ES2546943T3 - Polipéptidos, dominios variables de anticuerpo y antagonistas - Google Patents

Polipéptidos, dominios variables de anticuerpo y antagonistas Download PDF

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Abstract

Un dominio variable único de inmunoglobulina anti-receptor TNFα tipo 1 que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAHETMVWVRQAPGKGLEWV SHIPPDGQDPFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYHCAL LPKRGPWFDYWGQGTLVTVSS

Description

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En algunas realizaciones, el sistema de presentación comprende un bacteriófago de presentación. Por ejemplo, el bacteriófago puede ser fd, M13, lambda. MS2 o T7. En realizaciones particulares, el sistema de presentación en bacteriófago es multivalente. En algunas realizaciones, el péptido o polipéptido se presenta como una proteína de fusión pIII.
En otras realizaciones, el procedimiento comprende además la amplificación del ácido nucleico que codifica un péptido o polipéptido que tiene la actividad biológica deseada. En realizaciones particulares, el ácido nucleico se amplifica por amplificación de fago, cultivo celular o reacción en cadena de la polimerasa.
En algunas realizaciones, el repertorio es un repertorio de dominios variables únicos de inmunoglobulinas. En realizaciones particulares, el dominio variable único de inmunoglobulina es un dominio variable de cadena pesada. En realizaciones más particulares, el dominio variable de cadena pesada es un dominio variable de cadena pesada humano. En otras realizaciones, el dominio variable único de inmunoglobulina es un dominio variable de cadena ligera. En realizaciones particulares, el dominio variable de cadena ligera es un dominio variable de cadena ligera humano.
En otro aspecto, en el presente documento se describe un procedimiento para seleccionar un polipéptido resistente a proteasa que comprende un dominio variable único de inmunoglobulina (dAb) que se une a un ligando diana (por ejemplo, el TNFR1) a partir de un repertorio. En una realización, el procedimiento comprende proporcionar un sistema de presentación en fago que comprende un repertorio de polipéptidos que comprende un dominio variable único de inmunoglobulina, combinar el sistema de presentación en fago y una proteasa que se selecciona del grupo que consiste en elastasa, leucozima y tripsina, bajo condiciones adecuadas para la actividad proteasa, y recuperar un fago que presenta un polipéptido que comprende un dominio variable único de inmunoglobulina que se une al ligando diana.
En algunas realizaciones, la proteasa se utiliza a 100 g/ml, y el sistema de presentación en fago y la proteasa combinados se cultivan a aproximadamente a 37 ºC durante una noche.
En algunas realizaciones, el fago que presenta un polipéptido que comprende un dominio variable único de inmunoglobulina que se une al ligando diana se recupera uniéndose a dicha diana. En otras realizaciones, el fago que presenta un polipéptido que comprende un dominio variable único de inmunoglobulina que se une al ligando diana se recupera por selección.
También se describe un péptido o polipéptido resistente a proteasa aislado que se puede seleccionar o se selecciona por procedimientos que se describen en el presente documento. En una realización particular, se proporciona un dominio variable único de inmunoglobulina resistente a proteasa (por ejemplo, tripsina, elastasa, leucozima) aislado (por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo humano, un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo humano) que se puede seleccionar o se selecciona por los procedimientos descritos en el presente documento.
Se describe además en el presente documento un ácido nucleico aislado o recombinante que codifica un péptido o polipéptido resistente a proteasa (por ejemplo, un dominio variable único de inmunoglobulina resistente a tripsina, elastasa, o leucozima) que se puede seleccionar o se selecciona por los procedimientos descritos en el presente documento, y a los vectores (por ejemplo, vectores de expresión) y células huésped que comprenden los ácidos nucleicos.
Se describe además en el presente documento un péptido o polipéptido resistente a proteasa (por ejemplo, un dominio variable único de inmunoglobulina resistente a tripsina, elastasa, o leucozima) que se puede seleccionar o se selecciona por los procedimientos descritos en el presente documento, que comprende el mantenimiento de una célula huésped que contienen un ácido nucleico recombinante que codifica el péptido o polipéptido resistente a proteasa bajo condiciones adecuadas para la expresión, produciéndose de esta manera un péptido o polipéptido resistente a proteasa.
Se describe además en el presente documento un péptido o polipéptido resistente a proteasa (por ejemplo, un dominio variable único de inmunoglobulina resistente a tripsina, elastasa, o leucozima) que se puede seleccionar o se selecciona por los procedimientos descritos en el presente documento para su uso en medicina (por ejemplo, para terapia o diagnóstico). Se describe además en el presente documento el uso de un péptido o polipéptido resistente a proteasa (por ejemplo, un dominio variable único de inmunoglobulina resistente a tripsina, elastasa, o leucozima) que se puede seleccionar o se selecciona por los procedimientos descritos en el presente documento para la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad. Se describe además en el presente documento un péptido o polipéptido resistente a proteasa (por ejemplo, un dominio variable único de inmunoglobulina resistente a tripsina, elastasa, o leucozima) que se puede seleccionar o se selecciona por los procedimientos descritos en el presente documento para su uso en el tratamiento de una enfermedad.
Se describe además en el presente documento un kit de diagnóstico para determinar si está presente el TNFR1 en una muestra o cuanto TNFR1 está presente en una muestra, que comprende un polipéptido, dominio variable de inmunoglobulina (dAb) o antagonista de la invención e instrucciones para su uso (por ejemplo, para determinar la presencia y/o cantidad de TNFR1 en la muestra). En algunas realizaciones, el kit comprende además uno o más
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Las FIG. 26A a I muestran los rastros de la SEC que muestran el efecto del proceso térmico (37 y 50 ºC) sobre el DOM1h-131-511 (A a C), -202 (D a F) y -206 (G a I). También se muestra el porcentaje de monómero que permanece en la solución en un punto de tiempo determinado con respecto al T = 0.
La FIG. 27 Muestra los análisis IEF de DOM1h-131-202, DOM1h-131-206 y DOM1h-131-511 a las 24 h, 48 h y 7 y 14 días de proceso térmico. Las muestras se habían incubado o a 37 o a 50 ºC en tampón Britton-Robinson.
La FIG. 28 es el RBA de TNFR-1 que muestra el efecto de 14 días de incubación de DOMlh-131-202, DOM1h131-206 y DOM1h-131-511 a 50 °C. Se asumía que la concentración de proteínas era 1 mg/ml. También se muestra un control negativo dAb (VH simulado) que no se une al antígeno.
La FIG. 29 ilustra los efectos del almacenamiento A: DOM1h-131-202, B: DOM1h-131-206 y C: DOM1h-131-511 a  100 mg/ml durante 7 días en tampón Britton-Robinson a +4 ºC. Se controló el UV a 280 nm.
La FIG. 30 muestra los datos del ensayo de nebulizador de DOM1h-131-202, DOM1h-131-206 y DOM lh-131511 en el Pari E-flow y LC+. La concentración de proteína era de 5 mg/ml en tampón Britton-Robinson.
La FIG. 31 ilustra los cambios en el porcentaje relativo en concentraciones de monómero durante la nebulización de DOM1h-131-202, DOMlh-131-206 y DOM1h-131-511 en tampón de Britton-Robinson a 5 mg/ml.
La FIG. 32 muestra los rastros de la SEC de DOM1h-131-206 y DOM1h-131-511 en tampón Britton-Robinson tras la nebulización con el Pari LC+.
La FIG. 33 muestra los rastros de la SEC de DOM1h-131-206 durante el proceso de nebulización durante 1 hora a 40 mg/ml en PBS. La proteína tanto en la cubeta del nebulizador y el aerosol tiene una alta resistencia a los efectos de cizalladura y proceso térmico que puede experimentar el dAb durante la nebulización.
La FIG. 34 muestra las curvas de velocidad de sedimentación para cada una de las tres proteínas candidatas (DOM1h-131-206 y DOM1h-131-511 y DOM1h-131-202). El pico bimodal que se observa para la muestra con la concentración más baja de DOM1h-131-206 es un artefacto que se debe a una fuga de la célula en este caso.
La FIG. 35 muestra el efecto del tampón y el dispositivo sobre el tamaño de las gotas de GSK1995056A (DOM1h-131-511).
La FIG. 36 es la estabilidad del GSK1995056A (DOM1h-131-511) después de la nebulización en varios dispositivos evaluados por la formación de un dímero como se mide por SEC.
La FIG. 37 muestra el ensayo del nebulizador de GSK1922567A (202), GSK1995057A (206) y GSK1995056A
(511) en el Pari E-flow y LC+. A) ensayo en tampón de Britton-Robinson, B) ensayo en tampón PEG 1000/sacarosa.
La FIG. 38 representa una curva de dosis de TNF- en el ensayo de unión al receptor TNFR-1 humano. Cada muestra se ensayó cuatro veces.
La FIG. 39 muestra la inhibición por GSK1922567A (DOM1h-131-202), GSK1995057A (DOM1h-131-206) y GSK1995056A (DOM1h-131-511) en el ensayo de unión al receptor TNFR-1 humano. Cada muestra se ensayó cuatro veces.
La FIG. 40 ilustra la potencia de los dAb DOM15-26 y DOM15-26-593 en el VEGF RBA.
La FIG. 41 muestra la farmacocinética de DMS1529 (DOM 15-26-593) y DMS1545 (DOM15-26-501) tras la administración de una dosis en embolada única i.v. a ratas a 5 mg/ml.
La FIG. 42A muestra el análisis SEC-MALLs (cromatografía de exclusión por tamaño-dispersión de luz láser multi-ángulo) de la fusión DMS 1529 Fc (fusión DOM 15-26-593 Fc) que confirma las propiedades monoméricas. Se muestran dos lotes diferentes que demuestran propiedades similares con respecto al índice de refracción (es decir, la concentración, líneas interrumpidas) y la dispersión de luz (líneas continuas). La línea marcada con la flecha significa el cálculo de la masa molecular.
La FIG. 42B muestra el análisis AUC (ultracentrifugación analítica) de la fusión DMS 1529 Fc (fusión DOM 15-26593 Fc) que confirma las propiedades monoméricas. Se ensayó un lote de material a tres concentraciones diferentes, que se aproximan a 0,2, 0,5 y 1,0 mg/ml en tampón PBS. El análisis de la tasa de sedimentación confirmaba una masa molecular de aproximadamente 80 kDa.
La FIG. 43 muestra los rastros DSC de DMS1529 (DOM15-26-593) y DOM15-26-501.
La FIG. 44 es un ELISA de unión VEGF para DMS 1529 (DOM 15-26-593) antes y después de 10 ciclos de congelación-descongelación en dos lotes diferentes de material.
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La FIG. 45 muestra la consistencia del perfil SEC de DOM 15-26-593 antes y después de 10 ciclos de congelación-descongelación.
La FIG. 46 ilustra los resultados de un estudio de estabilidad acelerada de la fusión DMS 1529 Fc (fusión DOM 15-26-593 Fc); demostrando el ELISA de unión que la actividad tras 7 días de incubación a la temperatura que se muestra.
La FIG. 47A muestra la estabilidad de DMS 1529 (DOM 15-26-593) en Cynomolgus humano tras 14 y 15 días de incubación a 37 ºC.
La FIG. 47B muestra la estabilidad de DMS 1529 (DOM 15-26-593) en suero humano tras 14 y 15 días de incubación a 37 ºC.
La FIG. 48 muestra la potencia de los dAb DOM15-26 y DOM15-26-593 como fusiones con Fc (DMS 1564 y 1529, respectivamente) en el VEGF RBA.
La FIG. 49 ilustra la inhibición de la proliferación de células HUVEC por la fusión DMS 1529 Fc (fusión DOM 1526-593 Fc).
La FIG. 50 es el mapa del vector pDom33.
La FIG. 51 representa las secuencias (de aminoácidos y nucleótidos) de los dAb que se unen a la albúmina sérica.
Descripción detallada de la invención
A menos de que se indique otra cosa, todos los términos técnicos y científicos que se utilizan en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto habituado en la técnica (por ejemplo, en cultivo celular, genética molecular, química de ácido nucleico, técnicas de hibridación y bioquímica). Se utilizan técnicas de referencia para los procedimientos moleculares, genéticos y bioquímicos (véase en general, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. y Ausubel y col., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4ª Ed, John Wiley & Sons, Inc.) y procedimientos químicos.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión “antagonista del receptor del factor de necrosis tumoral 1 (TNFR-1)” o “ antagonista anti-TNFR-1” o similares se refiere a un agente (por ejemplo, una molécula, un compuesto) que se une al TNFR-1 y puede inhibir una (es decir, una o más) de las funciones del TNFR-1. Por ejemplo, una antagonista del TNFR-1 puede inhibir la unión del TNF al TNFR-1 y/o inhibir la transducción de la señal mediada por medio de TNFR-1. En consecuencia, se pueden inhibir los procesos mediados por TNFR-1 y las respuestas celulares (por ejemplo, muerte celular inducida por el TNF en un ensayo de toxicidad de referencia en L929) con un antagonista del TNFR-1.
Como se utiliza en el presente documento, “péptido” se refiere a aproximadamente dos a aproximadamente 50 aminoácidos que están unidos en conjunto por enlaces peptídicos.
Como se utiliza en el presente documento, “polipéptido” se refiere a al menos aproximadamente dos a aproximadamente 50 aminoácidos que están unidos en conjunto por enlaces peptídicos. Los polipéptidos en general comprenden una estructura terciaria y plegamiento en dominios funcionales.
Como se utiliza en el presente documento, un péptido o polipéptido (por ejemplo un dominio de anticuerpo (dAb)) que es “resistente a la degradación por proteasa” no se degrada sustancialmente por una proteasa cuando se incuba con la proteasa bajo condiciones adecuadas para la actividad de la proteasa. Un polipéptido (por ejemplo, un dAb) no se degrada sustancialmente, cuando se degrada no más de aproximadamente un 25%, no más de aproximadamente un 20%, no más de aproximadamente un 15%, no más de aproximadamente un 14%, no más de aproximadamente un 13%, no más de aproximadamente un 12%, no más de aproximadamente un 11%, no más de aproximadamente un 10%, no más de aproximadamente un 9%, no más de aproximadamente un 8%, no más de aproximadamente un 7%, no más de aproximadamente un 6%, no más de aproximadamente un 5%, no más de aproximadamente un 4%, no más de aproximadamente un 3%, no más de aproximadamente un 2%, no más de aproximadamente un 1%, o sustancialmente nada de la proteína por la proteasa tras la incubación con la proteasa durante aproximadamente una hora a una temperatura adecuada para la actividad de la proteasa. Por ejemplo a 37 a 50 grados C. La degradación de la proteína se puede evaluar utilizando cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo, por SDS-PAGE o por un ensayo funcional (por ejemplo, unión al ligando) como se describe en el presente documento.
Como se utiliza en el presente documento, “sistema de presentación” se refiere a un sistema en el que una colección de polipéptidos o péptidos son accesibles para la selección basada en una característica deseada, tal como una característica física, química o funcional. El sistema de presentación puede ser un repertorio adecuado de polipéptidos o péptidos (por ejemplo, en una solución, inmovilizados en un soporte adecuado). El sistema de
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factor de 10), al menos 2 log (un factor de 100), al menos aproximadamente 3 log (un factor de 1000) o al menos aproximadamente 4 log (un factor de 10.000). Las cantidades adecuadas de proteasa y condiciones de incubación que dará como resultado la reducción deseada de clones que se recuperan se pueden determinar utilizando procedimientos y/o las directrices proporcionadas en el presente documento.
La proteasa y la colección de péptidos o polipéptidos se pueden combinar e incubar utilizando cualquier procedimiento adecuado (por ejemplo, in vitro, in vivo, ex vivo). Por ejemplo, la proteasa y la colección de péptidos o polipéptidos se pueden combinar en un envase adecuado y dejarlo en reposo, sacudirlo, agitarlo, girarlo o similar, a una temperatura adecuada para la actividad de proteasa. Si se desea, la proteasa y la colección de péptidos o polipéptidos se pueden combinar en un sistema in vivo o ex vivo, tal como introduciendo la colección de polipéptidos (por ejemplo, una biblioteca o repertorio de fagos de presentación) en un animal adecuado (por ejemplo, un ratón), y después de que haya pasado el tiempo suficiente para la actividad de proteasa, recuperar la colección de péptidos o polipéptidos. En otro ejemplo, se perfunde un órgano o tejido con la colección de polipéptidos (por ejemplo, una biblioteca o repertorio de fagos de presentación), y después de que haya pasado el tiempo suficiente para la actividad de proteasa, se recupera la colección de polipéptidos.
Después de la incubación, se puede seleccionar un péptido o polipéptido resistente a proteasa basándose en una actividad biológica deseada, tal como la actividad de unión. Si se desea, se puede añadir un inhibidor de la proteasa antes de la selección. Se puede utilizar cualquier inhibidor de proteasa adecuado (o combinación de dos o más inhibidores de proteasa) que no interfieran sustancialmente con el procedimiento de selección. Ejemplos de inhibidores adecuados incluyen, 1-anti-tripsina, 2-macroglobulina, amastatina, antipaína, antitrombina III, aprotinina, 4-(2-Aminoetil) hidrocloruro de fluoruro benzenosulfonilo (AEBSF), Fluoruro de (4-Amidino-Fenil)-Metano-Sulfonilo (APMSF), bestatina, benzamidina, quimostatina, 3,4-Dicloroisocoumarina, fluorofosfato de diisopropilo (DIFP), E-64, etilendiamina de ácido tetraacético (EDTA), elastatina l, leupeptina, N-Etihnaleimida, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), pepstatina, 1,10-Fenantrolitie, fosforamidon, inhibidores de serina proteasa, N-tosil-Llisinaclorometil cetona (TLCK), Na-Tosil-Fe-clorometil cetona (TPCK) y similares. Además, muchas preparaciones que contienen inhibidores de varias clases de proteasas están disponibles comercialmente (por ejemplo, Inhibidor completo de proteasa Roche Cocktail Tablets™ (Roche Diagnostics Corporation; Indianapolis, IN, EE. UU.), que inhibe la quimotripsina, termolisina, papaína, pronasa, extracto pancreático y tripsina).
Se puede seleccionar un péptido o polipéptido resistente a la proteasa utilizando un procedimiento de selección por la actividad biológica, que permite que se distingan y seleccionen los péptidos y polipéptidos que tienen la actividad biológica deseada de los péptidos y polipéptidos que no tienen la actividad biológica deseada. En general, los péptidos o polipéptidos que se han digerido o escindido por la proteasa pierden su actividad biológica, mientras que los péptidos o polipéptidos resistentes a proteasa se mantienen funcionales. Por lo tanto, se pueden utilizar ensayos adecuados de actividad biológica para seleccionar péptidos o polipéptidos resistentes a proteasas, Por ejemplo, se puede evaluar una función de unión común (por ejemplo, la unión a un ligando general, unión a un ligando específico, o unión a un sustrato) utilizando un ensayo de unión adecuado (por ejemplo, ELISA, ensayo de selección). Por ejemplo, los polipéptidos que se unen a un ligando diana o un ligando genérico, tal como la proteína A, proteína L, o un anticuerpo, se pueden seleccionar, aislar y/o recuperar por ensayo de selección o utilizando una matriz de afinidad adecuada. El ensayo de selección se puede llevar a cabo añadiendo una solución de ligandos (por ejemplo, ligando genérico, ligando diana) a un recipiente adecuado (por ejemplo, un tuvo, una placa de Petri) y permitiendo que el ligando se deposite o revista las paredes del recipiente. El exceso de ligando se puede lavar y se pueden añadir los polipéptidos (por ejemplo, una biblioteca de fagos de presentación) al recipiente y se mantienen el recipiente bajo condiciones adecuadas para que los polipéptidos se unan al ligando inmovilizado. El polipéptido que no se une se puede lavar y se pueden recuperar los polipéptidos unidos utilizando cualquier procedimiento adecuado, tal como el rascado o bajando el pH, por ejemplo.
