KR101604274B1 - 폴리펩티드，항체 가변 도메인 및 길항제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 프로테아제에 의한 분해에 내성인 항-TNFR1 폴리펩티드 및 항체 단일 가변 도메인(dAb), 뿐만 아니라 이를 포함하는 길항제에 관한 것이다. 폴리펩티드, dAb 및 길항제는 환자에 투여되는 경우, 예를 들어, 폐 투여, 경구 투여, 환자의 폐로의 전달 및 위장관(GI tract)으로의 전달 동안 프로테아제와 조우되는 경우에 치료제 및/또는 예방제로 유용할 뿐만 아니라, 염증 질병, 예를 들어, 관절염 또는 COPD를 치료하는데 유용하다.

Description

폴리펩티드，항체 가변 도메인 및 길항제{POLYPEPTIDES，ANTIBODY VARIABLE DOMAINS AND ANTAGONISTS}
본 발명은 프로테아제 내성 폴리펩티드, 면역글로불린(항체) 단일 가변 도메인 및 이들을 포함하는 항-종양 괴사 인자 1(TNFR1, p55, CD120a, P60, TNF 수용체 상과 일원 1A, TNFRSF1A) 길항제에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 이러한 항-TNFR1 리간드를 포함하는 용도, 제형, 조성물 및 장치에 관한 것이다.
폴리펩티드 및 펩티드는 산업적 적용 및 약제, 치료제 및 진단제로서의 용도를 포함하는, 다양한 적용에서 점점 더 중요한 작용제가 되어 왔다. 그러나, 염증 상태(예컨대, COPD) 및 암과 같은 특정 생리학적 상태에서, 조직, 기관 또는 동물 (예컨대, 폐에, 종양이나 이에 인접하여)에 존재하는 프로테아제의 양이 증가될 수 있다. 프로테아제의 이러한 증가는 내인성 단백질 및 질병을 치료하기 위해 투여되는 치료용 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질의 가속된 분해 및 불활성화를 초래할 수 있다. 따라서, 생체내 사용 (예컨대, 질병을 치료, 진단 또는 예방하는 용도)의 가능성이 있는 일부 작용제는 이들이 프로테아제에 의해 신속하게 분해되고 불활성화되기 때문에 제한된 효능만을 지닌다.
프로테아제 내성 폴리펩티드는 여러 이점을 제공한다. 예를 들어, 프로테아제 내성 폴리펩티드는 프로테아제 민감성 작용제보다 더 길게 생체내 활성인 채로 남아 있으므로, 생물학적 효과를 제공하기에 충분한 기간 동안 여전히 기능성이다. 프로테아제 분해에 내성이고 또한 바람직한 생물학적 활성을 지니는 폴리펩티드를 선택하기 위한 개선된 방법에 대한 요구가 역시 존재한다.
TNFR1
TNFR1은 리간드에 결합하는 세포외 영역, 및 고유의 신호전달 활성이 결여되어 있으나 신호전달 분자와 회합될 수 있는 세포내 도메인을 함유하는 막횡단 수용체이다. TNFR1과 결합된 TNF의 복합체는 3개의 TNFR1 사슬 및 3개의 TNF 사슬을 함유한다(Banner et al ., Cell , 73(3) 431-445 (1993)). TNF 리간드는 삼합체로 존재하며, 이는 3개의 TNFR1 사슬에 의해 결합되어 있다(전술한 바와 같음). 3개의 TNFR1 사슬은 수용체-리간드 복합체 내에 함께 밀집하여 군집을 이루며, 이러한 군집화(clustering)는 TNFR-매개 신호전달에 필수적이다. 사실, TNFR1에 결합하는 다가 작용제, 예를 들어, 항-TNFR1 항체는 TNF의 부재하에서 TNFR1 군집화 및 신호전달을 유도할 수 있으며, 이는 통상적으로 TNFR1 효능제로 사용된다(예를 들어, Belka et al ., EMBO , 14(6): 1156-1165 (1995); Mandik-Nayak et al ., J. Immunol , 167: 1920-1928 (2001) 참조). 따라서, TNFR1에 결합하는 다가 작용제는 일반적으로 이들이 TNFR1에 대한 TNFα의 결합을 차단하더라도 TNFR1의 효과적인 길항제는 아니다.
TNFR1의 세포외 영역은 13개의 아미노산 아미노 말단 세그먼트(서열번호 603의 아미노산 1-13(인간); 서열번호 604의 아미노산 1-13(마우스)), 도메인 1(서열번호 603의 아미노산 14-53(인간); 서열번호 604의 아미노산 14-53(마우스)), 도메인 2(서열번호 603의 아미노산 54-97(인간); 서열번호 604의 아미노산 54-97(마우스)), 도메인 3(서열번호 603의 아미노산 98-138(인간); 서열번호 604의 아미노산 98-138(마우스)), 및 도메인 4(서열번호 603의 아미노산 139-167(인간); 서열번호 604의 아미노산 139-167(마우스)), 및 이에 이어서 막-인접 영역(서열번호 603의 아미노산 168-182(인간); 서열번호 604의 아미노산 168-183(마우스))를 포함한다(예를 들어, Banner et al ., Cell 73(3) 431-445 (1993) and Loetscher et al ., Cell 61(2) 351-359 (1990) 참조). 도메인 2 및 3은 결합된 리간드(TNFβ, TNFα)와 접촉한다(Banner et al ., Cell , 73(3) 431-445 (1993)). TNFR1의 세포외 영역은 또한 프리-리간드 결합 어셈블리 도메인(pre-ligand binding assembly domain) 또는 PLAD 도메인으로 언급되는 영역을 함유한다(서열번호 603의 아미노산 1-53(인간); 서열번호 604의 아미노산 1-53(마우스))(The Government of the USA, WO 01/58953; Deng et al ., Nature Medicine, doi: 10.1038/nml304 (2005)).
TNFR1은 도메인 4 또는 막-인접 영역(서열번호 603의 아미노산 168-182; 서열번호 604의 아미노산 168-183) 내에 TNFR1의 단백질분해를 포함하는 과정을 통해 생체내에서 세포의 표면으로부터 쉐딩(shedding)되어 TNFR1의 가용성 형태를 생성한다. 가용성 TNFR1은 TNFα에 결합함으로써 TNFα의 활성의 내인성 억제제로 작용하는 능력을 보유한다.
발명의 개요
일 구체예에서, 본 발명은 DOM1h-131-206의 아미노산 서열(도 3에 도시됨)과 93% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 일 구체예에서, 상기 퍼센트 동일성은 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상이다. 일 구체예에서, 폴리펩티드는 DOM1h-131-206이다. 본 발명은 (실질적으로) 순수한 DOM1h-131-206 단량체를 추가로 제공한다. 일 구체예에서, DOM1h-131-206은 98, 99, 99.5% 이상 또는 100% 순도의 단량체이다.
일 양태에서, 본 발명은 DOM1h-131-206의 누클레오티드 서열(도 19에 도시됨)과 80% 이상 동일한 누클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 폴리펩티드를 제공한다. 일 구체예에서, 상기 퍼센트 동일성은 70, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상이다.
일 양태에서, 본 발명은 DOM1h-131-206의 누클레오티드 서열(도 19에 도시됨)과 57% 이상 동일한 누클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 폴리펩티드를 제공하고, 이러한 폴리펩티드는 DOM1h-131-206의 아미노산 서열(도 3에 도시됨)과 93% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 누클레오티드 서열의 퍼센트 동일성은 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상이다. 일 구체예에서, 상기 아미노산 서열의 퍼센트 동일성은 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 또는 100%이다. 예를 들어, 누클레오티드 서열은 DOM1h-131-206의 누클레오티드 서열(도 19에 도시됨)의 코돈 최적화된 형태일 수 있다. 서열의 코돈 최적화는 당 분야에 공지되어 있다. 일 구체예에서, 누클레오티드 서열은 세균(예를 들어, E. 콜리(E. coli) 또는 슈도모나스(Pseudomonas), 예를 들어, P 플루오레센스(P fluorescens)), 포유동물(예를 들어, CHO) 또는 효모 숙주 세포(예를 들어, 피키아(Picchia) 또는 사카로마이세스(Saccharomyces), 예를 들어, P. 파스토리스(P. pastoris) 또는 S. 세레비지에(S. cerevisiae))에서의 발현에 최적화된다.
일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 DOM1h-131-206의 아미노산 서열(도 3에 도시됨)과 93% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항-TNFα 수용체 타입 1(TNFR1;p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 퍼센트 동일성은 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상이다.
일 양태에서, 본 발명은 DOM1h-131-206의 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 프로테아제 내성 항-TNFα 수용체 타입 1(TNFR1;p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공한다. 상기 양태의 일 구체예에서, 상기 퍼센트 동일성은 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상이다.
일 구체예에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 위치 53에 아스파르트산을 포함하며, 상기 넘버링(numbering)은 카밧(Kabat) 넘버링에 따른다("Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services 1991).
일 구체예에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 위치 91에 히스티딘을 포함하며, 상기 넘버링은 카밧 넘버링에 따른다.
일 양태에서, 본 발명은 DOM1h-131-206의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항-TNFα 수용체 타입 1(TNFR1;p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 DOM1h-131-206의 누클레오티드 서열(도 19에 도시됨)과 80% 이상 동일한 누클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 항-TNFα 수용체 타입 1(TNFR1;p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 퍼센트 동일성은 70, 80, 85, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상이다.
일 양태에서, 본 발명은 DOM1h-131-206의 누클레오티드 서열(도 19에 도시됨)과 57% 이상 동일한 누클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 항-TNFα 수용체 타입 1(TNFR1;p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공하며, 이러한 가변 도메인은 DOM1h-131-206의 아미노산 서열(도 3에 도시됨)과 93% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 누클레오티드 서열의 퍼센트 동일성은 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상이다. 일 구체예에서, 상기 아미노산 서열의 퍼센트 동일성은 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 또는 100%이다. 예를 들어, 누클레오티드 서열은 DOM1h-131-206의 누클레오티드 서열(도 19에 도시됨)의 코돈 최적화된 형태일 수 있다. 서열의 코돈 최적화는 당 분야에 공지되어 있다. 일 구체예에서, 누클레오티드 서열은 세균(예를 들어, E. 콜리 또는 슈도모나스, 예를 들어, P 플루오레센스), 포유동물(예를 들어, CHO) 또는 효모 숙주 세포(예를 들어, 피키아 또는 사카로마이세스, 예를 들어, P. 파스토리스 또는 S. 세레비지에)에서의 발현에 최적화된다.
일 구체예에서, 본 발명은 DOM1h-131-206의 누클레오티드 서열(도 19에 도시됨)과 동일한 서열에 의해 엔코딩된 항-TNFα 수용체 타입 1(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공한다.
일 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항-TNFR1 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 TNFα 수용체 타입 1(TNFR1; p55) 길항제를 제공한다. 일 구체예에서, 길항제는 제 1 및 제 2 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하며, 여기서 각각의 가변 도메인은 본 발명에 따른 것이다. 예를 들어, 길항제는 상기 단일 가변 도메인의 단량체 또는 상기 단일 가변 도메인의 동종이합체를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 단일 가변 도메인 또는 각각의 단일 가변 도메인의 아미노산 서열은 DOM1h-131-206의 아미노산 서열(도 3에 도시됨)과 동일하다.
일 양태에서, 본 발명은 DOM1h-131-206의 아미노산 서열(도 3에 도시됨)과 동일하거나, 25개 이하의 아미노산 위치에서 DOM1h-131-206의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함하고, DOM1h-131-206의 CDR1 서열과 50% 이상 동일한 CDR1 서열을 갖는, 항-TNFα 수용체 타입 1(TNFR1;p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 서열 상이는 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2개 이하 또는 1개의 아미노산 위치이다. 일 구체예에서, CDR 서열 동일성은 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상이다.
일 양태에서, 본 발명은 DOM1h-131-206의 아미노산 서열(도 3에 도시됨)과 동일하거나, 25개 이하의 아미노산 위치에서 DOM1h-131-206의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함하고, DOM1h-131-206의 CDR2 서열과 50% 이상 동일한 CDR2 서열을 갖는, 항-TNFα 수용체 타입 1(TNFR1;p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 서열 상이는 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2개 이하 또는 1개의 아미노산 위치이다. 일 구체예에서, CDR 서열 동일성은 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상이다.
일 양태에서, 본 발명은 DOM1h-131-206의 아미노산 서열(도 3에 도시됨)과 동일하거나, 25개 이하의 아미노산 위치에서 DOM1h-131-206의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함하고, DOM1h-131-206의 CDR3 서열과 50% 이상 동일한 CDR3 서열을 갖는, 항-TNFα 수용체 타입 1(TNFR1;p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 서열 상이는 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2개 이하 또는 1개의 아미노산 위치이다. 일 구체예에서, CDR 서열 동일성은 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상이다.
일 양태에서, 본 발명은 DOM1h-131-206의 아미노산 서열(도 3에 도시됨)과 동일하거나, 25개 이하의 아미노산 위치에서 DOM1h-131-206의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함하고, DOM1h-131-206의 CDR1 서열과 50% 이상 동일한 CDR1 서열을 갖고, DOM1h-131-206의 CDR2 서열과 50% 이상 동일한 CDR2 서열을 갖는, 항-TNFα 수용체 타입 1(TNFR1;p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 서열 상이는 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2개 이하 또는 1개의 아미노산 위치이다. 일 구체예에서, 상기 하나 또는 둘 모두의 CDR 서열 동일성은 각각 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상이다.
일 양태에서, 본 발명은 DOM1h-131-206의 아미노산 서열(도 3에 도시됨)과 동일하거나, 25개 이하의 아미노산 위치에서 DOM1h-131-206의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함하고, DOM1h-131-206의 CDR1 서열과 50% 이상 동일한 CDR1 서열을 갖고, DOM1h-131-206의 CDR3 서열과 50% 이상 동일한 CDR3 서열을 갖는, 항-TNFα 수용체 타입 1(TNFR1;p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 서열 상이는 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2개 이하 또는 1개의 아미노산 위치이다. 일 구체예에서, 상기 하나 또는 둘 모두의 CDR 서열 동일성은 각각 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상이다.
일 양태에서, 본 발명은 DOM1h-131-206의 아미노산 서열(도 3에 도시됨)과 동일하거나, 25개 이하의 아미노산 위치에서 DOM1h-131-206의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함하고, DOM1h-131-206의 CDR2 서열과 50% 이상 동일한 CDR2 서열을 갖고, DOM1h-131-206의 CDR3 서열과 50% 이상 동일한 CDR3 서열을 갖는, 항-TNFα 수용체 타입 1(TNFR1;p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 서열 상이는 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2개 이하 또는 1개의 아미노산 위치이다. 일 구체예에서, 상기 하나 또는 둘 모두의 CDR 서열 동일성은 각각 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상이다.
일 양태에서, 본 발명은 DOM1h-131-206의 아미노산 서열(도 3에 도시됨)과 동일하거나, 25개 이하의 아미노산 위치에서 DOM1h-131-206의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함하고, DOM1h-131-206의 CDR1 서열과 50% 이상 동일한 CDR1 서열을 갖고, DOM1h-131-206의 CDR2 서열과 50% 이상 동일한 CDR2 서열을 갖고, DOM1h-131-206의 CDR3 서열과 50% 이상 동일한 CDR3 서열을 갖는, 항-TNFα 수용체 타입 1(TNFR1;p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 서열 상이는 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2개 이하 또는 1개의 아미노산 위치이다. 일 구체예에서, 상기 하나 또는 둘 모두의 CDR 서열 동일성은 각각 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상이다.
일 양태에서, 본 발명은 DOM1h-131-206의 CDR1 서열(도 3에 도시됨)과 50% 이상 동일한 CDR1 서열을 갖는 TNFα 수용체 타입 1(TNFR1; p55) 길항제를 제공한다. 일 구체예에서, CDR 서열 동일성은 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상이다. 길항제는, 예를 들어, 본원에 기재된 한 세트의 조건하에서 프로테아제, 예를 들어, 본원에 기재된 프로테아제 중 하나 이상에 대해 내성일 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 DOM1h-131-206의 CDR1 서열(도 3에 도시됨)과 50% 이상 동일한 CDR2 서열을 갖는 TNFα 수용체 타입 1(TNFR1; p55) 길항제를 제공한다. 일 구체예에서, CDR 서열 동일성은 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상이다. 길항제는, 예를 들어, 본원에 기재된 한 세트의 조건하에서 프로테아제, 예를 들어, 본원에 기재된 프로테아제 중 하나 이상에 대해 내성일 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 DOM1h-131-206의 CDR1 서열(도 3에 도시됨)과 50% 이상 동일한 CDR3 서열을 갖는 TNFα 수용체 타입 1(TNFR1; p55) 길항제를 제공한다. 일 구체예에서, CDR 서열 동일성은 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상이다. 길항제는, 예를 들어, 본원에 기재된 한 세트의 조건하에서 프로테아제, 예를 들어, 본원에 기재된 프로테아제 중 하나 이상에 대해 내성일 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 DOM1h-131-206의 CDR1 서열(도 3에 도시됨)과 50% 이상 동일한 CDR1 서열을 갖고, DOM1h-131-206의 CDR2 서열과 50% 이상 동일한 CDR2 서열을 갖는 TNFα 수용체 타입 1(TNFR1; p55) 길항제를 제공한다. 일 구체예에서, 상기 하나 또는 둘 모두의 CDR의 CDR 서열 동일성은 각각 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상이다. 길항제는, 예를 들어, 본원에 기재된 한 세트의 조건하에서 프로테아제, 예를 들어, 본원에 기재된 프로테아제 중 하나 이상에 대해 내성일 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 DOM1h-131-206의 CDR1 서열(도 3에 도시됨)과 50% 이상 동일한 CDR1 서열을 갖고, DOM1h-131-206의 CDR3 서열과 50% 이상 동일한 CDR3 서열을 갖는 TNFα 수용체 타입 1(TNFR1; p55) 길항제를 제공한다. 일 구체예에서, 상기 하나 또는 둘 모두의 CDR의 CDR 서열 동일성은 각각 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상이다. 길항제는, 예를 들어, 본원에 기재된 한 세트의 조건하에서 프로테아제, 예를 들어, 본원에 기재된 프로테아제 중 하나 이상에 대해 내성일 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 DOM1h-131-206의 CDR2 서열(도 3에 도시됨)과 50% 이상 동일한 CDR2 서열을 갖고, DOM1h-131-206의 CDR3 서열과 50% 이상 동일한 CDR3 서열을 갖는 TNFα 수용체 타입 1(TNFR1; p55) 길항제를 제공한다. 일 구체예에서, 상기 하나 또는 둘 모두의 CDR의 CDR 서열 동일성은 각각 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상이다. 길항제는, 예를 들어, 본원에 기재된 한 세트의 조건하에서 프로테아제, 예를 들어, 본원에 기재된 프로테아제 중 하나 이상에 대해 내성일 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 DOM1h-131-206의 CDR1 서열(도 3에 도시됨)과 50% 이상 동일한 CDR1 서열을 갖고, DOM1h-131-206의 CDR2 서열과 50% 이상 동일한 CDR2 서열을 갖고, DOM1h-131-206의 CDR3 서열과 50% 이상 동일한 CDR3 서열을 갖는 TNFα 수용체 타입 1(TNFR1; p55) 길항제를 제공한다. 일 구체예에서, 상기 하나 또는 두개 또는 각각의 CDR의 CDR 서열 동일성은 각각 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상이다. 길항제는, 예를 들어, 본원에 기재된 한 세트의 조건하에서 프로테아제, 예를 들어, 본원에 기재된 프로테아제 중 하나 이상에 대해 내성일 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 DOM1h-131-206의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3(예를 들어, CDR1, CDR2, CDR3, CDR1 및 2, CDR1 및 3, CDR2 및 3 또는 CDR1, 2 및 3)의 서열(도 3에 도시됨)을 포함하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 TNFα 수용체 타입 1(TNFR1;p55) 길항제를 제공한다. 길항제는, 예를 들어, 본원에 기재된 한 세트의 조건하에서 프로테아제, 예를 들어, 본원에 기재된 프로테아제 중 하나 이상에 대해 내성일 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 TNFR1으로의 결합에 대해 DOM1h-131-511-206과 경쟁하는 TNFα 수용체 타입 1(TNFR1; p55) 길항제를 제공한다. 따라서, 길항제는 DOM1h-131-206과 동일한 에피토프 또는 중첩 에피토프에 결합할 수 있다. 일 구체예에서, 길항제는 DOM1h-131-206의 아미노산 서열(도 3에 도시됨)과 93% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 퍼센트 동일성은 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상이다. 길항제는, 예를 들어, 본원에 기재된 한 세트의 조건하에서 프로테아제, 예를 들어, 본원에 기재된 프로테아제 중 하나 이상에 대해 내성일 수 있다. 일 구체예에서, 길항제는 TNFR1에 대해 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예를 들어, 1가 항원 결합 단편(예를 들어, scFv, Fab, Fab', dAb)이다. 길항제의 다른 예는 TNFR1에 결합하는 본원에 기재된 리간드이다. 리간드는 TNFR1에 대해 결합 특이성을 갖는 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 도메인 항체(dAb), 또는 적합한 포맷의 상기 dAb의 상보성 결정 영역을 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 리간드는 TNFR1에 대해 결합 특이성을 갖는 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 dAb로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 dAb 단량체이다. 다른 구체예에서, 리간드는 적합한 포맷, 예를 들어, 항체 포맷의 dAb(또는 dAb의 CDR)를 포함하는 폴리펩티드이다.
본 발명의 TNFR1의 몇몇 길항제는 TNFR1으로의 TNFα의 결합을 억제하지 않지만, TNFR1을 통해 매개되는 신호전달을 억제한다. 예를 들어, TNFR1의 길항제는 TNFR1을 통한 신호전달에 선행하는 TNFR1의 TNFα-유도 군집화를 억제할 수 있다. 이러한 길항제는 여러 장점을 제공한다. 예를 들어, 상기 길항제의 존재하에서, TNFα는 세포의 표면 상에서 발현된 TNFR1에 결합할 수 있고, 세포 환경으로부터 제거될 수 있으나, TNFR1 매개 신호전달은 활성화되지 않을 것이다. 따라서, 추가 TNFα 및 다른 염증 매개체의 TNFR1 신호 유도 생성이 억제될 것이다. 유사하게, TNFR1에 결합하고, TNFR1을 통해 매개되는 신호전달을 억제하나, TNFR1으로의 TNFα의 결합을 억제하지 않는 TNFR1의 길항제는 TNFα-결합 및 내인적으로 생성된 가용성 TNFR1의 억제 활성을 억제하지 않을 것이다. 따라서, 상기 길항제를 투여할 필요가 있는 포유동물에 상기 길항제를 투여하는 것은 생체내에서의 TNFα의 활성 및 TNFR1의 활성을 억제하는 내인성 조절 경로를 보완할 수 있다. 본 발명은 또한 (ⅰ) TNFR1(예를 들어, 도메인 1 내에서)에 결합하고, (ⅱ) TNFR1 매개 신호전달의 활성화를 길항시키고, (ⅲ) TNFR1으로의 TNFα의 결합을 억제하지 않는 리간드에 관한 것이다. 이러한 리간드는 가용성 TNFR1에 결합하고, TNFα 결합으로부터 가용성 수용체를 방해하지 않음으로써, 길항제를 투여할 필요가 있는 포유동물에 상기 길항제를 투여하는 것은 혈청에서의 가용성 수용체의 반감기를 증가시킴으로써 생체내에서의 TNFα 활성을 억제하는 내인성 조절 경로를 보완할 수 있다. 이러한 장점은, 예를 들어, PEG 기, 혈청 알부민, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체 또는 적어도 이의 트랜스페린 결합 부분, 항체 Fc 영역의 부착, 또는 항체 도메인으로의 컨쥬게이션에 의해 보다 큰 유체역학 크기를 갖도록 포맷화된 리간드와 관련된다. 예를 들어, ⅰ) TNFR1(예를 들어, 도메인 1에서)에 결합하고, ⅱ) TNFR1 매개 신호전달의 활성화를 길항시키고, ⅲ) TNFR1으로의 TNFα의 결합을 억제하지 않는 작용제(예를 들어, 폴리펩티드, 가변 도메인 또는 길항제), 예를 들어, dAb 단량체는 항체의 큰 항원 결합 단편 또는 항체로 포맷화될 수 있다(예를 들어, Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, IgG, scFv로 포맷화됨). 리간드의 유체역학 크기 및 이의 혈청 반감기는 또한 본원에 기재된 바와 같이(전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 WO2006038027호의 부록 1 참조) 생체내에서 반감기를 증가시키는 항원 또는 에피토프에 결합하는 결합하는 결합 도메인(예를 들어, 항체 또는 항체 단편)으로의 TNFR1 결합 작용제(길항제; 가변 도메인)를 컨쥬게이션시키거나 연결시킴으로써 증가될 수 있다. 예를 들어, TNFR1 결합 작용제(예를 들어, 폴리펩티드)는 항-혈청 알부민 또는 항-신생아 Fc 수용체 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 항-SA 또는 항-신생아 Fc 수용체 dAb, Fab, Fab' 또는 scFv, 또는 항-SA 어피바디(affibody) 또는 항-신생아 Fc 수용체 어피바디에 컨쥬게이션되거나 연결될 수 있다.
본 발명에 따른 TNFR1-결합 리간드에 사용하기에 적합한 알부민, 알부민 단편 또는 알부민 변이체의 예가 WO 2005/077042A2 및 WO2006038027에 개시되어 있고, 이들은 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다.
본 설명의 전체에 걸쳐 개시된 본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명의 길항제 또는 리간드에 "dAb"를 이용하는 대신에, 당업자는 TNFR1에 결합되는 dAb의 CDR (예컨대, 어피바디, SpA 스캐폴드, LDL 수용체 부류 A 도메인 또는 EGF 도메인과 같은 적합한 단백질 스캐폴드 또는 골격으로 이식된 CDR)을 포함하는 도메인을 이용할 수 있거나, 이것은, 예컨대 도메인이 어피바디, SpA 도메인, LDL 수용체 부류 A 도메인 또는 EGF 도메인으로부터 선택되는, TNFR1에 대한 결합 부위를 포함하는 단백질 도메인일 수 있는 것으로 고려된다. 따라서 본 설명은 총괄하여 dAb 대신 이러한 도메인을 이용한 길항제, 리간드 및 방법의 설명을 제공하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 폴리펩티드, 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 길항제는 하기 중 하나 이상에 대해 내성을 지닐 수 있다: 세린 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파테이트 프로테아제, 티올 프로테아제, 매트릭스 메탈로프로테아제, 카르복시펩티다아제 (예컨대, 카르복시펩티다아제 A, 카르복시펩티다아제 B), 트립신, 키모트립신, 펩신, 파파인, 엘라스타아제, 류코자임, 판크레아틴, 트롬빈, 플라스민, 카텝신 (예컨대, 카텝신 G), 단백분해효소(예컨대, 단백분해효소 1, 단백분해효소 2, 단백분해효소 3), 써몰리신, 키모신, 엔테로펩티다아제, 카스파아제 (예컨대, 카스파아제 1, 카스파아제 2, 카스파아제 4, 카스파아제 5, 카스파아제 9, 카스파아제 12, 카스파아제 13), 칼파인, 피카인, 클로스트리파인, 악티니다인, 브로멜라인 및 세파라아제. 특정 구체예에서, 프로테아제는 트립신, 엘라스타아제 또는 류코자임이다. 프로테아제는 생물학적 추출물, 생물학적 균질액 또는 생물학적 제조물에 의해 제공될 수도 있다. 일 구체예에서, 프로테아제는 가래, 점액 (예컨대, 위 점액, 비 점액, 기관지 점액), 기관지폐포 세척액, 폐 균질액, 폐 추출물, 췌장 추출물, 위액, 타액 또는 눈물에서 발견된 프로테아제이다. 일 구체예에서, 프로테아제는 눈 및/또는 눈물에서 발견된 것이다. 일 구체예에서, 프로테아제는 비-세균성 프로테아제이다. 일 구체예에서, 프로테아제는 동물, 예컨대 인간과 같은 포유동물 프로테아제이다. 일 구체예에서, 프로테아제는 위장관(GI tract) 프로테아제 또는 폐 조직 프로테아제, 예컨대 인간에서 발견되는 위장관 프로테아제 또는 폐 조직 프로테아제이다. 본원에 나열된 이러한 프로테아제는 라이브러리의 레퍼토리를 프로테아제에 노출시키는 것을 포함하는 본원에 개시된 방법에도 이용될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 TNFα 수용체 타입 1(TNFR1;p55) 결합 부위를 포함하는 프로테아제 내성 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공하고, 여기서 가변 도메인은,
(i) 적어도 1시간의 시간 (t) 동안 37℃에서 적어도 10 마이크로그램/프로테아제 ml의 농도 (c)로 인큐베이션되거나,
(ii) 적어도 1시간의 시간 (t) 동안 30℃에서 적어도 40 마이크로그램/프로테아제 ml의 농도 (c')로 인큐베이션될 때, 프로테아제, 예를 들어, 트립신에 내성이며, 여기서 상기 가변 도메인은 DOM1h-131-206의 아미노산 서열(도 3에 도시됨)과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 구체예에서, 가변 도메인에 대한 트립신과 같은 프로테아제의 비율 (몰/몰 기준으로)은 8,000 내지 80,000의 프로테아제:가변 도메인이고, 예컨대 C가 10 마이크로그램/ml일 때, 그 비율은 800 내지 80,000의 프로테아제:가변 도메인이거나; C 또는 C'가 100 마이크로그램/ml일 때, 그 비율은 8,000 내지 80,000의 프로테아제:가변 도메인이다. 일 구체예에서, 가변 도메인에 대한 프로테아제 (예컨대, 트립신)의 비율 (중량/중량에 대해, 예컨대 마이크로그램/마이크로그램 기준)은 16,000 내지 160,000의 프로테아제:가변 도메인이고, 예컨대 C가 10 마이크로그램/ml일 때, 그 비율은 1,600 내지 160,000의 프로테아제:가변 도메인이거나; C 또는 C'가 100 마이크로그램/ml일 때, 그 비율은 16,000 내지 160,000의 프로테아제:가변 도메인이다. 일 구체예에서, 농도 (c 또는 c')는 적어도 100 또는 1000 마이크로그램/프로테아제 ml이다. 일 구체예에서, 농도 (c 또는 c')는 적어도 100 또는 1000 마이크로그램/프로테아제 ml이다. 펩티드 또는 폴리펩티드의 레퍼토리 또는 라이브러리로 작업할 때 사용되는 프로테아제의 단백질분해 활성에 적합한 조건에 대한 본원의 설명을 참조한다 (예컨대, w/w 파라미터). 이러한 조건은 특정 면역글로불린 단일 가변 도메인의 프로테아제 내성을 결정하기 위한 조건에 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 시간 (t)는 1시간, 3시간, 24시간 또는 밤새(예컨대, 약 12-16시간)이거나 대략 1시간, 3시간, 24시간 또는 밤새이다. 일 구체예에서, 가변 도메인은 조건 (i)하에 내성이고, 농도 (c)는 10 또는 100 마이크로그램/프로테아제 ml이거나 약 10 또는 100 마이크로그램/프로테아제 ml이며, 시간 (t)은 1시간이다. 일 구체예에서, 가변 도메인은 조건 (ii)하에 내성이고, 농도 (c')는 40 또는 약 40 마이크로그램/프로테아제 ml이며, 시간 (t)은 3시간 또는 약 3시간이다. 일 구체에에서, 프로테아제는 트립신, 엘라스타아제, 류코자임 및 판크레아틴으로부터 선택된다. 일 구체예에서, 프로테아제는 트립신이다. 일 구체예에서, 프로테아제는 가래, 점액 (예컨대, 위 점액, 비 점액, 기관지 점액), 기관지폐포 세척액, 폐 균질액, 폐 추출물, 췌장 추출물, 위액, 타액 또는 눈물에서 발견된 프로테아제이다. 일 구체예에서, 프로테아제는 눈 및/또는 눈물에서 발견된 것이다. 일 구체예에서, 프로테아제는 비-세균성 프로테아제이다. 일 구체예에서, 프로테아제는 동물, 예컨대 인간과 같은 포유동물 프로테아제이다. 일 구체예에서, 프로테아제는 위장관 프로테아제 또는 폐 조직 프로테아제, 예컨대 인간에서 발견된 위장관 프로테아제 또는 폐 조직 프로테아제이다. 본원에 나열된 이러한 프로테아제는 라이브러리의 레퍼토리를 프로테아제에 노출시키는 것을 포함하는 본원에 개시된 방법에도 사용될 수 있다.
일 구체예에서, 가변 도메인은 트립신 및/또는 엘라스타아제, 류코자임 및 판크레아틴으로부터 선택된 하나 이상의 다른 프로테아제에 내성이다. 예를 들어, 내성은 트립신과 엘라스타아제; 트립신과 류코자임; 트립신과 판크레아틴; 트립신, 엘라스타아제와 류코자임; 트립신, 엘라스타아제와 판크레아틴; 트립신, 엘라스타아제, 판크레아틴과 류코자임; 또는 트립신, 판크레아틴과 류코자임에 대한 것이다.
일 구체예에서, 가변 도메인은 조건 (i) 또는 (ii)하에 인큐베이션될 때, 예를 들어 106 내지 1013의 파지 라이브러리 크기, 예컨대 108 내지 1012 복제 유닛 (감염성 비리온)으로 박테리오파지 상에 디스플레이된다.
일 구체예에서, 가변 도메인은 조건 (i) 또는 (ii)하에 인큐베이션 후 TNFR1에 특이적으로 결합되며, 예컨대 BiaCore TM 또는 ELISA, 예컨대 파지 ELISA 또는 모노클로날 파지 ELISA를 이용하여 평가된다.
일 구체예에서, 본 발명의 가변 도메인은 단백질 A 또는 단백질 L에 특이적으로 결합된다. 일 구체예에서, 단백질 A 또는 L로의 특이적 결합은 조건 (i) 또는 (ii)하에 인큐베이션한 후에 존재한다.
일 구체예에서, 본 발명의 가변 도메인은, 예컨대 조건 (i) 또는 (ii)하에 인큐베이션한 후, 적어도 0.404의 ELISA (예컨대, 파지 ELISA 또는 모노클로날 파지 ELISA)에서의 OD450 판독값을 지닐 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 가변 도메인은, 예컨대 조건 (i) 또는 (ii)하에 인큐베이션한 후, 겔 전기영동에서 (실질적으로) 단일 밴드를 디스플레이한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 TNFR1에 결합되는 본 발명에 따른 제1 dAb와 제1 dAb와 동일하거나 상이한 결합 특이성을 지니는 제2 dAb를 포함하는 이중-특이적 리간드인 TNFR1 길항제를 제공한다. 제2 dAb는 ApoE, Apo-SAA, BDNF, 카르디오트로핀-1, CEA, CD40, CD40 리간드, CD56, CD38, CD138, EGF, EGF 수용체, ENA-78, 에오탁신, 에오탁신-2, 엑소두스-2, FAPα, FGF-산성, FGF-염기성, 섬유모세포 성장 인자-10, FLT3 리간드, 프랙트알킨 (CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-β1, 인간 혈청 알부민, 인슐린, IFN-γ, IGF-I, IGF-II, IL-1α, IL-1β, IL-1 수용체, IL-1 수용체 타입 1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (72 a.a.), IL-8 (77 a.a.), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 (IGIF), 인히빈 α, 인히빈 β, IP-10, 각질세포 성장 인자-2 (KGF-2), KGF, 렙틴, LIF, 림포탁틴, 뮬러관(Mullerian) 억제 물질, 단핵구 콜로니 억제 인자, 단핵구 유인 단백질, M-CSF, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MCP-1 (MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MIG, MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, MIP-3β, MIP-4, 골수모양 선조 억제 인자-1 (MPIF-1), NAP-2, 뉴르투린, 신경 성장 인자, β-NGF, NT-3, NT-4, 온코스타틴 M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF1α, SDF1β, SCF, SCGF, 줄기 세포 인자 (SCF), TARC, TGF-α, TGF-β, TGF-β2, TGF-β3, 종양 괴사 인자 (TNF), TNF-α, TNF-β, TNF 수용체 I, TNF 수용체 II, TNIL-I, TPO, VEGF, VEGF A, VEGF B, VEGF C, VEGF D, VEGF 수용체 1, VEGF 수용체 2, VEGF 수용체 3, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-β, GRO-γ, HCC1, 1-309, HER 1, HER 2, HER 3, HER 4, 혈청 알부민, vWF, 아밀로이드 단백질 (예컨대, 아밀로이드 알파), MMP12, PDK1, IgE, IL-13Rα1, IL-13Ra2, IL-15, IL-15R, IL-16, IL-17R, IL-17, IL-18, IL-18R, IL-23, IL-23R, IL-25, CD2, CD4, CD11a, CD23, CD25, CD27, CD28, CD30, CD40, CD40L, CD56, CD138, ALK5, EGFR, FcER1, TGFb, CCL2, CCL18, CEA, CR8, CTGF, CXCL12 (SDF-1), 치마아제, FGF, 푸린, 엔도텔린-1, 에오탁신 (예컨대, 에오탁신, 에오탁신-2, 에오탁신-3), GM-CSF, ICAM-1, ICOS, IgE, IFNa, I-309, 인테그린, L-셀렉틴, MIF, MIP4, MDC, MCP-1, MMP, 호중구 엘라스타아제, 오스테오폰틴, OX-40, PARC, PD-1, RANTES, SCF, SDF-1, 시글렉(siglec)8, TARC, TGFb, 트롬빈, Tim-1, TNF, TRANCE, 트립타아제, VEGF, VLA-4, VCAM, α4β7, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR8, 알파v베타6, 알파v베타8, cMET, CD8, vWF, 아밀로이드 단백질 (예컨대, 아밀로이드 알파), MMP12, PDK1, 및 IgE로부터 선택된 표적에 결합될 수 있다.
일례에서, 이중-특이적 리간드는 TNFR1 상의 제1 에피토프에 결합되는 제1 dAb와 상이한 표적 상의 에피토프에 결합되는 제2 dAb를 포함한다. 또 다른 예에서, 제2 dAb는 혈청 알부민 상의 에피토프에 결합된다.
다른 구체예에서, 리간드는 TNFR1에 대해 결합 특이성을 갖는 제1 에피토프 결합 도메인 및 제1 에피토프 결합 도메인과 상이한 결합 특이성을 갖는 하나 이상의 다른 에피토프 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 리간드이다. 예를 들어, 제1 에피토프 결합 도메인은 TNFR1에 결합되는 dAb일 수 있거나, TNFR1에 결합되는 dAb의 CDR을 포함하는 도메인일 수 있거나 (예컨대, 어피바디, SpA 스캐폴드, LDL 수용체 부류 A 도메인 또는 EGF 도메인과 같은 적합한 단백질 스캐폴드 또는 골격으로 이식된 CDR), 도메인이 어피바디, SpA 도메인, LDL 수용체 부류 A 도메인 또는 EGF 도메인으로부터 선택되는, TNFR1에 결합되는 도메인일 수 있다.
특정 구체예에서, 폴리펩티드, 길항제, 리간드 또는 항-TNFR1 dAb 단량체는 하기 중 하나 이상을 특징으로 한다: 1) 인간 TNFR1으로부터 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 50 nM 내지 20 pM의 분리 상수(Kd) 및 5 x lO-1 내지 1 x 10-7 s-1의 Koff 속도 상수로 분리; 2) 500 nM 내지 50 pM의 IC50으로 TNFR1에 대한 종양 괴사 인자 알파(TNFα)의 결합 억제; 3) 500 nM 내지 50 pM의 ND50으로 표준 L929 세포 검정에서 인간 TNFR1 중화; 4) ≤100 nM의 ND50으로 표준 세포 검정에서 TNFR1의 활성 길항, 및 상기 검정에서 ≤ 10 μM의 농도에서, dAb가 TNFR1의 활성을 ≤ 5%로 효능화; (5) 마우스 LPS/D-갈락토사민 유도 패혈성 쇼크 모델에서 치사율 억제; 6) 응집에 저항; 7) E. 콜리(E. coli) 또는 피키아 종 (예컨대, P. 파스토리스(P. pastoris)에서 발현시 적어도 약 0.5 mg/L의 양으로 분비; 8) 가역적으로 폴딩되지 않음; 9) 마우스 콜라겐 유도 관절염 모델, 관절염의 마우스 ΔARE 모델, 염증성 장질병의 마우스 ΔARE 모델, 염증성 장질병의 마우스 덱스트란 술페이트 나트륨 유도 모델, 만성폐쇄폐병의 마우스 담배 연기 모델, 및 적합한 영장류 모델(예를 들어, 영장류 콜라겐 유도 관절염 모델)로 구성된 군으로부터 선택된 만성 염증 질병의 모델에서 효능을 가짐; 및/또는 10) 만성 염증 질병의 치료, 억제 또는 예방에서 효능을 가짐. 상기 조건 (1) 내지 (10)에 적용가능한 검정 및 시험 및 파라미터의 세부사항은 WO2006038027을 참조하며, 이는 참조로서 본원에 포함된다.
특정 구체예에서, 폴리펩티드, 길항제, 리간드 또는 dAb 단량체는 인간 TNFR1으로부터 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 50 nM 내지 20 pM의 분리 상수(Kd) 및 5 x lO-1 내지 1 x 10-7 s-1의 Koff 속도 상수로 분리되고; 500 nM 내지 50 pM의 IC50으로 TNFR1에 대한 종양 괴사 인자 알파(TNFα)의 결합을 억제하고; 500 nM 내지 50 pM의 ND50으로 표준 L929 세포 검정에서 인간 TNFR1을 중화시킨다. 다른 특정 구체예에서, 폴리펩티드, 길항제, 리간드 또는 dAb 단량체는 인간 TNFR1으로부터 50 nM 내지 20 pM의 분리 상수(Kd) 및 5 x lO-1 내지 1 x 10-7 s-1의 Koff 속도 상수로 분리되고; 500 nM 내지 50 pM의 IC50으로 TNFR1으로의 종양 괴사 인자 알파(TNFα)의 결합을 억제하고; 마우스 콜라겐 유도 관절염 모델, 관절염의 마우스 ΔARE 모델, 염증성 장질병의 마우스 ΔARE 모델, 염증성 장질병의 마우스 덱스트란 술페이트 나트륨 유도 모델, 만성폐쇄폐병의 마우스 담배 연기 모델, 및 적합한 영장류 모델(예를 들어, 영장류 콜라겐 유도 관절염 모델)로 구성된 군으로부터 선택된 만성 염증 질병의 모델에서 효능을 갖는다. 다른 특정 구체예에서, 폴리펩티드, 길항제, 리간드 또는 dAb 단량체는 인간 TNFR1으로부터 플라스몬 공명에 의해 측정된 50 nM 내지 20 pM의 분리 상수(Kd) 및 5 x lO-1 내지 1 x 10-7 s-1의 Koff 속도 상수로 분리되고; 500 nM 내지 50 pM의 ND50으로 표준 L929 세포 검정에서 인간 TNFR1을 중화시키고; ≤ 100 nM의 ND50으로 표준 세포 검정에서 TNFR1의 활성을 길항시키고, 상기 검정에서 ≤ 10 μM의 농도에서 dAb는 TNFR1의 활성을 ≤ 5%로 효능화시킨다.
본 발명의 프로테아제 내성 폴리펩티드, 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 길항제는 포유동물, 예컨대 인간에서 질병 또는 질환의 치료, 예방 및 진단에 유용성을 지닌다. 특히, 이들은 인간과 같은 환자에게 투여될 때 프로테아제와 조우될 수 있는 약물에 기초함에 따라서 유용성을 지닌다. 예를 들어, 위장관으로 투여될 때 (예컨대, 경구, 설하, 직장 투여됨), 폴리펩티드의 경우, 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 길항제는 상부 위장관, 하부 위장관, 구강, 위, 소장 및 대장 중 하나 이상에서 프로테아제로 처리될 수 있다. 따라서, 일 구체예는 환자의 질병 또는 질환을 치료 및/또는 예방하기 위해 환자의 위장관으로 경구, 설하 또는 직장에 의해 투여되는 프로테아제 내성 폴리펩티드, 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 길항제를 제공한다. 예를 들어, TNF 알파-매개 질환 또는 질병, 예를 들어, 관절염(예를 들어, 류머티스 관절염), IBD, 건선 또는 크론병의 치료 및/또는 예방을 위해 환자(예컨대, 인간 환자)에게 경구 투여된다. 또 다른 예에서, 폴리펩티드, 가변 도메인 또는 길항제는 폐 조직 (예컨대, 폐 또는 기도)으로 투여될 때 (예컨대, 흡입이나 비내에 의해) 프로테아제와 조우될 수 있다. 따라서, 일 구체예는 환자의 질병 또는 질환을 치료 및/또는 예방하기 위해 환자의 폐 조직으로 흡입이나 비내에 의해, 환자에게(예컨대, 인간) 프로테아제 내성 폴리펩티드, 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 길항제의 투여를 제공한다. 이러한 질환은 천식 (예컨대, 알레르기성 천식), COPD, 인플루엔자 또는 본원에 참조로서 포함된 WO2006038027에 개시된 임의의 다른 폐 질병이나 질환일 수 있다. 또 다른 예에서, 폴리펩티드, 가변 도메인 또는 길항제는 환자의 눈으로 투여될 때 (예컨대, 안내 주입 또는 점안제로서) 프로테아제와 조우될 수 있다. 따라서, 일 구체예는 환자의 질병 또는 질환 (예컨대, 눈의 질병이나 질환)을 치료 및/또는 예방하기 위해, 환자에게 (예컨대, 인간) 프로테아제 내성 폴리펩티드, 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 길항제의 안구 투여를 제공한다. 투여는, 점안제의 형태로 또는 눈, 예컨대 유리체액으로의 주입에 의해 눈으로 국소투여될 수 있었다.
본 발명에 따른 길항제, 폴리펩티드 및 면역글로불린 단일 가변 도메인은 개선된 또는 비교적 높은 융해 온도(Tm)를 나타내어 향상된 안정성을 제공할 수 있다. 높은 친화성 표적 결합은 또한 또는 대안적으로 길항제, 폴리펩티드 및 가변 도메인의 특징일 수 있다. 프로테아제 내성과 조합된 상기 특징 중 하나 이상은 길항제, 가변 도메인 및 폴리펩티드를 포유동물, 예를 들어, 인간에서 약물로 이용가능하게 하며, 예를 들어, 위장관 또는 폐 조직 투여 동안 프로테아제가 조우될 수 있다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 경구 전달을 위한 TNFR1 길항제를 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 환자의 위장관으로 전달하기 위한 TNFR1 길항제를 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 경구 전달을 위한 약제의 제조에서 TNFR1 길항제의 이용을 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 환자의 위장관으로 전달하기 위한 약제의 제조에서 TNFR1 길항제의 이용을 제공한다. 일 구체예에서, 가변 도메인은 트립신 및/또는 엘라스타아제, 류코자임 및 판크레아틴으로부터 선택된 하나 이상의 다른 프로테아제에 내성이다. 예를 들어, 내성은 트립신과 엘라스타아제; 트립신과 류코자임; 트립신과 판크레아틴; 트립신, 엘라스타아제와 류코자임; 트립신, 엘라스타아제와 판크레아틴; 트립신, 엘라스타아제, 판크레아틴과 류코자임; 또는 트립신, 판크레아틴과 류코자임에 대한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 폐 전달을 위한 TNFR1 길항제를 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 환자의 폐로의 전달을 위한 TNFR1 길항제를 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 폐 전달을 위한 약제의 제조에서 TNFR1 길항제의 이용을 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 환자의 폐로 전달하기 위한 약제의 제조에서 TNFR1 길항제의 이용을 제공한다. 일 구체예에서, 가변 도메인은 류코자임에 내성이다.
일 양태에서, 본 발명은 약제를 경구 전달 또는 환자의 위장관 또는 환자의 폐나 폐 조직으로 전달하는 방법을 제공하고, 여기서 상기 방법은 환자에게 약제학적 유효량의 본 발명의 TNFR1 길항제를 투여하는 것을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 염증 질환을 치료 및/또는 예방하기 위해 본 발명의 TNFR1 길항제를 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 염증 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에서 TNFR1 길항제의 이용을 제공한다. 일 구체예에서, 질환은 관절염, 다발성 경화증, 염증성 장질병 및 만성폐쇄폐병으로 구성된 군으로부터 선택된다. 예를 들어, 상기 관절염은 류머티스 관절염 또는 연소성 류머티스 관절염이다. 예를 들어, 상기 염증성 장질병은 크론병 및 궤양성 대장염(ulcerative colitis)으로 구성된 군으로부터 선택된다. 예를 들어, 상기 만성폐쇄폐병은 만성 기관지염, 만성 폐쇄성 기관지염 및 폐기종으로 구성된 군으로부터 선택된다. 예를 들어, 상기 폐기종은 세균성 폐기종이다. 예를 들어, 상기 세균성 폐기종은 포도구균(Staphylococcal) 폐렴이다.
일 양태에서, 본 발명은 호흡기 질환을 치료 및/또는 예방하기 위해 TNFR1 길항제를 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 호흡기 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에서 TNFR1 길항제의 이용을 제공한다. 예를 들어, 상기 호흡기 질환은 폐 염증, 만성폐쇄폐병, 천식, 폐렴, 과민성 폐렴, 호산구증가증으로 폐 침윤, 환경적 폐 질환, 폐렴, 기관지확장증, 낭성 섬유증, 사이질 페병, 일차 폐 고혈압, 폐 혈전색전증, 흉막의 질환, 종격의 질환, 횡경막의 질환, 호흡저하, 과다호흡, 수면 무호흡, 급성 호흡곤란 증후군, 중피종, 육종, 이식 거부, 이식편대 숙주 질환, 폐암, 알레르기성 비염, 알레르기, 석면증, 아스퍼질러스종, 아스퍼질러스증, 기관지확장증, 만성 기관지염, 공기증, 호산구성 폐렴, 특발성 폐섬유화증, 침습성 폐렴구균 질환, 인플루엔자, 비결핵성 미코박테리아 질환, 흉막 삼출, 진폐증, 뉴모시스티스병, 폐렴, 폐 방선균증, 폐포단백증, 폐 탄저병, 폐 부종, 폐 색전, 폐 염증, 폐 조직구증 X, 폐 고혈압, 폐 노카르디아증, 폐결핵, 폐 정맥폐색성 질환, 류마티스 폐질환, 사르코이드증 및 베게너 육아종증으로 구성된 군으로부터 선택된다. 예를 들어, 질환은 만성폐쇄폐병(COPD)이다. 예를 들어, 질환은 천식이다.
TNFR1을 억제하는 작용제를 포함하는 본 발명의 길항제(예를 들어, 여기서 상기 물질은 항체 단편(예를 들어, Fab 단편, Fab' 단편, Fv 단편(예를 들어, scFv, 이황화결합으로 결합된 Fv), F(ab')2 단편, dAb로 이루어진 군에서 선택됨), 리간드 및 dAb 단량체 및 중합체(예를 들어, 동종- 또는 이종이합체)는 임의의 적합한 방법을 이용하여 피검체의 폐 조직(예를 들어, 폐)에 국소적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 물질은 흡기 또는 비내 투여를 통해 폐 조직으로 국소적으로 투여될 수 있다. 흡기 또는 비내 투여의 경우, TNFR1의 길항제는 분무기, 흡입기, 어토마이저(atomizer), 에어로졸분무기(aerosolizer), 미스터(mister), 건조 분말 흡입기, 정량식 흡입기, 정량식 스프레이어, 정량식 미스터, 정량식 어토마이저, 또는 기타 적합한 흡입기 또는 비내 전달 기구를 사용하여 투여될 수 있다. 따라서, 일 구체예에서, 본 발명은 TNFR1 길항제를 함유한 폐 전달 기구를 제공한다. 일 구체예에서, 상기 기구는 흡입기 또는 비내 전달 기구이다.
