NL8700429A - Werkwijze voor de bepaling van microbeconcentraties met behulp van een plaatvormingswerkwijze en daarbij toegepaste schalen. - Google Patents

Description

·τ Μ 87.3007/vdKl/Tg

Merkwijze voor de bepaling van microbeconcentraties met behulp van een plaatvorminqswerkwijze en daarbij toeqepaste schalen.

De uivinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bepalen van microbeconcentraties volgens een plaatvormings-werkwijze, waarbij een monster en een medium in een schaal tot een plaat worden gevormd, men het medium vast laat worden 5 en de vaste plaat wordt geïncubeerd, waarna de kolonies in de plaat worden geteld. De uitvinding heeft eveneens betrekking op een schaal die geschikt is voor de bepaling van de microbeconcentraties met behulp van een plaatvormingswerk-wijze.

10 Bij de microbiologie van de zuivelbereiding en andere voedingsmiddelen, medische microbiologie alsmede de algemene microbiologie wordt de bepaling van het aantal microben dat in een monster aanwezig is, in het algemeen uitgevoerd met behulp van de verdunningsplaatmethoden. Veel van de zogenoem-15 de internationale vergelijkende methoden zijn van dit type.

In de verdunningsplaatmethoden wordt een bepaald volume van een te onderzoeken monster of een verdunning daarvan ge-ent in een petrischaal. Bijvoorbeeld 10 tot 15 ml van een steriel kweekmedium dat vast kan worden (agar) en een tempe-20 ratuur van 45+1 C bezit wordt op het monster uitgegoten.

Het monster wordt direkt gemengd met het medium, en men laat het stollen bij kamertemperatuur op een horizontaal oppervlak.

Het monster en het medium kunnen eveneens voor de plaatvorming worden gemengd. Het vaste medium vormt een laag met gelijke 25 dikte op de schaal. De vaste platen worden omgekeerd en in een incubator (incubatie) geplaatst. De incubatietemperaturen (bijvoorbeeld 10 °C, 30 °C, 37 °C, 44 °C, 55 °C) en de incubatietijd (bijvoorbeeld 2, 3, 6 en 10 dagen) hangt af van de toegepaste methode, voornamelijk van welke microbegroepen moe-. 30 ten worden onderzocht. De schalen bevinden zich in een horizontale positie tijdens het incuberen.

Na het incuberen worden de kolonies in de petrischaal ge- 8700429 i ï - 2 - teld. Wanneer de hoeveelheid entstof in het monster en de ver-dunningsverhoudingen bekend zijn, kan het aantal microben per volume-eenheid of gewichtseenheid van het monster, gewoonlijk microben/ml^'fnicroben/g, worden bepaald uit het aantal telbare 5 kolonies.

Het medium kan een groot aantal mogelijke voedingsmiddelen bevatten om zoveel mogelijk microbentypen van het monster de vereiste groeiomstandigheden te bieden (een zogenoemde totale kolonietelling). De voedingsmiddelen van het medium kun-10; nen eveneens worden beperkt of bekende groeiremmende verbindingen kunnen worden toegevoegd aan het medium. Dergelijke media worden aangeduid als selectieve media, en het oogmerk is een bepaalde^nicrobegroep onderscheidbaar te maken.

De tellingVmet het oog worden uitgevoerd (met behulp van 15 bekende hulpinrichtingen) of met behulp van verschillende elektrische telinrichtingen (automatische kolonietelinrich-tingen).

Een hoge kolonieconcentratie in de schaal beperkt het tellen. Het is gebruikelijk om bij het tellen uitsluitend pla-20 ten, waarvan de grootte van de kolonie niet een bepaalde grens overschrijdt, te gebruiken; bijvoorbeeld met platen met een diameter van 9 cm, wordt aangenomen dat de bovengrens ligt bij 300 kolonies. Om monsters met een hoge microbeconcentra-tie te kunnen onderzoeken is het noodzakelijk om verdunnings-25* technieken toe te passen. In de praktijk is het gewoonlijk altijd noodzakelijk om verdunningen bij de plaatvorming toe te passen. De bereiding van de opeenvolgende verdunningen neemt 70 tot 90?ó van de voor de gehele plaatvormingstrap vereiste bewerkingstijd in beslag (afhankelijk van de veronder-30 stelde noodzaak van verdunning). De materiaalbehoefte is op overeenkomstige wijze een veelvoud van het aantal verdunningen.

