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Die
Erfindung betrifft eine mikrobiologische Kulturplatte mit Führungsstiften
im unteren Deckelrand und mit einem integrierten Ausstrichsystem
zur emersen Kultivierung von Mikroorganismenkulturen, wobei mit
ihr ein aseptisches Arbeiten außerhalb steriler Laborbedingungen
möglich wird und zu prüfende flüssige
Proben – ohne die Kulturplatte öffnen zu müssen – dezentral
auf einem Nährboden aufgebracht und dort gleichmäßig
ausgestrichen werden.
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In
mikrobiologischen Laboren ist die Verwendung von sterilen Petrischalen
aus Glas oder Kunststoff zur emersen Kultivierung von Mikroorganismenkulturen
auf verfestigten Nährböden üblich und
vielfältig im Einsatz. Ein großes Einsatzgebiet
ist die Bestimmung von Lebendkeimzahlen als KBE (Kolonie bildende
Einheiten), um z. B. die Keimbelastungen in Ab- und Trinkwasser,
Lebensmitteln oder in der Medizindiagnostik zu prüfen.
Unter Verwendung spezieller Selektivnährböden
werden auch explizit Einzelstämme (z. B. pathogene Bakterien)
oder Mikroorganismengruppen (z. B. Schimmelpilze) bestimmt.
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Ein
solches Verfahren ist relativ einfach. Zur Keimzahlbestimmung wird
ein flüssiges Probenaliquot (i. d. R. 100 μl)
auf einen sterilen, verfestigten Nährboden in einer Petrischale
aufgebracht und mittels sterilem Werkzeug gleichmäßig
und vollständig auf der Fläche verteilt. Die Probenflüssigkeit
wird vom Nährboden absorbiert und vermehrungsfähige Keime
beginnen an der Oberfläche zu wachsen und eine sichtbare
Kolonie zu bilden. Diese können nach einer entsprechenden
Inkubationszeit ausgezählt werden.
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Ein
Problem besteht jedoch darin, dass für einen Probenausstrich
zwingend aseptische Bedingungen vorliegen müssen, was aber
bei einer bekanntermaßen zweiteiligen zu öffnenden
Petrischale, aufgrund einer einhergehenden Kontamination durch Umgebungskeime,
außerhalb steriler Laborbedingungen nicht gegeben ist.
Somit kann eine keimfreie Arbeitsweise nur im Sterilbereich mikrobiologischer Labore
vollzogen werden. Das Verfahren unter Feldbedingungen durchzuführen,
z. B. in der Sterilumgebung einer Brennerflamme, erfordert Kompromisse und
die qualitätsgerechte Ausführung ist nicht gewährleistet.
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Ein
großes Einsatzgebiet für Keimzahlbestimmungen
außerhalb von Laboren ist in der Beurteilung von Umweltproben
(z. B. Proben von Gewässern), von Trink- und Brauchwasserproben
im Privatbereich sowie von gewerblichen Proben (z. B. Proben von
Kompostierung oder der Müllverarbeitung) zu sehen.
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Anfragen
aus der Bevölkerung zeigen, dass zunehmend ein Interesse
zur Eigenkontrolle bzgl. der hygienischen Unbedenklichkeit von Trink-
und Nutzwasser existiert. Brauch-, Regen- und Brunnenwasser steht
dabei zunächst im Mittelpunkt des Interesses, da diese
Quel len vor allem im ländlichen Bereich gern zur Wasser-/Abwasser-
und damit Kostenersparnis genutzt werden.
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Nach
derzeitigem Stand der Technik müssen die flüssigen
Proben nach der Probennahme immer erst in kommerzielle Labore geschickt
werden, um dort geprüft zu werden. Das ist teuer, zeitaufwendig und
birgt die Gefahr der Veränderung der Probe während
der Transportzeiten in sich.
