CN102131827A - 用于肺部传递给药的组合物 - Google Patents
用于肺部传递给药的组合物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102131827A CN102131827A CN2008801271605A CN200880127160A CN102131827A CN 102131827 A CN102131827 A CN 102131827A CN 2008801271605 A CN2008801271605 A CN 2008801271605A CN 200880127160 A CN200880127160 A CN 200880127160A CN 102131827 A CN102131827 A CN 102131827A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- composition
- dab
- polypeptide
- aminoacid sequence
- lung
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/244—Interleukins [IL]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及直接肺部传递多肽(例如域抗体)的方法,并涉及适于直接肺部传递的特定多肽组合物。本发明还涉及这样的组合物在药物中的用途,所述药物例如用于治疗和诊断肺病,例如用于治疗慢性阻塞性肺病(COPD)和哮喘。
Description
本发明涉及直接肺部传递多肽例如域抗体的方法,并涉及适于直接肺部传递的特定多肽组合物。本发明还涉及这样的组合物在药物中的用途,所述药物例如用于治疗和诊断肺病,例如用于治疗慢性阻塞性肺病(COPD)和哮喘。
发明背景
治疗剂或诊断剂经常不能渗透入组织或器官中,因而不能在特别需要的位置产生所需的治疗或诊断作用。
因此,需要将这样的治疗剂或诊断剂直接给予组织或器官的方法,例如直接给予到肺组织,使该药剂产生较长的治疗窗。
还需要包含这样的治疗剂或诊断剂的特定组合物,所述组合物尤其适于直接给予特定的组织或器官,例如需要包含特别适合于直接给予到肺的治疗剂或诊断剂的组合物。这样的组合物可用于疾病的治疗、诊断或预防,例如用于呼吸道疾病的治疗、诊断或预防,其中所述药剂被配制用于直接局部给予至肺组织。这样的药剂的实例为域抗体(dAb)。
业已发现,结合肺组织中的靶的域抗体(dAb)可用于生产治疗或预防呼吸道疾病的组合物,其中所述组合物适于局部给予到肺组织。在一个实施方案中,可以使用多达约10mg/kg的结合肺组织靶的dAb。在另一个实施方案中,肺组织的靶介导肺部炎症或肺病(参见WO2007049017的公开内容,其内容通过引用结合到本文中)。
一个令人感兴趣的靶是肿瘤坏死因子(TNF-α)途径,人们相信该途径与肺病(如COPD)和哮喘的发病有关。
已产生了一些抑制TNFR1的域抗体(dAb),对这些域抗体(dAb)已有描述(例如在WO 2007049017和WO 06038027中),它们可有效治疗肺部炎症或呼吸道疾病,例如慢性阻塞性肺病(COPD)。
TNF-α具有与COPD相关的广谱炎性作用,通过释放蛋白酶导致嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、上皮细胞粘液分泌的活化和肺实质的破坏(Barnes PJ等人,Chronic obstructive pulmonary disease:molecular and cellular mechanisms.Eur Respir J.2003年10月;22(4):672-88)。
已公布的研究表明,与一般吸烟者和哮喘患者相比,TNF-α在COPD患者的诱导痰液中以较高的浓度存在(Keatings VM等人,Differences in interleukin-8 and tumor necrosis factor-alpha in induced sputum from patients with chronic obstructive pulmonary disease or asthma.Am J Respir Crit Care Med.1996年2月;153(2):530-4)。
另外,增加的TNF-α表达可能暂时与COPD患者的病情恶化相关(Calikoglu M等人,Leptin and TNF-alpha levels in patients with chronic obstructive pulmonary disease and their relationship to nutritional parameters.Respiration.2004年1月-2月;71(1):45-50)。
TNFR1的表达似乎在分离自COPD患者的外周T细胞上增加(Hodge.G.等人,Increased intracellular T helper 1 proinflammatory cytokine production in peripheral blood,BAL and intraepithelial T cells of COPD subjects.Clin.Exp.Immunol.2007.150(1).22-29)。
此外,升高的外周可溶性TNFR1水平与急性肺损伤患者和呼吸机诱导性肺损伤患者的发病率和死亡率密切相关(Parsons,P.E.等人,Elevated plasma levels of soluble TNF receptors are associated with morbidity and mortality in patients with acute lung injury.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.2005.288:L426-L431)。
肿瘤坏死因子α是一种在病理状况下的体液中以低浓度存在的多效性细胞因子。它是免疫学和病理生理反应的主要介导物。TNF-α主要由活化的巨噬细胞和单核细胞产生,但也由许多其它细胞类型产生,包括B淋巴细胞、T淋巴细胞和成纤维细胞。TNF-α一般以26kDa前体合成,其以膜结合形式储存于细胞上。在由细胞释放之前,前体形式转变为可溶性的17kDa TNF-α,并由TNF-α转化酶(TACE)或其它基质金属蛋白酶活化。
TNF-α是结合两种不同的细胞表面受体的同三聚体,两种受体为55-60kDa TNFR1链和70-80kDa TNFR2链,它们均以非共价结合的同三聚体受体复合物存在。TNFR由广泛的细胞表达。例如,迄今还没有在体内发现不表达TNFR1的细胞类型,而TNFR2主要由免疫细胞和内皮细胞表达。
TNFR1和TNFR2是主要在它们的胞外结构域中具有28%同源性的单跨膜糖蛋白,它们包含4个串联重复的富半胱氨酸基序。它们包含几个具有已知功能意义的基序。TNFR1和TNFR2均包含胞外前配体结合装配结构域(PLAD)(与配体结合区不同),其预复合受体,特别是在被TNF-α配体活化时促进三聚化。TNFR1包含至受体的羧基末端约80个氨基酸长度的死亡结构域(DD)基序,对TNFR1的死亡诱导活性很关键。
于0℃的结合研究确定了TNF-α对两种TNFR的高亲和性结合,对TNFR1的Kd值约为300-600pM,对TNFR2的Kd值约为70-200pm(MacEwan DJ.等人,TNF receptor subtype signalling:differences and cellular consequences.Cell Signal.2002年6月;14(6):477-92)。
然而,TNFR1(而不是TNFR2)于生理温度时是可溶性TNF-α的高亲和性受体(KD=19pM),这主要由TNF-α对TNFR1的非常慢的离去速率驱动。TNF-α与TNFR1的复合物非常稳定,平均存活时间为大约48分钟,更有可能被内化(相比于解离),产生在胞内持续存在的信号转导复合物。TNFR1和TNFR2均还能够结合与TNF-α同源(30%氨基酸同一性)的淋巴毒素。淋巴毒素在男性中的功能性作用很大程度上是未知的。
膜结合型TNF-α结合并活化TNFR1和TNFR2二者。而可溶性TNF-α不结合TNFR2,相比于膜结合型TNF-α对TNFR2的活化,随后的信号转导显著降低。TNFR2一旦被活化,就被基质金属蛋白酶(MMP)切割为可溶性形式,其仍能够结合TNF-α配体(Pennica D等人,Biochemical properties of the 75-kDa tumor necrosis factor receptor.Characterization of ligand binding,internalization,and,receptor phosphorylation.J Biol Chem.1992年10月15日;267(29):21172-8)。
多个实验方案已揭示,TNF-R1启动TNF-α的大部分生物活性。TNF-α与TNF-R1的结合触发一系列胞内事件,其最终导致两种主要转录因子的活化:核因子kB(NF-kB)和c-Jun。这些转录因子的作用是诱导表达对于不同生物学过程都重要的基因,所述生物学过程包括细胞的生长及死亡、发育、瘤形成和免疫、炎症以及应激反应。对于单核细胞增生李斯特菌或结核分枝杆菌的感染,TNFR1缺陷的转基因小鼠显示出更高的敏感性,但却能抵抗TNF-α或白介素-1介导的体内致命性,并且能抵抗由脂多糖和D-半乳糖胺诱导的内毒素休克模型。还已经表明,TNFR1能控制早期移植物抗宿主病。
使用TNFR2缺陷的转基因小鼠的研究已表明,TNFR2在几种有益的免疫学过程中起重要作用。已表明TNFR2在以下方面起作用:抗原驱动的T细胞应答和增殖(The type 1 receptor(CD120a)is the high-affinity receptor for soluble tumor necrosis factor.Proc Natl Acad Sci U S A.1998年1月20日;95(2):570-5.)、抗肿瘤作用(Zhao X等人,Tumor necrosis factor receptor 2-mediated tumor suppression is nitric oxide dependent and involves angiostasis.Cancer Res.2007年5月1日;67(9):4443-50)、缺血诱导的新血管化(Goukassian DA,等人,Tumor necrosis factor-alpha receptor p75 is required in ischemia-induced neovascularization.Circulation.2007年2月13日;115(6):752-62)、树突细胞-天然杀伤细胞交扰朗格汉斯细胞迁移。最后,Higuchi Y等人(Higuchi,Y.等人,Tumor necrosis factor receptors 1 and 2 Differentially Regulate Survival,Cardiac Dysfunction,and Remodeling in Transgenic Mice With Tumor Necrosis Factor Induced Cardiomyopathy.Circulation.2004;109:1892-1897)表明,经由TNFR2的信号转导可以在细胞因子介导的心力衰竭发病机理中起保护心脏的作用。TNFR1的特异性阻断可以潜在地使TNF-α经由TNFR2的信号转导发挥出其某些有益的免疫功能,同时消除TNFR1信号转导的有害作用。
临床前研究和临床研究已鉴定并验证,在许多免疫介导的炎性疾病中,TNF-α为关键的疾病分子和免疫治疗干预的治疗靶。临床适应症包括类风湿性关节炎、克罗恩氏病、强直性脊柱炎和银屑病。最近的临床发现表明,许多慢性炎性疾病共有某些致病途径,而其它疾病限于具体的疾病表型。使用抗-TNFα剂作为探测剂,已证实TNF-α能调节其它促炎细胞因子例如IL-1α和IL-1β、向关节的炎性细胞募集、基质金属蛋白酶和滑液血管分布(Taylor PC等人,Tumour necrosis factor alpha as a therapeutic target for immune-mediated inflammatory diseases.Curr Opin Biotechnol.2004年12月;15(6):557-63)。
TNF-α可以在肺病如COPD和哮喘中起关键作用,并增强炎性反应,通过蛋白酶的释放导致上皮细胞、单核细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞粘液分泌的活化以及肺实质的破坏。
COPD的特征在于缓慢进行性发展的气管狭窄,这是完全不可逆的。传统意义上,COPD包括慢性支气管炎和肺气肿两方面的临床表现或病理表现。在临床上,慢性支气管炎定义的基础是引起痰性咳嗽的粘液产生,而肺气肿是肺泡破坏的病理过程。除了显著的炎性浸润以外,在诊断患有COPD的患者的气管中,粘液细胞增生增加和肥大均是明显的。尽管临床上相关的粘液分泌的主要部位仍是较大的气管,但大部分气流阻塞被认为存在于非软骨的膜细支气管和末端气管中。小气管的长期炎症导致上皮下纤维化、细支气管壁厚度增加以及粘液性气道阻塞。
与一般吸烟者和哮喘患者相比,在COPD患者的诱导痰中存在较高浓度的TNF-α(Keatings VM等人,Differences in interleukin-8 and tumour necrosis factor-alpha in induced sputum from patients with chronic obstructive pulmonary disease or asthma.Am J Respir Crit Care Med.1996年2月;153(2):530-4)。另外,增加的TNF-α表达可能暂时与COPD患者的病情恶化相关(先前援引的Calikoglu等人,2004)。尽管似乎还没有研究肺组织中的TNFR1和TNFR2表达,但已表明外周可溶性TNFR2水平在COPD患者中增加,而TNFR1的表达似乎在分离自COPD患者的外周T细胞上增加(Hodge.G.等人,Increased intracellular T helper 1 proinflammatory cytokine production in peripheral blood,BAL and intraepithelial T cells of COPD subjects.Clin.Exp.Immunol.2007.150(1).22-29.)。而且,升高的外周可溶性TNFR1水平与急性肺损伤患者和呼吸机诱导性肺损伤患者的发病率和死亡率密切相关(Parsons,P.E.等人,Elevated plasma levels of soluble TNF receptoes are associated with morbidity and mortality in patients with acute lung injury.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.2005.288:L426-L431)。
在伴有体重减轻和骨骼肌减少的COPD患者中,TNF-α的血清浓度和外周单核细胞的诱导性TNF-α生产增加。这意味着在恶病质病因学中TNF-α通常与严重COPD相关。
因此,已产生了抗-TNFR1域抗体来抑制TNFR1靶(参见例如WO2007049017和WO06038027中的公开内容)。
尤其需要通过直接肺部传递这样的抗TNFR1域抗体,来实现例如治疗或预防肺病的TNFR1靶的局部抑制,因此,需要包含可抑制TNFR1靶的药剂(例如抗TNFR1域抗体)的组合物,所述组合物尤其适于直接给予到肺组织。这样的组合物可用于治疗或预防呼吸道疾病,例如COPD或哮喘或肺结节病。
短语“免疫球蛋白单可变结构域”是指独立于其它不同的V区或结构域,特异性结合抗原或表位的抗体可变结构域(VH、VHH、VL)。免疫球蛋白单可变结构域可以与其它可变区或可变结构域以一定形式(例如同多聚体或异多聚体)存在,其中所述其它区或结构域不是单免疫球蛋白可变结构域进行抗原结合所需要的(即其中免疫球蛋白单可变结构域独立于其它不同的可变结构域结合抗原)。“域抗体”或“dAb”与本文使用的术语“免疫球蛋白单可变结构域”相同。在一个实施方案中,免疫球蛋白单可变结构域是人抗体可变结构域,但也包括其它物种如啮齿类动物(例如WO 00/29004中所公开的,其内容整体通过引用结合到本文中)、护士鲨和骆驼类VHH dAb的单抗体可变结构域。骆驼类VHH是免疫球蛋白单可变结构域多肽,其来源于包括骆驼、无峰驼、羊驼、单峰驼和原驼的物种,产生天然缺少轻链的重链抗体。
“结构域”是折叠的蛋白结构,其具有与蛋白的其它部分无关的三级结构。一般而言,结构域形成蛋白的独立功能特性,在许多情况下,可以添加、除去或转移至其它蛋白,而不丧失蛋白和/或结构域的其余部分的功能。“单抗体可变结构域”是折叠的多肽结构域,其包含特征为抗体可变结构域的序列。因此其包括完整的抗体可变结构域和修饰的可变结构域,例如其中一个或多个环已被不以抗体可变结构域为特征的序列替代,或者已被截短或包含N末端或C末端延长的抗体可变结构域,以及保留全长结构域的至少结合活性和特异性的可变结构域的折叠片段。
发明概述
我们现在已开发了包含以下或由以下组成的组合物:(a)多肽,例如抗体(例如单克隆抗体)或免疫球蛋白多肽,例如域抗体(dAb),或者例如纳米抗体,以及(b)药学上可接受的缓冲液,其中所述组合物包含液滴,且在所述组合物中存在的液滴中,约40%或以上(例如50%或以上)的液滴小于约6微米,例如约1微米至约6微米,例如小于约5微米,例如约1微米至约5微米。这些组合物例如尤其适于通过直接局部肺部传递给予患者。例如,这些组合物可以直接给予到肺,例如通过吸入,例如通过使用喷雾器装置。
因此,本发明提供包含以下或由以下组成的组合物:(a)多肽,例如免疫球蛋白多肽,例如域抗体(dAb)或例如纳米抗体组合物,以及(b)药学上可接受的缓冲液,其中所述组合物包含液滴,且在所述组合物中存在的液滴中,约40%或以上(例如50%或以上)的液滴小于约6微米,例如约1微米至约6微米,例如小于约5微米,或例如约1微米至约5微米,例如通过直接局部肺部传递给予患者。这些组合物可以包含生理学上可接受的缓冲液,其具有约4至约8的pH范围,例如约7至约7.5,并且其粘度约等于约2%至约10%PEG 1000在含1.2%(重量/体积)蔗糖的50mM磷酸盐缓冲液中的溶液的粘度。
在所述组合物中存在的液滴中,至少40%的液滴、例如50%或以上、例如80%或以上的液滴的大小小于约6微米,例如约1微米至约6微米。小于约6微米的液滴大小范围可以为例如约1微米至约6微米,例如约2微米至约5微米,对于传递至深肺,其可优选为例如约2微米至约3微米。
目前已知的药学上可接受的缓冲液的实例包括磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液和组氨酸缓冲液。所述缓冲液还可以包含添加剂,例如(a)增加粘度的物质,例如PEG,例如PEG 1000;糖,例如蔗糖、甘露糖、lutrol(例如lutrol 44),和/或(b)稳定剂,例如洗涤剂。
本发明进一步涉及如上所述的组合物,其还进一步包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
所述多肽可以包含以下或由以下组成:例如治疗性、预防性或诊断性多肽,其需要向受试者传递,例如至多约150个氨基酸的所述多肽。
