DE2351617A1 - Verfahren und anordnung zur quantitativen bestimmung der konzentration von mikroorganismen - Google Patents

Description

Verfahren und Anordnung zur quantitativen Bestimmung der Konzentration von Mikroorganismen

Die Erfindung bezieht sich- allgemein auf die Untersuchung von Wasser- und Nahrungsmittelqualität» Umweltreinhaltung, auf die Überwachung von Verschmutzungen und auf die mikrobiologischen Aspekte der öffentlichen Gesundheitspflege. Insbesondere können das Verfahren und die Anordnung der Erfindung Anwendung finden bei der Bestimmung von lebensfähigen Mikroorganismen verschiedener Arten, die in verschiedenen physikalischen Systemen, wie Flüssigkeiten, Festkörpern, Oberflächen und in der Luft, vorhanden sind. Typische Anwendungen, bei denen derartige Bestimmungen wichtig sind und bei denen die Erfindung mit besonderem Nutzen anwendbar ist, sind wie folgts

Flüssigkeiten? Trinkwasserversorgungj Flüsse, Brunnen, Quel len j Abwasser j öffentliche und private Badeeinrichtungen;'' Wasserrezirkulierungseinricntungen, wie etwa bei Kühltür-iien und Pasteurisieranlagen § für die Arbeit in Papl@r£albrife©is verwendetes Wasssrg Überflutungswass©!³ auf Ölfelderag BSIIeIi _a

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Bier und andere Getränkej Eiskrem; flüssige oder kremförmige Nahrungsmittel; kosmetische oder pharmazeutische Flüssigkeiten, Krems, Gelees, Pasten,. Salben; Blut; Urin; Rückenmarksflüssigkeit usw.

Festkörper: Nahrungsmittel; Arzneimittel; Kosmetika; Papier; Stoffe und Kleidung usw.

Oberflächen: die Haut eines Patienten, Wunden, Verbände; Krankenhaus-Fußböden, -Decken, -Wände, -Ausgüsse, -Möbel; Laken und Kittel; Operationsräume, -handschuhe; Krankenhausausrüstung wie etwa Beatmungsgeräte, Inkubatoren, Zelte; sterile Einrichtungen und Füllstationen in pharmazeutischen Einrichtungen und in Flugzeugen; nahrungsmittelverarbeitende Anlagen und Ausrüstungen; Gefrier- und Kühleinrichtungen für Nahrungsmittel; fertige oder in Verarbeitung befindliche Waren wie Geflügel, Fisch, Fleisch in Produktionsstätten oder auf dem Markt; gefrorene Nahrungsmittel während der Verarbeitung, Lagerhaltung und dem Verkauf; Molkereieinrichtungen und -behälter; Pasteurisiereinrichtungen für Milch und Bier; Geräte, Gläser, Geschirr und Oberflächen in Restaurants, Bars, Krankenhäusern, Schulen, Pflegeheimen, öffentlichen Speiseräumen usw.

Luft: Operationssäle und besondere Isolierstationen, wie Inkubatoren, Sauerstoffzelte!, Station für Verbrennungen; Krankenhausräume und -korridore; sterile und saubere Räume von Arzneimittelherstellern und in Flugzeugeinrichtungen; Molkereien, Brauereien, Nahrungsmittelfabriken; Geflügelställe, Melkställe, Ausnehmanlagen usw.

Zusätzlich zu den oben erwähnten Anwendungsmöglichkeiten kann die Erfindung auch auf diversen anderen Gebieten verwendet werden, wie auf dem Gebiet der Toxikologie, der Im-

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munologie, der Pharmakologie, der Pflanzenpathologie, der Virusforschung und in jeder wissenschaftlichen Disziplin, in der quantitative Ergebnisse von der Beobachtung . von "quantenmäßigem" Ansprechen abhängen. Für das Gebiet der Gesundheitspflege sind viele Beispiele angegeben worden; jedoch können dieselben Prinzipien und analoge Anordnungen sowohl zur Bestimmung der Anzahl.von ansteckend wirkenden Organismen in einer Virus- oder Bakteriensuspension verwendet werden als auch zur Bestimmung der Empfindlichkeit von Patienten auf unterschiedlich starke Pollensuspensionen oder andere Allergien; ferner zur. quantitativen Nährbodenüberprüfung der antibiotischen Empfindlichkeit verschiedener Bakterienarten; zur Bestimmung der Wirksamkeit von anziehend oder sterilisierend auf Insekten wirkenden Mitteln usw.

Bestimmte Faktoren oder Organismen, die biologische Effekte hervorrufen, tun dies in einer Weise, die für den Beobachter ein "quantenmäßiges¹¹ Aussehen hat, d. h. sie erzeugen eine ^lfAlles-oder-nichts^tl-Reaktion. Man beobachtet beispielsweise, ob eine Flüssigkeit frei von Mikroorganismen ist, indem man einen Teil der Flüssigkeit in einen geeigneten Nährboden einführt. Wenn nach einer geeigneten Brutzeit sich kein Wachstum zeigt, bezeichnet man diesen Teil der Flüssigkeit als steril. Es ist möglich, daß, wenn man einen größeren Teil der Flüssigkeit in den Nährboden einführen würde, dieser Teil einen Mikroorganismus enthalten würde und somit sich in dem Nährboden Anzeichen von bakterieller Vervielfachung zeigen wurden. Wenn es bekannt ist, daß ein flüssiges System Mikroorganismen enthält, ist es immer möglich, das System mit steriler Flüssigkeit so weit zu verdünnen, daß bestimmte Proben der Verdünnung keine lebensfähigen Mikroorganismen enthalten, so daß das Ölpflanzen dieser Proben in Nährböden auch keine quantenmäßige Reaktion erbringt.

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In analoger Weise kann die Wirksamkeit von toxischen und therapeutischen Mitteln probenmäßig dadurch untersucht werden, daß sie so weit verdünnt werden, bis sie in dem zur Prüfung verwendetes Organismus keine Reaktion mehr erbringen, d„ h. keine Erkrankung oder Heilung» Bsi immunologischen Testverfahren ifird das zu, prüf ©Me Material nacheinander verdünnt, und es wird fortschreitend bei jeder Verdünnung beobachtet, ob die interessierend® serologische oder Iemnologiseiie Reaktion sneii stattfindet.

Das Verfahren zum Ermitteln der Ansahl τοπ biologisch aktiven Wesen oder des Wirkungsgrades siaes Präparats geht dahin, daß das Präparat so lange verdünnt wird, bis aufeinanderfolgende Verdünnung©:! die quantenmäSige Reaktion in der Testanordnung ergeben bzw» nicht mehr ergeben«, Es gibt Hunderte von veröffentlichten Abhandlungen sowohl mathematischer als auch experimenteller Art bezüglich efer statistischen Gültigkeit dieser Methode der Ermittlung von biologisch aktiven Organismen_s und es sind Standardmethoden entwickelt worden, um nicht nur die bakterielle Population oder die biologische Potenz von Präparaten zu bestimmen, die noch eine quantenmäßige Reaktion hervorruft, sondern auch, um eine Abschätzung für die wahrscheinlichen Fehler •zu erhalten, die mit der Verwendung solcher statistischen Parameter verbunden sind.

Um das Grundkonzept der Erfindung klarzustellen, wird nachstehend eine kurze Zusammenfassung einiger biologischer Testmethoden gegeben, die auf der Beobachtung eines ge- quantelten Ansprechvermögens beruhen.

Die toxische, d. h. die eine Ansteckung oder eine Heilung hervorrufende, Potenz wird mit einer quantenmäßigen Methode bestimmt, bei der der interessierende Wirkstoff verdünnt

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mrd und die Verdünnungen auf geeignete Testsysteme oder

Tiere angewendet- werden» Die lazahl der gestorbenen oder infizierten oder geheilten Tiere und die Gesamtzahl der mit der Verdünnung behandelten Tiere werden beobachtete Auf die Verdünnungen und die beobachteten Reaktionen werden dann statistische Formeln ©ngex^endet ₉ und es xfird ein Index berechnet, der L.B.K₀ oder EoBe₈₅₀ genannt wird (lethal dose =s tödliche Dosis bzw» effective dose = wirksame Dosis für 50 % der Testsysteme bzw«, -tiere). Dies ist diejenige Verdünnung des Präparats ₉ die die beobachtete quantenmäßig© Reaktion nur in der Hälfte der getesteten Tiere hervorruft _ΰ während die restliche Hälft© unbeeinflußt bleibt (vglο

Nr. 183p London,, 1933g L=Jo Reed und J»M«©nch₉ Journal Public Health* _P 27«, 493=497

