MX2011004244A - Ligandos que tienen especificidad de enlace para dc-sign. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona un único dominio variable de inmunoglobulina anti-no integrina de sujeción de ICAM-3 específica de células dendríticas (DC-SIGN; CD209). También se describen polipéptidos, ligandos, y composiciones que comprenden estos únicos dominios variables de inmunoglobulina anti-DC-SIGN, junto con ácidos nucleicos que codifican estas inmunoglobulinas, y vectores y células huésped para la expresión. La invención se refiere además a los usos, formulaciones, composiciones y dispositivos que comprenden estos agentes de enlace de DC-SIGN.

Description

LIGANDOS QUE TIENEN ESPECIFICIDAD DE ENLACE PARA DC-SIGN La presente invención se refiere a agentes que se enlazan a DC-SIGN. En particular, la presente invención se refiere a únicos dominios variables de inmunoglobulina que se enlazan a DC-SIGN. La invención se refiere además a los usos, formulaciones, composiciones y dispositivos que comprenden los agentes de enlace de DC-SIGN.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN No integrina de sujeción de ICAM-3 específica de células dendríticas (DC-SIGN o CD209) es una proteína de membrana tipo II que es una lectina dependiente de calcio (tipo-C) específica de mañosa. DC-SIGN media las interacciones entre las células dendríticas (DCs) y las células-T, y comparte el 77 por ciento de homología con la molécula relacionada, DC-SIGNR. Se ha demostrado que tanto DC-SIGN como DC-SIGNR se enlazan al VIH, a las glicoproteínas de hepatitis C, a las proteínas de glicol del virus de Ébola, y a la proteína de adhesión celular ICAM-3. DC-SIGN se expresa únicamente en las células dendríticas, mientras que DC-SIGNR se encuentra en las células endoteliales del hígado, en los senos de los ganglios linfáticos, y en las células endoteliales de la placenta. Las células dendríticas (DCs) son células presentadoras de antígeno especializadas capaces de activar los linfocitos-T puros y de memoria. El aprovechamiento de sus propiedades ha llegado a ser el enfoque de las estrategias inmunoterapéuticas contra la enfermedad, incluyendo cáncer.

Se han producido anticuerpos que se enlazan a DC-SIGN, pero existe una necesidad de mejores agentes de enlace.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la invención proporciona un único dominio variable de inmunoglobulina anti-no integrina de sujeción de ICAM-3 específica de células dendríticas (DC-SIGN; CD209).

En una modalidad, el único dominio variable de inmunoglobulina se enlaza al DC-SIGN humano con una constante de disociación (Kd) de 1 a 50 µ?, como se determina mediante resonancia de plasmón superficial.

En un aspecto, la invención proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es cuando menos el 70, 75, 80, 85 ó 90 por ciento idéntica a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de LIP1-12, LIP1-13, LIP1-15, LIP1-17, LIP1-19, LIP1-21, LIP1-22, LIP1-23, LIP1-24, LIP1-25, LIP1-26, LIP1-27, LIP1-28, LIP1-29, LIP1-30, LIP1-31, LIP1-32 o LIP1-33, como se muestra en la Figura 4 y como se estipula en las SEQ ID NOs: 19 a 36. En una modalidad, el porcentaje de identidad es de cuando menos el 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ó 99 por ciento. En una modalidad, el polipéptido es cualquiera de LIP1-12, LIP1-13, LIP1-15, LIP1-17, LIP1-19, LIP1-21, LIP1-22, LIP1-23, LIP1-24, LIP1-25, LIP1-26, LIP1-27, LIP1-28, LIP1-29, LIP1-30, LIP1-31, LIP1-32 o LIP1-33. La invención proporciona además cualquier monómero de LIP1-12, LIP1-13, LIP1-15, LIP1-17, LIP1-19, LIP1-21, LIP1-22, LIP1-23, LIP1-24, LIP1-25, LIP1-26, LIP1-27, LIP1-28, LIP1-29, LIP1-30, LIP1-31, LIP1-32 o LIP1-33 (sustancialmente) puro. En una modalidad, cualquiera de LIP1-12, LIP1-13, LIP1-15, LIP1-17, LIP1-19, LIP1-21, LIP1-22, LIP1-23, LIP1-24, LIP1-25, LIP1-26, LIP1-27, LIP1-28, LIP1-29, LIP1-30, LIP1-31, LIP1-32 o LIP1-33 es un monómero cuando menos el 98, 99, 99.5 por ciento puro o el 100 por ciento puro. De una manera adecuada, el polipéptido se enlaza al DC-SIGN.

En un aspecto, la invención proporciona un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos que es cuando menos el 60, 65, 70, 75 u 80 por ciento idéntica a la secuencia de nucleótidos de cualquiera de LIP1-12, LIP1-13, LIP1-15, LIP1-17, LIP1-19, LIP1-21, LIP1-22, LIP1-23, LIP1-24, LIP1-25, LIP1-26, LIP1-27, LIP1-28, LIP1-29, LIP1-30, LIP1-31, LIP1-32 o LIP1-33, como se muestra en la Figura 3 y como se estipula en las SEQ ID NOs: 1 a 18. En una modalidad, el porcentaje de identidad es de cuando menos el 70, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ó 99 por ciento. De una manera adecuada, el polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos se enlaza al DC-SIGN.

En un aspecto, la invención proporciona un único dominio variable de inmunoglobulina anti-no integrina de sujeción de ICAM-3 específica de células dendríticas (DC-SIGN; CD209), el cual comprende una secuencia de aminoácidos que es cuando menos el 70, 75, 80, 85 ó 90 por ciento idéntica a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de LIP1-12, LIP1-13, LIP1-15, LIP1-17, LIP1-19, LIP1-21, LIP1-22, LIP1-23, LIP1-24, LIP1-25, LIP1-26, LIP1-27, LIP1-28, LIP1-29, LIP1-30, LIP1-31, LIP1-32 o LIP1-33. En una modalidad, el porcentaje de identidad es de cuando menos el 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ó 99 por ciento.

En un aspecto, la invención proporciona un único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN, el cual comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de LIP1-12, LIP1-13, LIP1-15, LIP1-17, LIP1-19, LIP1-21, LIP1 -.22, LIP1-23, LIP1-24, LIP1-25, LIP1-26, LIP1-27, LIP1-28, LIP1-29, LIP1-30, LIP1-31, LIP1-32 o LIP1-33, como se muestra en la Figura 4 y como se estipula en las SEQ ID NOs: 19 a 36.

En un aspecto, la invención proporciona, un único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN, el cual comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de LIP1-29. En otro aspecto, la invención proporciona un único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN, el cual comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de Ll P1 -30.

En un aspecto, la invención proporciona un único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN, el cual comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de LIP1-12, LIP1-13, LIP1-15, LIP1-17, LIP1-19, LIP1-21, LIP1-22, LIP1-23, LIP1-24, LIP1-25, LIP1-26, LIP1-27, LIP1-28, LIP1-29, LIP1-30, LIP1-31, LIP1-32 o LIP1-33, o que difiere de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de LIP1-12, LIP1-13, LIP1-15, LIP1-17, LIP1-19, LIP1-21, LIP1-22, LIP1-23, LIP1- 24, LIP1-25, LIP1-26, LIP1-27, LIP1-28, LIP1-29, LIP1-30, LIP1-31, LIP1-32 o LIP1-33 en no más de 25 posiciones de aminoácidos, y tiene una secuencia de CDR1 que es cuando menos el 50 por ciento idéntica a la secuencia de CDR1 de cualquiera de LIP1-12, LIP1-13, LIP1-15, LIP1-17, LIP1-19, LIP1-21, LIP1-22, LIP1-23, LIP1-24, LIP1- 25, LIP1-26, LIP1-27, LIP1-28, LIP1-29, LIP1-30, LIP1-31, LIP1-32 o LIP1-33. En una modalidad, la diferencia no es de más de 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1 posiciones de aminoácidos. En una modalidad, la identidad de secuencia de CDR es de cuando menos el 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ó 99 por ciento.

En un aspecto, la invención proporciona un único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN, el cual comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de LIP1-12, LIP1-13, LIP1-15, LIP1-17, LIP1-19, LIP1-21, LIP1-22, LIP1-23, LIP1-24, LIP1-25, LIP1-26, LIP1-27, LIP1-28, LIP1-29, LIP1-30, LIP1-31, LIP1-32, LIP1-33, o que difiere de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de LIP1-12, LIP1-13, LIP1-15, LIP1-17, LIP1-19, LIP1-21, LIP1-22, LIP1-23, LIP1-24, LIP1-25, LIP1-26, LIP1-27, LIP1-28, LIP1-29, LIP1-30, LIP1-31, LIP1-32, LIP1-33 en no más de 25 posiciones de aminoácidos, y tiene una secuencia de CDR2 que es cuando menos el 50 por ciento idéntica a la secuencia de CDR2 de cualquiera de LIP1-12, LIP1-13, LIP1-15, LIP1-17, LIP1-19, LIP1-21, LIP1-22, LIP1-23, LIP1-24, LIP1-25, LIP1-26, LIP1-27, LIP1-28, LIP1-29, LIP1-30, LIP1-31, LIP1-32, LIP1-33. En una modalidad, la diferencia no es de más de 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1 posiciones de aminoácidos. En una modalidad, la identidad de secuencia de CDR es de cuando menos el 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ó 99 por ciento. En un aspecto, la invención proporciona un único dominio variable de inmunogiobulina anti-DC-SIGN, el cual comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de LIP1-12, LIP1-13, LIP1-15, LIP1-17, LIP1-19, LIP1-21, LIP1-22, LIP1-23, LIP1-24, LIP1-25, LIP1-26, LIP1-27, LIP1-28, LIP1-29, LIP1-30, LIP1- 31, Ll P 1 -32 , LIP1-33, o que difiere de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de LIP1-12, LIP1-13, LIP1-15, LIP1-17, LIP1-19, LIP1-21, LIP1-22, LIP1-23, LIP1-24, LIP1-25, LIP1-26, LIP1-27, LIP1-28, LIP1-29, LIP1-30, LIP1-31, LIP1-32, LIP1-33 en no más de 25 posiciones de aminoácidos, y tiene una secuencia de CDR3 que es cuando menos el 50 por ciento idéntica a la secuencia de CDR3 de cualquiera de LIP1-12, LIP1-13, LIP1-15, LIP1-17, LIP1-19, LIP1-21, LIP1-22, LIP1-23, LIP1-24, LIP1-25, LIP1-26, LIP1-27, LIP1-28, LIP1-29, LIP1-30, LIP1-31, LIP1-32, LIP1-33. En una modalidad, la diferencia no es de más de 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1 posiciones de aminoácidos. En una modalidad, la identidad de secuencia de CDR es de cuando menos el 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ó 99 por ciento.

En un aspecto, la invención proporciona un único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN, el cual comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de LIP1-12, LIP1-13, LIP1-15, LIP1-17, LIP1-19, LIP1-21, LIP1-22, LIP1-23, LIP1-24, LIP1-25, LIP1-26, LIP1-27, LIP1-28, LIP1-29, LIP1-30, LIP1-31, LIP1-32, LIP1-33, o que difiere de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de LIP1-12, LIP1-13, LIP1-15, LIP1-17, LIP1-19, LIP1-21, LIP1-22, LIP1-23, LIP1-24, LIP1-25, LIP1-26, LIP1-27, LIP1-28, LIP1-29, LIP1-30, LIP1-31, LIP1-32, LIP1-33 en no más de 25 posiciones de aminoácidos, y tiene una secuencia de CDR1 que es cuando menos el 50 por ciento idéntica a la secuencia de CDR1 de cualquiera de Ll P 1 -12, LIP1-13, LIP1-15, LIP1-17, LIP1-19, LIP1-21, LIP1-22, LIP1-23, LIP1-24, LIP1-25, LIP1-26, LIP1-27, LIP1-28, LIP1-29, LIP1-30, LIP1-31, LIP1-32, LIP1-33, y tiene una secuencia de CDR2 que es cuando menos el 50 por ciento idéntica a la secuencia de CDR2 de cualquiera de LIP1-12, LIP1-13, LIP1-15, LIP1-17, LIP1-19, LIP1-21, LIP1-22, LIP1-23, LIP1-24, LIP1-25, LIP1-26, LIP1-27, LIP1-28, LIP1-29, LIP1-30, LIP1-31, LIP1-32, LIP1-33. En una modalidad, la diferencia no es de más de 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1 posiciones de aminoácidos. En una modalidad, la identidad de secuencia de CDR es de cuando menos el 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ó 99 por ciento. En un aspecto, la invención proporciona un único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN, el cual comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de LIP1-12, LIP1-13, LIP1-15, LIP1-17, LIP1-19, LIP1-21, LIP1-22, LIP1-23, LIP1-24, LIP1-25, LIP1-26, LIP1-27, LIP1-28, LIP1-29, LIP1-30, LIP1-31, LIP1-32, LIP1-33, o que difiere de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de LIP1-12, LIP1-13, LIP1-15, LIP1-17, LIP1-19, LIP1-21, LIP1-22, LIP1-23, LIP1-24, LIP1-25, LIP1-26, LIP1-27, LIP1-28, LIP1-29, LIP1-30, LIP1-31, LIP1-32, LIP1-33 en no más de 25 posiciones de aminoácidos, y tiene una secuencia de CDR1 que es cuando menos el 50 por ciento idéntica a la secuencia de CDR1 de cualquiera de LIP1-12, LIP1-13, LIP1-15, LIP1-17, LIP1-19, LIP1-21, LIP1-22, LIP1-23, LIP1-24, LIP1-25, LIP1-26, LIP1-27, LIP1-28, LIP1-29, LIP1-30, LIP1-31, LIP1-32, LIP1-33, y tiene una secuencia de CDR3 que es cuando menos el 50 por ciento idéntica a la secuencia de CDR3 de cualquiera de LIP1-12, LIP1-13, LIP1-15, LIP1-17, LIP1-19, LIP1-21, LIP1-22, LIP1-23, LIP1-24, LIP1-25, LIP1-26, LIP1-27, LIP1-28, LIP1-29, LIP1-30, LIP1-31, LIP1-32, LIP1-33. En una modalidad, la diferencia no es de más de 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1 posiciones de aminoácidos. En una modalidad, la identidad de secuencia de CDR es de cuando menos el 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ó 99 por ciento.

En un aspecto, la invención proporciona un único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN, el cual comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de LIP1-12, LIP1-13, LIP1-15, LIP1-17, LIP1-19, LIP1-21, LIP1-22, LIP1-23, LIP1-24, LIP1-25, LIP1-26, LIP1-27, LIP1-28, LIP1-29, LIP1-30, LIP1-31, LIP1-32, LIP1-33, o que difiere de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de LIP1-12, LIP1-13, LIP1-15, LIP1-17, LIP1-19, LIP1-21, LIP1-22, LIP1-23, LIP1- 24, LIP1-25, LIP1-26, LIP1-27, LIP1-28, LIP1-29, LIP1-30, LIP1-31, LIP1-32, LIP1-33 en no más de 25 posiciones de aminoácidos, y tiene una secuencia de CDR2 que es cuando menos el 50 por ciento idéntica a la secuencia de CDR2 de cualquiera de LIP1-12, LIP1-13, LIP1-15, LIP1-17, LIP1-19, LIP1-21, LIP1-22, LIP1-23, LIP1-24, LIP1- 25, LIP1-26, LIP1-27, LIP1-28, LIP1-29, LIP1-30, LIP1-31, LIP1-32, LIP1-33, y tiene una secuencia de CDR3 que es cuando menos el 50 por ciento idéntica a la secuencia de CDR3 de cualquiera de LIP1-12, LIP1-13, LIP1-15, LIP1-17, LIP1-19, LIP1-21, LIP1-22, LIP1-23, LIP1-24, LIP1-25, LIP1-26, LIP1-27, LIP1-28, LIP1-29, LIP1-30, LIP1-31, LIP1-32, LIP1-33. En una modalidad, la diferencia no es de más de 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1 posiciones de aminoácidos. En una modalidad, la identidad de secuencia de CDR es de cuando menos el 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ó 99 por ciento.

