DE3705229A1 - Verfahren zur bestimmung von mikrobengehalten nach einem plattengussverfahren sowie dabei zu verwendende schalen - Google Patents
Verfahren zur bestimmung von mikrobengehalten nach einem plattengussverfahren sowie dabei zu verwendende schalenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur
Bestimmung von Mikrobengehalten nach einem Plattengussverfahren,
wobei man eine Probe und einen Nährboden
in eine Schale giesst, den Nährboden gerinnen
lässt und die geronnene Platte inkubiert, wonach man
die Kolonien in der Schale zählt. Die Erfindung betrifft
ferner eine Schale, die zur Bestimmung von
Mikrobengehalten nach einem Plattengussverfahren
verwendbar ist.
In Milchwirtschafts- und übriger Lebensmittelmikrobiologie,
in medizinischer Mikrobiologie sowie in
allgemeiner Mikrobiologie werden zur Bestimmung der
Zahl von Mikroben in Proben allgemein Plattengussverfahren
verwendet. Viele der sog. internationalen
Vergleichsmethoden sind diese Methoden.
In Plattengussverfahren wird ein bestimmtes
Volumen der zu untersuchenden Probe oder einer Verdünnung
derselben in eine Petrischale inokuliert. Ueber
die Probe werden z. B. 10 bis 15 ml eines sterilen
gerinnbaren (Agar) Nährbodens mit einer Temperatur von
45 ± 1°C gegossen. Die Probe wird unmittelbar mit dem
Nährboden vermischt und das Gerinnen kann bei Raumtemperatur
auf einer waagerechten Fläche erfolgen. Die
Probe und der Nährboden können auch vor dem Giessen in
die Schale vermischt werden. Der geronnene Nährboden
liegt in der Schale in Form einer gleichmässigen
Schicht. Die geronnenen Schalen werden auf den Kopf
gestellt und in einen Inkubator verstellt (Inkubation).
Von dem Verfahren (in erster Linie davon, welche
Mikrobengruppe man bestimmen will) sind die Inkubationstemperaturen
(z. B. 10°C, 30°C, 37°C, 44°C, 55°C) und
die Inkubationsdauer (z. B. 2 Tage, 3 Tage, 6 Tage und
10 Tage) abhängig. Während der Inkubation liegen die
Schalen in waagerechter Position.
Nach der Inkubation werden die Kolonien in der
Schale gezählt. Wenn die Menge der Inokulation und die verwendeten
Verdünnungsverhältnisse bekannt sind, wird
aufgrund der zu zählenden Kolonien die Zahl der
Mikroben pro Volumen- oder Gewichtseinheit Probe,
normalerweise Stück pro ml oder Stück pro g erhalten.
Der Nährboden kann im Hinblick auf seine Nährstoffe
möglichst vielseitig sein, damit möglichst
viele Mikrobentypen der Probe Wachstumsmöglichkeiten
hätten (sog. Gesamtkolonienzahl). Der Nährboden kann
im Hinblick auf seine Nährstoffe begrenzt sein oder
man hat ihm bekannte wachstumsfördernde Verbindungen
zugesetzt. Dann wird von selektiven Nährböden gesprochen,
und das Ziel besteht darin, bestimmte Mikrobengruppen
zum Vorschein zu bringen.
Das Zählen kann nach Augenmass (durch Verwendung
von bekannten Hilfsmitteln) oder durch Verwendung von
verschiedenen elektronischen Zählvorrichtungen (automatische
Kolonienzähler) erfolgen.
Das Zählen ist durch die grosse Koloniendichte
in der Schale begrenzt. Normalerweise sind zum Zählen
nur Schalen tauglich, deren Kolonienzahl eine bestimmte
Grenze nicht überschreitet; z. B. in Schalen mit einem
Durchmesser von 9 cm wird eine Kolonienzahl von
300 Stück für die obere Grenze gehalten. Um auch Proben
zählen zu können, die einen grossen Mikrobengehalt
aufweisen, müssen Verdünnungstechniken verwendet werden.