Cuando se utiliza un sistema de presentación en fagos, se puede ensayar la unión en un ELISA de fago. El ELISA de fago se puede llevar a cabo de acuerdo con cualquier procedimiento adecuado. En un ejemplo, las poblaciones de fagos que se produce en cada ronda de selección se pueden explorar en cuanto a su unión al ligando diana seleccionado o al ligando genérico por ELISA, para identificar el fago que presenta los péptidos o polipéptidos resistentes a proteasa. Si se desea, los péptidos y polipéptidos solubles se pueden ensayar en cuanto a su unión al ligando diana o ligando genérico, por ejemplo por ELISA utilizando reactivos, por ejemplo, contra el marcador del extremo N o C (véase por ejemplo, Winter y col. (1994) Ann. Rev. Immunology 12, 433-55 y las referencias citadas en el presente documento). La diversidad del fago seleccionado también se puede evaluar por electroforesis en gel de productos PCR (Marks y col. 1991, supra; Nissim y col. 1994 supra), hibridación (Tomlinson y col., (1992) J. Mol. Biol. 227, 776) o por secuenciación del vector ADN.
Además de la especificidad por TNFR1, un antagonista o polipéptido (por ejemplo, un ligando específico dual) que comprende un polipéptido anti-TNFR1 resistente a la proteasa (por ejemplo, un domino variable único de anticuerpo) puede tener una especificidad de unión por un ligando genérico o cualquier ligando diana deseado, tal como proteínas humanas o animales, que incluyen citoquinas, factores de crecimiento, receptores de citoquinas, receptores de factores de crecimiento, enzimas (por ejemplo, proteasas), cofactores para enzimas, proteínas de unión al ADN, lípidos y carbohidratos.
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en una solución al 0,04% (p/p) de leucozima durante un periodo de al menos aproximadamente 2 horas. En una realización, el dAb resistente a la leucozima no se degrada sustancialmente cuando se incuba a 37 ºC en una solución de 0,04% (p/p) de leucozima durante un periodo de al menos aproximadamente 12 horas. En una realización, el dAb resistente a la leucozima no se degrada sustancialmente cuando se incuba a 37 ºC en una solución al 0,04% (p/p) de leucozima durante un periodo de al menos aproximadamente 24 horas, al menos aproximadamente 36 horas, o al menos aproximadamente 48 horas.
En una realización, se proporciona un procedimiento para seleccionar un dominio variable único de inmunoglobulina (un dAb) que es resistente a la degradación por leucozima y se une al TNFR1. El procedimiento comprende proporcionar un sistema de presentación en fago que comprende un repertorio de polipéptidos que comprende un dominio variable único de inmunoglobulina, combinar el sistema de presentación en fago con leucozima (aproximadamente 100 g/ml) e incubar la mezcla a aproximadamente 37 ºC, por ejemplo, durante una noche (por ejemplo, aproximadamente 12-16 horas), y luego seleccionar el fago que presenta un dAb que se une específicamente al TNFR1.
En otro ejemplo, se proporciona un procedimiento para seleccionar un péptido o polipéptido (por ejemplo, un dAb) que es resistente a la degradación por tripsina, que comprende proporcionar una biblioteca o repertorio de péptidos
o polipéptidos, combinar la biblioteca o el repertorio con tripsina (o una preparación biológica, extracto u homogenado que comprende tripsina) bajo condiciones adecuadas para la digestión proteolítica por tripsina, y seleccionar, aislar y/o recuperar un péptido o polipéptido que es resistente a la degradación por tripsina y tiene una actividad de unión específica al TNFR1.
En realizaciones particulares, se proporciona un procedimiento para la selección de un dominio variable único de inmunoglobulina (un dAb) que es resistente a la degradación por tripsina y se une al TNFR1. En estas realizaciones, se proporciona una biblioteca o repertorio que comprende dAb y se combina con tripsina (o una preparación biológica, extracto u homogenado que comprende tripsina) bajo condiciones adecuadas para la digestión proteolítica por tripsina. Se seleccionan los dAb resistentes a la tripsina que se unen específicamente al TNFR1. Por ejemplo, el dAb resistente a la tripsina no se degrada sustancialmente cuando se incuba a 37 ºC en una solución al 0,04% (p/p) de tripsina durante un periodo de al menos aproximadamente 2 horas. En una realización, el dAb resistente a la tripsina no se degrada sustancialmente cuando se incuba a 37 ºC en una solución de 0,04% (p/p) de tripsina durante un periodo de al menos aproximadamente 3 horas. En una realización, el dAb resistente a la tripsina no se degrada sustancialmente cuando se incuba a 37 ºC en una solución al 0,04% (p/p) de tripsina durante un periodo de al menos aproximadamente 4 horas, al menos aproximadamente 5 horas, al menos aproximadamente 6 horas, al menos aproximadamente 7 horas, al menos aproximadamente 8 horas, al menos aproximadamente 9 horas, al menos aproximadamente 10 horas, al menos aproximadamente 11 horas, o al menos aproximadamente 12 horas.
En una realización ejemplar, se proporciona un procedimiento para seleccionar un dominio variable único de inmunoglobulina (un dAb) que es resistente a la degradación por tripsina y se une al TNFR1. El procedimiento comprende proporcionar un sistema de presentación en fago que comprende un repertorio de polipéptidos que comprende un dominio variable único de inmunoglobulina, combinar el sistema de presentación en fago con tripsina (aproximadamente 100 g/ml) e incubar la mezcla a aproximadamente 37 ºC, por ejemplo, durante una noche (por ejemplo, aproximadamente 12-16 horas), y luego seleccionar el fago que presenta un dAb que se une específicamente al TNFR1.
En otro aspecto, se proporciona un procedimiento para producir un repertorio de péptidos o polipéptidos resistentes a proteasa (por ejemplo, dAb). El procedimiento comprende proporcionar un repertorio de péptidos o polipéptidos; combinar el repertorio de péptidos o polipéptidos y una proteasa bajo condiciones adecuadas para la actividad de la proteasa; y recuperar una pluralidad de péptidos o polipéptidos que se unen específicamente al TNFR1, en que se produce un repertorio de péptidos o polipéptidos resistentes a proteasa. Las proteasas, sistemas de presentación, condiciones para la actividad proteasa, y los procedimientos para seleccionar péptidos o polipéptidos son adecuados para su uso en el procedimiento que se describe en el presente documento con respecto a otros procedimientos.
En algunas realizaciones, se utiliza un sistema de presentación (por ejemplo, un sistema de presentación que une la función codificante de un ácido nucleico y las características funcionales del péptido o polipéptido codificado por el ácido nucleico) que comprende un repertorio de péptidos o polipéptido, y el procedimiento comprende además la amplificación o aumento del número de copias de los ácidos nucleicos que codifican la pluralidad de péptidos o polipéptidos seleccionados. Los ácidos nucleicos se pueden amplificar utilizando cualquier procedimiento adecuado, tal como amplificación por fago, cultivo celular o reacción en cadena de la polimerasa.
En una realización particular, se proporciona un procedimiento para producir un repertorio de polipéptidos resistentes a la proteasa que comprende dAb anti-TNFR1. El procedimiento comprende proporcionar un repertorio de polipéptidos que comprende dAb; combinar el repertorio de péptidos o polipéptidos y una proteasa (por ejemplo, tripsina, elastasa, leucozima) bajo condiciones adecuadas para la actividad de la proteasa; y recuperar una pluralidad de polipéptidos que comprenden dAb que tienen una especificidad de unión por el TNFR1. El procedimiento puede utilizarse para producir un repertorio intacto, o un repertorio que está predispuesto hacia una especificidad de unión que se desee, tal como un repertorio de maduración de afinidad basado en un dAb parental que tiene una especificidad de unión por el TNFR1.
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Sistemas de presentación de polipéptidos
En una realización, el repertorio o biblioteca de péptidos o polipéptidos que se proporciona para su uso en los procedimientos descritos en el presente documento comprenden un sistema de presentación adecuado. El sistema de presentación puede resistir la degradación por proteasa (por ejemplo, una proteasa única o una combinación de proteasas, y cualquier extracto biológico, homogenado o preparación que contenga actividad proteolítica (por ejemplo, esputo, mucus (por ejemplo, mucus gástrico, mucus nasal, mucus bronquial), lavado broncoalveolar, homogenado de pulmón, extracto de pulmón, extracto pancreático, fluido gástrico, saliva, lágrimas y similares). El sistema de presentación y la unión entre el sistema de presentación y el polipéptido presentado es en una realización al menos tan resistente a la proteasa como el más estable de los los péptidos o polipéptidos del repertorio. Esto permite que un ácido nucleico que codifica un polipéptido presentado seleccionado se aísle y/o amplifique fácilmente.
En un ejemplo, un péptido o polipéptido resistente a proteasa, por ejemplo un dAb, se puede seleccionar, aislar y/o recuperar de un repertorio de péptidos o polipéptidos que está en una solución, o que está covalente o no covalentemente unida a una superficie adecuada, tal como un plástico o cristal (por ejemplo, una placa microtiter, una matriz de polipéptido tal como una micromatriz). Por ejemplo, se puede utilizar una matriz de péptidos en una superficie de manera que aloje cada miembro distinto de la biblioteca (por ejemplo, una secuencia peptídica única) en una localización separada, predefinida en la matriz. La identidad de cada miembro de la biblioteca en tal matriz se puede determinar por su localización espacial en la matriz. Las localizaciones en la matriz en las que se producen interacciones de unión entre un ligando diana, por ejemplo, y los miembros reactivos de la biblioteca se puede determinar, identificando de esta manera las secuencias de los miembros reactivos basándose en la localización espacial. (Véase, por ejemplo, Patente de EE. UU. Nº 5.143.854, documentos WO 90/15070 y WO 92/10092).
En una realización, los procedimientos emplean un sistema de presentación que une la función codificante de un ácido nucleico y las características físicas, químicas y funcionales del polipéptido codificado por el ácido nucleico. Tal sistema de presentación puede comprender una pluralidad de paquetes genéticos replicables, tal como un bacteriófago, o células (bacterias). En una realización, el sistema de presentación comprende una biblioteca, tal como una biblioteca de bacteriófagos de presentación.
Se han descrito varios sistemas de presentación por bacteriófago adecuados (por ejemplo, sistemas de presentación monovalente o de presentación multivalente). (Véase, por ejemplo, Griffiths y col., Patente de EE. UU. Nº 6.555.313 B1; Johnson y col., Patente de EE. UU. Nº 5.733.743; McCafferty y col., Patente de EE. UU. Nº 5.969.108; Mulligan-Kehoe, Patente de EE. UU. Nº 5.702.892; Winter, G. y col., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994); Soumillion, P. y col., Appl. Biochem. Biotechnol. 47(2-3):175-189 (1994); Castagnoli, L. y col., Comb. Chem. High Throughput Screen, 4(2):121-133 (2001)). Los péptidos o polipéptidos que se presentan en un sistema de presentación por bacteriófago se puede presentar sobre cualquier bacteriófago adecuado, tal como un fago filamentoso (por ejemplo, fd, M13, F1), un fago lítico (por ejemplo, T4, T7, lambda), o un fago ARN (por ejemplo, MS2), por ejemplo.
En general, se produce o se proporciona una biblioteca de fagos que presenta un repertorio de péptidos o polipéptidos del fago, como proteínas de fusión con una proteína de cubierta del fago adecuada (por ejemplo, la proteína fd pIII). La proteína de fusión puede presentar los péptidos o polipéptidos en la punta de la proteína de la cubierta del fago, o si se desea en una posición interna. Por ejemplo, el péptido o polipéptido que se presenta se puede presentar en una posición que está en el extremo amino del dominio 1 de pIII. (El extremo N del dominio 1 de pIII se denomina también N1). El polipéptido que se presenta puede fusionarse directamente a pIII (por ejemplo, al extremo N del dominio 1 de pIII) o se fusiona a pIII utilizando un engarce. Si se desea, la fusión puede comprender además un marcador (por ejemplo, un epítopo myc, marcador His). Las bibliotecas que comprenden un repertorio de péptidos o polipéptidos que se presentan como proteínas de fusión con una proteína de la envoltura del fago se pueden producir utilizando cualquiera de los procedimientos adecuados, tal como introduciendo una biblioteca de vectores fago o vectores fagémido que codifican los péptidos o polipéptidos presentados en una bacteria huésped, y cultivando la bacteria resultante para producir el fago (por ejemplo, utilizando un fago auxiliar adecuado o complementando el plásmido si se desea). La biblioteca de fagos se puede recuperar del cultivo utilizando cualquier procedimiento adecuado, tal como precipitación y centrifugación.
El sistema de presentación puede comprender un repertorio de péptidos y polipéptidos que contiene cualquier cantidad que se desee de diversidad. Por ejemplo, el repertorio puede contener péptidos o polipéptidos que tienen que tienen secuencias de aminoácidos que corresponden con los polipéptidos de origen natural que se expresan por un organismo, grupo de organismos (por ejemplo, un repertorio de secuencias de dAb VHH aisladas de un camélido), tejido deseado o tipo celular deseado, o puede contener péptidos o polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos aleatorias o aleatorizadas. Si se desea, los polipéptidos pueden compartir un centro común o armazón. Los polipéptidos en tal repertorio o biblioteca pueden comprender regiones definidas de secuencia de aminoácidos aleatorias o aleatorizadas y regiones de secuencia de aminoácidos comunes. En ciertas realizaciones, todos o sustancialmente todos los polipéptidos de un repertorio son de un tipo deseado, tal como una enzima deseada (por ejemplo, una polimerasa) o un fragmento de unión al antígeno de anticuerpo deseado (por ejemplo, VH humana o VL humana). En realizaciones, el sistema de presentación comprende un repertorio de polipéptidos en que cada polipéptido comprende un dominio variable de anticuerpo. Por ejemplo, cada polipéptido en el repertorio puede contener una VH, una VL o un Fv (por ejemplo, un Fv de cadena sencilla).
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son particularmente útiles como ligandos genéricos. Los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno adecuados para su uso como ligandos para aislar, seleccionar y/o recuperar los péptidos o polipéptidos resistentes a la proteasa pueden ser monoclonales o policlonales y se pueden preparar cualquier procedimiento adecuado.
BIBLIOTECAS/REPERTORIOS
En otros aspectos, se proporcionan repertorios de péptidos y polipéptidos resistentes a proteasa, bibliotecas que codifican los péptidos y polipéptidos resistentes a proteasa, y procedimientos para producir tales bibliotecas y repertorios.
Las bibliotecas que codifican y/o contienen péptidos y polipéptidos resistentes a proteasa se pueden preparar u obtener utilizando cualquier procedimiento adecuado. La biblioteca se puede diseñar para que codifique péptidos o polipéptidos resistentes a proteasa basándose en un péptido o polipéptido de interés (por ejemplo, un péptido o polipéptido anti-TNFR1 que se selecciona de una biblioteca) o se puede seleccionar de otra biblioteca utilizando los procedimientos descritos en el presente documento. Por ejemplo, se puede preparar una biblioteca enriquecida en polipéptidos resistentes a proteasa utilizando un sistema de presentación de polipéptidos adecuado.
En un ejemplo, se combina una librería de fagos de presentación que comprende un repertorio de polipéptidos presentados que comprenden dominios variables únicos de inmunoglobulina (por ejemplo, VH, Vk, V) con una proteasa bajo condiciones adecuadas para la actividad de la proteasa, como se describe en el presente documento. Los polipéptidos resistentes a la proteasa se recuperan basándose en una actividad biológica deseada, tal como una actividad de unión (por ejemplo, de unión a un ligando genérico, de unión a un ligando diana) produciendo de esta manera una biblioteca enriquecida en polipéptidos resistentes a proteasa. En una realización, la recuperación se basa en la unión a ligandos genéricos para producir una biblioteca enriquecida seguido por la selección de un miembro anti-TNFR1 de esa biblioteca basándose en la unión específica al TNFR1.
En otro ejemplo, una biblioteca de fagos de presentación que comprende un repertorio de polipéptidos presentados que comprende dominios variables únicos de inmunoglobulina (por ejemplo, VH, Vk, V) se explora primero para identificar miembros del repertorio que tiene especificidad de unión por un antígeno diana deseado (TNFR1). Se recupera una colección de polipéptidos que tienen la especificidad de unión deseada y la colección se combina con una proteasa bajo condiciones adecuadas para la actividad proteolítica, como se describe en el presente documento. Se recupera una colección de polipéptidos resistentes a la proteasa que tienen la especificidad de unión por la diana deseada, produciendo una biblioteca enriquecida en polipéptidos resistentes a proteasa y con alta afinidad. Como se describe en el presente documento en una realización, la resistencia a la proteasa en este procedimiento de selección se correlaciona con la alta afinidad de unión.
Las bibliotecas que codifican un repertorio de un tipo de polipéptidos deseado se puede producir fácilmente utilizando cualquier procedimiento adecuado. Por ejemplo, se puede obtener una secuencia de ácido nucleico que codifique un tipo de polipéptido deseado (por ejemplo, una polimerasa, un dominio variable de inmunoglobulina) y se puede preparar una colección de ácidos nucleicos que contenga cada uno una o más mutaciones, por ejemplo, amplificando el ácido nucleico utilizando un sistema de reacción en cadena de la polimerasa propensa a errores (PCR), por mutagénesis química (Deng y col., J. Biol. Chem., 269:9533 (1994)) o utilizando cepas bacterianas mutadoras (Low y col., J. Mol. Biol., 260:359 (1996)).
En otras realizaciones, se pueden dirigir regiones particulares del ácido nucleico para la diversificación. Los procedimientos para mutar posiciones seleccionadas también se conocen bien en la técnica e incluyen, por ejemplo, el uso de oligonucleótidos mal emparejados u oligonucleótidos degenerados, con o sin el uso de PCR. Por ejemplo, se han creado bibliotecas de anticuerpos sintéticos dirigiendo las mutaciones a los bucles de unión al antígeno. Las regiones de anticuerpo aleatorias o semi-aleatorias H3 y L3 se han añadido a los segmentos genéticos V de la línea germinal de inmunoglobulinas para producir grandes bibliotecas con regiones de armazón sin mutar (Hoogenboom y Winter (1992) supra; Nissim y col. (1994) supra; Griffiths y col. (1994) supra; DeKruif y col. (1995) supra). Tal diversificación se ha extendido para incluir algunos o todos los otros bucles de unión al antígeno (Crameri y col. (1996) Nature Med., 2:100; Riechmann y col. (1995) Bio/Technology, 13:475; Morphosys, documento WO 97/08320, supra). En otras realizaciones, se pueden dirigir regiones particulares del ácido nucleico para la diversificación, por ejemplo, por una estrategia PCR de dos etapas empleando el producto de la primera PCR como un “mega-cebador”. (Véase, por ejemplo, Landt, O. y col., Gene 96:125-128 (1990)). La diversificación dirigida se puede conseguir también, por ejemplo, por SOE PCR. (Véase, por ejemplo, Horton, R.M. y col., Gene 77:61-68 (1989)).
La diversidad de secuencia en posiciones seleccionadas se puede conseguir alternado la secuencia codificante que especifica la secuencia del polipéptido tal que se puedan incorporar varios aminoácidos posibles (por ejemplo, los 20
o un subgrupo de los mismos) en esa posición. Utilizando la nomenclatura IUPAC, el codón más versátil es el NNK, que codifica todos los aminoácidos así como el codón de parada TAG. El codón NNK se puede utilizar con el fin de introducir la diversidad necesaria. También se utilizan otros codones con los que se consigue el mismo fin, incluyendo el codón NNN, que dirige la producción de codones de parada TGA y TAA adicionales. Tal estrategia dirigida puede permitir que se explore el espacio de secuencia completo en un área diana.
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SCRIPT, pFB, pSG5, pXT1 (Stratagene, La Jolla, CA), pCDEF3 (Goldman, L.A., y col., Biotechniques, 21:1013-1015 (1996)), pSVSPORT (GibcoBRL, Rockville, MD), pEFBos (Mizushima, S., y col., Nucleic Acids Res.,18:5322 (1990)) y similares. Hay disponibles vectores de expresión que son adecuados para su uso en la expresión en varios huéspedes, tal como células procariotas (E. coli), células de insecto (células S2 de Drosophila Schnieder, Sf9), levaduras (P. methanolica, P. pastoris, S. cerevisiae) y células de mamífero (por ejemplo, células COS).