En un aspecto, la invención proporciona un único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN, el cual comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de LIP1-12, LIP1-13, LIP1-15, LIP1-17, LIP1-19, LIP1-21, LIP1-22, LIP1-23, LIP1-24, LIP1-25, LIP1-26, LIP1- 27, LIP1-28, LIP1-29, LIP1-30, LIP1- 31, LIP1-32, LIP1-33, o que difiere de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de LIP1-12, LIP1-13, LIP1-15, LIP1-17, LIP1-19, LIP1-21, LIP1-22, LIP1-23, LIP1- 24, LIP1-25, LIP1-26, LIP1-27, LIP1-28, LIP1-29, LIP1-30, LIP1-31, LIP1-32, LIP1-33 en no más de 25 posiciones de aminoácidos, y tiene una secuencia de CDR1 que es cuando menos el 50 por ciento idéntica a la secuencia de CDR1 de cualquiera de LIP1-12, LIP1-13, LIP1-15, LIP1-17, LIP1-19, LIP1-21, LIP1-22, LIP1-23, LIP1-24, LIP1- 25, LIP1-26, LIP1-27, LIP1-28, LIP1-29, LIP1-30, LIP1-31, LIP1-32, LIP1-33, y tiene una secuencia de CDR2 que es cuando menos el 50 por ciento idéntica a la secuencia de CDR2 de cualquiera de LIP1-12, LIP1-13, LIP1-15, LIP1-17, LIP1-19, LIP1-21, LIP1-22, LIP1-23, LIP1-24, LIP1-25, LIP1-26, LIP1-27, LIP1-28, LIP1-29, LIP1-30, LIP1-31, LIP1-32, LIP1-33, y tiene una secuencia de CDR3 que es cuando menos el 50 por ciento idéntica a la secuencia de CDR3 de cualquiera de LIP1-12, LIP1-13, LIP1-15, LIP1-17, LIP1-19, LIP1-21, LIP1-22, LIP1-23, LIP1-24, LIP1-25, LIP1-26, LIP1-27, LIP1-28, LIP1-29, LIP1-30, LIP1-31, LIP1-32, LIP1-33. En una modalidad, la diferencia no es de más de 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1 posiciones de aminoácidos. En una modalidad, la identidad de secuencia de CDR es de cuando menos el 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ó 99 por ciento.

En un aspecto, la invención proporciona un único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN, el cual comprende la secuencia de CDR3 a partir de cualquiera de LIP1-12, LIP1-13, LIP1-15, LIP1-17, LIP1-19, LIP1-21, LIP1-22, LIP1-23, LIP1-24, LIP1-25, LIP1-26, LIP1-27, LIP1-28, LIP1-29, LIP1-30, LIP1-31, LIP1-32 o LIP1-33, o una secuencia de CDR3 que es cuando menos el 50 por ciento idéntica a la secuencia de CDR3 de cualquiera de LIP1-12, LIP1-13, LIP1-15, LIP1-17, LIP1-19, LIP1-21, LIP1-22, LIP1-23, LIP1-24, LIP1-25, LIP1-26, LIP1-27, LIP1-28, LIP1-29, LIP1-30, LIP1-31, LIP1-32, LIP1-33. En una modalidad, la diferencia no es de más de 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1 posiciones de aminoácidos. En una modalidad, la identidad de secuencia de CDR es de cuando menos el 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ó 99 por ciento. En una modalidad, un único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN comprende una secuencia de CDR3 a partir de cualquiera de LIP1-12, LIP1-13, LIP1-15, LIP1-17, LIP1-19, LIP1-21, LIP1-22, LIP1-23, LIP1-24, LIP1-25, LIP1-26, LIP1-27, LIP1-28, LIP1-29, LIP1-30, LIP1-31, LIP1-32 o LIP1-33. En otro aspecto, la invención proporciona un único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN, el cual comprende la secuencia de CDR1, CDR2, y/o CDR3 (por ejemplo, CDR1, CDR2, CDR3, CDR1 y 2, CDR1 y 3, CDR2 y 3 o CDR1, 2 y 3) de cualquiera de LIP1-12, LIP1-13, LIP1-15, LIP1-17, LIP1-19, LIP1-21, LIP1-22, LIP1-23, LIP1-24, LIP1-25, LIP1-26, LIP1-27, LIP1-28, LIP1-29, LIP1-30, LIP1-31, LIP1-32, LIP1-33. En una modalidad, las secuencias de CDR 1, 2 ó 3 para cualesquiera únicos dominios variables de inmunoglobulina anti-DC-SIGN de acuerdo con la invención, son como se estipulan en las Figuras 5, 6 u 8. En una modalidad de cualquier aspecto de la invención, el único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN se enlaza al DC-SIGN.

En una modalidad, el único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN de acuerdo con cualquier aspecto de la invención, se enlaza a específicamente al DC-SIGN pero no al DC-SIGNR.

En una modalidad, el único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN de acuerdo con cualquier aspecto de la invención, se enlaza al DC-SIGN con una baja afinidad. En una modalidad, la afinidad del único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN de acuerdo con la invención por el DC-SIGN es de 1 µ? o más alta.

En otro aspecto, la invención proporciona un ligando que tiene especificidad de enlace por el DC-SIGN, e inhibe el enlace de un único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN que tiene la secuencia de aminoácidos de cualquiera de LIP1-12, LIP1-13, LIP1-15, LIP1-17, LIP1-19, LIP1-21, LIP1-22, LIP1-23, LIP1-24, LIP1-25, LIP1-26, LIP1-27, LIP1-28, LIP1-29, LIP1-30, LIP1-31, LIP1-32 o LIP1-33 al DC-SIGN.

En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN cuyo único dominio variable de inmunoglobulina tiene la especificidad de enlace de cualquiera de LIP1-12, LIP1-13, LIP1-15, LIP1-17, LIP1-19, LIP1-21, LIP1-22, LIP1-23, LIP1-24, LIP1-25, LIP1-26, LIP1-27, LIP1-28, LIP1-29. LIP1-30, LIP1-31, LIP1-32 o LIP1-33, es decir, de cualquiera de las SEQ ID NOs: 19 a 36.

En una modalidad, la secuencia de aminoácidos del polipéptido o del único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN de acuerdo con la invención, puede comprender aminoácidos adicionales en el extremo N- o C-terminal para facilitar la expresión y/o el uso del polipéptido o del único dominio variable. En una modalidad, el polipéptido o el único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN puede comprender aminoácidos ST N-terminales para la secuencia de aminoácidos como se estipula en cualquiera de las SEQ ID NOs: 19 a 36. En otra modalidad, el polipéptido o el único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN puede comprender una secuencia de marca, tal como una marca de polihistidina (marca-His). En una modalidad, el polipéptido o el único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN puede comprender una marca-His e el término C.

En un aspecto, la invención proporciona un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos que es cuando menos el 80 por ciento idéntica a la secuencia de nucleótidos de cualquiera de LIP1-12, LIP1-13, LIP1-15, LIP1-17, LIP1-19, LIP1-21, LIP1-22, LIP1-23, LIP1-24, LIP1-25, LIP1-26, LIP1-27, LIP1-28, LIP1-29, LIP1-30, LIP1-31, LIP1-32 o LIP1-33, como se muestra en la Figura 3 y como se estipula en las SEQ ID NOs: 1 a 18, y en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es cuando menos el 90 por ciento idéntica a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de LIP1-12, LIP1-13, LIP1-15, LIP1-17, LIP1-19, LIP1-21, LIP1-22, LIP1-23, LIP1-24, LIP1-25, LIP1-26, LIP1-27, LIP1-28, LIP1-29, LIP1-30, LIP1-31, LIP1-32 o LIP1-33. En una modalidad, el porcentaje de identidad de la secuencia de nucleótidos es de cuando menos el 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ó 99 por ciento. En una modalidad, el porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos es de cuando menos el 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ó 99 por ciento ó el 100 por ciento. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos puede ser una versión con los codones optimizados de la secuencia de nucleótidos de cualquiera de LIP1-12, LIP1-13, LIP1-15, LIP1-17, LIP1-19, LIP1-21, LIP1-22, LIP1-23, LIP1-24, LIP1-25, LIP1-26, LIP1-27, LIP1-28, LIP1-29, LIP1-30, LIP1-31, LIP1-32 O LIP1-33. La optimización de codones de las secuencias se conoce en la materia. En una modalidad, la secuencia de nucleótidos se optimiza para la expresión en una célula huésped bacteriana (por ejemplo, E. coli o Pseudomonas, por ejemplo, P. fluorescens), de mamífero (por ejemplo, CHO), o de levadura (por ejemplo, Picchia o Saccharomyces, por ejemplo, P. pastoris o S. cerevisiae).

En un aspecto, la invención proporciona una proteína de fusión, la cual comprende el polipéptido de la invención. En un aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante que codifica un polipéptido que comprende un único dominio variable de inmunoglobulina de acuerdo con cualquier aspecto de la invención. En un aspecto, la invención proporciona un vector, el cual comprende el ácido nucleico. En una modalidad, el vector es un vector de expresión, el cual comprende una secuencia líder, tal como una secuencia líder GAS (como se describe, por ejemplo, en la Publicación Internacional Número WO 2005/093074) para asegurar la expresión en el sobrenadante celular. En un aspecto, la invención proporciona una célula huésped, la cual comprende el ácido nucleico o el vector. En una modalidad, la célula huésped es E. Coli. Las cepas de E. Coli adecuadas serán familiares para los expertos en este campo, e incluyen, por ejemplo, células HB2151 o células BL21. En un aspecto, la invención proporciona un método para la producción de un polipéptido que comprende un único dominio variable de inmunoglobulina, comprendiendo el método mantener la célula huésped bajo condiciones adecuadas para la expresión del ácido nucleico o vector, en donde se produce un polipéptido que comprende un único dominio variable de inmunoglobulina. El método puede comprender además la purificación del polipéptido. El método puede comprender además aislar el polipéptido, el dominio variable, o el agente de enlace, y opcionalmente producir una variante, por ejemplo, una variante mutada, que tenga una mejor afinidad y/o ND50 (dosis neutralizante del 50 por ciento) que el polipéptido aislado, el dominio variable, o el agente de enlace. Las técnicas para mejorar la afinidad de enlace de los únicos dominios variables de inmunoglobulina son conocidas en la materia, por ejemplo, las técnicas para maduración de afinidad.

En un aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica, la cual comprende un único dominio variable de inmunoglobulina, polipéptido, o agente de enlace de acuerdo con cualquier aspecto de la invención, y un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.

En una modalidad, el único dominio variable de inmunoglobulina de acuerdo con la invención comprende un dominio constante de anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo Fe, opcionalmente en donde el término N del Fe se enlaza (de una manera opcional, se enlaza directamente) al término C del dominio variable.

El polipéptido o el dominio variable de la invención se puede aislar y/o puede ser recombinante.

En un aspecto, se proporciona un agente de enlace de DC-SIGN, el cual comprende un polipéptido o el dominio variable de acuerdo con cualquier aspecto de la invención. De una manera adecuada un " agente de enlace de DC-SIGN" es un agente que se enlaza al DC-SIGN y que comprende un único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN de acuerdo con la invención. En una modalidad, el agente de enlace es un único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN en un vehículo. De una manera adecuada el vehículo puede ser un vehículo basado en lípido, tal como una vesícula de membrana o un liposoma. En una modalidad, el único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN es llevado por un vehículo o está sobre un vehículo.

En una modalidad, la composición que comprende un único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN en un vehículo, confiere un aumento de la vida media al único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN.

En otro aspecto, se puede conferir un aumento de la vida media al único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN a través de la fusión con otra fracción.

Además se describe en la presente un kit de diagnóstico para determinar si está presente el DC-SIGN en una muestra, o cuánto DC-SIGN está presente en una muestra, el cual comprende un polipéptido, un dominio variable de inmunoglobulina (dAb) o el agente de enlace de la invención, e instrucciones para su uso (por ejemplo, para determinar la presencia y/o la cantidad de DC-SIGN en la muestra). En algunas modalidades, el kit comprende además uno o más reactivos auxiliares, tales como un regulador adecuado o un reactivo de detección adecuado (por ejemplo, un anticuerpo detectablemente marcado, o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, que se enlaza el polipéptido o al dAb de la invención, o a una fracción asociada o conjugada con el mismo).

La invención también se refiere a un dispositivo que comprende una superficie sólida sobre la cual se inmoviliza un polipéptido, antagonista o dAb de la invención, de tal manera que el polipéptido o dAb inmovilizado se enlaza al DC-SIGN. Se puede utilizar cualquier superficie sólida adecuada sobre la cual se pueda inmovilizar un anticuerpo o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, por ejemplo, vidrio, plástico, carbohidratos (por ejemplo, perlas de agarosa). Si se desea el soporte puede contener, o se puede modificar para contener, los grupos funcionales deseados para facilitar la inmovilización. El dispositivo, y/o el soporte, puede tener cualquier forma adecuada, por ejemplo, una hoja, varilla, tira, placa, portaobjetos, perla, aglomerado, disco, gel, tubo, esfera, placa o plato, y similares. En algunas modalidades, el dispositivo es una barra de inmersión. En una modalidad, este dispositivo se puede utilizar para la purificación o el aislamiento de las células dendríticas.

En otro aspecto, se proporciona una composición que comprende un único dominio variable anti-DC-SIGN de acuerdo con la invención, para utilizarse como un medicamento. En una modalidad, el único dominio variable anti-DC-SIGN se puede utilizar en el suministro de los compuestos a las células dendríticas a través de su enlace específico al DC-SIGN. Un uso adecuado para este suministro puede ser en la generación de una respuesta inmunitaria. En particular, se puede generar una respuesta anti-tumoral. De conformidad con lo anterior, la invención proporciona una composición para utilizarse en el tratamiento de cáncer, por ejemplo, melanoma. En otro aspecto, la invención proporciona una composición para utilizarse en el tratamiento de infecciones, en donde el agente infeccioso entra a las células a través del enlace con DC-SIGN. Los ejemplos de estas infecciones incluyen infecciones virales, tales como VIH, Hepatitis C, y virus de Ébola. De conformidad con lo anterior, la invención proporciona además una composición que comprende un único dominio variable anti-DC-SIGN de acuerdo con la invención, para utilizarse en el tratamiento de VIH, Hepatitis C, o Ébola. La invención también proporciona el uso de una composición que comprende un único dominio variable anti-DC-SIGN de acuerdo con la invención, en la elaboración de un medicamento para utilizarse en el tratamiento de infecciones. La invención proporciona además un método para el tratamiento de cáncer o infección, el cual comprende administrar una composición que comprende un único dominio variable anti-DC-SIGN de acuerdo con la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra partículas de fagos de LIP1 que se enlazan a las placas recubiertas con DC-SIGN. Se prepararon las partículas de fagos a partir de los clones de LIP1 individuales, y se probaron las diluciones en serie de las partículas de fagos en ELISA. Los pozos del ELISA se recubrieron durante la noche a 4°C con DC-SIGN (de 1 a 10 microgramos/mililitro en suero regulado con fosfato o regulador de NaHC03 0.1 M, pH 9.6). Después de bloquear los pozos con suero regulado con fosfato que contiene leche descremada en polvo al 2 por ciento (PBSM), el fago se incubó en PBSM durante 1 hora. Después de lavar con suero regulado con fosfato, se detectaron los fagos enlazados utilizando un conjugado de peroxidasa de radícula roja con un anticuerpo monoclonal anti-M13 (Amersham) utilizando 3,3',5,5'-tetrametil-bencidina como el sustrato. HEL4 (Jespers y colaboradores, J. Mol. Biol. (2004) 337, 893-903), y VK simulado son controles negativos no enlazantes.