Bei praktischer Plattengussarbeit sollen im allgemeinen
immer Verdünnungen verwendet werden. Die Fertigung von
Verdünnungsserien nimmt 70 bis 90% (anhängig vom angenommenen
Verdünnungsbedarf) von der Gesamtarbeitszeit
des Plattengussschritts in Anspruch.
Dementsprechend ist der Bedarf an Material das Vielfache
gegenüber der Anzahl der Verdünnungen.
Die bekannten Plattengussverfahren wiesen den
Nachteil auf, dass grosse Verdünnungsserien gefertigt
und mehrere Verdünnungen kultiviert werden sollen.
Dabei braucht man natürlich eine grosse Menge von
Schalen und auch der Bedarf an Inkubationsraum ist
gross. Die Verfahren sind somit aufwendig und zeitraubend.
Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung,
ein Verfahren zu schaffen, mit dem die vorstehend
genannten Nachteile vermieden werden und das die
Bestimmung von Mikrobengehalten in einfacher und
zuverlässiger Weise ermöglicht. Diese Aufgabe wird
mit dem erfindungsgemässen Verfahren gelöst, das
dadurch gekennzeichnet ist, dass die Mikroben in
einen in einer Schale gerinnenden Nährboden gebracht
werden, dessen Schichtdicke in kontrollierter Weise
variiert.
Der Grundgedanke der Erfindung besteht darin,
dass man einen Mikroben enthaltenden Nährboden in einer
Sache derart zum Gerinnen bringt, dass sich die Schichtdicke
des geronnenen Nährbodens in bestimmter Weise
ändert. Der Nährboden kann in einer Schale zum Gerinnen
gebracht werden, wobei die Schichtdicke mit Hilfe der
Geometrie der Schale eingestellt wird. Wenn sich die
Schichtdicke des Nährbodens beim Uebergang von einem
Bereich zu einem anderen Bereich der Schale ändert,
ändert sich auch die Zahl der Kolonien in entsprechender
Weise.
Der Grundgedanke kann auch derart angewendet werden,
dass eine Proben-Nährboden-Mischung in verschiedenen
Mengen in übliche Petrischalen genau dosiert
wird. Dabei wird eine Reihe von Schalen erhalten, die
eine unterschiedliche Schichtdicke aufweisen. Das
Verfahren als solches bietet aber nicht andere Rationalisierungsvorteile
als die Möglichkeit, auf die Verdünnungsserien
zu verzichten.
Nach dem Grundgedanken der Erfindung sind die
sich bildenden Kolonien nach der Inkubation in der
Zählstufe in den dünnsten Agarschichten am lichtesten
und in den dicksten Schichten am dicktesten und zwischen
diesen in Dichten, die von der Geometrie des Nährbodens
abhängig sind, zu sehen. Wenn die Probe und der
Nährboden (Agar) vor dem Giessen sorgfältig vermischt
sind und wenn ihre Mengen bekannt und die Geometrie des
Nährbodens und der Schale mathematisch bekannt sind,
lässt sich der Mikrobengehalt der Probe leicht zählen.
Für das Ergebnis kann jede den angenommenen mikrobiologischen
Standarden entsprechende Information verwendet
werden: nur die Kolonien, die in den verschiedenen
Schichtdickenzonen der Schale deutlich zu sehen sind,
werden berücksichtigt. Die Dichtegradient für die
Kolonien ist durch den Schichtdickengradienten bestimmt,
und dies wird in der Mathematik des Koloniezählens
berücksichtigt. Beim Plattengussschritt ist es wichtig,
dass die Schalen auf einer genau waagerechten Unterlage
liegen.
1. Es werden keine Verdünnungsserien benötigt,
weil die variierende Schichtdicke des Nährbodens die
Koloniendichte wenigstens in einem Bereich der Schale
derart lichter macht, dass die Proben gezählt werden
können. Die Ersparnis an Arbeitszeit gegenüber den
gegenwärtigen Verfahren beträgt 70 bis 90%, wenn keine
Verdünnungsserien benötigt werden.
