CN104311663B - 多肽、抗体可变域和拮抗剂 - Google Patents
多肽、抗体可变域和拮抗剂 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104311663B CN104311663B CN201410440384.9A CN201410440384A CN104311663B CN 104311663 B CN104311663 B CN 104311663B CN 201410440384 A CN201410440384 A CN 201410440384A CN 104311663 B CN104311663 B CN 104311663B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polypeptide
- protease
- tnfr1
- dab
- peptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title abstract description 681
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title abstract description 437
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title abstract description 429
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 title abstract description 177
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims abstract description 52
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 88
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 88
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 85
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 45
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 43
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 22
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 claims description 22
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 5
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 2
- 229940071648 metered dose inhaler Drugs 0.000 claims description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 2
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 claims 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 abstract description 304
- 239000004365 Protease Substances 0.000 abstract description 303
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 47
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 abstract description 35
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 abstract description 34
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 abstract description 15
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 abstract description 9
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 abstract description 9
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 abstract description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 8
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 abstract description 8
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 abstract description 7
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 abstract description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 abstract 1
- 229940126701 oral medication Drugs 0.000 abstract 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 303
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 286
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 154
- 238000000034 method Methods 0.000 description 144
- 102100038808 Transcription factor SOX-10 Human genes 0.000 description 141
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 91
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 91
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 81
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 77
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 77
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 71
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 70
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 68
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 68
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 64
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 57
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 54
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 51
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 51
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 51
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 49
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 49
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 46
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 42
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 38
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 38
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 36
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 32
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 32
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 32
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 30
- -1 preparation Substances 0.000 description 29
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 28
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 28
- BXSSCSKCOFKPOK-ARGVQFGUSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-n-[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-amino-1-oxohexan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-3- Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCC)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C(C)C)C1=CC=CC=C1 BXSSCSKCOFKPOK-ARGVQFGUSA-N 0.000 description 27
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 27
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 27
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 27
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 27
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 27
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 27
- 101000737793 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related antigen 1 Proteins 0.000 description 26
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 26
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 26
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 26
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 25
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 24
- 102100035361 Cerebellar degeneration-related protein 2 Human genes 0.000 description 22
- 101000737796 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related protein 2 Proteins 0.000 description 22
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 description 21
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 20
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 19
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 19
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 19
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 18
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 18
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 18
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 18
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 18
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 18
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 17
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 17
- 230000006870 function Effects 0.000 description 17
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 17
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 16
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 16
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 15
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 15
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 15
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 15
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 description 14
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 14
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 14
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 14
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 14
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 14
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 14
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 13
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 13
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 13
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 13
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 13
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 13
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 12
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 12
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 12
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108090000270 Ficain Proteins 0.000 description 10
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 10
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 10
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 10
- 235000019836 ficin Nutrition 0.000 description 10
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 10
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 9
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 9
- 102100021669 Stromal cell-derived factor 1 Human genes 0.000 description 9
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 9
- 239000002585 base Substances 0.000 description 9
- 230000008859 change Effects 0.000 description 9
- 239000002975 chemoattractant Substances 0.000 description 9
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 9
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 9
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 9
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 9
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 9
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 101710153593 Albumin A Proteins 0.000 description 8
- 239000006171 Britton–Robinson buffer Substances 0.000 description 8
- 102100023701 C-C motif chemokine 18 Human genes 0.000 description 8
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 8
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 8
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 8
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 8
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 8
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 8
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 8
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 8
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 8
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 8
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 8
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 8
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 8
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 8
- 102100021943 C-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 7
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 7
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 7
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 7
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 7
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 7
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 7
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 7
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 7
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 7
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 7
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 7
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 7
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 7
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 7
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 7
- 102000009091 Amyloidogenic Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108010048112 Amyloidogenic Proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 6
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 102000004864 Fibroblast growth factor 10 Human genes 0.000 description 6
- 108090001047 Fibroblast growth factor 10 Proteins 0.000 description 6
- 101000617130 Homo sapiens Stromal cell-derived factor 1 Proteins 0.000 description 6
- 101000686985 Mouse mammary tumor virus (strain C3H) Protein PR73 Proteins 0.000 description 6
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 6
- 102100033237 Pro-epidermal growth factor Human genes 0.000 description 6
- 101710098940 Pro-epidermal growth factor Proteins 0.000 description 6
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 6
- 108090001109 Thermolysin Proteins 0.000 description 6
- 230000002917 arthritic effect Effects 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- BLFLLBZGZJTVJG-UHFFFAOYSA-N benzocaine Chemical compound CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 BLFLLBZGZJTVJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 6
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 6
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 6
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 6
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 6
- 231100000617 superantigen Toxicity 0.000 description 6
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 6
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 6
- LKDMKWNDBAVNQZ-UHFFFAOYSA-N 4-[[1-[[1-[2-[[1-(4-nitroanilino)-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)NC(C)C(=O)NC(C)C(=O)N1CCCC1C(=O)NC(C(=O)NC=1C=CC(=CC=1)[N+]([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 LKDMKWNDBAVNQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010004032 Bromelains Proteins 0.000 description 5
- 108010032088 Calpain Proteins 0.000 description 5
- 102000007590 Calpain Human genes 0.000 description 5
- 108090000087 Carboxypeptidase B Proteins 0.000 description 5
- 102000003670 Carboxypeptidase B Human genes 0.000 description 5
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 5
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 5
- 102000000496 Carboxypeptidases A Human genes 0.000 description 5
- 108010080937 Carboxypeptidases A Proteins 0.000 description 5
- 102100035904 Caspase-1 Human genes 0.000 description 5
- 108090000426 Caspase-1 Proteins 0.000 description 5
- 102000004066 Caspase-12 Human genes 0.000 description 5
- 108090000570 Caspase-12 Proteins 0.000 description 5
- 102000004046 Caspase-2 Human genes 0.000 description 5
- 108090000552 Caspase-2 Proteins 0.000 description 5
- 102100025597 Caspase-4 Human genes 0.000 description 5
- 101710090338 Caspase-4 Proteins 0.000 description 5
- 102100038916 Caspase-5 Human genes 0.000 description 5
- 101710090333 Caspase-5 Proteins 0.000 description 5
- 108090000617 Cathepsin G Proteins 0.000 description 5
- 102000004173 Cathepsin G Human genes 0.000 description 5
- 102000005600 Cathepsins Human genes 0.000 description 5
- 108010084457 Cathepsins Proteins 0.000 description 5
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 5
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 5
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 5
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 5
- 208000009386 Experimental Arthritis Diseases 0.000 description 5
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 5
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 5
- 101710180319 Protease 1 Proteins 0.000 description 5
- 101710180316 Protease 2 Proteins 0.000 description 5
- 101710180313 Protease 3 Proteins 0.000 description 5
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 5
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 5
- 101710137710 Thioesterase 1/protease 1/lysophospholipase L1 Proteins 0.000 description 5
- 102100026144 Transferrin receptor protein 1 Human genes 0.000 description 5
- 102000002070 Transferrins Human genes 0.000 description 5
- 108010015865 Transferrins Proteins 0.000 description 5
- 102100033732 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Human genes 0.000 description 5
- 108090000350 actinidain Proteins 0.000 description 5
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 5
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 5
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000019835 bromelain Nutrition 0.000 description 5
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 108010018550 caspase 13 Proteins 0.000 description 5
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 5
- 208000037893 chronic inflammatory disorder Diseases 0.000 description 5
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 5
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 5
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 5
- 229940125532 enzyme inhibitor Drugs 0.000 description 5
- POTUGHMKJGOKRI-UHFFFAOYSA-N ficin Chemical compound FI=CI=N POTUGHMKJGOKRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 5
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 5
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 5
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 5
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 5
- 230000008646 thermal stress Effects 0.000 description 5
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 4
- 102000035101 Aspartic proteases Human genes 0.000 description 4
- 108091005502 Aspartic proteases Proteins 0.000 description 4
- 108010081589 Becaplermin Proteins 0.000 description 4
- 102100023995 Beta-nerve growth factor Human genes 0.000 description 4
- 102100023698 C-C motif chemokine 17 Human genes 0.000 description 4
- 102100032367 C-C motif chemokine 5 Human genes 0.000 description 4
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 4
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 4
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 4
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010055166 Chemokine CCL5 Proteins 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 102100031107 Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 11 Human genes 0.000 description 4
- 101710121366 Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 11 Proteins 0.000 description 4
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 4
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 4
- 102100034221 Growth-regulated alpha protein Human genes 0.000 description 4
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 4
- 101000600756 Homo sapiens 3-phosphoinositide-dependent protein kinase 1 Proteins 0.000 description 4
- 101000978362 Homo sapiens C-C motif chemokine 17 Proteins 0.000 description 4
- 101000978371 Homo sapiens C-C motif chemokine 18 Proteins 0.000 description 4
- 101000897480 Homo sapiens C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 4
- 101000914324 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Proteins 0.000 description 4
- 101000914321 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 7 Proteins 0.000 description 4
- 101000577881 Homo sapiens Macrophage metalloelastase Proteins 0.000 description 4
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 4
- 101000617725 Homo sapiens Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 2 Proteins 0.000 description 4
- 101000874179 Homo sapiens Syndecan-1 Proteins 0.000 description 4
- 101001117146 Homo sapiens [Pyruvate dehydrogenase (acetyl-transferring)] kinase isozyme 1, mitochondrial Proteins 0.000 description 4
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 4
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 4
- 101800003050 Interleukin-16 Proteins 0.000 description 4
- 108050003558 Interleukin-17 Proteins 0.000 description 4
- 102000013691 Interleukin-17 Human genes 0.000 description 4
- 102000003810 Interleukin-18 Human genes 0.000 description 4
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 description 4
- 102100039064 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 4
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 4
- 102000000853 LDL receptors Human genes 0.000 description 4
- 108010001831 LDL receptors Proteins 0.000 description 4
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 4
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 4
- 102100027998 Macrophage metalloelastase Human genes 0.000 description 4
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 4
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 4
- 102100022019 Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 2 Human genes 0.000 description 4
- 108010025832 RANK Ligand Proteins 0.000 description 4
- 108090000783 Renin Proteins 0.000 description 4
- 102100028255 Renin Human genes 0.000 description 4
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 102100035721 Syndecan-1 Human genes 0.000 description 4
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 4
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 4
- 102100024568 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 11 Human genes 0.000 description 4
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 4
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 4
- 102100024148 [Pyruvate dehydrogenase (acetyl-transferring)] kinase isozyme 1, mitochondrial Human genes 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N cephalexin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)C)C(O)=O)=CC=CC=C1 ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N 0.000 description 4
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 4
- 210000004051 gastric juice Anatomy 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000036541 health Effects 0.000 description 4
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 4
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 4
- 239000000893 inhibin Substances 0.000 description 4
- 229940076264 interleukin-3 Drugs 0.000 description 4
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000002818 protein evolution Methods 0.000 description 4
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 4
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 4
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 4
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 4
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 4
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 4
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 4
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 201000001178 Bacterial Pneumonia Diseases 0.000 description 3
- 101710155857 C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 3
- 102100036850 C-C motif chemokine 23 Human genes 0.000 description 3
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 102000004039 Caspase-9 Human genes 0.000 description 3
- 108090000566 Caspase-9 Proteins 0.000 description 3
- 108010078239 Chemokine CX3CL1 Proteins 0.000 description 3
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 3
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 3
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 3
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 3
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 3
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 3
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000013818 Fractalkine Human genes 0.000 description 3
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 3
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 3
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 3
- 101000713081 Homo sapiens C-C motif chemokine 23 Proteins 0.000 description 3
- 101000801228 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Proteins 0.000 description 3
- 101000808011 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 description 3
- 206010062530 Increased bronchial secretion Diseases 0.000 description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 3
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 3
- 108010092277 Leptin Proteins 0.000 description 3
- 102000016267 Leptin Human genes 0.000 description 3
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 102000009112 Mannose-Binding Lectin Human genes 0.000 description 3
- 108010087870 Mannose-Binding Lectin Proteins 0.000 description 3
- 206010029379 Neutrophilia Diseases 0.000 description 3
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 3
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 3
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 3
- 101710088580 Stromal cell-derived factor 1 Proteins 0.000 description 3
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 239000007767 bonding agent Substances 0.000 description 3
- 208000030303 breathing problems Diseases 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 3
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Natural products O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 102000058223 human VEGFA Human genes 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 3
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 3
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N leptin Chemical compound O=C([C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)CCSC)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N 0.000 description 3
- 229940039781 leptin Drugs 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 3
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 239000011049 pearl Substances 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 108091000053 retinol binding Proteins 0.000 description 3
- 102000029752 retinol binding Human genes 0.000 description 3
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 3
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 3
- 239000000779 smoke Substances 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100033312 Alpha-2-macroglobulin Human genes 0.000 description 2
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 description 2
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 description 2
- 108010025628 Apolipoproteins E Proteins 0.000 description 2
- 102000013918 Apolipoproteins E Human genes 0.000 description 2
- 101100067974 Arabidopsis thaliana POP2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101710129634 Beta-nerve growth factor Proteins 0.000 description 2
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 2
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 2
- 206010006458 Bronchitis chronic Diseases 0.000 description 2
- 102100031151 C-C chemokine receptor type 2 Human genes 0.000 description 2
- 101710149815 C-C chemokine receptor type 2 Proteins 0.000 description 2
- 102100024167 C-C chemokine receptor type 3 Human genes 0.000 description 2
- 101710149862 C-C chemokine receptor type 3 Proteins 0.000 description 2
- 101710149863 C-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 description 2
- 102100035875 C-C chemokine receptor type 5 Human genes 0.000 description 2
- 101710149870 C-C chemokine receptor type 5 Proteins 0.000 description 2
- 102100036301 C-C chemokine receptor type 7 Human genes 0.000 description 2
- 102100036305 C-C chemokine receptor type 8 Human genes 0.000 description 2
- 102100036841 C-C motif chemokine 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100023702 C-C motif chemokine 13 Human genes 0.000 description 2
- 101710112613 C-C motif chemokine 13 Proteins 0.000 description 2