La Figura 2 muestra el enlace del fago de LIP1-33 al péptido de DC-SIGN y al DC-SIGN. Se prepararon partículas de fagos a partir de LIP1-33, y se probaron diluciones en serie de las partículas de fagos en ELISA. Los pozos del ELISA se recubrieron durante la noche a 4°C con DC-SIGNR, neutravidina, DC-SIGN, o el péptido de DC-SIGN (de 1 a 10 microgramos/mililitro en suero regulado con fosfato o regulador de NaHC03 0.1 M, pH de 9.6). Después de bloquear los pozos con suero regulado con fosfato que contiene leche descremada en polvo al 2 por ciento (PBSM), el fago se incubó en PBSM durante 1 hora. Después de lavar con suero regulado con fosfato, se detectaron los fagos enlazados utilizando un conjugado de peroxidasa de radícula roja con un anticuerpo monoclonal anti-M13 (Amersham) utilizando 3,3',5,5'-tetrametil-bencidina como el sustrato. HEL4 y VK simulado son controles negativos no enlazantes.

La Figura 3 muestra las secuencias de nucleótidos a partir de los dAbs VH y VK de LIP1. "~" indica los espacios que se han introducido en las secuencias presentadas en la Figura 3 para permitir la alineación de las secuencias del dAb.

La Figura 4 muestra secuencias de aminoácidos a partir de los dAbs VH y VK de LIP1. "~" indica los espacios que se han introducido en las secuencias presentadas en la Figura 4 para permitir la alineación de las secuencias del dAb.

La Figura 5 muestra la alineación de aminoácidos de las secuencias a partir de los dAbs VK de LIP1. La numeración de aminoácidos es de acuerdo con Kabat. Cuando se indica un punto (".") en la alineación, la secuencia del dAb es idéntica al primer dAb de referencia enlistado. Los aminoácidos variantes se indican mediante el código de aminoácidos de una sola letra. Las secuencias representadas en la presente también se muestran por completo en la Figura 4. Las secuencias realzadas en negrillas y subrayadas representan las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, consecutivamente. "-" indica los espacios que se han introducido en las secuencias presentadas en la Figura 5 para permitir la alineación de todas las secuencias de dAb.

La Figura 6 muestra la alineación de aminoácidos de las secuencias a partir de los dAbs VH de LIP1. La numeración de aminoácidos es de acuerdo con Kabat. Cuando se indica un punto (".") en la alineación, la secuencia del dAb es idéntica al primer dAb de referencia enlistado. Los aminoácidos variantes se indican mediante el código de aminoácidos de una sola letra. Las secuencias representadas en la presente también se muestran por completo en la Figura 4. Las secuencias realzadas en negrillas representan las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, consecutivamente. "-" indica los espacios que se han introducido en las secuencias presentadas en la Figura 5 para permitir la alineación de todas las secuencias de dAb.

La Figura 7 muestra la alineación del DC-SIGN humano contra el DC-SIGNR. Se indican los aminoácidos idénticos así como las sustituciones conservadoras. La homología para la proteína de longitud completa (A) es del 69 por ciento, y para el dominio de reconocimiento de carbohidratos (CRD) (B) es del 71 por ciento. Se muestra la secuencia de aminoácidos para el DC-SIGN (SEQ ID NO: 41) y el DC-SIGNR (SEQ ID NO: 42), junto con el dominio de reconocimiento de carbohidratos (CRD) para el DC-SIGN (SEQ ID NO: 39) y el DC-SIGNR (SEQ ID NO : 40).

La Figura 8 muestra las secuencias para CDR1, CDR2 y CDR3 de los dAbs VK y VH de LIP1.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En esta memoria descriptiva se ha descrito la invención con referencia a las modalidades, de una manera que hace posible que se escriba una memoria descriptiva clara y concisa. Se pretende y se debe apreciar que las modalidades se pueden combinar diversamente o se pueden separar sin apartarse de la invención.

A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que es entendido comúnmente por un experto ordinario en este campo (por ejemplo, en cultivo celular, genética molecular, química de ácidos nucleicos, técnicas de hibridación, y bioquímica). Se emplean técnicas convencionales para los métodos moleculares, genéticos, y bioquímicos (véase, en términos generales, Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. y Ausubel y colaboradores, Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4a Edición, John Wiley & Sons, Inc., las cuales se incorporan a la presente como referencia), y métodos químicos.

Como se utiliza en la presente, "péptido" se refiere a aproximadamente 2 a aproximadamente 50 aminoácidos que se unen entre sí por medio de enlaces peptídicos.

Como se utiliza en la presente, "polipéptido" se refiere a cuando menos aproximadamente 50 aminoácidos que se unen entre sí mediante enlaces peptídicos. Los polipéptidos en términos generales comprenden la estructura terciaria y se pliegan en dominios funcionales.

Un polipéptido, anticuerpo, porción biológicamente activa de los mismos, "aislado" o "purificado", está sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes a partir de la célula o de la fuente de tejido a partir de la cual se deriva el polipéptido, anticuerpo o porción biológicamente activa de los mismos, o está sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetizan químicamente. El lenguaje "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de polipéptidos, anticuerpos o porciones biológicamente activas de los mismos, en donde la proteína se separa de los componentes celulares de las células a partir de las cuales se aisla o se produce de una manera recombinante. En una modalidad, el lenguaje "sustancialmente libre de material celular" incluye las preparaciones de polipéptidos, anticuerpos, o porciones biológicamente activas de los mismos, que tienen menos de aproximadamente el 30 por ciento (en peso seco) de no anticuerpo (también referido en la presente como una "proteína contaminante"), en una instancia, menos de aproximadamente el 20 por ciento de proteína no de anticuerpo, en otra instancia, menos de aproximadamente el 10 por ciento de proteína no de anticuerpo, y en otra instancia, menos de aproximadamente el 5 por ciento de proteína no de anticuerpo. Cuando el polipéptido, anticuerpo, o porción biológicamente activa de los mismos, se purifica a partir de una fuente recombinante, también está sustancialmente libre del medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente el 20 por ciento, en una instancia menos de aproximadamente el 10 por ciento, y en otra instancia menos de aproximadamente el 5 por ciento del volumen de la preparación de proteína.

La no integrina de sujeción de ICAM-3 específica de células dendríticas (DC-SIGN o CD209) es una proteína de membrana tipo II que es lectina dependiente de calcio (tipo-C) específica de mañosa. DC-SIGN media las interacciones entre las células dendríticas (DCs) y las células-T, y es descrita, por ejemplo, por Geijtenbeek y colaboradores, Cell (2000); 100, 565-585, Soilleux, Clinical Science (2003), 104, 437-446 dándose los datos de secuencia en NM_021155 (ARNm), y NP 066978 (proteína). La secuencia de aminoácidos para el DC-SIGN humano también se muestra en la Figura 7 (SEQ ID NO: 41). De una manera adecuada, el único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN de la invención se puede presentar en cualquier formato de anticuerpo.

Como se utiliza en la presente, un anticuerpo se refiere a IgG, IgM, IgA, IgD o IgE, o a un fragmento (tal como un Fab, F(ab')2, Fv, Fv enlazado por disulfuro, scFv, anticuerpo multiespecífico de conformación cerrada, scFv enlazado por disulfuro, diacuerpo) ya sea derivado a partir de cualquier especie que produzca naturalmente un anticuerpo, o bien creado mediante tecnología de ADN recombinante; ya sea aislado a partir de suero, células-B, hibridomas, transfectomas, levadura, o bacterias.

Como se utiliza en la presente, "formato de anticuerpo" se refiere a cualquier estructura de polipéptido adecuada en donde se pueden incorporar uno o más únicos dominios variables de anticuerpos anti-DC-SIGN, para conferir especificidad de enlace para el antígeno sobre la estructura. Una variedad de formatos de anticuerpos adecuados son conocidos en la materia, tales como anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, anticuerpos de una sola cadena, anticuerpos biespecíficos, cadenas pesadas de anticuerpos, cadenas ligeras de anticuerpos, homodímeros y heterodímeros de cadenas pesadas y/o cadenas ligeras de anticuerpos, fragmentos de enlace de antígeno de cualquiera de los anteriores (por ejemplo, un fragmento Fv (por ejemplo, Fv de una sola cadena (scFv), un Fv enlazado por disulfuro), un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2), un solo dominio variable de anticuerpo (por ejemplo, un dAb, VH, VHH, VK, Vu), y las versiones modificadas de cualquiera de los anteriores (por ejemplo, modificadas mediante la unión covalente de polietilenglicol u otro polímero adecuado, o una VHH humanizada).

Los dominios variables de acuerdo con la invención, se pueden combinar en estructuras de múltiples ligandos no de inmunoglobulina para formar complejos multivalentes, que se enlazan con las moléculas objetivo con el mismo antígeno, proporcionando de esta manera una avidez superior, mientras que cuando menos un dominio variable se enlaza a un antígeno para aumentar la vida media del multímero. Por ejemplo, se han utilizado receptores bacterianos naturales, tales como SpA como andamiajes para el injerto de CDRs para generar ligandos que se enlazan específicamente a uno o más epítopos. Los detalles de este procedimiento se describen en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US 5,831,012. Otros andamiajes adecuados incluyen aquéllos basados en fibronectina y AffíbodiesMB. Los detalles de los procedimientos adecuados se describen en la Publicación Internacional Número WO 98/58965. Otros andamiajes adecuados incluyen lipocalina y CTLA4, como se describe en van den Beuken y colaboradores, J. Mol. Biol. (2001) 310, 591-601, y los andamiajes tales como aquéllos descritos en la Publicación Internacional Número WO00/69907 (Medical Research Council), los cuales se basan, por ejemplo, en la estructura del anillo del GroEL bacteriano, u otros polipéptidos chaperones.

La frase "único dominio variable de inmunoglobulina" se refiere a un anticuerpo el dominio variable (VH, VHH, VK, Vl) que se enlaza específicamente a un antígeno o epítopo independientemente de otras regiones o dominios V. Los únicos dominios variables de inmunoglobulina de la invención también se describen en la presente como ligandos siempre que sean ligandos de enlace para el DC- SIGN. Un único dominio variable de inmunoglobulina "anti-DC-SIGN" es uno que reconoce DC-SIGN o se enlaza específicamente al DC-SIGN. En una modalidad, DC-SIGN es el DC-SIGN humano. Un único dominio variable de inmunoglobulina puede estar presente en un formato (por ejemplo, homo- o hetero-multímero) con otras regiones variables o dominios variables en donde las otras regiones o dominios no son requeridos para el enlace de antígeno por el único dominio variable de inmunoglobulina (es decir, en donde el único dominio variable de inmunoglobulina se enlaza a un antígeno independientemente de los dominios variables adicionales). Un "anticuerpo de dominio" o "dAb" es lo mismo que un "único dominio variable de inmunoglobulina" como se utiliza el término en la presente. Un "único dominio variable de inmunoglobulina" es lo mismo que un "dominio variable de inmunoglobulina único" como se utiliza el término en la presente. Un "único dominio variable de anticuerpo" o un "dominio variable de anticuerpo único" es lo mismo que un "único dominio variable de inmunoglobulina" como se utiliza el término en la presente. Un único dominio variable de inmunoglobulina, en una modalidad, es un dominio variable de anticuerpo humano, pero también incluye los únicos dominios variables de anticuerpos a partir de otras especies, tales como dAbs VHH de roedor (por ejemplo, como se da a conocer en la Publicación Internacional Número WO 00/29004, el contenido de la cual se incorpora a la presente como referencia en su totalidad), tiburón nodriza, y camélido. VHH de camélido son polipéptidos del único dominio variable de inmunoglobulina que se derivan a partir de las especies que incluyen camello, llama, alpaca, dromedario, y guanaco, los cuales producen anticuerpos de la cadena pesada naturalmente desprovistos de cadenas ligeras. La VHH se puede humanizar.

Los anticuerpos de un solo dominio (polipéptidos de un solo dominio variable, dAbs) se pueden generar para tener excelentes propiedades biofísicas y proporcionar un número de ventajas sobre los anticuerpos monoclonales. Por ejemplo, se pueden generar dAbs para ser resistentes a la aglomeración, a la proteólisis, y a la desnaturalización, haciéndolos más sensibles al establecimiento clínico. Más aún, su formato les da más flexibilidad. También puede haber problemas de formateo y de elaboración significativos con los anticuerpos monoclonales (los cuales se producen a partir de células de expresión de mamífero), mientras que los dAbs se pueden producir más fácilmente. Un "dominio" es una estructura de proteína plegada que tiene una estructura terciara independiente del resto de la proteína. En términos generales, los dominios son responsables de las propiedades funcionales separadas de las proteínas, y en muchos casos se pueden agregar, remover o transferir a otras proteínas sin pérdida de función del resto de la proteína y/o del dominio. Un "único dominio variable de anticuerpo" es un dominio de polipéptido plegado que comprende secuencias características de los dominios variables de anticuerpos. Por consiguiente, incluye los dominios variables de anticuerpos completos y los dominios variables modificados, por ejemplo, en donde uno o más ciclos han sido reemplazados por secuencias que no son características de los dominios variables de anticuerpos, o los dominios variables de anticuerpos que han truncado o que comprenden extensiones N- o C-terminales, así como fragmentos plegados de los dominios variables que conservan cuando menos la actividad de enlace y la especificidad del dominio de longitud completa. El enlace, el enlace específico, y la afinidad de enlace de un agente de enlace, tal como un anticuerpo o un único dominio variable de inmunoglobulina, se puede determinar mediante la medición de la constante de disociación (Kd). Los métodos adecuados para determinar la Kd incluyen resonancia de plasmón superficial. Uno de estos métodos incluye el aparato Biacore disponible en GE. Otros métodos adecuados incluyen ELISA. Véase la Publicación Internacional Número WO2006038027 para conocer los detalles de la manera en que se llevan a cabo los experimentos de ELISA competitivo y BiaCore competitivo, para determinar la afinidad de enlace.

En un ejemplo, se prueba el enlace utilizando ELISA de fago monoclonal. El ELISA de fago se puede llevar a cabo de acuerdo con cualquier procedimiento adecuado. Típicamente, se pueden rastrear las poblaciones de fagos producidos en cada ronda de selección para determinar los fagos que expresen los agentes de enlace, para determinar el enlace mediante ELISA al antígeno o epítopo seleccionado, y para identificar los anticuerpos de fagos "policlonales". Entonces se pueden rastrear los fagos a partir de las colonias bacterianas infectadas individuales a partir de estas poblaciones mediante ELISA, para identificar los anticuerpos de fagos "monoclonales" . También es deseable rastrear los fragmentos de anticuerpos solubles para enlazarse al antígeno o epítopo, y esto también se puede emprender mediante ELISA utilizando reactivos, por ejemplo, contra una marca C- o N-terminal (véase, por ejemplo, Winter y colaboradores (1994) Ann. Rev. Immunology 12, 433-55 y las referencias citadas en el mismo). En una modalidad, el ELISA de fagos se puede llevar a cabo en la presencia de proteína L o proteína A.