2. Die Ersparnis an Nährboden ist ebenso vielfach
wie der Bedarf an Verdünnungsserien (und der davon
abhängige Bedarf an Parallelschalen) bei den gegenwärtigen
Verfahren.
3. Wenn Einwegschalen verwendet werden, ist die
Ersparnis an Material ebenso vielfach wie der durch die
Verdünnungsserien bedingte Bedarf bei den gegenwärtigen
Verfahren.
4. Es wird eine vielfache Ersparnis an Inkubationsraum
erziehlt, wenn keine durch die Verdünnungsserien
bedingten Parallelschalen benötigt werden. Das
gleiche gilt unmittelbar proportional für die Ersparnis
an Arbeitsraum und an Materialfunktionen.
5. Die Kolonien brauchen nicht über die ganze
Schale gezählt zu werden, sondern das zählbare Kolonienmaterial
wird von den durch die Geometrie des
Schalenbodens bedingten Zählzonen oder -streifen
erhalten. Auch die Tatsache, dass auf Verdünnung und
auf damit verbundene Faktoren verzichtet werden kann,
erleichtert und beschleunigt das Zählen.
6. Das gesamte Verfahren einschliesslich des
Koloniezählens lässt sich zum grössten Teil durch
Ausnutzung und Modifikation der bekannten Technik
mechanisieren und automatisieren.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
erhaltenen Mikrobengehalte stimmen weitgehend mit
Ergebnissen überein, die nach den bekannten Verfahren
erhalten sind. Sämtliche bekannten Plattengussverfahren
können durch das vorliegende Verfahren ersetzt werden.
Die Erfindung betrifft ferner eine Schale, die
bei der Bestimmung von Mikrobengehalten nach einem
Plattengussverfahren verwendbar ist, wobei man eine
Probe und einen Nährboden in eine Schale giesst, den
Nährboden gerinnen läßt und die geronnene Platte
inkubiert, wonach man die Kolonien in der Schale zählt.
Die Schale ist dadurch gekennzeichnet, dass die so
ausgebildet sind, dass in der Schale nach dem Giessen
der Probe und des Nährbodens ein Gerinnsel gebildet
wird, dessen Schichtdicke in kontrollierter
Weise variiert.
Der Grundgedanke der Erfindung, nach dem die
Schichtdicke des gerinnenden Nährbodens in der Schale
in bekannter und kontrollierter Weise variiert, kann
durch die Verwendung von Schalen neuen Typs erziehlt
werden: die Schale ist so ausgebildet, dass in der
Schale nach dem Giessen der Proben-Nährboden-Mischung
auf einer waagerechten Unterlage ein Gerinnsel gebildet
wird, dessen Schichtdicke kontrolliert variiert. Diese
neue Schale kann z. B. rund, wie eine übliche Petrischale,
oder z. B. rechteckförmig sein. Die Schichtdicke
des Nährbodens wird auf einen gewünschten Wert
dadurch eingestellt, dass als Form des Bodens einer
runden Schale eine sphärische oder eine mathematische
bekannte asphärische Fläche, und diese zwar entweder
steigend oder fallend, gewählt wird. Der Boden einer
runden Schale kann auch derart steigend oder fallend
sein, dass die Schale konzentrisch ringförmige waagerechte
Ebenen, in der Mitte eine kreisförmige Ebene
aufweist. In einer rechteckförmigen Schale kann der
Boden linear, kreisbogenförmig oder sonst mathematisch
bekannt steigend sein. Der Boden einer rechteckförmigen
Schale kann auch als mit rechteckigen Ebenen steigend
ausgebildet werden. Die rechteckige Schale ist vorzugsweise
rektangulär. Die Geometrie der Schale kann auch
mit Hilfe von am Boden vorgesehenen Einlagen verschiedener
Höhe eingestellt werden. Bei den erfindungsgemässen
Schalen kann die kleinste Dicke der Nährbodenschicht
z. B. 1 mm und die grösste Dicke 10 mm betragen.