Im Fall der Konzentration von lebensfähigen Mikroorganismen ist der statistische Begriff der wahrscheinlichsten Zahl (MPH) eingeführt worden^ um den Parameter zu b®Schreibens, der' durch nacheinander ®rf olgendL© Ferclltaiuxig des Präparats und Beobachtung _p welche ¥©ntümung©m mim Wachstum in @ia©ii Nährboden bewirken und welche nicht HeMr₉ erhalten xf©rd©n kann (HoO= Hal-rorson vmß. M₀R₀ Ziegler^ ^Journal logf₉ 25 s 101-12I₉ 1933 s V.Q. Coehran©₉ ⁸³Biometries^l5 105=ll6p 1950). Bei dieser Method© wird-so vorg©gaag anstelle der ^©roitoawag umt¹ Flüssigk©it_p d@r©a Konzentration gefragt ist₈ if@2=ifielfa©lit© F2°ob@n den©r ¥ol«»iaa übt Flüssigkeit ia läSs^lbOdea g©pf lea und beobachtet WiM₉ w©lch© Fr©feen ©Is Ifeekstua g@ig@xi «afl welche nicht«

Immunologische Testv©r£aiiF@a ba©i©F@n ©baafall© auf @is>@m quantenmäßigen Jtosprsclivsi^iaögejao Das S©ryia ©etui? ©lass ge biologiish aktiw feteMal wlM aaeSs imä tmoh

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und die Verdünnungen werden auf den Verdünnungsfaktor hin überprüft, bei dem noch eine sichtbare oder auf andere Weise bestinmbare Reaktion auftritt, Derartige Reaktionen, die gewöhnlich in gepufferten physiologischen Lösungen oder in gelartigen Materialien durchgeführt werden, bestehen aus Niederschlägen, Agglutinationen, Koagulationen oder ähnlichen sichtbaren Phänomenen.

Das Auswerteverfahrsn in Verbindung mit einem quantenmäßigen Ansprechvermögen ist durch drei charakteristische Merkmale gekennzeichnet. 1) Verdünnung - von-dem den aktiven Wirkstoff enthaltenden Präparat wird eine Verdünnungsserie hergestellt, und jede Verdünnung wird durcii irgendwelche geeigneten Mittel daraufhin überprüft, ob die Reaktion stattfindet. Die Verdünnungen können jeweils zweifach sein, d* h. Is2, 1:4, 1:8, 1:16 usw., oder zehnfach, d. h. 1:1G, 1:100, 1:1000 usw., oder in irgendeinem anderen passenden Verhältnis. Eine äquivalente Maßnahm© dafür, eine Verdüimungsserie herzustellen, besteht darin, Proben verschiedener Größen direkt von dem zu überprüfenden Material zu entkeimen, d. h. z. B. 10 ml, I₈₁O ml, 0,1 ml usw. 2) Extinktion - Jede Verdünnung muß getestet werden, bis eine gefunden wird, bei der nicht alle Proben dieser Verdünnung positive Reaktionen ergeben» Die in statistischer Hinsicht zuverlässigsten Werte sind diejenigen, die von Verdünnungen erhalten werden, die 50 % positive und 50 % negative Reaktionen ergeben«, 3) Vervielfachung »die VerdüaEraagen werden in drei, fünf, acht oder zehn Vervielfachungen erstellt und getestet. Eine Erhöhung der Anzahl der Vervielfachungen erhöht die Genauigkeit des Schätzwertes der Population. Die mathematischen Grundlagen und die grundlegenden Tafeellen werden angegeben von W*L. Stevens in ^Statistical Tables for Biological, Agricultural and Medieal Research⁸¹, R.A«, Fisher und Fo Yates₅ Edinburgh (1948), S. 7/3, Tabelle ¥111-2.

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Methoden des direkten Kontakts zur Ermittlung des Bakteriengehaltes %

Die oben erwähnte Verdünnungsmethode gewährleistet znmr eine gute Genauigkeit5 o©^^oc& gibt ©s Fälle, in denen sieh ander© Methoden zur Bestimmmag der Bakterieakonsentration als nützlich erwiesen haben» Di© Erfindung -ist auf bärtig® Methoden des direkten Kontakts gleicherweise anwendbar, und dafeer wird eine- kurze Beschreibung dieser Methoden nachfolgend gegeben*

Oberflächen! Ein gängiges Verfahren zur Bestimmung der zahl iron lebensfähigen Bakterien auf horizontalen besteht darin ₉ agarhaltige Hährlösung auf das au Gebiet zu gießen und dann an Ort und Stelle ©inea Bratvorgang durchzuführen (Hammer und Olson ₉ Iowa Stat© Coll» AgFo Station Bulletin I4l_s 1931) oi©r d@a gehärteten laferboäeia zwecks Inkubation in ein Gefäß zu bringen (.tegelottij, Foter und Leifisi Food Researchj, 23p 173-185 (1958) )„ Die Bakterien werden dabei von der Oberfläche zu den Hährboden übertragen raid entwickeln sich in diesem zu sichtbaren Kolonien» Di® wahrscheinlich am häufigsten ¥erxfead@te Method© E«r quantitativen Erfassung der Bakterienanzahl auf Oberflächen besteht jedoch darin_s verflüssigbares, verfestigtes steril©© Mährbodenmaterial gegen die zu untersuchende Oberfläche zu drücken und dann in einen Inkubator zu bringen· Derartige Methoden werden in folgenden Veröffentlichungen erwähntg Walter, "Bacteriological Reviews«, 19₉ 284-286 (1955); Seidel und Plaschkes "Die Fleischwirtschaft", 1O₈ 276-277 (1958); US-PS 2 904 474; Posber: «Lancet«, I₅ 670-673, 26„ März'i960; Rubbo und Dixonj «Lancet«, 2, 394-397, 20c Aug, I960; Hall und Hartnettί «Public Health Reporte®, 79, 1021-1024 (1964); Ten Cate: "J. Applied Bacteriology", 28, 221-223 (1965)5 US-PS 3 337 416. Es haben wenigstens zwei auf diesem Prinzip basierende Geräte in dea Vereinigten Staaten Verwendung gefunden ,nämlich die

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Rodac-Platte der Baltimore Biological Laboratories und die Monoflex-Kontaktplatte der Hyland Laboratories. Einige erfindungsgemäße Ausführungsfarmen dienen dazu, derartige Methoden des direkten Kontakts mit der Oberfläche zu verbessern.

Flüssigkeitenj Die Methode des direkten Kontakts ist auch dazu verwendet worden, die Bakterisnanzahl in flüssigen Proben zu bestimmen; dadurch wird zwar keine hohe Genauigkeit erhalten, dafür aber ein sehr einfaches Verfahren zur Ermittlung der ungefähren Konzentration der !©bensfälligen Organismen in der Flüssigkeit. Ein Beispiel für ein derartiges Gerät unter Verwendung eines Oxoid-Tauchplättchens wird von Naylor und Guttman in "J. Jygiene⁸« (Camfe) 65* 367-371 (1967), beschrieben. Die aus mikroskopischen Objektivträgern bestehenden Plättchen werden dabei mit aus Agar bestehendem Nährboden überzogen und in die Urinproben getaucht und dann einem Brutvorgang unterworfen. Ein© Anzahl von Bakterien, die zum Bakteriengehalt in dem Urin proportional ist, haftet an der Nährbodenoberfläche und entwickelt sich nach dem Brutvorgang zu sichtbaren Kolonien. Einige erfindungsgemäße Ausführungsbeispiele beinhalten eine beträchtliche Verbesserung dieser Art von Probenentnahme.

•Luft ι Bei Verwendung der Methoden des direkten Kontakts für Luft werden die sterilen Nährbodenoberflächen für bestimmte Zeitspannen der Luft ausgesetzt, worauf ein Brutvorgang der Plättchen folgt. Die Erfindung sieht eine Modifizierung dieeer Art der Exponierung der Nährbodenoberflächen vor und bietet daher Vorteile gegenüber den bekannten Methoden.

Übertragungsmethoden zur Ermittlung des bakteriellen Gehalts ron Oberflächenj

Um einige Unbequemlichkeiten bei der direkten Probenentnahme von Oberflächen zu vermeiden, sind einige Methoden beschrieben

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worden, bei denen eine sterile Übertragungseinrichtung -verwendet wird, die gegen die Oberfläche gedrückt und dann gegen eine feste Nährbodenoberfläche gedrückt wird, um die lebensfähigen Organismen auf die letztgenannte Oberfläche zu übertragen (Greene, Vesly und Kesnan, "J* Baet«,¹³, 84, 188-189 (1962)j Gundstrups "Health Laboratory Science¹⁸, 5, 113-115 (1968)). Die Erfindung sieht Ausführungsformen vor, die auf diese Art der Oberflächenuntersuchung ebenfalls angepaßt werden können.

Die Methode der wahrscheinlichsten Zahl

Es ist bereits die MPN-Methode zur Bestimmung der lnzahl von Kolibakterien in Trinkwasser kurz erwähnt worden| da jedoch die Erfindung von den Prinzipien äisser Method© Gebrauch macht, wird die Methode im folgenden ©ingehsnder beschrieben.

