TW200911834A - Polypeptides, antibody variable domains & antagonists - Google Patents

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TW200911834A
TW200911834A TW097121265A TW97121265A TW200911834A TW 200911834 A TW200911834 A TW 200911834A TW 097121265 A TW097121265 A TW 097121265A TW 97121265 A TW97121265 A TW 97121265A TW 200911834 A TW200911834 A TW 200911834A
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antagonist
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protease
tnfr1
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Laurent Stephane Anne Therese Jespers
Malgorzata Pupecka
Ian Tomlinson
Carolyn Enever
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Domantis Ltd
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Description

200911834 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於蛋白酶抗性多肽、免疫球蛋白（抗體）單一 可變區域及包含其之抗腫瘤壞死因子l(anti-Tumor Necrosis Factor 1，TNFR1，p55，CD120a，P60，TNF 受 體超家族成員ΙΑ，TNFRSF1A)拮抗劑。本發明進一步係 關於包含該等抗TNFR1配位體之用途、調配物、組合物及 裝置。 ( 【先前技術】 多肽及肽已在多種應用中成為越來越重要之藥劑，包括 工業應用及作為醫藥劑、治療劑及診斷劑之用途。然而， 在諸如發炎狀態（例如，COPD)及癌症之特定生理狀態 中’組織、器官或動物中（例如’肺中、腫瘤中或腫瘤附 近）所存在之蛋白酶量會增加。該蛋白酶增加會導致内源 性蛋白質及投與以治療疾病之治療肽、多肽及蛋白貲加速 降解及鈍化。因此，一些具有活體内使用（例如，用於治 v 療、診斷或預防疾病）之潛力之藥劑僅具有有限的功效， 因為其由蛋白酶快速降解及失活。 蛋白酶抗性多肽提供數個優點。舉例而言，蛋白酶抗性 多肽在活體内保留活性比蛋白酶敏感劑時間長，且因此保 留功能歷時足以產生生物效應之時間。對選擇抗蛋白酶降 解且亦具有想要之生物活性之多肽的改良方法存在需要。 TNFR1 ^ 區及缺乏内在信號轉 TNFR 1為含有結合配位體之細胞外 131418.doc 200911834 導活性但可與信號轉導分子缔合之細胞内區域的橫跨膜受 體。TNFR1與結合TNF之複合物含有三個TNFR1鏈及三個 TNF鏈。（Banner等人，Ce", 73(3) 431-445 (1993)。）TNF 配位體以由三個TNFR1鏈結合之三聚體形式存在。（Id.) 三個TNFR1鏈在受體-配位體複合物中緊密叢集在一起， 且該叢集對TNFR1介導之信號轉導而言為必要的。實際 上，結合TNFR1之多價藥劑（諸如抗TNFR1抗體）可誘導 TNFR1叢集及不存在TNF下之信號轉導，且通常用作 TNFR1激動劑。（例如參見，Belka等人，五娜0, 14(6): 1 156-1 165 (1995) ; Mandik-Nayak 等人，·/· 167:1920-1928(2001)。）因此，結合TNFR1之多價藥劑通 常不為TNFR1之有效拮抗劑，即使其阻斷TNFa與TNFR1之 結合。 TNFR1之細胞外區包含13個胺基酸之胺基末端片段（SEQ ID NO:603(人類）之胺基酸 1-13 ; SEQ ID NO:604(小鼠）之 胺基酸1-13)、區域1(SEQ ID NO:603(人類）之胺基酸14-53;SEQIDNO:604(小鼠）之胺基酸14-53)、區域2(SEQID NO: 603(人類）之胺基酸54-97 ; SEQ ID NO:604(小鼠）之胺 基酸54-97)、區域3(SEQ ID NO: 603(人類）之胺基酸98-138; SEQ ID NO:604(小鼠）之胺基酸 98-138)及區域 4(SEQ ID NO:603(人類）之胺基酸 139-167 ; SEQ ID NO:604(小鼠） 之胺基酸139-167)，其後繼之以膜近端區（SEQ ID NO:603(人類）之胺基酸 168-182 ; SEQ ID NO: 604(小鼠）之 胺基酸 168-183)。（參見 Banner 等人，Ce// 73(3) 431-445 131418.doc 200911834 (1993)及 Loetscher 等人，Ce// 67(%) 351-359 (1990)。）區域 2及3與結合配位體（TNF0，TNFa)接觸。（Banner等人， Ce//，73(3) 431-445 (1993)。）TNFR1之細胞外區亦含有稱 為前配位體結合組合區域或PLAD區域之區（SEQ ID NO:603(人類）之胺基酸1-53 ; SEQ ID NO:604(小鼠）之胺基 酸 1-53)(美國政府之 WO 01/58953 ; Deng 等人，TVa/wre doi: 10.1038/nml304 (2005)) ° TNFR1在活體内經由包括蛋白水解存於區域4或膜近端 f 區（SEQ ID NO:603 之胺基酸 168-182 ; SEQ ID NO:604 之胺 基酸168-1 83)中之TNFR1而產生可溶性TNFR1形式之過程 自細胞表面排出。可溶性TNFR1保留結合TNFa之能力， 且從而充當TNFa活性之内源性抑制劑。 【發明内容】 在一態樣中，本發明提供一種多肽，其包含與DOMlh-13 1-206之胺基酸序列（展示於圖3中）至少93%—致之胺基 酸序列。在一實施例中，一致性％為至少94、95、96、 I 97、98或99%。在一實施例中，該多肽為DOMlh-131-206。本發明進一步提供一種（大體上）純DOMlh-13 1-206單 體。在一實施例中，DOMlh-131-206為至少98、99、 99.5%純或100%純之單體。 在一態樣中，本發明提供一種多肽，其係由與D0M1 la-13 1-206之核苷 酸序列 之核苷 酸序列 （展 示於圖 19 中）至少 80% —致之胺基酸序列編碼。在一實施例中，一致性％為 至少 70、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98 131418.doc 200911834 或 99%。 在一態樣中’本發明提供一種多肽，其係由與D〇Mlh-13 1-206之核苷酸序列（展示於圖19中）至少57%—致之核苷 酸序列編碼且其中該多肽包含與D〇Mlh-131-206之胺基酸 序列（展示於圖3中）至少93% —致之胺基酸序列。在一實施 例中，核苷酸序列之一致性〇/0為至少6〇、65、70、75、 80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98 或 990/〇。 在一實施例中，胺基酸序列之一致性％為至少94、95、 ( 96、97、98或99%或100%。舉例而言，核苷酸序列可為 DOMlh-13 1-206之核苷酸序列（展示於圖19中）之密碼子優 化形式。此項技術中已知序列之密碼子優化。在一實施例 中，核苷酸序列係經優化從而表現於細菌（例如，大腸桿 菌（£. co")或假單胞菌屬，例如螢光假單胞 菌（P. //woreae似））、哺乳動物（例如，CH〇)或酵母宿主細 胞（例如，酵母屬或植酵母屬（以例 如馬斯德畢赤酵母（P.户似⑺…）或釀酒酵母（5< 、中。 在一恝樣中，本發明提供一種包含本發明之多肽之融合 蛋白。 在恕樣中，本發明提供一種抗TNFot受體1型（TNFR1 ; P55)免疫球蛋白單一可變區域，其包含與D〇Mlh_131_2〇6 之胺基酸序列（展示於圖3中）至少93%一致之胺基酸序列。 在貝施例中’ 一致性％為至少94、95、96、97、98或 99%。 131418.doc •9- 200911834 在一態樣中’本發明提供一種蛋白酶抗性抗TNFa受體1 型（TNFR1 ; p55)免疫球蛋白單一可變區域，其包含與 DOMlh-1 31-206之胺基酸序列至少90% —致之胺基酸序 列。在該等態樣之一實施例中，一致性％為至少8 〇、8 5、 90、 91、92 ' 93、94、95、96 ' 97、98 或 99% 〇 在一實施例中’免疫球蛋白單一可變區域在位置5 3處包 含天冬fe酸’其中編號係根據Kabat(”Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services 1991)。 在一實施例中’免疫球蛋白單一可變區域在位置91處包 含組胺酸，其中編號係根據Kabat。 在一態樣中，本發明提供一種抗TNFa受體1型（TNFR1 ; p55)免疫球蛋白單一可變區域，其包含與D〇Mlh-131-206 之胺基酸序列一致之胺基酸序列。 在一態樣中，本發明提供一種抗TNFa受體1型（TNFR 1 ; P55)免疫球蛋白單一可變區域，其係由與D〇Mih-131-206 之核苷酸序列（展示於圖丨9中）至少80% —致之核苷酸序列 編碼。在一實施例中’ 一致性％為至少70、80、85、90、 91、 92、93、94、95、96、97、98 或 99%。 在一悲樣中’本發明提供一種抗TNFa受體1型（TNFR 1 ; P55)免疫球蛋白單一可變區域，其係由與D〇Mlh_131_2〇6 之核苷酸序列（展示於圖19中）至少57%一致之核苷酸序列 編碼且其中該可變區域包含與D〇N1lh-131-206之胺基酸序 列（展示於圖3中）至少93%—致之胺基酸序列。在一實施例 131418.doc -10- 200911834 中，核苷酸序列之一致性％為至少60、65、70、75、8〇、 85、90、91、92、93 ' 94、95、96、97、98 或 99%。在— 實施例中，胺基酸序列之一致性％為至少94、95、96、 97、98或99%或100%。舉例而言，核苷酸序列可為 DOMlh-131-206之核苷酸序列（展示於圖19中）之密碼子優 化形式。此項技術中已知序列之密碼子優化。在一實施例 中，核苷酸序列係經優化從而表現於細菌（例如，大腸桿 菌或假單胞菌屬，例如螢光假單胞菌）、哺乳動物（例如， CHO)或酵母宿主細胞（例如，酵母屬或植酵母屬，例如馬 斯德畢赤酵母或釀酒酵母）中。 在一態樣中，本發明提供一種抗TNFa受體】型（TNFRi ; P55)免疫球蛋白單一可變區域，其係由與1)〇]^11^131_2% 之核苷酸序列（展示於圖19中）一致之序列編碼。 在先、樣中，本發明提供一種TNFa受體1型（TNFR1 ; p55)拮抗劑’其包含本發明之抗TNFR1免疫球蛋白單一可 變區域。在一實施例中，該拮抗劑包含第一及第二免疫球 蛋白單一可變區域，其中各可變區域係根據本發明。舉例 而言，其中該拮抗劑包含該單一可變區域之單體或該單一 可變區域之同元二聚體。在一實施例中，該單一可變區域 或各單一可變區域之胺基酸序列係與DOMlh-1 31-206之胺 基酸序列（展示於圖3中）一致。 在也樣中，本發明提供一種抗TNFa受體1型（TNFR1 ; P5 5)免疫球蛋白單—可變區域其包含與⑴⑶挪 之胺基I序列（展τ於圖3中）—纟或在不超過25個胺基酸位 I3I4I8.doc 200911834 置處與DOMlh-131-206之胺基酸序列不同且具有與 DOMlh-13 1-206之CDR1序列至少50% —致之CDR1序列的 胺基酸序列。在一實施例中，不同之處不超過24、23、 22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、 10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸位置。在一實 施例中，CDR序列一致性為至少55、60、65、70、75、 80、85、90、95、96、97、98 或 99%。 在一態樣中，本發明提供一種抗TNFa受體1型（TNFR1 ; p55)免疫球蛋白單一可變區域，其包含與D〇Mlh-131-206 之胺基酸序列（展示於圖3中）一致或在不超過25個胺基酸位 置處與DOMlh-13 1-206之胺基酸序列不同且具有與 DOMlh-13 1-206之CDR2序列至少50% —致之CDR2序列的 胺基酸序列。在一實施例中，不同之處不超過24、23、 22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、 10、9、8、7、0、5、4、3、2或1個胺基酸位置。在一實 施例中’ CDR序列一致性為至少55、60、65、70、75 ' 80、85、90、95、96、97、98 或 99〇/〇。 在一態樣中’本發明提供一種抗TNFa受體1型（TNFR1 ; p55)免疫球蛋白單一可變區域，其包含與D〇Mih-131-206 之胺基酸序列（展示於圖3中）一致或在不超過25個胺基酸位 置處與DOMlh-131-206之胺基酸序列不同且具有與 DOMlh-13i_206之⑶以序列至少5〇%一致之CDR3序列的 胺基酸序列。在一實施例中，不同之處不超過24、23、 22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、 131418.doc -12- 200911834 、、、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸位置。在一實 施例中’ CDR序列一致性為至少55、60、65、70、75、 80、85、90、95、96、97、98 或 990/〇。 在一態樣中，本發明提供一種抗TNFa受體_(TNFR1 ; p55)免疫球蛋白單一可變區域，其包含與D〇Mlhl31_2〇6 之妝基酸序列（展示於圖3中）一致或在不超過25個胺基酸位 置處與DOMlh-131-206之胺基酸序列不同且具有與 DOMlh-13 1-206之CDR1序列至少50%—致之CDR1序列且 具有與DOM 1 h-1 3 1 -206之CDR2序列至少50% —致之CDR2 序列的胺基酸序列。在一實施例中，不同之處不超過Μ、 23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、 11、10、9、8、7、6、5' 4、3、2或1個胺基酸位置。在 一實施例中，一或兩個CDR序列一致性分別為至少55、 60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98 或 99%。 在一知、樣中’本發明提供一種抗TNFa受體1型（TNFR1 ; p55)免疫球蛋白單一可變區域，其包含與D〇Mih-131-206 之胺基酸序列（展示於圖3中）一致或在不超過25個胺基酸位 置處與DOMlh-131-206之胺基酸序列不同且具有與 DOMlh-131-206之CDR1序列至少50%—致之CDR1序列且 具有與DOMlh-131-206之CDR3序列至少50%—致之CDR3 序列的胺基酸序列。在一實施例中，不同之處不超過24、 23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、 11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸位置。在 一實施例中，一或兩個CDR序列一致性分別為至少55、 131418.doc -13- 200911834 60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98 或 99〇/〇。 在一態樣中’本發明提供一種抗TNFa受體1型（TNFR1 ; p55)免疫球蛋白單一可變區域，其包含與D〇Mih-131-206 之胺基酸序列（展示於圖3中）一致或在不超過25個胺基酸位 置處與DOMlh-13 1-206之胺基酸序列不同且具有與 DOMlh-131-206之CDR2序列至少50°/。一致之CDR2序列且 具有與DOMlh-131-206之CDR3序列至少50%—致之CDR3 序列的胺基酸序列。在一實施例中，不同之處不超過24、 23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、 11、10、9、8'7、6、5、4、3、2或1個胺基酸位置。在 一實施例中’一或兩個CDR序列一致性分別為至少55、 60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98 或 99% 〇 在一怨樣中’本發明提供一種抗TNFa受體1型（TNFR1 ; p55)免疫球蛋白單一可變區域’其包含與D〇Mlh-131-206 之胺基酸序列（展示於圖3中）一致或在不超過25個胺基酸位 置處與DOMlh-131-206之胺基酸序列不同且具有與 DOMlh-131-206之CDR1序列至少50%—致之CDR1序列且 具有與〇〇]\4111-131-206之€〇尺2序列至少50%—致之匸〇112 序列具有與DOMlh-131-206之CDR3序列至少50%_致之 CDR3序列的胺基酸序列。在一實施例中，在一實施例 中’不同之處不超過 24、23、22、21、20、19、18、17、 16、 15、 14、 13、 12、 11、 1〇、 9、 8、 7、 6、 5、 4、 3、 2 或1個胺基酸位置。在一實施例中，一或兩個或各CDR序 列一致性分別為至少 55、60、65、70、75、80、85、90、 131418.doc • 14- 200911834 95、96、97、98 或 990/〇。 在一態樣中，本發明提供一種TNFa受體1型（TNFR1 ; p55)括抗知1] ’其具有與DOMlh-131-206(展示於圖3中）之 CDR1序列至少50% —致之CDR1序列。在一實施例中， CDR 序列一致性為至少 55、60、65、70、75、80、85、 90、95、96、97、98或99%。該拮抗劑可（例如）在—組如 本文中所述之條件下對蛋白酶（例如一或多種如本文中所 述之蛋白酶）具有抗性。 (、 在一態樣中’本發明提供一種TNFtx受體1型（TNFR1 ; p55)拮抗劑’其具有與DOMlh-131-206(展示於圖3中）之 CDR1序列至少50% —致之CDR2序列。在一實施例中， CDR序列一致性為至少 55、60、65、70、75、80、85、 90、95、96、97、98或99%。該拮抗劑可（例如）在一組如 本文中所述之條件下對蛋白酶（例如一或多種如本文中所 述之蛋白酶）具有抗性。 在一態樣中，本發明提供一種TNFa受體1型（TNFR1 ; I p55)拮抗劑，其具有與DOMlh-131-206(展示於圖3中）之 CDR1序列至少50% —致之CDR3序列。在一實施例中， CDR序列一致性為至少 55、60、65、70、75、80、85、 90、95、96、97、98或99%。該拮抗劑可（例如）在一組如 本文中所述之條件下對蛋白酶（例如一或多種如本文中所 述之蛋白酶）具有抗性。 在一態樣中，本發明提供一種TNFct受體1型（TNFR1 ; p55)拮抗劑’其具有與D〇Mlh-131-206(展示於圖3中）之 131418.doc •15- 200911834 CDR1序列至少50%—致之CDR1序列及與DOMlh-131-206 之CDR2序歹ij至少50%—致之CDR2序列。在一實施例中， 一或兩個CDR之CDR序列一致性分別為至少55、60、65、 70、75、80、85、90、95、96、97、98 或 99%。該拮抗劑 可（例如）在一組如本文中所述之條件下對蛋白酶（例如一或 多種如本文中所述之蛋白酶）具有抗性。 在一態樣中，本發明提供一種TNFa受體1型（TNFR1 ; p55)拮抗劑，其具有與DOMlh-131-206(展示於圖3中）之 ( CDR1序列至少50%—致之CDR1序列及與DOMlh-131-206 之CDR3序列至少50% —致之CDR3序列。在一實施例中， 一或兩個CDR之CDR序列一致性分別為至少55、60、65、 70、75、80、85、90、95、96、97、98 或 99%。該拮抗劑 可（例如）在一組如本文中所述之條件下對蛋白酶（例如一或 多種如本文中所述之蛋白酶）具有抗性。 在一態樣中，本發明提供一種TNFa受體1型（TNFR1 ; p55)拮抗劑，其具有與DOMlh-131-206(展示於圖3中）之 I CDR2序歹>]至少50%—致之CDR2序列及與DOMlh-131-206 之CDR3序列至少50% —致之CDR3序列。在一實施例中， 一或兩個CDR之CDR序列一致性分別為至少55、60、65、 70、75、80、85、90、95、96、97、98 或99%。該拮抗劑 可（例如）在一組如本文中所述之條件下對蛋白酶（例如一或 多種如本文中所述之蛋白酶）具有抗性。 在一態樣中，本發明提供一種TNFa受體1型（TNFR1 ; p55)拮抗劑，其具有與DOMlh-131-206(展示於圖3中）之 131418.doc •16- 200911834 CDR1序列至少50%—致之CDR1序列及與DOMlh-131-206 之CDR2序列至少50%—致之CDR2序列及與DOMlh-131-206之CDR3序列至少50%—致之CDR3序列。在一實施例 中，一或兩個或各CDR之CDR序列一致性分別為至少55、 60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98 或 99% ° 該拮抗劑可（例如）在一組如本文中所述之條件下對蛋白酶 (例如一或多種如本文中所述之蛋白酶）具有抗性。 在一態樣中，本發明提供一種TNFa受體1型（TNFR1 ; f p 5 5 )结抗劑，其包含免疫球蛋白單一可變區域，該免疫球 蛋白單一可變區域包含DOMlh-1 3 1-206(展示於圖3中）之 CDR1、CDR2 及 / 或 CDR3(例如，CDR1、CDR2、CDR3、 CDR1 及 CDR2、CDR1 及 CDR3、CDR2 及 CDR3 或 CDR1、 CDR2及CDR3)之序列。該拮抗劑可（例如）在一組如本文中 所述之條件下對蛋白酶（例如一或多種如本文中所述之蛋 白酶）具有抗性。 在一態樣中，本發明提供一種TNFa受體1型（TNFR1 ; I p55)拮抗劑，其與DOMlh-13 1-51 1-206競爭以結合 TNFR1。因此，該拮抗劑可結合與DOMlh-131-206相同之 抗原決定基或重疊抗原決定基。在一實施例中，該拮抗劑 包含具有與DOMlh-131-206之胺基酸序歹(展示於圖3中）至 少93°/。一致之胺基酸序列的免疫球蛋白單一可變區域。在 一實施例中，一致性％為至少94、95、96、97、98或 99%。該拮抗劑可（例如）在一組如本文中所述之條件下對 蛋白酶（例如一或多種如本文中所述之蛋白酶）具有抗性。 131418.doc -17- 200911834 在一實施例中，拮抗劑為對TNFR1具有結合特異性之抗體 或其抗原結合片段，諸如單價抗原結合片段（例如， scFv、Fab、Fab'、dAb)。括抗劑之其他實例為本文中所述 之結合TNFR1之配位體。該等配位體可包含合適格式之對 TNFR1具有結合特異性之免疫球蛋白單一可變區域或區域 抗體（dAb)或該dAb之互補判定區。在一些實施例中，配位 體為基本上由對TNFR1具有結合特異性之免疫球蛋白單一 可變區域或dAb組成或由其組成之dAb單體。在其他實施 f 例中，配位體為包含合適格式（諸如抗體格式）之dAb(或 dAb之CDR)的多肽。 雖然本發明之TNFR1之一些拮抗劑不抑制TNFa與 TNFR1之結合，但抑制TNFR1介導之信號轉導。舉例而 言，TNFR1之拮抗劑可抑制TNFR1之信號轉導之前的TNFa 誘導之TNFR1叢集。該等拮抗劑提供數個優點。舉例而 言，在存在該拮抗劑下，雖然TNFa可結合表現於細胞表 面上之TNFR1且可自細胞環境移除，但不激活TNFR1介導 、 之信號轉導。因此，TNFR1信號誘導之其他TNFa及發炎 之其他調節劑的產生將被抑制。類似地，結合TNFR1且抑 制TNFR1介導之信號轉導但不抑制TNFa與TNFR1之結合的 TNFR1拮抗劑將不抑制内源性產生之可溶性TNFR1之TNFa 結合及抑制活性。因此，向有需要之哺乳動物投與該拮抗 劑可補充抑制活體内TNFa活性及TNFR1活性之内源性調 控通路。本發明亦係關於（i)結合TNFR1(例如，在區域1 中），（Π)拮抗TNFR1介導之信號轉導之激活及（iii)不抑制 131418.doc -18- 200911834 TNFa與TNFR1之結合 賵邊配位體結合可溶性 R1且不阻止可溶性受體結合TNFa，且因此向 之哺乳動物投與該拮抗劑可藉由増加可溶性受體在血清中 之期補充抑制活體内TNFa活性之内源性調控通路。 邊等優點尤其與已(例如)藉由連接PEG基團、血清白蛋 :、轉鐵蛋白、轉鐵蛋白受體或至少其轉鐵蛋白結合部 刀抗體Fc區或藉由接合抗體區域來編排格式以具有較大 流體動力學尺寸之配位體有關。舉例而言，⑴結合 /. TNFR1(例如’在區域丨中），⑻拮抗tnfri介導之信號& 導之激活及（iii)不抑制TNFc^TNFR1(諸如，dAb單體）之 結合的藥劑(例如’多肽、可變區域或拮抗劑)可經編排格 式為抗體之較大抗原結合片@或抗體（例如，經編排格式 為 Fab、Fab’、F(ab)2、F(abi)2、IgG、scFv)。如本文中所 述，亦可藉由使TNFR1結合劑（拮抗劑、可變區域）與結合 增加活體内半衰期之抗原或抗原決定基的結合區域（= 如，抗體或抗體片段）接合或連接來增加配位體之流體動 力學尺寸及其血清半衰期（參見，w〇 2〇〇6〇38〇27之附錄 1，其整體係以引用之方式併入本文中）。舉例而言，可使 TNFR1結合劑（例如，多肽）與抗血清白蛋白或抗新生兒Fc 受體抗體或抗體片段（例如，抗SA或抗新生兒Fc受體 dAb、Fab、Fab’或scFv)或抗SA親和體（affibody)或抗新生 兒Fc受體親和體接合或連接。 用於本發明之TNF R1結合配位體之合適白蛋白、白蛋白 片4又或白蛋白變異體的實例係描述於WO 2005/077042A2 及WO 200603 8027中，其整體係以引用之方式併入本文 131418.doc -19- 200911834 中。 在貫穿該揭示内容所述之本發明之其他實施例中，代替 在本發月之拮抗劑或配位體中使用"，涵蓋熟練的使 用者（addressee)可使用的區域包含結合tnfri之dAb之 ^ (例如，接枝於合適蛋白質骨架或骨幹上之CDR，該 骨架或骨幹例如親和體、SpA骨架、咖受體A類區域或 卿區域）或可為包含™FR1結合位點之蛋白質區域（其中 :區域係、自親和體、SpA區域、ldl受體A類區域或五仍 區域）。因此，揭示内容整體應解釋為提供使用該等區域 代替dAb之拮抗劑、配位體及方法之揭示内容。 一本發明之多肽、免疫球蛋白單一可變區域及拮抗劑可抗 或多種以下蛋白酶：絲胺酸蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、 天冬胺酸蛋白酶 '硫醇蛋白酶、基質金屬蛋白酶、幾基肽 扭（例如，縣肽酶A、縣肽酶B)、姨蛋白酶、胰凝乳蛋 二、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、彈性蛋白酶、白血球酶 i eu 〇zyme)、胰酶 '凝血酶、纖溶酶、組織蛋白 ::蛋白酶G)、蛋白酶(例如，蛋白酶卜蛋白酶2、= )、嗜熱菌蛋白酶 '凝乳酶、腸肽酶、卡斯蛋白酶 (caspase)(例如卡斯蛋白醢 4 L 蛋白轉1卡斯蛋白酶2、卡斯蛋白 4、卡斯蛋白酶5、卡斯番白紘〇上 姆 .^ 卞斯蛋白轉9、卡斯蛋白酶12、卡斯| 白酶13)、鈣激活蛋白益 蛋 …化呆蛋白酶（ficain)、梭菌1 每、獼猴桃蛋白酶、、 . 鳳糸蛋白駟及分離酶。在特定眘始 ，蛋白酶為胰蛋白酶、彈 給 資白酶或白血球每。| 軸亦可由生物提取物、生物租磁畔蛋白 生物，.且織勻漿或生物製劑提供。在 131418.doc •20- 200911834 f i -實施例中…酶為可見於一或多種以下各物中之蛋白 酶：瘦、黏液（例如胃黏液、鼻黏液、支氣管黏液）、支氣 管肺泡灌洗液、肺組織H肺提取物、騰腺提取物、胃 液、唾液或眼淚。在-實施例巾，蛋自酶為眼睛及/或眼 淚：可見之蛋白酶。在-實施例中，$白酶為非細菌性蛋 白酶在實施例中’蛋白酶為動物，例如哺乳動物，例 如人類蛋白酶。在一實施例中，}白酶為胃腸道蛋白酶或 肺組織蛋白酶，例如人類中可見之胃腸道蛋白酶或肺組織 蛋白酶。此處所列之該蛋白酶亦可用於本文中所述之包括 將庫之譜系暴露於蛋白酶中之方法中。 在一態樣中，本發明提供一種包含TNFa受體i型 (TNFR1，P55)結合位點之蛋白酶抗性免疫球蛋白單一可變 區域，其中該可變區域在以下情況下對蛋白酶（例如胰蛋 白酶）具有抗性： ⑴在37°C下與至少1〇微克/毫升之濃度（c)之蛋白酶一起 培養至少1小時之時間（t);或 (ii)在3 0°C下與至少40微克/毫升之濃度之蛋白酶一起 培養至少1小時之時間（t)，其中該可變區域包含與D〇M j h_ 13 1-206之胺基酸序列（展示於圖3中）至少90%—致之胺基 酸序列。在一實施例中’蛋白酶（例如姨蛋白酶）與可變區 域之比率（以莫耳/莫耳計）為8,000比80,000蛋白酶：可變區 域，例如當C為10微克/毫升時，比率為800比80,000蛋白 酶：可變區域；或當C或C'為1〇〇微克/毫升時，比率為 8,000比80,000蛋白酶：可變區域。在一實施例中，蛋白酶 131418.doc 200911834 (例如胰蛋白酶)與可變區域之比率(以重量/重量、例如微 克/微克計）為16，_比16〇，_蛋白酶：可變區域，例如當 C為H)微克/毫升時，比率為以⑼比⑽，〇〇〇蛋白酶：可: 區域；或當C或C為⑽微克/毫升時，比率為比 16〇，_蛋白酶：可變區域。在-實施例中，濃度(c或c，)為 100或1_微克/毫升蛋白酶。在—實施例中，濃度（C =)為至少100或1〇〇()微克/毫升蛋白酶。當與肽或多肽之 曰系或庫起作用時，參考本文中之適於所使用之蛋白酶 蛋白水解性之條件的描述（例如，w/w參數）。該等條件 了供敎特定免疫球蛋白單—可變區域之蛋白酶抗性之條 t用。在—實施例中，日寺間⑴為或約為1、3或24小時或 =(例如’約12_16小時）。在一實施例中，該可變區域在 “ 4⑴下具抗性且濃度卜）為或約為1〇或1〇〇微克/毫升蛋白 酶且時間⑴為！小時。在__實施例中’該可變區域在條件 …)下具抗性且濃度(c，)為或約為4〇微克 (:)為或約為叫在一實施例巾，該蛋白酶係選自^ 酶、彈性蛋白酶、白血球酶及胰酶^在—實施例中，該 ，白酶為胰蛋白酶。在一實施例中，蛋白酶為可見於一或 :種以下各物中之蛋白酶：瘦、黏液(例如胃黏液、鼻黏 =、支氣管黏液）、支氣管肺泡灌洗液、肺組織勻渡、肺 中取物、胰腺提取物、胃液、唾液或眼淚。在一實施例 歹，蛋白酶為眼睛及/或眼淚中可見之蛋白酶。在一實施 ，蛋白酶為非細菌性蛋白酶。在—實施例中，蛋白酶 .、、、物，例如哺乳動物，例如人類蛋白酶。在一實施例 131418.doc -22- 200911834 中，蛋白酶為胃腸道蛋白酶或肺組織蛋白酶，例如人類中 可見之胃腸道蛋白酶或肺組織蛋白酶。此處所列之該蛋白 酶亦可用於本文中所述之包括將庫之譜系暴露於蛋白酶中 之方法中。 在一實施例中，該可變區域對胰蛋白酶及/或至少—種 選自彈性蛋白酶、白血球酶及胰酶之其他蛋白酶具有抗 性。舉例而言，抗性係針對胰蛋白酶及彈性蛋白酶；騰蛋 白酶及白企球酶；騰蛋白酶及騰酶；胰蛋白酶、彈性蛋白 ( 酶及白血球酶；胰蛋白酶、彈性蛋白酶及胰酶；胰蛋白 每、彈性蛋白轉、膜及白血球酶；或膜蛋白酶、胰酶及 白血球酶。 在一實施例中，可變區域當在條件⑴或（ii)下培養時（例 如）以106至1013、例如1〇8至1〇12個複製單位（傳染性病毒體） 之噬菌體庫規模呈現於噬菌體上。 在一實施例中，該可變區域在條件（i)或（ii)下培養後特 異性結合TNFR1 ’例如，使用BiaC〇reTM或Eus A(例如’ < 喔菌體ELISA或單株噬菌體ELISA)評估。 在一實施例中，本發明之可變區域特異性結合蛋白質A 或蛋白質L。在一實施例中，在條件⑴或⑴）下培養後，出 現與蛋白質A或L之特異性結合。 在-實施例中，本發明之可變區域（例如）在條件⑴或⑼ 下培養後在ELISA(例如嗔菌體EUSA或單株噬菌體 中可具有至少0.404之〇D450讀數。 在-實施例中，本發明之可變區域（例如）在條件⑴或⑼ 131418.doc -23· 200911834 下培養後在凝膠電泳中展現（大體上）單一條帶。 在某些實施例中，本發明提供一種TNFR1拮抗劑，其為 包含結合TNFR1之本發明之第一 dAb及具有與第一 dAb相 同或不同結合特異性之第二dAb的雙特異性配位體。第二 dAb可結合選自以下之靶：ApoE、Apo-SAA、BDNF、心 營養素-1、CEA、CD40、CD40 配位體、CD56、CD38、 CD138、EGF、EGF受體、ENA-78、嗜酸性粒細胞趨化因 子、嗜酸性粒細胞趨化因子-2、次級淋巴組織趨化因子 (Exodus)-2、FAPa、FGF-酸性、FGF-驗性、纖維母細胞生 長因子-10、FLT3配位體、弗拉塔凱（Fractalkine)(CX3C)、 GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-βΙ、人類血清白蛋白、胰 島素、IFN-γ、IGF-I、IGF-II、IL-la、IL-Ιβ、IL-1 受體、 IL-1 受體 1 型、1[-2、11^3、11^4、1[-5、1[-6、11^7、11^ 8(72 a.a.)、IL-8(77 a.a.)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、 IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18(IGIF)、抑制素 α、抑 制素β、IP-10、角化細胞生長因子-2(KGF-2)、KGF、瘦體 素、LIF、淋巴細胞趨化因子、穆勒氏抑制物質（Mullerian inhibitory substance)、單核細胞集落抑制因子、單核細胞 引誘蛋白、M-CSF、MDC(67 a.a.)、MDC(69 a.a.)、MCP-1 (MCAF) 、 MCP_2 、 MCP-3 、 MCP-4 、 MDC(67 a.a)、 MDC(69 a.a.)、MIG、MIP-la、ΜΙΡ-1β、MIP-3a、MIP_ 3β、MIP-4、骨髓祖細胞抑制劑因子-l(MPIF-l)、NAP-2、 神經營養因子、神經生長因子、β-NGF、NT-3、NT-4、制 瘤素 Μ、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、 131418.doc -24- 200911834 RANTES、SDFla、SDFlp、SCF、SCGF、幹細胞因子 (SCF)、TARC、TGF-a、TGF-β、TGF-P2、TGF-03、腫瘤 壞死因子（TNF)、TNF-a、TNF-β、TNF 受體 I、TNF 受體 II、TNIL-1、TPO、VEGF、VEGF A、VEGF B、VEGF C、VEGF D、VEGF 受體 1、VEGF 受體 2、VEGF 受體 3、 GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β、GRO-γ、HCC1、1-309、 HER 1、HER 2、HER 3、HER 4、血清白蛋白、vWF、殿 粉樣蛋白（例如，澱粉樣a)、MMP12、PDK1、IgE、IL-f 13Ral、IL-13Ra2、IL_15、IL-15R、IL-16、IL-17R、IL- 17、IL-18、IL-18R、IL-23IL-23R、IL-25、CD2、CD4、 CDlla、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、 CD40L、CD56、CD138、ALK5、EGFR、FcERl、TGFb、 CCL2、CCL18、CEA、CR8、CTGF、CXCL12(SDF-1)、凝 乳酶、FGF、弗林蛋白酶（Furin)、内皮素-1、嗜酸性粒細 胞趨化因子（例如，嗜酸性粒細胞趨化因子、嗜酸性粒細 胞趨化因子-2、嗜酸性粒細胞趨化因子-3)、GM-CSF、 i ICAM-1、ICOS、IgE、IFNa、1-309、整合素、L-選擇 素、MIF、MIP4、MDC、MCP-1、MMP、嗜中性彈性蛋白 酶、骨橋蛋白、OX-40、PARC、PD-1、RANTES、SCF、 SDF-1、siglec8、TARC、TGFb、凝血酶、Tim-1、TNF、 TRANCE、類胰蛋白酶、VEGF、VLA-4、VCAM、α4β7、 CCR2 、 CCR3 、 CCR4 、 CCR5 、 CCR7 、 CCR8 、 ανβ6 、 ανβ8、cMET、CD8、vWF、澱粉樣蛋白（例如，澱粉樣 a)、MMP12、PDK1 及 IgE。 131418.doc -25- 200911834 在一實例中，雙特異性配位體包含結合TNFR1上之第一 抗原決定基之第一 dAb及結合不同靶上之抗原決定基之第 二dAb。在另一實例中，第二dAb結合血清白蛋白上之抗 原決定基。 在其他實施例中，該配位體為多特異性配位體，其包含 對TNFR1具有結合特異性之第一抗原決定基結合區域及具 有不同於第一抗原決定基結合區域之結合特異性之至少另 一抗原決定基結合區域。舉例而言，第一抗原決定基結合 區域可為結合TNFR1之dAb或可為包含結合TNFR1之dAb 之CDR(例如，接枝於合適蛋白質骨架或骨幹之CDR，該 骨架或骨幹例如親和體、SpA骨架、LDL受體A類區域或 EGF區域）的區域或可為結合TNFR1之區域，其中該區域係 選自親和體、SpA區域、LDL受體A類區域或EGF區域。 在某些實施例中，多肽、拮抗劑、配位體或抗TNFR1 dAb單體之特徵在於一或多個以下特徵：1)以如由表面電 漿共振所測定50 nM至20 pM之解離常數（Kd)及5x10」至 lxlO^s·1之Kw速率常數自人類TNFR1解離；2)以500 nM至 50 pM之IC50抑制腫瘤壞死因子cx(TNFa)與TNFR1之結合； 3)在標準L929細胞檢定中以500 nM至50 pM之ND50中和人 類TNFR1 ; 4)在標準細胞檢定中以$100 nM之ND5〇拮抗 TNFR1之活性，且在該檢定中，在$10 μΜ之濃度下，dAb 激動TNFR1之活性$5% ; 5)在小鼠LPS/D-半乳糖胺誘發之 敗血性休克模型中抑制死亡；6)抗聚集；7)當表現於大腸 桿菌或畢赤酵母屬物種（例如，馬斯德畢赤酵母）中時，以 131418.doc -26· 200911834 至夕約0.5 mg/L之量分泌；8)顯露可逆性；％在選自由小 鼠膠原誘發之關節炎模型、小鼠關節炎·Ε模型、小昧气 發火性腸疾病ΔΑΙΙΕ模型、小氣葡聚糖硫酸納誘發之發炎 性腸疾病拉型、小鼠慢性阻塞性肺病煙草煙霧模型及合適 靈長類動物杈型（例如’靈長類動物膠原誘發之關節炎模 型）組成之群之慢性發炎性疾病模型中具有功效；及_〇) 在冶療、抑止或預防慢性發炎性疾病中具有功效。關於適 用於條件（1)至（1 〇)之檢定及測試及參數之詳情，參考 f W〇 2006038027,且其以引用之方式併入本文中。〆 在特定實施例中，多肽、拮抗劑、配位體或dAb單體以 如由表面電漿共振所測定50 11河至2〇 pM之解離常數（Kd)及 5x10至1x10 s丨之〖。汀速率常數自人類TNFR1解離；以 500 nM至50 pM之IC50抑制腫瘤壞死因子a(TNFa)與 TNFR1之結合；在標準L929細胞檢定中以5〇〇 11河至5〇 pM 之ND50中和人類TNFRi。在其他特定實施例中，多肽、 拮抗劑、配位體或dAb單體以50 nM至20 PM之解離常數 "(Kd)及5Χ1(Γ1至1Χ10·7,之速率常數自人類TNFR1解 離，以500 nM至50 pM之IC50抑制腫瘤壞死因子a(TNFa) 與TNFR1之結合；在選自由小鼠膠原誘發之關節炎模型、 小鼠關節炎AARE模型、小鼠發炎性腸疾病δακε模型 '小 鼠葡聚糖硫酸納誘發之發炎性腸疾病模型、小鼠慢性阻塞 性肺病煙草煙霧模型及合適靈長類動物模型（例如，靈長 類動物膠原誘發之關節炎模型）組成之群之慢性發炎性疾 病模型中具有功效。在其他特定實施例中，多肽、抬抗 131418.doc -27- 200911834 劑、配位體或dAb單體以如由表面電藥共振所測定5〇碰 至20 PM之解離常數（Kd)及5xl(rl至之u速率常 數自人類TNFR1解離；在標準⑽細胞檢定中以5〇〇碰 至50州之则〇中和人類TNFR1 ;且在標準細胞檢定中以 训0 nM之ND50拮抗TNFR1之活性，且在該檢定巾在仙 μΜ之濃度下，dAb激動TNFR1之活性$5%。 本發明之蛋白酶抗性多肽、免疫球蛋白單—可變區域及 括抗劑H療、預防及診斷例如人類之哺乳動物之疾病或 病狀中具有效用。其尤其具有作為向諸如人類之患者投與 時很可能會遇到蛋白酶之藥物之基質的效用。舉例而言， 當向胃腸道投與（例如，經口、舌下、直腸投與）多肽、免 疫球蛋白單一可變區域及拮抗劑時，在此狀況下，其可能 會在上胃腸道、下胃腸道、口腔 '胃、小腸及大腸中之一 或多處受蛋白酶侵襲。因此，一個實施例提供—種待以經 口、舌下或直腸方式向患者之GI道投與以治療及/或預防 患者之疾病或病狀的蛋白酶抗性多肽、免疫球蛋白單一可 變區域或拮抗劑。舉例而言，經口向患者（例如，人類患 者）投與以治療及/或預防TNFa介導之病症或疾病，諸如關 節炎（例如，類風濕性關節炎）、IBD、牛皮癬或克羅恩氏 病（Crohn’s disease)。在另一實例中，當向肺組織（例如， 肺或氣管）投與（例如，藉由吸入或鼻内方式）多肽、可變區 域或拮抗劑時其很可能會遇到蛋白酶。因此，一個實施例 提供藉由吸入或鼻内向患者（例如人類）之肺組織投與之方 式向該患者投與蛋白酶抗性多肽、免疫球蛋白單—可變區 131418.doc •28- 200911834 域或拮抗劑以治療及/或預防患者之疾病或病狀。該病狀 可為哮喘（例如，過敏性哮喘）、c0PD、流感或 wo 2〇_蕭7中所揭示之任何其他f wo觸则係以引用之方式併入本文中。在另一實例 中，當向患者之眼睛投與(例如，以眼球内注射方式或以 滴眼劑形式）多肽、可變區域或枯抗劑時其很可能會遇到 蛋白酶。因此，一個實施例提供以眼睛方式向患者（例如 / 人類）投與蛋白酶抗性多肽、免疫球蛋白單-可變區域或 拮抗劑以治療及/或預防*去 、 万W者之疾病或病狀（例如，眼睛之 疾病或病狀）。投攀可或丨、；、立β 樂了為以滴眼劑形式或藉由注射至眼 睛、例如玻璃體液中而局部向眼睛投與。 本發明之拮抗劑、多肽及免疫球蛋白單-可變區域可展 2升=對較高之稼融溫度(Tm)’從而提供增強之穩定 ^和力減合村為或料為拮抗劑、乡肽 m特徵。該等特徵中之—或多”及蛋白酶抗性使得 “劑、可變區域及多肽可承擔作為諸如人類之哺乳動物 之樂物的用途，（例如）對於GI道或肺組織投 會遇到蛋白酶的情況而言。 織技樂而“艮可能 因此，在一態樣t，本發明提供_種 _ TNFRW抗劑。在—態樣中 / 口傳遞之 道傳遞之了酿丨拮抗劑。在—於向患者之⑴ 1拮抗劑在製造用於經口傳 ：:提供-種 態樣中’本發明提供™括抗^ 之胃GI道傳遞之藥物，的用途。在-實施例中，該；= 131418.doc •29- 200911834 域對騰蛋白酶及/或至少一種選自彈性蛋白酶、白血球酶 及騰酶之其他蛋白酶具有抗性。舉例μ，㈣_ 蛋白酶及彈性蛋㈣；騰蛋白酶及白血球酶；胰蛋白酶及 胰酶；胰蛋白酶、彈性蛋白酶及白血球酶；胰蛋白酶、彈 性蛋白酶及胰酶；騰蛋白酶、彈性蛋白酶、胰酶及白血球 酶；或胰蛋白酶、胰酶及白血球酶。 在-態樣中’本發明提供—種用於肺傳遞unfri抬抗 劑。在-態樣中，本發明提供一種用於向患者之肺傳遞之 TNFR1结抗劑。在-態樣中，本發明提供—種了酿^括抗 劑在製造用於肺傳遞之藥物中的用途。在一態樣中，本發 明提供-種丁制拮抗劑在製造用於向患者之肺傳遞之藥 物中的用it °在-實施例中’該可變區域對白▲球酶具有 抗性。 在一態樣中，本發明提供一種經口傳遞藥物或向患者之 胃腸道或患者之肺或肺組織傳遞藥物的方法，其中該方法 包含向該患者投與醫藥學有效量之本發明之tnf以拮抗 劑。 在一態樣中，本發明提供一種用於治療及/或預防發炎 性病狀之本發明之TNFR1拮抗劑。在一態樣中，本發明提 供一種TNFR1拮抗劑在製造用於治療及/或預防發炎性病 狀之藥物t的用途。在一實施例令，該病狀係選自由關節 人夕發性硬化症、發炎性腸疾病及慢性阻塞性肺病組成 之群。舉例而言，該關節炎為類風濕性關節炎或幼年型類 風濕性關節炎。舉例而言，該發炎性腸疾病係選自由克羅 131418.doc -30- 200911834 恩氏病及潰瘍性結腸炎組成之 W·咏，产於砰舉例而言，該慢性阻塞 性肺病係選自由慢性支氣管 ^ M^ 人陵性阻塞性支氣管炎及肺 亂腫組成之群。舉例而言， _ _ Μ肺穴為細菌性肺炎。舉例而 5 ，该細菌性肺炎為葡萄 pneumonia)。 肺 x (StaPhylococcal 二態樣中，本發明提供—種用於治療及/或預防呼吸 =:TNFR1拮抗劑。在—態樣中，本發明提供一種 TNFR1払抗劑在製造用於治 縻及/或預防呼吸道疾病之藥 物中的用途。舉例而言，該呼 、、 吁及道疾病係選自由以下各病 組成之群.肺發炎、慢性卩且宾，祕& — A丨又『丨且基性肺病、哮喘、肺炎、過敏 ㈣炎:與嗜伊紅血球增多相關之肺浸潤、環境肺病、肺 炎、支氣管擴張、囊性纖維化、„肺病、原發性肺動脈 南壓、肺血栓栓塞、胸膜病變、縱隔病變、隔膜病變、換 氣不足、換氣過度、睡眠呼吸暫停、急性呼吸窘迫症候 群、間皮瘤、肉瘤、移植排斥、移植物抗宿主疾病、肺 癌、過敏性鼻炎、過敏症、石棉沉著病、麴菌腫、麴菌 病、支氣管擴張、慢性支氣管炎、肺氣腫、嗜伊紅血球肺 炎、特發性肺纖維化、侵練肺炎球菌疾病、流感、非結 核性分枝桿菌，病、胸膜積液、塵肺病、肺孢子蟲病、肺 炎、肺放線菌病、肺泡蛋白沉著症、肺炭疽、肺水腫、肺 栓子、肺發炎、肺組織細胞增多病X、肺動脈高血壓、肺 土壤絲菌病（pulmonary nocardi〇sis)、肺結核、肺靜脈閉塞 疾病、類風濕性肺病、肉狀瘤病及韋格納肉牙腫病 (Wegeneris granulomatosis)。舉例而言，該疾病為慢性阻 131418.doc -31 - 200911834 塞性肺病（C0PD)e舉例而言，該疾病為哮喘。 包含抑制tNFR1之藥劑的本發明之拮抗劑（例如，立中 該藥劑係選自由以下各物組成之群：抗體片段（例如，㈣ 片段、恤片段、Fv片段(例如’ scFv、雙硫鍵鍵結之 Fv)、_，)2片段、dAb)、配位體及_單體及多聚體⑼ 如，同源或異源二聚體））可使用任何合適方法局部向個體 之肺組織（例如，肺）投與。舉例而言，藥劑可藉由吸入或 鼻内投與方式局部向肺組織投與。對於吸 言-咖之括抗劑可使用喷霧器、吸入器、=樂： f化器（ae_lizer)、彌霧器（mister)、乾粉吸人器、定劑 里吸入器、定劑量噴霧器、定劑量彌霧器、定劑量霧化器 或其他合適吸入器或鼻内傳遞裝置投與。因此，在一者, 例中，本發明提供—種含有TNFR1拮抗劑之肺傳遞裝= 在一實施例中，該裝置為吸入器或鼻内傳遞裝置。 ί 在-態樣中’本發明提供—種包含TNfri拮抗劑之口服 調配物。調配物可為錠劑、丸劑、膠囊、液體或糖聚。 在-實施财，本發明提供—種用於向肺傳遞之肺調配 物’其中該調配物包含粒度範圍小於5微米、例如小於 4·5、4、3.5或3微米之本發明之拮抗劑、多肽或可變區域 (例如，當在例如pH 6.5至8.0、例如pH ?至75、例如pH 7 或PH 7.5之伯瑞坦-魯賓遜（Britt〇n_R〇bi_)緩衝液 時）。 在—實施例中，提供阳6.5至8.〇、例如7至75、例如 7、例如7·5之本發明之調配物及組合物。 13I418.doc -32. 200911834 根據本發明之任何態樣之可變區域可具有至少50°C或至 少55°C或至少60°C或至少65°C或至少7(TC之Tm。本發明之 拮抗劑、用途、方法、裝置或調配物可包含該可變區域。 在本發明之一態樣中，本發明之多肽、可變區域、拮抗 劑、組合物或調配物在37°C至50。(：下在伯瑞坦-魯賓遜緩衝 液中培養（多肽或可變區域之濃度為1 mg/ml)14天後大體上 為穩定的。在一實施例中，至少65、70、75、80、85、 86 ' 87、88、90 ' 91、92 ' 93、94、95、96、97、98、 99¾之多肽、拮抗劑或可變區域在37。〇下進行該培養後仍 不聚集。在一實施例中’至少65、70、75、80、85、80、 87、88、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99〇/0之 多肽或可變區域在37°C下進行該培養後仍為單體。在一實 施例中，至少 5、10、15、20、25、30、35、40、45、 50、55、60、65、70、75、80、85、86、87、88、90、 91、 92、93、94、95、96、97、98、99〇/。之多肽、拮抗劑 或可變區域在5(TC下進行該培養後仍不聚集。在—實施例 中’至少 5、10、15、20、25、30、35、4〇、45、5〇、 55、60、65、70、75、8〇、85、％、87、88、9〇、9卜 92、 93、94、95、96、97、％、㈣之多狀或可變區域在 下進行該培養後仍為單體。在一實施例中，在任何一 個該等培養後未見多肽、可變區域 '拮抗劑之聚集。在一 實施例中，多肽或可變區域之财坑下在伯瑞垣 : 緩衝液中在1 mg/ml之多肽或可變區域 變化或大體上未變化。 。養後仍未 131418.doc •33· 200911834 在本發明之一態樣中，本發明之多肽、 _* ϊ ^ las. 3¾¾ \ 4jr 4^· 劑、組合物或調配物在4°C下在伯瑞坦_魯 马負遞緩衝液中* pH 7至7.5(例如pH 7或pH 7.5)下培養（多 4』變區域之澧 度為100 mg/ml)7天後大體上為穩定的。 ^ 在—實施例中， 至少 95、95.5、96、96.5、97、97 5、〇〇 98、98,5、99 或 99.5%之多肽、拮抗劑或可變區域在 枵蚕後仍不聚集。 在一實施例中，至少95、95.5、96、< 96·5、97、97.5、 98、98.5、99或99.5%之多肽或可變區域 β Μ在5亥培養後仍為 單體。在-實施例中，在任何一個該等培養後未見多肽、 可變區域、拮抗劑之聚集。 在本發明之一態樣中，本發明之多肽、可變區域、拮抗 劑、組合物或調配物（例如）在室溫、2〇t或37它下（例如） 在喷射喷霧器（例如Pari LC+杯）中喷霧（多肽或可變區域之 濃度為40 mg/ml)l小時後大體上為穩定的。在一實施例 中，至少 65、70、75、80、85、86、87、88、90、91、 92、93、94、95、95.5、96、96.5、97、97.5、98、98.5、