所述多肽可以为例如抗体(例如单克隆抗体)或免疫球蛋白多肽,或者它们可以为例如多肽结构域,例如单体,例如至多约150个氨基酸。
所述多肽可以包含以下或由以下组成:例如域抗体(“dAb”),例如域抗体(dAb)单体。
所述多肽还可以包含以下或由以下组成:非IgG样的骨架,例如亲和体(affibody)。
本文使用的术语“多肽”或域抗体(“dAb”)还用于指例如与其它分子融合或缀合或结合的多肽或dAb,例如需要将其传递给患者,例如Albudab,其中dAb与人血清白蛋白结合,以延长半衰期(参见例如WO 2005118642和WO 2006059106,其教导通过引用结合到本文中)。
所述多肽,例如域抗体分子,例如dAb单体,可以结合目标靶,例如存在于肺组织中的靶,所述靶可以为例如在肺病症或肺疾病或肺障碍中起作用的靶,例如,所述靶可以为TNF受体,例如TNFR1。所述多肽还可以结合一个以上的靶,例如它们可以为双重靶向dAb,例如在WO2004058821中所述那些。
dAb可以结合任何目标靶分子。dAb还可以为具有一定形式或格式(formatted)的dAb,例如它们可以为dAb-FC融合蛋白,或者它们可以连接至另一个基团,例如PEG基团。dAb还可以为连接另一个分子的基团,例如作为融合蛋白,例如连接至结合靶的另一个分子。
本发明还涉及如上所述的组合物的用途,例如域抗体(dAb)组合物,例如其结合肺组织中的靶,用于通过直接局部肺部传递给予患者。
还提供本文所述的组合物,例如本文所述的dAb组合物,用于药物,所述药物用于例如治疗、预防或诊断呼吸道疾病或肺疾病或肺障碍,例如COPD或哮喘或肺结节病。
本发明还涉及组合物(例如上述的dAb组合物)在生产用于治疗、预防或诊断呼吸道疾病或肺疾病或肺障碍的药物中的用途。在一个实施方案中,可以使用至多约10mg结合肺组织中的靶的dAb。肺组织中的靶可以为介导肺炎症或肺疾病的靶。
还提供治疗、预防或诊断疾病或病症(例如呼吸道病症或肺疾病或肺障碍)的方法,其包括给予患者一定量(例如治疗有效量)的本文所述组合物,例如dAb组合物。作为日剂量给予的剂量范围可以在约5mg/Kg患者体重至约0.005mg/Kg患者体重,例如约0.5mg/Kg至约0.1mg/Kg患者体重。在某些实施方案中,将组合物直接给予到肺组织,例如通过吸入,例如通过使用喷雾器、鼻内装置或吸入装置。
本发明进一步涉及传递装置,例如喷雾器、吸入器或鼻内传递装置,以及其用途,其用于向患者提供一定剂量(例如计量剂量)的本文所述组合物(例如dAb组合物),以治疗或预防或诊断疾病或病症(例如呼吸道疾病或病症),其中吸入器或鼻内传递装置装有dAb制剂,并且例如提供计量的日剂量,例如包含至多10mg dAb。可以依据本发明使用不同类型的喷雾器装置,例如喷射式喷雾器装置,如PARI,以及例如振荡筛喷雾器,例如eFlow和Aeroneb,还有例如超声装置,例如DeVilbiss和Kun-88。
本发明还提供生产本发明的组合物的方法,其包括以下步骤:混合(a)多肽,例如域抗体(dAb)和(b)药学上可接受的缓冲液,例如这样的缓冲液:其具有约4至约8的pH范围,例如约7至约7.5,并且其粘度约等于约2%至约10%PEG 1000在含1.2%(重量/体积)蔗糖的50mM磷酸盐缓冲液中的溶液的粘度。还可以加入添加剂,例如药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂,和/或增加粘度的药剂,和/或稳定剂。
本发明还涉及本文所述的组合物(例如本文所述的域抗体(dAb)组合物)用于诊断目的(例如用于造影)的用途,其中免疫球蛋白样分子(例如域抗体)的重链部分或轻链部分可以有利地包含可检测标记。适宜的可检测标记和用于标记药剂的方法是本领域众所周知的。适宜的可检测标记包括例如放射性同位素(例如铟-111、锝-99m或碘-131)、正电子发射标记(例如氟-19)、顺磁离子(例如钆(Gadlinium)(III)、锰(II))、表位标记(标签)、亲和标记(例如生物素、抗生物素蛋白)、自旋标记、酶、荧光基团或化学发光基团。当不使用标记时,可以通过表面等离子体共振或其它适宜的方法测定复合物形成。
本发明还涉及本文所述的组合物(例如本文所述的域抗体(dAb)组合物)在制备喷雾器、吸入器或鼻内传递装置中的用途,用于提供局部传递至肺的长效吸入dAb制剂。
本发明还涉及将组合物(例如本文所述的域抗体(dAb)组合物,其结合肺组织中的靶)给予患者以在肺组织中产生长治疗窗的方法,该方法包括向所述患者的肺组织局部给予有效量的所述组合物,例如本文所述的所述域抗体(dAb)组合物。
本发明还涉及生产多肽组合物如dAb组合物的方法,所述组合物用于例如治疗、预防或诊断肺病症或肺疾病,所述方法包括混合(a)多肽和(b)生理学上可接受的缓冲液,所述缓冲液具有约4至约8的pH范围,并且其粘度约等于约2%至约10%PEG 1000在含1.2%(重量/体积)蔗糖的50mM磷酸盐缓冲液中的溶液的粘度。
本发明进一步涉及生产多肽组合物如dAb组合物的方法,其包括以下步骤:(a)混合多肽和生理学上可接受的缓冲液,所述缓冲液例如这样的缓冲液:其具有约4至约8的pH范围,并且其粘度约等于约2%至约10%PEG 1000在含1.2%(重量/体积)蔗糖的50mM磷酸盐缓冲液中的溶液的粘度,然后(b),使得自步骤(a)的多肽和缓冲液组合物通过喷雾器、吸入器或鼻内传递装置。
本发明还进一步涉及生理学上可接受的缓冲液在制备例如用于肺部传递的多肽组合物(例如dAb组合物)中的用途,所述缓冲液具有约4至约8的pH范围,并且其粘度约等于约2%至约10%PEG 1000在含1.2%(重量/体积)蔗糖的50mM磷酸盐缓冲液中的溶液的粘度。
本发明还涉及将所需分子传递入系统循环中的方法,所述方法包括首先通过吸入(例如使用喷雾器、鼻内装置或吸入装置)将本文所述的组合物给予到肺。
本发明还涉及本文所述的dAb以及本文所述包含这些dAb的组合物,涉及如上所述的dAb的用途,以及制备这些dAb组合物的方法,并且还涉及例如如上所述的喷雾器或吸入器装置,其包含这些dAb组合物。
附图简述:
图1:显示了针对TNFR1的Dom1h-131前导域抗体的氨基酸序列。
图2:显示了在人TNFR1受体结合测定中的TNF-α剂量曲线。每种样品均以4份复制品测试。
图3:显示了DOM1H-131-202、DOM1H-131-206和DOM1H-131-511在人TNFR1受体结合测定中的抑制。每种样品均以4份复制品测试。
图4:显示了DOM1H-131-202、DOM1H-131-511和DOM1H-131-206的蛋白酶稳定性数据。
图5:显示了缓冲液和装置对GSK 1995056A(511)的雾化液滴大小的影响。
图6:显示了在各种装置中雾化后依据通过SEC检测的二聚体形成评价的DOM1H-131-511(511)稳定性。
图7:显示了使用Pari LC装置对206AT 40mg/ml至多1小时的SEC追踪。
图8:显示了RBA结果,表明DOM1H-131-511(511)在雾化后保留活性。
图9:显示了DOM1H-131-202(202)、DOM1H-131-206(206)和DOM1H-131-511(511)在Pari E-flow和LC+中的喷雾器测试。在Britton-Robinson或配制缓冲液中的蛋白浓度为5mg/ml。标准品(药物X)作为对照以其自身用于传递的配制缓冲液测试。
图10:显示了在使用振荡筛喷雾器(E-flow,Pari)雾化前和雾化后对DOM10-53-474的SEC追踪。
图11:显示了在使用喷射式喷雾器(LC+,Pari)雾化前和雾化后对DOM10-53-474的SEC追踪。
图12a-e:显示了以下的氨基酸序列:(a)毒蜥外泌肽4(G4S)3DOM7h-14融合蛋白(DAT0115)、(b)DOM10-53-474(抗IL-13dAb)、(c)DOM10-275-78(抗IL-13dAb)、(d)DOM4-130-202(抗IL-1R1)和(e)DOM4-130-201(抗IL-1R1)。
图13a-d:显示了某些抗TNFR1 dAb的氨基酸序列:(a)Dom1h-131-201、(b)Dom 1h-131-203、(c)Dom 1h-131-204、(d)Dom1h-131-205。
图14a-i:显示了某些抗VEGF dAb的氨基酸序列:(a)Dom15-26-593、(b)Dom 15-26-501、(c)Dom 15-26-555、(d)Dom 15-26-558、(e)Dom 15-26-589、(f)Dom 15-26-591dAb、(g)Dom 15-26-594、(h)Dom 15-26-595、(i)DMS 1529(VEGF dAb 15-26-593-Fc融合蛋白)。
发明详述
定义
短语“免疫球蛋白单可变结构域”是指独立于其它V区或结构域、特异性结合抗原或表位的抗体可变结构域(VH、VHH、VL)。免疫球蛋白单可变结构域可以与其它可变区或可变结构域以一定形式(例如同多聚体或异多聚体)存在,其中其它区或结构域不是单免疫球蛋白可变结构域进行抗原结合所需要的(即其中免疫球蛋白单可变结构域独立于其它的可变结构域结合抗原)。“域抗体”或“dAb”与本文使用的术语“免疫球蛋白单可变结构域”相同。在某些实施方案中,免疫球蛋白单可变结构域为人抗体可变结构域,但也包括其它物种如啮齿类动物(例如WO 00/29004中所公开的,其内容整体通过引用结合到本文中)、护士鲨和骆驼类VHH dAb的单抗体可变结构域。骆驼类VHH是免疫球蛋白单可变结构域多肽,其来源于包括骆驼、无峰驼、羊驼、单峰驼和原驼等物种,产生天然缺少轻链的重链抗体。
“结构域”是折叠的蛋白结构,其具有与蛋白的其它部分无关的三级结构。一般而言,结构域形成蛋白的独立功能特性,在许多情况下可以添加、除去或转移至其它蛋白,而不丧失蛋白和/或结构域的其余部分的功能。“单抗体可变结构域”是折叠的多肽结构域,其包含特征为抗体可变结构域的序列。因此其包括完整的抗体可变结构域和修饰的可变结构域,例如其中一个或多个环已被不以抗体可变结构域为特征的序列替代,或者已被截短或包含N末端或C末端延长的抗体可变结构域,以及保留全长结构域的至少结合活性和特异性的可变结构域的折叠片段。
术语“多肽”是指任何种类的多肽,例如肽;人蛋白;人蛋白片段;非人来源的蛋白或蛋白片段;工程改造形式的蛋白或蛋白片段;酶;抗原;药物;涉及细胞信号转导的分子如受体分子;抗体,包括免疫球蛋白超家族的多肽,例如抗体多肽或T-细胞受体多肽。
所述多肽例如可以为抗体或免疫球蛋白多肽,或者它们可以为例如多肽结构域,例如单体,例如至多约150个氨基酸。
所述多肽可有用地包含以下或由以下组成:例如域抗体(“dAb”),例如dAb单体。
所述多肽还可以包含以下或由以下组成:非IgG样骨架,例如亲和体。
本文使用的术语“多肽”或域抗体(“dAb”)还用于指例如与其它分子融合或缀合或结合的多肽或dAb。例如,所述多肽例如dAb可被PEG化,PEG化的dAb例如描述于WO2004081026。所述多肽例如dAb可以与血清白蛋白结合,例如它们可以为WO2005118642和WO2006059106中所述的连接血清白蛋白的dAb(Albudab)。
有利的是,所述抗体多肽可以包含重链(VH)多肽和轻链(VL)多肽,或者包含重链(VH)多肽或轻链(VL)多肽的单域抗体库(single domain antibody repertoires)。本文使用的抗体多肽是修饰的或未修饰的抗体或抗体组成部分的多肽。因此,术语抗体多肽包括重链、轻链、重链-轻链二聚体、Fab片段、F(ab′)2片段、重链单结构域、轻链单结构域、Dab片段或Fv片段(包括单链Fv(scFv))。构建这样的抗体分子和编码它们的核酸的方法是本领域众所周知的。
本文所述包含多肽(如域抗体)的组合物可以结合肺组织中的靶,所述靶选自:TNFR1、IL-1、IL-1R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-8R、IL-9、IL-9R、IL-10、IL-12、IL-12R、IL-13、IL-13Rα1、IL-13Ra2、IL-15、IL-15R、IL-16、IL-17R、IL-17、IL-18、IL-18R、IL-23、IL-23R、IL-25、CD2、CD4、CD11a、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD56、CD138、ALK5、EGFR、FcER1、TGFb、CCL2、CCL18、CEA、CR8、CTGF、CXCL12(SDF-1)、凝乳酶、FGF、弗林蛋白酶、内皮素-1、嗜酸性粒细胞趋化因子(例如嗜酸性粒细胞趋化因子、嗜酸性粒细胞趋化因子-2、嗜酸性粒细胞趋化因子-3)、GM-CSF、ICAM-1、ICOS、IgE、IFNa、I-309、整联蛋白、L-选择素、MIF、MIP4、MDC、MCP-1、MMPs、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、骨桥蛋白、OX-40、PARC、PD-1、RANTES、SCF、SDF-1、唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素8、TARC、TGFb、凝血酶、Tim-1、TNF、TNFR1、TRANCE、类胰蛋白酶、VEGF、VLA-4、VCAM、α4β7、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8、αvβ6、αvβ8、cMET和CD8。
本文所述包含多肽(如域抗体)的组合物还可以结合系统性靶,例如所述靶可以为GLP-1、毒蜥外泌肽和干扰素。
在一个实施方案中,本文所述的包含多肽(如域抗体)的组合物可以结合选自TNF信号转导级联中的蛋白的靶。在某些实施方案中,该蛋白靶选自TNFα、TNFβ、TNFR2、TRADD、FADD、半胱天冬酶-8、TNF受体相关因子(TRAF)、TRAF2、受体互作蛋白(RIP)、Hsp90、Cdc37、IKKα、IKKβ、NEMO、kB抑制剂(IkB)、NF-kB、NF-kB必需调节物、凋亡信号调节性激酶-1(aSMase)、中性神经磷脂酶(nSMase)、ASK1、组织蛋白酶-B、生发中心激酶(GSK)、GSK-3、死亡结构域蛋白相关因子(FADD)、中性神经磷脂酶活化相关因子(FAN)、FLIP、JunD、NF-kB激酶抑制剂(IKK)、MKK3、MKK4、MKK7、IKKγ、有丝分裂原活化的蛋白激酶/Erk激酶激酶(MEKK)、MEKK1、MEKK3、NIK、聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)、PKC-ζ、RelA、T2K、TRAF1、TRAF5、死亡效应子结构域(DED)、死亡结构域(DD)、死亡诱导信号转导复合物(DISC)、凋亡蛋白抑制剂(IAP)、c-Jun N-末端激酶(JNK)、有丝分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)、磷酸肌醇-3OH激酶(PI3K)、蛋白激酶A(PKA)、PKB、PKC、PLAD、PTEN、rel同源结构域(RHD)、真正令人感兴趣的新基因(RING)、应激激活的蛋白激酶(SAPK)、TNFα转化酶(TACE)、死亡结构域蛋白沉默子(SODD)和TRAF相关的NF-kB活化剂(TANK)。关于这些优选的靶,参考WO04046189、WO04046186和WO04046185(通过引用结合到本文中),这些文献为如何选择用于靶向胞内靶的抗体单可变结构域提供了指引。
本发明尤其涉及TNFR1拮抗剂,其为如本文所述配制的域抗体,并涉及其在制备用于治疗、抑制或预防肺部炎症和/或呼吸道疾病例如COPD或哮喘的药物中的用途。
还提供本文所述用于肺部传递的组合物,其包含结合IL-13的分子例如dAb,例如用于治疗哮喘。这些dAb的实例描述于例如WO2007/085815,在本文也称为DOM10-275-78和DOM10-275-78。
本发明进一步提供本文所述的用于肺部传递的组合物,其包含结合IL-13的免疫球蛋白单可变结构域,例如用于治疗哮喘,其具有与图12b(Dom 10-53-474)或图12c(Dom 10-275-78)中公开的氨基酸序列相同的氨基酸序列,或者其与图12b或图12c中公开的氨基酸序列具有例如80%的同一性,例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%或97%的同一性。
本发明进一步提供本文所述的用于肺部传递的组合物,其包含结合IL-1R1的免疫球蛋白单可变结构域,例如用于治疗炎性病症,例如肺部炎症或肺病或类风湿性关节炎,并具有与图12d(Dom 4-130-202)或图12e(Dom 4-130-201)中公开的氨基酸序列相同的氨基酸序列,或者其与图12d或图12e中公开的氨基酸序列具有例如80%的同一性,例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%或97%的同一性。
还提供用于肺部传递的本文所述组合物,其包含与Dom4-130-202的氨基酸序列(示于图12d)至少97%相同的氨基酸序列。
还提供本文所述用于肺部传递的组合物,其包含与Dom4-130-202的氨基酸序列(示于图12e)至少98%相同的氨基酸序列。
还提供本文所述用于肺部传递的组合物,例如用于治疗癌症,所述组合物包含结合VEGF的分子,例如dAb,例如WO2007080392和WO2007066106中的任何实例。
本发明进一步提供本文所述的用于肺部传递的组合物,其包含结合VEGF的免疫球蛋白单可变结构域,例如用于治疗癌症,其具有与图14中公开的氨基酸序列相同的氨基酸序列,或者其与图14中公开的氨基酸序列具有例如80%的同一性,例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%或97%或98%、99%的同一性。
还提供本文所述的用于肺部传递的组合物,其包含抗VEGF免疫球蛋白单可变结构域,该结构域包含的氨基酸序列与DOM15-26-593的氨基酸序列(示于图14a)至少97%相同。
还提供本文所述的用于肺部传递的组合物,其包含抗VEGF免疫球蛋白单可变结构域,该结构域包含的氨基酸序列与DOM15-26-593的氨基酸序列(示于图14a)至少97%相同,且其还包含抗体恒定区的结构域。
本发明还提供本文所述的用于肺部传递的组合物,其包含抗VEGF免疫球蛋白单可变结构域,该结构域包含的氨基酸序列选自DOM15-26-593的氨基酸序列(示于图14a)和DOM15-26-593-Fc融合蛋白的氨基酸序列(DMS1529;示于图14i)。
本发明的组合物尤其适于直接传递至肺,因此所述组合物可用于治疗、抑制、预防或诊断肺或呼吸道病症或疾病,例如在传递部位或接近传递部位。
然而,所述组合物虽然能够首先传递至肺,但却可以用于治疗机体其它部分的疾病,例如系统疾病。这是因为组合物首先被传递至肺,随后可能被吸收入系统循环,因此能够治疗肺病之外的疾病。例如,结合GLP受体的分子可传递至肺,这些分子可用于治疗诸如糖尿病或肥胖的疾病。这些分子的实例包括在WO2006/059106中所述那些分子,以及连接至albudab的毒蜥外泌肽-4的分子(在本文被描述为毒蜥外泌肽4(G4S)3DOM7h-14融合蛋白(DAT0115)),或任何与dat0115氨基酸序列具有例如80%同一性(例如85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%或97%、98%或99%同一性)的分子。
