CN117241826A - 用于治疗性递送的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本文描述了用于将单结构域抗体或其抗原结合片段递送至对象的组合物。所述单结构域抗体可以是用于治疗所述对象的疾病或病症，诸如影响所述对象的肺的疾病或病症的治疗剂。所述组合物包含被广泛工程化以产生所述单结构域抗体或其抗原结合片段的去核细胞，并且任选地含有额外组分，诸如靶向部分、免疫系统逃逸部分或额外的治疗剂或佐剂。提供了产生本文所述的组合物的方法，其涉及对亲本细胞进行去核以获得包含所述单结构域抗体或其抗原结合片段的所述去核细胞的方法。还提供了用于通过向所述对象施用所述组合物中的一种或多种来使用本文所述的组合物治疗所述疾病或病症的试剂盒和方法。

Description

用于治疗性递送的组合物和方法

交叉引用

本申请要求于2021年2月26日提交的美国临时申请序列号63/154,591和于2021年5月27日提交的美国临时申请序列号63/193,949的权益，每个申请特此通过引用全文并入本文。

序列表

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发明内容

在一些方面，本文描述了一种去核细胞，所述去核细胞包含：单结构域抗体或其片段，所述单结构域抗体或其片段结合免疫检查点分子；和一个或多个细胞内细胞器，所述一个或多个细胞内细胞器被配置为翻译编码所述单结构域抗体或其片段的外源信使核糖核酸(mRNA)分子。在一些实施方案中，所述单结构域抗体或其片段包含在所述去核细胞中。在一些实施方案中，所述单结构域抗体或其片段被所述去核细胞释放。在一些实施方案中，所述去核细胞还包含细胞膜，其中所述单结构域抗体或其片段在所述细胞膜的质膜外侧上表达。在一些实施方案中，所述去核细胞还包含细胞膜，其中所述细胞膜包含与所述单结构域抗体或其片段偶联的跨膜部分。在一些实施方案中，所述跨膜部分包含跨膜多肽。在一些实施方案中，所述单结构域抗体或其片段与所述跨膜多肽的N末端或C末端偶联。在一些实施方案中，所述单结构域抗体或片段与偶联至所述去核细胞的细胞表面的锚分子偶联，其中所述锚分子包含糖基磷脂酰肌醇、法尼基、棕榈酸酯、肉豆蔻酸酯或其任何组合。在一些实施方案中，所述去核细胞还包含被配置为将所述单结构域抗体或其片段从所述去核细胞转移至另一个细胞的融合蛋白。在一些实施方案中，所述单结构域抗体或其片段与细胞毒性药物偶联。在一些实施方案中，所述免疫检查点分子包括程序性细胞死亡蛋白1(PD-1或PDCD-1)、程序性死亡配体1(PD-L1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4，也称为分化簇152或CD152)、T细胞活化的V结构域Ig抑制因子(VISTA)、程序性细胞死亡1配体2(PDCD1LG2，也称为分化簇273或CD273)、B7同源物3(B7-H3，也称为分化簇276或CD276)、腺苷A2A受体(A2AR)、分化簇27(CD27)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、含T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域的蛋白3(TIM-3，也称为甲型肝炎病毒细胞受体2或HAVCR2)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、分化簇73(CD73)、CD94/NK组2成员A(NKG2A，也称为分化簇159或CD159)、含脊髓灰质炎病毒受体相关免疫球蛋白结构域的分子(PVRIG)、脊髓灰质炎病毒受体相关分子2(PVRL2)、癌胚抗原相关细胞粘附分子1(CEACAM1)、癌胚抗原相关细胞粘附分子5(CEACAM5)、癌胚抗原相关细胞粘附分子6(CEACAM6)、黏着斑激酶(FAK)、C-C趋化因子受体2型(CCR-2)、趋化因子(C-C基序)配体2(CCL-2)、白血病抑制因子(LIF)、分化簇47(CD47)、信号调节蛋白α(SIRPα)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、集落刺激因子1受体(CSF-1R)、白介素3(IL-3)、白介素-1受体辅助蛋白(IL-1RAP)、白介素8(IL-8)、轴突导向蛋白-4D(SEMA4D)、血管生成素-2、CLEVER-1、酪氨酸蛋白激酶受体UFO(Axl)、磷脂酰丝氨酸或其片段。在一些实施方案中，所述免疫检查点分子包括PD-L1。在一些实施方案中，所述免疫检查点分子包括CTLA-4。在一些实施方案中，所述免疫检查点分子包含与SEQ ID NO:155-164、203、204、315-322、511、531-535、551-554、571、594、611-619或711中的任一个具有大于或等于约80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体或其片段由与SEQ ID NO:801具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的脱氧核糖核酸(DNA)序列编码。在一些实施方案中，所述单结构域抗体或其片段包含与SEQ ID NO:851具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体或其片段由与SEQ ID NO:901具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的DNA序列编码。在一些实施方案中，所述单结构域抗体或其片段包含与SEQ ID NO:951具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述去核细胞还包含靶向部分。在一些实施方案中，所述靶向部分包含对于由肺组织中的细胞表达的配体具有特异性的归巢受体。在一些实施方案中，所述靶向部分包含抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段不同于所述单结构域抗体或其片段。在一些实施方案中，所述靶向部分包含趋化因子受体。在一些实施方案中，所述细胞是癌细胞。在一些实施方案中，所述癌细胞是非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、腺癌、鳞癌、大细胞(未分化)癌、大细胞神经内分泌癌、腺鳞癌或肉瘤样癌的细胞。在一些实施方案中，所述癌细胞是良性肺肿瘤的细胞。在一些实施方案中，所述癌细胞是错构瘤的细胞。在一些实施方案中，所述去核细胞还包含治疗剂。在一些实施方案中，所述治疗剂包含白介素12(IL-12)。在一些实施方案中，所述去核细胞还包含免疫逃逸部分，所述免疫逃逸部分包含分化簇(CD47)、PD-L1、I类主要组织相容性复合体E(HLA-E)、I类主要组织相容性复合体G(HLA-G)、其片段或其组合。在一些实施方案中，所述去核细胞具有包括在约1微米(μm)至约100μm之间的直径。在一些实施方案中，所述直径包括在约5μm至25μm之间。在一些实施方案中，所述直径包括在约8μm至12μm之间。在一些实施方案中，所述去核细胞表现出相对于在其他方面相同的有核细胞减小的直径，其中所述直径减小大于或等于约50％。在一些实施方案中，所述去核细胞还包含外源肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员多肽或其催化活性片段。在一些实施方案中，所述外源TNF超家族成员多肽或其催化活性片段在水性条件中是可溶的。在一些实施方案中，所述外源TNF超家族成员多肽包含肿瘤坏死因子超家族成员14(LIGHT)或其催化活性片段。在一些实施方案中，所述去核细胞从亲本细胞获得，其中所述亲本细胞包含干细胞。在一些实施方案中，所述干细胞包含诱导多能干细胞(iPSC)、成体干细胞、间充质基质细胞、胚胎干细胞或成纤维细胞。在一些实施方案中，所述去核细胞是经纯化的。在一些实施方案中，所述去核细胞是经冻干的。

在一些方面，本文描述了多个细胞，其包含：多个去核细胞，所述多个去核细胞包含：单结构域抗体或其片段，所述单结构域抗体或其片段结合免疫检查点分子；和一个或多个细胞内细胞器，所述一个或多个细胞内细胞器被配置为翻译编码所述单结构域抗体或其片段的外源信使核糖核酸(mRNA)分子。

在一些方面，本文描述了一种药物配制品，其包含：去核细胞，所述去核细胞包含：单结构域抗体或其片段，所述单结构域抗体或其片段结合免疫检查点分子；和一个或多个细胞内细胞器，所述一个或多个细胞内细胞器被配置为翻译编码所述单结构域抗体或其片段的外源信使核糖核酸(mRNA)分子；以及药学上可接受的赋形剂、载剂或稀释剂。

在一些方面，本文描述了一种将去核细胞递送至对象的方法，所述去核细胞包含：单结构域抗体或其片段，所述单结构域抗体或其片段结合免疫检查点分子；和一个或多个细胞内细胞器，所述一个或多个细胞内细胞器被配置为翻译编码所述单结构域抗体或其片段的外源信使核糖核酸(mRNA)分子，所述方法包括：向所述对象递送本文所述的去核细胞。在一些实施方案中，所述去核细胞是自体细胞。在一些实施方案中，所述去核细胞是同种异体细胞。在一些实施方案中，所述施用通过全身施用进行。在一些实施方案中，在所述施用后，所述去核细胞在所述对象中存活少于或等于5天。

在一些方面，本文描述了一种治疗对象的癌症的方法，所述方法包括：向所述对象施用治疗有效量的去核细胞或本文所述的药物配制品，从而治疗所述对象的所述癌症，所述去核细胞包含：单结构域抗体或其片段，所述单结构域抗体或其片段结合免疫检查点分子；和一个或多个细胞内细胞器，所述一个或多个细胞内细胞器被配置为翻译编码所述单结构域抗体或其片段的外源信使核糖核酸(mRNA)分子。在一些实施方案中，所述去核细胞是自体细胞。在一些实施方案中，所述去核细胞是同种异体细胞。在一些实施方案中，所述施用通过全身施用进行。在一些实施方案中，在所述施用后，所述去核细胞在所述对象中存活少于或等于5天。

在一些方面，本文描述了一种去核细胞，所述去核细胞包含：单结构域抗体或其片段，所述单结构域抗体或其片段结合结缔组织生长因子(CTGF)；和一个或多个细胞内细胞器，所述一个或多个细胞内细胞器被配置为(i)翻译编码所述单结构域抗体或其片段的外源mRNA分子，和(ii)从所述去核细胞中释放所述单结构域抗体或其片段。在一些实施方案中，所述单结构域抗体或其片段包含与SEQ ID NO:1701具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的多肽序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体或其片段与CTGF的氨基酸序列结合，其中所述CTGF的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1601或SEQ ID NO:1602。在一些实施方案中，所述去核细胞还包含对于由肺组织中的细胞表达的配体具有特异性的靶向部分。在一些实施方案中，所述靶向部分包含对于由肺组织中的所述细胞表达的所述配体具有特异性的归巢受体。在一些实施方案中，所述细胞是肺泡上皮细胞(AEC)。在一些实施方案中，所述细胞是支气管细胞。在一些实施方案中，所述去核细胞还包含免疫逃逸部分，其包含CD47、PD-L1、HLA-E、HLA-G、其片段或其任何组合。在一些实施方案中，所述靶向部分包含趋化因子受体。在一些实施方案中，所述靶向部分包含粘附分子。在一些实施方案中，所述靶向部分包含抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段不同于所述单结构域抗体或其片段。在一些实施方案中，所述去核细胞具有包括在约1微米(μm)至约100μm之间的直径。在一些实施方案中，所述直径是在约5μm至25μm之间。在一些实施方案中，所述直径包括在约8μm至12μm之间。在一些实施方案中，所述去核细胞表现出相对于在其他方面相同的有核细胞减小的直径，其中所述直径减小大于或等于约50％。在一些实施方案中，所述去核细胞还包含外源肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员多肽或其催化活性片段。在一些实施方案中，所述外源TNF超家族成员多肽或其催化活性片段在水性条件中是可溶的。在一些实施方案中，所述外源TNF超家族成员多肽包含LIGHT或其催化活性片段。在一些实施方案中，所述去核细胞从亲本细胞获得，其中所述亲本细胞包含干细胞。在一些实施方案中，所述干细胞包含诱导多能干细胞(iPSC)、成体干细胞、间充质基质细胞、胚胎干细胞或成纤维细胞。在一些实施方案中，所述去核细胞是经纯化的。在一些实施方案中，所述去核细胞是经冻干的。

在一些方面，本文描述了多个细胞，其包含：多个去核细胞，所述多个去核细胞包含：单结构域抗体或其片段，所述单结构域抗体或其片段结合结缔组织生长因子(CTGF)；和一个或多个细胞内细胞器，所述一个或多个细胞内细胞器被配置为(i)翻译编码所述单结构域抗体或其片段的外源mRNA分子，和(ii)从所述去核细胞中释放所述单结构域抗体或其片段。

在一些方面，本文描述了一种药物配制品，其包含：去核细胞，所述去核细胞包含：单结构域抗体或其片段，所述单结构域抗体或其片段结合结缔组织生长因子(CTGF)；和一个或多个细胞内细胞器，所述一个或多个细胞内细胞器被配置为(i)翻译编码所述单结构域抗体或其片段的外源mRNA分子，和(ii)从所述去核细胞中释放所述单结构域抗体或其片段；以及药学上可接受的赋形剂、载剂或稀释剂。

在一些方面，本文描述了一种将去核细胞递送至对象的方法，所述方法包括：向所述对象递送所述去核细胞或本文所述的药物配制品，所述去核细胞包含：单结构域抗体或其片段，所述单结构域抗体或其片段结合结缔组织生长因子(CTGF)；和一个或多个细胞内细胞器，所述一个或多个细胞内细胞器被配置为(i)翻译编码所述单结构域抗体或其片段的外源mRNA分子，和(ii)从所述去核细胞中释放所述单结构域抗体或其片段。在一些实施方案中，所述去核细胞是自体细胞。在一些实施方案中，所述去核细胞是同种异体细胞。在一些实施方案中，所述施用通过全身施用进行。在一些实施方案中，在所述施用后，所述去核细胞在所述对象中存活少于或等于5天。

在一些方面，本文描述了一种治疗有需要的对象的特发性肺纤维化(IPF)的方法，所述方法包括：向所述对象施用治疗有效量的去核细胞或本文所述的药物配制品，所述去核细胞包含：单结构域抗体或其片段，所述单结构域抗体或其片段结合结缔组织生长因子(CTGF)；和一个或多个细胞内细胞器，所述一个或多个细胞内细胞器被配置为(i)翻译编码所述单结构域抗体或其片段的外源mRNA分子，和(ii)从所述去核细胞中释放所述单结构域抗体或其片段。在一些实施方案中，所述去核细胞是自体细胞。在一些实施方案中，所述去核细胞是同种异体细胞。在一些实施方案中，所述施用通过全身施用进行。在一些实施方案中，在所述施用后，所述去核细胞在所述对象中存活少于或等于5天。

在一些方面，本文描述了一种治疗有需要的对象的疾病或病症的方法，所述方法包括：向患有与所述对象的靶细胞相关联的疾病或病症的所述对象施用治疗有效量的去核细胞，所述去核细胞包含：单结构域抗体或其片段，所述单结构域抗体或其片段结合结缔组织生长因子(CTGF)；和一个或多个细胞内细胞器，所述一个或多个细胞内细胞器被配置为(i)翻译编码所述单结构域抗体或其片段的外源mRNA分子，和(ii)从所述去核细胞中释放所述单结构域抗体或其片段，其中外源TNF超家族成员多肽或其催化活性片段使与所述疾病或病症相关联的脉管系统正常化，并且其中与没有使所述脉管系统正常化的相当方法的治疗功效相比，使所述脉管系统正常化增加治疗所述疾病或病症的治疗功效。

在一些方面，本文描述了一种治疗对象的特征至少部分在于异常脉管系统的疾病或病症的方法，所述方法包括：向患有所述疾病或病症的所述对象施用去核细胞，所述去核细胞包含：单结构域抗体或其片段，所述单结构域抗体或其片段结合结缔组织生长因子(CTGF)；和一个或多个细胞内细胞器，所述一个或多个细胞内细胞器被配置为(i)翻译编码所述单结构域抗体或其片段的外源mRNA分子，和(ii)从所述去核细胞中释放所述单结构域抗体或其片段，其中由所述去核细胞合成或释放的外源肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员多肽或其催化活性片段对于使所述对象的所述异常脉管系统正常化是治疗有效的。

在一些实施方案中，本文提供了去核细胞，其包含抗体，诸如单结构域抗体。还提供了将本文所述的去核细胞递送至对象，例如像以治疗所述对象的疾病或病症的方法。所述去核细胞和含有此类去核细胞的药物组合物及其使用方法提供了优于先前基于细胞的治疗剂的若干益处，包括安全性、限定的有效期、没有向宿主转移核编码基因的风险以及甚至在全身施用时也能将治疗性货物有效递送至靶细胞或组织。

本文公开的方面提供了从具有细胞核的亲本细胞获得的去核细胞，所述去核细胞包含：用于在所述细胞核不存在的情况下合成外源单结构域抗体或其片段的一个或多个细胞内细胞器。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或其片段被包封在所述去核细胞中。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或其片段在所述去核细胞的细胞膜的质膜外侧上由所述一个或多个细胞内细胞器表达。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或其片段在所述去核细胞的细胞膜的胞质侧上由所述一个或多个细胞内细胞器表达。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或其片段与跨膜部分复合。在一些实施方案中，所述跨膜部分包含跨膜多肽。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或其片段与所述跨膜多肽的N末端复合。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或其片段与所述跨膜多肽的C末端复合。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或其片段相对于在其他方面相同的参考单结构域抗体或其片段包含修饰，其中所述修饰将所述外源单结构域抗体或其片段锚定至所述去核细胞的细胞膜的质膜外侧或胞质侧。在一些实施方案中，所述修饰包括将所述外源单结构域抗体或其片段与糖基磷脂酰肌醇、法尼基、棕榈酸酯、肉豆蔻酸酯或其组合复合。在一些实施方案中，通过从所述去核细胞分泌所述外源单结构域抗体或其片段，所述外源单结构域抗体或其片段由所述去核细胞释放。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或其片段在所述去核细胞死亡时被释放。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或其片段在所述去核细胞破裂时被释放。在一些实施方案中，通过将所述去核细胞与另一个细胞融合，所述外源单结构域抗体或其片段从所述去核细胞转移至所述另一个细胞。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或其片段与细胞毒性药物缀合。在一些实施方案中，所述去核细胞包含具有编码所述外源单结构域抗体或其片段的多肽序列的外源核苷酸。在一些实施方案中，所述多肽序列包含在SEQ ID NO:1-36、101-111、121-123、165-192、195、205、206、211-213、221-231、241-245、325-331和401-404中提供的序列。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或其片段对于由SEQ ID NO:131-134、142-152、201-202、301-312、501、521-526、541-545、561、584、591-601和701-705中的至少一种核酸编码的抗原具有特异性。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或其片段对于包含编码PD-L1的肽序列的抗原具有特异性。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或其片段对于包含SEQID NO:155-164、203、204、315-322、511、531-535、551-554、571、594、611-619和711中的至少一种肽序列的抗原具有特异性。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或其片段对于与表1中的至少一种病原体相关联的抗原具有特异性。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或其片段对于包含编码结缔组织生长因子(CTGF)，也称为细胞通信网络因子2(CCN2)的肽序列的抗原具有特异性。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或其片段对于包含SEQ ID NO:1601和1602中的至少一种肽序列的抗原具有特异性。

在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或其片段由与SEQ ID NO:801具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或其片段包含与SEQ ID NO:851具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的多肽序列。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或其片段由与SEQ ID NO:901具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或其片段包含与SEQ ID NO:951具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的多肽序列。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或其片段包含与SEQ ID NO:1701具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的多肽序列。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或其片段对于由肺组织中的癌细胞表达的抗原具有特异性。在一些实施方案中，由肺组织中的所述癌细胞表达的所述抗原是PD-L1。在一些实施方案中，由肺组织中的所述癌细胞表达的所述抗原是CTGF。在一些实施方案中，所述癌细胞是非小细胞肺癌(NSCLC)细胞。在一些实施方案中，所述癌细胞是腺癌、鳞癌、大细胞(未分化)癌、大细胞神经内分泌癌、腺鳞癌或肉瘤样癌的细胞。在一些实施方案中，所述癌细胞是小细胞肺癌(SCLC)的细胞。在一些实施方案中，所述癌细胞是肺类癌瘤的细胞。在一些实施方案中，所述癌细胞是腺样囊性癌的细胞。在一些实施方案中，所述癌细胞是淋巴瘤的细胞。在一些实施方案中，所述癌细胞是肉瘤的细胞。在一些实施方案中，所述癌细胞是良性肺肿瘤的细胞。在一些实施方案中，所述癌细胞是错构瘤的细胞。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或其片段对于由与特发性肺纤维化相关联的细胞表达的抗原具有特异性。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或其片段对于由与特发性肺纤维化相关联的细胞表达的抗原具有特异性，所述细胞是肺细胞。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或其片段对于由与特发性肺纤维化相关联的细胞表达的抗原具有特异性，所述细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或其片段对于由与特发性肺纤维化相关联的细胞表达的抗原具有特异性，所述细胞是肺泡细胞。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或其片段对于由与特发性肺纤维化相关联的细胞表达的抗原具有特异性，所述细胞是肺泡上皮细胞(AEC)。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或其片段对于由与特发性肺纤维化相关联的细胞表达的抗原具有特异性，所述细胞是支气管细胞。在一些实施方案中，所述去核细胞还包含至少一种额外的外源治疗剂。在一些实施方案中，所述去核细胞还包含促融合部分。在一些实施方案中，所述促融合部分包含病毒促融合部分。在一些实施方案中，所述促融合部分包含真核促融合部分。在一些实施方案中，所述去核细胞还包含免疫逃逸部分。在一些实施方案中，所述免疫逃逸部分包含CD47、PD-L1、HLA-E、HLA-G、其片段或其组合。在一些实施方案中，所述去核细胞还包含靶向部分。在一些实施方案中，所述靶向部分靶向癌细胞的生物标志物。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或其片段对于由癌细胞表达的抗原具有特异性，并且其中所述生物标志物是与被所述外源单结构域抗体或其片段靶向的抗原分开且不同的实体。在一些实施方案中，所述靶向部分靶向肿瘤微环境内的免疫细胞的生物标志物。在一些实施方案中，所述生物标志物在所述免疫细胞的表面上表达。在一些实施方案中，所述生物标志物由所述免疫细胞释放。在一些实施方案中，所述靶向部分包含趋化因子。在一些实施方案中，所述靶向部分包含趋化因子受体。在一些实施方案中，所述靶向部分包含粘附分子。在一些实施方案中，所述靶向部分包含抗原。在一些实施方案中，所述靶向部分包含与由所述癌细胞表达的抗原分开且不同的抗原。在一些实施方案中，所述靶向部分包含不由所述癌细胞表达的抗体。在一些实施方案中，所述靶向部分包含膜结合抗体。在一些实施方案中，所述膜结合抗体是膜结合单结构域抗体。在一些实施方案中，所述去核细胞具有包括在约1微米(μm)至约100μm之间的直径。在一些实施方案中，所述直径包括在约1μm至约10μm之间。在一些实施方案中，所述直径包括在约10μm至约100μm之间。在一些实施方案中，所述直径是至少或约1μm、5μm、8μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm或100μm。在一些实施方案中，所述直径包括约8μm。在一些实施方案中，所述去核细胞表现出与有核的亲本细胞相比小至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的直径。在一些实施方案中，所述亲本细胞选自：干细胞、诱导多能干细胞(iPSC)、成体干细胞、间充质基质细胞、胚胎干细胞、成纤维细胞和来自细胞系的细胞。在一些实施方案中，所述亲本细胞是间充质基质细胞。在一些实施方案中，所述去核细胞在低温休眠之后表现出生存力。在一些实施方案中，所述去核细胞在低温休眠后表现出的如在低温休眠后24小时测量的生存力等于或大于未低温休眠的相当去核细胞的生存力。在一些实施方案中，所述去核细胞在冷冻保存之后表现出生存力。在一些实施方案中，所述去核细胞在冷冻保存后表现出的如在冷冻保存后24小时测量的生存力等于或大于未冷冻保存的相当去核细胞的生存力。在一些实施方案中，所述去核细胞是经分离的。在一些实施方案中，所述去核细胞是经纯化的。在一些实施方案中，所述去核细胞是经冻干的。在一些实施方案中，所述去核细胞包含包括中和抗体的外源单结构域抗体或其片段。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或其片段结合VEGF。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或其片段结合VEGF-A。在一些实施方案中，所述去核细胞包含靶向内皮细胞生物标志物的靶向部分。在一些实施方案中，所述内皮细胞生物标志物由脉管系统细胞表达。在一些实施方案中，所述内皮细胞生物标志物由血管细胞表达。在一些实施方案中，所述内皮细胞生物标志物由淋巴管细胞表达。在一些实施方案中，所述去核细胞包含至少一种额外的外源剂，所述外源剂包含包括肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员多肽或其催化活性片段的多肽。在一些实施方案中，所述TNF超家族成员多肽或其催化活性片段在水性条件中是可溶的，其中溶解度通过浊度溶解度测定或热力学溶解度测定在体外测量。在一些实施方案中，所述TNF超家族成员多肽包含肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14，也称为LIGHT)。在一些实施方案中，所述TNF超家族成员多肽包含可溶性LIGHT。在一些实施方案中，所述至少一种额外的外源剂包含免疫检查点分子。在一些实施方案中，所述至少一种额外的外源剂包含免疫检查点抑制剂分子。在一些实施方案中，所述至少一种额外的外源剂包含血管生成抑制剂。在一些实施方案中，所述血管生成抑制剂包括VEGF/VEGFR抑制剂。在一些实施方案中，所述VEGF/SOC抑制剂包括VEGF-A抑制剂。

本文公开的方面提供了一种细胞系，其包含本文所述的去核细胞。

本文公开的方面提供了多个细胞，其包含本文所述的去核细胞。

本文公开的方面提供了药物组合物，其包含：本文所述的去核细胞；以及药学上可接受的：赋形剂、载剂或稀释剂。在一些实施方案中，所述药物组合物包含单位剂型。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制用于鞘内、眼内、玻璃体内、视网膜、静脉内、肌内、心室内、脑内、小脑内、脑室内、脑实质、皮下、肿瘤内、肺内、气管内、腹膜内、膀胱内、阴道内、直肠内、口服、舌下、透皮、通过吸入、通过吸入雾化形式、通过管腔内-GI途径或其组合施用于有需要的对象。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制用于静脉内施用。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制用于肿瘤内施用。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制用于肺内施用。在一些实施方案中，所述药物被配制用于气管内施用。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制用于通过吸入雾化形式施用。在一些实施方案中，所述药物组合物包含至少一种额外的活性剂。在一些实施方案中，所述至少一种额外的活性剂包括细胞因子、生长因子、激素、抗体、酶、小分子、化合物或其组合。

本文公开的方面提供了试剂盒，其包括：本文所述的去核细胞、本文所述的细胞系、本文所述的多个细胞或本文所述的药物组合物；以及容器。

本文公开的方面提供了治疗有需要的对象的疾病或病症的方法，所述方法包括：向患有与所述对象的靶细胞相关联的疾病或病症的所述对象施用治疗有效量的本文公开的细胞或本文公开的药物组合物，从而治疗所述对象的所述疾病或病症，其中外源单结构域抗体或其片段与由所述对象的所述靶细胞表达的抗原结合。在一些实施方案中，所述去核细胞是自体细胞。在一些实施方案中，所述去核细胞是同种异体细胞。在一些实施方案中，所述抗原包括肿瘤相关抗原(TAA)。在一些实施方案中，所述抗原包括肿瘤特异性抗原(TSA)。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或其片段与所述抗原的结合直接杀死癌细胞。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或其片段与所述抗原的结合破坏癌细胞的细胞周期信号传导。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或其片段与所述抗原的结合破坏癌细胞的血管生成信号传导。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或其片段与所述抗原的结合将免疫细胞募集至癌细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，所述去核细胞或所述药物组合物鞘内、眼内、玻璃体内、视网膜、静脉内、肌内、心室内、脑内、小脑内、脑室内、脑实质、皮下、肿瘤内、肺内、气管内、腹膜内、膀胱内、阴道内、直肠内、口服、舌下、透皮、通过吸入、通过吸入雾化形式、通过管腔内-GI途径或其组合施用于所述对象。在一些实施方案中，所述去核细胞或所述药物组合物静脉内施用。在一些实施方案中，所述去核细胞或所述药物组合物肿瘤内施用。在一些实施方案中，所述去核细胞或所述药物组合物肺内施用。在一些实施方案中，所述去核细胞或所述药物组合物气管内施用。在一些实施方案中，所述去核细胞或所述药物组合物通过吸入雾化形式施用。在一些实施方案中，在向所述对象施用所述去核细胞或所述药物组合物后，所述去核细胞在对象中存活少于或等于14天。在一些实施方案中，在向所述对象施用所述去核细胞或所述药物组合物后，所述去核细胞在对象中存活少于或等于4天。在一些实施方案中，所述靶细胞是癌细胞。在一些实施方案中，所述疾病或病症是癌症或赘生物。

本文所述的方面提供了一种从具有细胞核的亲本细胞获得的去核细胞，所述去核细胞包含：用于在所述细胞核不存在的情况下合成外源多肽的一个或多个细胞内细胞器，所述外源多肽包括肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员多肽或其催化活性片段。在一些实施方案中，所述去核细胞包含至少一种外源靶向部分。在一些实施方案中，所述外源多肽在水性条件下具有至少0.0001mg/ml、0.0005mg/ml、0.001mg/ml、0.005mg/ml、0.01mg/ml、0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、5.0mg/ml、10mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、500mg/ml、1,000mg/ml、5,000mg/ml、10,000mg/ml、50,000mg/ml或100,000mg/ml的溶解度，其中溶解度通过浊度溶解度测定或热力学溶解度测定测量。在一些实施方案中，所述外源多肽在所述去核细胞的细胞膜的质膜外侧上由所述一个或多个细胞内细胞器表达。在一些实施方案中，所述外源多肽由所述去核细胞释放。在一些实施方案中，所述去核细胞还包含编码所述外源多肽的外源多核苷酸。在一些实施方案中，所述外源多肽包含与SEQ ID NO:1501-1511具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，所述外源多肽包含与SEQ ID NO:1511具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，所述TNF超家族成员多肽是LIGHT。在一些实施方案中，所述去核细胞还包含第二外源多肽。在一些实施方案中，所述第二外源多肽包含抗体、免疫检查点分子或其片段。在一些实施方案中，所述第二外源多肽包含抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段或所述单结构域抗体或其抗原结合片段是中和抗体或其中和抗原结合片段。在一些实施方案中，所述中和抗体或其中和抗原结合片段靶向免疫检查点分子。在一些实施方案中，所述中和抗体或其中和抗原结合片段靶向血管生成素-1、血管生成素-2、内皮抑素、FGF、MMP、DII4、3类轴突导向蛋白、FGF、VEGFR、NRP-1、PDGF(BB-同源二聚体)、PDGFR、TGF-β、内皮联蛋白、TGF-β受体、CCL2、整合素αVβ3、αVβ5或α5β1、VE-钙黏着蛋白、CD31、肝配蛋白、纤溶酶原激活物、纤溶酶原激活物抑制剂-1、eNOS、COX-2、AC133、ID1/ID3、3类轴突导向蛋白或Nogo-A。在一些实施方案中，所述中和抗体或其中和抗原结合片段靶向VEGF。在一些实施方案中，所述中和抗体或其中和抗原结合片段靶向VEGF-A。在一些实施方案中，所述免疫检查点分子包括PD-1、PD-L1、CTLA-4、VISTA、PDCD1LG2(CD273)、B7-H3(也称为CD276)、A2AR、CD27、LAG3、TIM-3、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、CD73、NKG2A、PVRIG、PVRL2、CEACAM1、CEACAM5、CEACAM6、FAK、CCR-2、CCL-2、LIF、CD47、SIRPα、M-CSF、CSF-1R、IL-3、IL-1RAP、IL-8、SEMA4D、血管生成素-2、CLEVER-1、Axl、磷脂酰丝氨酸或其片段。在一些实施方案中，所述至少一种外源靶向部分包含抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段或所述单结构域抗体或其抗原结合片段包括外源单结构域抗体或其片段。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段或所述单结构域抗体或其抗原结合结构域靶向癌细胞标志物。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段或所述单结构域抗体或其抗原结合片段靶向内皮细胞生物标志物。在一些实施方案中，所述内皮细胞生物标志物由脉管系统细胞表达。在一些实施方案中，所述内皮细胞生物标志物由血管细胞表达。在一些实施方案中，所述内皮细胞生物标志物由淋巴管细胞表达。

本文提供的方面是一种治疗对象的特征至少部分在于异常脉管系统的疾病或病症的方法，所述方法包括：向患有所述疾病或病症的所述对象施用包含一个或多个细胞内细胞器的去核细胞，所述去核细胞在细胞核不存在的情况下合成或释放包括肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员多肽或其催化活性片段的外源多肽，其中由所述细胞合成或释放的所述外源多肽对于使所述对象的所述异常脉管系统正常化是治疗有效的。在一些实施方案中，所述外源多肽包括可溶性TNF超家族成员多肽。在一些实施方案中，所述外源多肽由所述去核细胞释放。在一些实施方案中，所述外源多肽包含与SEQ ID NO:1501-1511具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的多肽序列。在一些实施方案中，所述外源多肽包含与SEQ ID NO:1508具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的多肽序列。在一些实施方案中，所述外源多肽包含与SEQ ID NO:1511具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的多肽序列。在一些实施方案中，所述TNF超家族成员是LIGHT。在一些实施方案中，所述去核细胞还包含至少一种外源靶向部分，其包含抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段或所述单结构域抗体或其抗原结合片段包括外源单结构域抗体或其片段。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段或所述单结构域抗体或其抗原结合片段靶向癌细胞标志物。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段或所述单结构域抗体或其抗原结合片段靶向内皮细胞生物标志物。在一些实施方案中，所述内皮细胞生物标志物由脉管系统细胞表达。在一些实施方案中，所述内皮细胞生物标志物由血管细胞表达。在一些实施方案中，所述内皮细胞生物标志物由淋巴管细胞表达。在一些实施方案中，所述去核细胞将所述外源多肽递送至所述对象的所述异常脉管系统内的细胞。在一些实施方案中，所述去核细胞包含至少一种额外的外源剂。在一些实施方案中，所述至少一种额外的外源剂包含免疫检查点分子。在一些实施方案中，所述至少一种额外的外源剂包含免疫检查点分子抑制剂。在一些实施方案中，所述至少一种额外的外源剂包含血管生成抑制剂。在一些实施方案中，所述血管生成抑制剂包括VEGF/VEGFR抑制剂。在一些实施方案中，所述VEGF/SOC抑制剂包括VEGF-A抑制剂。在一些实施方案中，所述至少一种外源剂杀死所述异常脉管系统内的癌症。在一些实施方案中，所述至少一种外源剂将外源免疫细胞募集至所述异常脉管系统以杀死所述异常脉管系统内的癌症。在一些实施方案中，所述去核细胞鞘内、眼内、玻璃体内、视网膜、静脉内、肌内、心室内、脑内、小脑内、脑室内、脑实质、皮下、肿瘤内、肺内、气管内、腹膜内、膀胱内、阴道内、直肠内、口服、舌下、透皮、通过吸入、通过吸入雾化形式、通过管腔内-GI途径或其组合施用于所述对象。在一些实施方案中，在向所述对象施用所述去核细胞后，所述去核细胞在对象中存活少于或等于14天。在一些实施方案中，在向所述对象施用所述去核细胞后，所述去核细胞在对象中存活少于或等于4天。在一些实施方案中，所述疾病或病症是癌症或赘生物。在一些实施方案中，所述异常脉管系统是在所述对象的肺中。在一些实施方案中，所述方法还包括向所述对象施用CPI-006、莫那利珠单抗(Monalizumab)、COM701、CM24、NEO-201、地法替尼(Defactinib)、PF-04136309、MSC-1、Hu5F9-G4(5F9)、ALX148、TTI-662、RRx-001、拉妥珠单抗(Lacnotuzumab，MCS110)、LY3022855、SNDX-6352、依米妥珠单抗(Emactuzumab，RG7155)、培西达替尼(Pexidartinib，PLX3397)、CAN04、卡那单抗(Canakinumab，ACZ885)、BMS-986253、派比奈单抗(Pepinemab，VX15/2503)、曲巴那尼(Trebananib)、FP-1305、纬恩泊妥单抗(Enapotamabvedotin，EnaV)、巴维妥昔单抗(Bavituximab)或其组合。

通过引用并入

本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，其并入程度如同每个单个的出版物、专利或专利申请被明确且单个地指示通过引用并入。就通过引用并入的出版物和专利或专利申请与本说明书中包含的公开内容相矛盾而言，本说明书旨在取代和/或优先于任何这种矛盾的材料。

附图说明

发明性概念的新型特征在所附权利要求书中特别地阐述。通过参考以下对利用发明性概念的说明性实施方案加以阐述的详细描述和附图，将会获得对本发明概念的特征和优点的更好的理解，在所述附图中：

图1说明了用于生成根据本文所述的各种实施方案的用于递送单结构域抗体的去核细胞的方法。

图2说明了与典型的生物药物开发时间线相比，用于产生根据各种实施方案的用于递送单结构域域抗体的去核细胞的时间线。

图3A是示出活细胞或去核细胞(“胞质体”)随时间推移的相对倍数变化的代表性图。

图3B是示出从冷冻储存中恢复之后(冷冻保存)的活细胞和胞质体的代表性图。

图3C是示出在去核之后24小时(新鲜胞质体)或在去核后从冷冻储存中恢复之后24小时(冷冻保存)的胞质体的相对生存力的代表性图，其中将新鲜和冷冻保存的胞质体与去核之后4小时的胞质体的生存力进行比较。平均值±SEM；n＝10。

图4A是示出刚从4摄氏度下的低温休眠中恢复之后间充质干细胞(MSC)和MSC衍生的胞质体在指示量的时间内的生存力的代表性线图。使用台盼蓝染料排除法在自动细胞计数(Cell Countess)中评估生存力，并展示为与输入细胞数的比率。

图4B是在博伊登小室测定(Boyden chamber assay)中在指示量的时间内比较刚从4摄氏度下的低温休眠中恢复之后的迁移MSC和MSC衍生的胞质体的代表性柱状图。允许细胞和胞质体在底部腔室中在没有血清(阴性对照)或具有10％特级FBS(P-FBS)作为化学引诱剂的情况下迁移3小时，并且将计数相对于加载对照归一化。