- 102100036846 C-C motif chemokine 21 Human genes 0.000 description 2
- 102100032366 C-C motif chemokine 7 Human genes 0.000 description 2
- 101710155834 C-C motif chemokine 7 Proteins 0.000 description 2
- 102100034871 C-C motif chemokine 8 Human genes 0.000 description 2
- 101710155833 C-C motif chemokine 8 Proteins 0.000 description 2
- 102100025248 C-X-C motif chemokine 10 Human genes 0.000 description 2
- 102100039398 C-X-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 2
- 102100036150 C-X-C motif chemokine 5 Human genes 0.000 description 2
- 102100036153 C-X-C motif chemokine 6 Human genes 0.000 description 2
- 101710085504 C-X-C motif chemokine 6 Proteins 0.000 description 2
- 102100032528 C-type lectin domain family 11 member A Human genes 0.000 description 2
- 102100031168 CCN family member 2 Human genes 0.000 description 2
- 102100032976 CCR4-NOT transcription complex subunit 6 Human genes 0.000 description 2
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 description 2
- 101150093802 CXCL1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100369802 Caenorhabditis elegans tim-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 2
- 102100028892 Cardiotrophin-1 Human genes 0.000 description 2
- 108010082155 Chemokine CCL18 Proteins 0.000 description 2
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 2
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 2
- 102000015833 Cystatin Human genes 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 2
- 206010014561 Emphysema Diseases 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101150021185 FGF gene Proteins 0.000 description 2
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 description 2
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 description 2
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 description 2
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 2
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 2
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 2
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 2
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 2
- 101710115997 Gamma-tubulin complex component 2 Proteins 0.000 description 2
- 102000034615 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 2
- 108091010837 Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000013271 Hemopexin Human genes 0.000 description 2
- 108010026027 Hemopexin Proteins 0.000 description 2
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000716065 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 7 Proteins 0.000 description 2
- 101000716063 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 8 Proteins 0.000 description 2
- 101000713085 Homo sapiens C-C motif chemokine 21 Proteins 0.000 description 2
- 101000889128 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000947186 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 5 Proteins 0.000 description 2
- 101000942297 Homo sapiens C-type lectin domain family 11 member A Proteins 0.000 description 2
- 101100382881 Homo sapiens CCL18 gene Proteins 0.000 description 2
- 101000777550 Homo sapiens CCN family member 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 description 2
- 101100118549 Homo sapiens EGFR gene Proteins 0.000 description 2
- 101001069921 Homo sapiens Growth-regulated alpha protein Proteins 0.000 description 2
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 101000960954 Homo sapiens Interleukin-18 Proteins 0.000 description 2
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 2
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 2
- 101000973997 Homo sapiens Nucleosome assembly protein 1-like 4 Proteins 0.000 description 2
- 101000947178 Homo sapiens Platelet basic protein Proteins 0.000 description 2
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 2
- 101000863884 Homo sapiens Sialic acid-binding Ig-like lectin 8 Proteins 0.000 description 2
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 2
- 101000851376 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Proteins 0.000 description 2
- 101000851030 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor receptor 3 Proteins 0.000 description 2
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 2
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 2
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 2
- 108010008212 Integrin alpha4beta1 Proteins 0.000 description 2
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 2
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 102100020881 Interleukin-1 alpha Human genes 0.000 description 2
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 2
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 2
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 2
- 108090000177 Interleukin-11 Proteins 0.000 description 2
- 102000003815 Interleukin-11 Human genes 0.000 description 2
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 2
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 2
- 102100020791 Interleukin-13 receptor subunit alpha-1 Human genes 0.000 description 2
- 101710112663 Interleukin-13 receptor subunit alpha-1 Proteins 0.000 description 2
- 102100039898 Interleukin-18 Human genes 0.000 description 2
- 108010082786 Interleukin-1alpha Proteins 0.000 description 2
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 2
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 2
- 102100036672 Interleukin-23 receptor Human genes 0.000 description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 2
- 108010002335 Interleukin-9 Proteins 0.000 description 2
- 208000003456 Juvenile Arthritis Diseases 0.000 description 2
- 206010059176 Juvenile idiopathic arthritis Diseases 0.000 description 2
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 2
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 2
- 102000004083 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 2
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 2
- 102000034655 MIF Human genes 0.000 description 2
- 108060004872 MIF Proteins 0.000 description 2
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 102100030335 Midkine Human genes 0.000 description 2
- 108010092801 Midkine Proteins 0.000 description 2
- 101710151805 Mitochondrial intermediate peptidase 1 Proteins 0.000 description 2
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 description 2
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 description 2
- 102100029268 Neurotrophin-3 Human genes 0.000 description 2
- 102000003683 Neurotrophin-4 Human genes 0.000 description 2
- 108090000099 Neurotrophin-4 Proteins 0.000 description 2
- 108090000630 Oncostatin M Proteins 0.000 description 2
- 102000004140 Oncostatin M Human genes 0.000 description 2
- 102000004264 Osteopontin Human genes 0.000 description 2
- 108010081689 Osteopontin Proteins 0.000 description 2
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 2
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 2
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 2
- ZPHBZEQOLSRPAK-UHFFFAOYSA-N Phosphoramidon Natural products C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NP(O)(=O)OC1OC(C)C(O)C(O)C1O ZPHBZEQOLSRPAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010082093 Placenta Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100035194 Placenta growth factor Human genes 0.000 description 2
- 102100036154 Platelet basic protein Human genes 0.000 description 2
- 108010071690 Prealbumin Proteins 0.000 description 2
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 description 2
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 2
- 102100029986 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Human genes 0.000 description 2
- 101710100969 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Proteins 0.000 description 2
- 102100029981 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-4 Human genes 0.000 description 2
- 101710100963 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-4 Proteins 0.000 description 2
- 101100123851 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) HER1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100029964 Sialic acid-binding Ig-like lectin 8 Human genes 0.000 description 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 2
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 101710097834 Thiol protease Proteins 0.000 description 2
- 102100027188 Thyroid peroxidase Human genes 0.000 description 2
- 101710113649 Thyroid peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 101150009046 Tnfrsf1a gene Proteins 0.000 description 2
- 102000006747 Transforming Growth Factor alpha Human genes 0.000 description 2
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 description 2
- 102000009190 Transthyretin Human genes 0.000 description 2
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 2
- 102100036857 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Human genes 0.000 description 2
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100033179 Vascular endothelial growth factor receptor 3 Human genes 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 208000038016 acute inflammation Diseases 0.000 description 2
- 230000006022 acute inflammation Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 description 2
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 description 2
- 108010026054 apolipoprotein SAA Proteins 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 2
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 2
- 201000009267 bronchiectasis Diseases 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 210000002318 cardia Anatomy 0.000 description 2
- 108010041776 cardiotrophin 1 Proteins 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000034196 cell chemotaxis Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000005482 chemotactic factor Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 208000007451 chronic bronchitis Diseases 0.000 description 2
- 208000019069 chronic childhood arthritis Diseases 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 108010030175 colony inhibiting factor Proteins 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 108050004038 cystatin Proteins 0.000 description 2
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 2
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N diisopropyl fluorophosphate Chemical compound CC(C)OP(F)(=O)OC(C)C MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 2
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 2
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 2
- 108700014844 flt3 ligand Proteins 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 2
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 2
- 102000008616 interleukin-15 receptor activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040002039 interleukin-15 receptor activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000053460 interleukin-17 receptor activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040001304 interleukin-17 receptor activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 108040001844 interleukin-23 receptor activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- IQZZFVDIZRWADY-UHFFFAOYSA-N isocoumarin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)OC=CC2=C1 IQZZFVDIZRWADY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000002215 juvenile rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 2
- 108010019677 lymphotactin Proteins 0.000 description 2
- AEUKDPKXTPNBNY-XEYRWQBLSA-N mcp 2 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 AEUKDPKXTPNBNY-XEYRWQBLSA-N 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 210000005012 myelin Anatomy 0.000 description 2
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 2
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 2
- 230000003448 neutrophilic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 2
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 108010072906 phosphoramidon Proteins 0.000 description 2
- BWSDNRQVTFZQQD-AYVHNPTNSA-N phosphoramidon Chemical compound O([P@@](O)(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CC=1[C]2C=CC=CC2=NC=1)C(O)=O)[C@H]1O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O BWSDNRQVTFZQQD-AYVHNPTNSA-N 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 108010017843 platelet-derived growth factor A Proteins 0.000 description 2
- 108010000685 platelet-derived growth factor AB Proteins 0.000 description 2
- 238000011809 primate model Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 2
- 208000004048 staphylococcal pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000001810 trypsinlike Effects 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJWCGVPEDDQUDE-YGJAXBLXSA-N (2s)-2-[[(1s)-2-[[(2s)-5-amino-1,5-dioxo-1-[[(2s)-1-oxopropan-2-yl]amino]pentan-2-yl]amino]-1-[(6s)-2-amino-1,4,5,6-tetrahydropyrimidin-6-yl]-2-oxoethyl]carbamoylamino]-4-methylpentanoic acid Chemical compound O=C[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)[C@@H]1CCN=C(N)N1 IJWCGVPEDDQUDE-YGJAXBLXSA-N 0.000 description 1
- HKZAAJSTFUZYTO-LURJTMIESA-N (2s)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-aminoacetyl)amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoic acid Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HKZAAJSTFUZYTO-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N (4S)-4-[[(4R,7S,10S,16S,19S,25S,28S,31R)-31-[[(2S)-2-[[(1R,6R,9S,12S,18S,21S,24S,27S,30S,33S,36S,39S,42R,47R,53S,56S,59S,62S,65S,68S,71S,76S,79S,85S)-47-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-methylbutanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-18-(4-aminobutyl)-27,68-bis(3-amino-3-oxopropyl)-36,71,76-tribenzyl-39-(3-carbamimidamidopropyl)-24-(2-carboxyethyl)-21,56-bis(carboxymethyl)-65,85-bis[(1R)-1-hydroxyethyl]-59-(hydroxymethyl)-62,79-bis(1H-imidazol-4-ylmethyl)-9-methyl-33-(2-methylpropyl)-8,11,17,20,23,26,29,32,35,38,41,48,54,57,60,63,66,69,72,74,77,80,83,86-tetracosaoxo-30-propan-2-yl-3,4,44,45-tetrathia-7,10,16,19,22,25,28,31,34,37,40,49,55,58,61,64,67,70,73,75,78,81,84,87-tetracosazatetracyclo[40.31.14.012,16.049,53]heptaoctacontane-6-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-7-(3-carbamimidamidopropyl)-25-(hydroxymethyl)-19-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-28-(1H-imidazol-4-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15,18,21,24,27,30-nonaoxo-16-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14,17,20,23,26,29-nonazacyclodotriacontane-4-carbonyl]amino]-5-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-3-carboxy-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(1S)-1-carboxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H]3NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H]4CCCN4C(=O)[C@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O)[C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc3ccccc3)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N3CCC[C@H]3C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](Cc2ccccc2)NC(=O)[C@H](Cc2c[nH]cn2)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc2c[nH]cn2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](Cc2ccc(O)cc2)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N 0.000 description 1
- GDSOZVZXVXTJMI-SNAWJCMRSA-N (e)-1-methylbut-1-ene-1,2,4-tricarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C(/C)=C(C(O)=O)\CCC(O)=O GDSOZVZXVXTJMI-SNAWJCMRSA-N 0.000 description 1
- MXNRLFUSFKVQSK-UHFFFAOYSA-N 2-Amino-6-(trimethylazaniumyl)hexanoate Chemical compound C[N+](C)(C)CCCCC(N)C([O-])=O MXNRLFUSFKVQSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000022 2-aminoethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100023990 60S ribosomal protein L17 Human genes 0.000 description 1
- 102100034215 AFG3-like protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 206010001497 Agitation Diseases 0.000 description 1
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- KHOITXIGCFIULA-UHFFFAOYSA-N Alophen Chemical compound C1=CC(OC(=O)C)=CC=C1C(C=1N=CC=CC=1)C1=CC=C(OC(C)=O)C=C1 KHOITXIGCFIULA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003966 Alpha-1-microglobulin Human genes 0.000 description 1
- 101800001761 Alpha-1-microglobulin Proteins 0.000 description 1
- 206010001881 Alveolar proteinosis Diseases 0.000 description 1
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 description 1
- 102000005666 Apolipoprotein A-I Human genes 0.000 description 1
- 108010059886 Apolipoprotein A-I Proteins 0.000 description 1
- 102100040214 Apolipoprotein(a) Human genes 0.000 description 1
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010027006 Apolipoproteins B Proteins 0.000 description 1
- 102000018616 Apolipoproteins B Human genes 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 206010003487 Aspergilloma Diseases 0.000 description 1
- 201000002909 Aspergillosis Diseases 0.000 description 1
- 208000036641 Aspergillus infections Diseases 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- VGGGPCQERPFHOB-MCIONIFRSA-N Bestatin Chemical compound CC(C)C[C@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](O)[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 VGGGPCQERPFHOB-MCIONIFRSA-N 0.000 description 1
- VGGGPCQERPFHOB-UHFFFAOYSA-N Bestatin Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 VGGGPCQERPFHOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010049931 Bone Morphogenetic Protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010049976 Bone Morphogenetic Protein 5 Proteins 0.000 description 1
- 108010049974 Bone Morphogenetic Protein 6 Proteins 0.000 description 1
- 108010049870 Bone Morphogenetic Protein 7 Proteins 0.000 description 1
- 102100024506 Bone morphogenetic protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100022526 Bone morphogenetic protein 5 Human genes 0.000 description 1
- 102100022525 Bone morphogenetic protein 6 Human genes 0.000 description 1
- 102100022544 Bone morphogenetic protein 7 Human genes 0.000 description 1
- 102100022545 Bone morphogenetic protein 8B Human genes 0.000 description 1
- 101150111062 C gene Proteins 0.000 description 1
- OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 Chemical compound C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N 0.000 description 1
- 108700012434 CCL3 Proteins 0.000 description 1
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 1
- 101100504320 Caenorhabditis elegans mcp-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100244725 Caenorhabditis elegans pef-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108090000712 Cathepsin B Proteins 0.000 description 1
- 102000004225 Cathepsin B Human genes 0.000 description 1
- 108010075016 Ceruloplasmin Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 102000000013 Chemokine CCL3 Human genes 0.000 description 1
- 108010055165 Chemokine CCL4 Proteins 0.000 description 1
- 102000001326 Chemokine CCL4 Human genes 0.000 description 1
- PEHHHZWUFUYCDZ-RGMNGODLSA-N ClCC(=O)CCl.C(CC)N[C@@H](CCO)C(=O)O Chemical compound ClCC(=O)CCl.C(CC)N[C@@H](CCO)C(=O)O PEHHHZWUFUYCDZ-RGMNGODLSA-N 0.000 description 1
- 102100029117 Coagulation factor X Human genes 0.000 description 1
- 102000002734 Collagen Type VI Human genes 0.000 description 1
- 108010043741 Collagen Type VI Proteins 0.000 description 1
- 206010056370 Congestive cardiomyopathy Diseases 0.000 description 1
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 1
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 description 1
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 241001269238 Data Species 0.000 description 1
- 201000010046 Dilated cardiomyopathy Diseases 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 229940122858 Elastase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- IJWCGVPEDDQUDE-UHFFFAOYSA-N Elastatinal Natural products O=CC(C)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)NC(CC(C)C)C(O)=O)C1CCN=C(N)N1 IJWCGVPEDDQUDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108010041308 Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 102400000686 Endothelin-1 Human genes 0.000 description 1
- 101800004490 Endothelin-1 Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 1
- 208000004248 Familial Primary Pulmonary Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 108010004460 Gastric Inhibitory Polypeptide Proteins 0.000 description 1
- 102100039994 Gastric inhibitory polypeptide Human genes 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 241000251152 Ginglymostoma cirratum Species 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039619 Granulocyte colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 206010072579 Granulomatosis with polyangiitis Diseases 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010045100 HSP27 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100039165 Heat shock protein beta-1 Human genes 0.000 description 1
- 101000883685 Heliothis virescens 60 kDa chaperonin, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 102100022057 Hepatocyte nuclear factor 1-alpha Human genes 0.000 description 1
- 101000780591 Homo sapiens AFG3-like protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000899368 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 8B Proteins 0.000 description 1
- 101000856395 Homo sapiens Cullin-9 Proteins 0.000 description 1
- 101001045751 Homo sapiens Hepatocyte nuclear factor 1-alpha Proteins 0.000 description 1
- 101001082060 Homo sapiens Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000617720 Homo sapiens Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000752245 Homo sapiens Rho guanine nucleotide exchange factor 5 Proteins 0.000 description 1
- 206010020460 Human T-cell lymphotropic virus type I infection Diseases 0.000 description 1
- 241000714260 Human T-lymphotropic virus 1 Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010021133 Hypoventilation Diseases 0.000 description 1
- 201000009794 Idiopathic Pulmonary Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 102000005755 Intercellular Signaling Peptides and Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010070716 Intercellular Signaling Peptides and Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000019223 Interleukin-1 receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050006617 Interleukin-1 receptor Proteins 0.000 description 1
- 208000029523 Interstitial Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- 101100079885 Lactobacillus johnsonii (strain CNCM I-12250 / La1 / NCC 533) nfr1 gene Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000282852 Lama guanicoe Species 0.000 description 1
- 201000005099 Langerhans cell histiocytosis Diseases 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010033266 Lipoprotein(a) Proteins 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 1
- 244000134336 Malus baccata Species 0.000 description 1
- 235000005079 Malus baccata Nutrition 0.000 description 1
- 208000029001 Mediastinal disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004378 Melanocortin Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000950 Melanocortin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010027336 Menstruation delayed Diseases 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- GHAZCVNUKKZTLG-UHFFFAOYSA-N N-ethyl-succinimide Natural products CCN1C(=O)CCC1=O GHAZCVNUKKZTLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HDFGOPSGAURCEO-UHFFFAOYSA-N N-ethylmaleimide Chemical compound CCN1C(=O)C=CC1=O HDFGOPSGAURCEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 241000187654 Nocardia Species 0.000 description 1
- 241001597008 Nomeidae Species 0.000 description 1
- 241001452677 Ogataea methanolica Species 0.000 description 1
- 102000007990 Organic Anion Transporters Human genes 0.000 description 1
- 108010089503 Organic Anion Transporters Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 101710126321 Pancreatic trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 206010033892 Paraplegia Diseases 0.000 description 1
- 102100027006 Paraplegin Human genes 0.000 description 1
- 101710083869 Paraplegin Proteins 0.000 description 1
- 101150034459 Parpbp gene Proteins 0.000 description 1
- 101710176384 Peptide 1 Proteins 0.000 description 1
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 1
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 1
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 1
- 102100030304 Platelet factor 4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000778 Platelet factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 208000002151 Pleural effusion Diseases 0.000 description 1
- 208000005384 Pneumocystis Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 206010073755 Pneumocystis jirovecii pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 206010035667 Pneumonia anthrax Diseases 0.000 description 1
- 206010035734 Pneumonia staphylococcal Diseases 0.000 description 1
- 102100022025 Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 5 Human genes 0.000 description 1
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 201000001263 Psoriatic Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 208000036824 Psoriatic arthropathy Diseases 0.000 description 1
- 208000010378 Pulmonary Embolism Diseases 0.000 description 1
- 206010064911 Pulmonary arterial hypertension Diseases 0.000 description 1
- 206010037423 Pulmonary oedema Diseases 0.000 description 1
- 206010039085 Rhinitis allergic Diseases 0.000 description 1
- 102100021688 Rho guanine nucleotide exchange factor 5 Human genes 0.000 description 1
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 238000011803 SJL/J (JAX™ mice strain) Methods 0.000 description 1
- 101000620888 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Repressible acid phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 102400001107 Secretory component Human genes 0.000 description 1
- 102000008847 Serpin Human genes 0.000 description 1
- 108050000761 Serpin Proteins 0.000 description 1
- 108700028909 Serum Amyloid A Proteins 0.000 description 1
- 102000054727 Serum Amyloid A Human genes 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 101150014221 Son gene Proteins 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010004408 TRPP Cation Channels Proteins 0.000 description 1
- 102000013537 Thymidine Phosphorylase Human genes 0.000 description 1