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Eine
andere Problemstellung ist die Kontrolle von mikrobiologischen Raumluftbelastungen,
z. B. durch aerogene Schimmelpilzsporen. Für die Abscheidung
dieser Keime existieren diverse Probennahmegeräte. Man
unterscheidet indirekte und direkte Filtrationsverfahren sowie Impaktorverfahren
und Impingerverfahren. Sie ermöglichen eine sanierungsbegleitende
Beurteilung bei schimmelkontaminierten Bauten. Die eindeutige mikrobiologische
Einschätzung des Kontaminationsstatus bildet nicht nur
die Voraussetzung zur Auswahl geeigneter Sanierungsmethoden, sondern
sie ist gleichzeitig das Kriterium zur Dokumentation des Sanierungserfolges
im Nachgang der Maßnahme.
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Werden
die Keime direkt auf Nährbodenplatten abgeschieden (Impaktorverfahren),
kann anschließend eine unmittelbare Inkubation stattfinden. Werden
die Keime aber nach dem Impingerverfahren zunächst in eine
Sammelflüssigkeit abgeschieden, was besonders bei sehr
hohen Konzentrationen angebracht ist, muss diese Probe im Anschluss
zeitnah und definiert auf Kulturplatten ausgestrichen werden.
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Eine
wesentliche Erleichterung und Verfahrensverbesserung ist es, wenn
gleich vor Ort eine Probenweiterbehandlung, d. h. ein Ausstrich
von flüssigen Probenmaterialien auf Kulturplatten möglich
wäre.
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Das
setzt ein geschlossenes, steriles Einweg-Kultivierungssystem mit
entsprechendem Nährboden voraus, in das mit einfachsten
Handgriffen durch den Laien die Probenaufgabe und -verteilung erfolgen
kann, ohne dass es zu Fremdkontaminationen kommt. Die Inkubation
der selbständig inokulierten Platten kann dann der Anwender
in aller Regel selbst bei Zimmertemperatur durchführen
und die sich bildenden Kolonien auszählen.
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Mit
einem solchen in sich abgeschlossenen Petrischalensystem, welches
auch preisgünstig als Massenartikel angeboten werden kann,
könnten gleichzeitig Privatanwender angesprochen werden, die
eine Eigenkontrolle von wässrigen Proben im Haushalt (Trinkwasser,
Brauchwasser, Brunnenwasser, Grauwasser, Regenwasser, Aquarien,
Teiche etc.) hinsichtlich der Keimbelastung durchführen
wollen.
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Zur
Erläuterung des bisher bekannten Standes der Technik wird
weiter ausgeführt.
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Direkte
Kultivierungen auf verfestigten Nährböden sind üblich
für eine aussagefähige Keimzahlbestimmung in wässrigen
Proben. Unter den für die jeweiligen gesuchten Spezies
oder Mikroorganismengruppen optimalen Kultivierungsbedingungen erfolgt
die Vermehrung lebender Keime und die Ausprägung von Kolonien,
die auf dem Nährboden sichtbar werden und ausgezählt
werden können. So ist sichergestellt, dass nur vermehrungsfähige
Keime erfasst werden, weshalb das Ergebnis als „Kolonie
bildende Einheiten (KBE/ml)” angegeben wird. Diese Ergebnisform
ist für die meisten Anwendungsfälle im Bereich
Hygiene, Medizin und Biologie relevant.
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Über
die Wahl des Nährbodens und der Inkubationsbedingungen
kann selektiert werden, welche Keime sich entwickeln. Daher ist
es möglich, Einzelstämme oder Mikroorganismengruppen
wie z. B. Schimmelpilze selektiv nachzuweisen.
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In
bekannter Weise wird für die Bestimmung aerober Keime das
Ausplattieren der Probe auf der Oberfläche eines Nährbodens
(Oberflächen-Spatelmethode) durchgeführt. Hierzu
werden Petrischalen verwendet, bestehend aus Schalenunterteil und übergreifendem
Deckel. Für den Ausstrich wird im Sterilbereich, z. B.
unter einer Laminarflowbox, mit sterilen Instrumenten eine Probenmenge
manuell aufgegeben und mittels Spatel (Drigalskispatel) möglichst
gleichmäßig verteilt. Dieses kann nicht außerhalb
eines Sterilbereiches qualitätsgerecht ausgeführt
werden, da die Platten für Probenaufgabe und Probenausstrich
geöffnet werden müssen und dadurch der Nährboden
durch Keime aus der Umgebung kontaminiert wird.
