白蛋白、白蛋白片段或白蛋白變異體： • SEQ ID NO: 1(如WO 2005077042中所揭示，該序列明 確地以引用之方式併入本發明揭示内容中）； •包含 WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1 之胺基酸 1-387 或由該等胺基酸1-3 87組成之白蛋白片段或變異體； •包含選自由以下各物組成之群之胺基酸序列的白蛋白 或其片段或變異體：（a) WO 2005077042中之SEQ ID NO: 1 之胺基酸 54 至 61 ; (b) WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1 之胺基酸 76 至 89 ; (c) WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1 之胺基酸 92 至 100 ; (d) WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1胺基酸 170至 176 ; (e) WO 2005077042 中之SEQ ID NO: 1之胺基酸247至252 ; (f) WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1之胺基酸266至 277 ; (g) WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1之胺基酸 280 至 288 ; (h) WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1胺基酸 362至 3 68 ; (i) 2005 077042 中之 SEQ ID NO: 1之胺基 酸 439至 447 ;⑴ WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1 之 胺基酸 462 至 475 ; (k) WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1 之胺基酸 478 至 486;及（1) WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1之胺基酸 560至 566。 供祀抗原結合格式使用之合適白蛋白、片段或類似物之 131415.doc -89- 200907128 其他實例描述於1WO 03076567中，其揭示内容以引用之方 式併入本文中且構成本發明正文之揭示内容之一部分。在 本發明中尤其可使用以下白蛋白、片段或變異體： •如WO 03076567中之（例如）圖3中所述之人類血清白蛋 白’（該序列資訊係明確地以引用之方式併入本發明 揭示内容中）； •由具有66,500之化學式分子量（formuia molecular weight)之585個胺基酸的非糖基化多肽單鏈組成的人 類血清白蛋白（HA)(參見’ Meloun等人，_^\£批 5S.136 (1975) ; Behrens 等人， (1975)，Lawn等人，9:61〇2_ 6114 (1981) ; Minghetti等人 ’ J.仏ο/· c/^所.2<57..67#7 (1986))； •如 Weitkamp專人，//¾所.37:219 (1973)中 所述之白蛋白之多晶型變異體或類似物或片段； •如EP 322094中所述之白蛋白片段或變異體，例如 ΗΑ(1-373)、ΗΑ(1·388)、ΗΑ(1-389)、HA(1_369)及 HA( 1-419)及1-369與1-419之間的片段； •如EP 399666中所述之白蛋白片段或變異體，例如 HA(1-177)及ΗΑ(1-200)及HA(l-X)之間的片段，其中χ 為178至199之任何數字。 當使用（一或多個）半衰期延長部分（例如，白蛋白、轉鐵 蛋白及其片段及類似物）編排本發明之靶抗原結合多肽、 dAb及拮抗劑格式時，可使用任何合適方法（諸如^直接融 131415.doc -90· 200907128 口）例如藉由使用編碼融合蛋 與乾抗原結合部分（例如，早核^構桌體使其 合蛋白係編碼為半衰 :1 dAb)接合’其中該融 叫或。-末端之多肽單鏈 用肽連接子實現接A 、 』精由在口 P刀之間使
2〇〇4〇_19 中所 ^ 子例如 W〇 _76567 或 WO 用之方式併入本發明:=(該等連接子揭示内容以” m *月揭不内容中以提供用於本發明之實 例）。增加活體内血、'主坐> # 私/3之實 π +衣功之多肽通常為活體内天然存 在且抗降解或由自生物辦（办丨l 、'、 物體（例如，人類）移除不想要之物質 之内源性機制移除的客 貝 之 ’、的多狀。例如’增加活體内血清半衰期 肽可“來自細胞外基質之蛋白質、血液中可見之 白質、血腦屏障或神經組織中可見之蛋白質、位於腎、 肝、肺、心臟、皮膚或骨中之蛋白質、應力蛋白、疾病特 異性蛋白質或涉及以轉運之蛋白質。 在貫穿該揭示内容所述之本發明之實施例中，代替在本 發明之拮抗劑或配位體中使用抗乾抗原"，，涵蓋熟練 的使用者（addressee)可使用包含結合把抗原之本^明之 dAb的-或多個或所有三個CDR(例如’接枝於合適蛋白質 骨架或骨幹上之CDR ’該骨架或骨幹例如親和體、SpA骨 架、LDL受體A類區域或EGF區域）的多肽或區域。因此， 揭示内容整體應解釋為提供使用該等區域代替dAb之拮抗 劑之揭示内容。在這點上，參見2〇〇8年2月8日申請之 PCT/GB 2008/000453，其揭示内容以引用之方式併入）。 因此，在一實施例中，本發明之拮抗劑包含呈合適格式 131415.doc 91 200907128 之對靶抗原具有結合特性的免疫球蛋白單一可變區域或區 域抗體（dAb)或該dAb之互補判定區。拮抗劑可為由該dAb 組成或大體上由該dAb組成之多肽。拮抗劑可為包含合適 格式、諸如抗體格式（例如，IgG樣格式、scFv、Fab、 Fab’、F(ab’）2)中之dAb(或dAb之CDR)之多肽，或包含結合 革巴抗原之dAb及結合另一靶蛋白質、抗原或抗原決定基（例 如’血清白蛋白）之第二dAb的雙特異性配位體。 可將本發明之多肽、dAb及拮抗劑編排格式為此項技術 已知之多種合適抗體格式，諸如IgG樣格式、嵌合抗體、 人化抗體、人類抗體、單鏈抗體、雙特異性抗體、抗體重 鏈、抗體輕鏈、抗體重鏈及/或輕鏈之同源二聚體及異源 二聚體、任何上述者之抗原結合片段（例如，Fv片段（例 如，單鏈Fv (scFv)、雙硫鍵鍵結之Fv)、Fab片段、Fab，片 段、F(ab’）2片段）、單一可變區域（例如，％、八）、偽及 任何上述者之經修飾形式（例如，藉由共價連接聚伸烷二 醇(例如，聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇)或其他合適聚 合物而修飾）。 在-些實施例中’本發明提供一種為砂樣格式之配位 體（例如，抗TNFR!拮抗劑）。該等格式具有習知_分子之 四鏈結構(兩個重鏈及兩個輕鏈），其中一或多個可變區Μ 及/或已經本發明之dAb置換。在—實施例中，各可變 區（2個VH區及2個VL區）經dAb或單一可變區域置換，其中 之至少。-個為本發明之抗乾抗原⑽。包括呈收樣格式之 dAb或單可變區域可具有相同特異性或不同特異性。在 131415.doc •92- 200907128 一些實施例中，IgG樣格式為四價且可具有一種（僅抗靶抗 原）、兩種（例如，抗靶抗原及抗SA)、三種或四種特異 性。舉例而言，IgG樣格式可為單特異性且包含四個具有 相同特異性之dAb ;可為雙特異性且包含三個具有相同特 異性之dAb及另一具有不同特異性之dAb ;可為雙特異性 且包含兩個具有相同特異性之dAb及兩個具有常見但不同 特異性之dAb ;可為三特異性且包含具有相同特異性之第 一及第二dAb、具有不同特異性之第三dAb及具有不同於 第一、第二及第三dAb之特異性之第四dAb ;或可為四異 性且包含四個各具有不同特異性之dAb。可製備IgG樣格式 之抗原結合片段（例如，Fab、F(ab，）2、Fab，、FV、SCFV)。 在一實施例中，IgG樣格式或其抗原結合片段不會交聯靶 抗原，例如該格式對靶抗原而言可為單價。若想要補體活 化及7或抗體依賴性細胞的細胞毒性（ADCC)功能，則配位 體可為IgGl-樣格式。必要時，IgG樣格式可包含突變悝定 區（變異體IgG重鏈恆定區）以最小化與Fc受體之結合及/或 固定補體之能力，（例如參見Winter等人，GB 2,209,757 B ’ Morrison 等人，w〇 89/07142 ; Morgan 等人，W〇 94/29351，1994年 12 月 22 日）。 可將本發明之配位體（多肽、dAb及拮抗劑）編排格式為 含有與第二免疫球蛋白單一可變區域直接融合之第一免疫 球蛋白單一可變區域的融合蛋白。必要時，該格式可進一 步包含半衰期延長部分。舉例而言，配位體可包含與第二 免疫球蛋白單一可變區域直接融合的第一免疫球蛋白單一 131415.doc •93- 200907128 可變區域的融合蛋白，#中該第二免疫球蛋白單—可變區 域直接融合於結合血清白蛋白之免疫球蛋白單—可變區 域。 具有對乾具有結合特異性之結合位點之多狀區域的定向 及配位體疋否包含連接子通常為設計所要選擇之問題。然 而’ -些定向在有或無連接子之情況下可提供較其他定向 佳之結合特徵。本發明所涵蓋之所有定向(例如，dAbl-連 接子-dAb2、dAb2-連接子_dAbl)為含有提供可藉由篩選容 易地鑑別之想要結合特徵的定向的配位體。 可使本發明之多肽及dAb(包括dAb單體二聚體及三聚 體）與抗體Fc區連接，該抗體卜區包含Ch2及Ch3區域中之 一者或兩者及視情況鉸鏈區。舉例而言，可使用編碼以單 核苷酸序列形式連接於以區之配位體之載體製造該等多 肽。 此外，本發明提供上述dAb單體之二聚體、三聚體及聚 合物。 密碼子優化序列 如上所述，本發明之實施例提供編碼本發明之多肽及可 ’复區域之在、碼子優化核皆酸序列。如以下說明中所示，可 產生編碼相同可變區域（在此狀況下，可變區域胺基酸序 列與DOMlh-13 1-206—致）之具有約70%一致性之密碼子優 化序列。在該情況下，序列經優化從而由馬斯德畢赤酵母 (Pk/ni (密碼子優化序列或大腸桿菌（密碼子 優化序列4及5)表現。 131415.doc -94· 200907128 考慮到遺傳密碼中之及簡併度執行計算且最大化由如圖 19中所示之DOMlh-13 1-206之核苷酸序列及還編碼與 DOM 1 h-1 3 1 -206 —致之可變區域之理論核苷酸序列所編碼 的各簡併密碼子中的核苷酸變化數。計算揭露理論序列將 與如圖19中所示之DOMlh-131-206之核苷酸序列具有僅 5 7 %之一致性。 密碼子優化序列1 DNA序列
gaggttcaattgttggaatccggtggtggattggttcaacctggtgqttctttgagattgtcctgtgctg cttccggttttactttcgctcacgagactatggtttgggttagacaggctccaggtaaaggattggaatg ggtttcccacattccaccagatggtcaagatccattctacgctgactccgttaagggaagattcactatc tccagagacaactccaagaacactttgtacttgcagatgaactccttgagagctgaggatactgctgttt accactgtgctttgttgccaaagagaggaccttggtttgattactggggacagggaactttggttactgt ttcttcc 相應AA序列 evqllesggglvqpggslrlscaasgftfahetmvwvrqapgkglewvshippdgqdpfyadsvkgrfti srdnskntlylqmnslraedtavyhcallpkrgpwfdywgqgtlvtvss •與WT序列之核苷酸序列一致性為74.1% ί
密石馬子優4匕31-206 O〇Blh-131>206 WT一致 密碼子優匕Domlh-131-206 D〇mlh«131-206 WT一致密碼子優化D〇»lh-131-2〇e Domlh-131-206 MT—致密碼子優化Do»lh-131-206 Donlb-131-206 WT一致密碼子優化D〇mih-i3i-2〇e D〇Blh«131«206 WT
1 c)0 (1) eAOOTTCJkA9T07T9GAATCC〇eTOOT〇aA7TOO7TCAACCTO99OG97C (1) QA0OTGCAaCT97T9QAG7CTQOOO<9AOGCTTOOTACAOCCTOOOOO<3TC (1) 0UM3OT CA ΤΘΤΤΟΟλ TC ΘΟ OG 0<3 TTOOT CA CCTOO QQ TC 51 100 (51) TTiGAdAfTQTCiCfOTeCTOCtTCCeaTfiTACTTTCaCTCXCGAGACTA (51) CCTOCt3TCTCTCCTSTQCAOCCTCCOOATTCACCTTTOCQCATOAailCOA C TCC (51)
T9 9 T TCCTQTOC OC TCCOO TT AC ΤΦ QC CA OJiOAC A 101 ISO <101) TOOTTTaOOTTAOACAOOCTCCAeaTAAAOaATTGOAArOOOTTTCCCAC <101) TG0T〇T9Q9TCCQCCAOOCACCIU9〇aAA9GOTCTAaAQT9OO7CTCACAT (101) ΤΘΟΤ TOOOT a CAOOC CCAOO AA OQ T 3A T90OT TC CA 151 200 (151) ATTCCACCAO!WVOGTCAAaJlTCC»TTC9ACaCTeACTCC€ (151) ATTCCCCCOG^TOOTCAGGATCCCTTCTACOCASACTCCO (15X) ATTCC CC OATOOTCA OATCC TTCTACOC OACTCCOT 201 2S0 (201) ATTCACTATCTCCftOASACAACTCCMUMUiCACTTTeTACTTOCAaAVOA <201
C0TTJUU300JUU3 COTOMkOOOCCO COT ΛλΟΟΟ G -致⑽ )OTTCACOkTCTCCCeCOACIiATTCCAAQAACACOCTXTATCTQCAAATOA )TTCAC ATCTCC O OAOUk TCCAAOAACAC T TA TOCA ATOli 2$1 300 密碼子優化口〇alh-131-20« (251) ACTCCTTeASAeCTQAGGATACTOCTOTTTACCACTOTOCTTTeTTQCCA D〇mlh-131-206 WT <251) ACAGCCTGCeTGCCaAGQACACAeCGQTATATCACTGTGCeCTGCTTCCT —致 （251) AC c T9 a OC ΟΑΟΟΛ AC ac QT TA CACTOTOC T9 T CC 301 350 密碼子優化 D〇mllir131-206 1301) AAGXQXGGACCiTQOT»TeATTACTGOGOACXGOGXACTTTGeTTACTOT D〇mlH_131-206 WT f3〇l) AAeAOGGGGCCTTGeTTTeKCTXCTGeGeTCAOGGAACCCTGeTCACCOT —致 {301) ΑλΟΑΘ 0O CC7TOOTTTSA TACTOOOO CAG90AAC TOOT AC 07 密竭子優化D〇»ih，i31-206 D〇»lh-131-20« WT—致
351 363 (351) TTCTTCCTAATGA (351) CTCGXeC------ (351) TC C 密碼子優化序列2 -95- 131415.doc 200907128 DNA序列 gagaaaagagaggttcaattgcttgaatctggaggaggtttggtccagccaggagggtcccttcgactaa gttgtgctgccagtgggtttacgtttgctcatgaaactatggtatgggtccgacaggcacctggtaaagg tcttgaatgggtttcacatatccctccagacggtcaagacccattttacgctgattccgtgaaaggcaga tttacaatttcacgagataattctaaaaacaccttgtacttacaaatgaactcattgagagctgaggaca ctgcagtttatcactgcgctttactaccaaaacgtggaccttggtttgattattggggccaaggtacgtt agtgactgttagttct 相應AA序列 ekrevqllesggglvqpggslrlscaasgftfahetmvwvrqapgkglewvshippdgqdpfyadsvkgr ftisrdnskntlylqmnslraedtavyhcallpkrgpwfdywgqgtlvtvss •與WT序列之核苷酸序列一致性為71.1 %
Do»lh-131-206 WT 僅畢赤酵母MFa 206 dAb —致 Domlh-131-206 WT 僅畢赤酵母MFa 2〇6 dAb —致 Domlh-131-206 WT 僅畢赤酵母MFa 206 dAti 一致 Domlh-131-206 WT 僅畢赤酵母MFa 2〇e dAb —致 Domlh-131-206 WT 僅畢赤酵母MFa 2〇e dAb 一致 Domlh'131-206 WT 僅畢赤酵母MFa 2〇6 dAfc —致 Domlh-131-206 WT 僅畢赤酵母MFa 206 dAb —致 Domlh-131-206 WT 僅畢赤酵母MFa 2〇6 dAb 一致 t/ t/ 111 211 211 ({ ( 4 5 5 9 0 0 —(( (11 (142) (151) (151) (192) (201) (201) (242) (251) (251) (292) (301) (301) (342) (351) (351)
1 50 ---------gaggtgcaqctgttggagtctgggggaggcttggtacagcc GAGAAAAGAGAGGITCAATXGCTTGAATCTGGAGGAGGTTTGGTCCACSCC GAGGT CA TG T GA TCTGG GGAGG TTGGT CAGCC 51 X00 tggggggtccctgcgtctctcctgtgcagcctccggattcacctttgcgc aggagggtcccttcgactaagttgtgctgccagtgggtttacgtttgctc GG GGGTCCCT CG CT TGTGC GCC GO TT AC TTTGC C 101 150 atgagacgatgotgtggctccgccaggcaccagggaag<?gtctagagtgg atgaaactatggtatgggtccgacaggcacctggtaaagctcttgaatqg ATGA AC ATGGT TGGGTCCG CAGGCACC GG AA GGTCT GA TGG 151 200 GTCTCAGATATTCCCCCGGATGGTCXGGATCCCTTCTACGCAGACTCCGT GTTTCACATATCCCTCCAGACGGTCAAGACCCATTTTACGCTGATTCCGT GT TCACATAT CC CC GA GGTCA GA CC TT TACGC GA TCCGT 201 250 GAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAJITTCCAAGAACACGCTATATC GAAAGGCAGATTTACAATrTTCACGAGATAATTCTAAAAACACCTTGTACT GAA GGC G TT AC AT TC CG GA AATTC AA AACAC T TA 251 300 TGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACAGCGGTATATCACTGTGCG TACAAATGAACTCATTGAGAGCTGAGGACilCTGCAGTTTATCACTGCGCT T CAAATGAAC TG G GC GAGGACAC GC GT TATCACTG GC 301 350 ctgcttcctaagagggggccttggtttgactactogggtcagggaaccct TTACTACCAAAACGT(3GACCTTGGTTTGATTATTGGGGCCAAGGTACGTT T CT CC AA G GG CCTTGGTTTGA TA TGGGG CA GG AC T 351 367 GGTCACCGTCTCGAGC-AGTGACTGT-TAGTTCT GT AC GT T G C 密碼子優化序列3 DNA序列 gaagtgcagcttcttgaaagtggtggagggctagtgcagccagggggatctttaagattatcatgcgctg ccagtggatttacttttgctcacgagacgatggtctgggtgagacaagctcctggaaaaggtttagagtg ggtttctcacattccacctgatggtcaagatcctttctacgcagattccgtcaaaggaagatttactatc tccagagataatagtaaaaacactttgtacctacagatgaactcacttagagccgaagataccgctgtgt accactgcgccttgttgccaaagagaggtccttggttcgattactggggtcagggtactctggttacagt ctcatct 相應AA序列 evqllesggglvqpggslrlscaasgftfahetmvwvrqapgkglewvshippdgqdpfyadsvkgrfti srdnskntlylqmnslraedtavyhcallpkrgpwfdywgqgtlvtvss -96- 131415.doc 200907128 •與WT序列之核苷酸序列一致性為72.6%
Domlh-131-206 WT 僅畢赤酵母Pre 2〇6 dAb 一致 Domlh-131-206 WT 僅畢赤酵母Pre 206 dAfc 一致 Domlh-131-206 WT 僅畢赤酵母Pre 2Q6 dAb 一致 Domlh-131-206 WT 僅畢赤酵母 Pre 206 dAi> 一致 Dorolh-131-206 WT 僅畢赤酵母Pre 2Q6 dAb 一致 Domlh-131-206 WT 僅畢赤酵母Pre 206 dAb —致 D<Mnlh-13X-206 WT 僅畢赤酵母Pre 206 dAb 一致 Domlh-131-206 WT 僅畢赤酵母Pre 206 dAb 一致 (1) (1> ⑴ (51) (51) (51) (101) (101) (101) U51) (151) <151)(201)(201)<201) (251) (251) (251) <301> (301) (301) (351) (351) (351)
50 CTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTC .GTGGTGGAGGGCTAGTGCJUSCCAGGGGGATC TGG GGAGG T GT CAGCC GGGGG TC 100 CCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGCGCATGAGACGA TTTAAGATTATCATGCGGTGCCAGTGGATTTACTTTTGCTCACGAGACGA T G T TC TG GC GCC GGATT AC TTTGC CA GAGACGA 101 150 TGGTGTGGGTCCGCCAGGCACCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACAT TGGTCTGGGTGAGACAAGCTCCTGGAAAAGGTTTAiSAGTGGGTTTCTCAC TGGT TGGGT G CA GC CC GG AA GGT TAGAGTGGGT TC CA 151 200 ATTCCCCCGGATGGTCAGGATCCCTTCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCG ATTCCACCTGATQOTCAAGATCCTTTCTACGCAGATTCCGTCAAAGGAAG ATTCC CC GAT(3GTCA GATCC TTCTACGCAGA TCCGT AA GG G 201 250 GTTCACCATCTCCCQCGACAATTCCAAGAACACGCTATATCTGCAAATGA ATTTACTATCTCCAGAGATAATAGTAAAAACACTTTGTACCTACAGATOA TT AC ATCTCC G GA ΑΛΤ AA AACAC T TA CT CA ATGA 251 300 ACAGCCTGCGTGCCGAGGACACAGCGGTATATCACTGTGCGCTGCTTCCT ACTCACTTAGAGCCGAAGATACCGCTGTGTACCACTGCGCCTTGTTGCCA AC CT G GCCGA GA AC GC GT TA CACTG GC TG T CC 301 350 AAGJVGGGGGCCTTGGTTTGACTACTGGGGTC&GGGAJICCCTGGTCACCGT AAaAGAQGTCCTTGGTTCGATTACTGGGGTCAGGGTACTCTGGTTACAGT AAGAG GG CCTTGGTT GA TACTGGGGTCAGGG AC CTGGT AC GT 351 CTCG CTC-CTC A C GGAGTi ΎΰΛΑλ， GAGGTGCAGCTGTT' GAASTGCAGCTTCTTI GA GTGCAGCT T GA 51
2GAGC- 3-ATCT 密碼子優化序列4 DNA序列 gaagtacaactgctggagagcggtggcggcctggttcaaccgggtggttccctgcgcctgtcctgtgcgg catctggtttcaccttcgcacacgaaaccatggtgtgggttcgccaagctccgggcaaaggcctggaatg g^taagccacattcctccagatggccaggacccattctatgcggattccgttaagggtcgctttaccatt tctcgtgataactccaaaaacaccctgtacctgcagatgaactccctgcgcgccgaggatactgcggtgt accattgtgcgctgctgcctaaacgtggcccgtggttcgattactggggtcagggtactctggtcaccgt aageagc 相應AA序列 evqllesggglvqpggslrlscaasgftfahetmvwvrqapgkglewvshippdgqdpfyadsvkgrfti srdnskntlylqmnslraedtavyhcallpkrgpwfdywgqgtlvtvss •與WT序列之核苷酸序列一致性為76.5°/〇 1 50
Domlh-131-206 WT 僅大腸桿菌Sec 2〇6 dAb 一致 Domlh-131-206 WT 僅大腸桿菌Sec 2〇6 dto _致 U) GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTQGTACAGCCTGGGGGGTC <1) GAAGTACAACTGCTGGAGAGCGGTGGCGGCCTGSTTCAACCGGOTGGTTC (1) GA GT CA CTG TG6A6 GG GG GGC TGGT CA CC GG GG TC 51 100 <51) CCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGCGCATGAGACGA (51) CCTGCGCCTGTCCTGTGCGGCATCTGGTTTCACCTTCGCACACGAAACCA (51) CCTGCG CT TCCTGTGC GC TC GG TTCACCTT OC CA GA AC A 101 150 97- 131415.doc 200907128
Domlh-131-206 WT 僅大腸桿菌Sec 2〇6 dAb 一致 Domlh-131-206 WT 僅大腸桿菌Sec 2〇6 dAb 一致 Domlh-131-206 WT 僅大腸桿菌Sec 2〇6 dAb 一致 Domlh-131-206 WT 僅大腸桿菌Sec 2〇e dAb 一致 Domlh-131-206 WT 僅大腸桿菌Sec 2〇6 dAb 一致 Domlh-131-206 WT 僅大腸桿ΐ Sec 2〇6 dAb 一致 (101) (101) (101) (151) U51> U5X) 111 o o o 2 2 2 (251) (251) (25X) ΛΙ- i/ if. ir \/ if XXI XXI ο ο o 5 5 5 3 3 3 3 3 3 #f\ /\ /1 / * /\ Ji\
TGGTGTGGGTCCGCCAGGCACCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACAT TGGTGTGGGTTCGCCAAGCTCCGGGCAAAGGGCTGGAATGGGTAAGCCAC TGGTGTGGGT CGCCA GC CC GG AA GG CT GA TGGGT CA X51 200 ATTCCCCCGGATC5GTCAGGATCCCXTCTACGCyiGACTCCGTGAAGGGCCG ATTCCTCCAGATGGCCAGGACCCATTCTATGCGGATTCCGTTAAGGGTCG ATTCC CC GATGG CAGGA CC TTCTA GC GA TCCQT AAGGG CG 201 250 gttcaccatctcccgcgacaattccaagaacacgctatatctgcaaatga CTTTACCATTTCTCGTGATAACTCCAAAAACACCCTGTACCTGCAGATGA TT ACCAT TC CG GA AA TCCAA AACAC CT TA CTGCA ATGA 251 300 ACAGGCTGCGTGCCGAGGACACAGCGGTATATCACTGTGCGCTGCTTCCT ACTCCCTGCGCGCCGAGGATACTGCGGTGTACCATTGTGCGCTGCTGCCT AC CCXGCG GCCGAGGA AC GCQGT TA CA TGTGCGCTGCT CCT 301 350 AAGAGGGGGCCTTGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGT AAACGTGGCCCGTGGTTCGATTACTGGGGTCAGGGTACTCTGGTCACCGT AA 0 GG CC TGGTT GA TACTGGGGTCAGGG AC CTGGTCACCGT 351 CTCGAGC AAOCAGC AGC 密碼子優化序列5 DNA序列 gaggttcaactgctggaatctggtggtggtctggtacaaccgggtggttccctgcgtctgagctgtgcag cctctggtttcaccttcgctcatgagaccatggtttgggtacgccaggctccgggtaaaggcctggagtg ggtaagccatatccctcctgatggtcaggacccgttctatgctgattccgtcaaaggccgttttaccatt tctcgtgacaacagcaaaaacactctgtacctgcaaatgaactccctgcgtgcagaagacacggcggttt atcactgtgcactgctgccaaaacgcggcccttggttcgactactggggccagggtactctggtcactgt atcttct 相應AA序列 evqllesggglvqpggslrlscaasgftfahetmvwvrqapgkglewvshippdgqdpfyadsvkgrfti srdnskntlylqmnslraedtavyhcallpkrgpwfdywgqgtlvtvss •與WT序列之核苷酸序列一致性為78.4%
Domlh-131-206 WT 僅大腸桿菌IC 2〇6 dAb —致
Domlh-131-206 WT 僅大腸桿菌IC 206 dAb 一致 Domlh-131-206 WT 僅大腸桿菌IC 2〇6 dAb 一致 Domlh-131-206 WT 僅大腸桿菌IC 2〇6 dAb -致 Donah-131-206 WT 僅大腸桿菌IC 2〇6 dAb 一致 ί f t/ XXI 1 1 X ((( 555 (101) (101) (101) 111 5 5 5 111 (201) <201) (201) 1 50 GAGOTGGAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTC GAQGTTCAACTGCTGGAATCTGGTQGTGGTCTGGTACAAGCGGGTGGTTC GA66T CA CTG TG6A TCT6G GG QG TGGTACA CC GG GG TC 51 100 CCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGCGCATGAGACGA CCTGCGTCTGAGCTGTGCACK：CTCTGGTTTCACCTTCGCTCATGAGACCA CCTGCGTCT CTGTGCAGCCTC GG TTCACCTT GC CATGAGAC A 101 150 TGGTGTGGGTCCGCCAGGCACCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACAT TGGTTTGGGTACGCCXGGCTCCGGGTAAAGGCCTGGAGTGGGTAAGCCAT TGK3T TGGGT CGCCAGGC CC GG AA GG CT GAGTGGGT CAT 151 200 ATTCCCCCGGATGGTCAGGATCCCTTCTACGCAQACTCCGTGAAGGGCCG ATCCCTCCTGATGGTCAGGACCCGTTCTATGCTGATTCCGTCAAAGGCCG AT CC CC GATGGTCAGGA CC TTCTA GC GA TCCGT AA GGCCG 201 250 GTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTATATCTGCAAATGA TTTTACGATTTCTCGTGACAACAGCAAAAACACTCTGTACCTGCAAATGA TT ACCAT TC CG GACAA CAA AACAC CT TA CTGCAAATGA 25X 300 98- 131415.doc 200907128
Domlh-131-206 WT (251) ACAGCCTGCQTGCCGAGGAGACAGCGGTATATCACTQTGCGCTGCTTCCT 僅大腸桿—IC 206 dAb (251) ACTCCCTGCGTGCAGAAGACACGGCGGTTTATCACTGTGCACTGCTGCCA 一致(251) AC CCTGCGTGC GA (3ACAC GCGGT TATCACTGTGC CTGCT CC 301 350
Domlh-131-206 WT (301) AAGAGGGGrGCCTTGGTTTGACTACTGCXSeTCAGGGAACCCTGGTCACCGT 僅大腸桿菌 IC 206 dAb (301) AAACGCGQCCCTTGGTTCGACTACTGGGGCCAGGGTACTCTGGTCACTGT —致(301) AA G GG CCTTGGTT GACTACTGGGG CAGGG AC CTGGTCAC GT 35X
Domlh-131-206 WT (351) CTCGAGC 僅大腸桿菌 IC 206 dAb <351) ATCTTCT 一致(351) TC 例證 實例A :主要選擇及表徵人類TNFR1之區域抗體 所產生之區域抗體係源自噬菌體庫。根據相關標準方法 執行被動吸收之人類TNFR1之可溶性選擇與淘選。人類 TNFR1係以可溶性重組蛋白質形式自R&D systems(目錄號 636-R1-025/CF)或 Peprotech(目錄號 310-07)購得，且直接 使用（在被動選擇之狀況下）或在生物素標記後，經由一級 胺偶合使用，接著在生物檢定中品質控制其活性且由質譜 分析其MW及生物素標記程度。通常執行3輪選擇，在每下 一輪中利用遞減含量之抗原。 由噬菌體ELISA篩選來自選擇物之輸出物的抗TNFR1結 合純系之存在。自該等噬菌體選擇物分離DNA且亞克隆於 表現載體中以表現可溶性dAb片段。將可溶性dAb片段表 現於96孔板中，且使用以抗c-myc偵測之直接結合ELIS A 或使用抗生蛋白鏈菌素/經生物素標記TNFR1 BIAcore™晶 片之BIAcore™使用上清液篩選抗TNFR1結合dAb之存在， 且根據解離速率（off-rate)分等級。 下文所述之前導分子係源自命名為DOMlh-131(揭示於 WO 2006038027中）之親本dAb。該分子在使用60 nM經生 物素標記抗原選擇3輪後自噬菌體呈現庫選得。在各輪選 131415.doc -99- 200907128 擇中將經抗生蛋白鏈菌素或中性鏈親和素塗佈之Dyna珠粒 交替作為捕獲試劑以防止選擇針對抗生蛋白鏈菌素或中性 鏈親和素之結合劑。該階段前導D〇Mlh-131之效價如在 MRC-5纖維母細胞/il-8釋放細胞檢定中所測定處於低微莫 耳範圍内。如由BIAc〇reTM所測定之結合動力學通常呈現 快速締合速率（on rate)/快速解離速率。該D〇Mlh_131前導 分子之大腸桿菌表現含量以c_末端myc標記單體計處於8 mg/Ι之範圍内。 前導分子之親和力成熟作用： 使DOM 1 h-1 3 1進行親和力成熟作用以產生具有較高效價 及改良生物物理學特徵之突變體（關於D〇M;lh-131來源之
如導分子之胺基酸序列，參見圖3)。使用易於出錯之PCR 聚合酶（Genemorph II，Stratagene)產生易於出錯之庫（平均 數為每dAb序列1個胺基酸變化’庫規模8x1 07)後，利用該 4易於出錯之庫執行7輪選擇。該策略可引起純系d〇m 1 h-131-8刀離’一種如由mrc - 5細胞檢定所量測4個胺基酸變 化（一個在構架1 (FRi)中，一個在CDR1*，一個在CDR3 中及一個在FR4中）產生約1〇〇倍效價提高（約4 nM)之分 子。在該檢定中，將MRC_5細胞與測試樣品一起培養】小 時，隨後添加TNF-cc (200 pg/ml)。培養隔夜後，使用IL_8 ABI 8200細胞偵測檢定（FMAT)測定IL_8釋放。各實驗中包 括TNF-α劑量曲線。在該檢定中，所使用之與dAb競爭結 合TNFR1之TNF-a的濃度（2〇〇 pg/mi)為最大TNF-a反應之約 70%。 131415.doc -100- 200907128 為進一步提向效價，由易於出錯之前導一致資訊提示之 關鍵位置處之养核苦酸引導的突變誘發使單一胺基酸位置 多樣化。該過程期間，經由BIAcore™篩選分離具有單個 K94Rfe基酸突變（胺基酸編號根據Kabat)及200-300 pM之 RBA效價之DOM 1 h-13 1 - 8純系的改良形式，D〇Mlh-l 3 1 · 24(在修正之前，最初命名為D〇Mlh-131-8-2)。 產生其他基於該前導分子及源於其之NNS庫之易於出錯 的庫且使用熱處理使其經受3輪噬菌體選擇（關於方法，參 見 Jespers L 等人，Aggregation-resistant domain antibodies selected on phage by heat denaturation. Nat Biotechnol. 2004年9月；22(9):1161-5)。在此選擇期間，彙集庫且自 第2輪選擇所獲得之純系產生認為更加熱穩定之諸如 〇0河111-131-53之(1八1)。假定該等純系將具有較佳生物物理 特徵。使純系DOM 1 h-1 3 1 -53中之一些構架突變生殖系化 以產生純系DOM 1 h-1 3 1 -83。該純系形成使用如上所述之 嗟菌體呈現選擇或使用使用乳液之活體外隔室化技術經由 寡核苷酸引導的個體CDR突變誘發進一步多樣化之基礎。 噬菌體呈現策略產生前導分子DOMlh-131-117及DOMlh-131-151。活體外隔室化技術產生D〇Mlh-l 31-511。 在該階段中，在生物物理及生物檢定中比較此等三個前 導分子，且DOMlh-131-511為具有最佳性質之分子。此 外’在胰蛋白酶或白血球酶存在下測試該等分子的蛋白水 解裂解抗性。白血球酶由自患有囊性纖維化之患者彙集的 痰組成且含有高含量之彈性蛋白酶及其他蛋白酶且用作肺 131415.doc • 101 - 200907128 疾病活體内條件之替代品。該資料指示所有三個前導分子 DOMlh-131-117、DOMlh-131-151 及 DOMlh-131-511 在胰 蛋白酶或白血球酶存在下均快速降解。該研究結果引起對 當DOMlh-1 31-511處於患者體内時其活體内持久性之關注 且研發-種選擇改良胰蛋白酶抗性之策略。假m經改良 胰蛋白酶抗性會對分子之其他生物物理性質產生有利效 應。基本上修改標準噬菌體選擇方法以允許在對抗原選擇 之前在蛋白酶存在下進行選擇。為此目的，使缺失ο,” 才示籤之新穎噬菌體載體工程化以允許在胰蛋白酶存在但未 使所呈現之dAb裂解脫離噬菌體的情況下進行選擇。產生 基於DOMlh-131-511之易於出錯之庫且選殖於pD〇M33载 體中（關於PDOM33載體圖，參見圖50)。在37r下用ι mg/ml或1 〇〇 pg/ml胰蛋白酶預處理由該庫產生之噬菌體儲 備液24小時，接著添加為R〇che完全蛋白酶抑制劑
Complete Protease Inhibitor)(2x)之蛋白酶抑制劑以在選擇 相關抗原之前阻斷胰蛋白酶活性。執行4輪選擇。在37艺 下在存在或不存在胰蛋白酶（在100 pg/mi41〇〇〇叫/d最 終胰蛋白酶；農度下）之情況下培養1小時或培養隔夜期間， 在存在或不存在蛋白酶之情況下使用BIAc〇reTM評定可溶 性表現TNFR1結合dAb的結合TNFR1之能力。 此引起兩個前導分子D〇Mlh-13 1-202及DOMlh-131-206 分離’該兩個前導分子如由BIAcore™抗原結合實驗所示 顯不改良之蛋白酶抗性。令人關注地注意到，與D〇Mlh_ 131-511相比，DOMlh-131-202僅在CDR2中含有一個突變 131415.doc -102· 200907128 (V53D)(所有胺基酸編號根據Kabat)，而DOMlh-131-206僅 含有兩個突變：第一突變與DOMlh-13 1-202相同（在CDR2 中之V5 3D突變）及第二突變為FR3中之Y91H突變（參見圖 3)。該FR3中之Y91H突變出現在3-20人類生殖系基因中， 指示該殘基出現在人類抗體中。該三個純系〇〇]\4111-131-5 11、DOMlh-131-202及 DOMlh-131-206具有如圖 3 中所示 之胺基酸序列。 如下測定分子活性： DOM1H-13 1-202、DOM1H-131-511 及 DOM1H-13 1-206 結合 人類TNFR1之BIAcore™結合親和力評定。 由 BIAcore™ 分析評定 DOM1H-131-202、DOM1H-131- 5 11及DOM 1 Η-1 3 1 -206結合人類重組大腸桿菌表現人類 TNFR1之結合親和力。使用經生物素標記人類tnfR 1進行 分析。將1400 RU經生物素標記TNFR1塗佈於抗生蛋白鏈 菌素（SA)晶片上。使用弱酸溶離條件使表面再生重新回到 基線。在規定濃度下使用50 μΙ/min之流速使]3〇1^1111-131-202、DOM1H-131-511 及 DOM1H-13 1-206 穿過該表面。在 BIAcoreTM 300〇機器上進行研究，且分析資料且擬合於ι:ι 之結合模型。所有測試分子之結合資料充分擬合於卜丨模 型。由kon及k0ff速率計算所有KD值。在25。〇下進行 BIAcore™運行。 以下資料由三個獨立的實驗產生。在各個實驗中，藉由 平均大ϊ擬合結果（對kd而吕使用最高之d Ab濃度及對ka而 吕使用較低之》辰度）來4算結果。資料以結果之平均值及 131415.doc -103- 200907128 標準偏差（在括號中）呈示（表1)。 表1 :結合人類 TNFR1 之 DOMlH-m-202、DOM1H-131-511及001\1111-131_206之61入(；〇代1^資料 K〇n k〇ff 勗(nM) DOM1H-131-511 5.03Ε+05 5.06E-04 1.07 (511) (1.07Ε+05) (1.01E-04) (0.44) DOM1H-131-202 1.02Ε+06 5.42E-04 0.55 (202) (2.69Ε+05) (3.69E-05) (0.11) DOM1H-131-206 1.55Ε+06 7.25E-04 0.47 (206) (3.57Ε+05) (1.95E-04) (0.06) DOM1H-13 1-202、DOM1H-131-511 及 DOM1H-131-206類 似地且以高親和力結合人類TNFR1。DOM1H-13 1-202及 DOM1H-13 1-206分別以0.55 nM及0.47 nM之平均親和力結 合。與具有1.07 nM之平均親和力之DOM1H-131-511相 比，DOM1H-13 1-202及DOM1H-131-206具有稍佳之親和 力。 受體結合檢定： 在受體結合檢定中測定dAb對人類TNFR1之效價。該檢 定量測TNF-oi與TNFR1之結合及可溶性dAb阻斷該相互作 用之能力。將TNFR1-FC融合物捕獲在預塗佈山羊抗人類 IgG (H&L)之珠粒上。將受體塗佈珠粒與TNF-a (10 ng/mL)、dAb、生物素接合抗TNF-a及抗生蛋白鏈菌素 alexa fluor 647在黑色側面透明底面之384孔板中一起培 養。6小時後，將板在ABI 8200細胞偵測系統中讀數且測 定珠粒相關螢光。若dAb阻斷TNF-α與TNFR1之結合，則 螢光強度將減小。 131415.doc -104- 200907128 使用ABI 8200分析軟體分析資料。使用GraphPad Prism 及具有可變斜率之S形劑量反應曲線測定濃度效應曲線及 效價（EC5〇)值。在三種獨立的情形下重複檢定。各實驗中 包括TNF-α劑量曲線（圖38及39)。所使用之與dAb競爭以結 合TNFR1之TNF-α濃度（10 ng/ml)在該檢定中為最大TNF-a 反應之約90%。 圖39中展示代表性曲線圖，其展示dAb抑制TNF-a與 TNFR1之結合之能力。在所有三個實驗中，陰性對照樣品 (HEL4，抗雞蛋白溶菌酶dAb及VH模擬物）在高濃度下微弱 抑制TNF-a與TNFR1之間的相互作用。表2中展示測試樣品 及陽性對照（自R&D Systems獲得之抗TNFR1 mAb， mAb225)及 EnbrelTM(依那西普（etanercept);由連接於 IgGl Fc部分之TNFR2組成之二聚融合物；經許可用於治療類風 濕性關節炎）的平均效價（EC5〇)值。 表2 :三個重複實驗之TNFR1受體結合檢定中DOM1H-131-202、DOM1H-13 1-206 及 DOM1H-131-511 之效價（EC5。）值 樣品 平均 EC50(nM) SEM DOM1H-131-202 0.11 0.008 DOM1H-131-206 0.07 0.01 DOM1H-131-511 0.19 0.01 Enbrel™ (Etanercept) 0.20 0.07 抗TNFR1 mAb # mAb225 0.08 0.003 在該檢定中，DOM 1 h-1 3 1 -206似乎比正測試之其他兩種 dAb 有效且與市售抗 TNFR1 mAb，MAB225 (R and D Systems)具有類似效價。 131415.doc -105 - 200907128 如下文所述進行來自馬斯德畢赤酵母之前導純系之表 現： 使用二種前導分子之一級胺基酸序列產生分泌表現於馬 斯捻畢赤酵母中之密碼子優化基因。密碼子優化DOM 1H- 13 1 206與非雄、碼子優化DOM1H-13 1-206之間存在75。/。之序 歹J致性。將二種合成基因選殖於表現載體pPIC_Za(來自
Invitrogen)中，且隨後轉型於兩種畢赤酵母菌株'η及
KM71H中。將轉型細胞濾出置於遞增濃度之芥森 (Zeocin)(l〇〇、3〇〇、6〇〇及9〇〇 pg/mi)上以選擇具有多個整 合子（integrant)之純系。選擇各個細胞系及構築體的約 個，，’屯系以用於表現篩選。因為馬斯德畢赤酵母中高/低基 因複本數與表現含量之間的相關性尚未完全理解，所以在 整個齐森濃度範圍内挑選數個純系。使用尚未就高產量進 订廣泛師選之純系進行5L醱酵罐運行。此使得產生大量用 於進一步研究之物質。 用於蛋白質表徵之物質產生： 、已廣泛使用基於蛋白質A之層析樹脂自微生物培養上清 液中純化VH dAb。雖，然此舉使得單步純化方法產生高純度 (在大多數情況下通常>90%)材料，但對於一些分子，低阳 值溶離條件會導致形成聚集體。亦存在用於_之親和力 樹脂之容量受到限制之問題，此將意謂使用大量樹月旨來加 工來自醱酵罐之物。為產生高品質物質用於表徵且進一步 用於穩定性及㈣器研究，使用混合㈣電荷感應樹脂 (rmxed modal charge inducti〇n _η)將下游的純化過程設 131415.doc 200907128 計為初級捕獲步驟，接著陰離子交換。未顯著優化，此允 許回收約70%之純度為約95%之表現dAb。 對於混合模態電荷感應樹脂，來自GE Healthcare之 Capto MMC上之捕獲步驟，使用5〇 mM磷酸鈉（pH 6 〇)執 仃官柱平衡且在不需要任何稀釋液或pH值調節之情況下加 載上清液。洗滌管柱後，使用為5〇 mM THs (pH 9 〇)之溶 離綾衝液由pH梯度溶離蛋白質。特定洗滌及梯度條件將略 視正溶離之蛋白質之pi而變化。 隨後使用陰離子交換層析用流經步驟（fl〇w thr〇ugh step) 進一步純化溶離液峰。此舉可移除諸如醇氧化酶之殘餘 HMW污染且減少内毒素。使樹脂與pBs或無鹽之磷酸鹽緩 衝液（pH 7.4)平衡。將來自Capt〇 MMC之溶離液加載於陰 離子交換樹脂上之後’ dAb不結合且由流經步驟回收。内 毒素及其他污染物與樹脂結合。鹽之存在（若使用pBs緩衝 液）使該步驟之蛋白質回收率提高為91%，而非無鹽情況下 所達成之議回收率。然而，鹽之存在會降低内毒素移除 之效力’以致與當不存在鹽時所獲得之< 〇 _之心 之内毒素含量相比，包括鹽之該步驟之後的典型含量經量 測為 5 8 E U / m 1。 蛋白質表徵： 使用電嘴霧質譜、胺基末端測序及等電聚焦表徵由㈣ 酵罐運仃所產生之物f的_致性，且使用⑽-削e、 SEC及Gele。㈣蛋白染色套組（pi⑽）表徵純度。 一致性： 131415.doc -107- 200907128 各蛋白質之第一個5殘基之胺基末端序列分析係如所預 期（EVQLL··.)。使用 C4 Zip 尖頭（Millipore)斟 p 检保 / ^己叛衝液交 換於含有辦醋酸之50:50 H2〇:乙腈中之蛋白質樣品 執行質譜分析。對於三種蛋白質中每一種所量測到的質量 當允許因形成内部雙硫鍵而產生之_2的質量差時係在美於 一級胺基酸序列之理論質量（使用平均質量計算）之〇 / 、 範圍内。使用IEF基於對於各蛋白質為不同之…鑑別5蛋^ 質。 (純度： 將三種蛋白質以1叫及Π)叫之量一式兩份裝載於非還原 SDS-PAGE凝膠上。在所有情況下，觀察到單一條帶。亦 執行尺寸排阻層析以顯示純度級。對於尺寸排阻層析 (SEC)，將1〇〇叫各蛋白質裝載於T〇s〇H G2〇〇〇 8〜乂匕管 柱上，在〇.5ml/min下流動。移動相為pBs/i〇%乙醇。 研究dAb穩定性用於候選物選擇： ( '對於⑶PD適應症，將有必要（例如）使用喷霧器裝置傳 遞dAb至肺中。此將意謂視所使用之喷霧器類型而定蛋白 質可潛在經歷一定範圍之剪切應力及熱應力且在肺環境下 可經受蛋白酶酶促降解。已確定若蛋白質可使用該類型之 裳置傳4則其形成適當粒度分布且在喷霧器傳遞後保留 2能。因此’力究各分子對一定範圍之物理應力之固有穩 疋！·生X $定扣不基線穩定性及最敏感穩定性之檢定。因為 各蛋白質之穩定性將依賴於各蛋白質溶解於其中之緩衝溶 液’所以—些預調配研究為必需的。該諸如緩衝液、阳值 131415.doc 200907128 之資訊亦適用於理解下游純化過程及隨後儲存期間蛋白質 之穩定性。為表徵曝露於一定範圍之物理應力期間分子之 變化，使用大量分析技術，諸如尺寸排阻層析（SEC)、 SDS-PAGE及等電點聚焦（IEF)。 DOM1H-131-202、DOM1H-131-511 及 DOM1H-131-206 之蛋 白酶穩定性之評定： 在過量蛋白酶中預培養規定時點後由BIAcore™分析殘 餘結合活性評定 DOM1H-131-202、DOM1H-131-511 及 DOM1H-13 1-206之蛋白酶穩定性。將約14〇〇 RU經生物素 標s己TNTR1塗佈於抗生蛋白鏈菌素（sa)晶片上。在3〇°C下 使 250 nM DOM1H-131-202、DOMIH-I3 卜511 及 DOM1H- 131-206與僅PBS—起或與1〇〇 pg/mi膜蛋白酶、彈性蛋白 酶或白血球酶一起培養1、3及24小時。藉由添加蛋白酶抑 制劑混合物使反應停止。然後使用參考池扣除法（reference cell subtraction)使dAb/蛋白酶混合物穿過tnFRI塗佈晶 片。在每次注射循環之間用10 μ1 〇丨Μ甘胺酸（pH 2.2)使 晶片表面再生。相對於無蛋白酶之dAb結合，測定與蛋白 酶一起預培養結合人類TNFR1(在1〇秒内）之DOM1H-131-
202、DOM1H-131-511 及 DOM1H-131-206 的比例。在25°C 下進行BIAcoreTM運行。由三個獨立的實驗產生資料。條 形圖指示平均值且誤差棒指示結果之標準偏差（關於結 果，參見圖24)。 已發現，與 DOM1H-131-511相比’展示 DOM1H-131-202 及DOM1H-13 1-206具有較高胰蛋白酶、彈性蛋白酶或白血 131415.doc •109- 200907128 球酶蛋白質降解抗性。與DOM 1 Η-1 3 1 -5 11相比，DOM 1 H-13 1-202與DOM1H-13 1-206之間的差異在與胰蛋白酶一起1 小時後及與彈性蛋白酶或白血球酶一起3小時後最明顯。 如使用DSC所測定之熱穩定性： 為測定在何pH值下分子具有最大穩定性，使用差示掃描 量熱計（DSC)量測各dAb在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中之熔融 溫度（Τ„〇。當伯瑞坦-魯賓遜係由三組分緩衝液系統（乙酸 鹽、磷酸鹽及硼酸鹽）構成時，在同一溶液中有可能產生3-10範圍内之pH值。由蛋白質一級胺基酸序列確定理論pi。 由DSC，可見dAb具有最大内在熱穩定性之pH值對 DOM1H-131-202 (202)而言為 pH 7，對 DOM1H-131-206 (206)而言為 pH 7-7.5，且對 DOM1H-131-511 (511)而言為 pH 7.5。關於所有隨後應力及穩定性研究，對於各dAb使 用以下pH值：在伯瑞坦魯賓遜緩衝液中，對於DOM1H-131-202 (202)及 DOM1H-131-206 (206)，pH 7.0 ;且對於 DOM1H-131-511 (511)，pH 7.5。結果概述於下表 3 中： 表3 :如由DSC所測定於伯瑞坦·魯賓遜緩衝液中之1 nig/ml DOM1H-131-202 (202)、DOM1H-131-206 (206)及 DOM1H-131-511 (511)之 pH 值及 的概述 dAb 產生最大固有熱穩定性 之pH值 在給定pH值下dAb之 Tm (°〇 DOM1H-131-202 (202) 7.0 68.6 DOM 1H-131-206 (206) 7.0-7.5 65.8 DOM1H-131-511 (511) 7.5 58.0 固有溶解度測試： 131415.doc -110- 200907128 在離心Vivaspin濃縮器（5K截止點）中濃縮所有前導dAb 以4疋其最大;谷解度及濃縮後之回收含量。在伯瑞坦-魯 賓遜緩衝液中在最穩定pH值下執行實驗。經一定時程量測 樣品體積及濃度，且記錄與預期濃度之偏差以及樣品回收 百分率。 已發現，所有蛋白質均可在伯瑞坦_魯賓遜緩衝液中濃 縮至超過100 mg/m卜雖然與〇〇河出_〗31_511 (5U)相比， dom1H-131_202 (202)與 DOM1H_131_2〇6(2〇6)展示比預期 低之回收率，但仍在可接受之水準内。 前導dAb之喷霧器傳遞： 藉由測試不同噴霧器及調配物緩衝液，已證明dAb可使 用廣泛範圍之㈣裝置有效傳遞。更重要地，首次展示 ⑽於調配物緩衝液中之嘴霧產生有效肺傳遞想要之粒度 分布（使用<5 μιη之液滴之百分率進行比較），同時維持蛋 白質功能性。此進一步描述如下。 比較多種裝置中之效能： 在六個喷霧器裝置中測試D〇M1H_131_5u (511)，該六 個喷霧器裝置包含三個主要種類之液體調配物喷霧器（亦 即’超音喷霧器、喷射喷霧器及振網噴霧器）之每-類的 各兩個裝置。在各裝置中，在一定範圍之PEG濃度下，測 s § ml dAb。對於各樣品，使用心卜⑽s^aytek DeVlce (Malvern⑹㈣咖咖[㈤㈣，υκ)量測<5陣之液 t尺1之百分率且結果展示於圖35中。使用sec評定各樣 口口嘴務後之穩定性以分析已二聚於殘留在杯中及所收集之 131415.doc 200907128 氣霧劑中之物質中的樣品的量。結果可見於圖3 6中。二聚 體形成裎度越小，穩定性越高。 大多數裝置可傳遞40%或更多的適當尺寸範圍内之液體 調配物’但eFlow(振網喷霧器裝置）及pARI lC(喷射喷霧 器）裝置表現更佳’其中當緩衝液中包括PE(3時，PARI LC (生號）裝置傳遞超過8〇%。由eFi〇w亦觀察到因peg該 傳遞之增加’對於PARI LC+，程度較小。 重要地，亦發現，dAb之活性在噴霧後仍保留（參見圖8 中之結果）。 緩衝液添加劑之效應： 由於DOM1H-131-511 (511)之較低穩定性’ 50 mM磷酸鹽 調配物緩衝液含有PEG丨000與蔗糖（且具有定義為約等於 約2°/。至約1〇% pEG 1000於含有} 2% w/v蔗糖之5〇 mM磷酸 鹽緩衝液中之溶液黏度之範圍内的黏度）以有助於保護dAb 以免受剪切應力與熱應力。當DOM1H-131-202 (202)及 DOM1H-131-206 (206)具有較高Tm且展示顯著增加之熱應 力穩定性時，在原始調配物緩衝液中及伯瑞坦-魯賓遜緩 衝液（其具有比調配物缓衝液低之黏度）中測試所有分子。 在5 mg/ml之蛋白質濃度下在3.5分鐘之運行時間内在E_ flow 與 Pari LC+裝置中測試 dAb 且使用 Malvern Spraytek
Device測定粒度分布。作為比較，使用噴霧器裝置傳遞之 用於膀胱纖維化之市售藥物（命名為標準蛋白質χ)在其自 身調配物緩衝液中測試。結果展示於圖37中。為獲得良好 傳遞及於深肺中之分配，理想粒度小於6微米，例如<5 131415.doc -112- 200907128 (λγπ 〇所有dAb在伯搜本口 ^ ^ 端土--甘賓遜緩衝液與調配物緩衝液（如 先前所述）中均得$,丨，# π 于至】小於5 μιη之可比較級別之粒度。然 而，調配物緩衝液夕4JS古& A , u '、、、 巧饮之較尚黏度尤其可有利產生適當尺寸範 圍内之粒子，例如j ^ 5 μιη之粒子。在喷霧之前及之後由 α:8。量測法測定襄置之杯中_之濃度。已發現，蛋白質 /辰度並未顯著變化’指示蛋白質與媒劑在傳遞期間均不會 優先霧化。 結論： 如上所述，已證明諸如dAb之多肽可在大量市售喷霧器 心置中喷霧’且重要地，其在喷霧後保留穩定性及生物活 性，且喷霧後未觀察到顯著聚集。當向緩衝液調配物中添加 諸如PEG之黏度增強賦形劑時，粒度分布及小於5 μιη之液滴 尺寸百分率得以改良，因此潛在改良dAb至深肺之傳遞。 dAb至肺之傳遞亦可藉由增加dAb濃度、例如高達約40 mg/ml之濃度及傳遞時間來改良而無dAb穩定性或活性之 任何降低。 實例1 噬菌髏載體PDOM13 使用絲狀噬菌體（fd)呈現載體pDOM13。該載體與噬菌 體外殼蛋白III產生融合蛋白。圖1中說明PD0M13之多個 選殖位點。將編碼dAb之基因選殖為心/Ι/τΥσίΙ片段。 實例2 測試蛋白酶對具有一定範圍之胰蛋白酶抗性之噬菌體呈 現區域抗體（dAb)的選擇 131415.doc -113- 200907128 將編碼結合IL-1R1之dAb DOM4-130-54、結合TNFR1之 DOMlh-131-511 及結合 VEGFA 之 DOM15-10、DOM15-26 及 DOM15-26-501的基因選殖於pd〇M13中，且根據標準技術 產生可呈現該等dAb之噬菌體。噬菌體藉由Peg沈澱作用 純化，再懸浮於PBS中且測力價。 當以經分離蛋白質形式測試時，上述dAb展示一定範圍 之抗胰蛋白S#降解作用之能力《如下評定抗降解性：在 30°C下將40 pg/ml於PBS中之dAb (1 mg/mi)與胰蛋白酶一 起培養，產生25 (dAb):l(胰蛋白酶）之分子比。添加胰蛋 白酶之則立刻，且隨後在T= 1小時、3時間及24小時時採集 樣品（30 μΐ)。藉由添加R0che完全蛋白酶抑制劑中和蛋 白酶活性，接著浸入液氮中且儲存於乾冰上。隨後藉由在 Novex 10-20% Tricine凝膠上電泳分析15叫各^^^樣品， 且用SureBlue(lx)染色蛋白質。 第一個3小時期間，00河15_1〇與〇〇]^15_26_5〇1明顯地 被分解。DOM15-26、DOM4.130-54 及 DOMlh-131-511 較 穩定，其中dAb之分解僅在24小時後變得明顯（圖2)。 噬菌體呈現dAb亦培養於胰蛋白酶存在，以評估噬菌體 呈現dAb之胰蛋白酶抗性是否與由經分離可溶性所獲 得之結果相關。測試多種濃度之胰蛋白酶及培養時間。在 所有狀況下，用Roche完全蛋白酶抑制劑中和胰蛋白酶 後，測試噬菌體結合一般配位體：蛋白質A(其結合所有Vh 區域抗體（例如，DOMlh-131、DOM15-26、DOM15-26- 501))或蛋白質l(其結合所有νκ區域抗體（例如，D〇M4_ 131415.doc -114- 200907128 130-54、DOMl 5-10))之能力。亦測試噬菌體與靶抗原之結 合。在該兩種狀況下’認為結合與因經抗蛋白水解性保留 dAb結構完整性具有相關性。由ELISA(使用針對噬菌體之 接合抗體）或由溶離所結合之噬菌體及指數生長大腸桿菌 T G1細胞感染後進行力價分析來量測結合活性。 用 DOM15-10、DOM15-26及DOM15-26-501 測試噬菌體 在室溫下在一定範圍之胰蛋白酶濃度（1〇〇 M/如、 pg/ml及0 pg/ml)下，將各dAb處理1小時。用R〇che完全蛋 白酶抑制劑（lx)阻斷騰蛋白酶活性，且隨後將噬菌體稀釋 於PBS中之2% Marvell中，在室溫下與5〇 nM經生物素標記 抗原（重組人類VEGF (R & D systems))—起培養丨小時。添 加在室溫下用PBS中之2% Marvell預阻斷丨小時之抗生蛋白 鏈菌素塗佈微珠（Dynabeads M-280 (Invitrogen))，且隨後 在室溫下將混合物培養5分鐘。所有與Dynabeads 一起培養 之步驟均在轉輪上進行。藉由用i ml於pBs中之 Tween-20洗滌珠粒8次洗除未結合噬菌體。用〇.5 w 〇ι m 甘胺酸（卩^12.2)溶離所結合噬菌體且用1〇〇(^11^丁^_ HCL (pH 8.0)中和。使用溶離噬菌體感染指數生長之丁⑴ 細胞（在”。(:下丨小時）且塗鋪於四環素板上。在37。〇下將板 培養隔夜，且進行菌落計數（參見表4)。由與1〇〇吨化丨胰 蛋白酶-起培養之選擇觀察到最佳結果。與d〇mi5_i〇及 DOM15-26-5G1相比，D〇M15_26之產率增加約1〇倍。 進行第-實驗以在更苛刻培養條件下進―步證實該等結 果。在攪拌（250 rpm)下在3rc下將嗟菌冑呈現心處理卜卜 131415.doc -115- 200907128 時或2小時。由與100 gg/ml胰蛋白酶一起培養2小時之選擇 觀察到最佳結果。DOM15-26之產率比D〇M15_26_5〇1之產 率高200倍且比DOM15_1〇之產率高1〇〇〇倍。 在第二實驗中，開始時將呈現〇〇]^15_26及 之筮菌體1:1混合。隨後在攪拌（25〇印⑺）下在37。〇下在 有胰蛋白酶（1000 pg/ml)或無胰蛋白酶之情況下將其培養2 J、日守，且隨後如上所述就抗原結合加以選擇。測序來自各 f 選擇之10個菌落，對於無胰蛋白酶預處理之選擇，揭露純 系混合群體（DOM15-26:4/10 ; D〇Ml5-26-501:6/10)，而有 騰蛋白扭進行選擇之所有純系如所預期編碼DOM 1 5-26。 5亥等實驗指示選擇壓力可藉由向噬菌體呈現dAb中添加 蛋白酶來獲得，以致優先選擇呈現蛋白水解最穩定之dAb 之喔菌體（在淘選一般配位體或抗原之後）。 表4 實驗 垮養時間 長短 溫度 胰蛋白酶 濃度 DOM15-26 力價 DOM15-26-501力價 1:1混合 力償 DOM15-10 力價 1 lhr 室溫 100 pg/ml 1.6χ108 6.3xl07 l.lxio7 輪入101Q 1 hr 室温 10 pg/ml 3χ108 4.4x10s 2.4xl08 lhr 0 pg/ml 0.9xl08 2xl08 0.7x10s 1 hr，250 rpm 37〇C 100 pg/ml 2xl07 lxlO6 lxlO5 2 輸入1〇9 2 hr > 250 一 rpm 37〇C 100 μξ/ηύ lxlO7 6xl04 lxlO4 2 hr ， 250 rqm 37〇C 0 pg/ml 5.4xl07 4.1xl07 3xl08 3 輸入1010 2h，250rpm 37〇C 100 pg/ml 2.3x10s 8xl05 6.8χ107 2h > 250rpm 37〇C 0 pg/ml 3.9xl08 4.4xl08 4.8x10s1 131415.doc -116- 200907128 用DOM4-130-54測試噬菌想 以如上所述之類似方案測試D〇M4_13〇_54。變化之參數 為：胰蛋白酶之濃度、溫度及培養時間長短。針對IL_RI· Fc(IL-lRl與Fc之融合物）在！ nM於pBS中之濃度下進行生 物淘選。僅在37°C下使噬菌體與1〇〇 gg/mi胰蛋白酶一起培 養隔夜後才觀察到噬菌體力價之顯著降低（參見表5 )。