In ihrer am meisten verwendeten Ausbildung sieht di® MPM-Methode für jede Wasserprotoe fünf mit ©iner Kappe verschlossene sterile Röhrchen vor, die je 10 ml einer geeigneten sterilen, auf doppelt© Stärk© angesetzten Mhrfleisehbrühe enthalten, sowie fünf steril© Röhrchen, die je 19 ml einer einer in einfacher Stärke angesetzten Hährfleischbrühe enthalten, und fünf sterile Röhrchen, die 19,9 El derselben sterilen Nährfleischbrühe und auSerdem eine Anzahl von sterilen Pipetten enthalten. Zur Durchführung des feats werden di® Röhrchen in ein Gestell gebracht, und 10 ml des m Wassers werden zu j@d©s ά©ζ° fümf Röhrchen_D di© 10 auf doppelte Stärk© aisgesetzt ©ja FleisehfertlM® osathalteßp hinzugesetzt. Mengen von je 1 al IJasssr Röhren©» gegeben, und M©ag@B voa j© O₀I ml 19» 9 ml-Röhrshen gegebea. All© ES^r©fe®a w@rd©a ©laera

les Wachstum hin überprüft

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Es sind Standardtabellen aufgestellt worden, um die Anzahl der positiv und negativ reagierenden Röhrchen in einen Index umzusetzen, der die wahrscheinlichste Zahl der Bakterien pro 100 ml geprüftes Wasser genannt wird (American Public Health Association - "Standard Methods £or the Examination of Vater and Waste Water", 12. Aufl., S. 604-609 (1965)). Wenn beispielsweise die fünf Röhrchen, die mit je 10 ml Wasser geimpft wurden, fünf Plusreaktionen hervorrufen, während die fünf Röhrchen, denen 1,0 ml Wasser hinzugefügt wurde, und die fünf Röhrchen, denen 0,1 ml Wasser hinzugefügt wurde, keine Plusreaktion ergeben, erhält man aus der MPN-Tabelle einen Wert von 23 Mikroorganismen pro 100 ml Wasser. Ferner besagt die Tabelle, daß in 95 % aller Fälle das dieses experimentelle Ergebnis ergebende Wasser nicht weniger als sieben Mikroorganismen pro 100 ml und nicht mehr als 70 Mikroorganismen pro 100 ml aufweisen wird.

Es werden täglich Hunderte solcher Tests in Instituten der öffentlichen Gesundheitspflege durchgeführt, woraus ersichtlich ist, daß hierzu nicht nur ein beträchtlicher Aufwand an Glasbehältern erforderlich ist, sondern daß auch viel Zeit aufgewendet werden muß, um die verschiedenen Materialien vorzubereiten und die für den Test erforderlichen Verfahrensgänge durchzuführen.

Die Aufgabe der Erfindung ist es, diese Testmethode mit weniger Aufwand an Zeit, Mühe, Materialien und Kosten durchzuführen.

Die Erfindung kann in vielen Ausführungsformen realisiert werden, von denen einige später eingehend beschrieben werden. Grundsätzlich wird eine Vielzahl von Flächen oder Volumina vorgesehen, die zueinander im Verhältnis einer geometrischen Reihe stehen, und dies© Flächen oder Volumina werden mit Nähr-

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stoffen oder biochemisch reaktiven Substanzen oder Lösungen versehen, die bei Anwesenheit der gesuchten biologisch aktiven Objekte eine quantenmäßige Reaktion zeigen» Einige Ausführungsformen verwenden eine Reihe verschiedener zu beobachtender Flächen- oder Volumina und setzen diese den Nährböden aus, wo sie dann in quantenmäßiger Weise ansprechen. Bei änigen AusführungsformeB werden die biologisch aktiven Objekte von einer Reihe von Flächen oder Volumina aufgenommen, die sich wie die Glieder einer geometrischen Reihe zueinander verhalten, und es erfolgt dann eine übertragung (Verdünnung) auf gleiche Flächen oder Volumina von Nährlösungen oder Wirkstoffen, so daß im Ergebnis eine Reihe von Verdünnungen ausgeführt worden ist.

Der Zweck der Erfindung ist @s_s die Notwendigkeit zur Durchführung von Verdünnungen oder zum Einpflanzen von vervielfachten und verschiedenen Volumina oder zur einzelnen Mitnahme von Proben verschiedener Flächen eu eliminieren« Die hierfür vorgesehenen erfinäungsgemäßen Lösungsmittel führen im Endeffekt Verdünnungen durch oder entnehmen Proben verschiedener Volumina» Bei siner Ausführungsforra der Erfindung erzeugt jedes Fach eine quantenmäßige Plus— oder Minusreaktion, und die Anzahl dieser Plus- und Minusreaktionen kann direkt in die wahrscheinlichste Anzahl von Bakterien oder in den LDcQ-Wert eines Toxins oder in ©ine äquivalente Potenzeinheit eines Serums oder eines Allergien hervorrufenden Stoffes umgesetzt werden. Diese Umsetzung wird mittels einer für jede Ausführungsfarm vorzusehenden besonderen Tabelle in einfacher und schneller Weise durchgeführt und eliminiert die Notwendigkeit einer mathematischen Berechnung. Bei der Aufstellung der Tabelle werden die Art der Fächer, die dabei verwendete geometrische Reihe, die Anzahl der Vervielfachungen jeder Fläche oder jedes Volumens, der besondere dabei verwendete Nährboden usw. berücksichtigt.

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Es werden in der Beschreibung Begriffe wie "Flächen", "Volumina¹¹, "Fächer" verwendet; im Rahmen der Erfindung sind jedoch auch tablettartige Gestelle, Folien. Schablonen, bestimmte Muster, absorbierende Materialien, Anordnungen von Borsten oder Stiften, Schaummaterialien, Vorsprünge oder sonstige beschriebene Mittel verwendbar. Aus der folgenden Beschreibung wird für den Fachmann ersichtlich, in welcher Weise die Erfindung auf andere Ausführungsformen als die im einzelnen beschriebenen ausgedehnt werden kann.

Die Erfindung wird im folgenden an Hand von Ausführungsbei-

spielen unter Bezugnahme auf die Zeicimung näher erläutert. Es zeigen;

Fig. 1 eine Draufsicht auf ©in© unbedeckte, mit vielen Fächern versehene erfinäungsgemäße Anordnung zur Probenentnahme, wobei ein© Vielzahl von Proben unterschiedlicher Volumina einschließlich Vervielfachungen derselben aufneiimbar sindj

Fig. 2 eine Draufsicht von vorn auf die Probenentnahmeanordnung won Fig. 1, wobei ©in Deckel aufgesetzt ist ι

Fig. 3 eine Draufsicht von oben auf eine zweite Ausführmigsform einer mit vielen Fächern versehenen erfindungsgemäßen Probenentnahmeanordnung, wobei die Fächer radial angeordnet sind;

Fig. 4 eine Draufsicht von vorn auf die Probenentnahmeanordnung von Fig. 3j

Fig. 5 eine Draufsicht auf ein Plättchen, das derart überzogen 1st, daß eine Reihe von diskreten Testbereichen oder -Inseln verschiedener Größe in vervielfachter Form entstanden ist;

Fig. 6 eine Draufsicht von vom auf das überzogene Plättchen von Fig. 5;

Fig. 7 eine Draufsicht von vom auf eine mit Vertiefungen, Höhlungen oder Fächern versehene Platte, die zur Aufnahme eines Stoffes geeignet sind, der die Reaktion von zu biologisch aktivem Wachstum fähigen biologischen Objekten anzeigt;

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Fig_o 8 eine Draufsicht von oben auf eine Testfoli©

oder -platte, die mit einer R@ihe von diskreten_p in mehrfacher Yervielfachung vorliegenden Flächen versehen ist, die dag Wachstim von irgendwelchen anwesenden biologisch aktiven Objekten anzeigen können|

Fig» 9 eine seitliche Draufsicht auf die Testfolie

von Fig. 8, die in eine Schutzhüll© eingesetzt ist j

Fig» 10 eine Draufsicht von vom auf eine Testfolie ₉

die ähnlich der von Fig. 8 ist, jedoch mit Yartiefungan ausgebildet ist, um einen Nährboden aufzunehmen, der auf irgendwelche anwasenden biologisch aktiven Objekt© anspricht§

Fig. 11 eine .Testplatte und eine daran anzuheftende

Schablone _ΰ die di© Tastbereißli® abgrenzt j und

Fig. 12 eine Draufsicht von vom auf ©in© Anordnung zur Probenentnahme is einem @insig©n Jerf&hrenmsehritt und zur Übertragung der Proben in ©inem einzigen Ferfahrensschrittp wobei di© Proben im Yerhältsiig d©r Glieder ein@r geometrischen Reihe Eueiaander stehen.