- 108700023160 Thymidine phosphorylases Proteins 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 108010033576 Transferrin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 description 1
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 description 1
- 102000018594 Tumour necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007852 Tumour necrosis factor Proteins 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 108090000203 Uteroglobin Proteins 0.000 description 1
- 102000003848 Uteroglobin Human genes 0.000 description 1
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 1
- 102100039037 Vascular endothelial growth factor A Human genes 0.000 description 1
- 241001416177 Vicugna pacos Species 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 241000235017 Zygosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 201000007691 actinomycosis Diseases 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 229940009456 adriamycin Drugs 0.000 description 1
- 208000017304 adult pulmonary Langerhans cell histiocytosis Diseases 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 201000009961 allergic asthma Diseases 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 201000010105 allergic rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010052590 amastatin Proteins 0.000 description 1
- QFAADIRHLBXJJS-ZAZJUGBXSA-N amastatin Chemical compound CC(C)C[C@@H](N)[C@H](O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O QFAADIRHLBXJJS-ZAZJUGBXSA-N 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001475 anti-trypsic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 208000037849 arterial hypertension Diseases 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IDIPWEYIBKUDNY-UHFFFAOYSA-N benzenesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 IDIPWEYIBKUDNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000015736 beta 2-Microglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 230000002902 bimodal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 101150067309 bmp4 gene Proteins 0.000 description 1
- 210000002805 bone matrix Anatomy 0.000 description 1
- 210000004781 brain capillary Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 1
- BPKIGYQJPYCAOW-FFJTTWKXSA-I calcium;potassium;disodium;(2s)-2-hydroxypropanoate;dichloride;dihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[Na+].[Na+].[Cl-].[Cl-].[K+].[Ca+2].C[C@H](O)C([O-])=O BPKIGYQJPYCAOW-FFJTTWKXSA-I 0.000 description 1
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 1
- 108090001092 clostripain Proteins 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 description 1
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000005034 decoration Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000003405 delayed action preparation Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 208000012059 diaphragm disease Diseases 0.000 description 1
- 238000000113 differential scanning calorimetry Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000009429 distress Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 239000003602 elastase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 108010039262 elastatinal Proteins 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000002996 emotional effect Effects 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000012407 engineering method Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 208000037902 enteropathy Diseases 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 201000001155 extrinsic allergic alveolitis Diseases 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 101150054895 ftsH gene Proteins 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011990 functional testing Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 229940022353 herceptin Drugs 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 208000022098 hypersensitivity pneumonitis Diseases 0.000 description 1
- 208000000122 hyperventilation Diseases 0.000 description 1
- 230000000870 hyperventilation Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 description 1
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 208000009449 inhalation anthrax Diseases 0.000 description 1
- 208000023372 inhalational anthrax Diseases 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 102000008625 interleukin-18 receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040002014 interleukin-18 receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000036971 interstitial lung disease 2 Diseases 0.000 description 1
- 208000028774 intestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003871 intestinal function Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 208000018937 joint inflammation Diseases 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 238000002898 library design Methods 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 238000005497 microtitration Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 229940057059 monascus purpureus Drugs 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000000569 multi-angle light scattering Methods 0.000 description 1
- 206010028417 myasthenia gravis Diseases 0.000 description 1
- 208000027531 mycobacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 1
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000004126 nerve fiber Anatomy 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 210000003458 notochord Anatomy 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000006919 peptide aggregation Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 108700010839 phage proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Substances [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000024356 pleural disease Diseases 0.000 description 1
- 206010035653 pneumoconiosis Diseases 0.000 description 1
- 201000000317 pneumocystosis Diseases 0.000 description 1
- 229920002523 polyethylene Glycol 1000 Polymers 0.000 description 1
- 210000004896 polypeptide structure Anatomy 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 201000008312 primary pulmonary hypertension Diseases 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 108020003519 protein disulfide isomerase Proteins 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 230000007065 protein hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 201000003489 pulmonary alveolar proteinosis Diseases 0.000 description 1
- 208000005333 pulmonary edema Diseases 0.000 description 1
- 201000009732 pulmonary eosinophilia Diseases 0.000 description 1
- 208000008128 pulmonary tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 210000003492 pulmonary vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 201000000306 sarcoidosis Diseases 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 239000003001 serine protease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 201000002859 sleep apnea Diseases 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043517 specific immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- PXQLVRUNWNTZOS-UHFFFAOYSA-N sulfanyl Chemical class [SH] PXQLVRUNWNTZOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 230000001839 systemic circulation Effects 0.000 description 1
- 238000012385 systemic delivery Methods 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 206010043778 thyroiditis Diseases 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 102000027257 transmembrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008578 transmembrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 208000035408 type 1 diabetes mellitus 1 Diseases 0.000 description 1
- 229950009811 ubenimex Drugs 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 1
- 150000003952 β-lactams Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/005—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies constructed by phage libraries
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/007—Pulmonary tract; Aromatherapy
- A61K9/0073—Sprays or powders for inhalation; Aerolised or nebulised preparations generated by other means than thermal energy
- A61K9/0078—Sprays or powders for inhalation; Aerolised or nebulised preparations generated by other means than thermal energy for inhalation via a nebulizer such as a jet nebulizer, ultrasonic nebulizer, e.g. in the form of aqueous drug solutions or dispersions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/06—Anti-spasmodics, e.g. drugs for colics, esophagic dyskinesia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/06—Antiasthmatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
- A61P27/04—Artificial tears; Irrigation solutions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
- A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
- A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P39/00—General protective or antinoxious agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/12—Antihypertensives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
- A61K2039/543—Mucosal route intranasal
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
- A61K2039/544—Mucosal route to the airways
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/567—Framework region [FR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Virology (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Otolaryngology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Toxicology (AREA)
Abstract
本发明涉及多肽、抗体可变域和拮抗剂。本发明涉及能抵抗蛋白酶降解的抗‑TNFR多肽和抗体单可变域(dAb),以及含有这些的拮抗剂。多肽、dAb和拮抗剂可作为可能在被给药于患者时遇到蛋白酶的治疗剂和/或预防剂,例如用于肺部给药、口服给药,递送至患者的肺和递送至患者的GI道,以及用于治疗癌症和炎症,如关节炎或COPD。
Description
本申请是国际申请日为2008年6月4日的国际申请PCT/GB2008/050405进入中国、申请号为200880102207.2的题为“多肽、抗体可变域和拮抗剂”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及蛋白酶抗性多肽、免疫球蛋白(抗体)单可变域和包含这些的抗肿瘤坏死因子1(TNFR1,p55,CD120a,P60,TNF受体超家族成员1A,TNFRSF1A)拮抗剂。本发明进一步涉及含有该抗-TNFR1配体的用途、制剂、组合物和装置。
背景技术
多肽和肽日益成为各种应用中的重要制剂,这些应用包括工业应用和用作医学、治疗和诊断试剂。然而,在特定的生理学情况中,如炎症(例如,COPD)状况和癌症中,组织、器官或动物(例如,在肺中,在肿瘤中或邻近肿瘤)中存在的蛋白酶含量将增加。这种蛋白酶的增加会导致内源蛋白质以及给药来治疗疾病的治疗肽、多肽和蛋白质加速的降解和失活。因此,对体内使用(例如,用于治疗、诊断或预防疾病)具有潜能的一些药剂仅仅具有有限的功效,因为它们受到蛋白酶的快速降解和灭活。
蛋白酶抗性多肽提供了若干优势。例如,蛋白酶抗性多肽在体内能比蛋白酶敏感性药剂保持更长时间的活性,因此,能将功能保持足以产生生物效应的时间段。对于选择能抵抗蛋白酶降解并且还具有理想生物活性的多肽的改进方法还存在着需求。
TNFR1
TNFR1是一种跨膜受体,其含有结合配体的胞外区和缺少固有信号转导活性但能够结合信号转导分子的胞内结构域。TNFR1与所结合的TNF的复合物含有三条TNFR1链和三条TNF链。(Banner等人,Cell,73(3)431-445(1993).)TNF配体作为被三条TNFR1链结合的三聚体而存在(同上)。在受体-配体复合物中,三条TNFR1链被紧密聚簇(cluster)在一起,而这种聚簇是TNFR1介导的信号转导的先决条件。事实上,结合TNFR1的多价试剂例如抗-TNFR1抗体能够在不存在TNF时诱导TNFR1聚簇和信号转导,并且通常被用作TNFR1激动剂(参见例如,Belka等人,EMBO,14(6):1156-1165(1995);Mandik-Nayak等人,J.Immunol,167:1920-1928(2001).)。因此,结合TNFR1的多价试剂通常不是有效的TNFR1拮抗剂,甚至即使它们阻断TNFα与TNFR 1的结合时。
TNFR1的胞外区包含十三个氨基酸的氨基末端区段(SEQ ID NO:603(人)的氨基酸1-13;SEQ ID NO:604(小鼠)的氨基酸1-13)、结构域1(SEQ ID NO:603(人)的氨基酸14-53;SEQ ID NO:604(小鼠)的氨基酸14-53)、结构域2(SEQ ID NO:603(人)的氨基酸54-97;SEQID NO:604(小鼠)的氨基酸54-97)、结构域3(8 SEQ ID NO:603(人)的氨基酸98-13;SEQ IDNO:604(小鼠)的氨基酸98-138)、和结构域4(SEQ ID NO:603(人)的氨基酸139-167;SEQ IDNO:604(小鼠)的氨基酸139-167),后面是近膜区(SEQ ID NO:603_(人)的氨基酸168-182;SEQ ID NO:604(小鼠)的氨基酸168-183)(参见Banner等人,Cell73(3)431-445(1993)和Loetscher等人,Cell61(2)351-359(1990).)。结构域2和3与所结合的配体(TNFβ,TNFα)接触(Banner等人,Cell,73(3)431-445(1993).)。TNFR1的胞外区还含有一个区域,其被称为前-配体结合组装结构域(pre-ligand binding assembly domain)或PLAD结构域(SEQ IDNO:603_(人)的氨基酸1-53;SEQ ID NO:604(小鼠)的氨基酸1-53)(美国政府,WO 01/58953;Deng等人,Nature Medicine,doi:10.1038/nm1304(2005))。
在体内通过一种处理将TNFR1从细胞的表面除去,该处理包括在结构域4或在近膜区(SEQ ID NO:603的氨基酸168-182;SEQ ID NO:604的氨基酸168-183)中TNFR1的蛋白质水解,以产生可溶形式的TNFR1。可溶的TNFR1保持了结合TNFα的能力,进而能够作为TNFα活性的内源性抑制剂。
发明内容
在一个方面中,本发明提供了含有与DOM 1h-131-206的氨基酸序列(显示于图3中)为至少93%同一性的氨基酸序列的多肽。在一个实施方案中,同一性百分比为至少94、95、96、97、98或99%。在一个实施方案中,多肽是DOM 1h-131-206。本发明进一步提供了(基本上)纯的DOM 1h-131-206单体。在一个实施方案中,DOM 1h-131-206为至少98、99、99.5%纯或100%纯的单体。
在一个方面中,本发明提供了一种多肽是由与DOM 1h-131-206的核苷酸序列(显示于图19中)为至少80%同一性的核苷酸序列编码的。 在一个实施方案中,同一性百分比为至少70、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%。
在一个方面中,本发明提供了由与DOM 1h-131-206的核苷酸序列(显示于图19中)为至少57%同一性的核苷酸序列编码的多肽,并且其中该多肽包含与DOM 1h-131-206的氨基酸序列(显示于图3中)为至少93%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中,核苷酸序列的同一性百分比为至少60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%。在一个实施方案中,氨基酸序列的同一性百分比为至少94、95、96、97、98或99%或100%。例如,核苷酸序列可以是DOM 1h-131-206核苷酸序列(显示于图19中)的密码子优化形式。序列的密码子优化是本领域已知的。在一个实施方案中,对于在细菌(例如,大肠杆菌(E.coli)或假单胞菌属(Pseudomonas),例如,荧光假单胞菌(P fluorescens))、哺乳动物(例如,CHO)或酵母宿主细胞(例如,毕赤酵母属(Picchia)或酵母属(Saccharomyces),例如,巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)或酿酒酵母(S.cerevisiae))中的表达,将核苷酸序列优化。
在一个方面中,本发明提供了含有本发明多肽的融合蛋白。
在一个方面中,本发明提供了抗-TNFαI型受体(TNFR1;p55)免疫球蛋白单可变域,其包含与DOM 1h-131-206的氨基酸序列(显示于图3中)为至少93%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中,同一性百分比为至少94、95、96、97、98或99%。
在一个方面中,本发明提供了抵抗蛋白酶的抗-TNFαI型受体(TNFR1;p55)免疫球蛋白单可变域,其包含与DOM 1h-131-206的氨基酸序列为至少90%同一性的氨基酸序列。在这些方面的一个实施方案中,同一性百分比为至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%。
在一个实施方案中,免疫球蛋白单可变域在位置53包含天冬氨酸,其中编号是根据Kabat(“Sequences of Proteins of Immunological Interest”(免疫学重要性蛋白的序列),US Department of Health and Human Services(美国卫生和人类服务部),1991)。
在一个实施方案中,免疫球蛋白单可变域在位置91包含组氨酸,其中编号是根据Kabat。
在一个方面中,本发明提供了抗-TNFαI型受体(TNFR1;p55)免疫球蛋白单可变域,其包含与DOM 1h-131-206的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
在一个方面中,本发明提供了由与DOM 1h-131-206的核苷酸序列(显示于图19中)为至少80%同一性的核苷酸序列编码的抗-TNFαI型受体(TNFR1;p55)免疫球蛋白单可变域。在一个实施方案中,同一性百分比为至少70、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%。
在一个方面中,本发明提供了由与DOM 1h-131-206的核苷酸序列(显示于图19中)为至少57%同一性的核苷酸序列编码的抗-TNFαI型受体(TNFR1;p55)免疫球蛋白单可变域,并且其中可变域包含与DOM1h-131-206的氨基酸序列(显示于图3中)为至少93%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中,核苷酸序列的同一性百分比为至少60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%。在一个实施方案中,氨基酸序列的同一性百分比为至少94、95、96、97、98或99%或100%。例如,核苷酸序列可以是DOM 1h-131-206核苷酸序列(显示于图19中)的密码子优化形式。序列的密码子优化是本领域已知的。在一个实施方案中,对于在细菌(例如,大肠杆菌或假单胞菌属,例如,荧光假单胞菌)、哺乳动物(例如,CHO)或酵母宿主细胞(例如,毕赤酵母属或酵母属,例如,巴斯德毕赤酵母或酿酒酵母)中的表达,将核苷酸序列优化。
在一个方面中,本发明提供了由与DOM 1h-131-206的核苷酸序列(显示于图19中)相同的序列编码的抗-TNFαI型受体(TNFR1;p55)免疫球蛋白单可变域。
在一个方面中,本发明提供了含有根据本发明的抗-TNFR免疫球蛋白单可变域的抗-TNFαI型受体(TNFR1;p55)拮抗剂。在一个实施方案中,拮抗剂包含第一和第二免疫球蛋白单可变域,其中每个可变域是根据本发明的。例如,其中拮抗剂包含所述单可变域的单体或所述单可变域的同型二聚体。在一个实施方案中,那个或每个单可变域的氨基酸序列与DOM 1h-131-206的氨基酸序列(显示于图3中)相同。
在一个方面中,本发明提供了含有与DOM 1h-131-206的氨基酸序列(显示于图3中)相同或在不超过25个氨基酸位置不同于DOM 1h-131-206的氨基酸序列并具有与DOM1h-131-206的CDR1序列为至少50%同一性的CDR1序列的氨基酸序列的抗-TNFαI型受体(TNFR1;p55)免疫球蛋白单可变域。在一个实施方案中,差异不超过24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸位置。在一个实施方案中,CDR序列同一性为至少55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%。
在一个方面中,本发明提供了含有与DOM 1h-131-206的氨基酸序列(显示于图3中)相同或在不超过25个氨基酸位置不同于DOM1h-131-206的氨基酸序列并具有与DOM 1h-131-206的CDR2序列为至少50%同一性的CDR2序列的氨基酸序列的抗-TNFαI型受体(TNFR1;p55)免疫球蛋白单可变域。在一个实施方案中,差异不超过24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸位置。在一个实施方案中,CDR序列同一性为至少55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%。
在一个方面中,本发明提供了含有与DOM 1h-131-206的氨基酸序列(显示于图3中)相同或在不超过25个氨基酸位置不同于DOM1h-131-206的氨基酸序列并具有与DOM 1h-131-206的CDR3序列为至少50%同一性的CDR3序列的氨基酸序列的抗-TNFαI型受体(TNFR1;p55)免疫球蛋白单可变域。在一个实施方案中,差异不超过24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸位置。在一个实施方案中,CDR序列同一性为至少55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%。
在一个方面中,本发明提供了含有与DOM 1h-131-206的氨基酸序列(显示于图3中)相同或在不超过25个氨基酸位置不同于DOM1h-131-206的氨基酸序列并具有与DOM 1h-131-206的CDR1序列为至少50%同一性的CDR1序列和与DOM 1h-131-206的CDR2序列为至少50%同一性的CDR2序列的氨基酸序列的抗-TNFαI型受体(TNFR1;p55)免疫球蛋白单可变域。在一个实施方案中,差异不超过24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸位置。在一个实施方案中,一个或两个CDR序列同一性各自为至少55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%。
在一个方面中,本发明提供了含有与DOM 1h-131-206的氨基酸序列(显示于图3中)相同或在不超过25个氨基酸位置不同于DOM1h-131-206的氨基酸序列并具有与DOM 1h-131-206的CDR1序列为至少50%同一性的CDR1序列和与DOM 1h-131-206的CDR3序列为至少50%同一性的CDR3序列的氨基酸序列的抗-TNFαI型受体(TNFR1;p55)免疫球蛋白单可变域。在一个实施方案中,差异不超过24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸位置。在一个实施方案中,一个或两个CDR序列同一性各自为至少55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%。
在一个方面中,本发明提供了含有与DOM 1h-131-206的氨基酸序列(显示于图3中)相同或在不超过25个氨基酸位置不同于DOM1h-131-206的氨基酸序列并具有与DOM 1h-131-206的CDR2序列为至少50%同一性的CDR2序列和与DOM 1h-131-206的CDR3序列为至少50%同一性的CDR3序列的氨基酸序列的抗-TNFαI型受体(TNFR1;p55)免疫球蛋白单可变域。在一个实施方案中,差异不超过24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸位置。在一个实施方案中,一个或两个CDR序列同一性各自为至少55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%。
在一个方面中,本发明提供了含有与DOM 1h-131-206的氨基酸序列(显示于图3中)相同或在不超过25个氨基酸位置不同于DOM1h-131-206的氨基酸序列并具有与DOM 1h-131-206的CDR1序列为至少50%同一性的CDR1序列和与DOM 1h-131-206的CDR2序列为至少50%同一性的CDR2序列和与DOM 1h-131-206的CDR3序列为至少50%同一性的CDR3序列的氨基酸序列的抗-TNFαI型受体(TNFR1;p55)免疫球蛋白单可变域。在一个实施方案中,差异不超过24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸位置。在一个实施方案中,一个或两个或每个CDR序列同一性各自为至少55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%。
在一个方面中,本发明提供了具有与DOM 1h-131-206(显示于图3 中)的CDR1序列为至少50%同一性的CDR1序列的抗-TNFαI型受体(TNFR1;p55)拮抗剂。在一个实施方案中,CDR序列同一性为至少55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%。例如,在本文所述的一组条件下,拮抗剂可以抵抗蛋白酶,例如,本文所述的一种或更多种蛋白酶。
在一个方面中,本发明提供了具有与DOM 1h-131-206(显示于图3中)的CDR1序列为至少50%同一性的CDR2序列的抗-TNFαI型受体(TNFR1;p55)拮抗剂。在一个实施方案中,CDR序列同一性为至少55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%。例如,在本文所述的一组条件下,拮抗剂可以抵抗蛋白酶,例如,本文所述的一种或更多种蛋白酶。
在一个方面中,本发明提供了具有与DOM 1h-131-206(显示于图3中)的CDR1序列为至少50%同一性的CDR3序列的抗-TNFαI型受体(TNFR1;p55)拮抗剂。在一个实施方案中,CDR序列同一性为至少55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%。例如,在本文所述的一组条件下,拮抗剂可以抵抗蛋白酶,例如,本文所述的一种或更多种蛋白酶。
在一个方面中,本发明提供了具有与DOM 1h-131-206(显示于图3中)的CDR1序列为至少50%同一性的CDR1序列和与DOM 1h-131-206的CDR2序列为至少50%同一性的CDR2序列的抗-TNFαI型受体(TNFR1;p55)拮抗剂。在一个实施方案中,一个或两个CDR的CDR序列同一性各自为至少55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%。例如,在本文所述的一组条件下,拮抗剂可以抵抗蛋白酶,例如,本文所述的一种或更多种蛋白酶。
在一个方面中,本发明提供了具有与DOM 1h-131-206(显示于图3中)的CDR1序列为至少50%同一性的CDR1序列和与DOM 1h-131-206的CDR3序列为至少50%同一性的CDR3序列的抗-TNFαI型受体(TNFR1;p55)拮抗剂。在一个实施方案中,一个或两个CDR的CDR序列同一性各自为至少55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%。例如,在本文所述的一组条件下,拮抗剂可以抵抗蛋白酶,例如,本文所述一种或更多种的蛋白酶。
在一个方面中,本发明提供了具有与DOM 1h-131-206(显示于图3 中)的CDR2序列为至少50%同一性的CDR2序列和与DOM 1h-131-206的CDR3序列为至少50%同一性的CDR3序列的抗-TNFαI型受体(TNFR1;p55)拮抗剂。在一个实施方案中,一个或两个CDR的CDR序列同一性各自为至少55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%。例如,在本文所述的一组条件下,拮抗剂可以抵抗蛋白酶,例如,本文所述的一种或更多种蛋白酶。
在一个方面中,本发明提供了具有与DOM 1h-131-206(显示于图3中)的CDR1序列为至少50%同一性的CDR1序列和与DOM 1h-131-206的CDR2序列为至少50%同一性的CDR2序列和与DOM 1h-131-206的CDR3序列为至少50%同一性的CDR3序列的抗-TNFαI型受体(TNFR1;p55)拮抗剂。在一个实施方案中,一个或两个或每个CDR的CDR序列同一性各自为至少55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%。例如,在本文所述的一组条件下,拮抗剂可以抵抗蛋白酶,例如,本文所述的一种或更多种蛋白酶。
在一个方面中,本发明提供了含有免疫球蛋白单可变域的抗-TNFαI型受体(TNFR1;p55)拮抗剂,该免疫球蛋白单可变域含有DOM1h-131-206(显示于图3中)的CDR1、CDR2和/或CDR3的序列(例如,CDR1,CDR2,CDR3,CDR1和2,CDR1和3,CDR2和3,或CDR1、2和3)。例如,在本文所述的一组条件下,拮抗剂可以抵抗蛋白酶,例如,本文所述的一种或更多种蛋白酶。
在一个方面中,本发明提供了与DOM 1h-131-206竞争与TNFR1结合的TNFαI型受体(TNFR1;p55)拮抗剂。因此,拮抗剂可以结合与DOM 1h-131-206相同的表位或重叠的表位。在一个实施方案中,拮抗剂包含具有与DOM 1h-131-206(显示于图3中)的氨基酸序列为至少93%同一性的氨基酸序列的免疫球蛋白单可变域。在一个实施方案中,同一性百分比为至少94、95、96、97、98或99%。例如,在本文所述的一组条件下,拮抗剂可以抵抗蛋白酶,例如,本文所述的一种或更多种蛋白酶。在一个实施方案中,拮抗剂是抗体或其抗原结合片段,如具有TNFR1结合特异性的单价抗原结合片段(例如,scFv、Fab、Fab’、dAb)。拮抗剂的其他实例是本文所述的结合TNFR1的配体。配体可以包含具有TNFR1结合特异性的免疫球蛋白单可变域或结构域抗体(dAb),或以合适形式的该dAb的互补性决定区。在一些实施方案中,配体是基本上由具有TNFR1结合特异性的免疫球蛋白单可变域或dAb组成或由具有TNFR1结合特异性的免疫球蛋白单可变域或dAb组成的dAb单体。在其他实施方案中,配体是包含合适形式如抗体形式的dAb(或dAb的CDR)的多肽。
本发明的某些TNFR1的拮抗剂不抑制TNFα与TNFR1的结合,而是抑制通过TNFR1介导的信号转导。例如,TNFR1的拮抗剂能够抑制在通过TNFR1的信号转导之前的TNFα-诱导的TNFR1的聚簇。这些拮抗剂提供了某些优点。例如,在存在这类拮抗剂时,TNFα能够结合在细胞表面上所表达的以及从细胞环境移除的TNFR1,但是TNFR1介导的信号转导不能被激活。因此,TNFR1信号诱导的其他TNFα以及其他炎症介质的产生将被抑制。类似地,结合TNFR1并抑制通过TNFR1所介导的信号转导但不会抑制TNFα结合TNFR1的TNFR1拮抗剂,将不会抑制内源产生的可溶TNFR1的TNFα-结合并抑制活性。因此,为有此需要的哺乳动物给药这类拮抗剂能够补充抑制体内TNFα活性和TNFR1活性的内源调控途径。本发明还涉及配体,所述配体(i)结合TNFR1(例如,在结构域1中),(ii)拮抗TNFR 1介导的信号转导的激活,和(iii)不抑制TNFα与TNFR1的结合。这类配体结合可溶TNFR1而不防止可溶受体结合TNFα,进而为有此需要的哺乳动物给药这类拮抗剂,能够通过提高血清中可溶受体半衰期而补充体内抑制TNFα活性的内源调节通路。这些优点与一些配体特别相关,这些配体已经通过连接PEG基团、血清白蛋白、转铁蛋白、转铁蛋白受体或至少转铁蛋白结合部分、抗体Fc区,或通过缀合抗体结构域,而被格式化,以具有较大的流体动力学大小。例如,(i)结合TNFR1(如在结构域1中),(ii)拮抗TNFR1介导的信号转导活动和(iii)没有抑制TNFα与TNFR1如dAb单体的结合的物质(例如,多肽、可变域或拮抗剂)可以格式化(formatted)成较大的抗体的抗原结合片段或格式化为抗体(例如,格式化成Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、IgG、scFv)。还可以通过将TNFR1结合剂(拮抗剂、可变域)缀合或连接结合提高体内半衰期的抗原或表位的结合域(例如,抗体或抗体片段)来提高配体的流体动力学大小及其血清半衰期,如本文所述的(参见,WO2006038027的附录1,在此将其整体引入作为参考)。例如,可以将TNFR1结合剂(例如,多肽,例如,dAb)缀合或连接抗-血清白蛋白或抗-新生儿Fc受体抗体或抗体 片段,例如,抗-SA或抗新生儿Fc受体dAb、Fab、Fab’或scFv,或抗-SA亲和体(affibody)或抗-新生儿Fc受体亲和体。
用于根据本发明的TNFR1-结合配体中的合适的白蛋白、白蛋白片段或白蛋白变体的实例描述于WO2005/077042A2和WO2006038027中,在此将其整体引入作为参考。
在整个说明书中描述的本发明的其他实施方案中,替代本发明的拮抗剂或配体中“dAb”的使用,设想本领域技术人员可以使用含有结合TNFR1的dAb的CDR的结构域(例如,嫁接于合适的蛋白质支架或骨架上的CDR,支架或骨架例如为亲和体、SpA支架、LDL受体A类结构域或EGF结构域)或可以是含有TNFR1结合位点的蛋白质结构域,例如,其中结构域选自亲和体、SpA结构域、LDL受体A类结构域或EGF结构域。因此认为本文公开内容作为整体提供了使用这样的结构域替代dAb的拮抗剂、配体和方法的公开内容。
本发明的多肽、免疫球蛋白单可变域和拮抗剂可以抵抗以下的一种或更多种:丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、基质金属蛋白酶、羧肽酶(例如,羧肽酶A、羧肽酶B)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、弹性蛋白酶、leukozyme、胰酶、凝血酶、血纤维蛋白溶酶、组织蛋白酶(例如,组织蛋白酶G)、蛋白酶(例如,蛋白酶1、蛋白酶2、蛋白酶3)、嗜热菌蛋白酶、凝乳酶、肠肽酶、胱天蛋白酶(caspase)(例如,胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶5、胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶12、胱天蛋白酶13)、钙激活中性蛋白酶、无花果蛋白酶(ficain)、梭菌蛋白酶、奇异果蛋白酶(actinidain)、菠萝蛋白酶和分离酶。在特定的实施方案中,蛋白酶是胰蛋白酶、弹性蛋白酶或leucozyme。还可以通过生物提取物、生物匀浆或生物制剂来提供蛋白酶。在一个实施方案中,蛋白酶是在痰液、粘液(例如,胃粘液、鼻粘液、支气管粘液)、支气管肺泡灌洗、肺匀浆、肺提取物、胰腺提取物、胃液、唾液或眼泪中发现的蛋白酶。在一个实施方案中,蛋白酶是在眼睛和/或眼泪中发现的。在一个实施方案中,蛋白酶是非细菌蛋白酶。在一个实施方案中,蛋白酶是动物蛋白酶,例如,哺乳动物蛋白酶,例如,人蛋白酶。在一个实施方案中,蛋白酶是GI道蛋白酶或肺组织蛋白酶,例如,在人体中发现的GI道蛋白酶或肺组织蛋白酶。在此所列的这些蛋白酶也可以用于 本文所述的涉及蛋白酶库组(repertoire)暴露于蛋白酶的方法中。
在一个方面中,本发明提供了包含TNFαI型受体(TNFR1;p55)结合位点的蛋白酶抗性免疫球蛋白单可变域,其中与以下温育时,可变域能抵抗蛋白酶例如胰蛋白酶:
(i)在37℃下用浓度(c)为至少1O微克/ml的蛋白酶温育至少一个小时的时间(t);或
(ii)在30℃下用浓度(c’)为至少40微克/ml的蛋白酶温育至少一个小时的时间(t),
其中所述可变域包含与DOM1h-131-206的氨基酸序列(显示于图3中)为至少90%同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中,蛋白酶例如胰蛋白酶与可变域的比例(以摩尔/摩尔为基础)为8,000至80,000蛋白酶∶可变域,例如,C为10微克/ml时,比例为800至80,000蛋白酶∶可变域;或C或C’为100微克/ml时,比例为8,000至80,000蛋白酶∶可变域。在一个实施方案中,蛋白酶(例如,胰蛋白酶)与可变域的比例(以重量/重量为基础,例如微克/微克)为16,000至160,000蛋白酶∶可变域,例如,C为10微克/ml时,比例为1,600至160,000蛋白酶∶可变域;或C或C’为100微克/ml时,比例为16,000至160,000蛋白酶∶可变域。在一个实施方案中,浓度(c或c’)为至少100或1000微克/ml蛋白酶。在一个实施方案中,浓度(c或c’)为至少100或1000微克/ml蛋白酶。参照在此对使用肽或多肽的组或文库工作时适于蛋白酶使用的蛋白水解活性的条件的描述(例如,w/w参数)。这些条件可以用于测定特定免疫球蛋白单可变域的蛋白酶抗性的条件。在一个实施方案中,时间(t)为或约为一、三或24小时或过夜(例如,约12-16小时)。在一个实施方案中,可变域在条件(i)下是有抗性的,并且浓度(c)为或约为10或100微克/ml蛋白酶,而时间(t)为1小时。在一个实施方案中,可变域在条件(ii)下是有抗性的,并且浓度(c’)为或约为40微克/ml蛋白酶,而时间(t)为或约为3小时。在一个实施方案中,蛋白酶选自胰蛋白酶、弹性蛋白酶、leucozyme和胰酶。在一个实施方案中,蛋白酶是胰蛋白酶。在一个实施方案中,蛋白酶是在痰液、粘液(例如,胃粘液、鼻粘液、支气管粘液)、支气管肺泡灌洗、肺匀浆、肺提取物、胰腺提取物、胃液、唾液或眼泪中发现的蛋白酶。在一个实施方案中,蛋白酶是在眼睛和/或眼泪中发现的。 在一个实施方案中,蛋白酶是非细菌蛋白酶。在一个实施方案中,蛋白酶是动物蛋白酶,例如,哺乳动物蛋白酶,例如,人蛋白酶。在一个实施方案中,蛋白酶是GI道蛋白酶或肺组织蛋白酶,例如,在人体中发现的GI道蛋白酶或肺组织蛋白酶。在此所列的这些蛋白酶也可以用于本文所述的涉及蛋白酶库组暴露于蛋白酶的方法中。
在一个实施方案中,可变域能抵抗胰蛋白酶和/或选自弹性蛋白酶、leucozyme和胰酶中的至少一种其他蛋白酶。例如,能抵抗胰蛋白酶和弹性蛋白酶;胰蛋白酶和leucozyme;胰蛋白酶和胰酶;胰蛋白酶、弹性蛋白酶和leucozyme;胰蛋白酶、弹性蛋白酶和胰酶;胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胰酶和leucozyme;或胰蛋白酶、胰酶和leucozyme。
在一个实施方案中,在条件(i)或(ii)下温育后,例如,在106至1013的噬菌体文库大小,例如108至1012复制单位(传染性病毒粒子),在噬菌体上展示可变域。
在一个实施方案中,在条件(i)或(ii)下温育后,可变域特异性地结合TNFR1,例如,使用BiaCoreTM或ELISA来测定,例如,噬菌体ELISA或单克隆噬菌体ELISA。
在一个实施方案中,本发明的可变域特异性地结合蛋白A或蛋白L。在一个实施方案中,在条件(i)或(ii)下温育后,存在与蛋白A或L的特异性结合。
在一个实施方案中,例如,在条件(i)或(ii)下温育后,本发明的可变域在ELISA中,例如,在噬菌体ELISA或单克隆噬菌体ELISA中,具有至少0.404的OD450读数。
在一个实施方案中,例如,在条件(i)或(ii)下温育后,本发明的可变域在凝胶电泳中(基本上)展示出单条条带。
在特定的实施方案中,本发明提供了为双特异性配体的TNFR1拮抗剂,其含有根据本发明的结合TNFR1的第一dAb和具有与第一dAb相同或不同结合特异性的第二dAb。第二dAb可以结合选自ApoE、Apo-SAA、BDNF、心肌营养素-1、CEA、CD40、CD40配体、CD56、CD38、CD138、EGF、EGF受体、ENA-78、嗜酸粒细胞趋化蛋白、嗜酸粒细胞趋化蛋白-2、Exodus-2、FAPα、FGF-酸性、FGF-碱性、成纤维细胞生长因子-10、FLT3配体、Fractalkine(CX3C)、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-β1、人血清白蛋白、胰岛素、IFN-γ、IGF-I、IGF-II、IL-1α、IL-1β、IL-1受体、IL-1I型受体、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8(72a.a.)、IL-8(77a.a.)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18(IGIF)、抑制素α、抑制素β、IP-10、角化细胞生长因子-2(KGF-2)、KGF、瘦蛋白(Leptin)、LIF、淋巴细胞趋化因子、缪勒管抑制物质、单核细胞集落抑制因子、单核细胞引诱蛋白、M-CSF、MDC(67a.a.)、MDC(69a.a.)、MCP-1(MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC(67a.a.)、MDC(69a.a.)、MIG、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、MIP-3β、MIP-4、脊髓源祖细胞抑制剂因子-1(MPIF-1)、NAP-2、神经营养因子、神经生长因子、β-NGF、NT-3、NT-4、制瘤素M、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDF1α、SDF1β、SCF、SCGF、干细胞因子(SCF)、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-β2、TGF-β3、肿瘤坏死因子(TNF)、TNF-α、TNF-β、TNF受体I、TNF受体II、TNIL-1、TPO、VEGF、VEGF A、VEGF B、VEGF C、VEGF D、VEGF受体1、VEGF受体2、VEGF受体3、GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β、GRO-γ、HCC1、1-309、HER1、HER2、HER3、HER4、血清白蛋白、vWF、淀粉样蛋白(例如,淀粉样蛋白α)、MMP12、PDK1、IgE、IL-13Rα1、IL-13Ra2、IL-15、IL-15R、IL-16、IL-17R、IL-17、IL-18、IL-18R、IL-23、IL-23R、IL-25、CD2、CD4、CD11a、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD56、CD138、ALK5、EGFR、FcER1、TGFb、CCL2、CCL18、CEA、CR8、CTGF、CXCL12(SDF-1)、糜蛋白酶、FGF、Furin、内皮缩血管肽-1、嗜酸粒细胞趋化蛋白(例如,嗜酸粒细胞趋化蛋白、嗜酸粒细胞趋化蛋白-2、嗜酸粒细胞趋化蛋白-3)、GM-CSF、ICAM-1、ICOS、IgE、IFNa、I-309、整联蛋白、L-选择蛋白、MIF、MIP4、MDC、MCP-1、MMP、嗜中性弹性蛋白酶、骨桥蛋白、OX-40、PARC、PD-1、RANTES、SCF、SDF-1、siglec8、TARC、TGFb、凝血酶、Tim-1、TNF、TRANCE、类胰蛋白酶、VEGF、VLA-4、VCAM、α4β7、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8、αvβ6、αvβ8、cMET、CD8、vWF、淀粉样蛋白(例如,淀粉样蛋白α)、MMP12、PDK1和IgE的目标物。
在一个实例中,双特异性配体包含结合TNFR1上第一表位的第一dAb和结合不同目标上表位的第二dAb。在另一个实例中,第二dAb结合血清白蛋白上的表位。
在其他实施方案中,配体是包含具有TNFR1结合特异性的第一表 位结合域和至少一个具有不同于第一表位结合域的结合特异性的其他抗原结合域的多特异性配体。例如,第一表位结合域可以是结合TNFR1的dAb或可以是包含结合TNFR1的dAb的CDR(例如,嫁接于合适的蛋白质支架或骨架上的CDR,支架或骨架例如为亲和体、SpA支架、LDL受体A类结构域或EGF结构域)的结构域或可以是结合TNFR1的结构域,其中结构域选自亲和体、SpA结构域、LDL受体A类结构域或EGF结构域。
在特定的实施方案中,多肽、拮抗剂、配体或抗-TNFR1dAb单体的特征在于以下的一个或更多个:1)与人TNFR1解离,具有50nM至20pM的解离常数(Kd)和5×10-1至1×10-7s-1的Koff速度常数;如通过表面等离子共振所测定的;2)抑制肿瘤坏死因子α(TNFα)与TNFR1的结合,具有500nM至50pM的IC50;3)在标准L929细胞测试中中和人TNFR1,具有500nM至50pM的ND50;4)在标准细胞测试中对抗TNFR1的活性,具有≤100nM的ND50,并且在该测试中浓度<10μM的dAb激动TNFR1的活性<5%;5)抑制在小鼠LSP/D-半乳糖胺诱导的败血病性休克模型中的致死力;6)抵抗聚集;7)当在大肠杆菌或毕赤酵母属种(例如,巴斯德毕赤酵母)中表达时,以至少约0.5mg/L的量分泌;8)可逆地去折叠(unfold);9)在选自小鼠胶原诱导的关节炎模型、小鼠ΔARE关节炎模型、小鼠ΔARE炎性肠病模型、小鼠葡聚糖硫酸钠诱导的炎性肠病模型、小鼠烟草烟雾慢性梗阻性肺病模型和适当的灵长动物模型(例如灵长动物胶原诱导的关节炎模型)的慢性炎症疾病的模型中具有功效;或10)在治疗、抑制或预防慢性炎症疾病中具有功效。对于适用于条件(1)至(10)的测定和测试以及参数的详细内容,参考WO2006038027,并且在此将其引入作为参考。
在特定的实施方案中,多肽、拮抗剂、配体或dAb单体与人TNFR1解离,具有50nM至20pM的解离常数(Kd)和5×10-1至1×10-7s-1的Koff速度常数,如通过表面等离子共振所测定的;抑制肿瘤坏死因子α(TNFα)与TNFR1的结合,具有500nM至50pM的IC50;在标准L929细胞测试中中和人TNFR1,具有500nM至50pM的ND50。在其他特定的实施方案中,多肽、拮抗剂、配体或dAb单体与人TNFR1解离,具有50nM至20pM的解离常数(Kd)和5×10-1至1×10-7s-1的Koff速度常数;抑制肿瘤坏死因子α(TNFα)与TNFR1的结合,具有500nM至50pM 的IC50;并且在选自小鼠胶原诱导的关节炎模型、小鼠ΔARE关节炎模型、小鼠ΔARE炎性肠病模型、小鼠葡聚糖硫酸钠诱导的炎性肠病模型、小鼠烟草烟雾慢性梗阻性肺病模型和适当的灵长动物模型(例如灵长动物胶原诱导的关节炎模型)的慢性炎症疾病的模型中具有功效。在其他特定的实施方案中,多肽、拮抗剂、配体或dAb单体与人TNFR1解离,具有50nM至20pM的解离常数(Kd)和5×10-1至1×10-/s-1的Koff速度常数,如通过表面等离子共振所测定的;在标准L929细胞测试中中和人TNFR1,具有500nM至50pM的ND50;并且在标准细胞测试中拮抗TNFR1的活性,具有≤100nM的ND50,并且浓度≤10μM的dAb在测试中激动TNFR1的活性≤5%。
本发明的蛋白酶抗性多肽、免疫球蛋白单可变域和拮抗剂在哺乳动物例如人的疾病或病症的治疗、预防和诊断中具有实用性。特别地,由于给药于患者如人时药物很可能遇到蛋白酶,因此它们具有实用性。例如,给药于GI道(例如,口服、舌下、直肠给药)时,在该情况中,多肽、免疫球蛋白单可变域和拮抗剂可能遇到上GI道、下GI道、口、胃、小肠和大肠中的一个或更多个中的蛋白酶。因此,一个实施方案提供了口服、舌下或直肠给药于患者GI道的蛋白酶抗性多肽、免疫球蛋白单可变域或拮抗剂,以治疗和/或预防患者的疾病或病症。例如,口服给药于患者(例如,人患者),用于治疗和/或预防TNFα-介导的病症或疾病,如关节炎(例如类风湿性关节炎)、IBD、牛皮癣或克罗恩氏病(Crohn’s disease)。
