TW200902551A - Polypeptides, antibody variable domains & antagonists - Google Patents

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TW200902551A
TW200902551A TW097121296A TW97121296A TW200902551A TW 200902551 A TW200902551 A TW 200902551A TW 097121296 A TW097121296 A TW 097121296A TW 97121296 A TW97121296 A TW 97121296A TW 200902551 A TW200902551 A TW 200902551A
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domlh
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antagonist
amino acid
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Armin Sepp
Laurent Stephane Anne Therese Jespers
Malgorzata Pupecka
Ian Tomlinson
Carolyn Enever
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Domantis Ltd
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Description

200902551 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於蛋白酶抗性多肽、免疫球蛋白（抗體）單— 可變區域及包含其之抗腫瘤壞死因子丨（anti_Tum〇r Necr〇sis
Factor 1 ’ TNFRl ’ p55 ’ CD120a，P60，TNF 受體超家族成員 ΙΑ ’ TNFRSF1A)拮抗劑。本發明進一步係關於包含該等 抗TNFR1配位體之用途、調配物、組合物及裝置。 【先前技術】 多肽及肽已在多種應用中成為越來越重要之藥劑，包括 工業應用及作為醫藥劑、治療劑及診斷劑之用@。然而， 在諸如發炎狀‘態（例如，C〇PD)及癌症之特定生理狀態 中，組織、器官或動物中（例如，肺中、腫瘤中或腫瘤附 近）所存在之蛋白酶量會增加。該蛋白酶增加會導致内源 性蛋白質及投與m錢之治療肽、多肽及蛋白質加速 降解及鈍化。因此，一些具有活體内使用⑽，用於治
療、、診斷或預防疾病)之潛力之藥劑僅具有有限的功效， 因為其會經蛋白酶快速降解且失活。 夕蛋白酶抗性多肽提供數個優點。舉例而η白酶抗性 夕肽在活體内保留活性較蛋白酶敏感劑時間長，且因此可 2功能m以產生生物效應之時間。選擇抗蛋白酶降 解作用且亦具有相展4 有心、要生物活性之多肽的改良方法是有必要 的。 TNFR1 TNFR1為含有結合 配位體之細胞外區及缺 乏内在信號轉 13I416.doc 200902551
導活性但可與信號轉導分子締合之細胞内區域的橫跨膜受 體。TNFR1與結合TNF之複合物含有三個TNFR1鏈及三個 TNF鏈。（Banner 等人，CW/，73⑺ 43 卜445 (1993)。）TNF 配位體以由三個TNFR1鏈結合之三聚體形式存在。（Id·)三 個TNFR1鏈在受體-配位體複合物中緊密叢集在一起，且 該叢集對TNFR1介導之信號轉導而言為必要的。實際上， 結合TNFR1之多價藥劑（諸如抗TNFR1抗體）可誘導TNFR1 叢集及不存在TNF下之信號轉導，且通常用作TNFR1激動 劑。（例如參見，Belka 等人，五14(6): 1156-1165 (1995); Mandik-Nayak 等人，J. Jmmimo/, 167:1920-1928(2001)。）因 此，結合TNFR1之多價藥劑通常不為TNFR1之有效拮抗 劑，即使其阻斷TNFa與TNFR1之結合。 TNFR1之細胞外區包含13個胺基酸之胺基末端片段（SEQ ID NO:603(人類）之胺基酸 1-13 ; SEQ ID NO:604(小鼠）之 胺基酸1-13)、區域1(SEQ ID NO:603(人類）之胺基酸14-53 ; SEQ ID NO:604(小鼠）之胺基酸 14-53)、區域2(SEQ ID NO: 603(人類）之胺基酸54-97 ; SEQ ID NO:604(小鼠）之胺 基酸54-97)、區域3(SEQ ID NO: 603(人類）之胺基酸98-138; SEQ ID NO:604(小鼠）之胺基酸 98-138)及區域 4(SEQ ID NO:603(人類）之胺基酸 139-167 ; SEQ ID NO:604(小鼠） 之胺基酸139-167)，其後繼之以膜近端區（SEQ ID NO:603(人類）之胺基酸 168-182 ; SEQ ID NO: 604(小鼠）之 胺基酸 168-183)。（參見Banner等人，Ce// 73(3) 431-445 (1993)及 Loetscher 等人，Ce// (57(%) 351-359 (1990)。）區域 131416.doc 200902551 2及3與結合配位體（TNFP，TNFoi)接觸。（Banner等人， CW/, 73⑺431-445 (1993)。）TNFR1之細胞外區亦含有稱 為前配位體結合組合區域或PLAD區域之區（SEQ ID NO:603(人類）之胺基酸1-53 ; SEQ ID NO:604(小鼠）之胺基 酸 1-53)(美國政府之 WO 0 1/58953 ; Deng 等人，
Me山.cz’《e, doi: 10.1038/nml304 (2005))。
TNFR1在活體内經由包括蛋白水解存於區域4或膜近端 區（SEQ ID NO:603之胺基酸 168-182 ; SEQ ID NO:604之胺 基酸168-183)中之TNFR1而產生可溶性TNFR1形式之過程 自細胞表面排出。可溶性TNFR1保留結合TNFa之能力， 且從而充當TNFtx活性之内源性抑制劑。 【發明内容】 在一態樣中，本發明提供一種多肽，其包含與DOMlh-1 3 1 - 5 1 1之胺基酸序列（示於圖3 )至少9 5 % —致之胺基酸序 列。在一態樣中’本發明提供一種多肽，其包含與 DOMlh-131-511、DOM—lh-131-201、DOMlh-131-202、 DOMlh-131-203、DOMlh-131-204、DOMlh-131-205 及 DOMlh-131-206之胺基酸序列（示於圖3)至少95%—致之胺 基酸序列。在一態樣中，本發明提供一種多肽，其包含與 DOMlh-131-511、DOMlh-131-201、DOMlh-131-202、 DOMlh-131-203、DOMlh-13 1-204 及 DOMlh-13 1-205 之胺 基酸序列至少95% —致之胺基酸序列。在該等態樣之一實 施例中，一致性0/〇為至少96、97、98或99%。在一實施例 中，該多肽為 DOMlh-131-511 、DOMlh-131-201 、 131416.doc 200902551 DOMlh-131-202、DOMlh-13 1-203、DOMlh-131-204、 DOMlh-131-205 或 DOMlh-131-206。本發明進一步提供一 種（大體上）純〇〇河111-131-511、〇〇]\41}1-131-201、〇〇]^111- 13 1-202、DOMlh-131-203、DOMlh-131-204、DOMlh-1 3 1 -205或DOM 1 h-1 3 1 -206單體。在一實施例中，提供至 少98、99、99.5°/。純或100%純之單體。
在一態樣中’本發明提供一種多肽，其包含與〇01^4111·· 1 3 1 -5 11之胺基酸序列至少90% —致之蛋白酶抗性胺基酸序 列。在一態樣中，本發明提供一種多肽，其包含與 DOMlh-131-511、DOMlh-131-201、DOMlh-131-202、 DOMlh-131-203、DOMlh-13 1-204、DOMlh-131-205 及 DOM 1 h-1 3 1 -206之胺基酸序列至少90% —致之蛋白酶抗性 胺基酸序列。在一態樣中，本發明提供一種多肽，其包含 與 DOMlh-131-511、DOMlh-131-201、DOMlh-131-202、 DOMlh-13 1-203、DOMlh-131-204 及 DOMlh-13 1-205 之胺 基酸序列至少90% —致之蛋白酶抗性胺基酸序列。在該等 態樣之一實施例中，一致性％為至少80、85、90、91、 92、93、94、95、96、97、98 或 99%。在一實施例中，該 多肽為 DOMlh-131-511、DOMlh-131-201、DOMlh-131-202、 DOMlh-131-203、DOMlh-131-204、DOMlh-13 1-205 或 DOMlh-13 1-206。 在一態樣中，本發明提供一種多肽，其係由與00河1}1-13 1 -5 11之核苷酸序列（示於圖1 9)至少80% —致之核苷酸序 列編碼。在一態樣中，本發明提供一種多肽，其係由與 131416.doc 200902551 DOMlh-131-511、DOMlh-131-201、DOMlh-131-202、 DOMlh-131-203、DOMlh-131-204、DOMlh-13 1-205 或 DOM 1 h-1 3 1 -206之核苷酸序列至少80% —致之核苷酸序列 編碼。在一態樣中，本發明提供一種多肽，其係由與 DOMlh-131-511、DOMlh-131-201、DOMlh-131-202、 DOMlh-13 1-203、DOMlh-131-204 或 DOMlh-131-205 之核 苷酸序列至少80% —致之核苷酸序列編碼。在該等態樣之 一實施例中，一致性％為至少70、80、85、90、91、92、 93、 94、95、96、97、98 或 99%。 在一悲樣中’本發明提供一種蛋白酶抗性多肽，其係由 與DOMlh-131-511之核苷酸序列至少80%—致之核苷酸序 列編碼。在一態樣中，本發明提供一種蛋白酶抗性多肽， 其係由與DOMlh-131-511、DOMlh-131-201、DOMlh-131-202、DOMlh-13 1-203、DOMlh-13 1-204、DOMlh-131-205 或DOM lh-1 3 1-206之核苷酸序列至少80% —致之核苷酸序 列編碼。在一態樣中，本發明提供一種蛋白酶抗性多肽， 其係由與〇〇]\4111-131-511、〇€^1}1-131-201、〇〇1^111-131- 202 ' DOMlh-13 1-203、DOMlh-13 1-204 或 DOMlh-131-205 之核苷酸序列至少80% —致之核苷酸序列編碼。在一實施 例中’ 一致性 ％ 為至少 70、80、85、90、91、92、93、 94、 95、96、97、98 或 99%。 在一態樣中’本發明提供一種多肽，其係由與〇〇1^111-1 3 1 -5 11之核苷酸序列至少5 7°/。一致之核苷酸序列編碼且其 中該多肽包含與DOMlh-131-511之胺基酸序列至少95% 一 131416.doc -10- 200902551 致之胺基酸序列。在一態樣中，本發明提供一種多肽，其 係由與選自001^111-131-511、〇01^1^1-131-201、001^111-131-202、DOMlh-13 1-203、DOMlh-13 1-204、DOMlh-13 1-205或DOMlh-1 3 1-206之核苷酸序列之核苷酸序列至 少57% —致的核苷酸序列編碼且其中該多肽相應包含與 DOMlh-13 1-5 11 ' DOM1 h-1 3 1-201 ' DOM1 h-1 3 1-202 ' DOMlh-13 1-203、DOMlh-131-204、DOMlh-131-205 或 DOMlh-13 1-206之胺基酸序列至少95% —致之胺基酸序 列。在一態樣中，本發明提供一種多肽，其係由與選自 DOMlh-131-511、DOMlh-131-201、DOMlh-131-202、 DOMlh-131-203、DOMlh-131-204、DOMlh-13 1-205 或 DOM 1 h-1 3 1 -206之核苷酸序列之核苷酸序列至少57% 一致 的核苷酸序列編碼且其中該多肽相應包含與〇〇1^111-131- 511、DOMlh-131-201、DOMlh-131-202、DOMlh-131-203、DOMlh-131-204 或 DOMlh-131-205 之胺基酸序列至 少9 5 % —致之胺基酸序列。在一實施例中，核苷酸序列之 一致性 ％為至少 60、65、70、75、80、85、90、91、92、 93、94、95、96、97、98或99%。在一實施例中，胺基酸 序列之一致性％為至少94、95、96、97、98或99%或 100%。舉例而言’核苷酸序列可為D〇Mlh_131_511、 DOMlh-131-201、DOMlh-131-202、DOMlh-131-203、 DOMlh-131-204、DOMlh-13 1-205 或 DOMlh-13 1-206 之核 苷酸序列之密碼子優化形式。此項技術中已知序列之密碼 子優化。在一實施例中，核苷酸序列係經優化從而表現於 131416.doc .Π - 200902551 細菌（例如’大腸桿菌（五.cW)或假單胞菌屬也歸„似）， j螢光饭單胞菌（户· //worescens))、哺乳動物（例如， )或酵母伤主細胞（例如’酵母屬（户化以…或植酵母屬 ’例如馬斯德畢赤酵母（户或釀酒 酵母（& cerevzWae))* 0 在恶樣中，本發明提供一種包含本發明之多肽之融合 蛋白。
在恶樣中’本發明提供一種抗TNFa受體1型（TNFR1 ; P55)免疫球蛋白單一可變區域，其包含與〇〇^1^131_^1 之胺基酸序列至少95% 一致之胺基酸序列。在一態樣中， 本發明提供一種抗TNFcx受體1型（TNFR1 ; P55)免疫球蛋白 單一可變區域，其包含與〇〇]\41}1-131-511、〇01^111-131-201 > DOMlh-13 1-202 ^ DOM 1 h-1 3 1-203 > DOMlh-131-204、DOMlh-13 1-205 或 DOMlh-131-206之胺基酸序列至 少95% —致之胺基酸序列。在一態樣中，本發明提供一種 抗TNFa受體1型（TNFR1 ; p55)免疫球蛋白單一可變區域， 其包含與〇〇^1111-131-511、〇(^111-131-201、〇〇河111-131- 202、DOMlh-131-203、DOMlh-131-204或 DOMlh-131-205 之胺基酸序列至少95% —致之胺基酸序列。在該等態樣之 一實施例中，一致性。/〇為至少96、97、98或99%。 在一態樣中，本發明提供一種蛋白酶抗性抗TNFa受體1 型（TNFR1 ; p55)免疫球蛋白單一可變區域，其包含與 DOM 1 h-1 3 1 -5 11之胺基酸序列至少9〇% 一致之胺基酸序 列。在一態樣中，本發明提供一種蛋白酶抗性抗TNFa受 131416.doc -12- 200902551 體1型（TNFRl ’ p55)免疫球蛋白單一可變區域，其包含與 DOMlh-131-511、DOMlh-131-201、DOMlh-131-202、 DOMlh-13 1-203、DOMlh-131-204、DOMlh-13 1-205 或 DOMlh-1 31-206之胺基酸序列至少9〇% 一致之胺基酸序 列。在一態樣中’本發明提供一種蛋白酶抗性抗TNFa受 體1型（TNFRl ; p55)免疫球蛋白單一可變區域，其包含與 DOMlh-131-511 > DOM1 h-13 1-201 > DOM 1 h-1 3 1-202 ' DOMlh-131-203、DOMlh-131-204 或 DOMlh-13 1-205 之胺 基酸序列至少90% —致之胺基酸序列。在該等態樣之—實 施例中，一致性％為至少80、85、90、91、92、93、94、 95、96、97、98 或 99%。 在一恶樣中’本發明提供一種抗TNFa受體1型（TNFRl ; p55)免疫球蛋白單一可變區域，其係由與D〇Mih-131-511 之核苷酸序列至少57%—致之核苷酸序列編碼且其中該多 狀包含與DOMlh-131-511之胺基酸序列至少95% —致之胺 基酸序列。在一態樣中，本發明提供一種抗TNFa受體【型 (TNFRl ; p55)免疫球蛋白單一可變區域，其係由與選自 DOMlh-131-511、DOMlh-131-201、DOMlh-13 1-202、 DOMlh-13 1-203、DOMlh-131-204、D〇Mlh-13 1-205 或 DOMlh-131-206之核苦酸序列之核苦酸序列至少π% 一致 的核皆酸序列編碼且其中該多肽相應包含與D〇m 1 h-1 3 1 · 511 ^ DOMlh-131-201 ^ DOM 1 h-13 1-202 > DOMlh-131- 203、DOMlh-131-204、DOMlh-13 1-205 或 DOMlh-131-206 之胺基酸序列至少95% —致之胺基酸序列。在一態樣中， 131416.doc -13- 200902551 本發明提供一種抗TNFa受體1型（TNFRl ; p55)免疫球蛋白 單一可變區域，其係由與選自〇€^111-131-511、〇01^111-131-201 ^ DOMlh-131-202 > DOM1 h-131-203 > DOMlh-13 1-204、DOMlh-13 1-205 或DOMlh-13 1-206之核苷酸序列 之核苷酸序列至少57% —致的核苷酸序列編碼且其中該多 肽相應包含與 DOM lh-131-511 、DOMlh-131-201 、 DOMlh-131-202、DOMlh-131-203、DOMlh-131-204 或 DOMlh-1 31-205之胺基酸序列至少95%一致之胺基酸序 列。在一實施例中’核苷酸序列之一致性％為至少6〇、 65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、 97、98或99°/。。在一實施例中，胺基酸序列之一致性％為 至少94、95、96、97、98或99%或100%。舉例而言，核苷 酸序列可為〇〇>4111-131-511、〇€^111-131-201、〇〇1^111- 131-202、DOMlh-131-203、DOMlh-13 1-204、DOMlh- 1 3 1-205或DOM lh-13 1-206之核苷酸序列之密碼子優化形 式。此項技術中已知序列之密碼子優化。在一實施例中， 核苷酸序列係經優化從而表現於細菌（例如’大腸桿菌或 假單胞菌屬，例如螢光假單胞菌）、哺乳動物（例如，cH〇) 或酵母宿主細胞（例如，酵母屬或植酵母屬，例如馬斯德 畢赤酵母或釀酒酵母）中。 在一實施例中，免疫球蛋白單一可變區域在位置53處包 含天冬胺酸’其中編號係根據Kabat("Se叫〇f
Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services 1991)。 131416.doc -14- 200902551 在實細*例中，免疫球蛋白單一可變區域在位置91處包 含組胺酸’其中編號係根據Kabat。 在態樣中’本發明提供一種抗TNFa受體1型（TNFR1 ; P55)免疫球蛋白單一可變區域，其包含與D〇Mlh_ni_ 511 ' DOMlh-131-201 > DOM 1 h-13 1-202 > DOMlh-131- 203、DOMlh-131-204、DOMlh-13 1-205 或 DOMlh-131-206 之胺基酸序列一致之胺基酸序列。在一態樣令，本發明提 供一種抗TNFa受體1型（TNFR1 ; P5 5)免疫球蛋白單一可變 區域’其包含與 DOMlh-131-511、DOMlh-131-201、 DOMlh-131-202、DOMlh-131-203、DOMlh-131-204 或 DOMlh-1 3 1-205之胺基酸序列一致之胺基酸序列。
在一態樣中’本發明提供一種抗TNFa受體1型（TNFR 1 ; P5 5)免疫球蛋白單一可變區域，其係由與d〇m lh-1 31-511 之核苷酸序列至少80% —致之核苷酸序列編碼。在一態樣 中’本發明提供一種抗TNFa受體1型（TNFR1 ; P55)免疫球 蛋白單一可變區域，其係由與〇〇]^111-131-511、〇0?4111-131-201 > DOMlh-13 1-202 > DOM 1 h-13 1-203 > DOMlh-131-204、DOMlh-131-205 或 DOMlh-131-206之核苷酸序列 至少80% —致之核苷酸序列編碼。在一態樣中，本發明提 供一種抗TNFa受體1型（TNFR1 ; p55)免疫球蛋白單一可變 區域，其係由與 DOMlh-131-511、DOMlh-131-201、 DOMlh-131-202、DOMlh-131-203、DOMlh-131-204 或 DOM 1 h-1 3 1 -205之核苷酸序列至少80% —致之核苷酸序列 編碼。在一實施例中，一致性％為至少70、80、85、90、 131416.doc •15- 200902551 91 92、93、94、95、96、97、98 或 99%。 在嘘樣中，本發明提供一種抗TNFa受體1型（TNFR1 ; P55)免疫球蛋白單一可變區域，其係由與D〇Mlh_131_ 511 D〇Mlh-131-201 ^ DOMlh-131-202 ' DOMlh-131- 203、DOMlh-131-204、DOMlh-131-205 或 DOMlh-131-206 之核苷酸序列一致之序列編碼。 在悲樣中’本發明提供一種TNFa受體1型（TNFR1 ; P55)拮抗劑，其包含本發明之抗免疫球蛋白單一可 變區域。在一實施例中，該拮抗劑包含第一及第二免疫球 蛋白單一可變區域，其中各可變區域係根據發明。舉例而 δ，其中該拮抗劑包含該單—可變區域之單體或該單一可 蓃區域之同源二聚體。在一實施例中，該單一可變區域或 各單一可變區域之胺基酸序列係與D〇Mlh_131_511、 DOMlh-131-201 > DOM 1 h-1 3 1-202 > DOM 1 h-1 3 1-203 ' DOMlh-131-204、DOMlh-13 1-205 或 DOMlh-13 1-206 之胺 基駿序列-致。 在悲樣中’本發明提供一種抗TNFa受體1型（TNFR1 ; P5 5)免疫球蛋白單一可變區域，其包含與選自DoMlh_ 131-511、DOMlh-131-201、D〇Mlh_131_2Q2、D〇Mlh- 13 1-203、DOMlh-13 1-204 及 DOMlh- 13 1-205(視情況及 DOMlh-1 3 1-206)(展示於圖3中）之胺基酸序列一致或在不 超過25個胺基酸位置處與該所選擇序列不同且具有與該所 選擇序列之CDR1序列至少50%一致之CDR1序列的胺基酸 序列。在一實施例中’不同之處不超過24、23、22、2丄、 131416.doc • 16 · 200902551 20 、 19 、 18 、 17 、 16 、 15 、 14 、 13 、 12 、 11 、 10 、 9 、 8 、 7、6、5、4、3、2或1個胺基酸位置。在一實施例中， CDR序列一致性為至少 55、6〇、65、7〇、75、、85、 90、95、96、97、98 或 99%。 在一態樣中，本發明提供一種抗TNFa受體㈣（TNFR1 ; P55)免疫球蛋白單一可變區域，其包含與選自1)〇1^卟_ 131-511、DOMlh-131-201、DOMlh-131-202、DOMlh- 13 1-203、D〇Mlh-13 1-204 及 DOMlh-13 1-205(視情況及 DOMlh-13 1-206)(展示於圖3中）之胺基酸序列一致或在不 超過25個胺基酸位置處與該所選擇之胺基酸序列不同且具 有與該所選擇序列之CDR2序列至少5〇% 一致之cdr2序列 的胺基酸序列。在一實施例中，不同之處不超過Μ、U、 22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、 10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸位置。在一實 她例中’ CDR序列一致性為至少55、6〇、65、、75、 80、85 ' 90、95、96、97、98 或 990/〇。 在一態樣中，本發明提供一種抗TNFa受體1型（丁nfri ; P5 5)免疫球蛋白單一可變區域，其包含與選自〇〇謝^ 131-511 . D〇Mlh-131-201 > DOM 1 h-13 1-202 ^ DOMlh-13 1-203、D〇Mlh_131_2〇4 及 D〇Mlhl3i2〇5(視情況及 DOMlh]31_206)(展示於圖3中）之胺基酸序列—致或在不 超過25個胺基酸位置處與該所選擇之胺基酸序列不同且具 有與該所選擇序列之CDR3序列至少5G% _致之cdr3序列 的胺基酸序列。在—實施例中，T同之處不超過24、23、 131416.doc -17- 200902551 22、 21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、 10、9、8'7、0、5、4、3、2或1個胺基酸位置。在一實 施例中’ CDR序列一致性為至少55、6〇、65、7〇、75、 80、85、90、95、96、97、98 或 99〇/〇。 在一態樣中，本發明提供一種抗TNFct受體1型（TNFR1 ; p5 5)免疫球蛋白單一可變區域，其包含與選自D〇Mlh_ 131 511 ' DOMlh-13 1-201 > DOM 1 h-13 1-202 ' DOMlh- 13 1-203、DOMlh-13 1-204 及 DOMlh_13 1-205(視情況及 DOMlh-13 1-206)(展示於圖3中）之胺基酸序列一致或在不 超過25個胺基酸位置處與該所選擇之胺基酸序列不同且具 有與該所選擇序列之CDR1序列至少5〇% 一致之CDR1序列 且具有與該所選擇序列之CDR2序列至少50%—致之CDR2 序列的胺基酸序列。在一實施例中，不同之處不超過24、 23、 22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、 11 1〇、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸位置。在 一實施例中，一或兩個CDR序列一致性分別為至少55、 60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98 或 99%。 在態樣中，本發明提供一種抗TNFa受體1型（tnfR 1 ; P5 5)免疫球蛋白單一可變區域，其包含與選自〇〇^^_
Ul-511、D〇Mlh-131-201、DOMlh-13 1-202、DOMlh-131-203、DOMlh_131_2〇4 及 DOMlh_131_2〇5(視情況及 DOMlh-13 1-206)(展示於圖3中）之胺基酸序列一致或在不 超過25個胺基酸位置處與該所選擇之胺基酸序列不同且具 有與該所選擇序列之CDR1序列至少50% —致之CDR1序列 131416.doc -18- 200902551 且具有與該所選擇序列之CDR3序列至少50%—致之CDR3 序列的胺基酸序列。在一實施例中不同之處不超過24、 23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、 11、10、9' 8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸位置。在 一實施例中，一或兩個CDR序列一致性分別為至少55、 60、65、70、75、80、85、90、95、96、97 ' 98 或 99%。 在悲樣中’本發明提供一種抗TNFa受體1型（TNFR1 ; p55)免疫球蛋白單一可變區域，其包含與選自d〇m丨h_ 131-511 > DOMlh-131-201 > DOM 1 h-13 1-202 > DOMlh-13 1-203、DOMlh-13 1-204 及 DOMlh-13 1 -205(視情況及 DOMlh-1 3 1-206)(展示於圖3中）之胺基酸序列一致或在不 超過25個胺基酸位置處與該所選擇之胺基酸序列不同且具 有與δ亥所遥擇序列之CDR2序列至少50% —致之CDR2序列 且具有與该所選擇序列之CDR3序列至少50% —致之CDR3 序列的胺基酸序列。在一實施例中’不同之處不超過24、 23 ' 22 ' 21 > 20 ' 19、18、17、16、15、14、13、12、 11、10、9、8、7、0、5、4、3、2或1個胺基酸位置。在 一實施例中’一或兩個CDR序列一致性分別為至少55、 60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98 或 99%。 在一態樣中’本發明提供一種抗TNFa受體1型（TNFR1 ; p55)免疫球蛋白單一可變區域，其包含與選自〇〇河111-131-511 > DOMlh-131-201 ^ DOM 1 h-13 1-202 > DOMlh-13 1-203、DOMlh-13 1-204 及 DOMlh-13 1-205(視情況及 DOMlh-13 1-206)(展示於圖3中）之胺基酸序列一致或在不 I31416.doc -19· 200902551 超過25個胺基酸位置處與該所選擇之胺基酸序列不同且具 有與該所選擇序列之咖序列至少5〇%一致之cdri序列 且具有與該所選擇序列之(：〇112序列至少5〇%一致之 序列且具有與該所選擇序列之CDR3序列至少50% 一致之 CDR3序列的胺基酸序列。在一實施例中，不同之處不超 過 24、23 ' 22、21 20、 19、 18、 17、 16、 15、 14、 13、 、、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸位 置。在一實施例中，一或兩個或各CDR序列一致性分別為
至少 55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98 或 99% 〇 在一態樣中’本發明提供一種TNFa受體1型（TNFR1 ; p55)拮抗劑’其具有與〇〇^1111-131-511、〇01^111-131-201、DOMlh-13 1-202、DOMlh-13 卜203、DOMlh-131-204 或DOMlh-13 1-205(視情況或DOMlh-13 1-206)(展示於圖3 中）之CDR1序列至少50%一致之cdRI序列。在一實施例 中，CDR序列一致性為至少55、60、65、70、75、80、 85、90、95、96、97、98或99°/〇。該拮抗劑可（例如）在一 組如本文中所述之條件下對蛋白酶（例如一或多種如本文 中所述之蛋白酶）具有抗性。 在一態樣中，本發明提供一種TNFtx受體1型（TNFR1 ; p55)拮抗劑，其具有與〇0\1111-131-511、00^1111-131-201 ' DOMlh-13 1-202 > DOM 1 h-1 3 1-203 ' DOM 1 h-1 3 1-204 或 DOMlh-13 1-205(視情況或 DOMlh-13 卜206)之 CDR2序列 至少50%—致之CDR2序列。在一實施例中，CDR序列一致 131416.doc -20- 200902551 性為至少 55 ' 60、65、70、75、80、85、90、95、96、 97、98或99%。該拮抗劑可（例如）在一組如本文中所述之 條件下對蛋白酶（例如一或多種如本文中所述之蛋白酶）具 有抗性。
在一態樣中，本發明提供一種TNFot受體1型（TNFR1 ; p55)拮抗劑，其具有與〇〇1^111-131-511、〇〇]^111-131-201 > DOMlh-131-202 ' DOM 1 h-1 3 1-203 ' DOM 1 h-1 3 1-204 或 DOMlh-13 1-205(視情況或 〇(^111-131-206)之€〇113序列 至少50%—致之CDR3序列。在一實施例中，CDR序列一致 性為至少 55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、 97、98或99%。該拮抗劑可（例如）在―組如本文中所述之 條件下對蛋白酶（例如一或多種如本文中所述之蛋白酶）具 有抗性。 在一態樣中，本發明提供一種TNFa受體1型（TNFR1 ; 卩5 5)拮抗劑’其具有與選自£)〇1^1]1-131-511、〇〇]\4111-131- 201、DOMlh-131-202、DOMlh-131-203、DOMlh-131-204 及D〇Mlh-13 1-205(視情況及DOMlh_131_2〇6)之胺基酸序 列之CDR1序列至少50%—致之CDR1序列及與該所選擇序 列之CDR2序列至少5〇。/。一致之cDR2序列。在一實施例 中，一或兩個CDR之CDR序列一致性分別為至少55、6〇、 65、70、75、80、85、90 ' 95、96、97、98 或 99%。該拮 抗劑可（例如）在一組如本文中所述之條件下對蛋白酶（例如 一或多種如本文中所述之蛋白酶）具有抗性。 在一態樣中，本發明提供一種TNFa受體旧（TNFR1 ; 1314l6.doc -21 · 200902551 口55)拮抗劑’其具有與選自£)〇]\4111-131-511、〇〇]\/1111-131-201 ' DOMlh-13 1-202 ' DOM 1 h-1 3 1-203 > DOM 1 h-1 3 1-204 及DOMlh-13 1-205(視情況及DOMlh-131-206)之胺基酸序 列之CDR1序列至少50%—致之CDR1序列及與該所選擇序 列之CDR3序列至少50% —致之CDR3序列，在一實施例 中，一或兩個CDR之CDR序列一致性分別為至少55、6〇、 65、70、75、80、85、90、95、96、97、98 或 99%。該拮 抗劑可（例如）在一組如本文中所述之條件下對蛋白酶（例如 一或多種如本文中所述之蛋白酶）具有抗性。 在一態樣中，本發明提供一種TNFa受體1型（tNFR1 ; p55)拮抗劑，其具有與選自〇〇]^111-131-511、〇〇]^111-131-201、DOMlh-131-202、DOMlh-13 1-203、DOMlh-131-204 及DOMlh-13 1-205(視情況及DOMlh-13 1-206)之胺基酸序 列之CDR2序列至少50%—致之CDR2序列及與該所選擇序 列之CDR3序列至少50% —致之CDR3序列。在一實施例 中，一或兩個CDR之CDR序列一致性分別為至少55、6〇、 65、70、75、80、85、90、95、96、97、98 或99%。該拮 抗劑可（例如）在一組如本文中所述之條件下對蛋白酶（例如 一或多種如本文中所述之蛋白酶）具有抗性。 在一態樣中，本發明提供一種TNFa受體is (丁NFR1 ; p55)拮抗劑，其具有與選自 D〇Mlh-13 1-511、D〇Mlh_131_ 201、DOMlh-131-202、DOMlh-13 1-203、DOMlh-131-204 及DOMlh-13 1-205(視情況及DOMlh-13 1-206)之胺基酸序 列之CDR1序列至少50%一致之CDR1序列及與該所選擇序 131416.doc -22- 200902551 列之CDR2序列至少50%—致之CDR2序列及與該所選擇序 列之CDR3序列至少50°/。一致之CDR3序列。在一實施例 中，一或兩個或各CDR之CDR序列一致性分別為至少55、 60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98 或 99% ° 該拮抗劑可（例如）在一組如本文中所述之條件下對蛋白酶 (例如一或多種如本文中所述之蛋白酶）具有抗性。
在一態樣中，本發明提供一種TNFa受體1型（TNFR1 ; p55)拮抗劑，其包含免疫球蛋白單一可變區域，該免疫球 蛋白單一可變區域包含00厘111-131-511、0〇]^111-131-201、DOMlh-131-202、DOMlh-131-203、DOMlh-131-204 或 DOMlh-13 1-205(視情況或 DOMlh-131-206)之 CDR1、 CDR2 及 / 或 CDR3(例如，CDR1、CDR2、CDR3、CDR1 及 CDR2、CDR1 及 CDR3、CDR2 及 CDR3 或 CDR1、CDR2 及 CDR3)之序歹。該拮抗劑可（例如）在一組如本文中所述之 條件下對蛋白酶（例如一或多種如本文中所述之蛋白酶）具 有抗性。 在一態樣中，本發明提供一種TNFtx受體1型（TNFR1 ; p55)拮抗劑，其與選自 DOMlh-131-511、DOMlh-131-201、DOMlh-131-202 ' DOM1 h-131-203 ' DOMlh-131-204、00!^111-13 1-205 或0〇]^111-131-206之免疫球蛋白單 一可變區域競爭以結合TNFR1。因此，該拮抗劑可結合與 DOMlh-131-511 、DOMlh-131-201、DOMlh-131-202、 DOMlh-13 1-203、DOMlh-131-204、DOMlh-131-205 或 DOMlh-1 31-206相同之抗原決定基或重疊抗原決定基。在 131416.doc -23- 200902551 一實施例中，該拮抗劑包含具有與DOMlh-l 3 1-511、
DOMlh-131-201、DOMlh-13 1-203、DOMlh-131-204、 DOMlh-13 1-205或DOMlh-131-206之胺基酸序列（展示於圖 3中）至少91%—致之胺基酸序列的免疫球蛋白單一可變區 域。在一實施例中，一致性％為至少80、85、90、91、 92、93、94、95、96、97、98 或 99%。在一實施例中，該 所選擇之可變區域為 DOM lh-l 3 1-511、DOMlh-13 1-201、 DOMlh-131-202、DOMlh-13 1-203、DOMlh-13 1-204、 DOMlh-13 1-205 或 DOMlh-13 1-206。該拮抗劑可（例如）在 一組如本文中所述之條件下對蛋白酶（例如一或多種如本 文中所述之蛋白酶）具有抗性。在一實施例中，拮抗劑為 對TNFR1具有結合特異性之抗體或其抗原結合片段，諸如 單價抗原結合片段（例如，scFv、Fab、Fab’、dAb)。拮抗 劑之其他實例為本文中所述之結合TNFR1之配位體。該等 配位體可包含合適格式之對TNFR1具有結合特異性之免疫 球蛋白单一可變區域或區域抗體（cj A b)或該d A b之互補判定 區。在一些實施例中’配位體為基本上由對TNFR1具有結 a特異性之免疫球蛋白單一可變區域或dAb組成或由其組 成之dAb單體。在其他實施例中，配位體為包含合適格式 (諸如抗體格式）之dAb(或dAb之CDR)的多肽。 雖然本發明之TNFR1之一些拮抗劑不抑制TNFa與 TNFR1之結合，但抑制TNFR1介導之信號轉導。舉例而 言’ TNFR1之拮抗劑可抑制TNFR1之信號轉導之前的TNFa 誘導之TNFR1叢集。該等拮抗劑提供數個優點。舉例而 131416.doc -24· 200902551 δ ’在存在該拮抗劑下，雖然TNFa可結合表現於細胞表 面上之TNFR1且可自細胞環境移除，但不激活TNFR1介導 之仏旒轉導。因此，TNFR1信號誘導之其他TNFa及發炎 之其他调節劑的產生將被抑制。類似地，結合TNFRi且抑 制TNFR1介導之信號轉導但不抑制TNFa與TNFR1之結合的 TNFR1抬抗劑將不抑制内源性產生之可溶性tNFR1之TNFa …口及抑制活性。因此，向有需要之哺乳動物投與該拮抗 劑可補充抑制活體内丁NFa活性及TNFR1活性之内源性調 控通路。本發明亦係關於⑴結合TNFR1 (例如，在區域J 中），（η)拮抗TNFR1介導之信號轉導之激活及（iii)不抑制 TNFa與TNFR1之結合的配位體。該配位體結合可溶性 R1且不阻止可溶性受體結合ΤΝρα，且因此向有需要 之甫乳動物投與該拮抗劑可藉由增加可溶性受體在血清中 之半衰期補充抑制活體内TNFa活性之内源性調控通路。 違等優點尤其與已（例如）藉由連接pEG基團、血清白蛋 白、轉鐵蛋白、轉鐵蛋白受體或至少其轉鐵蛋白結合部 刀抗體F c區或藉由接合抗體區域來編排格式以具有較大 流體動力學尺寸之配位體有關。舉例而言，⑴結合 ™FR1 (例如’在區域1中）’（ii)拮抗TNFR1介導之信號轉 導之激活及（iii)不抑制TNFa與TNFR1(諸如，dAb單體）之 、’·。θ的藥洌（例如，多肽、可變區域或拮抗劑）可經編排格 式為抗體之較大抗原結合片段或抗體（例如，經編排格式 為 Fab、Fab，、F(ab)2、F(ab，）2、IgG、scFv)。如本文中所 述，亦可藉由使TNFR1結合劑（拮抗劑、可變區域）與結合 131416.doc •25· 200902551 增加活體内半衰期之抗原或抗原決定基的結合區域（例 如’抗體或抗體片段）接合或連接來增加配位體之流體動 力學尺寸及其血清半衰期（參見，WO2006038027之附錄 1，其整體係以引用之方式併入本文中）。舉例而言，可使 TNFR1結合劑（例如，多肽）與抗血清白蛋白或抗新生兒Fc 焚體抗體或抗體片段（例如，抗SA或抗新生兒Fc受體 dAb、Fab、Fab’或scFv)或抗SA親和體（affib〇dy)或抗新生 兒Fc受體親和體接合或連接。 用於本發明之TNFR1結合配位體之合適白蛋白、白蛋白 片段或白蛋白變異體的實例係描述於WO 2005/077042A2 及WO 2006038027中，其整體係以引用之方式併入本文 中〇 在貫穿該揭示内容所述之本發明之其他實施例中，代替 在本發明之拮抗劑或配位體中使用"dAb"，涵蓋熟練的使 用者（addressee)可使用的區域包含結合tnfri之dAb之 CE>R(例如，接枝於合適蛋白質骨架或骨幹上之CDR，該 月木或骨幹例如親和體、SpA骨架、ldl受體A類區域或 EGF區域）或可為包含TNFR1結合位點之蛋白質區域（其中 該區域係選自親和體、SpA區域、LDL受體A類區域或 區域）。因此，揭示内容整體應解釋為提供使用該等區域 代替dAb之拮抗劑、配位體及方法之揭示内容。 ^發月之夕肽、免疫球蛋白單一可變區域及拮抗劑可抗 或多種以下蛋白酶：絲胺酸蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、 天冬胺酸蛋白®1、硫醇蛋白酶、基質金屬蛋白酶、叛基肽 131416.doc -26- 200902551 T例如，《肽酶八、㈣肽酶B)、姨蛋白酶、胰凝 =、胃蛋白酶:木反蛋白酶、彈性蛋白酶、白血球酶 ⑶ozyme)、胰酶、凝血酶、纖溶酶、組石 組織蛋白_、蛋白_如，蛋白酶卜蛋白二： ㈣、嗜熱-囷蛋白酶、凝乳酶、腸肽酶、卡斯蛋白酶 (叫叫（例如卡斯蛋白酶卜卡斯蛋白酶2、卡斯蛋白酶 4、卡斯蛋白酶5、卡斯蛋白酶9、卡斯蛋白酶12、卡斯蛋 白酶13)、約激活蛋白酶、無花 '、、、化禾蛋白酶（flcain)、梭菌 白酶、獼猴桃蛋白酶、屑aI ώ^ 文姆鳳^蛋自轉及分離酶。在特定 例中，蛋白酶為胰蛋白酶、彈性蛋白酶或白血球酶。蛋白 酶亦可由生物提取物、生物組織勻漿或生物製劑提供。必 要時，該方法進一步分冬立墓—丄 、 在0養凡成後向譜系與蛋白酶之 組合中添加蛋白酶抑制劑。在—眘a彳丨丄 M在實知例中，蛋白酶為可見 於1夕種以下各物中之蛋白酶：疫、黏液（例如胃黏 ./ ’二7、支氣管黏液)' 支氣管肺泡灌洗液、肺組織 勾漿、肺提取物、胰腺提取物、胃液、唾液或眼淚。在一 實施例中，蛋白酶為眼睛及/或眼淚中可見之蛋白酶。在 一實施例中’蛋㈣為非細g性蛋㈣。在—實施例中， 蛋白酶為動物，例如哺乳動物，例如人類蛋白酶。在—實 施例中，蛋白酶為胃腸道蛋白酶或肺組織蛋白酶，例如人 類中可見之胃腸道蛋白酶或肺組織蛋白酶。此處所列之該
蛋白酶亦可用於本文中所述之包括將庫之譜系暴露於蛋白 酶中之方法中D 在一態樣中，本發明提供—種包含TNFa受體Θ 131416.doc -27- 200902551 P55)結合位點之免疫球蛋白單—可變區域，其中 性： 丨月况下對蛋白鉍(例如胰蛋白酶)具有抗 在m：下與^職克/毫升之濃度⑷之蛋白酶一 起培養至少1小時之時間（t);或 ⑴）在⑽下與至少4克/毫升之濃度⑻之蛋白酶— :培養至少1小時之時間⑴。在-實施例中，蛋白酶(例如 胰蛋白酶)與可變區域之比率(以莫耳/莫耳計)為8，_比 8〇，_蛋白酶··可變區域，例如tc為職克/毫升時，比 率為_請，_蛋白酶：可變區域；或仏从，為⑽微 克/毫升時，比率為8,000比8〇,〇〇〇蛋白酶：可變區域。在 只她例中，蛋白酶（例如胰蛋白酶）與可變區域之比率（以 重量/重量、例如微克/微克計）為16,〇〇〇比16〇,〇〇〇蛋白酶： 可變區域，例如當€為10微克/毫升時，比率為丨，600比 16〇,〇〇〇蛋白酶··可變區域；或當esc，為1〇〇微克/毫升 時，比率為1,6000比16〇,〇〇〇蛋白酶：可變區域。在—實施 例中，濃度（c或c’）為至少100或1〇〇〇微克/毫升蛋白酶。在 一實施例中，可變區域包含與D〇Mlh-l 31-511之胺基酸序 列至少90% —致之胺基酸序列。在一實施例中，該可變區 域包含與〇〇^4111-131-511、1)〇1^111-131-201、〇〇]^111-131- 202、DOMlh-131-203、DOMlh-131-204、DOMlh-131-205 及DOMlh-131-206之胺基酸序列至少90%—致之胺基酸序 列。在一實施例中’該可變區域包含與D〇Mlh-131-511、 DOMlh-131-201、DOMlh-131-202、DOMlh-131-203、 •28- 131416.doc 200902551 DOMlh-131-204及 DOMlh-131-205之胺基酸序列至少 90% 一致之胺基酸序列。在該等態樣之一實施例中，一致性％ 為至少 80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98 或 99 /〇。在一實施例中，濃度（c或c，）為至少i 〇〇或1 微克/ 毫升蛋白酶。當與肽或多肽之譜系或庫一起作用時，參考 本文中之適於所使用之蛋白酶蛋白水解活性之條件的描述 (例如，重量比參數）。該等條件可供測定特定免疫球蛋白 單-可變區域之蛋白酶抗性之條件使用。在一實施例中， 時間⑴為或約為1、3或24小時或隔夜(例如，約仏以小 時）。在-實施例中，該可變區域在條件⑴下具抗性且濃 度⑷為或約為或⑽微克/毫升蛋白酶且時間⑴為W 時。在-實施例中，該可變區域在條件⑼下具抗性且濃 度⑹為或約為40微克/毫升蛋白酶且時間⑴為或約㈣、 4。在-實施例中，該蛋白酶係選自胰蛋白酶、彈性蛋白 =、白血球酶及胰酶。在—實施例中，該蛋白酶為胰蛋白 V一實施例中，蛋白酶為可見於-或多種以下各物中 :蛋白酶、痰、黏液(例如胃黏液、鼻黏液、 液）、支氣管肺泡灌洗液、肺組織勻 ’、^ 提取物、胃液、唾液或眼淚。在 物、胰腺 睛及/或眼淚中可見之蛋白酶。在巾f白酶為眼 仕實施例中，| ώ * 非細菌性蛋白酶。在一實施例中， 酶為 朝動铷，， 资白辦為動物’例如哺 礼動物，例如人類蛋㈣。在_實施例 丨如南 道蛋白酶或肺組織蛋白酶，例如人類中^ 酶為胃腸 酶或肺組織蛋白酶。此處所列之 可見之月腸道蛋白 '-蛋白酶亦可用於本文中 131416.doc •29- 200902551 所述之包括將庫之譜系暴露於蛋白酶中之方法中。 在一實施例中，該可變區域對騰蛋白酶及/或至少 贪姆白血球轉及姨酶之其他蛋白_ 性。舉例而言，抗性係針對胰蛋白酶及彈性蛋白酶^ 白酶及白血球酶；騰蛋白酶及胰酶；胰蛋白酶、彈 酶及白血球酶；騰蛋㈣、彈性蛋㈣及㈣；胰= 酶彈性蛋白酶、胰酶及白血球酶；或 白血球酶。 啤膦酶及
域在條件（i)或（ii)下培養（例如） 2個複製單位（傳染性病毒體）之 上時，測試該可變區域的蛋白 在一實施例中，當可變區 以10至1 〇 υ、例如1 〇 8至1 〇 ] 兔產體庫規模呈現於嗟菌體 酶抗性。 在-實施射’該可變區域在條件⑴或（ii)下培養 異性結合丁順卜例如，使用BiacoreT^ELISA(例如，-噬菌體ELISA或單株噬菌體EUSA)評定。 在-實施例中’本發明之可變區域特異性結合蛋白質A 或蛋白質L。在-實施例中，在條件⑴或⑼下培養後，、出 現與蛋白質A或L之特異性結合。 在實施例中’本發明之可變區域（例如）在條件⑴或⑼ 下培養後在ELIS A(例如噬菌體EUSA或單株噬菌體elisa) 中可具有至少0.404之〇D450讀數。 在一實施例中，本發明之可變區域（例如）在條件⑴或（Η) 下培養後在凝膠電泳中展現（大體上）單一帶。 在某些實施例中，本發明提供一種TNFR1拮抗劑，其為 131416.doc -30- 200902551