Im folgenden wird überwiegend auf sir©i gsnaidsät^lieh© Farian ten eingegangen^ di© ⁵'&irekte2» Kontakt⁸¹ «ad ^tJbertragyng® genannt werden, und von d®n©ia ^@d@ an Hand von n©tir©ren Beispielen erläutert wirclL

1) Direkter Kontakts . *

Bei der
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aktiv® Substanz enthält _ρ ά®τ im Fllefeeia ©d@r

Bi© g gen in dir©kt©a Kontakt Mit <ä®r Flüegsigkültj, ύφτ 0h®^£liefe© od@r a&m Qm.m_B die di© g®Buoht®n fei©l©gis©l also S₀-B₀ di©

* t ί t

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erreicht, daß beispielsweise die flüssige Probe in Fächer gegossen wird oder daß eine verfestigte reaktionsfähige unterteilt© Oberfläche gegen die zu untersuchende Oberfläche gedrückt wird, und daß dann die Testflächen, -bereiche oder -volumina der Anordnung auf die quantenmäßige Reaktion hin beobachtet werden.

2) Übertragungj

Es wird eine Übertragungseinrichtung dazu verwendet, die Flüssigkeit, die Oberfläche oder das zu untersuchende Gas zu berühren und dadurch die zu bestimmenden biologisch aktiven Objekte aufzunehmen. Das probenmäßig entnommene Material wird dann in eine Nährlösung oder in ein Reaktionsmedium gebracht, worin die quantenmäßige Reaktion beobachtet wird. Beispielsweise können solche Systeme folgende Merkmale aufweisen;

a) Die übertragungseinrichtung ist gleichmäßig über ihre Oberfläche; jedoch ist die Aufnahmeeinrichtung für den Nährboden im Verhältnis einer geometrischen Reihe in Flächenoder Volumenanteile unterteilt.

b) Die übertragungseinrichtung ist im Verhältnis einer geometriechen Reihe in Flächen- oder Volumenanteile unterteilt, wobei aber die Aufnahmeeinrichtung für den Nährboden bzw. das ReaktionsHie&iuii in gleiche oder äquivalent© Flächenoder Volumenanteile unterteilt ist (Fig. 12).

o) Bei einer Kombination der beiden vorgenannten Typen zur Herstellung aufeinanderfolgender Verdünnungen im Verhältnis ©Im®F gßQmetrlBohen Reihe, wobei die Aafangskonzentration d&r zn fe®stlffia®si€l©ii biologisch aktiven Objekte groß ist und hohe feriHMiMsagen notwendig Bind» vm die Voraussetzung zu er«

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füllen, daß einige der Wachstums·= oder Reaktionszellen kein Wachstum bzw. keine Reaktion zeigen, während ander® eine positive Reaktion zeigen,,

Direkter Kontakt
Beispiel Ί

Die in der Draufsicht von Fig* 1 und der ¥ord@ransieht von Fig. 2 dargestellte Anordnung 20 dient zur Ermittlung der X'/ahrscheinlichsten Zahl bei Bakterien in einer Flüssigkeit. Die Anordnung 20 enthält ein tablettartiges Gestell 22 aus festem ₉ aber formbarem Material wie einer Kunststoffplatte oder -folie, Papier, Glas oder Metall mit durch Yertiefungen gebildeten Hohlräumen oder Fächern 24 v@rs©lii©d©m©r ¥©lumina_s die in den gezeigten Beispielen fünffach vervielfältigte Volumina von 1O₉ I₉O und 0,1 ml aufweisen. Diese Fächer 24 dienen dazu₉ Wasser oder ©ine andere zu untersuchende Flüssigkeit aufzunehmenρ und di© in Fig. 1 und 2 gezeigten Zahlen stellen das Volumen Jedes Faches dar= Di© geometrische Anordnung der Vertiefungen auf der Foli® bzw. <äsr Platte ißt rein willkürlich gewählt und für die Erfindung nicht kritisch. Die" Fächer haben vorzugsweise folgend© Abmessungen «ad enthalten vorzugsweise folgende gewichtsmäßigen Mengen an Mährboden j

Volumen	Tiefe	Durchmesser	Fleischbrühe im
{ml)	(cm)	(cm)	Festzustand (mg)
10	2	2,53	200
1	1	1,13	20
OA	0,2	0,80	2

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Es sei darauf hingewiesen, daß dies eine willkürlich getroffene Anordnung istj es kann irgendeine Anzahl von vervielfachten Fächern irgendeines Volumens verwendet werden, die durch Kombination geeigneter Abmessungen hinsichtlich Tiefe, Durchmesser oder geometrischer Form der Vertiefungen erhalten werden, um dasselbe Ziel zu erreichen, und es kann irgendein geometrisches Volumenverhältnis, z. B. 2, 4, 5, 10 nach Wunsch verwendet werden. Wesentlich ist lediglich, daß die Volumina der verschieden großen Fächer bekannt sein müssen und daß sie im Verhältnis einer geometrischen Reihe zueinander stehen.

In jedem Fach 24 wird eine Menge getrockneter Bestandteile 26 einer Nährfleischbrülie untergebracht, wobei bei Auflösung dieser Bestandteile in Wasser oder einer anderen Flüssigkeit in der Vertiefung sich wieder die Nährfleischbrühe ergibt. Eine derartige Fleischbrühe enthält üblicherweise 2 % Feststoffe, bestehend aus 0,5 % Pepton, 1 % Hefeextrakt und 0,5 % NaCl, muß aber nicht unbedingt diese Bestandteile oder Anteile enthalten. Die Nährfleischbrühe kann Zusätze verschiedener Arten enthalten, etwa Farbstoffe oder Indikatoren, die ihre Farbe ändern, wenn die Bakterien sich in einem bestimmten Ausmaß vervielfacht haben, wodurch die übliche Beobachtung der Trübung zusätzlich unterstützt wird. Es können andere Chemikalien hinzugegeben werden, die das Wachstum nur bestimmter besonderer Mikroorganismen gestatten oder anzeigen, und im allgemeinen können die getrockneten Wirkstoffe irgendeines mikrobiologischen oder biochemischen Tests nach Wunsch in die Fächer gebracht werden. Die in jedem Fach untergebrachte Menge hängt vom Volumen des Faches und der in dem Fach gewünschten Endkonzentration der anhydriden Chemikalien ab. FUr den Fall einer Nährfleischbrühe mit 2 % Feststoffen und den im vorliegenden Beispiel angegebenen Fächern sind die Nährfleisehbrühmengen in der obigen Tabelle aufgeführt.

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Die getrockneten Ingredienzien können in jedes Fach eingewogen werden, oder sie können in jedes Fach eingebracht werden, indem jedes Fach bis zur Grenze seines Aufnahmevermögens mit der Fleischbrühe gefüllt wird und dann das Wasser - vorzugsweise unter Vakuum - weggedampft wird, wodurch das genaue Gewicht der Fleischbrühefeststoffe in jedem Fach zurückbleibt, das zur erneuten Bildung der Fleischbrühe bei Zugabe von Wasser erforderlich ist. Alternativ können auch absorbierend wirkendes Papier oder andere geeignete Materialien mit Fleischbrühe gesättigt und dann getrocknet werden, und einzelne Stücke, die die gewünschte Menge von Fleischbrühefeststoffen enthalten, werden dann in jedes Fach gegeben.

Die Anordnung 20 wird durch einen Deckel 28 vervollständigt, der aus irgendeinem geeigneten Material wie Kunststoff, Metall usw. bestehen kann. Es kann einfach eine Folie sein, die sich fest anliegend über alle Fächer erstreckt, oder es können auch angehobene Flächenbereiche vorgesehen sein, die genau den Fächern entsprechen. Der Deckel kann an dem Gestell 22 mit einem Scharnier 30 befestigt sein. Der Deckel 28 kann eine Klebschicht 36 in einem solchen Muster aufweisen, daß, wenn das Gestell bedeckt wird, die Klebschicht eine feste Haftung des Deckels an den zwischen den Probenfächern befindlichen Flächen bewirkt. Der Deckel kann auch Rippen oder Vertiefungen aufweisen, die mit Vertiefungen oder Rippen in dem Gestell korrespondieren, um jedes Fach gegen alle anderen Fächer des Gestells abzudichten.

Beim Zusammenbau der Anordnung wird, nachdem die Fleischbrühefeststoffe 26 in die Fächer 22 in der oben beschriebenen Weise eingebracht worden sind, der Deckel 28 an seinen Ort gebracht und die ganze Anordnung sterilisiert. Es-kann Dampfsterilisation benutzt werden, wenn die Komponenten die Steri-

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lisationsbedingungen aushalten; andernfalls können Äthylenoxidgas oder andere Sterilisierungsmittel benutzt werden. Ein Klebband oder ein anderes Verschluömittel kann erforderlich sein, um die Sterilität des Inneren der Anordnung aufrechtzuerhalten, oder die Anordnung kann vor dem Sterilisieren in ein Papier oder in Plastiktüten gepackt werden. Diese Sterilisiermethoden und der Schutz steriler Gegenstände sind bekannt.