99或99.5%之多肽、拮抗劑或可變區域在該噴霧後仍不聚 集。在一實施例中’至少65、70、75、80、85、86、87、 88、90、91、92、93、94、95、95.5、96、96.5、97、 97.5、98、98.5、99或99.5%之多肽或可變區域在該喷霧後 仍為單體。在一實施例中，在任何一個該噴霧後未見多 肽、可變區域、拮抗劑之聚集。 在MRC-5細胞檢定中，本發明之任何態樣之可變區域可 以2 nM至5 0 pM之ND50中和TNFct刺激之IL-8釋放。本發明 131418.doc -34· 200911834 之拮抗劑 域。 用途、方法 裝置或調配物可包含該可變區 f κ 在一態樣中’本發明提供一種經分離或重組核酸，其編 碼包含本發明之任何態樣之免疫球蛋白單—可變區域之多 肽或編碼本發明之任何態樣之多a、拮抗劑或可變區域: 在心樣中，本發明提供一種包含該核酸之载體。在—熊 樣中，本發明提供一種包含核酸或載體之宿主細胞。在一 態樣中’本發明提供—種產生包含免疫球蛋白單—可變區 域之多肽之方法，該方法包含將宿主細胞維持在適於該核 酸或該載録現之料τ，藉此產生包含免疫球蛋白單一 可變區域之多R。該方法可進一步包含分離多肽、可變區 域或拮抗劑及視情況產生比經分離多肽、可變區域或拮抗 劑具有改良之親和力及/或ND50的變異體（例如，突變變異 體）。此項技術已知改良免疫球蛋白單一可變區域之結合 親和力之技術，例如親和力成熟技術。 在一態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含本發 明之任何態樣之免疫球蛋白單一可變區域、多肽或拮抗劑 及醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。 在一實施例中，本發明之任何態樣之免疫球蛋白單一可 變區域或拮抗劑包含抗體恆定區域，例如抗體Fc，視情況 其中Fc之N-末端連接於（視情況直接連接於）可變區域之c_ 末端。 本發明之多肽或可變區域可為經分離的及/或重纟且的。 本文中描述一種選擇蛋白酶抗性肽或多肽之方法。該方 131418.doc -35· 200911834 法包含提供肽或多肽之譜系，在適於蛋白 使該譜系與蛋㈣組合，及时具有想要生m 如，特異性結合丁咖）之肽或多肽，藉此選擇蛋白酶 性肽或多肽。 伴蛋白抗 通常將譜系及蛋白酶培養至少約3G分鐘之時間。 中可使用任何想要之蛋白酶，諸如一或多種以下蛋' 絲胺酸蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、天冬 _ I白臨、史曰_、硫醇 / 蛋白_、絲肽酶（例如，㈣㈣A、 竣基肽酶B)、胰蛋白醢眭 卷白疏^ 蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜 彈性蛋白酶、白血球酶、胰酶、 酸、细挑疋人& 疑·^酶、纖溶 蛋白 腸肽 卡斯 :、、’織蛋白酶（例如組織蛋白酶G)、蛋白酶（例如 酶卜蛋白酶2、蛋白酶3)、嗜熱菌蛋白酶、凝乳酶
=、卡斯蛋白酶（例如卡斯蛋白酶i、卡斯蛋白酶2 H '卡斯蛋白酶5、卡斯蛋白酶9、卡斯蛋白酶η、 白鉍13)、鈣激活蛋白酶、無花果蛋白酶、梭菌蛋 獼、猴桃蛋白酶、鳳梨蛋白酶及分離酶。在特定實施 2 ’蛋白酶為姨蛋白酶、彈性蛋白酶或白血球酶。蛋白 =可由生物提取物、生物組織勻讓或生物製劑提供。必 ^方法進-步包含在培養完成後向譜系與蛋白酶之 組合中添加蛋白酶抑制劑。 二實％例中，基於結合活性回收具有想要之生物活 性^或多肽。舉例而言’可基於結合諸如蛋白質八、蛋 貝G或蛋白貝[之—般配位體如㈣卜4and)回收狀或多 肽。結合活性亦可為與乾配位體之特異性結合。例示性靶 131418.doc -36- 200911834 配位體包括ApoE、Apo-SAA、BDNF、心營養素-1、 CEA、CD40、CD40 配位體、CD56、CD38、CD138、 EGF、EGF受體、ENA-78、嗜酸性粒細胞趨化因子、嗜酸 性粒細胞趨化因子-2、次級淋巴組織趨化因子-2、FAPtx、 FGF-酸性、FGF-鹼性、纖維母細胞生長因子-10、FLT3配 位體、弗拉塔凱（CX3C)、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-βΐ、人類血清白蛋白、胰島素、IFN-γ、IGF-I、IGF-II、 IL-lcx、IL-Ιβ、IL-1 受體、IL-1 受體 1 型、IL-2、IL-3、IL-{ 4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8(72a.a.)、IL-8(77a.a.)、IL- 9 、 IL-10 、 IL-11 、 IL-12 、 IL-13 、 IL-15 、 IL-16 、 IL-17 、 IL-1 8(IGIF)、抑制素α、抑制素β、IP-1 0、角化細胞生長 因子-2(KGF-2)、KGF、痩體素、LIF、淋巴細胞趨化因 子、穆勒氏抑制物質、單核細胞集落抑制因子、單核細胞 引誘蛋白、]^-08?、1^〇(：(67 3.&.)、^1〇(：(69 3.3.)、厘€?-l(MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC(67 a.a)、 MDC(69 a.a_)、MIG、ΜΙΡ-1α、ΜΙΡ-1β、ΜΙΡ-3α、MIP-‘ 3β、MIP-4、骨髓祖細胞抑制劑因子- l(MPIF-l)、NAP-2、 神經營養因子、神經生長因子、β-NGF、NT-3、NT-4、制 瘤素 Μ、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、 RANTES、SDFloi、SDFip、SCF、SCGF、幹細胞因子 (SCF)、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-02、TGF-P3、腫瘤 壞死因子（TNF)、TNF-a、TNF-β、TNF 受體 I、TNF 受體 II、TNIL-1、ΤΡΟ、VEGF、VEGF A、VEGF B、VEGF C、VEGF D、VEGF 受體 1、VEGF 受體 2、VEGF 受體 3、 131418.doc -37- 200911834 GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β、GRO-γ、HCCl、1-309、 HER 1、HER 2、HER 3、HER 4、血清白蛋白、vWF、澱 粉樣蛋白（例如，澱粉樣〇〇、]^]\^12、？0〖1、1吕£、1[-13Ral、IL-13Ra2、IL-15、IL-15R、IL-16、IL-17R、IL-17、IL-18、IL-18R、IL-23IL-23R、IL-25、CD2、CD4、 CDlla、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、 CD40L、CD56、CD138、ALK5、EGFR、FcERl、TGFb、 CCL2、CCL18、CEA、CR8、CTGF、CXCL12 (SDF-1)、 凝乳酶、FGF、弗林蛋白酶、内皮素-1、嗜酸性粒細胞趨 化因子（例如，嗜酸性粒細胞趨化因子、嗜酸性粒細胞趨 化因子-2、嗜酸性粒細胞趨化因子-3)、0^4-€5?、1€八]^-1、ICOS、IgE、IFNa、1-3 09、整合素、L-選擇素、MIF、 MIP4、MDC、MCP-1、MMP、嗜中性彈性蛋白酶、骨橋 蛋白、OX-40、PARC、PD-1、RANTES、SCF、SDF-1、 siglec8、TARC、TGFb、凝血酶、Tim-1、TNF、 TRANCE、類胰蛋白酶、VEGF、VLA-4、VCAM、α4β7、 CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8、ανβ6、 ανβ8、cMET、CD8、vWF、殿粉樣蛋白（例如，澱粉樣 a)、MMP12、PDK1 及 IgE。 在特定實施例中，藉由淘選回收肽或多肽。 在一些實施例中，譜系包含呈現系統。舉例而言，呈現 系統可為噬菌體呈現、核糖體呈現、乳液隔室化及呈現、 酵母呈現、嘌呤黴素呈現、細菌呈現、質體上之呈現或共 價呈現。例示性呈現系統使核酸之編碼功能與由核酸所編 131418.doc -38- 200911834 碼之肽或多肽之功能特徵相關聯。在特定實施例中，呈現 系統包含可複製之基因組。 在一些實施例中，呈現系統包含噬菌體呈現。舉例而 言，嗟菌體可為lMl3、人、廳2或丁7。在特定;施例 中，噬菌體呈現系統為多價系統。在一些實施例中，肽或 多狀呈現為pill融合蛋白。 在其他實施例中’方法進一步包含擴增編碼具有想要之 生物活性之肽或多肽的核酸。在特定實施例中藉由噬菌 體擴增、細胞生長或聚合酶鏈反應擴增核酸。 在一些實施例中，譜系為免疫球蛋白單一可變區域譜 系。在特定實施例中，免疫球蛋白單—可變區域為重鍵可 變區域。在更特定實施例中，重鏈可變區域為人類重鍵可 變區域。在其他實施例中，免疫球蛋白單一可變區域為輕 鏈可變區域。在特定實施例中，輕鏈可變區域為人類輕鏈 可變區域。 %樣中’提供―種自肽或多肽譜系選擇以口 力結合革巴配位體（例女口，TNFR1)之狀或多狀之方法。 法包含提供狀或多妝银备 ,* V 曰系在適於蛋白酶活性之條件下使 譜系與蛋白酶組合，；5㈤w 人v 及口收、纟σ合靶配位體之肽或 通常將譜系及蛋白醢拉盖s & 贪白酶培養至少約3〇分鐘之時 中可使用任何想要之蛋白酶，諸如一 在方法 絲胺酸蛋白酶、半胱胺 5夕以下蛋白酶： 恭“ ^ 酶、天冬胺酸蛋白酶、硫醇 蛋白3#、基質金屬疋& & ;,L ^ 錄A肽酶m 基肽酶(例如，幾基肽酶A、 羧基肽酶B)、膜^ ^ ， _、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜 131418.doc •39· 200911834 蛋白酶'彈性蛋白酶、白血球 轉、組織蛋白酶（例如組織蛋 & *血酶、纖溶 酶1、蛋白酶2、蛋白酶3) 蛋白酶（例如，蛋白 給上 f熱菌蛋白酶、凝谢給 轉、卡斯蛋㈣（例如卡斯蛋 是錢、腸肽 蛋白酶4、卡斯蛋白酶5、·卡斯蛋自酶2、卡斯 卡斯卡斯蛋白扭9、卡斯蛋白酶12 卡斯蛋白酶13)，活蛋白酶、 白酶12、 白酶、魅修蛋白®梭菌蛋 :鞠猴桃蛋白酶、鳳梨蛋白酶及分離酶。在： 例中’蛋白酶為胰蛋白酶、 ί 贫曰晦或白血球酶。I白 酶亦可由生物提取物、生物 轉蛋白 « Β. ^ 物，，且織勻漿或生物製劑提供。必 要日守’該方法進一步包含Α +立矣+ > ^ 在0養元成後向譜系與蛋白酶之 ，、且σ中添加蛋白酶抑制劑。 可基於結合任何想要之靶配位體、諸如本文中所揭示之 乾配位體（例如，TNFR1)回收肽或多肽。在特定實施例 中’藉由淘選回收肽或多肽。 在一些實施例中，譜系包含呈現系統。舉例而言，呈現 系統可為嗟菌體呈現、核糖體呈現、乳液隔室化及呈現、 酵母呈現、％吟黴素呈現、細菌呈現、質體上之呈現或共 饧呈現。例不性呈現系統使核酸之編碼功能與由核酸所編 碼之肽或多肽之功能特徵相關聯。在特定實施例中，呈現 系統包含可複製之基因組。 在一些實施例中，呈現系統包含噬菌體呈現。舉例而 吕，嗟菌體可為fd、Ml3、X、MS2或T7。在特定實施例 中’嗟菌體呈現系統為多價系統。在一些實施例中，肽或 多肽呈現為pill融合蛋白。 131418.doc -40- 200911834 在其他實施例中，方法進一步包含擴增編碼具有想要之 生物活性之肽或多肽的核酸。在特定實施例中 體撼秘 啊坩巫闺 瓶彍、、細胞生長或聚合酶鏈反應擴增核酸。 在-些實施例中，譜系為免疫球蛋白單一可變區域堪 =。在特定實施财，免疫球蛋白單—可變區域為重^ 變區域。在更特定實施例中，重鏈可變區域為人類重鏈可 變區域。在其他實施例中，免疫球蛋白單一可變區域為輕 鏈可變區域。在特定實施例中，輕鏈可變區域為人 可變區域。 蛾 在另-態樣中，本文中描述一種產生蛋白酶抗性肽或多 肽譜系之方法。該方法包含提供肽或多肽譜系，在適於蛋 白酶活性之條件下使肽或多肽⑽與蛋白酶組合，及回收 複數種具有想要之生物活性之肽或纽藉此產生蛋 抗性肽或多肽譜系。 在一些實施例中’通常將譜系及蛋白酶培養至少約30八 鐘之時間。舉例而言，方法中所使 刀 使用之蛋白酶可為—戋多 種以下蛋白酶：絲胺酸蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、天夂胺 ，蛋白酶、硫醇蛋白酶、基質金屬蛋白酶、絲肽酶(例 。’竣基肽扭A、録肽酶B)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白 酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、彈性蛋白酶、白血球酶、胰 酶、凝血酶、纖溶酶、組織蛋白酶(例如組織蛋白酶G)、 :白酶(例如，蛋白酶卜蛋白酶2、蛋白酶3)、嗜熱菌蛋白 私、凝乳酶、腸肽酶、卡斯蛋白酶（例如卡斯蛋白酶i、卡 斯蛋白酶2、卡斯蛋白酶4、卡斯蛋白酶5、卡斯蛋白酶9、 131418.doc 200911834 卡斯蛋白酶12、卡斯蛋 酶、梭菌蛋白酿-酶、無花果蛋白 在特〜眘 冑猴桃蛋白酶、鳳梨蛋白酶及分離酶。 球酿疋施例中，蛋白酶為胰蛋白酶、彈性蛋白酶或白血 球酶。|白臨介 7W生物提取物、生物組織勻漿咬生物製 劑提供。必要時，兮方“ a ”水次生物製 盥番白故 ^方法進一步包含在培養完成後向譜系 /、蛋白酶之組合中添加蛋白酶抑制劑。 一實施例中，基於結合活性回收複數種具有相要之 生物活性之肽或多1。舉例而言，可基於結合諸如;白質 蛋白貝G或蛋白質L之一般配位體回收複數種狀或多 肽。結合活性亦可為與乾配位體、諸如本文中所述之乾配 位體之特異性結合。在特定實施例中，藉由淘選回收複數 種具有想要之生物活性之肽或多肽。 /
V 在-些實施例中，譜系包含呈現系統。舉例而言，呈現 系統可為噬菌體呈現、核糖體呈現、乳液隔室化及呈現、 酵母呈現、嗓吟黴素呈現、、細菌呈現、質體上之呈現或共 價呈現。在特定實施例中，呈現系統使核酸之編碼功能與 由核酸所編碼之肽或多肽之功能特徵相關聯。在特定實施 例中’呈現系統包含可複製之基因組。 在一些實施例中’呈現系統包含噬菌體呈現。舉例而 言’嗤菌體可為fd、M13、λ、MS2或T7。在特定實施例 中虽函體呈現糸統為多價糸統。在一些實施例中，狀戍 多肽呈現為pill融合蛋白。 在其他實施例中’方法進一步包含擴增編竭複數種具有 想要之生物活性之肽或多肽的核酸。在特定實施例中，藉 131418.doc -42- 200911834 由嗟菌體擴增、細胞生長或聚合酶鏈反應擴增核酸。 /在一些實施例中，譜系、為免疫球蛋白單-可變區域譜 =。在特疋實施例t，免疫球蛋白單—可變區域為重鍵可 區域。在更特定實施例中’重鏈可變區域為人類重鏈可 變區域。在其他實施例中，免疫球蛋白單一可變區域為輕 鏈可變區域。在特定實施例中，輕鏈可變區域為人類輕鏈 可變區域。 鍵 在另-態樣中，本文中描述一種自譜系選擇包含結合靶 配位體（例如’ tNFR1)之免疫球蛋白單_可變區域（dAb)之 蛋白酶抗性多狀的方法。在一實施例中’該方法包含提供 包含f肽之譜系的喔菌體呈現系統，該等多狀包含免疫球 單可I區域’在適於蛋白酶活性之條件下使嗤菌體 呈現系統與選自由彈性蛋白酶、白血球酶及姨蛋白酶組成 蛋白酶、、且σ ’及回收呈現包含結合乾配位體之免疫 球蛋白單一可變區域之多肽的噬菌體。 在-些實施例中，使用100…灿之蛋白酶，且在約 37C下將所組合之嘆菌體呈現系統及蛋白酶培養隔夜。 在一些實施例中，藉由餘配位體結合回收呈現包含結 合該把之免疫球蛋白單-可變區域之多肽的㈣體。在其 :實鉍例中，精由淘選回收呈現包含結合靶配位體之免疫 球蛋白單一可變區域之多肽的噬菌體。 '、冑種由本文中所述之方法可選擇或選擇之經分離 蛋白酶抗性肽或多肽。在一特定實施例中，提供一種由本 文中所述之方法可選煜 、擇或選擇之經分離蛋白酶（例如，胰 131418.doc -43- 200911834 蛋白酶、彈性i a 、 蛋白駟、白血球酶）抗性免疫球蛋白單一可 =:(例如’人類抗體重鏈可變區域、人類抗體 變區域）。 ％ j 本^進-步描述_種經分離或重組核酸，其係編碼由 本文中所叙方法可選擇或選擇之蛋㈣抗性肽或多狀 (例广’胰蛋白酶、彈性蛋白酶或白血球酶抗性免疫球蛋 白早-可變區域)，及係關於包含該等核酸之載體(例如， 表現載體）及宿主細胞。 本文中進-步描述-種製備由本文令所述之方法可選擇 或選擇之蛋白酶抗性肽或多肽（例如，胰蛋白酶' 彈性蛋 白酶或白血球酶抗性免疫球蛋白單-可變區域)之方法， ，方法包含將含有編碼蛋白酶抗性肽或多肽之重組核酸之 宿主細胞維持在適於表現之條件下，藉此製造蛋白酶抗性 狀或多狀。 i 本文中進一步描述一種由本文中所述之方法可選擇或選 擇之蛋白酶抗性肽或多肽（例如，胰蛋白酶、彈性蛋白酶 或白血球酶抗性免疫球蛋白單一可變區域），其用於醫學 中(例如，用於治療或診斷本文中進—步描述一種由： 文中所述之方法可選擇或選擇之蛋白酶抗性肽或多肽（例 如’胰蛋白酶、彈性蛋白酶或白血球酶抗性免疫球蛋白單 -可變區域)用於製造供治療疾病用之藥物的用途。本文 中進一步描述一種治療疾病之方法’該方法包含向有需要 之個體投與有效量之由本文中所述之方法可選擇或選擇之 蛋白酶抗性肽或多肽（例如’騰蛋白酶、彈性蛋白酶或白 131418.doc •44· 200911834 血球酶抗性免疫球蛋白單一可變區域)。 本文中進—步描述一種確定樣品中是否存在TNFR1或樣 中存在夕少TNFR1之診斷套組，該套組包含本發明之多 肽免疫球蛋白可變區域（dAb)或拮抗劑及使用說明書（例 如’確定樣品巾TNFR1之存在及/絲量）。在—些實施例 中套、‘且進步包含一或多種輔助試劑，諸如合適緩衝劑 =合適偵測試劑（例如，結合本發明之多肽或dAb或與其締 口或接合之部分的經可偵性標記之抗體或其抗原結合片 段）。 本發明亦係關於一種包含固體表面的裝置，可在該固體 表面上固定本發明之多肽、拮抗劑或dAb以使所固定之多 肽或dAb結合TNFR1。可使用上面可固定抗體或其抗原結 «片&之任何合適固體表面，例如，玻璃、塑膠、碳水化 «物（例如，瓊脂糖珠粒）。必要時，支撐物可含有或經改 質以含有有助於固定之想要官能基。裝置及/或支撐物可 具有任何合適形狀，例如片、桿、帶、板' 載玻片、珠 粒、小球、盤狀物、凝膠、試管、球體、晶片、板或器皿 及其類似物。在一些實施例中，該裝置為量桿。 【實施方式】 在本說明書内，已參考實施例以使得能夠編寫清楚且簡 明之說明書之方式描述本發明。希望且應瞭解，在不脫離 本發明之情況下，實施例可不同地組合或分離。 除非另有規定，否則本文中所使用之所有技術及科學術 具有一般熟習此項技術（例如，細胞培養、分子遣傳 13I418.doc -45- 200911834 學、核酸化學、雜交技術及生物化學）者通常所理解之相 同之含義。關於分子、遺傳及生化法（通常參見， Sambrook 等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual ’ 第 2 版（1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，N.Y.及 Ausubel 等人，Short Protocols in Molecular Biology (1999)第 4版，John Wiley & Sons，Inc·，其係以引用之方式併入本文中）及化學方 法’使用標準技術。 如本文中所使用’術語"腫瘤壞死因子受體1 (TNFR1)拮 抗劑或"抗TNFR1括抗劑"或其類似術語係指結合tnfR 1且 可抑制TNFR1之（一或多種）功能的藥劑（例如，分子、化合 物）。舉例而吕，TNFR1之拮抗劑可抑制丁卵以與tnFRI之 、会α合及/或抑制TNFR 1介導之信號轉導。因此，tnfr 1介導 之過程及細胞反應（例如，標準L929細胞毒性檢定中TNFa 誘導之細胞死亡）可用TNFR1之拮抗劑來抑制。 如本文中所使用，"肽”係指經由肽鍵結合在一起之約2 個至約50個胺基酸。 如本文中所使用’，，多肽”係指經由肽鍵結合在一起之至 少約50個胺基酸。多肽通常包含二 匕3 —級結構且摺疊為功能區 域。 如本文中所使用 "抗蛋白酶降解"肽或多肽（例如，區域 抗體（dAb))當在適於蛋白酶活性 養時大體上不會被蛋白酶降解。 度，例如在3 7 °C或5 〇下與蛋白 之條件下與蛋白酶一起培 當在適於蛋白酶活性之溫 酶一起培養約1小時後不 131418.doc • 46 - 200911834 超過約25%、不超過約繼、不超過約i5%、不超過約 ⑽、不超過約13%、不超過約12%、不超過約心、不超 過厲、不超過約9%、不超過約8%、不超過約7%、不 超過祕、不超過約5%、不超過約4%、不超過㈣、不 超過約2%、不超過約或大體上無蛋白質被蛋白酶降解 時，多肽（例如，dAb)大體上不降解。可使用任何合適方 法評估蛋白質降解，例如由SDS_pAGE或由如本文中所述 之功能檢定（例如’配位體結合）。 如本文中所使用，”呈現系統”係指其中多狀或狀之华合 易於基於想要之特徵(諸如物理、化學或功能特徵)加以選 擇之系統。呈現系統可為多肽或肽之合適譜系（例如，在 溶液中’固定於合適支樓物上)。呈現系統亦可為採用細 胞表現系統(例如，於(例如)經轉型、感染、轉染或轉導細 胞中表現核酸庫及於細胞表面上呈現經編碼多肽)或非細 胞表現系統（例如，乳液隔室化及呈現）之系統。例示性呈 現系統使核酸之編碼功能與由核酸所編碼之多狀或狀之物 理、化學及/或功能特徵相關聯。當採用該呈現系統時， 可選擇具有想要之物理、化學及/或功能特徵之多肽或 肽，且可容易地分離或时編碼所選擇之多肽或狀之核 酸。此項技術已知許多使核酸之編碼功能與多肽或狀之物 理、化帛及/或功能特徵相關聯之呈現系统，例如嗟菌體 呈現（bacteriophagedisplay/phagedispia 伙例如，嗟質體呈 ，現)、核糖體呈現、乳液隔室化及呈現、酵母呈現 '嗓呤 黴素呈現、細菌呈現、質體上之呈現、共價呈現及其類似 131418.doc •47· 200911834 者。（例如參見EP〇436597(Dyax)、美國專利第6，172，197號 (McCafferty等人）、美國專利第6 489 1〇3號（(3他加等 人）。） 士本文中所使用，"譜系"係指以胺基酸序列多樣性為特 徵之多肽或肽之集合。譜系之個體成員可具有常見特徵， 諸如常見結構特點（例如，常見核心結構）及/或常見功能特 徵（例如，結合常見配位體（例如，—般配位體或靶配位 體’ TNFR1)之能力）。
如本文中所使用，"功能，，摇述具有生物活性、諸如特異 性結合活性之多肽或肽。舉例而言，術語”功能多肽”包括 經由抗原結合位點結合靶抗原之抗體或其抗原結合片段。 如本文中所使用，"一般配位體"係指結合給定譜系之相 當一部分（例如，大體上所有）功能成員之配位體。一般配 位體（例如，常見一般配位體）可結合給定譜系之許多成 員，即使料成員1能對常見#配位體不具有結合特異 性。多肽上存在功能一般配位體結合位點（如結合一般配 位體之能力所指示）通常指示多肽經適當摺疊且具有功 能。-般配位體之合適實例包括超抗㉟、結合表現於譜系 之相當-部分功能成員上之抗原決定基之抗體及其類似 者0 ，’超抗原，，為技術術語，其係指與免疫球蛋白超家族之成 員在不同於該等蛋白質之把配位體結合位點之位點處相互 作用之-般配位體。葡萄球菌腸毒素為與τ'細胞受體相互 作用之超抗原實例。結合抗體之超抗原包括結合邮怪定 131418.doc •48- 200911834 區之蛋白質 G(Bjorck 及 Kronvall，《/· //«mMno/.，133:969 (1984));結合IgG恆定區及VH區域之蛋白質A(F〇rsgren&
Sjoquist，·/. /wmwo/.，97:822 (1966));及結合 VL區域之蛋 白質 L(Bjorck，《/. /mmwno/.，140:1194 (1988))。 如本文中所使用’乾配位體''係指多狀或狀特異性或選 擇性結合之配位體。舉例而言，當多肽為抗體或其抗原結 合片段時，靶配位體可為任何想要之抗原或抗原決定基。 與乾抗原之結合係視具有功能性之多狀或狀而定。 如本文中所使用，抗體係指源自任何天然產生抗體之物 種或由DNA重組技術產生的自血清、b細胞、融合瘤、轉 染瘤、酵母或細囷分離的IgG、IgVI、IgA、IgD或IgE或片 段（諸如Fab、F(ab，）2、Fv、雙硫鍵鍵結之Fv、scFv、封閉 構形多特異性抗體、雙硫鍵鍵結之scFv、雙抗體）。 如本文中所使用，”抗體格式（antib〇(jy format)”係指其中 可合併一或多個抗體可變區域以在結構上賦予抗原結合特 異性之任何合適多肽結構。此項技術已知多種合適抗體格 式，諸如嵌合抗體、人化抗體、人類抗體、單鏈抗體、雙 特異性抗體、抗體重鏈、抗體輕鏈、抗體重鏈及/或輕鍵 之同兀一聚體及異兀二聚體、任何上述各者之抗原結合片 段（例如’ Fv片段（例如單鏈Fv(scFv)、雙硫鍵鍵結之π)、
Fab片奴Fab片段、F(ab，)2片段）、單一抗體可變區域（例
Ab VH VHH、vL)及任何上述各者之經修飾形式 (例如經由共價連接聚乙二醇或其他合適聚合物或人化V邮 來修飾）。 13I418.doc 49- 200911834 短語’，免疫球蛋白單一可變區域，，係指獨立於其他v區或 區域特異性結合抗原或抗原決定基之抗體可變區域（Vh、
Vhh、VLp免疫球蛋白單―可變區域可以某一格式（例 如同源、或異源多聚體）與其他彳變區或可變區域一起存 在，其中該等其他區或區域不為單一免疫球蛋白可變區域 之抗原結合所需（亦即’其中免疫球蛋白單-可變區域獨 立於其他可變區域結合抗原）。"區域抗體"或,，dAb”與本文 f 中所使用之術語"免疫球蛋白單—可變區域"相同。"單一 ，疫球蛋白可變區域”與本文中所使用之術語"免疫球蛋白 早-可變區域’’相同。”單一抗體可變區域"或”抗體單一可 變區域"與本文中所使用之術語”免疫球蛋白單一可變區域" 才同▲在貝％例中’免疫球蛋白單-可變區域為人類抗 體可變區域’1包括來自其他物種之單-抗體可變區域， 諸如齧齒動物（例如，如wo⑽/2嶋中所揭示，直内容係 =引用之方式整體併入本文中）、護士f(nurseshark)及路 馬匕類（cw/寧HH dAb。路馬它類Vhh為自產生天然缺少輕 鏈之重鏈抗體之包括路騎、美洲乾、羊跪、單峰㈣及原 m勿種獲得的免疫球蛋白單—可變區域多肽。VHH 人化的。 "區域”為具有獨立於蛋白皙甘 白質其餘部分之三級結構之摺疊 貝夕結構。區域通常會產生蛋白質之離散功能性質，且 之功Γ狀況下’可在不損失蛋白f之其餘部分及/或區域 移二：之情況下，添加至其他蛋白質中、自其他蛋白質中 移除或轉移至其他蛋白質中。”單—抗體可變區域"為包含 13l418.doc -50· 200911834 具有抗體可變區域特徵之序列之摺疊多肽區域。因此，其 包括完全抗體可變區域及（例如）其中一或多個環已經被不 具有抗體可隻區域之特徵之序列置換的經修飾可變區域， 或已、、二被截斷或包含N-末端或c-末端延伸之抗體可變區 域以及保邊全長區域之至少結合活性及特異性之可變區 域的摺疊片段。 術語"庫"係指異源多肽或核酸之混合物。庫包含各具有 單一多肤或核酸序列之成員。就此而論，"庫”與，，譜系”同 義。庫成員之間的序列差異產生庫中所存在之多樣性。庫 可採取多肽或核酸之簡單混合物形式或可呈經核酸庫轉型 之例如細菌、病毒、動物或植物細胞及其類似者之生物體 或細胞形式。在一實施例中，各個體生物或細胞僅含有一 個或有限數目之庫成員。在一實施例中，將核酸併入表現 載體中以允許表現由核酸所編碼之多肽。因此，在一態樣 中，庫可採取宿主生物體群體之形式，各生物體含有一或 多個含有單個呈核酸形式之庫成員的表現載體複本，該庫 成員可經表現以產生相應多肽成員之核酸形式之庫成員。 因此，宿主生物體群體具有編碼多樣性多肽大譜系之潛 通用構架為對應於如Kabat(，，Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services)所定義之在序列方面保守之抗體區或對應 於如 Chothia 及 Lesk，（1987) J. Mol. Biol. 196:910-917所定 義之人類生殖系免疫球蛋白譜系或結構的單一抗體構架序 131418.doc -51 · 200911834 列。庫及譜系可使用單一構架或一組該等構架，儘管僅高 變區中存在變異但已發現其仍准許實際上任何結合特異性 之起源。 〜至即^日一次（單位劑量）或在 如本文中所使 規定時間間隔内分兩次或兩次以上投藥向個體投與之配位 體之數量。舉例而言，劑量可指在！天（24小時）（每曰劑 量）、2天、1週、2週、3週或一或多個月之時程内向個體 投與（例如，單次投藥或兩次或兩次以上投藥）之配位體（例 如，包含結合靶抗原之免疫球蛋白單一可變區域之配位 體）之數量。劑量之間的間隔可為任何想要之時間量。 短語”半衰期"係指配位體（例如，dAb、多肽或拮抗劑） 之血清濃度（例如）歸因於自然機制所致之配位體降解及/或 配位體清除或隔冑而活體内減小5〇%所需之時間。本發明 之配位體在活體内可為穩定的且其半衰期可因結合抗降解 及/或清除或隔離之分子而增加。該等分子通常為本身且 有長活體内半衰期之天然存在之蛋白質。若配位體之功能 f在活體内比對半衰期增加分子不具有特異 位體持續更長之時間，則豆主一 ^ 彳配 1則其+哀期增加。舉例而言，掛人 類血清白蛋白（HAS)及靶分子呈 對 於對HSAx/·― 耙刀子/、有特異性之配位體係可比 #在特異性（即*結合舰但結合另 相同配位體。舉例 刀于）之 期、*〜 U而5 ’其可結合細胞上之第三靶。半衰 期通吊增加10〇/〇、20〇 干r 倍、 ：…，，或以上。2倍、3 圍内之半㈣/ 0倍、30倍、40倍、50倍或以上範 增加為可能的。另外或其他’高達30倍、 131418.doc -52· 200911834 40倍、50倍、6〇倍、7G倍、8()倍 圍内之半衰期之增加為可能的。…00倍、150倍範 如本文中所使用，"流 通過水溶液之分子（例如，蛋白干寸係指基於分子擴散 蛋白貝分子、配位體彳矣麵p 寸。可使得蛋白質擴散或運動㈣㈣ 觀尺寸’其中該尺寸係以蛋白質粒子之”斯托克二表 (Stokes radius)”或”流體動力學 斤丰從 .t 干k、、'口出。蛋白質之" 動力干尺寸"視質量與形狀（構形）而定，如此兩個且有㈣ 分子質量之蛋白質基於蛋白質 ：： 動力學尺寸。 』此具有不冋流體 八術語"競爭”意謂第，其同_ :的：況下受到抑制。舉例而言，結合可能會⑼二 ^區域之物理阻斷或結合區域之結構或環境改變以致)㈣ 之親和力（afflnity或avidity)減小而在空間上受 關於如何執行競爭ELISA及競爭BiaC〇re實驗以確定第一应 第-=區域之間的競爭的詳情，參見鄭2嶋義η。 之兩:序列之間的”同源性”或"-致性"或” (4術語在本文中可互換使用）。出於最佳比較目 ==(例如，為最佳比對，可在第-與第二胺基酸 列之—個或兩個中引人間隙，且出於比較之目 的，可忽視非同源序列）。在一實施例中，出 的所比狀參考序狀長度為至少參考相之長 薦、或至少術、或至少鄕、或至少咖、或至少 131418.doc -53- 200911834 70%、80%、90%、1 00%。隨後比較相應胺基酸位置或核 苷酸位置處之胺基酸殘基或核苷酸。當第一序列中之某一 位置由與第二序列中之相應位置相同之胺基酸殘基或核苷 酸佔據時，則分子在該位置處一致（如本文中所使用，胺 基酸或核酸”同源性'’等效於胺基酸或核酸” 一致性"）。兩個 序列之間的一致性％係隨考慮為最佳比對兩個序列所引入 之間隙之數目及各間隙之長度的序列所共享之一致位置之 數目而變化。可使用奍法BLAST 2 Sequences使用缺省參 數（Tatusova，T. A.等人，FEMSMicrobiolLett，174:187- 18 8(1 999))準備且確定如本文中所定義之胺基酸及核苷酸 序列比對及同源性、相似性或一致性。 選擇方法 在一實施例中’本發明係關於由選擇具有想要生物活性 之蛋白酶抗性肽及多肽的方法選擇的多肽及dAb。方法中 使用兩個選擇壓力,χ產生選擇高度穩定且抗蛋白酶降解且 具有想要生物活性之多肽的高效過程。如本文中所述，蛋 白酶抗性肽及多肽通常保留生物活性。相反，纟白酶敏感 肽及夕肽在本文中所述之方法中會被蛋白酶裂解或分解， 且因此喪失其生物活性。因&，通常基於諸如結合活性之 生物活性選擇蛋白酶抗性肽或多肽。 本文中所述之方法提供數個優點。舉例而言，如本文中 所揭示及例示’經選擇而抗-種蛋白酶(例如，胰蛋白酶)
之蛋白水解降解的可變P 支£域、拮抗劑、肽或多肽亦對其他 蛋白酶（例如，彈性I占 蛋白酶、白血球酶）降解具有抗性。在 131418.doc •54· 200911834 相 巾蛋白酶抗性與狀或多狀之較高炼融溫度（Tm) 。較高炫融溫度指示較穩定可變區域、拮抗劑、肽及 古/在—實施例中，抗蛋白酶降解亦與結絲配位體之 分離及^相關。因此’本文中所述之方法提供一種選擇、 5回收具有想要之生物活性且因其具蛋白酶抗性 才亟適於活體内治療及’或診斷使用之可變區域、 1 & >肽的有效方式。在-實施例中，蛋白酶抗 '、改良之PK(例如’比不具蛋白酶抗性之可變區域、拮 抗劑、肽或多肽改良)相關。改良之PK可為改良之AUC(曲 線下面積)及/或改良之半衰期。在-實施例中，蛋白酶抗 性與可變區域、拮抗劑、肽或多肽對剪切力及/或熱應力 之改良穩定性及/或喷霧期間減小之聚集傾向(例如，比不 具蛋白酶抗性之可變區域、拮抗劑、肽或多肽改良)相 關。在-實施例中，蛋白酶抗性與改良之儲存穩定性(例 如，比不具蛋白酶抗性之可變區域、括抗劑、狀或多肤改 良）相關。在一態樣中’提供一個、二個、三個、四個或 所有該等優點’該等優點為抗蛋白酶降解、較高及結 合靶配位體之高親和力。 13 在-態樣中，提供-種自肽及多肽之庫或譜系(例如， 呈現系統）選擇、分離及/或回收抗蛋白酶（例如—或多種蛋 ’該方法為 、分離及/或 之多肽之方 ’在適於蛋 白酶）降解之肽或多肽之方法。在一實施例中 自肽及多肽之庫或谱系（例如，呈現系統）選擇 回收抗蛋白酶（例如，一或多種蛋白酶）降解 法。該方法通常包含提供肽或多肽之庫或譜系 1314J8.doc -55- 200911834 白酶（例如’胰蛋白酶、彈性蛋白酶、白血球酶、騰酶、 痰）活性之條件下使該庫或該譜系與蛋白酶組合，及選 擇、分離及/或回收抗蛋白酶降解且具有想要之生物活性 之肽或多肽。歸因於蛋白酶之活性，由蛋白酶降解之肽咬 多肽通常生物活性減小或喪失其生物活性。因此，可使用 基於生物活性之方法選擇、分離及/或回收抗蛋白酶降解 之肽或多肽，該生物活性諸如結合活性（例如，結合一般 配位體、結合特異性配位體、結合受質）、催化活性或其 他生物活性。 i 在適於蛋白酶（例如，一或多種蛋白酶）之蛋白水解活性 之條件下使肽或多肽之庫或譜系與蛋白酶組合。適於蛋白 酶及具有蛋白水解活性之生物製劑或混合物之蛋白水解活 性的條件為此項技術所熟知或可由一般熟習此項技術者容 易地確定。必要時，可（例如）藉由在一定範圍之pH值條 件、蛋白酶濃度、溫度下評估蛋白酶活性及/或藉由改變 使庫或譜系與蛋白酶反應之時間之量來鑑別或優化合適條 件。舉例而言，在一些實施例中，蛋白酶（例如，胰蛋白 酶）與肽或夕肽（例如，可變區域）之比率（以莫耳/莫耳計）為 _比80,00(例如’ 8〇〇〇比8〇，_)蛋白酶：肽或多肽例 =當使用1〇微克/毫升蛋白酶時，比率為800比80,〇〇〇蛋白 酶♦肽或多肽’·或當使用⑽微克/毫升蛋白酶時，比率為 M00比80，_蛋白酶：肽或多肽。在一實施例中蛋白酶 (例如騰蛋白酶）與肽或多肽（例如，可變區域）之比率（以 重置7重$、例如微克/微克計）為1，600比160,000(例如， 131418.doc -56- 200911834 ㈣白n或多^例如當使用ι〇微克/ ^扭時，比率為蛋白酶：狀或多 ’ s t使用_微克/毫升蛋白㈣，比率為16，帽比 ，_蛋白酶：肽或多肽。在一實施例中，使用濃度為 微克/毫升之蛋白酶，且蛋白酶（例如，姨蛋 =)與肽或多肽(例如’可變區域)之蛋白酶：肽比率(以 莫耳耳計）為8,刚比8G，_蛋白酶：肽或多肽。在一實 施例中，使用濃度為至少職克/毫升之蛋白酶，且蛋白 柄（例如，騰蛋白酶）與肽或多肽（例如，可變區域）之蛋白 肽比率（以莫耳/莫耳計）為8〇〇比8〇，_蛋白酶：狀或 夕肽。在-實施例中’蛋白酶(例如，胰蛋白酶)與肽或多 :如’可變區域）之比率（以重量/重量 '例如微克/微克 ± ，貪白鉍.肽或多肽，例如當C為1〇微 /¾升時’或當c或C’為100微克/毫升時，比率為16，嶋 ^〇，刚蛋白酶：肽或多肽。在—實施财，濃度㈣〇 為至少丨⑼或咖微克/毫升蛋白酶。為測試個體或經分離 肽或多肽（例如’免疫球蛋白可變區域），例如早已自譜系 或庫分離之肽或多肽，可向肽或多肽存於合適緩衝液曰⑽ 如’ PBS)中之溶液中添加蛋白酶以製得肽或多肽/蛋白酶 溶液，諸如至少約0.01%(w/w)蛋白酶/肽或多肽、約〇㈣ 至約5%(w/w)蛋白酶/肽或多肽、約0 05〇/〇至約5%(，蛋白 酶/肽或多肽、約〇_1%至約5%(w/w)蛋白酶/肽或多肽、約 〇.5〇/。至約5%(w/w)蛋白酶/肽或多肽、約1%至約外（‘） 蛋白酶/肽或多肽、至少約0.01%(w/w)蛋白酶/肽或多肽' 131418.doc -57- 200911834 至少約0.02%(w/w)蛋白酶/肽或多肽、 蛋白酶/肽或多肽、至少約〇 Q > @ 至少約〇 _w/、： )蛋白酶/肽或多肽、 蛋二肽： /肽或多肽、至少約。·_(, 蛋輕肽或夕肽、至少約〇·〇7%(，蛋 至少約0.08%(w/w)蛋白酶/肽或多 肽或多肽 蛋白酶/肽或多肽、至少約〇 > ^ 〇.〇9〇/〇(w/w) U〇_1/〇(W/W)蛋白酶/肽或多肽、至 :約叫/W)蛋白酶/肽或多肽、至少約 酶/肽或多肽、至少約0.4%(w/w)蛋白酶/肽或多肽、至少約 白酶/肽或多肽、至少約。，，蛋白，肽 或夕肽、至少約0.7%(w/w)蛋白酶/肽或多肽、至少約 議㈣蛋白酶/肽或多肽、至少約〇9%(w/w)蛋白酶/狀 或多肽、至少約1%(w/w)蛋白酶/狀或多狀、至少約 蛋白酶/肽或多肽、至少約3%(w/w)蛋白酶級或多 肽 '、至少約4%(W/W)蛋白酶/肽或多肽或約5%(w/w)蛋白酶/ 肽或多肽之溶液。可在適於蛋白酶活性之溫度⑷如，室 ’皿約37 C )下培養混合物，且可以時間間隔(例如叫小 時、2小時、3小時等）採集樣品。可使用任何合適方法、 諸如SDS-PAGE分析或配位體結合就蛋白質降解分析樣 口口，且可使用結果建立降解時程。 在本文中所述之方法中可使用任何想要之蛋白酶。舉例 而口可使用|纟白酶、不同蛋白酶之任何想要之組合 或具有蛋白水解活性之任何生物製劑、生物提取物或生物 •、且織勻漿不必要知道所使用之蛋白酶之—致性。可單獨 或以任何想要之組合使用之蛋白酶之合適實例包括絲胺酸 131418.doc -58· 200911834 =質：胱胺酸蛋白酶、天冬胺酸蛋白酶、硫醇蛋白 肽酿只 白酶、幾基肽酶（例如，減肽酶A、竣基 )、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶 扭、彈性蛋白酶、白也球酶、騰酶、…m 胰鰣、凝血酶、纖溶酶、組 蛋白轉（例如，么且墻幕白> ⑴，、且織蛋白叫、蛋白酶（例如，蛋白酶 :蛋白酶2、蛋白酶3)、嗜熱菌蛋白酶、凝乳酶、腸肽 轉、卡斯蛋白酶（例如，卡斯蛋白酶i、卡斯蛋白酶2、卡
斯蛋白酶4、卡斯蛋白酶5、卡斯蛋白酶9、卡斯蛋白酶 *卡斯蛋白酶13)、鈣激活蛋白酶、無花果蛋白酶、梭 菌蛋白酶、獼猴桃蛋白酶、鳳冑蛋白酶、分離酶及其類似 物八有蛋白水解活性之合適生物提取物、組織勻漿及製 劑包括痰、黏液(例如’胃黏液、鼻黏液、支氣管黏液)、 支氣管肺泡灌洗液、肺組織勻漿、肺提取物、胰腺提取 物月液、唾液、眼淚及其類似物。蛋白酶係以適於發生 蛋白水解降解之量使用。舉例而言，如本文中所述，可使 用約0.01%至約5%(w/w，蛋白酶/肽或多肽）蛋白酶。當使 蛋白酶與包含肽或多肽譜系之呈現系統（例如，噬菌體呈 現系統）組合時’例如，可使用濃度為約丨〇 μ§/Γη1至約3 pg/ml μg/m\ Kg/ml Pg/ml mg/ml mg/ml、約 1〇 pg/mi、約 20 pg/mi、約 3〇 pg/ml、約 40 約 50 pg/ml、約 60 pg/ml、約 70 pg/ml、約 80 約 90 pg/ml、約 100 pg/ml、約 200 pg/ml、約 300 約 400 pg/ml 、約 500 pg/ml 、約 600 pg/ml 、約 700 約 800 pg/ml、約 900 pg/ml、約 1000 pg/ml、約 1.5 約2 mg/ml、約2.5 mg/ml或約3 mg/ml之蛋白酶。 131418.doc -59- 200911834 在適於蛋白酶活性之溫度下，將蛋白酶與肽或多肽之集 合（庫或譜系）一起培養。舉例而言，可在約2(rc至約 4(TC(例如，室溫、約2〇t、約2rc、約饥、約抑、約 24°C、約25°C、約2代、約27。〇、約抓、約机、約 3〇°C、約31t、約饥、約抑、約听、約饥、約 阶、約3rc、約38〇C、約抓、約贼）之溫度下培養蛋 白酶及肤或多肤之集合。將蛋白酶及肽或多肽之集合_起 培養一段足以發生蛋白水解降解之時@。舉例而言，可將 肽或夕肽之集合與蛋白酶一起培養約3〇分鐘至約以或約牦 約12小 約17小 約22小
V 在-些實例，將肽或多肽之集合與蛋白酶一起培養 隔夜’或培養至少約30分鐘、約1小時、約15小時、Μ 小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小 時、約8小時、約9小時、約1〇小時、約^小時 時、約13小時、約14小時、約15小時、約16小時 時、約18小時、約19小時、約20小時、約21小時 時約23小時、約24小時、約48小時或更長。 通吊希望’至少在早期各輪選擇 系統時），盥又七紅β 田使用呈現 )”不包括與蛋白酶-起培養之選擇相比，蛋白 轉使得所選擇之且古# ^曰 -個赵曰生物活性之純系數目減少至少 條::=。在，定實例中，方法中所使用之蛋白酶量及 倍) 所口收到之純系數目減少至少約1個對數(1〇 至:二:：:::倍)、至少約3個對數⑽。倍)或 適蛋白酶量及典養体：生想要之回收純系減少之合 及培養條件可使用習知方法及/或本文中所提 13 l418.doc -60- 200911834 供之指導容易地確定。 可使蛋白酶與肽或多肽 (例如，活體外、活體内或離體口且使用任何合適方法 白酶與肽或多肽之…入於八養。舉例而言，可使蛋 活性之-产下徂姓 適容器中且在適於蛋白酶 況。：二保持固定、搖動、震盪、渴旋或其類似情 :離：Γ，可使蛋白酶與肽或多肽之集合組合於活體内 諸如藉由將多肽之集合(例如，唆菌體呈 白/ )引入合適動物（例如，小鼠）中，且在足以使蛋 白辦活性起作用之pq、a 4 — 之T間過後，回收肽或多肽之集合。在另 ：中’用多肽之集合(例如，噬菌體呈現庫或譜系)灌 ,吕或，，且，哉且在足以使蛋白酶活性起作用之時間過 後’回收多肽之集合。 k養後’可基於諸如結合活性之想要之生物活性選擇蛋 白酶抗性肽或多肽。必要時’可在選擇之前添加蛋白酶抑 制劑。可使用大體上不會干擾選擇方法之任何合適蛋白酶 抑制劑（或兩種或兩種以上蛋白酶抑制劑之組合）。合適蛋 白酶抑制劑之實例包括α1_抗胰蛋白酶、α2_巨球蛋白、阿 馬他疋（amastatin)、抗痛素（antipain)、抗凝血酶m、抑肽 酶、4-(2-胺基乙基）苯磺醯氟鹽酸鹽（AEBSF)、（4_腩基_笨 基）-甲烷-磺醯氟（APMSF)、貝他定（bestatin)、苯甲脉、抑 凝乳蛋白酶素、3,4-二氯異香豆素、氟磷酸二異丙酯 (DIFP)、E-64、乙二胺四乙酸（EDTA)、彈性蛋白酶抑制劑 (elastatinal)、亮肽素、N-乙基馬來醯亞胺、苯基曱基磺醯 氟（pMSF)、胃酶抑素、1，1 〇-菲羅琳（phenanthroline)、膦 131418.doc -61 - 200911834 醯二肽（phosphoramidon)、絲胺酸蛋白酶抑制劑、n_甲苯 磺醯基-L-離胺酸-氣甲基酮（TLck)、Na-甲苯磺醯基_phe-氯甲基酮（TPCK)及其類似物。另外，可在購得許多含有數 類蛋白轉抑制劑之製劑（例如，Roche Complete Protease
Cocktail Tablets™(Roche Diagnostics
Corporation; Indianapolis，IN, USA)，其抑制胰凝乳蛋白 酶、嗜熱菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、鏈黴蛋白酶、胰腺提取 物及胰蛋白酶）。 可使用想要之生物活性選擇方法選擇蛋白酶抗性肽或多 肽，該方法可將具有想要之生物活性之肽及多肽與不具有 想要之生物活性之肽及多肽區分且加以選擇。通常，已經 被蛋白酶消化或裂解之肽或多肽喪失其生物活性，而蛋白 酶抗性肽或多肽仍具功能性。因此，可使用生物活性之適 合檢定選擇蛋白酶抗性肽或多肽。舉例而言，可使用適合 之結合檢定（例如ELISA，淘選）評估常見結合功能（例如結 °般配位體、結合特異性配位體或結合受質）^舉例而 言，可藉由淘選或使用適合親和力基質來選擇、分離及/ 或回收結合靶配位體或一般配位體諸如蛋白質a、蛋白質 L或抗體之多肽。可藉由向適合容器(例如試管、皮氏培養 凰（PetH dish))中添加配位體（例如—般配位體、靶配位
可使用諸如到削或降低pH之 之溶a”-·-——· 洗除 現庫 下。 1314l8.doc -62- 200911834 任何適合方法回收結合之多肽。 當使用噬菌體呈現系統時，可 ^ J以噬菌體ELISA測試結 \ 合。可根據任何適合程序執行嗟菌體咖。在一個實例 中，可由ELISA篩選與所選擇之起配位體或—般配位體結 合之各輪選擇所產生之嘆菌體群，以鑑別呈現蛋白酶抗性 肽或多肽之嗟菌體。必要時，可以例如藉由elisa使用例 如針對C端或N端標籤之試劑測試可溶性肽及多肽與靶配 位體或一般配位體之結合（參見例如Winter等人，（1994) d紙心v. /所则⑽/〇取12, 433_55及其中所引用之參考文 獻）。亦可由PCR產物之凝膠電泳（Marks等人，1991，同 上；Nissim等人 ’ 1994，同上）、探測（pr〇bing)(T〇mlins〇n 等人，1992, Μο/. 5ζ·0/· 227, 776)或藉由載體DNA之定序 評估所選擇之噬菌體之多樣性。 除對TNFR1具有特異性外，包含抗TNFR1蛋白酶抗性多 肽（例如’單一抗體可變區域）之拮抗劑或多肽（例如，雙特 異性配位體）可對一般配位體或任何想要之靶配位體具有 結合特異性’該一般配位體或靶配位體諸如人類或動物蛋 白質，包括細胞激素、生長因子、細胞激素受體、生長因 子受體、酶（例如’蛋白酶）、酶之輔因子、DNΑ結合蛋 白、月曰質及碳水化合物。 在一些實施例中，蛋白酶抗性肽或多肽（例如，dAb)或 拮抗劑結合肺組織t之TNFR1。在一實施例中，拮抗劑或 多肽亦結合肺組織中之另一靶。 當在本文中所述之方法中使用呈現系統（例如，使核酸 131418.doc -63· 200911834 馬力月b與由核酸編碼之肽或多肽之功能特徵相關聯的 呈見系統）k ϋ曾或增加編碼所選擇之狀或多狀之核酸 的複本數通常有利。此提供獲得足夠數量之供使用本文中 所述之方法或其他合適方法之其他輪選擇用或供製備其他 譜糸（例如，親和力成熟譜系）用之核酸及/或肽或多肽的有 效方式。因此’在一些實施例中，該等方法包含使用呈現 系統（例如，使核酸之編碼功能與由核酸編碼之狀或多狀 之功能特徵相關聯之呈現系統，諸如嗔菌體呈現)，且進 一步包含擴增或增加編碼所選擇之肽或多肽之核酸的複本 數。核酸可使用任何合適方法、諸如藉由嗤菌體擴增、細 胞生長或聚合酶鏈反應擴増。 本文中所述之方法可用作必要時可包含其他合適選擇方 :之分離蛋白酶抗性肽或多肽(例如，dAb)之程序的部 为。在該等情形中，可^e 了在程序之任何想要之點採用本文中 :斤述之方法，諸如使用其他選擇方法之前或之後。如本文 中所描述且例示，本t φ $、+、4 + i $文中料之方法亦μ於提供兩輪< 兩輪以上選擇。 ^ 在一實例中，該方法為撰煜 巧選擇抗彈性蛋白酶降解 肽（例如，dAb)，其包含提供肽^ 於彈性蛋白酶（或包含彈性I ώ ^ 在適 3彈性蛋白酶之生物製劑、提取物式 組織勻漿）蛋白水解分解之條 一 _組合，杉、與彈性蛋白 ㈣〃離及/或时抗彈性蛋 有TNFRm合活性之i❹肽。 轉且具 在特定實施例中，提供選擇 、伴机弹性蛋白酶降解且結合 131418.doc -64 - 200911834 ί TNFR1的免疫球蛋白單一可變區域（dAb)的方法。在該等 實施例中，提供包含dAb之庫或譜系且在適於彈性蛋白酶 (或包含彈性蛋白酶之生物製劑、提取物或組織勻漿）蛋白 水解分解之條件下使其與彈性蛋白酶組合。選擇特異性結 合TNFR1之彈性蛋白酶抗性dAb。舉例而言，彈性蛋白酶 抗性dAb當在37t下在〇.〇4%(w/w)彈性蛋白酶溶液中培養 至少約2小時之時間時大體上不降解。在—實施例中，彈 性蛋白酶抗性dAb當在37°C下在〇.〇4%(w/w)彈性蛋白酶溶 液中培養至少約12小時之時間時大體上不降解。在一實施 例中，彈性蛋白酶抗性dAb當在37t下在〇〇4%(w/⑼彈性 蛋白酶溶液中培養至少約24小時、至少㈣小時或至少約 48小時之時間時大體上不降解。 在實施例中H共一寿重選擇抗彈性蛋白酶降解且結合 的免疫球蛋白單-可變區域（dAb)的方法。該方: 包含提供包含多肽譜系之嗟菌體呈現系統，該等多狀包含 免疫球蛋白單—可變區域，使剌體呈⑽、統與彈性蛋白 酶（約100 Pg/m!)組合且將混合物在約37。〇下培養（例如）隔 仪（例如約12 -1 6小時、，75 p，左你、联神η t)及Ik後選擇呈現特異性結合TNFR1 之dAb的噬菌體。 在實例中，提供-種選擇抗白血球酶降解之狀或多狀 (例如，dAb)之方法，該方法包含提供肽或多肽之庫或譜 糸，在適於白血球酶蛋白(或包含白血球酶之生物製劑、 ^取物或組織W)水解分解之條件下使庫或譜系與白血 无、組合’及選擇、分離及/或回收抗白血球酶降解且具 131418.doc -65- 200911834 有特異性TNFR1結合活性之肽或多