包含結合TNFR1之本發明之第一 dAb及具有與第一 dAb相 同或不同結合特異性之第二dAb的雙特異性配位體。第二 dAb可結合選自以下之把：ApoE、Apo-SAA、BDNF、心 營養素-1、CEA、CD40、CD40配位體、CD56、CD38、 CD138、EGF、EGF受體、ENA-78、嗜酸性粒細胞趨化因 子、嗜酸性粒細胞趨化因子-2、次級淋巴組織趨化因子 (Exodus)-2、FAPa、FGF-酸性、FGF-鹼性、纖維母細胞生 長因子-10、FLT3配位體、弗拉塔凱（Fractalkine)(CX3C)、 GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-βΙ、人類血清白蛋白、月夷 島素、IFN-γ、IGF-I、IGF-II、IL-la、IL-Ιβ、IL-1 受體、 IL-1 受體 1 S、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8(72 a.a.)、IL-8(77 a.a.)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、 IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18(IGIF)、抑制素 α、抑 制素β、IP-10、角化細胞生長因子-2(KGF-2)、KGF、瘦體 素、LIF、淋巴細胞趨化因子、穆勒氏抑制物質（Mullerian inhibitory substance)、單核細胞集落抑制因子、單核細胞 吸附蛋白、M-CSF、MDC(67a.a·)、MDC(69a·a.)、MCP-l(MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC(67 a.a)、 MDC(69 a.a.)、MIG、ΜΙΡ-1α、ΜΙΡ-1β、ΜΙΡ-3α、MIP-3β、MIP-4、骨髓祖細胞抑制劑因子-l(MPIF-l)、NAP-2、 神經營養因子、神經生長因子、β-NGF、NT-3、NT-4、制 瘤素 Μ、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、 RANTES、SDFltx、SDFip、SCF、SCGF、幹細胞因子 (SCF)、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-P2、TGF-p3、腫瘤 131416.doc •31 - 200902551 壞死因子（TNF)、TNF-α、TNF-β、TNF 受體 I、TNF 受體 II、TNIL-1、ΤΡΟ、VEGF、VEGF A、VEGF B、VEGF C、VEGF D、VEGF 受體 1、VEGF 受體 2、VEGF 受體 3、 GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β、GRO-γ、HCC1、1-309、 HER 1、HER 2、HER 3、HER 4、血清白蛋白、vWF、激· 粉樣蛋白（例如，澱粉樣Cl)、MMP12、PDKl、IgE、IL-13Ral、IL-13Ra2、IL-15、IL-15R、IL-16、IL-17R、IL-17、IL-18、IL-18R、IL-23、IL-23R、IL-25、CD2、 ( CD4、CDlla、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、 CD40L、CD56、CD138、ALK5、EGFR、FcERl、TGFb、 CCL2、CCL18、CEA、CR8、CTGF、CXCL12(SDF-1)、凝 乳酶、FGF、弗林蛋白酶（Furin)、内皮素-1、嗜酸性粒細 胞趨化因子（例如，嗜酸性粒細胞趨化因子、嗜酸性粒細 胞趨化因子_2、嗜酸性粒細胞趨化因子-3)、GM-CSF、 ICAM-1、ICOS、IgE、IFNa、1-309、整合素、L-選擇 素、MIF、MIP4、MDC、MCP-1、MMP、嗜中性彈性蛋白
酶、骨橋蛋白、OX-40、PARC、PD-1、RANTES、SCF、 SDF-1、siglec 8、TARC、TGFb、凝血酶、Tim-1、TNF、 TRANCE、類胰蛋白酶、VEGF、VLA-4、VCAM、α4β7、 CCR2 、 CCR3 、 CCR4 、 CCR5 、 CCR7 、 CCR8 、 ανβ6 、 ανβ8、cMET、CD8、vWF、澱粉樣蛋白（例如，澱粉樣 a)、MMP12、PDK1 及 IgE。 在一實例中，雙特異性配位體包含結合TNFR1上之第一 抗原決定基之第一 dAb及結合不同靶上之抗原決定基之第 131416.doc •32· 200902551 二dAb。在另一實例中，第二dAb結合血清白蛋白上之抗 原決定基。 在其他實施例中，該配位體為多特異性配位體，其包含 對TNFR1具有結合特異性之第一抗原決定基結合區域及具 有不同於第一抗原決定基結合區域之結合特異性之至少另 一抗原決定基結合區域。舉例而言，第一抗原決定基結合 區域可為結合TNFR1之dAb或可為包含結合TNFR1之dAb
之CDR(例如，接枝於合適蛋白質骨架或骨幹之cdr，該 骨架或骨幹例如親和體、SpA骨架、LDL受體A類區域或 EGF區域）的區域或可為結合TNFR1之區域，其中該區域係 選自親和體、SpA區域、LDL受體A類區域或EGF區域。 在某些實施例中’多肽、拮抗劑、配位體或抗TNFR1 dAb單體之特徵在於一或多個以下特徵：丨）以如由表面電 漿共振所測定50 ηΜ至20 ΡΜ之解離常數（Kd)及5Χ10·1至 7 1 Ιχΐ0 S之Kofi^率常數自人類TNFR1解離；2)以5〇〇碰至 50 之1C5Q抑制腫瘤壞死因子a(TNFc〇與TNFR1之結合； 3)在標準L929細胞檢定中以5〇〇 ηΜ至50pM之ND50中和人 類TNFR1 ; 4)在標準細胞檢定中以<1〇〇 ηΜ2 拮抗 TNFR1之活（·生，且在該檢定中在η 〇 之濃度下，dAb 激動TNFR1之活性$5% ; 5)在]、鼠Lps/D_半乳糖胺誘發之 敗血性休克模型中抑制死亡；6)抗聚集；7)當表現於大腸 桿菌或畢赤酵母屬物種(例如，馬斯德畢赤酵母)中時，以 至少約0.5 mg/L之量分泌；8)顯露可逆性；9)在選自由小 鼠膠原誘發之關節炎模型、小鼠關節炎AARE模型、小鼠 131416.doc •33- 200902551 發炎性腸疾病&圳 RE模t、小鼠葡聚糖硫酸鈉誘發之發炎 =腸疾病拉型、小鼠慢性阻塞性肺病煙草煙霧模型及合適 1長類動物模型(例如，靈長類動物膠原誘發之關節炎模 型成之群之慢性發炎性疾病模型中具有功效；及/或10) 在治療、#止或預防慢性發炎性疾病中具有功效。關於適 用於條件（1)至（1 0)之檢定及測試及參數之詳情，參考购 2_〇勒，且其以引用之方式併入本文中。 在特定實施例中’多肽、拮抗劑、配位體或dAb單體以 如由表面電漿共振所測定5〇 1^]^至2〇 pM之解離常數及 5X10至1X10 S,之Κ〇»速率常數自人類TNFR1解離；以 5〇〇 ηΜ至50 ΡΜ之IC50抑制腫瘤壞死因子a(TNFa)與 TNFR1之結合，在標準[929細胞檢定中以5〇〇 至 之ND50中和人類TNFR1。在其他特定實施例中多肽、 拮抗劑、配位體或dAb單體以5〇 11河至2〇 pM之解離常數 (1^)及5x10 —丨至lxi〇-7s-i之〖。订速率常數自人類tnfri解 離，以500 nM至50 pM之IC5 0抑制腫瘤壞死因子a(TNFa) 與TNFR1之結合；在選自由小鼠膠原誘發之關節炎模型、 小鼠關節炎AARE模型、小鼠發炎性腸疾病AARE模型、小 乳葡聚糖硫酸鈉誘發之發炎性腸疾病模型、小鼠慢性阻塞 性肺病煙草煙霧模型及合適靈長類動物模型（例如，靈長 類動物膠原誘發之關節炎模型）組成之群之慢性發炎性疾 病模型中具有功效。在其他特定實施例中，多肽、拮抗 劑、配位體或dAb单體以50 nM至20 pM之解離常數（Kd)及 5x10 1至lxl〇-7s_】之Koff速率常數自人類丁·^解離；在標 131416.doc -34· 200902551 準L929細胞檢定中以5〇〇 nM至5〇pM之中和人類 TNFR1，且在標準細胞檢定中以U〇〇 nM之ND50拮抗 TNFR1之活性’且在該檢定中，在，_之濃度下，湯 激動TNFR1之活性<5%。 本發明之蛋白酶抗性多狀、免疫球$白單一可變區域及 拮抗;^在冶療、預防及診斷例如人類之哺乳動物之疾病或 病狀中具有效用。肽及多肽尤其具有作為向諸如人類之患 者投與時很可能會遇到蛋白酶之藥物之基f的效用。舉例 而言’當向胃腸道投與（例如，經σ、舌下、直腸投與）多 肽、免疫球蛋白單—可變區域及拮抗料，在此狀況下， 其可能會在上胃腸道、下胃腸道、口腔、胃、小腸及大腸 中之-或多處受蛋白酶侵襲。因Λ ’―個實施例提供一種 待以經口、舌下或直腸方式向患者之⑴道投與以治療及/ 或預防患者之疾病或病狀的蛋白酶抗性多月太、免疫球蛋白 單-可變區域或拮抗劑。舉例而言，㉟口向患者(例如， 人類患者）投與以治療及/或預防TNFa介導之病症或疾病， 諸如關節炎(例如’類風濕性關節炎）、㈣、牛 羅恩氏病（Cr〇hn，s disease)。 ^ / }社力貫例中，當向肺組織 (例如，肺或氣管）投與（例如，藉由吸入或鼻内方式）多 肽、可變區域或拮抗劑時其很可能會遇到蛋白_。因此， -個實施例提供藉由吸人或鼻内向患者（例如人類）之肺組 :投與之方式向該患者投與蛋白酶抗性多肽、免疫球蛋白 早-可變區域或拮抗劑來治療及/或預防患者之疾病或病 狀。該病狀可為哮喘(例如，過敏性缘喘）、c〇pD、流感 131416.doc -35- 200902551 或 W〇2〇〇6〇38027 中所捃 + + / 所揭不之任何其他肺疾病或病狀， WO2006038027係以引用之方4 方式併入本文中。本發明之栌 =、多肽及免疫球蛋白單—可變區域可展現升高或相對 較尚之熔融溫度（Tm)，從 ’攸而知供增強之穩定性。高親和力 1
乾結合亦可為或另外為拮抗劑、多肽及可變區域之特徵。 :等特徵中之一或多個以及蛋白酶抗性使得拮抗劑、可變 區域及多肽可承擔作為諸如人類之哺乳動物之藥物的用 途’(例如)對於GI道或肺組織投藥而言很可能會遇到蛋白 酶的情況而言。在另-實例中，冑向患者之眼睛投與(例 如’以眼球内注射方式或以滴眼劑形式）多狀、可變區域 或拮抗劑時其很可能會遇到蛋白酶。因此，一個實施例提 供以眼睛方式向患者（例如人類）投與蛋白酶抗性多狀、免 疫求蛋白單可變區域或拮抗劑以治療及/或預防患者之 疾病或病狀（例如，眼睛之疾病或病狀）。投藥可為以滴眼 劑形式或藉由注射至眼睛、例如玻璃體液中而局部向眼睛 投與。 因此，在一態樣中，本發明提供一種用於經口傳遞之 TNFR1拮抗劑。在一態樣中，本發明提供用於向患者之a 道傳遞之TNFR1拮抗劑。在一態樣中，本發明提供一種 TNFR1拮抗劑在製造用於經口傳遞之藥物中的用途。在— 態樣中，本發明提供一種丁^^以拮抗劑在製造用於向患者 之胃GI道傳遞之藥物中的用途。在一實施例中，該可變區 域對胰蛋白酶及/或至少一種選自彈性蛋白酶、白血球酶 及騰酶之其他蛋白酶具有抗性。舉例而言，抗性係針對騰 131416.doc -36- 200902551 蛋白酶及彈性蛋㈣；騰蛋白酶及白血球酶；胰蛋白酶及 騰酶；胰蛋白酶、彈，卜生;, 评注蛋白酶及白血球酶；胰蛋白酶、彈 性蛋白酶及胰酶；胰蛋白酶、彈性蛋白酶、㈣及白血球 酶；或胰蛋白酶、胰酶及白血球酶。 在一態樣中，本發明接供__接田& # & Λ 種用於肺傳遞之TNFR1拮抗 劑。在-態樣中，本發明提供一種用於向患者之肺傳遞之 TNFIU拮抗劑。在—態樣中’本發明提供—種挪叫吉抗 劑在製造用於肺傳遞之藥物中的用途。在一態樣中，本發 明提供-種㈣㈣抗劑在製造用於向患者之肺傳遞之^ 物中的用途。在一實施例中，該可變區域對白血球酶具有 抗性。 在-態樣中，本發明提供—種經口傳遞藥物或向患者之 胃腸道或患者之肺或肺組織傳遞藥物的方法，里中該方法 包含向該患者投與醫藥學有效量之本發明之；贿:拮抗 劑。 在-態樣中’本發明提供一種甩於治療及/或預防發炎 性病狀之本發明之TNFR1拮抗劑。在'態樣中，本發明提 供—種™FR1拮抗劑在製造用於治療及/或㈣發炎性病 :之藥物中的用途。在-實施例中，該病狀係選自由關節 火、多發性硬化症、發炎性腸疾病及慢性阻塞性肺病组成 之群。舉例而f ’該關節炎為類風濕性關節炎或幼年型類 風濕性關節炎。舉例而t，該發炎性腸疾病係選自由克羅 恩氏病及潰癌性結腸炎組成之群。舉例而$，該慢性阻塞 性肺病係選自由慢性支氣管炎、慢性阻塞性支氣管炎及； Ϊ 31416.doc -37· 200902551 山成之群。舉例而言，該肺炎為細菌性肺炎。舉例而 -^^^ ^^(Staphyj〇c〇ccaipn_ia)〇 一樣中，本發明提供一種用於治療及/或預防呼 道疾病之咖R1拮抗劑。在—態樣中，本發明提供一種 ™FR1拮抗劑在製造用於治療及/或預防呼吸道疾病之藥 物中的用途。舉例而言，該啤吸道疾病係選自由以下各病 組成之群：肺發炎、慢性阻塞性肺病、哮喘、肺炎、過敏 !·生肺人肖嗜伊紅血球增多相關之肺浸冑、環境肺病、 肺炎、支氣管擴張、囊性纖維化、間質肺病、原發性肺動 脈南壓、肺血栓栓塞、胸膜紊亂、縱隔純、隔膜蒼亂、 換氣不足、換氣過度、睡眠呼吸暫停、急性啤吸奢迫症候 群、間皮瘤、肉瘤、移植排斥、移植物抗宿主疾病、肺 f、過敏性鼻炎、過敏症、石棉沉著病、曲黴菌腫、曲黴 菌病、支氣管擴張、慢性支氣管炎、肺氣腫、嗜伊紅血球 肺炎、特發性肺纖維化、侵襲性肺炎球菌疾病、流感、非 結核性分枝桿菌病、胸膜積液、塵肺病、肺孢子蟲病、肺 炎、肺放線菌病、肺泡蛋白沉著症、肺炭疽、肺水腫、肺 栓子、肺發炎、肺組織細胞增多病X、肺動脈高血壓、肺 諾卡氏菌病（pulmonary nocardiosis)、肺結核、肺靜脈閉塞 疾病、類風濕性肺病、肉狀瘤病及韋格納肉牙腫病 (Wegener’s granul〇matosis)。舉例而言，該疾病為慢性阻 塞性肺病（COPD)。舉例而言’該疾病為哮喘。 包含抑制TNFR1之藥劑的本發明之拮抗劑（例如，其中 該藥劑係選自由以下各物組成之群：抗體片段（例如，Fab 131416.doc •38- 200902551 片段、Fab’片段、Fv片段（例如，scFv、雙硫鍵鍵結之 Fv)、F(ab’）2片段、dAb)、配位體及dAb單體及多聚體（例 如，同源或異源二聚體））可使用任何合適方法局部向個體 之肺組織（例如，肺）投與。舉例而言，藥劑可藉由吸入或 鼻内投與方式局部向肺組織投與。對於吸入或鼻内投藥而 吕’ TNFR1之拮抗劑可使用喷霧器、吸入器、霧化器、氣 霧化器（aer〇solizer)、彌霧器（mister)、乾粉吸入器、定劑 量吸入器、定劑量喷霧器、定劑量彌霧器、定劑量霧化器 或其他合適吸入器或鼻内傳遞裝置投與。因此，在一實施 例中，本發明提供一種含有TNFR1拮抗劑之肺傳遞裝置。 在一實施例中，該裝置為吸入器或鼻内傳遞裝置。 在一恶樣中，本發明提供一種包含TNFR1拮抗劑之口服 調配物。_配物可為鍵劑、丸劑、膠囊、液體或糖漿。 在一實施例中，本發明提供一種用於向肺傳遞之肺調配 物，其中該調配物包含粒度範圍小於5微米、例如小於 4'5 4、3·5或3微米之本發明之拮抗劑、多肽或可變區域 如，§在例如pH 6·5至8·0、例如pH 7至7.5、例如pH 7 或PH 7.5之伯瑞坦_魯賓遜（Britt〇n R〇bins〇n)緩衝液 時）。 ' 在實施例中，提供pH 6.5至8.〇、例如7至7.5、例如 7、例如7.5之本發明之調配物及組合物。 ，根據本發明之任何態樣之可變區域可具有至少5〇它或至 ^5°c或至少6(rc或至少65t或至少7〇。〇之丁爪。本發明之 J用途、方法、裝置或調配物可包含該可變區域。 131416.doc •39- 200902551 在本發明之_態#中， 劑、組合物或調配物在3rc至夕太、山可變區域、括抗 液中培養（多肽$ 在伯瑞坦-魯賓遜緩衝 貪（夕狀或可變區域 g 為穩定的。在_、二 為mg/ml)i4天後大體上 86、87、88、Qn T 至乂65、70、75、80、85、 99%之多肽二91、92、93、94、95、96、97、98、 *聚集。在-實施例中，至少65、7。=二培養後仍 87 、 88 、 90 、 5 8〇 、 85 、 86 、 多肽或可變區域在3斤93、94、95、96、97、98、"%之 施例中，至;/下進行該培養後仍為單體。在-實 5〇、55、6 、2〇、25、3〇、35、4〇、45、 91、92 9 〇 Μ、7〇、75、8° ' 85 ' %、”、88、9。、 或可變二=95、96、97、98、"%之多肽、拮抗劑 中，至少5 1〇 / 培養後仍不聚集。在—實施例 55 6/ 2〇、25、3〇、35、4°、45、5。、 55、6〇m8〇、85、86、87、 92、93、94、95、96、97、 9卜 50。「下、隹 > 分^ 〇之夕狀或可變區域在 C下進订该培養後仍為單體。在_實施例 個該等培養後未見多肽、可變區域、拮抗劑之 實施例中’多肽或可變區域之下在伯瑞坦： 緩衝液中在1 mg/ml之多肽或可變 k 變化或大體上未變化。 〔域，農度下培養後仍未 在本發明之-態樣中，本發明之多月太、可變區域 劑、組合物或調配物在η：下在伯瑞坦_魯賓遜緩衝液中二 沖7至7.5(例如阳7或阳7.5)下培養（多肽或可變區域之濃 I31416.doc -40- 200902551 度為1 00 mg/ml)7天後大體上為穩定的。在一實施例中， 至少 95、95.5、96、96.5、97、97.5、98、98.5、99 或 99.5%之多肽、拮抗劑或可變區域在該培養後仍不聚集。 在一實施例中’至少 95、95.5、96、96.5、97、97.5、 98、98.5、99或99.5%之多肽或可變區域在該培養後仍為 單體。在一實施例中，在任何一個該等培養後未見多肽、 可變區域、拮抗劑之聚集。
在本發明之一態樣中，本發明之多肽、可變區域、括抗 劑、組合物或調配物（例如）在室溫、2 〇 °c或3 7 〇C下（例如) 在噴射喷霧器（例如Pari LC +杯）中噴霧（多肽或可變區域之 濃度為40 mg/ml)l小時後大體上為穩定的。在一實施例 中’至少 65、70、75、80、85、86 ' 87、88、90、91、 92、93、94、95、95.5、96 ' 96.5、97、97.5、98、98.5、 99或99·5%之多肽、拮抗劑或可變區域在該喷霧後仍不聚 集。在一實施例中’至少65、70、75、80、85、86、87、 88、90、91、92、93、94、95、95.5、96、96.5、97、 97·5、98、98.5、99或99.5%之多肽或可變區域在該噴霧後 仍為單體。在一實施例中，在任何一個該喷霧後未見多 肽、可變區域、拮抗劑之聚集。 在MRC-5細胞檢定中’本發明之任何態樣之可變區域可 以2 ηΜ至50 ΡΜ之ND50中和TNFoi刺激之IL-8釋放。本發明 之拮抗劑、用途、方法、裝置或調配物可包含該可變區 域。 在一態樣中，本發明提供一種經分離或重組核酸，其編 131416.doc -41 - 200902551 :::本發明之任何態樣之免疫球蛋白單—可變區域之夕 肽或編碼本發明之任何態樣之多狀、括抗劑或可變夕 揭… 七月棱供一種包含該核酸之載體。在—能 :中本發明提供一種包含核酸或載體之宿主細胞。在： 代夕,"徒1、種產生包含免疫球蛋白單一可變區 =夕肽之方法，該方法包含將宿主細 ； 酸；該載體表現之條件下，藉此產生包含免疫球二= u域之多肽。該方法可進_步包含 域或括抗劑及視情況產生比經分離多狀、可變區域：:； 劑具有改良之親和力及/或腿0的變異體(例如，突變變： :此項技術已知改良免疫球蛋白單一可變區域之結ς 親和力之技術，例如親和力成熟技術。 在-態樣中’本發明提供—種醫藥組合物，其包含本發 明之任何態樣之免疫球蛋白單一可變區域、多肽或拮抗劑 及醫樂學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。 在一實施例中，本發明之任何態樣之免疫球蛋白單一可 變區域或拮抗劑包含抗體怪定區域，例如抗體氏，視情況 其中Fc之N-末端連接於（視情況直接連接於）可變區域之c_ 末端。 本發明之多肽或可變區域可為經分離的及/或重組的。 本文中描述-種選擇蛋白酶抗性肽或多肽之方法。該方 法包含提供肽或多肽之譜系’在適於蛋白酶活性之條件下 使該譜系與蛋白酶組合，及回收具有想要生物活性“列 如，特異性結合TNFR1)之肽或多肽，藉此選擇蛋白酶抗 1314l6.doc -42- 200902551 性肽或多肽。 通㊉將譜系及蛋白酶培養至少約 中可使用任何想要之蛋白，間。在方法 ^ ^ ^ 贫曰輙诸如一或多種以下蛋白酶. 、、糸胺敲蛋白酶、半胱胺酸蛋 蛋白醢、、妝黾蛋白酶、硫醇 -土貝金屬蛋白酶、羧基肽酶（例如，m其肽酶Α、 _'Λ 1: 蛋白 腸肽 卡斯 …蛋柄、騰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜 蛋白扭、彈性蛋白酶、白血球酶、騰酶、凝血酶、纖容 辦、組織蛋白酶(例如組織蛋白酶G)、蛋白酶(例如… ^蛋白酶2'蛋白酶3)、唁熱菌蛋白酶、凝乳酶 =、卡斯蛋白酶（例如卡斯蛋白酶i、卡斯蛋白酶2、下习 =1、：斯蛋白酶5、卡斯蛋白酶9、卡斯蛋白酶12、 13)、鈣激活蛋白酶、無花果蛋白酶、梭菌蛋 :、摘猴桃蛋白酶、鳳梨蛋白酶及分離酶。在特定實施 歹：，蛋白酶為胰蛋白酶、彈性蛋白酶或白血球酶。蛋白 轉亦可由生物提取物、生物組織勻漿或生物製劑提供。必 要時’該方法進-步包含在培養完成後向譜系與蛋白酶之 組合中添加蛋白酶抑制劑。 在-些實施例中’基於結合活性回收具有想要之生物活 性之肽或多肽。舉例而Ϋ ’可基於結合諸如蛋白質A、蛋 白質G或蛋白質L之—般配位體（柳心ngand)回收狀或多 肽。結合活性亦可為與㈣位體之特異性結合。例示性拓 配位體包括ApoE、Apo_SAA、BDNF、心營養素」、 CEA、CD40、CD40 配位體、CD56、cd38、⑶⑽、 EGF、EGF受體、ENA_78、嗜酸性粒細胞趨化因子、嗜酸 131416.doc -43- 200902551 性粒細胞趨化因子-2、次級淋巴組織趨化因子-2、FAPtx、 FGF-酸性、FGF-鹼性、纖維母細胞生長因子-10、FLT3配 位體、弗拉塔凱（CX3C)、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-βΐ、人類血清白蛋白、胰島素、IFN-γ、IGF-I、IGF-II、 IL-la、IL-Ιβ、IL-1 受體、IL-1 受體 1 型、11^-2、11^3、1]^-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8(72a.a.)、IL-8(77a.a.)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、 IL-18(IGIF)、抑制素α、抑制素β、IP-10、角化細胞生長 C 因子-2(KGF-2)、KGF、痩體素、LIF、淋巴細胞趨化因 子、穆勒氏抑制物質、單核細胞集落抑制因子、單核細胞 吸附蛋白、M-CSF、MDC(67a.a.)、MDC(69a·a·)、MCP-l(MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC(67 a.a)、 MDC(69 a.a.)、MIG、ΜΙΡ-1α、ΜΙΡ-1β、ΜΙΡ-3α、MIP-3β、MIP-4、骨髓祖細胞抑制劑因子-l(MPIF-l)、NAP-2、 神經營養因子、神經生長因子、β-NGF、NT-3、NT-4、制 瘤素 Μ、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、 ί ) RANTES、SDFla、SDFip、SCF、SCGF、幹細胞因子 (SCF)、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-P2、TGF-P3、腫瘤 壞死因子（TNF)、TNF-α、TNF-β、TNF 受體 I、TNF 受體 II、TNIL-1、TPO、VEGF、VEGF A、VEGF B、VEGF C、VEGF D、VEGF受體 1、VEGF 受體 2、VEGF 受體 3、 GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β、GRO-γ、HCC1、1-309、 HER 1、HER 2、HER 3、HER 4、血清白蛋白、vWF、澱 粉樣蛋白（例如，澱粉樣c〇、MMP12、PDK1、IgE、IL- 131416.doc -44- 200902551 13Ral、IL-13Ra2、IL-15、IL-15R、IL-16、IL-17R、IL-17、IL-18、IL-18R、IL-23、IL-23R、IL-25、CD2、CD4、 CDlla、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、
CD40L、CD56、CD 138、ALK5、EGFR、FcERl、 TGFb 、 CCL2 、 CCL18 ' CEA 、 CR8 、 CTGF 、 CXCL12 (SDF-1)、凝乳酶、FGF、弗林蛋白酶、内皮素-1、嗜酸性 粒細胞趨化因子（例如，嗜酸性粒細胞趨化因子、嗜酸性 粒細胞趨化因子-2、嗜酸性粒細胞趨化因子-3)、GM-CSF、ICAM-1、ICOS、IgE、IFNa、1-309、整合素、L-選 擇素、MIF、MIP4、MDC、MCP-1、MMP、嗜中性彈性蛋 白酶、骨橋蛋白、OX-40、PARC、PD-1、RANTES、 SCF、SDF-1、siglec 8、TARC、TGFb、凝 jk 酶、Tim-1、 TNF、TRANCE、類胰蛋白酶、VEGF、VLA-4、VCAM、 α4β7 、 CCR2 、 CCR3 、 CCR4 、 CCR5 、 CCR7 、 CCR8 、 ανβ6、ανβ8、cMET、CD8、vWF、澱粉樣蛋白（例如，殿 粉樣 〇〇、MMP12、PDK1 及 IgE。 在特定實施例中，藉由淘選回收肽或多肽。 在一些實施例中，譜系包含呈現系統。舉例而言，呈現 系統可為噬菌體呈現、核糖體呈現、乳液隔室化及呈現、 酵母呈現、嘌呤黴素呈現、細菌呈現、質體上之呈現或共 價呈現。例示性呈現系統使核酸之編碼功能與由核酸所編 碼之肽或多肽之功能特徵相關聯。在特定實施例中，呈現 系統包含可複製之基因組。 在一些實施例中，呈現系統包含噬菌體呈現。舉例而 131416.doc -45- 200902551 吕，噬菌體可為fd、、λ、购或丁7。在特定實施例 中’噬菌體呈現系統為多價系統。在一些實施例中，肽或 多肽呈現為pin融合蛋白。 在其他實施例中，方法進一步包含擴增編碼具有想要之 生物活性之肽或多肽的核酸。在特定實施例中，藉由噬菌 體擴增、細胞生長或聚合酶鏈反應擴增核酸。 在-些實施例中，譜系為免疫球蛋白單—可變區域譜
系。在特定實施例中’免疫球蛋白單—可變區域為重鍵可 變區域。在更特定實施例巾，重鏈可變區域為人類重鍵可 變區域。在其他實施例中，免疫球蛋白單—可變區域為輕 鍵可變區域。在特定實施财，輕鏈可變區域為人類輕鍵 可變區域。 =態樣中’提供一種自肽或多肽譜系選擇以高親和 力、、δ靶配位體（例如，TNFR1)之肽或多肽之方法。該方 法包含提供肽或多肽譜系，在適於蛋白酶活性之條件;使 譜系與蛋白酶組合’及回收結合把配位體之肽或多肽。 中系及蛋白酶培養至少約30分鐘之時間。在方法 中可使用任何想要之蛋白酶，諸如-或多種以下蛋白酶. 絲胺酸蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、天冬胺酸蛋白酶、硫醇 ==質金屬蛋白酶、羧基肽酶(例如，羧基肽酶A、 基㈣、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白_、胃蛋白酶、木瓜 蛋白 '彈性蛋白酶、白血球酶1夷酶、凝血酶、纖溶 酶、組織蛋白酶（例如組織蛋白酶 )蛋白酶（例如，蛋白 ⑷、蛋白酶2、蛋白酶3)、嗜熱菌蛋白酶、凝乳酶、腸肽 131416.doc -46- 200902551 柄、切蛋白酶（例如卡斯蛋白酶1、卡斯蛋白酶2、卡斯 蛋白酶4、卡斯蛋白酶5、卡斯蛋白酶9、卡斯蛋白酶& 卡斯蛋白酶13)、鈣激活蛋白酶、無花果蛋白冑、梭菌蛋 白酶、_桃蛋白酶、鳳㈣白酶及分離酶。在特定實施 例中’蛋白酶為胰蛋白肖、彈性蛋白酶或白血球酶。蛋白 酶亦可由生物提取物、生物組織勻漿或生物製劑提供。必
要寺該方法進一步包含在培養完成後向譜系與蛋白酶之 組合中添加蛋白酶抑制劑。 可基於結合任何想要之靶配位體、諸如本文中所揭示之 靶配位體（例如，TNFR1)回收肽或多肽。在特定實施例 中’藉由淘選回收肽或多肽。 在一些實施例中’譜系包含呈現系統。舉例而言，呈現 糸統可為兔ii體呈現、核糖體呈現、乳液隔室化及呈現、 酵母呈現、嘌呤黴素呈現、細菌呈現、質體上之呈現或共 價呈現。例示性呈現系統使核酸之編碼功能與由核酸所編 瑪之肽或多肽之功能特徵相關聯。在特定實施例中，呈現 系統包含可複製之基因組。 在一些實施例中’呈現系統包含噬菌體呈現。舉例而 言，噬菌體可為fd、M13、λ、MS2或T7。在特定實施例 中’嗟菌體呈現糸統為多價系統。在一些實施例中，肽或 多肽呈現為pin融合蛋白。 在其他實施例中，方法進一步包含擴增編碼具有想要之 生物活性之肽或多肽的核酸。在特定實施例中，藉由噬菌 體擴增、細胞生長或聚合酶鏈反應擴增核酸。 13I4l6.doc -47- 200902551 在;=施例中，譜系為免疫球蛋白單_可變區域譜 ::、&實施例中，*疫球蛋白單-可變區域為重錘 1區域。在更特定實施例中’重鏈可變區域為人類重鏈； Μ區域。在其他實施例中，免疫球蛋白單一 鏈可變區域。在牯宗杏施如由± 匚或為輕 可變區域。切“施例中，輕鏈可變區域為人類輕鏈 在另一態樣中，本文中描述一種產 肽譜系之方法。纟蛋白酶抗性肽或多 {
J 白心 包含提供肽或多肽譜系，在適於蛋 =活性之條件下使肽或多肽譜系與蛋白酶組合回 ::種具有想要之生物活性之肽或多肽，藉此產生 抗性肽或多肽譜系。 贪白酶 鐘實施例中，通常將譜系及蛋白酶培養至少約3。分 種以下 舉例而言，方法中所使用之蛋白酶可為-或多 =白酶：絲胺酸蛋白酶、半耽胺酸蛋白酶、天冬胺 如，肽酶A、㈣肽‘ ㈣狀酶(例 酶、胃蛋白酿士 ）騰蛋白酶、胰凝乳蛋白 酶、凝血酿^蛋白酶、彈性蛋白酶、白血球酶、胰 蛋白酶(例士、纖溶酶、組織蛋白酶(例如組織蛋白酶G)、 =^酶白酶^蛋白酶2、蛋白酶小嗜熱菌蛋白 斯ιΓ 腸肽酶、卡斯蛋白酶（例如卡斯蛋白酶卜卡 卡：扭2、卡斯蛋白酶4、卡斯蛋白酶5、卡斯蛋白酶9、 酶、 > 4蛋白酶】3)、鈣蛋白酶、無花果蛋白 在牿-鲁白酶揭猴桃蛋白酶、鳳梨蛋白酶及分離酶。 、疋施例中，蛋白酶為胰蛋白酶、彈性蛋白酶或白血 13 ⑷ 6.doc -48- 200902551 球酶。蛋白酶亦可由生物提取物、生物組織勻漿或生物製 劑提供。必要時，該方法進一步包含在培養完成後向譜系 與蛋白酶之組合中添加蛋白酶抑制劑。
在一些實施例中’基於結合活性回收複數種具有想要之 生物活性之肽或多肽。舉例而言，可基於結合諸如蛋白質 A、蛋白質G或蛋白質L之一般配位體回收複數種肽或多 肽。結合活性亦可為與靶配位體、諸如本文中所述之靶配 位體之特異性結合。在特定實施例中，藉由淘選回收複數 種具有想要之生物活性之肽或多肽。 在一些實施例中，譜系包含呈現系統。舉例而言，呈現 系統可為噬菌體呈現、核糖體呈現、乳液隔室化及呈現、 酵母呈現、嘌呤黴素呈現、細菌呈現、質體上之呈現或共 價呈現。在特定實施例中，呈現系統使核酸之編碼功能與 由核酸所編碼之肽或多肽之功能特徵相關聯。在特定實施 例中’呈現系統包含可複製之基因組。 在一些實施例中’呈現系統包含噬菌體呈現。舉例而 言’嗟菌體可為fd、MU、人、则2或丁7。在特定實施例 中，嗟鹵體呈現系統為多價系統。在—些實施例中 、 狀或 多肽呈現為pin融合蛋白。 在其他實施例中，方法進一步包含擴增編碼複數種具有 想要之生物活性之肽或多肽的核酸。在特定實施例中 1 由嗟菌體擴增、細胞生長或聚合酶鏈反應擴增核酸。 曰 些實施例中 / , 雙區域譜
糸。在特定實施例中，免疫球蛋白單一可變F A 域為重鏈可 131416.doc -49- 200902551 =區域。在更特定實施例中，重鏈可變區域為人類重鏈可 變區域。在其他實施例中，免疫球蛋白單一可變區域為輕 鏈可變區域。在特定實施例中，輕鏈可變區域為人類輕鏈 可變區域。 在另-態樣中，本文中描述—種自譜系選擇包含砝 配位體（例如，τΝ σ 口 1NFR1)之免疫球蛋白早—可變區域（dAb)之 蛋白酶抗性多肽的方法。在一實施例中，該方法包含提供 包含多肽之譜系的嗔菌體呈現系統，該等多狀包含免疫球 T白早-可變區域’在適於蛋白酶活性之條件下使嗟菌體 =系統與選自由彈性蛋白酶、白血球酶及騰蛋白酶組成 :群之蛋白I组合’及回收呈現包含結合乾配 球蛋白單一可變區域之多肽的嗟菌體。 光文 在一些實施例中，使用100咖之蛋白酶，且在約 3 7 C下將所組合之嗟菌I* g & μ n 現系統及蛋白酶培養隔夜。 .j 人^^’藉由與把配位體結合回收呈現包含結 “乾之免疫球蛋白單一可變區域之多肽 他實施例中，藉由淘選时呈 在/、 球蛋白單一可變區域之多肽的乂、、、°合乾配位體之免疫 L蟑又多肽的噬菌體。 Μ述-㈣本^所述之方 蛋白酶抗性肽或多敗。在 ^擇或選擇之經分離 文中所述之方法可選擇戈摆'“列中’提供-種由本 蛋白酶、彈性蛋白梅、白血球酶)抗:離蛋白酶(例如，姨 變區域（例如，人類抗體重鍵可變 史球蛋白早一可 變區域）。 °σ域、人類抗體輕鏈可 131416.doc -50- 200902551 本文中進一步描述一種經分離或重組核酸，其編碼由本 文中所述之方法可選擇或選擇之蛋白酶抗性肽或多肽（例 如，胰蛋白酶、彈性蛋白酶或白血球酶抗性免疫球蛋白單 一可變區域）’且係關於包含該等核酸之載體（例如，表現 載體）及宿主細胞。 本文中進一步描述一種製備由本文t所述之方法可選擇 或選擇之蛋白酶抗性肽或多肽（例如，胰蛋白酶、彈性蛋 白酶或白血球酶抗性免疫球蛋白單—可變區域）之方法， 該方法包含將含有編碼蛋白酶抗性肽或多肽之重組核酸之 宿主細胞維持在適於表現之條件下，藉此製造蛋白酶抗性 狀或多肽。 本文中進-步描述一種由本文中所述之方法可選擇或選 擇之蛋白酶抗性肽或多肽（例如，胰蛋白酶、彈性蛋白酶 或白血球酶抗性免疫球蛋白單一可變區域），其用於醫學 中（例如，用於治療或診斷）。本文中進一步描述—種由I 文中所述之方法可選擇或選擇之蛋白酶抗性肽或多肽(例 如’騰蛋白酶、彈性蛋白酶或白血球酶抗性免疫球蛋白單 -可變區域)用於製造供治療疾病用之藥物的用途。本文 中進-步描述一種治療疾病之方法’言亥方法包含向有需要 之個體投與有效量之由本文中所述之方法可選擇或選擇之 蛋白酶抗性肽或多肽(例如，胰蛋白冑、彈性蛋白酶或白 血球酶抗性免疫球蛋白單一可變區域）。 本文中進-步描述一種域定樣品中是否存在tnfri或樣 品中存在多少™FRe診斷套組’該套組包含本發明之多 131416.doc -51 - 200902551 狀、免疫球蛋白可變區域（dAb)或拮抗劑及使用說明書（例 如，確定樣品中TNFR1之存在及/或數量）。在一些實施例 中’套組進一步包含一或多種輔助試劑，諸如合適緩衝劑 或口適偵硎試劑（例如’結合本發明之多肽或dAb或與其締 合或接合之部分的經可偵性標記之抗體或其抗原結合片 段）。 本發明亦係關於一種包含固體表面的裝置，可在該固體 表面上固定本發明之多肽、拮抗劑或dAb以使所固定之多 肽或dAb結合TNFR1。可使用上面可固定抗體或其抗原結 s片丰又之任何合適固體表面，例如，玻璃、塑膠、破水化 合物（例如，瓊脂糖珠粒）。必要時，支撐物可含有或經改 質以含有有助於固定之想要官能基。裝置及/或支撐物可 具有任何合適形狀，例如片、桿、帶、板、載玻片、珠 粒、小球、盤狀物、凝膠、試管、球體、晶片、板或器皿 及其類似物。在一些實施例中，該裝置為量桿。 【實施方式】 在本說明書内’已參考實施例以使得能夠編寫清楚且簡 明之說明書之方式描述本發明。希望且應瞭解，在不脫離 本發明之情況下，實施例可不同地組合或分離。 除非另有規定’否則本文中所使用之所有技術及科學術 語具有一般熟習此項技術（例如，細胞培養、分子遺傳 學、核酸化學、雜交技術及生物化學）者通常所理解之相 同之含義。關於分子、遺傳及生化法（通常來見，
Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manua卜第 2 131416.doc -52- 200902551 版（1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，N.Y.及 Ausubel 等人，Short Protocols in Molecular Biology (1999)第 4版 ’ j〇hn Wiley & Sons, Inc·，其係以引 用之方式併入本文中）及化學方法，使用標準技術。
如本文中所使用，術語，，腫瘤壞死因子受體l(TNFRl)拮 抗劑"或’’抗TNFR1拮抗劑”或其類似術語係指結合TNFR1且 可抑制TNFR1之（一或多種）功能的藥劑（例如，分子、化合 物）。舉例而言’ TNFR1之拮抗劑可抑制TNF〇^ TNFR1之 結合及/或抑制TNFR1介導之信號轉導。因此，tnfRI介導 之過程及細胞反應（例如，標準L929細胞毒性檢定中TNFa 誘導之細胞死亡）可用TNFR1之拮抗劑來抑制。 如本文中所使用，”肽，，係指經由肽鍵結合在一起之約2 個至約50個胺基酸。 如本文中所使用 少約50個胺基酸。 域0 ，”多肽"係指經由肽鍵結合在一起之至 多肽通常包含三級結構且摺疊為功能區 如本文中所使用，丨，括 酶降解”肽或多肽（例如，區域 抗體（dAb))當在適於蛋 ^ ^ 養時大I*上… 之條件下與蛋白酶-起培 度，例如在37。(：或5()。 §红於蛋白酶活性之溫 超過約25%、不超過二 酶一起培養約1小時後不 1 4%、不超過約1 3。/。、 不超過約 過約ίο%、不超過約9〇/、°過約12%、不超過約"％、不超 超過約6%、不超過約不超過約8%、不超過約7%、不 。、不超過賴、不超過約3%、不 131416.doc -53- 200902551 超過約2%、不超過約1%或大體上無蛋白質被蛋白酶降解 時’多狀（例如，dAb)大體上不降解。可使用任何合適方 法評定蛋白質降解’例如由sdS_PAGe或由如本文中所述 之功能檢定（例如，配位體結合）。 如本文中所使用，”呈現系統”係指其中多肽或肽之集合 易於基於想要之特徵（諸如物理、化學或功能特徵）加以選 擇之系統。呈現系統可為多肽或肽之合適譜系（例如，在 /合液中固疋於合適支撐物上）。呈現系統亦可為採用細 胞表現系統(例如，於(例如)經轉型、感染、轉染或轉導細 胞中表現核酸庫及於細胞表面丨呈現經編碼多狀）或非細 胞表現系統（例如，乳液隔室化及呈現）之系統。例示性呈 現系統使核酉曼之編碼功能與由核酸所編碼之多&或狀之物 理、化學及/或功能特徵相關聯。當採用該呈現系統時， 可選擇具有想要之物理、化學及/或功能特徵之多肽或 肽’且可容易地分離或时編碼所選擇之多肽或狀之核 °此項技術已知許多使核酸之編碼功能與多肽或狀之物 理、化學及/或功能特徵相關聯之呈現系、统，例如噬菌體 呈現（baCteri〇phage display/ phage (例如，噬質體 呈現）、才請體呈ί見、乳液隔室化及呈玉見、酵母呈現、嗓 呤黴素呈現、、細菌呈現、質體上之呈現、共價呈現及其： 似者。（例如參見EP 〇436597(Dyax)、美國專利第6，ΐ72，ΐ97 號，⑽叫等人）、美國專利第M89，103號（Gri鼠3等 人）。） 如本文中所使用，”譜系"将并w π甘a — 係才日以胺基酸序列多樣性為特 131416.doc •54· 200902551 欲之夕肽或肽之集合。譜系之個體成員可具有常見特徵， 諸如㊉見結構特點（例如，常見核心結構）及/或常見功能特 徵(例士 、纟10合常見配位體（例如，一般配位體或靶配位 體，TNFR1)之能力）。 如本文中所使用，”功能”描述具有生物活性、諸如特異 性結合活性之多肽或肽。舉例而言，術語"功能多肽”包括 經由抗原結合位點結合靶抗原之抗體或其抗原結合片段。 如本文中所使用，”一般配位體，，係指結合給定譜系之相 當一部分（例如，大體上所有）功能成員之配位體。一般配 位體（例如，常見一般配位體）可結合給定譜系之許多成 員，即使該等成員可能對常見靶配位體不具有結合特異 性。多肽上存在功能一般配位體結合位點（如結合一般配 位體之能力所指示）通常指示多肽經適當摺疊且具有功 能。一般配位體之合適實例包括超抗原、結合表現於譜系 之相當一部分功能成員上之抗原決定基之抗體及其類似 者。 "超抗原"為技術術語，其係指與免疫球蛋白超家族之成 員在不同於該等蛋白質之靶配位體結合位點之位點處相互 作用之般配位體。葡萄球菌腸毒素為與丁_細胞受體相互 作用之超抗原實例》結合抗體之超抗原包栝結合IgG怔定 區之蛋白質 G(Bjorck 及 Kronvall，乂 /膽關〇/.，ι33:969 (1984));結合IgG恆定區及Vh區域之蛋白質八（17〇1^以如及
Sjoquist，乂 /wwwwo/.，97:822 (1966));及結合 ％區域之蛋 白質 L(Bjorck，J. /mmwwo/·，1 40:1194 (1 988))。 131416.doc -55- 200902551 如本文中所使用，”靶配位體”係指多肽或肽特異性或選 擇性結合之配位體。舉例而言，當多肽為抗體或其抗原結 合月段時，靶配位體可為任何想要之抗原或抗原決定基。 與靶抗原之結合係視具有功能性之多肽或肽而定。
如本文中所使用，抗體係指源自任何天然產生抗體之物 種或由DNA重組技術產生的自血清、B細胞、融合瘤、轉 染瘤、酵母或細菌分離的IgG、IgM、lgA、㈣或邮或片 段（諸如Fab、F(ab，）2、Fv、雙硫鍵鍵結之Fv、scFv、封閉 構形多特異性抗體、雙硫鍵鍵結之scFv、雙抗體）。 如本文中所使用’ ”抗體格式（antib〇dyf〇rmat)，,係指並中 可合併—或多個抗體可變區域以在結構上賦予抗原結合特 異性之任何合適多肽結構。此項技術已知多種合適抗體格 式’諸如嵌合抗體、人化抗體、人類抗體、單鍵抗體、雙 特異I·生抗體、k體重鏈、抗體輕鏈、抗體重鏈及/或輕鍵 之同源二聚體及異源二聚體、任何上述各者之抗原結合片 段（例如，Fv片段（例如單鏈Fv(scFv)、雙硫鍵鍵結之Fv)、 片奴Fab片&、F(ab，）2>i段）、單__抗體可變㈣⑼ Ab VH vhh、Vl)及任何上述各者之經修飾形式 (例如經由共價連接令 _ 接聚乙—知或其他合適聚合物或人化VHH 來修飾）。 短語”免疫球蛋白單一可變區域，，係指獨立於其他V區或 品戈特/、!生、。口抗原或抗原決定基之抗體可變區域(Vh、 HH L)免疫球蛋白單一可變區域可以某一格式（例 如，同源或異源多令# 歙體）與其他可變區或可變區域一起存 131416.doc -56· 200902551 在，其中該等其他區或區 為早一免疫球蛋白可變區域 之抗原，.、σ 5所需（亦即，Α中 。 ，、免疫表蛋白早一可變區域獨 立於其他可變區域紝人杼店、 埝、、、° &抗原）。”區域抗體”或”dAb”盘本文 中所使用之術語"免疫球 τ作厂> 又砵贫臼早一可變區域"相同。”單一 免疫球蛋白可變區域"盘本 „ 、尽文中所使用之術語，•免疫球蛋白 早一可變區域”相同。 扞触π η J 早一抗體可變區域"或，，抗體單一可 變區域”與本文中所>^田 斤使用之術浯"免疫球蛋白單一可變區域,， 相同。在一實施例中，免疫球蛋白單一可變區域為人類抗 體可變區域，1包括來自其他物種之單—抗體可變區域， 諸如馨齒動物（例如’如w〇 〇〇/29〇〇4中所揭示其内容係 以引用之方式整體併入本文中）、護士黑k)及駱 轮類（c晰㈣Vhh dAb。路㈣％為自產生天然缺少輕 鏈之重鏈抗體之包括路馬它、美洲騎、羊乾、單學路騎及原 ,¾之物種獲得的免疫球蛋白單一可變區域多肽。Vhh可為 人化的。 π區域’’為具有獨立於蛋白質其餘部分之三級結構之摺疊 蛋白質結構。區域通常會產生蛋白質之離散功能性質，且 在許多狀況下，可在不損失蛋白質之其餘部分及/或區域 之功能之情況下，添加至其他蛋白質中、自其他蛋白質中 移除或轉移至其他蛋白質中單一抗體可變區域”為包含 具有抗體可變區域特徵之序列之摺疊多肽區域。因此，其 包括70全抗體可變區域及（例如）其中一或多個環已經被不 具有抗體可變區域之特徵之序列置換的經修飾可變區域， 或已經被截斷或包含Ν_末端或C-末端延伸之抗體可變區 I31416.doc •57· 200902551 域，以及保留全長區域之至少結合活性及特異性之可變區 域的摺疊片段。 抑2 = ”庫"係指異源多肽或核酸之混合物。庫包含各具有 早一多肽或核醆序列之成員。就此而論，”庫"與”譜系，，同 義:庫成員之間的序列差異產生庫中所存在之多樣性。庫 可採取夕肽或核酸之簡單混合物形式或可呈經核酸庫轉型 之例如細菌、病毒、動物或植物細胞及其類似者之生物體 或細胞形式。在—實施例中，各個體生物或細胞僅含有一 個或有限數目之庫成員。在一實施例中，將核酸併入表現 載體中以允許表現由核酸所編碼之多狀。因此，在一態樣 中，庫可採取宿主生物體群體之形式，各生物體含有—或 多個含有單個呈核酸形式之庫成員的表現載體複本，該庫 成員可經表現以產生相應多肽成員之核酸形式之庫成員。 因此，宿主生物體群體具有編碼多樣性多肽大譜系之潛 "通用構架，，為對應於wKabat(，，Sequences 〇f Pr〇teins 〇f Immunological Interest", US Department of Health and
Human Services)所定義之在序列方面保守之抗體區或對應 於如 Chothia及 Lesk，（1987) M〇1 Bi〇1 196·91〇9ΐ7 所定 義之人類生殖系免疫球蛋白譜系或結構的單一抗體構架序 列。庫及譜系可制單-構架或—組該等構架，儘管僅高 變區中存在變異但已發現其仍准許實際上任何結合特異性 之起源。 如本文中所使用，術語”劑量"係指一次（單位劑量）或在 131416.doc •58- 200902551 規定時間間隔内分兩次或兩次以上投藥向個體投與之配位 體之數量。舉例而言，劑量可指在1天（24小時）（每曰劑 量）、2天、i週、2週、3週或一或多個月之時程内向個體 投與(例如’單次投藥或兩次或兩次以上投藥)之配位體(例 如’包含結合以原之免疫球蛋白單—可變區域之配位 體)之數量。劑量之間的間隔可為任何想要之時間量。 f
L β 短語"半衰期"係指配位體(例如，㈣、多肽或拮抗劑) 之血清濃度（例如）歸因於自然機制所致之配位體降解及/或 配位體清除或隔離而活體内減小5〇%所需之時間。本發明 之配位體在活體内可為穩定的且其半衰期可因結合抗降解 及/或清除或隔離之分子而增加。該等分子通常為本身且 體内半衰期之天'然存在之蛋白質。若配位體之功能 位内比對半衰期增加分子不具有特異性之類似配 類血清白蛋白_)及:八=加。舉例而 ΗςΔ_ . 刀子”有特異性之配位體係可比 不存在特異性(即不結合HSA但結合另一分子)之 相同配位體。舉例而丄 丁 期通常增加]〇%、:；：可結合細胞上之第三把。半衰 倍、情m %、5{)%或以上。2倍、3 圍内之半衰期之^ 2G倍、3G倍、4G倍、50倍或以上範 4。倍，倍、6〇::7〇:能的。另外或其他’高達倍、 ° 70倍、80倍、90倍、100户、i5_ r 圍内之半衰期之增加為可能的。 _一倍乾 如本文中所使用，”沪 通過水溶液之分子“ 力予尺寸，,係指基於分子擴散 刀子（例如，蛋白質分子、配位體）表觀尺 1314\6.doc -59- 200902551 寸。可使得蛋白質擴散或運動通過溶液以獲得蛋白質之表 觀尺寸，其中該尺寸係以蛋白質粒子之”斯托克斯半徑 (Stokes radius)”或”流體動力學半徑”給出。蛋白質之"流體 動力學尺寸”視質量與形狀（構形）而定，如此兩個具有相同 分子質量之蛋白質基於蛋白質之總構形可能具有不同流體 動力學尺寸。 如本文中所提及，術語"競爭"意謂第一靶與其同源靶結 合區域之結合在存在對該同源革巴具有特異性之第二结合區 域的情況下受到抑制。舉例而言，結合可能會（例如）因結 合區域之物理阻斷或結合區域之結構或環境改變以致其對 靶之親和力（affinity或avidity)減小而在空間上受到抑制。 關於如何執行競爭ELISA及競爭BiaCore實驗以確定第一與 第二結合區域之間的競爭的詳情，參見W02006038027。 如下執行兩個序列之間的”同源性”或” 一致性"或"相似性" 之計算（該等術語在本文中可互換使用）。出於最佳比較目 的-對序列（例如，為最佳比對，可在第一與第二胺基酸 或核酸序歹U之一個或兩個中引入$隙，j^於比較之目 的，可忽視非同源序列）。在一實施例中，出於比較之目 的所比對《參考序列之長度為至少參考序列之長度的至少 3〇/°或至少40%、或至少50%、或至少60% '或至少 ^〇/〇 8〇 /〇、90%、1 00%。隨後比較相應胺基酸位置或核 苷鲅位置處之胺基酸殘基或核苷酸。當第一序列中之某一 位' 置由Si後一产 、一序列中之相應位置相同之胺基酸殘基或核普 康寺則分子在該位置處一致（如本文中所使用，胺 131416.doc -60- 200902551 基酸或核酸"同源性”等效於胺基酸或核酸"一致性”）。兩個 序列之間的一致性％係隨考慮為最佳比對兩個序列所引入 之間隙之數目及各間隙之長度的序列所共享之一致位置之 數目而變化。可使用算法BLAST 2 Sequences使用缺省參 數（Tatusova，T. A·等人，？£]\48]\441>〇1)1〇1[61;1;，174:187- 18 8(1 999))準備且確定如本文中所定義之胺基酸及核苷酸 序列比對及同源性、相似性或一致性。 選擇方法
在一實施例中，本發明係關於由選擇具有想要生物活性 之蛋白酶抗性肽及多肽的方法選擇的多肽及dAb。方法中 使用兩個選擇壓力以產生選擇高度穩定且抗蛋白酶降解且 具有想要生物活性之多肽的高效過程。如本文中所述，蛋 白酶抗性肽及多肽通常保留生物活性。相反，蛋白酶敏感 肽及多肽在本文中所述之方法中會被蛋白酶裂解或分解， 且因此喪失其生物活性。因企匕，通常基於諸如結合活性之 生物活性選擇蛋白酶抗性肽或多肽。 本文中所述之方法提供數個優點。舉例而言，如本文中 所揭示及例示，經選擇而抗-種蛋白酶(例如，胰蛋白酶) 之蛋白水解降解的可變區域、拮抗劑、肽或多肽亦對其他 :白酶(例如’彈性蛋白酶、白血球酶)降解具有抗性。在 :實施例中白酶抗性與肽或多肽之較高熔融溫度(Tm) 相關。較高熔融溫度指示鲂藉 ,如 又扣不車乂穩疋可變區域、拮抗劑、肽及 夕狀。在一實施例中，γ疋& & 财^蛋“降解亦與結合㈣位體之 间親和力相關。因此，本 又〒所迷之方法提供一種選擇、 131416.doc -61 · 200902551