Mit diesen Schalen werden sämtliche Vorteile
des erfindungsgemässen Verfahrens erziehlt. Es werden
keine Verdünnungsserien benötigt, und die Ersparnis
an Material, Nährboden und Inkubationsraum ist vielfach
im Vergleich zu den gegenwärtigen Verfahren. Wenn eine
rektanguläre Schale verwendet wird, ist der Bedarf an
Nährboden auch sonst geringer, im besten Falle nur
etwa 50% des Bedarfs an Nährboden in einer Petrischale,
und der Bedarf an Inkubationsraum ist mehr als 20%
kleiner als bei der Verwendung von runden Schalen,
bezogen auf die Fläche.
Erfindungsgemäss soll somit vorzugsweise eine
rektanguläre Schale verwendet werden. Dabei wiederum
wird als bevorzugt betrachtet, dass die Probe (Inokulation)
und der verwendete Nährboden vor dem Giessen in
die Schale gründlich vermischt werden.
Fig. 1A, 2A, 3, 4A, 5, 6 und 7 zeigen in
vertikalem Schnitt verschiedene Ausführungsformen der
erfindungsgemäßen Schalen mit Nährboden, und Fig. 1B,
2B und 4B zeigen die entsprechenden Schalen von oben
gesehen.
Fig. 1A und 1B zeigen eine Schale 1, die von
oben gesehen rund ist und einen nach oben konvexen
Boden 1 a aufweist. Der Nährboden ist mit Bezugszeichen 2
bezeichnet. Aus den Figuren geht hervor, dass wenn
die Schichtdicke des Nährbodens auf den äusseren
Umfang der Schale hin in einer durch die Geometrie
des Schalenbodens bedingten bekannten Weise zunimmt,
nimmt die Koloniendichte in entsprechender Weise zu.
Fig. 2A und 2B zeigen eine Schale 11, die von
der vorstehend beschriebenen Schale dadurch abweicht,
dass sie einen nach unten konvexen Boden 11 a aufweist,
wobei die Schichtdicke des Nährbodens 2 und analog
hierzu die Koloniedichte in der Mitte der Schale
am grössten sind und auf die Ränder der Schale hin abnehmen.
Fig. 3 zeigt eine Schale 21, deren Boden 21 a mit
konzentrischen waagerechten Ebenen stufenweise veränderlich
ist. In der Schale werden kreisförmige Schichtdickenzonen
gebildet, die der Geometrie des Bodens
entsprechen.
Fig. 4A und 4B zeigen eine Schale 31, die von oben
gesehen rektangulär ist und einen linear veränderlichen
Boden 31 a aufweist. Wenn die Schichtdicke beim Uebergang
von der einen kurzen Seite der Schale zu der
anderen zunimmt, nimmt die Zahl der Kolonien entsprechend
zu.
Fig. 5 zeigt eine Schale 41, deren Boden 41 a
bogenförmig steigend ist, wobei ein entsprechender
Schichtdickengradient und ein entsprechender Dichtegradient
für die Kolonien erhalten werden.
Fig, 6 zeigt eine Schale 51, deren Boden 51 a
mit rechteckigen Ebenen stufenweise steigend ist, wobei
in der Schale Schichtdickenzonen entsprechend der
Geometrie des Schalenbodens gebildet werden.
Fig. 7 zeigt eine Schale 61, deren Boden mit
Einlagen 61 a versehen ist. Die Proben-Agar-Mischung
wird ins Fach 1 zugegeben, von dem ein Teil ins Fach 2
fliesst usw., wobei in der Schale verschiedene Schichtdickenzonen
gebildet werden.
Die Erfindung wird anhand folgender Beispiele
näher erläutert.