En ciertas modalidades, el polipéptido, anticuerpo, único dominio variable de inmunoglobulina o dAb, se enlaza específicamente al DC-SIGN, por ejemplo, al DC-SIGN humano, y se disocia del DC-SIGN humano con una constante de disociación (Kd) de 300 nM a 1 pM, o de 300 nM a 5 pM, o de 50 nM a 1 pM, o de 50 nM a 5 pM, o de 50 nM a 20 pM, o de aproximadamente 10 pM, o de aproximadamente 15 pM, o de aproximadamente 20 pM, como se determina mediante resonancia de plasmón superficial. En otras modalidades, el polipéptido, anticuerpo, único dominio variable de inmunoglobulina o dAb, se enlaza específicamente al DC-SIGN, por ejemplo, al DC-SIGN humano, y se disocia del DC-SIGN humano con una constante de disociación (Kd) de 400 nM a 1 µ?, o de 500 nM a 1 µ?, o de 600 nM a 1 µ?, o de 700 nM a 1 µ?, o de 800 nM a 1 µ?, o de 900 nM a 1 µ?. En otras modalidades, el polipéptido, anticuerpo, único dominio variable de inmunoglobulina o dAb, se enlaza específicamente al DC-SIGN, por ejemplo, al DC-SIGN humano, y se disocia del DC-SIGN humano con una constante de disociación (Kd) de 1 a 2 µ?, o de 1 µ? a 5 µ , o de 1 µ? a 10 µ , 0 de 5 µ? a 10 µ?, o de 10 a 20, 30, 40, o 50 µ?. En ciertas modalidades, el polipéptido, anticuerpo, único dominio variable de inmunoglobulina o dAb, se enlaza específicamente al DC-SIGN, por ejemplo, al DC-SIGN humano, y se disocia del DC-SIGN humano con una constante de índice K de 5 x 10'' s"1 a 1 x 10"7 s'1, o de 1 x 10'3 s"1 a 1 x 10'7 s \ o de 1 x 10"4 s"1 a 1 x 10"7 s"1, o de 1 x 10"5 s"1 a 1 x 10'7 s"\ o de 1 x 10"4 s"1, o de 1 x 10"5 s'1, como se determina mediante resonancia de plasmón superficial. En ciertas modalidades, el polipéptido, anticuerpo, único dominio variable de inmunoglobulina o dAb, se enlaza específicamente al DC-SIGN, por ejemplo, al DC-SIGN humano, con una Kactivada de 1 x 10'3 M"1s'1 a 1 x 10"7 M"1s"1, o de 1 x 10"3 M"1s'1 a 1 x 10"6 M"1s"1, o de aproximadamente 1 x 10'4 M'1s"\ o de aproximadamente 1 x 10'5 M"1s"1. En una modalidad, el polipéptido, anticuerpo, único dominio variable de inmunoglobulina o dAb, se enlaza específicamente al DC-SIGN, por ejemplo, al DC-SIGN humano, y se disocia del DC-SIGN humano con una constante de disociación (Kd), y una K como se define en este párrafo. En una modalidad, el polipéptido, anticuerpo, único dominio variable de inmunoglobulina o dAb, se enlaza específicamente al DC-SIGN, por ejemplo, al DC-SIGN humano, y se disocia del DC-SIGN humano con una constante de disociación (Kd), y a K como se define en este párrafo. En algunas modalidades, el polipéptido, anticuerpo, único dominio variable de ¡nmunoglobulina o dAb, se enlaza específicamente al DC-SIGN (por ejemplo, al DC-SIGN humano) con una Kd y/o Kdesaclivada y/o «activada como se menciona en este párrafo, y comprende una secuencia de aminoácidos que es de cuando menos, o cuando menos aproximadamente, el 80 por ciento, el 85 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, o el 99 por ciento idéntica a la secuencia de aminoácidos de LIP1-29. En una modalidad, un agente de enlace de "alta afinidad" es uno que, cuando está en una forma monomérica, se enlaza a una molécula de DC-SIGN expresada sobre una superficie celular, haciendo posible el enlace a una célula, tal como a una célula dendrítica.

Típicamente, un agente de enlace de "alta afinidad", tal como un polipéptido, anticuerpo, único dominio variable de inmuno-globulina o dAb, de acuerdo con la invención, es uno que se enlaza a la molécula, antígeno, o epítopo objetivo con un valor de afinidad de enlace (Kd) de no más de aproximadamente 300 nM a 1 pM, o de 300 nM a 5 pM, o de 50 nM a 1 pM, o de 50 nM a 5 pM, o de 50 nM a 20 pM, o de aproximadamente 10 pM, o de aproximadamente 15 pM, o de aproximadamente 20 pM. De una manera adecuada, un agente de enlace de "baja afinidad" de acuerdo con la presente invención es uno que se enlaza a la molécula o antígeno objetivo con un valor Kd de 400 nM a 1 µ?, o de 500 nM a 1 µ?, o de 600 nM a 1 µ?, o de 700 nM a 1 µ?, o de 800 nM a 1 µ?, o de 900 nM a 1 µ?. En otras modalidades, un agente de enlace de "baja afinidad" de acuerdo con la invención, se enlaza específicamente al DC-SIGN, por ejemplo, al DC-SIGN humano, y se disocia del DC-SIGN humano con una constante de disociación (Kd) de 1 a 2 µ?, o de 1 µ? a 5 µ?, o de 1 µ? a 10 µ?, o de 5 µ? a 10 µ?, o de 10 a 20, 30, 40 ó 50 µ?.

En una modalidad, la afinidad se puede determinar cuando los únicos dominios variables de inmunoglobulina de la invención se presentan en los fagos multivalentes o se reticulan con la proteína L.

Como se describe y se ejemplifica en la presente, los dAbs de la invención se pueden enlazar a su DC-SIGN objetivo con una baja afinidad. El uso de un único dominio variable de inmunoglobulina con una baja afinidad puede ser conveniente.

En particular, un número o una pluralidad de moléculas de único dominio variable de inmunoglobulina de baja afinidad se pueden combinar en un agente portador, de tal manera que se presentan un número de interacciones entre las moléculas de un solo dominio variable y sus moléculas de enlace cognadas. De esta manera, las moléculas de un solo dominio variable se pueden utilizar para las células objetivo que lleven un número o una pluralidad de moléculas de enlace cognadas. Por ejemplo, en donde se incorpore un agente de enlace de baja afinidad, tal como una molécula de un solo dominio variable de inmunoglobulina de la invención sobre una molécula portadora en un formato de múltiples exhibiciones, se deben enlazar múltiples agentes de enlace a múltiples moléculas de DC-SIGN con el fin de que el agente portador se enlace a, o se ponga en asociación con, la célula. Este agente portador convenientemente se enlazaría a las células con una alta expresión de DC-SIGN, y no a las células con una baja expresión de DC-SIGN. De esta manera, los agentes de enlace de baja afinidad de la invención se pueden utilizar para dirigirse hacia las células específicas y, en combinación, proporcionan un enlace global de alta afinidad. En adición, un vehículo que comprenda una pluralidad de únicos dominios variables de inmunoglobulina de baja afinidad, tendría una alta avidez por las células que tengan un alto número de copias de DC-SIGN, tales como las células dendríticas, mientras que tengan una avidez solamente débil por las células que tengan un bajo número de copias de DC-SIGN. Por consiguiente, este vehículo sería selectivo para las células que expresen niveles más altos de DC-SIGN.

Los vehículos adecuados se describen, por ejemplo, en la Publicación Internacional Número WO 2007/072022. En una modalidad, el vehículo presenta una pluralidad de los agentes de enlace de acuerdo con la invención. Por ejemplo, el vehículo puede presentar más de 100, o más de 1000 moléculas de un solo dominio variable de inmunoglobulina. De conformidad con lo anterior, en un aspecto de la invención, se proporciona una composición que comprende un dAb de baja afinidad en un formato de múltiples exhibiciones. Un formato de múltiples exhibiciones puede incluir un multímero de moléculas de un solo dominio variable de inmunoglobulina de acuerdo con la invención, así como un vehículo, el cual comprende una pluralidad de moléculas de un solo dominio variable de inmunoglobulina, como se describe anteriormente. En otro aspecto, se proporciona un agente de enlace del receptor de DC-SIGN, el cual comprende un único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN de acuerdo con la invención. De una manera adecuada, el agente de enlace puede ser una estructura que comprenda uno o más únicos dominios variables de inmunoglobulina anti-DC-SIGN exhibidos sobre su superficie.

El uso de las moléculas de único dominio variable de inmunoglobulina de baja afinidad en un formato de múltiples exhibiciones proporciona una formulación conveniente en donde no es necesario remover las moléculas de un solo dominio variable de inmunoglobulina o enlazadas que no se hayan incorporado sobre el vehículo a partir de una formulación de composición para la administración. Las moléculas de un solo dominio variable de inmunoglobulina libres se eliminan rápidamente in vivo. Cuando estas moléculas de un solo dominio variable de inmunoglobulina tienen una baja afinidad por su molécula de enlace cognada, tienen pocas probabilidades de enlazarse al receptor y, por consiguiente, tienen probabilidades de permanecer en la circulación libre, y se eliminarán.

Los cálculos de la "homología" o "identidad" o "similitud" entre dos secuencias (los términos se utilizan indistintamente en la presente) se llevan a cabo como sigue. Las secuencias se alinean para los propósitos de una comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir huecos en uno o ambos de una primera y una segunda secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos para la alineación óptima, y las secuencias no homologas se pueden pasar por alto para los propósitos de la comparación). En una modalidad, la longitud de una secuencia de referencia alineada para propósitos de comparación es cuando menos el 30 por ciento, o cuando menos el 40 por ciento, o cuando menos el 50 por ciento, o cuando menos el 60 por ciento, o cuando menos el 70 por ciento, el 80 por ciento, el 90 por ciento, o el 100 por ciento de la longitud de la secuencia de referencia. Entonces se comparan los residuos de aminoácidos o de nucleótidos en las posiciones de aminoácidos o en las posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (como se utiliza en la presente, "homología" de aminoácidos o de ácidos nucleicos es equivalente a "identidad" de aminoácidos o de ácidos nucleicos). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, tomando en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que se necesiten introducir para la alineación óptima de las dos secuencias. Las alineaciones y la homología, similitud o identidad de secuencias de aminoácidos y de nucleótidos, como se definen en la presente, se pueden preparar y determinar utilizando el algoritmo de Secuencias BLAST 2, utilizando los parámetros por omisión (Tatusova, T. A. y colaboradores, FEMS Microbiol Lett, 774:187-188 (1999)). Regiones determinantes de complementariedad (CDRs), y regiones de estructura son las regiones de un dominio variable de inmunoglobulina. En particular hay regiones de la secuencia de un único dominio variable de anticuerpo que exhiben una variabilidad particular, es decir, las secuencias de la CDR (región determinante de complementariedad). Las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) están en posiciones definidas dentro de la secuencia del dominio variable de anticuerpo. Un número de sistemas para definir las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de una secuencia serán familiares para los expertos en este campo. En una modalidad, las secuencias de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de la presente invención son como se definen en la Datábase of Sequences of Proteins of Immunological Interest (Base de Datos de Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico) de Kabat (Kabat E.A., Wu, T.T., Perry, H., Gottesman, K. y Foeller, C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición. NIH Publicación No. 91-3242), la cual da un esquema de numeración estándar para numerar los residuos en un anticuerpo de una manera consistente. Los únicos dominios variables de inmunoglobulina (dAbs) descritos en la presente contienen regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3). En una modalidad, las secuencias de CDR de los únicos dominios variables de ¡nmunoglobulina ant¡-DC-SIGN de acuerdo con la invención, son las CDRs 1 , 2 y 3, como se estipulan en la Figura 8.

Las secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, CDR3) de los dAbs VH (CDRH1 , etc.), y VL (CDRL1 , etc.) (VK) que se dan a conocer en la presente, serán fácilmente evidentes para la persona experta en la materia, basándose en el sistema de numeración de aminoácidos de Kabat bien conocido, y en la definición de las regiones determinantes de complementariedad. De acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, el método más comúnmente empleado basándose en la variabilidad de la secuencia, las CDR-H3 de la cadena pesada tienen diferentes longitudes, y las inserciones se numeran entre los residuos H100 y H101 con letras hasta K (es decir, H100, H100A .. H100K, H101). Las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) se pueden determinar de una manera alternativa utilizando el sistema de Chotia (basado en la localización de las regiones de ciclo estructurales) (Chotia y colaboradores (1989) Conformations of ¡mmunoglobulin hypervariable regions; Nature 342 (6252), páginas 877-883), de acuerdo con AbM (compromiso entre Kabat y Chotia) o de acuerdo con el método Contact (basado en las estructuras del cristal en la predicción de los residuos de contacto con el antígeno) como sigue. Véase http://www.bioinf.org.uk/abs/ para conocer los métodos adecuados para determinar las regiones determinantes de complementariedad (CDRs).

Una vez que se ha numerado cada residuo, entonces se pueden aplicar las siguientes definiciones de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs): Kabat : CDR H1: 31-35/35A/35B CDR H2: 50-¦65 CDR H3: 95-•102 CDR L1: 24-¦34 CDR L2: 50-¦56 CDR L3: 89-•97 Chotia: CDR H1: 26-•32 CDR H2: 52-¦56 CDR H3: 95-¦102 CDR L1 : 24-•34 CDR L2: 50-¦56 CDR L3: 89-¦97 AbM: (Usando la numeración de Kabat) : (Usando la numeración de Chotia): CDR H1: 26-35/35A/35B 26-35 CDR H2: 50-58 CDR H3: 95-102 CDR L1 : 24-34 CDR L2: 50-56 CDR L3: 89-97 Contact (Usando la numeración de Kabat): (Usando la numeración de Chotia): CDR H1: 30-35/35A/35B 30-35 CDR H2: 47-58 CDR H3: 93-101 CDR L1: 30-36 CDR L2: 46-55 CDR L3: 89-96 ("-" significa la misma numeración que Kabat) La invención se refiere a ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes que codifican los péptidos o polipeptidos descritos en la presente.

Los ácidos nucleicos referidos en la presente como "aislados" son los ácidos nucleicos que se han separado de otro material (por ejemplo, otros ácidos nucleicos, tales como ADN genómico, ADNc y/o ARN) en su medio ambiente original (por ejemplo, en células o en una mezcla de ácidos nucleicos, tales como una biblioteca). Un ácido nucleico aislado se puede aislar como parte de un vector (por ejemplo, un plásmido).

Los ácidos nucleicos referidos en la presente como "recombinantes" son los ácidos nucleicos que se han producido mediante la metodología de ADN recombinante, incluyendo los métodos que se apoyan en la recombinación artificial, tales como la clonación en un vector o el uso de cromosomas, por ejemplo, enzimas de restricción, recombinación homologa, virus, y similares, y los ácidos nucleicos se preparados utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

La invención también se refiere a una célula huésped recombinante, la cual comprende un (uno o más) ácido nucleico recombinante o una construcción de expresión que comprenda un ácido nucleico que codifique un péptido o polipéptido descrito en la presente. También se proporciona un método para la preparación de un péptido o polipéptido, el cual comprende mantener una célula huésped recombinante de la invención bajo condiciones apropiadas para la expresión de un péptido o polipéptido. El método puede comprender además el paso de aislar o recuperar el péptido o polipéptido, si se desea.

Por ejemplo, se puede introducir una molécula de ácido nucleico (es decir, una o más moléculas de ácidos nucleicos) que codifique un péptido o polipéptido, o una construcción de expresión (es decir, una o más construcciones) que comprenda estas moléculas de ácidos nucleicos, en una célula huésped adecuada, para crear una célula huésped recombinante, empleando cualquier método apropiado para la célula huésped, seleccionado (por ejemplo, transformación, transfección, electroporación, infección), de tal manera que las moléculas de ácidos nucleicos se enlacen operativamente a uno o más elementos de control de expresión (por ejemplo, en un vector, en una construcción creada mediante los procesos de la célula, integrada en el genoma de la célula huésped). La célula huésped recombinante resultante se puede mantener bajo condiciones adecuadas para la expresión (por ejemplo, en la presencia de un inductor, en un animal adecuado, en un medio de cultivo adecuado complementado con las sales, factores de crecimiento, antibióticos, suplementos nutricionales apropiados, etc.), en donde se produzca el péptido o polipéptido codificado. Si se desea, el péptido o polipéptido codificado se puede aislar o recuperar (por ejemplo, a partir del animal, la célula huésped, el medio, leche). Este proceso abarca la expresión en una célula huésped de un animal transgénico (véase, por ejemplo, la Publicación Internacional Número WO 92/03918, GenPharm International).