在另一个实例中,给药于(例如,通过吸入或鼻内)肺部组织(例如,肺或气道)时,多肽、可变域或拮抗剂很可能遇到蛋白酶。因此,一个实施方案提供了通过吸入或鼻内将蛋白酶抗性多肽、免疫球蛋白单可变域或拮抗剂给药于患者(例如,人)的肺部组织,以治疗和/或预防患者的疾病或病症。这样的病症可以是哮喘(例如,过敏性哮喘)、COPD、流感或WO2006038027中公开的任何其他肺部疾病或病症,在此引入作为参考。在另一个实例中,给药于(例如,通过眼内注射或作为滴眼剂)患者眼睛时,多肽、可变域或拮抗剂很可能遇到蛋白酶。因此,一个实施方案提供了将蛋白酶抗性多肽、免疫球蛋白单可变域或拮抗剂通过眼睛给药于患者(例如,人),以治疗和/或预防患者的疾病或病症(例如,眼睛的疾病或病症)。给药可以是局部给药于眼睛,以滴眼剂的形式, 或通过注入眼睛中,例如进入玻璃体中。
根据本发明的拮抗剂、多肽和免疫球蛋白单可变域可以呈现出提高的或相对高的解链温度(Tm),提供提高的稳定性。高亲和性目标结合也是或者是可替换地是拮抗剂、多肽和可变域的特征。这些特征中的一个或更多个,结合蛋白酶抗性,使得拮抗剂、可变域和多肽可以用作哺乳动物如人的药物,其中,例如对于GI道或肺部组织给药,很可能遇到蛋白酶。
因此,在一个方面中,本发明提供了用于口服递送的TNFR1拮抗剂。在一个方面中,本发明提供了用于递送至患者GI道的TNFR1拮抗剂。在一个方面中,本发明提供了TNFR1拮抗剂在制造用于口服递送的药物中的用途。在一个方面中,本发明提供了TNFR1在制造用于递送至患者GI道的药物中的用途。在一个实施方案中,可变域能抵抗胰蛋白酶和/或至少一种选自弹性蛋白酶、leucozyme和胰酶的其他蛋白酶。例如,能抵抗胰蛋白酶和弹性蛋白酶;胰蛋白酶和leucozyme;胰蛋白酶和胰酶;胰蛋白酶、弹性蛋白酶和leucozyme;胰蛋白酶、弹性蛋白酶和胰酶;胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胰酶和leucozyme;或胰蛋白酶、胰酶和leucozyme。
在一个方面中,本发明提供了用于肺部递送的TNFR1拮抗剂。在一个方面中,本发明提供了TNFR1拮抗剂用于递送到患者的肺。在一个方面中,本发明提供了TNFR1拮抗剂在制造用于肺部递送的药物中的用途。在一个方面中,本发明提供了TNFR1拮抗剂在制造用于递送至患者肺部的药物中的用途。在一个实施方案中,可变域能抵抗leucozyme。
在一个方面中,本发明提供了口服递送或递送药物至患者的GI道或至患者的肺或肺部组织的方法,其中该方法包括将药物学上有效量的本发明的TNFR1拮抗剂给药于患者。
在一个方面中,本发明提供了本发明的TNFR1拮抗剂用于治疗和/或预防炎症。在一个方面中,本发明提供了TNFR1拮抗剂在制造用于治疗和/或预防炎症的药物中的用途。在一个实施方案中,病症选自关节炎、多发性硬化、炎性肠病和慢性梗阻性肺病。例如,所述关节炎是类风湿性关节炎或幼年型类风湿性关节炎。例如所述炎性肠病选自克罗恩氏病和溃疡性结肠炎。例如,所述慢性梗阻性肺病选自慢性支气管炎、 慢性梗阻性支气管炎和肺气肿。例如所述肺炎是细菌性肺炎。例如所述细菌性肺炎是葡萄球菌性肺炎。
在一个方面中,本发明提供了TNFR1拮抗剂用于治疗和/或预防呼吸道疾病。在一个方面中,本发明提供了TNFR1拮抗剂在制造用于治疗和/或预防呼吸道疾病的药物中的用途。例如,所述呼吸道疾病选自肺炎、慢性梗阻性肺病、哮喘、肺炎、超敏性肺炎、肺嗜酸性粒细胞浸润症、环境性肺病、肺炎、支气管扩张、囊性纤维化、间质性肺病、原发性肺动脉高压、肺血栓栓塞症、胸膜病症、纵隔病症、横膈膜病症、肺换气不足、换气过度、睡眠窒息、急性呼吸窘迫综合症、间皮瘤、肉瘤、移植排斥、移植对抗宿主疾病、肺癌、过敏性鼻炎、过敏症、石绵沉着病、曲霉肿、曲霉病、支气管扩张、慢性支气管炎、肺气肿、.嗜酸细胞性肺炎、特发性肺纤维化、入侵性肺炎球菌病、流感、非结核性分枝杆菌病、胸腔积液、肺尘症、肺孢子虫病、肺炎、肺放线菌病、肺泡蛋白沉着症、肺炭疽、肺水肿、肺栓子、肺炎、肺组织细胞增生症X、肺动脉高压、肺诺卡菌病、肺结核、肺静脉闭塞症、类风湿性肺病、结节病和韦格内氏肉芽肿症。例如,疾病是慢性梗阻性肺病(COPD)。例如,疾病是哮喘。
可以使用任何合适的方法将本发明含有抑制TNFR1的药剂(例如,其中药剂选自抗体片段(例如,Fab片段、Fab’片段、Fv片段(例如,scFv、二硫化物键合的Fv)、F(ab’)2片段、dAb)、配体以及dAb单体和多聚体(例如,同型-或杂二聚体))的拮抗剂局部给药于对象肺组织(例如,肺)。例如,可以通过吸入或鼻内给药将药剂局部给药于肺部组织。对于吸入或鼻内给药,可以使用喷雾器、吸入器、雾化器、烟雾器、弥雾器、干粉吸入器、计量吸入器、计量喷雾器、计量弥雾器、计量雾化器或其他合适的吸入器或鼻内递送装置来给药TNFR1的拮抗剂。因此,在一个实施方案中,本发明提供了含有TNFR1拮抗剂的肺递送装置。在一个实施方案中,装置是吸入器或鼻内递送装置。
在一个方面中,本发明提供了含有TNFR1拮抗剂的口服制剂。该制剂可以是片剂、丸剂、胶囊、液体或糖浆。
在一个方面中,本发明提供了用于递送至肺的肺制剂,其中制剂含有本发明的拮抗剂、多肽或可变域,粒径范围小于5微米,例如,小于4.5、4、3.5或3微米(例如,在Britton-Robinson缓冲液中时,例如, 在6.5至8.0的pH,例如在7至7.5的pH,例如在pH7或pH7.5)。
在一个实施方案中,在6.5至8.0的pH下提供本发明的制剂和组合物,例如7至7.5,例如7,例如7.5。
根据本发明任一方面的可变域可以具有至少50℃的Tm,或至少55℃,或至少60℃,或至少65℃,或至少70℃。本发明的拮抗剂、用途、方法、装置或制剂可以含有这样的可变域。
在本发明的一个方面中,本发明的多肽、可变域、拮抗剂、组合物或制剂在Britton-Robinson缓冲液中在37至50℃下温育14天后(在1mg/ml的多肽或可变域浓度下)基本上是稳定的。在一个实施方案中,在37℃下这样的温育后,至少65、70、75、80、85、86、87、88、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%的多肽、拮抗剂或可变域保持未聚集。在一个实施方案中,在37℃下这样的温育后,至少65、70、75、80、85、86、87、88、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%的多肽或可变域保持单体。在一个实施方案中,在50℃下这样的温育后,至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、86、87、88、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%的多肽、拮抗剂或可变域保持未聚集。在一个实施方案中,在50℃下这样的温育后,至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、86、87、88、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%的多肽或可变域保持单体。在一个实施方案中,在任一个这样的温育后,未看到多肽、可变域、拮抗剂的聚集。在一个实施方案中,在37℃下在Britton-Robinson缓冲液中以1mg/ml的多肽或可变域浓度温育后,多肽或可变域的pI保持未改变或基本上未改变。
在本发明的一个方面中,本发明的多肽、可变域、拮抗剂、组合物或制剂在Britton-Robinson缓冲液在7至7.5的pH(例如,在pH7或pH7.5)在4℃下温育7天后(在100mg/ml的多肽或可变域浓度下)基本上是稳定的。在一个实施方案中,在这样的温育后,至少95、95.5、96、96.5、97、97.5、98、98.5、99或99.5%的多肽、拮抗剂或可变域保持未聚集。在一个实施方案中,在这样的温育后,至少95、95.5、96、96.5、97、97.5、98、98.5、99或99.5%的多肽或可变域保持单体。在一个实施方案中,在任一个这样的温育后,未看到多肽、可变域、拮抗剂的聚集。
在本发明的一个方面中,本发明的多肽、可变域、拮抗剂、组合物或制剂在例如喷射喷雾器,例如在Pari LC+杯中,例如,在室温、20℃或37℃下喷雾1小时后(在40mg/ml的多肽或可变域浓度下)基本上是稳定的。在一个实施方案中,在这样的喷雾后,至少65、70、75、80、85、86、87、88、90、91、92、93、94、95、95.5、96、96.5、97、97.5、98、98.5、99或99.5%的多肽、拮抗剂或可变域保持未聚集。在一个实施方案中,在这样的喷雾后,至少65、70、75、80、85、86、87、88、90、91、92、93、94、95、95.5、96、96.5、97、97.5、98、98.5、99或99.5%的多肽或可变域保持单体。在一个实施方案中,在任一个这样的喷雾后,未看到多肽、可变域、拮抗剂的聚集。
根据本发明任何方面的可变域可以在MRC-5细胞测试中中和TNFα刺激的IL-8释放,其具有2nM~50pM的ND50。本发明的拮抗剂、用途、方法、装置或制剂可以包含这类可变域。
在一个方面中,本发明提供了编码含有根据本发明任一方面的免疫球蛋白单可变域的多肽或编码根据本发明任一方面的多肽、拮抗剂或可变域的分离的或重组的核酸。在一个方面中,本发明提供了含有核酸的载体。在一个方面中,本发明提供了含有核酸或载体的宿主细胞。在一个方面中,本发明提供了生产含有免疫球蛋白单可变域的多肽的方法,该方法包括在适于所述核酸或载体表达的条件下维持宿主细胞,由此产生含有免疫球蛋白单可变域的多肽。该方法进一步包括分离多肽、可变域或拮抗剂,并任选产生比分离的多肽可变域或拮抗剂具有提高的亲和性和/或ND50的变体,例如,突变体。用于提高免疫球蛋白单可变域的结合亲和性的技术是本领域已知的,例如,用于亲和性突变的技术。
在一个方面中,本发明提供了含有本发明任一方面的免疫球蛋白单可变域、多肽或拮抗剂和药物学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物。
在一个实施方案中,本发明任一方面的免疫球蛋白单可变域或拮抗剂含有抗体恒定域,例如,抗体Fc,任选其中Fc的N-端连接(任选直接连接)可变域的C-端。
本发明的多肽或可变域可以是分离的和/或重组的。
本文描述了用于选择蛋白酶抗性肽或多肽的方法。该方法包括提供一组肽或多肽,在适于蛋白酶活性的条件下混合组和蛋白酶,并回收具 有理想生物活性(例如特异性结合TNFR1)的肽或多肽,由此选择蛋白酶抗性肽或多肽。
通常将组和蛋白酶温育至少约30分钟的时间段。在该方法中可以使用任何所需的蛋白酶,如以下的一种或更多种,丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、基质金属蛋白酶、羧肽酶(例如,羧肽酶A、羧肽酶B)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、弹性蛋白酶、leukozyme、胰酶、凝血酶、血纤维蛋白溶酶、组织蛋白酶(例如,组织蛋白酶G)、蛋白酶(例如,蛋白酶1、蛋白酶2、蛋白酶3)、嗜热菌蛋白酶、凝乳酶、肠肽酶、胱天蛋白酶(例如,胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶5、胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶12、胱天蛋白酶13)、钙激活中性蛋白酶、无花果蛋白酶(ficain)、梭菌蛋白酶、奇异果蛋白酶(actinidain)、菠萝蛋白酶和分离酶。在特定的实施方案中,蛋白酶是胰蛋白酶、弹性蛋白酶或leucozyme。还可以通过生物提取物、生物匀浆或生物制剂来提供蛋白酶。如果需要,该方法进一步包括在完成温育后将蛋白酶抑制剂加入组和蛋白酶的混合物中。
在一些实施方案中,基于结合活性回收具有所需生物活性的肽或多肽。例如,可以基于结合通用配体(如蛋白A、蛋白G或蛋白L)来回收肽或多肽。结合活性还可以是对目标配体的特异性结合。示例性目标配体包括ApoE、Apo-SAA、BDNF、心肌营养素-1、CEA、CD40、CD40配体、CD56、CD38、CD138、EGF、EGF受体、ENA-78、嗜酸粒细胞趋化蛋白、嗜酸粒细胞趋化蛋白-2、Exodus-2、FAPα、FGF-酸性、FGF-碱性、成纤维细胞生长因子-10、FLT3配体、Fractalkine(CX3C)、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-β1、人血清白蛋白、胰岛素、IFN-γ、IGF-I、IGF-II、IL-1α、IL-1β、IL-1受体、IL-1I型受体、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8(72a.a.)、IL-8(77a.a.)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18(IGIF)、抑制素α、抑制素β、IP-10、角化细胞生长因子-2(KGF-2)、KGF、瘦蛋白、LIF、淋巴细胞趋化因子、缪勒管抑制物质、单核细胞集落抑制因子、单核细胞引诱蛋白、M-CSF、MDC(67a.a.)、MDC(69a.a.)、MCP-1(MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC(67a.a.)、MDC(69a.a.)、MIG、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、MIP-3β、MIP-4、脊髓源祖细胞抑制剂因子-1(MPIF-1)、NAP-2、神经营养因子、神经生长因子、β-NGF、NT-3、NT-4、制瘤素M、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDF1α、SDF1β、SCF、SCGF、干细胞因子(SCF)、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-β2、TGF-β3、肿瘤坏死因子(TNF)、TNF-α、TNF-β、TNF受体I、TNF受体II、TNIL-1、TPO、VEGF、VEGF A、VEGFB、VEGF C、VEGF D、VEGF受体1、VEGF受体2、VEGF受体3、GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β、GRO-γ、HCC1、1-309、HER1、HER2、HER3、HER4、血清白蛋白、vWF、淀粉样蛋白(例如,淀粉样蛋白α)、MMP12、PDK1、IgE、IL-13Rα1、IL-13Ra2、IL-15、IL-15R、IL-16、IL-17R、IL-17、IL-18、IL-18R、IL-23、IL-23R、IL-25、CD2、CD4、CD11a、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD56、CD138、ALK5、EGFR、FcER1、TGFb、CCL2、CCL18、CEA、CR8、CTGF、CXCL12(SDF-1)、糜蛋白酶、FGF、Furin、内皮缩血管肽-1、嗜酸粒细胞趋化蛋白(例如,嗜酸粒细胞趋化蛋白、嗜酸粒细胞趋化蛋白-2、嗜酸粒细胞趋化蛋白-3)、GM-CSF、ICAM-1、ICOS、IgE、IFNa、I-309、整联蛋白、L-选择蛋白、MIF、MIP4、MDC、MCP-1、MMP、嗜中性弹性蛋白酶、骨桥蛋白、OX-40、PARC、PD-1、RANTES、SCF、SDF-1、siglec8、TARC、TGFb、凝血酶、Tim-1、TNF、TRANCE、类胰蛋白酶、VEGF、VLA-4、VCAM、α4β7、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8、αvβ6、αvβ8、cMET、CD8、vWF、淀粉样蛋白(例如,淀粉样蛋白α)、MMP12、PDK1和IgE。
在特定的实施方案中,通过淘洗来回收肽或多肽。
在一些实施方案中,组包括展示系统。例如,展示系统可以是噬菌体展示、核糖体展示、乳液区室化(emulsion compartmentalization)和展示、酵母展示、嘌呤霉素展示、细菌展示、在质粒上展示或共价展示。示例性展示系统与核酸的编码功能和由核酸编码的肽或多肽的功能性特征相关。在特定的实施方案中,展示系统含有可复制的遗传包。
在一些实施方案中,展示系统包括噬菌体展示。例如,噬菌体可以是fd、M13、λ、MS2或T7。在特定的实施方案中,噬菌体展示系统是多价的。在一些实施方案中,作为pIII融合蛋白来展示肽或多肽。
在其他实施方案中,该方法进一步包括扩增编码具有所需生物活性的肽或多肽的核酸。在特定的实施方案中,通过噬菌体扩增、细胞生长或聚合酶链式反应来扩增核酸。
在一些实施方案中,组是一组免疫球蛋白单可变域。在特定的实施方案中,免疫球蛋白单可变域是重链可变域。在更特别的实施方案中,重链可变域是人重链可变域。在其他实施方案中,免疫球蛋白单可变域是轻链可变域。在特定的实施方案中,轻链可变域是人轻链可变域。
在另一个方面中,提供了从一组肽或多肽中选择以高亲和性结合目标配体例如TNFR1的肽或多肽的方法。该方法包括提供一组肽或多肽,在适于蛋白酶活性的条件下混合组和蛋白酶并回收结合目标配体的肽或多肽。
通常将组和蛋白酶温育至少约30分钟的时间段。在该方法中可以使用任何所需的蛋白酶,如以下的一种或更多种,丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、基质金属蛋白酶、羧肽酶(例如,羧肽酶A、羧肽酶B)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、弹性蛋白酶、leukozyme、胰酶、凝血酶、血纤维蛋白溶酶、组织蛋白酶(例如,组织蛋白酶G)、蛋白酶(例如,蛋白酶1、蛋白酶2、蛋白酶3)、嗜热菌蛋白酶、凝乳酶、肠肽酶、胱天蛋白酶(例如,胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶5、胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶12、胱天蛋白酶13)、钙激活中性蛋白酶、无花果蛋白酶(ficain)、梭菌蛋白酶、奇异果蛋白酶(actinidain)、菠萝蛋白酶和分离酶。在特定的实施方案中,蛋白酶是胰蛋白酶、弹性蛋白酶或leucozyme。还可以通过生物提取物、生物匀浆或生物制剂来提供蛋白酶。如果需要,该方法进一步包括在完成温育后将蛋白酶抑制剂加入组和蛋白酶的混合物中。
可以基于结合任何所需的目标配体如在此公开的目标配体(例如TNFR1)来回收肽或多肽。在特定的实施方案中,通过淘洗来回收肽或多肽。
在一些实施方案中,组包括展示系统。例如,展示系统可以是噬菌体展示、核糖体展示、乳液区室化(emulsion compartmentalization)和展示、酵母展示、嘌呤霉素展示、细菌展示、在质粒上展示或共价展示。示例性展示系统与核酸的编码功能和由核酸编码的肽或多肽的功能性特征相关。在特定的实施方案中,展示系统含有可复制的遗传包。
在一些实施方案中,展示系统包括噬菌体展示。例如,噬菌体可以是fd、M13、λ、MS2或T7。在特定的实施方案中,噬菌体展示系统是 多价的。在一些实施方案中,作为pIII融合蛋白来展示肽或多肽。
在其他实施方案中,该方法进一步包括扩增编码具有所需生物活性的肽或多肽的核酸。在特定的实施方案中,通过噬菌体扩增、细胞生长或聚合酶链式反应来扩增核酸。
在一些实施方案中,组是一组免疫球蛋白单可变域。在特定的实施方案中,免疫球蛋白单可变域是重链可变域。在更特别的实施方案中,重链可变域是人重链可变域。在其他实施方案中,免疫球蛋白单可变域是轻链可变域。在特定的实施方案中,轻链可变域是人轻链可变域。
在另一个方面中,本文描述了生产一组蛋白酶抗性肽或多肽的方法。该方法包括提供一组肽或多肽,在适于蛋白酶活性的条件下混合一组肽或多肽和蛋白酶,并回收多个具有所需生物活性的肽或多肽,由此产生一组蛋白酶抗体肽或多肽。
在一些实施方案中,将组和蛋白酶温育至少约30分钟的时间段。例如,在该方法中所用的蛋白酶可以是以下的一种或更多种,丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、基质金属蛋白酶、羧肽酶(例如,羧肽酶A、羧肽酶B)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、弹性蛋白酶、leukozyme、胰酶、凝血酶、血纤维蛋白溶酶、组织蛋白酶(例如,组织蛋白酶G)、蛋白酶(例如,蛋白酶1、蛋白酶2、蛋白酶3)、嗜热菌蛋白酶、凝乳酶、肠肽酶、胱天蛋白酶(例如,胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶5、胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶12、胱天蛋白酶13)、钙激活中性蛋白酶、无花果蛋白酶(ficain)、梭菌蛋白酶、奇异果蛋白酶(actinidain)、菠萝蛋白酶和分离酶。在特定的实施方案中,蛋白酶是胰蛋白酶、弹性蛋白酶或leucozyme。还可以通过生物提取物、生物匀浆或生物制剂来提供蛋白酶。如果需要,该方法进一步包括在完成温育后将蛋白酶抑制剂加入组和蛋白酶的混合物中。
在一些实施方案中,基于结合活性回收多个具有所需生物活性的肽或多肽。例如,可以基于结合通用配体(如蛋白A、蛋白G或蛋白L)来回收多个肽或多肽。结合活性还可以是对目标配体的特异性结合,如本文所述的目标配体。在特定的实施方案中,通过淘洗回收多个具有所需生物活性的肽或多肽。
在一些实施方案中,组包括展示系统。例如,展示系统可以是噬菌 体展示、核糖体展示、乳液区室化(emulsion compartmentalization)和展示、酵母展示、嘌呤霉素展示、细菌展示、在质粒上展示或共价展示。在特定的实施方案中,展示系统与核酸的编码功能和由核酸编码的肽或多肽的功能性特征相关。在特定的实施方案中,展示系统含有可复制的遗传包。
在一些实施方案中,展示系统包括噬菌体展示。例如,噬菌体可以是fd、M13、λ、MS2或T7。在特定的实施方案中,噬菌体展示系统是多价的。在一些实施方案中,作为pIII融合蛋白来展示肽或多肽。
在其他实施方案中,该方法进一步包括扩增编码多个具有所需生物活性的肽或多肽的核酸。在特定的实施方案中,通过噬菌体扩增、细胞生长或聚合酶链式反应来扩增核酸。
在一些实施方案中,组是一组免疫球蛋白单可变域。在特定的实施方案中,免疫球蛋白单可变域是重链可变域。在更特别的实施方案中,重链可变域是人重链可变域。在其他实施方案中,免疫球蛋白单可变域是轻链可变域。在特定的实施方案中,轻链可变域是人轻链可变域。
在另一个方面中,本文描述了从组中选择蛋白酶抗性多肽的方法,该多肽包括结合目标配体例如TNFR1的免疫球蛋白单可变域(dAb)。在一个实施方案中,该方法包括提供含有一组多肽的噬菌体展示系统,该多肽含有免疫球蛋白单可变域,在适于蛋白酶活性的条件下,将噬菌体展示系统和选自弹性蛋白酶、leucozyme和胰蛋白酶的蛋白酶混合,并回收展示了含有结合目标配体的免疫球蛋白单可变域的多肽的噬菌体。
在一些实施方案中,以100μg/ml来使用蛋白酶,并将混合的噬菌体展示系统和蛋白酶在约37℃下温育过夜。
在一些实施方案中,通过结合所述目标来回收展示了含有结合目标配体的免疫球蛋白单可变域的多肽的噬菌体。在其他实施方案中,通过淘洗来回收展示了含有结合目标配体的免疫球蛋白单可变域的多肽的噬菌体。
本文还描述了通过本文所述的方法可选择的或已选择的分离的蛋白酶抗性肽或多肽。在特定的实施方案中,本文提供了通过本文所述的方法可选择的或已选择的分离的蛋白酶(例如,胰蛋白酶、弹性蛋白酶、leucozyme)抗性免疫球蛋白单可变域(例如,人抗体重链可变域,人抗 体轻链可变域)。
本文还描述了编码通过本文所述的方法可选择的或已选择的蛋白酶抗性肽或多肽(例如,胰蛋白酶-、弹性蛋白酶-或leucozyme-抗性免疫球蛋白单可变域)的分离的或重组的核酸,以及含有该核酸的载体(例如,表达载体)和宿主细胞。
本文还描述了制备通过本文所述的方法可选择的或已选择的蛋白酶抗性肽或多肽(例如,胰蛋白酶-、弹性蛋白酶-或leucozyme-抗性免疫球蛋白单可变域)的方法,包括在适于表达的条件下维持含有编码蛋白酶抗性肽或多肽的重组核酸的宿主细胞,由此产生蛋白酶抗性肽或多肽。
本文还描述了通过本文所述的方法可选择的或已选择的蛋白酶抗性肽或多肽(例如,胰蛋白酶-、弹性蛋白酶-或leucozyme-抗性免疫球蛋白单可变域)用于药物中(例如,用于治疗或诊断)。本文还描述了通过本文所述的方法可选择的或已选择的蛋白酶抗性肽或多肽(例如,胰蛋白酶-、弹性蛋白酶-或leucozyme-抗性免疫球蛋白单可变域)用于制造治疗疾病的药物的用途。本文还描述了治疗疾病的方法,包括将有效量的通过本文所述的方法可选择的或已选择的蛋白酶抗性肽或多肽(例如,胰蛋白酶-、弹性蛋白酶-或leucozyme-抗性免疫球蛋白单可变域)给药于需要的患者。
本文还描述了用于测定样品中是否存在TNFR1或样品中存在多少TNFR1的诊断试剂盒,其含有本发明的多肽、免疫球蛋白可变域(dAb)或拮抗剂和使用说明书(例如,用于测定样品中TNFR1的存在和/或含量)。在一些实施方案中,试剂盒进一步包括一种或更多种助剂,如合适的缓冲剂或合适的检测剂(例如,结合本发明的多肽或dAb的可检测标记的抗体或其抗原结合片段或与其连接或缀合的部分)。
本发明还涉及包括固体表面的装置,在该表面上固定了本发明的多肽拮抗剂或dAb,使得固定的多肽或dAb结合TNFR1。可以使用在其上可以固定抗体或其抗原结合片段的任何合适的固体表面,例如,玻璃、塑料、碳水化合物(例如,琼脂糖珠子)。如果需要,支持物可以含有或将其修饰来含有所需的功能基团,以促进固定。装置和或支持物可以具有任何合适的形状,例如,片状、棒状、条状、平板、载玻片、珠子、丸状、圆板、凝胶、管状、球状、芯片、平板或圆盘等。在一些实施方 案中,装置是量杆。
附图说明
图1是pDOM 13(aka pDOM33)的多克隆位点的说明,其用来制备噬菌体展示组。
图2显示了用来自用40ug/ml胰蛋白酶在30℃下温育不同时间点的dAb的样品进行的几个Novex 10-20%Tricene凝胶电泳。就在加入胰蛋白酶之前,然后在加入胰蛋白酶之后一小时、三小时和24小时时立即取样。用1xSureBlue将蛋白质染色。凝胶说明DOM 15-10和DOM15-26-501在用胰蛋白酶温育的头三个小时的过程中都得到了明显消化。DOM 15-26、DOM 4-130-54和DOM 1h-131-511的消化只在用胰蛋白酶温育24小时后才变得明显。
图3是DOM 1h-131-511和24个选择的变体的氨基酸序列的说明。选定克隆中不同于亲本序列的氨基酸是高亮显示的(相同的那些用圆点标记)。用框显示对应于CDR1、CDR2和CDR3的环。
图4是DOM 4-130-54和27个选择的变体的氨基酸序列的说明。选定克隆中不同于亲本序列的氨基酸是高亮显示的(相同的那些用圆点标记)。用框显示对应于CDR1、CDR2和CDR3的环。
图5是DOM 15-26-555和21个选择的变体的氨基酸序列的说明。选定克隆中不同于亲本序列的氨基酸是高亮显示的(相同的那些用圆点标记)。用框显示对应于CDR1、CDR2和CDR3的环。
图6是DOM 15-10和16个选择的变体的氨基酸序列的说明。选定克隆中不同于亲本序列的氨基酸是高亮显示的(相同的那些用圆点标记)。用框显示对应于CDR1、CDR2和CDR3的环。
图7A-7D是显示了用不同浓度的胰蛋白酶(从0至100μg/ml)在37℃温育过夜后亲本dAb,DOM 1h-131-511(图7A)和三个变体dAb,DOM 1h-131-203(图7B)、DOM 1h-131-204(图7C)和DOM 1h-131-206(图7D)与固定的TNFR1结合的BIAcore痕迹。结果表明所有三个变体对高浓度胰蛋白酶(100ug/ml)的蛋白水解的抗性比亲本高。
图8A-8C是显示了用弹性蛋白酶和leucozyme温育过夜后dAbDOM 1h-131-511(图8A)、DOM 1h-131-202(图8B)和DOM 1h-131-206(图8C)与固定的TNFR1结合的BIAcore痕迹。与亲本相比,dAb显 示出对抗弹性蛋白酶和leucozyme的蛋白水解提高的抗性。
图9显示了用胰蛋白酶温育前dAb DOM 1h-131-511、DOM1h-131-203、DOM 1h-131-204、DOM 1h-131-206、DOM 1h-131-54、DOM1h-131-201和DOM 1h-131-202的样品和用100μg/ml胰蛋白酶温育1小时、3小时和24小时后的样品进行的两个4-12%Novex Bis-Tris凝胶电泳。
图10A-10C是显示了用不同浓度的胰蛋白酶(从0至100μg/ml)在37℃温育过夜后DOM 4-130-54(图10A)、DOM 4-130-201(图10B)和DOM 4-130-202(图10C)与固定的IL-1R1融合蛋白结合的BIAcore痕迹。结果显示两种变体对高浓度胰蛋白酶(100μg/ml)的蛋白水解的抗性都比它们的亲本高。
图11A-11C是显示了用弹性蛋白酶和leucozyme温育过夜后DOM4-130-54(图11A)、DOM 4-130-201(图11B)和DOM 4-130-202(图11C)与固定的IL-1R1融合蛋白结合的BIAcore痕迹。与亲本相比,dAb显示出对抗所测试的两种蛋白酶的蛋白水解提高的抗性。
图12是DOM 15-26-555和6个变体的氨基酸序列的说明。选定克隆中不同于亲本序列的氨基酸是高亮显示的(相同的那些用圆点标记)。
图13A和13B是显示了亲本dAb,DOM 15-26-555(图13A)和蛋白酶抗性最大的变体,DOM 1h-131-206(图13B)与固定的VEGF结合的BIAcore痕迹。在用浓度为200μg/ml的胰蛋白酶温育后,在100nM的dAb浓度下,比较BIAcore上亲本和变体的hVEGF结合。将反应在37℃下进行三小时或24小时。结果表明在胰蛋白酶处理24小时后,变体对蛋白水解的抗性比亲本高。
图14是显示了胰蛋白酶处理对DOM 15-26-555变体的hVEGF结合的影响的图。结果清楚地显示出在胰蛋白酶处理24小时后,所有变体对蛋白水解的抗性比亲本(DOM 15-26-555)高。
图15显示了装载了15μg处理过的和未处理过的DOM 15-26-555或DOM 1h-131-206样品的两个Novex 10-20%Tricine凝胶。就在加入胰蛋白酶之前,然后在加入胰蛋白酶之后一小时、三小时和24小时时立即取样。用1xSureBlue将蛋白质染色。凝胶说明DOM 1h-131-206的胰蛋白酶抗性特征不同于BIAcore实验显示的特征。
图16是DOM 15-10和变体,DOM 15-10-11的氨基酸序列的说明。 变体中不同于亲本序列的氨基酸是高亮显示的(相同的那些用圆点标记)。
图17A和17B是显示了亲本,DOM 15-10(图17A)和变体,DOM15-10-11(图17B)与固定的VEGF结合的BIAcore痕迹。在用浓度为200μg/ml的胰蛋白酶温育后,在100nM的dAb浓度下,比较BIAcore上亲本和变体的hVEGF结合。将反应在37℃下进行一小时、三小时或24小时。结果表明在胰蛋白酶处理24小时后,变体对蛋白水解的抗性比亲本高。
图18显示了装载了15μg DOM 15-10或DOM 15-10-11样品的两个Novex 10-20%Tricine凝胶。就在加入胰蛋白酶之前,然后在加入胰蛋白酶之后一小时、三小时和24小时时立即取样。用SureBlue(1x)将蛋白质染色。结果表明BIAcore研究中看到的结合活性直接反映出蛋白质的完整性。
图19A-19L说明了编码是DOM 1h-131-511或DOM 4-130-54变体的dAb的几个核酸的核苷酸序列。核苷酸序列各自编码图3和图4中所示的氨基酸序列。
图20A-20E说明了编码是DOM 15-26-555或DOM 15-10变体的dAb的几个核酸的核苷酸序列。核苷酸序列各自编码图5和图6中所示的氨基酸序列。
图21显示了pDOM 38的载体图谱。
图22:显示了Labchip上在30℃下在25∶1dAb∶胰蛋白酶比例下用胰蛋白酶处理DOM10-53-474和DOM 1h-131-206蛋白质不同时间点的凝胶电泳。箭头显示全长蛋白
图23:显示了通过MMC色谱接着阴离子交换的纯化后从每个样品获得的高水平纯度的大小排阻色谱痕迹。在225nm下监控UV,并将柱子在含有10%乙醇(v/v)的1xPBS中运行。通过整合使用基线校准的峰面积来计算单体百分比。
图24:显示了DOM 1h-131-511、DOM 1h-131-202和DOM1h-131-206的蛋白酶稳定性数据。
图25:是SEC,其说明了DOM 1h-131-202、DOM 1h-131-206和DOM 1h-131-511在37和50℃下在Britton-Robinson中的14天稳定性数据。对于所有dAb,蛋白质浓度为1mg/ml。SEC用来测定蛋白质在热应 力过程中是否发生了任何变化和相对于时间=0(T0)样品溶液中残余的单体含量。
图26A至I:显示了SEC痕迹,其显示了热应力(37和50℃)对DOM 1h-131-511(A至C),-202(D至F)和-206(G至I)的影响。还显示了在给定时间点时相对于T=0溶液中残余的单体含量。
图27:显示了DOM 1h-131-202、DOM 1h-131-206和DOM1h-131-511在24hr、48hr以及7和14天热应力的IEF分析。样品已经在Britton-Robinson缓冲液中在37或50℃下进行了温育。
图28:TNFR-1BRA,显示了DOM 1h-131-202、DOM 1h-131-206和DOM 1h-131-511在50℃下温育14天的影响。假定蛋白质浓度为1mg/ml。还显示了没有结合抗原的阴性对照dAb(VH模型(dummy))。
图29:说明了将~100mg/ml的A:DOM 1h-131-202、B:DOM 1h-131-206和C:DOM 1h-131-511在Britton-Robinson缓冲液中在+4℃下存储7天的影响。在280nm下监控UV。
图30:显示了来自DOM 1h-131-202、DOM 1h-131-206和DOM1h-131-511在Pari E-fiow和LC+中的喷雾器测试的数据。在任一Britton-Robinson缓冲液中,蛋白质浓度为5mg/ml。
图31:说明了Britton-Robinson缓冲液中5mg/ml的DOM1h-131-202、DOM 1h-131-206和DOM 1h-131-511在喷雾过程中单体浓度的相对百分比变化。
图32:显示了Brittor-Robinson缓冲液中DOM 1h-131-206和DOM1h-131-511从Pari LC+喷雾后的SEC痕迹。
图33:显示了PBS中40mg/ml的DOM 1h-131-206在1小时的喷雾过程中的SEC痕迹。喷雾器杯和气雾剂中的蛋白质对于喷雾过程中dAb经受到的剪切力和热应力的影响都是高度抗性的。
图34:显示了三种主要蛋白质(DOM 1h-131-206和DOM 1h-131-511和DOM 1h-131-202)中每一种的沉淀速度曲线。对于DOM 1h-131-206较低浓度的样品观察到的双峰是由于该情况中样品从室中泄漏出来造成的假象。
图35:显示了缓冲液和装置对GSK 1995056A(DOM 1h-131-511)喷雾液滴大小的影响。
图36:显示了GSK 1995056A(DOM 1h-131-511)在各种装置中喷 雾后的稳定性,通过二聚体形成来测定,如通过SEC来测量。
图37:显示了GSK 1922567A(202)、GSK 1995057A(206)和GSK 1995056A(511)在Pari E-flow和LC+中的喷雾器测试。A)在Britton-Robinson缓冲液中测试,B)在PEG 1000/蔗糖缓冲液中测试。
图38:描绘了人TNFR1受体结合测试中的TNF-α剂量曲线。每个样品重复四次进行测试。
图39:显示了GSK 1922567A(DOM 1h-131-202)、GSK 1995057A(DOM 1h-131-206)和GSK 1995056A(DOM 1h-131-511)在人TNFR1受体结合测试中的抑制作用。每个样品重复四次进行测试。
图40:说明了DOM 15-26和DOM 15-26-593dAb在VEGF RBA中的功效。
图41:显示了将5mg/mg DMS 1529(DOM 15-26-593)和DMS 1545(DOM 15-26-501)以单次浓注(bolus)剂量i.v.给药于大鼠后的药物动力学。
图42a:显示了DMS 1529Fc融合体(DOM 15-26-593Fc融合体)的SEC-MALL(大小排阻色谱-多角度激光散射)分析,证实了单体的特征。显示了两个不同的批次,对于折射率(即,浓度;虚线)和光散射(实线),证明了相似的特征。用箭头标记的线条表示分子量计算。
图42b:显示了DMS 1529Fc融合体(DOM 15-26-593Fc融合体)的AUC(分析超速离心)分析,证实了单体的特征。在三个不同的浓度下(PBS缓冲液中接近0.2、0.5&1.0mg/ml)测试一批材料。沉淀速率的分析证实了大约80kDa的分子量。
图43:显示了DMS 1529(DOM 15-26-593)和DOM 15-26-501的DSC痕迹。
图44:是对两个不同批次的材料进行10次冻-融循环之前和之后,DMS 1529(DOM1h-131-206)的VEGF结合ELISA。
图45:显示了10次冻-融循环之前和之后,DOM 15-26-593SEC特征的一致性。
图46:说明了DMS 1529融合体(DOM 15-26-593Fc融合体)的加速稳定性研究的结果;结合ELISA证明了在所示温度下温育7天后的活性。
图47A:显示了在37℃温育14&15天后,人猕猴中的DMS 1529 (DOM 15-26-593)的稳定性。
图47B:显示了在37℃温育14&15天后,人血清中的DMS 1529(DOM 15-26-593)的稳定性。
图48:显示了DOM 15-26&DOM 15-26-593dAb作为Fc融合体(各自为DOM 1564&DOM1529)在VEGF RBA中的功效。
图49:说明了DMS 1529融合体(DOM 15-26-593FC融合体)对HUVEC细胞增殖的抑制作用。
图50:pDom33载体图谱。
图51:描绘了结合血清白蛋白的dAb的序列(氨基酸和核苷酸序列)。
具体实施方式
在本说明书中,已经参照实施方案,以使得说明书既清楚又简明的撰写方式来描述了本发明。但是打算并且应当理解,可以对这些实施方案进行各种组合和分开,而没有脱离本发明。
除非另外限定,在此所用的所有技术和科学术语都具有本领域(例如,细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学)普通技术人员公知的相同含义。将标准技术用于分子、遗传和生化方法(通常参见,Sambrook等,Molecular Cloning:A LaboratoryManual(分子克隆,实验室手册),第2版(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.和Ausubel等,Short Protocols in Molecular Biology(简明分子生物学实验方法)(1999)第4版,John Wiley&Sons,Inc.,在此将其引入作为参考)和化学方法。
如在此所用的,术语“肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)的拮抗剂”或“抗-TNFR1拮抗剂”等指的是结合TNFR1并可以抑制(即,一种或更多种)TNFR1功能的物质(例如,分子,化合物)。例如TNFR1的拮抗剂能够抑制TNFα结合TNFR1和/或抑制通过TNFR1介导的信号转导。因此,利用TNFR1的拮抗剂能够抑制TNFR1介导的过程和细胞应答(例如在标准的L929细胞毒性测试中的TNFα诱导的细胞死亡)。
如在此所用的,“肽”指的是通过肽键连接在一起的两个至约50个氨基酸。
如在此所用的,“多肽”指的是通过肽键连接在一起的至少约50 个氨基酸。多肽通常包括三级结构并折叠成功能域。
如在此所用的,“对蛋白酶降解抗性的”肽或多肽(例如,域抗体(dAb))是在适于蛋白酶活性的条件下用蛋白酶温育时,基本上不受蛋白酶的降解。在适于蛋白酶活性的温度下用蛋白酶温育一小时后,不超过约25%、不超过约20%、不超过约15%、不超过约14%、不超过约13%、不超过约12%、不超过约11%、不超过约10%、不超过约9%、不超过约8%、不超过约7%、不超过约6%、不超过约5%、不超过约4%、不超过约3%、不超过约2%、不超过约1%或基本上没有蛋白质受蛋白酶降解时,多肽(例如,dAb)基本上是没有降解的。例如37或50℃。可以使用任何合适的方法来测定蛋白质降解,例如,如本文所述的。通过SDS-PAGE或通过功能测试(例如,配体结合)。
如在此所用的,“展示系统”指的是其中基于所需特征(如,物理、化学或功能特征)易于选择的多肽或肽的集合的系统。展示系统可以是合适的多肽或肽的组(例如,在溶液中,固定在合适的支持物上)。展示系统还可以是使用细胞表达系统(例如,在转化的、感染的、转染的或转导的细胞中核酸文库的表达和细胞表面上所编码多肽的展示)或非细胞表达系统(例如,乳液区室化和展示)的系统。示例性展示系统与核酸的编码功能以及由核酸编码的多肽或肽的物理、化学和/或功能特征相关。使用这样的展示系统时,可以选择具有所需物理、化学和/或功能特征的多肽或肽,并可以容易地分离或回收编码选定多肽或肽的核酸。与核酸的编码功能以及多肽或肽的物理、化学和/或功能特征相关的各种展示系统是本领域已知的,例如,细菌噬菌体(bacteriophage)展示(噬菌体展示,例如噬粒展示)、核糖体展示、乳液区室化和展示、酵母展示、嘌呤霉素展示、细菌展示、在质粒上展示、共价展示等。(参见,例如,EP 0436597(Dyax)、U.S.专利No.6,172,197(McCafferty等)、U.S.专利No.6,489,103(Griffiths等))。
如在此所用的,“组(repertoire)”指的是特征在于氨基酸序列多样性的多肽或肽的集合。组的单个成员可以具有共同的特征,如共同的结构特征(例如,共同的核心结构)和/或共同的功能特征(例如,结合共同配体(例如,通用配体或目标配体,TNFR1)的能力)。
如在此所用的,“功能性”描述了具有生物活性的多肽或肽,如特定的结合活性。例如,术语“功能性多肽”包括通过其抗原-结合位点结 合目标抗原的抗体或其抗原-结合片段。
如在此所用的,“通用配体"指的是结合给定组的绝大部分(例如,基本上全部)功能性成员的配体。通用配体(例如,共同的通用配体)可以结合给定组的许多成员,即使成员对于共同的目标配体不具有结合特异性。通常,多肽上功能性通用配体结合位点的存在(如通过结合通用配体的能力来表明)表明多肽是正确折叠的和功能性的。通用配体的合适实例包括超抗原、结合在组的绝大部分功能性成员上表达的表位的抗体等。
“超抗原”是指在与这些蛋白的目标配体结合位点不同的位点与免疫球蛋白超家族的成员相互作用的通用配体的术语。葡萄球菌肠毒素是与T-细胞受体相互作用的超抗原的实例。结合抗体的超抗原包括蛋白G,其结合IgG恒定域(Bjorck和Kronvall,J.Immunol.,133:969(1984));蛋白A,其结合IgG恒定域和VH结构域(Forsgren和Sjoquist,J.Immunol.,97:822(1966));和蛋白L,其结合VL结构域(Bjorck,J.Immunol.,140:1194(1988))。
如在此所用的,“目标配体”指的是由多肽或肽特异性或选择性结合的配体。例如,多肽是抗体或其抗原-结合片段时,目标配体可以是任何所需的抗原或表位。与目标抗原的结合取决于功能性的多肽或肽。
如在此所用的,抗体指的是IgG、IgM、IgA、IgD或IgE或片段(如Fab、F(ab’)2、Fv、二硫化物连接的scFv、闭合构象多特异性抗体、二硫化物连接的scFv、diabody),不管是源自天然产生抗体的物种,或是通过重组DNA技术形成的;不管是分离自血清、B-细胞、杂交瘤、转染瘤、酵母或细菌。
如在此所用的,“抗体形式”指的是其中可以引入一个或更多个抗体可变域使得给予结构上抗原结合特异性的任何合适的多肽结构。各种合适的抗体形式是本领域已知的,如,嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体、双特异性抗体、抗体重链、抗体轻链、抗体重链和/或轻链的同型二聚体和杂二聚体、之前任一项的抗原结合片段(例如,Fv片段(例如,单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv)、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段)、单抗体可变域(例如,dAb、VH、VHH、VL)和之前任一项的修饰形式(例如,通过聚乙二醇或其他合适聚合物或人源化VHH的共价连接修饰的)。
短语“免疫球蛋白单可变域”指的是与其他V区或域无关的特异性结合抗原或表位的抗体可变域(VH、VHH、VL)。免疫球蛋白单可变域可以以带有其他可变区或可变域的形式(例如,同型-或杂-多聚体)存在,其中其他区或域对于单免疫球蛋白可变域的抗原结合不是所需的(即,其中免疫球蛋白单可变域结合抗原与其他可变域无关)。“域抗体”或“dAb”与在此所用的术语“免疫球蛋白单可变域"相同。“单抗体可变域"或“抗体单可变域”与在此所用的术语“免疫球蛋白单可变域"相同。在一个实施方案中,免疫球蛋白单可变域是人抗体可变域,但还包括来自其他物种的单抗体可变域,如啮齿动物(例如,WO00/29004中公开的,在此将其内容作为整体引入作为参考)、护士鲨和Camelid VHH dAb。Camelid VHH是源自包括骆驼、美洲驼、羊驼、单峰骆驼和原驼的物种的免疫球蛋白单可变域多肽,其产生天然缺少轻链的重链抗体。可以将VHH人源化。
“结构域"是经过折叠的蛋白质结构,其具有与蛋白质其余部分无关的蛋白质三级结构。通常,结构域负责蛋白质的分离的功能特征,并且在许多情况下可以添加、去除或转移给其他蛋白质,而不丧失该蛋白质和/或该结构域的其余部分的功能。“单抗体可变域"是指经过折叠的多肽域,包含抗体可变域的特征性序列。因此,其包括完整的抗体可变区和修饰的可变域,例如,其中一个或更多个环已经由不是抗体可变区特征性的序列替代,或已被截断或包含N-端或C-端延伸的抗体可变域,以及保留全长结构域的至少结合活性和特异性的可变域的折叠片段。
术语“文库"指的是异源多肽或核酸的混合物。文库由成员组成,每个成员具有单个多肽或核酸序列。就这点而言,“文库”和“组"同义。文库成员之间的序列差异造成文库中存在的多样性。文库可以采用多肽或核酸的简单混合物的形式,或者用核酸文库转化的生物体或细胞的形式,例如细菌、病毒、动物或植物细胞等。在一个实施方案中,各个生物体或细胞仅含有一个或数目有限的文库成员。在一个实施方案中,将核酸掺入到表达载体中,以表达该核酸所编码的多肽。因此,在一个方面中,文库可以采用宿主生物体群的形式,每个生物体含有一个或更多个拷贝的表达载体,所述载体含有核酸形式的文库的单个成员,所述核酸可以表达而产生其相应的多肽成员。因此,宿主生物体群具有编码一大组不同多肽的潜力。
“通用框架”是单抗体框架序列,对应于序列中的保守抗体区,如Kabat限定的(“Sequences of Proteins of Immunological Interest”(免疫学重要性蛋白的序列),USDepartment of Health and Human Services(美国卫生和人类服务部)),或对应于人种系免疫球蛋白组或结构,如Chothia和Lesk限定的,(1987)J.Mol.Biol.196:910-917。文库和组可以使用单个框架,或一组这样的框架,已经发现其允许实质上任何结合特异性的产生,尽管变化仅在超变区内。
如在此所用的,术语“剂量"指的是在一次给药(单位剂量),或在限定时间间隔内两次或更多次给药时给药于患者的全部配体量。例如,剂量可以指的是在一天(24小时)(日剂量)、两天、一周、两周、三周或一个或更多个月(例如,通过单次给药,或通过两次或更多次给药)的过程中给药于患者的配体量(例如,含有结合目标抗原的免疫球蛋白单可变域的配体)。给药之间的间隔可以是任何所需的时间量。
短语“半衰期”是指配体的血清浓度在体内降至50%所需的时间,例如因为通过天然机制所致的配体降解和/或清除或螯合。本发明的配体在体内可以是稳定的,其半衰期因结合抗降解和/或清除或螯合的分子而延长。通常,这类分子是天然存在的蛋白质,它们本身在体内具有较长的半衰期。如果配体的功能活性在体内的持续时间比对延长半衰期的分子不具有特异性的类似配体更长的话,则配体半衰期延长。例如,将对人血清白蛋白(HAS)和靶分子具有特异性的配体,与对HSA无特异性且不结合HSA,而结合别的分子的相同配体进行比较。例如,它能结合细胞上的第三目标物。通常,半衰期延长10%、20%、30%、40%、50%或更多。半衰期延长范围在2x、3x、4x、5x、10x、20x、30x、40x、50x或以上是可能的。或者,或另外,半衰期延长范围高达30x、40x、50x、60x、70x、80x、90x、100x、150x也是可能的。
如在此所用的,“流体动力学大小”指的是基于分子通过水溶液扩散的分子(例如,蛋白质分子,配体)的表观大小。将蛋白质通过溶液的扩散或移动进行处理,以得到蛋白质的表观大小,其中通过蛋白质颗粒的“Stokes半径”或“流体动力学半径”来给出大小。蛋白质的“流体动力学大小”取决于质量和形状(构象),使得具有相同分子量的两个蛋白质基于蛋白质的整体构象可以具有不同的流体动力学大小。
如在此所用的,术语“竞争”意思是第一目标与其同源目标结合域 的结合在所述同源目标特异性的第二结合域的存在下受到抑制。例如,结合可以受到空间抑制,例如,通过结合域的物理阻断或通过改变结合域的结构或环境,使其对目标的亲和性或亲和力降低。对于怎样进行竞争ELISA和竞争BiaCore实验来测定第一和第二结合域之间的竞争的详细内容参见WO2006038027。
如下进行两个序列之间的“同源性”或“同一性"或“相似性”(在此可将这些术语互换使用)的计算。为了优化比较目的,将序列比对(例如,为了比较目的,对于最佳比对,可以在第一个和第二个氨基酸或核酸序列中引入缺口,并且非同源序列可以忽略不计)。在一个实施方案中,为了比较目的,所比对的参考序列的长度占参考序列长度的至少30%,或至少40%,或至少50%,或至少60%,或至少70%,80%,90%,100%。然后,将相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸进行比较。当第一序列中的某个位置由与第二序列相应位置的相同氨基酸残基或核苷酸占据时,那么分子在该位置上是相同的(在此所用的氨基酸或核酸“同源性”等同于氨基酸或核酸“同一性”)。两个序列之间的同一性百分比是考虑了缺口数和每个缺口的长度后序列共有的相同位置数的函数,需要引入这些缺口以进行两个序列的最佳比对。可以使用BLAST2Sequences算法,使用缺省参数,来准备和测定如在此所限定的氨基酸和核苷酸序列比对和同源性、相似性或同一性(Tatusova,T.A.等,FEMSMicrobiol Lett,174:187-188(1999))。
选择方法
在一个实施方案中,本发明涉及通过选择蛋白酶抗性肽和多肽的方法选择的具有所需生物活性的多肽和dAb。在方法中使用了两种选择程序来产生有效的方法,用于选择对蛋白酶降解高度稳定和抗性的并具有所需生物活性的多肽。如本文所述的,蛋白酶抗性肽和多肽通常保持生物活性。相反,在本文所述的方法中,蛋白酶敏感性肽和多肽受到蛋白酶的分裂或降解,并因此,失去其生物活性。因此,通常基于其生物活性如结合活性来选择蛋白酶抗性肽或多肽。
本文所述的方法提供了几个优点。例如,如在此公开的和例举的,对能抵抗一种蛋白酶(例如,胰蛋白酶)的蛋白水解降解而选择的可变域、拮抗剂、肽或多肽也能抵抗其他蛋白酶(例如,弹性蛋白酶、leucozyme)的降解。在一个实施方案中,蛋白酶抗性与肽或多肽的较高解链温度(Tm)相关。较高的解链温度表示更稳定的可变域、拮抗剂、肽和多肽。在一个实施方案中,对蛋白酶降解的抗性还与对目标配体的高亲和性结合相关。因此,本文所述的方法提供了选择、分离和/或回收具有所需生物活性并且非常适于体内治疗和/或诊断用途(因为这些是蛋白酶抗性和稳定的)的可变域、拮抗剂、肽、多肽的有效途径。在一个实施方案中,蛋白酶抗性与提高的PK相关,例如,提高的超过非蛋白酶抗性的可变域、拮抗剂、肽或多肽。提高的PK可以是提高的AUC(曲线下面积)和/或提高的半衰期。在一个实施方案中,蛋白酶抗性与可变域、拮抗剂、肽或多肽对剪切力和/或热应力的提高的稳定性和/或喷雾过程中降低的聚集倾向相关,例如,提高的超过非蛋白酶抗性的可变域、拮抗剂、肽或多肽。在一个实施方案中,蛋白酶抗性与提高的存储稳定性相关,例如,提高的超过非蛋白酶抗性的可变域、拮抗剂、肽或多肽。在一个方面中,提供了一个、两个、三个、四个或全部优点,优点是对蛋白酶降解的抗性、较高的Tm和对目标配体的高亲和性结合。
在一个方面中,提供了从肽和多肽的文库或组(例如,展示系统)中选择、分离和/或回收对蛋白酶(例如,一种或更多种蛋白酶)降解抗性的肽或多肽的方法。在一个实施方案中,该方法是从肽和多肽的文库或组(例如,展示系统)中选择、分离和/或回收对蛋白酶(例如,一种或更多种蛋白酶)降解抗性的多肽的方法。通常,该方法包括提供肽或多肽的文库或组,在适于蛋白酶活性的条件下将文库或组与蛋白酶(例如,胰蛋白酶、弹性蛋白酶、leucozyme、胰酶、痰液)混合,并选择、分离和/或回收对蛋白酶降解抗性的并具有所需生物活性的肽或多肽。由于蛋白酶的活性,蛋白酶降解的肽或多肽通常具有降低的生物活性或失去其生物活性。因此,可以使用基于生物活性的方法来选择、分离和/或回收对蛋白酶降解抗性的肽或多肽,生物活性如结合活性(例如,结合通用配体,结合特异性配体,结合底物)、催化活性或其他生物活性。
在适于蛋白酶的蛋白水解活性的条件下,将肽或多肽的文库或组与蛋白酶(例如,一种或更多种蛋白酶)混合。适于蛋白酶的蛋白水解活性的条件以及含有蛋白水解活性的生物制剂或混合物是本领域公知的,并可以通过本领域普通技术人员容易地测定。如果需要,例如,可以通过测定一定范围的pH条件、蛋白酶浓度、温度下的蛋白酶活性和/或通 过改变文库或组与蛋白酶反应的时间量来鉴定或优化合适的条件。例如,在一些实施方案中,蛋白酶例如胰蛋白酶与肽或多肽(例如,可变域)的比例(以摩尔/摩尔为基础)为800至80,00(例如,8,000至80,000)蛋白酶∶肽或多肽,例如,使用10微克/ml蛋白酶时,比例为800至80,000蛋白酶∶肽或多肽;或使用100微克/ml蛋白酶时,比例为8,000至80,000蛋白酶∶肽或多肽。在一个实施方案中,蛋白酶(例如,胰蛋白酶)与肽或多肽(例如,可变域)的比例(以重量/重量为基础,例如微克/微克)为1,600至160,000(例如,16,000至160,000)蛋白酶∶肽或多肽,例如,使用10微克/ml蛋白酶时,比例为1,600至160,000蛋白酶∶肽或多肽;或使用100微克/ml蛋白酶时,比例为16,000至160,000蛋白酶∶肽或多肽。在一个实施方案中,使用至少100或1000微克/ml浓度的蛋白酶,并且蛋白酶例如胰蛋白酶与肽或多肽(例如,可变域)的蛋白酶∶肽比例(以摩尔/摩尔为基础)为8,000至80,000蛋白酶∶肽或多肽。在一个实施方案中,使用至少10微克/ml浓度的蛋白酶,并且蛋白酶例如胰蛋白酶与肽或多肽(例如,可变域)的蛋白酶∶肽比例(以摩尔/摩尔为基础)为800至80,000蛋白酶∶肽或多肽。在一个实施方案中,例如,C为10微克/ml时,蛋白酶(例如,胰蛋白酶)与肽或多肽(例如,可变域)的比例(以重量/重量为基础,例如微克/微克)为1600至160,000蛋白酶∶肽或多肽;或C或C’为100微克/ml时,比例为16,000至160,000蛋白酶∶肽或多肽。在一个实施方案中,浓度(c或c’)为至少100或1000微克/ml蛋白酶。对于测试单个或分离的肽或多肽(例如,免疫球蛋白可变域),例如,已经从组或文库中分离出来的,可以将蛋白酶加入合适缓冲液(例如,PBS)中的肽或多肽溶液中,以产生肽或多肽/蛋白酶溶液,如至少约0.01%(w/w)蛋白酶/肽或多肽的溶液,约0.01%至约5%(w/w)蛋白酶/肽或多肽,约0.05%至约5%(w/w)蛋白酶/肽或多肽,约0.1%至约5%(w/w)蛋白酶/肽或多肽,约0.5%至约5%(w/w)蛋白酶/肽或多肽,约1%至约5%(w/w)蛋白酶/肽或多肽,至少约0.01%(w/w)蛋白酶/肽或多肽,至少约0.02%(w/w)蛋白酶/肽或多肽,至少约0.03%(w/w)蛋白酶/肽或多肽,至少约0.04%(w/w)蛋白酶/肽或多肽,至少约0.05%(w/w)蛋白酶/肽或多肽,至少约0.06%(w/w)蛋白酶/肽或多肽,至少约0.07%(w/w)蛋白酶/肽或多肽,至少约0.08%(w/w)蛋白酶/肽或多肽,至少约0.09%(w/w)蛋白酶/肽或多肽,至 少约0.1%(w/w)蛋白酶/肽或多肽,至少约0.2%(w/w)蛋白酶/肽或多肽,至少约0.3%(w/w)蛋白酶/肽或多肽,至少约0.4%(w/w)蛋白酶/肽或多肽,至少约0.5%(w/w)蛋白酶/肽或多肽,至少约0.6%(w/w)蛋白酶/肽或多肽,至少约0.7%(w/w)蛋白酶/肽或多肽,至少约0.8%(w/w)蛋白酶/肽或多肽,至少约0.9%(w/w)蛋白酶/肽或多肽,至少约1%(w/w)蛋白酶/肽或多肽,至少约2%(w/w)蛋白酶/肽或多肽,至少约3%(w/w)蛋白酶/肽或多肽,至少约4%(w/w)蛋白酶/肽或多肽,或约5%(w/w)蛋白酶/肽或多肽。可以在蛋白酶活性合适的温度下(例如,室温,约37℃)温育混合物,并以(例如,1小时,2小时,3小时等)时间间隔取样。使用任何合适的方法,如SDS-PAGE分析或配体结合,分析样品的蛋白质降解,并且结果可以用来建立降解的时间过程。
在本文所述的方法中,可以使用任何所需的一种或更多种蛋白酶。例如,可以使用单种蛋白酶,不同蛋白酶的任何所需组合或含有蛋白水解活性的任何生物制剂、生物提取物或生物匀浆。所用一种或更多种蛋白酶的特性不必定是已知的。可以单独或以任何所需组合来使用的蛋白酶的合适实例包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、基质金属蛋白酶、羧肽酶(例如,羧肽酶A、羧肽酶B)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、弹性蛋白酶、leukozyme、胰酶、凝血酶、血纤维蛋白溶酶、组织蛋白酶(例如,组织蛋白酶G)、蛋白酶(例如,蛋白酶1、蛋白酶2、蛋白酶3)、嗜热菌蛋白酶、凝乳酶、肠肽酶、胱天蛋白酶(例如,胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶5、胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶12、胱天蛋白酶13)、钙激活中性蛋白酶、无花果蛋白酶(ficain)、梭菌蛋白酶、奇异果蛋白酶(actinidain)、菠萝蛋白酶和分离酶。合适的含有蛋白水解活性的生物提取物、匀浆和制剂包括痰液、粘液(例如,胃粘液、鼻粘液、支气管粘液)、支气管肺泡灌洗、肺匀浆、肺提取物、胰腺提取物、胃液、唾液、眼泪等。以适于发生蛋白水解降解的含量使用蛋白酶。例如,如本文所述的,可以使用约0.01%至约5%(w/w,蛋白酶/肽或多肽)的蛋白酶。将蛋白酶与包括肽或多肽组的展示系统(例如,噬菌体展示系统)混合时,例如,可以使用约10μg/ml至约3mg/ml浓度的蛋白酶,约10μg/ml,约20μg/ml,约30μg/ml,约40μg/ml,约50μg/ml,约60μg/ml,约70μg/ml,约80μg/ml,约90μg/ml,约100μg/ml,约200μg/ml,约300μg/ml,约400μg/ml,约500μg/ml,约600μg/ml,约700μg/ml,约800μg/ml,约900μg/ml,约1000μg/ml,约1.5mg/ml,约2mg/ml,约2.5mg/ml或约3mg/ml。
在适于蛋白酶活性的温度下将蛋白酶与肽或多肽的集合(文库或组)一起温育。例如,可以在约20℃至约40℃的温度下温育蛋白酶和肽或多肽的集合(例如,在室温,约20℃,约21℃,约22℃,约23℃,约24℃,约25℃,约26℃,约27℃,约28℃,约29℃,约30℃,约31℃,约32℃,约33℃,约34℃,约35℃,约36℃,约37℃,约38℃,约39℃,约40℃)。将蛋白酶和肽或多肽的集合一起温育一段足以发生蛋白水解降解的时间。例如,可以将肽或多肽的集合与蛋白酶温育约30分钟至约24或约48小时。在一些实施例中,将肽或多肽的集合与蛋白酶一起温育过夜,或至少约30分钟,约1小时,约1.5小时,约2小时,约3小时,约4小时,约5小时,约6小时,约7小时,约8小时,约9小时,约10小时,约11小时,约12小时,约13小时,约14小时,约15小时,约16小时,约17小时,约18小时,约19小时,约20小时,约21小时,约22小时,约23小时,约24小时,约48小时,或更长时间。