可以使用本发明的药物、组合物以及制剂和方法治疗、抑制或预防的呼吸道病症或疾病包括:肺部炎症、慢性阻塞性肺病、哮喘、肺炎、过敏性肺炎、带有嗜酸粒细胞增多的肺部浸润、环境性肺病、肺炎、支气管扩张、囊性纤维化、间质性肺病、原发性肺高血压、肺血栓栓塞、胸膜疾病、纵隔疾病、横隔膜疾病、肺换气不足、换气过度、睡眠呼吸暂停、急性呼吸窘迫综合征、间皮瘤、肉瘤、移植物排斥、移植物抗宿主疾病、肺癌、变应性鼻炎、过敏、石绵沉着病、曲霉肿、曲霉病、支气管扩张、慢性支气管炎、肺气肿、嗜酸性粒细胞性肺炎、特发性肺纤维化、侵袭性肺炎球菌疾病、流感、非结核性分枝细菌、胸腔积液、肺尘症、肺囊虫病(pneumocytosis)、肺炎、肺放线菌病、肺泡蛋白沉着症、肺炭疽、肺水肿、肺栓塞、肺部炎症、肺组织细胞增多病X、肺高血压、肺诺卡菌病、肺结核、肺静脉闭塞性疾病、类风湿性肺病、肉样瘤病、Wegener氏肉芽肿病和非小细胞肺癌。
因此,本发明提供本文所述的用于肺部传递的组合物,其包含免疫球蛋白单可变结构域,该结构域结合TNFR1,并具有与图1或图13中公开的氨基酸序列相同的氨基酸序列,或者其与图1或图13中公开的氨基酸序列具有例如80%的同一性,例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%或97%的同一性。
本发明还提供本文所述的用于肺部传递的组合物,其包含抗TNFα受体1型(TNFR1;p55)免疫球蛋白单可变结构域,该结构域包含与DOM1h-131-206的氨基酸序列(示于图1)至少93%相同的氨基酸序列。
本发明还提供本文所述的用于肺部传递的组合物,其包含抗TNFα受体1型(TNFR1;p55)免疫球蛋白单可变结构域,该结构域包含与DOM1h-131-511的氨基酸序列(示于图1)至少95%相同的氨基酸序列。
可用于本发明的组合物的域抗体可以包含结合TNFR1的免疫球蛋白单可变结构域,其中结合TNFR1的免疫球蛋白单可变结构域与本文公开的抗TNFR1 dAb的氨基酸序列的差异不超过25个氨基酸位置,并具有与本文公开的抗TNFR1 dAb的CDR1序列具有至少50%同一性的CDR1序列。
可用于本发明组合物的域抗体可以包含结合TNFR1的免疫球蛋白单可变结构域,其中结合TNFR1的免疫球蛋白单可变结构域的氨基酸序列与本文公开的抗TNFR1 dAb的氨基酸序列的差异不超过25个氨基酸位置,并具有与本文公开的抗TNFR1 dAb的CDR2序列具有至少50%同一性的CDR2序列。
可用于本发明的组合物的域抗体可以包含结合TNFR1的免疫球蛋白单可变结构域,其中结合TNFR1的免疫球蛋白单可变结构域的氨基酸序列与本文公开的抗TNFR1 dAb的氨基酸序列的差异不超过25个氨基酸位置,并具有与本文公开的抗TNFR1 dAb的CDR3序列具有至少50%同一性的CDR3序列。
可用于本发明的组合物的域抗体可以包含结合TNFR1的免疫球蛋白单可变结构域,其中结合TNFR1的免疫球蛋白单可变结构域的氨基酸序列与本文公开的抗TNFR1 dAb的氨基酸序列的差异不超过25个氨基酸位置,并具有分别与本文公开的抗TNFR1 dAb的CDR1或CDR2序列具有至少50%同一性的CDR1序列和CDR2序列。
可用于本发明组合物的域抗体可以包含结合TNFR1的免疫球蛋白单可变结构域,其中结合TNFR1的免疫球蛋白单可变结构域的氨基酸序列与本文公开的抗TNFR1 dAb的氨基酸序列的差异不超过25个氨基酸位置,并具有分别与本文公开的抗TNFR1 dAb的CDR2或CDR3序列具有至少50%同一性的CDR2序列和CDR3序列。
可用于本发明的组合物的域抗体可以包含结合TNFR1的免疫球蛋白单可变结构域,其中结合TNFR1的免疫球蛋白单可变结构域的氨基酸序列与本文公开的抗TNFR1 dAb的氨基酸序列的差异不超过25个氨基酸位置,并具有分别与本文公开的抗TNFR1 dAb的CDR1或CDR3序列具有至少50%同一性的CDR1序列和CDR3序列。
可用于本发明组合物的域抗体可以包含结合TNFR1的免疫球蛋白单可变结构域,其中结合TNFR1的免疫球蛋白单可变结构域的氨基酸序列与本文公开的抗TNFR1 dAb的氨基酸序列的差异不超过25个氨基酸位置,并具有分别与本文公开的抗TNFR1 dAb的CDR1、CDR2或CDR3序列具有至少50%同一性的CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列。
可用于本发明组合物的域抗体可以包含结合TNFR1的免疫球蛋白单可变结构域,其中结合TNFR1的免疫球蛋白单可变结构域具有与本文公开的抗TNFR1 dAb的CDR1序列具有至少50%同一性的CDR1序列。
可用于本发明的组合物的域抗体可以包含结合TNFR1的免疫球蛋白单可变结构域,其中结合TNFR1的免疫球蛋白单可变结构域具有与本文公开的抗TNFR1 dAb的CDR2序列具有至少50%同一性的CDR2序列。
可用于本发明的组合物的域抗体可以包含结合TNFR1的免疫球蛋白单可变结构域,其中结合TNFR1的免疫球蛋白单可变结构域具有与本文公开的抗TNFR1 dAb的CDR3序列具有至少50%同一性的CDR3序列。
可用于本发明组合物的域抗体可以包含结合TNFR1的免疫球蛋白单可变结构域,其中结合TNFR1的免疫球蛋白单可变结构域具有分别与本文公开的抗TNFR1 dAb的CDR1和CDR2序列具有至少50%同一性的CDR1和CDR2序列。
可用于本发明组合物的域抗体可以包含结合TNFR1的免疫球蛋白单可变结构域,其中结合TNFR1的免疫球蛋白单可变结构域具有分别与本文公开的抗TNFR1 dAb的CDR2和CDR3序列具有至少50%同一性的CDR2和CDR3序列。
可用于本发明的组合物的域抗体可以包含结合TNFR1的免疫球蛋白单可变结构域,其中结合TNFR1的免疫球蛋白单可变结构域具有分别与本文公开的抗TNFR1 dAb的CDR1和CDR3序列具有至少50%同一性的CDR1和CDR3序列。
可用于本发明组合物的域抗体可以包含结合TNFR1的免疫球蛋白单可变结构域,其中结合TNFR1的免疫球蛋白单可变结构域具有分别与本文公开的抗TNFR1 dAb的CDR1、CDR2和CDR3序列具有至少50%同一性的CDR1、CDR2和CDR3序列。
可用于本发明肺部传递组合物的多肽、免疫球蛋白单可变结构域和拮抗剂可以抵抗以下的一种或多种:丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、硫醇蛋白酶、基质金属蛋白酶、羧肽酶(例如羧肽酶A、羧肽酶B)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、弹性蛋白酶、溶菌酶(leukozyme)、胰酶、凝血酶、纤溶酶、组织蛋白酶(例如组织蛋白酶G)、蛋白酶(例如蛋白酶1、蛋白酶2、蛋白酶3)、嗜热菌蛋白酶、凝乳酶、肠肽酶、半胱天冬酶(例如半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶9、半胱天冬酶12、半胱天冬酶13)、钙激活中性蛋白酶、无花果蛋白酶、梭菌蛋白酶、奇异果蛋白酶、菠萝蛋白酶和分离酶。在具体的实施方案中,所述蛋白酶为胰蛋白酶、弹性蛋白酶或溶菌酶(leucozyme)。所述蛋白酶还可以由生物提取物、生物匀化物或生物制备物提供。在一个实施方案中,所述蛋白酶为存在于痰、粘液(例如胃粘液、鼻涕、支气管粘液)、支气管肺泡灌洗液、肺匀化物、肺提取物、胰腺提取物、胃液、唾液中的蛋白酶。在一个实施方案中,所述蛋白酶为在眼睛和/或泪液中存在的蛋白酶。这种存在于眼睛中的蛋白酶的实例包括半胱天冬蛋白酶、钙激活中性蛋白酶、基质金属蛋白酶、解整合素样金属蛋白酶(ADAM)和具有血小板反应蛋白基序的ADAM、蛋白体、组织纤溶酶原激活物、分泌酶、组织蛋白酶B和D、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C、丝氨酸蛋白酶PRSS1、遍在蛋白蛋白酶体途径(UPP)。在一个实施方案中,所述蛋白酶为非细菌蛋白酶。在一个实施方案中,所述蛋白酶为动物(例如哺乳动物,例如人)蛋白酶。在一个实施方案中,所述蛋白酶为GI道蛋白酶或肺组织蛋白酶,例如在人中存在的GI道蛋白酶或肺组织蛋白酶。本文列出的这样的蛋白酶还可以用于本文所述方法,包括将文库所有组成部分与蛋白酶接触。
一方面,本发明的组合物包含蛋白酶抗性的免疫球蛋白单可变结构域,其中所述可变结构域在以下条件下抗蛋白酶:与i)至少10μg/ml浓度(c)的蛋白酶于37℃温育至少1小时的时间(t)时;或者与(ii)至少40μg/ml浓度(c’)的蛋白酶于30℃温育至少1小时的时间(t)时。在一个实施方案中,蛋白酶(例如胰蛋白酶)对可变结构域的比率(mol/mol)为8,000-80,000蛋白酶:可变结构域,例如当C为10μg/ml时,所述比率为800-80,000蛋白酶:可变结构域;或者当C或C’为100μg/ml时,所述比率为8,000-80,000蛋白酶:可变结构域。在一个实施方案中,蛋白酶(例如胰蛋白酶)对可变结构域的比率(基于重量/重量,例如μg/μg)为16,000-160,000蛋白酶:可变结构域,例如当C为10μg/ml时,所述比率为1,600-160,000蛋白酶:可变结构域;或者当C或C’为100μg/ml时,所述比率为1,6000-160,000蛋白酶:可变结构域。在一个实施方案中,所述浓度(c或c’)为至少100或1000μg/ml蛋白酶。在一个实施方案中,所述浓度(c或c’)为至少100或1000μg/ml蛋白酶。参考本文关于在用肽或多肽的库或文库工作时适于所用蛋白质水解活性的条件的描述(例如重量/重量参数)。这些条件可用于确定某种具体的免疫球蛋白单可变结构域的蛋白酶抗性的条件。在一个实施方案中,时间(t)为或约为1、3或24小时或过夜(例如约12-16小时)。在一个实施方案中,可变结构域在条件(i)下是抗性的,且浓度(c)为或约为10或100μg/ml蛋白酶,时间(t)为1小时。在一个实施方案中,可变结构域在条件(ii)下是抗性的,且浓度(c’)为或约为40μg/ml蛋白酶,时间(t)为或约为3小时。在一个实施方案中,所述蛋白酶选自胰蛋白酶、弹性蛋白酶、溶菌酶和胰酶。在一个实施方案中,所述蛋白酶为胰蛋白酶。在一个实施方案中,所述蛋白酶为在痰、粘液(例如胃粘液、鼻涕、支气管粘液)、支气管肺泡灌洗液、肺匀化物、肺提取物、胰腺提取物、胃液、唾液或泪液或眼睛中存在的蛋白酶。在一个实施方案中,所述蛋白酶为在眼睛和/或泪液中存在的蛋白酶。在一个实施方案中,所述蛋白酶为非细菌蛋白酶。在一个实施方案中,所述蛋白酶为动物(例如哺乳动物,例如人)蛋白酶。在一个实施方案中,所述蛋白酶为GI道蛋白酶或肺组织蛋白酶,例如在人中存在的GI道蛋白酶或肺组织蛋白酶。本文列出的这些蛋白酶还可以用于本文所述的方法,包括将文库所有组成部分与蛋白酶接触。
在一个实施方案中,可变结构域抗胰蛋白酶和/或至少一种选自以下的其它蛋白酶:弹性蛋白酶、溶菌酶和胰酶。例如,抗性针对胰蛋白酶和弹性蛋白酶;胰蛋白酶和溶菌酶;胰蛋白酶和胰酶(pacreatin);胰蛋白酶、弹性蛋白酶和溶菌酶;胰蛋白酶、弹性蛋白酶和胰酶;胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胰酶和溶菌酶;或者胰蛋白酶、胰酶和溶菌酶。
在一个实施方案中,可变结构域在条件(i)或(ii)下温育时展示在噬菌体上,例如以106-1013(例如108-1012)复制单位(感染性病毒体)的噬菌体文库大小。
在一个实施方案中,可变结构域在于条件(i)或(ii)下温育后特异性结合其靶,例如使用BiaCore TM或ELISA进行评价,例如噬菌体ELISA或单克隆噬菌体ELISA。
在一个实施方案中,本发明的可变结构域特异性结合A蛋白或L蛋白。在一个实施方案中,在条件(i)或(ii)下温育后存在对A或L蛋白的特异性结合。
在一个实施方案中,本发明的可变结构域例如在条件(i)或(ii)下温育后,在ELISA(例如噬菌体ELISA或单克隆噬菌体ELISA)中可具有至少0.404的OD450读数。
在一个实施方案中,本发明的可变结构域在凝胶电泳中展示(基本上)单一条带,例如在条件(i)或(ii)下温育后。
本文所述的组合物包含(a)多肽,例如域抗体(dAb),和(b)生理学上可接受的缓冲液,例如具有约4至约8的pH范围,并且其粘度约等于约2%至约10%PEG 1000在含1.2%(重量/体积)蔗糖的50mM磷酸盐缓冲液中的溶液的粘度的缓冲液;其中所述组合物包含液滴,在所述组合物中存在的液滴中,约40%或以上(例如50%或以上)的液滴小于约6微米,例如约1微米至约6微米的范围,例如小于约5微米,例如约1微米(或约2微米)至约5微米。对于深肺传递,有益的粒径可为约1微米至约3微米。
可按照本发明使用的适宜的缓冲液为生理学上可接受的缓冲液,例如可安全给予到肺的缓冲液,例如磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐或组氨酸缓冲液。
pH范围:在一个实施方案中,所述缓冲液的pH优选在约4至约8的范围内,例如约7至约7.5,或者约5至约6。
在某些实施方案中,缓冲液的粘度优选约等于约2%至约10%PEG 1000在含1.2%(重量/体积)蔗糖的50mM磷酸盐缓冲液中的溶液的粘度。粘度可以使用本领域已知的标准技术检测,例如锥板法或磁珠微流变仪法。
组合物中存在的液滴的大小可以使用用于检测粒径的标准方法检测,例如使用Malvern激光扫描装置或者例如使用多级冲击采样器,例如Dekatie冲击采样器装置或Malple冲击采样器装置。
可将例如添加剂加入至缓冲液,以改变粘度,有用的添加剂可为例如聚乙二醇(PEG),例如PEG 1000,或糖,例如蔗糖、甘露糖,其它添加剂可以包含例如稳定剂,例如洗涤剂,例如吐温。
用于如本文所述的直接肺部传递的制剂的多肽,例如dAb,可以有用地为例如抗TNFR1结合剂,例如结合抗TNFR1的dAb,例如,其可以为显著拮抗性的抗TNFR1 dAb,例如WO 2007/049017(其内容和讲述具体地通过引用结合到本文中)中公开的拮抗性抗TNFR1dAb,例如其可以具有如在WO 2007/049017的SEQ ID 1-650的任一个中描述的编码序列,所有这些序列都具体地通过引用结合到本文中。这样的抗TNFR1 dAb组合物可以为治疗呼吸道疾病例如COPD和哮喘的有效治疗剂。
对组合物的多肽例如dAb还可能有利的是具有高解链温度(Tm)。例如已经表明,具有较高解链温度(Tm)的dAb更加抗剪切力、升高的温度和长期储存稳定性诱导的聚集。剪切力和热应力在雾化过程中对诱导聚集形成起显著作用,所以选择具有高Tm的dAb是有利的。实现此目标的一种方法应是产生dAb的噬菌体展示文库,并使用蛋白酶(例如胰蛋白酶)选择和鉴定抗所述酶的作用的分子。通过该方法产生的蛋白酶抗性dAb具有较高的解链温度,这已经归因于增加蛋白的核心稳定性的dAb序列的改变,使得所述分子的肽骨架不大容易被所述酶水解。
蛋白酶抗性域抗体和选择它们的方法例如进一步描述于USSN60/933,632(其教导通过引用结合到本文中)。
dAb的Tm的升高还可以例如通过在选择过程中加热dAb实现。因此,当本发明的组合物包含域抗体时,dAb具有约例如55℃至约例如90℃(例如约80℃至约例如90℃)的Tm可能是理想的。Tm可以使用标准技术例如差异扫描量热法(DFC)来确定。
可用于本文所述组合物的多肽浓度(例如dAb)可以在约1mg/ml直至约40mg/ml的范围内。例如dAb的较高浓度,例如约20mg/ml至约40mg/ml,对于改善向肺的传递可能是有益的。
在以下的实施例中,仅通过举例来进一步描述本发明:
实施例:
以下详述了针对人TNFR1的域抗体的前导分子的选择和表征:
产生的域抗体来源于Domantis的噬菌体文库。对被动吸附的人TNFR1的可溶性选择和淘选按照相关的标准Domantis方法进行。人TNFR1作为可溶性重组蛋白由R&D系统(目录号636-R1-025/CF)或Peprotech(目录号310-07)购买,或者直接使用(在被动选择的情况下),或者在使用经伯胺的偶联生物素化之后,继之以生物测定质控其活性,并通过质谱分析其分子量和生物素化程度。通常,利用降低之后每一轮的抗原水平进行3轮选择。
通过噬菌体ELISA筛选关于抗TNFR1结合克隆的存在情况的选择输出。DNA分离自这些噬菌体选择,并亚克隆入表达载体,用于表达可溶性dAb片段。可溶性dAb片段在96孔板中表达,使用采用抗c-myc检测的直接结合ELISA,或者使用链霉抗生物素蛋白/生物素化TNFR1 BIAcoreTM芯片的BIAcoreTM,使用上清液筛选抗TNFR1结合dAb的存在情况,并按照解离速率排列。
下述的前导分子来源于亲代dAb,称为DOM1h-131。该分子在使用60nM生物素化抗原进行3轮选择后选自噬菌体展示文库。链霉抗生物素蛋白或中性链亲和素包被的Dyna珠交替作为每轮选择的捕获试剂,以防止选择针对链霉抗生物素蛋白或中性链亲和素的结合剂。据MRC-5成纤维细胞/IL-8释放细胞测定检测,前导分子DOM1h-131在该阶段的效力在低μmol范围内。依据BIAcoreTM测定的结合动力学通常展示出快速结合/快速解离速率。作为C-末端myc标记的单体的该DOM1h-131前导分子的大肠杆菌(E.coli)表达水平在8mg/l的区域内。
前导分子的亲和成熟:
将DOM1h-131进行进一步的亲和成熟,以产生具有较高效力和改善的生物物理特征的突变体(参见图1的DOM1h-131衍生的前导分子的氨基酸序列)。在使用错配PCR聚合酶(Genemorph II,Stratagene)产生错配文库(每个dAb序列的氨基酸改变数平均为1,文库大小为8×107)后,利用这些错配文库进行7轮选择。该策略使得分离出克隆DOM1h-131-8,依据MRC-5测定检测,该分子中的4个氨基酸改变(1个在构架1(FR1)中,1个在CDR1中,1个在CDR3中,1个在FR4中)产生了约100倍的效力改善(约4nM)。
为了进一步改善效力,单个氨基酸位置通过寡聚物引导的诱变在由错配前导分子共有信息提示的关键位置多样化。在该过程中,通过BIAcoreTM筛选分离改进形式的DOM1h-131-8克隆DOM1h-131-24(在修正之前最初命名为DOM1h-131-8-2),其具有单个K94R氨基酸突变(按照Kabat进行氨基酸编码)和200-300pM的RBA效力。
基于该前导分子和由其获得的NNS文库产生进一步的错配文库,并使用热处理对其进行3轮噬菌体选择(关于方法参见Jespers L等人,Aggregation-resistant domain antibodies selected on phage by heat denaturation.Nat Biotechnol.2004年9月;22(9):1161-5)。在该选择过程中,合并文库,来源于第二轮选择的克隆产生dAb,例如DOM1h-131-53,其热稳定性更好。推测这些克隆应具有更好的生物物理特征。将克隆DOM1h-131-53中的某些构架突变种系化,获得克隆DOM1h-131-83。以该克隆为基础使用如上所述的噬菌体展示选择或使用采用乳浊液的体外区室化技术,经由寡聚物引导的单个CDR诱变进一步多样化。噬菌体展示策略产生前导分子DOM1h-131-117和DOM1h-131-151。体外区室化技术产生DOM1h-131-511。