Ejemplos de vectores son vectores de expresión que hacen posible la expresión de una secuencia de nucleótidos que corresponden con un miembro de la biblioteca de polipéptidos. Por lo tanto, la selección con ligandos genéricos y/o diana se puede llevar a cabo por propagación por separado y expresión de un clon único que expresa el miembro de la biblioteca de polipéptidos. Como se ha descrito anteriormente, el sistema de selección por presentación puede ser un bacteriófago de presentación. Por lo tanto, se pueden utilizar vectores fago y fagémido. Un ejemplo de vectores son los vectores fagémidos que tienen un origen de replicación de E. coli (para la replicación de doble cadena) y también un origen de replicación del fago (para la producción de un ADN de cadena sencilla). La modificación y expresión de tales vectores se conoce bien en la técnica (Hoogenboom y Winter (1992) supra; Nissim y col. (1994) supra). En resumen, el vector puede contener un gen -lactamasa para conferir la selectividad en el fagémido y un promotor Iac corriente arriba de un casete de expresión que puede contener una secuencia directora adecuada, un sitio de clonación múltiple, uno o más marcadores peptídicos, uno o más codones TAG de parada y la proteína pIII del fago. Por lo tanto, utilizando varias cepas supresoras o no supresoras de E. coli y con la adición de glucosa, isopropil-tio--D-galactosidasa (IPTG) o un fago auxiliar, tal como el VCS M13, el vector es capaz de replicarse como un plásmido sin expresión, se producen grandes cantidades del miembro de la biblioteca de polipéptidos solamente o producto de fago, algunos de los cuales contienen al menos una copia de la fusión polipéptido-pIII en su superficie.
Las bibliotecas y repertorios descritos en el presente documento pueden contener formatos de anticuerpo. Por ejemplo, el polipéptido que está contenido en las bibliotecas y repertorios puede ser un domino VH o VL completo separado, cualquiera de los cuales pueden estar modificados o no modificados. Se pueden producir fácilmente fragmentos scFv, así como otros polipéptidos anticuerpos, utilizando cualquier procedimiento adecuadlo. Se conocen en la técnica varios procedimientos adecuados de modificación de anticuerpos. Por ejemplo, se puede formar un scFv uniendo ácidos nucleicos que codifican dos dominios variables con un oligonucleótido adecuado que codifica un péptido engarce adecuado, tal como (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3 u otros péptidos engarces adecuados. El engarce se une al extremo C de la primera región V y el extremo N de la segunda región V. Se pueden utilizar técnicas similares para la construcción de otros formatos de anticuerpo, tales como fragmentos Fv, Fab y F(ab’)2. Para el formato de fragmentos Fab y F(ab’)2, se pueden combinar los polipéptidos VH y VL con segmentos de la región constante, que se puede aislar a partir de genes reordenados, genes C de la línea germinal o sintetizarse a partir de los datos de la secuencia del anticuerpo. Una biblioteca o repertorio que se describe en el presente documento puede ser una biblioteca o repertorio VH o VL.
Los polipéptidos que comprenden un dominio variable resistente a proteasa puede comprender un sitio de unión al ligando diana (TNFR1) y un sitio de unión a un ligando genérico. En ciertas realizaciones, el sitio de unión al ligando genérico es un sitio de unión a un superantígeno tal como la proteína A, la proteína L o la proteína G. Los dominios variables se pueden basar en cualquier dominio variable deseado, por ejemplo un VH humano (por ejemplo, VH 1a, VH 1b, VH 2, VH 3, VH 4, VH 5, VH 6), un V humano (por ejemplo, VI, VII, VIII, VIV, VV, VVI o V1) o un V humano (por ejemplo, V2, V3, V4, V5, V6, V7, V8, V9 o V10) o un VHH de camélido, que opcionalmente se ha humanizado.
ÁCIDOS NUCLEICOS, CÉLULAS HUÉSPED Y PROCEDIMIENTOS PARA PRODUCIR POLIPÉPTIDOS RESISTENTES A PROTEASAS
La invención se refiere a los ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes que codifican péptidos o polipéptidos resistentes a proteasa, por ejemplo, que se pueden seleccionar o se seleccionan por los procedimientos descritos en el presente documento.
Los ácidos nucleicos a los que se denomina en el presente documento “aislados” son ácidos nucleicos que se han separado de otro material (por ejemplo, otros ácidos nucleicos tal como ADN genómico, ADNc y/o ARN) en su ambiente original (por ejemplo, en las células o en una mezcla de ácidos nucleicos tal como una biblioteca). Un ácido nucleico aislado se puede aislar como parte de un vector (por ejemplo, un plásmido).
Los ácidos nucleicos a los que se denomina en el presente documento “recombinantes” son ácidos nucleicos que se han producido por metodología de ADN recombinante que dependen de la recombinación artificial, tal como clonación en un vector o cromosoma utilizando, por ejemplo, enzimas de restricción, recombinación homóloga, virus y similares, y ácidos nucleicos preparados utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
La invención también se refiere a una célula huésped recombinante que comprende un (uno o más) ácido nucleico recombinante o construcción de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un péptido o polipéptido resistente a proteasa, por ejemplo, un péptido o polipéptido que se puede seleccionar o se selecciona por los procedimientos descritos en el presente documento. También se proporciona un procedimiento para preparar un péptido o polipéptido resistente a proteasa, que comprende el mantenimiento de una célula huésped de la invención
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bajo condiciones adecuadas para la expresión de un péptido o polipéptido resistente a proteasa. El procedimiento puede comprender además la etapa de aislamiento o recuperación del péptido o polipéptido resistente a proteasa, si así se desea.
Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico (es decir una o más moléculas de ácido nucleico) que codifica un péptido o polipéptido resistente a proteasa, o una construcción de expresión (es decir, una o más construcciones) que comprenden tal(es) molécula(s) de ácido nucleico, se pueden introducir en una célula huésped adecuada para crear una célula huésped recombinante utilizando cualquier procedimiento adecuado para la célula huésped seleccionada (por ejemplo, transformación, transfección, electroporación, infección), tal que la(s) molécula(s) de ácido nucleico está unida operativamente a uno o más elementos de control de expresión (por ejemplo, en un vector, en una construcción creada por procesos en la célula, integrado en el genoma de la célula huésped). La célula huésped recombinante resultante se puede mantener bajo condiciones adecuadas para la expresión (por ejemplo, en presencia de un inductor, en un animal adecuado, en medios de cultivo adecuados suplementados con sales, factores de crecimiento, antibióticos, suplementos nutricionales, etc., adecuados), de manera que se produce el péptido o polipéptidos que se codifica. Si se desea, el péptido o polipéptido codificado se puede aislar o recuperar (por ejemplo, a partir del animal, la célula huésped, el medio, la leche). Este proceso engloba la expresión en una célula huésped de un animal transgénico (véase, por ejemplo, el documento WO 92/03918, GenPharm International).
El péptido o polipéptido resistente a proteasa que se selecciona por el procedimiento descrito en el presente documento se puede producir también en un sistema de expresión in vitro adecuado, por síntesis química o por cualquier otro procedimiento adecuado. Por lo tanto, la presente invención proporciona péptidos y polipéptidos resistentes a proteasa.
POLIPÉPTIDOS, dAb Y ANTAGONISTAS
Como se describe y ejemplifica en el presente documento, los dAb resistentes a proteasa de la invención se unen generalmente a su ligando diana con alta afinidad. Por lo tanto, en otro aspecto, se proporciona un procedimiento para seleccionar, aislar y/o recuperar un polipéptido o dAb de la invención que se une el TNFR1 con alta afinidad. En general, el procedimiento comprende proporcionar una biblioteca o repertorio de péptidos o polipéptidos (por ejemplo, dAb), combinar la biblioteca o repertorio con una proteasa (por ejemplo, tripsina, elastasa, leucozima, pancreatina, esputo) bajo condiciones adecuadas para la actividad de proteasa, y seleccionar, aislar y/o recuperar un péptido o polipéptido que se une a un ligando (por ejemplo, un ligando diana). Debido a que la librería o repertorio se ha expuesto a una proteasa bajo condiciones en las que los péptidos o polipéptidos sensibles a la proteasa se digerirán, la actividad de la proteasa puede eliminar los polipéptidos menos estables que tienen una afinidad de unión baja, y de esta manera se produce una colección de péptidos o polipéptidos con alta afinidad de unión. Por ejemplo, el polipéptido o dAb de la invención se puede unir al TNFR1 con una afinidad (KD; KD = Koff(kd)/Kon(ka) como se determina por resonancia de plasmones superficiales) de un M o más fuerte, aproximadamente 500 nM a aproximadamente 0,5 pM. Por ejemplo, el polipéptido o dAb de la invención se puede unir al TNFR1 con una afinidad de aproximadamente 500 nM, aproximadamente 100 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 500 pM, aproximadamente 100 pM, aproximadamente 10 pM o aproximadamente 0,5 pM. Aunque sin quedar ligados por teoría alguna, se cree que los péptidos y polipéptidos que son resistentes a las proteasas tienen una entropía más baja y/o una energía de estabilización más alta. Por lo tanto, la correlación entre la resistencia a la proteasa y la alta afinidad de unión se puede relacionar con la compactibilidad y estabilidad de las superficies de los péptidos y polipéptidos y dAb que se seleccionan con el procedimiento descrito en el presente documento.
En una realización, el polipéptido, dAb o antagonista de la invención inhibe la unión del TNF alfa al receptor de TNF alfa I (receptor p55) con una concentración inhibidora 50 (CI50) de o aproximadamente 500 nM a 50 pM, o 100 nM a 50 pM, o 10 nM a 100 pM, o 1 nM a 100 pM; por ejemplo 50 nM o menos, o 5 nM o menos, o 500 pM o menos, o 200 pM o menos, o 100 pM o menos.
En ciertas realizaciones, el polipéptido, dAb o antagonista se une específicamente al TNFR1, por ejemplo, el TNFR1 humano, y se disocia del TNFR1 humano con una constante de disociación (KD) de 300 nM a 1pM o 300 nM a 5 pM o 50 nM a 1 pM o 50 nM a 5 pM o 50 nM a 20 pM o aproximadamente 10 pM o aproximadamente 15 pM o aproximadamente 20 pM como se determina por resonancia de plasmones superficiales. En ciertas realizaciones, el polipéptido, dAb o antagonista se une específicamente al TNFR1, por ejemplo, el TNFR1 humano, y se disocia del
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TNFR1 humano con una tasa constante Koff de 5 x10-1 s-1 a 1 x10-7 s-1 o 1x10-3 s-1 a 1x10-7 s-1 o 1x10-4 s-1 a 1x10-7 s
1 o 1x10-5 s-1 a 1x10-7 s-1 o 1x10-4 s-1 o 1x10-5 s-1 como se determina por resonancia de plasmones superficiales. En ciertas realizaciones, el polipéptido, dAb o antagonista se une específicamente al TNFR1, por ejemplo, al TNFR1 humano, con una Kon de 1x10-3 M-1s-1 a 1 x10-7 M-1s-1 o 1x10-3 M-1s-1 a 1x10-6 M-1s-1 o aproximadamente 1x10-4 M-1s-1
o aproximadamente 1x10-5 M-1s-1. En una realización, el polipéptido, dAb o antagonista se une específicamente al TNFR1, por ejemplo al TNFR1 humano, y se disocia del TNFR1 humano con una constante de disociación (KD) y una Koff como se define en el presente párrafo. En una realización, el polipéptido, dAb o antagonista se une específicamente al TNFR1, por ejemplo, TNFR1 humano, y se disocia del TNFR1 humano con una constante de disociación (KD) y una Kon como se define en el presente párrafo. En algunas realizaciones, el polipéptido o dAb se une específicamente al TNFR1 (por ejemplo, al TNFR1 humano) con una KD y/o una Koff y/o una Kon como se dicta
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en, por ejemplo, aproximadamente 1 día, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días, aproximadamente 10 días, aproximadamente 14 días, aproximadamente 21 días o aproximadamente 28 días, en comparación con un control adecuado. En otro ejemplo, la administración de una cantidad eficaz del polipéptido, dAb o antagonista puede dar como resultado una puntuación media de gravedad en el modelo DSS de IBD en ratón de 0 a aproximadamente 0,5, aproximadamente 0,5 a aproximadamente 1, aproximadamente 1 a aproximadamente 1,5, aproximadamente 1,5 a aproximadamente 2, o aproximadamente 2 a aproximadamente 2,5.
En realizaciones particulares, el polipéptido, dAb o antagonista es eficaz en el modelo de humo de tabaco en ratón de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) (véase el documento WO2006038027 y el documento WO2007049017 para detalles del modelo). Por ejemplo, la administración de una cantidad eficaz del ligando puede reducir o retrasar la aparición de los síntomas de COPD, en comparación con un control adecuado.
Están disponibles sistemas de modelos animales que se pueden utilizar para explorar la eficacia de los antagonistas del TNFR1 (por ejemplo, ligandos, anticuerpos o proteínas de unión de los mismos) para proteger contra o para tratar la enfermedad. Los procedimientos para ensayar el lupus eritematoso sistémico (LES) en ratones susceptibles se conocen en la técnica (Knight y col. (1978) J. Exp. Med., 147: 1653; Reinersten y col. (1978) New Eng. J. Med.,
299: 515). La miastenia gravis (MG) se ensaya en ratones SJL/J hembra induciendo la enfermedad con proteína AchR soluble de otras especies (Lindstrom y col. (1988) Adv. Immunol., 42: 233). La artritis se induce en una estirpe susceptible de ratón por inyección de colágeno tipo II (Stuart y col. (1984) Ann. Rev. Immunol., 42: 233). Se ha descrito un modelo por el que se induce un adyuvante de artritis en ratas susceptibles por inyección de proteína de choque térmico micobacteriana (Van Eden y col. (1988) Nature, 331: 171). La tiroiditis se induce en ratones por la administración de tiroglobulina como se ha descrito (Maron y col. (1980) J. Exp. Med., 152: 1115). La diabetes mellitus insulino dependiente (IDDM) se produce naturalmente o puede inducirse en ciertas estirpes de ratón tal como las que describen Kanasawa y col. (1984) Diabetologia, 27: 113. El EAE en ratón y rata sirve como modelo para la MS humana. En este modelo, la enfermedad desmielinizante se induce por la administración de proteína básica de mielina (véase Paterson (1986) Textbook of Immunopathology, Mischer y col., eds., Grune y Stratton, New York, pp. 179-213; McFarlin y col. (1973) Science, 179: 478: y Satoh y col. (1987) J. Immunol., 138: 179).
En general, los presentes ligandos (por ejemplo, antagonistas) se utilizarán en su forma purificada junto con vehículos farmacológicamente apropiados. Típicamente, estos vehículos incluyen soluciones acuosas o alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, cualquiera que incluya medios salinos y/o tamponados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico y lactato de Ringer. Se pueden escoger adyuvantes aceptables fisiológicamente adecuados, si fuera necesario para mantener un complejo de polipéptidos en suspensión, de entre espesantes tal como la carboximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, gelatina y alginatos.
Los vehículos intravenosos incluyen fluidos y reconstituyentes de nutrientes y reconstituyentes de electrolitos, tal como los que se basan en dextrosa de Ringer. También puede haber presentes conservantes y otros aditivos, tales como antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes (Mack (1982) Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16ª Edición). Se pueden utilizar una variedad de formulaciones adecuadas, incluyendo formulaciones de liberación extendida.
Los ligandos (por ejemplo, los antagonistas) de la presente invención se pueden utilizar como composiciones que se administran por separado, o en conjunción con otros agentes. Estos pueden incluir varios fármacos inmunoterápicos, tales como ciclosporina, metotrexato, adriamicina o cisplatino, e inmunotoxina. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir “cócteles” de varios agentes citotóxicos u otros agentes en conjunción con los ligandos de la presente invención, o incluso combinaciones de ligandos de acuerdo con la presente invención que tienen diferentes especificidades, tales como ligandos que se seleccionan diferentes antígenos diana o epítopos, estén o no agrupados antes de la administración.
La vía de administración de las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención puede ser cualquiera de las que conocen comúnmente los expertos habituados en la técnica. Como terapia, incluyendo sin limitación la inmunoterapia, los ligandos seleccionados de la invención se pueden administrar a cualquier paciente de acuerdo con las técnicas de referencia.
La administración puede ser por cualquier modo apropiado, que incluye la vía parenteral, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica, vía pulmonar, o también, adecuadamente, por infusión directa con un catéter. La dosificación y frecuencia de administración dependerá de la edad, sexo y estado del paciente, administración concurrente de otros fármacos, contraindicaciones y otros parámetros a tener en cuenta por el médico. La administración puede ser local (por ejemplo, suministro local del pulmón por administración pulmonar, por ejemplo, administración intranasal) o sistémica como esté indicado.
Los ligandos de la presente invención se pueden liofilizar para almacenarlos y reconstituirlos en un vehículo adecuado antes de su uso. Esta técnica ha demostrado que es eficaz con inmunoglobulinas convencionales y se pueden emplear técnicas de liofilización y reconstitución que se conocen en la técnica. Los expertos en la técnica apreciarán que la liofilización y reconstitución puede dar lugar a varios grados de pérdida de actividad (por ejemplo,
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las inmunoglobulinas convencionales, los anticuerpos IgM tienden a tener una mayor pérdida de actividad que los anticuerpos IgG) y que los niveles de utilización se tienen que ajustar al alza para compensar.
Las composiciones que contienen los presentes ligandos (por ejemplo, antagonistas) o un cóctel de los mismos se pueden administrar para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. En ciertas aplicaciones terapéuticas, una cantidad adecuada para conseguir al menos una inhibición parcial, supresión, modulación, destrucción, o algún otro parámetro medible, de una población de células seleccionadas se define como una “dosis terapéuticamente eficaz”. Las cantidades que se necesitan para conseguir esta dosificación dependerá de la gravedad de la enfermedad y el estado general del propio sistema inmunitario del paciente, pero en general varía desde 0,005 a 5,0 mg de ligando, por ejemplo un dAb o antagonista por kilogramo de peso corporal, siendo las dosis de 0,05 a 2,0 mg/kg/dosis las más utilizadas. Para las aplicaciones profilácticas, se pueden administrar las composiciones que contienen los presentes ligandos o cócteles de los mismos en dosificaciones similares o ligeramente más bajas, para evitar, inhibir
o retrasar la aparición de la enfermedad (por ejemplo, para una sostener una remisión o inactividad, o para prevenir una fase aguda). El clínico experto será capaz de determinar el intervalo de dosificación apropiado para tratar, suprimir o prevenir la enfermedad. Cuando un ligando de TNFR1 (por ejemplo, un antagonista) se administra para tratar, suprimir o prevenir una enfermedad inflamatoria crónica, se puede administrar hasta cuatro veces al día, dos veces por semana, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez al mes, o una vez cada dos meses, a una dosis de, por ejemplo, aproximadamente 10 g/kg a aproximadamente 80 mg/kg, aproximadamente 100 g/kg a aproximadamente 80 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 80 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 70 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 60 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg , aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 10 g/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 10 g/kg a aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 10 g/kg a aproximadamente 2,5 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 6 mg/kg, aproximadamente 7 mg/kg, aproximadamente 8 mg/kg, aproximadamente 9 mg/kg o aproximadamente 10 mg/kg. En realizaciones particulares, el ligando de TNFR1 (por ejemplo, el antagonista) se administra para tratar, suprimir o prevenir una enfermedad inflamatoria crónica una vez cada dos semanas o una vez al mes a una dosis de aproximadamente 10 g/kg a aproximadamente 10 mg/kg (por ejemplo, aproximadamente 10 g/kg, aproximadamente 100 g/kg, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 6 mg/kg, aproximadamente 7 mg/kg, aproximadamente 8 mg/kg, aproximadamente 9 mg/kg o aproximadamente 10 mg/kg).