El péptido o polipéptido descrito en la presente también se puede producir en un sistema de expresión in vitro adecuado, mediante síntesis química o mediante cualquier otro método adecuado. El polipéptido, el dAb, o el antagonista, se puede expresar en E. coli o en las espec.ies de Pichia (por ejemplo, P. pastoris). En una modalidad, el ligando o el monómero de dAb se secreta en una cantidad de cuando menos aproximadamente 0.5 miligramos/litro cuando se expresa en E. coli o en las especies de Pichia (por ejemplo, P. pastoris). En una modalidad, el vector de expresión se puede seleccionar para aumentar la expresión en el sobrenadante de la célula huésped. En una modalidad, el vector de expresión incorpora una secuencia líder GAS como se describe en la presente. Aunque los ligandos y los monómeros dAb descritos en la presente se pueden secretar cuando se expresan en E. coli o en especies de Pichia (por ejemplo, P. pastoris), se pueden producir empleando cualquier método adecuado, tal qomo los métodos químicos sintéticos o los métodos de producción biológica que no emplean E. coli o especies de Pichia.

La frase "vida media" se refiere al tiempo que se necesita para que se reduzca la concentración del ligando en suero (por ejemplo, dAb, polipéptido, o antagonista) por el 50 por ciento, in vivo, por ejemplo, debido a la degradación del ligando y/o a la eliminación o al secuestro del ligando mediante los mecanismos naturales. Los ligandos de la invención se pueden estabilizar in vivo, y se puede aumentar su vida media mediante el enlace con moléculas que resistan a la degradación y/o a la eliminación o al secuestro. Típicamente, estas moléculas son proteínas que se presentan naturalmente, las cuales tienen ellas mismas una larga vida media in vivo. La vida media de un ligando aumenta si persiste su actividad funcional, in vivo, durante un período más largo que un ligando similar que no sea específico para aumentar la vida media de la molécula. Por ejemplo, un ligando específico para la albúmina de suero humano (HSA), y una molécula objetivo se compara con el mismo ligando en donde no esté presente la especificidad para la albúmina de suero humano (HSA), que no se enlace a la albúmina de suero humano (HSA), pero que se enlace a otra molécula. Por ejemplo, se puede enlazar a un tercer objetivo sobre la célula. Típicamente, la vida media aumenta por el 10 por ciento, el 20 por ciento, el 30 por ciento, el 40 por ciento, el 50 por ciento, o más. Son posibles aumentos en el intervalo de 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces o más de la vida media. De una manera alternativa, o en adición, son posibles aumentos en el intervalo de hasta 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces, 150 veces de la vida media.

Los métodos para el análisis farmacocinético y para la determinación de la vida media del ligando serán familiares para los expertos en este campo. Los detalles se pueden encontrar en Kenneth, A y colaboradores: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists, y en Peters y colaboradores, Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996). También se hace referencia a "Pharmacokinetics", M Gibaldi y D Perron, publicado por Marcel Dekker, 2a Revisión, edición extra (1982), los cuales describen los parámetros farmacocinéticos, tales como las vidas medias t-alfa y t-beta, y el área debajo de la curva (AUC).

Las vidas medias (f/á-alfa y t1/2-beta) y AUC se pueden determinar a partir de una curva de la concentración del ligando en suero contra el tiempo. Se puede utilizar el paquete de análisis WinNonlin (disponible en Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, EUA), por ejemplo, para modelar la curva. En una primera fase (la fase alfa) el ligando está experimentando principalmente la distribución en el paciente, con alguna eliminación. Una segunda fase (la fase beta) es la fase terminal cuando se ha distribuido el ligando y la concentración en suero está disminuyendo a medida que se elimina el ligando del paciente. La vida media t-alfa es la vida media de la primera fase, y la vida media t-beta es la vida media de la segunda fase. Por consiguiente, de una manera conveniente, la presente invención proporciona un ligando o una composición que comprende un ligando de acuerdo con la invención, que tiene una vida media ta en el intervalo de 15 minutos o más. En una modalidad, el extremo inferior del intervalo es de 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 10 horas, 11 horas o 12 horas. En adición, o de una manera alternativa, un ligando o una composición de acuerdo con la invención, tendrá una vida media ta en el intervalo de hasta, e incluyendo, 12 horas. En una modalidad, el extremo superior del intervalo es de 11, 10, 9, 8, 7, 6 ó 5 horas. Un ejemplo de un intervalo adecuado es de 1 a 6 horas, de 2 a 5 horas, o de 3 a 4 horas.

De una manera conveniente, la presente invención proporciona un ligando o una composición que comprende un ligando de acuerdo con la invención, que tiene una vida media Xfí en el intervalo de 2.5 horas o más. En una modalidad, el extremo inferior del intervalo es de 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 10 horas, 11 horas, o 12 horas. En adición, o de una manera alternativa, un ligando o una composición de acuerdo con la invención, tiene una vida media tB en el intervalo de hasta, e incluyendo, 21 días. En una modalidad, el extremo superior del intervalo es de 12 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 5 días, 10 días, 15 días o 20 días. Convenientemente, un ligando o una composición de acuerdo con la invención tendrá una vida media \ñ en el intervalo de 12 a 60 horas. En una modalidad adicional, estará en el intervalo de 12 a 48 horas. En una modalidad todavía adicional, estará en el intervalo de 12 a 26 horas.

En adición, o de una manera alternativa a los criterios anteriores, la presente invención proporciona un ligando o una composición que comprende un ligando de acuerdo con la invención, que tiene un valor de AUC (área debajo de la curva) en el intervalo de 1 miligramo/minuto/mililitro o más. En una modalidad, el extremo inferior del intervalo es de 5, 10, 15, 20, 30, 100, 200 ó 300 miligramos/minuto/mililitro. En adición, o de una manera alternativa, un ligando o una composición de acuerdo con la invención tiene una AUC en el intervalo de hasta 600 miligramos/minuto/mililitro. En una modalidad, el extremo superior del intervalo es de 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 ó 50 miligramos/minuto/mililitro. De una manera conveniente, un ligando de acuerdo con la invención tendrá una AUC en el intervalo seleccionado a partir de, pero de preferencia no limitándose a, el grupo consistente en los siguientes: de 15 a 150 miligramos/minuto/mililitro, de 15 a 100 miligramos/minuto/mililitro, de 15 a 75 miligramos/minuto/mililitro, y de 15 a 50 miligramos/ minuto/mililitro.

En una modalidad, una (ona o más) fracción que extienda la vida media (por ejemplo, albúmina, transferrina y fragmentos y análogos de las mismas) se conjuga o se asocia con el único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN o el dAb de la invención. Los ejemplos adecuados de albúmina, fragmentos de albúmina, o variantes de albúmina para utilizarse en un formato de enlace de único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN, se describen en la Publicación Internacional Número WO 2005077042, cuya divulgación se incorpora a la presente como referencia y forma parte de la divulgación del presente texto. Otros ejemplos adecuados de albúmina, fragmentos y análogos para utilizarse en un formato de enlace de único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN se describen en la Publicación Internacional Número WO 03076567, cuya divulgación se incorpora a la presente como referencia y la cual forma parte de la divulgación del presente texto.

Cuando se utiliza una (una o más) fracción que extiende la vida media (por ejemplo, albúmina, transferrina y fragmentos y análogos de las mismas) u otra proteína de fusión, para formatear los polipéptidos de un solo dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN y los dAbs de la invención, se puede conjugar empleando cualquier método adecuado, tal como, mediante la fusión directa con el único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN (por ejemplo, dAb), por ejemplo, utilizando una construcción de un solo nucleótido que codifique una proteína de fusión, en donde la proteína de fusión se codifica como una sola cadena de polipéptido con la fracción que extiende la vida media localizada N- o C-terminalmente para el único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN. De una manera alternativa, la conjugación se puede lograr utilizando un enlazador peptídico entre fracciones, por ejemplo, un enlazador peptídico como se describe en las Publicaciones Internacionales Números WO 03076567 o WO 2004003019 (incorporándose estas divulgaciones de enlazadores como referencia a la presente divulgación, para proporcionar los ejemplos para utilizarse en la presente invención). Típicamente, un polipéptido que mejora la vida media en suero in vivo es un polipéptido que se presenta naturalmente in vivo y que resiste a la degradación o a la remoción mediante los mecanismos endógenos que remueven el material indeseado del organismo {por ejemplo, del ser humano). Por ejemplo, un polipéptido que mejore la vida media en suero in vivo se puede seleccionar a partir de las proteínas de la matriz extracelular, las proteínas encontradas en la sangre, las proteínas encontradas en la barrera hematoencefálica o en el tejido neural, las proteínas localizadas en el riñon, hígado, pulmón, corazón, piel o huesos, la proteínas de estrés, las proteínas específicas de la enfermedad, o las proteínas involucradas en el transporte de Fe.

En las modalidades de la invención descritas a través de toda esta divulgación, en lugar del uso de un "dAb" de un solo dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN de la invención, se contempla que el experto puede utilizar un polipéptido o dominio que comprenda una o más o las 3 de las regiones determinantes de complementariedacl de un dAb de la invención, que se enlace al DC-SIGN (por ejemplo, las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) injertadas sobre el andamiaje o esqueleto de proteína adecuado, por ejemplo, un Affibody, un andamiaje de SpA, un dominio de receptor de LDL clase A, o un dominio de EGF). La divulgación como un todo se debe interpretar de conformidad con lo anterior, para proporcionar la divulgación polipéptidos de un solo dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN utilizando estos dominios en lugar de un dAb. En este aspecto, véase la Publicación Internacional Número WO2008/096158.

En términos generales, el polipéptido, ligando, o agente de enlace de un solo dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN de la invención se utilizará en una forma purificada, junto con los vehículos farmacológicamente apropiados. Típicamente, estos vehículos incluyen soluciones, emulsiones o suspensiones acuosas o alcohólicas/acuosas, ya sea incluyendo una solución salina y/o un medio regulado. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, y solución de Ringer lactatada. Los adyuvantes fisiológicamente aceptables adecuados, si son necesarios para mantener un complejo de polipéptido en suspensión, se pueden seleccionar a partir de viscosantes, tales como carboxi-metil-celulosa, polivinil-pirrolidona, gelatina, y alginatos. En una modalidad, el único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN de la invención se puede arreglar sobre una vesícula, tal como un micelio o liposoma.

Los vehículos intravenosos incluyen rellenadores de fluidos y nutrientes y rellenadores de electrolitos, tales como aquéllos basados en dextrosa de Ringer. También puede haber conservadores y otros aditivos, tales como antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes presentes (Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a Edición). Se pueden utilizar una variedad de formulaciones adecuadas, incluyendo las formulaciones de liberación prolongada.

El único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN, polipéptido, ligando o agente de enlace de la presente invención, se puede utilizar como composiciones administradas por separado o en conjunto con otros agentes. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir "cócteles" de diferentes agentes citotóxicos u otros agentes en conjunto con los ligandos de la presente invención, o inclusive combinaciones de los ligandos de acuerdo con la presente invención, que tengan diferentes especificidades, tales como los ligandos seleccionados utilizando diferentes antígenos o epítopos objetivo, ya sea que se reserven o no antes de su administración.

La vía de administración de las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención puede ser cualquiera de aquéllas comúnmente conocidas por aquéllos de una experiencia ordinaria en este campo. Para la terapia, incluyendo sin limitación la inmunoterapia, los únicos dominios variables de inmunoglobulina seleccionados de la invención se pueden administrar a cualquier paciente de acuerdo con las técnicas convencionales.

La administración puede ser mediante cualquier modo apropiado, incluyendo parenteralmente, intravenosamente, intramuscularmente, intraperitonealmente, transdérmicamente, por medio de la vía pulmonar, o también, de una manera apropiada, mediante infusión directa con un catéter. La dosificación y frecuencia de administración dependerá de la edad, el sexo, y la condición del paciente, de la administración concurrente de otros fármacos, de las contra-indicaciones, y de otros parámetros que serán tomados en cuenta por el médico. La administración puede ser local (por ejemplo, suministro local al pulmón mediante administración pulmonar, por ejemplo, administración intranasal) o sistémica, como se indica.

Los únicos dominios variables de inmunoglobulina, polipéptidos, ligandos o agentes de enlace de esta invención, se pueden liofilizar para su almacenamiento, y se pueden reconstituir en un vehículo adecuado antes de usarse. Se ha demostrado que esta técnica es efectiva con la ¡nmunoglobulinas convencionales, y se pueden emplear las técnicas de liofilización y reconstitución conocidas en este campo. Será apreciado por los expertos en la materia que la liofilización y la reconstitución pueden conducir a diferentes grados de pérdida de actividad del anticuerpo (por ejemplo, con las ¡nmunoglobulinas convencionales, los anticuerpos de IgM tienden a tener una mayor pérdida de actividad que los anticuerpos de IgG), y que los niveles de uso pueden tener que ajustarse hacia arriba para compensarse.

Las composiciones que contienen los presentes únicos dominios variables de inmunoglobulina, polipéptidos, ligandos o agentes de enlace, o un cóctel de los mismos, se pueden administrar para los tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. En ciertas aplicaciones terapéuticas, una cantidad adecuada para llevar a cabo cuando menos una inhibición parcial, supresión, modulación, aniquilación, o algún otro parámetro mensurable, de una población de células seleccionadas, se define como una "dosis terapéuticamente efectiva". Las cantidades necesarias para alcanzar esta dosificación dependerán de la gravedad de la enfermedad y del estado general del propio sistema inmunológico del paciente, pero en términos generales estará en el intervalo de 0.005 a 5.0 miligramos del único dominio variable de inmunoglobulina, por ejemplo, el dAb o el antagonista, por kilogramo de peso corporal, utilizándose más comúnmente las dosis de 0.05 a 2.0 miligramos/kilogramo/dosis. Para las aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen los presentes únicos dominios variables de inmunoglobulina o los cócteles de los mismos, también se pueden administrar en dosificaciones similares o ligeramente más bajas, para prevenir, inhibir, o retardar el establecimiento de la enfermedad (por ejemplo, para sostener la remisión o la pasividad, o para prevenir la fase aguda). El clínico experto podrá determinar el intervalo de dosificación apropiado para tratar, suprimir, o prevenir la enfermedad.

El tratamiento o la terapia que se lleva a cabo utilizando las composiciones descritas en la presente se considera "efectiva" si se reducen uno o más síntomas (por ejemplo, por cuando menos el 10 por ciento o por cuando menos un punto en una escala de evaluación clínica), en relación con los síntomas presentes antes del tratamiento, o en relación con los síntomas en un individuo (humano o un animal modelo) no tratado con dicha composición u otro control adecuado. Los síntomas obviamente variarán dependiendo de la enfermedad o del trastorno dirigido, pero pueden ser medidos por un clínico o técnico ordinariamente experto. Estos síntomas se pueden medir, por ejemplo, mediante el monitoreo del nivel de uno o más indicadores bioquímicos de la enfermedad o del trastorno (por ejemplo, los niveles de un enzima o metabolito correlacionado con la enfermedad, los números de células afectadas, etc.), mediante el monitoreo de las manifestaciones físicas (por ejemplo, inflamación, tamaño del tumor, etc.), o mediante una escala de evaluación clínica aceptada. Una reducción sostenida (por ejemplo, uno o más días, o más tiempo) en los síntomas de la enfermedad o del trastorno por cuando menos el 10 por ciento o por uno o más puntos en una escala clínica dada, indica un tratamiento "efectivo". De una manera similar, la profilaxis llevada a cabo utilizando una composición como se describe en la presente es "efectiva" si se retarda, se reduce, o se elimina el establecimiento o la gravedad de uno o más síntomas en relación con tales síntomas en un individuo similar (humano o modelo animal) no tratado con la composición. Una composición que contiene un único dominio variable de inmunoglobulina, polipéptido, ligando, o agente de enlace, o un cóctel de los mismos, de acuerdo con la presente invención se puede utilizar en los establecimientos profiláctico y terapéutico para ayudar en la alteración, inactivación, aniquilación, o remoción de una población de células objetivo seleccionada en un mamífero. La composición también puede bloquear la infección mediante el bloqueo del receptor que normalmente media la entrada de un agente infeccioso, tal como VIH, Hepatitis C, o virus de Ébola. En adición, los repertorios de polipéptidos seleccionados descritos en la presente, se pueden utilizar extracorporeamente o in vitro selectivamente para aniquilar, agotar, o remover de otra manera efectivamente una población de células objetivo o un agente infeccioso, a partir de una colección de células heterogénea. La sangre a partir de un mamífero se puede combinar extracorporeamente con los ligandos en donde las células indeseadas o los agentes infecciosos se aniquilan o se remueven de otra manera de la sangre para regresarse al mamífero de acuerdo con las técnicas convencionales.

