EA018129B1 - Полипептиды, вариабельные домены антитела и антагонисты - Google Patents

Полипептиды, вариабельные домены антитела и антагонисты Download PDF

Info

Publication number
EA018129B1
EA018129B1 EA200901491A EA200901491A EA018129B1 EA 018129 B1 EA018129 B1 EA 018129B1 EA 200901491 A EA200901491 A EA 200901491A EA 200901491 A EA200901491 A EA 200901491A EA 018129 B1 EA018129 B1 EA 018129B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
variable domain
protease
polypeptide
antagonist
polypeptides
Prior art date
Application number
EA200901491A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200901491A1 (ru
Inventor
Лорен Йесперс
Малгорзата Пупека
Айан Томлинсон
Кэролин Эневер
Original Assignee
Домантис Лимитед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB0724331.4A external-priority patent/GB0724331D0/en
Application filed by Домантис Лимитед filed Critical Домантис Лимитед
Publication of EA200901491A1 publication Critical patent/EA200901491A1/ru
Publication of EA018129B1 publication Critical patent/EA018129B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/005—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies constructed by phage libraries
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/007—Pulmonary tract; Aromatherapy
    • A61K9/0073—Sprays or powders for inhalation; Aerolised or nebulised preparations generated by other means than thermal energy
    • A61K9/0078—Sprays or powders for inhalation; Aerolised or nebulised preparations generated by other means than thermal energy for inhalation via a nebulizer such as a jet nebulizer, ultrasonic nebulizer, e.g. in the form of aqueous drug solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/06—Anti-spasmodics, e.g. drugs for colics, esophagic dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/04—Artificial tears; Irrigation solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/543—Mucosal route intranasal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/544—Mucosal route to the airways
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Transplantation (AREA)

Abstract

Изобретение относится к полипептидам и единичным вариабельным доменам (dAb) антитела против IL-1R1, которые устойчивы к деградации протеазой, а также содержащим их антагонистам. Указанные полипептиды, dAb и антагонисты полезны в качестве терапевтических и/или профилактических средств, которые, вероятно, сталкиваются с протеазами при введении пациенту, например для внутрилегочного введения, перорального введения, доставки в легкое и доставки в ЖК (желудочно-кишечный) тракт пациента, а также для лечения воспалительного заболевания, такого как артрит или COPD (хроническое обструктивное заболевание легких).