De bekende verdunningsplaatmethoden bezitten derhalve het nadeel dat zij de vervaardiging van grote verdunnings-reeksen en het kweken van verschillende verdunningen vereisen.

35 Een groot aantal schalen is daarbij vereist; voorts is veel incubatieruimte nodig. Met andere woorden, de methoden zijn ingewikkeld en tijdverslindend. - "

Het oogmerk van de onderhavige uitvinding is het verschaffen van een werkwijze die de bovenstaande nadelen ondervangt 870 0 42 § - 3 - en de bepaling mogelijk maakt van microbeconcentratie op een eenvoudige en betrouwbare wijze. Dit wordt verkregen met behulp van de werkwijze volgens de uitvinding die wordt gekenmerkt doordat het medium en het monster worden gemengd ter 5 verkrijging van een homogeen mengsel waarvan de microbeconcentratie constant is, en men het mengsel zodanig vast laat worden, dat de laagdikte van het medium op geregelde wijze verandert.

De grondgedachte van de uitvinding is, dat men een medium 10 dat microben bevat vast laat worden in een schaal, zodanig dat de laagdikte van het vastgeworden medium verandert op een bepaalde wijze. Het medium kan men vast laten worden in een enkele schaal, zodat de laagdikte wordt bepaald door de geometrie van de schaal. Wanneer de laagdikte van het medium ver-15 andert van een gedeelte van de schaal ten opzichte van een ander gedeelte, verandert de hoeveelheid van de kolonies overeenkomstig .

De grondgedachte kan eveneens zodanig worden toegepast dat het mengsel van het monster en het medium wordt afgemeten . 20 in bekende petrischalen in hoeveelheden die op een nauwkeurig bepaalde wijze verschillen. Dit verschaft een reeks platen met verschillende laagdikten. De methode als zodanig biedt echter geen andere rationaliseringsvoordelen dan het ondervangen van de noodzaak van opeenvolgende verdunningen.

Z5 Volgens de grondgedachte van de uitvinding worden ont wikkelde kolonies onderscheiden na incubatie in verschillende dichtheden tijdens het tellen, waarbij de dichtheid het laagste is in de dunste agarlagen en het hoogste in de dikste lagen, variërend met de geometrie van het medium in oppervlakken 30 met een laagdikte daartussen. Wanneer het monster en het medium (agar) zorgvuldig voor de vorming van de plaat zijn gemengd, waarbij de hoeveelheden daarvan bekend en de geometrie van het medium en de schotel mathematisch geregeld zijri, kan de microbeconcentratie van het monster gemakkelijk worden be-35 paald. Alle informatie met betrekking tot aanvaarde microbiologische standaards kan bij de bepaling worden toegepast: uitsluitend kolonies die duidelijk onderscheidbaar zijn in de zones met verschillende laagdikte van de plaat worden in rekening genomen. De gradiënt van de laagdikte bepaalt de 8700429 'i * - 4 - dichtheidsgradiënt van de kolonies, en dit wordt bij het berekenen van de kolonietelling in rekening genomen. Bij het vormen van de plaat is het van belang dat de schalen werkelijk op een horizontaal oppervlak zijn geplaatst.

5 De voordelen van de plaatmethode volgens de uitvinding: 1. Opeenvolgende verdunningen zijn niet noodzakelijk, omdat de koloniedichtheid voldoende laag is om te worden geteld in tenminste enkele delen van de plaat op grond van de variërende laagdikte van het kweekmedium. In vergelijking met bekende 10 methoden wordt een besparing van 70 tot 90 procent verkregen in de bewerkingstijd, omdat geen opeenvolgende verdunningen noodzakelijk zijn.

2. De in het kweekmedium verkregen besparing is evenredig met de noodzaak van opeenvolgende verdunningen in bekende me- 15 thoden (alsmede derhalve met het aantal noodzakelijke parallelle schalen).