Una composición que contiene un ligando (por ejemplo, antagonista) de acuerdo con la presente invención, se puede utilizar en los establecimientos profilácticos y terapéuticos para ayudar en la alteración, inactivación, aniquilación, o remoción de una población de células objetivo seleccionada en un mamífero.

Los únicos dominios variables de inmunoglobulina, polipéptidos, ligandos o agentes de enlace, se pueden administrar y/o formular junto con uno o más agentes terapéuticos o activos adicionales. Cuando se administra un único dominio variable de inmunoglobulina (por ejemplo, un dAb) con un agente terapéutico adicional, el ligando se puede administrar antes, simultáneamente con, o subsiguientemente a, la administración del agente adicional. En términos generales, el ligando y el agente adicional se administran de una manera que proporcione un traslape del efecto terapéutico.

Como se utiliza en la presente, el término "dosis" se refiere a la cantidad de ligando administrada a un sujeto todo a la vez (dosis unitaria), o en dos o más administraciones durante un intervalo de tiempo definido. Por ejemplo, la dosis puede referirse a la cantidad de ligando (por ejemplo, el ligando que comprende un único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza al antígeno objetivo) administrada a un sujeto durante el transcurso de un día (24 horas) (dosis diaria), dos días, una semana, dos semanas, tres semanas, o uno o más meses (por ejemplo, mediante una sola administración, o mediante dos o más administraciones). El intervalo entre dosis puede ser cualquier cantidad de tiempo deseada.

La invención se describe además en los siguientes ejemplos, para propósitos de ilustración solamente.

EJEMPLOS EJEMPLO 1. Primera selección y caracterización de los anticuerpos de dominio para DC-SIGN.

Los anticuerpos de dominio generados se derivaron a partir de las bibliotecas de los fagos 4G y 6G. Las bibliotecas de 4G se basan en una sola estructura humana para VH (V3-23 [locus] DP47 [Entrada de V Base] y JH4b), y VL (012/02 [locus] DPK9 [Entrada de V Base] y JK 1) con diversidad de cadenas laterales incorporada en las posiciones en el sitio de enlace de antígeno que hacen contacto con el antígeno en las estructuras moleculares conocidas (véase la Publicación Internacional Número WO2005093074). Es importante que estas posiciones son también altamente diversas en el repertorio maduro. La estructura canónica (VH: 1-3, VK: 2-1-1) codificada por estas estructuras es por mucho la más común en el repertorio de anticuerpos humanos. La CDR3 de la cadena pesada se diseñó para ser tan corta como fuera posible, y no obstante, todavía era capaz de formar una superficie de enlace de antígeno. Las bibliotecas se pueden seleccionar y madurar en afinidad sin conocer la secuencia de los clones seleccionados.

Las bibliotecas de 6G se basan en una sola estructura humana para VH (V3-23 [locus] DP47 [Entrada de V Base] y JH4b), y VL (012/02 [locus] DP 9 [Entrada de V Base] y JKI) con diversidad de cadenas laterales incorporada en las posiciones en el sitio de enlace de antígeno que hacen contacto con el antígeno en las estructuras moleculares conocidas (véase la Publicación Internacional Número WO04101790).

Las bibliotecas de dAb 6G incorporan diversificación adicional para mejorar la eficiencia de pliegue de la biblioteca de 4G. En las secuencias VH y VK, solamente unos cuantos aminoácidos son críticos para la eficiencia del pliegue. Éstos se localizan en el ciclo Hl de VH DP-47 y en el límite de la estructura 2/CDR2 en VK DPK9. En la biblioteca de 6G, la diversificación se dirigió hacia estas regiones para mejorar la probabilidad de seleccionar los dAbs con un mejor pliegue. Las tirosinas en las posiciones 32 y 49 se diversificaron en el andamiaje de VH y VK, respectivamente. En el andamiaje de VK, los residuos 27 y 89 también se diversificaron para crear una superficie diversificada continua y más grande. Se seleccionó un mejor pliegue mediante un tratamiento con calor de la biblioteca de fagos primarios antes de la limpieza sobre la proteína A o L. Entonces se crearon las bibliotecas mediante la recombinación de los fragmentos de la biblioteca de CDR 1 + 2 reservados, derivados a partir de las bibliotecas primarias, con una biblioteca de fragmentos de CDR3 reservados.

Para las selecciones, el DC-SIGN humano o el péptido de DC- SIGN correspondiente a una marca 9xHIS, un enlazador, y el extremo C-terminal del DC-SIGN (Secuencia de aminoácidos: H HH HHH HH H-SGSG-KKSAASCSRDEEQFLSPAPATPN PPPA (SEQ ID NO: 37)), se recubrieron en los inmunotubos Maxisorp (Nunc) (de 5 a 50 microgramos/mililitro en suero regulado con fosfato o en regulador de NaHC03 0.1 M, pH de 9.6). Típicamente se utilizan 50 microgramos/mililitro de antígeno en la primera ronda de selección con 1012 TU de fagos en 1 mililitro de PBSM. En las siguientes rondas, la cantidad de antígeno se reduce en cada ronda. La mezcla de fago/antígeno se incuba durante 1 hora. Las perlas de los ¡nmunotubos se lavan ocho veces con PBST, y ocho veces con suero regulado con fosfato. Los fagos enlazados se eluyeron en 0.5 mililitros de 100 microgramos/mililitro de tripsina en suero regulado con fosfato durante 10 minutos, y entonces se utilizaron para infectar 2 mililitros de células TGI de E. coli en fase de registro (log) a 37°C durante 30 minutos. Se llevaron a cabo diluciones en serie (para la titulación de fagos), y el emplacado de la biblioteca en placas de agar 2xTY-Tet. Para la siguiente ronda de selección, las células se rasparon de las placas, y se utilizaron para inocular 200 mililitros de 2xTY-Tet a 37°C para la amplificación de los fagos. Se utilizó el sobrenadante para la preparación de los fagos, y se utilizaron los aglomerados de células bacterianas para aislar el dsADN del fago para la sub-clonación de los genes de dAb reservados, en el vector de expresión bacteriano pDOM5 (véase más adelante).

Para el ELISA de fagos, los pozos del ELISA se recubrieron durante la noche a 4°C con DC-SIGN o DC-SIGNR (R&D Número de Catálogo 162-D2) en (de 1 a 10 microgramos/mililitro en suero regulado con fosfato o regulador de NaHC03 0.1 M, pH de 9.6). Después de bloquear los pozos con suero regulado con fosfato que contenía leche descremada en polvo al 2 por ciento (PBSM), el fago se incubó en PBSM durante 1 hora. Después de lavar con suero regulado con fosfato, se detectaron los fagos enlazados utilizando un conjugado de peroxidasa de radícula roja con un anticuerpo monoclonal anti-M13 (Amersham) utilizando 3,3',5,5'-tetrametil-bencidina como el sustrato.

Se obtuvieron fagos positivos específicos que reconocieron DC-SIGN pero no reconocieron DC-SIGNR después de dos y tres rondas de selección. Los genes del dAb seleccionados se sub-clonaron a partir del vector del fago pDOM4 en pDOM5. (pDOM4, como se describe en la Publicación Internacional Número WO 2007/085815, es un derivado del vector del fago Fd, en donde la secuencia del péptido de señal del gen III es reemplazada con el péptido de señal de la proteína superficial anclada al glicolípido (GAS) de levadura (Publicación Internacional Número WO 2005/093074). También contiene una marca c-myc entre la secuencia líder y el gen III, que pone el gen III de regreso dentro del marco). pDOM5 es un vector de expresión basado en pUC119 bajo el control del promotor LacZ. La expresión de los dAbs en el sobrenadante se aseguró mediante la fusión con el péptido de señal líder GAS universal en el extremo N-terminal (descrito, por ejemplo en la Publicación Internacional Número WO 2005/093074). Los dAbs son precedidos por los residuos Ser-Thr que están presentes en el poli-enlazador para acomodar un sitio de clonación Sa/I. En adición, se adjuntó una marca c-myc en el extremo C-terminal de los dAbs. Después de la transformación de las células HB2151 de E. coli, las colonias se utilizaron para inocular de 50 a 500 mililitros del medio Terrific Broth complementado con carbenicilina (100 microgramos por mililitro). La inducción se llevó a cabo con el OVERNIGHT EXPRESSMR SYSTEM 1 (sistema de expresión de proteína de alto nivel, Novagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cultivos se incubaron a 30°C durante 24 a 48 horas con agitación a 250 revoluciones por minuto. Después de la aglomeración de las células mediante centrifugación (4,000 revoluciones por minuto durante 20 minutos), los sobrenadantes se filtraron utilizando un filtro de 0.45 mieras, y se incubaron durante la noche a 4°C con perlas de proteína A-Streamline (Amersham Biosciences, capacidad de enlace: 5 miligramos de dAb por mililitro de perlas) para los dAbs VH, o con perlas de Proteína L-Sepharose (Affítech, capacidad de enlace: 2 miligramos de dAb por mililitro de perlas) para los dAbs VL. Las perlas se empacaron entonces en columnas de goteo, se lavaron con 10 volúmenes de la columna de suero regulado con fosfato (PBS), y los dAbs enlazados se eluyeron en glicina-HCI 0.1 M, pH de 2.0 ó 3.0 para los dAbs VH y Vu, respectivamente. Después de la neutralización con Tris-HCI 1 M, pH de 8.0, las muestras de proteína se dializaron en suero regulado con fosfato (PBS), y se concentraron en concentradores Vivaspin de 5-kDa ( Vivascience) antes del almacenamiento a 4°C. La pureza de la proteína se estimó mediante análisis visual después del SDS-PAGE sobre gel de acrilamida/Tris-glicina al 12 por ciento (Invitrogen). Las concentraciones de proteína y los rendimientos (en miligramos por litro de cultivo bacteriano) se midieron a 280 nanómetros, utilizando coeficientes de extinción calculados a partir de las composiciones de aminoácidos.

Para los ensayos ELISA con los dAbs solubles, ios antígenos se recubrieron como se describe en el protocolo del ELISA de fagos.

Los pozos se bloquearon con suero regulado con fosfato que contenía Tween al 2 por ciento (PBST), y los dAbs se incubaron en PBST durante 1 hora. Después de lavar con suero regulado con fosfato, los dAbs enlazados se detectaron con el mAb 9E10 (Sigma, dilución a 1/2000), seguido por anticuerpo de conejo anti-ratón conjugado con peroxidasa de radícula roja (Sigma, dilución a 1/2000). Este ELISA también se llevó a cabo en donde los dAbs se incubaron en la presencia de proteína L (1 microgramo/mililitro).

Los dAbs no proporcionaron señales de ELISA positivas cuando se probaron como dAbs solubles. Es probable que las afinidades como dAbs fueran demasiado bajas.

En el caso de la reticulación de la proteína L, se identificaron 129 clones de enlace. Éstos se secuenciaron y se volvieron a probar para determinar su enlace en el ELISA al DC-SIGN y al DC-SIGNR. Se identificaron 40 clones únicos. Algunos clones se enlazaron al DC-SIGN específicamente (y no al DC-SIGNR) en la presencia de proteína L.

Se identificaron varios clones que se enlazaron al DC-SIGN específicamente (y que no se enlazaron al DC-SIGNR) como fagos, pero dan un enlace indetectable como dAbs solubles. Esto proporciona varios clones VH (Véase la Figura 1).

Se llevaron a cabo varios planteamientos de selección para identificar los clones que se enlazaban solamente al DC-SIGN y al péptido de DC-SIGN (extremo C-terminal único del DC-SIGN).

Planteamientos de selección: 1. Ronda 1, Ronda 2 y Ronda 3 con proteína de DC-SIGN. 2. Ronda 1 y Ronda 2 con proteína de DC-SIGN y Ronda 3 sobre el péptido de DC-SIGN. 3. Ronda 1 y Ronda 3 con proteína de DC-SIGN y Ronda 2 sobre el péptido de DC-SIGN.

En total, se rastrearon 2200 clones a partir de los tres planteamientos en el ELISA de fagos. Se rastrearon 1000 clones a partir de la selección con el péptido de DC-SIGN (R1 y R3 con proteína de DC-SIGN y R2 sobre el péptido). Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de los clones seleccionados se estipulan en las Figuras 3 y 4. De siete fagos positivos a partir del rastreo primario, solamente se encontró que un clon (LIP1-33) se enlaza específicamente al DC-SIGN y al péptido de DC-SIGN. También se encontró que el enlace de LIP1-33 al péptido de DC-SIGN puede ser inhibido por el DC-SIGN, y por el péptido de DS-SIGN tanto marcado con HIS como biotinilado, pero no con las proteínas de control (no se muestran los datos).

LIP1-33 y otros clones VH de fagos específicos de DC-SIGN a partir de las selecciones de DC-SIGN se volvieron a clonar en pDOM5, en donde se adjuntó una marca GHHGHHGHHGHHGHH (SEQ ID NO: 38) en el extremo C-terminal. Los dAbs solubles se expresaron y se purificaron. Se incluyó VH dAb HEL4 (Jespers y colaboradores, J. Mol. Biol. (2004) 337, 893-903) como un control negativo.

Tabla 1 dAbs con marca GHHGHH GH HGH HGHH (10xHIS) (SEQ ID NO: 38) Aunque esta invención se ha mostrado y descrito en particular con referencia a las modalidades de la misma, será entendido por los expertos en la materia que se pueden hacer diferentes cambios en la forma y en los detalles de las mismas sin apartarse del alcance de la invención abarcada por las reivindicaciones adjuntas.

Claims (29)

REIVINDICACIONES

1. Un único dominio variable de inmunoglobulina anti-no integrina de sujeción de ICAM-3 específica de células dendríticas (DC-SIGN; CD209).

2. El único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el único dominio variable de inmunoglobulina se enlaza al DC-SIGN humano con una constante de disociación (Kd) de 1 a 50 µ?, como se determina mediante resonancia de plasmón superficial.

3. Un polipéptido aislado, el cual comprende una secuencia de aminoácidos que es cuando menos el 70 por ciento idéntica a cuando menos un secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo consistente en: SEQ ID NO: 19 (LIP1-12), SEQ ID NO: 20 (LIP1-13), SEQ ID NO: 21 (LIP1-15), SEQ ID NO: 22 (LIP1-17), SEQ ID NO: 23 (LIP1-19), SEQ ID NO: 24 (LIP1-21), SEQ ID NO: 25 (LIP1-22), SEQ ID NO: 26 (LIP1-23), SEQ ID NO: 27 (LIP1-26), SEQ ID NO: 28 (LIP1-28), SEQ ID NO: 29 (LIP1-30), SEQ ID NO: 30 (LIP1-32), SEQ ID NO: 31 (LIP1-24), SEQ ID NO: 32 (LIP1-25), SEQ ID NO: 33 (LIP1-27), SEQ ID NO: 34 (LIP1-29), SEQ ID NO: 35 (LIP1-31), y SEQ ID NO: 36 (LIP1-33), y que se enlaza al DC-SIGN humano.