表5
用DOMlh-131測試噬菌體 在至'皿下用 〇 Pg/ml、10 pg/ml、100 pg/ml及 1 〇〇〇 pg /ml 胰蛋白酶處噬菌體（胺基酸序列與〇〇]^丨^ 1 3 1 511役切相關）1小時。藉由添加25 X完全蛋白酶抑制劑 (R〇Che)抑制分解。沿著塗佈有1 nM TNFR1之EUSA板進 仃噬囷體之2倍連續稀釋，且用抗M13_HRp偵測結合噬菌 體。結果展示下表6中。 I3I415.doc 200907128 26-555)。 藉由以PEG雙重沈澱製備噬菌體庫且再懸浮於pBs中。 胺基酸突變率對DOMlh-131-511及DOM4-130-54譜系、@ 言分別為2.3及4.4。藉由在噬菌體ELISA中使用塗佈有蛋 白質A或蛋白質L (1 pg/ml)之孔測試96個純系評定功能性。 在 DOM1 h-1 3 1 - 5 11 及 DOM4 -1 30-54 譜系中分別有 62.50/〇 及 27%之純系展示功能性呈現dAb。 胺基酸突變率對DOM1 5-10及DOM1 5-26-555譜系而言分 別為2.5及4.6。藉由在噬菌體ELISA中使用塗佈有蛋白質a 或蛋白質L (1 pg/ml)之孔測試96個純系來評定功能性。在 DOM15-10及 DOM15-26-55 5譜系中分別有 3 1.3〇/〇及 1〇.4〇/0之 純系展示功能性呈現dAb。 DOM4-130-54及 D〇Mlh-131-511 譜系 對該等庫進行4輪選擇以選擇具有改良蛋白酶抗性之 dAb。 第1輪選擇係抗原結合（1 nM*10 nM抗原）而無蛋白酶處 理從而淨化庫以移除不再以高親和力結合抗原之任何純 系。第1輪之輸出係在1〇8-1〇1〇範圍内（與1〇"噬菌體之輸入 形成對比），^曰示庫之大部分以高親和力結合抗原。 在第2輪中引入1〇〇 μg/ml胰蛋白酶之蛋白酶處理，且輸 出展示於下表7中： 131415.doc -119- 200907128 表7 氣蛋白酶培養條~^ DOMlh-131-511 庫 DOM4-130-54庫 37°C隔夜 1.86χ106 2.1xl〇6 37°C，2小時 4.8x10s 5.1xl〇8 室溫，2小時 1.2xlOy ί62χ109 無騰蛋白酶 約 lxlOy 約 4x109 無抗原 1.8xl04 <6x1 〇3 當在37°C下用胰蛋白酶處理dAb隔夜時，存在顯著選 擇。將該輸出物送至第3輪，其中在37。〇下用1 mg/mi或 100 pg/ml胰蛋白酶處理噬菌體24小時。來自第3輪之經胰 蛋白酶處理過之噬菌體的力價對D〇Mlh-131-511譜系而言 為 105-1 06且對0〇]\44-130-154譜系而言為107-1〇8。 來自第3輪之所有輸出物（DOMlh-131-511及DOM4-130-154’ 1 mg/ml及1〇〇 4§/1111)在1〇() gg/ml騰蛋白酶下經受針 對1 nM抗原之第4輪選擇。類似於第3輪中所見，力價係在 ιο6-ιο8範圍内。對於DOMlh_131_511譜系可見—些富集， 而對於DOM4-130-54譜系無富集。 DOM15-10及 DOM1S-26-555譜系 第1輪選擇係用2 nM經生物素標記hVEGF(人類血管内皮 生長因子）濃縮物來進行而無蛋白酶處理從而淨化庫以移 除不再以高親和力結合抗原之任何純系。第1輪之輸出為 約 10 (與 DOM15-1〇2 1〇〗〇噬菌體及 D〇M15_26_555 < 1〇"噬 菌體之輸入形成對比）’指示庫之大部分以高親和力結合 抗原。 用2 nM經生物素標記hVEGF執行第2及第3輪選擇。在對 131415.doc 200907128 hVEGF、淘選之前，在37°C下在震盪IS(25G fPm)中在騰蛋白 酶（100 Hg/ml)存在下培養噬菌體。培養時間對D〇M15]〇 譜系而言為1小時且對D〇M15_26_555譜系而言2小時。 輸出如下：D〇M15_10譜系之第2及第3輪選擇為ΐ5χΐ〇6 及9xl05 ; DOM1 5-26-555之第2及第3輪選擇為2 2χ1〇8及 3.9χ 1〇9 = 實例4 分析選擇輸出物：DOM4-130-54及DOMlh-131-511譜系 將來自第3及第4輪之所有輸出物亞選殖MpD〇M5載體中 且轉型於JM83細胞中。pD〇M5載體為pUCl 19基載體。由 PUC啟動子驅動蛋白質之表現。GAS1前導序列（參見w〇 2005/093074)確保經分離可溶性dAb分泌於大腸桿菌jM83 之周質及培養上清液中。隨機挑選96個及72個來自第3輪 及第4輪之個體菌落來表現。 對第3輪及第4輪輸出物之各12_24個純系進行測序。在 該兩輪選擇中觀察到一致突變且挑選約25個持有一致基序 (consensus m〇tif)之純系來進一步表徵。該等純系之胺基 酸序列展示於圖3 (DOMlh_131_511m選擇之變異體）及圊4 …◦刚-:^^所選擇之變異體彡中且以腿八序列形式列於 圖19A-1 9L中。突出所選擇之純系中不同於親本序列的胺 基酸（彼等一致胺基酸由點標記）。對應於CDRi、CDR2及 CDR3之環用框勾畫。 該等純系係以大量表現，在蛋白質L(就D〇M4-130-54變 異體而言）及蛋白質A(就DOMlh-1 31-511變異體而言）上純 131415.doc -121 - 200907128 化且在存在或不存在胰蛋白 1Λ 啤1玟終濃度為100 pg/ml或 1000 pg/ml)之情況下在37。 从人、 卜σ養1小時或隔夜後就抗原 、·口 口以BIAcore方式測試。 來 系保 時， 自 DOM4-130-54選擇 留胰蛋白酶抗性1小 來自 DOMlh-131-511 而無純糸抗騰蛋白酶隔夜。 之輸出物通常較穩定，大多數純 蚧且最佳純系保留隔夜。比較而 選擇之少量純系抗胰蛋白酶1小 實例5 Γ
分析選擇輸出物：D〇Mls鐵_ΐ5 Μ说譜系 首先以單株喧菌體ELISA方式在存在或不存在騰蛋白酶 分解之情況下測試經騰蛋白酶預處理之選擇有效性。挑選 ★庫之來自第2輪選擇之18個菌落及來自第3輪選擇之^個 菌落。使用純系 D0M15_1()、d〇m15_26_5(^d〇mi5_26 作為對照。其他對照包括第2及&輪騰蛋白酶選擇後來自 各庫之擴增且純化的噬菌體溶液。 將各嗟菌體樣品分為兩部分，第一部分用1〇〇畔⑻姨蛋 白酶處理，第二部分不用胰蛋白酶處理。在37。(：下在攪拌 ⑽㈣下將編部㈣ 全蛋白酶抑制劑（1 X)阻斷。 使用經胰蛋白酶分解及未經分解樣品執行噬菌體 ELISA。使ELISA孔塗佈有濃度為i gg/mi之於〇1 M碳酸氫 鹽緩衝液中之中性鏈親和素。用pBS進行洗滌及在室溫下 用1%於PBS中之Tween-20阻斷抗原塗佈孔1小時之步驟 後’使孔塗佈有濃度為丨〇〇 ng/mi之稀釋於於pBs中之 131415.doc -122- 200907128
Tween-20中的經生物素標記hVEGF。接著，用PBS洗務各 孔且添加用1 % Tween-20/PBS 1:1稀釋之經處理或未經處理 之噬菌體上清液。在3 7°C下培養3 0分鐘後，用1 % Tween-20/PBS洗滌孔，接著在37°C下與抗M13噬菌體-HRP接合物 (1/5000稀釋於1% Tween-20/PBS中）一起培養30分鐘。隨後 用PBS及過氧化酶洗務孔。藉由添加SureBlue試劑啓始反 應。約10分鐘後，用等效體積1 M HC1使反應停止，且在 OD45O ηΜ下讀取孑匕。 經胰蛋白酶處理之不穩定對照DOM15-10及DOM15-26-501之ELIS Α讀數給出低於0.404之OD45()，且認為該值為不 穩定純系之邊界值。產生低於0.404之OD之所有樣品視為 不穩定。超過彼值之所有樣品視為穩定。 表8 庫 胰蛋白酶 無胰蛋白酶 第2輪選擇 第3輪選擇 第2輪選擇 第3輪選擇 DOM15-10 33% 89% 100% 100% DOM15-26-555 94.4% 100% 100% 100% 表8展示各庫之第2及第3輪胰蛋白酶選擇後穩定純系之 百分率。第3輪選擇後，該兩個庫中可見胰蛋白酶抗性純 系之富集。在各狀況下，胰蛋白酶分解後，每次選擇後含 有擴增純化噬菌體混合物之對照ELIS A孔之值大大高於 0.404。此外，當比較來自第3輪選擇之胰蛋白酶處理噬菌 體與來自第2輪選擇之胰蛋白酶處理噬菌體時，觀察到信 號小幅增加。DOM1 5-10噬菌體庫展示該起始值之約14% 131415.doc -123 - 200907128 之增加。ΙΧ)Μ15·26_555 μ體庫展示代表該起始值之約 2 %之增加。 所有該等結果展示經胰蛋白酶預處理之選擇係有效自 DOM1 5-10及DOM1 5-26-555譜系選擇胰蛋白酶抗性嗟菌體 純系。 將來自第2及第3輪選擇（D〇M 15-26-555)及僅來自第3浐 選擇（DOM15-10)之所有輸出物亞選殖於？]〇〇1^5載體中且 轉型於ΗΒ2151電穿孔法勝任細胞（eiectr〇c〇mpetent wU) 中。pD〇M5載體為pUC119基載體。由心啟動子驅動蛋白 質表現。GAS1前導序列確保經分離可溶性dAb分泌於大腸 桿菌HB2 1 5 1之周質及培養上清液中。隨機挑選丨84個來自 各輪選擇（3及4)之個體集落來在丨ml培養物體積中表現。 將細菌上清液稀釋於HBS-EP BIAcore緩衝液（丨：丨體積比） 中且分成兩份。僅向一個小瓶中添加胰蛋白酶，最終濃度 為20 pg/ml。在攪拌（250 rpm)下在37〇c下培養4〇分鐘。用 Roche完全蛋白酶抑制劑（lx)阻斷反應後，在BUc〇re 3〇〇〇 上就抗原結合（SA感應器晶片上之2,〇〇〇 Ru經生物素標記 hVEGF)測試經胰蛋白酶處理與未經處理之噬菌體上清 液。 挑選純系之標準為：相對於未經處理之dAb，<〗5%之經 胰蛋白Sf：處理之d A b的抗原結合減小（基於在所選擇之時點 所達到之最大RU) ’此通常將反映dAb對蛋白酶處理之穩 疋性，及dAb自抗原解離期間，兩個時點之間的解離速率 減小<40%。基於該等值，對6〇個來自D〇M15_26_555庫之 131415.doc •124- 200907128 第2與第3輪選擇之純系及17個來自DOM 15-10庫之第3幹選 擇之屯系進行測序。在該兩個庫之輸出物中觀察到一致突 變’且自各持有一致基序之庫挑選17個純系來進—步表 徵。該等純系之胺基酸序列展示於圖5 (D〇Ml5_26_555所 選擇之變異體）及圖6 (DOM15-10所選擇之變異體）中，且 以DNA序列形式列於圖2〇A_2〇E中。突出所選擇之純系中 不同於親本序列之胺基酸（彼等一致胺基酸由點標記）。對 應於CDR1、CDR2及CDR3之環由框勾晝。 將该等純系表現於50 ml表現培養物中，在稀釋於hbs_ EP緩衝液中至1〇〇 nM濃度之蛋白質A(就〇〇河15_26_555變 異體而言）或蛋白質L(就DOM1 5-10變異體而言）上純化且在 存在或不存在胰蛋白酶（最終濃度為20 pg/ml)之情況下在 攪拌（250 rpm)下在37°C下培養1.5小時後就抗原結合以 BIAcore方式測試。 亦使用實例2中所述之方法測試該等純系胰蛋白酶抗 性。將蛋白質緩衝液交換至PBS中且濃縮至1 mg/ml。將25 Mg蛋白質與1 pg騰蛋白酶（Promega)混合且在30°C下培養0 小時及24小時。此後，用R0Che完全蛋白酶抑制劑（1 X)阻 斷反應’且添加DTT以及增重劑（loading agent)。使樣品在 100°C下變性5分鐘。隨後由電泳在Novex 10-20% Tricine凝 膠上分析15 各樣品，且用SureBlue(lx)染色蛋白質。 來自DOM1 5-26-555選擇之輸出物通常較穩定，當以 BIAcore方式測試時大多數純系保留胰蛋白酶抗性1.5小 時，且當以SDS-PAGE方式運行時，保留隔夜。相比較而 131415.doc -125- 200907128 & ’當以SDS-PAGE方式運行時，斜认 μ呵對於隔促處理，僅少量 來自DOM15-10選擇之純系抗胰蛋白酶。 實例6 鑑別DOMlh-131-511變異想 更詳細地分析 DOMlh-l31_203、D〇Mlh_131_2〇4 及 DOMlh-131-206。在37°C下與不同濃度之騰蛋白酶（在〇至 100 pg/ml範圍内）一起培養隔夜後，以BIAc〇re方式在5〇〇 nM之dAb濃度下將其加以比較。mAc〇re迹線展示於圖7 中。結果顯然展示在高濃度胰蛋白酶（100 μ§/ηιι)下該兩個 變異體比其親本對蛋白水解更具抗性。亦在上述條件下就 抗大量包括白血球酶、彈性蛋白酶及胰酶之其他蛋白酶而 言，在100 pg/ml之蛋白酶濃度下，比較兩個dAb D〇Mlh_ 13 1-202及DOMlh-13 1-206與其親本。與親本相比，dAb抗 所有所測試之蛋白酶之蛋白水解展示增加之抗性。彈性蛋 白酶及白血球酶之BIAcore迹線展示於圖8中。 用100 pg/ml測序級胰蛋白酶處理5 μΜ各dAb 〇、1、3及 24小時。用25xR〇che完全蛋白酶抑制劑抑制反應，且使反 應物在4-12% Novex Bis-Tris凝膠上運行。凝膠展示於圖9 中〇 實例7 鑑別DOM4-130-54變異艘 更詳細地分析 DOM4-130-201 及 DOM4-130-202。在 37。〇 下與不同濃度之胰蛋白酶（在〇與100 pg/ml範圍内）一起培 養隔夜後’以BIAcore方式在500 nM之dAb濃度下將其加以 131415.doc -126- 200907128 比較。BIAcore迹線展示於圖1 0中。結果顯然展示在高濃 度胰蛋白酶（100 pg/ml)下所有三個變異體比其親本對蛋白 水解更具抗性。亦在上述條件下就抗大量包括白血球酶、 彈性蛋白酶及胰酶之其他蛋白酶而言，在100 pg/ml之蛋白 酶濃度下，比較DOM4-130-201及DOM4-130-202與親本。 雖然結果與在胰蛋白酶下相比不太明顯，但前導dAb與親 本相比對所有所測試之蛋白酶展示增加之抗蛋白水解性。 彈性蛋白酶及白血球酶之BIAcore迹線展示於圖11中。 用1 00 pg/ml測序級胰蛋白酶處理5 μΜ各dAb 0、1、3及 24小時。用25 XRoche完全蛋白酶抑制劑抑制反應，且使反應 物在4-12%NovexBis-Tris凝膠上運行。凝膠展示於圖9中。 實例8 進一步表徵〇〇1\!111-131-511及〇〇]\14-130-54變異體 首先使用差示掃描量熱法（DSC)分析dAb以確定胰蛋白 酶抗性之增加是否與溶融溫度（Tm)之增加相關。胰蛋白酶 穩定性之增加確實與Tm之增加相關（參見表9)。 表9 名稱 Tm(°C) DOMlh-131-511 57.9 DOMlh-131-202 67.5 DOMlh-131-203 65.7 DOMlh-131-204 62.3 DOMlh-131-206 64.9 DOM4-130-54 54.1 DOM4-130-201 64.7 DOM4-130-202 64.5 131415.doc -127- 200907128 亦在MRC-5細胞基檢定（cell-based assay)中比較DOMlh-13 1-511來源之dAb(參見表10)。在該檢定中，量測dAb中 和TNFa刺激之IL-8釋放之能力以確定胰蛋白酶穩定性之增 加是否已使得功效降低。然而，姨蛋白酶抗性dAb之活性 在該檢定中大體上未受影響。 表10 樣品 ND50 (nM) DOMlh-131-511 1.98 DOMlh-131-511 1.71 DOMlh-131-511 (230307CE) 1.89 DOM lh-131-203 (230307CE) 2.28 DOMlh-131-204 (230307CE) 1.89 DOMlh-131-511 1.46 DOMlh-131-206 (230307CE) 0.71 在受體結合檢定中測試DOM4-130-54來源之dAb以瞭解 其是否仍具有相同的抑制IL-1與IL-RI結合之能力（參見表 11)。胰蛋白酶抗性dAb之活性在該檢定中未受影響。 表11
dAb IC50 (nM) DOM4-130-54 280 pM DOM4-130-201 257 pM DOM4-130-202 254 pM 實例9 鑑別DOM15-26-555變異體 更詳細地分析 DOM15-26-588、DOM15-26-589、 DOM1 5-26-591及DOM15-26-593以及其親本及兩個其他 dAb DOM15-26-594及DOM15-26-595，其係藉由組合將對 131415.doc -128· 200907128 效價及穩定性產生最大影響之突變（E6V及F100S/I)之突變 誘發而創建。序列展示於圖12中。與濃度為200 pg/ml之胰 蛋白酶一起培養後在1〇0 nM之dAb濃度下就hVEGF結合以 BIAcore方式比較純系。在攪拌（25〇 rpm)下在37〇c下使反 應進行3小時及24小時。最佳純系DOM15-26-593及親本之 BIAcore迹線展示於圖13中。其他結果以圖表形式呈示於 圖14中。結果顯然展示在胰蛋白酶處理24小時後，所有變 異體比親本對蛋白水解更具抗性。 f . 亦藉由以SDS-PAGE方式運行經處理及未經處理之樣品 來檢查DOM15-26-593及親本之胰蛋白酶抗性。簡言之， 將蛋白質緩衝液交換至PBS中且濃縮至1 mg/ml。將25 pg 蛋白貝與1 pg測序級胰蛋白酶（pr〇rnega)混合且在3〇。〇下培 養0小時、1小時、3小時及24小時。此後，用R0che完全蛋 白酶抑制劑（1 X)阻斷反應，且添加DTT以及增重劑。使樣 品在1〇〇t：下變性5分鐘。將15 各樣品加載於N〇vex 10_ 《 2〇/。Tn<?lne凝膠上，且用SureBlue (lx)染色蛋白質。結果 展示於圖15中。該實驗中D〇M15_26_593之胰蛋白酶抗性 概況不同於BIAcore實驗所展示之概況，從而提示反應條 件之不同可能會影響胰蛋白酶裂解之最終結果。儘管如 此士下文所示，D〇M 15-26-593仍具有較其他所選擇之 純系佳之生物物理性質以及親和力。D〇Mi5_26_555變異 體之性質之概述亦展示於下表12中。 13I415.doc -129- 200907128 表12 屬性 ~_~----- SEC-MALLS DSC RBA BIAcore .胰蛋白' dAb 單體％ 估算mw Tm(°C) nM KD(nM) ———-—一 ^ j 土 在 15-26 0 37-136 64 10 28.2 30 ~~---- 15-26-501 0-40 18-290 51 1.14 9.1 5 -— 15-26-555 0 28-78 63 11.7 26.1 10 ~~~~---- 15-26-588 10 33 70 27 59.1 15 ---- 15-26-589 90 17 63 1.94 9.6 65 ----- 15-26-591 20 21-234 63 16 38 35-*---- 15-26-593 80 17 65 0.323 3.2 80 ~--—- 15-26-595 17 65 0.828 5 70 ~~~~— 實例10 鑑別DOM15-10變異體 更詳細地分析DOM15-10-11以及其親本DOM15-10。序 列展示於圖16中。與濃度為200 pg/ml之騰蛋白酶一起培養 後在100 nM之dAb濃度下就hVEGF結合以BIAcore方式比較 dAb。在攪拌（250 rpm)下在37°C下使反應進行1小時、3小 時及24小時。該等dAb之BIAcore迹線展示於圖17中。结果 顯然展示在姨蛋白酶處理2 4小時後，所選擇之變異體比親 本對蛋白水解更具抗性。 亦藉由運行SDS-PAGE之經處理及未經處理之樣品檢查 前導分子及親本之胰蛋白酶抗性。簡言之，將蛋白質緩衝 液交換至PBS中且濃縮至1 mg/ml。將25 pg蛋白質與i畔 測序級胰蛋白酶（Promega)混合且在3(TC下培養〇小時、w、 時、3小時及24小時。此後’用Roche完全蛋白酶抑制劑 (lx)阻斷反應，且添加DTT以及增重劑。使樣品在i〇〇t：下 變性5分鐘。將1 5 pg各樣品加載於Novex 1 0-20% Tricine凝 1314l5.doc •130· 200907128 膠上’且用SureBlue (lx)染色蛋白質。結果呈示於圖18 中。在此狀況下’胰蛋白酶抗性概況與BIAcore胰蛋白酶 測試充分相關，從而展示結合活性直接反映蛋白質之完整 性。 實例11 進一步表徵DOM15-26-555及DOM15-10變異艘 首先使用差示掃描量熱法（DSC)分析dAb以確定騰蛋白 酶抗性之增加是否與T m之增加相關。結果展示於表！ 3 中。DOM1 5-26-555變異體之胰蛋白酶抗性與熔融溫度之 間存在相關性。前導DOM15-26-588及DOM15-26-593展示 改良之T m，但其他純系不展示。值得注意的是，雖然起 始時 DOM1 5-26-555 及 DOM15-10親本分子（63.3-63.7。〇具 有比DOM4-13 0-54及DOMlh-131-511親本分子（起始時 Tm : 57.9-54.TC)高得多之Tm，但總之，蛋白酶抗性純系 達到類似範圍内之Tm (DOMlh-13 1-511/DOM4-130-54變異 體之平均 Tm 為 65.1°C，DOM15-26-55/DOM15-10 變異體之 平均丁m為 64.9°C)。 表13 名稱 Tm (°〇 D0M 15-26-555 63.3 DOM15-26-588 70.1 DOM15-26-589 63 DOM15-26-591 63 DOM15-26-593 65 DOM15-10 63.7 DOM15-10-11 63.3 1314l5.doc -131 - 200907128 在受體結合檢定中比較dAb，且量測BIAcore動力學以確 定胰蛋白酶穩定性之增加是否已使得功效降低。然而， dAb之活性在該檢定中大體上未受影響或甚至得以改良。 結果呈示於表14中。 表14 純系ID EC5〇(nM) KD(nM) DOM15-26-555 11.7 26.1 DOM15-26-588 27 59.1 DOM15-26-589 1.94 9.6 DOM15-26-591 16 38 DOM15-26-593 0.323 3.2 DOM15-26-594 4.09 15.1 DOM15-26-595 0.828 5 DOM15-10 10.23 23.6 DOM15-10-11 3.58 14.6
Tm增加之優點 大多數蛋白質（包括區域抗體）以兩種狀態存在：摺疊狀 態（產生生物學活性分子）及展開狀態（不具有功能活性）。 該兩種狀態在所有溫度下共存且各狀態之相對比例通常由 隨摺疊及展開之動力學常數而變之常數K確定。熔融溫度 通常定義為κ=1之溫度，亦即，摺疊蛋白質之比例等於展 開蛋白質之比例時的溫度。常數K係由蛋白質之穩定及不 穩定分子内相互作用確定，且因此主要由蛋白質之胺基酸 序列確定。諸如溫度、pH值、緩衝液組成、壓力之外在參 數影響K，且因此影響熔融溫度。 展開蛋白質為降解機制之容易靶：（i)曝露雙硫鍵視境況 而定會增加氧化或減小之風險，（Π)增加主鏈靈活性可有 助於自身蛋白水解反應，（iii)曝露肽片段可提供活體内蛋 131415.doc -132- 200907128 白酶、製造過程期間蛋白 留蛋白酶之革巴，及長期儲存期間遺 聚集及蛋白L: 有聚集傾向片段會導致分子間 « 又在所有狀況下，發生蛋白質完整性、 蛋白質含量及蛋白質 性，f生知失，從而危及⑴確保批次重現 *子放長期穩定性及(出)活體内功效之努力。 行且=界中，蛋白質已藉由進化設計以適於在體溫下執 仃且，，，工由穩態機制容 Η置換。經由生物技術方法製造出 义，口療蛋白質面對不同罗 來宿主n H其通常由DNA重組技術在外 中’在大容器中以較高量表現，整個下游過程 度儲二 之阳值或緩衝液組成變化且最後長期以高濃 2子I生理學緩衝液中。新賴傳遞技術（例如吸入、 5 k傳遞奈米粒子）亦會增加治療蛋白質所經 後，蛋白^程化技術之出現使得可產生增 強或元王新穎之治療蛋白。 A ^ ^ 、 因為大夕數工程化技術為旨 1或創造新賴胺基酸序列之基於活體外之技術，不會 ί 發生逐步改良生物蛋白質之推於、两4 貝之進化過程，因而產生在應力抗 生方面具有次最佳效能之蛋白質。 ，發明之技術旨在再現整個達爾文進化(― e: U:n)中蛋白質所面對之條件中之一種。用在組織重 蛋白質穩態中發揮重要作用之蛋白酶灌注肽或多肽 (例如免疫球蛋白單_ 、 早 了·文&域）。亦測試任何可產生具有 良之力此適應之蛋白質的特定突變的適應其表現環境之 能力。在本發明之一實施例中，再現該過程：建立肽或多 肽變異體譜系且曝露於蛋白酶中。在第二步驟中，使變異 131415.doc -133- 200907128 體譜系與特定靶接觸。僅彼等經受住蛋白酶降解之蛋白質 變異體能夠與靶接合，且因此（例如）由稱為‘淘選’之簡單 親和力純化過程回收。與活體内過程相比，該系統提供多 個優點：蛋白質譜系可面對較寬範圍之條件，例如多種蛋 白酶、在較高濃度下、歷時較長時間、在不同緩衝液或pH 值下且在不同溫度下。因此，該活體外技術提供一種設計 可在較所起源之環境範圍寬之環境中表現且仍穩定的蛋白 質之方式。顯然，此為生物技術工業且尤其治療蛋白質領 域提供多個優點。 實例12 :蛋白酶抗性前導分子之PK相關性資料 進一步在活體内評估四個dAb品系中之每一個品系之親 本dAb及蛋白酶抗性dAb(關於清單及詳情，參見下表15)。 表15 : 品糸 dAb ID 胰蛋白酶 抗性 Tm CC) 活性(nM) Fc融合物 形式之ID DOM4-130 DOM4-130-54 良好 54 0.128* DMS1541 DOM4-130-202 極南 64 0.160* DMS1542 DOMlh- 131 DOMlh-131-511 良好 57 0.0481· DMS1543 DOMlh-131-206 極南 64 0.047t DMS1544 DOM15-10 DOM15-10 低 64 0.913f DMS1546 DOM15-10-11 向 63 0.5771 DMS1531 DOM15-26 DOM15-26-501(*) 低 52 0.33〇t DMS1545 DOM15-26-593 高 65 0.033t DMS1529 * :如由MRC5/IL-a生物檢定所測定；t :如由RBA檢定所測定 註解：DOM15-26-501為本專利申請案中上文所例示之 DOM15-26-555 之親本形式。D0M15-26-555 在 CDR1(134M) 中具有一個生殖系胺基酸突變。DOM15-26-501具有比 131415.doc -134- 200907128 DOMl 5-26-555低之熔融溫度（52°C對63.3°C)及增加之對胰 蛋白酶之分解的敏感性。優於DOM15-26-555挑選DOM15-26-501用於PK研究，因為與D0M15-26-593相比，其更充 分代表不良穩定性。 吾人可如下解釋抗性： 1 低 2 中 3 良好 ( 4高 5 極高 則此意謂親本分子之胰蛋白酶抗性為： DOM4-130-54 良好 DOMlh-131-511 良好 DOM15-10 低 DOM15-26-501 低 關於所選擇之前導分子： DOM4-130-202 極高 DOMlh-131-206 極高 DOM15-10-11 高 DOM15-26-593 高 因為區域抗體之尺寸小（12-1 5 kDa)，所以其在靜脈内或 皮下注射後自循環中快速清除。實際上，腎絲球過濾截止 點超過50 kDa，且因此諸如dAb之小蛋白質當其穿過腎時 不會保留在循環中。因此，為評估活體内蛋白酶抗性之長 131415.doc -135 - 200907128 期效應，
及肝細胞中且涉及延長抗體及白蛋白 之壽命：實際上，在 抗體及其他血清蛋白之胞飲作用I，蛋白質係引導至酸化 核内體’纟中FcRn受體在抗體轉運至核内體且使其返回至 循環中之前截取抗體（經由與^部分結合）。因此，藉由使 Fc部分標記於dAb，確保dAb將長期曝露於至少兩個隔 至 血，月及别核内體隔室（pre-endosomal compartment) 中，其各自含有一組特定蛋白水解酶。另外，FcRn受體介 導之穿胞作用（transcytosis)，藉此使攜帶Fc之蛋白質遷至 及遷出血管外空間。 藉由經由短介入肽連接子（粗體）使編碼VH及Vk dAb之 基因與編碼人類IgGl Fc之基因融合實現用Fc編排格式： 對於VH dAb(加下劃線）： EVQ•…GQGTLVTVSSASTHTCPPCPAPELLGGP.. (hlgG IFc).. .PGK* 對Vk dAb(加下劃線）：
DIQ.........GQGTKVEIKRTVAAPSTHTCPPCPAPELLGGP...(hlgGlFc). .P GK* 根據標準方案使用293-fectin(Invitrogen)藉由瞬時轉染 131415.doc •136· 200907128 HEK293/6E細胞產生物質。該等細胞係經設計以當與ρΤΤ 系列載體組合使用時高含量瞬時表現（Durocher等人， 2002)。因此，將dAb基因選殖於經修改pTT5載體 (pDOM38)中以產生Fc融合物表現載體（參見圖21)。在轉染 後5天收集轉染細胞之上清液，藉由離心澄清且經〇 . 2 μη1 過濾器過濾。藉由捕獲於蛋白質Α流線型樹脂（GE Healthcare)上純化dAb-Fc融合蛋白。以10 mM檸檬酸納 (pH 3)自管柱中溶離蛋白質，接著添加…及1 μ檸檬酸鈉 (pH 6)以達到1〇〇 mM擰檬酸鈉（ΡΗ 6)之最終組成。 就活體内半衰期在大鼠中以於雌性Sprague-Dawley大鼠 (每組n=3)中5 mg/kg之靶劑量測試dAb-Fc分子。應注意， 把劑量大大超過大鼠中之靶濃度’所以預期親本dAb與胰 蛋白酶抗性dAb之間的親和力差異（參見實例1丨）不會影響 活體内分子之最終結果。因此，希望dAb之間的ρκ概況之 差異歸咎於抗原獨立性排除過程。 在投藥後 0.03、1、4、8、24、48、72、96、120及 168 小時採集血樣。凝塊形成後，抽出血清且隨後在hIL_ 1R1、TNFR1或VEGF抗原捕獲檢定中測試。 hIL-lRl抗原捕獲檢定： 塗佈有 4 pg/rnL 抗 hIL-lRl 阻斷 添加 500 ng/mL shIL-lRl 添加樣品 在1:10,000下用抗人類Fc HRP偵測 131415.doc -137- 200907128 TNFR1抗原捕獲檢定： 塗佈有 0.1 pg/mL sTNFRl 阻斷 添加樣品 在1:10,000下用抗人類Fc HRP偵測 VEGF抗原捕獲檢定： 塗佈有 0.25 pg/mL VEGF 阻斷 添加樣品 在1:10,000下用抗人類Fc HRP偵測 使檢定之原始資料轉化為各血清樣品中之藥物之濃度。 隨後在WinNonLin中使用非隔室分析（non-compartmental analysis，NCA)分析各時點之平均pg/mL值。各dAb-Fc對 之PK概況展示於表1 6中，其概述所測出之PK參數。 表16 : ID dAb 半衰期(hr) AUC/D{0-inf) (hr* pg/mL)/(mg/kg) 外推 AUC% DMS1541 4-130-54 93.2 691.5 22.7 DMS1542 4-130-202 176.8 710.1 49 DMS1543 lh-131-511 140.8 1807.5 40 DMS1544 lh-131-206 158.6 2173.0 43.6 DMS1546 15-10 43.2 324.6 3.8 DMS1531 15-10-11 56.6 770.5 n.d. DMS1545 15-26-501 12.9 89 5.1 DMS1529 15-26-593 86.2 804.7 21.0 結果清楚指示，雖然dAb-Fc對4-130-54至lh-131-206之 PK概況幾乎可重疊，但該等概況與其他對相差甚遠。當考 131415.doc -138- 200907128 慮AUC/D時，主要可見如下效應、：15_1〇之概/〇僅為& 10-11 之 42%。15_26·501 之 AUC/D僅為 15_26_593 之11%。 該等重要差異亦影響（較小程度）半衰期：15_1〇及151〇七 分別為43.2 h對56.6 h。對於DOMl5_26品系可見更大差 異：15-26-50U15_26_593 分別為 12 9 匕。實際 上，對於使用非隔室分析之良&ρκ分析，應存在至少4個 用以擬合線性回歸斜率之資料點，且半衰期估算值之時間 應為半衰期計算值之至少3倍。 根據本文中之實例中所述之生物物理性質，任何給定 dAb抗胰蛋㈣降解之能力似乎與dAb_Fc融合物在大鼠血 清中循環較長時間之能力相關。實際上’如實例（諸如實 f
例10)中所不，DOM15-10及DOM1 5-26-501為最易降解之 dAb:在1叫騰蛋白酶存在下在听下培養25叫⑽約^、 時可產生完全降解。該研究中之所有其他dAb(不管其是否 以胰蛋白酶來選擇（亦即，D〇M15_1〇_U、d〇mi5_26_ 593、DOM4_130_202 及 D〇Mlh_1312〇6)或其是否已具有部 分如親本分子之胰蛋白酶抗性（D〇M4_13〇_54& 131 511))當再編排格式於dAb_Fc分子中時在大鼠中具有可 比之pk概況。因此，本發明之pK研究提示當彼等dAb具有 極低抗蛋白水解性時，對蛋白水解敏感會對dAb之活體内 穩定性產生最大影響。亦展示，超過__定程度，胰蛋白酶 降解抗性之進一步增量（例如〇〇河413〇_2〇6對〇〇?^4_13〇_ 54)並不等於說dAb_Fc分子進一步減缓活體内排除之能 力0 131415.doc 139- 200907128 在三種狀況下’在胰蛋白酶存在下之選擇產生熱穩定性 (由溶融溫度所定義）增加之新穎分子：D〇M4_i3〇_2〇2、 ⑽囊-⑶屬及D〇M15_26_593。ρκ研究指$，在本發 明資料集中，熔融溫度不足以使所觀察到之ρκ概況合理化 之參數·實際上，DOM15-10具有比D〇M15_1〇_U高之 Tm，但比議…㈣更快速地自循環中清除。另外， DOM4-130品系之兩個dAb具有顯著不同之化（相差1〇。㈡， =當編排格絲dAb_Fe分子中時展示幾乎相同之活體内穩 定性。應注意，本質上不應排除㈣溫度作為預測活體内 穩定性之關鍵參數。對於本發明之資料集恰好發生的為， 大Tm差異（自54。(：及以上）並不對活體内dAb之走向產生顯 著影響。此並不排除在低於⑽之溶融溫度下，心之活 體内穩定性可能與熱穩定性相關或也許甚至與熱穩定性及 蛋白酶抗性都相關的可能性。 實例1 3 對DOM10-53-474之胰蛋白酶選擇 經純化DOM10-53-474之胰蛋白酶穩定性： D〇M10-53-474為以高效價與IL_m4合之區域抗體。為 評定在胰蛋白酶存在下該dAb之穩定性，用胰蛋白酶分解 純化dAb歷時增加之時點且在凝膠上運行以檢查任何可能 的蛋白貝降解。在3〇c下使25 μΐ 1 mg/ml之純KD〇Iy[1〇、 53-474與1 μΐ 1 mg/ml之測序級胰蛋白酶一起培養，從而產 生25:1 dAb:胰蛋白酶之分子比。使dAb與胰蛋白酶一起培 養1 h、4 h及24 h，且藉由添加4 μι尺〇仏6完全蛋白酶抑制 131415.doc -140- 200907128 劑中和蛋白酶活性，接著在冰上培養。藉由向从b中添加 蛋白酶抑制劑而不添加胰蛋白酶製備時間〇之樣品。接著 藉由電泳使sLabehip根據製造商說明書分析2μΐ樣品。 圖22展示以與騰蛋白酶—起培養歷時增加之時點之 DOMH)-53_474運行的凝膠。為了比較，亦如以上所說明 用胰蛋白酶處理-種騰蛋白酶穩定⑽〇_5_26_593且
並排運行。如圖中所示，D〇Ml5_26_593即使在與騰蛋白 酶一起培養24 h後看起來亦為穩定的。然而，雖然 DOM10-53-474在 24 h後在一定程度上降解，但在1 h及4 h 時點時看起來為穩定的。該等資料表明在 一疋程度上抗胰蛋白酶降解，但不如最具胰蛋白酶穩定性 之 dAbDOMl5-26-593穩定。 噬菌體呈現DOM10-53-474之胰蛋白酶穩定性： 為s平疋嗟菌體呈現DOM10-53-474之胰蛋白酶穩定性， 將編碼DOM10-53-474之基因選殖於pD〇M33(圖5〇)之 位點中及根據標準技術產生噬菌體。將噬菌體由 PEG沈殿純化，再懸浮於pb s中且測力價。 使°里菌體呈現dAb與胰蛋白酶一起培養不同時點以評估 胰蛋白酶抗性。與胰蛋白酶一起培養後’在感染指數生長 大腸桿菌TG1細胞後，由力價分析量測穩定性。 在37°C下在震盪培養箱中使100 μΐ噬菌體於1〇〇 gg/mi胰 蛋白酶中培養1 h、2 h、4 h及隔夜。用Roche完全蛋白酶 抑制劑（x2)阻斷胰蛋白酶活性，且隨後將噬菌體稀釋於2〇/〇 於PBS中之marvel中，在室溫下與1〇 nM經生物素標記 131415.doc -141 - 200907128 IL-13 —起培養i小時。添加在室溫下用2%於中之 marvel預阻斷！小時的抗生蛋白鏈菌素塗佈珠粒 M-280 (Invitr〇gen))，且隨後在室溫下將混合物培養5分 鐘。所有與Dynabeads 一起進行之培養步驟均在轉輪上進
行。藉由用存於PBS中之0.1% Tween_2〇洗滌珠粒8次洗除 未結合噬菌體。用0.5 ml 〇」M甘胺酸（pH 2 2)溶離結合噬 菌體且用刚μ1 i M Tris_HCL (pH 8,G)中和。使用:離 噬囷體感染指數生長之TG1細胞（在37°c下！小時）且塗鋪於 四環素板上。在3rc下將各板培養隔夜，且進行菌落計 數。將胰蛋白酶分解後之噬菌體輸出力價概述於表17中。 當與胰蛋白酶-起培養歷時增加時點時，㈣體力價降 低。培養24小時後，所有噬菌體分解。 表17 .對噬菌體呈現D〇M_1〇_53_474親本執行之胰蛋白酶 選擇之輸出力價 胰蛋白鉍培卷時問長庙 胰蛋白酶濃度 __ 力價 無姨蛋白酶對昭 100 us/ml~ 100 μβ/ηιΐ 100 gg/ml lh _ 2h 3χ1〇7 " ------ lxio7 ___ 7x10° C ν 1 隔夜 L 100 pg/ml 5XIU 〇 選擇更抗胰蛋白酶之dAb : 為選擇更抗胰蛋白酶降解之dAb，使用 Mutazyme U套組、，經生物素標記引子及供5〇似應用之 5·5〇 Pg模板由PCR向編碼D〇M1(M3_474i基因中引入隨 機突變。經細及編！分解後，用抗生蛋白鍵菌素塗佈珠 131415.doc 142- 200907128 粒自未77解產物中純化插人物且將其在相應位點處連接於 PDOM33中。用經純化連接混合物轉型大腸桿菌1細 胞，從而產生〇〇河10_53_474之易於出錯之庫。庫之規模 為1.9><109且胺基酸突變率為丨.3。 對該庫執行3輪選擇以選擇具有改良蛋白酶抗性之⑽。 在僅有抗原而無胰f白酶處理的情況下執行第^輪選擇以 淨化庫從而移除不再以高親和力結合抗原之任何純系。在 M IL 13下進行選擇。與6χ1〇ι〇個輸入噬菌體相比，第 1輪之輸出為2><1〇9，仰, 抗原 攸而私不庫之大部分以高親和力結合 用1 nM經生物素標記IL_13執行第2及第3輪選擇。在對 淘選之前，在抓下在震盈器(25〇州中使_ 與1〇0⑽1姨蛋白酶一起培養。對於第2輪選擇，在室溫 下或在37C下培養騰蛋白酶丨小時。第2輪選擇 於表1 8中： 表18.第2輪選擇後輸出之噬菌體力價 姨蛋白醮虚理 一'~ i處理~~ — ---- ---力货_ 1 h，室溫 _ 1x10» 1 h > 37〇C" 5^107 ----- 2^107 使用來自37°C下1 h胰故占 於中純4理的第2輪選擇的嗟菌體 輸出物作為弟3輪選擇之輸入 切對於弟3輪選擇，用；[〇〇 gg/ml胰蛋白酶處理噬菌體且 歷時杈長時點：在3 7 下2 h,在37C下4 h，在室溫下眩丄』 凰下隔仗或在37°C下隔夜。第3輪選 13I4J5.doc -143 - 200907128 擇之輸出力價概述於表19中： 表19:第3輪選擇後輸出之噬菌體力價 胰蛋白酶處理 力價 無騰蛋白酶 1.3χ108 2 h，37〇C 1.9χ107 4 h > 37〇C 2x10b 隔夜，室溫 4x10’ 隔夜，37°C 2.1xlOb 對來自第1、2及3輪之各選擇輸出物之數個純系進行測 序以評定序列多樣性。無胰蛋白酶處理之第丨輪選擇後， 選擇輸出物之50%具有親本D〇M1〇_53_474序列。第2輪選 擇後’親本之百分率增加至75%。第3輪選擇後，親本之 百分率增加至80%。 該資料指示DOM1G_53_474已抗胰蛋白酶降解，且可自 該等胰蛋白酶選擇物中選擇不太多之新賴純系。圖22展示 當用胰蛋白酶分解經純化蛋白質日夺，D讀G_53_474即使 在胰蛋白酶處理隔夜後亦不會完全分解。然而，為瞭解在 k擇輸出物中疋否存在任何更具騰蛋白 :抗:生之新穎純系，將在3rc下用胰蛋白酶處理噬菌體 仪之弟3輪選擇之輸出物亞選殖於PDQM5中。隨後對數百 個純糸測序以墓抑^ / +找任何胰蛋白酶抗性純系。在所分析之數 :個：系中，僅26個純系具有新賴序列，然而該等純系中 ’又有個在胰蛋白酶裂解位點(離胺酸或精胺酸)具有突 變，表明該笙純么 尺 。 4純糸不比D〇MH)-53-474更具胰蛋白酶抗 131415.doc -144- 200907128 實例14 在胰蛋白酶存在下由噬菌體選擇引入前導DOM0101 (抗 TNFR1) dAb中之儲存及生物物理性改良： 為改良前導分子DOMlh-131-511之蛋白酶抗性，如先前 所述在騰蛋白酶存在下進行噬菌體選擇。該方法產生大量 與親本D〇Mlh-l 31-511分子相比具有改良胰蛋白酶穩定性 之純系。選擇兩個純系D〇Mlh-131-202及DOMlh-131-206 以進一步表徵’因為其展示胰蛋白酶作用之最顯著改良。 如下文所概述之進一步研究展示，對於胰蛋白酶作用具有 改良抗性，主要對分子抗剪切應力及熱應力之穩定性存在 其他有利效應。該兩個參數對增加生物醫藥產物之儲存及 存放期穩定性至關重要。 馬斯德畢赤酵母中前導DOM0101 dAb之產生： 使用編碼三種前導分子之一級胺基酸序列之基因在馬斯 德畢赤酵母中產生分泌蛋白質。將三種合成基因（D〇Mlh_ 131-511、DOMlh-131-202 及 DOMlh-13 1-206)選殖於表現 載體pPIC-Zct中’且隨後轉型於兩種畢赤酵母菌株X33及 KM71H中。將經轉型細胞濾出置於遞增濃度之芥森（1〇〇、 300、600及900 pg/mi)上以選擇具有多個整合子之純系。 隨後在2 L燒瓶中篩選數個純系以鑑別高表現細胞系。隨 後使用最佳表現純系在醱酵罐中以5 L規模產生物質。 蛋白質純化及物質表徵： 為產生高品質物質用於表徵且用於進一步穩定性研究， 使用混合模態電荷感應樹脂（Capto MMC)將下游純化過程 131415.doc -145- 200907128 設計為初級捕獲步驟，接著進行陰離子交換（q
Se〇Phar〇se)。未顯著優化，此允許回收約鳩之純度為約 表現dAb。使用電喷霧質譜、胺基末端測序及等電 聚焦表徵物質—致性，且使用SDS-PAGE及SEC(尺寸排阻 層析法）表徵純度。 蛋白質一致性： 各蛋白質之第一個5殘基之胺基末端序列分析係如所預 期（EVQLL·.·)。使用C4 Zlp尖頭（MiUip〇re)對已緩衝液交換 =含有0.1%冰醋酸之50:50 h2〇:乙猜中之蛋白質樣品執行 貝〃曰刀析。對於二種蛋白質中每一種所量測到的質量當允 許因形成内部雙硫鍵而產生之_2質量差時係在基於一級胺 基酸序列之理論質量（使用平均質量計算）的0.5 Da範圍 内。使用IEF基於對於各蛋白質為不同之pI鑑別蛋白質。 蛋白質純度： 將二種蛋白質以1盹及1 〇 μβ之量一式兩份裝載於非還原 SDS-PAGE凝膠上。在所有情況下，觀察到單一條帶。 亦執行尺寸排阻層析以顯示純度級。對於尺寸排阻層析 (SEC) ’將1〇〇肫各蛋白質裝載於T〇s〇H g2_ SWXL管 柱上，在0.5 ml/min下流動。移動相為PBS/10。/。乙醇。基 於曲線下之面積量測單體百分率（參見圖23)。 比較 DOMlh-131-511、DOMlh-131-202 及 DOMlh-131- 206之穩定性 評定蛋白酶穩定性： 在過量蛋白酶中預培養規定時點後，由BlAC0reTM分析 131415.doc -146· 200907128 殘餘結合活性評定DOMlh-131-511、DOMlh-131-202及 0€^111-13 1-206之蛋白酶穩定性。將約14〇〇111;經生物素 標記TNFR1塗佈於抗生蛋白鏈菌素（SA)晶片上。在3〇它下 使 250 nM DOMlh-131-511、DOMlh-131-202 及 DOMlh- 131-206與僅PBS —起或與100吨/〇11胰蛋白酶、彈性蛋白酶 或白血球酶一起培養1、3及24小時。藉由添加蛋白酶抑制 劑混合物使反應停止。隨後使用參考池扣除法使dAb/蛋白 酶混合物穿過TNFR1塗佈晶片。在每次注射循環之間用工〇 μΐ 0.1 Μ甘胺酸（pH 2.2)使晶片表面再生。相對於無蛋白酶 之dAb結合，測定與蛋白酶一起預培養結合人類TNFR1之 DOMlh-131-511、DOMlh-131-202 及 DOMlh-13 1-206 (10 秒時）之比例。在25°C下進行BIAcoreTM運行。以下資料由 二個獨立的實驗產生。條形圖指示平均值，且誤差棒指示 結果之標準偏差（圖24)。 已發現’與 DOMlh-131-511相比 ’ DOMlh-131-202 及 DOMlh-13 1-206展示具有較大的騰蛋白酶、彈性蛋白酶或 白血球酶蛋白水解降解抗性。與胰蛋白酶一起1小時後及 與彈性蛋白酶或白血球酶一起3小時後，與DOM 1 h-13 1 -5 11相比，DOMlh-13 1 -202與 DOMlh-131-206之間的差異 最明顯。在大部分測試條件下’存在與DOMlh-131-202相 比，DOMlh-131-206稍更穩定之趨勢。 如使用DSC所測定之dAb之熱穩定性： 為確定在何pH值下前導分子具有最大穩定性，使用差示 掃描量熱計（DSC)量測各dAb在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中之 131415.doc -147- 200907128 熔融溫度（Tm)。因為伯瑞坦-魯賓遜由三組分緩衝系統（乙 酸、磷酸及硼酸各40 mM)構成，所以有可能在同一溶液中 產生3-10範圍内之pH值。由蛋白質一級胺基酸序列確定理 論pi。由DSC ’可見dAb具有最大内在熱穩定性之pH值對 〇〇^4111-1：3 1-202而言為1)117，對〇〇1^111-131-206而言為口11 7-7.5，且對DOMlh-131-511而言為ρΗ 7.5。對於所有隨後 應力及穩定性研究，各dAb在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中使用
以下 pH 值：對 DOMlh-131-202 及 GSK1995057A DOMlh-13 1-200 而言，pH 7_0，且對 DOMlh-131-511 而言，PH 7.5。結果概述於表20中。 表20 :如由DSC所測定於伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中1 mg/ml 之 DOMlh-131-202、DOMlh-131-206 及 DOMlh-131- 5 11之pH值及Tm的概述。溫度以丨8〇。〇 /小時勻變。 dAb 產生最大固有熱穩定性 之pH值 在給定pH值下dAb之 Tm (°〇 DOMlh-131-202 DOMlh-131-206 7.0 68.6 7.0-7.5 65.8 DOMlh-131-511 7.5 58.0 兩週熱穩定性測試 蛋白質在高溫下持續長時間之能力通常為其穩定性之良 好指示。在該等條件下，蛋白質可經受數種諸如聚集之物 理過程’或化學改質。在37=及5(rc下在伯瑞坦_魯賓遜緩 衝液中將dAb (1 mg/ml)培養14天。使用SEC測定經U天之 時間溶液中遺留多少單體（圖25)。 由圖 25 可見 DOMlh-13 1-202 與 DOMlh-13 1-206 顯著比 131415.doc -148- 200907128 DOMlh-l31-511對熱應力穩定。通常將蛋白質曝露於諸如 37°C及5(TC之高溫下來給出藥物長期存放期之指示。使用 該等較高溫度加速與室溫下長期儲存相關之正常過程，諸 如脫醯胺作用、氧化或聚集。亦可使用咖監測溶液中聚 集形成之程度（圖26A至I)。37它下14天後，D〇Mlh_l3i_ 5 11自溶液中之損失可歸於沈澱與如由SEc所測定之較高有 序性聚集體之形成（圖26B)。14天後在37。〇下，關於 DOMlh-131-202與DOMlh-131_2G6亦可見顯著較低之蛋白 質損失，其中聚集體形成極少或無實質性增加，尤其在 DOMlh-131-206之狀況下（圖26Hp在抓下，分子之間的 差異甚至更明顯，〇〇]^111_131_206在14天後在較高溫度下 展示較D〇Mlh-13 1-202佳之穩定性，展示較高分子量聚集 體之形成顯著降低（圖26)。相對於t=0，14天後，DOMlh- 13 1-206僅展示聚集體形成之小幅增加（圖261)，*DOMlh-1 3 1 -5 11幾乎沈澱析出溶液（圖26C)。 此展示由胰蛋白酶選擇引入dAb中之變化（例如改良之熱 穩定性）顯著改良蛋白質在37°C及5(TC下儲存穩定性。 DOMlh-13 1-202明顯具有且D〇Mlh-l 3 1-206更顯著明顯具 有改良之溶液穩定性及較低的在高溫下形成聚集體之傾 向’此可直接解釋為在諸如+4。〇及室溫之更多相關溫度下 具有改良之長期儲存穩定性。 隨後由IEF分析熱應力實驗24小時、48小時、7天及1 4天 時點之樣品以瞭解蛋白質是否經受任何會影響蛋白質總電 荷之生物物理變化（圖27)。 131415.doc •149- 200907128 在 37°C 下 ’ DOMlh-131-202 與 DOMlh-l3l_2〇6 再次展示 與DOMlh-13 1-511相比無顯著變化。關於D〇Mlh_13i_ 511 ’ 24小時後在37°C下出現微弱之第二條帶。咸信，該 額外出現的帶係歸因於蛋白質之二聚作用，從而掩蔽電荷 且產生兩個分子群體。在5(TC下，分子之間的差異更明 顯，在高溫下DOMlh-131-206明顯展示無顯著變化，而24 小時後，DOMlh-13 1-202展示一些改質跡象。在伯瑞坦· 魯賓遜中48小時後，大部分DOMlh_131_5u因沈澱而損 失。 由TNFR-1 RBA分析5(rc下之τ=〇、7及14天時點以確定 曝露於高溫後蛋白質之功能性（圖28)。雖然目前該檢定在 檢測歸因於應力之分子之微小變化方面不如SEC或IEF靈 敏’但可使用其展示dAb仍可結合抗原。 DOMlh-131-511之曲線之向左移動反映大部分dAb已歸 因於沈澱而損失之事實。溶液中遺留之物質仍能夠結合抗 原。如圖25中所示’大部分D〇Mlh-13 1-202與DOMlh-13 1 -206即使在14天後亦能夠保持在溶液中。RBa展示所 有可浴性蛋白質仍具功能性且能夠結合Tnfr 1。 高蛋白濃度下測試之儲存穩定性： 進行實驗以研究+4°C極高蛋白質濃度下之儲存穩定性以 瞭解在該等條件下各分子如何表現。將所有前導dAb在最 穩定pH值在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中在離心Vivaspin濃縮器 中濃縮（5K截止點）至約100 mg/mi。隨後將約1〇〇爪吕/…之 樣品搁置在+4t：下7天，且隨後由SEC分析以瞭解在高濃度 131415.doc -150- 200907128 下儲存期間樣品是否會發生任何其他物理變化（圖29)。在 SEC官柱上k1xPBS 1〇%乙醇（v/v)中走柱之前，將樣品稀 釋至約1 nig/ml。 由 SEC 迹線，可見DOMlh-131-202 與 DOMlh-131-206 在 7 天後在聚集體形成方面均不展示任何顯著增加，而 〇〇Mlh-131-511單體濃度存在約2%之減小。 前導dAb之噴霧器傳遞：
為進行早期毒理學及臨床研究，將dAb調配為液體形式 且經由噴霧裝置傳遞^視裝置（例如，超音波、噴射或振 網）而定，dAb當其經嗔霧以形成規定粒纟t氣霧劑時將經 歷一定程度之剪切應力及熱應力。因為與1)〇]^111_131_511 相比，D〇Mlh-13 1-202與 DOMlh-13 1-206具有較高1 且展 示大大改良之熱應力穩定性，所以所有dAb均在兩種喷霧 器裝置中測試以瞭解其如何回應噴霧期間所誘發之剪切應 力/熱應力。隨後由SEC分析來自噴霧氣霧劑之蛋白質與裝 置中（亦即，杯中）之殘留dAb以確定該過程期間產生聚集 之量。 在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中在最穩定pH值下測試所有分 子。在E-fl〇w Rapid(振網）與PaH LC +(喷射噴霧器）中測試 dAb ’其中操作時間為3·5分鐘，蛋白質濃度為5 — 粒度分布使用Malvern Spraytek確定。結果展示於圖3〇 中。為良好傳遞且分布於深肺中，理想粒度為<5 。所 有dAb在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中產生小於5 μιη之可比粒度 、’及在噴霧之岫及之後，由Am量測法測定震置杯中之 131415.doc -151 - 200907128 湯之漢度（資料未圖示）。已發現，蛋白質滚度並未顯著改 變，從而指示蛋白質與媒劑在傳遞期間均不會優先霧化。 C上運行在伯瑞坦_魯賓遜緩衝液中霧化之之樣 品以確定傳遞期間蛋白質是否經受任何物理變化。圖”展 不由SEC所測定之杯或氣霧劑中之相對百分率變化。可 見’在單體濃度方面，DOMlh_131_2G2 與 D〇Mih_i3i_2〇6 相對於DOMlh-131-511經受相對較小之變化。此證明具有
改良、之⑽祕-⑶⑽與⑽心⑶侧在喷霧期間具 有較小的聚集傾向。 圖32展示於伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中之DOMlh· 13 1-206 及DOMlh-131-511在噴霧後之實際SEC迹線且顯示單體之 相對損失（圖31)係歸因於二聚體形成。此再次提供由 DOMih-iMJM及DOMlh-131_2〇6所展示之較高熱穩定性 即使在未優化調配物緩衝液中亦可阻止顯著聚集之理論的 其他證據。 關於毒理學及安全評定研究，有必要傳遞比給予患者之 治療劑量顯著高之含量的dAb至動物中。此僅可藉由使用 顯著較高之蛋白質濃度及/或經長時間傳遞dAb來達成。因 為已展示DOMlh-131-511在經3.5分鐘在5 mg/ml下噴霧時 形成聚集體，所以DOMlh-13 1-206係在PBS中在40 mg/ml 下測D式且使用Pari LC + 霧至多1小時。整個運行期間在 各時點採集杯及氣霧劑之樣品以瞭解延長噴霧是否會導致 dAb歸因於剪切應力或熱應力（由SEC測定）及蛋白質濃度 (A280 nm量測法）而聚集。表21展示由A280確定之杯與氣 131415.doc -152- 200907128 霧劑中之dAb的蛋白質濃度。 表21 ·在使用pari LC +在約4〇 mg/mi下喷霧dAb期間， 杯與軋霧劑之由A280吸光度讀數確定之〇〇]^1}1_131_206的 經里測蛋白質濃度。考慮到稀釋誤差及儀器誤差，在經1 小時噴霧dAb後，樣品濃度並未改變。 時間(Min) 「丨丨· —— 杯樣品(mg/ml) 氣霧劑樣品(mg/ml) 1 43.8 43 4 29 44.5 r 43.5 59 44.6 44.1 由表21可見蛋白質濃度在運行期間並未顯著改變，顯示 不存在顯著的歸因於聚集之蛋白質損失。圖33展示如由 SEC所測定，經H、時之噴霧時間，D〇Mih_m_2〇6並未形 成任何較高有序性之聚集體，諸如二聚體。此㈣顯示如 由騰蛋白酶選擇向分子中引人之改良生物物理性質顯著增 加dAb抗剪切應力及熱應力性，且此可與改良之儲存存放 期及喷霧蛋白質以致不形成較高有序性聚集體之能力直接 相關。
前導dAb之溶解狀態： β两m另二裡則导dAb之主要降解途徑似乎為最初導致 二聚合接著進-步聚集且最終沈澱之自締合，所以由分析 超速離心（Analytical Ultra_Centrifugati〇n，auc)研究节三 種前導分子以確定自締合之程度。 以一 及由兩種方法，即沈降平 衡及沈降速度研究蛋白質。 關於沈降平衡方法，在〇. 5 種不同濃度下用離心效應使用 mg/ml至5 mg/ml範圍内 二個不同轉子速度運行 之三 三個 131415.doc •153· 200907128 樣品。由該方法，確定DOMlh_131_51l為穩定二聚體 (26.1-34.4 kDa)，DOMlh-m-m 為單體 /二聚體平衡 (2.7 27.8 kDa) ’由Kd-1.3 μΜ量測在各濃度下具有相對穩 定之二聚物狀態，且D0隱131_2〇6主要為單體性(Μ 17.9 kDa)，單體締合為二聚體之1為36〇 。 由沈降速度方法，所有樣品在稀釋後展示一定程度之解 離。由展示於圖34中之所獲得之結果，^D〇Mih_i3i_ 川所觀察到之沈降係數指示較高有序性聚集體，且稀釋 後峰位移為該等聚集體解離之指示。纟白質聚集及解離互 相抵消，可得出如由沈降平衡所觀察到之穩定二聚體之印 象。關於DOMlh-13“202所觀察到之沈降係數指示快速動 力平衡，且因此可將單體及二聚體峰彼此分開，從而得到 具有比適於樣品質量高之沈降係數之單冑。該肖果與沈降 平衡方法所獲得之結果—致，且解離常數經量測為【_。 DOM 1 h-1 3 1 -206係經測定比其他兩個樣品更具單體性，與 其他兩個樣品之2.5 s相比，其具有19 s之沈降係數。該資 料與沈降平衡資料極一致。在量測濃度下，36〇 μΜ之心以 下約1 0倍’樣品主要為單體性。 實例15 DOM15-26-593 dAb 之效價增強： 圖40中展示VEGFR2受體結合檢定中d〇m15-26-593 dAb 比DOMI 5-26親本之效價增加之實例。在該檢定中，在板 基檢疋中罝測潛在抑制劑阻止VEGf與VEGFR2結合之能 力。在该檢定中’將VEGFR2_Fc嵌合體塗佈於96孔队18八 131415.doc •154- 200907128 板上，且向其中添加預定量之已與測試dAb稀釋系列一起 預培養之VEGF。洗除未結合蛋白質後，用抗VEGF抗體偵 測與受體結合之VEGF之量，比色測定其含量。以隨測試 物質濃度變化之VEGF結合抑制百分率繪製劑量-反應效 應。因此有效抑制劑為顯示在低濃度下實質性阻斷配位體 結合之抑制劑。 FC融合物之效價及半衰期： VEGF阻斷在治療腫瘤中之治療潛能已實現超過30年。 癌症之慢性性質指示生物醫藥需要長的血清半衰期來介導 其效應，而此與游離dAb因腎濾過而自循環快速清除不相 符。為評定VEGF dAb作為治療癌症之抗血管生成劑之效 用，藉由使用FcRn介導抗體補救途徑經由雜交連接子使前 導區域抗體編排格式為與野生型人類IgGl Fc之融合物以 形成具有延長的血清半衰期之二價分子。 在該Fc融合物格式中，使用先前所述之檢定，可將前導 胰蛋白酶選擇dAb (DOM15-26-5 93)之效價與最初親本dAb (DOM1 5-26)及胰蛋白酶不穩定dAb (DOM 15-26-501)作比 較。結果展示於下表22中： 表22:呈Fc融合物格式之DQM1 5-26前導分子之效價 (RBA)及半衰期特徵 dAb Fc 效價(nM) Tl/2b (hr) DOM15-26 hlgGl 0.506 ND D0M15-26-501 hlgGl 0.323 12.9 DOM15-26-593 hlgGl 0.033 84.6 131415.doc -155- 200907128 ⑧由該等結果可見，在二聚體Fe融合格式中，親和力及效 價歸因於親和性（avidity)效應相對於游離dAb增加。顯 然，由於胰蛋白酶選擇所獲得之D〇M15_26_593之效價增 加知以維持且在該Fe格式中甚至更明顯。此外，熱及蛋白 酶穩疋性之改良解釋為分子活體内藥物動力學特性之深度 改變。與DOM 15-26-501相比，D〇M15_26_593之排除半衰 期之改良（參見圖41)很可能為dAb穩定性增加之直接結 果，從而使其變得更抗核内體隔室（end〇s〇mal c〇mpartment) 内所發生之降解過程。因此，亦預期具有增強蛋白酶穩定 性之dAb能夠在其中蛋白水解為涉及生物分子轉換 (turnover)之活性過程的其他生物隔室（諸如血清、黏膜表 面及多種組織隔室）中持續較長時間。 藥物動力學清除概況： 在向3隻大鼠靜脈内投與濃度為5 mg/kg之DOM1 5-26- 593及 DOM15-26-501後 ’ 4 須JDOM15-26-593及 DOM15-26- 5 01之藥物動力學清除概況。隨後使用直接vegf結合標準 丘[18八檢定及抗人類？£：抗體量測〇〇]^15-26-593及001^15-26-501在血清中之含量，因此僅偵測血清樣品中之完整藥 物。完整藥物動力學概況展示於下表23中： 表23 :大鼠中DOM15-26及DOM15-26-593 Fc融合物之 藥物動力學參數概述 dAb 半衰期 Cmax (pg/ml) AUC (0-inf)(hrVg/ml) 清除率(ml/hr/kg) DOM 15-26-501 12.9 91.4 445.1 11.8 DOM15-26-593 ^4.6 101.8 h3810 1.3 131415.doc -156- 200907128 之藥物動 3 學性質產 為溶解狀 ，與約76 由該等結果可見DOMl5_26_593具有顯著改良 力學概況’（例如）延長之半衰期及降低之清除^ _ 5-26-593之顯著改良之效價及藥物動力 生對化合物之多種其他生物物理屬性的分析。 溶解狀態性質：由SEC_MALLs及AUC分析： 用DOM15-26-593如下進行實驗·· DOM15-26-593在至多2·5 mg/ml之濃度下表現
態中之單體，其中計算分子質量為78_81 kDa之計算完整分子質量（圖42a&42b)一致。 熱熔融性質：由DSC分析 用DOM15-26-593如下進行實驗： 胰蛋白酶選擇dAb (65°C，圖43之中間圖）之增加之熱穩 定性在FC融合物（64.5。(：，圖43之上圖）中得以維持。展示 DOM15-26-501 dAb (52°C，圖43之下圖）iTm曲線以便比 較。 冷凍-解凍、溫度應力及血清組分之穩定性 用DOM15-26-593如下進行實驗： DOM1 5-26-593 dAb之穩定性性質意謂可使dom15_26_ 593 dAb經受物理及生物應力，而對其結合VEGF之能力產 生最小影響（圖44-47 (a及b))。舉例而言，可使分子自液氣 (-196°C)至體溫（37°C)重複冷凍解凍10次循環，而如由 ELISA所測定未損失結合活性（圖44)。如由習知尺寸排阻 層析法所評定，該處理亦不會對分子聚集狀態產生明顯改 變（圖45)。其他測試顯示分子可置放於-80°C至55°C範圍之 131415.doc -157- 200907128 不同溫度下而僅在最高培養溫度下1 68小時後，抗原結合 活性略微減小（圖46)。此外，如由VEGF結合ELISA所測 定，在37°C下與人類或獼猴血清一起培養1 4天不會導致抗 原結合能力損失（圖47a及47b)。 VEGFR2受體結合檢定及HUVEC細胞檢定中之效價： 如下進行上述受體結合檢定： 使用上述受體結合檢定評定Fc融合物之效價（圖48)。已 發現，DOM1 5-26-593 dAb在該檢定中具有增強之效價， 此確立dAb阻斷VEGF與VEGFR2活體外結合之能力。亦在 量測VEGF拮抗劑阻斷HUVE細胞之VEGF刺激增生之能力 的HUVEC(人類臍靜脈内皮細胞）檢定中說明DMS1529之效 價。在與預定量之VEGF及不同量之測試樣品一起培養固 定時期結束時，測定細胞數目。拮抗劑越有效，所觀察到 之細胞增生越低（圖4 9)。 實例16 研究目的 研究之目的在於藉由執行噬菌體選擇，繼之以蛋白酶處 理噬菌體，獲得GLP-1 AlbudAb™融合物之蛋白酶抗性變 異體。AlbudAb™為特異性結合血清白蛋白之免疫球蛋白 單一可變區域。 GLP-1受體 高血糖素樣肽-1受體（GLP-1R)屬於七跨膜G蛋白偶合受 體之B 1家族。藉由使配位體與受體之細胞外N -末端區域 (ECD GLP-1R)結合且接著與跨膜分子之核心相互作用（A1- 131415.doc -158- 200907128