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Es
sind nun diverse Vorrichtungen und Verfahren für unterschiedliche
Abwandlungen und spezielle Einsatzfälle beschrieben, wobei
es die Möglichkeit gibt, Keime mit unterschiedlicher Sauerstoffverträglichkeit
(anaerob, mikroaerophil) zu vermehren, indem ein Überschichten
mit flüssigem Nährboden oder das Einmischen der
Probe in anfangs flüssigem Nährboden erfolgt (Gussplattenmethode).
Ebenso können verschiedene Stoffwechselaktivitäten über Indikatoren
im Nährboden sichtbar gemacht werden.
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Auf
konkrete Beispiele des Standes der Technik soll nachfolgend näher
eingegangen werden.
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So
wird nach
DE 37 05
229 C2 ein Verfahren zur Bestimmung von Mikrobengehalten
nach einem Plattengussverfahren sowie dabei zu verwendende Schalen
genannt. Hier werden Nährboden und Probe homogen miteinander
vermischt, wobei die Schichtdicke durch Geo metrie und Größe
der Schale/-n und durch das eingebrachte Volumen variiert wird.
Die Schalen besitzen eine runde oder rechtwinklige Gestalt mit Böden,
die voneinander abweichend z. B. konkav, konvex, linear steigend,
gestaltet sind. Damit sollen unterschiedliche Konzentrationsbereiche
auswertbar sein. Ein gleichmäßiger Ausstrich einer
Probe unter Feldbedingungen zur Erzielung eines emersen Mikroorganismenwachstums
ist hierdurch nicht möglich.
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Nach
US 4,358,539 wird ein Einweg-Kultivierungssystem
beschrieben, mit dem aseptisch in einfacher Art und Weise eine Überführung
einer flüssigen Probe, z. B. aus Flüssigkulturen,
auf einen Nährboden durchgeführt wird, indem die
Probe über eine interne Kanüle auf eine absorbierende
Fasergewebescheibe übertragen wird, welche zentral auf
dem festen Nährboden aufliegt. Von diesem zentralen Pad
aus wächst die Kultur radial auf den Nährboden. Mit
diesem System sind zwar mikrobielle Übertragungen für
einfache Kontrollaufgaben möglich, z. B. zur Reinheitskontrolle
einer Kultur, jedoch keine quantitative Keimzahlbestimmung. Eine
aktive und gleichmäßige Verteilung der Probe auf
der Nährbodenoberfläche erfolgt nicht. Die übertragene
Flüssigkeitsmenge wird nicht überprüft.
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Mit
US 5,830,746 werden eine
Vorrichtung und ein Verfahren zum Aufwachsen anaerober Mikroorganismen
beschrieben. Es wird hier durch eine ringförmige Dichtfläche
im Deckel ein abgeschlossener Gasraum im Kultivierungsraum gebildet,
wenn die Platte umgedreht gelagert wird. Vorrichtungen zur Probenaufbringung
und -verteilung sind nicht vorgesehen. Das System muss deshalb wie
bei konventionellen Petrischalen zur Inokulierung geöffnet
werden, wodurch eine Anwendung im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung
nur unter aseptischen Bedingungen möglich ist.
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In
EP 1 528 100 B1 wird
eine verriegelbare Kontaktplatte gezeigt. Es stehen dabei ein Teller
mit einer Bodenplatte sowie ein Deckel über einen Verriegelungsmechanismus
in Wirkverbindung. Die Elemente müssen bei Probennahme
geöffnet werden, so dass ein aseptisches Arbeiten unter
Feldbedingungen nicht gegeben ist. Verteilungs- bzw. Ausstrichelemente
sind nicht vorhanden.