4. Un polipéptido aislado, el cual comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo consistente en: SEQ ID NO: 19 (LIP1-12), SEQ ID NO: 20 (LIP1-13), SEQ ID NO: 21 (LIP1-15), SEQ ID NO: 22 (LIP1-17), SEQ ID NO: 23 (LIP1-19), SEQ ID NO: 24 (LIP1-21), SEQ ID NO: 25 (LIP1-22), SEQ ID NO: 26 (LIP1-23), SEQ ID NO: 27 (LIP1-26), SEQ ID NO: 28 (LIP1-28), SEQ ID NO: 29 (LIP1-30), SEQ ID NO: 30 (LIP1-32), SEQ ID NO: 31 (LIP1-24), SEQ ID NO: 32 (LIP1-25), SEQ ID NO: 33 (LIP1-27), SEQ ID NO: 34 (LIP1-29), SEQ ID NO: 35 (LIP1-31), y SEQ ID NO: 36 (LIP1-33).

5. Un polipéptido aislado codificado por una secuencia de nucleotidos que es cuando menos el 60 por ciento idéntica a la secuencia de nucleotidos seleccionada a partir del grupo consistente en: SEQ ID NO: 1 (LIP1-12), SEQ ID NO: 2 (LIP1-13), SEQ ID NO: 3 (LIP1-15), SEQ ID NO: 4 (LIP1-17), SEQ ID NO: 5 (LIP1-19), SEQ ID NO: 6 (LIP1-21), SEQ ID NO: 7 (LIP1-22), SEQ ID NO: 8 (LIP1-23), SEQ ID NO: 9 (LIP1-26), SEQ ID NO: 10 (LIP1-28), SEQ ID NO: 11 (LIP1-30), SEQ ID NO: 12 (LIP1-32), SEQ ID NO: 13 (LIP1-24), SEQ ID NO: 14 (LIP1-25), SEQ ID NO: 15 (LIP1-27), SEQ ID NO: 16 (LIP1-29), SEQ ID NO: 17 (LIP1-31), y SEQ ID NO: 18 (LIP1-33), y que se enlaza al DC-SIGN humano.

6. Un único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN, el cual comprende una secuencia de aminoácidos que es cuando menos el 90 por ciento idéntica a la secuencia de aminoácidos de cualquier secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo consistente en: SEQ ID NO: 19 (LIP1-12), SEQ ID NO: 20 (LIP1-13), SEQ ID NO: 21 (LIP1-15), SEQ ID NO: 22 (LIP1-17), SEQ ID NO: 23 (LIP1-19), SEQ ID NO: 24 (LIP1-21), SEQ ID NO: 25 (LIP1-22), SEQ ID NO: 26 (LIP1-23), SEQ ID NO: 27 (LIP1-26), SEQ ID NO: 28 (LIP1-28), SEQ ID NO: 29 (LIP1-30), SEQ ID NO: 30 (LIP1-32), SEQ ID NO: 31 (LIP1-24), SEQ ID NO: 32 (LIP1-25), SEQ ID NO: 33 (LIP1-27), SEQ ID NO: 34 (LIP1-29), SEQ ID NO: 35 (LIP1-31), y SEQ ID NO: 36 (LIP1-33), y que se enlaza al DC-SIGN humano.

7. Un único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN, el cual comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 32 (LIP1-29), SEQ ID NO: 33 (LIP1-30). o SEQ ID NO: 36 (LIP1-33).

8. Un único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN, el cual comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo consistente en: SEQ ID NO: 19 (LIP1-12), SEQ ID NO: 20 (LIP1-13), SEQ ID NO: 21 (LIP1-15), SEQ ID NO: 22 (LIP1-17), SEQ ID NO: 23 (LIP1-19), SEQ ID NO: 24 (LIP1-21), SEQ ID NO: 25 (LIP1-22), SEQ ID NO: 26 (LIP1-23), SEQ ID NO: 27 (LIP1-26), SEQ ID NO: 28 (LIP1-28), SEQ ID NO: 29 (LIP1-30), SEQ ID NO: 30 (LIP1-32), SEQ ID NO: 31 (LIP1-24), SEQ ID NO: 32 (LIP1-25), SEQ ID NO: 33 (LIP1-27), SEQ ID NO: 34 (LIP1-29), SEQ ID NO: 35 (LIP1-31), y SEQ ID NO: 36 (LIP1-33).

9. Un único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN, el cual comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de aminoácidos estipuladas en las SEQ ID NO: 19 (LIP1-12), SEQ ID NO: 20 (LIP1-13), SEQ ID NO: 21 (LIP1-15), SEQ ID NO: 22 (LIP1-17), SEQ ID NO: 23 (LIP1-19), SEQ ID NO: 24 (LIP1-21), SEQ ID NO: 25 (LIP1-22), SEQ ID NO: 26 (LIP1-23), SEQ ID NO: 27 (LIP1-26), SEQ ID NO: 28 (LIP1-28), SEQ ID NO: 29 (LIP1-30), SEQ ID NO: 30 (LIP1-32), SEQ ID NO: 31 (LIP1-24), SEQ ID NO: 32 (LIP1-25), SEQ ID NO: 33 (LIP1-27), SEQ ID NO: 34 (LIP1-29), SEQ ID NO: 35 (LIP1-31) o SEQ ID NO: 36 (LIP1-33), que se modifica en no más de 25 posiciones de aminoácidos, y comprende una secuencia de CDR1 que es cuando menos el 50 por ciento idéntica a la secuencia de CDR1 de cualquiera de las SEQ ID NO: 19 (LIP1-12), SEQ ID NO: 20 (LIP1-13), SEQ ID NO: 21 (LIP1-15), SEQ ID NO: 22 (LIP1-17), SEQ ID NO: 23 (LIP1-19), SEQ ID NO: 24 (LIP1-21), SEQ ID NO: 25 (LIP1-22), SEQ ID NO: 26 (LIP1-23), SEQ ID NO: 27 (LIP1-26), SEQ ID NO: 28 (LIP1-28), SEQ ID NO: 29 (LIP1-30), SEQ ID NO: 30 (LIP1-32), SEQ ID NO: 31 (LIP1-24), SEQ ID NO: 32 (LIP1-25), SEQ ID NO: 33 (LIP1-27), SEQ ID NO: 34 (LIP1-29), SEQ ID NO: 35 (LIP1-31) o SEQ ID NO: 36 (LIP1-33).

10. Un único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN, el cual comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de aminoácidos estipuladas en las SEQ ID NO: 19 (LIP1-12), SEQ ID NO: 20 (LIP1-13), SEQ ID NO: 21 (LIP1-15), SEQ ID NO: 22 (LIP1-17), SEQ ID NO: 23 (LIP1-19), SEQ ID NO: 24 (LIP1-21), SEQ ID NO: 25 (LIP1-22), SEQ ID NO: 26 (LIP1-23), SEQ ID NO: 27 (LIP1-26), SEQ ID NO: 28 (LIP1-28), SEQ ID NO: 29 (LIP1-30), SEQ ID NO: 30 (LIP1-32), SEQ ID NO: 31 (LIP1-24), SEQ ID NO: 32 (LIP1-25), SEQ ID NO: 33 (LIP1-27), SEQ ID NO: 34 (LIP1-29), SEQ ID NO: 35 (LIP1-31) o SEQ ID NO: 36 (LIP1-33), que se modifica en no más de 25 posiciones de aminoácidos, y comprende una secuencia de CDR2 que es cuando menos el 50 por ciento idéntica a la secuencia de CDR2 de cualquiera de las SEQ ID NO: 19 (LIP1-12), SEQ ID NO: 20 (LIP1-13), SEQ ID NO: 21 (LIP1-15), SEQ ID NO: 22 (LIP1-17), SEQ ID NO: 23 (LIP1-19), SEQ ID NO: 24 (LIP1-21), SEQ ID NO: 25 (LIP1-22), SEQ ID NO: 26 (LIP1-23), SEQ ID NO: 27 (LIP1-26), SEQ ID NO: 28 (LIP1-28), SEQ ID NO: 29 (LIP1-30), SEQ ID NO: 30 (LIP1-32), SEQ ID NO: 31 (LIP1-24), SEQ ID NO: 32 (LIP1-25), SEQ ID NO: 33 (LIP1-27), SEQ ID NO: 34 (LIP1-29), SEQ ID NO: 35 (LIP1-31) o SEQ ID NO: 36 (LIP1-33).

11. Un único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN, el cual comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de aminoácidos estipuladas en las SEQ ID NO: 19 (LIP1-12), SEQ ID NO: 20 (LIP1-13), SEQ ID NO: 21 (LIP1-15), SEQ ID NO: 22 (LIP1-17), SEQ ID NO: 23 (LIP1-19), SEQ ID NO: 24 (LIP1-21), SEQ ID NO: 25 (LIP1-22), SEQ ID NO: 26 (LIP1-23), SEQ ID NO: 27 (LIP1-26), SEQ ID NO: 28 (LIP1-28), SEQ ID NO: 29 (LIP1-30), SEQ ID NO: 30 (LIP1-32), SEQ ID NO: 31 (LIP1-24), SEQ ID NO: 32 (LIP1-25), SEQ ID NO: 33 (LIP1-27), SEQ ID NO: 34 (LIP1-29), SEQ ID NO: 35 (LIP1-31) o SEQ ID NO: 36 (LIP1-33), que se modifica en no más de 25 posiciones de aminoácidos, y comprende una secuencia de CDR3 que es cuando menos el 50 por ciento idéntica a la secuencia de CDR3 de cualquiera de las SEQ ID NO: 19 (LIP1-12), SEQ ID NO: 20 (LIP1-13), SEQ ID NO: 21 (LIP1-15), SEQ ID NO: 22 (LIP1-17), SEQ ID NO: 23 (LIP1-19), SEQ ID NO: 24 (LIP1-21), SEQ ID NO: 25 (LIP1-22), SEQ ID NO: 26 (LIP1-23), SEQ ID NO: 27 (LIP1-26), SEQ ID NO: 28 (LIP1-28), SEQ ID NO: 29 (LIP -30), SEQ ID NO: 30 (LIP1-32), SEQ ID NO: 31 (LIP1-24), SEQ ID NO: 32 (LIP1-25), SEQ ID NO: 33 (LIP1-27), SEQ ID NO: 34 (LIP1-29), SEQ ID NO: 35 (LIP1-31) o SEQ ID NO: 36 (LIP1-33).

12. Un único dominio variable de ¡nmunoglobulina anti-DC-SIGN, el cual comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de aminoácidos estipuladas en las SEQ ID NO: 19 (LIP1-12), SEQ ID NO: 20 (LIP1-13), SEQ ID NO: 21 (LIP1-15), SEQ ID NO: 22 (LIP1-17), SEQ ID NO: 23 (LIP1-19), SEQ ID NO: 24 (LIP1-21), SEQ ID NO: 25 (LIP1-22), SEQ ID NO: 26 (LIP1-23), SEQ ID NO: 27 (LIP1-26), SEQ ID NO: 28 (LIP1-28), SEQ ID NO: 29 (LIP1-30), SEQ ID NO: 30 (LIP1-32), SEQ ID NO: 31 (LIP1-24), SEQ ID NO: 32 (LIP1-25), SEQ ID NO: 33 (LIP1-27), SEQ ID NO: 34 (LIP1-29), SEQ ID NO: 35 (LIP1-31) o SEQ ID NO: 36 (LIP1-33), que se modifica en no más de 25 posiciones de aminoácidos, y comprende una secuencia de CDR1 que es cuando menos el 50 por ciento idéntica a una secuencia de CDR1 de cualquiera de las SEQ ID NO: 19 (LIP1-12), SEQ ID NO: 20 (LIP1-13), SEQ ID NO: 21 (LIP1-15), SEQ ID NO: 22 (LIP1-17), SEQ ID NO: 23 (LIP1-19), SEQ ID NO: 24 (LIP1-21), SEQ ID NO: 25 (LIP1-22), SEQ ID NO: 26 (LIP1-23), SEQ ID NO: 27 (LIP1-26), SEQ ID NO: 28 (LIP1-28), SEQ ID NO: 29 (LIP1-30), SEQ ID NO: 30 (LIP1-32), SEQ ID NO: 31 (LIP1-24), SEQ ID NO: 32 (LIP1-25), SEQ ID NO: 33 (LIP1-27), SEQ ID NO: 34 (LIP1-29), SEQ ID NO: 35 (LIP1-31) o SEQ ID NO: 36 (LIP1-33), y comprende una secuencia de CDR2 que es cuando menos el 50 por ciento idéntica a una secuencia de CDR2 de cualquiera de las SEQ ID NO: 19 (LIP1-12), SEQ ID NO: 20 (LIP1-13), SEQ ID NO: 21 (LIP1-15), SEQ ID NO: 22 (LIP1-17), SEQ ID NO: 23 (LIP1-19), SEQ ID NO: 24 (LIP1-21), SEQ ID NO: 25 (LIP1-22), SEQ ID NO: 26 (LIP1-23), SEQ ID NO: 27 (LIP1-26). SEQ ID NO: 28 (LIP1-28), SEQ ID NO: 29 (LIP1-30), SEQ ID NO: 30 (LIP1-32), SEQ ID NO: 31 (LIP1-24), SEQ ID NO: 32 (LIP1-25), SEQ ID NO: 33 (LIP1-27), SEQ ID NO: 34 (LIP1-29), SEQ ID NO: 35 (LIP1-31) o SEQ ID NO: 36 (LIP1-33).

13. Un único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN, el cual comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de aminoácidos estipuladas en las SEQ ID NO: 19 (LIP1-12), SEQ ID NO: 20 (LIP1-13), SEQ ID NO: 21 (LIP1-15), SEQ ID NO: 22 (LIP1-17), SEQ ID NO: 23 (LIP1-19), SEQ ID NO: 24 (LIP1-21), SEQ ID NO: 25 (LIP1-22), SEQ ID NO: 26 (LIP1-23), SEQ ID NO: 27 (LIP1-26), SEQ ID NO: 28 (LIP1-28), SEQ ID NO: 29 (LIP1-30), SEQ ID NO: 30 (LIP1-32), SEQ ID NO: 31 (LIP1-24), SEQ ID NO: 32 (LIP1-25), SEQ ID NO: 33 (LIP1-27), SEQ ID NO: 34 (LIP1-29), SEQ ID NO: 35 (LIP1-31) o SEQ ID NO: 36 (LIP1-33), que se modifica en no más de 25 posiciones de aminoácidos, y comprende una secuencia de CDR1 que es cuando menos el 50 por ciento idéntica a la secuencia de CDR1 de cualquiera de las SEQ ID NO: 19 (LIP1-12), SEQ ID NO: 20 (LIP1-13), SEQ ID NO: 21 (LIP1-15), SEQ ID NO: 22 (LIP1-17), SEQ ID NO: 23 (LIP1-19), SEQ ID NO: 24 (LIP1-21), SEQ ID NO: 25 (LIP1-22), SEQ ID NO: 26 (LIP1-23), SEQ ID NO: 27 (LIP1-26), SEQ ID NO: 28 (LIP1-28), SEQ ID NO: 29 (LIP1-30), SEQ ID NO: 30 (LIP1-32), SEQ ID NO: 31 (LIP1-24), SEQ ID NO: 32 (LIP1-25), SEQ ID NO: 33 (LIP1-27), SEQ ID NO: 34 (LIP1-29), SEQ ID NO: 35 (LIP1-31) o SEQ ID NO: 36 (LIP1-33), y comprende una secuencia de CDR3 que es cuando menos el 50 por ciento idéntica a la secuencia de CDR3 de cualquiera de las SEQ ID NO: 19 (LIP1-12), SEQ ID NO: 20 (LIP1-13), SEQ ID NO: 21 (LIP1-15), SEQ ID NO: 22 (LIP1-17), SEQ ID NO: 23 (LIP1-19), SEQ ID NO: 24 (LIP1-21), SEQ ID NO: 25 (LIP1-22), SEQ ID NO: 26 (LIP1-23), SEQ ID NO: 27 (LIP1-26), SEQ ID NO: 28 (LIP1-28), SEQ ID NO: 29 (LIP1-30), SEQ ID NO: 30 (LIP1-32), SEQ ID NO: 31 (LIP1-24), SEQ ID NO: 32 (LIP1-25), SEQ ID NO: 33 (LIP1-27), SEQ ID NO: 34 (LIP1-29), SEQ ID NO: 35 (LIP1-31) o SEQ ID NO: 36 (LIP1-33).