Description

Настоящее изобретение относится к протеазоустойчивым полипептидам, иммуноглобулиновым (антительным) единичным вариабельным доменам и содержащим их антагонистам против рецептора интерлейкина-1 типа 1 (1Ь-1В1). Изобретение также относится к применениям, препаратам, композициям и устройствам, содержащим такие лиганды против 1Ь-1В1.
Предшествующий уровень техники
Полипептиды и пептиды становятся все более важными агентами во многих применениях, включая промышленное применение и применение в качестве медицинских, терапевтических и диагностических агентов. Однако при некоторых физиологических состояниях, таких как воспалительные состояния (например ΟΟΡΌ (хроническое обструктивное заболевание легких)) и рак, количество протеаз, присутствующих в ткани, органе или животном (например в легком, внутри или около опухоли) может увеличиваться. Такое увеличение протеаз может приводить к ускоренному расщеплению и инактивации эндогенных белков и терапевтических пептидов, полипептидов и белков, которые вводят для лечения заболевания. Соответственно, некоторые агенты, которые обладают потенциалом для применения их ίη νίνο (например для применения в лечении, диагностике или предупреждении заболевания), имеют только ограниченную эффективность вследствие того, что они быстро расщепляются и инактивируются протеазами.
Протеазоустойчивые полипептиды предоставляют некоторые преимущества. Например, протеазоустойчивые полипептиды сохраняют свою активность ίη νίνο дольше, чем протеазочувствительные агенты, и, соответственно, сохраняют свою функциональность в течение периода времени, достаточного для получения биологических эффектов. Существует необходимость в улучшенных способах селекции полипептидов, устойчивых к расщеплению протеазой и, кроме того, имеющих желаемую биологическую активность.
1Б-1К1
Оказалось, что некоторые агенты, связывающие рецептор интерлейкина-1 типа 1 (1Ь-1К1) и нейтрализующие его активность, представляют собой эффективные терапевтические агенты для некоторых воспалительных состояний, таких как ревматоидный артрит от умеренно активного до тяжелой степени. Однако другие агенты, связывающие 1Ь-1КТ, такие как антитело против 1Ь-1К1 ΆΜΟ 108 (Атдеп), не удовлетворяют основным конечным точкам клинических исследований. Желательно обеспечить агенты, которые связывают и оказывают антагонистическое воздействие на 1Ь-1К1 и являются эффективными в лечении воспаления легких или респираторных заболеваний, таких как хроническое обструктивное заболевание легких (СОРЭ).
Существует потребность в улучшенных агентах, которые оказывают антагонистическое воздействие на 1Ь-1КТ, и способах введения таких агентов для лечения воспаления легких и заболевания легких.
Краткое изложение сущности изобретения
В одном из аспектов в изобретении предложен полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 98% идентична аминокислотной последовательности ΌΟΜ4130-201 или по меньшей мере на 97% идентична аминокислотной последовательности ΌΟΜ4-130-202 (представленной на фиг. 4). В одном из воплощений процентная идентичность составляет по меньшей мере 97,5, 98, 98,5 или 99%. В одном из воплощений полипептид представляет собой ΌΟΜ4-130-201 или ΌΟΜ4-130-202. В изобретении также предложен (по существу) чистый мономер ΌΟΜ4-130-201 или ΌΟΜ4-130-202. В одном из воплощений ΌΟΜ4-130-201 или ΌΟΜ4-130-202 представляет собой по меньшей мере на 98, 99, 99,5% чистый или 100% чистый мономер.
В одном из аспектов в изобретении предложен полипептид, содержащий протеазоустойчивую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности ΌΟΜ4-130-201 или ΌΟΜ4-130-202. В одном из воплощений этих аспектов процентная идентичность составляет по меньшей мере 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%. В одном из воплощений полипептид представляет собой ΌΟΜ4-130-201 или ΌΟΜ4-130-202.
В одном из аспектов в изобретении предложен полипептид, кодируемый аминокислотной последовательностью, которая по меньшей мере на 80% идентична нуклеотидной последовательности ΌΟΜ4130-201 или ΌΟΜ4-130-202 (представленной на фиг. 19). В одном из воплощений процентная идентичность составляет по меньшей мере 70, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%.
В одном из аспектов в изобретении предложен полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере на 57% идентична нуклеотидной последовательности ΌΟΜ4-130201 или ΌΟΜ4-130-202 (представленной на фиг. 19), и где полипептид содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 98% идентична аминокислотной последовательности ΌΟΜ4-130-201 или по меньшей мере на 97% идентична аминокислотной последовательности ΌΟΜ4130-202. В одном из воплощений процентная идентичность нуклеотидной последовательности составляет по меньшей мере 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%. В одном из воплощений процентная идентичность аминокислотной последовательности составляет по меньшей мере 94, 95, 96, 97, 98 или 99% или 100%. Например, нуклеотидная последовательность может представлять собой кодон-оптимизированный вариант нуклеотидной последовательности ΌΟΜ4-130-201 или ΌΟΜ4-130-202 (представленной на фиг. 19). Оптимизация кодонов последовательностей известна в данной области тех
- 1 018129 ники. В одном из воплощений нуклеотидная последовательность оптимизирована для экспрессии в бактериальной (например Е. соб или Рвеиботоиав, например Р Диотевсеив), млекопитающего (например СНО) или дрожжевой клетке-хозяине (например РюсбДа или 8ассбаготусев, например Р. равЮпв или 8. сетеуДвДае).
В одном из аспектов в изобретении предложен слитый белок, содержащий полипептид по изобретению.
В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора интерлейкина-1 типа 1 (1Ь-1К1), содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 98% идентична аминокислотной последовательности ΌΘΜ4-130-201 или по меньшей мере на 97% идентична аминокислотной последовательности ΌΘΜ4-130-202 (представленной на фиг. 4). В одном из воплощений процентная идентичность составляет по меньшей мере 97,5, 98, 98,5 или 99%.
В одном из воплощений иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен содержит по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из 228, 498, 838 и 94Υ, согласно нумерации Кабата (8есщепсев оДРто1ешв оД 1ттипо1од1са1 1и1егев1, И8 Эераг1теп1 оДНеабб апб Нитап 8егуДсев 1991).
В одном из воплощений иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен содержит 228, 498, 838 и 94Υ, согласно нумерации Кабата.
В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора интерлейкина-1 типа 1 (1Ь-1К1), содержащий аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотной последовательности ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130-202.
В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора интерлейкина-1 типа 1 (1Ь-1К1), кодируемый нуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере на 80% идентична нуклеотидной последовательности ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130-202 (представленной на фиг. 19). В одном из воплощений процентная идентичность составляет по меньшей мере 70, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%.
В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора интерлейкина-1 типа 1 (1Ь-1К1), кодируемый нуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере на 57% идентична нуклеотидной последовательности ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130-202 (представленной на фиг. 19), и где вариабельный домен содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 98% идентична аминокислотной последовательности ΌΘΜ4-130-201 или по меньшей мере на 97% идентична аминокислотной последовательности ΌΘΜ4130-202. В одном из воплощений процентная идентичность нуклеотидной последовательности составляет по меньшей мере 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%. В одном из воплощений процентная идентичность аминокислотной последовательности составляет по меньшей мере 94, 95, 96, 97, 98 или 99 или 100%. Например, нуклеотидная последовательность может представлять собой кодон-оптимизированный вариант нуклеотидной последовательности ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130-202 (представленной на фиг. 19). Оптимизация кодонов последовательностей известна в данной области техники. В одном из воплощений нуклеотидная последовательность оптимизирована для экспрессии в бактериальной (например Е. соб или Рвеиботоиав, например Р Диогевсеив), млекопитающего (например СНО) или дрожжевой клетке-хозяине (например РюсбДа или 8ассбаготусев, например Р. равЮпв или 8. сетеуДвДае).
В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора интерлейкина-1 типа 1 (1Д-1К.1), кодируемый нуклеотидной последовательностью, идентичной нуклеотидной последовательности ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130-202 (представленной на фиг. 19).
В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист рецептора интерлейкина-1 типа 1 (1Ь1К.1), содержащий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против 1Д-1К1 по изобретению. В одном из воплощений антагонист содержит первый и второй иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, где каждый вариабельный домен представляет собой вариабельный домен по изобретению. Например, когда антагонист содержит мономер указанного единичного вариабельного домена или гомодимер указанного единичного вариабельного домена. В одном из воплощений аминокислотная последовательность единичного вариабельного домена или каждого единичного вариабельного домена идентична аминокислотной последовательности ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130-202 (представленной на фиг. 4).
В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора интерлейкина-1 типа 1 (1Ь-1К1), содержащий аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотной последовательности ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130-202 (представленной на фиг. 4) или отличается от аминокислотной последовательности ΌΘΜ4-130-202 не более чем по 25 аминокислотным положениям, и имеет последовательность СЭРЕ которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности ί.ΌΡ1 ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130-202. В одном из воплощений различие имеется не более чем по 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотному(ым) положению(ям). В одном из воплощений идентичность последо
- 2 018129 вательности СБК составляет по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%.
В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора интерлейкина-1 типа 1 (1Ь-1К.1), содержащий аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотной последовательности ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130-202 (представленной на фиг. 4), или отличается от аминокислотной последовательности ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130-202 по не более чем 25 аминокислотным положениям и имеет последовательность СБК2, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности СБВ2 ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130202. В одном из воплощений различие имеется не более чем по 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотному(ым) положению(ям). В одном из воплощений идентичность последовательности СБК. составляет по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%.
В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора интерлейкина-1 тип 1 (1Ь-1В1), содержащий аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотной последовательности ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130-202 (представленной на фиг. 4), или отличается от аминокислотной последовательности ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4130-202 не более чем по 25 аминокислотным положениям и имеет последовательность СБК.3, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности СБК.3 ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130-202. В одном из воплощений различие имеется не более чем по 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотному(ым) положению(ям). В одном из воплощений идентичность последовательности СБК. составляет по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%.
В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора интерлейкина-1 типа 1 (1Ь-1К.1), содержащий аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотной последовательности ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130-202 (представленной на фиг. 4), или отличается от аминокислотной последовательности ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130-202 не более чем по 25 аминокислотным положениям и имеет последовательность СБК.1, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности СБК.1 ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130202, и имеет последовательность СБК2, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности СБВ2 ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130-202. В одном из воплощений различие имеется не более чем по 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотному(ым) положению(ям). В одном из воплощений идентичности одной или обеих последовательностей СБК. составляют по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% соответственно.
В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора интерлейкина-1 типа 1 (1Ь-1К.1), содержащий аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотной последовательности ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130-202 (представленной на фиг. 4), или отличается от аминокислотной последовательности ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130-202 не более чем по 25 аминокислотным положениям и имеет последовательность СБК.1, которая по меньшей мере на 50% идентична СБК.1 последовательности ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130202, и имеет последовательность СБК.3, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности СБК.3 ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130-202. В одном из воплощений различие имеется не более чем по 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотному(ым) положению(ям). В одном из воплощений идентичности одной или обеих последовательностей СБК. составляют по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% соответственно.
В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора интерлейкина-1 типа 1 (1Ь-1К.1), содержащий аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотной последовательности ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130-202 (представленной на фиг. 4), или отличается от аминокислотной последовательности ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130-202 не более чем по 25 аминокислотным положениям и имеет последовательность СБК.2, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности СБВ2 ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130202, и имеет последовательность СБК.3, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности СБК.3 ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130-201, или ΌΘΜ4-130-202. В одном из воплощений различие имеется не более чем по 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, б, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотному(ым) положению(ям). В одном из воплощений идентичности одной или обеих последовательностей СБК. составляют по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% соответственно.
В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора интерлейкина-1 типа 1 (1Ь-1К.1), содержащий аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотной последовательности ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130-202 (представленной на фиг. 4), или отличается от аминокислотной последовательности ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130-202 не более чем по 25 аминокислотным положениям и имеет последовательность СБК.1, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности СБК.1 ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130202, и имеет последовательность СБК2, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности СБВ2 ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130-202, и имеет последовательность СБВ3. которая по меньшей мере
- 3 018129 на 50% идентична последовательности СОЯ3 ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130-202. В одном из воплощений различие имеется не более чем по 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотному(ым) положению(ям). В одном из воплощений одна или две, или каждая идентичность последовательности СОЯ составляет по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% соответственно.
В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист рецептора интерлейкина-1 типа 1 (1Ь1Я1), имеющий последовательность СЭКЕ которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности СОЯ1 ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130-202 (представленной на фиг. 4). В одном из воплощений идентичность последовательности СОЯ составляет по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%. Антагонист может быть устойчив к протеазе, например одной или более протеазам, описанным в данной заявке, например в описанном в данной заявке наборе условий.
В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист рецептора интерлейкина-1 типа 1 (1Ь1Я1), имеющий последовательность СОЯ2, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности СЭВ1 ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130-202 (представленной на фиг. 4). В одном из воплощений идентичность последовательности СОЯ составляет по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%. Антагонист может быть устойчив к протеазе, например одной или более протеазам, описанным в данной заявке, например в описанном в данной заявке наборе условий.
В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист рецептора интерлейкина-1 типа 1 (1Ь1Я1), имеющий последовательность СЭЯ/, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности СЭВ1 ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130-202 (представленной на фиг. 4). В одном из воплощений идентичность последовательности СОЯ составляет по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%. Антагонист может быть устойчив к протеазе, например одной или более протеазам, описанным в данной заявке, например в описанном в данной заявке наборе условий.
В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист рецептора интерлейкина-1 типа 1 (1Ь1Я1), имеющий последовательность СОЯ1, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности СЭВ1 ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130-202 (представленной на фиг. 4), и последовательность СОЯ2, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности СЭВ2 ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130202 соответственно. В одном из воплощений идентичность последовательности СОЯ одной или обеих СОЯ составляет по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% соответственно. Антагонист может быть устойчив к протеазе, например одной или более протеазам, описанным в данной заявке, например в описанном в данной заявке наборе условий.
В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист рецептора интерлейкина-1 типа 1 (1Ь1Я1), имеющий последовательность СОЯ1, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности СЭВ1 ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130-202 (представленной на фиг. 4), и последовательность СОЯ3, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности СЭЯ/ ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130202 соответственно. В одном из воплощений идентичность последовательности СОЯ одной или обеих СОЯ составляет по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% соответственно. Антагонист может быть устойчив к протеазе, например одной или более протеазам, описанным в данной заявке, например в описанном в данной заявке наборе условий.
В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист рецептора интерлейкина-1 типа 1 (1Ь1Я1), имеющий последовательность СОЯ2, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности СЭВ2 ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130-202 (представленной на фиг. 4), и последовательность СЭЯ/, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности СЭЯ/ ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130202. В одном из воплощений идентичность последовательности СОЯ одной или обеих СОЯ составляет по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% соответственно. Антагонист может быть устойчив к протеазе, например одной или более протеазам, описанным в данной заявке, например в описанном в данной заявке наборе условий.
В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист рецептора интерлейкина-1 типа 1 (1Ь1Я1), имеющий последовательность СОЯ1, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности СЭВ1 ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130-202 (представленной на фиг. 4), и последовательность СОЯ2, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности СЭВ2 ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130202 соответственно, и последовательность СЭЯ/, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности СЭЯ/ ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130-202 соответственно. В одном из воплощений идентичность последовательности СОЯ одной или двух, или каждой СОЯ составляет по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% соответственно. Антагонист может быть устойчив к протеазе, например одной или более протеазам, описанным в данной заявке, например в описанном в данной заявке наборе условий.
В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист рецептора интерлейкина-1 типа 1 (1Ь1Я1), содержащий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, содержащий последовательность СЭКЕ СОЯ2 и/или СОЯ3 (например СОЯ1, СОЯ2, СОЯ3, СОЯ1 и 2, СОЯ1 и 3, СОЯ2 и 3 или СОЯ1, 2 и 3) ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130-202 (представленной на фиг. 4). Антагонист может быть устойчив к протеазе, например одной или более протеазам, описанным в данной заявке, например в опи- 4 018129 санном в данной заявке наборе условий.
В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист рецептора интерлейкина-1 типа 1 (1Ь1К.1), который конкурирует с ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130-202 за связывание с 1Ь-1К.1. Таким образом, антагонист может связываться с тем же самым эпитопом, что и ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130-202, или перекрывающимся эпитопом. В одном из воплощений антагонист содержит иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 98% идентична аминокислотной последовательности ΌΘΜ4-130-201, или по меньшей мере на 97% идентична аминокислотной последовательности ΌΘΜ4-130-202 (представленной на фиг. 4). В одном из воплощений процентная идентичность составляет по меньшей мере 97,5, 98, 98,5 или 99%. В одном из воплощений вариабельный домен представляет собой ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130-202. Антагонист может быть устойчив к протеазе, например одной или более протеазам, описанным в данной заявке, например в описанном в данной заявке наборе условий. В одном из воплощений антагонист представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, такой как одновалентный антигенсвязывающий фрагмент (например 8сЕу, ЕаЬ, ЕаЬ', бЛЬ) обладающий специфичностью связывания в отношении 1Ь-1К.1. Другие предпочтительные антагонисты представляют собой описанные в данной заявке лиганды, связывающиеся с 1Ь-1КТ. Эти лиганды содержат иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен или доменное антитело (бЛЬ). обладающее специфичностью связывания в отношении 1Ь-1К1, или гипервариабельные участки такого бАЬ в подходящем формате. В некоторых воплощениях лиганд представляет собой мономер бАЬ, который состоит, по существу, или состоит из иммуноглобулинового единичного вариабельного домена, или бАЬ, обладающего специфичностью связывания в отношении 1Ь-1К.1. В других воплощениях лиганд представляет собой полипептид, который содержит бАЬ (или СБК. бАЬ) в подходящем формате, таком как формат антитела.
В одном из аспектов в изобретении предложен протеазоустойчивый иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против 1Ь-1К1, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130202. В одном из воплощений этих аспектов процентная идентичность составляет по меньшей мере 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%.
В одном из воплощений лиганды (например полипептиды, антагонисты, вариабельные домены) по изобретению форматированы таким образом, что обладают большим гидродинамическим размером, например путем присоединения группы ПЭГ (полиэтиленгликоль), сывороточного альбумина, трансферрина, рецептора трансферрина или по меньшей мере его трансферрин-связывающего фрагмента, Есобласти антитела, или путем конъюгации с доменом антитела. Например, мономер бАЬ может быть форматирован в виде более крупного антигенсвязывающего фрагмента антитела или в виде антитела (например форматирован в виде ЕаЬ, ЕаЬ', Е(аЬ)2, Е(аЬ')2, 1дС, ксЕу). Гидродинамический размер лиганда и его период полувыведения из сыворотки также может быть увеличен путем конъюгации или связывания 1Ь-1К1-связывающего агента (лиганда; антагониста) со связывающим доменом (например, антителом или фрагментом антитела), связывающим антиген или эпитоп, что увеличивает период полувыведения ίη νίνο, как описано в данной заявке (см. Приложение 1 в νθ 2006038027, включенной в данную заявку посредством ссылки). Например, связывающий агент (например полипептид) может быть конъюгирован или связан с антителом против сывороточного альбумина или антителом или фрагментом антитела против неонатального Ес-рецептора, например бАЬ, ЕаЬ, ЕаЬ' или 5сЕу против 8А или против неонатального Ес-рецептора, или с аффителом против 8А или аффителом против неонатального Ес-рецептора.
Примеры подходящего альбумина, фрагментов альбумина или вариантов альбумина для применения в 1Ь-1К1-связывающем лиганде по изобретению описаны в νθ 2005/077042А2 и νθ 2006038027, которые включены в данную заявку посредством ссылки.
В других воплощениях по изобретению, раскрытых в данном описании, вместо применения бАЬ в антагонисте или лиганде по изобретению, предполагается, что специалист в данной области техники может использовать домен, который содержит СОК бАЬ, которое связывается с 1Ь-1К1 (например СОК, перенесенные на подходящий белковый каркас или скелет, например аффитело, 8рА каркас, домен рецептора ЬОЬ (липопротеинов низкой плотности) класса А или домен ЕСЕ (эпителиальный фактор роста)), или может представлять собой белковый домен, содержащий сайт связывания с 1Ь-1К1, например когда домен выбран из аффитела, домена 8рА, домена ЬОЬ рецептора класс А или домена ЕСЕ. Полное описание следует рассматривать таким образом, что оно раскрывает антагонисты, лиганды и способы применения таких доменов вместо бАЬ.
Полипептиды, иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены и антагонисты по изобретению могут быть устойчивыми к одной или более чем одной из следующих: сериновая протеаза, цистеиновая протеаза, аспартатные протеазы, тиоловые протеазы, матриксная металлопротеаза, карбоксипептидаза (например карбоксипептидаза А, карбоксипептидаза В), трипсин, химотрипсин, пепсин, папаин, эластаза, лейкозим, панкреатин, тромбин, плазмин, катепсины (например катепсин С), протеиназа (например протеиназа 1, протеиназа 2, протеиназа 3), термолизин, химозин, энтеропептидаза, каспаза (например каспаза 1, каспаза 2, каспаза 4, каспаза 5, каспаза 9, каспаза 12, каспаза 13), кальпаин, фикаин, клострипаин, актинидаин, бромелаин и сепараза. В конкретных воплощениях протеаза представляет со
- 5 018129 бой трипсин, эластазу или лейкозим. Протеаза также может быть предложена в биологическом экстракте, биологическом гомогенате или биологическом препарате. Если желательно, способ дополнительно включает добавление ингибитора протеазы к комбинации репертуара и протеазы после завершения инкубации. В одном из воплощений протеаза представляет собой протеазу, обнаруженную в мокроте, слизи (например желудочной слизи, носовой слизи, бронхиальной слизи), бронхоальвеолярном лаваже, гомогенате легких, экстракте легких, экстракте поджелудочной железы, желудочной жидкости, слюне или слезах. В одном из воплощений протеаза представляет собой протеазу, обнаруженную в глазу и/или слезах. В одном из воплощений протеаза представляет собой небактериальную протеазу. В этом воплощении протеаза представляет собой протеазу животного, например млекопитающего, например человека. В этом воплощении протеаза представляет собой протеазу ЖК (желудочно-кишечного) тракта или протеазу легочной ткани, например протеазу ЖК тракта или протеазу легочной ткани, обнаруженные у людей. Такая приведенная в данной заявке протеаза также может быть использована в описанных в данной заявке способах, включающих воздействие протеазы на репертуар библиотеки.
В одном из аспектов в изобретении предложен протеазоустойчивый иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, содержащий сайт связывания рецептора интерлейкина-1 типа 1 (1Ь-1К1), где вариабельный домен устойчив к протеазе, например трипсину, при инкубации с (1) протеазой в концентрации (с) по меньшей мере 10 мкг/мл при 37°С в течение периода времени (1) по меньшей мере 1 ч; или (2) протеазой в концентрации (с') по меньшей мере 40 мкг/мл при 30°С в течение периода времени (1) по меньшей мере 1 ч, где вариабельный домен содержит аминокислотную последовательность которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности ΌΘΜ4-130-201 или ΌΘΜ4-130202. В одном из воплощений отношение (моль/моль) протеазы, например трипсина, к вариабельному домену (протеаза:вариабельный домен) составляет 8000 к 80000, например, когда С (концентрация) равна 10 мкг/мл, отношение протеаза:вариабельный домен составляет 800 к 80000; или когда С или С' равна 100 мкг/мл, отношение протеаза:вариабельный домен составляет 8000 к 80000. В одном из воплощений отношение (масса/масса, например микрограмм/микрограмм) протеазы (например трипсина) к вариабельному домену (протеаза/вариабельный домен) составляет 16000 к 160000, например, когда С равна 10 мкг/мл, отношение протеаза/вариабельный домен составляет 1600 к 160000; или когда С или С' равна 100 мкгмл, отношение протеаза/вариабельный домен составляет 16000 к 160000. В одном из воплощений концентрация (с или с') протеазы составляет по меньшей мере 100 или 1000 мкг/мл. В данной заявке сделана ссылка на описание условий, подходящих для протеолитической активности протеазы для применения при работе с репертуарами или библиотеками пептидов или полипептидов (например параметры мас./мас.). Эти условия могут быть использованы для определения устойчивости к протеазе конкретного иммуноглобулинового единичного вариабельного домена. В одном из воплощений время (1) составляет примерно 1, 3 или 24 ч, или в течение ночи (например примерно 12-16 ч). В одном из воплощений вариабельный домен устойчив в условиях (1) и концентрация протеазы (с) составляет или примерно составляет 10 или 100 мкг/мл, и время (1) составляет 1 ч. В одном из воплощений вариабельный домен устойчив в условиях (2) и концентрация протеазы (с') составляет или примерно составляет 40 мкг/мл, и время (1) составляет или примерно составляет 3 ч. В одном из воплощений протеаза выбрана из трипсина, эластазы, лейкозима и панкреатина. В одном из воплощений протеаза представляет собой трипсин. В одном из воплощений протеаза представляет собой протеазу, обнаруженную в мокроте, слизи (например желудочной слизи, носовой слизи, бронхиальной слизи), бронхоальвеолярном лаваже, гомогенате легких, экстракте легких, экстракте поджелудочной железы, желудочной жидкости, слюне или слезах. В одном из воплощений протеаза представляет собой протеазу, обнаруженную в глазу и/или слезах. В одном из воплощений протеаза представляет собой небактериальную протеазу. В этом воплощении протеаза представляет собой протеазу животного, например протеазу млекопитающего, например человека. В этом воплощении протеаза представляет собой протеазу ЖК тракта или протеазу легочной ткани, например протеазу ЖК тракта или протеазу легочной ткани, обнаруженные у людей. Такая приведенная в данной заявке протеаза также может быть использована в описанных в данной заявке способах, включающих воздействие протеазы на репертуар библиотеки.
В одном из воплощений вариабельный домен устойчив к трипсину и/или по меньшей мере одной другой протеазе, выбранной из эластазы, лейкозима и панкреатина. Например, устойчивость представляет собой устойчивость к трипсину и эластазе; трипсину и лейкозиму; трипсину и панкреатину; трипсину, эластазе и лейкозиму; трипсину, эластазе и панкреатину; трипсину, эластазе, панкреатину и лейкозиму; или трипсину, панкреатину и лейкозиму.
В одном из воплощений вариабельный домен экспонирован на бактериофаге при инкубации в условиях (1) или (2), например в фаговой библиотеке, имеющей размер от 106 до 1013, например от 108 до 1012 репликативных единиц (инфекционных вирионов).
В одном из воплощений вариабельный домен специфически связывается с 1Ь-1К1 после инкубации в условиях (1) или (2), например как оцивали с использованием ЫаСоге™ или ЕЬ1§А (твердофазного иммуноферментного анализа), например фагового ЕЬ1§А или моноклонального фагового ЕЬ1§А.
В одном из воплощений вариабельные домены по изобретению специфически связываются с бел
- 6 018129 ком А или белком Ь. В одном из воплощений специфическое связывание с белком А или Ь происходит после инкубации в условиях (1) или (2).
В одном из воплощений вариабельные домены по изобретению могут иметь ОП450 в ЕЙ18Л. например фаговом ЕЬ18А или моноклональном фаговом ЕЬ18А, по меньшей мере 0,404, например после инкубации в условиях (1) или (2).
В одном из воплощений вариабельные домены по изобретению демонстрируют, по существу, одну полосу при электрофорезе в геле, например после инкубации в условиях (1) или (2).
В некоторых воплощениях в изобретении предложен антагонист Ш-1К1, который представляет собой лиганд с двойной специфичностью, содержащий первое бАЬ по изобретению, которое связывается с Ш-1К1, и второе бАЬ, которое имеет такую же или отличающуюся от первого бАЬ специфичность связывания. Второе бАЬ может связываться с мишенью, выбранной из следующего: АроЕ (аполипопротеин Е), Аро-8АА (Аро-сывороточный амилоид А-1), ΒΌΝΕ (нейротрофический фактор головного мозга), кардиотрофин-1, СЕА (карциноэмбриональный антиген), СЭ40 (кластер дифференцировки 40), лиганд СЭ40, СЭ56, СП38, СП138, ЕСЕ (эпидермальный фактор роста), рецептор ЕСЕ, ЕNА-78 (эпителиальный нейтрофил-активирующий пептид-78), эотаксин, эотаксин-2, экзодус-2, ЕАР/ (белок активации фибробластов α), кислый ЕСЕ (фактор роста фибробластов), основный ЕСЕ, фактор роста фибробластов-10, лиганд ЕЬТ3 (Ешк-подобной тирозинкиназы-3), фракталкин (СХЗС), СП№ (глиальный нейротрофический фактор), С-С8Е (колониестимулирующий фактор гранулоцитов), СМ-С8Е (колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов), СЕ-β 1 (фактор роста β1), человеческий сывороточный альбумин, инсулин, ΙΡΝ-γ (интерферон-γ), 1СЕ-1 (инсулиноподобный фактор роста I), 1СЕ-11, 1Ь-1а (интерлейкин1α), ΙΕ-1β, рецептор 1Ь-1, рецептор 1Ь-1 типа 1, 1Ь-2, Ш-3, 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-6, 1Ь-7, 1Ь-8 (72 а.к.), 1Ь-8 (77 а.к.), 1Ь-9, ΙΕ-10, 1Ь-11, 1Ь-12, ΙΕ-13, ΙΕ-15, 1Ь-16, 1Ь-17, ΙΕ-18 (1С1Е (интерферон^-индуцирующий фактор)), ингибин α, ингибин β, ΙΡ-10 (интерферон-индуцибельный белок 10), фактор роста кератиноцитов-2 (КСЕ-2), КСЕ, лептин, ЫЕ (лейкоз-ингибирующий фактор), лимфотактин, вещество, ингибирующее мюллеровы протоки, фактор, ингибирующий колониеобразование моноцитов, белок-аттрактант моноцитов, М-С8Е (колониестимулирующий фактор макрофагов), МЛС (макрофагальный хемокин) (67 а.к.). МЭС (69 а.к.), МСР-1 (моноцитарный хемотаксический фактор-1) (МСАЕ (моноцитарный хемотаксический и активирующий фактор)), МСР-2, МСР-3, МСР-4, МЭС (67 а.к.), МЭС (69 а.к.), МЮ (монокин, индуцируемый ΙΕΝγ), МШ-1а (макрофагальный белок воспаления 1α), М№-1в, МШ-3а, М[Р-3[Й МШ-4, фактор-1, ингибирующий миелоидные предшественники (МРШ-Ц, NАΡ-2 (нейтрофил-активирующий белок-2), нейртурин, фактор роста нервов (ΝΟΕ), β-Ν6Ε, ΝΤ-3 (нейротрофин-3), ΝΤ-4, онкостатин М, РЭСЕ-АА (тромбоцитарный фактор роста-АА), РЭСЕ-АВ, РЭСЕ-ВВ, РЕ-4 (тромбоцитарный фактор 4), КА№ГЕ8 (цитокин, экспрессируемый и секретируемый нормальными Т-клетками при активации), 8ΠΕ1α (фактор-Е/. стромальных клеток), 8ΌΕ1β, 8СЕ, 8ССЕ (фактор роста стволовых клеток), фактор стволовых клеток (8СЕ), ТАКС (хемокин, регулируемый тимусом и при активации), ТСЕ-α (трансформирующий фактор роста α), ТСЕ-β, ТСЕ-в2, ТСЕ-в3, фактор некроза опухолей (ΤΝΕ), ΤΝΡ-α, ΤΝΡ-β, рецептор Ι ΤΝΡ, рецептор ΙΙ ΤΝΡ, ΤΝΙΕ-1, ТРО (тромбопоэтин), УЕСЕ (фактор роста сосудистого эндотелия), УЕСЕ А, УЕСЕ В, УЕСЕ С, УЕСЕ Ό, рецептор 1 УЕСЕ, рецептор 2 УЕСЕ, рецептор 3 УЕСЕ, ССР-2 (гранулоцитарный хемотаксический фактор-2), СКО/МС8А (регулирующий рост онкоген/фактор, стимулирующий рост меланомы), СКО-β, СКО-γ, НСС1 (гемофильтратный СС-хемокин 1), 1-309, НЕК 1, НЕК 2, НЕК 3, НЕК 4, сывороточный альбумин, у\УЕ (фактор (фон) Виллебранда), амилоидные белки (например альфа-амилоид), ММР12 (матриксная металлопротеаза 12), РЭК1 (ΡI3К(фосфатидилинозит-3киназа)-зависимая киназа 1), ЦЕ (иммуноглобулин Е), ΙΕ-13Κα1, ΙΕ-13Κα2, ЕЪ-15, Ш-15К, ΙΕ-16, Ш-17К, Ш-17, ΙΕ-18, Ш-18К, Ш-23, Ш-23К, Ш-25, СП2, СП4, СП11а, СП23, СП25, СП27, СП28, СП30, СП40, СП40Ь, СЭ56, СО138, АЬК5 (активиновый рецептор-подобная киназа 5), ЕСЕК (рецептор эпидермального фактора роста), ЕсЕК1 (высокоаффинный рецептор для ЦЕ), ТСЕЬ, ССЬ2 (хемокиновый лиганд-2 с СС-мотивом), ССЬ18, СЕА, СК8 (цитокин-отвечающие (СК) гены), СТСЕ (фактор роста соединительной ткани), СХСЬ12 (хемокиновый лиганд-12 с СХС-мотивом) (8ПЕ-1), химазу, ЕСЕ, фурин, эндотелин-1, эотаксины (например эотаксин, эотаксин-2, эотаксин-3), СМ-С8Е, ШАМ-1 (фактор межклеточной адгезии 1), Κ'Όδ (индуцибельный Т-клеточный костимулятор), ЦЕ, ШЫа, Ι-309, интегрины, Ь-селектин, МП (фактор, ингибирующий миграцию макрофагов), МШ4, МПС, МСР-1, ММР, эластазу нейтрофилов, остеопонтин, ОХ-40, РАКС (легочный хемокин, регулируемый активацией), РП-1 (рецептор апоптоза 1), КА№ГЕ8, 8СЕ, 8ПЕ-1, яд1ес8 (связывающий сиаловую кислоту иммуноглобулиноподобный лектин 8), ТАКС, ТСЕЬ, тромбин, Т1Ш-1 (семейство 1д и муциновых доменов, член 1), ЮТ, ТКАЫСЕ (индуцирующий ΤΝΡ-ассоциированную активацию цитокин), триптазу, УЕСЕ, УЪА-4 (очень поздний антиген-4), УСАМ (молекула адгезии сосудистых клеток), α4β7, ССК2 (хемокиновый рецептор-2 с СС-мотивом), ССК3, ССК4, СсК5, ССК7, сСк8, альфаубета8, альфаубета8, сМЕТ, СЭ8, у^Е, амилоидные белки (например альфа-амилоид), ММР12, РПК1 и 1дЕ.
В одном из примеров лиганд с двойной специфичностью содержит первое бАЬ, которое связывается с первым эпитопом на Ш-1К1, и второе бАЬ, которое связывается с эпитопом на другой мишени. В еще одном примере второе бАЬ связывается с эпитопом на сывороточном альбумине.
- 7 018129
В других воплощениях лиганд представляет собой полиспецифический лиганд, который содержит первый эпитоп-связывающий домен, обладающий специфичностью связывания в отношении 1Ь-1В1, и по меньшей мере один другой эпитоп-связывающий домен, обладающий специфичностью связывания, отличающейся от первого эпитоп-связывающего домена. Например, первый эпитоп-связывающий домен может представлять собой ЙАЬ. которое связывается с 1Ь-1В1, или может представлять собой домен, который содержит СЭВ йАЬ, которое связывается с 1Ь-1К1 (например СЭК перенесенные на подходящий белковый каркас или скелет, например аффитело, каркас 8рА, домен ЬПЬ рецептора класса А или домен ЕСР) или может представлять собой домен, который связывается с 1Ь-1В1, где домен выбран из аффитела, домена 8рА, домена ЬВЬ рецептора класса А или домена ЕСР).
В одном из воплощений антагонист 1Ь-1К1 содержит полипептидный домен, обладающий специфичностью связывания в отношении 1Ь-1В1, который связывает 1Ь-1К1 человека с аффинностью (ΚΌ) от примерно 300 нМ до примерно 5 пМ, как определено посредством поверхностного плазмонного резонанса. В одном из воплощений вариабельный домен по изобретению обладает специфичностью связывания в отношении 1Ь-1К1, который связывает 1Ь-1В1 человека с аффинностью (ΚΌ) от примерно 300 нМ до примерно 5 пМ, как определено посредством поверхностного плазмонного резонанса.
Антагонисты, полипептиды и вариабельные домены, связывающие 1Ь-1В1, могут связываться с 1Ь1В1 с любой желаемой аффинностью и могут быть легко идентифицированы с использованием любого подходящего способа скрининга. Антагонисты, полипептиды и вариабельные домены, связывающие 1Ь1В1 (например ЙАЬ), как правило, связываются с ΚΌ (ΚΌ=Κοίϊ (1<ά)/Κοιι (ка), определяемой посредством поверхностного плазмонного резонанса) примерно от 300 нМ до 5 пМ (т.е. от 3 х 10-7 до 5 х 10-12 М), предпочтительно от 50 нМ до 20 пМ, например от 5 нМ до 200 пМ, и, например, от 1 нМ до 100 пМ, например 1 х пример 1 х 10-1 с-1 до 1 х 10-7 с-1, например от 1 х 10-2 с-1 до 1 х 10-6 с-1, например от 5 х 10-3 с-1 до 1 х 10 мер 5 х 10-1 1 х 10-4 с-1 или меньше, например 1 х 10-5 с-1 или меньше, например 1 х 10-6 с-1 или меньше, как определено посредством поверхностного плазмонного резонанса. Некоторые антагонисты, полипептиды и вариабельные домены, связывающие 1Ь-1КТ, специфически связываются с 1Ь-1К1 человека с ΚΌ от 50 нМ до 20 пМ, и константой скорости Κ^ от 5 х 10-1 с-1 до 1 х 10-7 с-1, как определено посредством поверхност
10-7 М или меньше, например 1 х 10-8 М или меньше, например 1 х 10-9 М или меньше, на10-10 М или меньше, например 1 х 10-11 М или меньше; и/или константой скорости Κ^ от 5 х г5 с-1, наприс-1 или меньше, например 1 х 10-2 с-1 или меньше, например 1 х 10-3 с-1 или меньше, например ного плазмонного резонанса.
Предпочтительно антагонисты, полипептиды и вариабельные домены, связывающие 1Ь-1КТ, ингибируют связывание 1Ь-1а и/или ΣΚ-1β с 1Ь-1К1 со средней ингибирующей концентрацией (1С50) <10 мкМ, <1 мкМ, < 100 нМ, < 0 нМ, < 1 нМ, <500 пМ, <300 пМ, <100 пМ, или <10 пМ. 1С50 определяют, например, с использованием анализа связывания с рецептором ίη νίίτο, такого как анализ, описанный в \\'О 2006059108.
Также предпочтительно, чтобы антагонисты, полипептиды и вариабельные домены, связывающие 1Ш-1В1, ингибировали 1Ь-1а- и/или ΣΚ-1β-индуцированные функции в подходящем анализе ίη νίίτο со средней нейтрализующей дозой (ΝΏ50), которая составляет <10 рМ, <1 μΜ, <100 нМ, <10 нМ, <1 нМ, <500 пМ, <300 пМ, <100 пМ, или <10 пМ. Например, антагонисты, полипептиды и вариабельные домены, связывающие 1Ь-1К1, могут ингибировать 1Ь-1а- и/или 1Ь-1в-индуцированное высвобождение интерлейкина-8 клетками МВС-5 (АТСС (Американская коллекция типовых культур) № ССЬ-171) в анализе ίη νίίτο, таком как анализ, описанный в \УО 2006059108. В еще одном примере полипептиды и вариабельные домены связываются с 1Ь-1КТ и могут ингибировать 1Ь-1а- и/или ΣΚ-1β-индуцированное высвобождение интерлейкина-6 в анализе цельной крови, таком как анализ, описанный в \УО 2006059108.
Лекарственные средства, вариабельные домены, полипептиды и антагонисты по изобретению могут быть предназначены для системного или локального введения. В некоторых воплощениях лекарственное средство предназначено для интраперитонеального или подкожного введения. В других воплощениях лекарственное средство предназначено для локального введения в легочную ткань, например лекарственное средство может быть предназначено для ингаляции или интраназального введения.
В некоторых воплощениях лекарственное средство или антагонист дополнительно содержит антагонист рецептора 1 фактора некроза опухолей (ΤΝΕΚΤ, р55), или предназначен для введения вместе с антагонистом рецептора 1 фактора некроза опухолей (ΤΝΕΒ1, р55).
Протеазоустойчивые полипептиды, иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены и антагонисты по изобретению полезны в терапии, профилактике и диагностике заболевания или состояний у млекопитающих, например людей. В частности, пептиды и полипептиды полезны в качестве основы для лекарств, которые, вероятно, сталкиваются с протеазами при введении пациенту, такому как человек. Например, при введении в ЖК тракт (например при пероральном, подъязычном, ректальном введении), в этом случае полипептиды, иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены и антагонисты могут подвергаться воздействию протеазы в одном или более чем одном верхнем отделе ЖК тракта, нижнем отделе ЖК тракта, во рту, в желудке, тонкой кишке и толстой кишке. Таким образом, в одном из воплощений предложен протеазоустойчивый полипептид, иммуноглобулиновый единичный вариабельный
- 8 018129 домен или антагонист для введения перорально, подъязычно или ректально в ЖК тракт пациента для лечения и/или профилактики заболевания или состояния у пациента. Например, пероральное введение пациенту (например пациенту-человеку) для лечения и/или профилактики ГЬ-1-опосредованного состояния или заболевания, такого как артрит (например, ревматоидный артрит), ΙΒΌ (воспалительное заболевание кишечника), псориаз или болезнь Крона. В еще одном примере полипептид, вариабельный домен или антагонист, вероятно, сталкивается с протеазой при введении (например путем ингаляции или интраназально) в легочную ткань (например легкое или дыхательные пути). Таким образом, в одном из воплощений предложено введение пациенту (например человеку) протеазоустойчивого полипептида, иммуноглобулинового единичного вариабельного домена или антагониста путем ингаляции или интраназально в легочную ткань пациента для лечения и/или профилактики заболевания или состояния у пациента. Такое состояние может представлять собой астму (например аллергическую астму), СОРЭ (хроническое обструктивное заболевание легких), грипп или любое другое легочное заболевание или состояние, раскрытое в \УО 2006038027, включенной в данную заявку посредством ссылки. Антагонисты, полипептиды и иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены по изобретению могут демонстрировать улучшенные или относительно высокие температуры плавления (Тт), обеспечивающие повышенную стабильность.
Высокоаффинное связывание с мишенью может также или альтернативно представлять собой свойство антагонистов, полипептидов и вариабельных доменов. Одно или более чем одно из этих свойств, объединенное с устойчивостью к протеазе, делает антагонисты, вариабельные домены и полипептиды пригодными для применения в качестве лекарственных средств у млекопитающих, таких как люди, где, вероятно, сталкиваются с протеазами, например для введения в ЖК тракт или легочную ткань. В еще одном примере полипептид, вариабельный домен или антагонист, вероятно, сталкивается с протеазой при введении (например посредством внутриглазной инъекции или в виде глазных капель) в глаз пациента. Таким образом, в одном из воплощений предложено глазное введение пациенту (например человеку) протеазоустойчивого полипептида, иммуноглобулинового единичного вариабельного домена или антагониста для лечения у пациента и/или профилактики заболевания или состояния (например заболевания или состояния глаз). Введение может представлять собой местное введение в глаз, в форме глазных капель или путем инъекции в глаз, например в стекловидное тело глаза.
Таким образом, в одном из аспектов в изобретении предложен антагонист 1Ь-1К1 для пероральной доставки. В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист 1Ь-1КТ для доставки в ЖК тракт пациента. В одном из аспектов в изобретении предложено применение антагониста 1Ь-1К1 в изготовлении лекарственного средства для пероральной доставки. В одном из аспектов в изобретении предложено применение антагониста 1Ь-1К1 в изготовлении лекарственного средства для доставки в ЖК тракт пациента. В одном из воплощений вариабельный домен устойчив к трипсину и/или по меньшей мере одной другой протеазе, выбранной из эластазы, лейкозима и панкреатина. Например, устойчивость представляет собой устойчивость к трипсину и эластазе; трипсину и лейкозиму; трипсину и панкреатину; трипсину, эластазе и лейкозиму; трипсину, эластазе и панкреатину; трипсину, эластазе, панкреатину и лейкозиму; или трипсину, панкреатину и лейкозиму.
В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист 1Ь-1К1 для внутрилегочной доставки. В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист 1Ь-1К1 для доставки в легкое пациента. В одном из аспектов в изобретении предложено применение антагониста 1Ь-1К1 в изготовлении лекарственного средства для внутрилегочной доставки. В одном из аспектов в изобретении предложено применение антагониста 1Ь-1К1 в изготовлении лекарственного средства для доставки в легкое пациента. В одном из воплощений вариабельный домен устойчив к лейкозиму.
В одном из аспектов в изобретении предложен способ пероральной доставки или доставки лекарственного средства в ЖК тракт пациента или в легкое, или легочную ткань пациента, включающий введение пациенту фармацевтически эффективного количества антагониста 1Ь-1К1 по изобретению.
В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист 1Ь-1К1 по изобретению для лечения и/или профилактики воспалительного состояния. В одном из аспектов в изобретении предложено применение антагониста 1Ь-1К1 в изготовлении лекарственного средства для лечения и/или профилактики воспалительного состояния. В одном из воплощений состояние выбрано из группы, состоящей из артрита, рассеянного склероза, воспалительного заболевания кишечника и хронического обструктивного заболевания легких. Например, указанный артрит представляет собой ревматоидный артрит или ювенильный ревматоидный артрит. Например, указанное воспалительное заболевание кишечника выбрано из группы, состоящей из болезни Крона и неспецифического язвенного колита. Например, указанное хроническое обструктивное заболевание легких выбрано из группы, состоящей из хронического бронхита, хронического обструктивного бронхита и эмфиземы. Например, указанная пневмония представляет собой бактериальную пневмонию. Например, указанная бактериальная пневмония представляет собой стафилококковую пневмонию.
В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист 1Ь-1КТ для лечения и/или профилактики респираторного заболевания. В одном из аспектов в изобретении предложено применение антагониста 1Ь-1КТ в изготовлении лекарственного средства для лечения и/или профилактики респираторного забо
- 9 018129 левания. Например, указанное респираторное заболевание выбрано из группы, состоящей из воспаления легких, хронического обструктивного заболевания легких, астмы, пневмонии, гиперчувствительной пневмонии, легочного инфильтрата с эозинофилией, заболевания легких, вызванного факторами окружающей среды, пневмонии, бронхоэктаза, муковисцидоза, интерстициального заболевания легких, первичной легочной гипертензии, легочной тромбоэмболии, расстройств плевры, расстройств средостения, расстройств диафрагмы, гиповентиляции, гипервентиляции, приступов апноэ во сне, острого респираторного дистресс-синдрома, мезотелиомы, саркомы, отторжения трансплантата, заболевания трансплантат против хозяина, рака легких, аллергического ринита, аллергии, асбестоза, аспергилломы, аспергиллеза, бронхоэктаза, хронического бронхита, эмфиземы, эозинофильной пневмонии, идиопатического легочного фиброза, инвазивного пневмококкового заболевания, гриппа, нетуберкулезных микобактерий, плеврального выпота, пневмокониоза, пневмоцитоза, пневмонии, легочного актиномикоза, легочного альвеолярного протеиноза, легочной формы сибирской язвы, отека легких, легочного эмбола, воспаления легких, гистиоцитоза X легких, легочной гипертензии, легочного нокардиоза, туберкулеза легких, веноокклюзионного заболевания легких, ревматоидного заболевания легких, саркоидоза и гранулематоза Вегенера. Например, заболевание представляет собой хроническое обструктивное заболевание легких (СОРИ). Например, заболевание представляет собой астму.
Антагонист по изобретению, содержащий агент, который ингибирует 1Ь-1К1 (например, когда агент выбран из группы, состоящей из фрагментов антитела (например ЕаЬ-фрагмента, ЕаЬ'-фрагмента, Εν-фрагмента (например 5сЕу. связанный дисульфидной связью Εν), Е(аЬ')2-фрагмента, бАЬ), лигандов и мономеров и мультимеров (например гомо- или гетеродимеров) бАЬ, может быть введен локально в легочную ткань (например легкое) субъекта с использованием любого подходящего способа. Например, агент может быть введен локально в легочную ткань путем ингаляции или интраназального введения. Для ингаляции или интраназального введения антагонист 1Ь-1К1 может быть введен с использованием распылителя, ингалятора, пульверизатора, аэрозоля, туманообразователя, сухого порошкового ингалятора, дозирующего ингалятора, дозирующего распылителя, дозирующего туманообразователя, дозирующего пульверизатора или другого подходящего ингалятора или устройства для интраназальной доставки. Таким образом, в одном из воплощений изобретения предложено устройство для внутрилегочной доставки, содержащее антагонист 1Б-1К.1. В одном из воплощений устройство представляет собой ингалятор или устройство для интраназальной доставки.
Изобретение также относится к устройству для доставки лекарственного средства, содержащему фармацевтическую композицию, антагонист, полипептид или вариабельный домен по изобретению. Например, устройство для доставки лекарственного средства может представлять собой устройство для парентеральной доставки, устройство для внутривенной доставки, устройство для внутримышечной доставки, устройство для интраперитонеальной доставки, устройство для трансдермальной доставки, устройство для внутрилегочной доставки, устройство для внутриартериальной доставки, устройство для внутриоболочечной доставки, устройство для внутрисуставной доставки, устройство для подкожной доставки, устройство для интраназальной доставки, устройство для внутривагинальной доставки или устройство для ректальной доставки. В конкретных воплощениях устройство для доставки лекарственного средства выбрано из группы, состоящей из шприца, устройства для трансдермальной доставки, капсулы, таблетки, распылителя, ингалятора, пульверизатора, аэрозоля, туманообразователя, сухого порошкового ингалятора, дозирующего ингалятора, дозирующего распылителя, дозирующего туманообразователя, дозирующего пульверизатора и катетера.
В одном из аспектов в изобретении предложен препарат для перорального введения, содержащий антагонист 1Ь-1К4. Препарат может представлять собой таблетку, пилюлю, капсулу, жидкость или сироп.
В одном из воплощений изобретения предложена легочная композиция для доставки в легкое, содержащая антагонист, полипептид или вариабельный домен по изобретению с размером частиц в диапазоне менее 5 мкм, например, менее 4,5, 4, 3,5 или 3 мкм (например, когда находится в буфере БриттонаРобинсона, например, при рН от 6,5 до 8,0, например, при рН от 7 до 7,5, например при рН 7 или при рН 7,5).
В одном из воплощений предложены композиции и препараты по изобретению при рН от 6,5 до 8,0, например от 7 до 7,5, например 7 или, например, 7,5.
Вариабельные домены, соответствующие любому аспекту изобретения, могут иметь Тт по меньшей мере 50°С, или по меньшей мере 55°С, или по меньшей мере 60°С, или по меньшей мере 65°С, или по меньшей мере 70°С. Антагонист, применение, способ, композиция, устройство или препарат по изобретению могут включать такой вариабельный домен.
В одном аспекте изобретения полипептиды, вариабельные домены, антагонисты, композиции или препараты по изобретению являются, по существу, стабильными после инкубации (в концентрации полипептида или вариабельного домена 1 мг/мл) при 37-50°С в течение 14 суток в буфере БриттонаРобинсона. В одном из воплощений по меньшей мере 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% полипептида, антагониста или вариабельного домена остается в неагрегированном состоянии после такой инкубации при 37°С. В одном из воплощений по меньшей мере 65, 70, 75, 80, 85, 86,
- 10 018129
87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% полипептида или вариабельного домена остается в мономерном состоянии после такой инкубации при 37°С. В одном из воплощений по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% полипептида, антагониста или вариабельного домена остается в неагрегированном состоянии после такой инкубации при 50°С. В одном из воплощений по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% полипептида или вариабельного домена остается в мономерном состоянии после такой инкубации при 50°С. В одном из воплощений никакой агрегации полипептидов, вариабельных доменов, антагонистов не наблюдается после любой из таких инкубации. В одном из воплощений р1 полипептида или вариабельного домена остается неизменной или, по существу, неизменной после инкубации при 37°С в концентрации полипептида или вариабельного домена 1 мг/мл в буфере Бриттона-Робинсона.
В одном аспекте изобретения полипептиды, вариабельные домены, антагонисты, композиции или препараты по изобретению являются, по существу, стабильными после инкубации (в концентрации полипептида или вариабельного домена 100 мг/мл) при 4°С в течение 7 суток в буфере Бриттона-Робинсона при рН от 7 до 7,5 (например при рН 7 или рН 7,5). В одном из воплощений по меньшей мере 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99 или 99,5% полипептида, антагониста или вариабельного домена остается в неагрегированном состоянии после такой инкубации. В одном из воплощений по меньшей мере 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99 или 99,5% полипептида или вариабельного домена остается в мономерном состоянии после такой инкубации. В одном из воплощений никакой агрегации полипептидов, вариабельных доменов, антагонистов не наблюдается после любой из таких инкубаций.
В одном аспекте изобретения полипептиды, вариабельные домены, антагонисты, композиции или препараты по изобретению являются, по существу, стабильными после распыления (в концентрации полипептида или вариабельного домена 40 мг/мл), например при комнатной температуре, 20 или 37°С, в течение 1 ч, например в струйном небулайзере, например колпачке Рап ЬС+. В одном из воплощений по меньшей мере 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99 или 99,5% полипептида, антагониста или вариабельного домена остается в неагрегированном состоянии после такого распыления. В одном из воплощений по меньшей мере 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99 или 99,5% полипептида или вариабельного домена остается в мономерном состоянии после такого распыления. В одном из воплощений никакой агрегации полипептидов, вариабельных доменов, антагонистов не наблюдается после любого такого распыления.
Вариабельный домен по изобретению в одном из воплощений ингибирует 1Ь-1-индуцированное высвобождение интерлейкина-8 клетками МКС-5 (АТСС № ССЬ-171) в анализе ίη νίΐτο с ΝΏ50 (средняя нейтрализующая доза), которая составляет не более 1 мкМ. В одном из воплощений вариабельный домен дополнительно или альтернативно ингибирует связывание 1Ь-1 с 1Б-1К1 с 1С50, которая составляет не более 1 мкМ. В одном из воплощений вариабельный домен дополнительно или альтернативно ингибирует 1Ь-1-индуцированное высвобождение интерлейкина-6 в анализе цельной крови с ΝΏ50, которая составляет не более 1 мкМ. Антагонист, применение, способ, устройство или композиция по изобретению могут содержать такой вариабельный домен.
Существуют модельные системы на животных, которые могут быть использованы для скрининга эффективности антагонистов 1Б-1К1 в предупреждении, подавлении или лечении воспаления легких или респираторного заболевания. Например, подходящие животные модели респираторного заболевания включают модели хронического обструктивного респираторного заболевания (см. СгопеЬегд, ΌΑ е1 а1., КекрйаЮгу Кекеагсй 5:18 (2004)) и модели астмы (см. Сойтап е1 а1., 1. Ехр. Мей. 201(12):1875-1879 (2001). Предпочтительно антагонист 1Б-1К1 эффективен в мышиной модели хронического обструктивного респираторного заболевания, индуцированного табачным дымом (например раскрытой в данной заявке субхронической модели) или подходящей модели астмы или хронического обструктивного респираторного заболевания у приматов. Более предпочтительно антагонист 1Б-1К1 эффективен в мышиной модели хронического обструктивного респираторного заболевания, индуцированного табачным дымом (например раскрытой в данной заявке субхронической модели) (см. также Агщ1И апй Сйигд, СйекГ, 122:301-306 (2002)). Например, введение эффективного количества лиганда может уменьшать, замедлять или предотвращать появление симптомов СОРЭ в модели по сравнению с соответствующим контролем. Дополнительную подробную информацию об анализах и моделях применения в оценке антагонистов и вариабельных доменов по настоящему изобретению см. АО 2006059108, описание которой включено в данную заявку посредством ссылки.
Антагонисты 1Б-1К1 могут быть использованы в виде отдельно вводимых композиций или в сочетании с другими агентами. Эти агенты могут включать различные лекарственные средства, такие как ингибиторы фосфодиэстеразы (например ингибиторы фосфодиэстеразы 4), бронхолитические средства (например бета 2-агонисты, антихолинергические средства, теофиллин), бета-агонисты кратковременного действия (например альбутерол, сальбутамол, бамбутерол, фенотерол, изоэтерин, изопротеренол, левалбутерол, метапротеренол, пирбутерол, тербуталин и торнлат), бета-агонисты длительного действия (например формотерол и сальметерол), антихолинергические агенты кратковременного действия (на
- 11 018129 пример ипратропия бромид и окситропия бромид), антихолинергические агенты длительного действия (например тиотропий), теофиллин (например препарат кратковременного действия, препарат длительного действия), ингалируемые стероиды (например беклометазон, будезонид, флунизолид, флутиказона пропионат и триамцинолон), стероиды для перорального введения (например метилпреднизолон, преднизолон, преднизолон и преднизон), комбинации бета-агонистов кратковременного действия с антихолинергическими агентами (например альбутерол/сальбутамол/ипратропий и фенотерол/ипратропий), комбинации бета-агонистов длительного действия с ингалируемыми стероидами (например сальметерол/флутиказон и формотерол/будезонид) и муколитические агенты (например эрдостеин, ацетилцистеин, бромгексин, карбоцистеин, гвайфенезин и йодированный глицерин), циклоспорин, антибиотики, противовирусные средства, метотрексат, адриамицин, цисплатин и иммунотоксины.
Композиции, содержащие антагонист 1Ь-1К.1 или его коктейль, могут быть введены для профилактического и/или терапевтического лечения. В некоторых терапевтических применениях количество, достаточное для достижения, по меньшей мере, частичного ингибирования, подавления, модуляции, килинга или какого-либо другого измеряемого параметра популяции селектированных клеток определяют как терапевтически эффективную дозу или фармацевтически эффективную дозу. Например, для лечения воспаления легких и/или респираторного заболевания может быть введено количество, ингибирующее образование мокроты, количество, ингибирующее воспаление при бронхиальной биопсии, количество, ингибирующее одышку, количество, увеличивающее объем форсированного выдоха в секунду (РЕУ (1)), количество, улучшающее состояние здоровья, определенные в соответствующем опроснике, таком как опросник госпиталя Св. Георгия (81. Сеотде'к КекрпаЮту Оисйюппайе) (например улучшение оценки на 4 пункта).
Количества, необходимые для достижения этих эффектов, зависят от тяжести заболевания и общего состояния иммунной системы пациента, но обычно варьируют от 0,005 до 10,0 мг антагониста 1Ь-1К1 на килограмм массы тела, причем обычно используют дозы от 0,05 до 2,0 мг/кг/дозу.
Для профилактических применений композиции, содержащие антагонист 1Ь-1К1 или его коктейли, также могут быть введены в похожих или несколько меньших дозах для предупреждения, ингибирования или замедления начала заболевания (например для поддержания ремиссии или состояния покоя, или для предотвращения острой фазы). Опытный врач-клиницист способен определить подходящий интервал дозирования для лечения, подавления или предупреждения заболевания. Когда антагонист 1Ь-1К1 вводят для лечения, подавления или предупреждения воспаления легких или респираторного заболевания, он может быть введен до четырех раз в сутки, два раза в неделю, один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в месяц, или один раз в два месяца, в дозе, например, от примерно 10 до примерно 80 мг/кг, от примерно 100 до примерно 80 мг/кг, от примерно 1 до примерно 80 мг/кг, от примерно 1 до примерно 70 мг/кг, от примерно 1 до примерно 60 мг/кг, от примерно 1 до примерно 50 мг/кг, от примерно 1 до примерно 40 мг/кг, от примерно 1 до примерно 30 мг/кг, от примерно 1 до примерно 20 мг/кг, от примерно 1 до примерно 10 мг/кг, от примерно 10 до примерно 10 мг/кг, от примерно 10 до примерно 5 мг/кг, от примерно 10 мкг/кг до примерно 2,5 мг/кг, примерно 1 мг/кг, примерно 2 мг/кг, примерно 3 мг/кг, примерно 4 мг/кг, примерно 5 мг/кг, примерно 6 мг/кг, примерно 7 мг/кг, примерно 8 мг/кг, примерно 9 мг/кг или примерно 10 мг/кг. В конкретных воплощениях антагонист 1Ь-ТК1 вводят для лечения, подавления или предупреждения воспаления легких или респираторного заболевания каждые сутки, каждые двое суток, один раз в неделю, один раз в две недели или один раз в месяц в дозе от примерно 10 мкг/кг до примерно 10 мг/кг (например примерно 10 мкг/кг, примерно 100 мкг/кг, примерно 1 мг/кг, примерно 2 мг/кг, примерно 3 мг/кг, примерно 4 мг/кг, примерно 5 мг/кг, примерно 6 мг/кг, примерно 7 мг/кг, примерно 8 мг/кг, примерно 9 мг/кг или примерно 10 мг/кг). Антагонист 1Ь-ТК1 можно вводить также для лечения, подавления или предупреждения воспаления легких или респираторного заболевания в суточной дозе или стандартной дозе примерно 10 мг, примерно 9 мг, примерно 8 мг, примерно 7 мг, примерно 6 мг, примерно 5 мг, примерно 4 мг, примерно 3 мг, примерно 2 мг или примерно 1 мг.
Описанные в данной заявке лечение или терапия, проводимые с использованием антагониста 1Ь1К1, рассматривают как эффективные, например фармацевтически эффективные, если один или более чем один симптом уменьшается (например, по меньшей мере на 10% или по меньшей мере на одну точку по шкале клинической оценки) по сравнению с такими симптомами, присутствующими до лечения, или по сравнению с такими симптомами у индивидуума (человека или животной модели), которого не лечили с помощью такой композиции, или другого подходящего контроля. Симптомы будут варьировать в зависимости от предполагаемого заболевания или расстройства, но могут быть измерены средним специалистом-клиницистом или специалистом среднего звена в данной области техники. Такие симптомы могут быть измерены, например посредством мониторинга одного или более физических показателей заболевания или расстройства (например клеточного инфильтрата в легочной ткани, продукции слизи, клеточного инфильтрата в слизи, одышки, переносимости физической нагрузки, спирометрии (например форсированной жизненной емкости легких (РУС), форсированного объема выдоха в одну секунду (РЕУ (1), РЕУ (1)/РУС), степени или тяжести обострения заболевания, или с помощью приемлемой шкалы клинической оценки, например опросника госпиталя Св. Георгия. Подходящие шкалы клинической оценки включают, например, оценку степени обструкции потока воздуха в соответствии с РЕУ (1) (СНш
- 12 018129 са1 Сшбе1ше 12, СЬгошс ОЬПгисЙуе ВекртаЮту бщеаке, Мападетеп! οί Сйгошс ОЬПгисЙуе Ри1топагу Όίкеаке ш Аби118 ш Рптагу апб 8есопбагу Саге, №1бопа1 1п8Йи1е Гог СНшса1 Ехсе11епсе, Ьопбоп (2004)), максимальную скорость выдоха (РЕЕ) (Βτίΐίδ! Сшбейпе оп 111е Мападетеп! оГ Аййта, Βτίίίδ! Тйогасю 8ос1е!у, 8соШ511 1п1етсо11ед1а1е Сшбейпек №1\\огк. Веущеб ЕбШоп (2004)), стадию СОРЭ в соответствии со стандартом Американского торакального общества (Атепсап Тйотасю 8ос1е1у) (АТ8) (Ат. 1. Векрп. Сп1. Саге Меб., 152:877-8120 (1995), класс астматического нарушения в соответствии со стандартом АТ8 (Ат. Веу. Векри·. Όίδ., 147:1056-1061 (1993), или другую приемлемую шкалу клинической оценки, известную в данной области техники. Длительное (например в течение одних суток или больше, предпочтительно более длительное) уменьшение симптомов заболевания или расстройства по меньшей мере на 10% или на одну или более точек на заданной клинической шкале является показателем эффективного лечения. Аналогично, профилактика, осуществляемая с использованием описанной в данной заявке композиции, является эффективной, если начало или тяжесть одного или более симптомов замедляется, уменьшается или прекращается по сравнению с такими симптомами у аналогичного индивидуума (человека или модельного животного), которого не лечили с помощью данной композиции.
Композиция, содержащая антагонист 1Ь-1В1 по настоящему изобретению, может быть использована в профилактических и терапевтических схемах для того, чтобы способствовать изменению, инактивации, килингу или удалению выбранной целевой популяции клеток у млекопитающего. Например, такая композиция может быть использована для уменьшения уровней воспалительных клеток в легком и/или ингибирования клеточной инфильтрации легкого.
В одном из аспектов в изобретении предложена выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен по любому из аспектов изобретения, или кодирующая полипептид, антагонист или вариабельный домен по любому из аспектов изобретения. В одном из аспектов в изобретении предложен вектор, содержащий нуклеиновую кислоту. В одном из аспектов в изобретении предложена клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту или вектор. В одном из аспектов в изобретении предложен способ получения полипептида, содержащего иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, включающий поддержание клетки-хозяина в условиях, подходящих для экспрессии указанной нуклеиновой кислоты или вектора, посредством чего получают полипептид, содержащий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен. Способ может дополнительно включать выделение полипептида, вариабельного домена или антагониста и, возможно, получение варианта, например мутантного варианта, обладающего улучшенной аффинностью и/или ΝΌ50 по сравнению с выделенным полипептидом, вариабельным доменом или антагонистом. В данной области техники известны способы улучшения аффинности связывания иммуноглобулинового единичного вариабельного домена, например способы созревания аффинности.
В одном из аспектов в изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, полипептид или антагонист по любому из аспектов изобретения и фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель.
В одном из воплощений иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен или антагонист по любому из аспектов изобретения содержит константный домен антитела, например Ес антитела, возможно, где Ν-конец Ес связан (возможно непосредственно связан) с С-концом вариабельного домена.
Полипептид или вариабельный домен по изобретению может быть выделенным и/или рекомбинантным.
В данной заявке описан способ селекции протеазоустойчивого пептида или полипептида. Способ включает получение репертуара пептидов или полипептидов, объединение репертуара и протеазы в условиях, подходящих для протеазной активности, и извлечение пептида или полипептида, обладающего желаемой биологической активностью (например специфическим связыванием с 1Ь-1В1), посредством чего селектируют протеазоустойчивый пептид или полипептид.
Репертуар и протеазу, как правило, инкубируют в течение периода по меньшей мере примерно 30 мин. В данном способе может быть использована любая желаемая протеаза, такая как одна или более из следующих: сериновая протеаза, цистеиновая протеаза, аспартатные протеазы, тиоловые протеазы, матриксная металлопротеаза, карбоксипептидаза (например карбоксипептидаза А, карбоксипептидаза В), трипсин, химотрипсин, пепсин, папаин, эластаза, лейкозим, панкреатин, тромбин, плазмин, катепсины (например катепсин С), протеиназа (например протеиназа 1, протеиназа 2, протеиназа 3), термолизин, химозин, энтеропептидаза, каспаза (например каспаза 1, каспаза 2, каспаза 4, каспаза 5, каспаза 9, каспаза 12, каспаза 13), кальпаин, фикаин, клострипаин, актинидаин, бромелаин и сепараза. В конкретных воплощениях протеаза представляет собой трипсин, эластазу или лейкозим. Протеаза также может быть получена из биологического экстракта, биологического гомогената или биологического препарата. Если желательно, способ дополнительно включает добавление ингибитора протеазы к данной комбинации репертуара и протеазы после завершения инкубации.
В некоторых воплощениях пептид или полипептид, который имеет желаемую биологическую активность, извлекают на основании связывающей активности. Например, пептид или полипептид может быть извлечен на основании связывания с типичным лигандом, таким как белок А, белок С или белок Ь. Связывающая активность также может представлять собой специфическое связывание с целевым лиган
- 13 018129 дом. Типичные целевые лиганды включают АроЕ (аполипопротеин Е), Аро-8АА (Аро-сывороточный амилоид А-1), ΒΌΝΕ (нейротрофический фактор головного мозга), кардиотрофин-1, СЕА (карциноэмбриональный антиген), СЭ40 (кластер дифференцировки 40), лиганд СЭ40. СЭ56, СЭ38. СЭ138. ЕСЕ (эпидермальный фактор роста), рецептор ЕСЕ, ΕΝΑ-78 (эпителиальный нейтрофил-активирующий пептид-78), эотаксин, эотаксин-2, экзодус-2, ЕАРа (белок активации фибробластов α), кислый ЕСЕ (фактор роста фибробластов), основный ЕСЕ, фактор роста фибробластов-10, лиганд ЕЬТЗ (Ешз-подобной тирозинкиназы-3), фракталкин (СХЗС), СОА (глиальный нейротрофический фактор), С-С8Е (колониестимулирующий фактор гранулоцитов), СМ-С8Е (колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов), СЕ-βΙ (фактор роста β1), человеческий сывороточный альбумин, инсулин, ΙΡΝ-γ (интерферон-γ), 1СЕ-1 (инсулиноподобный фактор роста I), 1СЕ-11, 1Ь-1а (интерлейкин-1а), ΙΕ-1β, рецептор 1Ь-1, рецептор 1Ь-1 типа 1, Ш-2, 1Ь-3, 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-6, 1Ь-7, 1Ь-8 (72 а.к.), 1Ь-8 (77 а.к.), 1Ь-9, 1Ь-10, 1Ь-11, 1Ь-12, 1Ь13, 1Ь-15, 1Ь-16, 1Ь-17, 1Ь-18 (1С1Е (интерферон^-индуцирующий фактор)), ингибин α, ингибин β, ΙΡ-10 (интерферон-индуцибельный белок 10), фактор роста кератиноцитов-2 (КСЕ-2), КСЕ, лептин, ЫЕ (лейкоз-ингибирующий фактор), лимфотактин, вещество, ингибирующее мюллеровы протоки, фактор, ингибирующий колониеобразование моноцитов, белок-аттрактант моноцитов, М-С8Е (колониестимулирующий фактор макрофагов), МЭС (макрофагальный хемокин) (67 а.к.), МЭС (69 а.к.), МСР-1 (моноцитарный хемотаксический фактор-1) (МСАЕ (моноцитарный хемотаксический и активирующий фактор)), МСР-2, МСР-3, МСР-4, МЭС (67 а.к.), МЭС (69 а.к.), М1С (монокин, индуцируемый ΙΕΝγ), М1Р-1а (макрофагальный белок воспаления 1α), М1Р-1 β, М1Р-3а, М1Р-3в, М1Р-4, фактор-1, ингибирующий миелоидные предшественники (МР1Е-1), NΑΡ-2 (нейтрофил-активирующий белок-2), нейртурин, фактор роста нервов АСЕ), β-ΝΟΕ, ΝΤ-3 (нейротрофин-3), ΝΤ-4, онкостатин М, РЭСЕ-АА (тромбоцитарный фактор роста-АА), РЭСЕ-АВ, РЭСЕ-ВВ, РЕ-4 (тромбоцитарный фактор 4), КАЫТЕ8 (цитокин, экспрессируемый и секретируемый нормальными Т-клетками при активации), 8ΌΡ1α (фактор-1а стромальных клеток), 8ΌΡ1β, 8СР, 8ССР (фактор роста стволовых клеток), фактор стволовых клеток (8СР), ТАКС (хемокин, регулируемый тимусом и при активации), ТСЕ-α (трансформирующий фактор роста α), ТСЕ-β, ΤСР-β2, ΤСР-β3, фактор некроза опухолей (ЮТ), 'ТЫЕ^, ЮТ-β, рецептор I Т№, рецептор II Т№, ТХШ-Е ТРО (тромбопоэтин), УЕСЕ (фактор роста сосудистого эндотелия), УЕСЕ А, УЕСЕ В, УЕСЕ С, УЕСЕ Ό, рецептор 1 УЕСЕ, рецептор 2 УЕСЕ, рецептор 3 УЕСЕ, ССР-2 (гранулоцитарный хемотаксический фактор2), СКО/МС8А (регулирующий рост онкоген/фактор, стимулирующий рост меланомы), СКО-β, СКО-γ, НСС1 (гемофильтратный СС-хемокин 1), 1-309, НЕК 1, НЕК 2, НЕК 3, НЕК 4, сывороточный альбумин, у\УЕ (фактор (фон) Виллебранда), амилоидные белки (например альфа-амилоид), ММР12 (матриксная металлопротеаза 12), РЭК1 (ΡI3К(фосфатидилинозит-3-киназа)-зависимая киназа 1), !дЕ (иммуноглобулин Е), I^-13Кα1, Ш-13Ка2, Ш-15, Ш-15К, Ш-16, Ш-17К, Ш-17, Ш-18, Ш-18К, Ш-23, Ш-23К, Ш-25, СЭ2, СЭ4, СО11а, СО23, СП25, СП27, СП28, СП30, СП40, СП40Ь, СП56, СП138, АЬК5 (активиновый рецептор-подобная киназа 5), ЕСЕК (рецептор эпидермального фактора роста), ЕсЕК1 (высокоаффинный рецептор для ^Е), ТСЕЬ, ССЬ2 (хемокиновый лиганд-2 с СС-мотивом), ССЬ18, СЕА, СК8 (цитокинотвечающие (СК) гены), СТСЕ (фактор роста соединительной ткани), СХСЬ12 (хемокиновый лиганд-12 с СХС-мотивом) (8ОЕ-1), химазу, ЕСЕ, фурин, эндотелин-1, эотаксины (например эотаксин, эотаксин-2, эотаксин-3), СМ-С8Е, ШАМ-1 (фактор межклеточной адгезии 1), Ш'О8 (индуцибельный Т-клеточный костимулятор), ^Е, ΖΗΝα, Е309, интегрины, Ь-селектин, МГЕ (фактор, ингибирующий миграцию макрофагов), МШ4, МОС, МСР-1, ММР, эластазу нейтрофилов, остеопонтин, ОХ-40, РАКС (легочный хемокин, регулируемый активацией), РЭ-1 (рецептор апоптоза 1), КАЫТЕ8, 8СЕ, 80Е-Е ыд1ес8 (связывающий сиаловую кислоту иммуноглобулиноподобный лектин 8), ТАКС, ТСЕЬ, тромбин, Т1Ш-1 (семейство и муциновых доменов, член 1), ТНЕ, ΤКΑNСΕ (индуцирующий ТОТ-ассоциированную активацию цитокин), триптазу, УЕСЕ, УБА-4 (очень поздний антиген-4), УСАМ (молекула адгезии сосудистых клеток), α4β7, ССК2 (хемокиновый рецептор-2 с СС-мотивом), ССК3, ССК4, ССК5, ССК7, ССК8, альфаубета6, альфаубета8, сМЕТ, СЭ8, уШЕ, амилоидные белки (например альфа-амилоид), ММР12, РЭК1 и