Sabah等人，2003)啓始受體與其天然激動劑配位體OLP-l 之間的結合相互作用。已展示，雖然在移除跨膜核心的情 況下GLP-1與經分離…末端區域之結合保留，但親和力減 小（Lopez de MatUrana等人，2003)。因為不希望在溶液中 使用整個受體來噬菌體選擇，所以使用經分離細胞外區域 用於噬菌體捕獲。雖然肽與其受體之親和力不與其活性直 接相關’但此使吾人簡化實驗且富集對ECE) GLp_1R具有 親和力之噬菌體呈現分子。 測試噬菌體選擇 執行測試以驗證GLP-1受體之細胞外區域可用於喔菌體 呈現庫選擇。 噬菌體載體 使用絲狀噬菌體（fd)呈現載體（PD0M4)，其係基於經myc 標記之fd載體且其中可將蛋白質序列選殖於限制位點之間 以提供蛋白質-基因III融合物。將編碼庫譜系之基因選殖 為 Α^σΙ/TVoiI 片段。 使載體在Machl細胞中繁殖且使用Mega Preps分離，在 氯化铯梯度下分離Qiagen及超螺旋部份。用Ncol及Notl酶 切告!1載體’接者用PstI切割以減小自連接速率。苯盼/氣仿 萃取後，使DNA乙醇沈殿且在Chromaspin TE-1000管柱 (Clontech)上自充填機純化。純化後，使用载體DNA測試 與多樣性DAT-X DNA片段之連接。 DAT-X庫構築 基於包含GLP-1之DAT-X親本分子構築1 8個譜系。為覆 131415.doc •159- 200907128 蓋GLP-1之全序列(排除對受體結合而言重要之位點），ι7 個譜系係基於在50微升反應體積中使用高保直度 聚合酶之組合PCR。藉由引子在初級PCR中每庫引入4個隨 機化核苦酸，且隨後用經生物素標記引子執行組合。使用
St她gene MUtazyme „套組、經生物素標記引子及供％ μΐ 反應用之5-50 Pg模板之易於出錯之PCR在GUM内引入隨 機突變。使用螺旋狀連接子序列。歸因於苦酸序 歹J之短長度&行易於出錯之pCR兩次以增力口突變率。 經心1及偏1分解後，用抗生蛋白鏈菌素塗佈珠粒自未 分解產物中純化插入物且在相應位點處連接於經修飾 pDOM4 中。 對測試連接純系進行測序確認所有庫中之適當多樣化， 因此接著為庫之全規模連接及轉型。以5〇〇微升之總體積 用1000微克分解載體及與T4 DNA連接酶成1:2比率（V…之 插入物執行連接。分兩次注射使各庫轉型，每1〇〇微升電 感受態大腸桿菌ΤΒ1細胞注射10微升，從而產生1〇7_1〇8之 庫規模。藉由以PEG雙重沈澱製備噬菌體庫，且再懸浮於 PBS中。 一、 隨機挑選來自未經選擇之庫之純系。 製備噬菌體庫後之第1輪選擇 使用GLP-1爻體之細胞外區域淘選。使J 〇〇微升嗟菌體庫 與含有100 nM受體之2% Marvell PBS—起培養。在室溫下 培養1小時，且隨後使噬菌體與預阻斷（2% Marvell pBS，j 小時，室溫）蛋白質A dynabead組合。在室溫下在轉輪上培 131415.doc -160- 200907128 養1小時後’在King Fisher中用〇.1% Tween職先務珠粒8 次，且藉由在500微升O.i M甘胺酸（pH 2〇)中溶離回收特 異性喧菌體。用100微升！ M Tris_cl (pH 8〇)中和後，在 37C下使用m體感染對數期大腸桿g TG1細胞45分鐘。 與胰蛋白酶（100 μ§/η^，；!小時，4。〇;以2小時，坑， 250 rpm)—起培養後，亦執行DATX之測試選擇。庫之力 i貝輸入輸出及庫規模係呈示於下表中。 庫 庫規模 第1輪選擇噬菌體u/ml " 輸入 輸出 1 2.8x10" 3.9χ10ιυ 3.2 x1ο7 '~ 2 1.2χ108 1.0x10 川 Γο^Το5 — 3 2.4xl0; 4.6χ10ιυ XOxlO5 ' 4 8.〇χ107 1.〇χ10,υ δ^οχίο3 ~ 5 4.〇χ107 2.6x10y Τ.οχίο7 6 8.0x10' 7.3χ10,υ 6.0ΧΪ05 ~~ 7 4χ107 8.0xl0y 6.0xl0b 8 2.8χ107 5.4xlOy l.〇xl〇7 — 9 6.8x10’ 9.4x10y 5.0X106 10 2.〇χ10δ 5.7x10s 1.5x10s 11 8.8χ10δ 4.5xlOv 2.〇xl〇6 ~ 12 6.6x10^ 4.〇xl〇9 1.6xl〇6 13 1.8χ108 6.7xl0lu 2.〇xl〇5 14 4.8χ10; 6.0xl0y 3.〇xl〇5 15 ό.ΟχΙΟ7 4.2x10,υ l.OxlO6 16 2.4χ108 1.6χ10,υ 4.8xl〇5 '~~ 17 4.2χ108 1.3χ10ιυ 1.4xl〇6 18易於出錯 1.5χ108 2.5xlOy 6.0xl05 — 自身連接 4.0Χ105 5)χ109 lLio7 ~~^^ DAT-X對照 - 第1輪選擇對於所有庫均產生合理的輸出，因此擴增輸 出，且將噬菌體用於第2輪選擇。 在蛋白酶存在下之DAT-X噬菌體呈現庫選擇 131415.doc -161 - 200907128 在無蛋白酶處理情況下對各庫分開執行第i輪庫選擇以 富集結合劑。GLP·】受體之細胞外區域之濃度為ι〇〇碰， ^所有後續選擇中保持該漠度。第】輪選擇後補救嗟菌 體（reSCUed phage)之力價係介於〗xl〇5-l X107 cp/mI之門。 對所選出之嗟g體執行後續選擇。由含有第旧擇之輸 出物之大腸桿菌甘油組合培養物獲得噬菌體。 另外’在以胰蛋白酶進行選擇之前，將嗟菌體與r曆 犬變亞選殖於AlbudAb序列中，因為在過去之蛋白酶選擇 期間，已證明當該突變呈現於嗟菌體上時使wAb ㈣對胰蛋白酶處理更具抗性。此使得存在兩批即將用於 弟2輪選擇之㈣體，即鳩祕巾有或㈣卿突變之喧 菌體。
擴增各輪選擇之嗟菌體輸出（0 _mM〇 pg/mi)且用於相 同培養條件下之第3輪選擇中。 用蛋白酶處理嗟菌體’然後在室溫下與受體一起培❸ 小時。第2輪選擇之力價（{p/ml)係呈示於下表中。 弟3輪選擇之力價（(p/mi)呈示於下表中。 第2輪選擇之Φ及濃度： 輸入 無蛋白酶 Lib 1_18無蛋白酶 T ；ih K1 8 1 .irr/rvJ " 1χ1〇ιυ 7x10s~ i i〇 i μ^/Γηΐ Lib 1-18 10 μ^/ιηΐ 1χ10υ "ΐχ10ιυ 8χ1 〇7~ 對照DAT-X 1χ10ιυ 5χ1〇^ Hg/ml 5^10^ — 6^ϊ〇^ 131415.doc 10 pg/ml
約 ΙχΙΟ3 卩104 ND -162· 200907128
?辰度處理之噬菌體之 菌體小之程度減小。 理之嗤菌體之力價極
第2輪期間經1 0 pg/ml胰凝乳蛋白酶 力價仍以比先前經較低濃度處理之嗟 第2輪期間經1 〇 pg/mi胰蛋白酶濃度處 穩定。 亦用大腸桿菌菌株HB215丨之細胞溶解產物（cl)及周質 提取物_處理以α_胰凝乳蛋白酶進行第3輪後擴增之噬 菌體以得出關於細菌蛋白酶穩定性之觀點。將噬菌體與蛋 白酶1:1混合且在37。〇下在震盪器中培養2小時，之後與受 體一起培養。
對包括對照未經修飾之分子之所有選擇輸出物而言，力 價之減小極小（小於1〇倍），其可指示細胞溶解產物及周質 提取物中之蛋白酶與純胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶相比不太 強烈。因為純系之多樣性在第3輪後已減小，所以將所選 擇之輸出物亞選殖於表現載體中。 DAT-X噬菌體呈現庫選擇輸出物 將選擇過程期間經！ 〇 μ§/ηι1蛋白酶濃度處理兩次之以胰 131415.doc -163· 200907128 蛋白酶及胰凝乳蛋白酶進行之第3輪選擇的DAT-Χ庫輸出 物亞選殖於表現載體中。自選擇輸出物分離噬菌體載體 DNA (Mini Prep ’ Qiagen)且分解 Ncol及 Notl位點。由兩步 裂解製備平行表現載體。首先，將其用在AlbudAb序列内 部切割之ΚρηΙ限制核酸内切酶分解。執行該步驟以降低載 體自連接之概率。隨後進行Ncol Notl位點之分解以誘發連 接位點。各分解步驟後’藉由使用PCR純化套組（Qiagen) 純化载體。第二次純化後，亦將載體DNA加載於2%瓊脂 糖凝膠上，且凝膠純化對應於4699bp之帶（凝膠純化套 組，Qiagen)。 用200 u T4 DNA連接酶（NEB)使50 ng載體DNA與自室溫 下以胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶進行1小時之第3輪選擇之輸 出物切割的6 ng/1.5 ng插入物連接。 根據製造商方案使用5 μΐ連接混合物轉型25 μΐ Machl化 學性感受態細胞（Invitrogen)且塗鋪。第二天，用15%於 2XTY培養基中之甘油自板到菌落，且將ι〇〇微升儲備液用 於 DNA 分離（Mini Prep，Qiagen)。使用約 150 ng 載體 DNA 轉型40 μΐ BL21 (DE3)化學性感受態大腸桿菌細胞 (Invitrogen)。藉由使用QPix2XT機器人挑選87個來自該兩 種輸出物之菌落於1 ml補充有卡本西林（carbenicillin)及消 泡劑204 96之TB onex培養基中且在潮濕氣氛中在9〇〇 rpm 下在96深孔板中培養63小時（首先20小時3 7°C，後續小時 30 C)。將培養物在4600 rpm下自旋40 min，經0.22過濾板 過濾'且經蛋白質L CIM盤狀物HPLC純化。從而表現數種蛋 131415.doc -164- 200907128 白酶抗性GLP - 1變異肽。 該段落中陳列DOMlh-131-511之核苷酸序列。 DOMlh-131-511之核苷酸序列：
GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGCG CATGAGACGA TGGTGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCACAT ATTCCCCCGG TTGGTCAGGA TCCCTTCTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTATAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACAGCGGTAT ATTACTGTGC GCTGCTTCCT AAGAGGGGGC CTTGGTTTGA CTACTGGGGT CAGGGAACCC TGGTCACCGT CTCGAGC 【圖式簡單說明】 圖1說明用於製備噬菌體呈現譜系之pDOM13(亦稱為 pDOM33)之多個選殖位點。 圖2展示以來自在30°C與40 pg/ml胰蛋白酶一起培養之 dAb之不同時點的樣品運行之數個Novex 1 0-20% Tricene凝 膠。在添加胰蛋白酶之前即刻及隨後在添加胰蛋白酶之後 1小時、3小時及24小時獲取樣品。用lxSureBlue染色蛋白 質。凝膠說明在與胰蛋白酶一起培養第一個3小時期間， DOM15-10 與 DOM1 5-26-501 顯著分解。DOM15-26、 DOM4-13 0-5 4及DOMlh-131-5 11之分解僅在與胰蛋白酶一 起培養24小時後才變得明顯。 圖3說明DOMlh-1 3 1-511及24個所選擇之變異體之胺基 酸序列。突出所選擇之純系中不同於親本序列之胺基酸 (彼等一致胺基酸由點標記）。對應於CDR1、CDR2及CDR3 之環用框勾畫。 圖4說明DOM4-130-54及27個所選擇之變異體之胺基酸 131415.doc -165 - 200907128 序列。突出所選擇之純系中不同於親本序列之胺基酸（彼 等一致胺基酸由點標記）。對應於CDR1、CDR2及CDR3之 環用框勾畫。 圖5說明DOM15-26-55 5及21個所選擇之變異體之胺基酸 序列。突出所選擇之純系中不同於親本序列之胺基酸（彼 等一致胺基酸由點標記）。對應於CDR1、CDR2及CDR3之 環用框勾晝。 圖6說明DOM15-10及16個所選擇之變異體之胺基酸序 列。突出所選擇之純系中不同於親本序列之胺基酸（彼等 一致胺基酸由點標記）。對應於CDR1、CDR2及CDR3之環 用框勾畫。 圖7A-7D為展示在37°C下與不同濃度之胰蛋白酶（在〇至 100 pg/ml範圍内）一起培養隔夜後，親本dAb D〇Mlh-131-5 11(圖 7A)及三個變異體 dAb DOMlh-13 1-203(圖 7B)、 DOMlh-13 1-204(圖 7C)及 D〇Mlh-13 1-206(圖 7D)與固定 TNFR1之結合的BIAcore迹線。結果展示在高濃度胰蛋白 酶（100 pg/ml)下，所有三個變異體比親本對蛋白水解更具 抗性。 圖8A-8C為展示在與彈性蛋白酶及白血球酶一起培養隔 夜後 dAb DOMlh-13 1-511(圖 8A)、DOMlh-13 1-202(圖 8B) 及DOMlh-13 1-206(圖8C)與固定TNFR1之結合的BIAcore迹 線。與親本相比’ dAb對彈性蛋白酶與白血球酶之蛋白水 解展示增加之抗性。 圖 9 展示以 dAb DOMlh-131-511、DOMlh-13 1-203、 131415.doc -166- 200907128 DOMlh-131-204、DOMlh-131-206、DOMlh-131-54、 〇〇]^1111-131-201及〇〇]^111-131-202之與胰蛋白酶一起培養 之前的樣品及以1 00 pg/ml胰蛋白酶一起培養1小時、3小時 及24小時後的樣品運行的兩個4-12% Novex Bis-Tris凝 膠。 圖10A-10C為展示在37°C下與不同濃度胰蛋白酶（在〇至 100 pg/ml範圍内）一起培養隔夜後，d〇M4-130-54(圖 10A)、DOM4-130-201(圖 10B)及 DOM4-130-202(圖 10C)與 固定IL- 1R1融合蛋白之結合的BIAcore迹線。結果展示在 高濃度胰蛋白酶（100 pg/ml)下’兩個變異體比其親本對蛋 白水解更具抗性。 圖11A-11C為展示與彈性蛋白酶及白血球酶一起培養隔 夜後 ’ DOM4-130-54(圖 11A)、DOM4-130-201(圖 11B)及 DOM4-130-202(圖11C)與固定IL-1R1融合蛋白之結合的 BIAcore迹線。與親本相比，dAb對兩種所測試之蛋白酶之 蛋白水解展示增加之抗性。 圖12說明DOM1 5-26-5 55及6個變異體之胺基酸序列。突 出所選擇之純系中不同於親本序列之胺基酸（彼等一致胺 基酸由點標記）。
圖13A及13B為展示親本dAb DOM15-26-555(圖13A)及最 具蛋白_抗性變異體D〇M15-26-593(圖13B)與固定VEGF 之結合的BIAcore迹線。與濃度為2〇〇 μ§/ιη1之胰蛋白酶一 起培養後在100 nM之dAb濃度下就hVEGF結合以BlAcore* 式比較親本及變異體。在37°C下進行反應3小時或24小 131415.doc -167- 200907128 時。結果展示在胰蛋白酶處理24小時後，變異體比親本對 蛋白水解更具抗性。 圖14為展示胰蛋白酶處理對d〇mi 5-26-555變異體之 hVEGF結合之影響的圖表。結果顯然展示胰蛋白酶處理以 小時後’所有變異體比親本（Ε)〇Μ15·26·555)對蛋白水解更 具抗性。 圖15展示兩個加載15吨經處理及未經處理之D〇]yil5_ 26-555 或 DOM15-26-593 樣品之 Novex 10-20% Tricine 凝 膠。在添加胰蛋白酶之前即刻及隨後在添加胰蛋白酶之後 1小時、3小時及24小時獲取樣品。用lxSureBlue染色蛋白 貝。凝膠說明DOM1 5-26-593之胰蛋白酶抗性概況不同於 由BIAcore實驗展示之概況。 圖16說明DOM 15-10及變異體DOM 15-10-11之胺基酸序 列。突出變異體中不同於親本序列之胺基酸（彼等一致胺 基酸由點標記）。 圖17A及1§B為展不親本d〇M15-1〇(圖丨7A)及變異體 〇〇1\415-10-11(圖173)與固定乂丑〇?之結合的81^〇1^迹線。 與濃度為200 pg/ml之胰蛋白酶一起培養後在1〇〇 nM之dAb 漢度下就hVEGF結合以BIAcore方式比較親本及變異體。 在37°C下進行反應1小時、3小時及24小時。結果展示在胰 蛋白酶處理24小時後，變異體比親本對蛋白水解更具抗 性。 圖18展示兩個加載15 gg DOM15-10及DOM15-10-11樣品 之Novex 10-20% Tricene凝膠。在添加胰蛋白酶之前即刻 131415.doc -168- 200907128 及隨後在添加胰蛋白酶之後i小時、3小時及24小時獲取樣 品。用WBlue (1χ)染色蛋白質。結果展示心咖研究 中可見之結合活性直接反映蛋白質之完整性。 圖19A-19L說明數個編碼為D〇Mlh_i3i_5u或d〇m4_ 1 30-54之變異體之dAb的核酸的㈣酸序列。㈣酸序列 分別編碼圖3及圖4中所呈示之胺基酸序列。 圖20A-20E說明數個編碼為D_5_26_555或d〇mi5_i〇 之變異體之dAb的核酸的核苷酸序列。核苷酸序列分別編 碼圖5及圖6中所呈示之胺基酸序列。 圖21展示pDOM38之載體圖。 圖22展示不同時點在3(rc下以25:1她姨蛋白酶比率用 胰蛋白酶處理之DOM10-53-474及DOM15_26_593蛋白質之 在Labchip上運行的凝膠。箭頭展示全長蛋白質。 圖23為展示各樣品由MMC層析接著陰離子交換純化後 所獲得之高純度級的尺寸排阻層析迹線。在225 nm下監測 UV且用具有10%乙醇（，之卜酬走柱。藉由經基線校正 之峰面積積分計算單體百分率。 圖 24 展示 DOMlh_131-5n、DOMlh_131_2〇^D〇Mlh_ 1 3 1 -206之蛋白酶穩定性資料。 圖 25 為 5兒明 DOMlh-131-202、D〇Mlh-13 1-206 及 〇〇肘111-131-511在37。〇及50。(：下在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中 之14天穩定性資料的SEC。所有dAb之蛋白質濃度為1 mg/ml。使用§£c確定熱應力期間蛋白質中是否會發生任 何變化及相對於時間=〇(τ〇)樣品溶液中所遺留之單體之 131415.doc -169- 200907128 Ο 圖26A至I展示SEC迹線，其展示DOMlh-131-511 (八至 C)、DOMlh-13 1-202 (D至 F)及 DOMlh-13 1-206 (G至 I)之熱 應力（37°C及50°C)效應。亦展示給定時點下相對於τ = 〇時溶 液中所遺留之單體百分率。 圖27展示熱應力24小時、48小時及7天及14天時DOMlh- 1 31-202、DOMlh-13 1-206 及 DOMlh-131-511 之 IEF 分析。 樣品已在37。(：或50°C下在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中培養。 圖 28 為展示在 50°C 下將 DOMlh-13 1-202、DOMlh-131-206 及 DOMlh-131-511 培養 14 天之效應的 TNFR-1 RBA。假 定蛋白質濃度為1 mg/ml。亦展示不結合抗原之陰性對照 dAb (VH模擬物）。 圖 29說明在 +4°C 下在約 1〇〇 mg/mlTWA:DOMlh-131- 2 02’8:〇〇]\4111-131-206及(：：〇〇^1111-131-511在伯瑞坦_ 魯賓遜緩衝液中儲存7天之效應。在280 nm下監測UV。 圖 30 展示 Pari E-flow 及 LC+ 中之 DOMlh-131-202、 DOMlh-131-206及DOMlh-131-511之喷霧器測試的資料。 蛋白質濃度在任一伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中為5 mg/ml。 圖3 1說明在以5 mg/ml存於伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中之 DOMlh-131-202、DOMlh-131-206 及 DOMlh-131-511 噴霧 期間，單體濃度之相對百分率之變化。 圖32展示伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中之D〇Mlh-13 1-206及 DOMlh-13 1-5 11 自 pari LC +噴霧後之 SEC迹線。 圖33展示經1小時喷霧過程期間以4〇 mg/ml存於pBS中之 131415.doc •170· 200907128 DOMlh-13 1-206之SEC迹線。噴霧器杯與氣霧劑中之蛋白 質對喷霧期間dAb可能會經歷之剪切應力及熱應力效應具 有高抗性。 圖34展示三種主要蛋白質（DOMlh-131-206及DOMlh-13 1-511及DOM lh-13 1-202)各自之沈降速度曲線。所觀察 到之較低濃度樣品DOMlh-13 1-206之雙峰為在此情況下由 來自樣品池之樣品7¾漏所致之偽跡。 圖35展示緩衝液及裝置對GSK 1995056A (DOMlh-131-5 11)之噴霧液滴尺寸之影響。 圖36為如由SEC所量測，在各裝置中喷霧後，由二聚體 形成評定之GSK1995056A (DOMlh-13 1-5 11)之穩定性。 圖 37 展示 Pari E-flow 及 LC+ 中 GSK1922567A (202)、 08艮1995 057八（206)及03艮1995056八（511)之喷霧器測試。 A)伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中之測試，B) PEG1000/蔗糖緩衝 液中之測試。 圖38描繪人類TNFR1受體結合檢定中之TNF-α劑量曲 線。以四個複本測試各樣品。 圖39展示人類TNFR1受體結合檢定中GSK1922567A (DOMlh-131-202)、GSK1995057A (DOMlh-131-206)及 GSK1995056A (DOMlh-131-511)之抑制。以四個複本測試 各樣品。 圖 40說明 DOM15-26及 DOM15-26-593 dAb在 VEGF RBA 中之效價。 圖 41 展示 DMS1529 (DOM15-26-593)及 DMS1545 (DOM15- 131415.doc -171 - 200907128 26-501)在以 5 藥物動力學。 mg/mg單次快速靜脈内 〉主射向大鼠投與後之 圖42a展示確認單體性質之_1529卜融合物⑽·_ 2-593 FC融合物）之SEC_MALLs(尺寸排阻層析-多角雷射散 射）分析。展巾在折射率（亦即，濃度；虛線）及光散射（實 線)方面顯示類似性質之兩個不同批次。用箭頭標記之線 表示分子質量計算值。
圖42b展示確認單體性質之DMsm9 &融合物（d〇mi5_ 26-593 Fc融合物）之AUC(分析超速離心）分析。在三個不 同濃度’即約0.2、0.5及1.〇 mg/ml下在pBS緩衝液中測試 -個批次之材料。沈降速率分析確認分子質量約歸” 圖 43展示 DMS1529 (D〇Ml5_26 593)及 D〇Mi5 26 5〇k D S C迹線。 圖44為對兩個不同批次之材料進行丨〇次冷凍-解凍循環 之刖及之後，DMS1529 (D〇Ml5_26_593)之 VEGF 結合 EUSA。 圖45展不10次冷凍-解凍循環之前及之後，d〇mi5-26-593 SEC概況之一致性。 圖46說明DMS1529融合物（D〇M15_26 593 Fc融合物）之 加速穩定性研究的結果；結合ELISA在所示溫度下顯示培 養7天後之活性。 圖47A展示在37°C下培養14及15天後’ DMS1529 (DOM15-26-593)在人類獼猴中之穩定性。 圖47B展示在37°C下培養14及15天後，DMS1529 131415.doc -172- 200907128 (DOM15-26-593)在人類血清中之穩定性。 圖48展示〇01^15-26及〇01^15-26-593 (1八5作為？(；融合物 (相應DMS15 64及 15 29)在VEGFRBA中之效價。 圖49說明DMS15 29融合物（DOM15-26-593 FC融合物）對 HUVEC細胞增生之抑制。 圖50為pDom33載體圖。 圖5 la及5 lb描繪結合血清白蛋白之dAb之序列（胺基酸及 核苦酸）。 131415.doc -173 - 200907128 序列表 <11〇>英商多曼提斯有限公司 <120>選擇蛋白酶抗性多肽的方法 <130> D0043 <140> 097121280 <141> 2008-06-06 <150> US 60/933,632 <151> 2007-06-06 <150> GB 0724331.4 <15'1> 2007-12-13 <160〉 235 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 109 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> pD0M13 <400> 1 taatgttatt taaatcatta tcaaaattag caaccgcagc agcatttttt gcaggcgtgg 60 caacagcgtc gacacactgc aggaggcggc cgcagaaact gttgaacgt 109 <210> 2 <211> 119 <212> PRT <213>智人 <400> 2
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 ]5
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala His Glu 20 25 30
Thr Met Val Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser His ile Pro Pro Val Gly Gin Asp Pro Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Leu Leu Pro Lys Arg Gly Pro Trp Phe Asp Tyr 丁卬 Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400〉 3
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp lie 丁yr Leu Asn 20 25 30
Leu Asp Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Asn Phe Gly Ser Glu Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 131415-序列表.doc 200907128 65 70 75 80 G!u Asp Phe Ala Thr 丁yr Tyr Cys Gin Pro Ser Phe 丁yr Phe Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 4 <211> 116 <212> PRT <213>智人 <400> 4
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Ala Tyr 20 25 30
Pro Met Met 丁rp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Glu lie Ser Pro Ser Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr iie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Mn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ma Val Tyr Tyr dys 85 90 95
Ala Lys Asp Pro Arg Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 100 105 110
Thr Val Ser Ser 115 <210> 5 <2n> 108 <212> PRT <2!3>智人 <400> 5
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Trp lie Gly Pro Glu 20 25 30
Leu Ser 丁rp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr His Thr Ser lie Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Giu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 丁yr Met Phe Gin Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Arg Arg 100 105
<210> 6 <211> 358 <212> DNA <213>智人 <400> 6 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc atggtacagc ctggggggtc cctgcgtcic 60 tcctgtgcag cctccggatt caccUtgcg calgagacga tggtgigggt ccgccaggct ]20 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat altcccccgg ttggtcagga tcccuctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc icccgcgaca attccaagaa cacgctatat' 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acagcgglal attactgigc gcigcttcci 300 aagagggggc cttggtttga ctactggggt cagggaaccc tggicaccgt cicgagcg 358 <210> 7 <211> 358 <212> DNA <213>智人 <400> 7 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtcic 60 tcctgtgcag cctccggatt cgcctttgcg catgagacga tggigtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcccccgg ttggtcagga tcccttctac 180 131415-序列表.doc 200907128 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa ctgcaaatga acagcctgcg agccgaggac acagcggtat attactgtgc aagagggggc cttggtuga cuctggggt cagggaaccc tggtcaccgt <210> 8 <211> 358 <212> DNA <2]3>智人 cacgctatat 240 gctgcttcct 300 ctcgagcg 358 f 1 <400> 8 gaggtgcagc tcctgtgcag ccagggaagg gcagactccg ctgcaaatga aagagggggc <210> 9 <21)> 358 <212> DNA <2]3>智人 <400> 9 gaggtgcagc tcctgtgcag ccagggaagg gcagactccg ctgcaaatga aagagggggc <210> 10 <211> 358 <212> DNA <213>智人 <400> 10 gaggtgcagc tcctgtgcag ccagggaagg gcagactccg ctgcaaatga aagagggggc <210> 11 <21i> 358 <212> DNA <213>智人 <400> 11 gaggtgcagc tcctgtgcag ccagggaagg gcagactccg ctgcaaatga aagagggggc <210> 12 <211> 358 <212> DNA <213>智人 <400> 12 gaggtgcagc tcctgtgcag cctgggaagg gcagactccg ctgcaaatga aagagggggc <210> 13 <211> 358 <212> DNA <213>智人 tgitggagtc cctccggat t gtctagagtg tgaagggccg acagcctgcg cttggtuga tgitggagtc cciccggatt gtctagagtg tgaagggccg acagcctgcg cttggtttga tgttggagtc cctccggatt gtctagagtg tgaagggccg acaaccigcg cttggtuga tgttggagtc cctccggatt gtctagagtg tgaagggccg acggcctgcg cttggtttga igttggagtc cctccggatt gtctagagtg tgaagggccg acagcctgcg cttggtttga tgggggaggc caactttgcg ggtctcacat gttcaccatc tgccgaggac ctactggggt tgggggaggc caccntgcg ggtctcacai gttcaccatc tgccgaggac ctactggggt tgggggaggc cacctttgcg ggtctcacat gttcaccatc cgccgaggac ctactggggt tgggggaggc cacctttgcg ggtctcacat gttcaccatc tgccgaggac ctactggggt tgggggaggc cacct t tgcg ggtctcacat gttcaccatc tgccgaggac ctactggggt t tggiacagc catgagacga attcccccgg tcccgcgaca acagcggtat cagggaaccc ttggiacagc catgagacga attcccccgg tcccgcgacg acagcggtat cagggaaccc ttggtacagc catgagacga attcccccgg tcccgcgaca acagcggtat cagggaaccc ttggtacagc catgagacga attcccccgg tcccgcgaca acagcggtat cagggaaccc ttggtaaagc catgagacga attcccccgg tcccgcgaca acagcggtat cagggaaccc ctgggggglc tggtgtgggt uggtcagga attccaagaa attactgtgc tggtcaccgt ctggggggtc tggtgtgggt ttggtcagga attccaagaa atiactgigc tggtcaccgt ctggggggtc tggtgtgggt uggtcagga attccaagaa attactgtgc lggtcaccgt ctggggggtc tggtgtgggt ctggtcagga attccaagag auaetgtgc tggtcaccgt ctggggggtc tggtgtgggt ctggtcagga attccaagaa attactgtgc tggtcaccgt cctgcgtctc 60 ccgccaggct 120 tcccttctac 180 cacgctatat 240 gctgcttcct 300 ctcgagcg 358 cctgcgtctc 60 ccgccaggct 120 tcccttctac 180 cacgctatat 240 gctgciicc丨 300 ctcgagcg 358 cctgcgtctc 60 ccgccaggct 120 tcccitctat 180 cacgctatat 240 gctgcttcct 300 ctcgagcg 358 cctgcgtctc ccgccaggcc tcccttctac cacgctatat getgct tcct ctcgagcg 00008 028405 6 112 3 3 cctgcgtctc 60 ccgccaggct 120 tcccttctac 180 cacgctatat 240 gctgcttcct 300 ctcgagcg 358 <400〉 13 131415-序列表.doc 200907128 gaggtgcagc tcctgtgcag ccagggaagg gcagactccg ctgcaaatga aagagggggc tgitggagtc cctccggatt gtctagagtg tgaagggccg acagcctgcg cttggtitga tgggggaggc cacct t tgcg ggtctcacat gt tcaccatc tgccgaggac ctactggggt ttggtacagc catgagacga at tcccccgg tcccgcgaca acagcggtat cagggaaccc ctggggggtc tggtgtgggt acggtcaaga at tccaagaa at tactgtgc iggtcaccgt cctgcgtctc 60 ccgccaggcc 120 tcccttctac 180 cacgctatat 240 gctgcttcct 300 t <210> 14 <21]> 358 <212> DNA <213>智人
<400> 14 gaggtgcagc tgtgggagtc tggg££aggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg catgagacga tggtgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcccccgg atggtcagga tcccuctac 】S〇 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctatat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acagcggtat attactgtgc gctgcttcct 300 aagagggggc cttggattga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcg 35S <210> 15 <211> 358 <212> DNA <213>智人 <400> 15 gaggtgcagc tgtcggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg catgagacga tggtgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcccccag atggtcagga tcccttctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca aitccaagaa cacgctatat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acagcggtat attactgtgc gctgcttcct 300 aatagggggc cttggtttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcg 358 <210> 16 <211> 358 <212> DNA <213>智人 <400〉 16 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg catgagacga tggtgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcccccgg atggtcagga tcccttctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctatat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acagcggtat attactgtgc gctgcitcct 300 aagagggggc cttggtttga ctactggggt cagggaaccc aggicaccgi ctcgagcg 358 <2]0> 17 <211> 358 <212> DNA <213>智人 <400> 17 gaggtgcggx tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctg-cgtctc 60- tcctgtacag cctccggatt cacctttgcg catgagacga tggtgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat aucccccgg atggtcagga tcccttctac 180 gcagactccg tgaagagccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctatat 240 ctgcagatga acagcctgcg tgccgaggac acagcggtgt attactgtgc gctgcttcct 300 aagagagggc cttggtttga ctactggggt cagggaaccc aggtcaccgt ctcgagcg 358 <210> 18 <211> 35S <212> DNA <213>智人 <400> 18 gaggtgcggc tgttggagtc tcctgtgcag cctccggatt ccagggaagg gtctagagtg gcagactccg tgaagggccg ctgcaaatga acagcctgcg aagagggggc cttggtttga tgggggaggc ttggtacagc cacctttgcg catgagacga ggtctcacat attcccccgg gttcaccatc tcccgcgaca tgccgaggac acagcggtat ctacaggggt cagggaaccc ctgaggggtc cctgcgtctc 60 tggtgtgggt ccgccaggct 120 atagccagga tcccttctac 180 attccaagaa cacgctatat 240 attactgigg gctgcttcct 300 iggtcaccgt ctcgagcg 358
<210> 19 <211> 358 <212> DNA 131415-序列表.doc 4- 200907128 <213>智人 <400> 19 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt caccattgcg catgaaacga tggtgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcccccgg ttggtcagga tcccttctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctatat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acagcggtat aitactgtgc gctgcttcct 300 aagagggggc cttggtttga ctaccggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcg 358 <210> 20 <211> 358 <212> DNA <213>智人 <400> 20 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc ccigcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg catgagacga tggtgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcctccgg ttggtcagga tcccttctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctatat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acagcggtat aitactgtgc gcggcttcct 300 aagagggggc cttggtttga ctactggggt cagggaacct tggtcaccgt ctcgagcg 358 <210> 21 <211> 357 <212> DNA <213>智人 <400> 21 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg catgagacga tggtgtgggt ccgccaggca 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcccccgg atggtcagga tcccttctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctatat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acagcggtat atcactgtgc gctgcttcct 300 aagagggggc cttggtttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 22 <211> 357 <212> DNA <213>智人 <400> 22 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc ccigcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg catgagacga tggtgtgggt ccgccgggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcccccgg atggtcagga tcccliciac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctatat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acagcggtat at tactgtgc gcigci tcct 300 aagagggggc cttggtttga ctactgg£gt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 23 <211> 357 <2)2> DNA <213>智人 <400> 23 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag ccaccggatt cacctttgcg catgagacga tggtgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaggg gtctagagtg ggtctcacat attcccccgg atggtcagga tcccttctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctatat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acagcggtat aitactgtgc gctgcttcct 300 aagagggggc cttggtuga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 24 <211> 357 <212> DNA <213>智人 <400> 24 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg ccagggaggg gtctagagtg ggtctcacat gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac aagagggggc cttggttcga ctactggggt ctggtacagc ctggggggtc ccigcgtctc 60 catgagacga tggtgtgggt ccgccaggct 120 attccctcgg atggtcagga tcccttctac 180 tcccgcgaca aticcaagaa cacgctatat 240 acagcggtat aitactgtgc gctgcttcct 300 cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 131415-序歹[|表.doc 200907128 <2)0> 25 <211> 357 <212> DNA <213>智人
<400> 25 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc ctgcaaaiga acagcctgcg tgccgaggac aagaaggggc cttgglUga ctactggggt <210> 26 <211> 357 <212> DNA <213>智人 <400> 26 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat gcagactccg tgaagggccg gllcaccatc ctgcaaaiga acagcctgcg tgccgaggac aagagggggc cttggtttga ctactggggt <210> 27 <211> 357 <212> DNA <213〉智人 <400> 27 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaagac aagagggggc cttggtttga ctactggggt <210> 28 <2I1> 357 <212> DNA <2]3>智人 <400> 28 gaggtgcagc tgtiggagtc tgggggaggc tcctgtgcag cttccggatt cacctttgcg ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac aagaaggggc cttggtttga ctactggggt <210> 29 <211> 357 <212> DNA <213>智人 <4〇0> 29 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac aagagggggc cttggtttga ctactggggt <210> 30 <211> 325 <212> DNA <213>智人 <400> 30 gacatcctga tgacccagtc tccatcctcc atcacttgcc gggcaagtca ggatautac gggaaggccc ctaagctcct gatcaatctt cgtttcagtg gcagtggata tgggacagat ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 catgagacga tggtgtgggt ccgccaggct 120 attcccccgg atggtcagga tcccttctac 180 tcccgcgaca attccaagaa cacgctatat 240 acagcggtat attactgtgc gctgcttcct 300 cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 cgtgagacga iggtgtgggl ccgccaggct ]20 attcccccgg ttggtcagga tcccttctac 180 tcccgcgaca attccaagaa cacgctatat 240 acagcggtat auactgtgc gctgcttcct 300 cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 caagagacga tggtgtgggt ccgccaggct 120 attcccccgg ttggtcagga tcccttctac 180 tcccgcgaca attccaagaa cacgctatat 240 acagcggtat attactgtgc gcggcttcct 300 cagggaaccc iggtcaccgt ctcgagc 357 ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 catgagacga tggtgtggg丨 ccgccaggct 120 attcccccgg ttgglcagga tcccttctac 180 tcccgcgaca attccaagaa cacgctatat 240 acagcggtat attactgtgc gctgcttcct 300 cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 catgagacga tggtgtgggt ccgccaggct 120 attcccccgg ctggtcagga tcccttctac 180 tcccgcgaca attccaagaa cacgctatat 240 acagcggtat attactgtgc gcggcttcci 300 cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 cigaatnag aciggtatca gcagaaacca 120 geEtccgagt tgcaaagtgg tgtcccatca 180 ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 131415-序歹 y 表.doc 6- 200907128 gaagatgtcg ctacgtacta ctgtcaaccg tctttttact tcccttatac gtlcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acggg 325 <210> 31 <211> 325 <212> DNA <213>智人 <400> 31 cigtaggaga ccgtgtcacc 60 actggtatca gcagaaacca 120 tgcaaagtgg tgtcccatca 180 ccatcagcag tctgcaacct 240 tcccttatac gttcggccag 300 325 gacatcctga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat atcacttgcc gggcaagtca ggatatttac ctgaaittag gggaaagccc ctaagctcct gatcaatttt ggctccgagt cgtttcagtg gcagcggata tgggacagat ttcactctca gaagatttcg ctacgtacta ctgtcaaccg tctttttact gggaccaagg tggaaatcaa acggg <210> 32 <211> 325 <212> DNA <213>智人 <400> 32 gacaiccaga cgacccagtc tccgtcctcc ctgtctgcat cigtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca ggatatltac cagaatnag aciggtatca gcaeaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatcaatttt ggitccgagt tgcaaagtgg tgtcccatct 180 cgtttcagtg gcagtggata tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagatttcg ctacgtacta ctgtcaaccg tctttttact tcccttatac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acggg 325 <210> 33 <211> 325 <212> DNA <2I3>智人 <400> 33 ctgtctgcat cigtaggaga ccgtgtcacc 60 cigaattug actggtatca gcagaaacca 120 ggttccgagt tgcaaagtgg tgtcccatca 180 ttcactctca ccatcagcag tctgcaacci 240 tctttitact tcccttatac gttcggccga 300 325 gacatccagg tgacccagtc 〖ccatccacc atcacttgcc gggcaagtca ggatatttac gggaaagccc ctaagctcct gatcaacttt cgtttcagtg gcagtggata tgggacagat gaagatttcg ctacgtacta ctgtcaaccg gggaccaagg tggaaatcaa acggg <210> 34 <211〉 325 <212> DNA <213>智人 <400> 34 gacatccaga tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtglcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca ggatatttac cagaatttag actggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatcaatttt ggttccgagt tgcaaagtgg tgtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggata cgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagatatcg ctacgtacta-ctgtcaaccg tctttttact tc-c-cttatac gtttggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa agggg 325 <210> 35 <211> 325 <212> DNA <213>智人 <400> 35 ctgtcggcat ctgaaggaga ccgtgtcacc 60 cagaatttag actggtatca gcagaaacca 120 ggttccgagt tgcaaagtgg tglcccatca 180 ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 tctttttact 丨cccitatac gttcggccaa 300 325 ctgtctgcat cigtaggaga ccgtgtcacc 60 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc atcacttgcc gggcaagtca ggatatttac gggaaagccc ctaagctcct gatcaatttt cgtttcagtg gcagtggata tgggacagaa gaagacttcg ctacgtacta ctgtcaaccg gggaccaagg tggaaatcaa acggg <210> 36 <211> 325 <212> DNA <213>智人 <400> 36 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc 】31415-序列表,doc 200907128 ί gtcacttgcc gggcaagtca ggatatttac ctgaatttag gggaaagccc ctaagctcct gatcaatttt ggttccgagt cgtttcagtg gcagtggata tgggacagat ttcactctca gaagatttcg ctacgtacta ctgtcaaccg tctttttact gggaccaagg tggaaatcaa acggg <210> 37 <211> 325 <212> DNA <213〉智人 <400> 37 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat atcacttgcc gggcaagtca ggatatttac ctggatttag gggaaagccc ctaagctcct gatcaat t ΐ t ggttccgagt cgtttcagtg gcagtggata tgggacagat ttcactctca gaagatttcg ctacgtacta ctgtcaaccg tctttttact gggaccaggg tggaaatcaa acggg <210> 38 <211〉 325 <212> DNA <213>智人 <400> 38 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca ggataittac ctgaatttag actggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatcagtttt ggttccgagt tgcaaagtgg tgtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggata tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagatttcg ctacgtacta ctgtcaaccg tctttttact tcccttacac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acggg 325 actggtaica gcagaaacca 120 tgcaaagtgg tgtcccatca 180 ccatcagcag tctgcagcct 240 tcccttatac gttcggccaa 300 325 ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 actggtatca gcagaaacca 120 tgcaaagtgg tgtcccatca 180 ccatcagcgg tctgcaacct 240 tcccttatac gttcggccga 300 325 <210> 39 <21i> 325 <212> DNA <213>智人 <400> 39 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat atcacttgcc gggcaagtca ggatatttac ctgaatttag gggaaagccc ctaagctcct gatcaaatΐt ggttccgagt cgtttcagtg gcagtggata tgggacagat ucactctca gaagatttcg ctacgtacta ctgtcaaccg tctttttact gggaccaagg tggaaatcaa atggg <210> 40 <211> 325 <212> DNA <213>智人 <400〉 40 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat atcacttgcc gggcaagtca