1 µl (Schleife oder Mikropipette) einer Milchprobe
wird in 12 ml von geschmolzenem, sterilem und auf 45°C
abgekühltem Standard Plate Count Agar (z. B. FIL-IDF
100 : 1981) in steriler Teströhre aseptisch inokuliert.
Nach der Inokulation wird die Proben-Agar-Mischung
z. B. in einem Teströhrenmischer kräftig geschüttelt.
Nach dem Schütteln wird die Proben-Agar-Mischung
in eine rektanguläre Schale gegossen, deren Boden mit
waagerechten, rechteckigen Ebenen steigend ist. Die
Schale weist fünf Ebenen auf, die jeweils eine Fläche
von 4 cm2 aufweisen. Die Ebenen sind steigend und mit
einer Höhendifferenz von 2 mm abgestuft. Die Flüssigkeitsmenge
von 12 ml, das Agarvolumen des Beispiels,
füllt die beschriebene Schale so ab, dass in der Schale
fünf im Hinblick auf die Fläche gleich grosse, im
Hinblick auf die Dicke der Agarschicht aber unterschiedliche
Streifen gebildet werden. Die Schichtdicken
betragen in dem ersten Streifen 2 mm, im
zweiten Streifen 4 mm, im dritten Streifen 6 mm, im
vierten Streifen 8 mm und im fünften Streifen 10 mm.
Analog hierzu betragen die Agarmengen (und Probenmengen)
im ersten Streifen 0,80 ml (0,066 µl), im
zweiten Streifen 1,60 ml (0,133 µl), im dritten
Streifen 2,40 ml (0,199 µl), im vierten Streifen
3,20 ml (0,266 µl) und im fünften Streifen 4,00 ml
(0,333 µl). Die gemeinsame Agarfläche der Streifen
beträgt nach dem Giessen 20 cm2. Die Agar- und Probenmengen
der Streifen werden auch in Tabelle 1 aufgeführt.
Die Schale mit geschlossenem Deckel wird in
waagerechter Position 72 ± 2 Stunden bei + 30 ± 1°C
inkubiert.
Die Ergebnisse werden streifenweise durch Dividieren
der in jedem Streifen zählbaren Koloniezahl
(in der Praxis ≦ωτ 40 Stück pro Streifen) durch die
Probenzahl der Streifen gerechnet, wobei die Probenzahl
im ersten Streifen des Beispiels 0,066 µl,
d. h. 0,000066 ml und die Probenzahl im fünften Streifen
0,333 µl, d. h. 0,000333 ml, beträgt. Somit bedeuten
die Koloniezahl 3 Stück im ersten Streifen
3 Stück/0,000066 ml etwa 45 000 Stück/ml und die
Koloniezahl 17 Stück im fünften Streifen 17 Stück/
0,000333 ml etwa 50 000 Stück. Das Ergebnis stellt
direkt die Mikrobenzahl Stück pro ml der Probe dar.
Der Koloniezahlen der Streifen und die aufgrund
dieser gerechneten Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt.
Die Information aller zählbaren Streifen kann
durch Rechnen des Mittelwertes der Ergebnisse der
Streifen für das Ergebnis verwendet werden.
Die Probe wird in Agar in einem Verdünnungsverhältnis
von 10-4 (10 µl der ursprünglichen Probe in
100 ml Agar) aseptisch inokuliert. Nach der Inokulation
wird die Proben-Agar-Mischung kräftig geschüttelt
und in Mengen von 2, 5, 10, 20, 40 und 60 ml in
übliche Petrischalen gegossen, wobei die ursprüngliche
Probe in Mengen von 0,0002 ml, 0,0005 ml, 0,001 ml,
0,002 ml, 0,004 ml bzw. 0,006 ml anwesend ist. Die
Schalen werden inkubiert und die Kolonien gezählt.
Die auf den Schalen gezählten Koloniezahlen
werden nach der folgenden Formel in Koloniendichte
der ursprünglichen Probe umgerechnet
Koloniendichte in der Probe = gezählte Koloniendichte: Menge derursprünglichen Probe
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt.