В конкретных воплощениях пептид или полипептид извлекают посредством пэннинга.
В некоторых воплощениях репертуар включает дисплейную систему. Например, дисплейная система может представлять собой бактериофаговый дисплей, рибосомный дисплей, компартментализацию и дисплей с использованием эмульсии, дрожжевой дисплей, пуромициновый дисплей, бактериальный дисплей, плазмидный дисплей или ковалентный дисплей (соуа1еи! б18р1ау). Примерные дисплейные системы связывают кодирующую функцию нуклеиновой кислоты и функциональные характеристики пептида или полипептида, кодируемого данной нуклеиновой кислотой. В конкретных воплощениях дисплейная система содержит реплицируемые генетические комплексы (депейс раскадек).
В некоторых воплощениях дисплейная система представляет собой бактериофаговый дисплей. Например, бактериофагом может быть Гб, М13, лямбда, М82 или Т7. В конкретных воплощениях бактериофаг-дисплейная система является поливалентной. В некоторых воплощениях пептид или полипептид экспонируется в виде слитого белка рШ.
В других воплощениях способ дополнительно включает амплификацию нуклеиновой кислоты, ко
- 14 018129 дирующей пептид или полипептид, который имеет желаемую биологическую активность. В конкретных воплощениях нуклеиновую кислоту амплифицируют посредством амплификации фагов, роста клеток или полимеразной цепной реакции.
В некоторых воплощениях репертуар представляет собой репертуар иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов. В конкретных воплощениях иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи. В более конкретных воплощениях вариабельный домен тяжелой цепи представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи человека. В других воплощениях иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой вариабельный домен легкой цепи. В конкретных воплощениях вариабельный домен легкой цепи представляет собой вариабельный домен легкой цепи человека.
В другом аспекте изобретение относится к способу селекции пептида или полипептида, который связывает с высокой аффинностью целевой лиганд (например 1Ь-1К1) из репертуара пептидов или полипептидов. Способ включает получение репертуара пептидов или полипептидов, объединение этого репертуара и протеазы в условиях, подходящих для протеазной активности, и извлечение пептида или полипептида, который связывается с целевым лигандом.
Репертуар и протеазу обычно инкубируют в течение по меньшей мере примерно 30 мин. В данном способе может быть использована любая желаемая протеаза, такая как одна или более чем одна из следующих: сериновая протеаза, цистеиновая протеаза, аспартатные протеазы, тиоловые протеазы, матриксная металлопротеаза, карбоксипептидаза (например карбоксипептидаза А, карбоксипептидаза В), трипсин, химотрипсин, пепсин, папаин, эластаза, лейкозим, панкреатин, тромбин, плазмин, катепсины (например катепсин 6), протеиназа (например протеиназа 1, протеиназа 2, протеиназа 3), термолизин, химозин, энтеропептидаза, каспаза (например каспаза 1, каспаза 2, каспаза 4, каспаза 5, каспаза 9, каспаза 12, каспаза 13), кальпаин, фикаин, клострипаин, актинидаин, бромелаин и сепараза. В конкретных воплощениях протеаза представляет собой трипсин, эластазу или лейкозим. Протеаза также может быть получена из биологического экстракта, биологического гомогената или биологического препарата, например цельных клеток ίη νίΐτο. Если желательно, способ дополнительно включает добавление ингибитора протеазы к данной комбинации репертуара и протеазы после завершения инкубации.
Пептид или полипептид может быть извлечен на основании связывания с любым желаемым целевым лигандом, таким как целевые лиганды (например 1Ь-1В1), описанные в данной заявке. В конкретных воплощениях пептид или полипептид извлекают посредством пэннинга.
В некоторых воплощениях репертуар включает дисплейную систему. Например, дисплейная система может представлять собой бактериофаговый дисплей, рибосомный дисплей, компартментализацию и дисплей с использованием эмульсии, дрожжевой дисплей, пуромициновый дисплей, бактериальный дисплей, плазмидный дисплей или ковалентный дисплей. Примерные дисплейные системы связывают кодирующую функцию нуклеиновой кислоты и функциональные характеристики пептида или полипептида, кодируемого данной нуклеиновой кислотой. В конкретных воплощениях дисплейная система содержит реплицируемые генетические комплексы.
В некоторых воплощениях дисплейная система представляет собой бактериофаговый дисплей. Например, бактериофаг может представлять собой ίά, Μ13, лямбда, Μ82 или Т7. В конкретных воплощениях бактериофаг-дисплейная система является поливалентной. В некоторых воплощениях пептид или полипептид экспонируется в виде слитого белка ρΙΙΙ.
В других воплощениях способ дополнительно включает амплификацию нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид или полипептид, который имеет желаемую биологическую активность. В конкретных воплощениях нуклеиновую кислоту амплифицируют посредством амплификации фагов, роста клеток или полимеразной цепной реакции.
В некоторых воплощениях репертуар представляет собой репертуар иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов. В конкретных воплощениях иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи. В более конкретных воплощениях вариабельный домен тяжелой цепи представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи человека. В других воплощениях иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой вариабельный домен легкой цепи. В конкретных воплощениях вариабельный домен легкой цепи представляет собой вариабельный домен легкой цепи человека.
В другом аспекте в данной заявке описан способ получения репертуара протеазоустойчивых пептидов или полипептидов. Способ включает получение репертуара пептидов или полипептидов, объединение репертуара пептидов или полипептидов и протеазы в условиях, подходящих для протеазной активности, и извлечение множества пептидов или полипептидов, которые имеют желаемую биологическую активность, посредством чего получают репертуар протеазоустойчивых пептидов или полипептидов.
В некоторых воплощениях репертуар и протеазу инкубируют в течение по меньшей мере примерно 30 мин. Например, протеаза, используемая в данном способе, может представлять собой одно или более чем одно из следующего: сериновую протеазу, цистеиновую протеазу, аспартатные протеазы, тиоловые протеазы, матриксную металлопротеазу, карбоксипептидазу (например карбоксипептидазу А, карбоксипептидазу В), трипсин, химотрипсин, пепсин, папаин, эластазу, лейкозим, панкреатин, тромбин, плазмин,
- 15 018129 катепсины (например катепсин С), протеиназу (например протеиназу 1, протеиназу 2, протеиназу 3), термолизин, химозин, энтеропептидазу, каспазу (например каспазу 1, каспазу 2, каспазу 4, каспазу 5, каспазу 9, каспазу 12, каспазу 13), кальпаин, фикаин, клострипаин, актинидаин, бромелаин и сепаразу. В конкретных воплощениях протеазой является трипсин, эластаза или лейкозим. Протеаза также может быть получена из биологического экстракта, биологического гомогената или биологического препарата. Если желательно, способ дополнительно включает добавление ингибитора протеазы к данной комбинации репертуара и протеазы после завершения инкубации.
В некоторых воплощениях множество пептидов или полипептидов, которые имеют желаемую биологическую активность, извлекают на основании связывающей активности. Например, множество пептидов или полипептидов может быть извлечено на основании связывания с типичным лигандом, таким как белок А, белок С или белок Ь. Связывающая активность также может относиться к специфическому связыванию с целевым лигандом, таким как целевой лиганд, описанный в данном изобретении. В конкретных воплощениях множество пептидов или полипептидов, которые имеют желаемую биологическую активность, извлекают посредством пэннинга.
В некоторых воплощениях репертуар включает дисплейную систему. Например, дисплейная система может представлять собой бактериофаговый дисплей, рибосомный дисплей, компартментализацию и дисплей с использованием эмульсии, дрожжевой дисплей, пуромициновый дисплей, бактериальный дисплей, плазмидный дисплей или ковалентный дисплей. В конкретных воплощениях дисплейная система связывает кодирующую функцию и функциональные характеристики пептида или полипептида, кодируемого данной нуклеиновой кислотой. В конкретных воплощениях дисплейная система содержит реплицируемые генетические комплексы.
В некоторых воплощениях дисплейная система представляет собой бактериофаговый дисплей. Например, бактериофаг может представлять собой Гб. М13, лямбда, М82 или Т7. В конкретных воплощениях бактериофаг-дисплейная система является поливалентной. В некоторых воплощениях пептид или полипептид экспонируется в виде слитого белка ρΙΙΙ.
В других воплощениях способ дополнительно включает амплификацию нуклеиновых кислот, кодирующих множество пептидов или полипептидов, которые имеют желаемую биологическую активность. В конкретных воплощениях нуклеиновые кислоты амплифицируют посредством амплификации фагов, роста клеток или полимеразной цепной реакции.
В некоторых воплощениях репертуар представляет собой репертуар иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов. В конкретных воплощениях иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи. В более конкретных воплощениях вариабельный домен тяжелой цепи представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи человека. В других воплощениях иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой вариабельный домен легкой цепи. В конкретных воплощениях вариабельный домен легкой цепи представляет собой вариабельный домен легкой цепи человека.
В другом аспекте изобретение относится к способу селекции протеазоустойчивого полипептида, содержащего иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен (бАЬ), который связывается с целевым лигандом (например 1Ь-1К.1) из репертуара. В одном из воплощений способ включает получение фаг-дисплейной системы, содержащей репертуар полипептидов, которые содержат иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, объединение данной фаг-дисплейной системы и протеазы, выбранной из группы, состоящей из эластазы, лейкозима и трипсина, в условиях, подходящих для протеазной активности, и извлечение фага, который экспонирует полипептид, содержащий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, который связывается с целевым лигандом.
В некоторых воплощениях протеазу используют в концентрации 100 мкг/мл и объединенные фагдисплейную систему и протеазу инкубируют при примерно 37°С в течение ночи.
В некоторых воплощениях фаг, который экспонирует полипептид, содержащий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, который связывается с целевым лигандом, извлекают посредством связывания с указанной мишенью. В других воплощениях фаг, который экспонирует полипептид, содержащий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, который связывается с целевым лигандом, извлекают посредством пэннинга.
Также описан выделенный протеазоустойчивый пептид или полипептид, селектируемый или селектированный способами, описанными в данной заявке. В конкретном воплощении предложен выделенный, устойчивый к протеазам (например трипсину, эластазе, лейкозиму) иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен (например вариабельный домен тяжелой цепи антитела человека, вариабельный домен легкой цепи антитела человека), селектируемый или селектированный способами, описанными в данной заявке.
В данной заявке также описана выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, которая кодирует протеазоустойчивый пептид или полипептид (например трипсин-, эластаза- или лейкозимустойчивый иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен), селектируемый или селектированный способами, описанными в данной заявке, и векторы (например экспрессирующие векторы) и клеткихозяева, которые содержат данные нуклеиновые кислоты.
- 16 018129
В данной заявке также описан способ получения протеазоустойчивого пептида или полипептида (например трипсин-, эластаза- или лейкозим-устойчивого иммуноглобулинового единичного вариабельного домена), селектируемого или селектированного способами, описанными в данной заявке, включающий поддержание клетки-хозяина, которая содержит рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую протеазоустойчивый пептид или полипептид, в условиях, подходящих для экспрессии, в результате чего продуцируется протеазоустойчивый пептид или полипептид.
В данной заявке также описан протеазоустойчивый пептид или полипептид (например трипсин-, эластаза- или лейкозим-устойчивый иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен), селектируемый или селектированный способами, описанными в данной заявке, для применения в медицине (например для терапии или диагностики). В данной заявке также описано применение протеазоустойчивого пептида или полипептида (например трипсин-, эластаза- или лейкозим-устойчивого иммуноглобулинового единичного вариабельного домена), селектируемого или селектированного способами, описанными в данной заявке, для изготовления лекарственного средства для лечения заболевания. В данной заявке также описан способ лечения заболевания, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества протеазоустойчивого пептида или полипептида (например трипсин-, эластазаили лейкозим-устойчивого иммуноглобулинового единичного вариабельного домена), селектируемого или селектированного способами, описанными в данной заявке.
В данной заявке дополнительно описан диагностический набор для определения того, присутствует ли в образце 1Ь-1К1 или как много 1Ь-ГК1 присутствует в образце, включающий полипептид, ЗАЬ или антагонист по изобретению и инструкции по применению (например для определения присутствия и/или количества 1Ь-ГК1 в образце). В некоторых воплощениях набор дополнительно включает один или более чем один вспомогательный реагент, такой как подходящий буфер или подходящий детектирующий реагент (например детектируемое меченое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, связывающий полипептид или ЗАЬ по изобретению, или группировку, ассоциирующуюся или конъюгированную с ним).
Изобретение также относится к устройству, содержащему твердую поверхность, на которой иммобилизован полипептид или ЗАЬ по изобретению таким образом, что иммобилизованный полипептид или ЗАЬ связывается с 1Ь-ГК1. Могут быть использованы любые подходящие твердые поверхности, на которых могут быть иммобилизованы антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, например стекло, пластик, углеводороды (например агарозные гранулы). Если желательно, то подложка может содержать или может быть модифицирована с получением желаемых функциональных групп для облегчения иммобилизации. Устройство и/или подложка могут иметь любую подходящую форму, например форму листа, стержня, ленты, пластины, предметного стекла, шарика, гранулы, диска, геля, пробирки, сферы, чипа, планшета или чашки и т.п. В некоторых воплощениях устройство представляет собой тест-полоску.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1 представляет собой иллюстрацию сайта множественного клонирования ρΌΟΜ13 (также известного как ρΌΟΜ33), который использовали для получения фаг-дисплейного репертуара.
На фиг. 2 показаны несколько гелей Νονβχ 10-20% Тисше с образцами ЗАЬ, отобранными в разные моменты времени, которые инкубировали с трипсином в концентрации 40 мкг/мл при 30°С. Образцы отбирали непосредственно перед добавлением трипсина и затем через 1, 3 и 24 ч после добавления трипсина. Белки окрашивали с помощью 1х 8итеВ1ие. Гели иллюстрируют, что и ΌΘΜ15-10, и ΌΘΜ15-26501 оба подвергались значительному перевариванию в течение первых трех часов инкубации с трипсином. Переваривание ΌΘΜ15-26, ΌΘΜ4-130-54 и ΌΟΜ1Γ-131-511 становилось заметным только через 24 ч инкубации с трипсином.
Фиг. 3 представляет собой иллюстрацию аминокислотных последовательностей ΌΟΜ1Γ-131-511 и 24 селектированных вариантов. Аминокислоты в селектированных клонах, которые отличаются от родительской последовательности, указаны (идентичные аминокислоты обозначены точками). Петли, соответствующие СИКЗ (гипервариабельный участок 1), СИКЗ и ί.ΌΒ3. обведены рамками.
Фиг. 4 представляет собой иллюстрацию аминокислотных последовательностей ΌΟΜ4-130-54 и 27 селектированных вариантов. Аминокислоты в селектированных клонах, которые отличаются от родительской последовательности, указаны (идентичные аминокислоты обозначены точками). Петли, соответствующие СЭК1, СИК2 и СИКЗ, обведены рамками.
Фиг. 5 представляет собой иллюстрацию аминокислотной последовательности ΌΟΜ15-26-555 и 21 селектированного варианта. Аминокислоты в селектированных клонах, которые отличаются от родительской последовательности, указаны (идентичные аминокислоты обозначены точками). Петли, соответствующие СЭК1, СИК2 и СИКЗ, обведены рамками.
Фиг. 6 представляет собой иллюстрацию аминокислотной последовательности ΌΟΜ15-10 и 16 селектированных вариантов. Аминокислоты в селектированных клонах, которые отличаются от родительской последовательности, указаны (идентичные аминокислоты обозначены точками). Петли, соответствующие СИКЗ, СИК2 и СИКЗ, обведены рамками.
Фиг. 7Λ-7Ό представляют кривые В1Асоге, показывающие связывание родительского ЗАЬ, ΌΟΜ111131-511 (фиг. 7А), и трех вариантов ЗАЬ, ΌΟΜ1Γ-131-203 (фиг. 7В), ΌΟΜ1Γ-131-204 (фиг. 7С) и ΌΟΜ1Γ
- 17 018129
131-206 (фиг. 7Ό), с иммобилизованным ΤΝΡΚ1 после инкубации с различными концентрациями трипсина (варьирующими от 0 до 100 мкг/мл) в течение ночи при 37°С.
Результаты демонстрируют, что все три варианта более устойчивы, чем родительское антитело, к протеолизу при высоких концентрациях трипсина (100 мкг/мл).
Фиг. 8А-8С представляют кривые В1Асоге, показывающие связывание бАЬ ΌΘΜ16-131-511 (фиг. 8А), ΌΘΜ16-131-202 (фиг. 8В) и ΌΘΜ16-131-206 (фиг. 8С) с иммобилизованным ΤΝΕΒ1 после инкубации с эластазой и лейкозимом в течение ночи. Эти бАЬ продемонстрировали повышенную устойчивость к протеолизу по сравнению с родительским антителом против эластазы и лейкозима.
На фиг. 9 показаны два геля 4-12% №хех В1в-Тпв с образцами бАЬ ΌΘΜ16-131-511, ΌΘΜ16-131203, ΌΘΜ16-131-204, ΌΘΜ16-131-206, ΌΘΜ16-131-54, ΌΘΜ16-131-201 и ΌΘΜ16-131-202 перед инкубацией с трипсином, и образцами после инкубации с 100 мкг/мл трипсина в течение 1, 3 и 24 ч.
Фиг. 10А-10С представляют кривые В1Асоге, показывающие связывание ΌΘΜ4-130-54 (фиг. 10А), ΌΘΜ4-130-201 (фиг. 10В) и ΌΘΜ4-130-202 (фиг. 10С) с иммобилизованным слитым белком Ι6-1Κ1 после инкубации с различными концентрациями трипсина (варьирующими от 0 до 100 мкг/мл) в течение ночи при 37°С. Результаты демонстрируют, что оба варианта более устойчивы, чем родительское антитело, к протеолизу при высоких концентрациях трипсина.
Фиг. 11А-11С представляют кривые В1Асоге, показывающие связывание ΌΘΜ4-130-54 (фиг. 11А), ΌΘΜ4-130-201 (фиг. 11В) и ΌΘΜ4-130-202 (фиг. 11С) с иммобилизованным слитым белком Ι6-1Κ1 после инкубации с эластазой и лейкозимом в течение ночи. Эти бАЬ продемонстрировали повышенную устойчивость к протеолизу по сравнению с родительским антителом против обеих тестируемых протеаз.
Фиг. 12 представляет собой иллюстрацию аминокислотной последовательности ΌΘΜ15-26-555 и 6 вариантов. Аминокислоты, которые отличаются от родительской последовательности, в селектированных клонах указаны (идентичные аминокислоты обозначены точками).
Фиг. 13А и 13В представляют кривые В1Асоге, показывающие связывание родительского бАЬ, ΌΘΜ15-26-555 (фиг. 13А), и наиболее протеазоустойчивого варианта, ΌΘΜ15-26-593 (фиг. 13В), с иммобилизованным УЕСЕ. Родительское антитело и вариант сравнивали на В1Асоге в отношении связывания с бУЕСЕ (УЕСЕ человека) при концентрации бАЬ 100 нМ после инкубации с трипсином в концентрации 200 мкг/мл. Реакцию осуществляли в течение 3 или 24 ч при 37°С. Результаты демонстрируют, что вариант более устойчив, чем родительское антитело, к протеолизу после 24-часовой обработки трипсином.
Фиг. 14 представляет собой график, показывающий влияние обработки трипсином на связывание вариантов ΌΘΜ15-26-555 с бУЕСЕ. Результаты ясно демонстрируют, что все варианты более устойчивы, чем родительское антитело (ΌΘΜ15-26-555), к протеолизу после 24-часовой обработки трипсином.
На фиг. 15 показаны два геля №хех 10-20% Тлсше, на которые наносили по 15 мкг обработанных и необработанных образцов ΌΘΜ15-26-555 или ΌΘΜ15-26-593. Образцы отбирали непосредственно перед добавлением трипсина и затем через 2, 3 и 24 ч после добавления трипсина. Белки окрашивали с помощью 1х 8итеВ1ие. Гели иллюстрируют, что профиль устойчивости к трипсину для ΌΘΜ15-26-593 отличается от профиля, продемонстрированного В1Асоге экспериментом.
Фиг. 16 представляет собой иллюстрацию аминокислотной последовательности ΌΘΜ15-10 и варианта ΌΘΜ15-10-11. Аминокислоты, которые в этом варианте отличаются от родительской последовательности, указаны (идентичные аминокислоты обозначены точками).
Фиг. 17А и 17В представляют кривые В1Асоге, показывающие связывание родительского антитела ΌΘΜ15-10 (фиг. 17А) и варианта ΌΘΜ15-10-11 (фиг. 17В), с иммобилизованным УЕСЕ. Родительское антитело и вариант сравнивали на В1Асоге в отношении связывания с бУЕСЕ при концентрации бАЬ 100 нМ после инкубации с трипсином в концентрации 200 мкг/мл. Реакцию осуществляли в течение 1, 3 и 24 ч при 37°С. Результаты демонстрируют, что вариант более устойчив, чем родительское антитело, к протеолизу после 24-часовой обработки трипсином.
На фиг. 18 показаны два геля Шхех 10-20% Тисте, на которые наносили по 15 мкг образцов ΌΘΜ15-10 и ΌΘΜ15-10-11. Образцы отбирали непосредственно перед добавлением трипсина и затем через 1, 3 и 24 ч после добавления трипсина. Белки окрашивали с помощью 8итеВ1ие (1х). Результаты демонстрируют, что связывающая активность, обнаруженная в В1Асоге исследовании, непосредственно отражает целостность белка.
Фиг. 19А-196 иллюстрируют нуклеотидные последовательности нескольких нуклеиновых кислот, кодирующих бАЬ, которые представляют собой варианты ΌΘΜ16-131-511 или ΌΘΜ4-130-54. Нуклеотидные последовательности кодируют аминокислотные последовательности, представленные соответственно на фиг. 3 и 4.
Фиг. 20А-20Е иллюстрируют нуклеотидные последовательности нескольких нуклеиновых кислот, кодирующих бАЬ, которые представляют собой варианты ΌΘΜ15-26-555 или ΌΘΜ15-10. Нуклеотидные последовательности кодируют аминокислотные последовательности, представленные соответственно на фиг. 5 и 6.
На фиг. 21 показана карта вектора ρΌΘΜ 38.
На фиг. 22 показан гель (ЬаЬсЫр) с белками ΌΘΜ10-53-474 и ΌΘΜ15-26-593, обработанными
- 18 018129 трипсином при соотношении бАЬ:трипсин 25:1 при 30°С в различные моменты времени. Стрелки указывают на полноразмерный белок.
На фиг. 23 представлены кривые гель-фильтрации (8ЕС), демонстрирующие высокий уровень чистоты, полученный для каждого образца после очистки посредством ММС-хроматографии, затем анионного обмена. УФ контролировали при 225 нм и через колонку пропускали 1х РВ8 (забуференный фосфатом физиологический раствор) с 10% этанола (об./об.). Процентное содержание мономера рассчитывали посредством интегрирования площади пика с учетом фона.
На фиг. 24 представлены данные по стабильности к протеазам для ΌΟΜ1Η-131-511, ΌΘΜ1Η-131202 и ΌΘΜ1Η-131-206.
На фиг. 25 представлены результаты 8ЕС, которые иллюстрируют данные по стабильности ΌΘΜ1Η-131-202, ΌΘΜ1Η-131-206 и ΌΟΜ1Η-131-511 в течение 14 суток в буфере Бриттона-Робинсона при 37 и 50°С. Концентрация белка для всех бАЬ составляла 1 мг/мл. 8ЕС использовали для определения того, произошли ли какие-либо изменения в белке во время теплового стресса и в количестве мономера, остающегося в растворе, по сравнению с образцом на момент времени 0 (Т0).
На фиг. 26 А-1 показаны 8ЕС кривые, демонстрирующие влияние теплового стресса (37 и 50°С) на ΩΟΜ111-131-511 (А-С), -202 (Ό-Е) и -206 (С-Ι). Также показан процент мономера, остающегося в растворе, относительно Т=0 в заданный момент времени.
На фиг. 27 показан 1ЕЕ (изоэлектрофокусирование) анализ ΌΘΜ1Η-131-202, ΌΘΜ1Η-131-206 и ΩΟΜ111-131-511 на 24, 48 ч и 7-е и 14-е сутки теплового стресса. Образцы инкубировали либо при 37, либо при 50°С в буфере Бриттона-Робинсона.
Фиг. 28 - КВА (гесерФг Ьтбтд аккау, анализ связывания с рецептором) с ΤΝΕΚ-1, демонстрирующий влияние 14-суточной инкубации ΌΘΜ1Η-131-202, ΌΘΜ1Η-131-206 и ΌΟΜ1Η-131-511 при 50°С. Концентрацию белка считали равной 1 мг/мл. Также показано отрицательное контрольное бАЬ (имитация (битту) Ун), которое не связывалось с антигеном.
На фиг. 29 проиллюстрированы эффекты хранения А: ΌΘΜ1Η-131-202, В: ΌΟΜ1Η-131-206 и С: ΩΟΜ111-131-511 в концентрации примерно 100 мг/мл в течение 7 суток в буфере Бриттона-Робинсона при +4°С. УФ контролировали при 280 нм.
На фиг. 30 показаны данные тестирования ΌΘΜ1Η-131-202, ΌΘΜ1Η-131-206 и ΌΟΜ1Η-131-511 с использованием небулайзеров Рап Е-По\у и ЬС+. Концентрация белка в каждом случае составляла 5 мг/мл в буфере Бриттона-Робинсона.
На фиг. 31 проиллюстрированы относительные процентные изменения концентраций мономера в процессе распыления ΌΘΜ1Η-131-202, ΌΘΜ1Η-131-206 и ΌΟΜ1Η-131-511 в буфере Бриттона-Робинсона при 5 мг/мл.
На фиг. 32 показаны 8ЕС кривые для ΌΘΜ1Η-131-206 и ΌΟΜ1Η-131-511 в буфере БриттонаРобинсона после распыления из Рап ЬС+.
На фиг. 33 показаны 8ЕС кривые для ΌΘΜ1Η-131-206 в процессе распыления в течение 1 ч при 40 мг/мл в РВ8. Белки, находящиеся как в колпачке небулайзера, так и в аэрозоле, обладают высокой устойчивостью к эффектам сдвига и теплового стресса, которым может подвергаться бАЬ при распылении.
На фиг. 34 показаны кривые скорости седиментации для каждого из трех основных белков (ΌΘΜ1Η-131-206, ΌΟΜ1Η-131-511 и ΌΘΜ1Η-131-202). Бимодальный пик, наблюдаемый для образца с более низкой концентрацией, ΌΘΜ1Η-131-206, в этом случае представляет собой артефакт вследствие утечки образца из ячейки.
На фиг. 35 показано влияние буфера и устройства на размер капли при распылении С8К1995056А (ΌΟΜ1Η-131-511).
Фиг. 36 - стабильность С8К1995056А (ΌΟΜ1Η-131-511) после распыления в различных устройствах, оцениваемая по образованию димеров, как измерено с использованием 8ЕС.
На фиг. 37 показаны данные тестирования С8К1922567А (202), С8К1995057А (206) и С8К1995056А (511) с использованием небулайзеров Рап Е-По\у и ЬС+. А) тестирование в буфере Бриттона-Робинсона, В) тестирование в ПЭГ1000/сахарозном буфере.
На фиг. 38 изображена кривая зависимости от дозы ΤΝΕ-α, полученная в анализе связывания с рецептором ΤΝΕΚ1 человека. Каждый образец тестировали в четырех повторах.
На фиг. 39 показано ингибирование посредством С8К1922567А (ΌΘΜ1Η-131-202), С8К1995057А (ΌΘΜ1Η-131-206) и С8К1995056А (ΌΟΜ1Η-131-511) в анализе связывания с рецептором ΤΝΕΚ1 человека. Каждый образец тестировали в четырех повторах.
На фиг. 40 проиллюстрирована эффективность бАЬ ΌΟΜ15-26 и ΌΟΜ15-26-593 в КВА с УЕСЕ.
На фиг. 41 показаны фармакокинетические данные для ΌΜ81529 (ΌΘΜ 15-26-593) и ΌΜ81545 (ΌΘΜ15-26-501) после однократного в/в (внутривенного) введения болюсной дозы крысам в концентрации 5 мг/мг.
На фиг. 42а показан 8ЕС-ΜА^^8 (гель-хроматография/многоугловое лазерное светорассеяние) анализ слитой конструкции ^Μ81529Ес (слитой конструкции ΌΘΜ 15-26-593 Ес), подтверждающий мономерные свойства. Показаны две разные партии, которые демонстрируют похожие свойства в отношении показателя преломления (т.е. концентрации; пунктирные линии) и светорассеяния (сплошные линии).
- 19 018129
Линия, отмеченная стрелкой, показывает расчет молекулярной массы.
На фиг. 42Ь показан АИС (аналитическое ультрацентрифугирование) анализ слитой конструкции ΌΜ81529Ρο (слитой конструкции ΌΟΜ 15-26-593 Рс), подтверждающий мономерные свойства. Одну партию вещества тестировали в трех разных концентрациях, приблизительно равных 0,2, 0,5 и 1,0 мг/мл в РВ8-буфере. Анализ скорости седиментации подтвердил, что молекулярная масса составляет приблизительно 80 кДа.
На фиг. 43 показаны Э8С (дифференциальная сканирующая калориметрия) кривые для ΌΜ81529 (ΌΟΜ15-26-593) и ΌΟΜ15-26-501.
На фиг. 44 представлены данные ЕБ18А (твердофазного иммуноферментного анализа) связывания с УБОР для ΌΜ81529 (ΌΟΜ 15-26-593) до и после 10 циклов замораживания-оттаивания для двух разных партий вещества.
На фиг. 45 показан 8ЕС-профиль устойчивости ΌΟΜ 15-26-593 до и после 10 циклов замораживания-оттаивания.
На фиг. 46 проиллюстрированы результаты ускоренного исследования стабильности для слитой конструкции ΌΜ81529 (слитой конструкции ΌΟΜ 15-26-593 Рс); где связывание в ЕБ18А демонстрирует активность через 7 суток инкубации при показанной температуре.
На фиг. 47А показана стабильность ΌΜ81529 (ΌΟΜ 15-26-593) у яванского макака через 14 и 15 суток инкубации при 37°С.
На фиг. 47В показана стабильность ΌΜ81529 (ΌΟΜ 15-26-593) в сыворотке человека через 14 и 15 суток инкубации при 37°С.
На фиг. 48 показана эффективность бАЬ ΌΟΜ15-26 и ΌΟΜ15-26-593 в виде Рс слияний (ΌΜ81564 и 1529 соответственно) в КВА с УБОР.
На фиг. 49 проиллюстрировано ингибирование пролиферации клеток НИУЕС (эндотелиальные клетки пупочной вены человека) слитой конструкцией ΌΜ81529 (слитой конструкцией ΌΟΜ15-26-593 Рс).
Фиг. 50 - карта вектора рЭот33.
На фиг. 51 изображены последовательности (аминокислотная и нуклеотидная) бАЬ, связывающихся с сывороточным альбумином.
Подробное описание изобретения
Данное изобретение раскрыто в данном описании со ссылкой на воплощения, что делает возможным составление ясного и четкого описания. Предполагается и должно быть очевидным, что данные воплощения можно различным образом комбинировать или разделять без отклонения от сущности изобретения.
Если не указано иное, то все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют такое же значение, которое обычно понимается специалистом в данной области техники (например в клеточном культивировании, молекулярной генетике, химии нуклеиновых кислот, методах гибридизации и биохимии). Стандартные методы используются для молекулярных, генетических и биохимических способов (в общем см. 8атЬтоок с1 а1., Μοίο^ΐατ С1ошпд: А БаЬотакту Μαηυαΐ, 26 еб. (1989) Со1б 8рттд НагЬог БаЬота1оту Ртезз, Со1б 8рппд НагЬог, Ν.Υ. и Аи8иЬе1 е1 а1., 8йой Рто!осо1з ίη Μο1еси1а^ Вю1оду (1999) 4 Еб, бо1ит ^УПеу & 8опз, 1пс., включенные в данную заявку посредством ссылки) и химических способов.
Как использовано в данной заявке, рецептор интерлейкина-1 типа 1 (1Б-1К1; СЭ121а) относится к встречающимся в природе или эндогенным белкам 1Б-1К1 млекопитающих и к белкам, имеющим аминокислотную последовательность, которая является такой же, как у встречающегося в природе или эндогенного белка, соответствующего 1Б-1К1 млекопитающего (например рекомбинантные белки, синтетические белки (т.е. полученные с использованием способов синтетической органической химии)). Соответственно, как определено в данной заявке, данный термин включает зрелый белок, полиморфные или аллельные варианты и другие изоформы 1Б-1К1 (например полученные посредством альтернативного сплайсинга или других клеточных способов), и их модифицированные или немодифицированные формы (например липидированные, гликозилированные). Встречающиеся в природе или эндогенные 1Б-1К1 включают белки дикого типа, такие как зрелый 1Б-1К1, полиморфные или аллельные варианты и другие изоформы, которые встречаются в природе у млекопитающих (например людей, приматов, не являющихся людьми). Такие белки могут быть извлечены или выделены из источника, который в природе продуцирует, например, 1Б-1К1. Эти белки и белки 1Б-1К1, имеющие такую же аминокислотную последовательность, как встречающиеся в природе или эндогенные соответствующие 1Б-1К1, называют по названию соответствующего млекопитающего. Например, когда соответствующее млекопитающее представляет собой человека, тогда белок обозначают как 1Б-1К1 человека.
Как использовано в данной заявке, антагонист рецептора интерлейкина-1 типа 1 (1Б-1К1) относится к любому соединению (например полипептиду), которое может быть введено индивидууму для обеспечения благоприятного терапевтического или диагностического воздействия посредством связывания с 1Б-1К1 и ингибирования функции 1Б-1К1 у индивидуума (например ингибирует связывание 1Б-1а
- 20 018129 и/или 1Ь-1 β с 1Ь-1Я1, ингибирует передачу сигнала функции через 1Ь-1Я1 при связывании 1Ь-1а и/или 1Й-1Р).
Как использовано в данной заявке, пептид относится к аминокислотам в количестве от примерно двух до примерно 50, которые соединены вместе посредством пептидных связей.
Как использовано в данной заявке, полипептид относится к по меньшей мере примерно 50 аминокислотам, которые соединены вместе пептидными связями. В большинстве случаев полипептиды имеют третичную структуру и сворачиваются в функциональные домены.
Как использовано в данной заявке, пептид или полипептид (например доменное антитело (бЛЬ)), который является устойчивым к расщеплению протеазой, по существу, не расщепляется протеазой при инкубации с данной протеазой в условиях, подходящих для протеазной активности. Полипептид (например бЛЬ), по существу, не расщепляется, когда не более чем примерно 25%, не более чем примерно 20%, не более чем примерно 15%, не более чем примерно 14%, не более чем примерно 13%, не более чем примерно 12%, не более чем примерно 11%, не более чем примерно 10%, не более чем примерно 9%, не более чем примерно 8%, не более чем примерно 7%, не более чем примерно 6%, не более чем примерно 5%, не более чем примерно 4%, не более чем примерно 3%, не более чем примерно 2%, не более чем примерно 1% белка расщепляется протеазой, или, по существу, никакое количество белка не расщепляется протеазой при инкубации с протеазой в течение примерно одного часа при температуре, подходящей для протеазной активности. Например, при 37 или 50°С. Расщепление белка можно оценивать с использованием любого подходящего способа, например, с использованием 8Ό8-ΡΆ6Ε (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) или функционального анализа (например, связывания с лигандом), как описано в данной заявке.
Как использовано в данной заявке, дисплейная система относится к системе, в которой коллекция полипептидов или пептидов доступна для селекции на основании желаемой характеристики, такой как физическая, химическая или функциональная характеристика. Дисплейная система может представлять собой подходящий репертуар полипептидов или пептидов (например в растворе, иммобилизованном на подходящей подложке). Дисплейная система также может представлять собой биохимическую систему, которая использует клеточную экспрессирующую систему (например экспрессию библиотеки нуклеиновых кислот, например в трансформированных, инфицированных, трансфицированных или трансдуцированных клетках и экспонирование кодируемых полипептидов на поверхности этих клеток) или бесклеточную экспрессирующую систему (например компартментализацию и дисплей с использованием эмульсии). Примерные дисплейные системы связывают кодирующую функцию нуклеиновой кислоты и физические, химические и/или функциональные характеристики полипептида или пептида, кодируемого данной нуклеиновой кислотой. Когда используют такую дисплейную систему, тогда можно выбрать полипептиды или пептиды, имеющие желаемую физическую, химическую и/или функциональную характеристику, и можно легко выделить или извлечь нуклеиновую кислоту, кодирующую селектированный полипептид или пептид. В данной области техники известны различные дисплейные системы, которые связывают кодирующую функцию нуклеиновой кислоты и физические, химические и/или функциональные характеристики полипептида или пептида, например бактериофаговый дисплей (фаговый дисплей, например фагмидный дисплей), рибосомный дисплей, компартментализация и дисплей с использованием эмульсии, дрожжевой дисплей, пуромициновый дисплей, бактериальный дисплей, плазмидный дисплей, ковалентный дисплей и тому подобное (см., например, ЕР 0436597 (Оуах), патент США № 6172197 (ΜοίαίΪΜ^ е! а1.), патент США № 6489103 (СпййШ е! а1.)).
Как использовано в данной заявке, репертуар относится к коллекции полипептидов или пептидов, которые характеризуются разнообразием аминокислотных последовательностей. Индивидуальные члены репертуара могут иметь общие признаки, такие как общие структурные признаки (например, общую коровую структуру) и/или общие функциональные признаки (например, способность связываться с общим лигандом (например типичным лигандом или целевым лигандом, 1Й-1Я1)).
Как использовано в данной заявке, функциональный описывает полипептид или пептид, который имеет такую биологическую активность, как специфическая связывающая активность. Например, термин функциональный полипептид включает в себя антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с целевым антигеном посредством своего антигенсвязывающего сайта.
Как использовано в данной заявке, типичный лиганд относится к лиганду, который связывается со значительной частью функциональных членов (например, по существу, всеми функциональнами членами) заданного репертуара. Типичный лиганд (например, общий типичный лиганд) может связываться со многими членами заданного репертуара даже несмотря на то, что эти члены могут не обладать специфичностью связывания, присущей общему целевому лиганду. В общем случае присутствие функционального сайта связывания с типичным лигандом на полипептиде (на что указывает способность связывания с типичным лигандом) указывает на то, что полипептид правильно свернут и функционален. Подходящие примеры типичных лигандов включают суперантигены, антитела, которые связываются с эпитопом, экспрессируемым на значительной части функциональных членов репертуара, и тому подобное.
Суперантиген представляет собой термин в данной области техники, который относится к типич
- 21 018129 ным лигандам, взаимодействующим с членами иммуноглобулинового суперсемейства в сайте, отличающемся от сайтов этих белков, связывающихся с целевым лигандом. Примерами суперантигенов являются стафилококковые энтеротоксины, которые взаимодействуют с Т-клеточными рецепторами. Суперантигены, которые связываются с антителами, включают белок С, который связывается с константной областью 1дС (В_)огск апб Кгопуа11.1. 1ттипо1., 133: 969 (1984)); белок А, который связывается с константной областью 1дС и Ун-доменами (Еогкдгеп апб 8)ос.|Ш81. I. 1ттипо1., 97: 822 (1966)); и белок Ь, который связывается с Уь-доменами (В_)огск, I. 1ттипо1., 140: 1194 (1988)).
Как использовано в данной заявке, целевой лиганд относится к лиганду, который специфически или селективно связывается полипептидом или пептидом. Например, если полипептид представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, то целевой лиганд может представлять собой любой желаемый антиген или эпитоп, а если полипептид представляет собой фермент, то целевой лиганд может представлять собой любой желаемый субстрат. Связывание с целевым антигеном зависит от функциональности данного полипептида или пептида.
Как использовано в данной заявке, антитело относится к 1§С. 1дМ, 1дА, 1§ϋ или 1дЕ или фрагменту (такому как ЕаЬ, Е(аЬ')2, Εν, связанный дисульфидной связью Εν, хсГу. полиспецифическое антитело в закрытой конформации, связанный дисульфидной связью 5сЕу. диатело), происходящему из любого вида, естественным образом продуцирующего антитело, или созданному посредством технологии рекомбинантной ДНК; или выделенному из сыворотки крови, В-клеток, гибридом, трансфектом, дрожжей или бактерий.
Как использовано в данной заявке, формат антитела относится к любой подходящей полипептидной структуре, в которую может быть встроен один или более чем один вариабельный домен антитела для того, чтобы придать данной структуре специфичность связывания с антигеном. В данной области техники известны различные подходящие форматы антител, такие как химерные антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела, одноцепочечные антитела, биспецифические антитела, тяжелые цепи антител, легкие цепи антител, гомодимеры и гетеродимеры тяжелых цепей и/или легких цепей антител, антигенсвязывающие фрагменты любого из перечисленного выше (например Εν-фрагмент (например одноцепочечный Εν (^Εν), связанный дисульфидной связью Εν), ΕаЬ-фрагмент, ΕаЬ'-фрагмент, Ε(аЬ')2-фрагмент), единичный вариабельный домен антитела (например абАЬ, Ун, Унн, Уь) и модифицированные варианты любого из перечисленного выше (например модифицированные посредством ковалентного присоединения полиэтиленгликоля или другого подходящего полимера, или гуманизированного νΗΗ).
Фраза иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен относится к вариабельному домену антитела (Ун, Унн, УД специфически связывающемуся с антигеном или эпитопом независимо от других У-областей или доменов. Иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен может быть представлен в формате (например гомо- или гетеромультимера) с другими вариабельными областями или вариабельными доменами, где другие области или домены не требуются для связывания антигена с единичным иммуноглобулиновым вариабельным доменом (т.е. когда иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен связывается с антигеном независимо от дополнительных вариабельных доменов). Доменное антитело или бАЬ представляет собой то же, что и иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, как этот термин используется в данной заявке. Единичный иммуноглобулиновый вариабельный домен представляет собой то же, что и иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, как этот термин используется в данной заявке. Единичный антительный вариабельный домен или антительный вариабельный единичный домен представляет собой то же, что и иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, как этот термин используется в данной заявке. Иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен в одном из воплощений представляет собой вариабельный домен антитела человека, но также включает единичные вариабельные домены антител из других видов, таких как Унн бАЬ грызунов (например, как описано в \УО 00/29004, содержание которой включено в данное описание во всей своей полноте посредством ссылки), усатых акул и верблюжьи Унн бАЬ. Верблюжьи Унн представляют собой полипептиды иммуноглобулинового единичного вариабельного домена, которые происходят из видов, включающих верблюда, ламу, альпаку, дромадера и гуанако, которые продуцируют антитела, состоящие из тяжелых цепей, лишенные легких цепей. Унн может быть гуманизированным.
Домен представляет собой свернутую белковую структуру, которая сохраняет свою третичную структуру независимо от остальной части белка. В большинстве случаев домены ответственны за отдельные функциональные свойства белков и во многих случаях могут быть добавлены, удалены или перенесены в другие белки без потери функции остальной части белка и/или домена. Единичный вариабельный домен антитела представляет собой свернутый полипептидный домен, содержащий последовательности, характерные для вариабельных доменов антител. Следовательно, он включает полные вариабельные домены антител и модифицированные вариабельные домены, например, в которых одна или более петель заменены последовательностями, не характерными для вариабельных доменов антител, или вариабельные домены антител, которые укорочены или содержат Ν- или С-концевые удлинения, а также свернутые фрагменты вариабельных доменов, которые сохраняют, по меньшей мере, частично, связы
- 22 018129 вающую активность и специфичность полноразмерного домена.
Термин библиотека относится к смеси гетерогенных полипептидов или нуклеиновых кислот. Библиотека состоит из членов, каждый из которых имеет единичную полипептидную или нуклеиновокислотную последовательность. В некоторой степени библиотека является синонимом репертуара. Различия в последовательностях среди членов библиотеки ответственны за разнообразие, представленное в этой библиотеке. Библиотека может принимать форму простой смеси полипептидов или нуклеиновых кислот или может находиться в форме организмов или клеток, например бактерий, вирусов, клеток животных и растений и тому подобного, трансформированных библиотекой нуклеиновых кислот. В одном из воплощений каждый индивидуальный организм или клетка содержит только один член или ограниченное количество членов. В одном из воплощений нуклеиновые кислоты встроены в экспрессирующие векторы, чтобы сделать возможной экспрессию полипептидов, кодируемых данными нуклеиновыми кислотами. Следовательно, в одном аспекте библиотека может принимать форму популяции организмовхозяев, где каждый микроорганизм содержит одну или более копий экспрессирующего вектора, содержащего единичный член библиотеки в форме нуклеиновой кислоты, которая может быть экспрессирована с целью получения соответствующего ей полипептидного члена. Таким образом, популяция организмов-хозяев имеет потенциал для кодирования большого репертуара различающихся полипептидов.
Универсальный каркас представляет собой последовательность каркаса единичного антитела, соответствующую областям антитела с консервативной последовательностью, как определено КаЬа! (8ес.|испес5 о£ РгсИеиъ о£ 1штипо1од1са1 1п1еге51, И8 Берайтей о£ НеаИЬ аиб Нитап 8егу1се5), или соответствующую репертуару или структуре иммуноглобулинов зародышевой линии человека, как определено в С1ю11па аиб Бекк, (1987) 1. Μо1. Вю1. 196: 910-917. В библиотеках и репертуарах можно использовать единичный каркас или набор таких каркасов, которые, как обнаружено, допускают получение производных по сути с любой специфичностью связывания посредством варьирования только в гипервариабельных участках.
Как использовано в данной заявке, термин доза относится к количеству лиганда, вводимому субъекту одновременно (однократная доза), или двумя или более введениями в течение определенного периода времени. Например, доза может относиться к количеству лиганда (например лиганда, содержащего иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, связывающий целевой антиген), вводимому субъекту в течение суток (24 ч) (суточная доза), двух суток, одной недели, двух недель, трех недель или одного или более чем одного месяца (например посредством однократного введения, или посредством двух или более введений). Интервал между дозами может представлять собой любое желаемое количество времени.
Фраза период полувыведения представляет собой период времени, в течение которого концентрация лиганда (например бАЬ, полипептида или антагониста) в сыворотке уменьшается на 50% ίη у1уо, например вследствие расщепления лиганда и/или клиренса или секвестрации лиганда с помощью природных механизмов. Лиганды по изобретению могут быть стабилизированы ίη у1уо, и период их полувыведения увеличивается посредством связывания с молекулами, которые устойчивы к расщеплению и/или клиренсу, или секвестрации. Типично, такие молекулы представляют собой встречающиеся в природе белки, которые сами по себе обладают длительным периодом полувыведения ίη у1уо. Период полувыведения лиганда увеличивается в том случае, если его функциональная активность сохраняется ίη у1уо в течение более длительного периода, чем похожего лиганда, который не специфичен в отношении молекулы, увеличивающей период полувыведения. Например, лиганд, специфический в отношении НА8 (человеческого сывороточного альбумина), и молекулу-мишень сравнивают с тем же лигандом, у которого специфичность в отношении Н8А отсутствует, то есть он не связывается с НА8, но связывается с другой молекулой. Например, он может связываться с третьей мишенью на клетке. Типично, период полувыведения увеличивается на 10, 20, 30, 40, 50% или более. Возможны увеличения периода полувыведения в диапазоне 2х, 3х, 4х, 5х, 10х, 20х, 30х, 40х, 50х или более. Альтернативно или в дополнение к этому, возможно увеличение периода полувыведения в диапазоне 30х, 40х, 50х, 60х, 70х, 80х, 90х, 100х, 150х.
Как использовано в данной заявке, гидродинамический размер относится к кажущемуся размеру молекулы (например белковой молекулы, лиганда) на основе диффузии молекулы через водный раствор. Диффузию или движение белка через раствор можно преобразовать для выведения кажущегося размера белка, где размер приводят в виде радиусе Стокса или гидродинамического радиуса белковой частицы. Гидродинамический размер белка зависит от массы и формы (конформации), так что два белка, обладающие одинаковой молекулярной массой, могут иметь различные гидродинамические размеры на основании общей конформации белка.
Как использовано в данной заявке, термин конкурирует означает, что связывание первой мишени со своим штатным мишень-связывающим доменом ингибируется в присутствии второго связывающего домена, который является специфическим в отношении указанной когнатной мишени. Например, связывание может быть ингибировано стерически, например посредством физического блокирования связывающего домена или изменения структуры или окружения связывающего домена таким образом, что его аффинность или авидность в отношении мишени уменьшается. См. ^02006038027 в отношении подробной информации относительно того, как осуществлять конкурентные ЕБ18А и конкурентные В1аСоге
- 23 018129 эксперименты для определения конкуренции между первым и вторым связывающими доменами.
Расчеты гомологии или идентичности, или сходства между двумя последовательностями (термины в данной заявке используются взаимозаменяемо) осуществляют следующим образом. Последовательности выравнивают в целях оптимального сравнения (например, могут быть введены бреши в одну или обе первую и вторую аминокислотную или нуклеиновокислотную последовательности для оптимального выравнивания, а негомологичными последовательностями можно пренебречь для сравнительных целей). В воплощении длина сравниваемой последовательности, выравниваемой для сравнительных целей, составляет по меньшей мере 30%, предпочтительно по меньшей мере 40%, более предпочтительно по меньшей мере 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере 60% и еще более предпочтительно по меньшей мере 70, 80, 90, 100% от длины последовательности сравнения. Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих аминокислотных положениях или нуклеотидных положениях. Если положение в первой последовательности занято тем же аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и соответствующее положение во второй последовательности, то молекулы идентичны по этому положению (как использовано в данном описании, аминокислотная гомология или гомология нуклеиновой кислоты эквивалентна аминокислотной идентичности или идентичности нуклеиновой кислоты). Процент идентичности между двумя последовательностями есть функция количества идентичных положений, общих для этих последовательностей, с учетом количества брешей и длины каждой бреши, которые следует вводить для оптимального выравнивания двух последовательностей. Выравнивания аминокислотной и нуклеотидной последовательности и их гомология, сходство или идентичность, как определено в данном описании, могут быть получены и определены с использованием алгоритма для последовательностей ВБА8Т 2 Зедиепсек с использованием параметров по умолчанию (Та1икονа, Т. А. еГ а1., ЕЕМ8 МюгоЬю1. Ьей., 174: 187-188 (1999)).
Способы селекции
Изобретение в одном из воплощений относится к полипептидам и ЙАЬ. селектированным способом селекции протеазоустойчивых пептидов и полипептидов, обладающих желаемой биологической активностью. В способе используют два селекционных давления для обеспечения эффективного процесса селекции полипептидов, которые являются высокостабильными и устойчивыми к расщеплению протеазой, и которые обладают желаемой биологической активностью. Как описано в данной заявке, протеазоустойчивые пептиды и полипептиды, как правило, сохраняют биологическую активность. В противопожность этому пептиды и полипептиды, чувствительные к протеазам, расщепляются или перевариваются протеазой в способах, описанных в данной заявке, и поэтому теряют свою биологическую активность. Соответственно, протеазоустойчивые пептиды или полипептиды обычно селектируют на основании их биологической активности, такой как связывающая активность.
В одном аспекте предложен способ селекции, выделения и/или извлечения пептида или полипептида из библиотеки или репертуара пептидов и полипептидов (например дисплейной системы), который является устойчивым к расщеплению протеазой (например одной или более протеазами). В одном из воплощений данный способ представляет собой способ селекции, выделения и/или извлечения полипептида из библиотеки или репертуара пептидов и полипептидов (например дисплейной системы), который является устойчивым к расщеплению протеазой (например одной или более протеазами). В большинстве случаев способ включает получение библиотеки или репертуара пептидов или полипептидов, объединение библиотеки или репертуара с протеазой (например трипсином, эластазой, лейкозимом, панкреатином, слюной) в условиях, подходящих для протеазной активности, и селекцию, выделение и/или извлечение пептида или полипептида, который является устойчивым к расщеплению протеазой и имеет желаемую биологическую активность. Пептиды или полипептиды, которые расщепляются протеазой, обычно имеют сниженную биологическую активность или утрачивают свою биологическую активность вследствие активности протеазы. Соответственно, пептиды или полипептиды, устойчивые к расщеплению протеазой, могут быть селектированы, выделены и/или извлечены с использованием способа на основе их биологической активности, такой как связывающая активность (например, связывание с типичным лигандом, связывание со специфическим лигандом, связывание с субстратом), каталитическая активность или другая биологическая активность.
Библиотеку или репертуар пептидов или полипептидов объединяют с протеазой (например одной или более протеазами) в условиях, подходящих для протеолитической активности протеазы. Условия, которые подходят для протеолитической активности протеазы, и биологические препараты или смеси, содержащие протеолитическую активность, общеизвестны в данной области техники или могут быть легко определены средним специалистом в данной области. При желании, подходящие условия могут быть идентифицированы или оптимизированы, например, путем оценки протеазной активности в диапазоне условий рН, концентраций протеазы, температур и/или путем варьирования периода времени, в течение которого допускается взаимодействие библиотеки или репертуара и протеазы. Например, в некоторых воплощениях отношение (моль/моль) протеазы, например трипсина, к пептиду или полипептиду (например вариабельному домену), составляет 800 к 8000 (например 8000 к 80000) для протеаза:пептид или полипептид, например, когда используют 10 мкг/мл протеазы, тогда отношение протеаза:пептид или полипептид составляет 800 к 80000; или когда используют 100 мкг/мл протеазы, тогда отношение про
- 24 018129 теаза:пептид или полипептид составляет 8000 к 80000. В одном из воплощений отношение (масса/масса, например мкг/мкг) протеазы (например трипсина) к пептиду или полипептиду (например вариабельному домену), составляет 1600 к 160000 (например 16000 к 160000) для протеаза:пептид или полипептид, например, когда используют 10 мкг/мл протеазы, тогда отношение протеаза:пептид или полипептид составляет 1600 к 160000; или когда используют 100 мкг/мл протеазы, отношение протеаза:пептид или полипептид составляет 16000 к 160000. В одном из воплощений протеазу используют в концентрации по меньшей мере 100 или 1000 мкг/мл и отношение (моль/моль) протеазы, например трипсина, к пептиду или полипептиду (например вариабельному домену) составляет 8000 к 80000 для протеаза:пептид или полипептид. В одном из воплощений протеазу используют в концентрации по меньшей мере 10 мкг/мл и отношение (моль/моль) протеазы, например трипсина, к пептиду или полипептиду (например вариабельному домену) составляет 800 к 80000 для протеаза:пептид или полипептид. В одном из воплощений отношение (мас./мас., например мкг/мкг) протеазы (например трипсина) к пептиду или полипептиду (например вариабельному домену) составляет 1600 к 160000 для протеаза:пептид или полипептид, например, когда С равна 10 мкг/мл; или когда С или С' равна 100 мкг/мл, тогда отношение протеаза:пептид или полипептид составляет 16000 к 160000. В одном из воплощений концентрация протеазы (С или С) составляет по меньшей мере 100 или 1000 мкг/мл. Для тестирования индивидуального или выделенного пептида или полипептида (например иммуноглобулинового вариабельного домена), например, который уже выделен из репертуара или библиотеки, протеазу можно добавлять в раствор пептида или полипептида в подходящем буфере (например РВ8) для получения раствора пептида или полипептида/протеазы, такого как раствор по меньшей мере примерно 0,01% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, от примерно 0,01 до примерно 5% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, от примерно 0,05 до примерно 5% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, от примерно 0,1 до примерно 5% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, от примерно 0,5 до примерно 5% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, от примерно 1 до примерно 5% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 0,01% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 0,02% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 0,03% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 0,04% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 0,05% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 0,06% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 0,07% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 0,08% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 0,09% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 0,1% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 0,2% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 0,3% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 0,4% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 0,5% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 0,6% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 0,7% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 0,8% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 0,9% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 1% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 2% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 3% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 4% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, или примерно 5% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида. Такую смесь можно инкубировать при подходящей для протеазной активности температуре (например комнатной температуре, примерно 37°С) и образцы можно отбирать через промежутки времени (например через 1, 2, 3 ч и т.д.). Образцы могут быть проанализированы в отношении расщепления белка с использованием любого подходящего способа, такого как δΌδ-РАСЕ-анализ или связывание с лигандом, и результаты можно использовать для установления динамики расщепления.
В способах, описанных в данной заявке, можно использовать любую желаемую протеазу или протеазы. Например, можно использовать одну протеазу, любую желаемую комбинацию различных протеаз или любой биологический препарат, биологический экстракт или биологический гомогенат, который содержит протеолитическую активность. Нет необходимости в идентификации используемой(ых) протеазы или протеаз. Подходящие примеры протеаз, которые могут быть использованы сами по себе или в любой желаемой комбинации, включают сериновую протеазу, цистеиновую протеазу, аспартатные протеазы, тиоловые протеазы, матриксную металлопротеазу, карбоксипептидазу (например карбоксипептидазу А, карбоксипептидазу В), трипсин, химотрипсин, пепсин, папаин, эластазу, лейкозим, панкреатин, тромбин, плазмин, катепсины (например катепсин С), протеиназу (например протеиназу 1, протеиназу 2, протеиназу 3), термолизин, химозин, энтеропептидазу, каспазу (например каспазу 1, каспазу 2, каспазу 4, каспазу 5, каспазу 9, каспазу 12, каспазу 13), кальпаин, фикаин, клострипаин, актинидаин, бромелаин, сепаразу и тому подобное. Подходящие биологические экстракты, гомогенаты и препараты, которые содержат протеолитическую активность, включают мокроту, слизь (например желудочную слизь, носовую слизь, бронхиальную слизь), бронхоальвеолярный лаваж, гомогенат легких, экстракт легких, экстракт поджелудочной железы, желудочную жидкость, слюну, слезы и тому подобное. Протеазу используют в
- 25 018129 количестве, подходящем для осуществления протеолитического расщепления. Например, как описано в данной заявке, протеаза может быть использована в концентрации от примерно 0,01 до примерно 5% (мас./мас., протеаза/пептид или полипептид). Когда протеазу объединяют с дисплейной системой, содержащей репертуар пептидов или полипептидов (например фаг-дисплейной системой), например, протеаза может быть использована в концентрации от примерно 10 мкг/мл до примерно 3 мг/мл, примерно 10 мкг/мл, примерно 20 мкг/мл, примерно 30 мкг/мл, примерно 40 мкг/мл, примерно 50 мкг/мл, примерно 60 мкг/мл, примерно 70 мкг/мл, примерно 80 мкг/мл, примерно 90 мкг/мл, примерно 100 мкг/мл, примерно 200 мкг/мл, примерно 300 мкг/мл, примерно 400 мкг/мл, примерно 500 мкг/мл, примерно 600 мкг/мл, примерно 700 мкг/мл, примерно 800 мкг/мл, примерно 900 мкг/мл, примерно 1000 мкг/мл, примерно 1,5 мг/мл, примерно 2 мг/мл, примерно 2,5 мг/мл или примерно 3 мг/мл.
Протеазу инкубируют с коллекцией пептидов или полипептидов (библиотекой или репертуаром) при температуре, подходящей для активности протеазы. Например, протеазу и коллекцию пептидов или полипептидов можно инкубировать при температуре от примерно 20 до примерно 40°С (например при комнатной температуре, примерно 20°С, примерно 21°С, примерно 22°С, примерно 23°С, примерно 24°С, примерно 25°С, примерно 26°С, примерно 27°С, примерно 28°С, примерно 29°С, примерно 30°С, примерно 31°С, примерно 32°С, примерно 33°С, примерно 34°С, примерно 35°С, примерно 36°С, примерно 37°С, примерно 38°С, примерно 39°С, примерно 40°С). Протеазу и коллекцию пептидов или полипептидов инкубируют вместе в течение периода времени, достаточного для осуществления протеолитического расщепления. Например, коллекцию пептидов или полипептидов можно инкубировать вместе с протеазой в течение от примерно 30 мин до примерно 24 или примерно 48 ч. В некоторых примерах коллекцию пептидов или полипептидов инкубируют вместе с протеазой в течение ночи или в течение по меньшей мере примерно 30 мин, примерно 1 ч, примерно 1,5 ч, примерно 2 ч, примерно 3 ч, примерно 4 ч, примерно 5 ч, примерно 6 ч, примерно 7 ч, примерно 8 ч, примерно 9 ч, примерно 10 ч, примерно 11 ч, примерно 12 ч, примерно 13 ч, примерно 14 ч, примерно 15 ч, примерно 16 ч, примерно 17 ч, примерно 18 ч, примерно 19 ч, примерно 20 ч, примерно 21 ч, примерно 22 ч, примерно 23 ч, примерно 24 ч, примерно 48 ч или больше.
В большинстве случаев желательно, по меньшей мере, на ранних раундах селекции (например, когда используют дисплейную систему), чтобы протеаза приводила к уменьшению количества клонов, имеющих желаемую биологическую активность, которую селектируют в отношении по меньшей мере одного порядка величины, по сравнению с селекциями, которые не включают инкубацию с протеазой. В конкретных примерах количество протеазы и условия, использованные в таких способах, являются достаточными для уменьшения количества извлеченных клонов по меньшей мере примерно на один логарифм (коэффициент 10), по меньшей мере примерно на 2 логарифма (коэффициент 100), по меньшей мере примерно 3 логарифма (коэффициент 1000) или по меньшей мере примерно 4 логарифма (коэффициент 10000). Подходящие количества протеазы и условия инкубации, которые будут приводить к желаемому уменьшению количества извлеченных клонов, могут быть легко определены с использованием традиционных способов и/или руководства, предложенного в данной заявке.
Протеаза и коллекция пептидов или полипептидов могут быть объединены и инкубированы с использованием любого подходящего способа (например ίη νίίτο, ίη νίνο или ех νίνο). Например, протеаза и коллекция пептидов или полипептидов могут быть объединены в подходящем контейнере и содержаться в стационарном состоянии, при качании, встряхивании, вихревом вращении или тому подобном, при температуре, подходящей для протеазной активности. При желании, протеаза и коллекция пептидов или полипептидов могут быть объединены в системе ίη νίνο или ех νίνο, например, путем введения коллекции полипептидов (например фаг-дисплейной библиотеки или репертуара) подходящему животному (например мыши) и после периода времени, достаточного для проявления протеазной активности, извлечения коллекции пептидов или полипептидов. В другом примере орган или ткань подвергают перфузии коллекцией полипептидов (например фаг-дисплейной библиотекой или репертуаром) и после периода времени, достаточного для проявления протеазной активности, извлекают коллекцию полипептидов.
После инкубации протеазоустойчивый пептид или полипептид может быть селектирован на основании желаемой биологической активности, такой как связывающая активность. При желании, протеазный ингибитор может быть добавлен перед селекцией. Можно использовать любой подходящий ингибитор протеазы (или комбинацию двух или более ингибиторов протеаз), которые, по существу, не будут препятствовать данному способу селекции. Примеры подходящих ингибиторов протеаз включают α1антитрипсин, а2-макроглобулин, амастатин, антипаин, антитромбин ΣΣΣ, апротинин, 4-(2аминоэтил)бензолсульфонил-фторида гидрохлорид (АЕВ8Р), (4-амидинофенил)метансульфонилфторид (АРМ8Р), бестатин, бензамидин, химостатин, 3,4-дихлоризокумарин, диизопропилфторфосфат (ΌΣΡΡ), Е64, этилендиаминтетрауксусную кислоту (ΕΌΤΑ), эластатиналь, лейпептин, Ν-этилмалеимид, фенилметилсульфонилфторид (РМ8Р), пепстатин, 1,10-фенантролин, фосфорамидон, ингибиторы сериновых протеаз, Ν-тозил-Ь-лизин-хлорметилкетон (ΤΕΟΚ), №-тозил-РРе-хлорметилкетон (ΤΡΟΚ) и тому подобное. В дополнение к этому в продаже имеется много препаратов, которые содержат ингибиторы нескольких классов протеаз (например, ΕοΠ^ Ссшр1е1е Ρ^οίеа8е !η1ιίΝΐοΓ С'осПаП Τ;ώΕΐδ™ (полный коктейль
- 26 018129 ингибиторов протеаз в таблетках от ЕосНс) (ЕосНс Ωίαβηοδίίοδ Согрогайоп; Ιπάίαπαροΐίδ. ΙΝ, И8А), который ингибирует химотрипсин, термолизин, папаин, проназу, экстракт поджелудочной железы и трипсин).
Протеазоустойчивый пептид или полипептид может быть селектирован с использованием желаемого способа селекции биологической активности, который позволяет отличать и селектировать пептиды и полипептиды, имеющие желаемую биологическую активность, от или относительно пептидов и полипептидов, не имеющих желаемой биологической активности. Как правило, пептиды или полипептиды, которые были подвергнуты перевариванию или расщеплению протеазой, теряют свою биологическую активность, тогда как протеазоустойчивые пептиды или полипептиды остаются функциональными. Таким образом, для селекции протеазоустойчивых пептидов или полипептидов могут быть использованы подходящие анализы биологической активности. Например, общая связывающая функция (например, связывание с типичным лигандом, связывание со специфическим лигандом или связывание с субстратом) может быть оценена с использованием подходящего анализа связывания (например ЕЬ18Л, пэннинга). Например, полипептиды, которые связываются с целевым лигандом или типичным лигандом, таким как белок А, белок Ь или антитело, могут быть селектированы, выделены и/или извлечены посредством пэннинга или с использованием подходящей аффинной матрицы. Пэннинг может быть осуществлен путем добавления раствора лиганда (например типичного лиганда, целевого лиганда) в подходящий сосуд (например пробирку, чашку Петри) и обеспечения возможности для лиганда осаждаться на стенках или покрывать стенки сосуда. Избыток лиганда можно отмыть и полипептиды (например фаг-дисплейную библиотеку) можно добавить в сосуд и сосуд поддерживать в условиях, подходящих для связывания полипептидов с иммобилизованным лигандом. Несвязавшийся полипептид можно отмыть, а связавшиеся полипептиды можно извлечь с использованием любого подходящего способа, такого как, например, соскабливание или снижение рН.
Когда используют фаг-дисплейную систему, тогда связывание может быть протестировано в фаговом ЕЬ18Л-анализе. Фаговый ЕЫ8Л-анализ может быть проведен в соответствии с любой подходящей методикой. В одном из примеров популяции фага, продуцируемые в каждом раунде селекции, могут быть подвергнуты скринингу в отношении связывания в ЕЬ18А с селектированным целевым лигандом или типичным лигандом с целью идентификации фага, который экспонирует протеазоустойчивые пептиды или полипептиды. При желании, растворимые пептиды и полипептиды могут быть протестированы в отношении связывания с целевым лигандом или типичным лигандом, например, посредством ЕЬ18А с использованием реагентов, например, против С- или Ν-концевой метки (см., например ХУНИсг е1 а1. (1994) Апп. Есу. 1ттипо1оду 12, 433-55 и приведенные там ссылки). Разнообразие селектированного фага также может быть оценено посредством гель-электрофореза продуктов ПЦР (полимеразной цепной реакции) (Магкк с! а1. 1991, выше; Νίκκίιη с! а1. 1994, выше), путем введения зонда (Тотйпкоп с! а1., 1992, 1. Мо1. Бю1. 227, 776) или посредством секвенирования векторной ДНК.
В дополнение к специфичности в отношении 1И-1Е1 антагонист или полипептид (например лиганд с двойной специфичностью), содержащий протеазоустойчивый полипептид против 1Б-1Е1 (например, единичный вариабельный домен антитела) может обладать специфичностью связывания в отношении типичного лиганда или любого желаемого целевого лиганда, такого как человеческие или животные белки, включающие цитокины, факторы роста, цитокиновые рецепторы, рецепторы факторов роста, ферменты (например протеазы), кофакторы ферментов, ДНК-связывающие белки, липиды и углеводороды.
В некоторых воплощениях протеазоустойчивый пептид или полипептид (например бАЬ) или антагонист связывается с 1Б-1Е1 в легочной ткани. В одном из воплощений антагонист или полипептид также связывается с другой мишенью в легочной ткани.
Когда в способах, описанных в данной заявке, используют дисплейную систему (например дисплейную систему, которая связывает кодирующую функцию нуклеиновой кислоты и функциональные характеристики пептида или полипептида, кодируемого данной нуклеиновой кислотой), тогда часто предпочтительно амплифицировать или увеличить количество копий нуклеиновых кислот, которые кодируют селектированные пептиды или полипептиды. Это обеспечивает эффективный способ получения достаточных количеств нуклеиновых кислот и/или пептидов или полипептидов для дополнительных раундов селекции с использованием способов, описанных в данной заявке, или других подходящих способов либо для получения дополнительных репертуаров (например репертуаров созревания аффинности). Таким образом, в некоторых воплощениях способ по изобретению включает применение дисплейной системы (например, которая связывает кодирующую функцию нуклеиновой кислоты и функциональные характеристики пептида или полипептида, кодируемого данной нуклеиновой кислотой, такой как фаговый дисплей) и также включает амплификацию или увеличение количества копий нуклеиновой кислоты, которая кодирует селектированный пептид или полипептид. Нуклеиновые кислоты могут быть амплифицированы с использованием любых подходящих способов, например, посредством амплификации фагов, роста клеток или полимеразной цепной реакции.
Способы, описанные в данной заявке, могут быть использованы как часть программы по выделению протеазоустойчивых пептидов или полипептидов, например бАЬ, которая может включать, если желательно, другие подходящие способы селекции. В этих ситуациях способы, описанные в данной за
- 27 018129 явке, могут быть использованы в любом желаемом месте данной программы, например, до или после использования других способов селекции. Способы, описанные в данной заявке, могут быть использованы также для проведения двух или более раундов селекции, как описано и проиллюстрировано в данной заявке.
В одном из примеров изобретение относится к способу селекции пептида или полипептида, например бАЬ, устойчивого к расщеплению эластазой, включающему получение библиотеки или репертуара пептидов или полипептидов, объединение библиотеки или репертуара с эластазой (или биологическим препаратом, экстрактом или гомогенатом, содержащим эластазу) в условиях, подходящих для протеолитического расщепления эластазой, и селекцию, выделение и/или извлечение пептида или полипептида, который устойчив к расщеплению эластазой и имеет связывающую активность в отношении 1Ь-1К.1.
В конкретных воплощениях предложен способ селекции иммуноглобулинового единичного вариабельного домена (бАЬ), который устойчив к расщеплению эластазой и связывается с 1Ь-1Я1. В этих воплощениях библиотеку или репертуар, содержащие бАЬ, получают и объединяют с эластазой (или биологическим препаратом, экстрактом или гомогенатом, содержащим эластазу) в условиях, подходящих для протеолитического расщепления эластазой. Отбирают устойчивые к эластазе бАЬ, которые связываются с 1Б-1К.1. Например, устойчивое к эластазе бАЬ, по существу, не расщепляется при инкубации при 37°С в 0,04%-ном (мас./мас.) растворе эластазы в течение по меньшей мере примерно 2 ч. В одном из воплощений устойчивое к эластазе бАЬ, по существу, не расщепляется при инкубации при 37°С в 0,04%ном (мас./мас.) растворе эластазы в течение по меньшей мере примерно 12 ч. В одном из воплощений устойчивое к эластазе бАЬ, по существу, не расщепляется при инкубации при 37°С в 0,04%-ном (мас./мас.) растворе эластазы в течение по меньшей мере примерно 24 ч, по меньшей мере примерно 36 ч или по меньшей мере примерно 48 ч.
В воплощении предложен способ селекции иммуноглобулинового единичного вариабельного домена (бАЬ), который устойчив к расщеплению эластазой и связывается с 1Б-1К.1. Способ включает получение фаг-дисплейной системы, содержащей репертуар полипептидов, которые содержат иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, объединение данной фаг-дисплейной системы с эластазой (примерно 100 мкг/мл) и инкубирование этой смеси при примерно 37°С, например, в течение ночи (например примерно 12-16 ч) и затем селекцию фага, экспонирующего бАЬ, которое специфически связывается с 1Ь-1Я1.
В одном из примеров предложен способ селекции пептида или полипептида (например бАЬ), который устойчив к расщеплению лейкозимом, включающий получение библиотеки или репертуара пептидов или полипептидов, объединение библиотеки или репертуара с лейкозимом (или биологическим препаратом, экстрактом или гомогенатом, содержащим лейкозим) в условиях, подходящих для протеолитического расщепления лейкозимом, и селекцию, выделение и/или извлечение пептида или полипептида, который устойчив к расщеплению лейкозимом и имеет специфическую связывающую активность в отношении 1Ь-1Я1.