分離及/或回收具有想要之生物活性且因其具蛋白酶抗性 且穩定而極適於活體内治療及/或診斷使用4卩變區域、 拮抗劑、a、多肽的有效方式。在一實施例中，蛋白酶抗 性與改良之PK(例如，比不具蛋白酶抗性之可變區域、抬 抗劑、肽或多肽改良)相關。改良之PK可為改良之AUC(曲 線下面積）及/或改良之半衰期。在一實施例中，蛋白酶抗 性與可變區域、拮抗劑、肽或多肽對剪切力及/或熱應： 之改良穩定性及/或喷霧期間減小之聚集傾向(例如，比不 具蛋白酶抗性之可變區域、拮抗劑、肽或多肽改良)相 關。在-實施例中’蛋白酶抗性與改良之儲存穩定性（例 如’比不具蛋白酶抗性之可變區域、拮抗劑'肽或多肽改 良）相關。在一態樣中’提供一個、二個、三個、四個或 所有該等優點，該等優點為抗蛋白酶降解、較高及結 合靶配位體之高親和力。 在一態樣中，提供一種自肽及多肽之庫或譜系（例如， 呈現系統）選擇、分離及/或回收抗蛋白酶（例如一或多種蛋 白酶）降解之肽或多肽之方法。在一實施例中，該方法為 自肽及多肽之庫或譜系（例如，呈現系統）選擇、分離及/或 回收抗蛋白酶（例如，一或多種蛋白酶）降解之多肽之方 法。該方法通常包含提供肽或多肽之庫或譜系，在適於蛋 白酶（例如，胰蛋白酶、彈性蛋白酶、白血球酶、胰酶、 痰）活性之條件下使該庫或該譜系與蛋白酶組合，及選 擇、分離及/或回收抗蛋白酶降解且具有想要之生物活性 之肽或多肽。歸因於蛋白酶之活性，由蛋白酶降解之肽或 1314I6.doc •62· 200902551 多肽通常生物活性減小或喪失其生物活性。因此，可使用 基於生物活性之方法選擇、分離及/或回收抗蛋白酶降解 之肽或多肽，該生物活性諸如結合活性（例如，結合—般 配位體、結合特異性配位體、結合受f )、催化活性或其 他生物活性。 t 在適於蛋白酶（例如，-或多種蛋白酶）之蛋白水解Μ 之條件下使肽或多肽之庫或譜系與蛋白酶組合。適於蛋白 酶及具有蛋白水解活性之生物製劑或混合物之蛋白水解活 性的條件為此項技術所熟知或可由一般熟習此項技術者_ 易地確定。必要時，可（例如）藉由在一定範圍之阳㈣ 件、蛋白酶濃度、溫度下評估蛋白酶活性及/或藉由改變 使庫或譜系與蛋白酶反應之時間之量來鑑別或優化合適條 件。舉例而言’在一些實施例中，蛋白酶(例#，胰蛋白 酶）與肽或多肽（例如，可變區域）之比率（以莫耳/莫耳計）為 800比80,00(例如’ 8，_比8〇〇〇〇)蛋白酶：肽或多肽例 如當使们〇微克/毫升蛋白酶時，比率為则比⑽，嶋蛋白 酶：肽或多肽；或當使用ΗΚ)微克/毫升蛋白酶時，比率為 8，_比80，_蛋白酶：肽或多肽。在—實施例中蛋白酶 (例旦如，胰蛋白酶）與肽或多肽（例如，可變區域）之比率（以 重量/重量、例如微克/微克計(例如， ⑽⑼比叫啊蛋白酶：肽或多^例如當使用⑽克/ 毫升蛋白酶時’比率為以⑽比⑽侧蛋白酶：狀或多 肽；或當使用1〇〇微克/毫升蛋白酶時，比率為16,〇〇〇比 16〇,_蛋白酶：肽或多肽。在—實施例中，使用濃度為 131416.doc •63 - 200902551 至少100或厲微克/毫升之蛋白酶，且蛋白酶（例如， 蛋白酶）與肽或多肽（例如，可變區域）之蛋白, 胰 (以莫耳/莫耳計）為8,000比80 % .肽比率 贫臼輙.肽或多肽。 實施例中，使用濃度為至少10微克/毫 在— 、貧白峰，日疋 白酶（例如，胰蛋白酶）與肽或多肽（例如，可變區 蛋 白酶：肽比率（以莫耳/莫耳計）為8〇〇比8〇,〇〇〇蛋白酶之蛋 或多肽。在-實施例中’蛋白酶(例如，騰蛋白酶心 多肽（例如，可變區域）之比率（以重量/重旦 或 克計）為以隊⑽卿蛋白酶.肽$夕日士里、例*微克/微 贫白酶.肽或多肽，例如當c 微克/毫升時；或當C或C，為1〇〇微 一 毛邛日f，比率為 ，000比16MGG蛋白酶：肽或多肽。在-實施例中，Μ (C或〇為至少100或⑽微克/毫升蛋白酶。為測試個體： 紐分離肽或多肽(例如，免疫球蛋白可變區域)，例如早已 自譜系或庫分離之肽或多肽，可向肽或多肽存於合適緩衝 液(例如’PBS)中之溶液中添加蛋白酶以製得肽或多肽/蛋 白酶溶液’諸如至少約〇.〇1%(重量比）蛋白酶/狀或多狀、 約0.01%至約5%(重量比）蛋白酶/肽或多肽、約0 05%至約 5%(重量比）蛋白酶/肽或多肽、約〇 1%至約5%(重量比）蛋 白酶/肽或多肽、約〇.5%至約5%(重量比)蛋白酶/肽或多 肽約1%至約5%(重量比）蛋白酶/肽或多肽、至少約 0·01 /〇(重1比）蛋白酶/肽或多肽、至少約〇 （重量比）蛋 白酶/肽或多肽、至少約〇.〇3%(重量比）蛋白酶/狀或多狀、 至少約0.04。/。（重量比）蛋白酶/肽或多狀、至少約重 量比）蛋白酶/肽或多肽、至少約〇〇6%(重量比）蛋白酶/狀 131416.doc -64 - 200902551 或多肽、至少約0.07%(重量比） 0.08%(重量比）蛋白酶/肽或多肽、—/肽或多肽、至少約 白酶/肽或多肽、至少 至二約0·〇9%(重量比）蛋 乂 β I0/。（重量卟、 至少她(重量比)蛋白酶 )蛋白酶/肽或多肽、 比)蛋白酶/肽或多肽、至少約。. 肽、至少約0.5%(重θ 垔里比）蛋白鉍/肽或多 ―比)蛋白酶二 η 酶/肽或多肽、至少約〇.8%(重：約〇:7%(重量比)蛋白 少約0.9%(重量比）蛋 蛋白酶/肽或多肽、至 白酶/肽或多肽、至少約）〇"去 至夕約工/。（重置比）蛋 少約W重量比)蛋白酶/肽❹量：)蛋白㈣^ 白酶/肽或多肽或約5% 至少約4%(重量比）蛋 可在適於蛋白酶里比）蛋白酶/肽或多肽之溶液。 蛋白酶店性之溫度（例如 -合物’且可以時間 下均養 採集樣品。可使用 ’ ° ’ 1小時、2小時、3小時等） 配位體社„可σ適方法、諸如SDS_PAGE分析或 解時程:口就蛋白質降解分析樣品，且可使用結果建立降 而言，可使用斤t方法:可使用任何想要之蛋白酶。舉例 或具有蛋白水:活二：不同蛋白酶之任何想要之組合 組織勻漿。不必可生物製劑、生物提取物或生物 或以任何想要之=道所使用之蛋白酶之一致性。可單獨 ^ , 、且σ使用之蛋白酶之合適實例包括絲胺酸 t 半脱胺酸蛋白酶、天冬胺酸蛋白酶、硫醇蛋白 ' 麵、羧基肽酶（例如，羧基肽酶A、羧基 131416.doc -65 - 200902551 肽酶β)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白 酶、彈性蛋白酶、白血球酶、胰酶、凝血酶、纖溶酶、組 織蛋白酶（例如，組織蛋白酶G)、蛋白酶（例如，蛋白酶 蛋白酶2、蛋白酶3)、嗜熱菌蛋白酶、凝乳酶、腸肽 酶、卡斯蛋白酶（例如，卡斯蛋白酶丨、卡斯蛋白酶2、卡 斯蛋白酶4、卡斯蛋白酶5、卡斯蛋白酶9、卡斯蛋白酶 U、卡斯蛋白酶13)、鈣激活蛋白酶、無花果蛋白酶、梭 菌蛋白酶、獼猴桃蛋白酶、鳳梨蛋白酶、分離酶及其類似 物具有蛋白水解活性之合適生物提取物、組織勻漿及製 劑包括痰、黏液（例如，胃黏液、鼻黏液、支氣管黏液）、 支軋管肺泡灌洗液、肺組織勻漿、肺提取物、胰腺提取 物月液、唾液、眼淚及其類似物。蛋白酶係以適於發生 蛋白水解降解之量使用。舉例而言，如本文中所述，可使 用約0.01%至約5%(重量比，蛋白酶/肽或多肽）蛋白酶。當 使蛋白酶與包含肽或多肽譜系之呈現系統（例如，噬菌體 ς X 呈現系統）組合時，例如，可使用濃度為約10 pg/ml至約;3 mg/ml、約 1〇 pg/ml、約 2〇 μ§/ηι1、約 3〇 、約 4〇
Kg/ml、約 50 pg/ml、約 60 μ§/ιη1、約 7〇 μ§/ιη1、約 8〇 pg/ml、約 90 pg/m卜約 1〇〇 μ§/ηι卜約 2〇〇 叩/mi、約 3〇〇 Hg/ml、約 400 pg/ml、約 500 μ§/ιη卜約 6〇〇 μ§/ιηι、約 7〇〇 pg/ml、約 800 pg/ml、約 9〇〇 pg/ml、約 1〇〇〇 gg/mi、約 1.5 mg/ml、約 2 mg/ml、約 2.5 mg/ml或約 3 mg/ml之蛋白酶。 在適於蛋白酶活性之溫度下，將蛋白酶與肽或多肽之集 合（庫或I晋系）一起培養。舉例而言，可在約2 〇。〇至約 131416.doc -66- 200902551 4〇C(例如，室溫、約20°C、約2TC、約22°C、約23°C、約 24 C、約 25°C、約 26〇C、約 27。(：、約 28DC、約 29〇C、約 30 C、約 31°C、約 32°C、約 3VC、約 34〇C、約 35。(：、約 36C、約37°C、約38°C、約39它、約40。〇之溫度下培養蛋 白酶及肽或多肽之集合。將蛋白酶及肽或多肽之集合—起 培養一段足以發生蛋白水解降解之時間。舉例而言，可將 肽或夕肽之集合與蛋白酶一起培養約30分鐘至約24或約48 J日守在一些實例，將肽或多肽之集合與蛋白酶一起培養
Pw仪或培養至少約30分鐘、約1小時、約1.5小時、約2 小時、約3小時 '約4小時、約5小時、約6小時、約7小 時、約8小時、約9小時、約1〇小時、約u小時、約叫、 時、約13小時、約14小時、約15小時、約16小時、約17小 忖約18小時、約19小時、約2〇小時、約21小時、約^小 時、力23小時、約24小時、約48小時或更長。 /通常希望，至少在早期各輪選擇中（例如，當使用呈現 系，先時）’與不包括與蛋白酶一起培養之選擇相比，蛋白 酶使得所選擇之具有想要之生物活性之純系數目減少至少 -個數量級。在特定實例中’方法中所使用之蛋白酶量及 條件足以使所时到之純系數目減少至少約！個對數（1〇 倍）至J約2個對數（100倍）、至少約3個對數（ι〇〇〇倍）或 至少約顿對數（1〇，嶋倍）。產生想要之回收純系減少之合 適蛋白酶I及培養條件可使用習知方法及/或本文中 供之指導容易地確定。 可使蛋白酶與肽或多肽之集合組合且使用任何合適方法 131416.doc -67· 200902551 (例如，活體外、活 白酶與肽或多肽之集合J合體」培養。舉例而言’可使蛋 活性之溫度下保持固°定、y合適:器中且在適於蛋白酶 況。必要時，可使I 展盪、渦旋或其類似情 蛋白輕與肽或多肤>隹人z人 或離體系統中，諸如藉由將多 之人集…於活體内 現庫或譜系H,入合適動物(例如(例如1菌體呈 白酶活性起作用之時間過後狀’且在足以使蛋 —實例中，用之收肽或夕肽之集合。在另
>之集合（例如，噬菌體呈現庫戋碰李v、植 注器官或組'織，且在万m 兄厍A D曰系）准 德，π dw 纟足乂使蛋白酶活性起作用之時間過 後，回收多肽之集合。 培養後，可基於諸如結合活性 心心罟之生物活性選擇蛋 白酶抗性肽或多肽。必要時， 受时了在選擇之珂添加蛋白酶抑 …可使用大體上不會干擾選擇方法之任何合適蛋白酶 午制劑(或兩種或兩種以上蛋白酶抑制劑之組合)。合適蛋 酶抑制㈣之實例包括α卜抗胰蛋白酶、巨球蛋白、阿 馬他疋（amastatin)、抗痛素（antipain)、抗凝血酶m、抑肽 酶4-(2-胺基乙基）苯績醢氟鹽酸鹽（AEBSF)、（4_脒基_ 苯基）_甲烷-磺醯氟（APMSF)、貝他定（bestatin)、苯甲脒、 抑凝乳蛋白酶素、3,4_二氣異香豆素、氟磷酸二異丙酯 (DIFP)、E-64、乙二胺四乙酸（EDTA)、彈性蛋白酶抑制劑 (elastatinal)、亮肽素、N-乙基馬來醯亞胺、苯基甲基磺醯 氟（PMSF)、胃酶抑素、no—菲羅啉（Phenanthr〇Une)、膦 醢二肽（phosphoramidon)、絲胺酸蛋白酶抑制劑、N-甲笨 續醯基-L-離胺酸-氣曱基酮（TLCK)、Na-曱苯磺醯基_phe_ 131416.doc -68- 200902551 氣曱基酮（TPCK)及其類似物。另外，可在購得許多含有數 類蛋白酶抑制劑之製劑（例如，Roche Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets™(Roche Diagnostics Corporation; Indianapolis，IN，USA)，其抑制胰凝乳蛋白酶、嗜熱菌蛋 白酶、木瓜蛋白酶、鏈黴蛋白酶、胰腺提取物及胰蛋白 酶）。 可使用想要之生物活性選擇方法選擇蛋白酶抗性肽
肽，s亥方法使得具有想要之生物活性之肽及多肽不同於不 具有想要之生物活性之肽及多肽且對其加以選擇。已經被 蛋白酶分解或裂解之肽或多肽通常喪失其生物活性，而蛋 白酶抗性肽或多肽仍具功能性。因此，可使用生物活性之 合適檢定選擇蛋白酶抗性肽或多肽。舉例而言，可使用合 適結合檢定（例如，ELISA，淘選）評定常見結合功能（例 如，結合一般配位體、結合特異性配位體或結合受質）。 舉例而。可藉由淘選或使用合適親和力基質選擇、分離 及/或回收結合靶配位體或諸如蛋白質A、蛋白質L之或— ，配位體或抗體之多肽。可藉由向合適容器(例如：試 管、皮氏培養皿（petri dish))中添加配位體（例如，一般配 位體配位體）之落液且使配位體變得沈積或塗佈於容 器壁之上來實現淘選。可洗除過量配位體且可向容器中添 加多例如’嗟菌體呈現庫)且將容器維持在適於多肽結 合固疋配位體之條件下。可洗除未結合多肽且可使用諸如 刮=或（例如）降低PH值之任何合適方法回收結合多肽。 田使用巫g體呈現系統時’可在㈣體ELBA中測試結 131416.doc •69- 200902551 合。可根據任何合適程序執行噬菌體ELISA。在一實例 中，可由ELISA就與所選擇之靶配位體或一般配位體之結 合篩選各輪選擇下所產生之噬菌體群體以鑑別呈現蛋白酶 抗性肽或多肽之僅菌體。必要時，可由例如eusa使用例 汝針對C-末鳊或N-末端標籤之試劑就與靶配位體或一般配 位體之結合測試可溶性肽及多肽（例如參見，Winter等人， (1994) 12, 433_55及其中所引用之參
考文獻）。亦可由PCR產物之凝膠電泳（Marks等人，ΐ99ι, 同上，Nlsslm等人，1994，同上）、探測（pr〇bing)(T〇祕咖等 人’ 1992，乂偏.心/· 227, 776)或藉由對載體dna測序評 定所選擇之噬菌體之多樣性。 除對TNFR1具有特異性外’包含抗TNFR1蛋白酶抗性多 肽(例如，單-抗體可變區域)之拮抗劑或多肽(例如，雙特 配位體）可對一般配位體或任何想要之靶配位體具有 結=特異性，該-般配位體或乾配位體諸如人類或動物蛋 白質，包括細胞激素、±長因子、細胞激素受體、生長因 子受體、酶（例如’蛋白酶）、酶之辅因子、wa結合蛋 白、脂質及碳水化合物。 如，dAb)或 ，拮抗劑或 在—些實施例中，蛋白酶抗性肽或多肽（例 拮抗劑結合肺組織中之TNFR1。在一實施例中 多狀亦結合肺組織中之另—革巴。 當在本文中所述之方法中使用呈現系統(例如，使核酸 :編碼功能與由核酸編碼之肽或多肽之功能特徵相關聯的 現糸統m，通常可有利擴增或增加編碼所選擇之狀或 131416.doc -70· 200902551 多肽之核酸的複本數。此提 I獲付足夠數置之供使用本文 中所述之方法或其他合適方 方去之其他輪選擇用或供製備其 他譜糸（例如，親和力成熟譜 、 糸）用之核酸及/或肽或多肽的 有效方式。因此，在一肽會#/，丄 —貫知例中，該等方法包含使用呈 現系統（例如，使核酸之绝s 之編碼功能與由核酸編碼之肽或多 肽之功能特徵相關聯之呈現 ’ 兄糸統’諸如噬菌體呈現），且 進一步包含擴增或增加編媽 π k擇之肽或多肽之核酸的複 本數。核酸可使用任何合谪 、方法、諸如藉由噬菌體擴增、 細胞生長或聚合酶鏈反應擴增。 、 本文_所述之方法可用作 必要時可包含其他合適選擇方 法之分離蛋白酶抗性肽或 夕肽（例如，dAb)之程序的部 分。在該等情形中，可在 、 在耘序之任何想要之點採用本文中 所述之方法’諸如使用其 、擇方法之珂或之後。如本文 中所描述且例示，本文中 丰文 兩輪以上選擇。 _之方法亦可用於提供兩輪或
C 在一實例中’該方法為選擇抗彈性蛋白酶降解之肽或多 肽（例如，dAb)，其句今担w „ 具包3^供肽或多肽之庫或譜系，在適 於彈性蛋白酶（或包含彈性 ,^ , 蛋白鉍之生物製劑、提取物或 組織勻漿）蛋白水解分解之总从 ^ 條件下使庫或譜系與彈性 酶組合，及選擇、分離只/+ 來㈡ 離及/或回收抗彈性蛋白酶降解且且 有丁NFR1結合活性之肽或多肽。 鮮八 在特疋戶、把例中，提供一種選擇抗彈性蛋白酶降解且么士 合™·的免疫球蛋白單—可變區域（㈣）的方法。二 等實施例中’提供包含dAb之庫或譜系且在適於彈性蛋= 131416.doc 200902551 酶（或包含彈性蛋白酶之生物製劑、提取物或組織勻聚）蛋 白水解分解之條件下使其與彈性蛋白酶組合。選擇特異性 結合TNFR1之彈性蛋白酶抗性dAb。舉例而言，彈性蛋白 酶抗性dAb當在37°C下在0.04%(重量比）彈性蛋白酶溶液中 培養至少約2小時之時間時大體上不降解。在一實施例 中，彈性蛋白酶抗性dAb當在37〇C下在〇.〇4%(重量比）彈性 蛋白酶溶液中培養至少約12小時之時間時大體上不降解。 在一實施例中，彈性蛋白酶抗性dAb當在37它下在 〇.〇4〇/。（重量比）彈性蛋白酶溶液中培養至少約以小時、至 少約36小時或至少約48小時之時間時大體上不降解。 在一實施例中，提供一種選擇抗彈性蛋白酶降解且社八 tnfR1的免疫球蛋白單一可變區域（dAb)的方法。該= 包含提供包含多肽譜系之嗟菌體呈現系統，該等多肽包含 免疫球蛋白單一可變區域’使嗤菌體呈現系統與彈性蛋白 酶（約_叫/mi)組合且將混合物在約37t下培養（例如）隔 j 仪（例如約12·16小時），及隨後選擇呈現特異性結*TNFR1 之dAb的噬菌體。 在實例中，提供_種選擇抗白血球酶降解之狀或多狀 (例如，dAb)之方法，士女士、| a人 〇法匕3提供肽或多肽之庫或譜 糸’在適於白血破酿i r >、a人 酶蛋白（或包含白血球酶之生物製劑、 提取物或組織勻幾;）k 八 )解刀解之條件下使庫或譜系與白血 ^組合，及選擇、分離及/或回收抗白血球酶降解且且 有特異f4TNFR1結合活性m多肽。 在特定實施例中，提供一種選擇抗白血球酶降解且結合 I314I6.doc -72- 200902551 TNFR1的免疫球蛋白單一可變區域（dAb)的方法。在該等 實把例中’提供包含dAb之庫或譜系且在適於白也球酶（或 e 3白A球酶之生物製劑、提取物或組、織勾衆）蛋白水解 刀解之條件下使其與白血球酶組合。選擇特異性結合 TNFRR白血球酶抗性dAb。舉例而言，白血球酶抗性 ㈣當在3rc下在請％(重量比）白血_溶液中培養至少 約2小時之時間時大體上不降解。在一實施例中，白血球
酶抗性dAb當在37t下在〇〇4%(重量比）白血球酶溶液中培 養至少約12小時之時間時大體上不降解。在—實施例中， 白企球酶抗性dAb當在37t：T纽峨（重量比W球酶溶 液中培養至少約24小時、至少約36小時或至少約48小時之 時間時大體上不降解。 在-實施例中，提供—種選擇抗白血球酶降解且特显性 結合™FR1的免疫球蛋白單—可變區域（dAb)的方法。該 方法包含提供包含多肽譜系之嗤菌體呈現系統，該等多肽 包含免疫球蛋白單一可變區心使嗤菌體呈現系統與白血 球轉⑷〇〇 _丨）組合且將混合物在約3rc下培養（例如） 隔夜（例如約12-1 6小時），及隨接母裡w 丁_之_^菌體。後選擇呈現特異性結合 在另一實射，提供-種選擇抗騰蛋白酶降解之狀或多 :(例如，夠之方法，該方法包含提供狀或多肽之庫或 §.曰糸，在適於胰蛋白酶（或包含騰蛋白酶之生物製叫、提 取物或組織勻衆）蛋白水解分解之條件下使庫或譜“騰 蛋白酶組合，及選擇、分離及/或回收抗騰蛋白酶降解且 131416.doc -73· 200902551 特異性結合TNFR1之肽或多肽。 在特定實施例中，提供一種選擇抗胰蛋白酶降解且特異 性結合TNFR1的免疫球蛋白單一可變區域（dAb)的方法。 在該等實施例中，提供包含dAb之庫或譜系且在適於胰蛋 白酶（或包含胰蛋白酶之生物製劑、提取物或組織勻漿）蛋 白水解分解之條件下使其與胰蛋白酶組合。選擇結合 TNFR1之胰蛋白酶抗性dAb。舉例而言，胰蛋白酶抗性 dAb當在37°C下在0.04%(重量比）胰蛋白酶溶液中培養至少 約2小時之時間時大體上不降解。在一實施例中，騰蛋白 酶抗性dAb當在37t下在0.04〇/〇(重量比）胰蛋白酶溶液中培 養至少約3小時之時間時大體上不降解。在一實施例中， 胰蛋白酶抗性dAb當在37t下在0.04%(重量比）胰蛋白酶溶 液中培養至少約4小時、至少約5小時、至少約6小時、至 少約7小時、至少約8小時、至少約9小時、至少約1〇小 %、至少約11小時或至少約12小時之時間時大體上不降 解。 在一例示性實施例中，提供一種選擇抗胰蛋白酶降解且 特異性結合TNFR1的免疫球蛋白單一可變區域（dAb)的方 法。該方法包含提供包含譜系之噬菌體呈現系統，該等多 肽包含免疫球蛋白單一可變區域，使噬菌體呈現系統與胰 蛋白酶（1 00 pg/ml)組合且將混合物在約37〇c下培養（例如） 隔仪（例如約1 2-1 6小時）’及隨後選擇呈現特異性結合 TNFR1之dAb的嗟菌體。 在另一態樣中’提供一種產生蛋白酶抗性肽或多肽（例 131416.doc •74· 200902551 如，dAb)譜系之方法。 °亥方法包含提供肽或多肽譜系；在 適於蛋白酶活性之條件下 怿件下使肽或多肽譜系與蛋白酶組合； 及回收複數種特異性处人, '、。D TNFR1之肽或多肽；藉此產生 白酶抗性肽或多肽譜季。商 曰系適用於方法中之蛋白酶、呈現系 統、蛋白酶活性之條件芬、登 '、 仏件及選擇肽或多肽之方法係在本文中 相對於其他方法描述。 在一些實施例中，借用台人。^ 使用包含肽或多肽譜系之呈現系統 (例如，使核酸之編碼功能盥 刀月b與由核酸編碼之肽或多肽之功 能特徵相關聯的呈現系統）， } 邊万法進一步包含擴增或 增加編碼複數種所選擇之月夫& 、 伴之肽或多肽之核酸的複本數。核酸 可使用任何合適方法、諸如M a 淆如稭由噬菌體擴增、細胞生長或 聚合酶鍵反應加以擴增。 在特定實施例中，提供一 ^ , 诙供種產生包含抗TNFR1 dAb之蛋 白s#抗性多肽之譜系的方法。_古、土 — a 由該方法包含提供包含dAb之
多狀谱系，在適於蛋白酿f也丨L 曰姆（例如，胰蛋白酶、彈性蛋白 ί 酶、白血球酶）活性之條俥下你斗、々 1朱仵下使肽或多肽譜系與蛋白酶組 合；及回收複數種包含對TNFR1具有結合特異性之心之 多肽。該方法可用於產生未經處理偏㈣想要之 結合特異性之§普糸’諸如基於斟θ 丞於對TNFR1具有結合特異性之 親本dAb的親和力成熟譜系。 多肽呈現系統 在-實施例中，提供用於本文中所述之方法中之狀或多 肽之譜系或庫包含合適呈現系統。呈現系統可抗蛋白酶 (例如，單-蛋白酶或蛋白酶之組合及具有蛋白水解活性 131416.doc 200902551 之任何生物提取物、組織勻漿或製 如，田逢上、、古奮釘、— 表J(例如，痰、黏液（例 :、、一、支氣管黏液）、支氣管肺泡灌洗 液、肺組織句漿、肺提取物、騰腺提取物、胃液、唾液 眼淚及其類似物))降解。在-實施例巾，呈現系統及呈現 糸統與所呈現多肽之間的關聯為至少與譜系之大多數 肽或多肽-樣抗蛋白酶。此使得編碼所選擇之呈現多月太之 核酸易於分離及/或擴增。
在一實例中’可自溶液中或共價或非共價連接於合適表 面（諸如塑膠或玻璃（例如，微量滴定板、多肽陣列，諸如 微陣列））之肽或多肽（例如，dAb)譜系選擇、分離及/或回 收：白酶抗性肽或多肽。舉例而·^，可使用以將各不同庫 成員（例如，獨特肽序列）置放在陣列離散預定位置上之方 式位於表面上之肽陣列。可由其在陣列中之空間位置確定 該陣列中之各庫成員之-致性。可確㈣列中發生（例如） 靶配位體與活性庫成員之間的結合相互作用之位置，從而 基於空間位置鑑別活性成員之序列。（例如參見，美國專 利第 5，143,854號、WO 90/15070及 WO 92/10092。） 在一實施例中，方法採用使核酸之編碼功能與由核酸編 碼之多肽之物理、化學及/或功能特徵相關聯之呈現系 統。該呈現系統可包含複數種可複製基因組，諸如噬菌體 或細胞（細菌）。在一實施例中，呈現系統包含庫，諸如嗟 菌體呈現庫。 已描述許多合適噬菌體呈現系統（例如，單價呈現及多 價呈現系統）。（例如參見，Griffiths等人，美國專利第 131416.doc •76- 200902551 6,555，3 13 B1號（以引用之方式併入本文中）；Johnson等 人，美國專利第5,733,743號（以引用之方式併入本文中）； McCafferty等人，美國專利第5,969，108號（以引用之方式併 入本文中）；Mulligan-Kehoe,美國專利第5,702,892號（以 引用之方式併入本文中）；Winter, G.等人，.及ev. Immunol. 12:433-455 (1994) ; Soumillion, P. ^ A » Appl. Biochem. Biotechnol. 47(2-3): 175-189 (1994) ； Castagnoli, L·專尺，Comb. Chem. High Throughput Screen, 4、2)·, \2Y- 133 (2001)。）呈現於噬菌體呈現系統中之肽或多肽可呈現 於任何合適噬菌體上，諸如絲狀噬菌體（例如，fd、M1 3、 F1)、裂解性噬菌體（例如，T4、T7、λ)或RNA噬菌體（例 如，MS2)。 通常產生或提供以與合適噬菌體外殼蛋白（例如，fd ρΠΙ 蛋白）形成之融合蛋白形式呈現肽或噬菌體多肽譜系之噬 菌體庫。融合蛋白可在噬菌體外殼蛋白之尖端或必要時在 内部位置呈現肽或多肽。舉例而言，所呈現之肽或多肽可 存在於Pm之區域丨之胺基未端位置。（pm之區域i亦稱為 N1。）所呈現之多肽可與pIII直接融合（例如，ρπι之區域丄 之N-末端）或使用連接子與^^融合。必要時，融合物可進 一步包含標籤（例如，myc抗原決定基、ms標籤）。可使用 任何合適方法產纟包含以與菌體外殼蛋㈣成之融合蛋 白形式呈現之肽或多肽譜系之庫’該等方法諸如藉由將編 碼所呈現之肽或多肽之嗤菌體載體或嗟質體⑽吻，載 體庫引入合適宿主細菌中’且培養所得細菌以產生嗟菌體 131416.doc -77- 200902551 (例如，必要時使用合適輔助噬菌體或互補質體）。可使用 諸如沈殿及離心之任何合適方法自培養物中回收噬菌體 庫。 呈現系統可包含含有任何想要之量之多樣性的肽或多狀 譜系。舉例而言’譜系可含有胺基酸序列對應於由生物 體、生物體群（例如，自駱駝類分離之vhh dAb序列之譜 系）、想要之組織或想要之細胞類型表現之天然存在之多 月太的狀或多狀或可含有具有隨機或隨機化之胺基酸序列之 狀或多狀。必要時’多肽可共享共同核心或骨架。該譜系 或遠庫中之多狀可包含具有隨機或隨機化之胺基酸序列之 規定區及常見胺基酸序列區。在某些實施例中，譜系中之 所有或大體上所有多肽具有想要之類型，諸如想要之酶 (例如，聚合酶）或想要之抗體之抗原結合片段（例如，人類 vH或人類vL)。在實施例中，多肽呈現系統包含多肽譜 系’其中各多肽包含抗體可變區域。舉例而言，譜系中之 各多狀可含有VH、VL或Fv(例如，單鏈Fv)。 ^吏用任何合適方法將胺基酸序列多樣性引人肽或多肽 或二木之任何想要之區中。舉例而言，可藉由使用任何合 :广1誘發方法(例如’低保真度PCR、募核苷酸介導之突 又誘2或弋位突變誘發，使用NNK密碼子多樣化）或任何 —I方法製備編碼多樣性多肽之核酸庫將胺基酸序列 多樣性弓丨人s 。 苹巴區、諸如抗體可變區域或疏水性區域之互補 判定區中0 ν面士 必要時’可隨機化待要使多樣化之多肽之區。 構成譜系> & '、多肽之尺寸基本上為一個需要選擇之問題， I31416.doc -78- 200902551 且不需要均—的多肽尺寸。在—實施例中，譜系中之多肽 具有至少三級結構（形成至少一個區域）。 選擇/分離/回收 ρ可使用任何合適方法自譜系或庫(例如，於呈現系統中) 選擇刀離及/或回收蛋白酶抗性肽或多肽（例如，蛋白酶 抗性多肽群體）。纟-實施例中，I於可選擇之特徵(例 如，物理特徵、化學特性、功能特徵)選擇或分離蛋白酶 抗）生夕肽。合適之可選擇之功能特徵包括譜系中之肽或多 肽之生物活性，例如與一般配位體（例如，超抗原）之結 合、與靶配位體（例如，抗原、抗原決定基、受質）之結 合、與抗體之結合(例如，、經由肽或多肽上所表現之抗原 决疋基），及催化活性。（例如參見，T〇mHns〇n等人，W〇 99/20749、WO 〇1/57〇65、w〇 99/58655。）在—實施例 中’選擇係基於特異性結合TNFR1。纟另―實施例中，選 擇係基於所選擇之功能特徵以產生成員具有蛋白酶抗性之 第—瑨系，接著自該第二譜系中選擇特異性結合TNFR1之 成員。 在二貝施例中，自大體上所有蛋白酶抗性肽或多肽共 享常見之可選擇之特徵的肽或多肽之庫或譜系選擇及/或 分離蛋白酶抗性肽或多肽。舉例而言，蛋白酶抗性肽或多 肽可選自大體上所有蛋白酶抗性肽或多肽結合常見一般配 位體、結合f見乾配位體、結合常見抗體（或由常見抗體 結合）或具有常見催化活性之庫或譜系。該類型之選擇尤 其適用於製備基於具有想要之生物活性的親本肽或多狀蛋 131416.doc •79· 200902551 白酶抗性肽或多肽譜系 予例如執仃免疫球蛋白單一可變 區域之親和力成熟化作用時。
基於與常見'般彳fr ϋ A ^ I配位體之結合選擇可產生含有所有或大 、 飞。曰糸之組分之蛋白酶抗性肽或多肽之 肽或多狀集合或群體。徵备丨^ +例而δ，可藉由淘選或使用合適 親和力基質選擇、公雜Β 77離及/或回收結合靶配位體或諸如蛋 白質Α、蛋白習An 之或一叙配位體或抗體之肽或多肽。可 藉由向合適容器（例如， °式S 、皮氏培養皿）中添加配位體 ⑽如’-般配位體1配位體）之溶液且使配位體變得沈 積或土佈於^壁上來實現淘選。可洗除過量配位體且可 向容器中添加肽或多肽(例如，已與蛋白酶-起培養之譜 糸）且將容器維持在適於肽或多肽結合固定配位體之條件 下可洗除未、、.σ合肽或多肽且可使用諸如刮削或（例如）降 低pH值之任何合適方法回收結合肽或多狀。 σ :^配位體親和力基質通常含有配位體共價或非共價連 接之固體支撐物或珠粒(例如’瓊脂糖)。可使用分批法、 ? 或^何”他合適方法在適於使肽或多肽與基質上之 配位體結合的條件下使親和力基質與肽或多肽（例如，已 與蛋白酶一起培養之古並 ^ t 〇日糸）組合。可洗除未結合親和力基 貝之肽或夕肽’且可使用任何合適方法溶離及回收結合肽 或多肽’該合適方法諸如用較低阳值之緩衝液、用溫和變 性劑(例如’ |素)或用競爭以與配位體結合之肽進行溶 離在_例中，在適於譜系中之肽或多肽結合輕配位體 (R1)之條件下使生物素標記靶配位體與譜系組合。使 131416.doc 200902551 用固定抗生物夸i a々> “士人 蛋白鍵菌素（例如，在珠粒上） 回收、’，Q合狀或多狀。 在：些實施例中’ 一般配位體為抗體或其抗原結合片 又。u在庫或譜系之肽或多肽中大體上為保守的狀或多 肽之結構特徵之抗體或抗原結合片段尤其適合作為一般配 位體。適合用作分離、選擇及/或回收蛋白酶抗性肽或多
肽之配位體之抗體及抗原結合片段可為單株或多株，且可 使用任何合適方法製備。 庫/譜系 :其他態樣中，提供蛋白酶抗性肽及多肽譜系，編碼蛋 白酶抗性肽及多肽之庫及產生該等庫及譜系之方法。 可使用任何合適方法製備或獲得編碼及/或含有蛋白酶 抗性肽及多肽之庫。該庫可基於所關注之肽或多肽(例 如，選自庫之抗TNFRi肽或多肽）經設計以編碼蛋白酶抗 性肽或多肽’或可使用本文中所述之方法 例而言，可使用合適之多肽呈現系統製備 多肽之庫。 域自另一庫。舉 富集蛋白酶抗性 在一實例中，如本文中所述，在適於蛋白酶活性條件下 使包含呈現多肽（包含免疫球蛋白單一可變區域（例如 vH、v«、νλ))之譜系的嗤菌體呈現庫與蛋白酶組入 、、、己。基於 想要之生物活性’諸如結合活性（例如，纟J;·八— '''σ σ —般配位 體、結合靶配位體）回收蛋白酶抗性多肽，從 攸句產生富集 蛋白if：抗性多狀之喔菌體呈現庫。在一實施你丨ψ ^ 扪Τ，回收係 基於結合一般配位體以產生富集庫’接著基於特異性纟士人 131416.doc -81- 200902551 TNFR1選擇該庫之抗TNFR1成員。 在另-實例中，首先_選 白單-可變區域(例如，Vh、v、二夕肽(包含免疫球蛋 κ λ))之谱系的喔菌體呈 現庫以鑑別譜系中對相耍之釦ρ κ , 主 m ^原（™fri)具有結合特里 性之成員。回收具有想要之结厶 寸’、 文<、口 〇将異性之多肽隼人，曰丄 本文中所述’在適於蛋白水解活性之條件下使集合與蛋白0 S#組合。回收具有想要之革巴杜人姓s u 年°σ特異性之蛋白酶抗性多肽
集合’從而產生富集蛋白酶抗性 丨五呵親和力多肽之庫。如 本文在一實施例中所述，該選擇 千刀次Τ之蛋白酶抗性與高 親和力結合相關。 可使用任何合適方法容易地產生編碼想要類型之多肽譜 系之庫I例而s，可獲得編碼想要類型之多狀（例如， 聚合酶、免疫球蛋白可變區域)之核酸序列，且可(例如)藉 由使用易於出錯之聚合酶鏈反應（PCR)系統擴增核酸、藉 由化學突變誘發（Deng等人，乂胸cw, 269:9533 (1994)a) 或使用細菌突變菌株(Low等人，J财氣，260⑽ (1996))製備各含有一或多個突變之核酸集合。 在其他實施例中，可靶向核酸之特定區以供多樣化。使 所選位置產生突變之方法亦為此項技術所熟知且包括（例 如）在使用或不使用PCR之情況下使用錯配寡核苷酸或簡併 寡核苦酸。舉例而言’已藉由使突變乾向抗原結合環建立 合成抗體庫。已將隨機或半隨機抗體H3及L3區附加至生 殖系免疫球蛋白V基因片段以產生具有未突變構架區之大 庫（H〇〇genb〇om及 Winter (1992)同上；Nissim等人，〇994) 131416.doc -82· 200902551 同上；Griffiths等人，（1994)同上；DeKruif等人，（1995) 同上）。已擴展該多樣化以包括部分或所有其他抗原結合 環（Crameri 等人，（1996) iVaiwe Med.，2:100 ; Riechmann 等人，（1995) 13:475 ; Morphosys，WO 97/08320，
同上）。在其他實施例中，可例如由採用第一 PCR產物作為 ”大引子（mega-primer)"之兩步PCR策略革巴向核酸之特定區 以供多樣化。（例如參見，Landt，0_等人，Gene 96·· 125- 128 (1 990)。）亦可（例如）由SOE PCR實現靶向多樣化。（例如參 見，Horton, R.M.等人，77:61-68 (1989)。） 所選擇位置處之序列多樣性可藉由改變指定多肽序列之 編碼序列以便可在該位置併入許多可能的胺基酸（例如， 所有20種或其子集）來實現。使用IUPAC命名法，最通用密 碼子為NNK，其可編碼所有胺基酸以及TAG終止密碼子。 可使用NNK密碼子以引入所需之多樣性。亦使用實現相同 終端之其他密碼子，包括NNN密碼子，其使得產生其他終 止密碼子TGA及TAA。該靶向方法可使完全序列空間處於 待探索之靶區域内。 該等庫可包含具有已知主鏈構形之蛋白酶抗性抗體多 肽。（例如參見 ’ Tomlinson等人 ’ WO 99/20749。） 庫可在合適質體或載體中製備。如本文中所使用 ' ，裁體 係指用於將異源DNA引入細胞中以用於其表現及/气複製 之離散元件。可使用任何合適載體，包括質體（例如，系 菌質體）、病毒或噬菌體載體、人造染色體及游離型 體。可使用該等載體進行簡單的選殖及突變綉發，或可使 131416.doc -83- 200902551 用表現載體驅動座矣招 殖位點（例如载體及質體通常含有―或多個選 物基因。表現載體可進—牛人右^/個可選擇標記 件，諸如增強子元件、啟動夕狀轉錄及轉譯之元 及其類似物。該等元件=轉錄終止信號、信號序列 選殖插入物以致二:， ⑷士 +人田5亥表現載體維持在適於表現之侔件下 (例如，在合適宿主 κ条仵下 列。 胞中)時表現且產生多肽的方式排 :殖及表現载體通常含有使得載體 所選擇之宿主細胞中之核酸序列。在選殖載體中，^ 通常為使得载體能夠獨立於宿主染色體dna複製之序亥= 包括複製起點或自發複製序 卷^種細g '酵母及病 於大：。吾人所熟知。質體PBR322之複製起點適 於大夕數革蘭氏陰性菌（Gram_negative ，2微米質 ^起點較酵母’且多種病毒起點（例如，sv4〇、腺病毒） j ^ °哺乳動物表現載體通 ,不需要複製起點’除非該等表現載體用於能夠複製高級 DNA之哺礼動物細胞（諸如c〇s細胞）中。 選殖或表現載體可含有亦稱為可選擇標記物之選擇基 因。該等標記物基因編碼為在選擇性培養基中生長之轉型 宿主細胞之存活或生長所需的蛋白質。因此，未經含有選 擇基因之載體轉型之宿主細胞在培養基中將不能存活。典 型選擇基因編碼帶有抗生素及其他毒素（例如，胺节西林 (ampiciInn)、新黴素、甲胺喋呤或四環素）抗性、互補營 I31416.doc -84- 200902551 養缺陷不足或不可在生長培養基中供應關鍵營養物之蛋 質。 合適表現載體可含有許多組分，例如複製起點、可選擇 標記物基因、一或多個表現控制元件（諸如轉錄控制元件 (例如，啟動子、強化子、終止子))及/或一或多個轉譯信 號、信號序列或前導序列及其類似物。表現控制元件及信 號或前導序列存在時可由載體或其他來源提供。舉例而 吕，可使用編碼抗體鏈之選殖核酸之轉錄及/或轉譯控制 序列引導表現。 可提供啟動子以表現於想要之宿主細胞中。啟動子可為 組成性或可誘導性啟動子。舉例而言，啟動子可可操作性 連接於編碼抗體、抗體鏈或其部分之核酸，如此其引導核 酸轉錄。可利用多種合適啟動子，對於原核宿主（例如， 對於大腸杯菌（E. c〇ii)為β_内醯胺酶及乳糖啟動子系統、 驗性鱗酸酶、色胺酸（trp)啟動子系統、lac、加、τ3、Τ7 啟動子）及對於真核宿主（例如，猿猴病毒4〇早期或晚期啟 子勞氏肉瘤病f (Rous sarcoma virus)長末端重複序列 啟動子 '細胞巨大病毒啟動子、腺病毒晚期啟動子、抓 1 a啟動子）。 另外’表現载體通常包含選擇運載載體之宿主細胞之可 選擇標記物’且在可複製表現載體之狀況下，包含複製起 ,點編碼帶有抗生素或藥物抗性之產物之基因為常見之可 k擇‘。己物且可用於原核細胞（例如，卜内醯胺酶基因（胺 苄西林抗性）、Tet基因（四環素抗性））及真核細胞（例如，新 131416.doc -85- 200902551 黴素（G4 1 8或遺傳徽素）、gpt(麥考酚酸）、胺苄西林或潮黴 素抗性基因）中。二氫葉酸還原酶標記物基因准許在多種 宿主中用曱胺喋呤選擇。編碼宿主之營養缺陷標記物之基 因產物的基因（例如，LEU2、URA3、HIS3)通常用作酵母 中之可選擇標記物。亦涵蓋使用病毒（例如，桿狀病毒）或 噬菌體載體及能夠整合於宿主細胞基因組中之載體，諸如 反轉錄病毒載體。
適於表現於原核細胞（例如，細菌細胞，諸如大腸桿菌） 或哺乳動物細胞中之表現載體包括（例如）pET載體（例如， pET-12a、pET-36、pET-37、pET-39、pET-40、Novagen及其他）、 噬菌體載體（例如，pCANTAB 5 E ’ Pharmacia)、pRIT2T(蛋白 質 A 融合載體，Pharmacia)、pCDM8、pCDNAl.l/amp、 pcDNA3.1 ' pRc/RSV ' pEF-l(Invitrogen, Carlsbad, CA) ' pCMV-SCRIPT、pFB、pSG5、pXTl(Stratagene，La Jolla，CA)、 pCDEF3(Goldman，L.A.等人，Biotechniques，27:1013-1015 (1996))、pSVSPORT(GibcoBRL，Rockville, MD)、pEF-Bos (Mizushima，S.等人，Nucleic Acids Res.，18:5322 (1990)) 及其類似物。可利用適於用於多種表現宿主中之表現載 體，該等宿主諸如原核細胞（大腸桿菌）、昆蟲細胞（果蠅史 奈德 S2 細胞（Drosop/nVa Schnieder S2 cells)、Sf9)、酵母 (嗜甲醇酵母（户· mei/ztmo/ica)、馬斯德畢赤酵母（P. pasionX)、 釀酒酵母（》S. cereWhae))及哺乳動物細胞（例如，COS細 胞）。 載體之實例為使得能夠表現對應於多肽庫成員之核苷酸 131416.doc -86- 200902551 序列之表現載體。因此，可藉由使表現多肽庫成貢之單-純系獨立繁瘦及表現執行用—般及/絲配位體進行之選 擇。如上所述，選擇呈現系統可為㈣體呈現。因此，可 使用嗤菌體或嗔質體載體。例示性載體為具有大腸桿菌複 製起點（用於雙鏈複製）以及嗤菌體複製起點（用於產生單鍵 DNA)之嗟質體載體。該等載體之操作及表現在此項技術 中為熟知的（H〇ogenb〇〇m 及 Winter 〇992)同上；Nissim 等 人’（1994)同上）。簡言之，載體可含有賦予嗟質體選擇性 之卜内醯胺酶基因及在表現卡£上游可含有合適前導序 列、多個選殖位點、一或多個肽標籤、—或多個tag終止 =碼子及嗟菌體蛋白質_之心啟動子。因此，使用大腸 桿菌之多種抑制因子及非抑制因子菌株且添加葡萄糖、異 丙基硫基仰-半乳糖利PTG)或輔助嘆菌體，諸如vcs μ n， 該載體能夠以質體形式複製而不表現，來產生大量僅多狀 庫成員或產物噬菌體中一些在其表面上含有至少一個 多肽-pill融合物複本。 本文中所述之庫及譜系可含有抗體格式。舉例而言，庫 及4系中所含之多肽可為整個獨立的VH4VL區域，其任一 係經修飾或未經修飾。可使用任何合適方法容易地產生 scFv片段以及其他抗體多肽。此項技術中熟知許多合適抗 體工程化方法。舉例而纟，scFv可藉由使編碼兩個可變區 域之核酸與編碼適當連接子肽（諸如（Gly_Gly_Giy_Giy_ 、）3或其他合適連接子肽）之合適寡核苷酸相連接而形 成。連接子橋接第一 Vgc_末端與第二乂區沭末端。可使 131416.doc •87· 200902551 用構造諸如Fv、Fab及F(ab，)2片段之其他抗體格式之類似 技術。為編排格式Fab及F(ab，)2片段，可使^及^多肽與 可自重排基因、生殖系c基因分離或由抗體序列資料合成 之恆定區片段組合。本文中所述之庫或譜系可為％或火庫 或譜系。 包含蛋白酶抗性可變區域之多肽可包含靶配位體 (TNFR1)結合位點及—般配位體結合位點。在某些實施例 、'.、 中，一般配位體結合位點為諸如蛋白質A、蛋白質l或蛋 \ 白質G之超抗原之結合位點。可變區域可基於任何想要之 可變區域’例如人類Vh(例如，vH la、Vh lb、vH 2、v
ΙΊ v H 3、VH 4、VH 5、Vh 6)、人類 νλ(例如，n、、 νχιπ、νλιν、νλν、νλνι 或 VK1)或人類 VK(例如，νκ2、
Vk3、VK4、VK5、VK6、VK7、Vk8、νκ9 或 Vk1〇)或視情況經 人化之駱駝類VHH。 產生蛋白酶抗性多肽之核酸、宿主細胞及方法 (』 本發明係關於編碼（例如）由本文中所述之方法可選擇戈 選擇之蛋白酶抗性肽或多肽的經分離及/或重組核酸。 本文中稱為”經分離”之核酸為已其原始環境中（例如，細 胞中或諸如庫之核酸混合物中）之其他物質（例如，其他核 酸’諸如基因組DNA、cDNA及/或RNA)遠遠分離之核酸。 經分離核酸可以載體（例如，質體）之部分形式分離。 本文中稱為”重組”之核酸為已由重組DNA方法產生之核 酸’ s亥等方法包括依賴於諸如使用（例如）限制酶、同源重 組、病毒及其類似物選殖於载體或染色體中之人工重組之 131416.doc •88· 200902551 方法’及使用聚合酶鏈反應（PCR)製得之核酸。 本發明亦係關於重組宿主細胞，其包含（一或多個）包含 編碼蛋白酶抗性肽或多肽、例如由本文中所述之方法可選 ，或選擇之肽或多肽之核酸的重組核酸或表現構築體。亦 提供製造蛋白酶抗性肽或多肽之方法，其包含將本發明之 重組宿主細胞維持在適於表現蛋白酶抗性肽或多肽之條件
下1方法必要時可進-步包含分離或回收蛋白酶抗性狀 或多肽之步驟。 舉例而言，可使用任何適合於所選擇之宿主細胞之方法 (例如，轉型、轉染、電穿孔、感染)’將編碼蛋白酶抗性 肽或多肽之核酸分子(亦即，一或多個核酸分子)或包含該 核酸分子之表現構築體（亦即，—或多個構築幻引入 °4宿主細胞中以建立重組宿主細胞’如此核酸分子可操 作性連接於—或多個表現控制元件（例如，於載體中、於 =諸多方法在細胞中產生之構築體中、整合於宿主細胞基 中）可將所诗重組宿主細胞維持在適於表現（例如， =誘導物存在下、在合適動物中、在補充有適當鹽、生長 因子、抗生素、營養增補㈣之合適培養基中）之條件 :，藉此產生經編碼之肽或多肽。必要時，可分離或回收 自動物、伯主細胞、培養基、乳汁中）經編碼之肽
戏多狀。該方法Q 嚴表現於轉殖基因動物之宿主細胞中 (例如參見’W0 9勒9l8，Genph霞Int咖觸D。 亦可在合適活體外类 表見糸統中由化學合成或任何其他合 適方法產生由本文中撕、+、 中所远之方法選擇之蛋白酶抗性肽或多 I314l6.doc •89· 200902551 肽。因此，本發明提供蛋白酶抗性狀及多狀 多肽、dAb及拮抗劑
如本文中所描述及例示，本發明之蛋白酶抗性dAb通常 以高親和力結合其乾配位體。因此，在另一態樣中，提供 選擇、分離及/或回收以高親和力結合TNFR1之本發明之 多肽或dAb的方法。該方法通常包含提供肽或多肽（例如， dAb)之庫或譜系，在適於蛋白酶（例如，胰蛋白酶、彈性 蛋白酶、白企球酶、胰酶、痰）活性之條件下使該庫或該 譜系與蛋白酶組合，及選擇、分離及，或回收結合配位體 (例如’瓣體)之肽或多肽。因為庫或譜系已在蛋白酶 敏感肽或多肽將會分解之條件下暴露於蛋白酶中，所以蛋 白酶之活性可消除具㈣結合親和力之不太穩定的多狀， 且從而產生高親和力結合肽或多肽之集合。舉例而言，本 發明之多肽或dAb可以i μΜ或更強或約5〇〇 nM至約〇5 Μ 之親和力(kd ;如由表面電聚共振所測定KM。··、(㈣) 結合TN而。舉例而言，本發明之多肽或⑽可以約· nM、約⑽nM、約1()碰、約i nM、約$⑼pM、約⑽ PM、約10 pM、約i pM或約〇5 _之親和力結合。 雖然吾人不受任何特定理論限制，但咸信，抗蛋白酶之狀 及多肽具有較低熵及/或較高穩定能。因&，蛋白酶抗性 與高親和力結合之間的相關性可能與由本文中所述之方法 所選擇之肽及及多肽及dAb之表面緊密性及穩定性相關。 在一實施例中，本發明之多肽、⑽或拮抗劑以約5〇〇 nM至50pM、或1〇“職5〇_、或1〇禮至⑽州、或 131416.doc •90· 200902551 1 nM至100 PM，例如50 nM或以下、或5 nM或以下、或 500 pM或以下、或200 pM或以下、或1〇〇 pM或以下之抑 制濃度50(IC50)抑制TNF α與TNF a受體I(p55受體）之結 合。 在某些實施例中’多肽、dAb或拮抗劑以如由表面電漿 共振所測定300 nM至1 pM、或300 nM至5 pM、或50 nM至 1 pM、或 50 nM至 5 pM、或 50 nM至 20 pM、或約 1〇 pM、
或約1 5 pM、或約2〇 pM之解離常數（kd)特異性結合 TNFR1 ’例如人類TNFR1且與人類TNFR1解離。在某些實 施例中，多肽、dAb或拮抗劑以如由表面電漿共振所測定 5M0 s 至 1χ1〇·7 s·丨、或 lxl(T3 s’1 至 ixi〇·7 s-丨、或 lxl〇-4 S 1至 lxl〇-7 S·1、或 lxl〇-5 S-1至 lxl〇-7 S-1、或 ΐχΐ〇_4 〆、或 1 χίο s 1之Κ。^速率常數特異性結合tnfri，例如人類 TNFR1 ’且與人類丁邪以解離。在某些實施例中，多肽、 dAb 或拮抗劑以 ΐχ10-3 μ·丨 s'〗至 lxl〇-7 、或 1χ1〇.3 μ、-】 至 lxio-6 Μ··，、或約 lxl0-4 M-V1、或約 1χ1〇·5μ.丨之 Kon特異性結合TNFR1，例如人類TNFRh在一實施例 中，多肽、dAb或拮抗劑以如該段落中所詳細說明之解離 常數（kd)及Koff特異性結合TNFR1，例如人類TNFR1，且 與人類TNFIU解離。在-實施例中，多肽、心或結抗劑 以如該段落中所詳細說明之解離常數（Kd)及I。特異性結 合TNFR1 ’例如人類TNFR1，且與人類tnfri解離。在一 些實施例中，多肽或dAb以如該段落中所述之尺〇及/或κ。打 及/或κοη特異性結合TNFR1(例如，人類tnfri)，且包2 131416.doc •91 · 200902551 與DOMlh-l 31-206之胺基酸序列（展示於圖3中）至少或至小 約 80〇/〇、85%、90〇/。、91〇/〇、92%、93〇/〇、94〇/〇、95%^ 96%、97%、98%或99%—致之胺基酸序列。
可將多肽、dAb或拮抗劑表現於大腸桿菌或畢赤酵母物 種（例如，馬斯德畢赤酵母）中。在一實施例中，當表現於 大腸桿菌或畢赤酵母物種（例如，馬斯德畢赤酵母）中時， 分泌至少約0.5 mg/L之量之配位體或dAb單體。雖然當表 現於大腸桿菌或畢赤酵母物種（例如，馬斯德畢赤酵母）中 時，可分泌本文中所述之配位體及dAb單體，但其可使用 任何合適方法產生，諸如合成化學方法或不採用大腸桿菌 或畢赤酵母物種之生物產生方法。 在—些實施例中’多肽、dAb或拮抗劑不包含駱駝類免 疫求蛋白可邊區域或一或多個僅為駱駝類生殖系抗體基因 片段所編碼之免疫球蛋白可變區域所特有之構架胺基酸， 例如在位置108、37、44、45及/或47處。 本發明之TNFR1之拮抗劑可為單價或多價拮抗劑。在一 -實&例中，拮抗劑為單價且含有一個與1相互作用 ::合位點，該結合位點由本發明之多肽或dAb提供。單 抗劑合一個TNFR1且可能不會誘導可引起受體活化 及仏號轉導之細胞表面上之TNFR1的交聯或叢集。 在其他實施例中，TNFR1之括抗劑為多價枯抗劑。 TNFR1之客押4士 _ 入 貝才口抗蜊可έ有兩個或兩個以上特定TNFR1結 口 4點複本或含有兩個或兩個以上結合TNFR1之不同結合 X等結合位點中之至少一個由本發明之多肽或dAb 131416.doc *92- 200902551 提供。舉例而言，如本文中所述，TNFR1之拮抗劑可為包 含兩個或兩個以上結合TNFR1之本發明之特定多肽或dAb 複本或兩個或兩個以上結合TNFR1之本發明之不同多肽或 dAb的二聚體、三聚體或多聚體。在一實施例中，TNFR1 之多價拮抗劑在標準細胞檢定中大體上不會激動 TNFR1(充當TNFR1之激動劑）（亦即，當以1 nM、10 nM、 100 nM、1 μΜ、10 μΜ、100 μΜ、1000 μΜ或 5,000 μΜ之 濃度存在時，在該檢定中產生不超過約5%之由TNFtx(l 00 pg/ml)誘導的TNFR1介導之活性）。 在某些實施例中，TNFR1之多價拮抗劑含有兩個或兩個 以上TNFR1之想要之抗原決定基或區域的結合位點。舉例 而言，TNFR1之多價拮抗劑含有兩個或兩個以上結合 TNFR1之區域1中之相同抗原決定基的結合位點。 在其他實施例中，TNFR1之多價拮抗劑含有兩個或兩個 以上結合TNFR1之不同抗原決定基或區域的由本發明之多 肽或dAb提供的結合位點。在一實施例中，在如 W02006038027中所述之標準L929細胞毒性檢定或標準 HeLa IL-8檢定中，該等多價拮抗劑當以約1 nM、或約10 nM、或約1 00 nM、或約1 μΜ、或約1 0 μΜ之濃度存在時不 激動TNFR 1。 丁NFR1之其他拮抗劑不抑制TNFoi與TNFR1之結合。因 為該等配位體（及拮抗劑）可用於結合且偵測、定量或量測 樣品中之TNFR1且不會與樣品中之TNF競爭以結合 TNFR 1，所以其可具有診斷劑之效用。因此，可進行樣品 131416.doc •93· 200902551 中是否存在TNFR1或存在多少TNFR1之精確測定。