dAb當在37°C下在〇.〇4%(w/w)白血球酶溶液中培養至少約2 白血球酶抗 令培養至少 小時之時間時大體上不降解。在一實施例中，白j 性dAb虽在37 C下在〇_〇4%(w/w)白血球酶溶液中转 約12小時之時間時大體上不降解。在一實施例中， 酶抗性dAb當在37。〇下在〇.〇4%(w/w)白血球酶溶液中培養 至少約24小時、至少約36小時或至少約48小時之時間時大 體上不降解。 在一實施例中，提供選擇抗白血球酶降解且特異性結合 TNFR1的免疫球蛋白單一可變區域（dAb)的方法。該方法 包含提供包含多肽譜系之噬菌體呈現系統，該等多肽包含 免疫球蛋白單一可變區域，使噬菌體呈現系統與白血球酶 (約100 gg/ml)組合且將混合物在約3rc下培養（例如）隔夜 (例如約12 -1 6小時），及隨後選擇呈現特異性結合τ N F r丨之 dAb的噬菌體。 在另一實例中，提供選擇抗胰蛋白酶降解之肽或多狀 (例如，dAb)之方法，該方法包含提供肽或多肽之庫或譜 系’在適於胰蛋白酶（或包含胰蛋白酶之生物製劑、提取 131418.doc -66 - 200911834 物或組織勻漿）蛋白水解降解之條件下使庫或譜系與胰蛋 白酶組合’及選擇、分離及/或回收抗胰蛋白酶降解且特 異性結合TNFR1之肽或多肽。 f 在特定實施例中’提供選擇抗胰蛋白酶降解且特異性結 合TNFR1的免疫球蛋白單一可變區域（dAb)的方法。在該 等實施例中，提供包含dAb之庫或譜系且在適於胰蛋白酶 (或包含騰蛋白酶之生物製劑、提取物或組織勻衆）蛋白水 解降解之條件下使其與胰蛋白酶組合。選擇結合tnfr12 胰蛋白酶抗性dAb。舉例而言，胰蛋白酶抗性dAb當在 3 7°C下在0.04%(w/w)胰蛋白酶溶液中培養至少約2小時之 時間時大體上不降解。在-實施例中，胰蛋白酶抗性Z 當在37°C下在0.04%(w/w)胰蛋白酶溶液中培養至少約^小 時之時間時大體上不降解。在-實施例中，騰蛋⑽抗性 dAb當在37C下在0.04%(w/w)胰蛋白酶溶液中培養至少約4 小時、至少約5小時、至少約6小時、至少約?小時、至少 約8小時、至少約9小時、至少約1〇小時、至少和小時或 至少約12小時之時間時大體上不降解。 在一例示性實施例中，提供選擇枋腌 <伴机胰蛋白酶降解且特異 性結合TNFR1的免疫球蛋白單一可轡 J I h域（dAb)的方法。 該方法包含提供包含譜系之噬菌體呈 見糸統，該等多肽包 含免疫球蛋白單一可變區域，使噬菌 巫固體呈現系統與胰蛋白 酶（100 pg/ml)組合且將混合物在的 下培養（例如）隔夜 (例如約12-16小時），及隨後選擇呈 現特異性結合TNFR1之 dAb的噬菌體。 < 131418.doc -67- 200911834 另----4；y 11 ^ ’ k供產生蛋白酶抗性肽或多肽（例如， dAb)°曰系之方法。該方法包含提供肽或多肽譜系；在適於 蛋白酶活性之你彼丁 # '、午下使肽或多肽譜系與蛋白酶組合；及回 收複數種特異性沾人了XTm 注〜s TNFR1之肽或多肽；藉此產生蛋白酶 抗性狀或多狀言益备 、*; m θ系。適用於方法中之蛋白酶、呈現系統、 蛋白酶活性之侔杜β、西 ’令件及選擇肽或多肽之方法係在本文中相對 於其他方法描述。 在-些實施例中，使用包含肽或多肽譜系之呈現系統 (例如|核^之編碼功能與由核酸編碼之肽或多狀之功 能特徵相關聯的呈現系統），且該方法進—步包含擴增或 增加編碼複數種所選擇之肽或多肽之核酸的複本數。核酸 可使用任何α適方法、諸如藉由嗟菌體擴增、細胞生長或 t合柄鍵反應加以擴增。 在特定實施例中，提供產生包含抗tnfri⑽之蛋㈣ 抗性多肽之譜系的方法。該方法包含提供包含心之多狀 譜系；在適於蛋白酶(例如，胰蛋㈣、彈性蛋白酶、白 血球酶）活性之條件下使肽或多肽譜系與蛋白酶組合；及 回收複數種包㈣™FR#有結切異性之⑽之多狀。 該方法可詩產生未經處理之譜系或偏向於想要之結合特 異，之❹、，諸如基於對挪幻具有結合特異性之親本 dAb的親和力成熟譜系。 多肽呈現系統 在一實施例中，提供用於本文令 〇 人甲所述之方法中之肽或多 狀之谱系或庫包含合適呈現系統。 呈現系統可抗蛋白酶 131418.doc •68- 200911834 =口’單-蛋白酶或蛋白酶之組合及具有蛋白水解活性 任何生物提取物、組織勾聚或製劑(例如，痰 二’胃黏液、鼻黏液、支氣管黏液)、支氣管肺泡灌洗 攻肺組織勻漿、肺提取物、胰腺提取物、田 „ . 7 月液、唾液、 …其類似物))降解。在一實施例t，呈現系統及呈現 糸統與所呈現多肽之間的關聯為至少與譜系之 肽或多肽一樣抗蛋白酶。此使得編碼所選擇之呈現多：疋 核酸易於分離及/或擴增。 夕之 在一實例中’可自溶液中或共價或非共價連接於合適表 面（诸如塑膠或玻璃（例如’微量滴定板、多肽陣列，諸如 微陣列））之肽或多肽（例如’ dAb)譜系選擇、分離及/或回 收蛋白酶抗性肽或多肽。舉例而t，可使用以將各不同庫 成員(例如’獨特肽序列)置放在陣列離散預定位置上之方 式位於表面上之肽陣列。可由其在陣列中之空間位置碟定 該陣列中之各庫成員之-致i可衫陣列中發生（例如） 乾配位體與活性庫成員之間的結合相互作用之位置，從而 基於空間位置鑑別活性成員之序列。（例如參見，美國專 利第 5,243,854號、W0 90/15〇7〇及貨〇 92/1〇〇92。） 在-實施例中，方法採用使核酸之編碼功能與由核酸編 碼之多R之物王里、化學及/或工力能特徵相關聯之呈現系 統。該呈現系統可包含複數種可複製基因組，諸如嗔菌體 或細胞（細菌）。在-實施例中，呈現系統包含庫諸如嗟 菌體呈現庫。 已描述許多合適噬菌體呈現系統（例如，單價呈現及多 131418.doc -69 - 200911834 價呈現系統）。（例如參見’ Griffiths等人，美國專利第 6,555,3 13 B1號（以引用之方式併入本文中）；Johnson等 人，美國專利第5,733,743號（以引用之方式併入本文中 McCafferty等人，美國專利第5,969，108號（以引用之方式併 入本文中）；1^14牡11-1^11〇6，美國專利第5,702,892號（以 引用之方式併入本文中）；Winter，G.等人，.及ev. Immunol. 12:433-455 (1994) ； Soumillion, Ρ. ^ Λ > Appl. Biochem. Biotechnol. 47(2-3): 175-189 (1994) ； Castagnoli, L.專尺，Comb. Chem. High Throughput Screen, 4(2).· \2\- 133 (2001)。）呈現於嗟菌體呈現系統中之肽或多肽可呈現 於任何合適噬菌體上’諸如絲狀噬菌體（例如，、M丨3、 FI)、裂解性噬菌體（例如，Τ4、T7、λ)或RNA噬菌體（例 如，MS2) 〇 通常產生或提供以與合適噬菌體外殼蛋白（例如，w ρΙΠ 蛋白）形成之融合蛋白形式呈現肽或噬菌體多肽譜系之嗟 菌體庫。融合蛋白可在嗟菌體外殼蛋白之尖端或必要時在 内部位置呈現肽或多肽。舉例而言，所呈現之肽或多肽可 存在於pill之區域丨之胺基未端位置。（ρΙΙΙ之區域i亦稱為 N1。）所呈現之多肽可與pIII直接融合（例如，ρΙΠ之區域工 之N-末端）或使用連接子與？111融合。必要時，融合物可進 一步包含標籤（例如，myc抗原決定基' His標籤）。可使用 任何合適方法產生包含以與噬菌體外殼蛋白形成之融合蛋 白形式呈現之肽或多肽譜系之庫，該等方法諸如藉由將編 碼所呈現之肽或多肽之噬菌體載體或噬質體（phagemid)載 131418.doc -70- 200911834 體庫引入合適宿主細喆由 , 、’ ，且培養所得細菌以產生噬菌體 (例如’必要時使用合適輔 諾姑 、稀助噬菌體或互補質體可使用 邊如沈澱及離心之铵彳人 庫。 σ、方法自培養物中回收噬菌體 呈現系統可包含含有任何 碰 j μ要之里之多樣性的肽或多肽 。例而言’譜系可含有胺基酸序列對應於由生物 /、生物體群㈣，自駱駝類分離之vH“Ab序列之譜 糸）、想要之組織或想要之細胞類型表現之天然存在之多 肽的肽或多肽, 次了 3有具有隨機或隨機化之胺基酸序列之 肽或多肽必要時’多肽可共享共同核心或骨架。該譜系 ㈣庫中之多肽可包含具有隨機或隨機化之胺基酸序列之 規定區及*見胺基酸序列區。在某些實施例中，譜系中之 所有或大體上所有多肽具有想要之類型，諸如想要之酶 (例如，聚合酶）或想要之抗體之抗原結合片段（例如，人類 VH或人類Vl)。在實施例中，多肽呈現系統包含多肽譜 系，其中各多肽包含抗體可變區域。舉例而言，譜系中之 各多狀可含有VH、VL或Fv(例如，單鏈FV)。 可使用任何合適方法將胺基酸序列多樣性引入肽或多肽 或骨条之任何想要之區中。舉例而言，可藉由使用任何合 適突變誘發方法（例如，低保真度PCR、募核苷酸介導之突 變誘發或定位突變誘發，使用NNK密碼子多樣化）或任何 其他合適方法製備編碼多樣性多肽之核酸庫將胺基酸序列 H #引入乾區、諸如抗體可變區域或疏水性區域之互補 判定區中。必要時，可隨機化待要使多樣化之多肽之區。 131418.doc -71 · 200911834 構成譜系之多肽之尺寸基本上為一個需要選擇之問題， 且不需要均一的多肽尺寸。在一實施例令，譜系中之多肽 具有至 > 二級結構（形成至少一個區域）。 選擇/分離/回收 可使用任何合適方法自譜系或庫（例如，於呈現系統中） 選擇、分離及/或回收蛋白酶抗性肽或多肽（例如，蛋白酶 抗性多肽群體）。在一實施例中，基於可選擇之特徵（例 如’物理特徵、化學特性、功能特徵）選擇或分離蛋白酶 f 抗性多肽。合適之可選擇之功能特徵包括譜系中之肽或多 肽之生物活性，例如與一般配位體（例如，超抗原）之結 合、與靶配位體（例如，抗原、抗原決定基、受質）之結 合、與抗體之結合（例如，經由肽或多肽上所表現之抗原 決定基），及催化活性。（例如參見，Tomlins〇n等人，w〇 99/20749、WO 01/57065、WO 99/58655。）在一實施例 中’選擇係基於特異性結合TNFR1。在另一實施例中，選 擇係基於所選擇之功能特徵以產纟成員具有$白酶抗性之 v 第二譜系，接著自該第二譜系中選擇特異性結合TNFR1之 成員。 在一些實施例中，自大體上所有蛋白酶抗性肽或多肽共 享常見之可選擇之特徵的肽或多肽之庫或譜系選擇及/或 分離蛋白酶抗性肽或多肽。舉例而言，蛋白酶抗性肽或多 肽可選自大體上所有蛋白酶抗性肽或多肽結合常見一般配 位體、結合常見靶配位體、結合常見抗體（或由常見抗體 結合）或具有常見催化活性之庫或譜系。該類型之選擇尤 131418.doc -72- 200911834 多肽蛋 一可變 其適用於製備基於具有想要之生物活性的親本肽或 白酶抗性肽或多肽譜系，例如當執行免疫球蛋白單 區域之親和力成熟化作用時。 體：：：！見一般配位體之結合選擇可產生含有所有或大 體上所有為原始庫或错系之組分之蛋白酶抗性肽或多狀之 肽或多肽集合或群體。舉例而言，可藉由淘選或使用合適 親和力基質選擇、分離及/或回收結合靶配位體或諸如蛋
白質A、蛋白質l之或一般配位體或抗體之狀或多狀。可 藉由向合適容器（例如，# # . ^ ^ „ °式s、皮氏培養皿）中添加配位體 (例如…般配位體、配位體）之溶液且使配位體變得沈 積或塗佈於各器壁上來實現淘選。可洗除過量配位體且可 向容器中添加肽或多肽(例如，已與蛋白酶一起培養之譜 系）且將4器維持在適於肽或多肽結合固定配位體之條件 下。可洗除未結合肽或多肽且可使用諸如刮削或（例如）降 低P Η值之任何合適方法回收結合肽或多肽。 〇適配位體親和力&質通常含冑配位冑共價或非共價連 接之固體支撐物或珠粒(例如’瓊脂糖)。可使用分批法、 e柱法或任i可其他合適方法在適於使肤或多狀與基質上之 配位體結合的條件下使親和力基質與肽或多肽（例如，已 /、蛋白酶起培養之譜系）組合。可洗除未結合親和力基 質之狀或多肽’ 彳使用任何合適方法溶離及回收結合狀 或多肽，該合適方法諸如用較低pH值之緩衝液、用溫和變
(例如尿素）或用競爭以與配位體結合之肽進行溶 難^。實 Y歹丨I Ψ ， I,. .X Λ』甲在適於譜系中之肽或多肽結合靶配位體 131418.doc -73. 200911834 (TNFR1)之條件下使生物素標記乾配位體與譜系組合。使 用固定抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素（例如，在珠粒 回收結合肽或多肽。 在-些實施例中，一般配位體為抗體或其抗原結合片 段。結合在庫或譜系之肽或多肽中大體上為保守的肽或多 肽之結構特徵之抗體或抗原結合片段尤其適合作為一般配 位體適口用作分離、選擇及/或回收蛋白酶抗性狀或多 肽之配位體之抗體及抗原結合片段可為單株或多株，且可 使用任何合適方法製備。 庫/譜系 在其他態樣中，提供蛋白酶抗性肽及多肽譜系，編碼蛋 白酶抗性肽及多肽之庫及產生該等庫及譜系之方法。 可使用任何合適方法製備或獲得編碼及/或含有蛋白酶 抗性肽及多肽之庫。該庫可基於所關注之肽或多肽（例 如，選自庫之抗TNFR1肽或多肽）經設計以編碼蛋白酶抗 性肽或多肽，或可使用本文中所述之方法選自另一庫。舉 例而言，可使用合適之多肽呈現系統製備富集蛋白酶抗性 多肽之庫。 在實例中，如本文中所述，在適於蛋白酶活性條件下 使包含呈現多肽（包含免疫球蛋白單一可變區域（例如， VH、νκ、νλ))之譜系的噬菌體呈現庫與蛋白酶組合。基於 想要之生物活性’諸如結合活性（例如，結合一般配位 體、結合乾配位體）回收蛋白酶抗性多肽，從而產生富集 蛋白酶抗性多肽之嗤菌體呈現庫。在一實施例中，回收係 131418.doc -74- 200911834 基於結合一般配位體以產生富集庫，接著基於特異性結合 TNFR1選擇該庫之抗TNFR1成員。
V 在另一實例中，首先篩選包含呈現多肽（包含免疫球蛋 白單-可變區域(例如，VH、νκ、νλ))之譜系的噬菌體呈 現庫以鑑別譜系中對想要之靶抗原（TNFR1)具有結合特異 性之成員。回收具有想要之結合特異性之多肽集合，且如 本文中所述，在適於蛋白水解活性之條件下使集合與蛋白 酶組合。回收具有想要之靶結合特異性之蛋白酶抗性多肽 集合，從而產生富集蛋白酶抗性且高親和力多肽之庫。如 本文在另-實施例中所述’該選擇方法中之蛋白酶抗性與 南親和力結合相關。 可使絲何合適方>去容易i也產生編碼想要類型之多狀譜 系之庫。舉例而t，可獲得編碼想要類型之多狀（例如°，曰 聚合酶、免疫球蛋白可變區域）之核酸序列，且可（例如）藉 由使用易於出錯之聚合酶鏈反應（PCR)系統擴增核酸、藉 由化學突變誘發（Deng等人，乂价〇/ c心所，269:95333 (1994))或使用細菌突變菌株（L〇w等人，乂万⑹ 260:359 (1996))製備各含有-或多個突變之㈣n 在其他實施例中’可把向核酸之特定區以供多樣化。使 所選位置產生突變之方法亦為此項技術所熟知且包括(例 ^在使用或不使用PCR之情況下❹錯配募料酸或簡併 寡核苷酸。舉例而言，已藉由使突變靶向抗原結合環建立 合成抗體庫。已將隨機或半隨機抗體H3&l3區附加至生 殖系免疫球蛋白V基因片段以產生具有未突變構架區之大 131418.doc -75- 200911834 庫（Hoogenboom及 Winter (1992)同上；Nissim 等人，（1994) 同上；Griffiths 等人，（1994)同上；DeKruif 等人，（1995) 同上）。已擴展該多樣化以包括部分或所有其他抗原結合 環（Crameri 等人，（1996) Mei/.，2:100 ; Riechmann 等 k ’（1995) Bi〇/Technology，13:475 ； Morphosys, WO 97/083 20 ’同上）。在其他實施例中，可例如由採用第一 PCR產物作為"大引子（mega-primer)"之兩步PCR策略靶向 核酸之特定區以供多樣化。（例如參見，Lancjt，〇·等人， 96.125-128 (1990)。）亦可（例如）由 s〇E PCR實現靶向 多樣化。（例如參見，Horton，R.M.等人，仏狀77:61-68 (1989)。） 所選擇位置處之序列多樣性可藉由改變指定多肽序列之 編碼序列以便可在該位置併入許多可能的胺基酸（例如， 所有20種或其子集）來實現。使用IUPAC命名法，最通用密 碼子為NNK，其可編碼所有胺基酸以及tag終止密碼子。 可使用NNK密碼子以引入所需之多樣性。亦使用實現相同 終端之其他密碼子，包括NNN密碼子，其使得產生其他終 止狁碼子TGA及TAA。該靶向方法可使完全序列空間處於 待探索之靶區域内。 該等庫可包含具有已知主鏈構形之蛋白酶抗性抗體多 肽。（例如參見，Tomlinson等人，w〇 99/2〇749。） 庫可在α適質體或载體中製備。如本文中所使用，載體 係指用於將異源DNA引Α細胞+以用於其表現及/或複製 之離散元件。可使用任何合適載體，包括質體（例如，細 131418.doc -76- 200911834 菌質體）、病毒或嗤菌體載體、人造染色體及游離型載 體。可使用該等载體進行簡單的選殖及突變誘發，或可使 用表現載體驅動庫表現。載體及質體通常含有-或多個選 ::點(例如，多接頭)、複製起點及至少一個可選擇標記 物基因。表現載體可進一步含有驅動多肽轉錄及轉譯之元 件，諸如增強子兀件、啟動子、轉錄終止信號、信號序列 及其類似物。該等元件可以可操作性連接於編碼多狀之經 選殖插入物以致當該表現载體維持在適於表現之條件下 (例如，在合適宿主細胞中）時表現且產生多肤的方式排 列。 選殖及表現載體通常含有使得載體能夠複製於—或多個 所選擇之宿主細胞中之核酸序列。在選殖載體中，該序列 通常為使得載體能夠獨立於宿主染色體D N A複製之序列且 包括複製起點或自發複製序列。對於多種細菌、酵母及病 毒，該等序列為吾人所熟知。質體卿322之複製起點適 於大多數革蘭氏陰性菌（G職-negative bacteHa) ’ 2微米質 L體起點適於酵母，且多種病毒起點（例如，sv4G、腺病毒） 適用於在哺乳動物細胞中選殖載體。哺乳動物表現載體通 吊不需要硬製起點，除非該等表現載體用於能夠複製高級 DNA之哺乳動物細胞（諸如cos細胞）中。 選殖或表現載體可含有亦稱為可選擇標記物之選擇基 因。該等標記物基因編碼為在選擇性培養基中生長之轉型 宿主細胞之存活或生長所需的蛋白質。因此，未經含有選 擇基因之載體轉型之宿主細胞在培養基中將不能存活。典 131418.doc -77· 200911834 型選擇基因編碼帶有抗生素及其他毒素（例如，胺苄西林 (ampicillin)、新黴素、曱胺喋呤或四環素）抗性、互補營 養缺陷不足或不可在生長培養基中供應關鍵營養物之蛋白 質。 σ適表現載體可含有許多組分，例如複製起點、可選擇 心己物基因 或多個表現控制元件（諸如轉錄控制元件 :例如，啟動子、強化子、終止子))及/或一或多個轉譯信 號、信號序列或前導序列及其類似物。表現控制元件及信 號或前導序列存在時可由載體或其他來源提供。舉例而 吕，可使用編碼抗體鏈之選殖核酸之轉錄及/或轉譯控制 序列引導表現。 可提供啟動子以表現於想要之宿主細胞中。啟動子可為 組成性或可誘導性啟動子。舉例而言，啟動子可可操作性 連接於編碼抗體、抗體鏈或其部分之核酸，如此其引導核 酸轉錄。可利用多種合適啟動子，對於原核宿主（例如， 對於大腸桿菌（E. c〇li)為内醯胺酶及乳糖啟動子系統、 鹼性磷酸酶、色胺酸（trp)啟動子系統、^、丁3、丁7 啟動子）及對於真核宿主（例如’猿猴病毒4G早期或晚期啟 動子、勞氏肉瘤病毒（R〇us sarc〇ma virus)長末端重複序列 啟動子、細胞巨大病毒啟動子、腺病毒晚期啟動子、eg_ 1 a啟動子）。 另外，表現載體通常包含選擇運載載體之宿主細胞之可 選擇標記物’且在可複製表現載體之狀況下，包含複製起 點。編碼帶有抗生素或藥物抗性之產物之基因為常見之可 131418.doc •78- 200911834 選擇標記物且可用於原核細胞（例如，β_内醯胺酶基因（胺 节西林抗性）、Tet基因（四環素抗性））及真核細胞（例如，新 徽素（G418或遺傳黴素）、gpt(麥考酚酸）、胺苄西林或潮黴 素抗性基因）中。二氫葉酸還原酶標記物基因准許在多種 宿主中用甲胺喋呤選擇。編碼宿主之營養缺陷標記物之基 因產物的基因（例如，LEU2、URA3 ' HIS3)通常用作酵母 中之可選擇標記物。亦涵蓋使用病毒（例如，桿狀病毒）或 嗟菌體載體及能夠整合於宿主細胞基因組中之載體，諸如 反轉錄病毒載體。 適於表現於原核細胞（例如，細菌細胞，諸如大腸桿菌） 或哺乳動物細胞中之表現載體包括（例如）pET載體（例如， pET-12a、pET-36、pET-37、pET-39、pET-40、Novagen及 其他）、噬菌體載體（例如，pCANTAB 5 E，Pharmacia)、 pRIT2T(蛋白質 A 融合載體，Pharmacia)、pCDM8、 pCDNAl.l/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、pEF-l(Invitrogen,
Carlsbad, CA) 、 pCMV-SCRIPT 、 pFB 、 pSG5 、 pXTl(Stratagene，La Jolla，CA)、pCDEF3(Goldman, L.A.等 人，Biotechniques， 27:1013-1015 (1996)) ' Psvsport (GibcoBRL, Rockville, MD)、pEF-Bos (Mizushima, S.,等 人，Nucleic Acids Res.，18:5322 (1990))及其類似物。可利 用適於用於多種表現宿主中之表現載體，該等宿主諸如原 核細胞（大腸桿菌）、昆蟲細胞（果蠅史奈德S2細胞 (Drosop/n'/a Schnieder S2 cells)、Sf9)、酵母（嗜甲醇酵母 (P. mei/zizwo/ica)、馬斯德畢赤酵母（Ρ· 、釀酒酵母 131418.doc -79- 200911834 (51· cerevzWae))及哺乳動物細胞（例如，COS細胞）。 載體之實例為使得能夠表現對應於多肽庫成員之核普酸 序列之表現載體。因此，可藉由使表現多肽庫成員之單一 純糸獨立繁殖及表現執行用一般及/或把配位體進行之選 擇。如上所述’選擇呈現系統可為噬菌體呈現。因此，可 使用噬菌體或噬質體載體。例示性載體為具有大腸桿菌複 製起點（用於雙鏈複製）以及唆菌體複製起點（用於產生單鏈 DNA)之噬質體載體。該等載體之操作及表現在此項技術 〆 中為熟知的（Hoogenboom 及 Winter (1992)同上；Nissim 等 人（丨994)同上）。簡s之，載體可含有賦予嗤質體選擇性 之β-内醯胺酶基因及在表現卡g上游可含有合適前導序 列、多個選殖位點、-或多個肽標鐵、—或多個丁ag終止 密碼子及嗤菌體蛋白質ρΙΠ之lac啟動子。因此，使用大腸 桿菌之多種抑制因子及非抑制因？菌株且添加葡萄糖、異 丙基硫基·β·ϋ_半乳㈣（IPTG)或輔助”體，諸如吧 MU，該載體能夠以質體形式複製而不表現，來產生大量 僅多肽庫成員或產物嗤菌體，其中一些在其表面上含有： 少一個多肽-pill融合物複本。 本文中所述之庫及譜系可含有抗體格式。舉例而言，庫 及谱系中所含之多肽可為整個獨立的^或火區域，其任一 係經㈣或未經修飾。可使用任何合適方法容易地產生 ===體，。此_中熟知許多合適抗 +而°，SCFV可藉由使編碼兩個可變區 ”編碼適當連接子肽（諸如（Gly_Giy_Gly_⑴y_ 131418.doc •80- 200911834
Ser)3或其他合適連接子肽）之合適寡核苷酸相連接而形 成。連接子橋接第一 V區C-末端與第二V區N-末端。可使 用構造諸如FV、Fab及F(ab，)2片段之其他抗體格式之類似 f術為編排格式Fab及F(ab')2片段，可使VH及VL多肽與 可自重排基因、生殖系c基因分離或由抗體序列資料合成 之匣疋區片段組合。本文中所述之庫或譜系可為％或&庫 或譜系。 包含蛋白酶抗性可變區域之多肽可包含靶配位體 ((TNFR1)結合位點及—般配位體結合位點。在某些實施例 中 般配位體結合位點為諸如蛋白質A、蛋白質L或蛋 白質G之超抗原之結合位點。可變區域可基於任何想要之 可變區域，例如人類Vh(例如，Vh la、Vh lb、％ 2、％ 3、VH 4、VH 5、Vh 6)、人類 ％(例如，％、、 νλΙΙΙ、νλΐν、νλν、νλνΐ 或 νκ1)或人類 νκ(例如，νκ2、 VK3、VK4、Vk5、VK6、VK7、VK8、VK9或 VK10)或視情況經 人化之駱,ts類vHH 〇 v 產生蛋白酶抗性多肽之核酸、宿主細胞及方法 本發明係關於編碼（例如）由本文中所述之方法可選擇或 選擇之蛋白酶抗性肽或多肽的經分離及/或重組核酸。 本文中稱為’’經分離"之核酸為已其原始環境中（例如，細 胞中或諸如庫之核酸混合物中）之其他物質（例如，其他核 酸，諸如基因組DNA、cDNA及/或RNA)遠遠分離之核酸。 經分離核酸可以載體（例如，質體）之部分形式分離。 本文中稱為”重組"之核酸為已由重組DNA方法產生之核 131418.doc 81 200911834 酸，該等方法包括依賴於諸如使用（例如）限制酶、同源重 組、病毒及其類似物選殖於載體或染色體中之人工重組 方法’及使用聚合酶鏈反應（PCR)製得之核酸。 本發明亦係關於重組宿主細胞，其包含（一或多個）包含 編碼蛋白酶抗性肽或多肽、例如由本文中所述之方法可選 擇或選擇之肽或多肽之核酸的重組核酸或表現構築體。亦 提供製造蛋白酶抗性肽或多肽之方法’其包含將本發明之 重組伤主細胞維持在適於表現蛋白酶抗性肽或多肽之條件 1 下。該方法必要時可進一步包含分離或回收蛋白酶抗性肽 或多肽之步驟。 舉例而言’可使用任何適合於所選擇之宿主細胞之方法 (例如，轉型、轉染、電穿孔、感染），將編碼蛋白酶抗性 肽或多肽之核酸分子（亦即，一或多個核酸分子）或包含該 (等）核酸分子之表現構築體（亦即，一或多個構築體）引入 合適宿主細胞中以建立重組宿主細胞，如此核酸分子可操 作性連接於一或多個表現控制元件（例如，於載體中、於 v 由諸多方法在細胞中產生之構築體中、整合於宿主細胞基 因組中）。可將所得重組宿主細胞維持在適於表現（例如， 在誘導物存在下、在合適動物中、在補充有適當鹽、生長 因子、抗生素、營養增補劑等之合適培養基中）之條件 下，藉此產生經編碼之肽或多肽。必要時，可分離或回收 (例如，自動物、宿主細胞、培養基、乳汁中）經編碼之肽 或多肽。該方法涵蓋表現於轉殖基因動物之宿主細胞中 (例如參見 ’ WO 92/03918，GenPharm International)。 131418.doc -82- 200911834 亦可在合適活體外表現系統中由化學合成或任何其他合 適方法產生由本文中所述之方法選擇之蛋白酶抗性肽或多 肽。因此，本發明提供蛋白酶抗性肽及多肽。 多肽、dAb及拮抗劑 如本文中所描述及例示，本發明之蛋白酶抗性心通常 以高親和力結合其把配位體。因此，在另一態樣中，提供 ‘擇刀離及/或回收以高親和力結合TNFR1之本發明之 多肽或d A b的方法。該方法通常包含提供肽或多肽(例如， dAb)之庫或譜系，在適於蛋白酶（例如，胰蛋白酶、彈性 蛋白酶、白血球酶、胰酶、痰）活性之條件下使該庫或該 譜系與蛋白酶組合，及選擇、分離及/或回收結合配位體 (例如，靶配位體)之肽或多肽。因為庫或譜系已在蛋白酶 敏感肽或多肽將會分解之條件下暴露於蛋白酶中，所以蛋 白酶之活性可肩除具有弱結合親和力之不太穩定的多肽， 且從而產生高親和力結合肽或多肽之集合。舉例而言，本 毛月之多肽或dAb可以1 μΜ或更強或約5〇〇 至約〇 5 之親和力（KD ;如由表面電漿共振所測定 KD=Koff(kd)/Kon(ka))結合TNFR1。舉例而言，本發明之多 肽或dAb可以約500 nM'約1〇〇 _、約ι〇 nM、約【m Μ〇〇ΡΜΐ100ρΜι1〇ρΜιΐρ_〇5ρ_ 矛力、。TNFR1。雖然吾人不受任何特定理論限制，但咸 仏，抗蛋白酶之肽及多肽具有較低熵及/或較高穩定能。 b蛋白酶抗眭與咼親和力結合之間的相關性可能與由 本文中所述之方法所選擇之肽及及多肽及_之表面緊密 131418.doc -83- 200911834 性及穩定性相關。 在一實施例中，本發明之多肽、dAb或拮抗劑以約500 nM至 50 pM、或 100 nM至 50 pM、或 10 nM至 100 pM、或 1 nM至1〇〇 pM，例如50 nM或以下、或5 nM或以下、或500 pM或以下、或200 pM或以下、或100 pM或以下之抑制濃 度50(IC50)抑制TNF α與TNF α受體I(p55受體）之結合。 在某些實施例中，多肽、dAb或拮抗劑以如由表面電毁 共振所測定300 nM至1 pM、或300 nM至5 pM、或50 nlv[至 1 pM、或 50 nM至 5 pM、或 50 nM至 20 pM、或約 1〇 pM、 或約15 pM、或約20 pM之解離常數（KD)特異性結合 TNFR1，例如人類TNFR1，且與人類TNFR1解離。在某些 實施例中’多肽、dAb或拮抗劑以如由表面電漿共振所測 定 5xl0_1 s·1 至 lxlO·7 s_1、或 lxl0_3 s-1 至 lxlO-7 、或 lxl〇·4 s 1 至 1 X 1 0-7 s-1、或 1 X 1 〇·5 s·1 至 1 X 1 〇_7 s·1、或 1 X 1 〇·4 s·1、或 1 X 10 5 s 1之Koff速率常數特異性結合TNFR1，例如人類 TNFR1，且與人類TNFR1解離。在某些實施例中，多肽、 dAb或拮抗劑以 lxl〇-3 至 1χ1〇-7 Μ、.！、或 1χ1〇_3 Μ—γ! 至 lxio—6 Μ·、-1、或約 lxio·4 、或約 1x1〇-5M-is-i 之
Kon特異性結合tnFRI，例如人類TNFR1。在一實施例 中，多肽、dAb或拮抗劑以如該段落中所詳細說明之解離 常數（KD)及K-特異性結合TNFR1，例如人類丁^^以，且 與人類TNFR1解離。在一實施例中，多肽、dAb或拮抗劑 以如該段落中所詳細說明之解離常數（Kd)及κ〇η特異性結 合TNFRi，例如人類TNFR1，且與人類tnfri解離。在一 131418.doc •84- 200911834 些實施例中，多肽或dAb以如該段落中所詳細說明之kd及/ 或Kcfi^/或尺⑽特異性結合TNFR1(例如，人類TNFR1)，且 包含與DOMlh-131-206之胺基酸序列（展示於圖3中）至少或 至少約 80。/〇、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98°/。或99。/。一致之胺基酸序列。 可將多肽、dAb或拮抗劑表現於大腸桿菌或畢赤酵母物 種（例如’馬斯德畢赤酵母）中。在一實施例中，當表現於 大腸桿菌或畢赤酵母物種（例如，馬斯德畢赤酵母）中時， 分泌至少約0.5 mg/L之量之配位體或dAb單體。雖然當表 現於大腸桿菌或畢赤酵母物種（例如，馬斯德畢赤酵母）中 時’可分泌本文中所述之配位體及dAb單體，但其可使用 任何合適方法產生，諸如合成化學方法或不採用大腸桿菌 或畢赤酵母物種之生物產生方法。 在一些實施例中’多肽、dAb或拮抗劑不包含駱駝類免 疫球蛋白可變區域或一或多個僅為駱駝類生殖系抗體基因 片段所編碼之免疫球蛋白可變區域所特有之構架胺基酸， 例如在位置1〇8、37、44、45及/或47處。 本發明之TNFR1之拮抗劑可為單價或多價拮抗劑。在一 些實施例中，拮抗劑為單價且含有一個與TNFRUg互作用 之結合位點，該結合位點由本發明之多肽或（1八1)提供。單 價拮抗劑結合一個TNFR!且可能不會誘導可引起受體活化 及信號轉導之細胞表面上之TNFR1的交聯或叢集。 在其他實施例中，TNFIU之拮抗劑為多價拮抗劑。 ™FR1之多價拮抗劑可含有兩個或兩個以上特定TNFR1結 131418.doc -85- 200911834 合位點複本或含有兩個或兩個以上結合TNFR1之不同結合 位點，該等結合位點中之至少一個由本發明之多肽或dAb 提供。舉例而言，如本文中所述，TNFR1之拮抗劑可為包 含兩個或兩個以上結合TNFR1之本發明之特定多肽或dAb 複本或兩個或兩個以上結合TNFR1之本發明之不同多肽或 dAb的二聚體、三聚體或多聚體。在一實施例中，TNFR1 之多價拮抗劑在標準細胞檢定中大體上不會激動 TNFR1(充當TNFR1之激動劑）（亦即，當以1 nM、10 nM、 100 nM、1 μΜ、10 μΜ、100 μΜ、1000 μΜ或 5,000 μΜ之 濃度存在時，在該檢定中產生不超過5%之由TNFa(100 pg/ml)誘導的TNFR1介導之活性）。 在某些實施例中，TNFR1之多價拮抗劑含有兩個或兩個 以上TNFR1之想要之抗原決定基或區域的結合位點。舉例 而言，TNFR1之多價拮抗劑含有兩個或兩個以上結合 TNFR1之區域1中之相同抗原決定基的結合位點。 在其他實施例中，TNFR1之多價拮抗劑含有兩個或兩個 以上結合TNFR1之不同抗原決定基或區域的由本發明之多 肽或dAb提供的結合位點。在一實施例中，在如 WO 200603 8027中所述之標準L929細胞毒性檢定或標準 HeLa IL-8檢定中，該等多價拮抗劑當以約1 nM、或約10 nM、或約100 nM、或約1 μΜ、或約10 μΜ之濃度存在時不 激動TNFR卜 TNFR1之其他拮抗劑不抑制TNFa與TNFR1之結合。因 為該等配位體（及拮抗劑）可用於結合且偵測、定量或量測 131418.doc -86- 200911834 樣品中之TNFR1且不會與樣品中之TNF競爭以結合 TNFR1，所以其可具有診斷劑之效用。因此，可進行樣品 中是否存在TNFR1或存在多少TNFR1之精確測定。 在其他實施例中，多肽、dAb或拮抗劑以本文中所述之 KD特異性結合TNFR1且在標準小鼠LPS/D-半乳糖胺誘發之 敗血性休克模型中抑制死亡（亦即，阻止死亡或與合適對 照相比，使死亡減少至少約1 0%)。在一實施例中，當投與 約5 mg/kg或以上，例如約1 mg/kg時，與標準小鼠LPS/D-半乳糖胺誘發之敗血性休克模型中之合適對照相比，多 肽、dAb或拮抗劑抑制死亡至少約25%或至少約50%。 在其他實施例中，多肽、dAb或拮抗劑結合TNFR1且在 標準細胞檢定中以$100 nM之ND5Q拮抗TNFR1之活性，且 在該檢定中，在$10 μΜ之濃度下，dAb激動TNFR1之活性 £5%。 在特定實施例中，多肽、dAb或拮抗劑在標準細胞檢定 中大體上不激動TNFR1(充當TNFR1激動劑）（亦即，在該檢 定中，當以 1 nM、10 nM、100 nM、1 μΜ、10 μΜ、100 μΜ、1000 μΜ或5,000 μΜ之濃度存在時，產生不超過約5% 之由TNFa(100 pg/ml)誘導之TNFR1介導之活性）。 在某些實施例中，當在慢性發炎性疾病模型中投與有效 量之本發明之多肽、dAb或拮抗劑時為有效的。有效量通 常為約1 mg/kg至約10 mg/kg(例如，約1 mg/kg、約2 mg/kg、約 3 mg/kg、約 4 mg/kg、約 5 mg/kg、約 6 mg/kg、 約 7 mg/kg、約 8 mg/kg、約 9 mg/kg或約 10 mg/kg)。熟習此 131418.doc -87- 200911834 員技術者⑽為丨更性發炎性疾病模型（參見w〇 8〇27中 所述之模型）可預測在人類中之治療功效。 -在特疋實施例中，多肽、dAb或拮抗劑在標準小鼠膠原 誘發之關節炎模型（關於模型之詳情，參見w〇 200603 8027)中為有效的。舉例而言，與合適對照相比， 才又與有效量之多肽、dAb或拮抗劑可使標準小鼠膠原誘發 之關節炎模型中四肢總和之平均關節炎評分減小（例如^約】 至約16、約3至約16、約6至約16、約9至約16或約12至約 f 1 6。在另一實例中，與合適對照相比，投與有效量之多 肽、dAb或拮抗劑可使標準小鼠膠原誘發之關節炎模型中 關節炎症狀之發作延遲（例如）約1天、約2天、約3天、約4 天、約5天、約6天、約7天、約1 〇天、約丨4天、約2 1天或 約28天。在另一實例中，投與有效量之多肽、dAb或拮抗 劑可在標準小鼠膠原誘發之關節炎模型中產生〇至約3、約 3至約5、約5至約7、約7至約15、約9至約1 5、約1 〇至約 1 5、約12至約1 5或約14至約1 5之四肢總和之平均關節炎評 \ 分。 在其他實施例中，多肽、dAb或拮抗劑在小鼠關節炎 △ ARE模型中為有效的（關於模型詳情，參見 WO 200603 8027)。舉例而言，與合適對照相比，投與有效 量之多肽、dAb或拮抗劑可使小鼠關節炎AARE模型之平均 關節炎評分減小（例如）約0.1至約2.5、約〇. 5至約2.5、約1 至約2.5、約0.5至約2.5、約1至約2.5、約1.5至約2.5或約2 至約2.5。在另一實例中，與合適對照相比，投與有效量 131418.doc -88 - 200911834 之多肽、dAb或拮抗劑可使小鼠關節炎△ ARE模型中關節炎 症狀之發作延遲（例如）約1天、約2天、約3天、約4天、約5 天、約6天、約7天、約10天、約14天、約21天或約28天。 在另一實例中，投與有效量之多肽、dAb或拮抗劑可在小 鼠關節炎ΔΑΙΙΕ模型中產生〇至約〇.5、約0.5至約1、約1至 約1.5、約1.5至約2或約2至約2.5之平均關節炎評分。 在其他實施例中’多肽、dAb或拮抗劑在小鼠發炎性腸 疾病（IBD)AARE模型中為有效的（關於模型詳情，參見w〇 2 0 0 6 0 3 8 0 2 7 )。舉例而言，與合適對照相比，投與有效量 之多肽、dAb或拮抗劑可使小鼠ibd AARE模型之平均急性 及/或丨艾性發炎評分減小（例如）約〇 · 1至約2.5、約〇. 5至約 2.5、約1至約2.5、約1.5至約2_5或約2至約2.5。在另一實 例中’與合適對照相比，投與有效量之多肽、dAb或拮抗 劑可使小鼠IBD ΔΑΙΙΕ模型中IBD症狀之發作延遲（例如）約 1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約 10天、約14天、約2 1天或約28天。在另一實例中，投與有 效量之多肽、dAb或拮抗劑可在小鼠IBD ^are模型中產生 0至約0.5、約0.5至約1、約1至約丨.5、約i 5至約2或約2至 約2.5之平均急性及/或慢性發炎評分。 在其他實施例中，多肽、dAb或拮抗劑在小鼠葡聚糖硫 酸鈉（DSS)誘發之IBD模型中為有效的（關於模型詳情，參 見WO 200603 8027)。舉例而言，與合適對照相比，投與有 效ΐ之多肽、dAb或拮抗劑可使小鼠IBD Dss模型中之平 均嚴重程度評分減小（例如）約〇丨至約2 5、約〇 5至約2 $、 131418.doc -89· 200911834 約1至約2.5、約1.5至約2.5或約2至約2.5。在另一實例中， 與合適對照相比，投與有效量之多肽、dAb或拮抗劑可使 小鼠IBD DSS模型中IBD症狀之發作延遲（例如）約1天、約2 天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約1 〇天、約 14天、約2 1天或約28天。在另一實例中，投與有效量之多 肽、dAb或拮抗劑可在小鼠IBD DSS模型中產生〇至約〇.5、 約0.5至約1、約1至約15、約15至約2或約2至約2.5之平均 嚴重程度評分。 在特定實施例中，多肽、dAb或拮抗劑在小鼠慢性阻塞 性肺疾病（COPD)煙草煙霧模型中為有效的（關於模型詳 情，參見 WO 200603 8027 及 WO 2007049017)。舉例而言， 與合適對照相比，投與有效量之配位體可減小或延遲 COPD症狀之發作。 可利用可用於篩選TNFR1之拮抗劑（例如，配位體、抗 體或其結合蛋白）在預防或治療疾病中之效力的動物模型 系統。此項技術已知關於測試易感小鼠之全身性紅斑狼瘡 (SLE)之方法（Knight 等人，（1978) 乂五147: 1653 ; Reinersten等人，（1978) π—五叹 j 299: 515)。藉由用來自另一物種之可溶性AchR蛋白質誘發疾病 在SJL/J雌性小鼠中測試重症肌無力（VIG)(Lindstrom等人， (1988)d办· /所衍⑽从，42: 233)。在小鼠之易感品系中藉由 注射11型膠原誘發關節炎（Stuart等人，（1984) ⑽〇/·，42: 233)。已描述藉由注射分枝桿菌熱休克蛋白 在易感大鼠中誘發佐劑關節炎之模型（Van Eden等人， 131418.doc •90· 200911834 (1988) iVfliwre, 331: 171)。如所述在小鼠中藉由投與曱狀 腺球蛋白誘發曱狀腺炎（Maron等人，（1980) J.丑即·从从 152: 1115)。胰島素依賴性糖尿病（IDDM)天然發生或可在 小鼠之某些品系中誘發，諸如如Kanasawa等人，（1984) 27: 113中所述之胰島素依賴型糖尿病。小鼠 及大鼠中之EAE充當人類之MS之模型。在該模型中，藉由 投與髓鞘鹼性蛋白誘發脫髓鞘疾病（參見Paters〇n (1986) rexMooA： 〇//所卿似Mischer 等人編，Grune and
Stratton，New York’ 第 179-213 頁；McFarlin等人，（1973) SW㈣179: 478 ;及 Satoh等人，（1987) J. /隨㈣0/, 138: 179)。 本發明配位體（例如，拮抗劑）通常將以純形式與藥理學 上適當之載劑一起使用。該等載劑通常包括水性或醇性/ 水性溶液、乳液或懸浮液，任何均包括生理食蠱水及/或 緩衝介質。非經腸媒劑包括氣化鈉溶液、林格氏右旋糖 (Ringer's dextrose)、右旋糖及氣化鈉及乳酸化林格氏液 (lactated Ringeris)。必要時保持多肽複合物呈懸浮狀之合 適的生理學上可接受之佐劑可選自增稠劑，諸如羧曱基纖 維素、聚乙烯》比嘻啶酮、明膠及海藻酸鹽。 靜脈内媒劑包括流體及營養物補充劑及電解質補充劑， 諸如基於林格氏右旋糖之彼等。亦可存在諸如抗菌劑、抗 氧化劑、螯合劑及惰性氣體之防腐劑及其他添加劑（河扣让 (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences ’ 第 16版）。可 使用多種合適調配物，包括延緩釋放調配物。 131418.doc -91 - 200911834 本發明之配位體（例如，拮抗劑）可以《 形式使用或與其他藥劑結合使用 ^與之組合物 疫治療荜物，諸#eh# μ專樂劑可包括多種免 療樂物肖如％抱素、甲胺噪吟、阿 疫毒素。㈣組合物可包括多種細胞毒性免 本發明之配位體或甚至不管在投藥 :、樂劑與 同特性的本發明之配位體(諸如使用不 有： 定基所選擇之配位體)之組合結合的"混合物，,?、3几原，、 本發明之醫藥組合物之投藥途徑 ^ ^ q•仏了為—般熟習此項技術 者i吊已知之任-投藥途徑。對於治療（包括不限於免疫 治療)而言，可根據標準技術向任何患者投與本發明之所 選擇之配位體。 投藥可藉由任何適當模式，包括非經腸、靜脈内、肌肉 内、腹膜内、經皮、經由肺途徑或亦適當地，藉由用導管 直接輸注。投_量及鮮應視患者之年齡、性別及病 症、其他藥物之並行投與、禁忌症及臨床醫師要考慮之其 他參數而$。如所指示，投藥可為局部（例如，藉由肺投 藥方向局部向肺傳遞，例如，鼻内投藥方向）或全身性。 本發明之配位體可經凍乾以便儲存且在使用之前於合適 載劑中復原。已經由習知免疫球蛋白展示該技術有效，且 可採用技術已知之㈣及復原技術。熟習此項技術者應瞭 解，凍乾及復原可導致不同程度之抗體活性損失（例如， 對於習知免疫球蛋白而言，IgM抗體傾向於比IgG抗體具有 較大之活性損失）且可能必須上調用量來補償。 含有本發明配位體（例如，拮抗劑）或其混合物之組合物 131418.doc -92- 200911834 可出於預防性及/或治療性治療目的而投與。在某些治療 應用中，所選擇細胞之群體足以實現至少部分抑制'抑 止、調節、殺死或一些其他可量測參數之量係定義為"治 療有效劑量"。達成該劑量所需之量應視疾病之嚴重程度 及患者自身免疫系統之一般狀態而定，但通常在每公斤體 重0.005 mg至5.0 mg配位體（例如dAb或拮抗劑）範圍内，其 中更通常使用0.05至2.0毫克/公斤/劑量之劑量。對於預防 性應用而言’亦可以類似或稍低劑量投與含有本發明配位 體或其混合物之組合物以預防、抑制或延遲疾病發作（例 如’維持症狀緩解或靜止期’或阻止急性期）。熟練的臨 床醫師應能夠確定治療、抑止或預防疾病之適當給藥間 隔。當投與TNFR1配位體（例如’拮抗劑）以治療、抑止或 預防慢性發炎性疾病時，可以（例如）約1 〇 pg/kg至約80 mg/kg、約 1〇〇 pg/kg 至約 80 mg/kg、約 1 mg/kg 至約 80 mg/kg、約 1 mg/kg 至約 70 mg/kg、約 1 mg/kg 至約 60 mg/kg、約 1 mg/kg 至約 50 mg/kg、約 1 mg/kg 至約 40 mg/kg、約 1 mg/kg 至約 30 mg/kg、約 1 mg/kg 至約 20 mg/kg 、約 1 mg/kg 至約 10 mg/kg、約 1〇 pg/kg 至約 1〇 mg/kg、約 1〇 pg/kg 至約 5 mg/kg、約 1〇 pg/kg 至約 2.5 mg/kg、約 1 mg/kg、約 2 mg/kg、約 3 mg/kg、約 4 mg/kg、 約 5 mg/kg、約 6 mg/kg、約 7 mg/kg、約 8 mg/kg、約 9 mg/kg或約1〇 mg/kg之劑量每天投與至多4次、每週兩次、 每週一次、每兩週一次、每月一次或每兩月一次。在特定 實施例中，以約10 pg/kg至約10 mg/kg(例如，約1〇 131418.doc -93- 200911834 叫/kg、約 100 pg/kg、約！ mg/kg、約 2 、約 3 mg/kg、約 4 mg/kg、約 5 mg/kg、約 6 mg/kg、約 7 mg/kg、 約8 mg/kg、約9 mg/kg或約1〇 mg/kg)之劑量每兩週一次或 每月一次投與TNFR1配位體（例如，拮抗劑）來治療、抑止 或預防慢性發炎性疾病。 右相對於治療之前所存在之一或多個症狀或相對於未經 該組合物或其他合適對照物治療之個體（人類或模型動物） 中之該或該等症狀，減少該或該等症狀（例如，減少至少 10%或臨床評估表上之至少一個點），則認為使用本文中所 述之組合物執行之治療或療法”有效％雖然症狀顯然將視 靶向之疾病或病症而變化，但其可由一般熟練的臨床醫師 或技師加以量測。該等症狀可（例如）藉由監測疾病或病症 之或夕個生化指標之含量（例如’與疾病、感染細胞數 目等相關之酶或代謝物之含量）、藉由監測物理表現症狀 (例如’發炎、腫瘤尺寸等）或藉由公認之臨床評估表量 測’該等評估表例如為擴展殘疾狀況評分表（Expanded Disabiluy Status Scale)(對於多發性硬化症）、歐文發炎性 腸疾病置表（Irvjne Inflammat〇ry Bowel Disease Questionnaire)(關於腸功能、全身性症狀、社會職能及感 情狀態之32點評估評估生活品質：評分在32至224範圍 内’其中較高評分指示較佳生活品質）、類風濕性關節炎 生’舌°0 質表（Quality of Life Rheumatoid Arthritis Scale)或 如該領域中已知之其他公認之臨床評估表。至少10%或給 定臨床表上之一或多個點之疾病或病症症狀之維持（例 131418.doc • 94- 200911834 ’一天或一天以上或更長）減少指示"有效"治療。類似 地’右相對於未經組合物治療之類似個體（人類或動物模 I)中之一或多個症狀，延遲、減少或消除該或該等症狀 發作或嚴重程度，則使用如本文中所述之組合物所執行 之預防，，有效”。 含有本發明之配位體（例如，拮抗劑）或其混合物之組合 物可在預防性及治療性情形下使用以幫助改變'滅活、殺 死或移除浦乳動物中所選擇之乾細胞群體。另外，可離體 f或活體外選擇性使用本文中所述之所選擇之多肽譜系以殺 死、排除或自細胞之異源集合有效移除靶細胞群體。可使 哺乳動物之血液與配位體離體組合，藉此根據標準技術殺 死或自血液移除不想要之細胞從而將血液送回至哺乳動物 中。 3有本發明之配位體（例如，拮抗劑）之組合物可在預防 性及治療性情形下使H助改變、滅活、殺死或移除哺 乳動物中所選擇之靶細胞群體。
配位體（例如，抗TNFR1拮抗劑、dAb單體）可與一或多 種其他治療或活性劑一起投與及/或調配。當配位體（例 ^ dAb)與其他治療劑_起投與時，配位體可在投與其他 藥Μ之⑴與其同時或在其之後投與。配位體及其他藥劑 通常以提供疊加治療效應之方式投與。 在貝把例中，本發明為治療、抑止或預防慢性發炎性 疾病之方法，該方法+ °有系要之哺乳動物投與治療有 效劑量或量之本發明之多月太、dAb或TNFR1之括抗劑。 131418.doc -95· 200911834 在一實施例中，本發明為 巧化摩抑止或預防關節炎 如，類風濕性關節炎、幼年型 尺（例 椎火、牛皮癬性關節炎）之方 贫 n亥方法包含向有需要之 哺乳動物投與治療有效劑量 蜊$次里之本發明之多肽、 TNFR1之拮抗劑。 另實施例中’本發明為治療、抑止或預防牛皮癖之 方：’該方法包含向有需要之哺乳動物投與治療有效劑量 或里之本發明之多肽、咖或辦以之拮抗劑。 f k. 在另Λ把例中，本發明為治療、抑止或預防發炎性腸 疾病（例如，克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎）之方法，該方法 包3向有需要之哺乳動物投與治療有效劑量或量之本發明 之多肽' dAb或TNFR1之拮抗劑。 另貝施例中，本發明為治療、抑止或預防慢性阻塞 性肺疾病（例如，慢性支氣管炎、慢性阻塞性支氣管炎、 肺《I腫)之方法’ t亥方法包含向有需要之哺乳動物投與治 療有效蜊1或量之本發明之多肽、dAb或TNFR1之拮抗 在另一實施例中，本發明為治療、抑止或預防肺炎（例 如，細菌性肺炎，諸如葡萄球菌肺炎（Staphyl〇c〇ccal pneumonia))之方法，該方法包含向有需要之哺乳動物投與 治療有效劑量或量之本發明之多肽、dAb或TNFR1之拮抗 劑。 本發明提供治療、抑止或預防除慢性阻塞性肺疾病及肺 火以外之其他肺疾病之方法。根據本發明可治療、抑止或 131418.doc •96· 200911834 預防之其他肺疾病包括(例如)囊性纖維化及哮喘口 固醇抗性哮喘)。因此，在另-實施例中，本發明為： 療、抑止或預防肺疾病⑽，囊性纖維化、哮喘)之 ，，該方法包含向有需要之哺乳動物投與治療有： 置之本發明之多肽、dAb或TNFR1之拮抗劑。 三 +在特&實〜例中，TNFR丨之拮抗劑係經由肺傳遞、諸如 :由吸亡(例如’支氣管内、鼻内或經口吸入、鼻内滴劑 技與或藉由全身傳遞(例如，非經腸、靜脈内、肌肉内、 腹膜内、皮下）投與。 實知例中，本發明為治療、抑止或預防敗也性休 克之方法’該方法包含向有需要之哺乳動物投與治療有效 劑量或量之本發明之多肽、_或_幻之括抗劑。 在本發明之另-態樣t ’提供—種組合物，其包含本發 明之多肽、dAb或TNFR1之拮抗劑及醫藥學上可接受之載 劑、稀釋劑或賦形劑。 κ 此外，本發明提供使用本發明之多肽、dAb或TNFR1之 拮抗劑或組合物治療疾病之方法。在一實施例中，該疾病 為癌症或發炎性疾病，例如類風濕性關節炎、哮喘或克羅 恩氏病。 格式 半哀期增加可適用於免疫球蛋白、尤其抗體且最尤其小 尺寸抗體片段之活體内應用。該等片段（Fv、雙硫鍵鍵結 之Fv、Fab、scFv、dAb)遭遇自身體内之快速清除；因 此，雖然其能夠快速到達身體之大部分且快速產生且易於 131418.doc •97- 200911834 處理，但其活體内應用因其僅短暫之活體内持久性而受到 限制。本發明之一實施例藉由提供活體内半衰期增加因此 在身體内具有持續時間較長之配位體功能活性之配位體來 解決該問題。 熟省此項技術者應熟悉藥物動力學分析及配位體半衰期 之測定之方法。詳情可見於尺⑼⑽汍w等人，Chemical
Stability of Pharmaceuticals: a Handbook for Pharmacists及
Pwm等人 ’ Phannacokinetc analysis: a Practieal Appr〇ach (1996)。亦參考"Pharmae〇kinetics"，m Gibaldi 及 D Perr〇n， 由 Marcel Dekker出版’第 2修訂附加版（Rev· ex editi〇n) (1982) ’其描述藥物動力學參數，諸如“及邙半衰期及曲 線下面積（AUC)。 半衰期0½ a&tl/2 (3)及AUC可由配位體之血清濃度對時 間之曲線確定。可使用WinNonlin軟體套件（自pharsight