在该阶段,以生物物理测定和生物学测定比较这3个前导分子,DOM1h-131-511为具有最佳特性的分子。此外,在胰蛋白酶或溶菌酶存在下,测试这些分子对蛋白酶剪切的抗性。溶菌酶(leucozyme)由囊性纤维化患者的合并痰液组成,其含有高水平的弹性蛋白酶和其它蛋白酶,用其代表肺病的体内状况。该数据表明,所有3种前导分子DOM1h-131-117、DOM1h-131-151和DOM1h-131-511在胰蛋白酶或溶菌酶存在下都快速降解。该发现使人们对DOM1h-131-511在患者体内持续存在更为担心,并开发了选择提高对胰蛋白酶抗性的策略。推测这样改善的胰蛋白酶抗性,对所述分子的其它生物物理特性可能具有有益作用。从根本上修改标准噬菌体的选择方法,以允许在抗原选择之前在蛋白酶存在下选择。为此工程改造新的噬菌体载体,其中缺失c-myc标签,以允许在胰蛋白酶存在下选择,而不切割离开噬菌体的展示的dAb。产生基于DOM1h-131-511的错配文库,并克隆入新的pDOM33载体中。由该文库产生的噬菌体母液用胰蛋白酶预处理,随后加入蛋白酶抑制剂,以封闭胰蛋白酶活性,然后在相关抗原上选择。进行4轮选择。使用BIAcoreTM评价可溶性表达的TNFR1结合dAb对TNFR1的结合能力(在有或没有蛋白酶存在下)。这使得分离出两种前导分子DOM1h-131-202和DOM1h-131-206,由BIAcoreTM抗原结合实验证实,它们的蛋白酶抗性提高。值得指出的是,DOM1h-131-202相比于DOM1h-131-511在CDR2中仅包含1个突变(V53D,所有的氨基酸编码都依据Kabat),而DOM1h-131-206仅包含两个突变:第一个突变与DOM1h-131-202相同(在CDR2中的V53D突变),第二个突变为FR3中的Y91H突变(参见图1)。FR3中的该Y91H突变确实出现在3-20人种系基因中,表明该残基存在于人抗体中。3个克隆DOM1h-131-511、DOM1h-131-202和DOM1h-131-206具有如图1所示的氨基酸序列。
如下测定所述分子的活性:
DOM1H-131-202、DOM1H-131-511和DOM1H-131-206结合人TNFR1的BIAcoreTM结合亲和性评价。
通过BIAcoreTM分析评价DOM1H-131-202、DOM1H-131-511和DOM1H-131-206结合人重组大肠杆菌表达的人TNFR1的结合亲和力。使用生物素化人TNFR1进行分析。将1400RU的生物素化TNFR1包被至链霉抗生物素蛋白(SA)芯片。使用温和的酸洗脱条件将表面再生回基线。使用50μl/分钟的流速于限定的浓度使DOM1H-131-202、DOM1H-131-511和DOM1H-131-206通过该表面。在BIAcoreTM 3000机器上进行工作,并分析数据,将数据拟合为结合的1∶1模型。对于所有测试分子结合数据都良好地拟合为1∶1模型。所有的KD值都由kon和koff速率计算。于25℃实施BIAcoreTM运行。
以下的数据由3个独立实验产生。在每个实验中,结果都使用kd的最高dAb浓度和较低的ka浓度通过平均众多拟合来计算。数据以结果的平均值和标准偏差(在括号中)提供(表1)。
表1:DOM1H-131-202、DOM1H-131-511和DOM1H-131-206
结合人TNFR1的BIAcoreTM数据
DOM1H-131-202、DOM1H-131-511和DOM1H-131-206类似地结合,并对人TNFR1具有高亲和力。DOM1H-131-202和DOM1H-131-206分别以0.55nM和0.47nM的平均亲和力结合。相比于平均亲和力1.07nM的DOM1H-131-511,DOM1H-131-202和DOM1H-131-206具有略好的亲合力。
受体结合测定:
以受体结合测定确定dAb对人TNFR1的效力。该测定检测TNF-α对TNFR1的结合以及可溶性dAb阻断该相互作用的能力。将TNFR1捕获在山羊抗人IgG(H&L)预包被的珠上。将受体包被的珠与TNF-α(10ng/ml)、dAb、缀合生物素的抗TNF-α和链霉抗生物素蛋白alexafluor 647在黑色侧面底部透明的384孔板中温育。6小时后,以ABI8200细胞检测系统读取该板,并测定结合珠的荧光。如果dAb阻断结合TNFR1的TNF-α,则荧光强度将减少。
使用ABI 8200分析软件分析数据。使用GraphPad Prism和具有可变斜率的S形剂量反应曲线确定浓度效应曲线和效力(EC50)值。以3次单独的实验重复该测定。每个实验中均包含TNF-α剂量曲线(图2和图3)。用于和结合TNFR1的dAb(10ng/ml)竞争的TNF-α的浓度约为该测定中的最大TNF-α响应的90%。
代表性的图示于图3,表明dAb抑制TNF-α结合TNFR1的能力。在全部3个实验中,阴性对照样品(HEL4和VH模拟物)于高浓度微弱抑制TNF-α和TNFR1之间的相互作用。测试样品与阳性对照(得自R&D Systems的抗TNFR1mAb,mAb225)和EnbrelTM(依那西普;由连接IgG1的Fc部分的TNFR2组成的二聚体融合蛋白;批准用于治疗类风湿性关节炎)的平均效力(EC50)值示于表2。
表2:在TNFR1受体结合测定中3个重复实验的DOM1H-131-202、DOM1H-131-206和DOM1H-131-511的效力(EC50)值。
样品 | 平均EC50(nM) | SEM |
DOM1H-131-202 | 0.11 | 0.008 |
DOM1H-131-206 | 0.07 | 0.01 |
DOM1H-131-511 | 0.19 | 0.01 |
EnbrelTM(依那西普) | 0.20 | 0.07 |
抗TNFR1mAb#mAb225 | 0.08 | 0.003 |
在该测定中,DOM1H-131-206似乎比测试的其它两个dAb更有效,并具有与市售可得的抗TNFR1mAb,MAB225(R&D Systems)相似的效力。
如下所述进行巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)表达前导克隆:
使用3种前导分子的一级氨基酸序列产生用于在巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)中分泌表达的密码子优化基因。将3种合成基因克隆入表达载体pPIC-Zα(得自Invitrogen)中,然后转化入两个毕赤(Pichia)菌株X33和KM71H中。将转化的细胞平板移种至浓度渐增的Zeocin(100、300、600和900μg/ml)上,以选择具有多个整合体的克隆。每个细胞系和构建体选择约15个克隆进行表达筛选。由于未完全了解巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)中高/低基因拷贝数和表达水平之间的关系,所以在Zeocin浓度范围内拣选几个克隆。使用还没有彻底筛选高生产率的克隆进行5L发酵罐运行。这使得可以产生显著量的物质进行进一步的研究。
用于蛋白质表征的材料制备:
基于A蛋白的层析树脂已广泛用于由微生物培养上清液纯化VHdAb。尽管这使得可以一步纯化方法生产高纯度物质,通常多数情况下>90%,但对于某些分子,低pH洗脱条件可导致形成聚集体。还存在亲和树脂对dAb的容量有限的问题;这意味着将在发酵罐之后的工艺使用大量的树脂。为了产生用于表征及进一步稳定以及喷雾器研究的高质量物质,使用混合型电荷感应树脂作为初始捕获步骤,之后为阴离子交换,设计下游纯化工艺。在没有显著优化的情况下,这使得可以以约95%的纯度将所表达dAb的大约70%回收。对于在混合型电荷感应树脂—得自GE Healthcare的Capto MMC上的捕获步骤,使用50mM磷酸钠pH 6.0进行柱平衡,并上样上清液,不需要任何稀释或pH调节。在洗涤柱子后,使用为50mM Tris pH 9.0的洗脱缓冲液通过pH梯度洗脱蛋白。具体的洗涤和梯度条件将根据要洗脱的蛋白的pI而稍微改变。
然后使用阴离子交换层析用流通步骤进一步纯化洗脱峰。这除去了残余HMW杂质,例如醇氧化酶,并减少了内毒素。树脂用PBS或无盐的磷酸盐缓冲液pH 7.4平衡。在将来自Capto MMC的洗脱液加样至阴离子交换树脂上时,dAb不结合,并由流通液回收。内毒素和其它杂质结合树脂。如果使用PBS缓冲液,则盐的存在将该步骤的蛋白回收率提升至91%,而不是无盐时达到的86%回收率。然而,盐的存在降低了内毒素去除效率,使得在包含盐的该步骤后,dAb的典型内毒素水平经检测为58EU/ml,相比之下不存在盐时获得的dAb内毒素水平<1.0EU/ml。
蛋白质表征:
使用电喷雾质谱、氨基末端测序和等电聚焦表征由5L发酵罐操作产生的物质的特征,并使用SDS-PAGE、SEC和Gelcode糖蛋白染色试剂盒(Pierce)表征纯度。
特征:
对于每种蛋白的前5个残基的氨基末端序列分析,正如所料(EVQLL...)。对已使用C4Zip-tips(Millipore)缓冲交换为含0.1%冰醋酸的50∶50 H2O∶乙腈的蛋白样品进行质谱。当允许与内部二硫键形成的质量差异为-2时,三种蛋白中的每一种的检测质量都在基于一级氨基酸序列的理论质量(使用平均质量计算)的0.5Da之内。基于其pI(对于每种蛋白来说不同),使用IEF鉴定蛋白。
纯度:
将三种蛋白以1μg和10μg的量一式两份加载至非还原性SDS-PAGE凝胶上。在所有情况下都观察到单一条带。
还进行大小排阻层析,以证实纯度水平。对于大小排阻层析(SEC),将100μg的每种蛋白加至以0.5ml/分钟流动的TOSOH G2000SWXL柱上。流动相为PBS/10%乙醇。
用于候选物选择的dAb稳定性研究:
对于COPD适应症,有必要使用喷雾器装置将dAb传递至肺中。这意味着所述蛋白根据所用的喷雾器类型可能会潜在地承受一定范围的剪切力和热应力,并可能经受肺环境中的蛋白酶的酶降解。必需明确知晓的是,如果所述蛋白可以使用该类型的装置传递,则所述蛋白在喷雾器传递后将形成恰当的颗粒大小分布,并保持其功能。因此,研究了每种分子对一定范围的物理应力的内在稳定性,以确定基线稳定性和最敏感的稳定性指示测定。由于每种蛋白的稳定性取决于其溶解其中的缓冲溶液,所以某些配制前工作是必需的。该信息(例如缓冲液、pH)应当还可以用于理解下游纯化过程和随后的储存过程中的蛋白稳定性。为了表征所述分子在接触一定范围的物理应力过程中的变化,使用一系列分析技术,例如大小排阻层析(SEC)、SDS-PAGE和等电聚焦(IEF)。
DOM1H-131-202、DOM1H-131-511和DOM1H-131-206的蛋白酶稳 定性的评价:
在预温育超过蛋白酶的限定时间点后,通过BIAcoreTM分析保留的结合活性评价DOM1H-131-202、DOM1H-131-511和DOM1H-131-206的稳定性。将约1400RU的生物素化TNFR1包被至链霉抗生物素蛋白(SA)芯片。将250nM的DOM1H-131-202、DOM1H-131-511和DOM1H-131-206与仅PBS或与100μg/ml的胰蛋白酶、弹性蛋白酶或溶菌酶于30℃温育1、3和24小时。通过加入蛋白酶抑制剂混合物终止反应。然后使dAb/蛋白酶混合物通过使用参比细胞扣除的TNFR1包被芯片。在每个注射周期之间,芯片表面用10μl 0.1M甘氨酸pH 2.2再生。相对于没有蛋白酶的dAb结合,测定与蛋白酶预温育的DOM1H-131-202、DOM1H-131-511和DOM1H-131-206结合人TNFR1(以10秒)的比例。于25℃运行BIAcoreTM。
数据由3个独立实验产生。条形图表示平均值,误差条表示结果的标准偏差(结果参见图4)。
相比于DOM1H-131-511,发现DOM1H-131-202和DOM1H-131-206显示出对胰蛋白酶、弹性蛋白酶或溶菌酶的蛋白水解降解具有较大的抗性。在与胰蛋白酶温育1小时和与弹性蛋白酶或溶菌酶温育3小时后,DOM1H-131-202和DOM1H-131-206之间的差异相比于DOM1H-131-511是最显著的。
使用DSC测定的热稳定性:
为了确定所述分子具有最大稳定性的pH值,使用差异扫描量热计(DSC)检测Britton-Robinson缓冲液中的每个dAb的解链温度(Tm)。由于Britton-Robinson由3组分缓冲体系(乙酸盐、磷酸盐和硼酸盐)组成,所以有可能在同一溶液中产生3-10的pH范围。由蛋白一级氨基酸序列确定理论pI。由DSC找到dAb具有其最大内在热稳定性的pH值:对DOM1H-131-202(202)为pH 7,对DOM1H-131-206(206)为pH 7-7.5,对DOM1H-131-511(511)为pH 7.5。对于所有随后的应力及稳定性工作,各dAb使用以下的pH值的Britton-Robinson缓冲液:DOM1H-131-202(202)和DOM1H-131-206(206)为pH 7.0,对于DOM1H-131-511(511)为pH 7.5。结果汇总于表3。
表3:以DSC测定的1mg/ml DOM1H-131-202(202)、DOM1H-131-206(206)和DOM1H-131-511(511)的Britton-Robinson缓冲液的pH和Tm的汇总
内在溶解性测试:
所有的前导dAb都在离心式Vivaspin浓缩器(5K截留分子量)中浓缩,以确定它们的最大溶解度和浓缩时的回收水平。在Britton-Robinson缓冲液中以最稳定的pH进行试验。检测时程内的样品体积和浓度,记录与预期浓度的偏差以及样品的回收百分率。
发现在Britton-Robinson缓冲液中所有的蛋白都可以浓缩至100mg/ml以上。相比于DOM1H-131-511(511),DOM1H-131-202(202)和DOM1H-131-206(206)显示出低于预期的回收率,但仍在可接受的水平内。
前导dAb的喷雾器传递:
通过测试不同的喷雾器和配制缓冲液,证实dAb可以使用各种喷雾装置有效地传递。更重要的是,首次表明配制缓冲液中的dAb雾化产生有效肺传递的优选粒径分布(使用<5μm的液滴百分率比较),同时保持蛋白功能。这在下文进一步描述。
在多种装置中的性能比较:
在6个喷雾器装置中测试了DOM1H-131-511(511),包括用于液体制剂的3种主要喷雾器类别(即超声喷雾器、喷射式喷雾器和振荡筛喷雾器)的每一类的两种装置。在每种装置中,都以5mg/ml和一系列PEG浓度测试dAb。对于每个样品,使用Malvern Spraytek装置(Malvern Instruments Limited,UK)检测尺寸<5μm的液滴的百分率,结果示于图5。在雾化后使用SEC评价每种样品的稳定性,分析在杯中保留的物质中和收集的气溶胶中二聚化的样品量。结果可见于图6。二聚体形成的程度越小,稳定性越大。图7还显示了SEC追踪,表明在PBS GSK 206中即便于40mg/ml对于雾化仍稳定,且二聚体形成较低。
大部分装置可以以恰当的尺寸范围传递40%或以上的液体制剂,但eFlow(一种振荡筛喷雾器装置)和PARI LC(一种喷射式喷雾器)装置效果更好,当缓冲液中包含PEG时,PARI LC*(星号)装置传递80%以上。在采用PEG的传递中,采用eFlow也能观察到这样的传递增加,用PARI LC+也观察到传递增加,但程度较低。
重要的是,还发现dAb在雾化后保留其活性(参见图8的结果)。
缓冲添加剂的影响:
由于DOM1H-131-511(511)的较低稳定性,50mM磷酸盐配制缓冲液含有PEG 1000和蔗糖(其粘度在定义范围内,即约等于约2%至约10%PEG 1000在含1.2%(重量/体积蔗糖)的50mM磷酸盐缓冲液中的溶液的粘度),以帮助保护dAb对抗剪切力和热应力。由于DOM1H-131-202(202)和DOM1H-131-206(206)均具有较高的Tm,并显示出对热应力的稳定性有了显著改善,所以以原配制缓冲液和Britton-Robinson缓冲液(其具有比配制缓冲液低的粘度)测试了所有分子。以E-flow和Pari LC+这两种装置测试了dAb,运行时间为3.5分钟,蛋白浓度为5mg/ml,使用Malvern Spraytek装置测定粒径分布。作为对比,使用喷雾器装置传递的用于囊性纤维化的市售药物(称为标准X蛋白)以其自身配制缓冲液测试。结果示于图9。为了良好地传递并分配入深肺中,理想的粒径小于6微米,例如<5μm。所有的dAb在Britton-Robinson缓冲液和配制缓冲液(如前所述)中都得到小于5μm的相当粒径水平。然而,配制缓冲液的较高粘度可能特别有利于产生恰当尺寸范围内的颗粒(例如颗粒<5μm)。
在雾化前和雾化后通过A280检测测定在装置杯中的dAb浓度。发现蛋白浓度不显著改变,表明蛋白和载体在传递过程中均没有优先雾化。
抗IL13单体dAb的喷雾器传递:
对于其它肺病如哮喘,还可能需要将dAb直接传递至作用部位。通过测试结合细胞因子IL13的单体dAb,证实dAb可以通过使用喷雾器的肺部传递进行有效给药,并可以潜在地用于治疗哮喘。这在下文进一步描述。
WO 2007/085815已描述了结合IL13的dAb,在其中列出的dAb中选择两个,基于其对靶的效力和其生物物理特性测试其喷雾器传递效果,两个dAb是DOM10-53-474和DOM10-275-78。
抗IL-13 dAb DOM10-53-474和DOM10-275-78在HEK细胞测定中 的效力:
该测定使用以STAT6基因和SEAP(分泌的胚胎碱性磷酸酶)报告基因(Invitrogen,San Diego)稳定转染的HEK293细胞。在用IL-13刺激时,SEAP被分泌入上清液中,使用比色方法检测上清液。测试可溶性dAb经由STAT6途径阻断IL-13信号转导的能力。简而言之,dAb与6ng/ml重组IL-13(GSK)预温育1小时,然后加至在组织培养微量滴定板中的DMEM(Gibco,Invitrogen Ltd,Paisley,UK)中的50000HEKSTAT6细胞。将平板于37℃5%CO2温育24小时。然后将培养物上清液与QuantiBlue(Invivogen)混合,并读取640nm的吸光度。相比于IL-13刺激,抗IL-13 dAb活性引起STAT6活化降低以及相应的A640降低。
表4:
以下表4的结果汇总显示了每个选定dAb抗人IL-13(hIL-13)和猕猴(cyno)IL-13(cIL-13)的EC50:
表4
10-53-474EC50(nM) | 10-275-78EC50(nM) | |
HEK测定hIL-13 | 0.63(n=13) | 2.5(n=7) |
HEK测定cIL-13 | 11.1(n=10) | 1.4(n=7) |
DOM10-53-474由于其卓越的效力而为优选的临床候选物,然而,其在NHP临床模型中效力有所降低。DOM10-275-78在NHP临床模型中效力应有所升高。
DOM10夹心ELISA:
该测定也检测dAb的效力。该测定使用小鼠抗人IL-13捕获抗体和单独的小鼠抗人IL-13检测抗体(bender MedSystems,目录号BMS231/3MST)。捕获Ab捕获在ELISA板上,然后加入IL-13(GSK)和dAb蛋白的混合物。然后使用生物素化的抗IL-13检测Ab和链霉抗生物素蛋白HRP检测捕获的IL-13。所述板使用比色底物显色,并读取450nm的OD。dAb阻断IL-13结合通过OD的下降显示。
表5:
表5的结果汇总表明了每个选定dAb抗人IL-13的EC50
10-53-474EC50(nM) | 10-275-78EC50(nM) | |
夹心测定hIL-13 | 0.057(n=3) | 3.326(n=3) |
DOM10结合测定:
该测定使用生物素化的人IL-13(内部制备的生物素化的GSKIL-13)来捕获dAb。ELISA板用中性链亲和素(Pierce,目录号31000)包被,以捕获生物素化的IL-13。加入dAb,使用兔抗人Ig(VH特异性)Ab,然后使用缀合HR的抗兔IgGAM Ab(Sigma目录号A-2074),检测结合的dAb。所述板使用比色底物显色,并读取450nm的OD。该测定的信号与结合的dAb的量成比例。
表6:
表6的结果汇总显示了每个选定dAb的EC50。
10-53-474EC50(nM) | 10-275-78EC50(nM) | |
结合测定 | 1.08(n=5) | 1.304(n=10) |
链酶抗生物素蛋白包被的SA芯片(Biacore)用约100RU生物素化的人IL-13(R&D Systems,Minneapolis,USA)或猕猴(cynomolgous)IL-13(内部制备)包被。dAb用HBS-EP运行缓冲液连续稀释。将50-100μl稀释的上清液以50μl/分钟的流速注射(kininject),之后是5分钟的解离期。结合和解离速率和常数使用BIAevaluation软件v4.1(Biacore)计算。