Bei Benutzung wird der Deckel 28 entfernt, und das tablettartige Gestell 22 wird in das zu testende Wasser getaucht, und dann-wird der Deckel wieder aufgesetzt. Der Zweck der Klebedichtung zwischen Deckel und Gestell bzw. der ineinandergreifenden Rippen und Vertiefungen besteht darin, ein Schütteln der Anordnung nach Aufnahme der Proben zu ermöglichen, um die Fleischbrühefeststoffe 26 in dem Wasser zu verteilen, während der Inhalt Jedes Faches von allen anderen Fächern getrennt bleibt. Die Anordnung 20 wird dann in einem Brutkasten auf die Temperatur gebracht, die zur maximalen Entwicklung der interessierenden Mikroorganismen erforderlich ist. Eine andere Methode zum Beschicken der Anordnung mit der zu testenden Flüssigkeit besteht darin, die Flüssigkeit Über die Anordnung zu gießen oder die Anordnung unter einen die Flüssigkeit ausströmenden Hahn zu halten und dann die Anordnung etwas zu schütteln, um das Wasser von den außerhalb der Fächer 24 liegenden Flächen zu entfernen. Es kann erwünscht sein, diese Flächen 32 zwischen den Fächern mit einem nichtbenetzbaren Material wie etwa Teflon oder einem unter dem Warenzeichen KeI-F bekannten Polyhalogenhydrocarbon oder einem Klebstoff 34 zu behandeln, der wasserabstoßend ist und gleichzeitig als Dichtung für den Deckel dient.

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Zu jeder Anordnung - und zwar in aufgedruckter oder in begleitender Form - ist eine Tabelle mit MPN-¥ert©n vorgesehen, die speziell auf die Volumina₉ Verhältnisse und Vervielfachungszahlen der Hohlräume der Anordnung abgestimmt ist. Nachdem der Brutvorgang beendet ist, wird die Anzahl der Plusfächer gezählt, und der MPN-Wert des Wassers ist direkt von der Tabelle ablesbar.

Beispiel II

Die oben beschriebene Anordnung gemäß Fig. 1 und 2 verwendet drei Probenvolumina mit je fünf Vervielfachungen derselben mit einem Maximalvolumen von 10 ml. In vielen Fällen, in denen das Wasser eine gute Qualität aufweist, ist es erwünscht, Volumina einzupflanzen, die größer sind als 10 ml (vgl= Hoskins, J»K_S und Butterfield CT., ⁵¹J. Amer. Water Works Assoc.% 27, 1101-1109 (1935)). Auch ist di® Schwankungsbreite und die Standardabweichung der wahrscheinlichsten Zahl geringer, je geringer das geometrische Verhältnis zwischen aufeinanderfolgenden Proben'oder Verdünnungen ist (vgl» Stevens in Fisher & Yates wie oben zitiert), so daß, falls dies praktikabel wäre, es genauer wäre, Zweifachverdünnungen zu verwenden anstelle von Zehnfachvardünnungen. Bei Verwendung eines Zweifachverdünnungsverhältnisses muß man jedoch die Probenreihe vergrößern, um sicher zu sein, daß derselbe Bereich der Bakterienkonzentration in der Wasserprobe überdeckt ist. Man müßte also acht aufeinanderfolgende Zweifachverdünnungen nehmen, um denselben Volumenbereich zu testen, der durch drei aufeinanderfolgende Zehnfachverdünnungen überdeckt wird. Bisher hat es sich als mühsam erwiesen, eine lange Reihe von Proben, die jeweils um einen Faktor zwei differieren, einzupflangen, und daher verwenden die meisten Methoden zum Analysieren von Wasser

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Zehnfachverdünnungen, wobei ein gewisses Maß der dieser Methode anhaftenden Präzision verlorengeht. Ferner kann eine verbesserte Genauigkeit dadurch erhalten werden, daß die Anzahl der Vervielfachungen jeder eingepflanzten Probe vergrößert wird. Praktische Überlegungen unter Einbeziehung der Anzahl degferforderlichen sterilen Behälter und der zum Einpflanzen von vielen Vervielfachungen benötigten Zeit haben dazu geführt, daß Verfahrensweisen verwendet werden^ die nicht so genau wie möglich sind.

Bei der Erfindung ist jedoch kein größerer Zeit- oder Materialaufwand erforderlich, wem men aufeinanderfolgende Zweifachverdümmngen anstatt Zelmfachirerdünnungen eiigflanzt oder wenn man zehn anstelle von drei Vervielfachungen vorsieht. Das Ablesen dor Ergebnisse dauert bei mehr Fächern etwas länger ι aber die Genauigkeit kann um ein Vielfaches erhöht werden.

Bei dsia zweiten erfindungsgemäBen Beispiel, das gegenüber dem ersten gewisse Vorteile aufweist, wird eine Anordnung verwendet, bei der fünf Vervielfachungen jeder von neun einer geometrischen Reihe gehorchenden Probengrößen Anwendung finden. Wieder sei darauf hingewiesen, daß diese Anordnung willkürlich gewählt istι die Größen und Stellen der Fächer werden hier mehr der Vollständigkeit halber angegeben, nicht aber als notwendig einschränkende Merkmale·* Notwendig ist lediglich, daß die Volumina bekannt sind und daß sie sich wie die Glieder einer geometrischen Reihe zueinander verhalten. Die Fächer in der Anordnung von Beispiel II haben die folgenden Eigenschaften, wobei für ^Jedes Volumen fünf Fächer existieren:

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Vol. 24 12 6 3 1,5 0,75 0,375 0,187 0,093

Höhe 2 2 1,5 1 1 0,5 0,25 0,25 0„25

0 (cm) 3,92 2,76 2,26 1,95 1,38 1,38 1_S38 0,98 0,74

Andere Eigenschaften und ' Merkmale der Anordnung entsprechen denen der Anordnung von Pig* 1 und 2, d· η_β die Trockenbestandteile der Nährfleischbrühe sind entsprechend dem Aufnahmevermögen des jeweiligen Faches in jedem Fach enthalten. Die Anordnung wird durch Eintauchen in Wasser oder durch Draufgießen von Wasser gefüllt, und es wird ein Deckel aufgesetzt s, der jedes Fach abdichtet. Eine in& einzelne gehende Beschreibung erscheint daher nicht notwendig. Die ganze Anordnung wird vor Benutzung- sterilisiert, und zwar entweder vom Hersteller oder vom Benutzer.

Beispiel III

Eine etwas abgeänderte Ausführungsform₉ die jedoch in der Wirkungsweise der von Beispiel II entspricht, wird in Fig. 3 und 5 gezeigt, die in etwa demselben Mafl^tab wie Fig. 1 und 2 gezeichnet sind* Bei dieser Ausführungsform sind, die Fächer 40 des tablettartigen Gestells 44 als konzentrische Quadrate angeordnet! es kann sich auch vsm konzentrische Zylind@r oder um eine andere geeignet© Form handeln. Ein einzig©!· Satz von neun Fächern von 24 ml bis 0,093 nü. nimmt eine Flä«- ehe von 6,35 · 6,35 em = 40,3 cm ©in. Bei B©ispiel II nahm die beschriebene Anordnung, die fünffach vervielfacht© Pro-

bensät ze enthielt, eine Fläche von 310 "cm ein. _ Das Beispiel III ist daher raumökonomischer hinsichtlich des Brutapparates und dem benötigten Lagerraum. Das Gestell gemäß Beispiel

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II wird ebenfalls mit dehydrierter Fleischbrühe 46 gefüllt und mit einem Deckel 48 versehen und dann vor der Benutzung sterilisiert. Die Anordnung ist leichter zu handhaben als die der Beispiele I oder II und bietet Vorteile hinsichtlich der Herstellung und der Schnelligkeit beim Ermitteln der getrübten Fächer. Wie vorher beschrieben wurde, können die zwischen den Fächern 40 befindlichen Flächenteile mit einem nichtbenetzbaren Material 50 behandelt werden.

Beispiel IV

Eine weitere Ausführungsform zur Bestimmung des Bakteriengehalts von Flüssigkeiten wird in der Draufsicht von oben in Fig. 5 und von der Seite in Fig. 6 gezeigt. Das Probengestell besteht hier aus einem Mikroskop-Objektträger 52 aus Glas oder Kunststoff, der in ausgewählten Flächenbereichen 56 mit Nährboden enthaltendem Agar 54 überzogen ist. Eine Anwendung dieser Ausführungsform ist die Bestimmung des Bakteriengehalts von Urin, und zwar weitgehend in der Weise, wie das von Mackey und Sandys (Brit. Med. Journal, 2, 1286-8 (1965)) beschrieben wird oder wie bei dem Objektträger-Eintauchverfahren gemäß Naylor und Guttman (J. Hyg. (Camb)_s 65, 367-71 (1967)) vorgegangen wird. Die letdgenannten Einrichtungen sind im Handel erhältlich bei der Firma Oxoid, Ltd.