Corp·，Mountain View，CA94040，USA獲得）模擬曲線。在 第一期（α期）中’配位體主要分布於患者中，其中部分消 除。第二期（β期）為末期，此時配位體已分布且血清濃度配 位體隨著自患者中清除配位體而降低。1〇1半衰期為第一期 之半衰期且ίβ半衰期為第二期之半衰期。因此，在一實施 例中，本發明提供ta半衰期在丨5分鐘或以上範圍内之配位 體或包含本發明之配位體的組合物。在一實施例中，範圍 之下限為30分鐘、45分鐘、i小時、2小時、3小時、4小 時、5小時、6小時、7小時、1〇小時、u小時或12小時。 另外或其他，本發明之配位體或組合物應具有在至多12小 131418.doc -98· 200911834 時且包括12小時範圍内之ta半衰期。在一實施例中，範圍 之上限為 11、10、9、g 7 r Λ? 、 6、/、6或5小時。合適範圍之實例 為1至6小時、2至5小時或3至4小時。 在一實施财，本發明提供料衰期在25小時或以上範 圍内之之配位體（多肽、dAb或拮抗劑）或包含本發明之配 位體的組合物。在一實施例中，範圍之下限為3小時、4小 時、5小時、6小時、7小時、1〇小時' "小時或12小時。 另外或其他，本發明之配位體或組合物具有在至多21天且 包括21天範圍内之料衰期。在一實施例中，冑圍之上限 為12小時、24小時' 2天、3天、5天、1〇天、15天或2〇 天。在一實施例中，本發明之配位體或組合物應具有12至 60小時範圍内之tp半衰期。在另一實施例中，其應在丨2至 48小時範圍内。在又一實施例中，其應在12至26小時範圍 内0 除以上標準以外或其他，本發明提供AUC值（曲線下面 積）在1 mg_min/ml或以上範圍内之配位體或包含本發明之 配位體之組合物在一實施例中，範圍之下限為5、1〇、 15、20、30、100、200或 300 mg·min/ml。另外或其他，本 發明之配位體或組合物具有在至多600 mg，min/ml範圍内之 AUC。在一實施例中，範圍之上限為500、400、300、 200、150、100、75 或 50 mg.min/ml。在一實施例中，本發 明之配位體應具有在選自由以下各範圍組成之群之範圍内 之 AUC : 15 至 150 mg.min/ml、15 至 100 mg.min/ml、15 至 75 mg-min/ml及 15至 50 mg-min/ml。 131418.doc -99- 200911834 本發明之多肽及dAb及包含該等多肽及dAb之拮抗劑可 經編排格式以具有較大流體動力學尺寸，例如，藉由連接 PEG基團、血清白蛋白、轉鐵蛋白、轉鐵蛋白受體或至少 其轉鐵蛋白結合部分、抗體Fc區，或藉由接合抗體區域。 舉例而言，多肽、dAb及拮抗劑經編排格式為抗體之較大 抗原結合片段或抗體（例如，經編排格式為Fab、Fab,、 F(ab)2、F(ab')2、IgG、scFv)。 可使用此項技術中熟知之方法測定本發明之配位體（例 f 如，dAb單體及多聚體）之流體動力學尺寸。舉例而言，可 使用凝膠過濾層析法測定配位體之流體動力學尺寸。諸如 父聯瓊脂糖基質之用於測定配位體之流體動力學尺寸之合 適凝膠過濾基質為吾人所熟知且可容易地獲得。 配位體格式之尺寸（例如，連接於dAb單體之PEG部分之 尺寸）可視想要之應用而變化。舉例而言，當配位體意欲 離開循環且進入周邊組織時，希望保持配位體之流體動力 學尺寸較低以有助於自血流外溢。或者，當希望使配位體 〆. I 保留在體循環中較長時間時，可（例如）藉由編排格式為1§ 樣蛋白增加配位體尺寸。 藉由靶向增加活體内半衰期之抗原或抗原決定基延長半 衰期 如本文中所述，亦可藉由使本發明之TNFR1結合多肽、 dAb或拮抗劑與結合增加活體内半衰期之抗原或抗原決定 基的結合區域（例如，抗體或抗體片段）接合或締合來增加 配位體之流體動力學尺寸及其血清半衰期。舉例而言，可 131418.doc ，100· 200911834 使TNFR1結合劑（例如，多肽）與抗血清白蛋白或抗新生兒 Fc受體抗體或抗體片段（例如，抗SA或抗新生兒Fc受體 dAb、Fab、Fab，或scFv)或與抗SA親和體或抗新生兒卜受 體親和體或抗SA avimer或抗SA結合區域接合或連接，該 抗SA結合區域包含選自（但較佳不限於）由以下各物組成之 群之骨架：CTLA-4、脂質運載蛋白、SpA、親和體、 avimer、GroEl及纖維連接蛋白（參見，2〇〇8年2月8日申請 之揭不該等結合區域之PCT/GB2008/000453，該等區域及 ( 其序列以引用之方式併入本文中且構成本發明正文之揭示 内容之一部分）。接合物係指包含鍵結（共價或非共價）於結 合血清白蛋白之結合區域的本發明之多肽、dAb或拮抗劑 之組合物。 增加活體内血清半衰期之合適多肽包括（例如）轉鐵蛋白 受體特異性配位體-神經藥劑融合蛋白（參見美國專利第 5,977,307號，其教示内容以引用之方式併入本文中）、腦 毛細血管内皮細胞受體、轉鐵蛋白、轉鐵蛋白受體（例 、 如，可溶性轉鐵蛋白受體）、胰島素、胰島素樣生長因子 1(IGF 1)受體、胰島素樣生長因子2)受體、騰島素受 體、血凝因子X、αΐ-抗胰蛋白酶及HNF Ια。增加血清半 衣期之合適多肽亦包括α-1 蛋白（血清類黏蛋白；aaG)、 α-l抗凝乳蛋白酶（ACT)、α_ι微球蛋白（蛋白質hc ; AIM)、抗凝血酶ΠΙ(ΑΤΙΙΙ)、脫脂蛋白α-1(ΑΡ〇 Α-1)、脫脂 蛋白Β(Αρο Β)、血漿銅藍蛋白（Cp)、互補組分C3(C3)、互 補組分C4(C4)、C1酯酶抑制劑（ci INH)、C-反應蛋白 131418.doc -101 - 200911834 (CRP)、鐵蛋白（pgR)、 ⑷™、甘露糖結合蛋白二合素叫… 白蛋白（甲狀腺素運送蛋白 ）、二血球素⑽。）、前 及類風濕因子（RF)。 口蛋白（RBP) 來自細胞外基質之入搞；7 ^ ^ ,故 °蛋白貝包括（例如）膠原、層黏連 蛋白、整合素及纖維連接 ▲ 接蛋白。膠原為細胞外基質之主要 蛋白貝。目丽已知約i 5種類 3^之膠原分子，可見於身體之 不同部位，例如I型膠廣、 （佔體膠原之90%)可見於骨、皮 膚、腱、韌帶、角膜、内臟中 臟肀次11型膝原可見於軟骨、脊 椎盤、脊索及眼睛玻璃狀液中。 血液之合適蛋白質包括（例如）血㈣白（例如，纖維蛋 白、（Χ-2巨球蛋白、血清白蛋白、纖維蛋白原（例如，纖維 蛋白原A、纖維蛋白原Β)、血清澱粉樣蛋白a、結合珠蛋 白、前纖維蛋白（profiUn)、泛素、子宮球蛋白及卜2_微球 蛋白）、酶及酶抑制劑（例如，纖溶酶原、溶菌酶、半胱胺 酸蛋白酶抑制劑C(cystatin C)、a-i_抗胰蛋白酶及胰腺胰 蛋白酶抑制劑）、免疫系統蛋白質，諸如免疫球蛋白蛋白 質（例如、IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、免疫球蛋白輕鏈 (κ/λ))、轉運蛋白（例如，視黃醇結合蛋白、心丨微球蛋 白）、防禦素（defensin)(例如’ β-防禦素1、嗜中性白血球 防禦素1、嗜中性白jk球防禦素2及嗜中性白血球防禦素3) 及其類似物。 血腦屏障或神經組織中可見之合適蛋白質包括（例如）黑 色素皮質素受體、髓磷脂、抗壞血酸轉運體及其類似物。 131418.doc -102- 200911834 增加活體内血清半衰期之合適多肽亦包括位於腎中之蛋 =(例如，多囊蛋白㈣沖tin)、IV型膠原、有機陰離 運體K1、海曼氏抗原（Heymann，s antigen》、位於肝中 之蛋白質（例如’乙醇脫氫酶、G25G)、位於肺中之蛋白質 (例如’結合IgA之分泌組分）、位於心臟中之蛋白質(例 如’與擴張性心肌病相關之HSP 27)、位於皮膚之蛋白質 (例如’角蛋白）、骨特異性蛋白f (諸如促進骨生成之蛋白 f (BMP) ’其為顯示成骨活性之蛋白質之轉化生長因子p超 家族的子集（例如，BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMp_6、 跡-7、BMP_8))、腫瘤特異性蛋白f (例如，滋養母細胞 抗原、贺癌平受體（herceptin recept〇r)、雌激素受體、組 織蛋白酶（例如，可見於肝及脾中之組織蛋白酶B))。 合適之疾病特異性蛋白質包括（例如）僅表現於活化T_細 胞上之抗原（包括LAG_3(淋巴細胞活化基因））、骨保護素 配位體（OPGL ;參見402, 304-309 (1999))、、 〇X40(TNF受體家族之成員，表現於活化丁細胞上且尤其在 I型人類τ細胞白血病病毒（ΗΤΙΛΜ)產生細胞中上調；參見 /jnW. 165⑴:263·7〇 (2〇〇〇))。合適之疾病特異性蛋白 貝亦L括（例如）金屬蛋白酶（metall〇pr〇tease)(與關節炎/癌 症相關），包括CG6512果蠅、人類截癱蛋e(paraplegin)、 人類FUH、人類AFG3L2、鼠類ftsH;及血管生成生長因 子’包括酸性纖維母細胞生長因子（FGIM)、驗性纖維母 細胞生長因子（FGF-2)、血管内皮生長因子/血管滲透因子 (VEGF/VPF)、轉化生長因子·a(TGF α)、腫瘤壞死因子_ 131418.doc -103- 200911834 a(TNF-a)、血管生長素（angiogenin)、介白素-3(IL-3)、介 白素-8(IL-8)、血小板源内皮生長因子（PD-ECGF)、胎盤生 長因子（P1GF)、中期因子血小板源生長因子_bb(PDGF)及 弗拉塔凱。 增加活體内血清半衰期之合適多肽亦包括應力蛋白，諸 如熱休克蛋白（HSP)。HSP通常在細胞内可見。當其細胞 外可見時’其為細胞已死亡且溢出其内含物之指示。因外 傷、疾病或損傷’發生該未計劃之細胞死亡（壞死），細胞 外HSP引發免疫系統之反應。與細胞外HSP之結合可使得 使本發明之組合物定位於疾病部位。 涉及Fc轉運之合適蛋白質包括（例如）布蘭貝爾受體 (Brambell receptor)(亦稱為FcRB)。Fc受體具有兩種功能， 兩者均潛在適用於傳遞。該等功能為（1)自母體穿過胎盤轉 運IgG至小孩，（2)保護IgG以免降解，從而延長其血清半 衰期。認為受體使IgG自核内體再循環。（參見，Holliger 等人，Nat Biotechnol \5(Ί).·632-6 (\997)。） 結合血清白蛋白之dAb 在一實施例中，本發明提供一種包含結合TNFR1之抗 TNFRldAb(第一 dAb)及結合血清白蛋白（SA)之第二dAb之 多肽或括抗劑（例如，雙特異性配位體），該第二dAb以如 由表面電漿共振所測定1 nM至1、2、3、4、5、10、20、 30、40、50、60、70、100、200、300、400 或 500 μΜ(亦 即 ’ ΧΙΟ·9 至 5xl〇-4)或 1〇〇 nM 至 10 μΜ、或 1至 5 μΜ、或3 至 70 nM、或1〇πΜ至1、2、3、4或5 μΜ之KD結合SA。舉例 131418.doc -104- 200911834 而言，如由表面電漿共振所測定30至70 nM。在一實施例 中，第一 dAb(或dAb單體）以如由表面血漿共振所測定約 1、50、70、100、150、200、300 nM 或 1、2 或 3 μΜ之 KD 結合SA(例如，HSA)。在一實施例中，對於包含第一抗SA dAb及第二抗TNFR1 dAb之雙特異性配位體而言，第二 dAb對其乾之親和力（例如，如由表面電漿共振、例如使用 BiaCore所量測，KD及/或Koff)為第一 dAb對SA之親和力的1 至 100000 倍（例如，100 至 100000、或 1000 至 100000、或 10000至100000倍）。在一實施例中，血清白蛋白為人類血 清白蛋白（HSA)。舉例而言，第一 dAb以約10 μΜ之親和力 結合SA，而第二dAb以100 ρΜ之親和力結合其靶。在一實 施例中，血清白蛋白為人類血清白蛋白（HSA)。在一實施 例中，第一 dAb 以約 50 nM，例如 70、100、150 或 200 nM 之KD結合SA(例如，HSA)。雙特異性配位體之詳情可見於 W0 03002609、WO 04003019及 W0 04058821 中。 在一實施例中，本發明之配位體可包含以如由所表面電 漿共振測定 1 nM至 1、2、3、4、5、10、20、30、40、 50、60、70、100、200、300、400 或 500 μΜ(亦即，xlO'9 至 5xl0·4)或 100 nM 至 10 μΜ、或 1至 5 μΜ、或 3至 70 nM、 或10nM至1、2、3、4或5 μΜ之KD結合血清白蛋白（SA)之 dAb。舉例而言，如由表面電漿共振所測定30至70 nM。 在一實施例中，第一dAb(或dAb單體）以如由表面血漿共振 所測定約 1、50、70、100、150、200、300 nM或 1、2 或 3 μΜ之KD結合SA(例如，HSA)。在一實施例中，第一及第 131418.doc -105- 200911834 二dAb由連接子連接，例如1至4個胺基酸或1至3個胺基酸 或超過3個胺基酸或超過4、5、6、7、8、9、10、15或20 個胺基酸之連接子。在一實施例中，使用較長連接子（超 過3個胺基酸）增加效價（拮抗劑中之一個或兩個dAb之 KD)。 在配位體及拮抗劑之特定實施例中’ dAb結合人類血清 白蛋白且與選自由以下各物組成之群之dAb競爭以結合白 蛋白： MSA-16、MSA-26(關於該等序列之揭示内容，參見 WO 04003019，該等序列及其核酸對應物以引用之方式併 入本文中且構成本發明正文之揭示内容的一部分），
DOM7m-16(SEQ ID NO: 473) ' DOM7m-12(SEQ ID NO: 474) ' DOM7m-26(SEQ ID NO: 475) ' DOM7r-l(SEQ ID NO: 476)、DOM7r-3(SEQ ID NO: 477)、DOM7r-4(SEQ ID NO: 478) ' DOM7r-5(SEQ ID NO: 479) > DOM7r-7(SEQ ID NO: 480)、DOM7r-8(SEQ ID NO: 481)、DOM7h-2(SEQ ID NO: 482)、DOM7h-3(SEQ ID NO: 483)、DOM7h-4(SEQ ID NO: 484)、DOM7h-6(SEQ ID NO: 485)、DOM7h-l(SEQ ID NO: 486)、DOM7h-7(SEQ ID NO: 487)、DOM7h-22(SEQ ID NO: 489)、DOM7h-23(SEQ ID NO: 490)、DOM7h-24(SEQ ID NO: 491)、DOM7h-25(SEQ ID NO: 492)、 DOM7h-26(SEQ ID NO: 493) ' DOM7h-21(SEQ ID NO: 494) ' DOM7h-27(SEQ ID NO: 495) > DOM7h-8(SEQ ID NO: 496)、DOM7r-13(SEQ ID NO: 497)、DOM7r-14(SEQ 131418.doc 106· 200911834 ID NO: 498)、DOM7r-15(SEQ ID NO: 499)、DOM7r-16(SEQ ID NO: 500)、DOM7r-17(SEQ ID NO: 501)、 DOM7r-18(SEQ ID NO: 502) > DOM7r-19(SEQ ID NO: 503) ' DOM7r-20(SEQ ID NO: 504)、DOM7r-21(SEQ ID NO: 505) ' DOM7r-22(SEQ ID NO: 506)、DOM7r-23(SEQ ID NO: 507) ' DOM7r-24(SEQ ID NO: 508)、DOM7r-25(SEQ ID NO: 509)、DOM7r-26(SEQ ID NO: 510)、 DOM7r-27(SEQ ID NO: 511)、DOM7r-28(SEQ ID NO: f 512) > DOM7r-29(SEQ ID NO: 513)、DOM7r-30(SEQ ID NO: 514)> DOM7r-31(SEQ ID NO: 515)' DOM7r-32(SEQ ID NO: 516)、DOM7r-33(SEQ ID NO: 517)(關於該等序列 之揭示内容，參見WO 2007080392，該等序列及其核酸對 應物以引用之方式併入本文中且構成本發明正文之揭示内 容的一部分；該段落中之SEQ ID No為WO 2007080392中 所出現之SEQ ID No)， dAb8(dAb 10)、dAb 1 0、dAb36、dAb7r20(DOM7r20) ' v dAb7r21(DOM7r21) 、 dAb7r22(DOM7r22) 、 dAb7r23(DOM7r23) 、 dAb7r24(DOM7r24) 、 dAb7r25(DOM7r25) 、 dAb7r26(DOM7r26) 、 dAb7r27(DOM7r27) 、 dAb7r28(DOM7r28) 、 dAb7r29(DOM7r29) 、 dAb7r29(DOM7r29) 、 dAb7r31(DOM7r31) 、 dAb7r3 2(DOM7r32) 、 dAb7r33(DOM7r33) 、 dAb7r33(DOM7r33) 、 dAb7h22(DOM7h22) 、 dAb7h23(DOM7h23) 、 131418.doc - 107- 200911834 、 dAb7h25(DOM7h25) 、 、 dAb7h27(DOM7h27) 、 dAb7h31(DOM7h31)、dAb2(dAb4、 dAb4 、 dAb7 、 dAbll 、 dAbl3(dAb 15) 、 dAbl5 、 dAb 16(dAb21、dAb7ml 6) 、dAb 17、dAbl8、dAbl9、 ( dAb7h24(DOM7h24) dAb7h26(DOM7h26) dAb7h30(DOM7h30)、 dAb7 、 dAb41)、 dAbl2(dAb7ml2)、 dAb21 、dAb22 、dAb23 、dAb24 、dAb25(dAb26 、 dAb7m26)、dAb27、dAb30(dAb35)、dAb31、dAb33、 dAb34、dAb35、dAb38(dAb54)、dAb41、dAb46(dAb 47 ' dAb 52 及 dAb 56)、dAb47、dAb52 ' dAb53 ' dAb54、 dAb5 5 、 dAb5 6 、 dAb7m 12 、 dAb7m 16 、 dAb7m26 、 dAb7rl(DOM7rl)、dAb7r3(DOM7r3)、dAb7r4(DOM7r4)、 dAb7r5(DOM7r5)、dAb7r7(DOM7r7)、dAb7r8(DOM7r8)、 dAb7rl3(DOM7rl3) 、 dAb7rl4(DOM7rl4) 、 dAb7rl5(DOM7rl5) 、 dAb7r 16(DOM7r 16) 、 dAb7rl7(DOM7rl7) 、 dAb7rl 8(DOM7rl 8) 、 dAb7rl9(DOM7rl9) 、 dAb7h 1 (DOM7h 1 ) 、 dAb7h2(DOM7h2) 、 dAb7h6(DOM7h6) 、 dAb7h7(DOM7h7) 、 dAb7h8(DOM7h8) 、 dAb7h9(DOM7h9) 、 dAb7h 1 0(DOM7h 1 0) 、 dAb7hl l(DOM7hll) 、 dAb7hl 2(DOM7hl 2) 、 dAb7hl3(DOM7hl3) 、 dAb7h 14(DOM7h 14) 、 dAb7pl(DOM7pl)及 dAb7p2(DOM7p2)(關於該等序列之揭 示内容，參見2008年2月8曰申請之PCT/GB2008/000453， 131418.doc -108- 200911834 該等序列及其核酸對應物以引用之方式併入本文中且構成 本發明正文之揭示内容之一部分）。dAb後之括號中展示替 代名稱，例如dAb8具有替代名稱dAblO，亦即 dAb8(dAbl0)。該等序列亦陳述於圖51a及b中。 在某些實施例中，dAb結合人類血清白蛋白且包含與選 自由以下各物組成之群之dAb的胺基酸序列具有至少約 80%、或至少約85%、或至少約90°/。、或至少約95%、或至 少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少約99%之 胺基酸序列一致性的胺基酸序列： MSA-16、MSA-26、 DOM7m-16(SEQ ID NO: 473) ' DOM7m-12(SEQ ID NO: 474) ' DOM7m-26(SEQ ID NO: 475) > DOM7r-l(SEQ ID NO: 476) ' DOM7r-3(SEQ ID NO: 477) ' DOM7r-4(SEQ ID NO: 478)、DOM7r-5(SEQ ID NO: 479)、DOM7r-7(SEQ ID NO: 480)、DOM7r-8(SEQ ID NO: 481)、DOM7h-2(SEQ ID NO: 482)、DOM7h-3(SEQ ID NO: 483)、DOM7h-4(SEQ ID NO: 484)、DOM7h-6(SEQ ID NO: 485)、DOM7h-l(SEQ ID NO: 486) > DOM7h-7(SEQ ID NO: 487) > DOM7h-22(SEQ ID NO: 489)、DOM7h-23(SEQ ID NO: 490)、DOM7h-24(SEQ ID NO: 491)、DOM7h-25(SEQ ID NO: 492)、 DOM7h-26(SEQ ID NO: 493)、DOM7h-21(SEQ ID NO: 494)、DOM7h-27(SEQ ID NO: 495)、DOM7h-8(SEQ ID NO: 496)、DOM7r-13(SEQ ID NO: 497)、DOM7r-14(SEQ ID NO: 498)、DOM7r-15(SEQ ID NO: 499)、DOM7r- 131418.doc •109· 200911834 16(SEQ ID NO: 500)、DOM7r-17(SEQ ID NO: 501)、 DOM7r-18(SEQ ID NO: 502)、DOM7r-19(SEQ ID NO: 503)、DOM7r-20(SEQ ID NO: 504)、DOM7r-21(SEQ ID NO: 505) ' DOM7r-22(SEQ ID NO: 506)、DOM7r-23(SEQ ID NO: 507)、DOM7r-24(SEQ ID NO: 508)、DOM7r-25(SEQ ID NO: 509)、DOM7r-26(SEQ ID NO: 510)、 DOM7r-27(SEQ ID NO: 511) > DOM7r-28(SEQ ID NO: 512) > DOM7r-29(SEQ ID NO: 513)、DOM7r-30(SEQ ID NO: 514)> DOM7r-31(SEQ ID NO: 515)' DOM7r-32(SEQ ID NO: 516)、DOM7r-33(SEQ ID NO: 517)(該段落中之 SEQ ID No為 WO 2007080392 中所出現之SEQ ID No)， dAb8 、 dAb 10 、 dAb36 、 dAb7r20 、 dAb7r21 、 dAb7r22、 dAb7r27、 dAb7r32 、 dAb7r23 dAb7r28 dAb7r33 、 dAb7r24、 dAb7r29、 dAb7h21 、 dAb7r25、 dAb7r30、 dAb7h22 、 dAb7r26、 dAb7r31、 dAb7h23 '
Ab7h24 、 Ab7h25 、 Ab7h26 、 dAb7h27 、 dAb7h30 、 \ dAbl3 ' dAbl9 、 dAb21 、 dAb26 、 dAb27 、 dAb38、 dAb53 、 dAb54 、 dAb7h31、dAb2、dAb4、dAb7、dAbll、dAbl2、 dAbl5、 dAbl6 、 dAb22、 dAb23、 dAb30 、 dAb31 、 dAb41 、 dAb46 、 dAb55 、 dAb56 、 dAbl7、dAbl8、 dAb24 、 dAb25 、 dAb33、 dAb47 、 dAb52 、 dAb34 、 dAb35 、 dAb7ml 2 、 dAb7m 16 、 dAb7m26 、 dAb7r 1、dAb7r3、dAb7r4、dAb7r5、dAb7r7、dAb7r8、 dAb7rl3 、 dAb7rl4 、 dAb7rl5 、 dAb7rl6 、 dAb7rl7 、 131418.doc -110- 200911834 dAb7rl8 、dAb7rl9、dAb7hl 、dAb7h2 、dAb7h6 、 dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、dAb7hlO、dAb7hll 、 dAb7hl2、dAb7hl3、dAb7hl4、dAb7pl 及 dAb7p2 °
舉例而言，結合人類血清白蛋白之dAb可包含與以下各 物具有至少約90%、或至少約95%、或至少約96%、或至 少約97°/。、或至少約98°/。、或至少約99%之胺基酸序列一 致性的胺基酸序列：DOM7h-2(SEQIDNO:482)、DOM7h-3(SEQIDNO:483)、DOM7h-4(SEQIDNO:484)、DOM7h-6(SEQIDNO:485)、DOM7h-l(SEQIDNO:486)、DOM7h-7(SEQIDNO:487)'DOM7h-8(SEQIDNO:496)、DOM7r-13(SEQ ID NO:497)、DOM7r-14(SEQ ID NO:498)、 DOM7h-22(SEQ ID NO:489) 、 DOM7h-23(SEQ ID NO:490)、DOM7h_24(SEQ ID NO:491)、DOM7h-25(SEQ ID NO:492) ' DOM7h-26(SEQ ID NO:493) > DOM7h-21(SEQ ID NO:494)、DOM7h-27(SEQ ID NO:495)(該段落 中之SEQ ID No為WO 2007080392中所出現之SEQ ID No)， dAb8、dAb 10、dAb36、dAb7h21 、dAb7h22、 dAb7h23 、 Ab7h24 、 Ab7h25 、 Ab7h26 、 dAb7h27 、 dAb7h30、dAb7h31、dAb2、dAb4、dAb7、dAbll、dAb 12、dAb 13、dAbl5、dAbl6、dAbl7、dAbl8、dAb 19 ' dAb21、dAb22、dAb23、dAb24、dAb25、dAb26、 dAb27、dAb30、dAb31 、 dAb33 、 dAb34、dAb35、 dAb38 、 dAb41 、 dAb46 、 dAb47 、 dAb52 、 dAb53 、 131418.doc • 111 - 200911834 dAb54、dAb55、dAb56、dAb7hl、dAb7h2、dAb7h6 > dAb7h7、dAb7h8 、dAb7h9、dAb7hlO、dAb7hll 、 dAb7hl2、dAb7hl3及 dAb7hl4。 在某些實施例中，dAb結合人類血清白蛋白且包含與選 自由以下各物組成之群之dAb的胺基酸序列具有至少約 80%、或至少約85%、或至少約90°/。、或至少約95%、或至 少約96%、或至少約97%、或至少約98°/。、或至少約99%之 胺基酸序列一致性的胺基酸序列：
DOM7h-2(SEQ ID NO:482) 、 DOM7h-6(SEQ ID NO:485) ' DOM7h-l(SEQ ID NO:486) > DOM7h-7(SEQ ID NO:487)、DOM7h-8(SEQ ID NO:496)、DOM7h-22(SEQ ID NO:489)、DOM7h-23(SEQ ID NO:490)、DOM7h-24(SEQ ID NO:491)、DOM7h-25(SEQ ID NO:492)、DOM7h-26(SEQ ID NO:493)、DOM7h-21(SEQ ID NO:494)、 DOM7h-27(SEQ ID NO:495)(該段落中之 SEQ ID No 為 WO 2007080392 中所出現之 SEQ ID No)， ^ dAb7h21 、 dAb7h22 、 dAb7h23 、 Ab7h24 、 Ab7h25 、
Ab7h26 > dAb7h27、dAb7h30、dAb7h31、dAb2、dAb4、 dAb7、dAb38、dAb41、dAb7hl、dAb7h2、dAb7h6、 dAb7h7、dAb7h8 、dAb7h9、dAb7hlO 、dAb7hll 、 dAb7hl2、dAb7hl3及 dAb7hl4 ° 在更特定實施例中，dAb為結合人類血清白蛋白且具有 選自由以下各物組成之群之胺基酸序列的VK dAb : DOM7h-2(SEQ ID NO:482)、DOM7h-6(SEQ ID NO: 131418.doc -112- 200911834 485)、DOM7h-l(SEQ ID NO:486)、DOM7h-7(SEQ ID NO:487) ' DOM7h-8(SEQ ID NO:496)(該段落中之 SEQ ID No為 WO 20070803 92 中所出現之SEQ ID No)， dAb2、dAb4、dAb7、dAb38 、dAb41 、dAb54、 dAb7hl、dAb7h2、dAb7h6、dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、 dAb7hlO 、 dAb7hll 、 dAb7hl2 、 dAb7hl3及dAb7hl4 ° 在更特定實施例中，dAb為結合人類血清白蛋白且具有 選自dAb7h3 0及dAb7h31之胺基酸序列的VH dAb。 ( 在更特定實施例中，dAb為dAb7hll或dAb7hl4。 在其他實施例中，dAb、配位體或拮抗劑結合人類血清 白蛋白且包含任何上述胺基酸序列中之一、兩或三個 CDR，例如dAb7hl 1或dAb7hl4中之一、兩或三個CDR。
結合血清白蛋白之合適駱駝類VHH包括WO 2004/041862(Ablynx N.V.)及 WO 2007080392 中所揭示之彼 等Vhh(該等Vhh序列及其核酸對應物以引用之方式併入本 文中且構成本發明正文之揭示内容之一部分），諸如序列 A(SEQ ID NO:518)、序列 B(SEQ ID NO:519)、序列 C(SEQ ID NO:520)、序列 D(SEQ ID NO:521)、序列 E(SEQ ID NO:522)、序列 F(SEQ ID NO:523)、序列 G(SEQ ID
NO:524)、序列 H(SEQ ID NO:525)、序列 I(SEQ ID
NO:526)、序列 J(SEQ ID NO:527)、序列 K(SEQ ID
NO:528)、序列 L(SEQ ID NO:529)、序列 M(SEQ ID
NO:530)、序列 N(SEQ ID NO:531)、序列 0(SEQ ID
NO:532)、序列 P(SEQ ID NO:533)、序列 Q(SEQ ID 131418.doc -113- 200911834 NO:534)，該等序列號對應於WO 2007080392或WO 2004/041 862(Ablynx Ν·ν·)中所引用之序列號。在某些實施 例中，胳馬它類Vhh結合人類血清白蛋白且包含與 WO 2007080392 中所揭示之 ALB 1 或 SEQ ID NOS:518-534 中之任何一個具有至少約80%、或至少約85%、或至少約 90°/。、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97°/。、或至 少約98%、或至少約99%之胺基酸序列一致性的胺基酸序 列，該等序列號對應於WO 2007080392或WO 2004/041862 中所引用之序列號。 在一些實施例中，配位體或拮抗劑包含與本文中所揭示 之任何抗血清白蛋白dAb競爭以結合血清白蛋白（例如人類 血清白蛋白）之抗血清白蛋白dAb。 在一替代實施例中，拮抗劑或配位體包含對TNFR1(例 如，人類TNFR1)具有特異性之結合部分，其中該部分包 含如2008年2月8曰申請之同在申請中之申請案 PCT/GB2008/000453中所述的非免疫球蛋白序列，該等結 合部分、其製造及選擇（例如，自多樣性庫）方法及其序列 之揭示内容以引用之方式併入本文中作為本發明正文之揭 示内容之一部分）。 接合半衰期延長部分（例如，白蛋白） 在一實施例中，使（一或多個）半衰期延長部分（例如，白 蛋白、轉鐵蛋白及其片段及類似物）與本發明之TNFR1結 合多肽、dAb或拮抗劑接合或締合。供TNFR1結合格式使 用之合適白蛋白、白蛋白片段或白蛋白變異體之實例描述 131418.doc -114- 200911834 於WO 2005077042中，其揭示内容以引用之方式併入本文 中且構成本發明正文之揭示内容之一部分。在本發明中 尤其可使用以下白蛋白、白蛋白片段或白蛋白變異體： • SEQ ID NO: 1(如WO 2005077042中所揭示，該序列明 確地以引用之方式併入本發明揭示内容中）； •包含 WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1 之胺基酸 1-3 87 或由該等胺基酸1-3 87組成之白蛋白片段或變異體； •包含選自由以下各物組成之群之胺基酸序列的白蛋白 或其片段或變異體：（a)WO 2005077042中之SEQ ID NO: 1 之胺基酸 54 至 61 ; (b)WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1 之胺基酸 76 至 89; (c)WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1 之胺基酸 92 至 100 ; (d)WO 2005077042 中之 SEQ ID ΝΟ:1 胺基酸 170 至 176 ； (e)WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1之胺基酸 247 至 252; (f)WO 2005077042 中之 SEQ ID NO·· 1 之胺基酸 266 至 277; (g)WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1 之胺基酸 280至 288 ; (h)WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1胺基 酸 362 至 368 ; (i)2005077042 中之 SEQ ID NO: 1 之胺基 酸 439至 447 ; (j)WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1 之 胺基酸 462 至 475; (k)WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1之胺基酸478至486 ;及⑴WO 2005077042中之 SEQ ID NO: 1 之胺基酸 560 至 566。 供TNFR1結合格式使用之合適白蛋白、片段或類似物之 其他實例描述於WO 03076567中，其揭示内容以引用之方 131418.doc -115- 200911834 式併入本文中且構成本發明正文之揭示内容之一部分。在 本發明中尤其可使用以下白蛋白、片段或變異體： •如WO 03076567中之（例如）圖3中所述之人類血清白蛋 白’（該序列資訊係明確地以引用之方式併入本發明 揭示内容中）； •由具有66,500之化學式分子量（formula molecular weight)之585個胺基酸的非糖基化多肽單鏈組成的人 類血清白蛋白（HA)(參見’ Meloun等人，/τ五似乙 (1975) ; Behrens 等人，尸3(.5夕7 、\9Ί5)，專 k，Nucleic Acids Research 9·,6\02- 6114 (1981)，Minghetti等人 ’ J. c/zem. 2(57..6747 (1986))； •如 Weitkamp 等人，Fwm. Gwei. 37:219 (1973)中 所述之白蛋白之多晶型變異體或類似物或片段； •如EP 322094中所述之白蛋白片段或變異體，例如
HA㈤73) ' ΗΑ(1·388)、HA(1_389)、ha(1_369)及 ΗΑ(1-4 19)及1-369與1-419之間的片段； •如EP 399666中所述之白蛋白片段或變異體，例如 HAU-m)及HA(1_200)及HA(UX)之間的片段其中乂 為178至199之任何數字。 當使用卜或多個)半衰期延長部分(例如，白蛋白、轉鐵 蛋白及其片#又及類似物）編排本發明之tnfri纟士人 dAb及拮抗劑格式時，可使用任何合 D夕 、乃邊（啫如，直接融 合）例如藉由使用編碼融合蛋白之單— 早核苷醆構築體使其 131418.doc -116- 200911834 與™而結合部分（例如，抗TNFRidAb)接合，其中兮融 合蛋白係編碼為半衰期延長部分定位於⑶謝結合^ N-末端或C·末端之多肽單鏈。或者，可藉由在部㈣ 用肽連接子實現接合，狀造垃工y , , 史 肽連接子例如W〇 〇3〇76567
2004003019中所述之肽連接 义WU 逆筏子（該4連接子揭示内容以 用之方式併入本發明椹千向p & 个I月揭不内容中以提供用於本發明 例）。增加活體内血清半衰期之多肽通常為活體内天秋存 在且抗降解或由自生物體（例如，人類）移除不想要之 之内源性機制移除的多肽。例如，增加活體内血清半衰期 之多肽可選自來自細胞外基質之蛋白質、血液中可見之蛋 白質、血腦屏障或神經組織中可見之蛋白質、位於腎、 肝、肺、心臟、皮膚或骨中之蛋白質、應力蛋白、疾病特 異性蛋白質或涉及FC轉運之蛋白質。 在貫穿該揭示内容所述之本發明之實施例中，代替在本 發明之拮抗劑或配位體中使用抗TNFRl，,dAb"，涵蓋熟練 的使用者（addressee)可使用包含結合丁?^111之本發明之 dAb的-或多個或所有三個CDR(例如，接枝於合適蛋白質 骨架或骨幹上之CDR ’該骨架或骨幹例如親和體、SpA骨 架、LDL受體A類區域或_區域）的多肽或區域。因此， 揭不内容整體應解釋為提供使用該等區域代替dAb之拮抗 劑之揭不内容。在這點上，參見2〇〇8年2月8曰申請之 PCT/GB2008/000453，其揭示内容以引用之方式併入）。 因此，在一實施例中，本發明之拮抗劑包含合適格式之 對TNFR1具有結合特性的免疫球蛋白單一可變區域或區域 131418.doc 117 200911834 抗體（ciAb)或該dAb之互補判定區。抬抗劑可為由該_組 成或大體±由該dAb組成之多[拮抗劑可為&含合適格 式、諸如抗體格式（例如，IgG樣格式、scFv、、^^,、 F(ab’）2)中之dAb(或dAb之CDR)之多肽，或包含結合tnfri 之dAb及結合另-乾蛋白質、抗原或抗原決定基（例如，血 清白蛋白）之第二dAb的雙特異性配位體。 可將本發明之多肽、dAb及拮抗劑可編排格式為此項技 術已知之多種合適抗體格式，諸如IgG樣格式、彼合抗 體、人化抗體、人類抗體、單鏈抗體、雙特異性抗體、抗 體重鏈、抗體輕鏈、抗體重鏈及/或輕鏈之同元二聚體及 異元二聚體、任何上述者之抗原結合片段（例如，Fv片段 (例如，單鏈Fv(ScFv)、雙硫鍵鍵結之Fv)、Fab片段、 片段、F(ab，）2片段）、單一可變區域（例如，％、火）、⑽ 及任何上述者之經修飾形式（例如，藉由共價連接聚伸烷 二醇(例如’聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇)或其他合適 聚合物而修飾）。 在-些實施例_，本發明提供—種為IgG樣格式之配位 體（例如，抗顶阳拮抗劑）。該等格式具有習知邮分子之 四鏈結構（兩個重鏈及兩個輕鏈），其中一或多個可變區（Vh 及/或VL)已經本發明之dAb置換。在一實施例中，各可變 區（2個VH區及2個义區）經dAb或單—可變區域置換，其中 之至少-個為本發明之MNFR1心。包括在邮樣格式 之dAb或單-可變區域可具有相同特異杜或不㈣異性。 在一些實施例巾，IgG樣格式為四價且可具有—種(僅抗 131418.doc -118- 200911834 TNFRl)、兩種（例如，抗TNFR1及抗SA)、三種或四種特異 性。舉例而言，IgG樣格式可為單特異性且包含四個具有 相同特異性之dAb ;可為雙特異性且包含三個具有相同特 異性之dAb及另一具有不同特異性之dAb ;可為雙特異性 且包含兩個具有相同特異性之dAb及兩個具有常見但不同 特異性之dAb ;可為三特異性且包含具有相同特異性之第 一及第二dAb、具有不同特異性之第三dAb及具有不同於 第一、第二及第三dAb之特異性之第四dAb ;或可為四異 性且包含四個各具有不同特異性之dAb。可製備IgG樣格式 之抗原結合片段（例如，Fab、F(ab')2、Fab'、Fv、scFv)。 在一實施例中，IgG樣格式或其抗原結合片段不會交聯 TNFR1，例如該格式對TNFR1而言可為單價。若想要補體 活化及/或抗體依賴性細胞的細胞毒性（ADCC)功能，則配 位體可為IgGl-樣格式。必要時，IgG樣格式可包含突變恆 定區（變異體IgG重鏈恆定區）以最小化與Fc受體之結合及/ 或固定補體之能力，（例如參見Winter等人，GB 2,209,757 B ； Morrison 等人，WO 89/07142 ; Morgan 等人，WO 94/29351，1994年 12 月 22 曰）° 可將本發明之配位體（多肽、dAb及拮抗劑）編排格式為 含有與第二免疫球蛋白單一可變區域直接融合之第一免疫 球蛋白單一可變區域的融合蛋白。必要時，該格式可進一 步包含半衰期延長部分。舉例而言，配位體可包含第二免 疫球蛋白單一可變區域直接融合的第一免疫球蛋白單一可 變區域的融合蛋白，其中該第二免疫球蛋白單一可變區域 131418.doc -119- 200911834 直接融合於結合血清白蛋白之免疫球蛋白單一可變區域。 具有對乾具有結合特異性之結合位點之多肽區域的定向 及配位體是否包含連接子通常為設計所要選擇之問題。然 而’些疋向在有或無連接子之情況下可提供較其他定向 佳之結合特徵。本發明所涵蓋之所有定向（例如，dAb丨_連 接子-dAb2、dAb2-連接子-dAbl)為含有提供可藉由篩選容 易地鑑別之想要結合特徵的定向的配位體。 可使本發明之多肽及dAb(包括dAb單體、二聚體及三聚 體）與抗體Fc區連接，該抗體卜區包含Ch2及Ch3區域中之 一者或兩者及視情況鉸鏈區。舉例而言，可使用編碼以單 一核苷酸序列形式連接於以區之配位體之载體製造該等多 肽。 此外’本發明提供上述dAb單體之二聚體、三聚體及聚 合物。 密碼子優化序列 如上所述，本發明之實施例提供編碼本發明之多肽及可 變區域之密碼子優化核苷酸序列。如以下說明中所示，可 產生編碼相同可變區域（在此狀況下，可變區域胺基酸序 列與DOM 1 h-1 3 1 -206 —致）之具有約70% —致性之密碼子優 化序列。在該情況下，序列經優化從而由馬斯德畢赤酵母 (密碼子優化序列丨_3)或大腸桿菌（密碼子 優化序列4及5)表現。 考慮到遺傳密碼中之及簡併度執行計算且最大化由如圖 19中所不之DOMlh-131-206之核苷酸序列及還編碼與 I314l8.doc -120- 200911834 DOM 1 h-1 3 1 -206 —致之可變區域之理論核苷酸序列所編碼 的各簡併密碼子中的核苷酸變化數。計算揭露理論序列將 與如圖19中所示之DOMlh-131-206之核苷酸序列具有僅 5 7 %之一致性。 密碼子優化序列1 DNA序列 ga^gttcaittgttggmatc.c：i|gtggtggat;tggttGaacctggtggttett:t-g.agatt:gtcctgtgetg cttccggttttsctttegctcacgagictiatggtttgggtfcagaeaggctecaggtaaaggattggaatg ggtttcccacattcc 為 ccagatggtcaagaticc 过ttictacgetgaetcegttaagg^aag连ttc^ctatc tccagagacaactccaa'ga.acactttgtacttgcagatgaactccttgagagctgaggatactgctgttt aceactgtgctttgttgccaaagagaggacetfcggtttgattacfcggggacagggaacttliggtfcactgt /" ' ttcttcc 相應AA序列 evqllesggglvqpggslrlscaasgftfahetinvwvxq^pgKglewvshippcIgqdpfyadsvIcgrfti srdnskntlylqmnslraedtavyhcallpkxgpwfdyii?gqgtlvtv5s •與wt序列之核苷酸序列一致性為74.1 % 密碼子優化Dorolh-131-206 Demih-13X-206 WS—致 密瑪子優化Domlh-131-206 D〇mlh*13l>206 WT一致 密瑪子優化Domlh-131-206 Doalh-131-206 KT一致 密碼子優化Domlh-131-206 S〇mlh«13X-206 ITT一致 密碼子優化Domlh-131-206 P〇ttlD-13X*206 WT—致 密碼子優化Domlh-131-206 Doalh-131-206 WT—致 密碼子優化Domlh-131-206 D〇mlh'131-20€ WT一致 密碼子優化Domlh-131-2 06 Domih-X31-20€ NT一致
1 50 (1) αλ〇〇7τ〇λΑΤΤοττο〇λΑτεσοοτοοτοαλ.τχοοττ〇λλΰ€Τ9ατοοτΦα (1) aA09T0CA0CT9TT0eA9TCT990〇aMaCT700XACAGCCT00O〇GeTC (1) OAOGT CA TOTTOOA TC 90 OO ΘΘ ΤΤΟΘΦ CA CCTOO 90 TC 5X 100 (51) TTTeAeATT9TCCT0TeCT8CTTCC09TTTTACmceCTCACeiteACTA (51) CCTQCI TO < a ? TCC79T0C 9C TCC90 TT AC TT OC CA OAGAC λ (101) TOOTTTOOO7TA0ACA6OCTCCA〇e?AUi〇aJkTTOOAIkTGOOT7TCCCAC (101) TG>OTGTe〇aTCCGCCAGK3CACCAaeaAAe〇O7CTAeA9T0〇aTCTCACAT TOOT TGGOT 9 CXOOC CCAOO ΑΛ 00 T Ολ TOOOT TC Ολ 151 200 (151) AT7CCACCAaAT0eTCAAeATCCX7TCTAC0C7flACTCCaTTAA90QAAa (X51) ATTCCCCC0QATQOTCA〇aiiTCCC7TCTACQCAOACTCCOTGAA9OOCCO (151) ATTCC CC OATOOTCA OATCC T7CTAC0C OACTCCOT AAO<90 0 201 250 (201) ATTCACTATCTCCAeAQACAILCTCCAAOAACACTTnieTACTTOCAQATOA (201) QtTCACCATCTCCCOCQACAATTCCAAOAACACQCTATATCTaCAAATOA (201) TTCAC X^CTCC Q GACAA 7CCAAOAACAC Φ TA TQCA AT9A 251 300 (251) ACTCCTTOAeA0CTeA€CMLTACTOCTOTT7ACCACTeTOC77T9TTOCCA (251) ACAaCCTGCOTOCCOA€OACACAGCOGTATATCAC7GTOC<X；TOCTTCCT (251) AC C TO 0 OC ΟλΟΟλ AC OC OT Τλ CACT9TOC TO Φ CC 301 350 (301) λλΟλΟλΘ€ΑΟΟΤΤΟΟΤΤΤβλΦΦλΟ?ΟΘΟΟλαλβΟ〇λλ€ΤΤΤΟΟΤΤλΟΤσΤ
(301) AAaAe〇〇a〇CC7T〇aT7T〇ACTACT〇e9QTCA90QAACCCT99TCACC9T (301) AAGAQ 90 CCTTOGTTTQA TACTG<?〇a CASQOAAC TOGT AC ΘΤ 351 363 (351 > TTCTTCCTAATiSA (3511 CTCOAOC------ (3SX) TC C 密碼子優化序列2 DNA序列 • 121 - 131418.doc 200911834 gagaaaacfagaggt：tca.at.tgcttgaatctggagga.ggtttggtccagccaggagggtcccttcgactaa gttgtgctgccagtgggtttacgtttgctcatgaaact.atggtatgggtccgaea.ggcacct.ggtaaagg tctt.gaatgggtttcacatatccctccagacggt.caagacccattttacgctgattccgtgaaag^caga tttacsfitttcacgagatastfccfcaaaaaeacettgtacttaGaaatg^aGtcrattgagagetgagg'aca ctgcagtttatcactgcgctttacta.ccaaaa-cgtggaccttggtt：tgattattg9ggccaaggtacgtt agtgactgttagttct 相應AA序列 ekrevqlle£sggglvc|pggslrlscaasgftfah@tmvwvrgapgkgi^wv3hippdgqdpfyadsvk.9r ftisrdnskntlylqiTinsXraedta^yhcallpkrgpwfdywgqgtlvtvss •與WT序列之核苷酸序列一致性為71 · 1 % 僅畢赤酵母nr» 20€ dftb 一致 DefflkIh-13i-a〇« m 僅畢赤酵母HTa 2〇fi d&b 一致 &雄αΚ.13；1·2Κ)6 WT 僅畢赤酵母ΜΛΐ 20« dAb 一致 ENm£h-X31*2{}6 WT 僅畢赤酵母MF* 2伽dAb 一致 ⑽ wx 僅畢赤酵母IIF* 20i <IAb 一致 僅畢赤酵母扣《 <*«> 一致 vfr 僅畢赤酵母imi dlkb 一致 僅畢赤酵母财* 也必 一致 H)------—娜 ⑴ wsiuyyra^aisnau，!rc3craE3iJk!f^sGa^AiisTXT@3rcc»eGa
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《42} 儀嫌fax^os^rcrCTccirmiGftaccTCC^si^Ta^cmecGC (si) j^wfc^ygcccTtcgftcrA^twgSCTgccAQg^myMagmecfc i^ty m- m^xccct oai at t^r^c occ de tx jm: tttcsc c ιοί iso t»2) A^aim〇(mG0t<m^7co@cciM^cACCiio〇8iui^G@rcmu^cs& (toil A<imftftC¥M%KmiTG^»<^(3ACil^(3CACC!ra〇MJUy3mC!rr6UUlTC& <ioi) Aim ac Armt cmK^sc 〇ΰ m on tc»s
111 200 (i 似 <τχαχίλ〇λχλττοοοοο織T«»3taM3SAirccanrcmbcscft»cTccaT a$w ^m^cmtcccTCCAS^撕au^cceKTtm«msiTTCc〇T ciSM m 7ΰλ€κχλτ cc cc sa « cc tt tuc^ <sa teem 201 2S0 it$t} gmW^g6〇ggOTyC3MXJWrrcO〇g〇gM!JMVrTCCUMglUMC&〇qCTIltMC tm} 缺fmCMmc^OGAGI^MTTCTlUAMaUSCTTGTACt
(2^11 <3ΑΛ oec 0 TT AC AT TC ca 0λ AUttC Μ ΑλΟΜ： T TA asi 抑 0 a4幻 (2^X) it%t) <3〇li mt) (34¾) <351) fJumiuomAorc^miysi^mfteGACMTrisoMSTTfiircACTGC^rr *x auUitOMC Ydi 0 iic OMSOivCAC dc or tatci^tgi ac 30X 350 C$GC3rTCCTAIkeA〇eGGOCCTTOQrrTOiKCS%Cr〇OOCTCAl3G&AAOCCt ffikiCmecakwuMS^miiccitsaTTTGJvmTnsGGGccwwamosTT T ct cc Μ 〇 〇& tk t^iaa cjl gg： ac t 351 3e? ocm^ccaTCTCOMC^
AOTOftCTOt-TA^rPTCt OT AC ST T 0 C 密碼子優化序列3 DNA序列 gaagtgcagcttcttgaaagtggtg^agggctagtgcagccag^gggatctttaagattatcatgcgctg <xagtg守atttac；tttt：gct.cac:..gagacgatggtctgggtgatgacaagetcetggaa.aaggt.ttag.agfcg ggtttefccacattccacct9atggt:caagai；Gcrt:t'.tctac.goaga.ttC!egt.caea^9..aagat.ttactatc tGc^gagataatagtaaaaacactttgtacetacag 孩 tgaactcac.ttagsgccg'遂 a'g 兹 taocgetgtgt accactgcqccttgttgccaaaga9aggtcctt.ggttcgattactggggtcagggt:actetfigtta cagt ctcatct 相應AA序列 evq.1 玉 esgggivqpggslrlscaasgftfahetmv^wvriiapgkglewshippclgqdpfyadsvkgrfti srdnskntlylq^mslraedtavyhcallpkrgpwfdywgqgtlvtvss -122- 131418.doc 200911834 •與WT序列之核苷酸序列一致性為72.6°/〇 i ⑽ 僅畢赤酵母知· 2糾战b 一致 Dowlh»131^0$ HT 僅畢赤酵母知》a馘你b —致
僅畢赤酵母20β必怎 一致 Dsalhtt131^20€ WT ⑴ 0A09xsc^GCt^TTGGi^TCTG〇aHs@A00cn 撕JucMcct^sooatc
a) dM0tSOU9GTfCTTWUM?r@^GOftGG®CTIOTeCMCCAGKI®SOIlfC α\ βλ dfsckdct τ m tm 7 gt cagcc tc
Si i_ ccfacsTCTCTcaH^oci^ccTccGaATrcikarmocdci^ftai^m (si) rrau^reMci^soscTocaKSTsaimiTACTmGeTCAcaiysaye：软 m) t β τ w t® dK： sec _m »c ca 规_^ £91 iso {M ：U XG9TaT9Qe；rTC〇CCA00C»C〇l^〇S|^〇^TCmCS^€Rr媒柏TCTCJWCftf1 (m)沉跃rcTiiGwsMMCJUdcxccttiaftjyu^NsmMiafMrdGefTtcicftc U«> Tear toc&f <3 ca oc cc 卸从瓣 taohotocktt *rc ca m 200 《m> ATrCOCCCG»T©STOM3aWCam*CfAOOOW3AC3POC^P⑽ / 僅畢赤酵母穸必b 一致 Domlh-X31-20€ Wt 僅畢赤酵母206 eiWs 一致 ϊ>Φ«ά|ι-5.3ΐ-5ίό6 in 僅畢赤酵母的冰2δβ dlUs —致 0eaftlh-131»2〇€ W 僅畢赤酵母知* 2如diib 一致 Dts«ah*i3i-^e wr 僅畢赤酵母办* 20β 一致 < m > a傲o^c 織f ewau^Ltt»tta^ 叙:織me猜〇yyMMM3 ATTCC CC OUTGOTCA GhTCC tT<^9iCtSC9mi TCCOT λλ €0 <3 如 l sso (舰> {jm) (201} 繼iuiuykaLCtmmccma^酿 tr AC AtCTCC e 3λ Mf AA MCAC f fΛ ^ CA Αΐ^Ιί 251 300 JM?Mraap〇ci?rGa^w<5iiqftCWGG«w^TWPWTOCWTOCfl^5f 口糾 JI0GACTTiy3l成CC脚AOIimCC9Ct^r0rACCIkCTOCGCCT»TfSCC» iM^l} Λ0 CT a ,λΟ OC Τλ CHGTO ac ?fO ? oc 301 3S0撕AMMd^occTt^mmi^rjucm^游 {3cm AMiusM^TCCTTGGTraiAmct^saTCAGoemLCTCTQGm^aurr (301) AAOI^a OO CC77^3itT Ολ tACf^^tOkOOd μ &〇m Ae w 351 t 於u CTCOMC· (351) CTC-ATCT i^Sl) CTC λ c 密碼子優化序列4 DNA序列 gaagtacaactgctcfgagagcggtggcggcctggttcaaccgggtggttccctgcgcctftccbgtgcgg catctggtttcaccttcgcacacgaanccatggtgtg^gttGgccaafctccgggcaaaggcGtggaatg ggtaagccacattcctccagatggccaggacccattctatgcggattccgttaagggtcgctttaccatt tctcgtgataactccaaaaacaccctgtacctgcagatgaactccctgcgcgccgaggatactgcggcgt «eattftqeigctgctgcctaaacgtggcccqtq'gtt-cgattact^g^gtcaggg.tac.tctggtca.ccgt \ aageage 相應AA序列 evqllesggglvqpggslrlscaasgft fahetmwvrqapgkgl€wvshippdgqcipfyacisvkg.r fti srd^$.kntlyl.<pn.slraedta'vyhcallpkrgpiwfdiyw§qgtlvtvss •與WT序列之核苷酸序列一致性為76.5% 123- 131418.doc 200911834 I；.