表7:比较两种选定的dAb DOM10-53-474和DOM10-275-78对人和猕猴IL-13的结合亲合力。
DOM10-53-474(nM) | DOM10-275-78(nM) | |
Biacore hIL-13 | 0.028 | 0.072-0.1 |
Biacore cIL-13 | 2.0 | 0.32-0.75 |
结合变体IL-13(R130Q):
在IL-13的基因变体中,R130Q是一种常见变体,其与哮喘(Heinzmann等人,Hum Mol Genet.(2000)9549-59)和支气管高反应性(Howard等人,Am.J.Resp.Cell Molec.Biol.(2001)377-384)的风险增加有关。因此,需要抗IL-13 dAb对所述细胞因子的该变体也具有结合亲合力。DOM10-53-474结合IL-13(R130Q)并抑制IL-13(R130Q)在两种细胞测定(TF-1&Hek-Stat6)中刺激增殖作用。
表8:该表显示了DOM10-53-474对变体IL-13的结合亲合力
细胞测定 | EC50nM |
Hek-Stat6(变体hIL-13刺激=3ng/ml) | 0.273(n=4) |
TF-1(变体hIL-13刺激=5ng/ml) | 0.133(n=3) |
拮抗活性:
为确定DOM10-53-474是否结合非靶蛋白,并确保不需要的细胞因子/干扰素由于dAb的拮抗活性而被释放,在人血测定中测试DOM10-53-474的拮抗活性。每种样品都由1μM-10nM的DOM10-53-474滴定,并以两个供体A和B测试。测定以一式双份(a和b)建立,中尺度发现(the meso scale discovery)(MSD)以一式双份进行。零孔包含单独的血(即未加入dAb),对于供体A有8个零孔,对于供体B有4个零孔。测定的细胞因子为IL-8、IL-6、TNFα、IL-10、IL-1β、IL-12p70和IFNγ。对于IL-6、TNFα、IL-10、IL-1β、IL-12p70或IFNγ没有观察到拮抗活性。在1μM浓度时产生了少量IL-8,但这非常低。
SEC-MALLS:
dAb蛋白的溶解特性如下测定:以SEC(大小排阻层析;TSKgelG2000/3000SWXL,Tosoh Biosciences,Germany;BioSep-SEC-S2000/3000,Phenomenex,CA,USA)初始分离,随后通过UV(Abs 280nm)、RI(折射率)和光散射(激光,685nm)在线检测洗脱的蛋白类物质。依据280nm的吸光度测定,对于DOM10-275-78蛋白起始浓度为2mg/mL,对于DOM10-53-474蛋白起始浓度为1.4mg/ml,并通过SDS-PAGE目测杂质。注射样品的均匀性通常>90%。将100μL注射至SEC柱上。在SEC上的蛋白分离以0.5mL/分钟进行45分钟。PBS(磷酸缓冲盐水±10%EtOH)用作流动相。ASTRA软件(Wyatt Inc;CA;USA)整合全部3个检测器的信号,并由‘第一物理定律’以蛋白的kDa测定摩尔量。通过以每个样品批次运行已知溶解状态的阳性对照,评价运行间变异和数据质量。
对于某些DOM10-53克隆,不能确定可靠的溶液状态,因为所述分子非特异性(aspecifically)结合柱基质,或者不能使用大小排阻柱解析。对于其中溶液状态可信的这些情况(即DOM10-53-474和DOM10-275-78),证实DOM10-275-78分子在溶液中主要是单体,且90%由柱中洗脱出来,对于DOM10-53-474分子,大部分蛋白为纯粹的单体。DOM10-53-474以单峰洗脱,峰的右侧部分定义为13kDa的摩尔量(单体),但在峰的左侧部分逐渐接近18kDa,表明存在一定程度的快速自结合(在该峰的平均质量为14kDa)。
差异扫描量热法(DSC):
DOM10-275-78蛋白在PBS缓冲液(磷酸缓冲盐水)中以过滤产生2mg/ml的浓度提供,以及在50mM磷酸钾缓冲液pH 7.4中以2mg/ml提供。浓度通过于280nm的吸光度测定。PBS缓冲液和磷酸钾缓冲液用作对应样品的对照。DSC使用毛细孔微量热计VP-DSC(Microcal,MA,USA)以180℃/小时的加热速率进行。对于对照缓冲液和蛋白样品,典型的扫描通常在25-90℃。在每个对照缓冲液和样品配对后,用1%Decon的水溶液接着用PBS清洗毛细孔。所获数据追踪使用Origin 7 Microcal软件分析。由对照缓冲液获得的DSC追踪由样品追踪中扣除。将样品的精确摩尔浓度进入数据分析路径,以产生表观Tm值、焓(ΔH)和范得华焓(van’t Hoff enthalpy)(ΔHv)值。典型地,将数据拟合为非-2-态模型。DSC实验表明,某些DOM10分子(例如10-53-474(SEQ ID NO:2105)相比于其它分子(例如10-275-78)具有较高解链温度,参见下表9。这样的特性说明稳定性增加,并表明例如对肺部传递有较好的适用性。
表9:显示了选定的dAb DOM10-275-78和DOM10-53-474的表观Tm。
分子 | 表观Tm(℃) |
在PBS中的DOM10-275-78 | 49.4 |
在磷酸钾中的DOM10-275-78 | 49.8 |
在PBS中的DOM10-53-474 | 54.0 |
DOM10-53-474蛋白的解折叠是不可逆的,因此,由于在解链点之前发生的解折叠机制中存在某些不可逆步骤,表观Tm可能低于解链温度。
溶解度:
含有高dAb浓度的液体制剂对某些用途是理想的。例如,经由喷雾装置治疗性传递的蛋白可能需要比预期的系统传递更高的浓度,因为不是所有的雾化蛋白都将被吸入,也不是所有的雾化蛋白都沉积在肺中。给予的体积也受限于目标喷雾器中的储存器大小。为此,检测DOM10-53-474和DOM10-275-78这二者的溶解度,以确定在通过聚集和沉淀导致蛋白损失之前可以达到的最大浓度。
将通过检测280nm的吸光度测定的、已知在PBS中的起始浓度且已知体积的蛋白各自施加至带有MWCO 3,000Da PES膜的Vivaspin 20离心式浓缩装置(Vivasciences),并在台式离心机中以4,000g离心10-30分钟的时间。最初使用10分钟的时间,并且时间随着蛋白不断的浓缩而逐渐增加,以便达到所需的体积减少。
在每次离心后,由装置中取出蛋白,计量体积,使用移液管使其最接近50μl,并测定浓度。在样品以16,000g离心以除去所有沉淀物之后,使用获得的吸光度读数进行浓度测定,所述吸光度读数为280nm测得的吸光度减去320nm测得的吸光度。
实验浓度对该体积的理论浓度作图,最大溶解度的取点为实验浓度与理论值分离的点。
对于两种蛋白,在发散之前获得100mg/ml的浓度,实际的蛋白回收率为起始物质的约100%。
DOM10-53-474的下游处理和所获得的纯度:
使用巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)表达系统表达DOM10-53-474,并分泌入上清液中。用于含DOM10-53-474的发酵罐上清液的初始捕获步骤是直接加样至以PBS平衡的A蛋白Streamline树脂(GE Healthcare)上。所述树脂用5-10个柱体积的PBS洗涤,之后用2-5个柱体积的50mM TrisHCl pH 8洗涤,之后用4个柱体积的0.1M甘氨酸pH 2.0洗脱蛋白。洗脱的蛋白用1M TrisHCl pH8雾化至终浓度为0.2M TrisHCl。在观察到雾化沉淀时,通过离心收集沉淀物,并再溶解蛋白。蛋白的再溶解通过将沉淀重悬浮在10mMTrisHCl pH 7.4,其用量体积等于A蛋白纯化步骤的1个柱体积,然后加入1M NaOH至75mM的终浓度,以完全溶解沉淀的蛋白。通过逐渐加入1M甘氨酸pH 2(终浓度约0.1M)将pH调节至pH 8。通过SDS-PAGE分析表明,再溶解的蛋白溶液对于DOM10-53-474为约80%纯。通过阴离子交换层析进一步纯化DOM10-53-474。将再溶解的沉淀透析入50mM磷酸钾pH 6中,并加样至QFF柱上,用50mM磷酸钾pH 6平衡。使用超过20个柱体积的0-100%50mM磷酸钾pH6+1M NaCl梯度洗脱DOM10-53-474。洗脱峰的级分通过SDS-PAGE分析,混合最纯的级分,并缓冲交换至PBS中。在该阶段洗脱的蛋白依据SEC检测为约97%纯。
DOM10-275-78的下游处理和所获得的纯度:
用于由发酵罐上清液或周质级分初始捕获并纯化抗体和抗体片段的传统方法是使用固定在惰性基质上的A蛋白。作为亲和层析步骤,这具有良好的蛋白回收率和高纯度水平(例如约90%)的优势。然而,存在一些缺点。如同所有形式的亲和层析一样,某些配体会在洗脱阶段由柱支持基质流失。已知A蛋白是潜在的免疫原。因此,如果使用A蛋白,则脱离柱子的任何残余的A蛋白,都应当在随后的层析步骤中被除去或尽可能减少。
DOM10-275-78纯化:
用于含DOM10-275-78的发酵罐上清液或周质级分的初始捕获步骤是直接加样至以PBS平衡的A蛋白Streamline树脂(GE Healthcare)上。所述树脂用2-5个柱体积的PBS洗涤,之后用4个柱体积的0.1M甘氨酸pH 3.0洗脱蛋白。在该阶段洗脱的蛋白为约99%纯,含有依据SEC检测约1%的二聚化DOM10-275-78。蛋白回收率实际上为100%。残余的A蛋白使用A蛋白ELISA试剂盒(Cygnus,#F400)检测,并测定为50-200ppm。
去除残余的A蛋白:
使用两个进一步的层析步骤减少残余的A蛋白。使用1M Tris pH8.0将A蛋白步骤的洗脱液pH调节至pH 6.5,并通过加入1%(体积/体积)0.5M磷酸钠pH 6.5,产生5mM的最终磷酸盐浓度,使其准备用于在羟磷灰石II型上纯化。将A蛋白洗脱液施加至已用5mM磷酸盐pH 6.5平衡的柱子,DOM10-275-78单体被洗脱在流通液中。将二聚体结合至所述柱,并在DOM10-275-78已回收后施加的盐梯度开始时洗脱出来。梯度在30个柱体积内由5mM磷酸盐pH 6.5中的0M运行至1M NaCl。预期A蛋白应于该梯度洗脱,不过量太小,以至于不能够通过层析上的吸光度观察到。当将500mM磷酸盐pH6.5洗涤液施加至柱子时,A蛋白与DOM10-275-78的复合物在盐梯度后洗脱出来。基于280nm的吸光度,在该阶段后的DOM10-275-78单体的回收率经检测为74%,纯度依据SEC检测为100%。检测残余的A蛋白水平,发现其已降低至0.4-0.56ppm(百万分之一,即ng/mg)。
引入进一步的纯化步骤,以更进一步减少残余的A蛋白。在加入NaCl至终浓度为2M后,将来自羟磷灰石柱的洗脱液合并物直接施加至苯基(HIC)柱(GE Healthcare)。柱子已用25mM磷酸盐pH 7.4加2M NaCl平衡。蛋白用在20个柱体积内由2M NaCl至无盐的梯度洗脱。在该步骤后,残余的A蛋白水平降低至0.15-0.19ppm,蛋白回收率依据280nm的吸光度检测为80%。
DOM10-53-474和DOM10-275-78的喷雾器测试:
DOM10-53-474的测试:
雾化装置可以将dAb溶液雾化为液滴,其中仅一些属于肺部沉积所需要的尺寸范围(1-5μm)。气溶胶颗粒的粒径使用Malvern Spraytek装置通过激光散射分析。收集两种雾化后的样品:i)保留在储存器中的蛋白溶液,和ii)通过凝聚收集的气溶胶化的蛋白。评价雾化过程的检测参数为i)可呼吸分数,即在1-5μm尺寸范围内的颗粒百分率,这对于确定有多少dAb到达深肺是重要的;ii)dAb的粒径分布(psd);iii)平均中值空气动力学直径(MMAD),即在psd之内的雾化dAb溶液的平均液滴大小。dAb对雾化过程的稳定性通过使用多种方法比较雾化前样品和雾化后样品评价:i)大小排阻层析(SEC),其表明了雾化过程是否引起dAb聚集;ii)结合hIL-13的夹心ELISA。
使用喷射式喷雾器(两种LC+,由Pari生产)以及振荡筛喷雾器(两种E-flow,由Pari生产)研究DOM10-53-474的雾化特性。DOM10-53-474蛋白在PBS缓冲液(磷酸缓冲盐水)中以2.6mg/ml的浓度测试,在25mM磷酸钠缓冲液pH 7.5,7%(体积/体积)PEG1000、1.2%(重量/体积)蔗糖中以2.3和4.7mg/ml测试。雾化进行约3分钟。将100μL的蛋白样品(稀释至1mg/mL)注射至SEC(TSKgel G2000SWXL,Tosoh Biosciences,Germany)柱上。在SEC上的蛋白分离以0.5mL/分钟进行45分钟。PBS(磷酸缓冲盐水)+10%EtOH用作流动相。通过UV在线检测(280nm和215nm的吸光度)进行洗脱的蛋白类物质的检测。雾化前和两次雾化后的样品的SEC谱是相同的;在雾化后没有观察到指示聚集的峰,参见图10和图11。使用早前描述的夹心Elisa分析样品与hIL-13的结合,表明效力不受雾化影响,如表10所示。
表10:DOM10-53-474雾化前和雾化后样品的夹心ELISA数据。14-2.3mg/mL 25mM磷酸钠缓冲液pH 7.5,7%(体积/体积)PEG1000,1.2%(重量/体积)蔗糖;15-4.7mg/mL 25mM磷酸钠缓冲液pH 7.5,7%(体积/体积)PEG 1000,1.2%(重量/体积)蔗糖;16-2.6mg/mL PBS;Cup-在雾化后杯中残留的物质;Aero-气溶胶化的物质。DOM10-53-474为在1×PBS中的物质。
样品 | IC50nM |
DOM10-53-344(标准品) | 0.07157 |
DOM10-53-474 | 0.04578 |
DOM10-53-474#14Eflow Cup | |
DOM10-53-474#14Eflow Aero | 0.03222 |
DOM10-53-474#14LC+CUP | 0.03168 |
DOM10-53-344(标准品) | 0.12456 |
DOM10-53-474 | 0.03556 |
DOM10-53-474#14LC+Aero | 0.03480 |
DOM10-53-474#15Eflow Cup | 0.02144 |
DOM10-53-474#15Eflow Aero | 0.01849 |
DOM10-53-344(标准品) | 0.04552 |
DOM10-53-474 | 0.02886 |
DOM10-53-474#15LC+CUP | 0.01285 |
DOM10-53-474#15LC+Aero | 0.01494 |
DOM10-53-474#16Eflow Cup | 0.02242 |
DOM10-53-344(标准品) | 0.06709 |
DOM10-53-474 | 0.02692 |
DOM10-53-474#16Eflow Aero | 0.03508 |
DOM10-53-474#16LC+Cup | 0.03386 |
DOM10-53-474#16LC+Aero | 0.02298 |
最佳的MMAD为3μm,对于深肺传递,理想的可呼吸分数为最高百分率的<5μm颗粒。如以下的表11所示,LC+(Pari)喷射式喷雾器产生较好的MMAD。MMAD值在缓冲液含PEG时较低;MMAD随着蛋白浓度增加而降低。LC+(Pari)喷射式喷雾器产生较高的<5μm%:在缓冲液含PEG时获得较高的<5μm%值;<5μm%随着蛋白浓度增加也增加。
表11:显示了使用LC+(Pari)喷射式喷雾器和E-flow Rapid喷雾器雾化后的MMAD和<5μm颗粒的百分率:
DOM10-275-78的测试:
为确定该分子在临床前PK和效力研究过程中是否具有有效肺沉积所需的必要特征,使用PARI LC*喷射式喷雾器测试其在雾化过程中的特性。分析的特性为:i)使用Malvem Spraytek通过激光散射分析的气溶胶的粒径分布;ii)可呼吸分数,即1-5μm尺寸范围的颗粒的百分率;iii)质量中值空气动力学直径(MMAD),即在psd内的雾化dAb溶液的平均液滴大小。dAb对雾化过程的稳定性通过使用多种方法比较雾化前样品和雾化后样品来评价:i)大小排阻层析(SEC),其证实雾化过程是否引起dAb的聚集;ii)用于结合hIL-13的夹心ELISA;iii)HEK细胞测定。
依据280nm的u.v.吸光度测定,以PBS中20mg/ml的浓度测试dAb,其代表了实际的给药浓度。雾化dAb 30分钟,在雾化过程中于3个时间点的每一个时间点收集两种样品:i)保留在储存器中的蛋白溶液和ii)通过凝聚收集的气溶胶化蛋白。3个时间点为3分钟、15分钟和29分钟,代表雾化的开始、中间和结束。
将100μL的蛋白样品(稀释至1mg/mL)注射至SEC(TSKgel G2000SWXL,Tosoh Biosciences,Germany)柱上。在SEC上的蛋白分离以0.5mL/分钟进行45分钟。PBS(磷酸缓冲盐水)用作流动相。洗脱的蛋白类物质的检测通过UV(280nm和215nm的吸光度)在线检测进行。雾化样品的SEC谱是相同的;在雾化后未观察到指示聚集的峰。分析样品与hIL-13的结合,表明效力未受雾化影响,结果如下表12所示。
表12:表明了雾化前和雾化后dAb结合hIL-13的效力:
样品 | 结合测定 | HEK细胞测定EC50nM |
IC50nM | 猕猴IL-13 | 人IL-13 | |
DOM 10-275-78起始 | 1.2 | 0.93 | 0.58 |
DOM 10-275-78cup 3分钟 | 1.1 | 1.77 | 1.45 |
DOM 10-275-78cup 15分钟 | 1.2 | 1.52 | 2.18 |
DOM 10-275-78cup 29分钟 | 1.1 | 0.74 | 0.48 |
DOM 10-275-78气溶胶3分钟 | 1.1 | 0.99 | 1.8 |
DOM 10-275-78气溶胶15分钟 | 1 | 0.95 | 1.01 |
DOM 10-275-78气溶胶29分钟 | 1.1 | 0.74 | 0.62 |
DOM 10-53-474标准品 | 15.24 | 0.62 |
表13:显示了质量中值空气动力学直径(MMAD),即雾化的dAb溶液的平均液滴大小。最佳的MMAD为2-3μm,对于深肺传递,理想的可呼吸分数应为尽可能的最高百分率的<5μm颗粒。
DOM10-275-78对采用高百分率<5μm液滴的PARI LC*喷射式喷雾器中的雾化是稳定的,其达到了所需的MMAD。
在临床前PK和效力研究过程中应用喷雾器传递DOM10-275-78 猕猴PK:
为确定DOM10-275-78在猕猴中的药代动力学分布,并因此能够预测可能需要的临床给药频率,测试DOM10-275-78在猕猴的传递给药。为了能够尽可能全面地理解该分子传递至肺时的药代动力学,进行了众多不同的研究,参见表14:
表14:研究方案概述
*研究2的动物中仅3只动物得到的数据目前可用。
药物以3个逐步增加的剂量传递给给予镇静剂的动物,以确保药物耐受性(0.01、0.1和1mg/kg)。在所有情况下,都用2mg/kg Telazol进行镇静。为确保药物传递水平的一致性,并在已知不同药物溶液浓度对雾化的不同倾向性情况下,在18分钟药物传递期内进行0.01mg/kg和0.1mg/kg的给药。在20分钟内传递给药1mg/kg剂量。为抵偿预期的较高的呼吸速率和清醒的响铃传递动物的潮气量,这些动物以单剂接受药物,并仅持续接受10分钟。雾化的药物量通过在传递前和传递后对喷雾器药物杯称重而得到证实。
为了测试样品在传递后于肺和血清中的DOM10-275-78的存在情况,收集血液和支气管肺泡灌洗液(BAL)(用磷酸缓冲盐水冲洗一部分动物肺)。在符合伦理指引的情况下,血液通常在给药前和给药后24小时内至多9个时间点收集。BAL收集的侵袭性使得仅能在每只动物每次传递的传递后1小时或24小时收集1次。使血液在收集后凝集,然后离心,以产生血清。然后在分析前将血清和BAL储存于-80℃。