В конкретных воплощениях предложен способ селекции иммуноглобулинового единичного вариабельного домена (бАЬ), который устойчив к расщеплению лейкозимом и связывается с 1Ь-1Я1. В этих воплощениях библиотеку или репертуар, содержащие бАЬ, получают и объединяют с лейкозимом (или биологическим препаратом, экстрактом или гомогенатом, содержащим лейкозим) в условиях, подходящих для протеолитического расщепления лейкозимом. Отбирают устойчивые к лейкозиму бАЬ, которые специфически связываются с 1Б-1К.1. Например, устойчивое к лейкозиму бАЬ, по существу, не расщепляется при инкубации при 37°С в 0,04%-ном (мас./мас.) растворе лейкозима в течение по меньшей мере примерно 2 ч. В одном из воплощений устойчивое к лейкозиму бАЬ, по существу, не расщепляется при инкубации при 37°С в 0,04%-ном (мас./мас.) растворе лейкозима в течение по меньшей мере примерно 12 ч. В одном из воплощений устойчивое к лейкозиму бАЬ, по существу, не расщепляется при инкубации при 37°С в 0,04%-ном (мас./мас.) растворе лейкозима в течение по меньшей мере примерно 24 ч, по меньшей мере примерно 36 ч или по меньшей мере примерно 48 ч.
В воплощении предложен способ селекции иммуноглобулинового единичного вариабельного домена (бАЬ), который устойчив к расщеплению лейкозимом и специфически связывается с 1Ь-1Я1. Способ включает получение фаг-дисплейной системы, содержащей репертуар полипептидов, которые содержат иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, объединение данной фаг-дисплейной системы с лейкозимом (примерно 100 мкг/мл) и инкубирование этой смеси при примерно 37°С, например, в течение ночи (например примерно 12-16 ч) и затем селекцию фага, экспонирующего бАЬ, которое специфически связывается с 1Ь-1К1.
В другом примере предложен способ селекции пептида или полипептида (например бАЬ), который устойчив к расщеплению трипсином, включающий получение библиотеки или репертуара пептидов или полипептидов, объединение библиотеки или репертуара с трипсином в условиях, подходящих для протеолитического расщепления трипсином, и селекцию, выделение и/или извлечение пептида или полипептида, который устойчив к расщеплению трипсином и специфически связывается с 1Ь-1К1.
В конкретных воплощениях предложен способ селекции иммуноглобулинового единичного вариабельного домена (бАЬ), который устойчив к расщеплению трипсином и специфически связывается с ГЬ
- 28 018129
1К1. В этих воплощениях библиотеку или репертуар, содержащие ЙАЬ, получают и объединяют с трипсином (или биологическим препаратом, экстрактом или гомогенатом, содержащим трипсин) в условиях, подходящих для протеолитического расщепления трипсином. Отбирают устойчивые к трипсину бАЬ, которые связываются с ΙΕ-1Κ1. Например, устойчивое к трипсину бАЬ, по существу, не расщепляется при инкубации при 37°С в 0,04%-ном (мас./мас.) растворе трипсина в течение по меньшей мере примерно 2 ч. В одном из воплощений устойчивое к трипсину бАЬ, по существу, не расщепляется при инкубации при 37°С в 0,04%-ном (мас./мас.) растворе трипсина в течение по меньшей мере примерно 3 ч. В одном из воплощений устойчивое к трипсину бАЬ, по существу, не расщепляется при инкубации при 37°С в 0,04%-ном (мас./мас.) растворе трипсина в течение по меньшей мере примерно 4 ч, по меньшей мере примерно 5 ч, по меньшей мере примерно 6 ч, по меньшей мере примерно 7 ч, по меньшей мере примерно 8 ч, по меньшей мере примерно 9 ч, по меньшей мере примерно 10 ч, по меньшей мере примерно 11 ч или по меньшей мере примерно 12 ч.
В типичном воплощении предложен способ селекции иммуноглобулинового единичного вариабельного домена (ЙАЬ), который устойчив к расщеплению трипсином и специфически связывается с Ш1К1. Способ включает получение фаг-дисплейной системы, содержащей репертуар полипептидов, которые содержат иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, объединение данной фагдисплейной системы с трипсином (100 мкг/мл) и инкубирование этой смеси при примерно 37°С, например, в течение ночи (например примерно 12-16 ч), и затем селекцию фага, экспонирующего ЙАЬ, которое специфически связывается с ΙΕ-1Κ1.
В другом аспекте предложен способ получения репертуара протеазоустойчивых пептидов или полипептидов (например ЙАЬ). Способ включает получение репертуара пептидов или полипептидов; объединение репертуара пептидов или полипептидов и протеазы в условиях, подходящих для протеазной активности; и извлечение множества пептидов или полипептидов, которые специфически связываются с ΙΕ-1Κ1, посредством чего получают репертуар протеазоустойчивых пептидов или полипептидов. Протеазы, дисплейные системы, условия для протеазной активности и способы селекции пептидов или полипептидов, которые подходят для применения в данном способе, описаны в данном изобретении с учетом других способов по изобретению.
В некоторых воплощениях используют дисплейную систему (например дисплейную систему, которая связывает кодирующую функцию нуклеиновой кислоты и функциональные характеристики пептида или полипептида, кодируемого данной нуклеиновой кислотой), которая содержит репертуар пептидов или полипептидов, и способ также включает амплификацию или увеличение количества копий нуклеиновых кислот, кодирующих это множество селектированных пептидов или полипептидов. Нуклеиновые кислоты могут быть амплифицированы с использованием любого подходящего способа, например, посредством амплификации фагов, роста клеток или полимеразной цепной реакции.
В конкретном воплощении предложен способ получения репертуара протеазоустойчивых полипептидов, которые представляют собой бАЬ против ΙΕ-1Κ1. Способ включает получение репертуара полипептидов, которые представляют собой бАЬ; объединение репертуара пептидов или полипептидов и протеазы (например трипсина, эластазы, лейкозима) в условиях, подходящих для протеазной активности; и извлечение множества полипептидов, которые представляют собой бАЬ, обладающие специфичностью связывания в отношении ΙΕ-1Κ1. Способ может быть использован для получения наивного репертуара или репертуара, который смещен в сторону желаемой специфичности связывания, такого как репертуар созревания аффинности на основе родительского ЙАЬ, обладающего специфичностью связывания в отношении ΙΕ-1Κ1.
Полипептидные дисплейные системы
В одном из воплощений репертуар или библиотека пептидов или полипептидов, предложенные для применения в способах по изобретению, содержали подходящую дисплейную систему. Дисплейная система может препятствовать расщеплению протеазой (например одной протеазой или комбинацией протеаз и любым биологическим экстрактом, гомогенатом или препаратом, который содержит протеолитическую активность (например мокротой, слизью (например желудочной слизью, носовой слизью, бронхиальной слизью), бронхоальвеолярным лаважем, гомогенатом легких, экстрактом легких, экстрактом поджелудочной железы, желудочной жидкостью, слюной, слезами и тому подобным)). Дисплейная система и связь между этой дисплейной системой и экспонируемым полипептидом в одном из воплощений, по меньшей мере, настолько устойчивы к протеазе, насколько устойчивы наиболее стабильные пептиды или полипептиды репертуара. Это позволяет легко выделять и/или амплифицировать нуклеиновую кислоту, которая кодирует селектированный экспонируемый полипептид.
В одном из примеров протеазоустойчивый пептид или полипептид, например ЙАЬ, может быть селектирован, выделен и/или извлечен из репертуара пептидов или полипептидов, который находится в растворе или ковалентно или нековалентно присоединен к подходящей поверхности, такой как пластик или стекло (например титрационный микропланшет, полипептидный чип, такой как микрочип). Например, можно использовать чип пептидов на поверхности способом, посредством которого каждый индивидуальный член библиотеки (например уникальная пептидная последовательность) располагается в отдельном, предварительно определенном месте в данном чипе. Идентичность каждого члена библиотеки в
- 29 018129 таком чипе можно определить по его пространственному положению в данном чипе. Те положения в чипе, где происходят связывающие взаимодействия, например, между целевым лигандом и реакционноспособными членами библиотеки, могут быть определены, таким образом идентифицируют последовательности реакционноспособных членов на основе пространственного расположения (см., например, патент США № 5143854, №О 90/15070 и №О 92/10092).
В одном из воплощений в данных способах используют дисплейную систему, которая связывает кодирующую функцию нуклеиновой кислоты и физические, химические и/или функциональные характеристики полипептида, кодируемого данной нуклеиновой кислотой. Такая дисплейная система может содержать множество способных реплицируемых генетических комплексов, таких как бактериофаг или клетки (бактерии). В одном из воплощений дисплейная система содержит библиотеку, такую как бактериофаг-дисплейная библиотека.
Описаны несколько подходящих бактериофаг-дисплейных систем (например, моновалентные дисплейные и поливалентные дисплейные системы). (См., например, СпГГййк и др., патент США № 6555313 В1 (включенный в данное описание посредством ссылки); 1оЬи8оп и др., патент США № 5733743 (включенный в данное описание посредством ссылки); МсСаГГейу и др., патент США № 5969108 (включенный в данное описание посредством ссылки); МиШдап-Кейое, патент США № 5702892 (включенный в данное описание посредством ссылки); ХУпИек С. е! а1., Аппи. Веу. 1ттипо1. 12: 433-455 (1994); Зоитййоп, Р. е! а1., Арр1. Вюсйет. Вю!есйпо1. 47(2-3): 175-189 (1994); Сайадпой, Ь. е! а1., СотЬ. С1ет. Шдй Тйгоидйри! 8сгееп., 4(2): 121-133 (2001).) Пептиды или полипептиды, экспонируемые в бактериофаг-дисплейной системе, могут экспонироваться, например, на любом подходящем бактериофаге, таком как нитчатый фаг (например Гб, М13, Е1), литический фаг (например Т4, Т7, лямбда) или РНК-содержащий фаг (например М82).
В большинстве случаев получают или предлагают библиотеку фага, экспонирующего репертуар пептидов или полипептидов в виде белков, слитых с подходящим оболочечным фаговым белком (например с р111-белком Гб). Слитый белок может экспонировать пептиды или полипептиды на конце оболочечного фагового белка, или, если будет желательно, во внутреннем положении. Например, экспонируемый пептид или полипептид может быть представлен в положении, которое является аминоконцевым относительно домена 1 в р111 (домен 1 в р111 также обозначают как N1). Экспонируемый полипептид может быть непосредственно слит с р111 (например с Ν-концом домена 1 в рШ) или слит с р111 с использованием линкера. При желании, такая слитая конструкция может дополнительно содержать метку (например эпитоп тус, Ηίδ-метку). Библиотеки, содержащие репертуар пептидов или полипептидов, которые экспонируются в виде белков, слитых с оболочечным фаговым белком, могут быть получены с использованием любых подходящих способов, таких как введение библиотеки фаговых векторов или фагмидных векторов, кодирующих экспонируемые пептиды или полипептиды в подходящих бактериях-хозяевах, и культивирование полученных бактерий для продуцирования фага (например, с использованием подходящего хелперного фага или комплементирующей плазмиды, при желании). Библиотека фага может быть извлечена из культуры с использованием любого подходящего метода, такого как осаждение и центрифугирование.
Дисплейная система может содержать репертуар пептидов или полипептидов, который содержит любое желаемое количество разнообразных вариантов. Например, репертуар может содержать пептиды или полипептиды, которые имеют аминокислотные последовательности, соответствующие природным полипептидам, экспрессируемым организмом, группой организмов (например репертуар последовательностей νΗΗ бАЬ, выделенной из верблюдов), желаемой тканью или желаемым типом клеток, или может содержать пептиды или полипептиды, которые имеют случайные или рандомизированные аминокислотные последовательности. При желании, полипептиды могут иметь общий кор или каркас. Полипептиды в таком репертуаре или такой библиотеке могут содержать определенные области случайной или рандомизированной аминокислотной последовательности и области общей аминокислотной последовательности. В некоторых воплощениях все или, по существу, все полипептиды в репертуаре являются полипептидами желаемого типа, такими как желаемый фермент (например полимераза) или желаемый антигенсвязывающий фрагмент антитела (например νΗ человека или ν9 человека). В предпочтительных воплощениях полипептидная дисплейная система содержит репертуар полипептидов, где каждый полипептид содержит вариабельный домен антитела. Например, каждый полипептид в репертуаре может содержать νΗ, ν9 или Εν (например одноцепочечный Εν).
Разнообразие аминокислотной последовательности может быть введено в любую желаемую область пептида или полипептида, или каркаса с использованием любого подходящего способа. Например, разнообразие аминокислотной последовательности может быть введено в целевую область, такую как гипервариабельная область вариабельного домена антитела или гидрофобный домен, посредством получения библиотеки нуклеиновых кислот, кодирующих разнообразные полипептиды, с использованием любых подходящих методов мутагенеза (например ПЦР пониженной точности, олигонуклеотидопосредованного или сайт-направленного мутагенеза, диверсификации с использованием кодонов ΝΝΚ) или любого другого подходящего способа. При желании, область диверсифицируемого полипептида может быть рандомизирована.
- 30 018129
Размер полипептидов, образующих репертуар, в значительной степени является предметом выбора и единый размер полипептида не обязателен. В одном из воплощений полипептиды в репертуаре имеют, по меньшей мере, третичную структуру (образуют по меньшей мере один домен).
С елекция/ выделение/ извлечение
Протеазоустойчивый пептид или полипептид (например популяция протеазоустойчивых полипептидов) может быть селектирован, выделен и/или извлечен из репертуара или библиотеки (например, в дисплейной системе) с использованием любого подходящего способа. В одном из воплощений протеазоустойчивый полипептид селектируют или выделяют на основании селектируемой характеристики (например, физической характеристики, химической характеристики, функциональной характеристики). Подходящие селектируемые функциональные характеристики включают биологические активности пептидов или полипептидов в репертуаре, например связывание с типичным лигандом (например, суперантигеном), связывание с целевым лигандом (например антигеном, эпитопом, субстратом), связывание с антителом (например, через эпитоп, экспрессируемый на пептиде или полипептиде) и каталитическую активность (см., например, Тошйпкоп е1 а1., ΧΥΟ 99/20749; \νΟ 01/57065; \νΟ 99/58655). В одном из воплощений селекция основана на специфическом связывании с 1Ь-1К1. В еще одном воплощении селекция основана на выбранной функциональной характеристике с получением второго репертуара, в котором члены являются протеазоустойчивыми, с последующей селекцией члена из второго репертуара, специфически связывающегося с 1Ь-1К1.
В некоторых воплощениях протеазоустойчивый пептид или полипептид селектируют и/или выделяют из библиотеки или репертуара пептидов или полипептидов, в которых, по существу, все протеазоустойчивые пептиды или полипептиды имеют общий селектируемый признак. Например, протеазоустойчивый пептид или полипептид может быть селектирован из библиотеки или репертуара, в которых, по существу, все протеазоустойчивые пептиды или полипептиды связываются с общим типичным лигандом, связываются с общим целевым лигандом, связываются (или связаны) с общим антителом или обладают общей каталитической активностью. Этот тип селекции особенно полезен для получения репертуара протеазоустойчивых пептидов или полипептидов на основе родительского пептида или полипептида, который имеет желаемую биологическую активность, например, при осуществлении созревания аффинности иммуноглобулинового единичного вариабельного домена.
Селекция на основе связывания с общим типичным лигандом может привести к получению коллекции или популяции пептидов или полипептидов, содержащих все или, по существу, все протеазоустойчивые пептиды или полипептиды, которые являлись компонентами первоначальных библиотеки или репертуара. Например, пептиды или полипептиды, которые связываются с целевым лигандом или типичным лигандом, таким как белок А, белок Ь или антитело, могут быть селектированы, выделены и/или извлечены посредством пэннинга или с использованием подходящей аффинной матрицы. Пэннинг может быть осуществлен путем добавления раствора лиганда (например, типичного лиганда, целевого лиганда) в подходящий сосуд (например, пробирку, чашку Петри) и обеспечения возможности для лиганда осаждаться на стенках или покрывать стенки сосуда. Избыток лиганда можно отмыть, и пептиды или полипептиды (например репертуар, который инкубировали с протеазой) можно добавить в сосуд и сосуд поддерживать в условиях, подходящих для связывания пептидов или полипептидов с иммобилизованным лигандом. Несвязавшиеся пептиды или полипептиды можно отмыть, а связавшиеся пептиды или полипептиды можно извлечь с использованием любого подходящего способа, такого как, например, соскабливание или снижение рН.
Подходящие аффинные матрицы на основе лиганда, как правило, содержат твердую подложку или гранулу (например агарозу), к которой ковалентно или нековалентно присоединен лиганд. Аффинная матрица может быть объединена с пептидами или полипептидами (например, с репертуаром, который инкубировали с протеазой) с использованием периодического способа, колоночного способа или любого другого подходящего способа в условиях, подходящих для связывания пептидов или полипептидов с лигандом на матрице. Пептиды или полипептиды, которые не связываются с аффинной матрицей, можно отмыть, а связавшиеся пептиды или полипептиды можно элюировать и извлечь с использованием любого подходящего способа, такого как элюция буфером с более низким рН, мягким денатурирующим агентом (например, мочевиной) или пептидом, который конкурирует за связывание с лигандом. В одном из примеров биотинилированный целевой лиганд объединяют с репертуаром в условиях, подходящих для связывания пептидов или полипептидов в этом репертуаре с целевым лигандом (1Ь-1К1). Связавшиеся пептиды или полипептиды извлекают, используя иммобилизованный авидин или стрептавидин (например, на грануле).
В некоторых воплощениях типичным лигандом является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются со структурными особенностями пептидов или полипептидов, являющимися, по существу, консервативными в пептидах или полипептидах библиотеки или репертуара, особенно полезны в качестве типичных лигандов. Антитела и антигенсвязывающие фрагменты, подходящие для применения в качестве лигандов для выделения, селекции и/или извлечения протеазоустойчивых пептидов или полипептидов, могут быть моноклональными или поликлональными и могут быть получены с использованием любого подходящего метода.
- 31 018129
Библиотеки/Репертуары
В других аспектах изобретение относится к репертуарам протеазоустойчивых пептидов и полипептидов, к библиотекам, кодирующим протеазоустойчивые пептиды и полипептиды, и к способам получения таких библиотек и репертуаров.
Библиотеки, которые кодируют и/или содержат протеазоустойчивые пептиды и полипептиды, могут быть приготовлены или получены с использованием любого подходящего способа. Библиотека по изобретению может быть сконструирована таким образом, чтобы кодировать протеазоустойчивые пептиды или полипептиды на основе представляющего интерес пептида или полипептида (например пептида или полипептида против 1Б-1Я1, селектированного из библиотеки), или может быть селектирована из другой библиотеки с использованием способов, описанных в данной заявке. Например, библиотека, обогащенная протеазоустойчивыми полипептидами, может быть получена с использованием подходящей полипептидной дисплейной системы.
В одном из примеров фаг-дисплейную библиотеку, содержащую репертуар экспонируемых полипептидов, содержащих иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены (например Ун, Ук, νλ), объединяют с протеазой в условиях, подходящих для протеазной активности, как описано в данной заявке. Протеазоустойчивые полипептиды извлекают на основании желаемой биологической активности, такой как связывающая активность (например, связывание с типичным лигандом, связывание с целевым лигандом), получая в результате фаг-дисплейную библиотеку, обогащенную протеазоустойчивыми полипептидами. В одном из воплощений извлечение основано на связывании типичного лиганда с получением обогащенной библиотеки, а затем селекции члена этой библиотеки против 1Б-1Я1 на основе специфического связывания с 1Б-1Я1.
В другом примере сначала проводят скрининг фаг-дисплейной библиотеки, содержащей репертуар экспонируемых полипептидов, содержащих иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены (например, Ун, Ук, νλ), для идентификации членов репертуара, обладающих специфичностью связывания с желаемым целевым антигеном (1Б-1Я1). Извлекают коллекцию полипептидов, имеющих желаемую специфичность связывания, и эту коллекцию объединяют с протеазой в условиях, подходящих для протеолитической активности, как описано в данной заявке. Коллекцию протеазоустойчивых полипептидов, которые имеют желаемую специфичность связывания с мишенью, извлекают, получая библиотеку, обогащенную протеазоустойчивыми и высокоаффинными полипептидами. Как описано в данной заявке, протеазоустойчивость в данном способе селекции коррелирует с высокой аффинностью связывания.
Библиотеки, которые кодируют репертуар желаемого типа полипептидов, могут быть легко получены с использованием любого подходящего способа. Например, можно получить последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую желаемый тип полипептида (например полимеразу, иммуноглобулиновый вариабельный домен), а можно приготовить коллекцию нуклеиновых кислот, каждая из которых содержит одну или более мутаций, например, посредством амплификации нуклеиновой кислоты с использованием системы ПЦР (полимеразной цепной реакции) пониженной точности (еггог-ргопе РСЯ), посредством химического мутагенеза (Бепд е! а1, 1. Бю1. Скет., 269: 9533 (1994)) или с использованием бактериальных мутаторных штаммов (Боте е! а1., 1. Μο1. Бю1., 260: 359 (1996)).
В других воплощениях конкретные области нуклеиновой кислоты могут быть выбраны в качестве мишеней для диверсификации. Методы введения мутаций в выбранные положения также общеизвестны в данной области техники и включают, например, использование ошибочно спаренных олигонуклеотидов или вырожденных олигонуклеотидов с применением или без применения ПЦР. Например, были созданы библиотеки синтетических антител посредством направленных мутаций в антигенсвязывающих петлях. Произвольные или полупроизвольные Н3- и Ь3-области антител присоединяли к У-генным сегментам иммуноглобулинов зародышевой линии с получением больших библиотек с немутировавшими каркасными областями (НоодепЬоот и Ат!ег (1992), выше; Νίκκίιη е! а1. (1994), выше; ΟπΓΠΐΙικ е! а1. (1994), выше; БеКгшГ е! а1. (1995), выше). Такая диверсификация была расширена с тем, чтобы включить некоторые или все другие антигенсвязывающие петли (Статей е! а1. (1996) Ыа!иге Μеб., 2: 100; Я1есЬтапп е! а1. (1995) Бю/Тесйпо1оду, 13: 475; Μο^рйοκуκ, АО 97/08320, выше). В других воплощениях конкретные области нуклеиновой кислоты могут быть выбраны в качестве мишеней для диверсификации, например, посредством двухстадийной стратегии ПЦР, в которой продукт первой ПЦР используют в качестве мегапраймера (см., например, Ьапб!, О. е! а1., Оепе 96: 125-128 (1990)). Направленная диверсификация также может быть осуществлена, например, посредством 8ОЕ (крНсшд Ьу оуейарршд ех!епкюп) РСЯ (ПЦР со сплайсингом частично перекрывающихся концов). (См., например, Нойои, ЯМ. е! а1., Оепе 77: 61-68 (1989)).
Разнообразие последовательности в выбранных положениях может быть достигнуто путем изменения кодирующей последовательности, которая определяет последовательность полипептида таким образом, чтобы множество возможных аминокислот (например все 20 или их подмножество) можно было включить в данное положение. В соответствии с номенклатурой ШРАС (Международный союз теоретической и прикладной химии) наиболее универсальным кодоном (уегкаШе собоп) является ΝΝΚ, который кодирует все аминокислоты, а также стоп-кодон ТАО. Кодон ΝΝΚ может быть использован для введения
- 32 018129 необходимого разнообразия. Также используют другие кодоны, с помощью которых добиваются той же цели, включая кодон ΝΝΝ, который приводит к созданию дополнительных стоп-кодонов ТСА и ТАА. Такой направленный подход может обеспечить возможность изучения всей последовательности в целевой области.
Библиотеки могут содержать протеазоустойчивые полипептиды антител, которые имеют известную конформацию основной цепи (см., например, Тотбивои и др., \УО 99/20749).
Библиотеки могут быть получены в подходящих плазмиде или векторе. Как использовано в данной заявке, вектор относится к дискретному элементу, который используют для введения гетерологичной ДНК в клетки для ее экспрессии и/или репликации. Можно использовать любой подходящий вектор, включая плазмиды (например бактериальные плазмиды), векторы на основе вирусов или бактериофагов, искусственные хромосомы и эписомальные векторы. Такие векторы могут быть использованы для простого клонирования и мутагенеза, или экспрессирующий вектор может быть использован для управления экспрессией библиотеки. Векторы и плазмиды обычно содержат один или более клонирующих сайтов (например полилинкер), ориджин репликации и по меньшей мере один селектируемый маркерный ген. Экспрессирующие векторы могут дополнительно содержать элементы для управления транскрипцией и трансляцией полипептида, такие как энхансерный элемент, промотор, сигнал терминации транскрипции, сигнальные последовательности и тому подобное. Эти элементы могут быть расположены таким образом, чтобы функциональным образом связываться с клонируемой вставкой, кодирующей полипептид, так что полипептид экспрессируется и продуцируется, когда такой экспрессирующий вектор поддерживают в условиях, подходящих для экспрессии (например в подходящей клетке-хозяине).
Клонирующие и экспрессирующие векторы, как правило, содержат последовательности нуклеиновой кислоты, позволяющие вектору реплицироваться в одном или более выбранных типах клеток-хозяев. Обычно в клонирующих векторах эта последовательность представляет собой последовательность, позволяющую вектору реплицироваться независимо от хромосомной ДНК хозяина, и включает ориджины репликации или автономно реплицирующиеся последовательности. Такие последовательности хорошо известны для многих бактерий, дрожжей и вирусов. Ориджин репликация из плазмиды рВК322 подходит для большинства грамотрицательных бактерий, 2-микронный плазмидный ориджин подходит для дрожжей, а различные вирусные ориджины (например 8У40 (обезьяньего вируса 40), аденовируса) полезны для клонирования векторов в клетках млекопитающих. Как правило, ориджинт репликации не требуется для экспрессирующих векторов млекопитающих за исключением тех случаев, когда их используют в клетках млекопитающих, способных реплицировать высокие уровни ДНК, таких как клетки СО8 (клетки почки африканской зеленой мартышки).
Клонирующие или экспрессирующие векторы могут содержать ген селекции, также называемый селектируемым маркером. Такие маркерные гены кодируют белок, необходимый для выживания или роста трансформированных клеток-хозяев, растущих в селективной культуральной среде. Поэтому клетки-хозяева, не трансформированные вектором, содержащим ген селекции, не будут выживать в данной культуральной среде. Типичные гены селекции кодируют белки, которые придают устойчивость к антибиотикам и другим токсинам, например ампициллину, неомицину, метотрексату или тетрациклину, дополняют ауксотрофные дефициты или обеспечивают критические питательные вещества, отсутствующие в ростовых средах.
Подходящие экспрессирующие векторы могут содержать различные компоненты, например ориджин репликации, селектируемый маркерный ген, один или более элементов регуляции экспрессии, таких как элемент регуляции транскрипции (например промотор, энхансер, терминатор) и/или один или более сигналов трансляции, сигнальную последовательность или лидерную последовательность и тому подобное. Элементы регуляции экспрессии и сигнальная или лидерная последовательность, если они присутствуют, могут обеспечиваться вектором или другим источником. Например, для непосредственной экспрессии могут быть использованы транскрипционные и/или трансляционные регуляторные последовательности клонируемой нуклеиновой кислоты, кодирующей цепь антитела.
Для экспрессии в желаемой клетке-хозяине может быть предложен промотор. Промоторы могут быть конститутивными или индуцибельными. Например, промотор может быть функциональным образом связан с нуклеиновой кислотой, кодирующей антитело, цепь антитела или его участок, так что он направляет транскрипцию нуклеиновой кислоты. Имеются различные подходящие промоторы для прокариотических (например β-лактамазная и лактозная промоторные системы, щелочная фосфатаза, триптофановая (!гр) промоторная система, промоторы 1ас, 1ас, Т3, Т7 для Е. соб) и эукариотических (например, ранний и поздний промотор обезьянего вируса 40, промотор длинных концевых повторов вируса саркомы Рауса, цитомегаловирусный промотор, поздний промотор аденовируса, промотор ЕС-1а) хозяев.
В дополнение к этому, экспрессирующие векторы обычно содержат селектируемый маркер для селекции клеток-хозяев, несущих данный вектор, и, в случае реплицируемого экспрессирующего вектора, ориджин репликации. Гены, кодирующие продукты, которые придают устойчивость к антибиотикам или лекарственным средствам, представляют собой общеизвестные селектируемые маркеры и могут быть использованы в прокариотических (например, ген β-лактамазы (устойчивость к ампициллину), ген Те!
- 33 018129 для устойчивости к тетрациклину) и эукариотических клетках (например гены устойчивости к неомицину (С418 или генетицину), др! (микофеноловой кислоте), ампициллину или гигромицину). Маркерные гены дигидрофолатредуктазы позволяют проводить селекцию с метотрексатом в различных хозяевах. Гены, кодирующие генный продукт ауксотрофных маркеров хозяина (например, ЬЕИ2, ИКА3, И183), часто используют в качестве селектируемых маркеров в дрожжах. Также рассматривается применение вирусных (например бакуловирусных) или фаговых векторов и векторов, которые способны интегрироваться в геном клетки-хозяина, таких как ретровирусные векторы.
Подходящие экспрессирующие векторы для экспрессии в прокариотических клетках (например бактериальных клетках, таких как Е. сой) или клетках млекопитающих включают, например, вектор рЕТ (например рЕТ-12а, рЕТ-36, рЕТ-37, рЕТ-39, рЕТ-40; Nονадеη и других фирм), фаговый вектор (например, ρί,’ΛΝΤΛΒ 5 Е; Рйагтас1а), рК1Т2Т (вектор, представляющий собой слияние с белком А, Рйагтас1а), рСЭМ8, рСОтЫ/атр, рс^NА3.1, рКс/К8У, рЕЕ-1 (1п\Игодеп. СагИЬаб, СА), рСМУ-8СК1РТ, рЕВ, р8С5, рХТ1 (8!га!адепе, Ьа Ло11а, СА), рСЭЕЕ3 (Со1бтап, Ь.А., е! а1., Вю1есйпк.|ие8. 21: 1013-1015 (1996)), р8У8РОКТ (С1ЬсоВКЬ, КоскуШе, ΜΌ), рЕЕ-Вок (Μίζιΐ81ιίιηη. 8., е! а1., №.1с1ею Ас1бк Кек., 18: 5322 (1990)) и тому подобное. Доступны экспрессирующие векторы, которые подходят для применения в различных экспрессирующих хозяевах, таких как прокариотические клетки (Е. сой), клетки насекомых (клетки 82 Эгокорйба 8сйтебег, 8Г9), дрожжи (Р. те!йапойса, Р. райогщ, 8. се^еν^κ^ае) и клетки млекопитающих (например, клетки СО8).
Примеры векторов представляют собой экспрессирующие векторы, которые обеспечивают экспрессию нуклеотидной последовательности, соответствующей члену библиотеки полипептидов. Так, селекция с использованием типичных и/или целевых лигандов может быть осуществлена посредством раздельного размножения и экспрессии единичного клона, экспрессирующего член библиотеки полипептидов. Как описано выше, предпочтительной дисплейной системой для селекции является бактериофаговый дисплей. Так, могут быть использованы фаговые или фагмидные векторы. Предпочтительными векторами являются фагмидные векторы, имеющие ориджин репликации Е. сой (для двухцепочечной репликации), а также фаговый ориджин репликации (для продуцирования одноцепочечной ДНК). Манипуляция такими векторами и их экспрессия хорошо известны в данной области техники (ноодепЬоот апб ХУйНег (1992), выше; Νίκκίιη е! а1. (1994), выше). Кратко, вектор может содержать ген β-лактамазы на фагмиде для придания селективности и 1ас-промотор, расположенный выше экспрессирующей кассеты, которая может содержать подходящую лидерную последовательность, сайт множественного клонирования, одну или более пептидных меток, один или более стоп-кодонов ТАС и фаговый белок рШ. Таким образом, с использованием различных супрессорных и несупрессорных штаммов Е. сой и с добавлением глюкозы, изопропилтио-в-Э-галактозида (1РТС) или хелперного фага, такого как УС8 М13, вектор способен реплицироваться в виде плазмиды без какой-либо экспрессии, продуцировать большие количества только данного члена библиотеки полипептидов либо продуктивные фаги, некоторые из них содержат по меньшей мере одну копию слитой конструкции полипептид-р111 на своей поверхности.
Библиотеки и репертуары по изобретению могут содержать форматы антител. Например, полипептид, содержащийся в библиотеках и репертуарах, может представлять собой отдельные Ун- или Уъдомены, каждый из которых либо модифицирован, либо не модифицирован. Фрагменты ксРу. а также другие полипептиды антител могут быть легко получены с использованием любого подходящего метода. В данной области техники хорошо известны различные подходящие методы конструирования антител. Например, ксЕу может быть образован путем соединения нуклеиновых кислот, кодирующих два вариабельных домена, с подходящим олигонуклеотидом, который кодирует соответствующий линкерный пептид, такой как (С1у-С1у-С1у-С1у-8ег)3, или другие подходящие линкерные пептиды. Линкер связывает Сконец первой У-области и Ν-конец второй У-области. Для конструирования других форматов антител, таких как Εν-, ЕаЬ- и Е(аЬ')2-фрагменты, могут быть использованы аналогичные методики. Для образования ЕаЬ- и Р(аЬ')2-фрагментов полипептиды Ун и Уъ могут быть объединены с сегментами константной области, которые могут быть выделены из перегруппированных генов, С-генов зародышевой линии или синтезированы на основании данных о последовательности антитела. Библиотека или репертуар по изобретению могут представлять собой библиотеку или репертуар Ун или Уь.
Полипептиды, содержащие протеазоустойчивый вариабельный домен, предпочтительно содержат сайт связывания с целевым лигандом (1Й-1К1) и сайт связывания с типичным лигандом. В некоторых воплощениях сайтом связывания с типичным лигандом является сайт связывания для суперантигена, такого как белок А, белок Ь или белок С. Основой для вариабельных доменов может служить любой желаемый вариабельный домен, например Ун человека (например Ун 1а, Ун 1Ь, Ун 2, Ун 3, Ун 4, Ун 5, Ун 6), УХ человека (например УХ1, УХ11, УХ111, УХ1У, УХУ, УХУ1 или Ук1) или Ук человека (например Ук2, Ук3, Ук4, Ук5, Ук6, Ук7, Ук8, Ук9 ИЛИ Ук10) или Унн верблюда, возможно гуманизированный.
Нуклеиновые кислоты, клетки-хозяева и способы получения протеазоустойчивых полипептидов
Данное изобретение также относится к выделенным и/или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, кодирующим протеазоустойчивые пептиды или полипептиды, например селектируемые или селектированные способами, описанными в данной заявке.
- 34 018129
Нуклеиновые кислоты, названные в данной заявке выделенными, представляют собой нуклеиновые кислоты, которые отделены от другого материала (например других нуклеиновых кислот, таких как геномная ДНК, кДНК и/или РНК) в своем первоначальном окружении (например, в клетках или в смеси нуклеиновых кислот, такой как библиотека). Выделенная нуклеиновая кислота может быть выделена как часть вектора (например, плазмиды).
Нуклеиновые кислоты, названные в данной заявке рекомбинантными, представляют собой нуклеиновые кислоты, которые получены с использованием методологии рекомбинантной ДНК, включая способы, основанные на искусственной рекомбинации, такие как клонирование в вектор или хромосому с использованием, например, рестрикционных ферментов, гомологичная рекомбинация, вирусы и тому подобное, и нуклеиновые кислоты, полученные с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Изобретение также относится к рекомбинантной клетке-хозяину, которая содержит (одну или более чем одну) рекомбинантную нуклеиновую кислоту или экспрессирующую конструкцию, содержащую нуклеиновую кислоту, кодирующую протеазоустойчивый пептид или полипептид, например пептид или полипептид, селектируемый или селектированный способами, описанными в данной заявке. Изобретение также включает способ получения протеазоустойчивого пептида или полипептида, включающий поддержание рекомбинантной клетки-хозяина по изобретению в условиях, подходящих для экспрессии данного протеазоустойчивого пептида или полипептида. Способ может дополнительно включать стадию выделения или извлечения протеазоустойчивого пептида или полипептида, если желательно.
Например, молекулу нуклеиновой кислоты (т.е. одну или более молекул нуклеиновой кислоты), кодирующую протеазоустойчивый пептид или полипептид, или экспрессирующую конструкцию (т.е. одну или более конструкций), содержащую такую(ие) молекулу(ы) нуклеиновой кислоты, можно ввести в подходящую клетку-хозяина для создания рекомбинантной клетки-хозяина, используя любой способ, подходящий для выбранной клетки-хозяина (например трансформацию, трансфекцию, электропорацию, инфекцию), с тем чтобы молекула(ы) нуклеиновой кислоты была(и) функциональным образом связана(ы) с одним или более элементами регуляции экспрессии (например, в векторе, в конструкции, созданной с помощью процессов, протекающих в данной клетке, интегрированной в геном клетки-хозяина). Полученную рекомбинантную клетку-хозяина можно поддерживать в условиях, подходящих для экспрессии (например в присутствии индуктора, в подходящем животном, в подходящих культуральных средах, дополненных подходящими солями, ростовыми факторами, антибиотиками, пищевыми добавками и т.д.), в результате чего продуцируется кодируемый пептид или полипептид. Если желательно, то кодируемый пептид или полипептид может быть выделен или извлечен (например, из животного, клетки-хозяина, среды, молока). Этот способ охватывает экспрессию в клетке-хозяине трансгенного животного (см., например, ΧΥΟ 92/03918, СепРНагш 1п1егпайопа1).
Протеазоустойчивый пептид или полипептид, селектированный способом, описанным в данной заявке, также можно продуцировать в подходящей экспрессирующей системе ш νίΙΐΌ с помощью химического синтеза или любого другого подходящего способа. Таким образом, в настоящем изобретении предложены протеазоустойчивые пептиды и полипептиды.
Полипептиды, йАЬ и антагонисты
Как описано и проиллюстрировано в данной заявке, протеазоустойчивые бАЬ по изобретению, как правило, связываются со своим целевым лигандом с высокой аффинностью. Таким образом, в другом аспекте предложен способ селекции, выделения и/или извлечения полипептида или бАЬ по изобретению, который связывается с 1Б-1К1 с высокой аффинностью. Как правило, способ включает получение библиотеки или репертуара пептидов или полипептидов (например бАЬ), объединение библиотеки или репертуара с протеазой (например с трипсином, эластазой, лейкозимом, панкреатином, слюной) в условиях, подходящих для протеазной активности, и селекцию, выделение и/или извлечение пептида или полипептида, который связывается с лигандом (например, целевым лигандом). Поскольку библиотека или репертуар подвергается воздействию протеазы в условиях, в которых чувствительные к протеазе пептиды или полипептиды будут перевариваться, то активность протеазы может элиминировать менее стабильные полипептиды, имеющие низкую аффинность связывания, и таким образом обеспечивать коллекцию пептидов или полипептидов с высокой аффинностью связывания. Например, полипептид или бАЬ по изобретению может связываться с 1Б-1К1 с аффинностью (Кс; Кс = КоГ£(кб)/Коп(ка), как определено посредством поверхностного плазмонного резонанса) 1 мкМ или больше, или от примерно 500 нМ до примерно 0,5 пМ. Например, полипептид или бАЬ по изобретению может связываться с 1Б-1К1 с аффинностью примерно 500 нМ, примерно 100 нМ, примерно 10 нМ, примерно 1 нМ, примерно 500 пМ, примерно 100 пМ, примерно 10 пМ, примерно 1 пМ или примерно 0,5 пМ. Хотя авторы изобретения не связаны какой-либо конкретной теорией, полагают, что пептиды и полипептиды, устойчивые к протеазам, имеют более низкую энтропию и/или более высокую энергию стабилизации. Таким образом, корреляция между устойчивостью к протеазам и высокой аффинностью связывания может быть связана с компактностью и стабильностью поверхностей пептидов и полипептидов, и бАЬ, селектированных способом, описанным в данной заявке.
В одном из воплощений полипептид, бАЬ или антагонист по изобретению ингибирует связывание 1Ь-1 с 1Б-1К1 со средней ингибирующей концентрацией (1С50), равной или составляющей от примерно
- 35 018129
500 нМ до 50 пМ, или от 100 нМ до 50 пМ, или от 10 нМ до 100 пМ, или от 1 нМ до 100 пМ; например 50 нМ или меньше, или 5 нМ или меньше, или 500 пМ или меньше, или 200 пМ или меньше, или 100 пМ или меньше.
В некоторых воплощениях полипептид, ЙАЬ или антагонист специфически связываются с 1Б-1К1, например 1Б-1К1 человека, и диссоциируют из 1Б-1К1 человека с константой диссоциацией (Кс) от 300 нМ до 1 пМ, или от 300 нМ до 5 пМ, или от 50 нМ до 1 пМ, или от 50 нМ до 5 пМ, или от 50 нМ до 20 пМ, или примерно 10 пМ, или примерно 15 пМ, или примерно 20 пМ, как определено посредством поверхностного плазмонного резонанса. В некоторых воплощениях полипептид, ЙАЬ или антагонист специфически связываются с 1Б-1К1, например 1Б-1К1 человека, и диссоциируют из 1Б-1К1 человека с константой скорости Кой от 5х 10-1 с-1 до 1х 10-7 с-1, или от 1х 10-3 с-1 до 1х 10-7 с-1, или от 1х 10-4 с-1 до 1х 10-7 с-1, или от 1х 10-5 с-1 до 1х 10-7 с-1, или 1х 10-4 с-1, или 1х 10-5 с-1, как определено посредством поверхностного плазмонного резонанса. В некоторых воплощениях полипептид, ЙАЬ или антагонист специфически свя-3 -1 -1 -7 -1 -1 -3 -1 -1 зываются с 1Б-1К1, например 1Б-1К1 человека, с Коп от 1х 10 М с до 1х 10 М с , или от 1х 10 М с до 1х 10-6 М-1с-1, или примерно 1х 10-4 М-1с-1, или примерно 1х 10-5 М-1с-1. В одном из воплощений полипептид, ЙАЬ или антагонист специфически связываются с 1Б-1К1, например 1Б-1К1 человека, и диссоциируют из ГБ-1К1 человека с константой диссоциации (Кс) и Ко[1: которые определены в данном абзаце. В одном из воплощений полипептид, ЙАЬ или антагонист специфически связываются с 1Б-1К1, например 1Б-1К1 человека, и диссоциируют из 1Б-1К1 человека с константой диссоциации (Кс) и Коп, которые определены в данном абзаце. В некоторых воплощениях полипептид или ЙАЬ специфически связываются с 1Б-1К1 (например 1Б-1К1 человека) с Кс и/или Кой и/или Коп, которые указаны в данном абзаце, и содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на или по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную аминокислотной последовательности ЭОМ4-130202 (представленной на фиг. 4).
Полипептид, ЙАЬ или антагонист могут быть экспрессированы в Е. сой или в видах РюЫа (например Р. раЧопк). В одном из воплощений лиганд или мономер ЙАЬ секретируется в количестве по меньшей мере примерно 0,5 мг/л при экспрессии в Е. сой или видах РюЫа (например Р. раЧопк). Хотя лиганды и мономеры ЙАЬ, описанные в данной заявке, могут секретироваться при экспрессии в Е. сой или видах Р1сй1а (например Р. раЧопк), они могут быть получены с использованием любого подходящего способа, такого как способы химического синтеза или способы биологического продуцирования, в которых не используют Е. сой или виды РюЫа.
В некоторых воплощениях полипептид, ЙАЬ или антагонист не содержат верблюжий (Сатейй) иммуноглобулиновый вариабельный домен или одну или более каркасных аминокислот, которые являются уникальными для иммуноглобулиновых вариабельных доменов, кодируемых генными сегментами антитела зародышевой линии верблюда, например, в положении 108, 37, 44, 45 и/или 47.
Антагонисты 1Б-1К1 по изобретению могут быть моновалентными или поливалентными. В некоторых воплощениях антагонист является моновалентным и содержит один сайт связывания, который взаимодействует с 1Б-1К1, где сайт связывания обеспечивается полипептидом или ЙАЬ по изобретению. Моновалентные антагонисты связываются с одним 1Б-1К1 и не могут индуцировать перекрестное связывание или кластеризацию ГБ-1К1 на поверхности клеток, что может привести к активации этого рецептора и трансдукции сигнала.
В других воплощениях антагонист 1Б-1К1 является поливалентным. Поливалентные антагонисты 1Б-1К1 могут содержать две или более копий конкретного сайта связывания 1Б-1К1 или содержать два или более разных сайтов связывания, которые связываются с 1Б-1К1, где по меньшей мере один из сайтов связывания обеспечивается полипептидом или ЙАЬ по изобретению. Например, как описано в данной заявке, антагонист 1Б-1К1 может представлять собой димер, тример или мультимер, содержащий две или более копий конкретного полипептида или ЙАЬ по изобретению, который связывается с 1Б-1К1, или два или более разных полипептидов или ЙАЬ по изобретению, которые связываются с 1Б-1К1. В одном из воплощений поливалентный антагонист 1Б-1К1, по существу, не оказывает агонистического воздействия на 1Б-1К1 (действует в качестве агониста ГБ-1К1) в стандартном клеточном анализе (т.е. когда присутствует в концентрации 1 нМ, 10 нМ, 100 нМ, 1 мкМ, 10 мкМ, 100 мкМ, 1000 мкМ или 5000 мкМ, тогда приводит в результате к не более чем примерно 5% 1Ь-1К1-опосредованной активности, индуцированной 1Ь-1 (100 пг/мл) в анализе).
В некоторых воплощениях поливалентный антагонист 1Б-1К1 содержит два или более сайтов связывания с желаемым эпитопом или доменом 1Б-1К1.
В конкретных воплощениях полипептид, ЙАЬ или антагонист, по существу, не оказывает агонистического воздействия на 1Б-1К1 (действует в качестве агониста 1Б-1К1) в стандартном клеточном анализе (т.е. когда присутствует в концентрации 1 нМ, 10 нМ, 100 нМ, 1 мкМ, 10 мкМ, 100 мкМ, 1000 мкМ или 5000 мкМ, тогда приводит в результате к не более чем примерно 5% 1Ь-1К1-опосредованной активности, индуцированной ГС-1 (100 пг/мл) в анализе).
В некоторых воплощениях полипептид, ЙАЬ или антагонист по изобретению эффективны в моделях хронических воспалительных заболеваний при введении эффективного количества. Как правило, эффек- 36 018129 тивное количество составляет от примерно 1 до примерно 10 мг/кг (например примерно 1 мг/кг, примерно 2 мг/кг, примерно 3 мг/кг, примерно 4 мг/кг, примерно 5 мг/кг, примерно 6 мг/кг, примерно 7 мг/кг, примерно 8 мг/кг, примерно 9 мг/кг или примерно 10 мг/кг). Модели хронического воспалительного заболевания (см. описанные в ШО 2006038027) известны специалистам в данной области техники в качестве моделей, прогнозирующих терапевтическую эффективность у людей.
В других воплощениях полипептид, бАЬ или антагонист эффективен в модели ΣΒΌ (воспалительного заболевания кишечника) у мышей, индуцированной декстрансульфатом натрия (Ό88) (подробную информацию о модели см. в ШО 2006038027). Например, введение эффективного количества полипептида, бАЬ или антагониста может уменьшать среднюю оценку тяжести в Όδδ-индуцированной модели ШЭ у мышей, например от примерно 0,1 до примерно 2,5, от примерно 0,5 до примерно 2,5, от примерно 1 до примерно 2,5, от примерно 1,5 до примерно 2,5, или от примерно 2 до примерно 2,5 раз по сравнению с соответствующим контролем. В другом примере введение эффективного количества полипептида, бАЬ или антагониста может замедлять появление симптомов ШЭ в Όδδ-индуцированной модели ШЭ у мышей, например, примерно на 1 сутки, примерно 2 суток, примерно 3 суток, примерно 4 суток, примерно 5 суток, примерно 6 суток, примерно 7 суток, примерно 10 суток, примерно 14 суток, примерно 21 суток, или примерно 28 суток по сравнению с соответствующим контролем. В другом примере введение эффективного количества полипептида, бАЬ или антагониста может приводить в результате к средней оценке тяжести в Όδδ-индуцированной модели ΕΌ у мышей от 0 до примерно 0,5, от примерно 0,5 до примерно 1, от примерно 1 до примерно 1,5, от примерно 1,5 до примерно 2 или от примерно 2 до примерно 2,5.
В конкретных воплощениях полипептид, бАЬ или антагонист эффективен в модели хронического обструктивного заболевания легких (СОРЭ) у мышей, индуцированного табачным дымом (подробную информацию о модели см. в ШО 2006038027 и ШО 2007049017). Например, введение эффективного количества лиганда может уменьшать или замедлять появление симптомов СОРЭ по сравнению с соответствующим контролем.
Имеются модельные системы на животных, которые можно использовать для скрининга эффективности антагонистов Ш-1К1 (например их лигандов, антител или связывающих белков) в защите против заболевания или лечения заболевания. В данной области техники известны способы тестирования системной красной волчанки (8ЬЕ) на восприимчивых мышах (Кшдй! е! а1. (1978) 1. Ехр. Меб., 147: 1653; Кететйеп е! а1. (1978) №\ν Епд. 1. Меб., 299: 515). Злокачественную миастению (МС) тестируют на самках мышей 81Й/1, индуцируя заболевание растворимым белком АсйК из другого вида (Ьтб^йот е! а1. (1988) Абу. Iттиηо1., 42: 233). Артрит у восприимчивой линии мышей индуцируют путем введения коллагена II типа (81иай е! а1. (1984) Апп. Кеу. Iттипо1., 42: 233). Описана модель, в которой адъювантный артрит у восприимчивых крыс индуцируют инъекцией микобактериального белка теплового шока (Уап Ебеп е! а1. (1988) Мише, 331: 171). Тиреоидит у мышей индуцируют путем введения тиреоглобулина, как описано (Магоп е! а1. (1980) 1. Ехр. Меб., 152: 1115). Инсулинозависимый сахарный диабет (ЮЭМ) возникает естественным образом или может быть индуцирован у определенных линий мышей, например, описанных в Капа5а\\а е! а1. (1984) О|аЬе1о1од1а, 27: 113. ЕАЕ у мышей и крыс служит моделью рассеянного склероза (М8) у человека. В этой модели демиелинизирующее заболевание индуцируют путем введения миелинового основного белка (см. Ра1ет§оп (1986) Тех!Ьоок о£ Iттипораΐйо1оду, Мщсйег е! а1., ебк., Сгипе апб 81тайоп, №\ν Уогк, рр. 179-213; МсЕатйп е! а1. (1973) 8с1епсе, 179: 478 и 8а1ой е! а1. (1987) 1. Iттипо1., 138: 179).
Как правило, лиганды по настоящему изобретению (например, антагонисты) будут использоваться в очищенной форме вместе с фармакологически приемлемыми носителями. Обычно эти носители включают водные или спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, любые среды, включающие физиологический раствор, и/или буферные среды. Парентеральные разбавители включают раствор хлорида натрия, декстрозный раствор Рингера, декстрозу и хлорид натрия и раствор Рингера с лактатом. Подходящие физиологически приемлемые адъюванты, при необходимости хранения полипептидного комплекса в суспензии, могут быть выбраны из таких загустителей, как карбоксиметилцеллюлоза, поливинилпирролидон, желатин и альгинаты.
Внутривенные разбавители включают жидкость и питательные добавки и электролитные добавки, такие как разбавители на основе декстрозного раствора Рингера. Также могут присутствовать консерванты и другие добавки, такие как антимикробные средства, антиоксиданты, хелатирующие агенты и инертные газы (Маск (1982) КетшдФп'к Рйаттасеийса1 8с1епсе§, 16-е издание). Можно использовать различные подходящие композиции, включая композиции с длительным высвобождением.
Лиганды (например антагонисты) по настоящему изобретению могут быть использованы в виде вводимых по отдельности композиций или вместе с другими агентами. Они могут включать различные иммунотерапевтические лекарственные средства, такие как циклоспорин, метотрексат, адриамицин или цисплатин и иммунотоксины. Фармацевтические композиции могут включать коктейли различных цитотоксических или других агентов вместе с лигандами по настоящему изобретению или даже комбинациями лигандов по настоящему изобретению, имеющих различные специфичности, таких как лиганды, селектированные с использованием различных целевых антигенов или эпитопов, независимо от того, объединены они перед введением или нет.
- 37 018129
Путь введения фармацевтических композиций по изобретению может представлять собой любой из путей, хорошо известных средним специалистам в данной области техники. Что касается терапии, включая, но не ограничиваясь этим, иммунотерапию, то селектированные лиганды по изобретению могут быть введены любому пациенту в соответствии со стандартными методиками.
Введение может быть осуществлено любым подходящим способом, в том числе парентерально, внутривенно, внутримышечно, интраперитонеально, трансдермально, через легочный путь или соответственно также посредством прямой инфузии с использованием катетера. Дозировка и частота введения будут зависеть от возраста, пола и состояния пациента, совместного введения других лекарственных средств, противопоказаний и других параметров, которые должны быть учтены практикующим врачом. Введение может быть локальным (например локальная доставка в легкое путем внутрилегочного введения, например интраназального введения) или системным, по показаниям.
Лиганды по данному изобретению могут быть лиофилизированы для хранения и повторного разведения в подходящем носителе перед применением. Показано, что эта методика эффективна для традиционных иммуноглобулинов и что могут быть использованы известные в данной области методики лиофилизации и разведения. Специалистам в данной области техники будет понятно, что лиофилизация и разведение могут приводить к потере антителами активности в различной степени (например, что касается традиционных иммуноглобулинов, то Ι§Μ антитела имеют тенденцию к большей потере активности, чем 1дС антитела) и что используемые уровни, возможно, следует коррелировать с целью компенсации.
Композиции, содержащие лиганды по настоящему изобретению (например антагонисты), или их коктейль, можно вводить для профилактического и/или терапевтического лечения. В некоторых терапевтических применениях адекватное количество, необходимое для достижения, по меньшей мере, частичного ингибирования, подавления, модуляции, киллинга или какого-либо другого измеряемого параметра популяции выбранных клеток, определяют как терапевтически эффективную дозу. Количества, необходимые для достижения этой дозировки, будут зависеть от тяжести заболевания и общего состояния иммунной системы пациента, но обычно варьируют от 0,005 до 5,0 мг лиганда, например бАЬ или антагониста, на килограмм массы тела, где чаще всего используют дозы от 0,05 до 2,0 мг/кг/доза. В случае профилактических применений композиции, содержащие лиганды по настоящему изобретению или их коктейли, также можно вводить в похожих или несколько меньших дозировках для предупреждения, ингибирования или задержки начала заболевания (например для поддержания ремиссии или бессимптомного состояния, либо для предупреждения острой фазы). Практикующий врач сможет определить подходящий интервал дозирования для лечения, подавления или предупреждения заболевания. Когда лиганд 1Б-1К1 (например антагонист) вводят для лечения, подавления или предупреждения хронического воспалительного заболевания, тогда его можно вводить вплоть до четырех раз в сутки, два раза в неделю, один раз в неделю, один раз каждые две недели, один раз в месяц или один раз каждые два месяца в дозе, например от примерно 10 до примерно 80 мг/кг, от примерно 100 до примерно 80 мг/кг, от примерно 1 до примерно 80 мг/кг, от примерно 1 до примерно 70 мг/кг, от примерно 1 до примерно 60 мг/кг, от примерно 1 до примерно 50 мг/кг, от примерно 1 до примерно 40 мг/кг, от примерно 1 до примерно 30 мг/кг, от примерно 1 до примерно 20 мг/кг, от примерно 1 до примерно 10 мг/кг, от примерно 10 мкг/кг до примерно 10 мг/кг, от примерно 10 мкг/кг до примерно 5 мг/кг, от примерно 10 мкг/кг до примерно 2,5 мг/кг, примерно 1 мг/кг, примерно 2 мг/кг, примерно 3 мг/кг, примерно 4 мг/кг, примерно 5 мг/кг, примерно 6 мг/кг, примерно 7 мг/кг, примерно 8 мг/кг, примерно 9 мг/кг или примерно 10 мг/кг. В конкретных воплощениях лиганд ГБ-1К1 (например, антагонист) вводят для лечения, подавления или предупреждения хронического воспалительного заболевания один раз в неделю или один раз в месяц в дозе от примерно 10 мкг/кг до примерно 10 мг/кг (например, примерно 10 мкг/кг, примерно 100 мкг/кг, примерно 1 мг/кг, примерно 2 мг/кг, примерно 3 мг/кг, примерно 4 мг/кг, примерно 5 мг/кг, примерно 6 мг/кг, примерно 7 мг/кг, примерно 8 мг/кг, примерно 9 мг/кг или примерно 10 мг/кг).
Лечение или терапия, проведенные с использованием композиций, описанных в данной заявке, считаются эффективными, если один или более симптомов ослабляются (например по меньшей мере на 10% или по меньшей мере на один пункт по шкале клинической оценки) относительно таких симптомов, присутствующих до лечения, или относительно таких симптомов у индивидуума (человека или модельного животного), не подвергнутого лечению такой композицией или другим подходящим контролем. Конечно, симптомы будут варьировать в зависимости от целевого заболевания или расстройства, но могут быть оценены практикующим врачом или специалистом средней квалификации. Такие симптомы могут быть оценены, например, посредством мониторинга уровня одного или более биохимических индикаторов заболевания или расстройства (например уровней Фермента или метаболита, которые коррелируют с данным заболеванием, количеств пораженных клеток и т.д.). посредством мониторинга физических проявлений (например, воспаления, размера опухоли и т.д.) или согласно принятой шкале клинической оценки, например, расширенной шкале инвалидизации (Ехраибеб Б15аЬ11йу 8!а!ик 8са1е (ЕБ88)) (для множественного склероза), опроснику Ирвина больных воспалительным заболеванием кишечника (1гу1ие 1иПатта!огу Во\\е1 Б15еа5е Оие81юппа1ге) (32 вопроса позволяют оценить качество жизни в отношении кишечной функции, системных симптомов, социальной функции и эмоционального статуса оценка варьирует от 32 до 224 баллов, при этом более высокие баллы указывают на лучшее качество
- 38 018129 жизни), шкале оценки качества жизни больных ревматоидным артритом (ОиаШу οί ЫГе РНеита1о1б АгΙΐιπίίδ 8са1е) или другой приемлемой шкале клинической оценки, известной в данной области. Длительное (например, в течение одних суток или более, или еще дольше) ослабление симптомов заболевания или расстройства по меньшей мере на 10% или по меньшей мере на один или более пунктов по данной клинической шкале является показателем эффективного лечения. Аналогично, профилактика, осуществляемая с использованием композиции, описанной в данной заявке, является эффективной, если начало или тяжесть одного или более чем одного симптома замедляется, уменьшается или исчезает по сравнению с такими симптомами у аналогичного индивидуума (человека или животной модели), не подвергнутого лечению данной композицией.
Композиция, содержащая лиганд (например, антагонист) или его коктейль по настоящему изобретению, может быть использована в профилактических и терапевтических целях для изменения, инактивации, киллинга или удаления выбранной популяции целевых клеток у млекопитающего. В дополнение к этому, выбранные репертуары полипептидов, описанных в данной заявке, могут быть использованы экстракорпорально или селективно ίη νίΐτο для киллинга, истощения или иного эффективного удаления популяции целевых клеток из гетерогенной коллекции клеток. Кровь млекопитающего можно объединить экстракорпорально с лигандами, посредством чего нежелательные клетки подвергаются уничтожению или иным образом удаляются из крови для возврата млекопитающему в соответствии со стандартными методиками.
Композиция, содержащая лиганд (например, антагонист) по настоящему изобретению, может быть использована в профилактических и терапевтических целях для изменения, инактивации, уничтожения или удаления выбранной популяции целевых клеток у млекопитающего.
Лиганды (например, антагонисты против 1Ь-1К1, мономеры бАЬ) могут быть введены и/или приготовлены вместе с одним или более чем одним дополнительным терапевтическим или активным агентом. Когда лиганд (например, бАЬ) вводят с дополнительным терапевтическим агентом, тогда указанный лиганд может быть введен до, одновременно или после введения дополнительного агента. Как правило, лиганд и дополнительный агент вводят способом, обеспечивающим перекрывание терапевтического эффекта.
В одном из воплощений изобретение относится к способу лечения, подавления или предупреждения хронического воспалительного заболевания, включающему введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективной(ого) дозы или количества полипептида, бАЬ или антагониста 1Ь-1К1 по изобретению.
В одном из воплощений изобретение относится к способу лечения, подавления или предупреждения артрита (например, ревматоидного артрита, ювенильного ревматоидного артрита, анкилозирующего спондилита, псориатического артрита), включающему введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективной(ого) дозы или количества полипептида, бАЬ или антагониста 1Ь-1В1 по изобретению.
В другом воплощении изобретение относится к способу лечения, подавления или предупреждения псориаза, включающему введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективной(ого) дозы или количества полипептида, бАЬ или антагониста 1Ь-1К1 по изобретению.
В другом воплощении изобретение относится к способу лечения, подавления или предупреждения воспалительного заболевания кишечника (например, болезни Крона, язвенного колита), включающему введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективной(ого) дозы или количества полипептида, бАЬ или антагониста 1Ь-1В1 по изобретению.
В другом воплощении изобретение относится к способу лечения, подавления или предупреждения хронического обструктивного заболевания легких (например, хронического бронхита, хронического обструктивного бронхита, эмфиземы), включающему введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективной(ого) дозы или количества полипептида, бАЬ или антагониста 1Ь-1В1 по изобретению.
В другом воплощении изобретение относится к способу лечения, подавления или предупреждения пневмонии (например, бактериальной пневмонии, такой как стафилококковая пневмония), включающему введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективной(ого) дозы или количества полипептида, бАЬ или антагониста 1Ь-1К1 по изобретению.
В изобретении предложен способ лечения, подавления или предупреждения других заболеваний легких в дополнение к хроническому обструктивному заболеванию легких и пневмонии. Другие заболевания легких, которые можно лечить, подавлять или предупреждать в соответствии с изобретением, включают, например, муковисцидоз и астму (например, стероид-резистентную астму). Таким образом, в другом воплощении изобретение относится к способу лечения, подавления или предупреждения заболевания легких (например, муковисцидоза, астмы), включающему введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективной(ого) дозы или количества полипептида, бАЬ или антагониста 1Ь-1К1 по изобретению.
В конкретных воплощениях антагонист 1Ь-1К1 вводят посредством внутрилегочной доставки, такой как ингаляция (например, внутрибронхиальная, интраназальная или пероральная ингаляция, интрана
- 39 018129 зальные капли), или посредством системной доставки (например парентеральной, внутривенной, внутримышечной, интраперитонеальной, подкожной).
В другом воплощении изобретение относится к способу лечения, подавления или предупреждения септического шока, включающему введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективной(ого) дозы или количества полипептида, бАЬ или антагониста 1Ь-1К1 по изобретению.
В другом аспекте изобретения предложена композиция, содержащая полипептид, бАЬ или антагонист 1Ь-1К1 по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент.
Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ лечения заболевания с использованием полипептида, бАЬ или антагониста 1Ь-1К1 либо композиции по настоящему изобретению. В одном из воплощений заболевание представляет собой рак или воспалительное заболевание, например ревматоидный артрит, астму или болезнь Крона.
Форматы
Увеличенный период полувыведения полезен для применений ίη νίνο иммуноглобулинов, особенно антител и в особенности фрагментов антител небольшого размера. Такие фрагменты (Εν, связанные дисульфидной связью Еу, ЕаЬ, 5сЕу, бАЬ) подвергаются быстрому клиренсу из организма; таким образом, несмотря на то, что они способны быстро достигать большинства частей организма, их можно быстро получить и с ними легче работать, их применения ίη νίνο были ограничены только их непродолжительной персистенцией ίη νίνο. Одно из воплощений изобретения решает эту проблему путем обеспечения увеличенного периода полувыведения лигандов ίη νίνο и, следовательно, более длительного сохранения в организме функциональной активности лиганда.
Методы фармакокинетического анализа и определения периода полувыведения лиганда хорошо известны специалистам в данной области техники. Подробности можно найти в Ι<Όηικ11ι, А е1 а1.: Сйетюа1 8(аЬ1П(у о£ РйагтасеийсаК А ΗаηбЬοοк £ог РкаппасЬ® и в Ре1ег5 е1 а1., Ркагтасоктекс анаРхЬ: А РгасПса1 Арргоаск (1996). Также дана ссылка на Рйагтасоктейск, Μ С1Ьа1б1 & Ό Регют опубликованную Μа^се1 Эеккег, 2п6 Кег. ех ебНю!! (1982), где описаны такие фармакокинетические параметры, как периоды полувыведения ΐ-альфа и ΐ-бета и площадь под кривой (АИС).
Периоды полувыведения (ΐ'/2 альфа и ΐ'/2 бета) и АИС можно определить из кривой зависимости концентрации лиганда в сыворотке от времени. Для моделирования кривой можно использовать пакет программ νίηΝοηΙίη (фирмы РкаглдЫ Согр., ΜοιιηΙηίη У1ете, СА94040, И8А). В первой фазе (альфа-фазе) лиганд в основном подвергается распределению в организме пациента с некоторой элиминацией. Вторая фаза (бета-фаза) представляет собой конечную фазу, когда лиганд уже распределен и концентрация в сыворотке уменьшается по мере того, как лиганд выводится из организма пациента. Период полувыведения ΐ-альфа представляет собой период полувыведения в первой фазе, а период полувыведения ΐ-бета представляет собой период полувыведения во второй фазе. Таким образом, в одном из воплощений согласно настоящему изобретению предложены лиганд или композиция, содержащая лиганд по изобретению, с периодом полувыведения ΐα в диапазоне 15 мин или больше. В одном из воплощений нижняя граница диапазона составляет 30, 45 мин, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 11 или 12 ч. В дополнение к этому, или альтернативно, лиганд или композиция по изобретению будут иметь период полувыведения ΐα в диапазоне до 12 ч включительно. В одном из воплощений верхняя граница диапазона составляет 11, 10, 9, 8, 7, 6 или 5 ч. Примером подходящего диапазона является диапазон от 1 до 6 ч, от 2 до 5 ч или от 3 до 4 ч.
В одном из воплощений согласно настоящему изобретению предложены лиганд (полипептид, бАЬ или антагонист) или композиция, содержащая лиганд по изобретению, с периодом полувыведения ΐβ в диапазоне 2,5 ч или больше. В одном из воплощений нижняя граница диапазона составляет 3, 4, 5, 6, 7, 10, 11 или 12 ч. В дополнение к этому, или альтернативно, лиганд или композиция по изобретению имеют период полувыведения ΐβ в диапазоне до 21 суток включительно. В одном из воплощений верхняя граница диапазона составляет 12, 24 ч, 2 суток, 3 суток, 5 суток, 10 суток, 15 суток или 20 суток. В одном из воплощений лиганд или композиция по изобретению будут иметь период полувыведения ΐβ в диапазоне от 12 до 60 ч. В другом воплощении он будет лежать в диапазоне от 12 до 48 ч. В еще одном воплощении он будет лежать в диапазоне от 12 до 26 ч.
В дополнение к этому или в противоположность приведенным выше критериям, согласно настоящему изобретению предложены лиганд или композиция, содержащая лиганд по изобретению, имеющие величину АИС (площадь под кривой) в диапазоне 1 мгмин/мл или больше. В одном из воплощений нижняя граница диапазона составляет 5, 10, 15, 20, 30, 100, 200 или 300 мгмин/мл. В дополнение к этому, или альтернативно, лиганд или композиция по изобретению имеют АИС в диапазоне до 600 мг-мин/мл. В одном из воплощений верхняя граница диапазона составляет 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 или 50 мг-мин/мл. В одном из воплощений лиганд по изобретению будет иметь АИС в диапазоне, выбранном из группы, состоящей из следующего: 15-150 мг-мин/мл, 15-100 мг-мин/мл, 15-75 мг-мин/мл и 15-50 мг-мин/мл.
Полипептиды и бАЬ по изобретению и антагонисты, содержащие их, могут быть форматированы с большим гидродинамическим размером, например, посредством присоединения ПЭГ (полиэтиленгликоль) группы, сывороточного альбумина, трансферрина, рецептора трансферрина или по меньшей мере
- 40 018129 его трансферрин-связывающей части, Рс-области антитела, или посредством конъюгирования с доменом антитела. Например, полипептиды, ЙАЬ и антагонисты были форматированы в виде более крупного антигенсвязывающего фрагмента антитела или в виде антитела (например, форматированы в виде РаЬ, РаЬ', Р(аЬ)2, Р(аЬ')2, [дС, 5сРу).
Гидродинамический размер лигандов (например, мономеров и мультимеров ЙАЬ) по изобретению может быть определен с использованием способов, которые хорошо известны в данной области техники. Например, для определения гидродинамического размера лиганда может быть использована гельфильтрационная хроматография. Матрицы, подходящие для гельфильтрационного определения гидродинамических размеров лигандов, такие как поперечно-сшитые агарозные матрицы, хорошо известны и легко доступны.
Размер формата лиганда (например размер ПЭГ группировки, присоединенной к мономеру ЙАЬ), можно варьировать в зависимости от желаемого применения. Например, когда лиганд, как предполагают, удаляется из кровообращения и проникает в периферические ткани, то желательно поддерживать гидродинамический размер лиганда достаточно низким для того, чтобы облегчить выход из кровотока. Альтернативно, когда желательно, чтобы лиганд оставался в системном кровообращении в течение более продолжительного периода времени, тогда размер лиганда можно увеличить, например, путем форматирования в виде Σд-подобного белка.
Увеличение периода полувыведения путем конъюгирования с антигеном или эпитопом, который увеличивает период полувыведения ΐη νίνο
Гидродинамический размер лиганда и период его полувыведения из сыворотки также могут быть увеличены путем конъюгирования или присоединения Σ^-1В1-связывающего полипептида, ЙАЬ или антагониста по изобретению к связывающему домену (например, антителу или фрагменту антитела), который связывается с антигеном или эпитопом, который увеличивает период полувыведения ίη νίνο, как описано в данной заявке. Например, Σ^-1В1-связывающий агент (например полипептид) может быть конъюгирован или связан с антителом или фрагментом антитела против сывороточного альбумина или против неонатального Рс-рецептора, например ЙАЬ, РаЬ, РаЬ' или 5сРу против 8А или против неонатального Рс-рецептора, или с аффителом против 8А или аффителом против неонатального Рс-рецептора, или авимером против 8А, или связывающим доменом против 8А, который содержит каркас, выбранный, но предпочтительно не ограниченный этим, из группы, состоящей из СТЬА-4, липокалина, 8рА, аффитела. авимера, ΟτοΕΣ и фибронектина (см. РСТ/СВ 2008/000453, поданную 8 февраля 2008 г., в которой описаны эти связывающие домены, при этом указанные домены и их последовательности включены в данную заявку посредством ссылки и образуют часть описания настоящего изобретения). Конъюгирование относится к композиции, содержащей полипептид, ЙАЬ или антагонист по изобретению, которые связываются (ковалентно или нековалентно) со связывающим доменом, который связывается с сывороточным альбумином.
Подходящие полипептиды, которые увеличивают период полувыведения из сыворотки ίη νίνο, включают, например, белки слияния лиганда, специфичного к рецептору трансферрина, и нейрофармацевтического агента (см. патент США № 5977307, содержание которого включено в данное описание посредством ссылки), рецептор эндотелиальных клеток капилляров головного мозга, трансферрин, рецептор трансферрина (например растворимый рецептор трансферрина), инсулин, рецептор инсулиноподобного ростового фактора 1 (ЮР 1), рецептор инсулиноподобного ростового фактора 2 (ЮР 2), рецептор инсулина, фактор свертывания крови X, а1-антитрипсин и ΗΝί 1α (ядерный фактор гепатоцитов 1а). Подходящие полипептиды, которые увеличивают период полувыведения из сыворотки, также включают альфа-1-гликопротеин (орозомукоид; ААС), альфа-1-антихимотрипсин (АСТ), альфа-1-микроглобулин (белок НС; А!М), антитромбин ΣΣΣ (ΛΤ ΣΣΣ), аполипопротеин А-1 (Аро А-1), аполипопротеин В (Аро В), церулоплазмин (Ср), компонент комплемента С3 (С3), компонент комплемента С4 (С4), ингибитор эстеразы С1 (С1 ΣΝΗ), С-реактивный белок (СВР), ферритин (РЕВ), гемопексин (НРХ), липопротеин(а) (Ьр(а)), маннозасвязывающий белок (МВР), миоглобин (Муо), преальбумин (транстиретин; РАЬ), ретинолсвязывающий белок (ВВР) и ревматоидный фактор (ВР).
Подходящие белки внеклеточного матрикса включают, например, коллагены, ламинины, интегрины и фибронектин. Коллагены являются основными белками внеклеточного матрикса. В настоящее время известно около 15 типов коллагеновых молекул, обнаруженных в различных частях организма, например коллаген Σ типа (составляющий 90% коллагена организма), обнаруженный в костях, коже, сухожилиях, связках, роговице, внутренних органах, или коллаген ΣΣ типа, обнаруженный в хряще, позвоночном диске, хорде и стекловидном теле глаза.
Подходящие белки крови включают, например, белки плазмы (например фибрин, α-2макроглобулин, сывороточный альбумин, фибриноген (например, фибриноген А, фибриноген В), сывороточный амилоидный белок А, гаптоглобин, профилин, убиквитин, утероглобулин и β-2микроглобулин), ферменты и ингибиторы ферментов (например, плазминоген, лизоцим, цистатин С, альфа-1-антитрипсин и панкреатический ингибитор трипсина), белки иммунной системы, такие как иммуноглобулиновые белки (например, ΣдΛ, ΣβΌ, ΣдΕ, ΣдС, ΣдΜ, легкие цепи (каппа/лямбда) иммуноглобули
- 41 018129 нов), транспортные белки (например ретинолсвязывающий белок, α-1-микроглобулин), дефензины (например бета-дефензин 1, дефензин нейтрофилов 1, дефензин нейтрофилов 2 и дефензин нейтрофилов 3) и тому подобное.
Подходящие белки, обнаруженные в гематоэнцефалическом барьере или в нервной ткани, включают, например, рецептор меланокортина, миелин, переносчик аскорбата и тому подобное.
Подходящие полипептиды, которые увеличивают период полувыведения из сыворотки ίη νίνο, также включают белки, локализованные в почке (например, полицистин, коллаген IV типа, переносчик органических анионов ΚΙ, антиген Хейманна), белки, локализованные в печени (например алкогольдегидрогеназу, С250), белки, локализованные в легком (например секреторный компонент, который связывается с 1§А), белки, локализованные в сердце (например Н8Р (белок теплового шока) 27, который ассоциируется с дилатационной кардиомиопатией), белки, локализованные в коже (например кератин), остеоспецифические белки, такие как (костные) морфогенные белки (ВМР), которые представляют собой подгруппу суперсемейства белков трансформирующего ростового фактора β, демонстрирующих остеогенную активность (например ВМР-2, ВМР-4, ВМР-5, ВМР-6, ВМР-7, ВМР-8), опухолеспецифические белки (например трофобластный антиген, герцептиновый рецептор, эстрогеновый рецептор, катепсины (например катепсин В, который можно обнаружить в печени и селезенке)).
Подходящие белки, специфические для заболевания, включают, например, антигены, экспрессируемые только на активированных Т-клетках, включая ЬАС-3 (ген активации лимфоцитов), лиганд остеопротегерина (ОРСЬ; см. Ыа1иге 402, 304-309 (1999)), ОХ40 (член семейства рецепторов ΤΝΚ, экспрессирующийся на активированных Т-клетках и специфически активируемый в Т-клетках человека, продуцирующих вирус лейкоза типа I (ΗΤΕν-Ι); см. 1ттипо1. 165 (1): 263-70 (2000)). Подходящие белки, специфические для заболевания, также включают, например, металлопротеазы (ассоциированные с артритом/видами рака), включая СС6512 дрозофилы (ОгозорШа), параплегин человека, Е1зН человека, АЕС3Б2 человека, йзН мыши и ангиогенные ростовые факторы, включая кислотный фактор роста фибробластов (ЕСЕ-1), основный фактор роста фибробластов (ЕСЕ-2), фактор роста сосудистого эндотелия/фактор проницаемости сосудов (VΕСЕ/VРЕ), трансформирующий фактор роста-α (ТСЕа), фактор некроза опухолей-альфа СТ№-а), ангиогенин, интерлейкин-3 (ΙΒ-3), интерлейкин-8 (ΙΒ-8), тромбоцитарный фактор роста эндотелиальных клеток (ΡΌ-ЕССЕ), плацентарный фактор роста (РЮЕ), тромбоцитарный фактор роста-ВВ т1бкте (РОСЕ) и фракталкин.