Do〇aii-191-20€ W7 僅大腸桿菌》w 20δ dAI> 一致 僅大腸桿菌dftb 一致 僅大腸桿菌see 2〇e <t» 一致 D〇eah*i3i-2〇i m 僅大腸桿菌》M 26S «0你 一致 DCMlh-ISl-206 m 僅大腸桿菌2:⑽<«lb 一致 Do»ib-m-20« *ΤΤ 僅大腸桿菌4W> 一致 D〇pa^i31-206 m 僅大腸桿菌2〇®似to i 50 it) oauomcMM?TGC7G^^scG0T@6c@c^crrc^muuMX0〇€Te^T7C (1) Ά m CX Cf6 ^QG3kG G6 GG GGC TGGT CC GG @G 7C 戢 100 iSD CCWSCGtCTCTeCTiSTOCJySCCWamTTCiUCCTCTOOSCH糊 631CGA ⑼} octecaccrcmrx^T^c联OkTcroaTTTCAccTCcsc^cAGSMAcc^ tsi) ccMCta ear ^ccktoc ®c te ©s «ciccw oc πλ ac a 1,01 150 (101) TOG^STGQGTCCSCCftSGakCCAGOGUGGGTCTJIS^TGGSTCfaiCIl? (Ιΰΐ) l^fcrrSa^ttaiC^AJkdCTOCOO^CIUUMifS^CfOSAAtiG^GTiMLQCCAC a〇D TtaK^GTOost oscoi gc cc og aa as cv to^t ca X)Sl 200 asi》jwxco⑽傲ec这 t isn j^ocKscm^t^k^^^ecamtifid激織撕ffcc^n纖级錄 ilSl) *TTCC CC SfcTSS CAGGA CC TTCH» m TCOOT AftG^S €S 501 ¢50 卿 i} ^ii^AiCCAfC^ccc议ma^raEmtmftciusecfikf細^auudm U01) CrmACCA言為CCt窃 t^O'i) ΤΓ AGCAT TC CG SA AA TCCAA AKCAG CT TA CTiSCil Aim mi sod 《OUSCCX€C€T9CC^@6M^OOOGGirit你TOACTG70C：GC7QCR<X^ (2$1} IlCfCCOfTCOC^eaS祕ΟΙίΐΤ祕TOO掷wstmoaitx您ocgctoctoogt (251) *C OCTGCG SiCC^AGOA IfeC GCSS7 » CA TafQGBCtOCf CCf 301 399 130i} AM3U3N9GK30CCTT^OTrr湖<C»C»a〇G^C&e@aiUyCCCT©OTCACOS7 i%n) AMCOTQOCOCCT^NSmCQftnACTOQGfm^C^CTACTCSrQCrrCADOG^ 一致 僅大腸桿菌S*0 dMs —致 {3阳 Μ CC TOOT? €A TACTGea^^CMiaO AC CTOOlCAOraT 351 asi> v^mjsG i^BX} AAi&CMfC issii mo 密碼子優化序列5 DNA序列 夺 gttca 為 etgetgg 森孩 I；c：tggfcggtggtet 窃 gtscaaccgggtggttccctigcgtetgagetigtgc 在 g cctctggttfccacettcgctcatijagaccatggtttgggtacgeeaggcrtccgggtaaaggcetggagtg ggtaagccatatccctcctgatggtca^gacccgttctatgct^attGGgtcaaaggccgtfcttaacatt tctcgtgacaacagcaaaaacactctgtacctgcaaatgaactccctgcgtgcagaagacacggcggttt atcaGtgtfcactgctgccaaaacgcggcccttggttcgactactggggccagggtactctggtcactgt atcttct 相應AA序列 evqllesggglvcgjggslrlscaasgftfaheti^vwrqapgkgl^wvshippdgqdpf yadsvkgrfti srdnskntlylqmn-sira«<ita.vyhca.Ilpkrgp!Wfdywg'qgtlvtvs.s •與WT序列之核苷酸序列一致性為78.4% D<5*ftih-i3i-a〇6 m 僅大腸桿菌re 20S dUa 一致 ©〇*ai»-i3 v-2〇f wr 僅大腸桿菌IC 206 dfcb 一致 De»lfc-131-^0i W3* 僅大腸桿菌IC 206 dte 一致 1 SO (i> ajb^da^acTdttOQAOTCTwaQOMacfTOG^i^aikCKxrTis^^mc ⑴ G^m〇y^Ct0CTOaDAfCTtS^0TG挪T财^CMOC^iOTG^TTC 〇 Ολ €Φ0 TOOA tctoo do ⑽ tO<iTACA CC 挪 09 TC 51 100 《54} ecroeoterefccEtofoakdcdtecqQvn^M^QTTrocociCTaiieiiiCGii mi ccrcocGTci^&scTaTGCiidccTci^rmakoettaxrrcKmftGftccit {SI} CC7@C97C? CTO/TGCM&CCfC «<3 TtCAC^tt &C CRTSiA@%C A IQX 150 篆麻！ VOf^TS^QTOCeCCKOOCIbCCAOGWHUOM^C^AGILGTOSG^CTC^CII^ ⑽u t9^fT€)^TACaCaM»aCTCCSOGrTIUUU3GeCTG)Qftetd〇eTMGOCJI!r a〇u tocnr Tmm cocchooc cc se m €G cr cat l&l 200 131418.doc 124- 200911834 m (於 ATTCCCCCOS»eraCA谈达琪mi级CTCOGTO&»S€»Ca3i 僅大腸桿菌 ic sens 战b (.1$” 财cccrccT^ToracMo^occc^cf^^ci1 财7fc〇QTc%AA^c^ 一致(X5i) Jkt cc ΰΰ G^roa^oMSGi, CC TTCTA Q〇 tcom ：jul
201 2SO s>〇aih*i3i^« m t2〇i) sTzcauscKrcTGoaKmauaTCCxauaaukCiMsacrAtiiTcracuuum 僅大腸桿菌 ic 霪闐战b t抑TTTTjyecATTTCTCGtaiuCMCAoayuuuau^cirtmcc挪cmuga 一致 £汹1》TT ACG%T το CO m〇A CMk AACAC Ct m CtQCMJaa&k 251 aoo &Q9Sih-131-2^« KT (2ηϊ AOU)GC7iKS9^M3C»5aKCACA0Q5OTATAtayC^OT€OSar〇CR&C^ 僅大腸桿菌 XC 206 <iMa (2Sl| ACTCCCTGCSI^M^IUSaM^O雜為代l^tCTGaiCTOC^C^ 一致(25i> ac cctgc^tkc m o^aic τΑτ〇Α〇χοτ〇€ ctoct cc 302 350 &cmlh-*13l»a0« wr (抑D AI_^9C^CTfO@m0JM^rACtO雜額誤齡dM£CCt@GTCftCTO7
僅大腸桿菌 IC 2&6 dAb 《301} AAXC^0CCX^Q^r〇Q^a7ACTGG60COMSG賊松tarSMCftCTOT 一致 ¢301} AA ΰ OCI C^rroa^r aAG^ACTOGeG CA9Q0 C^GOtCIAC 0t 3SI DMlli^X31-20€ wr ί3δ^ϊ 僅大腸桿菌¢0 2⑽dto <M；li A1CT3CT 一致 《35i| TC 例證 實例A :主要選擇及表徵人類TNFR1之區域抗體 所產生之區域抗體係源自噬菌體庫。根據相關標準方法 執行被動吸收之人類TNFR1之可溶性選擇與淘選。人類 TNFR1係以可溶性重組蛋白質形式自R&D systems(目錄號 636-R1-025/CF)或 Peprotech(目錄號 310-07)購得，且直接 使用（在被動選擇之狀況下）或在生物素標記後，經由一級 胺偶合使用，接著在生物檢定中品質控制其活性且由質譜 分析其MW及生物素標記程度。通常執行3輪選擇在每下一 輪中利用遞減含量之抗原。 由噬菌體ELISA篩選來自選擇物之輸出物的抗TNFR1結 合純系之存在。自該等噬菌體選擇分離DNA且亞克隆於表 現載體中以表現可溶性dAb片段。將可溶性dAb片段表現 於96孔板中，且使用以抗c-myc伯測之直接結合ELISA或 使用抗生蛋白鏈菌素/經生物素標記TNFR1 BIAcore™晶片 之BIAcore™使用上清液篩選抗TNFR1結合dAb之存在，且 根據解離速率（off-rate)分等級。 下文所述之前導分子係源自命名為DOMlh-131(揭示於 -125 - 131418.doc 200911834 wo 2006038027中）之親本dAb。該分子在使用6〇 nM經生 物素標記抗原選擇3輪後自噬菌體呈現庫選得。在各輪選 擇中將經抗生蛋白鏈菌素或中性鏈親和素塗佈之£)%&=粒 交替作為捕獲試劑以防止選擇針對抗生蛋白鏈菌素或中性 鏈親和素之結合劑。該階段前之效價如在 MRC-5纖維母細胞/IL_8釋放細胞檢定中所測定處於低微莫 耳範圍内。如由BIAc〇re™所測定之結合動力學通常呈現 快速締合速率（on rate)/快速解離速率。該D〇Mihi3i前導 分子之大腸桿菌表現含量以C_末端myc標記單體計處於8 mg/Ι之範圍内。 前導分子之親和力成熟作用： 使DOMlh-131進行親和力成熟作用以產生具有較高效價 及改良生物物理學特徵之突變體（關於D〇Mlh_ni來源之
前導分子之胺基酸序列，參見圖3)。使用易於出錯之pCR 聚合酶（Genemorph II，Stratagene)產生易於出錯之庫（平均 數為每dAb序列1個胺基酸變化，庫規模8 χ丨〇7)後，利用該 等易於出錯之庫執行7輪選擇。該策略可引起純系D〇Mih_ 1 3 1 8刀離 種如由MRC-5細胞檢定所量測4個胺基酸變 化（一個在構架i(FR1)中，一個在CDR1$，一個在cdr3中 及一個在FR4中）產生約100倍效價提高（約4 nM)之分子。 在該檢疋中，將MRC-5細胞與測試樣品一起培養i小時， 隨後添加TNF-a(200 pg/ml)。培養隔夜後，使用江_8 abi 8200細胞偵測檢定（FMAT)測定化_8釋放。各實驗中包括 TNF-α劑量曲線。在該檢定中，所使用之與dAb競爭結合 131418.doc •126· 200911834 TNFR1之TNF-α的濃度（200 pg/ml)為最大TNF-α反應之約 70%。 為進一步提高效價，由易於出錯之前導一致資訊提示之 關鍵位置處之寡核苷酸引導的突變誘發使單一胺基酸位置 多樣化。該過程期間，經由BIAc〇reTM篩選分離具有單個 K94R胺基酸突變（胺基酸編號根據Kabat)及200-300 PM之 RBA效價之DOMlh_m_8純系的改良形式，D〇Mih_i3h 24(在修正之前，最初命名為D〇Mlh-131-8-2)。 產生其他基於該前導分子及源於其之nn s庫之易於出錯 的庫且使用熱處理使其經受3輪噬菌體選擇（關於方法，參 見 Jespers L 等人，Aggregation-resistant domain antibodies selected on phage by heat denaturation. Nat Biotechnol. 2004年9月；22(9):1161-5)。在此選擇期間，彙集庫且自 第2輪選擇所獲得之純系產生認為更加熱穩定之諸如 DOMlh-131-53之dAb。假定該等純系將具有較佳生物物理 特徵。使純系DOM lh-131-53中之一些構架突變生殖系化 以產生純糸DOM 1 h-1 3 1 -83。該純系形成使用如上所述之 嗤菌體呈現選擇或使用使用乳液之活體外隔室化技術經由 募核苦酸引導的個體CDR突變誘發進一步多樣化之基礎。 嗟菌體呈現策略產生前導分子D〇Mlh-131-117及DOMlh-131-151。活體外隔室化技術產生D〇Mlh-l 31-511。 在該階段中’在生物物理及生物檢定中比較此等三個前 導分子，且DOMlh-131-511為具有最佳性質之分子。此 外，在胰蛋白酶或白血球酶存在下測試該等分子的蛋白水 I31418.doc •127- 200911834 解裂解抗性。白血球酶由自患有囊性纖維化之患者彙集的 瘦組成且含有高含量之彈性蛋白酶及其他蛋白酶且用作肺 疾病活體内條件之替代品。該資料指示所有三個前導分子 DOMlh-131-117、DOMlh-131-151 及 DOMlh-131-511 在胰 蛋白酶或白血球酶存在下均快速降解。該研究結果引起對 田DOMlh-131-511處於患者體内時其活體内持久性之關注 且研發-種選擇改良胰蛋白酶抗性之策略。假定該經改良 胰蛋白酶抗性會對分子4其他生物物理纟f產生有利效 應二基本上修改標準噬菌體選擇方法以允許在對抗原選擇 之前在蛋白酶存在下進行選擇。為此目的，使缺失。部 標籤之新賴噬菌體載體工程化以允許在胰蛋白酶存在但未 使所呈現之dAb裂解脫離噬菌體的情況下進行選擇。產生 基於DOMlh-131-511之易於出錯之庫且選殖於卿㈣載 體中（關於PDOM33載體圖，參見圖5〇)。在37。〇下用i 夷蛋白酶預處理由該庫產生之嗟菌體儲 備液24小時，接著添加為㈣以全蛋白酶抑制劑（RO-
Complete Protease Inhibit〇r)(2x)之蛋白酶抑制劑以在選擇 相前阻斷騰蛋白酶活性。&行4輪選擇。在沉 下在存在或不存在胰蛋白酶（在1〇〇 μ§/ηιΐ或1〇〇〇最 終姨蛋白酶濃度下）之情況τ培養W、時或培養隔夜期間， 在存在或不存在蛋白酶之情況下使用扪心〇^顶評估可溶 性表現TNFR1結合dAb的結合TNFR1之能力。 冷 八此引起兩個前導分子DQMlh_131_2G2&D咖h i3i_2〇6 分離’該兩個前導分子如BIA⑽eTM抗原結合實驗所示顯 131418.doc -128- 200911834 示改良之蛋白酶抗性。令人關注地注意到，與DOMlh-131-511相比，DOMlh-131-202僅含有一個突變在CDR2中 (V53D)(所有胺基酸編號根據Kabat)，而DOMlh-131-206僅 含有兩個突變：第一突變與〇01^111-131-202相同（在〇0112 中之V53D突變）及第二突變為FR3中之Y91H突變（參見圖 3)。該FR3中之Y91H突變出現在3-20人類生殖系基因中， 指示該殘基出現在人類抗體中。該三個純系DOM 1 h- 13 1 - 511、DOMlh-131-202及 DOMlh-131-206 具有如圖 3 中所示 ί 之胺基酸序列。 如下測定分子活性： DOM1H-131-202、DOM1H-131-511 及 DOM1H-131-206結 合人類TNFR1之BIAcore™結合親和力評估。 由 BIAcore™ 分析評估 DOM1H_131_2〇2、D〇M1H131_ 511及DOM1H-13 1-206結合人類重組大腸桿菌表現之人類 TNFR1之結合親和力。使用生物素標記之人類TNFR1進行 分析。將1400 RU經生物素標記之TNFR1塗佈於抗生蛋白 、 鏈菌素（SA)晶片上。使用弱酸溶離條件使表面再生回到基 線。規定濃度之 DOM1H-131-202、DOM1H-131-511 及 DOM1H-131-206使用50 4/min之流速通過該表面。在 BIAc〇re™ 3000機器上進行研究，分析資料且擬合於ι:ι之 結合模型。所有測試分子之結合資料充分擬合於Μ模 型。由kjkoff速率計算所有κ—。在饥進行bia⑽— 運行。 以下資料由三個獨立的實驗吝士 扪Λ驗產生。在各個實驗中，藉由 131418.doc -129- 200911834 平均大量擬合結果（對kd而言使用最高之dAb濃度及對ka而 言使用較低之濃度）來計算結果。資料以結果之平均值及 標準偏差（在括號中）呈示（表1)。 表1 :結合人類TNFR1 之 DOM1H-131-202、DOM1H-131-511 及 DOM1H-131-206之 BIAcoreTM 資料 κοη k〇ff ΛΓζ,(ηΜ) DOM1H-131-511 5.03Ε+05 5.06E-04 1.07 (511) (1.07Ε+05) (1.01E-04) (0.44) DOM1H-131-202 1.02Ε+06 5.42E-04 0.55 (202) (2.69Ε+05) (3.69E-05) (0.11) DOM1H-131-206 1.55Ε+06 7.25E-04 0.47 (206) (3.57Ε+05) (1.95E-04) (0.06) DOM1H-131-202、DOM1H-131-511 及DOM1H-131-206類 似地且以高親和力結合人類TNFR1。DOM1H-131-202及 DOM1H-131-206分別以0.55 nM及0.47 nM之平均親和力結 合。與具有1.07 nM之平均親和力之DOM1H-131-511相 比，DOM1H-131-202及DOM1H-131-206具有稍佳之親和 力。 受體結合檢定： 在受體結合檢定中測定dAb對人類TNFR1之效價。該檢 定量測TNF-α與TNFR1之結合及可溶性dAb阻斷該相互作 用之能力。將TNFR1-FC融合物捕獲在預塗佈山羊抗人類 IgG(H&L)之珠粒上。將受體塗佈珠粒與TNF-a(10 ng/mL)、dAb、生物素接合抗TNF-a及抗生蛋白鏈菌素 alexa fluor 647在黑色側面透明底面之384孔板中一起培 131418.doc •130- 200911834 養。6小時後，將板在ABI 8200細胞偵測系統中讀數且測 定珠粒相關螢光。若dAb阻斷TNF-α與TNFR1之結合，則 螢光強度將減小。 使用ABI 8200分析軟體分析資料。使用GraphPad Prism 及具有可變斜率之S形劑量反應曲線測定濃度效應曲線及 效價（EC5〇)值。在三種獨立的情形下重複檢定。各實驗中 包括TNF-α劑量曲線（圖38及39)。所使用之與dAb競爭以結 合TNFR1之TNF-α濃度（10 ng/ml)在該檢定中為最大TNF-a 反應之約90%。 圖39中展示代表性曲線圖，其展示dAb抑制TNF-α與 TNFR1之結合之能力。在所有三個實驗中，陰性對照樣品 (HEL4，抗雞蛋白溶菌酶dAb及VH模擬物）在高濃度下微弱 抑制TNF-a與TNFR1之間的相互作用。表2中展示測試樣品 及陽性對照（自R&D Systems獲得之抗TNFR1 mAb， mAb225)及 EnbrelTM(依那西普（etanercept);由連接於 IgGl Fc部分之TNFR2組成之二聚融合物；經許可用於治療類風 濕性關節炎）的平均效價（EC5〇)值。 表2 :三個重複實驗之TNFR1受體結合檢定中DOM1H-13卜 202、DOM1H-13 1-206 及 DOM1H-131-511 之效價（EC5。）值 樣品 平均 EC50(nM) SEM DOM1H-131-202 0.11 0.008 DOM1H-131-206 0.07 0.01 DOM1H-131-511 0.19 0.01 Enbrel™(Etanercept) 0.20 0.07 ’抗 TNFRlmAb# mAb225 0.08 0.003 131418.doc -131 - 200911834 在該檢疋中，D〇M丨h·丨3丨_2〇6似乎比正測試之其他兩種 dAb 有效且與市售抗 TNFR1 mAb，maB225(R and D Systems)具有類似效價。 如下文所述進行來自馬斯德畢赤酵母之前導純系之表現： 使用一個4導分子之一級胺基酸序列產生分泌表現於馬 斯德畢赤酵母中之密碼子優化基因。密碼子優化DOM1H-13 1-206與非密碼子優化D〇Mm_131摘之間存在75%之序 列致丨生。將二個合成基因選殖於表現載體pPIC-Ζα(來自 ^ InVltr〇gen)中，且隨後轉型為兩個畢赤酵母菌株X33及 KM71H。將轉型細胞濾出置於遞增濃度之芥森 (Zeocin)(l〇〇、3〇〇、6〇〇及9〇〇叫/爪丨）上以選擇具有多個整 合子（integrant)之純系。選擇各個細胞系及構築體的約15 個純系以用於表現篩選。因為馬斯德畢赤酵母中高/低基 因複本數與表現含量之間的相關性尚未完全理解，所以在 整個芥森濃度範圍内挑選數個純系。使用尚未就高產量進 行廣泛筛選之純系進行5 L醱酵罐運行。此使得產生大量 ( 用於進一步研究之物質。 用於蛋白質表徵之物質產生： 已廣泛使用基於蛋白質A之層析樹脂自微生物培養上清 液中純化VH dAb。雖然此舉使得單步純化方法產生高純度 (在大多數情況下通常>90%)材料，但對於一些分子，低pH 值溶離條件會導致形成聚集體。亦存在用於dAb之親和力 樹脂之容量受到限制之問題，此將意謂使用大量樹脂來加 工來自_罐之物H生用於表徵且進一步用於穩定性 131418.doc -132- 200911834 及喷霧器研究之高品質物質，使用混合模態電荷感應樹脂 (mixed modal charge induction resin)將下游的純化過程設 計為初級捕獲步驟，接著陰離子交換。未顯著優化，此允 許回收約70%之純度為約95°/。之表現dAb。 對於混合模態電荷感應樹脂，來自GE Healthcare之 Capto MMC上之捕獲步驟，使用50 mM磷酸鈉（pH 6.0)執 行管柱平衡且在不需要任何稀釋液或pH值調節之情況下加 載上清液。洗滌管柱後，使用為50 mM Tris(pH 9.0)之溶 離緩衝液由pH梯度溶離蛋白質。特定洗滌及梯度條件將略 視正溶離之蛋白質之pi而變化。 隨後使用陰離子交換層析用流經步驟（flow through step) 進一步純化溶離液峰。此舉可移除諸如醇氧化酶之殘餘 HMW污染且減少内毒素。使樹脂與PBS或無鹽之磷酸鹽緩 衝液（pH 7.4)平衡。將來自Capto MMC之溶離液加載於陰 離子交換樹脂上之後，dAb不結合且由流經步驟回收。内 毒素及其他污染物與樹脂結合。鹽之存在（若使用PBS缓衝 液）使該步驟之蛋白質回收率提高為91%，而非無鹽情況下 所達成之86%回收率。然而，鹽之存在會降低内毒素移除 之效力，以致與當不存在鹽時所獲得之<1.0 EU/ml之dAb 之内毒素含量相比，包括鹽之該步驟之後的典型含量經量 測為 58 EU/ml。 蛋白質表徵： 使用電喷霧質譜、胺基末端測序及等電聚焦表徵由5L醱 酵罐運行所產生之物質的一致性，且使用SDS-PAGE、 131418.doc -133 - 200911834 SEC及Gelcode醣蛋白染色套組（pierc匀表徵純度。 一致性： 各蛋白質之第一個5殘基之胺基末端序列分析係如所預 期（EVQLL..·)。使用C4 Zip央頭（Millipore)對已緩衝液交 換於含有〇.1〇/0冰醋酸之5〇:5〇 H2〇:乙腈中之蛋白質樣品 執行質譜分析。三種蛋白質中每一種之量測質量當允許因 形成内部雙硫鍵而產生之_2的質量差時係在基於一級胺基 酸序列之理論質量（使用平均質量計算）之〇.5 〇&範圍内。 使用IEF基於對於各蛋白質為不同之pI鑑別蛋白質。 純度： 將二種蛋白質叫及1〇吨之量一式兩份裝載於非還原 SDS-PAGE凝膠上。在所有情況下，觀察到單一條帶。亦 執订尺寸排阻層析以顯示純度級。對於尺寸排阻層析 (SEC) ’將1〇〇 各蛋白質裝載於T〇s〇H G2〇〇〇 §貿紅管 柱上，在0.5 ml/min下流動。移動相為pBS/1〇%乙醇。 研究dAb穩定性用於候選物選擇·· 、對於COPD適應症，將有必要（例如）使用噴霧器裝置傳 遞dAb至肺中。此將意謂視所使用之噴霧器類型而定蛋白 質可潛在經歷一定範圍之剪切應力及熱應力且在肺環境下 可經受蛋白酶酶促降解。已確定若蛋白質可使用該類型之 裝置傳遞’則其形成適當粒度分布且在噴霧器傳遞後保留 :能。因,匕，研究各分子對一定範圍之物理應力之固有穩 疋性以喊定指示基線穩定性及最易感穩定性之檢^ 1為 各蛋白質之穩定性將依㈣各蛋白f溶解於其中之緩衝溶 13I418.doc •134- 200911834 液，所以一些預調配研究為必需的。該諸如緩衝液、卩^值 之負δίΐ亦適用於理解下游純化過程及隨後儲存期間蛋白質 之穩疋性。為表徵暴露於一定範圍之物理應力期間分子之 變化，使用大量分析技術，諸如尺寸排阻層析（Sec)、 SDS-PAGE及等電點聚焦（jef)。 DOM1H-131-202、DOM1H-131-511 及 DOM1H-131-206 之蛋 白酶穩定性之評估： 在過量蛋白酶中預培養規定時間點後由BIAcoreTM分析 殘餘結合活性評估DOM1H-13 1-202、DOM1H-131-511及 DOM1H-13 1-206之蛋白酶穩定性。將約14〇〇 RU經生物素 標記TNTRT塗佈於抗生蛋白鏈菌素（SA)晶片上。在3〇{>c下 使 250 nM DOM1H-131-202、DOM1H-131-511 及 DOM1H-13 1-206與僅PBS —起或與1〇〇 pg/mi騰蛋白酶、彈性蛋白 酶或白血球酶一起培養1、3及24小時。藉由添加蛋白酶抑 制劑混合物使反應停止。然後使用參考池扣除法（reference cell subtraction)使dAb/蛋白酶混合物越過TNFR1塗佈晶 片。在每次注射循環之間用1〇 μ1 〇丨Μ甘胺酸（pH 2.2)使 晶片表面再生。相對於無蛋白酶之dAb結合，測定結合與 蛋白酶一起預培養之人類TNFR1 (在10秒内）之DOM1H- 131-202、DOM1H-131-511 及 DOM1H-131-206 的比例。在 25°C下進行BIAcore™運行。由三個獨立的實驗產生資料。 條形圖指示平均值且誤差棒指示結果之標準偏差（關於結 果，參見圖24)。 已發現’與 DOM1H-131-511相比，展示 DOM1H-131-202 131418.doc -135· 200911834 及DOM 1H-13 1-206具有較高胰蛋白酶、彈性蛋白酶或白血 球酶蛋白質降解抗性。與DOM1H-131-511相比，DOM1H-13 1-202與DOM1H-13 1-206之間的差異在與胰蛋白酶一起1 小時後及與彈性蛋白酶或白血球酶一起3小時後最明顯。 如使用DSC所測定之熱穩定性： 為測定在何pH值下分子具有最大穩定性’使用差示掃描 量熱計（DSC)量測各dAb在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中之熔融 溫度（Tm)。當伯瑞坦-魯賓遜係由三組分緩衝液系統（乙酸 f 鹽、磷酸鹽及硼酸鹽）構成時，在同一溶液中有可能產生3-10範圍内之pH值。由蛋白質一級胺基酸序列確定理論P1。 由DSC，可見dAb具有最大内在熱穩定性之pH值對 DOM1H-131-202 (202)而言為 pH 7 ’ 對 DOM1H-131-206 (206)而言為 pH 7-7.5，且對 DOM1H-131-511 (511)而言為 pH 7.5。關於所有隨後應力及穩定性研究，對於各dAb使 用以下pH值：在伯瑞坦-魯賓遜缓衝液中，對於DOM1H-131-202 (202)及 DOM1H-131-206 (206)，pH 7.0 ;且對於 、 DOM1H-131-511 (511)，pH 7.5。結果概述於下表3 中： 表3 :如由DSC所測定於伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中之1 mg/ml DOM1H-131-202 (202)、DOM1H-131-206 (206)及 DOM1H-131-511 (511)之 pH 及 Tm 的概述 dAb 產^最大固有熱穩 定性之pH值 在給定pH值下dAb之 Tm(°C) DOM1H-131-202(202) 7.0 68.6 DOM1H-131-206 (206) 7.0-7.5 65.8 DOM1H-131-511 (511) 7.5 58.0 131418.doc -136- 200911834 固有溶解度測試： 在離心Vivaspin濃縮器（5K截止點）中濃縮所有前導心
樣品體積及濃度，且 —八观啡m <印队篁。在伯瑞坦_魯 穩疋pH值下執行實驗。經一定時程量測 且記錄與預期濃度之偏差以及樣品回收 百分率。 已發現，所有蛋白質均可在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中濃 縮至超過100 mg/ml。雖然與D〇M1H_131_5U (511)相比， DOM1H-131 202 (202)與 D〇M1H_131_206 (2〇6)展示比預期 低之回收率’但仍在可接受之水準内。 前導dAb之喷霧器傳遞： 藉由測試不同噴霧器及調配物緩衝液，已證明{1人13可使 用廣泛範圍之喷霧裝置有效傳遞。更重要地，首次展示 dAb於調配物緩衝液中之噴霧產生有效肺傳遞想要之粒度 分布（使用<5 μηι之液滴之百分率進行比較），同時維持蛋 白質功能性。此進一步描述如下。 比較多種裝置中之效能： 在六個喷霧器裝置中測試DOM1H-13 1-511 (511)，該六 個喷霧器裝置包含三個主要種類之液體調配物喷霧器（亦 即，超音噴霧器、喷射喷霧器及振網喷霧器）之每一類的 各兩個裝置。在各裝置中，在一定範圍之PEG濃度下，測 試 5 mg/ml dAb。對於各樣品，使用 Malvern Spraytek Device(Malvern Instruments Limited，UK)量測 <5 μιη之液 滴尺寸之百分率且結果展示於圖35中。使用SEC評估各樣 131418.doc -137- 200911834 喷務後之穩定性以分析已二聚於殘留在杯中及所收集之 氣霧劑中之物質中的樣品的量。結果可見於圖36中。二聚 體形成程度越小，穩定性越高。 大多數裝置可傳遞40%或更多的適當尺寸範圍内之液體 調配物’但eFl〇w(振網噴霧器裝置）及PARI LC(喷射噴霧 器）裝置表現更佳，其中當緩衝液中包括PEG時，PARI LC (星就）裝置傳遞超過80%。由eF low亦觀察到因peg該 傳遞之增加，對於PARI LC+，程度較小。 重要地’亦發現’ dAb之活性在噴霧後仍保留（參見圖8 中之結果）。 緩衝液添加劑之效應： 由於〇〇]^111-131-511(511)之較低穩定性，5〇1111^填酸鹽 調配物緩衝液含有PEG 1000與蔗糖（且具有定義為約等於 約2%至約1 0% PEG丨000於含有丨2% w/v蔗糖之5〇 m]y[磷酸 鹽緩衝液中之溶液黏度之範圍内的黏度）以有助於保護^八匕 以免受剪切應力與熱應力。當DOM1H-131-202 (202)及 DOM1H-13 1·206 (206)具有較高Tm且展示顯著增加之熱應 力穩疋性日年’在原始調配物緩衝液中及伯瑞坦-魯賓遜緩 衝液（其具有比調配物緩衝液低之黏度）中測試所有分子。 在5 mg/ml之蛋白質濃度下在3.5分鐘之運行時間内在E_ flow 與 Pari LC+裝置中測試dAb且使用 Malvern Spraytek Device測定粒度分布。作為比較，使用噴霧器裝置傳遞之 用於膀胱纖維化之市售藥物（命名為標準蛋白質χ)在其自 身調配物緩衝液中測試。結果展示於圖3 7中。為獲得良好 131418.doc •138- 200911834 傳遞及於深肺中之分配，理想粒度小於6微米，例如u μιη。所有dAb在伯瑞坦_魯賓遜緩衝液與調配物緩衝液（如 先珂所述）中均得到小於5 μιη之可比較級別之粒度。然 而，調配物緩衝液之較高黏度尤其可有利產生適當尺寸範 圍内之粒子，例如<5 μηι之粒子。在噴霧之前及之後由 α280量測法測定裝置之杯中dAb之濃度。已發現，蛋白質 濃度並未顯著變化’指示蛋白質與媒劑在傳遞期間均不會 優先喷霧。 結論： 如上所述，已證明諸如dAb之多肽可在大量市售噴霧器 裝置中喷霧，且重要地，其在噴霧後保留穩定性及生物活 性，且喷霧後未觀察到顯著聚集。當向緩衝液調配物中添 加諸如PEG之黏度增強賦形劑時，粒度分布及小於5 之 液滴尺寸百分率得以改良，因此潛在改良dAb至深肺之傳 遞。 dAb至肺之傳遞亦可藉由增加dAb濃度、例如高達約4〇 mg/ml之濃度及傳遞時間來改良而無dAb穩定性或活性之 任何降低。 實例1 嗜菌艘載艘PDOM13 使用絲狀噬菌體（fd)呈現載體pD〇MU。該載體與噬菌 體外殼蛋白111產生融合蛋白。圖1中說明pDOM13之多個 選殖位點。將編碼dAb之基因選殖為心/1/TVoiI片段。 實例2 131418.doc •139- 200911834 測試蛋白酶對具有一定範圍之胰蛋白酶抗性之噬菌體呈 現區域抗體（dAb)的選擇 將編碼結合IL-1R1之dAb DOM4-1 30-54、結合TNFR1之 〇〇^/[111-131-511及結合乂£〇?人之〇〇^115-10、〇〇]\415-26及 DOM15-26_501的基因選殖於pD〇M13中，且根據標準技術 產生呈現該等dAb之噬菌體◦將噬菌體由PEG沈澱純化， 再懸浮於PBS中且測力價。 當以經分離蛋白質形式測試時，上述dAb展示一定範圍 之抗胰蛋白酶降解之能力。如下評估抗降解性：在3(rc下 將40 μ§/ιη1於PBS中之dAb(l mg/mi)與胰蛋白酶一起培養， 產生25:1 dAb :胰蛋白酶之分子比。添加胰蛋白酶之前即 刻，且隨後在T=1小時、3時間及24小時時採集樣品（3〇 μΐ)。藉由添加Roche完全蛋白酶抑制劑中和蛋白酶活 性，接著浸入液氮中且儲存於乾冰上。隨後藉由在 10-20% Tricine凝膠上電泳分析15 ^&dAb樣品，且用 SureBlue(l X)染色蛋白質。 第一個3小時期間，〇01^15_1〇與〇〇]^15_26_5〇1顯著分 解。DOM15-26、DOM4_130_54&D〇Mlh l3i-5ii 較二 定，其中dAb之分解僅在24小時後變得明顯（圖2)。 _ 亦在胰蛋白酶存在下培養噬菌體呈現(1八13以評估噬菌體 呈現dAb之胰蛋白酶抗性是否與由經分離可溶性_所獲 得之結果相關。測試多種濃度之騰蛋白酶及培養時間。: 所有狀況下，用Roche完全蛋白酶抑制劑中和胰 後’測試嗤菌體結合-般配位體：蛋白f A(其結合所有^ 131418.doc -140- 200911834 區域抗體（例如，DOMlh-131、DOM15-26、DOM15-26-5〇1))或蛋白質L(其結合所有\區域抗體（例如，D〇M4_ 130-54、DOM15JO))之能力。亦測試噬菌體與靶抗原之結 合。在該兩種狀況下，認為結合與因經抗蛋白水解性保留 dAb結構完整性相關。由EUSA(使用針對噬菌體之接合抗 體）或由溶離所結合之噬菌體及指數生長大腸桿菌TG1細胞 感染後進行力價分析來量測結合活性。 用 DOM15-10、D〇M15-26及 DOM15-26-501 測試噬菌體 在室溫下在一定範圍之胰蛋白酶濃度（1〇〇 pg/ml、1〇 pg/ml及〇 pg/ml)下，將各dAb處理丨小時。用R〇che完全蛋 白酶抑制劑（lx)阻斷胰蛋白酶活性，且隨後將噬菌體稀釋 於PBS中之2% Marvell中，在室溫下與5〇 nM經生物素標記 抗原（重組人類VEGF(R & D systems))—起培養1小時。添 加在至溫下用PBS中之2% Marvell預阻斷1小時之抗生蛋白 鏈菌素塗佈微珠（Dynabeads M-280(Invitrogen))，且隨後在 至/JBL下將此合物培養5分鐘。所有與Dynabeads —起培養之 步驟均在轉輪上進行。藉由用1 mlMPBs中之〇 1〇/〇 Tween_ 20洗滌珠粒8次洗除未結合噬菌體。用〇5 ml 〇1 M甘胺酸
(pH 2.2)溶離所結合噬菌體且用1〇〇 μ1 1 μ Tris-H(：L(pH 8·〇)中和。使用溶離噬菌體感染指數生長之TG1細胞（在 37 C下I小時）且塗鋪於四環素板上。在3Γ(：下將板培養隔 伏且進行囷落计數（參見表4)。由與100 pg/ml騰蛋白酶 一起培養之選擇觀察到最佳結果。與D〇mi5-1〇及DOM15-26-501相比，D〇Ml5_26之產率增加約1〇倍。 131418. doc 200911834 進行第二實驗以在更苛刻培養條件下進一步證實該等結 果。在攪拌（25 0 rpm)下在3 7°C下將噬菌體呈現dAb處理H、 時或2小時。由與100 μ§/ιηι胰蛋白酶一起培養2小時之選擇 觀察到最佳結果。DOM15-26之產率比D〇M15_26_5〇1之產 率向200倍且比d〇M 15-10之產率高looo倍。 在第二實驗中，開始時將呈現〇〇馗15_26及D〇Mi5_26_ 501之噬菌體i:1混合。隨後在攪拌（25〇印以）下在37它下在 有胰蛋白酶（1〇〇〇 pg/ml)或無胰蛋白酶之情況下將其培養2 小時，且隨後如上所述就抗原結合加以選擇。測序來自各 選擇之10個菌落，對於無胰蛋白酶預處理之選擇，揭露純 系混合群體（DOM15-26 : 4/10 ; DOM15-26-501 : 6/10)， 而有胰蛋白酶進行選擇之所有純系如所預期編碼D〇m1 5-26 ° 該等實驗指示選擇壓力可藉由向噬菌體呈現dAb中添加 蛋白酶來獲得’以致優先選擇呈現蛋白水解最穩定之dAb 之喔菌體（在淘選一般配位體或抗原之後）。 表4 實驗 培養時間 長短 溫度 胰蛋白 酶濃度 DOM15-26力價 DOM15- 26-501 力價 1:1 混合 力價 DOM15-10力價 1 輸入101D lhr 室溫 100 μ^ιηΐ 1·6χ108 6.3χ107 l.lxio7 lhr 室溫 10 pg/ml 3χ108 4.4χ108 2.4χ1〇8 lhr 室溫 0 pg/ml 0.9χ108 2χ108 0.7xl〇8 2 輪入10 1 hr，250 rpm 37〇C 100 pg/ml 2χ107 ΙχΙΟ6 lxlO5 2 hr > 250 rpm 37〇C 100 pg/ml 1χ107 6χ104 lxlO4 2 hr，250 rqm 37〇C 0 μβ/ιηΐ 5.4χ107 4.1χ107 丨 3xl〇8 131418.doc -142- 200911834 實驗 培養時間 長短 溫度 胰蛋白 酶濃度 DOM15-26力價 DOM15- 26-501 力價 1:1 混合 力償 3 輸入101G 2 h，250 rpm 37〇C 100 pg/ml 2.3χ108 8χ105 2 h，250 rpm 37〇C 0 μ^ηιΐ 3.9χ108 4.4χ108 4.8χ108 用DOM4-130-54測試噬菌體 DOM15-10力價
以如上所述之類似方案測試DOM4-130-54。變化之參數 為：胰蛋白酶之濃度、溫度及培養時間長短。針對IL-RI-Fc(IL-lRl與Fc之融合物）在1 nM於PBS中之濃度下進行生 物淘選。僅在37°C下使噬菌體與100 pg/ml胰蛋白酶一起培 養隔夜後才觀察到噬菌體力價之顯著降低（參見表5)。 表5 培養時間長短 溫度 胰蛋白酶濃度 力償 1 hr 它、、田 主/皿 100 pg/ml 1.8xl010 1 hr 它、、苡 主/息 10 pg/ml 7.2x109 1 hr 主航 0 pg/ml 6.6χ109 隔夜 它、、田 主/凰 100 μ§/ιη1 2.16xl09 隔夜 金、、田 3L /m 10 pg/ml 7.2x109 隔夜 主度 0 pg/ml 7.8xl09 隔夜 37〇C 100 pg/ml 2.04xl06 隔夜 37〇C 10 pg/ml 3.84x10s 隔夜 37〇C 0 pg/ml 7.2xl09 用DOMlh-131測試噬菌體 在室溫下用 〇 pg/ml、1〇 pg/rnl、1〇〇 pg/ml及 1000 gg/ml 胰蛋白酶處理DOMlh-131噬菌體（胺基酸序列與DOMlh-13卜511密切相關小時。藉由添加25x完全蛋白酶抑制劑 (Roche)抑制分解。沿著塗佈有i nM TNFR1之ELISA板進 131418.doc -143- 200911834 用純化連接混合物使大腸桿菌TB1細胞轉型’從而產生四 環素抗性純系大譜系：8.5xl08(DOM4-130-54)、ΐ.5χΐ09 (DOMlh-131-511)、6xl08(DOM15-10)及 3xl09(D〇M15-26- 555)。 藉由以PEG雙重沈澱製備噬菌體庫且再懸浮於PBS中。 胺基酸突變率對〇〇?4111-131-511及〇〇1^4-130-54譜系而 言分別為2.3及4.4。藉由在噬菌體ELISA中使用塗佈有蛋 白質A或蛋白質L(1 pg/ml)之孔測試96個純系評估功能性。 在〇〇]\4111-131-511及〇〇?^4-130-54譜系中分別有62.5。/0及 27%之純系展示功能性呈現dAb。 胺基酸突變率對DOM1 5-10及DOM1 5-26-555譜系而言分 別為2.5及4.6。藉由在噬菌體ELISA中使用塗佈有蛋白質A 或蛋白質L(1 pg/ml)之孔測試96個純系來評估功能性。在 DOM1 5-10及DOM1 5-26-555譜系中分別有 31.3%及 ίο.4%之 純系展示功能性呈現dAb。 DOM4-130-54及 DOMlh-131-511 譜系 對該等庫進行4輪選擇以選擇具有改良蛋白酶抗性之 dAb。 第1輪選擇係抗原結合（1 nM或10 nM抗原）而無蛋白酶處 理從而淨化庫以移除不再以高親和力結合抗原之任何純 系。第1輪之輸出係在1〇8_1〇10範圍内（與1〇"噬菌體之輸入 形成對比）’指示庫之大部分以高親和力結合抗原。 在第2輪中引入1〇〇 0§/1111胰蛋白酶之蛋白酶處理，且輸 出展示於下表7中： 131418.doc -145 - 200911834 表7 胰蛋白酶培養條件 DOMlh-131-511 庫 DOM4-130-54庫 37°C隔夜 1.86χ106 2.1xl〇6 37°C，2小時 4.8χ108 5.1xl〇8 室溫，2小時 1.2xl09 4.62X109 無胰蛋白酶 約ΙχΙΟ9 約 4xl09 無抗原 1.8xl04 <6x103 當在37°C下用胰蛋白酶處理dAb隔夜時，存在顯著選 Γ 擇。將該輸出物送至第3輪，其中在37t：下用1 mg/ml或 100 pg/ml胰蛋白酶處理噬菌體24小時。來自第3輪之經胰 蛋白酶處理過之噬菌體的力價對D〇Mlh-l 3 1-511譜系而言 為 105-106且對 DOM4-13 0-154譜系而言為 107-1〇8。 來自第3輪之所有輸出物（D〇Mih-131-511 &DOM4-130-1 54，1 mg/ml及100 kg/mi)在loo gg/mi姨蛋白酶下經受針 對1 nM抗原之第4輪選擇。類似於第3輪中所見，力價係在 106-108範圍内。對於DOMlh-131-511譜系可見一些富集’ % 而對於DOM4-130-54譜系無富集。 DOM15-10 及 DOM15-26-555 議系 第1輪選擇係用2 nM經生物素標記hVEGF(人類血管内皮 生長因子）濃縮物來進行而無蛋白酶處理從而淨化庫以移 除不再以高親和力結合抗原之任何純系。第丨輪之輸出為 約 108(與 DOM15-10之 1〇10噬菌體及 D〇M15_26_555 之 1〇1 丨噬 菌體之輸入形成對比），指示庫之大部分以高親和力結合 抗原。 131418.doc •146· 200911834 用2 nM經生物素標記hVEGF執行第2及第3輪選擇。在對 hVEGF淘選之前，在37t下在震盪器（250 rpm)中在胰蛋白 酶（1〇〇 pg/ml)存在下培養噬菌體。培養時間對dom15_1〇 譜系而言為1小時且對DOM1 5-26-555譜系而言2小時。 輸出如下：DOM15-10譜系之第2及第3輪選擇為^叫… 及9xl05 ; DOM15_26_555之第2及第3輪選擇為2 2><1〇8及 3.9χ1〇9 〇 實例4 f 分析選擇輸出物：DOM4-130-54及DOMlh-131-511譜系 將來自第3及第4輪之所有輸出物亞選殖於pD〇M5載體中 且轉型於JM83細胞中。pD〇M5載體為PUC119基載體。由 PlaC啟動子驅動蛋白質之表現^ GAS1前導序列（參見w〇 2005/093074)確保經分離可溶性dAb分泌於大腸桿菌JM83 之周貝及培養上清液中。隨機挑選96個及72個來自第3輪 及第4輪之個體菌落來表現。 對第3輪及第4輪輸出物之各12-24個純系進行測序。在 °亥兩輪選擇中觀察到一致突變且挑選約2 5個持有一致基序 (consensus motif)之純系來進一步表徵。該等純系之胺基 酸序列展示於圖3(D〇Mlh_131_5u所選擇之變異體）及圖 4(D〇M4-1 30-54所選擇之變異體）中且以DNA序列形式列於 圖19A-19L中。突出所選擇之純系中不同於親本序列的胺 基酸（彼等一致胺基酸由點標記p對應kCdri、cDR2及 CDR3之環用框勾畫。 該等純系係以大量表現，在蛋白質L(就DOM4-13 0-54變 131418.doc -147- 200911834 異體而言）及蛋白質A(就DOMlh-131-511戀思触 1 Μ M1變異體而言）上純 化且在存在或不存在胰蛋白酶(最終濃度為或 1000 pg/ml)之情況下在37°C下捭盖！ , 卜D養1小時或隔夜後就抗原 結合以BIAcore方式測試。 來自DOM4-M54選擇之輸出物通常較穩定大多數純 系保留胰蛋白酶抗性i小時且最佳純系保留隔夜。比較而 言，來自D〇Mlh·131·511選擇之少量純系抗騰蛋白酶H、 時’而無純糸抗姨蛋白酶隔夜。 ( 實例5 分析選擇輸出物：DOM15-10及DOMl5_26_555譜系 首先以單株嗟菌體阳从方式在存在或不存在姨蛋白酶 /刀解之情況下測試經胰蛋白酶預處理之選擇有效性。挑選 各庫之來自第2輪選擇之18個菌落及來自第3輪選擇之洲 菌落。使用純系 DOM15_1〇、D〇MI5各5〇1 及 d〇mi5-26 作為對照。其他對照包括第2及第3輪胰蛋白酶選擇後來自 各庫之擴增且純化的噬菌體溶液。 將各嗔菌體樣品分為兩部分，第一部分用1〇〇吨—姨蛋 酶處理第一 分不用胰蛋白酶處理。在^下在授掉 (25〇 rPm)下將該兩個部分培養i小時，且藉由添加r〇-完 全蛋白酶抑制劑（1 X )阻斷。 使用經胰蛋白酶分解及未經分解樣品執行噬菌體 ISA使ELISA孔塗佈有濃度為1 μ§/ηιι之於〇 1 μ碳酸氫 鹽緩衝液中之中性鏈親和素。用PBS進行絲及在室溫下 用1 /〇於PBS中之Tween-20阻斷抗原塗佈孔i小時之步驟 131418.doc 200911834 後，使孔塗佈有濃度為100 ng/ml之稀釋於1%於PBS中之 Tween-20中的經生物素標記hVEGF。接著，用PBS洗滌各 孔且添加用1% Tween-20/PBS 1:1稀釋之經處理或未經處理 之噬菌體上清液。在37°C下培養30分鐘後，用1% Tween-20/PBS洗滌孔，接著在37t下與抗M13噬菌體-HRP接合物 (1/5000稀釋於1% Tween-20/PBS中）一起培養30分鐘。隨後 用PBS及過氧化酶洗滌孔。藉由添加SureBlue試劑啓始反 應。約10分鐘後，用等效體積1 M HC1使反應停止，且在 OD45O ηΜ下讀取孑匕。 經胰蛋白酶處理之不穩定對照DOM1 5-10及DOM15-26-501之ELISA讀數給出低於0.404之OD45G，且認為該值為不 穩定純系之邊界值。產生低於0.404之OD之所有樣品視為 不穩定。超過彼值之所有樣品視為穩定。 表8 庫 胰蛋白酶 無胰蛋白酶 第2輪選擇 第3輪選擇 第2輪選擇 第3輪選擇 DOM15-10 33% 89% 100% 100% DOM15-26-555 94.4% 100% 100% 100% 表8展示各庫之第2及第3輪胰蛋白酶選擇後穩定純系之 百分率。第3輪選擇後，該兩個庫中可見胰蛋白酶抗性純 系之富集。在各狀況下，胰蛋白酶分解後，每次選擇後含 有擴增純化噬菌體混合物之對照ELISA孔之值大大高於 0.404。此外，當比較來自第3輪選擇之胰蛋白酶處理噬菌 體與來自第2輪選擇之胰蛋白酶處理噬菌體時，觀察到信 131418.doc -149- 200911834 號小幅增加。DOMl 5-10噬菌體庫展示該起始值之約14% 之增加。DOM15-26-5 55噬菌體庫展示代表該起始值之約 2 %之增加。 所有該等結果展示經騰蛋白酶預處理之選擇係有效自 DOM1 5-10及DOM1 5-26-555譜系選擇騰蛋白酶抗性嗟菌體 純系。 將來自第2及第3輪選擇（DOM15-26-555)及僅來自第3輪 選擇（DOM15-10)之所有輸出物亞選殖於pD〇M5載體中且 轉型於HB2 1 5 1電穿孔法勝任細胞（eiectr〇c〇mpetent 中。pDOM5載體為pUC119基載體。由Plac啟動子驅動蛋白 質表現。GAS 1前導序列確保經分離可溶性dAb分泌於大腸 桿菌HB 21 51之周質及培養上清液中。隨機挑選184個來自 各輪選擇（3及4)之個體集落來在1 ml培養物體積中表現。 將細函上清液稀釋於HBS-EP BIAcore緩衝液（1:1體積比） 中且分成兩份。僅向一個小瓶中添加胰蛋白酶，最終濃度 為20 pg/ml。在攪拌（250 rpm)下在37。〇下培養4〇分鐘。用 Roche完全蛋白酶抑制劑（lx)阻斷反應後，在mAc〇re 3〇〇〇 上就抗原結合（SA感應器晶片上之2,〇〇〇 ru經生物素標記 hVEGF)測試經胰蛋白酶處理與未經處理之喔菌體上清 液。 挑選純系之標準為：相對於未經處理之dAb，<〗5%之經 胰蛋白酶處理之dAb的抗原結合減小（基於在所選擇之時點 所達到之最大RU)，此通常將反映dAb對蛋白酶處理之穩 定性；及dAb自抗原解離期間，兩個時點之間的解離速率 131418.doc •150· 200911834 減小<4〇%。基於該等值，對60個來自DOM15-26-555庫之 第2與第3輪選擇之純系及17個來自DOM1 5-10庫之第3輪選 擇之純系進行測序。在該兩個庫之輸出物中觀察到一致突 變，且自各持有一致基序之庫挑選17個純系來進一步表 徵。該等純系之胺基酸序列展示於圖5(DOM15-26-555所 選擇之變異體）及圖6(DOM 15-10所選擇之變異體）中，且以 DNA序列形式列於圖2〇A_2〇E中。突出所選擇之純系中不 同於親本序列之胺基酸（彼等一致胺基酸由點標記）。對應 於CDR1、CDR2及CDR3之環由框勾畫。 將該等純糸表現於5 〇 m 1表現培養物中，在稀釋於hb § _ EP緩衝液中至100 nM濃度之蛋白質a(就D〇M15_26_555變 異體而言）或蛋白質L(就DOM15-10變異體而言）上純化且在 存在或不存在胰蛋白酶（最終濃度為2〇 μ§/ιη1)之情況下在 攪拌（250 rpm)下在37°c下培養丨5小時後就抗原結合以 BIAcore方式測試。 亦使用實例2中所述之方法測試該等純系胰蛋白酶抗 性。將蛋白質緩衝液交換至PBS中且濃縮至1 mg/ml。將25 Pg蛋白質與1 pg胰蛋白酶（promega)混合且在3〇。〇下培養〇 小時及24小時。此後，用R〇che完全蛋白酶抑制劑（1χ)阻 斷反應，且添加DTT以及增重劑（loading agent)。使樣品在 1 00 C下變性5分鐘。隨後由電泳在N〇vex i〇_2〇% Tricine凝 膝上分析1 5 Kg各樣品，且用SureBlue( 1 X)染色蛋白質。 來自DOM1 5-26-555選擇之輸出物通常較穩定，當以 BIAcore方式測試時大多數純系保留胰蛋白酶抗性丨5小 131418.doc -151 - 200911834 時’且當以SDS-PAGE方式運行時，保留隔夜。相比較而 吕，當以SDS-PAGE方式運行時，對於隔夜處理，僅少量 來自DOM1 5-10選擇之純系抗胰蛋白酶。 實例6 鑑別DOMlh-131-511變異體 更詳細地分析 DOMlh-131-203、DOMlh-131-204 及 DOMlh-131-2〇6。在37°C下與不同濃度之胰蛋白酶（在〇至 100 pg/ml範圍内）一起培養隔夜後，以BlAC0re方式在5〇〇 nM之dAb濃度下將其加以比較。BIAcore迹線展示於圖7 中。結果顯然展示在咼濃度騰蛋白酶（1〇〇 pg/ml)下該兩個 變異體比其親本對蛋白水解更具抗性。亦在上述條件下就 抗大量包括白金球酶、彈性蛋白酶及騰酶之其他蛋白酶而 言’在100 pg/ml之蛋白酶濃度下，比較兩個dAb DOMlh- 13 1-202及DOMlh-13 1-206與其親本。與親本相比，dAb抗 所有所測試之蛋白酶之蛋白水解展示增加之抗性。彈性蛋 白酶及白血球酶之BIAcore迹線展示於圖8中。 用100 pg/ml測序級胰蛋白酶處理5 μΜ各dAb 0、1、3及 24小時《用25 X Roche完全蛋白酶抑制劑抑制反應，且使 反應物在4-12% Novex Bis-Tris凝膠上運行。凝膠展示於 圖9中。 實例7 鑑別DOM4-130-54變異體
更詳細地分析 DOM4-130-201 及 DOM4-130-202。在 37°C 下與不同濃度之胰蛋白酶（在0與100 pg/ml範圍内）一起培 131418.doc -152- 200911834 養隔夜後，以BIAcore方式在500 nM之dAb濃度下將其加以 比較。BIAcore迹線展示於圖10中。結果顯然展示在高濃 度胰蛋白酶（100 pg/ml)下所有三個變異體比其親本對蛋白 水解更具抗性。亦在上述條件下就抗大量包括白血球酶、 彈性蛋白酶及胰酶之其他蛋白酶而言，在100 pg/ml之蛋白 酶濃度下，比較DOM4-130-201及DOM4-130-202與親本。 雖然結果與在胰蛋白酶下相比不太明顯，但前導dAb與親 本相比對所有所測試之蛋白酶展示增加之抗蛋白水解性。 ί ' 彈性蛋白酶及白血球酶之BIAcore迹線展示於圖11中。 用1 00 pg/ml測序級騰蛋白酶處理5 μΜ各dAb 0、1、3及 24小時。用25 X Roche完全蛋白酶抑制劑抑制反應，且使 反應物在4-12% Novex Bis-Tris凝膠上運行。凝膠展示於 圖9中。 實例8 進一步表徵DOMlh-131-511及 DOM4-130-54變異體 首先使用差示掃描量熱法（DSC)分析dAb以確定胰蛋白 ' 酶抗性之增加是否與熔融溫度（Tm)之增加相關。胰蛋白酶 穩定性之增加確實與Tm之增加相關（參見表9)。 表9 名稱 Tm(°C) DOMlh-131-511 57.9 DOMlh-131-202 67.5 DOMlh-131-203 65.7 DOMlh-131-204 62.3 131418.doc -153 - 200911834 名稱 Tm(°C) DOMlh-131-206 64.9 DOM4-130-54 54.1 DOM4-130-201 64.7 DOM4-130-202 64.5 亦在MRC-5細胞基檢定（cell-based assay)中比較DOMlh-131-511來源之dAb(參見表10)。在該檢定中，量測dAb中 和TNFa刺激之IL-8釋放之能力以確定胰蛋白酶穩定性之增 加是否已使得功效降低。然而，胰蛋白酶抗性dAb之活性 在該檢定中大體上未受影響。 表10 樣品 ND50(nM) DOMlh-131-511 1.98 DOMlh-131-511 1.71 DOM 1 h-131 -511 (230307CE) 1.89 DOM 1 h-131 -203(2303 07CE) 2.28 DOM 1 h-131 -204(2303 07CE) 1.89 DOMlh-131-511 1.46 DOM 1 h-131 -206(23 0307CE) 0.71 在受體結合檢定中測試DOM4-130-54來源之dAb以瞭解 其是否仍具有相同的抑制IL-1與IL-RI結合之能力（參見表 11)。胰蛋白酶抗性dAb之活性在該檢定中未受影響。 131418.doc -154- 200911834 表11
dAb IC50(nM) DOM4-130-54 280 pM DOM4-13 0-201 257 pM DOM4-130-202 254 pM 實例9 鑑別DOM15-26-555變異艎 更詳細地分析 DOM15-26-588、DOM15-26-589、 ， DOM15-26-591及DOM15-26-593以及其親本及兩個其他 dAbDOM15-26-5 94及DOM15-26-595，其係藉由組合將對 效價及穩定性產生最大影響之突變（E6V及F100S/I)之突變 誘發而創建。序列展示於圖12中。與濃度為200 pg/ml之胰 蛋白酶一起培養後在100 nM之dAb濃度下就hVEGF結合以 BIAcore方式比較純系。在攪拌（250 rpm)下在37°C下使反 應進行3小時及24小時。最佳純系DOM15-26-593及親本之 BIAcore迹線展示於圖13中。其他結果以圖表形式呈示於 ( 圖14中。結果顯然展示在胰蛋白酶處理24小時後，所有變 異體比親本對蛋白水解更具抗性。 亦藉由以SDS-PAGE方式運行經處理及未經處理之樣品 來檢查DOM1 5-26-593及親本之胰蛋白酶抗性。簡言之， 將蛋白質緩衝液交換至PBS中且濃縮至1 mg/ml。將25 pg 蛋白質與1 gg測序級胰蛋白酶（Promega)混合且在30°c下培 養0小時、1小時、3小時及24小時。此後，用Roche完全蛋 白酶抑制劑（1 X )阻斷反應，且添加DTT以及增重劑。使樣 131418.doc -155 - 200911834 品在100°C下變性5分鐘。將15 pg各樣品加載於Novex 10-20% Tricine凝膠上，且用SureBlue(lx)染色蛋白質。結果 展示於圖15中。該實驗中DOM15-26-593之胰蛋白酶抗性 概況不同於BIAcore實驗所展示之概況，從而提示反應條 件之不同可能會影響胰蛋白酶裂解之最終結果。儘管如 此，如下文所示，DOM15-26-593仍具有較其他所選擇之 純系佳之生物物理性質以及親和力。DOM1 5-26-555變異 體之性質之概述亦展示於下表1 2中。 表12 屬性 SEC-MALLS DSC RBA BIAcore 胰蛋白酶穩定性 dAb 單體％ 估算 mw Tm °C nM KDnM 在+24小時時之結合％ 15-26 0 37-136 64 10 28.2 30 15-26- 501 0-40 18-290 51 1.14 9.1 5 15-26- 555 0 28-78 63 11.7 26.1 10 15-26- 588 10 33 70 27 59.1 15 15-26- 589 90 17 63 1.94 9.6 65 15-26- 591 20 21-234 63 16 38 35 15-26- 593 80 17 65 0.323 3.2 80 15-26- 595 60 17 65 0.828 5 70 131418.doc -156- 200911834 實例1 ο 鑑別DOM15-10變異體 更詳細地分析DOM 15-10-11以及其親本〇〇]^15_1〇。序 列展示於圖16中。與濃度為200 pg/ml之胰蛋白酶一起培養 後在100 nM之dAb濃度下就hVEGF結合以BlAC0re方式比軾 dAb。在攪拌（250 rpm)下在37r下使反應進行1小時、3小 時及24小時。該等dAb之BIAcore迹線展示於圖17中。社果 顯然展示在胰蛋白酶處理24小時後，所選擇之變異體比親 本對蛋白水解更具抗性。 亦藉由運行SDS-PAGE之經處理及未經處理之樣品檢查 前導分子及親本之胰蛋白酶抗性。簡言之，將蛋白質緩衝 液交換至PBS中且濃縮至1 mg/m卜將25叫蛋白質與i肫 測序級胰蛋白酶（PromegahU合且在3(rc下培養〇小時、卜】、 時、3小時及24小時。此後，用Roche完全蛋白酶抑制劑 (lx)阻斷反應，且添加DTT以及增重劑。使樣品在下 變性5分鐘。將15 Mg各樣品加載於Novex 10-20% Tricing "’且用SureBlue(lx)染色蛋白質。結果呈示於圖18 中在此狀況下’胰蛋白酶抗性概況與BiAcore胰蛋白酶 、!-式充分相關，從而展示結合活性直接反映蛋白質之完整 性。 實例11 進一步表徵DOM15-26-55S及DOM15-10變異體 、百先使用差示掃描量熱法（Dsc)分析dAb以確定胰蛋白 b加疋否與Tm之增加相關。結果展示於表1 3 1314l8.doc -157- 200911834 中。DOM 15-26-5 55變異體之胰蛋白酶抗性與熔融溫度之 間存在相關性。前導DOM1 5-26-5 88及DOM15-26-593展示 改良之Tm，但其他純系不展示。值得注意的是，雖然起 始時 DOM15-26-5 55 及 DOM15-10 親本分子（63·3-63·7°〇 具 有比DOM4-130-54及DOMlh-131-511親本分子（起始時 Tm : 5 7·9-54.Γ〇高得多之Tm，但總之，蛋白酶抗性純系 達到類似範圍内之 丁〇1(001^111-131-511/001^4-130-54 變異 體之平均 Tm 為 65.1°C，DOM15-26-55/DOM15-10 變異體之 f 平均 Tm 為 64.9°C)。 表13 名稱 Tm(°C) D0M 15-26-555 63.3 DOM15-26-588 70.1 DOM15-26-589 63 DOM15-26-591 63 DOM15-26-593 65 DOM15-10 63.7 DOM15-10-11 63.3 在受體結合檢定中比較dAb，且量測BIAcore動力學以確 定胰蛋白酶穩定性之增加是否已使得功效降低。然而， dAb之活性在該檢定中大體上未受影響或甚至得以改良。 結果呈示於表1 4中。 131418.doc -158- 200911834 表14 純系ID EC5〇(nM) KD(nM) DOM15-26-555 11.7 26.1 DOM15-26-588 27 59.1 DOM15-26-589 1.94 9.6 DOM15-26-591 16 38 DOM15-26-593 0.323 3.2 DOM15-26-594 4.09 15.1 DOM15-26-595 0.828 5 DOM15-10 10.23 23.6 DOM15-10-11 3.58 14.6
Tm增加之優點 大多數蛋白質（包括區域抗體）以兩種狀態存在：摺疊狀 態（產生生物學活性分子）及展開狀態（不具有功能活性）。 該兩種狀態在所有溫度下共存且各狀態之相對比例通常由 隨摺疊及展開之動力學常數而變之常數K確定。熔融溫度 通常定義為κ=1之溫度，亦即，摺疊蛋白質之比例等於展 1 開蛋白質之比例時的溫度。常數κ係由蛋白質之穩定及不 穩定分子内相互作用確定，且因此主要由蛋白質之胺基酸 序列確定。諸如溫度、pH值、緩衝液組成、壓力之外在參 數影響K，且因此影響熔融溫度。 展開蛋白質為降解機制之容易靶：（i)暴露雙硫鍵視境況 而定會增加氧化或減小之風險，（Π)增加主鏈靈活性可有 助於自身蛋白水解反應，（iii)暴露肽片段可提供活體内蛋 白酶、製造過程期間蛋白酶及下游加工及長期儲存期間遺 131418.doc -159- 200911834 f 蛋白酶之靶，及（lv)暴露有聚集傾向片段會導致分子間 聚集及蛋白質沈殿。在所有狀況下，發生蛋白質完整性、 蛋白質含量及蛋白質活性損失，從而危及⑴確保批次重現 性’（η)確保存放長期穩定性及（iH)活體内功效之努力。 〃在自然界t ’蛋白質已藉由進化設計以適於在體溫下執 行且經由穩態機制容易地置換。經由生物技術方法製造出 之=療蛋白質面對不同環境：其通常由腿重組技術在外 ^ 中產生在大谷器中以較高量表現，整個下游過程 中經文極重大之pH值或緩衝液組成變化且最後長期以高濃 度儲存在非生理學緩衝液中。新賴傳遞技術（例如吸入、 皮下貼片、緩慢傳遞奈米粒子）亦會增加治療蛋白質所經 又之應力最後’蛋自質卫程化技術之出現使得可產生增 強或完全新穎之治療蛋白質。因為大多數工程化技術為旨 在改變或創造新賴胺基酸序列之基於活體外之技術，不會 發生逐步改良生物蛋白質之進化過程’因而產生在應力抗 性方面具有次最佳效能之蛋白質。 本發明之技術旨在再頦敕彳 隹冉現整個達爾文進化（Darwinian evolution)中蛋白質所面餅 /r面對之條件中之—種。用在組織重 塑及蛋白質穩態中發揮重要作用之蛋白酶灌注肽或多肽 W如免疫球蛋白單—可變區域）。亦測試任何可產生具有 改良之功能適應之蛋白質的 能力。在本發明之-實施例中，境之 肽變異體譜系且暴露於蛋白 胧次多 玄臼酶中。在第二步驟中，使變里 體譜糸與特定靶接觸。僅彼 ^ 又伍蛋白酶降解之蛋白質 131418.doc -160· 200911834 變異體能夠與靶接合，且因此（例如）由稱為’淘選'之簡單親 和力純化過程回收。與活體内過程相比，該系統提供多個 優點：蛋白質譜系可面對較寬範圍之條件，例如多種蛋白 酶、在較高濃度下、歷時較長時間、在不同緩衝液或pH值 下且在不同溫度下。因此，該活體外技術提供一種設計可 在較所起源之環境範圍寬之環境中表現且仍穩定的蛋白質 之方式。顯然，此為生物技術工業且尤其治療蛋白質領域 提供多個優點。 實例1 2 :蛋白酶抗性前導分子之PK相關性資料 進一步在活體内評估四個dAb品系中之每一個品系之親 本dAb及蛋白酶抗性dAb(關於清單及詳情，參見下表15)。 表15 : 品糸 dAb ID 胰蛋白酶 抗性 Tm CC) 活性 (nM) Fc融合物形式 之ID DOM4- 130 DOM4-130-54 良好 54 0.128* DMS1541 DOM4-130-202 極南 64 0.160* DMS1542 DOMlh- 131 DOMlh-131- 511 良好 57 0.048f DMS1543 DOMlh-131- 206 極南 64 0.0471 DMS1544 DOM15- 10 DOM15-10 低 64 0.913t DMS1546 DOM15-10-11 63 0.577f DMS1531 DOM15- 26 DOM15-26- 501(*) 低 52 0.330f DMS1545 DOM15-26-593 1¾ 65 0.033t DMS1529 131418.doc -161 - 200911834 * :如由MRC5/IL-a生物檢定所測定；t :如由RBA檢定所測定 註解：DOM15-26-501為本專利申請案中上文所例示之DOM15-26-555之親本形式。DOM15-26-555在CDR1(134M)中具有一個生 瘦系胺基酸突變。DOM15-26-501具有比DOM15-26-555低之熔融 溫度（52 V對63.3 t)及增加之對胰蛋白酶之分解的敏感性。優於 DOM15-26-555 挑選 DOM15-26-501 用於 PK 研究，因為與〇0从15-2 6-593相比，其更充分代表不良穩定性。 吾人可如下解釋抗性： 1低 2中 3良好 則此意謂親本分子之胰蛋白酶抗性為： DOM4-130-54 良好 DOMlh-131-511 良好 DOM15-10 低 DOM15-26-501 低 關於所選擇之前導分子： DOM4-130-202 極南 DOMlh-13 1-206 極南 DOM15-10-11 DOM15-26-593 因為區域抗體之尺寸小（12-15 kDa)，所以其在靜脈内或 皮下注射後自循環中快速清除。實際上，腎絲球過濾截止 點超過50 kDa，且因此諸如dAb之小蛋白質當其穿過腎時 131418.doc -162- 200911834 不會保留在循環中。因此，為評估活體内蛋白酶抗性之長 期效應，吾人用增加全身性滯留之部分標記區域抗體。文 獻中已報導數種旨在延長半衰期之方法（例如PEG、Fc融 合、白蛋白融合等）。在本申請案中，用人類IgGl抗體之 Fc部分標記區域抗體（或對其編排格式）。該格式提供兩個 優點：（i)所得dAb-Fc之分子尺寸為約75 kDa，其足夠大以 確保保留在循環中；（Π)抗體Fc部分結合FcRn受體（亦稱 "布蘭貝爾"受體）。該受體定位於上皮細胞、内皮細胞及肝 f 細胞中且涉及延長抗體及白蛋白之壽命：實際上，在抗體 及其他血清蛋白之胞飲作用後，蛋白質係引導至酸化核内 體，其中FcRn受體在抗體轉運至核内體且使其返回至循環 中之前截取抗體（經由與Fc部分結合）。因此，藉由使Fc部 分標記於dAb，確保dAb將長期暴露於至少兩個隔室：血 清及前核内體隔室（pre-endosomal compartment)中，其各 自含有一組特定蛋白水解酶。另外，FcRn受體介導之穿胞 運輸（transcytosis)，藉此使攜帶Fc之蛋白質遷至及遷出血 I 管外空間。 藉由經由短介入肽連接子（粗體）使編碼VH及Vk dAb之 基因與編碼人類IgGl Fc之基因融合實現用Fc編排格式： 對於VH dAb(加下劃線）： EVQ......GQGTLVTVSSASTHTCPPCPAPELLGGP.. .(hlgGlFc).. .PGK* 對Vk dAb(加下劃線）：
DIQ.........GQGTKVEIKRTVAAPSTHTCPPCPAPELLGGP.. (hlgGlFc)...P GK* 根據標準方案使用293-fectin(Invitrogen)藉由瞬時轉染 131418.doc -163- 200911834
HEK293/6E細胞產生物質。該等細胞係經設計以當與pTT 系列載體組合使用時局含量瞬時表現（Durocher等人， 2〇〇2)。因此，將dAb基因選殖於經修改ρΤΤ5載體 (pDOM3 8)中以產生Fc融合物表現載體（參見圖21)。在轉染 後5天收集轉染細胞之上清液’藉由離心澄清且經〇. 2 過濾器過濾。藉由捕獲於蛋白質Α流線型樹脂（GE
Healthcare)上純化dAb-Fc融合蛋白。以1〇 mM檸檬酸鈉 (pH 3)自管柱中溶離蛋白質，接著添加…及1 μ檸檬酸鈉 (pH 6)以達到1〇〇 檬酸鈉（pH 6)之最終組成。 就活體内半衰期在大鼠中以於雌性Sprague_Dawiey大鼠 (每組n=3)中5 mg/kg之靶劑量測試dAb-Fc分子。應注意， 靶劑量大大超過大鼠中之靶濃度，所以預期親本dAb與胰 蛋白酶抗性dAb之間的親和力差異（參見實例i丨）不會影響 活體内分子之最終結果。因此，希望dAb之間的PK概況之 差異歸咎於抗原獨立性排除過程。 在投藥後 0.03、1、4、8、24、48、72、96、120及 168 小時採集血樣。凝塊形成後，抽出血清且隨後在hIL_ 1R1、TNFR1或VEGF抗原捕獲檢定中測試。 hIL-lRl抗原捕獲檢定： 塗佈有 4 pg/mL 抗 hIL-lRl 阻斷 添加 500 ng/mL shIL-lRl 添加樣品 在1:10,000下用抗人類Fc HRP偵測 131418.doc -164- 200911834 TNFR1抗原捕獲檢定： 塗佈有 0.1 pg/mL sTNFRl 阻斷 添加樣品 在1:10,000下用抗人類？〇：«1^偵測 VEGF抗原捕獲檢定： 塗佈有 0.25 pg/mL VEGF 阻斷 ( 添加樣品 在1:10,000下用抗人類Fc HRP偵測 使檢定之原始資料轉化為各血清樣品中之藥物之濃度。 隨後在WinNonLin中使用非隔室分析（non-compartmental analysis，NCA)分析各時點之平均pg/mL值。各dAb-Fc對 之PK概況展示於表16中，其概述所測出之PK參數。 表16 : ID dAb 半衰期 (hr) AUC/D(0-inf) (hr* pg/mL)/(mg/kg) 外推AUC% DMS1541 4-130-54 93.2 691.5 22.7 DMS1542 4-130-202 176.8 710.1 49 DMS1543 lh-131-511 140.8 1807.5 40 DMS1544 lh-131-206 158.6 2173.0 43.6 DMS1546 15-10 43.2 324.6 3.8 DMS1531 15-10-11 56.6 770.5 n.d. DMS1545 15-26-501 12.9 89 5.1 DMS1529 15-26-593 86.2 804.7 21.0 131418.doc -165- 200911834 結果清楚指示，雖然dAb-Fc對4-130-54至111-131-206之 pk概況幾乎可重疊，但該等概況與其他對相差甚遠。當考 慮八1^/〇時，主要可見如下效應：15_10之八1；(：/;〇僅為15_ 10-11 之 42%。15-26-501 之 AUC/D僅為 15-26-593 之 11°/〇。 該等重要差異亦影響（較小程度）半衰期：15_1〇及151〇_11 分別為43.2 h對56.6 h。對於DOM15-26品系可見更大差 異· 15-26-501 及 15-26-593 分別為 12.9 h 對 86.2 h。實際 上，對於使用非隔室分析之良好Ρκ分析，應存在至少4個 f 用以擬合線性回歸斜率之資料點，且半衰期估算值之時間 應為半哀期計算值之至少3倍。 根據本文中之實例中所述之生物物理性質，任何給定 dAb抗胰蛋白酶降解之能力似乎與（1八13_1^融合物在大鼠血 清中循環較長時間之能力相關。實際上，如實例（諸如實 例10)中所不，DOM15-10及DOM15-26-501為最易降解之 dAb :在1 胰蛋白酶存在下在3(rc下培養25叫dAl^3小 時可產生完全降解。該研究中之所有其他dAb(不管其是否 ：： 、 以胰蛋白酶來選擇（亦即，DOM15-HM1、DOM15-26- 593、DOM4-130-202 及 D〇Mlh_131-206)或其是否已具有部 分如親本分子之胰蛋白酶抗性（DOM4-130-54及DOMlh-131-5 11))當再編排格式於dAb_Fc分子中時在大鼠中具有可 比之ρκ概況。因此，本發明之ρκ研究提示當彼等dAb具有 極低抗蛋白水解性時，對蛋白水解敏感會對dAb之活體内 穩定性產生最大影響。亦展示，超過一定程度，胰蛋白酶 降解抗性之進一步增量（例如DOM4-130-206對DOM4-130- 131418.doc -166 - 200911834 54)並不等於說dAb-Fc分子進一步減緩活體内排除之能 力。 在三種狀況下，在胰蛋白酶存在下之選擇產生熱穩定性 (由炼融溫度所疋義）增加之新穎分子：D〇M4_13〇_2〇2、 DOMlh-131-206 及 DOM15-26-593。PK 研究指示，在本發 明資料集中，熔融溫度不足以使所觀察到之ρκ概況合理化 之參數.實際上，DOM15-10具有比D〇M15_1〇 n高之 Tm，但比DOM 1 5-1 0-11更快速地自循環中清除。另外， DOM4-130品系之兩個dAb具有顯著不同之Tm(相差1〇。〇， 但當編排格式於dAb-Fc分子中時展示幾乎相同之活體内穩 疋性。應注意，本質上不應排除熔融溫度作為預測活體内 穩定性之關鍵參數。對於本發明之資料集恰好發生的為， 大Tm差異（自54。(：及以上）並不對活體内dAb之走向產生顯 著影響。此並不排除在低於54它之熔融溫度下，dAb之活 體内穩定性可能與熱穩定性相關或也許甚至與熱穩定性及 蛋白酶抗性都相關的可能性。 實例13 對DOM10-53-474之胰蛋白酶選擇 經純化DOM10-53-474之胰蛋白酶穩定性： DOM10-53-474為以高效價與iL_13結合之區域抗體。為 評估在胰蛋白酶存在下該dAb之穩定性，用胰蛋白酶分解 純化dAb歷時增加之時點且在凝膠上運行以檢查任何可能 的蛋白質降解。在3{rc下使25 μ1 i mg/ml之純化D〇Mi〇b_ 53-474與1 μΐ 1 mg/ml2測序級胰蛋白酶一起培養從而產 131418.doc -167- 200911834 生25.1 dAb :胰蛋白酶分 t ^ , L 刀千比。使dAb與胰蛋白酶一起 培養1 h、4 h及24 h，且蕤出、夭上 , 藉由添加4 μ】 Roche完全蛋白酶抑 =中 酶活性，料在冰上培養。藉由向⑽^ j白酶抑制劑而不添加胰蛋白酶製備時間〇之樣品。接 者猎由電泳使用LabchiD；^；t#®、止士 ^ P根據製商况明書分析2 μ1樣品。 圖22展示以與胰蛋白 一 酶起k養歷時增加之時點之 DOM10-53-474運行的凝 ’·· 马了比較，亦如以上所說明 用騰蛋白酶處理一種胰 但艰蛋白酶穩定dAb DOM15-26-593且 並排運行。如圖中所+，·ρ^ Α I。 y' DOM15-26-593即使在與胰蛋白 酶一起培養24 h後看起來亦盔禮 ^ 韦t术亦為穩定的。然而，雖然 DOM10-53-474在24 h德在一中和由， 、 便在疋知度上降解，但在1 h及4 h 時料看S來為穩定的。料f料表明dqmiq_53_474在 一又程度上抗膜蛋白酶降解，但不如最具騰蛋白酶穩定性 之 dAbDOM15-26-593穩定。 噬菌體呈現DOM10-53-474之胰蛋白酶穩定性：
為評估噬菌體呈現DOM10-53-474之胰蛋白酶穩定性， 將編碼DOM10-53-474之基因選殖於pD〇M33(圖5〇)之 位點中及根據標準技術產生噬菌體。將噬菌體由 PEG沈澱純化，再懸浮於Pbs中且測力價。 使噬菌體呈現dAb與胰蛋白酶一起培養不同時點以評估 胰蛋白酶抗性。與胰蛋白酶一起培養後，在感染指數生長 大腸桿菌TG1細胞後，由力價分析量測穩定性。 在37°C下在震盪培養箱中使100 y噬菌體於1〇〇叫^丨胰 蛋白酶中培養lh、 2h、 4 h及隔夜。用Roche完全蛋白 131418.doc -168- 200911834 酶抑制劑（x2)阻斷胰蛋白酶活性，且隨後將噬菌體稀釋於 2%於PBS中之marvel中，在室溫下與10 ηΜ經生物素標記 IL-13 —起培養1小時。添加在室溫下用2%於PBS中之 marvel預阻斷1小時的抗生蛋白鏈菌素塗佈珠粒（Dynabeads M-280(Invitrogen))，且隨後在室溫下將混合物培養5分 鐘。所有與Dynabeads —起進行之培養步驟均在轉輪上進 行。藉由用存於PBS中之0.1 % Tween-20洗務珠粒8次洗除 未結合噬菌體。用0.5 ml 0.1 Μ甘胺酸（pH 2.2)溶離結合噬 菌體且用100 μΐ 1 M Tris-HCL(pH 8.0)中和。使用經溶離 噬菌體感染指數生長之TG1細胞（在37°C下1小時）且塗鋪於 四環素板上。在37°C下將各板培養隔夜，且進行菌落計 數。將胰蛋白酶分解後之噬菌體輸出力價概述於表1 7中。 當與胰蛋白酶一起培養歷時增加時點時，噬菌體力價降 低。培養24小時後，所有噬菌體分解。 表17 :對噬菌體呈現DOM-10-53-474親本執行之胰蛋白 酶選擇之輸出力價 胰蛋白酶培養時間長短 胰蛋白酶濃度 力價 無胰蛋白酶對照 - 3χ107 1 h 100 pg/ml ΙχΙΟ7 2h 100 pg/ml 7χ106 4h 100 pg/ml 5χ106 隔仪 100 pg/ml 0 選擇更抗胰蛋白酶之dAb : 為選擇更抗胰蛋白酶降解之dAb，使用Stratergene 131418.doc •169- 200911834 跑犯㈣11套'组、經生物素標記引子及供50 μΙ反應用之 5-50 pg模板由PCR向編碼D〇M1〇_53_474之基因中引入隨 機突變。經知/；[及制分解後，用抗生蛋白鍵菌素塗佈珠 粒自未分解產物中純化插入物且將其在相應位點處連接於 PDOM33中。用經純化連接混合物轉型大腸桿菌頂細 胞’從而產生D〇M10_53_474之易於出錯之庫。庫之規模 為1.9xl〇9且胺基酸突變率為〗3。 〆 對該庫執行3輪選擇以選擇具有改良蛋白酶抗性之他。 在僅有抗原而無胰蛋白酶處理的情況下執行第】輪選擇以 淨化庫從而移除不再以高親和力結合抗原之任何純系。在 1〇 nMIL-U下進行選擇。與…〇1〇個輸入嗡菌體相比，第 ::原之輸出為WO9 ’從而指示庫之大部分以高親和力結合 们福經生物素標記IL_13執行第2及第3輪選擇 IL-13淘選之前，方+恭 在對 逬《月J在37匚下在震盪器（25〇 r 與100 Mg/ml胰蛋白酶—枳拉甚 使巫il體 下或在3rc下择養姨蛋白 對於第2輪選擇，在室溫 於表18中:養騰蛋白叫、時。第2輪選擇之輪出展示 表U :第2輪選擇後輸出之嗤菌體力價 姨蛋白梅處理
使用來自37°C下1 \ ----- 胰蛋白酶處理的第2輪選擇 谭的噬菌體 1314I8.doc -170- 200911834 輸出物作為第3輪選擇之輸入物。對於第3
Kg/ml胰蛋白酶處理噬菌體且歷時較長-選擇用100 h ’在37°C下4 h，在室溫下隔夜或在听下'' 纟37C下2 擇之輸出力價概述於表19中： 第3輪選 表19:第3輪選擇後輸出之噬菌體力價 _ 胰蛋白酶處理 力價 無騰蛋白酶 ----___ 1·3χΐ〇^ - 2 h，37°C ------- - 4 h，37°C -~~~------ 隔夜，室溫 4^1? 隔夜，37°C 2.1χΐ〇6 對來自第1、2及3輪之各選擇輸出物之數個純系進行測 序以評估序列多樣性。無胰蛋白酶處理之第丨輪選擇後， 選擇輸出物之50%具有親本〇〇^110_53_474序列。第2輪選 擇後，親本之百分率增加至75%。第3輪選擇後，親本之 百分率增加至80%。