在其他實施例中，多肽、dAb或拮抗劑以本文中所述之 kd特異性結合TNFR1且在標準小鼠Lps/D_半乳糖胺誘發之 敗血性休克模型中抑制死亡（亦即，阻止死亡或與合適對 照相比，使死亡減少至少約1〇%)。在一實施例中，當投與 約5 mg/kg或以上，例如約！ mg/kg時，與標準小鼠Lps/D_ 半乳糖胺誘發之敗血性休克模型中之合適對照相比，多 肽、dAb或拮抗劑抑制死亡至少約25%或至少約5〇%。 在其他實施例中，多肽、dAb或拮抗劑結合TNFR1且在 標準細胞檢定中以<100 nMiNDw拮抗TNFR1之活性’且 在該檢定中，在S10 μΜ之濃度下，dAb激動TNFR1之活性 €5%。 在特定實施例中，多肽、dAb或拮抗劑在標準細胞檢定 中大體上不激動TNFR1(充當TNFR1激動劑）（亦即，在該檢 疋中，當以 1 nM、1〇 nM、1〇〇 nM、1 μΜ、10 μΜ、100 μΜ、1000 μΜ或5,000 μΜ之濃度存在時，產生不超過約5% 之由TNFa(100 pg/ml)誘導之TNFR1介導之活性）。 在某些實施例中，當在慢性發炎性疾病模型中投與有效 量之本發明之多肽、dAb或拮抗劑時為有效的。有效量通 常為約1 mg/kg至約10 mg/kg(例如，約i mg/kg、約2 mg/kg、約 3 mg/kg、約 4 mg/kg、約 5 mg/kg、約 6 mg/kg、 約 7 mg/kg、約 8 mg/kg、約 9 mg/kg或約 1〇 mg/kg)。熟習此 項技術者認為k性發炎性疾病模型（參見w〇2〇〇6〇38〇27中 所述之模型）可預測在人類中之治療功效。 13l416.doc •94- 200902551
特疋實加例中，多肽、dAb或抬抗劑在標準小鼠膠原 誘發之關節炎模型（關於模型之詳情，失見 则嶋細7胃)中為有μ。舉例而言，μ㈣❹ 比技與有效1之多月大、dAb或结抗劑可使標準小鼠勝原 誘發之關即炎模型中四肢總和之平均關節炎言平分減小（例 如）約1至約16、、約3至約16、約6至約16、約9至約Μ或約 12^約16。在另一實例中，與合適對照相比，投與有效量 之多肽、dAb或拮抗劑可使標準小鼠膠原誘發之關節炎模 型中關節炎症狀之發作延遲（例如）約K、約2天、約3天、 約4天、約5天、約6天、約7天、約1〇天、約叫、約。天 ，約28天。在另—實例巾，投與有效量之多肽、dAb或拮 抗劑可在標準小鼠膠原誘發之關節炎模型中產生q至約3、 約3至約5、約5至約7、約7至約15、約9至約15、約1〇至約 勺1 2至，，々1 5或約1 4至約1 5之四肢總和之平均關節炎評 分。 i J 在其他實施例中，多肽、dAb或拮抗劑在小鼠關節炎 △ARE模型中為有效的（關於模型詳情，參見w〇2刪27)。 f例而言’與合適對照相比，投與有效量之多肽、dAb或 扰抗劑可使小鼠關節炎ΔΑΙΙΕ模型之平均關節炎評分減小 (例如）約（Μ至約2.5、約0.5至約2.5、⑴至約2 5、約〇 5至 約2.5、約丨至約2·5、約1>5至約25或約2至約2 $。在另— 實例中，與合適對照相比，投與有效量之多肽、dAb或拮 抗劑可使小鼠關節炎Δ A R E模型中關節炎症狀之發作延遲 (例如）約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7 】314l6.cJ〇c -95- 200902551 天、約10天、約14天、約21天或約28天。在另—實例中， 才又”有效里之夕肽、dAb或拮抗劑可在小鼠關節炎△八1^^模 型中產生0至約0.5、約〇,5至約i、約i至約丨5、約丨5至約2 或約2至約2.5之平均關節炎評分。 在其他實施例中，多肽、dAb或抬抗劑在小鼠發炎性腸 疾病（IBD)AARE模型中為有效的（關於模型詳情，參見 W02006038027)。舉例而言，與合適對照相比，投與有效 ϊ之多肽、dAb或拮抗劑可使小鼠IBD AARE模型之平均急 性及/或慢性發炎評分減小（例如）約〇1至約2 5、約〇 5至約 2.5、約1至約2.5、約1·5至約2.5或約2至約2.5。在另一實 例中，與合適對照相比，投與有效量之多肽、或拮抗 劑可使小鼠IBD A ARE模型中iBD症狀之發作延遲（例如）約 1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約 1 0天、約1 4天、約2 1天或約28天。在另一實例中，投與有 效量之多肽、dAb或拮抗劑可在小鼠IBD ΔΑΚΕ模型中產生 0至約0.5、約0.5至約1、約1至約丨5、約15至約2或約2至 約2.5之平均急性及/或慢性發炎評分。 在其他實施例中，多肽、dAb或拮抗劑在小鼠葡聚糖硫 酸鈉（DSS)誘發之IBD模型中為有效的（關於模型詳情，參 見W0200603 8 027)。舉例而言，與合適對照相比，投與有 效量之多肽、dAb或拮抗劑可使小鼠丨BD DSS模型中之平 均嚴重程度評分減小（例如）約〇· 1至約2.5、約0.5至約2 5、 約1至約2·5、約1.5至約2.5或約2至約2.5。在另一實例中， 與合適對照相比’投與有效量之多肽、dAb或拮抗劑可使 131416.doc -96- 200902551 小鼠IBD DSS模型中IBD症狀之發作延遲（例如）約1天、約2 天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約1 〇天、約 1 4天、約2 1天或約2 8天。在另一實例中，投與有效量之多 肽、dAb或拮抗劑可在小鼠IBD DSS模型中產生〇至約〇.5、 約0.5至約1、約1至約1.5、約1.5至約2或約2至約2.5之平均 嚴重程度評分。
在特定實施例中’多肽、dAb或拮抗劑在小鼠慢性阻塞 性肺疾病（COPD)煙草煙霧模型中為有效的（關於模型詳 情，參見W02006038027 及W02007049017)。舉例而言， 與合適對照相比’投與有效量之配位體可減少或延遲 COPD症狀之發作。 可利用可用於篩選TNFR1之拮抗劑（例如，配位體、抗 體或其結合蛋白）在預防或治療疾病中之效力的動物模型 系統。此項技術已知關於測試易感小鼠之全身性紅斑狼瘡 (SLE)之方法（Knight 等人，（1978) 五;φ. Μ喊 147: 1653 ;
Reinersten等人，（1978) iVew 五《g. J.她心 299: 515)。藉由 用來自另一物種之可溶性AchR蛋白質誘發疾病在SJL/J雌 I"生小鼠中測δ式重症肌無力（MG)(Lindstrom等人，（1988) 42: 233)。在小鼠之易感品系中藉由注射卩 型膠原誘發關節炎（Stuart等人，（1984) J肌/m纖《〇/., 42: 233)。已描述藉由注射分枝桿菌熱休克蛋白在易感大鼠中 誘發佐劑關節炎之模型（Van Eden等人，（1988) 33 1. 171)。如所述在小鼠中藉由投與甲狀腺球蛋白誘發甲 狀腺炎（Mar0n等人，〇98〇)】細ϋ, 152: ιιΐ5)。胰島 131416.doc -97· 200902551 素依賴性糖尿病（IDDM)天然發生或可在小鼠之某些品系 中誘發，諸如如 Kanasawa等人，（1984) 27: 113中所述之胰島素依賴型糖尿病。小鼠及大鼠中之εαε 充當人類之MS之模型。在該模型中，藉由投與髓鞘鹼性 蛋白誘發脫趙鞘疾病（參見Paterson (1 986) 〇/· 兄 Mischer 等人編，Grune and Stratton， New York，第 179-213 頁；McFarlin等人，（1973) 179. 478，及 Satoh等人 ’（1987) «/· 138: 179)。 本發明配位體（例如，拮抗劑）通常將以純形式與藥理學 上適當之載劑一起使用。該等載劑通常包括水性或醇性/ 水溶液、乳液或懸浮液，任何均包括生理食鹽水及/或緩 衝介質。非經腸媒劑包括氣化鈉溶液、林格氏右旋糖 (Ringer's dextrose)、右旋糖及氣化鈉及乳酸化林格氏液 (lactated Ringeris)。必要時保持多肽複合物呈懸浮狀之合 適的生理學上可接受之佐劑可選自增稠劑，諸如羧甲基纖 維素、聚乙烯°比嘻咬酮、明膠及海藻酸鹽。 靜脈内媒劑包括流體及營養物補充劑及電解質補充劑， 諸如基於林格氏右旋糖之彼等。亦可存在諸如抗菌劑、抗 氧化劑、螯合劑及惰性氣體之防腐劑及其他添加劑（MM (1982) Remington’s以—⑽，第i6版）。可 使用多種合適調配物，包括延緩釋放調配物。 本發明之配位體（例如，拮抗劑）可以單獨投與之組合物 形式使用或與其他藥劑結合使用。該等藥劑可包括多種免 疫療藥4勿肖如％孢素、甲胺嗓呤、阿黴素或順銘及免 131416.doc -98· 200902551 ❹素。醫藥組合物可包括多種細胞毒性劑或其他藥劑與 本發明之配位體或甚至不管在投藥之前是否彙集之具有不 ㈣性的本發明之配位體（諸如使用不同乾抗原或抗原決 定基所選擇之配位體）之組合結合的”混合物，， 本發明之醫藥組合物之投藥途徑可為—般熟習此項技術 者通常已知之任-投藥途徑。對於治療（包括不限於免疫 治療）而言，可根據標準技術向任何患者投與本發明 選擇之配位體。 投藥可藉由任何適當模式’包括非經腸、靜脈内、肌肉 内、腹膜内、經皮、經由肺途徑或亦適當地，藉由用導管 直接輸注。投藥劑量及頻率應視患者之年齡、性別及： 症、其他藥物之並行投與、荦 '丙 他參數而定。如所指示，投;; 樂了為局邛（例如，藉由肺投 杂方向局部向肺傳遞’例如，鼻内投藥方向)或全身性。 j 本發明之配㈣可經隸以便料且在 載劑中復原。已經由習知免疫球蛋白展示該技财 p用技術已知之; 東乾及復原技術。熟習此項技術者 程度之—: 較大之活性損失）且可能必須上調用量來補償。'、有 ::本發明配位體(例如，拮抗劑)或其混合物之 :出於預防性及/或治療性治療目的而投與 應用中，戶斤馮姐4 ^ 二’口療 止、調… 群體足以實現至少部分抑制、抑 5〇 杈死或—些其他可量測參數之量係定義為，,> 131416.doc •99· 200902551 療有效劑罝’’。達成該劑量所需之量應視疾病之嚴重程度 及患者自身免疫系統之一般狀態而定，但通常在每公斤體 重0.005 mg至5.0 mg配位體（例如dAb或拮抗劑）範圍内，其 中更通常使用0.05至2·0毫克/公斤/劑量之劑量。對於預防 性應用而言，亦可以類似或稍低劑量投與含有本發明配位 體或其混合物之組合物以預防、抑制或延遲疾病發作（例 如，維持症狀緩解或靜止期，或阻止急性期）。熟練的臨 床醫師應能夠確定治療、抑止或預防疾病之適當給藥間 隔。當投與TNFR1配位體（例如，拮抗劑）以治療、抑止或 預防k性發炎性疾病時，可以（例如）約丨〇 至約8 〇 mg/kg、約 1〇〇 gg/kg 至約 8〇 mg/kg、約丨 mg/kg 至約 8〇 mg/kg、約 1 mg/kg 至約 7〇 mg/kg、約 1 mg/kg 至約 6〇 mg/kg、約 1 mg/kg 至約 5〇 mg/kg、約 1 mg/kg 至約 4〇 mg/kg、約 i mg/kg 至約 3〇 mg/kg、約 1 叫/“ 至約 2〇 mg/kg 、約 1 mg/kg 至約 10 mg/kg、約 1〇 叫/“ 至約 1〇 mg/kg、約1〇 pg/kg至約5 mg/kg、約1〇叫心至約2 $ mg/kg、約】mg/kg、約 2 mg/kg、約 3 叫心 ' 約 * mg/kg、 約 5 mg/kg、約 6 mg/kg、約 7 mg/kg、約 8 mg/kg、約 9 mg/kg或約1〇 mg/kg之劑量每天投與至多4次、每週兩次、 每週一次、每兩週一次、每月一次或每兩月一次。在特定 實施例中，以約1〇 pg/kg至約1〇 mg/kg(例如，約1〇 Kg/kg、約100畔/kg、約丨mg/kg、約2叫㈣、約3 mg/kg、約 4 mg/kg、約 5 mg/kg、約 6 mg/kg、約 7 mg/kg、 約8 mg/kg、約9爪““或約⑺mg/kg)之劑量每兩週一次或 131416.doc -100- 200902551 ==:位_*’拮抗劑)_、抑止 療之前所存在之-或多個症狀或相對於未經 中之他合適對照物治療之個體（人類或模型動物） τ <違或該等症狀，減少 咖或臨床評定表上之至/狀（例如，減少至少 之至乂—個點），則認為使用本文中所 乾向之°物執仃之治療或療法”有效”。雖然症狀顯然將視 ,4+ 6 欠化但其可由一般熟練的臨床醫師 $ 一巾加以量測。該等症狀可（例如）藉由監測疾病或病症 之或多個生化指標之含量（例如，與疾病、感染細胞數 目寻相關之酶或代謝物之含量）、藉由監測物理表現症狀 ( 發火、腫瘤尺寸等）或藉由公認之臨床評定表量 則該等5f疋表例如為擴展殘疾狀況評分表（叫⑽― DisabUity Status Scale)(對於多發性硬化症）、歐文發炎性 腸疾病量表（Irvine Inflammat〇ry B〇wd Questi_aire)(關 ;腸力此i身性症狀、杜會職能及感情狀態之3 2點評定 。平估生活σο貝.评分在32至224範圍内，其中較高評分指 示較佳生活品質）、類風濕性關節炎生活品質表⑴仙出丫 〇f Life Rheumatoid Arthritis Scale)或如該領域中已知之其他 公認之臨床評定表。至少1〇%或給定臨床表上之一或多個 點之疾病或病症症狀之維持（例如，一天或一天以上或更 長）減少指示”有效π治療。類似地，若相對於未經組合物治 療之類似個體（人類或動物模型）中之一或多個症狀，延 遲、減少或消除§亥或該等症狀之發作或嚴重程度，則使用 131416.doc -101 - 200902551 如本文中所述之組合物所執行之預防”有效"。 含有本發明之配位體（例如，括抗劑）或其混合物之組合 物可在預防性及治療性情形下使用以幫助改變、滅活、殺 死或移除哺乳動物中所選擇之乾細胞群體。另夕卜，可離體 或活體外選擇性使用本文中所述之所選擇之多肽譜系以殺
死排除或自細胞之異源集合有效移除革巴細胞群體。可使 哺乳動物之血液與配位體離體組合，藉此根據標準技術殺 或自’夜移除不想要之細胞從而將企液送回至哺乳動物 中〇 含有本發明之配位體（例如 性及治療性情形下使用以幫助 乳動物中所選擇之靶細胞群體 拮抗劑）之組合物可在預防 改變、滅活、殺死或移除哺
配位體（例如，抗™FR1拮抗劑、dAb單體）可與—或多 種其他治療或活性劑_起投與及/或調配。當配位體（例 dA^)與其他治療劑—起投與時，配位體可在投與其他 樂劑之前、與其同時或在其之後投與。配位體及其他藥劑 通常以提供疊加治療效應之方式投與。 、例中本發明為治療、抑止或預防慢性發炎性 疾病之方法’該方法包含向有需要之哺乳動物投與治療有 效㈣或量之本發明之多肽、d A b或τ N f r ι之棺抗劑。 在實％例中，本發明為治療、抑止或預防關節炎_ 如’類風濕性關節《、幼年型類風濕性關節炎、強直性脊 椎炎、牛皮癬性關節炎)之方法，該方法包含向有需要之 甫礼動物才又與治療有效劑量或量之本發明之多狀、咖或 131416.doc -102- 200902551 TNFR1之拮抗劑。 在另-實施例中，本發明為治療、抑止或預防牛皮癖之 方：，該方法包含向有需要之哺乳動物投與治療有效劑量 或置之本發明之多肽、dAb或TNFR1之拮抗劑。 在另-實施例中’本發明H療、抑止或預防發炎性腸 疾病（例如，克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎）之方法，該方法 匕3向有而要之哺乳動物投與治療有效劑量或量之本發明 之多肽、dAb或TNFR1之拮抗劑。 在另一實施例中，本發明為治療、抑止或預防慢性阻塞 性肺疾病⑷慢性支氣f炎、慢性阻塞性支氣管炎: 肺軋腫)之方法’ t亥方法包含向有需要之哺乳動物投與治 療有效劑量或量之本發明之多肽、_或聊幻之括: 只知例中’本發明為治療、#止或預防肺炎（例 如，細菌性肺炎，諸如葡萄球菌肺炎（Staphy1〇COCCal LJ PneUm°nia))之方法’該方法包含向有需要之哺乳動物投舆 療有效劑量或量之本發明之多肽、咖或了猶1之抬抗
劑。 D *本發明提供治療、抑止或預防除慢性阻塞性肺疾病及肺 火以外之其他肺疾病之方法。根據本發明可治療、抑止或 預防之其他肺疾病包括（例如）囊性纖維化及哮喘⑼如，類 固醇抗性哮喘）。因此’在另-實施例中，本發明為治 療、抑止或預防肺疾病（例如，囊性纖維化、哮喘）之方 法’該方法包含向有需要之哺乳動物投與治療有效劑量或 131416.doc • 103- 200902551 量之切明之多肽、dAb3tTNFRi之拮抗劑。 冑施例中，™FR1之拮抗劑係經由肺傳遞、諸如 二斑：t (例如’支氣管内、鼻内或經口吸入、鼻内滴劑) 技與或藉由全身傳遞（例如，非經腸、靜脈内、肌肉内、 腹膜内、皮下）投與。 、 彳中本發明為治療、抑止或預防敗血性休 =&方法包含向有需要之哺乳動物投與^療有效 Μ置或置之本發明之多肽、dAb或tnfri之拮抗劑。 么月之另癌'樣中’提供-種組合物，其包含本發 明之多肽、dAb或τ咖之拮抗劑及醫藥學上可接受之載 劑、稀釋劑或賦形劑。 此外’本發明提供使用本發明之多月太、⑽或丁職1之 =彳或組合物治療疾病之方法。在—實施例中，該疾病 為癌症或發炎性;东、戌 办丨Λ # 疾病例如類風濕性關節炎、哮喘或克羅 恩氏病。 ''' 格式 半衰期增加可適用於免疫球蛋白、尤其抗體且最尤並小 尺寸抗體片段之活體内應用。該等片段（Fv、雙硫鍵鍵扯 之…ab、scFv、dAb)遭遇自身體内之快速清除；因 此，雖然其能夠快速到達身體之大部分且快速產生且易於 處理，但其活體内應用因其僅短暫之活體内持久性而受到 限制。本發明之一實施例藉由提供活體内半衰期增加因此 在身體内具有持續時間較長之配位體功能活性之 解決該問題。 水 I31416.doc -104- 200902551 熟習此項技術者應熟悉藥物動力學分析及配位體半衰期 之測定之方法。詳情可見於尺e㈣d等人，Chemical
Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists及 Peters % A，Phannacokinetc analysis: A Practical Approach (1996)。亦參考”Pharmacokinetics”，M Gibaldi 及 D Perron, 由 Marcel Dekker 出版，第 2 修訂附加版（Rev. ex editionXBu)， 其描述藥物動力學參數，諸如ta及邙半衰期及曲線下面積 (AUC)。
半衰期（t1/2 a及t1/2 β)及AUC可由配位體之血清濃度對時 間之曲線確定。可使用WinNonlin軟體套件（自Pharsight C〇fp·，Mountain View，CA94040, USA獲得）模擬曲線。在 第一期〇期）中，配位體主要分布於患者中，其中部分消 除。第二期（β期）為末期，此時配位體已分布且血清濃度配 位體隨著自患者中清除配位體而降低。化半衰期為第一期 之半衰，月且ίβ半衰期為第二期之半衰期。因此，在一實施 例中’本發明提供ta半衰期在15分鐘或以上範圍内之配位 體或包含本發明之配位體的組合物。在一實施例中，範圍 之下限為30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、3小時、4小 時' 5小時、6小時、7小時、】M、時、η小時或12小時。 另卜或/、他本發明之配位體或組合物應具有在至多丨2小 時且包括1 2小時節Jfj肉# w ^ 圍内之ta +衣期。在一實施例中，範圍 之上限為 11、1〇、9、8、7 A_+、c, 士 8 7、6或5小時。合適範圍之實例 為1至6小時、2至5小時或3至4小時。 在一實施例中’本發明提供料衰期在2.5小時或以上範 1314J6.doc -105 - 200902551 圍内之之配位體（多肽、dAb或拮抗劑）或包含本發明之配 位體的組合物。在一實施例中，範圍之下限為3小時、4小 時、5小時、6小時、7小時、1〇小時、u小時或12小時。 另外或其他，本發明之配位體或組合物具有在至多21天且 包括21天範圍内之邙半衰期。在一實施例中，範圍之上限 為12小時、24小時、2天、3天、5天、1〇天、15天或2〇
天。在一實施例中，本發明之配位體或組合物應具有12至 60小時範圍内之邙半衰期。在另一實施例中，其應在12至 48小時範圍内。在又一實施例中，其應在12至26小時範圍 内。 除以上標準以外或其他，本發明提供Auc值（曲線下面 積）在1 mg .min/mi或以上範圍内之配位體或包含本發明之 配位體之組合物在一實施例中’範圍之下限為5、1 〇、 15、20、30、1〇〇、200 或 300 mg. min/ml。另外或其他， 本發明之配位體或組合物具有在至多6〇〇 mg . min/ml範圍 内之AUC。在一實施例中，範圍之上限為5〇〇、4〇〇、 300、200、150、1〇〇、75 或 50 mg.min/ml。在一實施例 中’本發明之配位體應具有在選自由以下各範圍組成之群 之 圍内之 AUC : 15 至 150 mg · min/ml、15 至 1〇〇 mg . min/ml、15至 75 mg.min/ml及 15至 50 mg.min/ml。 本發明之多肽及dAb及包含該等多肽及dAb之拮抗劑可 經編排格式以具有較大流體動力學尺寸，例如，藉由連接 PEG基團、血清白蛋白、轉鐵蛋白、轉鐵蛋白受體或至少 其轉鐵蛋白結合部分、抗體Fc區，或藉由接合抗體區域。 1314I6.doc •106- 200902551 舉例而言，多肽、dAb及拮抗劑經編排格式為抗體之較大 抗原結合片段或抗體（例如，經編排格式為Fab、Fab,、 F(ab)2、F(ab，）2、igG、scFv)。 可使用此項技術中熟知之方法測定本發明之配位體（例 如，dAb單體及多聚體）之流體動力學尺寸。舉例而言，可 使用凝膠過濾層析法測定配位體之流體動力學尺寸。諸如 父聯瓊脂糖基質之用於測定配位體之流體動力學尺寸之合 適凝膠過濾基質為吾人所熟知且可容易地獲得。 配位體格式之尺寸（例如，連接於單體之peg部分之 尺寸）可視想要之應用而變化。舉例而言，當配位體意欲 離開循環且進入周邊組織時，希望保持配位體之流體動力 學尺寸較低以有助於自血流外溢。或者，當希望使配位體 保留在體循環中較長時間時，可（例如）藉由編排格式為匕 樣蛋白增加配位體尺寸。 藉由靶向增加活體内半衰期之抗原或抗原決定基延長半衰期 如本文中所述，亦可藉由使本發明之TNFR1結合多肽、 dAb或拮抗劑與結合增加活體内半衰期之抗原或抗原決定 基的結合區域（例如’抗體或抗體片段）接合或締合來增加 配位體之流體動力學尺寸及其血清半衰期。舉例而言，可 使TNFR1結合劑（例如，多肽）與抗血清白蛋白或抗新生兒 Fc受體抗體或抗體片段（例如’抗sA或抗新生兒Fc受體 dAb、Fab、Fab'或scFv)或與抗SA親和體或抗新生兒以受 體親和體或抗SA avimer或抗SA結合區域接合或連接，该 抗S A結合區域包含遠自（但較佳不限於）由以下各物、组成之 131416.doc -107· 200902551 群之骨架：CTLA-4、脂質運載蛋白、spA、親和體、 avimer、GroEl及纖維連接蛋白（參見，2008年2月8日申請 之揭示該等結合區域之PCT/GB2008/00〇453，該等區域及 其序列以引用之方式併入本文中且構成本發明正文之揭示 内容之一部分）。接合物係指包含鍵結（共價或非共價）於結 合血清白蛋白之結合區域的本發明之多肽、dAb或拮抗劑 之組合物。 增加活體内血清半衰期之合適多肽包括（例如）轉鐵蛋白 受體特異性配位體-神經藥劑融合蛋白（參見美國專利第 5,977,307號’其教示内容以引用之方式併入本文中）、腦 毛細血管内皮細胞受體 '轉鐵蛋白、轉鐵蛋白受體（例 如’可溶性轉鐵蛋白受體）、胰島素、胰島素樣生長因子 1(IGF 1)受體、胰島素樣生長因子2(IGF 2)受體、騰島素受 體、血凝因子X、αΐ -抗胰蛋白酶及HNF 1α。増加血清半 衰期之合適多肽亦包括(Χ-1醣蛋白（血清類黏蛋白；AAG)、 α-l抗凝乳蛋白酶（ACT)、α-ΐ微球蛋白（蛋白質HC ; AIM)、抗凝血酶ΠΙ(ΑΤ III)、脫脂蛋白Α·ΐ(Αρ〇 Α_υ、脫 脂蛋白Β(Αρο Β) '血漿銅藍蛋白（cp)、互補組*C3(C3)、 互補組分C4(C4)、Cl酯酶抑制劑（Cl INH)、c-反應蛋白 (CRP)、鐵蛋白（FER)、血液結合素（Ηρχ)、脂蛋白 (a)(Lp(a))、甘露糖結合蛋白（ΜΒΡ)、肌血球素（My〇)、前 白蛋白（曱狀腺素運送蛋白；PAL)、視黃醇結合蛋白（RBp) 及類風濕因子（RF)。 來自細胞外基質之合適蛋白質包括（例如）膠原、層黏連 131416.doc -108· 200902551 蛋白、整合素及纖維連接 蛋白。膠原為細胞外基質之主要 蛋白貝。目前已知約15種類型 貝4'之膠原分子，可見於身體之 ，位’例如】型膠原挪膠原之9〇%)可見於骨、皮 胃腱、動帶、角膜、内臟中或π型膠原可見於軟骨 椎盤、脊索及眼睛玻璃狀液中。
血液之合適蛋白質包括（例如）血漿蛋白（例如，纖維蛋 白、α-2巨球蛋白、血清白蛋白、纖維蛋白原“列如，纖維 蛋白原A、纖維蛋白原Β)、血清殿粉樣蛋白A、结人珠蛋 白、前纖維蛋白(pr〇nnn)、泛素、子宮球蛋白及陶球 蛋白）、酶及酶抑制劑（例如，纖溶酶原、溶自冑、半耽胺 酸蛋白酶抑制劑C(cystatin 〇、α小抗胰蛋白酶及胰腺胰 $白酶抑制劑）、免疫系統蛋白質，諸如免疫球蛋白蛋白 質（例如、IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、免疫球蛋白輕鏈 (κ/λ))、轉運蛋白（例如，視黃醇結合蛋白、^丨微球蛋 白）、防禦素（defensin)(例如，β-防禦素i、嗜中性白血球 防紫素1、嗜中性白血球防禦素2及嗜中性白血球防紫素3) 及其類似物。 / ' 血腦屏障或神經組織中可見之合適蛋白質包括（例如 )t *>> 色素皮質素受體、髓磷脂、抗壞血酸轉運體及其類似物。 增加活體内血清半衰期之合適多肽亦包括位於腎中之蛋 白質（例如’多囊蛋白（polycystin)、IV型膠原、有機陰離 子轉運體K1、海曼氏抗原（Heymann’s antigen))、位於肝中 之蛋白質（例如，乙醇脫氫酶、G250)、位於肺中之蛋白皙 (例如，結合IgA之分泌組分）、位於心臟中之蛋白質（例 131416.doc -109- 200902551 如，與擴張性心肌病相關之HSP 27)、位於皮膚之蛋白質 T如’角蛋白）、骨特異性蛋白質（諸如促進骨生成之蛋白 貝(bmp)，其為顯示成骨活性之蛋白質之轉化生長因增 豕族的子集（例如，BMP-2、BMP-4 ' BMP_5、BMP 6、 BMP-7、BMP,、腫瘤特異性蛋白細如，滋養母細胞 抗原、贺癌平受體（h⑽ptin㈣㈣、雌激素受體、植 織蛋白酶(例如，可見於肝及脾中之組織蛋白酶B))。 合適之疾病特異性蛋白質包括（例如）僅表現於活化口田 胞上之抗原（包括LAG_3(淋巴細胞活化基因））、骨保護素 配位體（OPGL ;參見黯㈣4〇2, π4·9 (Μ"》、 〇X40(TNF受體家族之成員’表現於活化丁細胞上且尤其在 I型人類τ細胞白血病病毒（ΗΤΙΛΜ)產生細胞中上調；參見 165 (1):263_7〇 (2〇〇〇))。合適之疾病特異性蛋白 質亦包括（例如）金屬蛋白酶（metaU〇pr〇tease)(與關節炎八癌 i
J 症相關），包括CG6512果蠅、人類截癱蛋白（paraplegin)、 人類FtsH、人類AFG3L2、鼠類ftsH ;及血管生成生長因 子，包括酸性纖維母細胞生長因子（FGF_1}、鹼性纖維母 細胞生長因子（FGF-2)、血管内皮生長因子/血管滲透因子 (VEGF/VPF)、轉化生長因子_a(TGF α)、腫瘤壞死因子 (TNF-a)、血官生長素（angiogenin)、介白素_3(iL_3)、介白 素-8(IL-8)、血小板源内皮生長因子（Pd_ECGF)、胎盤生長 因子（P1GF)、中期因子血小板源生長因子_BB(pDGF)及弗 拉塔凱。 增加活體内血清半衰期之合適多肽亦包括應力蛋白，諸 131416.doc -110- 200902551 如熱休克蛋白（HSP)。HSP通常在細胞内可見。當其細胞 外了見日ΤΓ ’其為細胞已死亡且溢出其内含物之指示。因外 傷、疾病或損傷，發生該未計劃之細胞死亡（壞死），細胞 外HSP引發免疫系統之反應。與細胞外HSp之結合可使得 使本發明之組合物定位於疾病部位。 涉及Fc轉運之合適蛋白質包括（例如）布蘭貝爾受體 (Brambell receptor)(亦稱為FcRB)。Fc受體具有兩種功能， 兩者均潛在適用於傳遞。該等功能為（1)自母體穿過胎盤轉 運IgG至小孩，（2)保護IgG以免降解，從而延長其血清半 衰期。認為受體使IgG自核内體再循環。（參見，H〇Uiger 專 k，Nat Biotechnol .632-6 [\99Ί、。） 結合血清白蛋白之dAb 在一實施例中’本發明提供一種包含結合TNFR1之抗 TNFRldAb(第一 dAb)及結合血清白蛋白（SA)之第二dAb之 多肽或拮抗劑（例如’雙特異性配位體），該第二dAb以如 由表面電漿共振所測定1 nM至1、2、3、4、5、1 〇、20、 30、40、50、60、70、100、200、300、400 或 500 μΜ(亦 即 ’ xlO·9至 5xl〇-4)或 1〇〇 ηΜ至 10 μΜ、或 1至 5 μΜ、或 3至 70 ηΜ、或1〇 ηΜ至1、2、3、4或5 μΜ之KD結合SA。舉例 而言’如由表面電漿共振所測定30至70 nM。在一實施例 中’第一 dAb(或dAb單體）以如由表面血漿共振所測定約
1、50、70、1〇〇、150、2〇〇、3 00 nM或 1、2 或 3 μΜ之 KD 結合SA(例如，HSA)。在一實施例中，對於包含第一抗sa dAb及第二抗TNFR1 dAb之雙特異性配位體而言，第二 131416.doc -111 - 200902551 dAb對其乾之親和力（例如，如由表面電聚共振、例如使用 BmCore所量測，Kd及/或K〇ff)為第一 dAw+sA之親和力的i 至 looooo倍（例如，100至100_、或1〇〇〇至1〇〇_、或 10000至100000倍）。在一實施例中，血清白蛋白為人類血 清白蛋白(HSA)。舉例而t，第一dAb以約1〇 _之親和力 結合SA，而第二dAb以1〇〇 PM之親和力結合其靶。在一實 施例中，血清白蛋白為人類血清白蛋白（HSA)。在一實施 例中，第一dAb 以約 50 nM，例如 70、1〇〇、150 或 2〇〇 nM 之KD結合SA(例如，HSA)。雙特異性配位體之詳情可見於 W003002609、W004003019及 W004058821 中。 在一實施例中’本發明之配位體可包含以如由所表面電 漿共振測定 1 nM 至 1、2、3、4、5、1〇、20、30、40、 50、60、70、1〇〇、200、300、400或 500 μΜ(亦即，χιό-9 至 5x10 )或 1〇〇 ηΜ至 1〇 μΜ、或 1至 5 μΜ、或3 至 70 nM、 或10 nM至1、2、3、4或5 μΜ之KD結合血清白蛋白（SA)之 dAb。舉例而言，如由表面電漿共振所測定3〇至7〇 nM。 在一實施例中，第一dAb(或dAb單體）以如由表面血漿共振 所測定約 1、50、70、100、150、200、300 nM或 1、2 或 3 μΜ之KD結合SA(例如，HSA)。在一實施例中，第一及第 二dAb由連接子連接，例如1至4個胺基酸或1至3個胺基酸 或超過3個胺基酸或超過4、5、6、7、8、9、1〇、15或20 個胺基酸之連接子。在一實施例中，使用較長連接子（超 過3個胺基酸）增加效價（拮抗劑中之一個或兩個dAb之 KD)。 131416.doc • 112· 200902551 在配位體及拮抗劑之特定實施例中，dAb結合人類血清 白蛋白且與選自由以下各物組成之群之dAb競爭以結合白 蛋白： MSA-16、MSA_26(關於該等序列之揭示内容，參見 W004003019，該等序列及其核酸對應物以引用之方式併 入本文中且構成本發明正文之揭示内容的一部分），
DOM7m-16(SEQ ID NO: 473) ' DOM7m-12(SEQ ID NO: 474)、DOM7m-26(SEQ ID NO: 475)、DOM7r-l(SEQ ID NO: 476)、DOM7r-3(SEQ ID NO: 477)、DOM7r-4(SEQ ID NO: 478)、DOM7r-5(SEQ ID NO: 479)、DOM7r-7(SEQ ID NO: 480) ' DOM7r-8(SEQ ID NO: 481) > DOM7h-2(SEQ ID NO: 482)、DOM7h-3(SEQ ID NO: 483)、DOM7h-4(SEQ ID NO: 484)、D〇M7h-6(SEQ ID NO: 485)、DOM7h-l(SEQ ID NO: 486)、DOM7h-7(SEQ ID NO: 487)、DOM7h-22(SEQ ID NO: 489) > DOM7h-23(SEQ ID NO: 490) ' DOM7h-24(SEQ ID NO: 491)、DOM7h-25(SEQ ID NO: 492)、 DOM7h-26(SEQ ID NO: 493)、DOM7h-21(SEQ ID NO: 494)、DOM7h-27(SEQ ID NO: 495)、DOM7h-8(SEQ ID NO: 496)、DOM7r-13(SEQ ID NO: 497)、DOM7r-14(SEQ ID NO: 498)、DOM7r-15(SEQ ID NO: 499) > DOM7r-16(SEQ ID NO: 500)、DOM7r-17(SEQ ID NO: 501)、 DOM7r-18(SEQ ID NO: 502)、DOM7r-19(SEQ ID NO: 503)、DOM7r-20(SEQ ID NO: 504)、DOM7r-21(SEQ ID NO: 505)、DOM7r-22(SEQ ID NO: 506)、DOM7r-23(SEQ 131416.doc -113 - 200902551
ID NO: 507)、DOM7r-24(SEQ ID NO: 508)、DOM7r-25(SEQ ID NO: 509)、DOM7r_26(SEQ ID NO: 510)、 DOM7r-27(SEQ ID NO: 511)、DOM7r-28(SEQ ID NO: 512)、DOM7r-29(SEQ ID NO: 513)、DOM7r-30(SEQ ID NO: 514)、DOM7r-31(SEQ ID NO: 515)、DOM7r-32(SEQ IDNO:516)、DOM7r-33(SEQIDN〇：517)(關於該等序列 之揭示内容，參見W02007080392，該等序列及其核酸對 應物以引用之方式併入本文中且構成本發明正文之揭示内 容的一部分；該段落中之SEQ ID No為W02007080392中所 出現之SEQ ID No)， dAb8(dAb 10)、dAb 1 0、dAb36、dAb7r20(DOM7r20)、 dAb7r21(DOM7r21)、dAb7r22(DOM7r22)、dAb7r23(DOM7r23)、 dAb7r24(DOM7r24)、dAb7r25(DOM7r25)、dAb7r26(DOM7r26)、 dAb7r27(DOM7r27) > dAb7r28(DOM7r28)、dAb7r29(DOM7r29)、 dAb7r29(DOM7r29)、dAb7r31(DOM7r31)、dAb7r32(DOM7r32) ' dAb7r33(DOM7r33)、dAb7r33(DOM7r33)、dAb7h22(DOM7h22)、 dAb7h23(DOM7h23)、dAb7h24(DOM7h24)、dAb7h25(DOM7h25)、 dAb7h26(DOM7h26)、dAb7h27(DOM7h27)、dAb7h30(DOM7h30)、 dAb7h31(DOM7h31)、dAb2(dAb4、dAb7、dAb41)、dAb4、dAb7、 dAbll、dAbl2(dAb7ml2)、dAbl3(dAb 15)、dAbl5、dAbl6(dAb21、 dAb7ml6) 、dAbl7、dAbl8、dAbl9、dAb21、dAb22、dAb23、 dAb24、dAb25(dAb26、dAb7m26)、dAb27、dAb30(dAb35)、 dAb31、dAb33、dAb34、dAb35、dAb38(dAb54)、dAb41、 dAb46(dAb 47、dAb 52 及 dAb 56)、dAb47、dAb52、dAb53、 131416.doc -114- 200902551 dAb54、dAb55、dAb56、dAb7ml2、dAb7ml6、dAb7m26、 dAb7rl(DOM7rl) 、 dAb7r3(DOM7r3) 、 dAb7r4(DOM7r4)、 dAb7r5(DOM7r5) 、 dAb7r7(DOM7r7) 、 dAb7r8(DOM7r8)、 dAb7rl3(DOM7rl3)、dAb7rl4(DOM7rl4)、dAb7rl5(DOM7rl5)、 dAb7rl6(DOM7rl6)、dAb7rl7(DOM7rl7)、dAb7rl8(DOM7rl8)、 dAb7rl9(DOM7rl9) 、dAb7hl(DOM7hl)、dAb7h2(DOM7h2)、 dAb7h6(DOM7h6) 、dAb7h7(DOM7h7) 、dAb7h8(DOM7h8)、
dAb7h9(DOM7h9)、dAb7hlO(DOM7hlO)、dAb7hll(DOM7hll)、 dAb7hl2(DOM7hl2)、dAb7hl3(DOM7hl3)、dAb7hl4(DOM7hl4)、 dAb7pl(DOM7pl)及dAb7p2(DOM7p2)(關於該等序列之揭示 内容，參見2008年2月8日申請之PCT/GB2008/000453，該 等序列及其核酸對應物以引用之方式併入本文中且構成本 發明正文之揭示内容之一部分）。dAb後之括號中展示替代 名稱，例如dAb8具有替代名稱dAb 1 0，亦即dAb8(dAbl0)。 該等序列亦陳述於圖5 1 a及b中。 在某些實施例中，dAb結合人類血清白蛋白且包含與選 自由以下各物組成之群之dAb的胺基酸序列具有至少約 80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%、或至 少約96%、或至少約97%、或至少約98°/。、或至少約99%之 胺基酸序列一致性的胺基酸序列： MSA-16、MSA-26、
DOM7m-16(SEQ ID NO: 473)、D〇M7m-12(SEQ ID NO: 474)、DOM7m-26(SEQ ID NO: 475)、DOM7r-l(SEQ ID NO: 476)、DOM7r-3(SEQ ID NO: 477)、DOM7r-4(SEQ ID 131416.doc -115- 200902551
NO: 478)、DOM7r-5(SEQ ID NO: 479)、DOM7r-7(SEQ ID NO: 480)、DOM7r-8(SEQ ID NO: 481)、DOM7h-2(SEQ ID NO: 482)、D〇M7h-3(SEQ ID NO: 483)、DOM7h-4(SEQ ID NO: 484) ' DOM7h-6(SEQ ID NO: 485) > DOM7h-l(SEQ ID NO: 486)、DOM7h-7(SEQ ID NO: 487)、DOM7h-22(SEQ ID NO: 489)、DOM7h-23(SEQ ID NO: 490)、DOM7h-24(SEQ ID NO: 491)、DOM7h-25(SEQ ID NO: 492)、 DOM7h-26(SEQ ID NO: 493)、DOM7h-21(SEQ ID NO: 494)、DOM7h-27(SEQ ID NO: 495)、DOM7h-8(SEQ ID NO: 496)、DOM7r-13(SEQ ID NO: 497)、DOM7r-14(SEQ ID NO: 498)、DOM7r-15(SEQ ID NO: 499)、DOM7r-16(SEQ ID NO: 500) ' DOM7r-17(SEQ ID NO: 501) ' DOM7r-18(SEQ ID NO: 502)、DOM7r-19(SEQ ID NO: 503)、 DOM7r-20(SEQ ID NO: 504)、DOM7r-21(SEQ ID NO: 505) ' DOM7r-22(SEQ ID NO: 506)、DOM7r-23(SEQ ID NO: 507)、DOM7r-24(SEQ ID NO: 5Q8)、DOM7r-25(SEQ ID NO: 509) ' DOM7r-26(SEQ ID NO: 510) > DOM7r-27(SEQ ID NO: 511) > DOM7r-28(SEQ ID NO: 512) ' DOM7r-29(SEQ ID NO: 513) ' DOM7r-30(SEQ ID NO: 514) > DOM7r-31(SEQ ID NO: 515) ' DOM7r-32(SEQ ID NO: 516) > DOM7r-33(SEQ ID NO: 5 17)(該段落中之 SEQ ID No 為 W020070803 92 中所出現之 SEQ ID No)， dAb8 、dAb 10、dAb36 、dAb7r20、dAb7r21 、dAb7r22、 dAb7r23、dAb7r24、dAb7r25、dAb7r26、dAb7r27、dAb7r28、 131416.doc -116- 200902551 dAb7r29、dAb7r30、dAb7r31、dAb7r32、dAb7r33、dAb7h21、 dAb7h22、dAb7h23、Ab7h24、Ab7h25、Ab7h26、dAb7h27、 dAb7h30、dAb7h31 、dAb2、dAb4、dAb7、dAbll 、dAbl2、 dAbl3、dAbl5、dAbl6、dAbl7、dAbl8、dAbl9、dAb21、dAb22、 dAb23、dAb24、dAb25、dAb26、dAb27、dAb30、dAb3 卜 dAb33、 dAb34、dAb35、dAb38、dAb41、dAb46、dAb47、dAb52、dAb53、 dAb54 、dAb55 、dAb56 、dAb7ml2 、dAb7ml6 、dAb7m26 、
C ) dAb7rl、dAb7r3、dAb7r4、dAb7r5、dAb7r7、dAb7r8、dAb7rl3、 dAb7rl4、dAb7rl5、dAb7rl6、dAb7rl7、dAb7rl8、dAb7rl9、 dAb7hl、dAb7h2、dAb7h6、dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、 dAb7hlO、dAb7hll、dAb7hl2、dAb7hl3、dAb7hl4、dAb7pl 及 dAb7p2 。 舉例而言，結合人類血清白蛋白之dAb可包含與以下各 物具有至少約90%、或至少約95°/。、或至少約96%、或至 少約97%、或至少約98%、或至少約99%之胺基酸序列一 致性的胺基酸序列：DOM7h-2(SEQID NO:482)、DOM7h-3(SEQ ID NO:483) > DOM7h-4(SEQ ID NO:484) > DOM7h-6(SEQIDNO:485)、DOM7h-l(SEQIDNO:486)、DOM7h-7(SEQIDNO:487)、DOM7h-8(SEQIDNO:496)、DOM7r-13(SEQ ID NO:497)、DOM7r-14(SEQ ID NO:498)、 DOM7h-22(SEQ ID NO:489)、DOM7h-23(SEQ ID NO:490)、 DOM7h-24(SEQ ID NO:491)、DOM7h-25(SEQ ID NO:492)、 DOM7h-26(SEQ ID NO:493) ' DOM7h-21(SEQ ID NO:494)、 DOM7h-27(SEQ ID NO:495)(該段落中之 SEQ ID No 為 131416.doc -117- 200902551 W02007080392中所出現之 SEQ ID No)， dAb8 、dAblO 、 dAb36 、dAb7h21 、 dAb7h22 、 dAb7h23 、 Ab7h24 、 Ab7h25 、 Ab7h26 、 dAb7h27 、 dAb7h30、dAb7h31、dAb2、dAb4、dAb7、dAbll、dAbl2、 dAbl3 、dAbl5 、dAbl6 、dAb17 、dAbl8 、dAbl9 、 dAb21 、dAb22 、dAb23 、dAb24 、dAb25 、dAb26 、 dAb27 、dAb30 、dAb31 、dAb33 、dAb34 、dAb35 、 dAb38 、dAb41 、dAb46 、dAb47 、dAb52 、dAb53 、 dAb54 、dAb55 、dAb56 、 dAb7hl 、 dAb7h2 、dAb7h6 、 dAb7h7 、 dAb7h8 、 dAb7h9 、 dAb7hlO 、 dAb7hll 、 dAb7hl2、dAb7hl3及 dAb7hl4 〇
在某些實施例中，dAb結合人類血清白蛋白且包含與選 自由以下各物組成之群之dAb的胺基酸序列具有至少約 80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%、或至 少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少約99%之 胺基酸序列一致性的胺基酸序列：
DOM7h-2(SEQ ID NO:482) > DOM7h-6(SEQ ID NO:485) > DOM7h-l(SEQ ID NO:486)、DOM7h-7(SEQ ID NO:487)、 DOM7h-8(SEQ ID NO:496)、DOM7h-22(SEQ ID NO:489)、 DOM7h-23(SEQ ID NO:490)、DOM7h-24(SEQ ID NO:491)、 DOM7h-25(SEQ ID NO:492)、DOM7h-26(SEQ ID NO:493)、 DOM7h-21(SEQ ID NO:494)、DOM7h-27(SEQ ID NO:495)(該段 落中之SEQ ID No為W02007080392中所出現之SEQ ID
No)， 131416.doc •118- 200902551 dAb7h21、dAb7h22、dAb7h23、Ab7h24、Ab7h25、 Ab7h26、dAb7h27、dAb7h30、dAb7h31、dAb2、dAb4、 dAb7、dAb38、dAb41、dAb7hl、dAb7h2、dAb7h6、 dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、dAb7hlO、dAb7hll 、 dAb7hl2、dAb7hl3及 dAb7hl4。 在更特定實施例中，dAb為結合人類血清白蛋白且具有 選自由以下各物組成之群之胺基酸序列的V« dAb : DOM7h-2(SEQ ID NO:482) ' DOM7h-6(SEQ ID NO:485) ' DOM7h-l(SEQ ID N〇:486)、DOM7h-7(SEQ ID NO:487)、 DOM7h-8(SEQ ID NO:496)(該段落中之 SEQ ID No 為 W020070803 92 中所出現之SEQIDNo)， dAb2 、 dAb4 、 dAb7 、 dAb38 、 dAb41 、 dAb54 、 dAb7hl、dAb7h2、dAb7h6、dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、 dAb7hlO、dAb7hll、dAb7hl2、dAb7hl3 及 dAb7hl4 ° 在更特定實施例中’ dAb為結合人類血清白蛋白且具有 選自dAb7h3 0及dAb7h31之胺基酸序列的VH dAb。 在更特定實施例中，dAb為dAb7hl 1或dAb7hl4。 在其他實施例中，dAb、配位體或拮抗劑結合人類血清 白蛋白且包含任何上述胺基酸序列中之一、兩或三個 CDR，例如dAb7hll或dAb7hl4中之一、兩或三個CDR。
結合血清白蛋白之合適駱駝類Vhh包括WO 2004/041862 (Ablynx N.V.)及W02007080392中所揭示之彼等VHH(該等 Vhh序列及其核酸對應物以引用之方式併入本文中且構成 本發明正文之揭示内容之一部分），諸如序列A(SEQ ID 131416.doc -119- 200902551
NO:518)、序列 B(SEQ ID NO:519)、序列 C(SEQ ID
NO:520)、序列 D(SEQ ID NO:521)、序列 E(SEQ ID
NO:522)、序列 F(SEQ ID NO:523)、序列 G(SEQ ID
NO:524)、序列 H(SEQ ID NO:525)、序列 I(SEQ ID
NO:526)、序列 J(SEQ ID NO:527)、序列 K(SEQ ID
NO:528)、序歹ij L(SEQ ID NO:529)、序列 M(SEQ ID
NO:530)、序列 N(SEQ ID NO:531)、序列 0(SEQ ID
NO:532)、序列 P(SEQ ID NO:533)、序列 Q(SEQ ID
NO:534)，該等序列號對應於W02007080392或WO 20〇4/041862(Ablynx N.V.)中所引用之序列號。在某些實施 例中，駱駝類Vhh結合人類血清白蛋白且包含與 W02007080392 中所揭示之 ALB1 或 SEQ ID NOS:5 18-534 中 之任何一個具有至少約80%、或至少約85%、或至少約 90%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至 少約98%、或至少約99%之胺基酸序列一致性的胺基酸序 列，該等序列號對應於W02007080392或WO 2004/041862 中所引用之序列號。 在一些實施例中，配位體或拮抗劑包含與本文中所揭示 之任何抗血清白蛋白dAb競爭以結合血清白蛋白（例如人類 血清白蛋白）之抗jk清白蛋白d Ab。 在一替代實施例中，拮抗劑或配位體包含對TNFR1 (例 如，人類TNFR1)具有特異性之結合部分，其中該部分包 含如2008年2月8曰申請之同在申請中之申請案 PCT/GB2008/000453中所述的非免疫球蛋白序列，該等結 131416.doc •120· 200902551 合部分、其製造及選擇（例如，自多樣性庫）方法及其序列 之揭示内容以引用之方式併入本文中作為本發明正文之揭 示内容之一部分）。 接合半衰期延長部分（例如，白蛋白）