通常理想的是,至少在较早的选择轮次中(例如,使用展示系统时),与没有包括蛋白酶温育的选择相比,蛋白酶导致选择的具有所需生物活性的克隆数量减少至少一个数量级。在特定的实施例中,方法中所用的蛋白酶含量和条件足以将回收的克隆数量减少至少一个对数(10倍),至少约2个对数(100倍),至少约3个对数(1000倍)或至少约4个对数(10,000倍)。使用常规方法和/或在此提供的指导,可以容易地测定导致所需回收克隆减少的合适的蛋白酶含量和温育条件。
可以使用任何合适的方法(例如,体外、体内或离体(ex vivo))来混合并温育蛋白酶和肽或多肽的集合。例如,可以在合适的容器中将蛋白酶和肽或多肽的集合混合并在适于蛋白酶活性的温度下保持静止、摇晃、振荡、涡旋等。如果需要,可以在体内或离体(exvivo)系统中混合蛋白酶和肽或多肽的集合,如通过将多肽的集合(例如,噬菌体展示文库或组)引入合适的动物中(例如,小鼠),经过对于蛋白酶活性而言足够的时间后,回收肽或多肽的集合。在另一个实施例中,用多肽 的集合(例如,噬菌体展示文库或组)灌注器官或组织,经过对于蛋白酶活性而言足够的时间后,回收多肽的集合。
温育后,可以基于所需生物活性如结合活性来选择蛋白酶抗性肽或多肽。如果需要,可以在选择前加入蛋白酶抑制剂。可以使用基本上不干扰选择方法的任何合适的蛋白酶抑制剂(或两种或更多种蛋白酶抑制剂的组合物)。合适的蛋白酶抑制剂的实例包括,α1-抗-胰蛋白酶、α2-巨球蛋白、阿吗他定、抗凝血酶III、抑肽酶、4-(2-氨乙基)苯磺酰基氟化物氢氯化物(AEBSF)、(4-脒基-苯基)-甲烷-磺酰氟化物(APMSF)、贝他定、苄脒、抑凝乳蛋白酶素、3,4-二氯异香豆素、二异丙基氟磷酸盐(DIFP)、E-64、乙二胺四乙酸(EDTA)、弹性蛋白酶抑制剂(elastatinal)、亮肽素、N-乙基马来酰亚胺、苯甲基磺酰氟化物(PMSF)、抑胃肽、1,10-邻二氮杂菲、膦酰二肽(phosphoramidon)、丝氨酸蛋白酶抑制剂、N-甲苯磺酰基-L-赖氨酸-氯甲基酮(TLCK)、Na-甲苯磺酰基-Phe-氯甲基酮(TPCK)等。此外,许多含有几类蛋白酶抑制剂的制剂是可购得的(例如,Roche Complete Protease Inhibitor CocktailTabletsTM(RocheDiagnostics Corporation;Indianapolis,IN,USA),其抑制胰凝乳蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶、胰腺提取物和胰蛋白酶)。
可以使用所需的生物活性选择方法来选择蛋白酶抗性肽或多肽,这种选择方法可以使具有所需生物活性的肽和多肽与不具有所需生物活性的肽和多肽区分开来并进行选择。通常,已经受到蛋白酶消化或分裂的肽或多肽失去了它们的生物活性,而蛋白酶抗性肽或多肽仍然保留功能。因此,对于生物活性合适的测试可以用来选择蛋白酶抗性肽或多肽。例如,可以使用合适的结合测试(例如,ELISA、淘选)来测定共同的结合功能(例如,结合通用配体,结合特异性配体或结合底物)。例如,可以通过淘选或使用合适的亲和性基质来选择、分离和/或回收结合目标配体或通用配体(如蛋白A、蛋白L或抗体)的多肽。可以通过将配体(例如,通用配体、目标配体)溶液加入合适的容器(例如,试管、培养皿)中并使配体沉积或覆盖在容器壁上来完成淘选。将过量的配体洗掉并将多肽(例如,噬菌体展示文库)加入容器中,并将容器维持在适于多肽结合固定化配体的条件下。将未结合的多肽洗掉,使用任何合适的方法(如刮下(scraping)或降低pH)来回收结合的多肽。
使用噬菌体展示系统时,可以在噬菌体ELISA中测试结合。可以根 据任何合适的程序来进行噬菌体ELISA。在一个实施例中,通过ELISA筛选每一轮选择产生的噬菌体群与选定的目标配体或通用配体的结合,以鉴定呈现出蛋白酶抗性肽或多肽的噬菌体。如果需要,可以测试可溶性肽和多肽与目标配体或通用配体的结合,例如,通过ELISA,例如,使用对抗C-或N-端标记物的试剂(参见,例如Winter等(1994),Ann.Rev.Immunology 12,433-55以及其中引用的参考文献)。还可以通过PCR产物的凝胶电泳(Marks等,1991,上文;Nission等,1994,上文)、探针检测(Tomlinson等,1992,J.Mol.Biol.227,776)或通过载体DNA的测序来测定选定噬菌体的多样性。
除了对TNFR1的特异性,含有抗-TNFR1蛋白酶抗性多肽(例如,单抗体可变域)的拮抗剂或多肽(例如,双特异性配体)可以具有通用配体或任何所需目标配体的结合特异性,目标配体如人或动物蛋白,包括细胞因子、生长因子、细胞因子受体、生长因子受体、酶(例如,蛋白酶)、酶的辅因子、DNA结合蛋白、脂质和碳水化合物。
在一些实施方案中,蛋白酶抗性肽或多肽(例如,dAb)或拮抗剂结合肺组织中的TNFR1。在一个实施方案中,拮抗剂或多肽还结合肺组织中的其他目标物。
在本文所述的方法中使用展示系统时(例如,与核酸的编码功能和该核酸编码的肽或多肽的功能性特征相关的展示系统),常常能有利地扩增或提高编码选定肽或多肽的核酸的拷贝数。这提供了一条获得足量核酸和/或肽或多肽的有效途径,以用于更多轮次的选择,使用本文所述的方法或其他合适的方法,或用于制备其他的组(例如,亲和性突变组)。因此,在一些实施方案中,该方法包括使用展示系统(例如,与核酸的编码功能和该核酸编码的肽或多肽的功能性特征相关的展示系统,如噬菌体展示)并进一步包括扩增或提高编码选定肽或多肽的核酸的拷贝数。可以使用任何合适的方法来扩增核酸,如通过噬菌体扩增、细胞生长或聚合酶链式反应。
本文所述的方法可以用作计划的一部分来分离蛋白酶抗性肽或多肽,例如,dAb,如果需要,可以包括其他合适的选择方法。在这些情况中,可以在计划的任何所需点使用本文所述的方法,如在使用其他选择方法之前或之后。本文所述的方法还可以用来提供两轮或更多轮的选择,如本文所述和举例说明的。
在一个实施例中,方法用于选择能抵抗弹性蛋白酶降解的肽或多肽,例如dAb,包括提供肽或多肽的文库或组,在适于弹性蛋白酶的蛋白水解消化的条件下将文库或组与弹性蛋白酶(或含有弹性蛋白酶的生物制剂、提取物或匀浆)混合,并选择、分离和/或回收能抵抗弹性蛋白酶降解并具有TNFR1结合活性的肽或多肽。
在特定的实施方案中,提供了选择能抵抗弹性蛋白酶降解并结合TNFR1的免疫球蛋白单可变域(dAb)的方法。在这些实施方案中,提供了含有dAb的文库或组,并在适于弹性蛋白酶的蛋白水解消化的条件下与弹性蛋白酶(或含有弹性蛋白酶的生物制剂、提取物或匀浆)混合。选择特异性结合TNFR1的弹性蛋白酶抗性dAb。例如,弹性蛋白酶抗性dAb在0.04%(w/w)弹性蛋白酶溶液中在37℃下持续至少约2小时时基本上没有降解。在一个实施方案中,弹性蛋白酶抗性dAb在0.04%(w/w)弹性蛋白酶溶液中在37℃下持续至少约12小时时基本上没有降解。在一个实施方案中,弹性蛋白酶抗性dAb在0.04%(w/w)弹性蛋白酶溶液中在37℃下持续至少约24小时、至少约36小时或至少约48小时时基本上没有降解。
在一个实施方案中,提供了选择能抵抗弹性蛋白酶降解并结合TNFR1的免疫球蛋白单可变域(dAb)的方法,该方法包括提供含有一组多肽的噬菌体展示系统,该多肽含有免疫球蛋白单可变域,将噬菌体展示系统与弹性蛋白酶(约100μg/ml)混合并将混合物在约37℃下温育,例如过夜(例如,约12-16小时),然后选择呈现出特异性结合TNFR1的dAb的噬菌体。
在一个实施例中,提供了选择能抵抗leucozyme降解的肽或多肽(例如,dAb)的方法,包括提供肽或多肽的文库或组,在适于leucozyme的蛋白水解消化的条件下将文库或组与leucozyme(或含有leucozyme的生物制剂、提取物或匀浆)混合,并选择、分离和/或回收能抵抗leucozyme降解并具有特异性TNFR1结合活性的肽或多肽。
在特定的实施方案中,提供了选择能抵抗leucozyme降解并结合TNFR1的免疫球蛋白单可变域(dAb)的方法。在这些实施方案中,提供了含有dAb的文库或组,并在适于leucozyme的蛋白水解消化的条件下与leucozyme(或含有leucozyme的生物制剂、提取物或匀浆)混合。选择特异性结合TNFR1的leucozyme抗性dAb。例如,leucozyme抗性dAb在0.04%(w/w)leucozyme溶液中在37℃下持续至少约2小时时基本上没有降解。在一个实施方案中,leucozyme抗性dAb在0.04%(w/w)leucozyme溶液中在37℃下持续至少约12小时时基本上没有降解。在一个实施方案中,leucozyme抗性dAb在0.04%(w/w)leucozyme溶液中在37℃下持续至少约24小时、至少约36小时或至少约48小时时基本上没有降解。
在一个实施方案中,提供了选择能抵抗leucozyme降解并特异性结合TNFR1的免疫球蛋白单可变域(dAb)的方法,该方法包括提供含有一组多肽的噬菌体展示系统,该多肽含有免疫球蛋白单可变域,将噬菌体展示系统与leucozyme(约100μg/ml)混合并将混合物在约37℃下温育,例如过夜(例如,约12-16小时),然后选择呈现出特异性结合TNFR1的dAb的噬菌体。
在另一个实施例中,提供了用于选择对胰蛋白酶降解有抗性的肽或多肽(例如dAb)的方法,其包括提供肽或多肽的文库或组,在适于胰蛋白酶蛋白水解消化的条件下将所述文库或组与胰蛋白酶组合,以及选择、分离和/或回收对胰蛋白酶降解有抗性且特异性结合TNFR1的肽或多肽。
在特定的实施方案中,提供了选择对胰蛋白酶降解有抗性且特异性结合TNFR1的免疫球蛋白单可变域(dAb)的方法。在这些实施方案中,提供了包含dAb的文库或组,并将其与胰蛋白酶(或包含胰蛋白酶的生物制剂、提取物或匀浆液)在适于胰蛋白酶蛋白水解消化的条件下组合。选择结合TNFR1的胰蛋白酶抗性dAb。例如,在37℃下在0.04%(w/w)胰蛋白酶溶液中温育至少大约2小时的时间段时,胰蛋白酶抗性dAb基本上不被降解。在一个实施方案中,在37℃下在0.04%(w/w)胰蛋白酶溶液中温育至少大约3小时的时间段时,胰蛋白酶抗性dAb基本上不被降解。在37℃下在0.04%(w/w)胰蛋白酶溶液中温育至少大约4小时、至少大约5小时、至少大约6小时、至少大约7小时、至少大约8小时、至少大约9小时、至少大约10小时、至少大约11小时、或至少大约12小时的时间段时,胰蛋白酶抗性dAb基本上不被降解。
在示范性的实施方案中,提供了用于选择对胰蛋白酶降解有抗性且特异性结合TNFR1的免疫球蛋白单可变域(dAb)的方法。该方法包括提供噬菌体展示系统(其包含一组含有免疫球蛋白单可变域的多肽), 将所述噬菌体展示系统与胰蛋白酶(100μg/ml)组合,并在大约37℃下温育混合物例如过夜(例如大约12-16小时),接着选择展示特异性结合TNFR1的dAb的噬菌体。
在另一个方面中,提供了一组产生蛋白酶抗性肽或多肽(例如,dAb)的方法。该方法包括提供一组肽或多肽;在适于蛋白酶活性的条件下将肽或多肽组与蛋白酶混合;并回收多个特异性结合TNFR1的肽或多肽,由此产生一组蛋白酶抗性肽或多肽。在此对于其他方法描述了适用于该方法中的蛋白酶、展示系统、用于蛋白酶活性的条件和选择肽或多肽的方法。
在一些实施方案中,使用了含有一组肽或多肽的展示系统(例如,与核酸的编码功能和该核酸编码的肽或多肽的功能性特征相关的展示系统),并且该方法进一步包括扩增或提高编码多个选定肽或多肽的核酸的拷贝数。可以使用任何合适的方法来扩增核酸,如通过噬菌体扩增、细胞生长或聚合酶链式反应。
在特定的实施方案中,提供了产生一组包含抗-TNFR 1dAb的蛋白酶抗性多肽的方法。该方法包括提供一组包含dAb的多肽;在适于蛋白酶活性的条件下将肽或多肽组与蛋白酶(例如,胰蛋白酶、弹性蛋白酶、leucozyme)混合;并回收多个包含具有TNFR1结合特异性的dAb的多肽。该方法可以用于产生天然组,或偏向所需结合活性的组,如基于具有TNFR1结合特异性的亲本dAb的亲和性突变组。
多肽展示系统
在一个实施方案中,提供用于本文所述方法中的肽或多肽的组或文库包含合适的展示系统。该展示系统可以抵抗蛋白酶的降解(例如,单种蛋白酶或蛋白酶的组合,以及含有蛋白水解活性的任何生物提取物、匀浆或制剂(例如,痰液、粘液(例如,胃粘液、鼻粘液、支气管粘液)、支气管灌洗、肺匀浆、肺提取物、胰腺提取物、胃液、唾液、眼泪等))。在一个实施方案中,展示系统以及展示系统与所展示肽之间的联系至少抵抗蛋白酶能与组中最稳定的肽或多肽那样。这使得可以容易地分离和/或扩增编码选定的展示多肽的核酸。
在一个实施例中,可以从溶液中或共价或非共价连接合适表面(如塑料或玻璃(例如,微滴定平板、多肽阵列,如微阵列))的一组肽或 多肽中选择、分离和/或回收蛋白酶抗性肽或多肽,例如dAb。例如,可以使用在表面上的肽阵列,其排列方式使每个不同的文库成员(例如,独特的肽序列)处于阵列中分开的、预定的位置。可以通过阵列中的空间位置来决定该阵列中每个文库成员的身份。可以测定在目标配体与例如反应性文库成员之间发生结合作用的阵列中的位置,因此基于空间位置来鉴定反应性成员的序列。(参见,例如,U.S.专利No.5,143,854,WO90/15070和WO92/10092)。
在一个实施方案中,该方法使用连接核酸的编码功能和该核酸编码的多肽的物理、化学和/或功能性特征的展示系统。这样的展示系统可以包括多个可复制的遗传包,如噬菌体或细胞(细菌)。在一个实施方案中,展示系统包括文库,如细菌噬菌体展示文库。
已经描述了各种合适的细菌噬菌体展示系统(例如,多价展示和多价展示系统)。(参见,例如,Griffiths等,U.S.专利No.6,555,313B1(在此引入作为参考);Johnson等,U.S.专利No.5,733,743(在此引入作为参考);McCafferty等,U.S.专利No.5,969,108(在此引入作为参考);Mulligan-Kehoe,U.S.专利No.5,702,892(在此引入作为参考);Winter,G.等,Annu.Rev.Immunol.12:433-455(1994);Soumillion P.等,Appl.Biochem.Biotechnol.47(2-3):175-189(1994);Castagonoli,L.等,Comb.Chem.HighThroughput Screen,4(2):121-133(2001))。细菌噬菌体展示系统中展示的肽或多肽可以在任何合适的细菌噬菌体上展示,如丝状噬菌体(例如,fd,M 13,F 1)、溶菌噬菌体(例如,T4、T7、λ)或RNA噬菌体(例如,MS2)。
通常,产生或提供展示一组肽或噬菌体多肽的噬菌体文库,作为与合适的噬菌体外壳蛋白(例如,fd pIII蛋白)的融合蛋白。融合蛋白可以展示在噬菌体外壳蛋白尖端的肽或多肽,或如果需要,在内部位置。例如,展示的肽或多肽可以存在于pIII结构域1的氨基端的位置。(pIII的结构域1也称为N1)。展示的肽可以直接与pIII融合(例如,pIII结构域1的N-端)或使用连接物与pIII融合。如果需要,融合体可以进一步包括标记物(例如,myc表位、His标记物)。可以使用任何合适的方法来产生包括作为与噬菌体外壳蛋白的融合蛋白展示的一组肽或多肽的文库,如通过将编码展示的肽或多肽的噬菌体载体或噬粒载体的文库引入合适的宿主细胞中,并培养所得到的细菌来产生噬菌体(例如, 如果需要,使用合适的辅助噬菌体或补充质粒)。可以使用任何合适的方法从培养物中回收噬菌体文库,如沉淀和离心。
展示系统可以包含一组含有任何所需量多样性的肽或多肽。例如,组可以含有具有对应于由生物体、一组生物体(例如,一组分离自Camelid的VHH dAb的序列)、所需组织或所需细胞类型表达的天然产生多肽的氨基酸序列的肽或多肽,或可以含有具有随机或随机化氨基酸序列的肽或多肽。如果需要,多肽可以共有共同的核心或支架。该组或文库中的多肽可以包含随机或随机化氨基酸序列的限定片段或共同的氨基酸序列的片段。在特定的实施方案中,组中所有或基本上所有的多肽是所需类型的,如所需的酶(例如,聚合酶)或所需的抗体的抗原结合片段(例如,人VH或人VL)。在实施方案中,多肽展示系统包含一组多肽,其中每个多肽包含抗体可变域。例如,组中的每个多肽可以含有VH、VL或Fv(例如,单链Fv)。
可以使用任何合适的方法将氨基酸序列多样性引入任何所需的肽或多肽或支架的片段中。例如,可以通过使用任何合适的诱变方法(例如,低保真度PCR、寡核苷酸-介导的或定向突变、使用NNK密码子的多样化)或任何其他合适的方法制备编码多样化多肽的核酸,将氨基酸序列多样性引入目标片段中,如抗体可变域的互补性决定区或疏水性结构域。如果需要,可以将待多样化的多肽片段随机化。
构成组的多肽的大小很大程度上是选择的问题,并且不需要统一的多肽大小。在一个实施方案中,组中的多肽至少具有三级结构(形成至少一个结构域)。
选择/分离/回收
可以使用任何合适的方法从组或文库(例如,在展示系统中)中选择、分离和/或回收蛋白酶抗性肽或多肽(例如,一群蛋白酶抗性多肽)。在一个实施方案中,基于可选择的特征(例如,物理特征、化学特征、功能性特征)来选择或分离蛋白酶抗性多肽。合适的可选择的功能性特征包括组中肽或多肽的生物活性,例如,结合通用配体(例如,超抗原)、结合目标配体(例如,抗原、表位、底物)、结合抗体(例如,通过肽或多肽上表达的表位)或催化活性。(参见,例如,Tomlinson等,WO99/20749;WO01/57065;WO99/58655)。在一个实施方案中,选择 是基于与TNFR1的特异性选择。在另一个实施方案中,选择是基于能产生其中成员是蛋白酶抗性的第二组的选定功能性特征,接着从第二组中选择特异性结合TNFR1的成员。
在一些实施方案中,从其中基本上所有蛋白酶抗性肽或多肽共有共同的可选择特征的文库或组中选择和/或分离蛋白酶抗性肽或多肽。例如,可以从其中基本上所有蛋白酶抗性肽或多肽结合共同的通用配体、结合共同的目标配体、结合共同的抗体(或由其结合)或具有共同的催化活性的文库或组中选择蛋白酶抗性肽或多肽。这种类型的选择对于基于具有所需生物活性的亲本肽或多肽来制备一组蛋白酶抗性肽或多肽特别有用,例如,进行免疫球蛋白单可变域的亲和性突变时。
基于结合共同的通用配体的选择可以产生含有为原始库或组成分的全部或基本上全部蛋白酶抗性肽或多肽的肽或多肽的集合或群体。例如,可以通过淘选或使用合适的亲和性基质来选择、分离和/或回收结合目标配体或通用配体(如,蛋白A、蛋白L或抗体)的肽或多肽。可以通过将配体(例如,通用配体、目标配体)溶液加入合适的容器中(例如,试管、培养皿)并使配体沉积或覆盖在容器壁上来完成淘选。将过量的配体洗掉并将肽或多肽(例如,已经用蛋白酶温育过的组)加入容器中,并将容器维持在适于肽或多肽结合固定化配体的条件下。将未结合的肽或多肽洗掉,使用任何合适的方法(如刮下(scraping)或降低pH)来回收结合的肽或多肽。
合适的配体亲和性基质通常含有固体支持物或珠子(例如,琼脂糖),配体与其共价或非共价连接。可以使用分批方法、柱方法或任何其他合适的方法,在适于肽或多肽与基质上的配体结合的条件下,将亲和性基质与肽或多肽(例如,已经用蛋白酶温育过的组)混合。可以将没有结合亲和性基质的肽或多肽洗掉,并使用任何合适的方法将结合的肽或多肽洗脱并回收,例如用较低pH的缓冲液、用温和的去污剂(例如,脲)或竞争与配体结合的肽来洗脱。在一个实施例中,在适于组中的肽或多肽结合目标配体(TNFR1)的条件下,将生物素化的目标配体与组混合。使用固定化的抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素(例如,在珠子上)来回收结合的肽或多肽,
在一些实施方案中,通用配体是抗体或其表位。结合文库或组的肽或多肽中基本上保守的肽或多肽的结构特征的抗体或抗原结合片段作 为通用配体是特别有用的。对于分离、选择和/或回收蛋白酶抗性肽或多肽而适宜用作配体的抗体和抗原结合片段可以是单克隆或多克隆的,并可以使用任何合适的方法来制备。
文库/组
在其他方面中,提供了蛋白酶抗性肽和多肽的组、编码蛋白酶抗性肽和多肽的文库以及产生该文库和组的方法。
可以使用任何合适的方法制备或获得编码和/或含有蛋白酶抗性肽和多肽的文库。可以基于目标肽或多肽(例如,选自文库的抗-TNFR1肽或多肽)将文库设计来编码蛋白酶抗性肽或多肽,或可以使用本文所述的方法选自另一个文库。例如,可以使用合适的多肽展示系统来制备富含蛋白酶抗性多肽的文库。
在一个实施例中,如本文所述的,在适于蛋白酶活性的条件下,将含有一组展示多肽的噬菌体展示文库与蛋白酶混合,该展示多肽含有免疫球蛋白单可变域(例如,VH、Vk、Vλ)。基于所需的生物活性,如结合活性(例如,结合通用配体,结合目标配体),来回收蛋白酶抗性多肽,由此产生富含蛋白酶抗性多肽的噬菌体展示文库。在一个实施方案中,回收是基于结合通用配体,以产生富集文库,接着基于与TNFR1的特异性结合来选择文库的抗-TNFR1成员。
在另一个实施例中,首先筛选包含一组展示肽的噬菌体文库来鉴定对所需目标抗原(例如,TNFR1)具有结合特异性的组成员,该展示多肽含有免疫球蛋白单可变域(例如,VH、Vk、Vλ)。回收具有所需结合特异性的多肽集合,并如本文所述的,在适于蛋白水解活性的条件下,将集合与蛋白酶混合。回收具有所需目标结合特异性的蛋白酶抗性多肽的集合,产生富含蛋白酶抗性和高亲和性多肽的文库。如本文所述的,在一个实施方案中,该选择方法中的蛋白酶抗性与高亲和性结合相关。
可以使用任何合适的方法容易地产生编码所需类型多肽组的文库。例如,可以获得编码所需类型多肽(例如,聚合酶、免疫球蛋白可变域)的核酸序列,并可以制备每个含有一个或更多个突变的核酸的集合,例如通过使用易出错聚合酶链式反应(PCR)系统来扩增核酸,通过化学诱变(Deng等,J.Biol.Chem.269:9533(1994))或使用细菌突变体菌株(Low等,J.Mol.Biol.,260:359(1996))。
在其他实施方案中,为了多样化,可以靶向核酸的特定片段。突变选定位置的方法也是本领域公知的,并包括,例如,使用错配的寡核苷酸或简并的寡核苷酸,使用或不使用PCR。例如,已经通过将突变靶向抗原结合环形成了合成的抗体文库。已经将随机或半随机抗体H3和L3片段添加至种系免疫球蛋白V基因片段,以产生具有未突变框架片段的大文库(Hoogenboom和Winter(1992)上文;Nissim等(1994)上文;Griffiths等(1994)上文;DeKruif等(1995)上文)。将这样的多样化延伸来包括一些或全部其他抗原结合环(Crameri等(1996)Nature Med.2∶100;Riechmann等(1995)Bio/Technology,13:475;Morphosys,WO97/08320,上文)。在其他实施方案中,对于多样化,可以靶向核酸的特定片段,例如,通过两步PCR策略,使用第一PCR的产物作为“mega-引物”。(参见,例如,Landt,O.等,Gene 96:125-128(1990))。例如,还可以通过SOE PCR来完成靶向多样化。(参见,例如,Horton,R.M.等,Gene 77:61-68(1989))。
可以通过改变编码序列来获得选定位置的序列多样性,编码序列限定了多肽的序列,使得可以在该位置引入各种可能的氨基酸(例如,全部的20个或其子集)。使用IUPAC命名,最通用的密码子是NNK,其编码所有氨基酸以及TAG终止密码子。可以使用NNK密码子,以引入所需的多样性。实现相同目的的其他密码子也是有用的,包括NNN密码子,其导致其他终止密码子TGA和TAA的产生。这样的靶向方法使得可以在目标区域中开发所有的序列空间。
文库可以包含具有已知主链构象的蛋白酶抗性抗体多肽。(参见,例如,Tomlinson等,WO99/20749)。
可以在合适的质粒或载体中制备文库。如在此所用的,载体指的是用于将异源DNA引入用于表达和/或其复制的细胞中的离散序列。可以使用任何合适的载体,包括质粒(例如,细菌质粒)、病毒或细菌噬菌体载体、人造染色体和游离基因载体。这样的载体可以用于简单克隆和诱变,或表达载体可以用于驱动文库的表达。载体和质粒通常含有一个或更多个克隆位点(例如,多连接物)、复制起点和至少一个可选择的标记基因。表达载体可以进一步含有用于驱动多肽转录和翻译的元件,如增强子元件、启动子、转录终止细胞、信号序列等。可以以可操作地连接克隆的编码多肽的插入片段的方式来安置这些元件,使得在适于表 达的条件下(例如,在合适的宿主细胞中)维持该表达载体时,表达和产生多肽。
克隆和表达载体通常含有能够使载体在一个或更多个选定的宿主细胞中复制的核酸序列。通常,在克隆载体中,该序列能够使载体独立于宿主染色体DNA而复制,并包括复制起点或自主复制序列。对于各种细菌、酵母和病毒,这样的序列是公知的。来自质粒pBR322的复制起点适用于大部分革兰氏阴性细菌,2微米质粒来源适用于酵母,而各种病毒来源(例如,SV40,腺病毒)适用于在哺乳动物细胞中克隆载体。通常,对于哺乳动物表达载体是不需要复制起点的,除非将这些用于能够复制高水平DNA的哺乳动物细胞中,如COS细胞。
克隆或表达载体可以含有也称为选择标记的选择基因。这样的标记基因编码在选择性培养基中生长的转化宿主细胞的存活或生长需要的蛋白质。因此,没有用含有选择基因的载体转化的宿主细胞在培养基中将不会存活。通常的选择基因编码给予抗生素和其他毒素(例如,氨苄青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四环素)抗性、补充营养缺陷不足或提供生长培养基中不可获得的关键营养素的蛋白质。
合适的表达载体可以含有各种成分,例如,复制起点、可选择标记基因、一种或更多种表达控制元件,如转录控制元件(例如,启动子、增强子、终止子)和/或一种或更多种翻译信号、信号序列或前导序列等。表达控制元件和信号或前导序列如果存在,可以通过载体或其他来源来提供。例如,克隆的编码抗体链的核酸的转录和/或翻译控制序列可以用来指导表达。
可以提供启动子用于所需宿主细胞中的表达。启动子可以是组成型或诱导型的。例如,启动子可以可操作地连接编码抗体、抗体链或其一部分的核酸,使得其指导核酸的转录。用于原核宿主(例如,用于大肠杆菌的β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统、lac、tac、T3、T7启动子)和真核宿主(例如,猿病毒40早期或晚期启动子、劳斯肉瘤病毒长终止重复启动子、巨细胞病毒启动子、腺病毒晚期启动子、EG-1a启动子)的各种合适的启动子是可获得的。
此外,表达载体通常含有用于选择携带载体的宿主细胞的选择标记,并且在可复制表达载体的情况中,还含有复制起点。编码给予抗生素或药物抗性的产物的基因是常用的选择标记,并可以用于原核细胞(例如,β-内酰胺酶基因(氨苄青霉素抗性)、用于四环素抗性的Tet基因)和真核细胞(例如,新霉素(G418或geneticin)、gpt(霉酚酸)、氨苄青霉素或潮霉素抗性基因)。二氢叶酸还原酶标记基因使得可以用氨甲喋呤在各种细胞中选择。编码宿主营养缺陷标记的基因产物的基因(例如,LEU2、URA3、HIS3)通常用作酵母中的选择标记。还考虑了使用病毒(例如,杆状病毒)或噬菌体载体和能够整合至宿主细胞基因组的载体,如逆转录病毒载体。
用于在原核细胞(例如,细菌细胞,如大肠杆菌)或哺乳动物细胞中表达的合适表达载体包括,例如,pET载体(例如,pET-12a、pET-36、pET-37、pET-39、pET-40,Novagen等)、噬菌体载体(例如,pCANTAB5E,Pharmacia)、pRIT2T(蛋白A融合载体,Pharmacia)、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、pEF-1(Invitrogen,Carlsbad,CA)、pCMV-SCRIPT、pFB、pSG5、pXT1(Stratagene,La Jolla,CA)、pCDEF3(Goldman,L.A.等,Biotechniques,21:1013-1015(1996))、pSVSPORT(GibcoBRL,Rockville,MD)、pEF-Bos(Mizushima,S.等,Nucleic Acids Res.,18:5322(1990))等。适用于各种表达宿主如原核细胞(大肠杆菌)、昆虫细胞(果蝇Schnideer S2细胞,Sf9)、酵母(P.methanolica、巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母(S.cerevisiae))和哺乳动物细胞(例如,COS细胞)中的表达载体是可获得的。
载体的实例是能够表达对应于多肽文库成员的核苷酸序列的表达载体。因此,可以通过分开的繁殖和表达多肽文库成员的单克隆的表达来进行使用通用配体和/或目标配体的选择。如以上所述的,选择展示系统可以是细菌噬菌体展示。因此,可以使用噬菌体或噬粒载体。实例载体是具有大肠杆菌复制起点(用于双链复制)以及噬菌体复制起点(用于生产单链DNA)的噬粒载体。这些载体的操纵和表达是本领域公知的(Hoogenboom和Winter(1992)上文;Nissim等(1994)上文)。简而言之,载体可以含有给予噬粒上选择性的β-内酰胺酶基因和表达盒的lac启动子上游,该表达盒含有合适前导序列、多克隆位点、一个或更多个肽标记物、一个或更多个TAG终止密码子和噬菌体蛋白pIII。因此,使用各种抑制剂和大肠杆菌的非抑制剂菌株并添加葡萄糖、异丙基硫-β-D-半乳糖苷(IPTG)或辅助噬菌体如VCS M13,载体能够作为没有表达的质粒复制,只产生大量多肽文库成员或产物噬菌体,其中一些在 其表面上含有多肽-pIII融合体的至少一个拷贝。
本文所述的文库和组可以含有抗体形式。例如,文库和组内包含的多肽可以是完整的分开的VH或VL结构域,其中任一个是修饰的或未修饰的。可以使用任何合适的方法,容易地产生scFv片段,以及其他抗体多肽。各种合适的抗体工程化方法是本领域公知的。例如,可以通过将编码两个可变域的核酸连接合适的编码合适的连接肽的寡核苷酸来形成scFv,连接肽如(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3或其他合适的连接肽。连接物桥接第一V区的C-端和第二V区的N-端。可以使用相似的技术,用于构建其他抗体形式,如Fv、Fab和F(ab)2片段。为了使Fab和F(ab)2格式化,可以将VH和VL多肽与恒定域片段混合,恒定域片段分离自重排基因、种系C基因或从抗体序列库合成的。本文所述的文库或组可以使VH或VL,文库或组。
包含蛋白酶抗性可变域的多肽可以含有目标配体(例如,TNFR1)结合位点和通用配体结合位点。在特定的实施方案中,通用配体结合位点是用于超抗原(如蛋白A、蛋白L或蛋白G)的结合位点。可变域可以基于任何所需的可变域,例如,人VH(例如,VH1a、VH1b、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6)、人Vλ(例如,VλI、VλII、VλIII、VλIV、VλV、VλVI或Vκ1)或人Vκ(例如,Vκ2,Vκ3,Vκ4,Vκ5,Vκ6,Vκ7,Vκ8,Vκ9或Vκ10)或Camelid VHH,任选已经人源化。
核酸、宿主细胞和生产蛋白酶抗性多肽的方法
本发明涉及分离的和/或重组的编码蛋白酶抗性肽或多肽的核酸,例如,通过本文所述的方法可选择或已选择的肽或多肽。
在此称为“分离的”核酸是已经与原始环境(例如,在细胞或在核酸混合物如文库中)中的其他物质(例如,其他核酸,如基因组DNA、cDNA和/或RNA)分开的核酸。分离的核酸可以作为载体(例如,质粒)的一部分来分离。
在此称为“重组的”核酸是通过重组DNA方法产生的核酸,重组DNA方法包括依赖于人工重组的方法,如克隆至载体或染色体中,例如,使用限制酶、同源重组、病毒等,以及使用聚合酶链式反应(PCR)制备的核酸。
本发明还涉及重组宿主细胞,其包括(一个或更多个)重组核酸或 含有编码蛋白酶抗性肽或多肽的核酸的表达构建体,例如,通过本文所述的方法可选择的或已选择的肽或多肽。还提供了制备蛋白酶抗性肽或多肽的方法,其包括在适于蛋白酶抗性肽或多肽表达的条件下,维持本发明的宿主细胞。如果需要,该方法可以进一步包括分离或回收蛋白酶抗性肽或多肽的步骤。
例如,可以使用任何适于选定宿主细胞的方法(例如,转化、转染、电穿孔、感染),将编码蛋白酶抗性肽或多肽的核酸分子(例如,一个或更多个核酸分子),或含有该核酸分子的表达构建体(一个或更多个构建体)引入合适的宿主细胞中,以形成重组宿主细胞,使得核酸分子可操作地连接一个或更多个表达控制元件(例如,在载体中、在通过细胞中的加工形成的构建体中、整合至宿主细胞基因组)。在适于表达的条件下(例如,在诱导剂的存在下、在合适的动物中、在补充了适当盐、生长因子、抗生素、营养补充剂的合适培养基中等),维持所得到的重组宿主细胞,由此产生编码的肽或多肽。如果需要,可以分离或回收编码的肽或多肽(例如,从动物、宿主细胞、培养基、乳)。该方法包括在转基因动物的宿主细胞中的表达(参见,例如,WO92/03918,GenPharm International)。
还可以在合适的体外表达系统中,通过化学合成或通过任何其他合适的方法,来产生通过本文所述的方法选择的蛋白酶抗性肽或多肽。因此,本发明提供了蛋白酶抗性肽和多肽。
多肽、dAb&拮抗剂
如本文所述和举例说明的,本发明的蛋白酶抗性dAb通常以高亲和性结合它们的目标配体。因此,在另一个方面中,提供了选择、分离和/或回收本发明的以高亲和性结合TNFR1的多肽或dAb。通常,该方法包括提供肽或多肽(例如,dAb)的文库或组,在适于蛋白酶活性的条件下,将文库或组与蛋白酶(例如,胰蛋白酶、弹性蛋白酶、leucozyme、胰酶、痰液)混合,并选择、分离和/或回收结合配体(例如,目标配体)的肽或多肽。因为已经在蛋白酶敏感性肽或多肽将得到消化的条件下将文库或组暴露于蛋白酶,因此蛋白酶的活性可以消除具有低结合亲和性的不太稳定的多肽,并因此产生高亲和性结合肽或多肽的集合。
例如,本发明的多肽或dAb可以以1μm或更强,或大约500nM~0.5pM的亲和性(KD;KD=Koff(kd)/Kon(ka),如通过表面等离子共振所测定的)来结合TNFR1。例如,本发明的多肽或dAb能够以大约500nM、大约100nM、大约10nM、大约1nM、大约500pM、大约100pM、大约10pM、大约1pM或大约0.5pM的亲和力结合TNFR1。
尽管我们没有受到任何特定理论的束缚,认为能抵抗蛋白酶的肽或多肽具有较低的熵和/或较高的稳定能量。因此,蛋白酶抗性与高亲和性结合之间的关联可能与通过本文所述的方法选择的肽和多肽和dAb表面的紧密性和稳定性相关。
在一个实施方案中,本发明的多肽、dAb或拮抗剂抑制TNFα与TNFα受体1(p55受体)的结合,其具有为大约500nM~50pM,或100nM~50pM,或10nM~100pM,或1nM~100pM;例如50nM或更小,或5nM或更小,或500pM或更小,或200pM或更小,或100pM或更小的抑制浓度50(IC50)。
在特定的实施方案中,多肽、dAb或拮抗剂特异性地结合TNFR1,例如人TNFR1,并与人TNFR1分离,具有300nM至1pM的解离常数(KD),或300nM至5pM,或50nM至1pM,或50nM至5pM,或50nM至20pM,或约10pM,或约15pM,或约20pM,如通过表面等离子共振所测定的。在特定的实施方案中,多肽、dAb或拮抗剂特异性地结合TNFR1,例如人TNFR1,并与人TNFR1分离,具有5x10-1s-1~1x10-7s-1或1x10-3s-1-1x10-7s-1或1x10-4s-1~1x10-7s-1或1x10-5s-1~1x10-7s-1或1x10-4s-1或1x10-5s-1的Koff速度常数,如通过表面等离子共振所测定的。
在特定的实施方案中,多肽、dAb或拮抗剂特异性地结合TNFR1,例如人TNFR1,具有1x10-3M-1s-1至1x10-7M-1s-1的Kon,或1x10-3M-1s-1至1x10-6M-1s-1,或约1x10-4M-1s-1或约1x10-5M-1s-1。在一个实施方案中,多肽、dAb或拮抗剂特异性地结合TNFR1,例如人TNFR1,并与人TNFR1分离,具有在该段落中限定的解离常数(KD)和Koff。在一个实施方案中,多肽、dAb或拮抗剂特异性地结合TNFR1,例如人TNFR1,并与人TNFR1分离,具有该段落中限定的解离常数(KD)和Kon。在一些实施方案中,多肽或dAb特异性地结合TNFR1(例如人TNFR1),具有该段落中引用的KD和/或Koff和/或Kon,并包括与DOM 1h-131-206的氨基酸序列(显示于图3中)为至少或至少约80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。
可以在大肠杆菌或毕赤酵母属种(例如,巴斯德毕赤酵母)中表达多肽、dAb或拮抗剂。在一个实施方案中,在大肠杆菌或毕赤酵母属种(例如,巴斯德毕赤酵母)中表达时,以至少约0.5mg/L的量来分泌配体或dAb单体。尽管,在大肠杆菌或毕赤酵母属种(例如,巴斯德毕赤酵母)中表达时,本文所述的配体和dAb单体是可分泌的,可以使用任何合适的方法来生产,如合成的化学方法或没有使用大肠杆菌或毕赤酵母属种的生物生产方法。
在一些实施方案中,多肽、dAb或拮抗剂不含有Camelid免疫球蛋白可变域,或一个或更多个框架氨基酸,这些氨基酸对于由Camelid种系抗体基因片段编码的免疫球蛋白可变域是独特的,例如,在位置108、37、44、45和/或47。
根据本发明的TNFR1的拮抗剂可以是单价的或多价的。在一些实施方案中,拮抗剂是单价的并含有一个与TNFR1相互作用的结合位点,该结合位点是由本发明的多肽或dAb提供的。单价拮抗剂结合一个TNFR1并可以不诱导导致受体和信号转导激活的细胞表面上的TNFR1的交联或聚集。
在其他实施方案中,TNFR1的拮抗剂是多价的。TNFR1的多价拮抗剂可以含有两个或更多个用于TNFR1的特定结合位点的拷贝或含有两个或更多个结合TNFR1的不同结合位点,至少一个结合位点是由本发明的多肽或dAb提供的。例如,如本文所述的,TNFR1的拮抗剂可以是二聚体、三聚体或多聚体,其含有两个或更多个本发明的结合TNFR1的特定多肽或dAb的拷贝,或两个或更多个本发明的结合TNFR1的不同多肽或dAb。在一个实施方案中,TNFR1的多价拮抗剂在标准的细胞测试中基本上不激动TNFR1(作为TNFR1的激动剂)(即,当以1nM,10nM,100nM,1μM,10μM,100μM,1000μM或5,000μM的浓度存在时,在测试中达到了不超过大约5%的TNFα(100pg/ml)诱导的TNFR1-介导的活性)。
在特定的实施方案中,TNFR1的多价拮抗剂含有两个或更多个用于TNFR1所需的表位或结构域的结合位点。例如,TNFR1的多价拮抗剂能够包含两个或者更多个结合位点,其结合TNFR1的结构域1中的相同的表位。
在其他一些实施方案中,TNFR1的多价拮抗剂含有由本发明的多肽 或dAb提供的两个或更多个结合位点,其结合TNFR1的不同表位或结构域。在一个实施方案中,这些多价拮抗剂在如WO2006038027所描述的标准L929细胞毒性测试或标准HeLa IL-8测试中以大约1nm或大约10nM或大约100nM或大约1μM或大约10μM的浓度存在时不会激动TNFR1。
TNFR1的其他拮抗剂不会抑制TNFα与TNFR1的结合。这些配体(和拮抗剂)可以具有作为诊断剂的实用性,因为它们可以用于结合并检测、定量或测量样品中的TNFR1,并且不会与样品中的TNF竞争与TNFR1的结合。因此,可以准确地测定样品中是否存在TNFR1或存在多少TNFR1。
在其他实施方案中,多肽、dAb或拮抗剂特异性地结合TNFR1,具有本文所述的KD,并抑制了标准小鼠LPS/D-半乳糖胺诱导的败血病性休克模型中的致死率(例如,与合适对照相比,防止致死性或降低了至少约10%的致死率)。在一个实施方案中,以约5mg/kg或更多,例如,约1mg/kg给药时,与标准小鼠LPS/D-半乳糖胺诱导的败血病性休克模型中的合适对照相比,多肽、dAb或拮抗剂抑制至少约10%或至少约25%或至少约50%的致死率。
在其他实施方案中,多肽、dAb或拮抗剂结合TNFR1并在标准细胞测试中拮抗TNFR1介导的活性,具有≤100nM的ND50,并且以<10μM的浓度,dAb在测试中激动<5%的TNFR1的活性。
在特定的实施方案中,多肽、dAb或拮抗剂在标准细胞测试中基本上不激动TNFR1(作为TNFR1的激动剂)((即,当以1nM,10nM,100nM,1μM,10μM,100μM,1000μM或5,000μM的浓度存在时,在测试中达到了不超过大约5%的TNFα(100pg/ml)诱导的TNFR1-介导的活性)。
在特定的实施方案中,给予有效量时,本发明的多肽、dAb或拮抗剂在慢性炎症疾病模型中是有效的。通常,有效量为约1mg/kg至约10mg/kg(例如,约1mg/kg,约2mg/kg,约3mg/kg,约4mg/kg,约5mg/kg,约6mg/kg,约7mg/kg,约8mg/kg,约9mg/kg或约10mg/kg)。本领域技术人员认为慢性炎症的模型(参见WO2006038027中所描述的)预示着在人体中的治疗功效。
在特定的实施方案中,多肽、dAb或拮抗剂在标准小鼠胶原诱导的关节炎模型中是有效的(关于该模型的细节参见WO2006038027)。例如, 给药有效量的多肽、dAb或拮抗剂能够降低在标准小鼠胶原诱导关节炎模型中四肢总和的平均关节炎评分,例如与适当的对照相比,降低大约1~大约16,大约3~大约16,大约6~大约16,大约9~大约16,或大约12~大约16。在另一个例子中,给药有效量的多肽、dAb或拮抗剂能够在标准小鼠胶原诱导的关节炎模型中延迟关节炎症状的开始,例如与适当的对照相比,延迟大约1天,大约2天,大约3天,大约4天,大约5天,大约6天,大约7天,大约10天,大约14天,大约21天或大约28天。在另一个例子中,给药有效量的多肽、dAb或拮抗剂能够在标准小鼠胶原诱导的关节炎模型中得到0~大约3,大约3~大约5,大约5~大约7,大约7~大约15,大约9~大约15,大约10~大约15,大约12~大约15,或大约14~大约15的四肢总和的关节炎评分。
在其他实施方案中,多肽,dAb或拮抗剂在小鼠关节炎ΔARE模型中是有效的(关于该模型的细节参见WO2006038027)。例如,给药有效量的多肽、dAb或拮抗剂能够在小鼠关节炎ΔARE模型中降低平均关节炎评分,例如与适当的对照相比降低大约0.1~大约2.5,大约0.5~大约2.5,大约1~大约2.5,大约1.5~大约2.5,或大约2~大约2.5。在另一个例子中,给药有效量的多肽、dAb或拮抗剂能够在小鼠关节炎ΔARE模型中延迟关节炎症状的开始,例如与与适当的对照相比延迟大约1天,大约2天,大约3天,大约4天,大约5天,大约6天,大约7天,大约10天,大约14天,大约21天或大约28天。在另一个例子中,给药有效量的多肽、dAb或拮抗剂能够在小鼠关节炎ΔARE模型中得到0~大约0.5,大约0.5~大约1,大约1~大约1.5,大约1.5~大约2,或大约2~大约2.5的平均关节炎评分。
在其他实施方案中,多肽,dAb或拮抗剂在小鼠炎性肠病(IBD)ΔARE模型中是有效的(关于该模型的细节参见WO2006038027)。例如,给药有效量的多肽、dAb或拮抗剂能够在小鼠IBDΔARE模型中降低急性和/或慢性炎症评分,例如与适当的对照相比降低大约0.1~大约2.5,大约0.5~大约2.5,大约1~大约2.5,大约1.5~大约2.5,或大约2~大约2.5。在另一个例子中,给药有效量的多肽、dAb或拮抗剂能够在小鼠IBDΔARE模型中延迟IBD症状的开始,例如,与适当的对照相比延迟大约1天,大约2天,大约3天,大约4天,大约5天,大约6天,大约7天,大约10天,大约14天,大约21天或大约28天。在另一个 例子中,给药有效量的多肽、dAb或拮抗剂在小鼠IBDΔARE模型中得到0~大约0.5,大约0.5~大约1,大约1~大约1.5,大约1.5~大约2,或大约2~大约2.5的平均急性和/或慢性炎症评分。
在其他实施方案中,多肽,dAb或拮抗剂在小鼠葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的炎性肠病模型中是有效的(关于该模型的细节参见WO2006038027)。例如,给药有效量的多肽、dAb或拮抗剂能够在小鼠IBD的DSS模型中降低平均严重程度评分,例如与适当的对照相比降低大约0.1~大约2.5,大约0.5~大约2.5,大约1~大约2.5,大约1.5~大约2.5,或大约2~大约2.5。在另一个例子中,给药有效量的多肽、dAb或拮抗剂能够在小鼠IBD的DSS模型中延迟IBD症状的开始,例如与适当的对照相比延迟大约1天,大约2天,大约3天,大约4天,大约5天,大约6天,大约7天,大约10天,大约14天,大约21天或大约28天。在另一个例子中,给药有效量的多肽、dAb或拮抗剂能够在小鼠IBD的DSS模型中得到0~大约0.5,大约0.5~大约1,大约1~大约1.5,大约1.5~大约2,或大约2~大约2.5的平均严重程度评分。
在特定的实施方案中,多肽,dAb或拮抗剂在小鼠烟草烟雾慢性梗阻性肺病模型(COPD)中是有效的(关于该模型的细节,参见WO2006038027和WO2007049017)。例如,与适当的对照相比,给药有效量的配体能够降低COPD症状或延迟COPD症状的开始。
可以获得一些动物模型系统,其能够用于筛选TNFR1的拮抗剂(例如其配体、抗体或结合蛋白)在保护抵抗或治疗疾病中的效率。用于在易感性小鼠中测试系统性红斑狼疮(SLE)的方法是本领域中已知的(Knight et al.(1978)J.Exp.Med.,147:1653;Reinerstenet al.(1978)New Eng.J.Med.,299:515)。在SJL/J雌性小鼠中测试重症肌无力(MG),其通过利用来自另一物种的可溶性AchR蛋白诱导该疾病(Lindstrom et al.(1988)Adv.Immunol.,42:233)。关节炎是在小鼠的易感株中通过注射II型胶原而诱导的(Stuartet al.(1984)Ann.Rev.Immunol.,42:233)。在易感大鼠中通过注射分枝杆菌热休克蛋白而诱导佐剂关节炎的模型已经被描述(Van Eden et al.(1988)Nature,331:171)。甲状腺炎是在小鼠中根据所描述的通过给药甲状腺球蛋白而诱导的(Maron et al.(1980)J.Exp.Med.,152:1115)。胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)是自然出现的,或者可以 在某些小鼠株中根据Kanasawa et al.(1984)Diabetologia,27:113.所描述的那些进行诱导。在小鼠和大鼠中EAE作为人中MS的模型。在该模型中,去髓鞘疾病是通过给药髓鞘碱性蛋白而诱导的(参见Paterson (1986)Textbook of Immunopathology,Mischer et al.,eds.,Gruneand Stratton,New York,pp.179-213;McFarlin et al.(1973)Science,179:478:andSatoh et al.(1987)J.Immunol.,138:179)。
通常,本发明的配体(例如,拮抗剂)将以纯化的形式与药物学上合适的载体一起使用。通常,这些载体包括水或醇/水溶液、乳液或悬浮液、任何包括盐和/或缓冲的基质。非肠道载体包括氯化钠溶液、Ringer’s葡萄糖、葡萄糖和氯化钠和乳酸化Ringer’s。如果需要在悬浮液中保持多肽复合物,合适的生理学上可接受的佐剂可以选自增稠剂,如羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和海藻酸盐。
静脉内载体包括流体和营养补充剂和电解质补充剂,如基于Ringer’s葡萄糖的那些。防腐剂和其他添加剂,如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体,也可以存在(Mack(1982)Remington’s Pharmaceutical Sciences,第16版)。可以使用各种合适的制剂,包括缓释制剂。
本发明的配体(例如,拮抗剂)可以用作分开给药的组合物或结合其他药剂。这些包括各种免疫治疗药物,如环孢霉素、氨甲喋呤、阿霉素或顺铂和免疫毒素。药物组合物可以包括各种细胞毒性或其他药剂与本发明配体结合的“组合药剂(cocktails)”,或甚至是根据本发明的具有不同特异性的配体的组合物,如使用不同目标抗原或表位选择的配体,不管是否是在给药之前混合。
根据本发明的药物组合物的给药途径可以是本领域技术人员公知的那些。对于治疗,包括但不限于免疫治疗,根据标准技术将本发明选定的配体给药于任何患者。
给药可以是任何合适的模式,包括非肠道、静脉内、肌内、腹膜内、经皮、通过肺的途径,或者其他,合适地,通过用导管直接灌输。给药的剂量和频率将取决于患者的年龄、性别和状况、其他药物的同时给药、禁忌和医师将要考虑的其他参数。如所示的,给药可以是局部(例如,通过肺部给药局部递送至肺,例如,鼻内给药)或全身的。
可以将本发明的配体冻干,用于存储以及在使用前在合适的载体中 重建。已经表明该技术对常规的免疫球蛋白是有效的,并可以使用本领域已知的冻干和重建技术。本领域技术人员将认识到冻干和重建可能导致抗体活性不同程度的损耗(例如,使用常规的免疫球蛋白,IgM抗体的活性损耗易于比IgG抗体高),可以调节使用水平来补偿。
可以将含有本发明配体(例如,拮抗剂)或其混合物的组合物给药来用于预防和/或治疗处理。在特定的治疗应用中,将实现选定细胞群的至少部分抑制、遏制、调节、杀灭或一些其他可测量参数的适当含量定义为“治疗有效量”。实现该剂量需要的含量将取决于疾病的严重程度和患者自身免疫系统的一般状况,但通常为0.005至5.0mg配体/kg体重,配体例如为dAb或拮抗剂,更常使用0.05至2.0mg/kg/剂的剂量。对于预防性应用,可以给药相似或略低剂量的含有本发明配体或其混合物的组合物,以预防、抑制或延迟疾病的发作(例如,维持缓解或静止,或防止急性期)。本领域技术人员能够测定治疗、抑制或预防疾病的合适给药间隔。将TNFR1的配体(例如,拮抗剂)给药来治疗、抑制或预防慢性炎症疾病时,可以给药高达四次/天,每周两次,每周一次,每两周一次,一月一次或每两月一次,例如,剂量为约10μg/kg至约80mg/kg,约100μg/kg至约80mg/kg,约1mg/kg至约80mg/kg,约1mg/kg至约70mg/kg,约1mg/kg至约60mg/kg,约1mg/kg至约50mg/kg,约1mg/kg至约40mg/kg,约1mg/kg至约30mg/kg,约1mg/kg至约20mg/kg,约1mg/kg至约10mg/kg,约10μg/kg至约10mg/kg,约10μg/kg至约5mg/kg,约10μg/kg至约2.5mg/kg,约1mg/kg,约2mg/kg,约3mg/kg,约4mg/kg,约5mg/kg,约6mg/kg,约7mg/kg,约8mg/kg,约9mg/kg或约10mg/kg。在特定的实施方案中,将TNFR1的配体(例如,拮抗剂)给药来治疗、抑制或防止慢性炎症疾病,每两周一次或一月一次,剂量为约10μg/kg至约10mg/kg(例如,约10μg/kg,约100μg/kg,约1mg/kg,约2mg/kg,约3mg/kg,约4mg/kg,约5mg/kg,约6mg/kg,约7mg/kg,约8mg/kg,约9mg/kg或约10mg/kg)。
如果相对于治疗前存在的症状,或相对于没有用该组合物治疗的个体(人或模型动物)或其他合适对照中的症状,一种或更多种症状得到减轻(例如,至少10%或临床评价等级的至少一个点),认为使用本文所述的组合物进行的处理或治疗是“有效的”。症状将根据靶向的疾病或病症而明显不同,但可以通过普通医师或技术人员来测量。例如,可 以通过监控疾病或病症的一个或更多个生化指示剂的水平(例如,酶或与疾病相关的代谢产物的水平、受影响细胞的数目等)、通过监控身体呈现(例如,炎症、肿瘤大小等),或通过公认临床评价等级来测量该症状-例如扩展运动障碍状态量度(对于多发性硬化)、欧文炎症性肠病调查表(32点评定评价关于肠功能、系统性症状、社会功能和情绪状态的生活质量-评分在32到224的范围内,评分越高说明生活质量越好)、类风湿性关节炎生活质量标准、或本领域中已知的其他认可的临床评估标准。在给定的临床标准上疾病或紊乱症状持续(例如一天或更多,或更长)降低至少10%或一个或更多个点是有效治疗的指标。
相似地,如果相对于未用组合物治疗的相似个体(人或动物模型)中的症状,一种或更多种症状的发作或严重程度得到了延迟、减轻或消除,使用本文所述的组合物进行的预防是“有效的”。
可以在预防或治疗情况中使用含有根据本发明的配体(例如,拮抗剂)或其混合物的组合物,以帮助改变、灭活、杀灭或除去哺乳动物中选定的目标细胞群。此外,本文所述的选定的多肽组可以离体地或在体外选择性地从异源细胞集合中杀灭、耗尽或另外有效地除去目标细胞群。可以根据标准技术,将来自哺乳动物的血液在体外与配体混合,由此杀灭或另外从用于返回至哺乳动物的血液中除去不利的细胞。
可以在预防或治疗情况中使用含有根据本发明的配体(例如,拮抗剂)的组合物,以帮助改变、灭活、杀灭或除去哺乳动物中选定的目标细胞群。
可以将配体(例如,抗-TNFR1拮抗剂、dAb单体)给药,和或与一种或更多种其他的治疗剂或活性剂一起配制。配体(dAb)与其他的治疗剂一起给药时,可以在给药其他药剂之前、同时或之后,给药配体。通常,以提供重叠治疗效果的方法来给药配体和其他药剂。
在一个实施方案中,本发明是用于治疗、抑制或预防慢性炎症疾病的方法,该方法包括将治疗有效剂量或含量的根据本发明的多肽、dAb或TNFR1的拮抗剂给药于需要的哺乳动物。
在一个实施方案中,本发明是用于治疗、抑制或预防关节炎(例如类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、牛皮癣关节炎)的方法,其包括为有此需要的哺乳动物给药治疗有效剂量或量的根据本发明的多肽、dAb或TNFR1的拮抗剂。
在另一个实施方式中,本发明是用于治疗、抑制或者预防牛皮癣的方法,其包括为有此需要的哺乳动物给药治疗有效剂量或者量的根据本发明的多肽、dAb或TNFR1的拮抗剂。
在另一个实施方式中,本发明是用于治疗、抑制或者预防炎性肠病(例如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎)的方法,其包括为有此需要的哺乳动物给药治疗有效剂量或者量的根据本发明的多肽、dAb或TNFR1的拮抗剂。
在另一个实施方式中,本发明是用于治疗、抑制或者预防慢性阻塞性肺病(例如慢性支气管炎、慢性梗阻性支气管炎、肺气肿)的方法,其包括为有此需要的哺乳动物给药治疗有效剂量或者量的根据本发明的多肽、dAb或TNFR1的拮抗剂。
在另一个实施方式中,本发明是用于治疗、抑制或者预防肺炎(例如细菌性肺炎例如葡萄球菌肺炎)的方法,其包括为有此需要的哺乳动物给药治疗有效剂量或者量的根据本发明的多肽、dAb或TNFR1的拮抗剂。
本发明提供了用于治疗、抑制或预防除了慢性梗阻性肺病和肺炎之外的其他肺病的方法。根据本发明可以治疗、抑制或预防的其他肺病包括例如囊性纤维变性和哮喘(例如类固醇抗性哮喘)因此,在另一个实施方案中,本发明是用于治疗、抑制或预防肺病(例如,囊性纤维变性和哮喘)的方法,其包括将治疗有效剂量或含量的根据本发明的多肽、dAb或TNFR1的拮抗剂给药于需要的哺乳动物。
在特定的实施方案中,通过肺部递送,如通过吸入(例如,支气管内、鼻内或口腔吸入、鼻内滴剂)或通过全身性递送(例如,非肠道、静脉内、粘膜内、腹膜内、皮下)来给药TNFR1的拮抗剂。
在另一个实施方案中,本发明是治疗、抑制或预防败血性休克的方法,其包括为有此需要的哺乳动物给药治疗有效剂量或者量的根据本发明的多肽、dAb或TNFR1的拮抗剂。
在本发明进一步的方面中,提供了组合物,其包含根据本发明的多肽、dAb或TNFR1的拮抗剂和药物学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
此外,本发明提供了使用根据本发明的多肽、dAb或TNFR1的拮抗剂或组合物来治疗疾病的方法。在一个实施方案中,疾病是癌症或炎症,例如,类风湿性关节炎、哮喘或克罗恩氏病。
形式
提高的半衰期在免疫球蛋白,特别是抗体,最特别是小尺寸的抗体片段的体内应用中是有用的。这样的片段(Fv、二硫化物键合的Fv、Fab、scFv、dAb)能从体内快速清除;因此,尽管它们能够快速地到达身体的大部分部位,并且能快速产生和更容易操作,但它们在体内的应用受到仅在体内短暂持续的限制。本发明的一个实施方案通过提供体内半衰期延长的配体并且随后配体的功能活性在体内持续更长时间来解决了该问题。
药物动力学分析的方法和配体半衰期的测定是本领域技术人员熟知的。可以在Kenneth,A等:Chemical Stability of Pharmaceuticals:A Handbook for Pharmacists(药物动力学的化学稳定性:药剂师手册)和Peters等,Pharmacokinetc analysis:APhactical Approach(药物动力学分析:实践方法)(1996)中找到详细内容。还可以参考“Pharmacokinetics”(药物动力学),M Gibaldi&D Perron,Marcel Dekker出版,第2次再版(1982),其描述了药物动力学参数,如tα和tβ半衰期和曲线下面积(AUC)。
可以从配体随时间的血清浓度曲线确定半衰期(t1/2α和t1/2β)和AUC。例如,可以使用WinNonlin分析包(从Pharsight Corp.,Mountain View,CA94040,USA获得)来模拟曲线。在第一期中(α期),配体主要经历在患者中的分布,并有一些清除。第二期(β期)是配体已经得到分布的末期,血清浓度随着配体从患者体内清除出去而降低。tα半衰期是第一期的半衰期,而tβ半衰期是第二期的半衰期。因此,在一个实施方案中,本发明提供了具有15分钟或更长tα半衰期的配体或含有根据本发明的配体的组合物。在一个实施方案中,范围的下限是30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、11小时或12小时。此外,或可替换地,根据本发明的配体或组合物将具有高达并包括12小时的tα半衰期。在一个实施方案中,范围的上限是11、10、9、8、7、6或5小时。合适范围的实例是1至6小时,2至5小时或3至4小时。
在一个实施方案中,本发明提供具有2.5小时或更长tβ半衰期的配体(多肽、dAb或拮抗剂)或含有根据本发明的配体的组合物。在一个 实施方案中,范围的下限是3小时,4小时,5小时,6小时,7小时,10小时,11小时或12小时。此外,或可替换地,根据本发明的配体或组合物将具有高达并包括21天的tβ半衰期。在一个实施方案中,范围的上限是12小时,24小时,2天,3天,5天,10天,15天或20天。在一个实施方案中,根据本发明的配体或组合物将具有12至60小时的tβ半衰期。在进一步的实施方案中,将是12至48小时。在仍然进一步的实施方案中,将是12至26小时。
对于以上标准,另外或可替换地,本发明提供了具有1mg.min/ml或更高AUC值(曲线下面积)的配体或含有根据本发明的配体的组合物。在一个实施方案中,范围的下限是5、10、15、20、30、100、200或300mg.min/ml。此外,或可替换地,根据本发明的配体或组合物具有高达600mg.min/ml的AUC。在一个实施方案中,范围的上限是500、400、300、200、150、100、75或50mg.min/ml。在一个实施方案中,根据本发明的配体具有选自以下范围的AUC:15至150mg.min/ml,15至100mg.min/ml,15至75mg.min/ml和15至50mg.mon/ml。
例如,通过连接PEG基团、血清白蛋白、转铁蛋白、转铁蛋白受体或至少转铁蛋白结合部分、抗体Fc区,或通过缀合抗体结构域,将本发明的多肽和dAb以及含有这些的拮抗剂格式化,以具有较大的流体动力学大小。例如,将多肽dAb和拮抗剂格式化成较大的抗体的抗原结合片段或抗体(例如,格式化成Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、IgG、scFv)。
可以使用本领域公知的方法来测定本发明配体(例如,dAb单体或多聚体)的流体动力学大小。例如,凝胶过滤色谱可以用来测定配体的流体动力学大小。用于测定配体的流体动力学大小的合适的凝胶过滤基质,如交联的琼脂糖基质,是公知的并容易获得。
配体形式的大小(例如,连接dAb单体的PEG部分的大小)可以根据所需的应用而改变。例如,在打算将配体离开循环并进入外周组织的情况中,希望保持低的配体流体动力学大小,以促进从血流中外渗。或者,在期望配体在全身循环中保持更长时间的情况中,可以提高配体的大小,例如,通过格式化成Ig样蛋白。
通过靶向提高体内半衰期的抗原或表位来延长半衰期