該資料指示DOM10-53-474已抗胰蛋白酶降解，且可自 該等胰蛋白酶選擇物中選擇不太多之新穎純系。圖22展示 當用胰蛋白酶分解經純化蛋白質時，D〇M1〇_53_474即使 在胰蛋白酶處理隔夜後亦不會完全分解。然而，為瞭解在 選擇輸出物中疋否存在任何比D〇m1 0-53-474更具騰蛋白 酶抗性之新穎純系，將在37t下用胰蛋白酶處理噬菌體隔 夜之第3輪選擇之輪出物亞選殖於pD〇M5中。隨後對數百 個純系測序以尋找任何胰蛋白酶抗性純系。在所分析之數 131418.doc -171 - 200911834 百個純系中，僅26個純系具有新穎序列，然而該等純系中 沒有一個在胰蛋白酶裂解位點（離胺酸或精胺酸）具有突 變，表明該等純系不比DOM1〇_53_474更具胰蛋白酶抗 性。 實例14 在騰蛋白_；存在下由4痛體選擇引入前導D〇m〇 1 〇 1 (抗 TNFRl)dAb中之儲存及生物物理性改良： 為改良前導分子DOMlh-131-511之蛋白酶抗性，如先前 所述在胰蛋白酶存在下進行噬菌體選擇。該方法產生大量 與親本DOMlh-1 31-511分子相比具有改良胰蛋白酶穩定性 之純系。選擇兩個純 *D〇Mlh_131_2〇2 及 D〇Mlh_131_2〇6 以進一步表徵，因為其展示胰蛋白酶作用之最顯著改良。 如下文所概述之進一步研究展示，對於胰蛋白酶作用具有 改良抗性’主要對分子抗剪切應力及熱應力之穩定性存在 其他有利效應。該兩個參數對增加生物醫藥產物之儲存及 存放期穩定性至關重要。 馬斯德畢赤酵母中前導DOM0101 dAb之產生： 使用編碼三種前導分子之一級胺基酸序列之基因在馬斯 德畢赤酵母中產生分泌蛋白質。將三種合成基因（DOMlh- 131-511、DOMlh-131-202 及 DOMlh-131-206)選殖於表現 載體pPIC-Ζα中，且隨後轉型於兩種畢赤酵母菌株X33及 KM71H中。將經轉型細胞濾出置於遞增濃度之芥森（1〇〇、 300、600及900 Kg/ml)上以選擇具有多個整合子之純系。 隨後在2 L燒瓶中篩選數個純系以鑑別高表現細胞系。隨 131418.doc -172- 200911834 後使用最佳表現純系在醱酵罐中以5 L規模產生物質。 蛋白質純化及物質表徵： 為產生鬲品質物質用於表徵且用於進一步穩定性研究， 使用混合模態電荷感應樹脂（Capt〇 MMC)將下游純化過程 設計為初級捕獲步驟，接著進行陰離子交換（q Sepharose)。未顯著優化，此允許回收約7〇%之純度為約 95%之表現dAb。使用電噴霧質譜、胺基末端測序及等電 聚焦表徵物質一致性，且使用SDS_PAGE&SEC(尺寸排阻 層析法）表徵純度。 蛋白質一致性： 各蛋白質之第一個5殘基之胺基末端序列分析係如所預 期（EVQLL...)。使用C4 Zlp尖頭（MiUip〇re)對已緩衝液交換 於含有0.1%冰醋酸之50:50 h2〇:乙猜中之蛋白質樣品執行 質《•曰刀析對於二種蛋白質中每一種所量測到的質量當允 許因形成内部雙硫鍵而產生之·2質量差時係在基於一級胺 基酸序列之理論質量(使用平均質量計算)的〇5 W範圍 内。使用IEF基於對於各蛋白質為不同之y鑑別蛋白質。 蛋白質純度： ' .0 王 叭呵付衮載於非還肩 SDS-P細凝踢上。在所有情況下，觀察到單—條帶。。 Γ上:。Γ 質裳載於tos〇h G_ _管 柱上 在〇·5 ml/min下>'*私 放去 下桃動。移動相為PBS/10%乙醇。芙 線下之面積量剛單體百分率（參見圖23)。 土 131418.doc -173· 200911834 比較 DOMlh-131-511、DOMlh-131-202 及 DOMlh-131-206 之穩定性 評估蛋白酶穩定性： 在過量蛋白酶中預培養規定時點後，由BIAc〇reTM分析 殘餘結合活性評估 DOMlh_131_511、〇〇14111_1312〇2及 DOMlh-13 1-206之蛋白酶穩定性。將約14〇〇 RU經生物素 標記TNFR1塗佈於抗生蛋白鏈菌素（SA)晶片上。在3〇它下 使 250 nM DOMlh-131-511、DOMlh-131_202 及 DOMlh- 131-206與僅PBS —起或與loo μβ/ιηι胰蛋白酶、彈性蛋白酶 或白血球酶一起培養i、3及24小時。藉由添加蛋白酶抑制 劑混合物使反應停止。隨後使用參考池扣除法使dAb/蛋白 酶混合物穿過TNFR1塗佈晶片。在每次注射循環之間用1〇 μΐ 0.1 Μ甘胺酸（pH 2·2)使晶片表面再生。相對於無蛋白酶 之dAb結合，測定與蛋白酶一起預培養結合人類tnfri之 DOMlh-131-511 > DOMlh-13 1-202^ DOMlh-13 1-206(10^ 時）之比例。在25°C下進行BIAcore™運行。以下資料由三 個獨立的實驗產生。條形圖指示平均值，且誤差棒指示結 果之標準偏差（圖24)。 已發現’與 DOMlh-131-511 相比，D〇Mlh_131_2〇2 及 DOMlh-；131_2G6展示具有較大的騰蛋白酶、彈性蛋白酶或 白血球酶蛋白水解降解抗性。與胰蛋白酶一起丨小時後及 與彈性蛋白酶或白血球酶一起3小時後，與_h_i3i_ 511相比，D〇Mlh-13l-2〇2 與 D〇Mlh_131_2〇6之間的差異 最明顯。在大部分測試條件下，存在與⑽⑷⑽卜搬相 131418.doc •174· 200911834 比，DOMlh-13 1-206稍更穩定之趨勢。 如使用DSC所測定之dAb之熱穩定性： 為確定在何pH值下前導分子具有最大穩定性，使用差示 掃描量熱計（DSC)量測各dAb在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中之 熔融溫度（Tm)。因為伯瑞坦-魯賓遜由三組分緩衝系統（乙 酸、磷酸及硼酸各40 mM)構成，所以有可能在同一溶液中 產生3 -1 0範圍内之pH值。由蛋白質一級胺基酸序列確定理 論pi。由DSC，可見dAb具有最大内在熱穩定性之pH值對 DOMlh-131-202 而言為 pH 7，對DOMlh-131-206 而言為 pH 7-7.5，且對DOMlh-131-511而言為pH 7.5。對於所有隨後 應力及穩定性研究，各dAb在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中使用 以下 pH 值：對 DOMlh-131-202 及 GSK1995057A DOMlh-131-206 而言，pH 7.0，且對 DOMlh-131-511 而言，pH 7.5。結果概述於表20中。 表20 :如由DSC所測定於伯瑞坦-魯賓遜缓衝液中1 mg/ml 之 DOMlh-131-202、DOMlh-131-206 及 DOMlh-131-511之pH 值及 L的概述 。溫 度以 180°C/小時 勻變。 dAb 產生最大固有 熱穩定性之pH值 在給定pH值下 dAb 之 Tm(°C) DOMlh-131-202 7.0 68.6 DOMlh-131-206 7.0-7.5 65.8 DOMlh-131-511 7.5 58.0 兩週熱穩定性測試 蛋白質在高溫下持續長時間之能力通常為其穩定性之良 131418.doc -175- 200911834 好指示。在該等條件下，蛋白f可經受數種諸如聚集之物 理過程，或化學改質。在抓及抓下在伯瑞坦-魯賓遜緩 衝液中將dAb(l mg/ml)培養14天。使用SEC測定經14天之 時間溶液中遺留多少單體（圖25)。 由圖 25 可見 DOMlh-131-202 與 DOMlh-13 1-206 顯著比 0〇]^111-131-511對熱應力穩定。通常將蛋白質暴露於諸如 37C及50C之高溫下來給出藥物長期存放期之指示。使用 該等較高溫度加速與室溫下長期儲存相關之正常過程，諸 如脫醯胺作用、氧化或聚集。亦可使用SEC監測溶液中聚 集形成之程度（圖26A至I)。37t下14天後，D〇Mlh-131_ 5 11自溶液中之損失可歸於沈澱與如由SEC所測定之較高有 序性聚集體之形成（圖26B)。14天後在37。〇下，關於 DOMlh-13 1-202與D〇Mlh-131-206亦可見顯著較低之蛋白 質損失，其中聚集體形成極少或無實質性增加，尤其在 DOMlh-131-206之狀況下（圖26H)。在5(TC下，分子之間的 差異甚至更明顯，D〇Mlh-13 1-206在14天後在較高溫度下 展示較DOMlh-131-202佳之穩定性，展示較高分子量聚集 體之形成顯著降低（圖26)。相對於t=0，14天後，DOMlh-131-206僅展示聚 集體形 成之小 幅增加（圖 261) ， 而^^^ 1 3 1 -5 11幾乎沈澱析出溶液（圖26C)。 此展示由胰蛋白酶選擇引入dAb中之變化（例如改良之熱 穩定性）顯著改良蛋白質在37°C及50。(：下儲存穩定性。 DOMlh-13 1-202明顯具有且DOMlh_131_2〇6更顯著明顯具 有改良之溶液穩定性及較低的在高溫下形成聚集體之傾 131418.doc -176- 200911834 向，此可直接解釋為在諸如+4t:及室溫之更多相關溫度下 具有改良之長期儲存穩定性。 隨後由IEF分析熱應力實驗24小時、48小時、7天及14天 時點之樣品以瞭解蛋白質是否經受任何會影響蛋白質總電 荷之生物物理變化（圖27)。 在 37°C 下，DOMlh-131-202 與 DOMlh-13 1-206 再次展示 與DOMlh-131-511相比無顯著變化。關於D〇]Vnh-131- 511，24小時後在37。(：下出現微弱之第二條帶。咸信，該 額外出現的帶係歸因於蛋白質之二聚作用，從而掩蔽電荷 且產生兩個分子群體。在5〇。〇下，分子之間的差異更明 顯，在尚溫下DOMlh-131-206明顯展示無顯著變化，而24 小時後，DOMlh-13 1-202展示一些改質跡象。在伯瑞坦_ 魯賓遜中48小時後，大部*DOMlh_131_5U因沈澱而損 失。 由TNFR-1 RBA分析50°C下之T=0、7及14天時點以確定 暴露於高溫後蛋白質之功能性（圖28)。雖然目前該檢定在 檢測歸因於應力之分子之微小變化方面不如SEC或IEF靈 敏’但可使用其展示dAb仍可結合抗原。 D〇Mlh-13 1-5 11之曲線之向左移動反映大部分dAb已歸 因於沈澱而損失之事實。溶液中遺留之物質仍能夠結合抗 原。如圖25中所示’大部分D〇Mlh-131-202與DOMlh-131-206即使在14天後亦能夠保持在溶液中。rba展示所 有可溶性蛋白質仍具功能性且能夠結合TNFR1。 局蛋白濃度下測試之儲存穩定性： 1314l8.doc •177- 200911834 進行實驗以研究+4°C極高蛋白質濃度下之儲存穩定性以 瞭解在該等條件下各分子如何表現。將所有前導dAb在最 穩定pH值在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中在離心viyaspin濃縮器 中濃縮（5K截止點）至約100 mg/mI。隨後將約1〇〇 樣品擱置在+4t下7天，且隨後由SEC分析以瞭解在高濃度 下儲存期間樣品是否會發生任何其他物理變化（圖29)。在 SEC管柱上於lxPBS 10%乙醇（v/v)中走柱之前，將樣品稀 釋至約1 mg/ml。 由 SEC 迹線，可見DOMlh_131_2〇2 與 〇〇〜[111_131_2〇6在7 天後在聚集體形成方面均不展示任何顯著增加，而 DOMlh-131-511單體濃度存在約2%之減小。 前導dAb之噴霧器傳遞： 為進行早期毒理學及臨床研究，將dAb調配為液體形式 且經由噴霧裝置傳遞。視裝置（例如，超音波、噴射或振 網）而定，dAb當其經噴霧以形成規定粒度之氣霧劑時將經 歷一定程度之剪切應力及熱應力。因為與]〇〇]^1}1_131_511 相比，DOMlh-13 1-202與 DOMlh-131-206具有較高 τ 且展 不大大改良之熱應力穩定性，所以所有dAb均在兩種嘴霧 器裝置中測試以瞭解其如何回應喷霧期間所誘發之剪切應 力/熱應力。隨後由SEC分析來自喷霧氣霧劑之蛋白質與妒 置中（亦即，杯中）之殘留dAb以確定該過程期間產生聚集 之量。 ” 在伯瑞坦_魯賓遜緩衝液中在最穩定p H值下測試所有分 子。在E-flow Rapid(振網）與pari LC+(噴射噴霧器）中= 131418.doc •178· 200911834
編，其中操作時間為3·5分鐘，蛋白質濃度為5 mg/mlX 粒度分布使用Malvern Spraytek確定。結果展示於圖％ 中。為良好傳遞且分布於深肺中，理想粒度為々_。所 有^在伯瑞坦-魯賓遜緩衝》夜中產生小於5 _之可比粒度 級在噴霧之刖及之後，由a28〇量測法測定裝置杯中之 dAb之濃度(資料未圖示)。已發現，蛋白質濃度並未顯著 改變’從而指示蛋白f與媒劑在傳遞期間均不會優先霧 化。 在SEC上運仃在伯瑞坦_魯賓遜緩衝液中霧化之之樣 :以確疋傳遞期間蛋白質是否經受任何物理變化。圖3 1展 不由SEC所測定之杯或氣霧劑中之相對百分率變化。可 見’在單體濃m DOMlh_131_2_D〇Mlh_i3i_2〇6 相對於D咖h-131_511經受相對較小之變化。此證明具有 改良TzDOMlh]31_2_D〇Mih_i3i德在纟霧期間具 有較小的聚集傾向。 圖2展示於伯知坦_魯賓遜緩衝液中之 及OMlh-UUii在喷霧後之實際SEc迹線且顯示單體之 相對損失(圖31)係歸因於二聚體形成。此再次提供由 D〇Mlh_131_2()2及D〇Mlh_13i•裏所展示之較高熱穩定性 即使在未優化調配物緩衝液中亦可阻止顯著聚集之理論的 其他證據。 關於毒理學及安全評估研究，有必要傳遞比給予患者之 治療劑量顯著高之含量的dAb至動物中。此僅可藉由使用 顯著較高之蛋白質濃度及/或經長時間傳遞心來達成。因 131418.doc -179- 200911834 為已展不00^1111-131-511在經3.5分鐘在5 1118/1111下喷霧時 形成聚集體，所以DOMlh-131-206係在PBS中在40 mg/ml 下測試且使用Pari LC+喷霧至多1小時。整個運行期間在 各時點採集杯及氣霧劑之樣品以瞭解延長喷霧是否會導致 dAb歸因於剪切應力或熱應力（由SEC測定）及蛋白質濃度 (A280 nm量測法）而聚集。表21展示由A280確定之杯與氣 霧劑中之dAb的蛋白質濃度。 表21 .在使用Pari LC+在約40 mg/ml下噴霧dAb期間， 杯與氣霧劑之由A280吸光度讀數確定之D〇Mlh-13 1-206的 經量測蛋白質濃度。考慮到稀釋誤差及儀器誤差，在經丄 小時噴霧dAb後，樣品濃度並未改變。 時間 (Min) 杯樣品 (mg/ml) 氣霧劑樣品 (mg/ml) 1 43.8 43.4 29 44.5 43.5 59 44.6 44.1 由表21可見蛋白質濃度在運行期間並未顯著改變，顯示 不存在顯著的歸因於聚集之蛋白質損失。圖33展示如由 SEC所測定，、經之喷霧時間，D〇Mih_i3i_2〇6並未形 成任何較高有序性之聚集體，諸如二聚體。此明顯顯示如 由騰蛋白酶選擇向分子中引人之改良生物物理性質顯著增 加_抗剪切應力及錢力性，且此可與改良之儲存存放 期及噴霧蛋白質以致不形成較高有序性聚集體之能力直接 相關。 131418.doc 200911834 前導dAb之溶解狀態： 因為所有三種前導dAb之主要降解途徑似乎為最初導致 二聚合接著進一步聚集且最終沈澱之自締合，所以由分析 超速離心（Analytical Ultra-Centrifugation，AUC)研究該三 種前導分子以確定自締合之程度。由兩種方法，即沈降平 衡及沈降速度研究蛋白質。 關於沈降平衡方法，在0.5 mg/ml至5 mg/ml範圍内之三 種不同濃度下用離心效應使用三個不同轉子速度運行三個 樣品。由該方法，確定DOMlh-131-511為穩定二聚體 (26.1-34.4 kDa)，DOMlh_131_2〇2 為單體 /二聚體平衡 (22.7-27.8 kDa) ’ *Kd=l.3 μΜ量測在各濃度下具有相對穩 定之二聚物狀態，且DOMlh_131_2〇6主要為單體性（154_ 17.9 kDa)，單體締合為二聚體之Κ(^36〇μΜ。 由沈降速度方法，所有樣品在稀釋後展示一定程度之解 離。由展示於圖34中之所獲得之結果，關於D〇Mlh_131_ 5H所觀察到之沈降係數指示較高有序性聚集體，且稀釋 後峰位移為㈣聚集體解離之指示。蛋白f聚集及解離互 相抵消，可得出如由沈降平衡所觀察狀穩定二聚體之印 象。關於D讀h_l31_2G2所觀察到之沈降係數指示快速動 力平衡，且因此可將單體及二聚體峰彼此分開，從而得到 具有比適於樣品質量高之沈降係數之單峰。該結果與 平衡方法所獲得之結果一致’且解離常數經量測為工 DOMlh-131-206係經測定比其他兩個樣品更具單體性，鱼 其他兩個樣品之2.5s相比’其具有⑴之沈降係數。該資 131418.doc -181 - 200911834 料與沈降平衡資料極一致。在量測濃度下，360 μΜ之Kd& 下約1 0倍，樣品主要為單體性。 實例1 5 DOM15-26-593 dAb 之效價增強： 圖40中展示VEGFR2受體結合檢定中DOM15-26-593 dAb 比DOM1 5-26親本之效價增加之實例。在該檢定中，在板 基檢定中量測潛在抑制劑阻止VEGF與VEGFR2結合之能 力。在該檢定中，將VEGFR2-Fc嵌合體塗佈於96孔ELISA 板上，且向其中添加預定量之已與測試dAb稀釋系列一起 預培養之VEGF。洗除未結合蛋白質後，用抗VEGF抗體偵 測與受體結合之VEGF之量，比色測定其含量。以隨測試 物質濃度變化之VEGF結合抑制百分率繪製劑量-反應效 應。因此有效抑制劑為顯示在低濃度下實質性阻斷配位體 結合之抑制劑。 FC融合物之效價及半衰期： VEGF阻斷在治療腫瘤中之治療潛能已實現超過30年。 癌症之慢性性質指示生物醫藥需要長的血清半衰期來介導 其效應，而此與游離dAb因腎濾過而自循環快速清除不相 符。為評估VEGF dAb作為治療癌症之抗血管生成劑之效 用，藉由使用FcRn介導抗體補救途徑經由雜交連接子使前 導區域抗體編排格式為與野生型人類IgGl Fc之融合物以 形成具有延長的血清半衰期之二價分子。 在該Fc融合物格式中，使用先前所述之檢定，可將前導 胰蛋白酶選擇dAb(DOM15-26-593)之效價與最初親本 131418.doc •182- 200911834 dAb(DOM 15-26)及胰蛋白酶不穩定 dAb(DOMl 5-26-501)作 比較。結果展示於下表22中： 表22:呈Fc融合物格式之DOM1 5-26前導分子之效價 (RBA)及半衰期特徵 dAb Fc 效價(nM) Tl/2b(hr) DOM15-26 hlgGl 0.506 ND D0M15-26-501 hlgGl 0.323 12.9 DOM15-26-593 hlgGl 0.033 84.6 由該等結果可見，在二聚體Fc融合格式中，親和力及效 價歸因於親和性（avidity)效應相對於游離dAb增加。顯 然，由於胰蛋白酶選擇所獲得之DOM15-26-593之效價增 加得以維持且在該Fc格式中甚至更明顯。此外，熱及蛋白 酶穩定性之改良解釋為分子活體内藥物動力學特性之深度 改變。與DOM15-26-501相比，DOM15-26-593之排除半衰 期之改良（參見圖41)很可能為dAb穩定性增加之直接結 果，從而使其變得更抗核内體隔室（endosomal compartment)内所發生之降解過程。因此，亦預期具有增 強蛋白酶穩定性之dAb能夠在其中蛋白水解為涉及生物分 子轉換（turnover)之活性過程的其他生物隔室（諸如血清、 黏膜表面及多種組織隔室）中持續較長時間。 藥物動力學清除概況： 在向3隻大鼠靜脈内投與濃度為5 mg/kg之DOM15-26-593及 DOM15-26-501後，量測 DOM15-26-593及 DOM15-26-501之藥物動力學清除概況。隨後使用直接VEGF結合標準 131418.doc -183 - 200911834 ELISA檢定及抗人類Fc抗體量測DOM 15-26-593及DOM 15-26-501在血清中之含量，因此僅偵測血清樣品中之完整藥 物。完整藥物動力學概況展示於下表23中： 表23:大鼠中DOM15-26及DOM15-26-593 Fc融合物之 藥物動力學參數概述 dAb 半衰期 Cmax (pg/ml) AUC(O-inf) (hrVg/ml) 清除率(ml/hr/kg) DOM15-26-501 12.9 91.4 445.1 11.8 DOM15-26-593 84.6 101.8 3810 1.3 由該等結果可見DOM1 5-26-593具有顯著改良之藥物動 力學概況，（例如）延長之半衰期及降低之清除率。 DOM15-26-5 93之顯著改良之效價及藥物動力學性質產 生對化合物之多種其他生物物理屬性的分析。 溶解狀態性質：由SEC-MALLs及AUC分析： 用DOM15-26-593如下進行實驗： DOM15-26-593在至多2.5mg/ml之濃度下表現為溶解狀 態中之單體，其中計算分子質量為78-81 KDa，與約76 kDa之計算完整分子質量（圖42a及42b)—致。 熱熔融性質：由DSC分析 用DOM15-26-593如下進行實驗： 胰蛋白酶選擇dAb(65°C，圖43之中間圖）之增加之熱穩 定性在Fc融合物（64.5°C，圖43之上圖）中得以維持。展示 DOM15-26-501 dAb(52°C，圖43之下圖）之Tm曲線以便比 較。 131418.doc -184- 200911834 冷凉_ -解滚、溫度應力及血清組分之穩定性 用DOM15-26-593如下進行實驗： DOM 1 5-26-593 dAb之穩定性性質意謂可使DOM15-26-593 dAb經受物理及生物應力，而對其結合VEGF之能力產 生最小影響（圖44-47(a及b))。舉例而言，可使分子自液氮 (-196°C)至體溫（37°C)重複冷凍解凍10次循環，而如由 ELISA所測定未損失結合活性（圖44)。如由習知尺寸排阻 層析法所評估，該處理亦不會對分子聚集狀態產生明顯改 變（圖45)。其他測試顯示分子可置放於-80°C至55°C範圍之 不同溫度下而僅在最高培養溫度下168小時後，抗原結合 活性略微減小（圖46)。此外，如由VEGF結合ELISA所測 定，在37°C下與人類或獼猴血清一起培養14天不會導致抗 原結合能力損失（圖47a及47b)。 VEGFR2受體結合檢定及HUVEC細胞檢定中之效價： 如下進行上述受體結合檢定： 使用上述受體結合檢定評估Fc融合物之效價（圖48)。已 發現，DOM1 5-26-593 dAb在該檢定中具有增強之效價， 此確立dAb阻斷VEGF與VEGFR2活體外結合之能力。亦在 量測VEGF拮抗劑阻斷HUVE細胞之VEGF刺激增生之能力 的HUVEC(人類臍靜脈内皮細胞）檢定中說明DMS1529之效 價。在與預定量之VEGF及不同量之測試樣品一起培養固 定時期結束時，測定細胞數目。拮抗劑越有效，所觀察到 之細胞增生越低（圖49)。 該段落中陳列DOMlh-131-511之核苷酸序列。 131418.doc -185 - 200911834 DOMlh-131-511之核苷酸序列：
GAQGTQCAQC TGTTQmQTC TSGGGGASGC TTSGTACAGC CTGGGGQGTC CCTGCfOTCTC TCCTGTGCAG' cctccgcatt cacctttqcg c^tgagacg^ tggtgtggot ccgccaggct
CCAGGGIiAGO· QTCTAQh<3TQ i^TCTCftCAT ATTCCCCCW TTGGtCAGGA TCCCTTCTAC GCAG^CTCCG TGAAGCGCC0 aTTCACCATC TCCCOCGACA ATTCCAAQA^ CACQCTATAT
CTQChmWk ACAGCCTGCQ· TGCCGM®C ACAGC®TAT ATTACTCTCC GCTGCTTCCT AAGAGGGG<X： CTTGGTTTCA CTACTGOOGT CAQ0GM.CCC TOOTCACCOT CTC0AGC 【圖式簡單說明】 圖1說明用於製備噬菌體呈現譜系之pDOMl3(亦稱為 pDOM33)之多個選殖位點。 圖2展示以來自在30°C與40 pg/ml胰蛋白酶一起培養之 dAb之不同時點的樣品運行之數個Novex 10-20% Tricene凝 膠。在添加胰蛋白酶之前即刻及隨後在添加胰蛋白酶之後 1小時、3小時及24小時獲取樣品。用1 xSureBlue染色蛋白 質。凝膠說明在與胰蛋白酶一起培養第一個3小時期間， DOM15-10 與 DOM15-26-501 顯著分解。DOM15-26、 DOM4-1 30-54及DOMlh-131-511之分解僅在與胰蛋白酶一 起培養24小時後才變得明顯。 圖3說明DOMlh-131-511及24個所選擇之變異體之胺基 酸序列。突出所選擇之純系中不同於親本序列之胺基酸 (彼等一致胺基酸由點標記）。對應於CDR1、CDR2及CDR3 之環用框勾畫。 圖4說明DOM4-1 3 0-54及27個所選擇之變異體之胺基酸 序列。突出所選擇之純系中不同於親本序列之胺基酸（彼 等一致胺基酸由點標記）。對應於CDR1、CDR2及CDR3之 131418.doc -186- 200911834 環用框勾畫。 圖5說明D〇M15·26·555及21個所選擇之變異體之胺基酸 序列。突出所選擇之純系中不同於親本序列之胺基酸（彼 等一致胺基酸由點標記）。對應於CDRl、及们之 環用框勾畫。 圖6說明DOM15-10及16個所選擇之變異體之胺基酸序 列。突出所選擇之純系中不同於親本序列之胺基酸（彼等 一致胺基酸由點標記）。對應於CDR1、CDR2& cdr3之環 用框勾晝。 圖7A-7D為展示在37°C下與不同濃度之胰蛋白酶（在〇至 100 pg/ml範圍内）一起培養隔夜後，親本dAb D〇Mih_i3i_ 511(圖 7A)及三個變異體 dAb D〇Mlh-131-203(圖 7B)、 DOMlh-13 1-204(圖 7C)及 DOMlh-13 1-206(圖 7D)與固定 TNFR1之結合的BIAcore迹線。結果展示在高濃度姨蛋白 酶（100 pg/ml)下，所有三個變異體比親本對蛋白水解更具 抗性。 \ , 圖8A-8C為展示在與彈性蛋白酶及白血球酶一起培養隔 夜後 dAb DOMlh-131-511(圖 8A)、DOMlh-131-202(圖 8B) 及DOMlh-131-206(圖8C)與固定TNFR1之結合的BIAcore迹 線。與親本相比，dAb對彈性蛋白酶與白血球酶之蛋白水 解展示增加之抗性。 圖 9 展示以 dAb DOMlh-131-511、DOMlh-131-203、 DOMlh-131-204、DOMlh-131-206、DOMlh-131-54、 00^4111-131-201及001^111-131-202之與胰蛋白酶一起培養 131418.doc •187- 200911834 之前的樣品及以1 00 Kg/ml胰蛋白酶一起培養1小時、3小時 及24小時後的樣品運行的兩個4_12% Novex Bis-Tris凝 膠。 圖10A-10C為展示在37°C下與不同濃度胰蛋白酶（在〇至 100 pg/ml範圍内）一起培養隔夜後，d〇M4-130-54(圖 10A)、DOM4-130-201(U 10B)及 DOM4-130-202(i] l〇c)與 固定IL-1R1融合蛋白之結合的BIAcore迹線。結果展示在 高濃度胰蛋白酶（100 pg/ml)下，兩個變異體比其親本對蛋 ' 白水解更具抗性。 圖11A-11C為展示與彈性蛋白酶及白血球酶一起培養隔 仪後，DOM4-130-54(圖 11A)、DOM4-130-201(圖 ΠΒ)及 DOM4-13 0-202(圖11C)與固定IL-1R1融合蛋白之結合的 BIAcore迹線。與親本相比，dAb對兩種所測試之蛋白酶之 蛋白水解展示增加之抗性。 圖12說明DOM1 5-26-5 55及6個變異體之胺基酸序列。突 出所選擇之純系中不同於親本序列之胺基酸（彼等一致胺 基酸由點標記）。 圖13A及13B為展示親本dAb DOM15-26-5 55(圖13A)及最 具蛋白酶抗性變異體DOM 15-26-593(圖13B)與固定VEGF 之結合的BIAcore迹線。與濃度為200 pg/ml之胰蛋白酶一 起培養後在100 nM之dAb濃度下就hVEGF結合以BIAcore方 式比較親本及變異體。在37。(：下進行反應3小時或24小 時。結果展示在胰蛋白酶處理24小時後，變異體比親本對 蛋白水解更具抗性。 131418.doc -188· 200911834 圖14為展示胰蛋白酶處理對d〇m 15-26-555變異體之 hVEGF結合之影響的圖表。結果顯然展示胰蛋白酶處理24 小時後，所有變異體比親本（D〇M15_26_555)對蛋白水解更 具抗性。 圖15展示兩個加載15 經處理及未經處理iD〇Ml5_ 26-555 或 DOM15-26-593 樣品之 Novex 10-20% Tricine 凝 膠。在添加胰蛋白酶之前即刻及隨後在添加胰蛋白酶之後 1小時、3小時及24小時獲取樣品。用lxSureBlue染色蛋白 質。凝膠說明DOM1 5-26-593之騰蛋白酶抗性概況不同於 由BIAcore實驗展示之概況。 圖16說明DOM15-10及變異體DOM15-10-11之胺基酸序 列。突出變異體中不同於親本序列之胺基酸（彼等一致胺 基酸由點標記）。 圖17A及17B為展示親本d〇M15-1〇(圖17A)及變異體 DOM15-10-11(圖17B)與固定VEGF之結合的BIAcore迹線。 與濃度為200 pg/ml之胰蛋白酶一起培養後在1〇〇 nM之dAb 濃度下就hVEGF結合以BIAcore方式比較親本及變異體。 在37°C下進行反應1小時、3小時及24小時。結果展示在胰 蛋白酶處理24小時後’變異體比親本對蛋白水解更具抗 性。 圖1 8展示兩個加載1 5 pg DOM 1 5 -1 〇及d〇M 1 5 -1 0-11樣品 之Novex 10-20% Tricene凝膠。在添加胰蛋白酶之前即刻 及隨後在添加肤蛋白酶之後1小時、3小時及24小時獲取樣 品。用SureBlue(lx)染色蛋白質。結果展示BIAcore研究中 131418.doc •189- 200911834 可見之結合活 可見之.、，σ &活性直接反映蛋白質之完整性。 圖19A-19L說明數個編碼為D0Mlh_13] -131-511 或 DOM4·
圖20A-20E說明數個編碼為D〇M15_26_555或d〇mi5_i〇 之變異體之dAb的核酿66扮it ·ε.丨^
圖21展示pDOM38之載體圖。
用胰蛋白酶處理之DOM10-53-474及DOM15-26-593蛋白質 之在Labchip上運行的凝膠。箭頭展示全長蛋白質。 圖23為展示各樣品由MMC層析接著陰離子交換純化後 所獲得之高純度級的尺寸排阻層析迹線。在225 nm下監測 UV且用具有1〇%乙醇（v/v)ilxpBS走柱。藉由經基線校正 之峰面積積分計算單體百分率。 圖 24 展示 DOMlh-131-511、DOMlh-131-202 及 DOMlh_ 13 1-206之蛋白酶穩定性資料。 圖 25 為 5兒明 DOMlh-131-202 、D〇Mlh-131-206 及 DOMlh-131-511在37°C及50°C下在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中 之14天穩定性資料的sec。所有dAb之蛋白質濃度為1 mg/ml。使用SEC確定熱應力期間蛋白質中是否會發生任 何變化及相對於時間=〇(TO)樣品溶液中所遺留之單體之 量° 圖26Α至I展示SEC迹線，其展示DOMl h-13 1-5 11 (Α至 131418.doc • 190- 200911834 C)、DOMlh-131-202(D 至 F)及 DOMlh-131-206(G 至 I)之熱 應力（37°C及5〇t：)效應。亦展示給定時點下相對於τ=〇時溶 液中所遺留之單體百分率。 圖27展示熱應力24小時、48小時及7天及14天時DOMlh- 131-202、DOMlh-131-206 及 DOMlh-131-511 之 IEF 分析。 樣品已在3 7 C或5 0 °C下在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中培養。 圖 28 為展示在 50°C 下將 DOMlh-131-202、DOMlh-131-206 及 DOMlh-131-511 培養 14 天之效應的 TNFR-1 RBA。假 定蛋白質濃度為1 mg/ml。亦展示不結合抗原之陰性對照 dAb(VH模擬物）。 圖29說明在+4°C下在約100 mg/ml下將八：0〇]\4111-131-202 ’ B : DOMlh-131-206及C : DOMlh-1 3 1-511在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中儲存7天之效應。在280 nm下監測UV。 圖 30 展示 Pari E-flow 及 LC+ 中之 DOMlh-131-202、 DOMlh-13 1-206及DOMlh-13 1-511之喷霧器測試的資料。 蛋白質濃度在任一伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中為5 mg/ml。 圖3 1說明在以5 mg/ml存於伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中之 DOMlh-131-202、DOMlh_13 1-206 及 DOMlh-131-511 喷霧 期間，單體濃度之相對百分率之變化。 圖32展示伯瑞坦·魯賓遜緩衝液中之D〇Mlh-l 3 1-206及 DOMlh-131-511 自 Pari LC +噴霧後之SEC迹線。 圖33展示經1小時喷霧過程期間以4〇 mg/ml存於PBS中之 DOMlh-13 1-206之SEC迹線。噴霧器杯與氣霧劑中之蛋白 質對噴霧期間dAb可能會經歷之剪切應力及熱應力效應具 131418.doc -191 - 200911834 有高抗性。 圖34展示三種主要蛋白質（DOMlh-131-206及DOMlh-131-511及DOMlh-13 1-202)各自之沈降速度曲線。所觀察 到之較低濃度樣品DOMlh-13 1-206之雙峰為在此情況下由 來自樣品池之樣品洩漏所致之偽跡。 圖35展示緩衝液及裝置對〇81<：199505 6八(〇〇“^11-131-5 11)之喷霧液滴尺寸之影響。 圖36為如由SEC所量測，在各裝置中噴霧後，由二聚體 形成評估之GSK1995056A(DOMlh-131-511)之穩定性。 圖 37 展示 Pari E-flow 及 LC+ 中 GSK1922567A(202)、 GSK1995057A(206)及 GSK199505 6A(511)之喷霧器測試。 A)伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中之測試，B)PEG1 000/蔗糖緩衝 液中之測試。 圖38描繪人類TNFR1受體結合檢定中之TNF-α劑量曲 線。以四個複本測試各樣品。 圖39展示人類TNFR1受體結合檢定中GSK1922567A (DOMlh-131-202) 、 GSK1995057A(DOMlh-131-206)及 GSK1995056A(DOMlh-131-511)之抑制。以四個複本測試 各樣品。 圖 40說明 DOM15-26及 DOM15-26-593 dAb在 VEGF RBA 中之效價。 圖41展示DMS1529(DOM1526-5 93)及DMS1545(DOM15-26-501)在以5 mg/mg單次快速靜脈内注射向大鼠投與後之 藥物動力學。 131418.doc • 192· 200911834 圖42a展示確認單體性質之DMS1529 Fc融合物（DOM15-2-593 Fc融合物）之SEC-MALLs(尺寸排阻層析-多角雷射散 射）分析。展示在折射率（亦即，濃度；虛線）及光散射（實 線）方面顯示類似性質之兩個不同批次。用箭頭標記之線 表示分子質量計算值。 圖42b展示確認單體性質之DMS1529 Fc融合物（DOM15-26-593 Fc融合物）之AUC(分析超速離心）分析。在三個不 同濃度，即約0.2、0.5及1·0 mg/ml下在PBS緩衝液中測試 一個批次之材料。沈降速率分析確認分子質量約80 kDa。 圖 43 展示 DMS1529(DOM 15-26-593)及 DOM15-26-501 之 DSC迹線。 圖44為對兩個不同批次之材料進行10次冷凍-解凍循環 之前及之後，DMS1529(DOM15-26-593)之 VEGF 結合 ELISA。 圖45展示10次冷凍-解凍循環之前及之後，DOM15-26-593 SEC概況之一致性。 圖46說明DMS1529融合物（DOM15-26-593 Fc融合物）之 加速穩定性研究的結果；結合ELIS A在所示溫度下顯示培 養7天後之活性。 圖47A展示在37°C下培養14及15天後，DMS1529 (DOM1 5-26-593)在人類獼猴中之穩定性。 圖47B展示在37°C下培養14及15天後，DMS1529 (DOM15-26-593)在人類血清中之穩定性。 圖48展示DOM15-26及DOM15-26-593 dAb作為Fc融合物 131418.doc -193- 200911834 (相應DMS1564及1529)在VEGF RBA中之效價。 圖49說明DMS1529融合物（DOM15-26-593 FC融合物）對 HUVEC細胞增生之抑制。 圖50為pDom33載體圖。 圖51a及51b描繪結合血清白蛋白之dAb之序列（胺基酸及 核苷酸）。 131418.doc -194- 200911834 序列表 <1]0>英商多曼提斯有限公司 <120>多肽、抗體可變區域及拮抗劑 <130> D0056 <140> TO97121265 <141> 2008-06-06 <150> US 60/933,632 <151> 2007-06-06 <150> GB 0724331.4 <151> 2007-12-13 <160> 235 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1 <211〉 109 <212> DNA 〆 <213>人工序列 f ' <220> <223> pD0M13 <400> 1 taatgttatt taaatcatta tcaaaattag caaccgcagc agcatttttt gcaggcgtgg 60 caacagcgtc gacacactgc aggaggcggc cgcagaaact gttgaacgt 109 <210> 2 <211> 119 <212〉 PR丁 <213>智人 <400> 2
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala His Glu 20 25 30
Thr Met Val Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser His lie Pro Pro Val Gly Gin Asp Pro Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 i Ala Leu Leu Pro Lys Arg Gly Pro Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly \ 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210〉 3 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 3
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp lie Tyr Leu Asn 20 25 30
Leu Asp Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Asn Phe Gly Ser Glu Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 131418-序列表.doc 200911834
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Pro Ser Phe Tyr Phe Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Cly G)n G)y Thr Lys Va] G)u lie Lys Arg 100 105 <210> 4 <2\\> 116 <212> PRT <213>智人 <400〉 4
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gjy Phe Thr Phe Lys Ala Tyr 20 25 30
Pro Met Met Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 丁rp Val 35 40 45
Ser Glu He Ser Pro Ser Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Asp Pro Arg Lys Phe Asp Tyr Trp G]y Gin Gly 丁hr Leu Val 100 lt)5 ]!0
Thr Val Ser Ser 115 <210〉 5 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 5
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Aia Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Trp lie Gly Pro Glu 20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr His Thr Ser lie Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Me Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Met Phe Gin Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Giu He Arg Arg 100 105
<210> 6 <211> 358 K <2]2> DNA <2丨3>智人 <400> 6 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc atggtacagc ctggggggtc cclgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg catgagacga tggtgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcccccgg ttggtcagga tcccttciac 180 gcagaciccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctatat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acagcggtat atiactgtgc gctgcttcct 300 aagagggggc citggtttga ciactggggt cagggaaccc iggtcaccgt cicgagcg 358 <210> 7 <211> 358 <212> DNA <213>智人 <400> 7 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc irggtacagc ctggggggtc cclgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cgcctttgcg catgagacga tggtgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcccccgg ttggtcagga tcccttctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctatat 240 1· 131418-序列表.doc 200911834 ctgcaaatga acagcctgcg agccgaggac acagcggtat attactgtgc gctgcttcct 300 aagagggggc cttggt t tga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcg 358 <210> 8 <211> 358 <2】2> DNA <2】3>智人 <400> 8 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc tcctgtgcag cctccggat t caactttgcg ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac aagagggggc citggtttga ctactggggt <210> 9 <21I> 358 <212> DNA <213>智人 ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 catgagacga tggtgigggt ccgccaggct 120 attcccccgg ttggtcagga tcc'cttctac 180 tcccgcgaca at tccaagaa cacgctatat 240 acagcggtat attactgtgc gctgcttcct 300 cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcg 358 <400> 9 gaggtgcagc tgttggagtc 丨gggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg catgagacga tggtgtgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcccccgg ttggtcagga tcccttctac ISO gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgacg attccaagaa cacgctatat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acagcggtat attactgtgc gctgcttcct 300 aagagggggc cttggtttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcg 358 <210> 10 <211> 358 <212> DNA <2]3>智人 ctggggggtc cctgcgtctc 60 tggtgtgggt ccgccaggct 120 ttggtcagga tcccttctat 180 attccaagaa cacgctatat 240 attactgtgc gctgcttcct 300 tggtcaccgt ctcgagcg 358 <400> 10 gaggtgcagc tccigtgcag ccagggaagg gcagactccg ctgcaaatga aagagggggc tgttggagtc cctccggatt gtctagagtg tgaagggccg acaacctgcg cttggtttga tgggggaggc cacctttgcg ggtctcacat gt tcaccatc cgccgaggac ctactggggt ttggtacagc catgagacga attcccccgg tcccgcgaca acagcggtat cagggaaccc <210〉】】 <211> 358 <212> DNA <213>智人 <400〉 11 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc ctgcaaatga acggcctgcg tgccgaggac aagagggggc cttggtttga ctactggggt ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtcic 60 catgagacga tggtgtgggt ccgccaggcc 丨20 attcccccgg ctggtcagga tccct tctac 180 tcccgcgaca attccaagag cacgctatat 240 acagcggtat attactgtgc gctgcttcct 300 cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcg 358 <210〉 12 <211> 358 <212> DNA <213>智人 cctgcgtctc 60 ccgccaggct ]20 tcccttctac 180 cacgctatat 240 gctgcttcct 300 <400> 12 gaggtgcagc tcctgtgcag cctgggaagg gcagactccg ctgcaaatga aagagggggc tgttggagtc cctccggatt gtctagagtg tgaagggccg acagcctgcg cttggtttga igggggaggc cacctttgcg ggtctcacat gttcaccatc tgccgaggac ctactggggt itggtaaagc catgagacga attcccccgg tcccgcgaca acagcggtat cagggaaccc ctggggggtc tggtgtgggt ctggtcagga attccaagaa at tacigtgc tggtcaccgt <210> 13 <211> 358 <212> DNA <213>智人 <400> 13 gaggigcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 131418-序列表.doc 200911834 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg catgagacga tggtgtgggt ccgccaggcc 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcccccgg acggtcaaga tcccttctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctatat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac ucagcggtat attactgtgc gctgcttcct 300 aagagggggc cttggtttga ctactggggt cagggaaccc iggtcaccgt ctcgagcg 358 <230> 34 <211> 358 <212> DNA <213>智人 <400> 14 gaggtgcagc tgtgggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg catgagacga tggtgtgggt ccgccaggct ]20 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcccccgg atggtcagga tcccttctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctatat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acagcggtat attactgtgc gctgcttcct 300 aagagggggc cttggattga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcg 358 <210> 15 <211> 358 <212> DNA <213>智人 <400> 15 gaggtgcagc lgtcggagtc tgggggaggc ttggiacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 〆 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg catgagacga tggtgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcccccag atggtcagga tcccttctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc icccgcgaca attccaagaa cacgctatat 240 cigcaaaiga acagcctgcg tgccgaggac acagcggtat attactgigc 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ctcgagcg 358 <210> 18 <211> 358 <212> DNA <213>智人 <400> 18 gaggtgcggc tgtlggagtc tgggggaggc tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac aagagggggc cttggtttga ctacaggggt ttggtacagc ctgaggggtc cctgcgtctc 60 catgagacga tggtgtgggt ccgccaggct 120 attcccccgg atagccagga tcccttctac 180 tcccgcgaca attccaagaa cacgctatat 240 acagcggial atiactgtgg gctgcitcct 300 cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcg 358 <2)0> )9 <2】1> 358 <212> DNA <213>會人 4- 131418-序列表.doc 200911834 <400> 19 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt caccattgcg catgaaacga tggtgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggictcacat attcccccgg 丨tggtcagga tcccttctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca auccaagaa cacgctatat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acagcggiat atlactgtgc gctgcttcct 300 aagagggggc cttggtttga ctaccggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcg 358 <210> 20 <211> 358 <212> DNA <213>智人 <400> 20 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgictc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctitgcg catgagacga tggtgtgggi ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcctccgg ttggtcagga tcccttciac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctatat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acagcggiat attactgtgc gcggcttcct 300 aagagggggc cttggtttga ctactggggt cagggaacct tggtcaccgt ctcgagcg 358 <2]0> 21 <21l> 357 <212> DNA <213>智人 <400〉 21 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctitgcg catgagacga tggigtgggt ccgccaggca 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcccccgg atggtcagga tcccttctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctatat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acagcggtat atcactgtgc gcigcttcct 300 aagagggggc cttggtttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210〉 22 <21]> 357 <212> DNA <213>智人 <400> 22 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc uggiacagc ctggggggtc 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<210> 71 <2]1> 348 <212> DNA 131418-序列表.doc •13- 200911834 <213>智人 <400> 71 gaggtgcatc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtcic 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttaag gcttatccga tgatgigggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagag atttcgcctt cgggttctta lacatactac 180 gcaaactccg tgaagggccg gttcaccatc icccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagatcct 300 cggaagattg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tcicgagc 348 <2I0> 72 <211> 348 <212> DNA <213〉智人 <400> 72 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cciccggatt cacctttaag gcttatccga tgatgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagag atticgcctt cgggttcua tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc icccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagatcct 300 cggaagt tag actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 73 <2]1> 348 <212> DNA <213>智人 cctgcgtctc 60 ccgccaggct 120 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<211> 324 <212> DNA <2]3>智人 ccggagt taa gttggtacca gcagaaacca 120 acgtccattt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 tatatgtttc agcctatgac gttcggccaa 300 324 ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 ccggagtlac gttggtacca gcataaacca 120 acgtccattt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 itcactctci ccatcagcag tctgcaacct 240 tatatgtttc agcctaggac gttcggccaa 300 324 <400> 90 gacaiccaga atcacttgcc gggaaagccc cgtttcagtg gaggatittg gggaccaagg tgacccagtc gggcaagtca caaagctcct gcagtggatc ctacgiacta tggaaatcag tccatcctcc gtggattggt gatctatcat tgggacagat ctgtcaacag acag ctgtctgcat ccggagt taa acgtccaut ttcactctca latatgt 111 ctgtaggaga gttggtacca tgcaaggtgg ccatcagcag ggcciaggac ccgtgtcacc 60 gcagaaacca 120 ggtcccaica ISO tctgcaacct 240 2ttceeccaa 300 <210> 91 <211> 300 <212> DNA <213〉智人 <400> 91 gacatccaga tgacccagtc atcacttgcc gggcaagtca gggaaagccc ctaagctcct cgtttcagtg gcagtggatc gaagattttg ctacgtacta tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 gtggattggt ccggagttac gttggtacca gcagaaacca 120 gatctatcat acgtccattt tgcaaagtgg ggtcccatca )80 tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 ctgtcaacag tataigutc agcctatgac gttcggccaa 300 <2I0> 92 <211> 22 <212> PRT <2丨3>人工序列 <220> <223> Gas前導序列 <400> 92
Met Leu Phe Lys Ser Leu Ser Lys Leu Ala Thr Ala Ala Ala Phe Phe 1 5 10 15
Ala Gly Val Ala Thr Ala 20 <210> 93 <211> 8 <212> PRT <2丨3>人工序列 <220> <223>基因III序列 <400> 93
Ala Ala Ala Glu Thr Val Glu Ser <210> 94 <211> 108 17- 131418-序列表.doc 200911834 <212> PRT <213〉智人 <400> 94
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 )5
Asp Arg Va! Thr ile 丁hr Cys Arg Ala Ser GJn Ser Ser Ser 丁yr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Arg Asn Ser Phe Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Tyr Thr Val Pro Pro 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Gin 100 105 <210> 95 <211〉 108 <212〉 PR丁 <213>智人 <400> 95
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Arg Asn Ser Pro Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Me Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Tyr Ser lie Pro Pro 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 96 <211> 108 <212> PRT <2丨3>智人 <400> 96
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Arg Pro lie Gly Thr Thr 20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu ile / 35 40 45 % Trp Phe Gly Ser Arg Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gin Ala Gly Thr His Pro Thr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210〉 97 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 97
Asp ile G】n Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Lys Tyr lie Gly Ser Gin 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie -18- 131418-序列表.doc 200911834 35 40 45
Ala Trp Ala Ser Val Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Arg Gin Gly Ala Ala Ser Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 98 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 98
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Phe lie Tyr Arg Tyr 20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Giy Lys Val Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asn Ala Ser Tyr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 01u Asp Phe Ala Thr 丁yr Tyr Cys G)n His Ala His Leu Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 99 <211> 108 <212> PRT <2]3>智人 <400> 99
Asp lie Gin Mel Thr Gin Ser Pro Scr Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly ] 5 10 )5
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Trp He Gly Ser Gin 20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Mel Trp Arg Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gin Gly Ala Ala Leu Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 100 <211> ]〇8 <212> PRT <2丨3>智人 <400> 100
Asp Me Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Va) Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Lys lie Ala Thr Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Arg Ser Ser Ser Leu Gin Ser Ala Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Val Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr 丁yr Tyr Cys Gin G】n Thr Tyr Ala Val Pro Pro 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 -19- 131418-序列表.doc 200911834 <210> 101 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 101
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Trp lie Asp Thr Gly 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asn Val Ser Arg Leu Gin Ser Gly Val Pro Scr Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 丁hr Leu Thr He Ser Ser Leu G】n Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Trp Gly Ser Pro Thr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin 01y Thr Lys Val Glu I]e Lys Arg 100 105 <2I0> 102 <211> 108 <212> PR丁 <213>智人 <400> 102
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Aia Ser Gin Glu He Tyr Ser Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asn Ala Ser His Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Val He Gly Asp Pro Val 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 103 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 103
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Aia Ser Gin Ser lie Ser Ser Tyr ， 20 25 30 V Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Thr Leu Leu He 35 40 45
Tyr Arg Leu Ser Val Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 G】u Asp Phe Ala Thr 丁yr Tyr Cys G!n Gin Thr Tyr Asn Val Pro Pro 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 104 <21)> 108 <212> PRT <2]3>智人 <400> 104
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 20- 131418-序列表.doc 200911834 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp 丁yr G!n Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 1!e 35 40 45
Tyr Arg Asn Ser Gin Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Cly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Phe Ala Val Pro Pro 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 105 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 105
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Me 35 40 45
Tyr Arg Asn Ser Pro Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Giy 1 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 G]u Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Tyr Arg Val Pro Pro 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 106 <211> 108 <212> PRT <2丨3>智人 <400> 106
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin His He Gly Leu Trp 20 25 30
Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Arg Ser Ser Leu Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr I!e Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 SO
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Lys Tyr Asn Leu Pro Tyr 85 90 95
Thr Ser Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Me Lys Arg 100 105 <210> 107 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 107
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Phe Arg His 20 25 30
Leu Lys Trp 丁yr G!n Gin Lys Pro C)y Lys Ala Pro Lys Leu Leu I le 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 -21 - 131418·序列表.doc 200911834 G!u Asp Phe Ala Thr Tyr 丁yr Cys Gin Gin Val A】a Leu Tyr Pro Lys 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 100 105 <210> 108 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 108
Asp Me Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr Me Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Me Lys His 20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Arg Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys G3n Gin Gly Ala Arg Trp Pro Gin 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 109 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 109
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Va! Thr ile 丁hr Cys Arg Ala Ser G!n Ser ile 丁yr 丁yr His 20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Lys Ala vSer Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 15 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Val Arg Lys Val Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 110 <211> 108 <212> PRT <213〉智人 <400〉 110
Asp Me Gin Thr Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Tyr lie Gly Arg Tyr 20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asp Ser Ser Val Leu Gin Ser Gly Va! Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Tyr Arg Met Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Val Glu Me Lys Arg 100 105 <210> 111 <211> 108 -22- 131418·序列表.doc 200911834 <2】2> PRT <213>智人 <400〉 111
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin His lie His Arg Glu 20 25 30
Leu Arg 丁rp 亍yr G!n G]n Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Gin Ala Ser Arg Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gjy Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Giu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys G]n Gin Lys Tyr Leu Pro Pro 丁yr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 112 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400〉 112
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly / 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin His lie His Arg Glu 20 25 30
Leu Arg 丁rp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Gin Ala Ser Arg Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Me Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 01u Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Tyr Arg Val Pro 丁yr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 113 <211> 108 <212〉 PR丁 <213>智人 <400〉 113
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Gly Arg Arg 20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gin G)n Lys Pro Gly Ala Ala Pro Arg Leu Leu Me 35 40 45
Tyr Arg Thr Ser Trp Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Ser Gin Trp Pro His 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg )00 105 <210> 114 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <_> 114
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 ]0 15
Asp Arg Val 丁 hr lie Thr Cys Arg A】a Ser Gin Lys 丨 le Tyr Lys Asn 20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie -23- 131418-序列表.doc 200911834 35 40 45
Tyr Asn Ser Ser lie Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 SO
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Tyr Leu Ser Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 115 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 115
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Lys lie Tyr Asn Asn 20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asn Thr Ser lie Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 01u Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg 丁rp Arg Ala Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 116 <211> 108 <212> PRT <2丨3>智人 <400> 116
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Va! Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Trp lie Tyr Lys Ser 20 25 30
Leu Gly 丁rp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Gin Ser Ser Leu Leu Gin Ser Gly Va) Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser 0iy Ser G]y Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 B0 0!u Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr His Gin Met Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 117 <21]> 108 <212> PRT <213>智人 <400> Π7
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Trp lie Tyr Arg His 20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Arg Leu Gin Ser Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Giy Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr His Asn Pro Pro Lys 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 -24- 131418-序列表.doc 200911834 <210> 118 <211> 108 <2I2> PR丁 <213>智人 <400〉丨18
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Scr Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Tyr He Gly Arg Tyr 20 25 30
Leu Arg Trp Tyr G]n Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asp Ser Ser Va] Leu Gin Ser Gly Va! Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu G]n Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Tyr Met Gin Pro Phe 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 119 <211> 108 <212> PRT <2]3>智人 <400〉 119
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Scr Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Trp lie Gly Arg Tyr 20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gty Lys Aia Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asn Gly Ser Gin Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Giy Ser Gly Thr Asp the Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr 丁yr Tyr Cys Gin Gin Arg Tyr Leu Gin Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu 】le Lys Arg 100 105 <210〉 120 <211> 108 <212> PRT <2]3>智人 <400> 120
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin 丁yr He Gly Arg Tyr 20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He 35 40 45