在一實施例中，使（一或多個）半衰期延長部分（例如，白 蛋白、轉鐵蛋白及其片段及類似物）與本發明之TNFR1結 合多肽、dAb或拮抗劑接合或締合。供TNFR1結合格式使 用之合適白蛋白、白蛋白片段或白蛋白變異體之實例描述 於WO 2005 077042中，其揭示内容以引用之方式併入本文 中且構成本發明正文之揭示内容之一部分。在本發明中 尤其可使用以下白蛋白、白蛋白片段或白蛋白變異體： • SEQ ID NO: 1(如WO 2005077042中所揭示，該序列明 確地以引用之方式併入本發明揭示内容中）； •包含 WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1之胺基酸 1-387 或由該等胺基酸1-3 87組成之白蛋白片段或變異體； •包含選自由以下各物組成之群之胺基酸序列的白蛋白 或其片段或變異體：（a)WO 2005077042中之SEQ ID NO: 1 之胺基酸 54 至 61 ; (b)WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1 之胺基酸 76 至 89 ; (c)WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1 之胺基酸 92 至 1〇〇 ; (d)WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1 胺基酸 170 至 176 ; (e)WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1 之胺基酸 247 至 252; (f)WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1 之胺基酸 266 至 277; (g)WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1 之胺基酸 131416.doc -121 - 200902551 280 至 288 ; (h)WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1 胺基 酸 362至 368 ; (i)WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1 之 胺基酸 439 至 447 ; (j)WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1 之胺基酸 462 至 475 ; (k)WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1 之胺基酸 478 至 486;及（l)WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1之胺基酸 560至 566。 供TNFR1結合格式使用之合適白蛋白、片段或類似物之 其他實例描述於WO 03076567中，其揭示内容以引用之方 式併入本文中且構成本發明正文之揭示内容之一部分。在 本發明中尤其可使用以下白蛋白、片段或變異體： •如WO 03076567中之（例如）圖3中所述之人類血清白蛋 白，（該序列資訊係明確地以引用之方式併入本發明 揭示内容中）； •由具有66,500之化學式分子量（formula molecular weight)之5 85個胺基酸的非糖基化多肽單鏈組成的人 類血清白蛋白（HA)(參見，Meloun等人，Leiiers
5δ··/3(5 (1975) ; Behrens等人，Fed. Pr〇c. 34..597 (1975); Lawn等人，iVwc/ez.c? jczWs 9:6102-6114 (1981);
Minghetti 等人;J. Biol. Chem. 261:6747 (1986))； • 士口 Weitkamp 等人，Ann. Hum. Genet. 37:219 (1973)中 所述之白蛋白之多晶型變異體或類似物或片段； •如EP 322094中所述之白蛋白片段或變異體，例如 ΗΑ(1-373)、ΗΑ(1-388)、ΗΑ(1-389)、ΗΑ(1-369)及 HA( 1-419)及1-3 69與1-419之間的片段； 131416.doc -122- 200902551 •如EP 399666中所述之白蛋白片段或變異體，例如 ΗΑ(1]77)及HA(1_2〇〇)及ΗΑ(1_χ)之間的片段，其中X 為178至199之任何數字。 當使用（-或多個）半衰期延長部分（例如，白蛋白、轉鐵 蛋白及其片段及類似物）編排本發明之tnfri結合多狀、 ⑽及结抗劑格式時，可使用任何合適方法（諸如，直接融 合）例如猎由使用編碼融合蛋白之單—核普 = Γ:_，一，合，其中： 5蛋白係編碼為半衰期| 勹干衣d延長部分定位於T N F R!結合 N-末端或C_末端之多肽單鏈。或者，可 用肽連接子實規桩入 &Μ I刀 < 间1史 實見接5 ’肽連接子例如wo 〇3〇76567或购 2_咖19中料之肽連接子（㈣連接子揭示内容以引 用之方式併人本發明揭示内容中以提供用於本發明 ^)。增加活體内血清半衰期之多狀通常為活體内天秋存 降解或由自生物體（例如，人類）移除不想要之物質 之：源性機制移除的多肽。例如，增加活體内血清半衰： 之夕肽可選自來自細胞外基質之蛋白質、血液中可見之蛋 :質肺血腦屏障或神經組織中可見之蛋白質、位於腎、 、臟、皮膚或骨中之蛋白質、應力蛋白、疾病特 異性蛋白質或涉及Fc轉運之蛋白質。 、、 在貫穿該揭示内容所述之本發明之實施例中 =:抗劑或配位體中使—一函蓋熟： 個：用者可使用包含結合TNFR1之本發明之心的—或多 s所有三個CDR(例如，接枝於合適蛋白質骨架或骨幹 131416.doc -123- 200902551 上之CDR，該骨架或骨幹例如親和體、SpA骨架、LDL受 體A類區域或EGF區域）的多肽或區域。因此，揭示内容整 體應解釋為提供使用該等區域代替dAb之拮抗劑之揭示内 容。在這點上，參見2008年2月8日申請之PC77GB2〇〇8/〇〇〇453， 其揭示内容以引用之方式併入）。
因此，在一實施例中，本發明之拮抗劑包含合適格式之 對TNFR1具有、结合特性的免疫球蛋白單—可變區域或區域 抗體（dAb)或該dAb之互補判定區。拮抗劑可為由該dAb組 成或大體上由該dAb組成之多肽。拮抗劑可為包含合適格 式、諸如抗體格式（例如，IgG樣格式、scFv、Fab、、
Fhb’）2)中之dAb(或dAb之CDR)之多肽，或包含結合tnfri 之dAb及結合另一靶蛋白質、抗原或抗原決定基（例如，血 清白蛋白）之第二dAb的雙特異性配位體。 可將本發明之多肽、dAb及拮抗劑可編排格式為此項技 術已知之多種合適抗體格式，諸如IgG樣格式、嵌合抗 體、人化抗體、人類抗體、單鏈抗體、雙特異性抗體、抗 體重鏈、抗體輕鏈、抗體重鏈及/或輕鏈之同源二聚體及 異源二聚體、任何上述者之抗原結合片段(例如，F翁 (例如，單鏈FV(ScFv)、雙硫鍵鍵結之Fv)、^片段、Μ 片段、F⑽’)2片段）、單一可變區域（例如，％、〜）、場 =何上述者之經㈣形式（例如，#由共價連接聚伸烧 ::(例如’聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇)或其他合 聚合物而修飾）。 在一些實施例中 本發明提供一 種為IgG樣格式之配位 131416.doc -124· 200902551
體（例如，抗TNFR1拮抗劑）。該等格式具有習知IgG分子之 四鏈結構（兩個重鏈及兩個輕鏈），其中一或多個可變區（VH 及/或VL)已經本發明之dAb置換。在一實施例中，各可變 區（2個VH區及2個VL區）經dAb或單一可變區域置換，其中 之至少一個為本發明之抗TNFR1 dAb。包括在IgG樣格式 之dAb或單一可變區域可具有相同特異性或不同特異性。 在一些實施例中，IgG樣格式為四價且可具有一種（僅抗 TNFR1)、兩種（例如，抗TNFR1及抗SA)、三種或四種特異 性。舉例而言，IgG樣格式可為單特異性且包含四個具有 相同特異性之dAb ;可為雙特異性且包含三個具有相同特 異性之dAb及另一具有不同特異性之dAb ;可為雙特異性 且包含兩個具有相同特異性之dAb及兩個具有常見但不同 特異性之dAb ;可為三特異性且包含具有相同特異性之第 一及第二dAb、具有不同特異性之第三dAb及具有不同於 第一、第二及第三dAb之特異性之第四dAb ;或可為四異 性且包含四値各具有不同特異性之dAb。可製備IgG樣格式 之抗原結合片段（例如，Fab、F(ab')2、Fab'、Fv、scFv)。 在一實施例中，IgG樣格式或其抗原結合片段不會交聯 TNFR1，例如該格式對TNFR1而言可為單價。若想要補體 活化及/或抗體依賴性細胞的細胞毒性（ADCC)功能，則配 位體可為IgG 1-樣格式。必要時，IgG樣格式可包含突變恆 定區（變異體IgG重鏈恆定區）以最小化與Fc受體之結合及/ 或固定補體之能力，（例如參見Winter等人，GB 2,209,757 B ; Morrison等人，WO 89/07142 ; Morgan等人，WO 94/29351， 131416.doc -125 - 200902551 1994 年 12 月 22 日）。 可將本發明之配位體(多肽、⑽及拮抗 、 含有與第二免疫球蛋白„ 、 七式為 衣蛋白早一可變區域直接融合之笛 —可變區域的融合蛋白。必要時，該格:;Γ 步包含半衰期延長部分。舉例而纟，配位體可包J = 免疫球蛋白單一可變p a 士 _ '、第一 了 k Q域直接融合的第一免疫球 可變區域的融合黍白 甘山 龙白早一
域直接融合；^人血、主^ 龙曰早可變區 於、、。σ血'^白蛋白之免疫球蛋白單—可 域。 夂122 具有對靶具有結合特異性之結合位點之多肽區域的定向 及配位體疋否包含連接子通f為設計所要選擇之問題。然 而’一些定向在有或無連接子之情況下可提供較其他定向 佳之結合特徵。本發明所涵蓋之所有定向（例如，連 接子-dAb2、dAb2·連接子·dAbl)g含有提供可藉由筛選容 易地鑑別之想要結合特徵的定向的配位體。 可使本發明之多肽及ijAb(包括dAb單體、二聚體及=聚 體）與抗體FC區連接，該抗體以區包含Ch2及cy區域中之 一者或兩者及視情況鉸鏈區。舉例而言，可使用編碼以單 一核苦酸序列开> 式連接於F c區之配位體之載體製造該等多 肽。 此外’本發明提供上述dAb單體之二聚體、三聚體及聚 合物。 密碼子優化序列 如上所述’本發明之實施例提供編碼本發明之多狀及可 1314I6.doc -126- 200902551 變區域之密碼子優化核苷酸序列。如以下說明中所示，可 產生編碼相同可變區域（在此狀況下，可變區域胺基酸序 列與DOMlh-13 1-206—致）之具有約70%—致性之密碼子優 化序列。在該情況下，序列經優化從而由馬斯德畢赤酵母 (/^c/n_a (密碼子優化序列1 -3)或大腸桿菌（密碼子 優化序列4及5)表現。
考慮到遺傳密碼中之及簡併度執行計算且最大化由如圖 19中所示之DOMlh-13 1-206之核苷酸序列及還編碼與 DOM 1 h-1 3 1 -206 —致之可變區域之理論核苷酸序列所編碼 的各簡併密碼子中的核苷酸變化數。計算揭露理論序列將 與如圖19中所示之DOMlh-13 1-206之核苷酸序列具有僅 57%之一致性。 密碼子優化序列1 DNA序列 gaggttcaattgttggaatccggtggtggattggttcaacctggtggttctttgagattgtcctgtgctg cttccggttttactttcgctcacgagactatggtttgggttagacaggctccaggtaaaggattggaatg ggtttcccacattccaccagatggtcaagatccattctacgctgactccgttaagggaagattcactatc tccagagacaactccaagaacactttgtacttgcagatgaactccttgagagctgaggatactgctgttt accactgtgctttgttgccaaagagaggaccttggtttgattactggggacagggaactttggttactgt ttcttcc 相應AA序列 evqllesggglvqpggslrlscaasgftfahetmvwvrqapgkglewvshippdgqdpfyadsvkgrfti srdnskntlylqmnslraedtavyhcallpkrgpwfdywgqgtlvtvss •與WT序列之核苷酸序列一致性為74.1 % 密碼子優化Domlh_131-206 DomlH-131-206 WT 一致 1 50 密碼子優化Domlh-131-206 Domlh-131-206 WT 一致 密碼子優化Domlh-131-206 Doolh-131-206 m 一致 (1) U) U) (51) (51) (51) (101) (101) (1〇1>
rGOAATCCQ rwAorcTq Γββλ TC G rGTGCTGCTTCCOGTTTTACTTTCQCTCAC0AGACTJi rOTQCAQCCTCCQOATTCACCTTTGCOCATGXGACeA rOTOC 9C TCCOO TT AC TT OC CA QK9AC A C3AOOTOCA〇CT(?TTWA〇TCT<»<3aeQAQ〇CTT0GTACAOCCT^QQ〇GTC ΟΛΟΘΤ CA ΤΟΤΤββλ TC GO 00 9Θ TTOOT CA CCTQO QQ TC 51 100 TTTGAOATTeTCCTGT CCTQCQTCTCTCCTG ΤΘ G T TCCTQ 101 150 TaeTTTGGGTTAGACAQaCTCCAGGTAAAGGATTGQAATGGQTTTCCCAC TOOT9TGGK3TCCGCCAGOCACCJ)kOOOAJlGOGTCTAeAOTe0GTCTCACAT TOOT ΦΟΟΘΤ 8 CAGQC CCAOO Λλ 9Θ T GA TGGGT TC CA 151 200 -127- 131416.doc 200902551 密碼子優化Domlh-131-206 (isi) Domlh-131-206 WT (151) Consensus (1S1) 密碼子優化Domlh-131-206 (201} Domlh-131-206 WT (201) 一致 Ϊ201Ϊ 密碼子優化Domlh-131-206 (251) Domlh-13i-206 WT (251) 一致（251) 密碼子優化 Domlh-131-206 〇oi) Domlh-131-206 WT (301) 一致（301) 密碼子優化 Domlh-131-206 〇5i) Domlh-131-206 WT (351) 一致（351)
ATTCCACCAaAT007CAA0A?CCATTC?ACC3CTaAC7CCQTTAAaQ<3M0 ATTCCCCCOGATeeTCAGQATCCCTTCTACiSCAQACTCCQTQAAQGGCCG ATTCC CC SATGGTCA GATCC TTCTACGC QACTCCGT ΑΑΘΘΟ G 201 250
ATTCACTATCTCCAGAOACAACTCCAAi^AACACTTTGTACTTQCAQATQA 3TTCACCATCTCCCQCQACAATTCCAAGAACACGCTATATCTGCAAATQA TTCAC ATCTCC G GACAA TCCAAGAACAC T TA TOCA ATSA 251 300 XCTCCTTQAaAGCTOXGGATACTGCTGTTTACCACTGTGCTTTOTTGCCA ACAGCCTOCaTGCCGAGOACACASCOOTATATCACTQTGCGCTQCTTCCT AC C TO 3 9C OA0GA AC OC GT ΤΛ CAC扣TOC TG T CC 301 350 AAGAeAGGACCTTGaTTT<3ATTACT〇eQaACA£3Gi3AACTTTeM3,PTACTGT AAaAQ99GOCCTTQ0T?T02iCTACTQ<i〇aTC^9OQAACCCTSOTCACC9T λλΟΛΘ GO CCTTOOITTGA TACTGGOG CAGGOAAC TOQT AC GT 351 363
TTCTTCCTAATGA CTCOAOC------ TC c 密碼子優化序列2 DNA序列 gagaaaagagaggttcaattgcttgaatctggaggaggtttggtccagccaggagggtcccttcgactaa gttgtgctgccagtgggtttacgtttgctcatgaaactatggtatgggtccgacaggcacctggtaaagg tcttgaatgggtttcacatatccctccagacggtcaagacccattttacgctgattccgtgaaaggcaga tttacaatttcacgagataattctaaaaacaccttgtacttacaaatgaactcattgagagctgaggaca ctgcagtttatcactgcgctttactaccaaaacgtggaccttggtttgattattggggccaaggtacgtt agtgactgttagttct 相應AA序列 ekrevqllesggglvqpggslrlscaasgftfahetmvwvrqapgkglewvshippdgqdpfyadsvkgr ft isrdns kntlylqmnslraedtavyhcallpkrgpwfdywgqgtlvtvss 與wt序列之核苷酸序列一致性為7 1 · 1 %
Domlh-131-206 WT 僅畢赤酵母MFa 206 dAb 一致 Domlh-131-206 WT 僅畢赤酵母MFa 206 dAb 一致 111
Domlh-131-206 WT 僅畢赤酵母MFa 206 dAb —致 Doralh-131-206 WT 僅畢赤酵母MFa 206 dAb —致 Domlh-131-206 WT 僅畢赤酵母MFa 206 dAb —致 Domlh-131-206 WT 僅畢赤酵母MFa 206 dAb 一致 Domlh-131-206 WT 僅畢赤酵母MFa 206 dAb —致 Domlh-131-206 WT 僅畢赤酵母MFa206 dAb 一致 (42) (51) (51) (92) (l〇X) (101) U42) <151) (151) (192) (201) <201) (242) (251) (251) (292) (301) (30X) (342) (351) <351)
---------gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcc GAGftAAAGAGAGGTTGAATTGCTTGAATCTGGAGGAGGTTTGGTCCAGCC GAGGT CA TG T GA TCTGG GGAGG TTGGT CAGCC 51 100 TGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTQCAGCCTCCGGATTCACCTTTGCGC AGGAGGGTCCCTTCGACTAAGTTGTGCTGCCAGTGGGTTTACGTTTGCTC GG GGGTCCCT CG CT TGTGC GCC GG TT AC TTTGC C 101 150 ATGAGACGATGGTGTGGGTCCGCCAGGCACCAGGGAAGGGTCTAGAGTGG ATGAAACTATQGTATGGGTCCGACAQGCACCTGGTAAAGGTCTTGAATGG ATGA AC ATGGT TGGGTCCG CAGGCACC GG AA GGTCT GA TGG 151 200 ICATATTCCCCCGGATGGTCAGGATCCCTTCTACGGAGACTCCGT ^CATATCCCTCCAGACGGTCAAGACCCATTTTACGCTGATTCCGT GT TCACATAT CC CC GA GGTCA GA CC TT TACGC GA TCCGT 201 250 GAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTATATC GAAAGGCAGATTTACAATTTCACGAGATAATTCTAAAAACACCTTGTACT GAA GGC G TT AC AT TC CG GA AATTC AA AACAC T TA 251 300 TGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGC3ACACAGCGGTATATCACTGTGCG TACAAATGAACTCATTGAGAGCTGAGGACACTGCAGTTTATCACTGCGCT T CAAATGAAC TG G GC GAGGACAC GC GT TATCACTG GC 301 350 CTGCTTCCTAAGAGGGGGCCTTGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCT TTACTACCAAAACGTGGACCTTGGTTTGATTATTGGGGCCAAGGTACGTT T CT CC AA G GG CCTTGGTTTGA TA TGGGG CA GG AC T 351 367 GGTCACCGTCTCGAGC-AGTGAC TGT-TAGTTCT GT AC GT T G C
GTCTCAC GTTTCAC -128- 131416.doc 200902551 密碼子優化序列3 DNA序列 gaagtgcagcttcttgaaagtggtggagggctagtgcagccagggggatctttaagattatcatgcgctg ccagtggatttacttttgctcacgagacgatggtctgggtgagacaagctcctggaaaaggtttagagtg ggtttctcacattccacctgatggtcaagatcctttctacgcagattccgtcaaaggaagatttactatc tccagagataatagtaaaaacactttgtacctacagatgaactcacttagagccgaagataccgctgtgt accactgcgccttgttgccaaagagaggtccttggttcgattactggggtcagggtactctggttacagt ctcatct 相應AA序列 evqllesggglvqpggslrlscaasgftfahetmvwvrqapgkglewvshippdgqdpfyadsvkgrfti srdnskntlylqmnslraedtavyhcallpkrgpwfdywgqgtlvtvss •與WT序列之核苷酸序列一致性為72.6% 1 50
Domlh-131-206 WT 僅畢赤酵母Pre206dAb 一致 Domlh-131-206 WT 僅畢赤酵母Pre206dAb 一致 Domlh-131-206 WT 僅畢赤酵母Pre206dAb 一致 Domlh-131-206 WT 僅畢赤酵母Pre206 dAb 一致 Domlh-131-206 WT 僅畢赤酵母Pre206 dAb 一致 DomXh-131-206 WT 僅畢赤酵母Pre206dAb 一致 Domlh-131-206 WT 僅畢赤酵母Pre206dAb 一致 Domlh-131-206 WT 僅畢赤酵母Pre 206 dAb 一致
(1) GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGOGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTC {1) GAAGTGCAGCTTCTTGAAAGTGGTGGAGGGCTAGTGCAGCCAGGGGGATC <1) GA GTGCAGCT T GA TGG GGAGG T GT CAGCC GGGGG TC 51 100 (51) CCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGCGCATGAGACGA (5X) TTTAAGATTATCATGCGCTGCCAGTGGATTTACTTTTGCTCACGAGACGA (51) T G T TC TG GC C5CC GGATT AC TTTGC CA GAGACGA 101 150 (101) TGGTGTGGGTCCGCCAOGCACCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACAT (101) TOGTCTGGOTGAOACAAGCTCCTGGAAAAGGTTTAGAGTGGGTTTCTCAC (101) TGGT TGGGT G CA GC CC GG AA GGT TAGAGTGGGT TC CA 151 200 (151) ATTCCCCCGGATGGTCAGGATCCCTTCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCG (151) ATTCCACCTQATGGTCAAGATCCTTTCTACGCAGATTCCGTCAAAGGAAG (151) ATTCC CC GATGGTCA GATCC TTCTACGCAGA TCCGT AA GG G 201 250 ¢201) GTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTATATCTGCAAATGA (201) ATTTACTATCTCCAGAGATAATAGTAAAAACACTTTGTACCTACAGATGA (201) TT AC ATCTCC G GA AAT AA AACAC T TA CT CA ATGA 251 300 (251) ACAGCCTGCGTGCCGAGGACACAGCGGTATATCACTGTGCGCTGCTTCCT (251) ACTCACTTAGAGCCGAAGATACCGCTGTGTACCACTGCGCCTTGTTGCCA (251) AC CT G GCCGA GA AC GC GT TA CACTG GC TG T CC 301 350 (301) AAGAGGGGGCCTTGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGT (3 01) AAGAGAGGTCCTTGGTTCGATTACTGGGGTCAGGGTACTCTGGTTACAGT (301) AAGAG GG CCTTGGTT GA TACTGGGGTCAGGG AC CTGGT AC GT 351
(351) CTCGAGC-(351) CTC-ATCT (351) CTC A C 密碼子優化序列4 DNA序列 gaagtacaactgctggagagcggtggcggcctggttcaaccgggtggttccctgcgcctgtcctgtgcgg catctggtttcaccttcgcacacgaaaccatggtgtgggttcgccaagctccgggcaaaggcctggaatg ggtaagccacattcctccagatggccaggacccattctatgcggattccgttaagggtcgctttaccatt tctcgtgataactccaaaaacaccctgtacctgcagatgaactccctgcgcgccgaggatactgcggtgt accattgtgcgctgctgcctaaacgtggcccgtggttcgattactggggtcagggtactctggtcaccgt aagcagc 129- 131416.doc 200902551 相應AA序列 evqllesggglvqpggslrlscaasgftfahetmvwvrqapgkglewvshippdgqdpfyadsvkgrfti srdnskntlylqmnslraedtavyhcallpkrgpwfdywgqgtlvtvss •與wt序列之核苷酸序列一致性為76.5%
Dcmlh-131-206 WT 僅大腸桿菌Sec 206 dAb 一致 Domlh-131-206 WT 僅大腸桿菌Sec 206 dAb 一致 Domlh-131-206 WT 僅大腸桿g Sec 206 dAb 一致 Domlh-131-206 WT 僅大腸桿菌Sec 206 dAb —致 Domlh-131-206 WT 僅大腸桿菌Sec 206 dAb 一致 Domlh-131-206 WT 僅大腸桿g Sec 206 dAb —致 Domlh-131-206 WT 僅大腸桿菌Sec 206 dAb 一致 Domlh-131-206 WT 僅大腸桿菌Sec 206 dAb 一致 (1) d> (1) <51) (51) (51) (101) (101) (101) (151) (151) (151) (201) (201> (201) (251) (251) (251) (301) (301) (301) 051) (351) (351)
1 50 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTC GAAGTACAACTGCTGGAGAGCGGTGGCGGCCTGGTTCAACCGGGTOGTTC GA GT CA CTG TGGAG GG GG GGC TGGT CA CC GG QG TC 51 100 CCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGCGCATGAGACGA CCTGCGCCTGTCCTGTGCGGCATCTGGTTTCACCTTCGCACACGAAACCA CCTGCG CT TCCTGTGC GC TC GG TTCACCTT GC CA GA AC A 101 150 TGGTGTGGGTCCGCCAGGGACCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACAT TGGTGTGGGTTCGCCAAGCTCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGGTAAGCCAC TGGTGTGGGT CGCCA GC CC GG AA GG CT GA TGGGT CA 151 200 ATTCCCCCGGATGGTCAGGATCCCTTCTACGCAGACTCCGTGAAGOGCCG ATTCGTCCAGATGGCCAGGACCCATTCTAT&CGGATTCCGTTAAGGOTCG ATTCC CC C3ATGG CAGGA CC TTCTA GC GA TCCGT AAGGG CG 201 250 GT7CACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTATATCTGCAAA.TGA CTTTACCATTTCTCGTGATAACTCCAAAAACACCCTGTACCTGCAGATGA TT ACCAT TC CG GA AA TCCAA AACAC CT TA CTGCA ATGA 251 300 ACAGCCTGCGTGCCGAGGACACAGCGGTATATCACTGTGCGCTGCTTCCT ACTCCCTGCGCGCCGAGGATACTGCGGTGTACCATTGTGCGCTGCTGCCT AC CCTGCG GCCGAGGA AC GCGGT TA CA TGTGCGCTGCT CCT 301 350 SCCTTGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGT ^CCGTGGTTCGATTACTGGGGTCAGGGTACTCTGGTCACCGT AA G GG CC TGGTT GA TACTGGGGTCAGGG AC CTGGTCACCGT 351 CTCGAGC AAGCAGC AGC
AAGAGGGGGC AAACGTGGCC 密碼子優化序列5DNA序列 gaggttcaactgctggaatctggtggtggtctggtacaaccgggtggttccctgcgtctgagctgtgcag cctctggtttcaccttcgctcatgagaccatggtttgggtacgccaggctccgggtaaaggcctggagtg ggtaagccatatccctcctgatggtcaggacccgttctatgctgattccgtcaaaggccgttttaccatt tctcgtgacaacagcaaaaacactctgtacctgcaaatgaactccctgcgtgcagaagacacggcggttt atcactgtgcactgctgccaaaacgcggcccttggttcgactactggggccagggtactctggtcactgt atcttct 相應AA序列 evqllesggglvqpggslrlscaasgftfahetmvwvrqapgkglewvshippdgqdpfyadsvkgrfti srdnskntlylqmnslraedtavyhcallpkrgpwfdywgqgtlvtvss •與WT序列之核苷酸序列一致性為78.4% 131416.doc 130- 200902551
Domlh-131-206 WT 僅大腸桿菌IC206dAb 一致
Domlh-131-206 WT 僅大腸桿菌IC206dAb 一致
Domlh-131-206 WT 僅大腸桿菌IC206dAb 一致 Domlh-131-206 WT 僅大腸桿菌IC206 dAb 一致
Domlh-131-206 WT 僅大腸桿菌IC206dAb 一致 Domlh-131-206 WT 僅大腸桿菌IC206dAb 一致 DomXh-131-206 WT 僅大腸桿菌IC206dAb一致 Domlh-131-206 WT 僅大腸桿菌IC206dAb —致
1 Γ3〇 (1) GAGGTGGAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTC U) GAGGTTCAACTGCTGGAATCTGGTCGTGGTCTGGTACAACCGGGTGGTTC (1) GAGGT CA CTG TGGA TCTGG GG GG TGGTACA CC GG GG TC 51 100 (51) CCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGCGCATGAGACGA (51) CCTGCGTCTGAGCTGTGCAGCCTCTGGTTTCACCTTCGCTCATGAGACCA (51) CCTGCGTCT CTGTGCAGCCTC GG TTCACCTT GC CATGAGAC A 101 150 (101) TGGTGTGGOTCCecCAGGCACCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACAT (XOX) TGGTTTGGCTACGCCAGGCTCCGGGTAAAGGCCTGGAGTGGGTAAGCCAT (101) TGGT TGGGT CGCCAGGC CC GG AA GG CT GAGTGGGT CAT 151 200 (151) ATTCCCCCGGATGGTCAGGATCCCTTCTACGCAGACTCCGTGAAGGGJCCG (151) ATCCCTCCTQATGGTCAGGACCCGTTCTATGCTGATTCCGTCAAAGGCCG (151) AT CC CC GATGGTCAGGA CC TTCTA GC GA TCCGT AA GGCCG 201 250 (201) GTTCACGATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTATATCTGCAAATGA (201) TTTTACCATTTCTCGTGACAACAGCAAAAACACTCTGTACCTGCAAATGA (201) TT ACCAT TC CG GACAA CAA AACAC CT TA CTGCAAATGA 251 300 (251) ACAGCCTGCGTGCCGAGeACACAGCGGTATATCACTGTGCGCT(X：TTCCT (251) ACTCCCTGCGTGCAGAAGACACGGCGGTTTATCACTGTGCACTGCTGCCA (25X) AC CCTGCGTGC GA GACAC GCGGT TATCACTGTGC CTGCT CC 301 350 <301) AAGAGGGGGCCTTGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGT (301) AAACQCGGCCCTTGGTTCGACTACTGGGGCCAGGGTACTCTGGTGACTGT (301) AA G GG CCTTGGTT GACTACTGGGG CAGGG AC CTGGTCAC GT 351 (351) CTCGAGC (351) ATCTTCX (351) TC 例證 實例A :主要選擇及表徵人類TNFR1之區域抗體 所產生之區域抗體係源自噬菌體庫。根據相關標準方法 執行被動吸收之人類TNFR1之可溶性選擇與淘選。人類 TNFR1係以可溶性重組蛋白質形式購自R&D systems(目錄 號 636-R1-025/CF)或 Peprotech(目錄號 310-07)，且可以直 接使用（在被動選擇之狀況下），或在生物素標記後，經由 利用一級胺偶合，接著在生物檢定中品質控制其活性及由 質譜分析其MW及生物素標記程度後使用。通常利用每次 一輪遞減抗原執行3輪選擇。 藉由噬菌體ELISA從選擇物結果篩選出抗TNFR1結合純 系之存在。自該等噬菌體選擇物分離DNA，並次選殖至表 現載體中以表現可溶性dAb片段。將可溶性dAb片段經表 -131 - 131416.doc 200902551 現於96孔板巾，且使用以抗e_mye彳貞測之直接結合阳 或使用抗生蛋白鏈菌素/經生物素標記TNFR1 ΒΐΑααΤΜ晶 片之BIAc〇re™及根據解離速率分級，篩選上清液2 TNFR1結合dAb之存在。 下文所述之前導分子係源自命名為D〇Mlh]3i(揭示於 WO2006038〇27中）之親本dAb。該分子經過使用6〇囊經生 物素標記抗原進行3輪選擇後從噬菌體呈現庫選得。在各 輪選擇中將經抗生蛋白鏈菌素或中性鏈親和素塗佈之〇辦 珠粒交料為捕獲試劑以防止選擇針對抗生蛋㈣菌素或 中性鏈親和素之結合劑。該階段前導D〇Mlh_m之效價如 在MRC-5纖維母細胞/IL_8釋放細胞檢$中所測定處於低微 莫耳範圍内。如由BIAc〇re™所測定之結合動力學通常呈 現快速締合速率（on rate)/快速解離速率。該D〇Mih_i3i前 導分子之大腸桿菌表現含量以（：_末端myc標記單體計係處 於8 mg/1之範圍内。 前導分子之親和力成熟作用： 使DOMlh-1 3 1進行親和力成熟作用以產生具有較高效價 及改良生物物理學特徵之突變體（關於D〇Mlh_13丨來源之 前導分子之胺基酸序列，參見圖3)。使用易於出錯之pcR 聚合酶（Genemorph II，Stratagene)產生易於出錯之庫（平均 數為每dAb序列1個胺基酸變化，庫規模8χ1〇7)後，利用該 等易於出錯之庫執行7輪選擇。該策略可引起純系D〇Mlh_ 131-8分離，一種如由MRC_5細胞檢定所量測4個胺基酸變 化（一個在構架1(FR1)中，一個在CDR】*，一個在CD们中 131416.doc -132- 200902551 及一個在FR4中）產生約100倍效價提高（約4 nM)之分子。 在該檢定中，將MRC-5細胞與測試樣品一起培養丨小時， 隨後添加TNF-a(200 Pg/ml)。培養隔夜後，使用比_8 ABI 8200細胞偵測檢定（FMAT)測定IL_8釋放。各實驗中包括 TNF-a劑量曲、線。㈣較中，戶斤使用之與心競爭結合 TNFR1之TNF-a的濃度（200 pg/ml)為最大TNF a&應之約 70%。 為進一步提高效價，由易於出錯之前導一致資訊提示之 關鍵位置處之寡核苷酸引導的突變誘發使單一胺基酸位置 夕樣化。该過程期間，經由BIAcore™篩選分離具有單個 K94R胺基酸突變（胺基酸編號根據Kabat)及2〇〇_3〇〇 pM之 RBA效價之D〇Mlh-131-8純系的改良形式，D〇Mlh_131_ 24(在修正之前’最初命名為DOMlh-131-8-2)。 產生其他基於該前導分子及源於其之Nn s庫之易於出錯 的庫且使用熱處理使其經受3輪噬菌體選擇（關於方法，參 見 Jespers L 等人 ’ Aggregation-resistant domain antibodies selected 〇n phage by heat denaturation. Nat Biotechnol. 2004年9月；22(9):1161-5)。在此選擇期間，彙集庫且自 第2輪選擇所獲得之純系產生認為更加熱穩定之諸如 OOM1 h-1 3 1 -53之dAb。假定該等純系將具有較佳生物物理 特徵。使純系DOM 1 h- 1 3 1 -53中之一些構架突變生殖系化 以產生純系DOM 1 h-1 3 1 -83。該純系形成使用如上所述之 I菌體呈現選擇或使用使用乳液之活體外隔室化技術經由 养核芽酸引導的個體CDR突變誘發進—步多樣化之基礎。 I31416.doc -133 - 200902551 嗤菌體呈現策略產生前導分子DOM 1 h-1 3 1 - 11 7 &D〇Mlh-1 3 1 -1 5 1。活體外隔室化技術產生d〇m 1 h-1 3 1 -5 11。 在該階段中’在生物物理及生物檢定中比較此等三個前 導分子，且DOMlh-131-511為具有最佳性質之分子。此 外，在胰蛋白酶或白血球酶存在下測試該等分子的蛋白水 解裂解抗性。白血球酶由自患有囊性纖維化之患者彙集的 痰組成且含有高含量之彈性蛋白酶及其他蛋白酶且用作肺 疾病活體内條件之替代品。該資料指示所有三個前導分子 DOMlh-131-117、DOMlh-131-151 及 DOMlh-131-511 在騰 蛋白酶或白血球酶存在下均快速降解。該研究結果引起對 當DOMlh-131_5ll處於患者體内時其活體内持久性之關注 且研發一種選擇改良胰蛋白酶抗性之策略。假定該經改良 胰蛋白酶抗性會對分子之其他生物物理性質產生有利效 應。基本上修改標準噬菌體選擇方法以允許在對抗原選擇 之前在蛋白酶存在下進行選擇。為此目的，使缺失c_myc 標籤之新穎喔菌體載體工程化以允許在胰蛋白酶存在但未 使所呈現之dAb裂解脫離噬菌體的情況下進行選擇。產生 基於DOMlh-13 1-5 1 1之易於出錯之庫且選殖於pD〇M33 載體中（關於PDOM33載體圖，參見圖5〇)。在37t：下用 1 mg/ml或100 pg/ml胰蛋白酶預處理由該庫產生之噬菌體 儲備液24小時’接著添加為R〇che完全蛋白酶抑制劑 (Roche Complete Protease Inhibit〇r)(2x)之蛋白酶抑制劑以 在選擇相關抗原之前阻斷胰蛋白酶活性。執行4輪選擇。 在37°C下在存在或不存在胰蛋白酶（在1〇〇 μ§/ιη14 1〇〇〇 131416.doc -134- 200902551
Mg/ml最終膦蛋白酶濃度下）之情況下培養丨小時或培養隔 仪期間’在存在或不存在蛋白酶之情況下使用BIAc〇reTM §平定可溶性表現TNFR1結合dAb的結合TNFR1之能力。
此引起兩個前導分子£)〇]^1}1-131-202及00\1111-131-206 分離’該兩個前導分子如由BIAcoreTM抗原結合實驗所示 顯不改良之蛋白酶抗性。令人關注地注意到，與D〇m 1 h-131-51 1相比，D〇Mlh_131_2〇2僅在cDR2中含有一個突變 (V53D)(所有胺基酸編號根據Kabat)，而DOMlh-13 1-206僅 含有兩個突變：第一突變與DOMlh-13 1-202相同（在CDR2 中之V5 3D突變）及第二突變為FR3中之Y9ih突變（參見圖 3)。該FR3中之Y91H突變出現在3-20人類生殖系基因中， 指不該殘基出現在人類抗體中。該三個純系D〇m 1 h-1 3 1 - 511、DOMlh-131-202 及 DOMlh-131-206具有如圖 3中所示 之胺基酸序列。 如下測定分子活性： DOM1H-13 1-202、DOM1H-131-511 及 DOM1H-13 1-206結 合人類TNFR1之BIAcore™結合親和力評定。 由 BIAcore™ 分析評定 DOM1H-13 1-202、DOM1H-131- 511及DOM1H-131-206結合人類重組大腸桿菌表現人類 TNFR1之結合親和力。使用經生物素標記人類TNFR丨進行 分析。將1400 RU經生物素標記TNFR1塗佈於抗生蛋白鏈 菌素（SA)晶片上。使用弱酸溶離條件使表面再生重新回到 基線。在規定濃度下使用5 0 μΐ/min之流速使|)〇1^11^-131-202、〇〇厘11^-131-511及〇〇]^出-131-206 穿過該表面。在 131416.doc •135- 200902551 BIAcore™ 3 000機器上進行研究，且分析資料且擬合於1:1 之結合模型。所有測試分子之結合資料充分擬合於1:1模 型。由kcn及kcff速率計算所有KD值。在25°C下進行 BIAcore™運行。 以下資料由三個獨立的實驗產生。在各個實驗中，藉由 平均大量擬合結果（對kd而言使用最高之dAb濃度及對ka而 言使用較低之濃度）來計算結果。資料以結果之平均值及 標準偏差（在括號中）呈示（表1)。 广、 ( 表 1 :結合人類 TNFR1 之 DOM1H-131-202、DOM1H-131-511 及 DOMlH-131-206之BIAcoI·eTM資料 K〇n k〇rr A〇(nM) DOM1H-131-511 5.03E+05 5.06E-04 1.07 (511) (1.07E+05) (1.01E-04) (0.44) DOM1H-131-202 1.02E+06 5.42E-04 0.55 (202) (2.69E+05) (3.69E-05) (0.11) DOM1H-131-206 1.55E+06 7.25E-04 0.47 (206) (3.57E+05) (1.95E-04) (0.06)
DOM1H-13 1-202、DOM1H-131-511 及 DOM1H-13 1-206類 似地且以高親和力結合人類TNFR1。DOM1H-13 1-202及 DOM1H-13 1-206分別以0.55 nM及0.47 nM之平均親和力結 合。與具有1.07 nM之平均親和力之DOM1H-131-511相 比，DOM1H-13 1-202及DOM1H-13 1-206具有稍佳之親和 力。 受體結合檢定： 在受體結合檢定中測定dAb對人類TNFR1之效價。該檢 定量測TNF-α與TNFR1之結合及可溶性dAb阻斷該相互作 131416.doc -136- 200902551 用之能力。將TNFR1-FC融合物捕獲在預塗佈山羊抗人類 IgG(H&L)之珠粒上。將受體塗佈珠粒與TNF-a(10 ng/mL)、dAb、生物素接合抗TNF-a及抗生蛋白鏈菌素 alexa fluor 647在黑色側面透明底面之384孔板中一起培 養。6小時後，將板在ABI 8200細胞偵測系統中讀數且測 定珠粒相關螢光。若dAb阻斷TNF-(x與TNFR1之結合，則 螢光強度將減小。
使用ABI 8200分析軟體分析資料。使用GraphPad Prism 及具有可變斜率之S形劑量反應曲線測定濃度效應曲線及 效價（EC5〇)值。在三種獨立的情形下重複檢定。各實驗中 包括TNF-α劑量曲線（圖38及39)。所使用之與dAb競爭以結 合TNFR1之TNF-a濃度（10 ng/ml)在該檢定中為最大TNF-a 反應之約90%。 圖39中展示代表性曲線圖，其展示dAb抑制TNF-a與 TNFR1之結合之能力。在所有三個實，驗中，陰性對照樣品 (HEL4，抗雞蛋白溶菌酶dAb及VH模擬物）在高濃度下微弱 抑制TNF-tx與TNFR1之間的相互作用。表2中展示測試樣品 及陽性對照（自R&D Systems獲得之抗TNFR1 mAb， mAb225)及 EnbrelTM(依那西普（etanercept);由連接於IgGl Fc部分之TNFR2組成之二聚融合物；經許可用於治療類風 濕性關節炎）的平均效價（EC5〇)值。 表2 :三個重複實驗之TNFR1受體結合檢定中DOM1H-131-202、DOM1H-13 1-206 及 DOM1H-131-511 之效價（EC50)值 131416.doc -137 - 200902551 樣品 平均 EC5G(nM) SEM DOM1H-131-202 0.11 0.008 DOM1H-131-206 0.07 0.01 DOM1H-131-511 0.19 0.01 Enbrel™(Etanercept) 0.20 0.07 抗TNFR1 mAb #mAb225 0.08 0.003 在該檢定中，DOM 1 h-1 3 1 -206似乎比正測試之其他兩種 dAb 有效且與市售抗 TNFR1 mAb，MAB225(R and D Systems)具有類似效價。
如下文所述進行來自馬斯德畢赤酵母之前導純系之表 現： 使用三個前導分子之一級胺基酸序列產生分泌表現於馬 斯德畢赤酵母中之密碼子優化基因。密碼子優化D〇m 1H- 13 1-206與非密碼子優化DOM1H-1 3 1-206之間存在75%之序 列一致性。將三個合成基因選殖於表現載體ppic_Za(來自
Invitrogen)中’且隨後轉型為兩個畢赤酵母菌株X33&km 71Η。將轉型細胞濾出置於遞增濃度之芥森（Zeocin)(100、 300、600及900 pg/m丨）上以選擇具有多個整合子（integrant) 之、:屯系。選擇各個細胞系及構築體的約15個純系以用於表 現篩k目為馬斯德畢赤酵母中高/低基因複本數與表現 3里之間的相關性尚未完全理解，所以在整個芥森濃度範 圍内挑選數個紬糸。# m Α ^ '、吏用尚未就高產量進行廣泛篩選之純 系進行5L醱酵罐運粁。 日 逆订此使侍產生大量用於進一步研究之 物質。 用於蛋白質表徵之物質產 已廣泛使用基於蛋白質 生： A之層析樹脂自微生物培養上 清 131416.doc •138- 200902551 液中純KVH dAb。雖然此舉使得單步純化方法產生高純度 (在大多數情況下通常>90%)材料，但對於一些分子，低pH 值溶離條件會導致形成聚集體。亦存在用於dAb之親和力 樹脂之容量受到限制之問題，此將意謂使用大量樹脂來加 工來自醱酵罐之物。為產生用於表徵且進—步用於穩定性 及喷霧器研究之高品質物質，使用混合模態電荷感應樹脂 (mixed modal charge induction resin)將下游的純化過程設 計為初級捕獲步，驟，接諸離子錢。未顯著優化，此允 許回收約70%之純度為約95%之表現dAb。 對於混合模態電荷感應樹脂，來自GE Healthcare之 Capto MMC上之捕獲步驟，使用5〇 mM磷酸鈉（pH 6〇)執 行管柱平衡且在不需要任何稀釋液4pH值調節之情況下加 載上清液。洗滌管柱後，使用為5〇 mM Tris(pH 9 〇)之溶 離緩衝液由pH梯度溶離蛋白質。特定洗滌及梯度條件將略 視正溶離之蛋白質之pi而變化。