ggataittac ctgaatttag gggaaagccc ctaagctcct gatcatttat ggttccgagt cgtttcagtg gcagtggata tgggacagat ttcactctca gaagattccg ctacgtacta ctgtcaaccg tctttttact gggaccaagg tggaaalcaa acggg <2]〇> 41 <211> 325 <2I2> DNA <2丨3>智人 ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 actggtatca gcagaaacca 120 tgcaaagtgg tgtcccatca 180 ccatcagcaa tctgcaacct 240 tcccttatac gttcggccaa 300 325 ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 actggtatca gcagaaacca 120 tgcaaagtgg tgtcccacca 180 ccatcagcag tctgcaacct 240 tcccttatac gttcggccaa 300 325 <400> 41 gacatccaga atcacttgcc gggaaagccc cgtttcagtg gaagatttcg gggaccaagg tgacccagtc gggcaagtca ctaagctcct gcagtggata ctacgtacta tggaaatcaa tccatcctcc ggatatatac gatcaatttt tgggacagat ctgtcaaccg acagg ctgtctgcat ctgaatttag ggttccgagt ttcactctca tctttttact ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 actggtatca gcagaaacca 120 tgcaaagtgg tgtcccacca 180 ccatcagcag tctgcaacct 240 tcccttatac gltcggccaa 300 325 <210> 42 <21]> 325 <212> DNA <2]3>智人 131415-序列表.doc 200907128 clgtctgcat ctgaatttag ggttccgagt ΐ tcactctca tctttttact ctgtaggaga actggtatca tgcaaagtgg ccatcagcag tcccatatac ctgtctgcat ctgaatttgg ggttccgagt ticactctca tctttttact ctgtaggaga actggtatca tgcaaagtgg ccatcagcag tcccttatac <400> 42 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc atcacttgcc gggcaagtca ggatatttac gggaaagccc ctaagctcct gatcaattlt cgtttcagtg gcagtggata tgggacagat gaagattccg ctacgtacta ctgtcaaccg gggaccaagg tggaaatcaa acagg <210〉 43 <211> 325 <212> DNA <213>智人 <400> 43 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc atcacttgcc gggcaagtca ggatatttac gggaaagccc ctaagctcct gatcaat 111 cgtttcagtg gcagtggata tgggacagat gaagatgtcg ctacgtacta ctgtcaaccg gggaccaagg tggaaatcaa acggg <210> 44 <211> 325 <212> DNA <213>智人 <400> 44 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc atcacttgcc gggcaagtca ggatatttac gggaaagccc ctaagctcct gatcaat111 cgtttcagtg gcagtggata tgggacagat gaagactteg ctacgtacta ctgtcaaccg gggaccaagg tggaaatcaa acagg <210> 45 <211> 325 <212> DNA <213>智人 <400〉 45 gacatccaaa tggcccagtc tccatcctcc atcacttgcc gggcaagtca ggatatttac gggaaagccc ctaagctcct gatcagt111 cgtttcagtg gcagtggata tgggacagat gaagat tccg ctacgtacta ctgtcagccg gggaccaagg tggaaatcaa acagg dgteigeat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 ctgaatttag actggtatca gcagaaacca 120 ggttccgagt tgcaaagigg tgtcccatca 180 ttcgctctca ccatcagcag tctgcaacct 240 tctttttact tcccatatac gttcggccaa 300 325 clgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcact 60 ctgaatttag actggtatca gcagaaacca 120 ggttccgagt tgcaaagtgg tgtcccatca ISO ticactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 tctttttact tcccttatac gttcggccaa 300 325 ccgtgtcacc 60 gcagaaacca ]20 tgtcccatca ISO tctgcaacct 240 gt t tggccaa 300 325 ccgtgtcacc 60 gcagaaacca 120 tgtcccatca 180 tctgcaacct 240 <210> 46 <211> 325 <212> DNA <213>智人 <40Q> 46 gacatccaga atcacttgcc gggaaagccc cgtttcagtg gaagat t teg gggaccaagg tgacccagtc gggcaagtca ctaagctcct gcagtggata ctacgtacta tggaaatcaa accatcctcc ggacatttac gatcaatttt tgggacagat ctgtcaaccg acggg ctgtctgcat ctgaatttag ggttccgagt ticactctca tctttttact ctgtaggaga actggtatca tgcaaagtgg ccatcagcag iccct tatac ccgtgtcacc 60 gcagaaacca 120 tgtcccatca 180 tctgcaacct 240 ettcesccaa 300 <210> 47 <211> 324 <212> DNA <213>智人 <400> 47 gacatccaga atcacttgcc gggaaagccc cgtttcagtg gaagatttcg gggaccaagg tgacccagtc gggcaagtca ctaagctcct gcagtggata ctacgtacta tggaaatcaa tccatcctcc ggatatttac gatcaatttt tgggacagat ctgtcaaccg actg ctgtctgcgt ctgaat t tag ggttccgagt t tcacactca tctttttact ctgtaggaga actggtatca tgcaaagtgg ccatcagcag tcccttatac ccgtgtcacc gcagaaacca tgtcccatca tctgcaacct gttcggccaa 60 120 180 240 300 <210> 48 131415-序列表.doc -9- 200907128 <211> 324 <212> DNA <2]3>智人 <400> 48 gacatccaga atcacitgcc gggaaagccc cgtttcagtg gaagatttcg gggaccaagg taacccagtc gggcaagtca ctaagctcct gcagtggata ctacgtacla tggaaatcaa tccatcctcc ggaiat t tac gatcaatttt tgggacagat ctgtcaaccg accg ctgtctgcat ctgaa ulag ggttccgagt t tcactctca tctttttact ctgtaggaga aciggtatca tgcaaagtgg ccatcagcag tccct tatac ccgtgtcacc 60 gcagaaacca )20 tgtcccatca 180 tctgcaacct 240 gttcggccaa 300 <210> 49 <211> 324 <212> DNA <213〉智人 <400> 49 gacatccaga tgacccagtc atcact tgcc gggcaagtca gggaaagccc ctaagctcct cgtttcagtg gcagtggata gaagatttcg ctacgtacta gggaccaagg iggaaalcaa tccatcctcc ctgtctgcai ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 ggatattiac ctgaatttag actggtatca gcagaaacca 120 gatcaatttt ggttccgagt tgcaaagtgg tgtcccatca 180 tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 ctgtcaaccg tctttttact acccttatac gttcggccaa 300 acag 324 <210> 50 <211> 324 <212> DNA <213>智人 <400> 50 gacatccaga tgacacagtc tccatcctcc atctcitgcc gggcaagtca ggatattiac gggaaagccc ctaagctcct gatcagt 111 cgtttcagtg gcagtggata tgggacagat gaagattccg ctacgtacta ctgtcaaccg gggaccaagg tggaaatcaa acgg ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 ctgaatttag actggtatca gcagaaacca 120 ggttccgagt tgcaaagtgg tgttccttca 180 ttcactctca ccatcagcag tctgcagcct 240 tctttttact acccttatac gttcggccaa 300 324 <210> 51 <211> 324 <212> DNA <213>智人 <400> 51 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc atcacttgcc gggcaagtca ggatattiac gggaaagccc ctaagctcct gatcaatttt cgtttcagtg gcagtggata tgggacagat gaagatttcg ctacgtacta ctgtcaaccg gggaccaagg tggaaatcaa acgg cigtctgcat ctgaatttag ggttccgagt ttcactctca tctttttact ctgtaggaga actggtatca tgcaaagtgg ccatcagcag acccttatac ccgtgtcacc 60 gcagaaacca 120 tgtcccatca 180 tctgcaacct 240 ettcseccaa 300 <210> 52 <21 ]> 3-24 <212> DNA <213>智人 ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 actggtatca gcagaaacca 120 tgcaaagtgg agtcccatca 180 ccatcagcag tctgcaacct 240 tcccttatac gttcggccaa 300 324 <400> 52 gacatccaga tgacccagtc atcacttgcc gggcaagtca gggaaagccc ctaagctcct cgtttcagtg gcagtggata gaagattccg ctacgtacta gggaccaagg tggaaatcaa tccatcctcc ctgtcigcai ggatattiac ctgaatttag gatcaatttt ggttccgagt tgggacagat ttcactctca ctgtcaaccg tctttttact tcgg <210> 53 <211> 324 <212> DNA <213>智人 <400> 53 ccgtgtcacc 60 gcagaaacca 】20 tgtcccatca 180 tctgcaacct 240 gttcggccaa 300 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat atgtaggaga atcacttgcc gggcaagtca ggatattiac ctgaatttag actggtatca gggaaagccc ctaagctcct gatcagtt11 ggttccgagt tgcaaagtgg cgtttcagtg gcagtggata tgggacagat ttcactctca ccatcagcag gaagatttcg giacgtacta ctgtcaaccg ictttttact tcccltatac 10- 131415-序列表.doc 200907128 324 gggaccaagg tggaaatcaa acgg <210> 54 <211> 324 <212> DNA <213>智人 <400> 54 gacatccaga tgacccagtc atcact tgtc gggcaagtca gggaaagccc ctaagctcct cgtt tcagtg gcagtggata gaagat t teg gtacgtacta gggaccaagg tggaaatcaa tccaicctcc ctgtctgcat ggatatttac ctgaatttag gatcaatttt ggttccgagt tgggacagat ttcactctca ctgtcaaccg tctttttact acgg ctglaggaga ccgtgtcacc 60 actggtatca gcagaaacca 120 tgcaaagtgg tgtcccatca 180 ccatcagcag tctgcaacct 240 tcccttatac gncggccaa 300 324 <210> 55 <211> 324 <212> DNA <213>智人 ccttgtcacc 60 gcagaaacca 120 tgtcccatca 180 tctgcaacct 240 gttcggccaa 300 <400> 55 gacaiccaga atcact tgee gggaaagccc cgtttcagtg gaagatttcg gggaccaagg tgacccagtc gggcaagica ctaagctcct gcagtggata ciacgtacta tggaaatcaa tccgtcctcc ggatatttac gatcaattta tgggacagat ctgtcaaccg aegt ctgtctgcat ctgaan tag ggttccgagt ttcactctca tctttttact ctglaggaga actggtatca tgcaaagtgg ccatcagcag tcccttatac <210> 56 <211> 324 <212> DNA <213〉智人 tccatcctcc ggatatttac gatcaatctt tgggacagat ctgtcaaccg acgg <400> 56 gacatcctga tgacccagtc atcact tgee gggcaagtca gggaaggccc ctaagctcct cgtttcagtg gcagtggata gaagatgtcg ctacglacta gggaccaagg tggaaatcaa ctgtctgcat cigiaggaga ctgaatttag actggtatca ggttccgagt tgcaaagtgg ttcactctca ccatcagcag ictttttact tcccttatac ccgtgtcacc 60 gcagaaacca 120 tgtcccatca 180 tctgcaacct 240 gttcggccaa 300 324 / <210> 57 <211> 348 <212> DNA <213>智人 <400> 57 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tccigtgcag cctccggatt cacclttaag gcttatccga tgatgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagag atttegeett cgggttetta tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgeegaggae accgcggtat attactgtgc gaaagatcci 300 cggaagtttg actactgggg tcagggaacG ctggtcaceg tGtegage 348 <210> 58 <211> 348 <212> DNA <213>智人 <400> 58 gaggtgcagc tcctgtgcag ccagggaagg gcagactccg ctgcaaatga eggaagt t tg tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 cctccggatt cacclttaag gcttatccga tgatgtgggt ccgccaggct 120 gtccagagtg ggtctcagag atttegeett cgggttctta tacatactac 180 tgaagggccg gttcaccatc tcccgtgaca attccaagaa cacgctgtat 240 acagcctgcg tgeegaggae accgcggtat attactgtgc gaaagatcct 300 actactgggg tcagggaacc ctggtcaceg tetegage 348 <210> 59 <23]> 348 <212> WK <213〉智人 <400> 59 gaggtgcagc tgttggtgtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 icctgtgcag cctccggatt cacctttaag gcttatccga tgatgtgggt ccgccaggct 120 131415-序列表.doc -11 - 200907128 ccagggaagg gtccagagtg ggtctcagag atttcgcctt cgggttctta gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa ctgcaaatga acagcctgcg tgcagaggac accgcggtat attactgtgc cggaagtug actactgggg tcagggagcc ctggicaccg tctcgagc <210> 60 <21]> 348 <212> DNA <213>智人 <400> 60 gaggtgcagc tgttggtgtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc tcctgtgcag cctccggatt cacctttaag gcttatccga tgatgtgggt ccagggaagg gtctagagtg gatctcagag atttcgcctt cgggttctta gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat atiactgtgc cggaagt t tg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc <210> 61 <211> 348 <212> DNA <213>智人 <400> 61 gaggtgcagc tgctggtgtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc tcctgtgcag cctccggatt cacctttaag gcttatccga tgatgtgggt ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagag atttcgcctt cgggttcata gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc cggaagtttg aatacigggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc <210〉 62 <211> 348 <212> DNA <213>智人 <400> 62 gaggtgcagc igttggtgtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc tcctglgcag cctccggatt cacctttaag gcttatccga igatgtgggt ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagag atttcgcctt cgggttctta gcggaciccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc cggaagtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc <210> 63 <211> 348 <2]2> DNA <2】3>智人 <400> 63 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc tcctgtgcag cctccggatt cacatttaag gcttatccga tgatgtgggt ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagag atttcgcctt cgggttctta gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa ctgcaaatga acggcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc cggaagattg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc <210> 64 <231> 348 <212> DNA <213>智人 <400> 64 gaggtgcagc tgttggtgtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc tcctgtgcag cctccggatt cacctttaag gcttatccga tgatgtgggt ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagag atttcgcctt cgggttctta gcatactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa ctgcaaatga acagcctgca tgccgaggac accgcggtat attactgtgc cggaagt tag actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc <2IO> 65 <211> 348 <212> DNA <213>智人 tacatactac 180 cgcgctgtat 240 gaaagatcct 300 348 cctgcgtctc ccgccaggct tacatactac cacgctgtat aaaagatcct cctgcgtctc ccgccaggct tacatactat cacgctgtat gaaagatcct cctgcgtctc ccgccaggct tacatactac cacgctgtat gaatgatcct 00008 028404 6 1 n 2 3 3 00008 0 2 8 4 0 4 6 .—- n 2 3 3 00008 028404 6 112 3 3 cctgcgtctc 60 ccgccaggct 120 tacatactac 180 cacgctgtat 240 gaacgatcci 300 348 cctgcgtctc 60 ccgccaggct 120 tacatactac 180 cacgctgtat 240 gaaagatcci 300 348 131415-序列表.doc -12- 200907128 <400> 65 gaggtgcagc tguggagtc tgggggaggc ttggtacagc caggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgctg cctccggatt cacctttaag gcttatccga tgatgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaaga gtctagagtg ggtctcagag atttcgcctt cgggttctta tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcacaatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat at tactgtgc gaaagatcct 300 cggaagat tg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 66 <231> 348 <212> DNA <213> ^口人 <400〉 66 ctggggggtc cctgcgictc 60 tgatgtgggt ccgccaggct 120 cgggttctta tacatactac 180 attccaagaa cacgctgtat 240 attacigtac gaaagatcct 300 tctcgagc 348 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc tcctgtgcag cctccggatt cacctttaag gcttatccga ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagag atttcgcctt gcagagtccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat cggaagtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg <210> 67 <211> 348 <212> DNA <213>智人 <400> 67 gaggtgcagt tgttggtgtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttaag gcttatccga tgatgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagag atticgcctt cgggttctta tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatt tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagatcct 300 cggaagtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 68 <211> 348 <212> DNA <213>智人 <400> 68 00008 o 2 8 4 4 6 1 .—-233 gaggtgcagc igttggagtc 丨gggggaggc ttggtacagc ctggggggic cctgcgtctc tcctgtgcag cctccggatt cacctttaag gcttatccga tgatgtgggt ccgccaggct ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagag atttcgcctt cgggttctta tacatactac gcaaactccg tgaagggtcg gttcaccatc tcccgcgaca atlccaagaa cacgctgtat ctgcaaaiga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagatcct cggaagattg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc <210> 69 <211> 348 <212> DNA <213>智人 <400> 69 gaggtgcagc tcctgtgcag ccagggaagg gcagactccg ctgcaaatga cggaagtctg <210> 70 <211> 348 <212> DNA <213>智人 <400> 70 gaggtgcagc tcctgtgcag ccagggaagg gcagactccg ctgcaaatga cggaagattg <210> 71 <211> 348 tgttggagtc cctccggatt gtctagagtg tgaagggccg acagcctgcg actactgggg tgggggaggc cacctttaag ggtctcagag gttcaccatc tgccgaggac tcagggaacc ttggtacagc gcttatccga atttcgcctt tcccgcgaca accgcggtat ctggtcaccg ctggggggtc tgatgtgggt cgggttctta a t tccaagaa attactgtgc tctcgagc cctgcgtctc 60 ccgccaggct ]20 tacatactac 180 cacgctgtat 240 gaaagatcct 300 348 tgttggagtc cctccggatt gtctagagtg tgaagggccg acagcctgcg actactgggg tgggggaggc cacctttaag ggtctcagag gttcaccatc tgccgaggac tcagggaacc ttggtacagc gcttatccga atctcgcct t tcccgcgaca accgcggtat ctggtcaccg
Ctggggggtc tgatgtgggt cgggttctta a t tccaagaa attactgtgc tctcgagc
cctgcgtctc 60 ccgccaggct 120 tacatactac 180 cacgctgtat 240 gaaagatcct 300 34S -13- 131415-序列表.doc 200907128 <212> DNA <2]3>智人 <400> 71 gaggtgcatc tgttggagtc tgggggaggc uggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttaag gcttatccga tgatgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagag atttcgcctt cgggttctta tacatactac 180 gcaaactccg tgaagggccg gitcaccatc icccgcgaca aticcaagaa cacgctgiat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggiat attactgigc gaaagatcct 300 cggaagattg actactgggg tcagggaacc ciggtcaccg tctcgagc 348 <210> 72 <211> 348 <212> DNA <213>智人 <400> 72 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc tcctgtgcag cctccggatt cacctttaag ccagggaagg gtciagagtg ggtctcagag gcagactccg tgaagggccg gttcaccaic ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac cggaagttag actactgggg tcagggaacc <2IO> 73 <211> 348 <212> DNA <213>智人 <400> 73 gaggtgcagc tgttggtgtc tgggggaggc tcctgtgcag cctccggatt cacctttaag ccagggaagg gtctagagtg ggtclcagag gcagactccg tgaagggccg gucaccatc ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac cggaagtttg actactgggg tcagggaacc <210> 74 <211> 348 <212> DNA <213>智人 <400> 74 gaggtgcagc tgttggtgtc tgggggaggc tcctgtgcag cctccggatt cacct ttaag ccagggaagg gtctagagtg ggtttcagag gcagactccg tgaagggccg gttcaccaic ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac cggaagttag actactgggg tcagggaacc <210> 75 <211> 324 <212> DNA <213> %人
Uggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 gcttatccga tgatgtgggt ccgccaggct 120 atttcgcctt cgggttctta tacatactac ISO tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 accgcggtal attactgtgc gaaagatcc丨 3〇0 ciggtcaccg tctcgagc 348
Uggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 gcttatccga tga丨gtgggt ccgccaggct 丨20 atttcgcctt cgggttctta tacatactac 180 tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 accgcggtat attactgtac gaaagatcct 300 ctggtcaccg tctcgagc 348 ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 gcttatccga tgatgtgggt ccgccaggct 120 atttcgcctt cgggttctta tacatactac 180 tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 accgcggtat aitactgtgc gaaagatccl 300 ctggtcaccg tctcgagc 348
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc atcacttgcc gggcaagtca gtggattggt gggaaagccc ctaagctcct gatctatcat cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gggaccaagg tggaaatcag acgg <210〉 76 <211> 324 <212> DNA <213>智人 <400> 76 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc atcacttgcc gggcaagtca gtggattggt gggaaagccc ctaagcgcci gatctatcat cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gggaccaagg tggaaatcag acag ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 ccggagttaa gttggtacca gcagaaacca 120 acgtccattt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 tatatgtuc agcctaggac gttcggccaa 300 324 ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 ccggagttaa gttggtacca gcagaaacca 120 tcgtccaiti tgcaaagtgg ggtcccatca 180 ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 tatatgtttg agcctaggac gttcggccaa 300 324 131415-序列表.doc 14· 200907128 f <210> 77 <211> 324 <212> DNA <2〗3>智人 <400> 77 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc atcacttgtc gggcaagtca gtggattggt gggaaagccc ctaagctcct gatctaicat cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gggaccaagg tggaaatcag acgg <210> 78 <2]1> 324 <212> DNA <213〉智人 <400> 78 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc atcacttgcc gggcaagtca gtggattggt gggaaagccc ctaagcacct gatctatcat cgtttcagtg gcagtagatc tgggacagat gaagatittg ctacgtacta ctgtcaacag gggaccaagg tggaaatcag atgg <210> 79 <211> 324 <212> DNA <213>智人 <400> 79 gacatccaga tgacccagtc iccatcctcc atcacttgcc gggcaagtca gtggattggt gggaaagccc ctaagctcct gatctatcat cgt t tcagtg gcagtggata tgggacagat gaaeattltg ctacgtacta ctgtcaacag gggaccaagg tggaaattag acgg <210> 80 <2】1> 324 <2】2> DNA <2]3>智人 ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 ccggagttaa gatggtacca gaagaaacca 120 acgtccattt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 tatatgtttc agcctaggac gttcggccaa 300 324 ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 ccggagttaa gttggtacca gcagaaacca 120 acgtccattt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 tatatgtttc agcctaagac gttcggccaa 300 324 ctgicigcai ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 ccigagttaa gatggtacca gaagaaacca 120 acgtccattt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 ttcactttca ccatcagcag tctgcaacct 240 tatatgtttc agcctaggac gttcggccca 300 324 <400〉 80 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat atcacttgcc gggcaagtca gtggattggt ccggagttaa gggaaagccc ctaagctcct gatctatcat acgtccattt cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tatatgtttc gggaccaagg tggaaatcag atgg ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 gttggtacca gcagaaacca 120 tgcgaagtgg ggtcccatct 180 ccatcagcag tctgcaacct 240 agcctaggac gttcggccaa 300 324
<210> 81 <211> 324 <212> DNA <213>智人 ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 gttggtacca gcagaaacca 120 lacagagtgg ggtcccaica 180 ccatcagcag tctgcaacct 240 agcctaggac gttcggccaa 300 324 <400> 81 gacatccaga tgacccagtc atcacttgcc gggcaagtca gggaaagccc ctaagcgcct cgt t tcagtg gcagtggata gcagat ΐ t tg caacgtacta gggaccaagg tggaaatcag tccatcctcc ctgtctgcat gtggattggt ccggagttaa gatctatcat acgtccatit tgggacagat ttcactctca ctgtcaacag tatatgtttc acag <210〉 82 <211> 324 <212> DNA <213>智人 <400> 82 gacatccaga tgacccagtc cccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggattggt ccggagttaa gttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatcat acgtccattt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 15- 131415-序列表.doc 200907128 cgtttcagtg gcagtggalc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta cigtcaacag tatatgttn ggcctaggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcag acaa 324 <210> 83 <211> 324 <212> DNA <2丨3>智人 <400> 83 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtccgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggattggt ccggagttaa gttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagctc ctaagctcct gatctatcat acgtccattt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggata tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaactt 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tatatgtttc tgcctaggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcag aggg 324 <210> S4 <211> 324 <212> DNA <213>智人 <400> 84 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgicacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggattggt ccggagttaa gttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagttcct gatctatcat acgtccattt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggata tgggacagat ttcactctca ccatcaacag tctgcaacct 240 ggagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tatatgtttc agcctaggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcag acgg 324 <210> 85 <211> 324 <212> DNA <213>智人 <400> 85 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggattggt ccggagttaa gttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatcat acgtccattt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcastg scagtggata tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta cigtcaacag tatatgtatc agcctaggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcag acag 324 <21Q> 86 <211> 324 <212> DNA <213>智人 <400> 86 ^ gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcai ctgiaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggattggt ccggagttaa gatggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatcat acgtccattt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cstttcaste scastfigatc teggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgt&aacag tatatgntc agcctatgac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcag aggg 324 <210> 87 <211> 324 <2]2> DNA <213>智人 <400> 87 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc atcacttgcc gggcaagtca gtggattggt gggaaagccc ctaagctcct gatctatcat cgtltcagtg gcagtggata tgggacagat gaagattctg ctacgtacta ctgtcaacag gggaccaagg tggaaaccag acgg <210> 88 <211> 324 <212> DNA <213〉智人 ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 ccggagttaa gatggtacca gaagaaacca 120 acgtccattt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 ttcactctca ccatcagcag tctgcaagci 240 tatatgtttc agcctaggac gttcggccaa 300 324 <400〉 88 131415-序列表,doc -16- 200907128 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgaaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggattggt ccggagttaa gttggtacca gcagaaacca 120 cggaaagccc ctaagctcct galctatcat acgtccat11 tgcaaagtgg gglcccatca 180 cgtttcactg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tatatgttic agcctatgac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcag acgg 324 <210> 89 <211> 324 <212> DNA <213>智人 <400> 89 gacatcctga tgacccagic tccatcctcc ctgtctgcat atcacttgcc gggcaagtca gtggattggt ccggagttac gggaaagccc ctaagctcct gatctaicat acgtccat 11 cglttcagtg gcagtggata tgggacagat ttcactctct gaagattlcg ctacgtacta ctgtcaacag tatatgttic gggaccaagg tggaaatcag atgg <210> 90 <211> 324 <212> DNA <213>智人 <400> 90 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggattggt ccggagttaa gttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc caaagctcct gatctaicat acgtccat11 tgcaaggtgg ggtcccatca 180 cgt ttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaggattttg ctacgtacta ctgtcaacag tatatgtttt ggcctaggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcag acag 324 ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 gttgglacca gcaiaaacca 120 tgcaaagtgg ggtcccatca 180 ccatcagcag tctgcaacct 240 agcctaggac gttcggccaa 300 324 <210> 91 <211> 300 <232> DNA <213>會人 <400> 91 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggattggt ccggagttac gttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatcat acgtccat 11 tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgt ttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tatatgtttc agcctatgac gttcggccaa 300 <210> 92 <211> 22 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> Gas前導序列 <400> 92 Met Leu Phe Lys Ser Leu Ser Lys Leu Ala Thr Ala Ala Ala Phe Phe 15 10 15
Ala Gly Val Ala Thr Ala 20 <210> 93 <211> 8 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>基因III序列 <400> 93 Ala Ala Ala Glu Thr Val Glu Ser <210> 94 131415-序列表.doc 17- 200907128 <211> 108 <212〉PRT <2]3>智人 <40O> 94
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Arg Asn Ser Phe Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser G】y Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Tyr 丁hr Val Pro Pro 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Gin 100 105 <210> 95 <211> 108 <212> PR丁 <213>智人 <40O> 95 , Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly f \ 5 10 15 % Asp Arg Val Thr He 丁hr Cys Arg Ala Ser Gin Ser I le Ser Ser 丁yr 20 25 30
Uu Asn Trp Tyr G】n Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45 丁yr Arg Asn Ser Pro Leu Gin Ser Gly Va】Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Tyr Ser lie Pro Pro 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 96 <211> 108 <212> PRT <2]3>智人 <40O> 96
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Arg Pro lie Gly Thr Thr 20 25 30
Leu Ser Trp 丁yr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Trp Phe Gly Ser Arg Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gin Ala Gly Thr His Pro Thr 85 90 95
Thr Phe Gly G!n Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 97 <2]]> 108 <212> PRT <2]3>智人 <400> 97
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Tyr lie Gly Ser Gin 20 25 30 -18- 131415-序列表.doc 200907128
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He 35 40 45
Ala Trp Ala Ser Val Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Arg G!n Gly Ala Ala Ser Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 98 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 98
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 】 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Phe ile Tyr Arg 丁yr 20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asn Ala Ser Tyr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin His Ala His Leu Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Me Lys Arg 100 105 <210> 99 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 99
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Trp lie Gly Ser Gin 20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He 35 40 45
Met Trp Arg Ser Ser Leu G】n Ser Gly Va】Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gin Gly Ala Ala Leu Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 )05 <210> 100 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 100
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 ]5
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Lys He Ala Thr Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp 丁yr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Arg Ser Ser Ser Leu Gin Ser Ala Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Val Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 01u Asp Phe Ala 丁hr Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Tyr A】a Val Pro Pro 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 19- 131415-序列表.doc 200907128 100 105 <210> 101 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 101
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Va) Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin T卬 He Asp Thr Gly 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu He 35 40 45
Tyr Asn Val Ser Arg Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 丁hr 】le Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Trp Gly Ser Pro Thr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> )02 <211> !08 <212> PR丁 <2]3>智人 <400> 102
Asp lie Gin Mel Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Va) Gly 15 10 ]5
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Glu lie Tyr Ser Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin CHn Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asn Ala Ser His Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Val lie Gly Asp Pro Val 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 103 <211> 108 <2]2> PR丁 <213>智人 <400> 103