일 양태에서, 본 발명은 TNFR1 길항제를 포함하는 경구 제형을 제공한다. 제형은 정제, 환약, 캡슐, 액체 또는 시럽일 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 폐로의 전달을 위한 폐 제형을 제공하는데, 여기서 상기 제형은 (예를 들어, 브리튼-로빈슨(Britton-Robinson) 완충액 중에 존재할 때, 예를 들어, pH 6.5 내지 8.0, 예를 들어, pH 7 내지 7.5, 예를 들어, pH 7 또는 pH 7.5에서) 5 미크론 미만, 예를 들어, 4.5, 4, 3.5 또는 3 미크론 미만의 입자 크기 범위를 지니는 길항제, 본 발명의 폴리펩티드 또는 가변 도메인을 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명의 제형 및 조성물은 pH 6.5 내지 8.0, 예를 들어, pH 7 내지 7.5, 예를 들어 pH 7, 예를 들어 pH 7.5로 제공된다.
본 발명의 임의 양태에 따른 가변 도메인은 5O℃ 이상, 또는 55℃ 이상, 또는 60℃ 이상, 또는 65℃ 이상, 또는 70℃ 이상의 Tm을 가질 수 있다. 본 발명의 길항제, 용도, 방법, 기구 또는 제형은 그러한 가변 도메인을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명의 폴리펩티드, 가변 도메인, 길항제, 조성물 또는 제형은 37 내지 50℃에서 14일 동안 브리튼-로빈슨 완충액 또는 PBS 완충액 중에서 (1mg/ml의 폴리펩티드 또는 가변 도메인 농도로) 인큐베이션된 후 실질적으로 안정하다. 일 구체예에서, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 이상의 폴리펩티드, 길항제 또는 가변 도메인이 37℃에서 그러한 인큐베이션후 비응집된(unaggregated) 상태로 유지된다. 일 구체예에서, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 이상의 폴리펩티드 또는 가변 도메인이 37℃에서 그러한 인큐베이션후 단량체로 유지된다. 일 구체예에서, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 이상의 폴리펩티드, 길항제 또는 가변 도메인이 50℃에서 그러한 인큐베이션후 비응집된 상태로 유지된다. 일 구체예에서, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 이상의 폴리펩티드 또는 가변 도메인이 50℃에서 그러한 인큐베이션후 단량체로 유지된다. 일 구체예에서, 폴리펩티드, 가변 도메인, 길항제의 응집은 그러한 인큐베이션중 임의의 인큐베이션된 후 관찰되지 않는다. 일 구체예에서, 폴리펩티드 또는 가변 도메인의 pI는 브리튼-로빈슨 완충액 중에서 1mg/ml의 폴리펩티드 또는 가변 도메인의 농도로 37℃에서 인큐베이션된 후 변화되지 않은 상태로 유지되거나 실질적으로 변화되지 않은 상태로 유지된다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명의 폴리펩티드, 가변 도메인, 길항제, 조성물 또는 제형은 브리튼-로빈슨 완충액 중에서 pH 7 내지 7.5(예를 들어, pH 7 또는 pH 7.5)로 (100mg/ml의 폴리펩티드 또는 가변 도메인의 농도로) 4℃에서 7일 동안 인큐베이션된 후 실질적으로 안정하다. 일 구체예에서, 95, 95.5, 96, 96.5, 97, 97.5, 98, 98.5, 99 또는 99.5% 이상의 폴리펩티드, 길항제 또는 가변 도메인이 그러한 인큐베이션후 비응집된 상태로 유지된다. 일 구체예에서, 95, 95.5, 96, 96.5, 97, 97.5, 98, 98.5, 99 또는 99.5% 이상의 폴리펩티드 또는 가변 도메인이 그러한 인큐베이션후 단량체로 유지된다. 일 구체예에서, 폴리펩티드, 가변 도메인, 길항제의 응집은 상기한 인큐베이션중 임의의 인큐베이션후 관찰되지 않는다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명의 폴리펩티드, 가변 도메인, 길항제, 조성물 또는 제형은, 예를 들어, 제트 분무기, 예를 들어, Pari LC+ 컵내에서, 1시간 동안, 예를 들어, 실온(20℃ 또는 37℃)에서, (예를 들어, 40mg/ml의 폴리펩티드 또는 가변 도메인의 농도로) 분무 후 실질적으로 안정하다. 일 구체예에서, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95.5, 96, 96.5, 97, 97.5, 98, 98.5, 99 또는 99.5% 이상의 폴리펩티드, 길항제 또는 가변 도메인은 그러한 분무 후 비응집된 상태로 유지된다. 일 구체예에서, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95.5, 96, 96.5, 97, 97.5, 98, 98.5, 99 또는 99.5% 이상의 폴리펩티드 또는 가변 도메인이 그러한 분무 후 단량체로 유지된다. 일 구체예에서, 폴리펩티드, 가변 도메인, 길항제의 응집은 상기한 인큐베이션중 임의의 인큐베이션후 관찰되지 않는다.
본 발명의 임의의 양태에 따른 가변 도메인은 MRC-5 세포 검정에서 2 nM 내지 50 pM의 ND50으로 TNFα 자극 IL-8 방출을 중화시킬 수 있다. 본 발명의 길항제, 용도, 방법, 장치 또는 제형은 상기 가변 도메인을 포함할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 임의 양태에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 엔코딩하거나 본 발명의 임의 양태에 따른 폴리펩티드, 길항제 또는 가변 도메인을 엔코딩하는 분리되거나 재조합된 핵산을 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 핵산 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 생산하는 방법을 제공하는데, 당해 방법은 상기 핵산 또는 벡터의 발현에 적합한 조건하에서 숙수 세포를 유지하는 단계를 포함하며, 그로 인해 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드가 생산된다. 당해 방법은 추가로 폴리펩티드, 가변 도메인 또는 길항제를 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며 분리된 폴리펩티드 가변 도메인 또는 길항제보다 개선된 친화성 및/또는 ND50을 지니는, 변이체, 예를 들어, 돌연변이된 변이체를 생산하는 단계를 추가로 포함하거나 불포함할 수 있다. 면역글로불린 단일 가변 도메인의 결합 친화성을 개선시키는 기법들(예를 들어, 친화성 성숙을 위한 기법들)은 당업계에 공지되어 있다.
일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 임의 양태의 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 길항제, 및 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약제 조성물을 제공한다.
일 구체예에서, 본 발명의 임의 양태의 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 길항제는 항체 불변 도메인, 예를 들어, 항체 Fc(임의로, 여기서 상기 Fc의 N-말단은 가변 도메인의 C-말단에 연결됨(임의로 직접적으로 연결됨))를 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 가변 도메인은 분리되고/거나 재조합될 수 있다.
프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드를 선택하는 방법이 본원에 기재된다. 당해 방법은 펩티드 또는 폴리펩티드의 레퍼토리를 제공하는 단계, 상기 레퍼토리와 프로테아제를 프로테아제 활성에 적합한 조건하에서 결합시키는 단계, 및 원하는 생물학적 활성(예를 들어, TNFR1으로의 특이적 결합)을 지니는 펩티드 또는 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하며, 그로 인해 프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드가 선택된다.
레퍼토리와 프로테아제는 일반적으로 약 30분 이상의 기간 동안 인큐베이션된다. 임의의 원하는 프로테아제가 본 발명에 사용될 수 있는데, 예컨대, 하기 프로테아제들 중 하나 이상이 사용될 수 있다: 세린 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파테이트 프로테아제, 티올 프로테아제, 매트릭스 메탈로프로테아제, 카르복시펩티다아제(예를 들어, 카르복시펩티다아제 A, 카르복시펩티다아제 B), 트립신, 키모트립신, 펩신, 파파인, 엘라스타아제, 류코자임, 판크레아틴, 트롬빈, 플라스민, 카텝신(예를 들어, 카텝신 G), 단백분해효소(예를 들어, 단백분해효소 1, 단백분해효소 2, 단백분해효소 3), 써몰리신, 키모신, 엔테로펩티다아제, 카스파아제(예를 들어, 카스파아제 1, 카스파아제 2, 카스파아제 4, 카스파아제 5, 카스파아제 9, 카스파아제 12, 카스파아제 13), 칼파인, 피카인(ficain), 클로스트리파인(clostripain), 악티니다인(actinidain), 브로멜라인, 및 세파라아제. 특정 구체예들에서, 상기 프로테아제는 트립신, 엘라스타아제 또는 류코자임이다. 상기 프로테아제는 또한 생물학적 추출물, 생물학적 균질물 또는 생물학적 제조물에 의해 제공된다. 원하는 경우, 상기 방법은 인큐베이션이 완료된 후 레퍼토리와 프로테아제의 조합물에 프로테아제 억제제를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구체예들에서, 원하는 생물학적 활성을 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드는 결합 활성에 기초하여 회수된다. 예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드는 제너릭 리간드, 예컨대, 단백질 A, 단백질 G 또는 단백질 L에 대한 결합에 기초하여 회수될 수 있다. 결합 활성은 또한 표적 리간드에 대한 특이적 결합일 수 있다. 대표적인 표적 리간드는 ApoE, Apo-SAA, BDNF, 카디오트로핀-1, CEA, CD40, CD40 리간드, CD56, CD38, CD138, EGF, EGF 수용체, ENA-78, 에오탁신(Eotaxin), 에오탁신-2, 엑소더스-2, FAPα, FGF-산성, FGF-염기성, 섬유아세포 성장 인자-10, FLT3 리간드, 프랙탈킨(CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-β1, 인간 혈청 알부민, 인슐린, IFN-γ, IGF-I, IGF-II, IL-lα, IL-lβ, IL-I 수용체, IL-I 수용체 타입 1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8(72 a.a.), IL-8(77 a.a.), IL-9, IL-1O, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18(IGIF), 인히빈 α, 인히빈 β, IP-1O, 각질형성세포 성장 인자-2(KGF-2), KGF, Leptin, LIF, 림포탁틴, 뮬러관 억제 물질(Mullerian inhibitory substance), 단핵구 콜로니 억제 인자, 단핵구 유인 단백질, M-CSF, MDC(67 a.a.), MDC(69 a.a.), MCP-I(MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC(67 a.a.), MDC(69 a.a.), MIG, MIP-1a, MlP-1β, MIP-3α, MIP-3β, MIP-4, 골수 선조세포 억제 인자(myeloid progenitor inhibitor factor)-1(MPIF-I), NAP-2, 뉴르튜린(Neurturin), 신경 성장 인자, β-NGF, NT-3, NT-4, 온코스타틴 M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDFlα, SDFlβ, SCF, SCGF, 줄기 세포 인자(SCF), TARC, TGF-α, TGF-β, TGF-β2, TGF-β3, 종양괴사인자(TNF), TNF-α, TNF-β, TNF 수용체 I, TNF 수용체 II, TNIL-1, TPO, VEGF, VEGF A, VEGF B, VEGF C, VEGF D, VEGF 수용체 1, VEGF 수용체 2, VEGF 수용체 3, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-β, GRO-γ, HCC1, 1-309, HER1, HER2, HER3, HER4, 혈청 알부민, vWF, 아밀로이드 단백질(예를 들어, 아밀로이드 알파), MMP12, PDKl, IgE, IL-13Rα1, IL-13Ra2, IL-15, IL-15R, IL-16, IL-17R, IL-17, IL-18, IL-18R, IL-23 IL-23R, IL-25, CD2, CD4, CD11a, CD23, CD25, CD27, CD28, CD30, CD40, CD40L, CD56, CD138, ALK5, EGFR, FcER1, TGFb, CCL2, CCL18, CEA, CR8, CTGF, CXCL12(SDF-1), 키마제(chymase), FGF, 퓨린(Furin), 엔도텔린(Endothelin)-1, 에오탁신(예를 들어, 에오탁신, 에오탁신-2, 에오탁신-3), GM-CSF, ICAM-1, ICOS, IgE, IFNa, 1-309, 인테그린, L-셀렉틴, MIF, MIP4, MDC, MCP-I, MMP, 호중구 엘라스타아제, 오스테오폰틴(osteopontin), OX-40, PARC, PD-I, RANTES, SCF, SDF-1, 시그렉8(siglec8), TARC, TGFb, 트롬빈, Tim-1, TNF, TRANCE, 트립타제(Tryptase), VEGF, VLA-4, VCAM, α4β7, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR8, 알파브베타6(alphavbeta6), 알파브베타8, cMET, CD8, vWF, 아밀로이드 단백질(예를 들어, 아밀로이드 alpha), MMP12, PDK1, 및 IgE.
특정 구체예들에서, 상기 펩티드 또는 폴리펩티드는 패닝(panning)에 의해 회수된다.
일부 구체예들에서, 레퍼토리는 디스플레이 시스템을 포함한다. 예를 들어, 디스플레이 시스템은 박테리오파지 디스플레이, 리보좀 디스플레이, 에멀젼 구획화(compartmentalization) 및 디스플레이, 효모 디스플레이, 퓨로마이신 디스플레이, 박테리아 디스플레이, 플라스미드상의 디스플레이, 또는 공유결합성(covalent) 디스플레이일 수 있다. 대표적인 디스플레이 시스템은 핵산의 코딩 기능과 상기 핵산에 의해 엔코딩되는 펩티드 또는 폴리펩티드의 기능적 특성을 연결시킨다. 특정 구체예들에서, 상기 디스플레이 시스템은 복제가능한 유전자 패키지를 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 디스플레이 시스템은 박테리오파지 디스플레이를 포함한다. 예를 들어, 박테리오파지는 fd, M13, 람다, MS2 또는 T7일 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 박테리오파지 디스플레이 시스템은 다가(multivalent)이다. 일부 구체예들에서, 상기 펩티드 또는 폴리펩티드는 pⅢ 융합 단백질로서 디스플레이된다.
다른 구체예들에서, 상기 방법은 원하는 생물학적 활성을 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산을 증폭하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 핵산은 파지 증폭, 세포 성장 또는 중합효소 연쇄 반응으로 증폭된다.
일부 구체예들에서, 상기 레퍼토리는 면역글로불린 단일 가변 도메인들의 레퍼토리이다. 특정 구체예들에서, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인은 중쇄 가변 도메인이다. 더 특정한 구체예들에서, 중쇄 가변 도메인은 인간 중쇄 가변 도메인이다. 다른 구체예들에서, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인이다. 특정 구체예들에서, 상기 경쇄 가변 도메인은 인간 경쇄 가변 도메인이다.
또 다른 양태에서, 펩티드 또는 폴리펩티드의 레퍼토리로부터 고 친화성으로 표적 리간드(예를 들어, TNFR1)에 결합하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 선택하는 방법이 제공된다. 당해 방법은 펩티드 또는 폴리펩티드의 레퍼토리를 제공하는 단계, 레퍼토리와 프로테아제를 프로테아제 활성에 적합한 조건하에서 결합시키는 단계, 및 표적 리간드에 결합하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함한다.
상기 레퍼토리와 프로테아제는 일반적으로 약 30분 이상의 기간 동안 인큐베이션된다. 임의의 원하는 프로테아제가 상기 방법에 사용될 수 있는데, 예컨대, 하기 프로테아제들 중 하나 이상이 사용될 수 있다: 세린 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파테이트 프로테아제, 티올 프로테아제, 매트릭스 메틸로프로테아제, 카르복시펩티다아제(예를 들어, 카르복시펩티다아제 A, 카르복시펩티다아제 B), 트립신, 키모트립신, 펩신, 파파인, 엘라스타아제, 류코자임, 판크레아틴, 트롬빈, 플라스민, 카텝신(예를 들어, 카텝신 G), 단백분해효소(예를 들어, 단백분해효소 1, 단백분해효소 2, 단백분해효소 3), 써몰리신, 키모신, 엔테로펩티다아제, 카스파아제(예를 들어, 카스파아제 1, 카스파아제 2, 카스파아제 4, 카스파아제 5, 카스파아제 9, 카스파아제 12, 카스파아제 13), 칼파인, 피카인, 클로스트리파인, 악티니다인, 브로멜라인, 및 세파라아제. 특정 구체예들에서, 상기 프로테아제는 트립신, 엘라스타아제 또는 류코자임이다. 상기 프로테아제는 또한 생물학적 추출물, 생물학적 균질물 또는 생물학적 제조물에 의해 제공될 수 있다. 원하는 경우, 상기 방법은 인큐베이션이 완료된 후, 레퍼토리와 프로테아제의 조합물에 프로테아제 억제제를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다.
상기 펩티드 또는 폴리펩티드는 임의의 원하는 표적 리간드, 예컨대, 본원에 개시된 표적 리간드(예를 들어, TNFR1)에 대한 결합에 기초하여 회수될 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 펩티드 또는 폴리펩티드는 패닝에 의해 회수된다.
일부 구체예들에서, 상기 레퍼토리는 디스플레이 시스템을 포함한다. 예를 들어, 상기 디스플레이 시스템은 박테리오파지 디스플레이, 리보좀 디스플레이, 에멀젼 구획화 및 디스플레이, 효모 디스플레이, 퓨로마이신 디스플레이, 박테리아 디스플레이, 플라스미드상의 디스플레이, 또는 공유결합성 디스플레이일 수 있다. 대표적인 디스플레이 시스템은 핵산의 코딩 기능과 상기 핵산에 의해 엔코딩되는 펩티드 또는 폴리펩티드의 기능적 특성을 연결시킨다. 특정 구체예들에서, 상기 디스플레이 시스템은 복제가능한 유전자 패키지를 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 디스플레이 시스템은 박테리오파지 디스플레이를 포함한다. 예를 들어, 박테리오파지는 fd, M13, 람다, MS2 또는 T7일 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 박테리오파지 디스플레이 시스템은 다가이다. 일부 구체예들에서, 상기 펩티드 또는 폴리펩티드는 pⅢ 융합 단백질로서 디스플레이된다.
다른 구체예들에서, 상기 방법은 원하는 생물학적 활성을 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산을 증폭하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 핵산은 파지 증폭, 세포 성장 또는 중합효소 연쇄 반응으로 증폭된다.
일부 구체예들에서, 상기 레퍼토리는 면역글로불린 단일 가변 도메인들의 레퍼토리이다. 특정 구체예들에서, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인은 중쇄 가변 도메인이다. 더 특정한 구체예들에서, 중쇄 가변 도메인은 인간 중쇄 가변 도메인이다. 다른 구체예들에서, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인이다. 특정 구체예들에서, 상기 경쇄 가변 도메인은 인간 경쇄 가변 도메인이다.
또 다른 양태에서, 프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드의 레퍼토리를 생산하는 방법이 본원에 기재된다. 당해 방법은 펩티드 또는 폴리펩티드의 레퍼토리를 제공하는 단계, 레퍼토리와 프로테아제를 프로테아제 활성에 적합한 조건하에서 결합시키는 단계, 및 표적 리간드에 결합하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하며, 그로 인해 프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드가 생산된다.
일부 구체예들에서, 상기 레퍼토리와 프로테아제는 약 30분 이상의 기간 동안 인큐베이션된다. 예를 들어, 당해 방법에 사용되는 프로테아제는 하기 프로테아제들 중 하나 이상이다: 세린 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파테이트 프로테아제, 티올 프로테아제, 매트릭스 메틸로프로테아제, 카르복시펩티다아제(예를 들어, 카르복시펩티다아제 A, 카르복시펩티다아제 B), 트립신, 키모트립신, 펩신, 파파인, 엘라스타아제, 류코자임, 판크레아틴, 트롬빈, 플라스민, 카텝신(예를 들어, 카텝신 G), 단백분해효소(예를 들어, 단백분해효소 1, 단백분해효소 2, 단백분해효소 3), 써몰리신, 키모신, 엔테로펩티다아제, 카스파아제(예를 들어, 카스파아제 1, 카스파아제 2, 카스파아제 4, 카스파아제 5, 카스파아제 9, 카스파아제 12, 카스파아제 13), 칼파인, 피카인, 클로스트리파인, 악티니다인, 브로멜라인, 및 세파라아제. 특정 구체예들에서, 상기 프로테아제는 트립신, 엘라스타아제 또는 류코자임이다. 상기 프로테아제는 또한 생물학적 추출물, 생물학적 균질물 또는 생물학적 제조물에 의해 제공될 수 있다. 원하는 경우, 상기 방법은 인큐베이션이 완료된 후, 레퍼토리와 프로테아제의 조합물에 프로테아제 억제제를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구체예들에서, 원하는 생물학적 활성을 갖는 복수의 펩티드 또는 폴리펩티드가 결합 활성에 기초하여 회수된다. 예를 들어, 복수의 펩티드 또는 폴리펩티드는 제너릭 리간드, 예컨대, 단백질 A, 단백질 G 또는 단백질 L에 대한 결합에 기초하여 회수될 수 있다. 결합 활성은 또한 표적 리간드, 예컨대, 본원에 기재된 표적 리간드에 대한 특이적 결합일 수 있다. 특정 구체예들에서, 원하는 생물학적 활성을 갖는 복수의 펩티드 또는 폴리펩티드는 패닝에 의해 회수된다.
일부 구체예들에서, 상기 레퍼토리는 디스플레이 시스템을 포함한다. 예를 들어, 상기 디스플레이 시스템은 박테리오파지 디스플레이, 리보좀 디스플레이, 에멀젼 구획화 및 디스플레이, 효모 디스플레이, 퓨로마이신 디스플레이, 박테리아 디스플레이, 플라스미드상의 디스플레이, 또는 공유결합성 디스플레이일 수 있다. 대표적인 디스플레이 시스템은 핵산의 코딩 기능과 상기 핵산에 의해 엔코딩되는 펩티드 또는 폴리펩티드의 기능적 특성을 연결시킨다. 특정 구체예들에서, 상기 디스플레이 시스템은 복제가능한 유전자 패키지를 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 디스플레이 시스템은 박테리오파지 디스플레이를 포함한다. 예를 들어, 박테리오파지는 fd, M13, 람다, MS2 또는 T7일 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 박테리오파지 디스플레이 시스템은 다가이다. 일부 구체예들에서, 상기 펩티드 또는 폴리펩티드는 pⅢ 융합 단백질로서 디스플레이된다.
다른 구체예들에서, 상기 방법은 원하는 생물학적 활성을 갖는 복수의 펩티드 또는 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산을 증폭시키는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 핵산은 파지 증폭, 세포 성장 또는 중합효소 연쇄 반응에 의해 증폭된다.
일부 구체예들에서, 상기 레퍼토리는 면역글로불린 단일 가변 도메인의 레퍼토리이다. 특정 구체예들에서, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인은 중쇄 가변 도메인이다. 더 특정한 구체예들에서, 상기 중쇄 가변 도메인은 인간 중쇄 가변 도메인이다. 다른 구체예들에서, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인이다. 특정 구체예들에서, 상기 경쇄 가변 도메인은 인간 경쇄 가변 도메인이다.
또 다른 양태에서, 레퍼토리로부터 표적 리간드(예를 들어, TNFR1)에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인(dAb)을 포함하는 프로테아제 내성 폴리펩티드를 선택하는 방법이 본원에 기재된다. 일 구체예에서, 당해 방법은 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 레퍼토리를 포함하는 파지 디스플레이 시스템을 제공하는 단계, 상기 파지 디스플레이 시스템과 엘라스타아제, 류코자임 및 트립신로 이루어진 군에서 선택된 프로테아제를 프로테아제 활성에 적합한 조건하에서 조합하는 단계, 및 표적 리간드에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 디스플레이하는 파지를 회수하는 단계를 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 프로테아제는 100 μg/ml로 사용되고, 조합된 파지 디스플레이 시스템과 프로테아제는 약 37℃에서 밤새 인큐베이션된다.
일부 구체예들에서, 표적 리간드에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 디스플레이하는 파지는 상기 표적에 대한 결합으로 회수된다. 다른 구체예들에서, 표적 리간드에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 디스플레이하는 파지는 패닝에 의해 회수된다.
또한 본 발명은 본원에 개시된 방법들에 의해 선택가능하거나 선택된, 분리된 프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드와 관련이 있다. 특정 구체예에서, 본원에 개시된 방법들에 의해 선택가능하거나 선택된, 분리된 프로테아제(예를 들어, 트립신, 엘라스타아제, 류코자임) 내성 면역글로불린 단일 가변 도메인(예를 들어, 인간 항체 중쇄 가변 도메인, 인간 항체 경쇄 가변 도메인)이 제공된다.
본원에 개시된 방법들에 의해 선택가능하거나 선택된 프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드(예를 들어, 트립신-, 엘라스타아제-, 또는 류코자임-내성 면역글로불린 단일 가변 도메인)를 엔코딩하는 분리되거나 재조합된 핵산, 및 상기 핵산을 포함하는 벡터(예를 들어, 발현 벡터)와 숙주 세포가 본원에 추가로 기재된다.
본원에 개시된 방법들에 의해 선택가능하거나 선택된 프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드(예를 들어, 트립신-, 엘라스타아제-, 또는 류코자임-내성 면역글로불린 단일 가변 도메인)를 제조하는 방법이 추가로 기재되며, 당해 방법은 발현에 적합한 조건하에서 상기 프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드를 엔코딩하는 재조합 핵산을 함유한 숙주 세포를 유지하는 단계를 포함하며, 그로 인해 프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드가 생산된다.
(예를 들어, 치료용 또는 진단용) 의약으로 사용하기 위한 본원에 개시된 방법들에 의해 선택가능하거나 선택된 프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드(예를 들어, 트립신-, 엘라스타아제-, 또는 류코자임-내성 면역글로불린 단일 가변 도메인)가 추가로 본원에 기재된다. 질환 치료를 위한 의약의 제조를 위한 본원에 개시된 방법들에 의해 선택가능하거나 선택된 프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드(예를 들어, 트립신-, 엘라스타아제-, 또는 류코자임-내성 면역글로불린 단일 가변 도메인)의 용도가 추가로 본원에 기재된다. 본원에 개시된 방법들에 의해 선택가능하거나 선택된 유효량의 프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드(예를 들어, 트립신-, 엘라스타아제-, 또는 류코자임-내성 면역글로불린 단일 가변 도메인)를, 이의 투여가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환 치료 방법이 추가로 본원에 기재된다.
TNFR1이 샘플내에 존재하는지 여부, 또는 TNFR1이 샘플내에 얼마나 많이 존재하는지 여부를 측정하기 위한 진단 키트가 본원에 추가로 기재되며, 당해 키트는 본 발명의 폴리펩티드, 면역글로불린 가변 도메인(dAb), 또는 길항제와 사용설명서(예를 들어, 샘플내의 TNFR1의 존재 및/또는 량을 결정하기 위한 사용설명서)를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 키트는 하나 이상의 보조 시약, 예컨대, 적합한 완충액 또는 적합한 검출시약(예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 또는 dAb에 결합하는 검출가능하게 표지된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 이에 결합되거나 컨쥬게이션된 모이어티)을 추가로 포함한다.
또한 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 길항제 또는 dAb가 고정되어 상기 고정된 폴리펩티드 또는 dAb가 TNFR1에 결합되는 고체 표면을 포함하는 기구와 관련이 있다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 고정될 수 있는 임의의 적합한 고체 표면, 예를 들어, 유리, 플라스틱, 탄수화물(예를 들어, 아가로스 비드)가 사용될 수 있다. 원하는 경우, 당해 지지체는 고정화를 촉진시키는 원하는 작용기를 함유하거나 함유하도록 변형될 수 있다. 기구, 및/또는 지지체는 임의의 적합한 형상, 예를 들어, 시트, 막대, 스트립, 플레이트, 슬라이드, 비드, 펠렛, 디스크, 겔, 튜브, 구(sphere), 칩, 플레이트 또는 디쉬(dish) 등의 형상을 지닐 수 있다. 일부 구체예들에서, 당해 기구는 딥스틱(dipstick)이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 파지 디스플레이 레퍼토리를 제조하기 위해 사용된, pDOM13 (aka pDOM33)의 다중 클로닝 부위를 보여주는 도면이다.
도 2는 30℃에서 40ug/ml로 트립신과 함께 인큐베이션한, 상이한 시점에 얻은 dAb 샘플들에 관한 다수의 Novex 10-20% Tricene 겔 영동사진이다. 샘플을 트립신 첨가 직전에 채취하고, 이후 트립신 첨가후 1시간 3시간 및 24시간 경과 시점에 채취하였다. 단백질을 1x SureBlue로 염색하였다. 겔은 DOM15-10 및 DOM15-26-501 둘 모두가 트립신과의 인큐베이션의 처음 3시간 동안 상당히 절단되었음을 보여준다. DOM15-26, DOM4-130-54 및 DOM1h-131-511의 절단은 단지 트립신과의 인큐베이션 24시간 경과후에 명백하게 나타났다.
도 3은 DOM1h-131-511 및 24에서 선택된 변이체들의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다. 선택된 클론에서 모 서열과 상이한 아미노산은 강조되어 있다(동일한 아미노산은 점으로 표기되어 있음). CDR1, CDR2 및 CDR3에 상응하는 루프는 박스로 윤곽이 그려져 있다.
도 4는 DOM4-130-54 및 27에서 선택된 변이체들의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다. 선택된 클론에서 모 서열과 상이한 아미노산은 강조되어 있다(동일한 아미노산은 점으로 표기되어 있음). CDR1, CDR2 및 CDR3에 상응하는 루프는 박스로 윤곽이 그려져 있다.
도 5는 DOM15-26-555 및 21에서 선택된 변이체들의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다. 선택된 클론에서 모 서열과 상이한 아미노산은 강조되어 있다(동일한 아미노산은 점으로 표기되어 있음). CDR1, CDR2 및 CDR3에 상응하는 루프는 박스로 윤곽이 그려져 있다.
도 6은 DOM15-10 및 16에서 선택된 변이체들의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다. 선택된 클론에서 모 서열과 상이한 아미노산은 강조되어 있다(동일한 아미노산은 점으로 표기되어 있음). CDR1, CDR2 및 CDR3에 상응하는 루프는 박스로 윤곽이 그려져 있다.
도 7A-7D는 37℃에서 밤새 상이한 농도의 트립신(0 내지 100 μg/ml 범위)과 함께 인큐베이션한 후 고정된 TNFR1에 대한, 모 dAb인 DOM1h-131-511(도 7A) 및 3개의 변이체 dAb인, DOM1h-131-203(도 7B), DOM1h-131-204(도 7C) 및 DOM1h-131-206(도 7D)의 결합을 보여주는 BIAcore 추적이다. 결과는 3개의 변이체 모두가 고농도의 트립신(100ug/ml)에서 단백질가수분해에 대해 모 분자보다 내성임을 보여준다.
도 8A-8C는 밤새 엘라스타아제 및 류코자임과 함께 인큐베이션한 후 고정된 TNFR1에 대한, dAb DOM1h-131-511(도 8A), DOM1h-131-202(도 8B) 및 DOM1h-131-206 (도 8C)의 결합을 보여주는 BIAcore 추적이다. 상기 dAb들은 엘라스타아제 및 류코자임 둘 모두에 대하여 모 분자에 비해 단백질가수분해에 대해 증가된 내성을 나타내었다.
도 9는 트립신과의 인큐베이션 전 dAb DOM1h-131-511, DOM1h-131-203, DOM1h-131-204, DOM1h-131-206, DOM1h-131-54, DOM1h-131-201, 및 DOM Ih-131-202의 샘플 및 100 μg/ml의 트립신과 함께 1시간, 3시간, 및 24시간 동안 인큐베이션한 후의 샘플에 대한 2개의 4-12% Novex Bis-Tris 겔 전기영동사진이다.
도 10A-1OC는 37℃에서 밤새 상이한 농도의 트립신(0 내지 100 μg/ml 범위)과 함께 인큐베이션한 후 고정된 IL-1R1 융합 단백질에 대한, DOM4-130-54(도 10A), D0M4-130-201(도 10B) 및 D0M4-130-202(도 10C)의 결합을 보여주는 BIAcore 추적이다. 결과는 두 변이체 모두가 고농도의 트립신(100ug/ml)에서 단백질가수분해에 대해 이들의 모 분자보다 내성임을 보여준다.
도 11A-11C는 밤새 엘라스타아제 및 류코자임과 함께 인큐베이션한 후 고정된 IL-1R1 융합 단백질에 대한, DOM4-130-54(도 11A), DOM4-130-201(도 11B) 및 DOM4-130-202(도 HC)의 결합을 보여주는 BIAcore 추적이다. 상기 dAb들은 상기 두 프로테아제에 대하여 모 분자에 비해 증가된 단백질가수분해 내성을 나타내었다.
도 12는 DOM15-26-555 및 6에서 선택된 변이체들의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다. 선택된 클론에서 모 서열과 상이한 아미노산은 강조되어 있다(동일한 아미노산은 점으로 표기되어 있음).
도 13A 및 13B는 고정된 VEGF에 대한, 모 dAb인, DOM15-26-555(도 13A)와 가장 내성이 높은 프로테아제 변이체인, DOM15-26-593(도 13B)의 결합을 보여주는 BIAcore 추적이다. 모 분자 및 변이체를 BIAcore로 200 μg/ml의 농도로 트립신과 함께 인큐베이션한 후 10OnM의 dAb 농도에서 결합하는 hVEGF에 관하여 비교하였다. 반응을 37℃에서 3시간 또는 24시간 동안 진행시켰다. 결과는 변이체가 트립신 처리 24시간 경과후 단백질가수분해에 대해 모 분자보다 더 내성임을 보여준다.
도 14는 DOM15-26-555 변이체에 의한 hVEGF 결합에 대한 트립신 처리의 효과를 보여주는 그래프이다. 결과는 모든 변이체들이 트립신 처리 24시간 경과후 단백질가수분해에 대해 모 분자(DOM15-26-555)보다 더 내성임을 명백하게 보여준다.
도 15는 DOM15-26-555 또는 DOM15-26-593의 15 μg의 처리된 샘플과 비처리된 샘플을 로딩시킨 2개의 Novex 10-20% Tricine 겔을 보여준다. 샘플을 트립신 첨가 직전에 채취하고, 이후 트립신 첨가후 1시간, 3시간 및 24시간 경과후에 채취하였다. 단백질을 1x SureBlue로 염색시켰다. 겔은 DOM15-26-593 의 트립신 내성 프로파일이 BIAcore 실험으로 드러난 프로파일과 달랐음을 보여준다.
도 16은 DOM15-10 및 변이체인, DOM15-10-11의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다. 변이체에서 모 서열과 상이한 아미노산은 강조되어 있다(동일한 아미노산은 점으로 표기되어 있다).
도 17A와 17B는 고정된 VEGF에 대한, 모 분자인, D0M15-10(도 17A) 및 변이체인, DOM15-10-11(도 17B)의 결합을 보여주는 BIAcore 추적이다. 모 분자와 변이체를 200 μg/ml의 농도로 트립신과 함께 인큐베이션한 후 10OnM의 dAb 농도에서 결합하는 hVEGF에 관하여 BIAcore상에서 비교하였다. 반응을 37℃에서 3시간 또는 24시간 동안 진행시켰다. 결과는 변이체가 트립신 처리 24시간 경과후 단백질가수분해에 대해 모 분자보다 더 내성임을 보여준다.
도 18은 DOM15-10 및 DOM15-10-11의 15 μg을 로딩시킨 2개의 Novex 10-20% Tricine 겔을 보여준다. 샘플을 트립신 첨가 직전에 채취하고, 이후 트립신 첨가후 1시간, 3시간 및 24시간 경과후에 채취하였다. 단백질을 SureBlue(1x)로 염색시켰다. 결과는 BIAcore 연구에서 드러난 결합 활성이 단백질의 통합성을 직접적으로 반영함음 보여준다.
도 19A-19L은 DOM1h-131-511 또는 D0M4-130-54의 변이체인 dAb을 엔코딩하는 몇몇 핵산의 뉴클레오티드 서열을 보여준다. 뉴클레오티드 서열은, 각각, 도 3 및 도 4에 제시된 아미노산 서열을 엔코딩한다.
도 20A-20E는 DOM15-26-555 또는 DOM15-10의 변이체인 dAb을 엔코딩하는 몇몇 핵산의 뉴클레오티드 서열을 보여준다. 뉴클레오티드 서열은, 각각, 도 5 및 도 6에 제시된 아미노산 서열을 엔코딩한다.
도 21은 pDOM 38의 벡터 개열지도이다.
도 22는 30℃에서 상이한 시간 동안 25:1의 dAb:트립신비로 트립신 처리된 DOM10-53-474 및 DOM15-26-593 단백질의 Labchip 상의 겔 영동사진을 보여준다. 화살표는 전장 단백질을 나타낸다.
도 23은 MMC 크로마토그래피에 후속하여 음이온 교환으로 정제한 후 각각의 샘플에 대해 획득된 고 순도 수준을 보여주는 크기 배제 크로마토그래피 추적이다. UV를 225 nm에서 모니터링하였고 컬럼을 10% 에탄올(v/v)과 함께 1x PBS 중에서 전개시켰다. 단량체 비율을 기준선 보정과 함께 피크 영역의 적분으로 계산하였다.
도 24는 DOM1h-131-511, DOM1h-131-202 및 DOM1h-131-206에 대한 프로테아제 안정성을 보여준다.
도 25는 37와 50℃에서 브리튼-로빈슨 완충액 중의 DOM1h-131-202, DOM1h-131-206 및 DOM1h-131-511의 14일의 안정성 데이터를 보여주는 SEC이다. 모든 dAb의 단백질 농도는 1mg/ml이었다. SEC를 사용하여 임의의 변화가 열 스트레스가 부가되는 동안 단백질에서 일어났는지 여부 및 시점=0(T0) 샘플과 대비하여 용액중에 남아 있는 단량체의 양을 결정하였다.
도 26A 내지 I는 DOM1h-131-511(A 내지 C), -202(D 내지 F) 및 -206(G 내지 I)에 대한 열 스트레스(37 및 50℃)의 효과를 보여주는 SEC 추적을 보여준다. 또한 당해 도면은 주어진 시점에서 T=0과 대비하여 용액중에 남아 있는 단량체의 비율을 보여준다.
도 27은 24시, 48시 및 7일 및 14일 경과시 열 스트레스에 대한 DOM1h-131-202, DOM1h-131-206 및 DOM1h-131-511의 IEF 분석을 보여준다. 샘플을 브리튼-로빈슨 완충액 중에서 37 또는 50℃에서 인큐베이션하였다.
도 28은 50℃에서 DOM1h-131-202, DOM1h-131-206 및 DOM1h-131-511의 14일 인큐베이션의 효과를 보여주는 TNFR-1 RBA이다. 단백질 농도는 1mg/ml인 것으로 추정되었다. 또한 당해 도면은 항원에 결합하지 않은 음성 대조군 dAb(VH 더미(dummy))를 보여준다.
도 29는 +4℃에서 브리튼-로빈슨 완충액 중에서 7일 동안 ~100 mg/ml로 A: DOM1h-131-202, B: DOM1h-131-206 및 C: DOM1h-131-511를 저장한 효과를 보여준다. UV를 280 nm에서 모니터링하였다.
도 30은 Pari E-flow 및 LC+에서 DOM1h-131-202, DOM1h-131-206 및 DOM1h-131-511의 분무기 시험으로부터의 데이터를 보여준다. 단백질 농도는 브리튼-로빈슨 완충액 중에서 5mg/ml이었다.
도 31은 5 mg/ml로 브리튼-로빈슨 완충액 중의 DOM1h-131-202, DOM1h-131-206 및 DOM1h-131-511의 분무 동안 단량체 농도에서의 상대적 비율 변화를 보여준다.
도 32는 Pari LC+로부터의 분무 후 브리튼-로빈슨 완충액 중의 DOM1h-131-206 및 DOM1h-131-511의 SEC 추적을 보여준다.
도 33은 PBS 중의 40mg/ml로 1시간에 걸친 분무 과정이 진행되는 동안 DOM1h-131-206의 SEC 추적을 보여준다. 분무 컵 및 에어로졸 둘 모두에서 단백질은 분무가 진행되는 동안 dAb에 의해 겪게 될 수 있는 전단 스트레스 및 열 스트레스의 효과에 고도소 내성을 나타낸다.
도 34는 3개의 리드(lead) 단백질(DOM1h-131-206 및 DOM1h-131-511 및 DOM1h-131-202) 각각에 대한 침강 속도 곡선을 보여준다. DOM1h-131-206의 보다 낮은 농도의 샘플의 경우에 관찰된 바이모달(bimodal) 피크는 이 경우에 있어서 세포로부터의 샘플 피크에 기인한 아티팩트(artefact)이다.
도 35는 GSK 1995056A(DOM1h-131-511)의 분무되는 점적 크기에 대한 완충액 및 기구의 효과를 보여준다.
도 36은 SEC로 측정된 이합체 형성에 의해 평가된 다양한 기구내에서의 분무 후 GSK1995056A(DOM1h-131-511)의 안정성을 보여준다.
도 37은 Pari E-flow and LC+에서의 GSK1922567A(202), GSK1995057A(206) 및 GSK1995056A(511)의 분무 시험을 보여준다. A) 브리튼-로빈슨 완충액에서의 시험, B) PEGlOOO/수크로스 완충액에서의 시험.
도 38은 인간 TNFR1 수용체 결합 검정에서의 TNF-α 용량 곡선을 나타낸다. 각각의 샘플을 4개의 레플리케이트로 시험하였다.
도 39는 인간 TNFRI 수용체 결합 검정에서 GSK1922567A(DOM1h-131-202), GSK1995057A(DOM1h-131-206) 및 GSK1995056A(DOM1h-131-511)에 의한 억제를 보여준다. 각각의 샘플을 4개의 레플리케이트로 시험하였다.
도 40은 VEGF RBA에서 DOM15-26 및 DOM15-26-593 dAb의 효능을 보여준다.
도 41은 5mg/mg으로 래트에 단일 볼루스 투여량 정맥내(i.v.) 투여후 DMS 1529(DOM15-26-593) 및 DMS1545(DOM15-26-501)의 약동학을 보여준다.
도 42a는 단량체 특성을 확증시키는 DMS 1529 Fc 융합체(DOM15-26-593 Fc 융합체)의 SEC-MALLs(크기 배제 크로마토그래피-다각도레이저광산란; Size exclusion chromatograph-multi-angle laser light scattering)를 보여준다. 굴절율(즉, 농도: 파선) 및 광산란(실선)과 관련하여 유사한 특성을 나타내는 2개의 상이한 배치들이 도시되어 있다. 화살표로 표시된 선은 분자량 계산을 의미한다.
도 42b는 단량체 특성을 확증시키는 DMS1529 Fc 융합체(DOM15-26-593 Fc 융합체)의 AUC(분석용 초원심분리; analytical ultracentrifugation) 분석을 보여준다. 1배치의 물질을 PBS 완충액 중에서 거의 0.2, 0.5 & 1.0mg/ml인 3가지 상이한 농도에서 시험하였다. 침강 속도의 분석은 분자량이 대략 80kDa임을 확증시켰다.
도 43은 DMS1529(DOM15-26-593) 및 DOM15-26-501의 DSC 추적을 보여준다.
도 44는 2가지 상이한 배치의 물질에 대한 10회 동결-해동 사이클 전후에 DMS1529(DOM15-26-593)에 대한 VEGF 결합 ELISA이다.
도 45는 10회 동결 해동 사이클 전후의 DOM15-26-593 SEC 프로파일의 일관성(consistency)을 보여준다.
도 46은 DMS1529 융합체(DOM15-26-593 Fc 융합체)의 가속화된 안정성 연구로부터의 결과를 보여준다; 당해 도면은 해당 온도에서 7일간 인큐베이션한 후의 활성을 입증하는 결합 ELISA를 보여준다.
도 47A는 37℃에서 14일 및 15일간 인큐베이션한 후 인간과 시노몰구스(cynomolgus)에서 DMS1529(DOM15-26-593)의 안정성을 보여준다.
도 47B는 37℃에서 14일 및 15일간 인큐베이션한 후 인간 혈청에서 DMS1529(DOM15-26-593)의 안정성을 보여준다.
도 48은 VEGF RBA에서 Fc 융합체로서(각각, DMS 1564 & 1529) DOM15-26 및 DOM15-26-593 dAb의 효능을 보여준다.
도 49는 DMS1529 융합체(DOM15-26-593 FC 융합체)에 의한 HUVEC 세포 증식의 억제를 보여준다.
도 50은 pDom33 벡터 개열지도이다.
도 51은 혈청 알부민에 결합하는 dAb의 서열(아미노산 및 누클레오티드)을 나타낸다.
본 발명의 상세한 설명
본 명세서 내에서, 본 발명은 명확하고 정확한 명세서가 기재될 수 있도록 만드른 방식으로, 구체예들을 참조하여, 기재되었다. 상기 구체예들은 본 발명으로부터 벗어남이 없이 다양하게 조합되고 분리될 수 있도록 의도되며 그럴 수 있음이 이해되어야 한다.
달리 정의하지 않는한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용더들은 당해 기술분야(예를 들어, 세포 배양, 분자 유전학, 핵산 화학, 하이브리드화 기법 및 생화학 분야)에 종사하는 통상의 기술자에 의해 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 표준 기법들은 분자적, 유전학적 및 생화학적 방법(일반적으로, 참고문헌으로 본원에 통합되는, 하기 문헌을 참조하라: Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. 및 Ausubel et al, Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4 Ed, John Wiley & Sons, Inc. which are incorporated herein by reference)과 화학적 방법에 사용된다.
본원에 사용된, 용어 "종양 괴사 인자 수용체 1(TNFR1)의 길항제" 또는 "항-TNFR1 길항제" 등은 TNFR1에 결합하여 TNFR1의 기능(즉, 하나 이상의 기능)을 억제할 수 있는 작용제(예를 들어, 분자, 화합물)를 의미한다. 예를 들어, TNFR1의 길항제는 TNFR1으로의 TNF α의 결합을 억제할 수 있고/있거나 TNFR1을 통해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있다. 따라서, TNFR1-매개 과정 및 세포 반응(예를 들어, 표준 L929 세포독성 검정에서의 TNFα-유도 세포 사멸)이 TNFR1의 길항제를 이용하여 억제될 수 있다.
본원에 사용된, "펩티드"는 펩티드 결합을 통해 같이 연결된 약 2 내지 약 50개의 아미노산을 의미한다.
본원에 사용된, "폴리펩티드"는 펩티드 결합을 통해 함께 연결된 약 50개 이상의 아미노산을 의미한다. 폴리펩티드는 일반저으로 3차 구조를 포함하며 기능성 도메인들로 폴딩된다.
본원에 사용된, "프로테아제 분해(degradation)에 대하여 내성있는" 펩티드 또는 폴리펩티드(예를 들어, 도메인 항체(dAb))는 프로테아제 활성에 적합한 조건하에서 프로테아제와 함께 인큐베이션될 때 프로테아제에 의해 실질적으로 분해되지 않는다. 폴리펩티드(예를 들어, dAb)는, 단백질의 약 25% 이상(no more than), 약 20% 이상, 약 15% 이상, 약 14% 이상, 약 13% 이상, 약 12% 이상, 약 11% 이상, 약 10% 이상, 약 9% 이상, 약 8% 이상, 약 7% 이상, 약 6% 이상, 약 5% 이상, 약 4% 이상, 약 3% 이상, 약 2% 이상, 약 1% 이상, 또는 실질적으로 전부가 프로테아제 활성에 적합한 온도, 예를 들어, 37 또는 50℃에서 약 1시간 동안 프로테아아제와 함께 인큐베이션된 후 프로테아제에 의해 분해되지 않는 경우, 실질적으로 분해되지 않는다. 단백질 분해는 임의의 적합한 방법을 사용하여, 예를 들어, 본원에 기재된 SDS-PAGE 또는 기능 검정(예를 들어, 리간드 결합)에 의해 평가될 수 있다.
본원에 사용된 "디스플레이 시스템"은 폴리펩티드 또는 펩티드의 집합체(collection)가 원하는 특성, 예컨대, 물리적, 화학적 또는 기능적 특성에 기초하여 선택을 위해 접근가능한 시스템을 의미한다. 디스플레이 시스템은 (예를 들어, 용액중에서, 적합한 지지체에 고정된) 폴리펩티드 또는 펩티드의 적합한 레퍼토리일 수 있다. 디스플레이 시스템은 또한 세포 발현 시스템(예를 들어, 형질변환되거나, 감염되거나, 트랜스펙션되거나 형질도입된 세포내에서 핵산 라이브러리의 발현 및 세포의 표면 상의 엔코딩된 폴리펩티드의 디스플레이) 또는 무세포 발현 시스템(예를 들어, 에멀젼 구획화 및 디스플레이)을 이용하는 시스템일 수 있다. 대표적인 디스플레이 시스템은 핵산의 코딩 기능과 상기 핵산에 의해 엔코딩된 폴리펩티드 또는 펩티드의 물리적, 화학적 및/또는 기능적 특성을 연결시킨다. 이와 같은 디스플레이 시스템이 이용되는 경우, 원하는 물리적, 화학적 및/또는 기능적 특성을 지니는 폴리펩티드 또는 펩티드가 선택될 수 있고 선택된 폴리펩티드 또는 펩티드를 엔코딩하는 핵산은 용이하게 분리되거나 회수될 수 있다. 핵산의 코딩 기능과 폴리펩티드 또는 펩티드의 물리적, 화학적 및/또는 기능적 특성을 연결시키는 다수의 디스플레이 시스템이 당업계에 공지되어 있는데, 예를 들어, 박테리오파지 디스플레이(파지 디스플레이, 예를 들어, 파지미드 디스플레이), 리보좀 디스플레이, 에멀젼 구획화 및 디스플레이, 효모 디스플레이, 퓨로마이신 디스플레이, 박테리아 디스플레이, 플라스미드상의 디스플레이, 공유결합성 디스플레이 등이 있다. (예를 들어, 하기 문헌들을 참조하라: EP 0436597(Dyax), 미국 특허 제6,172,197호(McCafferty et al), 미국 특허 제6,489,103호(Griffiths et al.))
본원에서 사용되는 "레퍼토리(repertoire)"는 아미노산 서열 다양성을 특징으로 하는 폴리펩티드 또는 펩티드의 집합물을 의미한다. 레퍼토리의 개별적 일원은 공통의 특징, 예를 들어, 공통의 구조적 특징(예를 들어, 공통의 코어 구조) 및/또는 공통의 기능적 특징(예를 들어, 공통의 리간드(예를 들어, 제너릭 리간드(generic ligand) 또는 표적 리간드, TNFR1)에 결합하는 능력)을 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 "기능적"은 생물학적 활성, 예를 들어, 특정 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 펩티드를 나타낸다. 예를 들어, 용어 "기능적 폴리펩티드"는 항원 결합 부위를 통해 표적 항원에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
본원에서 사용되는 "제너릭 리간드"는 제공된 레퍼토리의 기능적 일원의 많은 부분(예를 들어, 실질적으로 모든 부분)에 결합하는 리간드를 의미한다. 제너릭 리간드(예를 들어, 공통의 제너릭 리간드)는 제공된 레퍼토리의 많은 일원에 결합할 수 있는데, 상기 일원이 공통의 표적 리간드에 대해 결합 특이성을 갖지 않더라도 상기 일원에 결합할 수 있다. 일반적으로, 폴리펩티드 상의 기능적 제너릭 리간드 결합 부위의 존재(제너릭 리간드에 결합하는 능력에 의해 나타남)는 폴리펩티드가 정확하게 폴딩되었고 기능성임을 나타낸다. 제너릭 리간드의 적합한 예는 초항원(superantigen), 레퍼토리의 기능적 일원의 많은 부분에서 발현된 에피토프에 결합하는 항체 등을 포함한다.
"초항원"은 단백질의 표적 리간드 결합 부위와 다른 부위의 면역글로불린 상과의 일원과 상호작용하는 제너릭 리간드를 의미하는 당 분야의 용어이다. 포도구균 장독소가 T 세포 수용체와 상호작용하는 초항원의 예이다. 항체에 결합하는 초항원은 IgG 불변 영역에 결합하는 단백질 G(Bjorck and Kronvall, J. Immunol ., 133:969 (1984)); IgG 불변 영역 및 VH 도메인에 결합하는 단백질 A(Forsgren and Sjoquist, J. Immunol ., 97:822 (1966)); 및 VL 도메인에 결합하는 단백질 L(Bjorck, J. Immunol , 140:1194 (1988))을 포함한다.