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Schließlich
sei noch auf
DE 690
108 56 T2 hingewiesen, worin eine Wegwerfkulturschale mit Verstärkungsrippen
genannt ist. Hier weist die Petrischale innen am Boden nach oben
stehende Rippen auf, die lediglich zur Verstärkung des
dünnen Glasmaterials dienen. Diese behindern ein gleichmäßiges Ausstreichen
einer Probe, wobei diese Kulturschale ebenfalls geöffnet
werden muss und damit keine sichere Keimzahlauslesung ermöglicht.
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Zur
Keimzahlbestimmung werden auch sogenannte „Dip-Slides” genutzt.
Es handelt sich hier um ein Kulturverfahren zur (semi-)quantitativen Keimzahlbestimmung
aus wässrigen Medien. Die Dip-Slides können aber
auch zur Oberflächenkeimzahlbestimmung verwendet werden.
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Die „Dip-Slides” sind
kommerziell hergestellte beidseitig nährbodenbeschichtete,
flexible Kunststoffträger, die ursprünglich für
die Urindiagnostik entwickelt wurden. Sie finden aber mittlerweile
auch breite Anwendung in technischen Bereichen.
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Die
Trägerplatte des Eintauchobjektträgers ist auf
der Ober- und Unterseite in aller Regel mit zwei unterschiedlichen
Nährmedien zur Gesamtkeimzahlbestimmung von Bakterien und
Hefen/Schimmelpilzen beschickt. Darüber hinaus gibt es
noch Systeme mit dreiflächigen Trägerplatten.
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Von
verschiedenen Firmen wurden „Dip-Slides” für
Hygienekontrollen entwickelt. Von den Herstellern werden Dip-Slides
mit verschiedenen Nährmedien angeboten. Es gibt dementsprechend Agar
zur Gesamtkeimzahlbestimmung oder Selektivnährmedien zum
Nachweis von z. B. Enterobakterien oder zum Nachweis von Hefen und
Pilzen.
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Im
Unterschied zur vorgeschlagenen Erfindung nimmt man im Falle von
Dip-Slides bewusst eine unsterile Probennahme und eine undefinierte Probenmenge
und -verteilung in Kauf, die auf der Nährbodenoberfläche
durch das Eintauchen absorbiert wird.
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„Dip-Slides” werden
zwar in einem sterilen Röhrchen aufbewahrt und ausgeliefert.
Zur Probennahme muss der Nährbodenträger aber
kurzzeitig herausgenommen und in eine aseptische Umgebung gebracht
werden.
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Die
vorgeschlagene Erfindung hat gegenüber den „Dip-Slides” den
Vorteil, dass eine genau definierte Probenmenge auf einer definierten
Nährbodenoberfläche vollständig und gleichmäßig
verteilt werden kann. Dadurch können die ermittelten Koloniezahlen
sehr genau auf das Probevolumen bezogen werden. Zudem wird der Nährboden
zur Probenapplikation erfindungsgemäß nie einer
unsterilen Umgebung ausgesetzt.
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Anhand
des vorliegend diskutierten Standes der Technik wird deutlich, dass
nach einer Lösung gesucht werden muss, die die Nachteile
der bisher bekannten überwindet.
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Es
ist daher Aufgabe der Erfindung, eine gattungsgemäße
Petrischale als mikrobiologische Kulturplatte mit einem integrierten
Ausstrichsystem derart weiterzuentwickeln, dass ein in ein Unterteil übergreifender
Deckel in Führungen am Umfang des Unterteils gleitend,
einen bevorzugt aseptischen Innenraum einschließt, der
zur Probenaufgabe geschlossen bleibt, im Deckel ein auf einen Nährboden
und auf eine steril von außen aufgebrachten Probe absenk bares
und kreisförmig bewegbares Ausstrichelement fest angebracht
ist, welches nach dem Ausstrich durch eine gegenläufige
Drehung zwischen Deckel und Unterteil wieder in seine Ausgangslage über
die in gleichmäßiger Höhe auf dem Nährboden ausgestrichenen
Probe anhebbar ist. Über ein im Deckel, insbesondere außermittig,
angebrachtes Septum soll mittels eines geeigneten Probenaufgabesystems
keimfrei eine Probe auf den Nährboden abgesetzt werden
können. Die erfindungsgemäße Kulturplatte
soll einfach und kostengünstig in der Herstellung ausgeführt
und unkompliziert in der Handhabung sein.