El tratamiento o terapia que se lleva a cabo utilizando las composiciones descritas en el presente documento se considera “eficaz” si se reducen uno o más síntomas (por ejemplo, en al menos un 10% o al menos un punto en una escala de evaluación clínica), con respecto a tales síntomas presentes antes del tratamiento, respecto a tales síntomas en un individuo (ser humano o modelo animal) que no se trate con tal composición u otro control adecuado. Los síntomas variarán obviamente dependiendo de la enfermedad o trastorno al que se dirige, pero puede medirlo un médico o técnico experto habituado. Tales síntomas se pueden medir, por ejemplo, controlando el nivel de uno o más indicadores bioquímicos de la enfermedad o trastorno (por ejemplo, niveles de una enzima o metabolito correlacionado con la enfermedad, número de células afectadas, etc.), controlando las manifestaciones físicas (por ejemplo, inflamación, tamaño tumoral, etc.), o por una escala de evaluación clínica aceptada, por ejemplo, la escala de estado de discapacidad expandida (para la esclerosis múltiple), el cuestionario de enfermedad inflamatoria del intestino grueso de Irvine (evaluación de 32 puntos que evalúa la calidad de vida con respecto a la función del intestino grueso, síntomas sistémicos, función social y estado emocional -la puntuación varía de 32 a 224, indicando las puntuaciones más altas una mejor calidad de vida), la escala de calidad de vida en artritis reumatoide, u otra escala de evaluación clínica aceptada como se conoce en el campo. Una reducción sostenida (por ejemplo, un día o más, o más larga) de los síntomas de la enfermedad o trastorno en al menos un 10% o en uno o más puntos de una escala clínica determinada es indicativa de un tratamiento “eficaz”. De manera similar, la profilaxis que se lleva a cabo utilizando una composición como se describe en el presente documento es “eficaz” si se retrasa, reduce o abole la aparición o gravedad de uno o más síntomas con respecto a tales síntomas en un individuo similar (ser humano o modelo animal) que no se trata con la composición.
Una composición que contiene un ligando (por ejemplo, un antagonista) o cóctel de los mismos de acuerdo con la presente invención se puede utilizar en grupos profilácticos y terapéuticos para ayudar en la alteración, inactivación, destrucción o eliminación de una población diana seleccionada en un mamífero. Además, los repertorios seleccionados de polipéptidos que se describen en el presente documento se pueden utilizar extracorpóreamente, o in vitro selectivamente para destruir, vaciar o eliminar eficaz mente de otra manera una población celular diana de una colección heterogénea de células. Se puede combinar la sangre de un mamífero de manera extracorpórea con los ligandos de manera que se destruyan o se eliminen de otra manera las células no deseadas de la sangre para devolverla al mamífero de acuerdo con técnicas de referencia.
Una composición que contiene un ligando (por ejemplo, un antagonista) de acuerdo con la presente invención se puede utilizar en grupos profilácticos y terapéuticos para ayudar en la alteración, inactivación, destrucción o eliminación de una población celular diana seleccionada en un mamífero.
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Los ligandos (por ejemplo, los antagonistas anti-TNFR1, monómeros de dAb) se pueden administrar y/o formular junto con uno o más agentes terapéuticos adicionales o agentes activos. Cuando un ligando (por ejemplo, un dAb) se administra con un agente terapéutico adicional, el ligando se puede administrar antes, simultáneamente con o posteriormente a la administración del agente adicional. En general, el ligando y el agente adicional se administran en una manera que proporciona un solapamiento del efecto terapéutico.
En una realización, la invención es un polipéptido, dAb o antagonista de TNFR1 de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento, supresión o prevención de una enfermedad inflamatoria crónica.
En una realización, la invención es un polipéptido, dAb o antagonista de TNFR1 de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento, supresión o prevención de la artritis (por ejemplo, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, espondilitis anquilosante, artritis psoriásica).
En otra realización, la invención es un polipéptido, dAb o antagonista de TNFR1 de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento, supresión o prevención de la psoriasis.
En otra realización, la invención es un polipéptido, dAb o antagonista de TNFR1 de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento, supresión o prevención de una enfermedad inflamatoria del intestino grueso (por ejemplo, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa).
En otra realización, la invención es un polipéptido, dAb o antagonista de TNFR1 de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento, supresión o prevención de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (por ejemplo, bronquitis crónica, bronquitis obstructiva crónica, enfisema).
En otra realización, la invención es un polipéptido, dAb o antagonista de TNFR1 de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento, supresión o prevención de la neumonía (por ejemplo, neumonía bacteriana, tal como la neumonía estafilocócica).
La invención proporciona usos para tratar, suprimir o prevenir otras enfermedades pulmonares además de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica y la neumonía. Las otras enfermedades pulmonares que se pueden tratar, suprimir o prevenir de acuerdo con la invención incluyen, por ejemplo, fibrosis quísticas y asma (por ejemplo asma resistente a esteroides). Por lo tanto, en otra realización, la invención en un polipéptido, dAb o antagonista de TNFR1 de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento, supresión o prevención de una enfermedad pulmonar (por ejemplo, fibrosis quísticas, asma).
En realizaciones particulares, un antagonista del TNFR1 se administra por medio de suministro pulmonar, tal como por inhalación (por ejemplo, intrabronquial, inhalación intranasal u oral, gotas intranasales) o por suministro sistémico (por ejemplo, parenteral, intravenoso, intramuscular, intraperitoneal, subcutáneo).
En otra realización, la divulgación es un polipéptido, dAb o antagonista de TNFR1 de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento, supresión o prevención del choque séptico.
En un aspecto más de la invención, se proporciona una composición que comprende un polipéptido, dAb o antagonista de TNFR1 de acuerdo con la invención y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Además, la presente divulgación proporciona un polipéptido, dAb o antagonista del TNFR1 o una composición de acuerdo con la presente invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad. En una realización la enfermedad es el cáncer o una enfermedad inflamatoria, por ejemplo, artritis reumatoide, asma o enfermedad de Crohn.
FORMATOS
El aumento de la semivida es útil en aplicaciones de inmunoglobulinas in vivo, especialmente para los anticuerpos y más especialmente para los fragmentos de anticuerpo de pequeño tamaño. Tales fragmentos Fv, Fv unidos por enlaces disulfuro, Fab, scFv, dAb) sufren un aclaramiento rápido en el cuerpo; por lo tanto, aunque son capaces de alcanzar la mayoría de las partes del cuerpo rápidamente, y se producen rápidamente y son fáciles de manipular, sus aplicaciones in vivo están limitadas solamente por su breve persistencia in vivo. Una realización de la invención resuelve este problema proporcionando un aumento de la semivida de los ligandos in vivo y en consecuencia tiempos más largos de persistencia en el cuerpo de la actividad funcional del ligando.
Los procedimientos para los análisis farmacocinéticos y la determinación de la semivida son familiares para los expertos en la técnica. Se pueden encontrar los detalles en Kenneth, A y col: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists y en Peters y col, Pharmacokinete analysis: A Practical Approach (1996). También se hace referencia a "Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. ex edición (1982), que describe los parámetros farmacocinéticos tales como las semividas t alfa y t beta y el área bajo la curva (AUC).
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Las semividas (t1/2 alfa y t1/2 beta) y el AUC se pueden determinar a partir de una curva de la concentración del ligando en el suero contra el tiempo. Se puede utilizar el paquete de análisis WinNonlin (disponible en Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, USA), por ejemplo, para modelar la curva. En una primer fase (la fase alfa) el ligando se somete principalmente a la distribución en el paciente, con alguna eliminación. Una segunda fase (la fase beta) es la fase terminal cuando el ligando se ha distribuido y la concentración en el suero disminuye según se va aclarando el ligando del paciente. La semivida t alfa es la semivida de la primera fase y la semivida t beta es la semivida de la segunda fase. Por lo tanto, en una realización, la presente invención proporciona un ligando o una composición que comprende un ligando de acuerdo con la invención que tiene una semivida t en el intervalo de 15 minutos o más. En una realización el límite inferior del intervalo es de 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 10 horas, 11 horas o 12 horas. Además, o de manera alternativa, un ligando o composición de acuerdo con la invención tendrá una semivida t en el intervalo de hasta 12 horas incluidas. En una realización, el límite superior del intervalo es 11, 10, 9 ,8 , 7, 6 o 5 horas. Un ejemplo de un intervalo adecuado es de 1 a 6 horas, 2 a 5 horas o 3 a 4 horas.
En una realización, la presente invención proporciona un ligando (polipéptido, dAb o antagonista) o una composición que comprende un ligando de acuerdo con la invención que tiene una semivida t en el intervalo de 2,5 horas o más. En una realización, el límite inferior del intervalo es de 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 10 horas, 11 horas, o 12 horas. Además o de manera alternativa, un ligando o composición de acuerdo con la invención tiene una semivida t en el intervalo de hasta 21 días incluidos. En una realización, el límite superior del intervalo es de 12 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 5 días, 10 días, 15 días o 20 días. En una realización, un ligando o composición de acuerdo con la invención tendrá una semivida t en el intervalo de 12 a 60 horas. En una realización más, estará en un intervalo de 12 a 48 horas. En una realización más, estará en el intervalo de 12 a 26 horas.
Además, o alternativamente a los criterios anteriores, la presente invención proporciona un ligando o una composición que comprende un ligando de acuerdo con la invención que tiene un valor AUC (área bajo la curva) en el intervalo de 1 mg.min/ml o más. En una realización, el límite inferior del intervalo es 5, 10, 15, 20, 30, 100, 200 o 300 mg.min/ml. Además, en una realización, el límite superior del intervalo es 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 o 50 mg.min/ml. En una realización un ligando de acuerdo con la invención tendrá un AUC en el intervalo que se selecciona de entre el grupo que consiste en el siguiente: 15 a 150 mg.min/ml, 15 a 100 mg.min/ml; y 15 a 50 mg.min/ml.
Los polipéptidos y dAb de la invención y los antagonistas comprenden los que se pueden formatear para que tengan un mayor tamaño hidrodinámico, por ejemplo, uniéndose a un grupo PEG, albúmina sérica, transferrina, receptor de transferrina o al menos la parte de unión a la transferrina del mismo, una región Fc de anticuerpo, o por conjugación con un dominio de anticuerpo. Por ejemplo, los polipéptidos, dAb y antagonistas se formatean más grandes como un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo o como un anticuerpo (por ejemplo, se formatean como un Fab, Fab’, F(ab)2, F(ab’)2, IgG, scFv).
El tamaño hidrodinámico de los ligandos (por ejemplo, monómeros y multímeros de dAb) de la invención se puede determinar utilizando procedimientos que se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar la cromatografía por filtración en gel para determinar el tamaño hidrodinámico de un ligando. Las matrices de filtración en gel adecuadas para determinar los tamaños hidrodinámicos de los ligandos tal como las matrices de agarosa reticuladas, se conocen bien y están disponibles fácilmente.
El tamaño de un formato de ligando (por ejemplo, el tamaño de un resto PEG unido a un monómero de dAb), se puede variar dependiendo de la aplicación que se desee. Por ejemplo, cuando se pretende que el ligando deje la circulación y entre el los tejidos periféricos, es deseable mantener un tamaño hidrodinámico bajo del ligando para facilitar la extravasación desde la corriente sanguínea. De manera alternativa, cuando se desea que el ligando permanezca en la circulación sistémica durante un periodo de tiempo más largo el tamaño del ligando se tiene que aumentar, por ejemplo formateándolo como una proteína tipo Ig.
Extensión de la semivida dirigiendo a un antígeno o epítopo que aumenta la semivida in vivo
El tamaño hidrodinámico de un ligando y su semivida en el suero también se puede aumentar conjugando o asociando un polipéptido, dAb o antagonista de unión al TNFR1 de la invención a un dominio de unión (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo) que une un antígeno o epítopo que aumenta la semivida in vivo, como se describe en el presente documento. Por ejemplo, el agente de unión al TNFR1 (por ejemplo, un polipéptido) se puede conjugar o unir a un anticuerpo anti-seroalbúmina o un anticuerpo anti-receptor Fc neonatal o a un fragmento de anticuerpo, por ejemplo un dAb, Fab, Fab’, o scFv anti-SA o anti-receptor Fc neonatal, o a un aficuerpo anti-SA o un aficuerpo del receptor Fc neonatal o a un avímero anti-SA, o a un dominio de unión anti-SA que comprende un armazón que se selecciona de entre, pero preferentemente no limitado al grupo que consisten en CTLA-4, lipocalina, SpA, un aficuerpo, un avímero, GroEI y fibronectina (véase el documento PCT/GB2008/000453 presentado el 8 de febrero de 2008 que desvela estos dominios de unión). La conjugación se refiere a una composición que comprende un polipéptido, dAb o antagonista de la invención que está enlazado (covalente o no covalentemente) a un dominio de unión que se une a la albúmina sérica.
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Los polipéptidos adecuados que aumentan la semivida en el suero in vivo incluyen, por ejemplo, las proteínas de fusión agentes neurofarmacéuticos del ligando específico del receptor de transferrina (véase la Patente de EE. UU. Nº 5.977.307), el receptor celular endotelial capilar, transferrina, receptor de transferrina (por ejemplo, el receptor de transferrina soluble), insulina, receptor del factor de crecimiento tipo insulina 1 (IGF 1), receptor del factor de crecimiento tipo insulina 2 (IGF 2) , receptor de insulina, factor X de coagulación sanguínea, 1-antitripsina y HNF 1. Los polipéptidos adecuados que aumentan la semivida en el suero incluyen también la glucoproteína alfa-1 (orosomucoide; AAQ), antiquimiotripsina alfa-1 (ACT), microglobulina alfa-1 (proteína HC; AIM), antitrombina III (AT III), apolipoproteína A-1 (Apo A-1), apolipoproteína B (Apo B), ceruloplasmina (Cp), componente complemento C3 (C3), componente complemento C4 (C4), inhibidor de esterasa C1 (C1 INH), proteína C-reactiva (CRP), ferritina (FER), hemopexina (HPX), lipoproteína (a) (Lp(a)), proteína de unión a manosa (MBP), mioglobina (Myo), prealbúmina (transtiretina; PAL), proteína de unión al retinol (RBP), y factor reumatoide (RF).
Las proteínas adecuadas de la matriz extracelular incluyen, por ejemplo, colágenos, lamininas, integrinas y fibronectina. Los colágenos son las proteínas más importantes de la matriz extracelular. Se conocen actualmente aproximadamente 15 tipos de moléculas de colágeno, que se encuentran en diferentes partes del cuerpo, por ejemplo, el colágeno tipo I (que supone el 90% del colágeno del cuerpo) se encuentra en hueso, piel, tendones, ligamentos, córnea, órganos internos o el colágeno tipo II que se encuentra en el cartílago, discos vertebrales, notocorda, y humor vítreo del ojo.
Las proteínas adecuadas de la sangre incluyen, por ejemplo, las proteínas del plasma (por ejemplo, fibrina, -2 macroglobulina, albúmina sérica, fibrinógeno (por ejemplo, fibrinógeno A, fibrinógeno B), proteína amiloide A sérica, haptoglobulina, profilina, ubiquitina, uteroglobulina, y -2-microglobulina), enzimas e inhibidores de enzimas (por ejemplo, plasminógeno, lisozima, cistatina C, alfa-1-antitripsina e inhibidor de la tripsina pancreática), proteínas del sistema inmunitario, tal como proteínas inmunoglobulinas (por ejemplo, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, cadenas ligeras de inmunoglobulina (kappa/lambda)), proteínas de transporte (por ejemplo, proteína de unión al retinol, -1 microglobulina), defensinas (por ejemplo, beta-defensina 1, defensina de neutrófilos 1, defensina de neutrófilos 2 y defensina de neutrófilos 3) y similares.
Las proteínas adecuadas que se encuentran en la barrera hematoencefálica o en el tejido neuronal incluyen, por ejemplo, el receptor de melanocortina, mielina, transportador de ascorbato y similares.
Los polipéptidos adecuados que aumentan la semivida en el suero in vivo también incluyen proteínas que se localizan en el riñón (por ejemplo, policistina, colágeno tipo IV, transportador K1 de anión orgánico, antígeno de Heymann), proteínas localizadas en el hígado (por ejemplo, alcohol deshidrogenasa, G250), proteínas localizadas en el pulmón (por ejemplo, componente secretor, que se une a la IgA), proteínas localizadas en el corazón (por ejemplo, HSP 27, que se asocia con cardiomiopatía dilatada), proteínas localizadas en la piel (por ejemplo, queratina), proteínas específicas del hueso tales como proteínas morfogénicas (BMP), que son un subgrupo de la superfamilia de proteínas del factor  transformante del crecimiento que han demostrado una actividad osteogénica (por ejemplo, BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8), proteínas específicas de tumores (por ejemplo, antígeno trofoblástico, receptor herceptina, receptor estrogénico, catepsinas (por ejemplo, catepsina B, que se puede encontrar en el hígado y bazo)).
Las proteínas específicas de enfermedad adecuadas incluyen, por ejemplo, antígenos que se expresan solo en linfocitos T activados, que incluyen LAG-3 (gen de activación de linfocitos), ligando de osteoprotegerina (OPGL; véase Nature 402, 304-309 (1999)), OX40 (un miembro de la familia del receptor de TNF, que se expresa en linfocitos T activados y específicamente regulado positivamente en las células que producen virus de leucemia tipo I (HTLV-1) de linfocitos T humanos; véase Immunol. 165 (1):263-70 (2000)). Las proteínas específicas de enfermedad adecuadas incluyen, por ejemplo, metaloproteasas (asociadas con artritis/cánceres) que incluyen CG6512 de Drosophila, paraplegina humana, FtsH humana, AFG3L2 humana, ftsH murina; y factores de crecimiento angiogénico, que incluyen factor de crecimiento de fibroblastos ácido (FGF-1) factor de crecimiento de fibroblastos básico (FGF-2), factor de crecimiento endotelial vascular/factor de permeabilidad vascular (VEGF/VPF), factor transformante del crecimiento- (TGF ), factor de necrosis tumoral (TNF-), angiogenina, interleucina-3 (IL-3), interleucina-8 (IL-8), factor de crecimiento endotelial derivado de plaquetas (PD-ECGF), factor de crecimiento placentario (P1GF), midkina del factor de crecimiento derivado de plaquetas -BB (PDGF), y fractalquina.
Los polipéptidos adecuados que aumentan la semivida in vivo también incluyen las proteínas de presión tales como las proteínas de choque térmico (HSP). Las HSP se encuentran normalmente intracelularmente. Cuando se encuentran extracelularmente, es un indicador de que la célula ha muerto y ha vertido sus contenidos. Cuando se produce esta muerte celular no programada (necrosis) como resultado de un traumatismo, enfermedad o lesión, las HSP extracelulares desencadenan una respuesta del sistema inmunitario. La unión a HSP extracelulares puede dar como resultado la localización de las composiciones de la invención en el sitio de la enfermedad.
Las proteínas adecuadas que están implicadas en el transporte de Fc incluyen, por ejemplo, el receptor de Brambell (también conocido como FcRB). Este receptor Fc tiene dos funciones, ambas de las cuales son potencialmente útiles para el suministro. Las funciones son (1) transporte de IgG de la madre al hijo a través de la placenta (2) protección de la degradación de IgG prolongando de esta manera su semivida en el suero. Se cree que el receptor recicla las IgG de los endosomas. (Véase, Holliger y col, Nat Biotechnol 15(7):632-6 (1997)).
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dAb que se unen a la albúmina sérica
La invención en una realización proporciona un polipéptido o antagonista (por ejemplo, ligandos específicos duales que comprenden un dAb anti-TNFR1 (un primer dAb)) que se une al TNFR1 y un segundo dAb que se une a la albúmina sérica (SA), el segundo dAb se une a la SA con una KD como se determina por resonancia de plasmones superficiales de 1 nM a 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30,,40, 50, 60, 70, 100, 200, 300, 400 o 500 M (es decir, x10-9 a 5 x 104), o de 100 nM a 10 M, o 1 a 5 M o de 3 a 70 nM o de 10 nM a 1, 2, 3, 4 o 5 M. Por ejemplo 30 a 70 nM como se determina por resonancia de plasmones superficiales. En una realización, el primer dAb (o un monómero de dAb) se une a la SA (por ejemplo, HSA) con una KD como se determina por resonancia de plasmones superficiales de aproximadamente 1, 50, 70, 100, 150, 200, 300 nM o 1, 2 o 3 M. En una realización, para un ligando específico dual que comprende un primer dAb anti-SA y un segundo dAb para TNFR1, la afinidad (por ejemplo, la KD y/o Koff como se mide por resonancia de plasmones superficiales, por ejemplo utilizando BiaCore) del segundo dAb para esta diana es desde 1 a 100000 veces (por ejemplo, de 100 a 100000, o 1000 a 100000, o 10000 a 100000 veces) la afinidad del primer dAb por la SA. En una realización, la albúmina sérica es albúmina sérica humana (HSA). Por ejemplo, el primer dAb se une a la SA con una afinidad de aproximadamente 10 M, mientras que el segundo dAb se une a su diana con una afinidad de 100 pM. En una realización, la albúmina sérica es albúmina sérica humana (HSA). En una realización, el primer dAb se une a la SA (por ejemplo, HSA) con una KD de aproximadamente 50, por ejemplo 70, 100, 150 o 200 nM. Los detales de los ligandos específicos duales se encuentran en los documentos WO03002609, WO04003019 y WO04058821.