PK研究样品的测试:
为了确定所收集的样品中的DOM10-275-78水平,建立药代动力学测定。基于标准的结合电化学发光的平板用中性链亲和素包被,封闭,然后加入生物素化IL-13,以允许捕获至中性链亲和素。然后以一系列稀释度加入样品。随后使用多克隆兔抗Vh抗体检测任何结合的DOM10-275-78,之后用抗兔-sulfo-标记二抗检测。加入1×浓度的MSD T读数缓冲液(Mesoscale Discovery,Maryland),并使用sector 6000MSD成像仪(Mesoscale Discovery,Maryland)读板。在测定的每个阶段之间进行洗涤步骤。
药代动力学研究的结果:
计算每个收集时间点的血清和BAL浓度,并使用WinnonLin(Pharsight Corporation,California)药代动力学分析软件分析每个动物的所获数据。通过该分析产生的药代动力学参数汇总于下表15:
表15:药代动力学参数的汇总
每个研究于多个时间点的平均血清浓度汇总于下表16:
表16:研究1-3中的每一个研究在多个时间点的平均血清浓度
另外,测定24小时后BAL中存在的药物水平分析,并使用尿素水平测定调节以便稀释,得到每ml上皮层液体表示的图。这些结果在下表17中给出:
表17:支气管肺泡灌洗液(BAL)中的DOM10-275-78水平
研究编号 | 24小时时间点(mg DOM10-275-78/ml ELF) |
研究1 | 1.23 |
研究2 | 4.52 |
研究3 | 4.75 |
总之,可以将显著水平的域抗体给到猕猴肺,域抗体水平在24小时后仍相当可观。此外,每天重复给药如果说存在任何累积的话,也极其微少。过敏动物通常具有约200ng/ml的最大血清药物浓度,并且血清药物浓度在清醒给予药物的动物中是最高的。最高药物水平通常在传递后2-4小时达到。DOM10-275-78的半衰期在所有情况下均约为4小时,并在传递24小时的肺和血清中存在显著治疗相关水平的药物,其支持潜在的每日给予。
替代dAb形式的喷雾器传递:
通过将配体缀合或连接至结合增加体内半衰期的抗原或表位的结合域(例如抗体或抗体片段),还可以增加配体(例如dAb单体)的流体力学尺寸及其血清半衰期。例如,配体(例如dAb单体)可以缀合或连接至抗血清白蛋白dAb或人IgG分子的Fc结构域。另外,其它生物活性的肽,例如毒蜥外泌肽-4,可以通过与抗血清白蛋白dAb缀合改善它们的体内半衰期。
PK研究已证实,传递至肺的dAb容易且快速地转移入循环。因此,如果具有较长血清半衰期的替代dAb形式显示所需的特征,肺部传递有可能为其提供容易且有效的给予途径。
因此,在两个不同的喷雾器装置中测试了两种替代的dAb形式,以确定替代的dAb形式是否可以成功被雾化。测试的dAb为DMS1529,其是一种与人Fc缀合的抗VEGF dAb;和DAT0115,其是一种缀合毒蜥外泌肽-4肽的抗人血清dAb,其结合GLP受体和人白蛋白。
DMS1529的生产:
DMS1529在无血清/蛋白的培养基中的CHO细胞中以约0.5mg/ml的滴度表达。0.2μm过滤培养上清液,并如下通过亲和层析纯化。用Mab Select Sure树脂(GE Healthcare)将XK50柱装填至20cm床高,并以30ml/分钟平衡为1×PBS。用2CV(0.8L)的0.1M NaOH洗柱,并用4CV(1.6L)1×PBS再平衡。
然后将10L DMS1529上清液以30ml/分钟(cm/小时)上样。在上清液上样后如下进行洗柱:用4CV(1.6L)1×PBS、补加0.85M NaCl的2CV(0.8L)1×PBS和4CV(1.6L)10mM乙酸钠,pH 5.5。蛋白使用0.1M乙酸钠pH 3.6洗脱。收集以OD280达到20mAus开始,并以其下降至35mAus以下终止。洗脱峰为600ml,pH为3.7。将其于该pH保持1小时,之后用2M乙酸钠中和至pH 4.5。当溶液pH接近4.5,其变为雾状。然后通过SartoBran-P深层滤器过滤蛋白,并检测OD。然后除菌过滤蛋白合并液,并储存于4度。
最终的蛋白合并液为6mg/ml的浓度,纯度经SEC检测为96.4%。将100μl的蛋白样品加至TSK3000 SWXL SEC柱(Tosoh,Germany)上,该柱以0.5ml/分钟在0.1M磷酸钠/400mM NaCl pH 6.8流动相中运行30分钟。
连续使用3个53ml CV脱盐柱(GE Healthcare),并以5ml/分钟运行,将40ml的该蛋白缓冲交换至含10mM乙酸钠/2%甘氨酸/0.05mM EDTA/0.04%Tween 80/10%蔗糖pH 5的更稳定的制剂中。使用具有MWCO 3,000Da的Vivaspin离心式浓缩器(Vivasciences)将缓冲交换的蛋白浓缩至9.8mg/ml,在用喷雾器测试前储存于4℃。
DAT0115的生产:
将在5L发酵罐中生产的1L冷冻的大肠杆菌培养上清液于室温解冻,并于4度过夜。通过在1M NaOH中过夜静置消毒Akta Xpress模块(得自GE Healthcare,UK的纯化系统),第二天早晨以无菌、无内毒素的dulbeccos PBS洗涤Akta。将解冻的上清液以16,000rpm离心,然后0.2μm过滤。用200ml 6M盐酸胍清洗200ml L蛋白streamline柱,然后以PBS洗涤。将解冻的上清液以20ml/分钟上柱,然后用dulbeccos PBS洗涤柱子,直至A280为15mAus以下,然后用约400ml的20mM Tris,pH 7.4洗涤。柱子使用0.1M甘氨酸,pH 2洗脱,将洗脱峰收集入两个级分中,主峰包含峰最大值和一些拖尾(200ml),洗脱尾包含剩下的洗脱尾(200ml)。通过加入1/5终体积的1M Tris,pH7.4雾化两个洗脱级分,用pH试纸检查pH,所述级分除菌过滤,并储存于4度。
将含有峰最大值的级分浓缩至8.3mg/ml,并用于喷雾器测试。
替代dAb形式的雾化:
以约10mg/ml测试不同的dAb形式达30分钟。使用MalvernSpraytek研究粒径分布、MMAD和<5μm的粒子(液滴)百分率,以确定其肺部沉积特征。
使用喷射式喷雾器(LC+,Pari)和振荡筛喷射式喷雾器(E-flow,Pari)测试两种格式化dAb。在测试过程中,于3个时间点由喷雾器样品储存器(杯)和收集的气溶胶化dAb凝聚物取样,并使用以下来评价稳定性:i)SEC-HPLC,以测定任何聚集增加;和ii)效力测定,以评价活性的任何减少。对于用LC+喷雾器雾化的样品,取样时间点为3分钟、15分钟和29分钟,对于e-Flow喷雾器仅为3分钟,因为该装置雾化样品更加快速,如下表18所示。
表18:格式化dAb的雾化速率
雾化样品 | E-Flow(ml/分钟) | LC+(ml/分钟) |
DMS1529 10mg/ml起始(3分钟) | 0.17 | |
DMS1529 10mg/ml中间(15分钟) | 0.18 | |
DMS1529 10mg/ml结束(27分钟) | 0.15 | |
DMS1529 10mg/ml(3分钟) | 0.76 | |
DAT0115 8.3mg/ml起始(3分钟) | 0.31 | |
DAT0115 8.3mg/ml中间(15分钟) | 0.23 | |
DAT0115 8.3mg/ml结束(27分钟) | 0.13 | |
DAT0115 8.3mg/ml(3分钟) | 0.47 |
研究结果表明,随着体积减少,DMS1529在整个30分钟雾化时间内以相当恒定的速率被雾化,而DAT0115的雾化速率似乎随着时间降低。因此,对于该分子必须检测所需临床传递时间的雾化速率。
为测定雾化过程中的蛋白稳定性和聚集倾向性,将100μL蛋白样品注射到SEC柱上。对于DMS1529,用0.1M磷酸钠/400mM NaCl pH 6.8将样品稀释至1mg/ml,所用柱子为TSKgel G3000SWXL(Tosoh Biosciences,Germany)。蛋白分离以0.5mL/分钟进行45分钟。0.1M磷酸钠/400mM NaCl pH 6.8用作流动相。对于DAT0115,所用柱子为Superdex 20010/300柱(GE Healthcare)。蛋白分离以0.5mL/分钟进行50分钟。将100μl的纯样品以约8.3mg/ml在200mM Tris/80mM甘氨酸pH 7.4中注射,20mM柠檬酸钠pH 6.2,100mM NaCl用作流动相。每个柱洗脱的蛋白类物质的检测为利用UV(280nm和215nm的吸光度)在线的检测。雾化前和雾化后样品的SEC谱基本相同;在雾化后没有观察到指示任何增加聚集的峰。由积分的层析图计算每个样品中的单体百分率。分析样品在其相应的活性测定中的结合,显示效力未受雾化影响,如表19所示。
表19:DMS1529 Fc雾化前和雾化后样品的结合测定数据和DAT0115的细胞测定数据。
样品 | EC50(nm) |
DMS1529(标准品) | 0.088 |
DMS1529Fc T0 | 0.138 |
DMS1529Fc e-Flow cup 3分钟 | 0.15 |
DMS1529Fc e-Flow气溶胶3分钟 | 0.164 |
DMS1529Fc LC+cup 3分钟 | 0.137 |
DMS1529Fc LC+cup 15分钟 | 0.12 |
DMS1529Fc LC+cup 29分钟 | 0.128 |
DMS1529Fc LC+气溶胶3分钟 | 0.134 |
DMS1529Fc LC+气溶胶15分钟 | 0.12 |
DMS1529Fc LC+气溶胶29分钟 | 0.095 |
样品 | EC50(nm) |
DAT0115(标准品)(LH200208) | 310.5 |
DAT0115 T0 | 178.2 |
DAT0115 e-Flow cup 3分钟 | 535.1 |
DAT0115 e-Flow气溶胶3分钟 | 797.8 |
DAT0115 LC+cup 3分钟 | 725.1 |
DAT0115 LC+cup 15分钟 | 453.3 |
DAT0115 LC+cup 29分钟 | 445.4 |
DAT0115 LC+气溶胶3分钟 | 295.6 |
DAT0115 LC+气溶胶15分钟 | 316.4 |
DAT0115 LC+气溶胶29分钟 | 141.8 |
用于DMS1529的效力测定为DOM15 Fc结合测定,用于DAT0115的效力测定为DAT01细胞测定。以下描述了这些测定。
最佳的MMAD为约3μm,对于深肺传递,理想的可呼吸分数应为尽可能的最高百分率的<5μm颗粒。两种喷雾器中的两种dAb形式的检测结果示于表20。
表20:格式化dAb的MMAD检测和<5μm的颗粒百分率:
样品 | MMAD(μm) | %<5μm |
DMS1529Fc e-Flow 3分钟 | 2.98 | 82.9% |
DMS1529Fc LC+3分钟 | 1.25 | 70.2% |
DMS1529Fc LC+15分钟 | 1.84 | 65.9% |
DMS1529Fc LC+29分钟 | 1.25 | 76.6% |
样品 | MMAD(μm) | %<5μm |
DAT0115 e-Flow 3分钟 | 2.93 | 85.0% |
DAT0115 LC+3分钟 | 2.55 | 56.1% |
DAT0115 LC+15分钟 | 1.22 | 63.6% |
DAT0115 LC+29分钟 | 2.11 | 56.4% |
两种分子在两种喷雾器中都被有效雾化。对于两种分子,e-Flow喷雾器产生更大量的<5μm的液滴,尽管e-Flow的MMAD高于LC+。这应当表明,用e-Flow观测到的PSD比用LC+观测到的更紧密。两种分子都以一致的MMAD和<5μm%在LC+中被雾化达30分钟。对于DAT0115,两种雾化方法(喷射式和振荡筛)之间的差异比DMS1529更显著。DAT0115在e-Flow振荡筛喷雾器中更有效雾化,MMAD为约3μm,可呼吸分数中的液滴为85%。
DMS1529结合测定:
将重组人VEGF捕获在Nunc maxisorp ELISA板上,然后用1%BSA的PBS溶液封闭非特异性结合。然后将所述板与dms 1529(dAb-hFc)温育1小时。使用过氧化物酶抗人IgG(Fc特异性的)抗体检测结合。1小时后,使用SureBlue TMB底物(KPL)显色板,并读取450nm的吸光度。
DAT01细胞测定:
该测定使用以6CRE/萤光素酶报告基因(CHO-luc)(GSK)稳定转染的CHO细胞。在GLP-1活化受体后生产cAMP时,启动子基因(含6个拷贝的cAMP响应元件-6CRE)驱动萤光素酶报告基因的表达。然后,其催化萤光素反应,以产生可以读板器检测的光。简而言之,使CHO-luc细胞粘附至组织培养板,然后加入dAb样品。3小时后,将Bright Glo萤光素酶试剂(Promega)加至各孔,以读板器检测发光。
DOM1h-131-206的雾化:
进行这些实验,以确定域抗体DOM 1h-131-206是否可以被雾化以经口吸入。因为适用于经口吸入的雾化剂量高度依赖某些关键物理参数,所以还依据液滴大小分布、活性成分的浓度和活性组分稳定性(片段化/聚集)进行实验来研究DOM 1h-131-206的雾化效果。
方法:
确定雾化制剂的效果
使用Pari eFlow雾化9.7mg/ml DOM 1h-131-206在20mM乙酸盐缓冲液pH 5.5中的溶液,该溶液含有4%Lutrol L44、0.5%精氨酸、0.01%聚山梨醇酯80和0.682%NaCl。
以成对碰撞取样器装置从喷雾器收集产出的气溶胶,在碰撞取样器连接辅助泵时设定为牵引60L/分钟的流速。(欧洲药典2.9.18.章)。实验的设置如下。喷雾器吹口直接置于前方,并与位于4cm远的成对碰撞取样器喉管入口在同一直线上。成对碰撞取样器在第1阶段具有7ml缓冲液,在第2阶段具有30ml相同缓冲液;用于该实验的缓冲液组成为20mM乙酸盐缓冲液pH 5.5,含有0.5%精氨酸和0.682%NaCl。
按顺序用6ml药物溶液充入Pari eFlow。开启连接成对碰撞取样器装置的泵,之后开启喷雾器,来自喷雾器的药剂进入,通过成对碰撞取样器装置收集。为收集多个样品,喷雾器运行2分钟,此后关闭喷雾器,并更换成对碰撞取样器装置。打开喷雾器,以再收集喷雾器的相同物质2分钟。两个成对碰撞取样器装置的每一个的样品都分别定量洗涤入用于第1阶段和第2阶段的100ml容量瓶中。使用缓冲液进行冲洗(如上所述)。样品使用大小排阻层析(SEC)运行,以确定单体峰的浓度,并观察样品在给药时是否经历片段化/聚集。通过与已知浓度的分析标准溶液比较,可确定单体峰的浓度。
表21:显示了SEC的方法细节:
流动相 | 100mM磷酸钠,400mM NaCl,pH 6.8,具有10%正丙醇 |
流速 | 0.5ml/分钟 |
柱温 | 未控制 |
UV检测波长 | 280nm |
注射体积 | 10μl |
分析时间 | 40分钟 |
为测定雾化气流的液滴大小分布(DSD):
用于检测DSD的设备为Malvern Spraytec(Malvern Instruments UK,型号STP5311),这是一种通过激光散射检测液滴大小的非侵入性系统。
将喷雾器吹口置于距激光束1cm远和距接收光学透镜3cm远。将成对碰撞取样器装置设定于70L/分钟,以引导雾化气流通过激光检测区。在雾化气流行进方向上,将成对碰撞取样器装置的吹口置于距激光束1cm远之处。
Pari eFlow的气流密度高,引起光束转向(beam steering)的问题。在检测区的空气密度(以及因此产生的折射率)变得与环境空气显著不同时,例如在显著浓度的推进剂气体或其它蒸汽存在时,观察到光束转向。当光束转向发生时,激光束与其在环境条件下的直线偏离,导致对大颗粒的错误读数。因此,受光束转向影响的检测器不能进行检测。这确实减少了分析的尺寸范围,因为大颗粒不能被检测到。然而,这些颗粒在这些样品中不存在。
水由检测区中的雾化液滴蒸发引起‘光束转向’,其中能感觉到存在某些非常大的液滴。关闭检测器,直至双峰分布消失,这意味着光散射装置的检测器1-12失效。使用连续检测技术进行检测,每5秒进行1次检测。
按顺序用6ml药物溶液充入Pari eFlow。开启连接至成对碰撞取样器装置的泵,之后开始检测。然后开启喷雾器,于是来自喷雾器的剂量穿过Spraytec的检测区,被成对碰撞取样器装置收集。为收集多个样品,喷雾器运行2分钟,此后关闭喷雾器,终止检测,并更换成对碰撞取样器装置。开启喷雾器,以再收集喷雾器的相同物质2分钟。
结果
表22:依据SEC测定的成对碰撞取样器的第1阶段和第2阶段的活性成分量对雾化时间
以上表22的结果表明,尽管喷雾器的输出速率存在固有的变化,但随着时间推移,传递的质量却是一致的。
表23:依据以SEC测定的面积%的活性成分(单体)浓度
2 | 96.76 | 96.69 |
表23中的结果表明,雾化样品具有与输入物质相当量的DOM1h-131-206。当该数据与定量浓度数据联系在一起时,这提示,所述物质在雾化时没经历显著的片段化或聚集。
表24:雾化活性成分的液滴大小分布
时间点 | 0-2分钟 | 2-4分钟 |
Dv(10) | 1.377 | 1.713 |
Dv(50) | 3.617 | 3.860 |
Dv(90) | 7.573 | 7.819 |
%<10μm | 97.045 | 96.615 |
%<5μm | 70.029 | 67.081 |
%<2μm | 19.717 | 14.675 |
以上表24中的液滴大小分布表明,在第二个时间点有一些轻微的粗化,但这在雾化制剂中是一个常见特性。Dv值的最大变化为0.34μm,其不可能对体内剂量有影响。
总之,提供的结果表明,活性dAb可以使用Pari eFlow喷雾器成功地雾化,对制剂的浓度和组成几乎没有影响。
结论:
如上所述已证实,多肽如dAb可以在一系列市售可得的喷雾器装置中被雾化,且重要的是,它们在雾化后保留了稳定性和生物活性,在雾化后没有观察到显著的聚集。在向缓冲制剂加入粘度增强赋形剂如PEG时,可以改善粒径分布和小于5μm的液滴大小百分率,由此潜在地改善向深肺的dAb传递。
dAb向肺的传递还可以通过增加dAb浓度(例如至多约40mg/ml的浓度)和传递时间进一步改善,而dAb的稳定性或活性没有任何降低。
Claims (60)
1.一种包含以下物质或由以下物质组成的组合物:(a)多肽和(b)生理学上可接受的缓冲液,其中所述组合物包含液滴,并且所述组合物中存在的液滴中,约40%或以上的液滴小于约6微米。
2.权利要求1的组合物,其中所述组合物中存在的液滴中,约40%或以上液滴的大小为约1微米至约6微米。
3.权利要求1或2的组合物,其中所述组合物中存在的液滴中,约40%或以上的液滴小于约5微米。
4.权利要求1-3中任一项的组合物,其中所述多肽包含多肽结构域或由多肽结构域组成,所述多肽结构域例如为单体。
5.前述权利要求中任一项的组合物,其中所述多肽包含免疫球蛋白分子或由免疫球蛋白分子组成。
6.前述权利要求中任一项的组合物,其中所述多肽包含至多150个氨基酸或由至多150个氨基酸组成。
7.前述权利要求中任一项的组合物,其中所述多肽包含域抗体(dAb)或由域抗体(dAb)组成。
8.权利要求1-4中任一项或权利要求6的组合物,其中所述多肽包含非Ig骨架或由非Ig骨架组成,所述非Ig骨架例如为亲和体。
9.前述权利要求中任一项的组合物,其中所述多肽例如域抗体具有约55℃至约90℃的解链温度(TM)。
10.前述权利要求中任一项的组合物,其中所述缓冲液具有约4至约8的pH范围。
11.前述权利要求中任一项的组合物,其中所述缓冲液的粘度约等于约2%至约10%PEG 1000在含1.2%(重量/体积)蔗糖的50mM磷酸盐缓冲液中的溶液的粘度。