图5A是示出在工程化胞质体和工程化亲本MSC上由荧光抗体进行的细胞表面C-X-C基序趋化因子受体4(CXCR4)表达的信号强度上计数的事件数的代表性流式细胞术图，如通过FlowJo分析。

图5B是示出迁移到博伊登小室膜的下表面的迁移细胞或胞质体与加载对照相比的比率的代表性柱状图。平均值±SEM；n＝10。在博伊登小室测定中，允许具有和没有工程化CXCR4受体的MSC和MSC衍生的胞质体朝向指示浓度的基质细胞衍生因子1α(SDF-1α)迁移2小时。

图6A是示出在工程化胞质体和工程化亲本MSC上由荧光抗体进行的细胞表面P-选择素糖蛋白配体-1(PSGL1)表达的信号强度上计数的事件数的代表性流式细胞术图，如通过FlowJo分析。

图6B是示出P-选择素与工程化MSC和MSC衍生的胞质体的细胞表面结合的代表性图，如通过流式细胞术确定。MSC对照＝亲本MSC。工程化MSC＝PSGL1/(岩藻糖基转移酶7)Fut7工程化MSC。工程化胞质体＝PSGL1/Fut7工程化MSC衍生的胞质体。

图7A是示出在工程化胞质体和MSC上mCD47表达的细胞表面的信号强度上计数的事件数的代表性流式细胞术图，如通过FlowJo分析。

图7B是示出未被巨噬细胞吞噬(F4/80^-和CD11b^-)，从而指示胞质体逃脱了肺中的巨噬细胞吞噬作用的活胞质体(DiD+)的数量的代表性柱状图。平均值±SEM；n＝3。将DiD染料标记的对照胞质体或工程化胞质体(mCD47胞质体)眶后注射到小鼠的脉管系统中。在24小时之后，收获组织并用两种不同的泛巨噬细胞标志物(F4/80和CD11b)染色。

图7C是示出未被巨噬细胞吞噬(F4/80^-和CD11b^-)，从而指示胞质体逃脱了肝脏中的巨噬细胞吞噬作用的活胞质体(DiD+)的代表性柱状图。平均值±SEM；n＝3。将DiD染料标记的对照胞质体或工程化胞质体(mCD47胞质体)眶后注射到小鼠的脉管系统中。在24小时之后，收获组织并用两种不同的泛巨噬细胞标志物(F4/80和CD11b)染色。

图8A是示出在肺中检测到的DiD标记的MSC或胞质体的数量的代表性散点图。在标准贴壁条件(2D)下或通过生成3D胞质体的悬滴法(3D)在悬浮液中培养MSC。用DiD染料标记MSC和胞质体，并眶后注射到C57BL/6小鼠的脉管系统中。在24小时之后收获组织，并通过流式细胞术分析细胞悬浮液。平均值±SEM；n＝2。

图8B是示出在肝脏中检测到的DiD标记的MSC或胞质体的数量的代表性散点图。在标准贴壁条件(2D)下或通过生成3D胞质体的悬滴法(3D)在悬浮液中培养MSC。用DiD染料标记MSC和胞质体，并眶后注射到C57BL/6小鼠的脉管系统中。在24小时之后收获组织，并通过流式细胞术分析细胞悬浮液。平均值±SEM；n＝2。

图8C是示出在脾脏中检测到的DiD标记的MSC或胞质体的数量的代表性散点图。在标准贴壁条件(2D)下或通过生成3D胞质体的悬滴法(3D)在悬浮液中培养MSC。用DiD染料标记MSC和胞质体，并眶后注射到C57BL/6小鼠的脉管系统中。在24小时之后收获组织，并通过流式细胞术分析细胞悬浮液。平均值±SEM；n＝2。

图9说明了针对细胞生存力分析通过流式细胞术分析的间充质基质细胞(MSC)或胞质体上异硫氰酸荧光素(FITC)标记的膜联蛋白V的细胞表面染色。

图10A是示出在非转染(hTERT)细胞或用编码单结构域抗体(scFv)的载体转染的细胞的条件培养基中分泌的单结构域抗体的丰度(如通过酶联免疫测定(ELISA)测量)的代表性图。将转染的细胞去核并接种在6孔板(0.5X10⁶/孔)中，并在去核之后24和48小时后收集条件培养基以进行ELISA检测。平均值±SEM；n＝3个生物重复。

图10B是示出非转染(仅hTERT-MSC)或转染(去核细胞+NBαPD-L1)细胞的条件培养基中分泌的抗程序性死亡配体1(PD-L1)纳米抗体、单结构域抗体或scFv(NB)(通过ELISA测量)的代表性图。将细胞接种在6孔板(0.5X10⁶/孔)中，并在去核之后24和48小时后收集条件培养基以进行ELISA检测。平均值±SEM；n＝3个生物重复。

图10C是示出非转染(仅hTERT-MSC)和转染(去核细胞+NBαCTLA-4)细胞的条件培养基中分泌的抗细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)NB(通过ELISA测量)的代表性图。将细胞接种在6孔板(0.5X10⁶/孔)中，并在去核之后24和48小时后收集条件培养基以进行ELISA检测。平均值±SEM；n＝3个生物重复。

具体实施方式

本文公开了能够被广泛工程化以在细胞核不存在的情况下表达单结构域抗体或其部分的去核细胞。此类去核细胞可以用于表达单结构域抗体或其部分并将其递送至体内靶细胞或组织，甚至在全身施用时也是如此。单结构域抗体或其部分或其片段可以发挥治疗性功效。例如，单结构域抗体或其部分或其片段可以靶向免疫检查点分子并与其结合，从而减少免疫检查点分子在对象中的表达并治疗对象的疾病或病症。在一些方面，所述去核细胞可以被工程化以表达外源肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员多肽或其催化活性片段。在一些方面，所述去核细胞可以被工程化以表达单结构域抗体和外源TNF两者。在一些方面，所述外源TNF使对象的异常脉管系统正常化。在一些方面，对象的异常脉管系统的正常化增加去核细胞的治疗性功效。例如，正常化的脉管系统允许将单结构域抗体递送至与疾病或病症相关联的靶位点。

本文所述的去核细胞可以被工程化以表达一个或多个靶向部分，所述一个或多个靶向部分在由去核细胞表达(例如，在其表面上)时将去核细胞引导至体内靶细胞或组织。为了避免在体内意外清除去核细胞，去核细胞还可以包含免疫系统逃逸部分(“不要吃我”信号传导多肽)，诸如CD47、PD-L1、HLA-E或HLA-G。在一些实施方案中，本文所述的去核细胞包含额外的活性剂，诸如治疗剂。

常规治疗细胞的全身施用存在两个主要问题。第一，大多数细胞可能被困在肺或其他组织中的小毛细血管中，对治疗性货物的生物分布产生负面影响，并且可能引起严重的副作用，如肺栓塞。第二，缺乏组织特异性归巢受体和粘附分子(例如，SDF-1α/CXCR4、CCL2/CCR2、PSGL-1)以靶向预期细胞或组织的常规治疗性细胞无法有效地归巢至此类预期细胞或组织。

本公开内容的去核细胞通过在一些实施方案中比传统治疗性细胞及其亲本细胞小得多(例如，亲本细胞直径的约60％和体积的1/8)并且不具有刚性细胞核来解决此类问题。因此，去核细胞可以比其常规对应物更好地通过小毛细血管和血管。另外，本文所述的去核细胞可以被工程化以表达功能性靶向部分(例如，归巢受体、粘附分子或膜结合抗体，诸如膜结合单结构域抗体)，以促进向靶细胞或组织的有效归巢，即使在全身施用于对象时也是如此。在一些实施方案中，所述靶细胞或组织是癌细胞或组织。在靶向癌细胞或组织的去核细胞的情况下，去核细胞可以被工程化以表达识别由癌细胞或组织产生的抗原的靶向部分。在一些实施方案中，去核细胞可以被工程化以表达其他靶向部分，以将去核细胞引导至靶组织，包括趋化因子、整合素、粘附分子、膜结合抗体或膜结合单结构域抗体。

在一些实施方案中，所述单结构域抗体或其部分对于去核细胞或其亲本细胞是外源的。外源单结构域抗体或其部分可以赋予治疗性作用，诸如治疗本文所述的疾病或病症。在一些实施方案中，单结构域抗体或其部分与可以靶向单个表位或多个表位(例如，双特异性)的多个抗体或多个单结构域抗体融合。在一些实施方案中，单结构域抗体与小分子缀合，诸如抗体-药物缀合物(ADC)。在一些实施方案中，所述小分子是细胞毒性药物或其治疗有效部分。

在一些实施方案中，去核细胞包含编码单结构域抗体或其部分的多核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸对于去核细胞或其亲本细胞是外源的。在一些实施方案中，所述多核苷酸编码与本文所述的多个抗体或多个单结构域抗体融合的单结构域抗体。

本文还公开了使用去核细胞和包含本公开内容的去核细胞的组合物的方法。在一些实施方案中，提供了用于通过将去核细胞或含有去核细胞的组合物递送至对象来治疗疾病或病症的方法。在一些实施方案中，所述疾病或病症与去核细胞被工程化以靶向的靶细胞或靶组织相关联。在一些实施方案中，所述靶细胞是癌细胞。在一些实施方案中，所述靶细胞是上皮细胞。在一些情况下，所述组织是肿瘤。在一些实施方案中，所述组织是肺组织。在一些实施方案中，所述疾病或病症包括癌症。在一些实施方案中，所述疾病或病症包括特发性肺纤维化。在一些实施方案中，方法包括使用本公开内容的去核细胞将货物(例如，单结构域抗体、治疗剂)转移至靶细胞，例如像用促融合部分或隧道纳米管。

本文公开了通过从例如像未经历亲本细胞的分化的有核亲本细胞中去除细胞核来产生本文所述的去核细胞的方法。例如，含有细胞核的亲本细胞可以被工程化以表达单结构域抗体或其部分、靶向部分或“不要吃我”信号传导肽；并且随后，可以去除亲本细胞的细胞核。在另一个实例中，将含有细胞核的亲本细胞去核，并且去核细胞被工程化以表达结构域抗体或其部分、靶向部分或“不要吃我”信号传导肽。在一些实施方案中，去除细胞核涉及机械地去除细胞核。

在对亲本细胞去核后，本文所述的去核细胞保留对于亲本细胞内源的一个或多个细胞内细胞器。在一些实施方案中，一个或多个细胞内细胞器中的所有被保留。在一些实施方案中，一个或多个细胞内细胞器中并非所有都被保留。在一些实施方案中，高尔基体和/或内质网被保留，它们参与蛋白质合成和分泌。保留一个或多个细胞内细胞器至少部分地使去核细胞能够在细胞核不存在的情况下合成或释放本文公开的生物分子(例如，单结构域抗体或其部分、靶向部分、免疫逃逸部分等)。

在一些实施方案中，亲本细胞是本文所述的有核细胞中的任一种。在一些实施方案中，亲本细胞是成人干细胞。在一些实施方案中，亲本细胞是间充质基质细胞(MSC)。在一些实施方案中，去核细胞衍生自诱导多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，亲本细胞不是红细胞或红细胞前体细胞。在一些实施方案中，亲本细胞是血小板细胞。在一些实施方案中，亲本细胞不是内皮细胞。在一些实施方案中，亲本细胞不是内皮细胞前体细胞或红细胞前体细胞。在一些实施方案中，亲本细胞不是血小板细胞。在一些实施方案中，亲本细胞不是内皮细胞。在一些实施方案中，亲本细胞不是内皮细胞前体细胞。在一些实施方案中，亲本细胞不表达补体受体1(CR1)。在一些实施方案中，亲本细胞不表达CD44。在一些实施方案中，亲本细胞不表达VLA-4。在一些实施方案中，亲本细胞不表达BCAM。在一些实施方案中，亲本细胞不表达ICAM。在一些实施方案中，亲本细胞不表达胶原蛋白的受体。在一些实施方案中，亲本细胞不表达血小板生成素的受体。在一些实施方案中，亲本细胞不表达胶原蛋白的受体。在一些实施方案中，亲本细胞不表达血管性假血友病因子(VWF)的受体。在一些实施方案中，亲本细胞不表达纤维蛋白原的受体。在一些实施方案中，亲本细胞不表达GP1b-IX-V受体。在一些实施方案中，亲本细胞不表达GPIIb/IIIa受体。在一些实施方案中，亲本细胞不表达前列腺素类激素受体。在一些实施方案中，亲本细胞不表达嘌呤受体。在一些实施方案中，亲本细胞不表达血栓素受体。

组合物

本文提供了包含单结构域抗体或其部分的细胞以及含有此类去核细胞的组合物。在一些实施方案中，所述细胞是经去核的。在一些实施方案中，所述单结构域抗体是治疗剂。在一些实施方案中，去核细胞能够使用由去核细胞从亲本细胞保留的一个或多个细胞内细胞器在细胞核不存在的情况下表达单结构域抗体(例如，治疗剂)。在一些实施方案中，所述单结构域抗体或其部分(例如，治疗剂)对于去核细胞或其亲本细胞是外源的。在一些实施方案中，去核细胞在去核细胞的表面表达单结构域抗体或其部分(例如，治疗剂)。在一些实施方案中，单结构域抗体或其部分由去核细胞分泌到靶组织(例如，微环境)处的细胞外空间中。在一些方面，所述组合物包含本文所述的去核细胞。在一些方面，所述去核细胞获得自或衍生自有核细胞(例如，亲本细胞)。在一些方面，所述去核细胞包含跨膜部分。在一些实施方案中，所述去核细胞包含靶向部分。在一些实施方案中，所述去核细胞包含治疗剂。在一些实施方案中，所述去核细胞包含抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体或其抗原结合片段。在一些方面，所述靶向部分包含抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述治疗剂包含抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述去核细胞被配制到本文所述的药物配制品中。

去核细胞

本公开内容的去核细胞获得自或衍生自对应的有核细胞(在本文中被称为“亲本细胞”)。亲本细胞可以衍生自各种不同的细胞类型，包括真核细胞。例如，去核细胞可以衍生自成体干细胞、间充质基质细胞(MSC)、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、成肌细胞、中性粒细胞、内皮细胞、内皮细胞前体细胞和/或成纤维细胞。在一些实施方案中，去核细胞衍生自间充质基质细胞。在一些实施方案中，去核细胞衍生自诱导多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，亲本细胞衍生自使用合适的方法永生化的细胞。例如，亲本细胞通过表达人端粒酶逆转录酶(hTERT)、癌基因或病毒基因诸如猿猴病毒40(SV40)来永生化。在一些实施方案中，胞质体使用美国专利号10,927,349提供的合适方法来衍生自亲本细胞，所述专利特此通过引用全文并入。在一些实施方案中，去核细胞保留一个或多个细胞内细胞器，用于在细胞核不存在的情况下合成外源单结构域抗体或其片段。

在一些实施方案中，细胞可以源自具有一个或多个细胞的任何生物体。细胞的非限制性实例包括：原核细胞、真核细胞、细菌细胞、古细菌细胞、单细胞真核生物体的细胞、原生动物细胞、来自植物的细胞(例如，来自植物作物、水果、蔬菜、谷物、大豆、玉米、玉蜀黍、小麦、种子、番茄、水稻、木薯、甘蔗、南瓜、干草、土豆、棉花、大麻、烟草、开花植物、针叶树、裸子植物、蕨类植物、石松、金鱼藻、地钱、苔藓的细胞)、藻细胞(例如，布朗葡萄藻(Botryococcusbraunii)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、微拟球藻(Nannochloropsisgaditana)、蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、展枝马尾藻(Sargassum patens C.Agardh)等)、海藻类(例如，海带)、真菌细胞(例如，酵母细胞、来自蘑菇的细胞)、动物细胞、来自无脊椎动物(例如，果蝇、刺胞动物、棘皮动物、线虫等)的细胞、来自脊椎动物(例如，鱼、两栖动物、爬行动物、鸟类、哺乳动物)的细胞、来自哺乳动物(例如，猪、奶牛、山羊、绵羊、啮齿动物、大鼠、小鼠、非人灵长类、人等)的细胞等等。有时，细胞并非源自天然生物体(例如，细胞可以是合成的，有时称为人工细胞)。在一些实施方案中，所述细胞是体细胞。在一些实施方案中，所述细胞是干细胞或祖细胞。在一些实施方案中，所述细胞是间充质干细胞或祖细胞。在一些实施方案中，所述细胞是造血干细胞或祖细胞。在一些实施方案中，所述细胞是肌肉细胞、皮肤细胞、血细胞或免疫细胞。细胞的其他非限制性实例包括淋巴样细胞，诸如B细胞、T细胞(细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、调节性T细胞、T辅助细胞)、自然杀伤细胞、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞；髓样细胞，诸如粒细胞(嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞/分叶过多中性粒细胞)、单核细胞/巨噬细胞、红细胞(网织红细胞)、肥大细胞、凝血细胞/巨核细胞、树突状细胞；来自内分泌系统的细胞，包括甲状腺细胞(甲状腺上皮细胞、滤泡旁细胞)、甲状旁腺细胞(甲状旁腺主细胞、嗜酸性细胞)、肾上腺细胞(嗜铬细胞)、松果体细胞(松果体细胞(Pinealocyte))；神经系统的细胞，包括神经胶质细胞(星形胶质细胞、小胶质细胞)、大细胞神经分泌细胞、星形细胞、伯特歇尔细胞(Boettcher cell)和垂体细胞(促性腺激素细胞、促肾上腺皮质激素细胞、促甲状腺激素细胞、亲躯体细胞、催乳激素细胞)；呼吸系统的细胞，包括肺细胞(I型肺细胞、II型肺细胞)、克拉拉细胞、杯状细胞、尘细胞；循环系统的细胞，包括心肌细胞、周细胞；消化系统的细胞，包括胃细胞(胃主细胞、周缘细胞)、杯状细胞、帕内特细胞、G细胞、D细胞、ECL细胞、I细胞、K细胞、S细胞；肠内分泌细胞，包括肠嗜铬细胞、APUD细胞、肝脏细胞(肝细胞、库普弗细胞)、软骨/骨骼/肌肉；骨细胞，包括成骨细胞、骨细胞、破骨细胞、牙齿细胞(成牙骨质细胞、成釉质细胞)；软骨细胞，包括成软骨细胞、软骨细胞；皮肤细胞，包括毛细胞、角质形成细胞、黑色素细胞(痣细胞)；肌肉细胞，包括肌细胞；泌尿系统细胞，包括足细胞、球旁细胞、球内系膜细胞/球外系膜细胞、肾近端小管刷状缘细胞、致密斑细胞；生殖系统细胞，包括精子、塞托利细胞、睾丸间质细胞、卵细胞；和其他细胞，包括脂肪细胞、成纤维细胞、肌腱细胞、表皮角质形成细胞(分化表皮细胞)、表皮基底细胞(干细胞)、指甲和脚趾甲的角质形成细胞、甲床基底细胞(干细胞)、髓质毛干细胞、皮质毛干细胞、角质毛干细胞、角质毛根鞘细胞、赫胥黎层的毛根鞘细胞、亨勒层的毛根鞘细胞、外毛根鞘细胞、毛母质细胞(干细胞)、湿分层屏障上皮细胞、角膜、舌、口腔、食道、肛管、远端尿道和阴道的复层鳞状上皮的表面上皮细胞、角膜、舌、口腔、食道、肛管、远端尿道和阴道的上皮的基底细胞(干细胞)、尿上皮细胞(内衬尿道膀胱和尿管)、外分泌上皮细胞、唾液腺粘液细胞(富含多糖的分泌)、唾液腺浆液细胞(富含糖蛋白酶的分泌)、舌头中的冯·埃布纳腺细胞(洗涤味蕾)、乳腺细胞(乳汁分泌)、泪腺细胞(泪液分泌)、耳中的耵聍腺细胞(蜡分泌)、外泌汗腺暗细胞(糖蛋白分泌)、外分泌汗腺亮细胞(小分子分泌)。顶泌汗腺细胞(气味分泌、性激素敏感)、眼睑中的睫毛腺细胞(专用汗腺)、皮脂腺细胞(富含脂质的皮脂分泌)、鼻子中的鲍曼腺细胞(洗涤嗅上皮)、十二指肠中的布伦纳腺细胞(酶和碱性粘液)、精囊细胞(分泌精液组分，包括游动精子的果糖)、前列腺细胞(分泌精液组分)、尿道球腺细胞(粘液分泌)、巴氏腺细胞(阴道润滑剂分泌)、利特雷氏腺细胞腺(粘液分泌)、子宫内膜细胞(碳水化合物分泌)、呼吸道和消化道的分离杯状细胞(粘液分泌)、胃内壁粘液细胞(粘液分泌)、胃腺酶原细胞(胃蛋白酶原分泌)、胃腺泌酸细胞(盐酸分泌)、胰腺腺泡细胞(碳酸氢盐和消化酶分泌)、小肠潘氏细胞(溶菌酶分泌)、肺的II型肺细胞(表面活性剂分泌)、肺的克拉拉细胞、激素分泌细胞、垂体前叶细胞、亲躯体细胞、催乳素细胞(Lactotropes)、促甲状腺激素、促性腺激素细胞、促肾上腺皮质激素细胞、中间垂体细胞、大细胞神经分泌细胞、肠道和呼吸道细胞、甲状腺细胞、甲状腺上皮细胞、滤泡旁细胞、甲状旁腺细胞、甲状旁腺主细胞、嗜酸性细胞、肾上腺细胞、嗜铬细胞、睾丸间质细胞、卵泡的内膜细胞、破裂卵泡的黄体细胞、颗粒黄体细胞、膜黄体细胞、肾小球旁细胞(肾素分泌)、肾的致密斑细胞、代谢和储存细胞、屏障功能细胞(Barrierfunction cells)(肺、肠、外分泌腺和泌尿生殖道)、肾细胞(Kidney)、I型肺细胞(肺的衬里空气空间(lining air space of lung))、胰管细胞(泡心细胞)、(汗腺、唾液腺、乳腺等的)无横纹的导管细胞(Nonstriated duct cell)、(精囊、前列腺等)的导管细胞、内衬封闭内体腔的上皮细胞(Epithelial cells lining closed internal body cavities)、具有推进功能的纤毛细胞、细胞外基质分泌细胞、收缩细胞；骨骼肌细胞、干细胞、心肌细胞、血液和免疫系统细胞、红细胞(红细胞(red blood cell))、巨核细胞(血小板前体)、单核细胞、结缔组织巨噬细胞(各种类型)、表皮朗格汉斯细胞、破骨细胞(在骨中)、树突状细胞(在淋巴组织中)、小胶质细胞(在中枢神经系统中)、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、辅助T细胞、抑制T细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、网织红细胞、血液和免疫系统的干细胞和定向祖细胞(各种类型)、多能干细胞、全能干细胞、诱导多能干细胞、成体干细胞、感官传感器细胞(Sensory transducer cells)、自主神经元细胞、感觉器官和外周神经元支持细胞、中枢神经系统神经元和神经胶质细胞、晶状体细胞、色素细胞、黑色素细胞、视网膜色素上皮细胞、生殖细胞、卵母细胞(Oogonium/Oocyte)、精子细胞、精母细胞、精原细胞(精母细胞的干细胞)、精子、看护细胞、卵巢卵泡细胞、塞托利细胞(在睾丸中)、胸腺上皮细胞、间质细胞和间质肾细胞。

在一些实施方案中，所述细胞是真核细胞。真核细胞的非限制性实例包括哺乳动物(例如，啮齿动物、非人灵长类动物或人)、非哺乳动物类动物(例如，鱼类、鸟类、爬行动物或两栖动物)、无脊椎动物、昆虫、真菌或植物细胞。在一些实施方案中，真核细胞是酵母细胞，诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在一些实施方案中，真核细胞是高等真核生物，诸如哺乳动物、鸟类、植物或昆虫细胞。在一些实施方案中，有核细胞是原代细胞。在一些实施方案中，有核细胞是免疫细胞(例如，淋巴细胞(例如，T细胞、B细胞)、巨噬细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、单核细胞、髓源性抑制细胞、嗜酸性粒细胞)。在一些实施方案中，有核细胞是吞噬细胞或白细胞。在一些实施方案中，有核细胞是干细胞(例如，成体干细胞(例如，造血干细胞、乳腺干细胞、肠道干细胞、间充质干细胞、内皮干细胞、神经干细胞、嗅觉成体干细胞、神经嵴干细胞、睾丸细胞)、胚胎干细胞、诱导多能干细胞(iPS))。在一些实施方案中，有核细胞是祖细胞。在一些实施方案中，有核细胞来自癌细胞系。在一些实施方案中，有核细胞是悬浮细胞。在一些实施方案中，有核细胞是黏附细胞。在一些实施方案中，有核细胞是通过癌基因的表达而永生化的细胞。在一些实施方案中，有核细胞通过人端粒酶逆转录酶(hTERT)或任何癌基因的表达来永生化。在一些实施方案中，有核细胞通过病毒基因诸如猿猴病毒40(SV40)的表达来永生化。在一些实施方案中，有核细胞是患者或对象衍生的细胞(例如，自体患者衍生的细胞，或同种异体患者衍生的细胞)。在一些实施方案中，在使用本文所述的任何去核技术对有核细胞去核之前，用载体(例如，病毒载体(例如，逆转录病毒载体(例如，慢病毒载体)、腺相关病毒(AAV)载体、囊泡病毒载体(例如，水疱性口炎病毒(VSV)载体)或杂交病毒载体)、质粒)转染有核细胞。

在一些实施方案中，胞质体衍生自对象的自体细胞。在一些实施方案中，胞质体衍生自对象的同种异体细胞。

在一些实施方案中，胞质体衍生自免疫细胞。在一些实施方案中，胞质体衍生自自然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、成体干细胞(例如，造血干细胞、乳腺干细胞、肠道干细胞、间充质干细胞、间充质基质细胞、内皮干细胞、神经干细胞、嗅觉成体干细胞、神经嵴干细胞、皮肤干细胞或睾丸细胞)、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、内皮细胞、内皮细胞前体细胞或诱导多能干细胞。

在一些实施方案中，亲本细胞不是红细胞或红细胞前体细胞。在一些实施方案中，亲本细胞是血小板细胞。在一些实施方案中，亲本细胞不是内皮细胞。在一些实施方案中，亲本细胞不是内皮细胞前体细胞。在一些实施方案中，去核细胞不是红细胞或红细胞前体细胞。在一些实施方案中，去核细胞不是血小板细胞。在一些实施方案中，去核细胞不是内皮细胞。在一些实施方案中，去核细胞不是内皮细胞前体细胞。在一些实施方案中，去核细胞不表达补体受体1(CR1)。在一些实施方案中，去核细胞不表达CD44。在一些实施方案中，去核细胞不表达VLA-4。在一些实施方案中，去核细胞不表达BCAM。在一些实施方案中，去核细胞不表达ICAM。在一些实施方案中，去核细胞不表达胶原蛋白的受体。在一些实施方案中，去核细胞不表达血小板生成素的受体。在一些实施方案中，去核细胞不表达胶原蛋白的受体。在一些实施方案中，去核细胞不表达血管性假血友病因子(VWF)的受体。在一些实施方案中，去核细胞不表达纤维蛋白原的受体。在一些实施方案中，去核细胞不表达GP1b-IX-V受体。在一些实施方案中，去核细胞不表达GPIIb/IIIa受体。在一些实施方案中，去核细胞不表达前列腺素类激素受体。在一些实施方案中，去核细胞不表达嘌呤受体。在一些实施方案中，去核细胞不表达血栓素受体。

在一些实施方案中，亲本细胞可以是有核的并被工程化用于治疗性用途。在一些实施方案中，亲本细胞是本文所述的有核细胞中的任一种。在一些实施方案中，亲本细胞是成人干细胞。在一些实施方案中，亲本细胞是间充质基质细胞(MSC)。在一些实施方案中，去核细胞衍生自诱导多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，亲本细胞不是红细胞或红细胞前体细胞。在一些实施方案中，亲本细胞是血小板细胞。在一些实施方案中，亲本细胞不是内皮细胞。在一些实施方案中，亲本细胞不是内皮细胞前体细胞。可以用细胞松弛素处理亲本细胞以软化皮质肌动蛋白细胞骨架。然后可以通过在Ficoll梯度中高速离心来从细胞体中物理提取细胞核以生成去核细胞。因为去核细胞和完整的有核细胞沉积到Ficoll梯度中的不同层，所以去核细胞可以容易地分离并制备用于治疗性目的或与其他细胞(有核或去核)融合。去核过程在临床上可扩展，以处理数千万个细胞。在一些实施方案中，去核细胞可以用作疾病归巢媒介物，以递送临床上相关的货物/有效载荷以治疗各种疾病。

在一些实施方案中，去核细胞含有一个或多个细胞器或细胞骨架以形成隧道纳米管(TNT)或膜纳米管。本公开内容的发明人发现，在一些情况下对细胞去核可以增加细胞中的TNT，这可以提供治疗优势。在一些实施方案中，去核细胞的TNT增加通过与未去核的在其他方面相同的细胞相比去核细胞表现出增加的TNT形成数量来确定。在一些实施方案中，去核细胞的TNT增加通过与未去核的在其他方面相同的细胞的TNT形成长度相比去核细胞表现出增加的TNT形成长度来确定。在一些实施方案中，去核细胞的TNT增加通过与未去核的在其他方面相同的细胞的TNT形成直径相比去核细胞表现出增加的TNT形成直径来确定。在一些实施方案中，隧道纳米管将本文所述的至少一种外源剂递送至靶细胞。在一些实施方案中，增加的TNT形成、增加的TNT长度或增加的TNT直径增加了通过去核细胞向靶细胞递送至少一种外源剂的功效。在一些实施方案中，所述外源剂是治疗剂。在一些实施方案中，所述外源剂可以使脉管系统正常化。在一些实施方案中，隧道纳米管是从去核细胞的质膜延伸的突起，其中隧道纳米管可以具有约1μm至约1000μm的长度。在一些实施方案中，隧道纳米管具有约0.1nm至约10.0μm的长度。在一些实施方案中，隧道纳米管包含肌动蛋白。在一些实施方案中，隧道纳米管包含肌动蛋白和微管两者。在一些实施方案中，隧道纳米管包含去核细胞的细胞质的内容物。例如，隧道纳米管可以含有囊泡、细胞器或本文所述的至少一种外源剂。在一些实施方案中，隧道纳米管可以通过与靶细胞接触来递送至少一种外源剂。在一些实施方案中，隧道纳米管可以通过在去核细胞与靶细胞之间形成流体连通来将至少一种外源剂递送至靶细胞。在一些实施方案中，在将至少一种外源剂从去核细胞递送至靶细胞后，靶细胞可以与其他非靶向细胞形成额外的隧道纳米管。在这种情景下(类似于旁观者效应)，靶细胞可以将至少一种外源剂及其作用传递给其他非靶向细胞，从而将去核细胞的治疗性作用传播到其他非靶细胞。

在对亲本细胞去核后，本文所述的去核细胞保留对于亲本细胞内源的一个或多个细胞内细胞器。在一些实施方案中，一个或多个细胞内细胞器中的所有被保留。在一些实施方案中，一个或多个细胞内细胞器中并非所有都被保留。在一些实施方案中，高尔基体和/或内质网被保留，它们参与蛋白质合成和分泌。保留一个或多个细胞内细胞器至少部分地使去核细胞能够在细胞核不存在的情况下合成或释放本文公开的生物分子(例如，单结构域抗体或其部分、靶向部分、免疫逃逸部分等)。在一些实施方案中，去核细胞保留细胞骨架，诸如用于形成TNT的纤丝或小管。

去核细胞可以比其有核对应物(例如，有核亲本细胞)小，并且因此可以通过脉管系统和组织实质中的小开口更好地迁移。另外，去除大致密细胞核减轻了主要的物理屏障，从而允许细胞通过血管和组织实质中的小开口自由移动。因此，去核细胞改善了体内的生物分布和进入靶组织的移动。在一些实施方案中，去核细胞具有至少1μm的直径。在一些实施方案中，去核细胞的直径大于1μm。在一些实施方案中，去核细胞的直径为1-100μm(例如，1-90μm、1-80μm、1-70μm、1-60μm、1-50μm、1-40μm、1-30μm、1-20μm、1-10μm、1-5μm、5-90μm、5-80μm、5-70μm、5-60μm、5-50μm、5-40μm、5-30μm、5-20μm、5-10μm、10-90μm、10-80μm、10-70μm、10-60μm、10-50μm、10-40μm、10-30μm、10-20μm、10-15μm、15-90μm、15-80μm、15-70μm、15-60μm、15-50μm、15-40μm、15-30μm、15-20μm)。在一些实施方案中，去核细胞的直径为10-30μm。在一些实施方案中，去核细胞的直径在5-25μm之间(例如，5-20μm、5-15μm、5-10μm、10-25μm、10-20μm、10-15μm、15-25μm、15-20μm或20-25μm)。在一些实施方案中，去核细胞具有约8μm的直径。在一些实施方案中，一些去核细胞可以有利地足够小以允许更好的归巢或递送至靶位点。例如，本文所述的去核细胞可以通过狭窄的肺组织或肺结构诸如肺泡管或微毛细血管中的通道，而大多数细胞诸如亲本细胞可能无法通过。

在一些实施方案中，去核细胞具有显著的治疗价值，因为它们保持活力，不分化成其他细胞类型，分泌生物活性分子，并且可以在少于或等于约5天内物理迁移/归巢，可以广泛地离体去核以执行特定的治疗功能，并且可以与相同或其他细胞类型融合以转移希望的产物，无论是天然的还是去核的。因此，去核细胞作为细胞媒介物具有广泛的用途，以递送具有治疗重要性的生物分子和疾病靶向货物，包括基因、病毒、细菌、mRNA、shRNA、siRNA、多肽(包括抗体和抗原结合片段)、质粒、基因编辑机器或纳米颗粒。本公开内容能够生成安全的(例如，没有不需要的DNA被转移至对象)且可控的(例如，细胞死亡发生在3-4天内)的基于细胞的载剂，其可以被基因去核以将特定的抗病和促进健康的货物递送至人。在一些实施方案中，在施用于有需要的对象之后，去核细胞保持存活且保留迁移或归巢的功能，持续大于或等于约12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时、108小时或5天。

在一些实施方案中，去核细胞被工程化以表达外源DNA分子、外源RNA分子、外源蛋白或外源蛋白、基因编辑机器中的至少一种或其组合。在一些实施方案中，外源DNA分子是单链DNA、双链DNA、寡核苷酸、质粒、细菌DNA分子、DNA病毒或其组合。在一些实施方案中，外源RNA分子是信使RNA(mRNA)、小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、RNA病毒或其组合。在一些实施方案中，外源蛋白是细胞因子、生长因子、激素、抗体或其抗原结合片段、酶或其组合。在一些实施方案中，抗体是单结构域抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，亲本细胞(例如，有核细胞)在去核之前(例如，去核前)进行基因去核。在一些实施方案中，亲本细胞在去核之后(例如，去核后)进行基因去核。

在一些实施方案中，本文所述的去核细胞包含跨膜部分。在一些实施方案中，跨膜部分经基因修饰以与单结构域抗体或其抗原结合片段、或本文所述的治疗剂或其组合融合或复合。在一些实施方案中，跨膜部分经基因修饰以与单结构域抗体或其抗原结合片段、或本文所述的治疗剂或其组合融合。在一些实施方案中，去核细胞包含免疫逃逸部分。在一些实施方案中，免疫逃逸部分包含“不要吃我”信号传导肽，诸如CD47、PD-L1、HLA-E、HLA-G、其片段或其组合。

在一些实施方案中，去核细胞或包含去核细胞的组合物可以是经冷冻保存的(例如，将去核细胞或包含去核细胞的组合物储存在冷冻温度下)或经低温休眠的(例如，将去核细胞或包含去核细胞的组合物储存在环境温度与冷冻温度之间的温度下)。冷冻保存或低温休眠的持续时间可以是大于或等于约一小时、两小时、六小时、12小时、一天、两天、三天、四天、五天、六天、一周、两周、三周、四周、一个月、两个月、三个月或更长的时间段。在一些实施方案中，去核细胞在冷冻保存或低温休眠之后表现出的生存力与相同时间段的冷冻保存或低温休眠之后的相当细胞(例如，未经冷冻保存或低温休眠的本文所述的亲本细胞或无核细胞)大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％类似。例如，在一些实施方案中，与相当细胞相比，生存力降低50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在另一个实例中，在一些实施方案中，与相当细胞相比，生存力增加50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。此环境中的生存力可以通过如本文所述的台盼蓝染料排除法来测量。在一些实施方案中，台盼蓝染料排除法通过以下进行：(a)在悬浮液中离心多个没有细胞核的细胞的等分试样以产生细胞沉淀；(b)将细胞沉淀重悬浮在无血清培养基中以产生无血清细胞悬浮液；(c)将1份台盼蓝染料和1份无血清细胞悬浮液混合；(d)在(c)的3-5分钟内计数多个没有细胞核的细胞，其中多个没有细胞核的细胞中的至少一些未被台盼蓝染料染色，这指示生存力。在一些实施方案中，生存力使用膜联蛋白-V细胞表面染色来测量。在一些实施方案中，生存力通过外源多肽的表达来测量。例如，去核细胞的生存力可以通过由去核细胞表达的外源抗体或单结构域抗体的表达来确定。在一些实施方案中，生存力通过本文所述的任一种细胞表面标志物，诸如CD105、CD90、CD45、CXCR4、PSGL-1或CCR2的表达来测量。在一些实施方案中，生存力通过去核细胞的细胞活性来测量。在一些实施方案中，生存力通过本文所述的化学感应或趋化因子归巢活性确定的去核细胞的归巢能力来测量。