본원에서 사용되는 "표적 리간드"는 폴리펩티드 또는 펩티드에 의해 특이적 또는 선택적으로 결합되는 리간드를 의미한다. 예를 들어, 폴리펩티드가 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 경우, 표적 리간드는 임의의 요망되는 항원 또는 에피토프일 수 있다. 표적 항원에 대한 결합은 기능성이 되는 폴리펩티드 또는 펩티드에 좌우된다.
본원에서 사용되는 항체는 항체를 천연 생성하는 임의의 종으로부터 유래되거나 재조합 DNA 기술에 의해 생성되었는지의 여부에 상관 없이; 또한 혈청, B 세포, 하이브리도마, 이입세포(transfectoma), 효모 또는 세균으로부터 분리되었는지의 여부에 상관 없이, IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE 또는 단편(예를 들어, Fab , F(ab')2, Fv, 이황화 결합된 Fv, scFv, 닫힌 형태의 다중특이적 항체, 이황화 결합된 scFv, 디아바디(diabody))을 의미한다.
본원에서 사용되는 "항체 포맷"은 하나 이상의 항체 가변 도메인이 통합되어 구조 상의 항원에 대한 결합 특이성을 제공할 수 있는 임의의 적합한 폴리펩티드 구조를 의미한다. 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 단일 사슬 항체, 이중특이적 항체, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 동종이합체 및 이종이합체, 상기 중 임의의 것의 항원 결합 단편(예를 들어, Fv 단편(예를 들어, 단일 사슬 Fv(scFv), 이황화 결합된 Fv), Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편), 단일 항체 가변 도메인(예를 들어, dAb, VH, VHH, VL), 및 상기 중 임의의 것의 변형된 형태(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 또는 다른 적합한 중합체 또는 인간화 VHH의 공유 결합에 의해 변형됨)와 같은 다양한 적합한 항체 포맷이 당 분야에 공지되어 있다.
구 "면역글로불린 단일 가변 도메인"은 다른 V 영역 또는 도메인과는 독립적으로 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 가변 도메인(VH, VHH, VL)을 의미한다. 면역글로불린 단일 가변 도메인은 다른 가변 영역 또는 가변 도메인을 갖는 포맷(예를 들어, 동종중합체 또는 이종중합체)으로 존재할 수 있고, 여기서 다른 영역 또는 도메인은 단일 면역글로불린 가변 도메인에 의한 항원 결합에 필요하지 않다(즉, 면역글로불린 단일 가변 도메인이 추가의 가변 도메인과는 독립적으로 항원에 결합하는 경우). "도메인 항체" 또는 "dAb"는 본원에서 사용되는 용어 "면역글로불린 단일 가변 도메인"과 동일하다. "단일 면역글로불린 가변 도메인"은 본원에서 사용되는 용어 "면역글로불린 단일 가변 도메인"과 동일하다. "단일 항체 가변 도메인" 또는 "항체 단일 가변 도메인"은 본원에서 사용되는 용어 "면역글로불린 단일 가변 도메인"과 동일하다. 면역글로불린 단일 가변 도메인은 일 구체예에서 인간 항체 가변 도메인이나, 이는 또한 설치류(예를 들어, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 WO 00/29004), 너스 샤크(nurse shark) 및 카멜리드(Camelid) VHH dAb와 같은 다른 종으로부터의 단일 항체 가변 도메인을 포함한다. 카멜리드 VHH는 천연적으로 경쇄가 결여된 중쇄 항체를 생성하는 낙타, 라마, 알파카, 단봉 낙타 및 과나코를 포함하는 종으로부터 유래된 면역글로불린 단일 가변 도메인 폴리펩티드이다. VHH는 인간화될 수 있다.
"도메인"은 단백질의 나머지와는 독립적인 3차 구조를 갖는 폴딩된 단백질 구조이다. 일반적으로, 도메인은 단백질의 별개의 기능적 특성을 책임지며, 많은 경우에 단백질 및/또는 도메인의 나머지의 기능 상실 없이 첨가되거나, 제거되거나, 다른 단백질로 이동될 수 있다. "단일 항체 가변 도메인"은 항체 가변 도메인의 서열 특성을 포함하는 폴딩된 폴리펩티드 도메인이다. 따라서, 이는 완전한 항체 가변 도메인 및, 예를 들어, 하나 이상의 루프가 항체 가변 도메인의 특징을 이루지 않는 서열로 대체된 변형된 가변 도메인, 또는 트렁케이션되거나 N-말단 신장 또는 C-말단 신장을 포함하는 항체 가변 도메인, 뿐만 아니라 적어도 전장 도메인의 결합 활성 및 특이성을 보유하는 가변 도메인의 폴딩된 단편을 포함한다.
용어 "라이브러리"는 이종성 폴리펩티드 또는 핵산의 혼합물을 의미한다. 라이브러리는 일원으로 구성되고, 이러한 구성 각각은 단일 폴리펩티드 또는 핵산 서열을 갖는다. 본 발명에서, "라이브러리"는 "레퍼토리"와 동의어이다. 라이브러리 일원 사이의 서열 차이는 라이브러리에 존재하는 다양성의 원인이 된다. 라이브러리는 폴리펩티드 또는 핵산의 단순한 혼합물의 형태를 취할 수 있거나, 핵산의 라이브러리로 형질전환된 유기체 또는 세포, 예를 들어, 세균, 바이러스, 동물 또는 식물 세포 등의 형태일 수 있다. 일 구체예에서, 각각의 개별적 유기체 또는 세포는 단지 하나 또는 한정된 수의 라이브러리 일원을 함유한다. 일 구체예에서, 핵산에 의해 엔코딩되는 폴리펩티드의 발현을 가능케 하기 위해 핵산은 발현 벡터로 통합된다. 따라서, 일 양태에서, 라이브러리는 숙주 유기체의 집단의 형태를 취할 수 있고, 이러한 각각의 유기체는 핵산의 해당 폴리펩티드 일원을 생성시키기 위해 발현될 수 있는 핵산 형태의 라이브러리의 단일 일원을 함유하는 하나 이상의 카피의 발현 벡터를 함유한다. 따라서, 숙주 유기체의 집단은 다양한 폴리펩티드의 큰 레파토리를 엔코딩하는 잠재성을 갖는다.
"유니버셜 프레임워크(universal framework)"는 카밧(Kabat)("Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services)에 의해 정의된 바와 같은 서열에 보존된 항체의 영역에 해당하거나, 문헌[Chothia and Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196:910-917]에 정의된 인간 점라인 면역글로불린 레퍼토리 또는 구조에 해당하는 단일 항체 프레임워크 서열이다. 라이브러리 및 레퍼토리는 단일 프레임워크 또는 이러한 프레임워크의 세트를 이용할 수 있고, 이는 과가변 영역 단독에서의 변화이긴 하나 사실상 임의의 결합 특이성의 유도를 허용하는 것으로 밝혀졌다.
본원에서 사용되는 용어 "용량"은 한번에(단일 용량) 투여되거나, 규정된 시간 간격에 걸쳐 2회 이상의 투여로 투여되는 리간드의 양을 의미한다. 예를 들어, 용량은 1일(24시간)(일일 용량), 2일, 1주, 2주, 3주 또는 1개월 이상의 경과에 걸쳐 피검체에 투여(예를 들어, 단일 투여, 또는 2회 이상의 투여에 의함)되는 리간드(예를 들어, 표적 항원에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드)의 양을 의미할 수 있다. 용량 사이의 간격은 임의의 요망되는 기간의 시간일 수 있다.
구 "반감기"는, 예를 들어, 천연 메커니즘에 의한 리간드의 분해 및/또는 리간드의 청소 또는 분리로 인해 생체내에서 리간드(예를 들어, dAb, 폴리펩티드 또는 길항제)의 혈청 농도가 50% 감소되는데 걸리는 시간을 의미한다. 본 발명의 리간드는 생체내에서 안정화되고, 이의 반감기는 분해 및/또는 청소 또는 분리에 저항하는 분자로의 결합에 의해 증가된다. 통상적으로, 이러한 분자는 자체로 생체내에서 긴 반감기를 갖는 천연 발생 단백질이다. 리간드의 반감기는 이의 기능성 활성이 생체내에서 반감기 증가 분자에 특이적이지 않은 유사한 리간드보다 긴 기간 지속되는 경우에 증가된다. 예를 들어, 인간 혈청 알부민(HAS) 및 표적 분자에 특이적인 리간드가 HSA에 결합하지 않으나 또 다른 분자에 결합하는 HSA에 대한 특이성이 존재하지 않는 동일한 리간드와 비교된다. 예를 들어, 이는 세포 상의 제 3의 표적에 결합할 수 있다. 통상적으로, 반감기는 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 이 이상 증가된다. 반감기의 2x, 3x, 4x, 5x, 10x, 20x, 30x, 40x, 50x 또는 이 이상의 범위의 증가가 가능하다. 대안적으로 또는 또한, 반감기의 30x, 40x, 50x, 60x, 70x, 80x, 90x, 100x, 150x 이하의 범위의 증가가 가능하다.
본원에서 사용되는 "유체역학 크기"는 수용액을 통한 분자의 확산에 기초한 분자(예를 들어, 단백질 분자, 리간드)의 명백한 크기를 의미한다. 용액을 통한 단백질의 확산 또는 운동은 단백질의 명백한 크기를 유도하도록 처리될 수 있고, 여기서 상기 크기는 단백질 입자의 "스톡스 반경(Stokes radius)" 또는 "유체역학 반경"에 의해 제공된다. 단백질의 "유체역학 크기"는 질량 및 형상(형태) 둘 모두에 좌우되어, 동일한 분자 질량을 갖는 2개의 단백질이 단백질의 종합적인 형태에 기초하여 상이한 유체역학 크기를 가질 수 있다.
본원에 언급되는 용어 "경쟁하다"는 인지체 표적 결합 도메인에 대한 제 1 표적의 결합이 상기 인지체 표적에 대해 특이적인 제 2의 결합 도메인의 존재하에서 억제되는 것을 의미한다. 예를 들어, 결합 도메인의 물리적 차단, 또는 결합 도메인의 구조 또는 환경의 변화에 의해 입체구조적으로 억제되어, 표적에 대한 친화성 또는 결합력이 감소될 수 있다. 제 1 및 제 2의 결합 도메인 사이의 경쟁을 결정하기 위한 경쟁 ELISA 및 경쟁 비아코어(BiaCore) 실험을 수행하기 위한 방법의 세부사항은 WO2006038027을 참조하라.
2개 서열 사이의 "상동성" 또는 "동일성" 또는 "유사성"(상기 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용됨)의 계산은 하기와 같이 수행된다. 최적 비교 목적을 위해 서열이 정렬된다(예를 들어, 최적 정렬을 위해 제 1 및 제 2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 모두에 갭이 도입될 수 있고, 비-상동성 서열이 비교 목적을 위해 무시될 수 있음). 일 구체예에서, 비교 목적을 위해 정렬된 참조 서열의 길이는 참조 서열의 길이의 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 80%, 90%, 100%이다. 이후, 해당 아미노산 위치 또는 누클레오티드 위치의 아미노산 잔기 또는 누클레오티드가 비교된다. 제 1 서열 내의 위치가 제 2의 서열 내의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 누클레오티드에 의해 점유되는 경우, 분자는 상기 위치에서 동일하다(본원에서 사용되는 아미노산 핵산 "상동성"은 아미노산 또는 핵산 "동일성"과 동등함). 2개의 서열 사이의 동일성 퍼센트는 2개의 서열의 최적의 정렬을 위해 도입되는 것이 필요한 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려한, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다. 본원에 정의된 아미노산 및 누클레오티드 서열 정렬 및 상동성, 유사성 또는 동일성은 디폴트(default) 파라미터를 이용하는 알고리듬 BLAST 2 시퀀시즈(BLAST 2 Sequences)를 이용하여 준비되고 결정될 수 있다(Tatusova, T. A. et al., FEMS Microbiol Lett , 174:187-188 (1999)).
선택 방법
일 구체예에서, 본 발명은 요망되는 생물학적 활성을 갖는 프로테아제 내성 펩티드 및 폴리펩티드의 선택 방법에 의해 선택된, 폴리펩티드 및 dAb에 관한 것이다. 매우 안정적이고 프로테아제 분해에 대해 내성이고, 요망되는 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드를 선택하기 위한 효과적인 과정을 생성시키기 위한 방법에서 2개의 선택압이 이용된다. 본원에 기재된 프로테아제 내성 펩티드 및 폴리펩티드는 일반적으로 생물학적 활성을 보유한다. 대조적으로, 프로테아제 민감성 펩티드 및 폴리펩티드는 본원에 기재된 방법에서 프로테아제에 의해 절단되거나 분해되고, 따라서 이의 생물학적 활성을 상실한다. 따라서, 프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드는 일반적으로 이의 생물학적 활성, 예를 들어, 결합 활성에 기초하여 선택된다.
본원에 기재된 방법은 여러 장점을 제공한다. 예를 들어, 본원에 개시되고 예시된 바와 같이, 하나의 프로테아제(예를 들어, 트립신)에 의한 단백질분해성 분해에 대한 내성을 위해 선택된 가변 도메인, 길항제, 펩티드 또는 폴리펩티드는 또한 다른 프로테아제(예를 들어, 엘라스타아제, 류코자임)에 의한 분해에 내성이다. 일 구체예에서, 프로테아제 내성은 펩티드 또는 폴리펩티드의 보다 높은 융해 온도(Tm)와 상관 관계가 있다. 보다 높은 융해 온도는 보다 안정한 가변 도메인, 길항제, 펩티드 및 폴리펩티드를 나타낸다. 프로테아제 분해에 대한 내성은 또한 일 구체예에서 표적 리간드에 대한 높은 친화성의 결합과 상관 관계가 있다. 따라서, 본원에 기재된 방법은 요망되는 생물학적 활성을 갖고, 생체내 치료 및/또는 진단 용도에 매우 적합한 가변 도메인, 길항제, 펩티드, 폴리펩티드를 선택하고/하거나, 분리하고/하거나, 회수하는 효과적인 방식을 제공하는데, 이는 이들이 프로테아제 내성이고 안정적이기 때문이다. 일 구체예에서, 프로테아제 내성은 개선된 PK와 상관관계가 있고, 예를 들어, 프로테아제 내성이 아닌 n개의 가변 도메인, 길항제, 펩티드 또는 폴리펩티드에 비해 개선된다. 개선된 PK는 개선된 AUC(곡선하영역) 및/또는 개선된 반감기일 수 있다. 일 구체예에서, 프로테아제 내성은 전단 및/또는 열 스트레스에 대한 가변 도메인, 길항제, 펩티드 또는 폴리펩티드의 개선된 안정성 및/또는 분무 동안의 감소된 응집 경향과 상관관계가 있고, 예를 들어, 프로테아제 내성이 아닌 가변 도메인, 길항제, 펩티드 또는 폴리펩티드에 비해 개선된다. 일 구체예에서, 프로테아제 내성은 개선된 보관 안정성과 상관관계가 있고, 예를 들어, 프로테아제 내성이 아닌 가변 도메인, 길항제, 펩티드 또는 폴리펩티드에 비해 개선된다. 일 양태에서, 상기 장점 중 1개, 2개, 3개, 4개 또는 모두가 제공되며, 상기 장점은 프로테아제 분해에 대한 내성, 보다 높은 Tm 및 표적 리간드에 대한 보다 높은 친화성 결합이다.
일 양태에서, 프로테아제(예를 들어, 하나 이상의 프로테아제)에 의한 분해에 내성인 펩티드 및 폴리펩티드의 라이브러리 또는 레퍼토리(예를 들어, 디스플레이 시스템)으로부터 펩티드 또는 폴리펩티드를 선택하고/하거나, 분리하고/하거나, 회수하는 방법이 제공된다. 일 양태에서, 상기 방법은 프로테아제(예를 들어, 하나 이상의 프로테아제)에 의한 분해에 내성인 펩티드 및 폴리펩티드의 라이브러리 또는 레퍼토리(예를 들어, 디스플레이 시스템)로부터 폴리펩티드를 선택하고/하거나, 분리하고/하거나, 회수하는 방법이다. 일반적으로, 상기 방법은 펩티드 또는 폴리펩티드의 라이브러리 또는 레퍼토리를 제공하는 단계, 프로테아제 활성에 적합한 조건하에서 상기 라이브러리 또는 레퍼토리와 프로테아제(예를 들어, 트립신, 엘라스타아제, 류코자임, 판크레아틴, 타액)를 조합시키는 단계, 및 프로테아제에 의한 분해에 내성이고 요망되는 생물학적 활성을 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드를 선택하고/하거나, 분리하고/하거나, 회수하는 단계를 포함한다. 프로테아제에 의해 분해되는 펩티드 또는 폴리펩티드는 일반적으로 프로테아제의 활성으로 인해 감소된 생물학적 활성을 갖거나, 생물학적 활성을 상실한다. 따라서, 프로테아제 분해에 내성인 펩티드 또는 폴리펩티드는 이의 생물학적 활성, 예를 들어, 결합 활성(예를 들어, 일반 리간드 결합, 특정 리간드 결합, 기질 결합), 촉매 활성 또는 다른 생물학적 활성에 기초하는 방법을 이용하여 선택되고/되거나, 분리되고/되거나, 회수될 수 있다.
펩티드 또는 폴리펩티드의 라이브러리 또는 레퍼토리는 프로테아제의 단백질분해 활성에 적합한 조건하에서 프로테아제(예를 들어, 하나 이상의 프로테아제)와 조합된다. 프로테아제의 단백질분해 활성에 적합한 조건, 및 단백질분해 활성을 함유하는 생물학적 제조물 또는 혼합물은 당 분야에 널리 공지되어 있거나, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 요망되는 경우, 예를 들어, 다양한 pH 조건, 프로테아제 농도 및 온도하에서 프로테아제 활성을 측정하고/하거나 라이브러리 또는 레퍼토리의 시간의 양을 변화시킴으로써 적합한 조건이 확인되거나 최적화될 수 있고, 프로테아제가 반응되도록 한다. 예를 들어, 몇몇 구체예에서, 트립신과 같은 프로테아제 대 펩티드 또는 폴리펩티드(예를 들어, 가변 도메인)의 비(몰/몰 기초)는 800 내지 80,000(예를 들어, 8,000 내지 80,000)의 프로테아제:펩티드 또는 폴리펩티드이고, 예를 들어, 10 마이크로그램/프로테아제 ml가 사용되는 경우, 상기 비는 800 내지 80,000의 프로테아제:펩티드 또는 폴리펩티드이거나; 100 마이크로그램/프로테아제 ml가 사용되는 경우, 상기 비는 8,000 내지 80,000의 프로테아제:펩티드 또는 폴리펩티드이다. 일 구체예에서, 프로테아제(예를 들어, 트립신) 대 펩티드 또는 폴리펩티드(예를 들어, 가변 도메인)의 비(중량/중량, 예를 들어, 마이크로그램/마이크로그램 기초)는 1,600 내지 160,000(예를 들어, 16,000 내지 160,000)의 프로테아제:펩티드 또는 폴리펩티드이고, 예를 들어, 10 마이크로그램/프로테아제 ml가 사용되는 경우, 상기 비는 1,600 내지 160,000의 프로테아제:펩티드 또는 폴리펩티드이거나; 100 마이크로그램/프로테아제 ml가 사용되는 경우, 상기 비는 16,000 내지 160,000의 프로테아제:펩티드 또는 폴리펩티드이다. 일 구체예에서, 프로테아제는 100 또는 1000 마이크로그램/ml 이상의 농도로 사용되고, 트립신과 같은 프로테아제 대 펩티드 또는 폴리펩티드(예를 들어, 가변 도메인)의 프로테아제:펩티드 비(몰/몰 기초)는 8,000 내지 80,000의 프로테아제:펩티드 또는 폴리펩티드이다. 일 구체예에서, 프로테아제는 10 마이크로그램/ml 이상의 농도로 사용되고, 트립신과 같은 프로테아제 대 펩티드 또는 폴리펩티드(예를 들어, 가변 도메인)의 프로테아제:펩티드 비(몰/몰 기초)는 800 내지 80,000의 프로테아제:펩티드 또는 폴리펩티드이다. 일 구체예에서, 프로테아제(예를 들어, 트립신) 대 펩티드 또는 폴리펩티드(예를 들어, 가변 도메인)의 비(중량/중량, 예를 들어, 마이크로그램/마이크로그램 기초)는 1600 내지 160,000의 프로테아제:펩티드 또는 폴리펩티드이고, 예를 들어, C가 10 마이크로그램/ml이거나; C 또는 C'이 100 마이크로그램/ml인 경우, 상기 비는 16,000 내지 160,000의 프로테아제:펩티드 또는 폴리펩티드이다. 일 구체예에서, 농도(c 또는 c')는 적어도 100 또는 1000 마이크로그램/프로테아제 ml이다. 개별적 또는 분리된 펩티드 또는 폴리펩티드(예를 들어, 면역글로불린 가변 도메인), 예를 들어, 레퍼토리 또는 라이브러리로부터 이미 분리된 펩티드 또는 폴리펩티드를 시험하기 위해, 프로테아제는 약 0.01%(w/w) 이상의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 약 0.01% 내지 약 5%(w/w)의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 약 0.05% 내지 약 5%(w/w)의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 약 0.1% 내지 약 5%(w/w)의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 약 0.5% 내지 약 5%(w/w)의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 약 1% 내지 약 5%(w/w)의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 약 0.01%(w/w) 이상의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 약 0.02%(w/w) 이상의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 약 0.03%(w/w) 이상의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 약 0.04%(w/w) 이상의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 약 0.05%(w/w) 이상의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 약 0.06%(w/w) 이상의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 약 0.07%(w/w) 이상의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 약 0.08%(w/w) 이상의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 약 0.09%(w/w) 이상의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 약 0.1%(w/w) 이상의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 약 0.2%(w/w) 이상의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 약 0.3%(w/w) 이상의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 약 0.4%(w/w) 이상의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 약 0.5%(w/w) 이상의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 약 0.6%(w/w) 이상의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 약 0.7%(w/w) 이상의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 약 0.8%(w/w) 이상의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 약 0.9%(w/w) 이상의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 약 1%(w/w) 이상의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 약 2%(w/w) 이상의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 약 3%(w/w) 이상의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 약 4%(w/w) 이상의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 약 5%(w/w) 이상의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드의 용액과 같은 펩티드 또는 폴리펩티드/프로테아제 용액을 생성시키기 위해 적합한 완충액(예를 들어, PBS) 중의 펩티드 또는 폴리펩티드의 용액에 첨가될 수 있다. 혼합물은 프로테아제 활성에 적합한 온도(예를 들어, 실온, 약 37℃)에서 인큐베이션될 수 있고, 샘플은 시간 간격(예를 들어, 1시간, 2시간, 3시간 등)에 따라 채취될 수 있다. 샘플은 임의의 적합한 방법, 예를 들어, SDS-PAGE 분석 또는 리간드 결합을 이용하여 단백질 분해에 대해 분석될 수 있고, 결과는 분해의 시간 경과를 확립시키기 위해 사용될 수 있다.
임의의 요망되는 프로테아제 또는 프로테아제들이 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 단일 프로테아제, 상이한 프로테아제의 임의의 요망되는 조합물, 또는 임의의 생물학적 제조물, 생물학적 추출물, 또는 단백질분해성 활성을 함유하는 생물학적 균질액이 사용될 수 있다. 사용되는 프로테아제 또는 프로테아제들의 확인이 공지되어 있을 필요는 없다. 단독으로 사용되거나 임의의 요망되는 조합물로 사용될 수 있는 프로테아제의 적합한 예는 세린 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파테이트 프로테아제, 티올 프로테아제, 매트릭스 메탈로프로테아제(matrix metalloprotease), 카르복시펩티다아제(예를 들어, 카르복시펩티다아제 A, 카르복시펩티다아제 B), 트립신, 키모트립신, 펩신, 파파인, 엘라스타아제, 류코자임, 판크레아틴, 트롬빈, 플라스민, 카텝신(예를 들어, 카텝신 G), 단백분해효소(예를 들어, 단백분해효소 1, 단백분해효소 2, 단백분해효소 3), 써몰리신(thermolysin), 키모신(chymosin), 엔테로펩티다아제(enteropeptidase), 카스파아제(caspase)(예를 들어, 카스파아제 1, 카스파아제 2, 카스파아제 4, 카스파아제 5, 카스파아제 9, 카스파아제 12, 카스파아제 13), 칼파인(calpain), 피카인(ficain), 클로스트리파인(clostripain), 악티니다인(actinidain), 브로멜라인(bromelain), 세파라아제(separase) 등을 포함한다. 단백질분해성 활성을 함유하는 적합한 생물학적 추출물, 균질액 및 제조물은 가래, 점액(예를 들어, 위 점액, 비 점액, 기관지 점액), 기관지폐포 세척액, 폐 균질액, 폐 추출물, 췌장 추출물, 위액, 타액, 눈물 등을 포함한다. 프로테아제는 단백질분해성 분해가 발생하기에 적합한 양으로 사용된다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 프로테아제는 약 0.01% 내지 약 5%(w/w, 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드)로 사용될 수 있다. 프로테아제가 펩티드 또는 폴리펩티드의 레퍼토리(예를 들어, 파지 디스플레이 시스템)를 포함하는 디스플레이 시스템과 조합되는 경우, 예를 들어, 프로테아제는 약 10 μg/ml 내지 약 3 mg/ml, 약 10 μg/ml, 약 20 μg/ml, 약 30 μg/ml, 약 40 μg/ml, 약 50 μg/ml, 약 60 μg/ml, 약 70 μg/ml, 약 80 μg/ml, 약 90 μg/ml, 약 100 μg/ml, 약 200 μg/ml, 약 300 μg/ml, 약 400 μg/ml, 약 500 μg/ml, 약 600 μg/ml, 약 700 μg/ml, 약 800 μg/ml, 약 900 μg/ml, 약 1000 μg/ml, 약 1.5 mg/ml, 약 2 mg/ml, 약 2.5 mg/ml 또는 약 3 mg/ml의 농도로 사용될 수 있다.
프로테아제는 프로테아제의 활성에 적합한 온도에서 펩티드 또는 폴리펩티드의 집합물(라이브러리 또는 레퍼토리)와 인큐베이션된다. 예를 들어, 프로테아제, 및 펩티드 또는 폴리펩티드의 집합물은 약 20℃ 내지 약 40℃(예를 들어, 실온, 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃, 약 30℃, 약 31℃, 약 32℃, 약 33℃, 약 34℃, 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃, 약 40℃)의 온도에서 인큐베이션될 수 있다. 프로테아제, 및 펩티드 또는 폴리펩티드의 집합물은 단백질분해성 분해가 발생하기에 충분한 기간 동안 함께 인큐베이션된다. 예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드의 집합물은 약 30분 내지 약 24시간 또는 약 48시간 동안 프로테아제와 함께 인큐베이션될 수 있다. 몇몇 예에서, 펩티드 또는 폴리펩티드의 집합물은 밤새, 또는 약 30 분, 약 1 시간, 약 1.5 시간, 약 2 시간, 약 3 시간, 약 4 시간, 약 5 시간, 약 6 시간, 약 7 시간, 약 8 시간, 약 9 시간, 약 10 시간, 약 11 시간, 약 12 시간, 약 13 시간, 약 14 시간, 약 15 시간, 약 16 시간, 약 17 시간, 약 18 시간, 약 19 시간, 약 20 시간, 약 21 시간, 약 22 시간, 약 23 시간, 약 24 시간, 약 48 시간 또는 이 이상 동안 함께 인큐베이션된다.
적어도 초기 선택 라운드(예를 들어, 디스플레이 시스템이 사용되는 경우)에서, 프로테아제가 프로테아제와의 인큐베이션을 포함하지 않는 선택에 비해 선택되는 요망되는 생물학적 활성을 갖는 클론의 수를 적어도 10배까지의 범위(order of magnitude)로 감소시키는 것이 일반적으로 바람직하다. 특정 예에서, 상기 방법에 사용되는 프로테아제 및 조건은 회수되는 클론의 수를 적어도 약 1 log(10배), 적어도 약 2 log(100배), 적어도 약 3 log(1000배) 또는 적어도 약 4 log(10,000배)로 감소시키기에 충분하다. 회수된 클론에서 요망되는 감소를 발생시키는 프로테아제 및 인큐베이션 조건의 적합한 양은 통상적인 방법 및/또는 본원에 제공된 지침을 이용하여 용이하게 결정될 수 있다.
프로테아제, 및 펩티드 또는 폴리펩티드의 집합물은 임의의 적합한 방법(예를 들어, 시험관내, 생체내 또는 생체외)을 이용하여 조합되고 인큐베이션될 수 있다. 예를 들어, 프로테아제, 및 펩티드 또는 폴리펩티드의 집합물은 적합한 용기에서 조합될 수 있고, 프로테아제 활성에 적합한 온도에서 정지, 록킹(rocking), 진탕, 스월링(swirling) 등과 같은 상태로 유지될 수 있다. 요망시, 프로테아제, 및 펩티드 또는 폴리펩티드의 집합물은, 예를 들어, 폴리펩티드의 집합물(예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리 또는 레퍼토리)을 적합한 동물(예를 들어, 마우스)에 도입시키고, 프로테아제 활성이 발생되기에 충분한 시간 후, 펩티드 또는 폴리펩티드의 집합물을 회수함으로써 생체내 또는 생체외 시스템에서 조합될 수 있다. 또 다른 예에서, 기관 또는 조직이 폴리펩티드의 집합물(예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리 또는 레퍼토리)로 관류되고, 프로테아제 활성이 발생되기에 충분한 시간 후, 폴리펩티드의 집합물이 회수된다.
인큐베이션 후, 프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드가 요망되는 생물학적 활성, 예를 들어, 결합 활성에 기초하여 선택될 수 있다. 요망시, 선택 전에 프로테아제 억제제가 첨가될 수 있다. 선택 방법을 실질적으로 방해하지 않는 임의의 적합한 억제제(또는 2개 이상의 프로테아제 억제제의 조합물)가 사용될 수 있다. 적합한 프로테아제 억제제의 예는 α1-항-트립신, α2-마크로글로불린, 아마스타틴, 안티파인, 항트롬빈 Ⅲ, 아프로티닌, 4-(2-아미노에틸) 벤젠술포닐 플루오라이드 히드로클로라이드(AEBSF), (4-아미디노-페닐)-메탄-술포닐 플루오라이드(APMSF), 베스타틴, 벤즈아미딘, 키모스타틴, 3,4-디클로로이소쿠마린, 디이소프로필 플루오로포스페이트(DIFP), E-64, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 엘라스타티날(elastatinal), 류펩틴, N-에틸말레이미드, 페닐메틸술포닐플루오라이드(PMSF), 펩스타틴, 1,10-페난트롤린, 포스포라미돈(phosphoramidon), 세린 프로테아제 억제제, N-토실-L-리신-클로로메틸 케톤(TLCK), Na-토실-Phe-클로로메틸케톤(TPCK) 등을 포함한다. 또한, 프로테아제의 여러 부류의 억제제를 함유하는 많은 제조물이 시판된다(예를 들어, 키모트립신, 써몰리신, 파파인, 프로나아제, 췌장 추출물 및 트립신을 억제하는 로슈 컴플릿 프로테아제 인히비터 칵테일 태블릿(Roche Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets™)(Roche Diagnostics Corporation; Indianapolis, IN, USA)).
펩티드 및 폴리펩티드가 요망되는 생물학적 활성을 갖지 않는 펩티드 및 폴리펩티드와 구별되거나 이에 비하여 선택되는 요망되는 생물학적 활성을 갖도록 하는 것을 허용하는, 요망되는 생물학적 활성 선택 방법을 이용하여 프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드가 선택될 수 있다. 일반적으로, 프로테아제에 의해 분해되거나 절단된 펩티드 또는 폴리펩티드는 이의 생물학적 활성이 떨어지는데 반해, 프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드는 기능적인 채로 유지된다. 따라서, 생물학적 활성에 적합한 검정이 프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드를 선택하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 공통의 결합 기능(예를 들어, 일반 리간드 결합, 특정 리간드 결합, 또는 기질 결합)이 적합한 결합 검정(예를 들어, ELISA, 패닝(panning))을 이용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 표적 리간드 또는 제너릭 리간드, 예를 들어, 단백질 A, 단백질 L 또는 항체에 결합할 수 있는 폴리펩티드가 패닝에 의해, 또는 적합한 친화성 매트릭스를 이용하여 선택되고/되거나, 분리되고/되거나, 회수될 수 있다. 패닝은 리간드(예를 들어, 제너릭 리간드, 표적 리간드)의 용액을 적합한 용기(예를 들어, 튜브, 페트리 접시)에 첨가하고, 상기 리간드가 용기의 벽에 부착되거나 코팅되도록 함으로써 달성될 수 있다. 과량의 리간드는 세척되고, 폴리펩티드(예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리)가 용기에 첨가되고, 폴리펩티드가 고정된 리간드에 결합하기에 적합한 조건하에서 용기가 유지된다. 결합되지 않은 폴리펩티드는 세척되고, 결합된 폴리펩티드는 임의의 적합한 방법, 예를 들어 스크래핑(scraping) 또는, 예를 들어, pH 저하를 이용하여 회수될 수 있다.
파지 디스플레이 시스템이 사용되는 경우, 결합은 파지 ELISA에서 시험될 수 있다. 파지 ELISA는 임의의 적합한 절차에 따라 수행될 수 있다. 일 구체예에서, 각각의 라운드의 선택에서 생성된 파지의 집단은 프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드를 디스플레이하는 파지를 확인하기 위해, 선택 표적 리간드 또는 제너릭 리간드에 대한 ELISA에 의한 결합에 대해 스크리닝될 수 있다. 요망시, 가용성 펩티드 및 폴리펩티드가, 예를 들어, C- 또는 N-말단 태그(tag)에 대한 시약을 이용하는, 예를 들어, ELISA에 의해 표적 리간드 또는 제너릭 리간드에 대한 결합에 대해 시험될 수 있다(예를 들어, 문헌[Winter et al. (1994) Ann . Rev . Immunology 12, 433-55] 및 이에 인용된 참고문헌 참조). 선택된 파지의 다양성은 또한 PCR 생성물의 겔 전기영동(Marks et al . 1991, supra; Nissim et al . 1994 supra), 프로빙(probing)(Tomlinson et al ., 1992, J. Mol . Biol . 227, 776) 또는 벡터 DNA의 서열분석에 의해 평가될 수 있다.
TNFR1에 대한 특이성에 더하여, 항-TNFR1 프로테아제 내성 폴리펩티드(예를 들어, 단일 항체 가변 도메인)를 포함하는 길항제 또는 폴리펩티드(예를 들어, 이중 특이적 리간드)는 제너릭 리간드 또는 임의의 요망되는 표적 리간드, 예를 들어, 인간 또는 동물 단백질, 예를 들어, 사이토카인, 성장 인자, 사이토카인 수용체, 성장 인자 수용체, 효소(예를 들어, 프로테아제), 효소에 대한 보조인자, DNA 결합 단백질, 지질 및 탄수화물에 대해 결합 특이성을 가질 수 있다.
몇몇 구체예에서, 프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드(예를 들어, dAb) 또는 길항제는 폐 조직 내의 TNFR1에 결합한다. 몇몇 구체예에서, 길항제 또는 폴리펩티드는 또한 폐 조직 내의 추가 표적에 결합한다.
본원에 기재된 방법에서 디스플레이 시스템(예를 들어, 핵산의 코딩 기능과 핵산에 의해 엔코딩된 펩티드 또는 폴리펩티드의 기능적 특성을 연결짓는 디스플레이 시스템)이 사용되는 경우, 이는 선택 펩티드 또는 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산의 카피수를 증폭시키거나 증가시키는데 종종 유리할 수 있다. 이는 본원에 기재된 방법 또는 다른 적합한 방법을 이용하여 추가 라운드의 선택을 위하거나, 추가 레퍼토리(예를 들어, 친화성 성숙 레퍼토리)를 제조하기에 충분한 양의 핵산 및/또는 펩티드 또는 폴리펩티드를 수득하는 효과적인 방식을 제공한다. 따라서, 몇몇 구체예에서, 상기 방법은 디스플레이 시스템(예를 들어, 핵산의 코딩 기능과 핵산에 의해 엔코딩된 펩티드 또는 폴리펩티드의 기능적 특성을 연결짓는 디스플레이 시스템, 예를 들어, 파지 디스플레이)을 이용하는 것을 포함하고, 선택 펩티드 또는 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산의 카피수를 증폭시키거나 증가시키는 것을 추가로 포함한다. 핵산은 임의의 적합한 방법, 예를 들어, 파지 증폭, 세포 성장 또는 중합효소 연쇄 반응을 이용하여 증폭될 수 있다.
본원에 기재된 방법은 프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드, 예를 들어, dAb를 분리시키기 위한 프로그램의 일부로 사용될 수 있고, 이는 요망시 다른 적합한 선택 방법을 포함할 수 있다. 이러한 상황에서, 본원에 기재된 방법은 프로그램의 임의의 요망되는 시점에 이용될 수 있고, 예를 들어, 다른 선택 방법 전 또는 후에 이용된다. 본원에 기재된 방법은 또한 본원에 기재되고 예시된 2개 이상의 라운드의 선택을 제공하기 위해 사용될 수 있다.
일례에서, 상기 방법은 펩티드 또는 폴리펩티드의 라이브러리 또는 레퍼토리를 제공하는 단계, 엘라스타아제에 의한 단백질분해성 분해에 적합한 조건하에서 상기 라이브러리 또는 레퍼토리와 엘라스타아제(또는 엘라스타아제를 포함하는 생물학적 제조물, 추출물 또는 균질액)를 조합시키는 단계, 및 엘라스타아제에 의한 분해에 내성이고 TNFR1 결합 활성을 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드를 선택하고/하거나, 분리하고/하거나, 회수하는 단계를 포함하는, 엘라스타아제에 의한 분해에 내성인 펩티드 또는 폴리펩티드, 예를 들어, dAb를 선택하기 위한 방법이다.
특정 구체예에서, 엘라스타아제에 의한 분해에 내성이고 TNFR1에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인(dAb)을 선택하는 방법이 제공된다. 이러한 구체예에서, dAb를 포함하는 라이브러리 또는 레퍼토리가 제공되고, 엘라스타아제에 의한 단백질분해성 분해에 적합한 조건하에서 엘라스타아제(또는 엘라스타아제를 포함하는 생물학적 제조물, 추출물 또는 균질액)과 조합된다. TNFR1에 특이적으로 결합하는 엘라스타아제 내성 dAb가 선택된다. 예를 들어, 엘라스타아제 내성 dAb는 약 2시간 이상의 기간 동안 0.04%(w/w) 엘라스타아제 용액 중에서 37℃에서 인큐베이션되는 경우 실질적으로 분해되지 않는다. 일 구체예에서, 엘라스타아제 내성 dAb는 약 12시간 이상의 기간 동안 0.04%(w/w) 엘라스타아제 용액 중에서 37℃에서 인큐베이션되는 경우 실질적으로 분해되지 않는다. 일 구체예에서, 엘라스타아제 내성 dAb는 약 24시간 이상, 약 36시간 이상, 또는 약 48시간 이상의 기간 동안 0.04%(w/w) 엘라스타아제 용액 중에서 37℃에서 인큐베이션되는 경우 실질적으로 분해되지 않는다.
일 구체예에서, 엘라스타아제에 의한 분해에 내성이고 TNFR1에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인(dAb)을 선택하는 방법에 제공된다. 상기 방법은 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 레퍼토리를 포함하는 파지 디스플레이 시스템을 제겅하는 단계, 파지 디스플레이 시스템과 엘라스타아제(100 μg/ml)을 조합시키는 단계, 및 혼합물을, 예를 들어, 밤새(예를 들어, 약 12-16시간) 동안 약 37℃에서 인큐베이션시키는 단계, 및 이후 TNFR1에 특이적으로 결합하는 dAb를 디스플레이하는 파지를 선택하는 단계를 포함한다.
일례에서, 펩티드 또는 폴리펩티드의 라이브러리 또는 레퍼토리를 제공하는 단계, 류코자임에 의한 단백질분해성 분해에 적합한 조건하에서 상기 라이브러리 또는 레퍼토리와 류코자임(또는 류코자임을 포함하는 생물학적 제조물, 추출물 또는 균질액)를 조합시키는 단계, 및 류코자임에 의한 분해에 내성이고 특이적 TNFR1 결합 활성을 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드를 선택하고/하거나, 분리시키고/시키거나, 회수하는 단계를 포함하는, 류코자임에 의한 분해에 내성인 펩티드 또는 폴리펩티드(예를 들어, dAb)를 선택하는 방법이 제공된다.
특정 구체예에서, 류코자임에 의한 분해에 내성이고 TNFR1에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인(dAb)을 선택하기 위한 방법이 제공된다. 이러한 구체예에서, dAb를 포함하는 라이브러리 또는 레퍼토리가 제공되고, 이는 류코자임에 의한 단백질분해성 분해에 적합한 조건하에서 류코자임(또는 류코자임을 포함하는 생물학적 제조물, 추출물 또는 균질액)와 조합된다. TNFR1에 특이적으로 결합하는 류코자임 내성 dAb가 선택된다. 예를 들어, 류코자임 내성 dAb는 적어도 약 2시간의 기간 동안 0.04%(w/w) 류코자임 용액 중에서 37℃에서 인큐베이션되는 경우에 실질적으로 분해되지 않는다. 일 구체예에서, 류코자임 내성 dAb는 적어도 약 12시간의 기간 동안 0.04%(w/w) 류코자임 용액 중에서 37℃에서 인큐베이션되는 경우에 실질적으로 분해되지 않는다. 일 구체예에서, 류코자임 내성 dAb는 적어도 약 24시간, 적어도 약 36시간, 또는 적어도 약 48시간의 기간 동안 0.04%(w/w) 류코자임 용액 중에서 37℃에서 인큐베이션되는 경우에 실질적으로 분해되지 않는다.
일 구체예에서, 류코자임에 의한 분해에 내성이고 TNFR1에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인(dAb)을 선택하기 위한 방법이 제공된다. 상기 방법은 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 레퍼토리를 포함하는 파지 디스플레이 시스템을 제공하는 단계, 상기 파지 디스플레이 시스템과 류코자임(약 100 μg/ml)을 조합시키는 단계, 및, 예를 들어, 밤새(예를 들어, 약 12-16시간) 동안 약 37℃에서 상기 혼합물을 인큐베이션시키는 단계, 및 이후에 TNFR1에 특이적으로 결합하는 dAb를 디스플레이하는 파지를 선택하는 단계를 포함한다.
또 다른 예에서, 펩티드 또는 폴리펩티드의 라이브러리 또는 레퍼토리를 제공하는 단계, 트립신에 의한 단백질분해성 분해에 적합한 조건하에서 상기 라이브러리 또는 레퍼토리와 트립신을 조합시키는 단계, 및 트립신에 의한 분해에 내성이고 TNFR1에 특이적으로 결합하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 선택하고/하거나, 분리하고/하거나, 회수하는 단계를 포함하는, 트립신에 의한 분해에 내성인 펩티드 또는 폴리펩티드(예를 들어, dAb)를 선택하기 위한 방법이 제공된다.
특정 구체예에서, 트립신에 의한 분해에 내성이고 TNFR1에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인(dAb)을 선택하기 위한 방법이 제공된다. 이러한 구체예에서, dAb를 포함하는 라이브러리 또는 레퍼토리가 제공되고, 이는 트립신에 의한 단백질분해성 분해에 적합한 조건하에서 트립신(또는 트립신을 포함하는 생물학적 제조물, 추출물 또는 균질액)과 조합된다. TNFR1에 결합하는 트립신 내성 dAb가 선택된다. 예를 들어, 트립신 내성 dAb는 적어도 약 2시간의 기간 동안 0.04%(w/w) 트립신 용액 중에서 37℃에서 인큐베이션되는 경우에 실질적으로 분해되지 않는다. 일 구체예에서, 트립신 내성 dAb는 적어도 약 3시간의 기간 동안 0.04%(w/w) 트립신 용액 중에서 37℃에서 인큐베이션되는 경우에 실질적으로 분해되지 않는다. 일 구체예에서, 트립신 내성 dAb는 적어도 약 4시간, 적어도 약 5시간, 적어도 약 6시간, 적어도 약 7시간, 적어도 약 8시간, 적어도 약 9시간, 적어도 약 10시간, 적어도 약 11시간, 또는 적어도 약 12시간의 기간 동안 0.04%(w/w) 트립신 용액 중에서 37℃에서 인큐베이션되는 경우에 실질적으로 분해되지 않는다.
일 예시적 구체예에서, 트립신에 의한 분해에 내성이고 TNFR1에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인(dAb)을 선택하기 위한 방법이 제공된다. 상기 방법은 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 레퍼토리를 포함하는 파지 디스플레이 시스템을 제공하는 단계, 상기 파지 디스플레이 시스템과 트립신(약 100 μg/ml)을 조합시키는 단계, 및, 예를 들어, 밤새(예를 들어, 약 12-16시간) 동안 약 37℃에서 상기 혼합물을 인큐베이션시키는 단계, 및 이후에 TNFR1에 특이적으로 결합하는 dAb를 디스플레이하는 파지를 선택하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드(예를 들어, dAbs)의 레퍼토리를 생성하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 펩티드 또는 폴리펩티드의 레퍼토리를 제공하는 단계; 프로테아제 활성에 적합한 조건하에서 펩티드 또는 폴리펩티드의 레퍼토리 및 프로테아제를 조합시키는 단계; 및 TNFR1에 특이적으로 결합하는 다수의 펩티드 또는 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함함으로써, 프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드의 레퍼토리가 생성된다. 상기 방법에서의 사용에 적합한 프로테아제, 디스플레이 시스템, 프로테아제 활성을 위한 조건, 및 펩티드 또는 폴리펩티드를 선택하기 위한 방법이 다른 방법과 관련하여 본원에 기재된다.
몇몇 구체예에서, 펩티드 또는 폴리펩티드의 레퍼토리를 포함하는 디스플레이 시스템(예를 들어, 핵산의 코딩 기능과 핵산에 의해 엔코딩된 펩티드 또는 폴리펩티드의 기능적 특성을 연결짓는 디스플레이 시스템)이 사용되고, 상기 방법은 다수의 선택 펩티드 또는 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산의 카피수를 증폭시키거나 증가시키는 단계를 추가로 포함한다. 핵산은 임의의 적합한 방법, 예를 들어, 파지 증폭, 세포 성장 또는 중합효소 연쇄 반응에 의해 증폭될 수 있다.
특정 구체예에서, 항-TNFR1 dAb를 포함하는 프로테아제 내성 폴리펩티드의 레퍼토리를 생성시키는 방법이 제공된다. 상기 방법은 dAb를 포함하는 폴리펩티드의 레퍼토리를 제공하는 단계; 프로테아제 활성에 적합한 조건하에서 펩티드 또는 폴리펩티드의 레퍼토리 및 프로테아제(예를 들어, 트립신, 엘라스타아제, 류코자임)를 조합시키는 단계; 및 TNFR1에 대한 결합 특이성을 갖는 dAb를 포함하는 다수의 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 천연 레퍼토리, 또는 요망되는 결합 특이성에 대해 편향된 레퍼토리, 예를 들어, TNFR1에 대해 결합 특이성을 갖는 모 dAb에 기초한 친화성 돌연변이 레퍼토리를 생성시키는데 사용될 수 있다.
폴리펩티드 디스플레이 시스템
일 구체예에서, 본원에 기재된 방법에 사용하기 위해 제공된 펩티드 또는 폴리펩티드의 레퍼토리 또는 라이브러리는 적합한 디스플레이 시스템을 포함한다. 디스플레이 시스템은 프로테아제(예를 들어, 단일 프로테아제 또는 프로테아제의 조합물)에 의한 분해에 내성일 수 있다. 단백질분해성 활성을 함유하는 임의의 생물학적 추출물, 균질액 또는 제조물(예를 들어, 가래, 점액(예를 들어, 위 점액, 비 점액, 기관지 점액), 기관지폐포 세척액, 폐 균질액, 폐 추출물, 췌장 추출물, 위액, 타액, 눈물 등을 포함함). 디스플레이 시스템 및 디스플레이 시스템과 디스플레이된 폴리펩티드 사이의 연관은 일 구체예에서 적어도 레퍼토리의 가장 안정적인 펩티드 또는 폴리펩티드만큼 프로테아제에 대해 내성이다. 이는 디스플레이된 선택 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산이 용이하게 분리되고/되거나 증폭되는 것을 가능케 한다.
일례에서, 프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드, 예를 들어, dAb는 용액 중에 존재하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 레퍼토리로부터 선택되고/되거나, 분리되고/되거나, 회수될 수 있거나, 이는 적합한 표면, 예를 들어, 플라스틱 또는 유리(예를 들어, 미세역가 플레이트, 폴리펩티드 어레이, 예를 들어, 마이크로어레이)에 공유 또는 비공유적으로 부착된다. 예를 들어, 어레이 내의 별개의 소정의 위치에 각각의 별개의 라이브러리 일원(예를 들어, 독특한 펩티드 서열)이 배치되는 방식의 표면 상의 펩티드의 어레이가 사용될 수 있다. 이러한 어레이 내의 각각의 라이브러리 일원의 확인은 이의 어레이 내의 공간적 위치에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 표적 리간드와 반응성 라이브러리 일원 사이에 결합 상호작용이 발생하는 어레이 내의 위치가 결정됨으로써, 공간적 위치를 기초로 하여 반응성 일원의 서열이 확인될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 제 5,143,854호, WO 90/15070호 및 WO 92/10092호 참조).
일례에서, 상기 방법은 핵산의 코딩 기능과 이러한 핵산에 의해 엔코딩되는 폴리펩티드의 물리적, 화학적 및/또는 기능적 특성을 연결짓는 디스플레이 시스템을 이용한다. 이러한 디스플레이 시스템은 다수의 복제가능한 유전적 패키지, 예를 들어, 박테리오파지 또는 세포(세균)을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 디스플레이 시스템은 라이브러리, 예를 들어, 박테리오파지 디스플레이 라이브러리를 포함한다.
다양한 적합한 박테리오파지 디스플레이 시스템(예를 들어, 1가 디스플레이 및 다가 디스플레이 시스템)이 기재되어 있다(예를 들어, Griffiths et al ., 미국 특허 번호 제 6,555,313 B1호(참조로서 본원에 포함됨); Johnson et al ., 미국 특허 번호 제 5,733,743호(참조로서 본원에 포함됨); McCafferty et al ., 미국 특허 번호 제 5,969,108호(참조로서 본원에 포함됨); Mulligan-Kehoe, 미국 특허 번호 제 5,702,892호(참조로서 본원에 포함됨); Winter, G. et al ., Annu . Rev . Immunol. 12:433-455 (1994); Soumillion, P. et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 47(2-3):175-189 (1994); Castagnoli, L. et al ., Comb . Chem . High Throughput Screen, 4(2):121-133 (2001) 참조). 박테리오파지 디스플레이 시스템에서 디스플레이된 펩티드 또는 폴리펩티드는 임의의 적합한 박테리오파지, 예를 들어, 섬유상 파지(예를 들어, fd, M13, F1), 용균성 파지(예를 들어, T4, T7, 람다) 또는 RNA 파지(예를 들어, MS2) 상에 디스플레이될 수 있다.