Подходящие полипептиды, которые увеличивают период полувыведения из сыворотки ίη νίνο, также включают стресс-белки, такие как белки теплового шока (Н8Р). В норме Н8Р являются внутриклеточными. Когда они обнаруживаются вне клеток, это указывает на то, что клетка погибла и ее содержимое вытекло. Эта непрограммируемая гибель клеток (некроз) случается в результате травмы, заболевания или повреждения, при этом внеклеточные Н8Р запускают ответ иммунной системы. Связывание с внеклеточным Н8Р может приводить к локализации композиций по изобретению в месте заболевания.
Подходящие белки, вовлеченные в Ес-транспорт, включают, например, рецептор Брамбелла (также известный как ЕсКВ). Этот Ес-рецептор имеет две функции, которые обе потенциально полезны для доставки. Эти функции представляют собой: (1) транспорт от матери к ребенку через плаценту; (2) защиту от расщепления, пролонгирование таким образом периода его полувыведения из сыворотки. Полагают, что данный рецептор осуществляет рециркуляцию ΙβΟ из эндосом (см. НоШдег е1 а1., Ναι. Вю1есЬпо1. 15(7): 632-6 (1997)).
ЙАЬ, которые связываются с сывороточным альбумином
Согласно изобретению в одном из воплощений предложен полипептид или антагонист (например лиганд с двойной специфичностью, содержащий бАЬ против ΙΕ-1Κ1 (первое бАЬ)), которое связывается с ΙΕ-1Κ1, и второе бАЬ, которое связывается с сывороточным альбумином (8А), где второе бАЬ связывается с 8А с Кс, как определено посредством поверхностного плазмонного резонанса, составляющей от 1 нМ до 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 100, 200, 300, 400 или 500 мкМ (т.е. от х 10-9 до 5 х 10-4), или от 100 нМ до 10 мкМ, или от 1 до 5 мкМ или от 3 до 70 нМ или от 10 нМ до 1, 2, 3, 4 или 5 мкМ. Например, от 30 до 70 нМ, как определено посредством поверхностного плазмонного резонанса. В одном из воплощений первое бАЬ (или мономер бАЬ) связывается с 8А (например Н8А) с Кс, как определено посредством поверхностного плазмонного резонанса, составляющей приблизительно 1, 50, 70, 100, 150, 200, 300 нМ или 1, 2 или 3 мкМ. В одном из воплощений, относящихся к лиганду с двойной специфичностью, содержащему первое анти-8А бАЬ и второе бАЬ к целевому антигену, аффинность (например Кс и/или КоГГ, как измерено посредством поверхностного плазмонного резонанса, например, с использованием В1аСоге) второго бАЬ в отношении его мишени в 1-100000 раз (например от 100 до 100000, или от 1000 до 100000, или от 10000 до 100000 раз) выше аффинности первого бАЬ в отношении 8А. В одном из воплощений сывороточный альбумин представляет собой человеческий сывороточный альбумин (Н8А). Например, первое бАЬ связывается с 8А с аффинностью приблизительно 10 мкМ, тогда как второе бАЬ связывается со своей мишенью с аффинностью 100 пМ. В одном из воплощений сывороточный альбумин представляет собой человеческий сывороточный альбумин (Н8А). В одном из воплощений первое бАЬ связывается с 8А (например Н8А) с Кс приблизительно 50, например 70, 100, 150 или 200 нМ. Под
- 42 018129 робности относительно лигандов с двойной специфичностью можно найти в νϋ 03002609, νϋ 04003019 и νϋ 04058821.
Лиганды по изобретению в одном из воплощений могут содержать бАЬ, которое связывается с сывороточным альбумином (8А) с Кс, как определено посредством поверхностного плазмонного резонанса, составляющей от 1 нМ до 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 100, 200, 300, 400 или 500 мкМ (т.е. от х10-9 до 5 х 10-4), или от 100 нМ до 10 мкМ, или от 1 до 5 мкМ, или от 3 до 70 нМ, или от 10 нМ до 1, 2, 3, 4 или 5 мкМ. Например, от 30 до 70 нМ, как определено посредством поверхностного плазмонного резонанса. В одном из воплощений первое бАЬ (или мономер бАЬ) связывается с 8А (например Н8А) с Кс, как определено посредством поверхностного плазмонного резонанса, приблизительно 1, 50, 70, 100, 150, 200, 300 нМ или 1, 2 или 3 мкМ. В одном из воплощений первое и второе бАЬ соединены линкером, например линкером, состоящим из 1-4 аминокислот, или из 1-3 аминокислот, или более чем из 3 аминокислот, или более чем из 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 или 20 аминокислот. В одном из воплощений более длинный линкер (более 3 аминокислот) используют для повышения эффективности (Ко одного или обоих бАЬ в данном антагонисте).
В конкретных воплощениях лигандов и антагонистов бАЬ связывается с человеческим сывороточным альбумином и конкурирует за связывание с альбумином с бАЬ, выбранным из группы, состоящей из:
М8А-16, М8А-26 (см. νϋ04003019 в отношении описания этих последовательностей, где данные последовательности и их нуклеиновокислотные аналоги включены в данное описание посредством ссылки и образуют часть описания настоящего изобретения)
ООМ7пп-16 (ЗЕО ГО ΝΟ: 473), ООМ7т-12 (ЗЕО ГО N0: 474), ООМ7т-26 (ЗЕО ГО ΝΟ: 475), 00М7Г-1 (ЗЕО Ю ΝΟ: 476), ООМ7Г-3 (ЗЕО ГО ΝΟ: 477), ООМ7Г-4 (ЗЕО ГО ΝΟ: 478), ООМ7г-5 (ЗЕО ГО ΝΟ: 479), ООМ7Г-7 (ЗЕО Ю ΝΟ: 480), ООМ7Г-8 (ЗЕО ГО ΝΟ: 481), ООМ7Н-2 (ЗЕО ГО ΝΟ: 482), ООМ7Р-3 (ЗЕО ГО ΝΟ: 483), ООМ7Й-4 (ЗЕО ГО МО: 484), ϋΟΜ7ή-6 (ЗЕО ГО ΝΟ: 485), ϋΟΜ7Κ-1 (ЗЕО Ю ΝΟ: 486), ΟΟΜ7Ι1-7 (ЗЕО ГО ΝΟ: 487), ΟΟΜ7Ι1-22 (ЗЕО ГО ΝΟ: 489), ООМ711-23 (ЗЕО ГО ΝΟ: 490), ООМ7+24 (ЗЕО ГО ΝΟ: 491), ООМ7Н-25 (ЗЕО ГО ΝΟ: 492), ООМ7И-26 (ЗЕО ΙΟ ΝΟ: 493), ООМ7М-21 (ЗЕО ГО ΝΟ: 494), ϋΟΜ7ή-27 (δΕΟ ГО ΝΟ; 495), ООМ7Н-8 (ЗЕО ГО ΝΟ: 496), ООМ7МЗ (ЗЕО ГО ΝΟ: 497), ООМ7Г-14 (ЗЕО ГО ΝΟ: 498), ООМ7г-15 (8ЕО ГО ΝΟ: 499), ООМ7М6 (ЗЕО ГО ΝΟ: 500), ООМ7Г-17 (ЗЕО ГО ΝΟ: 501), ООМ7г-18 (ЗЕО ГО ΝΟ: 502), ООМ7Г-19 (ЗЕО ГО ΝΟ: 503), ϋΟΜ7η20 (ЗЕО ГО ΝΟ: 504), ООМ7Г-21 (ЗЕО ГО ΝΟ: 505), ООМ7Г-22 (ЗЕО ГО ΝΟ: 506), ЭОМ7г-23 (ЗЕО ГО ΝΟ: 507), ϋΟΜ7Γ-24 (8Е0 ГО ΝΟ: 508), ООМ7Г-25 (ЗЕО ГО ΝΟ: 509), ООМ7г-26 (ЗЕО ГО ΝΟ: 510), ООМ7Г-27 (ЗЕО ГО ΝΟ. 511), ΘΟΜ7Γ-28 (ЗЕО ГО ΝΟ: 512), ООМ7г-29 (8ЕО ГО ΝΟ: 513), ООМ7Г-30 (ЗЕО ГО ΝΟ: 514), ООМ7Г-31 (8Е0 ГО ΝΟ: 515), ООМ7Г-32 (ЗЕО ГО ΝΟ: 516), ООМ7Г-33 (ЗЕО ГО ΝΟ: 517) (см. νϋ 2007080392 в отношении описания этих последовательностей, где данные последовательности и их нуклеиновокислотные аналоги включены в данное описание посредством ссылки и образуют часть описания настоящего изобретения; 8ЕЦ ΙΌ N0 в этом абзаце аналогичны приведенным в νϋ 2007080392)
- 43 018129 с1АЬ8 (с!АЫО), 0АЫО, с1АЬ36, <1АЬ7г20 (ООМ7г20), 0АЬ7г21 (ООМ7г21), с!АЬ7г22 (ООМ7Г22), с!АЬ7г23 (ООМ7г23), с!АЬ7г24 (ООМ7Г24), <1АЬ7г25 (ООМ7г25), бАЬ7г26 (ООМ7г26), с!АЬ7г27 (ООМ7г27), <1АЬ7г28 (ООМ7г28), 8АЬ7г29 (ООМ7Г29), дАЬ7г29 (ООМ7г29), 5АЬ7г31 (ООМ7г31), бАЬ7г32 (ООМ7Г32), 0АЬ7гЗЗ (ООМ7гЗЗ), бАЬ7гЗЗ (ООМ7гЗЗ), 6АЬ7Ь22 (ООМ7К22), 6АЬ71123 (ϋΟΜ7Ι>23), ЗАЬ7Ь24 (ΟΟΜ7Ι124), с1АЬ7И25 (ООМ7К25), с1АЬ7Г)26 (ΟΟΜ7Ι126), С1АЬ7Г|27 (ООМ7Н27), ЦАЬ7Ь30 (ΟΟΜ7Ι130), сГАЬ7Г131 (ООМ7Н31), с!АЬ2 (6АЬ 4,7,41), с!АЬ4, 6АЬ7, 6АЫ1, с!АЫ2 (с1АЬ7т12), <1АЫЗ (8АЬ 15), дАЫ5, 8АЫ6 (с1АЬ21, с1АЬ7т16), с!АЫ7, с!АЫ8, с!АЫ9, 0АЬ21, с!АЬ22, с!АЬ23, с!АЬ24, с1АЬ25 ( 8АЬ26, с!АЬ7т26), с!АЬ27, с!АЬ30 (с!АЬ35), 6АЬ31, <1АЬЗЗ, с1АЬ34, с1АЬ35, 0АЬ38 (с1АЬ54), 6АЬ41, с!АЬ46 (с!АЬ 47, 52 и 56), <1АЬ47, 6АЬ52, 9АЬ53, с1АЬ54, 0АЬ55, с1АЬ56, с1АЬ7т12, <1АЬ7т16, <1АЬ7т26, 8АЬ7г1 (ООМ 7г1), с!АЬ7гЗ (ООМ7гЗ), с1АЬ7г4 (ООМ7г4), с1АЬ7г5 (ООМ7г5), 8АЬ7г7 (ООМ7г7), 8АЬ7г8 (ООМ7г8), <1АЬ7г13 (ООМ7НЗ), 5АЬ7г14 (ЭОМ7г14), 8АЬ7г15 (ООМ7г15), 6АЬ7г16 (ООМ7г16), 8АЬ7г17 (ΟΟΜ7Η7), 8АЬ7г18 (ϋΟΜ7Π8), 5АЬ7г19 (ООМ7Н9), 8АЬ7Ь1 (00М7М), с!АЬ7Г12 (ООМ7112), с1АЬ7Ь6 (ООМ7И6), с!АЬ7117 (ΟΟΜ7Ι17), с1АЬ7К8 (ΟΟΜ7Ι18), с1АЬ7119 (ООМ7Ь9), с1АЬ71110 (ООМ7МО), 6АЬ7М1 (ООМ7М1), 6АЬ7М2 (ООМ7К12), <1АЬ7МЗ (ООМ7ЫЗ), С1АЬ7М4 (0019171114), 8АЬ7р1 (ϋΟΜ7ρ1) и с!АЬ7р2 (ООМ7р2) (см. РСТ/СВ2008/000453 в отношении описания этих последовательностей, поданную 8 февраля 2008 г., где данные последовательности и их нуклеиновокислотные аналоги включены в данное описание посредством ссылки и образуют часть описания настоящего изобретения). Альтернативные названия показаны в круглых скобках после ЗАЬ, например ЗАЬ8 имеет альтернативное название ЗАЬ10, т.е. ЗАЬ8 (ЗАЬ10). Эти последовательности также представлены на фиг. 51а и Ь.
В некоторых воплощениях ЗАЬ связывается с человеческим сывороточным альбумином и содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 80%-ную или по меньшей мере примерно 85%-ную, или по меньшей мере примерно 90%-ную, или по меньшей мере примерно 95%-ную, или по меньшей мере примерно 96%-ную, или по меньшей мере примерно 97%-ную, или по меньшей мере примерно 98%-ную, или по меньшей мере примерно 99%-ную идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью ЗАЬ, выбранного из группы, состоящей из:
- 44 018129
МЗА-16, МЗА-26, ООМ7т-16 (ЗЕО ГО ΝΟ: 473), ООМ7т-12 (ЗЕО ГО N0: 474), ООМ7т-26 (ЗЕО ΙΟ ΝΟ: 475), 00М7г-1 (ЗЕО ГО ΝΟ: 476), ООМ7г-3 (ЗЕО ГО N0: 477), ϋΟΜ7Μ (ЗЕО ГО ΝΟ: 478), ООМ7г-5 (ЗЕО ГО N0: 479), ООМ7г-7 (ЗЕО ГО N0: 480), ООМ7Г-8 (ЗЕО ГО ΝΟ: 481), ϋΟΜ7Γι-2 (ЗЕО ГО ΝΟ: 482), ООМ7Н-3 (ЗЕО ГО ΝΟ: 483), ϋΟΜ7ή-4 (ЗЕО ГО N0: 484), ООМ76-6 (ЗЕО ГО N0: 485), 00М7П-1 (ЗЕО ГО ΝΟ: 486), ООМ7К-7 (ЗЕО ГО ΝΟ: 487), ϋΟΜ7ή-22 (ЗЕО ГО N0: 489), ΟΟΜ7Ι1-23 (ЗЕО ГО ΝΟ: 490), ООМ7Н-24 (ЗЕО ГО ΝΟ: 491), ООМ7Гь25 (ЗЕО ГО ΝΟ: 492), ООМ7И-26 (ЗЕО ГО N0: 493), ООМ7К-21 (ЗЕО ГО ΝΟ: 494), ООМ7Ь27 (ЗЕО ГО ΝΟ: 495), ООМ7Н-8 (ЗЕО ГО N0: 496), ΟΟΜ7Μ3 (ЗЕО ГО ΝΟ: 497), ООМ7Г-14 (ЗЕО ГО N0: 498), ООМ7г-15 (ЗЕО ГО N0: 499), ООМ7г-16 (ЗЕО ГО ΝΟ: 500), ООМ7Г-17 (ЗЕО ГО ΝΟ: 501), ΟΟΜ7Γ-18 (ЗЕО ГО ΝΟ: 502), ООМ7Г-19 (ЗЕО ГО N0: 503), 0ОМ7г-20 (ЗЕО Ю N0: 504), ΩΟΜ7Γ-21 (ЗЕО ГО N0: 505), ООМ7Г-22 (ЗЕО ГО ΝΟ: 506), ΟΟΜ7Γ-23 (ЗЕО ГО ΝΟ: 507), ϋΟΜ7ί-24 (ЗЕО ГО N0: 508), ООМ7г-25 (ЗЕО ГО ΝΟ: 509), ООМ7г-26 (ЗЕО ГО N0: 510), ООМ7г-27 (ЗЕО ГО ΝΟ: 511), ООМ7г-28 (ЗЕО ГО ΝΟ: 512), ООМ7г-29 (ЗЕО ГО N0: 513), ООМ7Г-30 (ЗЕО ГО N0: 514), ΟΟΜ7Γ-31 (ЗЕО ГО ΝΟ: 515), ϋΟΜ7ί-32 (ЗЕО ГО ΝΟ: 516), ООМ7Г-33 (ЗЕО ГО N0: 517) (ЗЕО ГО N0 в этом абзаце аналогичны приведенным в ννθ2007080392), <1АЬ8, с!АЬ 10, ЦАЬЗб, с1АЬ7г20, ЙАЬ7г21, 6АЬ7г22, с!АЬ7г23, <1АЬ7г24, 6АЬ7г25, <1АЬ7г26, 6АЬ7г27, 6АЬ7г28, с1АЬ7г29, с!АЬ7г30, 6АЬ7г31, с!АЬ7г32, с(АЬ7гЗЗ, дАЬ7Ь21, с(АЬ7Ь22, 6АЬ7Г123, АЬ71т24, АЬ7Н25, АЬ7Ь26, 6АЬ7К27, 0АЬ7К30, с1АЬ7Ь31, с!АЬ2, 6АЬ4, с!АЬ7, άАЫ1, 6АЫ2, ЦАЫЗ, ЧАЫ5, <1АЫ6, <1АМ7, 6АЫ8, 6АЫ9, С1АЬ21, 6АЬ22, С1АЬ23, ЧАЬ24, с1АЬ25, 0АЬ26, 6АЬ27, бАЬЗО, 6АЬ31, бАЬЗЗ, с!АЬ34, 6АЬ35, <1АЬ38, ЙАЬ41, с!АЬ46, с!АЬ47, 6АЬ52, <1АЬ53, с!АЬ54, 6АЬ55, дАЬ56, 6АЬ7т12, 6АЬ7т16, с!АЬ7т26, 6АЬ7г1, с1АЬ7гЗ, с!АЬ7г4, 6АЬ7г5, 6АЬ7г7, 6АЬ7г8, 6АЬ7г13, с1АЬ7г14, 6АЬ7г15, с1АЬ7г16, 6АЬ7г17, с1АЬ7г18, с1АЬ7г19, с1АЬ7111, 6АЬ7П2, 6АЬ7П6, 6АЬ71г7, с1АЬ7118, с!АЬ7119, дАЬ7П10, с1АЬ7М1, 6А67П12, 6АЬ7М13, 6АЬ7Ь14, 6АЬ7р1 и 0АЬ7р2.
Например, ЙАЬ, которое связывается с человеческим сывороточным альбумином, может содержать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 90%-ную, или по меньшей мере примерно 95%-ную, или по меньшей мере примерно 96%-ную, или по меньшей мере примерно 97%-ную, или по меньшей мере примерно 98%-ную, или по меньшей мере примерно 99%-ную идентичность аминокислотной последовательности с
00М7И-2 (ЗЕО ГО N0:482), ϋΟΜ7ή-3 (ЗЕО ГО N0:483), 00М7Н-4 (ЗЕО ГО N0:484), ООМ7Н-6 (ЗЕО ГО N0:485), ΟΟΜ7Ι1-1 (ЗЕО ГО N0:486), ООМ7Ь-7 (ЗЕО ГО N0:487), ООМ7И-8 (ЗЕО ГО N0:496), ООМ7г-13 (ЗЕО ГО N0:497), 00Μ7Γ-14 (ЗЕО ГО N0:498), ϋΟΜ7Γι-22 (ЗЕО ГО N0:489), ООМ7И-23 (ЗЕО ГО N0:490), 00М76-24 (ЗЕО ГО N0:491), ООМ7И-25 (ЗЕО Ι0 N0:492), ООМ7К-26 (ЗЕО ГО N0:493), ΟΟΜ7Ι1-21 (ЗЕО ГО N0:494), ООМ7Г-27 (ЗЕО ГО N0:495) (ЗЕО ГО N0 в этом абзаце аналогичны приведенным в 1/702007080392), с1АЬ8, с<АЬ 10, 6АЬ36, ЦАЬ7п21, с!АЬ7п22, с1АЬ7Н23, АЬ7Г|24, АЬ7Ь25, АЬ7Ь26, 6АЬ71127, 6АЬ7п30, 6АЬ7Н31, 6АЬ2, 6АЬ4, 6АЬ7, 6АЫ1, <1АЫ2, САЫЗ, 6АЫ5, 6АЫ6, 0АЫ7, 0АЫ8, ПАЫ9, 6АЬ21, ЙАЬ22, 6АЬ23, 6АЬ24, с!АЬ25, 6АЬ26, с1АЬ27, ЙАЬЗО, 6АЬ31, бАЬЗЗ, 6АЬ34, <1АЬ35, 6АЬ38, 6АЬ41, 6АЬ46, 6АЬ47, <ЗАЬ52, с!АЬ53, <1АЬ54, с1АЬ55, с1АЬ56, с!АЬ71т1, с1АЬ7Г12, с!АЬ7Г)6, 6АЬ7п7. с!АЬ7Н8, 6АЬ7Н9, 6АЬ7Ы0, с1АЬ7М1, 6АЬ7М2, 6АЬ7Н13 и 6АЬ7М4.
В некоторых воплощениях бАЬ связывается с человеческим сывороточным альбумином и содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 80%-ную, или по меньшей мере примерно 85%-ную, или по меньшей мере примерно 90%-ную, или по меньшей мере примерно 95%-ную, или по меньшей мере примерно 96%-ную, или по меньшей мере примерно 97%-ную, или по меньшей мере примерно 98%-ную, или по меньшей мере примерно 99%-ную идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью ЙАЬ, выбранного из группы, состоящей из
- 45 018129 ϋΟΜ7ή-2 (ΘΕΟ Ю N0:482). ϋΟΜ7Π-θ (ΘΕΟ Ю N0:485), ΟΟΜ7Μ-1 (ΘΕΟ Ю
N0:486), ΟΟΜ76-7 (ΘΕΟ Ю N0:487), ϋΟΜ7Π-8 (ΘΕΟ Ю N0:496), ϋΟΜ7Ι>22 (ΘΕΟ Ю N0:489), ϋΟΜ7Ιι-23 (ΘΕΟ Ю N0:490), ϋΟΜ7Κ-24 (ΘΕΟ 10 N0:491), ΟΟΜ7Ϊ1-25 (ΘΕΟ Ю N0:492), ΟΟΜ7Κ-26 (ΘΕΟ Ю N0:493), 00Μ76-21 (ΘΕΟ ΙΟ N0:494), ΟΟΜ76-27 (ΘΕΟ Ю N0:495) (8Е0 ΙΌ N0 в этом абзаце аналогичны приведенным в \УО 2007080392), с1АЬ7Ь21, 0АЬ7Ь22, с!АЬ7Ь23, АЬ7Ь24, АЬ7п25, АЬ7Ь26, 6АЬ7Ь27, 6АЬ7ЬЗО, с!АЬ71п31, 8АЬ2, 6АЬ4, с1АЬ7, с1АЬЗЗ, 4АЬ41, с1АЬ7Ы, 6АЬ7И2, с1АЬ7Ь6, 8АЬ7Ь7, с!АЬ7(18, с1АЬ7п9, с1АЬ7Ы0, с1АЬ7п11, дАЬ7Ь12, с!АЬ7п13 и 8АЬ7К14.
В более конкретных воплощениях бАЬ представляет собой Ук бАЬ, которое связывается с человеческим сывороточным альбумином и имеет аминокислотную последовательность, выбраную из группы, состоящей из
00М7К-2 (ΘΕΟ Ю N0:482), ООМ76-6 (ΘΕΟ ΙΟ N0:485), ООМ7П-1 (ΘΕΟ Ю
N0:486), ϋΟΜ7ή-7 (ΘΕΟ Ю N0:487), ϋΟΜ76-8 (ΘΕΟ Ю N0.496) (ΘΕΟ ΙΟ ΝΟ в этом абзаце аналогичны приведенным в \ЛЮ2007080392),
6АЬ2, с1АЬ4, 6АЬ7, с!АЬ38, 6АЬ41, с(АЬ54, 6АЬ761,6АЬ7И2, с!АЬ7Н6, с1АЬ707,
С1АЬ768, 6АЬ7Г19, 8АЬ7М0, 6АЬ7М1, с1АЬ7М2, 0АЬ7К13 и 6АЬ7К14.
В более конкретных воплощениях бАЬ представляет собой УН бАЬ, которое связывается с человеческим сывороточным альбумином и имеет аминокислотную последовательность, выбраную из бАЬ7Н30 и бАЬ7б31.
В более конкретных воплощениях бАЬ представляет собой бАЬ71111 или бАЬ71114.
В других воплощениях бАЬ, лиганд или антагонист связывается с человеческим сывороточным альбумином и содержит один, два или три СИЯ (гипервариабельных участка) любой из перечисленных выше аминокислотных последовательностей, например один, два или три СИЯ из бАЬ71111 или бАЬ71114.
Подходящие верблюжьи (СатеНб) УНН, которые связываются с сывороточным альбумином, включают описанные в \У0 2004/041862 (АЬ1уих АУ.) и в ^02007080392 (где последовательности УНН и их нуклеиновокислотные аналоги включены в данное описание посредством ссылки и образуют часть описания настоящего изобретения), такие как Последовательность А (8Е0 ΙΌ N0:518), Последовательность В (8Е0 ΙΌ N0:519), Последовательность С (8Е0 ΙΌ N0:520), Последовательность Ό (8Е0 ΙΌ N0:521), Последовательность Е (8Е0 ΙΌ N0:522), Последовательность Е (8Е0 ΙΌ N0:523), Последовательность С (8Е0 ΙΌ N0:524), Последовательность Н (8Е0 ΙΌ N0:525), Последовательность Ι (8Е0 ΙΌ N0:526), Последовательность 1 (8Е0 ΙΌ N0:527), Последовательность К (8Е0 ΙΌ N0:528), Последовательность Ь (8Е0 ΙΌ N0:529), Последовательность М (8Е0 ΙΌ N0:530), Последовательность N (8Е0 ΙΌ N0:531), Последовательность О (8Е0 ΙΌ N0:532), Последовательность Р (8Е0 ΙΌ N0:533), Последовательность О (8Е0 ΙΌ N0:534), где номера этих последовательностей соответствуют номерам, приведенным в \У0 2007080392 или \У0 2004/041862 (АЬ1уих АУ.). В некоторых воплощениях верблюжий (СатеНб) УНН связывается с человеческим сывороточным альбумином и содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 80%-ную, или по меньшей мере примерно 85%-ную, или по меньшей мере примерно 90%-ную, или по меньшей мере примерно 95%-ную, или по меньшей мере примерно 96%-ную, или по меньшей мере примерно 97%-ную, или по меньшей мере примерно 98%-ную, или по меньшей мере примерно 99%-ную идентичность аминокислотной последовательности с АЬВ1, описанной в \У0 2007080392 или любой из 8Е0 ΙΌ N0: 518-534, где номера этих последовательностей соответствуют номерам, приведенным в \У0 2007080392 или \У0 2004/041862.
В некоторых воплощениях лиганд или антагонист содержит бАЬ против сывороточного альбумина, которое конкурирует с любым бАЬ против сывороточного альбумина, описанным в данной заявке, за связывание с сывороточным альбумином (например человеческим сывороточным альбумином).
В альтернативном воплощении антагонист или лиганд содержит связывающую группировку, специфическую в отношении Ш-1Я1 (например ГЕ-1Я1 человека), которая содержит неиммуноглобулиновые последовательности, описанные в находящейся на совместном расмотрении заявке РСТ/СВ 2008/000453, поданной 8 февраля 2008 г.; описание этих связывающих группировок, способы их получения и селекции (например из разнообразных библиотек) и их последовательности включены в данное описание посредством ссылки как часть описания настоящего изобретения).
Конъюгирование с группировкой, увеличивающей период полувыведения (например альбумином)
В одном из воплощений (одна или более чем одна) группировка, увеличивающая период полувыведения (например альбумин, трансферрин и их фрагменты и аналоги) конъюгирована или ассоциирована со связывающимся с Ш-1Я1 полипептидом, бАЬ или антагонистом по изобретению. Примеры альбумина, фрагментов альбумина или вариантов альбумина, подходящих для применения в ГЬНЯНсвязывающем формате, описаны в \У0 2005077042, описание которой включено в данное описание посредством ссылки и образует часть описания настоящего изобретения. В частности, в настоящем изобретении может
- 46 018129 быть использовано следующее: альбумин, фрагменты альбумина или варианты альбумина:
8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:1 (как описано в АО 2005077042, где данная последовательность непосредственно включена в настоящее описание посредством ссылки);
фрагмент или вариант альбумина, содержащий аминокислоты 1-387 из 8ЕЦ ΙΌ NΟ:1 в АО 2005077042 или состоящий из них;
альбумин или его фрагмент или вариант, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (а) аминокислот 54-61 из 8ЕЦ ΙΌ NΟ:1 в АО 2005077042; (Ь) аминокислоты 76-89 из 8ЕЦ ΙΌ NΟ:1 в АО 2005077042; (с) аминокислоты 92-100 из 8ЕЦ ΙΌ NΟ:1 в АО 2005077042; (б) аминокислоты 170-176 из 8ЕЦ ΙΌ NΟ:1 в АО 2005077042; (е) аминокислоты 247-252 из 8ЕО ΙΌ ^:1 в АО 2005077042; (Г) аминокислоты 266-277 из 8ЕО ΙΌ ^:1 в АО 2005077042; (д) аминокислоты 280-288 из 8ЕО ΙΌ ^:1 в АО 2005077042; (1) аминокислоты 362-368 из 8ЕО ΙΌ ^:1 в АО 2005077042; (1) аминокислоты 439-447 из 8ЕЦ ΙΌ NΟ:1 в АО 2005077042 (|) аминокислоты 462-475 из 8ЕО ΙΌ ^:1 в АО 2005077042; (к) аминокислоты 478-486 из 8ЕО ΙΌ ^:1 в АО 2005077042 и (1) аминокислоты 560-566 из 8ЕО ΙΌ ^:1 в АО 2005077042.
Следующие примеры альбумина, фрагментов и аналогов, подходящих для применения в ГЕ-1В1связывающем формате, описаны в АО 03076567, описание которой включено в данное описание посредством ссылки и которое образует часть описания настоящего изобретения. В частности, в настоящем изобретении может быть использовано следующее: альбумин, фрагменты или варианты:
человеческий сывороточный альбумин, как описано в АО 03076567, например, на фиг. 3 (где информация об этой последовательности непосредственно включена в настоящее описание посредством ссылки);
человеческий сывороточный альбумин (НА), состоящий из единичной негликозилированной полипептидной цепи из 585 аминокислот с молекулярной массой 66500 (см. Ме1оип, е! а1., ЕЕВ8 Ьейегк 58: 136 (1975); ВеЬгепк, е! а1., Ееб Ргос. 34: 591 (1975); Ьатеп, е! а1., М.1с1е1с Аабк Векеагсй 9: 6102-6114 (1981); Мтдйейц е! а1., I. Вю1. С1ет. 261: 6747 (1986));
полиморфный вариант или аналог, или фрагмент альбумина, как описано в Аейкатр, е! а1., Апп. Ишп. Сепе!. 37: 219 (1973);
фрагмент или вариант альбумина, как описано в ЕР 322094, например НА(1-373), НА(1-388), НА(1389), НА(1-369) и НА(1-419), и фрагменты 1-369 и 1-419;
фрагмент или вариант альбумина, как описано в ЕР 399666, например НА(1-177) и НА(1-200), и фрагменты НА(1-Х), где X равно любому числу от 178 до 199.
Когда (одну или более чем одну) увеличивающую период полувыведения группировку (например альбумин, трансферрин и их фрагменты и аналоги) используют для форматирования связывающихся с ББ-1В1 полипептидов, бАЬ и антагонистов по изобретению, ее можно конъюгировать с использованием любого подходящего способа, такого как непосредственное слияние со связывающейся с ББ-1В1 группировкой (например анти-[Ь-1В1 бАЬ), например с использованием единичной нуклеотидной конструкции, кодирующей слитый белок, где слитый белок кодируется в виде единичной полипептидной цепи с увеличивающей период полувыведения группировкой, расположенной на Ν-или С-конце относительно связывающейся с ЕБ-1В1 группировки. Альтернативно, конъюгирование может быть осуществлено с использованием пептидного линкера между группировками, например пептидного линкера, который описан в АО 03076567 или АО 2004003019 (где описания линкера включены посредством ссылки в настоящее описание для обеспечения примеров применения в настоящем изобретении). Обычно полипептид, увеличивающий период полувыведения из сыворотки ш у1уо, представляет собой полипептид, который существует в природе т у1уо и который устойчив к расщеплению либо удалению с помощью эндогенных механизмов, посредством которых нежелательное вещество выводится из организма (например, человека). Например, полипептид, который увеличивает период полувыведения из сыворотки ш у1уо, может быть выбран из белков внеклеточного матрикса, белков, обнаруженных в крови, белков, обнаруженных в гематоэнцефалическом барьере или в нервной ткани, белков, локализованных в почках, печени, легких, сердце, коже или костях, стресс-белков, белков, специфичных для заболевания, или белков, вовлеченных в Ес-транспорт.
В воплощениях изобретения, раскрытых в данном описании, вместо использования бАЬ против ГБ-1В1 в антагонисте или лиганде по изобретению, предполагается, что специалист сможет использовать полипептид или домен, содержащий один или более, или все 3 СОВ из бАЬ по изобретению, которое связывается с ББ-1В1 (например СОВ, перенесенные на подходящий белковый каркас или скелет, например аффитело, каркас 8рА, домен класса А рецептора БОБ (липопротеинов низкой плотности) или домен ЕСЕ). Соответственно, данное описание в целом следует истолковывать как описание антагонистов, в которых такие домены используются вместо бАЬ. В этой связи см. РСТ/СВ 2008/000453, поданную 8 февраля 2008 г., описание которой включено посредством ссылки.
Таким образом, в одном из воплощений антагонист по изобретению содержит иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен или доменное антитело (бАЬ), обладающие специфичностью связывания в отношении ЕБ-1В1, или гипервариабельные участки такого бАЬ в подходящем формате. Антагонист может представлять собой полипептид, состоящий из такого бАЬ или, по существу, состоящий из
- 47 018129 такого бАЬ. Антагонист может представлять собой полипептид, содержащий бАЬ (или СОЯ из бАЬ) в подходящем формате, таком как формат антитела (например 1дО-подобный формат, ксЕу, ЕаЬ, ЕаЬ', Е(аЬ')2), или лиганд с двойной специфичностью, содержащий бАЬ, которое связывается с 1Ь-1Я1, и второе бАЬ, которое связывается с другим целевым белком, антигеном или эпитопом (например сывороточным альбумином).
Полипептиды, бАЬ и антагонисты по изобретению могут быть форматированы в виде множества антител подходящих форматов, которые известны в данной области техники, таких как 1дО-подобные форматы, химерные антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела, одноцепочечные антитела, биспецифические антитела, тяжелые цепи антител, легкие цепи антител, гомодимеры и гетеродимеры тяжелых цепей и/или легких цепей антител, антигенсвязывающие фрагменты любого из перечисленного выше (например Εν-фрагмент (например одноцепочечный Εν (ксЕу), связанный дисульфидной связью Εν), ЕаЬ-фрагмент, ЕаЬ'-фрагмент, Е(аЬ')2-фрагмент), единичный вариабельный домен (например Ун, Уъ), бАЬ и модифицированные варианты любого из перечисленного выше (например, модифицированные посредством ковалентного присоединения полиалкиленгликоля (например, полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, полибутиленгликоля) или другого подходящего полимера).
В некоторых воплощениях изобретения предложен лиганд (например, анти-1Ь-1Я1 антагонист), представленный в 1дО-подобном формате. Такие форматы имеют традиционную четырехцепочечную структуру молекулы 1дО (2 тяжелых цепи и две легких цепи), в которых одна или более чем одна из вариабельных областей (Ун и/или Уъ) заменена на бАЬ по изобретению. В одном из воплощений каждая из вариабельных областей (2 Ун-области и 2 Уъ-области) заменена на бАЬ или единичный вариабельный домен, по меньшей мере один из которых представляет собой бАЬ против 1Б-1Я1 по изобретению. бАЬ(доменные антитела) или единичный(е) вариабельный(е) домен(ы), которые включены в 1дОподобный формат, могут иметь одинаковую специфичность или разные специфичности. В некоторых воплощениях 1дО-подобный формат является тетравалентным и может иметь одну (только против 1Ь1Я1), две (например, против против 1Б-1Я1 и против 8А), три или четыре специфичности. Например, 1дО-подобный формат может быть моноспецифическим и содержать 4 бАЬ, которые имеют одинаковую специфичность; биспецифическим и содержать 3 бАЬ, которые имеют одинаковую специфичность, и другое бАЬ, имеющее иную специфичность; биспецифическим и содержать два бАЬ, которые имеют одинаковую специфичность, и два бАЬ, которые имеют общую, но другую специфичность; триспецифическим и содержать первое и второе бАЬ, которые имеют одинаковую специфичность, третье бАЬ с другой специфичностью, и четвертое бАЬ со специфичностью, отличающейся от первого, второго и третьего бАЬ; или тетраспецифическим и содержать четыре бАЬ, каждое из которых имеет разную специфичность. Могут быть получены антигенсвязывающие фрагменты 1дС-подобных форматов (например ЕаЬ, Е(аЬ')2, ЕаЬ', Εν, ксЕу). В одном из воплощений 1дО-подобные форматы или их антигенсвязывающие фрагменты не связываются перекрестно с 1Б-1Я1, например, данный формат может быть моновалентным в отношении ГБ-1Я1. Если желательна функция активации комплемента и/или антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЭСС), то лиганд может представлять собой 1дО1-подобный формат. Если желательно, 1дС-подобный формат может содержать мутантную константную область (вариант константной области тяжелой цепи 1дО) с целью минимизации связывания с Ес-рецепторами и/или способности фиксировать комплемент (см., например, А1п!ег и др., ОВ 2209757 В; Μο^^^κοп и др., АО 89/07142; Μο^даи и др., АО 94/29351, 22 декабря 1994 г.).
Лиганды по изобретению (полипептиды, бАЬ и антагонисты) могут быть форматированы в виде слитого белка, содержащего первый иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, который слит непосредственно со вторым иммуноглобулиновым единичным вариабельным доменом. Если желательно, такой формат может дополнительно содержать группировку, увеличивающую период полувыведения. Например, лиганд может содержать первый иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, который слит непосредственно со вторым иммуноглобулиновым единичным вариабельным доменом, слитым непосредственно с иммуноглобулиновым единичным вариабельным доменом, который связывается с сывороточным альбумином.
Как правило, ориентация полипептидных доменов, имеющих сайт связывания со специфичностью связывания с мишенью, и то, содержит ли данный лиганд линкер, является предметом выбора при конструировании. Однако некоторые ориентации, с линкерами или без них, могут обеспечивать более хорошие характеристики связывания по сравнению с другими ориентациями. Все ориентации (например, бАЬ1-линкер-бАЬ2; бАЬ2-линкер-бАЬ1) охвачены данным изобретением и лиганды, которые содержат ориентацию, обеспечивающую желаемые характеристики связывания, могут быть легко идентифицированы посредством скрининга.
Полипептиды и бАЬ по изобретению, включая мономеры, димеры и тримеры бАЬ, могут быть связаны с Ес-областью антитела, содержащей один или оба домена Сн2 и Сн3 и, возможно, шарнирную область. Например, для получения таких полипептидов могут быть использованы векторы, кодирующие лиганды, связанные в виде единой нуклеотидной последовательности с Ес-областью.
В изобретении также предложены димеры, тримеры и полимеры вышеупомянутых мономеров бАЬ.
- 48 018129
Кодон-оптимизированные последовательности
Как описано выше, согласно воплощениям изобретения предложены кодон-оптимизированные нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептиды и вариабельные домены по изобретению. Как показано в следующей иллюстрации, могут быть получены кодон-оптимизированные последовательности с примерно 70%-ной идентичностью, которые кодируют один и тот же вариабельный домен (в этом случае аминокислотная последовательность вариабельного домена идентична ΌΟΜ1Η-131-206). В этом случае последовательности были оптимизированы для экспрессии в РЫяа раз1ог15 (кодоноптимизированные последовательности 1-3) или Е. со11 (кодон-оптимизированные последовательности 4 и 5).
Авторы изобретения осуществили расчеты с учетом вырожденности генетического кода и максимизировали количество нуклеотидных изменений в каждом вырожденном кодоне, кодируемом нуклеотидной последовательностью ΌΟΜ1Η-131-206, как показано на фиг. 19, и рассчитали теоретическую нуклеотидную последовательность, которая все еще будет кодировать вариабельный домен, идентичный ΌΟΜ1Η-131-206. Этот расчет показал, что теоретическая последовательность будет иметь только 57%ную идентичность с нуклеотидной последовательностью ΌΟΜ1Η-131-206, как показано на фиг. 19.
Кодон-оптимизированная последовательность 1 Последовательность ДНК ςςίζΐΐ* ддкр-Ьддди^адасаддс^ссаддЪаааддаг^ддааЪддд-Ы^сссас аЕ'Ессассадакдд^саадаЬссаЕкс'СасдсСдас^ссдЕ^аадддаада!:!: сас!: а£сЪссададасаасЕсс аадаасас^Ькд^асЕ^дсада^даас^сс^Едададс^даддаЕас'ЕдсЬдЪС^ассас'Сд'Ьдс^Е^дЕЪдсса а.адададдасс£-£дд'Ы:£да1:!:асЕддддасадддаас£.1:1:дд£1:асгд1:£ГсгС.сс
Соответствующая а.к. (аминокислотная) последовательность еуд11езддд1удрддз!г15саазд£С г аЬе1;п1У|.>'гтгдардкд1еи'У£Ырр^ддс1р5уас15Укдг1':15ГС1пз кпр1у1дгг1лч$1гаес1РаууГ1са11ркгдр;-гкс1у«дддЪ1”(:5 5
74,1% идентичности нуклеотидной последовательности с последовательностью ХУТ (дикого типа). 1 50
САССТТСКМтеттаскАтсссзтсстаеАТТбеттскасстаетадттс
00^114-131-206; кодон- (1)
оп тими зиро в энная ОопйЬ-131-206 ИТ (1)
Консенсусная (1)
00111111-131-2 06; кодон- (51)
о втимкзиро в анна я 0ош1Ь-131-206 ИТ (51)
Консенсусная (51)
ΟοϊΤίΙΙι-131-206; кодон- (101)
оптимизированная О0т1Ь-131-206 КТ (101)
Консенсусная (101)
Оот1к-131-206; кодон- (151)
оптимизированная Пот1Ь-131-20б ИТ (151)
Консенсусная (151)
ΟοτπΙϊι-131-206; кодон- (201)
оптимизированная пот1]п-131-20б ИТ (201)
Консенсусная (201)
ϋοιη1ϊΐ“131-2Οβ; кодон- (251)
оптимиэированная ϋοπι11ι-131-206 ИТ (251)
Консенсусная (251)
ϋοτπΠι-131-206; кодон- (301)
оптимизированная ΟθΐηΙϊι-131-206 ТСТ (301)
Консенсусная (301)
ООШ111-131-206; кодон- (351)
оптимизированная Оот1Ь-131-20б ТСТ (351)
Консенсусная (351)
САССТ5САССТСТТСеАСТСТСЗСССАСССТТССТАСАССС.ТССССС6ТС ЗАЕСТ СА ТСТТССА ТС СС ОС 06 ТТССТ СА ССТСС ОС ТС 51 100 ТТТСАСАТТСТССТСТСС т сст Т ССССТТТТ АС тттссстс ассас; АСТ А
ССТСССгТСТСТССТСТСЗСАСССТССССАТТСАССТТТССССАТСАСАССА тс д т тсстбтбс сс тсссс тт АС тт сс са сасас а 101 150
ТСбТТТССОТТАСАСАСССТССАСОТАААСОАТТ&ЗААТСССТТТСССАС
Т СбТСТСССТСССССДОССАССЛСССААСС6Т СТА£Л6ТСС6ТСТСАСАТ ТОСТ ТСССТ С САСЕС ССАС6 ΆΑ СЕ Т СА ТЕССТ ТС СА 151 200
АТТССАССАСАТСЙТСААСАТССА'Л1 СТАС СС ТСАС ТСС&Т ТААЙБ6ААС
АТТСССССССАТОЙТСАССАТСССТТСТАСССАСАСТССЙТСААССаССС АТТСС СС САТСЗТСА САТСС ТТСТАССС САСТСССТ ААССС С 201 250 АТТ САСТАТСТССА £5 АС АС ААСТССААСААСАСТТТСТАСТ ТССАСЛТ ΰА
СТТ САССАТСТССССССАСДАТ ТССААСАСАСССТАТАТ СТССАДАТ5А
ТТСАС АТСТСС С САСАА ТССААБААСАС Т ТА ТБСА АТЕА
251 300
АСТССТТСАСАССТСАССАТАСТССТСТТТАССАСТСТССТТТСТ'ГСССА
А САСССТбССТССССАССАСАСАССССТАТАТСАСТ СТСС ССТС С Т ТС С Т АС С ТС С СС САССА АС СС СТ ТА САСТСТСС ТС Т СС 301 350
ДАОДОАес АССТТССТ У Т ЙДТ Т АСТСССБАСАбССААСТ Т Т С6ТТ АСТ СтТ
ААСАСССССССТГбСТТТСАСТАСТССХ^ТСАбббААСССТССТСАСССТ АА6АС СС ССТТССТТТСА ТАСТЕССС САСССААС ТОСТ АС СТ 351 363
ТГСТТССТААТСА
СТС0А6С’ тс с
- 49 018129
Кодон-оптимизированная последовательность 2 Последовательность ДНК дадаа.аада.дадд^РсааЬ^дс^РдааЪскддаддаддР^Ъдд^ссадссаддаддд^ассЬРсдасЬаад'Ь^дЬ дс^дссад^дддА^асдЬЪ^дсЪса^дааас^аСддЦа^дддАсдасаддсассЪддИаааддГсЕ^дааЪдд д£^.ксаса,11аРссс,1:ссадасддРсаадасссак1:,1:£асдс£да1:'Ьссд£даааддсада'Ь£12асааккксасда даСааЪЪс^ааааасассЬЬдЬас'ЬЬасаааЪдаасТзса^ЛдададсЪдаддасасЪдсад^^а^сас^дсдс'С: рЪасЪассаааасдЪддасс^дд'ЫРдаРЪаЪкддддссааддРасдЬРадРдасСдкРадккс!:
Соответствующая а.к. последовательность екгеуд11езддд1удрадЕ1г 1зсаавд£АаЪеСтукУГдардкд1^к^льррс1дд;21рьу=:С!£ Укдг ГС15Г с1пакп111у1дтпз1гаедРауукса11ркгдрм£0уцдддк1 тЬгзз
71,1% идентичности нуклеотидной последовательности с последовательностью νΤ.
50 ηοπιΙΙι-131-206 КТ
Только РхсМа 206 МЕа оАЬ Консенсусная
Пот1Ь-131-206 КТ
Только Р1сЫа 206 МЕа ЗАЬ
Консенсусная
Оот1Н-131-206 КТ
Только РхсЫа 206 МГа с1АЬ Консенсусная
0οιη11ι-Ί31~2ϋ6 КТ
Только Р1сЬ±а 206 МГа САЬ Кон сенсу сн ая ϋοιη11ι-131-206 КТ Только РхсЪха 206 МЕа дАЬ Консенсусная ϋοπιΙϊι-131-206 КТ
Только Р1сЬ1а 206 МЕа ОАЬ Консенсусная
ООП11П-131“206 ИТ
Только Рхскха МЕа 206 бАЬ Консенсусная ϋθτπΙϊι-131-206 ИТ
Только РхсЫа МЕа 206 сАЬ
Консенсусная (1) (II (1) (42) (51» (51» (92)
- ---- -СДЙСТССАССТСТТССАСТСТСаСССАСССТТССТАСАССС
САСААААСАСАбСТТСААТТССТТСЛАТСТССАССАееТТТССТССАССС
САССТ СА ТС Т СА ТСТСС ССАСС ТТССТ САССС 51 ЮО
ТСаССССТСССТСССТСТСТССТСТССАСССТССССАТТСАССТТТСОбС АССАСОСТСССТТССАСТААСТТСТССТСССАСТСССТТТАССТТТССТС СС СССТСССТ СС СТ ТСТСС ССС СС ТТ АС тттсс с 101 150 атсасассатсотстссстсссссасссассасссаассзСтстасастсс (101) АТСАААСТАТССТАТ0ССТСССАСАСССАССТССТАААССТСТТСАА.ТС6 (101) АТСА АС АТССТ ТСССТССС САСССАСС СС АА ССТСТ СА ТСС
151200 (142) СТСТСАСАТАТТСССССССАТСОГСАСеЛТСССТТСТАСССАСАСТСССТ 1151) еТТТСАСАТАТСССТССАСАСОСТСААСАСССА'ПТТАСССТЗАТТСССТ <1513 СТ ТСАСАТАТ СС СС СА ССТСА СА СС ТТ ТАССС ЗА ТСССТ
201250 <192) СААССЗСССбТТСАССАТСТССССССАСМтТССААСААСАСССТАТАТС (201) САААСССА&АТТТАСААТТТСАССАСАТААТТСТАААААСАССТТСТАСТ (201) САА ССС С ТТ АС АТ ТС СС СА ААТТС АА ААСАС Т ТА
251300 (242) тссааатсаасассстссстссссассасасазссстататсастстссс (251) ТАСАААТСААСТСАТТСАСАССТСАССАСАСТССАСТТТАТСАСТССССТ (251) Т САААТСААС ТС С СС САССАСАС СС СТ ТАТСАСТС СС
301350 (292) СТССТТССТААСАЙССССССТТССТТТСАСТАСТСЗССТСАСССААСССТ (301) ттастассаааасотссаСсттсстттсаттаттсссСссаасстасстт (301) Т СТ СС АА С СС ССТТССТТТСА ТА ТСССС СА СС АС Т
351367 (342) ССТСАСССТСТССА6С“ (351) АСТСАСТСТ-ТАСГТСТ (351) СТ АС СТ Т С С
Кодон-оптимизированная последовательность 3 Последовательность ДНК даад1:дсадс^1:с1:Ъдааад’идд1:ддадддс1:адСдсадссаддддда11с1:1:1:аада^1:а1:са1:дсдс^дссадЪ дда^кСа.сСккСдсСс-сдадяадэ^ддЪскддд^дадйсаа.дскссРддааа.аддк'ЬкададкдддР ЬксЪсас а1:Ьссасс^да!:дд1:саада'Ь.сс1:^1:с^асдсада1:1:ссд1:саааддаада1:1:1:ас£а1:с1;ссадада^аа£адк ааааасасктсдгасс^асадаРсаастсасг£ададссдаадакассдскдРдкассаскдсдсск£дккдсса аадададдСсс^дд^сдаЪЪасйдддд^саддд^ас^скддЪ^асадЪсЪса^с!:
Соответствующая а.к. последовательность етс[11езддд1^чрддз1г1зсаазд£1:£аке1:т™угдардкд1еыузЫррс1ддс1р£уас1зук.дг££1вгс1пз кп£1у1дтпз1гаедРаууйса11ркгдрн£0уыддд11νΐ т/зз
72,6% идентичности нуклеотидной последовательности с последовательностью νΤ.
- 50 018129
0ош1Ь-131-20б ИТ Только РгсМа Рге 206 с1АЬ Консенсусная (1) (1) (1)
0от1к-131-206 ИТ (51)
Только Р1сЬ1а Рге 206 йаь (51)
консенсусная (51)
□от.111-131-206 нт (101)
Только РхсЫа Рге 206 ЦАЬ (101)
Консенсусная (101)
□οκΐΐϊι-131-206 НТ (151)
Только РхсЪла Рге 206 ЙАЬ (151)
Консенсусна я (151)
0от1Ъ-131-206 ПТ (201)
Только Р1сЫа Рге 206 дАЬ (2011
Консенсусная <2011
оопаь-131-206 ит (251)
Только Р±сЫа Рге 206 с!АЬ (251)
Консенсусная (251)
ϋθΗίΙϊϊ-131-206 ИТ (301)
Только ΡίοΙιιβ Рге 206 ЗДЬ (301)
Консенсусная (301)
0ОЖ111-131-2С6 ИТ (351)
ТОЛЬКО
50 аАССТССАССТСТТССАСТСТСССССАСССТТССТАСАСССТССССССТС СААСТССА&СТТСТТСАААСТ£СТССА£СССТАСТССАСС0АС(5СбСАТС СА СТССАССТ Т СА ТСС ССАСС Т СТ САССС ССССС ТС 51 100
ССТСССТСТСТССТСТССАСССТССССАТТСЛССТТТССССАТСАСАССА ТТТААСАТТДТСАТССССТСССАСТССАТТТАСТТТТССТСАССАСАССА
Т С Т ТС ТС СС ССС ССАТТ АС ТТТЕС СА САСАССД 101 150
ТССТСТСССТСССССАСССАССА^СААСССТСТАОАСТССбТСТСАСАТ Т«5-ТСТО€СТ(ЗАОАСАА6СТССТЗСААЛАСбТТТАеЛСТСССТТТСТСЛС ТССТ ТСССТ С СА СС СС СС АА СОТ ТАСАЙТСССТ ТС СА 151 200
АТТСССССССАТССТСАССАТСССТТСТАСССАйАСТСССГСААССЙССС АТТССАССТСАТССТСААСАТССТТТСТАСССАСАТТСССТСАААССААС АТТСС СС САТСЗТСА САТСС ТТСТАСССАСА ТСССТ АА ОС С 201 250
СТТСАССАТСТССССССАСААТТССААСААСАСССТАТАТСТССАААТСА АТТТЛСТАТСГССАСАСАТААТАСТАЛАААСЛСТТТСТАССТАСАСАТЙА ТТ АС ДТСТСС С СА ДАТ АА ДДСАС Т ТА СТ СА АТСА 251 300
АСАСССТСССТССССАССАСАСАССССТАТАТСДСТСТССССТССТТССТ АСТСАСТТАСАЙСССААСАТАССССТСТСТАСС^СТСССССТТСТТСССА АС СТ С ССССА СА АС СС СТ ТА САСТС СС ТС Т СС 301 350
МСАСССйСССТТЙСТТТСАСТАСТССССТСАйССААСССТССТСАСССТ ААСАСАССТССТТССТТССАТТАСТСЗССТСАССЙТАСТСТССТТАСАСТ ААСАС сс ССТТССТТ СА ТАСТССССТСАССС АС СТССТ АС СТ 351 СТССАССР1сЫа Рге 206 бАЬ Консенсусная (351) СТС-АТСТ (351) СТС А С
Кодон-оптимизированная последовательность 4 Последовательность ДНК даадЪасаасЪдсЪддададсддЪддсддсс^ддС^саассдддСддССсссЪдсдссЪдЪсс^дСдсддсаРс^ дд^ТСсассС^сдсасасдааассаСддЪдСдддИТсдссаадсСссдддсаааддсс^ддааЪдддГаадссас а££сс£сса.да'1гддссаддассса1:Сс£а£дсддаМ:ссд1:1:ааддд1:сдс1:11£асса1:1:1:с1:сд1:да£аас1:сс ааааасассс1:д1:асс1:дсада1:даас1:ссс1:дсдсдссдадда1:ас1:дсддЪд1:ассаЫ:д1:дсдс£дс!1:дсс£ ааасд1:ддсссд£дд1:1:сда1:1:ас1:ддддСсаддд1:ас1:с£дд£ сассд^аадсадс
Соответствующая а.к. последовательность ет,д11езддд1удрдд$1г1зсаазд£С£а1!е£тумтгдардкд1еигузЬ1ррсЗддс1р£уас15Укдг £Мзгдпз кпГ1у1фпп51гаесГ1:аууИса11ркгдригМуиддд1:1у1:У5 3
76,5% идентичности нуклеотидной последовательности с последовательностью ^Т.
50
САССТССАССТСТТССДСТСТСЙСССАСССТТССТАСАСССТССССЗССТС САДСТАСААСТССТССАСАССССТСССССЙСТССТТСААСССССТССТТС СА СТ СА СТС ТСЙАС СС СС ССС ТССТ СА СС СС СС ТС 51 100
ССТСССТСТСТССТСЛССАСССТССС5АТТСЛССТТТССССАТСАСЛССА ССТСССССТСТССТСТССС^САТСТССТТТСАССТТСССАСаССАААССА ССТ&СС ст ТССТСТСС СС ТС СС ТТСАССТТ СС СА СА АС А 101 150
ТССТЭТСССТСССССАСССАССАйОбААСССТСТАСАСТСССТСТСАСАТ ТССТСТССаТТССССААССТССССССАААССССТССААТСаСТААСССАС ТССТОТСССТ ССССА СС СС СС АА СС СТ СА ТСССТ СА 151 200
АТТССССССйАТСЗТСА^САТСССТТСТАСССАСАСТССЙГСАЛСССССС ЛТТССТССАОАТбСС САСЙЛС ССАТТСТЛТйСССАТТСССТТАДСССТ СС АТТСС СС САТСС САССА СС ТТСТА СС СА ТСССТ ААССС СС 201 250
СТТСАССАТСТССССССАСААТТССААСААСАСССТАТДТСТССАААТСА стттассаттгстссгсатаастссааааасассстстасстссасдтса ТТ АССАТ ТС сс СА ДА ТССАА ААСАС СТ ТА СТССА ДТСА 251 300
АСАСССТСССТССССАССАСАСАССССТАТАТСАСТЙТССССТССТТССТ АСТСССТССССССССАЗСАТАСТССССТСТДССАТТСТССССТйСТСГСТ АС ССТССС ССССАСйА АС ССССТ ТА СА ТСТССССТССТ ССТ 301 350
ААСАСС5СССС-ТТСй1ТТйАСТАСТйСССТСАСССААСССС0СРСАСССТ АААССТССССССТССТТССАТ ТАСТССССТСДХСТАСТСТССТСАССОТ АА О ЕС СС ТССТТ СА ТАСТССССТСАССС АС СТССТСАСССТ 351
СТССАСС ААССАСС АСС
Только
Только
Только
Только
Только
Только
Только
Только
0ОШ1Н-131-2О6 НТ
Е.со1ъ Зес 206 <1АЬ Консенсусная
0От1П-131-2О6 НТ Е.СО11 зес 206 с1АЬ консенсусная
Οοιη11ι-131-206 ИГ
Е.соП Зес 206 ЙАЬ консенсусная
0от1Ь-131-206 ИТ Е.со11 5ес 206 сЗАЬ Консенсусная οοϊλΙΙϊ-131-206 нт Е.со11 5ес 206 с;АЬ Консенсусная
ΟΟΙΛ1Ϊ1-131-206 ИТ Е.СО11 Зес 206 ОАЬ Консенсусная
ΟοπιΙΙι-131-206 НТ Е.СО11 Зес 206 оАЬ Консенсусная
Оопй.к-131-206 ИТ Е.со11 Зес 206 с1АЬ Консенсусная (101) (101) (101) (151) (151) (151) (201) (201) (201) (251) (251) (251) (301) (301) (301) (351) (351) (351)
Кодон-оптимизированная последовательность 5 Последовательность ДНК
- 51 018129 даддк^сааскдсЬддааЪсЪддРдд’ЬддРсРддСасаассдддЬддЬРсссЬдсдксЪдадсЕдСдсадссЬс!: ддТМтсассСТсдсСсаРдадассакддСЪЕдддСасдссаддсТссдддТаааддссСддадСдддСаадссаС абсссЬссбдабддксаддасссдРТсЬаРдсСдаССссдЕсаааддссдТСССассаРРТсЬсдСдасаасадс ааааасас+скд^асскдсааакдааскссс+дсд^дсадаадасасддсддРкЬаЬсасЪдРдсаседсЬдсса ааасдсддссскСддСбсдасЬасГддддссадддРасРскддбсасЬдРаРсЪРсТ
Соответствующая а.к. последовательность е1/д11езддд1идрддз1г1зсаазд£е£аЬекгп71гегдардкд1емузЫррс1ддс1р£уа<1зукдг££15гс1пз кпгАу! дтпя! гаос+<:1чуНсс311ркгдры.Ес1уидддЬ1ч!1УЗЗ
78,4% идентичности нуклеотидной последовательности с последовательностью νΤ. 1 50 слсстсСйсстсттсолстстасеесАйссттсстАсдссстсссеестс еАссттсыстсстссААТстсстоатс5тст13СТАСАлссссетееттс САССТ СА СТС ТССА ТСТСС <ЗС СС ТССТАСА СС СС СС ТС 51 100
ССТСССТСТСТССТ5ТССЛСССТССССАТТСАССТТТССССАТСАСЛССА ССТСсетстсАССгетссАесстстзстт’гсдсс'ттссстсмсАКАССА ССТСССТСТ СТСТССАСССТС СС ТТСАССТТ СС САГОЛСАС А 101 150
ТССТСТСССТСССССАСССАССАСССААСССТСТЛСАСТСЗСТСТСАСАТ тсстттссстассссассСтссссста.аасссстссастсжтаасссат тест теист ссссассс сс се аа ее ст састссст саг 151 200 лттссс'хсслтсстслсет'.тсссттстАсесделстссетслАСбсссв АТСССТССТСАТССТСАССАСаССТТСТЛТеСТСЛТТСССТСАААССССС ат сс сс сатсстсасса сс ттста сс са тссст аа ссссе 201 250
СТТСАССАТСТССССССАСААТТССААСадСАСССТАТАТСТаСАДАТСА ТТТТАССАТТТСТССТСАСААСаССААЛАпСАСТСТСТАССТССАААТСА ТТ ЛССАТ ТС СС С-АСАА САА ААСАС СТ ТА СТССАААТСА 251 300
АСАссстссстссссдссАСАСАссестАТАТ'Сдстйтсйсстссттсст АстесстеСвтеаАйААсиСАссессетттл'мзлстстЕСАСТССТСссА АС ССТСССТСС СА САСАС ССССТ ТАТСАСТЙТСС СТССТ СС 301 350
ААСАСССКЕССТТССТТТСАСТАСТССССТСАСесААСССТСЩТСАСССТ АААССССССССТТСЭТТССАСТАСТСИИССАбСеТАСТСТССТСАСТСТ аа е ет ссттсстт састастсссс сдсес ас стестсдс ст 351
СТССЛСС АТСТТСТ ТС
Сот1П-131-206 ИТ Только Е.СО11 1С 206 дАЬ Консенсусная
Ооп1й-131-206 ИТ Только Е.соИ 1С 206 с1АЬ Консенсусная
Ооп11Ь-131-20б ИТ
Только Е. со11 1С 206 ЙАЬ
Консенсусная
Только
Только
Только
Только
ТОЛЬКО
ООЛ11П’131-206 ИТ Е.СО11 1С 206 ЙАЬ Консенсусная
0ога11т-131-206 НТ Е.соЦ 1С 206 С1АЬ Консенсусная
ООШ111-131-206 ИТ Ε.αοΐΐ ГС 206 с1АЬ Консенсусная ϋοΐϊΐΙϊι-131-206 ИТ
Е.СО11 1С 206 ДАЬ
Консенсусная
0от1й-131-206 ИТ
Е.соИ 1С 206 Консенсусная (I) (1) (1) (101) (101) (101) (151) (151) (151) (201) (201) (201) (251) (251) (251) (301) (301) (301)
Пояснение на примерах
Пример А. Основная селекция и характеристика доменных антител к ΤΝΡΚ1 человека.
Доменные антитела получали из фаговых библиотек. И селекцию в растворе, и пэннинг в отношении пассивно адсорбированного ΤΝΕΒ.1 человека осуществляли в соответствии с релевантными стандартными способами. ΤΝΕΒ.1 человека приобретали в виде растворимого рекомбинантного белка либо в Κ&Ό 8у51еш5 (№ по каталогу 636-В1-025/СР), либо в Ρер^οίесй (№ по каталогу 310-07) и использовали либо непосредственно (в случае пассивной селекции), либо после биотинилирования, используя реакцию сочетания через первичные амины с последующим качественным контролем его активности в биологическом анализе и анализе его Μν (молекулярная масса) и степени биотинилирования посредством массспектрометрии. Обычно осуществляли 3 раунда селекции, используя уменьшающиеся уровни антигена в каждом последующем раунде.
Продукты селекции подвергали скринингу с использованием фагового ЕЫ8А на присутствие антиΤNРΉ1-связывающих клонов. ДНК из этих селектированных фагов выделяли и субклонировали в экспрессирующий вектор для экспрессии растворимых фрагментов йАЬ. Растворимые фрагменты йАЬ экспрессировали в 96-луночных планшетах и супернатанты использовали для скрининга на присутствие анти-ΤNРΉ1-связывающих йАЬ, используя либо непосредственное связывание в ЕЫ8А с детекцией анти-с-тус, либо ВЮ^те™ с использованием чипа ВЮ^те™ со стрептавидин/биотинилированным ΤΝΕΒ.1, и ранжировали в соответствии со скоростями диссоциации.
Основные молекулы, описанные ниже, происходили из родительского йАЬ, названного ΌΟΜ111-131 (описанного в νΟ 2006038027). Эту молекулу селектировали из фаг-дисплейной библиотеки после 3 раундов селекции с использованием 60 нМ биотинилированного антигена. Покрытые стрептавидином или нейтравидином гранулы ОуиаЬеайх чередовали в качестве захватывающих реагентов в каждом раунде селекции для предупреждения селекции структур, связывающихся либо со стрептавидином, либо с нейтравидином. Эффективность основной молекулы ΌΟΜ111-131 на этой стадии находилась в низком микромолярном диапазоне, как определено в клеточном анализе на фибробластах МВС-5 с высвобождением ΣΕ-8. Кинетика связывания, определенная с помощью ВΣΛсο^е™, обычно представляла скорости быстрой ассоциации и быстрой диссоциации (ίηδΙ-οη/ίηδΙ-οίΤ га!е5). Уровни экспрессии в Е. сο1^ этой основной молекулы ΌΟΜ111-131 в виде мономера с присоединенной к С-концу тус-меткой находились в диапазоне 8 мг/л.
Созревание аффинности основных молекул
ΌΟΜ111-131 подвергали созреванию аффинности с получением мутантов с более высокой эффективностью и улучшенными биофизическими характеристиками (см. фиг. 3 в отношении аминокислотных
- 52 018129 последовательностей основных молекул, происходящих из ЭОМ1Й-131). После создания допускающей ошибки библиотеки (в среднем 1 аминокислотная замена на последовательность бАЬ, размер библиотеки 8х107) с использованием ПЦР-полимеразы низкой точности (Сепетогрй II, 81га!адепе) осуществляли семь раундов селекции, используя эти допускающие ошибки библиотеки. Такая стратегия привела к выделению клона ЭОМ1Й-131-8, молекулы, в которой 4 аминокислотные замены (одна в каркасной области 1 (ЕК1), одна в СЭК1. одна в СЭК3 и одна в ЕК4) дали приблизительно 100-кратное улучшение эффективности, как измерено в анализе с использованием клеток МКС-5 (приблизительно 4 нМ). В этом анализе клетки МКС-5 инкубировали с тестируемыми образцами в течение одного часа, затем добавляли Т№-а (200 нг/мл). После инкубации в течение ночи определяли высвобождение 1Ь-8 с использованием клеточного анализа, обнаруживающего 1Ь-8 с помощью АВ1 8200 (ЕМАТ) (йиоготейяс тюгомойппе аккау !есйпо1оду; технология флуориметрического анализа в микрообъеме). В каждый эксперимент включали кривую зависимости от дозы Т№-а. Концентрация Т№-а, используемая для конкуренции с бАЬ за связывание с ТКЕК1 (200 пг/мл), составляла приблизительно 70% от максимального ответа на ТКЕ-а в этом анализе.
Для дальнейшего улучшения эффективности отдельные аминокислотные положения диверсифицировали посредством олиго-направленного мутагенеза по ключевым положениям, предсказанным на основании информации о допускающей ошибки консенсусной последовательности основной молекулы. Во время этого процесса посредством скрининга с использованием В1Асоге™ выделили улучшенный вариант клона ООМ111-131-8, ЭОМ111-131-24 (первоначально названный ЭОМ111-131-8-2 до коррекции), который имел единственную аминокислотную мутацию К94К (нумерация аминокислот согласно КаЬа!) и эффективность в КВА 200-300 пМ.
Далее на основе этой основной молекулы и КК8-библиотеки, из которой она происходила, создавали допускающие ошибки библиотеки и подвергали их трем раундам фаговой селекции, используя тепловую обработку (описание способа см. в 1екрегк Ь, е! а1., Адгеда1юп-гек1к1ап! ботат ап11Ьоб1ек ке1ес!еб оп рйаде Ьу йеа! бепа!ига!юп. №11. Вю!есйпо1. 2004 8ер; 22(9): 1161-5). В процессе селекции библиотеки объединяли и из клонов, полученных во втором раунде селекции, получали бАЬ, такие как ЭОМ111-131-53. которое, как полагали, было более термостабильным. Предположили, что эти клоны будут обладать улучшенными биофизическими характеристиками. Некоторые мутации в каркасной области в клоне ЭОМ111-131-53 были эмбрионального типа для создания клона ЭОМ111-131-83. Этот клон стал основой для дальнейшей диверсификации посредством олигонаправленного мутагенеза индивидуальных СОК либо с применением фаг-дисплейной селекции, как описано выше, либо с применением технологии компартментализации ш у11го с использованием эмульсий. С применением фаг-дисплейной стратегии были созданы основные молекулы ООМ1й-131-117 и ООМ1й-131-151. ООМ1й-131-511 создавали с применением технологии компартментализации ш у11го.
На этой стадии сравнивали эти три основные молекулы в биофизических и биологических анализах, и наилучшими свойствами обладала молекула ООМ111-131-511. Кроме того, эти молекулы тестировали на их устойчивость к протеолитическому расщеплению в присутствии трипсина или лейкозима. Лейкозим состоит из объединенной слюны, полученной от пациентов с муковисцидозом, и содержит высокие уровни эластазы и других протеаз, и его использовали в качестве имитатора условий ш νί\Ό при легочных заболеваниях. Эти результаты показали, что все три основные молекулы ЭОМ1й-131-117, ЭОМ111-131-151 и ЭОМ111-131-511 быстро расщеплялись в присутствии трипсина или лейкозима. Эти данные поставили вопрос о персистенции ЭОМ111-131-511 ш νί\Ό, в организме пациента, и была разработана стратегия селекции в отношении улучшенной устойчивости к трипсину. Предположили, что такая улучшенная устойчивость к трипсину может оказывать благоприятный эффект на другие биофизические свойства данной молекулы. По существу, модифицировали стандартный способ селекции фагов, чтобы обеспечить возможность селекции в присутствии протеаз перед селекцией по антигену. Для этого конструировали новый фаговый вектор, в котором делетировали концевую последовательность с-тус, чтобы обеспечить возможность селекции в присутствии трипсина без отщепления экспонируемого бАЬ от фага. На основе ЭОМ111-131-511 создали допускающие ошибки библиотеки и клонировали их в вектор рЭОМ33 (см. фиг. 50 в отношении карты вектора рЭОМ33). Фаговые концентраты, полученные из этой библиотеки, предварительно обрабатывали трипсином в концентрации либо 1 мг/мл, либо 100 мкг/мл при 37°С в течение 24 ч, затем добавляли ингибитор протеазы, который представлял собой полный набор ингибиторов протеаз от Косйе (2х), для блокирования активности трипсина перед селекцией по релевантному антигену. Осуществляли четыре раунда селекции. Экспрессируемые растворимые Т№К1связывающие бАЬ оценивали, используя В1Асоге™, в отношении их способности связываться с Т№К1 в присутствии или в отсутствие протеаз при инкубациях в течение одного часа или в течение ночи при 37°С в присутствии или в отсутствие трипсина (в конечной концентрации трипсина 100 мкг/мл или 1000 мкг/мл).
Это привело к выделению двух основных молекул ООМ111-131-202 и ЭОМ1й-131-206, которые демонстрировали улучшенную устойчивость к протеазам, как показано в В1Асоге™-экспериментах по связыванию с антигеном. Интересно отметить, что ООМ111-131-202 содержала только одну мутацию в
- 53 018129
СЭК2 (У53Э) (нумерация всех аминокислот согласно КаЬа1) по сравнению с ΌΟΜ1Η-131-511, в то время как ΌΟΜ1Η-131-206 содержала только две мутации: первая мутация является такой же, как в ΟΟΜ111131-202 (мутация У53Э в СОК2), а вторая мутация представляет собой мутацию Υ91Η в ЕК3 (см. фиг. 3). Эта мутация Υ91Η в ЕК3 встречается в гене 3-20 зародышевой линии человека, что указывает на то, что этот остаток присутствует в антителах человека. Три клона ΌΟΜ1Η-131-511, ΌΘΜ1Η-131-202 и ΟΟΜ111131-206 имеют аминокислотные последовательности, показанные на фиг. 3.
Активность молекул определяли, как показано ниже.
- 54 018129
Оценка аффинности связывания ΏΟΜ1Η-131-202, ϋΟΜ1Η-131-511 и ΏΟΜ1Η-131-206 в отношении связывания с человеческим ΤΝΕΚ1 с использованием В1Асоге™
Аффинности связывания ООМ1Н-131-202, ООМ1Н-131-511 и ООМ1Н-131-206 в отношении связывания с человеческим рекомбинантным ТАК1, экспрессируемым в Е.со11, оценивали посредством ΒIΑсо^е™-анализа. Анализ осуществляли с использованием биотинилированного человеческого ТАК1. 1400 Ки (резонансных единиц) биотинилированного ТАК1 использовали для нанесения на чип со стрептавидином (8А). Поверхность регенерировали до исходного состояния, используя элюцию в условиях слабой кислотности. ООМ1Н-131-202, ООМ1Н-131-511 и ООМ1Н-131-206 пропускали через эту поверхность при определенных концентрациях, используя скорость потока 50 мкл/мин. Для работы использовали устройство В^сою™ 3000 и данные анализировали и подгоняли к модели связывания 1:1. Данные по связыванию хорошо соответствовали модели 1:1 для всех тестируемых молекул. Все значения Кс рассчитывали, исходя из констант коп и ко[1\ ΒIΑсо^е™-анализы осуществляли при 25°С.
Приведенные ниже данные получены их трех независимых экспериментов. В каждом эксперименте результаты вычисляли путем усреднения числа подгонок с использованием наибольших концентраций бАЬ для кб и меньших концентраций для ка. Данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения (в скобках) результатов (табл. 1).
Таблица 1. Данные В^сого™ для связывания ООМ1Н-131-202, ООМ1Н-131-511 и ООМ1Н-131-206 с ТАК1 человека
&оп 8о№ Ко (нМ)
ООМ1Н-131-511 5.03Е+05 5.06Е-04 1,07
(511) (1.07Е+05) (1.01ЕО4) (0,44)
ДОМ1Н-131-202 1.02Е+06 5.42Е-04 0,55
(202) (2.69Е+05) (3.69Е-05) (0,11)
ООМ1Н-131-206 1.55Е+06 7.25Е-04 0,47
(206) (3.57Е+05) (1.95Е-04) (0,06)
ООМ1Н-131-202, ООМ1Н-131-511 и ООМ1Н-131-206 связывались с ТАК1 человека сходным образом и с высокой аффинностью. ЭОМ1Н-131-202 и ЭОМ1Н-131-206 связываются со средними аффинностями 0,55 нМ и 0,47 нМ соответственно. И ООМ1Н-131-202, и ООМ1Н-131-206 имеют несколько лучшую аффинность по сравнению с ООМ1Н-131-511, который имеет среднюю аффинность 1,07 нМ.
- 55 018129
Анализ связывания с рецептором
Эффективность бАЬ определяли в отношении ΤΝΕΚ1 человека в анализе связывания с рецептором. В этом анализе измеряют связывание ΤΝΕ-альфа с ΤΝΕΡ1 и определяют способность растворимого бАЬ блокировать это взаимодействие. Слияние ΊΝΈΚ1-ΕΟ улавливают на шариках, предварительно покрытых козьими антителами против 1дС человека (Н&Ь). Покрытые рецептором гранулы инкубируют с ΤΝΕ-альфа (10 нг/мл), бАЬ, биотин-конъюгированным анти-ΤNΕ-альфа и стрептавидин-(а1еха Пног 647) в 384-луночном планшете с прозрачным дном и черными стенками. Через 6 ч планшет считывают в системе АВ1 8200 Се11и1аг ^еΐесΐ^οη и определяют ассоциированную с гранулами флуоресценцию. Если бАЬ блокирует связывание ΤNΕ-альфа с Τ^ΚΕ то интенсивность флуоресценции будет уменьшаться.
Данные анализировали с использованием программного обеспечения для анализа АВ1 8200. Кривые зависимости эффекта от концентрации и значения эффективности (ЕС50, средняя эффективная концентрация) определяли с использованием СгарЬРаб Рпкт и сигмоидальной кривой зависимости ответа от дозы с вариабельным наклоном. Анализ повторяли в трех отдельных параллелях. Кривую зависимости от дозы ΤNΕ-альфа включали в каждый эксперимент (фиг. 38 и 39). Концентрация ΤΝΡ-α, используемая для конкуренции с бАЬ за связывание с ΤΝΡΚ1 (10 нг/мл), составляет приблизительно 90% от максимального ответа на ΤNΕ-α в этом анализе.
Репрезентативный график, представленный на фиг. 39, демонстрирует способность бАЬ ингибировать связывание ΤΝΡ-α с ΤΝΡΚ1. Во всех трех экспериментах отрицательные контрольные образцы (НЕЬ4, бАЬ против лизоцима белка куриного яйца и имитация Ун) слабо ингибируют взаимодействие между Τ^-α и ΤΝΗΚ1 при высоких концентрациях. Средние значения эффективности (ЕС50) для тестируемых образцов и положительных контролей (ΜΠΉ-ΤΝίΚΙ тАЬ (моноклональное антитело), полученное от К&И 8ук1ет5, тАЬ225) и ЕпЬгеГ1™ (этанерцепт; димерная слитая конструкция, состоящая из Τ^ΙΠ, связанного с Ес-областью 1дС1; разрешен для лечения ревматоидного артрита) представлены в табл. 2.
Таблица 2. Значения эффективности (ЕС50) для ΌΘΜ1Η-131-202, ΌΘΜ1Η-131-206 и ΌΟΜ1Η-131-511 в анализе связывания с рецептором Е№К1 для трех повторных экспериментов
Образец Средняя ЕС60 (нМ) ЗЕЛЛ (стандартная ошибка среднего)
ООМ1Н-131-202 0,11 0,008
ООМ1Н-131-206 0,07 0,01
ϋΟΜ1Η-131-511 0,19 0,01
ЕпЬге!™ (этанерцепт) 0,20 0,07
Анти-ΤΝΡΒΙ тАЬ № тАЬ225 0,08 0,003
В этом анализе ΌΘΜ1Η-131-206 кажется более эффективным, чем два других тестируемых бАЬ, и имеет похожую эффективность с имеющимся в продаже анти-ГОТИ тАЬ, ΜАВ225 (К & И Зук1етк).
Экспрессию основных клонов в РюЫа ракЮпк осуществляли, как описано ниже.
Первичную аминокислотную последовательность трех основных молекул использовали для получения кодон-оптимизированных генов для секретируемой экспрессии в РюЫа ракЮпк. Имеется 75%-ная идентичность последовательностей между кодон-оптимизированной и кодон-неоптимизированной последовательностью ΌΘΜ1Η-131-206. Три синтетических гена клонировали в экспрессирующий вектор рРГС-Ζα (от ΙηνίΐΓο^η) и затем осуществляли трансформацию двух штаммов РюЫа, Х33 и КΜ71Н. Трансформированные клетки высевали на чашки с увеличивающимися концентрациями зеоцина (100, 300, 600 и 900 мкг/мл) для селекции клонов с множественными интегратами (1ЫедгаЫк). Для скрининга экспрессии было отобрано приблизительно 15 клонов для каждой клеточной линии и конструкции. Поскольку корреляция между высокой/низкой копийностью гена и уровнем экспрессии в РюЫа ракЮпк до конца не понятна, несколько клонов отбирали во всем диапазоне концентраций зеоцина. Циклы ферментации в 5-литровом ферментере осуществляли с использованием клонов, которые не были подвергнуты расширенному скринингу в отношении высокой продуктивности. Это позволило получить значительные количества материала для дальнейших исследований.
Получение материала для характеристики белка
Для очистки Ун бАЬ из супернатантов микробных культур широко используются хроматографические смолы на основе белка А. Хотя это позволяет использовать одностадийный способ очистки для получения высоко очищенного материала, обычно в более чем 90% случаев условия элюции при низких рН для некоторых молекул могут приводить к образованию агрегатов. Также существует проблема ограниченной емкости аффинных смол для бАЬ; это означает необходимость использования значительных количеств смолы для обработки материала из ферментеров. Для получения высококачественного материала с целью его характеристики и дальнейших исследований стабильности и исследований с применением
- 56 018129 небулайзеров разработали следующий способ очистки с использованием смолы с индукцией заряда смешанной модальности в качестве первичной стадии захвата с последующей анионообменной хроматографией. Без какой-либо значительной оптимизации это позволяет достичь приблизительно 70%-ного извлечения экспрессированного ЙАЬ с чистотой приблизительно 95%.
Для проведения стадии захвата на смоле с индукцией заряда смешанной модальности (СарГо ММС от СЕ Неа11йсаге) колонку уравновешивают, используя 50 мМ фосфат натрия рН 6,0, и супернатант наносят без разведения или корректировки рН. После промывки колонки белок элюируют градиентом рН, используя буфер для элюции, представляющий собой 50 мМ Трис рН 9,0. Конкретные условия промывки и градиента слегка варьируют в зависимости от р1 элюируемого белка.
Пик элюата затем дополнительно очищают посредством стадии анионообменной хроматографии. Это позволяет удалить остаточную НМА (высокомолекулярную) примесь, такую как алкогольоксидаза, и уменьшает содержание эндотоксина. Смолу уравновешивают либо РВ8, либо фосфатным буфером рН 7,4 без соли. При нанесении элюата с СарГо ММС на анионообменную смолу ЙАЬ не связывается, и его извлекают из проскока (Доте ГЬгоидй). Эндотоксин и другие примеси связываются со смолой. Присутствие соли, в случае использования РВ8-буфера, улучшает выход белка до 91% для этой стадии вместо выхода 86%, достигаемого в отсутствие соли. Однако присутствие соли снижает эффективность удаления эндотоксина, так что типичный уровень эндотоксина в ЙАЬ после этой стадии с включением соли составлял 58 ЕИ/мл по сравнению с уровнем менее 1,0 ЕИ/мл, полученным в отсутствие соли.
Характеристика белка
Материал, полученный из циклов ферментации в 5-литровом ферментере, характеризовали в отношении идентичности, используя масс-спектрометрию с электрораспылением, амино-концевое секвенирование и изоэлектрическое фокусирование, а также в отношении чистоты, используя 8Э8-РАСЕ, 8ЕС и набор для окрашивания гликопротеинов Се1сойе (Р1егсе).
Идентичность
Анализ аминоконцевой последовательности первых пяти остатков каждого белка дал ожидаемый результат (ЕУРЬЬ...). Масс-спектрометрию осуществляли на образцах белков, в которых произвели замену буфера на Н2О:ацетонитрил 50:50, содержащий 0,1% ледяной уксусной кислоты, с использованием С4 21р-йрк (М1Шроге). Измеренная масса каждого из трех белков находилась в пределах 0,5 Да от теоретической массы на основании первичной аминокислотной последовательности (рассчитанной с использованием средних масс) с учетом разницы масс -2, получаемой в результате образования внутренней дисульфидной связи. 1ЕЕ использовали для идентификации белков на основании их р1, которые различались для каждого белка.
Чистота
Эти три белка наносили на невосстанавливающие 8Э8-РАСЕ гели в количествах 1 и 10 мкг в двух повторностях. Во всех случаях наблюдали одну полосу. Для демонстрации уровней чистоты также осуществляли гель-фильтрацию. При проведении гель-фильтрации (8ЕС) на колонку С2000 8АХЬ ТО8ОН наносили по 100 мкг каждого белка при скорости потока 0,5 мл/мин. Использовали подвижную фазу РВ8/10% этанола.
Исследование стабильности йАЬ для селекции кандидатов
При показании СОРИ необходимо доставлять АЬ в легкое, например, с использованием распылительного устройства. Это означает, что белок может испытывать сдвиговую деформацию и тепловой стресс в некотором диапазоне в зависимости от типа используемого небулайзера и может подвергаться ферментативному расщеплению протеазами во внутрилегочной среде. Определяли, может ли белок доставляться с использованием этого типа устройства, происходит ли правильное распределение по размеру частиц и остается ли он функциональным после доставки небулайзером. Поэтому исследовали внутреннюю стабильность молекулы в диапазоне физических нагрузок для того, чтобы определить исходную стабильность и наиболее чувствительные анализы для измерения стабильности. Поскольку стабильность каждого белка будет зависеть от буферного раствора, в котором он растворен, необходимо было провести некоторую подготовительную работу. Такая информация, как буфер, рН, также может быть полезна для представления о стабильности белка во время последующего процесса очистки и дальнейшего хранения. Для того чтобы охарактеризовать изменения в молекулах во время воздействия на них различных физических нагрузок, использовали ряд аналитических методик, таких как гель-фильтрация (8ЕС), 8Ό8РАСЕ и изоэлектрическое фокусирование (1ЕЕ).
Оценка стабильности ИОМ1Н-131-202, ИОМ1Н-131-511 и ИОМ1Н-131-206 в присутствии протеаз
Стабильность ЭОМ1Н-131-202, ЭОМ1Н-131-511 и ЭОМ1Н-131-206 в присутствии протеаз оценивали в В1Асоге™-анализе остаточной связывающей активности после предварительной инкубации в течение определенных периодов времени с избытком протеаз. Приблизительно 1400 КИ биотинилированного ΤΝΕΚ1 использовали для нанесения на чип со стрептавидином (8А). 250 нМ ЭОМ1Н-131-202, ЭОМ1Н-131-511 и ЭОМ1Н-131-206 инкубировали только с РВ8 или с 100 мкг/мл трипсина, эластазы или лейкозима в течение 1, 3 и 24 ч при 30°С. Реакцию останавливали путем добавления коктейля ингибиторов протеаз. Затем йАЬ/протеазные смеси пропускали через чип, покрытый ΤΝΕΚ1, вычитая сигнал ячейки сравнения. Поверхность чипа регенерировали перед каждым циклом инжекции, используя 10 мкл
- 57 018129
0,1 М глицина, рН 2,2. Фракцию ООМ1Н-131-202, ООМ1Н-131-511 и ООМ1Н-131-206, связавшихся с ΤΝΕΉ1 человека (за 10 с), предварительно инкубированных с протеазами, определяли относительно бАЬ, связавшегося в отсутствие протеаз. В^солг^-анализы осуществляли при 25°С.
Данные получали из трех независимых экспериментов. Гистограмма показывает средние значения, а планки погрешностей указывают на стандартное отклонение результатов (результаты см. на фиг. 24).
Обнаружили, что ЭОМ1Н-131-202 и ЭОМ1Н-131-206 показали более высокую устойчивость к протеолитическому расщеплению трипсином, эластазой или лейкозимом по сравнению с ЭОМ1Н-131-511. Различие между ООМ1Н-131-202 и ООМ1Н-131-206 по сравнению с ООМ1Н-131-511 наиболее ярко выражено после инкубации в течение 1 ч с трипсином и 3 ч с эластазой или лейкозимом.
Термостабильность, определенная с использованием Б8С
Для того чтобы определить, при каких значениях рН молекулы имели наибольшую стабильность, использовали дифференциальную сканирующую калориметрию (Э8С) для измерения температур плавления (Тт) каждого бАЬ в буфере Бриттона-Робинсона. Поскольку буфер Бриттона-Робинсона изготовлен из трех буферных систем (ацетата, фосфата и бората), то в одном и том же растворе можно получать рН в диапазоне от 3 до 10. Теоретическую величину ρ1 определяли из первичной аминокислотной последовательности белков. На основании данных Э8С обнаружили, что рН, при котором бАЬ имеют самую высокую внутреннюю термостабильность, составляет: рН 7 для ЭОМ1Н-131-202 (202), рН 7-7,5 для ООМ1Н-131-206 (206) и рН 7,5 для ООМ1Н-131-511 (511). Во всех последующих исследованиях нагрузок и стабильности для каждого бАЬ использовали следующие значения рН: для ЭОМ1Н-131-202 (202) и ООМ1Н-131-206 (206) рН 7,0, а для ООМ1Н-131-511 (511) рН 7,5 в буфере Бриттона-Робинсона. Результаты суммированы ниже в табл. 3.
Таблица 3. Краткий обзор значений рН и Тт для ООМ1Н-131-202 (202), ООМ1Н-131-206 (206) и ЭОМ1Н-131-511 (511), как определено посредством Э8С в буфере Бриттона-Робинсона при концентрации 1 мг/мл
ЙАЬ рН, который дает наибольшую внутреннюю термостабильность Тт (’С) ЙАЬ при данном рН
ϋΟΜΊΗ-131-202 (202) 7,0 68,6
ϋΟΜ1Η-131-206 (206) 7,0-7,5 65,8
ϋΟΜ1Η-131-511 (511) 7,5 58,0
Тестирование собственной растворимости
Все основные молекулы бАЬ концентрировали в центрифужных концентраторах νίνπδρίη (отсечение 5 кДа) для определения их максимальной растворимости и выходов после концентрирования. Эксперименты осуществляли в буфере Бриттона-Робинсона при наиболее стабильном рН. Объемы образцов и концентрации измеряли во времени и регистрировали отклонение от ожидаемой концентрации, а также процентный выход образца.
Обнаружили, что все белки могут быть сконцентрированы до концентрации более 100 мг/мл в буфере Бриттона-Робинсона. И ООМ1Н-131-202 (202), и ООМ1Н-131-206 (206) демонстрировали более низкие выходы, чем ожидалось, по сравнению с ЭОМ1Н-131-511 (511), но остающиеся все еще на приемлемых уровнях.
Доставка основных ЙАЬ с использованием небулайзеров
В результате тестирования различных небулайзеров и препаративных буферов было продемонстрировано, что бАЬ могут эффективно доставляться с использованием широкого набора распылительных устройств. Важнее то, что впервые было показано, что распыление бАЬ в препаративном буфере приводило к получению желаемого распределения частиц по размерам (сравнимое с использованием процента капель менее 5 мкм) для эффективной доставки в легкое при сохранении функциональности белка. Это дополнительно описано ниже.
Сравнение производительности различных устройств
ЭОМ1Н-131-511 (511) тестировали в шести распылительных устройствах, включающих по два устройства из каждой из трех основных групп небулайзеров, используемых для жидких композиций, т.е. ультразвуковых небулайзерах, струйных небулайзерах и небулайзерах на основе технологии вибрирующего сита. В каждом устройстве бАЬ тестировали в концентрации 5 мг/мл с диапазоном концентраций ПЭГ. Для каждого образца измеряли процент капель размером менее 5 мкм, используя устройство Ма1уегп 8ргау1ек (Макет Iη8ΐ^итеηΐ8 Ытйеб, ИК), и результаты представлены на фиг. 35. Стабильность каждого образца после его распыления оценивали, используя 8ЕС для анализа количества образца, который димеризовался как в веществе, оставшемся в колпачке, так и в собранном аэрозоле. Результаты можно видеть на фиг. 36. Чем меньше степень образования димеров, тем выше стабильность.
Большая часть устройств может доставлять 40% или более жидкой композиции в подходящем диапазоне размеров, но устройства еЕ1оте (распылительное устройство на основе технологии вибрирующего сита) и РАШ ЬС (струйный небулайзер) работают лучше, причем устройство РАШ ЬС* (к1аг) доставляет более 80%, когда в состав буфера включен ПЭГ. Это увеличение доставки при использовании ПЭГ также
- 58 018129 наблюдается для сЕ1о\с и в меньшей степени для РАЕ1 ЬС+.
Важно, что также обнаружили, что после распыления сохраняется активность бАЬ (см. результаты на фиг. 8).
Влияние буферных добавок
Вследствие меньшей стабильности БОМ1Н-131-511 (511) 50 мМ фосфатный препаративный буфер, содержащий как ПЭГ 1000, так и сахарозу (и имеющий вязкость, которая находится в диапазоне, который определен как примерно равный вязкости раствора от примерно 2% до примерно 10% ПЭГ 1000 в 50 мМ фосфатном буфере, содержащем 1,2% сахарозы (мас./об.)), способствует защите бАЬ как от сдвиговой деформации, так и от теплового стресса. Поскольку и БОМ1Н-131-202 (202), и БОМ1Н-131-206 (206) имеют более высокие Тт и демонстрируют значительно улучшенную стабильность к тепловому стрессу, все молекулы тестировали как в исходном препаративном буфере, так и в буфере БриттонаРобинсона (который имеет меньшую вязкость, чем препаративный буфер). бАЬ тестировали в обоих устройствах Е-По\у и Рап ЬС+ со временем работы 3,5 мин при концентрации белка 5 мг/мл и распределение частиц по размерам определяли с использованием устройства Ма1устп 8ртауГск. Для сравнения имеющееся в продаже лекарственное средство для лечения муковисцидоза (обозначенное как стандартный белок X), которое доставляют с использованием распылительного устройства, тестировали в его собственном препаративном буфере. Результаты представлены на фиг. 37. Для хорошей доставки и распределения в глубоких отделах легких идеальный размер частиц составляет менее 6 мкм, например менее 5 мкм. Все бАЬ обеспечивают сравнимые уровни размеров частиц, которые были меньше 5 мкм как в буфере Бриттона-Робинсона, так и в препаративном буфере (как описано ранее). Однако более высокая вязкость препаративного буфера может быть особенно полезной для продуцирования частиц в подходящем диапазоне размеров, например частиц менее 5 мкм. Концентрацию бАЬ в колпачке устройства определяли, измеряя А280 до и после распыления. Обнаружили, что концентрация белка не изменялась существенно, что указывает на то, что ни белок, ни разбавитель не распылялись предпочтительно во время доставки.
Заключение
Продемонстрировано, как описано выше, что полипептиды, такие как бАЬ, можно распылять с использованием различных, имеющихся в продаже распылительных устройств, и важно, что они сохраняют стабильность и биологическую активность после распыления и что после распыления не наблюдается никакой значительной агрегации. Когда в состав буфера добавляют эксципиенты, увеличивающие вязкость, такие как ПЭГ, распределение частиц по размеру и процент капель с размером менее 5 мкм могут быть улучшены, что потенциально улучшает доставку бАЬ в глубокие отделы легких.
Доставка бАЬ в легкое также может быть улучшена посредством увеличения концентрации бАЬ, например, вплоть до концентрации примерно 40 мг/мл, и времени доставки без какого-либо уменьшения стабильности или активности бАЬ.
Пример 1. Фаговый вектор рБОМ13
Использовали вектор рБОМ13 для фагового дисплея на основе нитчатого фага (Гб). Этот вектор продуцирует белки, слитые с оболочечным фаговым белком ΙΙΙ. Сайт множественного клонирования рБОМ13 проиллюстрирован на фиг. 1. Гены, кодирующие бАЬ, клонировали в виде 8а11^оГ1фрагментов.
Пример 2. Протеазные селекции экспонируемых на фагах доменных антител (бАЬ) с различной устойчивостью к трипсину
Гены, кодирующие бАЬ: ООМ4-130-54, которое связывается с 1Б-1Е1, ООМ1Н-131-511, которое связывается с ΤΝΕΚ1, и БОМ15-10, БОМ15-26 и БОМ15-26-501, которые связываются с УБОРА, клонировали в рБОМ13, и фаги, экспонирующие эти бАЬ, получали в соответствии со стандартными методиками. Фаги очищали посредством ПЭГ -преципитации, ресуспендировали в РВ8 и титровали.
Указанные выше бАЬ демонстрировали разную способность противостоять расщеплению трипсином при тестировании их в виде выделенных белков. Устойчивость к расщеплению оценивали следующим образом: бАЬ (1 мг/мл) в РВ8 инкубировали с трипсином в концентрации 40 мкг/мл при 30°С, что приводит к молекулярному соотношению бАЬ:трипсин 25:1. Образцы (30 мкл) отбирали непосредственно перед добавлением трипсина и затем через 1, 3 и 24 ч. Протеазную активность нейтрализовали путем добавления полного набора ингибиторов протеаз от ЕосНс (2х) с последующим погружением в жидкий азот и хранением на сухом льду. По 15 мкг каждого образца бАЬ далее анализировали посредством электрофореза на геле №ссх (10-20%) Тпстс и белки окрашивали с помощью 8игсВ1ис (1х).
И БОМ15-10, и Б0М15-26-501 оба в значительной степени переваривались в течение первых 3 ч. БОМ15-26, БОМ4-130-54 и БОМ1Н-131-511 оказались более стабильными, причем переваривание этих бАЬ становилось заметным только через 24 ч (фиг. 2).
Экспонируемые на фагах бАЬ инкубировали также в присутствии трипсина для оценки того, коррелирует ли устойчивость к трипсину экспонируемых на фагах АЬ с результатами, полученными с выделенными растворимыми бАЬ. Тестировали различные концентрации трипсина и времена инкубации. Во всех случаях после нейтрализации трипсина полным набором ингибиторов протеаз от ЕосНс фаги тестировали в отношении их способности связываться с типичным лигандом: белком А, который связывается
- 59 018129 со всеми ^-доменными антителами (например ООМ111-13Е ЭОМ15-26, ЭОМ 15-26-501) или белком Ь, который связывается со всеми νκ-доменными антителами (например ЭОМ4-130-54, ЭОМ15-10). Фаги также тестировали в отношении связывания с целевыми антигенами. В обоих случаях предполагалось, что связывание коррелирует с сохранением структурной целостности бАЬ благодаря устойчивости к протеолизу. Связывающую активность измеряли либо посредством ЕЫ8А (с использованием конъюгированных антител против фага), либо посредством элюции связавшихся фагов и анализа титрованием после инфицирования клеток Е. сой ТС1, находящихся в экспоненциальной фазе роста.
Тестирования БОМ15-10, БОМ15-26 и БОМ 15-26-501 на фаге
Каждое бАЬ обрабатывали в течение одного часа при комнатной температуре трипсином в диапазоне концентраций (100 мкг/мл, 10 мкг/мл и 0 мкг/мл). Активность трипсина блокировали полным набором ингибиторов протеаз от Воске (1Х) и затем фаги разбавляли в 2% Магуе11 в РВ8, инкубировали с 50 нМ биотинилированного антигена (рекомбинантного ЧЕСЕ человека (В&Н 8у8!етк)) в течение одного часа при комнатной температуре. Добавляли покрытые стрептавидином гранулы (ЭупаЬебк М-280 Цпуйгодеп)), которые предварительно блокировали в течение одного часа при комнатной температуре 2% Магуе11 в РВ8 и смесь затем инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. Все стадии инкубации с ЭупаЬебк осуществляли на вращающемся диске (го!айпд \\'кее1). Несвязавшийся фаг отмывали путем промывки гранул восемь раз 1 мл 0,1% Т\гееп-20 в РВ8. Связавшийся фаг элюировали, используя 0,5 мл 0,1 М глицина, рН 2,2, и нейтрализовали 100 мкл 1 М трис-ИС1, рН 8,0. Элюированный фаг использовали для инфицирования клеток ТС1, находящихся в экспоненциальной фазе роста (1 ч при 37°С), и высевали на чашки с тетрациклином. Чашки инкубировали в течение ночи при 37°С и осуществляли подсчет колоний (см. табл. 4). Наилучшие результаты наблюдали для селекции с инкубацией при 100 мкг/мл трипсина. Наблюдали примерно 10-кратное увеличение выхода ЭОМ15-26 по сравнению с ООМ15-10 и ООМ15-26-501.
Второй эксперимент осуществляли для дополнительного подтверждения этих результатов в более жестких условиях инкубации. Экспонируемые на фагах бАЬ обрабатывали в течение 1 или 2 ч при 37°С с перемешиванием (250 об./мин). Наилучшие результаты наблюдали для селекции с инкубацией в течение 2 ч при 100 мкг/мл трипсина. Выход ООМ15-26 был в 200 раз выше, чем выход ООМ15-26-501, и в 1000 раз выше, чем выход ЭОМ15-10.
В третьем эксперименте фаги, экспонирующие ЭОМ15-26 и ЭОМ15-26-501, в начале смешивали 1:1. Затем их инкубировали либо с трипсином (1000 мкг/мл), либо без трипсина в течение двух часов при 37°С с перемешиванием (250 об./мин) и затем селектировали в отношении связывания с антигеном, как описано выше. Секвенирование десяти колоний для каждой селекции обнаружило смешанную популяцию клонов для селекции без предварительной обработки трипсином (ЭОМ15-26: 4/10; ЭОМ15-26-501: 6/10), в то время как все клоны для селекции с трипсином кодировали ЭОМ15-26, как и ожидалось.
Эти эксперименты показывают, что селекционное давление может быть получено путем добавления протеазы к фагам, экспонирующим бАЬ, так что предпочтительно селектируются фаги, экспонирующие наиболее стабильные к протеолизу бАЬ (после пэннинга на типичным лиганде или антигене).
Таблица 4
Эксперимент Длительность инкубации Темп. Концентрация трипсина Титр ЦО М15-26 Титр ЦОМ15-26501
1 исходное 1 ч Комн, темп. 100 мкг/мл 1,6x108 6,3x107
кол-во (ΐηρυί) Ю10 1 ч Комн, темп. 10 мкг/мл 3x10а 4,4x10е
1 ч Комн, темп. 0 мкг/мл 0,9x10“ 2x10“ |
2 исходное кол-во 109 1 ч, 250 об/мин 37”С 100 мкг/мл 2x10' 1x10“
2 ч, 250 об/мин 37°С 100 мкг/мл 1x10' 6x104
2 ч. 250 об/мин 37°С 0 мкг/мл ~~5,4χΪ0Γ 4,1x107