在一些实施方案中，去核细胞或包含去核细胞的组合物可以是经冻干的。在一些实施方案中，去核细胞在从冻干重构之后表现出的生存力与相当细胞(例如，未经冻干的本文所述的亲本细胞或去核细胞)大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％类似。

在一些实施方案中，去核细胞或包含去核细胞的组合物可以是经脱水的。在一些实施方案中，去核细胞在从冻干再水合之后表现出的生存力与相当细胞(例如，未经脱水的本文所述的亲本细胞或去核细胞)大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％类似。

在一些实施方案中，去核细胞或包含去核细胞的组合物在4℃下稳定大于或等于约一小时、两小时、六小时、12小时、一天、两天、三天、四天、五天、六天、一周、两周、三周、四周、一个月、两个月、三个月或更长的时间段。在一些实施方案中，所述组合物在室温下稳定大于或等于约一小时、两小时、六小时、12小时、一天、两天、三天、四天、五天、六天、一周、两周、三周、四周、一个月、两个月、三个月或更长的时间段。在一些实施方案中，所述组合物在37℃下稳定大于或等于约一小时、两小时、六小时、12小时、一天、两天、三天、四天、五天、六天、一周、两周、三周、四周、一个月、两个月、三个月或更长的时间段。在一些实施方案中，去核细胞或包含去核细胞的组合物在施用于有需要的对象之后可以保持存活，以用于治疗本文所述的疾病或病症。在一些实施方案中，去核细胞或包含去核细胞的组合物在施用于对象之后可以保持存活大于或等于约一小时、两小时、六小时、12小时、一天、两天、三天、四天、五天、六天、一周、两周、三周、四周、一个月、两个月、三个月或更长的时间段。

在一些实施方案中，去核细胞可以从对象的自体亲本细胞获得，所述对象需要通过本文所述的去核细胞进行治疗。在一些实施方案中，去核细胞可以从对象的同种异体亲本细胞获得，所述对象需要通过本文所述的去核细胞进行治疗。

跨膜部分

在一些实施方案中，本文描述了细胞或包含含有至少一个跨膜部分的去核细胞的组合物。在一些实施方案中，细胞是经去核的，诸如用本文公开的去核方法。在一些实施方案中，跨膜部分与多肽，诸如单结构域抗体或其抗原结合片段、在此公开的治疗剂或其组合偶联。在一些实施方案中，跨膜部分通过共价键的方式偶联。在一些实施方案中，跨膜部分是包含单结构域抗体或其抗原结合片段、在此公开的治疗剂或其组合的融合蛋白。在一些实施方案中，外源多肽与跨膜部分复合。在一些实施方案中，跨膜部分包含全长蛋白或其变体或其片段。在一些实施方案中，跨膜部分对于进行去核以用于获得去核细胞的亲本细胞是内源的。在一些实施方案中，跨膜部分可以是亲本细胞或去核细胞的外源跨膜部分。在一些实施方案中，跨膜部分包含单个跨膜α螺旋(二向配体膜蛋白)。跨膜部分包含多顶跨膜α螺旋蛋白。在一些实施方案中，跨膜部分包含多顶跨膜β折叠蛋白。在一些实施方案中，跨膜部分包含I、II、III或IV型跨膜蛋白。跨膜蛋白的非限制性实例可以包括CD4、CD14、糖蛋白a(GPA)或整合素的任何组合。

在一些实施方案中，跨膜部分通过修饰的方式添加到外源多肽中。例如，可以将跨膜部分添加到外源多肽的N末端或C末端，以将外源多肽插入本文所述的去核细胞的细胞膜中。对外源多肽进行修饰以添加跨膜部分的非限制性实例可以包括添加锚分子。锚分子可以是可以插入并保留在细胞膜中的任何分子(例如，糖脂)。在一些实施方案中，锚分子包含糖基磷脂酰肌醇、法尼基、棕榈酸酯、肉豆蔻酸酯或其组合。

靶向部分

在一些实施方案中，本文描述了包含靶向部分的细胞。在一些实施方案中，细胞是经去核的，诸如用本文公开的去核方法。本文所述的靶向部分被设计来在将去核细胞递送(例如，全身递送)至对象后将去核细胞引导至对象的靶细胞或靶环境(例如，组织)。在一些实施方案中，靶向部分在去核细胞的表面上表达。在一些实施方案中，靶向部分与本文所述的跨膜部分复合。在一些实施方案中，靶向部分由去核细胞分泌。与缺乏靶向部分的相当去核细胞的定位相比，包含靶向部分的去核细胞在对象的靶细胞或靶环境处的定位增加到2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍、5,000倍或10,000倍。在一些实施方案中，与缺乏靶向部分的相当去核细胞的定位相比，包含靶向部分的去核细胞在对象的靶细胞或靶环境处的定位增加到2倍。在一些实施方案中，与缺乏靶向部分的相当去核细胞的定位相比，包含靶向部分的去核细胞在对象的靶细胞或靶环境处的定位增加到5倍。在一些实施方案中，与缺乏靶向部分的相当去核细胞的定位相比，包含靶向部分的去核细胞在对象的靶细胞或靶环境处的定位增加到10倍。在一些实施方案中，与缺乏靶向部分的相当去核细胞的定位相比，包含靶向部分的去核细胞在对象的靶细胞或靶环境处的定位增加到20倍。在一些实施方案中，与缺乏靶向部分的相当去核细胞的定位相比，包含靶向部分的去核细胞在对象的靶细胞或靶环境处的定位增加到50倍。在一些实施方案中，与缺乏靶向部分的相当去核细胞的定位相比，包含靶向部分的去核细胞在对象的靶细胞或靶环境处的定位增加了5％。在一些实施方案中，与缺乏靶向部分的相当去核细胞的定位相比，包含靶向部分的去核细胞在对象的靶细胞或靶环境处的定位增加了10％。在一些实施方案中，与缺乏靶向部分的相当去核细胞的定位相比，包含靶向部分的去核细胞在对象的靶细胞或靶环境处的定位增加了20％。在一些实施方案中，与缺乏靶向部分的相当去核细胞的定位相比，包含靶向部分的去核细胞在对象的靶细胞或靶环境处的定位增加了30％。在一些实施方案中，与缺乏靶向部分的相当去核细胞的定位相比，包含靶向部分的去核细胞在对象的靶细胞或靶环境处的定位增加了40％。在一些实施方案中，与缺乏靶向部分的相当去核细胞的定位相比，包含靶向部分的去核细胞在对象的靶细胞或靶环境处的定位增加了50％。在一些实施方案中，与缺乏靶向部分的相当去核细胞的定位相比，包含靶向部分的去核细胞在对象的靶细胞或靶环境处的定位增加了60％。在一些实施方案中，与缺乏靶向部分的相当去核细胞的定位相比，包含靶向部分的去核细胞在对象的靶细胞或靶环境处的定位增加了70％。在一些实施方案中，与缺乏靶向部分的相当去核细胞的定位相比，包含靶向部分的去核细胞在对象的靶细胞或靶环境处的定位增加了80％。在一些实施方案中，与缺乏靶向部分的相当去核细胞的定位相比，包含靶向部分的去核细胞在对象的靶细胞或靶环境处的定位增加了90％。在一些实施方案中，与缺乏靶向部分的相当去核细胞的定位相比，包含靶向部分的去核细胞在对象的靶细胞或靶环境处的定位增加了100％。

在一些实施方案中，靶向部分包含用于靶向本文所述的生物标志物的外源抗体或外源抗原结合片段。在一些实施方案中，靶向部分包含用于靶向参与趋化因子信号传导的趋化因子受体或趋化因子配体或其部分的外源抗体或外源抗原结合片段。在一些实施方案中，外源抗体是外源单结构域抗体或其片段。

在一些实施方案中，靶向部分靶向由靶细胞或微环境表达或与靶细胞或微环境相关联的生物标志物。在一些实施方案中，生物标志物可以由靶细胞释放。生物标志物可以指示疾病或病症的存在。在一些实施方案中，生物标志物通过免疫细胞响应于与疾病或病症相关联的靶细胞或微环境而表达。在一些实施方案中，生物标志物可以是表位或抗原。在一些实施方案中，包含表位的生物标志物可以被不同于赋予治疗特性(例如，治疗剂)的抗体或其抗原结合片段的抗体结合。

在一些实施方案中，靶向部分靶向由肺细胞或肺癌细胞表达或释放的生物标志物。癌细胞生物标志物的非限制性实例包括碳酸酐酶9(CA9)、碳酸酐酶12(CA12)、北九州肺癌抗原1(Cxorf61)、桥粒黏蛋白3(DSG3)、脂肪非典型钙黏着蛋白2(FAT2)、G蛋白偶联受体87(GPR87)、吻素受体(KISS1R)、含LY6/PLAUR结构域的蛋白3(LYPD3)、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、跨膜丝氨酸蛋白酶4(TMPRSS4)、组织因子途径抑制剂(TFPI)、中期因子(MDK)、分泌的磷蛋白1(OPN)、基质金属肽酶2(MMP2)、TIMP金属肽酶抑制剂1(TIMP1)、癌胚抗原(CEA)、角蛋白19(CYFRA 21-1)、SCC、晚期糖基化终末产物特异性受体(AGER)、脂肪生成调节因子(C10orf116)、内收蛋白2(ADD2)、轴周蛋白(PRX)、层粘连蛋白亚基β3(LAMB3)、联丝蛋白(SYNM)、血影蛋白α红细胞型蛋白1(SPTA1)、锚蛋白1(ANK1)、血红蛋白亚基ε1(HBE1)、血红蛋白亚基γ1(HBG1)、碳酸酐酶1(CA1)、生腱蛋白XB(TNXB)、多聚素2(MMRN2)、血红蛋白亚基α1(HBA1)、陷窝蛋白1(CAV1)、血红蛋白亚基β(HBB)、VI型胶原蛋白α6链(COL6A6)、1号染色体开放阅读框198(C1orf198)、氯化物细胞内通道2(CLIC2)、血清剥夺反应蛋白(SDPR)、含EH结构域的蛋白2(EHD2)、载脂蛋白A2(APOA2)、NADH:泛醌氧化还原酶亚基B7(NDUFB7)、蛋白激酶Cδ结合蛋白(PRKCDBP)、层粘连蛋白亚基α3(LAMA3)、EvC睫状复合物亚基2(LBN)、肌动蛋白样蛋白(ACT)、胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3)、前列腺素D2合成酶(L-PGDS)、hapless(HAP)、肝细胞生长因子(HGF)、真核翻译起始因子4γ2(AAG1/2)、簇集素(CLU)、钙网蛋白(SSA)、tRNA抑制性反密码子2-1(TTA)、载脂蛋白A4(APOA4)、纤维蛋白原α链(FIBA)、血清淀粉样蛋白A簇(SAA)、血浆铜蓝蛋白(CP)、触珠蛋白(HP)、甲状腺素视黄质运载蛋白(TTR)、角蛋白2(KRT2A)、溶质载体家族1(GLT1B)、酪蛋白激酶1(CK1)、丝氨酸/苏氨酸激酶1(AKT)、MBL2(甘露糖结合凝集素2)、纤维蛋白原α链(FGA)、凝溶胶蛋白(GSN)、纤胶凝蛋白3(FCN3)、肌肽二肽酶1(CNDP1)、降钙素相关多肽α(CALCA)、氨甲酰磷酸合成酶1(CPS1)、嗜铬粒蛋白B(CHGB)、内披蛋白(IVL)、前梯度蛋白2、蛋白二硫化物异构酶家族成员(AGR2)、核自身抗原精子蛋白(NASP)、磷酸果糖激酶血小板(PFKP)、血小板应答蛋白2(THBS2)、含硫氧还蛋白结构域的蛋白17(TXNDC17)、蛋白质原转换酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 1型(PCSK1)、细胞视黄酸结合蛋白2(CRABP2)、含酰基辅酶A结合结构域的蛋白3(ACBD3)、桥粒黏蛋白2(DSG2)、LPS反应性米色锚样蛋白(LRBA)、丝氨酸/苏氨酸激酶受体相关蛋白(STRAP)、VGF神经生长因子诱导蛋白(VGF)、NOP2核仁蛋白(NOP2)、脂质运载蛋白2(LCN2)、肌酸激酶、线粒体肌酸激酶1B(CKMT1B)、醛酮还原酶家族1成员B10(AKR1B10)、羧肽酶D(CPD)、蛋白酶体激活亚基3(PSME3)、绒毛蛋白1(VIL1)、丝酶抑制蛋白家族B成员5(SERPINB5)、核糖体蛋白L5(RPL5)、桥粒斑菲素蛋白1(PKP1)、核糖体蛋白L10(RPL10)、醛酮还原酶家族1成员B10(AKR1B10)、醛酮还原酶家族1成员C1(AKR1C1)、增殖细胞核抗原(PCNA)、核糖体蛋白S2(RPS2)、醛酮还原酶家族1成员C3(AKR1C3)、含酰基辅酶A结合结构域的蛋白3(ACBD3)、视锥蛋白样蛋白1(VSNL1)、腺苷高半胱氨酸酶(AHCY)、基质相互作用分子1(STIM1或IMMP10)、p21(RAC1)激活激酶2(PAK2)、内披蛋白(IVL)、异亮氨酸-tRNA合成酶(IARS)、非ATP酶蛋白酶体26S亚基泛素受体2(PSMD2)、鸟苷酸结合蛋白5(GBP5)、微小染色体维持复合体组分6(MCM6)、N-myc下游调节蛋白1(NDRG1)、NOP58核糖核蛋白(NOP58)、S100钙结合蛋白A2(S100A2)、神经调节蛋白1(NRG1-2)、肌肽二肽酶1(CNDP1)、泛素交叉反应蛋白(UCRP)、cerberus(CER)、纤溶酶原激活物、尿激酶(UPA或PLAU)、基质金属肽酶14(MT1-MMP)、分层蛋白(SFN)、转铁蛋白(TF)、白蛋白(ALB)、S100钙结合蛋白A9(S100A9)、抑微管装配蛋白1(STMN)、烯醇化酶(ENO)、胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)、基质金属肽酶14(MMP14)、血小板应答蛋白1(THBS1)和血小板应答蛋白2(THBS2)。

在一些实施方案中，靶向部分靶向由转移的癌细胞表达或释放的生物标志物。例如，癌细胞可以从一个组织产生，并且随后转移到另一个位置。在一些实施方案中，转移的癌细胞表达本文所述的癌症生物标志物的非限制性实例。在一些实施例中，转移的癌细胞表达癌症生物标志物，包括黑色素瘤相关抗原(MAGE-A3)、膜相关糖蛋白(MUC-1)、糖蛋白上皮细胞粘附分子(EpCAM)、KRAS原癌基因(KRAS)、间变性淋巴瘤激酶(ALK)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、表皮生长因子(EGF)、丝氨酸蛋白酶easter(EA)、端粒酶逆转录酶(TERT)、PRAME核受体转录调节因子(PRAME)、受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2(HER)或血管内皮生长因子(VEGF)、癌胚抗原(CEA)、MAGE-A1、MAGE-A4、存活蛋白、前列腺六段跨膜上皮抗原1(STEAP1)、SRY(性别决定区Y)-盒2(SOX2)或癌/睾丸抗原1(CTAG1B)。

在一些实施方案中，靶向部分靶向由内皮细胞表达或释放的生物标志物。在一些实施方案中，内皮细胞是血管细胞。在一些实施方案中，内皮细胞是淋巴管细胞。在一些实施方案中，生物标志物由血管细胞表达或释放。在一些实施方案中，生物标志物由淋巴管细胞表达或释放。内皮细胞生物标志物的非限制性实例包括血管紧张素I转化酶(ACE或CD143)、C1qR1/CD93、VE-钙黏着蛋白、CC趋化因子受体D6、CD31/PECAM-1、CD34、CD36/SR-B3、CD151、CD160、CD300g/Nepmucin、CL-K1/COLEC11、CL-P1/COLEC12、凝血因子III/组织因子、DC-SIGNR/CD299、DCBLD2/ESDN、ECSCR、EMMPRIN/CD147、内皮联蛋白/CD105、内皮粘蛋白、内皮唾液酸蛋白/CD248、EPCR、促红细胞生成素R、内皮细胞粘附分子(ESAM)、脂肪酸结合蛋白5(FABP5或E-FABP)、脂肪酸结合蛋白6(FABP6)、ICAM-1/CD54、ICAM-2/CD102、IL-1RI、IL-13Rα1、整合素α4/CD49d、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、整合素α2/CD18、克鲁珀尔样因子4(KLF4)、淋巴管内皮透明质酸受体1(LYVE-1)、MCAM/CD146、连接蛋白-2/CD112、PD-ECGF/胸苷磷酸化酶、足萼糖蛋白、平足蛋白、鞘氨醇-1-磷酸受体1(S1P1或EDG-1)、鞘氨醇-1-磷酸受体2(S1P2或EDG-5)、鞘氨醇-1-磷酸受体3(S1P3或EDG-3)、鞘氨醇-1-磷酸受体4(S1P4或EDG-6)、鞘氨醇-1-磷酸受体5(S1P5或EDG-8)、E-选择素/CD62E、P-选择素/CD62P、SLAM/CD150、稳定素-1、稳定素-2、含丛状蛋白结构域的蛋白1(TEM7或PLXDC1)、ANTXR细胞粘附分子1(TEM8或ANTXR1)、凝血酶调节蛋白/BDCA-3、含血小板应答蛋白1型结构域的蛋白1(THSD1)、含血小板应答蛋白1型结构域的蛋白7A(THSD7A)、TEK受体酪氨酸激酶(Tie-2)、TNF RI/TNFRSF1A、TNF RII/TNFRSF1B、TRA-1-85/CD147、TRAIL R2/TNFRSF10B、TRAILR1/TNFRSF10A、VCAM-1/CD106、VE-胆固醇合成酶抑制剂、VEGFR1/Flt-1、VEGFR2/KDR/Flk-1、VEGFR3/Flt-4、G补缀FHA结构域血管生成因子1(VG5Q)、或血管性假血友病因子(vWF-A2)。

在一些实施方案中，靶向部分包含参与趋化因子信号传导的趋化因子受体或趋化因子配体或其部分，例如像SDF-1α/CXCR4、CCL2/CCR2或粘附分子，例如像PSGL-1。如本文所示，去核细胞可以被去核以表达功能性CXCR4、CCR2以及糖基化的PSGL-1，这可以极大地促进去核细胞的特异性靶向。在一些实施方案中，靶向部分诸如CXCR4、CCR2或PSGL-1可以在去核细胞的表面上表达。可以作为靶向部分在去核细胞的细胞表面上表达的细胞表面蛋白的非限制性实例包括趋化因子，诸如CXCR4、CCR2、CCR1、CCR5、CXCR7、CXCR2和CXCR1。在一些实施方案中，去核细胞可以被去核以分泌靶向部分，或被拴系至细胞外基质，例如SDF1α或CCL2。可以由去核细胞分泌的靶向部分的非限制性实例包括SDF1α、CCL2、CCL3、CCL5、CCL8、CCL1、CXCL9、CXCL10、CCL11和CXCL12。在一些实施方案中，去核细胞包含细胞-基质受体，并且细胞-细胞粘附分子包括整合素、钙黏着蛋白、糖蛋白和硫酸肝素蛋白聚糖。

在一些实施方案中，去核细胞还可以包含(例如，通过工程化或从获得它们的细胞)有助于它们逃避对象的免疫系统的表面标志物。例如，在一些实施方案中，去核细胞可以包含CD47、PD-L1、HLA-E、HLA-G、其片段或其组合。不受任何特定理论的约束，据信CD47、PD-L1、HLA-E、HLA-G、其片段或其组合有助于防止去核细胞被巨噬细胞吞噬。细胞-基质受体和细胞-细胞粘附分子的非限制性实例包括整合素、钙黏着蛋白、糖蛋白或硫酸肝素蛋白聚糖。在一些实施方案中，细胞-基质受体或细胞-细胞粘附分子包括PD-L1、HLA-E或HLA-G。治疗分子的非限制性实例包括肿瘤抗原和免疫调节肽、多胺和ATP。在一些实施方案中，治疗分子可以被免疫细胞识别并且可以诱导免疫应答。例如，治疗分子可以是4-1BB或本文所述的诱导免疫应答的任一种细胞因子。

治疗剂

在一些实施方案中，本公开内容的细胞包含至少一种治疗剂。在一些实施方案中，细胞是经去核的，诸如用本文公开的去核方法。在一些实施方案中，治疗剂包含活性剂。在一些实施方案中，活性剂包括以下中的至少一种：DNA分子、RNA分子、蛋白质(例如，酶、抗体、抗原、毒素、细胞因子、蛋白质激素、生长因子、细胞表面受体或疫苗)、肽(例如，肽激素或抗原)、小分子(例如，类固醇、聚酮、生物碱、毒素、抗生素、抗病毒药物、秋水仙碱、紫杉醇、丝裂霉素或恩坦辛(emtansine))、基因编辑因子、纳米颗粒或另一种活性剂(例如，细菌、细菌孢子、噬菌体、细菌组分、病毒(例如，溶瘤病毒)、外泌体、脂质或离子)。RNA分子的非限制性实例包括信使RNA(mRNA)、短发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)、微RNA、长非编码RNA(lncRNA)和RNA病毒。DNA分子的非限制性实例包括单链DNA、双链DNA、寡核苷酸、质粒、细菌DNA分子和DNA病毒。蛋白质的非限制性实例包括细胞因子、生长因子、激素、抗体或其抗原结合片段、单结构域抗体或其抗原结合片段、基于小肽的药物和酶。溶瘤病毒的非限制性实例包括Talimogene laherparepvec、Onyx-015、GL-ONC1、CV706、Voyager-V1和HSV-1716。一些野生型病毒也显示溶瘤行为，诸如牛痘病毒、水疱性口炎病毒、脊髓灰质炎病毒、呼肠孤病毒、塞内卡病毒(Senecavirus)、ECHO-7或塞姆利基森林病毒(Semliki Forestvirus)。

在一些实施方案中，去核细胞被工程化以产生(例如，表达，并且在一些情况下，释放或分泌)治疗剂。在一些实施方案中，从其获得去核细胞的亲本细胞可以被工程化以在去核以产生去核细胞之前产生治疗剂。在一些实施方案中，去核细胞被工程化以在去核之后(在细胞核不存在的情况下)产生治疗剂。在一些实施方案中，治疗剂对于去核细胞或其亲本细胞是外源的。在一些实施方案中，治疗剂对于去核细胞或其亲本细胞是内源的。在一些实施方案中，本公开内容的去核细胞包含至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种治疗剂。

在一些实施方案中，治疗剂包含与天然存在的版本相比DNA分子、RNA分子、蛋白质、肽、小分子活性剂和/或基因编辑因子的经修饰版本。在一些实施方案中，治疗剂是DNA分子、RNA分子、蛋白质、肽、小分子活性剂和/或基因编辑因子的经校正、截短或非突变版本和/或拷贝。例如，治疗剂可以校正靶细胞中突变的肿瘤蛋白p53(p53)或表皮生长因子受体(EGFR)，作为肺癌治疗的一部分。

治疗剂可以是或包含本文所述的靶向部分。可以由去核细胞产生或包含在去核细胞中的靶向部分的非限制性实例包括趋化因子受体、粘附分子和抗原结合多肽(例如，单结构域抗体和抗原结合片段)或其部分。在一些实施方案中，治疗剂可以是或包含本文所述的跨膜部分。

在一些实施方案中，治疗剂由去核细胞或其亲本细胞重组表达。在一些实施方案中，从中衍生或获得去核细胞的亲本细胞被工程化以产生或表达治疗剂。在一些实施方案中，治疗剂的表达是稳定的(例如，永久的)。在一些实施方案中，由亲本细胞进行的治疗剂的表达是暂时的(例如，非永久的)。在一些实施方案中，在对去核细胞工程化之前将亲本细胞去核以重组表达治疗剂。在一些实施方案中，亲本细胞被工程化以在去核之前重组表达治疗剂。

在一些实施方案中，治疗剂不是在衍生或获得去核细胞的细胞中天然表达的(例如，在没有工程化的情况下)(例如，治疗剂对于亲本细胞是外源的)。在一些实施方案中，治疗剂不是在对象中天然表达的(例如，治疗剂对于对象是外源的)。在一些实施方案中，治疗剂不是在对象的预期治疗部位(例如，肿瘤或特定组织，诸如脑、肠、肺、心脏、肝脏、脾脏、胰腺、肌肉、眼睛等)处天然表达的(例如，治疗剂对于预期治疗部位是外源的)。在一些实施方案中，治疗剂的水平在亲本细胞的去核细胞中不是天然存在的，诸如治疗剂过表达或表达不足。

在一些实施方案中，治疗剂衍生自合成细胞并加载到去核细胞中。例如，治疗剂可以在细胞去核之前或之后被内吞到细胞中。可替代地，治疗剂可以由细胞合成并随后递送至靶细胞。

在一些实施方案中，治疗剂包含至少2种(例如，至少2、3、4、5种或更多种)不同的DNA分子、RNA分子、蛋白质、肽、小分子活性剂或基因编辑因子的任何组合。例如，在一些实施方案中，治疗剂包含DNA分子和小分子活性剂。例如，在一些实施方案中，治疗剂包含两种不同的小分子活性剂。例如，在一些实施方案中，治疗剂包含趋化因子受体(例如，用于靶向)和小分子活性剂。

在一些实施方案中，治疗剂包含多肽。在一些实施方案中，所述多肽是外源的。在一些实施方案中，所述多肽由递送到亲本细胞或去核细胞中的外源多核苷酸编码。在一些实施方案中，所述多肽由去核细胞的至少一个细胞内细胞器合成或释放。在一些实施方案中，所述多肽由去核细胞释放。在一些实施方案中，所述多肽在细胞表面或去核细胞上表达。在一些实施方案中，去核细胞将多肽递送至靶细胞。在一些实施方案中，所述靶细胞是癌细胞。在一些实施方案中，癌细胞表达本文所述的任何癌症的癌症生物标志物。在一些实施方案中，所述靶细胞是内皮细胞。在一些实施方案中，所述内皮细胞表达本文所述的内皮生物标志物。在一些实施方案中，所述内皮细胞是血管细胞。在一些实施方案中，所述内皮细胞是淋巴管细胞。

在一些实施方案中，所述外源多肽包含本文所述的任一种细胞因子的细胞因子。在一些实施方案中，所述外源多肽包含可溶性细胞因子。例如，外源多肽可以包含细胞因子的细胞外结构域或片段。在一些实施方案中，外源多肽具有如通过浊度溶解度测定或热力学溶解度测定确定的溶解度，通过将外源多肽溶解在溶剂，诸如有机溶剂，包括二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈等，或无机溶剂，包括水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)中来确定。在一些实施方案中，外源多肽具有至少0.0001mg/ml、0.0005mg/ml、0.001mg/ml、0.005mg/ml、0.01mg/ml、0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、5.0mg/ml、10mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、500mg/ml、1,000mg/ml、5,000mg/ml、10,000mg/ml、50,000mg/ml或100,000mg/ml的溶解度。

在一些实施方案中，外源多肽包括肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员多肽或其催化活性片段。TNF超家族成员多肽的非限制性实例包括淋巴毒素α(TNFβ)、肿瘤坏死因子(TNFα)、淋巴毒素β(TNFγ)、OX40配体(CD252、Gp34或CD134L)、CD40配体(CD154、TRAP、Gp39或T-BAM)、Fas配体(CD178、APTL或CD95L)、CD27配体(CD70)、CD30配体(CD153)、CD137配体(4-1BBL)、TNF相关细胞凋亡诱导配体(CD253或APO-2L)、核因子κ-β配体的受体激活剂(CD254、OPGL、TRANCE或ODF)、TNF相关的弱细胞凋亡诱导剂(APO-3L或DR3L)、增殖诱导配体(CD256、TALL-2或TRDL1)、B细胞激活因子(CD257、BLyS、TALL-1或TNFSF20)、LIGHT(CD258或HVEML)、血管内皮生长抑制剂(TL1或TL-1A)、TNF超家族成员18(GITRL、AITRL或TL-6)或外异蛋白A(ED1-A1或ED1-A2)。在一些实施方案中，外源多肽包含与SEQ ID NO:1501、1504、1505或1508具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多同一性的肽序列。在一些实施方案中，外源多肽包含LIGHT或其催化活性片段。在一些实施方案中，外源多肽包含与SEQID NO:1508具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多同一性的肽序列。在一些实施方案中，外源多肽包含LIGHT或其催化活性片段。在一些实施方案中，外源多肽包含与SEQ ID NO:1511具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多同一性的肽序列。

在一些实施方案中，外源多肽包含TNF超家族的可溶性成员或其可溶性催化活性片段。在一些实施方案中，可溶性TNF超家族成员多肽或其催化活性片段包含与SEQ ID NO:1501-1511具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多同一性的肽序列。在一些实施方案中，可溶性TNF超家族成员多肽或其催化活性片段包含与SEQ ID NO:1508-1510具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多同一性的肽序列。在一些实施方案中，可溶性TNF超家族成员多肽或其催化活性片段包含与SEQ ID NO:1511具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多同一性的肽序列。

在一些实施方案中，治疗剂包含本文所述的免疫检查点分子中的任一种或用于抑制本文所述的免疫检查点分子中的任一种的免疫检查点分子抑制剂。免疫检查点分子的非限制性实例包括PD-1、PD-L1、CTLA-4、VISTA、PDCD1LG2(CD273)、B7-H3(也称为CD276)、A2AR、CD27、LAG3、TIM-3、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、CD73、NKG2A、PVRIG、PVRL2、CEACAM1、CEACAM5、CEACAM6、FAK、CCR-2、CCL-2、LIF、CD47、SIRPα、M-CSF、CSF-1R、IL-3、IL-1RAP、IL-8、SEMA4D、血管生成素-2、CLEVER-1、Axl、磷脂酰丝氨酸或其片段。

在一些实施方案中，治疗剂包含抗体，诸如本文所述的单结构域抗体。在一些实施方案中，所述抗体或单结构域抗体与免疫检查点分子结合。在一些实施方案中，所述单结构域抗体与免疫检查点分子结合并调控免疫检查点分子的表达或活性。在一些实施方案中，所述单结构域抗体是免疫检查点分子的活性或表达的抑制剂。在一些实施方案中，所述单结构域抗体是免疫检查点分子的活性或表达的激活剂。在一些实施方案中，所述抗体或单结构域抗体与以下结合：PD-1、PD-L1、CTLA-4、VISTA、PDCD1LG2(CD273)、B7-H3(也称为CD276)、A2AR、CD27、LAG3、TIM-3、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、CD73、NKG2A、PVRIG、PVRL2、CEACAM1、CEACAM5、CEACAM6、FAK、CCR-2、CCL-2、LIF、CD47、SIRPα、M-CSF、CSF-1R、IL-3、IL-1RAP、IL-8、SEMA4D、血管生成素-2、CLEVER-1、Axl、磷脂酰丝氨酸或其片段。在一些实施方案中，包含所述抗体或单结构域抗体的治疗剂与PD-L1结合。在一些实施方案中，包含所述抗体或单结构域抗体的治疗剂与CTLA-4结合。在一些实施方案中，所述免疫检查点分子包含与SEQ ID NO:155-164、203、204、315-322、511、531-535、551-554、571、594、611-619或711中的任一个具有大于或等于约80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体或其片段由与SEQ ID NO:801具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的脱氧核糖核酸(DNA)序列编码。在一些实施方案中，所述单结构域抗体或其片段包含与SEQ ID NO:851具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体或其片段由与SEQ ID NO:901具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的DNA序列编码。在一些实施方案中，所述单结构域抗体或其片段包含与SEQ ID NO:951具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，治疗剂包含抗体，诸如结合结缔组织生长因子(CTGF)的单结构域抗体。在一些实施方案中，所述单结构域抗体或其片段包含与SEQ ID NO:1701具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的多肽序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体或其片段与CTGF的氨基酸序列结合，其中所述CTGF的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1601或SEQ ID NO:1602。

在一些实施方案中，治疗剂包括包含血管生成抑制剂的外源剂。在一些实施方案中，血管生成抑制剂包括抑制血管内皮生长因子(VEGF)受体(VEGFR)或其组合(VEGF/VEGFR)的抑制剂。在一些实施方案中，VEGF/VEGFR抑制剂包含化合物、小分子、肽、抗体或其组合。在一些实施方案中，VEGF抑制剂抑制VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、胎盘生长因子(PIGF)或其组合。在一些实施方案中，VEGF抑制剂是VEGF-A抑制剂。在一些实施方案中，VEGF抑制剂包含用于靶向和抑制VEGF-A的抗体或单结构域抗体。在一些实施方案中，VEGF抑制剂包含肽，诸如KDR或FLT1肽。在一些实施方案中，VEGF抑制剂包含用于靶向和抑制VEGF-A受体的抗体或单结构域抗体。

抗体和单结构域抗体

在一些实施方案中，本文描述了去核细胞，其包含抗体或单结构域抗体。在一些实施方案中，去核细胞包含编码抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。在特定实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段可以是中和抗体、非中和抗体或其组合。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是单结构域抗体。单结构域抗体(sdAb)的实用性和优势包括但不限于与其全长抗体相比，其尺寸更小、可触及表位数量更多、生产成本相对较低以及稳健性改善。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段是人源化抗体、其变体或衍生物，其可以例如配制成用于施用于人。在一些实施方案中，人源化抗体是嵌合人源化抗体或全人抗体，例如包含来自人抗体氨基酸序列或与人抗体氨基酸序列具有相似性的氨基酸序列，以及非人氨基酸序列。例如，嵌合人源化抗体的重链和/或轻链的一部分可以与人抗体中的对应序列相同或相似，而一条或多条链的其余部分可以是非人链，例如，与衍生自另一个物种或属于另一个抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或相似。非人序列可以人源化以降低免疫原性的可能性，同时保留靶特异性，例如，通过将人DNA掺入在非人动物中产生抗体的基因的基因序列中。人源化抗体可以是全人抗体，例如含有作为人抗体氨基酸序列的氨基酸序列。

本公开内容的抗体或其抗原结合片段可以包含基础四链抗体单元。基础四链抗体单元包含两个重链(H)多肽序列和两个轻链(L)多肽序列。每条重链包含一个N末端可变(VH)区和三个或四个C末端恒定(CH1、CH2、CH3和CH4)区。每条轻链包含一个N末端可变(VL)区和一个C末端恒定(CL)区。轻链可变区与重链可变区对齐，并且轻链恒定区与第一重链恒定区CH1对齐。重链可变区和轻链可变区配对在一起形成单个抗原结合位点。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接。两条重链通过一个或多个二硫键彼此连接，这取决于重链同种型。每条重链和轻链还可以包含规则间隔的链内二硫键。重链的C末端恒定区包括抗体的Fc区，其可以介导效应功能，例如，通过与Fc受体或补体蛋白相互作用。

轻链可以基于恒定区的氨基酸序列被指定为κ或λ。重链可以基于恒定区的氨基酸序列被指定为α、δ、ε、γ或μ。抗体基于重链分为五个免疫球蛋白类别或同种型。IgA包括α重链，IgD包括δ重链，IgE包括ε重链，IgG包括γ重链，并且IgM包括μ重链。IgG、IgD和IgE类别的抗体包含以上所述的四链单元(两条重链和两条轻链)的单体，而IgM和IgA类别包含四链单元的多聚体。α类别和γ类别可以基于重链恒定区的序列和功能的差异而进一步分为亚类。人表达的IgA和IgG的亚类包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。本公开内容的抗体包含人轻链恒定结构域序列，例如κ(IgK)链或λ(IgL)链。在一些实施方案中，抗体包含人IgK恒定结构域、其变体、衍生物或片段。在一些实施方案中，抗体包含人IgL恒定结构域、其变体、衍生物或片段。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体或其抗原结合片段包含信号肽。信号肽可以导致细胞的更高蛋白质表达和/或分泌。信号肽酶可以例如在分泌过程期间从抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体或其抗原结合片段上切割信号肽，从而生成不包含信号肽序列的成熟抗体。

抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体或其抗原结合片段的恒定区可以介导各种效应功能，并且可以最小地参与抗原结合。例如，由于与不同Fc受体和/或补体蛋白的相互作用，不同的IgG同种型或亚类可能与不同的效应功能或治疗特征相关联。包含接合激活Fc受体的Fc区的抗体可以例如参与抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、补体依赖性细胞毒性(CDC)、通过免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)诱导信号传导以及诱导细胞因子分泌。包含接合抑制性Fc受体的Fc区的抗体可以例如通过免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)诱导信号传导。

不同的抗体亚类具有不同的引发免疫效应功能的能力。例如，IgG1和IgG3可以有效地募集补体来激活CDC，IgG2引发微小ADCC。IgG4触发免疫效应功能的能力较低。恒定区的修饰也可以影响抗体特征，例如，增强或减少Fc受体连接、增强或减少ADCC、增强或减少ADCP、增强或减少CDC、增强或减少通过ITAM进行的信号传导、增强或减少细胞因子诱导、增强或减少通过ITIM进行的信号传导、增强或减少半衰期、或增强或减少抗原与Fc受体的共接合。修饰可以包括例如氨基酸突变、改变翻译后修饰(例如，糖基化)、组合来自不同同种型或亚类的结构域或其组合。

本公开内容的抗体或其抗原结合片段包含恒定区或Fc区，所述区域被选择或修饰以提供合适的抗体特征，例如，用于治疗如本文公开的疾病或病症的合适特征。在一些实施方案中，IgG1可以用于例如促进炎症、免疫激活和免疫效应功能，以用于治疗感染。在一些实施方案中，IgG4可以用于例如需要具有降低的免疫效应功能的抗体的拮抗特性的情况(例如，中和冠状病毒抗原并抑制病毒进入细胞而不促进炎症和免疫激活)。