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser He Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro G】y Lys Ala Pro Thr Leu Leu 11e 35 40 45
Tyr Arg Leu Ser Val Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Tyr Asn Val Pro Pro 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 104 <211〉 108 <212> PRT <2]3>智人 <400> 104 •20- 131415-序列表.doc 200907128
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Arg Asn Ser Gin Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu G】n Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Phe Ala Val Pro Pro 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg 100 105 <2)0> 105 <211> 108 <212> PRT <213〉智人 <400> ]〇5
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Va) Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Arg Asn Ser Pro Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Me Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Tyr Arg Val Pro Pro 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 106 <211> 108 <212> PRT <2丨3>智人 <400> 106
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin His lie Gly Leu 丁rp 20 25 30
Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He 35 40 45
Tyr Arg Ser Ser Leu Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr 丁yr Tyr Cys Gin G]n Lys Tyr Asn Leu Pro Tyr 85 90 95
Thr Ser Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 107 <211> 108 <212> PRT <213〉智人 <400> 107
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Phe Arg His 20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gin Ser Gly Va] Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr I】e Ser Ser Leu Gin Pro -21 - 131415-序列表.doc 200907128 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Val Ala Leu Tyr Pro Lys 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly 丁hr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 100 105 <210> 108 <211> 108 <212> PRT <2I3>智人 <400> 108
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Va] Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie lie Lys His 20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gin G】n Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu I】e 35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Arg Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 丁yr Cys Gin Gin Gly Ala Arg Trp Pro Gjn 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 109 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 109
Asp I!e G】n Met 丁hr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Vai Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Tyr Tyr His 20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Giy 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Me Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Val Arg Lys Val Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 】00 105 <210> 110
<211> 108 / -. <212> PRT U <213>智人 <400> 110
Asp lie Gin Thr Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin 丁yr lie Gly Arg Tyr 20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 11e 35 40 45
Tyr Asp Ser Ser Val Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 G]u Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Tyr Arg Met Pro 丁yr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 111 22- 131415-序列表.doc 200907128 <2il> 108 <212> PRT <213> %人 <400> 111
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin His He His Arg Glu 20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He 35 40 45
Tyr Gin Ala Ser Arg Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Lea Gin Pro 65 70 75 80 01u Asp Phe AU Thr Tyr Tyr Cys G]n Gin Lys 丁yr Leu Pro Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 112 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 112
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin His lie His Arg Glu 20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Gin Ala Ser Arg Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 0iu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ty「Arg Val Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly 丁hr Lys Va】Glu lie Lys Arg ]〇0 105 <210> 113 <211> 108 <2]2> PR丁 <2Π>智人 <400> 113
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Gly Arg Arg 20 25 30
Leu Lys- Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ala Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Arg Thr Ser Trp Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Ser Gin Trp Pro His 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 1J4 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 114
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Lys He Tyr Lys Asn 20 25 30 -23- 131415-序列表.doc 200907128
Leu Arg Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys A]a Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asn Ser Ser lie Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser 01y Ser Giy Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Tyr Leu Ser Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 115 <2U> 108 <212> PRT <213>智人 <400>115
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 】5
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Lys lie Tyr Asn Asn 20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asn Thr Ser lie Leu Gin Ser Gly Va) Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Trp Arg Ala Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 116 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 116
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly ] 5 30 ]5
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Trp lie Tyr Lys Ser 20 25 30
Leu Gly Trp 丁yr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Gin Ser Ser Leu Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr His Gin Met Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 117 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 117
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Trp Me Tyr Arg His 20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Arg Leu Gin Ser Gly Vai Pro Thr Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr His Asn Pro Pro Lys 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 24- 131415·序列表.doc 200907128 100 105 <210〉 118 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 118
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Tyr lie Gly Arg Tyr 20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asp Ser Ser Val Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Tyr Met Gin Pro Phe 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105
<210> 119 <211〉 108 ( <2\2> PRT k <213>智人 <400> 119
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Trp lie Gly Arg Tyr 20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asn Gly Ser Gin Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Tyr Leu Gin Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly G3n Gly Thr Lys Val Glu Me Lys Arg 100 105 <210> 120 <211> 108 <212> PRT <2丨3>智人 <400> 120
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr ile Thr Cys Arg A]a Ser G】n Tyr Me Gly Arg Tyr 20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asp Ser Ser Val Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Me Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Tyr Ser Ser Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg 100 105 <210> 121 <211> 108 <212> PR丁 <213>智人 <400〉 121 -25 - 131415-序列表.doc 200907128
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Va) Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Tyr lie Ser Arg Gin 20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Val Leu Gin Ser Gly lie Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr 丁yr Tyr Cys Gin Gin Arg Tyr lie Thr Pro 丁yr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Val Lys Arg 100 105 <210> 122 <211> 108 <212> PRT <2】3>智人 <400> 122
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Va! G)y 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Trp lie His Arg Gin 20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser lie Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Phe Ser Lys Pro Ser 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 123 <211> 118 <212> PR丁 <213>智人 <400> 123
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Tyr Asp Tyr 20 25 30
Asn Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 丁rp Val 35 40 45
Ser Thr He Thr His Thr Gly Gly Val 丁hr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Mel Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Gin Asn Pro Ser Tyr Gin Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> )24 <211> 120 <212> PRT <213〉智人 <400〉 124
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val G!n Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Leu Tyr 20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ser lie Va] Asn Ser Gly Val Arg Thr Tyr 丁yr Ala Asp Ser Val 26- 131415-序列表.doc 200907128 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 丁hr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Leu Asn όΐη Ser 丁yr His Trp Asp Phe Asp Tyr Trp Gly G]n 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 125 <211> 123 <212> PRT <213>智人 <400〉 125
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr 20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg G】n A]a Pro Gly Lys Gly Leu Giu 丁rp Val 35 40 45
Ser Ser He Asp Phe Met Gly Pro His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Gly Arg Thr Ser Met Leu Pro Met Lys Gly Lys Phe Asp 丁yr 100 105 Π0
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 126 <211> 118 <212> PRT <213>智人 <400> 126
Glu Va) Gin Leu Leu Glu Ser Gly G]y Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe His Arg Tyr 20 25 30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr lie Leu Pro Gly Gly Asp Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Gin Thr Pro Asp Tyr Met Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 127 <211> 117 <212> PRT <2]3>智人 <400> ]27
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Lys Tyr 20 25 30
Asn Mel Ala Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr lie Leu Gly Glu Gly Asn Asn Thr Tyr 丁yr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 27- 131415-序列表，doc 200907128
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Thr Met Asp Tyr Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 100 105 Π0
Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 】28 <211> 118 <212> PRT <213>智人 <400> 128
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Glu Tyr 20 25 30
Asn Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Fro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr lie Leu Pro His Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Gin Asp Pro Leu Tyr Arg Phe Asp Tyr Trp Gly G!n Gly Thr 100 105 1)0
Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 129 <211> 118 <212> PRT <213>智人 <400> 129
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30
Arg Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr lie He Ser Asn Gly Lys Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 丁hr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Mel Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Gin Asp Trp Met 丁yr Met Phe Asp 丁yr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 130 <211> Π8 <212> PRT <213>智人 <400> 130
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr 20 25 30
Thr Met Ala Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ser lie Thr Ser Ser Gly Ser Scr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Val Asn Ser Leu Tyr Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 28- 131415-序列表.doc 200907128 100 105 110
Leu Va1 Thr Val Ser Ser 115 <210> 131 <211> 119 <2]2> PR丁 <2]3>智人 <220> <221> VARIANT <222> 119 <223> Xaa =任何胺基酸 <400> 131
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Pro Thr 20 25 30
Asn Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr lie Thr Gly Thr Gly Ala Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Gin Asn Ser Arg Tyr Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Xaa 1)5 <210> 132 <211> 117 <212> PR丁 <2]3>智人 <220> <221> VARIANT <222> ]17 <223> Xaa =任何胺基酸 <400> 132
Glu Val G!n Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 丁rp Pro 丁yr 20 25 30
Thr Mel Ser 丁rp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 丁rp Val 35 40 45
Ser Thr lie Ser Pro Phe Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys S5 90 95
Ala Lys Gly Gly Lys Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 100 105 110
Thr Val Ser Ser Xaa 115 <210> 133 <2Π> 123 <2)2> PRT <2丨3>智人 <220> <221> VARIANT <222> 123 <223> Xaa =任何胺基酸 <400> 133
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly G]y 29- 131415-序列表.doc 200907128 15 】〇 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Pro 丁yr 20 25 30
Thr Met Ser Trp Va! Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr lie Ser Pro Phe Gly Ser Thr 丁hr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu 丁yr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Ser Asp Val Leu Lys Thr Gly Leu Asp Gly Phe Asp Tyr Trp 100 105 110
Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Xaa 115 120 <210> 134 <211> 121 <212> PRT <213〉智人 <220> <221〉 VARIANT <222> 121 <223> Xaa =任何胺基酸 <400> 134
Glu Vai Gin Leu Leu Giu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Met Ala Tyr 20 25 30
Gin Met Ala Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr lie His G!n 丁hr Gly Phe Ser Thr Tyr 丁yr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu 丁yr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Val Arg Ser Met Arg Pro Tyr Lys Phe Asp Tyr 丁rp Gly G]n loo 105 no
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Xaa 115 120 <210> 135 <211> 118 <212> PRT <213>智人 <220> <221> VARIANT <222> 118 <223> Xaa =任何胺基酸 <400> 135
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro G)y Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Pro Tyr 20 25 30
Thr Met Ser Trp Va! Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 丁rp Val 35 40 45
Ser Thr lie Ser Pro Phe G】y Ser Thr Thr 丁yr Tyr Ala Asp Ser Va】 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Gly Asn Leu Glu Pro Phe Asp Tyr Trp Gly G!n Gly Thr Leu 100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Xaa 115 -30- 131415-序列表.doc 200907128 <210> 136 <211> 119 <212> PRT <213>智人 <220> <221> VARIANT <222> 139 <223> Xaa =任何胺基酸 <400> 136
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Pro Tyr 20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr lie Ser Pro Phe Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg A!a Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Lys Thr Gly Pro Ser Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Xaa 115 <210> 137 <211> 11B <212> PRT <213>智人 <220> <221> VARIANT <222> 118 <223> Xaa =任何胺基酸 <400> 137
Glu Va) Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Pro Tyr 20 25 30
Thr Met Ser Trp Va] Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr lie Ser Pro Phe Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Lys Leu Ser Asn Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu ]〇0 105 110
Val Thr Val Ser Ser Xaa 115 <210> 138 <211> 119 <212> PRT <213〉智人 <220> <221> VARIANT <222> 119 <223> Xaa =任何胺基酸 <400> 138
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Pro 丁yr 20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 -31 - 131415-序列表.doc 200907128
Ser Thr lie Ser Pro Phe Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Va! 50 55 60
Lys G】y Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu 丁yr 65 70 75 80
Leu G】n Met Asn Ser Leu Arg A】a G】u Asp Thr Ala Va】丁yr 丁yr Cys 85 90 95
Ala Lys Val Val Lys Asp Asn Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Xaa 115 <210> 139 <211> 119 <212> PRT <213>智人 <220> <22]> VARIANT <222> 119 <223> Xaa ：=任何胺基酸 <400> 139
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Glv Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Pro Tyr 20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr lie Ser Pro Phe Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Aia Lys Asn 丁hr Giy Giy Lys Gin Phe Asp Tyr 丁rp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Xaa 115 <210> 140 <211> 121 <212> PRT <2丨3>智人 <220> <221> VARIANT <222> 121 <223> Xaa =任何胺基酸 <400> 140
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Pro Tyr 20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr ile Ser Pro Phe Gly Ser Thr Thr Tyr 丁yr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Arg Thr Glu Asn Arg G]y Val Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Xaa 115 120 <210> 141 <211〉 121 <212> PRT <213>智人 -32- 131415-序列表.doc 200907128 <220> <221> VARIANT <222> 121 <223> Xaa =任何胺基酸 <400> 141
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Asp Tyr 20 25 30
Asp Met Thr 亍rp Val Arg Gin A】a Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Met lie Ser Ser Ser Gly Leu 丁rp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Gly Phe Arg Leu Phe Pro Arg Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin ]〇0 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Xaa 115 120 <210> 142 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 142
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie 丁hr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Ser 丁yr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Pro Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Tyr Ser Va) Pro Pro 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg ]〇0 105 <210> 143 <211> 108 <212> PRT <213〉智人 <400> 143 ί
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly ] 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Ser 丁yr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Pro Leu Gin Ser Gly Va! Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 6】u Asp Phe Ala Thr Tyr 丁yr Cys Gin Gin 丁hr Tyr Arg lie Pro Pro 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <2lO> 144 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 144
Asp lie G!n Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly •33- 131415-序列表.doc 200907128 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Me Phe Lys Ser 20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asn Ala Ser Tyr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 G3u Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Val Val Tyr Trp Pro Val 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Giu lie Lys Arg 100 105 <210> 145 <211> ]〇7 <212> PRT <213>智人 <400> 145
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser He 丁yr Tyr His 20 25 30
Leu Lys 丁rp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Lys Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu 65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Val Arg Lys Val Pro Arg Thr 85 90 95
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg 100 105 <210> 146 <211> 108 <212> PR丁 <213>智人 <400> 146
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie 丁hr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Arg Arg Tyr 20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He 35 40 45
Tyr Gin Aia Ser Val Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Gly Leu Tyr Pro Pro lie 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu !le Lys Arg 100 105 <210> 147 <211> 108 <212> PRT <213〉智人 <400> 147
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Tyr Asn Trp 20 25 30
Leu Lys Trp Tyr G)n Gin Lys Pro Gly Lys A]a Pro Lys Leu Leu Me 35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 34- Ϊ 31415-序列表.doc 200907128
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Asn Val Val lie Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Ciy Thr Lys Val Glu He Lys Arg 100 105 <210> 148 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 148
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 】5
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Leu Trp His 20 25 30
Leu Arg 丁rp Tyr Gin Gin Lys Pro G]y Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr His Ala Ser Leu Leu Gin Ser G】y Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe A】a Thr Tyr 丁yr Cys Gin Gin Ser Ala Val Tyr Pro Lys 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 149 <21]> 108 <2]2> PR丁 <213>智人 <400> ]49
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Phe Arg 丁yr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr His Ala Ser His Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Giy Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Leu Leu Tyr Pro Lys 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 150 <211> 108 <212> FRT <213>智人 <400> 150
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Phe Tyr His 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Pro Ala Ser Lys Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Aia Arg Trp Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105
<210> 151 <211> 108 <212> PRT 35- 131415-序列表.doc 200907128 <2]3>智人 <400> 151
Asp !le G!n Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie 丁hr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ik lie 丁rp His 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Arg Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Val Ala Arg Val Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 152 <211> 108 <2]2> PR丁 <213>智人 <40O> 152
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Tyr Arg Tyr 20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 11 e 35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr 丁yr Tyr Cys Gin Gin Tyr Val Gly Tyr Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Giy Thr Lys Val Glu ile Lys Arg 100 105 <210> 153 <211> 108 <212> PRT <2]3>智人 <400> 153
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Aia Ser Val Gly 15 】0 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Leu Lys Tyr 20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 11e 35 40 45
Tyr Asn Ala Ser His Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Giu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 丁hr Thr Tyr Tyr Pro lie 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Va] Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 154 <211> 108 <212> PRT <2I3>智人 <400〉 154
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Aia Ser Gin Ser lie Leu Arg Tyr 20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45 36- 131415-序列表.doc 200907128
Tyr Lys Ala Ser Trp Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 όΐυ Asp Phe Ala Thr Tyr 丁yr Cys G)n Gin Va] Leu 丁yr 丁yr Pro Gin 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 155 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 155
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Va] Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Me Leu Arg Ser 20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Val Val Tyr Trp Pro Ala 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 156 <211> 108 <212> PRT <2I3>智人 <400> 156
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Phe Arg His 20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 SO
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys G]n Gin Val Ala Leu Tyr Pro Lys 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210〉 157 <2)1> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 157
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Arg Lys Tyr 20 25 30
Leu Arg 丁rp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 01u Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Asn Leu Phe Trp Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 -37- 131415-序列表.doc 200907128 <210> 158 <211> 108 <212〉 PRT <213>智人 <400> 158
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie 丁hr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Arg Arg Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Met Leu Phe Tyr Pro Lys 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 159 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 159
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser ]le He Lys His 20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys A】a Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Arg Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gtn Gly Ala Arg Trp Pro Gin 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 160 <211> 108 <212> PR丁 <213>智人 <400> 160
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 ]〇 15
Asp Arg Vai Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Tyr Tyr His 20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gin G】n Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Val Arg Lys Val Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Giy Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 161 <211> 108 <212〉 PRT <213>智人 <400> 161
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15 38- 131415-序列表.doc 200907128
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Tyr Lys His 20 25 30
Leu Lys 丁rp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 丨le 35 40 45
Tyr Asn Ala Ser His Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Val Gly Arg Tyr Pro Lys 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 162 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 162
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Phe Lys Ser 20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He 35 40 45
Tyr Asn Ala Ser 丁yr Leu Gin Ser G]y Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu G)n Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Val Val Tyr Trp Pro Val 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg 100 105 <2!0> 163 <211> 116 <212> PRT <2!3>智人 <400> 163
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Val Tyr 20 25 30
Gin Met Asp Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ser He Ser Ala Phe Gly Ala Lys Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Leu Ser Gly Lys Phe Asp 丁yr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 100 105 ]10
Thr Val Ser Ser 115 <210> 164 <2U> 120 <212> PRT <213>智人 <400> 164
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Ser Tyr 20 25 30
Gin Met Thr Trp Val Arg Gin A]a Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ser lie Ser Ser Phe Gly Ser Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr -39- 131415-序列表.doc 200907128 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Va! Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Gly Arg Asp His Asn Tyr Ser Leu Pbe Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 165 <211> 324 <212> DNA <213>智人 ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 attggtacca gcagaaacca 120 tgcaaagtgg ggtcccatca 180 ccatcagcag tctgcaaccc 240 ttcctcctac gtttggccaa 300 324 <400> 165 gacatccaga atcact tgcc gggaaagccc cgt t tcagtg gaagattttg gggaccaagg tgacccagtc gggcaagtca ctaagctcct gcagtggatc ctacgtacta tggaaatcaa tccatcctcc gagcat tagc gatctatcgg tgggacagat ctgtcaacag acag ctgtctgcat agctat ttaa aattcctttt t tcactctca acgtatactg ... <210> 166 <211> 324 <212> DNA <213〉智人 <400> 166 gacatccaga tgacccagtc tccacccicc atcact tgcc gggcaagtca gagcattagc gggaaagccc ctaagctcct gatctatcgg cggttcagtg gcagtggatc tgggacagat gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gggaccaagg tggaaatcaa acgg <210> 167 <211> 324 <212> DNA <213>智人 <400> 167 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc atcacugcc gggcaagtcg tccgattggg gggaaagccc ctaagctcct gatctggttt cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat gaagattttg ctacgtacta ctgtgcgcag gggaccaagg tggaaatcaa acgg ctgtccgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120 aattcccctt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 act tat tcga ttcctcctac gt tcggccaa 300 324 ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 acgacgt taa gt tggtacca gcagaaacca 120 ggttcccggt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gctgggacgc atcctacgac gttcggccaa 300 324 <210> 168 <21]> 324 <212> DNA <2I3>智人 <400> 168 ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 at tggtacca gcagaaacca 120 tgcaaagtgg ggtcccatca 180 ccatcagcag tctgcaacct 240 cgcctcggac gttcggccaa 300 324 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat atcacugcc gggcaagtaa gtatattggt tcgcagttaa gggaaagccc ctaagctcct gatcgct tgg gcgtccgt 11 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca gaagattttg ctacgtacta ctgtcgtcag ggtgctgcgt gggaccaagg tggaaatcaa acgg <210> 169 <211> 324 <212> DNA <213>智人 <400>169 gacat tcaga atcact tgcc gggaaagtcc cgtttcagtg gaagattttg gggaccaagg tgacccagtc gggcaagtca ctaagctcct gcagtggatc ctacgtacta tggaaatcaa tccatcctcc gt t tat t tat gatctataat tgggacagat ctgtcaacag acgg ctgtctgcat cggtat t tat gcgtcctat t ttcactctca catgctcatt ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 cglggtatca gcagaaacca 120 tgcaaagtgg ggtcccatca 180 ccatcagcag tctgcaacct 240 tgcctcgtac gttcggccaa 300 324 <210> 170 131415-序列表.doc -40- 200907128 <211> 324 <212> DNA <213>智人 <400> 170 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc cigtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcactigcc gggcaagtca gtggaitggg tctcagttat cltggiacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatcaigtgg cgttcctcgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcacictca ccatcagcag icigcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtgctcag ggtgcggcgt igcctaggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <2IO> 171 <211> 324 <212> DNA <213>智人 <400> 171 ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 attggtatca gcagaaacca 120 tgcaaagcgc ggtcccatca 180 ccatcagcag tctgcaacct 240 ttcctcctac gttcggccaa 300 324 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat atcacttgcc gggcaagtca gaagattgct acttatttaa gggaaagccc ctaagctcct gatctatagg tcttcctctt cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagtt ttcacactca gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag acgtaigctg gggaccaagg tggaaatcaa acgg <210> 172 <211> 324 <212> DNA <213>智人 <400> 172 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggattgat actgggttag cgtggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaggctcct gatctataat gtgtccaggt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tattggggta gtcctacgac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <2]〇> ]73 <2]]> 324 <212> DNA <213>智人 <400> 173 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca ggagatttat tcgtggttag cgtggiacca gcagagacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctataat gcticccatt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgt ticagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gtgattggtg atcctgttac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324