Ik後使用陰離子交換層析用流經步驟（fl〇w thr〇ugh step) 進一步純化溶離液峰。此舉可移除諸如醇氧化酶之殘餘 HMW巧染且減少内毒素。使樹脂與PBS或無鹽之磷酸鹽緩 衝液（pH 7.4)平衡。將來自Capt。MMC之溶離液加載於陰 離子父換樹脂上之後，dAb不結合且由流經步驟回收。内 毒素及其他污杂物與樹脂結合。鹽之存在（若使用pBs緩衝 液）使该步驟之蛋白質回收率提高為91% ’而非無鹽情況下 所達成之86。/。回收率。然而，鹽之存在會降低内毒素移除 之效力’以致與當不存在鹽時所獲得之<1〇 EU/mlidAb 131416.doc -139· 200902551 之内毒素含量相比，包括鹽之該步驟之後的典型含量經量 測為 58 EU/ml。 蛋白質表徵： 使用電喷霧質譜、胺基末端測序及等電聚焦表徵由5 L醱 酵罐運行所產生之物質的一致性，且使用SDS-PAGE、 SEC及Gelcode醣蛋白染色套組（Pierce)表徵純度。 一致性： 各蛋白質之第一個5殘基之胺基末端序列分析係如所預 期（EVQLL...)。使用C4 Zip尖頭（MiUipore)對已緩衝液交 換於含有0.1%冰醋酸之50:50 HA:乙腈中之蛋白質樣品執 行質譜分析。三種蛋白質中每一種之量測質量當允許因形 成内部雙硫鍵而產生之-2的質量差時係在基於一級胺基酸 序列之理論質量（使用平均質量計算）之〇·5 Da範圍内。使 用IEF基於對於各蛋白質為不同之鑑別蛋白質。 純度： 將三種蛋白質以1叫及1G 之量—式兩份裝载於非還原 SDS-PAGE凝膠上。在所有情況下，觀察到單一帶。亦執 行尺寸排阻層析以顯示純度級。對於尺寸排阻層析 (SEC) ’將100盹各蛋白質裝載於T〇s〇H G2〇〇〇 8界虹管 柱上，在0.5 ml/min下流動。移動相為pBS/1〇%乙醇。 研究dAb穩定性用於候選物選擇： 對於COPD適應症，將有必要（例如）使用嗔霧器農置傳 遞dAb至肺中。此將意謂視所使用之喷霧器類型而定蛋白 質可潛在經歷-定範圍之剪切應力及熱應力且在肺環境下 131416.doc -140- 200902551 可經受蛋白酶酶促降解。已確^蛋白質可使用該類型之 裝置傳遞’則其形成適當粒度分布且在噴霧器傳遞後保留 魏。因&，研究各分子對—定範圍之物理應力之固有穩 定性以確定指示基線穩定性及最敏感穩定性之檢定。因為 各蛋白質之穩定性將依賴於各蛋白質料於纟中之緩衝溶 液所以些預調配研究為必需的。該諸如緩衝液、1?^1值 之資訊亦適用於理解下游純化過程及隨後儲存期間蛋白質 之穩疋性。為表徵暴露於一定範圍之物理應力期間分子之 變化使用大量分析技術，諸如尺寸排阻層析（SEC)、 SDS-PAGE及等電點聚焦（mF)。 DOM1H-131-202、DOM1H-131-511 及 DOM1H-131-206 之蛋 白酶穩定性之評定： 在過里蛋白轉中預培養規定時間點後由BIAc〇reTM分析 殘餘結合活性評定DOM1H-13 1-202、DOM1H-131-511及 DOM1H-131-206之蛋白酶穩定性。將約14〇〇 RU經生物素 標記TNTRT塗佈於抗生蛋白鏈菌素（SA)晶片上。在3(Γ(：下 使 250 nM DOM1H-131-202、DOM1H-131-511 及 DOM1H- 131-206與僅PBS—起或與10〇叫/…胰蛋白酶、彈性蛋白 酶或白企球酶一起培養1、3及24小時。藉由添加蛋白酶抑 制劑/見合物使反應停止。然後使用參考池扣除法（reference cell subtraction)使dAb/蛋白酶混合物越過TNFR1塗佈晶 片。在每次注射循環之間用1〇 μ1 〇丨Μ甘胺酸（pH 2.2)使 晶片表面再生。相對於無蛋白酶之dAb結合，測定結合與 蛋白酶一起預培養之人類TNFR1(在10秒内）之DOM1H- 131416.doc • 141 - 200902551 13 1-202、DOM1H-131-511 及 D〇M1H_131_2〇_ 比例。在 25 C下進行BIAcoreTM運行。由三個獨立的實驗產生資料。 條形圖指示平均值且誤差棒指示結果之標準偏差（關於結 果，參見圖24)。 已發現，與 DOM1H-131-511相比，展示 DOM1H-131-202 及DOM1H-13 1-206具有較高胰蛋白酶、彈性蛋白酶或白血 球酶蛋白質降解抗性。與〇〇!^111-131-511相比，〇01^1^1-
13 1-2 02與DOM1H-1 3 1-206之間的差異在與胰蛋白酶一起1 小時後及與彈性蛋白酶或白血球酶一起3小時後最明顯。 如使用DSC所測定之熱穩定性： 為測定在何pH值下分子具有最大穩定性，使用差示掃描 量熱計（DSC)量測各dAb在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中之熔融 溫度（Tm)。當伯瑞坦-魯賓遜係由三組分緩衝液系統（乙酸 鹽、磷酸鹽及硼酸鹽）構成時，在同一溶液中有可能產生3_ 1 〇範圍内之pH值。由蛋白質一級胺基酸序列確定理論pI。 由DSC ’可見dAb具有最大内在熱穩定性之pH值對 DOM1H-131-202 (202)而言為 pH 7，對 DOM1H-131-206 (206)而言為 pH 7-7.5，且對 D0M1H-1 3 1-511 (511)而言為 pH 7·5。關於所有隨後應力及穩定性研究，對於各dAb使 用以下pH值：在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中，對於DOM1H-131-202 (202)及 DOM1H-131-206 (206)，pH 7.0 ;且對於 DOM1H-131-511 (511)，pH 7,5。結果概述於下表 3 中： 131416.doc •142· 200902551 表3 :如由DSC所測定於伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中之1 mg/ml DOM1H-131-202 (202)、DOM1H-131-206 (206)及 DOM1H-131-511 (511)之 pH&Tm 的概述 dAb 產生取大固有熱穩定性之nH佶 在給定pH值下dAb之Tm (°C) DOM1H-131-202 (202) 7.0 ' 68 6 DOM1H-131-206 (206) 7.0-7.5 '- 65 8 DUM1H-131-511 (511) 7.5 '~~- 58.0 固有溶解度測試： 在離心Vivaspin濃縮器（5K截止點）中濃縮所有前導湯
以確定其最大溶解度及濃縮後之回收含量。在伯瑞坦_魯 賓遜緩衝液中在最穩定pH值下執行實驗。經一定時程量測 樣品體積及濃度，且記錄與預期濃度之偏差以及樣品回收 百分率。 已發現’所有蛋白質均可在伯瑞坦_魯賓遜緩衝液中濃 縮至超過100 mg/m卜雖然與D0M1H_131_5U (511)相比， D Ο Μ1Η -1 3 1 - 2 0 2 ( 2 0 2)盘 D Ο ΜΓ1 Η 1 q 1 q λ / V 幻/'UUM1H-13 1-206 (206)展示比預期 低之回收率，但仍在可接受之水準内。 前導dAb之噴霧器傳遞： 藉由測.式不同喷霧态及調配物緩衝液，已證明dAb可使 用廣泛範圍之嘴霧裝置有效傳遞。更重要地，首次展示 dAb於調配物緩衝液中之噴霧產生有效肺傳遞想要之粒度 分布（使用<5 μπι之液滴之百公、玄，, 汉，同惑白刀率進行比較），同時維持蛋 白質功能性。此進一步描述如下。 比較多種裝置中之效能·· 在六個喷霧器裝置中測SD0M1H131_511 (511)，該六 131416.doc -143- 200902551 個喷霧n裝置包含三個主要種類之液體調配物喷霧器（亦 即，超音喷霧器、噴射噴霧器及振網喷霧器）之每一類的 各兩個裝置。在各裝置中，在-定範圍之PEG濃度下，測 試5 mg/ml dAb。對於各樣品，使用MaWern加吵以 Device(MalVern lnstru_ts Limhed，υκ)量測 <5 叫之液 滴尺寸之百刀率且結果展示於圖35中。使用SEc評定各樣 品喷霧後之穩定性以分析已二聚於殘留在杯中及所收集之 氣霧劑中之物質中的樣品的量。結果可見於圖36中。二聚 體形成程度越小’穩定性越高。 大多數裝置可傳遞40%或更多的適當尺寸範圍内之液體 調配物，但eFlow(振網噴霧器裝置）及pARI lC(喷射噴霧 器）裝置表現更佳’其中當緩衝液中包括pEG時，pari LC*(生號）裝置傳遞超過8〇 %。由ep ι〇ν/亦觀察到因peg該 傳遞之增加，對於PARI LC+，程度較小。 重要地’亦發現，dAb之活性在喷霧後仍保留（參見圖8 中之結果）。 緩衝液添加劑之效應： 由於DOM1H-131-511 (511)之較低穩定性，50 mM磷酸 鹽調配物緩衝液含有PEG 1000與蔗糖（且具有定義為約等 於約2%至約1〇% pEG 1000於含有1.2% w/v蔗糖之5〇 酸鹽緩衝液中之溶液黏度之範圍内的黏度）以有助於保護 dAb以免受剪切應力與熱應力。當DOM1H-131-202 (202)及 DOM1H-131-206 (206)具有較高Tm且展示顯著増加之熱應 力穩定性時，在原始調配物緩衝液中及伯瑞坦-魯賓遜緩 131416.doc -144- 200902551 衝液（其具有比調配物緩衝液低之黏度）中測試 叮有分子。 在5 mg/ml之蛋白質濃度下在3·5分鐘之運行時間内在e flow與 Pari LC+裝置中測試dAb且使用 MalVern Spfaytek
Device測定粒度分布。作為比較，使用噴霧器裝置傳遞之 用於膀胱纖維化之市售藥物（命名為標準蛋白質χ)在其自 身調配物緩衝液中測試。結果展示於圖3 7中。 句後传良好 傳遞及於深肺中之分配，理想粒度小於6微米，例如。 所有dAb在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液與調配物緩衝液（如先前 所述）中均得到小於5 μηι之可比較級別之粒度。然而，碉 配物緩衝液之較高黏度尤其可有利產生適當尺寸範圍内之 粒子，例如<5 μπι之粒子。在喷霧之前及之後由八㈣量測 法測定裝置之杯中dAb之濃度。已發現，}白質濃度並未 顯著變化，指示蛋白質與媒劑在傳遞期間均不會優先喷 霧。 、 結論 · 如上所述，已證明諸如dAb之多肽可在大量市售噴霧器 U中喷霧’ i重要地’其在噴霧後保留穩定性及生物活 性，且喷霧後未觀察到顯著聚集。當向緩衝液調配物中添 加諸如PEG之黏度增強賦形劑時’粒度分布及小於5叫之 液滴尺寸百刀率得以改良，因此潛在改良dAb至深肺之傳 遞。
Ab至肺之傳遞亦可藉由增加濃度、例如高達約4〇 mg/ml之濃度及傳遞時間來改良而無·穩定性或活性之 任何降低。 131416.doc -145- 200902551 實例1 噬菌體載體pDOM13 使用絲狀噬菌體（fd)呈現載體pDOM13。該載體與噬菌 體外殼蛋白III產生融合蛋白。圖1中說明pDOM13之多個 選殖位點。將編碼dAb之基因選殖為心片段。 實例2 測試蛋白酶對具有一定範圍之联蛋白酶抗性之嗤菌體呈 現區域抗體（dAb)的選擇
將編碼結合IL-1R1之dAb DOM4-130-54、結合TNFR1之 DOMlh-131-511 及結合 VEGFA 之 DOM15-10、DOM15-26 及 DOM15-26-501的基因選殖於pDOM 13中，且根據標準技術 產生呈現該等dAb之噬菌體。將噬菌體由Peg沈澱純化， 再懸浮於PB S中且測力價。 當以經分離蛋白質形式測試時，上述dAb展示一定範圍 之抗胰蛋白酶降解之能力。如下評定抗降解性：在3〇它下 將40 pg/ml於PBS中之dAb(l mg/ml)與胰蛋白酶一起培養， 產生25:1 dAb:胰蛋白酶之分子比。添加胰蛋白酶之前即 刻，且隨後在τ=ι小時、3小時及24小時時採集樣品（3〇 μΐ)。藉由添加Roche完全蛋白酶抑制劑（2χ)中和蛋白酶活 性，接著浸入液氮中且儲存於乾冰上。隨後藉由在Ν〇νεχ 10-20% THcine凝膠上電泳分析15叫各^匕樣品，且用 SureBlue(lx)染色蛋白質。 第一個3小時期間，D〇M15-1(mD〇M15_26_5〇1顯著分 解。DOM15-26、D〇M4-l30-54 &D〇Mlh_131_5n 較穩 131416.doc •146· 200902551 定，其中dAb之分解僅在24小時後變得明顯（圖2)。 亦在胰蛋白酶存在下培養嗟菌體呈現dAb以評估嗟菌體 ^見dAb之胰蛋白酶抗性是否與由經分離可溶性_所獲 得之結果相關。測試多種濃度之胰蛋白酶及培養時間。在 所有狀況下，用Roche完全蛋白酶抑制劑中和胰蛋白酶 後，測試嗟菌體結合-般配位體：蛋自質A(其結合所有％ 區域抗體（例如，DOMlh-131、DOM15-26、DOM15_26_ 501))或蛋白質L(其結合所有l區域抗體（例如，d〇m4_ 130-54、DQM15-1G))之能力。亦測試嗟菌體與革巴抗原之結 合。在該兩種狀況下，認為結合與因經抗蛋白水解性 dAb結構完整性相M。由EUSA(使用針對嗟菌體之接合抗 體）或由溶離所結合之噬菌體及指數生長大腸桿菌tgi細胞 感染後進行力價分析來量測結合活性。 用 DOM15-10、DOM15_26AD〇M15_26 5〇1 測試噬菌體 在室溫下在一定範圍之胰蛋白酶濃度（1〇〇 pg/rnl及〇 pg/mi)下，將各_處理1小時。用R〇che完全蛋 白酶抑制劑（1χ)阻斷胰蛋白酶活性，且隨後將噬菌體稀釋 於PBS中之2% Marvel!中’在室溫下與5〇福經生物素標記 抗原（重組人類VEGF(R & D systems))—起培養卜j、時。添 加在室溫下用PBS中之2% Marvell預阻斷1小時之抗生蛋白 鏈菌素塗佈微珠（Dynabeads M_280(Invitrogen))，且隨後在 室溫下將混合物培養5分鐘。所有一起培養之 步驟均在轉輪上進行。藉由用J ml於pBS中之〇 1 % Tween-20洗 滌珠粒 8次洗除未結合噬菌體 。用 〇. 5 ml 〇 丨 M甘胺酸 131416.doc -147- 200902551 (卩^12.2)溶離所結合噬菌體且用1〇()(^11^1^3_]9[(：1^1^ 8.0)中和。使用溶離噬菌體感染指數生長之To〗細胞（在 37°C下1小時）且塗鋪於四環素板上。在37t：下將板培養隔 夜，且進行菌落計數（參見表4)。由與1〇〇 pg/ml胰蛋白酶 起培養之遠擇觀察到最佳結果。與d〇M15_1〇及 26-501相比，D〇M15_26之產率增加約1〇倍。
進行第二實驗以在更苛刻培養條件下進一步證實該等結 果。在攪拌（250 rpm)下在將噬菌體呈現dAb處理丨小 守或2小日寸。由與1〇〇 μβ/ηι1胰蛋白酶一起培養2小時之選擇 觀察到最佳結|。0隨5_26之產率比D咖5·26_5〇ι之產 率高200倍且比DOM15-10之產率高10〇〇倍。 在第二實驗中，開始時將呈現D〇Ml5_26及 5〇1之巫菌體ι:1混合。隨後在搜拌（25〇 下在37。〇下在 有胰蛋白酶(1000 μ§/ιη1)或無胰蛋白酶之情況下將其培養2 J寺且隨後如上所述就抗原結合加以選擇。測序來自各 選擇之1 0個菌落，對於無胰蛋白酶預處理之選擇，揭露純 系混合群體（D〇M15_26 : 4/1〇 ; D〇Ml5心〇ι : 6/1〇), 而有胰蛋白酶進行選擇之所有純系如所預期編碼d〇mi5_ 26 ° 該等實驗指示選擇壓力可藉由向嗟菌體呈現中添加 蛋白酶來獲得’以致優先選擇呈現蛋白水解最穩定之dAb 之°盈菌體（在淘選一般配位體或抗原之後）。 131416.doc •148· 200902551 表4 實驗 培養時間 長短 溫度 胰蛋白酶 濃度 DOM15-26力價 DOM15- 26-501 力價 1 輸入1〇10 lhr 室溫 100 pg/ml 1.6χ108 6.3χ107 lhr 室溫 10 μ^ιηΐ 3χ108 4.4x10s lhr 室溫 0 μ§/ηι1 0.9χ108 2χ108 2 輸入109 lhr， 250 rpm 37〇C 100 μ§/ηι1 2χ107 1χ 106 2 hr > 250 rpm 37〇C 100 μ§/ιη1 1χ107 6χ104 2 hr » 250 rpm 37〇C 0 μ^ΓηΙ 5.4χ107 4.1 χΙΟ7 3 輸入1(Γ 2h， 250 rpm 37〇C 100 pg/ml 2.3χ108 8χ105 2h， 250 rpm 37〇C 0 μ^ηιΐ 3.9x10s 4.4x10s
用DOM4-130-54測試噬菌體 以如上所述之類似方案測試DOM4-1 30-54。變化之參數 為：胰蛋白酶之濃度、溫度及培養時間長短。針對IL-RI-Fc(IL-lRl與Fc之融合物）在1 nM於PBS中之濃度下進行生 物淘選。僅在37°C下使噬菌體與100 pg/ml胰蛋白酶一起培 養隔夜後才觀察到噬菌體力價之顯著降低（參見表5)。
表5 培養時間長短 溫度 胰蛋白酶濃度 力價 1 hr 室溫 100 μ§/ηι1 1.8χ10]〇 1 hr 室溫 10 pg/ml 7.2xl09 1 hr 室溫 0 pg/ml 6.6xl09 隔夜 室溫 100 pg/ml 2.16xl09 隔夜 室溫 10 pg/ml 7.2xl09 隔夜 室溫 0 pg/ml 7.8xl09 隔仪 37〇C 100 pg/ml 2.04xl06 隔夜 37°C 10 pg/ml 3.84xl08 隔仪 37〇C 0 pg/ml 7.2xl09 131416.doc -149- 200902551 用DOMlh-131測試噬菌體 在室溫下用 0 pg/ml、10 pg/ml、100 pg/ml及 1000 pg /ml 胰蛋白酶處理DOMlh-131噬菌體（胺基酸序列與DOMlh-131 -5 11 密 切相關 ） 1 小時 。藉 由添加 25 χ 完全 蛋白酶 抑制劑 (Roche)抑制分解。沿著塗佈有lnMTNFRl之ELISA板進 行噬菌體之2倍連續稀釋，且用抗M13-HRP偵測結合噬菌 體。結果展示下表6中。 表6 0 284 0.229 0.183 0,133 0.114 0.089 0.084 0.080
0.409 0.286 0.213 0.284 0.196 0.141 0.115 0.084 0.084 4.51E+10 2.26E+10 1.13E+10 5.64E+09 2.82E+09 1.41E+09 7.05E+08 3.52E+08 DOMlh-131 胰蛋白酶濃度 1 mg/ml 100 pg/ml K) pg/ml 0 pg/ml 嗟菌體輸入 該等測試實驗顯然展示100 pg/ml胰蛋白酶及37°C之溫度 適於將選擇壓力應用於呈現多種抗胰蛋白酶蛋白水解程度 之dAb之噬菌體上。必要時，可優化各噬菌體呈現dAb之 蛋白酶培養時間。 實例3 噬菌體呈現區域抗體譜系之蛋白酶選擇 使用以下dAb作為親本分子建立四個譜系：DOM4-1 30-54、DOMlh-13 卜 511、DOM15-10 及 DOM1 5-26-555。使用 Stratagene Mutazyme II套組、經生物素標記引子及供50 μΐ 131416.doc -150- 200902551 反應用之5-50 pg模板由PCR在基因中引入隨機突變。用 6WI及iVoil分解後，用抗生蛋白鏈菌素塗佈微珠自未分解 產物中純化插入物且使其在相應位點連接於pDOM 1 3中。 用純化連接混合物使大腸桿菌TB 1細胞轉型，從而產生四 環素抗性純系大譜系：8.5xl08(DOM4-130-54)、1.5xl09(DOMlh-131-511)、6xl08(DOM15-10)及 3xl09(DOM15-26-555)。 藉由以PEG雙重沈澱製備噬菌體庫且再懸浮於pbs中。
胺基酸突變率對DOMlh-131-511及DOM4-130-54譜系而 言分別為2.3及4.4。藉由在噬菌體ELISA中使用塗佈有蛋 白質A或蛋白質L(1 pg/ml)之孔測試96個純系評定功能性。 在〇〇1^111-131-511及〇〇]\44-13 0-54譜系中分別有62.5%及 27%之純系展示功能性呈現dAb。 胺基酸突變率對DOM15-10及DOM1 5-26-555譜系而言分 別為2.5及4.6。藉由在噬菌體ELISA中使用塗佈有蛋白質A 或蛋白質L(1 pg/rnl)之孔測試96個純系來評定功能性。在 DOM1 5-10及 DOM1 5-26-555譜系中分別有 3 1.3%及 10.4%之 純系展不功能性呈現dAb。 DOM4-130-54及 DOMlh-131-511 譜系 對該等庫進行4輪選擇以選擇具有改良蛋白酶抗性之 dAb。 第1輪選擇係抗原結合（1 nM或1 〇 nM抗原）而無蛋白酶處 理從而淨化庫以移除不再以高親和力結合抗原之任何純 系。第1輪之輪出係在108_1〇ι〇範圍内（與1〇11噬菌體之輸入 升> 成對比）’指示庫之大部分以高親和力結合抗原。 131416.doc -151 - 200902551 在第2輪中引入100 pg/ml胰蛋白酶之蛋白酶處理，且輸 出展示於下表7中： 表7
畲在37。〇下用胰蛋白酶處理dAb隔夜時，存在顯著選 擇。將該輸出物送至第3輪，其中在37t：下用i mg/ml或 WO pg/ml胰蛋白酶處理噬菌體24小時。來自第3輪之經胰 蛋白酶處理過之噬菌體的力價對DOMlh-131-511譜系而言 為 1〇5-106且對 DOM4-130-154譜系而言為 1〇7_1〇8。 來自第3輪之所有輸出物（D〇Ivnh-l31-511 &D〇M4-130-154, i mg/ml&100叫/111丨）在1〇〇叫/M胰蛋白酶下經受針 對1 ηΜ抗原之第4輪選擇。類似於第3輪中所見，力價係在 1〇6-1〇8範圍内。對於DONUh-UldU譜系可見一些富集， 而對於DOM4-130-54譜系無富集。 DOM15-10及 DOM15-26-555譜系 第1輪選擇係用2 ηΜ經生物素標記hVEGF(人類血管内皮 生長因子）濃縮物來進行而無蛋白酶處理從而淨化庫以移 除不再以高親和力結合抗原之任何純系。第丨輪之輪出為 約 (與 D〇M15-1〇 之 H)】〇噬菌體及 d〇mi5_26_555《i〇]i^ 菌體之輸入形成對比），指示庫之大部分以高親和力結2 131416.doc •152· 200902551 抗原。 用2 nM經生物素標記hVEGF執行第2及第3輪選擇。在對 hVEGF淘選之前，在37t下在震S器（250 rpm)中在騰蛋白 酶（1〇〇 Kg/ml)存在下培養噬菌體。培養時間對D〇Mi5_i〇 譜系而言為1小時且對£)01^15_26_555譜系而言2小時。 輸出如下：DOM15-10譜系之第2及第3輪選擇為丨乃叫… 及9xl05 ; DOM15-26-555之第2及第3輪選擇為2.2xl〇8及 3.9xl09。
實例4 分析選擇輸出物：DOM4-130-54及DOMlh-131-511譜系 將來自第3及第4輪之所有輸出物亞選殖於pD〇M5載體中 且轉型於JM83細胞中。pd〇M5載體為pUC119基載體。由 Plac啟動子驅動蛋白質之表現。GAS1前導序列（參見w〇 2005/093074)確保經分離可溶性dAb分泌於大腸桿菌JM83 之周質及培養上清液中。隨機挑選96個及72個來自第3輪 及第4輪之個體菌落來表現。 對第3輪及第4輪輸出物之各i 2-24個純系進行測序。在 該兩輪選擇中觀察到一致突變且挑選約25個持有一致基序 (consensus motif)之純系來進一步表徵。該等純系之胺基 酸序列展示於圖3(DOMlh-131-511所選擇之變異體）及圖 4(DOM4-130-54所選擇之變異體）中且以DNA序列形式列於 圖19A-19L中。突出所選擇之純系中不同於親本序列的胺 基酸（彼等一致胺基酸由點標記）。對應於CDRi、CDR2及 CDR3之環用框勾畫。 131416.doc •153- 200902551 該等純系係以大量表現，在蛋白f LWd〇m4_i3〇_5^ 異體而言）及蛋白質A(就D〇Mlh_13l_5 n變異體而言）上純 化且在存在或不存在胰蛋白酶（最終濃度為1〇〇㈣或 1000 μ8/ΙΏΐ)之情況下在37°c下培養1小時或隔夜後就抗原 結合以BIAcore方式測試。 來自D〇M4-130_54選擇之輸出物通常較穩定，大多數純 系保留胰蛋白酶抗性i小時且最佳純系保留隔夜。比較而
言’來自DOMlh_131_511選擇之少量純系抗胰蛋白酶h、 時’而無純系抗胰蛋白酶隔夜。 實例5 分析選擇輸出物：DOM1S-10及DOM15-26-555譜系 首先以單株噬菌體ELISA方式在存在或不存在胰蛋白酶 分解之情況下測試經胰蛋白酶預處理之選擇有效性。挑選 各庫之來自第2輪選擇之18個菌落及來自第3輪選擇之24個 ΐί 落。使用純系 DOM15-10、DOM15-26-501 及 DOM15-26 作為對照。其他對照包括第2及第3輪姨蛋白酶選擇後來自 各庫之擴增且純化的噬菌體溶液。 將各噬菌體樣品分為兩部分，第一部分用丨〇〇 μ§/ίη1胰蛋 白酶處理’第二部分不用胰蛋白酶處理。在37。〇下在攪拌 (25〇 rpm)下將該兩個部分培養1小時’且藉由添加R〇che完 全蛋白酶抑制劑（1 X)阻斷。 使用經胰蛋白酶分解及未經分解樣品執行噬菌體 ELISA。使ELISA孔塗佈有濃度為之於〇.1 μ碳酸氫 鹽緩衝液中之中性鏈親和素。用PBS進行洗滌及在室溫下 131416.doc -154- 200902551 用1%於PBS中之Tween-20阻斷抗原塗佈孔1小時之步驟 後’使孔塗佈有濃度為100 ng/mi之稀釋於ρ/。於pBS中之 Tween-20中的經生物素標記hVEGF。接著，用PBS洗滌各 孔且添加用1% Tween_2〇/pBS 1:1稀釋之經處理或未經處理 之1&菌體上清液。在37T：下培養30分鐘後，用1。/〇 Tween_ 2〇/PBS洗滌孔，接著在37°C下與抗M13噬菌體-HRP接合物 (1/5〇〇〇稀釋於1% 丁ween_2〇/PBS中）一起培養3〇分鐘。隨後 用PBS及過氧化酶洗滌孔。藉由添加試劑啓始反 應。約1〇分鐘後，用等效體積！ M HC1使反應停止，且在 OD45O nM下讀取孑匕。 、，二胰蛋白酶處理之不穩定對照D〇M1 5_丨〇及 501之ELISA讀數給出低於〇4〇4i〇D45G，且認為該值為不 穩定純系之邊界值。產生低於請4之㈤之所有樣品視為 不穩定。超過彼值之所有樣品視為穩定。 表8
表8展示各庫之第2及第3輪胰蛋白酶選擇後穩定純系之 百分率。第3輪選擇後，兮 么〇 。亥兩個庫巾可見胰蛋白酶抗性純 : 各狀況下1蛋白酶分解後，每次選擇後含 有擴&、、4化％菌體混合物之對照elisa 〇·4。4。此外’當比較來自第3輪選擇之騰蛋白酶處= 體與來自第2輪選擇之胰^ u 、擇之胰蛋白酶處理噬菌體時，觀察到信 131416.doc -155. 200902551 號小幅增加。dqmb]㈣菌體庫展示該起始值之約14% 之增加。DOM15_26-555 _體庫展示代表該起始值之約 2 %之增加。 所有該等結果展示經胰蛋白酶預處理之選擇係有效自 DOM15-1G及DOM15-26-555譜系、選擇胰蛋白酶抗性嗟菌體 純系。 將來自第2及第3輪選擇（D〇M15_26_555)及僅來自第3輪 選擇（DOM15-10)之所有輸出物亞選殖於ρ〇〇Μ5載體中且 轉型於HB2151電穿孔法勝任細胞⑷ectr〇c_petent ceu) 中。pDOM5載體為PUC119基載體。由？1扣啟動子驅動蛋白 質表現。GAS1珂導序列確保經分離可溶性dAb分泌於大腸 才干菌HB2 1 5 1之周質及培養上清液中。隨機挑選i 84個來自 各輪選擇（3及4)之個體集落來在〗mi培養物體積中表現。 將細菌上;^液稀釋於HBS-EP BIAcore緩衝液（1:1體積比） 中且分成兩份。僅向一個小瓶中添加胰蛋白酶，最終濃度 為20 Kg/m卜在攪拌（250 rpm)下在37°C下培養4〇分鐘。用 Roche完全蛋白酶抑制劑（lx)阻斷反應後，在mAc〇re 3〇〇〇 上就抗原結合（SA感應器晶片上之2,〇〇〇 ru經生物素標記 hVEGF)測試經胰蛋白酶處理與未經處理之噬菌體上清 液。 挑遥純系之標準為：相對於未經處理之dAb，< 1 5%之經 肤蛋白S#處理之dAb的抗原結合減小（基於在所選擇之時點 所達到之最大RU) ’此通常將反映dAb對蛋白酶處理之穩 定性；及dAb自抗原解離期間，兩個時點之間的解離速率 131416.doc -156- 200902551
減】40/°。基於該等值，對60個來自DOMl 5-26-555庫之 第2與第3輪選擇之純系及17個來自DOM1 5-10庫之第3輪選 擇之’、、屯系進行測序。在該兩個庫之輸出物中觀察到一致突 ’支，且自各持有一致基序之庫挑選17個純系來進一步表 徵。該等純系之胺基酸序列展示於圖5(D〇M15_26_555所 選擇之變異體）及圖6(DOM15-10所選擇之變異體）中，且以 DNA序列形式列於圖20A-20E中。突出所選擇之純系中不 Π於親本序列之胺基酸（彼等一致胺基酸由點標記）。對應 於CDR1、CDR2及CDR3之環由框勾晝。 將"玄專純系表現於5 〇 m 1表現培養物中，在稀釋於hb s_ EP緩衝液中至丨00 nM濃度之蛋白質a(就d〇m15-26-555變 異體而言）或蛋白質L(就DOM15-10變異體而言）上純化且在 存在或不存在胰蛋白酶（最終濃度為2〇 pg/ml)之情況下在 攪拌（250 rpm)下在37它下培養丨·5小時後就抗原結合以 BIAcore方式測試。 亦使用實例2中所述之方法測試該等純系胰蛋白酶抗 性。將蛋白質緩衝液交換至PBS中且濃縮至1 mg/ml。將25 Kg蛋白質與1 pg胰蛋白酶（Promega)混合且在30〇C下培養〇 小時及24小時。此後，用R0Che完全蛋白酶抑制劑（1 X)阻 斷反應’且添加DTT以及增重劑（loading agent)。使樣品在 1 00°C下變性5分鐘。隨後由電泳在Nov ex 1 0-20% Tri cine凝 膠上分析15gg各樣品，且用SureBlue(lx)染色蛋白質。 來自DOM1 5·26-555選擇之輸出物通常較穩定，當以 BIAcore方式測試時大多數純系保留騰蛋白酶抗性丨5小 131416.doc -157- 200902551 時，且當以SDS-PAGE方式運行時，保留隔夜。相比較而 言’當以SDS-PAGE方式運行時，對於隔夜處理，僅少量 來自DOM 15-10選擇之純系抗胰蛋白酶。 實例6 鑑別DOMlh-131-511變異體 更詳細地分析 DOMlh-131-203、DOMlh-131-204 及 DOMlh-13 1-206。在37°C下與不同濃度之騰蛋白酶（在〇至 100 gg/ml範圍内）一起培養隔夜後，以BIAcore方式在500 nM之dAb濃度下將其加以比較。BIAcore迹線展示於圖7 中。結果顯然展示在局》辰度騰蛋白酶（1〇〇 pg/ml)下該兩個 變異體比其親本對蛋白水解更具抗性。亦在上述條件下就 抗大量包括白血球酶、彈性蛋白酶及胰酶之其他蛋白酶而 言’在100 pg/ml之蛋白酶濃度下，比較兩個dAb DOMlh-13 1-202及DOMlh-13 1-206與其親本。與親本相比，dAb抗 所有所測試之蛋白酶之蛋白水解展示增加之抗性。彈性蛋 白酶及白jk球酶之BIAcore迹線展示於圖8中。 用100 pg/ml測序級胰蛋白酶處理5 μΜ各dAb 0、1、3及 24小時。用25X Roche完全蛋白酶抑制劑抑制反應，且使 反應物在4-12% Novex Bis-Tris凝膠上運行。凝膠展示於 圖9中。 實例7 鑑別DOM4-130-54變異體
更詳細地分析 DOM4-1 30-20 1 及 DOM4-130-202。在 37°C 下與不同濃度之胰蛋白酶（在0與100 pg/ml範圍内）一起培 131416.doc -158- 200902551
養隔夜後，以BIAcore方式在500 nM之dAb濃度下將其加以 比較。BIAcore迹線展示於圖1 0中。結果顯然展示在高濃 度胰蛋白酶（100 pg/ml)下所有三個變異體比其親本對蛋白 水解更具抗性。亦在上述條件下就抗大量包括白血球酶、 彈性蛋白酶及胰酶之其他蛋白酶而言，在100 pg/ml之蛋白 酶濃度下，比較DOM4-130-201及DOM4-130-202與親本。 雖然結果與在胰蛋白酶下相比不太明顯，但前導dAb與親 本相比對所有所測試之蛋白酶展示增加之抗蛋白水解性。 彈性蛋白酶及白血球酶之BIAcore迹線展示於圖11中。 用100 pg/ml測序級胰蛋白酶處理5 μΜ各dAb 0、1、3及 24小時。用25X Roche完全蛋白酶抑制劑抑制反應，且使反應 物在4-12%NovexBis-Tris凝膠上運行。凝膠展示於圖9中。 實例8 進一步表徵DOMlh-131-511 及 DOM4-130-54變異體 首先使用差示掃描量熱法（DSC)分析dAb以確定胰蛋白 酶抗性之增加是否與熔融溫度（Tm)之增加相關。胰蛋白酶 穩定性之增加確實與Tm之增加相關（參見表9)。 表9 名稱 Tm (°C) DOMlh-131-511 57.9 DOMlh-131-202 67.5 DOM lh-131-203 65.7 DOMlh-131-204 62.3 DOM lh-131-206 64.9 DOM4-130-54 54.1 DOM4-13 0-201 64.7 DOM4-130-202 64.5 131416.doc -159- 200902551 亦在MRC-5細胞基檢定（cell-based assay)中比較DOMlh-13卜511來源之dAb(參見表10)。在該檢定中，量測dAb中 和TNFa刺激之IL-8釋放之能力以確定联蛋白酶穩定性之增 加是否已使得功效降低。然而，胰蛋白酶抗性dAb之活性 在該檢定中大體上未受影響。 表10 樣品 ND50 (nM) DOMlh-131-511 1.98 DOMlh-131-511 1.71 DOMlh-131-511 (230307CE) 1.89 DOMlh-131-203 (230307CE) 2.28 DOMlh-131-204 (230307CE) 1.89 DOMlh-131-511 1.46 DOMlh-131-206 (230307CE) 0.71 在受體結合檢定中測試DOM4-130-54來源之dAb以瞭解 其是否仍具有相同的抑制IL-1與IL-RI結合之能力（參見表 11)。胰蛋白酶抗性dAb之活性在該檢定中未受影響。 表11
dAb IC50 (nM) DOM4-130-54 280 pM DOM4-13 0-201 257 pM DOM4-13 0-202 254 pM
實例9 鑑別DOM15-26-555變異體 更詳細地分析 DOM1 5-26-588、DOM1 5-26-589、 DOM1 5-26-591及DOM1 5-26-593以及其親本及兩個其他 dAb DOM15-26-594 及 DOM1 5-26-595，其係藉由組合將對 131416.doc -160 - 200902551 效價及穩定性產生最大影響之突變（E6V及F100S/I)之突變 誘發而創建。序列展示於圖12中。與濃度為200 pg/ml之胰 蛋白酶—起培養後在100 nM之dAb濃度下就hVEGF結合以 BIAcore方式比較純系。在攪拌（250 rpm)下在37。(：下使反 應進行3小時及24小時。最佳純系DOM15-26-593及親本之 BIAC0re迹線展示於圖13中。其他結果以圖表形式呈示於 圖1 4中。結果顯然展示在胰蛋白酶處理24小時後，所有變 異體比親本對蛋白水解更具抗性。
亦藉由以SDS-PAGE方式運行經處理及未經處理之樣品 來檢查DOM15-26-593及親本之胰蛋白酶抗性。簡言之， 將蛋白質緩衝液交換至PBS中且濃縮至1 mg/ml。將25料 蛋白質與1 gg測序級騰蛋白酶（pr〇mega)混合且在30。(3下培 養0小時、1小時、3小時及24小時。此後，用Roche完全蛋 白酶抑制劑（1 X)阻斷反應，且添加DTT以及增重劑。使樣 品在100°C下變性5分鐘。將15 pg各樣品加載於Novex 10-20% Tricine凝膠上，且用SureBlue(l X)染色蛋白質。結果 展示於圖15中。該實驗中DOM15-26-5 93之胰蛋白酶抗性 概況不同於BIAcore實驗所展示之概況，從而提示反應條 件之不同可能會影響胰蛋白酶裂解之最終結果。儘管如 此’如下文所示’ DOM15-26-593仍具有較其他所選擇之 純系佳之生物物理性質以及親和力。DOM1 5-26-555變異 體之性質之概述亦展示於下表1 2中。 131416.doc • 161 - 200902551 表12 屬性 ' ~~~ SEC-MALLS DSC RBA BIAcore 胰蛋白~~- dAb 單體％ 估算mw Tm(°C) nM KD (nM) 在+24 小 15-26 0 37-136 64 10 28.2 15-26-501 0-40 18-290 51 1.14 9.1 i ~~-------- 15-26-555 0 28-78 63 11.7 26.1 10 ^ 15-26-588 33 70 2Ί 59.1 Is '---'-- 15-26-589 90 17 63 1.94 9.6 65 —~- 15-26-591 ~20 21-234 63 16 38 35 ~~--- 15-26-593 80 17 65 0.323 3.2 80 ~- 15-26-595 60 17 65 0.828 5 "70 ·~~~--- 1 _ 實例1 0
鑑別DOM15-10變異體 更詳細地分析DOM15-10-11以及其親本DOM15-1〇。序 列展示於圖16中。與濃度為200 pg/ml之胰蛋白酶—起培養 後在100 nM之dAb濃度下就hVEGF結合以BIACOre方式比較 dAb。在攪拌（250 rpm)下在37°C下使反應進行1小時、3小 時及24小時。該等dAb之BIAcore迹線展示於圖17中。|士果 顯然展示在胰蛋白酶處理24小時後，所選擇之變異體比親 本對蛋白水解更具抗性。 亦藉由運行SDS-PAGE之經處理及未經處理之樣品檢查 月導分子及親本之胰蛋白酶抗性。簡言之，將蛋白質緩衝 液交換至PBS中且濃縮至i mg/mle將25叫蛋白質與1盹 測序級胰蛋白酶（promega)混合且在3〇t下培養〇小時、i小 時、3小時及24小時。此後，用—完全蛋白酶抑制劑 (lx)阻斷反應，且添加DTT以及增重劑。使樣品在i〇(rcT 變性5分鐘。將丨5叩各樣品加載於N〇vex 1〇_2〇%他刚凝 膠上，且用―(1χ)染色蛋白質。結果呈示於圖以 131416‘doc •162- 200902551 中。在此狀況下，胰蛋白酶抗性概況與BIAcore胰蛋白酶 測試充分相關，從而展示結合活性直接反映蛋白質之完整 性。 實例11 進一步表徵DOM15-26-555及DOM15-10變異體
首先使用差示掃描量熱法（DSC)分析dAb以確定胰蛋白 酶抗性之增加是否與T m之增加相關。結果展示於表13 中。DOM1 5-26-555變異體之胰蛋白酶抗性與熔融溫度之 間存在相關性。前導DOM15-26-588及DOM15-26-593展示 改良之Tm，但其他純系不展示。值得注意的是，雖然起 始時 DOM15-26-5 55 及 DOM15-10親本分子（63.3-63.7°C)具 有比DOM4-13 0-54及DOMlh-131-511親本分子（起始時 Tm : 57.9_54.1°C)高得多之Tm，但總之，蛋白酶抗性純系 達到類似範圍内之Tm(DOMlh-131-511/DOM4-130-54 變異 體之平均 Tm 為 65.1°C，DOM15-26-55/DOM15-10 變異體之 平均 Tm為 64.9°C)。 表13 名稱 Tm (°〇 DOM 15-26-555 63.3 DOM15-26-588 70.1 DOM15-26-589 63 DOM15-26-591 63 DOM15-26-593 65 DOM15-10 63.7 DOM15-10-11 63.3 在受體結合檢定中比較dAb，且量測BIAcore動力學以確 131416.doc -163- 200902551 定胰蛋白酶穩定性之增加是否已使得功效降低。然而， dAb之活性在該檢定中大體上未受影響或甚至得以改良。 結果呈示於表14中。 表14 純系ID EC5〇(nM) KD(nM) DOM15-26-555 11.7 26.1 DOM15-26-588 27 59.1 DOM15-26-589 1.94 9.6 DOM15-26-591 16 38 DOM15-26-593 0.323 3.2 DOM15-26-594 4.09 15.1 DOM15-26-595 0.828 5 DOM15-10 10.23 23.6 DOM15-10-11 3.58 14.6
Tm增加之優點 大多數蛋白質（包括區域抗體）以兩種狀態存在：摺疊狀 態（產生生物學活性分子）及展開狀態（不具有功能活性）。 該兩種狀態在所有溫度下共存且各狀態之相對比例通常由 隨摺疊及展開之動力學常數而變之常數K確定。熔融溫度 通常定義為κ=1之溫度，亦即，摺疊蛋白質之比例等於展 開蛋白質之比例時的溫度。常數K係由蛋白質之穩定及不 穩定分子内相互作用確定，且因此主要由蛋白質之胺基酸 序列確定。諸如溫度、pH值、緩衝液組成、壓力之外在參 數影響K，且因此影響熔融溫度。 展開蛋白質為降解機制之容易靶：（i)暴露雙硫鍵視境況 而定會增加氧化或減小之風險，（ii)增加主鏈靈活性可有 助於自身蛋白水解反應，（iii)暴露肽片段可提供活體内蛋 131416.doc -164- 200902551 白酶、製造過程期間蛋白酶及下游加工及長期儲存期間遺 留蛋白酶之革巴，及（iv)暴露有聚集傾向片段會導致分子間 聚集及蛋白貝沈殿。在所有狀況下，發生蛋白質完整性、 蛋白質3罝及蛋白質活性損失，從而危及⑴確保批次重現 性’⑼確保存放長_定性及间活體内功效之努力。 在自'、、、界中’蛋白質已藉由進化設計以適於在體溫下執 行且經由穩態機制玄_ & 制备易地置換。經由生物技術方法製造出 之治療蛋白質面對不同環境：其通常由讓重組技術在外 來佰：中產生’在大容器令以較高量表現，整個下游過程 中I又極重大之pH值或緩衝液組成變化且最後長期以高濃 度儲存在非生理學緩衝液中。新穎傳遞技術（例如吸入、 ◊、片’緩『又傳遞奈米粒子)亦會增加治療蛋白質所經 受之應力。最穩，茂 蛋白貝工程化技術之出現使得可產生妗 全新穎之治療蛋白質。因為大多數工程化技術為： ?又或創w新穎胺基醆序列之基於活體外之技術，不會 發生逐步改良峰物I & 蛋白貝之進化過程’因而產生在應力抗 方面具有次最佳效能之蛋白質。 本發明之技術旨名盈/ ^ Τ曰在再現整個達爾文進化（Darwinian evohmon)中蛋白質所面 塑及蛋白質穩態中發揮重要種。用在組織重 A ^ 室要作用之蛋白酶灌注肽或多肽 改/ I球蛋白單—可變區域)。亦測試任何可產生具有 々之^適應之蛋白質的特定突變的適應其表現環境之 匕。在本發明之一實施例中，再 肽變異體譜系且暴露於蛋 L冑立肤或多 变曰鲫中。在弟二步驟中，使變異 131416.doc -165 - 200902551 體譜系與特定靶接觸。僅彼等經受住蛋白酶降解之蛋白質 變異體能夠與靶接合，且因此（例如）由稱為"淘選"之簡單 親和力純化過程回收。與活體内過程相比，該系統提供多 個優點：蛋白質譜系可面對較寬範圍之條件，例如多種蛋 白酶、在較高濃度下、歷時較長時間、在不同緩衝液或pH 值下且在不同溫度下。因此，該活體外技術提供一種設計 可在較所起源之環境範圍寬之環境中表現且仍穩定的蛋白 質之方式。顯然，此為生物技術工業且尤其治療蛋白質領 (、 域提供多個優點。 實例12 :蛋白酶抗性前導分子之PK相關性資料 進一步在活體内評估四個dAb品系中之每一個品系之親 本dAb及蛋白酶抗性dAb(關於清單及詳情，參見下表15)。 表15 : 品系 dAb ID 胰蛋白酶抗性 TmfC) 活性(ιιΜ) Fc融合物形式之ID DOM4-130 DOM4-130-54 良好 54 0.128* DMS1541 DOM4-130-202 極局 64 0.160* DMS1542 DOMlh-131 DOMlh-131-511 良好 57 0.048f DMS1543 DOMlh-131-206 極尚 64 0.047f DMS1544 DOM15-10 DOM15-10 低 64 0.913f DMS1546 DOM15-10-11 南 63 0.577t DMS1531 DOM 15-26 DOM15-26-501 (*) 低 52 0.330f DMS1545 DOM15-26-593 65 0.033f DMS1529 * :如由MRC5/IL-a生物檢定所測定；t :如由RBA檢定所測定 註解：DOM15-26-501為本專利申請案中上文所例示之 DOM15-26-555 之親本形式。DOM15-26-555 在 CDR1(134M) 中具有一個生殖系胺基酸突變。DOM15-26-501具有比 DOM15-26-555低之熔融溫度（52 V對63.3 °C)及增加之對胰 蛋白酶之分解的敏感性。優於DOM15-26-555挑選DOM15- 131416.doc -166- 200902551 26-501用於PK研究，因為與DOM15-26-593相比，其更充 分代表不良穩定性。 吾人可如下解釋抗性： 1 低 2 中 3 良好 4 向 5 極向
則此意謂親本分子之胰蛋白酶抗性為： DOM4-130-54 良好 DOMlh-131-511 良好 DOM15-10 低 DOM15-26-501 低 關於所選擇之前導分子： DOM4-130-202 極高 DOMlh-131-206 極高 DOM15-10-11 高 DOM15-26-593 高 kDa)，所以其在靜脈内或 實際上，腎絲球過濾截止 因為區域抗體之尺寸小（12-15 皮下注射後自循環中快速清除。 點超過50 kDa，且因此諸如dAb之小蛋白質當其穿過腎時 不會保留在循環中。因&，為評估活體内蛋白酶抗性之長 期效應，吾人用増加全身性滯留之部分標記區域抗體。文 獻中已報導數冑旨在延長半衰期之方法（例如觸、&融 131416.doc -167- 200902551 合、白蛋白融合等）。在本申請案中，用人類IgGl抗體之 Fc部分標記區域抗體（或對其編排格式）。該格式提供兩個 優點：（i)所得dAb-Fc之分子尺寸為約75 kDa，其足夠大以 確保保留在循環中；（Π)抗體Fc部分結合FcRri受體（亦稱 ”布蘭貝爾"受體）。該受體定位於上皮細胞、内皮細胞及肝 細胞中且涉及延長抗體及白蛋白之壽命：實際上，在抗體 及其他血清蛋白之胞飲作用後，蛋白質係弓丨導至酸化核内 體，其中FcRn受體在抗體轉運至核内體且使其返回至循環 中之前截取抗體（經由與Fc部分結合）。因此，藉由使Fc部 分標記於dAb，確保dAb將長期暴露於至少兩個隔室：血 清及前核内體隔室（pre-endosomal compartment)中，其各 自含有一組特定蛋白水解酶。另外，FcRn受體介導之穿胞 作用（transcytosis)，藉此使搞帶Fc之蛋白質遷至及遷出血 管外空間。
藉由經由短介入肽連接子（粗體）使編碼VH及V /c dAb之 基因與編碼人類IgGl_ Fc之基因融合實現用Fc編排格式： 對於VH dAb(加下劃線）： EVQ.····.GQGTLVTVSSASTHTCPPCPAPELLGGP.. .(hJgGlFc).. .PGK* 對VK dAb(加下劃線）： DIQ.........GQGTKVEIKRTVAAPSTHTCPPCPAPELLGGP.. .(hIgGIFc).. .PGK* 根據標準方案使用293-fectin(Invitrogen)藉由瞬時轉染 HEK293/6E細胞產生物質。該等細胞係經設計以當與Ρττ 系列載體組合使用時高含量瞬時表現（Durocher等人’ 131416.doc -168 - 200902551 2002)因此，將dAb基因選殖於經修改pTT5載體 (PDOM3 8)中以產生合物表現載體(參見圖2”。在轉染 後5天。收集轉染細胞之上清液，藉由離心澄清且經0.2 , 過濾器過濾。藉由捕獲於蛋白質A流線型樹脂(ge
Healthcare)上純化dAb-Fc融合蛋白。以1〇 m]y^檬酸鈉 (PH 3)自管柱中溶離蛋白質，接著添加...及i轉檬酸鈉 (PH 6)以達到丨00 m_檬酸鈉（pH ^之最終組成。 ,,：—就活體内半衰期在大鼠中以於雌性sprague-Dawley大鼠 (每組n=3)f5 mg/kg之靶劑量測試dAbFc分子。應注意’ 靶劑量大大超過大鼠中之靶遭度，所以預期親本dAb與胰 蛋白酶抗性dAb之間的親和力差異（參見實例11}不會影響 活體内分子之最終結果。因此，希望dAb之間的PK概況之 差異歸咎於抗原獨立性排除過程。 在投藥後 0.03、i、4、8、24、48、72、96、12〇 及 168 小時採集血樣。凝塊形成後，抽出血清且隨後在hiL_ 、1R1、™FR1或VEGF抗原捕獲檢定中測試。 "J hIL-lRl抗原捕獲檢定： 塗佈有 4 gg/mL抗hIL-lRl 阻斷 添加 500 ng/mL shIL-lRl 添·加樣品 在1:10,000下用抗人類Fc HRP偵測 TNFR1抗原捕獲檢定： 塗佈有 0.1 pg/mL sTNFRl 131416.doc •169- 200902551 阻斷 添加樣品 在1:10,000下用抗人類Fc HRP偵測 VEGF抗原捕獲檢定： 塗佈有 0,25 pg/mL VEGF 阻斷 添加樣品 在1:10,000下用抗人類Fc HRP偵測