可变(V)区介导抗原结合并限定特定抗体对抗原的特异性。可变区包含称为构架区的相对不变的序列，和在具有不同结合特异性的抗体之间的序列差异相当大的高变区。每条抗体重链或轻链的可变区包含被三个高变区分开的四个框架区。重链和轻链的可变区以使高变区紧密地聚集在一起，以产生抗原结合位点的方式折叠。四个框架区主要采用f3折叠构型，而三个高变区形成连接f3折叠结构并在一些情况下形成其一部分的环。

在高变区内有主要决定抗体的结合特异性的氨基酸残基。包含这些残基的序列称为互补决定区(CDR)。抗体的一个抗原结合位点包含六个CDR，三个在轻链的高变区，三个在重链的高变区。轻链中的CDR可以被指定为LCDR1、LCDR2、LCDR3，而重链中的CDR可以被指定为HCDR1、HCDR2和HCDR3。

在一些实施方案中，本公开内容的抗体或其抗原结合片段包含其变体或衍生物。例如，非人动物可以进行基因修饰以产生抗体变体或衍生物。在一些实施方案中，抗体可以是单结构域抗体(sdAb)，例如仅重链抗体(HCAb)VHH或纳米抗体。抗原结合片段的非限制性实例包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fab IL-6R的二聚体和三聚体、Fv、scFv、微型抗体(minibody)、双链抗体、三链抗体和四链抗体，以及线性抗体。Fab和Fab'是抗原结合片段，其包含通过二硫键与轻链的VL和CL结构域连接的重链的VH和CH1结构域。F(ab')2包含通过二硫键连接的两个Fab或Fab'。Fv包含通过非共价相互作用保持在一起的VH和VL结构域。scFv(单链可变片段)是一种融合蛋白，其包含通过肽接头连接的VH和VL结构域。对VH和VL结构域的取向以及接头长度的操控可以用于产生不同形式的分子，所述分子可以是单体、二聚体(双链抗体)、三聚体(三链抗体)或四聚体(四链抗体)。微型抗体是组装成二价二聚体的scFv-CH3融合蛋白。

在其他实施方案中，抗体是其结合片段。在一些情况下，抗体是人源化抗体或其结合片段、嵌合抗体或其结合片段、单克隆抗体或其结合片段、多特异性抗体或其结合片段、双特异性抗体或其结合片段、或其单结构域抗体(例如，)。在一些情况下，抗体是单价Fab'、二价Fab2、F(ab)'3片段、单链可变片段(scFv)、bis-scFv、(scFv)2、双链抗体、微型抗体、纳米抗体、三链抗体、四链抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)、单结构域抗体(sdAb)、Ig NAR、骆驼科动物抗体或其结合片段或其化学修饰的衍生物。在一些实施方案中，抗体可以是多特异性抗体。在一些情况下，多特异性抗体包含两个或更多个靶结合部分，其中两个或更多个靶结合部分中的每一个与抗原特异性结合，并且两个或更多个抗原是不同的。在一些情况下，多特异性抗体包含与三个或更多个不同抗原、四个或更多个不同抗原或五个或更多个不同抗原特异性结合的靶结合部分。在一些实施方案中，抗体可以是双特异性抗体。在一些情况下，双特异性抗体或结合片段包括杵臼(KiH)、不对称重工程化技术免疫球蛋白(ART-Ig)、Triomab quadroma、双特异性单克隆抗体(BiMAb、BsmAb、BsAb、bsMab、BS-Mab或Bi-MAb)、FcΔAdp、XmAb、Azymetric、基于T细胞受体的抗体双特异性接合(BEAT)、双特异性T细胞接合器(BiTE)、Biclonics、Fab-scFv-Fc、二合一/双作用Fab(DAF)、FinomAb、scFv-Fc-(Fab)融合、停靠锁定(DNL)、Adaptir(以前称为SCORPION)、串联双链抗体(TandAb)、双重亲和力重定向(DART)或纳米抗体。在一些实施方案中，双特异性抗体是三功能抗体或双特异性微抗体。在一些情况下，双特异性抗体是三功能抗体。所述三功能抗体可以是包含两个不同抗原的结合位点的全长单克隆抗体。

在一些情况下，双特异性抗体是双特异性微抗体。在一些情况下，双特异性微抗体包括二价Fab2、F(ab)'3片段、bis-scFv、(scFv)2、双链抗体、微型抗体、三链抗体、四链抗体或双特异性T细胞接合器(BiTE)。在一些实施方案中，双特异性T细胞接合器是融合蛋白，其含有两个单链可变片段(scFv)，其中两个scFv靶向两个不同抗原的表位。

在一些实施方案中，本文所述的抗体包含IgG框架、IgA框架、IgE框架或IgM框架。在一些情况下，抗体包含IgG框架(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。在一些情况下，抗体包含IgG1框架。在一些情况下，抗体包含IgG2(例如，IgG2a或IgG2b)框架。在一些情况下，抗体包含IgG2a框架。在一些情况下，抗体包含IgG2b框架。在一些情况下，抗体包含IgG3框架。在一些情况下，抗体包含IgG4框架。

在一些情况下，本文所述的抗体在框架区，例如，在CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域、铰链区或其组合中包含一个或多个突变。在一些情况下，一个或多个突变用于稳定抗体和/或增加半衰期。在一些情况下，一个或多个突变用于调控Fc受体相互作用，减少或消除Fc效应功能，诸如FcyR、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。在另外的情况下，一个或多个突变用于调控糖基化。

在一些实施方案中，抗体包括人源化抗体或其结合片段或嵌合抗体或其结合片段。在一些实施方案中，抗体包括多特异性抗体或其结合片段。在一些实施方案中，抗体包括双特异性抗体或其结合片段。在一些实施方案中，抗体可以是IgG-scFv、纳米抗体、BiTE、双链抗体、DART、TandAb、scDiabody、scDiabody-CH3、三重体(triple body)、微抗体(mini-antibody)、微型抗体(minibody)、TriBi微型抗体、scFv-CH3KIH、Fab-scFv-Fc KIH、Fab-scFv、scFv-CH-CL-scFv、F(ab')2、F(ab')2-scFv2、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四价HCAb、scDiabody-Fc、二链抗体-Fc、串联scFv-Fc或内抗体。在一些情况下，抗体是单价Fab'、二价Fab2、F(ab)'3片段、单链可变片段(scFv)、bis-scFv、(scFv)2、双链抗体、微抗体、纳米抗体、三链抗体、四链抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)、单结构域抗体(例如，scFv)、IgNAR、骆驼科动物抗体或其结合片段或其化学修饰的衍生物。

在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体或其抗原结合片段结合与本文所述的疾病或病症相关联的靶细胞表达的表位。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体或其抗原结合片段结合与本文所述的微环境相关联的表位。表位的非限制性实例包括细胞因子的肽片段、免疫检查点分子或与疾病或病症相关联的任何其他蛋白质。细胞因子的非限制性实例可以包括4-1BBL、促酰化蛋白、脂肪细胞因子、白蛋白干扰素(albinterferon)、APRIL、Arh、BAFF、Bcl-6、CCL1、CCL1/TCA3、CCL11、CCL12/MCP-5、CCL13/MCP-4、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17/TARC、CCL18、CCL19、CCL2、CCL2/MCP-1、CCL20、CCL21、CCL22/MDC、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL3L3、CCL4、CCL4L1/LAG-1、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCR10、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CD153、CD154、CD178、CD40LG、CD70、CD95L/CD178、Cerberus(蛋白质)、趋化因子、CLCF1、CNTF、集落刺激因子、共同b链(CD131)、共同g链(CD132)、CX3CL1、CX3CR1、CXCL1、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL17、CXCL2、CXCL2/MIP-2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL9、CXCR3、CXCR4、CXCR5、EDA-A1、Epo、促红细胞生成素、FAM19A1、FAM19A2、FAM19A3、FAM19A4、FAM19A5、Flt-3L、FMS样酪氨酸激酶3配体、Foxp3、GATA-3、GcMAF、G-CSF、GITRL、GM-CSF、粒细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、肝细胞生长因子、IFNA1、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA2、IFNA4、IFNA5/IFNaG、IFNA7、IFNA8、IFNB1、IFNE、IFNG、IFNZ、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFNω/IFNW1、IL-1、IL-10、IL-10家族、IL-10样蛋白、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-17家族、IL-17A-F、IL-18、IL-18BP、IL-19、IL-1A、IL-1B、IL-1F10、IL-1F3/IL-1RA、IL-1F5、IL-1F6、IL-1F7、IL-1F8、IL-1F9、IL-1样蛋白、IL-1RA、IL-1RL2、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-3、IL-31、IL-33、IL-35、IL-4、IL-5、IL-6、IL-6样蛋白、IL-7、IL-8/CXCL8、IL-9、炎性小体、干扰素组、干扰素、干扰素β-1a、干扰素β-1b、干扰素γ、I型干扰素、II型干扰素、III型干扰素、干扰素、白介素、白介素1受体拮抗剂、白介素8、IRF4、瘦素、白血病抑制因子(LIF)、白细胞促进因子、LIGHT、LTA/TNFB、LT-β、淋巴因子、淋巴毒素、淋巴毒素α、淋巴毒素β、巨噬细胞集落刺激因子、巨噬细胞炎症蛋白、巨噬细胞激活因子、M-CSF、MHC III类、混杂红细胞生成素、单核因子、MSP、肌细胞因子、肌联素、烟酰胺磷酸核糖基转移酶、抑癌蛋白M(OSM)、奥普瑞白介素(oprelvekin)、OX40L、血小板因子4、promegapoietin、RANKL、SCF、STAT3、STAT4、STAT6、基质细胞衍生因子1、TALL-1、TBX21、TGF-α、TGF-β、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TNF、TNFSF10、TNFSF11、TNFSF12、TNFSF13、TNFSF14、TNFSF15、TNFSF4、TNFSF8、TNF-α、TNF-β、Tpo、TRAIL、TRANCE、TWEAK、血管内皮生长抑制剂、XCL1或XCL2。免疫检查点分子的实例可以包括VISTA、PDCD1LG2(CD273)、PD-L1、CTLA-4、PD-L2、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、B7-H3(CD276)、B7-H2、B7-H4(VTCN1)、HVEM(CD270，TNFRSF14)、半乳凝素9、半乳凝素3、CEACAM1(CD66a)、OX-2(CD200)、PVR(CD155)、PVRL2(连接蛋白-2，CD112)、FGL-1、PECAM-1、TSG-6、CD47、稳定素-1(Clever-1)、神经菌毛素1、神经菌毛素2、CD158(家族)、IGSF2(CD101)、CD155、GITRL、CD137L、OX40L、LIGHT、CD70、PD-1、RGMB、CTLA-4(CD152)、BTLA、CD160、Tim-3、CD200R、TIGIT、CD112R(PVRIG)、LAG-3(CD223)、PECAM-1、CD44、SIRPα(CD172a)或IGSF11。在一些实施方案中，表位是选自LAG-3、P2X7或白蛋白或其任何组合或部分的肽序列。在一些实施方案，抗体或其抗原结合片段(例如，单结构域抗体)结合与特发性肺纤维化相关联的靶细胞表达的表位。在一些实施方案，抗体或其抗原结合片段(例如，单结构域抗体)结合包含编码CTGF的肽序列的表位。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或其片段对于包含SEQ ID NO:1601-1602中的至少一种肽序列的抗原具有特异性。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或片段包含与SEQ ID NO:1701具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的肽序列。

在一些实施方案中，所述外源抗体或单结构域抗体充当激动剂或拮抗剂，其中在与本文所述的任一个表位结合时，所述抗体或单结构域抗体的结合诱导激动剂或拮抗剂作用。例如，所述外源抗体或单结构域抗体在与免疫检查点抑制剂(诸如PD-L1/PD-1或CTLA-4)结合后，对免疫检查点信号传导途径(SEQ ID NO:801、851、901和951)产生激动或拮抗作用。在一些实施方案中，由去核细胞表达的外源抗体或单结构域抗体由与SEQ ID NO:801具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或其片段包含与SEQ ID NO:851具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的多肽序列。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或其片段由与SEQ ID NO:901具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或其片段包含与SEQ ID NO:951具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的多肽序列。

在一些情况下，表位可以包含病原体蛋白的肽序列。例如，表位可以是病毒蛋白或其片段。在一些实施方案中，表位可以是冠状病毒的病毒蛋白。在一些实施方案中，冠状病毒可以是严重急性呼吸综合征相关病毒(SARS-CoV)。在一些实施方案中，SARS-CoV是SARS-CoV-2。在一些实施方案中，表位可以是选自以下的病毒蛋白：orf1a、orf1ab、刺突蛋白(S蛋白)、3a、3b、包膜蛋白(E蛋白)、基质蛋白(M蛋白)、p6、7a、7b、8b、9b、核衣壳蛋白(N蛋白)、orf14、nsp1(前导蛋白)、nsp2、nsp3、nsp4、nsp5(3C样蛋白酶)、nsp6、nsp7、nsp8、nsp9、nsp10(生长因子样蛋白)、nsp12(RNA依赖性RNA聚合酶或RdRp)、nsp13(RNA 5'-三磷酸酶)、nsp14(3'至5'核酸外切酶)、nsp15(endoRNAse)和nsp16(2'-O-核糖甲基转移酶)、其部分或其组合。

表位的另一个实例可以包含流感病毒的病毒蛋白的肽序列。在一些实施方案中，所述流感病毒选自甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒和丁型流感病毒。在另外的实施方案中，甲型流感病毒具有H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7、H7N9或H6N1亚型。在另外的实施方案中，乙型流感病毒具有B/Yamagata/16/88样谱系或B/Victoria/2/87样谱系。在一些实施方案中，流感可以是流感病毒的任何毒株或流感病毒染色内的任何血清型。在一些情况下，流感病毒包括病毒表面糖蛋白血凝素(H或HA)和神经氨酸酶(N或NA)的任何组合。

在一些实施方案中，所述表位由SEQ ID NO:131-134、142-152、201、202、301-312、501、521-526、541-545、561、584、591-601和701-705中提供的核酸序列编码。在一些实施方案中，所述表位由与SEQ ID NO:131-134、142-152、201、202、301-312、501、521-526、541-545、561、584、591-601和701-705中存在的核酸序列具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大同一性的核酸序列编码。

在一些实施方案中，所述表位包含SEQ ID NO:155-164、203、204、315-322、511、531-535、551-554、571、594、611-619和711中提供的肽序列。在一些实施方案中，所述表位包含与SEQ ID NO:155-164、203、204、315-322、511、531-535、551-554、571、594、611-619和711中存在的肽序列具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大同一性的肽序列。

在一些情况下，抗体或其抗原结合片段(例如，单结构域抗体)由本文所述的多核苷酸序列编码。在一些实施方案中，所述多核苷酸序列对于去核细胞或亲本细胞是外源的。在一些实施方案中，所述多核苷酸序列包含与编码本文所述的抗体或其抗原结合片段的mRNA或cDNA序列具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大同一性的核酸序列。

在一些实施方案中，去核细胞包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码抗体或其抗原结合片段(例如，单结构域抗体)的核酸序列。由本文的多核苷酸编码的抗体或其抗原结合片段的非限制性实例可以在SEQ ID NO:1-36、101-111、121-123、165-192、195、205、206、211-213、221-231、241-245、325-331和401-404中找到。

在一些实施方案中，去核细胞包含具有SEQ ID NO:1-36、101-111、121-123、165-192、195、205、206、211-213、221-231、241-245、325-331和401-404中提供的氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段(例如，单结构域抗体)。在一些实施方案中，所述单结构域抗体包含与SEQ ID NO:1-36、101-111、121-123、165-192、195、205、206、211-213、221-231、241-245、325-331和401-404中列出的氨基酸序列具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与肿瘤坏死因子(TNF)结合。TNF的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体的肽序列的实例可以在SEQ ID NO:1-36中找到。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与白蛋白结合。白蛋白的抗体或单结构域抗体的肽序列的非限制性实例可以在SEQ ID NO:101-111中找到。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或片段包含与SEQ ID NO:101-111具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的肽序列。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与嘌呤受体P2X7(P2X7)结合。P2x7的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体的肽序列的实例可以在SEQ ID NO:121-123中找到。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或片段包含与SEQ ID NO 121-123具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的肽序列。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与人PD-L1结合，所述人PD-L1由与SEQ ID NO:131-152中的任一个具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸编码。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与人PD-L1结合，所述人PD-L1包含与SEQ ID NO:155-164中的任一个具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽序列。人PD-L1的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体的肽序列的实例可以在SEQID NO:165-192中找到。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或片段包含与SEQ IDNO:165-192具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的肽序列。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与小鼠CD274抗原(PD-L1)结合。小鼠PD-L1的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体的肽序列的实例与SEQ ID NO:195具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与人CTLA-4结合，所述人CTLA-4由与SEQ ID NO:201或SEQ ID NO:202具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸编码。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与人CTLA-4结合，所述人CTLA-4包含与SEQID NO:203或SEQ ID NO:204具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽序列。人CTLA-4的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体的肽序列的实例可以在SEQ ID NO:205和206中找到。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或片段包含与SEQ ID NO:205或206具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的肽序列。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与小鼠CTLA-4结合。小鼠CTLA-4的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体的肽序列的实例可以在SEQ ID NO:211-213中找到。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或片段包含与SEQ ID NO:211-213具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的肽序列。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与白介素-6受体(IL-6R)结合。IL-6R的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体的肽序列的实例可以在SEQ ID NO:221-231和241-245中找到。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或片段包含与SEQ ID NO:221-231和241-245具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的肽序列。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与人淋巴细胞活化基因3(LAG-3)结合，所述人LAG-3由与SEQ ID NO:301-312中的任一个具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸编码。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与人LAG-3结合，所述人LAG-3包含与SEQ ID NO:315-321中的任一个具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽序列。人LAG-3的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体的肽序列的实例可以在SEQ ID NO:325-331中找到。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或片段包含与SEQ IDNO:325-331具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的肽序列。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与刺突蛋白，例如冠状病毒的刺突糖蛋白结合。刺突蛋白的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体或其抗原结合片段的肽序列的实例可以在SEQ ID NO:401-404中找到。在一些实施方案中，所述外源单结构域抗体或片段包含与SEQ ID NO:401-404具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的肽序列。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体或其抗原结合片段可以与本文所述的任一种病原体的表位结合。病原体的非限制性实例可以在表1中找到。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体或其抗原结合片段可以与程序性细胞死亡1配体2(PDCD1LG2)结合，所述PDCD1LG2由与SEQ ID NO:501具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸编码。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与PDCD1LG2结合，所述PDCD1LG2包含与SEQ ID NO:511具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽序列。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与程序性细胞死亡蛋白1(PDCD-1或PD-1)结合，所述程序性细胞死亡蛋白1由与SEQ ID NO:521-526中的任一个具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸编码。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与PDCD-1结合，所述PDCD-1包含与SEQ ID NO:531-535中的任一个具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽序列。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与PD-1结合，所述PD-1由与SEQ ID NO:541-545中的任一个具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸编码。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与PD-1结合，所述PD-1包含与SEQ ID NO:551-554中的任一个具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽序列。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与PD-1结合，所述PD-1由与SEQ ID NO:561具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与LAG3相关蛋白(LAG3P)结合，所述LAG3P由与SEQ ID NO:561中的任一个具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸编码。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与LAG3P结合，所述LAG3P包含与SEQID NO:571中的任一个具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽序列。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与含T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域的蛋白3(TIM3)结合，所述TIM3由与SEQ ID NO:581具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸编码。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与TIM3结合，所述TIM3包含与SEQ ID NO:594中的任一个具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽序列。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以结合具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)，所述TIGIT由与SEQ ID NO:591至SEQ IDNO:601中的任一个具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸编码。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与TIGIT结合，所述TIGIT包含与SEQ ID NO:611至SEQ ID NO:619中的任一个具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽序列。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与T细胞活化的V结构域Ig抑制因子(VISTA)结合，所述VISTA由与SEQ ID NO:701至SEQ ID NO:705中的任一个具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸编码。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与VISTA结合，所述VISTA包含与SEQ ID NO:711具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽序列。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与人脑源性神经营养因子(BDNF)结合，以发挥针对人BDNF的拮抗剂作用。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与小鼠BDNF结合，以发挥针对小鼠BDNF的拮抗剂作用。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与人原肌球蛋白受体激酶B(TrkB)结合，以发挥针对人TrkB的拮抗剂作用。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与小鼠TrkB结合，以发挥针对小鼠TrkB的拮抗剂作用。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与人TrkB结合，以发挥针对人TrkB的激动剂作用。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与小鼠TrkB结合，以发挥针对小鼠TrkB的激动剂作用。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与人PD-1结合，以发挥针对人PD-1的激动剂作用。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与小鼠PD-1结合，以发挥针对小鼠PD-1的激动剂作用。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与人PD-L1结合，以发挥针对人PD-L1的拮抗剂作用。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与小鼠PD-L1结合，以发挥针对小鼠PD-L1的拮抗剂作用。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与CTLA-4，诸如Yervoy(伊匹单抗(ipilimumab))结合。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与PD-1，诸如纳武单抗(Nivolumab)(欧狄沃(Opdivo))、派姆单抗(Pembrolizumab)(可瑞达(Keytruda))或西米普利单抗(Cemiplimab)(Libtayo)结合。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与PD-L1，诸如阿维单抗(Avelumab)(巴文西亚(Bavencio))、德瓦鲁单抗(durvalumab)(Imfinzi)或阿替利珠单抗(atezolizumab)(特善奇(Tecentriq))结合。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与HER2，诸如赫赛汀(Herceptin)(曲妥珠单抗(trastuzumab))、马吉妥昔单抗(margetuximab-cmkb，MARGENZA)或帕妥珠单抗(Pertuzumab)(帕罗嘉(Perjeta))结合。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与TROP-2，诸如沙西妥珠单抗(Sacituzumab，Trodelvy)结合。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与IL-6，诸如司妥昔单抗(Siltuximab)(萨温珂(Sylvant))结合。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与IL-6R，诸如托珠单抗(Tocilizumab)(雅美罗(Actemra))结合。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与CD20，诸如利妥昔单抗(Rituximab)(美罗华(MabThera))结合。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体或其抗原结合片段可以与药物缀合，以形成抗体-药物缀合物(ADC)。可以作为ADC的一部分的药物或化合物的实例可以包括化疗剂、细胞毒性剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂、抗血管生成剂、心脏保护剂和/或检查点抑制剂。非限制性检查点抑制剂包括IMP321/依替莫德α(Eftilagimod alpha，Immutep)、瑞拉利单抗(Relatlimab)BMS-986016、伊匹单抗(Yervoy)、派姆单抗(可瑞达)、纳武单抗(欧狄沃)、西米普利单抗(Libtayo)、阿替利珠单抗(特善奇)、阿维单抗(巴文西亚)、德瓦鲁单抗(Imfinzi)、伊匹单抗(Yervoy)、LAG525、MK-4280、伊立替康(Irinotecan)、奥沙利铂(Oxaliplatin)、REGN3767、TSR-033、BI754111、Sym022、FS118(双特异性抗LAG3/PD-L1拮抗mAb)、MGD013(双特异性抗LAG3/PD-1拮抗mAb)、TSR-022、尼拉帕尼(Niraparib)、贝伐珠单抗(Bevacizumab)、MBG453、地西他滨(Decitabine)、斯巴达珠单抗(Spartalizumab)、Sym023、INCAGN2390、LY3321367、雷莫芦单抗(Ramucirumab)、阿贝西利(Abemaciclib)、美沙替尼(Merestinib)、BMS-986258、SHR-1702、卡瑞利珠单抗(Camrelizumab)、MK-7684、艾替利单抗(Etigilimab)/OMP-313M32、替瑞利尤单抗(Tiragolumab)/MTIG7192A/RG-6058、BMS-986207、AB-154、ASP-8374、JNJ-61610588、CA-170d、依诺妥珠单抗(Enoblituzumab)/MGA271、MGD009、I-8H9/奥博妥单抗(omburtamab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、MGD013(抗PD-1、抗LAG-3双重检查点抑制剂)、BGB-A1217、CM-24(MK-6018)、BMS 986178、MEDI6469、PF-04518600、GSK3174998、MOXR0916、乌托鲁单抗(Utomilimab，PF-05082566)、乌瑞芦单抗(Urelumab，BMS-663513)ES101、BMS-986156、TRX-518、AMG 228、JTX-2011、GSK3359609、BMS-986226、MEDI-570或伐立鲁单抗(Varlilumab，CDX-1127)。此类化合物或药物可以以有效用于预期目的量组合存在。在一些实施方案中，所述ADC包含用于治疗特发性肺纤维化的分子。在一些实施方案中，所述ADC包含尼达尼布(nintedanib)或吡非尼酮(pirfenidone)。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与VEGF、VEGFR或其组合(VEGF/VEGFR)结合。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与以下结合：VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、胎盘生长因子(PIGF)、血管生成素-1、血管生成素-2、内皮抑素、FGF、MMP、DII4、3类轴突导向蛋白、FGF、VEGFR、NRP-1、PDGF(BB-同源二聚体)、PDGFR、TGF-β、内皮联蛋白、TGF-β受体、CCL2、整合素αVβ3、αVβ5或α5β1、VE-钙黏着蛋白、CD31、肝配蛋白、纤溶酶原激活物、纤溶酶原激活物抑制剂-1、eNOS、COX-2、AC133、ID1/ID3、3类轴突导向蛋白或Nogo-A或其组合。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体可以与VEGF-A受体、VEGF-B受体、VEGF-C受体、VEGF-D、胎盘生长因子受体(PIGF)或其组合结合。

药物配制品

本文描述了包含本文所述的去核细胞或组合物的药物配制品。在一些实施方案中，药物配制品还包含药学上可接受的：载剂、赋形剂、稀释剂或雾化吸入剂。

在一些实施方案中，药物配制品包含两种或更多种活性剂，或两种或更多种如本文公开的治疗剂。在一些实施方案中，两种或更多种活性剂包含在单个剂量单位中，例如，当去核细胞包含两种或更多种治疗剂时。在实施方案中，两种或更多种活性剂包含在单独的剂量单位中，例如，当去核细胞与额外的治疗剂或佐剂单独施用时。在一些实施方案中，可以在一些实施方案中作为额外的治疗剂的活性剂可以包括化疗剂、细胞毒性剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂、抗血管生成剂、心脏保护剂和/或检查点抑制剂。非限制性检查点抑制剂包括IMP321/依替莫德α(Immutep)、瑞拉利单抗BMS-986016、伊匹单抗(Yervoy)、派姆单抗(可瑞达)、纳武单抗(欧狄沃)、西米普利单抗(Libtayo)、阿替利珠单抗(特善奇)、阿维单抗(巴文西亚)、德瓦鲁单抗(Imfinzi)、伊匹单抗(Yervoy)、LAG525、MK-4280、伊立替康、奥沙利铂、REGN3767、TSR-033、BI754111、Sym022、FS118(双特异性抗LAG3/PD-L1拮抗mAb)、MGD013(双特异性抗LAG3/PD-1拮抗mAb)、TSR-022、尼拉帕尼、贝伐珠单抗、MBG453、地西他滨、斯巴达珠单抗、Sym023、INCAGN2390、LY3321367、雷莫芦单抗、阿贝西利、美沙替尼、BMS-986258、SHR-1702、卡瑞利珠单抗、MK-7684、艾替利单抗/OMP-313M32、替瑞利尤单抗/MTIG7192A/RG-6058、BMS-986207、AB-154、ASP-8374、JNJ-61610588、CA-170d、依诺妥珠单抗/MGA271、MGD009、I-8H9/奥博妥单抗、曲妥珠单抗、MGD013(抗PD-1、抗LAG-3双重检查点抑制剂)、BGB-A1217、CM-24(MK-6018)、BMS 986178、MEDI6469、PF-04518600、GSK3174998、MOXR0916、乌托鲁单抗(PF-05082566)、乌瑞芦单抗(BMS-663513)ES101、BMS-986156、TRX-518、AMG 228、JTX-2011、GSK3359609、BMS-986226、MEDI-570或伐立鲁单抗(CDX-1127)。此类化合物或药物可以以有效用于预期目的量组合存在。可以在一些实施方案中作为额外的治疗剂的活性剂的非限制性实例包括CPI-006(用于抑制CD73并允许T细胞和APC激活)；莫那利珠单抗(用于抑制NKG2A)；COM701(用于抑制PVRIG/PVRL2并激活T细胞)；CM24(用于抑制CEACAM1并允许T细胞和NK细胞激活)；NEO-201(用于抑制CEACAM5和CEACAM6，其允许T细胞激活，同时干扰肿瘤细胞生长)；地法替尼(用于抑制FAK并干扰肿瘤生长)；PF-04136309(用于抑制CCR-2和CCL-2并允许T细胞募集和激活)；MSC-1(用于抑制LIF并允许T细胞和APC激活，同时干扰癌症生长)；Hu5F9-G4(5F9)、ALX148、TTI-662和RRx-001(用于抑制CD47或SIRPα并允许T细胞和APC激活)；拉妥珠单抗(MCS-110)、LY3022855、SNDX-6352、依米妥珠单抗(RG7155)和培西达替尼(PLX3397)(用于抑制M-CSF或CSF-1R并允许APC激活)；CAN04和卡那单抗(ACZ885)(用于抑制IL-3或IL-1RAP并允许T细胞和APC激活)；BMS-986253(用于抑制IL-8并降低免疫抑制性肿瘤微环境，同时干扰肿瘤生长)；派比奈单抗(VX15/2503)(用于抑制SEMA4D并降低免疫抑制性肿瘤微环境，同时干扰肿瘤生长)；曲巴那尼(用于抑制血管生成素-2并允许APC激活，同时干扰癌症生长)；FP-1305(用于抑制CLEVER-1并允许APC激活)；纬恩泊妥单抗(EnaV)(用于抑制Axl并允许APC激活，同时干扰癌症生长)；或巴维妥昔单抗(用于抑制磷脂酰丝氨酸并允许T细胞和APC激活，同时干扰癌症生长)。

在实践本文提供的治疗方法或用途中，将治疗有效量的本文所述的药物配制品施用于患有待治疗的疾病、障碍或病症，例如癌症的哺乳动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人。治疗有效量可以广泛地根据疾病严重性、对象的年龄和相对健康、所使用的治疗剂的效力和其他因素而广泛变化。治疗剂，并且在一些情况下本文所述的药物配制品可以单独或与作为混合物的组分的一种或多种治疗剂组合使用。

本文所述的药物配制品可以通过适当的施用途径施用于对象，包括但不限于静脉内、动脉内、口服、肠胃外、口腔、局部、透皮、直肠、肌内、皮下、骨内、经粘膜、吸入或腹膜内施用途径。本文所述的组合物可以包括但不限于水性液体分散体、自乳化分散体、固溶体、脂质体分散体、气溶胶、固体剂型、粉末、立即释放配制品、受控释放配制品、快速熔融配制品、片剂、胶囊、丸剂、延迟释放配制品、延长释放配制品、脉动释放配制品、多颗粒配制品以及混合的立即释放和受控释放配制品。

包含治疗剂的药物配制品可以以常规方式制造，仅通过举例的方式，诸如借助常规混合、溶解、制粒、制糖衣、磨粉、乳化、胶囊化、包埋或压缩工艺的方式。

所述药物配制品可以包含至少一种外源治疗剂作为活性成分，呈游离酸或游离碱形式，或呈药学上可接受的盐形式。另外，本文所述的方法和组合物包括使用N-氧化物(如果适当的话)、结晶形式、非晶相以及具有相同类型活性的这些化合物的活性代谢物。在一些实施方案中，治疗剂以非溶剂化形式或具有药学上可接受的溶剂(诸如水、乙醇等)的溶剂化形式存在。还考虑治疗剂的溶剂化形式在本文中公开。

在某些实施方案中，本文提供的药物配制品包含一种或多种防腐剂来抑制微生物活性。合适的防腐剂包括含汞物质，诸如苯汞(merfen)和硫柳汞(thiomersal)；稳定的二氧化氯；和季铵化合物，诸如苯扎氯铵、十六烷基三甲基溴化铵和十六烷基氯化吡啶。

在一些实施方案中，本文所述的药物配制品受益于抗氧化剂、金属螯合剂、含有硫醇的化合物和其他一般的稳定剂。此类稳定剂的实例包括但不限于：(a)约0.5％至约2％w/v甘油、(b)约0.1％至约1％w/v甲硫氨酸、(c)约0.1％至约2％w/v硫代甘油、(d)约1mM至约10mM EDTA，I约0.01％至约2％w/v抗坏血酸、(f)0.003％至约0.02％w/v聚山梨酸酯80、(g)0.001％至约0.05％w/v.聚山梨酸酯20、(h)精氨酸、(i)肝素、(j)硫酸葡聚糖、(k)环糊精、(l)戊聚糖多硫酸酯和其他类肝素、(m)二价阳离子诸如镁和锌；或(n)其组合。

本文所述的药物配制品被配制成任何合适的剂型，包括但不限于水性口服分散体、液体、凝胶、糖浆、酏剂、浆液、悬浮液、固体口服剂型、气溶胶、受控释放配制品、快速熔融配制品、泡腾配制品、冻干配制品、片剂、粉末、丸剂、糖衣丸、胶囊、延迟释放配制品、延长释放配制品、脉动释放配制品、多颗粒配制品以及混合的立即释放和受控释放配制品。在一方面，如本文讨论的治疗剂，例如治疗剂被配制成适用于肌内、皮下或静脉内注射的药物组合物。在一方面，适用于肌内、皮下或静脉内注射的配制品包含生理学上可接受的无菌水性或非水性溶液、分散体、悬浮液或乳液、以及用于再水合成无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。合适的水性和非水性载剂、稀释剂、溶剂或媒介物的实例包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油、氢化蓖麻油(cremophor)等)、其合适的混合物、植物油(诸如橄榄油)以及可注射有机酯(诸如油酸乙酯)。可以例如通过以下方式维持适当流动性：通过使用诸如卵磷脂等包衣，在分散体情况下通过维持所需粒径，以及通过使用表面活性剂。在一些实施方案中，适于皮下注射的配制品还含有添加剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。微生物生长的预防可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂，诸如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等来确保。在一些情况下，也希望包括等渗剂，诸如糖、氯化钠等。可以通过使用延迟吸收的剂，诸如单硬脂酸铝和明胶来使可注射药物形式的吸收延长。

对于静脉内注射或滴注或输注，将本文所述的药物配制品配制在水性溶液中，优选地生理上相容的缓冲液诸如汉克氏溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液中。对于经粘膜施用，在配制品中使用适合于待渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂通常是本领域已知的。对于其他肠胃外注射，适当的配制品包含水性或非水性溶液，优选地具有生理上相容的缓冲液或赋形剂。此类赋形剂是已知的。

肠胃外注射可以涉及快速浓注或连续输注。用于注射的药物配制品可以单位剂型呈现，例如在添加有防腐剂的安瓿中或在多剂量容器中。本文所述的组合物可以呈适用于作为油性或水性媒介物中的无菌悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可以含有配制剂，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。在一方面，活性成分呈粉末形式，用于在使用之前用合适的媒介物(例如，无菌的无热原水)构成。

对于通过吸入进行的施用，治疗剂被配制成作为气溶胶、雾或粉末来使用。本文所述的药物配制品使用合适的推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体)从加压包装或喷雾器以气溶胶喷雾剂呈现形式方便地递送。在增压式气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供阀以递送计量的量来确定。在吸入器或吹入器中使用的胶囊和药筒(仅以举例的方式，诸如明胶)可以配制成含有本文所述的治疗剂和合适的散剂基料(诸如乳糖或淀粉)的粉末混合物。采用苯甲醇或其他合适的防腐剂、氟碳化合物和/或其他本领域已知的溶解剂或分散剂将包含组合物的配制品在盐水中制备为溶液。优选地，这些组合物和制剂用合适的非毒性药学上可接受的成分制备。合适的载剂的选择取决于所需的鼻剂型，例如溶液、悬浮液、软膏或凝胶的准确性质。除了活性成分外，鼻剂型通常含有大量水。任选地存在微量的其他成分，诸如pH调节剂、乳化剂或分散剂、防腐剂、表面活性剂、胶凝剂或缓冲剂和其他稳定剂和溶解剂。优选地，鼻剂型应与鼻分泌物等渗。

口服使用的药物制剂是通过以下获得的：将一种或多种固体赋形剂与本文所述的一种或多种组合物混合，任选地研磨所得的混合物，并且在添加合适的助剂(如果需要的话)之后加工颗粒混合物，以获得片剂或糖衣丸核。合适的赋形剂包括例如填充剂，诸如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；纤维素制剂，例如像玉米淀粉、小麦淀粉、稻米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、微晶纤维素、羟基丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；或其他填充剂，诸如：聚乙烯吡咯烷酮(PVP或聚维酮)或磷酸钙。如果需要，添加崩解剂，诸如交联羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐，诸如海藻酸钠。在一些实施方案中，向片剂或糖锭剂包衣中添加染料或颜料以用于鉴定或表征活性治疗剂剂量的不同组合。

在一些实施方案中，外源治疗剂的药物配制品呈胶囊的形式，包括由明胶制成的推入配合型胶囊，以及由明胶和增塑剂诸如甘油或山梨糖醇制成的柔软密封胶囊。推入配合型胶囊含有与填充剂(诸如乳糖)、粘合剂(诸如淀粉)和/或润滑剂(诸如滑石或硬脂酸镁)以及任选地稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性治疗剂溶解或悬浮在合适的液体，诸如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇中。在一些实施方案中，添加稳定剂。胶囊可以例如通过将治疗剂的配制品的散装共混物置于胶囊内来制备。在一些实施方案中，配制品(非水性悬浮液和溶液)置于软明胶胶囊中。在其他实施方案中，配制品置于标准明胶胶囊或非明胶胶囊诸如包含HPMC的胶囊中。在其他实施方案中，配制品置于分散型胶囊中，其中胶囊被完全吞入，或者将胶囊打开并且在食用之前将内容物撒布在食物上。