<210> 174 <211> 324 <212> DNA <213>智人 <400> 174 gacatccaga atcacttgcc gggaaagccc cgtttcagtg gaagattttg gggaccaagg ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 aitggtacca gcagaaacca 120 tgcaaagtgg ggtcccatca 180 ccatcagcag tctgcaacct 240 ttcctcctac gttcggccaa 300 324 <2 Kb 175 <211> 324 <212> DNA <2丨3>智人 tgacccagic gggcaagtca ciacgctcci gcagtggatc ctacgtacta tggaaatcaa tccatcctcc gagcattagc gatctatcgg tgggacagat ctgtcaacag acgg ctgtctgcat agctautaa ttgtccgtgt i tcactctca acttataatg 60 120 180 240 300 <400> J75 gacatccaga atcacttgcc gggaaagccc cgtttcagtg gaagattttg tgacccagtc gggcaagtca ctaagctcct gcagtggatc ctacgtacta tccatcctcc gagcattagc gatctatagg tgggacagat ctgtcaacag ctgtctgcat agctatctaa aat tcccagt ttcactctca acttttgcgg ctgtaggaga at tggtacca tgcaaagtgg ccatcagcag ttcctcctac ccgtgicacc gcagaaacca ggtcccatca tctgcaacct gttcggccaa -41 - 131415-序列表.doc 200907128 gggaccaagg tggagatcaa acgg 324 <210> 176 <2Π> 324 <212> DNA <2丨3>智人 <400> 176 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcal cigtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatcgg aattccccit tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat tlcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagaittlg ctacgtacta ctgtcaacag acgtataggg tgcctcctac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 177 <211> 324 <2I2> DNA <2丨3>智人 <400> 177 gacatccaga 丨gacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat cigtaggaga ccglgicacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gcatattggg ttgtggttac attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatagg tcttccttgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag aagtataatt tgccttatac gtccggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 f <210〉 178 ^ <211> 324 <2I2> DNA <213>智人 <400> 178 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat cigtaggaga ccgigtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattttt cggcatttaa agtggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgcg gcatcccgtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gttgcgctgt atcctaagac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 179 <211> 324 <212> DNA <213>智人 <400> 179 tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgigtcacc 60 gagcanau aagcamaa agiggiacca gcagaaacca ]20 gatctatggt gcatcccggt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 tgggacagat tlcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 ctgtcaacag ggggctcggt ggcctcagac gttcggccaa 300 acgg 324 gacatccaga tgacccagtc atcacttgcc gggcaagtca gggaaagccc ctaagctcct cgtttcagtg gcagtggatc gaagat 11 tg ctacgtacta gggaccaagg tggaaatcaa / , <210> 180 V ^ <2ll> 324 <212> DNA <2丨3>智人 <400> 180 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcatttat tatcattiaa agtggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctataag gcatccacgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat tlcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gttcggaagg tgcctcggac gucggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 181 <211> 324 <212> DNA <213>智人 <400> 181 gacatccaga cgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat cigtaggaga ccgigtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtataitggt aggtatttac gitggtatca gcagaaacca 120 42- 131415-序列表.doc 200907128 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat tcttccgtgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattltg ctacgtacta ctgtcaacag cgttatcgta tgccttatac gttcggccaa 300 gggaccaggg tagaaatcaa acgg 324 <210> 182 <211> 324 <212> DNA <2丨3>智人 <400> 182 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc cigtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gcatattcai agggagttaa ggtggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatcag gcgtcccgtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag aagtatctgc ctccttatac gticggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <2I0> 183 <211> 324 <212> DNA <213〉智人 <400> 183 gacatccaga tgacccagtc atcacttgcc gggcaagtca gggaaagccc ctaagctcct cgtttcagtg gcagtggatc gaagattttg ctacgtacta gggaccaagg tggaaatcaa tccatcctcc cigtctgcat gcatattcat agggagttaa gatctatcag gcgtcccgtt tgggacagat ttcactctca ctgtcaacag cgttataggg acgg ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 ggtggtatca gcagaaacca 120 tgcaaagtgg ggtcccatca 180 ccatcagcag tctgcaacct 240 tgccuatac gttcggccaa 300 324
<210> 184 <211> 324 <212> DNA <213>智人 <400> 184 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc atcacttgcc gggcaagtca gagtattggg ggggcagccc ctaggctcct gatctaicgt cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gggaccaagg tggaaatcaa acgg <210> 185 <211> 324 <212> DNA <213>智人 <400> 185 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc atcacttgcc gggcaagtca gaagatttat gggaaagccc ctaagctcct gatctataal cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gggaccaagg tggaaatcaa acgg ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 cggaggttaa agtggtacca gcagaaacca 120 acgtcctggt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 ticacictca ccatcagcag tctgcaacct 240 acgtcgcagt ggcctcatac gttcggccaa 300 324 ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 aagaatttac gttggiatca gcagaaacca 120 tcttccattt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 aggtatctgt cgccttatac gltcggccaa 300 324 <210> 186 <211> 324 <2I2> DNA <213>智人 <400> 186 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gaagatttat aataatttaa ggtggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctataat acttccattt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag cgatggcgtg cgccttatac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 187 <211> 324 <212> DNA <213>智人 131415-序列表.doc •43- 200907128 <400> 187 gacattcaga tgacccagic tccatcctcc atcacttgcc gggcaagtca gtggatttat gggaaagccc ctaagctcct gatctatcag cgtttcagtg gcagtggalc tgggacagat gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gggaccaagg tggaaatcaa acgg <210> 188 <211> 324 <212> DNA <213〉智人 <400> 188 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc atcacttgcc gggcaagtca gtggatttat gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gggaccaagg tggaaatcaa acgg <210> 189 <211> 324 <212> DNA <213>智人 <400> 189 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc atcacttgcc gggcaagtca gtatattggt gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat cgtucagtg gcagtggatc tgggacagat gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gggaccaagg tggaaatcaa acgg <210> 190 <211> 324 <212> DNA <213>智人 <400> 190 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc atcacttgcc gggcaagtca gtggattggt gggaaagccc ctaagctcct gatctataat cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat gaagattttg ctacgtacta ctgicaacag gggaccaagg tggaaatcaa acgg <210> 191 <21]> 324 <212> DNA <213>智人 <4〇〇> 191 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc atcacttgcc gggcaagtca gtatattggt gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat gaagattttg ctacgtacta ctgicaacag gggaccaagg tggaaatcaa gcgg <210> 192 <211> 324 <212> DNA <213>智人 <400> 192 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc atcacttgcc gggcaagtca gtatatttcg gggaaagccc ctaggctcct gatctatggg cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat gaagauttg ctacgtacta ctgtcaacag gggaccaagg tggaagtcaa acgg <210> 193 <211> 324 ctgtcigcai ctgiaggaga ccgtgicacc 60 aagtcgttag ggtggtacca gcagaaacca 120 tcttctttgt tgcaaagtgg ggtcccaica 180 ttcaclctca ccatcagcag tctgcaacct 240 latcatcaga tgcctcggac gttcggccaa 300 324 ctatctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 aggcatttaa ggtggtacca gcagaaacca 120 gcgtccaggt tgcaaagtgg gglcccaaca 180 ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 actcataatc ctcctaagac gttcggccaa 300 324 cigtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 aggtatttac gttggtatca gcagaaacca 120 tcttccgtgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 tlcaclctca ccatcagcag tctgcaacct 240 aggtatatgc agcctttiac gttcggccaa 300 324 cigtccgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 cggtaillac ggiggiacca gcagaaacca 120 gggtcccagl tgcaaagtgg ggtcccatca 180 ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 cggtatcttc agccttatac gttcggccaa 300 324 ctgtctgcat ctgiaggaga ccgtgtcacc 60 aggtatttac gttggtatca gcagaaacca 120 tcttccgtgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 cgttattctt cgccttatac gttcggccaa 300 324 cigtctgcat ctgtaggaga ccgtgicacc 60 cgtcagttaa ggtggtacca gcagaaacca 120 gcgtccgttt igcaaagcgg gatcccatca 180 ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 a£gtatatta ctccilaiac gttcggccaa 300 324 131415·序列表.doc 44· 200907128 <212> DNA <213>智人 <400> 193 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccglglcacc 60 alcacttgcc gggcaagtca gtggattcat aggcagttaa agtggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctattat gcttccattt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag acgttttcta agccttctac gitcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 194 <211> 354 <212> DNA <2】3>智人 <400> 194 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt caccttttat gattataata tgtcttgggl ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaact attacgcata cgggtggggt tacaiac丨ac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg igccgaggat accgcggtat aitactgtgc gaaacagaat 300 cct tcttatc agtttgacta ctggggtcag ggaaccctgg tcaccgtctc gage 354 <210> 195 <211> 360 <212> DNA <213>智人 <400> 195 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgat etttatgata tgtcgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggteleateg attgttaatt cgggtgttag gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgeegaggae accgcggtat attactgtgc gaaacttaat 300 cagagttatc attgggattt tgactactgg ggtcagggaa ccctggtcac cgtctcgagc 360 <2!0> 196 <211> 369 <212> DNA <213>智人 <400> 196 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgigcag cctccggatt cacctttlcg aagtattgga tgtcgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatct attgatttta tgggtccgca tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgeegaggat accgcggtat attactgtgc gaaagggagg 300 aegtegatgt tgccgatgaa ggggaagttt gactactggg gtcagggaac cctggtcacc 360 gtetegage 369 <210> 197 <211> 354 <212> DNA <213>智人 <400> 197 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttcat cgttattcga tgtcttgggl ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaacg attttgcctg gtggtgatgt tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgeegaggat accgcggtat attactgtgc gaaacagacg 300 cctgattata tgtttgacta ctggggtcag ggaaccctgg tcaccgtctc gage 354 <210> 198 <211> 351 <212> DNA <213>智人 <400> 198 gaggtgcagc: tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt caccttttgg aagtataata tggcgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaact aticttggtg agggtaataa tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgcigtat 240 45· 131415-序列表.doc 200907128 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaaacgatg 300 gattataagt ttgactactg gggtcaggga accctggtca ccgtctcgag c 351 <210> 199 <211> 354 <212> DNA <213;>智人 <400> 199 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctgggggglc cctgcgtctc 60 tcctgiacag cctccggatt cacctttgat gagtataata igtcttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaacg attctgccgc atggtgatcg gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgclgtat 240 cigcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacaggat 300 ccutgtata ggtttgacta ctggggtcag ggaaccctgg tcaccgtctc gage 354 <210> 200 <211> 354 <212> DNA <213>智人 <400> 200 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt caccttttcg gattategga tgagttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaacg aitatitcga atggtaagit tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgeegaggae accgcggtat attactgtgc gaaacaggat 300 tggatgtata tgtttgacta ctggggtcag ggaaccctgg tcaccgtctc gage 354 <210> 201 <211> 354 <212> DNA <213〉智人 <400> 201 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctgggggglc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttcgg acgtatacta tggcttgggt ccgccaggcc 320 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatcg attactagta gtggttcttc tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaagtgaat 300 tctttgtata agtttgacta ctggggtcag ggaaccctgg tcaccgtctc gage 354 <2]0> 202 <211> 355 <212> DNA <2】3>智人 <400〉 202 gaggtgcagc igltggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttcgg ccgactaata tgtcgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaact aitaciggta ctggtgctgc gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgeegaggae accgcggtat attactgtgc gaaacagaat 300 tetegttata ggtttgacta ctggggtcag ggaaccctgg tcaccgtctc gageg 355 <210> 203 <211> 349 <212〉 DNA <2I3>智人 <400> 203 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctutgg ccgtatacga tgagttgggi ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaacg atttegeegt tiggltcgac tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgeegaggae accgcggtat attactgtgc gaaagggggg 300 aaggattttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tetegageg 349 <210> 204 <211> 367 <212> DNA <2]3>智人 <400> 204 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 -46- 131415-序歹 il表.doc 200907128 tcctgtgcag cctccggatt caccttttgg ccgtatacga igagttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagig ggtctcaacg atttcgccgt ttggttcgac tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaagtgat 300 gttcttaaga cgggtctgga tggttttgac tactggggtc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcgagcg 367 <210> 205 <211> 361 <212> DNA <2]3>智人 <400> 205 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggic cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttatg gcgtatcaga tggcttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaact altcatcaga cgggttttlc tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaagtgcgt 300 tctatgcgtc cttataagtt tgactactgg ggtcagggaa ccctggtcac cgtctcgagc 360 g 361 <2]〇> 206 <211> 352 <212> DNA <213>智人 <400> 206
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc tlggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt caccttttgg ccgtatacga tgagttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaacg atttcgccgt ttggttcgac tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaggtaat 300 cttgagccgt ttgactactg gggtcaggga accctggtca ccgicicgag eg 352 <210> 207 <211> 355 <212> DNA <213>智人 <400> 207 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt caccttttgg ccgtatacga igagttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaacg atttcgccgt ttggttcgac tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaaagacg 300 ggtccgtcgt cgtttgacta ctggggtcag ggaaccctgg tcaccgtctc gageg 355 <210> 208 <211> 352 <212> DNA <213>智人
<400> 20S gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggt ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt caccttttgg ccgtatacga tgagttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagig ggictcaacg aiiicgccgi uggiicgac iacataciac 】80 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaaaagctt 300 agtaatggtt ttgactactg gggtcaggga accctggtca ccgtctcgag eg 352 <210> 209 <211> 355 <212> DNA <213>智人 <400> 209 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggucagc ctggggggtc cc丨gcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt caccttttgg ccgtatacga tgagttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaacg atttcgccgt tiggttcgac tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagtggtt 300 aaggataata cgtttgacta ctggggtcag ggaaccctgg tcaccgtctc gageg 355 <210> 210 <211> 355 47· 131415-序列表，doe 200907128 <212> DNA <213>智人 <400> 210 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggiacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctutgg ccgtatacga tgagttgggt ccgccaggci 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaacg atttcgccgt tiggttcgac tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatt tcccgcgaca attccaagaa cacgctgiat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgigc gaaaaatact 300 gggggtaagc agtugacia ctggggtcag ggaaccctgg tcaccgtac gagcg 355 <210> 211 <211> 361 <212> DNA <213>智人 <400> 2Π gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt caccttttgg ccgtatacga tgagttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaacg atttcgccgt tiggttcgac tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg igccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaaggac丨 300 gagaataggg gggtttcttt tgactactgg ggtcagggaa ccctggtcac cgtctcgagc 360 g 361 4?' c <210〉 212 <211> 361 <212> DNA <213>智人 <400> 212 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtcic 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttaag gattatgata tgacttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaatg atttcttcgt cgggtctttg gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaggtttt 300 aggctgtttc ctcggacttt tgactactgg ggtcagggaa ccctggtcac cgtctcgagc 360 g 36] <210> 213 <211> 357 <212> DNA <213>智人 <400> 213 gaggttcaat tgttggaatc cggtggtgga tiggttcaac ctggtggttc tttgagattg 60 tcctgtgctg cttccggttt tactttcgct cacgagacta tggtttgggt tagacaggct 120 ccaggtaaag gattggaatg ggtttcccac attccaccag atggtcaaga tccattctac 180 gctgactccg ttaagggaag attcactatc tccagagaca actccaagaa cactttgtac 240 ttgcagatga actccttgag agctgaggat actgctgttt accactgtgc tttgttgcca 300 aagagaggac cttggtttga ttactgggga cagggaactt tggttactgt ttcttcc 357 <210> 214 <211> 119 <212> PRT <213>智人 <400> 214
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly G]y 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala His Glu 20 25 30
Thr Met Val Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser His lie Pro Pro Asp Gly Gin Asp Pro Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys G!y Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys 85 90 95
Ala Leu Leu Pro Lys Arg Gly Pro Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Π5 48- 131415·序列表.doc 200907128 <210> 215 <211> 357 <212> DNA <2]3>人工序列 <220> <223> —致序列 <220> <221> misc_feature <222> (6)...(6) <223> n = t 或 g <220> <221> misc_feature <222> (9)...(9) <223> n = a ^ g <220> <221> misc一feature <222> (10)...(10) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222〉 （18).,.(18) <223> n = a 或 g <220> <221> misc^feature <222> ¢21)7..(21) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (24)...(24) <223> n = t 或 g <220〉 <221〉 misc一feature <222> (27)...(27) <223> n = t 或 a <220> <221> misc_feature <222> (30)...(30) <223> n = a 或 c
<220> <221> misc feature <222> (36)...(36) <223> n = t 或 a <220> <221> misc一feature <222〉（39)…（39) <223> n = a 或 g <220> <221> misc_feature <222> (45)...(45) <223> n = t 或 g <220> <221> misc一feature <222> (48)...(48) -49 131415-序列表.doc 200907128 <223> η = t 或 g <220> <221> misc_feature <222> (51)…（51) <223> n = t 或 c <220> <221> misc一feature <222〉 （52)…（52) <223〉 n = t 或 c <220> <221> misc一feature <222> (55)7..(55) <223> n = a 或 c <220> <221> mi sc一feature <222> (57)..,(57) <223> n = a 或 t <220> <221> misc_feature <222> (58)...(58) <223> n = t 或 c <220> <221> misc一feature <222〉 （60)…（60) <223> n = g 或 c <220> <221> misc_feature <222> (69)...(69) <223> n = t 或 a <220> <22i> misc—feature <222> (72)..,(72) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> ¢78)...(78) <223〉 n =〖或 a <220> <221> misc_feature <222> (81)...(81) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (84).,.(84) <223> n = t 或 c <220> <221〉 misc—feature <222> ¢87)...(87) <223> n = c ^ t •50 131415-序列表.doc 200907128 <220〉 <221> misc_feature <222> (90)...(90) <223> η = t 或 g <220> <221> mi sc—feature <222> (93)7..(93) <223> n = c 或 t <220> <221> misc一feature <222> ¢99)...(99) <223> n = t 或 g <220> <221> misc_feature <222> (105)...(105) <223> n = t 或 g <220> <221> misc_feature <222> (lllT...(111) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (112T...012) <223> n = a 或 c <220> <221> misc feature <222> (114)...(114) <223> n = a 或 c <220〉 <221> misc—feature <222> (12〇T...(120) <223> n = t 或 a <220> <221> misc一feature <222> (126T...(126) <223> n = t 或 g <220> <221> misc_feature <222> (129)...(129) <223> n = a 或 g <220> <221> mi sc_feature <222> (132j...(132) <223〉 n = a 或 t <220> <221> misc.feature <222> (133)...(133} <223> n = t 或 c <220> <221> misc一feature <222> (135T...(135) -51 131415·序列表.doc 200907128 <223> η = g 或 a <220> <221> misc^feature <222> (138)...(138) <223> n = a 或 g <220> <221> misc.feature <222> (144T...(144) <223> n = t 或 c <220> <221> misc.feature <222> (147)...(147) <223〉 n = c 或 a <220> <221> misc一feature <222> (150了…（150) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (156).,.(156) <223> n = a 或 c <220> <221> misc_feature <222> (159)...(159) <223> n = a 或 g <220> <221> misc_feature <222> (168)...(168) <223〉 n = a 或 g <220〉 <221> misc.feature <222> (174)...(174) <223> n = a 或 c <220>
<221> misc_feature <222> (183T...(183) <223> n = t 或 a <220> <221> misc_feature <222> (192)...(192) <223> n = t 或 g <220> <221> misc_feature <222> (198)...(198) <223> n = a 或 c <220> <221> misc_feature <222〉 （199了…（199) <2七> n = a 或 c -52 131415-序列表.doc 200907128 <220> <221> misc_feature <222> (20lT...(201) <223〉 η = a 或 g <220> <221> misc_feature <222〉 （207了...（207) <223> n = t 或 c <220> <221> misc^feature <222> (2147...(214) <i23> n = a 或 c <220> <221> misc_feature <222> (216T...(216) <223〉 n = a 或 c <220> <221> misc_feature <222> (222). ..(222) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (234)...(234) <223〉 n = i 或 g <220> <221> misc_feature <222> (235T...(235) <223> n = t 或 c <220> <221> misc一feature <222> (2371...(237) <223> π = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (24〇T...(240) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (24lT...(241) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (246)...(246) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (253T...(253) <223> n = t 或 a <220> <221> misc一feature <222> (2547...(254) -53- 131415·序列表.doc 200907128 <223> η = c 或 g <220> <221> misc^feature <222> (256T...(256) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (259j...(259) <223> n = a 或 c <220> <221> misc_feature <222> (26lT-..(261) <223> n = a 或 t <220> <221> misc^feature <222> (264T...(264) <223> n = t 或 c <220> <221> misc feature <222> (270)...(270) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (273)...(273) <223〉 π = t 或 a <220> <221> misc_feature <222> (276)...(276) <2 n = t 或 g <220> <221> misc_feature <222> (279了…（279) <223〉 n = t 或 a <220>
<221> misc一feature <222> (282).,.(282) <223〉 n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (291)...(291) <223> n = t 或 g <220> <221> misc_feature <222> (292^...(292) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (295)...(295) <223> n = t 或 c -54 131415-序列表.doc 200907128 <220> <221> misc一feature <222> (297)..,(297) <223> n = g 或 t <220> <221> misc^feature <222> (300)...(300) <223> n = a 或 t <221> misc_feature <222> (306)...(306) <223> π = a 或 g <220> <221> misc feature <222> (309j...(309) <223> η = a 或 g <220> <22】> misc-feature <222> (32ΰ.,，（321) <223> η = t 或 c <220> <221> misc一feature <222> (330了…（330) <223> n = a 或 t <220> <221> misc一feature <222> (339T...(339) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (340)...(340) <223> n = t 或 c <220> <221> misc^feature <222> (345)...(345) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (348)...(348) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (351)...(351) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (354)...(354) <223> n = t 或 g <220> <221> misc^feature <222> (355). ..(355) <223> n = t 或 a -55 131415-序列表.doc 200907128 <220〉 <221> misc_feature <222> (356)...(356) <223> η = c 或 g <400> 215 gaggtncann tgttggantc nggnggnggn ttggtncanc ctggnggntc nntgngnntn tcctgtgcng cntccggntt nacnttngcn cangagacna tggtntgggt nngncaggcn ccaggnaang gnntngantg ggtntcncan attccnccng atgglcanga tccnttctac gcngactccg tnaagggnng nttcacnatc tccngngaca antccaagaa cacnntntan ntgcanatga acnncntgng ngcngaggan acngcngtnt ancactgtgc nntgntnccn aagagnggnc cttggtttga ntactggggn cagggaacnn tggtnacngi ntcnnnc <210> 216 <211> 366 <212> DNA <213>智人 <400> 216 gagaaaagag aggttcaatt gcitgaatct ggaggaggtt tggtccagcc aggagggicc cttcgactaa gttgtgctgc cagtgggttt acgtttgctc atgaaactat ggtaigggtc cgacaggcac ctggtaaagg tcttgaatgg gtttcacata tccctccaga cggtcaagac ccattttacg ctgattccgt gaaaggcaga tttacaatu cacgagataa ttctaaaaac accttgtact tacaaatgaa ctcattgaga gctgaggaca ctgcagttta tcactgcgct ttactaccaa aacgtggacc ttggtttgat tattggggcc aaggtacgtt agtgactgtt agttct <210> 217 <211> 122 <2]2> PRT <213>智人 <400> 217
Glu Lys Arg Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin 1 5 10 15
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 20 25 30
Ala His Glu Thr Met Val Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45
Glu Trp Val Ser His lie Pro Pro Asp Gly Gin Asp Pro Phe Tyr Ala 50 55 60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 65 70 75 80
Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95
Tyr His Cys Ala Leu Leu Pro Lys Arg Gly Pro Trp Phe Asp Tyr Trp 100 105 110
Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 218 <211> 366 <212> DNA π <2]3>馬斯德畢赤酵母 <400> 218 gagaaaagag aggttcaatt gcttgaatct ggaggaggtt tggtccagcc aggagggtcc cttcgactaa gttgtgctgc cagtgggttt acgtttgctc atgaaactat ggtaigggtc cgacaggcac ctggtaaagg tcttgaatgg gtttcacata tccctccaga cggtcaagac ccattttacg ctgattccgt gaaaggcaga tttacaattt cacgagataa ttctaaaaac accttgtact tacaaatgaa ctcattgaga gctgaggaca ctgcagttta tcactgcgct ttactaccaa aacgtggacc ttggtttgat tattggggcc aaggtacgtt agtgactgtt agttct <210> 219 <211> 358 <212> DNA <2丨3>人工序列 <220> <223> —致序列 56- 131415-序列表.doc 200907128 <220> <221> misc_feature <222> (6)...(6) <223> n = g 或 t <220> <221> misc一feature <222> (9)...(9) <223> n = g 或 a <220> <221> misc.feature <222〉 （10)…（10) <223> n = c ^ t <220> <221〉 misc一feature <222〉 （13)…（13) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (15)...(15) <223> n = g 或 t <220> <221> misc_feature <222> (18)...(18) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (24)...(24) <223〉 n = g 或 a <220> <221> misc一feature <222> (30)...(30) <223> n = c 或 t <220> <221> misc feature <222> (36>，‘·（36) <223〉 η = a 或 c <220>