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Erfindungsgemäß wird
die Aufgabe wie folgt gelöst, wobei hinsichtlich der grundlegenden
erfinderischen Gedanken auf die Merkmale des Schutzanspruchs 1 verwiesen
wird. Die weitere Ausgestaltung der Erfindung wird in den Schutzansprüchen
2 bis 8 angegeben.
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Zur
erfinderischen Lösung sind weitere Hinweise erforderlich.
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Die
mikrobiologische Kulturplatte stellt sich als ein in sich geschlossenes
System zur Kultivierung von Mikroorganismen dar. Sie besteht aus
einem ein Unterteil übergreifenden Deckel – zunächst ähnlich einer
bekannten Petrischale-, wobei jedoch eine spezielle Randausbildung
am unteren Deckelrand und am Außenumfang des Unterteils,
der eigentlichen Schale, dazu geeignet sind, ein ungewolltes Öffnen dieses
in sich geschlossenen Systems zu verhindern. Das Unterteil beinhaltet
innen auf seinem Boden bereits einen dort fest eingebrachten Nährboden in
definiertem Volumen, der durch den absenkbaren Deckel mit seinem
integrierten Ausstrichsystem derart erreichbar ist, indem Führungsstifte
am Ende des das Unterteil umgreifenden Deckelrandes angebracht,
in eine Führungsnut am Außenumfang des Unterteils
eingreifen und beim Absenken und Verdrehen des Deckels gegenüber
dem Unterteil im Uhrzeigersinn über eine gewindeähnliche
Steigung einer schiefen Ebene in einen ringförmig umlaufenden
Bereich der Führungsnut im Unterteil führbar sind,
so dass dort ein Verdrehen des Deckels gegenüber dem Unterteil
um mindestens 360° erfolgen kann. Es erreicht der insbesondere
aus elastischem und transparentem Material bestehende Deckel, der
während seines Absenkens und Drehens innere mechanische Spannung
entwickelt, wieder seine Ausgangslage, wenn er gegen den Uhrzeigersinn,
die gewindeähnliche Steigung im umgekehrten Fall überwindet
und über die Ausgangslage sichernde Arretierungselemente
geführt ist.
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In
der eingenommenen Ausgangslage des Deckels besteht gegenüber
dem oberen Rand des Unterteils ein derartiger Abstand, der dem entspricht, den
das fest an der Innenseite des Deckels angebrachte Ausstrichsystem,
bestehend aus mindestens einem in radialer Form bemessenen Steg
und einer daran nach unten weisenden elastischen Lippe, überwindet,
um an der Nährbodenfläche die durch mindestens
einem vorgesehenen Septum eingebrachte Probe zu erreichen und kreisförmig,
gleichmäßig zu verteilen. Das Septum befindet
sich im Deckel in außenmittiger Lage, wobei generell festzuhalten
ist, dass der Deckel und das Unterteil zur Sicherung der erfindungsgemäßen
Funktion als rotationssymmetrische Elemente ausgebildet sind. Das
Unterteil soll dabei aus festem Material, z. B. hitzebeständigen,
transparenten Glas oder Kunststoff bestehen, so dass mindestens
Temperaturen von 90°C realisiert werden können,
was für die Herstellung nötig ist, um den anfangs
heißen, flüssigen Nährboden einfüllen
zu können.
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Schließlich
ist vorgesehen, dass alle Elemente der mikrobiologischen Kulturplatte
aus sterilisierbaren, vorzugsweise strahlensterilisierbaren Materialien,
bestehen.
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Für
die aerobe Mikroorganismenkultivierung sind Deckel und Unterteil
ungedichtet gegeneinander aufliegend, so dass über geringste
Materialtoleranzen ein Gasaustausch mit der Umgebung gegeben ist,
ohne dass es zu Fremdinfektionen kommen kann.