Die Klammern in der Tabelle bedeuten, dass die
betreffenden Koloniendichten in den Schalen nicht
gezählt werden können. Wenn Petrischalen mit einem
Durchmesser von 90 mm verwendet werden, ist nur in Schalen,
die 10 ml oder mehr Agar enthalten, der Schalenboden
völlig von Agar bedeckt.
- Literaturverzeichnis:
- Plattenverdünnungsverfahren Standard Plate Count Method:
- 1. FIL-IDF 100 : 1981 Liquid Milk Enumeration of Microorganisms Colony Count Technique at 30°C.
- 2. ISO/DP 6610 ibid.
- 3. APHA American Public Health Association, Standard Methods for the Examination of Dairy Products, 14th Edition, 1978, S. 77-93.
- Schleifenmethode: Plate Loop Method
- 1. APHA, 14th Edition, S. 315-317
- 2. Thompson, Donnelly & Black, 1960, A Plate Loop Method for Determining Viable Counts of Raw Milk
- 3. J. Milk Food Technol. 26: 156-171
Claims (13)
1. Verfahren zur Bestimmung von Mikrobengehalten
nach einem Plattengussverfahren, wobei man eine
Probe und einen Nährboden gerinnen lässt und die geronnene Platte
inkubiert, wonach man die Kolonien in der Schale
zählt, dadurch gekennzeichnet,
dass man den Nährboden und die Probe zur Bildung einer
homogenen Mischung vermischt, in welcher der Mikrobengehalt
konstant ist, und die Mischung derart zum
Gerinnen bringt, dass die Schichtdicke des Nährbodens
in kontrollierter Weise variiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, dass man den Nährboden
in einer Schale zum Gerinnen bringt und die Schichtdicke
mit Hilfe der Geometrie der Schale einstellt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß man den Nährboden
in mehreren Schalen zum Gerinnen bringt und die
Schichtdicke mit Hilfe der Grösse der Schale und/oder
des Volumens des Nährbodens einstellt.
4. Schale, die bei der Bestimmung von Mikrobengehalten
nach einem Plattgussverfahren verwendbar
ist, wobei man eine Probe und einen Nährboden in eine
Schale giesst, den Nährboden gerinnen lässt und die
geronnene Platte inkubiert, wonach man die Kolonien in
der Schale zählt, dadurch gekennzeichnet,
dass die Schale so ausgebildet ist, dass sich
in der Schale nach dem Giessen der Probe und des
Nährbodens ein Gerinnsel bildet, dessen Schichtdicke
kontrolliert variiert.
5. Schale nach Anspruch 4, dadurch
gekennzeichnet, dass sie im Querschnitt
rund ist.
6. Schale nach Anspruch 4, dadurch
gekennzeichnet, dass sie im Querschnitt
rektangulär ist.
7. Schale nach Anspruch 4, dadurch
gekennzeichnet, dass sie einen konkaven
Boden aufweist.
8. Schale nach Anspruch 4, dadurch
gekennzeichnet, dass sie einen konvexen
Boden aufweist.
9. Schale nach Anspruch 4, dadurch
gekennzeichnet, dass sie einen linear
steigenden Boden aufweist.
10. Schale nach Anspruch 4, dadurch
gekennzeichnet, dass sie einen kreisbogenförmig
steigenden Boden aufweist.
11. Schale nach Anspruch 5, dadurch
gekennzeichnet, dass sie einen steigenden
oder fallenden Boden derart aufweist, dass in der
Schale konzentrisch ringförmige waagerechte Ebenen
und in der Mitte eine kreisförmige Ebene vorgesehen sind.
12. Schale nach Anspruch 6, dadurch
gekennzeichnet, dass sie einen mit rechteckigen
Ebenen steigenden Boden aufweist.
13. Schale nach Anspruch 4, dadurch
gekennzeichnet, dass an ihrem Bodenteil
eine Einlage oder mehrere Einlagen verschiedener
Höhe angebracht sind.
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