Die Anordnung von Fig. 5 und 6 unterscheidet sich von diesen bekannten Anordnungen durch die charakteristischen Eigenschaften der Erfindung, nämlich eine Reihe von getrennten vervielfachten Reaktionsbereichen 56, die sich zueinander wie eine geometrische Reihe verhalten. Diese Bereiche werden in den Figuren abschattiert gezeigt. Und zwar werden sechs Bereiche mit einer Fläche von je 1 · 1 cm₉ sechs Bereiche mit

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einer Fläche von je 0,5 · 0,5 cm und fünfzehn Bereiche mit einer Fläche von je 0,25 · 0,25 cm gezeigt, wobei jeder Bereich eine Agarschieht 54 geeigneter Dicke aufweist. Bei dem Agar kann es sich um üblich© Nähragar oder um C.LoE.D.-Nährboden (vgl. Mackey und Sandys, ^!lBrit, Med. Journal" ₉ 1, 1173 (I960)) handeln oder um irgendeinen anderen besonderen gewünschten Nährboden. Der Agaraährboden 54 kann auch einen Farbindikator aufweisen, der die Beobachtung irgendeiner bakteriologischen Vermehrung erleichtert.

Die Flächen 60 zwischen den Agarschichten 54 können mit Silikon oder mit einem Fluorcarbon oder einem anderen wasser«*· abstoßenden überzug 62 versehen werden, oder die Foli© selbst kann wasserabstoßend sein, so daß nur· die mit Agar versehenen Bereiche 56 Flüssigkeit aufnehmen.,

Bei der Benutzung der aseptisch gemachten oder sterilisierten Anordnung wird diese in die Probenflüssigkeitj, d. h. in Urin, getaucht, dessen Bakteriengehalt bestimmt werden soll* Der Objektträger 52 xfird wieder in seinen sterilen Behälter zurückgebracht und wird so zn einem t-aTbor transportiert oder verschickt, w© ©r ©ine® Brutvorgang «nt©:m©r£en wird«, Nach einer geeigneten. Brutzeit zählt aan die Msahl der Bereiche jeder Größe, in denen ein Wachstum stattgefunden hat. Die Bezugnahme auf eine MPN-Eichtabelle, die speziell für diesen Zweck aufgestellt worden ist_p ergibt ©inen Indexwert, der die Bakterienkonzentration der untersuchten Flüssigkeit darstellt. Sowohl Mackey und Sandys als aueh Naylor sand Guttman haben an ihren Anordnungen Eichungen durchgeführt, bei denen die Amhl der erhaltenen Kolonien mit der Bakterienanzahl pro ml Urin in Beziehung gesetzt wird» Ihr® Anordnungen weisen zwar unterschiedliche Formen auf,und si® benutzen unterschiedliche Mhrböden; jedoch erhalten sie für je 1000 Bakterien pro ml Urin zwischen 0,15 und 0,8 Kolonien pro cm behandelter Nährbodenfläche. Im Durchschnitts, wenn die von

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ORfGfK(AL

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ihnen untersuchte Population lOOO/ml beträgt, beobachten sie eine sich entwickelnde Kolonie auf Je 3₉3 cm Nährbodenfläche { eine Population tobl 10 000/ral erzeugt eine Kolonie auf

de 0,33 cm ι eine Population von 100 OOö/ml erzeugt eine Kolonie auf Je 0,033 cm"" Nährbodenfläche.

2 Die in Fig. 5 gezeigte Anordnung sieht Flächen von 1 cm ,

2 2.

0,25 cm und 0,0625 cm vor, Diese Abmessungen sind ideal für einen Populationswert bis zu 50 000/ml; wenn höhere Konzentrationen betroffen sind, ketenen kleinere Hährbodenf lachen vorgesehen werden „ Die Verwendung kleinere!* Nährbodenfläclien ermöglicht die zahlenmäßige Erfassung von Populationen von mehr als 150 000/ml, ©line daß das Zusammenwachsen von Kulturen auftritt, das gegenwärtig die im Handel erhältlichen Anordnungen beschränkt.

Ea sei betont, daß bei d©r beschriebenen Anordnung die Notwendigkeit zur Auszählung einzelner Kolonien nicht mehr besteht} die einzige bei der beschriebenen Anordnung durchzuführende Zählung besteht in der Zählung der irgendein Wachstum enthaltenden Bereiche. Die Bezugnahme auf eine Eichtabelle von MPN-Werten ergibt dann den gewünschten Index der bakteriellen Population.

Bei diesem Beispiel stehen die Flächen aufeinanderfolgender Bereiche gemäß einem Faktor vier ia Verhältnis zueinander, und β£ sind Jeweils 6 bzw. 6 bzw. 15 Vervielfachungen vorgesehen. Ee ergeben eich keine Schwierigkeiten bei der Aufstellung von MPN-Tabellen, wenn verschiedene Anzahlen von Vervielfachungen verwendet werden (vgl. z. B. "Standard Methode for Examination of Water and Waste Water", wie oben zitiert).

Die Beziehung des MPN-Index, d. h. der Zahl der sich ergebenden Pluebereiche, zu der Anzahl der lebensfähigen Bakterien in der Flüssigkeit wird experimentell bestimmt für 3ede be-

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sondere Probenuntersuehungsanordaumg, wie dies won Mackey iand Sandys sowie von N&ylor und Guttman (i?i© oben zitiert) getan wurde.

Eine geänderte Ausführungs£orm iron Beispiel IY wird in Draufsicht in Fig* 7 gezeigt. Di© mit Nähragar -versehenen Bereiche 66 befinden sich in ¥@rtiefung©a eines entweder starren oder flexiblen tabelttartigen Gestells 70 aus Kunststoff, Metall oder Glasj» wobei die Agaroberflache 72 unterhalb oder oberhalb der Gestelloberfläeh© oder bündig mit dieser abschließend angeordnet ist.

Beispiel ¥1

Sine andere Art der Mordnungs, bai der Flächen iron Nährbodenagar 80 auf einem nichtbenetzbaren Substrat 82 angeordnet sindj wird in der Draufsicht von oben in Fig_e 8 und in der Seitenansicht in Figo 9 gezeigt. In dieses Fall sind fc

Z P

acht Vervielfachungen mit den Flächen 25 ©» _s 2_P5 ca ρ

O₉ 25 cm vorgesehen j die sich Jeweils durcli zehn unt@Fs©lieid©a w&u bm£ d@® Kicfetbsaetsbs plattenförmigen S^batrat 82 angeordnet sißö._o Ebenso wi© bei der Anordnung ύοώ, B@ispi©l IF wird dies© "ψύτϊϊθΤ¹ stes'ilge=- machte iaordaumg in di© zu unterstehend© Flüssigkeit ge taucht und dann für den Brutrorgang in ihre Hüll© 88 gebracht, die mit einen Deckel 90

gen der Hüll© 88 dadureh feragehaltea, daß ©s dto>©M ©inoia Schlitz 96 in den Deckel 90 sieh ©rstrsckt ο Di© MEaIaI ®ß_s üi® Größe, das Flächenve^MltEälSp die

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f. ^ ο iy ( / SY 3217 - 26 -

sielle geometrische Gestalt, der Nährboden usw. können dabei auch anders gewählt werden« Nach Beendigung des Brutvorganges wird die Anzahl der Plusflächen und die Anzahl der Minusflächen bestimmt, und unter Bezugnahme auf eine MPN-Tabelle erhält man dann einen Indexwert für die bakterielle Konzentration in der untersuchten Flüssigkeit. Wie in Fig. angedeutet ist, können die mit Agar bedeckten Bereiche 98 sowohl auf der oberen als auch auf der unteren Fläche des Substrats 82 vorgesehen werden.

Die Agarschichten müssen nicht auf eine Platte oder Folie aufgelegt werden, sondern können auch in Vertiefungen einer tablettartigen Platt© angeordnet werden, wie Fig. 10 zeigt. Die abschattierten Bereiche stellen dort die Querschnitte der mit Agar gefüllten Fächer 104 dar. Die Querschnittsansicht zeigt Jeweils ein Vervielfachungspaar von vier im Verhältnis einer geometrischen Reihe zueinander stehenden Flächenmaßen.

Beispiel VII

Bei einer weiteren, in Fig. 11 dargestellten Ausführungsform ist eine mit Agar 112 versehene Platte 110 von einer als Maske dienenden Schabion© 116 bedeckt, die beim Gebrauch fest gegen die Agaroberflache gedrückt wird. Die Schablone 116 kann starr oder flexibel sein und irgendeine geeignete Dicke haben. Sie hat dieselben oder etwas größere Abmessungen wie die Platt© 110 und besitzt Öffnungen 120, deren in vervielfachter Weise vorliegende Flächen im Verhältnis einer geometrischen Reih® zueinander stehen. Die Schablone 116 kann die in Fig. 5 und 8 veranschaulichte oder irgendeine äpisralen-■fce ösoaetrie aufweisen;, wobei die früher erwähnten schattierten FläeheB* di® dort Agar darstellten, nun als

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in der Schablone zu verstehen slnd^ iureh die die Agarschicht 112 der Platte 110 freiliegt.