如本文所述的,还可以通过将本发明的TNFR1结合多肽、dAb或 拮抗剂缀合或连接结合提高体内半衰期的抗原或表位的结合域(例如,抗体或抗体片段)来提高配体的流体动力学大小及其血清半衰期。例如,可以将TNFR1结合剂(例如,多肽)缀合或连接抗-血清白蛋白或抗-新生儿Fc受体抗体或抗体片段,例如,抗-SA或抗新生儿Fc受体dAb、Fab、Fab’或scFv,或抗-SA亲和体或抗-新生儿Fc受体亲和体或抗-SA avimer,或抗-SA结合域,其包含选自但优选不限于CTLA-4、lipocallin、SpA、亲和体、avimer、GroEl和纤连蛋白的支架(对于这些结合域的公开内容,参见,PCT/GB2008/000453,2008年2月8日申请,在此将结合域及其序列引入作为参考,并形成本发明文本公开内容的一部分)。缀合指的是将含有本发明的多肽、dAb或拮抗剂的组合物结合(共价或非共价)结合血清白蛋白的结合域。
提高体内血清半衰期的合适多肽包括,例如,转铁蛋白受体特异性配体-神经药剂融合蛋白(参见,U.S.专利No.5,977,307,在此将其教导引入作为参考)、脑毛细管内皮细胞受体、转铁蛋白、转铁蛋白受体(例如,可溶性转铁蛋白受体)、胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF1)受体、胰岛素样生长因子2(IGF2)受体、胰岛素受体、凝血因子X、α1-抗胰蛋白酶和HNF1α。合适的提高血清半衰期的多肽还包括α1-糖蛋白(血清类粘蛋白;AAG)、α1-抗凝乳蛋白酶(ACT)、α1-微球蛋白(蛋白HC;AIM)、抗凝血酶III(AT III)、阿朴脂蛋白A-1(Apo A-1)、阿朴脂蛋白B(Apo B)、血浆铜蓝蛋白(Cp)、补体成分C3(C3)、补体成分C4(C4)、C1弹性蛋白酶抑制剂(C1IHN)、C-反应性蛋白(CRP)、铁蛋白(FER)、血液结合素(HPX)、脂蛋白(a)(Lp(a))、甘露糖-结合蛋白(MBP)、肌红蛋白(Myo)、前清蛋白(甲状腺素运载蛋白(transthyretin);PAL)、视黄醇-结合蛋白(RBP)和类风湿因子(RF)。
来自胞外基质的合适蛋白包括,例如,胶原蛋白、昆布氨酸、整联蛋白和纤连蛋白。胶原蛋白是胞外基质主要的蛋白。目前已知约15种类型的胶原蛋白,在身体的不同部分发现,例如,在骨、皮肤、腱、韧带、角膜、内脏中发现的I型胶原蛋白(占身体胶原蛋白的90%),或在软骨、椎间盘、脊索和眼睛的玻璃体中发现的II型胶原蛋白。
来自血液的合适蛋白包括,例如,血浆蛋白(例如,纤维蛋白、α-2巨球蛋白、血清白蛋白、纤维蛋白原(例如,纤维蛋白原A、纤维蛋白 原B)、血清淀粉状蛋白A、结合珠蛋白、抑制蛋白、泛素、子宫球蛋白和β-2-微球蛋白)、酶和酶抑制剂(例如,血纤维蛋白溶酶原、溶菌酶、半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)C、α-1-抗胰蛋白酶和胰腺胰蛋白酶抑制剂)、免疫系统的蛋白,如免疫球蛋白(例如,IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、免疫球蛋白轻链(κ/λ))、转运蛋白(例如,视黄醇结合蛋白、α-1微球蛋白)、防御素(例如,β-防御素1、嗜中性防御素1、嗜中性防御素2和嗜中性防御素3)等。
在血脑屏障或神经组织中发现的合适蛋白包括,例如,黑皮素受体、髓磷脂、抗坏血酸转运子等。
提高体内血清半衰期的合适多肽还包括位于肾脏中的蛋白(例如,polycystin、IV型胶原蛋白、有机阴离子转运子K1、Heymann’s抗原)、位于肝脏中的蛋白(例如,醇脱氢酶、G250)、位于肺中的蛋白(例如,分泌成分,其结合IgA)、位于心脏中的蛋白(例如,HSP27,其与扩张型心肌病相关)、位于皮肤中的蛋白(例如,角蛋白)、骨特异性蛋白,如骨形态发生蛋白(BMP),其是证明了骨形成活性的蛋白的转化生长因子β超家族的子集(例如,BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8)、肿瘤特异性蛋白(例如,滋养层抗原、herceptin受体、雌激素受体、组织蛋白酶(例如,组织蛋白酶B,其可以在肝脏和脾脏中找到)。
合适的疾病特异性蛋白包括,例如,只在激活的T-细胞上表达的抗原,包括LAG-3(淋巴细胞激活基因)、骨保护素配体(OPGL;参见Nature 402,304-309(1999)),OX40(TNF受体家族的成员,在激活的T细胞上表达并在人I-型T细胞白血病病毒(HTLV-I)-产生细胞中特异性地上调;参见Immunol.165(1):263-70(2000))。合适的疾病特异性蛋白还包括,例如,金属蛋白酶(与关节炎/癌症相关),包括CG6512果蝇、人截瘫蛋白(paraplegin)、人FtsH、人AFG3L2、鼠ftsH;和血管生成生长因子,包括酸性成纤维细胞生长因子(FGF-1)、碱性成纤维细胞生长因子(VEGF/VPF)、转化生长因子-α(TGFα)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血管生成素、白细胞间介素-3(IL-3)、白细胞间介素-8(IL-8)、血小板衍生内皮生长因子(PD-ECGF)、胎盘生长因子(PlGF)、中期因子(midkine)血小板-衍生生长因子-BB(PDGF)和fractalkine。
提高体内血清半衰期的合适多肽还包括应激蛋白,如热休克蛋白(HSP)。HSP通常在细胞内发现。在胞外发现时,它是细胞已经死亡并溢出其内含物的指示剂。作为创伤、疾病或损伤的结果时,发生这种非程序化细胞死亡(坏死),胞外HSP引发了来自免疫系统的应答。结合胞外HSP可以导致将本发明的组合物定位于患病部位。
涉及Fc转运的合适蛋白包括,例如,Brambell受体(也称为FcRB)。这种Fc受体具有两个功能,对于递送都是潜在有用的。功能是(1)通过胎盘将IgG从母体转运至子女,(2)保护IgG免受降解,由此延长其血清半衰期。认为受体使来自核内体的IgG再循环。(参见,Holliger等,Nat Biotechnol 15(7):632-6(1997))。
结合血清白蛋白的dAb
在一个实施方案中,本发明提供了多肽或拮抗剂(例如,双特异性配体),其含有结合TNFR1的抗TNFR1dAb(第一dAb)和结合血清白蛋白(SA)的第二dAb,第二dAb结合SA,具有通过表面等离子共振测定的1nM至1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、100、200、300、400或500μM(即,x10-9至5x10-4)的KD,或100nM至10μM,或1至5μM,或3至70nM,或10nM至1、2、3、4或5μM。例如,30至70nM,如通过表面等离子共振所测定的。在一个实施方案中,第一dAb(或dAb单体)结合SA(例如,HSA),具有通过表面等离共振测定的大约1、50、70、100、150、200、300nM或1、2或3μM的KD。在一个实施方案中,对于含有第一抗-SA dAb和第二对TNFR1的dAb的双特异性抗体,第二dAb对其目标的亲和性(例如KD和/或Koff,如通过表面等离子共振所测量的,例如使用BiaCore)为dAb对SA的亲和性的1至100000倍(例如,100至100000,或1000至100000,或10000至100000倍)。在一个实施方案中,血清白蛋白是人血清白蛋白(HSA)。例如,第一dAb以大约10μM的亲和性结合SA,而第二dAb以100pM的亲和性结合其目标。在一个实施方案中,血清白蛋白是人血清白蛋白(HSA)。在一个实施方案中,第一dAb以大约50,例如,70、100、150或200nM的KD结合SA(例如,HSA)。双特异性配体的详细内容可以在WO03002609、WO04003019和WO04058821中找到。
在一个实施方案中,本发明的配体包含结合血清白蛋白(SA)的dAb,具有通过表面等离子共振测定的1nM至1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、100、200、300、400或500μM(即,x10-9至5x10-4)的KD,或100nM至10μM,或1至5μM,或3至70nM,或10nM至1、2、3、4或5μM。例如,30至70nM,如通过表面等离子共振所测定的。在一个实施方案中,第一dAb(或dAb单体)结合SA(例如,HAS),具有通过表面等离共振测定的大约1、50、70、100、150、200、300nM或1、2或3μM的KD。在一个实施方案中,第一和第二dAb通过连接物连接,例如,1至4个氨基酸的连接物,或1至3个氨基酸,或多于3个氨基酸,或多于4、5、6、7、8、9、10、15或20个氨基酸。在一个实施方案中,可以使用较长的连接物(多于3个氨基酸)来提高功效(拮抗剂中一个或两个dAb的KD)。
在配体和拮抗剂的特定实施方案中,dAb结合人血清白蛋白并与选自以下的dAb竞争与白蛋白的结合:
MSA-16、MSA-26(对于这些序列的公开内容,参见WO04003019,在此将该序列及其核酸对应物引入作为参考并形成本发明文本公开内容的一部分),
DOM7m-16(SEQ ID NO:473)、DOM7m-12(SEQ ID NO:474)、DOM7m-26(SEQ ID NO:475)、D0M7r-1(SEQ ID NO:476)、DOM7r-3(SEQ ID NO:477)、DOM7r-4(SEQ ID NO:478)、DOM7r-5(SEQ ID NO:479)、DOM7r-7(SEQ ID NO:480)、DOM7r-8(SEQ ID NO:481)、DOM7h-2(SEQ ID NO:482)、DOM7h-3(SEQ ID NO:483)、DOM7h-4(SEQ ID NO:484)、DOM7h-6(SEQ IDNO:485)、DOM7h-1(SEQ ID NO:486)、DOM7h-7(SEQ ID NO:487)、DOM7h-22(SEQ ID NO:489)、DOM7h-23(SEQ ID NO:490)、DOM7h-24(SEQ ID NO:491)、DOM7h-25(SEQ ID NO:492)、DOM7h-26(SEQ ID NO:493)、DOM7h-21(SEQ ID NO:494)、DOM7h-27(SEQ ID NO:495)、DOM7h-8(SEQ ID NO:496)、DOM7r-13(SEQ ID NO:497)、DOM7r-14(SEQ ID NO:498)、DOM7r-15(SEQ ID NO:499)、DOM7r-16(SEQ ID NO:500)、DOM7r-17(SEQ ID NO:501)、DOM7r-18(SEQ ID NO:502)、DOM7r-19(SEQ ID NO:503)、DOM7r-20(SEQ ID NO:504)、DOM7r-21(SEQID NO:505)、DOM7r-22(SEQ ID NO:506)、DOM7r-23(SEQ ID NO:507)、DOM7r-24(SEQ IDNO:508)、DOM7r-25(SEQ ID NO:509)、DOM7r-26 (SEQ ID NO:510)、DOM7r-27(SEQ ID NO:511)、DOM7r-28(SEQ ID NO:512)、DOM7r-29(SEQ ID NO:513)、DOM7r-30(SEQ ID NO:514)、DOM7r-31(SEQ ID NO:515)、DOM7r-32(SEQ ID NO:516)、DOM7r-33(SEQ ID NO:517)(对于这些序列的公开内容,参见WO2007080392,在此将其序列及其核酸对应物引入作为参考并形成本发明文本公开内容的一部分;该段落中的SEQ ID NO是WO2007080392公开的那些),
dAb8(dAb10)、dAb10、dAb36、dAb7r20(DOM7r20)、dAb7r21(DOM7r21)、dAb7r22(DOM7r22)、dAb7r23(DOM7r23)、dAb7r24(DOM7r24)、dAb7r25(DOM7r25)、dAb7r26(DOM7r26)、dAb7r27(DOM7r27)、dAb7r28(DOM7r28)、dAb7r29(DOM7r29)、dAb7r29(DOM7r29)、dAb7r31(DOM7r31)、dAb7r32(DOM7r32)、dAb7r33(DOM7r33)、dAb7r33(DOM7r33)、dAb7h22(DOM7h22)、dAb7h23(DOM7h23)、dAb7h24(DOM7h24)、dAb7h25(DOM7h25)、dAb7h26(DOM7h26)、dAb7h27(DOM7h27)、dAb7h30(DOM7h30)、dAb7h31(DOM7h31)、dAb2(dAbs4、7、41)、dAb4、dAb7、dAb11、dAb 12(dAb7m12)、dAb13(dAb15)、dAb15、dAb16(dAb21、dAb7m16)、dAb17、dAb18、dAb19、dAb21、dAb22、dAb23、dAb24、dAb25(dAb26、dAb7m26)、dAb27、dAb30(dAb35)、dAb31、dAb33、dAb34、dAb35、dAb38(dAb54)、dAb41、dAb46(dAbs47、52和56)、dAb47、dAb52、dAb53、dAb54、dAb55、dAb56、dAb7m12、dAb7m16、dAb7m26、dAb7r1(DOM7r1)、dAb7r3(DOM7r3)、dAb7r4(DOM7r4)、dAb7r5(DOM7r5)、dAb7r7(DOM7r7)、dAb7r8(DOM7r8)、dAb7r13(DOM7r13)、dAb7r14(DOM7r14)、dAb7r15(DOM7r15)、dAb7r16(DOM7r16)、dAb7r17(DOM7r17)、dAb7r18(DOM7r18)、dAb7r19(DOM7r19)、dAb7h1(DOM7h1)、dAb7h2(DOM7h2)、dAb7h6(DOM7h6)、dAb7h7(DOM7h7)、dAb7h8(DOM7h8)、dAb7h9(DOM7h9)、dAb7h10(DOM7h10)、dAb7h11(DOM7h11)、dAb7h12(DOM7h12)、dAb7h13(DOM7h13)、dAb7h14(DOM7h14)、dAb7p1(DOM7p1)和dAb7p2(DOM7p2)(对于这些序列的公开内容,参见PCT/GB2008/000453,2008年2月8日申请,在此将其序列及其核酸对应物引入作为参考并形成本发明文本的公开内容的一部分)。dAb后括号中显示了可替换的名称,例如dAb8具有可替换的名称dAb10,即dAb8(dAb10)。还在图51a和b中列出了这些序列。
在特定的实施方案中,dAb结合人血清白蛋白,并包含与选自以下的dAb的氨基酸序列具有至少约80%或至少约85%,或至少约90%,或至少约95%,或至少约96%,或至少约97%,或至少约98%,或至少约99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列:
MSA-16、MSA-26,
DOM7m-16(SEQ ID NO:473)、DOM7m-12(SEQ ID NO:474)、DOM7m-26(SEQ ID NO:475)、D0M7r-1(SEQ ID NO:476)、DOM7r-3(SEQ ID NO:477)、DOM7r-4(SEQ ID NO:478)、DOM7r-5(SEQ ID NO:479)、DOM7r-7(SEQ ID NO:480)、DOM7r-8(SEQ ID NO:481)、DOM7h-2(SEQ ID NO:482)、DOM7h-3(SEQ ID NO:483)、DOM7h-4(SEQ ID NO:484)、DOM7h-6(SEQ IDNO:485)、DOM7h-1(SEQ ID NO:486)、DOM7h-7(SEQ ID NO:487)、DOM7h-22(SEQ ID NO:489)、DOM7h-23(SEQ ID NO:490)、DOM7h-24(SEQ ID NO:491)、DOM7h-25(SEQ ID NO:492)、DOM7h-26(SEQ ID NO:493)、DOM7h-21(SEQ ID NO:494)、DOM7h-27(SEQ ID NO:495)、DOM7h-8(SEQ ID NO:496)、DOM7r-13(SEQ ID NO:497)、DOM7r-14(SEQ ID NO:498)、DOM7r-15(SEQ ID NO:499)、DOM7r-16(SEQ ID NO:500)、DOM7r-17(SEQ ID NO:501)、DOM7r-18(SEQ ID NO:502)、DOM7r-19(SEQ ID NO:503)、DOM7r-20(SEQ ID NO:504)、DOM7r-21(SEQID NO:505)、DOM7r-22(SEQ ID NO:506)、DOM7r-23(SEQ ID NO:507)、DOM7r-24(SEQ IDNO:508)、DOM7r-25(SEQ ID NO:509)、DOM7r-26(SEQ ID NO:510)、DOM7r-27(SEQ ID NO:511)、DOM7r-28(SEQ ID NO:512)、DOM7r-29(SEQ ID NO:513)、DOM7r-30(SEQ ID NO:514)、DOM7r-31(SEQ ID NO:515)、DOM7r-32(SEQ ID NO:516)、DOM7r-33(SEQ ID NO:517)(该段落中的SEQ ID NO是WO2007080392中公开的那些),
dAb8、dAb 10、dAb36、dAb7r20、dAb7r21、dAb7r22、dAb7r23、dAb7r24、dAb7r25、dAb7r26、dAb7r27、dAb7r28、dAb7r29、dAb7r30、dAb7r31、dAb7r32、dAb7r33、dAb7h21、dAb7h22、dAb7h23、Ab7h24、Ab7h25、Ab7h26、dAb7h27、dAb7h30、dAb7h31、dAb2、dAb4、dAb7、dAb11、dAb12、dAb13、dAb15、dAb16、dAb17、dAb18、dAb19、dAb21、dAb22、dAb23、dAb24、dAb25、dAb26、dAb27、dAb30、dAb31、dAb33、dAb34、dAb35、dAb38、dAb41、dAb46、dAb47、dAb52、dAb53、dAb54、dAb55、dAb56、dAb7m12、dAb7m16、dAb7m26、dAb7r1、dAb7r3、dAb7r4、dAb7r5、dAb7r7、dAb7r8、dAb7rl3、dAb7r14、dAb7r15、dAb7r16、dAb7r17、dAb7r18、dAb7r19、dAb7h1、dAb7h2、dAb7h6、dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、dAb7h10、dAb7h11、dAb7h12、dAb7h13、dAb7h14、dAb7p1和dAb7p2。
例如,结合人血清白蛋白的dAb可以含有与以下序列具有至少约90%,或至少约95%,或至少约96%,或至少约97%,或至少约98%,或至少约99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列:DOM7h-2(SEQ ID NO:482)、DOM7h-3(SEQ ID NO:483)、DOM7h-4(SEQ ID NO:484)、DOM7h-6(SEQ ID NO:485)、DOM7h-1(SEQ ID NO:486)、DOM7h-7(SEQ ID NO:487)、DOM7h-8(SEQ ID NO:496)、DOM7r-13(SEQ ID NO:497)、DOM7r-14(SEQ ID NO:498)、DOM7h-22(SEQ ID NO:489)、DOM7h-23(SEQ ID NO:490)、DOM7h-24(SEQ ID NO:491)、DOM7h-25(SEQ ID NO:492)、DOM7h-26(SEQ ID NO:493)、DOM7h-21(SEQ ID NO:494)、DOM7h-27(SEQID NO:495)(该段落中的SEQ ID NO 是WO2007080392中公开的那些),
dAb8、dAb10、dAb36、dAb7h21、dAb7h22、dAb7h23、Ab7h24、Ab7h25Ab7h26、dAb7h27、dAb7h30、dAb7h31、dAb2、dAb4、dAb7、dAb11、dAb12、dAb13、dAb15、dAb16、dAb17、dAb18、dAb19、dAb21、dAb22、dAb23、dAb24、dAb25、dAb26、dAb27、dAb30、dAb31、dAb33、dAb34、dAb35、dAb38、dAb41、dAb46、dAb47、dAb52、dAb53、dAb54、dAb55、dAb56、dAb7h1、dAb7h2、dAb7h6、dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、dAb7h10、dAb7h11、dAb7h12、dAb7h13和dAb7h14。
在特定的实施方案中,dAb结合人血清白蛋白并含有与以下序列具有至少约80%或至少约85%,或至少约90%,或至少约95%,或至少约96%,或至少约97%,或至少约98%,或至少约99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列:
DOM7h-2(SEQ ID NO:482)、DOM7h-6(SEQ ID NO:485)、DOM7h-1(SEQ ID NO:486)、DOM7h-7(SEQ ID NO:487)、DOM7h-8(SEQ ID NO:496)、DOM7h-22(SEQ ID NO:489)、DOM7h-23(SEQ ID NO:490)、DOM7h-24(SEQ ID NO:491)、DOM7h-25(SEQ ID NO:492)、DOM7h-26(SEQ ID NO:493)、DOM7h-21(SEQ ID NO:494)、DOM7h-27(SEQ ID NO:495)(该段落中的SEQID NO是WO2007080392中公开的那些),
dAb7h21、dAb7h22、dAb7h23、Ab7h24、Ab7h25、Ab7h26、dAb7h27、dAb7h30、dAb7h31、dAb2、dAb4、dAb7、dAb38、dAb41、dAb7h1、dAb7h2、dAb7h6、dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、dAb7h10、dAb7h11、dAb7h12、dAb7h13和dAb7h14。
在更特别的实施方案中,dAb是结合人血清白蛋白的VκdAb,并具有选自以下的氨基酸序列:
DOM7h-2(SEQ ID NO:482)、DOM7h-6(SEQ ID NO:485)、DOM7h-1(SEQ ID NO:486)、DOM7h-7(SEQ ID NO:487)、DOM7h-8(SEQ ID NO:496)(该段落中的SEQ ID NO是WO2007080392中公开的那些),
dAb2、dAb4、dAb7、dAb38、dAb41、dAb54、dAb7h1、dAb7h2、dAb7h6、dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、dAb7h10、dAb7h11、dAb7h12、dAb7h13和dAb7h14。
在更特别的实施方案中,dAb是结合人血清白蛋白的VH dAb,并具有选自dAb7h30和dAb7h31的氨基酸序列。
在更特别的实施方案中,dAb是dAb7h11或dAb7h14。
在其他实施方案中,dAb、配体或拮抗剂结合人血清白蛋白,并含有之前任一氨基酸序列的一个、两个或三个CDR,例如,dAb7h11或dAb7h 14的一个、两个或三个CDR。
合适的结合血清白蛋白的Camelid VHH包括WO2004/041862(Ablynx N.V.)和WO2007080392中公开的那些(在此将其VHH序列及其核酸对应物引入作为参考,并形成本发明文本公开内容的一部分),如序列A(SEQ ID NO:518)、序列B(SEQ ID NO:519)、序列C(SEQID NO:520)、序列D(SEQ ID NO:521)、序列E(SEQ ID NO:522)、序列F(SEQ ID NO:523)、序列G(SEQ ID NO:524)、序列H(SEQ ID NO:525)、序列I(SEQ ID NO:526)、序列J(SEQ ID NO:527)、序列K(SEQ ID NO:528)、序列L(SEQ ID NO:529)、序列M(SEQ ID NO:530)、序列N(SEQID NO:531)、序列O(SEQ ID NO:532)、序列P(SEQ ID NO:533)、序列Q(SEQ ID NO:534),这些序列编号对应于WO2007080392或WO2004/041862(Ablynx N.V.)中引用的那些。 在特定的实施方案中,Camelid VHH结合人血清白蛋白并含有与WO200708030392中公开的ALB 1或SEQ ID NO:518-534中任一个具有至少约80%,或至少约85%,或至少约90%,或至少约95%,或至少约96%,或至少约97%,或至少约98%,或至少约99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列,这些序列编号对应于WO2007080392或WO2004/041862中引用的那些。
在一些实施方案中,配体或拮抗剂含有与在此公开的任一抗-血清白蛋白dAb竞争与血清白蛋白(例如,人血清白蛋白)结合的抗-血清白蛋白dAb。
在可替换的实施方案中,拮抗剂或配体含有TNFR1(例如,人TNFR1)特异性的结合部分,其中该部分含有非免疫球蛋白序列,如2008年2月8日申请的共同未决申请PCT/GB2008/000453中所述的,这些结合部分、它们的生产和选择方法(例如,来自不同的文库)及其序列的公开内容在此引入作为参考,作为本发明文本的公开内容的一部分。
与半衰期延长部分(例如,白蛋白)的缀合
在一个实施方案中,将(一个或更多个)半衰期延长部分(half-life extendingmoiety)(例如,白蛋白、转铁蛋白及其片段和类似物)缀合或连接本发明的TNFR1-结合多肽、dAb或拮抗剂。对用于TNFR1-结合形式中的合适白蛋白、白蛋白片段或白蛋白变体的实例描述于WO2005077042中,在此将其公开内容引入作为参考,并形成本发明文本的公开内容的一部分。特别地,以下的白蛋白、白蛋白片段或白蛋白变体可以用于本发明中:
·SEQ ID NO:1(如WO2005077042中公开的,在此明确地将该序列引入本发明公开内容中作为参考);
·含有WO2005077042中的SEQ ID NO:1的氨基酸1-387或由WO2005077042中的SEQID NO:1的氨基酸1-387组成的白蛋白片段或变体;
·白蛋白、或其片段或变体,含有选自以下的氨基酸序列:(a)WO2005077042中的SEQ ID NO:1的氨基酸54-61;(b)WO2005077042中的SEQ ID NO:1的氨基酸76至89;(c)WO2005077042中的SEQ ID NO:1的氨基酸92至100;(d)WO2005077042中的SEQ ID NO:1的氨基酸170至176;(e)WO2005077042中的SEQ ID NO:1的氨基酸247至252;(f)WO2005077042中的SEQ ID NO:1的氨基酸266至277;(g)WO2005077042中的SEQ ID NO:1的氨基酸280至288;(h)WO2005077042中的SEQ ID NO:1的氨基酸362至368;(i)WO2005077042中的SEQ ID NO:1的氨基酸439至447;(i)WO2005077042中的SEQ ID NO:1的氨基酸462至475;(k)WO2005077042中的SEQ ID NO:1的氨基酸478至486;和(1)WO2005077042中的SEQ ID NO:1的氨基酸560至566。
对用于TNFR1结合形式中的合适白蛋白、片段或类似物的更多实例描述于WO03076567中,在此将其公开内容引入作为参考,并形成本发明文本的公开内容的一部分。特别地,以下的白蛋白、片段或变体可以用于本发明中:
·如WO03076567中所述的人血清白蛋白,例如,图3中(在此明确地将该序列信息引入本发明公开内容中作为参考);
·由具有66,500通式分子量的585个氨基酸的单非糖基化多肽链组成的人血清白蛋白(参见,Meloun等,FEBS Letters 58:136(1975);Behrens等,Fed.Proc.34:591(1975);Lawn等,Nucleic Acids Research 9:6102-6114(1981);Minghetti等,J.Biol.Chem.261:6747(1986));
·白蛋白的多态变体或类似物或片段,如Weitkamp等,Ann.Hum.Genet.37:219(1973)中所述的;
·如EP322094中所述的白蛋白片段或变体,例如,HA(1-373)、HA(1-388)、HA(1-389)、HA(1-369)和HA(1-419)以及1-369和1-419之间的片段;
·如EP399666中所述的白蛋白片段或变体,例如,HA(1-177)和HA(1-200)以及HA(1-X)之间的片段,其中X是178至199的任何数字。
在将(一个或更多个)半衰期延长部分(例如,白蛋白、转铁蛋白及其片段和类似物)用于格式化本发明的TNFR1-结合多肽、dAb和拮抗剂的情况中,可以使用任何合适的方法来缀合,如通过直接融合TNFR1-结合部分(例如,抗-TNFR1dAb),例如,通过使用编码融合蛋白的单核苷酸构建体,其中将融合蛋白编码为单多肽链,在位于TNFR 1结合部分的N-或C-端具有半衰期延长部分。或者,可以通过在部分之 间使用肽连接物来完成缀合,例如,WO03076567或WO2004003019中所述的肽连接物(在此将这些连接物的公开内容引入作为参考,以提供用于本发明中的实例)。通常,提高体内血清半衰期的多肽是在体内天然产生的多肽,并且能抵抗从生物体内(例如,人)除去不利物质的内源机制的降解或去除。例如,提高体内血清半衰期的多肽可以选自胞外基质的蛋白,血液中发现的蛋白,血脑屏障或神经组织中发现的蛋白,位于肾脏、肝脏、肺、心脏、皮肤或骨中的蛋白,应激蛋白,疾病特异性蛋白或涉及Fc转运的蛋白。
在整个公开内容中所述的本发明的实施方案中,替代本发明的拮抗剂或配体中的抗-TNFR1“dAb”的使用,考虑了本领域技术人员可以使用含有本发明的结合TNFR1的dAb的一个或更多个或全部3个CDR的多肽或结构域(例如,嫁接在合适蛋白支架或骨架上的CDR,支架或骨架例如为,亲和体、SpA支架、LDL受体A类结构域或EGF结构域)。因此,认为该公开内容作为整体提供了使用这样的结构域替代dAb的拮抗剂的公开内容。在这点上,参见2008年2月8日申请的PCT/GB2008/000453,在此将其公开内容引入作为参考)。
因此,在一个实施方案中,本发明的拮抗剂包含具有TNFR1结合特异性的免疫球蛋白单可变域或结构域抗体(dAb)或该dAb合适形式的互补性决定区。拮抗剂可以是由该dAb组成的多肽,或基本上是由该dAb组成的多肽。拮抗剂可以是包含合适形式的dAb(或dAb的CDR)的多肽,如抗体形式(例如,IgG-样形式,scFv、Fab、Fab’、F(ab’)2),或含有结合TNFR1的dAb和结合另一个目标蛋白、抗原或表位(例如,血清白蛋白)的第二dAb的双特异性配体。
可以将根据本发明的多肽、dAb和拮抗剂格式化成本领域已知的各种合适的抗体形式,如IgG-样形式、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体、双特异性抗体、抗体重链、抗体轻链、抗体重链和/或轻链的同型二聚体和杂二聚体、之前任一项的抗原结合片段(例如,Fv片段(例如,单链Fv)(scFv)、二硫化物键合的Fv)、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段)、单可变域(例如,VH、VL)、dAb和之前任一项的修饰形式(通过共价连接聚烷撑二醇(例如,聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇)或其他合适聚合物的修饰)。
在一些实施方案中,本发明提供了为IgG-样形式的配体(例如,抗-TNFR1拮抗剂)。这样的形式具有IgG分子常规的四条链结构(2条重链和两条轻链),其中一个或更多个可变区(VH和或VL)已经由本发明的dAb替代。在一个实施方案中,每个可变区(2个VH区和2个VL区)由dAb或单可变域替代,其中至少一个是根据本发明的抗-TNFR1dAb。IgG-样形式中包括的dAb或单可变域可以具有相同的特异性或不同的特异性。在一些实施方案中,IgG-样形式是三价的,并可以具有一种(只抗-TNFR1)、两种(例如,抗-TNFR1和抗-SA)、三种或四种特异性。例如,IgG样形式可以是单价的,并含有具有相同特异性的4个dAb;是双特异性的并含有3个具有相同特异性的dAb和另一个具有不同特异性的dAb;是双特异性的并含有两个具有相同特异性的dAb和两个具有共同的但不相同特异性的dAb;三特异性的并含有具有相同特异性的第一和第二dAb,具有不同特异性的第三dAb和具有不同于第一、第二和第三dAb的特异性的第四dAb;或四特异性的,并含有四个具有各不相同特异性的dAb。可以制备IgG样形式的抗原结合片段(例如,Fab、F(ab’)2、Fab’、Fv、scFv)。在一个实施方案中,IgG样形式或其抗原结合片段不与TNFR1交联,例如,形式对于TNFR1可以是单价的。如果需要补体激活和/或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能,配体可以是IgG1-样形式。如果需要,IgG-样形式可以包含突变的恒定域(变体IgG重链恒定域),以最小化与Fc受体的结合和/或固定补体的能力。(参见,例如,Winter等,GB2,209,757B;Morrison等,WO89/07142;Morgan等,WO94/29351,1994年12月22日)。
本发明的配体(多肽、dAb和拮抗剂)可以格式化成融合蛋白,其含有与第二免疫球蛋白单可变域直接融合的第一免疫球蛋白单可变域。如果需要,该形式可以进一步包含半衰期延长部分。例如,配体可以包含与第二免疫球蛋白单可变域直接融合的第一免疫球蛋白单可变域,而第二免疫球蛋白单可变域与结合血清白蛋白的免疫球蛋白可变域直接融合。
通常,不管配体是否包含连接物,具有对目标有结合特异性的结合位点的多肽结构域的方向是设计选择的问题。然而,一些方向,使用或不使用连接物,可以提供比其他方向更好的结合特征。本发明包括的所有方向(例如,dAb1-连接物-dAb2;dAb2-连接物-dAb1)是含有提供所需结合特征的方向的配体,该结合特征可以通过筛选容易地识别。
根据本发明的多肽和dAb,包括dAb单体、二聚体和三聚体,可以连接抗体Fc区,包含CH2和CH3结构域中的一个或两个,和任选铰链区。例如,作为单个核苷酸序列连接Fc区的载体编码配体可以用来制备这样的多肽。
此外,本发明提供了上述dAb单体的二聚体、三聚体和多聚体。
密码子优化序列
如上所述,本发明的实施方案提供了编码本发明的多肽和可变域的密码子优化核苷酸序列。如以下说明中所示的,可以产生编码相同可变域的约70%同一性的密码子优化序列(在该情况中,可变域氨基酸序列与DOM 1h-131-206相同)。在这种情况下,对于通过巴斯德毕赤酵母(密码子优化序列1-3)或大肠杆菌(密码子优化序列4和5)的表达,将序列优化。
我们在考虑了遗传密码的简并性之后进行了计算,并将通过DOM1h-131-206(如显示于图19中)的核苷酸序列和理论核苷酸序列编码的每个简并密码子内的核苷酸变化数量最大化,理论核苷酸序列仍然编码与DOM 1h-131-206相同的可变域。计算揭示了理论序列与显示于图19中的DOM 1h-131-206的核苷酸序列只具有57%的同一性。
密码子优化序列1
DNA序列
gaggttcaattgttggaatccggtggtggattggttcaacctggtggttctttgagattgtcctgtgctgcttccggttttactttcgctcacgagactatggtttgggttagacaggctccaggtaaaggattggaatgggtttcccacattccaccagatggtcaagatccattctacgctgactccgttaagggaagattcactatctccagagacaactccaagaacactttgtacttgcagatgaactccttgagagctgaggatactgctgtttaccactgtgctttgttgccaaagagaggaccttggtttgattactggggacagggaactttggttactgtttcttcc
相应的AA序列
evqllesggglvqpggslrlscaasgftfahetmvwvrqapgkglewvshippdgqdpfyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyhcallpkrgpwfdywgqgtlvtvss
·与WT序列74.1%的核苷酸序列同一性
密码子优化序列2
DNA序列
gagaaaagagaggttcaattgcttgaatctggaggaggtttggtccagccaggagggtcccttcgactaagttgtgctgccagtgggtttacgtttgctcatgaaactatggtatgggtccgacaggcacctggtaaaggtcttgaatgggtttcacatatccctccagacggtcaagacccattttacgctgattccgtgaaaggcagatttacaatttcacgagataattctaaaaacaccttgtacttacaaatgaactcattgagagctgaggacactgcagtttatcactgcgctttactaccaaaacgtggaccttggtttgattattggggccaaggtacgttagtgactgttagttct
相应的AA序列
ekrevqllesggglvqpggslrlscaasgftfahetmvwvrqapgkglewvshippdgqdpfyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyhcallpkrgpwfdywgqgtlvtvss
·与WT序列71.1%的核苷酸序列同一性
密码子优化序列3
DNA序列
gaagtgcagcttcttgaaagtggtggagggctagtgcagccagggggatctttaagattatcatgcgctgccagtggatttacttttgctcacgagacgatggtctgggtgagacaagctcctggaaaaggtttagagtgggtttctcacattccacctgatggtcaagatcctttctacgcagattccgtcaaaggaagatttactatctccagagataatagtaaaaacactttgtacctacagatgaactcacttagagccgaagataccgctgtgtaccactgcgccttgttgccaaagagaggtccttggttcgattactggggtcagggtactctggttacagtctcatct
相应的AA序列
evqllesggglvqpggslrlscaasgftfahetmvwvrqapgkglewvshippdgqdpfyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyhcallpkrgpwfdywgqgtlvtvss
·与WT序列72.6%的核苷酸序列同一性
密码子优化序列4
DNA序列
gaagtacaactgctggagagcggtggcggcctggttcaaccgggtggttccctgcgcctgtcctgtgcggcatctggtttcaccttcgcacacgaaaccatggtgtgggttcgccaagctccgggcaaaggcctggaatgggtaagccacattcctccagatggccaggacccattctatgcggattccgttaagggtcgctttaccatttctcgtgataactccaaaaacaccctgtacctgcagatgaactccctgcgcgccgaggatactgcggtgtaccattgtgcgctgctgcctaaacgtggcccgtggttcgattactggggtcagggtactctggtcaccgtaagcagc
相应的AA序列
evqllesggglvqpggslrlscaasgftfahetmvwvrqapgkglewvshippdgqdpfyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyhcallpkrgpwfdywgqgtlvtvss
·与WT序列76.5%的核苷酸序列同一性
密码子优化序列5
DNA序列
gaggttcaactgctggaatctggtggtggtctggtacaaccgggtggttccctgcgtctgagctgtgcagcctctggtttcaccttcgctcatgagaccatggtttgggtacgccaggctccgggtaaaggcctggagtgggtaagccatatccctcctgatggtcaggacccgttctatgctgattccgtcaaaggccgttttaccatttctcgtgacaacagcaaaaacactctgtacctgcaaatgaactccctgcgtgcagaagacacggcggtttatcactgtgcactgctgccaaaacgcggcccttggttcgactactggggccagggtactctggtcactgtatcttct
相应的AA序列
evqllesggglvqpggslrlscaasgftfahetmvwvrqapgkglewvshippdgqdpfyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyhcallpkrgpwfdywgqgtlvtvss
·与WT序列78.4%的核苷酸序列同一性
例证
实施例A:人TNFR1的结构域抗体的前导选择(lead selection)&表征
结构域抗体从噬菌体文库产生。根据相关标准方法进行被动吸收人TNFR1的可溶性选择和淘选。从R&D systems(Cat No 636-R1-025/CF)或Peprotech(Cat no.310-07)购买人TNFR1作为可溶性重组蛋白,直接使用(在被动选择的情况中)或在生物素化后使用,使用通过伯胺偶联接着在生物测试中质量控制其活性以及通过质谱分析其MW和生物素化程度来生物素化。通常,利用每下一轮中降低水平的抗原来进行3轮选择。
对于抗-TNFR1结合克隆的存在,通过噬菌体ELISA来筛选来自选择的结果。从这些噬菌体选择中分离DNA并亚克隆至用于可溶性dAb片段表达的表达载体中。在96-孔平板中表达可溶性dAb片段,并将上清液用于筛选抗-TNFR1结合dAb的存在,使用直接结合ELISA,其使用抗-c-myc检测,或使用抗生物素蛋白链菌素/生物素化TNFR1BIAcoreTM芯片的BIAcoreTM,并根据解离速率(off-rate)来分级。
以下所述的前导分子(lead molecule)源自亲本dAb,命名为DOM1h-131(公开于WO2006038027中)。使用60nM生物素化抗原的3轮选择后,从噬菌体展示文库中选择了该分子。将抗生物素蛋白链菌素或 中性链亲和素覆盖的Dyna珠子替换为每轮选择中的捕获试剂,以防止对抗抗生物素蛋白链菌素或中性链亲和素的粘合剂的选择。该阶段的前导DOM1h-131功效是低微摩尔范围的,如通过MRC-5成纤维细胞/IL-8释放细胞测试所测定的。通过BIAcoreTM测定的结合动力学通常呈现出快结合快解离速率(fast-on/fast-off rate)。该DOM 1h-131前导分析的大肠杆菌表达水平,作为C-端myc标记的单体,在8mg/l的范围中。
前导的亲和性成熟:
促使DOM 1h-131亲和性成熟,以产生具有较高功效和改进的生物物理特征的突变体(对于DOM 1h-131产生的前导的氨基酸序列,参考图3)。使用易出错PCR聚合酶(Genemorph II,Stratagene)产生易出错文库后(1个氨基酸变化/dAb序列的平均数,文库大小8×107),利用这些易出错文库进行了七轮选择。该策略导致克隆DOM 1h-131-8的分离,这是其中有4个氨基酸变化的分子(一个在框架1中(FR1)、一个在CDR1中、一个在CDR3中和一个在FR4中),获得了大约100倍的功效提高,如通过MRC-5细胞测试所测量的(~4nM)。在该测试中,用测试样品将MRC-5细胞培养一小时,然后加入TNF-α(200pg/ml)。在过夜培养后,使用IL-8ABI 8200细胞检测测试(FMAT)测定IL-8释放。在每个实验中包括TNF-α剂量曲线。用于与dAb竞争与TNFR1结合的TNF-α浓度(200pg/ml)大约为该测试中最大TNF-α应答的70%。
为了进一步提高功效,通过在易出错前导共有序列信息建议的关键位置的寡-定向突变使单个氨基酸位置多样化。在该方法的过程中,通过BIAcoreTM筛选分离DOM 1h-131-8克隆的改进形式,DOM 1h-131-24(在校正之前最初命名为DOM 1h-131-8-2),其具有单个K94R氨基酸突变(氨基酸编号根据Kabat)和200-300pM的RBA功效。
产生更多基于该前导的易出错文库和源自其的NNS文库,并接受三轮使用热处理的噬菌体选择(对于方法,参见Jespers L等,Aggregation-resistant domain antibodiesselected on phage by heat denaturation(通过热变性在噬菌体上选择的抗聚集结构域抗体),Nat Biotechnol.2004年9月;22(9):1161-5)。在该选择过程中,将文库集合,并且源自两轮选择的克隆产生了dAb,如DOM 1h-131-53,认为其热稳定性更高。推测这些克隆具有更好的生物物理特征。将克隆DOM 1h-131-53中的一些框架突变形成种系,以产生克隆DOM1h-131-83。该克隆形成了进一步通过寡-定向单个CDR突变来多样化的基础,可以使用如上所述的噬菌体展示选择或使用体外区室化技术,该技术使用乳液。噬菌体展示策略产生了前导DOM 1h-131-117和DOM1h-131-151。体外区室化技术产生了DOM 1h-131-151。
在该阶段,在生物物理和生物测试中比较了这三个前导,DOM1h-131-511是具有最佳特征的分子。此外,测试了这些分子在胰蛋白酶或leucozyme的存在下对蛋白水解分裂的抵抗性。Leucozyme由来自囊性纤维化患者的集合痰液组成,并含有高水平的弹性蛋白酶和其他蛋白酶,并用作肺病体内状况的替代品。该数据表明全部三种前导DOM1h-131-117、DOM1h-131-151和DOM 1h-131-511在胰蛋白酶或leucozyme的存在下快速降解。这种发现引起了对DOM 1h-131-511在患者中时的体内持久性的关注,并且研发了一种策略来选择对胰蛋白酶提高的抵抗性。推测这种提高的胰蛋白酶抗性对分子的其他生物物理特征具有有益作用。实际上,改进了标准噬菌体选择方法,以允许在对抗原选择之前在蛋白酶的存在下进行选择。因此,工程化了一种新的噬菌体载体,其中检测c-myc标记物,以允许在胰蛋白酶存在下的选择而没有分裂噬菌体展示的dAb。产生了基于易出错文库的DOM 1h-131-511,并在pDOM33载体中克隆(对于pDOM33载体图谱,参见图50)。用1mg/ml或100μg/ml胰蛋白酶在37℃下将从该文库产生的噬菌体备料处理24小时,随后将Roche Complete ProteaseInhibitors(2x)的蛋白酶抑制剂加入,以在对相关抗原选择之前阻断胰蛋白酶活性。进行了四轮选择。在胰蛋白酶(100μg/ml或1000μg/ml终胰蛋白酶浓度)的存在或不存在下在37℃下温育一小时或过夜的过程中,使用BIAcoreTM测定可溶性表达的TNFR1结合dAb,测定其在蛋白酶存在或不存在下结合TNFR1的能力。
这导致两种前导分子DOM 1h-131-202和DOM 1h-13-206的分离,这证明了提高的蛋白酶抗性,如通过BIAcoreTM抗原结合实验所显示的。感兴趣的是注意到与DOM 1h-131-511相比,DOM 1h-131-202只在CDR2(V53D)中含有一个突变,所有氨基酸编号根据Kabat,而DOM1h-131-206只含有两个突变:第一突变与DOM 1h-131-202中的相同(CDR2中的V53D突变),第二突变是FR3中的Y91H突变(参见, 图3)。该FR3中的Y91H突变在3-20人种系基因中没有发生,表明该残基在人抗体中产生。三个克隆DOM 1h-131-511、DOM 1h-131-202和DOM1h-131-206具有如图3中所示的氨基酸序列。
如下测定分子的活性:
DOM 1H-131-202、DOM 1H-131-511和DOM 1H-131-206与人TNFR1结合的BIAcoreTM结合亲和性测定。
通过BIAcoreTM分析测定DOM 1H-131-202、DOM 1H-131-511和DOM 1H-13-206对结合人重组大肠杆菌表达的人TNFR1的结合亲和性。使用生物素化的人TNFR1进行分析。将1400RU生物素化的TNFR1覆盖在抗生物素蛋白链菌素(SA)芯片上。使用弱酸洗脱条件将表面再生回基线。使用50μl/min的流速,将限定浓度的DOM 1H-131-202、DOM1H-131-511和DOM1H-131-206通过该表面。在BIAcoreTM3000机器上进行工作,并分析数据和使其拟合1∶1的结合模型。对于所有测试的分子,结合数据充分拟合1∶1模型。从kon和koff速率计算所有KD值。在25℃下进行BIAcoreTM运行。
从三个单独的实验产生以下的数据。在每个实验中,通过平均拟合的数量来计算结果,对于kd,使用最高的dAb浓度,对于ka,使用较低的浓度。数据作为结果的平均和标准偏差(括号中)来呈现(表1)。表1:DOM 1H-131-202、DOM 1H-131-511和DOM 1H-131-206结合人TNFR1的BIAcoreTM数据
DOM 1H-131-202、DOM 1H-131-511和DOM 1H-13-206相似地结合,并对人TNFR1具有高亲和性。DOM 1H-131-202和DOM 1H-13-206 各自以0.55nM和0.47nM的平均亲和性结合。与DOM 1H-131-511相比(其具有1.07nM的平均亲和性),DOM 1H-131-202和DOM 1H-13-206两者具有略高的亲和性。
受体结合测试:
在受体结合测试中测定dAb对抗人TNFR1的效力。该测试测量了TNF-α与TNFR1的结合和可溶性dAb阻断这种相互作用的能力。在预先覆盖山羊抗人IgG(H&L)的珠子上捕获TNFR1-FC融合体。在黑边透明圆底384孔平板中用TNF-α(10mg/ml)、dAb、生物素缀合的抗-TNF-α和抗生物素蛋白链菌素alexa fluor647温育受体覆盖的珠子。6小时后,在ABI8200Cellular Detection系统上阅读平板,并测定珠子相连的荧光。如果dAb阻断TNF-α结合TNFR1,荧光强度将降低。
使用ABI 8200分析软件分析数据。使用GraphPad Prism和具有可变斜率的S形剂量应答曲线测定浓度效应曲线和功效(EC50)值。对三种分开的情况重复测试。在每次实验中包括TNF-α剂量曲线(图38和39)。用于与dAb竞争结合TNFR1的TNF-α浓度(10ng/ml)大约为该测试中最大TNF-α应答的90%。
代表性的图显示于图39中,显示了dAb抑制TNF-α结合TNFR1的能力。在所有三个实验中,阴性对照样品(HEL4,抗-鸡蛋白lysozyme dAb和VH dummy)在高浓度下微弱地抑制TNF-α和TNFR1之间的相互作用。对于测试样品和阳性对照(获自R&D Systems的抗-TNFR1mAb,mAb225)和EnbrelTM(etanercept;由连接IgG1的Fc部分的TNFR2组成的二聚融合体;得到许可用于治疗类风湿性关节炎)的平均功效(EC50)值显示于表2中。
表2:在三次重复实验的TNFR1受体结合测试中对DOM 1H-131-202、DOM 1H-131-206和DOM 1H-13-511的功效(EC50)值。
样品 | 平均EC50(nM) | SEM |
DOM1H-131-202 | 0.11 | 0.008 |
DOM1H-131-206 | 0.07 | 0.01 |
DOM1H-131-511 | 0.19 | 0.01 |
EnbrelTM(Etanercept) | 0.20 | 0.07 |
抗-TNFR1mAb#mAb225 | 0.08 | 0.003 |
在该测试中,DOM 1H-131-206显示出比其他两个测试的dAb功效高,并具有与可购得的抗-TNFR1mAb,MAB225(R&D Systems)相似的功效。
如下进行来自巴斯德毕赤酵母的前导克隆的表达:
将三个前导分子的一级氨基酸序列用来产生用于在巴斯德毕赤酵母中分泌表达的密码子优化基因。在密码子优化和非密码子优化的DOM 1H-131-206之间存在75%的序列同一性。将三个合成基因克隆至表达载体pPIC-Zα中(来自Invitrogen),然后转化至两个毕赤酵母菌株中,X33和KM71H。将转化的细胞涂布于递增浓度的Zeocin(100、300、600和900μg/ml)上,来选择具有多个成分的克隆。对于每个细胞系和构建体,选择大约15个克隆,用于表达筛选。因为高/低基因拷贝数和表达水平之间的相关性在巴斯德毕赤酵母中没有完全理解,从Zeocin浓度范围中选择了几个克隆。使用没有对高生产力大范围筛选的克隆来进行5L发酵罐运行。这使得生产了大量的材料用于进一步研究。
用于蛋白质表征的材料生产:
基于蛋白A的色谱树脂已经广泛用于从微生物培养上清液中纯化VHdAb。尽管这使得可以用单步骤纯化方法用于生产高纯度材料,但通常在>90%的大部分情况中,对于一些分子,低pH洗脱条件会导致聚集物的形成。还存在亲和性树脂对dAb能力有限的问题;这意味着需要使用大量树脂来处理来自发酵罐的材料。为了产生高质量的材料用于表征以及进一步的稳定性和喷雾器研究,使用混合模型电荷诱导树脂作为主 要的捕获步骤接着阴离子交换来设计下游纯化方法。没有明显的优化,这使得回收了~70%纯度为~95%的表达的dAb。
对于混合模型电荷诱导树脂上(来自GE Healthcare的Capto MMC)的捕获步骤,使用50mM磷酸钠pH6.0进行柱平衡,并且装载上清液,而不需要稀释或pH调节。柱子洗涤后,使用50mM Tris pH9.0的洗脱缓冲液通过pH梯度洗脱蛋白质。特定的洗涤和梯度条件将根据待洗脱蛋白质的pI而略有改变。
然后使用流过步骤进一步纯化洗脱物峰,使用阴离子交换色谱。这除去了残余的HMW污染,如醇氧化酶和减少了内毒素。用PBS或不含盐的磷酸盐缓冲液pH7.4将树脂平衡。将来自Capto MMC的洗脱物装载在阴离子交换树脂上时,dAb没有结合,并从流过物中回收。内毒素和其他污染物结合树脂。如果使用PBS缓冲液,盐的存在将该步骤中的蛋白质回收提高至91%,而无盐获得了86%回收。
然而,盐的存在降低内毒素除去的有效性,使得与没有盐存在时获得的水平<1.0EU/ml相比较,使用盐的该步骤后的dAb的通常内毒素水平测量为58EU/ml。
蛋白质表征:
将产自5L发酵罐运行的材料进行表征,使用电喷雾质谱进行同一性分析,氨基端测序和等电子聚焦,以及使用SDS-PAGE、SEC和Gelcode糖蛋白染色试剂盒(Pierce)测定纯度。
同一性:
每个蛋白的头五个残基的氨基末端序列分析与预期的相同(EVQLL...)。对蛋白质样品进行了质谱分析,该样品已经使用C4Zip-tips(Millipore)缓冲交换至50∶50H2O∶含有0.1%冰醋酸的乙腈中。允许与内部二硫化物键的形成为-2的质量差异时,对于三个蛋白各自测量的质量在基于一级氨基酸序列的理论质量的0.5Da内(使用平均质量来计算)。IEF用来鉴定蛋白质,基于每种蛋白质各不相同的pI。
纯度:
将三种蛋白质以1μg和10μg的量装载于非还原SDS-PAGE凝胶上, 重复两份。在所有情况中观察到单个条带。还进行了大小排阻色谱来证明了纯度的水平。对于大小排阻色谱(SEC),将100μg的各种蛋白装载于TOSOH G2000SWXL柱上,以0.5ml/min流动。移动相为PBS/10%乙醇。
对候选物选择的dAb稳定性的研究
对于COPD的指示,需要将dAb递送至肺,例如使用喷雾器装置。这将意味着蛋白质将可能经历各种剪切和热应激,这取决于所用的喷雾器类型,并将接受肺环境中蛋白酶的酶降解。测定了使用这种类型的装置来递送蛋白质,是否形成正确的颗粒大小分布并在喷雾器递送后保持功能性。因此,研究了各个分子对各种物理应力的内在稳定性,来测定基线稳定性和最敏感稳定性指示测试。因为每种蛋白质的稳定性将取决于其溶解的缓冲液,因此需要一些预配制的工作。该信息,如缓冲液、pH,对于理解下游纯化过程和随后的存储过程中的蛋白质稳定性也是有用的。为了表征分子在暴露于各种物理应力过程中的变化,使用了各种分析技术,如分子排阻色谱(SEC)、SDS-PAGE和等电点聚焦(IEF)。
DOM 1H-131-202、DOM 1H-131-511和DOM 1H-131-206的蛋白酶稳定性测定:
通过在过量蛋白酶下预温育限定的时间点后残余结合活性的BIAcoreTM分析来测定DOM 1H-131-202、DOM 1H-131-511和DOM1H-131-206的蛋白酶稳定性。将大约1400RU的生物素化TNFR1覆盖抗生物素蛋白链菌素(SA)芯片。只用PBS或用100μg/ml胰蛋白酶、弹性蛋白酶或leucozyme来温育250nM的DOM 1H-131-202、DOM1H-131-511和DOM 1H-131-206,在30℃下持续1、3和24小时。通过加入蛋白酶抑制剂的混合物来停止反应。然后使用参考细胞减少将dAb/蛋白酶混合物在TNFR1覆盖的芯片上通过。在每个注射循环之间用10μl0.1M甘氨酸pH2.2使芯片表面再生。相对于没有蛋白酶的dAb结合,测定用蛋白酶预温育的结合人TNFR1(在10秒时)的DOM 1H-131-202、DOM 1H-131-511和DOM 1H-131-206的部分。在25℃下进行BIAcoreTM运行。
从三个独立的实验产生数据。条形图表示平均值,而误差棒表示结 果的标准偏差(对于结果,参见图24)。
发现DOM 1H-131-202和DOM 1H-131-206与DOM 1H-131-511相比,显示出对胰蛋白酶、弹性蛋白酶或leucozyme的蛋白水解降解具有更高的抵抗力。用胰蛋白酶1hr后和用弹性蛋白酶或leucozyme 3hr后,DOM 1H-131-202和DOM 1H-131-206与DOM 1H-131-511相比之间的差异最明显。
使用DSC测定的热稳定性:
为了测定分子具有最大稳定性的pH,使用差示扫描量热法(DSC)来测量Britton-Robinson缓冲液中各种dAb的解链温度(Tm)。因为Britton-Robinson是由三种成分的缓冲体系(醋酸盐、磷酸盐和硼酸盐)制成的,因此可能在相同的溶液中产生3-10的pH范围。从蛋白质一级氨基酸序列测定理论pI。从DSC,发现dAb具有最高内在热稳定性的pH,对于DOM1H-131-202(202)为pH7,对于DOM 1H-131-206(206)为pH 7-7.5,和对于DOM 1H-131-511(511),为pH7.5。对于所有随后的应力和稳定性工作,对于各种dAb,使用以下的pH;在Britton-Robinson缓冲液中,对于DOM 1H-131-202(202)和DOM1H-131-206(206)为pH 7.0,而对于DOM 1H-131-511(511)为pH 7.5。结果概括于以下的表3中:
表3:在Britton-Robinson缓冲液中,以1mg/ml通过DSC测定的DOM1H-131-202(202)、DOM 1H-131-206(206)和DOM 1H-131-511(511)的pH和Tm的概括
内在稳定性测试:
在离心Vivaspin浓缩器(5K截留)中浓缩所有前导dAb,来测定最大的溶解性和浓缩时的回收水平。在Britton-Robinson缓冲液中在最 稳定的pH下进行实验。在整个时间过程中测量样品体积和浓度,记录与预期浓度的偏差以及样品的回收百分比。
发现将所有蛋白在Britton-Robinson缓冲液中浓度至超过100mg/ml。与DOM 1H-131-511(511)相比,DOM 1H-131-202(202)和DOM 1H-131-206(206)显示出低于预期的回收,但仍然在可接受的水平内。