使檢定之原始資料轉化為各血清樣品中之藥物之濃度。 隨後在WinNonLin中使用非隔室分析（non-compartmental analysis，NCA)分析各時點之平均pg/mL值。各dAb-Fc對 之PK概況展示於表1 6中，其概述所測出之PK參數。 表16 : ID dAb 半衰期 (hr) AUC/D (0-ini) (hr* pg/mL)/(mg/kg) 外推AUC % DMS1541 4-130-54 93.2 691.5 22.7 DMS1542 4-130-202 176.8 710.1 49 DMS1543 lh-131-511 140.8 1807.5 40 DMS1544 lh-131-206 158.6 2173.0 43.6 DMS1546 15-10 43.2 324.6 3.8 DMS1531 15-10-11 56.6 770.5 n.d. DMS1545 15-26-501 12.9 89 5.1 DMS1529 15-26-593 86.2 804.7 21.0 結果清楚指示，雖然dAb-Fc對4-130-54至lh-13 1-206之 PK概況幾乎可重疊，但該等概況與其他對相差甚遠。當考 慮AUC/D時，主要可見如下效應：15-10之AUC/D僅為15-10-11 之 42%。15-26-501 之 AUC/D僅為 15-26-593 之 11%。 該等重要差異亦影響（較小程度）半衰期：15-10及15-10-11 131416.doc -170- 200902551 分別為43.2 h對56.6 h。料麵15_26品系可見更大差 異：15-26-501 及 15_26_593 分別為 129 u+ 86 2 匕。實際 上’對於使用非隔室分析之良好PK分析，應存在至少4個 用以擬合線性回歸斜率之資料點，且半衰期估算值之時間 應為半衰期計算值之至少3倍。 … 根據本文中之實例中所述之生物物理性質，任何給定 d主Ab抗胰蛋白酶降解之能力似乎與dAb Fc融合物在大鼠血 清中循環較長時間之能力相關。實際上，如實例（諸如實 例10)中所示，DOM15_1(^DOM15_26 5〇1為最易降解之 dAb:在！呢胰蛋白酶存在下在3〇。〇下培養2s吨心約]小 時可產生完全降解。該研究中之所有其他dAb(不管其是否 以胰蛋白酶來選擇（亦即，D〇M15_1〇_U、d〇mi5 26_ 593、ΟΟΜ4·130·2〇2 及 D〇Mlh_1312〇6)或其是否已具有部 分如親本分子之胰蛋白酶抗性（D〇M4_13〇 54及D〇Mih· 131-51 1))當再編排格式於dAb_Fc分子中時在大鼠中具有可 比之pk概況。因此，本發明之PKw究提示當彼等dAb具有 極低抗蛋白水解性時，對蛋白水解敏感會對dAb之活體内 穩定性產生最大影響。亦展示，超過一定程度，胰蛋白酶 降解抗性之進一步增量（例如〇〇]^4_13〇_2〇6對d〇M4_13〇_ 54)並不等於說dAb-Fc分子進一步減緩活體内排除之能 力。 在二種狀況下’在姨蛋白酶存在下之選擇產生熱穩定性 (由嫁融溫度所定義）增加之新穎分子：D〇m4-〗 30-202、 DOMlh-13 1-206 及 DOMI 5-26-593。PK研究指示，在本發 131416.doc -171 - 200902551 明資料集中’溶融溫度不足以使所觀察到之職況合理化 之參數際上，_5·10具有比_5_1〇11高之
Tm，但比DOM15-10-11更快讳砧ώ & 又氏迷地自循環中清除。另外， D〇M4-U〇品系之兩個dAb具有顯著不同之丁爪（相差， 但當編排格式於dAb-Fc分子中時展示幾乎相同之活體㈣ 定性。應注意’本質上不應排除炫融溫度作為預測活體内 穩定性之關鍵參數。對於本發明之恰好發生的為， 大Tm差異（自54°C及以上）並不對活體内⑽之走向產生顯 著影響。此並不排除在低於5代之熔融溫度下，_之活 體内穩定性可能與熱衫性相關或也許甚至與熱穩定性及 蛋白酶抗性都相關的可能性。 實例13 對DOM10-53-474之胰蛋白酶選擇 經純化DOM10-53-474之胰蛋白酶穩定性： 麵10-53-474為以高效價與比-13結合之區域抗體。為 評定在胰蛋白酶存在下該dAb之穩定性，用胰蛋白酶分解 純化dAb歷時增加之時點且在凝膠上運行以檢查任何可能 的蛋白質降解。在賊下使25 μ1 1叫㈤之純化刪1〇_ 53-474與1 μ1 i mg/mR測序級胰蛋白酶—起培養，從而產 生25.1 dAb.胰蛋白酶之分子比。使dAb與胰蛋白酶一起培 養1 h、4 h及Μ h ’且藉由添加4 μ1以士完全蛋白酶抑制 劑中和蛋白酶活性，接著在冰上培養。藉由向中添加 蛋白酶抑制劑而不添加胰蛋白酶製備時間。之樣品。接著 藉由電泳使用Labchip根據製造商說明書分析2 μ1樣品。 131416.doc -172- 200902551 DO_t不以與胰蛋白酶—起培養歷時增加之時點之 用膜ΓΓ474運行的凝膠。為了比較，亦如以上所說明 用胰蛋白酶處理—種胰蛋白酶穩定dAb D〇Mi 5_26-⑼且 並排運行。如时W，D〇Ml5_26_593即使在與姨蛋白 酶一起培養24 h後看起來亦為穩定的。然而，雖然 DOM10-53-474在24 h後在一定程度上降解，但在丨h^h 時點時看起來為穩定的。該等f料表明dc>miq_53，在
一定程度上抗胰蛋白酶降解，但不如最具胰蛋白酶穩定性 之 dAbDOMl5-26-593穩定。 噬菌體呈現DOM10-53-474之胰蛋白酶穩定性： 為評定噬菌體呈現DOM1 0-53-474之胰蛋白酶穩定性， 將編碼DOM10-53-474之基因選殖於pD〇M33(圖5〇)之 心立點中及根據標準技術產生噬菌體。將噬菌體由 PEG沈澱純化，再懸浮於PBS中且測力價。 使噬菌體呈現dAb與胰蛋白酶一起培養不同時點以評估 胰蛋白酶抗性。與胰蛋白酶一起培養後，在感染指數生長 大腸桿菌TG1細胞後，由力價分析量測穩定性。 在37°C下在震盪培養箱中使1〇〇 μ1噬菌體於1〇〇 ^^/⑺丨胰 蛋白酶中培養1 h、2 h、4 h及隔夜。用R0Che完全蛋白酶 抑制劑（χ2)阻斷胰蛋白酶活性，且隨後將噬菌體稀釋於2〇/。 於PBS中之marvel中’在室溫下與1〇 經生物素標記il-13 —起培養1小時。添加在室溫下用2〇/。於pBs中之marvel 預阻k/f 1小時的抗生蛋白鏈菌素塗佈珠粒（Dynabeads 2 80(Invitrogen)) ’且隨後在室溫下將混合物培養5分鐘。 131416.doc -173 - 200902551 所有與Dynabeads-起進行之培養步驟均在轉輪 =由用存於PBS中之。.】％、，2〇洗務珠粒8次洗二: 合^體。用0.5 〇·! M甘胺酸（pH 2 2)溶離結合谨菌體 且用〜！ MTris_HCL(pH8.〇)中和。使用經溶 體感染指數生長之TG1細胞（在3rcyi小時）且塗舖於四产 素板上。在37。(：下將各板培養隔夜，且進行菌落計數。2 胰蛋白酶分解後之嗤菌體輸出力價概述於_中。當與騰 蛋白酶一起培養歷時增加時點時，噬菌體力價降低Y培養 24小時後，所有噬菌體分解。 表17 :㈣菌體呈現D0M魯53_474親本執行之姨蛋白酶 選擇之輸出力價 胰蛋白酶培養時間長短 胰蛋白酶濃度
選擇更抗胰蛋白酶之dAb : 為選擇更抗胰蛋白酶降解之dAb，使用Stratergene Mutazyme 11套組、經生物素標記引子及供5〇 ^反應用之 5-5 0 pg模板由PCR向編碼DOM10-53-474之基因中引入隨 機突變。經仏/I及分解後，用抗生蛋白鏈菌素塗佈珠 粒自未分解產物中純化插入物且將其在相應位點處連接於 pDOM33中。用經純化連接混合物轉型大腸桿菌TB1細 胞，從而產生DOM10-53-474之易於出錯之庫。庫之規模 為1.9xlO9且胺基酸突變率為1.3。 131416.doc -174- 200902551 執行3輪選擇以選擇具有改良蛋白酶抗性之_。在 蛋白酶_情況T執行第1輪選擇以淨化 =而:除不再以高親和力結合抗原之任何純系。在_ 二輪 年八丨刀以呵親和力結合抗原。 二===rr。在對 與:°° 一蛋白酶-起培養。對於第：選擇使 :=τ培養胰蛋白酶1小時，輪選擇之輸 表18:第2輪選擇後輸出之噬菌體力價
1 h，37°C 使用來自 37。。下 1 ^ : -- 姨蛋白每處理的第2齡；t 輸出物作為第3輪選擇_ 、擇的噬_體
7 ^ 之輸入物。對於第3輪選擇，用1π
Pg/ml胰蛋白酶處理噬菌 伴用1〇〇 ,,7〇r _體且歷時較長時點：在37。 在 37C 下 4h’ 在室、;卜 2h， 至伽·下隔仗或在37°C下p在 ^ 之輸出力價概述於表19中： π 。第3輪選擇 表19:第3輪選擇後輪出之備力價
131416.doc -175- 200902551 對來自第卜2及3輪之各選擇輸出物之數個純系 、心=序列多樣性。無腾蛋白酶處理之第1輪選擇後， =輸出物之5G%具有親本Dq跡仏物序列。第… =親本之百分率增加至75%。第3輪選擇後親本之 百刀率增加至80%。 該資料指示DGMHM3.474已抗騰蛋白酶降解，且可自 =等騰蛋白酶選擇物中選擇不太多之新賴純系。圖η展示 田用胰蛋白酶分解經純化蛋白質時，d〇mi〇_53_474即使 在騰蛋白酶處理隔夜後亦不會完全分解。，然而，為瞭解在 選擇輸出物中是否存在任何比D〇M1〇_53_474更具胰蛋白 酶抗性之新穎純系’將在3rc下用胰蛋白酶處理噬菌體隔 仪之第3輪選擇之輸出物亞選殖於pD〇M5中。隨後對數百 個純系測序以尋找任何胰蛋白酶抗性純系。在所分析之數 百個純系中，僅26個純系具有新穎序列，然而該等純系中 ’又有—個在胰蛋白酶裂解位點（離胺酸或精胺酸）具有突 變表明該等純系不比DOM1 0-53-474更具胰蛋白酶抗 性。 實例14 在騰蛋白酶存在下由噬菌體選擇引入前導DOM01 01(抗 ™FRl)dAb中之儲存及生物物理性改良： 為改良前導分子D〇Mlh-l 31-511之蛋白酶抗性，如先前 所述在胰蛋白酶存在下進行噬菌體選擇。該方法產生大量 與親本DOM 1 h-1 3 1 -5 11分子相比具有改良胰蛋白酶穩定性 之純系。選擇兩個純系DOMlh-131-202及DOMlh-131-206 131416.doc -176- 200902551 以進一步表徵’因為其展示胰蛋白酶作用之最顯著改良。 如下文所概述之進一步研究展示，對於胰蛋白酶作用具有 改良抗性，主要對分子抗剪切應力及熱應力之穩定性存在 其他有利效應。該兩個參數對增加生物醫藥產物之儲存及 存放期穩定性至關重要。 馬斯德畢赤酵母中前導DOM0101 dAb之產生：
使用編碼二種前導分子之一級胺基酸序列之基因在馬斯 德畢赤酵母中產生分泌蛋白質。將三種合成基因（D〇Mlh_ 131-511、D〇Mlh-131-202 及 DOMlh-131-206)選殖於表現 載體pPIC-Ζα中，且隨後轉型於兩種畢赤酵母菌株χ33及 ΚΜ71Η中。將經轉型細胞濾出置於遞增濃度之芥森（1〇〇、 300、600及900 pg/ml)上以選擇具有多個整合子之純系。 隨後在2 L燒瓶中篩選數個純系以鑑別高表現細胞系。隨 後使用最佳表現純系在醱酵罐中以5 L規模產生物質。 蛋白質純化及物質表徵： 為產生高品質物質用於表徵且用於進一步穩定性研究， 使用混合模態電荷感應樹脂（Capto MMC)將下游純化過程 設計為初級捕獲步驟，接著進行陰離子交換（Q Sephar〇se)。 未顯著優化，此允許回收約70%之純度為約95%之表現 dAb。使用電喷霧質譜、胺基末端測序及等電聚焦表徵物 質一致性，且使用SDS-PAGE及SEC(尺寸排阻層析法）表徵 純度。 蛋白質一致性： 各蛋白質之第一個5殘基之胺基末端序列分析係如所預 131416.doc •177· 200902551 於人右Q .)。使用C4 zip尖頭（Mi出p叫對已緩衝液交換 質二有·水醋酸之50:5。h2〇:乙腈中之蛋白質樣品執行 ⑽析。對於三種蛋白質中每一種所量測到的質量當允 成㈣雙硫鍵而產生之_2f量差時係在基於一級胺 基…!之理論質量(使用平均質量計算)的〇5以範圍 内。使用IEF基於對於各蛋白質為不同之以鑑別蛋白質。 蛋白質純度： ' 將二種蛋白質以1 pg及1 〇 pg之量__P /,V a*
里式兩伤裝载於非還原 SDS-PAGE凝膠上。在所有情況下，觀察到單—帶。’、 亦執行尺寸排阻層析以顯示純度級。對於尺寸排阻層析 (SEC) ’將1〇〇盹各蛋白質裝載於T〇s〇H G2〇〇〇 sw灯管 柱上，在0.5 ml/min下流動。移動相為pBs/i〇%乙醇。基 於曲線下之面積量測單體百分率（參見圖23)。 比較 DOMlh-131-511、 之穩定性 評定蛋白酶穩定性：. 在過量蛋白酶中預培養規定時點後，由BIAc〇reTM分析 殘餘結合活性評定D〇Mlh_131_5n、D〇Mlh l312〇2及 〇01^111-131-206之蛋白酶穩定性。將約14〇〇1111經生物素 標記TNFR1塗佈於抗生蛋白鏈菌素（SA)晶片上。在3〇它下 使 250 nM DOMlh-131-511、DOMlh-131-202 及 DOMlh- 13 1-206與僅PBS—起或與100叫/〇11胰蛋白酶 '彈性蛋白酶 或白血球酶一起培養3及24小時。藉由添加蛋白酶抑制 劑此合物使反應停止。隨後使用參考池扣除法使^八匕/蛋白 1314I6.doc •178· 200902551 酶混合物穿過TNFR1塗佈晶片。在每次注射循環之間用ι〇 μΐ CU Μ甘胺酸（ρΗ 2·2)使晶片表面再生。相對於無蛋白酶 之dAb結合，測定與蛋白酶一起預培養結合人類tnfr丨之 DOMlh-131-511、DOMlh_131_2()2及 時）之比例。在25。〇下進行BIAcoreTM運行。以下資料由三 個獨立的實驗產±。條形圖指示平均m，且誤差棒指示結 果之標準偏差（圖24)。 、 已發現’與麵…⑴_5114“匕，_h i3i指及 (’ DOMlh-131-206展示具有較大的胰蛋白酶、彈性蛋白酶或 白血球酶蛋白水解降解抗性。與胰蛋白酶一起丨小時後及 與彈性蛋白酶或白血球酶一起3小時後，與_h_i3i_ 5H相比，DOMlh_131 _2〇2與 D〇Mlh_i3i2〇6之間的差異 - 最明顯。在大部分測試條件下，存在與DOMlh-131-202相 比，DOMlh-131-206稍更穩定之趨勢。 如使用D S C所測定之d A b之熱穩定性： .} 為確定在何pH值下前導分子具有最大穩线，使用差示 ^ '掃描量熱計（DSC)量測各dAb在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中之 溶融溫度⑹。因為伯瑞坦_魯賓遜由三組分緩衝系統（乙 酸、磷酸及硼酸各40 mM)構成，所以有可能在同一溶液中 產生3-10範圍内之pH值。由蛋白質一級胺基酸序列確定理
論0。由縱’可見dAb具有最大内在熱穩定性之pH值對 DOMih-131-202 而言為 pH 7，對D〇Mlh_13l2〇6 而言為 pH 7-7.5，且對DOMlh-131_511而言為pH 7 5。對於所有隨後 應力及穩定性研究’各dAb在伯瑞坦_魯賓遜緩衝液中使用 131416.doc -179- 200902551
以下 pH 值：對 DOMlh-13 1-202 及 GSK1995057A DOMlh-131-206 而言，pH 7.0，且對 DOMlh-131-511 而言，pH 7.5。結果概述於表20中。 表20 :如由DSC所測定於伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中1 mg/ml 之 DOMlh-131-202、DOMlh-131-206 及 DOMlh-131-511 之 pH值及Tm的概述。溫度以i8〇〇c/小時勻變。 dAb 產生最大固有熱穩定性之pH值 在給定pH值下dAb之Tm(°C) DOMlh-131-202 7.0 ' ' - 68.6 DOMlh-131-206 7.0-7.5 65.8 DOMlh-131-511 7.5 58.0 兩週熱穩定性測試 蛋白質在高溫下持續長時間之能力通常為其穩定性之良 好指不。在該等條件下，蛋白質可經受數種諸如聚集之物 理過程，或化學改質。在37乞及5〇。〇下在伯瑞坦-魯賓遜緩 衝液中將dAb(l mg/ml)培養14天。使用SEC測定經14天之 時間溶液中遺留多少單體（圖2 5)。
由圖 25 可見 DOMlh-131-202 與 DOMlh-131-206 顯著比 DOMlh-131_511對熱應力穩定。通常將蛋白f暴露於諸如 37t及50°C之高溫下來給出藥物長期存放期之指示。使用 該等較高溫度加速與室溫下長期儲存相關之正常過程，諸 如脫醯胺作用、氧化或聚集。亦可使用SEC監測溶液中聚 集形成之程度（圖26^υ。371下14天後，D〇Mlh_131_ 川自溶液中之損失可歸於沈澱肖如由sec所測定之較高有 序性聚集體之形成（圖26B)。Μ天後在37°C下，關於 DOMlh-131-2G2與DQMlh-131-2G6亦可見顯著較低之蛋白 i3I4i6.doc 200902551 貝損失，其中聚集體形成極少或無實質性增加，尤其在 〇〇肘111-131-206之狀況下（圖2611)。在5 0。0下，分子之間的 差異甚至更明顯，DOMlh-13 1-206在14天後在較高温度下 展不較DOMlh-13 1-202佳之穩定性，展示較高分子量聚集 體之形成顯著降低（圖26)。相對於t=〇，14天後，DOMlh- 131-206僅展示聚集體形成之小幅增加（圖261)，而〇〇]^111- 1 3 1 -5 11幾乎沈澱析出溶液（圖26C)。
此展示由胰蛋白酶選擇引入dAb中之變化（例如改良之熱 穩定性）顯著改良蛋白質在37°c及5〇〇c下儲存穩定性。 DOMlh-131-202明顯具有且DOMlh-13 1-206更顯著明顯具 有改良之溶液穩定性及較低的在高溫下形成聚集體之傾 向’此可直接解釋為在諸如+4°C及室溫之更多相關溫度下 具有改良之長期儲存穩定性。 隨後由IEF分析熱應力實驗24小時、48小時、7天及14天 時點之樣品以瞭解蛋白質是否經受任何會影響蛋白質總電 荷之生物物理變化（圖27)。 在 37°C 下，DOMlh-131-202 與 DOMlh-131-206 再次展示 與DOMlh-131-511相比無顯著變化。關於〇〇熥111-131- 5 11，24小時後在37t下出現微弱之第二帶。咸信，該額 外出現的帶係歸因於蛋白質之二聚作用，從而掩蔽電荷且 產生兩個分子群體。在50°C下，分子之間的差異更明顯， 在高溫下DOMlh-1 3 1-206明顯展示無顯著變化，而24小時 後’ DOMlh-131-202展示一些改質跡象。在伯瑞坦_魯賓 遜中48小時後，大部分DOMlh-131-511因沈澱而損失。 131416.doc -181 - 200902551 由TNFR-l RBA分析50。(：下之T=〇、7及14天時點以確定 暴露於高溫後蛋白質之功能性（圖28)。雖然目前該檢定在 檢測歸因於應力之分子之微小變化方面不如犯匸或ieF靈 敏’但可使用其展示dAb仍可結合抗原。 DOMlh-13 1-5 11之曲線之向左移動反映大部分dAb已歸 因於沈澱而損失之事實。溶液中遺留之物質仍能夠結合抗 原。如圖25中所示，大部分DOMlh-131-202 與DOMlh-13 1-206即使在14天後亦能夠保持在溶液中。RBA展示所 有可溶性蛋白質仍具功能性且能夠結合Tnfri。 高蛋白濃度下測試之儲存穩定性·· 進行實驗以研究+4。(：極高蛋白質濃度下之儲存穩定性以 瞭解在該等條件下各分子如何表現。將所有前導dAb在最 穩定pH值在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中在離心Vivaspin濃縮器 中濃縮（5K截止點）至約100 mg/ml。隨後將約1〇〇 ^^/…之 樣αρ擱置在+4 C下7天，且隨後由SEC分析以瞭解在高濃度 下儲存期間樣品是否會發生任何其他物理變化（圖29)。在 SEC管柱上k1xPBS 10%乙醇（v/v)中走柱之前，將樣品稀 釋至約1 mg/ml。 由 SEC 迹線，可見 D〇Mlh-131-202 與 DOMlh-131-206 在 7 天後在聚集體形成方面均不展示任何顯著增加，而 DOMlh-131-511單體濃度存在約2%之減小。 前導dAb之噴霧器傳遞： 為進行早期毒理學及臨床研究，將dAb調配為液體形式 且經由喷霧裝置傳遞。視裝置（例如，超音波、喷射或振 131416.doc -182· 200902551 網）而定，dAb當其經喷霧以形成規定粒度之氣霧劑時將經 歷一定程度之剪切應力及熱應力。因為與1)〇馗111_131巧11 相比 ’ DOMlh-13 1-202與 D〇Mlh-13 1-206具有較言 τ
^ m -*cL 示大大改良之熱應力穩定性，所以所有dAb均在兩種噴霧 器裝置中測試以瞭解其如何回應噴霧期間所誘發之剪切應 力/熱應力。隨後由SEC分析來自噴霧氣霧劑之蛋白質與裝 置中（亦即，杯中）之殘留dAb以確定該過程期間產生聚集 之量。 ' 在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中在最穩定pH值下測試所有分 子。在E-flow Rapid(振網）與Pari LC +(噴射喷霧器）中測試 dAb，其中操作時間為3.5分鐘，蛋白質濃度為5 粒度分布使用Malvern Spraytek確定。結果展示於圖3〇 中。為良好傳遞且分布於深肺中，理想粒度為<5 μιη。所 有dAb在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中產生小於5 μηι之可比粒度 級在贺霧之剛及之後，由Am量測法測定裝置杯中之 dAb之濃度（資料未圖示）。已發現，蛋白質濃度並未顯著 改變，從而指示蛋白質與媒劑在傳遞期間均不會優先霧 化。 在SEC上運行在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中霧化之dAb之樣 品以確定傳遞期間蛋白質是否經受任何物理變化。圖3 1展 示由SEC所測定之杯或氣霧劑中之相對百分率變化。可 見，在單體濃度方面，DOMlh-131-202 與 DOMlh-131-206 相對於經受相對較小之變化。此證明具有 改良丁„!之〇〇]\/[1]1-131-202與〇〇]\/1111-131-206在喷霧期間具 131416.doc -183- 200902551 有較小的聚集傾向。 圖32展示於伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中之D〇Mlh-131_2〇0 及DOMlh-131-511在喷霧後之實際SEC迹線且顯示單體之 相對損失（圖3 1)係歸因於二聚體形成。此再次提供由 DOMlh-131-202及DOMlh-131-206所展示之較高熱穩定性 即使在未優化調配物緩衝液中亦可阻止顯著聚集之理論的 其他證據。
關於毒理學及安全評定研究，有必要傳遞比給予患者之 治療劑量顯著高之含量的dAb至動物中。此僅可藉由使用 顯著較高之蛋白質濃度及/或經長時間傳遞dAb來達成。因 為已展示0〇]\4111-131-511在經3.5分鐘在5 11^/1111下噴霧時 形成聚集體，所以DOMlh-131-206係在PBS中在40 mg/mi 下測試且使用Pari LC+噴霧至多i小時。整個運行期間在 各時點採集杯及氣霧劑之樣品以瞭解延長喷霧是否會導致 dAb歸因於剪切應力或熱應力（由SEC測定）及蛋白質濃度 (A280 nmi測法）而聚集。表21展示由A28〇確定之杯與氣 霧劑中之dAb的蛋白質濃度。 表21 ·在使用Pari LC +在約4〇 mg/mi下喷霧dAb期間杯 與氣霧劑之由A280吸光度讀數確定之D〇Mlh l312〇6的經 量測蛋白質濃度。考慮到稀釋誤差及儀器誤差，在經1小 時噴霧dAb後，樣品濃度並未改變。 時間(Min') 杯樣品(mg/mF) 氣霧劑樣品(mg/ml) Ϊ 43.8 43.4 29 44.5 43 5 59 44 fs 44.1 131416.doc -184- 200902551 並未顯著改變 顯示 由表2 1可見蛋白質濃度在運行期間 質損失。圖33展示如由 DOMlh-131-206 並未形 一 4體。此明顯顯示如 不存在顯著的歸因於聚集之蛋白 SEC所測定，經1小時之喷霧時間， 成任何較高有序性之聚集體，諸如 之改良生物物理性質顯著增 ’且此可與改良之儲存存放 由胰蛋白酶選擇向分子中引入 加dAb抗剪切應力及熱應力性 期及喷霧蛋白質以致不形成較高有序性聚集體之能力直接 相關。
前導dAb之溶解狀態： 因為所有三種前導dAb之主要降解途徑似乎為最初導致 二聚合接著進-步聚集且最終沈殿之自締合，所以由分析 超速離心（Analytical Ultra_Centrifugati〇n，AUC)研究該三 種前導分子以確定自締合之程度。由兩種方法，即沈降平 衡及沈降速度研究蛋白質。 關於沈降平衡方法，在〇.5 mg/ml至5 mg/ml範圍内之三 種不同濃度下用離心效應使用三個不同轉子速度運行三個 樣品。由該方法，確定DOMlh_13l_5U為穩定二聚體 (26.1-34.4 kDa) ’ DOMlh-131-202 為單體 / 二聚體平衡 (22.7-27.8 kDa),由！^=1.3 μΜ量測在各濃度下具有相對穩 定之二聚物狀癌，且DOMlh_131_2〇6主要為單體性（154_ 17.9 kDa)，單體締合為二聚體之1為36() μΜ。 由沈降速度方法，所有樣品在稀釋後展示一定程度之解 離。由展示於圖34中之所獲得之結果，關於D〇Mlh_131_ 5 11所觀察到之沈降係數指示較高有序性聚集體，且稀釋 131416.doc -185- 200902551 後峰位移為該等聚集體解離之指示。蛋白質聚集及解離互 相抵消，可得出％由沈降平衡所m察到之穩定二聚體之印 象。關於DOMlh-131-202所觀察到之沈降係數指示快速動 力平衡，且因此可將單體及二聚體峰彼此分開，從而得到 具有比適於樣品質量高之沈降係數之單峰。該結果與沈降 平衡方法所獲得之結果—致，且解離常數經量測為i 。 DOMlh-131-206係經測定比其他兩個樣品更具單體性，與 其他兩個樣品之2.5 s相比，其具有19 s之沈降係數。該資 料與沈降平衡資料極一致。在量測濃度下，36〇 之h以 下約10倍，樣品主要為單體性。 實例1 5 DOM15-26-593 dAb 之效價增強： 圖40中展示VEGFR2受體結合檢定中D〇M15_26_593 dAb 比DOM 1 5-26親本之效價增加之實例。在該檢定中，在板 基k疋中量測潛在抑制劑阻止Vegf與VEGFR2結合之能
力。在該檢定中’將VEGFR2-FC嵌合體塗佈於9yLELISA 板上，且向其中添加預定量之已與測試dAb稀釋系列一起 預坨養之VEGF。洗除未結合蛋白質後，用抗VEGF抗體偵 測與受體結合之VEGF之量’比色測定其含量。以隨測試 物貝/辰度化之VEGF結合抑制百分率綠製劑量‘反應效 應°因此有效抑制劑為顯示在低濃度下實f性阻斷配位體 結合之抑制劑。 FC融合物之效價及半衰期： VEGF阻斷在治療腫瘤中之治療潛能已實現超過30年。 131416.doc -186- 200902551 癌症之慢性性質指示生物醫藥需要長的血清半衰期來介導 其效應，而此與游離dAb因腎遽過而自猶環快速清除^相 符。為評定VEGF dAb作為治療癌症之抗血管生成劑之^ 用，藉由使用FcRn介導抗體補救途徑經由雜交連料使^ 導區域抗體編排格式為與野生型人類IgGl以之融合物r 形成具有延長的血清半衰期之二價分子。 在該Fc融合物格式中，使用先前所述之檢定，可將前導 1胰蛋白酶選擇dAb(_15-26-593)之效價與最初親本 Γ ’ dAb(DOM15-26)及胰蛋白酶不穩定dAb(D〇Mi5 26 5^)作 比較。結果展示於下表22中： 表22:呈Fc融合物格式之D〇M15_26前導分子之效價 (RBA)及半衰期特徵 dAb Fc 效價（nM) Tl/2b (hr) JD〇M15-26 D0MT5-26-501- WsGL__l hlgGl 0.506 "5.323 0.033 ND ----- 12.9 DOM15-26-593 hlgGl oH-.o L j 由該等結果可見’在二聚體Fc融合格式中，親和力及效 價歸因於親和性（avidity)效應相對於游離dAb增加。顯 '、’；由於胰蛋白酶選擇所獲得之DOM1 5-26-593之效價增 加付以維持且在該Fc格式中甚至更明顯。此外，熱及蛋白 酶穩定性之改良解釋為分子活體内藥物動力學特性之深度 改變。與DOM15-26-501相比，DOM15_26_593之排除半衰 期之改良（參見圖41)很可能為dAb穩定性增加之直接結 從而使其變得更抗核内體隔室c〇mpartment) 131416.doc -187- 200902551 内所發生之降解過程。因此，亦預期具有增強蛋白酶穩定 性之dAb能夠在其中蛋白水解為涉及生物分子轉換 (turnover)之活性過程的其他生物隔室（諸如血清、黏膜表 面及多種組織隔室）中持續較長時間。 藥物動力學清除概況： 在向3隻大鼠靜脈内投與濃度為5 mg/kg之DOM15-26-593及 DOM15-26-501後，量測 DOM15-26-593及 DOM15-26-501之藥物動力學清除概況。隨後使用直接VEGF結合標準 ELISA檢定及抗人類Fc抗體量測DOM 15-26-593及DOM15-26-501在血清中之含量，因此僅偵測血清樣品中之完整藥 物。完整藥物動力學概況展示於下表23中： 表23 :大鼠中DOM15-26及DOM15-26-593 Fc融合物之 藥物動力學參數概述 dAb 半衰期 Cmax (pg/ml) AUCXO-infXhrhg/ml) 清除率(ml/hr/kg) DOM15-26-501 12.9 91.4 445.1 11.8 DOM15-26-593 84.6 101.8 3810 1.3 由該等結果可見DOM15-26-593具有顯著改良之藥物動 力學概況，（例如）延長之半衰期及降低之清除率。 DOM15-26-5 93之顯著改良之效價及藥物動力學性質產 生對化合物之多種其他生物物理屬性的分析。 溶解狀態性質：由SEC-MALLs及AUC分析： 用DOM15-26-593如下進行實驗： 001^15-26_593在至多2.5 11^/1111之濃度下表現為溶解狀 態中之單體，其中計算分子質量為78-81 KDa，與約76 131416.doc -188- 200902551 kDa之計算完整分子質量（圖42a及42b)一致。 熱熔融性質：由DSC分析 用DOM15-26-593如下進行實驗： ’圖43之中間圖)之增加之熱穩 圖43之上圖）中得以維持。展示 圖43之下圖）iTm曲線以便比 胰蛋白酶選擇dAb(65°C 定性在Fc融合物（64.5°C， DOM15-26-501 dAb(52〇C > 較。
冷凍-解凍、溫度應.力及血清組分之穩定性 用D Ο Μ15-26-593如下進行實驗· dAb之穩定性性質意謂可使〇〇Μΐ5_26 593 dAb經受物理及生物應力，而對其結合vegf之能力產 生最小影響(圖44-47(a及b))。舉例而言，可使分子自液氮 (-196T：)至體溫（3rC)重複冷凍解凍1〇次循環，而如由 ELISA所測定未損失結合活性（圖44)。如由習知尺寸排阻 層析法所評定，該處理亦不會對分子聚集狀態產生明顯改 變（圖45)。其他測試顯示分子可置放於_8〇它至55。〇範圍之 不同溫度下而僅在最高培養溫度下！ 68小時後，抗原結合 活性略微減小（圖46)。此外，如由VEGF結合ELISA所測 疋，在37C下與人類或獼猴血清一起培養14天不會導致抗 原結合能力損失（圖47a及47b)。 VEGFR2受體結合檢定及HUVEC細胞檢定中之效價： 如下進行上述受體結合檢定： 使用上述受體結合檢定評定Fc融合物之效價（圖48)。已 發現’ DOM1 5-26-593 dAb在該檢定中具有增強之效價’ 131416.doc •189- 200902551 此確立dAb阻斷VEGF與VEGFR2活體外結合之能力。亦在 量測VEGF拮抗劑阻斷HUVE細胞之VEGF刺激增生之能力 的HUVEC(人類臍靜脈内皮細胞）檢定中說明DMS1529之效 價。在與預定量之VEGF及不同量之測試樣品一起培養固 定時期結束時，測定細胞數目。拮抗劑越有效，所觀察到 之細胞增生越低（圖49)。
該段落中陳列DOMlh-131-511之核苷酸序列，且本文中 對"展示於圖19中”之DOMlh-131-511之核苷酸序列的提及 係關於陳列於該段落中之序列。 DOMlh-131-511之核苷酸序列：
GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGCG CATGAGACGA TGGTGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCACAT ATTCCCCCGG TTGGTCAGGA TCCCTTCTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTATAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACAGCGGTAT ATTACTGTGC GCTGCTTCCT AAGAGGGGGC CTTGGTTTGA CTACTGGGGT CAGGGAACCC TGGTCACGGT CTCGAGC 【圖式簡單說明】 圖1說明用於製備噬菌體呈現譜系之pDOM13(亦稱為 pDOM33)之多個選殖位點。 圖2展示以來自在30°C與40 pg/ml胰蛋白酶一起培養之 dAb之不同時點的樣品運行之數個No vex 1 0-20% Tricene凝 膠。在添加胰蛋白酶之前即刻及隨後在添加胰蛋白酶之後 1小時、3小時及24小時獲取樣品。用lxSureBlue染色蛋白 質。凝膠說明在與胰蛋白酶一起培養第一個3小時期間， 131416.doc •190· 200902551 DOM15-10 與 DOM15-26-501 顯 DOM4-13 0-54及 D〇Mlh-131-511 著分 解0 DOM15-26 、 13 1-511之分解僅在與胰蛋白酶一 起培養24小時後才變得明顯。
(彼等一致胺基酸由點標記）。對應於CDR1、cdr2&cdr3 之環用框勾晝。 圖4說明DOM4- 13 0-54及27個所選擇之變異體之胺基酸 序列。突出所選擇之純系中不同於親本序列之胺基酸（彼 等一致胺基酸由點標記）。對應於CDR1、CDR2及CDR3之 環用框勾畫。 圖5說明DOM15-26-555及21個所選擇之變異體之胺基酸 序列。突出所選擇之純系中不同於親本序列之胺基酸（彼 等一致胺基酸由點標記）。對應於CDR1、CDR2及CDR3之 環用框勾畫。 圖6說明DOM15-10及16個所選擇之變異體之胺基酸序 列。突出所選擇之純系中不同於親本序列之胺基酸（彼等 一致胺基酸由點標記）。對應於CDR1、CDR2及CDR3之環 用框勾晝。 圖7A-7D為展示在37°C下與不同濃度之胰蛋白酶（在〇至 100 pg/ml範圍内）一起培養隔夜後，親本dAb DOMlh-131-511(圖 7A)及三個變異體 dAb DOMlh-131-203(圖 7B)、 DOMlh-131-204(圖 7C)及 DOMlh-131-206(圖 7D)與固定 TNFR1之結合的BIAcore迹線。結果展示在高濃度胰蛋白
131416.doc • 19U 200902551 酶（100 pg/ml)下，所有三個變異體比親本對蛋白水解更具 抗性。 圖8 A-8C為展示在與彈性蛋白酶及白血球酶一起培養隔 夜後 dAb DOMlh-131-511(圖 8A)、DOMlh-131-202(圖 8B) 及DOMlh-13 1-206(圖8C)與固定TNFR1之結合的BIAcore迹 線。與親本相比，dAb對彈性蛋白酶與白血球酶之蛋白水 解展示增加之抗性。 圖 9 展示以 dAb DOMlh-131-511、DOMlh-13 1-203、 DOMlh-131-204、DOMlh-131-206、DOMlh-131-54、 DOM lh-1 3 1-201及DOM lh-13 1-202之與胰蛋白酶一起培養 之前的樣品及以1 00 pg/ml胰蛋白酶一起培養1小時、3小時 及24小時後的樣品運行的兩個4-12% Novex Bis-Tris凝 膠。 圖10A-10C為展示在37°C下與不同濃度胰蛋白酶（在〇至 100 pg/ml範圍内）一起培養隔夜後，d〇M4-130-54(圖 10A)、DOM4-130-201(圖 10B)及 D〇M4-130-202(圖 10C)與 固定IL-1R1融合蛋白之結合的BIAcore迹線。結果展示在 尚濃度胰蛋白酶（100 pg/ml)下，兩個變異體比其親本對蛋 白水解更具抗性。 圖11A-11C為展示與彈性蛋白酶及白血球酶一起培養隔 夜後，DOM4-130-54(圖 11A)、DOM4-130-201(圖 11B)及 DOM4-130-202(圖11C)與固定IL-1R1融合蛋白之結合的 BIAcore迹線。與親本相比，dAb對兩種所測試之蛋白酶之 蛋白水解展示增加之抗性。 131416.doc -192- 200902551 圖12說明DOM15-26-555及6個變異體之胺基酸序列。突 出所選擇之純系中不同於親本序列之胺基酸（彼等一致胺 基酸由點標記）。 圖13A及13B為展示親本dAb DOM1 5-26-555(圖13A)及最 具蛋白酶抗性變異體D〇M15-26-593(圖13B)與固定VEGF 之結合的BIAcore迹線。與濃度為2〇〇 pg/mi之胰蛋白酶一 起培養後在100 nM之dAb濃度下就hVEGF結合以BIAcore方 式比較親本及變異體。在37°C下進行反應3小時或24小 時。結果展示在胰蛋白酶處理24小時後，變異體比親本對 蛋白水解更具抗性。 圖14為展示騰蛋白酶處理對DOM15-2 6-555變異體之 hVEGF結合之影響的圖表。結果顯然展示胰蛋白酶處理24 小時後’所有變異體比親本（DOM15-26-555)對蛋白水解更 具抗性。 圖1 5展示兩個加載1 5 pg經處理及未經處理之d〇m 1 5 - 26-555 或 DOM15-26-593 樣品之 Novex 10-20% T.ricine 凝 膠。在添加胰蛋白酶之前即刻及隨後在添加胰蛋白酶之後 1小時、3小時及24小時獲取樣品。用1 xSureBlue染色蛋白 負° /¾¾:勝§兒明DOM15-26-593之騰蛋白酶抗性概況不同於 由BIAcore實驗展示之概況。 圖16說明DOMI5-10及變異體DOM15-10-1!之胺基酸序 列。突出變異體中不同於親本序列之胺基酸（彼等一致胺 基酸由點標記）。 圖17A及18B為展示親本D〇M15-1〇(圖17A)及變異體 131416.doc -193 - 200902551 DOM 1 5-10-11(圖17B)與固定VEGF之結合的BiAcore迹線。 與濃度為200 pg/ml之胰蛋白酶一起培養後在1〇〇 nM之dAb 濃度下就hVEGF結合以BIAcore方式比較親本及變異體。 在37°C下進行反應1小時、3小時及24小時。結果展示在胰 蛋白酶處理24小時後’變異體比親本對蛋白水解更具抗 性。
圖18展示兩個加載15 pg DOM15-10及〇〇]^15-10-11樣品 之Novex 10-20% Tricene凝膠。在添加胰蛋白酶之前即刻 及隨後在添加胰蛋白岭之後1小時、3小時及2 4小時獲取樣 品。用SureBlue(lx)染色蛋白質。結果展示BIAc〇re研究中 可見之結合活性直接反映蛋白質之完整性。 圖19A-19L说明數個編碼為D〇Mlh-131-511或DOM4· 130-54之變異體之dAb的核酸的核苷酸序列。核苷酸序列 分別編碼圖3及圖4中所呈示之胺基酸序列。 圖20A-20E說明數個編碼為d〇m15_26 555或D〇M15_1〇 之變異體之dAb的核酸的核苷酸序列。核苷酸序列分別編 碼圖5及圖6中所呈示之胺基酸序列。 圖21展示pD〇M38之載體圖。 圖22展示不同時點在3〇t下以25:1 騰蛋白酶比率用 胰蛋白酶處理之DOM10_53_474及D〇Ml 5_26巧93蛋白質之 在Labchip上運行的凝膠。箭頭展示全長蛋白質。 陰離子交換純化後 。在225 nm下監測 。藉由經基線校正 圖23為展示各樣品由mmc層析接著 所獲得之高純度級的尺寸排阻層析迹線 UV且用具有1 0〇/〇乙醇（v/v)之〗xpBS走柱 13M16.doc -194- 200902551 之峰面積積分計算單體百分率。 圖 24 展示 DOMlh-131-511、DOMlh-13 1-202 及 DOMlh- 13 1-206之蛋白酶穩定性資料。 圖 25 為說明 DOMlh-131-202 、DOMlh-13 1-206 及 〇〇]^111-131-511在37°(：及50°(：下在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中
之14天穩定性資料的SEC。所有dAb之蛋白質濃度為i mg/mb 使用SEC確定熱應力期間蛋白質中是否會發生任何變化及 相對於時間=〇(TO)樣品溶液中所遺留之單體之量。 圖26Α至I展示SEC迹線’其展示DOMlh-131-511(A至 C)、DOMlh-131-202(D 至 F)及 DOMlh-131-206(G 至 I)之熱 應力（3 7 C及5 0°C )效應。亦展示給定時點下相對於τ=〇時溶 液中所遺留之單體百分率。 圖27展示熱應力24小時、48小時及7天及14天時DOMlh- 131-202、DOMlh-131-206 及 DOMlh-131-511 之 IEF 分析。 樣品已在3 7 °C或5 0 °C下在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中培養。 圖 28 為展示在 50°C 下將 DOMlh-131-202、DOMlh-131-206及 DOMlh-131-511培養 14天之效應的 TNFR-1 RBA。假 定蛋白質濃度為1 mg/ml。亦展示不結合抗原之陰性對照 dAb(VH模擬物）。 圖 29說明在 +4°C 下在約 100 mg/mlTWA:DOMlh-131-202，B : DOMlh-13 1-206及C : DOMlh-131-511在伯瑞坦- 魯賓遜緩衝液中儲存7天之效應。在2 8 0 nm下監測UV。 圖 30 展示 Pari E-flow 及 LC+ 中之 DOMlh-131-202、 DOMlh-1 31-206及DOMlh-131-511之噴霧器測試的資料。 131416.doc -195- 200902551 蛋白質濃度在任—伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中為5 —丨。 圖3 1忒明在以5 mg/m丨存於伯瑞坦-魯賓遜缓衝液中之 OMlh 131 202、DOMlh-131-206 及 DOMlh-131-511 喷霧 期間，單體浪度之相對百分率之變化。 圖32展示伯私坦_魯賓遜緩衝液中之D〇Mih_13 ^06及 D〇Mlh-131-5U 自 Pari LC +喷霧後之 SEC 迹線。 圖33展示經！小時喷霧過程期間以4〇爪以…存於pBs中之 DOMlh-131-2G6之SEC迹線。喷霧器杯與氣霧劑中之蛋白 質對喷霧期間dAb可能會經歷之剪切應力及熱應力效應具 有南抗性。 圖34展不三種主要蛋白質（D〇Mlh_131_2〇6& D〇Mlh- 131-511及DOMlh-131-202)各自之沈降速度曲線。所觀察 到之較低濃度樣品DOM lh-131-206之雙峰為在此情況下由 來自樣品池之樣品洩漏所致之偽跡。 圖35展示緩衝液及裝置對〇^1995〇56八（1)〇1^111-131-511)之喷霧液滴尺寸之影響。 圖36為如由SEC所量測’在各裝置中噴霧後，由二聚體 形成評定之〇3〖1995 05 6八(〇〇]^1111-131-511)之穩定性。 圖 37 展示 pari Ε-flow 及 LC+ 中 GSK1922567A(202)、 〇81〇99505 7八（206)及〇81<：199505 6八（511)之喷霧器測試。 A)伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中之測試，b)peG1 000/蔗糖緩衝 液中之測試。 圖38描繪人類TNFR1受體結合檢定中之TNF-α劑量曲 線。以四個複本測試各樣品。 131416.doc -196- 200902551 圖39展示人類TNFR1受體結合檢定中GSK1922567A (DOMlh-131-202)、GSK1995057A(DOMlh-131-206)及 GSK1995056A (DOMlh-131-511)之抑制。以四個複本測試各樣品。 圖 40說明 DOM15-26及 DOM15-26-593 dAb在 VEGF RBA 中之效價。 圖41展示DMS1529(DOM15-26_593)及DMS1545(DOM15-26-50 1)在以5 mg/mg單次快速靜脈内注射向大鼠投與後之 藥物動力學。
圖42a展示確認單體性質之DMS1529 Fc融合物（DOM15-2-593 Fc融合物）之SEC-MALLs(尺寸排阻層析-多角雷射散 射）分析。展示在折射率（亦即，濃度；虚線）及光散射（實 線）方面顯示類似性質之兩個不同批次。用箭頭標記之線 表示分子質量計算值。 圖42b展示確認單體性質之DMS1529 Fc融合物（DOM15-26-593 Fc融合物）之AUC(分析超速離心）分析。在三個不 同濃度，即約0.2、0.5及1.0 mg/ml下在PBS緩衝液中測試 一個批次之材料。沈降速率分析確認分子質量約80 kDa。 圖 43 展示 DMS1529(DOMl 5-26-593)及 DOM1 5-26-501 之 DSC迹線。 圖44為對兩個不同批次之材料進行1 〇次冷凍-解凍循環 之前及之後，DMS 1529(DOM1 5-26-593)之 VEGF 結合 ELISA。 圖45展示10次冷凍-解凍循環之前及之後’ DOM1 5-26-5 93 SEC概況之一致性。 131416.doc -197- 200902551 圖46說明DMS15 29融合物（DOM15-26-593 Fc融合物）之 加速穩定性研究的結果；結合ELIS A在所示溫度下顯示培 養7天後之活性。 圖47A展示在37°C下培養14及15天後，DMS1529 (DOM1 5-26-593)在人類獼猴中之穩定性。 圖47B展示在37°C下培養14及15天後，DMS1529 (DOM15-26-593)在人類血清中之穩定性。 圖48展示DOM15-26及DOM1 5-26-593 dAb作為Fc融合物 产、 ( (相應DMS1564及1529)在VEGF RBA中之效價。 圖49說明DMS1529融合物（DOM1 5-26-593 FC融合物）對 HUVEC細胞增生之抑制。 ·. 圖50為pDom33載體圖。 , 圖51a及51b描繪結合血清白蛋白之dAb之序列（胺基酸及 核皆酸）。
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Claims (1)

  1. 200902551 十、申請專利範圍： 1. —種抗TNFct受體1型（TNFR1 ; p55)免疫球蛋白單一可變 區域，其包含與DOMlh-131-511之胺基酸序列（示於圖3) 至少95% —致之胺基酸序列。 2. 如請求項1之免疫球蛋白單一可變區域，其在位置53處包 含天冬胺酸，其中編號係根據Kabat。 3_如請求項1或2之免疫球蛋白單一可變區域，其在位置91 處包含組胺酸’其中編號係根據Kabat。 4. 一種抗TNFct受體1型（TNFR1 ; p55)免疫球蛋白單一可變 區域，其包含與選自由1)〇]^111-131-511、〇0河111-131-201 ' DOMlh-13 1-202 ' DOM 1 h-13 1-203 > DOMlh-131-204及DOMlh-13 1-205(示於圖3)組成之群之胺基酸序列 一致的胺基酸序列。 5. —種抗TNFcx受體1型（TNFR1 ; P55)免疫球蛋白單一可變 區域’其係由與DOM 1 h-1 3 1 -5 11之核苷酸序列（示於圖 19)至少80%—致之核苷酸序列編碼。 6· —種抗TNFa受體1型（TNFR1 ; P55)免疫球蛋白單一可變 區域’其係由與 DOMlh-131-511、DOMlh-131-201、 DOMlh-131-202、DOMlh-131-203、DOMlh-131-204 或 DOMlh-131-205之核苷酸序列（示於圖3) 一致之序列編 碼。 7. —種TNFa受體iSCTNFRi ; p55)拮抗劑，其包含如請求 項1至6中任一項之抗TNFR1免疫球蛋白單一可變區域。 8·如請求項7之拮抗劑，其包含第—及第二免疫球蛋白單一 131416.doc 200902551 可變區域，其中各可變區域係如請求項1至6中任一項。 9.如請求項7或8之拮抗劑，其中該拮抗劑包含該單一可變 區域之單體或該單一可變區域之同源二聚體。 1 〇·如請求項7或8之拮抗劑，其中該單一可變區域或各單一 可變區域之胺基酸序列係與胺基酸序列〇〇|^111-131- 511、DOMlh-131-201、DOMlh-131-202、DOMlh-131- 203、DOMlh-13 1-204 或 DOMlh-13 1-205(示於圖 3) 一 致。 π· —種抗TNFa受體1型（TNFR1 ; P55)免疫球蛋白單一可變 區域’其包含與選自 DOMlh_131_511、D0Mlh_131_ 201、DOMlh-131-202、DOMlh-131-203、DOMlh-131- 204及DOMlh-13 1-205(示於圖3)之胺基酸序列一致、或 不同於該所選擇序列不會超過25個胺基酸位置處，且具 有與該所選擇序列之CDR1序列至少50% —致之CDR1序 列的胺基酸序列。 12. —種抗TNFa受體1型（TNFR1 ; p5 5)免疫球蛋白單一可變 區域’其包含與選自〇〇]^1111-131-511、1)0^1111-131-201、DOMlh-131-202、DOMlh-131-203、DOMlh-131- 204及DOMlh-131-205(示於圖3)之胺基酸序列一致、或 不同於該所選擇胺基酸序列不會超過25個胺基酸位置 處，且具有與該所選擇序列之CDR2序列至少50%一致之 C D R 2序歹ij的月安基酉曼序列。 13. —種抗TNFa受體1型（TNFR1 ; p55)免疫球蛋白單一可變 區域，其包含與選自 DOMlh-131-511、DOMlh-131- 131416.doc 200902551 201、DOMlh-13 1-202、DOMlh-131-203、DOMlh-131- 204及DOMlh-1 3 1-205(示於圖3)之胺基酸序列一致、或 不同於該所選擇胺基酸序列不會超過25個胺基酸位置 處’且具有與該所選擇序列之CDR3序列至少50% —致之 CDR3序列的胺基酸序列。 14. 一種抗TNFa受體1型（TNFR1 ; p55)免疫球蛋白單一可變 區域’其包含與選自〇014111-131-511、0〇]^111-131- 201、DOMlh-131-202、DOMlh-131-203、DOMlh-131-204及DOMlh-13 1-205(示於圖3)之胺基酸序列一致、或 不同於该所選擇之胺基酸序列不會超過2 5個胺基酸位置 處’且具有與該所選擇序列之CDR1序列至少5 〇% 一致之 CDR1序列及具有與該所選擇序列之CDR2序列至少50% 一致之CDR2序列的胺基酸序列。 15. —種抗TNFa受體1型（7^：?尺1 ; p55)免疫球蛋白單一可變 區域’其包含與選自〇0河111-131-511、0〇]^111-131- 201、DOMlh-13 1-202、DOMlh-131-203、DOMlh-131-204及DOMlh-13l-205(示於圖3)之胺基酸序列一致、或 不同於該所選擇胺基酸序列不會超過25個胺基酸位置 處’且具有與該所選擇序列之cdr1序列至少5〇%一致之 CDR1序列及具有與該所選擇序列之CDR3序列至少5〇0/〇 一致之CDR3序列的胺基酸序列。 16. —種抗TNFa受體isaNFR〗；p55)免疫球蛋白單一可變 區域’其包含與選自£)〇河111_131_511、〇〇14111-131- 201、DOMlh-13l-2〇2、DOMlh-131-203、DOMlh-131- 131416.doc 200902551 204及DOMlh-13 1-205(示於圖3)之胺基酸序列一致、或 不同於該所述擇胺基酸序列不會超過25個胺基酸位置 處’且具有與該所選擇序列之CDR2序列至少5 0% —致之 CDR2序列及具有與該所選擇序列之cdr3序列至少50% 一致之CDR3序列的胺基酸序列。 17. —種抗TNFa受體1型（TNFR1 ; P55)免疫球蛋白單一可變 區域’其包含與選自〇〇]^1111-131-511、001^1}1-131- 201、DOMlh-131-202、DOMlh-131-203、DOMlh-131-204及DOMlh-131-205(示於圖3)之胺基酸序列一致、或 不同於該所選擇胺基酸序列不會超過25個胺基酸位置 處’且具有與該所選擇序列之CDR1序列至少5 0% —致之 CDR1序列及具有與該所選擇序列之cdR2序列至少50% 一致之CDR2序列及具有與該所選擇序列之CDR3序列至 少50%—致之CDR3序列的胺基酸序列。