用于口服施用的药物配制品具有适于这种施用的剂量。在一方面，固体口服剂型通过将组合物与以下中的一种或多种混合来制备：抗氧化剂、风味剂和载剂材料，诸如粘合剂、悬浮剂、崩解剂、填充剂、表面活性剂、增溶剂、稳定剂、润滑剂、润湿剂和稀释剂。在一些实施方案中，本文公开的固体剂型呈以下形式：片剂(包括悬浮片剂、速融片剂、一口崩解片剂、快速崩解片剂、泡腾片剂或囊片)、丸剂、粉末、胶囊、固体分散体、固溶体、可生物蚀解剂型、受控释放配制品、脉动释放剂型、多颗粒剂型、珠、丸粒、颗粒剂。在其他实施方案中，组合物呈粉末的形式。压缩片剂是通过压制以上所述的配制品的散装共混物来制备的固体剂型。在各个实施方案中，片剂将包含一种或多种风味剂。在其他实施方案中，片剂将包含包围最终压缩片剂的膜。在一些实施方案中，膜包衣可以提供治疗剂从配制品中的延迟释放。在其他实施方案中，膜包衣有助于患者依从性。膜包衣的范围通常是片剂重量的约1％至约3％。在一些实施方案中，固体剂型，例如片剂、泡腾片剂和胶囊，是通过将治疗剂的颗粒与一种或多种药物赋形剂混合以形成散装共混组合物来制备的。散装共混物很容易细分为同样有效的单位剂型，诸如片剂、丸剂和胶囊。在一些实施方案中，单个单位剂量包括膜包衣。这些配制品通过常规配制技术制造。

在另一方面，剂型包括微胶囊化配制品。在一些实施方案中，一种或多种其他相容的材料存在于微胶囊化材料。材料的非限制性实例包括pH调节剂、侵蚀促进剂、消泡剂、抗氧化剂、风味剂和载剂材料诸如粘合剂、悬浮剂、崩解剂、填充剂、表面活性剂、增溶剂、稳定剂、润滑剂、润湿剂和稀释剂。

用于口服施用的液体配制品剂型任选地是水性悬浮液，其选自包括但不限于以下的组：药学上可接受的水性口服分散体、乳液、溶液、酏剂、凝胶和糖浆。除了治疗剂外，液体剂型任选地包含添加剂，诸如：(a)崩解剂；(b)分散剂；(c)润湿剂；(d)至少一种防腐剂、(e)粘度增强剂、(f)至少一种甜味剂、和(g)至少一种风味剂。在一些实施方案中，水性分散体还包含晶体形成抑制剂。

在一些实施方案中，本文所述的药物配制品是自乳化药物递送系统(SEDDS)。乳液是一个不混溶相在另一个中的分散体，通常呈液滴的形式。通常，乳液通过剧烈机械分散来产生。在添加到过量水中而没有任何外部机械分散或搅动时，与乳液或微乳液相反，SEDDS自发形成乳液。SEDDS的优点是仅需要轻轻混合来将液滴分散在整个溶液中。另外，在即将施用之前添加水或水相，这确保不稳定或疏水性活性成分的稳定性。因此，SEDDS为疏水性活性成分的口服和肠胃外递送提供有效的递送系统。在一些实施方案中，SEDDS提供疏水性活性成分的可生物利用性的改善。

口腔配制品使用本领域已知的各种配制品来施用。另外，本文所述的口腔剂型还可以包含可生物蚀解(可水解)的聚合物载剂，其还用于将剂型粘附到口腔粘膜。对于口腔或舌下施用，所述组合物可以采用以常规方式配制的片剂、锭剂或凝胶的形式。

对于静脉内注射，将药物配制品任选地配制在水性溶液中，优选地生理上相容的缓冲液诸如汉克氏溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液中。对于经粘膜施用，在配制品中使用适合于待渗透屏障的渗透剂。对于其他肠胃外注射，适当的配制品包含水性或非水性溶液，优选地具有生理上相容的缓冲液或赋形剂。

肠胃外注射任选地涉及快速浓注或连续输注。用于注射的配制品任选地以单位剂型呈现，例如在添加有防腐剂的安瓿中或多剂量容器中。在一些实施方案中，本文所述的组合物呈作为油性或水性媒介物中的无菌悬浮液、溶液或乳液的适于肠胃外注射的形式，并且含有配制剂，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。用于肠胃外施用的组合物包含水溶性形式的调节颈动脉体活性的试剂的水性溶液。另外，在适当的情况下任选地制备调节颈动脉体活性的试剂的悬浮液，例如油性注射悬浮液。

常规的配制技术包括例如一种或多种方法的组合：(1)干混、(2)直接压缩、(3)研磨、(4)干法或非水制粒、(5)湿法制粒、或(6)熔融。其他方法包括例如喷雾干燥、锅包衣、熔融制粒、制粒、流化床喷雾干燥或包衣(例如，沃斯特包衣(wurster coating))、切向包衣、顶部喷涂、压片、挤出等。

在一些实施方案中，提供了组合物，其包含治疗剂的颗粒和至少一种分散剂或悬浮剂，用于向对象口服施用。配制品可以是用于悬浮的粉末和/或颗粒剂，并且在与水混合时，获得基本上均匀的悬浮液。

在某些实施方案中，药物配制品任选地包含一种或多种pH调节剂或缓冲剂，包括酸，诸如乙酸、硼酸、柠檬酸、乳酸、磷酸和盐酸；碱，诸如氢氧化钠、磷酸钠、硼酸钠、柠檬酸钠、醋酸钠、乳酸钠和三羟甲氨基甲烷；以及缓冲液，诸如柠檬酸盐/右旋糖、碳酸氢钠和氯化铵。此类酸、碱和缓冲液以将组合物的pH维持在可接受范围内所需的量包含在内。

另外，药物配制品任选地包含一种或多种盐，其量为使组合物的渗透压达到可接受的范围所需的量。此类盐包括具有钠、钾或铵阳离子和氯化物、柠檬酸盐、抗坏血酸、硼酸盐、磷酸盐、碳酸氢盐、硫酸盐、硫代硫酸盐或亚硫酸氢盐阴离子的那些盐；合适的盐包括氯化钠、氯化钾、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠和硫酸铵。

其他药物配制品任选地包含一种或多种防腐剂来抑制微生物活性。合适的防腐剂包括含汞物质，诸如苯汞(merfen)和硫柳汞(thiomersal)；稳定的二氧化氯；和季铵化合物，诸如苯扎氯铵、十六烷基三甲基溴化铵和十六烷基氯化吡啶。

在一个实施方案中，本文所述的水性悬浮液和分散体保持均质状态至少4小时。在一个实施方案中，水性悬浮液通过持续小于1分钟的物理搅动来重悬浮成均质悬浮液。在又一个实施方案中，不需要搅动来维持均质水性分散体。

用于鼻腔施用的气溶胶配制品通常是被设计来以滴剂或喷雾剂施用到鼻腔通道的水性溶液。鼻溶液可以与鼻分泌物相似，因为它们通常是等渗的，并轻微缓冲以维持约5.5至约6.5的pH，尽管可以另外使用超出此范围的pH值。抗菌剂或防腐剂也可以包含在配制品中。

用于吸入的气溶胶配制品和吸入剂可以被设计成使得在通过鼻腔或口腔呼吸途径施用时将药剂或药剂组合带入对象的呼吸树中。吸入溶液可以例如通过雾化器施用。包含细粉状或液体药物的吸入物或吹入物可以作为药剂或药剂组合的溶液或悬浮液的药物气溶胶被递送到呼吸系统中，例如，以帮助分发。推进剂可以是液化气体，包括卤烃，例如氟烃诸如氟化氯烃、氢氯氟烃和氢氯烃，以及烃和烃醚。

卤烃推进剂可以包括所有氢都用氟取代的氟烃推进剂、所有氢都用氯和至少一个氟取代的氯氟烃推进剂、含氢的氟烃推进剂和含氢的氯氟烃推进剂。可用的烃类推进剂包括例如丙烷、异丁烷、正丁烷、戊烷、异戊烷和新戊烷。碳氢化合物的混合物也可以用作推进剂。醚推进剂包括例如二甲醚以及醚。气雾剂配制品还可以包含超过一种推进剂。例如，气溶胶配制品包含来自相同类别的超过一种推进剂，诸如两种或更多种氟烃；或超过一种、超过两种、超过三种来自不同类别的推进剂，诸如氟烃和碳氢化合物。本公开内容的组合物还可以用压缩气体分配，例如惰性气体，诸如二氧化碳、一氧化二氮或氮气。

气溶胶配制品还可以包含其他组分，例如乙醇、异丙醇、丙二醇，以及表面活性剂或其他组分，诸如油和洗涤剂。这些组分可以用于使配制品和/或润滑阀门组分稳定。

气溶胶配制品可以在压力下包装，并且可以使用溶液、悬浮液、乳液、粉末和半固体制剂配制成气溶胶。例如，溶液气溶胶配制品包含呈(基本上)纯推进剂或作为推进剂和溶剂的混合物的药剂诸如转运蛋白、载剂或离子通道抑制剂的溶液。溶剂可以用于溶解药剂和/或延缓推进剂的蒸发。溶剂可以包括例如水、乙醇和乙二醇。可以使用合适溶剂的任何组合，任选地与防腐剂、抗氧化剂和/或其他气溶胶组分组合使用。

气溶胶配制品可以是分散体或悬浮液。悬浮气溶胶配制品包含一种药剂或药剂(例如转运蛋白、载剂或离子通道抑制剂)和分散剂的组合的悬浮液。分散剂可以包括例如山梨糖醇三油酸酯、油醇、油酸、卵磷脂和玉米油。悬浮气溶胶配制品还可以包含润滑剂、防腐剂、抗氧化剂和/或其他气溶胶组分。

气溶胶配制品可以类似地配制成乳液。乳液气溶胶配制品可以包含例如醇(诸如乙醇)、表面活性剂、水和推进剂，以及一种药剂或药剂(例如，转运蛋白、载剂或离子通道)的组合。所使用的表面活性剂可以是非离子的、阴离子的或阳离子的。乳液气溶胶配制品的一个实例包含例如乙醇、表面活性剂、水和推进剂。乳液气溶胶配制品的另一个实例包含例如植物油、单硬脂酸甘油酯和丙烷。

方法

在一些实施方案中，本文公开了制备和使用本公开内容的细胞的方法。本文公开的方法包括利用高速离心从有核细胞(亲本细胞)产生去核细胞的方法。在一些实施方案中，产生本公开内容的去核细胞的方法不包括有核细胞的分化。在一些实施方案中，去核细胞在减缓或暂停细胞的生物活性的条件下储存，诸如冷冻保存、冻干或低温休眠。在一些实施方案中，在此类条件下储存的去核细胞的生物活性可以在需要时恢复，并且任选地根据需要进一步工程化。还提供了将去核细胞递送至本文公开的对象的方法。在一些实施方案中，所述递送包括向对象施用所述去核细胞或包含所述去核细胞的组合物，以便治疗疾病或病症或本文公开的对象。在一些实施方案中，本文所述的方法是用于治疗对象的特征至少部分在于异常脉管系统的疾病或病症，所述方法包括：向患有所述疾病或病症的所述对象施用包含一个或多个细胞内细胞器的去核细胞，所述去核细胞在细胞核不存在的情况下合成或释放包括肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员多肽或其催化活性片段的外源多肽，其中由所述细胞合成或释放的所述外源多肽对于使所述对象的所述异常脉管系统正常化是治疗有效的。在一些实施方案中，本文所述的方法包括通过向所述对象施用表达单结构域抗体或其抗原结合片段的去核细胞来治疗疾病或病症，其中所述单结构域抗体或其抗原结合片段靶向免疫检查点分子。在一些实施方案中，本文所述的方法包括通过向所述对象施用表达单结构域抗体或其抗原结合片段的去核细胞来治疗疾病或病症，其中所述单结构域抗体或其抗原结合片段靶向本文所述的免疫检查点分子。在一些实施方案中，本文所述的方法包括通过向所述对象施用表达单结构域抗体或其抗原结合片段的去核细胞来治疗疾病或病症，其中所述单结构域抗体或其抗原结合片段靶向CTGF。

产生去核细胞的方法

本文公开了通过去除有核细胞(亲本细胞)的细胞核来产生本文所述的去核细胞的方法。在一些实施方案中，产生去核细胞的方法不需要亲本细胞的分化。在一些实施方案中，含有细胞核的亲本细胞被工程化以表达单结构域抗体或其抗原结合片段、治疗剂、跨膜部分、免疫逃逸部分和/或本文所述的靶向部分；并且随后，去除亲本细胞的细胞核。在一些实施方案中，含有细胞核的亲本细胞被去核，并且去核细胞被工程化以表达单结构域抗体或其抗原结合片段、治疗剂、跨膜部分、免疫逃逸部分和/或本文所述的靶向部分。在一些实施方案中，亲本细胞被工程化以表达以上一种或多种生物分子(例如，免疫逃逸部分和/或靶向部分)，并且所得的去核细胞(例如，已经表达免疫逃逸部分和/或靶向部分)被进一步工程化以表达以上生物分子中的第二种(例如，治疗剂)。以这种方式，本公开内容的去核细胞可以在去核之前被广泛地工程化，根据需要长时间储存(通过例如冻干、低温休眠、冷冻保存)，并在更接近需要的时间快速工程化以表达治疗剂。

如图1所示，亲本细胞可以在去核之前被工程化以表达靶向对象的淋巴组织(例如，淋巴结)的粘附分子、趋化因子或保留受体或两者。另外或可替代地，所得的去核细胞被工程化以表达并在一些情况下分泌治疗剂，例如像抗体或其抗原结合片段(例如，单结构域抗体)。在一些实施方案中，去核细胞可以被施用于有需要的对象以治疗对象的疾病或病症。

与相当的生物药物开发时间线相比，在去核之前和之后对本文所述的去核细胞进行广泛工程化的能力大大简化了制造工艺。制造本公开内容的去核细胞的工艺大约为2个月，而常规生物药物开发时间线为12个月或更长。现在参考图2，本公开内容的去核细胞可以预先制备并冷冻保存一段时间。这意味着，可以快速部署本公开内容的去核细胞(例如，被工程化以表达归巢受体、免疫激活剂等)。当去核细胞用于治疗由病原体暴露或感染的爆发引起的疾病或病症时，这种技术方面是特别重要的。

在一些实施方案中，去除细胞核涉及机械地去除细胞核。可以用细胞松弛素处理亲本细胞以软化皮质肌动蛋白细胞骨架。然后通过在Ficoll梯度中高速离心来从细胞体中物理提取细胞核以生成去核细胞。因为去核细胞和完整的有核细胞沉积到Ficoll梯度中的不同层，所以去核细胞可以容易地分离并制备用于治疗性目的或与其他细胞(有核或去核)融合。去核过程在临床上可扩展，以处理数千万个细胞。在一些实施方案中，去核细胞可以用作疾病归巢媒介物，以递送临床上相关的货物/有效载荷以治疗各种疾病。

可以使用各种方法来将生物分子(例如，治疗剂、跨膜部分、免疫逃逸部分和/或本文所述的靶向部分)引入本文所述的亲本细胞或去核细胞中。可以用于将生物分子引入亲本细胞或去核细胞中的方法的非限制性实例包括：脂质体介导的转移、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、基于逆转录病毒的载体、慢病毒载体、电穿孔、微注射、脂质转染、转染、磷酸钙转染、基于树状高分子的转染、阳离子聚合物转染、细胞挤压、超声、光学转染、穿刺(impalection)、流体动力学递送、磁转染、纳米颗粒转染或其组合。在本文提供的任何组合物和方法的一些实施方案中，可以将治疗剂、病毒、抗体或纳米颗粒引入去核细胞中。

在一些实施方案中，去核细胞通过冷冻保存、低温休眠或冻干来保存。冷冻保存包括冷冻去核细胞，而低温休眠包括将去核细胞储存在低于室温的温度下，但不冷冻去核细胞。在一些实施方案中，所述去核细胞是经冻干的。在一些实施方案中，经冻干的去核细胞可以被重构，并且经重构的去核细胞表现出与未冻干的去核细胞相当的生存力。在一些实施方案中，冻干包括以下组成部分：冷冻细胞；使用真空在非常低的压力(例如，<3000mTorr)下干燥细胞。干燥组成部分可以导致细胞升华和脱水，同时维持细胞生存力和生物功能。在一些实施方案中，冷冻阶段包括平衡冷冻的持续时间和温度，以维持细胞生存力和稳定性、适当的晶体形成和重构速度。物质的三相点是升华曲线、熔融曲线和汽化曲线相交的温度和压力。达到因物质而异的三相点，确保在接下来的干燥步骤中发生升华而不是熔化。为了促进更快且更高效的冷冻干燥，优选较大的冰晶，因为它们在产物内形成促进升华过程中更快去除水蒸气的网络。为了产生更大的晶体，产物应缓慢冷冻，或者温度可以在被称为退火的过程中上下循环。新鲜或冷冻的活组织或细胞没有单一的均匀熔点(共晶点)，并且因此材料(细胞或组织)的冷冻阶段被冷却至低于其三相点，所述三相点代表材料的固相、液相和气相可以共存的温度和压力。活细胞在相图上确实有一个临界点，在所述临界点处，物体或物质的液相和气相具有相同的密度并且因此无法区分。必须维持产物临界点温度，以防止在一次和二次干燥过程中发生回熔或滤饼塌陷(cake collapse)，这反映了升华不完全。对于需要保存结构的物质，像活细胞，大冰晶可能是有害的，并可能破坏细胞壁，从而可能导致质地越来越差和营养内容物的损失。在这种情况下，应迅速进行冷冻，以便将材料快速降低至低于其临界点，从而避免形成大冰晶。细胞或组织的冷冻温度可以变化，但通常在-50℃(-58°F)与-80℃(-112°F)之间的范围内。

在干燥阶段期间，环境压力降低至几毫巴的范围，然后通过传导或辐射向材料提供热量，使冰升华。可以使用升华分子的升华潜热来计算所需的热量。在这个初始干燥阶段，材料或物质中约95％的水被升华。这个阶段通常是缓慢的，甚至可能持续几天，这取决于所采用的物质和技术，但如果快速添加过多的热量，则材料的结构可能会改变。在这个阶段，通过施加部分真空来控制压力。真空加速了升华，使其可用作有意的干燥过程。使用寒冷的冷凝器室和/或冷凝器板作为水蒸气重新液化和固化的表面。重要的是要注意，在这个压力范围内，由于空气密度低，热量不能通过对流效应提供。干燥阶段还旨在去除剩余的未冻结水分子，因为在初级干燥阶段期间应去除冷冻引起的冰。冷冻干燥过程的这一部分由材料的吸附等温线控制。在这个阶段，温度升高至高于初级干燥阶段，甚至可以高于0℃(32°F)，以破坏水分子与冷冻材料之间形成的任何物理化学相互作用。通常，在这个阶段期间，压力也在这一阶段中降低以鼓励解吸。但是，有些产物也受益于压力增加。冷冻干燥过程完成之后，通常在密封材料之前用惰性气体(诸如氮气)打破真空。在操作结束时，产物中的残留水含量极低，并且应在原始浓度的<1％至4％的范围内。

在一些实施方案中，去核细胞的冻干包括使用冻干保护剂来保留细胞生存力和生物功能。冻保护剂包括添加在干燥过程期间保护细胞的试剂、盐或添加剂。常见的冻干保护剂包括海藻糖、DMSO、甲基纤维素、蔗糖、抗氧化剂、人或动物血清蛋白以及细胞应激蛋白。另外，用于在悬浮液中的细胞内增加冻干保护剂的转运的方法可以用作改善冻干之后细胞的生存力和功能的方式。这些方法包括电穿孔、添加增强细胞内转运的试剂、上调细胞膜上孔的表达的细胞遗传修饰以及部分破坏细胞膜完整性并可能促进冻干保护剂的细胞内转运的机械微流体装置。

使用方法

在一些实施方案中，本文公开了使用本文所述的组合物的方法。在一些实施方案中，所述方法包括通过向对象施用本文所述的组合物(例如，含有被工程化以表达治疗剂的去核细胞的药物组合物)来治疗对象的疾病或病症。在一些实施方案中，所述方法利用本文所述的去核细胞来离体生成组织或器官(例如，通过用于移植的整个组织和器官发育的3D生物打印、皮肤移植、合成肉源的开发、生物支架等)。在一些实施方案中，所述方法利用本文所述的去核细胞来繁殖和制造细胞质复制病毒，诸如VSV、狂犬病病毒等。在一些实施方案中，所述方法利用本文所述的去核细胞作为诊断工具来检测体内的疾病或疾病位置。在一些实施方案中，所述方法利用本文所述的去核细胞用于化妆品应用。在一些实施方案中，所述方法利用本文所述的去核细胞作为纯化蛋白质、膜、脂质、各种RNA、细胞器或需要不含核DNA的任何细胞组分的来源。在一些实施方案中，所述方法利用本文所述的去核细胞作为促融剂，其中去核细胞可以是将基因编辑模式体外转移到各种细胞类型中的体外来源。在一些实施方案中，所述方法利用本文所述的去核细胞用于促进伤口愈合或作为再生医学。

本公开内容还提供了使用去核细胞(天然或去核)作为其他细胞(治疗性或天然)的融合伴侣来增强和/或转移本文所述的生物分子(例如像单结构域抗体或其抗原结合片段和/或治疗剂)的方法。在一些实施方案中，生物分子包括DNA/基因、RNA(mRNA、shRNA、siRNA、miRNA)、纳米颗粒、肽、蛋白质和质粒、细菌、病毒、小分子药物、离子、细胞因子、生长因子和激素。在一些实施方案中，所述去核细胞被工程化以表达促融合部分。促融合部分可以是促进膜融合的任何生物分子(例如，糖、脂质或蛋白质)。在一些实施方案中，促融合部分是促融合蛋白。促融合蛋白允许表达促融合蛋白的去核细胞与靶细胞融合。在一些实施方案中，促融合蛋白促进表达促融合蛋白的去核细胞与靶细胞的合并，从而允许去核细胞的内容物进入靶细胞中。在一些实施方案中，促融合蛋白是异型的，诸如病毒类别I-III或Hapless 2前体HAP2或SNARE。在一些实施方案中，促融合蛋白是同质的，诸如EFF-1/AFF-1。促融合蛋白的其他非限制性实例是Izumo1或合胞素。在一些实施方案中，促融合蛋白是病毒蛋白。在一些实施方案中，来自病毒的促融合蛋白是VSV-g、hERV-W-ENV(合胞素)或MV-Ed-F+MV-Ed-H(血凝素)。与有核细胞不同，去核细胞与相同或不同来源的相同或另一种细胞类型的融合生成独特的细胞杂交体，其缺乏有问题的核转移，同时维持希望的治疗属性，包括但不限于细胞表面蛋白、信号转导分子、分泌蛋白和表观遗传变化。在一些实施方案中，促融合蛋白可以在TNT上表达，从而在TNT与靶细胞接触时，促进去核细胞与靶细胞之间的融合。

在一些实施方案中，促融合蛋白由与SEQ ID NO:1001-1106中的任一个核酸序列具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的多核苷酸编码。在一些实施方案中，促融合蛋白包含与SEQ ID NO:1201-1205、1207、1209-1211、1213-1229、1231-1233、1237-1247、1249、1251-1257和1259-1305中的任一个肽序列具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的多肽序列。在一些实施方案中，促融合蛋白由与SEQ ID NO:1001-1106中的任一个具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的多核苷酸编码。在一些实施方案中，促融合蛋白包含与SEQ ID NO:1201-1305中的任一个具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的多肽序列。

在一些实施方案中，永生化细胞，诸如人端粒酶逆转录酶(hTERT)细胞或癌细胞，在去核时，可以施用于有需要的对象，并为对象接种针对本文公开的疾病或病症的疫苗。人永生化细胞的非限制性实例包括HeLa(人上皮)细胞、293/293T/HEK-293T(人胚胎肾)细胞、SH-SY5Y(人神经母细胞瘤，从骨髓克隆)细胞等。哺乳动物永生化细胞的非限制性实例包括3T3(小鼠胚胎成纤维细胞)细胞、COS(猴肾)细胞、MDCK(狗肾上皮)细胞、CHO(中国仓鼠卵巢)细胞、PC12(大鼠嗜铬细胞瘤)细胞和Neuro-2a/N2a(小鼠神经母细胞瘤)细胞。例如，一旦去核，从对象获得的癌细胞就可以施用于对象以诱导针对肿瘤的免疫力而没有转移的风险。另外，去核癌细胞可以是同种异体的，因此不会触发对对象的其他有害免疫应答。在一些实施方案中，此上下文中的去核细胞可能不具有治疗有效载荷(例如，单结构域抗体或治疗剂)。在一些实施方案中，去核细胞可以包含靶向部分、免疫系统逃逸部分、治疗剂(例如，编码免疫检查点分子的mRNA、免疫检查点分子抑制剂、单结构域抗体或其抗原结合片段或溶瘤病毒)中的一种或多种或其组合。在一些实施方案中，去核细胞可以通过用病原体或抗原对对象进行免疫来激活对象的先天或适应性免疫。在一些实施方案中，去核细胞可以通过递送可以激活对象的免疫应答的治疗剂来激活对象的先天或适应性免疫。

治疗方法

本文提供了通过向对象施用本文所述的组合物来治疗所述对象的疾病或病症的方法。在一些实施方案中，施用通过任何合适的施用模式来进行，包括全身施用(例如，静脉内、吸入等)。在一些实施方案中，所述对象是人。在一些实施方案中，所述疾病或病症包括肺组织的疾病或病症。在一些实施方案中，所述疾病或病症包括癌症。在一些实施方案中，所述疾病或病症包括特发性肺纤维化。在一些实施方案中，所述组合物包含本文公开的去核细胞，其被工程化以表达并且在一些情况下分泌包含与免疫检查点分子(诸如PD-L1)结合的单结构域抗体或抗原结合片段的治疗剂。在一些实施方案中，所述组合物包含本文公开的去核细胞，其被工程化以表达并且在一些情况下分泌包含与上皮生物标志物(诸如CTGF)结合的单结构域抗体或抗原结合片段的治疗剂。

在一些实施方案中，所述疾病或病症包括感染(例如，人免疫缺陷病毒(HIV)感染、恰加斯病(Chagas disease)、结核病)、神经系统疾病(例如，帕金森病、亨廷顿病、阿尔茨海默病)、自身免疫性疾病(例如，糖尿病、克罗恩病、多发性硬化症、镰状细胞贫血)、心血管疾病(例如，急性心肌梗死、心力衰竭、顽固性心绞痛)、眼科疾病、骨骼疾病、代谢性疾病(例如，苯丙酮尿症、1A型糖原贮积缺乏症、戈谢病(Gaucher disease))、炎性疾病(例如，癌症、炎性肠病)或由对象的外部病原体或毒素引起的疾病。在一些实施方案中，所述疾病或病症包括特发性肺纤维化。在一些实施方案中，所述对象需要或已被确定为需要这种去核细胞治疗。

在一些实施方案中，本文所述的去核细胞包含抗体或其抗原结合片段(例如，单结构域抗体)，其与由癌细胞表达的表位或与肿瘤微环境相关联的表位结合。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段与表位的结合提供了治疗对象的癌症的治疗作用。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段与表位的结合募集免疫细胞以激活针对癌症的免疫应答。在一些实施方案中，所述癌症包括肺组织中的癌症。在一些实施方案中，所述癌症是肺癌。癌症的非限制性实例可以包括棘皮瘤、腺泡细胞癌、听神经瘤、肢端雀斑样黑色素瘤、肢端汗腺瘤、急性嗜酸性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性巨核细胞白血病、急性单核细胞白血病、急性粒细胞白血病伴成熟、急性髓系树突状细胞白血病、急性髓系白血病、急性早幼粒细胞白血病、釉质瘤、腺癌、腺样囊性癌、腺瘤、牙源性腺瘤样瘤、肾上腺皮质癌、成人T细胞白血病、侵袭性NK细胞白血病、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、腺泡状软组织肉瘤、成釉细胞纤维瘤、肛门癌、间变性大细胞淋巴瘤、甲状腺未分化癌、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、血管平滑肌脂肪瘤、血管肉瘤、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎样横纹肌样肿瘤、基底细胞癌、基底样癌、B细胞白血病、B细胞淋巴瘤、贝里尼导管癌、胆道癌、膀胱癌、母细胞瘤、骨癌、骨肿瘤、脑干胶质瘤、脑肿瘤、乳腺癌、布伦纳肿瘤、支气管肿瘤、细支气管肺泡癌、棕色瘤、伯基特淋巴瘤、原发灶不明的癌症、类癌瘤、癌、原位癌、阴茎癌、原发灶不明的癌症、癌肉瘤、卡斯尔曼病(Castleman's Disease)、中枢神经系统胚胎肿瘤、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤、宫颈癌、胆管癌、软骨瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、绒毛膜癌、脉络丛乳头状瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性单核细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性骨髓增生性疾病、慢性中性粒细胞白血病、透明细胞肿瘤、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、德戈斯病(Degos disease)、隆凸性皮肤纤维肉瘤、皮样囊肿、结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、胚胎发育不良性神经上皮肿瘤、胚胎癌、内胚窦瘤、内膜癌、子宫内膜癌、子宫内膜样肿瘤、肠病相关T细胞淋巴瘤、室管膜母细胞瘤、室管膜瘤、上皮样肉瘤、红白血病、食管癌、嗅神经母细胞瘤、尤文氏家族肿瘤、尤文氏家族肉瘤、尤文氏肉瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、乳房外佩吉特病、输卵管癌、胎中胎、纤维瘤、纤维肉瘤、滤泡性淋巴瘤、滤泡性甲状腺癌、胆囊癌、胆囊癌、神经节细胞胶质瘤、神经节瘤、胃癌、胃淋巴瘤、胃肠道癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤、胃肠道间质瘤、生殖细胞肿瘤、生殖细胞瘤、妊娠绒毛膜癌、妊娠滋养细胞肿瘤、骨巨细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、大脑胶质瘤病、血管球瘤、胰高血糖素瘤、成性腺细胞瘤、颗粒细胞瘤、毛细胞白血病、毛细胞白血病、头颈癌、头颈癌、心脏癌症、血管母细胞瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、血液系统恶性肿瘤、肝细胞癌、肝脾T细胞淋巴瘤、遗传性乳腺癌卵巢癌综合征、霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、下丘脑胶质瘤、炎症性乳腺癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞瘤、幼年型粒单核细胞白血病、卡波西肉瘤(Kaposi Sarcoma)、卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)、肾癌、克拉茨金瘤(Klatskin tumor)、克鲁肯贝格瘤(Krukenbergtumor)、喉癌、喉癌、恶性雀斑样痣黑色素瘤、白血病、白血病、唇和口腔癌、脂肪肉瘤、肺癌、黄体瘤、淋巴管瘤、淋巴管肉瘤、淋巴上皮瘤、淋巴性白血病、淋巴瘤、巨球蛋白血症、恶性纤维组织细胞瘤、恶性纤维组织细胞瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、恶性胶质瘤、恶性间皮瘤、恶性周围神经鞘瘤、恶性横纹肌样瘤、恶性蝾螈瘤(Malignant triton tumor)、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、肥大细胞白血病、纵隔生殖细胞肿瘤、纵隔肿瘤、甲状腺髓样癌、髓母细胞瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、黑色素瘤、黑色素瘤、脑膜瘤、梅克尔细胞癌(Merkel CellCarcinoma)、间皮瘤、间皮瘤、隐匿性原发性转移性鳞状颈癌(Metastatic Squamous NeckCancer with Occult Primary)、转移性尿路上皮癌、混合性苗勒氏瘤(Mixed Mulleriantumor)、单核细胞白血病、口癌、黏液肿瘤、多发性内分泌瘤病综合征、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤、蕈样肉芽肿病、蕈样肉芽肿病、骨髓增生异常病、骨髓增生异常综合征、髓系白血病、髓系肉瘤、骨髓增生性疾病、黏液瘤、鼻腔癌、鼻咽癌、鼻咽癌、赘生物、神经鞘瘤、神经母细胞瘤、神经母细胞瘤、神经纤维瘤、神经瘤、结节性黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、非黑色素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、眼肿瘤学、少突星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、嗜酸细胞瘤、视神经鞘脑膜瘤、口腔癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、骨肉瘤、卵巢癌、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜在肿瘤、乳腺佩吉特病、肺上沟瘤、胰腺癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、乳头瘤病、副神经节瘤、鼻旁窦癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、血管周上皮样细胞肿瘤、咽癌、嗜铬细胞瘤、中等分化松果体实质肿瘤(Pineal Parenchymal Tumor ofIntermediate Differentiation)、松果体母细胞瘤、垂体细胞瘤、垂体腺瘤、垂体肿瘤、浆细胞肿瘤、胸膜肺母细胞瘤、多胚瘤、前体T淋巴细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、原发性肝细胞癌、原发性肝癌、原发性腹膜癌、原始神经外胚叶肿瘤、前列腺癌、腹膜假黏液瘤、直肠癌、肾细胞癌、涉及15号染色体上的NUT基因的呼吸道癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、Richter转化(Richter's transformation)、骶尾部畸胎瘤、唾液腺癌、肉瘤、神经鞘瘤病、皮脂腺癌、继发性赘生物、精原细胞瘤、浆液性肿瘤、支持-间质细胞瘤(Sertoli-Leydig cell tumor)、性索间质肿瘤、塞扎里综合征(SezarySyndrome)、印戒细胞癌、皮肤癌、小蓝圆细胞肿瘤、小细胞癌、小细胞肺癌、小细胞淋巴瘤、小肠癌、软组织肉瘤、生长抑素瘤、煤烟疣(Soot wart)、脊髓肿瘤、脊柱肿瘤、脾边缘区淋巴瘤、鳞状细胞癌、胃癌、浅表扩散性黑色素瘤、幕上原始神经外胚叶肿瘤、表面上皮基质肿瘤、滑膜肉瘤、T细胞急性淋巴细胞白血病、T细胞大颗粒淋巴细胞白血病、T细胞白血病、T细胞淋巴瘤、T细胞幼淋巴细胞白血病、畸胎瘤、晚期淋巴癌、睾丸癌、卵泡膜细胞瘤、喉癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、移行细胞癌、脐尿管癌(Urachalcancer)、尿道癌、泌尿生殖道肿瘤(Urogenital neoplasm)、子宫肉瘤、葡萄膜黑色素瘤、阴道癌、弗纳莫里森综合征(Verner Morrison syndrome)、疣状癌、视路胶质瘤(VisualPathway Glioma)、外阴癌、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom'smacroglobulinemia)、沃辛瘤(Warthin's tumor)、肾母细胞瘤(Wilms'tumor)及其组合。在一些实施方案中，靶癌细胞代表癌细胞群体内的亚群，诸如癌症干细胞。

在一些实施方案中，所述癌症可以是肺癌，包括非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)或任何其他肺癌类型。例如，肺癌可以包括腺癌、鳞癌、大细胞(未分化)癌、大细胞神经内分泌癌、腺鳞癌、肉瘤样癌、肺类癌瘤或腺样囊性癌。肺癌的其他非限制性实例包括淋巴瘤、肉瘤、良性肺肿瘤或错构瘤。在一些实施方案中，所述癌症是转移性癌症。在一些实施方案中，癌症从不同的组织或来源转移到肺。例如，可能在肺中发现的转移性癌症可以包括乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肉瘤、膀胱癌、神经母细胞瘤和肾母细胞瘤。

在一些实施方案中，本文描述了去核细胞和使用这些去核细胞来治疗肺疾病或病症的方法。在一些实施方案中，肺疾病或病症包括哮喘、部分或全部肺塌陷(气胸或肺不张)、将空气输送到肺部的主要通道(支气管)中的肿胀和炎症(支气管炎)、慢性阻塞性肺病(COPD)、本文所述的肺癌、肺部感染(例如、肺炎)、肺液异常积聚(肺水肿)、肺动脉阻塞(肺栓塞)或特发性肺纤维化(IPF)。

在一些实施方案中，本文描述了去核细胞和使用这些去核细胞来治疗与对象的异常脉管系统相关联的疾病或病症的方法。异常脉管系统可以与疾病或病症诸如炎症(例如，IPF)和癌症(例如，本文所述的任一种癌症)相关联。在一些实施方案中，本文所述的去核细胞在与异常脉管系统接触时，增加了异常脉管系统的正常化，其中内皮细胞之间的粘附增加以防止血管内因子渗漏出脉管系统。在一些实施方案中，异常脉管系统的正常化包括减少损伤，诸如脉管系统的内皮细胞中死亡的细胞。在一些实施方案中，异常脉管系统的正常化包括未成熟或渗漏血管的血管生成。在一些实施方案中，由去核细胞施加的正常化可以包括血管、淋巴管或其组合的正常化。

在一些实施方案中，血管或淋巴管的正常化允许将治疗剂递送至靶细胞。例如，本文所述的去核细胞可以递送外源剂以首先使异常血管或淋巴管正常化，其中所述异常血管或淋巴管：允许与疾病或病症相关联的细胞(例如，癌细胞)从血流中接收营养物质；但足够小或渗漏而阻止向与疾病或病症相关联的细胞进行有效治疗剂递送。血管或淋巴管的正常化然后允许递送用于治疗与疾病或病症相关联的细胞的治疗剂。在一些实施方案中，本文所述的去核细胞包含用于使异常血管或淋巴管正常化的外源剂。在一些实施方案中，包含用于使异常血管或淋巴管正常化的外源剂的相同去核细胞还可以包含递送至靶细胞以治疗疾病或病症的第二外源剂。在一些实施方案中，所述疾病或病症包括癌症或IPF。例如，去核细胞可以首先递送可溶形式的TNF成员(例如，可溶形式的LIGHT)以使异常血管或淋巴管正常化。在正常化之后，相同的去核细胞可以递送抗癌治疗剂(诸如免疫检查点分子抑制剂)来治疗与疾病或病症相关联的细胞。