前导dAb的喷雾器递送:
通过测试不同的喷雾器和配制缓冲剂,证明了使用各种喷雾装置能有效地递送dAb。更重要地,第一次表明了配制缓冲液中的dAb的喷雾产生了有效肺递送所需的粒径分布(使用<5μm的液滴的百分比来比较),同时维持了蛋白的功能性。以下将对这进一步描述。
在不同装置中的性能比较:
在六个喷雾器装置中测试了DOM 1H-131-511(511),对于液体制剂的三个主要喷雾器组的每组,包括两个装置,三组喷雾器即超声波喷雾器、喷射喷雾器和振动筛喷雾器。在每个装置中,使用各种PEG浓度,测试5mg/ml的dAb。对于每个样品,使用MalvernSpraytek装置(Malvern Instruments Limited,UK)测量液滴大小<5μm的百分比,并且在图35中显示了结果。使用SEC测定喷雾后每个样品的稳定性,以分析在杯子中剩余的材料中和在收集的气溶胶中已经二聚的样品量。在图36中可看到结果。二聚物形成的程度越低,稳定性越高。
大部分装置可以递送40%或更多的正确大小范围中的液体制剂,但eFlow(振动筛喷雾器装置)和PARI LC(喷射喷雾器)装置进行地较好,缓冲液中包括PEG时,PARI LC*(星号)装置递送超过80%。使用eFlow也观察到了这种用PEG的递送提高,而使用PARI LC+,程度较低。
重要地,还发现在喷雾后,保持了dAb的活性(参见图8中的结果)。
缓冲添加剂的作用:
由于DOM 1H-131-511(511)较低的稳定性,50mM磷酸盐配制缓冲剂含有PEG 1000和蔗糖,并且具有限定为约等于含有1.2%(w/v蔗 糖)的50mM磷酸盐缓冲液中约2%至约10%PEG 1000溶液粘度的范围内的粘度,以帮助保护dAb免受剪切和热应激。因为DOM 1H-131-202(202)和DOM 1H-131-206(206)都具有较高的Tm,并显示出显著提高的对热应力的稳定性,在最初的配制缓冲液和Britton-Robinson缓冲液中(其具有低于配制缓冲液的粘度)测试了所有的分子。在E-flow和Pari LC+装置中测试了dAb,在5mg/ml的蛋白质浓度下使用3.5分钟的运行时间,并使用Malvern Sparytek装置测定粒径分布。作为比较,在其自身的配制缓冲液中测试了使用喷雾器装置递送的用于囊性纤维化的市售药物(称为标准蛋白质X)。结果显示于图37中。对于良好递送和分布至深肺中,理想的粒径为小于6微米,例如,<5μm。在Britton-Robinson缓冲液和配制缓冲液中(如之前所述的),所有dAb获得了低于5μm的可比较的粒径水平。然而,配制缓冲液较高的粘度对产生正确大小范围内的颗粒特别有益,例如,颗粒<5μm。在喷雾之前和之后通过A280测量来测定装置杯中的dAb浓度。发现了蛋白质浓度没有显著变化,表明在递送过程中没有优先将蛋白质或载体喷雾。
结论:
如上所述,已经证明了可以在各种可购得的喷雾器装置中将多肽如dAb进行喷雾,重要的是在喷雾后保持稳定性和生物活性,并且在喷雾后不存在观察到的明显聚集。将提高粘度的赋形剂如PEG加入缓冲液制剂中时,可以提高粒径分布和液滴大小小于5μm的百分比,因此潜在地提高了将dAb递送至深肺。
还可以通过提高dAb的浓度和递送时间来提高dAb至肺部的递送,例如,高达约40mg/ml的浓度,而dAb稳定性或活性没有任何降低。
实施例1
噬菌体载体pDOM 13
使用了丝状噬菌体(fd)展示载体,pDOM 13。该载体产生具有噬菌体外壳蛋白III的融合蛋白。图1中说明了pDOM 13的多个克隆位点。作为SalI/NotI片段来克隆编码dAb的基因。
实施例2
对噬菌体展示的具有各种胰蛋白酶抗性的结构域抗体(dAb)测试蛋白酶选择
在pDOM13中克隆编码dAb DOM 4-130-54(其结合IL-1R1)、DOM1h-131-511(其结合TNFR 1)以及DOM 15-10、DOM 15-26和DOM15-26-501(这些结合VEGFA)的基因,并根据标准技术产生展示这些dAb的噬菌体。通过PEG沉淀来纯化噬菌体,并重悬浮于PBS中和滴定。
作为分离的蛋白测试时,以上的dAb展示了各种抵抗胰蛋白酶降解的能力。如下测定对降解的抵抗性:用40μg/ml的胰蛋白酶在30℃下温育PBS中的dAb(1mg/ml),获得了25∶1dAb∶胰蛋白酶的分子比例。在加入胰蛋白酶之前,然后在T=1小时、3小时和24小时时,立即取样(30μl)。通过加入Roche Complete蛋白酶抑制剂(2x)来中和蛋白酶活性,接着浸入液氮中,并储存在干冰上。随后通过在Novex 10-20%Tricine凝胶上的电泳来分析15μg的各种dAb样品,并用SureBlue(1x)将蛋白质染色。
在头三个小时的过程中,DOM 15-10和DOM 15-26-501得到了明显消化。DOM 15-26、DOM 4-130-54和DOM 1h-131-511更稳定,dAb的消化只在24小时后变得明显(图2)。
还在胰蛋白酶存在下温育了噬菌体展示的dAb,以评价噬菌体展示的dAb的胰蛋白酶抗性是否与使用分离的可溶性dAb获得的结果相关联。测试了各种浓度的胰蛋白酶和温育时间。在所有情况中,用Roche Complete蛋白酶抑制剂中和胰蛋白酶后,测试了噬菌体结合通用配体的能力,通用配体为蛋白A(其结合所有VH结构域抗体(例如,DOM1h-131、DOM15-26、DOM 15-26-501))或蛋白L(其结合所有Vk结构域抗体(例如,DOM 4-130-54、DOM 15-10))。还测试了噬菌体结合目标抗原。在两种情况中,设想结合与dAb通过抵抗蛋白水解保持结构完整性相关。通过ELISA(使用对抗噬菌体的缀合抗体)或通过结合的噬菌体的洗脱和按指数生长的大肠杆菌TG1细胞感染后的滴定度分析来测量结合活性。
用噬菌体上的DOM 15-10、DOM 15-26和DOM 15-26-501进行测试
在室温下用各种胰蛋白酶浓度(100μg/ml、10μg/ml和0μg/ml)处 理每种dAb一小时。用Roche Complete蛋白酶抑制剂(1X)阻断胰蛋白酶活性,然后将噬菌体稀释于PBS中的2%Marvell中,在室温下用50nM生物素化的抗原(重组人VEGF(R&D systems))温育一小时。加入在室温下用PBS中的2%Marvell预封闭一小时的抗生物素蛋白链菌素覆盖的珠子(Dynabeads M-280(Invitrogen),然后将混合物在室温下温育五分钟。使用Dynabeads的所有温育步骤在转轮上进行。通过用1ml PBS中的0.1%吐温-20将珠子洗涤八次来洗掉未结合的噬菌体。用0.5ml的0.1M甘氨酸pH2.2洗脱结合的噬菌体,并用100μl 1M Tris-HClpH8.0中和。使用洗脱的噬菌体来感染按指数生长的TG 1细胞(在37℃下一小时),并涂布于四环素平板上。将平板在37℃下培养过夜,并进行菌落计数(参见表4)。从用100μg/ml胰蛋白酶温育的选择观察到最好的结果。与DOM 15-10和DOM 15-26-501相比较,DOM15-26的产量提高约10倍。
在更严格的温育条件下进行第二个实验来进一步证实这些结果。伴随搅拌(250rpm)将展示dAb的噬菌体在37℃下处理1小时或2小时。从用100μg/ml胰蛋白酶温育2小时的选择观察到最好的结果。DOM15-26的产量是DOM 15-26-501产量的200倍,是DOM 15-10产量的1000倍。
在第三个实验中,开始时将展示DOM 15-26和DOM 15-26-501的噬菌体以1∶1混合。然后伴随搅拌(250rpm)用胰蛋白酶(1000μg/ml)或没用胰蛋白酶在37℃下温育2小时,然后如上所述选择抗原结合。来自每个选择的十个克隆的测序揭示对于没用胰蛋白酶的预处理的克隆混合群(DOM 15-26:4/10;DOM 15-26-501:6/10),以及来自用胰蛋白酶选择的编码DOM 15-26的所有克隆和预期一样。
这些实验表明通过将蛋白酶加入展示dAb的噬菌体中可以获得选择压力,使得(在通用配体或抗原上淘选后)优先选择展示对蛋白水解最稳定dAb的噬菌体。
表4
用噬菌体上的DOM 4-130-54进行测试
用以上所述的相似实验方案测试了DOM 4-130-54。改变的参数如下:胰蛋白酶的浓度、温育的温度和长度。对抗PBS中1nM浓度的IL-RI-Fc(IL-1R1和Fc的融合体)来进行生物淘选。只在37℃下用100μg/ml胰蛋白酶温育噬菌体后观察到噬菌体滴定度的显著降低(参见表5)
表5
培养长度 | 温度 | 胰蛋白酶浓度 | 滴定度 |
1hr | 室温 | 100μg/ml | 1.8×1010 |
1hr | 室温 | 10μg/ml | 7.2×109 |
1hr | 室温 | 0μg/ml | 6.6×109 |
过夜 | 室温 | 100μg/ml | 2.16×109 |
过夜 | 室温 | 10μg/ml | 7.2×109 |
过夜 | 室温 | 0μg/ml | 7.8×109 |
过夜 | 37℃ | 100μg/ml | 2.04×106 |
过夜 | 37℃ | 10μg/ml | 3.84×108 |
过夜 | 37℃ | 0μg/ml | 7.2×109 |
用DOM 1h-131噬菌体的测试
在室温下用0μg/ml、10μg/ml、100μg/ml和1000μg/ml胰蛋白酶处理DOM 1h-131噬菌体(对于氨基酸序列,与DOM 1h-131-511密切相关)一小时。通过加入25x Complete蛋白酶抑制剂(Roche)来抑制消化。沿着用1nM TNFR1覆盖的ELISA平板进行噬菌体的连续2-倍稀释,并用抗M13-HRP检测结合噬菌体。结果显示于以下的表6中。
表6
这些测试实验清楚地表明了100μg/ml胰蛋白酶和37℃的温度适于将选择压力施加于对胰蛋白酶的蛋白水解有不同程度抵抗性的展示dAb的噬菌体。如果需要,对于每种展示dAb的噬菌体,优化蛋白酶的温育时间。
实施例3
展示结构域抗体组的噬菌体的蛋白酶选择
使用以下dAb作为母体分子形成了四个组:DOM 4-130-54、DOM1h-131-511、DOM15-10和DOM 15-26-555。对于50μl反应,使用Stratagene Mutazyme II试剂盒、生物素化的引物和5-50pg的模板,通过PCR在基因中引入随机突变。用SalI和NotI消化后,用抗生物素蛋白链菌素-覆盖的珠子从未消化的产品中纯化出插入片段,并在相应位点连接pDOM13。用纯化的连接混合物转化大肠杆菌TB1细胞,形成四环素 抗性克隆的大组:8.5x108(DOM 4-130-54)、1.5x109(DOM 1h-131-511)、6x108(DOM 15-10)和3x109(DOM 15-26-555)。
通过用PEG双重沉淀来制备噬菌体文库,并重悬浮于PBS中。
对于DOM 1h-131-511和DOM 4-130-54组,氨基酸突变的比例各自为2.3和4.4。通过使用蛋白A或蛋白L(以1μg/ml)覆盖的孔在噬菌体ELISA中测试96个克隆来测定功能性。在DOM 1h-131-511和DOM4-130-54组中,各自有62.5%和27%的克隆呈现出dAb的功能性展示。
对于DOM 15-10和DOM 15-26-555组,氨基酸突变的比例各自为2.5和4.6。通过使用蛋白A或蛋白L(以1μg/ml)覆盖的孔在噬菌体ELISA中测试96个克隆来测定功能性。在DOM15-10和DOM 15-26-555组中,各自有31.3%和10.4%的克隆呈现出dAb的功能性展示。
DOM 4-130-54和DOM 1h-131-511组
用这些文库进行了四轮选择,来选择具有提高的蛋白酶抗性的dAb。
第一轮选择是通过抗原结合(1nM或10nM抗原),没有使用蛋白酶处理来清理文库,以除去任何不再以高亲和性结合抗原的克隆。第1轮的结果为108-1010范围(与1011噬菌体的输入相比),表明大部分文库以高亲和性结合抗原。
在第2轮中,引入了使用100μg/ml胰蛋白酶的蛋白酶处理,并且结果如以下表7中所示。
表7
用胰蛋白酶在37℃下处理dAb过夜时,存在显著的选择。将该结果带至第3轮,其中用1mg/ml或100μg/ml胰蛋白酶在37℃下将噬菌体处理24小时。第3轮的胰蛋白酶处理过的噬菌体的滴定度对于DOM 1h-131-511组为105-106,对于DOM 4-130-154组为107-108。
来自第3轮的所有结果(用1mg/ml和100μg/ml的DOM 1h-131-511和DOM 4-130-154)经历了对抗1nM抗原的第四轮选择,使用100μg/ml胰蛋白酶。滴定度在106-108的范围内,与第3轮中看到的相似。对于DOM 1H-131-511组,看到一些富集,但对于DOM 4-130-54组,没有看到富集。
DOM 15-10和DOM 15-26-555组
用2nM生物素化的hVEGF(人血管内皮生长因子)浓缩物进行第一轮选择,并且没有使用蛋白酶处理来清理文库,以除去任何不再以高亲和性结合抗原的克隆。第1轮的结果为月108(对于DOM 15-10,与1010噬菌体的输入相当,对于DOM 15-26-555,与1010噬菌体输入相当),表明大部分文库以高亲和性结合抗原。
用2nM生物素化的hVEGF进行第二轮和第三轮选择。在hVEGF淘选之前,在胰蛋白酶(100μg/ml)存在下,在摇床(250rpm)中37℃下培养噬菌体。对于DOM15-10组,温育时间为一小时,对于DOM15-26-555组,为两小时。
结果如下:对于使用DOM 15-10组的第二轮和第三轮选择,为1.5x106和9x105;对于使用DOM 15-26-555的第二轮和第三轮选择,为2.2x108和3.9x109。
实施例4
选择结果的分析:DOM 4-130-54和DOM 1h-131-511组
将来自第3轮和第4轮的所有结果亚克隆至pDOM5载体中,并转化至JM83细胞中。pDOM5载体是基于pUC 119的载体。通过Plac启动子驱动蛋白质的表达。GAS1前导序列(参见WO2005/093074)确保了分离的可溶性dAb分泌至大肠杆菌JM83的周质和培养物上清液中。随机挑选来自第3轮和第4轮的96和72个单独的克隆,用于表达。
将各自来自第3轮和第4轮结果的12-24个克隆测序。在两个选择中都观察到了共有突变,并且选择大约25个带有共有基序的克隆用于进一步的表征。这些克隆的氨基酸序列显示于图3(DOM 1h-131-151选择的变体)和图4(DOM 4-130-54选择的变体)中,并作为DNA序列 列于图19A-19L中。将不同于选定克隆中亲本序列的氨基酸高亮显示(相同的那些用圆点来标记)。用框显示对应于CDR1、CDR2和CDR3的环。
这些克隆以较大的量表达,并在蛋白L(对于DOM 4-130-54变体)和蛋白A(对于DOM1h-131-511变体)上纯化,在胰蛋白酶(100μg/ml或1000μg/ml终浓度)存在或不存在下在37℃下温育一小时或过夜后,在BIAcore上测试抗原结合。
通常,来自DOM 4-130-54选择的结果更稳定,对于一小时,大部分克隆保持对胰蛋白酶的抗性,对于过夜,最佳克隆保持抗性。相反,对于一小时,来自DOM 1h-131-511选择的少量克隆能抵抗胰蛋白酶,对于过夜,没有一个克隆有抵抗力。
实施例5
选择结果的分析:DOM 15-10和DOM 15-26-555组
首先在使用或没有使用胰蛋白酶消化的单克隆噬菌体ELISA上测试了用胰蛋白酶预处理的选择的有效性。挑选了每个文库第二轮选择的十八个克隆和第三轮选择的24个克隆。将克隆DOM 15-10、DOM15-26-501和DOM 15-26用作对照。另外的对照包括第二轮和第三轮胰蛋白酶选择后来自每个文库的扩增并纯化的噬菌体溶液。
将每个噬菌体样品分成两个部分,第一个部分用100ug/ml胰蛋白酶处理,第二个没有用胰蛋白酶处理。两个部分的温育在37℃下进行一小时,伴随搅拌(250rpm),并通过加入Roche Complete蛋白酶抑制剂(1x)阻断。
使用胰蛋白酶消化的和未消化的样品进行噬菌体ELISA。用0.1M碳酸氢盐缓冲液中浓度为1μg/ml的中性链亲和素覆盖ELISA孔。用PBS的洗涤步骤和用PBS中的1%吐温-20封闭抗原覆盖的孔之后,用稀释于PBS中1%吐温-20中的生物素化hVEGF覆盖孔,浓度为100ng/ml。接着,用PBS洗涤孔,并加入用1%吐温-20/PBS 1∶1稀释的处理过的或未处理过的噬菌体上清液。在37℃温育30分钟后,用1%吐温-20/PBS洗涤孔,接着在37℃下用抗-M13噬菌体-HRP缀合物(在1%吐温-20/PBS中1/5000稀释)温育30分钟。然后用PBS和过氧化物酶洗涤孔。通过加入SureBlue试剂启动反应。约十分钟后,用等体积的1M HCl停止反 应,并在OD450nM阅读孔。
用胰蛋白酶处理的不稳定对照DOM 15-10和DOM 15-26-501的ELISA读数获得低于0.404的OD450,并且确定该值为不稳定克隆的边缘值。认为产生低于0.404OD的所有样品是不稳定的。认为所有超过该值的样品是稳定的。
表8
表8显示了每个文库第二轮和第三轮胰蛋白酶选择后稳定克隆的百分比。在第三轮选择后,可以看到两个文库中胰蛋白酶抗性克隆的富集。在胰蛋白酶消化后的每种情况中,含有扩增的纯化噬菌体混合物的对照ELISA孔的值在每次选择后都远高于0.404。此外,将来自第三轮选择的胰蛋白酶处理过的噬菌体与来自第二轮选择的胰蛋白酶处理过的噬菌体相比较时,观察到信号略有升高。DOM 15-10噬菌体文库显示出起始值约14%的升高。DOM 15-26-555噬菌体文库显示出表示约2%起始值的升高。
所有这些结果表明用胰蛋白酶预处理的选择能有效地从DOM15-10和DOM15-26-555组中选择胰蛋白酶抗性噬菌体克隆。
将来自第二和第三轮选择(DOM 15-26-555)以及只来自第三轮选择(DOM 15-10)的所有结果亚克隆至pDOM5载体中,并转化至HB2151电感受态细胞中。pDOM5载体是基于pUC119的载体。通过Plac启动子来驱动蛋白质的表达。GAS1前导序列确保分离的可溶性dAb分泌至大肠杆菌HB2151的周质和培养物上清液中。从每轮选择(3和4)随机挑选184个单独的克隆,用于在1ml培养物体积中表达。
将细菌上清液稀释于HBS-EP BIAcore缓冲液中(1∶1体积比)并分成两份。将20μg/ml终浓度的胰蛋白酶只加入一个瓶中。伴随搅拌(250rpm)在37℃下进行温育40分钟。用Roche Complete蛋白酶抑制剂(1X)阻断反应后,在BIAcore 3000上测试胰蛋白酶处理过的或未处 理的噬菌体上清液的抗原结合(SA传感器芯片上2,000RU生物素化的hVEGF)。
挑选克隆的标准是:相对于未处理的dAb,<15%用胰蛋白酶处理过的dAb的抗原结合降低(基于选定时间点达到的最大RU),这通常将反映出dAb对蛋白酶处理的稳定性;dAb从抗原分离的过程中,两个时间点之间<40%的解离速率降低。基于这些值,将来自DOM15-26-555文库的第二和第三轮选择的60个克隆以及来自DOM 15-10文库的第三轮选择的17个克隆测序。在两个文库的结果中观察到共有突变,从每个带有共有基序的文库中选择17个克隆,用于进一步的表征。这些克隆的氨基酸序列显示于图5(DOM 15-26-555选择的变体)和图6(DOM15-10选择的变体)中,并且作为DNA序列列于图20A-20E中。将不同于选定克隆中亲本序列的氨基酸高亮显示(相同的那些用圆点来标记)。用框显示对应于CDR1、CDR2和CDR3的环。
在50ml表达培养物中表达这些克隆,在HBS-EP缓冲液中稀释至100nM浓度的蛋白A(对于DOM 15-26-555变体)或蛋白L(对于DOM15-10变体)上纯化,并在胰蛋白酶(20μg/ml终浓度)存在或不存在下伴随搅拌(250rpm)在37℃下温育1.5小时后,在BIAcore上测试抗原结合。
还使用实施例2中所述的方法测试了这些克隆的胰蛋白酶抗性。将蛋白质缓冲交换至PBS中,并浓缩至1mg/ml。将25μg蛋白质与1μg胰蛋白酶(Promega)混合并在30℃下温育0小时和24小时。该时间后,用Roche Complete蛋白酶抑制剂(1X)和DTT阻断反应,并加入装载剂。将样品在100℃下变性五分钟。然后,通过在Novex 10-20%Tricine凝胶上电泳来分析15μg每种样品,并且用SureBlue(1x)将蛋白质染色。
通常,来自DOM 15-26-555选择的结果更稳定,在BIAcore上测试时,大部分克隆保持对胰蛋白酶的抗性持续1.5小时,在SDS-PAGE上运行时,持续过夜。相反,在SDS-PAGE上运行时,只有少量来自DOM15-10选择的克隆对胰蛋白酶的抗性持续过夜。
实施例6
DOM 1h-131-511变体的鉴定
更详细地分析DOM 1h-131-203、DOM 1h-131-204和DOM1h-131-206。用不同浓度的胰蛋白酶(0至100μg/ml)在37℃下温育过夜后,在BIAcore上在500nM的dAb浓度下比较。BIAcore痕迹显示于图7中。结果清楚地显示了两种变体对高浓度胰蛋白酶(100μg/ml)的蛋白水解的抗性比它们的亲本更高。还在上述条件下,与它们的亲本一起,比较了两种dAb,DOM 1h-131-202和DOM 1h-131-206,对抗各种其他蛋白酶,包括leucozyme、弹性蛋白酶和胰酶,使用100μg/ml的蛋白酶浓度。对抗所有测试的蛋白酶,与亲本相比较,dAb显示了提高的对蛋白水解的抗性。对于弹性蛋白酶和leucozyme的BIAcore痕迹显示于图8中。
用100μg/ml测序级别的胰蛋白酶处理5μM的每种dAb0、1、3和24小时。用25X RocheComplete蛋白酶抑制剂抑制反应,并将反应在4-12%Novex Bis-Tris凝胶上运行。凝胶显示于图9中。
实施例7
DOM 4-130-54变体的鉴定
更详细地分析DOM 4-130-201和DOM 4-130-202。用不同浓度的胰蛋白酶(0至100μg/ml)在37℃下温育过夜后,在BIAcore上在500nM的dAb浓度下比较。BIAcore痕迹显示于图10中。结果清楚地显示了所有三种变体对高浓度胰蛋白酶(100μg/ml)的蛋白水解的抗性比它们的亲本更高。还在上述条件下,比较了DOM 4-130-201和DOM 4-130-202与它们的亲本对抗各种其他蛋白酶,包括leucozyme、弹性蛋白酶和胰酶,使用100μg/ml的蛋白酶浓度。尽管结果没有使用胰蛋白酶那么明显,但对抗所有测试的蛋白酶,与亲本相比较,前导dAb显示了提高的对蛋白水解的抗性。对于弹性蛋白酶和leucozyme的BIAcore痕迹显示于图11中。
用100μg/ml测序级别的胰蛋白酶处理5μM的每种dAb0、1、3和24小时。用25X RocheComplete蛋白酶抑制剂抑制反应,并将反应在4-12%Novex Bis-Tris凝胶上运行。凝胶显示于图9中。
实施例8
DOM 1h-131-511和DOM 4-130-54变体的进一步表征
首先使用差示扫描量热法(DSC)分析dAb,以确定胰蛋白酶抗性提高是否与解链温度(Tm)提高相关。胰蛋白酶稳定性的提高与Tm的提高相关(参见表9)。
表9
名称 | Tm,℃ |
DOM1h-131-511 | 57.9 |
DOM1h-131-202 | 67.5 |
DOM1h-131-203 | 65.7 |
DOM1h-131-204 | 62.3 |
DOM1h-131-206 | 64.9 |
DOM4-130-54 | 54.1 |
DOM4-130-201 | 64.7 |
DOM4-130-202 | 64.5 |
还在基于MRC-5细胞的测试中比较了DOM 1h-131-511衍生的dAb(参见表10)。在该测试中,测量了dAb中和TNFα刺激的IL-8释放的能力,以确定胰蛋白酶稳定性的提高是否导致功效的降低。然而,该测试中胰蛋白酶抗性dAb的活性没有受到明显影响。
表10
样品 | ND50nM |
DOM1h-131-511 | 1.98 |
DOM1h-131-511 | 1.71 |
DOM1h-131-511(230307CE) | 1.89 |
DOM1h-131-203(230307CE) | 2.28 |
DOM1h-131-204(230307CE) | 1.89 |
DOM1h-131-511 | 1.46 |
DOM1h-131-206(230307CE) | 0.71 |
在受体结合测试中测试DOM 4-130-54衍生的dAb,以观察它们是否具有相同的抑制IL-1与IL-RI结合的能力(参见表11)。在该测试中,胰蛋白酶抗性dAb的活性没有受到影响。
表11
dAb | IC50(nM) |
DOM4-130-54 | 280pM |
DOM4-130-201 | 257pM |
DOM4-130-202 | 254pM |
实施例9
DOM 15-26-555变体的鉴定
与它们的亲本和两种另外的dAb,DOM 15-26-594和DOM15-26-595一起,更详细地分析了DOM 15-26-588、DOM 15-26-589和DOM 15-26-591和DOM 15-26-593,这另外两种dAb是通过突变形成的,以组合对功效和稳定性具有最大影响的突变(E6V和F100S/I)。序列显示于图12中。在用200μg/ml浓度的胰蛋白酶温育后,以100nM的dAb浓度,在BIAcore上比较克隆对hVEGF的结合。伴随搅拌(250rpm),将反应在37℃下进行三小时和24小时。最佳克隆DOM 15-26-593和亲本的BIAcore痕迹显示于图13中。其他结果作为图14中的图表来表示。结果清楚地表明了所有变体在24小时的胰蛋白酶处理后,对蛋白水解的抵抗性高于亲本。
还通过将处理过的和未处理过的样品在SDS-PAGE上跑胶检测了DOM 15-26-593和亲本的胰蛋白酶抗性。简而言之,将蛋白质缓冲交换至PBS中,并浓缩至1mg/ml。将25μg蛋白质与1μg测序级别的胰蛋白酶(Promega)混合,并在30℃下温育0小时、1小时、3小时和24小时。该时间后,用Roche Complete蛋白酶抑制剂(1x)和DTT阻断反应,并加入装载剂。将样品在100℃下变性五分钟。然后,通过在Novex10-20%Tricine凝胶上电泳来分析15μg每种样品,并且用SureBlue(1x)将蛋白质染色。结果显示于图15中。该实验中,DOM 15-26-593的胰蛋白酶抗性特征不同于BIAcore实验显示的特征,表明反应条件的差异将影响胰蛋白酶分裂的最终结果。尽管如此,DOM 15-26-593比其他选定的克隆具有更好的生物物理特性,以及亲和性,如下所示。还在以下的表12中显示了DOM 15-26-555变体的特性概述。
表12
实施例10
DOM 15-10变体的鉴定
与其亲本DOM 15-10一起,更详细地分析了DOM 15-10-11。序列显示于图16中。在用200μg/ml浓度的胰蛋白酶温育后,以100nM的dAb浓度,在BIAcore上比较dAb对hVEGF的结合。伴随搅拌(250rpm),将反应在37℃下进行1小时、3小时和24小时。这些dAb的BIAcore痕迹显示于图17中。结果清楚地表明了选定的变体在24小时的胰蛋白酶处理后,对蛋白水解的抵抗性高于亲本。
还通过将处理过的和未处理过的样品的SDS-PAGE跑胶检测了前导和亲本的胰蛋白酶抗性。简而言之,将蛋白质缓冲交换至PBS中,并浓缩至1mg/ml。将25μg蛋白质与1μg测序级别的胰蛋白酶(Promega)混合,并在30℃下温育0小时、1小时、3小时和24小时。该时间后,用Roche Complete蛋白酶抑制剂(1x)和DTT阻断反应,并加入装载剂。将样品在100℃下变性五分钟。然后,通过在Novex 10-20%Tricine凝胶上电泳来分析15μg每种样品,并且用SureBlue(1x)将蛋白质染色。结果显示于图18中。在该情况中,胰蛋白酶抗性特征与BIAcore胰蛋白酶测试非常相关,显示了结合活性直接反映出蛋白质的完整性。 实施例11
DOM 15-26-555和DOM 15-10变体的进一步表征
使用差示扫描量热法(DSC)分析dAb,以确定胰蛋白酶抗性提高是否与解链温度(Tm)提高相关。结果显示于表13中。DOM 15-26-593变体的蛋白酶抗性和解链温度之间存在关联。前导DOM 15-26-588和DOM 15-26-555显示出提高的Tm,但其他克隆没有。值得注意的是DOM15-26-555和DOM 15-10亲本分子(63.3-63.7℃)在开始时具有比DOM4-130-54和DOM1h-131-511亲本分子(开始时的Tm:57.9-54.1℃)具有高得多的Tm,但整体上,蛋白酶抗性克隆达到了相似范围的Tm(对于DOM 1h-131-511/DOM 4-130-54变体,平均Tm为65.1℃,而对于DOM 15-26-55/DOM 15-10变体,平均Tm为64.9℃)。
表13
名称 | Tm℃ |
DOM15-26-555 | 63.3 |
DOM15-26-588 | 70.1 |
DOM15-26-589 | 63 |
DOM15-26-591 | 63 |
DOM15-26-593 | 65 |
DOM15-10 | 63.7 |
DOM15-10-11 | 63.3 |
还在受体结合测试中比较了dAb,测量BIAcore动力学来测定胰蛋白酶稳定性提高是否导致功效降低。然而,测试中dAb的活性基本上没受影响,或甚至提高了。表14中呈现了该结果。
表14
克隆ID | EC50(nM) | KD(nM) |
DOM15-26-555 | 11.7 | 26.1 |
DOM15-26-588 | 27 | 59.1 |
DOM15-26-589 | 1.94 | 9.6 |
DOM15-26-591 | 16 | 38 |
DOM15-26-593 | 0.323 | 3.2 |
DOM15-26-594 | 4.09 | 15.1 |
DOM15-26-595 | 0.828 | 5 |
DOM15-10 | 10.23 | 23.6 |
DOM15-10-11 | 3.58 | 14.6 |
提高的Tm的优势
大部分蛋白-包括结构域抗体-以两种状态存在:折叠状态(这导致生物活性分子)和去折叠状态(其不带有功能性活性)。在所有温度下,这两种状态共存,并且每种状态的相对比例通常由常数K来决定,常数K是折叠和去折叠的动力学常数的函数。通常将解链温度限定为K=1时的温度,即,在该温度下,折叠蛋白的部分等于去折叠蛋白的部分。通过使蛋白的分子内相互作用稳定和失去稳定来确定常数K,并且因此主要是通过蛋白质的氨基酸序列来决定。外部参数,如温度、pH、缓冲液组成、压力,影响着K,并因此影响解链温度。
对于降解机制,去折叠的蛋白是容易的目标:(i)二硫键的暴露提高了取决于环境的氧化或还原的风险,(ii)提高的主链灵活性偏好自体蛋白水解反应,(iii)肽片段的暴露将目标提供给体内的蛋白酶、生产过程中的蛋白酶以及下游加工和长期储存过程中的负载蛋白酶,和(iv)易聚集片段的暴露导致分子间聚集和蛋白沉淀。在所有情况中,发生了蛋白完整性、蛋白含量和蛋白活性的丢失,因此妥协了努力来(i)确保批次可再现性,(ii)确保货架期的长期稳定性和(iii)体内功效。
在自然界中,蛋白质通过进化得到了设计,以在体温下足以进行任务,并且通过体内平衡机制容易地替换。通过生物技术方法制造的治疗蛋白面对不同的环境:通常在外源宿主中通过重组DNA技术来生产,在大的容器中以较高的含量表达,在整个下游加工过程中经历非常重要 的pH或缓冲液组成的变化,并且最终以高浓度存储在非生理学缓冲液中延长的时间段。新的递送技术(例如,吸入、sc贴剂、缓慢递送的纳米颗粒)还正在增加治疗蛋白经受的应力。最终,蛋白质工程化技术的出现将导致提高的或完全新的治疗蛋白的产生。因为大部分工程化技术是基于体外技术的,目的在于改变或形成新的氨基酸序列,没有产生逐渐提高生物蛋白的进化方法,因此导致对于应激抵抗力次佳性能的蛋白。
本发明的技术目的在于再现达尔文进化过程中蛋白质面对的条件之一。用在组织重塑和蛋白质体内平衡中起主要作用的蛋白酶浸渍肽或多肽,例如免疫球蛋白单可变域。还测试了任何可以形成对其功能具有提高适合度的蛋白质的特定突变,测试了在其执行功能的环境中适合的能力。在本发明的一个实施方案中,再现了该方法:形成一组肽或多肽变体,并暴露于蛋白酶。在第二个步骤中,将该组变体接触特定的目标。只有那些通过蛋白酶持续降解的蛋白质变体能够啮合目标,并因此例如通过称为“生物淘选”的简单亲和性纯化方法来回收。与体内方法相比,该系统给予了各种优势:蛋白质组可以面对多种条件,例如,各种蛋白酶、浓度较高、持续较长时间、在不同的缓冲液和pH中以及在不同的温度下。因此,这种体外技术提供了一种设计蛋白质的方式,与产生它们的那些原始蛋白质相比,这些蛋白质可以在更多的环境中执行功能和保持稳定。显然,这对于生物技术工业,并且特别是治疗蛋白领域,提供了多个优势。
实施例12:对于蛋白酶抗性前导的PK相关性数据
在体内进一步评价了四个dAb谱系中每个的亲本dAb和蛋白酶抗性dAb(对于列表和详细内容,参见以下的表15)
表15
*:通过MRC5/IL-a生物测试测定的;:通过RBA测试测定的
标注:DOM 15-26-501是本专利申请中以上举例的DOM 15-26-555的亲本形式。DOM15-26-555在CDR1(134M)中具有一个种系氨基酸突变。DOM 15-26-501具有比DOM 15-26-555更低的解链温度(52℃v63.3℃),和提高的对胰蛋白酶消化的敏感性。对于PK研究,优于DOM 15-26-555,选择了DOM 15-26-501,因为其与DOM 15-26-593相当,对于差的稳定性,是更好的代表。
我们翻译了抵抗性,如下:
1为低
2为中等
3为良好
4为高
5为非常高
然后这表示亲本分子的胰蛋白酶抗性为:
DOM 4-130-54良好
DOM 1h-131-511良好
DOM 15-10低
DOM 15-26-501低
同样,对于选定的前导为:
DOM 4-130-202非常高
DOM 1h-131-206非常高
DOM 15-10-11高
DOM 15-26-593高
因为结构域抗体的大小小(12-15kDa),iv或sc注射时,它们从循环中快速清除。实际上,肾小球过滤的截留为高于50kDa,并且因此小蛋白如dAb不能保持在循环中,因为它们能通过肾脏。因此,为了评价在体内对蛋白酶抗性的长期效果,我们用提高全身停留的部分标记了结构域抗体。文献中已经报道了几种针对延长半衰期的方法(例如,PEG、Fc融合体、白蛋白融合体等)。在本申请中,已经用人IgG1抗体的Fc部分标记(或格式化)结构域抗体。这种形式提供了两个优点:(i)所得到dAb-Fc的分子大小为~75kDa,这已足够大来确保保持在循环中,(ii)抗体Fc部分结合FcRn受体(也称为“Brambell"受体)。该受体位于上皮细胞、内皮细胞和肝细胞中,并且涉及延长抗体和白蛋白的寿命:实际上,在抗体和其他血清蛋白胞饮作用时,将蛋白质引向酸化内体,其中FcRn受体在通过内体之前中途阻止抗体(通过结合Fc部分)并将它们返回循环中。因此,通过将Fc部分标记在dAb上,确保dAb将长期暴露于至少两个区室-血清和前-内体区室,其中每种含有特定组的蛋白水解酶。此外,FcRn受体介导转胞吞作用,由此将带有Fc的蛋白质转移至血管外空间或从血管外空间转移出来。
通过将编码VH和VK dAb的基因融合至编码人IgG1Fc的基因来完成用Fc的格式化,通过短的插入肽连接物(粗体):
对于VH dAb(下划线的):
EVQ......GQGTLVTVSSASTHTCPPCPAPELLGGP...(hIgG1Fc)...PGK*
对于VK dAb(下划线的):
DIQ.........GQGTKVEIKRTVAAPSTHTCPPCPAPELLGGP...(hIgG1Fc)...P GK*
根据标准实验方案使用293-fectin(Invitrogen)通过HEK293/6E细胞的瞬时转染来产生材料。设计这些细胞用于结合pTT系列载体使用时 的高水平瞬时表达(Durocher等,2002)。因此,将dAb基因克隆至改良的pTT5载体(pDOM38)中,以产生Fc融合表达载体(参见图21)。在转染后5天收集来自转染细胞的上清液,通过离心和通过0.2μm滤器过滤来澄清。通过在蛋白A流线型树脂(GE Healthcare)上捕获来纯化dAb-Fc融合蛋白。在10mM柠檬酸钠pH3中从柱洗脱蛋白质,接着加入1M柠檬酸钠pH6,来获得100mM柠檬酸钠pH6的终浓度。
在大鼠中测试dAb-Fc分子的体内半衰期,将5mg/kg的目标剂量给予雌性Sprague-Dawley大鼠中(n=3/组)。应当注意到目标剂量大大超过大鼠中的目标浓度,因此预期亲本dAb和胰蛋白酶抗性dAb之间的亲和性差异(参见实施例11)将不会影响分子在体内的命运。因此,预期在抗原-无关性消除方法中反映出dAb之间的pK特征差异。
在给药后0.03、1、4、8、24、48、72、96、120和168小时采取血样。血块形成后,取出血清,然后在hIL-1R1、TNFR1或VEGF抗原捕获测试中测试:
hIL-1R1抗原捕获测试:
用4ug/mL抗-hIL-1R1覆盖
封闭
加入500ng/mL shIL-1R1
加入样品
用抗人Fc HRP检测@1∶10,000
TNFR1抗原捕获测试:
用0.1ug/mL sTNFR1覆盖
封闭
加入样品
用抗人Fc HRP检测@1∶10,000
VEGF抗原捕获:
用0.25ug/mL VEGF覆盖
封闭
加入样品
用抗人Fc HRP检测@1∶10,000
将来自这些测试的原始数据转化成每种血清样品中的药物浓度。然后使用非区室分析(NCA)在WinNonLin中分析每个时间点的平均μg/mL。每种dAb-Fc对的PK特征显示于表16中,该表概括了测定的PK参数。
表16:
结果清楚地表明-尽管dAb-Fc对4-130-54和1h-131-206的PK特征几乎是镜像(superimposable)的-特征与其他对变化很大。考虑AUC/D时,作用大部分是可见的:15-10的AUC/D只是15-10-11的42%。15-26-501的AUC/D只是15-26-593的11%。这些重要的差异还影响了(程度较低)半衰期:对于15-10和15-10-11,各自为43.2h vs.56.6h。使用DOM 15-26世系时,看到了更大的差异:对于15-26-501和15-26-593,各自为12.9h Vs.86.2h。实际上,对于使用非区室分析的良好PK分析,应当存在至少4个用于拟合线性回归斜率的数据点,并且估算半衰期的时间段应当为计算的半衰期的至少3倍。
根据在此实施例中所述的生物物理特征,显示出任何给定的dAb抵抗胰蛋白酶降解的能力与dAb-Fc融合体在大鼠血清中循环较长的时间段的能力相关。实际上,如实施例中所示的,如实施例10,DOM 15-10和DOM 15-26-501是最可能降解的dAb:在1ug胰蛋白酶存在下将25ug dAb在30℃下温育~3h导致完全降解。在该研究中,所有其他dAb(不 管它们是否已经用胰蛋白酶选择(即,DOM 15-10-11、DOM15-26-593、DOM 4-130-202和DOM 1h-131-206)或和亲本分子一样(DOM 4-130-54和DOM 1h-131-511)已经具有一定的胰蛋白酶抗性)再次格式化成dAb-Fc分子时,在大鼠中具有相当的PK特征。因此,本发明的PK研究表明那些dAb具有非常低的蛋白水解抵抗性时,对蛋白水解的敏感性对dAb的体内稳定性具有最大的影响。还表明了-超过一定的水平-对胰蛋白酶降解的抵抗性进一步增加(例如,DOM 4-130-206V DOM4-130-54)没有显著增加dAb-Fc分子进一步减缓体内消除的能力。
在三种情况中,在胰蛋白酶存在下的选择形成了具有提高的热稳定性的新分子(通过解链温度来限定):DOM 4-130-202、DOM 1h-13-206和DOM 15-26-593。PK研究表明-在本发明的数据集中-解链温度不是适当的参数来合理化观察到的PK特征:实际上,DOM 15-10具有高于DOM 15-10-11的Tm,并且也比DOM 15-10-11更快地从循环中清除。在别处,DOM4-130世系的两种dAb具有明显不同的Tm(差10℃),并且在格式化成dAb-Fc分子时显示出几乎相同的体内稳定性。应当注意到没有排除解链温度本身作为关键参数来预测体内稳定性。它只在使用本发明的数据集时发生,大的Tm差异(从54℃及以上)对dAb的体内命运不具有显著的影响。这没有排除在低于54℃的解链温度下,dAb的体内稳定性与热稳定性相关的可能,或甚至可能与热稳定性和对蛋白酶抗性都相关。
实施例13
对DOM 10-53-474的胰蛋白酶选择
纯化的DOM 10-53-474的胰蛋白酶稳定性:
DOM 10-53-474是结合IL-13的结构域抗体,具有高的功效。为了测定该dAb在胰蛋白酶存在下的稳定性,用胰蛋白酶消化纯化的dAb,持续提高的时间点,并在凝胶上跑胶来检测任何可能的蛋白质降解。用1μl 1mg/ml测序级别的胰蛋白酶在30℃下温育25μl 1mg/ml纯化的DOM 10-53-474,形成25∶1dAb∶胰蛋白酶的分子比例。用胰蛋白酶温育dAb 1h、4h和24h,并通过加入4μl Roche complete蛋白酶抑制剂来中和蛋白酶活性,接着在冰上温育。通过将蛋白酶抑制剂加入没有添加胰蛋白酶的dAb中来制备时间0样品。随后根据制造商的说明使用Labchip 通过电泳分析2μl的样品。
图22显示了用胰蛋白酶温育提高时间点的DOM 10-53-474的凝胶电泳。为了比较,还如上所述用胰蛋白酶处理了一种胰蛋白酶稳定的dAb,DOM 15-26-593,并且在旁侧跑胶。如图中所示的,甚至在用胰蛋白酶温育24h后,DOM 15-26-593显示是稳定的。然而,在24h后,DOM 10-53-474降解至一定的程度,但在1h和4h时间点时显示为稳定的。这些数据表明DOM 10-53-474能在一定程度上抵抗胰蛋白酶的降解,但是没有胰蛋白酶最稳定dAb之一的DOM 15-26-593那样稳定。
噬菌体展示的DOM 10-53-474的胰蛋白酶稳定性:
为了测定噬菌体展示的DOM 10-53-474的胰蛋白酶稳定性,将编码DOM 10-53-474的基因克隆至pDOM33的Sal/Not位点中(图50),并根据标准技术产生噬菌体。通过PEG沉淀纯化噬菌体,重悬浮于PBS中并滴定。
用胰蛋白酶温育噬菌体展示的dAb不同的时间点,以评价胰蛋白酶抗性。用胰蛋白酶温育后,感染按指数生长的大肠杆菌TG1细胞后通过滴定分析来测量稳定性。
在振荡培养器中,在37℃下用100μg/ml胰蛋白酶温育100μl噬菌体1h、2h、4h和过夜。用Roche complete蛋白酶抑制剂(x2)阻断胰蛋白酶活性,然后将噬菌体稀释于PBS中的2%marvel中,在室温下用10nM生物素化的IL-13温育一小时。加入在室温下用PBS中的2%marvell预封闭一小时的抗生物素蛋白链菌素覆盖的珠子(Dynabeads M-280(Invitrogen),然后将混合物在室温下温育5分钟。使用Dynabeads的所有温育步骤在转轮上进行。通过用1ml PBS中的0.1%吐温-20将珠子洗涤八次来洗掉未结合的噬菌体。用0.5ml的0.1M甘氨酸pH2.2洗脱结合的噬菌体,并用100μl1M Tris-HCl pH8.0中和。使用洗脱的噬菌体来感染按指数生长的TG1细胞(在37℃下1h),并涂布于四环素平板上。将平板在37℃下温育过夜,并进行菌落计数。用胰蛋白酶消化后的噬菌体结果概括于表17中。用胰蛋白酶温育提高的时间点时,噬菌体滴定度降低。24h温育后,所有噬菌体得到消化。
表17.对噬菌体展示的DOM 10-53-474亲本进行的胰蛋白酶选择的结果滴定
胰蛋白酶温育的长度 | 胰蛋白酶浓度 | 滴定度 |
无胰蛋白酶对照 | - | 3x107 |
1h | 100μg/ml | 1x107 |
2h | 100μg/ml | 7x106 |
4h | 100μg/ml | 5x106 |
过夜 | 100μg/ml | 0 |
对胰蛋白酶抗性更大的dAb的选择:
为了选择对胰蛋白酶降解抗性更大的dAb,对于50μl反应,使用StratergeneMutazyme 11试剂盒、生物素化的引物和5-50pg模板,通过PCR将随机突变引入编码DOM 10-53-474的基因中。用SalI和NotI消化后,用抗生物素蛋白链菌素覆盖的珠子从未消化的产物中纯化插入片段,并在相应位点连接pDOM33。用纯化的连接混合物转化大肠杆菌TB1细胞,形成DOM 10-53-474的易出错文库。文库的大小为1.9x109,并且氨基酸的突变率为1.3。
使用该文库来进行三轮选择来选择具有提高的蛋白酶抗性的dAb。只使用没有用胰蛋白酶处理的抗原进行第一轮选择,以清除文库,来除去任何不再以高亲和性结合抗原的克隆。以10nM IL-13进行选择。与6x1010的输入噬菌体相比,第一轮的结果为2x109,表明大部分克隆以高亲和性结合抗原。
用1nM生物素化的IL-13进行第二轮和第三轮选择。在对IL-13淘选之前,用100μg/ml胰蛋白酶在摇床(250rpm)中在37℃下温育噬菌体。对于第二轮选择,在室温下或在37℃下进行胰蛋白酶温育1h。第2轮选择的结果显示于表18中。
表18.第二轮选择后的结果噬菌体滴定度
胰蛋白酶处理 | 滴定度 |
无处理 | 1x108 |
室温1h | 5x107 |
1h37℃ | 2x107 |
将来自37℃下1h胰蛋白酶处理的第2轮选择的噬菌体结果用作第3轮选择的输入。对于第3轮选择,用100μg/ml胰蛋白酶处理噬菌体,但持续了更长的时间点:37℃2h,37℃4h,室温下过夜或37℃下过夜。第3轮选择的结果滴定度概括于表19中。
表19:第三轮选择后的结果噬菌体滴定度
胰蛋白酶处理 | 滴定度 |
无处理 | 1.3x108 |
2h at37℃ | 1.9x107 |
4h at37℃ | 2x106 |
室温下过夜 | 4x107 |
37℃过夜 | 2.1x106 |
将第1、2和3轮的每个选择结果的几个克隆测序,以测定序列多样性。第一轮没有使用胰蛋白酶处理后,50%的选择结果具有亲本DOM10-53-474序列。第2轮选择后,亲本的百分比提高至75%。第3轮选择后,亲本的百分比提高至80%。
该数据表明DOM 10-53-474已经能抵抗胰蛋白酶的降解,并且从这些胰蛋白酶选择中没有选择出更多新的克隆。图22显示了用胰蛋白酶消化纯化的蛋白时,即使在胰蛋白酶处理过夜后,DOM 10-53-474也没有完全消化。然而,为了观察选择结果中是否存在胰蛋白酶抗性比DOM10-53-474更高的任何新克隆,将其中用胰蛋白酶在37℃下处理过夜噬菌体的选择3结果亚克隆至pDOM5中。然后将一百个克隆测序,以寻找任何胰蛋白酶抗性克隆。在分析的一百个克隆中,只有26个克隆具有新的序列,然而,这些克隆中没有一个在胰蛋白酶分裂位点(赖氨酸或精氨酸)具有突变,表明这些克隆对胰蛋白酶的抗性没有比DOM 10-53-474更高。
实施例14
通过在胰蛋白酶存在下噬菌体选择将存储和生物物理改进引入前导DOM 0101(抗TNFRl)dAb中:
为了提高前导分子DOM 1h-131-511的蛋白酶抗性,如之前所述的,在胰蛋白酶存在下进行噬菌体选择。该方法产生了多个与亲本DOM1h-131-511分子相比具有提高的胰蛋白酶稳定性的克隆。选择了两个克隆,DOM 1h-131-202和DOM 1h-131-206用于进一步的表征,因为它们显示出对胰蛋白酶的作用最显著的提高。以下所述的更多工作表明对胰蛋白酶的作用具有提高的抵抗力,存在其他有益的作用,主要在于分子对剪切力和热应力的稳定性。这两个参数对提高生物药物产品的存储和货架期稳定性是关键的。
在巴斯德毕赤酵母中生产前导DOM 0101dAb:
将编码三个前导分子的一级氨基酸序列的基因用于在巴斯德毕赤酵母中生产分泌的蛋白质。将三个合成基因(DOM 1h-131-511、DOM1h-131-202和DOM 1h-131-206)克隆至表达载体pPIC-Zα中,然后转化至两个毕赤酵母株中,X33和KM71H。将转化的细胞涂布于递增浓度的Zeocin上(100、300、600和900μg/ml),以选择具有多个组分的克隆。然后在2L烧瓶中筛选几个克隆,以鉴定高表达细胞系。然后将最佳表达的克隆用于在发酵罐中在5L规模下生产材料。
蛋白质纯化和材料表征:
为了生产用于表征和进一步稳定性研究的高质量材料,使用混合模型电荷诱导树脂(Capto MMC)作为主要的捕获步骤接着阴离子交换(Q Sepharose)来设计下游纯化过程。没有明显优化,这使得可以回收~70%纯度为~95%的表达的dAb。对于同一性,使用电喷雾质谱、氨基端测序和等电点聚焦来表征材料,对于纯度,使用SDS-PAGE和SEC(大小排阻色谱)来表征材料。
蛋白质同一性:
每种蛋白质的头五个残基的氨基端序列分析与预期一样(EVQLL...)。对蛋白质样品进行了质谱分析,该样品已经使用C4Zip-tips(Millipore)缓冲交换至50∶50H20∶含有10%冰醋酸的乙腈中。允许与内部二硫化物键的形成为-2的质量差异时,对于三个蛋白各自测量的质量在基于一级氨基酸序列的理论质量的0.5Da内(使用平均质量来计算)。IEF用来鉴定蛋白质,基于每种蛋白质各不相同的pI。
蛋白质纯度:
将三种蛋白质以1μg和10μg的量装载于非还原SDS-PAGE凝胶上,重复两份。在所有情况中观察到单个条带。
还进行了大小排阻色谱来证明了纯度的水平。对于大小排阻色谱(SEC),将100μg的各种蛋白装载于TOSOH G2000SWXL柱上,以0.5ml/min流动。移动相为PBS/10%乙醇。基于曲线下的面积来计算单体的百分比(参见图23)。
DOM 1h-131-511、-202和-206的稳定性比较
蛋白酶稳定性的测定:
通过在过量蛋白酶下预温育限定的时间点后残余结合活性的BIAcoreTM分析来测定DOM 1h-131-511、DOM 1h-131-202和DOM1h-131-206的蛋白酶稳定性。将大约1400RU的生物素化TNFR1覆盖抗生物素蛋白链菌素(SA)芯片。只用PBS或用100μg/ml胰蛋白酶、弹性蛋白酶或leucozyme来温育250nM的DOM 1h-131-511、DOM1h-131-202和DOM 1h-131-206,在30℃下持续1、3和24小时。通过加入蛋白酶抑制剂的混合物来停止反应。然后使用参考细胞减少将dAb/蛋白酶混合物在TNFR1覆盖的芯片上通过。在每个注射循环之间用10μl0.1M甘氨酸pH2.2使芯片表面再生。相对于没有蛋白酶的dAb结合,测定用蛋白酶预温育的结合人TNFR1(在10秒时)的DOM 1h-131-511、DOM 1h-131-202和DOM 1h-131-206的部分。在25℃下进行BIAcoreTM运行。从三个独立的实验产生以下的数据。条形图表示平均值,而误差棒表示结果的标准偏差(图24)。
发现DOM 1h-131-202和DOM 1h-131-206与DOM 1h-131-511相比,显示出对胰蛋白酶、弹性蛋白酶或leucozyme的蛋白水解降解具有更高 的抵抗力。用胰蛋白酶1hr后和用弹性蛋白酶或leucozyme 3hr后,DOM1h-131-202和DOM 1hH-131-206与DOM 1h-131-511相比之间的差异最明显。存在这样一种倾向:在大部分测试的条件中,DOM 1h-131-206比DOM1h-131-202略微更稳定些。
使用DSC测定的dAb热稳定性:
为了测定前导分子具有最大稳定性的pH,使用差示扫描量热法(DSC)来测量Britton-Robinson缓冲液中各种dAb的解链温度(Tm)。因为Britton-Robinson是由三种成分的缓冲体系(各自40mM的醋酸盐、磷酸盐和硼酸盐)制成的,因此可能在相同的溶液中产生3-10的pH范围。从蛋白质一级氨基酸序列测定理论pI。从DSC,发现dAb具有最高内在热稳定性的pH,对于DOM 1h-131-202为pH7,对于DOM1h-131-206为pH 7-7.5,和对于DOM 1h-131-511,为pH7.5。对于所有随后的应力和稳定性工作,对于各种dAb,使用以下的pH;在Britton-Robinson缓冲液中,对于DOM 1h-131-202和GSK 1995057A DOM 1h-131-206为pH7.0,而对于DOM 1h-131-511为pH 7.5。结果概括于以下的表20中:
表20:在Britton-Robinson缓冲液中,以1mg/ml通过DSC测定的DOM1h-131-202、DOM 1h-131-206和DOM 1h-131-511的pH和Tm的概括。温度变化为180℃/小时。
两周热稳定性测试
蛋白质在升高的温度下能持续延长时间段的能力通常是稳定性的良好表现。在这些条件下,蛋白质可能经历几个物理过程,如聚集或化学变化。将dAb(1mg/ml)在Britton-Robinson缓冲液中在37和50℃下温育14天。使用SEC来测定14天的时间段中溶液中剩下多少单体(图25)。
从图25,可以看出DOM 1h-131-202和DOM 1h-131-206对热应力 的稳定性显著高于DOM 1h-131-511。将蛋白质暴露于升高的温度下,如37和50℃,通常用于获得药物长期贮存期的指示。将这些较高的温度用于加速与室温下长期存储相关的正常过程,如脱酰胺、氧化或聚集。还可以使用SEC监控溶液中聚集形成的水平(图26A至I)。在37℃下14天后,溶液中DOM 1h-131-511的丢失归因于沉淀和更高级别的聚集物形成,如通过SEC所测定的(图26B)。在37℃下14天后,还看到了DOM 1h-131-202和DOM 1h-131-206显著减少的蛋白质丢失,并且聚集物形成非常少或基本没有增加,尤其是在DOM 1h-131-206的情况中(图26H)。在50℃下,分子间的差异甚至更明显,DOM 1h-131-206在较高温度下14天后显示出高于DOM1h-131-202的稳定性,表明较高分子量聚集物的形成明显减少(图26)。相对于t=0,DOM1h-131-206在14天后只显示了聚集物形成的少量增加(图26I),而DOM 1h-131-511全部从溶液中沉淀出来(图26C)。
这表明通过胰蛋白酶选择引入dAb中的变化,例如,提高的热稳定性,显著提高了在37和50℃下的蛋白质存储稳定性。DOM 1h-131-202和更明显的DOM 1h-131-206,清楚地在升高的温度下具有提高的溶液稳定性和较低的形成聚集物的趋势,这可以直接翻译成在更相关的温度下如+4℃和室温下提高的长期存储稳定性。
然后通过IEF分析从热应激实验的24hr、48hr、7天和14天时间点取样,以观察蛋白质是否经历了将影响蛋白质整体电荷的任何生物物理变化(图27)。
再次,与DOM 1h-131-511相比,DOM 1h-131-202和DOM1h-131-206在37℃下显示出没有明显变化。使用DOM 1h-131-511,在37℃下24hr后出现了微弱的第二条条带。认为这条额外的条带是由于蛋白质的二聚化引起的,因此遮掩了电荷并产生了两个分子群。在50℃下,分子间的差异更明显,DOM 1h-131-206清楚地显示出在升高的温度下没有明显变化,而DOM 1h-131-202在24hr后显示出一些变化的信号。Britton-R0binsor中的大部分的DOM1h-131-511在48hr后由于沉淀而丢失。
通过TNFR-1RBA分析50℃下T=0、7和14天时间点,以确定蛋白质在暴露于高温后的功能性(图28)。该测试在检测由于应力引起的分子细微变化中通常没有SEC或IEF那样灵敏,但可以使用来显示dAb 可以结合抗原。
对于DOM 1h-131-511,曲线转移至左边,反映出大部分的dAb由于沉淀而丢失的事实。溶液中留下的材料仍然能够结合抗原。如图25中所示的,即使在14天后,DOM 1h-131-202和DOM 1h-131-206中的大部分能够维持在溶液中。RBA显示所有可溶性蛋白质仍然是功能性的并能够结合TNFR1。
在高蛋白浓度下的存储稳定性测试
进行实验来研究在非常高蛋白浓度下在4℃下的存储稳定性,以观察每种分子在这些条件下怎样进行。将所有前导dAb在Britton-Robinson缓冲液中在其最稳定的pH下在离心Vivaspin浓缩器中(5K截留)浓缩至~100mg/ml。然后将~100mg/ml的样品在4℃下保持7天,然后通过SEC分析来观察样品在高浓度存储过程中是否已经发生了任何其他物理变化(图29)。在1xPBS 10%乙醇(v/v)中的SEC柱上运行之前,将样品稀释至~1mg/ml。
从SEC痕迹,可以看出DOM 1h-131-202和DOM 1h-131-206在7天后都没有显示出聚集物形成的任何显著增加,其中对于DOM1h-131-511,存在单体浓度~2%的降低。
前导dAb的喷雾器递送:
对于早期毒理学和临床工作,将dAb配制成液体,并通过喷雾装置来递送。根据装置(例如,超声波、喷射或振动筛),dAb将经历各种程度的剪切力和热应力,因为将其喷雾来形成限定粒径的气溶胶。因为与DOM 1h-131-511相比,DOM 1h-131-202和-206都具有较高的Tm,并显示出显著提高的对热应力的稳定性,在两个喷雾器装置中测试了所有dAb,以观察它们怎样应答喷雾过程中诱导的剪切力/热应力。然后通过SEC分析来自喷雾气溶胶的蛋白质和装置中(即,杯中)剩余的dAb,以确定该处理过程中产生的聚集量。
在其最稳定的pH下在Britton-Robinson缓冲液中测试所有分子。在E-flow Rapid(振动筛)和Pari LC+(喷射喷雾器)装置中测试了dAb,在5mg/ml的蛋白质浓度下使用3.5分钟的运行时间,并使用Malvern Sparytek装置测定粒径分布。结果显示于图30中。对于良好递送和分布 至深肺中,理想的粒径为<5μm。在Britton-Robinson缓冲液和配制缓冲液中,所有dAb获得了低于5μm的可比较的粒径水平。在喷雾之前和之后通过A280测量来测定装置杯中的dAb浓度(数据未显示)。发现了蛋白质浓度没有显著变化,表明在递送过程中没有优先将蛋白质或载体喷雾。
将Britton-Robinson缓冲液中喷雾的dAb样品在SEC上运行,以确定在递送的过程中蛋白质是否经历了任何物理变化。图31显示了通过SEC测定的杯中或气溶胶中的相对百分比变化。可以看到DOM1h-131-202和DOM 1h-131-206相对于DOM 1h-131-511,经历了相对小的单体浓度变化。这证明了具有提高Tm的DOM 1h-131-202和DOM1h-131-206对喷雾过程中的聚集具有较低的倾向。
图32显示了Britton-Robinson缓冲液中的DOM 1h-131-206和DOM1h-131-511在喷雾后的实际SEC痕迹,并证明了单体的相对损耗(图31)是由于二聚体形成引起的。这再次给以下的理论提供了更多的支持证据:由DOM 1h-131-202和DOM 1h-131-206显示的更高热稳定性可以防止明显的聚集,即使是在未优化的配制缓冲液中。
对于毒理学和安全性测定工作,需要将明显高于给予患者的治疗剂量的水平的dAb递送至动物。这只能通过使用明显较高的蛋白质浓度和/或在延长的时间段内递送dAb来实现。因为已经表明DOM 1h-131-511以5mg/ml在3.5min喷雾过程中形成聚集物,在PBS中测试了40mg/ml的DOM 1h-131-206,并使用Pari LC+喷雾高达1小时。在整个运行过程中的不同时间点从杯子和气溶胶中取样,以观察延长的喷雾是否导致dAb由于通过SEC所测定的剪切力或热应力以及蛋白质浓度(A280nm测量)而聚集。表21显示了通过A280测定的杯子和气溶胶中的dAb蛋白质浓度。
表21:测量的使用Pari LC+的~40mg/ml的dAb喷雾过程中杯子和气溶胶中的DOM1h-131-206的蛋白质浓度,通过A280吸光值读数测定的。考虑到稀释误差和仪器误差,在dAb喷雾1hr后,样品浓度没有变化。
从表21可以看出蛋白质浓度在运行过程中没有明显变化,证明不存在由于聚集引起的蛋白质明显损耗。图33显示了在喷雾的1小时时间段中,DOM 1h-131-206没有形成任何更高级别的聚集物,如二聚物,如通过SEC测定的。这清楚地证明了提高的生物物理特性,如通过胰蛋白酶选择引入分子中的,显著提高了dAb对剪切力和热应力的抗性,并且这与提高的存储货架期以及将蛋白质喷雾的能力直接相关,使得不形成较高级别的聚集物。
前导dAb的溶液状态
因为对于所有三种前导dAb的主要降解途径,显示出自缔合最初导致二聚化,接着更多的聚集,并且最终沉淀,通过分析性超离心(AUC)研究这三种前导分子,以测定自缔合的程度。通过两种方法,沉降平衡和沉降速度,来研究蛋白质。
对于沉降平衡方法,在0.5mg/ml至5mg/ml范围的三种不同浓度下运行三种样品,使用三种不同的转子速度而具有离心作用。通过该方法,测定了DOM 1h-131-511是稳定的二聚体(26.1-34.4kDa),DOM1h-131-202是单体/二聚体平衡(22.7-27.8kDa),在测量的浓度下具有相对稳定的二聚体状态,Kd=1.3μM,DOM 1h-131-206主要是单体的(15.4-17.9kDa),具有360μM从单体至二聚体缔合的Kd。