일반적으로, 적합한 파지 코트 단백질(예를 들어, fd pⅢ 단백질)을 갖는 융합 단백질로서의 펩티드 또는 파지 폴리펩티드의 레퍼토리를 디스플레이하는 파지의 라이브러리가 생성되거나 제공된다. 융합 단백질은 파지 코트 단백질의 첨단, 또는 요망시 내부 위치에 펩티드 또는 폴리펩티드를 디스플레이할 수 있다. 예를 들어, 디스플레이된 펩티드 또는 폴리펩티드는 pⅢ의 도메인 1(pⅢ의 도메인 1은 N1으로도 언급됨)에 대해 아미노 말단인 위치에 제공될 수 있다. 디스플레이된 폴리펩티드는 pⅢ(예를 들어, pⅢ의 도메인 1의 N-말단)에 직접 융합될 수 있거나, 링커를 이용하여 pⅢ에 융합될 수 있다. 요망시, 융합체는 태그(tag)(예를 들어, myc 에피토프, His 태그)를 추가로 포함할 수 있다. 파지 코트 단백질을 갖는 융합 단백질로 디스플레이되는 펩티드 또는 폴리펩티드의 레퍼토리를 포함하는 라이브러리가 임의의 적합한 방법, 예를 들어, 디스플레이된 펩티드 또는 폴리펩티드를 엔코딩하는 파지 벡터 또는 파지미드 벡터의 라이브러리를 적합한 숙주 세균에 도입시키는 단계, 및 생성된 세균을 배양하여 파지를 생성시키는 단계(예를 들어, 요망시 적합한 헬퍼 파지 또는 보충 플라스미드를 이용함)를 포함하는 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 파지의 라이브러리가 임의의 적합한 방법, 예를 들어, 침전 및 원심분리를 이용하는 배양으로부터 회수될 수 있다.
디스플레이 시스템은 임의의 요망되는 양의 다양성을 함유하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 레퍼토리를 포함할 수 있다. 예를 들어, 레퍼토리는 유기체, 유기체의 그룹(예를 들어, 카멜리드로부터 분리된 VHH dAb의 서열의 레퍼토리), 요망되는 조직 또는 요망되는 세포 유형에 의해 발현된 천연 발생 폴리펩티드에 해당하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드를 함유할 수 있거나, 무작위 또는 무작위화 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 요망시, 폴리펩티드는 공통의 코어 또는 스캐폴드(scaffold)를 공유할 수 있다. 이러한 레퍼토리 또는 라이브러리 내의 폴리펩티드는 무작위 또는 무작위화 아미노산 서열의 규정된 영역 및 공통의 아미노산 서열의 영역을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 레퍼토리 내의 모든 또는 실질적으로 모든 폴리펩티드는 요망되는 유형, 예를 들어, 요망되는 효소(예를 들어, 중합효소) 또는 요망되는 항체의 항원 결합 단편(예를 들어, 인간 VH 또는 인간 VL)이다. 구체예에서, 폴리펩티드 디스플레이 시스템은 각각의 폴리펩티드가 항체 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 레퍼토리를 포함한다. 예를 들어, 레퍼토리 내의 각각의 폴리펩티드는 VH, VL 또는 Fv(예를 들어, 단일 사슬 Fv)를 함유할 수 있다.
아미노산 서열 다양성이 임의의 적합한 방법을 이용하여 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 스캐폴드의 임의의 요망되는 영역에 도입될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열 다양성은 임의의 적합한 돌연변이유발 방법(예를 들어, 저충실도(low fidelity) PCR, 올리고누클레오티드-매개 또는 부위 특이적 돌연변이유발, NNK 코돈을 이용한 다양화) 또는 임의의 다른 적합한 방법을 이용하여 다양화된 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산의 라이브러리를 제조함으로써 표적 영역, 예를 들어, 항체 가변 도메인 또는 소수성 도메인의 상보성 결정 영역에 도입될 수 있다. 요망시, 다양화되는 폴리펩티드의 영역이 무작위화될 수 있다.
레퍼토리를 구성하는 폴리펩티드의 크기는 대부분 선택의 문제이며, 균일한 폴리펩티드 크기가 필요하지는 않다. 일 구체예에서, 레퍼토리 내의 폴리펩티드는 적어도 3차 구조(하나 이상의 도메인을 형성함)를 갖는다.
선택/분리/회수
프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드(예를 들어, 프로테아제 내성 폴리펩티드의 집단)는 임의의 적합한 방법을 이용하여 레퍼토리 또는 라이브러리(예를 들어, 디스플레이 시스템)로부터 선택되고/되거나, 분리되고/되거나, 회수될 수 있다. 일 구체예에서, 프로테아제 내성 폴리펩티드는 선택가능한 특성(예를 들어, 물리적 특성, 화학적 특성, 기능적 특성)에 기초하여 선택되거나 분리된다. 적합한 선택가능한 기능적 특성은 레퍼토리 내의 펩티드 또는 폴리펩티드의 생물학적 활성, 예를 들어, 제너릭 리간드(예를 들어, 초항원)에 대한 결합, 표적 리간드(예를 들어, 항원, 에피토프, 기질)에 대한 결합, 항체에 대한 결합(예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드 상에서 발현된 에피토프를 통함), 및 촉매 활성을 포함한다(예를 들어, Tomlinson et al ., WO 99/20749; WO 01/57065; WO 99/58655 참조). 일 구체예에서, 선택은 TNFR1에 대한 특정 결합을 기초로 한다. 또 다른 구체예에서, 선택은 일원이 프로테아제 내성인 제 2의 레퍼토리를 생성하는 선택된 기능적 특성, 및 이후 TNFR1에 특이적으로 결합하는 제 2의 레퍼토리로부터의 일원의 선택을 기초로 한다.
몇몇 구체예에서, 프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드는 실질적으로 모든 프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드가 공통의 선택가능한 특징을 공유하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 라이브러리 또는 레퍼토리로부터 선택되고/되거나 분리된다. 예를 들어, 프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드는 실질적으로 모든 프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드가 공통의 제너릭 리간드에 결합하거나, 공통의 표적 리간드에 결합하거나, 공통의 항체에 결합(또는 이에 의해 결합됨)하거나, 공통의 촉매 활성을 갖는 라이브러리 또는 레퍼토리로부터 선택될 수 있다. 이러한 유형의 선택은, 예를 들어, 면역글로불린 단일 가변 도메인의 친화성 성숙을 수행하는 경우에 요망되는 생물학적 활성을 갖는 모 펩티드 또는 폴리펩티드를 기초로 하는 프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드의 레퍼토리를 제조하는데 특히 유용하다.
공통의 제너릭(generic) 리간드로의 결합에 기초한 선택은 원래 라이브러리 또는 레퍼토리의 성분들인 프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드를 모두 또는 실질적으로 모두 함유하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 집합물 또는 집단을 생성할 수 있다. 예를 들어, 단백질 A, 단백질 L 또는 항체와 같은 표적 리간드 또는 제너릭 리간드에 결합되는 펩티드 또는 폴리펩티드를 선택, 분리 및/또는 패닝(panning)에 의해서나 적합한 친화성 매트릭스를 이용하여 회수할 수 있다. 패닝은 리간드의 용액 (예컨대, 제너릭 리간드, 표적 리간드)을 적합한 용기 (예컨대, 튜브, 페트리 디시)에 첨가하고 리간드가 용기의 벽에 침착되거나 코팅되게 함에 의해 수행될 수 있다. 과량의 리간드를 세척제거할 수 있고 펩티드 또는 폴리펩티드 (예컨대 프로테아제와 인큐베이션된 레퍼토리)를 용기에 첨가하고 펩티드 또는 폴리펩티드가 고정된 리간드에 결합하기에 적합한 조건하에 용기를 유지할 수 있다. 결합되지 않은 펩티드 또는 폴리펩티드를 세척제거할 수 있고 결합된 펩티드 또는 폴리펩티드를, 예를 들어 스크레이핑(scraping)이나 pH를 낮추는 것과 같은 임의의 적합한 방법을 이용하여 회수할 수 있다.
적합한 리간드 친화성 매트릭스는 일반적으로 리간드가 공유적으로 또는 비공유적으로 부착된 고체 지지체 또는 비드 (예컨대, 아가로오스)를 함유한다. 친화성 매트릭스를 배치 공정, 컬럼 공정 또는 임의의 적합한 공정을 이용하여 펩티드나 폴리펩티드가 매트릭스 상에서 리간드에 결합하기에 적합한 조건하에 펩티드 또는 폴리펩티드 (예컨대, 프로테아제와 인큐베이션된 레퍼토리)와 조합시킬 수 있다. 친화성 매트릭스에 결합되지 않은 펩티드 또는 폴리펩티드를 세척제거할 수 있고, 결합된 펩티드 또는 폴리펩티드를 용리시키고 임의의 적합한 방법, 예컨대 낮은 pH 완충제, 보통의 변성제 (예컨대, 우레아), 또는 결합에 대해 리간드와 경쟁하는 펩티드를 이용한 용리를 이용하여 회수할 수 있다. 일례에서, 비오티닐화된 표적 리간드를 레퍼토리의 펩티드 또는 폴리펩티드가 표적 리간드(TNFR1)에 결합하기에 적합한 조건하에 레퍼토리와 조합시킨다. 결합된 펩티드 또는 폴리펩티드를 고정된 아비딘 또는 스트렙타비딘 (예컨대, 비드 상에서)을 이용하여 회수한다.
일부 구체예에서, 제너릭 리간드는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 라이브러리 또는 레퍼토리의 펩티드 또는 폴리펩티드에서 실질적으로 보존된 펩티드 또는 폴리펩티드의 구조적 특징부에 결합되는 항체 또는 항원 결합 단편이 제너릭 리간드로서 특히 유용하다. 프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드를 분리, 선택 및/또는 회수하기 위한 리간드로서 사용하기 적합한 항체 및 항원 결합 단편은 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있고 임의의 적합한 방법을 이용하여 제조될 수 있다.
라이브러리/레퍼토리
다른 양태에서, 프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드의 레퍼토리, 프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드를 엔코딩하는 라이브러리 및 이러한 라이브러리와 레퍼토리를 생성하기 위한 방법이 제공된다.
프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드를 엔코딩하고/거나 함유하는 라이브러리는 임의의 적합한 방법을 이용하여 제조되거나 수득될 수 있다. 라이브러리는 관심있는 펩티드 또는 폴리펩티드 (예컨대, 라이브러리로부터 선택된 항-TNFR1 펩티드 또는 폴리펩티드)에 기초하여 프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드를 엔코딩하도록 설계될 수 있거나, 본원에 개시된 방법을 이용하여 또 다른 라이브러리로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 적합한 폴리펩티드 디스플레이 시스템을 이용하여 프로테아제 내성 폴리펩티드가 부화된 라이브러리를 제조할 수 있다.
일례에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인 (예컨대, VH, Vκ, Vλ)을 포함하는 디스플레이된 폴리펩티드의 레퍼토리를 포함하는 파지 디스플레이 라이브러리를 본원에 개시된 대로 프로테아제 활성에 적합한 조건하에 프로테아제와 조합시킨다. 프로테아제 내성 폴리펩티드를 결합 활성 (예컨대, 제너릭 리간드와 결합, 표적 리간드와 결합)과 같은 요망되는 생물학적 활성에 기초하여 회수함으로써 프로테아제 내성 폴리펩티드가 부화된 파지 디스플레이 라이브러리를 생성한다. 일 구체예에서, 회수는 부화된 라이브러리를 생성하는 제너릭 리간드와의 결합에 이어서 TNFR1에 대한 특이적 결합에 기초하여 그 라이브러리의 항-TNFR1 구성원을 선택하는 것에 기초한다.
또 다른 예에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인 (예컨대, VH, Vκ, Vλ)을 포함하는 디스플레이된 폴리펩티드의 레퍼토리를 포함하는 파지 디스플레이 라이브러리를 우선 요망되는 표적 항원(TNFR1)에 대해 결합 특이성을 지니는 레퍼토리의 구성원을 동정하기 위해 스크리닝한다. 요망되는 결합 특이성을 지니는 폴리펩티드의 집합물을 회수하고 이 집합물을 본원에 개시된 대로 단백질분해 활성에 적합한 조건하에 프로테아제와 조합시킨다. 요망되는 표적 결합 특이성을 지니는 프로테아제 내성 폴리펩티드의 집합물을 회수하여, 프로테아제 내성 및 고 친화성 폴리펩티드가 부화된 라이브러리를 생성한다. 본원에 개시된 일 구체예에서, 선택 방법에서의 프로테아제 내성은 고 친화성 결합과 관련이 있다.
요망되는 유형의 폴리펩티드의 레퍼토리를 엔코딩하는 라이브러리를 임의의 적합한 방법을 이용하여 용이하게 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 요망되는 유형의 폴리펩티드 (예컨대, 중합효소, 면역글로불린 가변 도메인)를 엔코딩하는 핵산 서열을 수득할 수 있고, 하나 이상의 돌연변이를 각각 함유하는 핵산의 집합물을, 예를 들어 에러-프론 중합효소 연쇄 반응(PCR) 시스템을 이용하거나, 화학적 돌연변이 ((Deng et al ., J. Biol . Chem., 269:9533 (1994))에 의해서나, 세균 변이유발 균주 (Low et al ., J. Mol . Biol, 260:359 (1996))를 이용하여 핵산을 증폭시킴에 의해 제조할 수 있다.
다른 구체예에서, 핵산의 특정 영역을 다양화(diversification)를 위해 표적화할 수 있다. 선택된 위치를 돌연변이시키는 방법이 또한 당 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 PCR을 이용하거나 이용하지 않으며, 미스매칭된 올리고누클레오나 퇴화 올리고누클레오티드를 이용하는 것을 포함한다. 예를 들어, 항원 결합 루프로 돌연변이를 표적화함에 의해 합성 항체 라이브러리가 생성되었다. 랜덤 또는 반-랜덤 항체 H3 및 L3 영역이 생식세포(germline) 면역글로불린 V 유전자 세그먼트에 부가되어 돌연변이되지 않은 프레임워크 영역을 지니는 큰 라이브러리를 제공한다 (Hoogenboom and Winter (1992) supra; Nissim et al. (1994) supra; Griffiths et al. (1994) supra; DeKruif et al. (1995) supra). 이러한 다양화는 다른 항원 결합 루프의 일부 또는 전부를 포함하도록 확대되었다 (Crameri et al. (1996) Nature Med., 2:100; Riechmann et al. (1995) Bio / Technology, 13:475; Morphosys, WO 97/08320, supra). 다른 구체예에서, 핵산의 특정 영역을, 예를 들어 첫 번째 PCR의 생성물을 "메가-프라이머(mega-primer)"로서 적용시키는 2-단계 PCR 전략에 의해 다양화를 위해 표적화할 수 있다 (예컨대, Landt, O. et al ., Gene 96:125-128 (1990) 참조). 예를 들어 SOE PCR (예컨대, Horton, R.M. et al., Gene 77:61-68 (1989) 참조)에 의해 표적화된 다양화도 수립될 수 있다.
선택된 위치에서의 서열 다양성은, 많은 가능한 아미노산 (예컨대, 모두 20개 또는 이의 서브셋)이 그 위치에 혼입될 수 있도록 폴리펩티드의 서열을 지정하는 코딩 서열을 변화시킴에 의해 달성될 수 있다. IUPAC 명명법을 이용하여, 가장 다재다능한 코돈은 NNK이고, 이것은 모든 아미노산뿐 아니라 TAG 스톱 코돈을 엔코딩한다. NNK 코돈을 이용하여 요구되는 다양성을 도입시킬 수 있다. 동일한 목적을 달성하는 다른 코돈도 사용되며, 이는 추가의 스톱 코돈 TGA 및 TAA의 생성을 유도하는 NNN 코돈을 포함한다. 이러한 표적화된 접근법은 표적 범위의 충분한 서열 공간이 조사되도록 할 수 있다.
라이브러리는 공지된 주쇄 형태를 지니는 프로테아제 내성 항체 폴리펩티드를 포함할 수 있다 (예컨대, Tomlinson et al., WO 99/20749 참조).
라이브러리를 적합한 플라스미드 또는 벡터에서 제조할 수 있다. 본원에서 사용된 벡터는 이종 DNA를 이의 발현 및/또는 복제를 위해 세포에 도입하는데 사용된 분리된 엘리먼트를 언급한다. 플라스미드 (예컨대, 세균 플라스미드), 바이러스 또는 박테리오파지 벡터, 인공 염색체 및 에피솜 벡터를 포함하는 임의의 적합한 벡터를 이용할 수 있다. 이러한 벡터는 단순한 클로닝 및 돌연변이발생에 이용될 수 있거나, 발현 벡터를 이용하여 라이브러리의 발현을 유도할 수 있다. 벡터 및 플라스미드는 일반적으로 하나 이상의 클로닝 부위 (예컨대, 폴리링커), 복제 기점 및 하나 이상의 선택가능한 마커 유전자를 함유한다. 발현 벡터는 폴리펩티드의 전사 및 번역을 유도하는 엘리먼트를 추가로 함유할 수 있고, 예컨대 인핸서 엘리먼트, 프로모터, 전사 종료 신호, 신호 서열 등이다. 이러한 엘리먼트는 폴리펩티드를 엔코딩하는 클로닝된 삽입체에 작동가능하게 결합하는 방식으로 배열될 수 있어서, 이러한 발현 벡터가 발현에 적합한 조건하에 (예컨대, 적합한 숙주 세포에) 유지될 때 폴리펩티드가 발현 및 생성되게 한다.
클로닝 및 발현 벡터는 일반적으로 하나 이상의 선택된 숙주 세포에서 벡터가 복제될 수 있게 하는 핵산 서열을 함유한다. 전형적으로 클로닝 벡터에서, 이 서열은, 벡터가 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제될 수 있도록 하는 것이고 복제 기점 또는 독립적으로 복제되는 서열을 포함한다. 이러한 서열은 다양한 세균, 효모 및 바이러스에 대해 널리 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람-음성 세균에 적합하고, 2 미크론 플라스미드 기점은 효모에 적합하며, 다양한 바이러스 기점 (예컨대, SV40, 아데노바이러스)은 포유동물 세포에서의 클로닝 벡터에 적합하다. 일반적으로, 복제 기점은 COS 세포와 같이 높은 수준의 DNA를 복제할 수 있는 포유동물 세포에서 사용되는 않는 한, 포유동물 발현 벡터에 요구되지 않는다.
클로닝 및 발현 벡터는 선택가능한 마커로서도 언급되는 선택 유전자를 함유할 수 있다. 이러한 마커 유전자는 선택적인 배양 배지에서 성장하는 형질전환된 숙주 세포의 생존 또는 성장에 필수적인 단백질을 엔코딩한다. 따라서 선택 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환되지 않은 숙주 세포는 배양 배지에서 생존하지 못할 것이다. 통상적인 선택 유전자는 항생제 및 다른 독소, 예컨대 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 내성을 부여하거나, 상보적 영양요구 결핍이거나, 성장 배지에 이용될 수 없는 중요한 영양분을 공급하는 단백질을 엔코딩한다.
적합한 발현 벡터는 다수의 성분들, 예를 들어 복제 기점, 선택가능한 마커 유전자, 하나 이상의 발현 조절 엘리먼트, 예컨대 전사 조절 엘리먼트 (예컨대, 프로모터, 인핸서, 종결인자) 및/또는 하나 이상의 번역 신호, 신호 서열 또는 리더 서열 등을 함유할 수 있다. 발현 조절 엘리먼트 및 신호이나 리더 서열이 존재하는 경우, 이들은 벡터 또는 다른 공급원에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 항체 사슬을 엔코딩하는 클로닝된 핵산의 전사적 및/또는 번역적 조절 서열을 이용하여 발현을 유도할 수 있다.
프로모터는 요망되는 숙주 세포에서 발현을 위해 제공될 수 있다. 프로모터는 항시적이거나 유도적일 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 핵산의 전사를 유도하도록 항체, 항체 사슬 또는 이의 부분을 엔코딩하는 핵산에 작동가능하게 결합될 수 있다. 원핵 (예컨대, E. 콜리(E. coli)에 대한 β-락타마아제 및 락토오스 프로모터 시스템, 알칼리 포스파타아제, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, lac, tac, T3, T7 프로모터) 또는 진핵 (예컨대, 원숭이 바이러스 40 조기 또는 후기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 긴 말단 반복 프로모터, 시토메갈로바이러스 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, EG-1a 프로모터) 숙주에 적합한 다양한 프로모터가 이용가능하다.
또한, 발현 벡터는 통상적으로 벡터를 지니는 숙주 세포의 선택을 위해 선택가능한 마커를 포함하고, 복제될 수 있는 발현 벡터의 경우에, 복제 기점을 포함한다. 항생제 또는 약물 내성을 부여하는 생성물을 엔코딩하는 유전자가 일반적인 선택가능한 마커이며 원핵 (예컨대, β-락타마아제 유전자 (앰피실린 내성), 테트라사이클린 내성을 위한 Tet 유전자) 및 진핵 세포 (예컨대, 네오마이신 (G418 또는 제네티신), gpt (미코페놀산), 앰피실린, 또는 하이그로마이신 내성 유전자)에서 사용될 수 있다. 디히드로폴레이트 환원효소 마커 유전자는 다양한 숙주에서 메토트렉세이트를 이용한 선택을 허락한다. 숙주의 영양요구 마커의 유전자 생성물을 엔코딩하는 유전자 (예컨대, LEU2, URA3, HIS3)는 효모에서 선택가능한 마커로서 종종 이용된다. 바이러스 (예컨대, 바쿨로바이러스) 또는 파지 벡터, 및 레트로바이러스 벡터와 같이 숙주 세포의 유전체로 통합될 수 있는 벡터의 이용도 고려된다.
원핵 (예컨대, E. 콜리(E. coli)과 같은 세균 세포) 또는 포유동물 세포에서의 발현을 위해 적합한 발현 벡터는, 예를 들어 pET 벡터 (예컨대, pET-12a, pET-36, pET-37, pET-39, pET-40, 노바겐(Novagen) 등), 파지 벡터 (예컨대, pCANTAB 5 E, 파마시아(Pharmacia)), pRIT2T (단백질 A 융합 벡터, 파마시아), pCDM8, pCDNA1.1/amp, pcDNA3.1, pRc/RSV, pEF-1 (Invitrogen, Carlsbad, CA), pCMV-SCRIPT, pFB, pSG5, pXT1 (Stratagene, La Jolla, CA), pCDEF3 (Goldman, L.A., et al, Biotechniques, 27:1013-1015 (1996)), pSVSPORT (GibcoBRL, Rockville, MD), pEF-Bos (Mizushima, S., et al , Nucleic Acids Res., 18:5322 (1990)) 등을 포함한다. 원핵 세포 (E. 콜리(E. coli)), 곤충 세포 (드로소필라 슈나이더(Drosophila Schnieder) S2 세포, Sf9), 효모 (P. 메타놀리카(P. methanolica), P. 파스토리스(P. pastoris), S. 세리비지애(S. cerevisiae)) 및 포유동물 세포 (예컨대, COS 세포)를 이용할 수 있다.
벡터의 예는 폴리펩티드 라이브러리 구성원에 상응하는 누클레오티드 서열을 발현시킬 수 있는 발현 벡터이다. 따라서, 제너릭 및/또는 표적 리간드를 이용한 선택이 폴리펩티드 라이브러리 구성원을 발현시키는 단일 클론의 분리된 번식 및 발현에 의해 수행될 수 있다. 상기 개시된 대로, 선택 디스플레이 시스템은 박테리오파지 디스플레이일 수 있다. 이에 따라, 파지나 파지미드 벡터를 이용할 수 있다. 예시적인 벡터는 E. 콜리(E. coli) 복제 기점 (이중 가닥 복제를 위해)과 또한 파지 복제 기점 (단일 가닥 DNA의 생성을 위해)을 지니는 파지미드 벡터이다. 이러한 벡터의 조작 및 발현은 당 분야에 널리 공지되어 있다 (Hoogenboom and Winter (1992) supra; Nissim et al. (1994) supra). 간단히 말해, 벡터는 파지미드 상에 선택성을 제공하는 β-락타마아제 유전자와 적합한 리더 서열, 다중 클로닝 부위, 하나 이상의 펩티드 tag, 하나 이상의 TAG 스톱 코돈 및 파지 단백질 pⅢ을 함유할 수 있는 발현 카세트의 lac 프로모터 업스트림을 함유할 수 있다. 따라서, E. 콜리(E. coli)의 다양한 억제 및 비-억제 균주를 이용하고 글루코오스, 이소프로필 티오-β-D-갈락토시드 (IPTC) 또는 헬퍼 파지, 예컨대 VCS M13을 첨가시켜, 벡터는 발현 없이 플라스미드로서 복제되어 폴리펩티드 라이브러리 구성원 단독이나 생성물 파지를 다량으로 생성할 수 있고, 이들 중 일부는 폴리펩티드-pⅢ 융합체의 하나 이상의 카피를 그 표면에 함유한다.
본원에 개시된 라이브러리 및 레퍼토리는 항체 포맷을 함유할 수 있다. 예를 들어, 라이브러리 및 레퍼토리에 함유된 폴리펩티드는 전부 분리된 VH 또는 VL 도메인일 수 있고, 이들 중 어떤 것은 변형되거나 변형되지 않는다. scFv 단편뿐만 아니라 다른 항체 폴리펩티드는 임의의 적합한 방법을 이용하여 용이하게 생성될 수 있다. 다수의 적합한 항체 공학처리 방법이 당 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, scFv는 두 가변 도메인을 엔코딩하는 핵산을 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3와 같은 적절한 링커 펩티드나 다른 적합한 링커 펩티드를 엔코딩하는 적합한 올리고누클레오티드와 결합시킴에 의해 형성될 수 있다. 링커는 첫 번째 V 영역의 C-말단과 두 번째 V 영역의 N-말단에 다리를 놓는다. Fv, Fab 및 F(ab')2 단편과 같은 다른 항체 포맷을 구성하기 위한 유사한 기술이 이용될 수 있다. Fab 및 F(ab')2 단편을 포맷하기 위해, VH 및 VL 폴리펩티드를 재배열된 유전자, 즉 생식세포 C 유전자로부터 분리될 수 있는 불변 영역 세그먼트와 조합시킬 수 있거나 항체 서열 데이터로부터 합성할 수 있다. 본원에 개시된 라이브러리 또는 레퍼토리는 VH 또는 VL 라이브러리 또는 레퍼토리일 수 있다.
프로테아제 내성 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 표적 리간드(TNFR1) 결합 부위 및 제너릭 리간드 결합 부위를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 제너릭 리간드 결합 부위는 단백질 A, 단백질 L 또는 단백질 G와 같은 초항원을 위한 결합 부위이다. 가변 도메인은 임의의 요망되는 가변 도메인, 예를 들어 인간 VH (예컨대, VH 1a, VH 1b, VH 2, VH 3, VH 4, VH 5, VH 6), 인간 Vλ (예컨대, VλI, VλII, VλIII, VλIV, VλV, VλVI 또는 Vκ1) 또는 인간 Vκ (예컨대, Vκ2, Vκ3, Vκ4, Vκ5, Vκ6, Vκ7, Vκ8, Vκ9 또는 Vκ1O)나 임의로 인간화된 카멜리드(Camelid) VHH에 기초할 수 있다.
프로테아제 내성 폴리펩티드를 생성하는 핵산, 숙주 세포 및 방법.
본 발명은 예컨대 본원에 개시된 방법에 의해 선택될 수 있거나 선택되는 프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드를 엔코딩하는 분리된 재조합 핵산 및/또는 재조합 핵산에 관한 것이다.
본원에서 "분리된" 것으로 언급된 핵산은 이의 원래 환경에서 (예컨대, 세포 또는 라이브러리와 같은 핵산의 혼합물에서) 다른 물질 (예컨대, 유전체 DNA, cDNA 및/또는 RNA와 같은 다른 핵산)로부터 떨어져 분리된 핵산이다. 분리된 핵산은 벡터 (예컨대, 플라스미드)의 일부로서 분리될 수 있다.
본원에서 "재조합"으로 언급된 핵산은, 예를 들어 제한 효소, 동종 재조합, 바이러스 등과 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용하여 제조된 핵산을 이용한 벡터 또는 염색체로의 클로닝과 같이, 인위적인 재조합에 의존하는 방법을 포함하는 재조합 DNA 방법에 의해 생성된 핵산이다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 방법에 의해 선택될 수 있거나 선택된 펩티드 또는 폴리펩티드 같은 프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드를 엔코딩하는 (하나 이상의) 재조합 핵산 또는 핵산을 포함하는 발현 구성물을 포함하는 재조합 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 숙주 세포를 프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에 유지시키는 것을 포함하여, 프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드를 제조하는 방법이 또한 제공된다. 상기 방법은 요망되는 경우 프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드를 분리시키거나 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
예를 들어, 프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 분자 (즉, 하나 이상의 핵산 분자) 또는 이러한 핵산 분자(들)를 포함하는 발현 구성물 (즉, 하나 이상의 구성물)을 적합한 숙주 세포에 도입시켜 선택된 숙주 세포에 적합한 임의의 방법 (예컨대, 형질전환, 트랜스펙션, 전기천공, 감염)을 이용하여 재조합 숙주 세포를 제조할 수 있고, 이에 의해 핵산 분자(들)가 하나 이상의 발현 조절 엘리먼트 (예컨대, 벡터, 세포에서의 공정에 의해 생성된 구성물, 숙주 세포 유전체에 통합됨)에 작동가능하게 결합된다. 생성된 재조합 숙주 세포를 발현에 적합한 조건하에 유지함으로써 (예컨대, 인듀서의 존재하에, 적합한 동물에, 적절한 염, 성장 인자, 항생제, 영양 보충물 등이 보충된 적합한 배양 배지에서) 엔코딩된 펩티드 또는 폴리펩티드가 생성된다. 요망되는 경우, 엔코딩된 펩티드 또는 폴리펩티드를 (예컨대, 동물, 숙주 세포, 배지, 우유로부터) 분리시키거나 회수할 수 있다. 이 공정은 유전자이식 동물의 숙주 세포에서의 발현을 포함한다 (예컨대, WO 92/03918 참조, GenPharm International).
본원에 개시된 방법에 의해 선택된 프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드는 또한 적합한 실험관내 발현 시스템에서, 화학적 합성에 의해서나 임의의 다른 적합한 방법에 의해 생성될 수 있다. 따라서, 본 발명은 프로테아제 내성 펩티드 및 폴리펩티드를 제공한다.
폴리펩티드, dAbs & 길항제
본원에 기술되고 예시된 대로, 본 발명의 프로테아제 내성 dAb는 일반적으로 이들의 표적 리간드에 높은 친화성으로 결합된다. 따라서, 또 다른 양태에서, TNFR1에 높은 친화성으로 결합된 본 발명의 폴리펩티드 또는 dAb를 선택, 분리 및/또는 회수하는 방법이 제공된다. 일반적으로, 본 방법은 펩티드 또는 폴리펩티드 (예컨대, dAb)의 라이브러리 또는 레퍼토리를 제공하고, 라이브러리 또는 레퍼토리를 프로테아제 활성에 적합한 조건하에 프로테아제 (예컨대, 트립신, 엘라스타아제, 류코자임, 판크레아틴, 가래)와 조합시키고, 리간드 (예컨대, 표적 리간드)에 결합되는 펩티드 또는 폴리펩티드를 선택, 분리 및/또는 회수하는 것을 포함한다. 라이브러리 또는 레퍼토리는 프로테아제 민감성 펩티드 또는 폴리펩티드가 소화될 조건하에 프로테아제에 노출되었기 때문에, 프로테아제의 활성은 낮은 결합 친화성을 갖는 덜 안정한 폴리펩티드를 제거할 수 있고, 이에 의해 높은 결합 친화성의 펩티드 또는 폴리펩티드의 집합물을 생성할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 또는 dAb는 1 μM 또는 이 이상, 또는 약 500 nM 내지 약 0.5 pM의 친화성(KD; 표면 플라즈몬 공명으로 결정시 KD = Koff(kd)/Kon(ka))으로 TNFR1에 결합할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 또는 dAb는 약 500 nM, 약 100 nM, 약 10 nM, 약 1 nM, 약 500 pM, 약 100 pM, 약 10 pM, 약 1 pM 또는 약 0.5 pM의 친화성으로 TNFR1에 결합할 수 있다.
임의의 특정 이론에 매이지 않으며, 프로테아제에 내성인 펩티드 및 폴리펩티드는 보다 낮은 엔트로피 및/또는 보다 높은 안정화 에너지를 지니는 것으로 여겨진다. 따라서, 프로테아제 내성과 고 친화성 결합간 상관관계는 본원에 개시된 방법에 의해 선택된 펩티드와 폴리펩티드 및 dAb 표면의 안정성 및 치밀성(compactness)과 관련될 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드, dAb 또는 길항제는 약 500 nM 내지 50 pM, 또는 100 nM 내지 50 pM, 또는 10 nM 내지 100 pM, 또는 1 nM 내지 100 pM; 예를 들어, 50 nM 이하, 또는 5 nM 이하, 또는 500 pM 이하, 또는 200 pM 이하, 또는 100 pM 이하의 억제 농도 50(IC50)으로 TNF 알파 수용체 Ⅰ(p55 수용체)로의 TNF 알파의 결합을 억제한다.
특정 구체예에서, 폴리펩티드, dAb 또는 길항제는 TNFR1, 예컨대 인간 TNFR1에 특이적으로 결합되고 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 300 nM 내지 1pM 또는 30OnM 내지 5pM 또는 50nM 내지 1pM 또는 50nM 내지 5pM 또는 50nM 내지 20 pM 또는 약 10 pM 또는 약 15pM 또는 약 2OpM의 분리 상수(KD)로 인간 TNFR1으로부터 분리된다. 특정 구체예에서, 폴리펩티드, dAb 또는 길항제는 TNFR1, 예컨대 인간 TNFR1에 특이적으로 결합되고 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 5 x 10-1 s-1 내지 1 x 10-7 S-1, 또는 1 x 10-3 s-1 내지 1 x 10-7 S-1, 또는 1 x 10-4 s-1 내지 1 x 10-7 S-1, 또는 1 x 10-5 s-1 내지 1 x 10-7 S-1, 또는 1 x 10-4 s-1 내지 1 x 10-5 S-1의 Koff 속도 상수로 인간 TNFR1으로부터 분리된다. 특정 구체예에서, 폴리펩티드, dAb 또는 길항제는 TNFR1, 예컨대 인간 TNFR1에 1 x 1O-3 M-1s-1 내지 1 x 1O-7 M-1s-1 또는 1 x 1O-3 M-1s-1 내지 1 x 1O-6 M-1s-1 또는 약 1 x 1O-4 M-1s-1 또는 약 1 x 1O-5 M-1s-1의 Kon으로 특이적으로 결합된다. 일 구체예에서, 폴리펩티드, dAb 또는 길항제는 TNFR1, 예컨대 인간 TNFR1에 특이적으로 결합되고, 본 단락에 정의된 분리 상수 (KD) 및 Koff로 인간 TNFR1으로부터 분리된다. 일 구체예에서, 폴리펩티드, dAb 또는 길항제는 TNFR1, 예컨대 인간 TNFR1에 특이적으로 결합되고, 본 단락에 정의된 분리 상수 (KD) 및 Kon으로 인간 TNFR1으로부터 분리된다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드 또는 dAb는 본 단락에 언급된 KD 및/또는 Koff 및/또는 Kon으로 TNFR1(예컨대, 인간 TNFR1)에 특이적으로 결합되고 DOM1h-131-206(도 3에 도시됨)의 아미노산 서열을 지니는 dAb의 아미노산 서열과 적어도 또는 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
폴리펩티드, dAb 또는 길항제는 E. 콜리(E. coli)이나 피키아(Pichia) 종 (예컨대, P. 파스토리스(P. pastoris))에서 발현될 수 있다. 일 구체예에서, 리간드 또는 dAb 단량체는 E. 콜리(E. coli)이나 피키아(Pichia) 종 (예컨대, P. 파스토리스(P. pastoris))에서 발현될 때 적어도 약 0.5 mg/L의 양으로 분비된다. 비록 본원에 개시된 리간드 및 dAb 단량체가 E. 콜리(E. coli)이나 피키아(Pichia) 종 (예컨대, P. 파스토리스(P. pastoris))에서 발현될 때 분비될 수 있으나, 이들은 E. 콜리(E. coli)이나 피키아(Pichia) 종을 적용하지 않는 합성 화학적 방법이나 생물학적 생성 방법과 같은 임의의 적합한 방법을 이용하여 제조될 수 있다.
일부 구체예에서, 폴리펩티드, dAb 또는 길항제는 카멜리드 면역글로불린 가변 도메인, 또는 예컨대 위치 108, 37, 44, 45 및/또는 47에서 카멜리드 생식세포 항체 유전자 세그먼트에 의해 엔코딩되는 면역글로불린 가변 도메인에 유일한 하나 이상의 프레임워크 아미노산을 포함하지 않는다.
본 발명에 따른 TNFR1의 길항제는 일가 또는 다가일 수 있다. 일부 구체예에서, 길항제는 일가이고 TNFR1과 상호작용하는 하나의 결합 부위를 포함하는데, 이 결합 부위는 본 발명의 폴리펩티드 또는 dAb에 의해 제공된다. 일가 길항제는 하나의 TNFR1에 결합되며 수용체의 활성화 및 신호전달을 초래할 수 있는 세포의 표면 상에서 TNFR1의 가교 또는 군집화(cluestering)을 유도하지 않을 수 있다.
일부 구체예에서, TNFR1의 길항제는 다가이다. TNFR1의 다가 길항제는 TNFR1에 대한 특정 결합 부위의 둘 이상의 카피를 함유하거나 TNFR1에 결합되는 둘 이상의 상이한 결합 부위를 함유할 수 있는데, 이 결합 부위들 중 하나 이상은 본 발명의 폴리펩티드 또는 dAb에 의해 제공된다. 예를 들어, 본원에 개시된 대로 TNFR1의 길항제는 TNFR1에 결합되는 본 발명의 특정 폴리펩티드 또는 dAb의 둘 이상의 카피, 또는 TNFR1에 결합되는 본 발명의 둘 이상의 상이한 폴리펩티드 또는 dAb를 포함하는 이합체, 삼합체 또는 중합체일 수 있다. 일 구체예에서, TNFR1의 다가 길항제는 표준 세포 검정에서 TNFR1을 실질적으로 효능화(TNFR1의 효능제로 작용)시키지 않는다(즉, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 μM, 10 μM, 100 μM, 1000 μM 또는 5,000 μM의 농도로 존재하는 경우에 상기 검정에서 TNFα(100 pg/ml)에 의해 유도되는 TNFR1 매개 활성의 약 5% 이하를 발생시킴).
특정 구체예에서, TNFR1의 다가 길항제는 TNFR1의 요망되는 에피토프 또는 도메인에 대한 2개 이상의 결합 부위를 함유한다. 예를 들어, TNFR1의 다가 길항제는 TNFR1의 도메인 1 내의 동일한 에피토프에 결합하는 2개 이상의 결합 부위를 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, TNFR1의 다가 길항제는 TNFR1의 상이한 에피토프 또는 도메인에 결합하는 본 발명의 폴리펩티드 또는 dAb에 의해 제공되는 2개 이상의 결합 부위를 함유한다. 일 구체예에서, 상기 다가 길항제는 WO2006038027에 기재된 바와 같이 표준 L929 세포독성 검정 또는 표준 HeLa IL-8 검정에서 약 1 nM, 또는 약 10 nM, 또는 약 100 nM, 또는 약 1 μM, 또는 약 10 μM의 농도로 존재하는 경우 TNFR1을 효능화시키지 않는다.
TNFR1의 다른 길항제는 TNFR1로의 TNFα의 결합을 억제하지 않는다. 이러한 리간드(및 길항제)는 진단제로 유용할 수 있는데, 이는 이들이 샘플 내의 TNFR1에 결합하여 이를 검출하거나, 정량하거나, 측정하는데 사용될 수 있고, 이는 TNFR1으로의 결합에 대해 샘플 내의 TNF와 경쟁하지 않을 것이기 때문이다. 따라서, TNFR1이 샘플 내에 존재하는지의 여부 또는 얼마나 많이 존재하는지의 여부의 정확한 결정이 이루어질 수 있다.
다른 구체예에서, 폴리펩티드, dAb 또는 길항제는 본원에 기재된 KD로 TNFR1에 특이적으로 결합하고, 표준 마우스 LPS/D-갈락토사민 유도 패혈성 쇼크 모델에서 치사율을 억제한다(즉, 적합한 대조군과 비교시 치사율을 방지하거나 약 10% 이상으로 치사율을 감소시킴). 일 구체예에서, 폴리펩티드, dAb 또는 길항제는 약 5 mg/kg 이상, 예를 들어, 약 1 mg/kg으로 투여되는 경우 표준 마우스 LPS/D-갈락토사민 유도 패혈성 쇼크 모델에서 적합한 대조군에 비해 약 25 이상 또는 약 50% 이상으로 치사율을 억제한다.
다른 구체예에서, 폴리펩티드, dAb 또는 길항제는 TNFR1에 결합하여 표준 세포 검정에서 ≤ 100 nM의 ND5O으로 TNFR1의 활성을 길항시키고, ≤ 10 μM의 농도에서 dAb는 상기 검정에서 TNFR1의 활성을 ≤ 5%로 효능화시킨다.
특정 구체예에서, 폴리펩티드, dAb 또는 길항제는 표준 세포 검정에서 TNFR1을 실질적으로 효능화(TNFR1의 효능제로 작용)시키지 않는다(즉, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 μM, 10 μM, 100 μM, 1000 μM 또는 5,000 μM의 농도로 존재하는 경우에 상기 검정에서 TNFα(100 pg/ml)에 의해 유도된 TNFR1 매개 활성의 약 5% 이하를 발생시킴).
특정 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드, dAb 또는 길항제는 유효량으로 튜여되는 경우에 만성 염증 질병의 모델에서 유효하다. 일반적으로 유효량은 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg이다(예컨대 약 1 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 4 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 6 mg/kg, 약 7 mg/kg, 약 8 mg/kg, 약 9 mg/kg, 또는 약 10 mg/kg). 만성 염증 질환의 모델(WO2006038027에 기재된 것을 참조)은 인간에서의 치료적 효능을 예보하는 것으로 당업자에게 인식된다.
특정 구체예에서, 폴리펩티드, dAb 또는 길항제는 표준 마우스 콜라겐 유도 관절염 모델에서 유효하다(상기 모델의 세부사항은 WO2006038027 참조). 예를 들어, 유효량의 폴리펩티드, dAb 또는 길항제를 투여하는 것은 표준 마우스 콜라겐 유도 관절염 모델에서 4개의 사지의 평균 관절염 스코어 합계를 적합한 대조군에 비해 약 1 내지 약 16, 약 3 내지 약 16, 약 6 내지 약 16, 약 9 내지 약 16, 또는 약 12 내지 약 16을 감소시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 유효량의 폴리펩티드, dAb 또는 길항제를 투여하는 것은 표준 마우스 콜라겐 유도 관절염 모델에서 관절염의 증상의 발생을 적합한 대조군에 비해, 예를 들어, 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 10일, 약 14일, 약 21일 또는 약 28일 지연시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 유효량의 폴리펩티드, dAb 또는 길항제를 투여하는 것은 표준 마우스 콜라겐 유도 관절염 모델에서 0 내지 약 3, 약 3 내지 약 5, 약 5 내지 약 7, 약 7 내지 약 15, 약 9 내지 약 15, 약 10 내지 약 15, 약 12 내지 약 15, 또는 약 14 내지 약 15의 4개 사지의 평균 관절염 스코어 합계를 발생시킬 수 있다.
다른 구체예에서, 폴리펩티드, dAb 또는 길항제는 관절염의 마우스 ΔARE 모델(이러한 모델의 세부사항은 WO2006038027 참조)에서 유효하다. 예를 들어, 유효량의 폴리펩티드, dAb 또는 길항제를 투여하는 것은 관절염의 마우스 ΔARE 모델에서 평균 관절염 스코어를 적합한 대조군에 비해 약 0.1 내지 약 2.5, 약 0.5 내지 약 2.5, 약 1 내지 약 2.5, 약 1.5 내지 약 2.5, 또는 약 2 내지 약 2.5 감소시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 유효량의 폴리펩티드, dAb 또는 길항제를 투여하는 것은 관절염의 마우스 ΔARE 모델에서 관절염의 증상의 발생을 적합한 대조군에 비해, 예를 들어, 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 10일, 약 14일, 약 21일 또는 약 28일 지연시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 유효량의 폴리펩티드, dAb 또는 길항제를 투여하는 것은 관절염의 마우스 ΔARE 모델에서 0 내지 약 0.5, 약 0.5 내지 약 1, 약 1 내지 약 1.5, 약 1.5 내지 약 2, 또는 약 2 내지 약 2.5의 평균 관절염 스코어를 발생시킬 수 있다.
다른 구체예에서, 폴리펩티드, dAb 또는 길항제는 염증성 장질병(IBD)의 마우스 ΔARE 모델(이러한 모델의 세부사항은 WO2006038027 참조)에서 유효하다. 예를 들어, 유효량의 폴리펩티드, dAb 또는 길항제를 투여하는 것은 IBD의 마우스 ΔARE 모델에서 평균 급성 및/또는 만성 염증 스코어를 적합한 대조군에 비해 약 0.1 내지 약 2.5, 약 0.5 내지 약 2.5, 약 1 내지 약 2.5, 약 1.5 내지 약 2.5, 또는 약 2 내지 약 2.5 감소시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 유효량의 폴리펩티드, dAb 또는 길항제를 투여하는 것은 IBD의 마우스 ΔARE 모델에서 IBD의 증상의 발생을 적합한 대조군에 비해, 예를 들어, 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 10일, 약 14일, 약 21일 또는 약 28일 지연시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 유효량의 폴리펩티드, dAb 또는 길항제를 투여하는 것은 IBD의 마우스 ΔARE 모델에서 0 내지 약 0.5, 약 0.5 내지 약 1, 약 1 내지 약 1.5, 약 1.5 내지 약 2, 또는 약 2 내지 약 2.5의 평균 급성 및/또는 만성 염증 스코어를 발생시킬 수 있다.
다른 구체예에서, 폴리펩티드, dAb 또는 길항제는 IBD의 마우스 덱스트란 술페이트 나트륨(DSS) 유도 모델(이러한 모델의 세부사항은 WO2006038027 참조)에서 유효하다. 예를 들어, 유효량의 폴리펩티드, dAb 또는 길항제를 투여하는 것은 IBD의 마우스 DSS 모델에서 평균 중증도 스코어를 적합한 대조군에 비해 약 0.1 내지 약 2.5, 약 0.5 내지 약 2.5, 약 1 내지 약 2.5, 약 1.5 내지 약 2.5, 또는 약 2 내지 약 2.5 감소시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 유효량의 폴리펩티드, dAb 또는 길항제를 투여하는 것은 IBD의 마우스 DSS 모델에서 IBD의 증상의 발생을 적합한 대조군에 비해, 예를 들어, 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 10일, 약 14일, 약 21일 또는 약 28일 지연시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 유효량의 폴리펩티드, dAb 또는 길항제를 투여하는 것은 IBD의 마우스 DSS 모델에서 0 내지 약 0.5, 약 0.5 내지 약 1, 약 1 내지 약 1.5, 약 1.5 내지 약 2, 또는 약 2 내지 약 2.5의 평균 중증도 스코어를 발생시킬 수 있다.
특정 구체예에서, 폴리펩티드, dAb 또는 길항제는 만성폐쇄폐병(COPD)의 마우스 담배 연기 모델(이러한 모델의 세부사항은 WO2006038027 및 WO2007049017 참조)에서 유효하다. 예를 들어, 유효량의 리간드를 투여하는 것은 적합한 대조군에 비해 COPD의 증상의 발생을 감소시키거나 지연시킬 수 있다.
질병에 대해 보호하거나 치료하는데 있어서 TNFR1의 길항제(예를 들어, 리간드, 항체 또는 이의 결합 단백질)의 효과를 스크리닝하는데 사용될 수 있는 동물 모델 시스템이 이용가능하다. 민감한 마우스에서 전신홍반루푸스(SLE)를 시험하는 방법은 당 분야에 공지되어 있다(Knight et al . (1978) J. Exp . Med ., 147: 1653; Reinersten et al . (1978) New Eng . J. Med ., 299: 515). 중증근무력증(MG)은 또 다른 종으로부터의 가용성 AchR 단백질을 이용하여 이러한 질병을 유도함으로써 SJL/J 암컷 마우스에서 시험된다(Lindstrom et al. (1988) Adv . Immunol ., 42: 233). 관절염은 타입 Ⅱ 콜라겐의 주입에 의해 마우스의 민감한 균주에서 유도된다(Stuart et al. (1984) Ann . Rev . Immunol ., 42: 233). 애주번트 관절염이 미코박테리아 열 충격 단백질의 주입에 의해 민감한 래트에서 유도되는 모델이 기재되어 있다(Van Eden et al . (1988) Nature, 331:171). 갑상선염은 기재된 바와 같이 티로글로불린(thyroglobulin)의 투여에 의해 마우스에서 유도된다(Maron et al. (1980) J. Exp . Med ., 152: 1115). 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM)은 자연 발생하거나, 문헌[Kanasawa et al. (1984) Diabetologia, 27:113]에 기재된 바와 같이 마우스의 특정 균주에서 유도될 수 있다. 마우스 및 래트에서의 EAE는 인간에서의 MS에 대한 모델로 제공된다. 이러한 모델에서, 탈수초성 질병은 수초 염기성 단백질의 투여에 의해 유도된다(Paterson (1986) Textbook of Immunopathology, Mischer et al ., eds., Grune and Stratton, New York, pp. 179-213; McFarlin et al. (1973) Science, 179: 478: and Satoh et al. (1987) J. Immunol ., 138: 179 참조).
일반적으로, 본 리간드 (예컨대, 길항제)는 약리학적으로 적합한 담체와 함께 정제된 형태로 사용될 것이다. 전형적으로, 이러한 담체는 수성 또는 알코올/수용액, 에멀젼 또는 현탁액, 염수 및/또는 완충된 매질을 포함하는 임의의 것을 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로오스, 덱스트로오스와 염화나트륨 및 락테이트 링거를 포함한다. 폴리펩티드 복합체를 현탁액에 유지할 필요가 있는 경우, 적합한 약리학적으로 허용되는 애쥬번트를 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴 및 알기네이트와 같은 증점제로부터 선택할 수 있다.
정맥내 비히틀은 링거 덱스트로오스에 기초한 것들과 같은, 유체 및 영양소 보충물 및 전해질 보충물을 포함한다. 보존제 및 기타 첨가제, 예컨대 항균제, 항산화제, 킬레이팅제 및 불활성 가스도 존재할 수 있다 (Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition). 연장된 방출 제형을 포함하는 다양한 적합한 제형이 이용될 수 있다.
본 발명의 리간드 (예컨대, 길항제)는 단독으로 또는 다른 작용제와 함께 투여되는 조성물로서 이용될 수 있다. 이들은 다양한 면역치료적 약물, 예컨대 시클로스포린, 메토트렉세이트, 아드리아마이신 또는 시스플라티눔, 및 면역독소를 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 본 발명의 리간드와 함께 다양한 세포독성제 또는 기타 작용제의 "칵테일", 또는 심지어 상이한 특이성을 지니는 본 발명에 따른 리간드의 조합물을 포함하는데, 예컨대 리간드는 이들이 투여 전에 풀링되는지와 무관하게, 상이한 표적 항원 또는 에피토프를 이용하여 선택된다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물의 투여 경로는 당업자에게 일반적으로 공지된 임의의 경로일 수 있다. 제한 없이 면역치료를 포함하는 치료를 위해, 본 발명에서 선택된 이의 리간드를 표준 기술에 따라 임의의 환자에게 투여할 수 있다.
투여는 비경구, 정맥내, 근내, 복막내, 경피, 폐 경로를 거쳐, 또는 적합하게는 카테터를 이용한 직접 주입에 의한 것을 포함하는 임의의 적합한 방식으로 이루어질 수 있다. 투여 용량 및 빈도는 환자의 연령, 성별 및 상태, 다른 약물의 동시 투여, 맞조치(counterindication) 및 의사에 의해 고려되는 다른 파라미터에 의존적일 것이다. 투여는 지시된 대로 국소적 (예컨대, 폐 투여에 의해 폐로의 국소 전달, 예컨대 비내 투여) 또는 전신적일 수 있다.
본 발명의 리간드는 저장을 위해 냉동건조되고 사용 전에 적합한 담체에서 재구성될 수 있다. 이 기술은 통상적인 면역글로불린에 효과적인 것으로 나타났고 해당-공지된 냉동건조 및 재구성 기술이 적용될 수 있다. 당업자는 냉동건조 및 재구성이 다양한 정도의 항체 활성 손실을 초래할 수 있고 (예컨대, 통상적인 면역글로불린의 경우, IgM 항체는 IgG 항체보다 큰 활성 손실을 지니기 쉽다) 이용 수준은 보상을 위해 상향 조정되어야 할 수 있음을 이해할 것이다.