3 исходное кол-во Ю10 2 ч, 250 об/мин 37°С 100 мкг/мл 2,3x10 3x10’
2 ч, 250 об/мин 37’С 0 мкг/мл 3,9x10“ Ф4х1бь
Тесты с БОМ4-130-54 на фаге
ЭОМ4-130-54 тестировали согласно аналогичному протоколу, как описано выше. Варьировали следующие параметры: концентрацию трипсина, температуру и длительность инкубации. Биопэннинг осуществляли против ГЙЧВЬЕс (слияние ΙΕ-1ΚΙ и Ес) при 1 нМ концентрации в РВ8. Значительное уменьшение фагового титра наблюдали только после инкубации фага с трипсином в концентрации 100 мкг/мл в течение ночи при 37°С (см. табл. 5).
- 60 018129
Таблица 5
Длительность инкубации Температура Концентрация трипсина Титр
1 ч Комнатная темп. 100 мкг/мл 1,8x10”
1 ч Комнатная темп. 10 мкг/мл 7,2 х 105*
1 ч Комнатная темп. 0 мкг/мл 6,6х10э
В течение ночи Комнатная темп. 100 мкг/мл 2,16 хЮ9
В течение ночи Комнатная темп. 10 мкг/мл 7,2 х 10й
В течение ночи Комнатная темп. 0 мкг/мл 7,8 х 10й
В течение ночи 37° С 100 мкг/мл 2,04 х 106
В течение ночи 37’С 10 мкг/мл 3,84 x10е
В течение ночи 37°С 0 мкг/мп Ж.гхТо9-’
Тесты с фагом, экспонирующим ϋΟΜ1Η-131
Фаг ^ОΜ111-131 (близкородственный ^ОΜ1к-131-511 по аминокислотной последовательности) обрабатывали трипсином в концентрации 0, 10, 100 и 1000 мкг/мл в течение 1 ч при комнатной температуре. Переваривание ингибировали путем добавления 25х полного набора ингибиторов протеаз (Яоске). Последовательные 2-кратные разведения фага осуществляли в планшете для ЕЫ8А, покрытом 1 нМ ΤΝΈΚΙ, и связывание фага определяли с помощью анти-М13-НЯР (пероксидаза хрена). Результаты представлены ниже в табл. 6.
Таблица 6
Исходное количество фага 4.51Е+10 2.26Е+10 1.13Е+10 5.64Е+09 2.82Е+09 1.41Е+09 7.05Е+08 3.52Е+08
Эти тест-эксперименты ясно демонстрируют, что 100 мкг/мл трипсина и температура 37°С подходят для создания селекционного давления на фаги, экспонирующие бАЬ с разной степенью устойчивости к протеолизу трипсином. Продолжительность инкубации с протеазой может быть оптимизирована для каждого экспонируемого на фаге бАЬ, если это желательно.
Пример 3. Протеазная селекция экспонируемых на фагах репертуаров доменных антител
Были созданы четыре репертуара с использованием следующих бАЬ в качестве родительских молекул: ^ОΜ4-130-54, ^ОΜ1й-131-511, ^ОΜ15-10 и ^ОΜ15-26-555. Случайные мутации вводили в гены посредством ПЦР, используя набор 8!га1адепе Μиίаζуте II, биотинилированные праймеры и 5-50 пг матрицы для 50 мкл реакционной смеси. После переваривания с использованием 8а11 и вставки очищали от непереваренных продуктов с помощью покрытых стрептавидином гранул и лигировали в р^ОΜ13 по соответствующим сайтам. Клетки Е. сой ТВ 1 трансформировали очищенной смесью для лигирования, получая в результате большие репертуары устойчивых к тетрациклину клонов: 8,5х108 (^ОΜ4-130-54), 1,5х109 (^ОΜ1й-131-511), 6х108 (ВОНТб-Ю) и 3х109 (^ОΜ15-26-555).
Фаговые библиотеки получали двойной преципитацией с ПЭГ и ресуспендировали в РВ8.
Частоты аминокислотных мутаций составляли 2,3 и 4,4 для репертуаров ^ОΜ1й-131-511 и ЭО!^130-54 соответственно. Функциональность оценивали путем тестирования 96 клонов в фаговом ЕЫ8А, используя лунки, покрытые белком А или белком Ь (в концентрации 1 мкг/мл). 62,5 и 27% клонов демонстрировали функциональный дисплей бАЬ в репертуарах ^ОΜ1й-131-511 и ^ОΜ4-130-54 соответственно.
Частоты аминокислотных мутаций составляли 2,5 и 4,6 для репертуаров ^ОΜ15-10 и ^ОΜ15-26555 соответственно. Функциональность оценивали путем тестирования 96 клонов в фаговом ЕЫ8А, используя лунки, покрытые белком А или белком Ь (в концентрации 1 мкг/мл). 31,3 и 10,4% клонов демон
- 61 018129 стрировали функциональный дисплей бАЬ в репертуарах ЭОМ15-10 и ЭОМ15-26-555 соответственно.
Репертуары ΏΟΜ4-130-54 и ϋΟΜ1Η-131-511
Для селекции бАЬ с улучшенной устойчивостью к протеазам осуществляли четыре раунда селекции, используя эти библиотеки.
Первый раунд селекции был основан на связывании с антигеном (1 нМ или 10 нМ антигена) без обработки протеазами для очистки библиотеки с целью удаления клонов, которые больше не связывались с антигеном с высокой аффинностью. Выходы после 1-го раунда составляли 108-1010 (по сравнению с исходным количеством 1011 фагов), что указывает на то, что большая часть библиотеки связывалась с антигеном с высокой аффинностью.
Во 2-м раунде вводили обработку протеазой (100 мкг/мл трипсина) и выходы представлены ниже в табл. 7.
Таблица 7
Условия инкубации с Библиотека Библиотека
трипсином ООМ1Ш131-511 ООМ4-130-54
37°С, а течение ночи 1 8θχ10Β 2,1 х10®
37°С, 2 ч 4,8 х 10а 5,1x10®
Комнатная температура, 2 ч 1,2 х 10у 4 52^10-9
Без трипсина -1 х 10а ~4х 103
Без антигена 1,8 х Ю4 <6 х10а
Наблюдали значительную селекцию, когда бАЬ обрабатывали трипсином при 37°С в течение ночи. Этот выход использовали для 3-го раунда, где фаг обрабатывали либо 1 мг/мл, либо 100 мкг/мл трипсина при 37°С в течение 24 ч. Титры фагов, обработанных трипсином, из 3-го раунда составляли 105-106 для репертуара ЭОМ1Й-131-511 и 107-108 для репертуара ЭОМ4-130-154.
Все выходы после 3-го раунда (ЭОМ1Й-131-511 и ЭОМ4-130-154 с 1 мг/мл и 100 мкг/мл) подвергали четвертому раунду селекции против 1 нМ антигена с 100 мкг/мл трипсина. Титры находились в диапазоне 106-108 аналогично тому, что наблюдали в 3-м раунде. Некоторое обогащение наблюдали для репертуара ЭОМ1Й-131-511, но никакого обогащения не наблюдали для репертуара ЭОМ4-130-54.
Репертуары ΏΟΜ15-10 и ΏΟΜ15-26-555
Первый раунд селекции осуществляли с 2 нМ концентрацией биотинилированного ЙУЕСЕ (человеческого фактора роста сосудистого эндотелия) и без протеазной обработки для очистки библиотеки с целью удаления клонов, которые больше не связывались с антигеном с высокой аффинностью. Выходы после 1-го раунда составляли примерно 108 (по сравнению с исходным количеством 1010 фагов для ЭОМ15-10 и 1011 фагов для ЭОМ15-26-555), что указывает на то, что большая часть библиотеки связывалась с антигеном с высокой аффинностью.
Второй и третий раунды селекции осуществляли с 2 нМ биотинилированного ЙУЕСЕ. Перед пэннингом на ЙУЕСЕ фаги инкубировали в присутствии трипсина (100 мкг/мл) при 37°С в шейкере (250 об./мин). Продолжительность инкубации составляла 1 ч для репертуара ЭОМ15-10 и два часа для репертуара ЭОМ15-26-555.
Выходы были следующими: 1,5х106 и 9х105 для второго и третьего раундов селекции с репертуаром ЭОМ15-10; 2,2х108 и 3,9х109 для второго и третьего раундов селекции с ЭОМ15-26-555.
Пример 4.
Анализ продуктов селекции: репертуары ЭОМ4-130-54 и ЭОМ1Й-131-511
Все продукты 3-го раунда и 4-го раунда субклонировали в вектор рЭОМ5 и использовали для трансформации клеток 1М83. Вектор рЭОМ5 представляет собой вектор на основе рИС119. Экспрессия белков находится под контролем Р1ас-промотора. Лидерная последовательность СА81 (дгоМЙ аггейкресШс рго!еш 1; белок 1, специфический для остановки роста) (см. ШО 2005/093074) обеспечивает секрецию выделенных растворимых бАЬ в периплазму и культуральный супернатант Е. сой 1М83. 96 и 72 индивидуальных колоний после 3-го раунда и 4-го раунда перекалывали случайным образом для экспрессии.
12-24 клона секвенировали из каждого выхода после 3-го раунда и 4-го раунда. Консенсусные мутации наблюдали для обоих раундов селекции и приблизительно 25 клонов, содержащих консенсусные мотивы, выбирали для дальнейшей характеристики. Аминокислотные последовательности этих клонов представлены на фиг. 3 (селектированные варианты ЭОМ1Й-131-511) и фиг. 4 (селектированные варианты ЭОМ4-130-54), а последовательности ДНК представлены на фиг. 19А-19Й Аминокислоты, которые отличаются от родительской последовательности в селектированных клонах, указаны (идентичные аминокислоты обозначены точками). Петли, соответствующие СЭК1, СЭК2 и СЭК3, обведены рамками.
Эти клоны экспрессировали в большем количестве, очищали на белке Ь (для вариантов ЭОМ4-13054) и белке А (для вариантов ЭОМ1Й-131-511) и тестировали в отношении связывания с антигеном на
- 62 018129
ВАсоге после одного часа инкубации или после инкубации в течение ночи при 37°С в присутствии или в отсутствие трипсина (конечная концентрация 100 мкг/мл или 1000 мкг/мл).
Как правило, продукты селекции Ό0Μ4-130-54 были более стабильными, причем большая часть клонов сохраняла устойчивость к трипсину в течение одного часа, а самые лучшие клоны - в течение ночи. По сравнению с этим небольшое количество клонов после селекции Ό0Μ16-131-511 было устойчивым к трипсину в течение одного часа, и в то же время ни один клон не был устойчив в течение ночи.
Пример 5. Анализ продуктов селекции: репертуары Ό0Μ15-10 и Ό0Μ15-26-555
Эффективность селекции с предварительной обработкой трипсином сначала тестировали посредством фагового ЕЫ8А с использованием моноклональных антител с перевариванием и без переваривания трипсином. Перекалывали восемнадцать колоний со второго раунда селекции и 24 колонии с третьего раунда селекции каждой библиотеки. Клоны Ό0Μ15-10, Ό0Μ15-26-501 и Ό0Μ15-26 использовали в качестве контролей. Дополнительные контроли включали раствор амплифицированных и очищенных фагов из каждой библиотеки после второго и третьего раундов селекции с использованием трипсина.
Каждый образец фага делили на две фракции, первую обрабатывали 100 мкг/мл трипсина, вторую не обрабатывали трипсином. Инкубацию обеих фракций осуществляли в течение одного часа при 37°С с перемешиванием (250 об./мин) и блокировали путем добавления полного набора ингибиторов протеаз от Яосбе (1х).
Фаговый ЕЫ8А осуществляли, используя переваренные и непереваренные трипсином образцы. Лунки в ЕЫ8А покрывали нейтравидином в концентрации 1 мкг/мл в 0,1 М бикарбонатном буфере. После стадий промывки РВ8 и блокирования покрытых антигеном лунок 1% Ттееи-20 в РВ8 в течение одного часа при комнатной температуре лунки покрывали биотинилированным 11УЕСЕ, разбавленным в 1% Тгееи-20 в РВ8 в концентрации 100 нг/мл. Затем лунки промывали РВ8 и добавляли обработанные или необработанные фаговые супернатанты, разбавленные 1:1 1% Ттееи-20/РВ8. После 30 мин инкубации при 37°С лунки промывали 1% Тгееи-20/РВ8 с последующей 30-минутной инкубацией при 37°С с конъюгатом анти-(фаг Μ13)-НЯР (разбавленным 1/5000 в 1% Ттееи-20/РВ8). Затем лунки промывали РВ8 и пероксидазой. Реакцию инициировали путем добавления реагента 8игеВ1ие. Примерно через десять минут реакцию останавливали эквивалентным объемом 1 М НС1 и лунки считывали при 0О450нм.
Считывание результатов ЕЫ8А для нестабильных контролей Ό0Μ15-10 и Ό0Μ15-26-501, обработанных трипсином, давало 0Ό450 ниже 0,404, и это значение принимали в качестве предельного значения для нестабильного клона. Все образцы, которые давали 0Ό ниже 0,404, считались нестабильными. Все образцы, которые давали большее значение, считались стабильными.
Таблица 8
Библ потека Трипсин Без трипсина
2-я селекция 3-я селекция 2-я селекция 3-я селекция
ϋΟΜ15-10 33% 89% 100% 100%
ϋΟΜ 15-26-555 94,4% 100% 100% 100%
В табл. 8 показано процентное содержание стабильных клонов после второго и третьего раундов трипсиновой селекции каждой библиотеки. Обогащение устойчивых к трипсину клонов является заметным в обеих библиотеках после третьего раунда селекции. Полученные в ЕЫ8А значения для контрольных лунок, содержащих амплифицированную очищенную фаговую смесь, после каждого раунда селекции были намного выше 0,404 в каждом случае после переваривания трипсином. Кроме того, небольшое увеличение сигнала наблюдали при сравнении обработанных трипсином фагов после третьего раунда селекции с обработанными трипсином фагами после второго раунда селекции. Фаговая библиотека Ό0Μ15-10 демонстрировала увеличение примерно на 14% от исходного значения. Фаговая библиотека Ό0Μ15-26-555 демонстрировала увеличение, которое представляет собой примерно 2% от исходного значения.
В целом эти результаты демонстрируют, что селекция с предварительной обработкой трипсином была эффективной для отбора устойчивых к трипсину фаговых клонов из репертуаров Ό0Μ15-10 и Ό0Μ15-26-555.
Все продукты второго и третьего раундов селекции (Ό0Μ15-26-555) и только после третьего раунда селекции (Ό0Μ15-10) субклонировали в вектор ρΌ0Μ5 и трансформировали в электрокомпетентные клетки НВ2151. Вектор ρΌ0Μ5 представляет собой вектор на основе рИС119. Экспрессия белков находится под контролем Р1ас-промотора. Лидерная последовательность СА81 обеспечивает секрецию выделенных растворимых бАЬ в периплазму и культуральный супернатант Е. со11 НВ2151. 184 индивидуальные колонии после каждого раунда селекции (3 и 4) случайным образом перекалывали для экспрессии в 1 мл среды для культивирования.
Бактериальные супернатанты разбавляли в буфере НВ8-ЕР ВАсоге (соотношение объемов 1:1) и разделяли на две равные части. Трипсин добавляли только в один флакон до конечной концентрации 20 мкг/мл. Инкубацию осуществляли в течение 40 мин при 37°С с перемешиванием (250 об./мин). После блокирования реакции полным набором ингибиторов протеаз от Яосбе (1Х) как обработанные трипси
- 63 018129 ном, так и необработанные трипсином фаговые супернатанты тестировали на В1Асоге 3000 в отношении связывания с антигеном (2000 КИ биотинилированного кУЕСЕ на сенсорном чипе 8А).
Критериями для перенесенных перекалыванием клонов были уменьшение связывания с антигеном менее чем на 15% для бАЬ, обработанных трипсином, относительно необработанных бАЬ (на основании максимальных КИ, достигаемых для выбранной временной точки), которое отражает стабильность бАЬ к протеазной обработке в целом; и уменьшение скорости диссоциации менее чем на 40% между двумя временными точками в процессе диссоциации бАЬ от антигена. На основании этих величин осуществляли секвенирование 60 клонов после второго и третьего раундов селекции библиотеки ΌΟΜ15-26-555 и 17 клонов после третьего раунда селекции библиотеки ΌΘΜ15-10. Консенсусные мутации наблюдались в продуктах обеих библиотек и 17 клонов из каждой библиотеки, содержащих консенсусные мотивы, выбрали для дальнейшей характеристики. Аминокислотные последовательности этих клонов представлены на фиг. 5 (селектированные варианты ΌΟΜ15-26-555) и фиг. 6 (селектированные варианты ΌΘΜ15-10), а последовательности ДНК представлены на фиг. 20А-20Е. Аминокислоты, которые отличаются от родительской последовательности в селектированных клонах, указаны (идентичные аминокислоты обозначены точками). Петли, соответствующие СОК1, СЭК2 и СОК3, обведены рамками.
Эти клоны экспрессировали в 50 мл культуральной среды для экспрессии, очищали на белке А (для вариантов ΌΟΜ15-26-555) или белке Ь (для вариантов ΌΘΜ15-10), разбавленных до концентрации 100 нМ в буфере ΗΕδ-ЕР, и тестировали в отношении связывания с антигеном на В1Асоге после 1,5 ч инкубации при 37°С с перемешиванием (250 об./мин) в присутствии или в отсутствие трипсина (конечная концентрация 20 мкг/мл).
Эти клоны тестировали также в отношении устойчивости к трипсину, используя способ, описанный в примере 2. Белки подвергали замене буфера на РВ8 и концентрировали до 1 мг/мл. 25 мкг белка смешивали с 1 мкг трипсина (Рготеда) и инкубировали в течение 0 и 24 ч при 30°С. После этого реакцию блокировали полным набором ингибиторов протеаз от Коске (1Х) и ΌΤΤ (дитиотреитол), а также добавляли агент для нанесения образцов (1оабшд адей). Образцы денатурировали в течение 5 мин при 100°С. Затем 15 мкг каждого образца анализировали посредством электрофореза на гелях Nονеx 10-20% Τπαΐ'Κ и белки окрашивали с помощью 8игеВ1ие (1х).
Как правило, продукты селекции ΌΟΜ15-26-555 были более стабильными, причем большая часть клонов сохраняла устойчивость к трипсину в течение 1,5 ч при тестировании на В1Асоге и в течение ночи при тестировании на δΌδ-РАСЕ. По сравнению с этим только небольшое количество клонов после селекции ΌΘΜ15-10 было устойчивым к трипсину в течение ночной обработки при тестировании на δΌδ-РАСЕ.
Пример 6. Идентификация вариантов ΌΟΜ1Η-131-511
ΌΟΜ1Η-131-203, ΌΘΜ1Η-131-204 и ΌΘΜ1Η-131-206 анализировали более подробно. Их сравнивали на В1Асоге при концентрации бАЬ 500 нМ после инкубации с различными концентрациями трипсина (варьирующими от 0 до 100 мкг/мл) в течение ночи при 37°С. Кривые В1Асоге представлены на фиг. 7. Результаты ясно показывают, что оба варианта более устойчивы, чем родительское антитело, к протеолизу при высоких концентрациях трипсина (100 мкг/мл). Два бАЬ, ΌΘΜ1Η-131-202 и ΌΘΜ1Η-131-206 также сравнивали вместе с их родительским антителом в отношении устойчивости к различным другим протеазам, включая лейкозим, эластазу и панкреатин, в условиях, описанных выше, при концентрации протеазы 100 мкг/мл. бАЬ продемонстрировали повышенную устойчивость к протеолизу по сравнению с родительским антителом в отношении всех протестированных протеаз. Кривые В1Асоге для эластазы и лейкозима представлены на фиг. 8.
Каждое бАЬ (5 мкМ) обрабатывали 100 мкг/мл трипсина с чистотой для секвенирования в течение 0, 1, 3 и 24 ч. Реакцию ингибировали полным набором ингибиторов протеаз от Коске (25Х) и продукты реакции анализировали на геле 4-12% Nονеx βίκ-Τηκ. Гели представлены на фиг. 9.
Пример 7. Идентификация вариантов ΌΘΜ4-130-54
ΌΘΜ4-130-201 и ΌΘΜ4-130-202 анализировали более подробно. Их сравнивали на В1Асоге при концентрации бАЬ 500 нМ после инкубации с различными концентрациями трипсина (варьирующими от 0 до 100 мкг/мл) в течение ночи при 37°С. Кривые В1Асоге представлены на фиг. 10. Результаты ясно показывают, что все три варианта более устойчивы, чем родительское антитело, к протеолизу при высоких концентрациях трипсина (100 мкг/мл). ΌΘΜ4-130-201 и ΌΘΜ4-130-202 также сравнивали с родительским антителом в отношении устойчивости к различным другим протеазам, включая лейкозим, эластазу и панкреатин, в условиях, описанных выше, с концентрацией протеазы 100 мкг/мл. Хотя результаты были менее наглядными, чем с трипсином, основные бАЬ продемонстрировали повышенную устойчивость к протеолизу по сравнению с родительским антителом в отношении всех тестируемых протеаз. Кривые В1Асоге для эластазы и лейкозима представлены на фиг. 11.
Каждое бАЬ (5 мкМ) обрабатывали 100 мкг/мл трипсина с чистотой для секвенирования в течение 0, 1, 3 и 24 ч. Реакцию ингибировали полным набором ингибиторов протеаз от Коске (25Х) и продукты реакции анализировали на геле 4-12% Nονеx βίκ-Τηκ. Гели представлены на фиг. 9.
Пример 8. Дополнительная характеристика вариантов ΟΟΜ1Η-131-511 и ΌΘΜ4-130-54
Сначала бАЬ анализировали с использованием дифференциальной сканирующей калориметрии
- 64 018129 (Э8С) для того, чтобы определить, коррелирует ли увеличение устойчивости к трипсину с увеличением температуры плавления (Тт). Увеличение стабильности в присутствии трипсина коррелирует с увеличением Тт (см. табл. 9).
Таблица 9
ЙАЬ, происходящие из ЭОМ111-131-511, также сравнивали в анализе с использованием клеток МКС5 (см. табл. 10). В этом анализе измеряли способность ЙАЬ нейтрализовать ΤΝΕα-стимулированное высвобождение 1Ь-8 для того, чтобы определить, приводит ли увеличение стабильности в присутствии трипсина к уменьшению эффективности. Однако активность устойчивых к трипсину ЙАЬ в этом анализе была, по существу, неизменной.
Таблица 10
Образец Νϋ50 (средняя нейтрализующая доза), нМ
ϋΟΜ1ή-131-511 1,98
ΟΟΜ1Ι1-131-511 1,71
ϋΟΜΙΜ-131-511 (230307СЕ) 1,89
00М1Г1-131-203 (230307СЕ) 2,28
ϋΟΜ1Η-131-204 (230307СЕ) 1,89
ϋΟΜ1ή-131-511 1,46
ϋΟΜ1ή-131-206 (230307СЕ) 0,71
ЙАЬ, происходящие из ЭОМ4-130-54, тестировали в анализе связывания с рецептором для того, чтобы посмотреть, обладают ли они все той же способностью ингибировать связывание 1Ь-1 с 1Ь-К1 (см. табл. 11). В этом анализе активность устойчивых к трипсину ЙАЬ была неизменной.
Таблица 11
ЙАЬ 1С50 (нМ)
ϋΟΜ4-130-54 280 пМ
ϋΟΜ4-130-201 257 пМ
ООМ4-130-202 254 пМ
Пример 9. Идентификация вариантов ЭОМ 15-26-555
ЭОМ15-26-588, ЭОМ15-26-589, ЭОМ15-26-591 и ЭОМ15-26-593 анализировали более подробно вместе с их родительским антителом и двумя дополнительными ЙАЬ, ЭОМ15-26-594 и ЭОМ15-26-595, которые были созданы посредством мутагенеза с целью объединения мутаций, которые могли бы оказывать наибольшее влияние на эффективность и стабильность (Е6У и Ε1008/Ι). Последовательности представлены на фиг. 12. Клоны сравнивали на ВГАсоге в отношении связывания с ЙУЕСЕ при концентрации ЙАЬ 100 нМ после инкубации с трипсином в концентрации 200 мкг/мл. Реакцию осуществляли в течение 3 и 24 ч при 37°С с перемешиванием (250 об./мин). Кривые ВГАсоге для самого лучшего клона ЭОМ1526-593 и родительского антитела представлены на фиг. 13. Другие результаты представлены в виде диаграммы на фиг. 14. Эти результаты ясно показывают, что все варианты более устойчивы, чем родительское антитело, к протеолизу после 24-часовой обработки трипсином.
Устойчивость к трипсину ЭОМ15-26-593 и родительского антитела также исследовали, анализируя обработанные и необработанные образцы на 8Э8-РАСЕ. Кратко, белки подвергали замене буфера на РВ8 и концентрировали до 1 мг/мл. 25 мкг белка смешивали с 1 мкг трипсина со степенью чистоты для секвенирования (Рготеда) и инкубировали в течение 0, 1, 3 и 24 ч при 30°С. После этого реакцию блокировали полным набором ингибиторов протеаз от Косйе (1Х) и ΌΤΤ, а также добавляли агент для нанесения образцов. Образцы денатурировали в течение 5 мин при 100°С. 15 мкг каждого образца наносили на гели Nονеx 10-20% Τπαικ и белки окрашивали с помощью 8игеВ1ие (1х). Результаты представлены на фиг. 15. Профиль устойчивости к трипсину для ЭОМ15-26-593 в этом эксперименте отличался от профиля, продемонстрированного ВГАсоге экспериментом, подтверждая тот факт, что различия в условиях реакции могут оказывать влияние на конечный результат расщепления трипсином. Тем не менее, ЭОМ15
- 65 018129
26-593 имеет лучшие биофизические свойства, а также аффинность, чем другие селектированные клоны, как показано ниже. Краткий обзор свойств вариантов ЭОМ15-26-555 также представлен ниже в табл. 12.
Таблица 12
Свойство
ЗЕС-МАЙЙ5 ϋδΟ РВА В1Асоге Стабильность с трипсином
бАЬ % мономера Рассчит. Μνν Тт, °С нМ Ко, нМ % связывания при +24 ч
15-26 0 37-136 64 10 28,2 30
15-26-501 0-40 18-290 51 1,14 9,1 5
15-26-555 0 28-78 63 11,7 26,1 10
15-26-588 10 33 70 27 59,1 15
15-26-589 90 17 63 1,94 9,6 65
15-26-591 20 21-234 63 16 38 35
15-26-593 80 17 65 0,323 3,2 80
15-26-595 60 17 65 0,828 5 70
Пример 10. Идентификация вариантов ЭОМ15-10
ЭОМ15-10-11 анализировали более подробно вместе с его родительским вариантом ЭОМ15-10. Последовательности представлены на фиг. 16. бАЬ сравнивали на В1Асоге в отношении связывания с йУЕСЕ при концентрации бАЬ 100 нМ после инкубации с трипсином в концентрации 200 мкг/мл. Реакцию осуществляли в течение 1, 3 и 24 ч при 37°С с перемешиванием (250 об./мин). Кривые В1Асоге для этих бАЬ представлены на фиг. 17. Результаты ясно показывают, что селектированный вариант более устойчив к протеолизу, чем родительское антитело после 24-часовой обработки трипсином.
Устойчивость к трипсину основной молекулы и родительского антитела также проверяли посредством анализа обработанных и необработанных образцов на 8Э8-РАСЕ. Кратко, белки подвергали замене буфера на РВ8 и концентрировали до 1 мг/мл. 25 мкг белка смешивали с 1 мкг трипсина со степенью чистоты для секвенирования (Рготеда) и инкубировали в течение 0, 1, 3 и 24 ч при 30°С. После этого реакцию блокировали полным набором ингибиторов протеаз от Косйе (1Х) и ОТТ, а также добавляли агент для нанесения образцов. Образцы денатурировали в течение 5 мин при 100°С. 15 мкг каждого образца наносили на гели Nονеx 10-20% Тисше и белки окрашивали с помощью 8игеВ1ие (1х). Результаты представлены на фиг. 18. В этом случае профиль устойчивости к трипсину хорошо коррелирует с результатами В1Асоге теста с использованием трипсина, показывая, что связывающая активность непосредственно отражает целостность белка.
Пример 11. Дополнительная характеристика вариантов ЭОМ15-26-555 и ЭОМ15-10 бАЬ анализировали с использованием дифференциальной сканирующей калориметрии (Ό8Ο) для того, чтобы определить, коррелирует ли увеличение устойчивости к трипсину с увеличением Тт. Результаты представлены в табл. 13. Имеется корреляция между устойчивостью к трипсину вариантов ООМ15-26-555 и температурой плавления. Основные молекулы ООМ15-26-588 и ООМ15-26-593 демонстрируют улучшенные Тт, а другие клоны нет. Важно отметить, что обе родительские молекулы ЭОМ15-26-555 и ЭОМ15-10 имеют гораздо более высокие Тт (63,3-63,7°С) на старте, чем родительские молекулы ЭОМ4-130-54 и ЭОМ111-131-511 (Тт на старте: 57,9-54,1°С), но в целом протеазоустойчивые клоны достигают значений Тт в аналогичном диапазоне (средняя Тт 65,1°С для вариантов ЭОМ1й-131511/ООМ4-130-54 и средняя Тт 64,9°С для вариантов ПОМ15-26-55/ООМ15-10).
Таблица 13
Название Тт, °С
ϋΟΜ 15-26-555 63,3
ϋΟΜ 15-26-588 70,1
ϋΟΜ 15-26-589 63
ϋθ Μ15-26-591 63
ϋΟΜ 15-26-593 65
ϋΟΜ 15-10 63,7
ΟΟΜ15-10-11 63,3
Эти бАЬ также сравнивали в анализе связывания с рецептором и осуществляли измерения кинетики на В1Асоге для того, чтобы определить, приводит ли увеличение стабильности в присутствии трипсина к уменьшению эффективности. Однако активность бАЬ в данном анализе оказалась, по существу, не затронутой или даже улучшенной. Результаты представлены в табл. 14.
- 66 018129
Таблица 14
Клон(Ю) ЕС50 (нМ) Κο (нМ)
ЬОМ15-26-555 11,7 26,1
ϋΟΜ 15-26-588 27 59,1
ϋΟΜ 15-26-589 1,94 9,6
ϋΟΜ15-26-591 16 38
ϋΟΜ15-26-593 0,323 3,2
ϋΟΜ15-26-594 4,09 15,1
ϋΟΜ15-26-595 0,828 5
ООМ15-Ю 10,23 23,6
ΡΟΜ15-10-11 3,58 14,6
Преимущества увеличенной Тт
Большинство белков, включая доменные антитела, существуют в двух состояниях: свернутом состоянии (результатом которого является биологически активная молекула) и развернутом состоянии (которое не связано с функциональной активностью). Эти два состояния сосуществуют при всех температурах, и относительная доля каждого состояния обычно определяется константой К, которая зависит от кинетических констант сворачивания и разворачивания. Температуру плавления обычно определяют как температуру, при которой К= 1, т.е. температуру, при которой доля свернутого белка равна доле развернутого белка. Константа К определяется стабилизирующими и дестабилизирующими внутримолекулярными взаимодействиями в белке и поэтому в первую очередь определяется аминокислотной последовательностью белка. Внешние параметры, такие как температура, рН, состав буфера, давление, влияют на К и таким образом на температуру плавления.
Развернутые белки являются удобными мишенями для механизмов деградации: (1) экспонирование дисульфидных связей увеличивает риск окисления или восстановления в зависимости от обстоятельств, (2) повышенная гибкость скелета благоприятствует реакциям аутопротеолиза, (3) экспонирование пептидных сегментов делает их мишенями для протеаз ίη νί\Ό, для протеаз во время способов получения и для переноса протеаз на следующие стадии обработки и длительного хранения и (4) экспонирование склонных к агрегации сегментов приводит к внутримолекулярной агрегации и осаждению белка. Во всех случаях происходит потеря целостности белка, содержания белка и активности белка, ставя под сомнение попытки, направленные на (1) обеспечение воспроизводимости партий, (2) обеспечение стабильности при хранении в течение длительного времени и (3) обеспечение эффективности ίη νί\Ό.
В природе белки под действием эволюции были сконструированы таким образом, чтобы адекватно функционировать при температуре тела и чтобы без труда замещаться посредством механизмов гомеостаза. Терапевтические белки, полученные в биотехнологическом процессе, сталкиваются с другим окружением: их часто продуцируют с использованием технологии рекомбинантной ДНК в чужеродном хозяине и экспрессируют в большем количестве в больших сосудах, подвергают очень важным изменениям рН или состав буфера в последующих процессах и, наконец, хранят в высоких концентрациях в нефизиологических буферах в течение длительного периода времени. Новые способы доставки (например, ингаляция, пластырь для подкожного введения, наночастицы для замедленной доставки (§1оте бе1кегу)) также оказывают дополнительное стрессовое воздействие на терапевтические белки. В конце концов введение методов белковой инженерии привело к получению улучшенных или полностью новых терапевтических белков. Поскольку большая часть методов инженерии представляет собой методы ίη уйго, направленные на изменение или создание новых аминокислотных последовательностей, то эволюционные процессы, которые постепенно улучшали биологические белки, не происходят, что приводит к получению белков с субоптимальными характеристиками в отношении устойчивости к стрессу.
Способ по настоящему изобретению направлен на воспроизведение одного из условий, с которыми сталкиваются белки в ходе дарвиновской эволюции. Пептиды или полипептиды, например иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, заселены протеазами, которые играют главную роль в ремоделировании ткани и белковом гомеостазе. Любую конкретную мутацию, которая может приводить к образованию белка с улучшенным соответствием его функции, также тестируют на ее способность соответствовать окружению, в котором белок функционирует. Этот процесс воспроизводят в одном из воплощений настоящего изобретения: создают репертуар пептидных или полипептидных вариантов и подвергают воздействию протеазы. На второй стадии репертуар вариантов приводят в контакт со специфической мишенью. Только те варианты белка, которые оказались устойчивыми к деградации протеазой, способны взаимодействовать с мишенью и поэтому извлекаются, например, в простом процессе аффинной очистки, названном биопэннингом. Данная система предлагает ряд преимуществ по сравнению с процессами ίη νίνυ: репертуар белков может столкнуться с более широким диапазоном условий, например, с набором протеаз в более высоких концентрациях, в течение более длительных периодов времени, в различных буферах или рН и при различных температурах. Таким образом, такая технология ίη νίϋΌ
- 67 018129 предлагает средства для конструирования белков, которые могут функционировать и оставаться стабильными в более широком диапазоне условий окружающей среды, чем те условия, из которых они происходят. Ясно, что это дает значительные преимущества для биотехнологической промышленности и для области терапевтических белков, в частности.
Пример 12. РК корреляционные данные для протеазоустойчивых основных молекул
Родительское ЗАЬ и протеазоустойчивое ЗАЬ в каждой из четырех линий ЗАЬ затем оценивали ίη νί\Ό (перечень и подробности см. в табл. 15 ниже).
Таблица 15
Линия адь (Ю) Устойчивость к трипсину Тт (°С) Активность (нМ) Ю Гс слияния
ΟΘΜ4-130 ϋΟΜ4-130-54 Хорошая 54 0,128* ОМ81541
ϋΟΜ4-130-202 Очень высокая 64 0,160* ОМ81542
ООМ1Н-131 ООМ1Н-131-511 Хорошая 57 0,048+ ОМ31543
ϋΟΜ1ή-131-206 Очень высокая 64 0,047+ ϋΜ81544
ООМ15-Ю ЭОМ15-10 Низкая 64 0,913+ ϋΜ81546
ООМ15-Ю-11 Высокая 63 0,577+ ϋΜ31531
ϋΟΜ 15-26 ϋΟΜ 15-26-501 (*) Низкая 52 0,330+ ϋΜ81545
ϋΟΜ 15-26-593 Высокая 65 0,033+ ϋΜ31529
*: по данным биоанализа с использованием ΜΒί.'5/ΙΓ-α; +: по данным КВА-анализа
Примечание: ΌΟΜ15-26-501 является родительским вариантом ΌΟΜ15-26-555, приведенным в качестве примера в настоящей заявке на патент. ΌΟΜ15-26-555 имеет одну герминальную аминокислотную мутацию в СОК! (Ι34Μ). ΌΟΜ15-26-501 характеризуется более низкой температурой плавления, чем ΌΟΜ15-26-555 (52°С по сравнению с 63,3°С) и повышенной чувствительностью к перевариванию трипсином. ΌΟΜ15-26-501 выбрали относительно ΌΟΜ15-26-555 для РК исследования, поскольку оно является более типичным в отношении плохой стабильности по сравнению с ΌΟΜ15-26-593.
Авторы заявки истолковывают устойчивость следующим образом:
низкая, средняя, хорошая, высокая, очень высокая.
Тогда это означает, что устойчивость к трипсину родительских молекул является следующей: ΌΟΜ4-130-54 хорошая,
ΌΟΜ1Η-131-511 хорошая,
ΌΟΜ15-10 низкая,
ΌΟΜ15-26-501 низкая.
Для селектированных основных молекул:
ΌΟΜ4-130-202 очень высокая, ΌΟΜ111-131-206 очень высокая, ΌΟΜ15-10-11 высокая, ΌΟΜ15-26-593 высокая.
Поскольку доменные антитела характеризуются небольшим размером (12-15 кДа), они быстро выводятся из кровообращения после в/в (внутривенной) или п/к инъекции. Действительно, предел отсечения при почечной клубочковой фильтрации составляет более чем 50 кДа, и поэтому небольшие белки, такие как ЗАЬ, не задерживаются в кровотоке, поскольку они проходят через почки. Поэтому для того, чтобы оценить долговременные эффекты устойчивости к протеазам ίη νί\Ό, авторы изобретения метили доменные антитела группировкой, которая увеличивает пребывание в системе кровообращения. Некоторые подходы (например ПЭГ, слияния с Ес, слияния с альбумином и т.д.), направленные на увеличение периода полувыведения, известны из литературы. В настоящей заявке доменные антитела были помечены (или форматированы) Ес-областью 1дС1 антитела человека. Этот формат обеспечивает два преимущества: (1) молекулярный размер полученных ЗАЬ-Ес составляет приблизительно 75 кДа, что является достаточным для обеспечения удержания в кровотоке, (2) Ес-группировка антитела связывается с ЕсКп рецептором (также известным как рецептор Брамбелла). Этот рецептор локализуется на эпителиальных клетках, эндотелиальных клетках и гепатоцитах и вовлечен в пролонгирование продолжительности жизни антител и альбумина: действительно, после пиноцитоза антител и других сывороточных белков белки направляются в подкисленную эндосому, где ЕсКп рецептор перехватывает антитела (посредством связывания с Ес-областью) перед переносом в эндосому и возвращает их в кровоток. Таким образом, посредством мечения ЗАЬ Ес-областью обеспечивается присутствие ЗАЬ в течение более длительного периода времени по меньшей мере в двух компартментах - сыворотке и преэндосомальных компартментах,
- 68 018129 каждый из которых содержит специфический набор протеолитических ферментов. В дополнение к этому, РсЕ рецептор опосредует трансцитоз, посредством чего Рс-несущие белки мигрируют во внесосудистое пространство и из внесосудистого пространства.
Форматирование с использованием Рс осуществляли посредством слияния гена, кодирующего УН и УК бАЬ, с геном, кодирующим Рс 1дС1 человека, через короткий промежуточный пептидный линкер (выделенный жирным шрифтом):
Для УН бАЬ (подчеркнуто):
ЕУО......брбТЬУТУ88А8ТНТСРРСРАРЕЬЬ66Р...(Ыё61Рс)...Р6К*
Для УК бАЬ (подчеркнуто):
1)Ю......брбТКУЕ1КЕТУААР8ТНТСРРСРЛРЕЬЬ66Р...(Ыд61Рс)...Р6К*
Материал получали путем временной трансфекции клеток НЕК293/6Е, используя 293-фектин (1пу11годсп) в соответствии со стандартными протоколами. Эти клетки разработаны для высоких уровней временной экспрессии при их использовании вместе с векторами серий рТТ (ЭнгосНсг с! а1., 2002). Таким образом, гены бАЬ клонировали в модифицированный вектор рТТ5 (рЭОМ38) с целью создания вектора, экспрессирующего слияние с Рс (см. фиг. 21). Супернатант от трансфицированных клеток собирали на 5-е сутки после трансфекции, осветляли центрифугированием и фильтровали через 0,2 мкм фильтр. Слитые белки бАЬ-Рс очищали путем захвата на смоле Рго1ст-А кйсатНпс (СЕ НсаИйсаге). Белок элюировали с колонки в 10 мМ цитрате натрия, рН 3, с последующим добавлением 1 М цитрата натрия, рН 6, для достижения конечного содержания цитрата натрия 100 мМ (рН 6).
Молекулы бАЬ-Рс тестировали в отношении периода полувыведения т у1уо на крысах в целевой дозе 5 мг/кг для самок крыс 8ргадис-ОаМсу (п=3 на одну группу). Необходимо отметить, что целевая доза значительно превышает целевую концентрацию у крыс, поэтому ожидают, что различия в аффинностях между родительскими бАЬ и устойчивыми к трипсину бАЬ (см. пример 11) не будут влиять на судьбу молекул 1п у1уо. Следовательно, ожидают, что различия в РК профилях между бАЬ будут отражать независимый от антигена процесс элиминации.
Образцы крови отбирали через 0,03, 1, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120 и 168 ч после ввведения. После образования сгустка сыворотку извлекали и затем тестировали в анализах захвата антигена ЫЕ-1К1, ΤNРК1 или УЕСР.
Анализы захвата антигена ЫЕ-1К1:
покрывают с использованием 4 мкг/мл анти-ЫЬ-1Е.1;
блокируют;
добавляют 500 нг/мл 8ЫЬ-1К1;
добавляют образцы;
определяют с использованием анти-(Рс человека)-НЕР в разведении 1:10000.
Анализы захвата антигена Т№К1:
покрывают с использованием 0,1 мкг/мл 8Т№К1;
блокируют;
добавляют образцы;
определяют с использованием анти-(Рс человека)-НЕР в разведении 1:10000.
Анализы захвата антигена УЕСЕ:
покрывают с использованием 0,25 мкг/мл УЕСР;
блокируют;
добавляют образцы;
определяют с использованием анти-(Рс человека)-НЕР в разведении 1:10000.
Необработанные данные этих анализов преобразовывали в концентрации лекарственного средства в каждом образце сыворотки. Средние значения в мкг/мл для каждой временной точки затем анализировали в V^πNοπ^^π с использованием некомпартментного анализа (ΝΕΆ). РК профили для каждой пары бАЬ-Рс представлены в табл. 16, в которой суммированы определенные РК параметры.
Таблица 16
ю с!АЬ Период полувыведения (ч) АиС/ϋ (0-ίηΐ) (ч*мкг/мл)/(мг/кг) % лис экстраполир.
ОМ31541 4-130-54 93,2 691,5 22,7
ОМ31542 4-130-202 176,8 710,1 49
ОМ31543 16-131-511 140,8 1807,5 40
ОМ81544 16-131-206 158,6 2173,0 43,6
ОМ31546 15-10 43,2 324,6 3,8
ОМ81531 15-10-11 56,6 770,5 не опред.
ОМ31545 15-26-501 12,9 89 5,1
РМ81529 15-26-593 86,2 804,7 21,0
- 69 018129
Данные результаты ясно показывают, что, хотя РК профили для 6АЬ-Ес пар с 4-130-54 по 1Н-131206 почти совпадают при наложении, профили для других пар широко варьируют. Данные эффекты обычно видны, когда рассматривают АБС/Б: АБС/Б для 15-10 составляет только 42% от АИС/Б для 1510-11. АИС/Б для 15-26-501 составляет только 11 % от АИС/Б для 15-26-593. Эти важные раличия также влияют (в меньшей степени) на периоды полувыведения: 43,2 ч против 56,6 ч соответственно для 15-10 и 15-10-11. Большее различие наблюдается для линии ^ОΜ15-26: 12,9 ч против 86,2 ч соответственно для 15-26-501 и 15-26-593. Действительно, для проведения хорошего РК анализа с использованием некомпартментного анализа необходимо использовать по меньшей мере 4 точки на графике для подгонки угла наклона линейной регрессии, и период времени, в течение которого оценивают период полувыведения, должен быть по меньшей мере в 3 раза больше, чем рассчитанный период полувыведения.
В свете биофизических свойств, описанных в разделе Примеры в данной заявке, видно, что способность любого заданного бАЬ противостоять расщеплению трипсином коррелирует со способностью слияния 6АЬ-Ес циркулировать в течение более продолжительного периода времени в сыворотке крыс. Действительно, как показано в примерах, например в примере 10, ^ОΜ15-10 и ^ОΜ15-26-501 представляют собой наиболее расщепляемые бАЬ: инкубация 25 мкг бАЬ в присутствии 1 мкг трипсина при 30°С в течение приблизительно 3 ч приводит к полному расщеплению. Все другие бАЬ в этом исследовании (независимо от того, были ли они селектированы с использованием трипсина (т.е. ^ОΜ15-10-11, ^ОΜ15-26-593, ^ОΜ4-130-202 и ^ОΜ1й-131-206) или уже обладали некоторой устойчивостью к трипсину как родительские молекулы (^ОΜ4-130-54 и ^ОΜ1к-131-511)) имели сопоставимый РК профиль у крыс при реформатировании в молекулы 6АЬ-Ес. Таким образом, настоящее РК исследование позволяет предположить, что чувствительность к протеолизу оказывает наибольшее влияние на стабильность бАЬ 1п νί\Ό в случае, когда такие бАЬ обладают очень низкой устойчивостью к протеолизу. Оно также показывает, что при достижении определенного уровня дальнейшее возрастание устойчивости к расщеплению трипсином (например ^ОΜ4-130-206 по сравнению с ^ОΜ4-130-54) существенно не увеличивает способность молекулы 6АЬ-Ес дополнительно снижать скорость элиминации ш νί\Ό.
В трех случаях селекция в присутствии трипсина приводила к получению новых молекул с повышенной термостабильностью (определенной по температуре плавления): ^ОΜ4-130-202, ^ОΜ1й-131206 и ^ОΜ15-26-593. РК исследования показывают, что в соответствии с представленным набором данных - температура плавления не является адекватным параметром для объяснения наблюдаемых РК профилей: действительно, ^ОΜ15-10 имеет более высокую Тт, чем ^ОΜ15-10-11, однако быстрее выводится из кровотока, чем ^ОΜ15-10-11. В другом случае два бАЬ из линии ^ОΜ4-130 имеют заметно различающиеся Тт (на 10°С), однако демонстрируют почти идентичную стабильность ш νί\Ό при форматировании в молекулы 6АЬ-Ес. Следует отметить, что температуру плавления саму по себе не исключают в качестве ключевого параметра для предсказания стабильности ш νί\Ό. Так получилось, что в соответствии с представленным набором данных большие различия в Тт (от 54°С и выше) не оказывают значительного влияния на судьбу бАЬ ш νί\Ό. Это не исключает возможности того, что при температуре плавления ниже 54°С стабильность бАЬ ш νί\Ό будет коррелировать с термостабильностью или, возможно, и с термостабильностью, и с устойчивостью к протеазам.
Пример 13. Селекции ^ОΜ10-53-474 в присутствии трипсина
Стабильность очищенного ^ОΜ10-53-474 в присутствии трипсина ^ОΜ10-53-474 представляет собой доменное антитело, которое связывается с ГБ-13 с высокой эффективностью. Для оценки стабильности этого бАЬ в присутствии трипсина очищенное бАЬ переваривали трипсином в течение увеличивающихся периодов времени и наносили на гель для исследования любой возможной деградации белка. 25 мкл очищенного ^ОΜ10-53-474 в концентрации 1 мг/мл инкубировали с 1 мкл трипсина с чистотой для секвенирования в концентрации 1 мг/мл при 30°С, что соответствовало молекулярному соотношению бАЬ:трипсин 25:1. бАЬ инкубировали с трипсином в течение 1, 4 и 24 ч и протеазную активность нейтрализовали путем добавления 4 мкл полного набора ингибиторов протеаз от Яоске с последующей инкубацией на льду. Образец, соответствующий моменту времени 0, готовили путем добавления ингибиторов протеаз к бАЬ без добавления трипсина. 2 мкл образца затем анализировали посредством электрофореза с использованием БаЬсЫр в соответствии с инструкциями производителя.
На фиг. 22 показаны результаты гель-электрофореза ^ОΜ10-53-474, инкубированного с трипсином в течение увеличивающихся периодов времени. Для сравнения, одно из стабильных в присутствии трипсина бАЬ, ^ОΜ15-26-593, также обрабатывали трипсином, как описано выше, и анализировали параллельно. Как видно на фигуре, ^ОΜ15-26-593 выглядит стабильным даже через 24 ч инкубации с трипсином. Однако ^ОΜ10-53-474 расщепляется в некоторой степени через 24 ч, но выглядит стабильным во временные точки 1 и 4 ч. Эти данные позволяют предположить, что ^ОΜ10-53-474 устойчив к расщеплению трипсином в некоторой степени, но не настолько стабилен, как наиболее стабильные в присутствии трипсина бАЬ ^ОΜ15-26-593.
Стабильность экспонируемого на фаге ΏΟΜ10-53-474 в присутствии трипсина
Для оценки стабильности экспонируемого на фаге ^ОΜ10-53-474 в присутствии трипсина ген, кодирующий ^ОΜ10-53-474, клонировали в р^ОΜ33 по сайтам 8а1/Ио1 (фиг. 50) и фаг получали в соот
- 70 018129 ветствии со стандартными методиками. Фаг очищали посредством ПЭГ-преципитации, ресуспендировали в РВ8 и титровали.
Для оценки устойчивости к трипсину экспонируемые на фагах бАЬ инкубировали с трипсином в течение различных периодов времени. После инкубации с трипсином определяли стабильность посредством анализа титрованием после инфицирования клеток Е. сой ТС1, находящихся в экспоненциальной фазе роста.
100 мкл фага инкубировали в присутствии 100 мкг/мл трипсина в течение 1, 2, 4 ч и в течение ночи при 37°С в инкубаторе при встряхивании. Активность трипсина блокировали полным набором ингибиторов протеаз от Воске (х2), затем фаг разбавляли в 2% Магуей в РВ8, инкубировали с 10 нМ биотинилированного ГС-13 в течение одного часа при комнатной температуре. Добавляли покрытые стрептавидином гранулы (ЭупаЬебк М-280 (Iпν^ί^οдеп)), предварительно блокированные в течение одного часа при комнатной температуре с использованием 2% Магуей в РВ8, и смесь затем инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. Все стадии инкубации с ЭупаЬебк осуществляли на вращающемся диске. Несвязавшийся фаг отмывали путем промывки гранул восемь раз 1 мл 0,1% Тетееп-20 в РВ8. Связавшийся фаг элюировали, используя 0,5 мл 0,1 М глицина, рН 2,2 и нейтрализовали 100 мкл 1 М трис-ИС1, рН 8,0. Элюированный фаг использовали для инфицирования клеток ТС1, находящихся в экспоненциальной фазе роста (один час при 37°С), и высевали на чашки с тетрациклином. Чашки инкубировали в течение ночи при 37°С и осуществляли подсчет колоний. Титры выхода фага после переваривания трипсином суммированы в табл. 17. Титры фага уменьшались при инкубации с трипсином в течение увеличивающихся периодов времени. Через 24 ч инкубации все фаги переваривались.
Таблица 17. Титры продуктов селекции в присутствии трипсина, проведенной на экспонируемом на фаге родительском ООМ10-53-474
Длительность инкубации с трипсином Концентрация трипсина Титр
Контроль без трипсина - 3 χ 107
1 ч 100 мкг/мл Γχϊο7
2ч 100 мкг/мл Γχϊο5
4 ч 100 мкг/мл 5x10“
в течение ночи 100 мкг/мл 0
Селекция йАЬ, более устойчивых к трипсину
Для селекции бАЬ, которые более устойчивы к расщеплению трипсином, в ген, кодирующий ООМ10-53-474, вводили случайные мутации посредством ПЦР с использованием набора 81га!адепе Ми(ахуте ΙΙ, биотинилированных праймеров и 5-50 пг матрицы для 50 мкл реакционной смеси. После переваривания с использованием 8ай и №Й вставки очищали от непереваренных продуктов, используя покрытые стрептавидином гранулы, и лигировали в рЭОМ33 по соответствующим сайтам. Клетки Е. сой ТВ1 трансформировали очищенной смесью для лигирования, получая в результате допускающую ошибки библиотеку ЭОМ10-53-474. Размер библиотеки составлял 1,9х 109, а частота аминокислотных мутаций составляла 1,3.
Три раунда селекции осуществляли с использованием этой библиотеки для селекции бАЬ с улучшенной устойчивостью к протеазам. Первый раунд селекции осуществляли только с антигеном без обработки трипсином для очистки библиотеки с целью удаления клонов, которые больше не связывались с антигеном с высокой аффинностью. Селекцию осуществляли в присутствии 10 нМ СС-13. Выходы после первого раунда составляли 2х109 по сравнению с исходным количеством фага 6х1010, что указывает на то, что большая часть библиотеки связывается с антигеном с высокой аффинностью.
Второй и третий раунды селекции осуществляли в присутствии 1 нМ биотинилированного ΙΕ-13. Перед пэннингом на ΙΕ-13 фаг инкубировали с 100 мкг/мл трипсина при 37°С в шейкере (250 об./мин). Во втором раунде селекции инкубацию с трипсином осуществляли в течение 1 ч или при комнатной температуре, или при 37°С. Выходы после 2-го раунда селекции представлены в табл. 18.
Таблица 18. Титры выхода фага после второго раунда селекции
Обработка трипсином Титр
Без обработки 1 х 10е
1 ч, комнатная температура
1 ч, 37°С 2 4 107
Выходы фага, полученные во 2-ом раунде селекции с обработкой трипсином в течение 1 ч при 37°С, использовали в качестве исходного количества для 3-го раунда селекции. В 3-ем раунде селекции фаг обрабатывали 100 мкг/мл трипсина, но в течение более длительных периодов времени: 2 ч при 37°С, 4 ч при 37°С, в течение ночи при комнатной температуре или в течение ночи при 37°С. Титры выхода
- 71 018129 после 3-го раунда селекции суммированы в табл. 19.
Таблица 19. Титры выхода фага после третьего раунда селекции
Обработка трипсином Титр
Без трипсина
2 ч при 37°С 1,9х 10'
4 ч при 37°С 2χ 10(5
В течение ночи при комнатной температуре 4х 10’
В течение ночи при 37°С 2,1 х 10е
Для оценки разнообразия последовательностей осуществляли секвенирование некоторых клонов из каждого выхода селекции после раундов 1, 2 и 3. После первого раунда селекции без обработки трипсином 50% продуктов селекции имели последовательность родительского Ό0Μ10-53-474. После 2-го раунда селекции процент родительской последовательности увеличивался до 75%. После 3-го раунда селекции процент родительской последовательности увеличивался до 80%.
Эти данные показывают, что Ό0Μ10-53-474 уже устойчив к расщеплению трипсином, и из этих селекций с использованием трипсина может быть отобрано не так много новых клонов. На фиг. 22 показано, что когда трипсином переваривали очищенный белок, тогда Ό0Μ10-53-474 не переваривался полностью даже после обработки трипсином в течение ночи. Однако для того, чтобы определить, имеются ли в продуктах селекции какие-либо новые клоны, которые более устойчивы к трипсину, чем Ό0Μ10-53-474, продукт 3-й селекции, где фаг обрабатывали трипсином в течение ночи при 37°С, субклонировали в ρΌ0Μ5. Затем секвенировали сто клонов для поиска устойчивых к трипсину клонов. Среди ста проанализированных клонов только 26 клонов имели новые последовательности, однако ни один из этих клонов не имел мутаций в сайтах расщепления трипсином (лизин или аргинин), что позволяет предположить, что эти клоны не являются более устойчивыми к трипсину, чем Ό0Μ10-53-474.
Пример 14. Улучшения хранения и биофизических свойств, вводимые в основные бАЬ Ό0Μ0101 (анти-Т№КР, посредством селекции фагов в присутствии трипсина
Для улучшения устойчивости к протеазам основной молекулы Ό0Μ16-131-511 осуществляли селекции фагов в присутствии трипсина, как описано ранее. В соответствии с данным способом получали несколько клонов с улучшенной стабильностью в присутствии трипсина по сравнению с родительской молекулой Ό0Μ1Η-131-511. Два клона, Ό0Μ1Η-131-202 и Ό0Μ16-131-206, отобрали для дальнейшей характеристики, поскольку они продемонстрировали наиболее значительное улучшение к действию трипсина. Дальнейшие исследования, которые изложены ниже, показали, что вместе с улучшенной устойчивостью к действию трипсина имеются и другие благоприятные эффекты, главным образом в отношении стабильности молекул к сдвиговой деформации и тепловому стрессу. Эти два параметра являются главными в увеличении стабильности при хранении и длительности хранения биофармацевтических продуктов.
Продуцирование основных йАЬ ИОМ0101 в ИеЫа района
Гены, кодирующие первичную аминокислотную последовательность трех основных молекул, использовали для продуцирования секретируемого белка в РюЫа ρаβΐо^^β. Три синтетических гена (Ό0Μ16-131-511, Ό0Μ1Η-131-202 и Ό0Μ1Η-131-206) клонировали в экспрессирующий вектор ρРIС-Ζα и затем использовали для трансформации двух штаммов РюЫа, Х33 и ΚΜ714. Трансформированные клетки высевали на чашки с возрастающей концентрацией зеоцина (100, 300, 600 и 900 мкг/мл) для селекции клонов с множественными интегратами. Некоторые клоны затем подвергали скринингу в 2 л колбах для идентификации клеточных линий с высоким уровнем экспрессии. Клоны с наилучшим уровнем экспрессии затем использовали для получения материала в 5 л ферментерах.
Очистка белка и характеристика материала
Для получения материала высокого качества с целью его характеристики и дальнейших исследований стабильности был разработан следующий способ очистки с использованием смолы с индукцией заряда смешанной модальности (Саρΐо ΜΜ€) в качестве первичной стадии захвата с последующей анионообменной хроматографией (О 8е]э11агове). Без какой-либо значительной оптимизации это позволило осуществить извлечение приблизительно 70% экспрессированного бАЬ с чистотой приблизительно 95%. Данный материал характеризовали в отношении идентичности, используя масс-спектрометрию с электрораспылением, аминоконцевое секвенирование и изоэлектрическое фокусирование, а также анализировали чистоту, используя 8Э8-РАСЕ и 8ЕС (гель-фильтрацию).
Идентичность белков
Анализ аминоконцевой последовательности первых пяти остатков каждого белка дал ожидаемый результат (ЕУрЬЬ...). Масс-спектрометрию осуществляли на образцах белков, в которых была произведена замена буфера на 50:50 Н2О:ацетонитрил, содержащий 0,1% ледяной уксусной кислоты, с использованием С4 Ζ^ρ-ΐ^ρβ (Μ^Шρо^е). Измеренная масса каждого из трех белков находилась в пределах 0,5 Да от теоретической массы на основании первичной аминокислотной последовательности (рассчитанной с использованием средних масс) с учетом разницы масс -2, получаемой в результате образования внутренней
- 72 018129 дисульфидной связи. ШЕ использовали для идентификации белков на основании их р1, которые различались для каждого белка.
Чистота белков
Эти три белка наносили на невосстанавливающие δΌδ-РАСЕ гели в количествах 1 мкг и 10 мкг в двух повторностях. Во всех случаях наблюдали одну полосу.
Для демонстрации уровней чистоты также осуществляли гель-фильтрацию. При проведении гельфильтрации (8ЕС) на колонку С2000 8ШХЬ ТО8ОН наносили по 100 мкг каждого белка при скорости потока 0,5 мл/мин. Использовали подвижную фазу РВ8/10% этанола. Процентное содержание мономеров измеряли по площади под кривой (см. фиг. 23).
Сравнение стабильности ООМ1Й-131-511, -202 и -206
Оценка стабильности в присутствии протеаз
Стабильность ЭОМ1Й-131-511, ЭОМ1Й-131-202 и ЭОМ1Й-131-206 в присутствии протеаз оценивали посредством ΒIΑсо^е™-анализа остаточной связывающей активности после предварительной инкубации в течение определенных периодов времени с избытком протеаз. Приблизительно 1400 КИ биотинилированного ТАК1 наносили на чип со стрептавидином (8А). 250 нМ ООМ1Й-131-511, ООМ1Й-131-202 и ЭОМ1Й-131-206 инкубировали либо только с РВ8, либо с 100 мкг/мл трипсина, эластазы или лейкозима в течение 1, 3 и 24 ч при 30°С. Реакцию останавливали путем добавления коктейля ингибиторов протеаз. Затем бАЬ/протеазные смеси пропускали через чип, покрытый ТАК1, вычитая сигнал ячейки сравнения. Поверхность чипа регенерировали перед каждым циклом инжекции, используя 10 мкл 0,1 М глицина, рН 2,2. Фракцию ООМ1Й-131-511, ООМ1Й-131-202 и ООМ1Й-131-206, связавшихся с ТАК1 человека (за 10 с), предварительно инкубированных с протеазами, определяли относительно бАЬ, связавшегося в отсутствие протеаз. ΒIΑсо^е™-анализы осуществляли при 25°С. Данные ниже получали из трех независимых экспериментов. Гистограмма показывает средние значения, а планки погрешностей указывают на стандартное отклонение результатов (фиг. 24).
Обнаружили, что ЭОМ1Й-131-202 и ЭОМ1Й-131-206 показали более высокую устойчивость к протеолитическому расщеплению трипсином, эластазой или лейкозимом по сравнению с ЭОМ1Й-131-511. Различие между ООМ1Й-131-202 и ЭОМ1Й-131-206 по сравнению с ЭОМ1Й-131-511 наиболее ярко выражено после инкубации в течение 1 ч с трипсином и 3 ч с эластазой или лейкозимом. Имеется тенденция к тому, что ЭОМ1Й-131-206 будет обладать несколько большей стабильностью по сравнению с ЭОМ1Й-131-202 в большинстве тестируемых условий.
Термостабильность йАВ, определенная посредством Б8С
Для определения того, при каком рН основные молекулы обладали наибольшей стабильностью, использовали дифференциальный сканирующий калориметр (Ό8ί.') для измерения температур плавления (Тт) каждого бАЬ в буфере Бриттона-Робинсона. Поскольку буфер Бриттона-Робинсона изготовлен из трех буферных систем (40 мМ каждой из кислот: уксусной, фосфорной и борной), то в одном и том же растворе можно получать рН в диапазоне от 3 до 10. Теоретическую величину р1 определяли из первичной аминокислотной последовательности белков. На основании данных Ό8ί.' обнаружили, что рН, при котором бАЬ имеют самую высокую внутреннюю термостабильность, составляет: рН 7 для ЭОМ1Й-131202, рН 7-7,5 для ООМ1Й-131-206 и рН 7,5 для ООМ1Й-131-511. Во всех последующих исследованиях нагрузок и стабильности для каждого бАЬ использовали следующие значения рН: для ООМ1Й-131-202 и ООМ1Й-131-206 (С8К1995057А) рН 7,0, а для ПОМ1Й-131-511 рН 7,5 в буфере Бриттона-Робинсона. Результаты суммированы в табл. 20.
Таблица 20. Краткий обзор значений рН и Тт для ООМ1-131-202, ООМ1Й-131-206 и ООМ1Й-131511, как определено посредством Ό8ί.' в буфере Бриттона-Робинсона при концентрации 1 мг/мл. Температура изенялась со скоростью 180°С/ч.
ЙАЬ рН, который дает наибольшую внутреннюю термостабильность
Тт (°С) ЙАЬ при данном рН
ООМ1Н-131-202
ООМ1Н-131-206
ООМ1Н-131-511
7,0
68,6
65,8
58^
Тестирование термостабильности в течение двух недель
Способность белка выдерживать повышенные температуры в течение длительных периодов времени обычно является хорошим показателем его стабильности. В этих условиях белок может подвергаться различным физическим процессам, таким как агрегация или химическая модификация. бАЬ (в концентрации 1 мг/мл) инкубировали при 37 и 50°С в течение 14 суток в буфере Бриттона-Робинсона. Для того чтобы определить, сколько мономера осталось в растворе после 14 суток, использовали 8ЕС (фиг. 25).
Из фиг. 25 можно видеть, что и ЭОМ1Й-131-202, и ЭОМ1Й-131-206 значительно более стабильны, чем ЭОМ1Й-131-511, к тепловому стрессу. Воздействие на белки повышенных температур, таких как 37 и 50°С, обычно используют для получения указания относительно продолжительности срока хранения лекарственных средств. Эти повышенные температуры используют для ускорения обычных процессов,
- 73 018129 связанных с длительным хранением при комнатной температуре, таких как дезамидирование, окисление или агрегация. Уровень образования агрегатов в растворе также можно контролировать с использованием 8ЕС (фиг. 26А-1). После 14 суток при 37°С потеря ΩΟΜ111-131-511 из раствора может происходить вследствие как осаждения, так и образования агрегатов более высокого порядка, как определено посредством 8ЕС (фиг. 26В). Значительно меньшая потеря белка также наблюдалась для ΟΟΜ111-131-202 и ΟΟΜ111-131-206 при 37°С после 14 суток с очень незначительным, или, по существу, без него, увеличением образования агрегатов, особенно в случае ΟΟΜ111-131-206 (фиг. 26Н). При 50°С различие между молекулами становится еще более выраженным, причем ΟΟΜ111-131-206 демонстрирует лучшую стабильность при повышенной температуре, чем ΟΟΜ111-131-202 через 14 суток, что свидетельствует о значительно сниженном образовании агрегатов с более высокой молекулярной массой (фиг. 26). Относительно ΐ=0, ΟΟΜ111-131-206 демонстрирует лишь небольшое увеличение образования агрегатов через 14 суток (фиг. 26Ι), в то время как ΩΟΜ111-131-511 почти полностью выпадает в осадок из раствора (фиг. 26С).
Это показывает, что изменения, вводимые в бАЬ посредством селекции с использованием трипсина, например улучшенная термостабильность, значительно улучшили стабильность белка при хранении при 37 и 50°С. Очевидно, что и ΌΘΜ1^131-202, и в большей степени ΌΘΜ1^131-206 обладают улучшенной стабильностью в растворе и меньшей тенденцией к образованию агрегатов при повышенных температурах, которые могут непосредственно объяснить улучшенную стабильность при длительном хранении при более релевантных температурах, таких как +4°С и комнатная температура.
Образцы, соответствующие временным точкам 24, 48 ч, 7 и 14 суток эксперимента с тепловым стрессом, затем анализировали посредством 1ЕЕ для того, чтобы посмотреть, подвергались ли белки каким-либо биофизическим изменениям, которые могли бы повлиять на общий заряд белка (фиг. 27).
Кроме того, и ΟΟΜ111-131-202, и ΟΟΜ111-131-206 не показывают никаких существенных изменений при 37°С по сравнению с ΟΟΜ111-131-511. Для ΩΟΜ111-131-511 слабая вторая полоса появляется через 24 ч при 37°С. Полагают, что образование этой дополнительной полосы происходит вследствие димеризации данного белка, экранирующей таким образом заряд и дающей две популяции молекул. При 50°С различие между молекулами становится более выраженным, ΟΟΜ111-131-206 явно не демонстрирует никаких существенных изменений при повышенной температуре, тогда как ΟΟΜ111-131-202 демонстрирует некоторые признаки модификации через 24 ч. Большая часть ΩΟΜ111-131-511 теряется в результате осаждения через 48 ч в буфере Бриттона-Робинсона.
Временные точки Т=0-е, 7-е и 14-е сутки при 50°С анализировали в КВА с ΤNΕΚ-1 для определения функциональности белка после воздействия высоких температур (фиг. 28). В настоящее время этот анализ не является таким чувствительным, как 8ЕС или 1ЕЕ при обнаружении едва заметных изменений в молекуле под действием стресса, но он может быть использован для того, чтобы показать, что бАЬ все же может связываться с антигеном.
Смещение кривой влево для ΩΟΜ111-131-511 отражает тот факт, что большая часть бАЬ потеряна вследствие осаждения. Материал, который остается в растворе, все еще способен связываться с антигеном. Как показано на фиг. 25, большая часть как ΟΟΜ111-131-202, так и ΟΟΜ111-131-206 способна оставаться в растворе даже после 14 суток. Данные КВА показывают, что весь растворимый белок является все еще функциональным и способен связываться с ΤΝΕ!!.
Тестирование стабильности при хранении высоких концентраций белков
Осуществляли эксперименты с целью исследования стабильности при хранении при +4°С при очень высоких концентрациях белков, чтобы посмотреть, как каждая молекула функционировала в этих условиях. Все основные бАЬ концентрировали в центрифужных концентраторах Утоакрт (отсечение 5 кДа) в буфере Бриттона-Робинсона при их наиболее стабильном рН, до концентрации приблизительно 100 мг/мл. Затем образцы в концентрации приблизительно 100 мг/мл оставляли при +4°С на 7 суток и после этого анализировали посредством 8ЕС, чтобы посмотреть, появились ли какие-либо другие физические изменения в образцах в процессе хранения при высоких концентрациях (фиг. 29). Образцы разбавляли до приблизительно 1 мг/мл, после чего анализировали на 8ЕС колонке в 1хРВ8/10% этанола (об./об.).
Из 8ЕС кривых можно видеть, что ни ΟΟΜ111-131-202, ни ΟΟΜ111-131-206 не демонстрируют какого-либо существенного увеличения образования агрегатов через 7 суток, в то время как для ΩΟΜ111-131511 наблюдается уменьшение концентрации мономера приблизительно на 2%.
Доставка основных йАЬ с помощью небулайзеров
Для токсикологических и клинических исследований на ранних стадиях бАЬ будут приготавливаться в виде жидкости и доставляться посредством распылительного устройства. В зависимости от устройства (например ультразвукового, струйного или на основе технологии вибрирующего сита) бАЬ будет испытывать некоторый сдвиг и тепловой стресс по мере его распыления с образованием аэрозоля с частицами определенного размера. Поскольку и ΌΘΜ1^131-202, и -206 имеют более высокую и демонстрируют значительно улучшенную стабильность к тепловому стрессу по сравнению с ΟΟΜ111-131-511, все бАЬ тестировали в двух распылительных устройствах, чтобы понять, как они реагируют на сдвиг/тепловой стресс, индуцируемые в процессе распыления. Как белок из распыляемого аэрозоля, так
- 74 018129 и оставшееся бАЬ в устройстве (т.е. в колпачке) затем анализировали посредством 8ЕС для определения степени агрегации, происходящей во время этого процесса.
Все молекулы тестировали в буфере Бриттона-Робинсона при их наиболее стабильном рН. бАЬ тестировали как в устройстве Е-Г1о\у Кар1б (на основе технологии вибрирующего сита), так и в Рап ЬС+ (струйный небулайзер) со временем работы 3,5 мин при концентрации белка 5 мг/мл и распределением частиц по размеру, определенному с использованием Макет 8ргау!ек. Результаты представлены на фиг.
30. Для хорошей доставки и распределения в глубоких отделах легких идеальный размер частиц составляет менее 5 мкм. Все бАЬ дают сравнимые уровни размеров частиц, которые составляли менее 5 мкм в буфере Бриттона-Робинсона. Концентрацию бАЬ в колпачке устройства определяли с помощью измерений А280 до и после распыления (данные не показаны). Обнаружили, что концентрация белка не изменялась существенно, что указывает на то, что ни белок, ни разбавитель не распыляются предпочтительно в процессе доставки.
Образцы бАЬ, распыленные в буфере Бриттона-Робинсона, анализировали посредством 8ЕС для определения того, подвергался ли белок каким-либо физическим изменениям в процессе доставки. На фиг. 31 показано относительное процентное изменение как в колпачке, так и в аэрозоле, как определено посредством 8ЕС. Можно видеть, что и ООМ111-131-202. и ЭОМ1й-131-206 претерпевают относительно небольшие изменения в концентрации мономера относительно ЭОМ111-131-511. Это демонстрирует, что как ООМ111-131-202. так и ЭОМ1й-131-206, обладающие улучшенными Тт, имеют меньшую предрасположенность к образованию агрегатов в процессе распыления.
На фиг. 32 показаны фактические 8ЕС кривые для ЭОМ1й-131-206 и ЭОМ111-131-511 в буфере Бриттона-Робинсона после распыления и продемонстрировано, что относительная потеря мономера (фиг. 31) происходит вследствие образования димеров. Это снова дает дополнительное подтверждающее доказательство для теории, согласно которой более высокая термостабильность, демонстрируемая ООМ1й131-202 и ООМ111-131-206. может предотвращать существенную агрегацию даже в неоптимизированном препаративном буфере.
Для токсикологических исследований и оценки безвредности необходимо обеспечить доставку бАЬ животному при значительно более высоких уровнях уровней, чем терапевтические дозы, даваемые пациентам. Этого можно достичь только путем использования значительно более высоких концентраций белка и/или посредством доставки бАЬ в течение пролонгированного периода времени. Поскольку уже было показано, что ЭОМ111-131-511 образует агрегаты при распылении в концентрации 5 мг/мл в течение 3,5 мин, то ЭОМ111-131-206 тестировали в концентрации 40 мг/мл в РВ8 и распыляли, используя Рап ЬС+ в течение до 1 ч включительно. Образцы из колпачка и аэрозоля отбирали в моменты времени на протяжении всего исследования, чтобы посмотреть, вызывает ли пролонгированное распыление агрегацию бАЬ вследствие сдвига или теплового стресса, как определяли с помощью 8ЕС и концентрации белка (измерения А280 нм). В табл. 21 показана концентрация белка бАЬ как в колпачке, так и в аэрозоле, определенная по А280.
Таблица 21. Измеренная концентрация белка ЭОМ1й-131-206, определенная по величинам поглощения при А280 для колпачка и аэрозоля во время распыления бАЬ в концентрации приблизительно 40 мг/мл с использованием Рап ЬС+. С учетом ошибок при разведении и погрешности прибора концентрация образца не изменяется после распыления бАЬ в течение 1 ч.
Время(мин) Образец из колпачка (мг/мл) Образец из аэрозоля (мг/мл)
1 43,8 43,4
29 44,5 43,5
59 44,6 44,1
Из табл. 21 можно видеть, что концентрация белка существенно не изменялась во время анализа, демонстрируя отсутствие значительной потери белка вследствие агрегации. На фиг. 33 показано, что в течение 1 ч распыления ООМ111-131-206 не образует каких-либо агрегатов более высокого порядка, таких как димеры, как определено посредством 8ЕС. Это ясно демонстрирует, что улучшенные биофизические свойства, которые введены в молекулу посредством селекции с использованием трипсина, существенно увеличивают устойчивость бАЬ к сдвигу и тепловому стрессу и что это может непосредственно коррелировать с увеличением срока годности при хранении и со способностью распылять белок таким образом, чтобы не образовывались агрегаты более высокого порядка.
Состояние основных йАЬ в растворе
Поскольку основным путем деградации для всех трех основных бАЬ, по-видимому, является самоассоциация, приводящая сначала к димеризации, затем к дальнейшей агрегации и в конечном счете к осаждению, эти три основные молекулы исследовали посредством аналитического ультрацентрифугирования (АИС) для определения степени самоассоциации. Белки исследовали с помощью двух способов: седиментационного равновесия и скорости седиментации.
Для способа седиментационного равновесия эти три образца анализировали в трех различных кон
- 75 018129 центрациях, варьирующих от 0,5 до 5 мг/мл, исследуя эффекты центрифугирования при трех различных скоростях вращения ротора. Этим способом определили, что ЭОМ111-131-511 является стабильным димером (26,1-34,4 кДа), ЭОМ111-131-202 представляет собой равновесие мономер/димер (22,7-27,8 кДа) с относительно стабильным димерным состоянием в измеренных концентрациях сК,| = 1,3 мкМ, а ЭОМ1Н131-206 предпочтительно является мономерным (15,4-17,9 кДа) с К,| для ассоциации мономера в димер, равной 360 мкМ.
В способе седиментационного равновесия все образцы продемонстрировали некоторую степень диссоциации при разбавлении. Согласно полученным результатам, представленным на фиг. 34, коэффициент седиментации, измеренный для ООМ111-131-51Й является показателем агрегатов более высокого порядка, а смещение пика при разведении указывает на диссоциацию этих агрегатов. Агрегация и диссоциация белка компенсируют друг друга, что может создавать впечатление присутствия стабильного димера, как наблюдали при седиментационном равновесии. Коэффициенты седиментации, измеренные для ПОМ1Й-131-202, являются показателем быстрого динамического равновесия, и поэтому пики мономера и димера не могут быть отделены друг от друга, давая единственный пик с более высоким коэффициентом седиментации, чем соответствующий массе образца. Этот результат согласуется с результатом, полученным способом седиментационного равновесия, а измеренная константа диссоциации равна 1 мкМ. Было установлено, что ПОМ1Й-131-206, имея значение коэффициента седиментации 1,9 8 (единиц Сведберга), в большей степени представляет собой мономер, чем другие два образца (2,5 8). Эти данные хорошо согласуются с данными способа седиментационного равновесия. При тех концентрациях, при которых производили измерения, т.е. при концентрациях приблизительно в 10 раз меньше Кб, равной 360 мкМ, образец предпочтительно является мономером.
Пример 15. Повышение эффективности бАЬ ЭОМ15-26-593
Пример повышения эффективности бАЬ ЭОМ15-26-593 в анализе связывания с рецептором УЕСЕК2 по сравнению с родительским ЭОМ15-26 представлен на фиг. 40. В этом анализе способность потенциального ингибитора предупреждать связывание УЕСЕ с УЕСЕК2 измеряют в планшетном анализе. В этом анализе химерную конструкцию УЕСЕК2-ЕС наносят на 96-луночный планшет для ЕЫБА и к ней добавляют заданное количество УЕСЕ, который предварительно инкубировали с серией разведений тестируемого бАЬ. После отмывки несвязавшегося белка определяют количество УЕСЕ, связавшегося с рецептором, используя антитело против УЕСЕ, уровень которого определяют колориметрически. График зависимости доза-ответ строят в виде процента ингибирования связывания УЕСЕ в зависимости от концентрации тестируемого вещества. Таким образом, эффективный ингибитор представляет собой такой ингибитор, который в низких концентрациях демонстрирует существенное блокирование связывания лиганда.
Эффективность и период полувыведения слияний с Ее
Терапевтический потенциал УЕСЕ-блокады в лечении опухолей реализуется уже в течение более 30 лет. Хроническая природа рака диктует, что биофармацевтические продукты должны иметь длительный период полувыведения из сыворотки для опосредования их эффектов, и это не согласуется с быстрым клиренсом свободных бАЬ из кровотока посредством почечной фильтрации. Для оценки применимости бАЬ к УЕСЕ в качестве антиангиогенных средств для лечения рака основные доменные антитела форматировали в виде слияний с человеческим Ес 1дС1 дикого типа через гибридный линкер с тем, чтобы создать бивалентную молекулу с периодом полувыведения из сыворотки, увеличенным благодаря использованию ЕсКп-опосредованных путей утилизации антител (аийЬобу 8а1уаде ра111\\ау8).
В этом формате Ес-слияния эффективность основного, селектированного с использованием трипсина бАЬ, ЭОМ15-26-593, сравнивали с исходным родительским бАЬ (ЭОМ15-26) и чувствительным к трипсину бАЬ (ЭОМ15-26-501), используя анализ, описанный выше. Результаты представлены ниже в табл. 22.
Таблица 22. Характеристики эффективности (КВА) и периода полувыведения основных молекул на основе ЭОМ15-26 в формате Ес-слияния
с1АЬ Бс Эффективность (нМ) Т1/2Ь (ч)
ЭОМ15-26 И1д61 0,506 Не опред.
ООМ15-26-501 ЫдС1 0,323 12,9
ЭОМ15-26-593 П1дС1 0,033 84,6
Из этих результатов можно видеть, что в формате димерного слияния с Ес аффинность и эффективность повышены относительно свободных бАЬ благодаря эффекту авидности. Очевидно, что увеличение эффективности, полученное для ЭОМ15-26-593 благодаря селекции с использованием трипсина, поддерживается и даже еще более выражено в этом Ес-формате. Кроме того, улучшения термостабильности и стабильности к протеазам объясняют глубокие изменения фармакокинетического поведения данных молекул ίη νίνο. Увеличение периода полувыведения (см. фиг. 41) для ЭОМ15-26-593 по сравнению с ЭОМ15-26-501, вероятно, является прямым следствием повышенной стабильности бАЬ, делающей его более устойчивым к процессам расщепления, которые протекают в эндосомальном компартменте. По
- 76 018129 этому также следует ожидать, что ЙАЬ с повышенной стабильностью к протеазам, способны сохраняться в течение более длительного времени и в других биологических компартментах, таких как сыворотка, поверхности слизистых оболочек и компартменты различных тканей, где протеолиз представляет собой активный процесс, вовлеченный в метаболизм биологических молекул.
Фармакокинетические профили клиренса
Фармакокинетические профили клиренса ЭОМ15-26-593 и ЭОМ15-26-501 измеряли после в/в введения ЭОМ15-26-593 и ЭОМ15-26-501 3 крысам в концентрациях 5 мг/кг. Затем измеряли уровни ЭОМ15-26-593 и ЭОМ15-26-501 в сыворотке, используя стандартный ЕЫ8А-анализ прямого связывания с УЕСЕ и антитело против Ес человека, поэтому определяли только интактное лекарственное средство в образцах сыворотки. Полный фармакокинетический профиль показан ниже в табл. 23.
Таблица 23. Краткий обзор фармакокинетических параметров слияний ЭОМ15-26 и ЭОМ15-26-593 с Ес у крыс
ЙАЬ Период Стах дис (ο-ίηΐ) Выведение
полувыведения (ч) (кг/мл) (ч*мкг/мл) (мл/ч/кг)
ЭОМ15-26-501 12,9 91,4 445,1 11,8
ЭОМ15-26-593 ^84^6 101,8 3810 1,3
Из этих результатов видно, что ЭОМ15-26-593 имеет значительно улучшенный фармакокинетический профиль, например, с увеличенным периодом полувыведения и сниженной скоростью клиренса.
Значительно улучшенные эффективность и фармакокинетические свойства ЭОМ15-26-593 привели к анализу различных других биофизических свойств данного соединения.
Свойства в растворе: анализ посредством 8ЕС-МАЬЬ8 и АиС
Эксперименты с ЭОМ15-26-593 осуществляли следующим образом.
ЭОМ15-26-593 ведет себя как мономер в растворе при концентрациях до 2,5 мг/мл включительно с рассчитанной молекулярной массой 78-81 кДа, согласующейся с рассчитанной массой интактной молекулы приблизительно 76 кДа (фиг. 42а и 42Ь).
Свойства, связанные с температурой плавления: анализ посредством Б8С
Эксперименты с ЭОМ15-26-593 осуществляли следующим образом.
Повышенная термостабильность ЙАЬ, селектированного с использованием трипсина (65°С; фиг. 43, средняя панель), сохраняется в Ес-слиянии (64,5°С; фиг. 43, верхняя панель). Для сравнения показана Τт-кривая для ЙАЬ ЭОМ15-26-501 (52°С, фиг. 43, нижняя панель).
Стабильность к замораживанию-оттаиванию, тепловому стрессу и компонентам сыворотки
Эксперименты с ЭОМ15-26-593 осуществляли следующим образом.
Свойства стабильности ЙАЬ ЭОМ15-26-593 означают, что данное ЙАЬ ЭОМ15-26-593 может быть подвергнуто физическому и биологическому стрессу с минимальным влиянием на его способность связываться с УЕСЕ (фиг. 44-47 (А и В)). Например, данную молекулу можно неоднократно размораживать из замороженного состояния в жидком азоте (-196°С) до температуры тела (37°С) (10 циклов) без потери связывающей активности, как определено посредством ЕЬ18А (фиг. 44). Эта обработка также не приводила к каким-либо заметным изменениям в агрегированном состоянии молекул, как оценивали посредством традиционной гель-фильтрации (фиг. 45). Другие тесты продемонстрировали, что молекула может быть помещена в диапазон различных температур от -80 до 55°С лишь с незначительным падением антигенсвязывающей активности через 168 ч и только при самой высокой температуре инкубации (фиг. 46). Кроме того, инкубация с сывороткой человека или яванского макака при 37°С в течение 14 суток не вызывала никакой потери антигенсвязывающей способности (фиг. 47А и 47В), как определено посредством связывания УЕСЕ в ЕЬ18А. Эффективность в анализе связывания с рецептором УЕСЕК2 и в анализе с использованием клеток НИУЕС
Описанные выше анализы связывания с рецептором осуществляли следующим образом.
Описанный выше анализ связывания с рецептором использовали для оценки эффективности Есслияний (фиг. 48). Обнаружили, что ЙАЬ ЭОМ15-26-593 обладает повышенной эффективностью в этом анализе, в котором устанавливают способность ЙАЬ блокировать связывание УЕСЕ с УЕСЕК2 ш νίΙΐΌ. Кроме того, эффективность ЭМ81529 была продемонстрирована в анализе с НИУЕС (эндотелиальные клетки пупочной вены человека), в котором измеряют способность антагонистов УЕСЕ блокировать УЕСЕ-стимулированную пролиферацию клеток НИУЕС. Количества клеток определяют в конце фиксированного периода инкубации с заданным количеством УЕСЕ и варьирующим количеством тестируемого продукта. Чем больше эффективность антагониста, тем меньше наблюдаемая клеточная пролиферация (фиг. 49).
В этом абзаце приведена нуклеотидная последовательность ЭОМ1Й-131-511.