3. Wanneer wegwerpschalen worden toegepast zijn de materiaal-besparingen evenredig met het aantal opeenvolgende verdunningen die vereist zijn in de bekende methoden.

20 4. De behoefte aan incubatieruimte is aanzienlijk verminderd omdat geen parallelle schalen, die vereist zijn door opeenvolgende verdunningen, noodzakelijk zijn. Hetzelfde geldt di-rekt voor de behoefte aan werkruimte en materiaalvoorzieningen.

5. Het is niet noodzakelijk om de kolonies op de gehele 25 schaal te tellen, doch een koloniemateriaal, dat voldoende is voor de bepaling, wordt verkregen uit telzones en sectoren die worden bepaald door de geometrie van de bodem van de schaal.

Het tellen is eveneens vereenvoudigd en sneller doordat verdunning en de gevolgen daarvan zijn ondervangen.

30 6. De gehele werkwijze, met inbegrip van het tellen van de kolonie, kan worden gemechaniseerd en geautomatiseerd, voornamelijk door toepassing en wijziging van bekende technieken.

De met behulp van de werkwijze volgens de uitvinding ver-, kregen microbeconcentraties komen bijzonder goed overeen met 35 resultaten die zijn verkregen met bekende werkwijzen. De werkwijze kan alle bekende verdunningsplaatmethoden vervangen.

De uitvinding heeft eveneens betrekking op een schaal, J

die geschikt is voor het bepalen van microbeconcentraties met behulp van een plaatvormingswerkwijze, waarbij een monster en 8700429 Μ - 5 - een medium tot een plaat worden gevormd, men het medium vast laat worden, en de vastgeworden plaat incubeert, waarna de kolonies in de plaat worden geteld. De schaal wordt gekenmerkt doordat de vorm van de schaal zodanig is dat na de vorming 5 van de plaat van het monster en het medium* een vaste laag met een geregelde, variërende dikte in de schaal is gevormd,

De grondgedachte van de uitvinding, dat wil zeggen dat de dikte van het vastgewórden medium in de schaal varieert op een bekende, regelbare wijze, kan worden gerealiseerd door 10 toepassing van schalen van een nieuw type: de schaal bezit een zodanige vorm dat,nadat van het mengsel van een monster en een medium een plaat is gevormd op een horizontaal oppervlak, een vaste laag is gevormd in de schaal waarbij de dikte van de laag varieert op een geregelde wijze. Dit nieuwe type 15 schaal kan bijvoorbeeld rond, zoals een bekende petrischaal, of bijvoorbeeld rechthoekig zijn* De laagdikte van het medium wordt aangepast tot een gewenste waarde door het bodemopper-vlak van een ronde schaal een bolle of mathematisch geregelde asferische vorm, die oplopend of dalend kan zijn, te geven.

20 De bodem van een ronde schaal kan eveneens oplopend of dalend worden gemaakt door de schaal te voorzien van concentrische ringvormige, horizontale, vlakke oppervlaktegebieden, met een rond vlak oppervlaktegebied in het midden. De bodem van een rechthoekige schaal kan lineair oplopen, langs een cirkelboog 25 of op enige andere mathematisch geregelde wijze. Het is eveneens mogelijk om de bodem van een rechthoekige schaal te voorzien van rechthoekige vlakke oppervlaktegebieden om het oplopend te maken. Een voorkeursvorm van een rechthoekige schaal is een rechthoek. De geometrie van de schaal kan eveneens wor-30 den vastgesteld met behulp van scheidingswanden met verschillende hoogten, die zijn aangebracht op de bodem daarvan. De minimale laagdikte van het medium kan bijvoorbeeld 1 mm en de maximale dikte 10 mm in de schalen volgens de uitvinding bedragen.

35 Alle volgens de werkwijze van de uitvinding geboden voor delen kunnen worden bereikt met behulp van dit type schalen. Opeenvolgende verdunningen zijn niet noodzakelijk, en de verkregen besparingen in de materialen, het medium en de incuba-tieruimte zijn aanzienlijk in vergelijking met bekende werk- 8700429 £ ·» - 6 - wijzen. Bij toepassing van een schaal met een rechthoekige vorm is de vereiste hoeveelheid medium automatisch kleiner, ten hoogste slechts ongeveer 50 procent van het medium dat vereist is bij een petrischaal, en de behoefte aan incubatie-5 ruimte is meer dan 20 procent kleiner dan die van ronde schalen, berekend op het specifieke oppervlak.