在一些实施方案中，所述疾病或病症可能是由病原体导致的。在一些实施方案中，本文所述的去核细胞包含抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体，其与由病原体表达的表位或与病原体相关联的微环境相关联的表位结合。在一些情况下，抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体与表位的结合赋予针对病原体的治疗特性。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体与表位的结合募集免疫细胞以激活免疫应答，从而赋予针对病原体的治疗特性。例如，所述疾病或病症可能是由病毒、细菌、真菌、寄生虫或解毒作用产生的分子导致的。在一些实施方案中，病原体：可以容易地在人与人之间散布或传播；导致高死亡率并有可能对公共卫生产生重大影响；可能引起公众恐慌和社会动荡；并需要采取特别行动做好公共卫生防范。这些病原体的实例可以包括炭疽(炭疽杆菌)、波特淋菌(肉毒毒素)、鼠疫(鼠疫杆菌)、天花(大天花)、兔热病(土拉热弗朗西丝菌)或病毒性出血热，包括丝状病毒(埃博拉，马尔堡)和沙粒病毒(拉沙热，马丘波)。

在一些实施方案中，病原体：可以适度容易地散布；导致中等发病率和低死亡率；并需要特定增强诊断能力和加强疾病监控。这些病原体的实例可以包括布鲁氏菌病(布鲁氏杆菌种)、产气荚膜梭菌的ε毒素、食品安全威胁(例如，沙门氏菌种、大肠杆菌O157:H7或志贺氏菌)、鼻疽(鼻疽伯克霍尔德菌)、类鼻疽(类鼻疽伯克霍尔德菌)、鹦鹉热(鹦鹉热衣原体)、Q热(贝纳柯克斯体)、来自蓖麻(Ricinus communis)的蓖麻毒素(蓖麻(castorbeans))、金黄色葡萄球菌B型肠毒素、斑疹伤寒(普氏立克次体)、病毒性脑炎(甲病毒诸如东部马脑炎、委内瑞拉马脑炎和西部马脑炎)或水安全威胁(例如，霍乱弧菌和隐孢子虫)。

在一些实施方案中，病原体可以包括具有高死亡率和发病率潜力但尚未完全了解其延伸性的新兴病原体。这些病原体的非限制性实例可以包括尼帕病毒和汉坦病毒。

在一些实施方案中，病原体包括毒素。在一些情况下，毒素可以由本文所述的任一种病原体分泌。病原体以及可以用本文所述的组合物治疗的与这些病原体相关联的疾病或病症的非限制性实例可以在表1中找到。

表1.病原体靶和相关联的疾病或病症的非限制性实例

施用的剂量和频率

本文所述的去核细胞或含有此类去核细胞的组合物(在此部分中称为“组合物”)可以以合适的剂量、施用模式和频率施用于对象，这取决于预期作用。

在一些实施方案中，组合物在一段时间内施用至少一次(例如，每2天一次、每周两次、每周一次、每周一次、每个月三次、每个月两次、每个月一次、每2个月一次、每3个月一次、每4个月一次、每5个月一次、每6个月一次、每7个月一次、每8个月一次、每9个月一次、每10个月一次、每11个月一次、每年一次)。在一些实施方案中，组合物在一段时间内施用两次或更多次(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100次)。

在一些实施方案中，组合物以治疗有效量通过各种形式和途径施用，包括例如口服或局部施用。在一些实施方案中，组合物可以通过肠胃外、静脉内、皮下、肌内、皮内、腹膜内、脑内、蛛网膜下腔、眼内、胸骨内、眼部、内皮、局部、鼻内、肺内、直肠、动脉内、鞘内、吸入、病灶内、皮内、硬膜外、囊内、囊下、心内、经气管、表皮下、蛛网膜下腔或脊柱内施用，例如注射或输注来施用。在一些实施方案中，组合物可以通过上皮或粘膜皮肤衬里的吸收施用(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜施用)。在一些实施方案中，组合物通过多种施用途径来施用。

在一些实施方案中，组合物通过静脉内输注来施用。在一些实施方案中，组合物通过在长时间(诸如超过24小时)内缓慢连续输注来施用。在一些实施方案中，组合物作为静脉内注射或短输注来施用。

组合物可以以局部方式施用，例如，通过将药剂直接注射到器官中，任选地以储库或持续释放配制品或植入物的形式。组合物可以呈快速释放配制品的形式、呈延长释放配制品的形式或呈中间释放配制品的形式提供。快速释放形式可以提供立即释放。延长释放配制品可以提供受控释放或持续的延迟释放。在一些实施方案中，泵可以用于递送组合物。在一些实施方案中，可以使用笔递送装置，例如用于皮下递送本公开内容的组合物。

本文提供的组合物可以与本文公开的其他疗法联合施用，包括例如抗病毒疗法、化疗、抗生素、细胞疗法、细胞因子疗法或抗炎剂。在一些实施方案中，环状聚核糖核苷酸或本文所述的抗体或其抗原结合片段可以单独使用或与作为混合物的组分的一种或多种治疗剂组合使用。在一些实施方案中，线性聚核糖核苷酸或本文所述的抗体或其抗原结合片段可以单独使用或与作为混合物的组分的一种或多种治疗剂组合使用。

组合物(例如，去核细胞或包含本文所述的去核细胞的药物组合物)可以在疾病或病症发生之前、期间或之后施用，并且施用含有治疗剂的组合物的时限可以变化。在一些情况下，组合物可以作为预防剂使用，并且可以连续施用于对冠状病毒具有易感性或对与冠状病毒相关联的病症或疾病具有倾向的对象(例如，用于免疫的对象或用于治疗的对象)。预防性施用可以减少感染、疾病或病症发生的可能性，或者可以降低感染、疾病或病症的严重程度。

组合物可以在症状发作之前施用于对象。组合物可以在测试结果之后(例如，在测试结果之后尽可能快地)施用于对象(例如，用于免疫的对象或用于治疗的对象)，所述测试结果例如是提供诊断的测试结果、显示对象(例如，用于免疫的对象或用于治疗的对象)中存在冠状病毒的测试或显示病症进展(例如，血氧水平降低)的测试。治疗剂可以在检测到或怀疑疾病或病症发作之后(例如，在可行之后尽快)施用。治疗剂可以在潜在暴露于冠状病毒之后(例如，在可行之后尽快)，例如在对象(例如，用于免疫的对象或用于治疗的对象)与受感染对象接触之后，或得知他们与可能具有传染性的受感染对象接触之后施用。

本公开内容的药剂(例如，抗体或其抗原结合片段，或治疗剂)的实际剂量水平可以变化，以便获得一定量的药剂，以实现对特定对象、组合物和施用模式的所需治疗应答，而不会对对象(例如，用于免疫的对象或用于治疗的对象)产生毒性。所选择的剂量水平可以取决于多种药代动力学因素，包括所采用的本发明的特定组合物的活性、施用途径、施用时间、排泄速率、治疗持续时间、与所采用的特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、正在治疗的患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康状况和先前病史以及医学领域熟知的类似因素。

可以调整剂量方案以提供最佳所需应答(例如，治疗和/或预防应答)。例如，可以施用单次快速浓注，随着时间推移可以施用若干分开剂量或如由治疗情况的紧急状态指示，剂量可以按比例减少或增加。以剂量单位形式配制肠胃外组合物是尤其有利的，以便于施用和剂量的均匀。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为对象(例如，用于免疫的对象或用于治疗的对象)的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位含有经计算与所需的药物载剂联合可产生所需治疗作用的预定量的活性剂。本公开内容的剂量单位形式的规格可以由如下决定并且直接依赖于：(a)活性剂的独特特征和待实现的特定治疗作用，和(b)本领域中混配用于治疗个体的敏感性的这种活性剂的固有局限性。剂量可以通过参考环状聚核糖核苷酸或抗体或其抗原结合片段的血浆浓度或局部浓度来确定。剂量可以通过参考线性聚核糖核苷酸或抗体或其抗原结合片段的血浆浓度或局部浓度来确定。

本文所述的组合物可以呈适于单次施用精确剂量的单位剂型。在单位剂型中，配制品可以被分成含有适量组合物的单位剂量。在单位剂型中，配制品可以分为含有适量的一种或多种线性聚核糖核苷酸、抗体或其抗原结合片段和/或治疗剂的单位剂量。单位剂量可以呈含有离散量的配制品的包装的形式。非限制性实例是包装的注射剂、小瓶和安瓿。本文公开的水性悬浮液组合物可以包装在单剂量不可重新闭合的容器中。可以例如与或不与防腐剂组合使用多剂量可重新闭合的容器。本文公开的用于注射的配制品可以单位剂型呈现，例如在具有防腐剂的安瓿中或多剂量容器中

剂量可以基于每公斤对象(例如，用于免疫的对象或用于治疗的对象)体重的药剂量。药剂(例如，抗体)的剂量在10-3000mg/kg的范围内，例如100-2000mg/kg，例如300-500mg/kg/d，持续1-10天或1-5天；例如，400mg/kg/d，持续3-6天；例如，1g/kg/d，持续2-3天。在一些实施方案中，剂量可以基于每公斤对象体重的去核细胞数量。在一些实施方案中，剂量可以约1000个细胞/kg体重至约1,000,000,000,000个细胞/kg体重、约1,000个细胞/kg体重至约1,000,000,000,000个细胞/kg体重之间的剂量量施用。在一些实施方案中，剂量可以约1000个细胞/kg体重至约1,000,000,000,000个细胞/kg体重、约1,000个细胞/kg体重至约10,000个细胞/kg体重、约1,000个细胞/kg体重至约100,000个细胞/kg体重、约1,000个细胞/kg体重至约1,000,000个细胞/kg体重、约1,000个细胞/kg体重至约10,000,000个细胞/kg体重、约1,000个细胞/kg体重至约100,000,000个细胞/kg体重、约1,000个细胞/kg体重至约1,000,000,000个细胞/kg体重、约1,000个细胞/kg体重至约10,000,000,000个细胞/kg体重、约1,000个细胞/kg体重至约100,000,000,000个细胞/kg体重、约1,000个细胞/kg体重至约1,000,000,000,000个细胞/kg体重、约10,000个细胞/kg体重至约100,000个细胞/kg体重、约10,000个细胞/kg体重至约1,000,000个细胞/kg体重、约10,000个细胞/kg体重至约10,000,000个细胞/kg体重、约10,000个细胞/kg体重至约100,000,000个细胞/kg体重、约10,000个细胞/kg体重至约1,000,000,000个细胞/kg体重、约10,000个细胞/kg体重至约10,000,000,000个细胞/kg体重、约10,000个细胞/kg体重至约100,000,000,000个细胞/kg体重、约10,000个细胞/kg体重至约1,000,000,000,000个细胞/kg体重、约100,000个细胞/kg体重至约1,000,000个细胞/kg体重、约100,000个细胞/kg体重至约10,000,000个细胞/kg体重、约100,000个细胞/kg体重至约100,000,000个细胞/kg体重、约100,000个细胞/kg体重至约1,000,000,000个细胞/kg体重、约100,000个细胞/kg体重至约10,000,000,000个细胞/kg体重、约100,000个细胞/kg体重至约100,000,000,000个细胞/kg体重、约100,000个细胞/kg体重至约1,000,000,000,000个细胞/kg体重、约1,000,000个细胞/kg体重至约10,000,000个细胞/kg体重、约1,000,000个细胞/kg体重至约100,000,000个细胞/kg体重、约1,000,000个细胞/kg体重至约1,000,000,000个细胞/kg体重、约1,000,000个细胞/kg体重至约10,000,000,000个细胞/kg体重、约1,000,000个细胞/kg体重至约100,000,000,000个细胞/kg体重、约1,000,000个细胞/kg体重至约1,000,000,000,000个细胞/kg体重、约10,000,000个细胞/kg体重至约100,000,000个细胞/kg体重、约10,000,000个细胞/kg体重至约1,000,000,000个细胞/kg体重、约10,000,000个细胞/kg体重至约10,000,000,000个细胞/kg体重、约10,000,000个细胞/kg体重至约100,000,000,000个细胞/kg体重、约10,000,000个细胞/kg体重至约1,000,000,000,000个细胞/kg体重、约100,000,000个细胞/kg体重至约1,000,000,000个细胞/kg体重、约100,000,000个细胞/kg体重至约10,000,000,000个细胞/kg体重、约100,000,000个细胞/kg体重至约100,000,000,000个细胞/kg体重、约100,000,000个细胞/kg体重至约1,000,000,000,000个细胞/kg体重、约1,000,000,000个细胞/kg体重至约10,000,000,000个细胞/kg体重、约1,000,000,000个细胞/kg体重至约100,000,000,000个细胞/kg体重、约1,000,000,000个细胞/kg体重至约1,000,000,000,000个细胞/kg体重、约10,000,000,000个细胞/kg体重至约100,000,000,000个细胞/kg体重、约10,000,000,000个细胞/kg体重至约1,000,000,000,000个细胞/kg体重或约100,000,000,000个细胞/kg体重至约1,000,000,000,000个细胞/kg体重之间的剂量量施用。在一些实施方案中，剂量可以约1000个细胞/kg体重至约1000000000000个细胞/kg体重、约1,000个细胞/kg体重、约10,000个细胞/kg体重、约100,000个细胞/kg体重、约1,000,000个细胞/kg体重、约10,000,000个细胞/kg体重、约100,000,000个细胞/kg体重、约1,000,000,000个细胞/kg体重、约10,000,000,000个细胞/kg体重、约100,000,000,000个细胞/kg体重或约1,000,000,000,000个细胞/kg体重之间的剂量量施用。在一些实施方案中，剂量可以约1000个细胞/kg体重至约1000000000000个细胞/kg体重、至少约1,000个细胞/kg体重、约10,000个细胞/kg体重、约100,000个细胞/kg体重、约1,000,000个细胞/kg体重、约10,000,000个细胞/kg体重、约100,000,000个细胞/kg体重、约1,000,000,000个细胞/kg体重、约10,000,000,000个细胞/kg体重或约100,000,000,000个细胞/kg体重之间的剂量量施用。在一些实施方案中，剂量可以约1000个细胞/kg体重至约1000000000000个细胞/kg体重、至多约10,000个细胞/kg体重、约100,000个细胞/kg体重、约1,000,000个细胞/kg体重、约10,000,000个细胞/kg体重、约100,000,000个细胞/kg体重、约1,000,000,000个细胞/kg体重、约10,000,000,000个细胞/kg体重、约100,000,000,000个细胞/kg体重或约1,000,000,000,000个细胞/kg体重之间的剂量量施用。在一些实施方案中，没有细胞核的细胞在至少一小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、1天、2天、一周、2周、3周、一个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、一年、2年、3年或4年内两次施用于对象。

在一些实施方案中，包含相同去核细胞的组合物或药物组合物可以重复施用于有需要的对象。在一些实施方案中，第一次施用包含去核细胞的组合物或药物组合物使血管或淋巴管正常化。在一些实施方案中，包含相同去核细胞的组合物或药物组合物可以随后施用于对象，以用于：维持血管或淋巴管的正常化；以及递送用于治疗本文所述的疾病或病症的外源剂。

试剂盒

在一些实施方案中，本文公开了使用本文所述的组合物的试剂盒。在一些实施方案中，本文公开的试剂盒可以用于治疗对象的疾病或病症。在一些实施方案中，试剂盒包括除组合物之外的材料或组件的集合物。

在一些实施方案中，本文所述的试剂盒包括本文公开的药物配制品，所述药物配制品包含被工程化以表达(并且在一些情况下分泌)本文公开的单结构域抗体或抗原结合片段的去核细胞。在一些实施方案中，所述单结构域抗体或抗原结合片段对于免疫检查点分子(诸如PD-L1)具有特异性。在一些实施方案中，所述去核细胞被进一步工程化以表达靶向部分，诸如趋化因子受体、整合素信号传导分子或抗体或其抗原结合片段，所述靶向部分使去核细胞一旦施用就能够有效地迁移至对象的靶组织。在一些实施方案中，所述靶组织包括肺组织。在一些实施方案中，试剂盒还包括额外的治疗剂，诸如本文公开的那些。在一些实施方案中，试剂盒还包括用于向对象施用药物配制品和/或额外的治疗剂以治疗对象的疾病或病症诸如癌症的说明书。在一些实施方案中，所述癌症包括肺组织的癌症。在一些实施方案中，所述癌症是肺癌。

在一些实施方案中，本文所述的试剂盒包括本文公开的药物配制品，所述药物配制品包含被工程化以表达(并且在一些情况下分泌)对于上皮标志物(诸如CTGF)具有特异性的单结构域抗体或抗原结合片段的去核细胞。在一些实施方案中，所述去核细胞被进一步工程化以表达靶向部分，诸如趋化因子受体、整合素信号传导分子或抗体或其抗原结合片段，所述靶向部分使去核细胞一旦施用就能够有效地迁移至对象的靶组织。在一些实施方案中，所述靶组织包括肺组织。在一些实施方案中，试剂盒还包括额外的治疗剂，诸如本文公开的那些。在一些实施方案中，试剂盒还包括用于向对象施用药物配制品和/或额外的治疗剂以治疗对象的疾病或病症诸如肺纤维化的说明书。在一些实施方案中，所述肺纤维化包括特发性肺纤维化。

在一些实施方案中，本文所述的试剂盒包括用于选择去核细胞的均质群体的组件。在一些实施方案中，本文所述的试剂盒包括用于选择去核细胞的异质群体的组件。在一些实施方案中，试剂盒包括用于测定由去核细胞合成和/或在表面上释放或表达的生物分子(例如，治疗剂)的单元数的组件。在一些实施方案中，试剂盒包括用于进行测定诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)、单分子阵列(Simoa)、PCR和qPCR的组件。试剂盒中配置的组件的准确性质取决于其预期目的。例如，一些实施方案被配置用于治疗对象的本文公开的疾病或病症(例如，癌症)的目的。在一些实施方案中，试剂盒被特别配置用于治疗哺乳动物对象的目的。在一些实施方案中，试剂盒被特别配置用于治疗人对象的目的。

使用说明书可以包括在试剂盒中。在一些实施方案中，试剂盒包括用于向有需要的对象施用组合物的说明书。在一些实施方案中，试剂盒包括用于对组合物进行进一步工程化以表达生物分子(例如，治疗剂)的说明书。在一些实施方案中，试剂盒包括解冻或以其他方式恢复组合物的生物活性的说明书，所述组合物可以在储存或运输期间被冷冻保存、冻干或低温休眠。在一些实施方案中，试剂盒包括用于测量恢复组合物的生存力，以确保用于其预期目的的功效(例如，治疗功效，如果用于治疗对象)的说明书。

任选地，试剂盒还含有其他可用的组件，诸如稀释剂、缓冲液、药学上可接受的载剂、注射器、导管、施加器、移液或测量工具、绷带材料或其他可用的用具。试剂盒中组装的材料或组分可以以保持其可操作性和实用性的任何方便和合适的方式提供给从业者。例如，所述组分可以呈溶解的、脱水的或冻干的形式；它们可以在室温、冷藏或冷冻温度下提供。所述组分通常包含在一种或多种合适的包装材料中。

定义

使用绝对或顺序术语，例如“将”、“将不”、“应”、“不应”、“必须”、“不得”、“首先”、“最初”、“接下来”、“随后”、“之前”、“之后”、“最后”和“最终”，并不意味着限制本文公开的本实施方案的范围，而是作为示例性的。

如本文所用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”旨在还包括复数形式。此外，在术语“包括”(“including”)、“包括”(“includes”)、“具有”(“having”)、“具有”(“has”)、“具有”(“with”)或其变体在具体实施方式和/或权利要求书中使用的程度上，此类术语旨在以与术语“包含”(“comprising”)相似的方式是包含性的。

如本文所用，短语“至少一个”、“一个或多个”和“和/或”是开放式表达，在操作中既是连接词，也是反意连接词。例如，表达“A、B和C中的至少一个”、“A、B或C中的至少一个”、“A、B和C中的一个或多个”、“A、B或C中的一个或多个”和“A、B和/或C”中的每一个表示单独A、单独B、单独C、A和B一起、A和C一起、B和C一起或A、B和C一起。

如本文所用，“或”可以是指“和”、“或”或“和/或”，并且可以排外性地和包容性地使用。例如，术语“A或B”可以是指“A或B”、“A但不是B”、“B但不是A”以及“A和B”。在一些情况下，上下文可以决定特定的含义。

本文所述的任何系统、方法、软件和平台都是模块化的。因此，术语，诸如“第一”和“第二”并不一定意味着优先权、重要性顺序或行为顺序。

当提及数字或数值范围时，术语“约”意指所提及的数字或数值范围是在实验变异内(或在统计实验误差内)的近似值，并且所述数字或数值范围可以例如在所陈述的数字或数值范围的1％至15％之间变化。在实例中，术语“约”是指所陈述的数字或值的±10％。

术语“增加(increased)”、“增加(increasing)”或“增加(increase)”在本文中通常意指增加统计上显著的量。在一些方面，术语“增加(increased)”或“增加(increase)”意指与参考水平相比增加至少10％，例如与参考水平、标准或对照相比增加至少约10％、至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或高达且包括100％增加或10％-100％之间的任何增加。“增加”的其他实例包括与参考水平相比增加至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍或更多倍。

术语“降低(decreased)”、“降低(decreasing)”或“降低(decrease)”在本文中通常意指降低统计上显著的量。在一些方面，术语“降低(decreased)”或“降低(decrease)”意指与参考水平相比降低至少10％，例如与参考水平相比降低至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或高达且包括100％降低(例如，与参考水平相比不存在的水平或不可检测的水平)或10％-100％之间的任何降低。在标志物或症状的上下文中，这些术语意味着这种水平在统计上显著降低。例如，降低可以是例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或更多，并且优选下降至被接受为在没有给定疾病的个体的正常范围内的水平。“降低”的其他实例包括与参考水平相比降低至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍或更多倍。

术语“个体”或“对象”可互换使用，并且涵盖哺乳动物。哺乳动物的非限制性实例包括哺乳动物类的任何成员：人、非人灵长类动物，诸如黑猩猩和其他猿类和猴物种；农场动物，诸如牛、马、绵羊、山羊、猪；家养动物，诸如兔、狗和猫；实验室动物，包括啮齿动物，诸如大鼠、小鼠和豚鼠等。哺乳动物可以是人。如本文所用，术语“动物”包括人和非人动物。在一个实施方案中，“非人动物”是哺乳动物，例如啮齿动物，诸如大鼠或小鼠。如本文所用，“患者”是指患有或已被诊断为患有本文所述的疾病或病症的对象。

如本文所用，术语“免疫逃逸部分”是指通过其与吞噬细胞(诸如巨噬细胞和树突状细胞)表达的信号受体蛋白相互作用来减少细胞吞噬作用的信号传导肽或其部分。在一些实施方案中，免疫逃逸部分阻断免疫细胞识别或免疫细胞激活。

如本文所用，术语“靶向部分”是指将细胞(例如像去核细胞)引导至靶组织或细胞的实体。靶向部分可以是几乎任何生物分子，包括蛋白质、多肽、糖、核酸或小分子或其部分。在一些实施方案中，本文公开的靶向部分包括趋化因子受体、趋化因子、整合素信号传导分子、抗体或其抗原结合片段、或单结构域抗体或其抗原结合片段。

如本文所用，术语“跨膜部分”是指(至少部分地)跨越细胞(例如，去核细胞)的细胞膜的实体。

术语“表达(expression)”或“表达(expressing)”是指多核苷酸从DNA模板转录(诸如转录成mRNA或其他RNA转录物)的一个或多个过程和/或转录的mRNA随后翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽可以统称为“基因产物”。如果多核苷酸衍生自基因组DNA，则在真核细胞中的表达可以包括mRNA的剪接。就表达而言，“上调”通常是指多核苷酸(例如，RNA，诸如mRNA)和/或多肽序列的表达水平相对于其在对照，例如野生型状态中的表达水平有所增加，而“下调”通常是指多核苷酸(例如，RNA，诸如mRNA)和/或多肽序列的表达水平相对于其在对照，例如野生型状态中的表达有所降低。

如本文所用，“细胞”通常是指生物细胞。

如本文所用，“去核”是使细胞处于非复制状态，例如像通过去除细胞核来进行

如本文所用，术语“胞质体”、“没有细胞核的细胞”或“去核细胞”可互换使用，是指从先前有核的细胞(例如，本文所述的任何细胞)获得的无细胞核细胞。在一些实施方案中，有核细胞包括细胞器并且衍生自有核细胞的胞质体保留了此类细胞器，所述细胞器在一些情况下实现细胞功能，诸如细胞运动、蛋白质合成、蛋白质分泌、隧道纳米管的形成等。在一些实施方案中，“获得”是指涵盖对有核细胞进行去核的过程。在一些实施方案中，去核不涉及使用自然过程或其他方式将有核细胞分化为去核细胞。

如本文所用，术语“基因”是指编码个体蛋白或RNA的核酸区段(也称为“编码序列”或“编码区”)，任选地与相关联的调控区诸如启动子、操纵子、终止子等一起，所述调控区可以位于编码序列的上游或下游。术语“基因”应作广义解释，并且可以涵盖基因的mRNA、cDNA、cRNA和基因组DNA形式。在一些用途中，术语“基因”涵盖转录序列，包括5'和3'非翻译区(5'-UTR和3'-UTR)、外显子和内含子。在一些基因中，转录区可以含有编码多肽的“开放阅读框”。在所述术语的一些用途中，“基因”仅包含编码多肽所必需的编码序列(例如，“开放阅读框”或“编码区”)。在一些方面，基因不编码多肽，例如核糖体RNA基因(rRNA)和转移RNA(tRNA)基因。在一些方面，术语“基因”不仅包括转录序列，而且还包括非转录区，包括上游和下游调控区、增强子和启动子。术语“基因”可以涵盖基因的mRNA、cDNA和基因组形式。

术语“包装材料”是指用于容纳试剂盒的内容物诸如组合物等的一个或多个物理结构。将包装材料通过熟知的方法构造，优选地以提供无菌、无污染物的环境。试剂盒中采用的包装材料是习惯上用于基因表达测定和治疗施用的那些包装材料。

如本文所用，术语“包装”是指合适的固体基质或材料，诸如玻璃、塑料、纸、箔等，其能够容纳个体试剂盒组件。例如，包装可以是玻璃小瓶或预填充注射器，用于盛装适量的药物。包装材料具有外部标签，其指示试剂盒及其组件的内容物和/或用途。

术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合形式(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)或其类似物，无论是呈单链、双链抑或多链形式。多核苷酸对于细胞可以是外源的或内源的。多核苷酸可以存在于无细胞环境中。多核苷酸可以是基因或其片段。多核苷酸可以是DNA。多核苷酸可以是RNA。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。多核苷酸包含一种或多种类似物(例如，改变的骨架、糖或核碱基)。多核苷酸的非限制性实例包括基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析所定义的基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、无细胞的多核苷酸包括无细胞DNA(cfDNA)和无细胞RNA(cfRNA)、核酸探针和引物。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。

如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可以可互换使用，是指氨基酸的聚合物。蛋白质可以是指从编码开放阅读框翻译的全长多肽，或加工成其成熟形式，而多肽或肽可以是指蛋白质的降解片段或加工片段，但仍然唯一或可识别地映射到特定蛋白质。多肽可以是通过相邻氨基酸残基的羧基与氨基之间的肽键键合在一起的氨基酸的单个线性聚合物链。多肽可以被例如通过添加碳水化合物、磷酸化等来修饰。

如本文所用，术语“片段”或“部分”或等效术语可以是指具有小于蛋白质全长并任选地维持蛋白质功能的蛋白质部分。

如本文所用，术语“互补”、“互补序列”、“互补的”和“互补性”通常是指与给定序列完全互补并且杂交的序列。在一些情况下，与给定核酸杂交的序列，如果其在给定区域上的碱基序列能够互补地结合其结合配偶体的碱基，使得形成例如A-T、A-U、G-C和G-U碱基对，则被称为给定分子的“互补序列”或“反向互补序列”。一般而言，可与第二序列杂交的第一序列可特异性或选择性地与第二序列杂交，使得在杂交反应期间，与第二序列或第二序列组的杂交比与非靶序列杂交优选(例如在一组给定的条件诸如本领域常用的严格条件下热力学更稳定)。通常，可杂交序列在它们各自长度的全部或一部分上共享一定程度的序列互补性，诸如在25％-100％之间的互补性，包括大于或等于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％的序列互补性。序列同一性，诸如用于评估互补性百分比的目的，可以通过任何合适的比对算法来测量，包括但不限于Needleman-Wunsch算法(参见例如，EMBOSS Needle比对器，可见于www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html，任选地具有默认设置)、BLAST算法。可以使用所选算法的任何合适参数(包括默认参数)来评估最佳比对。

如本文所用，术语“同一性百分比(％)”通常是指在比对序列并引入空位(必要时)以实现最大同一性百分比(即，可以将空位引入候选序列和参考序列中的一者或两者以实现最佳比对，并且可以出于比较目的而忽视非同源序列)之后，候选序列的氨基酸(或核酸)残基与参考序列的氨基酸(或核酸)残基相同的百分比。可以以通常已知的多种方式实现出于确定同一性百分比的目的的比对。两个序列的同一性百分比可以通过以下来计算：使用BLAST比对测试序列与比较序列；确定比对的测试序列中与比较序列的相同位置中的氨基酸或核苷酸相同的氨基酸或核苷酸的数目；以及将相同氨基酸或核苷酸的数目除以比较序列中氨基酸或核苷酸的数目。

如本文所用，术语“体内”可以用于描述在生物体，诸如对象体内发生的事件。

如本文所用，术语“离体”可以用于描述在生物体，诸如对象体外发生的事件。不可以对对象进行“离体”测定。相反，它可以在样品与对象分开时进行。离体可以用于描述在对象体外的完整细胞中发生的事件。

如本文所用，术语“体外”可以用于描述在容器中发生的事件，所述容器用于盛装实验室试剂，使得它从获得材料的活生物来源生物体分离。体外测定可以涵盖采用活细胞或死细胞的基于细胞的测定。体外测定还可以涵盖不采用完整细胞的无细胞测定。

如本文所用，“治疗(Treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指缓解或废除障碍、疾病或病症；或与障碍、疾病或病症相关联的一种或多种症状；或环节或根除障碍、疾病或病症本身的病因。治疗的希望的作用可以包括但不限于预防疾病的发生或复发，缓解症状，减少疾病的任何直接或间接病理学结果，防止转移，降低疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，以及缓和或改进预后。

如在本文中可互换使用，术语“有效量”和“治疗有效量”通常是指足以在施用于有需要的对象时产生所需活性的组合物的量，例如包含免疫细胞诸如淋巴细胞(例如，T淋巴细胞和/或NK细胞)的组合物，其构成本公开内容的系统。在本公开内容的上下文中，术语“治疗有效”是指足以延迟通过本公开内容的方法治疗的障碍的至少一种症状的表现、阻止其进展、减轻或缓解所述至少一种症状的组合物的量。

术语“药学上可接受的载剂”、“药学上可接受的赋形剂”、“生理学上可接受的载剂”或“生理学上可接受的赋形剂”是指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。组分在可与药物配制品的其他成分相容的意义上可以是“药学上可接受的”。它还可以适于被用于接触人和动物的组织或器官，而不产生不当的毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或其他问题或并发症，与合理的益处/风险比例相当。

如本文所用，术语“施用(administration)”、“施用(administering)”及其变体是指将组合物或药剂引入对象中，并且包括组合物或药剂的同时和顺序引入。将组合物或药剂引入对象中是通过任何合适的途径进行的，包括口服、肺内、鼻内、肠胃外(静脉内、肌内、腹膜内或皮下)、直肠、淋巴内或局部。施用包括自我施用和由他人施用。合适的施用途径允许组合物或药剂执行其预期功能。例如，如果合适的途径是静脉内，则通过将组合物或药剂引入对象的静脉中来施用组合物。施用可以通过任何合适的途径来进行。在一些实施方案中，施用是静脉内施用。在一些实施方案中，施用是肺内施用。在一些实施方案中，施用是吸入。

术语“药物配制品”是指本文公开的组合物与其他化学组分诸如稀释剂或载剂(例如，药学上可接受的非活性成分)的混合物，所述其他化学组分是诸如载剂、赋形剂、粘合剂、填充剂、悬浮剂、风味剂、甜味剂、崩解剂、分散剂、表面活性剂、润滑剂、着色剂、稀释剂、增溶剂、湿润剂、增塑剂、稳定剂、渗透增强剂、润湿剂、消泡剂、抗氧化剂、防腐剂或其一种或多种组合。药物配制品可以有助于向生物体施用组合物。本领域存在多种施用化合物的技术，包括但不限于口服、注射、气溶胶、肠胃外和局部施用。

如本文所用，术语“促融合蛋白”是指当在细胞诸如去核细胞的表面上表达时，促进包含促融合蛋白的细胞和靶细胞融合的多肽。

术语“锚分子”包括可以插入并保留在细胞膜中的分子。例如，糖基磷脂酰肌醇(GPI)是可以与蛋白质复合的锚分子，其中GPI可以插入并保留在细胞膜中，从而将蛋白质锚定至细胞膜。

尽管本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员明显的是，此类实施方案仅通过举例的方式提供。本发明并不旨在受本说明书内提供的具体实施例的限制。虽然已经参考上述具体说明描述了本发明，但是对本文中实施方案的描述和说明不意在以限制性意义进行解释。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到多种变型、改变和替代。此外，应理解，本发明的所有方面不限于本文中所述的取决于各种条件和变量的具体的描绘、配置或相对比例。应理解，本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案可以用于实践本发明。因此，设想本发明还应覆盖任何此类替代方案、修改、变型或等同方案。预期以下权利要求限定本发明的范围，并且由此覆盖这些权利要求及其等同方案范围内的方法和结构。

实施方案

实施方案1.一种从具有细胞核的亲本细胞获得的去核细胞，所述去核细胞包含：用于在所述细胞核不存在的情况下合成外源单结构域抗体或其片段的一个或多个细胞内细胞器。

实施方案2.如实施方案1所述的去核细胞，其中所述外源单结构域抗体或其片段被包封在所述去核细胞中。

实施方案3.如实施方案1所述的去核细胞，其中所述外源单结构域抗体或其片段在所述去核细胞的细胞膜的质膜外侧上由所述一个或多个细胞内细胞器表达。

实施方案4.如实施方案1所述的去核细胞，其中所述外源单结构域抗体或其片段在所述去核细胞的细胞膜的胞质侧上由所述一个或多个细胞内细胞器表达。

实施方案5.如实施方案1所述的去核细胞，其中所述外源单结构域抗体或其片段与跨膜部分复合。

实施方案6.如实施方案5所述的去核细胞，其中所述跨膜部分包含跨膜多肽。

实施方案7.如实施方案6所述的去核细胞，其中所述外源单结构域抗体或其片段与所述跨膜多肽的N末端复合。

实施方案8.如实施方案6所述的去核细胞，其中所述外源单结构域抗体或其片段与所述跨膜多肽的C末端复合。

实施方案9.如实施方案1所述的去核细胞，其中所述外源单结构域抗体或其片段相对于在其他方面相同的参考单结构域抗体或其片段包含修饰，其中所述修饰将所述外源单结构域抗体或其片段锚定至所述去核细胞的细胞膜的质膜外侧或胞质侧。

实施方案10.如实施方案9所述的去核细胞，其中所述修饰包括将所述外源单结构域抗体或其片段与包含糖基磷脂酰肌醇、法尼基、棕榈酸酯、肉豆蔻酸酯或其组合的锚分子复合。

实施方案11.如实施方案1所述的去核细胞，其中通过从所述去核细胞分泌所述外源单结构域抗体或其片段，所述外源单结构域抗体或其片段由所述去核细胞释放。

实施方案12.如实施方案10所述的去核细胞，其中所述外源单结构域抗体或其片段在所述去核细胞死亡时被释放。

实施方案13.如实施方案11所述的去核细胞，其中所述外源单结构域抗体或其片段在所述去核细胞破裂时被释放。

实施方案14.如实施方案11所述的去核细胞，其中通过将所述去核细胞与另一个细胞融合，所述外源单结构域抗体或其片段从所述去核细胞转移至所述另一个细胞。

实施方案15.如前述实施方案中任一项所述的去核细胞，其中所述外源单结构域抗体或其片段与细胞毒性药物缀合。

实施方案16.如实施方案1所述的去核细胞，其中所述去核细胞包含外源多核苷酸，所述外源多核苷酸编码对应于所述外源单结构域抗体或其片段的多肽序列。

实施方案17.如实施方案16所述的去核细胞，其中所述多肽序列包含在SEQ IDNO:1-36、101-111、121-123、165-192、195、205、206、211-213、221-231、241-245、325-331和401-404中提供的序列。

实施方案18.如实施方案1所述的去核细胞，其中所述外源单结构域抗体或其片段对于由SEQ ID NO:131-134、142-152、201-202、301-312、501、521-526、541-545、561、584、591-601和701-705中的至少一种核酸编码的抗原具有特异性。

实施方案19.如实施方案1所述的去核细胞，其中所述外源单结构域抗体或其片段对于包含编码PD-L1的肽序列的抗原具有特异性。

实施方案20.如实施方案1所述的去核细胞，其中所述外源单结构域抗体或其片段对于包含SEQ ID NO:155-164、203、204、315-322、511、531-535、551-554、571、594、611-619和711中的至少一种肽序列的抗原具有特异性。