Claims (35)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора интерлейкина-1 типа 1 (ΙΕ-1Κ.1), содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 98% идентична аминокислотной последовательности ЭОМ4-130-202 (представленной на фиг. 4).
  2. 2. Иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен по п.1, содержащий 228, 498, 838 и 94Υ согласно нумерации Кабата.
  3. 3. Иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора интерлейкина-1 типа 1 (ΙΕ-1Κ.1) по п.1, содержащий аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотной последовательности ЭОМ4-130-202.
  4. 4. Иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора интерлейкина-1 типа 1 (ΙΕ-1Κ.1), кодируемый последовательностью, которая идентична нуклеотидной последовательности ЭОМ4-130-202 (представленной на фиг. 19).
  5. 5. Антагонист рецептора интерлейкина-1 типа 1 (ΙΕ-1Κ.1), содержащий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против ΙΕ-1Κ.1 по любому из пп.1-4.
  6. 6. Антагонист по п.5, содержащий первый и второй иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, где каждый вариабельный домен соответствует любому из пп.1-4.
  7. 7. Антагонист по п.5 или 6, где антагонист содержит мономер указанного единичного вариабельного домена или гомодимер указанного единичного вариабельного домена, где аминокислотная последовательность единичного вариабельного домена или каждого единичного вариабельного домена идентична аминокислотной последовательности ЭОМ4-130-202 (представленной на фиг. 4).
  8. 8. Иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, содержащий сайт связывания рецептора интерлейкина-1 типа 1 (ΙΕ-1Κ.1), где вариабельный домен устойчив к протеазе при инкубации с:
    (1) протеазой в концентрации (с) по меньшей мере 10 мкг/мл при 37°С в течение периода времени (ΐ) по меньшей мере один час или (2) протеазой в концентрации (с') по меньшей мере 40 мкг/мл при 30°С в течение периода времени (ί) по меньшей мере один час;
    где вариабельный домен содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 98% идентична аминокислотной последовательности ЭОМ4-130-202 (представленной на фиг. 4).
  9. 9. Антагонист рецептора интерлейкина-1 типа 1 (ΙΕ-1Κ1), содержащий вариабельный домен по п.8.
  10. 10. Антагонист ΙΕ-1Κ1 по п.9 для пероральной доставки.
  11. 11. Антагонист ΙΕ-1Κ1 по п.9 или 10 для доставки в ЖК (желудочно-кишечный) тракт пациента.
  12. 12. Антагонист по пп.9, 10 или 11, где вариабельный домен устойчив к трипсину, эластазе и/или панкреатину.
  13. 13. Применение антагониста ΙΕ-1Κ1 по п.9 для лечения и/или профилактики воспалительного состояния.
  14. 14. Антагонист по любому из пп.5-7 и 9-13, где антагонист содержит вариабельный домен, который имеет Тт по меньшей мере 50°С.
  15. 15. Вариабельный домен по любому из пп.1-4 и 8, который имеет Тт по меньшей мере 50°С.
  16. 16. Вариабельный домен по любому из пп.1-4 и 8, который ингибирует ΙΕ-1-индуцированное высвобождение интерлейкина-8 клетками МЯС-5 (номер доступа в АТСС ССЬ-171) в анализе ίη у11го с ΝΌ50 (средняя нейтрализующая доза) не более 1 мкМ.
  17. 17. Вариабельный домен по любому из пп.1-4 и 8, который ингибирует связывание ΙΠ-1 с ΙΕ-1Κ1 с Ιί.'50 (средняя ингибирующая концентрация) не более 1 мкМ.
  18. 18. Вариабельный домен по любому из пп.1-4 и 8, где вариабельный домен 1Я1 ингибирует ΙΠ-1индуцированное высвобождение интерлейкина-6 в анализе цельной крови с ΝΏ50 не более 1 мкМ.
  19. 19. Лиганд с двойной специфичностью, содержащий вариабельный домен по любому из пп.1-4, 8, 15, 16, 17 и 18.
  20. 20. Выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен по любому из пп.1-4, 8, 15, 16, 17 и 18.
  21. 21. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.20.
  22. 22. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.20 или вектор по п.21.
  23. 23. Фармацевтическая композиция, обладающая антагонистической активностью в отношении рецептора интерлейкина-1 типа 1 (ΙΕ-1Κ.1), содержащая иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен по любому из пп.1-4, 8, 15, 16, 17 и 18 или антагонист по любому из пп.5-7 и 9-14 и фармацевтиче
    - 78 018129 ски приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель.
  24. 24. Полипептид, содержащий последовательность, которая по меньшей мере на 98% идентична аминокислотной последовательности ЭОМ4-130-202 (представленной на фиг. 4).
  25. 25. Слитый белок, содержащий полипептид по п.24.
  26. 26. Выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по п.24 или слитый белок по п.25.
  27. 27. Иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен по любому из пп.1-4, 8, 15, 16, 17 и 18, содержащий константный домен антитела.
  28. 28. Антагонист по любому из пп.5-7 и 9-14, содержащий константный домен антитела.
  29. 29. Полипептид по п.24, содержащий константный домен антитела.
  30. 30. Вариабельный домен по п.27, содержащий Ес антитела, где Ν-конец Рс связан с С-концом вариабельного домена.
  31. 31. Вариабельный домен по п.30, где Ν-конец Ес непосредственно связан с С-концом вариабельного домена.
  32. 32. Антагонист по п.28, содержащий Ес антитела, где Ν-конец Ес связан с С-концом вариабельного домена.
  33. 33. Антагонист по п.32, где Ν-конец Ес непосредственно связан с С-концом вариабельного домена.
  34. 34. Полипептид по п.29, содержащий Ес антитела, где Ν-конец Ес связан с С-концом вариабельного домена.
  35. 35. Полипептид по п.34, где Ν-конец Ес непосредственно связан с С-концом вариабельного домена.
EA200901491A 2007-06-06 2008-06-04 Полипептиды, вариабельные домены антитела и антагонисты EA018129B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US93363207P 2007-06-06 2007-06-06
GBGB0724331.4A GB0724331D0 (en) 2007-12-13 2007-12-13 Compositions for pulmonary delivery
PCT/GB2008/050406 WO2008149149A2 (en) 2007-06-06 2008-06-04 Polypeptides, antibody variable domains and antagonists