Volgens de uitvinding is het derhalve bijzonder voordelig om een schaal toe te passen met de vorm van een rechthoek. Voorts verdient het daarbij de voorkeur dat het monster (ent-10 stof) en het toegepaste medium voor de vorming van de plaat op geschikte wijze worden gemengd.

De figuren IA, 2A, 3, 4A, 5. 6 en 7 zijn vertikale dwarsdoorsneden van de verschillende uitvoeringsvormen van de schaal volgens de uitvinding en de opeenvolgende media, en de figu-15 ren IB, 2B en 4B zijn bovenaanzichten van de opeenvolgende schalen.

Fig. IA en 1B tonen een schaal 1, die van bovenaf gezien rond, en een bodem la, die naar boven toe convex is. Het medium is aangeduid met het verwijzingscijfer 2. Uit de teke-20 ningen blijkt, dat wanneer de laagdikte van het medium op bekende wijze toeneemt naar de buitenrand van de schaal, bepaald door de geometrie van de bodem van de schaal, de dichtheid van de kolonie evenredig toeneemt.

De fig. 2A en 2B tonen een schaal 11, die verschillend 25 is van de voorgaande doordat de bodem 11a daarvan naar beneden toe convex is en, derhalve de laagdikte van het medium 2, en evenzo de dichtheid van de kolonie zo hoog mogelijk is in het midden van de schaal, en afneemt naar de randen van de schaal.

30 Fig. 3 toont een schaal 21, waarvan de bodem 21a is ge vormd door horizontale vlakke oppervlaktegebieden die zodanig concentrisch zijn aangebracht, dat de vorm van de bodem stapsgewijze verandert. De schaal is derhalve voorzien van ronde laagdiktezones, die overeenkomen met de geometrie van de bodem. 35 De fig. 4A en 4B tonen een schaal 31, die van bovenaf gezien de vorm van een rechthoek bezit, en waarvan de vorm van de bodem 31 lineair verandert. De laagdikte neemt toe van een korte zijde van de schaal naar de andere, en de hoeveelheid van de kolonies neemt op overeenkomstige wijze toe.

8700429 >*· %, - 7 -

Fig. 5 toont een schaal 41, waarvan de bodem 41a op boogvormige wijze oploopt, waardoor de gradiënt van de laagdikte en de dichtheidsgradient van de kolonies overeenkomstig veranderen.

5 Fig. 6 toont een schaal 51, waarvan de bodem 51a is ge vormd uit rechthoekige vlakke oppervlaktegebieden, zodat het stapsgewijze oploopt. Laagdiktezones overeenkomende met de geometrie van de bodem van de schaal worden daardoor in de schaal gevormd.

10 Fig. 7 toont een schaal 61, waarvan de bodem is voorzien van scheidingswanden 61a. Het monster-agarmengsel wordt in afdeling 1 gebracht, waaruit een gedeelte van het mengsel in afdeling 2 stroomt, enz., zodat afzonderlijke laagdiktezones worden gevormd.

15 De uitvinding zal nader worden toegelicht met behulp van de volgende voorbeelden.

Voorbeeld T.

1yül van een melkmonster wordt aseptisch geënt (een lus of een micropipet) in 12 ml van een gesmolten steriel stan-20 daard plaat tel agar (zoals FIL-IDF 100 : 1981) dat aanwezig is in een steriele proefbuis en gekoeld tot een temperatuur van 45 °C. Na het enten wordt het mengsel van het monster en agar op geschikte wijze geschud, bijvoorbeeld in een proef-buismenger.