实施方案21.如实施方案1所述的去核细胞，其中所述外源单结构域抗体或其片段对于与表1中的至少一种病原体相关联的抗原具有特异性。

实施方案22.如实施方案1所述的去核细胞，其中所述外源单结构域抗体或其片段对于包含编码结缔组织生长因子(CTGF)的至少一种肽序列的抗原具有特异性。

实施方案23.如实施方案1所述的去核细胞，其中所述外源单结构域抗体或其片段对于包含SEQ ID NO:1601-1602中的至少一种肽序列的抗原具有特异性。

实施方案24.如实施方案1所述的去核细胞，其中所述外源单结构域抗体或其片段由与SEQ ID NO:801具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的核酸序列编码。

实施方案25.如实施方案1所述的去核细胞，其中所述外源单结构域抗体或其片段包含与SEQ ID NO:851具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的多肽序列。

实施方案26.如实施方案1所述的去核细胞，其中所述外源单结构域抗体或其片段由与SEQ ID NO:901具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的核酸序列编码。

实施方案27.如实施方案1所述的去核细胞，其中所述外源单结构域抗体或其片段包含与SEQ ID NO:951具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的多肽序列。

实施方案28.如实施方案1所述的去核细胞，其中所述外源单结构域抗体或其片段包含与SEQ ID NO:1701具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的多肽序列。

实施方案29.如实施方案1所述的去核细胞，其中所述外源单结构域抗体或其片段对于由肺组织中的癌细胞表达的抗原具有特异性。

实施方案30.如实施方案29所述的去核细胞，其中所述癌细胞是非小细胞肺癌(NSCLC)细胞。

实施方案31.如实施方案29所述的去核细胞，其中所述癌细胞是腺癌、鳞癌、大细胞(未分化)癌、大细胞神经内分泌癌、腺鳞癌或肉瘤样癌的细胞。

实施方案32.如实施方案29所述的去核细胞，其中所述癌细胞是小细胞肺癌(SCLC)的细胞。

实施方案33.如实施方案29所述的去核细胞，其中所述癌细胞是肺类癌瘤的细胞。

实施方案34.如实施方案29所述的去核细胞，其中所述癌细胞是腺样囊性癌的细胞。

实施方案35.如实施方案29所述的去核细胞，其中所述癌细胞是淋巴瘤的细胞。

实施方案36.如实施方案29所述的去核细胞，其中所述癌细胞是肉瘤的细胞。

实施方案37.如实施方案29所述的去核细胞，其中所述癌细胞是良性肺肿瘤的细胞。

实施方案38.如实施方案37所述的去核细胞，其中所述癌细胞是错构瘤的细胞。

实施方案39.如实施方案1所述的去核细胞，其中所述外源单结构域抗体或其片段对于由与特发性肺纤维化相关联的细胞表达的抗原具有特异性。

实施方案40.如实施方案39所述的去核细胞，其中所述外源单结构域抗体或其片段对于由与特发性肺纤维化相关联的所述细胞表达的抗原具有特异性，所述细胞是肺细胞。

实施方案41.如实施方案39所述的去核细胞，其中所述外源单结构域抗体或其片段对于由与特发性肺纤维化相关联的所述细胞表达的抗原具有特异性，所述细胞是免疫细胞。

实施方案42.如实施方案39所述的去核细胞，其中所述外源单结构域抗体或其片段对于由与特发性肺纤维化相关联的所述细胞表达的抗原具有特异性，所述细胞是肺泡细胞。

实施方案43.如实施方案39所述的去核细胞，其中所述外源单结构域抗体或其片段对于由与特发性肺纤维化相关联的所述细胞表达的抗原具有特异性，所述细胞是肺泡上皮细胞(AEC)。

实施方案44.如实施方案39所述的去核细胞，其中所述外源单结构域抗体或其片段对于由与特发性肺纤维化相关联的所述细胞表达的抗原具有特异性，所述细胞是支气管细胞。

实施方案45.如前述实施方案中任一项所述的去核细胞，其中所述去核细胞还包含至少一种额外的外源剂。

实施方案46.如实施方案1所述的去核细胞，其中所述去核细胞还包含促融合部分。

实施方案47.如实施方案46所述的去核细胞，其中所述促融合部分包含病毒促融合部分。

实施方案48.如实施方案46所述的去核细胞，其中所述促融合部分包含真核促融合部分。

实施方案49.如实施方案1所述的去核细胞，其中所述去核细胞还包含免疫逃逸部分。

实施方案50.如实施方案49所述的去核细胞，其中所述免疫逃逸部分包含CD47、PD-L1、HLA-E、HLA-G、其片段或其组合。

实施方案51.如实施方案1所述的去核细胞，其中所述去核细胞还包含靶向部分。

实施方案52.如实施方案51所述的去核细胞，其中所述靶向部分靶向所述癌细胞的生物标志物。

实施方案53.如实施方案52所述的去核细胞，其中所述外源单结构域抗体或其片段对于由癌细胞表达的抗原具有特异性，并且其中所述生物标志物是与被所述外源单结构域抗体或其片段靶向的抗原分开且不同的实体。

实施方案54.如实施方案51所述的去核细胞，其中所述靶向部分靶向肿瘤微环境内的免疫细胞的生物标志物。

实施方案55.如实施方案54所述的去核细胞，其中所述生物标志物在所述免疫细胞的表面上表达。

实施方案56.如实施方案54所述的去核细胞，其中所述生物标志物由所述免疫细胞释放。

实施方案57.如实施方案51-56中任一项所述的去核细胞，其中所述靶向部分包含趋化因子。

实施方案58.如实施方案51-56中任一项所述的去核细胞，其中所述靶向部分包含趋化因子受体。

实施方案59.如实施方案41-56中任一项所述的去核细胞，其中所述靶向部分包含粘附分子。

实施方案60.如实施方案51-56中任一项所述的去核细胞，其中所述靶向部分包含抗原。

实施方案61.如实施方案51-56中任一项所述的去核细胞，其中所述靶向部分包含与由所述癌细胞表达的抗原分开且不同的抗原。

实施方案62.如实施方案51-56中任一项所述的去核细胞，其中所述靶向部分包含不由所述癌细胞表达的抗体。

实施方案63.如实施方案51-56中任一项所述的去核细胞，其中所述靶向部分包含膜结合抗体。

实施方案64.如实施方案63所述的去核细胞，其中所述膜结合抗体是膜结合单结构域抗体。

实施方案65.如实施方案1所述的去核细胞，其中所述去核细胞具有包括在约1微米(μm)至约100μm之间的直径。

实施方案66.如实施方案65所述的去核细胞，其中所述直径包括在约1μm至约10μm之间。

实施方案67.如实施方案65所述的去核细胞，其中所述直径包括在约10μm至约100μm之间。

实施方案68.如实施方案65所述的去核细胞，其中所述直径是至少或约1μm、5μm、8μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm或100μm。

实施方案69.如实施方案68所述的去核细胞，其中所述直径包括约8μm。

实施方案70.如实施方案1所述的去核细胞，其中所述去核细胞表现出与所述有核的亲本细胞相比小至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的直径。

实施方案71.如实施方案1所述的去核细胞，其中所述亲本细胞选自：干细胞、诱导多能干细胞(iPSC)、成体干细胞、间充质基质细胞、胚胎干细胞、成纤维细胞和来自细胞系的细胞。

实施方案72.如实施方案71所述的去核细胞，其中所述亲本细胞是间充质基质细胞。

实施方案73.如实施方案1所述的去核细胞，其中所述去核细胞在低温休眠之后表现出生存力。

实施方案74.如实施方案73所述的去核细胞，其中所述去核细胞在低温休眠后表现出的如在低温休眠后24小时测量的生存力等于或大于未低温休眠的相当去核细胞的生存力。

实施方案75.如实施方案1所述的去核细胞，其中所述去核细胞在冷冻保存之后表现出生存力。

实施方案76.如实施方案75所述的去核细胞，其中所述去核细胞在低温休眠后表现出的如在冷冻保存后24小时测量的生存力等于或大于未冷冻保存的相当去核细胞的生存力。

实施方案77.如前述实施方案中任一项所述的去核细胞，其中所述去核细胞是经分离的。

实施方案78.如实施方案1-77中任一项所述的去核细胞，其中所述去核细胞是经纯化的。

实施方案79.如实施方案1-77中任一项所述的去核细胞，其中所述去核细胞是经冻干的。

实施方案80.一种细胞系，其包含如前述实施方案中任一项所述的去核细胞。

实施方案81.多个细胞，其包含如前述实施方案中任一项所述的去核细胞。

实施方案82.一种药物组合物，其包含：如实施方案1-80中任一项所述的去核细胞；和药学上可接受的：赋形剂、载剂或稀释剂。

实施方案83.如实施方案82所述的药物组合物，其包含单位剂型。

实施方案84.如实施方案82或83所述的药物组合物，其被配制用于鞘内、眼内、玻璃体内、视网膜、静脉内、肌内、心室内、脑内、小脑内、脑室内、脑实质、皮下、肿瘤内、肺内、气管内、腹膜内、膀胱内、阴道内、直肠内、口服、舌下、透皮、通过吸入、通过吸入雾化形式、通过管腔内-GI途径或其组合施用于有需要的对象。

实施方案85.如实施方案82-84中任一项所述的药物组合物，其被配制用于静脉内施用。

实施方案86.如实施方案82-84中任一项所述的药物组合物，其被配制用于肿瘤内施用。

实施方案87.如实施方案82-84中任一项所述的药物组合物，其被配制用于肺内施用。

实施方案88.如实施方案82-84中任一项所述的药物组合物，其被配制用于气管内施用。

实施方案89.如实施方案82-84中任一项所述的药物组合物，其被配制用于通过吸入雾化形式施用。

实施方案90.如实施方案82-84中任一项所述的药物组合物，还包含至少一种额外的活性剂。

实施方案91.如实施方案90所述的药物组合物，其中所述至少一种额外的活性剂包括细胞因子、生长因子、激素、抗体、酶、小分子、化合物或其组合。

实施方案92.一种试剂盒，其包括：如实施方案1-80中任一项所述的去核细胞、如实施方案81所述的细胞系、如实施方案71所述的多个细胞或如实施方案82-91中任一项所述的药物组合物；和容器。

实施方案93.一种治疗有需要的对象的疾病或病症的方法，所述方法包括：向患有与所述对象的靶细胞相关联的所述疾病或病症的所述对象施用治疗有效量的如实施方案1-80中任一项所述的细胞或如实施方案82-91中任一项所述的药物组合物，从而治疗所述对象的所述疾病或病症，其中外源单结构域抗体或其片段与由所述对象的所述靶细胞表达的抗原结合。

实施方案94.如实施方案93所述的方法，其中所述去核细胞是自体细胞。

实施方案95.如实施方案93所述的方法，其中所述去核细胞是同种异体细胞。

实施方案96.如实施方案93所述的方法，其中所述抗原包括肿瘤相关抗原(TAA)。

实施方案97.如实施方案93所述的方法，其中所述抗原包括肿瘤特异性抗原(TSA)。

实施方案98.如实施方案93-97中任一项所述的方法，其中所述外源单结构域抗体或其片段与所述抗原的结合直接杀死癌细胞。

实施方案99.如实施方案93-97中任一项所述的方法，其中所述外源单结构域抗体或其片段与所述抗原的结合破坏所述癌细胞的细胞周期信号传导。

实施方案100.如实施方案93-97中任一项所述的方法，其中所述外源单结构域抗体或其片段与所述抗原的结合破坏所述癌细胞的血管生成信号传导。

实施方案101.如实施方案93-97中任一项所述的方法，其中所述外源单结构域抗体或其片段与所述抗原的结合将免疫细胞募集至所述癌细胞。

实施方案102.如实施方案83所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞。

实施方案103.如实施方案93-102中任一项所述的方法，其中如实施方案1-80中任一项所述的去核细胞或如实施方案82-91中任一项所述的药物组合物鞘内、眼内、玻璃体内、视网膜、静脉内、肌内、心室内、脑内、小脑内、脑室内、脑实质、皮下、肿瘤内、肺内、气管内、腹膜内、膀胱内、阴道内、直肠内、口服、舌下、透皮、通过吸入、通过吸入雾化形式、通过管腔内-GI途径或其组合施用于所述对象。

实施方案104.如实施方案87所述的方法，其中如实施方案1-80中任一项所述的去核细胞或如实施方案82-91中任一项所述的药物组合物静脉内施用。

实施方案105.如实施方案86所述的方法，其中如实施方案1-80中任一项所述的去核细胞或如实施方案82-91中任一项所述的药物组合物肿瘤内施用。

实施方案106.如实施方案86所述的方法，其中如实施方案1-80中任一项所述的去核细胞或如实施方案82-91中任一项所述的药物组合物肺内施用。

实施方案107.如实施方案86所述的方法，其中如实施方案1-80中任一项所述的去核细胞或如实施方案82-91中任一项所述的药物组合物气管内施用。

实施方案108.如实施方案86所述的方法，其中如实施方案1-80中任一项所述的去核细胞或如实施方案82-91中任一项所述的药物组合物通过吸入雾化形式施用。

实施方案109.如实施方案93-108中任一项所述的方法，其中在向所述对象施用如实施方案1-80中任一项所述的去核细胞或如实施方案82-91中任一项所述的药物组合物后，所述去核细胞在所述对象中存活少于或等于14天。

实施方案110.如实施方案93-109中任一项所述的方法，其中在向所述对象施用如实施方案1-90中任一项所述的去核细胞或如实施方案92-101中任一项所述的药物组合物后，所述去核细胞在所述对象中存活少于或等于4天。

实施方案111.如实施方案93-110中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是癌细胞。

实施方案112.如实施方案93-111中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症或赘生物。

实施方案113.如实施方案1-79中任一项所述的去核细胞，其中所述外源单结构域抗体或其片段包括中和抗体。

实施方案114.如实施方案1-79或113中任一项所述的去核细胞，其中所述外源单结构域抗体或其片段结合VEGF。

实施方案115.如实施方案114所述的去核细胞，其中所述外源单结构域抗体或其片段结合VEGF-A。

实施方案116.如实施方案51-64中任一项所述的去核细胞，其中所述靶向部分靶向内皮细胞生物标志物。

实施方案117.如实施方案116所述的去核细胞，其中所述内皮细胞生物标志物由脉管系统细胞表达。

实施方案118.如实施方案116所述的去核细胞，其中所述内皮细胞生物标志物由血管细胞表达。

实施方案119.如实施方案116所述的去核细胞，其中所述内皮细胞生物标志物由淋巴管细胞表达。

实施方案120.如实施方案45所述的去核细胞，其中所述至少一种额外的外源剂包含包括肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员多肽或其催化活性片段的多肽。

实施方案121.如实施方案120所述的去核细胞，其中所述TNF超家族成员多肽或其催化活性片段在水性条件中是可溶的，其中溶解度通过浊度溶解度测定或热力学溶解度测定在体外测量。

实施方案122.如实施方案120或121所述的去核细胞，其中所述TNF超家族成员多肽包含LIGHT。

实施方案123.如实施方案120-122中任一项所述的去核细胞，其中所述TNF超家族成员多肽包含可溶性LIGHT。

实施方案124.如实施方案45所述的去核细胞，其中所述至少一种额外的外源剂包含免疫检查点分子。

实施方案125.如实施方案45所述的去核细胞，其中所述至少一种额外的外源剂包含免疫检查点抑制剂分子。

实施方案126.如实施方案45所述的去核细胞，其中所述至少一种额外的外源剂包含血管生成抑制剂。

实施方案127.如实施方案126所述的去核细胞，其中所述血管生成抑制剂包括VEGF/VEGFR抑制剂。

实施方案128.如实施方案126所述的去核细胞，其中所述VEGF/VEGFR抑制剂包括VEGF-A抑制剂。

实施方案129.一种从具有细胞核的亲本细胞获得的去核细胞，所述去核细胞包含：用于在所述细胞核不存在的情况下合成外源多肽的一个或多个细胞内细胞器，所述外源多肽包括肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员多肽或其催化活性片段。

实施方案130.如实施方案129所述的去核细胞，还包含至少一种外源靶向部分。

实施方案131.如实施方案129或130所述的去核细胞，其中所述外源多肽在水性条件下具有至少0.0001mg/ml、0.0005mg/ml、0.001mg/ml、0.005mg/ml、0.01mg/ml、0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、5.0mg/ml、10mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、500mg/ml、1,000mg/ml、5,000mg/ml、10,000mg/ml、50,000mg/ml或100,000mg/ml的溶解度，其中溶解度通过浊度溶解度测定或热力学溶解度测定测量。

实施方案132.如实施方案129或130所述的去核细胞，其中所述外源多肽在所述去核细胞的细胞膜的质膜外侧上由所述一个或多个细胞内细胞器表达。

实施方案133.如实施方案129或130所述的去核细胞，其中所述外源多肽由所述去核细胞释放。

实施方案134.如实施方案129-133中任一项所述的去核细胞，还包含编码所述外源多肽的外源多核苷酸。

实施方案135.如实施方案129-134中任一项所述的去核细胞，其中所述外源多肽包含与SEQ ID NO:1501-1511具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。

实施方案136.如实施方案135中任一项所述的去核细胞，其中所述外源多肽包含与SEQ ID NO:1511具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。

实施方案137.如实施方案129-136中任一项所述的去核细胞，其中所述TNF超家族成员多肽是LIGHT。

实施方案138.如实施方案129-136中任一项所述的去核细胞，还包含第二外源多肽。

实施方案139.如实施方案138所述的去核细胞，其中所述第二外源多肽包含抗体、免疫检查点分子或其片段。

实施方案140.如实施方案138所述的去核细胞，其中所述第二外源多肽包含抗体或其抗原结合片段。

实施方案141.如实施方案140所述的去核细胞，其中所述抗体或其抗原结合片段是中和抗体或其中和抗原结合片段。

实施方案142.如实施方案141所述的去核细胞，其中所述中和抗体或其中和抗原结合片段靶向。

实施方案143.如实施方案141所述的去核细胞，其中所述中和抗体或其中和抗原结合片段靶向血管生成素-1、血管生成素-2、内皮抑素、FGF、MMP、DII4、3类轴突导向蛋白、FGF、VEGFR、NRP-1、PDGF(BB-同源二聚体)、PDGFR、TGF-β、内皮联蛋白、TGF-β受体、CCL2、整合素αVβ3、αVβ5或α5β1、VE-钙黏着蛋白、CD31、肝配蛋白、纤溶酶原激活物、纤溶酶原激活物抑制剂-1、eNOS、COX-2、AC133、ID1/ID3、3类轴突导向蛋白或Nogo-A。

实施方案144.如实施方案141所述的去核细胞，其中所述中和抗体或其中和抗原结合片段靶向VEGF。

实施方案145.如实施方案144所述的去核细胞，其中所述中和抗体或其中和抗原结合片段靶向VEGF-A。

实施方案146.如实施方案139所述的去核细胞，其中所述免疫检查点分子包括PD-1、PD-L1、CTLA-4、VISTA、PDCD1LG2(CD273)、B7-H3(也称为CD276)、A2AR、CD27、LAG3、TIM-3、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、CD73、NKG2A、PVRIG、PVRL2、CEACAM1、CEACAM5、CEACAM6、FAK、CCR-2、CCL-2、LIF、CD47、SIRPα、M-CSF、CSF-1R、IL-3、IL-1RAP、IL-8、SEMA4D、血管生成素-2、CLEVER-1、Axl、磷脂酰丝氨酸或其片段。

实施方案147.如实施方案130所述的去核细胞，其中所述至少一种外源靶向部分包含抗体或其抗原结合片段。

实施方案148.如实施方案140所述的去核细胞，其中所述抗体或其抗原结合片段包括外源单结构域抗体或其片段。

实施方案149.如实施方案148所述的去核细胞，其中所述抗体或其抗原结合片段靶向癌细胞标志物。

实施方案150.如实施方案148所述的去核细胞，其中所述抗体或其抗原结合片段靶向内皮细胞生物标志物。

实施方案151.如实施方案150所述的去核细胞，其中所述内皮细胞生物标志物由脉管系统细胞表达。

实施方案152.如实施方案150所述的去核细胞，其中所述内皮细胞生物标志物由血管细胞表达。

实施方案153.如实施方案150所述的去核细胞，其中所述内皮细胞生物标志物由淋巴管细胞表达。

实施方案154.一种治疗对象的特征至少部分在于异常脉管系统的疾病或病症的方法，所述方法包括：向患有所述疾病或病症的所述对象施用包含一个或多个细胞内细胞器的去核细胞，所述去核细胞在细胞核不存在的情况下合成或释放包括肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员多肽或其催化活性片段的外源多肽，其中由所述细胞合成或释放的所述外源多肽对于使所述对象的所述异常脉管系统正常化是治疗有效的。

实施方案155.如实施方案154所述的方法，其中所述外源多肽包括可溶性TNF超家族成员多肽。

实施方案156.如实施方案154所述的方法，其中所述外源多肽由所述去核细胞释放。

实施方案157.如实施方案154-156中任一项所述的方法，其中所述外源多肽包含与SEQ ID NO:1501-1511具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的多肽序列。

实施方案158.如实施方案157中任一项所述的方法，其中所述外源多肽包含与SEQID NO:1508具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的多肽序列。

实施方案159.如实施方案157中任一项所述的方法，其中所述外源多肽包含与SEQID NO:1511具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的多肽序列。

实施方案160.如实施方案154-159中任一项所述的方法，其中所述TNF超家族成员多肽是LIGHT。

实施方案161.如实施方案154所述的方法，其中所述去核细胞还包含至少一种外源靶向部分，其包含抗体或抗原结合片段。

实施方案162.如实施方案161所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段包括外源单结构域抗体或其片段。

实施方案163.如实施方案162所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段靶向癌细胞标志物。

实施方案164.如实施方案162所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段靶向内皮细胞生物标志物。

实施方案165.如实施方案164所述的方法，其中所述内皮细胞生物标志物由脉管系统细胞表达。

实施方案166.如实施方案164所述的方法，其中所述内皮细胞生物标志物由血管细胞表达。

实施方案167.如实施方案164所述的方法，其中所述内皮细胞生物标志物由淋巴管细胞表达。

实施方案168.如实施方案154-167中任一项所述的方法，其中所述去核细胞将所述外源多肽递送至所述对象的所述异常脉管系统内的细胞。

实施方案169.如实施方案154-168中任一项所述的方法，其中所述去核细胞包含至少一种额外的外源剂。

实施方案170.如实施方案169所述的方法，其中所述至少一种额外的外源剂包含免疫检查点分子。

实施方案171.如实施方案169所述的方法，其中所述至少一种额外的外源剂包含免疫检查点抑制剂分子。

实施方案172.如实施方案169所述的方法，其中所述至少一种额外的外源剂包含血管生成抑制剂。

实施方案173.如实施方案172所述的方法，其中所述血管生成抑制剂包括VEGF/VEGFR抑制剂。

实施方案174.如实施方案173所述的方法，其中所述VEGF/VEGFR抑制剂包括VEGF-A抑制剂。

实施方案175.如实施方案169所述的方法，其中所述至少一种外源剂杀死所述异常脉管系统内的癌症。

实施方案176.如实施方案169所述的方法，其中所述至少一种外源剂将外源免疫细胞募集至所述异常脉管系统以杀死所述异常脉管系统内的癌症。

实施方案177.如实施方案154-176中任一项所述的方法，其中所述去核细胞鞘内、眼内、玻璃体内、视网膜、静脉内、肌内、心室内、脑内、小脑内、脑室内、脑实质、皮下、肿瘤内、肺内、气管内、腹膜内、膀胱内、阴道内、直肠内、口服、舌下、透皮、通过吸入、通过吸入雾化形式、通过管腔内-GI途径或其组合施用于所述对象。

实施方案178.如实施方案154-177中任一项所述的方法，其中在向所述对象施用所述去核细胞后，所述去核细胞在所述对象中存活少于或等于14天。

实施方案179.如实施方案154-178中任一项所述的方法，其中在向所述对象施用所述去核细胞后，所述去核细胞在所述对象中存活少于或等于4天。

实施方案180.如实施方案154-179中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症或赘生物。

实施方案181.如实施方案154-180中任一项所述的方法，其中所述异常脉管系统是在所述对象的肺中。

实施方案182.如实施方案154-181中任一项所述的方法，其还包括向所述对象施用CPI-006、莫那利珠单抗、COM701、CM24、NEO-201、地法替尼、PF-04136309、MSC-1、Hu5F9-G4(5F9)、ALX148、TTI-662、RRx-001、拉妥珠单抗(MCS110)、LY3022855、SNDX-6352、依米妥珠单抗(RG7155)、培西达替尼(PLX3397)、CAN04、卡那单抗(ACZ885)、BMS-986253、派比奈单抗(VX15/2503)、曲巴那尼、FP-1305、纬恩泊妥单抗(EnaV)、巴维妥昔单抗或其组合。

实施例

以下说明性实施例代表本文所述的刺激、系统和方法的实施方案，并且不意味着以任何方式进行限制。

实施例1.哺乳动物细胞的成功去核和存活

确定各种类型的哺乳动物细胞(例如，间充质干细胞、中性粒细胞、成纤维细胞和自然杀伤细胞)的去核效率和恢复率。在从细胞培养板中取出哺乳动物细胞之后，使用不连续的Ficoll梯度通过密度梯度离心(高速离心)对哺乳动物细胞进行去核(图2A-图2D)。表2总结了使用悬浮方案进行去核的结果。hTERT转化的间充质干细胞和原代间充质干细胞(MSC)以及成纤维细胞和中性粒细胞中的去核效率和细胞生存力最高。表3总结了使用贴壁方案进行去核的结果。间充质干细胞和巨噬细胞中的去核效率均大于70％。此实验显示，各种类型的哺乳动物细胞可以使用本文所述的任何方法进行去核。

表2.哺乳动物细胞的去核效率和生存力确定

表3.哺乳动物细胞的去核效率和生存力确定

接下来，跨96小时确定胞质体的存活(图3A)。虽然MSC随时间推移而增殖，但胞质体没有。相反，活胞质体的相对倍数变化在72小时内保持相当恒定，然后在96小时下降。因此，胞质体存活期为3-4天。由于大多数基于细胞的疗法不会立即使用，因此确定冷冻保存之后胞质体的生存力。令人意外的是，冷冻保存之后胞质体的生存力大于冷冻保存后MSC的生存力(图3B)。去核之后立即铺板的胞质体和从冷冻保存中恢复的胞质体在24小时之后展示出类似的相对细胞生存力(图3C)。此实验显示胞质体存活不受冷冻保存的影响。另外，低温休眠之后胞质体的生存力与低温休眠后MSC的生存力类似(图4A)。低温休眠不同时间长度之后恢复的胞质体能够在博伊登小室测定中经历诱导迁移，与低温休眠之后恢复的MSC类似(图4B)。

对胞质体进行了额外的生存力研究。图9说明了通过流式细胞术分析的MSC或胞质体上FITC标记的膜联蛋白V的细胞表面染色。在Flowjo中分析数据并相对于模式归一化。亲本MSC＝非工程化的MSC；同种型对照＝用匹配IgG的同种型染色的MSC。2hr(小时)/24hr/48hr/72hr胞质体＝在去核后指示的时间点分析的MSC衍生的胞质体；热休克细胞充当凋亡MSC细胞死亡的阳性对照。示出了来自3个独立实验的代表性结果。去核后3天之后，胞质体表现出细胞凋亡，如通过膜联蛋白V染色和FACS所指示。

接下来，离体设置大规模的细胞生产，接着进行大容量密度梯度离心和去核，从而生成治疗性胞质体。在一个实施方案中，向治疗性胞质体加载用于疾病治疗的治疗性货物(例如，mRNA、药物、肽等)。在另一个实施方案中，制备用于立即使用(例如，用于静脉内注射(IV)、腹膜内注射(IP)、组织或体外应用)的治疗性胞质体。

实施例2.去核细胞保留完整和功能性细胞器

在确定胞质体在冷冻保存之后是否可以保留生存力之后，进行流式细胞术分析以确定MSC衍生的胞质体的细胞表面标志物谱是否与骨髓衍生的MSC不同。MSC衍生的胞质体和骨髓衍生的MSC均维持CD45、CD90、CD44、CD146和CD166的细胞表面表达。胞质体重组细胞骨架，在2D和3D培养系统中扩散在基质蛋白上，并形成隧道纳米管，其可以在相同或不同来源的细胞之间转移生物产物。细胞器染色指示高尔基体、ER、F-肌动蛋白细胞骨架、溶酶体、内体、微管和线粒体在胞质体中保持完整。此外，胞质体在体外表现出归巢潜力。胞质体容易在细胞外基质蛋白上迁移，并朝向可溶性趋化因子梯度定向迁移(例如，通过化学传感)。值得注意的是，用纯化的mRNA外源转染的胞质体产生功能性细胞内蛋白，这可以模拟正在为各种临床用途和疾病状态开发的治疗性mRNA应用。这也证明了在细胞核不存在的情况下，用于mRNA翻译和蛋白质合成的机器在胞质体中正常运行，并且因此可以用于产生具有治疗价值的生物活性分子。

用编码已知的分泌蛋白的纯化mRNA外源转染的胞质体在条件培养基中产生功能性细胞外蛋白，从而指示在细胞核不存在的情况下，ER/高尔基体和分泌途径在胞质体中正常运行。另外，用含有分泌蛋白的胞质体条件培养基处理巨噬细胞和内皮细胞激活了这些细胞中的关键信号转导应答。这些结果证明了胞质体可以用作产生和递送具有治疗价值的分泌蛋白和生物分子的新型媒介物的概念验证。可以向胞质体加载各种货物，包括但不限于siRNA、shRNA、mRNA、DNA质粒、肽和化疗剂。

实施例3.去核细胞可以表达功能性细胞表面蛋白

如图5A所示，工程化的MSC可以被工程化以进行表达，并且表达CXCR4的MSC和表达CXCR4的工程化MSC衍生的胞质体表达相当水平的CXCR4，如通过流式细胞术确定。为了确定工程化胞质体是否可以表达功能性细胞表面蛋白，允许表达CXCR4受体的MSC和MSC衍生的胞质体朝向各种浓度的SDF-1α迁移。如图5B所示，被工程化以表达功能性CXCR4的MSC衍生的胞质体可以朝向SDF-1α迁移，并且细胞迁移随着SDF-1α浓度的增加而增加。此外，迁移的MSC衍生胞质体的数量大于表达CXCR4的迁移MSC的数量(图5)。

图6A-B显示MSC衍生的胞质体可以被工程化以表达已知介导细胞粘附至发炎脉管系统的功能性细胞粘附蛋白。图7A-C显示MSC衍生的胞质体可以被工程化以表达已知调控治疗细胞的巨噬细胞相互作用和吞噬作用的细胞蛋白。

实施例4.3D培养的去核细胞显示更好的体内生物分布。

在3D悬挂液滴中培养MSC(3D MSC)，然后去核以生成3D胞质体。通过悬挂液滴进行的MSC的3D培养方案是根据Curr Protoc Stem Cell Biol.2014年2月6日；28:单元–2B.6.(Thomas J.Bartosh1和Joni H.Ylostalo)修改的。

通过胰蛋白酶从2D培养板中收获健康的MSC，并以143万个细胞/ml重悬浮在新鲜的α-MEM(ThermoFisher 12561056)完全培养基(16.5％特级FBS、1％抗生素-抗真菌剂、1％丙谷二肽(Glutamax)、1％ HEPES)中。将15cm板的盖子完全打开，并向板中添加20ml PBS。使用多通道移液管在板盖上以35μl/液滴(大约50,000个细胞/液滴)产生液滴。在每个盖子上放置约100-120个液滴。将盖子封闭，并且将板放回培养箱中。将液滴培养2天，然后通过细胞刮铲收获并收集到15ml管中(大约300个液滴/管)。将管以1,200rpm离心5分钟。去除上清液，并且用PBS洗涤管两次。然后去除所有的PBS，并且向每个管中添加7.5ml新鲜解冻的0.25％胰蛋白酶-EDTA(ThermoFisher 25200114)。将管在水浴中温育4分钟。用具有低吸附吸头的1ml移液管将液滴轻轻移液约10-20次，并在水浴中再温育4分钟。再次用具有低吸附吸头的1ml移液管将液滴轻轻移液约10-20次，直至大多数液滴被解离。向每个管中添加7.5ml完全血清培养基(丙谷二肽补充剂(Gibco 35050061)；胎牛血清-特级选择(AtlantaBiologicals S11550)；HEPES(1M)(Gibco 15630080)；抗生素-抗真菌剂(100X)(Gibco15240062))，并且将管在1,200rpm下离心10分钟。将解离的细胞用10ml完全血清培养基洗涤，并且将细胞用5ml完全血清培养基重悬浮。将细胞通过70μm细胞过滤器，并且然后用5ml完全血清培养基洗涤过滤器。对细胞进行计数，并用预处理的12.5％ Ficoll以超过10M/ml重悬浮。每个去核管使用30-40M个细胞。随后进行以上所述的去核方案。

将DiD标记的正常2D培养的MSC(2D MSC)、3D MSC或3D胞质体分别眶后注射到BalB/C小鼠中。在注射之后24小时收获指示的组织，并且通过FACS分析DiD标记的细胞。图8A-图8C显示从3D培养的MSC成功生成3D衍生的胞质体，并且还显示3D衍生的胞质体在注射到循环中之后比2D培养的细胞具有更少的肺捕获和更好的外周器官生物分布。预期这将极大地改善它们定位组织并将货物递送至组织的治疗能力。

实施例5.生成去核细胞

间充质基质细胞(MSC)的去核

50％ Ficoll溶液的制备：在避光的玻璃烧杯中，通过在室温下进行连续磁力搅拌24小时，将几克的Ficoll(PM400，GE Healthcare 17-0300-500)溶解在等毫升量的超纯水(Invitrogen 10977-015)中。然后将混合物高压灭菌30分钟。一旦将混合物冷却，就再次搅拌以确保均匀的稠度。在折射计(Reichert 13940000)上测量折射率，并且折射率在1.4230-1.4290的范围内。将等分试样储存在-20摄氏度下。

2XMEM的制备：对于每50ml量，使用10mL 10X MEM(Gibco，11430-030)、精确2.94mL的碳酸氢钠(7.5％，Gibco，25080-094)、1mL 100X青链霉素(Gibco 15140-122)和36mL超纯水(Invitrogen 10977-015)。然后将溶液通过0.22um膜烧瓶(Olympus 25-227)过滤并储存在4摄氏度下。

在去核的前一天，将MSC以2.5M/15cm板(Olympus 25-203)接种在20mL MSC培养基DMEM1X(Gibco 12561-056)；16.5％特级FBS(Atlanta Biologics S1150)；1％ HEPES1M(Gibco 15630-80)；1％抗-抗100X(Gibco 15240-062)；1％丙谷二肽100X(Gibco 35050-061)中。接下来，将细胞松弛素B(Sigma Aldrich C6762)添加到2X MEM(2μM/mL最终浓度)中。

Ficoll梯度的制备：将2XCytoB以1:1稀释度添加到50％ Ficoll等分试样中，产生25％ Ficoll储备液浓度。接下来，通过用适当体积的1X MEM缓冲液(以1:1稀释度将含有细胞松弛素B的2XMEM添加到超纯水中)稀释25％ Ficoll来制备17％、16％、15％和12.5％Ficoll。将稀释液在用未定牢的盖子覆盖的CO₂培养箱中平衡至少1小时。然后将Ficoll梯度倒入13.2mL超透明管(Beckman，344059)中，并在CO₂培养箱中温育过夜(6-18小时)。

在去核当天，将12-25M MSC(理想情况下为20M)收集到每个管中进行去核。抽吸培养基，并且将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)(GIBCO 14190-144)洗涤一次。向每个板中添加5mL TrypLE-Select(Gibco，12563011)并温育长达5分钟。当90％的细胞分离时，添加5mL完全MSC培养基，并且将细胞收集到50ml管(3-4个板/管)中。然后将管以1,200rpm离心5分钟。将沉淀重悬浮在10mL PBS中。对细胞进行计数，沉淀并用12.5％ Ficoll重悬浮。接下来，将细胞-Ficoll混合物逐滴通过40um细胞过滤网(Falcon 352340)到新的50mL管中。使用注射器，将3.2mL细胞悬浮液缓慢加载到预制梯度上。用注射器将1mL 1X MEM缓冲液添加在最后一层(顶层)上。然后将管加载到转子桶中，平衡，并在超速离心机(Beckman，L8M)中运行60分钟，26,000rpm，31℃，加速7，减速7。在离心结束时，有三层：靠近顶部的一层12.5％(胞质体和碎片)，靠近界面的一层12.5％/15％(胞质体)，以及在底部的沉淀25％(核质体)。将15％ Ficoll溶液以上的层收集到15ml锥形管中。然后将收集的层用超过4个体积的温热无血清MSC培养基(即，3mL Ficoll并用多达15mL培养基填充)稀释。在轻轻混合之后，将混合物以1,200rpm沉淀10分钟。用温热的无血清MSC培养基进行三次洗涤后，根据实验方案将细胞重悬浮在培养基中，例如，转染培养基相对于迁移培养基相对于无血清培养基相对于完全培养基。通过添加具有1:2000稀释度的Dyecycle^TM绿(分子探针V35004)或1:5000稀释度的Hoechst 33342的完全MSC培养基来在12孔板中确定去核效率。将每一层的小体积添加到每个孔中，并允许在培养箱中附着/染色10分钟。通过落射荧光显微镜确定每个群体的阴性胞质体的百分比。

胞质体mRNA转染

将1M胞质体用温热的1ml无氨基酸α-MEM完全培养基(ThermoFisher 12561056；16.5％特级胎牛血清(FBS)、1％丙谷二肽(Gibco 35050061)、1％ HEPES(Gibco15630080))悬浮。将1μg mRNA用温热的opti-MEM稀释，并用移液管混合至少20次。将4μl脂质体载体(lipofectamine)-3000(ThermoFisher L300015)添加到46μl温热的opti-MEM(ThermoFisher 31985062)中，并用移液管混合至少20次。mRNA与脂质体载体-3000的比率是1:4(w/v)。将mRNA和脂质体载体-3000稀释液用移液管混合至少20次，并在室温下温育15分钟。将mRNA和脂质体载体-3000混合物添加到胞质体悬浮液中，充分混合并在37℃下温育30分钟。将悬浮液每5分钟振荡一次以防止细胞聚集。在温育之后，将细胞离心，并重悬浮在正常的α-MEM完全培养基(16.5％特级FBS、1％抗生素-抗真菌剂、1％丙谷二肽、1％ HEPES)或PBS中。