Los ligandos de la invención pueden comprender en una realización un dAb que se une a la albúmina sérica (SA) con una KD como se determina por resonancia de plasmones superficiales de 1 nM a 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 100, 200, 300, 400 o 500 M (es decir, x 10-9 a 5 x 10-4), o 100 nM a 10 M, o 1 a 5 M o 3 a 70 nM o 10 nM a 1, 2, 3, 4 o 5 M. Por ejemplo 30 a 70 nM como se determina por resonancia de plasmones superficiales. En una realización, el primer dAb ( o un monómero de dAb) se une a la SA (por ejemplo, la HSA) con una KD como se determina por resonancia de plasmones superficiales de aproximadamente 1, 50, 70, 100, 150, 200, 300 nM o 1, 2 o 3 M. En una realización, el primer y segundo dAb están unidos por un engarce, por ejemplo un engarce de 1 a 4 aminoácidos o de 1 a 3 aminoácidos, o mayor de 3 aminoácidos o mayor de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o 20 aminoácidos. En una realización, se utiliza un engarce más largo (más de 3 aminoácidos) para aumentar la potencia (KD de uno o ambos dAb en el antagonista).
En realizaciones particulares de los ligandos y antagonistas, el dAb se une a la albúmina sérica y compite por la unión a la albúmina con un dAb que se selecciona de entre el grupo que consiste en MSA-16, MSA-26 (Véase el documento WO04003019 para desvelar estas secuencias), DOM7m-16 (SEC ID Nº 473), DOM7m-12 (SEC ID Nº 474), DOM7m-26 (SEC ID Nº 475), DOM7r-1 (SEC ID Nº 476), DOM7r-3 (SEC ID Nº 477), DOM7r-4 (SEC ID Nº 478), DOM7r-5 (SEC ID Nº 479), DOM7r-7 (SEC ID Nº 480), DOM7r-8 (SEC ID Nº 481), DOM7h-2 (SEC ID Nº 482), DOM7h-3 (SEC ID Nº 483), DOM7h-4 (SEC ID Nº 484), DOM7h-6 (SEC ID Nº 485), DOM7h-1 (SEC ID Nº 486), DOM7h-7 (SEC ID Nº 487), DOM7h-22 (SEC ID Nº 489), DOM7h-23 (SEC ID Nº 490), DOM7h-24 (SEC ID Nº 491), DOM7h-25 (SEC ID Nº 492), DOM7h-26 (SEC ID Nº 493), DOM7h-21 (SEC ID Nº 494), DOM7h-27 (SEC ID Nº 495), DOM7h-8 (SEC ID Nº 496), DOM7r-13 (SEC ID Nº 497), DOM7r-14 (SEC ID Nº 498), DOM7r-15 (SEC ID Nº 499), DOM7t-16 (SEC ID Nº 500), DOM7r-17 (SEC ID Nº 501), DOM7r-18 (SEC ID Nº 502), DOM7r-19 (SEC ID Nº 503), DOM7r-20 (SEC ID Nº 504), DOM7r-21 (SEC ID Nº 505), DOM7r-22 (SEC ID Nº 506), DOM7r-23 (SEC ID Nº 507), DOM7r-24 (SEC ID Nº 508), DOM7r-25 (SEC ID Nº 509), DOM7r-26 (SEC ID Nº 510), DOM7r-27 (SEC ID Nº 511), DOM7r-28 (SEC ID Nº 512), DOM7r-29 (SEC ID Nº 513), DOM7r-30 (SEC ID Nº 514), DOM7r-31 (SEC ID Nº 515), DOM7r-32 (SEC ID Nº 516), DOM7r-33 (SEC ID Nº 517) (Véase el documento WO2007080392 para desvelar estas secuencias; los números de SEC ID de este párrafo son los que aparecen en el documento WO2007080392), dAb8, dAb 10, dAb36, dAb7r20, dAb7r21, dAb7r22, dAb7r23, dAb7r24, dAb7r25, dAb7r26, dAb7r27, dAb7r28, dAb7r29, dAb7r30, dAb7r31, dAb7r32, dAb7r33, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb11, dAb12, dAb13, dAb15, dAb16, dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7m12, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1, dAb7r3, dAb7r4, dAb7r5, dAb7r7, dAb7r8, dAb7r13, dAb7r14, dAb7r15, dAb7r16, dAb7r17, dAb7r18, dAb7r19, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h10, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13, dAb7h14, dAb7p1, y dAb7p2 (véase el documento PCT/GB2008/000453 presentado el 8 de febrero de 2008 para desvelar estas secuencias). Estas secuencias también se presentan en la figura 51.
En ciertas realizaciones, el dAb se une a la albúmina sérica humana y comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente un 80%, o al menos aproximadamente un 85%, o al menos aproximadamente un 90%, o al menos aproximadamente un 95%, o al menos aproximadamente un 96%, o al menos aproximadamente un 97%, o al menos aproximadamente un 98%, o al menos aproximadamente un 99% con la secuencia de aminoácidos de un dAb que se selecciona de entre el grupo que consiste en MSA-16, MSA-26, DOM7m-16 (SEC ID Nº 473), DOM7m-12 (SEC ID Nº 474), DOM7m-26 (SEC ID Nº 475), DOM7r-1 (SEC ID Nº 476), DOM7r-3 (SEC ID Nº 477), DOM7r-4 (SEC ID Nº 478), DOM7r-5 (SEC ID Nº 479), DOM7r-7 (SEC ID Nº 480),
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DOM7r-8 (SEC ID Nº 481), DOM7h-2 (SEC ID Nº 482), DOM7h-3 (SEC ID Nº 483), DOM7h-4 (SEC ID Nº 484), DOM7h-6 (SEC ID Nº 485), DOM7h-1 (SEC ID Nº 486), DOM7h-7 (SEC ID Nº 487), DOM7h-22 (SEC ID Nº 489), DOM7h-23 (SEC ID Nº 490), DOM7h-24 (SEC ID Nº 491), DOM7h-25 (SEC ID Nº 492), DOM7h-26 (SEC ID Nº 493), DOM7h-21 (SEC ID Nº 494), DOM7h-27 (SEC ID Nº 495), DOM7h-8 (SEC ID Nº 496), DOM7r-13 (SEC ID Nº 497), DOM7r-14 (SEC ID Nº 498), DOM7r-15 (SEC ID Nº 499), DOM7r-16 (SEC ID Nº 500), DOM7r-17 (SEC ID Nº 501), DOM7r-18 (SEC ID Nº 502), DOM7r-19 (SEC ID Nº 503), DOM7r-20 (SEC ID Nº 504), DOM7r-21 (SEC ID Nº 505), DOM7r-22 (SEC ID Nº 506), DOM7r-23 (SEC ID Nº 507), DOM7r-24 (SEC ID Nº 508), DOM7r-25 (SEC ID Nº 509), DOM7r-26 (SEC ID Nº 510), DOM7r-27 (SEC ID Nº 511), DOM7r-28 (SEC ID Nº 512), DOM7r-29 (SEC ID Nº 513), DOM7r-30 (SEC ID Nº 514), DOM7r-31 (SEC ID Nº 515), DOM7r-32 (SEC ID Nº 516), DOM7r-33 (SEC ID Nº 517) (los números de SEC ID de este párrafo son los que aparecen en el documento WO2007080392), dAb8, dAb 10, dAb36, dAb7r20, dAb7r21, dAb7r22, dAb7r23, dAb7r24, dAb7r25, dAb7r26, dAb7r27, dAb7r28, dAb7r29, dAb7r30, dAb7r31, dAb7r32, dAb7r33, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb11, dAb12, dAb13, dAb15, dAb16, dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7m12, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1, dAb7r3, dAb7r4, dAb7r5, dAb7r7, dAb7r8, dAb7r13, dAb7r14, dAb7r15, dAb7r16, dAb7r17, dAb7r18, dAb7r19, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h10, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13, dAb7h14, dAb7p1, y dAb7p2.
Por ejemplo, el dAb que se une a la albúmina sérica humana puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente un 90%, o al menos aproximadamente un 95%, o al menos aproximadamente un 96%, o al menos aproximadamente un 97%, o al menos aproximadamente un 98%, o al menos aproximadamente un 99% con DOM7h-2 (SEC ID Nº 482), DOM7h-3 (SEC ID Nº 483), DOM7h-4 (SEC ID Nº 484), DOM7h-6 (SEC ID Nº 485), DOM7h-1 (SEC ID Nº 486), DOM7h-7 (SEC ID Nº 487), DOM7h-8 (SEC ID Nº 496), DOM7r-13 (SEC ID Nº 497), DOM7r-14 (SEC ID Nº 498), DOM7h-22 (SEC ID Nº 489), DOM7h-23 (SEC ID Nº 490), DOM7h-24 (SEC ID Nº 491), DOM7h-25 (SEC ID Nº 492), DOM7h-26 (SEC ID Nº 493), DOM7h-21 (SEC ID Nº 494), DOM7h-27 (SEC ID Nº 495) (los números de SEC ID de este párrafo son los que aparecen en el documento WO2007080392), dAb8, dAb 10, dAb36, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb11, dAb12, dAb13, dAb15, dAb16, dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h10, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13 y dAb7h14.
En ciertas realizaciones, el dAb se une a la albúmina sérica humana y comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente un 80%, o al menos aproximadamente un 85%, o al menos aproximadamente un 90%, o al menos aproximadamente un 95%, o al menos aproximadamente un 96%, o al menos aproximadamente un 97%, o al menos aproximadamente un 98%, o al menos aproximadamente un 99% con la secuencia de aminoácidos de un dAb que se selecciona de entre el grupo que consiste en DOM7h-2 (SEC ID Nº 482), DOM7h-6 (SEC ID Nº 485), DOM7h-1 (SEC ID Nº 486), DOM7h-7 (SEC ID Nº 487), DOM7h-8 (SEC ID Nº 496), DOM7h-22 (SEC ID Nº 489), DOM7h-23 (SEC ID Nº 490), DOM7h-24 (SEC ID Nº 491), DOM7h-25 (SEC ID Nº 492), DOM7h-26 (SEC ID Nº 493), DOM7h-21 (SEC ID Nº 494), DOM7h-27 (SEC ID Nº 495) (los números de SEC ID de este párrafo son los que aparecen en el documento WO2007080392), dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb38, dAb41, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h10, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13 y dAb7h14.
En realizaciones más particulares, el dAb es un dAb V que se une a la albúmina sérica humana y tiene una secuencia de aminoácidos que se selecciona de entre el grupo que consiste en DOM7h-2 (SEC ID Nº 482), DOM7h-6 (SEC ID Nº 485), DOM7h-1 (SEC ID Nº 486), DOM7h-7 (SEC ID Nº 487), DOM7h-8 (SEC ID Nº 496) (los números de SEC ID de este párrafo son los que aparecen en el documento WO2007080392), dAb2, dAb4, dAb7, dAb38, dAb41, dAb54, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h10, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13 y dAb7h14.
En realizaciones más particulares, el dAb es una dAb VH que se une a la albúmina sérica humana y tiene una secuencia de aminoácidos que se selecciona de entre dAb7h30 y dAb7h31.
En realizaciones más particulares, el dAb es dAb7h11 o dAb7h14.
En otras realizaciones, el dAb, ligando o antagonista se une a la albúmina sérica humana y comprende una, dos o tres CDR de cualquiera de las secuencias de aminoácidos anteriores, por ejemplo, una, dos o tres de las CDR de dAb7h11 o dAb7h14.
La VHH de camélido que se une a la albúmina sérica incluye los que se desvelan en el documento WO 2004/041862 (Ablynx N.V.) y en el documento WO2007080392, tal como la Secuencia A (SEC ID Nº 518), Secuencia B (SEC ID Nº 519), Secuencia C (SEC ID Nº 520) Secuencia D (SEC ID Nº 521), Secuencia E (SEC ID Nº 522), Secuencia F (SEC ID Nº 523), Secuencia G (SEC ID Nº 524), Secuencia H (SEC ID Nº 525), Secuencia I (SEC ID Nº 526),
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Secuencia J (SEC ID Nº 527), Secuencia K (SEC ID Nº 528), Secuencia L (SEC ID Nº 529), Secuencia M (SEC ID Nº 530), Secuencia N (SEC ID Nº 531), Secuencia O (SEC ID Nº 532), Secuencia P (SEC ID Nº 533), Secuencia Q (SEC ID Nº 534), estos números de secuencia corresponden a las que se citan en el documento WO2007080392 o o el documento WO 2004/041862 (Ablynx N.V.). En ciertas realizaciones, la VHH de camélido se une a la albúmina sérica humana y comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente un 80%, o al menos aproximadamente un 85%, o al menos aproximadamente un 90%, o al menos aproximadamente un 95%, o al menos aproximadamente un 96%, o al menos aproximadamente un 97%, o al menos aproximadamente un 98%, o al menos aproximadamente un 99% con el ALB 1 desvelados en el documento WO2007080392 o cualquiera de las SEC ID Nos 518-534, estos números de secuencia corresponden a los citados en el documento WO2007080392 o el documento WO 2004/041862.
En algunas realizaciones, el ligando o antagonista comprende un dAb anti-seroalbúmina que compite con cualquiera de los dAb anti-seroalbúmina que se desvelan en el presente documento por su unión a la albúmina sérica (por ejemplo, albúmina sérica humana).
En una realización alternativa, el antagonista o ligando comprende un resto de unión específico para el TNFR1 (por ejemplo, un TNFR1 humano), en que el resto comprende secuencias no de inmunoglobulinas como se describe en la solicitud co-pendiente PCT/GB2008/000453 presentada el 8 de febrero de 2008, la divulgación de estos restos de unión, sus procedimientos de producción y selección (por ejemplo, a partir de distintas bibliotecas).
Conjugación a un resto de extensión de la semivida (por ejemplo, albúmina)
En una realización, un (uno o más) restos de extensión de la semivida (por ejemplo, albúmina, transferrina y fragmentos análogos de los mismos) se conjuga o asocia con el polipéptido de unión al TNFR1, dAb o antagonista de la invención. Ejemplos de albúmina, fragmentos de albúmina o variantes de albúmina para su uso en un formato de unión al TNFR1 se describen en el documento WO 2005077042. En particular, se pueden utilizar los siguientes albúmina, fragmentos de albúmina o variantes de albúmina en la presente invención:
●
SEC ID Nº 1 (como se desvela en el documento WO 2005077042);
●
Fragmento o variante de albúmina que comprende o consiste en los aminoácidos 1-387 de la SEC ID Nº 1 del documento WO 2005077042;
●
Albúmina, o fragmento o variante de la misma, que comprende la secuencia de aminoácidos que se selecciona de entre el grupo que consiste en: (a) los aminoácidos 54 a 61 de la SEC ID Nº 1 del documento WO 2005077042; (b) los aminoácidos 76 a 89 de la SEC ID Nº 1 del documento WO 2005077042; (c ) los aminoácidos 92 a 100 de la SEC ID Nº 1 del documento WO 2005077042; (d) los aminoácidos 170 a 176 de la SEC ID Nº 1 del documento WO 2005077042; (e ) los aminoácidos 247 a 252 de la SEC ID Nº 1 del documento WO 2005077042; (f) los aminoácidos 266 a 277 de la SEC ID Nº 1 del documento WO 2005077042; (g) los aminoácidos 280 a 288 de la SEC ID Nº 1 del documento WO 2005077042; (h) los aminoácidos 362 a 368 de la SEC ID Nº 1 del documento WO 2005077042; (i) los aminoácidos 439 a 447 de la SEC ID Nº 1 del documento WO 2005077042; (j) los aminoácidos 462 a 475 de la SEC ID Nº 1 del documento WO 2005077042; (k) los aminoácidos 478 a 486 de la SEC ID Nº 1 del documento WO 2005077042; y (l) los aminoácidos 560 a 566 de la SEC ID Nº 1 del documento WO 2005077042.
Más ejemplos de albúmina, fragmentos y análogos adecuados para su uso en un formato de unión al TNFR1 se describen en el documento WO 03076567. En particular, se pueden utilizar los siguientes albúmina, fragmentos o variantes en la presente invención:
●
Albúmina sérica humana como se describe en el documento WO 03076567, por ejemplo, en la figura 3;
●
Albúmina sérica humana (HA) que consiste en una cadena sencilla no glucosilada de polipéptido de 585 aminoácidos con una fórmula de peso molecular de 66.500. Véase, Meloun, y col., FEBS Letters 58:136 (1975); Behrens, y col., Fed. Proc. 34:591 (1975); Lawn, y col., Nucleic Acids Research 9:6102-6114 (1981); Minghetti, y col., J. Riol. Chem. 261:6747 (1986));
●
Una variante polimórfica o análogo o fragmento de albúmina como se describe en Weitkamp, y col., Ann. Hum. Genet. 37:219 (1973);
●
Un fragmento o variante de albúmina como se describe en el documento EP 322094, por ejemplo, HA(1-373), HA(1-388), HA(1-389), HA(1-369), y HA(1-419) y fragmentos entre 1-369 y 1-419;
●
Un fragmento o variante de albúmina como se describe en el documento EP 399666, por ejemplo HA (1-177) y HA (1-200) y fragmentos entre HA (1-X), donde X es cualquier número entre 178 y 199.
Cuando un (uno o más) restos de extensión de la semivida (por ejemplo, albúmina, transferrina y fragmentos y análogos de los mismos) se utilizan para formatear los polipéptidos, dAb y antagonistas de unión al TNFR1 de la invención, se puede conjugar utilizando cualquier procedimiento adecuado, tal como , por fusión directa con el resto
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Secuencia de AA correspondiente
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● Identidad de secuencia de nucleótidos del 76,5% respecto a la secuencia WT
Domlh-131-206 WT (1) Solo dAb de E. coli Sec 206 (1) Consenso (1)
Domlh-131-206 WT (51) Solo dAb de E. coli Sec 206 (51) Consenso (51)
Domlh-131-206 WT (101) Solo dAb de E. coli Sec 206 (101) Consenso (101)
Domlh-131-206 WT (151) Solo dAb de E. coli Sec 206 (151) Consenso (151)
Domlh-131-206 WT (201) Solo dAb de E. coli Sec 206 (201) Consenso (201)
Domlh-131-206 WT (251) Solo dAb de E. coli Sec 206 (251) Consenso (251)
Domlh-131-206 WT (301) Solo dAb de E. coli Sec 206 (301) Consenso (301)
Domlh-131-206 WT (351) Solo dAb de E. coli Sec 206 (351) Consenso (351)
Secuencia con codón optimizado 5
Secuencia de ADN
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Secuencia de AA correspondiente
● Identidad de secuencia de nucleótidos del 78,4% con respecto a la secuencia WT 5
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Domlh-131-206 WT (1) Solo dAb de E. coli IC 206 (1) Consenso (1)
Domlh-131-206 WT (51) Solo dAb de E. coli IC 206 (51) Consenso (51)
Domlh-131-206 WT (101) Solo dAb de E. coli IC 206 (101) Consenso (101)
Domlh-131-206 WT (151) Solo dAb de E. coli IC 206 (151) Consenso (151)
Domlh-131-206 WT (201) Solo dAb de E. coli IC 206 (201) Consenso (201)
Domlh-131-206 WT (251) Solo dAb de E. coli IC 206 (251) Consenso (251)
Domlh-131-206 WT (301) Solo dAb de E. coli IC 206 (301) Consenso (301)
Domlh-131-206 WT (351) Solo dAb de E. coli IC 206 (351) Consenso (351)
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Ejemplificación
Los dominios de anticuerpo que se generaron se derivaron de bibliotecas de fagos. Tanto las selecciones solubles y ensayos de selección del TNFR1 humano que se absorbe pasivamente se llevaron a cabo de acuerdo con procedimientos de referencia relevantes. El TNFR1 humano se adquirió como una proteína recombinante soluble o bien en R&D Systems (Cat Nº 636-R1-025/CF) o en Peprotech (Cat nº 310-07) y, o se utilizó directamente (en el caso de selecciones pasivas) o tras la biotinilación utilizando el acoplamiento por medio aminas primarias seguido por un control de calidad de su actividad en un ensayo biológico y un análisis de su PM y extensión de biotinilación por espectrometría de masas. Típicamente se llevaron a cabo 3 rondas de selección utilizando niveles decrecientes de antígeno en cada nueva ronda.