Diese Ausführungsforj» hat den Vorteil der geringeren Fertigungskosten ₉ da eine gemeinsame, nicht unterteilte Platte als Substrat für ein© Vielzahl von verschi©denen Abänderungen der geometrischen Struktur dien&n -kann _f wobei ü&im ©ine entsprechende , wenig aufwendige Schablone anzufertigen ist.

Die sterile Platte 110 mit der darauf angebrachten Schablone 116 wird in die zu untersuchende Flüssigkeit geteuclit» Die Schablone kann nach dieser Probenentnahme entfernt t/erd©B oder auf der Platte 110 belassen werden. Die Platte 110 wird bedeckt und einsm geeignet langen Brutvorgang unterworfen. Wieder wird nur die Ixnaahl d©r Flusbsreioli© ^eder 6r8B® d@r Agarob@rflache gewählt, und d@r zugehörige MPN-Wert wird aus der auf die Anordnung abgestimmten Tabelle ermittelt»

Die diesen Beispielen gemeinsamen Merkmal® müssen nicht wiederholt werden=. Es sei betont ₉ daß unter ¥@rw®ndung dieser Anordnungen es möglich ist, eine Reih® vosa Y@rdümmng@n d@r ursprünglichen Flüssigkeit zu erhalten παά ^Jed© geeignet abzumessen, ohne die Verwendung von Pipetten, kolben oder Petrischalen. Der erhaltene MPN~Wert ist ebenso zuverlässig wie der mit den früheren Methoden erhaltene Zählwert. Ferner kann der gesamte Yorgang dort durchgeführt werden, wo die Probe entnommen wird, so daß die Notwendigkeit zur Sterilisierung von Probenfläschchen und zu® Transportieren derselben zur Probenentnahmestelle vermieden wird. Es wird auch die häufig erwähnte Erscheinung von ¥©runr©inigungs- oder Nährstoffen In dem Wasser oder Fläschehen vermieden, die das Bakteri©nwachstua hemmen oder stimulieren und so einen Fehlsr des Zählergebnissea verursachen. Manchmal wird ein Kühlschrank verwendet, uia die E®mm- o&qt Vervielfachunga-

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ORiGiMAL INSPECTED

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wirkung herabzusetzen oder das Wasser üfeer Macht oder über ein Wochenende zu halten, Ms die Verdünnungen und das Aufbringen der Proben durchgeführt werden k ©innen. Bei Verwendung der erfindungsgemäßen Anordnungen kmm man den Brutvorgang sofort beginnen und somit Werte der bakteriellen Population erhalten, die geaau dem Zusta&d des Systems im Zeitpunkt der Probenentnahme entsprechen« Ein anderer Vorteil der erfindungsgemäßen Anordnimgen besteht darin, daß die mühselige und zeitraubende Laborarbeit fast vollständig eliminiert wird.

Beispiel ¥111

Direkter Kontakt γοη Oberflächen

Wenn eine Oberfläche sinigernaSen gleichmäßig mit Mikroorganismen verunreinigt ist_$ kann irgendeine der in Fig. 5-10 gezeigten Anordnungen verwendet werden, mn den sog. "Obsrfläehen-MPN-Wert^w zu erhalten, und zwar in einer Weise, die der bei Flüssigkelten genau analog ist«, In jedem Fall wird der Deckel der Anordnimg entfernt und das folien- oder .plattenförmige Gestell gegen die Oberfläche gedrückt. Nach dem Brutvorgang wird die Anzahl derjenigen Flächen gezählt, die Wachstum, d. h» di© Anwesenheit ©iner biologisch aktiven Gesamtheit, anzeigen.« und eine dazugehörige Tabelle wird befragt, um daraus einen Wert für die Oberflächenverunreinigung zu erhalten. Ein solcher Vorgang vermag eine Darstellung der bakteriellen Population der Oberfläche so genau zu geben wiejiie unter den Warenzeichen Eodac oder Monoflex bekannten Kontaktplatten, jedoch mit dem Vorteil, da8 eine größere Fläch· untersucht wird und daß keine einzelnen Kolonien ausf·zählt werden müssen.

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Wenn die Oberfläche nicht gleichmäßig verunreinigt ist* können die genannten Anordnungen trotzdem verwendet werden, und zwar mit folgender Abänderungι Ein steriler 'Schwama wird mit ¥asser_s Lösungsmittel oder Hährfleisehbrühe benetzt und über die Oberfläche geführt, wodurch diese gründlich' benetst wird und die Oberflächenvarunreinigung so gleichmäßig wie möglich über die Oberfläche verrieben und verteilt wirdο Di© benetzte Oberfläche wird dam mit der Anordnung untersucht, und man erhält Ergebnisses, die denen ähnlich sind, die durch die Spül-und-Auffangpiethode erhalten ??®rd©n.

liegen seiner Einfachheit und Genauigkeit ist das beschrieben© Verfahren zur Ob@rfläch©nimt©rsueliuiig e©hr vorteilhafte Im allgemeinen können Fußböden und ander© verunreinigt© Oberflächen einige Mikroorganismen enthalten^ die als ^Ausbreitar⁸ bekannt sind_s weil ihre Kolonien sehr schnell wachs©a und sich über die ganze Oberfläche eines Mährbodens ausbreiten und dadurch die anderen Kulturan verdecken und heiasen. Die Anwesenheit solcher Ausbreiter macht ander© Arten von Kontaktplatten in vielen Fällen wertlos (vglc Kundsia u_oa_{o 0} "Jo Bacteriology® 82₃ So 619 (1961)),, Die Anordnungen der Erfindung sind jedoch gegenüber diese® E££©kt der nicht anfällig wegen der jaiehtb©n©t2bar©s Trenab©r©iefee sehen den ProbenbereiciieB;, durch di© ©in auf die Fläche b@sehri2ikt bleibt ₉ iia ä®r ©r eBfiagliofe war«

!'Jena die

gewiss© Z©itspas2ffi@₉ Isöiasea si© äasia fe>©aiatst w liert für di© in a®r Luft ©sxt!iialt©a©a !-!ilr©©FgQaiöiQoa Em II®= f®Fs_p ©b©ns© ifi© dl©® fe@i Flöissigiseitoia imä öB©F£lS@lao3a abglich ist ο Eb liSusm. mi@h ©la Luftstrom di^olst ühQW eälo

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denoberflachen geleitet werden, um die in ihm enthaltenen Mikroorganismen auf die Nährbodenflächen verschiedener Größe abzuladen.

Übertragung

Die oben beschriebenen Beispiele beruhen sämtlich auf dem Prinzip, verschiedene Volumina oder Flächenbereiche von Flüssigkeiten bzw. Oberflächen zu prüfen, wobei die Bildung der Proben durchgeführt werden konnte, ohne tatsächlich Verdünnungen vorzunehmen. Eine weitere zu der Erfindung gehörende Gruppe von Anordnungen enthält Mittel zum Durchführen einer einer geometrischen Reihe entsprechenden Serie von Verdünnungen, und zwar durch Übertragen der zu prüfenden Flüssigkeit in verschiedenen Volumina zu anderen NährfleischbrUhe oder biologisch aktive Flüssigkeit enthaltenden Volumina. Die Übertragungsvorrichtung selbst kann in Einheiten unterteilt sein, die nach Art einer geometrischen Reihe aufeinander bezogen sind, wobei die Übertragung mit gleichen Flüssigkeitsvolumina erfolgt, oder die Übertragungsvorrichtung kann gleichmäßig unterteilt sein, wobei die Übertragung mit Flüssigkeitsvolumina erfolgt, die nach Art einer geometrischen Reihe aufeinander bezogen sind.