通过沉降速度方法,所有样品显示出稀释时一定程度的解离。从所获得的结果,显示于图34中,对于DOM 1h-131-511观察到的沉降系数表示了较高级别的聚集物,并且稀释时的峰值位移表示了这些聚集物的解离。蛋白质聚集和解离相互抵偿,这产生了形成稳定的二聚体的印象,如通过沉降平衡所观察到的。对于DOM 1h-131-202观察到的沉降系数,表示了快速动态平衡,因此单体和二聚体峰没有相互分开,产生了单峰,具有高于适于样品质量的沉降系数。该结果与通过沉降平衡方法获得的结果相一致,并且测量解离常数为1μM。测定DOM 1h-131-206比其他两种样品单体更多,具有1.9s的沉降系数,与其他两种样品的2.5s相比较。该数据与沉降平衡数据非常一致。在测量的浓度下,低于360μM的Kd~10倍,样品主要是单体。
实施例15
DOM蛋白质dAb的功效增强:
图40中显示了DOM蛋白质dAb超过DOM 15-26亲本的VEGFR2受体结合测试中功效增强的实例。在该测试中,在基于平板的测试中测量了潜在抑制剂防止VEGF结合VEGFR2的能力。在该测试中,将VEGFR2-Fc嵌合体覆盖在96-孔ELISA平板上,并且向其加入预定量的已经用连续稀释的测试dAb预温育的VEGF。洗掉未结合的蛋白质后,用抗-VEGF抗体检测结合受体的VEGF的量,按比色滴定来测定其水平。按作为测试底物浓度函数的VEGF结合的抑制百分比将剂量应答效果作图。因此,有效的抑制剂是证明了在低浓度下基本上阻断了配体结合的那种。
FC融合体功效和半衰期:
VEGF阻断在肿瘤治疗中的治疗潜能已经实现了超过30年。癌症的慢性性质决定了生物药物需要长的血清半衰期来介导它们的作用,但这与通过肾过滤从循环中快速清除游离的dAb不相一致。为了测定VEGFdAb作为抗血管生成药用于癌症治疗的实用性,通过杂交连接物将前导结构域抗体与野生型人IgG1Fc格式化成融合体,使得形成二价分子,其通过使用FcRn介导的抗体补救途径延长了血清半衰期。
在该Fc融合体格式中,使用之前所述的测试将前导胰蛋白酶选定dAb DOM 15-26-593的功效与最初的亲本dAb(DOM 15-26)&胰蛋白酶不稳定dAb(DOM 15-26-501)相比较。结果显示于以下的表22中:
表22.Fc融合体形式的DOM 15-26前导的功效(RBA)&半衰期特征
dAb | Fc | 功效(nM) | T1/2b(hrs) |
DOM15-26 | hIgG1 | 0.506 | ND |
DOM15-26-501 | hIgG1 | 0.323 | 12.9 |
DOM15-26-593 | hIgG1 | 0.033 | 84.6 |
从这些结果可以看出,二聚Fc融合体形式,由于抗体亲抗原性(avidity)的作用,相对于游离dAb,提高了亲和性&功效。清楚的是通过胰蛋白酶选择获得的DOM 15-26-593功效增强在该Fc形式中得到维持,甚至更明显。此外,热和蛋白酶稳定性的增强翻译成分子在体内的药物动力学行为的明显变化。DOM 15-26-593与DOM 15-26-501相比较的消除半衰期的提高(参见图41)很可能是dAb提高稳定性的直接后果,使其对内体区室内发生的降解过程的抵抗性更大。因此,还预期了具有提高蛋白酶稳定性的dAb能够在其他生物区室中持续更长的时间,其他区室如血清、粘膜表面和各种组织区室,其中蛋白水解是涉及生物分子翻转的活性过程。
药物动力学清除特征:
以5mg/kg的浓度将DOM 15-26-593和DOM 15-26-501i.v.给药于3只大鼠后,测量DOM 15-26-593和DOM 15-26-501的药物动力学清除特征。然后使用直接VEGF结合标准ELISA测试和抗人Fc抗体测量了血清中DOM 15-26-593和DOM 15-26-501的水平,因此只检测了血清样品中的完整药物。以下的表23中显示了完整的药物动力学特征:
表23.大鼠中DOM 15-26&DOM 15-26-593Fc融合体的药物动力学参数概述
从这些结果可以看出DOM 15-26-593具有显著提高的药物动力学特征,具有,例如,延长的半衰期和降低清除率。
DOM 15-26-593显著提高的功效和药物动力学特征导致化合物用于各种其他生物物理特性的分析。
溶液状态特征:通过SEC-MALLs&AUC的分析:
如下利用DOM 15-26-593进行实验:
DOM15-26-593在高达2.5mg/ml的浓度下在溶液中,行为和单体一样,具有计算的78-81KDa的分子量,与计算的大约76kDa的完整分子量相一致(图42a&42b)。
热熔化特性:通过DSC的分析
如下进行实验,使用DOM 15-26-593:
在Fc融合体(64.5℃,图43,上图)中维持了胰蛋白酶选择的dAb提高的热稳定性(65℃,图43,中图)。显示了DOM 15-26-501dAb(52℃,图43,下图)的Tm曲线,用于比较。
对冻-融、温度应力和血清成分的稳定性
如下进行实验,使用15-26-593:
DOM 15-26-593dAb的稳定性特征意味着DOM 15-26-593dAb可以接受物理和生物应力,而对其结合VEGF的能力具有很小的影响(参见图44-47(a和b))。例如,将分子从液氮(-196℃)反复冻融至体温(37℃),循环10次,没有损耗结合活性,如通过ELISA所测定的(图44)。该处理还导致分子聚集状态没有明显变化,如通过常规大小排阻色谱所测定的(图45)。此外,测试证明了将分子置于从-80℃至55℃的不同温度范围下,在168小时后,只在最高温育温度下,抗原结合活性中才有少量下降(图46)。此外,用来自人或猕猴的血清在37℃温育14天时,没有引起抗原结合活性的损耗(图47a和47b),如通过VEGF结合ELISA所测定的。
VEGFR2受体结合测试&HUVEC细胞测试中的功效:
如下进行受体结合测试。
将以上所述的受体结合测试用于测定Fc融合体的功效(图48)。发现了DOM 15-26-593dAb在该测试中具有提高的功效,这确定了dAb在体外阻断了VEGF与VEGFR2结合的能力。还在HUVEC(人脐静脉内皮细胞)测试中证明了DMS 1529的功效,其中测量了VEGF拮抗剂 阻断VEGF刺激的HUVE细胞增殖的能力。在固定培养期结束时测定细胞数量,使用预定量的VEGF和不同含量的测试物质。观察到拮抗剂功效越大,细胞增殖越低(图49)。
在下一段中列出了DOM 1h-131-1511的核苷酸序列。
DOM 1h-131-1511的核苷酸序列:
Claims (12)
1.包含抗-TNFαI型受体免疫球蛋白单可变域的肺递送装置,其中所述抗-TNFαI型受体免疫球蛋白单可变域由与DOM1h-131-206的氨基酸序列为至少99%同一性的氨基酸序列组成。
2.根据权利要求1的肺递送装置,其包含抗-TNFαI型受体免疫球蛋白单可变域,所述抗-TNFαI型受体免疫球蛋白单可变域由DOM1h-131-206的氨基酸序列组成。
3.根据权利要求1-2任一项的肺递送装置,其中所述装置选自吸入器、鼻内给药装置、雾化器、烟雾器或喷雾器。
4.根据权利要求1-2任一项的肺递送装置,其中所述装置是计量喷雾器。
5.根据权利要求3的肺递送装置,其中所述喷雾器是喷射喷雾器或振动筛喷雾器。
6.根据权利要求3的肺递送装置,其是干粉吸入器或计量吸入器。
7.用于递送至肺的肺制剂,其包含:由与DOM1h-131-206的氨基酸序列为至少99%同一性的氨基酸序列组成的抗-TNFαI型受体免疫球蛋白单可变域或由DOM1h-131-206的氨基酸序列组成的抗-TNFαI型受体免疫球蛋白单可变域,其中所述可变域具有小于5微米的粒径范围。
8.权利要求7的肺制剂,其具有6.5-8.0的pH。
9.权利要求7-8任一项的肺制剂,其进一步包含粘度提高剂。
10.权利要求9的肺制剂,其中所述粘度提高剂是聚乙二醇(PEG)。
11.权利要求7或8的肺制剂,其进一步包含蔗糖。
12.根据权利要求1、2、5和6任一项的肺递送装置,其包含权利要求7-11任一项的用于递送至肺的肺制剂。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US93363207P | 2007-06-06 | 2007-06-06 | |
US60/933632 | 2007-06-06 | ||
GB0724331.4 | 2007-12-13 | ||
GBGB0724331.4A GB0724331D0 (en) | 2007-12-13 | 2007-12-13 | Compositions for pulmonary delivery |
CN200880102207.2A CN101778865B (zh) | 2007-06-06 | 2008-06-04 | 多肽、抗体可变域和拮抗剂 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN200880102207.2A Division CN101778865B (zh) | 2007-06-06 | 2008-06-04 | 多肽、抗体可变域和拮抗剂 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104311663A CN104311663A (zh) | 2015-01-28 |
CN104311663B true CN104311663B (zh) | 2018-11-02 |
Family
ID=39791116
Family Applications (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201410440384.9A Expired - Fee Related CN104311663B (zh) | 2007-06-06 | 2008-06-04 | 多肽、抗体可变域和拮抗剂 |
CN200880102207.2A Expired - Fee Related CN101778865B (zh) | 2007-06-06 | 2008-06-04 | 多肽、抗体可变域和拮抗剂 |
CN200880019060A Pending CN101802004A (zh) | 2007-06-06 | 2008-06-04 | 多肽、抗体可变域和拮抗剂 |
CN2008801020043A Pending CN101883788A (zh) | 2007-06-06 | 2008-06-04 | 多肽,抗体可变结构域&拮抗剂 |
Family Applications After (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN200880102207.2A Expired - Fee Related CN101778865B (zh) | 2007-06-06 | 2008-06-04 | 多肽、抗体可变域和拮抗剂 |
CN200880019060A Pending CN101802004A (zh) | 2007-06-06 | 2008-06-04 | 多肽、抗体可变域和拮抗剂 |
CN2008801020043A Pending CN101883788A (zh) | 2007-06-06 | 2008-06-04 | 多肽,抗体可变结构域&拮抗剂 |
Country Status (32)
Country | Link |
---|---|
US (5) | US20100247515A1 (zh) |
EP (5) | EP2162467B1 (zh) |
JP (3) | JP5325211B2 (zh) |
KR (4) | KR20100018040A (zh) |
CN (4) | CN104311663B (zh) |
AR (3) | AR066848A1 (zh) |
AU (4) | AU2008259590A1 (zh) |
BR (3) | BRPI0812268A2 (zh) |
CA (6) | CA2688433A1 (zh) |
CL (3) | CL2008001673A1 (zh) |
CO (2) | CO6251322A2 (zh) |
CR (2) | CR11194A (zh) |
CY (1) | CY1116762T1 (zh) |
DK (1) | DK2162467T3 (zh) |
DO (1) | DOP2009000268A (zh) |
EA (5) | EA200901494A1 (zh) |
ES (1) | ES2546943T3 (zh) |
HK (1) | HK1138022A1 (zh) |
HR (1) | HRP20151024T1 (zh) |
HU (1) | HUE025899T2 (zh) |
IL (2) | IL201398A0 (zh) |
MA (2) | MA31403B1 (zh) |
MX (4) | MX2009013137A (zh) |
NZ (1) | NZ581372A (zh) |
PE (3) | PE20090763A1 (zh) |
PL (1) | PL2162467T3 (zh) |
PT (1) | PT2162467E (zh) |
SG (2) | SG182151A1 (zh) |
SI (1) | SI2162467T1 (zh) |
TW (6) | TW200911832A (zh) |
WO (3) | WO2008149150A2 (zh) |
ZA (1) | ZA200908470B (zh) |
Families Citing this family (58)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005289809A (ja) | 2001-10-24 | 2005-10-20 | Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) | 突然変異重鎖抗体 |
MX363423B (es) | 2005-05-18 | 2019-03-22 | Ablynx Nv | Nanobodiestm (nanocuerpos) mejorados contra el factor alfa de necrosis del tumor. |
DE102005023617A1 (de) | 2005-05-21 | 2006-11-23 | Aspre Ag | Verfahren zum Mischen von Farben in einem Display |
CA2688433A1 (en) | 2007-06-06 | 2008-12-11 | Domantis Limited | Methods for selecting protease resistant polypeptides |
GB0724331D0 (en) | 2007-12-13 | 2008-01-23 | Domantis Ltd | Compositions for pulmonary delivery |
KR20100040840A (ko) * | 2007-06-06 | 2010-04-21 | 도만티스 리미티드 | 폴리펩티드,항체 가변 도메인 및 길항제 |
EP2220115A2 (en) * | 2007-12-13 | 2010-08-25 | Glaxo Group Limited | Polypeptides, antibody variable domains & antagonists |
JP2011516603A (ja) | 2008-04-17 | 2011-05-26 | アブリンクス エン.ヴェー. | 血清タンパク質と結合することが可能なペプチド、並びにこれを含む化合物、構築物及びポリペプチド |
KR102095257B1 (ko) | 2008-06-25 | 2020-04-01 | 노바르티스 아게 | Vegf를 억제하는 안정하고 가용성인 항체 |
US8268314B2 (en) | 2008-10-08 | 2012-09-18 | Hoffmann-La Roche Inc. | Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies |
AU2009319175A1 (en) * | 2008-11-26 | 2010-06-03 | Glaxo Group Limited | Polypeptides, antibody variable domains & antagonists |
WO2010081787A1 (en) | 2009-01-14 | 2010-07-22 | Domantis Limited | IMPROVED TNFα ANTAGONISM, PROPHYLAXIS & THERAPY WITH REDUCED ORGAN NECROSIS |
KR20110119806A (ko) * | 2009-02-19 | 2011-11-02 | 글락소 그룹 리미티드 | 개선된 항tnfr1 폴리펩티드,항체 가변 도메인 및 길항제 |
PE20120001A1 (es) | 2009-02-19 | 2012-02-12 | Glaxo Group Ltd | Dominios variables simples anti-albumina de suero mejorados |
CN105061593B (zh) * | 2009-02-19 | 2018-08-03 | 葛兰素集团有限公司 | 改良的抗血清清蛋白结合变体 |
EP2401298A1 (en) | 2009-02-24 | 2012-01-04 | Glaxo Group Limited | Antigen-binding constructs |
WO2011051217A1 (en) | 2009-10-27 | 2011-05-05 | Glaxo Group Limited | Stable anti-tnfr1 polypeptides, antibody variable domains & antagonists |
US20120107330A1 (en) | 2009-07-16 | 2012-05-03 | Adriaan Allart Stoop | Antagonists, uses & methods for partially inhibiting tnfr1 |
SG177601A1 (en) | 2009-07-16 | 2012-02-28 | Glaxo Group Ltd | Improved anti-serum albumin binding single variable domains |
WO2011047215A1 (en) * | 2009-10-14 | 2011-04-21 | Aileron Therapeutics, Inc. | Improved peptidomimetic macrocycles |
EP2531523A1 (en) | 2010-02-05 | 2012-12-12 | Ablynx N.V. | Peptides capable of binding to serum albumin and compounds, constructs and polypeptides comprising the same |
MX2012013406A (es) * | 2010-05-20 | 2012-12-10 | Glaxo Group Ltd | Variantes de union mejoradas anti-albumina serica. |
JP2013538566A (ja) * | 2010-08-13 | 2013-10-17 | グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッド | 改良された抗血清アルブミン結合変異体 |
EP2606065A2 (en) * | 2010-08-20 | 2013-06-26 | GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Limited | Improved anti-serum albumin binding variants |
ES2618586T3 (es) | 2010-09-16 | 2017-06-21 | Baliopharm Ag | Anticuerpo anti-huTNFR1 |
EP2646467A2 (en) | 2010-12-01 | 2013-10-09 | Glaxo Group Limited | Improved anti-serum albumin binding single variable domains |
US20130310281A1 (en) * | 2011-02-02 | 2013-11-21 | Glaxo Group Limited | Novel antigen binding proteins |
US9527925B2 (en) | 2011-04-01 | 2016-12-27 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Bispecific binding molecules binding to VEGF and ANG2 |
PT2726092T (pt) | 2011-06-28 | 2019-10-08 | Lp Inhibrx | Polipéptidos de fusão serpina e métodos para a sua utilização |
US10400029B2 (en) | 2011-06-28 | 2019-09-03 | Inhibrx, Lp | Serpin fusion polypeptides and methods of use thereof |
AU2012288846B2 (en) * | 2011-07-27 | 2016-05-19 | Glaxo Group Limited | Anti-VEGF single variable domains fused to fc domains |
CN103917557B (zh) * | 2011-08-17 | 2018-03-20 | 葛兰素集团有限公司 | 具有降低的与抗药物抗体结合的经修饰的单可变结构域抗体 |
GB2497138A (en) * | 2011-12-02 | 2013-06-05 | Randox Lab Ltd | Biomarkers for stroke and stroke subtype diagnosis. |
RS57704B1 (sr) | 2012-07-13 | 2018-12-31 | Roche Glycart Ag | Bispecifična anti-vegf/anti-ang-2 antitela i njihova primena u lečenju vaskularnih bolesti oka |
WO2014111550A1 (en) | 2013-01-17 | 2014-07-24 | Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited | Modified anti-serum albumin binding proteins |
WO2014118220A1 (en) | 2013-01-31 | 2014-08-07 | Glaxo Group Limited | Method of producing a protein |
US9840553B2 (en) | 2014-06-28 | 2017-12-12 | Kodiak Sciences Inc. | Dual PDGF/VEGF antagonists |
MA41374A (fr) * | 2015-01-20 | 2017-11-28 | Cytomx Therapeutics Inc | Substrats clivables par métalloprotéase matricielle et clivables par sérine protéase et procédés d'utilisation de ceux-ci |
RU2744860C2 (ru) | 2015-12-30 | 2021-03-16 | Кодиак Сайенсиз Инк. | Антитела и их конъюгаты |
GB201617622D0 (en) * | 2016-10-18 | 2016-11-30 | VIB VZW and Universiteit Gent | Means and methods to treat inflammation |
RU2625010C1 (ru) * | 2016-11-10 | 2017-07-11 | Илья Петрович Приколаб | Экспрессионный плазмидный вектор для экспрессии активной формы TNFR1-Fc и способ получения рекомбинантного белка |
AU2017364818A1 (en) | 2016-11-28 | 2019-05-23 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Ligand-binding molecule having adjustable ligand binding activity |
WO2018097307A1 (ja) | 2016-11-28 | 2018-05-31 | 中外製薬株式会社 | 抗原結合ドメインおよび運搬部分を含むポリペプチド |
UY37651A (es) * | 2017-03-31 | 2018-10-31 | Swedish Orphan Biovitrum Ab Publ | Polipéptido de unión al il-1r-i |
EP3703689A1 (en) * | 2017-11-01 | 2020-09-09 | Allogene Therapeutics, Inc. | Modified caspase-9 polypeptides and methods of use thereof |
TW201936208A (zh) | 2017-11-28 | 2019-09-16 | 日商中外製藥股份有限公司 | 含有抗原結合域及運輸部分之多胜肽 |
CN112203679A (zh) | 2018-03-02 | 2021-01-08 | 科达制药股份有限公司 | Il-6抗体及其融合构建体和缀合物 |
JP7428661B2 (ja) * | 2018-05-30 | 2024-02-06 | 中外製薬株式会社 | Il-1r1結合ドメインおよび運搬部分を含むポリペプチド |
PL3623798T3 (pl) * | 2018-09-13 | 2022-03-28 | Euroimmun Medizinische Labordiagnostika Ag | Sposób i urządzenie do wykrywania i przedstawiania obrazu immunofluorescencyjnego próbki biologicznej |
JP2022512798A (ja) * | 2018-10-25 | 2022-02-07 | エフ.ホフマン-ラ ロシュ アーゲー | 抗体FcRn結合の改変 |
EP3890764A2 (en) | 2018-12-06 | 2021-10-13 | CytomX Therapeutics, Inc. | Matrix metalloprotease-cleavable and serine or cysteine protease-cleavable substrates and methods of use thereof |
CN111454366B (zh) * | 2019-01-21 | 2023-06-16 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 一种融合蛋白及其应用 |
US20220107318A1 (en) * | 2019-01-31 | 2022-04-07 | Sekisui Medical Co., Ltd. | Immunoassay method for free aim in biological sample, and assay kit |
WO2021072265A1 (en) | 2019-10-10 | 2021-04-15 | Kodiak Sciences Inc. | Methods of treating an eye disorder |
AU2021332460A1 (en) | 2020-08-27 | 2023-04-06 | Enosi Therapeutics Corporation | Methods and compositions to treat autoimmune diseases and cancer |
WO2022117569A1 (en) | 2020-12-02 | 2022-06-09 | Oncurious Nv | A ccr8 antagonist antibody in combination with a lymphotoxin beta receptor agonist antibody in therapy against cancer |
CN115181751A (zh) * | 2021-04-02 | 2022-10-14 | 苏州博腾生物制药有限公司 | 靶向白蛋白的嵌合抗原受体及其使用方法 |
CN114657162B (zh) * | 2022-03-04 | 2023-06-16 | 华南理工大学 | 一种具有血管内皮细胞保护功能的抗氧化五肽及其应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004058820A2 (en) * | 2002-12-27 | 2004-07-15 | Domantis Limited | Single-domain-effector group and its uses |
WO2007049017A2 (en) * | 2005-10-24 | 2007-05-03 | Domantis Limited | Agents that bind a target in pulmonary tissue for treating respiratory diseases |
Family Cites Families (52)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB2148299B (en) * | 1983-09-01 | 1988-01-06 | Hybritech Inc | Antibody compositions of therapeutic agents having an extended serum half-life |
AU600575B2 (en) | 1987-03-18 | 1990-08-16 | Sb2, Inc. | Altered antibodies |
GB8725529D0 (en) | 1987-10-30 | 1987-12-02 | Delta Biotechnology Ltd | Polypeptides |
WO1989007142A1 (en) | 1988-02-05 | 1989-08-10 | Morrison Sherie L | Domain-modified constant region antibodies |
CA1340288C (en) | 1988-09-02 | 1998-12-29 | Robert Charles Ladner | Generation and selection of novel binding proteins |
KR0184860B1 (ko) | 1988-11-11 | 1999-04-01 | 메디칼 리써어치 카운실 | 단일영역 리간드와 이를 포함하는 수용체 및 이들의 제조방법과 이용(법) |
ATE92107T1 (de) | 1989-04-29 | 1993-08-15 | Delta Biotechnology Ltd | N-terminale fragmente von menschliches serumalbumin enthaltenden fusionsproteinen. |
CA2016842A1 (en) | 1989-05-16 | 1990-11-16 | Richard A. Lerner | Method for tapping the immunological repertoire |
US5143854A (en) | 1989-06-07 | 1992-09-01 | Affymax Technologies N.V. | Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof |
US5977307A (en) | 1989-09-07 | 1999-11-02 | Alkermes, Inc. | Transferrin receptor specific ligand-neuropharmaceutical agent fusion proteins |
GB9015198D0 (en) | 1990-07-10 | 1990-08-29 | Brien Caroline J O | Binding substance |
US6172197B1 (en) | 1991-07-10 | 2001-01-09 | Medical Research Council | Methods for producing members of specific binding pairs |
AU665190B2 (en) | 1990-07-10 | 1995-12-21 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing members of specific binding pairs |
ES2246502T3 (es) | 1990-08-29 | 2006-02-16 | Genpharm International, Inc. | Animales no humanos transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos. |
AU663300B2 (en) | 1990-12-06 | 1995-10-05 | Affymetrix, Inc. | Very large scale immobilized polymer synthesis |
DE69233745D1 (de) | 1991-12-02 | 2008-10-23 | Cambridge Antibody Tech | Herstellung von Autoantikörpern auf Phagenoberflächen ausgehend von Antikörpersegmentbibliotheken |
US5733743A (en) | 1992-03-24 | 1998-03-31 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing members of specific binding pairs |
EP0714409A1 (en) | 1993-06-16 | 1996-06-05 | Celltech Therapeutics Limited | Antibodies |
US5702892A (en) | 1995-05-09 | 1997-12-30 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Phage-display of immunoglobulin heavy chain libraries |
DK0859841T3 (da) | 1995-08-18 | 2002-09-09 | Morphosys Ag | Protein/(poly)peptidbiblioteker |
NZ512006A (en) * | 1996-02-09 | 2005-05-27 | Abbott Biotech Ltd | Medical treatment with human TNF-alpha antibodies |
DK1019496T3 (da) | 1997-07-07 | 2005-01-10 | Medical Res Council | In vitro-sorteringsmetode |
GB9722131D0 (en) | 1997-10-20 | 1997-12-17 | Medical Res Council | Method |
EP1078051B1 (en) | 1998-05-13 | 2007-12-12 | Domantis Limited | Phage-display system for the selection of correctly folded proteins |
IL127127A0 (en) | 1998-11-18 | 1999-09-22 | Peptor Ltd | Small functional units of antibody heavy chain variable regions |
JP2003523742A (ja) | 2000-02-03 | 2003-08-12 | ドマンティス リミテッド | コンビナトリアルタンパク質ドメイン |
AU2001238076A1 (en) | 2000-02-11 | 2001-08-20 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, National Institutes Of Health | Identification of a novel domain in the tumor necrosis factor receptor family that mediates pre-ligand receptor assembly and function |
US7265210B2 (en) * | 2000-09-15 | 2007-09-04 | Genentech, Inc. | Anti-PRO9821 antibodies |
CA2430039C (en) | 2000-11-28 | 2014-01-28 | Medimmune, Inc. | Methods of administering/dosing anti-rsv antibodies for prophylaxis and treatment |
US20060073141A1 (en) * | 2001-06-28 | 2006-04-06 | Domantis Limited | Compositions and methods for treating inflammatory disorders |
JP4303105B2 (ja) | 2001-06-28 | 2009-07-29 | ドマンティス リミテッド | 二重特異性リガンドとその利用 |
GB0118689D0 (en) * | 2001-08-01 | 2001-09-19 | Psimedica Ltd | Pharmaceutical formulation |
EP1572936A2 (en) | 2002-03-05 | 2005-09-14 | Eli Lilly And Company | Heterologous g-csf fusion proteins |
US20060002935A1 (en) | 2002-06-28 | 2006-01-05 | Domantis Limited | Tumor Necrosis Factor Receptor 1 antagonists and methods of use therefor |
ES2263984T3 (es) | 2002-06-28 | 2006-12-16 | Domantis Limited | Ligandos doble-especificos con una vida media serica aumentada. |
US7696320B2 (en) | 2004-08-24 | 2010-04-13 | Domantis Limited | Ligands that have binding specificity for VEGF and/or EGFR and methods of use therefor |
EP1545611B1 (en) | 2002-09-06 | 2016-11-09 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Method of treatment of asthma using antibodies to complement component c5 |
TWI289668B (en) | 2002-09-06 | 2007-11-11 | Amgen Inc | Therapeutic human anti-IL-1R1 monoclonal antibody |
EP3299393A1 (en) | 2002-11-08 | 2018-03-28 | Ablynx N.V. | Single domain antibodies directed against tumour necrosis factor-alpha and uses therefor |
AU2003290330A1 (en) | 2002-12-27 | 2004-07-22 | Domantis Limited | Dual specific single domain antibodies specific for a ligand and for the receptor of the ligand |
US20060104968A1 (en) * | 2003-03-05 | 2006-05-18 | Halozyme, Inc. | Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases |
CN1845938B (zh) * | 2003-06-30 | 2010-05-26 | 杜门蒂斯有限公司 | 多肽 |
PL1729795T3 (pl) | 2004-02-09 | 2016-08-31 | Human Genome Sciences Inc | Białka fuzyjne albuminy |
WO2005093074A1 (en) | 2004-03-24 | 2005-10-06 | Domantis Limited | Gas1 universal leader |
EP2324848A3 (en) * | 2004-10-21 | 2011-09-14 | Genentech, Inc. | Method for treating intraocular neovascular diseases |
WO2006059108A2 (en) * | 2004-12-02 | 2006-06-08 | Domantis Limited | ANTI-IL-IRl SINGLE DOMAIN ANTIBODIES AND THERAPEUTIC USES |
AU2006321364B2 (en) | 2005-12-01 | 2011-11-10 | Domantis Limited | Noncompetitive domain antibody formats that bind Interleukin 1 Receptor type 1 |
WO2007063311A2 (en) * | 2005-12-01 | 2007-06-07 | Domantis Limited | Competitive domain antibody formats that bind interleukin 1 receptor type 1 |
LT2068889T (lt) | 2006-08-10 | 2020-02-10 | Roy C. Levitt | Anakinra, naudojama bronchiolito obliteranso sindromo gydymui |
WO2008049897A1 (en) * | 2006-10-27 | 2008-05-02 | Ablynx N.V. | Intranasal delivery of polypeptides and proteins |
CA2688433A1 (en) | 2007-06-06 | 2008-12-11 | Domantis Limited | Methods for selecting protease resistant polypeptides |
KR20100040840A (ko) | 2007-06-06 | 2010-04-21 | 도만티스 리미티드 | 폴리펩티드,항체 가변 도메인 및 길항제 |
-
2008
- 2008-06-03 CA CA002688433A patent/CA2688433A1/en not_active Abandoned
- 2008-06-03 EA EA200901494A patent/EA200901494A1/ru unknown
- 2008-06-03 CA CA002688434A patent/CA2688434A1/en not_active Abandoned
- 2008-06-03 KR KR1020107000188A patent/KR20100018040A/ko not_active Application Discontinuation
- 2008-06-03 CA CA002683791A patent/CA2683791A1/en not_active Abandoned
- 2008-06-03 AU AU2008259590A patent/AU2008259590A1/en not_active Abandoned
- 2008-06-03 MX MX2009013137A patent/MX2009013137A/es not_active Application Discontinuation
- 2008-06-04 EP EP08750800.8A patent/EP2162467B1/en active Active
- 2008-06-04 SG SG2012040275A patent/SG182151A1/en unknown
- 2008-06-04 BR BRPI0812268A patent/BRPI0812268A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2008-06-04 EA EA200901300A patent/EA200901300A1/ru unknown
- 2008-06-04 DK DK08750800.8T patent/DK2162467T3/en active
- 2008-06-04 AR ARP080102363A patent/AR066848A1/es not_active Application Discontinuation
- 2008-06-04 EP EP08750801A patent/EP2164867A2/en not_active Withdrawn
- 2008-06-04 CN CN201410440384.9A patent/CN104311663B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2008-06-04 JP JP2010510886A patent/JP5325211B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2008-06-04 MX MX2009013138A patent/MX2009013138A/es active IP Right Grant
- 2008-06-04 EA EA200901491A patent/EA018129B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2008-06-04 CA CA2688447A patent/CA2688447C/en active Active
- 2008-06-04 EP EP13184209.8A patent/EP2746290B1/en active Active
- 2008-06-04 WO PCT/GB2008/050407 patent/WO2008149150A2/en active Application Filing
- 2008-06-04 JP JP2010510888A patent/JP2010530364A/ja active Pending
- 2008-06-04 CA CA002688456A patent/CA2688456A1/en not_active Abandoned
- 2008-06-04 PT PT87508008T patent/PT2162467E/pt unknown
- 2008-06-04 KR KR1020107000223A patent/KR20100040841A/ko not_active Application Discontinuation
- 2008-06-04 PE PE2008000943A patent/PE20090763A1/es not_active Application Discontinuation
- 2008-06-04 JP JP2010510887A patent/JP5444215B2/ja active Active
- 2008-06-04 BR BRPI0813899A patent/BRPI0813899A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2008-06-04 BR BRPI0812795A patent/BRPI0812795C1/pt not_active IP Right Cessation
- 2008-06-04 US US12/663,506 patent/US20100247515A1/en not_active Abandoned
- 2008-06-04 EA EA200901495A patent/EA018723B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2008-06-04 NZ NZ581372A patent/NZ581372A/en not_active IP Right Cessation
- 2008-06-04 SI SI200831508T patent/SI2162467T1/sl unknown
- 2008-06-04 CN CN200880102207.2A patent/CN101778865B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2008-06-04 PL PL08750800T patent/PL2162467T3/pl unknown
- 2008-06-04 AU AU2008259516A patent/AU2008259516A1/en not_active Abandoned
- 2008-06-04 EP EP08750802A patent/EP2162468A2/en not_active Withdrawn
- 2008-06-04 EP EP13184211.4A patent/EP2746291B1/en active Active
- 2008-06-04 PE PE2008000944A patent/PE20090323A1/es not_active Application Discontinuation
- 2008-06-04 KR KR1020107000212A patent/KR101604274B1/ko active IP Right Grant
- 2008-06-04 WO PCT/GB2008/050406 patent/WO2008149149A2/en active Application Filing
- 2008-06-04 ES ES08750800.8T patent/ES2546943T3/es active Active
- 2008-06-04 HU HUE08750800A patent/HUE025899T2/en unknown
- 2008-06-04 CA CA002683823A patent/CA2683823A1/en not_active Abandoned
- 2008-06-04 CN CN200880019060A patent/CN101802004A/zh active Pending
- 2008-06-04 CN CN2008801020043A patent/CN101883788A/zh active Pending
- 2008-06-04 WO PCT/GB2008/050405 patent/WO2008149148A2/en active Application Filing
- 2008-06-04 US US12/663,502 patent/US8398979B2/en active Active
- 2008-06-04 SG SG2012039541A patent/SG182141A1/en unknown
- 2008-06-04 MX MX2009013211A patent/MX2009013211A/es active IP Right Grant
- 2008-06-04 AR ARP080102365A patent/AR066850A1/es not_active Application Discontinuation
- 2008-06-04 MX MX2009012967A patent/MX2009012967A/es not_active Application Discontinuation
- 2008-06-04 KR KR1020107000213A patent/KR20100041746A/ko not_active Application Discontinuation
- 2008-06-04 AR ARP080102362A patent/AR066847A1/es unknown
- 2008-06-04 AU AU2008259514A patent/AU2008259514B2/en not_active Ceased
- 2008-06-04 AU AU2008259515A patent/AU2008259515A1/en not_active Abandoned
- 2008-06-04 PE PE2008000940A patent/PE20090322A1/es not_active Application Discontinuation
- 2008-06-06 CL CL2008001673A patent/CL2008001673A1/es unknown
- 2008-06-06 TW TW097121295A patent/TW200911832A/zh unknown
- 2008-06-06 TW TW097121265A patent/TW200911834A/zh unknown
- 2008-06-06 TW TW097121301A patent/TW200918088A/zh unknown
- 2008-06-06 TW TW097121296A patent/TW200902551A/zh unknown
- 2008-06-06 CL CL2008001674A patent/CL2008001674A1/es unknown
- 2008-06-06 TW TW097121268A patent/TW200911831A/zh unknown
- 2008-06-06 TW TW097121280A patent/TW200907128A/zh unknown
- 2008-06-06 CL CL2008001676A patent/CL2008001676A1/es unknown
- 2008-11-26 US US12/323,632 patent/US20090148437A1/en not_active Abandoned
-
2009
- 2009-10-11 IL IL201398A patent/IL201398A0/en unknown
- 2009-11-04 US US13/130,656 patent/US20110256122A1/en not_active Abandoned
- 2009-11-04 EA EA201100546A patent/EA201100546A1/ru unknown
- 2009-11-18 IL IL202204A patent/IL202204A0/en unknown
- 2009-11-27 DO DO2009000268A patent/DOP2009000268A/es unknown
- 2009-11-30 MA MA32388A patent/MA31403B1/fr unknown
- 2009-11-30 ZA ZA2009/08470A patent/ZA200908470B/en unknown
- 2009-12-14 CO CO09142782A patent/CO6251322A2/es not_active Application Discontinuation
- 2009-12-14 CO CO09142781A patent/CO6251321A2/es not_active Application Discontinuation
-
2010
- 2010-01-04 MA MA32475A patent/MA31668B1/fr unknown
- 2010-01-06 CR CR11194A patent/CR11194A/es not_active Application Discontinuation
- 2010-01-06 CR CR11195A patent/CR11195A/es unknown
- 2010-05-24 HK HK10105002.3A patent/HK1138022A1/zh not_active IP Right Cessation
-
2011
- 2011-11-17 US US13/299,030 patent/US20120134982A1/en not_active Abandoned
-
2015
- 2015-09-28 HR HRP20151024TT patent/HRP20151024T1/hr unknown
- 2015-10-06 CY CY20151100886T patent/CY1116762T1/el unknown
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004058820A2 (en) * | 2002-12-27 | 2004-07-15 | Domantis Limited | Single-domain-effector group and its uses |
WO2007049017A2 (en) * | 2005-10-24 | 2007-05-03 | Domantis Limited | Agents that bind a target in pulmonary tissue for treating respiratory diseases |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN104311663B (zh) | 多肽、抗体可变域和拮抗剂 | |
US10072089B2 (en) | Polypeptides, antibody variable domains and antagonists | |
AU2008259513B2 (en) | Polypeptides, antibody variable domains and antagonists |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20181102 |