Los resultados de las selecciones se exploraron por ELISA de fago en cuanto a la presencia de clones de unión anti-TNFR1. Se aisló el ADN a partir de estas selecciones de fagos y se subclonaron en un vector de expresión para la expresión de fragmentos de dAb solubles. Los fragmentos de dAb solubles se expresaron en placas de 96 pocillos y los sobrenadantes se utilizaron para explorar la presencia de dAb de unión anti-TNFR1, o bien se utilizó un ELISA de unión directo con detección anti-c-myc o BIAcore™ utilizando un chip BIAcore™ TNFR1 biotinilado/estreptavidina y se ordenaron de acuerdo con las tasas de disociación.
Las moléculas candidatas, que se describen posteriormente, se derivaron del dAb parental, que se designó DOM1h131 (desvelado en el documento WO2006038027). Esta molécula se seleccionó de la biblioteca de presentación en fagos tras 3 rondas de selección utilizando 60 nM de antígeno biotinilado. Se alternaban perlas Dyna revestidas de estreptavidina o neutravidina como reactivos de captura en cada ronda de selección para evitar la selección de agentes de unión para la estreptavidina o neutravidina. La potencia del candidato DOM1h-131 en este estadio estaba en el intervalo micromolar inferior como se determinaba por el ensayo celular de liberación de fibroblastos MRC-5/IL-8. La cinética de unión que se determinaba por BIAcore™ típicamente presentaba velocidades de asociación/disociación rápidas. Los niveles de expresión en E. coli de esta molécula candidata DOM1h-131, como
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monómero marcado con myc en el extremo C estaba en la región de los 8 mg/l.
Maduración de afinidad de los candidatos:
El DOM1h-131 se llevó a maduración de afinidad para generar mutantes con potencia más alta y características biofísicas mejoradas (véase la Figura 3 para las secuencias de aminoácidos de los candidatos derivados de DOM1h131) Tras la generación de un biblioteca propensa a errores (número medio de cambios de 1 aminoácido por secuencia de dAb, tamaño de biblioteca 8 x 107) utilizando una polimerasa PCR propensa a errores (Genemorph II, Stratagene), se llevaron a cabo siete rondas de selección utilizando estas bibliotecas propensas a errores. Esta estrategia daba lugar al aislamiento del clon DOM1h-131-8, una molécula en la que cambios en 4 aminoácidos (uno en el armazón 1 (FR1), uno en la CDR1, uno en la CDR3 y uno en FR4) daba una mejoría de la potencia de 100 veces según se mide con un ensayo celular con MRC-5 ( 4 nM). En este ensayo, las células MRC-5 se incubaron con las muestras de ensayo durante una hora y luego se añadió el TNF- (200 pg/ml). Después de una noche de incubación se determinó la liberación de IL-8 utilizando un ensayo de detección celular ABI 8200 IL-8 (FMAT). Se incluyó una curva de dosis de TNF- en cada experimento. La concentración de TNF- que se utilizó para competir con la unión del dAb al TNFR1, (200 pg/ml) era aproximadamente del 70% de respuesta de TNF- máxima en este ensayo.
Con el fin de mejorar más la potencia, se diversificaron las posiciones de aminoácidos únicos por mutagénesis dirigida por oligos en las posiciones clave sugeridas por la información del consenso propenso a errores del candidato. Durante este proceso se aisló una versión mejorada del clon DOM1h-131-8, el DOM1h-131-24 (llamado originalmente DOM1h-131-8-2 antes de la corrección) por medio de exploración por BIAcore™ que tenía una mutación de aminoácido única K94R (numeración de aminoácidos de acuerdo con Kabat) y una potencia RBA de 200-300 pM.
Se generaron más bibliotecas propensas a error basándose en este candidato y la biblioteca NNS de la que se derivaba y se sometieron a tres rondas de selecciones por fago utilizando el tratamiento por calor (para el procedimiento, véase Jespers L, y col., Aggregationresistant domain antibodies selected on phage by heat denaturation. Nat Biotechnol. 2004 Sep;22(9):1161-5). Durante esta selección, las bibliotecas se agruparon y los clones derivados de la ronda dos de la selección produjeron dAb tales como el DOM1h-131-53 que se consideró que era el más estable al calor. Se hizo la hipótesis de que estos clones poseían mejores características biofísicas. Se llevaron a la línea germinal algunas mutaciones del armazón en el clon DOM1h-131-53 para generar el clon DOM1h131-83. Este clon formaba la base para posterior diversificación por medio de mutagénesis de CDR individual dirigida por oligos o bien utilizando una estrategia de selección por presentación en fagos como se ha descrito anteriormente o utilizando la tecnología de compartimentación in vitro utilizando emulsiones. La estrategia de presentación en fagos da lugar al DOM1h-131-117 y DOM 1 h-131-151. La tecnología de compartimentación in vitro generó el DOM1h-131-511.
En este estadio se compararon estos tres candidatos en ensayos biofísicos y biológicos y el DOM1h-131-511 era la molécula con las mejores propiedades. Además, estas moléculas se ensayaron en cuanto a su resistencia a la escisión proteolítica en presencia de tripsina o leucozima. La leucozima consiste en un grupo de esputos de pacientes con fibrosis quística y contiene altos niveles de elastasa y otras proteasas y se utilizó como un sustituto de las condiciones in vivo en enfermedades pulmonares. Estos datos indicaban que los tres candidatos DOM1h-131117, DOM1h-131-151 y DOM1h-131-511 se degradaron rápidamente en presencia de tripsina o leucozima. Este hallazgo creaba preocupaciones acerca de la persistencia in vivo del DOM1h-131-511 cuando se desarrolló en el paciente una estrategia para seleccionar una resistencia mejorada a la tripsina. Se hizo la hipótesis de que tal resistencia mejorada a la tripsina podría tener un efecto beneficioso sobre otras propiedades biofísicas de la molécula. Esencialmente, el procedimiento de selección por fagos de referencia se modificó para permitir la selección en presencia de proteasas antes de la selección sobre antígeno. En este extremo, se creó un nuevo vector fago en el que se eliminó el marcador c-myc para permitir las selecciones en presencia de tripsina sin escindir el dAb presentado del fago. Se generaron bibliotecas propensas a error basadas en DOM1h-131-511 y se clonaron en el vector pDOM33 (véase la Fig. 50 para el mapa del vector pDOM33). Las reservas de fagos generadas de esta biblioteca se pre-trataron con o 1 mg/ml o 100 g/ml de tripsina a 37 ºC durante 24 horas, posteriormente se añadió un inhibidor de proteasa que era el inhibidor de proteasa completo de Roche (2x) para bloquear la actividad de la tripsina antes de la selección sobre el antígeno relevante. Se llevaron a cabo cuatro rondas de selección. Se evaluó el TNFR1 soluble que se expresó unido a dAb utilizando el BIAcore™ en cuanto a su capacidad para unirse al TNFR1 con o sin la presencia de proteasas durante incubaciones de una hora o de una noche a 37 ºC en presencia
o ausencia de tripsina (a 100 g/ml o 1000 g/ml de concentración final de tripsina).
Esto dio lugar al aislamiento de dos moléculas candidatas DOM1h-131-202 y DOM1h-131-206 que demostraron una resistencia a proteasas mejorada como se demostraba por experimentos BIAcore™ de unión al antígeno. Es interesante señalar que el DOM1h-131-202 contenía solo una mutación en la CDR2 (V53D), (toda la numeración de aminoácidos son de acuerdo con Kabat) en comparación con el DOM1h-131-511, mientras que el DOM1h-131-206 contenía solo dos mutaciones; la primera mutación es la misma que en DOM1h-131-202 (mutación V53D en CDR2) y la segunda es una mutación Y91H en FR3 (véase la Figura 3). Esta mutación Y91H en FR3 se produce en el gen de la línea germinal 3-20 lo que indica que este resto se encuentra en anticuerpos humanos. Los tres clones DOM1h-131-511, DOM1h-131-202 y DOM1h-131-206 tienen las secuencias de aminoácidos que se muestran en la
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Figura 3.
La actividad de las moléculas se determinó como posteriormente:
Evaluación BIAcore™ de afinidad de unión de DOM1h-131-202, DOM1h-131-511 y DOM1h-131-206 en cuanto a la unión al TNFR1 humano.
Las afinidades de unión de DOM1h-131-202, DOM1h-131-511 y DOM1h-131-206 de la unión al TNFR1 humano expresado en E. coli se evaluó por análisis BIAcore™. El análisis se llevó a cabo utilizando el TNFR1 humano biotinilado. Se revistió con 1400 UR de TNFR1 biotinilado un chip de estreptavidina (SA). La superficie se regeneró para volver a la línea base utilizando condiciones de elución con un ácido débil. El DOM1h-131-202, DOM1h-131511 y DOM1h-131-206 se pasaron por encima de esta superficie a concentraciones definidas utilizando una velocidad de flujo de 50 l/min. El trabajo se llevó a cabo en una máquina BIAcore 3000 y los datos se analizaron y ajustaron al modelo de unión 1:1. Los datos de unión se ajustaron bien al modelo 1:1 en todas las moléculas ensayadas. Se calcularon todos los valores de KD a partir de las tasas kon y koff. Los procesos BIAcore™ se llevaron a cabo a 25 ºC.
Los datos posteriores se produjeron a partir de tres experimentos independientes. En cada experimento los resultados se calcularon promediando un número d ajustes utilizando las concentraciones de dAb más altas para kd y las concentraciones más bajas de ka. Los datas se presentan como la media y la desviación estándar (entre paréntesis) de los resultados (Tabla 1).
Tabla 1: Datos del BIAcore™ para la unión de DOM1h-131-202, DOM1h-131-511 y DOM1h-131-206 al TNFR1 humano
kon
koff KD (nM)
DOM1H-131-511 (511)
5,03E+05 (1,07E+05) 5,06E-04 (1,01E-04) 1,07 (0,44)
DOM1H-131-202 (202)
1,02E+06 (2,69E+05) 5,42E-04 (3,69E-05) 0,55 (0,11)
DOM1H-131-206 (206)
1,55E+06 (3,57E+05) 7,25E-04 (1,95E-04) 0,47 (0,06)
El DOM1h-131-202, DOM1h-131-511 y DOM1h-131-206 se unen similarmente, y con alta afinidad al TNFR1 humano. El DOM1h-131-202 y DOM1h-131-206 se unen con afinidades medias de 0,55 nM y 0,47 nM respectivamente. Ambos DOM1h-131-202 y DOM1h-131-206 tienen una afinidad ligeramente mejor en comparación con el DOM1h-131-511 que tiene una afinidad media de 1,07 nM.
Ensayo de unión al receptor:
La potencia de los dAb se determinó contra el TNFR1 humano en un ensayo de unión al receptor. Este ensayo mide la unión del TNF- al TNFR1 y la capacidad del dAb soluble para bloquear esta interacción. La fusión TNFR1-FC se captura en una perla pre-revestida con anti-IgG humana de cabra (H&L). Las perlas revestidas con el receptor se incubaron con TNF-alfa (10 ng/ml), dAb, anti-TNF-alfa conjugada con biotina y estreptavidina Alexa flúor 647 en placas de fondo transparente con caras negras de 384 pocillos. Tras 6 horas la placa se leyó en un sistema de detección celular ABI 8200 y se determinó la fluorescencia asociada a las perlas. Si el dAb bloquea la unión del TNF-alfa al TNFR1 la intensidad de la fluorescencia se reducirá.
Se analizaron los datos utilizando el software de análisis ABI 8200. Los valores de las curvas del efecto de la concentración y la potencia (CE50) se determinaron utilizando el Prism GraphPad y una curva de respuesta a la dosis sigmoidea con pendiente variable. El ensayo se repitió en tres ocasiones por separado. Se incluyó una curva de dosis de TNF-alfa en cada experimento (Figuras 38 y 39). La concentración de TNF-alfa que se utiliza para competir con la unión del dAb al TNFR1 (10 ng/ml) es aproximadamente el 90% de la respuesta máxima de TNF-alfa en este ensayo.
En la figura 39 se muestra un gráfico representativo que muestra la capacidad de los dAb para inhibir la unión del TNF-alfa al TNFR1. En los tres experimentos las muestras de control negativo (HEL4, una lisozima anti-dAb de clara de huevo de gallina y una falsa VH) inhiben débilmente la interacción entre TNF-alfa y el TNFR1 a altas concentraciones. Los valores de potencia media (EC50) para las muestras de ensayo y los controles positivos (mAb anti-TNFR1 que se obtiene en R&D Systems, mAb225) y Enbrel™ (etanercept; una fusión dimérica que consiste en TNFR2 unido a la parte Fc de IgG1; aprobado para el tratamiento de la artritis reumatoide) como se muestra en el Tabla 2.
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Tabla 2: Valores de potencia (CE50) para DOM1H-131-202, DOM1H-131-206 y DOM1H-131-511 en un ensayo de unión al receptor del TNFR1 para tres experimentos repetidos.
Muestra
CE50 media (nM) SEM
DOM1H-131-202
0,11 0,008
DOM1H-131-206
0,07 0,01
DOM1H-131-511
0,19 0,01
Enbrel ™ (Etanercept)
0,20 0,07
Anti-TNFR1 mAb nº mAb225
0,08 0,003
En este ensayo, el DOM1H-131-206 aparece más potente que los otros dos dAb que se ensayan y tiene una potencia similar al mAb anti-TNFR1 disponible comercialmente, el MAB225 (R & D Systems).
La expresión de los clones candidatos a partir de Pichia pastoris se llevó a cabo como se describe a continuación: La secuencia de aminoácidos primaria de las tres moléculas candidatas se utilizó para producir genes con codón optimizado para la expresión segregada en Pichia pastoris. Hay una identidad de secuencia del 75% entre el DOM1H-131-206. Los tres genes sintéticos se clonaron en el vector de expresión pPIC-Z (de Invitrogen) y luego se transformaron en dos cepas de Pichia, X33 y KM71H. Las células transformadas se colocaron en placas en concentraciones crecientes de Zeocina (100, 300, 600 y 900 g/ml) para seleccionar clones con múltiples integrantes. Se seleccionaron aproximadamente 15 clones para cada línea celular y construcción para la exploración de expresión. Como la correlación entre el número alto/bajo de copias del gen y el nivel de expresión no se comprende totalmente en Pichia pastoris, se escogieron varios clones a través del intervalo de concentración de Zeocina. Se llevaron a cabo ejecuciones en fermentador de 5 l utilizando clones que no se habían explorado extensamente en cuanto a alta productividad. Esto permitió la producción de cantidades significativas de material para estudios posteriores.
Producción de material para la caracterización de proteínas:
Se han utilizado extensamente resinas de cromatografía basada en Proteína A para purificar mAb VH a partir de los sobrenadantes de cultivos bacterianos. Aunque esto permite un procedimiento de purificación en una etapa para producir material de alta pureza, habitualmente > 90% en la mayoría de los casos, para algunas moléculas las condiciones de elución con pH bajo puede dar lugar a la formación de agregados. También existe el problema de la limitada capacidad de las resinas de afinidad para los dAb; esto significaría que el uso de cantidades significativas de resina para procesar a partir de los fermentadores. Con el fin de producir un material de alta calidad para la caracterización y más estabilidad y los estudios de nebulizador, se ideó un proceso de purificación corriente abajo utilizando una resina de inducción de carga modal mezclada como la primera etapa de captura seguida por un intercambio aniónico. Sin una optimización significativa, esto permite la recuperación de  70% del dAb que se expresa a una pureza de  95%.
Para la etapa de captura en la resina de inducción de carga modal mezclada, se lleva a cabo la columna de equilibrio, Capti MMC de GE Healthcare, utilizando 50 mM de fosfato sódico pH 6,0 y se carga el sobrenadante sin que necesite dilución o ajuste del pH. Tras lavar la columna, la proteína se eluye con un gradiente de pH utilizando un tampón de elución que es de Tris 50 mM a pH 9,0. El lavado específico y las condiciones de gradiente variarán ligeramente dependiendo del pI de la proteína que se va a eluir.
El pico de eluído se purifica más entonces con un flujo por medio de una etapa que utiliza cromatografía de intercambio aniónico. Esto elimina la contaminación HMW residual tal como la alcohol oxidasa y recude endotoxinas. La resina se equilibra con o bien PBS o tampón fosfato pH 7,4 sin sal. Con la carga del eluído a partir de la Capto MMC en la resina de intercambio aniónico el dAb no se une y se recupera del flujo. Las endotoxinas y otros contaminantes se unen a la resina. La presencia de sal si se utiliza tampón PBS mejora la recuperación de proteína al 91% para esta etapa más que el 86% de recuperación que se consigue sin sal. Sin embargo la presencia de sal reduce la eficacia de la eliminación de endotoxina tal que típicamente se midió un nivel de endotoxina de dAb después de esa etapa con la inclusión de sal como 58 EU/ml en comparación con un nivel de < 1,0 EU/ml que se obtiene cuando no está presente la sal.
Caracterización de Proteínas:
El material producido de las ejecuciones en fermentador de 5 l se caracterizó en cuanto a la identidad utilizando espectrometría de masas con electropulverización, secuenciación del extremo amino y enfoque isoeléctrico y en cuanto a la pureza utilizando SDS-PAGE, SEC y el kit de tinción de glucoproteínas Gelcode (Pierce).
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Identidad:
El análisis de la secuencia del extremo amino de los primeros cinco restos de cada proteínas, era como se esperaba (EVQLL...). Se llevó a cabo la espectrometría de masas en muestras de las proteínas que habían sido intercambiados con tampón en 50:50 H2O:acetonitrilo que contenía un 0,1% de ácido acético glacial utilizando C4 Zip-tips (Millipore). La masa medida para cada una de las tres proteínas estaba en 0,5 Da de la masa teórica basándose en la secuencia de aminoácidos primario (calculado utilizando masas medias) cuando se permite una diferencia de masas de -2 a partir de la formación del enlace disulfuro interno. Se utilizó IEF para identificar las proteínas basándose en su pI que era diferente para cada proteína.
Pureza:
Las tres proteínas se cargaron en geles de SDS-PAGE no reductor en cantidades de 1 g y 10 g por duplicado. Se observó una sola banda en todos los casos. Se llevó a cabo también una cromatografía de exclusión por tamaño para demostrar los niveles de pureza. Para la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) se cargaron 100 g de cada proteína en una columna TOSOH G2000 SWXL con un flujo de 0,5 ml/min. La fase móvil era PBS/10% de etanol.
Investigación de estabilidad de dAb para la selección de candidatos:
Para la indicación en COPD, sería necesario suministrar el dAb en el pulmón, por ejemplo utilizando un dispositivo nebulizador. Esto significaría que la proteína podría potencialmente experimentar un intervalo de tensión por cizalladura y térmica dependiendo del tipo de nebulizador que se utilice y podría estar sometida a degradación enzimática por las proteasas del ambiente pulmonar. Se determinó si la proteína se podía suministrar utilizando este tipo de dispositivo, formar la distribución correcta de tamaño de la partícula y si permanecía funcional después del suministro con nebulizador. Por lo tanto, se investigó la estabilidad intrínseca de cada molécula en un intervalo de presiones físicas para determinar la línea base de estabilidad y la mayoría de los ensayos sensibles que indican la estabilidad. Como la estabilidad de cada proteína dependerá de la solución tampón en la que se solubiliza, era necesario hacer algún trabajo pre-formulación. Esta información, tal como el tampón, pH, también sería útil para entender la estabilidad de la proteína durante el proceso de purificación corriente abajo y el almacenamiento posterior. Con el fin de caracterizar los cambios en las moléculas durante la exposición a un intervalo de presiones físicas, se utilizó un intervalo de técnicas analíticas tal como la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), SDS-PAGE y enfoque isoeléctrico (IEF).