<221> misc_feature <222> (42)...(42) <223> n = t 或 a <220> <221〉 misc—feature <222> (45)...(45) <223> n = g 或 a <220> <221〉 misc—feature <222> (54)...(54) <223> n =： g 或 t <220〉 -57 131415-序列表.doc 200907128 <221> misc^feature <222〉 （57),..(57) <223> η = t 或 a <220> <221> misc_feature <222> (60)...(60) <223> n = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (61)...(61) <223> n = t 或 a <220> <221> misc_feature <222> (62)...(62) <223> n = c 或 g <220> <221> misc_feature <222〉 （63)…（63) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (69)...(69) <223〉 n = a 或 t <220> <221> misc_feature <222> (73)7..(73) <223> n = t 或 a <220> <221> misc_feature <222> (74)...(74) <223> n = c 或 g <220> <221> misc_feature <222> (75)...(75) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (78)...(78) <223> n = a 或 g <220> <221> misc一feature <222> (81)...(81) <223> n = c 或 t <220> <221> misc__feature <222> (84)...(84) <223〉 n = c 或 g <220> <221> misc一feature <222> (90)...(90) <223〉 n = g 或 t -58 131415-序列表.doc 200907128 <220> <221> misc_feature <222> ¢96)...(96) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> ¢99)...(99) <223> n = g 或 t <220> <221> misc_feature <222> (105)...(105) <223> n = g 或 a <220> <221> misc.feature <222> (114)...(114) <223> n = c 或 a <220> <221〉mi sc一feature <222> (123).,.(123) <223> n = a 或 t <220> <221> misc_feature <222> (126)...(126) <223> n = g 或 t <220> <221> misc_feature <222> (129T...(129) <223〉 n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (135T...(135) <223> n = a 或 I <220> <221> mi sc feature <222> (138)...(138) <223> n = g 或 a <220> <221> misc^feature <222> (144*).. .(144) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (153)...(153) <223> π = t 或 c <220> <221> misc^feature <222> (156)...(156) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature -59 13 Μ15-序列表.doc 200907128 <222> (159)…（159) <223〉 n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (162)...(162) <223> n = t 或 c <220> <221> misc一feature <222> (168)...(168) <223〉 n = g 或 a <220〉 <221> misc一feature <222> (171)...(171) <223> n = t 或 c <220〉 <221> misc—feature <222> (174T...(174) <223> n = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (177了·，.（177) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (183)...(1S3) <223〉 n = a 或 t <220> <221> misc—feature <222> (186T...(186) <223> n = c 或 t <220> <221> misc feature <222> (1957...(195) <223> n = g 或 a <220〉 <221> misc一feature <222> (199)...(199) <223> n = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (201)...(201) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (204T...(204) <223> n = c 或 t <220> <221> mi sc一feature <222> (207T,..(207) <223〉 n = c 或 a -60 131415-序列表.doc 200907128 <220> <221> misc_feature <222> (210)...(210) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (213)...(213) <223> n = c 或 a <220〉 <221> misc_feature <222> (216)...(216) <223> n = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (219)...(219) <223> n = c 或 t <220〉 <221> misc„feature <222> (225)...(225) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (228T...(228) <223> η 二 g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (234)...(234) <223> n = g 或 c <220> <221> misc_feature <222> (235)...(235) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (237)...(237) <223> n = a 或 g
<220> <221> misc_feature <222> ¢240)...(240) <七3> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (24lT...(241) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (243)...(243) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature -61 Ϊ31415-序列表.doc 200907128 <222〉 （253)...(253) <223> η = a 或 t <220> <221> misc一feature <222> (254)...(254) <223> n = g 或 c <220> <22]> misc一feature <222> (255)...(255) <223> n = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (256)...(256) <223> n = c 或 t <220> <221> misc-feature <222> (259)...(259) <223> n = c 或 a /.- \ <220> <221> misc一feature <222> (261)…（261) <223> n = i 或 a <220〉 <221> misc—feature <222> (264)...(264) <223> n = c 或 t <220> <22】> misc一feature <222> (273)...(273) <223> n = a 或 t <220> <221> misc_feature <222> (276了‘..（276) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (279)...(279) <223> π = a 或 t <220> <22】> misc-feature <222> (288)...(288) <223> n = t 或 c <220> <221> misc.feature <222> (2917...(291) <223> n = g 或 t <220> <221> misc一feature <222> ¢292)...(292) <223> n = c 或 t -62 131415-序列表.doc 200907128 <220〉 <221> misc—feaiure <222> (294)...(294) <223> η = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (297)...(297) <223> n = t 或 a <220> <22]> misc—feature <222> (300)...(300) <223> n = t 或 a <220> <221> misc一feature <222> (303)...(303) <223> η =： g 或 a <220> <221> misc一feature <222> (304)...(304) <223> n = a 或 c <220> <221〉 misc一feature <222> (306)...(306) <223> n = g 或 t <220> <22]> misc—feature <222> ¢309)...(309) <223〉 n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (32lT...(321) <223> π 二 c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (324)...(324) <223> n = c 或 t <220> <22]> misc一feature <222> (330)...(330) <223〉 n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (333)...(333) <223> n = g 或 a <220> <221> misc.feature <222> (336)...(336) <223> n = a 或 t <220> -63 131415-序列表.doc 200907128 <221> misc_feature <222> (339)...(339) <223> η = c 或 g <220> <221> misc_feature <222> (34〇T...(340) <223> η = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (342)...(342) <223> n = g 或 a <220> <221> misc一feature <222> (345T...(345) <223〉 n = c 或 g <220> <221> misc_feature <222> (348)...(348) <223> n = c 或 t <220> <221> misc一feature <222> (351)...(351) <223> n = c或空白 <220> <221> misc_feature <222> (353)...(353) <223〉 n = c 或 a <220> <221> misc^feature <222> (355了…（355) <223> n = a 或 t <220〉 <22】> misc—feature <222> (356)...(356) <223> n = g 或 t <220> <221> misc_feature <222> (358j...(358) <223〉n =空白或t cctncgnctn 60 ccgncaggca 120 nccnttntac 180 cacnntntan 240 nntnctnccn 300 ntngnncn 358 <400> 219 gaggtncann nnntgtgcng ccnggnaang gcngantccg ntncaaatga aanngnggnc tgntngantc ccnnnggnt t gtctngantg tgaanggcng acnnnntgng cttggtttga tggnggaggn nacnt t tgcn ggtntcacat nttnacnatn ngcngaggac ntantggggn ttggtncagc catganacna atnccnccng tcncgngana acngcngtnt canggnacnn cnggngggtc tggtntgggi anggtcanga at tcnaanaa atcactgngc tngtnacngt <210> 220 <211> 357 <212> DNA <213>智人 <400> 220 gaagtgcagc ttcttgaaag tggtggaggg ctagtgcagc cagggggatc tttaagatta 60 •64- 131415-序列表.doc 200907128 tcatgcgctg ccagtggatt tactttlgct cacgagacga tggtctgggt gagacaagct cctggaaaag gtttagagtg ggtttctcac attccacctg atggtcaaga tcctttctac gcagattccg tcaaaggaag atttactatc tccagagata atagtaaaaa cactttgtac ctacagatga actcacttag agccgaagat accgctgtgt accactgcgc cltgttgcca aagagaggtc cttggttcga ttactggggt cagggtactc tggttacagt ctcatct <210> 221 <211> 119 <212> PRT <213>智人 <400> 221
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 】 5 10 】5
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala His Glu 20 25 30
Thr Met Val Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 0iu Trp Val 35 40 45
Ser His Ik Pro Pro Asp Gly Gin Asp Pro Phe 丁yr Ala Asp Ser Vai 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys S5 90 95
Ala Leu Leu Pro Lys Arg Gly Pro Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
<210> 222 <211> 357 <212> DNA <2]3>馬斯德畢赤酵母 <400> 222 gaagtgcagc Itcngaaag tggiggaggg ctaglgcagc cagggggatc 11 taagatta tcatgcgctg ccagtggatt tacttttgct cacgagacga tggtctgggt gagacaagct cctggaaaag gtttagagtg ggtttctcac attccacctg atggtcaaga tcctlictac gcagattccg tcaaaggaag atttactatc tccagagata atagtaaaaa cactttgtac ctacagatga actcacttag agccgaagat accgctgtgt accactgcgc cltgttgcca aagagaggtc cttggttcga ttactggggt cagggtactc tggttacagt ctcatct <210> 223 <211> 358 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> —致序列 <220> <22]> misc一feature <222> (3)...(3) <223> n = g 或 a <220> <22]> misc_feature <222> (12)...(12) <223> n = g 或 t <220> <221> mi sc_feature <222> (13)...(13) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> ¢15)...(15) <223〉 n = g 或 t -65 - 131415-序列表.doc 200907128 <220> <22I> misc一feature <222> (18)...(18) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (19)...(19) <223> n = t 或 a <220> <221> misc_feature <222〉 （20)...(20) <223〉 n = c 或 g <220> <221> misc_feature <222> (24)...(24) <223> n = g ^ t <220> <221> misc_feature <222> (30),..(30) <223> n = c 或 g <220> <221> misc一feature <222> (31)...(31) <223> n = t 或 c <220〉 <221> misc_feature <222> ¢33)...(33) <223> n = g 或 a <220> <221〉 misc一feature <222> ¢36)...(36) <223> n = a 或 g <220> <221> misc feature <222> (42)7..(42) <223> n = t 或 a <220> <221> misc_feature <222> (48)...(48) <223> n = g 或 a <220> <221> misc一feature <222〉 （51)...(51) <223〉 π = c 或 t <220> <22】> misc_feature <222> (52)7..(52) <223> n = c 或 t <220> <221> misc一feature -66 131415-序列表.doc 200907128 <222> (54).,.(54) <223> η = g 或 a <220> <221> misc一feature <222> (55)...(55) <223> n = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (57),..(57) <223> n = t ^ a <220> <221> misc一feature <222> (58)...(58) <223> n = c 或 t <220> <221> misc feature <222> (60)...(60) <223> n = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (63)...(63) <223> n = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (66)...(66) c223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (69)...(69) <223> n = a 或 t <220> <221> misc_feature <222> (73)...(73) <223> n = t ^ a <220> <221> misc_feature <222> (74)...(74) <223> n = c 或 g <220> <221> misc_feature <222> (75)...(75) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (81)...(81) <223> π = c ^ t <220> <221> misc—feature <222> ¢84)...(84) <223> n = c 或 t •67 131415-序列表.doc 200907128 <220> <221> misc一feature <222> (90)...(90) <223> n = g ^ t <220> <221> misc_feature <222> (93)...(93) <223〉 n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (105^...(105) <223> n = g 或 c <220> <221> misc_feature <222> (lllT...(111) d23> n = c 或 g <220> <221> misc_feature <222> (112)...(112) <223〉 η = c 或 a <220〉 <221> misc_feature <222> (114Τ...(114) <223> η = c 或 a <220> <221> misc feature <222> {117)...(117) <223> η = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (120了…（120) <223〉 η = a 或 t <220> <221> misc一feature <222> (123^...(123) <223> n = a 或 t <220> <221> misc一feature <222> (126T...(126) <223> n = g 或 a <220> <221> misc一feature <222> ¢129).. .Π29) <223> n = g 或 a <220> <221> misc^feature <222> (133)...(133) <223> π = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (144)...(144) -68 131415-序列表.doc 200907128 <223> η = c 或 t <220> <221> misc^feature <222> (147)...(147) <223> n = a 或 t <220> <221〉 misc一feature <222> (15〇T...(150) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (156T...(156) <223> n = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (159)...(159) <223> n = g 或 t <220> <221> misc_feature <222> (168T...(168) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (1741..,(174) <223〉 n = c 或 l <220> <221> misc_feature <222> (186T...(186) <223> n = c 或 i <220> <221> misc_feature <222> (192T...(192) <223> n = g 或 c <220> <221〉 misc一feature <222> (195T...(195) <223> n = g 或 a <220> <221> misc一feature <222> (198T...(198) <223> n = c 或 a <220〉 <221> misc_feature <222> (199)...(199) <223> n = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (20lj...(201) <223> n = g 或 a -69 131415-序列表,doc 200907128 <220> <221> misc一feature <222> (204^...(204) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (207)...(207) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (214),..(214) <223〉 n = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (216)...(216) <223> n = c 或 a <220> f <221> misc„feature <222> (219).. .(219) <223〉 n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (223^...(223) <223> π = t 或 a <220> <221〉 misc一feature <222> (224j...(224) <223> n = c 或 g <220〉 <221> misc_feature <222> (225T...(225) <223> η = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> ¢228)...(228) <223〉 n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (234T...(234) <223> n = g 或 t <220> <221> misc_feature <222> (235^...(235) <】23> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (237)...(237) <223> n = a 或 g <220〉 -70 131415-序列表.doc 200907128 <221> misc_feature <222> (240)...(240) <223> n = t 或 c <220> <221> misc^feature <222> (243)...(243) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (246)...(246) <223> n = a 或 g <220> <221> misc_feature <222> (253"). ..(253) <223〉 n = a 或 t <220> <221> misc—feature <222> (254j,,.(254) <223〉 n = g 或 c <220> <221> misc_feature <222> (255T...(255) <223> n = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (258T...(258) <223> n = g 或 t <220> <221> misc一feature <222> (259T-.-(259) <223> n = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (26Π. ..(261) <223> n = t 或 a
<220> <221〉mi sc一feature <222> (267T，..(267) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (27〇T...(270) <223> n = c 或 t <220> <221> mi sc^feature <222> (273T...(273) <223〉 π = a 或 c <220> <221> mi sc_feature <222> (276j...(276) <223〉 n = g 或 t •71 131415-序列表.doc 200907128 <220> <221> misc_feature <222> (279)...(279) <223〉 n = a 或 g <220> <221〉mi sc一feature <222> (282了…（282) <223> η = t 或 c <220> <221> misc_feaiure <222> (288)...(288) <223〉 n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (29lT...(291) <223> n = g 或 c <220> <22I> misc一feature <222> (292)...(292) <223> n = c 或 t <220> <221> misc.feature <222> ¢2951...(295) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (297T...(297) <223> n = t 或 g <220> <221> misc.feature <222> (300)...(300) <223> n = t 或 a <220> <221> misc.feature <222> (306)...(306) <223〉 n = g 或 a <220> <221> misc一feature <222> (309)...(309) <223> n = g 或 t <220> <221> misc_feature <222> (318-). ..(318) <223〉 n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (321)...(323) <223> n = c 或 t <220> -72 131415-序列表.doc 200907128 <221> misc_feaiure <222> (336T..,(336) <223> n = a 或 t <220> <221> misc_feature <222> (339T...(339) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (345T...(345) <223> n = c 或 t <220> <221> mi sc_feature <222> (348T-..(348) <223〉 n = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (354T，..(354) <223〉n = g或空白 <220> <221> misc_feature <222> (356-).. .(356) <223〉n = g 或 1 <220> <22]> misc—feature <222> (358T-..(358) <223〉n =空白或t <400> 223 gangtgcagc tnntngannn tggnggaggn nlngtncagc cng^gggntc nninngnnln 60 tcntgngcng ccnnnggat t nacnt t tgcn cangagacga tggtntgggt nngncangcn 120 ccnggnaang gtntagagtg ggtntcncan attccnccng atggtcanga tccnttctac 180 gcagantccg tnaanggnng nttnacnatc tccngngana atnnnaanaa cacnntntan 240 ctncanatga acnnnctnng ngccgangan acngcngtnt ancaclgngc nntgntnccn 300 aagagnggnc cttggttnga ntactggggt cagggnacnc tggtnacngt ctcnancn 358 <210> 224 <211> 357 <212> DNA <2】3>智人 cctgcgcctg 60 tcgccaagct 120 cccattctat 180 caccctgtac 240 pcfpcrcmrf ^00 <400> 224 gaagtacaac tcctgtgcgg ccgggcaaag gcggattccg ctgcagatga aaacgtggcc tgctggagag catctggt 11 gcctggaatg ttaagggtcg actccctgcg cgtggttcga cggtggcggc cacct tcgca ggtaagccac ctttaccatt cgccgaggat ttactggggt ctggt tcaac cacgaaacca at tcctccag tctcgtgata actgcggtgt cagggtactc cgggtggttc tggtgtgggt atggccagga actccaaaaa accat tgtgc tggtcaccgl <210> 225 <211> ]19 <212> PRT <213>智人 <400> 225 G)u Va) Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly G)y Leu Val Gin Pro Gly G3y 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala His Glu 20 25 30
Thr Met Val Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 -73 - 131415-序列表.doc 200907128
Ser His lie Pro Pro Asp Giy Gin Asp Pro Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys 85 90 95
Ala Leu Leu Pro Lys Arg Gly Pro Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 226 <211> 357 <212> DNA <213>大腸桿菌 <400> 226 gaagtacaac tgctggagag cggtggcggc clggttcaac cgggtggttc cctgcgcctg 60 tcctgtgcgg catctggttt caccttcgca cacgaaacca tggtgtgggt tcgccaagct 120 ccgggcaaag gcctggaatg ggtaagccac aitcctccag atggccagga cccattctat 180 gcggattccg ttaagggtcg ctttaccatt tctcgtgata actccaaaaa caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg cgccgaggat actgcggtgt accattgtgc gctgctgcct 300 aaacgtggcc cgtggttcga ttactggggt cagggtactc tggtcaccgt aagcagc 357 <210> 227 <211> 357 <212〉 DNA <213>人工序列 <220> <223> —致序列 <220> <221> misc_feature <222〉 （3)...(3) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (6)...(6) <223〉 n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222〉 （9).,.(9) <223〉 n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222〉 （13)...(13) <223〉 n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222〉 （19)...(19) <223> n = t 或 a <220> <221> misc_feature <222〉 （20)...(20) <223> n = c 或 g <220> <221> misc_feature <222〉 （21)...(21) <223> n = t 或 c 74- 131415-序列表.doc 200907128 <220> <221> mi sc feature <222> (24)： ..(24) <223> n = g 或t <220〉 <221> mi sc feature <222〉 (27). -.(27) <223> n = a 或c <220> <221> mi sc feature <222> (31). ..(31) <223> n = t 或c <220> <221> mi sc feature <222> (36)" ..(36) <223> n = a 或' <220> <221> misc feature <222> (39). ..(39) <223> n = g 或a <220> <221〉 misc feature <222> (42)： ..(42) <223> n = t 或g <220> <221> mi sc feature <222> (45). ,.(45) <223> n = g 或t <220> <221> misc feature <222> (48). ..(48) <223> n = g 或t <220> <221> mi sc feature <222> (57). ..(57) <223> n = t 或c <220〉 <221> misc feature <222> (60). .‘（60) <223> n = c 或g <220〉 <22 ]> mi sc feature <222> (69)： ..(69) <223> n = a 或g <220> <221> mi sc feature <222> (72)' ..(72) <223> n = c 或a <220> <221> mi sc_ feature -75 131415-序列表.doc 200907128 <222> (75)...(75) <223> η = c 或 t <220> <22]> misc_feature <222> (78)~..(78) <223> η = a 或 t <220> <221> misc_feature <222> (87)...(87) <223〉 n = t 或 c <220> <221> mi sc feature <222> (90)...(90) <223〉 n = g 或 a <220> <221> misc^feature <222> (93).,.(93) <223> n = t 或 c 、 <220> <221> misc—feature <222> (96).,.(96) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_fealure <222> (99)，..（99) <223> n = g 或 c <220> <221> misc_feature <222> (] llT.. .(HD <223〉 n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (in'). ..(117) <223〉 n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (12〇T，..(120) <223> n = a 或 t <220> <221> misc_feature <222> (123*). ..(123) <223> n = a 或 g <220> <221> misc_feature <222> (126j...(126) <223〉 n = g 或 c <220> <221> misc_feaiure <222> (129)...(129) <223> n = g 或 a -76- 131415-序列表,doc 200907128 <220> <221> misc_feature <222> ¢332).,.(132) <223> η = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (135)...(135) <223> n = a ^ g <220> <221> misc_feature <222〉（138了…（138) <223> n = g 或 a <220> <22l> misc_feature <222> (]44了…（144) <223> n = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (145]...(145) <223〉 n = t 或 a <220> <22i> mi sc一feature <222> (146T...(146) <223:> n = c 或 g <220> <221> misc^feature <222> (1471...(147) <223〉 n = a 或 c <220> <221> misc_feature <222> (15〇T...(150) <223;> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (156T...(156) <223> n = c 或 t <220> <221> misc一feature <222> (159T...(159) <223；> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> ¢165^...(165) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_fealure <222> (17lT...(171) <223> n = t 或 c <220> •77 1314】5-序列表.doc 200907128 <221> mi sc一feature <222〉 （1741,,.(174) <223> n = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (180T...(180) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (183T...(183) <223〉 n = a 或 g <220> <221> misc—feature <222> (186T...(186) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (192)...(192) <223> π = g 或 t f x <220〉 <221> misc_feature <222> (198)...(198) <223> n = c 或 t <220> <221> misc.feature <222> ¢201)...(201) <223> π = g 或 c <220> <221> misc feature <222> (204j...(204) <223> n = c 或 t <220> <221> misc—feature <222> (21〇T...(210) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (213了…（213〉 <223> n = c 或 t <220> <221〉 misc一feature <222> (216)...(216) <223> n = c 或 t <220> <22]> misc_feature <222> (219T...(219) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> {222). ..(222) <223> n = t 或 c -78- 131415-序列表.doc 200907128 <220> <221> misc_feature <222> (228)...(228) <223〉 n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> ¢2347...(234) <223> η = g 或 c <220> <221> misc_feature <222> (237T...(237) <223> n = a 或 g <220> <221> misc_feature <222> (24〇T，..(240) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (246T...(246) , <223〉 n = a 或 g <220> <221> misc_feature <222> (253T...(253) <223〉 η = a 或 t <220> <221> misc_feature <222> (254T...(254) <223〉n = g 或 c; <220> <221> misc_feature <222> (26lT...(261) <223> n = t 或 c <220> <22)> misc_feature <222> (270"). ..(270) <223> n = c 或 t <220> <22I> misc一feature <222> (273)...(273) <223> n = a 或 t <220> <221> misc一feature <222> (279T，..(279) <223> n = a 或 g <220> <221> misc^feature <222> (282)...(282) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature -79 131415-序列表.doc 200907128 <222> (285)...(285) <223> η = c 或 t <220〉 <221> misc—feature <222> (297)...(297) <223> n = t 或 g <220> <221> misc_feature <222>(303T...(303) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (304T...(304) <223> n = a 或 c <220> <221> misc_feature <222> ¢306)...(306) <223> n = g 或 t / k. <220> <221> misc_feature <222> (309)...(309) <223> n = g 或 c <220> <221> misc_feature <222> (312T...(312) <223〉 n = i 或 g <220> <221> misc_feature <222> (318T-..(318) <223〉 n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (320..,(321) <223〉n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (336T...(336) <223〉 n = a 或 t <220〉 <221> misc_feature <222> ¢339)...(339) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (35lT...(351) <223> n = c 或 a <220〉 <221> mi sc_feature <222> (352)...(352) <223〉 n = t 或 a -80- 131415-序列表.doc 200907128 <220〉 <221> misc_feature <222> (353)...(353) <223> n = c 或 g <220> <221> misc feature <222> (354)...(354) <223> n = g 或 c <400> 227 gangtncanc Igntggagnn nggnggnggc tcctgtgcng cntcnggntt caccttngcn ccnggnaang gnctngantg ggtnnnncan gcngantccg tnaagggncg nt tnaccatn ctgcanatga acnncctgcg ngccgaggan aanngnggnc cntggttnga ntactggggt <210> 228 <211> 357 <212> DNA <213>智人 <400> 228 / gaggttcaac tgctggaatc tggtggtggt \ agctgtgcag cctctggttt caccttcgct ccgggtaaag gcctggagtg ggtaagccat gcigattccg tcaaaggccg 111taccatt ctgcaaatga actccctgcg tgcagaagac aaacgcggcc cttggttcga ctactggggc <210> 229 <211> 119 <212> PRT <213>智人 nlggtncanc cnggnggntc cctgcgncin 60 canganacna tggtgtgggt ncgccangcn 120 aitccnccng atggncagga nccnttcian 180 tcncgngana aniccaanaa cacnctntan 240 acngcggtnt ancantgtgc gctgctncct 300 cagggnacnc tggicaccgt nnnnagc 357 ciggtacaac cgggtggttc cctgcgtctg 60 catgagacca tggtttgggt acgccaggci 120 atccctcctg atggtcagga cccgttctat 180 tctcgtgaca acagcaaaaa cactctgtac 240 acggcggttt atcactgtgc actgctgcca 300 cagggtactc tggtcactgt atcttct 357 <400> 229
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala His Glu 20 25 30
Thr Met Val Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser His lie Pro Pro Asp Gly Gin Asp Pro Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys 85 90 95
Ala Leu Leu Pro Lys Arg Gly Pro Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser )15 <210> 230 <211> 357 <212> DNA <2】3>大腸桿菌 <400> 230 gaggttcaac tgctggaatc tggiggtggt ciggtacaac cgggtggttc cctgcgtctg 60 agctgtgcag cctctggttt caccttcgct catgagacca tggtttgggt acgccaggci 120 ccgggtaaag gcctggagtg ggtaagccat atccctcctg atggicagga cccgttctat 180 gctgat tccg icaaaggccg 11 ilacca I! tctcgtgaca acagcaaaaa cactctgtac 240 ctgcaaatga actccctgcg tgcagaagac acggcggt11 atcactgtgc actgctgcca 300 aaacgcggcc cttggttcga ctactggggc cagggtactc tggtcactgt atcttct 357
<210> 231 <211> 357 <2I2> DNA -81 - 13U15-序列表.doc 200907128 <213>人工序列 <220> <223> —致序列 <220〉 <221> mi sc一feature <222〉 （6)...(6) <223〉n = g 或 t <220〉 <221> misc^feature <222> (9)...(9) <223〉 n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222〉 （13)...(13) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (18)...(18) <223> n = g 或 a <220> <221> misc—feature <222> (24)...(24) <223> n = g ^ i <220> <221> misc_feature <222> (27)...(27) <223> π = a 或 t <220> <221> misc_feature <222> (30)...(30) <223> n = c 或 t <220> <221> mi sc_feature <222> ¢31)...(31) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feaiure <222〉 （39)...(39) <223> n = g 或 a <220〉 <221> misc_feature <222> (42)...(42) <223> π = t 或 g <220〉 <221> misc_feature <222> (45)…（45) <223〉 n = g 或 i <220> <221> misc_feature <222> ¢48)...(48) -82 131415-序列表.doc 200907128 <223> η = g 或 t <220> <221> misc_feature <222> (60)...(60) <223> n = c ^ g <220> <221> misc_feature <222> ¢61)...(61) <223> n = l 或 a <220> <221> misc feature <222> (62)...(62) <223> n = c 或 g <220> <221> misc_feature <222> (75)...(75) <223> n = c t <220> <221> misc_feature <222> (78)...(78) <223〉n = a 或 t <220> <221> misc_feature <222> (87)...(87) <223〉n = i 或 c <220〉 <221> misc_feature <222> (90)...(90) <223> n = g ^ t <220> <221> misc feature <222> (99)...(99) <223> n = g 或 c <220> <221> misc_feature <222> (]〇5T...(l〇5) <223〉n = g 或 ί <220〉 <22]> misc_feature <222> (110...(111) <223> n = c 或 a <220> <221 > misc_feature <222> ¢1207...(120) <223〉n = a 或 t <220> <221> misc_feature <222> (123)...(123) <223> n = a 或 g •83 131415-序列表,doc 200907128 <220> <221> mi sc一feature <222> (126)...(126) <223> η = g 或 t <220> <221> misc_feature <222> (129了…（129) <223〉 n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (132)...(132) <223〉 n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (135)...(135) <223> n = a 或 g <220> <221> misc^feature <222> (144)...(144) <223> n = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (145T...(145) <223> n = t 或 a <220> <221〉 misc—feature <222> (146T..,(146) <223〉 η = c 或 g <220> <221> misc^feature <222> (147J...(147) <223〉 n = a 或 c <220> <221> misc_feature <222> (153)...(153) <223> n = t 或 c <220> <221> misc一feature <222> (156T，..(156) <223> n = c 或 l <220> <221> misc.feature <222> (159)...(159) <223> n = g 或 t <220> <221> misc_fealure <222> (171).,.(171) <223〉 n = t 或 c <220> <221> mi sc_feature •84 131415-序列表.doc 200907128 <222〉 （174)..,(174) <223〉 η = c 或 g <220> <221> misc„feature <222> (180)...(180) <223> η = c 或 t <220> <221> misc一feature <222> (183T...(183) <223> n = a 或 t <220> <221> misc_feature <222> (186T，..(186) <223〉 n = c 或 t <220> <221> misc.feature <222> (1927...(192) <223〉 n = g 或 c <220> <221> misc_feature <222> (195T...(195) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222〉 （2017…（201) <223〉 n = g 或 I <220> <221> misc_feature <222> (204了...（204) <223> n = c 或 t <220> <221> misc一feature <222> (21〇T...(210) <223> n = c 或 t <220> <221> misc一feature <222> (213)...(213) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (216T...(216) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (222). ..(222) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (223T...(223) <223> n = t 或 a -85 131415-序列表.doc 200907128 <220> <221> misc_feaiure <222> (224T，..(224) <223〉 η = c 或 g <220> <221> misc_feature <222> (228)...(228) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (234)...(234) <223> n = g 或 i <220> <221〉 misc一feature <222> (237T...(237) <223> n = a 或 g <220> <221> misc_feature <222> (240)...(240) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (253T...(253) <223> n = a 或 ΐ <220> <221〉 misc一feature <222> (254)...(254) <223> n = g 或 c <220> <221> misc_feature <222> (264T...(264) <223> n = c 或 a <220〉 <221> misc一feature <222> (267T...(267) <223> n ：= g 或 a <220> <22]> misc一feature <222> (273T...(273) <223> n = a 或 g <220> <221> misc^feature <222> (279T...(279) <223> n = a 或 t <220> <221> misc_feature <222> (29lT...(291) <223> n = g 或 a <220> 131415-序列表.doc -86- 200907128 <221> misc^feature <222> (297T，..(297) <223> n = t 或 g <220> <221> misc一feature <222> (3007...(300) <223> n = t 或 a <220> <221> misc^feature <222> (303)...(303) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> {304T...(304) <223> n = a 或 c <220> <221> misc.feature <222> (306j...(306) <223> n = g 或 c <220> <221> misc_feature <222> (309T...(309) <223> π = g 或 c <220> <221> misc_feature <222> (318T...(318) <223> n = t 或 c <220> <221> misc.feature <222> (33〇T...(330) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (336T...(336) <223〉 n = a 或 t I <220> <221> misc_feaiure <222> (339T...(339) <223〉 π = c 或 t <220> <221> mi sc一feature <222> (348T...(348) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (35Π. ..(351) <223> n = c 或 a <220> <221> misc—feature <222> (354). ..(354) -87 131415-序列表.doc 200907128 <223> η = g 或 t <220〉 <221> mi sc一feature <222> (355T，..(355) <223> n = a 或 t <220> <22]> misc一feature <222> (356T，..(356) <223> n = g 或 c <220> <221> misc_feature <222> ¢3577...(357) <223> n = c 或 t <400> 231 gaggtncanc tgntggantc tggnggnggn ntggtacanc cnggnggntc cclgcgtctn 60 nnctgtgcag cctcnggntt caccttngcn catgagacna tggmtgggt ncgccaggcn 120 ccnggnaang gnctngagtg ggtnnnncat atnccnccng atggtcagga nccnttctan 180 gcngantccg tnaanggccg nttnaccatn tcncgngaca annncaanaa cacnctntan 240 ctgcaaatga acnncctgcg tgcngangac acngcggtnt atcactgtgc nctgctnccn 300 aanngnggnc cttggttnga ctactggggn cagggnacnc tggtcacngt ntcnnnn 357 <210> 232 <2]1> 5 <2\2> PRT <213>智人 <400> 232