본 리간드 (예컨대, 길항제) 또는 이의 칵테일을 함유하는 조성물을 예방 및/또는 치료적 처치를 위해 투여할 수 있다. 특정 치료적 용도에서, 선택된 세포 집단의 적어도 부분적인 억제, 억압, 조절, 치사, 또는 몇몇 다른 측정가능한 파라미터를 달성하기에 충분한 양은 "치료적 유효량"으로서 정의된다. 이 용량을 달성하는데 요구되는 양은 질환의 중증도 및 환자 자신의 면역 시스템의 일반적인 상태에 의해 좌우될 것이나 일반적으로 체중 킬로그램 당 0.005 내지 5.0 mg의 리간드, 예컨대 dAb 또는 길항제이고, 0.05 내지 2.0 mg/kg/용량이 더욱 일반적으로 사용된다. 예방적 용도를 위해, 본 리간드 또는 이의 칵테일을 함유하는 조성물을 질병의 개시를 예방, 억제 또는 지연 (예컨대, 관해 또는 정지의 유지, 또는 급성기 억제)하기 위해 유사하거나 다소 낮은 용량으로 투여할 수 있다. 숙련된 의사는 질병을 치료, 억제 또는 예방하기 위한 적합한 투약 간격을 결정할 수 있을 것이다. 만성 염증 질병을 치료, 억제 또는 예방하기 위해 TNFR1의 리간드(예컨대, 길항제)를 투여할 때, 이것은 예를 들어, 약 10 ㎍/kg 내지 약 80 mg/kg, 약 100 ㎍/kg 내지 약 80 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 80 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 70 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 60 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 40 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 20 mg/kg , 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 10 ㎍/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 10 ㎍/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 10 ㎍/kg 내지 약 2.5 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 4 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 6 mg/kg, 약 7 mg/kg, 약 8 mg/kg, 약 9 mg/kg 또는 약 10 mg/kg의 용량으로 하루에 4회 이하, 매주 2회, 매주 1회, 매 2주마다 1회, 한 달에 1회나 매 2개월마다 1회 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, TNFR1의 리간드(예컨대, 길항제)를 만성 염증 질병을 치료, 억제 또는 예방하기 위해 약 10 ㎍/kg 내지 약 10 mg/kg (예컨대, 약 10 ㎍/kg, 약 100 ㎍/kg, 약 1 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 4 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 6 mg/kg, 약 7 mg/kg, 약 8 mg/kg, 약 9 mg/kg 또는 약 10 mg/kg)의 용량으로 2주에 1회 또는 한 달에 1회 투여한다.
하나 이상의 징후가 치료 전에 존재하는 동일한 징후에 비해, 또는 상기 조성물이나 기타 적합한 대조군으로 치료되지 않은 개체 (인간 또는 모델 동물)에서의 동일한 징후에 비해 감소된 경우 (예컨대, 적어도 10% 또는 임상적 평가 척도 상에서 적어도 1점만큼) 본원에 개시된 조성물을 이용하여 수행된 처리 또는 치료는 "효과적"인 것으로 간주된다. 징후는 표적으로 하는 질환 또는 질병에 따라 명백히 다양할 것이나, 보통의 숙련된 의사 또는 전문가에 의해 측정될 수 있다. 이러한 징후는, 예를 들어 질환 또는 질병의 하나 이상의 생화학적 지표의 수준을 모니터링하거나 (예컨대, 질환과 관련된 효소 또는 대사산물의 수준, 침범된 세포 수 등), 물리적 조짐을 모니터링하거나 (예컨대, 염증, 종양 크기 등), 인정된 임상적 평가 척도, 예를 들어, 확장장애상태척도(Expanded Disability Status Scale)(다발성 경화증에 대한 것임), 어빈 염증성 장질병 질문서(장 기능, 전신 증상, 사회적 기능 및 감정 상태와 관련된 삶의 질을 평가하는 32 포인트의 평가 - 32 내지 224 범위의 스코어, 보다 높은 스코어는 보다 나은 삶의 질을 나타냄), 류머티스 관절염 스케일의 삶의 질, 또는 당 분야에 공지된 다른 허용되는 임상 평가 스케일에 의해 판단될 수 있다. 제공된 임상 스케일에서 10% 이상 또는 하나 이상의 포인트의 질병 또는 장애 증상의 지속된(예를 들어, 1일 이상, 또는 이 이상의 기간) 감소는 "효과적인" 치료를 나타낸다. 유사하게, 본원에 기재된 조성물을 이용하여 수행된 예방은 조성물로 치료되지 않은 유사한 개체(인간 또는 동물 모델)에서의 증상에 비해 하나 이상의 발생 또는 중증도가 지연되거나, 감소되거나, 제거된 경우에 "효과적"이다.
포유동물에서 선택 표적 세포 집단을 변경, 비활성화, 치사 또는 제거하는 것을 돕기 위해 본 발명에 따른 리간드 (예컨대, 길항제) 또는 이의 칵테일을 함유하는 조성물을 예방적 및 치료적 환경에서 이용할 수 있다. 또한 본원에 개시된 폴리펩티드의 선택된 레퍼토리는 체외순환에 의해서나 실험관내에서 표적 세포 집단을 세포의 이종 집합물로부터 선택적으로 치사, 고갈 또는 달리 효과적으로 제거하기 위해 이용될 수 있다. 포유동물로부터의 혈액을 체외순환에 의해 리간드와 조합시킴으로써 요망되지 않는 세포를 치사시키거나 표준 기술에 따라 포유동물로 돌려보내기 위해 혈액으로부터 달리 제거할 수 있다.
포유동물에서 선택 표적 세포 집단을 변경, 비활성화, 치사 또는 제거하는 것을 돕기 위해 본 발명에 따른 리간드 (예컨대, 길항제)를 함유하는 조성물을 예방적 및 치료적 환경에서 이용할 수 있다.
리간드 (예컨대, 항-TNFR1 길항제, dAb 단량체)를 하나 이상의 추가의 치료제 또는 활성제와 함께 투여하고/거나 제형화할 수 있다. 리간드 (예컨대, dAb)를 추가의 치료제와 함께 투여할 때, 리간드는 추가 작용제의 투여 이전에, 동시에 또는 이에 후속하여 투여될 수 있다. 일반적으로, 리간드와 추가 작용제는 치료적 효과의 중복을 제공하는 방식으로 투여된다.
일 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 치료적 유효 용량 또는 유효량의 폴리펩티드, dAb 또는 TNFR1의 길항제를 만성 염증 질병을 치료하거나, 억제하거나, 예방하는 것이 필요한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 만성 염증 질병을 치료하거나, 억제하거나, 예방하는 방법이다.
일 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 치료적 유효 용량 또는 유효량의 폴리펩티드, dAb 또는 TNFR1의 길항제를 관절염(예를 들어, 류머티스 관절염, 연소성 류머티스 관절염, 강직성 척추염, 건선성 관절염)을 치료하거나, 억제하거나, 예방하는 것이 필요한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 관절염을 치료하거나, 억제하거나, 예방하는 방법이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 치료적 유효 용량 또는 유효량의 폴리펩티드, dAb 또는 TNFR1의 길항제를 건선을 치료하거나, 억제하거나, 예방하는 것이 필요한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 건선을 치료하거나, 억제하거나, 예방하는 방법이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 치료적 유효 용량 또는 유효량의 폴리펩티드, dAb 또는 TNFR1의 길항제를 염증성 장질병(예를 들어, 크론병, 궤양성 대장염)을 치료하거나, 억제하거나, 예방하는 것이 필요한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 장질병을 치료하거나, 억제하거나, 예방하는 방법이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 치료적 유효 용량 또는 유효량의 폴리펩티드, dAb 또는 TNFR1의 길항제를 만성폐쇄폐병(예를 들어, 만성 기관지염, 만성 폐쇄성 기관지염, 폐기종)을 치료하거나, 억제하거나, 예방하는 것이 필요한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 만성폐쇄폐병을 치료하거나, 억제하거나, 예방하는 방법이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 치료적 유효 용량 또는 유효량의 폴리펩티드, dAb 또는 TNFR1의 길항제를 폐렴(예를 들어, 세균성 폐렴, 예를 들어, 포도구균 폐렴)을 치료하거나, 억제하거나, 예방하는 것이 필요한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 폐렴을 치료하거나, 억제하거나, 예방하는 방법이다.
본 발명은 만성폐쇄폐병 및 폐렴 외에 다른 폐 질병을 치료하거나, 억제하거나, 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따라 치료되거나, 억제되거나, 예방될 수 있는 다른 폐 질병은, 예를 들어, 낭성 섬유증 및 천식(예를 들어, 스테로이드 내성 천식)을 포함한다. 따라서, 또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 치료적 유효 용량 또는 유효량의 폴리펩티드, dAb 또는 TNFR1의 길항제를 폐 질병(예를 들어, 낭성 섬유증, 천식)을 치료하거나, 억제하거나, 예방하는 것이 필요한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 폐 질병을 치료하거나, 억제하거나, 예방하는 방법이다.
특정 구체예에서, TNFR1의 길항제는 폐 전달, 예를 들어, 흡입(예를 들어, 기관지내, 비내 또는 경구 흡입, 비내 점적) 또는 전신 전달(예를 들어, 비경구, 정맥내, 근내, 복막내, 피하)에 의해 투여된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 치료적 유효 용량 또는 유효량의 폴리펩티드, dAb 또는 TNFR1의 길항제를 패혈성 쇼크를 치료하거나, 억제하거나, 예방하는 것이 필요한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 패혈성 쇼크를 치료하거나, 억제하거나, 예방하는 방법이다.
본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드, dAb 또는 TNFR1의 길항제 및 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물이 제공된다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드, dAb 또는 TNFR1의 길항제를 이용하여 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 질환은 암 또는 염증 질병, 예를 들어, 류머티스 관절염, 천식 또는 크론병이다.
포맷
면역글로불린, 특히 항체 및 가장 특히 소형 크기의 항체 단편의 생체내 적용에 있어서 증가된 반감기가 유용하다. 이러한 단편 (Fv, 이황화 결합된 Fv, Fab, scFv, dAb)은 신체로부터 빠르게 청소된다; 따라서, 이들은 신체의 대부분에 신속하게 도달할 수 있고, 제조가 빠르고 다루기 용이하나, 이들의 생체내 적용은 이들의 짧은 생체내 지속성에 의해서만 제한되어 왔다. 본 발명의 일 구체예는 생체내에서 리간드의 증가된 반감기의 결과로서 지속성 시간이 더 긴 리간드의 기능적 활성을 신체에서 제공함에 의해 이러한 문제를 해결한다.
리간드 반감기의 약동학적 분석 및 결정 방법은 당업자에게 익숙할 것이다. 상세설명은 문헌[Kenneth , A et al : Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and in Peters et al, Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach (1996)]에서 볼 수 있다. t 알파 및 t 베타 반감기 및 곡선하영역(AUC)과 같은 약동학적 파라미터를 기술하고 있는 문헌["Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. ex edition (1982)]도 참조한다.
반감기 (t½ 알파 및 t½ 베타)와 AUC는 시간에 대한 리간드의 혈청 농도의 곡선으로부터 결정될 수 있다. 예를 들어, 곡선을 모델링하기 위해 윈논린(WinNonlin) 분석 패키지 (Pharsight Corp.로부터 이용가능함, Mountain View, CA94040, USA)를 이용할 수 있다. 제 1기 (알파기)에서 리간드는 일부 제거되며 환자에 주로 분포된다. 제 2기 (베타기)는 리간드가 분포되고 혈청 농도가 리간드가 환자로부터 제거됨에 따라 감소되는 말단기이다. t 알파 반감기는 제 1기의 반감기이고 t 베타 반감기는 제 2기의 반감기이다. 따라서, 일 구체예에서, 본 발명은 15분 이상의 tα 반감기를 지니는 본 발명에 따른 리간드 또는 리간드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 범위의 하한은 30분, 45분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 10시간, 11시간 또는 12시간이다. 추가로 또는 대안적으로, 본 발명에 따른 리간드 또는 조성물은 12시간 이하 및 12시간을 포함하는 범위의 tα 반감기를 지닐 것이다. 일 구체예에서, 상기 범위의 상한은 11, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5시간이다. 적합한 범위의 예는 1 내지 6시간, 2 내지 5시간 또는 3 내지 4시간이다.
일 구체예에서, 본 발명은 2.5시간 이상의 tβ 반감기를 지니는 본 발명에 따른 리간드(폴리펩티드, dAb 또는 길항제) 또는 리간드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 범위의 하한은 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 10시간, 11시간 또는 12시간이다. 추가로 또는 대안적으로, 본 발명에 따른 리간드 또는 조성물은 21일 이하 및 21일을 포함하는 범위의 tβ 반감기를 지닌다. 일 구체예에서, 상기 범위의 상한은 12시간, 24시간, 2일, 3일, 5일, 10일, 15일 또는 20일이다. 일 구체예에서, 본 발명에 따른 리간드 또는 조성물은 12 내지 60시간 범위의 tβ 반감기를 지닐 것이다. 추가의 구체예에서, 이것은 12 내지 48시간의 범위일 것이다. 여전히 추가의 구체예에서, 이것은 12 내지 26시간의 범위일 것이다.
상기 표준에 추가로 또는 대안적으로, 본 발명은 1 mg.분/ml 이상의 AUC 값 (곡선하영역)을 지니는 본 발명에 따른 리간드 또는 리간드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 범위의 하한은 5, 10, 15, 20, 30, 100, 200 또는 300 mg.분/ml이다. 추가로 또는 대안적으로, 본 발명에 따른 리간드 또는 조성물은 600 mg.분/ml 이하의 AUC를 지닌다. 일 구체예에서, 상기 범위의 상한은 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 또는 50 mg.분/ml이다. 일 구체예에서, 본 발명에 따른 리간드는 15 내지 150 mg.분/ml, 15 내지 100 mg.분/ml, 15 내지 75 mg.분/ml, 및 15 내지 50 mg.분/ml로 구성된 군으로부터 선택된 AUC를 지닐 것이다.
본 발명의 폴리펩티드 및 dAb 및 이들을 포함하는 길항제를 포맷화하여, 예를 들어 PEG 기, 혈청 알부민, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체 또는 적어도 이의 트랜스페린-결합 부분, 항체 Fc 영역의 부착에 의해서나, 항체 도메인의 컨쥬게이션에 의해 더 큰 유체역학적 크기를 지니도록 할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드, dAb 및 길항제는 항체의 더 큰 항원-결합 단편이나 항체로서 포맷화된다 (예컨대, Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, IgG, scFv로서 포맷화).
본 발명의 리간드 (예컨대, dAb 단량체 및 중합체)의 유체역학적 크기는 당 분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 리간드의 유체역학적 크기를 결정하기 위해 겔 여과 크로마토그래피를 이용할 수 있다. 리간드의 유체역학적 크기를 결정하기 위해 적합한 겔 여과 매트릭스, 예컨대 가교된 아가로오스 매트릭스가 널리 공지되어 있고 용이하게 이용가능하다.
리간드 포맷의 크기 (예컨대, dAb 단량체에 부착된 PEG 부분의 크기)는 요망되는 적용에 따라 변화될 수 있다. 예를 들어, 리간드가 순환을 벗어나 주변 조직으로 들어가고자 할 경우, 혈류로부터의 일혈(extravazation)을 촉진하기 위해 리간드의 유체역학적 크기를 작게 유지하는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로, 리간드가 더 긴 기간 동안 체순환에 남아 있는 것이 요망되는 경우, 리간드의 크기를, 예를 들어 Ig 유사 단백질로서 포맷화함에 의해 증가시킬 수 있다.
생체내 반감기를 증가시키는 항원 또는 에피토프를 표적화함에 의해 반감기 연장
본원에 개시된 대로, 생체내 반감기를 증가시키는 항원 또는 에피토프에 결합된 결합 도메인 (예컨대, 항체 또는 항체 단편)에 본 발명의 TNFR1 결합 폴리펩티드, dAb 또는 길항제를 컨쥬게이션하거나 결합시킴에 의해, 리간드의 유체역학적 크기 및 이의 혈청 반감기를 또한 증가시킬 수 있다. 예를 들어, TNFR1 결합 작용제 (예컨대, 폴리펩티드)를, 항-혈청 알부민 또는 항-신생아 Fc 수용체 항체나 항체 단편, 예컨대 항-SA 또는 항-신생아 Fc 수용체 dAb, Fab, Fab' 또는 scFv, 또는 항-SA 어피바디(affibody)나 항-신생아 Fc 수용체 어피바디 또는 항-SA 아비머(avimer), 또는 CTLA-4, 리포칼린, SpA, 어피바디, 아비머, GroEl 및 피브로넥틴으로 구성된 군으로부터 선택되나 바람직하게는 이로 제한되지 않는 골격을 포함하는 항-SA 결합 도메인에 컨쥬게이션하거나 결합시킬 수 있다 (이러한 결합 도메인의 설명에 대해서는 2008년 2월 8일 출원된 PCT/GB2008/000453 참조, 도메인 및 이들의 서열은 본원에 참조로서 포함되고 본 명세서의 설명의 일부를 형성한다). 컨쥬게이션은 혈청 알부민에 결합되는 결합 도메인에 결합된 (공유적으로 또는 비공유적으로) 본 발명의 폴리펩티드, dAb 또는 길항제를 포함하는 조성물을 언급한다.
생체내 혈청 반감기를 개선시키는 적합한 폴리펩티드는, 예를 들어 트랜스페린 수용체 특이적인 리간드-신경약제학적 작용제 융합 단백질 (미국특허 5,977,307 참조, 이의 교시가 본원에 참조로서 포함된다), 뇌 모세관 내피 세포 수용체, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체 (예컨대, 가용성 트랜스페린 수용체), 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자 1 (IGF 1) 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 2 (IGF 2) 수용체, 인슐린 수용체, 혈액 응고 인자 X, α1-항트립신 및 HNF 1α를 포함한다. 혈청 반감기를 개선시키는 적합한 폴리펩티드는 또한 알파-1 당단백질 (오로소뮤코이드; AAG), 알파-1 항키모트립신 (ACT), 알파-1 마이크로글로불린 (단백질 HC; AIM), 항트롬빈 III (AT III), 아포지단백질 A-1 (Apo A-1), 아포지단백질 B (Apo B), 세룰로플라스민 (Cp), 상보적 성분 C3 (C3), 상보적 성분 C4 (C4), C1 에스테라아제 억제제 (C1 INH), C-반응성 단백질 (CRP), 페리틴 (FER), 헤모펙신 (HPX), 지단백질(a) (Lp(a)), 만노오스-결합 단백질 (MBP), 미오글로빈 (Myo), 프리알부민 (트랜스타이레틴; PAL), 레티놀-결합 단백질 (RBP), 및 류마토이드 인자 (RF)를 포함한다.
세포외 매트릭스로부터의 적합한 단백질은 예를 들어 콜라겐, 라미닌, 인테그린 및 피브로넥틴을 포함한다. 콜라겐은 세포외 매트릭스의 주요 단백질이다. 뼈, 피부, 힘줄, 인대, 각막, 내부 기관에서 발견되는 타입 I 콜라겐 (신체 콜라겐의 90% 차지) 또는 연골, 추간판, 척삭 및 눈의 유리체 액에서 발견되는 타입 II 콜라겐과 같은 신체의 상이한 부분에서 발견되는 약 15개 유형의 콜라겐 분자가 현재 공지되어 있다.
혈액으로부터의 적합한 단백질은 예를 들어 혈장 단백질 (예컨대, 피브린, α-2 매크로글로불린, 혈청 알부민, 피브리노겐 (예컨대, 피브리노겐 A, 피브리노겐 B), 혈청 아밀로이드 단백질 A, 합토글로빈, 프로필린, 유비퀴틴, 우테로글로불린 및 β-2-마이크로글로불린), 효소 및 효소 억제제 (예컨대, 플라스미노겐, 리소자임, 시스타틴 C, 알파-1-항트립신 및 췌장 트립신 억제제), 면역 시스템의 단백질, 예컨대 면역글로불린 단백질 (예컨대, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, 면역글로불린 경쇄 (카파/람다)), 운반 단백질 (예컨대, 레티놀 결합 단백질, α-1 마이크로글로불린), 데펜신 (예컨대, 베타-데펜신 1, 호중구 데펜신 1, 호중구 데펜신 2 및 호중구 데펜신 3) 등을 포함한다.
혈뇌 장벽 또는 신경 조직에서 발견되는 적합한 단백질은 예를 들어 멜라노코르틴 수용체, 미엘린, 아스코르베이트 운반체 등을 포함한다.
생체내 혈청 반감기를 개선시키는 적합한 폴리펩티드는 또한 신장에 국한된 단백질 (예컨대, 폴리시스틴, 타입 IV 콜라겐, 유기 음이온 운반체 K1, 헤이만 항원), 간에 국한된 단백질 (예컨대, 알코올 데하이드로게나아제, G250), 폐에 국한된 단백질 (예컨대, IgA에 결합되는 분비 성분), 심장에 국한된 단백질 (예컨대, 팽창된 심근병증과 관련된 HSP 27), 피부에 국한된 단백질 (예컨대, 케라틴), 골 특이적 단백질, 예컨대 뼈형성 활성이 입증된 단백질의 형질전환 성장 인자 β 슈퍼패밀리의 서브셋인 형태발생 단백질 (BMP) (예컨대, BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8)과 같은 골 특이적 단백질, 종양 특이적 단백질 (예컨대, 영양막 항원, 헤르셉틴 수용체, 에스트로겐 수용체, 카텝신 (예컨대, 간과 비장에서 발견될 수 있는 카텝신 B)을 포함한다.
적합한 질병-특이적 단백질은 예를 들어 활성화된 T-세포 상에서만 발현되는 항원, 예컨대 LAG-3 (림프구 활성화 유전자), 오스테오프로테게린 리간드 (OPGL; Nature 402, 304-309 (1999) 참조), OX40 (활성화된 T 세포 상에서 발현되고 인간 T 세포 백혈병 바이러스 타입-I (HTLV-I)-생산 세포에서 특이적으로 상향조절되는 TNF 수용체 패밀리의 구성원; Immunol. 165 (l):263-70 (2000) 참조)을 포함한다. 적합한 질병-특이적 단백질은 또한, 예를 들어 CG6512 드로소필라, 인간 파라플레긴, 인간 FtsH, 인간 AFG3L2, 뮤린 ftsH를 포함하는 메탈로프로테아제 (관절염/암과 관련됨); 및 산성 섬유모세포 성장 인자 (FGF-I), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (FGF-2), 혈관 내피 성장 인자/혈관 투과성 인자 (VEGF/VPF), 형질전환 성장 인자-α (TGF-α), 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α), 안지오게닌, 인터루킨-3 (IL-3), 인터루킨-8 (IL-8), 혈소판-유래된 내피 성장 인자 (PD-ECGF), 태반 성장 인자 (PlGF), 미드킨 혈소판-유래된 성장 인자-BB (PDGF), 및 프랙트알킨을 포함하는 혈관형성 성장 인자를 포함한다.
생체내 혈청 반감기를 개선시키는 적합한 폴리펩티드는 또한 열 쇼크 단백질 (HSP)과 같은 스트레스 단백질을 포함한다. HSP는 세포내에서 일반적으로 발견된다. 이들이 세포외에서 발견되는 경우, 이것은 세포가 죽었거나 그 내용물이 흘러나왔다는 표시이다. 외상, 질병 또는 상해의 결과로서, 세포외 HSP가 면역 시스템으로부터 반응을 일으킬 때, 이러한 프로그래밍되지 않은 세포 치사 (괴사)가 발생한다. 세포외 HSP에 대한 결합은 질병 부위에 본 발명의 조성물의 국소화를 초래할 수 있다.
Fc 운반에 수반되는 적합한 단백질은 예를 들어 브람벨(Brambell) 수용체 (FcRB로서도 공지됨)를 포함한다. 이 Fc 수용체는 두 가지 기능을 지니는데, 두 기능 모두가 전달에 잠재적으로 유용하다. 기능은 (1) 모체에서 아기로의 태반을 통한 IgG의 운반 (2) IgG를 분해로부터 보호하는 것이고, 이에 의해 혈청 반감기가 연장된다. 수용체는 IgG를 엔도솜으로부터 재생시키는 것으로 여겨진다 (Holliger et al , Nat Biotechnol 15(7):632-6 (1997) 참조)
혈청 알부민에 결합되는 dAb
본 발명은 일 구체예에서 TNFR1에 결합되는 항-TNFR1 dAb (제 1 dAb) 및 혈청 알부민(SA)에 결합되는 제 2 dAb를 포함하는 폴리펩티드 또는 길항제 (예컨대, 이중 특이적 리간드)를 제공하며, 제 2 dAb는 1 nM 내지 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 100, 200, 300, 400 또는 500 μM (즉, x 10-9 내지 5 x 10-4), 또는 100 nM 내지 10 μM, 또는 1 내지 5 μM 또는 3 내지 70 nM 또는 1OnM 내지 1, 2, 3, 4 내지 5 μM의 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 KD로 SA에 결합된다. 예를 들어, 표면 플라스몬 공명에 의해 측정시 30 내지 70 nM이다. 일 구체예에서, 제 1 dAb (또는 dAb 단량체)는 약 1, 50, 70, 100, 150, 200, 300 nM 또는 1, 2 또는 3 μM의 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 KD로 SA (예컨대, HSA)에 결합된다. 일 구체예에서, TNFR1에 대한 제 1 항-SA dAb 및 제 2 dAb를 포함하는 이중 특이적 리간드의 경우, 제 2 dAb의 이의 표적에 대한 친화성 (예컨대, 표면 플라스몬 공정, 예컨대 BiaCore를 이용하여 측정된 KD 및/또는 Koff)은 제 1 dAb의 SA에 대한 친화성의 1 내지 100000배 (예컨대, 100 내지 100000배, 또는 1000 내지 100000배, 또는 10000 내지 100000배)이다. 일 구체예에서, 혈청 알부민은 인간 혈청 알부민 (HSA)이다. 예를 들어, 제 1 dAb는 약 10 μM의 친화성으로 SA에 결합되는 한편, 제 2 dAb는 100 pM의 친화성으로 이의 표적에 결합된다. 일 구체예에서, 혈청 알부민은 인간 혈청 알부민 (HSA)이다. 일 구체예에서, 제 1 dAb는 약 50, 예를 들어 70, 100, 150 또는 200 nM의 KD로 SA (예컨대 HSA)에 결합된다. 이중 특이적 리간드의 상세설명은 WO03002609, WO04003019 및 WO04058821에 있다.
본 발명의 리간드는 일 구체예에서 혈청 알부민 (SA)에 1 nM 내지 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 100, 200, 300, 400 또는 500 μM (즉, x 10-9 내지 5 x 10-4), 또는 100 nM 내지 10 μM, 또는 1 내지 5 μM 또는 3 내지 70 nM 또는 1O nM 내지 1, 2, 3, 4 또는 5 μM의 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 KD로 결합되는 dAb를 포함할 수 있다. 예를 들어, 표면 플라스몬 공명에 의해 측정시 30 내지 70 nM이다. 일 구체예에서, 제 1 dAb (또는 dAb 단량체)는 약 1, 50, 70, 100, 150, 200, 300 nM 또는 1, 2 또는 3 μM의 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 KD로 SA (예컨대, HSA)에 결합된다. 일 구체예에서, 제 1 및 제 2 dAb는 링커에 의해 결합되고, 예를 들어 1 내지 4개 아미노산 또는 1 내지 3개 아미노산, 또는 3개를 초과하는 아미노산이나 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개를 초과하는 아미노산의 링커에 의해 결합된다. 일 구체예에서, 효능(길항제에서 하나 또는 둘 모두의 dAb의 KD)을 개선시키기 위해 더 긴 링커 (3개를 초과하는 아미노산)를 이용한다.
리간드 및 길항제의 특정 구체예에서, dAb는 인간 혈청 알부민에 결합되고 알부민과의 결합에 대해 하기로 구성된 군으로부터 선택된 dAb와 경쟁한다:
MSA-16, MSA-26 (이러한 서열의 설명에 대해서는 WO04003019 참조, 그 서열들 및 이들의 핵산 대응물이 본원에 참조로서 포함되고 이들은 본 명세서의 설명의 일부를 구성한다),
DOM7m-16 (서열번호 473), DOM7m-12 (서열번호 474), DOM7m-26 (서열번호 475), D0M7r-1 (서열번호 476), DOM7r-3 (서열번호 477), DOM7r-4 (서열번호 478), DOM7r-5 (서열번호 479), DOM7r-7 (서열번호 480), DOM7r-8 (서열번호 481), DOM7h-2 (서열번호 482), DOM7h-3 (서열번호 483), DOM7h-4 (서열번호 484), DOM7h-6 (서열번호 485), DOM7h-1 (서열번호 486), DOM7h-7 (서열번호 487), DOM7h-22 (서열번호 489), DOM7h-23 (서열번호 490), DOM7h-24 (서열번호 491), DOM7h-25 (서열번호 492), DOM7h-26 (서열번호 493), DOM7h-21 (서열번호 494), DOM7h-27 (서열번호 495), DOM7h-8 (서열번호 496), DOM7r-13 (서열번호 497), DOM7r-14 (서열번호 498), DOM7r-15 (서열번호 499), DOM7r-16 (서열번호 500), DOM7r-17 (서열번호 501), DOM7r-18 (서열번호 502), DOM7r-19 (서열번호 503), DOM7r-20 (서열번호 504), DOM7r-21 (서열번호 505), DOM7r-22 (서열번호 506), DOM7r-23 (서열번호 507), DOM7r-24 (서열번호 508), DOM7r-25 (서열번호 509), DOM7r-26 (서열번호 510), DOM7r-27 (서열번호 511), DOM7r-28 (서열번호 512), DOM7r-29 (서열번호 513), DOM7r-30 (서열번호 514), DOM7r-31 (서열번호 515), DOM7r-32 (서열번호 516), DOM7r-33 (서열번호 517) (이러한 서열의 설명에 대해서는 WO2007080392 참조, 그 서열들 및 이들의 핵산 대응물이 본원에 참조로서 포함되고 이들은 본 명세서의 설명의 일부를 구성한다; 본 단락에서의 서열번호는 WO2007080392에 표시된 것들이다),
dAb8 (dAb1O), dAb 10, dAb36, dAb7r20 (DOM7r20), dAb7r21 (DOM7r21), dAb7r22 (DOM7r22), dAb7r23 (DOM7r23), dAb7r24 (DOM7r24), dAb7r25 (DOM7r25), dAb7r26 (DOM7r26), dAb7r27 (DOM7r27), dAb7r28 (DOM7r28), dAb7r29 (DOM7r29), dAb7r29 (DOM7r29), dAb7r31 (DOM7r31), dAb7r32 (DOM7r32), dAb7r33 (DOM7r33), dAb7r33 (DOM7r33), dAb7h22 (DOM7h22), dAb7h23 (DOM7h23), dAb7h24 (DOM7h24), dAb7h25 (DOM7h25), dAb7h26 (DOM7h26), dAb7h27 (DOM7h27), dAb7h30 (DOM7h30), dAb7h31 (DOM7h31), dAb2 (dAb 4,7,41), dAb4, dAb7, dAb11, dAb12 (dAb7m12), dAb13 (dAb 15), dAb15, dAb16 (dAb21, dAb7m16), dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25 (dAb26, dAb7m26), dAb27, dAb30 (dAb35), dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38 (dAb54), dAb41, dAb46 (dAb 47, 52 및 56), dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7m12, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1 (DOM 7r1), dAb7r3 (DOM7r3), dAb7r4 (DOM7r4), dAb7r5 (DOM7r5), dAb7r7 (DOM7r7), dAb7r8 (DOM7r8), dAb7r13 (DOM7r13), dAb7r14 (DOM7r14), dAb7r15 (DOM7r15), dAb7r16 (DOM7r16), dAb7r17 (DOM7r17), dAb7r18 (DOM7r18), dAb7r19 (DOM7r19), dAb7h1 (DOM7h1), dAb7h2 (DOM7h2), dAb7h6 (DOM7h6), dAb7h7 (DOM7h7), dAb7h8 (DOM7h8), dAb7h9 (DOM7h9), dAb7hlO (DOM7hlO), dAb7h11 (DOM7h11), dAb7h12 (DOM7h12), dAb7h13 (DOM7h13), dAb7h14 (DOM7h14), dAb7p1 (DOM7p1), 및 dAb7p2 (DOM7p2) (이러한 서열의 설명에 대해서는 2008년 2월 8일 출원된 PCT/GB2008/000453 참조, 그 서열들 및 이들의 핵산 대응물이 본원에 참조로서 포함되고 이들은 본 명세서의 설명의 일부를 구성한다). 대안적인 명칭이 dAb 뒤에 괄호로 표시되고, 예컨대 dAb8은 dAb10이라는 대안적인 명칭을 갖고, 즉 dAb8 (dAb10)이다. 이러한 서열들은 도 51a 및 b에도 개시되어 있다.
특정 구체예에서, dAb는 인간 혈청 알부민에 결합되고 하기로 구성된 군으로부터 선택된 dAb의 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 96%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다:
MSA-16, MSA-26,
DOM7m-16 (서열번호 473), DOM7m-12 (서열번호 474), DOM7m-26 (서열번호 475), D0M7r-1 (서열번호 476), DOM7r-3 (서열번호 477), DOM7r-4 (서열번호 478), DOM7r-5 (서열번호 479), DOM7r-7 (서열번호 480), DOM7r-8 (서열번호 481), DOM7h-2 (서열번호 482), DOM7h-3 (서열번호 483), DOM7h-4 (서열번호 484), DOM7h-6 (서열번호 485), DOM7h-1 (서열번호 486), DOM7h-7 (서열번호 487), DOM7h-22 (서열번호 489), DOM7h-23 (서열번호 490), DOM7h-24 (서열번호 491), DOM7h-25 (서열번호 492), DOM7h-26 (서열번호 493), DOM7h-21 (서열번호 494), DOM7h-27 (서열번호 495), DOM7h-8 (서열번호 496), DOM7r-13 (서열번호 497), DOM7r-14 (서열번호 498), DOM7r-15 (서열번호 499), DOM7r-16 (서열번호 500), DOM7r-17 (서열번호 501), DOM7r-18 (서열번호 502), DOM7r-19 (서열번호 503), DOM7r-20 (서열번호 504), DOM7r-21 (서열번호 505), DOM7r-22 (서열번호 506), DOM7r-23 (서열번호 507), DOM7r-24 (서열번호 508), DOM7r-25 (서열번호 509), DOM7r-26 (서열번호 510), DOM7r-27 (서열번호 511), DOM7r-28 (서열번호 512), DOM7r-29 (서열번호 513), DOM7r-30 (서열번호 514), DOM7r-31 (서열번호 515), DOM7r-32 (서열번호 516), DOM7r-33 (서열번호 517) (본 단락에서의 서열번호는 WO2007080392에 표시된 것들이다),
dAb8, dAb 10, dAb36, dAb7r20, dAb7r21, dAb7r22, dAb7r23, dAb7r24, dAb7r25, dAb7r26, dAb7r27, dAb7r28, dAb7r29, dAb7r30, dAb7r31, dAb7r32, dAb7r33, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb11, dAb12, dAb13, dAb15, dAb16, dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7m12, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1, dAb7r3, dAb7r4, dAb7r5, dAb7r7, dAb7r8, dAb7r13, dAb7r14, dAb7r15, dAb7r16, dAb7r17, dAb7r18, dAb7r19, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7hlO, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13, dAb7h14, dAb7p1, 및 dAb7p2.
예를 들어, 인간 혈청 알부민에 결합되는 dAb는 DOM7h-2 (서열번호 482), DOM7h-3 (서열번호 483), DOM7h-4 (서열번호 484), DOM7h-6 (서열번호 485), DOM7h-1 (서열번호 486), DOM7h-7 (서열번호 487), DOM7h-8 (서열번호 496), DOM7r-13 (서열번호 497), DOM7r-14 (서열번호 498), DOM7h-22 (서열번호 489), DOM7h-23 (서열번호 490), DOM7h-24 (서열번호 491), DOM7h-25 (서열번호 492), DOM7h-26 (서열번호 493), DOM7h-21 (서열번호 494), DOM7h-27 (서열번호 495) (본 단락에서의 서열번호는 WO2007080392에 표시된 것들이다),
dAb8, dAb 10, dAb36, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb11, dAb12, dAb13, dAb15, dAb16, dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h1O, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13 및 dAb7h14와 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 96%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산을 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, dAb는 인간 혈청 알부민에 결합되고 DOM7h-2 (서열번호 482), DOM7h-6 (서열번호 485), DOM7h-1 (서열번호 486), DOM7h-7 (서열번호 487), DOM7h-8 (서열번호 496), DOM7h-22 (서열번호 489), DOM7h-23 (서열번호 490), DOM7h-24 (서열번호 491), DOM7h-25 (서열번호 492), DOM7h-26 (서열번호 493), DOM7h-21 (서열번호 494), DOM7h-27 (서열번호 495) (본 단락에서의 서열번호는 WO2007080392에 표시된 것들이다),
dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb38, dAb41, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h1O, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13 및 dAb7h14로 구성된 군으로부터 선택된 dAb의 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 96%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 아미노산 서열 동일성을 지니는 아미노산 서열을 포함한다.
보다 상세한 구체예에서, dAb는 인간 혈청 알부민에 결합되는 Vκ dAb이고 DOM7h-2 (서열번호 482), DOM7h-6 (서열번호 485), DOM7h-1 (서열번호 486), DOM7h-7 (서열번호 487), DOM7h-8 (서열번호 496) (본 단락에서의 서열번호는 WO2007080392에 표시된 것들이다),
dAb2, dAb4, dAb7, dAb38, dAb41, dAb54, dAb7hl, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h1O, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13 및 dAb7h14로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 지닌다.
보다 상세한 구체예에서, dAb는 인간 혈청 알부민에 결합되는 VH dAb이고 dAb7h30 및 dAb7h31로부터 선택된 아미노산 서열을 지닌다.
보다 상세한 구체예에서, dAb는 dAb7h11 또는 dAb7h14이다.
다른 구체예에서, dAb, 리간드 또는 길항제는 인간 혈청 알부민에 결합되고 상기 아미노산 서열의 임의의 CDR 중 하나, 두 개 또는 세 개, 예컨대 dAb7h11 또는 dAb7h14의 CDR 중 하나, 두 개 또는 세 걔를 포함한다.
혈청 알부민에 결합되는 적합한 카멜리드 VHH는 WO 2004/041862 (Ablynx N.V.) 및 WO2007080392 (VHH 서열 및 이들의 핵산 대응물이 본원에 참조로서 포함되고 본 명세서 설명의 일부를 구성한다)에 개시된 것들, 예컨대 서열 A (서열번호 518), 서열 B (서열번호 519), 서열 C (서열번호 520), 서열 D (서열번호 521), 서열 E (서열번호 522), 서열 F (서열번호 523), 서열 G (서열번호 524), 서열 H (서열번호 525), 서열 I (서열번호 526), 서열 J (서열번호 527), 서열 K (서열번호 528), 서열 L (서열번호 529), 서열 M (서열번호 530), 서열 N (서열번호 531), 서열 O (서열번호 532), 서열 P (서열번호 533), 서열 Q (서열번호 534)를 포함하고, 이들 서열은 WO2007080392 또는 WO 2004/041862 (Ablynx N.V.)에 인용된 것들에 상응하는 서열번호이다. 특정 구체예에서, 카멜리드 VHH는 인간 혈청 알부민에 결합되고 WO2007080392에 개시된 ALB1 또는 서열번호 518-534(이들 서열은 WO2007080392 또는 WO 2004/041862에 인용된 것들에 상응하는 서열번호이다) 중 임의의 하나와 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 96%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 리간드 또는 길항체는 혈청 알부민 (예컨대, 인간 혈청 알부민)과의 결합에 대해 본원에 개시된 임의의 항-혈청 알부민 dAb와 경쟁하는 항-혈청 알부민 dAb를 포함한다.
대안적인 구체예에서, 길항제 또는 리간드는 TNFR1(예컨대, 인간 TNFR1)에 특이적인 결합 부분을 포함하고, 여기서 상기 부분은 2008년 2월 8일 출원된 공동-계류중인 출원 PCT/GB2008/000453에 개시된 비-면역글로불린 서열을 포함하며, 이러한 결합 부분, 이들을 생성하고 선택하는 방법 (예컨대, 다양한 라이브러리로부터) 및 이들의 서열에 대한 설명은 본 명세서의 설명의 일부로서 본원에 참조로서 포함된다.
반감기 연장 부분 (예컨대, 알부민)의 컨쥬게이션
일 구체예에서, (하나 이상의) 반감기 연장 부분 (예컨대, 알부민, 트랜스페린 및 이의 단편과 유사체)을 본 발명의 TNFR1-결합 폴리펩티드, dAb 또는 길항제에 컨쥬게이션하거나 결합시킨다. TNFR1-결합 포맷에 사용되는 적합한 알부민, 알부민 단편 또는 알부민 변이체의 예가 WO 2005077042에 개시되어 있고, 이의 설명이 본원에 참조로서 포함되며 본 명세서 설명의 일부를 형성한다. 특히, 하기 알부민, 알부민 단편 또는 알부민 변이체를 본 발명에 이용할 수 있다:
· 서열번호 1 (WO 2005077042에 명시됨, 이 서열은 본 설명에 참조로서 명백하게 포함된다);
· WO 2005077042에 기재된 서열번호 1의 아미노산 1-387을 포함하거나 이로 구성된 알부민 단편 또는 변이체;
· 하기로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 알부민, 또는 이의 단편이나 변이체: (a) WO 2005077042에 기재된 서열번호 1의 아미노산 54 내지 61; (b) WO 2005077042에 기재된 서열번호 1의 아미노산 76 내지 89; (c) WO 2005077042에 기재된 서열번호 1의 아미노산 92 내지 100; (d) WO 2005077042에 기재된 서열번호 1의 아미노산 170 내지 176; (e) WO 2005077042에 기재된 서열번호 1의 아미노산 247 내지 252; (f) WO 2005077042에 기재된 서열번호 1의 아미노산 266 내지 277; (g) WO 2005077042에 기재된 서열번호 1의 아미노산 280 내지 288; (h) WO 2005077042에 기재된 서열번호 1의 아미노산 362 내지 368; (i) WO 2005077042에 기재된 서열번호 1의 아미노산 439 내지 447; G) WO 2005077042에 기재된 서열번호 1의 아미노산 462 내지 475; (k) WO 2005077042에 기재된 서열번호 1의 아미노산 478 내지 486; 및 (1) WO 2005077042에 기재된 서열번호 1의 아미노산 560 내지 566.
TNFR1 결합 포맷에 이용된 적합한 알부민, 단편 및 유사체의 추가의 예가 WO 03076567에 개시되어 있고, 이의 설명은 본원에 참조로서 포함되고 본 명세서 설명의 일부를 구성한다. 특히 하기 알부민, 단편 또는 변이체를 본 발명에 이용할 수 있다:
· WO 03076567, 예컨대 도 3에 개시된 인간 혈청 알부민 (이 서열 정보는 참조로서 본 설명에 명백히 포함된다);
· 화학식 분자량이 66,500인 585개 아미노산의 단일 비-글리코실화된 폴리펩티드 사슬로 구성된 인간 혈청 알부민 (HA) (Meloun, et al , FEBS Letters 58:136 (1975); Behrens, et al , Fed . Proc. 34:591 (1975); Lawn, et al , Nucleic Acids Research 9:6102-6114 (1981); Minghetti, et al , J. Biol Chem. 261:6747 (1986) 참조);
· 문헌[Weitkamp, et al , Ann . Hum . Genet. 37:219 (1973)]에 기재된 알부민의 다형성 변이체 또는 유사체 또는 단편;
· EP 322094에 기재된 알부민 단편 또는 변이체, 예컨대 HA(1-373), HA(1-388), HA(1-389), HA(1-369), 및 HA(1-419)와 1-369 및 1-419 사이의 단편;
· EP 399666에 기재된 알부민 단편 또는 변이체, 예컨대 HA(1-177) 및 HA(1-200) 및 HA(1-X) 사이의 단편, 여기서 X는 178부터 199까지의 임의의 숫자이다.
(하나 이상의) 반감기 연장 부분 (예컨대, 알부민, 트랜스페린 및 이의 단편과 유사체)을 이용하여 본 발명의 TNFR1-결합 폴리펩티드, dAb 및 길항제를 포맷화하는 경우, 이것은 예를 들어 융합 단백질을 엔코딩하는 단일 누클레오티드 구성물을 이용함에 의해 TNFR1-결합 부분 (예컨대, 항-TNFR1 dAb)으로의 직접 융합과 같은 임의의 적합한 방법을 이용하여 컨쥬게이션될 수 있고, 여기서 융합 단백질은 TNFR1 결합 부분에 대해 N- 또는 C-말단에 위치한 반감기 연장 부분을 지니는 단일 폴리펩티드 사슬로서 엔코딩된다. 대안적으로, 컨쥬게이션은 WO 03076567 또는 WO 2004003019에 개시된 펩티드 링커와 같은, 부분들 사이에 있는 펩티드 링커를 이용하여 달성될 수 있다 (이러한 링커 설명은 본 발명에 사용되는 예를 제공하기 위해 본 설명에 참조로서 포함된다). 전형적으로, 생체내 혈청 반감기를 개선시키는 폴리펩티드는 생체내에서 자연적으로 발생하고 유기체 (예컨대 인간)로부터 원치 않는 물질을 제거하는 내인성 메카니즘에 의한 분해 또는 제거에 저항하는 폴리펩티드이다. 예를 들어, 생체내 혈청 반감기를 개선시키는 폴리펩티드는 세포외 매트릭스로부터의 단백질, 혈액에서 발견되는 단백질, 혈뇌장벽이나 신경 조직에서 발견되는 단백질, 신장, 간, 폐, 심장, 피부 또는 뼈에 국한된 단백질, 스트레스 단백질, 질병-특이적인 단백질, 또는 Fc 운반에 관여하는 단백질로부터 선택될 수 있다.
본 설명 전체에 걸쳐 개시된 본 발명의 구체예에서, 당업자는 본 발명의 길항제 또는 리간드에 항-TNFR1 "dAb"를 이용하는 대신, TNFR1에 결합되는 본 발명의 dAb의 CDR 중 하나 이상이나 세 개 모두를 포함하는 폴리펩티드 또는 도메인을 이용할 수 있을 것으로 고려된다 (예컨대, 어피바디, SpA 스캐폴드, LDL 수용체 부류 A 도메인 또는 EGF 도메인과 같은 적합한 단백질 스캐폴드나 골격으로 이식된 CDR). 본 설명은 총괄하여 dAb 대신 이러한 도메인을 이용하는 길항제의 설명을 제공하기 위해 그에 따라 번역되어야 한다. 이와 관련하여, 그 기술이 본원에 참조로서 포함된 2008년 2월 8일 출원된 PCT/GB2008/000453를 참조한다.
따라서, 일 구체예에서, 본 발명의 길항제는 TNFR1에 결합 특이성을 지니는 면역글로불린 단일 가변 도메인이나 도메인 항체(dAb) 또는 이러한 dAb의 상보성 결정 영역을 적합한 포맷으로 포함한다. 길항제는 이러한 dAb로 구성되거나, 이러한 dAb를 본질적으로 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 길항제는 dAb (또는 dAb의 CDR)을 항체 포맷 (예컨대, IgG-유사 포맷, scFv, Fab, Fab', F(ab')2)과 같은 적합 포맷으로 포함하는 폴리펩티드이거나, TNFR1에 결합되는 dAb와 또 다른 표적 단백질, 항원 또는 에피토프 (예컨대, 혈청 알부민)에 결합되는 제 2 dAb를 포함하는 이중 특이적 리간드일 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드, dAb 및 길항제는 당업계에 공지된 다양한 적합한 항체 포맷, 예컨대, IgG-유사 포맷, 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 단일쇄 항체, 이특이적 항체, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 동종이합체 및 이종이합체, 상기한 것들 중 임의의 것의 항원-결합 단편(예를 들어, Fv 단편(예를 들어, 단일쇄 Fv(scFv), 이황화결합으로 결합된 Fv), Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편), 단일 가변 도메인(예를 들어, VH, VL), dAb, 및 상기한 것들중 임의의 것의 변형된 버전(예를 들어, 폴리알킬렌 글리콜(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리부틸렌 글리콜) 또는 기타 적합한 폴리머의 공유결합성 부착으로 변형된 버전)으로 포맷화될 수 있다.
일부 구체예들에서, 본 발명은 IgG-유사 포맷인 리간드(예를 들어, 항-TNFR1 길항제)를 제공한다. 그러한 포맷은 IgG 분자의 통상의 4개 쇄 구조(2개 중쇄 및 2개 경쇄)를 갖는데, 이 포맷에서 하나 이상의 가변 영역(VH 및/또는 VL)이 본 발명의 dAb로 교체된다. 일 구체예에서, 각각의 가변 영역(2개의 VH 영역 및 2개의 VL 영역)은 dAb 또는 단일 가변 도메인으로 교체되며, 상기 가변 영역중 하나 이상이 본 발명에 따른 항-TNFR1 dAb이다. IgG-유사 포맷내에 함유된 dAb(들) 또는 단일 가변 도메인(들)은 동일하거나 상이한 특이성을 지닐 수 있다. 일부 구체예들에서, IgG-유사 포맷은 4가(tetravalent)이고 1가지(항-TNFR1 만), 2가지(예를 들어, 항-TNFR1 및 항-SA), 3가지 또는 4가지 특이성을 지닐 수 있다. 예를 들어, IgG-유사 포맷은 일특이적(monospecific)이고 동일한 특이성을 지니는 4개의 dAb를 포함하거나; 이특이적이고 동일한 특이성을 지니는 3개의 dAb와 상이한 특이성을 지니는 또 다른 dAb를 포함하거나; 이특이적이고 동일한 특이성을 지니는 2개의 dAb와 공통되나 상이한 특이성을 지니는 2개의 dAb를 포함하거나; 삼특이적이고 동일한 특이성을 지니는 제 1 및 제 2 dAb, 상이한 특이성을 지니는 제 3 dAb 및 상기 제 1, 제 2 및 제 3 dAb와 상이한 특이성을 지니는 제 4 dAb를 포함하거나; 사특이적이고 각각이 상이한 특이성을 지니는 4개의 dAb를 포함할 수 있다. IgG-유사 포맷의 항원-결합 단편(예를 들어, Fab, F(ab')2, Fab', Fv, scFv)이 제조될 수 있다. 일 구체예에서, IgG-유사 포맷 또는 이의 항원-결합 단편은 TNFR1과 교차결합하지 않는데, 예를 들어, 이 포맷은 TNFR1에 대해 1가일 수 있다. 보체 활성화 및/또는 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC) 기능이 요망되는 경우, 리간드는 IgG1-사 포맷일 수 있다. 요망되는 경우, IgG-유사 포맷은 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 보체를 수선(fix)하는 활성을 최소화하기 위해 돌연변이된 불변 영역(변이체 IgG 중쇄 불변 영역)을 포함할 수 있다. (예를 들어, 하기 문헌 참조: Winter et al ., GB 2,209,757 B; Morrison et al ., WO 89/07142; Morgan et al ., WO 94/29351, December 22, 1994).
본 발명의 리간드(폴리펩티드, dAb 및 길항제)는 제 2 면역글로불린 단일 가변 도메인에 직접적으로 융합된 제 1 면역글로불린 단일 가변 도메인을 함유한 융합 단백질로서 포맷화될 수 있다. 요망되는 경우, 그러한 포맷은 반감기 연장 모이어티를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 리간드는 혈청 알부민에 결합하는 면역글로불린단일 가변 도메인에 직접적으로 융합된 제 2 면역글로불린 단일 가변 도메인에 직접적으로 융합된 제 1 면역글로불린단일 가변 도메인을 포함할 수 있다.