Evaluación de la estabilidad a la proteasa de DOM1H-131-202, DOM1H-131-511 y DOM1H-131-206:
La estabilidad a la proteasa de DOM1H-131-202, DOM1H-131-511 y DOM1H-131-206: se evaluó por el análisis BIAcore™ de la actividad de unión residual tras la pre-incubación durante puntos de tiempo definidos en un exceso de proteasas. Se revistió con aproximadamente 1400 UR de TNFR1 biotinilado un chip de estreptavidina (SA). Se incubaron 250 nM de DOM1H-131-202, DOM1H-131-511 y DOM1H-131-206 con tampón PBS solo o con 100 g/ml de tripsina, elastasa o leucozima durante 1, 3, y 24 horas a 30 ºC. La reacción se paró por la adición de un cóctel de inhibidores de proteasa. Las mezclas dAb/proteasa se pasaron entonces sobre el chip revestido con TNFR1 utilizando una sustracción celular de referencia. La superficie del chip se regeneró con 10 ul de glicina 0,1 M a pH 2,2 entre cada ciclo de inyección. La fracción de DOM1H-131-202, DOM1H-131-511 y DOM1H-131-206 unida al TNFR1 humano (a 10 segundos) que se pre-incubaron con proteasas se determinó con respecto a la unión del dAb sin proteasas. Se llevó a cabo las ejecuciones de BIAcore™ a 25 ºC.
Los datos se produjeron a partir de tres experimentos independientes. El gráfico de barras indica valores medios y las barras de error indican la desviación estándar de los resultados (para los resultados véase la Figura 24).
Se descubrió que DOM1H-131-202 y DOM1H-131-206 tenían una resistencia mayor a la degradación proteolítica por tripsina, elastasa o leucozima en comparación con el DOM1H-131-511. La diferencia entre DOM1H-131-202 y DOM1H-131-206 en comparación con DOM1H-131-511 es más pronunciada tras 1 hora con tripsina y tras 3 horas con elastasa o leucozima.
Estabilidad térmica según se determina utilizando DSC:
Con el fin de determinar el pH en el que las moléculas tenían la mayor estabilidad, se utilizó un calorímetro de selección diferencial (DSC) para medir las temperaturas de fusión (Tm) de cada dAb en un tampón de Britton-Robinson. Como el Britton-Robinson está compuesto de tres sistemas de componentes tampón (acetato, fosfato o borato), es posible producir un intervalo de pH desde 3 -10 en la misma solución. Se determinó el pI teórico de la secuencia de aminoácidos primaria de las proteínas. Con el DSC se encontró que el pH al que los dAb tenían sus mayores estabilidades térmicas intrínsecas era con un pH 7 para DOM1H-13I-202 (202), pH 7-7,5 para DOM1H-131206 (206) y pH 7,5 para DOM1H-131-511 (511). Para los posteriores trabajos de presión y estabilidad se utilizaron los siguientes pH para cada dAb; para DOM1H-131-202 (202) y DOM1H-131-206 (206) pH 7,0 y para DOM1H-131511 (511) pH 7,5 en tampón de Britton-Robinson. Los resultados se resumen en la Tabla 3 a continuación:
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luego se diluyeron los fagos en un 2% de Marvell en PBS, se incubaron con 50 nM de antígeno biotinilado (VEGF recombinante humano (R&D Systems)) durante una hora a temperatura ambiente. Se añadieron perlas revestidas de estreptavidina (Dynabeads M-280 (Invitrogen)) que se había pre-bloqueado durante una hora a temperatura ambiente con un 2% de Marvell en PBS, y la mezcla se incubó entonces durante cinco minutos a temperatura ambiente. Todas las etapas de incubación con las Dynabeads se llevaron a cabo en una rueda rotatoria. Los fagos no unidos se eliminaron, lavando las perlas ocho veces con 1 ml de Tween-20 al 0,1% en PBS. Los fagos unidos se eluyeron con 0,5 ml de Glicina 0,1 M pH 2,2 y se neutralizaron con 100 l de 1 M de Tris-HCL a pH 8,0. Los fagos eluídos se utilizaron para infectar células TG1 en crecimiento exponencial (una hora a 37 ºC) y se colocaron en placas sobre placas de tetraciclina. Las placas se incubaron una noche a 37 ºC y se realizó el recuento de colonias (véase la Tabla 4). Los mejores resultados se observaron con la selección por incubación con 100 g/ml de tripsina. Había un aumento de aproximadamente 10 veces en el rendimiento de DOM15-26 en comparación con DOM15-10 y DOM15-26-501.
Se hizo un segundo experimento para confirmar más estos resultados bajo condiciones de incubación más rigurosas. Los fagos que presentan dAb se trataron durante 1 hora o 2 horas a 37 ºC con agitado (250 rpm). Los mejores resultados se observaron con las selecciones con las 2 horas de incubación con 100 ug/ml de tripsina. El rendimiento de DOM15-26 era 200 veces mayor que el rendimiento de DOM15-26-501 y 1000 veces mayor que el rendimiento de DOM15-10.
En un tercer experimento, los fagos que presentan DOM15-26 y DOM15-26-501 se mezclaron 1:1 en el comienzo. Entonces se incubaron o bien con tripsina (1000 g/ml) o sin tripsina durante dos horas a 37 ºC con agitado (250 rpm), y luego se seleccionaron en cuanto a su unión al antígeno como se ha descrito anteriormente. La secuenciación de diez colonias de cada selección revelaba una población mixta de clones para la selección sin pretratamiento con tripsina (DOM15-26: 4/10; DOM 15-26-501: 6/10), mientras que todos los clones de la selección con tripsina codificaban DOM 15-26 como se esperaba.
Estos experimentos indican que se puede obtener una presión de selección añadiendo una proteasa a los fagos que presentan los dAb, tal que los fagos que presentan la mayoría de los dAb proteolíticamente estables se seleccionan preferentemente (después del ensayo de selección sobre un ligando genérico o el antígeno).
Tabla 4
Experimento
Longitud de la incubación Temp. Concentración de tripsina Título de DOM1526 Título de DOM 1526-501 Mezcla de títulos 1:1 Título de DOM 1510
1 Entrada 1010
1 h Temp. ambiente 100 g/ml 1,6 x 108 6,3 x 107 1,1 x 107
1 h
Temp. ambiente 10 g/ml 3 x 108 4,4 x 108 2,4 x 108
1 h
Temp. ambiente 0 g/ml 0,9 x 108 2 x 108 0,7 x 108
2 entrada 109
1 h, 250 rpm 37 °C. 100 g/ml 2 x 107 1 x 106 1 x 105
2 h, 250 rpm
37 °C 100 g/ml 1 x 107 6 x 104 1 x 104
2 h, 250 rpm
37 °C 0 g/ml 5,4 x 107 4,1 x 107 3 x 108
3 Entrada1010
2 h, 250 rpm 37 °C 100 g/ml 2,3 x 108 8 x 105 6,8 x 107
2 h, 250 rpm
37 °C 0 g/ml 3,9 x 108 4,4 x 108 4,8 x 108
Ensayos con DOM4-130-54 sobre fagos
El DOM4-130-54 se ensayó con un protocolo similar al que se ha descrito anteriormente. Los parámetros que se variaban eran: concentración de tripsina, temperatura y longitud de la incubación. Se hizo un biopanning contra IL-RI-Fc (una fusión de IL-1RI y Fc) a una concentración de 1 nM en PBS. Solo se observaron reducciones en el título de fagos tras la incubación del fago con 100 g/ml de tripsina una noche a 37 ºC (véase la Tabla 5).
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modificación están basadas en técnicas in vitro con el objetivo de alterar o crear nuevas secuencias de aminoácidos, no tienen lugar los procesos de evolución que han mejorado gradualmente las proteínas biológicas, dando como resultado, por lo tanto, proteínas de actuaciones sub-óptimas con respecto a la resistencia a las presiones.
La técnica de la presente invención tiene como objetivo reproducir una de las condiciones afrontadas por las
5 proteínas a lo largo de la evolución Darwiniana. Los péptidos y polipéptidos, por ejemplo, los dominios variables únicos de inmunoglobulina se infunden con proteasas que tienen un papel principal en la remodelación de tejidos y en la homeostasis proteica. Cualquier mutación particular que puede dar como resultado una proteína con un ajuste mejorado a su función se ensaya también en cuanto a su capacidad para ajustarse en el ambiente y su actuación en él. Este proceso se reproduce en una realización de la presente invención: se crea un repertorio de variantes de
10 péptido o polipéptido y se expone a una proteasa. En una segunda etapa, el repertorio de variantes se pone en contacto con una diana específica. Solo las variantes de proteína que tienen una degradación sostenida por la proteasa serán capaces de relacionarse con la diana y por lo tanto recuperarse, por ejemplo, por un simple proceso de purificación llamado “biopanning”. El sistema ofrece varias ventajas en comparación con los procesos in vivo: el repertorio de proteínas puede hacer frente a un amplio intervalo de condiciones, por ejemplo una variedad de
15 proteasas, a altas concentraciones, durante tiempos más largos, en tampones o pH diferentes y a diferentes temperaturas. Por lo tanto, esta tecnología in vitro, ofrece un medio para diseñar proteínas que pueden actuar y permanecer estables en un intervalo de medios más amplio que en el que se originaron. Claramente esto ofrece múltiples ventajas para la industria biotecnológica y en el área de las proteínas terapéuticas en particular.
20 El dAb parental y un dAb resistente a proteasas en cada una de los cuatro linajes de dAb, se evaluaron más in vivo (véase la Tabla 15 a continuación para la lista y los detalles).
Tabla 15

Ejemplo 12: Correlación de datos de PK para candidatos resistentes a proteasa
Linaje
ID dAb Resistencia a tripsina Tm (°C) Actividad (nM) ID como fusión Fc
DOM4-130
DOM4-130-54 Buena 54 0,128* DMS1541
DOM4-130-202
Muy alta 64 0,160* DMS1542
DOM1h-131
DOM1h-131-511 Buena 57 0,048† DMS1543
DOM1h-131-206
Muy alta 64 0,047† DMS1544
DOM15-10
DOM15-10
Baja 64 0,913† DMS1546
DOM15-10-11
Alta 63 0,577† DMS1531
DOM15-26
DOM15-26-501(*) Baja 52 0,330† DMS1545
DOM 15-26-593
Alta 65 0,033† DMS1529
*: como se determina por un bioensayo MRC5/IL-a; †: como se determina por ensayo RBA Nota: DOM15-26-501 es una versión parental del DOM15-26-555 ejemplificada anteriormente en la presente solicitud. DOM15-26-555 tiene una mutación de aminoácidos de la línea germinal en CDR1 (I34M). DOM15-26-501 tiene una temperatura de fusión más baja que DOM15-26-555 (52 ºC v 63,3 ºC) y un aumento de susceptibilidad a la digestión con tripsina. DOM15-26-501 se escogió sobre el DOM15-26-555 para el estudio farmacocinético que es el más representativo de baja estabilidad en comparación con DOM15-26-593.
Se puede traducir la resistencia de la siguiente manera:
25 1 es baja 2 es moderada 3 es buena 4 es alta 5 es muy alta
30 Entonces esto significa que la resistencia a la tripsina de la molécula parental es:
DOM4-130-54
es Buena
DOM1h-131-511
es Buena
DOM15-10
es Baja
DOM15-26-501
es Baja
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excluye per se como un parámetro clave para predecir la estabilidad in vivo. Lo que pasa es solo que con el grupo de datos presente, grandes diferencias en la Tm (de 54 ºC y mayores) no tienen un impacto significativo en el destino de los dAb in vivo. Esto no excluye la posibilidad de que a una temperatura de fusión por debajo de 54 ºC, la estabilidad in vivo pueda correlacionarse con la estabilidad térmica, o quizá incluso con la estabilidad térmica y la resistencia a las proteasas en conjunto.
Ejemplo 13
Selecciones con tripsina en DOM10-53-474
Estabilidad en tripsina del DOM10-53-474 purificado:
El DOM10-53-474 es un dominio de anticuerpo que se une a la IL-13 con alta potencia. Para evaluar la estabilidad de este dAb en presencia de tripsina, se digirió el dAb purificado con tripsina durante puntos de tiempo más largos y se ejecutó sobre un gel para examinar cualquier posible degradación. Se incubaron 25 l de DOM10-53-474 purificado a 1 mg/ml con 1 l de tripsina de calidad de secuenciación a 1 mg/ml a 30 ºC, que daba como resultado una relación molecular de 25:1 dAb:tripsina. Se incubó el dAb con tripsina durante 1 h, 4 h y 24 h y se neutralizó la actividad de la proteasa por adición de 4 l de inhibidor de proteasa completo de Roche seguido por incubación en hielo. La muestra de tiempo 0 se hizo añadiendo los inhibidores de proteasa al dAb sin añadir tripsina. Se analizaron posteriormente 2 l de la muestra por electroforesis utilizando un Labchip de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
La figura 22 muestra el progreso en gel con DOM10-53-474 incubado con tripsina durante puntos de tiempo más largos. Para comparar, se ejecutó al lado uno de los dAb estables en tripsina, DOM15-26-593 que también se trató con tripsina como se ha explicado anteriormente. Como se muestra en la figura, el DOM15-26-593 parece estable incluso tras 24 h de incubación con tripsina. Sin embargo, el DOM10-53-474 se degrada en cierto grado tras 24 h, pero que se aprecia estable en los puntos de tiempo de 1 h y 4 h. Estos datos sugieren que el DOM10-53-474 es resistente a la degradación por tripsina hasta cierto punto, pero no es tan estable como uno de los dAb más estables en tripsina el DOM10-53-593.
Estabilidad en tripsina del DOM10-53-474 presentado en fago
Para evaluar la estabilidad en tripsina del DOM10-53-474 presentado en fago, se clonó el gen que codifica el DOM10-53-474 en los sitios Sal/Not de pDOM33 (Fig. 50) y el fago se produjo de acuerdo con las técnicas de referencia. Se purificó el fago por precipitación en PEG, se resuspendió en PBS y se tituló.
Los dAb presentados en fagos se incubaron en tripsina durante puntos de tiempo diferentes para evaluar la resistencia a la tripsina. Después de la incubación con tripsina, se midió la estabilidad por análisis de títulos tras la infección de células E. coli TG1 en crecimiento exponencial
Se incubaron 100 g/ml de tripsina durante 1 h, 2 h, 4 h y una noche a 37 ºC, en una incubadora con agitado. Se bloqueó la actividad de la tripsina con inhibidor de proteasa completo de Roche (x2) y luego se diluyó en un 2% de marvel en PBS, se incubó con 10 nM de IL-13 biotinilada durante una hora a temperatura ambiente. Se añadieron perlas revestidas de estreptavidina (Dynabeds M-280 (Invitrogen)) que habían sido pre-bloqueadas durante una hora a temperatura ambiente con un 2% de marvel en PBS, y la mezcla se incubó entonces durante 5 minutos a temperatura ambiente. Todas las etapas de incubación con Dynabeads se llevaron a cabo en una rueda rotatoria. Los fagos no unidos se lavaron lavando las perlas ocho veces con 1 ml de 0,1% de Tween-20 en PBS. Los fagos unidos se eluyeron con 0,5 ml de Glicina 0,1 M pH 2,2 y se neutralizaron con 100 l de Tris-HCl 1 M pH 8,0. El fago eluído se utilizó para infectar TG1 en crecimiento exponencial (1 h a 37 ºC) y se colocaron en placas de tetraciclina. Las placas se incubaron a 37 ºC durante una noche y se hizo el recuento de las colonias. Los títulos de los fagos resultantes tras la di gestión con tripsina se resume en la Tabla 17. Los títulos de fagos disminuían cuando se incubaban con tripsina durante puntos de tiempo prologando. Tras 24 h de incubación todos los fagos estaban digeridos.
Tabla 17
Longitud de incubación en tripsina
Concentración de tripsina Título
Control sin tripsina
- 3 x 107
1h
100 mg/ml 1 x 107
2h
100 mg/ml 7 x 106
4h
100 mg/ml 5 x 106
Una noche
100 mg/ml 0
Selección de dAb más resistentes a la tripsina:
Con el fin de seleccionar los dAb que son más resistentes a la degradación por la tripsina, se introdujeron mutaciones aleatorias en el gen que codifica el DOM10-53-474 por PCR utilizando el kit Mutazyme 11 de Stratagene, cebadores biotinilados y 5-50 pg de matriz para 50 l de reacción. Tras la digestión con Sal1y Not1, se
5 purificaron las inserciones de productos no digeridos con perlas revestidas de estreptavidina y se ligaron en el pDOM33 en los sitios correspondientes. Se transformaron las células de E. coli TB1 con la mezcla de unión purificada que daba como resultado una biblioteca propensa a error de DOM10-53-474. El tamaño de la biblioteca era de 1,9 x 109 y la tasa de mutación de aminoácidos era de 1,3.
Se llevaron a cabo tres rondas de selección con esta biblioteca para seleccionar dAb son una resistencia a la
10 proteasas mejorada. La primera ronda de selección se llevó a cabo solo con el antígeno sin tratamiento con tripsina para limpiar la biblioteca para eliminar cualquiera de los clones que no se unieron al antígeno con alta afinidad. La selección se llevó a cabo a 10 nM de IL-13. Los resultados de la ronda uno eran de 2 x 109 en comparación con los fagos de entrada de 6 x 1010 indicando que la mayoría de la biblioteca se unía al antígeno con alta afinidad.
La segunda y tercera rondas de selección se llevaron a cabo con 1 nM de IL-13 biotinilada. Antes del ensayo de
15 selección en IL-13, se incubaron los fagos con 100 g/ml de tripsina a 37 ºC en un agitador (250 rpm). Para la segunda ronda de selección, la incubación en tripsina se llevó a cabo durante 1 h o bien a temperatura ambiente o a 37 ºC. Los resultados de la ronda 2 de selección se muestran en la Tabla 18:
Tabla 18. Resultado de los títulos de fagos después de la segunda ronda de selección
Tratamiento con tripsina
Título
Sin tratamiento
1 x 108
1 h a temperatura ambiente
5 x 107
1 h a 37°C
2 x 107
20 Los resultados de los fagos de la ronda 2 de selección con tratamiento con tripsina durante 1 h a 37 ºC se utilizaron como entrada de la 3ª ronda de selección. Para la 3ª ronda de selección, se trataron los fagos con 100 g/ml de tripsina pero por puntos de tiempo más largos: 2 h a 37 ºC, 4 h a 37 ºC, una noche a temperatura ambiente o una noche a 37 ºC. Los títulos de fagos de la 3ª ronda de selección se resumen en la Tabla 19:
Tabla 19: Resultados de títulos de fagos después de la tercera ronda de selección
Tratamiento con tripsina
Título
Sin tripsina
1,3 x 108
2 h at 37 °C
1,9 x 107
4 h at 37 °C
2 x 106
Una noche a temperatura ambiente
4 x 107
Una noche a 37 °C
2,1 x 106
25
Se secuenciaron varios clones de cada resultado de las rondas 1, 2 y 3 para evaluar la diversidad de secuencias. Después de la primera ronda de selección sin tratamiento con tripsina, el 50% de los resultados de selección tenían la secuencia parental DOM10-53-474. Tras la 2ª ronda de selección, el porcentaje del parental aumentaba al 70%. Tras la 3ª ronda de selección, el porcentaje del parental aumentó hasta un 80%.
30 Estos datos indican que el DOM10-53-474 ya es resistente a la degradación con tripsina y no se seleccionaron muchos nuevos clones de estas selecciones con tripsina. La Figura 22 mostraba que mientras la proteína purificada se digiere con tripsina, el DOM10-53-474 no se digería completamente incluso tras un tratamiento con tripsina durante una noche. Sin embargo, para ver si hay algunos nuevos clones que son más resistentes a la tripsina que el DOM10-53-474 en los resultados de la selección, el resultado de la selección 3 en la que el fago se trataba durante
35 una noche con tripsina a 37 ºC se subclonó en DOM5. Se secuenciaron entonces cien clones para buscar cualquier clon resistente a la tripsina. De los cien clones analizados, solamente 26 clones tenían nuevas secuencias, sin embargo, ninguno de estos clones tenían mutaciones en los sitios de escisión de la tripsina (lisina o arginina) sugiriendo que estos clones no eran más resistentes a la tripsina que el DOM10-53-474.
imagen42
experimentos independientes. El gráfico de barras indica los valores medios y las barras de error indican la desviación estándar de los resultados (Figura 24).