胞质体siRNA转染

将1M胞质体用温热的1ml无A/Aα-MEM完全培养基(16.5％特级FBS、1％丙谷二肽、1％ HEPES)悬浮。将2μl siRNA用温热的opti-MEM稀释，并用移液管混合至少20次。将8μl脂质体载体-3000用92μl温热的opti-MEM稀释，并用移液管混合至少20次。siRNA与脂质体载体-3000的比率是1:4(w/v)。将siRNA和脂质体载体-3000稀释液用移液管混合至少20次，并在室温下温育15分钟。将siRNA和脂质体载体-3000混合物添加到胞质体悬浮液中，充分混合并在37℃下温育20分钟。将悬浮液每5分钟振荡一次以防止细胞聚集。在20分钟温育之后，将细胞离心，并用正常的α-MEM完全培养基(16.5％特级FBS、1％抗生素-抗真菌剂、1％丙谷二肽、1％ HEPES)重悬浮。

溶瘤病毒感染的胞质体的生成

在去核前一天(通常在去核之前18小时)，将2.5*10^6个hTERT-MSC接种在15cm培养皿上。在接种之后大约两小时，将细胞用PBS洗涤一次。然后用8mL无血清opti-MEM，将细胞以不同的MOI(例如，0.05或0.5)用oHSV-GFP(ImanisOV3001)感染。接下来，将细胞在37℃下温育2小时，偶尔振荡。然后将病毒接种物丢弃。将20mL预温热的完全培养基(α-MEM、16.5％特级FBS、1％抗生素-抗真菌剂、1％丙谷二肽、1％ HEPES)添加到每个孔中。将细胞在37℃下温育，直至去核。

在胞质体中过表达功能性蛋白的慢病毒

将靶细胞以1-2×10⁵个细胞/孔的密度铺板在6孔板的一个孔中，或以0.5-1M个MSC铺板在10cm板中。在第二天，将浓缩的重组慢病毒在37℃水浴中解冻，并且一旦解冻就立即从浴中取出。然后将细胞用PBS洗涤3次。添加200μL无血清培养基或2mL无血清培养基(1:1250SureENTRY)。将靶细胞在6孔板中以MOI 10:1感染。在第二天，去除病毒上清液，并且将适当的完全生长培养基添加到细胞中。在72小时温育之后，将细胞传代培养到2×100mm培养皿中。添加适量的选择药物(即，嘌呤霉素)以用于稳定生成细胞系。在选择之后10-15天，挑选克隆进行扩增，并筛选阳性克隆。扩增选择的阳性克隆以进行去核。如上概述制备工程化的胞质体。通过普通生化方法或功能测定(例如，荧光激活细胞分选(FACS)、蛋白质印迹或博伊登小室测定)确定胞质体上的靶蛋白表达。

将肽加载到胞质体中

将每孔1x 10⁵/ml铺板到在完全MSC培养基DMEM1X(Gibco 12561-056)；16.5％特级FBS(Atlanta Biologics S1150)；1％HEPES1M(Gibco 15630-80)；1％抗-抗100X(Gibco15240-062)；1％丙谷二肽100X(Gibco 35050-061)]中的4腔室玻璃载玻片(LabTek II 4腔室玻璃载玻片，155383)上。允许细胞附着至少1小时或过夜。然后将细胞用PBS(Gibco14190-144)冲洗。将Arg9(FAM)(10mM，Anaspec，AS-61207)在完全培养基中稀释至1:100(100uM)的总浓度。然后将胞质体温育1至2小时并用PBS冲洗3次。将Hoechst 33342(Invitrogen)以1:5000稀释度添加在完全培养基中至少10分钟。然后将细胞用PBS洗涤并通过落射荧光显微镜成像。

实施例6.产生用于治疗癌症的药物配制品

本文描述了用于治疗癌症的药物配制品，其中所述药物配制品包含本文所述的去核细胞。药物配制品可以包含本文所述的药学上可接受的赋形剂、载剂或稀释剂。药物配制品可以包含佐剂。药物配制品可以包含额外的治疗剂，诸如免疫检查点抑制剂(例如，IMP321/依替莫德α(Immutep)、瑞拉利单抗BMS-986016、伊匹单抗(Yervoy)、派姆单抗(可瑞达)、纳武单抗(欧狄沃)、西米普利单抗(Libtayo)、阿替利珠单抗(特善奇)、阿维单抗(巴文西亚)、德瓦鲁单抗(Imfinzi)、伊匹单抗(Yervoy)、LAG525、MK-4280、伊立替康、奥沙利铂、REGN3767、TSR-033、BI754111、Sym022、FS118(双特异性抗LAG3/PD-L1拮抗mAb)、MGD013(双特异性抗LAG3/PD-1拮抗mAb)、TSR-022、尼拉帕尼、贝伐珠单抗、MBG453、地西他滨、斯巴达珠单抗、Sym023、INCAGN2390、LY3321367、雷莫芦单抗、阿贝西利、美沙替尼、BMS-986258、SHR-1702、卡瑞利珠单抗、MK-7684、艾替利单抗/OMP-313M32、替瑞利尤单抗/MTIG7192A/RG-6058、BMS-986207、AB-154、ASP-8374、JNJ-61610588、CA-170d、依诺妥珠单抗/MGA271、MGD009、I-8H9/奥博妥单抗、曲妥珠单抗、MGD013(抗PD-1、抗LAG-3双重检查点抑制剂)、BGB-A1217、CM-24(MK-6018)、BMS 986178、MEDI6469、PF-04518600、GSK3174998、MOXR0916、乌托鲁单抗(PF-05082566)、乌瑞芦单抗(BMS-663513)ES101、BMS-986156、TRX-518、AMG228、JTX-2011、GSK3359609、BMS-986226、MEDI-570或伐立鲁单抗(CDX-1127))。

药物配制品可以被配制用于施用途径，包括但不限于静脉内、动脉内、口服、肠胃外、口腔、局部、透皮、直肠、肌内、皮下、骨内、经粘膜、吸入或腹膜内施用途径。本文所述的组合物可以包括但不限于水性液体分散体、自乳化分散体、固溶体、脂质体分散体、气溶胶、固体剂型、粉末、立即释放配制品、受控释放配制品、快速熔融配制品、片剂、胶囊、丸剂、延迟释放配制品、延长释放配制品、脉动释放配制品、多颗粒配制品以及混合的立即释放和受控释放配制品。

实施例7.用去核细胞治疗癌症

向被诊断患有癌症，诸如三阴性乳腺癌的对象施用包含多个胞质体的药物配制品，所述多个胞质体被工程化以含有或表达抗癌治疗剂，诸如免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1/PD-L1单克隆抗体或其单结构域抗原结合片段或其抗体-药物缀合物)或单结构域抗体或其抗原结合片段。所述药物配制品被配制用于静脉内施用或通过吸入施用。将药物配制品静脉内或通过吸入(诱导期)向对象施用一次。此后，将药物配制品以至少每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每七周一次、每两个月一次、每六个月一次或一次/任何最佳时间间隔或周期的频率施用于对象。在一些情况下，将药物配制品以维持期的时间间隔或周期施用。在治疗过程期间监测肿瘤质量的减少和/或肿瘤生物标志物(癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白片段19(CYFRA21-1)和神经元特异性烯醇化酶(NSE))水平的降低。在诱导治疗后，肿瘤质量和生物标志物水平降低，并且以剂量依赖性方式继续降低，从而说明药物配制品对于治疗癌症是治疗有效的。

在此实施例中，多个胞质体由间充质基质细胞(MSC)或诱导多能干细胞(iPSC)生成，并且被基因工程化以表达对于癌细胞上表达的配体(例如，碳酸酐酶9(CA9)、碳酸酐酶12(CA12)、癌症/睾丸抗原83(CT83)、桥粒黏蛋白(DSG3)、脂肪非典型钙黏着蛋白2(FAT2)、可能的G蛋白偶联受体87(GPR87)、KISS1受体(KISS1R)、含LY6/PLAUR结构域的蛋白3(LYPD3)、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)和跨膜丝氨酸蛋白酶4(TMPRSS4))具有特异性的归巢受体。MSC或iPSC也被工程化以表达“不要吃我”信号传导肽，诸如CD47、PD-L1、HLA-E、HLA-G、其片段或其组合。在MSC或iPSC去核之前，使用本文所述的合适的方法对MSC和iPSC进行工程化以表达归巢受体和“不要吃我”信号传导肽，以生成具有在MSC或iPSC的细胞表面表达的归巢受体和“不要吃我”信号传导肽的胞质体。

使用本文所述的合适的方法对表达归巢受体和“不要吃我”信号传导肽的MSC或iPSC进行去核，并且任选地使用冻干、低温休眠或冷冻保存进行保存。在需要时，使用本文所述的合适的方法(例如，编码抗PD-1抗体或单结构域抗体的mRNA的转染)将被工程化以表达归巢受体和“不要吃我”信号传导肽的MSC或iPSC进一步工程化以表达抗癌治疗剂。抗癌治疗剂与归巢受体和“不要吃我”信号传导肽一起在胞质体中表达。胞质体被配制用于人施用。

实施例8.用去核细胞治疗炭疽感染

对象暴露于炭疽(炭疽杆菌)并向其施用包含多个胞质体的药物配制品，所述多个胞质体被工程化以含有或表达与炭疽杆菌的表位结合的抗体或单结构域抗体或其抗原结合片段，以中和感染。所述药物配制品被配制用于静脉内施用或通过吸入施用。将药物配制品静脉内或通过吸入(诱导期)向对象施用一次。此后，将药物配制品以至少每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每七周一次、每两个月一次、每六个月一次或一次/任何最佳时间间隔或周期的频率施用于对象。在施用药物配制品后，观察到对象中炭疽杆菌减少，从而证明了药物配制品对于治疗由炭疽杆菌感染引起的疾病或病症是治疗有效的。

在此实施例中，多个胞质体由间充质基质细胞(MSC)或诱导多能干细胞(iPSC)生成，并且在去核之前或之后被基因工程化以表达抗体或单结构域抗体或其抗原结合片段，以产生多个胞质体。抗体或其抗原结合片段或单结构域抗体与炭疽杆菌表达的表位或炭疽杆菌孢子的表位结合，通过靶向用于降解的炭疽杆菌或炭疽杆菌孢子来直接赋予治疗特性，或将免疫细胞募集至炭疽杆菌或炭疽杆菌孢子并激活免疫细胞。在一些情况下，大量制造去核细胞并储存，以应对炭疽感染的爆发。储存可以是胞质体的冷冻保存、低温休眠或冻干。当有紧急需要时，胞质体的生物活性可以被恢复，并且胞质体可以制备成药物配制品用于施用。

实施例9.产生表达单链抗体的去核细胞

对MSC进行基因工程化以表达一种或多种外源单链抗体。编码单链抗体的核酸包括组氨酸标签(6XHis标签)(SEQ ID NO:1702)。在一些实施方案中，编码单链抗体的核酸与来自小鼠α-珠蛋白的5'-和3'-非翻译区(UTR)侧接。使用假尿苷的完全取代以合成转录物。在添加5'帽结构(AG)和3'多聚(A)尾(120A)(SEQ ID NO:1703)之后，将合成的核酸(例如，mRNA)用二氧化硅膜纯化。将来自TriLinkis的预制mRNA直接用于使用脂质体载体3000(ThermoFisher，#L3000008)对肺归巢胞质体(1μg/1x10⁶)进行mRNA转染，持续30分钟。冲洗转染的胞质体，然后铺板在24孔板(25,000/孔，1ml培养基)中；在24、48、72和96小时收集条件培养基；并且通过ELISA定量抗体水平。96孔ELISA板涂有抗6XHis抗体(“6XHis”，公开为SEQ ID NO:1702)(Cell Signaling，#2365)，接着与含有6XHis抗体(“6XHis”，公开为SEQ ID NO:1702)的胞质体条件培养基结合。使用与过氧化物酶抗体缀合的抗骆驼科动物VHH作为二抗(Jackson Immunoresearch，128-035-232)，接着进行TMB温育，终止溶液(Biolegend)并用μQuant酶标仪(Biotek)在450nm波长处读取。标准曲线是基于细菌纯化的6XHis抗体(“6XHis”，公开为SEQ ID NO:1702)。

实验一式三份进行，并且将结果报告为平均ng/ml，并通过学生t检验确定显著差异。使用基于细胞的测定来测试胞质体产生的抗体在体外调控靶活性的能力，所述抗体表达靶抗原并对FACS的抗体结合或可检测的细胞变化(诸如增殖、死亡、免疫抑制、细胞因子分泌等)产生应答。例如，通过使用鼠巨噬细胞系RAW264.7(ATCC)，在具有或没有LPS刺激的情况下进行巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)抗体生物活性实验。将细胞单独或与10ng LPS组合，在具有或没有125、250或500nM胞质体或细菌纯化的抗MIF抗体的情况下在NuncMaxisorp 96孔平底组织培养板中温育。将细胞在37℃下温育18h，之后收集上清液并在小鼠TNF-αELISA(R&DSystems)中进行测试。实验一式三份进行，并且将结果报告为条件的IC50，并且通过学生t检验确定显著差异。

图10A-图10C说明了表达本文所述的抗体(例如，纳米抗体、单结构域抗体或scFv)的去核细胞(工程化细胞)的示例性实验观察结果。对于细胞去核，将人端粒酶逆转录酶(hTERT)永生化的脂肪衍生的间充质基质细胞加载到Ficoll梯度(GE Healthcare，#17-0300-500)和细胞松弛素B(Sigma Aldrich，#C6762)上，最终浓度为10μg/ml。将细胞在制动最少的情况下在26,000rpm和31℃下旋转60分钟。用Vybrant Dyecycle绿(Invitrogen，#V35004)染色之后，用落射荧光显微镜(Nikon Eclipse Ti)检查去核效率。对于scFv分泌，从VectorBuilder购买慢病毒pLV-EF1A小鼠CTLA-4scFv，并且在Opti-MEM培养基(ThermoFisher，#31985088)中用8μg/ml SureENTRY转导试剂(Qiagen，#336921)以2至5MOI转导hTERT MSC。在共温育4小时之后，用CCM代替转导复合物。将细胞以5E5个细胞/6个孔接种，并且在24和48小时之后收集条件培养基。通过用抗CH3(BioRad，#MCA878G)抗体涂覆高吸收ELISA板(Biolegend，#423501)来进行scFv检测。将板在4℃下温育过夜。然后，封闭并用条件培养基在室温下振荡温育2h。用纯化的抗人IgG Fc(BioLegend，#409302)检测scFv，并且用TMD底物(Biolegend，#421101)使信号显影。在μQuant酶标仪(Biotek)上读取450nm处的吸光度，并在570nm处测量背景。

对于scFv分泌，将1μg编码抗PD-L1 NB(纳米抗体或单结构域抗体或scFv)或抗CTLA-4NB(纳米抗体或单结构域抗体或scFv)的mRNA添加到49μl预温热的opti-MEM(ThermoFisher，#31985088)中，并且单独地将4μl脂质体载体3000(ThermoFisher，#L3000008)添加到46μl opti-MEM中。将脂质体载体和mRNA溶液混合在一起，并在室温下温育15分钟。将MSC或去核细胞以1E6个细胞/ml悬浮在没有抗生素的αMEM中。将100μl混合的mRNA+脂质体载体-3000溶液添加到1ml MSC或去核细胞悬浮液中，充分混合并在37℃下温育30分钟。洗涤细胞，并且在每24个孔中接种2.5E4个细胞，每24小时收集一次条件培养基。通过用用于检测抗PD-L1 NB的抗His标签抗体(ThermoFisher，#MA121315)和用于检测抗CLTA4 NB的抗FLAG标签抗体(Sigma，#F3165)涂覆高吸收ELISA板(Biolegend，#423501)来确定scFv水平。将板在4℃下温育过夜。然后，将板封闭并用条件培养基在室温下振荡温育2h。用过氧化物酶山羊抗羊驼IgG VHH结构域(Jackson Immunoreasearch，#128-035-232)检测scFv，并且用TMD底物(Biolegend，#421101)使信号显影。在μQuant酶标仪(Biotek)上读取450nm处的吸光度并在570nm处测量背景。图10A是示出在非转染(hTERT)和转染(scFv)细胞的条件培养基中通过ELISA测量的分泌scFv的代表性图。将细胞去核(仅去核细胞和去核细胞+scFv)并接种在6孔板(0.5X10⁶/孔)中，并在去核之后24和48小时后收集条件培养基以进行ELISA检测。平均值±SEM；n＝3个生物重复。图10B是示出在非转染(仅hTERT-MSC)和转染(去核细胞+NBαPD-L1)细胞的条件培养基中通过ELISA测量的分泌抗PD-L1 NB的代表性图。将细胞接种在6孔板(0.5X10⁶/孔)中，并在去核之后24和48小时后收集条件培养基以进行ELISA检测。平均值±SEM；n＝3个生物重复。图10C是示出在非转染(仅hTERT-MSC)和转染(去核细胞+NBαCTLA-4)细胞的条件培养基中通过ELISA测量的分泌抗CTLA-4NB的代表性图。将细胞接种在6孔板(0.5X10⁶/孔)中，并在去核之后24和48小时后收集条件培养基以进行ELISA检测。平均值±SEM；n＝3个生物重复。图10A-10C证明了去核细胞表达并分泌(如通过检测条件培养基中的抗体所示)scFv或单结构域抗体。

实施例10.产生用于治疗特发性肺纤维化(IPF)的药物配制品

本文描述了用于治疗IPF的药物配制品，其中所述药物配制品包含本文所述的去核细胞。药物配制品可以包含本文所述的药学上可接受的赋形剂、载剂或稀释剂。药物配制品可以包含佐剂。药物配制品可以包含额外的治疗剂，诸如尼达尼布或吡非尼酮。

药物配制品可以被配制用于施用途径，包括但不限于静脉内、动脉内、口服、肠胃外、口腔、局部、透皮、直肠、肌内、皮下、骨内、经粘膜、吸入或腹膜内施用途径。本文所述的组合物可以包括但不限于水性液体分散体、自乳化分散体、固溶体、脂质体分散体、气溶胶、固体剂型、粉末、立即释放配制品、受控释放配制品、快速熔融配制品、片剂、胶囊、丸剂、延迟释放配制品、延长释放配制品、脉动释放配制品、多颗粒配制品以及混合的立即释放和受控释放配制品。

实施例11.治疗特发性肺纤维化(IPF)

向被诊断患有IPF的对象施用包含多个胞质体的药物配制品，所述多个胞质体被工程化以含有或表达靶向CTGF的治疗剂，诸如其抗体-药物缀合物或单结构域抗体或其抗原结合片段。药物配制品可以包含至少一种额外的治疗剂，诸如尼达尼布或吡非尼酮。所述药物配制品被配制用于静脉内施用或通过吸入施用。将药物配制品静脉内或通过吸入(诱导期)向对象施用一次。此后，将药物配制品以至少每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每七周一次、每两个月一次、每六个月一次或一次/任何最佳时间间隔或周期的频率施用于对象。在一些情况下，将药物配制品以维持期的时间间隔或周期施用。

在此实施例中，多个胞质体由间充质基质细胞(MSC)或诱导多能干细胞(iPSC)生成，并且被基因工程化以表达对于由本文所述的肺细胞表达的配体具有特异性的归巢受体。MSC或iPSC也被工程化以表达“不要吃我”信号传导肽，诸如CD47、PD-L1、HLA-E、HLA-G、其片段或其组合。在MSC或iPSC去核之前，使用本文所述的合适的方法对MSC和iPSC进行工程化以表达归巢受体和“不要吃我”信号传导肽，以生成具有在MSC或iPSC的细胞表面表达的归巢受体和“不要吃我”信号传导肽的胞质体。使用本文所述的合适的方法对表达归巢受体和“不要吃我”信号传导肽的MSC或iPSC进行去核，并且任选地使用冻干、低温休眠或冷冻保存进行保存。在需要时，使用本文所述的合适的方法(例如，编码抗CTGF抗体或单结构域抗体的mRNA的转染)将被工程化以表达归巢受体和“不要吃我”信号传导肽的MSC或iPSC进一步工程化以表达抗癌治疗剂。抗癌治疗剂与归巢受体和“不要吃我”信号传导肽一起在胞质体中表达。胞质体被配制用于人施用。

实施例12.去核细胞的冻干

间充质基质细胞(MSC)已被证明具有治疗作用。由于昂贵且苛刻的储存和转移冷冻保存条件，MSC细胞疗法的使用受到限制。本文描述了通过在较低温度(例如，-80℃或-20℃)下随时间推移保持细胞稳定性和生存力来使此过程较容易的冻干技术。优化去核细胞冻干，同时保持去核细胞的生存力、活性和蛋白表达完整，可以使去核细胞的疗法更容易获得。与液氮相比，在较高的温度下延长去核细胞生存力可以使其成为现成的产品，并降低运输、交付和储存成本。此外，冻干的去核细胞对瞬时变暖事件的敏感性低于重悬悬浮在冷冻培养基并储存在液氮中的去核细胞。另外，冻干不包括导致细胞损伤的除霜过程，特别是在大量(例如，来自重结晶)情况下。

实验程序：细胞生存力测定

为了确定冻干过程是否以及如何影响去核生存力，在完全αMEM培养基(16.6％FBS、1X丙谷二肽、1X AA和HEPES)中生长人hTERT MSC。在去核之前24小时，将细胞用0、100mM或250mM海藻糖在37℃下在完全培养基中温育。在去核之后，将去核细胞重悬浮在含有适当浓度的海藻糖的PBS中，最终浓度为在500μl中的5X10⁶个细胞/ml。测试了表4中列出的组。

表4.去核细胞的冻干

冻干可以过夜进行，并且样品可以在-20℃或-80℃下储存1、7、14或28天。对于每个时间点，可以将细胞重悬浮在0.5ml的具有适当海藻糖浓度的PBS中5分钟，接着重悬浮在4.5ml预温热的完全αMEM中。可以使用自动细胞计数器对细胞进行计数并测量其大小，比较冻干之前和之后的细胞数量和形态。可以将每种条件的7,000个细胞接种在96孔板中，并在1、24、48、72和96小时之后使用XTT分析生存力，与作为对照的有核细胞进行比较。可以将剩余的细胞接种以用于细胞表面表达、货物表达和细胞活性。

用海藻糖温育并在-80℃下储存的去核细胞比没用海藻糖温育和-20℃下储存的去核细胞更有生存力。较长的储存时间段可能导致去核细胞的生存力较低，死亡的去核细胞可能高达25％-30％。

实验程序：表面标志物表达

通过FACS在不同的时间点(1、24、48和96小时)分析表4中描述的每个样品的100,000个细胞的细胞表面表达。将每个样品用针对MSC表面标志物(CD105+、CD90+或CD45-)和工程化的过表达标志物(CXCR4、PSGL-1或CCR2)的抗体温育。冻干的去核细胞将恢复其膜脂质结构并表达天然和转染的受体。

实验程序：货物表达

将3D三重hTERT和3D三重NB hTERT组的700,000个细胞接种在6孔板上。在不同的时间点(1、24、48和96小时)收集每个样品的上清液，并使用ELISA分析抗人PD-L1单结构域抗体浓度。冻干之后对mRNA稳定性进行的实验显示，添加海藻糖使mRNA稳定性和蛋白质表达维持长达3个月。由此，通过使用海藻糖，去核细胞能够保持与新鲜制备的去核细胞相同的抗体表达水平。

实验程序：去核细胞活性

博伊登小室迁移测定可以用于评估体外去核细胞活性。将表4中每组的50,000个细胞接种在纤连蛋白涂覆的8μm孔插入物上2小时。向下腔室填充具有0.25％ BSA作为阴性对照或10％ FBS作为阳性对照的无血清αMEM。为了测试朝向趋化因子的迁移，下腔室具有SDF1α(100ng/ml)或CCL2(100ng/ml)。取出插入物并用结晶紫染色。用ImageJ对迁移的细胞成像并进行分析。如果去核细胞维持其生存力、货物表达和受体表达，则去核细胞应表现出归巢能力并随后进行迁移。

虽然前述公开内容已经出于清楚和理解的目的进行详细描述，但是本领域技术人员通过阅读本公开内容可以清楚地看到，可以在不脱离本公开内容真实范围的情况下对形式和细节进行各种改变。例如，以上所述的所有技术和装置可以以各种组合使用。本说明书中提到的所有出版物、专利、专利申请和/或其他文献都出于所有目的通过引用全文并入，其并入程度如同每个单个的出版物、专利、专利申请和/或其他文献被单个且单独地指示出于所有目的通过引用并入。

Claims (80)

1.一种去核细胞，所述去核细胞包含：

单结构域抗体或其片段，所述单结构域抗体或其片段结合免疫检查点分子；和

一个或多个细胞内细胞器，所述一个或多个细胞内细胞器被配置为翻译编码所述单结构域抗体或其片段的外源信使核糖核酸(mRNA)分子。

2.如权利要求1所述的去核细胞，其中所述单结构域抗体或其片段包含在所述去核细胞中。

3.如权利要求1所述的去核细胞，其中所述单结构域抗体或其片段由所述去核细胞释放。

4.如权利要求1所述的去核细胞，还包含细胞膜，其中所述单结构域抗体或其片段在所述细胞膜的质膜外侧上表达。

5.如权利要求1所述的去核细胞，还包含细胞膜，其中所述细胞膜包含与所述单结构域抗体或其片段偶联的跨膜部分。

6.如权利要求5所述的去核细胞，其中所述跨膜部分包含跨膜多肽。

7.如权利要求6所述的去核细胞，其中所述单结构域抗体或其片段与所述跨膜多肽的N末端或C末端偶联。

8.如权利要求1所述的去核细胞，其中所述单结构域抗体或片段与偶联至所述去核细胞的细胞表面的锚分子偶联，其中所述锚分子包含糖基磷脂酰肌醇、法尼基、棕榈酸酯、肉豆蔻酸酯或其任何组合。

9.如权利要求1所述的去核细胞，还包含被配置为将所述单结构域抗体或其片段从所述去核细胞转移至另一个细胞的融合蛋白。

10.如权利要求1-9中任一项所述的去核细胞，其中所述单结构域抗体或其片段与细胞毒性药物偶联。

11.如权利要求1所述的去核细胞，其中所述免疫检查点分子包括程序性细胞死亡蛋白1(PD-1或PDCD-1)、程序性死亡配体1(PD-L1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4，也称为分化簇152或CD152)、T细胞活化的V结构域Ig抑制因子(VISTA)、程序性细胞死亡1配体2(PDCD1LG2，也称为分化簇273或CD273)、B7同源物3(B7-H3，也称为分化簇276或CD276)、腺苷A2A受体(A2AR)、分化簇27(CD27)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、含T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域的蛋白3(TIM-3，也称为甲型肝炎病毒细胞受体2或HAVCR2)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、分化簇73(CD73)、CD94/NK组2成员A(NKG2A，也称为分化簇159或CD159)、含脊髓灰质炎病毒受体相关免疫球蛋白结构域的分子(PVRIG)、脊髓灰质炎病毒受体相关分子2(PVRL2)、癌胚抗原相关细胞粘附分子1(CEACAM1)、癌胚抗原相关细胞粘附分子5(CEACAM5)、癌胚抗原相关细胞粘附分子6(CEACAM6)、黏着斑激酶(FAK)、C-C趋化因子受体2型(CCR-2)、趋化因子(C-C基序)配体2(CCL-2)、白血病抑制因子(LIF)、分化簇47(CD47)、信号调节蛋白α(SIRPα)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、集落刺激因子1受体(CSF-1R)、白介素3(IL-3)、白介素-1受体辅助蛋白(IL-1RAP)、白介素8(IL-8)、轴突导向蛋白-4D(SEMA4D)、血管生成素-2、CLEVER-1、酪氨酸蛋白激酶受体UFO(Axl)、磷脂酰丝氨酸或其片段。

12.如权利要求11所述的去核细胞，其中所述免疫检查点分子包括PD-L1。

13.如权利要求11所述的去核细胞，其中所述免疫检查点分子包括CTLA-4。

14.如权利要求1所述的去核细胞，其中所述免疫检查点分子包含与SEQ ID NO:155–164、203、204、315–322、511、531–535、551–554、571、594、611–619或711中的任一个具有大于或等于约80％同一性的氨基酸序列。

15.如权利要求1所述的去核细胞，其中所述单结构域抗体或其片段由与SEQ ID NO:801具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的脱氧核糖核酸(DNA)序列编码。

16.如权利要求1所述的去核细胞，其中所述单结构域抗体或其片段包含与SEQ ID NO:851具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列。

17.如权利要求1所述的去核细胞，其中所述单结构域抗体或其片段由与SEQ ID NO:901具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的DNA序列编码。

18.如权利要求1所述的去核细胞，其中所述单结构域抗体或其片段包含与SEQ ID NO:951具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列。

19.如权利要求1所述的去核细胞，还包含靶向部分。

20.如权利要求19所述的去核细胞，其中所述靶向部分包含对于由肺组织中的细胞表达的配体具有特异性的归巢受体。

21.如权利要求19所述的去核细胞，其中所述靶向部分包含抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段不同于所述单结构域抗体或其片段。

22.如权利要求19所述的去核细胞，其中所述靶向部分包含趋化因子受体。

23.如权利要求20所述的去核细胞，其中所述细胞是癌细胞。

24.如权利要求23所述的去核细胞，其中所述癌细胞是非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、腺癌、鳞癌、大细胞(未分化)癌、大细胞神经内分泌癌、腺鳞癌或肉瘤样癌的细胞。

25.如权利要求20所述的去核细胞，其中所述癌细胞是良性肺肿瘤的细胞。

26.如权利要求20所述的去核细胞，其中所述癌细胞是错构瘤的细胞。

27.如权利要求1-26中任一项所述的去核细胞，其中所述去核细胞还包含治疗剂。

28.如任一项或权利要求27所述的去核细胞，其中所述治疗剂包含白介素12(IL-12)。

29.如权利要求1所述的去核细胞，还包含免疫逃逸部分，所述免疫逃逸部分包含分化簇(CD47)、PD-L1、I类主要组织相容性复合体E(HLA-E)、I类主要组织相容性复合体G(HLA-G)、其片段或其组合。

30.如权利要求1所述的去核细胞，其中所述去核细胞具有包括在约1微米(μm)至约100μm之间的直径。

31.如权利要求30所述的去核细胞，其中所述直径包括在约5μm至25μm之间。

32.如权利要求31所述的去核细胞，其中所述直径包括在约8μm至12μm之间。

33.如权利要求1所述的去核细胞，其中所述去核细胞表现出相对于在其他方面相同的有核细胞减小的直径，其中所述直径减小大于或等于约50％。

34.如权利要求1所述的去核细胞，还包含外源肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员多肽或其催化活性片段。

35.如权利要求34所述的去核细胞，其中所述外源TNF超家族成员多肽或其催化活性片段在水性条件中是可溶的。

36.如权利要求35所述的去核细胞，其中所述外源TNF超家族成员多肽包含肿瘤坏死因子超家族成员14(LIGHT)或其催化活性片段。

37.如权利要求1所述的去核细胞，其中所述去核细胞从亲本细胞获得，其中所述亲本细胞包含干细胞。

38.如权利要求37所述的去核细胞，其中所述干细胞包含诱导多能干细胞(iPSC)、成体干细胞、间充质基质细胞、胚胎干细胞或成纤维细胞。

39.如权利要求1-38中任一项所述的去核细胞，其中所述去核细胞是经纯化的。

40.如权利要求1-39中任一项所述的去核细胞，其中所述去核细胞是经冻干的。

41.多个细胞，其包含：多个如权利要求1-38中任一项所述的去核细胞。

42.一种药物配制品，其包含：

a)如权利要求1-38中任一项所述的去核细胞；和

b)药学上可接受的赋形剂、载剂或稀释剂。

43.一种将去核细胞递送至对象的方法，所述方法包括：向所述对象递送如权利要求1-38中任一项所述的去核细胞。

44.一种治疗对象的癌症的方法，所述方法包括：向所述对象施用治疗有效量的如权利要求1-38中任一项所述的去核细胞或如权利要求42所述的药物配制品，从而治疗所述对象的所述癌症。

45.如权利要求43或44所述的方法，其中所述去核细胞是自体细胞。

46.如权利要求43或44所述的方法，其中所述去核细胞是同种异体细胞。

47.如权利要求43-46中任一项所述的方法，其中所述施用通过全身施用进行。

48.如权利要求43-47中任一项所述的方法，其中在所述施用后，所述去核细胞在所述对象中存活少于或等于5天。

49.一种去核细胞，所述去核细胞包含：

单结构域抗体或其片段，所述单结构域抗体或其片段结合结缔组织生长因子(CTGF)；和

一个或多个细胞内细胞器，所述一个或多个细胞内细胞器被配置为(i)翻译编码所述单结构域抗体或其片段的外源mRNA分子，和(ii)从所述去核细胞中释放所述单结构域抗体或其片段。

50.如权利要求49所述的去核细胞，其中所述单结构域抗体或其片段包含与SEQ IDNO:1701具有大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的多肽序列。

51.如权利要求49所述的去核细胞，其中所述单结构域抗体或其片段与CTGF的氨基酸序列结合，其中所述CTGF的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1601或SEQ ID NO:1602。

52.如权利要求49所述的去核细胞，还包含对于由肺组织中的细胞表达的配体具有特异性的靶向部分。

53.如权利要求52所述的去核细胞，其中所述靶向部分包含对于由所述肺组织中的细胞表达的所述配体具有特异性的归巢受体。

54.如权利要求52所述的去核细胞，其中所述细胞是肺泡上皮细胞(AEC)。

55.如权利要求52所述的去核细胞，其中所述细胞是支气管细胞。

56.如权利要求49所述的去核细胞，还包含免疫逃逸部分，所述免疫逃逸部分包含CD47、PD-L1、HLA-E、HLA-G、其片段或其任何组合。

57.如权利要求52所述的去核细胞，其中所述靶向部分包含趋化因子受体。

58.如权利要求52所述的去核细胞，其中所述靶向部分包含粘附分子。

59.如权利要求52所述的去核细胞，其中所述靶向部分包含抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段不同于所述单结构域抗体或其片段。

60.如权利要求49所述的去核细胞，其中所述去核细胞具有包括在约1微米(μm)至约100μm之间的直径。

61.如权利要求60所述的去核细胞，其中所述直径在约5μm至25μm之间。

62.如权利要求61所述的去核细胞，其中所述直径包括在约8μm至12μm之间。

63.如权利要求49所述的去核细胞，其中所述去核细胞表现出相对于在其他方面相同的有核细胞减小的直径，其中所述直径减小大于或等于约50％。

64.如权利要求49所述的去核细胞，还包含外源肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员多肽或其催化活性片段。

65.如权利要求64所述的去核细胞，其中所述外源TNF超家族成员多肽或其催化活性片段在水性条件中是可溶的。

66.如权利要求64或65所述的去核细胞，其中所述外源TNF超家族成员多肽包含LIGHT或其催化活性片段。

67.如权利要求49所述的去核细胞，其中所述去核细胞从亲本细胞获得，其中所述亲本细胞包含干细胞。

68.如权利要求67所述的去核细胞，其中所述干细胞包含诱导多能干细胞(iPSC)、成体干细胞、间充质基质细胞、胚胎干细胞或成纤维细胞。

69.如权利要求49-68中任一项所述的去核细胞，其中所述去核细胞是经纯化的。

70.如权利要求49-69中任一项所述的去核细胞，其中所述去核细胞是经冻干的。

71.多个细胞，其包含：多个如权利要求49-70中任一项所述的去核细胞。

72.一种药物配制品，包含：

a)如权利要求49-70中任一项所述的去核细胞；和

b)药学上可接受的赋形剂、载剂或稀释剂。

73.一种将去核细胞递送至对象的方法，所述方法包括：向所述对象递送如权利要求49-70中任一项所述的去核细胞或如权利要求72所述的药物配制品。

74.一种治疗有需要的对象的特发性肺纤维化(IPF)的方法，所述方法包括：向所述对象施用治疗有效量的如权利要求49-70中任一项所述的去核细胞或如权利要求72所述的药物配制品。

75.如权利要求73或74所述的方法，其中所述去核细胞是自体细胞。

76.如权利要求73或74所述的方法，其中所述去核细胞是同种异体细胞。

77.如权利要求73-76中任一项所述的方法，其中所述施用通过全身施用进行。

78.如权利要求73-77中任一项所述的方法，其中在所述施用后，所述去核细胞在所述对象中存活少于或等于5天。

79.一种治疗有需要的对象的疾病或病症的方法，所述方法包括：向患有与所述对象的靶细胞相关联的所述疾病或病症的所述对象施用治疗有效量的如权利要求34-36或64-66中任一项所述的去核细胞，其中所述外源TNF超家族成员多肽或其催化活性片段使与所述疾病或病症相关联的脉管系统正常化，并且其中与没有使所述脉管系统正常化的相当方法的治疗功效相比，使所述脉管系统正常化增加治疗所述疾病或病症的治疗功效。

80.一种治疗对象的特征至少部分在于异常脉管系统的疾病或病症的方法，所述方法包括：向患有所述疾病或病症的所述对象施用如权利要求34-36或64-66中任一项所述的去核细胞，其中由所述去核细胞合成或释放的外源肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员多肽或其催化活性片段对于使所述对象的所述异常脉管系统正常化是治疗有效的。