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Es
ist denkbar, dass die Deckelabsenkung auch mittels anderer geometrischer
Formgebung eines Teilbereiches am Außenumfang des Unterteils möglich
ist und Halteelemente des unteren Deckelrandes in diesem Teilbereich
im Hintergriff mit einem Führungselement stehen, von welchem
sie sich wieder lösen können, um wieder in die
wie vorgenannte Beabstandung zwischen Deckel und Unterteil zu gelangen.
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Die
Erfindung soll nachfolgend anhand eines Ausführungsbeispiels
näher erläutert werden.
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Somit
zeigen:
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1:
Schnittdarstellung der mikrobiologischen Kulturplatte mit einer
Führungsnut im Unterteil, die eine gewindeähnliche
Steigung aufweist,
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2:
Draufsicht auf die mikrobiologische Kulturplatte von oben gem. 1,
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3:
Seitenansicht gem. der 1 und 2 von Deckel
und Unterteil,
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Die
in den Figuren verwendeten Bezugszeichen sind in einer gesonderten
Bezugszeichenliste aufgeführt.
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Nach 1 befinden
sich ein Deckel 2 und ein Unterteil 1 einer mikrobiologischen
Kulturplatte über eine Führungsnut 5,
eingebracht etwa in der Mitte des Außenumfangs am Unterteil 1,
und Führungsstifte 6 in formschlüssiger
Verbindung, wodurch ein ungewolltes Abhe ben des Deckels 2 verhindert
wird. in der Ausgangslage befindet sich der Deckel 2 mit einem
definierten Abstand H + x mit seiner Deckelinnenseite beabstandet
vom oberen Rand des Unterteils 1, was auch der Höhe
entspricht, die ausreicht, um das am Deckel 2 innen befestigte
Ausstrichsystem, bestehend aus einem Steg 7 und einer Lippe 8, auf
die Oberfläche eines festen Nährbodens 3 abzusenken.
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Über
ein außermittig im Deckel 2 vorhandenes Septum 4 ist
dabei eine Probenflüssigkeit in definierter Menge in das
in sich geschlossene Kultursystem einbringbar.
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Die
Absenkung wird möglich, indem per Drehung des Deckels 2 im
Uhrzeigersinn entgegen des Unterteils 1 der aus flexiblem
und transparentem Material bestehende Deckel 2, über
einen oberen und geneigten Abschnitt 10, 11 der
Führungsnut 5 seine Ausgangslage, bei Überwindung
des Widerstandes, den Arretierungspunkte 9 ausüben,
verlässt, wodurch schließlich bei Erreichen des
untersten und umlaufenden Bereiches der Führungsnut 5 ein
barrierefreies Drehen des Deckels 2 und damit das Ausstreichen
der Probe ermöglicht werden.
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Über
ein außermittig im Deckel 2 vorhandenes Septum 4 wird
eine Probenflüssigkeit in definierter Menge in das in sich
geschlossene Kultursystem eingebracht.
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Die
Vorteile der Erfindung können wie folgt zusammengefasst
werden:
- – Durchführung von
Arbeiten zur emersen Kultivierung von Mikroorganismenkulturen, auch
im Feldversuch, aseptisch möglich,
- – hohe Sicherheit bei der Keimzahlbestimmung,
- – Handhabung auch von Nichtfachleuten gegeben,
- – einfach und kostengünstig herstellbar.
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- 1
- Unterteil
- 2
- Deckel
- 3
- Nährboden
- 4
- Septum
- 5
- Führungsnut
- 6
- Führungsstift
- 7
- Steg
- 8
- Lippe
- 9
- Arretierungspunkt
- 10
- oberer
Abschnitt
- 11
- geneigter
Abschnitt
- H
+ x
- Abstand
+ Fertigungstoleranz
- H
- Abstand
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - DE 3705229
C2 [0019]
- - US 4358539 [0020]
- - US 5830746 [0021]
- - EP 1528100 B1 [0022]
- - DE 69010856 T2 [0023]