Tyr Asp Ser Ser Val Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Tyr Ser Ser Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210〉 121 <21)> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 121
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 25- 131418-序列表.doc 200911834 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Tyr lie Ser Arg Gin 20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Val Leu Gin Ser Gly lie Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Tyr lie Thr Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Val Lys Arg 100 105 <210> 122 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 122
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Scr Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Trp He His Arg Gin 20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser lie Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Phe Ser Lys Pro Ser 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Gtu He Lys Arg 100 105 <210> 123 <211> 118 <212> PRT <213>智人 <400> 123
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 )5
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Tyr Asp Tyr 20 25 30
Asn Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr He Thr His Thr Gly G!y Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Me Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Gin Asn Pro Ser Tyr Gin Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <2I0> 124 <21]> 120 <212> PRT <213> & 人 <400> 124
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 丁hr Phe Asp Leu Tyr 20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ser lie Val Asn Ser Gly Val Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 -26- 131418-序列表.doc 200911834
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 丁yr 0ys 85 90 95
Ala Lys Leu Asn Gin Ser 丁yr His Tip Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1)5 120 <210> 125 <211> 123 <212> PR丁 <2丨3>智人 <400> 125
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr 20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ser lie Asp Phe Met Gly Pro His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Gly Arg 丁hr Ser Met Leu Pro Met Lys Gly Lys Phe Asp 丁yr 100 105 110
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 126 <2]1> 118 <212> PRT <2I3>智人 <400> 126
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe His Arg 丁yr 20 25 30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr lie Leu Pro Gly Gly Asp Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gjy Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu 丁yr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Gin Thr Pro Asp Tyr Met Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Va) Ser Ser 115 <210> 127 <211> 117 <212> PRT <213>智人 <400> 127
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Lys Tyr 20 25 30
Asn Met Ala Trp Va] Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr lie Leu Gly Glu Gly Asn Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 27· 131418-序列表.doc 200911834 85 90 95
Ala Lys Thr Met Asp Tyr Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 128 <211> 118 <212> PRT <213>智人 <>128
Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Scr Gly Phe Thr Phe Asp Glu Tyr 20 25 30
Asn Met Ser Trp Va) Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr lie Leu Pro His Gly Asp Arg 丁hr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr 1 le Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 丁yr Tyr 0ys 85 90 95
Ala Lys Gin Asp Pro Leu 丁yr Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210〉 129 <211> 118 <212> PRT <213>智人 <400> 129
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Va] Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30
Arg Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr He lie Ser Asn Gly Lys Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Va) 50 55 60
Lys Giy Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Aia Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Gin Asp 亍rp Met Tyr Met Phe Asp 丁yr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 130 <211> 118 <212> PRT <213>智人 <400> 130
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr 20 25 30
Thr Met Ala Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ser lie Thr Ser Ser Gly Ser Ser Thr Tyr 丁yr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu 丁yr 65 70 75 80
Leu Gin Mel Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 丁yr Cys 85 90 95
Ala Lys Val Asn Ser Leu Tyr Lys Phe Asp Tyr 丁rp Gly Gin Gly Thr 100 105 110 28- 131418-序列表.doc 200911834
Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 131 <211> 119 <212> PRT <213>智人 <220〉 <22I> VARIANT <222> 119 <223> Xaa =任何胺基酸 <400> 131
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Pro Thr 20 25 30
Asn Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr lie Thr Gly Thr Gly Ala Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Gin Asn Ser Arg Tyr Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Xaa 115 <210> 132 <211> 117 <212> PR丁 <213> ^•人 <220> <221> VARIANT <222> 117 <223> Xaa =任何胺基酸 <400> 132
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Pro Tyr 20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr lie Ser Pro Phe Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 丁yr Cys 85 90 95
Ala Lys Gly Gly Lys Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 100 105 110
Thr Val Ser Ser Xaa 115 <210> 133 <21]> 123 <212> PRT <213>智人 <220> <221〉 VARIANT <222> 123 <223> Xaa =任何胺基酸 <400> 133
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15 29- 131418-序列表.doc 200911834
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Pro Tyr 20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr lie Ser Pro Phe Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Ser Asp Val Leu Lys Thr Gly Leu Asp Gly Phe Asp Tyr Trp 100 105 Π0
Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Xaa 115 120 <210> 134 <2il> 121 <212> PRT <2丨3>智人 <220〉 <22】> VARIANT <222> 121 <223> Xaa =任何胺基酸 <400> 134
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Met Ala Tyr 20 25 30
Gin Met Ala Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr lie His Gin Thr Gly Pile Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Val Arg Ser Met Arg Pro Tvr Lys Phe Asp Tyr Trp Gly G)n 100 )05 no
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Xaa 115 120 <210> 135 <2Ii> 118 <212> PRT <213>智人 <220> <221> VARIANT <222> 118 <223> Xaa =任何胺基酸 <400> 135
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly ] 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Pro Tyr 20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr lie Ser Pro Phe Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Gly Asn Leu Glu Pro Phe Asp 丁yr Trp G】y Gin Gly 丁hr Leu 100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Xaa 115 <210> 136 •30- 131418-序列表.doc 200911834 <211〉 ]19 <2丨2> PR丁 <213>智人 <220> <22]> VARIANT <222> 119 <223> Xaa =任何胺基酸 <400> 136
Glu Val Gin Leu Leu GIu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Pro Tyr 20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr lie Ser Pro Phe Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Giu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Lys Thr Gly Pro Ser Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Xaa 115 〆 l <210> 137 <211> Π8 <212〉 PR丁 <213>智人 <220> <221> VARIANT <222> 118 <223> Xaa =任何胺基酸 <400〉】37
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Pro Tyr 20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr lie Ser Pro Phe Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Lys Leu Ser Asn Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 100 105 110 / Val Thr Val Ser Ser Xaa i. ⑴ <210> 138 <21I> 119 <212> PRT <213>智人 <220> <221> VARIANT <222> 119 <223> Xaa =任何胺基酸 <400> 138
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Pro Tyr 20 25 30
Thr Mel Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45
Ser Thr lie Ser Pro Phe Gly Ser Tlir Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val -31 - 131418-序列表.doc 200911834 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Va] Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Va) Val Lys Asp Asn Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Xaa 1)5 <210> 139 <21i> 119 <212〉 PR丁 <2丨3>智人 <220> <221> VARIANT <222> 119 <223> Xaa =任何胺基酸 <400> 139
Glu Val G!n Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 3 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Pro Tyr 20 25 30
Thr Mel Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr He Ser Pro Phe Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Asn Thr Gly Gly Lys Gin Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Xaa 115 <210> 140 <211> 121 <212> PRT <213〉智人 <220> <221> VARIANT <222> 121 <223> Xaa =任何胺基酸 <400> 140
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Pro Tyr 20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr lie Ser Pro Phe Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 丁yr Cys 85 90 95
Ala Lys Arg Thr Glu Asn Arg Gly Val Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Xaa 115 120 <210> 14】 <211〉 121 <212> PRT <213>智人 <220> 32- 131418-序列表.doc 200911834 <221> VARIANT <222> 121 <223> Xaa =任何胺基酸 <400> 141
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Asp Tyr 20 25 30
Asp Met Thr Trp Val Arg Gin Ala Pro G)y Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Met lie Ser Ser Ser Gly Leu Trp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys S5 90 95
Ala Lys Gly Phe Arg Leu Phe Pro Arg Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Xaa 115 120 <21Q> 142 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 142
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Va) Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Pro Leu Gin Ser Gly Va) Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Tyr Ser Val Pro Pro 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 143 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 143
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Va) Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser He Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Arg A!a Ser Pro Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Tyr Arg lie Pro Pro 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210〉 144 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 144
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 】0 15 -33- 131418-序列表.doc 200911834
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Phe Lys Ser 20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asn Ala Ser Tyr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Val Val Tyr Trp Pro Val 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 145 <211> 107 <212> PR丁 <213>智人 <400> 145
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Tyr Tyr His 20 25 30
Leu Lys 丁rp fyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Lys Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu 65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Val Arg Lys Val Pro Arg Thr 85 90 95
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Me Lys Arg 100 105 <210> 146 <21J> 108 <212> PRT <213>智人 <400〉 146
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr Me Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Arg Arg Tyr 20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Gin Ala Ser Val Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Gly Leu Tyr Pro Pro lie f 85 90 95 i Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg 100 105 <210> 147 <2Π> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 147
Asp Me Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Giy 15 丨0 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Tyr Asn Trp 20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu I)e 35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Asn Val Val lie Pro Arg 34- 131418-序列表.doc 200911834 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 148 <211> 108 <2]2> PRT <213>智人 <400> 148
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Scr Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Leu Trp His 20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr His Ala Ser Leu Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr 丁yr Tyr Cys Gin Gin Ser Ala Val Tyr Pro Lys 85 90 95
Thr Phe Giy Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 ， <210> 149 <2]1> 108 <2]2> PRT <213>智人 <400> 149
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Scr Val Gly ] 5 10 15
Asp Arg Val rFhr Me Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Phe Arg Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr His Ala Ser His Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Leu Leu Tyr Pro Lys 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Me Lys Arg 100 105 <210> 150 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 150
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Phe Tyr His 20 25 30
Leu Ala Trp 丁yr G】n Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He 35 40 45
Tyr Pro Ala Ser Lys Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe A!a Thr 丁yr Tyr Cys Gin Gin Arg Ala Arg Trp Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 151 <211> 108 <212> PRT <2丨3>智人 -35 - 131418-序列表.doc 200911834 <400> 151
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Va] Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie lie Trp His 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Arg Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Val Ala Arg Val Pro Arg S5 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 152 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 152
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly ] 5 10 15 / Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Tyr Arg Tyr ^ 20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He 35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 01u Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 丁yr Val Gly Tyr Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Me Lys Arg 100 105 <210> 153 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 153
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Leu Lys Tyr 20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asn Ala Ser His Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Thr Tyr Tyr Pro lie 85 90 95
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Tyr Lys Ala Ser Trp Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly •36· 131418-序列表.doc 200911834 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Val Leu Tyr Tyr Pro Gin 85 90 95
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Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Tyr Lys His -38- 131418-序列表.doc 200911834 20 25 30
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Val Val Tyr Trp Pro Val 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg 100 105 <2I0> 163 <211> 116 <212〉 PR丁 <213>智人 <400> 163
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Ala Lys Leu Ser Gly Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 】00 105 110
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Ser Tyr 20 25 30
Gin Mel Thr Trp Val Arg Gin A]a Pro Gly Lys Gly Leu Giu Trp Val 35 40 45
Ser Ser lie Ser Ser Phe Gly Ser Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
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Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Gly Arg Asp His Asn 丁yr Ser Leu Phe Asp Tyr 丁rp Gjy Gin 100 105 110
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gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 188 <211> 324 <212> DNA <213>智人 <400> 188 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctatctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggatttat aggcatttaa ggtggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat gcgtccaggt tgcaaagtgg ggtcccaaca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctglcaacag actcataatc ctcctaagac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 189 <211> 324 <212> DNA <213>舍人 <400> 189 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtatattggt aggtatttac gttggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat tcttccgtgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccaicagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag aggtatatgc agccttttac gticggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 190 <21]> 324 <212> DNA <2】3>智人 <400> 190 ctgtccgcal ctgtaggaga ccgtgicacc 60 cggtatttac ggtggtacca gcagaaacca 120 gggtcccagi tgcaaagtgg ggtcccatca 180 ttcacicica ccatcagcag tctgcaacct 240 cggtatcttc agccttatac gitcggccaa 300 324 gacatccaga igacccagtc tccatcctcc atcacttgcc gggcaagtca gtggattggt gggaaagccc ctaagctcct gatctataat cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gggaccaagg tggaaatcaa acgg <210> 191 <211> 324 <212> DNA <213>智人 <400> 191 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat cigtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtatattggt aggtatttac gitggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat tcttccgtgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagatmg ctacgtacta ctgtcaacag cgltattcti cgccitaiac glicggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa gcgg 324 <210> 192 <211> 324 <212> DNA <213>智人 <400> 192 gacatccaga tgacccagtc 丨ccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtatatttcg cgtcagttaa ggtggiacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ciaggcicct gatctatggg gcgtccgtii tgcaaagcgg gatcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag aggtatatta ctcctiatac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaagtcaa acgg 324
<210> 193 <211> 324 <212> DNA 44- 131418-序列表.doc 200911834 <2丨3>智人 <400> 193 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcai ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggaitcat aggcagttaa agtggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gaictattat gcticcattt tgcaaagigg ggtcccaica 】80 cgtttcagtg gcagtggaic 〖gggacagat ttcactcica ccatcagcag ictgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag acgttttcta agccttctac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 194 <211> 354 <212> DNA <2】3>智人 <400> 194 gaggtgcagc tgttggagtc tggggfiaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgigcag cctccggatt cacctttlat gattataata tgtcttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaact attacgcata cgggtggggt tacatactac 180 gcagactccg igaagggccg gttcaccatc icccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 cigcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacagaat 300 cctictlatc agtttgacta ciggggtcag ggaaccctgg tcaccgictc gage 354 <2]0> 195 <21]> 360 <212> DNA <213>智人 <400> 195 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc uggiacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcct£tgcag cctccggatt cacctttgat etttatgata tgicgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg glctagagtg ggtctcatcg attgttaatt cgggtgttag gacataciac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaalga acagcctgcg tgeegaggae accgcggtat attactgtgc gaaacttaat 300 cagagttatc attgggatu tgactactgg ggtcagggaa ccctggtcac cgictcgagc 360 <210> 196 <21]> 369 <212> DNA <213>智人 <400> )96 gaggtgcagc igttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tccigigcag cctccggatl caccttttcg aagtattgga tgicgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatct attgatttta tgggtccgca tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaagggagg 300 aegtegatgt tgccgatgaa ggggaagttt gactactggg gtcagggaac cctggtcacc 360 gtetegage 369 <210> 197 <211> 354 <212> DNA <213>智人 <400> 197 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttcat cgttattcga tgtcttgggt ccgccaggct )20 ccagggaagg gtetagagig ggtctcaacg attttgcctg gtggtgatgt tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacagacg 300 cctgattata tgtttgacta ctggggtcag ggaaccctgg tcaccgtctc gage 354 <210> 198 <211> 351 <212> DNA <213>智人 <400> 198 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt caccttttgg aagtataata tggcgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaact attcttggtg agggtaataa tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaaacgaig 300 45- 131418-序列表.doc 200911834 gattataagt ttgactactg gggtcaggga accctggica ccgtctcgag c 35] <210> 199 <211> 354 <2I2> DNA <213>智人 <400> 199 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtcic 60 tcctgucag cctccggatt caccmgat gagtataata tgtcitgggt ccgccaggci 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaacg attctgccgc atggtgatcg gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccaic tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtai attactgtgc gaaacaggat 300 cctttgtata ggtttgacta ctggggtcag ggaacccigg tcaccgtctc gage 354 <210> 200 <2Π> 354 <212> DNA <213>智人 <400> 200 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc ccigcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt caccttttcg gattategga tgagttgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaacg attatttega atggtaagu tacatactac ISO gcagactccg tgaagggccg gttcaccaic tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 cigcaaatga acagcctgcg tgeegaggae accgcggiat attactgtgc gaaacaggai 300 / tggatgtata tgtttgacta ctggggtcag ggaaccctgg tcaccgtctc gage 354 <210> 201 <21]> 354 <212> DNA <213>智人 <400> 201 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacct t tegg acgtatacta tgget tgggt ccgccaggcc 120 ccagggaagg gictagagtg ggtctcatcg attactagta giggttcttc tacatactac 180 gcagactccg igaagggccg gttcaccaic tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatEa acagcctgcg tgeegaggat accgcggtat attactgtgc gaaagtgaat 300 tctttgtata agtttgacta ctggggtcag ggaaccctgg tcaccgtctc gage 354 <210> 202 <2]1> 355 <212> DNA <2]3> % 人 <400> 202 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc itggiacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttcgg ccgactaata tgtcgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaact attactggta ctggtgcigc gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgeegaggae accgcggtat aitactgtgc gaaacagaat 300 tctcgltata ggtttgacta ctggggtcag ggaaccctgg tcaccgtctc gageg 355 <210> 203 <211> 349 <212> DNA <213>智人 <400> 203 ctggggggtc cctgcgtctc 60 tgagttgggt ccgccaggct 120 ttggttcgac tacatactac 180 attccaagaa cacgctgtat 240 attactgtgc gaaagggggg 300 tclcgagcg 349 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc itggtacagc tcctgtgcag cctccggatt caccttttgg ccgtatacga ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaacg atttcgccgt gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca ctgcaaatga acagcctgcg tgeegaggae accgcggtat aaggattug actactgggg tcagggaacc c.tggtcaccg <210> 204 <211> 367 <212> DNA <213>智人 <400> 204 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc ccigcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt caccttttgg ccgtatacga tgagttgggt ccgccaggct 120 •46· 131418-序列表.doc 200911834 ccagggaagg gictagagtg ggtctcaacg atttcgccgt ttggttcgac tacataclac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca auccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaagtgat 300 gttcttaaga cgggtctgga tggttttgac tactggggtc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcgagcg 367 <210> 205 <211> 361 <212> DNA <213>智人 <400> 205 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc itggtacagc ctggggggtc ccigcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttatg gcgtatcaga tggcttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaact attcauaga cgggtmtc tacataclac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtai 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaagtgcgt 300 tctatgcgtc cttataagtt tgactacigg ggtcagggaa ccctggtcac cgtctcgagc 360 g 361 <2]0> 206 <211> 352 <212> DNA <2]3>智人 <400> 206 gagglgcagc tguggagtc tgggggaggc ttgglacagc ctggggggtc cctgcglctc 60 tcctgtgcag cctccggati caccitttgg ccgtatacga tgagttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg glciagagtg ggtctcaacg atttcgccgt ttggttcgac tacaiactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaggtaat 300 cttgagccgt ttgactactg gggtcaggga accctggtca ccgtctcgag eg 352 <2I0> 207 <21]> 355 <212> DNA <213> ^•人 ctggggggtc cctgcgtctc 60 tgagttgggt ccgccaggct 120 itggtlegae tacatactac 180 attccaagaa cacgcigtat 240 attactgtgc gaaaaaeacg 300 icaccglctc gageg 355 ctggggggtc cctgcgtctc 60 tgagttgggt ccgccaggct 120 ttggttcgac tacatactac 180 attccaagaa cacgctgtai 240 attactgtgc gaaaaagcti 300 ccgtctcgag eg 352 <400> 207 gaggtgcagc tguggagtc tcctgtgcag cctccggatt ccagggaagg gictagagtg gcagactccg tgaagggccg ctgcaaatga acagcctgcg ggtccgtcgt cgtttgacta <210> 208 <211> 352 <212> DNA <2i3>智人 <400> 208 gaggtgcagc tgttggagtc tcctgtgcag cctccggatt ccagggaagg gtctagagtg gcagactccg tgaagggccg ctgcaaatga acagcctgcg agtaatggtt ttgactactg tgggggaggc ttggtacagc caccttttgg ccgtatacga ggtctcaacg atttcgccgi gttcaccatc tcccgcgaca tgccgaggac accgcggtat ctggggtcag ggaaccctgg tgggggaggt ttggtacagc caccttttgg ccgtatacga ggtctcaacg atttcgccgt gttcaccatc tcccgcgaca tgccgaggat accgcggtat gggtcaggga accctggtca <210> 209 <211> 355 <212> DNA <213> _ 人 ctggggggtc cctgcgtctc 60 tgagttgggt ccgccaggct 120 tiggitegae tacatactac 180 attccaagaa cacgctgtat 240 attactgtgc gaaagtggtt 300 tcaccgtcic gageg 355
<400> 209 gaggtgcagc tgttggagtc tcctgtgcag cctccggatt ccagggaagg gtctagagtg gcagactccg tgaagggccg ctgcaaatga acagcctgcg aaggalaata cgtttgacta <210> 210 <211> 355 <212> DNA tgggggaggc ttggtacagc caccttttgg ccgtatacga ggtctcaacg atttcgccgt gttcaccatc tcccgcgaca tgccgaggac accgcggtat ctggggtcag ggaaccctgg • 47- 131418-序列表.doe 200911834 <2丨3>智人 <400> 210 ctggggggtc cctgcgtctc 60 tgagltgggt ccgccaggct 120 uggttcgac tacatactac 180 attccaagaa cacgctgtat 240 attactgtgc gaaaaatact 300 icaccgtctc gagcg 355 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc tcctgtgcag cctccggatt cacct 11tgg ccgtatacga ccagggaagg gtciagagtg ggtctcaacg atttcgccgt gcagactccg tgaagggccg gttcaccatt icccgcgaca ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat gggggtaagc agutgacta ctggggtcag ggaaccctgg <210> 211 <211> 361 <212> DNA <213> % 人 <400> 211 gaggtgcagc tgttggagtc 丨gggggaggc ttggtacagc ctggggggtc ccigcgictc 60 tcctgtgcag cctccggalt caccttttgg ccgtatacga tgagttgggt ccgccaggci 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaacg atttcgccgt ttggttcgac tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gticaccatc icccgcgaca attccaagaa cacgctgtal 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat aitactgtgc gaaaaggacl 300 gagaataggg gggilicitt tgactactgg ggtcagggaa ccctggtcac cgtctcgagc 360 g 361 <210> 212 <21]> 361 <212> DNA <213>智人 <400> 212 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctitaag gattatgata tgacttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaatg atttcttcgt cgggtctt tg gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gticaccatc icccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaggtttt 300 aggctgtttc ctcggacttt tgactactgg ggtcagggaa ccctggtcac cgtctcgagc 360 g 361 <210〉 213 <211> 357 <212> DNA <213>智人 60 120 180 240 300 357 <400> 213 gaggticaat tgt tggaatc tcctgtgctg ct tccggt 11 ccaggtaaag gat tggaatg gctgactccg ttaagggaag ttgcagatga actccttgag aagagaggac ct tggt t tga cggtggigga ttggttcaac tactttcgct cacgagacta ggttlcccac attccaccag attcactatc tccagagaca agctgaggat actgctgttt ttactgggga cagggaactt ctggtggttc tttgagatig tggtttgggt tagacaggct atggtcaaga tccat tctac actccaagaa cact t tgtac accacigtgc tttgttgcca tggt tactgt tlet tcc <210> 214 <211> 119 <212> PRT <2]3;>智人 <400> 214
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala His Glu 20 25 30
Thr Met Val Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser His He Pro Pro Asp Gly Gin Asp Pro Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys 85 90 95
Ala Leu Leu Pro Lys Arg Gly Pro Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 •48· 131418-序列表.doc 200911834 <210> 215 <211> 357 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> —致序列 <220> <221> misc一feature <222> (6)...(6) <223> n = t 或 g <22Q> <221> misc_feature <222> (9)...(9) <223> n = a 或 g <220> <221> misc_feature <222〉 （10)...(10) <223> n = t 或 c <220> <22】> misc一feature <222> (18)...(18) <223> n = a 或 g <220> <221> misc一feature <222〉 （21)…（21) <223〉 n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (24)...(24) <:223> n = t 或 g <220> <221> misc.feature <222> (27)...(27) <223〉 n = t 或 a <220> <22\> misc_feature <222> ¢30)...(30) <223> π = a 或 c <220> <221> misc一feature <222> (36)...(36) <223> n = t 或 a <220> <221> misc^feature <222> (39)...(39) <223> n = a 或 g <220> <221> misc.feature <222> (45)...(45) <223> n = t g <220> <221> misc_feature <222> (48)...(48) <223> n = t ^ g -49 131418-序列表.doc 200911834 <220> <221> misc_feature <222> (5])…（51) <223> n = t ^ c <220〉 <221> misc_feaiure <222> (52)...(52) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (55)...(55) <223> n = a 或 c <220> <221> misc_feature <222〉 （57)‘‘.（57) <223> n = a ^ t <220> <221> misc_feature <222> (58)...(58) <223> n = t ^ c <220〉 <221〉 misc一feature <222> (60)...(60) <223> n = g 或 c <220> <221〉 misc一feature <222> (69)...(69) <223> n = t 或 a <220> <221> misc_feature <222> (72)...(72) <223> n = t 或 c <220> <22)> misc_feature <222〉 （78)·,(78) <223> η = t 或 a <220> <221> mi sc一feature <222> (81)...(81) <223> η = t 或 c <220> <221> misc^feature <222> (84)...(84) <223> n = t 或 c <220> <221> misc^feature <222> (87)...(87) <223> n = c 或 ί <220> •50 131418-序列表.doc 200911834 <221> misc_feature <222> (90)7..(90) <223> η = t 或 g <220> <221> mi sc_feat ure <222> (93)7..(93) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> ¢99)-..(99) <223> n = t 或 g <220> <221> misc_feature <222> (105T·..(105) <223〉 n = t 或 g <220> <221> mi sc—feature <222> (110...(111) <223> n = t 或 c <220> <22l> misc一feature <222> (112*). ..(112) <223> n = a 或 c <220> <221> mi sc—feature <222> (114T.-.(114) <223> n = a 或 c <220> <221> mi sc一feature <222> (120Τ...Π20) <223> n = t 或 a <220> <221> misc_feature <222> (326)...(126) <223〉 n = t 或 g <220> <221> mi sc_feature <222> (129)...(129) n = a 或 g <220〉 <221> mi sc_feature <222> (132)...(132) <223〉 n = a 或 t <220> <221> misc_ieature <222> (133T...(133) <223〉 n = t 或 c <220> <221> misc.feature <222> (135)...(135) <223〉 n = g 或 a -51 - 131418·序列表.doc 200911834 <220> <221> misc_feature <222> (13δΤ...(138) <223> η = a 或 g <220> <221> misc_feature <222> C144j...(144) <323> η = l 或 c <220〉 <221> misc_feature <222> (147)...(147) <223> n = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (150了…（150) <223> n = c 或 i <220> <221> mi sc一feature <222> (1561...(356) / <223> n = a 或 c <220> <221> misc_feature <222> (159)...(159) <223〉 n = a 或 g <220> <221> misc_feature <222> (168j...(168) <223> n = a 或 g <220> <221> misc.feature <222〉（174了…（174) <223> π = a 或 c <220> <221> misc-fealure <222> (183T-..(183) <223> n = t 或 a <220> <221> mi sc_feature <222> (192)...(192) <223> n = t 或 g <220> <221> misc.feature <222> (198T...(198) <223> n = a 或 c <220> <22l> mi sc.feature <222> (199)...(199) <223> n = a 或 c <220> -52- 131418·序列表.doc 200911834 <221> mi sc_feature <222> (201)...(201) <223> n = a 或 g <220> <22]> mi sc_feature <222> (207)...(207) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (214)...(214) <223> n = a 或 c <220> <221> misc_feature <222> (216j...(216) <223> n = a 或 c <220> <221> misc_feature <222> (222)...(222) <223> n = c 或 t <220> <22]> misc—feature <222> (234]...(234) <223> n = t 或 g <220> <221> misc^feaiure <222> (2353...(235) <223> n = t 或 c <220> <221> mi sc一feature <222> (237j...(237) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (240]...(240) <223> n = c 或 t <220> <221> misc一feature <222> (24lT...(241) <223〉 n = l 或 c <220> <221> misc一feature <222> (246T...(246) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (253)...(253) <223> n =〖或 a <220> <221> misc_feature <222> (254T...(254) <223> n = c 或 g -53- 131418-序列表.doc 200911834 <220> <221> misc.feature <222> (256T...(256) <223> π = t 或 c <220> <221> misc^feature <222> ¢259)...(259) <223> n = a 或 c <220> <22]> misc_feature <222> (26lT...(261) <223> n = a 或 I <220〉 <221> misc_feature <222> (264j...(264) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (270T...C270) <223> η = 1 或 c <220> <221> misc_feature <222> (273)...(273) <223〉 n = t 或 a <220> <221> misc_feature <222> (276T...(276) <223〉 η = I 或 g <220> <221> mi sc feature <222> (2791...(279) <223〉n = t 或 a <220> <221> misc_feature <222> (282j...(282) <223> η = c 或 l <220> <22l> misc.feature <222> (29lT...(291) <223> n = t 或 g <220> <221> misc.fealure <222> {292T...(292) <223> n = t 或 c <220> <221> misc.fealure <222> (295j...(295) <223> n = t 或 c <220> -54- 131418-序列表.doc 200911834 <221> mi sc_feature <222> (297)...(297) <223> n = g 或 t <220> <221> mi sc_feature <222> (30〇T...(300) <223> n = a 或 t <221> misc_feature <222> (306)...(306) <223> n = a 或 g <220> <221> misc一feature <222> (309T...(309) <223> n = a or g <220> <221> misc feature <222> (321)...(321) <223> n = t 或 c <220> <221> mi sc_feature <222> (33〇T...(330) <223> n = a 或 l <220> <221> misc_feature <222> (339).,.(339) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (34〇y,..(340) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (345)...(345) <223> n = t 或 c <220> I <221> misc_feature ' <222> (34S)...(34S) <223〉 n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (350...(351) <223> n = l 或 c <220> <221> mi sc_feature <222> (354)...(354) <223> n = t 或 g <220> <221> misc_feature <222> (355T，..(355) <223> n = t 或 a -55- 131418-序列表.doc 200911834 <220> <221> misc feature <222> (356)...(356) <223> π = c 或 g <400> 215 gaggtncann tgttggantc nggnggnggn ttggtncanc ctggnggntc nntgngnntn tcclgtgcng cntccggnti nacnttngcn cangagacna tggtntgggt nngncaggcn ccaggnaang gnntngantg ggtntcncan attccnccng aiggtcanga tccnttctac gcngactccg tnaagggnng nttcacnatc tccngngaca anlccaagaa cacnntntan ntgcanatga acnncntgng ngcngaggan acngcngtnt ancactgtgc nntgntnccn aagagnggnc cttggittga ntactggggn cagggaacnn tgginacng丨 ntcnnnc <210> 216 <211> 366 <212> DNA <2】3>智人 <400> 216 gagaaaagag aggttcaatt gcttgaatct ggaggaggtt tggtccagcc aggagggtcc cttcgactaa gttgtgctgc cagtgggtti acgtttgctc atgaaactat ggtatgggtc cgacaggcac ctggtaaagg tcttgaatgg giticacata tccctccaga cggtcaagac ccattttacg clgattccgt gaaaggcaga ittacaattt cacgagataa ttctaaaaac accttgtact tacaaatgaa ctcattgaga gctgaggaca ctgcagttta tcactgcgct ttactaccaa aacgtggacc ttggtttgat lattggggcc aaggtacgtt agtgactgtl agl tct <210〉 217 <2]1> 122 <2】2> PRT <2]3> + 人 <400> 217
Glu Lys Arg Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin 15 10 15
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 20 25 30
Ala His Glu Thr Met Val Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45
Glu Trp Val Ser His Me Pro Pro Asp Gly Gin Asp Pro Phe Tyr Ala 50 55 60
Asp Ser Va] Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 65 70 75 80
Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Va! 85 90 95
Tyr His Cys Ala Leu Leu Pro Lys Arg Gly Pro Trp Phe Asp Tyr Trp 100 105 ]]〇
Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 218 <211> 366 f <212> DNA l <213>馬斯德畢赤酵母 <400> 218 gagaaaagag aggttcaatt gcttgaatct ggaggaggtt tggtccagcc aggagggtcc cttcgactaa gttgtgctgc cagtgggttt acgtttgctc atgaaactat ggtatgggtc cgacaggcac ctggtaaagg tettgaatgg gtttcacata tccctccaga cggtcaagac ccattttacg ctgattccgt gaaaggcaga utacaaill cacgagataa ttctaaaaac accttgtact tacaaatgaa ctcattgaga gctgaggaca cigcagttta tcactecgct ttactaccaa aacgtggacc ttggtttgat tattggggcc aaggtacgtt agtgactgtl agt tc i <210> 219 <211> 358 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> —致序列 56- 131418·序列表.doc 200911834 <220> <221> misc_feature <222> (6)...(6) <223> n = g 或 t <220> <221> misc一feature <222> (9)...(9) <223> n = g 或 a <220> <22】> misc一feature <222> (10)...(10) <223> n = c 或 t <220> <221> mi sc_feature <222> (13)...(13) c223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> ¢15)...(15) <223> n = g 或 t <220〉 <221> misc_feature <222> (18)...(18) <223> n = g 或 a <220〉 <221> misc_feature <222> (24)...(24) <223〉 n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (30)...(30) <223> n = c ^ t <220> c221> misc一feature <222> (36)...(36) <223> n = a 或 c <220> <221> misc_feature <222> (42)...(42) <223> n = t 或 a <220> <223> misc一feature <222> (45)...(45) <223> n = g 或 a <220> <22}> misc_feature <222> (54)...(54) <223> n = g 或 t <220〉 <221> misc_feature -57· 131418-序列表.doc 200911834 <222> ¢57)...(57) <223> η = t 或 a <220> <221> misc一feature <222> (60)...(60) <223> n = c ^ a <220> <221> mi sc feature <222> (61 Γ. .(61) <223> η = t 或 a <220> <221> misc一feature <222〉 （62)...(62) <223> n = c 或 g <220> <221> misc feature <222> (63)...(63) <223> n = c 或 t <220> <221> misc feature <222> (69).,.(69) <223> n = a ^ t <220> <221〉 misc—feature <222> (73)...(73) <223〉 n = I 或 a <220> <221> mi sc feature <222> (74)",.(74) <223> n = c ^ g <220> <221> misc_feature <222> (75)…（75) <223> π == c 或 t <220> <221> misc feature <222> (78)...(78) <223> n = a 或 g <220> <221> misc_feature <222> (81)...(81) <223> n = c 或 t <220> <221> mi sc feature <222> (84)7..(84) <223> π = c 或 g <220> <221> misc_feaiure <222> (90)...(90) <223> n = g 或 t -58 131418-序列表.doc 200911834 <220> <221> misc_feaiure <222> (96)...(96) <223> η = g 或 a <220〉 <221> mi sc一feature <222> (99)...(99) <223> n = g 或 t <220> <221> misc_feature <222> (105j...(105) <223〉 n = g 或 a <220> <221〉 misc一feature <222> (114). . .(Π4) <223> n = c 或 a <220> <221> misc_feaiure <222> ¢123)...(123) <223〉 n = a 或 t <220> <221> misc_feature <222> (126)...(126) <223〉 n = g 或 t <220> <221> misc_feature <222> (129j...(129) <223> n = g 或 a <220> <221> misc.fealure <222> (135)...(135) <223> n = a 或 t <220> <221> misc_feature <222> (138T...(138) <223〉 n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (144)...(144) <223〉 n = c 或 t <220> <221> misc-feaiure <222> (153)...(153) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (156j...(156) <223> n = c 或 t <220〉 <221> misc_feature <222> (359)...(159) -59- 131418-序列表.doc 200911834 <223> η = g 或 a <220> <221> misc一feature <m> (162T...(162) <223> n = t 或 c <220〉 <221> misc_feature <222> (168)...(168) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (17lT...(171) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> {174T...(174) <223〉 n = c 或 a f <220> • <221> misc.feature <222> (177)...(177) <223〉 n = c 或 t <220〉 <221> misc—feature <222> (183)...(183) <223> n = a 或 t <220> <221> misc_feature <222> (186]...(186) <223〉 n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (195T...(195) <223> n = g 或 a <220> <221> misc.feature <222> (1997...(199) <223> n = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (201)...(201) <223> n = g 或 a <220> <221> misc—feature <222> (204)...(204) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (207T，..(207) <223> n = c 或 a -60- 131418-序列表,doc 200911834 <220> <221> misc_fealure <222> (21〇T...(210) <223> η = c 或 t <220> <221> misc^feature <222> (213T...(213) <223> n = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (216)...(216) <223> n = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (219T...(219) <223> n = c 或 t <220> <221> miscjeature <222> (225)...(225) <223> n = c 或 t <220> <221> misc„feature <222> (228)...(228) <223> n = g 或 a <220> <221> niisc_fearure <222> (234T...(234) <223> n = g 或 c <220> <22]> mi sc—feature <222> (2357.,.(235) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (237)...(237) <223> n = a 或 g <220> <221> misc^feature <222> (240^...(240) <223> n = t 或 c <220> <221> mi sc^feature <222> (241)...(241) <223> n = c 或 t <220> <221> misc^feature <222〉 （243)...(243) <223> n = g 或 a <220> <221> misc一feature <222> ¢253)...(253) -61 - 131418-序列表.doc 200911834 <223〉η =： a 或 l <220> <22)> misc_feature <222> (254)...(254) <223> n = g 或 c <220> <221> misc feature <222> (255)...(255) <223> n = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (256T...(256) <223> n = c 或 t <220> <221> mi sc_feature <222> (259了…（259) <223> n = c 或 a <220> <221> misc_feaiure <222> (260...(261) <223> n = t 或 a <220> <221> misc_feature <222> ¢264)...(264) <223> n = c 或 t <220〉 <221> misc_feaiure <222> (273]...(273) <】23> n = a 或 t <220> <221> misc_feature <222> (276]...(276) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> ¢279)...(279) <223> n = a 或 t <220> <221> misc feature <222> (288)...(288) <223> n = t 或 c <220> <221> misc一feature <222> (290...(291) <223> n = g 或 t <220> <221> misc_feature <222> (292^...(292) <223> n = c 或 t -62- 131418-序列表.doc 200911834 <220> <221> misc_feature <222> (294T...(294) <223> n = g 或 a <220> <221> mi sc_feature <222> (297T...(297) <223> n = t 或 a <220> <221> misc_feature <222> (30〇T...(300) <223> n = t 或 a <220> <221> misc_feature <222> (303),..(303) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (304)...(304) / <223> n = a 或 c <220> <221> misc_feature <222> (306)...(306) <223> n = g 或 t <220> <221> misc_feature <222> (309j...(309) <223> π = g 或 a <220> <221> mi sc feature <222> (321)...(321) <2》3> n = c 或 t <220> <221> misc.feature <222> (324)...(324) <2》3> n = c 或 t <220> <221> mi sc一feature <222> (33〇T...(330) <223> n = t 或 c <220> <221> misc一feature <222> (333j...(333) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (336T...(336) <223> n =： a 或 t <220> <221> misc_feature •63- 131418-序列表.doc 200911834 <222> (339)...(339) <223> π = c 或 g <220> <22】> mi sc_feature <222> (34〇T...(340) <223> η = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (342)...(342) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (345T-..(345) <223> n = c 或 g <220> <221> mi sc_feature <222> (348)...(348) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (351]...(351) <223> n = c或空白 <220> <221> mi sc一feature <222> (353T...(353) <223> n = c 或 a <220> <221> mi sc.feature <222> (355j...(355) <223〉 n = a 或 t <220> <221> misc_feature <222> (356)...(356) <223> n = g 或 t <220> <221> misc_feature <222> ¢358)...(358) <223> n =空白或t <400> 219 gaggtncarm tgntnga^tc nnntgtgcng ccnnnggnit ccnggnaang gtctngantg gcngantccg tgaanggcng ntncaaatga acnnnntgng aanngnggnc cttggtttga tggnggaggn nacnt t tgcn ggtntcacat nt tnacnatn ngcngaggac ntantggggn ttggtncagc catganacna atnccnccng tcncgngana acngcngtnt canggnacnn cnggngggtc tggtntgggt anggtcanga at tcnaanaa atcactgngc tngtnacngi cctncgnctn ccgncaggca nccnt tntac cacnninlan nnmctnccn ntngnncn 60 120 180 240 300 358 <2J0> 220 <211> 357 <212> DNA <213>智人 <400> 220 gaagtgcagc ttciigaaag tggtggaggg ctagtEcagc cagggggatc ntaagaita 60 tcatgcgctg ccagtggatt tacttttgct cacgagacga tggtctgggt gagacaagci 120 -64- 131418-序列表.doc 200911834 cctggaaaag gtttagagtg ggtttctcac attccacctg atggtcaaga tcctttctac 180 gcagattccg tcaaaggaag atttactatc tccagagata atagtaaaaa cacttlgtac 240 ctacagatga actcacttag agccgaagat accgctgtgt accactgcgc cttgttgcca 300 aagagaggtc cttggttcga ttactggggt cagggtactc iggttacagt ctcatci 357 <210> 221 <211> 119 <212> PRT <2】3>智人 <400> 221
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly i 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala His Glu 20 25 30
Thr Met Val Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser His lie Pro Pro Asp Gly Gin Asp Pro Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu 丁yr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys 85 90 95
Ala Leu Leu Pro Lys Arg Gly Pro Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<2】0> 222 <211> 357 <212> DNA <213>馬斯德畢赤酵母 <400> 222 gaagtgcagc itcttgaaag tggtggaggg ctagtgcagc cagggggatc tttaagatta 60 tcatgcgctg ccagtggatt tacttttgct cacgagacga tggtctgggt gagacaagcl 120 cctggaaaag gttiagagtg ggtttctcac attccacctg atggtcaaga tcctttctac 180 gcagattccg tcaaaggaag atttactatc tccagagata atagtaaaaa cactttgtac 240 ctacagatga actcacttag agccgaagat accgctgtgt accactgcgc cttgttgcca 300 aagagaggtc cttggttcga ttaclggggt cagggtactc tggttacagt ctcatci 357 <2]〇> 223 <211> 358 <212> DNA <2]3>人工序列 <220> <223> —致序列 <220> <221> misc_feature \ <222> (3)...(3) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (12)...(12) <223> n = g 或 t <220> <221> misc_feature <222> (13)...(13) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (15)...(15) <223〉 n = g 或 t •65 · 131418-序列表.doc 200911834 <220> <221> misc_feature <222> {18).,.(18) <223> η = g 或 a <220> <221> misc^feature <222> (19)...(19) <223> n = t 或 a <220> <221> misc_feature <222> (20)...(20) <223> η = c 或 g <220> <221> misc^feature <222> (24)...(24) <223> n = g 或 t <220> <221> misc一feature <222〉 （30)…（30) 〆 <223> n = c 或 g <220> <221> misc_feature <222> (31). .(31) <223> n = t 或 c <220> <221> misc一feature <222> (33)…（33) <223> n = g ^ a <220〉 <221> misc_feature <222> (36)...(36) <223> n = a 或 g <220> <221> misc一feature <222> (42)...(42) <223> n = t ^ a <220> <221> misc_feature <222> (48)...(48) <223> n = g ^ a <220> <221> misc_feature <222> (51)...(53) <223> n = c 或 1 <220> <221> misc^feature <222> (52)…（52) <223> n = c 或 t <220> <22)> misc.feature <222> (54)...(54) -66- 131418-序列表.doc 200911834 <223〉 π = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (55)...(55) <223> η = c 或 a <220> <22]> mi sc_feature <222> (57). ..(57) <223> n = t 或 a <220> <221> misc_feature <222> (58)...(58) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (60)...(60) <223〉 n = c 或 a f <220> \ <221> misc一feature <222> (63)..(63) <223> n = c ^ a <220〉 <221> misc_feature <222〉 （66)...(66) <223> n = t ^ c <220> <22】> miscjeature <222> (69)...(69) <223> n = a 或 t <220> <223> misc_feature <222> (73)...(73) <223> n = t 或 a <220> <221> misc_feature <222> (74)...(74) <223> n = c 或 g <220> <221> misc_feature <222> (75)...(75) <223> n = c 或 t <220〉 <221> misc_feature <222> (81)...(81) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (84)...(84) <223> n = c 或 t •67- 131418-序列表.doc 200911834 <220> <22)> misc_feature <222> (90)...(90) <223> η = g 或 t <220> <221> misc一feature <222〉 （93)..,(93) <223> η = t 或 c <220> <221> mi sc feature <222> ¢105)...(105) <223> n = g 或 c <220> <221> misc.feature <222> (111j...(111) <223〉 n = c 或 g <220> <221> misc_feature <222> (112)...(112) <223> n = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (114T...(114) <223> n = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (117)...(117) <223> n = g 或 a <220〉 <221> misc_feature <222> (12〇T...(120) <223> n = a 或 t <220> <221> misc feature <222> ( 123*). ..( 123) <223〉 n = a 或 i <220> <221> misc_feature <222> (126T...(126) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (129T-..(129) <223> n = g 或 a <220〉 <221> misc_feature <222> ( 133*). . .(133) <223> n = c 或 t <220〉 <221> misc_feature <222> (144j...(144) <223〉 n = c 或 l -68- 131418-序列表.doc 200911834 <220> <221> misc.feature <222> (147)...(147) <223> n = a 或 t <220> <221> misc^feaiure <222> (150)...(150) <223> n = t 或 c <220> <221> misc一feature <222> (156)...(156) <223> n = c 或 a <220> <221> misc一feature <222〉 （159了...（159〉 <223> n = g 或 t <220> <221> misc一feature <222> (16ST...(168) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222〉（]74了…（174) <223> n = c 或 t <220> <221> mi sc一feature <222〉 （186),..(186) <223> η = c 或 t <220> <221> mi sc_feature <222> (192T...C192) <223〉 n = g 或 c <220> <221> misc_feature <222> (195T-..(195) <223> n = g 或 a <220〉 <221> misc一feature <222> (198)...(198) <223> n = c 或 a <220〉 <221> misc一feature <222> (199T...(199) <223> η = c 或 a <220> <221> misc_fealure <222> (20lT...(201) <223> n = g 或 a <220> -69- 131418-序列表.doc 200911834 <221> misc.feature <222> (204T...(204) <223> η = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (207"). ..(207) <223〉 π : c 或 t <220> <221> misc一feature <222> (214)...(214) <223> n = c 或 a <220> <221> misc—feature <222> (216)...(216) <223> n = c 或 a <220〉 <221> misc_feature <222> (219)...(219) <223> n = c 或 t <220> <221> misc.feature <222> (223)...(223) <223> n = t 或 a <220> <221> misc_feature <222> (224j...(224) <223> n = c 或 g <220> <221> misc_feature <222> (225)...(225) <223〉 n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (2287...(228) <223> n = g 或 a <220> <221> misc一feature <222> ¢2347...(234) <223〉 n = g 或 t <220> <221> misc_feature <222> (235T...(235) <223> n = c 或【 <220〉 <221> misc^feature <222> (237)...(237) <223〉 n = a 或 g <220> <221> misc_feature -70- 131418-序列表.doc 200911834 <222> ¢240)...(240) <223> η = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (243T...(243) <223> η = g 或 a <220> <221> misc一feature <222> (246T...(246) <223> n = a 或 g <220> <22]> mi sc_feature <222> (253T...(253) <223> n = a 或 i <220> <221> misc^feaiure <222> (254T...(254) <223> n = g 或 c <220> <221> misc_feature <222> ¢255]...(255) <223> n = c 或 a <220> <221> misc.feature <222> (258)...(258) <223> n = g 或 t <220> <221> misc—feature <222> (259T-..(259) <223> n = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (26Π. ..(261) <223> n = i 或 a <220> <221> misc_feature <222> (267T...(267) <223> n = g 或 a <220> <221> mi sc_feature <222> (270)...(270) <223> n = c 或 t <220> <221> misc一feature <222> ¢273)...(273) <223> n = a 或 c <220> <221> mi sc一feature <222> (276)...(276) <223〉 n = g 或 t -71 - 131418-序列表.doc 200911834 <220> <221> misc_feature <222> (279了…（279) <223> n = a 或 g <220> <221> misc_feature <222> (282了…（282) <223> n = t 或 c <220> <221> mi sc一feature <222> (288T...(288) <223> n = t 或 c <220> <221> mi sc_feature <222> (291)...(291) <223> n = g 或 c <220> <221> misc_feature <222> (292T-..(292) <223> n = c 或 t <220> <221> mi sc一feature <222> (295)...(295) <223> n = c 或 t <220> <221> misc一feature <222> (297)...(297) <223> n = t 或 g <220> <221> misc一feature <222> (300)...(300) <223> n = t 或 a <220> <221> mi sc一feature <222> (306T...(306) <223> n = g 或 a i <220> <221> misc一feature <222> (309)...(309) <223> n = g 或 I <220> <221> mi sc_fealure <222> (31ST...(318) <223> η = t 或 c <220> <221> mi sc—feature <222> (321)...(321) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feaiure • 72- 131418-序列表.doc 200911834 <222> (336)...(336) <223> η = a 或 ί <220> <221> misc_feature <222> (339T-..(339) <223> η = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (345)...(345) <223> n = c 或 t <220> <221> misc^feature <222> (3487-..(348) <223> n = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (354T...(354) <223> n = g或空白 <220> <221> misc_feature <222> (356T...(356) <22b n = g 或 t <220> <221> misc_feature <222> ¢358)...(358) <223> n =空白或i ntngincagc cngggggntc nninngnntn 60 cangagacga tggtntgggt nngncangcn 120 attccnccng atggtcanga tccnttctac 180 tccngngana atnnnaanaa cacnnintan 240 acngcngtnt ancactgngc nntgntnccn 300 cagggnacnc Iggtnacngt ctcnancn 358 cctgcgcctg 60 tcgccaagct 120 cccattciat 180 caccctgtac 240 gctgctgcct 300 aagcagc 357 <400> 223 gangtgcagc tcntgngcng ccnggnaang gcagantccg ctncanatga aagagnggnc <210> 224 <211> 357 <212> DNA <2〗3>智人 <400> 224 gaagtacaac tcctgtgcgg ccgggcaaag gcggaticcg ctgcagatga aaacgiggcc tnntngannn ccnnnggat t gtntagagtg tnaanggnng acnnnc tnng ct tggiinga tgctggagag catctggt 11 gcctggaatg t taagggtcg actccctgcg cgiggt tcga tggnggaggn nacnt ugcn ggtntcncan nt tnacnatc ngccgangan niaciggggt cggtggcggc cacct tcgca ggtaagccac ct t taccat t cgccgaggat t Eactggggt ctggttcaac cacgaaacca at tcctccag tctcgtgata actgcggtgt cagggtactc cgggtggttc tggtgtgggt atggccagga actccaaaaa accattgtgc iggtcaccgt <210〉 225 <211> 119 <212> PRT <213>智人 <400> 225
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly ] 5 ]〇 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala His Glu 20 25 30
Thr Met Val Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser His lie Pro Pro Asp Gly Gin Asp Pro Phe Tyr Ala Asp Ser Val •73- 131418-序列表 _doc 200911834 50 55 60
Lys Giy Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys 85 90 95
Ala Leu Leu Pro Lys Arg Gly Pro Trp Phe Asp Tyr Trp Gly G3n Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210〉 226 <21I> 357 <212> DNA <213>大腸桿菌 <400> 226 gaagtacaac tgciggagag cggtggcggc ctggttcaac cgggtggitc cctgcgcctg 60 tcctgtgcgg catctggttt caccttcgca cacgaaacca tggigtgggt tcgccaagct 120 ccgggcaaag gcctggaatg ggtaagccac at tcctccag atggccagga cccat tctat 180 gcggattccg ttaagggtcg ctttaccatt tctcgtgaia aciccaaaaa caccctgtac 240 ctgcagatga aclccctgcg cgccgaggai actgcggtgt accattgigc gctgctgcct 300 aaacgtggcc cgtggttcga ttactggggt cagggtactc tggtcaccgt aagcagc 357 <210> 227 <2】1> 357 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> —致序列 <220> <221> inisc_feature <222> (3)...(3) <223> n = g 或 a <220> <221> mi b'c^feature <222> ¢6)...(6) <223〉 n = £ 或 a <220> <221> misc_feature <222〉 （9)...(9) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (13)...(13) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (19)...(19) <223> n = t 或 a <220> <221> mi sc_feature <222> (20)...(20) <223> n = c 或 g <220> <221> misc_feature <222> (21)...(21) <223> n = t 或 c 74- 131418-序列表.doc 200911834 <220> <221> misc.feaiure <222> (24)...(24) <223> n = g 或 I <220> <221> misc一feature <222> (27)...(27) <223> n = a 或 c <220> <221> misc.feaiure <222> ¢31)...(31) <223> n = t 或 c <220> <221> misc^feature <222> (36)...(36) <223> n = a 或 t <220> <221> misc_feature <222> (39)...(39) / <223〉 n = g 或 a ί, <220〉 <221> misc一feature <222> (42)...(42) <223〉 η = t 或 g <220> <221> mi sc_feature <222> (45)...(45) <223> n = g 或 t <220> <22)> misc_feature <222〉 （48).,.(48) <223> n = g 或 t <220〉 <221> misc_feature <222> (57)...(57) <223> n = i 或 c <220〉 <221> misc_feature <222> (60)...(60) <223> n = c 或 g <220> <221> misc_feature <222> ¢69)...(69) <223> π = a 或 g <220> <221> misc^feature <222> (72)...(72) <223> n = c 或 a <220> <221> misc一feature <222> (75)...(75) -75 - 131418-序列表.doc 200911834 <223〉 η = c 或 t <220> <221> inisc_feature <222> ¢78)...(78) <223〉 n = a 或 t <220> <22)> misc.feature <222> (87)...(87) <223> n = t 或 c <220> <221> misc feature <222> (90)...(90) <223> n = g 或 a <220> <221> misc feature <222〉 （93)·..(93) <223> η = I 或 c / '·' <220〉 <221> misc feature <222> (96)...(96) <223> n = g 或 a <220> <221> misc一feature <222> ¢99)...(99) <223> n = g 或 c <220> <221> misc_feature <222> ¢111)...(111) <223〉 n = c 或 i <220> <221> misc_feaiure <222> (117)...(117) <223> n = g 或 a <220〉 / <221> misc_feature \ <222> (120)...(120) <223> π = a 或 t <220> <221> misc_feature <222> ()23)...023) <223> n = a 或 g <220> <221> misc feature <222> (126)...(126) <223〉 n = g 或 c <220> <221> misc^feature <222> (129)...(129) <223> n = g 或 a -76- 131418-序列表.doc 200911834 <220> <221> misc^feature <222> (132)...(132) <223> η = t 或 c <220> <221> misc.feature <222> (135)...(135) <223> n = a 或 g <220> <221> mi sc_feature <222> (138)...(138) <223〉 π = g 或 a <220> <221> misc_fealure <222> (144)...(144) <223> n = c 或 a <220> <22\> misc_fea\ure <222> 〇45).. .(145) <223> n = t 或 a <220> <221> mi sc_fea\ure <222> (146T...(146) <223> n = c 或 g <220> <221> misc_iealure <222> (147^...(147) <223〉 n = a 或 c <220> <221> misc_feaiure <222> (150T...(150) <223> n = t 或 c <220> <221> misc.feature <222> (156),..(156) <223> n = c 或 t <220> <221> mi sc_ieature <222> (159)...(159) <223:> n = g 或 a <220> <22]> mi sc_feature <222> (165)...(165) <223> n = I 或 c <220> <221> misc.feature <222> (171)...(171) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_iealure -77- 131418-序列表.doc 200911834 <222> (174)...(174) <223> η = c 或 a <220> <22】> miscjeature <222> (180)...(180) <223> η = c 或 t <220> <221> misc_fealure <222> (I83T...(183) <223〉 n = a 或 g <220> <221> misc_feature <222> ( 186-). ..( 186) <223> η = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (192T-..(192) <223> n = g 或 t <220> <221> misc_feature <222> (198)...(198) <223> n = c 或 t <220> <221> misc^feature <222> ¢200...(201) <223〉 n = g 或 c <220〉 <22J> misc.feaiure <222> (204)...(204) <223〉 η 二 c 或 t <220〉 <221> misc^feature <222> ¢2107...(210) <223> η = c 或 t <220> <221> misc.feature <222> (213)...(213) <223> n = c 或 ί <220> <221> misc_feature <222> (216^...(216) <223〉 n = c 或【 <220> <22]> misc_feature <222> (219)...(219) <223> n = c 或 t <220> <221> misc.feature <222> (222)...(222} <223> n = t 或 c -78- 131418·序列表.doc 200911834 <220> <221> misc_feature <222> (228).,.(228) <223> η = g 或 a <220> <22]> misc_feature <222> (234)...(234) <223> η = g 或 c <220> <221> misc_feature <222> (237).,.(237) <223> n = a 或 g <220> <221> misc—feature <222> (240),..(240) <223〉 n 二 t 或 c <220> <221> mi sc feature <222> (246j...(246) <223> n = a 或 g <220> <221> misc_fealure <222> (253T...(253) <223> n = a 或 t <220> <221> misc_feature <222> (254T-..(254) <223> n = g 或 c <220> <221> mi sc一feature <222> (26lT·..(261) <223> n = t 或 c <220> <221> misc^feaiure <222> (270)...(270) <223> n = c 或 t <220> <22)> misc^fealure <222> (273)...(273) <223> n = a 或 t <220> <221> mi sc_feat ure <222> (279T...(279) <223> n = a 或 g <220> <221> misc^feature <222> (282)...(282) <223> n = t 或 c <220> <22i> misc^fealure <222> (285T...(285) -79 131418·序列表.doc 200911834 <223> η = c 或 t <220> <221〉 misc一feature <222> (297)...(297) <223> n = t 或 g <220> <221> misc_feature <222> (303T...(303) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (304)...(304) <223> n = a 或 c <220> <221> misc—feature <222> (306). ..(306) <223> n = g 或 l , <220〉 、 <221> mi sc_feature <222> (309)...(309) <223〉 n = g 或 c <220> <221> misc一feature <222> (312)...(312) <223> n = t 或 g <220> <221〉imscj’eature <222〉 （318)...(3⑻ <223〉 n = t 或 c <220> <221> misc_feaiure <222> (32lT...(321) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature , <222> (336)...(336) 、 <223> n = a 或 t <220> <221> misc feature <222> (339)...(339) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (351)...(351) <223> n = c 或 a <220> <221> misc一feature <222> (352T...(352) <223> n = t 或 a -80- 131418-序列表.doc 200911834 <220> <221〉misc_feature <222> (353了…（353) <223> n = c 或 g <220> <221> misc_feature <222> (354)...(354) <223> n = g 或 c <400> 227 gangtncanc tgntggagnn nggnggnggc ntggtncanc cnggnggntc cctgcgncln tcctgtgcng cntcnggntt caccttngcn canganacna tggtgtgggt ncgccangcn ccnggnaang gncingantg ggtnnnncan attccnccng atggncagga nccnttctan gcngantccg tnaagggncg nt tnaccatn tcncgngana antccaanaa cacnctntan ctgcanatga acnncctgcg ngccgaggan acngcggtnt ancantgtgc gctgcmcct aanngnggnc cntggttnga ntactggggt cagggnacnc tggtcaccgt nnnnagc <2)0> 228 <211> 357 <212> DNA <213>智人 <400> 228 gaggttcaac tgciggaatc tggtggtggt ctggtacaac cgggtggttc cctgcgtcig agctgtgcag cctctggttt caccttcgct catgagacca tggtttgggt acgccaggct ccgggtaaag gcciggagtg ggtaagccat atccctcctg atggtcagga cccgttctat gctgattccg icaaaggccg ttttaccat〖丨ctcgtgaca acagcaaaaa cactcigiac ctgcaaaiga actccctgcg tgcagaagac acggcggttt atcactgigc actgctgcca aaacgcggcc cttggttcga ctactggggc cagggtactc tggtcactgt atcltct <210> 229 <211> 119 <212> PRT <213>智人 <400> 229
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala His Glu 20 25 30
Thr Met Val 丁rp Val Arg Gin A】a Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser His lie Pro Pro Asp Gly Gin Asp Pro Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys 85 90 95
Aia Leu Leu Pro Lys Arg Giy Pr◦丁rp Phe Asp Tyr 丁rp G’ly Gin CHy 100 . 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 230 <211> 357 <212> DNA <213>大腸桿菌 <400> 230 gaggttcaac tgctggaatc tggtggtggt ctggtacaac cgggtggtic cctgcgtcig agctgtgcag ccictggttt caccttcgct catgagacca tggtugggt acgccaggct ccgggtaaag gcciggagtg ggtaagccat atccctcctg atggtcagga cccgttctat gcigaticcg tcaaaggccg ttitaccatt tctcgtgaca acagcaaaaa cactctgtac ctgcaaaiga actccctgcg tgcagaagac acggcggttt atcactgtgc acigctgcca aaacgcggcc ctiggitcga ctactggggc cagggtactc tggtcactgt atcttct <210> 231 <21b 357 <212> DNA <213>人工序列 •81 - 131418-序列表.doc 200911834 <220> <223> —致序列 <220> <22i> misc_feature <222> (6)...(6) <223> n = g 或 t <220> <221> misc_feature <222> (9)...(9) <223〉 n = g 或 a <220> <221〉 misc一feature <222> (13)...(13) <223> η ：= t 或 c <220> <221> misc_feature <222> ¢18)...()8) <223> n = g 或 a <220> <221〉 misc_feaiure <222> (24)…（24) <223> n = g 或 t <220> <221> misc_feature <222〉 （27),.·(27) <223〉 n = a 或 t <220> <22]> mi sc一feature <222> (30)...(30) <223> η = c 或 t <220> <22)> misc_feature <222> (31)...(31) <223〉 η = t 或 c <220> <221> mi sc„feature <222> (39)...(39) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (42)...(42) <223〉 n = t 或 g <220> <221> misc_feature <222> (45)...(45) <223> n = g 或 t <220> <221> misc_feature <222> (48)...(48) <223> n = g ^ t -82 131418-序列表.doc 200911834 <22ϋ> <221> misc_fealure <222> (60)...(60) <223> η = c或 g <220> <221〉mi sc—feature <222> (61)...(61) <223> π = t或a <220> <221> misc_feature <222> ¢62)...(62) <223> n = c或g <220> <221> misc.feature <222> (75)…（75) <223〉n = c或 t <220> <22]> mi sc feature <222> (78)...(78) / <》23> π = a或 i <220> <221> mi sc„feature <222> (87)...(87) <223> n = t或c <220> <22i> mi sc_feature <222> (90)...(90) <223> n =： g或 t <220> <221> misc.feature <222> (99)...(99) <223〉n = g或 c <220> <221> misc.feaiure <222> (105T-..(105) <223> n = g或t <220〉 <221> misc.feature <222> (lllT.. .(111) <223〉n = c或a <220> <22!> misc^feature <222> (12〇T...(120) <223> n = a 或 t <220> <221> misc.feature <222> (123)...(123) <223> n =： a或 g <220> -83 - 131418-序列表.doc 200911834 <221> misc_feature <222> (126)...(126) <223〉n = g 或 t <220> <221> misc.feature <222> (129)...(129) <223> n = g或a <220> <221> misc.feature <222> ¢132)...(132) <223> n = t或c <220> <221> misc_feature <222> ¢135]...(135) <223> n = a或g <220> <221> misc feature <222> (144)...(144) <223> n = c或a <220> <221〉mi sc一feature <222> (145T.-.(145) <223〉 n = t或a <220> <221> mi sc_feature <222> (146)...(146) <223> n =。或运 <220> <221> mi sc一feature <222> (147了...（147) n = a或 c <220> <221> misc一feature <222> (153)...(153) c223> n = t或c <220> <221> misc.feature <222> (1567...(156) <223〉n = c或 i <220> <221> misc一feature <222> (159)...(159) <223> π = g或t <220> <22)> misc_feature <222> (17U...(171) <223> n = t或c <220> <221> misc_feature <222> (174T...(174) -84- 131418-序列表.doc 200911834 <223> η = c或g <220> <221> misc_feature <222> (]8〇T...(180) <223> n = c或t <220> <221> misc_feature <222> (183T·..(183) <223> n = a或 i <220> <221> misc_feature <222> (186T...(186) <223> n = c或t <220> <221> misc_feature <222> (192)...(192) <223> n = g或c <220> <221> fnisc_feature <222> ¢195)...(195) <223> n = g或a <220> <221> misc一feature <222> (2017...(201) <223> n = g或t <220> <221> misc.feature <222> (204).,.(204) <223> n = c或 t <220> <22]> misc.feaiure <222> (21〇T...(210) <223> n = c或 t <220> <22]> misc.i'eature <222> (213j...(213) <223〉 n = c或i <220> <221> misc_feature <222> (216T...(216) <223> n = c或t <220> <221> misc_feature <222> (222). ..(222) <223> n = t或c <220> <221> misc^feaiure <222> (223T...(223) <223〉 n = t或a -85 - 131418-序列表.doc 200911834 <220> <221> misc_feature <222> (224T...(224) <223> n = c或 g <220> <221> misc_feature <222> (228T...(228) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> ¢234]...(234) <223> n = g 或 t <220> <221> misc_feature <222> (237)...(237) <223> n = a 或 g <220> <221> misc-feature <222> ¢240)...(240) <223> η = I或 c <220> <221> misc_feature <222> (253)...(253) <223〉n = a 或 t <220> <221> misc—feature <222> (254),..(254) <223> η = g 或 c <220> <22]> misc一feature <222> (264T...(264) <223> n = c 或 a <220> <221> mi sc feature <222> (267)...(267) <223〉 n = g 或 a <220> <221> mi sc一feature <222> (273)...(273) <223> η = a 或 g <220> <22mi sc一feature <222> (279T..,(279) <223> η = a 或 t <220> <221> mi sc.feature <222> (29lT...(291) <223〉η = g 或 a <220> <221> mi sc„feature -86- 131418-序列表.doc 200911834 <222> (297)...(297) <223> η = t或g <220> <221> misc_feature <222> (300)...(300) <223> n = t或 a <220> <221> misc.feature <222〉（303了…（303) <223> n = g或a <220> <221> misc_feature <222> (304T...C304) <223> n = a或c <220> <221> misc—feature <222> (306T...(306) <223> n = g或c <220> <221> misc_feature <222> (309)...(309) <223> n = g或c <220> <221> misc_feature <222> (318T...(318) <223> n = t或c <220> <221> misc_feaiure <222> (33〇T...(330) <223> n = t或c <220> <221> misc_feature <222> (336)...(336) <223> n = a或t <220> <221> misc.feature <222> (339了...（339) <223> n = c或t <220> <221> misc_feaiure <222> (3487...(348) <223> n = c或t <220> <221> misc_feature <222> (35U. . .(351) <223> n = c或a <220> <221> misc_feature <222> (354]...(354) <223> n = g 或 t •87- 131418-序列表.doc 200911834 <220> <221> mi sc_feature <222> (355j...(355) <223> η = a或 ι <220> <221> misc_feature <222> (356)...(356) <223〉n = g 或 c <220> <221> misc.feature <222> (357)...(357) <223> n = c 或 t <400> 231 gaggtncanc tgntggantc tggnggnggn ntggtacanc cnggnggntc cctgcgtctn 60 nnctgtgcag cctcnggntt cacctmgcn catgagacna tggtntgggt ncgccaggcn 120 ccnggnaang gnctngagtg ggtnnnncat atnccnccng atggtcagga nccnttctan 180 gcngantccg tnaanggccg nt tnaccatn tcncgngaca annncaanaa cacnctntan 240 ctgcaaatga acnncctgcg tgcngangac acngcggtnt atcactgtgc nctgctnccn 300 aanngnggnc cttggttnga ctactggggn cagggnacnc tggtcacngt ntcnnnn 357 <2I0> 232 <211> 5 <212> PRT <213>智人 <400> 232
Glu Val Gin Leu Leu <210> 233 <2]]> 28 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>肽連接子 <400> 233
Giy Gin Gly Thr Leu Val Thr Va] Ser Ser Ala Ser Thr His Thr Cys ] 5 10 15
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 20 25 <210> 234 <211> 32 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>肽連接子 <400> 234
Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser 1 5 10 15
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 20 25 30 <210> 235 <211> 357 <212> DNA <213>智人 <400> 235 -88 - 131418-序列表.doc 200911834 gaggigcagc iccigtgcag ccagggaagg gcagactccg ctgcaaatga aagagggggc tgttggagtc tgggggaggc cctccggatt cacctttgcg gtctagagtg ggtctcacat igaagggccg gttcaccaic acagcctgcg tgccgaggac cttggtttga ctactggggt tiggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 catgagacga tggtgtgggt ccgccaggct 120 ailcccccgg ttggtcagga tcccttctac 180 tcccgcgaca attccaagaa cacgctatat 240 acagcggtat attactgtgc gctgcttcct 300 cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 131418-序列表.doc -89-

Claims (1)

  1. 200911834 十、申請專利範圍： 1. 一種抗TNFa受體1型（TNFR1 ; p55)免疫球蛋白單一可變 區域，其包含與DOMlh-131-206之胺基酸序列（展示於圖 3中）至少93%—致之胺基酸序列。 2.如請求項1之免疫球蛋白單一可變區域，其包含天冬胺 酸在位置53，其中編號係根據Kabat。 3.如請求項1或2之免疫球蛋白單一可變區域，其包含組胺 酸在位置91，其中編號係根據Kabat。 一種抗TNFa受體1型（TnFR1 ; p55)免疫球蛋白單—可變 區域，其包含與DOMlh-131-206之胺基酸序列（展示於圖 3中）一致之胺基酸序列。 5. —種抗TNFa受體1型（TNFR1 ; p55)免疫球蛋白單一可變 區域，其係由與DOMlh-131-206之核苷酸序列（展示於圖 1 9中）至少8〇〇/0 —致之核苷酸序列編碼。 6. —種抗TNFa受體丨型^!^^ ; p55)免疫球蛋白單—可變 區域，其係由與DOMlh_131_2〇6之核苦酸序列（展示於圖 19中）一致之序列編碼。 7· -種TNFa受體1M(TNFR1 ; p55)抬抗劑，其包含如請求 項1至6中任—項之抗TNFR1免疫球蛋白單_可變區域月。 8. ^凊未項7之拮抗劑，其包含第—及第二免疫球蛋白單 -可變區域，其中各可變區域係如請求们 項。 9. 如請求項7或8之拮抗劑 區域之單體或該單 ，其中該拮抗劑包含該單一可變 一可變區域„ 冋兀二聚體 131418.doc 200911834 (homodimer) ° 10.如請求項7或8之拮抗劑，其中該單一可變區域或各單— 可變區域之胺基酸序列係與DOMlh_131_2〇6之胺基酸序 列（展示於圖3中）一致。 Π· —種抗TNFa受體1型（TNFR1 ; P55)免疫球蛋白單一可變 區域’其包含與DOMlh-131-206之胺基酸序列（展示於圖 3中）一致或不超過25個胺基酸位置與D〇Mlh-l 3 1-206之 胺基酸序列不同且具有與DOMlh-131-206之CDR1序列至 少50%—致之CDR1序列的胺基酸序列。 12. —種抗TNFa受體1型（TNFR1 ; P55)免疫球蛋白單一可變 區域’其包含與DOMlh-131-206之胺基酸序列（展示於圖 3中）一致或不超過25個胺基酸位置與DOMlh-131-206之 胺基酸序列不同且具有與〇〇1^卟-131-206之€〇112序列至 少5 0°/。一致之CDR2序列的胺基酸序列。 13. —種抗TNFa受體1型（TNFR1 ; p55)免疫球蛋白單一可變 區域，其包含與DOMlh-131-206之胺基酸序列（展示於圖 3中）一致或不超過25個胺基酸位置與DOMlh-13 1-206之 胺基酸序列不同且具有與DOMlh-131-206之CDR3序列至 少5 0°/。一致之CDR3序列的胺基酸序列。 14. 一種抗TNFa受體1型（TNFR1 ; p55)免疫球蛋白單一可變 區域，其包含與DOMlh-131-206之胺基酸序列（展示於圖 3中）一致或不超過25個胺基酸位置與DOMlh-1 3 1-206之 胺基酸序列不同且具有與DOMlh-131-206之CDR1序列至 少50% —致之CDR1序列且具有與DOMlh-131-206之 131418.doc 200911834 CDR2序列至少5〇%一致之Cdr2序列的胺基酸序列。 15. —種抗TNFa受體1型（TNFR1 ; p55)免疫球蛋白單一可變 區域’其包含與DOMlh-131-206之胺基酸序列（展示於圖 3中）一致或不超過25個胺基酸位置與DOMlh-1 3 1-206之 胺基酸序列不同且具有與0〇1^111-131-206之〇0111序列至 少50% —致之CDR1序列且具有與DOMlh-131-206之 CDR3序列至少5〇%一致之CDR3序列的胺基酸序列。 16. —種抗TNFa受體1型（TNFR1 ; p55)免疫球蛋白單一可變 區域’其包含與D〇Mlh-131-206之胺基酸序列（展示於圖 3中）一致或不超過25個胺基酸位置與DOMlh-13 1-206之 胺基酸序列不同且具有與DOMlh-131-206之CDR2序列至 少50% —致之CDR2序列且具有與DOMlh-131-206之 CDR3序列至少50%—致之CDR3序列的胺基酸序列。 17. —種抗TNFa受體1型（TNFR1 ; p5 5)免疫球蛋白單一可變 區域’其包含與DOMlh-131-206之胺基酸序列（展示於圖 3中）一致或不超過25個胺基酸位置與DOMlh-1 3 1-206之 胺基酸序列不同且具有與〇〇1^111-131-206之〇〇尺1序列至 少50% —致之CDR1序列且具有與DOMlh-13 1-206之 CDR2序歹ij至少50% —致之CDR2序列且具有與DOMlh-13 1-206之CDR3序列至少50%—致之CDR3序列的胺基酸 序列。 18. —種TNFa受體1型（TNFR1 ; p55)拮抗劑，其具有與 DOMlh-131-206(展示於圖3中）之CDR1序列至少500/〇—致 之CDR1序列0 13I418.doc 200911834 19. 一種TNFa受體1型（TNFRl ; p55)拮抗劑，其具有與 DOMlh-131-206(展示於圖3中）之CDR1序列至少50%—致 之CDR2序列。 20. —種TNFa受體1型（TNFRl ; p55)拮抗劑，其具有與 DOMlh-131-206(展示於圖3中）之CDR1序列至少50%—致 之CDR3序列。 21. —種TNFa受體1型（TNFRl ; p55)拮抗劑，其具有與 DOMlh-131-206(展示於圖3中）之CDR1序列至少50%—致 之CDR1序列及與DOMlh-131-206之CDR2序列至少50% 一致之CDR2序列。 22. —種TNFa受體1型（TNFRl ; p55)拮抗劑，其具有與 DOMlh-131-206(展示於圖3中）之CDR1序列至少50%—致 之CDR1序歹ij及與DOMlh-131-206之CDR3序列至少50% 一致之CDR3序列。 23. —種TNFa受體1型（TNFRl ; p55)拮抗劑，其具有與 〇〇]^1111-131-206(展示於圖3中）之〇〇112序列至少50%—致 之CDR2序列及與DOMlh-131-206之CDR3序列至少 500/0 一致之CDR3序列。 24. —種TNFa受體1型（TNFRl ; p55)拮抗劑，其具有與 D〇Mlh-131-206(展示於圖3中）之CDR1序列至少50%—致 之CDR1序列及與DOMlh-131-206之CDR2序列至少50% 一致之CDR2序列及與DOMlh-131-206之CDR3序列至少 50%—致之CDR3序歹ij。 25· —種TNFa受體1型（TNFRl ; p5 5)拮抗劑，其包含免疫球 131418.doc 200911834 蛋白單一可變區域，該可變區域包含D〇Mlh-131-2〇6(展示於圖3中）之CDR1、CDR2及/或CDR3序列。 26. —種TNFa受體1型（TNFR1 ; p55)拮抗劑，其與DOMlh-131-51 1-206 競爭結合 TNFR1。 27. —種蛋白酶抗性免疫球蛋白單一可變區域，其包含TNFa 受體1型（TNFR1 ; p55)結合位點，其中該可變區域在以 下情況下對蛋白酶具有抗性： (1)在3 7°C與至少1 〇微克/毫升之濃度（c)之蛋白酶一起培 育至少1小時之時間（t);或 (ii)在30°C與至少40微克/毫升之濃度（c，）之蛋白酶一起培 育至少1小時之時間（t); 其中該可變區域包含與DOMlh-1 3 1-206之胺基酸序列（展 示於圖3中）至少90% —致之胺基酸序列。 28. 如請求項27之可變區域，其中該濃度卜或〇為至少1〇〇或 1000微克/毫升蛋白酶。 29. 如請求項27或28之可變區域，其中時間⑴為i、3或24小 時或隔夜。 30. 如請求項27之可變區域，其中該可變區域在條件⑴下具 抗性且該濃度（c)為1〇或100微克/毫升蛋白酶且時間⑴為 1小時。 31. 如請求項27之可變區域，其中該可變區域在條件（Η)下具 抗性且該濃度（c，）為40微克/毫升蛋白酶且時間⑴為3小 時。 32. 如請求項27、28、30及31中任一項之可變區域，其中該 131418.doc 200911834 蛋白扭係選自姨蛋白酶、彈极疋&仏 坪性蛋白酶、白血球酶 (leucozyme)及胰酶 〇 項之可變區域，其中該 33.如請求項27、28、30及31中任 蛋白酶為姨蛋白酶。 34. 如請求項27、28、30及31中任_項之可變區域，其中該 可變區域對胰蛋白酶及至少另—種選自彈性蛋白酶、白 血球酶及胰酶之蛋白酶具有抗性。 35. 如請求項27、28、30及31中任一項之可變區域，其中該 可變區域在條件⑴或（ii)下培育後特異性結合tnfri。 36.如請求項35之可變區域，該可變區域在條件⑴或下培 育後在ELISA中具有至少0.404之〇d450讀數。 37.如請求項27、28、30及31中任一項之可變區域，其中該 可變區域在條件⑴或（ii)下培育後特異性結合蛋白質八或 蛋白質L。 38·如請求項27、28' 30及31中任一項之可變區域，其中該 可變區域在條件⑴或（Π)下培育後在凝膠電泳中大體上展 現單一條帶。 39. —種TNFa受體1型（TNFR1 ; P55)拮抗劑，其包含如請求 項27至38中任一項之可變區域。 40. 如请求項39之TNFR1结抗劑’其係用於經口傳遞。 41. 如請求項39或40之TNFR1拮抗劑，其係用於向患者之胃 腸（GI)道傳遞。 42. —種如請求項39之TNFR1拮抗劑在製造用於經口傳遞之 藥物的用途。 131418.doc 200911834 43· —種如請求項39之TNFR1拮抗劑在製造 J %向患者之GI 道傳遞之藥物的用途。 44. 如請求項39或40之拮抗劑，其中該可變區域對胰蛋白 酶、彈性蛋白酶及/或胰酶具有抗性。 45. 如請求項42或43之用途，其中該可變區域對胰蛋白酶、 彈性蛋白酶及/或胰酶具有抗性。 46. 如請求項39之TNFR1拮抗劑，其係用於肺傳遞。 47. 如請求項39或46之TNFR1拮抗劑，其係用於向患者之 [ 傳遞。 48. —種如請求項39之TNFRU#抗劑在製造用於肺傳遞之藥 物的用途。 49. 一種如請求項39之丁>^尺1拮抗劑在製造用於向患者之肺 傳遞之藥物的用途。 50. 如請求項46之拮抗劑，其中該可變區域對白血球酶具有 抗性。 5 1.如請求項48或49之用途，其中該可變區域對白血球酶具 I 有抗性。 52. 如請求項39之TNFR1拮抗劑，其係用於治療及/或預防發 炎性病狀。 53. —種如請求項39iTNFR1拮抗劑在製造用於治療及/或預 防發炎性病狀之藥物的用途。 54. 如請求項52之拮抗劑，其中該病狀係選自由關節炎、多 發性硬化症、發炎性腸疾病及慢性阻塞性肺病組成之 群。 131418.doc 200911834 55. 如請求項53之用途，其中該病狀係選自由關節炎、多# 性硬化症、發炎性腸疾病及慢性阻塞性肺病组成之群* 56. 如請求項54之拮抗劑，其中該關節炎為類風濕性關節炎 或幼年型類風濕性關節炎。 57. 如請求項55之用途，其中該關節炎為類風濕性關節 幼年型類風濕性關節炎。 58. 如請求項54之拮抗劑，其中該發炎性腸疾病係選自由克 羅恩氏病（Crohn’s disease)及潰瘍性結腸炎組成之群。 59. 如請求項55之料，其中該發炎性腸疾病係選自由克羅 恩氏病及潰瘍性結腸炎組成之群。 60·如請求項54之拮抗劑，其中該慢性阻塞性肺病係選自由 慢性支氣管炎、慢性阻塞性支氣管炎及肺氣腫組成之 群。 61_如請求項55之用途，其中該慢性阻塞性肺病係選自由慢 性支氣管炎、慢性阻塞性支氣管炎及肺氣腫組成之群。 62.如請求項54之拮抗劑，其中該肺炎為細菌性肺炎。 63·如請求項55之用途，其中該肺炎為細菌性肺炎。 64. 如請求項62之拮抗劑，其中該細菌性肺炎為葡萄球菌肺 炎（Staphylococcal pneumonia)。 65. 如請求項63之用途，其中該細菌性肺炎為葡萄球菌肺 炎。 66. 如請求項39之TNFR1拮抗劑，其係用於治療及/或預防呼 吸道疾病。 67. —種如請求項39之TNFR1拮抗劑在製造用於治療及/或預 131418.doc 200911834 防呼吸道疾病之藥物的用途。 68·如請求項66之括抗劑，其中該呼吸道疾病係選自由以下 组成之群：肺發炎、慢性阻塞性肺病、哮喘、肺炎、過 敏性肺炎、與嗜伊紅血球增多相關之肺浸潤、環境肺疾 病、肺炎、支氣管擴張、囊性纖維化、間質肺疾病、原 發性肺動脈高壓、肺血栓栓塞、胸臈病變⑷、 縱隔病變、隔膜病變、換氣不足、換氣過度、睡眠呼吸 暫停急性啤吸箸迫症候群、間皮瘤、肉瘤、移植排 斥、移植物抗宿主疾病、肺癌、過敏性鼻炎、過敏症、 石棉沉著病、麴菌腫、麴菌病、支氣管擴張、慢性支氣 B ^肺氣腫、嗜伊紅血球肺炎、特發性肺纖維化、侵 襲性肺炎球菌疾病、流感、非結核性分枝桿菌病、胸膜 積液塵肺病、肺孢子蟲病（pneumocytosis)、肺炎、肺 放線菌病、肺泡蛋白沉著症、肺炭疽、肺水腫、肺栓 子肺發炎、肺組織細胞增多病（histiocytosis) X、肺動 脈尚血壓（pUlmonary hypertensi〇n)、肺土壤絲菌病 (pulmonary nocardiosis)、肺結核、肺靜脈閉塞疾病、類 風濕性肺病、肉狀瘤病及韋格納肉牙腫病（Wegener's granulomatosis)。 69·如研求項67之用途，其中該呼吸道疾病係選自由以下組 成之群：肺發炎、慢性阻塞性肺病、哮喘、肺炎、過敏 !生肺炎、與嗜伊紅血球增多相關之肺浸潤、環境肺疾 病、肺炎、支氣管擴張、囊性纖維化、間質肺疾病、原 發性肺動脈高壓、肺血栓栓塞、胸膜病變、縱隔病變、 131418.doc 200911834 隔膜病變、換氣不足、換負 呼吸窘迫… 眠呼吸暫停、急性 宿主疾病、肺虎瘤、肉瘤、移植排斥、移植物抗 值主疾病相、過敏性鼻炎、過敏症、石棉沉著病、 麴菌腫、麴菌病、支氣管擴張、慢性支氣管炎、肺氣 :、嗜伊紅血球肺炎、特發性肺纖維化、侵襲性肺炎球 函疾病 '流感、非結核性分枝桿菌病、胸膜積液、塵肺 病 '肺孢子蟲病、肺炎、肺放線菌病、肺泡蛋白沉著 症、肺炭疽、肺水腫、肺栓子、肺發炎、肺組織細胞增 多病X、肺動脈高血壓、肺土壤絲菌病、肺結核、肺靜 脈閉塞疾病、類風濕性肺病、肉㈣病及韋格納肉牙腫 病。 7種肺傳遞I置，其含有如請求項39、46、47或50之 TNFR1拮抗劑。 71.如明求項7〇之裝置，其中該裝置為吸入器或鼻内投藥裝 置。 72.種口服調配物，其包含如請求項39或40之TNFR1拮抗 劑。 73 ’如吻求項72之調配物’其中該調配物為錠劑、丸劑、膠 囊、液體或糖漿。 74.如叫求項 7、8、39、40、46、50、52 至 54、56、58、 6〇、62、64、66及68中任一項之拮抗劑，其中該拮抗劑 包3如請求項1至6、11至17及27至38中任一項之可變區 域。 75·如 °月求項 7、8、39、40、46、50、52 至 54、56、58、 131418.doc •10· 200911834 ό〇、62、64、66及68中任一項之拮抗劑，其中該拮抗劑 包含具有至少50 °C之Tm之可變區域。 76. 如请求項 7、8、39、40、46、50、52 至 54、56、58、 60、62、64、66及68中任一項之拮抗劑’其中該拮抗劑 包含在MRC-5細胞檢定中以2 nM至50 pM之ND50中和 TNFoi所刺激之iL_8釋放之可變區域。 77. 如請求項 42、43、48、49、53、55、57、59、61、63、 65、67及69中任一項之用途，其中該拮抗劑包含如請求 項1至6、11至17及27至38中任一項之可變區域。 78_ 如請求項 42、43、48、49、53、55、57、59、61、63、 65、67及69中任一項之用途，其中該拮抗劑包含具有至 少50°C之Tm之可變區域。 79·如請求項 42、43、48、49、53、55、57、59、61、63、 65、67及69中任一項之用途，其中該拮抗劑包含在 MRC-5細胞檢定中以2 nM至50 pM之ND50中和TNFa所刺 激之IL-8釋放之可變區域。 80.如請求項70或71之裝置，其中該拮抗劑包含如請求項1 至6、11至17及27至38中任一項之可變區域。 81·如請求項70或71之裝置，其中該拮抗劑包含具有至少 50°C之Tm之可變區域。 82.如請求項70或71之裝置，其中該拮抗劑包含在厘尺匸_5細 胞檢定中以2 nM至50 pM之ND50中和TNFa所刺激之il_8 釋放之可變區域。 83·如請求項72或73之調配物，其中該拮抗劑包含如請求項 131418.doc 200911834 1至6、11至17及27至38中任一項之可變區域。 84. 如請求項72或73之調配物，其中該拮抗劑包含具有至少 5〇°C之Tm之可變區域。 85. 如請求項72或73之調配物，其中該拮抗劑包含在MRC-5 細胞檢定中以2 nM至50 pM之ND50中和TNFa所刺激之 IL-8釋放之可變區域。 86. 如請求項i、2、4至6、^至17、27、28、3〇及31中任一 項之可變區域，其中該可變區域具有至少50T：之Tm。 87. 如請求項1、2、4至6 ' 11至17、27、28、30及31中任一 項之可變區域，其中該可變區域在MRC-5細胞檢定中以 2 nM至5 0 pM之ND50中和TNFa所刺激之IL-8釋放。 88. 種雙特異性配位體，其包含如請求項1至6、丨丨至丨7、 27至38、86及87中任一項之可變區域。 89. —種分離或重組核酸’其編碼包含如請求項1至6、1丨至 17、27至38、86及87中任一項之免疫球蛋白單一可變區 域之多肽。 90. —種載體，其包含如請求項89之核酸。 伯主、、田胞其包含如請求項89之核酸或如請求項9〇 之載體。 ' 92·種產生包含免疫球蛋白單—可變區域之多肽之方法， .亥方法包含將如請求項91之宿主細胞維持在適於該核酸 或該載體表現之條件下，藉此產生包含免疫球蛋白單一 可變區域之多肽。 93.如請求項92之方法， 去其進一步包含分離該多肽，及視情 131418.doc -12· 200911834 況產生比該分離之多肽具有改良親和力及/4ND5〇之變 異體’例如突變變異體。 94. 一種醫藥組合物，其包含如請求項丨至6、n至17、以 38、86及87 _任一項之免疫球蛋白單一可變區域或如請 求項 7 至 1〇、18至26、39 至 41、44、牝、47、％、52、 54 56、58、60、62、64、66、68及 74至 76 中任一項之 ^抗劑及醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。 / V 95. -種多肽，其包含與D〇Mlh_131领之胺基酸序列（展示 於圖3中）至少93%—致之序列。 96.種夕肽，其由與D〇Mlh_13l2〇6之核苦酸序列（展示於 圖19中）至少8〇〇/〇 —致之序列編碼。 97. —種融合蛋白，其包含如請求項”或外之多肽。 98. —種分離或重組核酸’其編碼如請求項％或％之多肽或 如請求項97之融合蛋白。 3 0及3 1中任一 99.如凊求項 1、2、4至6、11 至 17、27、28 項之免疫球蛋白單一可變區域，其包含抗體恆定區域。 刚·如請求項99之可變區域，其包含抗體Fc，視情況其中該 Fc之N端連接於（視情況直接連接於）該可變區域之匚端。 101.如請求項 7、8、39、40、46、50、52 至 54、56、58、 6〇、62、64、66及68中任__項之拮抗劑，其包含抗體恨 定區域。 脱如請求項101之拮抗劑，其包含抗體Fe，視情況其中該 Fc之N端連接於（視情況直接連接於）該可變區域之匚端。 103.如凊求項95或96之多肽，其包含抗體恆定區域。 131418.doc -13- 200911834 104.如請求項1 03之多肽，其包含抗體Fc，視情況其中該Fc 之N端連接於（視情況直接連接於）該可變區域之C端。 131418.doc 14-
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