Se encontró que el DOM1h-131-202 y DOM1h-131-206 mostraban tener una resistencia mayor a la degradación proteolítica de la tripsina, elastasa o leucozima en comparación con el DOM1h-131-511. La diferencia entre DOM1h
5 131-202 y DOM1h-131-206 en comparación con el DOM1h-131-511 es más pronunciada tras 1 h con tripsina y tras 3 h con elastasa o leucozima. Hay una tendencia que el DOM1h-131-206 es ligeramente más estable en comparación con el DOM1h-131-202 en la mayoría de las condiciones ensayadas.
Estabilidad térmica de los dAb según se determina utilizando DSC:
Con el fin de determinar a qué pH tienen mayor estabilidad las moléculas candidatas, se utilizó una calorimetría de
10 exploración diferencial (DSC) para medir las temperaturas de fusión (Tm) de cada dAb en tampón de Britton-Robinson. Como el Britton-Robinson está compuesto por tres sistemas de componentes tampón (40 mM de cada uno de los ácidos acético, fosfórico y bórico), es posible producir un intervalo de pH de 3 -10 en la misma solución. Se determinó el pI teórico a partir de las secuencias de aminoácidos de las proteínas. A partir del DSC, el pH al que los dAb tienen su estabilidad térmica intrínseca mayor se encontró que era a pH 7 para el DOM1h-131-202, pH 7-7,5
15 para el DOM1h-131-206 y un pH de 7,5 para el DOM1h-131-511. Para todos los trabajos de estabilidad y presión posteriores se utilizaron los siguientes pH para cada dAb: para DOM1h-131-202 y GSK1995057A DOM1h-131-206 un pH de 7,0 y para DOM1h-131-511 un pH de 7,5 en tampón de Britton-Robinson. Los resultados se resumen en la Tabla 20.
Tabla 20: Resumen del pH y Tm de DOM1h-131-202, DOM1h-131-206 y DOM1h-131-511 según se determina por 20 DSC en tampón de Britton-Robinson a 1 mg/ml. La temperatura se inclina a 180 ºC/hora.
dAb
pH que da la mayor estabilidad térmica intrínseca Tm (°C) del dAb al pH determinado
DOM1h-131-202
7,0 68,6
DOM1h-131-206
7,0-7,5 65,8
DOM1h-131-511
7,5 58,0
Ensayo de la estabilidad térmica de dos semanas
La capacidad de una proteína para resistir periodos prolongados de tiempo a temperaturas elevadas es una buena indicación de su estabilidad. Bajo estas condiciones, la proteínas se puede someter a varios procesos físicos como
25 agregación o modificación química. Los sAb (a 1 mg/ml) se incubaron a 37 y 50 ºC durante 14 días en tampón Britton-Robinson. Se utilizó la SEC para determinar cuánto monómero permaneció en solución durante el periodo de 14 días (Figura 25).
En la Figura 25 se puede ver que tanto DOM1h-131-202 como DOM1h-131-206 son significativamente más estables que el DOM1h-131-511 a la presión térmica. La exposición de las proteínas a temperaturas elevadas, tal como 37 y 30 50 ºC, se utilizan de manera rutinaria para dar una indicación de la vida en almacén a largo plazo de un fármaco. Estas altas temperaturas se utilizan para acelerar el proceso asociado con el almacenamiento a largo plazo a temperatura ambiente tal como la desamidación, oxidación o agregación. El nivel de formación de agregación en solución se puede controlar utilizando SEC (Figura 26A a I). Tras 14 días a 37 ºC, la pérdida de DOM1h-131-511 de la solución se puede atribuir tanto a precipitación como a la formación de agregados de orden mayor como se 35 determina por SEC (Figura 26B). Una pérdida de proteína significativamente menor se ve también en DOM1h-131202 y GSK1995057A DOM1h-131-206 a 37 ºC tras14 días con muy poco o ningún aumento en la formación de agregado, especialmente en el caso de DOM1h-131-206 (Figura 26H). A 50 ºC, la diferencia entre las moléculas es incluso más pronunciada, en que el DOM1h-131-206 muestra una estabilidad mejor a la temperatura más alta que el DOM1h-131-202 después de 14 días, mostrando una formación significativamente reducida de agregados de alto
40 peso molecular (Figura 26). Con respecto al tiempo t = 0, el DOM1h-131-206 muestra solo un pequeño aumento de la formación de agregados tras 14 días (Figura 26I), mientras que el DOM1h-131-511 tiene toda la solución precipitada (Figura 26C).
Esto muestra que los cambios introducidos en el dAb por las selecciones con tripsina, por ejemplo, la estabilidad térmica mejorada, mejora significativamente la estabilidad de almacenamiento de la proteína a 37 y 50 ºC. Tanto
45 DOM1h-131-202 y más significativamente el DOM1h-131-206, claramente tienen una estabilidad de la solución y menor tendencia a formar agregados a temperaturas elevadas que pueden traducirse directamente en una mejor estabilidad de almacenamiento a largo plazo a temperaturas más relevantes como a +4 ºC y temperatura ambiente.
Las muestras de los puntos de tiempo de 24 h, 48 h, 7 días y 14 días del experimento de presión térmica se analizaron entonces por IEF para ver si las proteínas habían sufrido cualquiera de los cambios biofísicos que afecten
50 a la carga total de la proteína (Figura 27).
De nuevo, ambos DOM1h-131-202 y DOM1h-131-206 no muestran cambios significativos a 37 ºC en comparación con el DOM1h-131-511. Con el DOM1h-131-511 aparece una segunda banda borrosa a 37 ºC tras 24 h. Se cree que esta banda extra se debe a la dimerización de la proteína, enmascarando de esta forma la carga y produciendo dos poblaciones de moléculas. A 50 ºC la diferencia entre las moléculas es más pronunciada, el DOM1h-131-206 claramente no muestra cambios significativos a temperatura elevada mientras que el DOM1h-131-202 muestra algún signo de modificación tras 24 h. La mayoría del DOM1h-131-511 se pierde por precipitación tras 48 h en Britton-Robinson.
Los puntos de tiempo T = 0, 7 y 14 días a 50 ºC se analizaron por TNFR-1 RBA para determinar la funcionalidad de la proteína tras la expresión a altas temperaturas (Figura 28). El ensayo actualmente no es tan sensible como la SEC o IEF para detectar cambios sutiles en la molécula debido a la presión, pero se puede utilizar para mostrar que el dAb se sigue uniendo al antígeno.
El cambio en la curva hacia la izquierda en el DOM1h-131-511 refleja el hecho que la mayoría del dAb se perdió debido a precipitación. El material que queda en solución aún es capaz de unirse al antígeno. Como se muestra en la figura 25, la mayoría de tanto DOM1h-131-202 y DOM1h-131-206 son capaces de mantenerse en solución incluso después de 14 días. El RBA muestra que toda la proteína soluble aún es funcional y capaz de unirse al TNFR1.
Ensayo de estabilidad en almacenamiento a altas concentraciones de proteína:
Se llevaron a cabo experimentos para investigar la estabilidad de almacenamiento a +4 ºC a concentraciones de proteínas muy altas para ver cómo actúa la molécula bajo estas condiciones. Todos los dAb candidatos se concentraron en concentradores centrífugos Vivaspin (corte a 5 K) en tampón Britton-Robinson a su pH más estable, hasta  100 mg/ml. Las muestras a  100 mg/ml se dejaron entonces a +4 ºC durante 7 días y luego se analizaron por SEC para ver si habían ocurrido en la muestra cualquier otro cambio físico durante el almacenamiento a altas concentraciones (Figura 29). Las muestras se diluyeron a  1 mg/ml antes de procesarse sobre la columna SEC en 1x PBS 10% de etanol (v/v).
A partir de los rastros de la SEC se puede ver que ni DOM1h-131-202 ni DOM1h-131-206 muestran ningún aumento en la formación de agregados tras 7 días, mientras que hay  2% de reducción en la concentración de monómeros en el DOM1h-131-511.
Suministro por nebulizador de los dAb candidatos:
En los primeros estadios de los trabajos toxicológicos y clínicos, los dAb se formularán como un líquido y se suministrará por medio de un dispositivo de nebulización. Dependiendo del dispositivo (por ejemplo, ultrasónico, chorro, o membrana vibrante), el dAb experimentará un grado de presión de cizalladura y térmica cuando se nebuliza para formar un aerosol de un tamaño de partícula determinado. Como tanto DOM1h-131-202 y DOM1h131-206 tienen las Tm más latas y muestran una estabilidad considerablemente mejor a la presión térmica en comparación con DOM1h-131-511, todos los dAb se ensayaron en dos dispositivos nebulizadores para ver cómo responden a la presión de cizalladura/térmica inducida durante la nebulización. Se analizaron entonces tanto la proteína del aerosol nebulizado como el dAb que permanecía en el dispositivo (es decir, en la cubeta) por SEC para determinar la cantidad de agregación que se generaba durante el proceso.
Todas las moléculas se ensayaron en tampón Britton-Robinson a su pH más estable. Los dAb se ensayaron en el Eflow Rapid (de membrana vibrante) y en Pari LC+ (nebulizador de chorro) con un tiempo de ejecución de 3,5 minutos a una concentración de 5 mg/ml y la distribución de tamaño de partícula que se determina utilizando el Spraytek de Malvern Los resultados se muestran en la Figura 30. Para un buen suministro y distribución en la profundidad del pulmón, el tamaño de partícula ideal es < 5 m. Todos los dAb tenían niveles comparables de tamaño de partícula que eran menores de < 5 m en tampón Britton-Robinson. La concentración del dAb en la cubeta del dispositivo se determinó por mediciones A280 antes y después de la nebulización (datos no mostrados). Se descubrió que la concentración de proteína no cambiaba significativamente indicando que ni la proteína ni el vehículo se han nebulizado preferentemente durante el suministro.
Las muestras de los dAb nebulizados en tampón Britton-Robinson se procesaron en la SEC para determinar si durante el suministro la proteína ha sufrido algún cambio físico. La Figura 31 muestra el porcentaje de cambio relativo en o bien la cubeta o en el aerosol según se determina por SEC. Se puede ver que tanto DOM1h-131-202 como DOM1h-131-206 sufren cambios relativamente pequeños en concentración de monómeros con respecto a DOM1h-131-511. Esto demuestra que tanto DOM1h-131-202 como DOM1h-131-206 con su Tm mejorada tienen menos propensión a agregarse durante la nebulización.
La Figura 32 muestra los rastros de la presente SEC para DOM1h-131-202 y DOM1h-131-511 en tampón Britton-Robinson tras la nebulización y demuestra que la pérdida relativa de monómeros (Figura 31) es debida a la formación de dímeros. Esto proporciona de nuevo más pruebas que apoyan la teoría de que la mayor estabilidad térmica que muestran DOM1h-131-202 y DOM1h-131-206 puede evitar una agregación significativa incluso en un tampón de formulación no optimizado.
En los trabajos de evaluación de la toxicología y seguridad, es necesario suministrar el dAb a niveles significativamente mayores en el animal que las dosis terapéuticas que se dan a los pacientes. Estos se puede conseguir solo utilizando concentraciones de proteína significativamente mayores y/o suministrando el dAb durante un periodo de tiempo muy prolongado. Como ya se ha demostrado que el DOM1h-131-511 forma agregados en la
5 nebulización a 5 mg/ml durante 3,5 min, se ensayó el DOM1h-131-206 a 40 mg/ml en PBS y se nebulizó utilizando el Pari LC+ durante hasta 1 hora. Se tomaron muestras de la cubeta y el aerosol en puntos de tiempo a lo largo del proceso para ver si la nebulización prolongada producía que los dAb se agregaran debido a presión de cizalladura o térmica según se determinaba por SEC y la concentración de proteína (mediciones A280 nm). La tabla 21 muestra la concentración de proteína del dAb tanto en la cubeta como en el aerosol según se determina por A280.
10 Tabla 21: Concentración medida de proteína de DOM1h-131-206 como se determina por lecturas de absorbancia A280 tanto de la cubeta como del aerosol durante la nebulización del dAb a  40 mg/ml utilizando el Pari LC+. Permitiendo los errores de dilución y el error del instrumental la concentración de la muestra no cambia tras la nebulización del dAb durante 1 h.
Tiempo (min)
Muestra de la cubeta (mg/ml) Muestra del Aerosol (mg/ml)
1
43,8 43,4
29
44,5 43,5
59
44,6 44,1
15 En la Tabla 21 se puede ver que la concentración de proteína no cambia durante el proceso, lo que demuestra que no hay una pérdida significativa de la proteína debido a agregación. La Figura 33 muestra que durante el periodo de nebulización de 1 h, el DOM1h-131-206 no forma agregados de orden mayor tal como dímeros según se determinaba por SEC. Esto demuestra claramente que las propiedades biofísicas mejoradas, como se presentan en la molécula por selecciones con tripsina, aumenta significativamente la resistencia de los dAb a la presión de
20 cizalladura y térmica y que esto se correlaciona directamente con la mejoría de la vida de almacenamiento en el almacén y la capacidad para nebulizar la proteína ya que no se forman agregados de mayor orden.
Estado en solución de los dAb candidatos:
Como la vía de degradación más importante para los tres dAb candidatos parece ser la auto-asociación que da lugar inicialmente a la dimerización seguida por más agregación y en último término la precipitación, se investigaron las
25 tres moléculas candidatas por Ultra-Centrifugación Analítica (AUC) para determinar el grado de auto-asociación. Las proteínas se investigaron por dos procedimientos, equilibrio de sedimentación y velocidad de sedimentación.
Para el procedimiento de equilibrio de sedimentación las tres muestras se procesaron en tres concentraciones diferentes que variaban entre 0,5 mg/ml a 5 mg/ml con efectos de centrifugación utilizando tres velocidades de rotor diferentes. Por este procedimiento se determinó que el DOM1h-131-511. Es un dímero estable (de 26,1-34,4 kDa),
30 el DOM1h-131-202 tiene un equilibrio monómero/dímero (22,7-27,8 kDa) con un estado dimérico relativamente estable a las concentraciones medidas con una Kd = 1,3 M y el DOM1h-131-206 es predominantemente monomérico (15,4-17,9 kDa) con una Kd para el monómero a asociación en dímero de 360 M.
Por el procedimiento de la velocidad de sedimentación todas las muestras mostraban algún grado de disociación en solución. De los resultados obtenidos, que se muestran en la Figura 34, se observó un coeficiente de sedimentación 35 para DOM1h-131-511 que es indicativo de agregados de mayor orden y el pico de cambio en la solución es una indicación de la disociación de estos agregados. La agregación de proteínas y la disociación se cancelan una a otra lo cual da la impresión de ser un dímero estable cuando se observa por equilibrio de sedimentación. Los coeficientes de sedimentación que se observan en DOM1h-131-202 indican un equilibrio dinámico rápido y por lo tanto no se podían separar los picos de monómero y dímero uno del otro, dando el único pico con un coeficiente de 40 sedimentación más alto que el que es apropiado para la masa de la muestra. Este resultado se corresponde con el resultado obtenido por el procedimiento de equilibrio de sedimentación y la constante de disociación que se midió era de 1 M. Se determinó que el DOM1h-131-206 era más monomérico que las otras dos muestras, que tenía un coeficiente de sedimentación de 1,9 s en comparación con el de 2,5 s para las otras dos muestras. Estos datos corresponden bien con los datos de equilibrio de sedimentación. A las concentraciones medidas,  10 veces por
45 debajo de una Kd de 360 M, la muestra es predominantemente monomérica.
Ejemplo 15
Aumento de la potencia del dAb DOM15-26-593:
Un ejemplo del aumento de la potencia en un Ensayo de Unión al Receptor VEGFR2 del dAb DOM15-26-593 sobre el DOM 15-26 se muestra en la Figura 40. En este ensayo, la capacidad de un inhibidor potencial de la unión VEGF
10
15
20
25
30
35
40
a VEGFR2 se mide en un ensayo basado en una placa. En este ensayo se reviste un placa ELISA de 96 pocillos con el VEGFR2-Fc quimérico, y a esta se añade una cantidad predeterminada de VEGF que se había pre-incubado con una serie de diluciones del dAb de ensayo. Después de lavar la proteína no unida, se detecta la cantidad de VEGF unido al receptor con un anticuerpo anti-VEGF, cuyo nivel se determina colorimétricamente. Se representa un efecto de respuesta a la dosis como el porcentaje de inhibición de unión de VEGF en función de la concentración de la sustancia de ensayo. Un inhibidor eficaz es, por lo tanto, el que demuestra un bloqueo sustancial de unión al ligando a bajas concentraciones.
Potencia y semivida de las fusiones con Fc:
El potencial terapéutico del bloqueo de VEGF en el tratamiento de tumores se ha conoce desde hace más de 30 años. La naturaleza crónica del cáncer dicta que los biofarmacéuticos necesiten una semivida en el suero larga para mediar sus efectos, y esto no es consistente con el rápido aclaramiento de los dAb libres de la circulación por la filtración renal. Para evaluar la utilidad de los dAb VEGF como anti-angiogénicos para el tratamiento del cáncer, los dominios de anticuerpo candidatos se formatearon como fusiones con el Fc de IgG1 humana de tipo silvestre por medio de un engarce híbrido de manera que se forma una molécula bivalente con una semivida en el suero extendida por el uso de las rutas silvestres de anticuerpo mediadas por FcRn.
En este formato de fusión con Fc, la potencia del dAb candidato seleccionado con tripsina, DOM15-26-593 se comparó con dAb parental inicial (DOM 15-26) y el dAb lábil a tripsina (DOM15-26-501) utilizando el ensayo descrito anteriormente. Los resultados se muestran en la Tabla 22 a continuación:
Tabla 22. Potencia (RBA) y semivida características de candidatos DOM 15-26 en formato de fusión con Fc
dAb
Fc Potencia (nM) T1/2b (h)
DOM15-26
hIgG1 0,506 ND
DORM15-26-501
hIgG1 0,323 12,9
DOM 15-26-593
hIgG1 0,033 84,6
Se puede ver a partir de estos resultados que en el formato dimérico de fusión con Fc, la afinidad y la potencia están aumentadas con respecto a los dAb libres debido al efecto de avidez. Está claro que el aumento de potencia que se obtiene en el DOM15-26-593 promedio de selección con tripsina se mantiene e incluso es más pronunciada en este formato con Fc. Además, las mejoras en estabilidad térmica y a la proteasa se traduce en cambios profundos en el comportamiento farmacocinético in vivo de las moléculas. La mejora en la semivida de eliminación (véase la Figura 41) de DOM15-26-593 en comparación con el DOM15-26-501 es probable que sea una consecuencia directa del aumento de estabilidad del dAb, haciéndole más resistente a los procesos de degradación que se producen en el compartimento endosómico. También se espera, por lo tanto, que los dAb con un aumento de la estabilidad a la proteasa son capaces de persistir durante más tiempo en otros compartimentos biológicos tales como el suero, superficies mucosas y varios compartimentos tisulares en donde la proteolisis es un proceso activo implicado en la pérdida de moléculas biológicas.
Perfiles farmacocinéticos de aclaramiento:
Los perfiles farmacocinéticos de aclaramiento de DOM15-26-593 y DOM15-26-501 se midieron tras la administración i.v. de DOM15-26-593 y DOM15-26-501 a 3 ratas a concentraciones de 5 mg/kg. Se midieron entonces los niveles de DOM15-26-593 y DOM15-26-501 en el suero utilizando un ensayo ELISA de referencia de unión directa al VEGF y un anticuerpo anti-Fc humano, por lo tanto solo se detectaban el fármaco intacto en las muestras de suero. El perfil farmacocinético completo se muestra en la Tabla 23 a continuación:
Tabla 23. Resumen de los parámetros farmacocinéticos de fusiones de DOM 15-26 y DOM15-26-593 con Fc en la rata
dAb
Semivida (h) Cmax (g/ml) AUC (0-inf) (h*mg/ml) Aclaramiento (ml/h/kg)
DOM 15-26-501
12,9 91,4 445,1 11,8
DOM15-26-593
84,6 101,8 3810 1,3
Se puede ver a partir de estos resultados que el DOM15-26-593 tiene un perfil farmacocinético significativamente mejorado con por ejemplo, una semivida extendida y una tasa de aclaramiento reducida.
La potencia y propiedades farmacocinéticas significativamente mejoradas del DOM15-26-593 deba como resultado el análisis del compuesto en cuanto a otros atributos biofísicos.
imagen43

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