    18. —種TNFa受體1型（TNFR1 ; P5 5)拮抗劑，其具有與選自 DOMlh-131-511、DOMlh-131-201、DOMlh-13 1-202、 DOMlh-131-203、DOMlh-13 1-204 及 DOMlh-13 1-205(示 於圖3)之胺基酸序列之CDR 1序列至少50% —致之CDR 1 序列。 19. 一種TNFa受體1型（TNFR1 ; p5 5)拮抗劑，其具有與選自 DOMlh-131-511、DOMlh-131-201、DOMlh-131-202、 DOMlh-13 1-203、DOMlh-13 1-204 及 DOMlh-1 3 1-205(示 於圖3)之胺基酸序列之CDRl序列至少50% —致之CDR2 序歹。 131416.doc 200902551 20. —種TNFa受體1型（TNFRl ; p5 5)拮抗劑，其具有與選自 DOMlh-131-511、DOMlh-131-201、DOMlh-13 1-202、 DOMlh-13 1-203、DOMlh-131-204 及 DOMlh-131-205(示 於圖3)之胺基酸序列之CDR3序列至少50%—致之CDR3 序列。 21. —種TNFa受體1型（TNFRl ; p55)拮抗劑，其具有與選自 DOMlh-131-511 > DOM 1 h-1 3 1-20 1 ' DOM 1 h-1 3 1-202 >
    DOMlh-131-203、DOMlh-131-204 及 DOMlh-131-205(示 於圖3)之胺基酸序列之CDR1序列至少50%—致之CDR1 序列及與該所選擇序列之CDR2序列至少50% —致之 CDR2序歹丨J。 22. —種TNFa受體1型（TNFRl ; p55)拮抗劑，其具有與選自 DOMlh-131-511、DOMlh-131-201、DOMlh-131-202、 DOMlh-131-203、DOMlh-131-204 及 DOMlh-131-205(示 於圖3)之胺基酸序列之CDR1序列至少50%—致之CDR1 序列及與該所選擇序列之CDR3序列至少50% —致之 CDR3序列。 23. —種TNFa受體1型（TNFRl ; p5 5)拮抗劑，其具有與選自 DOMlh-131-511、DOMlh-131-201、DOMlh-131-202、 DOMlh-131-203、DOMlh-131-204 及 DOMlh-131-205(示 於圖3)之胺基酸序列之CDR2序列至少50%—致之CDR2 序列及與該所選擇序列之CDR3序列至少50% —致之 C D R 3序列。 24, —種TNFa受體1型（TNFRl ; p55)拮抗劑，其具有與選自 131416.doc 200902551 DOMlh-131-511、DOMlh-131-201、DOMlh-131-202、 DOMlh-13 1-203、DOMlh_131_2()4 及 D〇Mlh_131_2〇5(示 於圖3)之胺基酸序列之cdri序列至少5〇% 一致之CDR1 序列及與該所選擇序列之CDR2序列至少50% —致之 CDR2序列及與該所選擇序列之cdr3序列至少50%—致 之CDR3序列。 25. —種TNFa受體1型（TNFR1 ; p55)拮抗劑，其包含免疫球 蛋白單一可變區域，該可變區域包含選自DOM 1 h-13 1 -511 、 DOMlh-131-201 、 DOMlh-131_202 、 DOMlh-131-203、DOMlh-131-204 及 DOMlh-131-205(示於圖 3)之胺 基酸序列之CDR1、CDR2及/或CDR3序列。 26. —種TNFa受體1型（TNFR1 ; p55)拮抗劑，其與選自 DOMlh-131-511、DOMlh-131-201、DOMlh-131-202、 DOMlh-13 1-203、DOMlh-131-204 或 DOMlh-13 1-205 之 胺基酸序列競爭以結合TNFR1。
    27. —種包含TNFa受體1型（TNFR1 ; p55)結合位點之免疫球 蛋白單一可變區域，其中該可變區域在以下情況下對蛋 白酶具有抗性： (i) 在37°C下與至少1〇微克/毫升之濃度（c)之蛋白酶培 養至少1小時之時間（t);或 (ii) 在3 0°C下與至少40微克/毫升之濃度（c]之蛋白酶培 養至少1小時之時間（t); 其中該可變區域包含與〇0?^11]1-131-511、0〇]\^111-131-201、DOMlh-131-202、DOMlh-13 1-203、DOMlh-131- 131416.doc 200902551 204及D〇Mlh_131_2G5之胺基酸序列至少90〇/ 酸序列。 〆90/°—致之胺基 28. 如請求項27之可變區域，其中該、、曲 、 1000微克/毫升蛋白酶。 ’辰度㈠或以）為至少100或 29. 如請求項27或28之可變區域，其 時或隔夜。 ’ a⑴為1、3或24小 30. 如請求項27之可變區域，1 該濃度⑷為1 〇或丨Go微克/毫二變區域在條件⑴、及 時下具有抗性。 酶及時間⑴為1小 3 1 ·如請求項27之可變區域，立φ 該濃度(一克/毫升蛋::可件⑼、及 有抗性。 及日-間⑴為3小時下具 32. 如請求項27、28、30及31中 唄之可變區域，盆中哼 蛋白酶係選自胰蛋白酶、彈性 二° 酶。 蛋白每白血球酶及胰 33. 如請求項27、28、30及31中任_項之可變區域，其中該 蛋白酶為胰蛋白酶。 34. 如請求項27、28、30及31中任_項之可變區域，其中該 可變區域對胰蛋白酶及至少另—選自彈性蛋白酶、白血 球酶及胰酶之蛋白酶具有抗性。 35. 如請求項27、28、30及31中任—項之可變區域，其中咳 可變區域在條件⑴或（ii)下培養後特異性地結合tnfri。 36. 如請求項35之可變區域，該可變區域在條件⑴或（丨^下培 養後在ELISA中具有至少0.404之〇〇45〇讀數。 131416.doc 200902551 37.如請求項27、28、30及31中任一項之可變區域，其中該 可變區域在條件（i)或（ii)下培養後特異性地結合蛋白質A 或蛋白質L。 3 8.如請求項27、28、30及3 1中任一項之可變區域，其中該 可變區域在條件⑴或（ii)下培養後在凝膠電泳中大體性地 呈現早一紋帶。 39· —種TNFa受體1型（TNFR1 ; P55)拮抗劑，其包含如請求 項27至3 8中任一項之可變區域。
    40·如睛求項39之TNFR1括抗劑’其係用於經口傳送。 41 ·如請求項3 9或40之TNFR1拮抗劑，其係用於傳送至患者 之胃腸（GI)道。 42. —種如請求項39之TNFR1拮抗劑在製造用於經口傳送之 藥物中的用途。 43. —種如請求項39之TNFRU#抗劑在製造用於傳送至患者 之GI道之藥物中的用途。 44 如請求項3 9或40之拮抗劑，其中該可變區域對胰蛋白 酶、彈性蛋白酶及/或胰酶具有抗性。 45.如請求項42或43之用途，其中該可變區域對胰蛋白酶、 彈性蛋白酶及/或胰酶具有抗性。 46·如請求項39之TNFR 1拮抗劑，其係用於肺傳送。 47.如請求項39或46之TNFR1拮抗劑，其係用於傳送至患者 之肺。 48.—種如請求項39之TNFRU#抗劑在製造用於肺傳送之藥 物中的用途。 μ 131416.doc 200902551 49. 一種如請求項π之TNFR1拮抗劑在製造用於傳送至患者 之肺之藥物中的用途。 50. 如凊求項46之拮抗劑，其中該可變區域對白血球酶具有 抗性。 、 51·如請求項48或49之用途，其中該可變區域對白血球酶具 有抗性。 52. 如請求項392TNFR1拮抗劑，其係用於治療及/或預防發 炎性病狀。 53. —種如請求項39iTNFR1拮抗劑在製造用於治療及/或預 防發炎性病狀之藥物中的用途。 54. 如請求項52之拮抗劑，其中該病狀係選自由關節炎、多 發性硬化症、發炎性腸疾病及慢性阻塞性肺疾病組成之 群0 55. 如請求項54之拮抗劑，其中該關節炎為類風濕性關節炎 或幼年型類風濕性關節炎。 56. 如請求項54之拮抗劑，其中該發炎性腸疾病係選自由克 羅恩氏病（Crohn’s disease)及潰瘍性結腸炎組成之群。 57. 如請求項54之拮抗劑，其中該慢性阻塞性肺疾病係選自 由慢性支氣管炎、慢性阻塞性支氣管炎及肺氣腫組成之 群。 5 8.如請求項54之拮抗劑’其中該肺炎為細菌性肺炎。 59.如請求項58之拮抗劑，其中該細菌性肺炎為葡萄球菌肺 炎。 6 0.如請求項5 3之用途’其中該病狀係選自由關節炎、夕欲 131416.doc 200902551 性硬化症 群。 發炎性腸疾病及慢性阻塞性肺疾病 組成之 61.如請求項6〇之 ^ _ 幼年型類風濕性關炎為類風濕性關節炎或 62’r=r::用途，其中該發炎性腸疾病係選自由克羅 及々瘍性結腸炎組成之群。 63::γγ:? V其中該慢性阻塞性肺疾病係選自由 群。孔s尺、忮性阻塞性支氣管炎及肺氣腫組成之 64. 如請求項6〇之用途， 65. 如凊求項64之用途 炎。 其中該肺炎為細菌性肺炎。 ，其中該細菌性肺炎為葡萄球菌
    66. 如請求項39《TNFR1拮抗劑，其係用於治療及/或預防坪 吸道疾病。 67. 一種如請求項39之™FR1拮抗劑在製造用於治療及/或預 防呼吸道疾病之藥物中的用途。 68. 如請求項66之拮抗劑，其中該呼吸道疾病係選自由以下 各病組成之群：肺發炎、慢性阻塞性肺疾病、哮喘、肺 炎、過敏性肺炎、與嗜伊紅血球增多相關之肺浸潤、環 境肺疾病、#炎、支氣管擴張、囊性纖維化、間質肺疾 病、原發性肺動脈高壓、肺血栓栓塞、胸膜紊亂、縱隔 紊亂、隔膜紊亂、換氣不足、換氣過度、睡眠呼吸暫 停、急性呼吸窘迫症候群、間皮瘤、肉瘤、移植排斥、 移植物抗宿主疾病、肺癌、過敏性鼻炎、過敏症、石棉 I3J416.doc -10- 200902551
    /儿著病、曲黴菌腫、曲徽菌病、支氣管擴張、慢性支氣 ^ 肺氣腫、嗜伊紅血球肺炎、特發性肺纖維化、侵 扁生肺X球菌疾病、流感、非結核性分枝桿菌病、胸膜 積液1：肺病、肺孢子蟲病、肺炎、肺放線菌病、肺泡 蛋白况著症、肺炭疽、肺水腫、肺栓子、肺發炎、肺組 織細胞增多病χ、肺動脈高血壓、肺諾卡氏菌病 (P monary n0cardl0s)、肺結核、肺靜脈閉塞疾病、類風 ’、〖生肺病、肉狀瘤病及韋格納肉牙腫病（Wegener's 69. granulomatosis)。 如請求項67之用途，其中該呼吸道疾病係選自由以下各 病組成之# :肺發炎、慢性阻塞性肺疾病、哮喘、肺 炎、過敏性肺炎、與嗜伊紅血球增多相關之肺浸潤、環 境肺疾病、肺炎、支氣管擴張、囊性纖維化、間質肺疾 病、原發性肺動脈高壓、肺血栓栓塞、胸膜I亂、縱隔 紊亂、隔料亂、耗不足、換氣過度、睡眠呼吸暫 停、急性呼吸窘迫症候群、間皮瘤、肉瘤、移植排斥、 移植物抗宿主疾病、肺癌、過敏性鼻炎、過敏症、石棉 :著病、曲黴菌腫、曲黴菌病、支氣管擴張、慢性支氣 e人肺氣腫、嗜伊紅血球肺炎、特發性肺纖維化、侵 襲性肺炎球菌疾病、流感、非結核性分枝桿菌病、胸膜 積液、塵肺病、肺孢子蟲病、肺炎、 肺放線菌病 蛋白沉著症、肺炭疽、肺水腫、 織細胞增多病X、肺動脈高血壓 、肺泡 核、肺靜脈閉塞疾病' 類風濕性肺病 肺栓子、肺發炎 、肺諾卡氏菌病 肺組 肺結 肉狀瘤病及韋格 131416.doc 200902551 納肉牙腫病。 7〇· 一種肺傳送裝置，其含有如請求項39、4ό、47或50之 TNFR1拮抗劑。 71.如請求項7〇之裝置，其中該裝置為吸入器或鼻内投藥裝 置。 72· 一種口服調配物，其包含如請求項39或40之TNFR1拮抗 劑。 、73.如請求項72之調配物，其中該調配物為錠劑、丸劑、膠 囊、液體或糖漿。 74. 如請求項7、8、39、40、46、5〇、52、54 至 59、66及68 中任項之拮抗劑，其中邊拮抗劑包含如請求項1至6、 11至17及27至38中任一項之可變區域。 75. 如請求項7、8、39、40、46、5〇、52、54 至 59、^及⑽ 中任項之抬抗劑，其中5亥抬抗劑包含具有至少$ 〇。〇之 Tm之可變區域。 》76.如請求項7、8、39、40、46、5〇、52、54 至 59、^及⑽ 中任一項之拮抗劑，其中s亥拮抗劑包含在MRc_5細胞檢 定係以2 nM至50 pM之ND50中和經TNFMlJ激之比_8釋放 之可變區域。 77·如請求項42、43、48、49、53、6〇至65及67中任一項之 用途，其中該拮抗劑包含如請求項1至6、11至17及27至 38中任一項之可變區域。 78.如請求項42、43、48、49、53、6〇至65及67中任一項之 用途，其中該拮抗劑包含具有至少5(rc之丁爪之可變區 131416.doc -12· 200902551 域。 79.如請求項42、43、48、49、53、的至以及。中任一項之 用途’其中該拮抗劑包含在MRC-5細胞檢定係以2 nM至 50 pM之ND50中和經TNFa刺激之IL-8釋放之可變區域。 80·如請求項70或7丨之裝置，其中該拮抗劑包含如請求項工 至6、11至17及27至38中任一項之可變區域。 8 1 ·如請求項70或7丨之裝置，其中該拮抗劑包含具有至少 5〇°C之Tm之可變區域。 82.如請求項70或71之裝置，其中該拮抗劑包含在MRC-5細 胞檢定係以2 nM至50 pM之ND50中和經TNFa刺激之IL-8 釋放之可變區域。 83·如請求項72或73之調配物，其中該拮抗劑包含如請求項 1至6、11至17及27至38中任一項之可變區域。 84·如請求項72或73之調配物，其中該拮抗劑包含具有至少 50C之Tm之可變區域。
    85.如請求項72或73之調配物，其中該拮抗劑包含 細胞檢定係以2 nM至50 PM之ND50中和經TNFa刺激之 IL-8釋放之可變區域。 86·如請求項丨、2、4至6、Uu7、27、28、3〇及31中任一 項之可‘k區域，纟中該可變區域具有至少5〇〇c之丁爪。 87, 如請求項1、2、4至6、"至17、27、28、中任— 項之可變區域，其中該可變區域在__5細胞檢定係以 2 nM至50 PM之ND50中和經TNFa刺激之IL_8釋放。 88. -種雙特異性配位體，其包含如請求項⑴、u至η、 131416.doc • 13 - 200902551 27至38、86及87中任一項之可變區域。 89. —種經分離或重組核酸，其編碼包含如請求項1至6i ^ 至1 7 27至38、86及87中任一項之免疫球蛋白單一可變 區域之多肽。 90. —種載體，其包含如請求項89之核酸。 91. 一種佰主細胞，其包含如請求項89之核酸或如請求項9〇 之載體。 92. —種產生包含免疫球蛋白單一可變區域之多肽之方法， 該方法包含將如清求項91之宿主細胞維持在適於該核酸 或該載體表現之條件下，藉此包含免疫球蛋白單一可變 區域之多肽係經產生。 93 ·如明求項92之方法，其進一步包含分離該多肽及視情況 產生較该經分離多肽具有改良之親和力及/或nd5〇之變 異體’例如突變變異體。 94. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至6、n至〗7、η至 38、86及87中任-項之免疫球蛋白單—可變區域或如請 求項 7至 10、18至26、39至 41、44、46、47、5〇、μ、 54至59、66、68及74至76中任一項之拮抗劑，及醫藥學 上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。 95. —種多肽，其包含與D〇Mlh_131_5n之胺基酸序列（示於 圖3)至少9 5 % —致之序列。 96. —種多肽，其由與DOMlh_131_5u之核苷酸序列之核普 酸序列（示於圖19)至少80%一致之序列編碼。 97. —種融合蛋白，其包含如請求項95或96之多肽。 I314l6.doc •14- 200902551 98· 或重組核酸’其編碼如請求項95或96之多肽 次女叫未項97之融合蛋白。 99. 如請求項1、？ 項之免η 、、至17、27、28、3〇及31中任一 員之免疫球蛋白單-可變區域，其包含抗體恆定 100. 如請求項99之可變 域 FaN“ …抗體Fe’視情況其中該 末Z末端連接至（視情況直接連接至）讀可變區域之c_ 1〇1.Π!項7、8、39、4°、46、5°、52、54至59、66及68 項之拮抗劑’其包含抗體恆定區域。 102·如請求項1〇1之拮抗劑，其包含抗體 Μ ▲ 現情況其中該 末端。-末端連接至（視情況直接連接至）讀可變區域之C_ 103. 如請求項95或96之多肽，其包含抗體恆定區域。 104. 如請求項1〇3之多肽，其包含抗體Fc 凡障况其中該Fc 之N-末端連接至（視情況直接連接至）該可 山 免區域之C-末 1314I6.doc 15
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TW097121265A TW200911834A (en) 2007-06-06 2008-06-06 Polypeptides, antibody variable domains & antagonists
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WO (3) WO2008149150A2 (zh)
ZA (1) ZA200908470B (zh)

Families Citing this family (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005289809A (ja) 2001-10-24 2005-10-20 Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) 突然変異重鎖抗体
MX342271B (es) 2005-05-18 2016-09-21 Ablynx Nv Nanobodiestm (nanocuerpos) mejorados contra el factor alfa de necrosis del tumor.
DE102005023617A1 (de) 2005-05-21 2006-11-23 Aspre Ag Verfahren zum Mischen von Farben in einem Display
KR20100018040A (ko) 2007-06-06 2010-02-16 도만티스 리미티드 프로테아제 내성 폴리펩티드를 선택하는 방법
CA2683801A1 (en) * 2007-06-06 2008-12-11 Domantis Limited Polypeptides, antibody variable domains and antagonists
GB0724331D0 (en) 2007-12-13 2008-01-23 Domantis Ltd Compositions for pulmonary delivery
US20100260853A1 (en) * 2007-12-13 2010-10-14 Amrik Basran Compositions for pulmonary delivery
WO2009127691A1 (en) 2008-04-17 2009-10-22 Ablynx N.V. Peptides capable of binding to serum proteins and compounds, constructs and polypeptides comprising the same
DK3216803T3 (da) 2008-06-25 2020-06-02 Novartis Ag Stabile og opløselige antistoffer, der hæmmer vegf
US8268314B2 (en) 2008-10-08 2012-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
CA2744055A1 (en) * 2008-11-26 2010-06-03 Glaxo Group Limited Polypeptides, antibody variable domains & antagonists
WO2010081787A1 (en) 2009-01-14 2010-07-22 Domantis Limited IMPROVED TNFα ANTAGONISM, PROPHYLAXIS & THERAPY WITH REDUCED ORGAN NECROSIS
WO2010094722A2 (en) 2009-02-19 2010-08-26 Glaxo Group Limited Improved anti-serum albumin binding variants
EA028178B1 (ru) * 2009-02-19 2017-10-31 Глэксо Груп Лимитед Улучшенные связывающие сывороточный альбумин варианты
SG173173A1 (en) * 2009-02-19 2011-08-29 Glaxo Group Ltd Improved anti-tnfr1 polypeptides, antibody variable domains & antagonists
CA2753287A1 (en) 2009-02-24 2010-09-02 Glaxo Group Limited Antigen-binding constructs
CA2768460A1 (en) 2009-07-16 2011-01-20 Glaxo Group Limited Antagonists, uses & methods for partially inhibiting tnfr1
SG177601A1 (en) 2009-07-16 2012-02-28 Glaxo Group Ltd Improved anti-serum albumin binding single variable domains
CA2777700A1 (en) * 2009-10-14 2011-04-21 Aileron Therapeutics, Inc. Improved peptidomimetic macrocycles
AR078763A1 (es) 2009-10-27 2011-11-30 Glaxo Group Ltd Polipeptidos anti factor de necrosis tumoral 1 (anti-tnfr1) estables, dominios variables de anticuerpos y antagonistas
WO2011095545A1 (en) 2010-02-05 2011-08-11 Ablynx Nv Peptides capable of binding to serum albumin and compounds, constructs and polypeptides comprising the same
KR20130109977A (ko) 2010-05-20 2013-10-08 글락소 그룹 리미티드 개선된 항-혈청 알부민 결합 변이체
US9012609B2 (en) * 2010-08-13 2015-04-21 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Anti-serum albumin binding variants
SG188204A1 (en) 2010-08-20 2013-04-30 Glaxo Group Ltd Improved anti-serum albumin binding variants
ES2618586T3 (es) * 2010-09-16 2017-06-21 Baliopharm Ag Anticuerpo anti-huTNFR1
JP2014501515A (ja) 2010-12-01 2014-01-23 グラクソ グループ リミテッド 改良された抗血清アルブミン結合単一可変ドメイン
EP2670778A1 (en) * 2011-02-02 2013-12-11 Glaxo Group Limited Novel antigen binding proteins
US9527925B2 (en) 2011-04-01 2016-12-27 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bispecific binding molecules binding to VEGF and ANG2
US10400029B2 (en) 2011-06-28 2019-09-03 Inhibrx, Lp Serpin fusion polypeptides and methods of use thereof
IL312872A (en) 2011-06-28 2024-07-01 Inhibrx Inc Methods for purifying fusion proteins containing serphin
WO2013014208A2 (en) 2011-07-27 2013-01-31 Glaxo Group Limited Antigen binding constructs
EA027160B1 (ru) 2011-08-17 2017-06-30 Глаксо Груп Лимитед Модифицированные белки и пептиды
GB2497138A (en) * 2011-12-02 2013-06-05 Randox Lab Ltd Biomarkers for stroke and stroke subtype diagnosis.
PE20150361A1 (es) 2012-07-13 2015-03-14 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos anti-vegf/anti-ang-2 y su utilizacion en el tratamiento de enfermedades vasculares oculares
WO2014111550A1 (en) 2013-01-17 2014-07-24 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Modified anti-serum albumin binding proteins
EP2951192A1 (en) 2013-01-31 2015-12-09 Glaxo Group Limited Method of producing a protein
US9840553B2 (en) 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
MA41374A (fr) * 2015-01-20 2017-11-28 Cytomx Therapeutics Inc Substrats clivables par métalloprotéase matricielle et clivables par sérine protéase et procédés d'utilisation de ceux-ci
IL290457B1 (en) 2015-12-30 2024-10-01 Kodiak Sciences Inc Antibodies and their conjugates
GB201617622D0 (en) * 2016-10-18 2016-11-30 VIB VZW and Universiteit Gent Means and methods to treat inflammation
RU2625010C1 (ru) * 2016-11-10 2017-07-11 Илья Петрович Приколаб Экспрессионный плазмидный вектор для экспрессии активной формы TNFR1-Fc и способ получения рекомбинантного белка
EP3546574A4 (en) 2016-11-28 2020-09-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ANTIGEN AND POLYPEPTIDE BINDING AREA INCLUDING A TRANSPORT SECTION
JPWO2018097308A1 (ja) 2016-11-28 2019-10-17 中外製薬株式会社 リガンド結合活性が調整可能なリガンド結合分子
UY37651A (es) * 2017-03-31 2018-10-31 Swedish Orphan Biovitrum Ab Publ Polipéptido de unión al il-1r-i
US11326156B2 (en) * 2017-11-01 2022-05-10 Allogene Therapeutics, Inc. Modified caspase-9 polypeptides and methods of use thereof
MX2020005220A (es) 2017-11-28 2020-08-24 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Polipeptido que incluye dominio de union al antigeno y seccion de transporte.
MX2020009152A (es) 2018-03-02 2020-11-09 Kodiak Sciences Inc Anticuerpos de il-6 y constructos de fusion y conjugados de los mismos.
EP3802831A4 (en) * 2018-05-30 2022-07-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha POLYPEPTIDE COMPRISING AN IL-1R1 BINDING DOMAIN AND A TRANSPORT FRACTION
WO2019230867A1 (en) 2018-05-30 2019-12-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Polypeptide comprising aggrecan binding domain and carrying moiety
EP3623798B1 (de) * 2018-09-13 2021-11-03 Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG Verfahren und vorrichtung zum erfassen und darstellen eines immunfluoreszenzbildes einer biologischen probe
CN112955240B (zh) * 2018-10-25 2022-09-16 豪夫迈·罗氏有限公司 抗体FcRn结合的修饰
US12049505B2 (en) 2018-12-06 2024-07-30 Cytomx Therapeutics, Inc. Matrix metalloprotease-cleavable and serine or cysteine protease-cleavable substrates and methods of use thereof
CN111454366B (zh) * 2019-01-21 2023-06-16 中国科学院深圳先进技术研究院 一种融合蛋白及其应用
EP3919903A4 (en) * 2019-01-31 2022-11-02 Sekisui Medical Co., Ltd. METHOD FOR IMMUNOLOGICAL ANALYSIS OF FREE AIM IN A BIOLOGICAL SAMPLE AND MEASUREMENT KIT
CA3157509A1 (en) 2019-10-10 2021-04-15 Kodiak Sciences Inc. Methods of treating an eye disorder
CA3193273A1 (en) 2020-08-27 2022-03-03 Enosi Therapeutics Corporation Methods and compositions to treat autoimmune diseases and cancer
WO2022117569A1 (en) 2020-12-02 2022-06-09 Oncurious Nv A ccr8 antagonist antibody in combination with a lymphotoxin beta receptor agonist antibody in therapy against cancer
CN115181751A (zh) * 2021-04-02 2022-10-14 苏州博腾生物制药有限公司 靶向白蛋白的嵌合抗原受体及其使用方法
CN114657162B (zh) * 2022-03-04 2023-06-16 华南理工大学 一种具有血管内皮细胞保护功能的抗氧化五肽及其应用
KR20240007881A (ko) 2022-07-08 2024-01-17 노보 노르디스크 에이/에스 FVIII(a)를 치환할 수 있는 매우 강력한 ISVD 화합물

Family Cites Families (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2148299B (en) * 1983-09-01 1988-01-06 Hybritech Inc Antibody compositions of therapeutic agents having an extended serum half-life
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
GB8725529D0 (en) 1987-10-30 1987-12-02 Delta Biotechnology Ltd Polypeptides
JP3095168B2 (ja) 1988-02-05 2000-10-03 エル． モリソン，シェリー ドメイン‐変性不変部を有する抗体
AU4308689A (en) 1988-09-02 1990-04-02 Protein Engineering Corporation Generation and selection of recombinant varied binding proteins
DE68913658T3 (de) 1988-11-11 2005-07-21 Stratagene, La Jolla Klonierung von Immunglobulin Sequenzen aus den variablen Domänen
ATE92107T1 (de) 1989-04-29 1993-08-15 Delta Biotechnology Ltd N-terminale fragmente von menschliches serumalbumin enthaltenden fusionsproteinen.
CA2016842A1 (en) 1989-05-16 1990-11-16 Richard A. Lerner Method for tapping the immunological repertoire
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5977307A (en) 1989-09-07 1999-11-02 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific ligand-neuropharmaceutical agent fusion proteins
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
AU665190B2 (en) 1990-07-10 1995-12-21 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
EP0562025B1 (en) 1990-12-06 2001-02-07 Affymetrix, Inc. (a Delaware Corporation) Compounds and their use in a binary synthesis strategy
PT1024191E (pt) 1991-12-02 2008-12-22 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
CA2163345A1 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Susan Adrienne Morgan Antibodies
US5702892A (en) 1995-05-09 1997-12-30 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Phage-display of immunoglobulin heavy chain libraries
CA2229043C (en) 1995-08-18 2016-06-07 Morphosys Gesellschaft Fur Proteinoptimierung Mbh Protein/(poly)peptide libraries
CN103275221B (zh) * 1996-02-09 2016-08-17 艾伯维生物技术有限公司 结合人TNFα的人抗体
EP1496120B1 (en) 1997-07-07 2007-03-28 Medical Research Council In vitro sorting method
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
DK1078051T3 (da) 1998-05-13 2008-04-07 Domantis Ltd Fagvisningsselektionssystem til selektion af korrekt foldede proteiner
IL127127A0 (en) 1998-11-18 1999-09-22 Peptor Ltd Small functional units of antibody heavy chain variable regions
EP1252319A2 (en) 2000-02-03 2002-10-30 Domantis Limited Combinatorial protein domains
CA2399388A1 (en) 2000-02-11 2001-08-16 Michael J. Lenardo Identification of a domain in the tumor necrosis factor receptor family that mediates pre-ligand receptor assembly and function
US7265210B2 (en) * 2000-09-15 2007-09-04 Genentech, Inc. Anti-PRO9821 antibodies
TWI327600B (en) 2000-11-28 2010-07-21 Medimmune Llc Methods of administering/dosing anti-rsv antibodies for prophylaxis and treatment
DE60237282D1 (de) 2001-06-28 2010-09-23 Domantis Ltd Doppelspezifischer ligand und dessen verwendung
US20060073141A1 (en) * 2001-06-28 2006-04-06 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
GB0118689D0 (en) * 2001-08-01 2001-09-19 Psimedica Ltd Pharmaceutical formulation
EP1572936A2 (en) 2002-03-05 2005-09-14 Eli Lilly And Company Heterologous g-csf fusion proteins
US20060002935A1 (en) * 2002-06-28 2006-01-05 Domantis Limited Tumor Necrosis Factor Receptor 1 antagonists and methods of use therefor
DK1517921T3 (da) * 2002-06-28 2006-10-09 Domantis Ltd Immunglobulin-enkeltvariable antigen-bindende domæner og dobbeltspecifikke konstruktioner deraf
US7696320B2 (en) 2004-08-24 2010-04-13 Domantis Limited Ligands that have binding specificity for VEGF and/or EGFR and methods of use therefor
NZ538384A (en) 2002-09-06 2009-04-30 Alexion Pharma Inc Treatment for asthma using a compound which binds to or otherwise blocks the generation and/or activity of one or more complement components reptors, such as, C5a receptors
NZ538569A (en) 2002-09-06 2009-02-28 Amgen Inc Therapeutic human anti-IL-1R1 monoclonal antibody
EP2336179A1 (en) 2002-11-08 2011-06-22 Ablynx N.V. Stabilized single domain antibodies
GB0230203D0 (en) * 2002-12-27 2003-02-05 Domantis Ltd Fc fusion
CA2511910A1 (en) 2002-12-27 2004-07-15 Domantis Limited Dual specific single domain antibodies specific for a ligand and for the receptor of the ligand
US20060104968A1 (en) * 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
PT1639011E (pt) * 2003-06-30 2009-01-20 Domantis Ltd Anticorpos (dab) de domínio único peguilados
SI1729795T1 (sl) 2004-02-09 2016-04-29 Human Genome Sciences, Inc. Albuminski fuzijski proteini
DE602005023291D1 (de) 2004-03-24 2010-10-14 Domantis Ltd Universelles signalpeptid gas1
RS52539B (en) * 2004-10-21 2013-04-30 Genentech Inc. METHOD FOR TREATMENT OF INTRAOCULAR NEOVASCULAR DISEASES
GB0521621D0 (en) * 2005-10-24 2005-11-30 Domantis Ltd Tumor necrosis factor receptor 1 antagonists for treating respiratory diseases
WO2006059108A2 (en) * 2004-12-02 2006-06-08 Domantis Limited ANTI-IL-IRl SINGLE DOMAIN ANTIBODIES AND THERAPEUTIC USES
KR20080077238A (ko) 2005-12-01 2008-08-21 도만티스 리미티드 인터루킨 1 수용체 타입 1에 결합하는 비경쟁적 도메인항체 포맷
KR20080077237A (ko) * 2005-12-01 2008-08-21 도만티스 리미티드 인터루킨 1 수용체 타입 1에 결합하는 경쟁적 도메인 항체포맷
DK2068889T3 (da) 2006-08-10 2020-02-03 Roy C Levitt Anakinra til anvendelse i behandling af bronchiolitis obliterans syndrom
AU2007310838A1 (en) * 2006-10-27 2008-05-02 Ablynx N.V. Intranasal delivery of polypeptides and proteins
KR20100018040A (ko) 2007-06-06 2010-02-16 도만티스 리미티드 프로테아제 내성 폴리펩티드를 선택하는 방법
CA2683801A1 (en) 2007-06-06 2008-12-11 Domantis Limited Polypeptides, antibody variable domains and antagonists

Also Published As

Publication number Publication date
AR066848A1 (es) 2009-09-16
EP2746290B1 (en) 2019-08-14
CA2688447C (en) 2016-11-08
EP2746290A3 (en) 2014-09-10
HUE025899T2 (en) 2016-05-30
SG182141A1 (en) 2012-07-30
EP2162467A2 (en) 2010-03-17
ES2546943T3 (es) 2015-09-30
JP5444215B2 (ja) 2014-03-19
SI2162467T1 (sl) 2015-11-30
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CO6251321A2 (es) 2011-02-21
CL2008001673A1 (es) 2008-11-21
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AU2008259514B2 (en) 2014-05-15
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AU2008259590A1 (en) 2008-12-11
PL2162467T3 (pl) 2015-12-31
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PT2162467E (pt) 2015-10-29
CA2688447A1 (en) 2008-12-11
MA31403B1 (fr) 2010-05-03
KR20100021642A (ko) 2010-02-25

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