Geometrische-Reihe-Übertragungseinrichtung und gleiche Nähr- bzw. Reaktionaflüssigkeitsfächer

Fig. 12 veranschaulicht teilweise in Draufsicht und teilweise im Schnitt'eine Anordnung, die dazu benutzt werden kann, dee erfiiidungggemäße Untersuchungsverfahren entweder an einem Festkörper oder einer Flüssigkeit durchzuführen. Bei der gegeigtem Ausführungsform bestallt die Anordnung aug einem Gestell 120, das durch, ein® Reihe -von Zwischenwänden 124 in Fächer 126 gl«Ieh@n Volumens unterteilt ist, von denen jedes

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eine Mhrflüssigkeit 130 oder ©ine sonstige biologisch reaktl- , ve Substanz im selben Volumenanteil enthält. Die Flüssigkeit 130 bzw. deren Oberfläche 132 wird von einer Vorrichtung I4ö berührt, die einer Bürste mit Borsten 142 ähneln kann oder auch aus einer Konstruktion mit einer Riffelung oder mit Kapillarröhren bestehen kann« Die über jede_ Gruppe von Borsten 142 gesetzte Zahl stellt entweder das relative Flüssigkeitsvolumen dar₉ das aufgenommen wird und von der betreffenden -Gruppe von Borsten, Vorsprüngen od©r Kapillarröhren festgehalten werden wird, oder die Oberfläche, di© von den Borsten besetzt v/erden wird₉. wenn diese eine abzutastende Oberfläche berühren=

Bei der Benutzung dieser Jnordnung zur bakteriellen Untersuchung einer Flüssigkeitsprobe wird ©ine Vielzahl von Borstenbüscheln jeder Größe vorgesehen,, Die Bürsteneinrichtung 140 \fird nach vorheriger Sterilisierung z„ B_e durch Dampf oder Gas oder auf sonstige geeignete Weise in die Flüssigkeit getaucht, dann abtropfen gelassen und darm über das Gestell 120 gebracht ₀ das die sterile Mäferfleischbrüae 130 in den Fächern 126 enthält» lach dem Bratirorgang wird die Anzahl der zu jeder Büschelgröße gehörende Plusfäeiser ©mittelt, und dann wird eine MPN-Tabelle, die auf ©io.©r Serie von zehn aufeinanderfolgenden Zweifaehv©rdümung@n und den von jedem Borstenbüschel aufgenommenen Volumina beruht ₉ hinzugezogen , um den·MPN- Wert d©r Flüssigkeit zn bestimmen.

Wenn eine Oberfläche untersucht wird, wird eine sterile Flüssigkeit daraufgegossen und die Bürsteneinrichtung dann nach Art einer Bürste für eine bestimmte Zeitspanne benutzt, und die so aufgenommenen Mikroorganismen auf $ed©m Bürstenbüschel läßt man dann mich in jedem Fach vsrashren.

Patentansprüche s

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ORlGiNAL INSPECTED

Claims (1)

1. SY 3217 -«ir·

   Patentansprüche

   Probenentnahme- und -uziterstachuiigsanordnung, mit der in einem einzigen Aufnahmevorgang von dem zu untersuchenden System eine Reihe von Probenanteilen mit quantenmäßigem Ansprechvermögen erstellt *.ferden kann, dadurch . gekennzeichnet , daß die Anordnung eine Vielzahl von Probenaufnahmebereichen (24? 40; 56; 66; 80ι 104j 1201 142) aufweist, die gleichzeitig dem zu untersuchenden System ausgesetzt werden können; daß die Probenaufnahmebereiche unterschiedliche Volumina alt bekannten geometrischen Abmessungen aufweisen; daß in jedem der Probenaufnahmebereiche Indikatormittel wirkungsmäßig vorhanden sind, die auf biologisch aktive Organismen ansprechen| und daß die Indikatormittel in Jedem Probenaufnahmebsreich auf die zu ermittelnden biologisch aktiven Organismen quantenmäßig ansprechen.

   2. Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die Probenaufnehmebereiche Behälter sind, die durch eine Vielzahl voneinander getrennter Fächer (241 40) gebildet sind, von denen jedes zur Aufnahme von Flüssigkeitsproben von dem zu analysierenden System geeignet ist, und daß VerschluSmittel (28; 48) vorgesehen sind, um jedes Fach dicht abzuschließen und eine Verunreinigung desselben sowie ein Übergehen von Probenflüssigkeit von einem Fach zum anderen zu verhindern, so daß die einwandfreie Beschaffenheit der Probe jedes Faches gesichert ist.

   3· Anordnung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß in jedem Fach (24; 40) ein Reaktionsmediurn (26; 46) untergebracht ist, das auf einen darin befindlichen biologisch aktiven Organismus visuell anspricht,

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   fHAL !HSFECTED

   SY 3217 - S*·- ' .

   daß das Reaktionsmedium in jedem Fach in ©iner Menge irorhanden isty die dem Aufnahmevolumen des betreffenden Faches proportional ist₉ so daß nach Verteilung des Reaktionsmediums in einem dem Fach entsprechendem Flüssigkeit tsYolumen die Konzentration des Reaktionsmsdiums in d©n sich ergebenden Lösungen in jedem Fach im wesentlichen dieselbe ist»

   4. Anordnung nach Anspruch I₉ dadurch, gekennzeichnet, daß di© Probenaufnahmebereiche visuell unterscheidbare und einzeln identifigierbare* auf einsm flachen Substratkörper (52 g 70 g 82 % 112 _g 116) angeordnet© Flächen (56| 66j 80p 120) sind_? im denen di® auf biologisch aktive Organismen ansprechenden IMikatomittel @athalt©n

   des Aufnahseirarganges iron den zu uat@rsuclieiiden Syst©» in eine Flüssigkeit eintaucnbar"ist sw@cks Ermittlung d®T darin befindlichen biologisch aktiven Organismen und !©Stimmung deren Konzentrationο

   5 ο Anordnung nach Anspruch !„ da ζ e i ch a e t _f

   verteilt ist, daS eine Sehafoloa® (116) vopg©seh©sä ist, di© deckungsgleich auf di© Platte g@fex°aelit werä@n kaaa_p iaaä dag die Schablone Fenster (120) mit teilweise v©rsciii@d®n@r öff° nungsfläeh© aufweist^ fii© Bereieti© MM©a_p du^cli Ulm am® Ia= dikatormitt©! £?eili@gt„ ?j©ms di© Platt© (110) suchenden System E,tJ<s©k.@ BestiEüMag cl©F la, ih® biologisch aktiven Organismus

   a i « ι³

   mitteln (142) "bestmh.t_D 'daß J©dl®© Pr©b©iaswL3!iffiate©sittQl

   SY 3217 - <$*-

   Probeaufnahme und -übertragung dient, daß die Übertragungskapazität jedes Probenaufnahmemittels (142) mit der ■ Übertragungskapazität der anderen Probenaufnahmemittel der Anordnung Im. Verhältnis einer geometrischen Reihe steht, so daß, Indem das auf biologisch aktive Organismen ansprechende Indikatormittel der Probenaufnahmeanordnung ausgesetzt wird, eine Reihe von Proben erstellt wird, die miteinander in einem bekannten geometrischen Verhältnis stehen bezüglich der zu ermittelnden biologisch aktiven Organismen.

   7. Anordnung nach Anspruch l_s dadurch gekenn-

   seiciinet , daß die Probenempfangsbereiche zur Erh5hung der statistischen Zuverlässigkeit der erhaltenen Daten jeweils in mehreren Vervielfachungen vorhanden sind.

   8. Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die auf biologisch aktive Organismen ansprechenden Indikatormittel einen Nährboden zur Unterstützung des Wachstums eines eu untersuchenden biologisch aktiven Organismus aufweisen»

   9« Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet _f daß die auf biologisch aktive Organismen ansprechenden Indikatormittel einen diagnostischen Wirkstoff enthalten, der eine sichtbare Anzeige der Anwesenheit der zu untersueliendeis biologisch aktiven Organismen bewirkt«

   10« Anordnung naefe Anspruch I₅ dadurch geicean«

   ζ β i s h "n © t , daß die Qr'öBe und Geometri© der Probenaufnatei©bereleli© se ist, daß Ia einigen der Probenaufnaha«e-'sereicfee sieh die ©!©logische Aktivität der in dem zu unteres. Syst en vorhandenen Organismen bemerkbar nacht, in

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   SY 3217

   I!» Verfahren zum' Unterteilen eimer einheitlichen Probe in eine Reihe von Probenanteilerx und zum quantitativen Untersuchen irgendeines Systems, bestehend aus Flüssigkeiten, Festkörpern, Oberflächen oder Gasen_s auf die Anzahl der in dem System enthaltenen biologisch aktiven Organismen₉ dadurch gekennzeichnet _s daß ein bestimmtes zu analysierendes besonderes System abgegrenzt wird5 daß diesem System eine Probenaufnähmeanordnung ausgesetzt ifirdj. die Mittel zur iäitnanme und zur definierten Aufbewahrung, einer Reihe von Probenanteilen in einem einzigen Verfahrensschritt enthält £ daß die Probenanteile im einzelnen gesteuerten Umgebungsparametem unterworfen werden einschließlich einer Zeitspanne und einer Temperatur, die dazu ' führt ₉ daß die in den Probenanteilen vorhandenen biologisch aktiven Organismen sich bemerkbar machenf und daß die Probenanteile auf das Vorhandensein von Indizien überprüft werden» die die ursprüngliche Anwesenheit von biologisch aktiven Organismen anzeigen_t um die Konzentration dieser biologisch aktiven Organismen in dem zu analysierenden System zu bestimmen.

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