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200901491A1 EA200901491A1 (ru) 2010-08-30
EA018129B1 true EA018129B1 (ru) 2013-05-30

Family

ID=39791116

Family Applications (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200901494A EA200901494A1 (ru) 2007-06-06 2008-06-03 Способы селекции протеазоустойчивых полипептидов
EA200901300A EA200901300A1 (ru) 2007-06-06 2008-06-04 Полипептиды, вариабельные домены антител и антагонисты
EA200901491A EA018129B1 (ru) 2007-06-06 2008-06-04 Полипептиды, вариабельные домены антитела и антагонисты
EA200901495A EA018723B1 (ru) 2007-06-06 2008-06-04 Полипептиды, вариабельные домены антител и антагонисты
EA201100546A EA201100546A1 (ru) 2007-06-06 2009-11-04 Полипептиды, вариабельные домены антител и антагонисты

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200901494A EA200901494A1 (ru) 2007-06-06 2008-06-03 Способы селекции протеазоустойчивых полипептидов
EA200901300A EA200901300A1 (ru) 2007-06-06 2008-06-04 Полипептиды, вариабельные домены антител и антагонисты

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200901495A EA018723B1 (ru) 2007-06-06 2008-06-04 Полипептиды, вариабельные домены антител и антагонисты
EA201100546A EA201100546A1 (ru) 2007-06-06 2009-11-04 Полипептиды, вариабельные домены антител и антагонисты

Country Status (32)

Country Link
US (5) US20100247515A1 (ru)
EP (5) EP2164867A2 (ru)
JP (3) JP2010530364A (ru)
KR (4) KR20100018040A (ru)
CN (4) CN101778865B (ru)
AR (3) AR066847A1 (ru)
AU (4) AU2008259590A1 (ru)
BR (3) BRPI0812795C1 (ru)
CA (6) CA2688433A1 (ru)
CL (3) CL2008001676A1 (ru)
CO (2) CO6251321A2 (ru)
CR (2) CR11195A (ru)
CY (1) CY1116762T1 (ru)
DK (1) DK2162467T3 (ru)
DO (1) DOP2009000268A (ru)
EA (5) EA200901494A1 (ru)
ES (1) ES2546943T3 (ru)
HK (1) HK1138022A1 (ru)
HR (1) HRP20151024T1 (ru)
HU (1) HUE025899T2 (ru)
IL (2) IL201398A0 (ru)
MA (2) MA31403B1 (ru)
MX (4) MX2009013137A (ru)
NZ (1) NZ581372A (ru)
PE (3) PE20090322A1 (ru)
PL (1) PL2162467T3 (ru)
PT (1) PT2162467E (ru)
SG (2) SG182151A1 (ru)
SI (1) SI2162467T1 (ru)
TW (6) TW200918088A (ru)
WO (3) WO2008149148A2 (ru)
ZA (1) ZA200908470B (ru)

Families Citing this family (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005289809A (ja) 2001-10-24 2005-10-20 Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) 突然変異重鎖抗体
CN103254309B (zh) 2005-05-18 2017-09-26 埃博灵克斯股份有限公司 针对肿瘤坏死因子α的改进的纳米体TM
DE102005023617A1 (de) 2005-05-21 2006-11-23 Aspre Ag Verfahren zum Mischen von Farben in einem Display
KR20100018040A (ko) 2007-06-06 2010-02-16 도만티스 리미티드 프로테아제 내성 폴리펩티드를 선택하는 방법
GB0724331D0 (en) 2007-12-13 2008-01-23 Domantis Ltd Compositions for pulmonary delivery
JP2010528647A (ja) * 2007-06-06 2010-08-26 ドマンティス リミテッド ポリペプチド、抗体可変ドメインおよびアンタゴニスト
EP2220115A2 (en) * 2007-12-13 2010-08-25 Glaxo Group Limited Polypeptides, antibody variable domains & antagonists
WO2009127691A1 (en) 2008-04-17 2009-10-22 Ablynx N.V. Peptides capable of binding to serum proteins and compounds, constructs and polypeptides comprising the same
PL3216803T3 (pl) 2008-06-25 2020-10-19 Novartis Ag Stabilne i rozpuszczalne przeciwciała hamujące vegf
US8268314B2 (en) 2008-10-08 2012-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
KR20110091777A (ko) * 2008-11-26 2011-08-12 글락소 그룹 리미티드 폴리펩티드, 항체 가변 도메인 및 길항제
WO2010081787A1 (en) 2009-01-14 2010-07-22 Domantis Limited IMPROVED TNFα ANTAGONISM, PROPHYLAXIS & THERAPY WITH REDUCED ORGAN NECROSIS
JP2012517818A (ja) 2009-02-19 2012-08-09 グラクソ グループ リミテッド 改善された抗ｔｎｆｒ１ポリペプチド、抗体可変ドメインおよびアンタゴニスト
BRPI1008705B1 (pt) * 2009-02-19 2021-05-25 Glaxo Group Limited Domínio variável único da imunoglobulina anti-soro albumina, ligante multiespecífico compreendendo o dito domínio, proteína de fusão fundida ao dito domínio, composição, ácido nucleico e vetor compreendendo o dito ácido nucleico
EP3656788A3 (en) * 2009-02-19 2020-07-29 Glaxo Group Limited Improved anti-serum albumin binding variants
CA2753287A1 (en) 2009-02-24 2010-09-02 Glaxo Group Limited Antigen-binding constructs
CA2768460A1 (en) * 2009-07-16 2011-01-20 Glaxo Group Limited Antagonists, uses & methods for partially inhibiting tnfr1
EA201270174A1 (ru) 2009-07-16 2012-07-30 Глэксо Груп Лимитед Отдельные связывающиеся вариабельные домены с улучшенными свойствами, направленные против сывороточного альбумина
CN102655875A (zh) * 2009-10-14 2012-09-05 爱勒让治疗公司 改善的拟肽大环化合物
TW201125877A (en) 2009-10-27 2011-08-01 Glaxo Group Ltd Stable anti-TNFR1 polypeptides, antibody variable domains & and antagonists
JP2013518853A (ja) 2010-02-05 2013-05-23 アブリンクス エン．ヴェー． 血清アルブミンと結合することが可能なペプチド並びにこれを含む化合物、構築物及びポリペプチド
BR112012029280A2 (pt) 2010-05-20 2016-11-29 Glaxo Group Ltd variante de domínio variável único de imunoglobulina antialbumina sérica, imunoglobulina anti-sa, ligando multiespecífico, proteína de fusão, composição, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira isolada, e, uso de uma variante, ligando multiespecífico ou proteína de fusão
JP2013538566A (ja) 2010-08-13 2013-10-17 グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッド 改良された抗血清アルブミン結合変異体
JP2013537421A (ja) 2010-08-20 2013-10-03 グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッド 改良された抗血清アルブミン結合変異体
US8859739B2 (en) 2010-09-16 2014-10-14 Baliopharm Ag Anti-huTNFR1 antibody and methods of use thereof for treatment
JP2014501515A (ja) 2010-12-01 2014-01-23 グラクソ グループ リミテッド 改良された抗血清アルブミン結合単一可変ドメイン
JP2014505698A (ja) * 2011-02-02 2014-03-06 グラクソ グループ リミテッド 新規抗原結合タンパク質
US9527925B2 (en) 2011-04-01 2016-12-27 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bispecific binding molecules binding to VEGF and ANG2
US10400029B2 (en) 2011-06-28 2019-09-03 Inhibrx, Lp Serpin fusion polypeptides and methods of use thereof
EP2726092B1 (en) * 2011-06-28 2019-06-19 Inhibrx, LP Serpin fusion polypeptides and methods of use thereof
EP2736925A2 (en) 2011-07-27 2014-06-04 Glaxo Group Limited Anti-vegf single variable domains fused to fc domains
EA027160B1 (ru) 2011-08-17 2017-06-30 Глаксо Груп Лимитед Модифицированные белки и пептиды
GB2497138A (en) * 2011-12-02 2013-06-05 Randox Lab Ltd Biomarkers for stroke and stroke subtype diagnosis.
HUE056217T2 (hu) 2012-07-13 2022-02-28 Roche Glycart Ag Bispecifikus anti-VEGF/anti-ANG-2 antitestek és ezek alkalmazása szemészeti érbetegségek kezelésében
WO2014111550A1 (en) 2013-01-17 2014-07-24 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Modified anti-serum albumin binding proteins
WO2014118220A1 (en) 2013-01-31 2014-08-07 Glaxo Group Limited Method of producing a protein
US9840553B2 (en) 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
MA41374A (fr) * 2015-01-20 2017-11-28 Cytomx Therapeutics Inc Substrats clivables par métalloprotéase matricielle et clivables par sérine protéase et procédés d'utilisation de ceux-ci
CN108712911A (zh) 2015-12-30 2018-10-26 科达制药股份有限公司 抗体及其缀合物
GB201617622D0 (en) * 2016-10-18 2016-11-30 VIB VZW and Universiteit Gent Means and methods to treat inflammation
RU2625010C1 (ru) * 2016-11-10 2017-07-11 Илья Петрович Приколаб Экспрессионный плазмидный вектор для экспрессии активной формы TNFR1-Fc и способ получения рекомбинантного белка
CN110177875B (zh) 2016-11-28 2023-11-28 中外制药株式会社 包含抗原结合结构域和运送部分的多肽
UY37651A (es) * 2017-03-31 2018-10-31 Swedish Orphan Biovitrum Ab Publ Polipéptido de unión al il-1r-i
US11326156B2 (en) * 2017-11-01 2022-05-10 Allogene Therapeutics, Inc. Modified caspase-9 polypeptides and methods of use thereof
WO2019230866A1 (en) * 2018-05-30 2019-12-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Polypeptide comprising il-1r1 binding domain and carrying moiety
ES2903440T3 (es) * 2018-09-13 2022-04-01 Euroimmun Medizinische Labordiagnostika Ag Procedimiento y dispositivo para registrar y visualizar una imagen de inmunofluorescencia de una muestra biológica
WO2020084032A1 (en) * 2018-10-25 2020-04-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Modification of antibody fcrn binding
CN111454366B (zh) * 2019-01-21 2023-06-16 中国科学院深圳先进技术研究院 一种融合蛋白及其应用
WO2020158857A1 (ja) * 2019-01-31 2020-08-06 積水メディカル株式会社 生物学的試料中の遊離ａｉｍの免疫学的分析方法及び測定キット
US11912784B2 (en) 2019-10-10 2024-02-27 Kodiak Sciences Inc. Methods of treating an eye disorder
CA3193273A1 (en) 2020-08-27 2022-03-03 Enosi Therapeutics Corporation Methods and compositions to treat autoimmune diseases and cancer
WO2022117569A1 (en) 2020-12-02 2022-06-09 Oncurious Nv A ccr8 antagonist antibody in combination with a lymphotoxin beta receptor agonist antibody in therapy against cancer
CN115181751A (zh) * 2021-04-02 2022-10-14 苏州博腾生物制药有限公司 靶向白蛋白的嵌合抗原受体及其使用方法
CN114657162B (zh) * 2022-03-04 2023-06-16 华南理工大学 一种具有血管内皮细胞保护功能的抗氧化五肽及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004058820A2 (en) * 2002-12-27 2004-07-15 Domantis Limited Single-domain-effector group and its uses
WO2006059108A2 (en) * 2004-12-02 2006-06-08 Domantis Limited ANTI-IL-IRl SINGLE DOMAIN ANTIBODIES AND THERAPEUTIC USES
WO2007063311A2 (en) * 2005-12-01 2007-06-07 Domantis Limited Competitive domain antibody formats that bind interleukin 1 receptor type 1
WO2007063308A2 (en) * 2005-12-01 2007-06-07 Domantis Limited Noncompetitive domain antibody formats that bind interleukin 1 receptor type 1

Family Cites Families (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2148299B (en) * 1983-09-01 1988-01-06 Hybritech Inc Antibody compositions of therapeutic agents having an extended serum half-life
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
GB8725529D0 (en) 1987-10-30 1987-12-02 Delta Biotechnology Ltd Polypeptides
JP3095168B2 (ja) 1988-02-05 2000-10-03 エル． モリソン，シェリー ドメイン‐変性不変部を有する抗体
ATE151110T1 (de) 1988-09-02 1997-04-15 Protein Eng Corp Herstellung und auswahl von rekombinantproteinen mit verschiedenen bindestellen
ES2052027T5 (es) 1988-11-11 2005-04-16 Medical Research Council Clonacion de secuencias de dominio variable de inmunoglobulina.
ATE92107T1 (de) 1989-04-29 1993-08-15 Delta Biotechnology Ltd N-terminale fragmente von menschliches serumalbumin enthaltenden fusionsproteinen.
CA2016842A1 (en) 1989-05-16 1990-11-16 Richard A. Lerner Method for tapping the immunological repertoire
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5977307A (en) 1989-09-07 1999-11-02 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific ligand-neuropharmaceutical agent fusion proteins
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
WO1992020791A1 (en) 1990-07-10 1992-11-26 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
WO1992003918A1 (en) 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ES2155822T3 (es) 1990-12-06 2001-06-01 Affymetrix Inc Compuestos y su utilizacion en una estrategia de sintesis binaria.
ATE275198T1 (de) 1991-12-02 2004-09-15 Medical Res Council Herstellung von antikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken.
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
JPH08511420A (ja) 1993-06-16 1996-12-03 セルテック・セラピューテイクス・リミテッド 抗 体
US5702892A (en) 1995-05-09 1997-12-30 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Phage-display of immunoglobulin heavy chain libraries
CA2229043C (en) 1995-08-18 2016-06-07 Morphosys Gesellschaft Fur Proteinoptimierung Mbh Protein/(poly)peptide libraries
DK0929578T3 (da) * 1996-02-09 2003-08-25 Abbott Lab Bermuda Ltd Humane antistoffer, der binder human TNFalfa
DE69838521T2 (de) 1997-07-07 2008-05-21 Medical Research Council Methode zur Erhöhung der Konzentration von Nucleinsäuremolekülen
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
EP1078051B1 (en) 1998-05-13 2007-12-12 Domantis Limited Phage-display system for the selection of correctly folded proteins
IL127127A0 (en) 1998-11-18 1999-09-22 Peptor Ltd Small functional units of antibody heavy chain variable regions
GB2375112A (en) 2000-02-03 2002-11-06 Domantis Ltd Combinatorial protein domains
WO2001058953A2 (en) 2000-02-11 2001-08-16 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Identification of a domain in the tumor necrosis factor receptor family that mediates pre-ligand receptor assembly and function
US7164009B2 (en) * 2000-09-15 2007-01-16 Genentech, Inc. Pro9821 polypeptides
EP2027874B1 (en) 2000-11-28 2013-10-16 Medimmune, Inc. Methods of administering/dosing anti-rsv antibodies for prophylaxis and treatment
US20060073141A1 (en) * 2001-06-28 2006-04-06 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
EP1399484B1 (en) 2001-06-28 2010-08-11 Domantis Limited Dual-specific ligand and its use
GB0118689D0 (en) * 2001-08-01 2001-09-19 Psimedica Ltd Pharmaceutical formulation
AU2003210806A1 (en) 2002-03-05 2003-09-22 Eli Lilly And Company Heterologous g-csf fusion proteins
US7696320B2 (en) 2004-08-24 2010-04-13 Domantis Limited Ligands that have binding specificity for VEGF and/or EGFR and methods of use therefor
US20060002935A1 (en) * 2002-06-28 2006-01-05 Domantis Limited Tumor Necrosis Factor Receptor 1 antagonists and methods of use therefor
ATE328906T1 (de) * 2002-06-28 2006-06-15 Domantis Ltd Dual-specifische liganden mit erhöhter halbwertszeit
US20040115194A1 (en) 2002-09-06 2004-06-17 Yi Wang Method of treatment of asthma using antibodies to complement component C5
MXPA05002514A (es) 2002-09-06 2005-05-27 Amgen Inc Anticuerpo monoclonal anti-il-1r1 humano terapeutico.
WO2004041865A2 (en) 2002-11-08 2004-05-21 Ablynx N.V. Stabilized single domain antibodies
EP1578801A2 (en) 2002-12-27 2005-09-28 Domantis Limited Dual specific single domain antibodies specific for a ligand and for the receptor of the ligand
US20060104968A1 (en) * 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
CA2529819A1 (en) * 2003-06-30 2004-09-23 Domantis Limited Pegylated single domain antibodies
PL1729795T3 (pl) 2004-02-09 2016-08-31 Human Genome Sciences Inc Białka fuzyjne albuminy
PT1737962E (pt) 2004-03-24 2010-12-03 Domantis Ltd Sequência líder universal gas1
EP2311433A3 (en) * 2004-10-21 2011-08-10 Genentech, Inc. Method for treating intraocular neovascular diseases
GB0521621D0 (en) * 2005-10-24 2005-11-30 Domantis Ltd Tumor necrosis factor receptor 1 antagonists for treating respiratory diseases
HUE048024T2 (hu) 2006-08-10 2020-05-28 Roy C Levitt Anakinra bronchiolitis obliterans szindróma kezelésében való alkalmazásra
US20100129354A1 (en) * 2006-10-27 2010-05-27 Ablynx N.V. Intranasal delivery of polypeptides and proteins
JP2010528647A (ja) 2007-06-06 2010-08-26 ドマンティス リミテッド ポリペプチド、抗体可変ドメインおよびアンタゴニスト
KR20100018040A (ko) 2007-06-06 2010-02-16 도만티스 리미티드 프로테아제 내성 폴리펩티드를 선택하는 방법

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004058820A2 (en) * 2002-12-27 2004-07-15 Domantis Limited Single-domain-effector group and its uses
WO2006059108A2 (en) * 2004-12-02 2006-06-08 Domantis Limited ANTI-IL-IRl SINGLE DOMAIN ANTIBODIES AND THERAPEUTIC USES
WO2007063311A2 (en) * 2005-12-01 2007-06-07 Domantis Limited Competitive domain antibody formats that bind interleukin 1 receptor type 1
WO2007063308A2 (en) * 2005-12-01 2007-06-07 Domantis Limited Noncompetitive domain antibody formats that bind interleukin 1 receptor type 1

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HARMSEN M. M. ET AL.: "Selection and optimization of proteolytically stable llama single-domain antibody fragments for oral immunotherapy," APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY SEP 2006, vol. 72, no. 3, September 2006 (2006-09), pages 544-551, XP002510773, ISSN: 0175-7598, abstract *

Also Published As

Publication number Publication date
AR066847A1 (es) 2009-09-16
EA200901495A1 (ru) 2010-10-29
AR066848A1 (es) 2009-09-16
US8398979B2 (en) 2013-03-19
CL2008001674A1 (es) 2008-11-21
SI2162467T1 (sl) 2015-11-30
ZA200908470B (en) 2011-02-23
EA200901300A1 (ru) 2010-06-30
US20090148437A1 (en) 2009-06-11
EP2746290A2 (en) 2014-06-25
JP2010529841A (ja) 2010-09-02
US20120134982A1 (en) 2012-05-31
MA31403B1 (fr) 2010-05-03
EP2746291A2 (en) 2014-06-25
MX2009013138A (es) 2010-04-30
CR11194A (es) 2010-06-28
EP2162467A2 (en) 2010-03-17
EP2162467B1 (en) 2015-07-22
CO6251322A2 (es) 2011-02-21
MX2009012967A (es) 2010-04-01
MX2009013137A (es) 2010-04-30
CL2008001676A1 (es) 2008-11-21
BRPI0812795A2 (pt) 2014-12-02
AU2008259590A1 (en) 2008-12-11
WO2008149148A2 (en) 2008-12-11
BRPI0813899A2 (pt) 2019-09-24
CN101802004A (zh) 2010-08-11
TW200918088A (en) 2009-05-01
HK1138022A1 (en) 2010-08-13
US20100266616A1 (en) 2010-10-21
JP2010530220A (ja) 2010-09-09
CA2688433A1 (en) 2008-12-11
ES2546943T3 (es) 2015-09-30
PL2162467T3 (pl) 2015-12-31
WO2008149149A2 (en) 2008-12-11
KR20100040841A (ko) 2010-04-21
EA200901491A1 (ru) 2010-08-30
BRPI0812795B1 (pt) 2019-12-03
CA2688434A1 (en) 2008-12-11
CA2683823A1 (en) 2008-12-11
CA2688456A1 (en) 2008-12-11
JP2010530364A (ja) 2010-09-09
EA018723B1 (ru) 2013-10-30
SG182151A1 (en) 2012-07-30
PE20090322A1 (es) 2009-04-20
WO2008149150A3 (en) 2009-06-25
CN101883788A (zh) 2010-11-10
AU2008259514B2 (en) 2014-05-15
AR066850A1 (es) 2009-09-16
EP2746290B1 (en) 2019-08-14
WO2008149150A2 (en) 2008-12-11
NZ581372A (en) 2012-02-24
TW200911834A (en) 2009-03-16
CN104311663A (zh) 2015-01-28
CN101778865B (zh) 2016-11-09
CA2683791A1 (en) 2008-12-11
AU2008259515A1 (en) 2008-12-11
BRPI0812795C1 (pt) 2021-05-25
CN101778865A (zh) 2010-07-14
KR101604274B1 (ko) 2016-03-17
US20100247515A1 (en) 2010-09-30
KR20100021642A (ko) 2010-02-25
EA201100546A1 (ru) 2011-12-30
CO6251321A2 (es) 2011-02-21
CR11195A (es) 2010-05-24
EP2164867A2 (en) 2010-03-24
HRP20151024T1 (hr) 2015-11-06
CL2008001673A1 (es) 2008-11-21
IL201398A0 (en) 2010-05-31
CY1116762T1 (el) 2017-03-15
IL202204A0 (en) 2010-06-16
EP2162468A2 (en) 2010-03-17
CN104311663B (zh) 2018-11-02
EP2746291B1 (en) 2019-08-14
DK2162467T3 (en) 2015-08-24
MA31668B1 (fr) 2010-09-01
TW200911831A (en) 2009-03-16
DOP2009000268A (es) 2010-02-28
JP5325211B2 (ja) 2013-10-23
SG182141A1 (en) 2012-07-30
CA2688447C (en) 2016-11-08
PE20090323A1 (es) 2009-04-20
PT2162467E (pt) 2015-10-29
EP2746290A3 (en) 2014-09-10
MX2009013211A (es) 2010-04-09
PE20090763A1 (es) 2009-07-10
TW200911832A (en) 2009-03-16
US20110256122A1 (en) 2011-10-20
WO2008149149A3 (en) 2009-04-02
KR20100018040A (ko) 2010-02-16
BRPI0812268A2 (pt) 2019-09-10
TW200902551A (en) 2009-01-16
BRPI0812795B8 (pt) 2020-01-28
WO2008149148A3 (en) 2009-04-02
AU2008259514A1 (en) 2008-12-11
JP5444215B2 (ja) 2014-03-19
EP2746291A3 (en) 2014-09-03
KR20100041746A (ko) 2010-04-22
AU2008259516A1 (en) 2008-12-11
HUE025899T2 (en) 2016-05-30
CA2688447A1 (en) 2008-12-11
TW200907128A (en) 2009-02-16
EA200901494A1 (ru) 2010-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA018129B1 (ru) Полипептиды, вариабельные домены антитела и антагонисты
CN106573966B (zh) 用于治疗代谢异常的组合物和方法
US10066017B2 (en) Methods for treating chronic sinusitis with nasal polyps by administering an IL-4R antagonist
EA014106B1 (ru) Агенты, связывающиеся с мишенью в легочной ткани, для лечения респираторных заболеваний
EP3010539B1 (en) Methods for treating nasal polyposis by administering an il-4r antagonist
US20210309754A1 (en) Fusion Protein Containing BDNF
US20090191217A1 (en) Anti-IL-1R1 Single Domain Antibodies And Therapeutic Uses
IL240898A (en) Antibodies against a5c for the preparation of drugs for the treatment of related diseases cause an increase
CN102131827A (zh) 用于肺部传递给药的组合物
AU2015202864A1 (en) Fibronectin type III domain based scaffold compositions, methods and uses
JP6995844B2 (ja) アトピー性皮膚炎を治療するためのｉｌ－１３アンタゴニストの使用
US20140205611A1 (en) Monoclonal antibodies that bind to hgm-csf and medical compositions comprising same
CN101848935A (zh) 选择蛋白酶抗性多肽的方法
JP2010505435A (ja) 本質的にｐＨに非依存的に血清タンパク質に結合するアミノ酸配列、それを含む化合物、およびその使用
TW200804425A (en) Ligands that have binding specificity for EGFR and/or VEGF and methods of use therefor
JP2021054866A (ja) シグレック−８関連疾患を処置するための方法および組成物
JP2022502500A (ja) 補体因子ｄ阻害剤の形態
TW201829471A (zh) 包含bdnf之融合蛋白質
EA022898B1 (ru) Стабильные полипептиды, вариабельные домены антитела и антагонисты против tnfr1
JP2020501518A (ja) キメラタンパク質を用いたアレルギー疾患の治療
KR20240008231A (ko) 급성호흡곤란증후군의 치료 또는 예방 방법
US9546219B2 (en) Treatment of allergic diseases with recombinant antibodies
EP4375298A1 (en) Pharmaceutical composition of anti-angptl3 antibody or antigen binding fragment thereof and its application
JP2023532316A (ja) Ｃ５ａを特異的に認識する抗体およびその使用
KR20230123477A (ko) 급성 호흡곤란 증후군의 치료 또는 예방 방법

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): BY KZ RU