일반적으로, 표적에 대한 결합 특이성을 지니는 결합 부위를 갖는 폴리펩티드 도메인의 배향(orientation), 및 리간드의 링커 포함 여부는, 디자인 선택의 문제이다. 그러나, 링커를 지니거나 지니지 않는, 일부 배향(orientations)은 다른 배향에 비해 더 나은 결합 특성을 제공할 수 있다. 본 발명에 의해 포괄되는 모든 배향(예를 들어, dAb1-링커-dAb2; dAb2-링커-dAb1)은 스크리닝으로 용이하게 확인될 수 있는 요망되는 결합 특성을 제공하는 배향을 내포하는 리간드이다.
dAb 단량체, 이합체 및 삼합체를 포함하는, 본 발명에 따른 폴리펩티드 및 dAb는, CH2 및 CH3 도메인중 어느 하나 또는 둘 모두와, 임의로 힌지 영역을 포함하는, 항체 Fc 영역에 연결될 수 있다. 예를 들어, Fc 영역에 단일 뉴클레오티드 서열로 연결된 리간드를 엔코딩하는 벡터가 그러한 폴리펩티드를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
게다가, 본 발명은 앞에서 언급한 dAb 단량체의, 이합체, 삼합체 및 폴리머를 제공한다.
코돈 최적화된 서열
상기한 것과 같이, 본 발명의 구체예들은 본 발명의 폴리펩티드와 가변 도메인을 엔코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 하기 예시에서 제시된 것과 같이, 동일한 가변 도메인을 엔코딩하는 약 70%의 동일성을 갖는 코돈 최적화된 서열이 생산될 수 있다(이 경우에 있어서, 가변 도메인 아미노산 서열은 DOM1h-131-206과 동일하다). 이 경우에 있어서, 서열은 피키아 패스토리스(Pichia pastoris)(코돈 최적화된 서열 1-3) 또는 E. coli (코돈 최적화된 서열 4 및 5)에 의한 발현을 위해 최적화되었다.
본 발명자들은 유전자 코드내의 축퇴성을 고려하여 계산을 수행하고, 도 19에 도시된 DOM1h-131-206의 뉴클레오티드 서열(DOM1h-131-206 WT로 아래에 제시된 것과 같은 서열) 및, DOM1h-131-206와 동일한 가변 도메인을 여전히 엔코딩하는, 이론적인 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 각각의 축퇴된 코돈 내의 뉴클레오티드 변화의 갯수를 최대화시켰다. 계산에 의해 이론적인 서열이 도 19에 도시된 DOM1h-131-206의 뉴클레오티드 서열과 단지 57%의 동일성을 지닐 것으로 드러났다.
코돈 최적화된 서열 1
DNA 서열
Figure 112013048225166-pct00001
상응하는 AA 서열
Figure 112013048225166-pct00002
· WT 서열과 74.1%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열
Figure 112013048225166-pct00003
코돈 최적화된 서열 2
DNA 서열
Figure 112013048225166-pct00004
상응하는 AA 서열
Figure 112013048225166-pct00005
· WT 서열과 71.1%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열
Figure 112013048225166-pct00006
코돈 최적화된 서열 3
DNA 서열
Figure 112013048225166-pct00007
상응하는 AA 서열
Figure 112013048225166-pct00008
· WT 서열과 72.6%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열
Figure 112013048225166-pct00009
코돈 최적화된 서열 4
DNA 서열
Figure 112013048225166-pct00010
상응하는 AA 서열
Figure 112013048225166-pct00011
· WT 서열과 76.5%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열
Figure 112013048225166-pct00012
코돈 최적화된 서열 5
DNA 서열
Figure 112013048225166-pct00013
상응하는 AA 서열
Figure 112013048225166-pct00014
· WT 서열과 78.4%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열
Figure 112013048225166-pct00015
예증
실시예 A: 인간 TNFR1에 대한 도메인 항체의 납 선택 & 특성결정
생성된 도메인 항체가 파지 라이브러리에서 유래되었다. 간접적으로(passively) 흡착된 인간 TNFR1에 대한 가용성 선택 및 패닝(panning) 둘 모두를 적절한 표준 방법에 따라 실행하였다. 인간 TNFR1을 가용성 재조합 단백질로서 R&D systems(Cat No 636-R1-025/CF) 또는 Peprotech(Cat no. 310-07)로부터 구매하고, 어느 하나를 직접적으로(패시브 선택의 경우) 사용하거나, 생물학적 검정 및 질량 분광광도기에 의한 이의 분자량(MW)과 비오티닐화 정도에 대한 분석에서, 일차 아민을 통한 커플링을 사용한 비오티닐화에 후속하여 이의 활성에 대한 품질 조절후, 사용하였다. 전형적으로, 매 다음 라운드에서 항원 수준을 감소시키는 것을 이용하면서 3라운드의 선택을 실행하였다.
선택으로부터의 결과물을 항-TNFR1 결합 클론의 존재에 관해 파지 ELISA로 스크리닝하였다. DNA를 이러한 파지 선택으로부터 동정하고 가용성 dAb 단편의 발현을 위한 발현 벡터내로 서브클로닝하였다. 가용성 dAb 단편을 96-웰 플레이트에서 발현시키고, 상층액을 항-c-myc 검출을 수반하는 직접 결합 ELISA 또는 스트렙타비딘/비오티닐화된 TNFR1 BIAcore™ 칩을 사용하는 BIAcore™을 사용하여, 항-TNFR1 결합 dAbs의 존재에 관해 스크리닝하는데 사용하고 오프-레이트에 따라 순위를 정하였다.
하기한 대로, 리드(lead) 분자를 (WO2006038027호에 개시된) DOM1h-131로 지정된, 모 dAb에서 유래되었다. 이 분자를 6OnM의 비오티닐화된 항원을 사용하는 3라운드의 선택 후 파지 디스플레이 라이브러리에서 선택하였다. 스트렙타비딘 또는 뉴트라비딘으로 코팅된 Dyna 비드를 스트렙타비딘 또는 뉴트라비딘중 어느 하나에 대한 결합제(binders)의 선택을 막기 위해 각각의 선택 라운드에서 포획 시약으로써 대신 사용하였다. 이 단계에서 리드 DOM1h-131의 효능은, MRC-5 섬유아세포/IL-8 방출 세포 검정에서 측정한 것과 같이, 피코몰 미만의 범위로 나타났다. BIAcore™으로 측정된 결합 동역학은 전형적으로 패스트-온(fast-on)/패스트-오프(fast-off) 레이트로 나타났다. C-말단에 myc 태그된 모노머와 마찬가지로, 이 DOM1h-131 리드 분자의 E. coli 발현 수준은 이 영역에서 8mg/ℓ이었다.
리드의 친화성 성숙:
DOM1h-131을 보다 높은 효능 및 개선된 생체물리 특성을 지니는 돌연변이체를 생성시키기 위해 친화성 성숙을 겪게 하였다(DOM1h-131 유래 리드의 아미노산 서열에 대해 도 3을 참조바람). 에러-유발 PCR 중합효소(Genemorph II, Stratagene)를 사용하여 에러-유발 라이브러리(dAb 서열 당 평균 1개의 아미노산 변화, 라이브러리 크기 8x107)를 생성시킨 후, 이러한 에러-유발 라이브러리를 사용하는 7라운드의 선택을 실행하였다. 이 전략은, 아미노산 4개의 변화(프레임워크 1(FR1)에 하나, CDR1에 하나, CDR3에 하나 및 FR4에 하나)가 MRC-5 세포 검정으로 측정한 경우 대략 100배의 개선된 효능을 부여한(~4nM) 분자인, 클론 DOM1h-131-8의 분리를 야기시켰다. 이 검정에서, MRC-5 세포를 1시간 동안 시험 샘플과 함께 인큐베이션하고 난 다음 TNF-α(200pg/ml)를 첨가하였다. 밤새 인큐베이션한 후, IL-8 방출을 IL-8 ABI 8200 세포 검출 검정(FMAT)을 사용하여 측정하였다. 각각의 실험은 TNF-α 투여량 곡선을 포함하였다. TNFR1에 대해 결합하는 dAb와 경쟁하도록 사용된 TNF-α의 농도(200pg/ml)는 이 검정에서 최대 TNF-α 반응의 대략 70%였다.
효능을 더 개선시키기 위해, 단일 아미노산 위치를 에러-유발 리드 컨센서스 정보에 의해 제시된 핵심 위치들에서 올리고-유발(oligo-directed) 돌연변이유발로 변형(diversification)시켰다. 이 과정을 진행하는 동안, DOM1h-131-8 클론의 개선된 버전, DOM1h-131-24(정정되기 전 초기에 DOM1h-131-8-2로 호칭됨)를 BIAcore™ 스크리닝으로 분리하였는데, 상기 DOM1h-131-24은 단일 K94R 아미노산 돌연변이(카바트에 따른 아미노산 넘버링)와 200-30OpM의 RBA 효능을 지녔다.
추가로 이 리드 및 이것이 유래된, NNS 라이브러리에 기초하여 에러-유발 라이브러리를 생성시키고 열 처리를 사용한 3라운드의 파지 선택에 적용하였다(열 처리 방법에 대해, 하기 문헌을 참조바람: Jespers L, et al., Aggregation-resistant domain antibodies selected on phage by heat denaturation. Nat Biotechnol. 2004 Sep;22(9):1161-5). 이 선택이 진행되는 동안, 라이브러리를 모았으며(pooled), 2라운드의 선택으로부터 유래된 클론은 dAb, 예컨대, 열에 더 안정한 것으로 간주된 DOM1h-131-53를 양산하였다. 이러한 클론은 더 나은 생물리적 특성들을 보유할 것으로 가정되었다. 클론 DOM1h-131-83을 생성시키기 위해 클론 DOM1h-131-53내의 일부 프레임워크 돌연변이를 생식선에서 유발시켰다(germlined). 상기한 것과 같은 파지 디스플레이 선택을 사용하거나 에멀젼을 사용하는 시험관내 구획화(in - vitro compartmentalization) 기술을 사용하는 올리고-특이적 개별 CDR 돌연변이유발을 통한 추가 변형에 기초하여 이 클론을 형성시켰다. 파지 디스플레이전략으로 리드 DOM1h-131-117 및 DOM1h-131-151을 생성시켰다. 시험관내 구획화 기술로 DOM1h-131-511을 생성시켰다.
이 단계에서, 이러한 3개의 리드를 생물리 및 생물학 검정에서 비교하였고 가장 양호한 특성을 지닌 분자는 DOM1h-131-511이었다. 더 나아가, 이러한 분자들을 트립신 또는 류코자임(leucozyme) 존재시 단백질가수분해 절단에 대한 이들의 내성에 관해 시험하였다. 류코자임은 낭성섬유증을 지니는 환자로부터의 모아진 가래로 이루어지고 높은 수준의 엘라스타아제와 기타 프로테아제를 함유하고 폐 질환에 있어서 생체내 조건에 대한 대리물(surrogate)로 사용하였다. 이 데이터는 3개의 리드 DOM1h-131-117, DOM1h-131-151 및 DOM 1h-131-511 모두가 트립신 또는 류코자임 존재시 급속하게 변성되었음을 제시하였다. 이러한 발견은 환자와 전략에 있어서 트립신에 대한 개선된 내성에 대해 선택되도록 개발될 때 DOM1h-131-511의 생체내 지속성(persistence)에 대한 우려를 야기시켰다. 그러한 개선된 트립신 내성은 분자의 다른 생물물리적 특성에 이로운 영향을 미칠 수 있다고 가정되었다. 본질적으로 표준 파지 선택 방법을 항원에 대한 선택에 앞서 프로테아제의 존재시 선택이 가능하도록 변형하였다. 이것을 달성하기 위해, 신규한 파지 벡터를 조작하였는데, c-myc 태그를 제거하여 디스플레이되는 dAb가 파지에서 절단되어 이탈됨이 없이 트립신 존재시 선택되게 하였다. DOM1h-131-511 기반 에러-유발 라이브러리를 생성시키고 pDOM33 벡터내로 클로닝시켰다(pDOM33 벡터 개열지도에 대해 도 50을 참조바람). 이 라이브러리에서 얻은 파지 스톡(stocks)을 37℃에서 24시간 동안 1 mg/ml 또는 100 μg/ml의 트립신으로 사전-처리하고, 후속하여 적절한 항원에 대한 선택에 앞서 Roche Complete Protease Inhibitors인 프로테아제 억제자(2x)를 첨가하여 트립신 활성을 차단하였다. 4라운드의 선택을 실행하였다. 가용성의 발현된 TNFR1 결합 dAb를 트립신 존재 또는 부재시(100 μg/ml 또는 1000 μg/ml의 최종 트립신 농도에서) 37℃에서 1시간 또는 밤새 인큐베이션이 진행되는 동안 프로테아제와 함께 또는 프로테아제 없이 TNFR1에 결합하는 이들의 활성에 관해 BIAcore™를 사용하여 평가하였다.
이것은 BIAcore™ 항원 결합 실험으로 제시된 것과 같이 개선된 프로테아제 내성을 입증하는 2개의 리드 분자 DOM1h-131-202와 DOM1h-131-206의 분리를 야기시켰다. DOM1h-131-202는 DOM1h-131-511과 대비하여 CDR2내에 단지 하나의 돌연변이(V53D)(모든 아미노산은 카바트를 따름)를 함유하였고, 반면 DOM1h-131-206은 단지 2개의 돌연변이[제 1 돌연변이는 DOM1h-131-202에서의 것과 동일하며(CDR2내의 V53D 돌연변이), 제 2 돌연변이는 FR3내의 Y91H 돌연변이임(도 3 참조)]만을 함유하였다는 것은 흥미롭다. FR3내의 이 Y91H 돌연변이는 3-20 인간 생식선 유전자내에서 발생하는데, 이것은 이러한 잔기가 인간 항체내에서 생성된다는 것을 제시한다. 3개의 클론 DOM1h-131-511, DOM1h-131-202 및 DOM1h-131-206은 도 3에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 지닌다.
분자의 활성을 아래와 같이 측정하였다:
인간 TNFR1에 대한 결합에 관한 DOM1H-131-202, DOM1H-131-511 및 DOM1H-131-206의 BIAcore™ 결합 친화성 평가.
인간 재조합 E. coli-발현 인간 TNFR1에 대한 결합에 관한 DOM 1H-131-202, DOM1H-131-511 및 DOM 1H-131-206의 결합 친화성을 BIAcore™ 분석으로 평가하였다. 비오티닐화된 인간 TNFR1을 사용하여 분석을 진행하여다. 1400 RU의 비오티닐화된 TNFR1을 스트렙타비딘 (SA) 칩 상에 코팅시켰다. 유순한 산 용리 조건을 사용하여 표면을 다시 생성시켰다. 50μl/min의 유속을 사용하여 규정된 농도로 DOM1H-131-202, DOM1H-131-511 및 DOM1H-131-206을 상기 표면에 흘려주었다. 이 작업을 BIAcore™ 3000 상에서 실행하고 데이터를 분석하고 결합의 1:1 모델로 조정하였다. 결합 데이터를 시험된 모든 분자에 대한 1:1 모델에 잘 조정하였다. 모든 KD 값을 k on 및 k off 레이트로부터 계산하였다. BIAcore™ 구동(runs)을 25℃에서 진행하였다.
하기 데이터를 3회의 독립된 실험으로부터 얻었다. 각각의 실험에서, kd의 경우 가장 높은 dAb 농도 및 ka의 경우 보다 낮은 농도를 사용하여 다수의 조정(fits)을 평균하여 결과들을 계산하였다. 데이터는 결과들의 평균과 표준 편차(괄호안)로 제시된다(표 1).
표 1: 인간 TNFR1에 결합하는 DOM1H-131-202, DOM1H-131-511 및 DOM1H-131-206에 대한 BIAcore™ 데이터
Figure 112013048225166-pct00016
DOM1H-131-202, DOM1H-131-511 및 DOM1H-131-206은 인간 TNFR1에 비슷하게 결합하였으며 높은 친화성을 지녔다. D0M1H-131-202 및 D0M1H-131-206은 각각 0.55nM 및 0.47nM의 평균 친화성으로 결합한다. DOM1H-131-202 및 DOM1H-131-206 둘 모두 1.07nM의 평균 친화성을 지닌 DOM1H-131-511과 비교하여 조금 더 나은 친화성을 지닌다.
수용체 결합 검정:
dAb의 효능을 수용체 결합 검정에서 인간 TNFR1에 대해 결정하였다. 이 검정은 TNFR1에 대한 TNF-알파의 결합과 이러한 상호작용을 차단시키는 가용성 dAb의 활성을 측정한다. TNFR1-FC 융합체는 염소 항-인간 IgG(H&L)로 사전-코팅된 비드상에 포획된다. 수용체 코팅된 비드를 측면은 검고 바닥은 투명한 384 웰 플레이트내의 TNF-알파(10ng/ml), dAb, 비오틴 컨쥬게이션된 항-TNF-알파 및 스트렙타비딘 알렉사(alexa) 플루오르(fluor) 647와 함께 인큐베이션한다. 6시간 후, 플레이트를 ABI 8200 Cellular Detection 시스템에서 판독하고 비드 연관 형광을 측정한다. dAb가 TNFR1에 대한 TNF-알파의 결합을 차단하면, 형광 강도가 감소될 것이다.
데이터를 ABI 8200 분석 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 농도 효과 곡선 및 효능(EC50) 값을 GraphPad Prism 및 가변성 기울기를 갖는 S자형 투여량 반응 곡선을 사용하여 결정하였다. 검정을 3개의 별개 실험(occasions)으로 반복하였다. 각각의 실험은 TNF-알파 투여량 곡선을 포함하였다(도 38 및 39). TNFR1에 결합하는 dAb와 경쟁하도록 사용된 TNF-알파의 농도(10ng/ml)는 이 검정에서 최대 TNF-알파 반응의 대략 90%이다.
대표 그래프가 TNFR1에 대한 TNF- 알파의 결합을 억제시키는 dAb의 활성을 보여주는 도 39에 제시되어 있다. 3회의 실험 모두에서, 음성 대조군 샘플[HEL4, 항-계란 흰자 리소자임 dAb 및 VH 더미(dummy)]은 고농도에서 TNF-알파와 TNFR1 사이의 상호작용을 약하게 억제시킨다. 시험 샘플과 양성 대조군(R&D Systems로부터 획득한 항-TNFR1 mAb, mAb225) 및 Enbrel™(에타너셉트(etanercept); IgG1의 Fc 부분에 연결된 TNFR2로 이루어진 이합체 융합체; 류머티스 관절염의 치료제로 승인됨)에 관한 평균 효능(EC50) 값이 표 2에 제시되어 있다.
표 2: 3회 반복된 TNFR1 수용체 결합 검정 실험에서의 D0M1H-131-202, D0M1H-131-206 및 DOM1H-131-511에 대한 효능(EC50) 값.
Figure 112013048225166-pct00017
이 검정에서 DOM1H-131-206은 시험된 다른 2개의 dAb 보다 더 효능이 있는 것으로 드러났고 시중에서 입수가능한 항-TNFR1 mAb, MAB225(R and D Systems)와 유사한 효능을 지닌다.
피키아 패스토리스(Pichia pastoris)로부터의 리드 클론의 발현을 하기한 것과 같이 진행하였다:
3개의 리드 분자의 주요 아미노산 서열을 사용하여 피키아 패스토리스(Pichia pastoris)내에서 분비되는 발현을 위한 코돈 최적화된 유전자를 생산하였다. 코돈 최적화된 DOM1H-131-206와 코돈 비최적화된 DOM1H-131-206 간에는 75% 서열 동일성이 존재한다. 3개의 합성 유전자들을 발현 벡터 pPIC-Zα(Invitrogen)내로 클로닝시키고 난 후 2개의 피키아(Pichia) 균주, X33 및 KM71H로 형질변환시켰다. 다수의 통합체(integrants)를 선택하기 위해 제오신(100, 300, 600 및 900 μg/ml)의 농도를 증가시키면서 형질변환된 세포를 플레이트아웃(plated out)시켰다. 대략, 각 세포주 및 작제물에 관한 15개 클론을 발현 스크리닝을 위해 선택하였다. 고/저 유전자 복제수 및 발현 수준 사이에 상관관계가 피키아 패스토리스(Pichia pastoris)에서 완전히 이해되지 않았으므로, 몇몇 클론을 상기 제오신 농도 범위에 걸쳐 골라내었다. 5L 발효조(fermenter) 구동을 고 생산성을 위해 광범위하게 스크리닝하지 않았던 클론을 사용하여 진행하였다. 이것은 추가 연구를 위한 물질을 상당한 양으로 생산되게 하였다.
단백질 특성결정을 위한 물질 생산:
단백질 A 기반 크로마토그래피 수지는 미생물 배양물 상층액으로부터 VH dAb를 정제하는데 폭넓게 사용되어 왔다. 일반적으로 >90%의 대부분의 경우에서, 이것이 고순도 물질 생산을 위한 단일 단계 정제 방법을 제공하나, 일부 분자의 경우, 낮은 pH 용리 조건이 결과적으로 응집(aggregates)의 형성을 초래할 수 있다. 또한 dAb용 친화성 수지의 제한된 용량에 관한 논쟁거리가 존재하며; 이것은 발효조로부터의 가공을 위하여 상당한 양의 수지를 사용하여야 함을 의미할 것이다. 특성결정 및 추가의 안정성 및 분무 연구를 위한 다량의 물질을 생산하기 위해, 일차 포집 단계로서 혼합된 형식 전하 유도 수지와 후속하여 음이온 교환을 사용하는 다운스트림 정제 공정을 고안하였다. 유의미한 최적화없이, 이것은 ~95%의 순도로 발현된 dAb의 ~70%의 회수를 가능케하였다.
혼합된 형식 전하 유도 수지 상의 포집 단계의 경우, GE Healthcare로부터의 Capto MMC, 컬럼 평형화(equilibration)를 5OmM 인산나트륨(pH 6.0)을 사용하여 실행하고 상층액을 추가 희석 또는 pH 조정 없이 로딩한다. 컬럼을 세척한 후, 단백질을 5OmM Tris(pH 9.0)인 용리 완충액을 사용하는 pH 구배로 용리시킨다. 구체적인 세척 및 구배 조건은 용리되는 단백질의 pI에 따라서 약간 달라질 것이다.
이후 용리물(eluate) 피크를 음이온 교환 크로마토그래피를 사용한 플로우 쓰로우(flow through) 단계로 추가 정제한다. 이것은 잔여 HMW 오염, 예컨대, 알코올 산화효소를 제거시키고 엔도톡신을 감소시킨다. 수지를 염(salt)없이 PBS 또는 포스페이트 완충액(pH 7.4)으로 평형화시킨다. 음이온 교환 수지 상으로 Capto MMC로부터의 용리물을 로딩시, dAb는 결합하지 않고 플로우 쓰로우로부터 회수된다. 엔도톡신과 기타 오염물질은 수지에 결합한다. PBS 사용시 염의 존재는 염을 사용하지 않을 때 달성되는 86%의 회수율보다 이 단계에서 91%까지 단백질 회수율을 개선시킨다. 그러나, 염의 존재는 엔도톡신의 유효성을 감소시키고, 그리하여 염의 포함으로 이 단계 실행후 dAb의 전형적인 엔도톡신 수준은 염이 존재하지 않았을 때 획득된 <1.0EU/ml 수준과 비교하여 58EU/ml로 측정되었다.
단백질 특성결정:
5L 발효조 구동으로 생산된 물질을 전자분사 질량 분광광도기, 아미노 말단 서열분석 및 등전점 전기영동(isoelectric focusing)을 사용하여 동일성에 대해서 특성결정하고 SDS-PAGE, SEC 및 Gelcode 당단백질 염색 키트(Pierce)를 사용하여 순도에 대해 특성결정하였다.
동일성:
각각의 단백질의 처음 5개 잔기의 아미노 말단 서열분석은 예상한 것(EVQLL...)과 동일하였다. 질량 분광광도분석을, 완충액이 C4 Zip-tips (Millipore)을 사용하여 50:50 H2O:0.1% 빙초산을 함유한 아세토니트릴로 교체된, 단백질 샘플에 대해 실행하였다. 3가지 단백질 각각에 대한 측정된 질량은 내부 이황화결합의 형성으로부터의 -2의 질량 차이를 감안할 때 (평균 질량을 이용하여 계산된) 일차 아미노산 서열에 기초한 이론적인 질량의 0.5Da 이내였다. 각각의 단백질에서 상이한 이들의 pI에 기반한 IEF를 사용하여 단백질을 확인하였다.
순도:
3가지 단백질을 1μg 및 lOμg의 양으로 2개 1세트로 비환원 SDS-PAGE 겔 상에 로딩하였다. 모든 경우에서 단일 밴드를 관찰하였다. 또한 순도의 수준을 입증하기 위해 크기 배제 크로마토그래피를 실행하였다. 크기 배제 크로마토그래피(SEC)의 경우, 각 단백질 1OOμg을 0.5ml/min의 유속으로 TOSOH G2000 SWXL 컬럼상에 로딩하였다. 이동상은 PBS/10% 에탄올이었다.
후보자 선택을 위한 dAb 안정성의 조사:
COPD의 징후(indication)의 경우, 예를 들어, 분무기 장치를 사용하여, dAb를 폐내로 전달시키는 것이 필요할 것이다. 이것은 단백질이 사용되는 분무기의 유형에 따라 소정 범위의 전단 스트레스 및 열 스트레스를 잠재적으로 경험할 수 있고 폐 환경내의 프로테아제에 의해 효소적 파괴를 겪게 될 수 있다는 것을 의미할 것이다. 단백질이 이러한 유형의 장치를 사용하여 전달될 수 있는지 여부, 정확한 입자 크기 분포를 형성하는지 여부 및 분무기 전달 후 기능성의 유지 여부를 결정하였다. 따라서, 소정 범위의 물리적 스트레스에 대한 각 분자의 고유의 안정성을 조사하여 기준선 안정성 및 가장 민감한 안정성을 나타내는 검정을 결정하였다. 각 단백질의 안정성이 이것이 용해되는 완충액 용액에 좌우될 수 있기 때문에, 일부 사전-제형화 작업이 필요하였다. 이러한 정보(예컨대, 완충액, pH)가 또한 다운스트림 정제 과정 및 연이은 저장과정이 진행되는 동안 단백질의 안정성을 이해하는데 유용할 것이다. 소정 범위의 물리적 스트레스에 대한 노출이 진행되는 동안 분자에서의 변화를 특성결정하기 위해, 소정의 분석 기법들, 예컨대, 크기 배제 크로마토그래피(SEC), SDS-PAGE 및 등전점 전기영동(IEF)을 사용하였다.
DOM1H-131-202, DOM1H-131-511 및 DOM1H-131-206의 프로테아제 안정성 평가:
DOM1H-131-202, DOM1H-131-511 및 DOM1H-131-206의 프로테아제 안정성을 과량의 프로테아제 중에서 규정된 시점동안 사전-인큐베이션후 잔여 결합 활성에 대한 BIAcore™ 분석으로 평가하였다. 대략 1400RU의 비오티닐화된 TNFR1을 스트렙타비딘(SA) 칩에 코팅시켰다. 250nM의 D0M1H-131-202, DOM1H-131-511 및 DOM 1H-131-206을 1, 3, 및 24시간 동안 30℃에서 오직 PBS와 함께 또는 1OOμg/ml의 트립신, 엘라스타아제 또는 류코자임과 함께 인큐베이션하였다. 반응을 프로테아제 억제자 칵테일을 첨가하여 종결시켰다. 이후 dAb/프로테아제 혼합물을 레퍼런스 세포 공제(subtraction)를 사용하는 TNFR1 코팅 칩상에 흘려주었다. 칩 표면을 각각의 주입 사이클 사이에 1O㎕ 0.1M 글리신(pH 2.2)으로 다시 생성시켰다. 프로테아제와 함께 사전-인큐베이션된 (10 초 경과시의) 인간 TNFR1에 결합된 DOM1H-131-202, DOM1H-131-511 및 DOM1H-131-206의 분획을 프로테아제 없이 결합하는 dAb와 대비하여 결정하였다. BIAcore™ 구동을 25℃에서 진행하였다. 데이터를 3회 독립된 실험으로부터 얻었다. 막대 그래프는 평균값을 나타내고 에러바는 당해 결과의 표준편차를 나타낸다(결과에 대해 도 24 참조바람). DOM1H-131-202 및 DOM1H-131-206가 DOM1H-131-511과 비교하여 트립신, 엘라스타아제 또는 류코자임에 의한 단백질가수분해성 분해에 더 큰 내성을 가진다는 것을 확인하였다. DOM1H-131-511와 비교하여 DOM1H-131-202와 DOM1H-131-206 사이의 차이는 트립신으로 처리후 1시간 및 엘라스타아제 또는 류코자임 처리후 3시간 후 가장 두드러지게 나타난다.
DSC를 사용하여 결정된 열 안정성:
분자가 어떤 pH에서 가장 높은 안정성을 지니는지를 결정하기 위해, 시차주사열량계(differential scanning calorimeter, DSC)를 사용하여 브리튼-로빈슨 완충액 중의 각각의 dAb의 해리 온도(melting temperatures)(Tm)를 측정하였다. 브리튼-로빈슨이 3가지 성분의 완충액 시스템(아세테이트, 포스페이트 및 보레이트)으로 구성되기 때문에, 동일한 용액에서 3 내지 10의 pH 범위를 생성시키는 것이 가능하다. 이론적인 pI를 단백질의 일차 아미노산 서열로부터 결정하였다. DSC로부터, dAb가 이들의 가장 높은 고유의 열적 안정성을 지니는 pH가 D0M1H-131-202 (202)의 경우 pH 7, DOM1H-131-206(206)의 경우 pH 7-7.5 및 DOM1H-131-511(511)의 경우 pH 7.5임을 확인하였다. 연이은 모든 스트레스 연구와 안정성 연구의 경우, 하기 pH를 각각의 dAb에 대해 사용하였다: 브리튼-로빈슨 중에서, D0M1H-131-202(202) 및 D0M1H-131-206(206)의 경우, pH 7.0 및 DOM1H-131-511(511)의 경우, pH 7.5. 결과는 하기 표 3에 요약되어 있다:
표 3: 1mg/ml로 브리튼-로빈슨 완충액 중에서 DSC로 결정된 DOM1H-131-202(202), DOM1H-131-206(206) 및 DOM1H-131-511(511)의 pH 및 Tm에 대한 요약
Figure 112013048225166-pct00018
고유의 용해도 시험:
이들의 최대 용해도와 농축시 회수 수준을 결정하기 위해, 리드 dAb 모두를 원심분리 Vivaspin 농축기(5K 컷-오프)에서 농축하였다. 실험을 가장 안정한 pH에서 브리튼-로빈슨 완충액 내에서 실행하였다. 샘플 부피와 농도를 시간 경과에 걸쳐 측정하고 예상된 농도로부터의 편차를 비롯한 샘플의 회수율을 기록하였다.
모든 단백질이 브리튼-로빈슨 완충액 중에서 100 mg/ml 넘게 농축될 수 있음이 확인하였다. DOM1H-131-202(202)와 DOM1H-131-206(206)은 DOM1H-131-511 (511)과 비교하여 예상한 것보다 더 낮은 회수율을 나타내었으나, 여전히 허용가능한 수준 이내였다.
리드 dAb의 분무기 전달:
다양한 분무기와 제형 완충액을 시험함으로써, dAb가 광범위한 분무기 장치를 사용하여 효과적으로 전달될 수 있다는 것이 입증되었다. 더 중요하게는, 제형화 완충액 중의 dAb의 분무는 단백질 기능성을 유지하면서 효과적인 폐 전달을 위한 (<5μm의 점적의 비율을 사용하여 비교한) 원하는 입자 크기 분포를 양산하였음이 드러났다. 이것은 아래에 더 상세하게 기재되어 있다.
다양한 장치에서의 성능 비교:
DOM1H-131-511(511)을 3가지 주요 액체 제형용 분무기 그룹, 즉, 초음파 분무기, 제트 분무기 및 진동 메쉬(vibrating mesh) 분무기 각각으로부터의 장치를 2개씩 포함하는 6개의 분무기 장치에서 시험하였다. 각각의 장치에서, dAb를 소정 범위의 PEG 농도를 지니는 5mg/ml로 시험하였다. 각각의 샘플에 대해, <5μm의 점적 크기의 비율을 Malvern Spraytek Device(Malvern Instruments Limited, UK)를 사용하여 측정하였고, 결과는 도 35에 제시되어 있다. 분무된 후 각 샘플의 안정성을 SEC를 사용하여 평가하여 컵중의 잔여 물질 및 수집된 에어로졸 둘 모두에서 이합체화된 샘플의 양을 분석하였다. 결과는 도 36에서 확인할 수 있다. 이합체 형성 정도가 더 적으면 적을 수록 안정성은 더 커진다. 대부분의 장치는 정확한 크기 범위에서 액체 제형의 40% 이상을 전달할 수 있으나 eFlow(진동 메쉬 분무기 장치)와 PARI LC(제트 분무기) 장치는 더 나은 성능을 발휘하며, PARI LC*(star) 장치는 PEG가 완충액에 함유된 경우 80% 넘게 전달한다. PEG를 이용한 전달에서의 이러한 증가는 또한 eFlow에서 관찰되며, 규모가 더 적지만, PARI LC+에서 관찰된다.
중요하게도, dAb의 활성은 또한 분무 후에 유지된다는 것이 확인되었다(도 8의 결과를 참조바람)
완충액 첨가제의 효과:
DOM1H-131-511(511)의 더 낮은 안정성 때문에, 5OmM 포스페이트 제형은 전단 스트레스와 열 스트레스 둘 모두로부터 dAb를 보호하기 위해 PEG 1000 및 수크로즈 둘 모두를 함유하였다(1.2%(w/v) 수크로즈를 함유한 5OmM 포스페이트 완충액 중의 약 2% 내지 약 10% PEG 1000의 용액이 점도와 대략 동일한 것으로 규정된 범위 이내의 점도를 지님). DOM1H-131-202(202)와 DOM1H-131-206(206) 둘 모두 더 높은 Tm을 지니고 열 스트레스에 대해 상당히 개선된 안정성을 나타내었기 때문에, 모든 분자를 본래의 제형화 완충액과 브리튼-로빈슨 완충액(상기 제형화 완충액 보다 더 낮은 점도를 지니는 완충액) 둘 모두에서 시험하였다. dAb를 5mg/ml의 단백질 농도로 3.5분의 전개(run) 시간으로 E-flow와 Pari LC+ 장치 둘 모두에서 시험하였고, 입자 크기 분포를 Malvern Spraytek Device를 사용하여 측정하였다. 대조를 위해, 분무기 장치를 사용하여 전달된 낭포성섬유증을 위한 시판되는 약물(표준 단백질 X로 지정됨)을 상기 약물 고유의 제형화 완충액 중에서 시험하였다. 결과는 도 37에 제시되어 있다. 심폐내로의 양호한 전달 및 분배를 위해, 이상적인 입자 크기는 6미크론 미만, 예를 들어, < 5 μm이다. 모든 dAb는 (앞서 기재한 것과 같이) 브리튼-로빈슨 완충액과 제형화 완충액 둘 모두에서 5 μm 미만이었던 입자 크기와 거의 유사한 수준을 제시한다. 그러나, 더 높은 점도의 제형화 완충액은 정확한 크기 범위 이내의 입자, 예를 들어, <5 μm의 입자를 생산하는데 특히 이로울 수 있다. 장치의 컵내의 dAb의 농도를 분무 전후에 A280 측정으로 결정하였다. 단백질 농도가 현저하게 변하지 않았음이 확인되었는데, 이것은 단백질과 비히클 둘 모두가 전달되는 동안 차별적으로(preferentially) 분무되지 아니함을 제시한다.
결론:
폴리펩티드, 예컨대, dAb가 소정 범위의 시중에서 입수가능한 분무기로 분무될 수 있으며 중요하게도 이들이 분무 후에도 안정성과 생물학적 활성을 보유하며 분무 후 관찰되는 유의미한 응집은 비존재한다는 것이 앞에서 기술한 바와 같이 입증되었다. 점도 향상 부형제, 예컨대, PEG가 완충액 제형에 첨가된 경우, 입자 크기 분포와 5μm 미만 크기의 소적 비율이 개선될 수 있으며, 그에 따라 심폐로의 dAd 전달이 잠재적으로 개선될 수 있다.
dAb의 폐로의 전달은 또한 dAb 안정성 또는 활성에서의 임의의 감소 없이 dAb 농도(예를 들어, 최대 약 40mg/ml의 농도)와 전달 시간을 증가시킴으로써 개선될 수 있다.
실시예 1
파지 벡터 pDOM13
섬유상(filamentous) 파지(fd) 디스플레이 벡터, pDOM13을 사용하였다. 이벡터는 파지 코트 단백질 III를 지니는 융합 단백질을 생산한다. pDOM13의 다중 클로닝 부위는 도 1에 도시되어 있다. dAb를 엔코딩하는 유전자를 SalⅠ/NotⅠ 단편으로 클로닝하였다.
실시예 2
트립신에 대한 소정 범위의 내성을 지니는 파지-디스플레이된 도메인 항체(dAbs)에 대한 프로테아세 선택 시험
IL-IR1에 결합하는 DOM4-130-54 dAb, TNFR1에 결합하는 DOM1h-131-51 dAb, 및 VEGFA에 결합하는 DOM15-10, DOM15-26와 DOM15-26-501 dAb를 엔코딩하는 유전자를 pDOM13에 클로닝하고, 이러한 dAb들을 디스플레이하는 파지들을 표준 기법에 따라서 생산하였다. 파지를 PEG 침전으로 정제하고, PBS에 재현탁시키고, 역가측정하였다(titered).
상기 dAb들은 분리된 단백질로 시험한 경우 트립신에 의한 파괴에 저항하는 소정 범위의 활성을 나타내었다. 파괴에 대한 내성을 하기와 같이 평가하였다: PBS 중의 dAb(1mg/ml)를 40 μg/ml로 트립신과 함께 30℃에서 인큐베이션하여, 그 결과 25:1의 dAb:트립신 분자비가 얻어졌다. 샘플(30 μl)을 트립신 첨가 직전에 채취하고, 이후 T=1시, 3시, 및 24시에 채취하였다. 프로테아제 활성을 Roche Complete Protease Inhibitors(2x)의 첨가로 중화시키고 연이어 액체 질소 중에 담그고, 드라이 아이스에 저장하였다. 15 μg의 dAb 샘플 각각을 후속하여 Novex 10-20% Tricine 겔상에서의 전기영동으로 분석하고 단백질을 SureBlue(1x)로 염색하였다. DOM15-10 및 DOM15-26-501 둘 모두는 처음 3시간 동안 상당히 절단되었다.
DOM15-26, DOM4-130-54 및 DOM1h-131-511은 더 안정하였으며, dAb의 절단은 24시간 경과후에 겨우 명확해졌다(도 2).
파지-디스플레이된 dAb를 또한 트립신 존재하에 인큐베이션하여 파지-디스플레이된 dAb의 트립신 내성이 분리된 가용성 dAb로 획득된 결과와 상관관계가 있는지 여부를 평가하였다. 다양한 농도의 트립신 및 인큐베이션 시간으로 평가하였다. 모든 경우에 있어서, Roche Complete Protease Inhibitors로 트립신을 중화시킨후, 파지를 제너릭 리간드에 결합하는 이들의 활성에 대해 시험하였다: 모든 VH 도메인 항체(예를 들어, DOM1h-131, D0M15-26, DOM15-26-501)에 결합하는, 단백질 A 또는 모든 VK 도메인 항체(예를 들어, D0M4- 130-54, DOM15-10)에 결합하는, 단백질 L. 파지를 또한 표적 항원에 대한 결합에 관해 시험하였다. 두 경우에 있어서, 결합은 단백질가수분해에 대한 내성을 통한 dAb 구조적 통합성의 유지와 상관관계가 있는 것으로 추정되었다. 결합 활성을 (파지에 대한 컨쥬게이션된 항체를 사용한) ELISA에 의해 또는 결합된 파지의 용리 및 지수적으로 성장하는 E. coli TG1 세포의 감염후 역가 분석으로 측정하였다.
파지상의 DOM15 -10, DOM15 -26 및 DOM15 -26- 501으로의 시험
각각의 dAb를 실온에서 1시간 동안 소정 범위의 트립신 농도(100 μg/ml, 10 μg/ml 및 0 μg/ml)로 처리하였다. 트립신 활성을 Roche Complete Protease Inhibitor(1X)로 차단하고 이후 파지를 PBS중의 2% Marvell로 희석하고, 실온에서 1시간 동안 50nM의 비오티닐화된 항원(재조합 인간 VEGF(R&D systems))과 함께 인큐베이션하였다. PBS 중의 2% Marvell로 실온에서 1시간 동안 사전-차단시킨 스트렙타비딘-코팅된 비드(Dynabeads M-280(Invitrogen))를 첨가하고, 이후 혼합물을 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. Dynabead와의 모든 인큐베이션 단계를 로테이팅 휠(rotating wheel)상에서 수행하였다. 상기 비드를 1 ml의 PBS 중의 0.1% Tween-20으로 8회 세척함으로써 비결합된 파지를 세척시켰다. 결합된 파지를 0.5 ml의 0.1 M Glycine(pH 2.2)로 용리시키고, 100 μl의 1M Tris-HCL(pH 8.0)으로 중화시켰다. 용리된 파지를 사용하여 지수적으로 성장중인 TG1 세포에 감염시키고(37℃에서 1시간) 테트라사이클린 플레이트에 플레이팅하였다. 플레이트를 밤새 37℃ 인큐베이션하고 콜로니 계측을 수행하였다(표 4 참조). 최상의 결과를 100 μg/ml 트립신과 인큐베이션한 선택으로부터 관찰하였다. DOM15-10과 DOM15-26-501과 비교하여 DOM15-26의 수율은 약 10배 증가하였다.
더 극심한 인큐베이션 조건하에서 이러한 결과를 추가로 확증하기 위해 제 2 실험을 실행하였다. 진탕(250rpm)과 함께 37℃에서 1시간 또는 2시간 동안 파지 디스플레이된 dAb를 처리하였다. 최상의 결과는 100ug/ml 트립신과 함께 2시간 인큐베이션한 선택으로부터 관찰되었다. DOM15-26의 수율은 DOM15-26-501의 수율을 200배 초과하였고 DOM15-10의 수율을 1000배 초과하였다.
제 3 실험에서, DOM15-26과 DOM15-26-501을 디스플레이하는 파지를 처음에 1:1로 혼합하였다. 이후 상기 파지를 트립신(1000 μg/ml)과 함께 또는 트립신 없이 37℃에서 진탕(250 rpm)과 함께 2시간 동안 인큐베이션하고 난 다음, 상기한 것과 같이 항원 결합에 대해 선택하였다. 각각의 선택으로부터의 콜로니의 서열분석은 종종 트립신의 사전-처리가 없는 선택의 경우 혼재된 클론 개체군을 드러냈으며(DOM15-26: 4/10; DOM15-26-501: 6/10), 반면 트립신으로 처리된 경우의 선택으로부터의 모든 클론은 예상된대로 DOM15-26을 엔코딩하였다.
이러한 실험들은 선택압이 dAb를 디스플레이하는 파지에 대해 프로테아제를 부가함으로써 획득될 수 있고, 그래서 단백질가수분해에 가장 안정한 dAb를 디스플레이하는 파지가 (본래의 리간드 또는 항원에 대한 패닝후) 우선적으로 선택된다는 것을 제시한다.
표 4
Figure 112013048225166-pct00019
파지에 대한 DOM4 -130-54으로의 시험
DOM4-130-54를 상기한 것과 유사한 프로토콜로 시험하였다. 달라진 파라미터들은 다음과 같다: 트립신 농도, 온도 및 인큐베이션 기간. 바이오패닝을 PBS 중의 1nM로 IL-RI-Fc(IL-1RI와 Fc의 융합체)에 대해 실행하였다. 파지 역가에서의 상당한 감소는 파지를 37℃에서 밤새 100 μg/ml의 트립신과 함께 인큐베이션한 후에 유일하게 관찰되었다(표 5 참조).
표 5
Figure 112013048225166-pct00020
DOM1h -131 파지로의 시험
DOM1h-131 파지(아미노산 서열로 DOM1h-131-511와 밀접하게 관련됨)를 실온에서 1시간 동안 0 μg/ml, 10 μg/ml, 100 μg/ml 및 1000 μg/ml 트립신으로 처리하였다. 절단을 25x Complete Protease Inhibitors(Roche)의 첨가로 억제시켰다. 파지의 연속 2배 희석을 1nM TNFRI로 코팅된 ELISA 플레이트에서 실행하고, 결합 파지를 항-M13-HRP로 검출하였다. 결과는 하기 표 6에 제시되어 있다.
표 6
Figure 112013048225166-pct00021
이러한 시험 실험은 100 μg/ml의 트립신과 37℃의 온도가 트립신에 의한 단백질가수분해에 대한 다양한 내성도의 dAb를 디스플레이하는 파지에 대한 선택압을 적용하는데 적절하다는 것을 명확하게 보여준다. 프로테아제와의 인큐베이션 시간은, 원하는 경우, 각각의 파지-디스플레이된 dAd에 관해 최적화될 수 있다.
실시예 3
도메인 항체의 파지-디스플레이된 레퍼토리에 대한 프로테아제 선택
4개의 레퍼토리를 모 분자로서 하기 dAb를 사용하여 생성시켰다: DOM4-130-54, DOM1h-131-511, DOM15-10 및 DOM15-26-555. 무작위 돌연변이를 Stratagene Mutazyme II 키트, 비오티닐화된 프라이머 및 50 μl 반응을 위한 5-50 pg의 주형을 사용한 PCR로 유전자내로 도입하였다. SalⅠ과 NotⅠ으로의 절단후, 삽입체를 스트렙타비딘-코팅된 비드로 비절단된 생성물로부터 정제하고 pDOM13의 상응하는 부위에 라이게이션시켰다. E. coli TBl 세포를 정제된 라이게이션 믹스로 형질변화시켜 그 결과 테트라사이클린-내성 클로의 거대 레퍼토리를 얻었다: 8.5 x 108(D0M4-130-54), 1.5 x 109(DOM1h-131-511), 6 x 108(DOM15-10) 및 3 x 1O9(DOM15-26-555).
파지 라이브러리를 PEG로의 이중 침전으로 제조하고 PBS에 재현탁시켰다.
아미노산 돌연변이의 비율은 DOM1h-131-511와 DOM4-130-54 각각의 경우, 2.3과 4.4이었다. 단백질 A 또는 단백질 L(1 μg/ml)로 코팅된 웰을 사용하는 파지 ELISA로 96개 클론을 시험함으로써 기능성을 평가하였다. DOM1h-131-511와 DOM4-130-54 레퍼토리에서, 각각, 62.5%와 27%의 클론이 dAd의 기능성 디스플레이를 나타내었다.
아미노산 돌연변이의 비율은 DOM15-10와 DOM15-26-555 각각의 경우, 2.5와 4.6이었다. 단백질 A 또는 단백질 L(1 μg/ml)로 코팅된 웰을 사용하는 파지 ELISA로 96개 클론을 시험함으로써 기능성을 평가하였다. DOM15-10와 DOM15-26-555 레퍼토리에서, 각각, 31.3%와 10.4%의 클론이 dAd의 기능성 디스플레이를 나타내었다.
DOM4 -130-54와 DOM1h -131-511 레퍼토리
4라운드의 선택을 이러한 라이브러리들에 실행하여 개선된 프로테아제 내성을 지니는 dAd를 선택하였다.
제 1 라운드의 선택을 고 친화성을 지니는 항원과 더 이상 결합하지 않은 임의의 클론을 제거할 목적으로 라이브러리를 청소하기 위한 프로테아제 처리 없이 결합하는 항원(1nM 또는 1OnM 항원)으로 실행하였다. 1라운드로부터의 결과물은 (1011 파지 투입량과 대비하여) 108-1010 범위이내였는데, 이는 라이브러리의 대부분이 고 친화성을 지니는 항원에 결합되었음을 제시한다.
2 라운드에서, 100 μg/ml 트립신으로의 프로테아제 처리를 도입하였고, 결과물은 하기 표 7에 제시된 것과 같다:
표 7
Figure 112013048225166-pct00022
dAb를 37℃에서 밤새 트립신으로 처리했을 때 유의미한 선택이 존재하였다. 이 결과물을 3라운드에 적용하였는데, 여기서 파지를 37℃에서 24시간 동안 1 mg/ml 또는 100 μg/ml 트립신으로 처리하였다. 3라운드로부터의 트립신으로 처리된 파지의 역가는 DOM1h-131-511 레퍼토리의 경우 105-106이었고 DOM4-130-154 레퍼토리의 경우 107-108이었다.
3라운드로부터의 모든 결과물(1 mg/ml와 100 μg/ml의 DOM1h-131-511과 DOM4-130-154)을 100 μg/ml 트립신과 함께 1nM 항원에 대하여 제 4라운드의 선택에 적용하였다. 역가는 3라운드에서 드러난 것과 유사하게 106-108 범위 이내였다. 일부 농축(enrichment)이 DOM1h-131-511 레퍼토리의 경우 관찰되었으나, D0M4-130-54 레퍼토리의 경우 어떠한 농축도 관찰되지 않았다.
DOM15 - 10및 DOM15 -26-555 레퍼토리
제 1 라운드 선택을 2nM 비오티닐화된 hVEGF(인간 혈관 내피 성장 인자) 농도 및 고 친화성으로는 항원에 더 이상 결합하지 않은 임의의 클론을 제거할 목적으로 라이브러리를 청소하기 위한 프로테아제 처리 없이 실행하였다. 1라운드로부터의 결과물은 (DOM15-10의 경우 1010 파지 및 DOM15-26-555의 경우 1011 파지의 투입량과 비교하여) 약 108이었고, 이것은 라이브러리의 대부분이 고 친화성으로 항원에 결합하였음을 제시한다.
제 2 및 제 3 라운드의 선택을 2nM 비오티닐화된 hVEGF로 실행하였다. hVEGF에 대한 패닝에 앞서, 파지를 진탕기(250 rpm)에서 37℃에서 트립신(100 μg/ml)의 존재하에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 시간을 DOM15-10 레퍼토리의 경우 1시간이었고, DOM15-26-555 레퍼토리의 경우 2시간이었다.
결과물은 다음과 같았다: DOM15-10 레퍼토리로의 제 2 및 제 3 라운드의 선택의 경우 1.5x1O6 및 9x1O5이었고; DOM15-26-555로의 제 2 및 제 3 라운드의 선택의 경우 2.2x1O8 및 3.9x1O9이었음.
실시예 4
선택 결과물에 대한 분석: DOM4 -130-54 및 DOM1h -131-511 레퍼토리
제 3 및 제 4 라운드로부터의 모든 결과물을 pDOM5 벡터내로 서브클로닝하고 상기 벡터로 JM83 세포를 형질변형시켰다. pDOM5 벡터는 pUC119-기반 벡터이다. 단백질의 발현은 Plac 프로모터에 의해 유도된다. GAS1 선도 서열(WO 2005/093074 참조)은 분리된, 가용성 dAb의 주변질 및 E. coli JM83의 배양 상층액으로의 분비를 보장하였다. 발현을 위해 제 3 라운드 및 제 4 라운드로부터의 96개 및 72개 개별 콜로니를 무작위로 골라내었다.
12-24개 클론을 각각의 제 3 라운드 및 제 4 라운드 결과물로부터 서열분석하였다. 컨센서스 돌연변이를 두 선택로부터 관찰하였고, 추가 특성결정을 위해 컨센서스 모티프를 지닌 대략 25개 클론을 선택하였다. 이러한 클론들의 아미노산 서열은 도 3(DOM1h-131-511에서 선택된 변이체)과 도 4(D0M4-130-54에서 선택된 변이체)에 제시되어 있고 도 19A-19L에 DNA 서열이 나열되어 있다. 선택된 클론들에서 모 서열과 상이한 아미노산이 강조되어 있다(동일한 아미노산은 점으로 표시되어 있다). CDR1, CDR2 및 CDR3에 상응하는 루프는 박스로 표시되어 있다.