Glu Va] Gin Leu Leu <210> 233 <211〉 28 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>肽連接子 <400> 233
Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr His Thr Cys 15 10 15
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 20 25 <210> 234 <211> 32 <2]2> PR丁 <2】3>人工序列 <220> <223>肽連接子 <400> 234
Gly Gin Gly Thr Lys Va] Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser 15 10 15
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 20 25 30 <210> 235 <211> 357 <212> DNA <213>智人 -88- 1314】5-序列表.doc 200907128 <400> 235 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc tcctgigcag cctccggalt cacciUgcg ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat gcagactccg tgaagggccg gt icaccatc ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac aagagggggc cttggtttga ctactggggt ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 catgagacga iggtgtgggi ccgccaggct 120 attcccccgg ttggtcagga tcccttctac 180 tcccgcgaca aitccaagaa cacgctatat 240 acagcggtat attactgtgc gctgcttcct 300 cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 •89· 131415-序列表.doc

Claims (1)

  1. 200907128 十、申請專利範圍： 1 · 一種從肽或多肽譜系選擇蛋白酶抗性肽或多肽之方法， 其包含 提供肽或多肽譜系； 在適於蛋白酶活性之條件下使該譜系與蛋白酶組合；及 回收具有想要生物活性之肽或多肽， 藉此蛋白酶抗性肽或多肽係經選擇， 其中該蛋白酶係選自見於痰、黏液（例如胃黏液、鼻黏 液、支氣管黏液）、支氣管肺泡灌洗液、肺組織勻漿、肺 提取物、胰腺提取物、胃液、唾液或眼淚中之蛋白酶。 2. 一種攸肽或多肽譜系選擇蛋白酶抗性肽或多肽之方法， 其包含 提供肽或多肽譜系； 在適於蛋白酶活性之條件下使該譜系與蛋白酶組合；及 回收具有想要生物活性之肽或多肽， 藉此蛋白酶抗性肽或多肽係經選擇， 其中該等條件為⑴約1〇吨/mi至約3以“…蛋白酶， (11)約2〇°C至約4〇。〇及（iii)歷時至少約3〇分鐘。 3. 如請求項2之方法，其中針對該等條件⑴為約1〇至約1〇〇 pg/ml蛋白酶。 4. 如請求項2或3之方法’其中針對該等條件（u)為約3〇至約 37。。。 5. 如請求項2或3之方法，其中針對該等條件⑴為至少約i 小時D 131415.doc 200907128 6· 如請求項2或3之方法’其中該蛋白酶係選自見於声 液(例如胃黏液、鼻黏液、支氣管黏液)、支氣管：泡:: 洗液、肺組織勻漿、肺提取物、胰腺提取物、胃液 液或眼淚中之蛋白酶。 如請求項1至3中任一項之方法，其中該蛋白酶包含 多種以下蛋白酶：絲胺酸蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、 冬胺酸蛋白酶、硫醇蛋白酶、基質金屬蛋白酶、羧式天 酶（例如，羧基肽酶A、羧基肽酶B)、胰蛋白酶、胰=肽 蛋白酶、月蛋白酶、木瓜蛋白酶、彈性蛋白、 ^ 曰Jlil·球 酶（leuc〇Zyme)、胰酶、凝血酶、纖溶酶、組織蛋白 (例如組織蛋白酶G)、蛋白酶(例如，蛋白酶/、蛋白酶 2、蛋白酶3)、嗜熱菌蛋白酶、凝乳酶、腸肽酶、卡： 白酶（caspase)(例如卡斯蛋白酶i、卡斯蛋白酶2、卡蛋 t酶4、卡斯蛋白酶5、卡斯蛋白酶9、卡斯蛋白酶/ :斯蛋白酶⑺、妈激活蛋白酶、無花果 :叫、梭菌蛋白酶、獮狼桃蛋白酶、鳳梨蛋 離酶。 7i 8. 如請求項1至3中任一項之方法，苴 酶或彈性蛋白酶。 …蛋白每為姨蛋白 9. 如請求項1至3中任一項之太、土 孙丄 提取物^ - 、 法，其中該蛋白酶係由生物 物、生物組織勻漿或生物製劑提供。 1〇·=:Γ之方法’其中該生物提取物、生物組_ 自由痰、黏液(例如胃黏液、鼻黏液、支 夜）、支氣管肺泡灌洗液、肺組織勾浆、肺提取 131415.doc 200907128 物、胰腺提取物、胃液、唾液及眼淚組成之群。 11 -如請求項1至3中任一項之方法，其中該想要生物活性為 結合活性。 12. 如請求項11之方法，其中該結合活性為鍵結一般配位體 (generic ligand) ° 13. 如請求項12之方法，其中該一般配位體為蛋白質a、蛋 白質G或蛋白質L。 14. 如請求項丨丨之方法’其中該結合活性係專—性鍵結至乾 配位體。 15. 如請求項14之方法，其中該靶配位體係選自由以下各物 組成之群：ApoE、Apo-SAA、BDNF、心營養素」' CEA、CD40、CD40配位體、CD56、CD38、CD138、 EGF、EGF受體、ENA-78、嗜酸性粒細胞趨化因子、嗜 酸性粒細胞趨化因子_2、次級淋巴組織趨化因子 (Exodus)-2、FAPa、FGF-酸性、FGF-驗性、纖維母細胞 生長因子-10 、 FLT3配位體、弗拉塔凱 (Fractalkine)(CX3C)、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF_ β 1、人類血清白蛋白、胰島素、ΙΡΝ·γ、ZGF」、IGF_n、 IL-lct、IL-Ιβ、IL-1 受體、IL_!受體 1 型、IL_2、IL 3、 IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8 (72 a.a.)、IL-8 (77 a.a.)、 ΙΙ^'Ιί-ΙΟ'ΙΙ^ΙΙ'ιι.κ'ιι^ΙΒ'ΙΙΜδ'ΙΙ^Ιό、；!]^ 17、IL-18 (IGIF)、抑制素α、抑制素p、ip_1()、角化細 胞生長因子-2 (KGF-2)、KGF、瘦體素、LIF、淋巴細胞 趨化因子穆勒氏抑制物質（Mullerian inhibitory 131415.doc 200907128 substance)、單核細胞集落抑制因子、單核細胞吸附蛋 白、M-CSF、MDC (67 a.a.)、MDC (69 a.a.)、MCP-1 (MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC (67 a.a)、 MDC (69 a.a.)、MIG、ΜΙΡ-Ια、ΜΙΡ-1β ' ΜΙΡ-3α、MIP-3β、MIP-4、骨髓祖細胞抑制劑因子_1 (MPIF-1)、NAP-2、神經營養因子、神經生長因子、β-NGF、NT-3、NT-4、制瘤素M、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDFla、SDFip、SCF、SCGF、幹細胞因 子（SCF)、TARC、TGF-a、TGF-β、TGF-P2、TGF-P3、 腫瘤壞死因子（TNF)、TNF-a、TNF-β、TNF 受體 I、TNF 受體 II、TNIL-1、TPO、VEGF、VEGF A、VEGF B、 VEGF C、VEGF D、VEGF受體 1、VEGF受體2、VEGF受 體3、GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β、GRO-γ、HCCl、l-309、HER 1、HER 2、HER 3、HER 4、血清白蛋白、 vWF、澱粉樣蛋白（例如，澱粉樣a)、MMP12、PDK1、 IgE、IL-13Ral、IL-13Ra2、LL-15、IL-15R、IL-16、IL-17R、IL-17、IL-18、IL-18R、IL-23IL-23R、IL-25、 CD2、CD4、CDlla、CD23、CD25、CD27、CD28、 CD30、CD40、CD40L、CD56、CD 138、ALK5、 EGFR、FcERl、TGFb、CCL2、CCL18、CEA、CR8、 CTGF、CXCL12 (SDF-1)、凝乳酶、FGF、弗林蛋白酶 (Furin)、内皮素-1、嗜酸性粒細胞趨化因子（例如，嗜酸 性粒細胞趨化因子、嗜酸性粒細胞趨化因子-2、嗜酸性 粒細胞趨化因子-3)、GM-CSF、ICAM-1、ICOS、IgE、 131415.doc 200907128 IFNa、1-309、整合素、L-選擇素、MIF、MIP4、MDC、 MCP-1、MMP、嗜中性彈性蛋白酶、骨橋蛋白、0又-40、PARC、PD-1、RANTES、SCF、SDF-1、siglec 8、 TARC、TGFb、凝血酶、Tim-1、TNF、TRANCE、類胰 蛋白酶、VEGF、VLA-4、VCAM、α4β7、CCR2、 CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8、ανβ6、ανβ8、 cMET、CD8、vWF、澱粉樣蛋白（例如，澱粉樣ο〇、 MMP12、PDK1 及 IgE。 ('' 16.如請求項1至3中任一項之方法，其中該具有想要生物活 性之肽或多肽係藉由淘選加以回收。 17.如請求項1至3中任一項之方法，其中該譜系包含呈現系 統。 18·如請求項17之方法，其中該呈現系統係選自由噬菌體呈 現、核糖體呈現、乳液隔室化（emulsion compartmentalization) 及呈現、酵母呈現、σ票吟黴素呈現、細菌呈現、質體上 之呈現及共價呈現組成之群。 / ^ 19.如請求項17之方法，其中該呈現系統可連結核酸之編碼 功能及由核酸所編碼之肽或多肽之功能特徵。 20.如請求項1 7之方法，其中該呈現系統包含可複製之基因 組。 2 1.如請求項1 7之方法，其中該呈現系統包含噬菌體呈現。 22. 如請求項2 1之方法，其中該噬菌體呈現系統為多價系 統。 23. 如請求項21之方法，其中該噬菌體係選自由fd、Ml 3、 131415.doc 200907128 λ、MS2及T7組成之群。 24.如請求項23之方法 形式呈現。 2 5 ·如請求項1 9之方法， 基末端。 其中該狀或多胳总、，τττ 夕狀係以pill融合蛋白 其中該肽或多肽& τττ ^ , 耽·為pill之區域1之胺 26.如請求項1 9之方法，其進一 之生物活性之狀或多狀的核 步包含擴增該編碼 酸。 具有想要 其中s亥核酸係藉由噬菌體擴增作 27.如請求項26之方法 增。 其中該譜系為免疫球蛋 用、細胞生長或聚合酶鏈反應擴 28.如請求項1至3中任一項之方法， 白單一可變區域譜系。 29·如請求項28之方法，其中該免疫珀1 „ τ邊尤设竦蛋白早一可變區域為 重鏈可變區域。 30.如請求項29之方法，其中該重鏈可變區域為人類或人化 重鏈可變區域。
    3 1 ·如請求項28之方法，其中該免疫球蛋白單一可變區域為 輕鏈可變區域。 32·如請求項3 1之方法，其中該輕鏈可變區域為人類或人化 輕鏈可變區域》 33. 如請求項1至3中任一項之方法，其用於從該肽或多肽譜 系選擇以高親和力結合靶配位體之肽或多肽。 34. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該蛋白酶係以約 100 pg/ml使用’且該組合譜系及蛋白酶係在約37它下培 養至少約…小時。 131415.doc 200907128 士明求項1至3令任一項之方法，其中各該多狀為結合輕 之免疫球蛋白單一可變區域（dAb);該譜系係由可呈現免 疫球蛋白單-可變區域譜系之噬菌體呈現系統提供；在 :組合步驟中，在適於蛋白酶活性之條件下使該噬菌體 、見系、、’先與選自由彈性蛋白酶、白血球酶及胰蛋白酶組 人群之蛋白酶組合，且在該回收步驟中，回收呈現包 含結合該靶配位體之免疫球蛋白單一可變區域之多肽的 噬菌體。 ί
    36. -種產生蛋白酶抗性肽或多肽譜系之方法，其包含進行 如明求項1至35中任-項之方法，其中在該回收步驟 中’複數種具有相I4‘、工 务 男心要之生物活性之肽或多肽係經回收， 藉此蛋白酶抗性肽或多肽譜系係經產生。 ::項36之方法，其中該蛋白酶抗性肽或多肽譜系為 未·、、里處理之譜系。 长員36或3 7之方法’其進一步包含在適於第二蛋白 肽：：性條件下使該第二蛋白酶與該蛋白酶抗性肽或多 肽5曰’系組合；及回收至少一種有相 男心I之生物活性之肽 肽。’藉此選擇至少—種抗該第二蛋白酶之肽或多 39.如凊求項38之方法，豆 10中# /、中。亥第一蛋白酶係如請求項6至 ⑶甲任一項中所定義。 4 0.如請灰 該级年φ 、36或37中任一項之方法’其中蛋白酶與 ^中肽或多肽之比率（以莫耳/莫耳計）為8，咖(蛋白 ;8〇,〇〇〇(肽或多肽）。 131415.doc 200907128 200907128 41. 法，其中蛋白酶與 里计）為1，6〇〇(蛋白 如請求項1至3、36或37中任一項之方 該譜系中肽或多肽之比率（以重量/重 酶）：16〇,〇〇〇(肽或多肽）。 其藉由如請求項！至 42. —種經分離蛋白酶抗性肽或多肽 35中任一項之方法可選擇或所選擇 -種經分離蛋白酶抗性免疫球蛋白單一可變區域， 由如請求項！至41中任一項之方法可選擇或所選擇。… 44. -種用於投與患者以治療及/或預防肺疾病或病狀之姐分 離肺乾拮抗劑，其包含當在⑴約1G pg/ml至約3蛋 白酶，約2(TC至約贼及（iii)歷時至少約3〇分鐘之條 件下（例如，在100 pg/ml蛋白酶在37r下歷時至少！小時 之條件下）與一或多種選自胰蛋白酶、彈性蛋白酶及白血 球酶之蛋白酶—起培養時可抵抗該或該等蛋白酶之免疫 球蛋白單一可變區域。 45.如請求項44之拮抗劑，其用於以吸入或鼻内方式向該患 者投與。
    46. -種用於投與患者以治療及/或預防gi道疾病或病狀之經 分離GI道靶拮抗劑，其包含當在⑴約1〇至約3 mg/ml蛋白酶’（⑴約2(rc至約4〇。〇及（出）歷時至少約％ 刀鐘之條件下（例如，在！ 〇〇 pg/ml蛋白酶在37。〇下歷時 至少1小時之條件下）與一或多種選自胰蛋白酶、彈性蛋 白酶及白血球酶之蛋白酶—起培養時可抵抗該或該等蛋 白酶之免疫球蛋白單一可變區域。 47.如請求項46之拮抗劑，其用於以經口、舌下或直腸方式 I31415.doc 200907128 投與該患者。 48. 如請求項44至47中任一項之拮抗劑，其中該拮抗劑拮抗 TNF α。 49. 如請求項48之拮抗劑，其中該可變區域包含TNFR1之έ士 、、'σ 合位點。 50. 如請求項44至47中任一項之拮抗劑，其中該拮抗劑拮抗 TNFR1、VEGF 或 IL-1R1。 5 1.如請求項50之拮抗劑，其中該可變區域分別包含 TNFR1、VEGF或IL-1R1之結合位點。 52. —種經分離肺靶拮抗劑在製造用於投與患者以治療及/或 預防肺疾病或病狀之藥物中的用途，該拮抗劑包含當在 ⑴約10 pg/ml至約3 mg/ml蛋白酶，（Π)約2〇〇C至約40。(：及 (iii)歷時至少約30分鐘之條件下（例如，在1〇〇 μ§/〇ι1蛋白 酶在3 7 C下歷時至少1小時之條件下）與一或多種選自胰 蛋白酶、彈性蛋白酶及白血球酶之蛋白酶一起培養時可 抵抗該或該等蛋白酶之免疫球蛋白單一可變區域。 53. 如請求項52之用途，其中該投藥係藉由吸入或鼻内方式 投與該患者。 54. —種經分離GI道靶拮抗劑在製造用於投與患者以治療及/ 或預防GI道疾病或病狀之藥物中的用途’該拮抗劑包含 备在⑴約10 pg/ml至約3 mg/ml蛋白酶，（丨丨）約2〇。〇至約 4〇。(：及（Hi)歷時至少約3〇分鐘之條件下（例如，在1〇〇 gg/ml蛋白酶在37t下歷時至少丨小時之條件下）與一或多 種選自胰蛋白酶、彈性蛋白酶及白血球酶之蛋白酶一起 131415.doc 200907128 培養時可抵抗該或該等蛋白酶之免疫球蛋白單一可變區 域。 55. 如睛求項54之用途’其中該投藥係以經口、舌下或直腸 方式投與該患者。 56. 如請求項52至54中任一項之用途，其中該括抗劑括抗 TNF α。 57. 如清求項56之拮抗劑，其中該可變區域包含TNFRi之結 合位點。 5 8 _ ά 〇月求項52至54中任一項之拮抗劑，其中該拮抗劑拮抗 TNFR1、VEGF 或 IL-1R1。 5 9.如凊求項58之拮抗劑，其中該可變區域分別包含 TNFR1、VEGF或IL-1R1之結合位點。 60. γ種經分離核酸，其編碼如請求項42之蛋白酶抗性肽或 多肽、如請求項43之蛋白酶抗性免疫球蛋白單一可變區 域或如請求項44至51中任一項之拮抗劑。 61. —種重組核酸，其編碼如請求項42之蛋白酶抗性肽或多 肽、如請求項43之蛋白酶抗性免疫球蛋白單一可變區域 或如請求項44至5 1申任一項之拮抗劑。 62. —種載體，其包含如請求項6〇或61中任—項之核酸。 6 3 _ 種佰主細胞’其包含如請求項6 2之核酸。 64. —種製造藉由如請求項丄至4丨中任一項之方法可選擇或 所述擇之蛋白酶抗性肽或多肽或如請求項至$ 1中任一 項之拮抗劑的方法，其包含將含有編碼該蛋白酶抗性肽 或多肽或拮抗劑之重組核酸之宿主細胞維持在適於表現 131415.doc • 10- 200907128 :條件下’籍此蛋白酶抗性狀或多狀或《抗劑係經製 65. —種藉由如請求項1至41中任一項之方法 租释或所選 擇之蛋白酶抗性肽或多肽，其係用於醫藥。 、 66. 如請求項43之可變區域，其係用於醫藥。 67· 一種藉由如請求項1至41中任一項之方法可選擇或所選 擇之蛋白酶抗性肽或多肽，其用於製造供治療及/或預防 疾病用之藥物。 f 68.如請求項43之可變區域 病用之藥物。 其用於製造供治療及/或預防疾 131415.doc
TW097121280A 2007-06-06 2008-06-06 Methods for selecting protease resistant polypeptides TW200907128A (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US93363207P 2007-06-06 2007-06-06
GBGB0724331.4A GB0724331D0 (en) 2007-12-13 2007-12-13 Compositions for pulmonary delivery

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW200907128A true TW200907128A (en) 2009-02-16

Family

ID=39791116

Family Applications (6)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW097121280A TW200907128A (en) 2007-06-06 2008-06-06 Methods for selecting protease resistant polypeptides
TW097121296A TW200902551A (en) 2007-06-06 2008-06-06 Polypeptides, antibody variable domains & antagonists
TW097121301A TW200918088A (en) 2007-06-06 2008-06-06 Polypeptides, antibody variable domains & antagonists
TW097121295A TW200911832A (en) 2007-06-06 2008-06-06 Polypeptides, antibody variable domains & antagonists
TW097121265A TW200911834A (en) 2007-06-06 2008-06-06 Polypeptides, antibody variable domains & antagonists
TW097121268A TW200911831A (en) 2007-06-06 2008-06-06 Polypeptides, antibody variable domains & antagonists

Family Applications After (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW097121296A TW200902551A (en) 2007-06-06 2008-06-06 Polypeptides, antibody variable domains & antagonists
TW097121301A TW200918088A (en) 2007-06-06 2008-06-06 Polypeptides, antibody variable domains & antagonists
TW097121295A TW200911832A (en) 2007-06-06 2008-06-06 Polypeptides, antibody variable domains & antagonists
TW097121265A TW200911834A (en) 2007-06-06 2008-06-06 Polypeptides, antibody variable domains & antagonists
TW097121268A TW200911831A (en) 2007-06-06 2008-06-06 Polypeptides, antibody variable domains & antagonists

Country Status (32)

Country Link
US (5) US20100247515A1 (zh)
EP (5) EP2746290B1 (zh)
JP (3) JP5444215B2 (zh)
KR (4) KR20100018040A (zh)
CN (4) CN101778865B (zh)
AR (3) AR066848A1 (zh)
AU (4) AU2008259590A1 (zh)
BR (3) BRPI0812268A2 (zh)
CA (6) CA2688434A1 (zh)
CL (3) CL2008001673A1 (zh)
CO (2) CO6251322A2 (zh)
CR (2) CR11195A (zh)
CY (1) CY1116762T1 (zh)
DK (1) DK2162467T3 (zh)
DO (1) DOP2009000268A (zh)
EA (5) EA200901494A1 (zh)
ES (1) ES2546943T3 (zh)
HK (1) HK1138022A1 (zh)
HR (1) HRP20151024T1 (zh)
HU (1) HUE025899T2 (zh)
IL (2) IL201398A0 (zh)
MA (2) MA31403B1 (zh)
MX (4) MX2009013137A (zh)
NZ (1) NZ581372A (zh)
PE (3) PE20090763A1 (zh)
PL (1) PL2162467T3 (zh)
PT (1) PT2162467E (zh)
SG (2) SG182141A1 (zh)
SI (1) SI2162467T1 (zh)
TW (6) TW200907128A (zh)
WO (3) WO2008149150A2 (zh)
ZA (1) ZA200908470B (zh)

Families Citing this family (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005289809A (ja) 2001-10-24 2005-10-20 Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) 突然変異重鎖抗体
ATE537188T1 (de) 2005-05-18 2011-12-15 Ablynx Nv Serumalbuminbindende proteine
DE102005023617A1 (de) 2005-05-21 2006-11-23 Aspre Ag Verfahren zum Mischen von Farben in einem Display
BRPI0812398A2 (pt) * 2007-06-06 2019-09-24 Domantis Ltd domínio variável simples de imunoglobulina anti-vegf, antagonista anti-vegf, domínio variável simples de imunoglobulina resistente à protease, uso do antagonista vegf, método para a dispensação oral ou dispensação de um medicamento ao trato gi de um paciente ou ao pulmão ou tecido pulmonar ou olho de um paciente, dispositivo de dispensação pulmonar, formulação oral, ligando específico duplo, ácido nucleico isolado ou recombinante, vetor, célula hospedeira, método para produzir polipeptídeo, composição farmacêutica, polipeptídeo, e, proteína de fusão
GB0724331D0 (en) 2007-12-13 2008-01-23 Domantis Ltd Compositions for pulmonary delivery
CA2688434A1 (en) 2007-06-06 2008-12-11 Domantis Limited Polypeptides, antibody variable domains and antagonists
KR20100098697A (ko) * 2007-12-13 2010-09-08 글락소 그룹 리미티드 폐 전달을 위한 조성물
WO2009127691A1 (en) 2008-04-17 2009-10-22 Ablynx N.V. Peptides capable of binding to serum proteins and compounds, constructs and polypeptides comprising the same
KR101671886B1 (ko) 2008-06-25 2016-11-04 에스바테크 - 어 노바티스 컴파니 엘엘씨 Ｖｅｇｆ를 억제하는 안정하고 가용성인 항체
US8268314B2 (en) 2008-10-08 2012-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
EP2356147A1 (en) * 2008-11-26 2011-08-17 Glaxo Group Limited Polypeptides, antibody variable domains&antagonists
WO2010081787A1 (en) 2009-01-14 2010-07-22 Domantis Limited IMPROVED TNFα ANTAGONISM, PROPHYLAXIS & THERAPY WITH REDUCED ORGAN NECROSIS
PE20120170A1 (es) 2009-02-19 2012-03-21 Glaxo Group Ltd Variantes de union a anti-albumina de suero mejoradas
EP3330287B1 (en) 2009-02-19 2019-12-18 Glaxo Group Limited Improved anti-serum albumin binding variants
WO2010094720A2 (en) * 2009-02-19 2010-08-26 Glaxo Group Limited Improved anti-tnfr1 polypeptides, antibody variable domains & antagonists
US20110305692A1 (en) 2009-02-24 2011-12-15 Glaxo Group Limited Antigen-binding contructs
BR112012001681A2 (pt) 2009-07-16 2019-09-24 Graxo Group Ltd domínios variáveis de ligação de anti-albumina sérica aperfeiçoados
CA2768460A1 (en) * 2009-07-16 2011-01-20 Glaxo Group Limited Antagonists, uses & methods for partially inhibiting tnfr1
AU2010306718A1 (en) * 2009-10-14 2012-05-24 Aileron Therapeutics, Inc. Improved peptidomimetic macrocycles
ES2552177T3 (es) 2009-10-27 2015-11-26 Glaxo Group Limited Polipéptidos anti-TNFR1 estables, dominios variables de anticuerpos y antagonistas
CA2788993A1 (en) 2010-02-05 2011-08-11 Ablynx N.V. Peptides capable of binding to serum albumin and compounds, constructs and polypeptides comprising the same
JP2013529080A (ja) * 2010-05-20 2013-07-18 グラクソ グループ リミテッド 改良された抗血清アルブミン結合変異体
US9012609B2 (en) * 2010-08-13 2015-04-21 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Anti-serum albumin binding variants
BR112013003899A2 (pt) * 2010-08-20 2016-06-07 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd domínio variável único da imunoglobina anti-albumina sérica (sa), ligando multiespecífico, proteína de fusão, composição, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira isolada, e, método de tratar ou previnir uma doença ou distúrbio em um paciente
JP6105472B2 (ja) * 2010-09-16 2017-03-29 バリオファルム・アクチェンゲゼルシャフト 抗ｈｕＴＮＦＲ１抗体
EP2646467A2 (en) 2010-12-01 2013-10-09 Glaxo Group Limited Improved anti-serum albumin binding single variable domains
US20130310281A1 (en) * 2011-02-02 2013-11-21 Glaxo Group Limited Novel antigen binding proteins
US9527925B2 (en) 2011-04-01 2016-12-27 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bispecific binding molecules binding to VEGF and ANG2
CN103917563A (zh) 2011-06-28 2014-07-09 英伊布里克斯有限责任公司 丝氨酸蛋白酶抑制蛋白融合多肽及其使用方法
US10400029B2 (en) 2011-06-28 2019-09-03 Inhibrx, Lp Serpin fusion polypeptides and methods of use thereof
WO2013014208A2 (en) * 2011-07-27 2013-01-31 Glaxo Group Limited Antigen binding constructs
MX2014001883A (es) 2011-08-17 2014-05-27 Glaxo Group Ltd Proteinas y peptidos modificados.
GB2497138A (en) * 2011-12-02 2013-06-05 Randox Lab Ltd Biomarkers for stroke and stroke subtype diagnosis.
AR092027A1 (es) 2012-07-13 2015-03-18 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos anti-vegf/anti-ang-2 y su utilizacion en el tratamiento de enfermedades vasculares oculares
WO2014111550A1 (en) 2013-01-17 2014-07-24 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Modified anti-serum albumin binding proteins
CA2897345A1 (en) 2013-01-31 2014-08-07 Glaxo Group Limited Method of producing a protein
US9840553B2 (en) 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
MA41374A (fr) * 2015-01-20 2017-11-28 Cytomx Therapeutics Inc Substrats clivables par métalloprotéase matricielle et clivables par sérine protéase et procédés d'utilisation de ceux-ci
AU2016381964B2 (en) 2015-12-30 2024-02-15 Kodiak Sciences Inc. Antibodies and conjugates thereof
GB201617622D0 (en) * 2016-10-18 2016-11-30 VIB VZW and Universiteit Gent Means and methods to treat inflammation
RU2625010C1 (ru) * 2016-11-10 2017-07-11 Илья Петрович Приколаб Экспрессионный плазмидный вектор для экспрессии активной формы TNFR1-Fc и способ получения рекомбинантного белка
BR112019008265A2 (pt) 2016-11-28 2019-07-09 Chugai Pharmaceutical Co Ltd molécula de ligação ao ligante cuja atividade de li-gação ao ligante é ajustável
CN110177875B (zh) 2016-11-28 2023-11-28 中外制药株式会社 包含抗原结合结构域和运送部分的多肽
UY37651A (es) * 2017-03-31 2018-10-31 Swedish Orphan Biovitrum Ab Publ Polipéptido de unión al il-1r-i
JP7261232B2 (ja) * 2017-11-01 2023-04-19 アロジーン セラピューティクス，インコーポレイテッド 改変カスパーゼ－９ポリペプチドおよびその使用方法
BR112020010450A2 (pt) 2017-11-28 2020-11-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha polipeptídeo que inclui domínio de ligação a antígeno e seção transportadora
CN112203679A (zh) 2018-03-02 2021-01-08 科达制药股份有限公司 Il-6抗体及其融合构建体和缀合物
WO2019230866A1 (en) * 2018-05-30 2019-12-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Polypeptide comprising il-1r1 binding domain and carrying moiety
JP7414736B2 (ja) 2018-05-30 2024-01-16 中外製薬株式会社 アグリカン結合ドメインおよび運搬部分を含むポリペプチド
EP3623798B1 (de) * 2018-09-13 2021-11-03 Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG Verfahren und vorrichtung zum erfassen und darstellen eines immunfluoreszenzbildes einer biologischen probe
CN112955240B (zh) * 2018-10-25 2022-09-16 豪夫迈·罗氏有限公司 抗体FcRn结合的修饰
JP2022512124A (ja) 2018-12-06 2022-02-02 シートムエックス セラピューティクス，インコーポレイテッド マトリックスメタロプロテアーゼ切断可能なおよびセリンまたはシステインプロテアーゼ切断可能な基質ならびにそれらの使用方法
CN111454366B (zh) * 2019-01-21 2023-06-16 中国科学院深圳先进技术研究院 一种融合蛋白及其应用
EP3919903A4 (en) * 2019-01-31 2022-11-02 Sekisui Medical Co., Ltd. METHOD FOR IMMUNOLOGICAL ANALYSIS OF FREE AIM IN A BIOLOGICAL SAMPLE AND MEASUREMENT KIT
CN114786731A (zh) 2019-10-10 2022-07-22 科达制药股份有限公司 治疗眼部病症的方法
IL300930A (en) 2020-08-27 2023-04-01 Enosi Therapeutics Corp Methods and compositions for the treatment of autoimmune diseases and cancer
WO2022117569A1 (en) 2020-12-02 2022-06-09 Oncurious Nv A ccr8 antagonist antibody in combination with a lymphotoxin beta receptor agonist antibody in therapy against cancer
CN115181751A (zh) * 2021-04-02 2022-10-14 苏州博腾生物制药有限公司 靶向白蛋白的嵌合抗原受体及其使用方法
CN114657162B (zh) * 2022-03-04 2023-06-16 华南理工大学 一种具有血管内皮细胞保护功能的抗氧化五肽及其应用

Family Cites Families (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2148299B (en) 1983-09-01 1988-01-06 Hybritech Inc Antibody compositions of therapeutic agents having an extended serum half-life
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2, Inc., Danville, Calif. Geänderte antikörper.
GB8725529D0 (en) 1987-10-30 1987-12-02 Delta Biotechnology Ltd Polypeptides
JP3095168B2 (ja) 1988-02-05 2000-10-03 エル． モリソン，シェリー ドメイン‐変性不変部を有する抗体
DE68927933T2 (de) 1988-09-02 1997-08-14 Dyax Corp Herstellung und auswahl von rekombinantproteinen mit verschiedenen bindestellen
WO1990005144A1 (en) 1988-11-11 1990-05-17 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
ATE92107T1 (de) 1989-04-29 1993-08-15 Delta Biotechnology Ltd N-terminale fragmente von menschliches serumalbumin enthaltenden fusionsproteinen.
CA2016842A1 (en) 1989-05-16 1990-11-16 Richard A. Lerner Method for tapping the immunological repertoire
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5977307A (en) 1989-09-07 1999-11-02 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific ligand-neuropharmaceutical agent fusion proteins
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
JPH06508511A (ja) 1990-07-10 1994-09-29 ケンブリッジ　アンティボディー　テクノロジー　リミティド 特異的な結合ペアーの構成員の製造方法
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
EP0814159B1 (en) 1990-08-29 2005-07-27 GenPharm International, Inc. Transgenic mice capable of producing heterologous antibodies
EP1046421B8 (en) 1990-12-06 2006-01-11 Affymetrix, Inc. (a Delaware Corporation) Methods and reagents for very large scale immobilized polymer synthesis
ATE408012T1 (de) 1991-12-02 2008-09-15 Medical Res Council Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
WO1994029351A2 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Celltech Limited Antibodies
US5702892A (en) 1995-05-09 1997-12-30 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Phage-display of immunoglobulin heavy chain libraries
CA2229043C (en) 1995-08-18 2016-06-07 Morphosys Gesellschaft Fur Proteinoptimierung Mbh Protein/(poly)peptide libraries
BRPI9715219B8 (pt) * 1996-02-09 2015-07-07 Abbvie Biotechnology Ltd Vetor recombinante de expressão, e célula hospedeira procariótica.
AU736836B2 (en) 1997-07-07 2001-08-02 Medical Research Council In vitro sorting method
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
PT1078051E (pt) 1998-05-13 2008-03-17 Domantis Ltd Sistema de apresentação em fagos para a selecção de proteínas correctamente organizadas
IL127127A0 (en) 1998-11-18 1999-09-22 Peptor Ltd Small functional units of antibody heavy chain variable regions
AU2002219944B2 (en) 2000-11-28 2008-02-21 Medimmune, Llc Methods of administering/dosing anti-RSV antibodies for prophylaxis and treatment
AU3040101A (en) 2000-02-03 2001-08-14 Domantis Limited Combinatorial protein domains
EP1263788A2 (en) 2000-02-11 2002-12-11 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Identification of a domain in the tumor necrosis factor receptor family that mediates pre-ligand receptor assembly and function
US7164009B2 (en) * 2000-09-15 2007-01-16 Genentech, Inc. Pro9821 polypeptides
WO2003002609A2 (en) 2001-06-28 2003-01-09 Domantis Limited Dual-specific ligand and its use
US20060073141A1 (en) * 2001-06-28 2006-04-06 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
GB0118689D0 (en) * 2001-08-01 2001-09-19 Psimedica Ltd Pharmaceutical formulation
WO2003076567A2 (en) 2002-03-05 2003-09-18 Eli Lilly And Company Heterologous g-csf fusion proteins
US20060002935A1 (en) 2002-06-28 2006-01-05 Domantis Limited Tumor Necrosis Factor Receptor 1 antagonists and methods of use therefor
CN1678634A (zh) 2002-06-28 2005-10-05 多曼蒂斯有限公司 免疫球蛋白单个变体抗原结合区及其特异性构建体
US7696320B2 (en) 2004-08-24 2010-04-13 Domantis Limited Ligands that have binding specificity for VEGF and/or EGFR and methods of use therefor
WO2004022096A1 (en) 2002-09-06 2004-03-18 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Method of treatment of asthma using antibodies to complement component c5
BRPI0314038B8 (pt) 2002-09-06 2021-05-25 Amgen Inc anticorpo humano isolado, molécula de ácido nucleico isolada, vetor, uso de um anticorpo, e, composição farmacêutica
CA2505326A1 (en) 2002-11-08 2004-05-21 Ablynx N.V. Camelidae antibodies against immunoglobulin e and use thereof for the treatment of allergic disorders
EP1578801A2 (en) * 2002-12-27 2005-09-28 Domantis Limited Dual specific single domain antibodies specific for a ligand and for the receptor of the ligand
GB0230203D0 (en) * 2002-12-27 2003-02-05 Domantis Ltd Fc fusion
US20060104968A1 (en) * 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
ES2315664T3 (es) 2003-06-30 2009-04-01 Domantis Limited Anticuerpos de dominio unico (dab) pegilados.
PL1729795T3 (pl) 2004-02-09 2016-08-31 Human Genome Sciences Inc Białka fuzyjne albuminy
SI1737962T1 (sl) 2004-03-24 2011-01-31 Domantis Ltd Univerzalni signalni peptid GAS1
NZ598502A (en) * 2004-10-21 2013-07-26 Genentech Inc Use of vegf antagonists in intraocular neovascular disease treatment
GB0521621D0 (en) * 2005-10-24 2005-11-30 Domantis Ltd Tumor necrosis factor receptor 1 antagonists for treating respiratory diseases
CN101133084A (zh) * 2004-12-02 2008-02-27 多曼蒂斯有限公司 采用白细胞介素-1ⅰ型受体拮抗剂治疗呼吸道疾病的方法
EP1957537A2 (en) * 2005-12-01 2008-08-20 Domantis Limited Competitive domain antibody formats that bind interleukin 1 receptor type 1
BRPI0619225A2 (pt) * 2005-12-01 2017-11-07 Domantis Ltd monômero de anticorpo de domínio, ligando, ácidos nucleicos isolado e recombinante, vetor, célula hospedeira, método para produzir um monômero de dab de ligando, composição farmacêutica, dispositivo de liberação de medicamento, uso de um monômero de anticorpo de domínio, e, método para tratar uma doença inflamatória, artrite ou doença respiratória
CA3177366A1 (en) 2006-08-10 2008-02-21 Roy C. Levitt Localized therapy of lower airways inflammatory disorders with proinflammatory cytokine inhibitors
WO2008049897A1 (en) * 2006-10-27 2008-05-02 Ablynx N.V. Intranasal delivery of polypeptides and proteins
BRPI0812398A2 (pt) 2007-06-06 2019-09-24 Domantis Ltd domínio variável simples de imunoglobulina anti-vegf, antagonista anti-vegf, domínio variável simples de imunoglobulina resistente à protease, uso do antagonista vegf, método para a dispensação oral ou dispensação de um medicamento ao trato gi de um paciente ou ao pulmão ou tecido pulmonar ou olho de um paciente, dispositivo de dispensação pulmonar, formulação oral, ligando específico duplo, ácido nucleico isolado ou recombinante, vetor, célula hospedeira, método para produzir polipeptídeo, composição farmacêutica, polipeptídeo, e, proteína de fusão
CA2688434A1 (en) 2007-06-06 2008-12-11 Domantis Limited Polypeptides, antibody variable domains and antagonists

Also Published As

Publication number Publication date
CN101802004A (zh) 2010-08-11
HRP20151024T1 (hr) 2015-11-06
CN104311663B (zh) 2018-11-02
MA31403B1 (fr) 2010-05-03
WO2008149149A2 (en) 2008-12-11
AU2008259514B2 (en) 2014-05-15
HK1138022A1 (zh) 2010-08-13
EA200901494A1 (ru) 2010-06-30
EA018129B1 (ru) 2013-05-30
EP2746290A2 (en) 2014-06-25
PE20090763A1 (es) 2009-07-10
EP2164867A2 (en) 2010-03-24
TW200911832A (en) 2009-03-16
EA201100546A1 (ru) 2011-12-30
NZ581372A (en) 2012-02-24
CR11195A (es) 2010-05-24
KR20100041746A (ko) 2010-04-22
US20100247515A1 (en) 2010-09-30
PE20090323A1 (es) 2009-04-20
EA018723B1 (ru) 2013-10-30
CA2688433A1 (en) 2008-12-11
CA2683823A1 (en) 2008-12-11
EP2746291A3 (en) 2014-09-03
IL202204A0 (en) 2010-06-16
KR101604274B1 (ko) 2016-03-17
PE20090322A1 (es) 2009-04-20
EA200901491A1 (ru) 2010-08-30
MA31668B1 (fr) 2010-09-01
CA2683791A1 (en) 2008-12-11
WO2008149150A3 (en) 2009-06-25
TW200918088A (en) 2009-05-01
BRPI0813899A2 (pt) 2019-09-24
US20110256122A1 (en) 2011-10-20
WO2008149149A3 (en) 2009-04-02
EP2162468A2 (en) 2010-03-17
AU2008259514A1 (en) 2008-12-11
AR066848A1 (es) 2009-09-16
CA2688434A1 (en) 2008-12-11
JP2010530220A (ja) 2010-09-09
CR11194A (es) 2010-06-28
CL2008001673A1 (es) 2008-11-21
WO2008149148A3 (en) 2009-04-02
KR20100018040A (ko) 2010-02-16
MX2009013138A (es) 2010-04-30
CY1116762T1 (el) 2017-03-15
DOP2009000268A (es) 2010-02-28
CL2008001674A1 (es) 2008-11-21
US8398979B2 (en) 2013-03-19
JP5325211B2 (ja) 2013-10-23
SG182141A1 (en) 2012-07-30
US20100266616A1 (en) 2010-10-21
KR20100040841A (ko) 2010-04-21
EP2746291B1 (en) 2019-08-14
AU2008259590A1 (en) 2008-12-11
HUE025899T2 (en) 2016-05-30
JP2010529841A (ja) 2010-09-02
CO6251321A2 (es) 2011-02-21
WO2008149148A2 (en) 2008-12-11
DK2162467T3 (en) 2015-08-24
EP2746290B1 (en) 2019-08-14
ZA200908470B (en) 2011-02-23
TW200911831A (en) 2009-03-16
US20090148437A1 (en) 2009-06-11
CA2688447C (en) 2016-11-08
BRPI0812795A2 (pt) 2014-12-02
JP2010530364A (ja) 2010-09-09
BRPI0812268A2 (pt) 2019-09-10
EA200901300A1 (ru) 2010-06-30
AU2008259516A1 (en) 2008-12-11
MX2009013211A (es) 2010-04-09
CN101778865A (zh) 2010-07-14
AR066850A1 (es) 2009-09-16
TW200902551A (en) 2009-01-16
CN104311663A (zh) 2015-01-28
MX2009012967A (es) 2010-04-01
EA200901495A1 (ru) 2010-10-29
BRPI0812795B1 (pt) 2019-12-03
EP2162467A2 (en) 2010-03-17
BRPI0812795B8 (pt) 2020-01-28
JP5444215B2 (ja) 2014-03-19
ES2546943T3 (es) 2015-09-30
AR066847A1 (es) 2009-09-16
CN101883788A (zh) 2010-11-10
CN101778865B (zh) 2016-11-09
EP2162467B1 (en) 2015-07-22
PT2162467E (pt) 2015-10-29
EP2746291A2 (en) 2014-06-25
IL201398A0 (en) 2010-05-31
WO2008149150A2 (en) 2008-12-11
CA2688456A1 (en) 2008-12-11
MX2009013137A (es) 2010-04-30
TW200911834A (en) 2009-03-16
PL2162467T3 (pl) 2015-12-31
US20120134982A1 (en) 2012-05-31
CL2008001676A1 (es) 2008-11-21
CO6251322A2 (es) 2011-02-21
AU2008259515A1 (en) 2008-12-11
BRPI0812795C1 (pt) 2021-05-25
SG182151A1 (en) 2012-07-30
CA2688447A1 (en) 2008-12-11
EP2746290A3 (en) 2014-09-10
KR20100021642A (ko) 2010-02-25
SI2162467T1 (sl) 2015-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TW200907128A (en) Methods for selecting protease resistant polypeptides
TW200906853A (en) Polypeptides, antibody variable domains & antagonists
CN101848935A (zh) 选择蛋白酶抗性多肽的方法
TW201125877A (en) Stable anti-TNFR1 polypeptides, antibody variable domains & and antagonists