25 Na het mengen wordt het monster-agarmengsel tot een plaat gevormd in een rechthoekige schaal, waarvan de bodem oploopt, en is gevormd door horizontale, rechthoekige, vlakke oppervlaktegebieden. De schaal bezit vijf vlakke oppervlaktegebie- 2 den, waarvan de grootte van elk gebied 4 cm bedraagt. De 50 vlakke oppervlaktegebieden zijn op oplopende wijze met hoogteverschillen van 2 mm aangebracht. Een vloeistofhoeveelheid van 12 ml, dat het agarvolume van het voorbeeld is, vult de beschreven schaal 2odanig, dat vijf sectoren, die eenzelfde oppervlaktegebied doch verschillende agarlaagdikten bezitten, 35 worden gevormd in de schaal. De laagdikten zijn 2 mm in sector I, 4 mm in sector II, 6 mm in sector III, 8 mm in sector IV en 10 mm in sector V, waarbij de overeenkomende agarhoe-veelheden (en de monsterhoeveelheden) zijn: I 0,80 ml (0,066 /ul), II 1,60 ml (0,133yUl), III 2,40 ml (0,199/U1), IV 3,20 ml 8700429 * - 8 - (0,266/Ul) en V 4,00 ml (0,333,ul). Het totale agaroppervlak- tegebied van de sectoren is 20 cm na de vorming van de plaat. De agar en monsterhoeveelheden van de sectoren zijn eveneens weergegeven in tabel A.

5 De schaal, is afgesloten met een deksel en geïncubeerd in een horizontale stand gedurende 72+2 uren bij een temperatuur van +30 + 1 °C.

De resultaten zijn afzonderlijk voor elke sector berekend door het aantal telbare kolonies in elke sector (in de praktijk 10 < 40 kolonies per sector) te delen door de hoeveelheid van het monster die specifiek is voor elke sector; in het onderhavige voorbeeld is de hoeveelheid monster 0,066yul of 0,0000-66 ml in sector I, en 0,333 yul of 0,000333 ml in sector V. Wanneer derhalve het aantal kolonies in sector I 3 is, zijn 3 15 kolonies aanwezig per 0,000066 ml r-* 43.000 kolonies per ml; en wanneer het aanta^ kolonies in sector V 17 is, zijn 17 kolonies per 0,000333Vr>^ 50.000 kolonies per ml aanwezig. Het resultaat geeft direkt de microbenhoeveelheid van het monster per ml aan. Het aantal kolonies in de sectoren en de resul,ta-20 ten, die zijn berekend op basis daarvan, zijn weergegeven in tabel B.

De uit alle telbare sectoren verkregen informatie kan worden toegepast in het resultaat door de gemiddelde waarde van de uit elke sector verkregen resultaten te berekenen.

25 Tabel A

2 Γ- ί

Sector (A = 4 cm ) Agar Monster % van het (ml) (ml) monster V 4,00 0,000333 33 IV 3,20 0,000266 28 III 2,40 0,000199 20 30 II 1,60 0,000133 13 I 0,80 0,000066 6 8700429 -9-

Tabel B

SPC x 1 OOQ SPC-modificatie ‘ Microbenhoeveelheid van het monster , microben x 10 /ml I II III IV V I Π in IV v 5· 10 1 1 2 3 3 - - - 11 9 50 3 7 10 13 17 45 53 50 49 51 100 7 13 20 27 33 106 98 100 101 99 200 13 27 40 53 67 197 203 201 199 -

10 Voorbeeld II

Het monster wordt aseptisch geënt in agar in een verdun-ningsverhouding van 10~^ (10 yul van het oorspronkelijke monster op 100 ml agarj. Na het enten wordt het agar-monster-mengsel doelmatig gemengd, en tot een plaat gevormd in beken-15 de petrischalen in hoeveelheden van 2, 5, 10, 20, 40 en 60 ml, zodat de hoeveelheden van het oorspronkelijke monster 0,0002 ml, 0,0005 ml, 0,001 ml, 0,002 ml, 0,004 ml respectievelijk 0,006 ml bedragen. De schalen worden geïncubeerd en de kolonies geteld. De aantallen in de schalen getelde kolonies wor-20 den omgezet in de microbedichtheid van het oorspronkelijke monster met behulp van de volgende formule: · _,· l ±_ i. de aetelde koloniedichtheid microbedichtheid van het monster = —?-rz—^r-;-l . ^ 1 de hoeveelheid van het oorspronkelijke monster 25 De resultaten zijn weergegeven in tabel C.