이러한 클론들을 단백질 L(DOM4-130-54 변이체의 경우) 및 단백질 A(DOM1h-131-511 변이체의 경우)에 대해 대량으로 발현시켰고, 상기 클론들을 트립신(100 μg/ml 또는 1000 μg/ml의 최종 농도) 존재 또는 부재하에 37℃에서 1시간 인큐베이션후 또는 밤새 인큐베이션후 BIAcore로 항원 결합에 대해 시험하였다.
일반적으로, DOM4-130-54 선택로부터의 결과물은 더 안정적이었는데, 대부분의 클론들은 1시간 동안 트립신에 대해 내성을 유지하였으며 최고의 클론들은 밤새 내성을 나타내었다. 대조적으로, DOM1h-131-511 선택로부터의 소수의 클론들은 1시간 동안 트립신에 내성을 나타내었으며, 한편 어떠한 클론들도 밤새 내성을 나타내지 않았다.
실시예 5
선택 결과물에 대한 분석: DOM15 -10 및 DOM15 -26-555 레퍼토리
트립신 사전-처리를 이용한 선택의 유효성을 제일 먼저 트립신 절단과 함께 또는 트립신 절단 없이 모노클로날 파지 ELISA로 시험하였다. 각각의 라이브러리의 제 2 라운드 선택으로부터의 18개의 콜로니들과 제 3 라운드로부터의 24개 콜로니들을 골라내었다. 클론 DOM15-10, DOM15-26-501 및 DOM15-26을 대조군으로 사용하였다. 추가 콜로니들은 제 2 및 제 3 라운드의 트립신 선택 후 각각의 라이브러리로부터의 증폭되고 정제된 파지 용액을 포함하였다.
각각의 파지 샘플을 2개의 분획으로 나누었고, 첫번째 분획을 100ug/ml 트립신으로 처리하였고, 두번째 분획을 트립신으로 처리하지 않았다. 두 분획의 인큐베이션을 진탕과 함께 37℃에서 1시간 동안 진행하고 Roche Complete Protease Inhibitor(1x)를 첨가하여 중단시켰다. 파지 ELISA를 트립신으로 절단된 샘플과 비절단된 샘플을 사용하여 실행하였다.
ELISA 웰을 1 μg/ml 농도의 0.1M 바이카보네이트 완충액 중의 뉴트라비딘으로 코팅시켰다. PBS를 이용한 세척 및 실온에서 1시간 동안 PBS중의 1% Tween-20으로의 항원-코팅된 웰의 차단 단계를 거친후, 웰을 100ng/ml의 농도로 PBS중의 1% Tween-20에서 희석시킨 비오티닐화된 hVEGF로 코팅시켰다. 그 다음, 웰을 PBS로 세척하고 1% Tween-20/PBS로 1:1로 희석시킨 처리 또는 비처리된 파지 상층액을 첨가하였다. 37℃에서 30분간 인큐베이션후, 웰을 1% Tween-20/PBS로 세척하고, 후속하여 항-M13 파지-HRP 컨쥬게이트(1% Tween-20/PBS 중에서 1/5000으로 희석시킴)과 함께 37℃에서 30분동안 인큐베이션하였다. 이후 웰을 PBS 및 퍼옥시다제로 세척하였다. 반응을 SureBlue 시약을 첨가하여 개시시켰다. 약 10분후, 반응을 등가 부피의 1M HCl로 종결시키고 웰을 OD450nM에서 판독하였다.
트립신으로 처리한 불안정한 대조군 DOM15-10 및 DOM15-26-501에 대한 ELISA 판독은 0.404 미만의 OD450을 나타내었고 이러한 값은 불안정한 클론의 경계값으로 가정하였다. 0.404 미만의 OD를 나타내느 모든 샘플을 분안정한 것으로 간주하였다. 상기 값을 초과하는 모든 샘플을 안정한 것으로 간주하였다.
표 8
Figure 112013048225166-pct00023
표 8은 각각의 라이브러리의 제 2 및 제 3 라운드의 트립신 선택 후 안정한 클론의 비율을 보여준다. 트립신 내성 클론의 농축은 제 3 라운드의 선택 후 두 라이브러리에서 육안으로 관찰가능하다. 각각의 선택 후 증폭되고 정제된 파지 믹스를 함유한 대조군 ELISA 웰의 값은 트립신 절단 후 각각의 경우에서 0.404를 훨씬 더 초과하였다. 더욱이, 제 3 라운드의 선택으로부터의 트립신-치리된 파지와 제 2 라운드의 선택으로부터의 트립신-처리된 파지를 비교할 때 신호의 적은 증가를 관찰하였다. DOM15-10 파지 라이브러리는 시작값에서 약 14%의 증가를 나타내었다. DOM15-26-555 파지 라이브러리는 시작값에서 약 2%의 증가를 나타내었다.
전반적으로, 이러한 결과들은 트립신 사전-처리로의 선택이 DOM15-10 및 DOM15-26-555 레퍼토리로부터의 트립신-내성 파지 클론을 선택하는데 효과적임을 제시한다.
제 2 및 제 3 라운드 선택(DOM15-26-555)과 오직 제 3 라운드 선택(DOM15- 10)으로부터의 모든 결과물을 pD0M5 벡터내로 서브클로닝하고 이 벡터로 HB2151 전자수임(electrocompetent) 세포를 형질변환시켰다. pD0M5 벡터는 pUC119-기반 벡터이다. 단백질의 발현은 Plac 프로모터에 의해 유도된다. GAS1 선도 서열은 분리된, 가용성 dAd의 주변질 및 E. coli HB2151의 배양 상층액으로의 분비를 보장하였다. 각각의 선택 라운드(제 3 및 제 4)로부터의 184개의 개별 콜로니들을 발현을 위해 1 ml 배양 부피로 무작위로 골라내었다.
박테리아 상층액을 HBS-EP BIAcore 완충액(1:1 부피비)으로 희석시키고 2개로 나누었다. 트립신을 20 μg/ml의 최종 농도로 한개의 바이얼에만 첨가하였다. 인큐베이션을 진탕(250 rpm)과 함께 37℃에서 40분 동안 실행하였다. Roche Complete Protease Inhibitor(1X)로 반응을 차단시킨 후, 트립신 처리된 파지 상층액과 트립신 비처리된 파지 상층액 둘 모두를 BIAcore 3000상에서 항원 결합에 관해 시험하였다(SA 센서칩상의 2,000 RU의 비오티닐화된 hVEGF).
클론을 골라내는 기준은 다음과 같다: (선택된 시점에 도달될 최대 RU에 기초하여) 비처리된 dAb와 대비한 트립신 처리된 dAb의 항원 결합에 있어서의 <15%의 감소[이것은 일반적으로 프로테아제 처리에 대한 dAb 안정성을 반영할 수 있음]; 및 항원으로부터의 dAb의 해리가 진행되는 동안 2 시점 사이에 <40%의 오프레이트 감소. 이러한 값들에 기초하여, DOM15-26-555 라이브러리의 제 2 및 제 3 라운드 선택 둘 모두로부터의 60개 클론과 DOM15-10 라이브러리의 제 3 라운드 선택으로부터의 17개 클론을 서열분석하였다. 컨센서스 돌연변이들이 두 라이브러리의 결과물에서 관찰되었으며 추가 특성결정을 위해 각각의 라이브러리로부터 컨센서스 모티프를 지닌 17개 클론들을 선택하였다. 이러한 클론들의 아미노산 서열은 도 5(DOM15-26-555 에서 선택된 변이체)과 도 6(DOM15-10에서 선택된 변이체)에 제시되어 있고 도 20A-20E에 DNA 서열이 나열되어 있다. 선택된 클론들에서 모 서열과 상이한 아미노산이 강조되어 있다(동일한 아미노산은 점으로 표시되어 있다). CDR1, CDR2 및 CDR3에 상응하는 루프는 박스로 표시되어 있다.
이러한 클론들을 50 ml 발현 배양물내에서 발현시키고, 단백질 L(DOM15-26-555 변이체의 경우) 및 단백질 A(DOM15-10 변이체의 경우)에 대해 정제하고, HBS-EP로 10OnM 농도로 희석시키고, 트립신(20 μg/ml의 최종 농도) 존재 또는 부재하에 진탕시키면서(250rpm) 37℃에서 1.5시간 인큐베이션후 BIAcore로 항원 결합에 대해 시험하였다.
이러한 클론들을 또한 실시예 2에 기술한 방법을 사용하여 트립신 내성에 관해 시험하였다. 단백질을 PBS로 완충액을 교체하여 완충시키고 1 mg/ml로 농축시켰다. 25 μg의 단백질을 1μg의 트립신(Promega)과 함께 혼합하고 30℃에서 0시간 및 24시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 시점 경과후, 반응을 Roche Complete Protease Inhibitor(1X)로 차단시키고, DTT를 비롯한 로딩제(loading agent)를 첨가하였다. 샘플을 100℃에서 5분간 변성(denaturation)시켰다. 이후, 15 μg의 각각의 샘플을 Novex 10-20% Tricine 겔 상의 전기영동으로 분석하고 단백질을SureBlue(1x)로 염색하였다.
일반적으로, DOM15-26-555 선택으로부터의 결과물은 더 안정하였는데, 대부분의 클론들은 BIAcore상에서 시험한 경우 1.5 시간 동안 그리고 SDS-PAGE 상에서 전개된 경우 밤새 트립신에 대한 내성을 유지하였다. 대조적으로, DOM15-10 선택으로부터의 소수의 클론들만이 SDS-PAGE 상에서 전개된 경우 밤새 처리 동안 트립신에 대한 내성을 나타내었다.
실시예 6
DOM1h -131-511 변이체의 확인
DOM1h-131-203, DOM1h-131-204 및 DOM1h-131-206을 더 자세하게 분석하였다. 이들을 상이한 농도의 트립신(0 내지 100 μg/ml 범위)으로 밤새 37℃에서 인큐베이션한 후 50OnM의 dAb 농도에서 BIAcore상에서 비교하였다. BIAcore 추적(traces)은 도 7에 제시되어 있다. 결과는 명백하게 두 변이체들이 높은 트립신농도에서(100 μg/ml) 단백질가수분해에 대해 이들의 모분자(parent)에 비해 보다 내성임을 보여준다. 2가지 dAb(DOM1h-131-202 및 DOM1h-131-206)를 또한, 100 μg/ml의 프로테아제 농도로, 상기한 조건하에서, 류코자임, 엘라스타아제 및 판크레아틴을 포함하는 소정 범위의 다른 프로테아제에 대하여 이들의 모 분자와 비교하였다. dAb는 시험된 모든 프로테아제에 대하여 모 분자에 비해 단백질가수분해에 대한 증가된 내성을 나타내었다. 엘라스타아제 및 류코자임에 대한 BIAcore 추적은 도 8에 제시되어 있다.
5μM의 각각의 dAb를 0, 1, 3 및 24시간 동안 100 μg/ml의 서열분석 등급 트립신으로 처리하였다. 반응을 25X Roche Complete Protease Inhibitor로 억제시키고 반응을 4-12% Novex Bis-Tris 겔상에서 전개시켰다. 겔은 도 9에 도시되어 있다.
실시예 7
D0M4 -130-54 변이체의 확인
D0M4-130-201 및 D0M4-130-202을 더 자세하게 분석하였다. 이들을 상이한 농도의 트립신(0 내지 100 μg/ml 범위)으로 밤새 37℃에서 인큐베이션한 후 50OnM의 dAb 농도에서 BIAcore상에서 비교하였다. BIAcore 추적은 도 10에 제시되어 있다. 결과는 명백하게 3개의 변이체들 모두가 높은 트립신 농도에서(100 μg/ml) 단백질가수분해에 대해 이들의 모분자에 비해 보다 내성임을 보여준다. DOM4-130-201 및 DOM4-130-202를 또한, 100 μg/ml의 프로테아제 농도로, 상기한 조건하에서, 류코자임, 엘라스타아제 및 판크레아틴을 포함하는 소정 범위의 다른 프로테아제에 대하여 이들의 모 분자와 비교하였다. 결과가 트립신의 경우보다 덜 분명하였지만, 리드 dAb는 시험된 모든 프로테아제에 대하여 모 분자에 비해 단백질가수분해에 대한 증가된 내성을 나타내었다. 엘라스타아제 및 류코자임에 대한 BIAcore 추적은 도 11에 제시되어 있다.
5μM의 각각의 dAb를 0, 1, 3 및 24시간 동안 100 μg/ml의 서열분석 등급 트립신으로 처리하였다. 반응을 25X Roche Complete Protease Inhibitor로 억제시키고 반응을 4-12% Novex Bis-Tris 겔상에서 전개시켰다. 겔은 도 9에 도시되어 있다.
실시예 8
DOM1h -131-511 및 DOM4 -130-54 변이체의 추가 특성결정
시차주사열량계(DSC)를 이용하여 dAb를 먼저 분석하여 트립신 내성의 증가가 융해 온도(Tm)에서의 증가와 관련이 있는지의 여부를 결정하였다. 트립신 안정성의 증가는 Tm의 증가와 관련이 있다(표 9 참조).
표 9
Figure 112013048225166-pct00024
DOM1h-131-511 유래 dAb를 또한 MRC-5 세포 기반 검정으로 비교하였다(표 10 참조). 이러한 검정에서, TNFα 자극된 IL-8 방출을 중화시키는 dAb의 능력을 측정하여 트립신 안정성의 증가가 효능의 감소를 발생시켰는지의 여부를 결정하였다. 그러나, 상기 검정에서 트립신 내성 dAb의 활성은 실질적으로 영향을 미치지 않았다.
표 10
Figure 112013048225166-pct00025
DOM4-130-54 유래 dAb를 이러한 dAb가 여전히 IL-RI에 대한 IL-1의 결합을 억제하는 동일한 능력을 여전히 가졌는지 확인하기 위해 수용체 결합 검정으로 시험하였다(표 11 참조). 트립신 내성 dAb의 활성은 이러한 검정에서 영향을 미치지 않았다.
표 11
Figure 112013048225166-pct00026
실시예 9
DOM15 -26-555 변이체의 확인
DOM15-26-588, DOM15-26-589, DOM15-26-591 및 DOM15-26-593을, 이의 모(parent) dAb 및 효능 및 안정성에 대해 가장 큰 영향을 미치는 조합 돌연변이로의 돌연변이유발에 의해 생성된 2개의 추가 dAb인 D0M15-26-594 및 DOM15-26-595과 함께 추가로 상세히 분석하였다(E6V 및 F100S/I). 서열은 도 12에 도시되어 있다. 클론을 200 ㎍/㎖의 농도의 트립신과의 인큐베이션 후에 100nM의 dAb 농도로 hVEGF 결합에 대해 비아코어(BIAcore) 상에서 비교하였다. 진탕(agitation)(250 rpm)과 함께 37℃에서 3시간 및 24시간 동안 반응을 수행하였다. 최적의 클론 DOM15-26-593 및 이의 모(parent)의 비아코어 추적이 도 13에 도시되어 있다. 다른 결과가 도 14에 도표로 제시되어 있다. 결과는 모든 변이체가 트립신 처리 24시간 후에 단백질분해에 대해 모보다 더욱 내성인 것을 명백하게 나타낸다.
DOM15-26-593 및 모의 트립신 내성을 또한 SDS-PAGE 상에서 처리 및 미처리 샘플을 영동시킴으로써 시험하였다. 간단히, 단백질을 PBS로 완충액 교환시키고, 1㎎/㎖로 농축시켰다. 25㎍의 단백질을 1㎍의 서열분석 등급(sequencing grade)의 트립신(Promega)과 혼합한 후, 30℃에서 0시간, 1시간, 3시간 및 24시간 동안 인큐베이션하였다. 이 시간 이후, 로슈 완전 프로테아제 억제제(Roche Complete Protease Inhibitor)(1x) 및 DTT로 반응을 차단시키고, 로딩 작용제(loading agent)를 첨가하였다. 샘플을 100℃에서 5분 동안 변성시켰다. 15㎍의 각각의 샘플을 노벡스 10-20% 트리신(Novex 10-20% Tricine) 겔에 로딩시키고, 단백질을 슈어블루(SureBlue)(1x)로 염색시켰다. 결과는 도 15에 도시되어 있다. 상기 실험에서 DOM15-26-593의 트립신 내성 프로파일은 비아코어 실험에 의해 밝혀진 프로파일에서 다양하였고, 이는 반응 조건에서의 차이가 트립신 절단의 최종 결과에 영향을 미칠 수 있음을 암시한다. 그럼에도 불구하고, DOM15-26-593은 하기 도시된 바와 같이 다른 선택된 클론보다 나은 생물물리적 특성 뿐만 아니라 친화성을 갖는다. DOM15-26-555 변이체의 특성의 요약이 또한 하기 표 12에 제시되어 있다.
표 12
Figure 112013048225166-pct00027
실시예 10
DOM15 -10 변이체의 확인
DOM15-10-11을 이의 모인 DOM15-10과 함께 추가로 상세하게 분석하였다. 서열은 도 16에 도시되어 있다. dAb를 200 ㎍/㎖의 농도의 트립신과의 인큐베이션 후에 100nM의 dAb 농도로 hVEGF 결합에 대해 비아코어 상에서 비교하였다. 진탕(250 rpm)과 함께 37℃에서 1시간, 3시간 및 24시간 동안 반응을 수행하였다. 이러한 dAb의 비아코어 추적이 도 17에 도시되어 있다. 결과는 선택된 변이체가 트립신 처리 24시간 후에 단백질분해에 대해 모보다 더욱 내성인 것을 명백하게 나타낸다.
리드(lead) 및 모의 트립신 내성을 또한 SDS-PAGE의 처리 및 미처리 샘플을 처리함으로써 시험하였다. 간단히, 단백질을 PBS로 완충액 교환시키고, 1㎎/㎖로 농축시켰다. 25㎍의 단백질을 1 μg의 서열분석 등급의 트립신(Promega)과 혼합한 후, 30℃에서 0시간, 1시간, 3시간 및 24시간 동안 인큐베이션하였다. 이시간 이후, 로슈 완전 프로테아제 억제제(1x) 및 DTT로 반응을 차단시키고, 로딩 작용제를 첨가하였다. 샘플을 100℃에서 5분 동안 변성시켰다. 15㎍의 각각의 샘플을 노벡스 10-20% 트리센(Novex 10-20% Tricene) 겔에 로딩시키고, 단백질을 슈어블루(SureBlue)(1x)로 염색시켰다. 결과는 도 18에 도시되어 있다. 이러한 경우, 트립신 내성 프로파일은 비아코어 트립신 시험과 매우 상관 관계가 있으며, 이는 결합 활성이 단백질의 온전성을 직접적으로 반영하는 것을 나타낸다.
실시예 11
DOM15 -26-555 및 DOM15 -10 변이체의 추가 특성규명
시차주사열량계(DSC)를 이용하여 dAb를 분석하여 트립신 내성의 증가가 Tm에서의 증가와 관련이 있는지의 여부를 결정하였다. 결과는 표 13에 도시되어 있다. DOM15-26-555 변이체의 트립신 내성과 융해 온도 사이의 상관관계가 존재한다. 리드 DOM15-26-588 및 DOM15-26-593은 개선된 Tm은 나타내었으나, 다른 클론은 그렇지 않았다. DOM15-26-555 및 DOM15-10 모 분자 둘 모두가 DOM4-130-54 및 DOM1h-131-511 모 분자(시작시의 Tm: 57.9-54.1℃) 보다 시작시에 훨씬 높은 Tm(63.3-63.7℃)을 가지나, 전체적으로 프로테아제 내성 클론이 유사한 범위의 Tm에 도달하는 것이 주목할 만하다(DOM1h-131-511/D0M4-130-54 변이체에 대해 65.1℃의 평균 Tm, 및 DOM15-26-55/DOM15-10 변이체에 대해 64.9℃의 평균 Tm).
표 13
Figure 112013048225166-pct00028
dAb를 또한 수용체 결합 검정으로 비교하고, 비아코어 동역학을 측정하여 트립신 안정성의 증가가 효능을 감소시켰는지의 여부를 결정하였다. 그러나, 검정에서의 dAb의 활성은 실질적으로 영향을 미치지 않거나, 심지어 개선시켰다. 결과는 표 14에 제시되어 있다.
표 14
Figure 112013048225166-pct00029
향상된 Tm 의 장점
도메인 항체를 포함하는 대부분의 단백질은 폴딩된 상태(생물학적 활성 분자를 발생시킴) 및 언폴딩된 상태(기능적 활성을 갖지 않음)의 두 상태로 존재한다. 이러한 두 단계는 모든 온도에서 공존하고, 각각의 상태의 상대적 비율은 보통 폴딩 및 언폴딩의 반응속도 상수(kinetic constant)의 함수인 상수 K에 의해 결정된다. 융해 온도는 보통 K가 1인 온도, 즉, 폴딩된 단백질의 분획이 언폴딩된 단백질의 분획가 동등한 온도로 정의된다. 상수 K는 단백질의 분자내 상호작용을 안정화시키고 불안정화시킴으로써 결정되고, 따라서 주로 단백질의 아미노산 서열에 의해 결정된다. 온도, pH, 완충액 조성, 압력과 같은 외인성 파라미터는 K에 영향을 미쳐, 이에 따라 융해 온도에 영향을 미친다.
언폴딩된 단백질은 분해 메커니즘에 대해 용이한 표적이다: (ⅰ) 이황화결합의 노출은 환경에 따라 산화 또는 환원의 위험을 증가시키고, (ⅱ) 향상된 백본 가요성은 자가-단백질분해 반응에 유리하고, (ⅲ) 펩티드 세그먼트의 노출은 생체내에서의 프로테아제, 생성 공정 동안의 프로테아제, 및 하류 공정 및 장기간의 보관 동안의 잔효(carry-over) 프로테아제에 표적을 제공하고, (ⅳ) 응집 경향의 세그먼트의 노출은 분자간 응집 및 단백질 침전을 발생시킨다. 모든 경우에, 단백질 온전성, 단백질 함량 및 단백질 활성의 손실이 발생함으로써, (ⅰ) 배치 재현성을 보장하고, (ⅱ) 보관시(on shelf) 장기간의 안정성을 보장하고, (ⅲ) 생체내 효능을 보장하려는 노력을 손상시킨다.
사실상, 단백질은 체온에서 적절히 작용하고, 항상성 메커니즘을 통해 용이하게 복귀되도록 하는 진화에 의해 디자인되었다. 생물공학 과정을 통해 제조된 치료 단백질은 다양한 환경에 직면된다: 이들은 외래 숙주에서 재조합 DNA 기술에 의해 종종 생성되고, 큰 용기에서 보다 많은 양으로 발현되고, 하류 공정을 통해 pH 또는 완충액 조성에서 매우 중요한 변화를 겪고, 최종적으로 장기간 동안 비-생리적 완충액 중에서 높은 농도로 보관된다. 새로운 전달 기술(예를 들어, 흡입, sc 패치, 저속 전달 나노입자(slow delivery nanoparticle))이 또한 치료 단백질이 겪는 스트레스에 포함된다. 최종적으로, 단백질 공학 기술의 출현은 향상되거나 완전히 신규한 치료 단백질을 생성시켰다. 대부분의 공학 기술은 신규한 아미노산 서열을 변경시키거나 생성시키는 것을 목표로 하는 시험관내 기반 기술이므로, 점진적으로 개선된 생물학적 단백질을 갖는 진화 과정이 발생하지 않고, 따라서 스트레스 내성에 관하여 준최적(sub-optimal) 성능의 단백질이 발생한다.
본 발명의 기술은 다윈 진화를 통해 단백질에 의해 당면되는 조건 중 하나를 재현시키는데 목적을 둔다. 펩티드 또는 펩티드들, 예를 들어, 면역글로불린 단일 가변 도메인이 조직 리모델링 및 단백질 항상성에서 중요한 역할을 하는 프로테아제에 주입된다. 기능에 대해 개선된 적합성을 갖는 단백질을 발생시킬 수 있는 임의의 특정 돌연변이가 또한 단백질이 수행되는 환경에서의 적합성 능력에 대해 시험된다. 이러한 과정은 본 발명의 일 구체예에서 재현되고: 펩티드 또는 폴리펩티드 변이체의 레퍼토리가 생성되고, 프로테아제에 노출된다. 두번째 단계에서, 변이체의 레퍼토리가 특정 표적과 접촉된다. 프로테아제에 의해 지속된 분해를 갖는 단백질 변이체만이 표적과 연동될 수 있고, 따라서, 예를 들어, '바이오패닝(biopanning)'으로 언급되는 간단한 친화성 정제 과정에 의해 회수될 수 있다. 시스템은 생체내 과정에 비해 다수의 장점을 제공한다: 단백질 레퍼토리가 광범위한 조건, 예를 들어, 다양한 완충제 또는 pH 및 다양한 온도에서 장기간 동안 높은 농도의 다양한 프로테아제와 직면될 수 있다. 따라서, 이러한 시험관내 기술은 단백질이 유래되는 환경보다 광범위한 환경에서 작용하고 안정적으로 유지될 수 있는 단백질을 디자인하기 위한 수단을 제공한다. 확실히, 이는 생명공학 산업 및 특히 치료 단백질 분야에 다수의 장점을 제공한다.
실시예 12: 프로테아제 내성 리드에 대한 PK 상관관계 데이터
4개의 dAb 계통 각각에서 모 dAb 및 프로테아제 내성 dAb를 생체내에서 추가로 평가하였다(목록 및 세부사항에 대해서는 하기 표 15 참조).
표 15:
Figure 112013048225166-pct00030
*: MRC5/IL-a 생물학적 검정에 의해 결정됨,
Figure 112013048225166-pct00031
: RBA 검정에 의해 결정됨.
주: DOM15 -26-501은 본 특허 출원에서 상기 예시된 DOM15 -26-555의 모 형태이다. DOM15 -26-555는 CDR1 내에 하나의 점라인 아미노산 돌연변이( I34M )를 갖는다. DOM15 -26-501은 DOM15 -26-555 보다 낮은 융해 온도를 갖고(52℃ 대 63.3℃), 트립신에 의한 절단에 대해 증가된 감수성을 갖는다. PK 연구를 위해 DOM15 -26-555에 비해 DOM15 -26-501을 선택하였고, 이는 상기 DOM15 -26-501이 DOM15 -26-593에 비해 불량한 안정성을 보다 잘 나타내기 때문이다.
본 발명자들은 하기와 같이 내성을 표현할 수 있다:
1: 낮음
2: 중간
3: 양호함
4: 높음
5: 매우 높음
다음으로, 모 분자의 트립신 내성은 하기와 같다:
DOM4-130-54: 양호함
DOM1h-131-511: 양호함
DOM15-10: 낮음
DOM15-26-501: 낮음
선택된 리드에 대해서는 다음과 같다:
DOM4-130-202: 매우 높음
DOM1h-131-206: 매우 높음
DOM15-10-11: 높음
DOM15-26-593: 높음
도메인 항체는 크기가 작으므로(12-15 kDa), 이들은 정맥내 또는 피하 주사후 순환으로부터 신속히 청소된다. 게다가, 신장 사구체 여과 컷오프(cut-off)는 50 kDa 초과이며, 이에 따라 dAb와 같은 작은 단백질이 순환에서 유지되지 않는데, 이는 이들이 신장을 통과하기 때문이다. 따라서, 생체내에서 프로테아제에 대한 장기간의 내성 효과를 평가하기 위해, 본 발명자들은 전신 거주(residence)를 증가시키는 부분을 갖도록 도메인 항체를 태깅(tagging)시켰다. 반감기를 연장시키는 것을 목적으로 하는 여러 접근법(예를 들어, PEG, Fc 융합, 알부민 융합 등)이 문헌에 보고되어 있다. 이러한 적용에서, 도메인 항체는 인간 IgG1 항체의 Fc 부분으로 태깅(또는 포맷화)되었다. 이러한 포맷은, (ⅰ) 생성되는 dAb-Fc의 분자 크기가 순환에서의 유지를 보장하기에 충분히 큰 ~75kDa이고, (ⅱ) 항체 Fc 부분이 FcRn 수용체("브람벨(Brambell)" 수용체로도 공지되어 있음)에 결합하는, 두 장점을 제공한다. 이러한 수용체는 외피 세포, 내피 세포 및 간세포에 국소화되어 있고, 항체 및 알부민의 수명 연장과 관련되어 있으며: 실제로 항체 및 다른 혈청 단백질의 음세포작용 후, 단백질은 산성화된 엔도솜으로 향하게 되고, 여기에서 FcRn 수용체가 엔도솜으로의 이동 전에 항체를 차단(Fc 부분으로의 결합을 통함)하여 항체를 순환으로 복귀시킨다. 따라서, Fc 부분을 dAb에 태깅시킴으로써, 각각이 특정 세트의 단백질분해 효소를 함유하는 적어도 2개의 구획인 혈청 구획 및 엔도솜전(pre-endosomal) 구획에 dAb가 장기간 동안 노출되는 것이 보장된다. 또한, FcRn 수용체는 트랜스사이토시스(transcytosis)를 매개함으로써, Fc-함유 단백질이 혈관외 공간으로 이동하고, 이로부터 이동한다.
Fc를 갖도록 하는 포맷화를 짧은 개재 펩티드 링커(굵은 글씨)를 통해 인간 IgG1 Fc를 엔코딩하는 유전자에 VH 및 VK dAb를 엔코딩하는 유전자를 융합시킴으로써 달성시켰다:
VH dAb(밑줄)에 대해서는 하기와 같다:
Figure 112013048225166-pct00032
VK dAb(밑줄)에 대해서는 하기와 같다:
Figure 112013048225166-pct00033
표준 프로토콜에 따라 293-펙틴(fectin)(Invitrogen)을 이용하여 HEK293/6E 세포의 일시적 트랜스펙션에 의해 물질을 생성시켰다. 상기 세포는 pTT 시리즈의 벡터와 함께 사용하는 경우 고-수준의 일시적 발현용으로 디자인된다(Durocher et al 2002). 따라서, dAb 유전자를 변형된 pTT5 벡터(pDOM38)로 클로닝시켜, Fc 융합체 발현 벡터를 발생시켰다(도 21 참조). 트랜스펙션된 세포로부터의 상층액을 트랜스펙션 5일 후에 수거하고, 원심분리에 의해 정화시키고, 0.2㎛ 필터를 통해 여과시켰다. dAb-Fc 융합 단백질을 단백질-A 유선형(streamline) 수지(GE Healthcare) 상으로의 포획에 의해 정제하였다. 단백질을 10mM 시트르산 나트륨(pH3) 중의 컬럼으로부터 용리시킨 후, 1M 시트르산 나트륨(pH6)의 첨가에 의해, 100mM 시트르산 나트륨(pH6)의 최종 조성을 달성시켰다.
dAb-Fc 분자를 암컷 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 래트(그룹당 n=3)로의 5㎎/kg의 표적 용량으로 래트에서의 생체내 반감기에 대해 시험하였다. 표적 용량이 래트에서의 표적 농도를 매우 초과하므로, 모 dAb와 트립신 내성 dAb 사이의 친화성의 차이(실시예 11 참조)가 생체내에서의 분자의 운명에 영향을 미치지 않는 것이 예상됨이 인지되어야 한다. 그러므로, dAb 사이의 PK 프로파일의 차이는 항원 의존성 배제 과정을 반영하는 것으로 예상된다.
혈액 샘플을 투여 0.03, 1, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120 및 168시간 후에 채취하였다. 혈병 형성 후, 혈청을 회수한 후, hIL-1R1, TNFR1 또는 VEGF 항원 포획 검정으로 시험하였다:
hIL-1R1 항원 포획 검정:
4㎍/㎖의 항-hIL-1R1으로 코팅
블로킹
500ng/㎖의 shIL-1R1 첨가
샘플 첨가
1:10,000의 항-인간 Fc HRP를 이용한 검출
TNFR1 항원 포획 검정:
0.1㎍/㎖의 sTNFR1을 이용한 코팅
블로킹
샘플 첨가
1:10,000의 항-인간 Fc HRP를 이용한 검출
VEGF 항원 포획 검정:
0.25㎍/㎖ VEGF을 이용한 코팅
블로킹
샘플 첨가
1:10,000의 항-인간 Fc HRP를 이용한 검출
검정으로부터의 미가공 데이터를 각각의 혈청 샘플 내의 약물의 농도로 전환시켰다. 이후, 각각의 시점에서의 평균 ㎍/㎖ 값을 비-구획 분석(non-compartmental analysis, NCA)을 이용하여 WinNonLin에서 분석하였다. 각각의 dAb-Fc 쌍의 PK 프로파일은 결정된 PK 파라미터가 요약된 표 16에 제시되어 있다.
표 16:
Figure 112013048225166-pct00034
상기 결과는 dAb-Fc 쌍 4-130-54 내지 1h-131-206의 PK 프로파일이 거의 중첩되는 반면, 상기 프로파일이 다른 쌍에 비해 매우 다양함을 명백히 나타낸다. 효과는 AUC/D가 고려되는 경우에 대부분 명백하고: 15-10의 AUC/D는 15-10-11의 AUC/D의 단지 42%이다. 15-26-501의 AUC/D는 15-26-593의 AUC/D의 단지 11%이다. 상기 중요한 차이는 또한 반감기에 영향(보다 적은 범위로)을 준다: 15-10 및 15-10-11에 대해 각각 43.2시간 대 56.6시간. DOM15-26 계통을 이용하여 큰 차이가 관찰된다: 15-26-501 및 15-26-593에 대해 각각 12.9시간 대 86.2시간. 또한, 비-구획 분석을 이용하는 양호한 PK 분석을 위해, 선형회귀 분석곡선을 적합시키는데 사용되는 적어도 4개의 데이터 포인트가 존재해야 하며, 반감기가 측정되는 기간은 계산된 반감기의 기간의 적어도 3배가 되어야 한다.
본원의 실시예에 기재된 생물물리적 특성의 견지에서, 트립신에 의한 분해에 저항하는 임의의 제공된 dAb의 능력은 래트 혈청에서 보다 장기간 동안 순환하는 dAb-Fc 융합체의 능력과 상관 관계가 있는 것으로 보인다. 또한, 실시예 10과 같은 실시예에 제시된 바와 같이, DOM15-10 및 DOM15-26-501은 가장 분해성의 dAb이고; ~3시간 동안 30℃에서의 1㎍의 트립신의 존재하에서의 25㎍ dAb의 인큐베이션은 완전한 분해를 발생시킨다. 이러한 연구에서의 모든 다른 dAb(이들이 트립신을 이용하여 선택(즉, DOM15-10-11, DOM15-26-593, DOM4-130-202 및 DOM1h-131-206)되었든지 아닌지 간에 또는 이들이 모 분자와 같이 약간의 트립신 내성을 이미 갖거나(DOM4-130-54 및 DOM1h-131-511) 그렇지 않은 간에)는 dAb-Fc 분자로 다시 포맷화되는 경우 래트에서 동등한 PK 프로파일을 갖는다. 따라서, 본 PK 연구는 단백질분해에 대한 감수성은 dAb가 단백질분해에 매우 낮은 내성을 갖는 경우 dAb의 생체내 안정성에 가장 큰 영향을 미치는 것을 암시한다. 특정 수준 이상에서, 트립신에 의한 분해에 내성에서의 추가의 증진(예를 들어, D0M4-130-206 v D0M4-130-54)은 생체내에서의 제거를 추가로 늦추는 dAb-Fc 분자의 능력을 유의하게 증가시키지 않음을 또한 나타낸다.
3가지 경우에서, 트립신의 존재하에서의 선택은 증가된 열 안정성(융해 온도에 의해 규정됨)을 갖는 신규한 분자를 발생시킨다: D0M4-130-202, DOM1h-131-206 및 DOM15-26-593. PK 연구는 본 실시예의 데이터세트(dataset)에서 융해 온도가 관찰된 PK 프로파일을 이론적으로 설명하기에 적절한 파라미터가 아님을 나타내며: 실제로 DOM15-10은 DOM15-10-11보다 높은 Tm을 갖고, 순환으로부터 DOM15-10-11보다 더욱 신속하게 청소된다. 다른 경우에, DOM4-130 계통의 2개의 dAb는 현저하게 상이한 Tm(10℃만큼)을 갖고, dAb-Fc 분자로 포맷화되는 경우에 생체내에서 거의 동일한 안정성을 나타낸다. 융해 온도는 그 자체로 생체내 안정성을 예측하기 위한 중요한 파라미터로서 제외되지 않음이 인지되어야 한다. 본 실시예의 데이터세트를 이용하여, 큰 Tm 차(54℃로부터 이 이상)가 생체내에서의 dAb의 운명에 현저한 영향을 미치지 않는 것이 우연히 발생하였다. 이는 54℃ 보다 낮은 융해 온도에서 dAb의 생체내 안정성이 열 안정성과 상관 관계가 있을 수 있거나, 혹은 전체적으로 열 안정성 및 프로테아제에 대한 내성과 상관 관계가 있을 수 있는 가능성을 배제하지 않는다.
실시예 13
DOM10 -53-474에 대한 트립신 선택
정제된 DOM10-53-474의 트립신 안정성:
DOM10-53-474는 높은 효능으로 IL-13에 결합하는 도메인 항체이다. 트립신의 존재하에서 상기 dAb의 안정성을 평가하기 위해, 정제된 dAb를 증가된 기간 동안 트립신으로 분해시키고, 겔 상에서 영동시켜 임의의 가능한 단백질 분해를 시험하였다. 1㎎/㎖의 25㎕의 정제된 DOM10-53-474를 30℃에서 1㎎/㎖의 1㎕의 서열분석 등급 트립신과 함께 인큐베이션시켜, 25:1의 dAb:트립신의 분자비를 발생시켰다. dAb를 1시간, 4시간 및 24시간 동안 트립신과 함께 인큐베이션시키고, 4㎕의 로슈 완전 프로테아제 억제제를 첨가한 후, 얼음 상에서 인큐베이션시켜 프로테아제 활성을 중화시켰다. 트립신의 첨가 없이 dAb에 프로테아제 억제제를 첨가하여 시간 0의 샘플을 제조하였다. 이어서, 제조업체의 설명서에 따라 랩칩(Labchip)을 이용하여 전기영동시킴으로써 2㎕의 샘플을 분석하였다.
도 22는 증가된 기간 동안 트립신과 함께 인큐베이션된 DOM10-53-474를 이용한 겔 영동을 도시한다. 트립신에 안정적인 dAb 중 하나의 비교를 위해, DOM15-26-593을 또한 상기 설명된 바와 같이 트립신으로 처리하고, 나란히 영동시켰다. 상기 도에 도시된 바와 같이, DOM15-26-593은 트립신과의 인큐베이션 24시간 후에도 안정적으로 보였다. 그러나, DOM10-53-474는 24시간 후에 특정 범위로 분해되나, 1시간 및 4시간에서는 안정적으로 보였다. 이러한 데이터는 DOM10-53-474가 트립신에 의한 분해에 특정 범위로 내성이나, 가장 트립신 안정적인 dAb인 DOM15-26-593 만큼 안정적이지 않음을 암시한다.
파지 디스플레이된 DOM10-53-474의 트립신 안정성:
파지 디스플레이된 DOM10-53-474의 트립신 안정성을 평가하기 위해, DOM10-53-474를 엔코딩하는 유전자를 pDOM33(도 50)의 Sal / Not 부위로 클로닝시키고, 표준 기술에 따라 파지를 생성시켰다. PEG 침전에 의해 파지를 정제시키고, PBS에 재현탁시키고, 적정시켰다.
파지 디스플레이된 dAb를 다양한 기간 동안 트립신과 인큐베이션하여 트립신 내성을 평가하였다. 트립신과의 인큐베이션 후, 지수적으로 성장하는 E. 콜리(E. coli) TG1 세포의 감염 후에 역가 분석에 의해 안정성을 측정하였다.
100㎕의 파지를 진탕 인큐베이터에서 37℃에서 1시간, 2시간, 4시간 및 밤새 동안 100㎍/㎖의 트립신과 함께 인큐베이션하였다. 로슈 완전 프로테아제 억제제(x2)를 이용하여 트립신 활성을 차단한 후, 파지를 PBS 중의 2% 마벨(marvel) 중에 희석시키고, 실온에서 1시간 동안 10nM의 비오티닐화된 IL-13과 함께 인큐베이션시켰다. PBS 중의 2% 마벨과 실온에서 1시간 동안 예비 차단된 스트렙타비딘 코팅된 비드(다이나비드(Dynabeads) M-280)(Invitrogen)를 첨가한 후, 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 다이나비드를 이용한 모든 인큐베이션 단계를 회전 휠(rotating wheel) 상에서 수행하였다. 1㎖의 PBS 중의 0.1% Tween-20으로 비드를 8회 세척함으로써 결합되지 않은 파지를 세척하였다. 결합된 파지를 0.5㎖의 0.1M 글리신(pH 2.2)으로 용리시키고, 100㎕의 1M Tris-HCL(pH 8.0)로 중화시켰다. 용리된 파지를 지수적으로 성장하는 TG1(37℃에서 1시간)를 감염시키는데 사용하고, 테트라사이클린 플레이트에 플레이팅시켰다. 플레이트를 밤새 37℃에서 인큐베이션시키고, 콜로니를 계수하였다. 트립신을 이용한 분해 후의 파지 결과 역가가 표 17에 요약되어 있다. 증가된 기간 동안 트립신과 인큐베이션하는 경우 파지 역가가 감소하였다. 24시간의 인큐베이션 후, 모든 파지가 분해되었다.
표 17. 파지 디스플레이된 DOM-10-53-474 모에서 수행된 트립신 선택의 결과 역가:
Figure 112013048225166-pct00035
트립신에 대해 더욱 내성인 dAb의 선택:
트립신에 의한 분해에 더욱 내성인 dAb를 선택하기 위해, 50㎕의 반응으로 스트라터진 뮤타자임(Stratergene Mutazyme) 11 키트, 비오티닐화된 프라이머 및 5-50 pg의 주형을 이용하는 PCR에 의해 DOM10-53-474를 엔코딩하는 유전자에 무작위 돌연변이를 도입시켰다. Sal1 및 Not1을 이용한 분해 후, 삽입물을 스트렙타비딘 코팅된 비드를 이용하여 분해되지 않은 생성물로부터 정제한 후, 해당 부위의 pDOM33으로 라이게이션시켰다. 정제된 라이게이션 혼합물을 이용하여 E. 콜리 TB1 세포를 형질전환시켜, DOM10-53-474의 오류 빈발(error prone) 라이브러리를 발생시켰다. 라이브러리의 크기는 1.9 x 109이었고, 아미노산 돌연변이의 비율은 1.3이었다.
개선된 프로테아제 내성을 갖는 dAb를 선택하기 위해 상기 라이브러리를 이용하여 3 라운드의 선택을 수행하였다. 높은 친화성으로 항원에 결합하지 않는 임의의 클론을 제거하기 위해 라이브러리를 청소하기 위한 트립신 처리 없이 항원만을 이용하여 첫번째 라운드의 선택을 수행하였다. 10nM의 IL-13으로 선택을 수행하였다. 6 x 1010개의 투입 파이지에 비해 라운드 1로부터의 결과는 2 x 109개였으며, 이는 라이브러리 대부분이 높은 친화성으로 항원에 결합하는 것을 나타낸다.
1 nM의 비오티닐화된 IL-13을 이용하여 두번째 및 세번째 라운드의 선택을 수행하였다. IL-13 상에서의 패닝(panning) 전에, 파지를 진탕기(250 rpm)에서 37℃에서 100㎍/㎖의 트립신과 인큐베이션하였다. 두번째 라운드의 선택을 위해, 트립신 인큐베이션을 실온 또는 37℃에서 1시간 동안 수행하였다. 라운드 2 선택으로부터의 결과는 표 18에 제시되어 있다:
표 18. 두번째 라운드의 선택 후의 결과 파지 역가.
Figure 112013048225166-pct00036
37℃에서의 1시간 동안의 트립신 처리를 이용한 라운드 2 선택으로부터의 파지 결과를 세번째 라운드 선택을 위한 투입물로 사용하였다. 세번째 라운드의 선택을 위해, 파지에 100㎍/㎖의 트립신을 처리하였고, 37℃에서 2시간, 37℃에서 4시간, 실온에서 밤새 또는 37℃에서 밤새와 같이 보다 긴 기간 동안 처리하였다. 세번째 라운드의 선택에 대한 결과 역가가 표 19에 요약되어 있다:
표 19: 세번째 라운드의 선택 후의 결과 파지 역가.
Figure 112013048225166-pct00037
라운드 1, 2 및 3으로부터의 각각의 선택 결과로부터의 여러 클론을 서열분석하여 서열 다양성을 평가하였다. 트립신 미처리의 첫번째 라운드의 선택 후, 선택 결과의 50%가 모 DOM10-53-474 서열을 가졌다. 두번째 라운드의 선택 후, 모의 백분율은 75%로 증가하였다. 세번째 라운드의 선택 후, 모의 백분율은 80%로 증가하였다.
이러한 데이터는 DOM10-53-474가 이미 트립신에 의한 분해에 내성이며, 많지 않은 신규한 클론이 상기 트립신 선택으로부터 선택될 수 있음을 나타낸다. 도 22는 정제된 단백질이 트립신으로 분해되는 경우, DOM10-53-474가 밤새의 트립신 처리 후에도 완전히 분해되지 않았음을 나타내었다. 그러나, 선택 결과에 DOM10-53-474 보다 더욱 트립신 내성인 임의의 신규한 클론이 존재하는지 확인하기 위해, 파지가 37℃에서 트립신으로 밤새 처리된 선택 3의 결과를 pD0M5으로 서브클로닝시켰다. 이후, 100개의 클론을 서열분석하여, 임의의 트립신 내성 클론을 확인하였다. 분석된 100개의 클론 중, 단지 26개의 클론이 신규한 서열을 가졌으나, 이들 클론중 어느 것도 트립신 절단 부위(리신 또는 아르기닌)에서 돌연변이를 갖지 않았으며, 이는 상기 클론이 DOM10-53-474 보다 트립신에 대해 더욱 내성이 아님을 암시한다.
실시예 14
트립신의 존재하에서의 파지 선택에 의해 리드 DOM0101(항-TNFR1) dAb로 도입된 보관 및 생물물리적 개선:
리드 분자 DOM1h-131-511의 프로테아제 내성을 개선시키기 위해, 트립신의 존재하에서의 파지 선택을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 상기 방법은 모 DOM1h-131-511 분자에 비해 개선된 트립신 안정성을 갖는 다양한 클론을 생성시켰다. 2개의 클론 DOM1h-131-202 및 DOM1h-131-206을 추가 특성규명을 위해 선택하였는데, 이는 이들이 트립신의 작용에 대해 가장 유의한 개선을 나타냈기 때문이다. 하기 개설되는 바와 같은 추가의 작업은 트립신의 작용에 대한 개선된 내성과 함께 주로 전단 및 열 스트레스에 대한 분자의 안정성에 다른 유리한 효과가 존재함을 나타낸다. 이러한 두 파라미터는 생물약제학적 생성물의 보관 및 저장 수명의 증가에 중요하다.
피키아 파스토리스에서의 리드 DOM0101 dAb의 생성:
3개의 리드 분자의 일차 아미노산 서열을 엔코딩하는 유전자를 피키아 파스토리스에서의 분비 단백질을 생성시키는데 사용하였다. 3개의 합성 유전자(DOM1h-131-511, DOM1h-131-202 및 DOM1h-131-206)를 발현 벡터 pPIC-Zα에 클로닝시킨 후, 2개의 피키아 균주 X33 및 KM71H로 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를 다수의 구성 부분(integrant)을 갖는 클론을 선택하기 위해 증가하는 농도의 제오신(100, 300, 600 및 900 ㎍/㎖) 상에 플레이팅하였다. 이후, 2L 플라스크에서 여러 클론을 스크리닝하여 고발현 세포주를 확인하였다. 이후, 발효통에서 5L 크기로 물질을 생성시키기 위해 최적 발현 클론을 이용하였다.
단백질 정제 및 물질 특성규명:
특성규명 및 추가의 안정성 연구를 위한 높은 품질의 물질을 생성시키기 위해, 일차 포획 단계로서 혼합 양식의 전하 유도 수지(Capto MMC)를 이용한 후 음이온 교환(Q Sepharose)에 의해 하류 정제 공정을 고안하였다. 유의한 최적화 없이, 이는 ~95% 순도의 발현된 dAb의 ~70%의 회수를 가능케 하였다. 전자분무 질량분광법, 아미노 말단 서열분석 및 등전 포커싱(isoelectric focusing)을 이용하여 동일성에 대해 상기 물질을 특성규명하고, SDS-PAGE 및 SEC(크기 배제 크로마토그래피)를 이용하여 순도에 대해 특성규명하였다.
단백질 확인:
각각의 단백질의 처음 5개의 잔기의 아미노 말단 서열 분석은 예상된 바와 같이 (EVQLL...)이었다. C4 집-팁(Zip-tips)(Millipore)을 이용하여 0.1% 빙초산을 함유하는 50:50의 H2O:아세토니트릴로 완충액 교환된 단백질의 샘플에 대해 질량분광법을 수행하였다. 3개의 단백질 각각에 대해 측정된 질량은 내부 이황화결합의 형성으로부터 -2의 질량차가 허용되는 경우 일차 아미노산 서열에 기초하여 0.5Da의 이론적 질량(평균 질량을 이용하여 계산됨)의 범위내였다. 각각의 단백질에 대해 상이한 pI에 기초하여 단백질을 확인하기 위해 IEF를 이용하였다.
단백질 정제:
3개의 단백질을 이중으로 1μg 및 10μg의 양으로 비-환원 SDS-PAGE 겔에 로딩시켰다. 모든 예에서 하나의 밴드가 관찰되었다.
순도 수준을 입증하기 위해 크기 배제 크로마토그래피를 또한 수행하였다. 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 위해, 100μg의 각각의 단백질을 0.5㎖/분으로 유동하는 TOSOH G2000 SWXL 컬럼에 로딩하였다. 이동상은 PBS/10% 에탄올이었다. 곡선하영역을 기초로 하여 단량체의 백분율을 측정하였다(도 23 참조).
DOM1h-131-511, -202 및 -206의 안정성의 비교
프로테아제 안정성의 평가:
DOM1h-131-511, DOM1h-131-202 및 DOM1h-131-206의 프로테아제 안정성을 과량의 프로테아제 중에서 규정된 기간 동안의 예비 인큐베이션 후에 잔여 결합 활성의 비아코어(BIAcore™) 분석에 의해 평가하였다. 약 1400RU의 비오티닐화된 TNFR1을 스트렙타비딘(SA) 칩에 코팅시켰다. 250nM의 DOM1h-131-511, DOM1h-131-202 및 DOM1h-131-206을 30℃에서 1, 3 및 24시간 동안 PBS 단독 또는 100㎍/㎖의 트립신, 엘라스타아제 또는 류코자임(leucozyme)과 함께 인큐베이션시켰다. 프로테아제 억제제의 칵테일을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 이후, dAb/프로테아제 혼합물을 참조 세포 공제(cell subtraction)를 이용하여 TNFR1 코팅된 칩 상을 통과시켰다. 각각의 주입 주기 사이에 10㎕의 0.1M 글리신(pH 2.2)을 이용하여 칩 표면을 재생시켰다. 프로테아제와 예비 인큐베이션(10초)된, 인간 TNFR1에 결합된 DOM1h-131-511, DOM1h-131-202 및 DOM1h-131-206의 분획을 프로테아제를 이용하지 않은 dAb 결합과 비교하여 결정하였다. 비아코어(BIAcore™) 실험을 25℃에서 수행하였다. 3개의 독립적인 실험으로부터 하기 데이터를 생성시켰다. 막대 그래프는 평균을 의미하고, 오차 막대는 결과의 표준 편차를 나타낸다(도 24).
DOM1h-131-202 및 DOM1h-131-206은 DOM1h-131-511과 비교하여 트립신, 엘라스타아제 또는 류코자임에 의한 단백질분해성 분해에 대해 더 큰 내성을 갖는 것을 나타내는 것으로 밝혀졌다. DOM1h-131-511에 비한 DOM1h-131-202 및 DOM1h-131-206 사이의 차이는 트립신을 이용하여 1시간 후, 및 엘라스타아제 또는 류코자임을 이용하여 3시간 후에 가장 현저하다. 대부분의 시험 조건에서 DOM1h-131-202에 비해 DOM1h-131-206이 약간 더 안정적인 경향이 있다.