12.一种包含以下物质或由以下物质组成的组合物:(a)多肽和(b)生理学上可接受的缓冲液,其中所述缓冲液具有约4至约8的pH范围,并且其粘度约等于约2%至约10%PEG 1000在含1.2%(重量/体积)蔗糖的50mM磷酸盐缓冲液中的溶液的粘度。
13.权利要求12的组合物,其中所述多肽包含多肽结构域或由多肽结构域组成,例如其中所述多肽结构域作为单体存在。
14.权利要求12或13的组合物,其中所述多肽包含免疫球蛋白分子或由免疫球蛋白分子组成。
15.权利要求12-14中任一项的组合物,其中所述多肽包含至多150个氨基酸或由至多150个氨基酸组成。
16.权利要求12-15中任一项的组合物,其中所述多肽包含域抗体(dAb)或由域抗体(dAb)组成。
17.权利要求12-13或15的组合物,其中所述多肽包含非Ig的骨架或由非Ig骨架组成,所述非Ig骨架例如为亲和体。
18.权利要求12-17中任一项的组合物,其中所述多肽具有约55℃至约90℃的解链温度(TM)。
19.权利要求12-18中任一项的组合物,其中在所述组合物中存在的液滴中,约40%或以上的液滴小于约6微米。
20.权利要求19的组合物,其中在所述组合物中存在的液滴中,约40%或以上的液滴大小为约1微米至约6微米。
21.权利要求19或20的组合物,其中在所述组合物中存在的液滴中,约40%或以上的液滴小于约5微米。
22.前述权利要求中任一项的组合物,其中所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或组氨酸缓冲液,并任选地进一步包含(a)增加粘度的添加剂和/或(b)稳定剂。
23.前述权利要求中任一项的组合物,其中所述多肽例如dAb可以结合靶分子,例如在肺组织中存在的靶分子。
24.权利要求23的组合物,其中所述靶分子选自TNF受体、TNFR1、IL-1、IL-1R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-8R、IL-9、IL-9R、IL-10、IL-12、IL-12R、IL-13、IL-13Rα1、IL-13Ra2、IL-15、IL-15R、IL-16、IL-17R、IL-17、IL-18、IL-18R、IL-23、IL-23R、IL-25、CD2、CD4、CD11a、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD56、CD138、ALK5、EGFR、FcER1、TGFb、CCL2、CCL18、CEA、CR8、CTGF、CXCL12(SDF-1)、凝乳酶、FGF、弗林蛋白酶、内皮素-1、嗜酸性粒细胞趋化因子(例如嗜酸性粒细胞趋化因子、嗜酸性粒细胞趋化因子-2、嗜酸性粒细胞趋化因子-3)、GM-CSF、ICAM-1、ICOS、IgE、IFNa、I-309、整联蛋白、L-选择素、MIF、MIP4、MDC、MCP-1、MMPs、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、骨桥蛋白、OX-40、PARC、PD-1、RANTES、SCF、SDF-1、唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素8、TARC、TGFb、凝血酶、Tim-1、TNF、TNFR1、TRANCE、类胰蛋白酶、VEGF、VLA-4、VCAM、α4β7、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8、αvβ6、αvβ8、cMET和CD8。
25.权利要求24的组合物,其中所述多肽为抗TNF受体结构域抗体(dAb)。
26.权利要求25的组合物,其中所述抗TNF受体dAb选自Dom1h-131、Dom 1h-131-8、Dom 1h-131-24、Dom 1h-131-53、Dom1h-131-70、Dom 1h-131-83、Dom 1h-131-117、Dom 1h-131-151、Dom 1h-131-511、Dom 1h-131-202、Dom 1h-131-206、Dom1h-131-201、1h-131-203、1h-131-204和1h-131-205。
27.权利要求26的组合物,其中所述抗-TNF受体dAb包含与DOM1h-131-206的氨基酸序列(示于图1)至少93%相同的氨基酸序列。
28.权利要求26的组合物,其中所述抗-TNF受体dAb包含与DOM1h-131-511的氨基酸序列(示于图1)至少95%相同的氨基酸序列。
29.权利要求24的组合物,其中所述dAb结合IL-13,并包含例如与图12b(Dom 10-53-474)或图12c(Dom 10-275-78)中公开的氨基酸序列相同的氨基酸序列,或者其包含与在图12b或图12c中公开的氨基酸序列具有例如80%同一性的序列,例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%或97%的同一性。
30.权利要求24的组合物,其中所述dAb结合IL-1R1,并包含例如与在图12d(Dom 4-130-202)或图12e(Dom 4-130-201)中公开的氨基酸序列相同的氨基酸序列,或者其包含与在图12d或图12e中公开的氨基酸序列具有例如80%同一性的序列,例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%或97%的同一性。
31.权利要求30的组合物,其中所述dAb包含与Dom 4-130-202的氨基酸序列(示于图12d)至少97%相同的氨基酸序列。
32.权利要求30的组合物,其中所述dAb包含与Dom 4-130-202的氨基酸序列(示于图12e)至少98%相同的氨基酸。
33.权利要求24的组合物,其中所述dAb结合VEGF,并包含例如与图14中公开的氨基酸序列相同的氨基酸序列,或者其包含与图14中公开的氨基酸序列具有例如80%同一性的序列,例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。
34.权利要求33的组合物,其中所述dAb包含与DOM15-26-593的氨基酸序列(示于图14a)至少97%相同的氨基酸序列。
35.权利要求33的组合物,其中所述dAb包含与DOM15-26-593的氨基酸序列(示于图14a)至少97%相同的氨基酸,且所述dAb还包含抗体恒定区的结构域。
36.权利要求24的组合物,其中所述dAb结合IL-13,且包含例如与图12b(Dom 10-53-474)或图12c(Dom 10-275-78)中公开的氨基酸序列相同的氨基酸序列,或者所述dAb包含与图12b或图12c中公开的氨基酸序列具有例如80%同一性的序列,例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%或97%的同一性。
37.权利要求23的组合物,其中所述多肽例如dAb可以结合系统靶分子,例如选自以下的系统靶分子:人或动物蛋白、细胞因子、细胞因子受体、用于酶的酶辅因子或DNA结合蛋白,例如ApoE、Apo-SAA、BDNF、心肌营养素-1、EGF、EGF受体、ENA-78、嗜酸性粒细胞趋化因子、嗜酸性粒细胞趋化因子-2、Exodus-2、EpoR、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-10、FLT3配体、Fractalkine(CX3C)、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-β1、胰岛素、IFN-γ、IGF-I、IGF-II、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8(72个氨基酸)、IL-8(77个氨基酸)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18(IGIF)、抑制素α、抑制素β、IP-10、角化细胞生长因子-2(KGF-2)、KGF、苗条蛋白、LIF、淋巴细胞趋化因子、苗勒氏管抑制物、单核细胞集落抑制因子、单核细胞引诱蛋白、M-CSF、MDC(67个氨基酸)、MDC(69个氨基酸)、MCP-1(MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC(67个氨基酸)、MDC(69个氨基酸)、MIG、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、MIP-3β、MIP-4、髓样祖细胞抑制因子-1(MPIF-1)、NAP-2、Neurturin、神经生长因子、β-NGF、NT-3、NT-4、制癌蛋白M、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDF1α、SDF1β、SCF、SCGF、干细胞因子(SCF)、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-β2、TGF-β3、肿瘤坏死因子(TNF)、TNF-α、TNF-β、TNF受体I、TNF受体II、TNIL-1、TPO、VEGF、VEGF受体1、VEGF受体2、VEGF受体3、GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β、GRO-γ、HCC1、1-309、HER 1、HER 2、HER 3和HER 4、毒蜥外泌肽和GLP-1。
38.权利要求13的组合物,其中所述dAb可以结合人白蛋白,且其连接至毒蜥外泌肽或GLP分子。
39.权利要求13的组合物,其中多肽分子包含毒蜥外泌肽4(G4S)3DOM7h-14融合蛋白(DAT0115)或与dat0115氨基酸序列具有例如80%同一性的任何分子,例如85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。
40.前述权利要求中任一项的组合物,所述组合物还包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
41.前述权利要求中任一项的组合物,所述组合物用于药物。
42.权利要求1-40中任一项的组合物,所述组合物用于将多肽例如dAb传递至肺,或者例如用于多肽的系统性传递。
43.权利要求1-40中任一项的组合物,所述组合物用于肺或呼吸道病症或疾病的治疗、预防或诊断。
44.前述权利要求中任一项的组合物,其中所述dAb是格式化dAb,例如其为dAb-Fc融合蛋白。
45.权利要求1-40中任一项的组合物在制备用于治疗、预防或诊断肺或呼吸道病症或疾病的药物中的用途。
46.权利要求12的组合物在制备用于治疗、预防或诊断深肺病症或疾病的药物中的用途。
47.权利要求12的组合物用于传递多肽至深肺组织的用途。
48.一种将所需分子传递给患者的方法,所述方法包括将权利要求1-40中任一项的组合物直接给予到患者的肺。
49.一种治疗、预防或诊断肺病或呼吸道疾病的方法,所述方法包括将权利要求1-40中任一项的组合物直接给予到患者的肺组织。
50.权利要求35或36的方法,其中所述组合物以日剂量约5mg/Kg体重至约0.005mg/Kg体重给予受治疗者。
51.权利要求48-50中任一项的方法,其中所述组合物使用喷雾器、吸入器或鼻内装置给予患者。
52.一种喷雾器、吸入器或鼻内装置,所述喷雾器、吸入器或鼻内装置装有权利要求1-40中任一项的组合物。
53.权利要求39的喷雾器、吸入器或鼻内装置用于将权利要求1-40的组合物传递至患者的肺组织的用途。
54.一种生产药物组合物的方法,所述药物组合物用于例如治疗、预防或诊断肺病症或疾病,所述方法包括混合(a)权利要求1-40中任一项的组合物和(b)药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
55.一种生产多肽组合物的方法,所述多肽组合物用于例如治疗、预防或诊断肺病症或疾病,所述方法包括混合(a)多肽和(b)生理学上可接受的缓冲液,所述缓冲液具有约4至约8的pH范围,并且其粘度约等于约2%至约10%PEG 1000在含1.2%(重量/体积)蔗糖的50mM磷酸缓冲液中的溶液的粘度。
56.权利要求55的方法,其中所述多肽包含域抗体(dAb)或由域抗体(dAb)组成。
57.一种生产权利要求1-40的组合物的方法,所述方法包括以下步骤:(a)混合多肽和生理学上可接受的缓冲液,然后(b),使步骤(a)的多肽和缓冲液组合物通过喷雾器、吸入器或鼻内传递装置。
58.权利要求57的方法,其中所述生理学上可接受的缓冲液具有约4至约8的pH范围,并且其粘度约等于约2%至约10%PEG 1000在含1.2%(重量/体积)蔗糖的50mM磷酸缓冲液中的溶液的粘度。
59.一种生理学上可接受的缓冲液的用途,所述缓冲液用于制备多肽组合物,例如肺部传递的多肽组合物,所述缓冲液具有约4至约8的pH范围,并且其粘度约等于约2%至约10%PEG 1000在含1.2%(重量/体积)蔗糖的50mM磷酸缓冲液中的溶液的粘度。
60.权利要求47的用途,其中所述多肽组合物包含域抗体(dAb)或由域抗体(dAb)组成。
Applications Claiming Priority (17)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBGB0724331.4A GB0724331D0 (en) | 2007-12-13 | 2007-12-13 | Compositions for pulmonary delivery |
GB0724331.4 | 2007-12-13 | ||
BD1272008 | 2008-05-22 | ||
BD127/2008 | 2008-05-22 | ||
BD1302008 | 2008-05-22 | ||
BD128/2008 | 2008-05-22 | ||
BD1292008 | 2008-05-22 | ||
BD129/2008 | 2008-05-22 | ||
BD1282008 | 2008-05-22 | ||
BD130/2008 | 2008-05-22 | ||
PCT/GB2008/050399 WO2008149143A2 (en) | 2007-06-06 | 2008-06-03 | Methods for selecting protease resistant polypeptides |
PCT/GB2008/050400 WO2008149144A2 (en) | 2007-06-06 | 2008-06-03 | Polypeptides, antibody variable domains and antagonists |
PCT/GB2008/050403 WO2008149146A2 (en) | 2007-06-06 | 2008-06-03 | Polypeptides, antibody variable domains and antagonists |
GBPCT/GB2008/050403 | 2008-06-03 | ||
GBPCT/GB2008/050399 | 2008-06-03 | ||
GBPCT/GB2008/050400 | 2008-06-03 | ||
PCT/EP2008/067295 WO2009074634A2 (en) | 2007-12-13 | 2008-12-11 | Compositions for pulmonary delivery |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102131827A true CN102131827A (zh) | 2011-07-20 |
Family
ID=61230984
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2008801271605A Pending CN102131827A (zh) | 2007-12-13 | 2008-12-11 | 用于肺部传递给药的组合物 |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20100260853A1 (zh) |
EP (1) | EP2220115A2 (zh) |
JP (1) | JP2011506396A (zh) |
KR (1) | KR20100098697A (zh) |
CN (1) | CN102131827A (zh) |
AU (1) | AU2008334605B2 (zh) |
BR (1) | BRPI0819932A2 (zh) |
CA (1) | CA2707986A1 (zh) |
EA (1) | EA201000785A1 (zh) |
SG (1) | SG185286A1 (zh) |
TW (1) | TW200938222A (zh) |
WO (1) | WO2009074634A2 (zh) |
ZA (1) | ZA201004093B (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103842380A (zh) * | 2011-07-27 | 2014-06-04 | 葛兰素集团有限公司 | 融合至Fc结构域的抗VEGF单可变结构域 |
CN106132398A (zh) * | 2014-04-03 | 2016-11-16 | 瑞士杰特贝林生物制品有限公司 | 免疫球蛋白的雾化 |
Families Citing this family (29)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9320792B2 (en) | 2002-11-08 | 2016-04-26 | Ablynx N.V. | Pulmonary administration of immunoglobulin single variable domains and constructs thereof |
WO2004041865A2 (en) | 2002-11-08 | 2004-05-21 | Ablynx N.V. | Stabilized single domain antibodies |
US20060034845A1 (en) | 2002-11-08 | 2006-02-16 | Karen Silence | Single domain antibodies directed against tumor necrosis factor alpha and uses therefor |
US7838250B1 (en) | 2006-04-04 | 2010-11-23 | Singulex, Inc. | Highly sensitive system and methods for analysis of troponin |
CA3086149A1 (en) | 2006-04-04 | 2007-10-11 | Singulex, Inc. | Highly sensitive system and methods for analysis of troponin |
JP2010528647A (ja) * | 2007-06-06 | 2010-08-26 | ドマンティス リミテッド | ポリペプチド、抗体可変ドメインおよびアンタゴニスト |
WO2010037818A1 (en) * | 2008-10-02 | 2010-04-08 | Ablynx Nv | Amino acid sequences directed against il-15 and/or the il-15 receptor and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with il-15 mediated signalling |