Tabel C

Kolonies in de schalen (hoeveelheden van het monster-aqarmenqsel)_ SPC x 1 000 2 ml 5 ml 10 ml 20 ml 40 ml 60 ml .

30 5 1 3 5 io 20 30 20 4 10 20 40 80 120 50 10 25 50 100 200 300 / “ 100 20 50 100 200 (400) (600) 200 (40) (100) 200 (400) 35 300 (60) (150) 300 500_ (100) (250) (500) - - _ 870 ö 42 9 * .

- 10 -

De haakjes in de tabel betekenen dat het niet mogelijk is om deze koloniedichtheden te tellen in de schalen. Bij toepassing van petrischalen met een diameter van 90 mm is de bodem van de schaal uitsluitend volledig bedekt met agar in scha-5 len, die 10 ml of meer agar bevatten.

Referenties:

Standaard Plaat tellingsmethode: 1. FIL-IDF 100 : 1981 vloeibare melk-opsomming van micro-organismen kolonie-tellingstechniek bij? 0 °C.

10 2. IS0/DP 6610 ibid.

3. APHA American Public Health Association Standaard-Methoden voor het onderzoeken van zuivelprodukten, 14e editie 1978, blz. 77 tot 93.

Plaat Lusmethode: 15 1. APHA 14e ed. blz. 315 tot 317.

2. Thompson, Donelly & Black 1960 Een plaat Lusmethode voor het bepalen van levensvatbare· tellingen van ruwe melk.

3. 3. Milk Food Technol. 26; 156 tot 171.

8700429

Claims (13)

1. Werkwijze voor het bepalen van de microbeconcentraties met een plaatvormingswerkwijze, waarbij een monster en een medium tot een plaat worden gevormd in een schaal, men het medium vast laat worden en de vaste plaat incubeert, waarna 5 de kolonies in de plaat worden geteld, met het kenmerk, dat het medium en het monster worden gemengd ter verkrijging van een homogeen mengsel waarvan de microbecon-centratie constant is, en men het mengsel vast laat worden zodat de laagdikte van het medium op geregelde wijze verandert.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, m e t het k e n -merk, dat men het medium vast maakt in een enkele schaal, waarvan de laagdikte wordt geregeld door de geometrie van de schaal.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het ken-15 m e r k, dat men het medium vast laat worden in een aantal schalen, waarvan de laagdikte wordt geregeld door middel van de grootte van de schaal en/of het volume van het medium.

4. Schaal die geschikt is voor het bepalen van de microbe-concentratie met behulp van een plaatvormingswerkwijze, waar- 20 bij een monster en een medium tot een plaat worden gevormd in een schaal, men het medium vast laat worden en de vaste plaat wordt geïncubeerd, waarna de kolonies in de plaat worden geteld, met het kenmerk, dat de vorm van de schaal zodanig is, dat, nadat het monster en het medium tot 25 een plaat zijn gevormd, een vaste laag met een geregelde, veranderende dikte is gevormd in de schaal.

5. Schaal volgens conclusie 4, m e t het kenmerk, dat de schaal een ronde dwarsdoorsnede bezit.

6. Schaal volgens conclusie 4, m e t h e t kenmerk, 30 dat de schaal een rechthoekige dwarsdoorsnede bezit.

7. Schaal volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat de bodem daarvan concaaf is. _

8. Schaal volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat de bodem daarvan convex is. 8700429 ' . v - 12 -

9. Schaal volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat de bodem daarvan lineair oploopt.

10. Schaal volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat de bodem daarvan oploopt volgens een ronde boog.

11. Schaal volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat de bodem daarvan oploopt of daalt, waarbij de schaal is voorzien van concentrische, ringvormige, horizontale, vlakke oppervlaktegebieden, met een rond, vlak oppervlak in het midden .

12. Schaal volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat de bodem oploopt, waarbij rechthoekig, vlakke oppervlaktegebieden zijn gevormd.

13. Schaal volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat een scheidingswand of een aantal scheidingswanden met 15 verschillende hoogten is/zijn aangebracht op de bodem daarvan. v 8700429