DSC를 이용하여 결정된 dAb의 열 안정성:
리드 분자가 가장 큰 안정성을 갖는 pH를 결정하기 위해, 시차주사열량계(DSC)를 브리튼-로빈슨(Britton-Robinson) 완충액 중의 각각의 dAb의 융해 온도(Tm)를 측정하기 위해 사용하였다. 브리튼-로빈슨은 3개 구성성분의 완충액 시스템(각각 40mM의 아세트산, 인산 및 붕산)으로 이루어지므로, 샘플 용액에서 3-10 범위의 pH를 발생시키는 것이 가능하다. 단백질 일차 아미노산 서열로부터 이론적 pI를 결정하였다. DSC로부터, dAb가 가장 큰 고유의 열 안정성을 갖는 pH가 DOM1h-131-202에 대해서는 pH 7이고, DOM1h-131-206에 대해서는 pH 7-7.5이고, DOM1h-131-511에 대해서는 pH 7.5인 것이 밝혀졌다. 모든 이후의 스트레스 및 안정성 작업에 대해, 다음과 같은 pH를 각각의 dAb에 대해 사용하였다: 브리튼-로빈슨 완충액 중에서 DOM1h-131-202 및 GSK1995057A DOM1h-131-206에 대해 pH7.0 및 DOM1h-131-511에 대해 pH 7.5. 결과는 표 20에 요약되어 있다.
표 20: 1㎎/㎖의 브리튼-로빈슨 완충액 중의 DSC에 의해 결정된 DOM1h-131-202, DOM1h-131-206 및 DOM1h-131-511의 pH 및 Tm의 요약. 온도는 180℃/시로 램핑(ramping)되도록 하였다.
Figure 112013048225166-pct00038
2주의 열 안정성 시험
상승된 온도에서 장기간 동안 견디는 단백질의 능력은 보통 단백질 안정성의 우수한 지표이다. 이러한 조건하에서, 단백질은 응집 또는 화학적 변형과 같은 여러 물리적 과정을 겪을 수 있다. dAb(1㎎/㎖)를 브리튼-로빈슨 완충액 중에서 14일 동안 37 및 50℃에서 인큐베이션하였다. 14일의 기간에 걸쳐 얼마나 많은 단량체가 용액 중에 남아 있는지 결정하기 위해 SEC를 이용하였다(도 25).
도 25로부터, 열 스트레스에 대해 DOM1h-131-202 및 DOM1h-131-206 둘 모두가 DOM1h-131-511보다 유의하게 안정적인 것이 관찰될 수 있다. 단백질을 상승된 온도, 예를 들어, 37 및 50℃에 노출시키는 것은 약물의 장기간의 저장 수명에 대한 지표를 발생시키는데 통상적으로 이용된다. 탈아미드화, 산화 또는 응집과 같은 실온에서의 장기간의 보관과 관련된 일반적인 과정을 촉진시키기 위해 상기 높은 온도를 이용한다. 용액에서의 응집 형성의 수준은 또한 SEC를 이용하여 모니터될 수 있다(도 26A 내지 I). 37℃에서 14일 후, 용액으로부터 DOM1h-131-511의 손실은 SEC에 의해 결정시 침전 및 보다 정연한 응집체의 형성 둘 모두에 기인될 수 있다(도 26B). 단백질에서 현저하기 낮은 손실이 또한 14일 후에 37℃에서 DOM1h-131-202 및 DOM1h-131-206 둘 모두에서 관찰되며, 특히 DOM1h-131-206의 경우에서 응집 형성의 실질적 증가가 거의 없거나 실질적 증가가 없었다(도 26H). 50℃에서, 분자 사이의 차이는 더욱 현저하며, DOM1h-131-206은 14일 후에 DOM1h-131-202보다 높은 온도에서 더욱 안정성을 나타내며, 유의하게 감소된 보다 높은 분자량의 응집체의 형성을 나타낸다(도 26). t=0과 비교하여, DOM1h-131-206은 14일 후에 응집체 형성에서 단지 소수의 증가(도 26I)를 나타내는 반면, DOM1h-131-511은 모드 증가하였으며, 용액에 침전되었다(도 26C).
이는 트립신 선택에 의해 dAb에 도입된 변화, 예를 들어, 개선된 열 안정성이 37 및 50℃에서 단백질 보관 안정성을 현저하게 개선시킨 것을 나타낸다. DOM1h-131-202 및, 더욱 유의하게는 DOM1h-131-206 둘 모두는 개선된 용액 안정성 및, +4℃ 및 실온과 같은 더욱 관련된 온도에서 개선된 장기간의 보관 안정성으로 직접 해석될 수 있는 상승된 온도에서 응집을 형성하는 낮은 경향을 명백히 갖는다.
이후, 열 스트레스 실험으로부터 24시간, 48시간, 7일 및 14일의 기간으로부터의 샘플을 단백질이 이의 전체적인 전하에 영향을 주는 임의의 생물물리적 변화를 겪는지의 여부를 확인하기 위해 IEF에 의해 분석하였다(도 27).
다시, DOM1h-131-202 및 DOM1h-131-206 둘 모두는 DOM1h-131-511에 비해 37℃에서 유의한 변화를 나타내지 않는다. DOM1h-131-511은 24시간 후에 37℃에서 희미한 두번째 밴드가 나타난다. 이러한 추가의 밴드형성은 단백질의 이합체화, 및 이에 따른 전하를 가리고, 2개의 분자 집단을 생성시키는 것으로 생각된다. 50℃에서, 분자 사이의 차이는 더욱 현격하며, DOM1h-131-206은 상승된 온도에서 유의한 변화를 나타내지 않는 반면, DOM1h-131-202는 24시간 후에 일부 변형의 징후를 나타낸다. DOM1h-131-511 대부분은 브리튼-로빈슨 중에서 48시간 후에 침전에 의해 상실된다.
고온에 대한 노출 후의 단백질의 기능성을 결정하기 위해 50℃에서의 T=O, 7 및 14일의 시점을 TNFR-1 RBA에 의해 분석하였다(도 28). 상기 검정은 현재 스트레스로 인한 분자에 대한 미묘한 변화를 검출하는데 있어서 SEC 또는 IEF 만큼 민감하지 않으나, 이는 dAb가 여전히 항원에 결합할 수 있는지 나타내기 위해 사용될 수 있다.
DOM1h-131-511에 대해 좌측으로의 곡선의 이동은 dAb의 대부분이 침전에 의해 상실된 사실을 반영한다. 용액에 존재하는 물질은 여전히 항원에 결합할 수 있다. 도 25에 도시된 바와 같이, DOM1h-131-202 및 DOM1h-131-206 둘 모두의 대부분은 14일 후에도 용액에 유지될 수 있다. RBA는 모든 가용성 단백질이 여전히 기능성이며, TNFR1에 결합할 수 있는 것을 나타낸다.
높은 단백질 농도에서의 보관 안정성 시험:
매우 높은 단백질 농도에서 +4℃에서의 보관 안정성을 연구하기 위한 실험을 수행하여, 상기 조건하에서 각각의 분자가 작용하는 방식을 확인하였다. 모든 리드 dAb를 가장 안정적인 pH에서 브리튼-로빈슨 완충액 중에서 원심분리 비바스핀(Vivaspin) 농축기(5K 컷오프)에서 ~100㎎/㎖로 농축시켰다. 이후, ~100㎎/㎖의 샘플을 7일 동안 +4℃에 둔 후, 높은 농도에서의 보관 동안 샘플에 임의의 다른 물리적 변화가 발생하였는지의 여부를 확인하기 위해 SEC에 의해 분석하였다(도 29). 샘플을 ~1㎎/㎖로 희석시키고, 1xPBS 10% 에탄올(v/v) 중의 SEC 컬럼 상에서 실험하였다.
SEC 추적으로부터, DOM1h-131-202 또는 DOM1h-131-206이 7일 후에 응집의 형성에서 임의의 유의한 증가를 나타내지 않은 반면, DOM1h-131-511에 대해서는 단량체 농도에서 ~2%의 감소가 있는 것이 관찰될 수 있다.
리드 dAb의 분무기 전달:
조기 단계 독물학 및 임상 연구를 위해, dAb는 액체로 제형화되고, 분무 장치를 통해 전달된다. 장치(예를 들어, 초음파, 제트 또는 진동 메시(vibrating mesh))에 따라, dAb는 규정된 입자 크기의 에어로졸을 형성시키도록 분무됨에 따라 약간의 전단 및 열 스트레스를 입게 될 것이다. DOM1h-131-202 및 -206 둘 모두는 높은 Tm을 갖고, DOM1h-131-511에 비해 열 스트레스에 대해 상당히 개선된 안정성을 나타냄에 따라, dAb가 분무 동안 유도된 전단/열 스트레스에 대해 어떻게 반응하는지 확인하기 위해 모든 dAb를 2개의 분무 장치에서 시험하였다. 이후, 분무된 에어로졸로부터의 단백질 및 장치(즉, 컵 내)에 남아있는 dAb 둘 모두를 상기 과정 동안 발생된 응집의 양을 결정하기 위해 SEC에 의해 분석하였다.
모든 분자를 이의 가장 안정적인 pH에서 브리튼-로빈슨 완충액 중에서 시험하였다. dAb를 5㎎/㎖의 단백질 농도 및 맬버른 스프레이텍(Malvern Spraytek)을 이용하여 결정된 입자 크기 분포에서 3.5분의 실험 시간을 이용하여 이-플로우 래피드(E-flow Rapid)(진동 메시) 및 패리(Pari) LC+(제트 분무기) 둘 모두에서 시험하였다. 결과는 도 30에 도시되어 있다. 깊은 폐로의 양호한 전달 및 분포를 위해, 이상적인 입자 크기는 < 5㎛이다. 모든 dAb는 브리튼-로빈슨 완충액에서 5㎛ 미만인 동등한 수준의 입자 크기를 발생시킨다. 장치의 컵 내의 dAb의 농도를 분무 전 및 분무 후에 A280 측정에 의해 결정하였다(데이터는 나타내지 않음). 단백질 농도는 유의하게 변화하지 않았음이 밝혀졌고, 이는 단백질 또는 비히클이 전달 동안 우선적으로 분무되지 않은 것을 나타낸다.
브리튼-로빈슨 완충액 중에 분무된 dAb의 샘플을 전달 동안 단백질이 임의의 물리적 변화를 겪었는지의 여부를 결정하기 위해 SEC 상에서 실험하였다. 도 31은 SEC에 의해 결정시 컵 또는 에어로졸에서의 상대 변화 백분율을 도시한다. DOM1h-131-202 및 DOM1h-131-206 둘 모두가 DOM1h-131-511에 비해 단량체의 농도에서 비교적 작은 변화를 겪은 것이 관찰될 수 있다. 이는 개선된 Tm을 갖는 DOM1h-131-202 및 DOM1h-131-206 둘 모두가 분무 동안 덜 응집하는 경향을 갖는 것을 입증한다.
도 32는 분무 후 브리튼-로빈슨 완충액에서의 DOM1h-131-206 및 DOM1h-131-511에 대한 실제 SEC 추적을 도시하고, 이는 단량체의 상대 손실(도 31)이 이합체 형성으로 인한 것임을 입증한다. 이는 또한 DOM1h-131-202 및 DOM1h-131-206에 의해 나타난 보다 큰 열 안정성이 최적화되지 않은 제형 완충액에서도 유의한 응집을 방지할 수 있다는 이론에 추가의 지지 증거를 제공한다.
독물학 및 안전성 평가 연구를 위해, 환자에 제공되는 치료량보다 유의하게 보다 높은 수준의 dAb를 동물에 전달하는 것이 필요하다. 이는 오직 유의하게 보다 높은 단백질 농도를 이용하고/하거나 장기간에 걸쳐 dAb를 전달함으로써 달성될 수 있다. DOM1h-131-511이 3.5분에 걸쳐 5㎎/㎖의 분무에 대해 응집체를 형성함이 이미 밝혀짐에 따라, DOM1h-131-206을 PBS 중에서 40㎎/㎖으로 시험하고, 1시간 이하 동안 패리(Pari) LC+를 이용하여 분무하였다. 장기간의 분무가 SEC 및 단백질 농도(A280 nm 측정)에 의해 결정시 전단 또는 열 스트레스로 인해 dAb를 응집시키는지의 여부를 확인하기 위한 실험 전체에 걸친 기간에서 컵 및 에어로졸로부터 샘플을 채취하였다. 표 21은 A280에 의해 결정시 컵 및 에어로졸 둘 모두에서의 dAb의 단백질 농도를 제시한다.
표 21: 패리(Pari) LC+를 이용하여 ~40㎎/㎖의 dAb의 분무 동안 컵 및 에어로졸 둘 모두에 대한, A280 흡광 판독에 의한 결정시의 DOM1h-131-206의 측정된 단백질 농도. 희석 오차 및 기기 오차를 공제하면, 1시간에 걸친 dAb의 분무 후에 변화하지 않았다.
Figure 112013048225166-pct00039
표 21로부터, 단백질의 농도가 실험 동안 유의하게 변화하지 않은 것이 관찰될 수 있고, 이는 응집으로 인한 단백질의 유의한 손실이 없음을 나타낸다. 도 33은 1시간의 분무 기간에 걸쳐, DOM1h-131-206이 SEC에 의해 결정시 이합체와 같은 임의의 보다 정연한 응집체를 형성하지 않음을 나타낸다. 이는 트립신 선택에 의해 분자로 도입됨에 따라 개선된 생물물리적 특성이 전단 및 열 스트레스에 대한 dAb 내성을 유의하게 증가시키고, 개선된 보관 저장 수명 및 보다 정연한 응집체가 형성되지 않도록 단백질을 분무하는 능력과 직접적으로 관련될 수 있음을 명백히 입증한다.
리드 dAb의 용액 상태:
3개 모두의 리드 dAb에 대한 주요 분해 경로가 이합체화를 최초로 발생시키는 자가-회합(self-association), 및 이후의 추가의 응집 및 궁극적으로 침전인 것으로 보이므로, 3개의 리드 분자를 자가-회합의 정도를 결정하기 위해 분석용 초원심분리(AUC)에 의해 연구하였다. 침강 평형 및 침강 속도의 두 방법에 의해 단백질을 연구하였다.
침강 평형 방법을 위해, 3개의 샘플을 0.5㎎/㎖ 내지 5㎎/㎖ 범위의 3개의 상이한 농도로 실험하고, 3개의 상이한 로터 속도를 이용하여 원심분리를 수행하였다. 이러한 방법에 의해, DOM1h-131-511이 안정적인 이합체(26.1-34.4 kDa)이고, DOM1h-131-202가 측정된 농도에서 Kd = 1.3μM을 갖는 비교적 안정적인 이합체 상태를 갖는 단량체/이합체 평형(22.7-27.8 kDa)이고, DOM1h-131-206이 360μM의 단량체 대 이합체 회합에 대한 Kd를 갖는 주로 단량체(15.4-17.9 kDa)인 것으로 결정되었다.
침강 속도 방법에 의해, 모든 샘플은 희석 후 약간의 해리를 나타내었다. 도 34에 도시된 수득된 결과로부터, DOM1h-131-511에 대해 관찰된 침강 계수는 보다 정연한 응집체를 나타내고, 희석 후의 피크 이동은 상기 응집체의 해리의 지표이다. 단백질 응집 및 해리는 서로 상쇄될 수 있고, 이는 침강 평형에 의해 관찰되는 바와 같이 안정적인 이합체로 생각될 수 있다. DOM1h-131-202에 대해 관찰된 침강 계수는 신속한 동적 평형을 나타내고, 따라서 단량체 및 이합체 피크는 서로 분리될 수 없어, 샘플의 질량에 대해 적절한 것보다 높은 침강 계수를 갖는 단일 피크를 발생시킨다. 이러한 결과는 침강 평형 방법에 의해 수득된 결과와 일치하고, 해리 상수는 1μM로 측정되었다. DOM1h-131-206은 다른 두 샘플보다 더욱 단량체인 것으로 결정되었고, 이는 다른 두 샘플에 대한 2.5s에 비해 1.9s의 침강 계수를 갖는다. 이러한 데이터는 침강 평형 데이터와 매우 일치한다. 360μM의 Kd의 ~10배 아래인 측정된 농도에서, 샘플은 주로 단량체이다.
실시예 15
DOM15-26-593 dAb의 효능 향상:
DOM15-26 모에 비한 DOM15-26-593 dAb의 VEGFR2 수용체 결합 검정에서의 효능 향상의 예가 도 40에 도시되어 있다. 이러한 검정에서, VEGFR2에 대한 VEGF의 결합을 방지하는 잠재적 억제제의 능력이 플레이트 기반 검정으로 측정된다. 이러한 검정에서, VEGFR2-Fc 키메라가 96-웰 ELISA 플레이트 상에 코팅되고, 여기에 시험 dAb의 희석 시리즈와 함께 예비 인큐베이션된 소정량의 VEGF가 첨가된다. 결합되지 않은 단백질의 세척 후, 수용체에 결합된 VEGF의 양이 항-VEGF 항체를 이용하여 검출되고, 이의 수준은 비색적으로 결정된다. 용량 반응 결과는 시험 물질 농도의 함수로서 VEGF 결하의 억제 백분율로 작도된다. 따라서, 효과적인 억제제는 낮은 농도에서 리간드 결합의 실질적 차단을 나타내는 것이다.
FC 융합체 효능 및 반감기:
종양의 치료에서 VEGF 봉쇄의 치료 잠재성이 30년이 넘는 기간 동안 실현되어 왔다. 암의 만성 특성은 생물약제가 이의 효과를 매개하는 긴 혈청 반감기를 필요로 함을 말하며, 이는 신장 여과에 의한 순환으로부터의 자유 dAb의 신속한 청소와 양립하지 않는다. 암의 치료를 위해 항-혈관형성제로서의 VEGF dAb의 유용성을 평가하기 위해, FcRn-매개 항체 구제 경로의 사용에 의해 연장된 혈청 반감기를 갖는 2가 분자를 형성시키기 위해 리드 도메인 항체를 하이브리드 링커를 통해 야생형 인간 IgG1 Fc를 갖는 융합체로 포맷화시켰다.
이러한 Fc 융합 포맷에서, 리드 트립신 선택 dAb인 D0M15-26-593의 효능을 상기 기재된 검정을 이용하여 최초 모 dAb(DOM15-26) 및 트립신 불안정 dAb(DOM15-26-501)와 비교하였다. 결과는 하기 표 22에 제시되어 있다:
표 22. Fc 융합 포맷의 DOM15-26 리드의 효능(RBA) 및 반감기 특성규명
Figure 112013048225166-pct00040
이합체 Fc 융합 포맷에서, 친화성 및 효능이 결합력의 효과로 인해 자유 dAb와 관련하여 향상됨이 상기 결과로부터 관찰될 수 있다. 트립신 선택에 의해 DOM15-26-593에서 수득된 효능 향상이 유지되고, 이러한 Fc 포맷에서 더욱 현저함이 명백하다. 더욱이, 열 및 프로테아제 안정성에서의 개선은 분자의 생체내 약동학 거동에서의 충분한 변화로 해석된다. DOM15-26-501에 비한 DOM15-26-593의 제거 반감기의 개선(도 41)은 dAb의 증가된 안정성의 직접적인 결과인 듯하고, 이는 이를 엔도솜 구획 내에서 발생하는 분해성 과정에 대해 더욱 내성으로 만든다. 따라서, 향상된 프로테아제 안정성을 갖는 dAb가 혈청, 점막 표면, 및 단백질분해가 생물학적 분자의 전환(turnover)에 관련된 활성 과정인 다양한 조직 구획과 같은 다른 생물학적 구획에서 보다 긴 기간 동안 존속할 수 있는 것이 예상된다.
약동학 청소 프로파일:
DOM15-26-593 및 DOM15-26-501의 약동학 청소 프로파일을 3마리의 래트로 5㎎/kg의 농도의 DOM15-26-593 및 DOM15-26-501의 정맥내 투여 후에 측정하였다. 이후, 혈청에서의 DOM15-26-593 및 DOM15-26-501의 수준을 직접적인 VEGF 결합 표준 ELISA 검정 및 항-인간 Fc 항체를 이용하여 측정하였고, 이에 따라 혈청 샘플에서 온전한 약물만을 검출하였다. 충분한 약동학 프로파일이 하기 표 23에 제시되어 있다:
표 23. 래트에서의 DOM15-26 & DOM15-26-593 Fc 융합체의 약동학 파라미터의 요약
Figure 112013048225166-pct00041
DOM15-26-593이, 예를 들어, 연장된 반감기 및 감소된 청소율을 갖는 유의하게 개선된 약동학 프로파일을 가짐이 상기 결과로부터 관찰될 수 있다.
DOM15-26-593의 유의하게 개선된 효능 및 약동학 특성은 다양한 다른 생물물리적 특성에 대한 화합물의 분석을 발생시킨다.
용액 상태 특성: SEC-MALLs 및 AUC에 의한 분석:
DOM15-26-593을 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다:
DOM15-26-593은 약 76kDa의 계산된 온전한 분자 질량과 일치하는 78-81KDa의 계산된 분자 질량과 함께 2.5㎎/㎖ 이하의 농도에서 용액 중에서 단량체로 거동한다(도 42a & 42b).
열 융해 특성: DSC에 의한 분석
DOM15-26-593을 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다:
트립신 선택된 dAb(65℃, 도 43의 중간 패널)의 증가된 열 안정성이 Fc 융합체(64.5℃, 도 43의 상단 패널)에서 유지된다. DOM15-26-501 dAb(52℃, 도 43 하단 패널)의 Tm 곡선이 비교를 위해 제시된다.
동결-해동, 온도 스트레스 및 혈청 성분에 대한 안정성
DOM15-26-593을 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다:
DOM15-26-593 dAb의 안정성 특성은 VEGF에 결합하는 이의 능력에 대해 최소 영향을 미치면서, 물리적 및 생물학적 스트레스에 적용될 수 있음을 의미한다(도 44-47 참조(a 및 b)). 예를 들어, 분자는 ELISA에 의해 결정시 결합 활성의 손실 없이 액체 질소(-196℃)로부터 체온(37℃)까지 10주기 동안 반복적으로 동결 해동될 수 있다(도 44). 이러한 처리는 또한 통상적인 크기 배제 크로마토그래피로 평가시 분자의 응집 상태에서 명백한 변화를 발생시키지 않았다(도 45). 추가 시험은 분자가 단지 가장 높은 인큐베이션 온도에서 168시간 후에 항원 결합 활성의 단지 약간의 하락과 함께 -80℃ 내지 55℃의 다양한 상이한 온도에 배치될 수 있음을 입증하였다(도 46). 또한, 14일 동안 37℃에서의 인간 또는 시노몰구스(cynomolgus) 원숭이로부터의 혈청과의 인큐베이션은 VEGF 결합 ELISA에 의해 결정시 항원 결합 능력을 손실을 발생시키지 않았다(도 47a 및 47b).
VEGFR2 수용체 결합 검정 및 HUVEC 세포 검정에서의 효능:
상기 기재된 수용체 결합 검정을 하기와 같이 수행하였다:
Fc 융합체의 효능을 평가하기 위해 상기 기재된 수용체 결합 검정을 이용하였다(도 48). DOM15-26-593 dAb가 상기 검정에서 향상된 효능을 가짐이 밝혀졌고, 이는 시험관내에서 VEGFR2에 대한 VEGF의 결합을 차단하는 dAb의 능력을 확립시킨다. DMS1529의 효능을 또한 HUVEC(인간 제대 정맥 내피 세포) 검정에서 입증하였고, 여기서 HUVE 세포의 VEGF 자극 증식을 차단하는 VEGF 길항제의 능력이 측정된다. 세포수는 소정량의 VEGF 및 다양한 양의 시험 물품과의 고정된 인큐베이션 기간 종료시에 결정된다. 길항제가 더욱 효능이 있을수록, 더욱 낮은 세포 증식이 관찰된다(도 49).
DOM1h-131-511의 누클레오티드 서열이 본 단락에 기재된다. DOM1h-131-511의 누클레오티드 서열은 하기와 같다:
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SEQUENCE LISTING <110> Domantis Limited Jespers, Laurent Pupecka, Malgorzata Tomlinson, Ian Enever, Carolyn <120> POLYPEPTIDES, ANTIBODY VARIABLE DOMAINS & ANTAGONISTS <130> D0056 <150> US 60/933,632 <151> 2007-06-06 <150> GB 0724331.4 <151> 2007-12-13 <160> 235 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 109 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> pDOM13 <400> 1 taatgttatt taaatcatta tcaaaattag caaccgcagc agcatttttt gcaggcgtgg 60 caacagcgtc gacacactgc aggaggcggc cgcagaaact gttgaacgt 109 <210> 2 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala His Glu 20 25 30 Thr Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser His Ile Pro Pro Val Gly Gln Asp Pro Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Leu Leu Pro Lys Arg Gly Pro Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Tyr Leu Asn 20 25 30 Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Asn Phe Gly Ser Glu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Pro Ser Phe Tyr Phe Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 4 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Ala Tyr 20 25 30 Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Glu Ile Ser Pro Ser Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Pro Arg Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Pro Glu 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr His Thr Ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Met Phe Gln Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Arg Arg 100 105 <210> 6 <211> 358 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc atggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg catgagacga tggtgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcccccgg ttggtcagga tcccttctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctatat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acagcggtat attactgtgc gctgcttcct 300 aagagggggc cttggtttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcg 358 <210> 7 <211> 358 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cgcctttgcg catgagacga tggtgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcccccgg ttggtcagga tcccttctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctatat 240 ctgcaaatga acagcctgcg agccgaggac acagcggtat attactgtgc gctgcttcct 300 aagagggggc cttggtttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcg 358 <210> 8 <211> 358 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt caactttgcg catgagacga tggtgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcccccgg ttggtcagga tcccttctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctatat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acagcggtat attactgtgc gctgcttcct 300 aagagggggc cttggtttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcg 358 <210> 9 <211> 358 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg catgagacga tggtgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcccccgg ttggtcagga tcccttctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgacg attccaagaa cacgctatat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acagcggtat attactgtgc gctgcttcct 300 aagagggggc cttggtttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcg 358 <210> 10 <211> 358 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg catgagacga tggtgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcccccgg ttggtcagga tcccttctat 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctatat 240 ctgcaaatga acaacctgcg cgccgaggac acagcggtat attactgtgc gctgcttcct 300 aagagggggc cttggtttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcg 358 <210> 11 <211> 358 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg catgagacga tggtgtgggt ccgccaggcc 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcccccgg ctggtcagga tcccttctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagag cacgctatat 240 ctgcaaatga acggcctgcg tgccgaggac acagcggtat attactgtgc gctgcttcct 300 aagagggggc cttggtttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcg 358 <210> 12 <211> 358 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtaaagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg catgagacga tggtgtgggt ccgccaggct 120 cctgggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcccccgg ctggtcagga tcccttctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctatat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acagcggtat attactgtgc gctgcttcct 300 aagagggggc cttggtttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcg 358 <210> 13 <211> 358 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg catgagacga tggtgtgggt ccgccaggcc 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcccccgg acggtcaaga tcccttctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctatat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acagcggtat attactgtgc gctgcttcct 300 aagagggggc cttggtttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcg 358 <210> 14 <211> 358 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 gaggtgcagc tgtgggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg catgagacga tggtgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcccccgg atggtcagga tcccttctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctatat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acagcggtat attactgtgc gctgcttcct 300 aagagggggc cttggattga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcg 358 <210> 15 <211> 358 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 gaggtgcagc tgtcggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg catgagacga tggtgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcccccag atggtcagga tcccttctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctatat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acagcggtat attactgtgc gctgcttcct 300 aatagggggc cttggtttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcg 358 <210> 16 <211> 358 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg catgagacga tggtgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcccccgg atggtcagga tcccttctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctatat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acagcggtat attactgtgc gctgcttcct 300 aagagggggc cttggtttga ctactggggt cagggaaccc aggtcaccgt ctcgagcg 358 <210> 17 <211> 358 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 gaggtgcggc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtacag cctccggatt cacctttgcg catgagacga tggtgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcccccgg atggtcagga tcccttctac 180 gcagactccg tgaagagccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctatat 240 ctgcagatga acagcctgcg tgccgaggac acagcggtgt attactgtgc gctgcttcct 300 aagagagggc cttggtttga ctactggggt cagggaaccc aggtcaccgt ctcgagcg 358 <210> 18 <211> 358 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 gaggtgcggc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctgaggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg catgagacga tggtgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcccccgg atagccagga tcccttctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctatat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acagcggtat attactgtgg gctgcttcct 300 aagagggggc cttggtttga ctacaggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcg 358 <210> 19 <211> 358 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt caccattgcg catgaaacga tggtgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcccccgg ttggtcagga tcccttctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctatat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acagcggtat attactgtgc gctgcttcct 300 aagagggggc cttggtttga ctaccggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcg 358 <210> 20 <211> 358 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg catgagacga tggtgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcctccgg ttggtcagga tcccttctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctatat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acagcggtat attactgtgc gcggcttcct 300 aagagggggc cttggtttga ctactggggt cagggaacct tggtcaccgt ctcgagcg 358 <210> 21 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg catgagacga tggtgtgggt ccgccaggca 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcccccgg atggtcagga tcccttctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctatat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acagcggtat atcactgtgc gctgcttcct 300 aagagggggc cttggtttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 22 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg catgagacga tggtgtgggt ccgccgggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcccccgg atggtcagga tcccttctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctatat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acagcggtat attactgtgc gctgcttcct 300 aagagggggc cttggtttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 23 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc 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sapiens <400> 61 gaggtgcagc tgctggtgtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttaag gcttatccga tgatgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagag atttcgcctt cgggttcata tacatactat 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagatcct 300 cggaagtttg aatactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 62 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 62 gaggtgcagc tgttggtgtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttaag gcttatccga tgatgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagag atttcgcctt cgggttctta tacatactac 180 gcggactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaatgatcct 300 cggaagtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 63 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 63 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc 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<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 191 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtatattggt aggtatttac gttggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat tcttccgtgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag cgttattctt cgccttatac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa gcgg 324 <210> 192 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 192 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtatatttcg cgtcagttaa ggtggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaggctcct gatctatggg gcgtccgttt tgcaaagcgg gatcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag aggtatatta ctccttatac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaagtcaa acgg 324 <210> 193 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 193 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggattcat aggcagttaa agtggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctattat gcttccattt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag acgttttcta agccttctac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 194 <211> 354 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 194 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt caccttttat gattataata tgtcttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaact attacgcata cgggtggggt tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacagaat 300 ccttcttatc agtttgacta ctggggtcag ggaaccctgg tcaccgtctc gagc 354 <210> 195 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 195 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgat ctttatgata tgtcgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg 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cctctggttt caccttcgct catgagacca tggtttgggt acgccaggct 120 ccgggtaaag gcctggagtg ggtaagccat atccctcctg atggtcagga cccgttctat 180 gctgattccg tcaaaggccg ttttaccatt tctcgtgaca acagcaaaaa cactctgtac 240 ctgcaaatga actccctgcg tgcagaagac acggcggttt atcactgtgc actgctgcca 300 aaacgcggcc cttggttcga ctactggggc cagggtactc tggtcactgt atcttct 357 <210> 229 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 229 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala His Glu 20 25 30 Thr Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser His Ile Pro Pro Asp Gly Gln Asp Pro Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys 85 90 95 Ala Leu Leu Pro Lys Arg Gly Pro Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 230 <211> 357 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 230 gaggttcaac tgctggaatc tggtggtggt ctggtacaac cgggtggttc cctgcgtctg 60 agctgtgcag cctctggttt caccttcgct catgagacca tggtttgggt acgccaggct 120 ccgggtaaag gcctggagtg ggtaagccat atccctcctg atggtcagga cccgttctat 180 gctgattccg tcaaaggccg ttttaccatt tctcgtgaca acagcaaaaa cactctgtac 240 ctgcaaatga actccctgcg tgcagaagac acggcggttt atcactgtgc actgctgcca 300 aaacgcggcc cttggttcga ctactggggc cagggtactc tggtcactgt atcttct 357 <210> 231 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus <220> <221> misc_feature <222> (6)...(6) <223> n = g or t <220> <221> misc_feature <222> (9)...(9) <223> n = g or a <220> <221> misc_feature <222> (13)...(13) <223> n = t or c <220> <221> misc_feature <222> (18)...(18) <223> n = g or a <220> <221> misc_feature <222> (24)...(24) <223> n = g or t <220> <221> misc_feature <222> (27)...(27) <223> n = a or t <220> <221> misc_feature <222> (30)...(30) <223> n = c or t <220> <221> misc_feature <222> (31)...(31) <223> n = t or c <220> <221> 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<221> misc_feature <222> (354)...(354) <223> n = g or t <220> <221> misc_feature <222> (355)...(355) <223> n = a or t <220> <221> misc_feature <222> (356)...(356) <223> n = g or c <220> <221> misc_feature <222> (357)...(357) <223> n = c or t <400> 231 gaggtncanc tgntggantc tggnggnggn ntggtacanc cnggnggntc cctgcgtctn 60 nnctgtgcag cctcnggntt caccttngcn catgagacna tggtntgggt ncgccaggcn 120 ccnggnaang gnctngagtg ggtnnnncat atnccnccng atggtcagga nccnttctan 180 gcngantccg tnaanggccg nttnaccatn tcncgngaca annncaanaa cacnctntan 240 ctgcaaatga acnncctgcg tgcngangac acngcggtnt atcactgtgc nctgctnccn 300 aanngnggnc cttggttnga ctactggggn cagggnacnc tggtcacngt ntcnnnn 357 <210> 232 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 232 Glu Val Gln Leu Leu 1 5 <210> 233 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide linker <400> 233 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr His Thr Cys 1 5 10 15 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 20 25 <210> 234 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide linker <400> 234 Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser 1 5 10 15 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 20 25 30 <210> 235 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 235 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg catgagacga tggtgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcccccgg ttggtcagga tcccttctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctatat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acagcggtat attactgtgc gctgcttcct 300 aagagggggc cttggtttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357

Claims (83)

  1. 하기 아미노산 서열을 포함하는 항-TNFα 수용체 타입 1(TNFR1;p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인:
    EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAHETMVWVRQAPGKGLEWVSHIPPDGQDPFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYHCALLPKRGPWFDYWGQGTLVTVSS.
  2. 제 1항에 있어서, 하기 DOM1h-131-206의 누클레오티드 서열과 동일한 누클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 항-TNFα 수용체 타입 1(TNFR1;p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인:
    GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGCGCATGAGACGATGGTGTGGGTCCGCCAGGCACCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACATATTCCCCCGGATGGTCAGGATCCCTTCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTATATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACAGCGGTATATCACTGTGCGCTGCTTCCTAAGAGGGGGCCTTGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC.
  3. 제 1항 또는 제 2항의 항-TNFR1 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 TNFα 수용체 타입 1 길항제 및 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는, 폐 질환, 건선, 관절염 또는 염증성 장 질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  4. 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 제2 면역글로불린 단일 가변도메인을 포함하는 TNFα 수용체 타입 1 길항제 및 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 폐 질환, 건선, 관절염 또는 염증성 장 질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물로서, 여기서 각각의 가변 도메인이 제 1항 또는 제 2항에 따른 것인 약학 조성물.
  5. 제 3항에 있어서, 길항제가 상기 단일 가변 도메인의 단량체 또는 상기 단일 가변 도메인의 동종이합체를 포함하고, 상기 가변 도메인이 DOM1h-131-206의 아미노산 서열과 동일한 약학 조성물.
  6. 제 4항에 있어서, 길항제가 상기 단일 가변 도메인의 단량체 또는 상기 단일 가변 도메인의 동종이합체를 포함하고, 상기 가변 도메인이 DOM1h-131-206의 아미노산 서열과 동일한 약학 조성물.
  7. 제 3항에 있어서, 경구 전달, 환자의 위장관(GI tract)으로의 전달, 또는 폐 전달을 통해 투여되는 약학 조성물.
  8. 제 4항에 있어서, 경구 전달, 환자의 위장관(GI tract)으로의 전달, 또는 폐 전달을 통해 투여되는 약학 조성물.
  9. 제 1항 또는 제 2항의 항-TNFR1 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 TNFα 수용체 타입 1 길항제 및 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는, 폐 염증, 만성폐쇄폐병, 천식, 폐렴, 낭성 섬유증, 사이질 폐병, 알레르기 및 염증성 폐질환으로 구성된 군으로부터 선택된 호흡기 질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  10. 제 1항 또는 제 2항에 따른 가변 도메인을 포함하는 이중 특이적 리간드.
  11. 제 1항 또는 제 2항에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 엔코딩하는 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
  12. 제 11항의 핵산을 포함하는 벡터.
  13. 제 11항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  14. 제 12항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  15. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 항체 불변 도메인을 포함하는 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  16. 제 3항에 있어서, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인이 항체 불변 도메인을 추가로 포함하는 약학 조성물.
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Families Citing this family (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005289809A (ja) 2001-10-24 2005-10-20 Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) 突然変異重鎖抗体
PL1888641T3 (pl) 2005-05-18 2012-05-31 Ablynx Nv Białka wiążące albuminę surowicy
DE102005023617A1 (de) 2005-05-21 2006-11-23 Aspre Ag Verfahren zum Mischen von Farben in einem Display
CN101679511A (zh) * 2007-06-06 2010-03-24 杜门蒂斯有限公司 多肽、抗体可变域和拮抗剂
GB0724331D0 (en) 2007-12-13 2008-01-23 Domantis Ltd Compositions for pulmonary delivery
MX2009013137A (es) 2007-06-06 2010-04-30 Domantis Ltd Metodos para seleccionar polipeptidos resistentes a la proteasa.
TW200938222A (en) * 2007-12-13 2009-09-16 Glaxo Group Ltd Compositions for pulmonary delivery
CA2721202A1 (en) 2008-04-17 2009-10-22 Hilde Adi Pierrette Revets Peptides capable of binding to serum proteins and compounds, constructs and polypeptides comprising the same
US8349322B2 (en) 2008-06-25 2013-01-08 ESBATech, an Alcon Biomedical Research Unit, LLC Stable and soluble antibodies inhibiting VEGF
US8268314B2 (en) 2008-10-08 2012-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
BRPI0921319A2 (pt) * 2008-11-26 2018-10-16 Glaxo Group Ltd composição, método para dispensação de uma composição, e para tratar, prevenir ou diagnosticar uma condição ocular, e, processo para produzir uma composição farmacêutica
WO2010081787A1 (en) 2009-01-14 2010-07-22 Domantis Limited IMPROVED TNFα ANTAGONISM, PROPHYLAXIS & THERAPY WITH REDUCED ORGAN NECROSIS
AR075505A1 (es) 2009-02-19 2011-04-06 Glaxo Group Ltd Variantes de union a anti- albumina de suero mejoradas
MA33052B1 (fr) 2009-02-19 2012-02-01 Glaxo Group Ltd Variants de liaison anti-albumine sérique améliorés
US20110301335A1 (en) * 2009-02-19 2011-12-08 Stephen Duffield Anti-tnfr1 polypeptides, antibody variable domains & antagonists
CA2753287A1 (en) 2009-02-24 2010-09-02 Glaxo Group Limited Antigen-binding constructs
CA2768460A1 (en) * 2009-07-16 2011-01-20 Glaxo Group Limited Antagonists, uses & methods for partially inhibiting tnfr1
CN102574914A (zh) 2009-07-16 2012-07-11 葛兰素集团有限公司 改进的抗血清清蛋白结合性单可变区
CA2777700A1 (en) * 2009-10-14 2011-04-21 Aileron Therapeutics, Inc. Improved peptidomimetic macrocycles
ES2552177T3 (es) 2009-10-27 2015-11-26 Glaxo Group Limited Polipéptidos anti-TNFR1 estables, dominios variables de anticuerpos y antagonistas
EP2531523A1 (en) 2010-02-05 2012-12-12 Ablynx N.V. Peptides capable of binding to serum albumin and compounds, constructs and polypeptides comprising the same
EP2571900A1 (en) * 2010-05-20 2013-03-27 Glaxo Group Limited Improved anti-serum albumin binding variants
EP2603522A1 (en) * 2010-08-13 2013-06-19 GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Limited Improved anti-serum albumin binding variants
BR112013003899A2 (pt) 2010-08-20 2016-06-07 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd domínio variável único da imunoglobina anti-albumina sérica (sa), ligando multiespecífico, proteína de fusão, composição, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira isolada, e, método de tratar ou previnir uma doença ou distúrbio em um paciente
WO2012035141A1 (en) * 2010-09-16 2012-03-22 Baliopharm Ag Anti-hutnfr1 antibody
WO2012072731A2 (en) 2010-12-01 2012-06-07 Glaxo Group Limited Improved anti-serum albumin binding single variable domains
US20130310281A1 (en) 2011-02-02 2013-11-21 Glaxo Group Limited Novel antigen binding proteins
US9527925B2 (en) 2011-04-01 2016-12-27 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bispecific binding molecules binding to VEGF and ANG2
US10400029B2 (en) 2011-06-28 2019-09-03 Inhibrx, Lp Serpin fusion polypeptides and methods of use thereof
IN2013MN02441A (ko) 2011-06-28 2015-06-12 Inhibrx Llc
KR101632620B1 (ko) * 2011-07-27 2016-06-23 글락소 그룹 리미티드 Ｆｃ 도메인에 융합된 항­ｖｅｇｆ 단일 가변 도메인
EP2987806A3 (en) * 2011-08-17 2016-07-13 Glaxo Group Limited Modified single variable domain antibodies with reduced binding to anti-drug-antibodies
GB2497138A (en) * 2011-12-02 2013-06-05 Randox Lab Ltd Biomarkers for stroke and stroke subtype diagnosis.
AU2013288641B2 (en) 2012-07-13 2017-07-06 Roche Glycart Ag Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies and their use in the treatment of ocular vascular diseases
WO2014111550A1 (en) 2013-01-17 2014-07-24 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Modified anti-serum albumin binding proteins
US20150368292A1 (en) * 2013-01-31 2015-12-24 Glaxo Group Limited Method of producing a protein
US9840553B2 (en) 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
MA41374A (fr) * 2015-01-20 2017-11-28 Cytomx Therapeutics Inc Substrats clivables par métalloprotéase matricielle et clivables par sérine protéase et procédés d'utilisation de ceux-ci
CA3010056A1 (en) 2015-12-30 2017-07-06 Kodiak Sciences Inc. Antibodies and conjugates thereof
GB201617622D0 (en) * 2016-10-18 2016-11-30 VIB VZW and Universiteit Gent Means and methods to treat inflammation
RU2625010C1 (ru) * 2016-11-10 2017-07-11 Илья Петрович Приколаб Экспрессионный плазмидный вектор для экспрессии активной формы TNFR1-Fc и способ получения рекомбинантного белка
BR112019008727A2 (pt) 2016-11-28 2019-07-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd domínio de ligação ao antígeno, e polipeptídeo incluindo seção de transporte
UY37651A (es) * 2017-03-31 2018-10-31 Swedish Orphan Biovitrum Ab Publ Polipéptido de unión al il-1r-i
EP3703689A1 (en) * 2017-11-01 2020-09-09 Allogene Therapeutics, Inc. Modified caspase-9 polypeptides and methods of use thereof
US20210155701A1 (en) * 2018-05-30 2021-05-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Polypeptide comprising il-1r1 binding domain and carrying moiety
PL3623798T3 (pl) * 2018-09-13 2022-03-28 Euroimmun Medizinische Labordiagnostika Ag Sposób i urządzenie do wykrywania i przedstawiania obrazu immunofluorescencyjnego próbki biologicznej
CN112955240B (zh) * 2018-10-25 2022-09-16 豪夫迈·罗氏有限公司 抗体FcRn结合的修饰
CN111454366B (zh) * 2019-01-21 2023-06-16 中国科学院深圳先进技术研究院 一种融合蛋白及其应用
CN113728233A (zh) * 2019-01-31 2021-11-30 积水医疗株式会社 用于生物样品中的游离aim的免疫分析方法和分析试剂盒
EP4041312A4 (en) 2019-10-10 2023-12-20 Kodiak Sciences Inc. METHOD FOR TREATING AN EYE DISORDER
CA3193273A1 (en) 2020-08-27 2022-03-03 Enosi Therapeutics Corporation Methods and compositions to treat autoimmune diseases and cancer
WO2022117569A1 (en) 2020-12-02 2022-06-09 Oncurious Nv A ccr8 antagonist antibody in combination with a lymphotoxin beta receptor agonist antibody in therapy against cancer
CN115181751A (zh) * 2021-04-02 2022-10-14 苏州博腾生物制药有限公司 靶向白蛋白的嵌合抗原受体及其使用方法
CN114657162B (zh) * 2022-03-04 2023-06-16 华南理工大学 一种具有血管内皮细胞保护功能的抗氧化五肽及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004058820A2 (en) 2002-12-27 2004-07-15 Domantis Limited Single-domain-effector group and its uses
WO2007049017A3 (en) * 2005-10-24 2008-01-31 Domantis Ltd Agents that bind a target in pulmonary tissue for treating respiratory diseases

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2148299B (en) 1983-09-01 1988-01-06 Hybritech Inc Antibody compositions of therapeutic agents having an extended serum half-life
AU600575B2 (en) 1987-03-18 1990-08-16 Sb2, Inc. Altered antibodies
GB8725529D0 (en) 1987-10-30 1987-12-02 Delta Biotechnology Ltd Polypeptides
JP3095168B2 (ja) 1988-02-05 2000-10-03 エル． モリソン，シェリー ドメイン‐変性不変部を有する抗体
WO1990002809A1 (en) 1988-09-02 1990-03-22 Protein Engineering Corporation Generation and selection of recombinant varied binding proteins
AU634186B2 (en) 1988-11-11 1993-02-18 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
ATE92107T1 (de) 1989-04-29 1993-08-15 Delta Biotechnology Ltd N-terminale fragmente von menschliches serumalbumin enthaltenden fusionsproteinen.
CA2016842A1 (en) 1989-05-16 1990-11-16 Richard A. Lerner Method for tapping the immunological repertoire
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5977307A (en) 1989-09-07 1999-11-02 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific ligand-neuropharmaceutical agent fusion proteins
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
CA2109602C (en) 1990-07-10 2002-10-01 Gregory P. Winter Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
EP0546073B1 (en) 1990-08-29 1997-09-10 GenPharm International, Inc. production and use of transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
JPH06504997A (ja) 1990-12-06 1994-06-09 アフィメトリックス，　インコーポレイテッド 非常に大きい規模の固定化されたポリマーの合成
DE69233782D1 (de) 1991-12-02 2010-05-20 Medical Res Council Herstellung von Autoantikörpern auf Phagenoberflächen ausgehend von Antikörpersegmentbibliotheken
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
EP0714409A1 (en) 1993-06-16 1996-06-05 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
US5702892A (en) 1995-05-09 1997-12-30 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Phage-display of immunoglobulin heavy chain libraries
ES2176484T3 (es) 1995-08-18 2002-12-01 Morphosys Ag Bancos de proteinas/(poli)peptidos.
HU230048B1 (hu) * 1996-02-09 2015-06-29 Abbvie Biotechnology Ltd Humán TNFalfa-kötő antitestek alkalmazása
DE69826697T2 (de) 1997-07-07 2006-02-16 Medical Research Council In vitro selektionsmethode
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
EP1078051B1 (en) 1998-05-13 2007-12-12 Domantis Limited Phage-display system for the selection of correctly folded proteins
IL127127A0 (en) 1998-11-18 1999-09-22 Peptor Ltd Small functional units of antibody heavy chain variable regions
WO2002043660A2 (en) 2000-11-28 2002-06-06 Mediummune, Inc Methods of administering/dosing anti-rsv antibodies for prophylaxis and treatment
JP2003523742A (ja) 2000-02-03 2003-08-12 ドマンティス リミテッド コンビナトリアルタンパク質ドメイン
WO2001058953A2 (en) 2000-02-11 2001-08-16 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Identification of a domain in the tumor necrosis factor receptor family that mediates pre-ligand receptor assembly and function
US7115415B2 (en) * 2000-09-15 2006-10-03 Genentech, Inc. PRO9821 nucleic acids
WO2004058821A2 (en) * 2002-12-27 2004-07-15 Domantis Limited Dual specific single domain antibodies specific for a ligand and for the receptor of the ligand
DK1399484T3 (da) 2001-06-28 2010-11-08 Domantis Ltd Dobbelt-specifik ligand og anvendelse af denne
US20060073141A1 (en) * 2001-06-28 2006-04-06 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
GB0118689D0 (en) * 2001-08-01 2001-09-19 Psimedica Ltd Pharmaceutical formulation
AU2003210806A1 (en) 2002-03-05 2003-09-22 Eli Lilly And Company Heterologous g-csf fusion proteins
ATE328906T1 (de) * 2002-06-28 2006-06-15 Domantis Ltd Dual-specifische liganden mit erhöhter halbwertszeit
US20060002935A1 (en) 2002-06-28 2006-01-05 Domantis Limited Tumor Necrosis Factor Receptor 1 antagonists and methods of use therefor
US7696320B2 (en) 2004-08-24 2010-04-13 Domantis Limited Ligands that have binding specificity for VEGF and/or EGFR and methods of use therefor
JP4601426B2 (ja) 2002-09-06 2010-12-22 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 補体成分ｃ５に対する抗体を使用する喘息の処置の方法
NZ605429A (en) 2002-09-06 2014-08-29 Amgen Inc Therapeutic human anti-il-1r1 monoclonal antibody
EP3299393A1 (en) 2002-11-08 2018-03-28 Ablynx N.V. Single domain antibodies directed against tumour necrosis factor-alpha and uses therefor
US20060104968A1 (en) * 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
ATE414106T1 (de) * 2003-06-30 2008-11-15 Domantis Ltd Pegylierte single-domain-antikörper (dab)
HUE027902T2 (en) 2004-02-09 2016-11-28 Human Genome Sciences Inc Corp Service Company Albumin fusion proteins
ATE479760T1 (de) 2004-03-24 2010-09-15 Domantis Ltd Universelles signalpeptid gas1
EP2319492A3 (en) * 2004-10-21 2011-08-10 Genentech, Inc. Method for treating intraocular neovascular diseases
MX2007006593A (es) 2004-12-02 2008-03-04 Domantis Ltd Anticuerpos de dominio simple anti-il 1r1 y sus usos terapeuticos.
EA200801170A1 (ru) * 2005-12-01 2008-12-30 Домантис Лимитед Форматы неконкурентного доменного антитела, которые связываются с рецептором интерлейкина 1 первого типа
JP2009517069A (ja) * 2005-12-01 2009-04-30 ドマンティス リミテッド インターロイキン１受容体１型に結合する競合ドメイン抗体フォーマット
PT2068889T (pt) 2006-08-10 2020-01-30 Roy C Levitt Anakinra para uso no tratamento da síndrome da bronquiolite obliterante
EP2081960B1 (en) * 2006-10-27 2018-06-27 Ablynx N.V. Intranasal delivery of polypeptides and proteins
MX2009013137A (es) 2007-06-06 2010-04-30 Domantis Ltd Metodos para seleccionar polipeptidos resistentes a la proteasa.
CN101679511A (zh) 2007-06-06 2010-03-24 杜门蒂斯有限公司 多肽、抗体可变域和拮抗剂

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004058820A2 (en) 2002-12-27 2004-07-15 Domantis Limited Single-domain-effector group and its uses
WO2007049017A3 (en) * 2005-10-24 2008-01-31 Domantis Ltd Agents that bind a target in pulmonary tissue for treating respiratory diseases

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Publication number Publication date
PE20090323A1 (es) 2009-04-20
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US20100247515A1 (en) 2010-09-30
CA2683791A1 (en) 2008-12-11
CN101778865A (zh) 2010-07-14
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SI2162467T1 (sl) 2015-11-30

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