JP2012509658A (ja) * | 2008-11-26 | 2012-04-26 | グラクソ グループ リミテッド | Il−13に結合するリガンド |
AU2010259022B2 (en) | 2009-06-08 | 2016-05-12 | Singulex, Inc. | Highly sensitive biomarker panels |
EP2483308A1 (en) * | 2009-09-30 | 2012-08-08 | Glaxo Group Limited | Drug fusions and conjugates with extended half life |
PL3501499T3 (pl) * | 2010-02-11 | 2023-01-09 | Ablynx Nv | Sposoby i kompozycje do wytwarzania aerozoli |
WO2012025536A1 (en) | 2010-08-25 | 2012-03-01 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Antibodies against il-18r1 and uses thereof |
US9422329B2 (en) | 2010-11-05 | 2016-08-23 | Hoffmann-La Roche Inc. | Optimized method for antibody capturing by mixed mode chromatography |
US9884909B2 (en) | 2010-12-01 | 2018-02-06 | Alderbio Holdings Llc | Anti-NGF compositions and use thereof |
WO2012075340A2 (en) | 2010-12-01 | 2012-06-07 | Alderbio Holdings Llc | Anti-ngf compositions and use thereof |
US11214610B2 (en) | 2010-12-01 | 2022-01-04 | H. Lundbeck A/S | High-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as Pichia pastoris |
US9539324B2 (en) | 2010-12-01 | 2017-01-10 | Alderbio Holdings, Llc | Methods of preventing inflammation and treating pain using anti-NGF compositions |
US9067988B2 (en) | 2010-12-01 | 2015-06-30 | Alderbio Holdings Llc | Methods of preventing or treating pain using anti-NGF antibodies |
US9078878B2 (en) | 2010-12-01 | 2015-07-14 | Alderbio Holdings Llc | Anti-NGF antibodies that selectively inhibit the association of NGF with TrkA, without affecting the association of NGF with p75 |
UY34054A (es) * | 2011-05-02 | 2012-11-30 | Millennium Pharm Inc | FORMULACIÓN PARA ANTICUERPO ANTI-a(alfa)4B(Beta)7 |
WO2012163519A1 (en) * | 2011-05-27 | 2012-12-06 | Dutalys | Antibodies with improved folding stability |
EP2726496B1 (en) | 2011-07-01 | 2018-04-04 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Method for separation of monomeric polypeptides from aggregated polypeptides |
EA027160B1 (ru) | 2011-08-17 | 2017-06-30 | Глаксо Груп Лимитед | Модифицированные белки и пептиды |
KR102588702B1 (ko) | 2013-03-15 | 2023-10-16 | 더 보드 오브 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 | 누트린-3a 및 펩티드에 의한 폐 섬유증의 저해 |
US10670611B2 (en) | 2014-09-26 | 2020-06-02 | Somalogic, Inc. | Cardiovascular risk event prediction and uses thereof |
CA2977519A1 (en) * | 2015-02-27 | 2016-09-01 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Nebulized cav-1 polypeptide therapeutics and uses thereof |
JP7496826B2 (ja) | 2018-09-10 | 2024-06-07 | ラング セラピューティクス,エルエルシー | Cav-1タンパク質の修飾ペプチドフラグメント及び線維症の治療におけるその使用 |
WO2020109621A1 (en) * | 2018-11-30 | 2020-06-04 | Csl Behring Ag | Methods and compositions for preventing or treating acute exacerbations with polyclonal immunoglobulin |
WO2021152175A1 (en) * | 2020-01-31 | 2021-08-05 | Sanofi | Pulmonary delivery of antibodies |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1441670A (zh) * | 2000-06-09 | 2003-09-10 | 先进吸入药剂研究公司 | 高效输送大量治疗性气雾剂 |
CN1464791A (zh) * | 2001-05-21 | 2003-12-31 | 瓦波特罗尼克斯有限公司 | 用于经肺部途径递送蛋白质的组合物 |
WO2005048985A2 (en) * | 2003-11-14 | 2005-06-02 | Baxter International Inc. | Alpha 1-antitrypsin compositions and treatment methods using such compositions |
US20060115470A1 (en) * | 2002-11-08 | 2006-06-01 | Ablynx N. V. | Camelidae antibodies against imminoglobulin e and use thereof for the treatment of allergic disorders |
WO2007049017A2 (en) * | 2005-10-24 | 2007-05-03 | Domantis Limited | Agents that bind a target in pulmonary tissue for treating respiratory diseases |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4620670A (en) * | 1983-11-28 | 1986-11-04 | Vortran Corporation | Gas-powered nebulizer |
CA2167538A1 (en) * | 1993-07-19 | 1995-02-02 | Tsutomu Arakawa | Stabilization of aerosolized proteins |
US6165463A (en) * | 1997-10-16 | 2000-12-26 | Inhale Therapeutic Systems, Inc. | Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use |
US7312196B2 (en) * | 1997-01-08 | 2007-12-25 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Formulations for amylin agonist peptides |
US6667344B2 (en) * | 2001-04-17 | 2003-12-23 | Dey, L.P. | Bronchodilating compositions and methods |
JP2007513180A (ja) * | 2003-12-04 | 2007-05-24 | ザ スクリプス リサーチ インスティテュート | 喘息の処置および予防 |
GB0405634D0 (en) * | 2004-03-12 | 2004-04-21 | Univ Southampton | Anti-virus therapy for respiratory diseases |
AU2005311101B8 (en) * | 2004-12-02 | 2011-03-03 | Domantis Limited | Anti-IL-IRI single domain antibodies and therapeutic uses |
EP1863840A1 (en) * | 2005-03-18 | 2007-12-12 | Novo Nordisk A/S | Pegylated single-chain insulin |
SI1919450T1 (sl) * | 2005-09-01 | 2014-10-30 | Meda Ab | Liposomski sestavek, ki vsebuje antihistaminik in kortikosteroid, in njegova uporaba za izdelavo zdravila za zdravljenje rinitisa in sorodnih motenj |
EP1957537A2 (en) * | 2005-12-01 | 2008-08-20 | Domantis Limited | Competitive domain antibody formats that bind interleukin 1 receptor type 1 |
KR20080077261A (ko) * | 2005-12-06 | 2008-08-21 | 도만티스 리미티드 | Egfr 및/또는 vegf에 대해 결합 특이성이 있는리간드 및 그의 사용 방법 |
JP2009525267A (ja) * | 2006-01-11 | 2009-07-09 | アエロヴァンス インコーポレイティッド | ヒトおよび非ヒト霊長類において喘息を処置するための方法および組成物 |
CA2636854A1 (en) * | 2006-01-24 | 2007-08-02 | Domantis Limited | Ligands that bind il-4 and/or il-13 |
KR20100018040A (ko) * | 2007-06-06 | 2010-02-16 | 도만티스 리미티드 | 프로테아제 내성 폴리펩티드를 선택하는 방법 |
-
2008
- 2008-12-11 EP EP08860520A patent/EP2220115A2/en not_active Withdrawn
- 2008-12-11 WO PCT/EP2008/067295 patent/WO2009074634A2/en active Application Filing
- 2008-12-11 KR KR1020107015536A patent/KR20100098697A/ko not_active Application Discontinuation
- 2008-12-11 TW TW097148298A patent/TW200938222A/zh unknown
- 2008-12-11 CN CN2008801271605A patent/CN102131827A/zh active Pending
- 2008-12-11 BR BRPI0819932A patent/BRPI0819932A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2008-12-11 SG SG2012074878A patent/SG185286A1/en unknown
- 2008-12-11 AU AU2008334605A patent/AU2008334605B2/en not_active Ceased
- 2008-12-11 CA CA2707986A patent/CA2707986A1/en not_active Abandoned
- 2008-12-11 EA EA201000785A patent/EA201000785A1/ru unknown
- 2008-12-11 JP JP2010537443A patent/JP2011506396A/ja active Pending
- 2008-12-11 US US12/747,203 patent/US20100260853A1/en not_active Abandoned
-
2010
- 2010-06-08 ZA ZA2010/04093A patent/ZA201004093B/en unknown
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1441670A (zh) * | 2000-06-09 | 2003-09-10 | 先进吸入药剂研究公司 | 高效输送大量治疗性气雾剂 |
CN1464791A (zh) * | 2001-05-21 | 2003-12-31 | 瓦波特罗尼克斯有限公司 | 用于经肺部途径递送蛋白质的组合物 |
US20060115470A1 (en) * | 2002-11-08 | 2006-06-01 | Ablynx N. V. | Camelidae antibodies against imminoglobulin e and use thereof for the treatment of allergic disorders |
WO2005048985A2 (en) * | 2003-11-14 | 2005-06-02 | Baxter International Inc. | Alpha 1-antitrypsin compositions and treatment methods using such compositions |
WO2007049017A2 (en) * | 2005-10-24 | 2007-05-03 | Domantis Limited | Agents that bind a target in pulmonary tissue for treating respiratory diseases |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103842380A (zh) * | 2011-07-27 | 2014-06-04 | 葛兰素集团有限公司 | 融合至Fc结构域的抗VEGF单可变结构域 |
CN106132398A (zh) * | 2014-04-03 | 2016-11-16 | 瑞士杰特贝林生物制品有限公司 | 免疫球蛋白的雾化 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2009074634A3 (en) | 2010-09-23 |
AU2008334605B2 (en) | 2013-07-18 |
EP2220115A2 (en) | 2010-08-25 |
US20100260853A1 (en) | 2010-10-14 |
SG185286A1 (en) | 2012-11-29 |
KR20100098697A (ko) | 2010-09-08 |
JP2011506396A (ja) | 2011-03-03 |
ZA201004093B (en) | 2011-11-30 |
EA201000785A1 (ru) | 2011-02-28 |
AU2008334605A1 (en) | 2009-06-18 |
CA2707986A1 (en) | 2009-06-18 |
BRPI0819932A2 (pt) | 2019-07-30 |
WO2009074634A2 (en) | 2009-06-18 |
TW200938222A (en) | 2009-09-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102131827A (zh) | 用于肺部传递给药的组合物 | |
CN101778865B (zh) | 多肽、抗体可变域和拮抗剂 | |
AU2006321364B2 (en) | Noncompetitive domain antibody formats that bind Interleukin 1 Receptor type 1 | |
AU2006321367B2 (en) | Competitive domain antibody formats that bind Interleukin 1 Receptor type 1 | |
US8129503B2 (en) | Agents that bind a target in pulmonary tissue for targeting respiratory diseases | |
US8877186B2 (en) | Polypeptides, antibody variable domains and antagonists | |
CN101848935A (zh) | 选择蛋白酶抗性多肽的方法 | |
MX2008006882A (en) | Noncompetitive domain antibody formats that bind interleukin 1 receptor type 1 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20110720 |