14. Un único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN, el cual comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de aminoácidos estipuladas en las SEQ ID NO: 19 (LIP1-12), SEQ ID NO: 20 (LIP1-13), SEQ ID NO: 21 (LIP1-15), SEQ ID NO: 22 (LIP1-17), SEQ ID NO: 23 (LIP1-19), SEQ ID NO: 24 (LIP1-21), SEQ ID NO: 25 (LIP1-22), SEQ ID NO: 26 (LIP1-23), SEQ ID NO: 27 (LIP1-26), SEQ ID NO: 28 (LIP1-28), SEQ ID NO: 29 (LIP1-30), SEQ ID NO: 30 (LIP1-32), SEQ ID NO: 31 (LIP1-24), SEQ ID NO: 32 (LIP1-25), SEQ ID NO: 33 (LIP1-27), SEQ ID NO: 34 (LIP1-29), SEQ ID NO: 35 (LIP1-31) o SEQ ID NO: 36 (LIP1-33), que se modifica en no más de 25 posiciones de aminoácidos, y comprende una secuencia de CDR2 que es cuando menos el 50 por ciento idéntica a la secuencia de CDR2 de cualquiera de las SEQ ID NO: 19 (LIP1-12), SEQ ID NO: 20 (LIP1-13), SEQ ID NO: 21 (LIP1-15), SEQ ID NO: 22 (LIP1-17), SEQ ID NO: 23 (LIP1-19), SEQ ID NO: 24 (LIP1-21), SEQ ID NO: 25 (LIP1-22), SEQ ID NO: 26 (LIP1-23), SEQ ID NO: 27 (LIP1-26), SEQ ID NO: 28 (LIP1-28), SEQ ID NO: 29 (LIP1-30), SEQ ID NO: 30 (LIP1-32), SEQ ID NO: 31 (LIP1-24), SEQ ID NO: 32 (LIP1-25), SEQ ID NO: 33 (LIP1-27), SEQ ID NO: 34 (LIP1-29), SEQ ID NO: 35 (LIP1-31) o SEQ ID NO: 36 (LIP1-33), y comprende una secuencia de CDR3 que es cuando menos el 50 por ciento idéntica a la secuencia de CDR3 de cualquiera de las SEQ ID NO: 19 (LIP1-12), SEQ ID NO: 20 (LIP1-13), SEQ ID NO: 21 (LIP1-15), SEQ ID NO: 22 (LIP1-17), SEQ ID NO: 23 (LIP1-19), SEQ ID NO: 24 (LIP1-21), SEQ ID NO: 25 (LIP1-22), SEQ ID NO: 26 (LIP1-23), SEQ ID NO: 27 (LIP1-26), SEQ ID NO: 28 (LIP1-28), SEQ ID NO: 29 (LIP1-30), SEQ ID NO: 30 (LIP1-32), SEQ ID NO: 31 (LIP1-24), SEQ ID NO: 32 (LIP1-25), SEQ ID NO: 33 (LIP1-27), SEQ ID NO: 34 (LIP1-29), SEQ ID NO: 35 (LIP1-31) o SEQ ID NO: 36 (LIP1-33).

15. Un único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN, el cual comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de aminoácidos estipuladas en las SEQ ID NO: 19 (LIP1-12), SEQ ID NO: 20 (LIP1-13), SEQ ID NO: 21 (LIP1-15), SEQ ID NO: 22 (LIP1-17). SEQ ID NO: 23 (LIP1-19), SEQ ID NO: 24 (LIP1-21), SEQ ID NO: 25 (LIP1-22), SEQ ID NO: 26 (LIP1-23), SEQ ID NO: 27 (LIP1-26), SEQ ID NO: 28 (LIP1-28), SEQ ID NO: 29 (LIP1-30), SEQ ID NO: 30 (LIP1-32), SEQ ID NO: 31 (LIP1-24), SEQ ID NO: 32 (LIP1-25), SEQ ID NO: 33 (LIP1-27), SEQ ID NO: 34 (LIP1-29), SEQ ID NO: 35 (LIP1-31) o SEQ ID NO: 36 (LIP1-33), que se modifica en no más de 25 posiciones de aminoácidos, y comprende una secuencia de CDR1 que es cuando menos el 50 por ciento idéntica a la secuencia de CDR1 de cualquiera de las SEQ ID NO: 19 (LIP1-12), SEQ ID NO: 20 (LIP1-13), SEQ ID NO: 21 (LIP1-15), SEQ ID NO: 22 (LIP1-17), SEQ ID NO: 23 (LIP1-19), SEQ ID NO: 24 (LIP1-21), SEQ ID NO: 25 (LIP1-22), SEQ ID NO: 26 (LIP1-23), SEQ ID NO: 27 (LIP1-26), SEQ ID NO: 28 (LIP1-28), SEQ ID NO: 29 (LIP1-30), SEQ ID NO: 30 (LIP1-32), SEQ ID NO: 31 (LIP1-24), SEQ ID NO: 32 (LIP1-25), SEQ ID NO: 33 (LIP1-27), SEQ ID NO: 34 (LIP1-29), SEQ ID NO: 35 (LIP1-31) o SEQ ID NO: 36 (LIP1-33), y comprende una secuencia de CDR2 que es cuando menos el 50 por ciento idéntica a la secuencia de CDR2 de cualquiera de las SEQ ID NO: 19 (LIP1-12), SEQ ID NO: 20 (LIP1-13), SEQ ID NO: 21 (LIP1-15), SEQ ID NO: 22 (LIP1-17), SEQ ID NO: 23 (LIP1-19), SEQ ID NO: 24 (LIP1-21), SEQ ID NO: 25 (LIP1-22), SEQ ID NO: 26 (LIP1-23), SEQ ID NO: 27 (LIP1-26), SEQ ID NO: 28 (LIP1-28), SEQ ID NO: 29 (LIP1-30), SEQ ID NO: 30 (LIP1-32), SEQ ID NO: 31 (LIP1-24), SEQ ID NO: 32 (LIP1-25), SEQ ID NO: 33 (LIP1-27), SEQ ID NO: 34 (LIP1-29), SEQ ID NO: 35 (LIP1-31) o SEQ ID NO: 36 (LIP1-33), y comprende una secuencia de CDR3 que es cuando menos el 50 por ciento idéntica a la secuencia de CDR3 de cualquiera de las SEQ ID NO: 19 (LIP1-12), SEQ ID NO: 20 (LIP1-13), SEQ ID NO: 21 (LIP1-15), SEQ ID NO: 22 (LIP1-17), SEQ ID NO: 23 (LIP1-19), SEQ ID NO: 24 (LIP1-21), SEQ ID NO: 25 (LIP1-22), SEQ ID NO: 26 (LIP1-23), SEQ ID NO: 27 (LIP1-26), SEQ ID NO: 28 (LIP1-28), SEQ ID NO: 29 (LIP1-30), SEQ ID NO: 30 (LIP1-32), SEQ ID NO: 31 (LIP1-24), SEQ ID NO: 32 (LIP1-25), SEQ ID NO: 33 (LIP1-27), SEQ ID NO: 34 (LIP1-29), SEQ ID NO: 35 (LIP1-31) o SEQ ID NO: 36 (LIP1-33).

16. Un único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN, el cual comprende una secuencia de CDR3 que es cuando menos el 50 por ciento idéntica a una secuencia de CDR3 seleccionada a partir del grupo consistente en: la secuencia de CDR3 de cualquiera de las SEQ ID NO: 19 (LIP1-12), SEQ ID NO: 20 (LIP1-13), SEQ ID NO: 21 (LIP1-15), SEQ ID NO: 22 (LIP1-17), SEQ ID NO: 23 (LIP1-19), SEQ ID NO: 24 (LIP1-21), SEQ ID NO: 25 (LIP1-22), SEQ ID NO: 26 (LIP1-23), SEQ ID NO: 27 (LIP1-26), SEQ ID NO: 28 (LIP1-28), SEQ ID NO: 29 (LIP1-30), SEQ ID NO: 30 (LIP1-32), SEQ ID NO: 31 (LIP1-24), SEQ ID NO: 32 (LIP1-25), SEQ ID NO: 33 (LIP1-27), SEQ ID NO: 34 (LIP1-29), SEQ ID NO: 35 (LIP1-31) o SEQ ID NO: 36 (LIP1-33).

17. Un único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC- SIGN, el cual comprende una secuencia de CDR3 seleccionada a partir del grupo consistente en: la secuencia de CDR3 de cualquiera de las SEQ ID NO: 19 (LIP1-12), SEQ ID NO: 20 (LIP1-13), SEQ ID NO: 21 (LIP1-15), SEQ ID NO: 22 (LIP1-17), SEQ ID NO: 23 (LIP1-19), SEQ ID NO: 24 (LIP1-21), SEQ ID NO: 25 (LIP1-22), SEQ ID NO: 26 (LIP1-23), SEQ ID NO: 27 (LIP1-26), SEQ ID NO: 28 (LIP1-28), SEQ ID NO: 29 (LIP1-30), SEQ ID NO: 30 (LIP1-32), SEQ ID NO: 31 (LIP1-24), SEQ ID NO: 32 (LIP1-25), SEQ ID NO: 33 (LIP1-27), SEQ ID NO: 34 (LIP1-29), SEQ ID NO: 35 (LIP1-31) o SEQ ID NO: 36 (LIP1-33).

18. Un único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN, el cual comprende cuando menos una CDR seleccionada a partir del grupo consistente en: CDR1, CDR2, y CDR3, en donde la CDR 1 , CDR2, o CDR3 es idéntica a una secuencia de CDR1, CDR2, o CDR3 de cualquiera de las SEQ ID NO: 19 (LIP1-12), SEQ ID NO: 20 (LIP1-13), SEQ ID NO: 21 (LIP1-15), SEQ ID NO: 22 (LIP1-17), SEQ ID NO: 23 (LIP1-19), SEQ ID NO: 24 (LIP1-21), SEQ ID NO: 25 (LIP1-22), SEQ ID NO: 26 (LIP1-23), SEQ ID NO: 27 (LIP1-26), SEQ ID NO: 28 (LIP1-28), SEQ ID NO: 29 (LIP1-30), SEQ ID NO: 30 (LIP1-32), SEQ ID NO: 31 (LIP1-24), SEQ ID NO: 32 (LIP1-25), SEQ ID NO: 33 (LIP1-27), SEQ ID NO: 34 (LIP1-29), SEQ ID NO: 35 (LIP1-31) o SEQ ID NO: 36 (LIP1-33).

19. Un único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se enlaza al DC-SIGN con una baja afinidad.

20. Un ligando que tiene especificidad de enlace para el DC-SIGN, e inhibe el enlace de un único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN, el cual comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo consistente en: SEQ ID NO: 19 (LIP1-12), SEQ ID NO: 20 (LIP1-13), SEQ ID NO: 21 (LIP1-15), SEQ ID NO: 22 (LIP1-17), SEQ ID NO: 23 (LIP1-19), SEQ ID NO: 24 (LIP1-21), SEQ ID NO: 25 (LIP1-22), SEQ ID NO: 26 (LIP1-23), SEQ ID NO: 27 (LIP1-26), SEQ ID NO: 28 (LIP1-28), SEQ ID NO: 29 (LIP1-30), SEQ ID NO: 30 (LIP1-32), SEQ ID NO: 31 (LIP1-24), SEQ ID NO: 32 (LIP1-25), SEQ ID NO: 33 (LIP1-27), SEQ ID NO: 34 (LIP1-29), SEQ ID NO: 35 (LIP1-31), y SEQ ID NO: 36 (LIP1-33) .

21. Un polipéptido aislado codificado por una secuencia de nucleótidos que es cuando menos el 80 por ciento idéntica a una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo consistente en: SEQ ID NO: 1 (LIP1-12), SEQ ID NO: 2 (LIP1-13), SEQ ID NO: 3 (LIP1-15), SEQ ID NO: 4 (LIP1-17), SEQ ID NO: 5 (LIP1-19), SEQ ID NO: 6 (LIP1-21), SEQ ID NO: 7 (LIP1-22), SEQ ID NO: 8 (LIP1-23), SEQ ID NO: 9 (LIP1-26), SEQ ID NO: 10 (LIP1-28), SEQ ID NO: 11 (LIP1-30), SEQ ID NO: 12 (LIP1-32), SEQ ID NO: 13 (LIP1-24), SEQ ID NO: 14 (LIP1-25), SEQ ID NO: 15 (LIP1-27), SEQ ID NO: 16 (LIP1-29), SEQ ID NO: 17 (LIP1-31), y SEQ ID NO: 18 (LIP1-33), y en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es cuando menos el 90 por ciento idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo consistente en: SEQ ID NO: 19 (LIP1-12), SEQ ID NO: 20 (LIP1-13), SEQ ID NO: 21 (LIP1- 15), SEQ ID NO: 22 (LIP1-17), SEQ ID NO: 23 (LIP1-19), SEQ ID NO: 24 (LIP1-21), SEQ ID NO: 25 (LIP1-22), SEQ ID NO: 26 (LIP1-23), SEQ ID NO: 27 (LIP1-26), SEQ ID NO: 28 (LIP1-28), SEQ ID NO: 29 (LIP1-30), SEQ ID NO: 30 (LIP1-32), SEQ ID NO: 31 (LIP1-24), SEQ ID NO: 32 (LIP1-25), SEQ ID NO: 33 (LIP1-27), SEQ ID NO: 34 (LIP1-29), SEQ ID NO: 35 (LIP1-31), y SEQ ID NO: 36 (LIP1-33).

22. Un único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN o un péptido como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se enlaza específicamente al DC-SIGN pero no al DC-SIGNR.

23. Un ácido nucleico aislado o recombinante que codifica un polipéptido que comprende un único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

24. Un vector, el cual comprende un ácido nucleico como se reclama en la reivindicación 23.

25. Una célula huésped, la cual comprende un ácido nucleico como se reclama en la reivindicación 23, o un vector como se reclama en la reivindicación 24.

26. Un método para la producción de un polipéptido que comprende un único dominio variable de inmunoglobulina anti-DC-SIGN, comprendiendo el método mantener una célula huésped como se reclama en la reivindicación 25, bajo condiciones adecuadas para la expresión del ácido nucleico o vector, en donde se produce un polipéptido que comprende un único dominio variable de ¡nmunoglobulina.

27. Un único dominio variable de ¡nmunoglobulina anti-DC-SIGN, cuyo único dominio variable de ¡nmunoglobulina tiene la especificidad de enlace de cualquiera de LIP1-12, LIP1-13, LIP1-15, LIP1-17, LIP1-19, LIP1-21, LIP1-22, LIP1-23, LIP1-24, LIP1-25, LIP1-26, LIP1-27, LIP1-28, LIP1-29, LIP1-30, LIP1-31, LIP1-32 o LIP1-33.

28. Un único dominio variable de ¡nmunoglobulina anti-DC-SIGN, como se reclama en cualquiera de reivindicaciones 1 a 2, 6 a 19, o 22, en donde la secuencia de aminoácidos comprende además los aminoácidos ST en el término N.

29. Un único dominio variable de ¡nmunoglobulina anti-DC-SIGN, como se reclama en cualquiera de reivindicaciones 1 a 2, 6 a 19, o 22, en donde la secuencia de aminoácidos comprende además una marca-His en el extremo C-terminal.